ES2551985T3

ES2551985T3 - Anticuerpos anti-IL-6, compuestos métodos y usos

Info

Publication number: ES2551985T3
Application number: ES06751915.7T
Authority: ES
Inventors: Yan Chen; Debra Gardner; David M. Knight; Michael W. Lark; Bailin Liang; David J. Shealy; Xiao-Yu R. Song; Vedrana Stojanovic-Susulic; Raymond W. Sweet; Susan H. Tam; Sheng-Jiun Wu; Jing Yang; David Matthew Marquis; Eric Michael Smith; Alain Philippe Vasserot
Original assignee: Janssen Biotech Inc; Applied Molecular Evolution Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc; Applied Molecular Evolution Inc
Priority date: 2005-04-29
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2015-11-24
Anticipated expiration: 2026-04-28
Also published as: HRP20181218T1; SV2006002513A; EP1874351B1; RS54133B1; EP3421492A1; EA015262B1; IL211132A0; SI2842968T1; EP2842968B1; EP1874351A2; PL1874351T3; CA2606348C; IL211133A; CN102924596A; HN2006016512A; US20060257407A1; US12065488B2; MY142835A; HUE039116T2; US7833755B2

Abstract

Un anticuerpo IL-6 aislado que incluye: (i) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con Nº DE ID DE SEC: 101 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con Nº DE ID DE SEC: 103; (ii) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con Nº DE ID DE SEC: 124 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con Nº DE ID DE SEC: 126; (iii) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con Nº DE ID DE SEC: l16 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con Nº DE ID DE SEC: 118; (iv) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con Nº DE ID DE SEC: 120 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con Nº DE ID DE SEC: 122; (v) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con Nº DE ID DE SEC: 128 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con Nº DE ID DE SEC: 130; o (vi) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con Nº DE ID DE SEC: 97 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con Nº DE ID DE SEC: 99.

Description

Anticuerpos anti-IL-6, compuestos métodos y usos

ÁMBITO DEL INVENTO

El presente invento trata de anticuerpos, incluidas las fracciones o variantes que se indican, especificas para por lo menos una proteina IL-6 o un fragmento de la misma, y ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos anti-IL-6, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células hospedadoras y métodos para su creación y su uso, incluidas formulaciones terapéuticas, administración e instrumentos.

CONTEXTO

IL-6 es una citoquina pro inflamatoria pleiotrópica producida y segregada por una amplia variedad de tipos celulares, especialmente células que presentan antigenos, células T y B. IL-6 está implicada en actividades tan diversas como el crecimiento y diferenciación de células B, activación de células T, hematopoyesis, activación osteoclástica, crecimiento de queratinocitos, crecimiento neuronal y activación de hepatocitos. IL-6 se une a IL-6R de transmembrana o soluble y señala a través de gp130, compartido por otras citoquinas.

IL-6 juega un papel importante en las anomalias de células B, tal Y como se demuestra en el lupus eritematoso sistémico, el mieloma múltiple y los trastomos linfoproliferativos. De forma similar, IL-6 también está implicada en la patogénesis de trastornos autoinmunes e inflamatorios como la artritis reumatoide y la osteoartritis. Recientemente, las pruebas indirectas sugieren una asociación entre IL-6 y trastorno obstructivo pUlmonar crónico y resistencia a la insulina en diabetes de tipo 2. IL-6 tiene tanto efecto pro-inflamatorio como anti-inflamatorio en el sistema inmunológico, indicando que es probable que esta citoquina tenga un papel central en la regulación de la respuesta fisiológica a la enfermedad. Por lo tanto, IL-6 podría proporcionar beneficios terapéuticos en una amplia va riedad de tipos de enfermedades.

Se ha observado un aumento en la producción de IL-6 en varias enfermedades, entre las que se incluyen: enfermedad de Alzheimer, trastomos autoinmunes, como artritis reumatoide, inflamación, infarto de miocardio, enfermedad de Paget, osteoporosis, tumores sólidos (carcinoma de célula renal), cánceres prostáticos y de vejiga, cánceres neurológicos y malignidad de célula B (por ejemplo, enfermedad de Casteleman, ciertos linfomas, leucemia linfocítica crónica y mieloma múltiple). La investigación ha indicado que IL-6 está unida a la patogénesis de muchas de esas enfermedades, especialmente el cáncer y, por lo tanto, el bloqueo de IL-6 debería traducirse en beneficios en el ámbito clín ico.

Se han desarrollado anticuerpos murinos, quiméricos y otros anti-IL-6 no humanos (por ejemplo, WQ 2004f039826 y EP 0783893); de todas formas, podrían tener una potencia y eficacia limitadas, podrían activar con frecuencia una respuesta inmunitaria inaceptable (por ejemplo, inmunogenicidad) yfo necesitar una dosificación elevada (ver, Trikha et al., Clin. Can. Res. 9, 4653-4665, oc!. 2003). Por ejemplo, los anticuerpos que contienen fracciones no humanas con frecuencia producen una respuesta inmunitaria en humanos. En consecuencia, la administración repetida de anticuerpos no es adecuada como terapia y la depuración de la circulación mediada por complejos inmunitarios de anticuerpos puede reducir la potencia/efectividad del anticuerpo. La enfermedad del suero y la anafilaxis son dos ejemplos de situaciones que puede provocar la administración repetida de anticuerpos con fracciones no humanas. A este respecto, se necesita un anticuerpo anti-IL-6 con un menor potencial para la inmunogenicidad, por ejemplo, más tolerable en humanos y que sea más potente de forma que necesite una dosis menor en comparación con los anticuerpos anti-IL-6 utilizados preViamente.

RESUMEN DEL INVENTO

El invento proporciona un anticuerpo aislado IL-6, que incluye:

(i): una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 101 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID N°: 103;

(ii): una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 124 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID N°: 126;

(iii) una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 116 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID N°: 118;

(iv): una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 120 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID N°: 122:

(v): una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 128 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID W: 130; o

(vi): una secuencia de aminoácido de reg ión variable de cadena ligera de SEC ID N°: 97 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada de SEC ID N°: 99; El invento también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un anticuerpo del invento. El invento también proporciona un vector aislado de ácido nucleico que incluye la molécula aislada de ácido nucleico del invento. El invento también proporciona una célula hospedadora procariótica o eucariótica que incluye la molécula aislada de ácido nucleico del invento.

El invento también proporciona un método para producir por lo menos un anticuerpo IL-6, que incluye el traslado de las moléculas de ácido nucleico del invento in vitro, in vivo o in situ, de forma que el anticuerpo IL-6 se exprese en cantidades detectables o recuperables. El invento también proporciona un compuesto que incluye por lo menos un anticuerpo aislado IL-6 del invento y por lo menos un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente. El invento también proporciona una composición que incluye por lo menos un anticuerpo aislado IL-6 del invento para su uso en terapia. El invento también proporciona un anticuerpo del invento para su uso en un método para el diagnóstico o tratamiento de una afección relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano o animal, donde la afección relacionada con IL-6 se selecciona a partir del grupo de: obesidad, enfermedad inmunológica, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa o enfermedad maligna y una enfermedad neurológica. El invento también proporciona un instrumento médico, que incluye un anticuerpo IL-6 del invento, donde dicho instrumento es adecuado para contactar o administrar dicho anticuerpo IL-6 por, como m¡nimo, una de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardial, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmica. El invento también proporciona un articulo de fabricación para uso farmacéutico o diagnóstico humano, que incluye un material de empaquetado y un envase que incluye una solución o forma liofilizada de un anticuerpo IL-6 del invento.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra el enlace de anticuerpos de ingenieria humana y quiméricos anti-IL-6 a complejos IL-6I1L-6R. La Figura 2 muestra el epitopo de enlace para el anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana del presente invento. La Figura 3 demuestra que el anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 inhibe la secreción de MCP-1 estimulado por IL-6 a partir de células U937 tal y como se han medido por EUSA. La Figura 4 muestra que el anticuerpo de ingenier¡a humana anti-IL-6 inhibe IL-6 y la secreción de SAA estimulada por IL-1 ~ a partir de células HepG2 tal y como se han medido por EU$A. Las Figuras 5A y 5B muestran que el anticuerpo anti-IL-6 de ingenier¡a humana bloqueó la fosforilación de stat3 mediada por IL-6 de la forma medida por análisis de Westem Blot que se ha mostrado a través de electroforesis de gel. La Figura 6 muestra la inhibición por medio de anticuerpo anti-IL-6 de ingenier¡a humana y quimérico de producción de $AA humano IL-6-inducido en ratones BalbfC. La Figura 7 muestra la inhibición de la producción de anticuerpos de anti-dsADN por anti-IL-6 mAb en ratones NZ8tw F1. La Figura 8A muestra el efecto de IL-6 en presencia y ausencia de anticuerpos anti-IL-6 de ingenier¡a humana sobre la fosforilación de Akt inducida por insulina. La Figura 88 muestra un análisis por Western blot del efecto de IL-6 en presencia y ausencia de anticuerpos anti-IL6 de fabricación humana sobre fosforilación de Akt inducida por insulina. La Figura 9 muestra los resultados del ensayo de enlace de EU$A descrito en el Ejemplo 3. La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo de anti-proliferación utilizando la línea de célula dependiente IL-6 descrita en el Ejemplo 3. La Figura 11A muestra activación de cinasa PI3 en hepatocitos de rata tratados con insulina, proteína IL-6 y anticuerpos anti-IL-6. La Figura 118 muestra el control del estudio de la activación de cinasa PI3 en hepatocitos de rata. La Figura 12A muestra el efecto de IL-B sobre la señalización en hepatocitos de rata a respecto de la fosforilación inducida por insulina de IR. La Figura 128 muestra el efecto de IL-6 sobre la señalización en hepatocitos de rata a respecto de la fosforilación inducida por insulina de Akt. La Figura 13A muestra el nivel de glucosa en ratones DIO tras tratamiento con anticuerpo anti-IL-6. La Figura 138 muestra el nivel de insulina en ratones DIO tras tratamiento con anticuerpo anti-IL-6. La Figura 13C muestra el ¡ndice de la evaluación de modelo homeostático (HOMA) en ratones DIO tras tratamiento con anticuerpo anti-IL-6. Las Figuras 14A-F muestran los niveles de lipidos antes y después de tratamiento con anticuerpo anti-IL-6. La Figura 15 muestra el calendario de tratamiento de ratones con anti IL-6 mAb para una prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa (ipGTT).

DESCRIPCiÓN DEL INVENTO

El presente invento proporciona anticuerpos anti-IL-6 aislados, recombinantes yfo sintéticos, asi como compuestos y codificaciones de moléculas de ácido nucleico que incluye por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un anticuerpo anti-IL-6. El presente invento también incluye, entre otros, métodos para crear y utilizar dichos ácidos nucleicos y anticuerpos, incluidos compuestos e instrumentos diagnósticos y terapéuticos.

De la forma en que se usa aquí, un "anticuerpo anti-IL-6", "anticuerpo IL-6", "fracción de anticuerpo anti-IL-6" o "fragmento de anticuerpo anti-IL-6" y/o "variante de anticuerpo anti-IL-6 " y similares incluyen cualquier proteina o péptido que contenga moléculas que comprendan por lo menos una fracción de una molécula de inmunoglobulina, como por ejemplo, entre otras, por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una fracción de enlace a un ligando, una cadena pesada o región variable de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región marco, o cualquier fracción de las mismas o por lo menos una fracción de un receptor IL-6 o proterna de enlace, que puede incorporarse a un anticuerpo del presente invento. Dicho anticuerpo también podría afectar a un ligando especifico, como por ejemplo, entre otros, donde dicho anticuerpo module, disminuya, aumente, antagonice, agonice, mitigue, alivie, bloquee, inhiba, anule y/o interfiera con por lo menos una actividad o enlace IL-6, o con actividad de receptor IL-6 o enlace, in vitro, in situ y/o in vivo. A modo de ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 adecuado, fracción especificada o variante del presente invento puede enlazar por lo menos una molécula IL-6, o sus porciones especificadas, variantes o áreas de los mismos. Un anticuerpo anti-IL-6 adecuado, una porción especificada o una variante también podria afectar por lo menos a una de las actividades o funciones de IL-6, como por ejemplo, entre otros, ARN, ADN o srntesis de proteina, liberación de IL-6, señalización de receptor de IL-6, división de membrana IL-6, actividad de IL-6, producción de IL-6 ylo síntesis.

El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos, fragmentos de digestión, fracciones y especificadas y sus variantes, incluidos similares a los anticuerpos o que incluye fracciones de anticuerpos que mimetizan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o fracción del mismo, incluidos anticuerpos de cadena única y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de enlace de antigeno que se unen a un mamrfero IL-6. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpo capaces de enlazarse a IL-6 o fracciones de los mismos entre las que se incluyen, entre otros, Fab (por ejemplo, por digestión de papaína), Fab' (por ejemplo, por digestión de pepsina y reducción parcial) y F(ab' )2 (por ejemplo, por digestión de pepsina), facb (por ejemplo, por digestión de plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión de pepsina, reducción parcial y reagregación), fragmentos de Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biologia molecular), se encompasan por el invento (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).

Dichos fragmentos pueden producirse por división enzimática, técnicas sintéticas o recombinantes, como las conocidas en este ámbito ylo como se describe en el presente documento. También se pueden producir anticuerpos en varias formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los que se ha introducido un codón de parada o más en dirección ascendente a respecto de la ubicación natural de parada. Por ejemplo, un gen de combinación que codifica una porción de cadena pesada F(ab'h pueden diseñarse para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH j ylo la región de articulación de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos pueden enlazarse quimicamente por medio de técnicas convencionales o pueden prepararse como proterna contigua usando técnicas de ingeniería genética.

En el presente documento, el término "anticuerpo de ingenierra humana" es un anticuerpo con por lo menos marcos humanos completos y regiones constantes (dominios Cl , CH (por ejemplo, CH1 , CH2, CH3), y articulación), y CDRs derivados de anticuerpos de enlace de antígeno. Los marcos humanos completos incluyen marcos que se corresponden con secuencias de línea germinal humana así como secuencias con mutaciones somáticas. Los CDRs podrían derivarse de uno o más CDRs que se unen a IL-6 en el contexto de cualquier marco de anticuerpo. Por ejemplo, los CDRs de anticuerpo de ingenieria humana podrran derivarse de CDRs que unen IL-6 en el contexto de un marco de anticuerpo de ratón y a continuación se manipulan para enlazar IL-6 en el contexto de un marco humano completo. Con frecuencia el anticuerpo de ingeniería humana es sustancialmente no-inmunogénico en humanos.

De forma similar, los anticuerpos designan a primates (mono, mandril, chimpancé, etc.), roedores (ratón, rata, conejo, cobaya, hámster y semejantes) y otros mamíferos desígnan a dichos anticuerpos especifícos de especies, sub-géneros, géneros, sub-familias, y familias. Además, los anticuerpos quiméricos pueden incluir cualquier combinación de los anteriores. Dichos cambios o variaciones podrían retener o reducir la inmunogenicidad en humanos y otras especies en relación con anticuerpos no modificados. Así, un anticuerpo de ingeniería humana es diferente de un anticuerpo quimérico o humanizado.

Se señala que se puede producir un anticuerpo de ingeniería humana por parte de un animal no humano o célula procariótica o eucariótica capaz de expresar genes de inmunoglobulina rearreglada funcionalmente humana o de ingenierra humana (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera). Además, cuando un anticuerpo de ingenieria humana es un anticuerpo de cadena ligera, puede incluir un péptido vinculador que no se encuentra en anticuerpos nativos humanos. Por ejemplo, un Fv puede incluir un péptido vinculador, como desde dos hasta aproximadamente ocho glicinas u otros residuos de aminoácido, que conecta la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Se considera que dichos péptidos vinculadores son de origen humano.

Los biespecíficos, los heterospecíficos, heteroconjugados u otros anticuerpos similares también se pueden usar y son monoclonales, preferiblemente, humanos, de ingeniería humana, o humanizados, anticuerpos que tienen caracterrsticas de enlace para por lo menos dos antigenos diferentes. En este caso, una de las caracterrsticas de enlace se da por lo menos para una proteina IL-6, el otro es para cualquier otro antigeno. En este ámbito se conocen métodos para realizar anticuerpos biespecificos. Trad icionalmente, la producción recombinante de anticuerpos

biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas pesadas tienen características diferentes (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la selección aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta nonnalmente se realiza por pasos de cromatografía por afinidad. Se detallan procedimientos similares, por ejemplo, en WO 93f08829 , Patentes de los EE. UU. nO, 6210668, 6193967,6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083,5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WQ 91/00360, WQ 92/00373, EP 03089, Traunecker et al, EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology [Métodos de enzimología] 121 :210 (1986).

Los anticuerpos anti-IL-6 útiles en los métodos y compuestos del presente invento podrían caracterizarse por uniones de alta afinidad a IL-6 y, opcional y preferiblemente, por tener un bajo nivel de toxicidad. En concreto, un anticuerpo, fragmento especificado o variante del invento, donde los componentes individuales, como la región variable, la región constante y el marco, de forma individual y/o colectiva, de fonna opcional y preferiblemente poseen un bajo nivel de inmunogenicidad, es útil en el presente invento. Los anticuerpos que se pueden usar en el invento pueden ser caracterizados por su capacidad para tratar pacientes durante períodos prolongados con un alivio cuantificable de los síntomas y un nivel de toxicidad bajo yfo aceptable. Un nivel bajo o aceptable de inmunogenicidad y/o una alta afinidad, así como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos que se consigan. En este documento, "nivel bajo de inmunogenicidad" se define como la incidencia de niveles valorables de anticuerpos del anticuerpo anti-IL-6 en pacientes tratados con anticuerpo anti-IL-6 que se produce en menos del 25 % de los pacientes tratados y preferiblemente en menos del 10 % de los pacientes tratados con la dosis recomendada durante el curso recomendado de la terapia durante el periodo del tratamiento.

Los ácidos nucleicos aislados del presente invento pueden usarse para la producción de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 o una de sus variantes especificadas, que se puede usar para medir o incidir sobre una célula, tejido, órgano o animal (incluidos mamíferos y humanos), para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los sintomas de por lo menos una afección IL-6, seleccionada de entre el grupo (sin limitarla a él) de: trastorno o enfennedad inmunológica, trastorno o enfermedad cardiovascular, trastorno o enfennedad infecciosa, maligna y/o neurológica, u aira afección relacionada con IL-6 conocida o especificada. Dicho método puede incluir la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento, alivio, prevención, o reducción de los síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede incluir una cantidad de aproximadamente entre 0,001 y sao mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), múltiple o continua, o conseguir una concentración en suero de 0,01-5000 IJg/ml por administración única, múltiple o continua o cualquier rango eficaz o valor del mismo, que se realizará y definirá utilizando métodos conocidos de la forma descrita en el presente documento o en las técnicas correspondientes.

Anticuerpos del presente invento -Producción y generación

Por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 del presente invento podría producirse por una línea de célula, una línea de célula míxta, una célula inmortalízada o una población clonal de células inmortalizadas, tal y como se conoce ampliamente. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology [Métodos actuales de biología molecular], John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: manual de laboratorio], 28 edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibod ies, a Laboratory Manual [Anticuerpos, manual de laboratorio], Cold Spring Harbar, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology [Protocolos actuales de inmunologia], John Wiley & Sons, Inc., NY (19942001); Collígan et al., Current Protocols ín Proteín Science [Protocolos actuales de la ciencia de las proteínas], John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Los anticuerpos de ingeniería humana que son especificos de las proteínas humanas IL-6 o sus fragmentos pueden crearse contra un antígeno inmunogénico apropiado, como una proteína IL-6 aislada yfo una porción de la misma (incluidas las moléculas sintéticas, como los péptidos sintéticos).

Pueden crearse otros anticuerpos específicos o generales de mamiferos. La preparación de antígenos inmunogénicos y la producción de anticuerpos monoclonales puede llevarse a cabo utilizando cualquier técnica apropiada.

En una de las aproximaciones, se produce un hibridoma fusionando una línea de célula inmortal adecuada (por ejemplo, una linea de célula de mieloma, como por ejemplo, entre otras, Sp2fO, Sp2fO-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1,

L.S, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAl, Sp2 SSI, Sp2 SAS, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1 , JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A, u airas semejantes, o heteromilomas, productos de su fusión o cualquier célula o célula de fusión derivada de ellas, o cualquier otra línea de células adecuada, de la forma conocida en este ámbito) (ver, por ejemplo, www.atcc.org, www.lifetech.com, y otras similares), con anticuerpos que produzcan células, como por ejemplo, entre otras, bazo aislado o clonado, sangre periférica, linfa, amígdalas, u otra célula inmune o B que contenga células, o cualquier otra célula que exprese

cadena pesada o ligera constante o variable o marco o secuencias CDR, ya sea como écido nudeico endógeno o heterólogo, recombinante o endógeno, viral, bacteriano, algal, procariótico, anfibio, insecto, reptil, pescado, mamífero, roedor, equino, ovino, cabra, oveja, primate, euca riota, ADN, cADN o rADN genómicos, ADN o ARN mitocondrial, ADN o ARN cloroplástico, hnARN, mARN, tARN, de cadena única, doble o triple, hibridizado y otros semejantes o cualquier combinación de los mismos. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, y Colligan, Immunology [Inmunología], supra , capítulo 2.

Los anticuerpos que producen células también pueden oblenerse a partir de la sangre periférica o, preferiblemente, del bazo o de los ganglios linfáticos, de humanos o de otros animales adecuados que hayan sido inmunizados con el antigeno de interés. Cualquier otra célula hospedadora adecuada también se puede usar para expresar ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, del presente invento. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes pueden aislarse usando afecciones de cultivos selectivos u otros métodos conocidos adecuados, y clonarse por medio de dilución limitante o separación de células, o por otros métodos conocidos. Las células que producen anticuerpos con la especificidad buscada pueden seleccionarse por medio de un ensayo apropiado (por ejemplo, ELlSA).

También se pueden usar métodos para la ingeniería o humanización de anticuerpos no-humanos o humanos y son bien conocidos en este ámbito. Un anticuerpo humanizado o procesado podría tener uno o más residuos de aminoácido a partir de una fuente que sea no-humana, por ejemplo, entre otros, ratones, ratas, conejos, primates no humanos u otros mamíferos. Estos residuos de aminoácidos no humanos a los que con frecuencia se denominan residuos "importados", que normalmente se obtienen de una variable "importada" o constante u otro ámbito de una secuencia humana conocida.

Se describen secuencias humanas conocidas de Ig, por ejemplo, en www. ncbi.nlm.nih.govfentrez/query.fcgi; www.ncbLnih.govfigblast; www.atcc.orgfphagefhdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www. kabatdatabase.comftop.html; ftp.ncbi.nih.govfrepositoryfkabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.anticuerporesource.comfonlinecomp.html; www.public.iastate.eduf-pedrofresearch_tools.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05fKuby05.htm; www.hhm i.org/grantsllectures/1996fvlab; www.path.cam.ac.uk/-mrc7fmikeimages.html; mcb.harvard.edufBioLinks/lmmunology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/-hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/anlicuerpo: www.rn.ehime-u.ac.jp/-yasuhilo/Elisa.hlml; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.ntl-jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www. ib!. u nam.mxlvirN _mice .html; http://www. bioinf.org.uklabs; anticuerpo.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.ukl-ubcg07s; www.nimr.mrc.ac.uklCC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.ukl-mrc7fhumanisationfTAHHP.hlml; www. ibt.unam.mxlvirfstructurelsta,-aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest [Secuencias de proteinas de interés inmunológico], Departamento de Salud de los EE. UU . (1983).

Dichas secuencias importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar el enlace, afinidad, tasa de subida, tasa de bajada, avidez, especificidad, media vida, o cualquier otra caracteristica adecuada de las conocidas en la materia. En generat, los residuos de CDR están implicados directa y notablemente en la influencia sobre el enlace de anUgenos. En consecuencia, parte o todas las secuencias CDR no-humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no-humanas de las regiones variables y constantes podrian sustituirse con aminoácidos humanos o de otros tipos.

Los anticuerpos también se podrian humanizar o procesar o los anticuerpos humanos procesarse con retención de alto nivel de afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos procesados humanizados (o humanos) o los anticuerpos procesados podrian prepararse por medio de un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales y procesados usando modelos tridimensionales de las secuencias parental, procesada y humanizada. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina suelen estar disponibles y son habituales para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que ilustran y muestran posibles estructuras tridimensionales para secuencias seleccionadas de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuenda candidata de inmunoglobulina, por ejemplo, el análisis de residuos que tienen influencia sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de enlazar su antrgeno. De esta forma, los residuos marco (FR) pueden seleccionarse y combinarse a partir del consenso e importar secuencias de forma que se consiga la caracteristica deseada de los anticuerpos, como un aumento de la afinidad por el antigeno(s) objetivo.

Además, el anticuerpo IL-6 de ingenieria humana presentado en este documento podria incluir un marco de cadena ligera de linea germinal humana. En ciertas representaciones, la secuencia cadena ligera de línea germinal se selecciona a partir de secuencias de VK humano que incluyen, entre otras, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, AS, A7, 82, 83, LI, L 10, LI 1, L 12, L 14, L 15, L 16, L 18, L 19. L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4f18a , L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012, 014, 018, 02, 04, Y 08. En ciertas representaciones, este marco de cadena ligera humana de linea germinal se selecciona a partir de VI-11, VI-13, VI-16, VI-17, VI-18, VI-19, VI-2, VI-20,

VI-22, VI-3, VI-4, VI-5, VI-7, VI-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 y V5-6. Ver PCT WO 2005f005604 para una descripción de las diferentes secuencias de línea germinal.

En otras representaciones, el anticuerpo de ingeniería humana IL-6 descrito en este documento podría incluir un marco de linea germinal humana de cadena pesada. En ciertas representaciones, este marco de cadena pesada humana de linea germinal se selecciona a partir de VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61 , VH5-51 , VH6-1 y VH7-81 . Ver PCT WO 2005f005604 para una descripción de las diferentes secuencias de linea germinal.

En ciertas representaciones, la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada incluye una región marco o por lo menos una porción de una región marco (por ejemplo, que contenga 2 o 3 subregiones, como FR2 Y FR3). En ciertas representaciones, por lo menos FRL 1, FRL2, FRL3, o FRL4 será completamente humano. En otras representaciones, por lo menos FRH1 , FRH2, FRH3, o FRH4 es totalmente humano. En algunas representaciones, por lo menos FRL 1, FRL2, FRL3, o FRL4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o incluye secuencias humanas de consenso para el marco concreto (disponible fácilmente en las fuentes de las secuencias conocidas de Ig humano descritas antes). En otras representaciones, por lo menos FRH1, FRH2, FRH3, o FRH4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, linea germinal humana) o incluye secuencias humanas de consenso para el marco concreto. En las representaciones preferidas, la región marco es una región marco humana (por ejemplo, las regiones de marco humano que se muestran en las Tablas 13 y 14). En algunas representaciones, la región marco incluye SECS con N° ID: 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, o combinaciones de las mismas.

La humanización o procesado de los anticuerpos del presente invento puede llevarse a cabo utilizando cualquier método conocido, como por ejemplo, entre otros, los descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321 :522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988», Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentes de los EE. UU. N°: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483,

5814476. 5763192. 5723323. 5.766886. 5714352. 6204023. 6180370. 5693762. 5530101. 5585089. 5225539:

4816567, PCTf: US98/16280, US96f18978, US91/09630, US91f05939, US94/01234, GB89f01334, GB91/01134, GB92101755; W090f14443 , W090f14424, W090f14430, EP 229246.

En ciertas representaciones, el anticuerpo incluye una región Fc modificada (por ejemplo, mutada). Por ejemplo, en algunas representaciones, la región Fc se ha modificado para reducir o mejorar las funciones efectoras del anticuerpo. En algunas representaciones, la región Fc es un isotipo seleccionado a partir de IgM, IgA, IgG, IgE, u otro isotipo.

De forma alternativa o adicional, podría ser útil combinar modificaciones de aminoácido con una o más modificaciones de aminoácido que modifiquen el enlace de unión de Clq y/o la función de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de la región Fc de una molécula de enlace con IL-6. El polipéptido de inicio de interés concreto podria ser uno que se una con Clq y muestre citotoxicidad dependiente de complementos. Los polipéptidos con actividad de enlace de Clq pre-existente, que podrían también tener la capacidad de mediar CDC, podrían modificarse de forma que una de esas actividades o ambas se mejoren. Las modificaciones de aminoácidos que alteran Clq y/o modifican su función de citotoxicidad dependiente de complemento se describen, por ejemplo, en WOO042072.

Tal y como se ha presentado, se puede diseñar una región de Fc de ingenieria humana de anticuerpo IL-6 del presente invento con función efectora alterada, por ejemplo, modificando el enlace Clq y/o enlace de FcyR y por lo tanto cambiando la actividad COC y/o la actividad AOCC. -Las funciones efectoras· son responsables de activar o disminuir una actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Entre los ejemplos de funciones efectoras se incluyen, entre otros: enlace Clq; citotoxicidad dependiente de complemento (COC); enlace de receptor Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación inferior de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras podrian necesitar que la región Fc se combine con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio de anticuerpo variable) y puede evaluarse usando varios ensayos (por ejemplo, ensayos de enlace Fc, ensayos AOCC, ensayos CDC, etc.).

Por ejemplo, se puede generar una variante de región Fc de anticuerpo de ingenieria humana IL-B con enlace de Clq mejorado y enlace de FcyR1I1 mejorado (por ejemplo, que tengan ambos actividad ADCC mejorada y actividad CDC mejorada). De forma altemativa, si se desea que la función efectora se reduzca o extirpe, una variante de región Fc puede modificarse con actividad de CDC reducida y/o actividad de ADCC reducida. En otras representaciones, solo una de esas actividades podría incrementarse, y, opcionalmente, también la otra actividad reducirse (por ejemplo, para generar una variante de región Fc con actividad de ADCC mejorada, pero con actividad CDC reducida y viceversa).

Las mutaciones de Fc también se pueden modificar para cambiar su interacción con el receptor de Fc neonatal (FcRn) y mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Se ha descrito una colección de variantes de Fc humano con enlace mejorado al FcRn (Shields et al., (2001). High resolution mapping of the binding site on human IgGI for FcyRI, FcyRII, FcyRI II, and FcRn and design of IgGI variants with improved binding to the FcyR [Mapeo de alta resolución de la ubicación de enlace en IgGI humano para FcyRI, FcyRII, FcyR1I1 y FcRn y diseño de variantes de IgGI con enlace mejorado al FcyR], J. Biol. Chem. 276:6591-6604).

Otro tipo de sustitución de aminoácido sirve para modificar el patrón de glucosilación de la región de Fc de anticuerpo IL-6 de ingeniería humana. La glucosilación de una región de Fc normalmente de enlace-N o de enlace-

o. Enlace-N hace referencia al enlace de la fracción del carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La glucosilación de enlace-O se refiere al enlace de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, los más habituales serina o treonina, aunque también se podrían utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Las secuencias de reconocimiento de unión enzimática de la fracción de carbohidrato a las secuencias péptidas de la cadena lateral de asparagina son asparagina-X-serina yasparagina-Xtreonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. De esa forma, la presencia de cualquiera de esas secuencias de péptidos en un polipéptido crea una ubicación potencial de glucosilaciÓn.

El patrón de glucosilación podria verse alterado, por ejemplo, al eliminar una o más ubicaciones de glucosilación encontradas en el polipéptido, y/o añadir una o más ubicaciones de glucosilación que no están presentes en el polipéptido. La adición de ubicaciones de glucosilación a la región de Fc de un anticuerpo de ingenieria humana IL-6 se consigue satisfactoriamente modificando la secuencia de aminoácido de forma que contenga una o más de las anteriormente descritas secuencias de tripéptidos (para ubicaciones de glucosilación de enlace-N). Una variante de glucosilación ejemplar tiene una sustitución de residuo de aminoácido de Asn 297 de la cadena pesada. La alteración también podria hacerse por medio de la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido original (para ubicaciones de glucosilación de enlace-O). De manera adicional, un cambio de Asn 297 a Ala puede retirar una de las ubicaciones de glucosilaciÓn.

En ciertas representaciones, el anticuerpo IL-6 del presente invento se expresa en células que expresan beta (1,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa 111 (GnT 111), de forma que GnT 111 añade GlcNAc al anticuerpo IL-6. Se proporcionan métodos para producir anticuerpos de esa forma en WO/9954342, WO/03011878, documento de patente 20030003097A1, y Umana et al., Nature Biotechnology [Biotecnología de la naturaleza], 17:176-180, febo 1999. Un anticuerpo humano anti-IL-6 podría generarse por inmunización de un animal transgénico (por ejemplo, ratón, rata, hámster, primate no humano y otros similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal y como se describe en este documento o de la forma conocida en este ámbito. Las células que producen un anticuerpo humano anti-IL-6 pueden aislarse de dichos animales e inmortalizarse usando métodos adecuados, como los métodos descritos en este documento.

Los ratones transgénicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se unen a anUgenos humanos pueden producirse por métodos conocidos (por ejemplo, entre otros, Patentes de los EE. UU. N°: 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 Y 5.789.650 publicado en Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98f24893 , Lonberg et al. WO 98f24884, Lonberg et al. WO 97f13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 BI, Kucherlapate et al. EP 0710 719 Al, Surani et al. Patente de EE. UU. N° 5.545.807, Bruggemann et al. WO 90f04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 BI, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Inl. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acid Research [Investigación de ácido nucleico] 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) y Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996». Generalmente, estos ratones incluyen por lo menos un transgen que incluye ADN de por lo menos un lugar de inmunoglobulina humana que está reorganizado funcionalmente, o que puede reorganizarse funcionalmente. Las ubicaciones de inmunoglobulina endógena en dichos ratones pueden alterarse o borrarse para eliminar la capacidad del animal de producir anticuerpos codificados por genes endógenos.

La investigación de anticuerpos para enlace específico a proteinas similares o fragmentos puede conseguirse de forma adecuada usando bibliotecas de péptidos. Este método implica la investigación de grandes colecciones de péptidos buscando miembros individuales que tengan la función o estructura deseadas. La investigación de anticuerpos sobre bibliotecas de péptidos es bien conocida en este ámbito. Las secuencias de péptidos mostradas pueden tener una longitud de entre 3 y 5000 o más aminoácidos, frecuentemente entre 5-100 aminoácidos, y muchas veces entre 8 y 25 aminoácidos de longitUd. Además de los métodos sintéticos quimicos directos para generar bibliotecas de péptidos, se han descrito varios métodos de ADN recombinante. Un tipo implica la exposición de una secuencia de péptido en la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de péptido concreta que se presenta. Dichos métodos se describen en las publicaciones de patentes PCT nO 91/17271, 91 f18980, 91 /19818 Y 93/08278. Otros sistemas para generar bibliotecas de péptidos tienen aspectos tanto de métodos de síntesis química in vitro y recombinantes. Véanse las publicaciones de patentes PCT nO 92f05258, 92f14843 y 96/19256. Véanse también las patentes de los EE. UU. N° 5.658.754 Y 5.643.768. Las bibliotecas de presentación de péptidos, vectores y kits de

investigación se encuentran disponibles comercialmente de proveedores como Invitrogen (Car1sbad, CA) y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. nO 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621 , 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, asignado a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, asignado a oyax, 5427908, 5580717, asignado a Afrymax; 5885793, asignado a Cambridge Antibody Technologies; 5750373, asignado a Genentech, 5618920, 5595898,5576195,5698435,5693493,5698417, asignado to Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; o Sambrook, supra. Los anticuerpos del presente invento también se pueden preparar usando por lo menos un anticuerpo anti-IL6 que codifica ácido nucleico para producir animales transgénicos o mamiferos, como cabras, vacas, caballos, ovejas, conejos y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Dichos animales pueden proporcionarse usando métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, entre otros, patentes de los EE. UU. N° 5.827.690; 5.849.992;

4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5.304.489 Y otros similares presentados en este documento.

Los anticuerpos presentados en este documento pueden también prepararse usando por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que codifica ácido nucleico para proporcionar plantas transgénicas y células de plantas cultivadas (por ejemplo, entre otras, tabaco y maíz) que producen dichos anticuerpos, porciones especificadas o variantes de las partes de las plantas o en células cultivadas de los mismos. Únicamente a modo de ejemplo, las hojas de tabaco transgénico que expresan proteínas recombinantes se han usado con éxito para proporcionar grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, usando un impulsor inducible. Véase, por ejemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) y referencias allí citadas. Además, el maíz transgénico se ha usado para expresar proteínas de mamiferos a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Ver, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) y referencias allí citadas. Los anticuerpos también se han producido en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas que incluyen fragmentos de anticuerpo, como anticuerpos de cadena única (scFv's), incluidas las semillas de tabaco y tubérculo de patata. Véase, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) y referencias alli citadas. Así, los anticuerpos del presente invento también pueden producirse usando plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos. Ver también, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (oct., 1999), Ma et al, Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soco Trans. 22:940-944 (1994); y referencias allí citadas.

Los anticuerpos presentados aquí pueden enlazar IL-6 humano con una amplia gama de afinidades (Kd). En una de las representaciones preferidas, por lo menos un mAb humano del presente invento podría enlazar IL-6 humano con alto nivel de afinidad. Por ejemplo, un mAb humano de ingeniería humana puede enlazar a IL-6 humano con un Ko igualo menor de aproximadamente tO-7 M, como por ejemplo, entre otros, 0,1-9,9 (o cualquier rango o valor del

10 1112 14

mismo) X 10.7, 10.8, 10-9, tO·, tO-, tO·, 10.13 , tO·, 10-15 o cualquier rango o valor de los mismos, determinado

por resonancia plasmónica de la superficie o el método Kinexa, practicado por expertos en la materia.

La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse de forma experimental usando cualquier método adecuado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, et al, -Anticuerpo-Antigen Interactions~ [Interacciones anticuerpoantigeno] en Fundamentallmmunology [Inmunología fundamenta~, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York., NY (1984); Kuby, Janis Immunology [Inmunología], W. H. freeman y Company: New York, NY (1992); Y los métodos allí descritos). La afinidad medida de una interacción concreta anticuerpo-antigeno puede variar si se mide bajo afecciones diferentes (por ejemplo, concentración salina, pH). Asi, la medición de afinidad y otros parámetros relacionados con el enlace de antígenos (por ejemplo, Ko, Kon, Kott) preferiblemente se realizan con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estanda rizado, como el descrito en el presente documento.

Pueden llevarse a cabo ensayos competitivos con el anticuerpo del presente invento para determinar qué prote inas, anticuerpos, y otros antagonistas compiten por enlazarse a IL-6 con el anticuerpo del presente invento y/o comparten la región de epítopo. Estos ensayos conocidos por cualquiera que tenga un conocimiento normal de la materia evalúan la competición entre antagonistas o ligandos por un número limitado de ubicaciones de enlace en una proteína. La proteína y/o anticuerpo se ha inmovilizado o insolubilizado antes o después de la competición y la muestra enlazada a IL-6 se separa a partir de la muestra no enlazada, por ejemplo, decantando (donde la proteína/anticuerpo se ha preinsolubilizado) o centrifugando (donde la proteína/anticuerpo se precipitó tras la reacción competitiva). Además, el enlace competitivo podría verse determinado por si la función se ver alterada por el enlace o falta de enlace del anticuerpo a la prote ina, por ejemplo, si la molécula del anticuerpo inhibe o potencia la actividad enzimática de, por ejemplo, una etiqueta. Podrian usarse ELlSA y otros ensayos funcionales, como se conoce en este ámbito.

Los anticuerpos anti-IL-6 presentados en este documento tienen las secuencias que se muestran en las Tablas 1-5 y t2-14. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 presentado en este documento tiene una de las secuencias de cadena ligera COR secuencias que se muestran en la Tabla 1 (por ejemplo, CDRL 1, CDRL2 Y CORL3) y una de las secuencias de la cadena pesada CoR que se muestran en la Tabla 2 (por ejemplo, CORH1 , CORH2 y CoRH3). Más específicamente, un anticuerpo anti-IL-6 (molécula AME-A9) tiene el CoRL1 de la SEC ID N°: 15, CoRL2 de la SEC ID N°: 27, CORL3 de la SEC ID N°: 35, CDRH1 de la SEC ID N°:4 7, CDRH2 de la SEC ID N°: 61 , CORH3 de la SEC ID N°:9 1.

Moléculas de ácido nucleico

Usando la información que se proporciona en este documenlo, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican por lo menos 70-100 % de los aminoácidos contiguos de por lo menos una de las regiones variables de cadenas ligeras de SEC ID N°: 93, 97 Y 101 , entre otras secuencias presentadas aqui, y por lo menos una de las regiones variables de la cadena pesada de SEC ID N°: 95, 99 Y 103, entre otras secuencias presentadas aqui, fragmentos especificados, variantes o secuencias de consenso de los mismos, o un vector depositado que incluye por lo menos una de esas secuencias, una molécula de ácido nucleico del presente invento que codifica por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 puede obtenerse usando descritos en el presente documento o por técnicas conocidas. Las moléculas de ácido nucleico del presente invento pueden estar en forma de ARN, como mARN, hnARN, tARN o cualquier otra forma, o en forma de AON, incluidos, entre otros, cAoN y AON genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El AON puede ser de triple cadena, de doble cadena o de cadena única o cualquier combinación de los anteriores. Cualquier porción de por lo menos una cadena del AoN o ARN puede ser la cadena de codificación, también conocida como cadena de sentido, o puede ser la cadena de no codificación, también denominada cadena anti-sentido.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas presentadas en este documento pueden incluir moléculas de ácido nucleico que incluye un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente, con un intrón o más, por ejemplo, entre otros, por lo menos una porción especificada de por lo menos un CoR, como COR1, COR2 y/o CoR3 de por lo menos una cadena pesada (por ejemplo, SEC ID N°: 38, 40, 42, 44, etc.) o cadena ligera (por ejemplo, SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, etc.); moléculas de ácido nucleico que incluyen la secuencia de codificación de un anticuerpo anti-IL-6 o región variable (por ejemplo, región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 94, 98 Y 102, entre otras secuencias presentadas en este documento, y regiones variables de cadena pesada de SEC ID N°: 96, 100 Y 104); y moléculas de ácido nucleico que incluyen una secuencia de nucleótido claramente diferente de las descritas anteriormente que, debido a la degeneración del código genético, siguen codificando por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como se describe en este documento y/o como se conoce en este ámbito. Por supuesto, el código genético es bien conocido en esta téCflica. Asi, seria rutinario para alguien experto en la materia generar dichas variantes de ácido nucleico degenerado que codifican anticuerpos especificos anti-IL-6s del presente invento. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., supra, y dichas variantes de ácido nucleico se incluyen en el presente invento.

Tal y como se indica en este documento, las moléculas de ácido nucleico del presente invento que incluyen un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6 pueden incluir, entre otras, las que codifican la secuencia de aminoácido de un fragmento de anticuerpo, por si mismo; la secuencia de codificación del anticuerpo completo o una porción del mismo; la secuencia de codificación de un anticuerpo, fragmento o porción, así como secuencias adicionales, como la secuencia de codificación de por lo menos una señal íder o péptido de fusión, con o sin las secuencias de codificación adicionales anteriormente mencionadas, como por lo menos un intrón, junto con secuencias adicionales de no-codificación, incluidas, entre otras, secuencias de no-codificación de 5' y 3·, como las secuencias transcritas no trasladadas que tienen un papel en transcripción, procesamiento mARN, incluido empalme y señales de poliadenilación (por ejemplo, el enlace de ribosoma y estabilidad de mARN); una secuencia de codificación adicional que codifica aminoácidos adicionales, como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Asi, la secuencia que codifica un anticuerpo puede fusionarse a una secuencia de marcador, como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo fusionado que incluye un fragmento o porción de anticuerpo.

Polinucleótidos que se hibridan de forma selectiva a un polinucleótido de la forma descrita en el presente documento

También se presentan ácidos nucleicos aislados que hibridizan bajo afecciones de hibridación selectiva a un polinucleótido presentado en este documento. Así, los polinucleótidos de esta representación pueden usarse para aislar, detectar, y/o cuantificar ácidos nucleicos que incluyen dichos polinucleólidos. Por ejemplo, esos polinucleótidos pueden usarse para identificar, aislar, o amplificar clones de longitud parcial o completa en una biblioteca depositada. En algunas representaciones, los polinucleótidos son genómicos o secuencias de cAON aisladas, o complementarios de otra forma a un cAoN de una biblioteca de ácido nucleico humano o mamífero.

Preferiblemente, la biblioteca de cAoN incluye por lo menos un 80 % de secuencias de longitud completa, preferiblemente, por lo menos un 85 % 090 % de secuencias de longitud completa, y, más preferiblemente, por lo menos un 95 % de secuencias de longitud completa. Las bibliotecas de cAoN pueden normalizarse para incrementar la representación de secuencias raras. Las afecciones de hibridación de nivel de endurecimiento bajo o moderado se usan normalmente, pero no solo, con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida en relación con secuencias complementarias. Las afecciones de nivel de endurecimiento moderado y elevado podrian usarse para secuencias de mayor identidad. Las afecciones de bajo nivel de endurecimiento permiten la hibridación selectiva de secuencias que tienen por lo menos una identidad de secuencia del 70 % Y pueden usarse para identificar secuencias ortólogas o parálogas.

De manera opcional, estos polinucleótidos codificarán por lo menos una porción de un anticuerpo codificado por los polinucleótidos descritos en este documento. Los polinucleótidos presentados abarcan secuencias de ácido nucleico que se pueden usar para hibridación a un polinucleótido que codifica un anticuerpo del presente invento. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra.

Construcción de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos aislados del presente invento pueden construirse utilizando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación yfo (d) combinaciones de las mismas, de forma bien conocida en este ámbito.

Los ácidos nucleicos pueden incluir secuencias además de un polinucleótido del presente invento. Por ejemplo, una ubicación de multi-clonación que comprende una o más ubicaciones de restricción de endonucleasa puede insertarse en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleótido. Además, las secuencias trasladables pueden insertarse para ayudar en el aislamiento del polinucleótido trasladado del presente invento. Por ejemplo, una secuencia de marcador de hexa-histidina proporciona un medio adecuado para la pUrificación de las proteinas del presente invento. El ácido nucleico del presente invento, sin incluir la secuencia de codificación, podria ser un vector, adaptador o vinculador para clonar yfo expresar un polinucle6tido del presente invento.

Pueden añadirse secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación yfo expresión para mejorar su función en la clonación yfo expresión, para ayudar al aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y vinculadores es bien conocido en este ámbito (véase, por ejemplo, Ausubel, supra; °Sambrook, supra).

Métodos recombinantes para la construcción de ácidos nucleicos

Los compuestos de ácido nucleico aislado de este invento, como ARN, cAON, AON genómico, o cualqu ier combinación de los mismos, puede obtenerse a partir de fuentes biológicas usando cualquier cantidad de métodos de clonación conocidos por los expertos en la materia. En algunas representaciones, las sondas de oIigonucleótido que hibridan de forma selectiva, en afecciones severas, a los polinucleótidos del presente invento se usan para identificar la secuencia deseada en una biblioteca de cAON o de AON genómico. El aislamiento de ARN y la construcción de bibliotecas de cAON y genómicas, son bien conocidas por los conocedores de estas técnicas (véase, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra)

Métodos de de investigación y aislamiento de ácido nucleico

Una biblioteca de cAON o genómica puede investigarse usando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido del presente invento, como los presentados en este documento. Las sondas pueden usarse para hibridar con secuencias de AON genómico o cADN para aislar genes homólogos en el mismo organismo o en otros diferentes. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden usar varios grados de endurecimiento de la hibridación; la hibridación o el medio de lavado pueden ser endurecedores. Al irse endureciendo las afecciones para la hibridación, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y el objetivo para que se produzca la formación doble. El grado de endurecimiento puede controlarse por uno o más de los siguientes elementos: temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizador, como la formamida. Por ejemplo, la dureza de la hibridación se modifica de forma adecuada cambiando la polaridad de la solución reactiva a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de forma mida dentro del rango de O % a 50 %. El grado de complementariedad (identidad de la secuencia) necesa rio para un enlace detectable variará de acuerdo con la estringencia del medio de hibridación yfo medio de lavado. El grado óptimo de complementariedad será 100 % o 70 -100 %, o cualquier rango o valor del mismo. De todas formas, debe entenderse que las variaciones menores de las secuencias en las sondas y cebadores se puede compensar reduciendo la dureza de la hibridación yfo del medio de lavado.

Los métodos de ampl ificación del ARN o ADN son bien conocidos en este ámbito y se pueden usar de acuerdo con el presente invento sin demasiada experimentación, en base a la formación y directrices que se presentan en este documento.

Entre los métodos conocidos de amplificación de ADN o ARN se incluyen, entre otros, reacción de cadena de polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, patentes de los EE. UU. nO

4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, a MUllis, el al.; 4.795.699 y 4.921 .794 a Tabor, el al; 5.142,033 to Innis;

5.122.464 a Wilson, el al.; 5.091 .310 a lnnis; 5.066.584 a Gyllenslen, el al; 4.889.818 a Gelfand, et al; 4.994.370 a Silver, et al; 4.766.067 a Biswas; 4.656.134 lo Ringold) y amplificación mediada por ARN que usa ARN anti-sentido a la secuencia objetivo como modelo para síntesis de ADN de doble cadena (patente de los EE. UU. nO 5.130.238 a Malek, et al, con NASBA como nombre comercial). (Véase, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra.) Por ejemplo, la tecnologia de reacción de cadena de polimerasa (PCR) puede usarse para amplificar las secuencias de polinucleótidos del presenle invenlo y genes relacionados directamente a partir de bibliotecas de AON genómico o cADN. PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias

de ácido nudeico que codifican para la expresión de las proteinas, para hacer ácidos nucleicos para su uso como sondas para detectar la presencia deseada de mARN en muestras, para la secuenciación de ácido nucleico o para otros propósitos. Se encuentran ejemplos de técnicas que permitirian guiar a conocedores de la materia en métodos de amplificación in vitro en Berger, supra, Sambrook, supra, y Ausubel, supra, asi como Mullís, et al., patente de los EE. UU. nO 4.683.202 (1987); Y Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications [Protocolos PCR, gura para métodos y aplicaciones], Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). En este ámbito se conocen los kits que se encuentran disponibles comercialmente para la amplificación genómica de PCR. Véase, por ejemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Además, por ejemplo, la proteína T4 de gen 32 (Boehringer Mannheim) puede usarse para mejorar el rend imiento de productos de PCR larga.

Métodos sintéticos para la construcción de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos aislados del presente invento también se pueden preparar por medio de síntesis quimica directa por métodos conocidos (véase, por ejemplo, Ausubel, et al., supra). La srntesis qurmica generalmente produce un oligonucleótido de cadena única, que se puede convertir a ADN de doble cadena por hibridación con una secuencia complementa ria, o por polimerización con una polimerasa de ADN usando la cadena única como modelo. Un experto en la materia reconocería que mientras la sintesis química del ADN se puede limitar a secuencias de aproximadamente 100 o más bases, se pueden obtener secuencias más largas por la ligadura de secuencias más cortas .

Casetes de expresión recombinante

El presente invento también proporciona casetes de expresión recombinante que incluye un ácido nucleico del presente invento. Una secuencia de ácido nucleico del presente invento, por ejemplo, un cADN o una secuencia genómica que codifica un anticuerpo del presente invento, puede usarse para construir una casete de expresión recombinante que se puede introducir en por lo menos una de las células hospedadoras que se deseen. Una casete de expresión recombinante normalmente incluirá un polinucleótido del presente invento enlazado de forma operativa a las secuencias regulatorias de iniciación transcripcional que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedadora pretendida. Tanto los promotores heterólogos como no-heterólogos (por ejemplo, endógeno) pueden usarse para la expresión directa de los ácidos nucleicos del presente invento.

En algunas representaciones, los ácidos nucleicos aislados que sirven como agente promotor, o de mejora, u otros elementos pueden introducirse en la posición adecuada (ascendente, descendiente o en el intrón) de una forma noheteróloga de un polinucleótido del presente invento para regular en dirección ascendiente o descendiente la expresión de un polinucleótido del presente invento. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden modificarse in vivo in vivo o in vitro por mutación, eliminación y/o sustitución. Vectores y células hospedadoras

El presente invento también tiene relación con los vectores que incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico del presente invento, células hospedadoras que se modifican genéticamente con los vectores recombinantes, y la producción de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por técnicas recombinantes, bien conocidas en este ámbito. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra.

Los polinucleótidos pueden enlazarse a un vector que contenga un marcador seleccionable para su propagación en un anfitrión. Generalmente, se introduce un vector plásmido en un precipitado, como un fosfato de calcio precipitado,

o en un complejo con un lipido cargado. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro usando una linea celular de empaquetado adecuado y a continuación transducirse a las células hospedadoras.

La inserción de ADN deberia estar enlazada de forma operativa a un promotor adecuado. La construcción de la expresión contendrá ubicaciones para la iniciación, terminación de la transcripción y, en la región transcrita, una ubicación de enlace de ribosoma para su conversión. La porción de codificación de las transcripciones maduras expresadas por las construcciones incluirán, preferiblemente, una transcripción que se iniciaria al principio y un codón de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) posicionado de forma apropiada al final del mARN que se va a convertir, siendo UAA y UAG preferibles para la expresión celular de mamíferos o eucariotas.

Los vectores de expresión preferiblemente (de forma opcional) incluirán por lo menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen, por ejemplo, entre otros, metotrexato (MTX), reductasa de dehidrofolato (DHFR, patente de los EE. UU. nO 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), resistencia al cultivo de célula eucariota de ácido micofenólico o sintetasa de glutamina (GS, patente de los EE. UU. nO 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) Y genes de resistencia de tetraciclina o ampicilina para el cultivo de E. coli y otras bacterias o procarióticos. Los medios de cultivo adecuados y afecciones de las células hospedadoras antes descritas son conocidos en este ámbito. Los vectores adecuados serán evidentes fácilmente para el experto en la materia. La introducción de una construcción de vector en una célula hospedadora puede lograrse por transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por dextrano-DEAE, transfección catiónica mediada por lipido, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos. Dichos métodos están descritos por ejemplo en Sambrook, supra, capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, capítulos 1, 9,13,15,16.

Por lo menos un anticuerpo del presente invento puede expresarse en forma modificada, como prote¡na de fusión, y puede incluir tanto señales de secreción como regiones funcionales adicionales de heterólogo. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, aminoácidos con carga particular, pueden aFiad irse al término-N de un anticuerpo para mejorar su estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante su posterior manipulación y almacenamiento. Además, las fracciones de péptido pueden añadirse a un anticuerpo del presente invento para facilitar la purificación. Dichas regiones pueden retirarse antes de la preparación final de un anticuerpo o por lo menos un fragmento de las mismas. Dichos métodos estan descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, como Sambrook, supra, capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, capítulos 16,

17y18.

Los expertos en la materia son conocedores de los muchos sistemas disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina del presente invento. De forma alternativa, ácidos nucleicos del presente invento pueden expresarse en una célula hospedadora activándose (por medio de manipulación) en una célula hospedadora que contiene ADN endógeno que codifica un anticuerpo del presente invento. Dichos métodos son bien conocidos en este ámbito, por ejemplo, tal y como se describe en las patentes de los EE. UU. nO 5.580.734, 5.641 .670,

5.733.746 Y 5.733.761.

Ilustrativas de los cultivos celulares útiles para la producción de los anticuerpos, porciones especificadas o variantes de las mismas, son las células de mam¡fero. Los sistemas celulares de mam¡feros con frecuencia tendrán la forma de monocapas de células aunque también se pueden usar suspensiones de células de mamiferos o biorreactores. Se han desarrollado varias líneas de células hospedadoras adecuadas capaces de expresar proteinas glicosiladas intactas, que incluyen COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCe CRL-26) lineas celulares, células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-AgI4, células 293, células HeLa y otras similares, que están disponibles a partir de, por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). Las células hospedadoras preferibles incluyen células de origen linfoide, como células de mieloma y linfoma. Se prefieren especialmente las células hospedadoras P3X63Ag8.653 (Número de entrada ATCC CRL-1580) y células SP2/0-Ag14 (Número de entrada ATCC CRL-1851). En una de las representaciones que se prefieren, la célula recombinante es una P3X63Ab8.653 o una célula SP2I0-AgI4.

Los vectores de expresión para esas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de expresión, como por ejemplo, entre otros, un origen de una replicación; un promotor (por ejemplo, promotores tardios o iniciales de $V40, el promotor CMV (patentes de los EE. UU. nO 5.168.062; 5.385.839), un promotor H$V tk, un promotor pgk (cinasas de fosfoglicerato), un promotor EF-1 alfa (patente de los EE. UU. nO 5.266.491), por lo menos un promotor de inmunoglobulina humana; un mejorador, y/o ubicaciones de procesamiento de información, como ubicaciones de enlace de ribosoma, ubicaciones de empalme de ARN, ubicaciones de poliadenilación (por ejemplo, una ubicación de adición $V40 T Ag poli A), y secuencias de terminación transcripcional. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Otras células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas del presente invento son conocidas y/o disponibles, por ejemplo, a partir del Catálogo de la Colección de Cultivos Tipo Americanos de Lineas Celulares e Hibridomas (www.atcc.org) u otras fuentes conocidas o comerciales.

Cuando se usan células hospedadoras eucariotas, las secuencias de terminación de poliadenilación o transcripción normalmente se incorporan al vector. Un ejemplo de secuencia de terminación es la secuencia de poliadenilación a del gen de la horma del crecimiento bovino. También se pueden incluir secuencias para empalmar de forma exacta la transcripción. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de $V40 ($prague, et al., J. Vi rol. 45:773-781 (1983)). Además, las secuencias de genes que van a controlar la replicación en la célula hospedadora pueden incorporarse al vector, por técnicas conocidas. Purificación de un anticuerpo

Un anticuerpo anti-IL-6 puede recubrirse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos conocidos entre los que se incluyen, entre otros, purificación de proteína A, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía por intercambio de anión o catión, cromatografia fosfocelulosa, cromatografia de interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía por hidroxilapatita y cromatografia por lectina. También se puede usar para la purificación la cromatografia liquida de alto rendimiento ("HPLC~). Véase, por ejemplo, Cotligan, Current Protocols in Immunology [Protocolos actuales en inmunologia), o Curren! Protocols in Protein Science [Protocolos actuales en ciencia de las proteínas), John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por ejemplo, capitulos 1, 4, 6, 8, 9, 10.

Los anticuerpos del presente invento incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un anfitrión eucariota, que incluye, por ejemplo, levadura, células de especies de planta superior, insectos y mamíferos. Dependiendo del anfitrión que se haya utilizado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo del presente invento puede glicosilarse o no-glicosilarse, pero se prefiere el glicosilado. Dichos métodos se describen en muchos manuales

estándar de laboratorio, como Sambrook, supra, secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 Y 20, Colligan, Protein Science [Ciencia de las proteinas], supra, capitulas 12-14.

Anticuerpos anti-ll-6s

Un anticuerpo anti-IL-6 presentado en este documento incluye cualquier proteina o molécula que contenga péptidos que incluya por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, como por ejemplo, entre otras, por lo menos una porción de enlace de ligando (LBP), como por ejemplo, entre otras, una región determinante de la complementariedad (CoR) de una cadena pesada o ligera o una porción de enlace a ligando del mismo, una cadena pesada o región variable de cadena ligera, una región marco (por ejemplo, FR1, FR2, FR3, FR4 o un fragmento de las mismas, o como se muestra en las SEC ID N°: 105-112, de forma opcional que incluye por lo menos una sustitución, inserción o eliminación), una región constante de cadena pesada o cadena ligera, (por ejemplo, que incluye por lo menos una CHl, articulaciónl, articulación2, articuladón3, articulación4, CH2 o CH3 o fragmentos de las mismas, que a demás podria comprender por lo menos una sustitución, inserción o eliminación), o cualquier porción de los mismos, que puede incorporarse a un anticuerpo presentado en este documento. Un anticuerpo presentado en este documento puede incluir o derivarse de cualquier mamífero, como por ejemplo, entre otros, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate o cualquier combinación de los mismos y otros similares.

Los anticuerpos aislados del presente invento incluyen las secuencias de anticuerpo de aminoácidos presentados en este documento codificados por cualquier polinucleótido adecuado o cualquier anticuerpo aislado o preparado. Preferiblemente, el anticuerpo humano o fragmento de enlace al antígeno une IL-6 humano y, por lo tanto, neutraliza parcial o notablemente por lo menos una actividad biológica de la proteína. Un anticuerpo, o porción especificada o variante de los mismos, que neutraliza parcialmente o preferiblemente de forma notable por lo menos una actividad biológica de por lo menos una proteina IL-6 o fragmento puede enlazar la proteina o fragmento y por lo tanto inhibir actividades mediadas por el enlace de IL-6 al receptor IL-6 o a través de otros mecanismos dependientes o mediados por IL-6. Tal y como se usa en este documento, el término "anticuerpo de neutralización" hace referencia a un anticuerpo que puede inhibir una actividad dependiente de IL-6 aproximadamente en un 20-120 %, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % o más dependiendo del ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-IL-6 de inhibir una actividad dependiente de IL-6 se evalúa preferiblemente por lo menos por una proteína adecuada IL-6 o ensayo receptor, como se describe en este documento y/o por técnicas conocidas. Un anticuerpo humano del invento puede ser de cualquier tipo (lgG, IgA, IgM, IgE, Igo, etc.) o isotipo y puede incluir una cadena ligera de kappa o lambda. En una representación, el anticuerpo humano incluye una cadena pesada de IgG o un fragmento definido, por ejemplo, por lo menos uno de los isotipos, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 (por ejemplo, Vi, V2, V3 o V4). Se pueden preparar anticuerpos de este tipo usando un ratón transgénico u otro mamífero transgénico no humano que incluye por lo menos transgenes de una cadena ligera humana (por ejemplo, IgG, IgA Y IgM) como los descritos en este documento yfo por técnicas conocidas. En otra representación, el anticuerpo anti-humano IL-6 humano incluye una cadena pesada IgGl y una cadena ligera IgGI.

Por lo menos un anticuerpo del invento une por lo menos un epítopo especifico a por lo menos una proteína IL-6, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los anteriores. Ese como minimo un epítopo puede comprender por lo menos una región de enlace al anticuerpo que incluye por lo menos una porción de la proteina, cuyo epítopo es preferiblemente comprendido de por lo menos una porción extracelular, soluble, hidrofílica, externa

: o citoplásmica de la proteina. Ese como minimo un epitopo especificado puede comprender cualquier combinación de lo menos una secuencia de aminoácido de por lo menos 1-3 aminoácidos a la porción especificada entera de aminoácidos contiguos de $EC ID N°: 115, por ejemplo), residuos de aminoácido 151-178, más específicamente, residuos 171-182.

Generalmente, el anticuerpo humano o fragmento de enlace de antigeno presentado en este documento incluirá una región de enlace de antigeno que incluye por lo menos una región determinante de complementariedad (COR1, COR2 y CDR3) o variante de por lo menos una región de cadena pesada variable y por lo menos una región determinante de la complementariedad humana (CDR1, COR2 y CDR3) o variante de por lo menos una región variable de cadena ligera. Las secuencias CDR podrían derivarse de secuencias de linea germinal humana o coinciden exactamente con las secuencias de la linea germinal. Por ejemplo, pueden usarse los CORs de una biblioteca sintética derivados de los CORs del ratón orig inal. Esos CORs podrian formarse por la incorporación de sustituciones conservadoras a partir de la secuencia original del ratón. Únicamente a modo de ejemplo, el anticuerpo

: o porción o variante de enlace de antígeno puede comprender por lo menos uno de los COR3 de cadena pesada que tenga una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consta de $EC ID N°: 79, 81 , 83, 85, 87, 89 Y 91, yfo un COR3 de cadena ligera que tenga una secuencia de aminoacido seleccionada a partir del grupo que consta de SEC ID N°: 29, 31, 33 Y 35. En una representación concreta, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno puede tener una región de enlace de antígeno que incluye por lo menos una porción de por lo menos una cadena pesada COR (por ejemplo, COR1 , COR2 yfo COR3) con la secuencia de aminoácido de los CORs 1, 2, y/o 3 correspondientes (por ejemplo, $EC ID N°:37, 49 y 79). En otra representación concreta, el anticuerpo o porción de enlace de antigeno o va riante puede tener una región de enlace de anligeno que comprenda por lo menos una

porción de por lo menos un CoR de cadena ligera (por ejemplo, COR1, COR2 yfo COR3) que tenga la secuencia de aminoácido de los CORs 1, 2 yfo 3 correspondientes (por ejemplo, SEC ID N°: 1, 17 Y 29).

En una de las representaciones preferidas, los tres CORs de cadena pesada y los tres CoRs de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno tienen la secuencia de aminoácido del COR correspondiente de por lo menos uno de los siguientes mAb AME-A9, AME-lb, AME-18a, AME-22a, AME-20b, AME-23a y AME-19a, de la fonna descrita en este documento. Dichos anticuerpos pueden prepararse uniendo quimicamente las diversas porciones (por ejemplo, CORs, marco) del anticuerpo usando técnicas convencionales, preparando y expresando una (por ejemplo, una o más) molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo usando técnicas convencionales de tecnologia de AON recombinante o usando otro método adecuado.

El anticuerpo anti-IL-6 puede incluir por lo menos uno entre: cadena pesada o región variable de cadena ligera con secuencia de aminoácido definida. Por ejemplo, en una de las representaciones preferidas, el anticuerpo anti-IL-6 incluye por lo menos uno entre: por lo menos una región variable de cadena pesada, que podria tener una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del gl1Jpo que consta de SEC ID W 95, 99, 103, 118, 122, 126 Y 130 yfo por lo menos una región variable de cadena ligera, que podria tener una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consta de SEC ID N°: 93, 97, 101, 116, 120, 124 Y 128. Los anticuerpos que se unen a11L-6 humano y que incluyen una cadena pesada definida o una región variable de cadena ligera pueden prepararse utilizando métodos adecuados, como muestra de fago (Katsube, Y., et al, IntJMol. Med, 1(5):863-868 (1998)) o métodos que emplean animales transgénicos, con técnicas conocidas y/o de la forma descrita en este documento. Por ejemplo, un ratón transgénico, que incluye un transgene de cadena pesada de cadena de inmunoglobina redistribuido de fonna funcional y un transgen que incluye AoN de una ubicación de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede reorganizarse de fonna funcional, puede inmunizarse con IL-6 humano o un fragmento del mismo para provocar la producción de anticuerpos. Si se desea, las células que producen anticuerpos pueden aislarse y los hibridomas u otras células inmortalizadas productoras de anticuerpos pueden prepararse de la fonna descrita en este documento yfo con técnicas conocidas. De forma alternativa, el anticuerpo, porción especificada o variante puede expresarse usando el ácido nucleico de codificación o una porción suya en una célula hospedadora adecuada.

Códigos de aminoácidos

Los aminoácidos crean anticuerpos anti-IL-6s del presente invento con frecuencia se abrevian. Las designaciones de aminoácidos pueden indicarse designando el aminoácido por su código de letra única, su código de tres letras, nombre, o codón (o codones) de tres nucleótidos, de fonna comprensible en este ámbito (ver Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Célula (Biologia molecular de la célula), Tercera Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Un anticuerpo anti-IL-6 del presente invento puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o adiciones, ya sea por mutaciones naturales o por manipulación humana, tal y como se especifica en el presente documento. Los aminoácidos de un anticuerpo anti-IL-6 el presente invento que son esenciales para su funcionamiento se pueden identificar por técnicas conocidas, como mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis de exploración de alanina (por ejemplo, Ausubel, supra, capítulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina simple en todos los residuos de la molécula. Se busca entonces actividad biológica en las moléculas mutantes resultantes, como por ejemplo, sin excluir otros, por lo menos una actividad neutralizadora de IL-6. Las ubicaciones criticas para el enlace de anticuerpos también se pueden identificar por medio de análisis estl1Jctural, como cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado de fotoafinidad (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).

Los anticuerpos anti-IL-6s presentados en este documento pueden incluir, entre otros, por lo menos una porción, secuencia o combinación seleccionada a partir de 5 hasta todos los aminoácidos contiguos de por lo menos una de las SEC ID N°: 91, 93, 95, 97, 99, etc.

Las variantes no limitadoras que pueden mejorar o mantener por lo menos una de las actividades indicadas incluyen, entre otros, cualquiera de los polipéptidos anteriores, que también incluye por lo menos una mutación correspondiente a por lo menos una sustitución de los residuos modificados entre las secuencias presentadas de variantes de aminoácido.

Un anticuerpo anti-IL-6 también pOOria incluir un polipéptido con una secuencia de aminoácido que varia a partir de la secuencia de los aminoácidos contiguos de por lo menos uno de: SEC ID N°: 95, 99 Y 103, etc (por ejemplo, una o más sustituciones conservadoras a partir de las secuencias indicadas en este documento). Además, en este documento se presentan variantes de la secuencia de aminoácido de una región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 93, 97 O 101, O la secuencia de aminoácido de una cadena pesada de SEC ID N°: 79, 81, 83, 85, 87, 89 o 91.

Como comprenderán los expertos, el presente invento incluye por lo menos un anticuerpo del presente invento biológicamente activo. Los anticuerpos activos biológicamente tienen una actividad específica de por lo menos 20 %, 30 % o 40 % Y preferiblemente, por lo menos 50 %, 60 %, o 70 %, Y todavía más preferible, por lo menos del 80 %, 90 %, o 95 %-1000 % o más de eso que el anticuerpo nativo (nO-SintétiCO), endógeno o relacionado y conocido. Los métodos para probar y cuantificar las medidas de actividad enzimática y especificidad de sustrato son bien conocidos en este ámbito.

En otro aspecto, el invento se relaciona con anticuerpos humanos y fragmentos de enlace con antigeno, de la forma descrita en este documento, modificados por el enlace covalente de una fracción orgánica. Dicha modificación puede producir un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno con propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, aumento de media vida de suero in vivo). La fracción orgánica puede ser un grupo polimérico lineal o hidrofilico ramificado, grupo de ácidos grasos, o grupo de éster de ácidos grasos. En ciertas representaciones, el grupo polimérico hidrofilico puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 800 a aproximadamente 120.000 Dalton y puede ser un glicol polialcano (por ejemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG» , carbohidrato de polímero, polímero de aminoácido o pirolidona de polivin ilo, y el ácido graso o grupo de éster de ácido graso puede comprender entre aproximadamente ocho hasta aproximadamente cuarenta átomos de carbono. Los anticuerpos modificados y los fragmentos de enlace de antígeno del invento pueden incluir una o más fracciones orgánicas que están enlazadas de forma covalente, directa o indirectamente, al anticuerpo. Cada fracción orgánica enlazada a un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del invento podrian de forma independiente ser un grupo polimérico hidrofílico, un grupo de ácido graso o un grupo de éster de ácido graso. En este documento, el término -ácido graso" abarca ácidos mono-carboxilicos y ácidos di-carboxílicos. -Grupo polimérico hidrofilico", usado en este texto, hace referencia al polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polisilina es más soluble en agua que en octano. Asi, un anticuerpo modificado por la unión covalenle de polisilina se incluye en el invento. Los polimeros hidrofílicos adecuados para la modificación de anticuerpos del invento pueden ser lineales o ramificados e incluir, por ejemplo, polialcan glicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polielilen glicol (mPEG), PPG y otros similares), carbohidratos (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y otros similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartata y otros similares), óxidos de polialcano (por ejemplo, óxido de polielileno, óxido de polipropileno y otros similares) y pirotidona de polivinilo.

Preferiblemente, el polimero hidrofílico que modifica el anticuerpo del invento tiene un peso molecular de aproximadamente entre 800 y 150.000 Dallon con entidad molecular independiente. Por ejemplo, se puede usar PEGsooo y PEG20.000, donde el subíndice es la media del peso molecular del polímero en Dalton. El grupo polimérico hidrofílico puede sustituirse con entre uno y seis grupos de alquilo, ácido graso o de éster de ácido graso. Los polimeros hidrofilicos que se sustituyen con un grupo de ácido graso o de éster de ácido graso se pueden preparar usando los métodos adecuados. Por ejemplo, un poli mero que incluye un grupo de amina se puede acoplar a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso, y un carboxilato activado (por ejemplo, activado con diimizadola N, N-carbonilo) en un ácido graso o éster de ácido graso pueden acoplarse a un grupo de hidroxilo en un polimero.

Los ácidos grasos y ésteres de ácido graso adecuados para modificar anticuerpos del invento pueden saturarse o contener una o más unidades de insaturaciÓn. Entre los ácidos grasos adecuados para modificar los anticuerpos del invenlo se incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (CI2, laurato), n-telradecanoalo (C14, mirislato), n-ocladecanoato (CIB, estearato), n-eicosanoato (C20, arachidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-Iriacontanoato (CJe), ntetracontanoato (C40), cis-L\9-octadecanoate (C18, oleato), todos cis-65,8, 11, 14-eicosatetraenoato (C20, araquidonalo), ácido octanedioico, ácido letradecanedioico, ácido ocladecanedioico, ácido docosanedioioo y otros similares. Entre los ésteres de ácidos grasos adecuados se incluyen los mono ésteres de ácidos dicarboxilicos que incluyen un grupo lineal o grupo bajo ramificado de alquilo. El grupo bajo de alquilo puede incluir entre uno y aproximadamente doce, y preferiblemente entre uno y seis átomos de carbono.

Los anticuerpos humanos modificados y los fragmenlos de enlace de antígeno pueden prepararse usando métodos adecuados, como por ejemplo por la reacción de uno o más agentes modificadores. Un ~agente modificador" en este lexlo, hace referencia a un grupo orgánico adecuado (por ejemplo, polimero hidrofilico, un ácido graso, un éster de ácido graso) que incluye un grupo de activación. Un "grupo de activación" es una fracción quimica o grupo funcional que puede, en afecciones concretas, reaccionar con un segundo grupo químico formando así un enlace covalenle entre el agente modificador y el segundo grupo quimico. Por ejemplo, los grupos de activación reactivos a amina incluyen grupos electrofílicos, como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, f1uoro, yodo), ésteres de Nhidroxisuccinimidilo (NHS) y olros similares. Los grupos de activación que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacelilo, acrilolilo, disulfidos de piridilo, 5-liol-2-liol de ácido nilrobenzoico (TNB-tiol) y otros similares. Un grupo funcional de aldehido puede acoplarse a moléculas que contengan amina-o hidrazida, y un grupo de azida puede reaccionar con un grupo trivalente de fósforo para formar fosforamidalo o enlaces de fosforimida. Los métodos adecuados para introducir grupos de activación en moléculas son conocidos en este ámbito (véase por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques [Técnicas de bioconjugadosj, Academic Press: San Diego, CA (1996». Un grupo de aclivación puede enlazarse directamenle al grupo orgánico (por ejemplo, polimero hidrofilico, ácido graso, ésler de ácido graso), o a través de una fracción vinculadora, por ejemplo, un grupo de Cl-CI2 divalente donde uno O más átomos de carbono pueden sustituirse por un heteroátomo, como el oxigeno, nitrógeno o azufre. Entre las fracciones vinculadoras adecuadas se incluyen, por ejemplo, glicol de tetraetileno, (CHzh -, -NH-(CHzl6-NH-, -(CHz)z-NH-y -CHz-o-CH2-CHz-o-CHz-CH2-0-CH-NH-. Los agentes modificadores que incluyen una fracción vinculadora se pueden producir, por ejemplo, reaccionando una mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-elilenediamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de l-eliI0-3-(3dimetilaminopropilo) carbodiimida (EDC) para formar un enlace de amida entre la amina libre y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc puede retirarse del producto tratándolo con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que puede acoplarse a otro carboxilalo, de la forma descrita, o puede reaccionarse con

anhidrido maleico y el producto resultante puede ciclizarse para producir un derivado de maleimido activado del ácido graso (véase, por ejemplo, Thompson, et al., WO 92/16221 .)

Los anticuerpos modificados del invento pueden producirse reaccionando un anticuerpo humano o fragmento de enlace de antrgeno con un agente modificador. Por ejemplo, las fracciones orgánicas pueden enlazarse al anticuerpo de forma no específica para la ubicación usando un agente modificador reactivo de amina, por ejemplo, un éster NHS de PEG. Los anticuerpos humanos modificados o fragmentos de enlace antigeno también se pueden preparar reduciendo enlaces de disulfuro (por ejemplo, enlaces de disulfuro del interior de la cadena) de un anticuerpo o fragmento de enlace antigeno. El ant icuerpo reducido o fragmento de enlace de antígeno entonces podria reaccionarse con un agente modificador reactivo de tiol para producir el anticuerpo modificado del invento. Los anticuerpos humanos modificados y los fragmentos de unión de antrgeno que incluyen una fracción orgánica enlazada a ubicaciones específicas de un anticuerpo del presente invento pueden prepararse usando métodos adecuados, como proteolisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 5968 (1996); CapeUas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), Y los métodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques [Técnicas de bioconjugadosj, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Anticuerpos anti-idiotipo para compuestos de anticuerpo anti-IL-6

Además de los anticuerpos monoclonales anti-IL-6, en este documento también se presenta un anticuerpo antiidiotipico (anti-id) específico de dichos anticuerpos. Un anticuerpo anti-id es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente a la región de enlace antigeno de otro anticuerpo. El anti-id puede prepararse inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, ratones) como fuente del anticuerpo de Id con el anticuerpo o un CDR que contenga una región de la misma. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotrpicos del anticuerpo inmunizador y producir un anticuerpo anti-id. El anticuerpo anti-id también se podrra usar como Rinmunogene" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal, produciendo lo que se denomina un anticuerpo anti-anti-Id.

También se presenta en este documento por lo menos un compuesto de anticuerpo anti-IL-6 que incluye por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis o más anticuerpos anti-IL-6 de los mismos, de la forma descrita aquí y/o con técnicas conocidas que se proporcionan en un compuesto, mezcla o forma que no se produce de forma natural. Dichos compuestos incluyen composiciones que no se producen naturalmente que incluyen por lo menos una o dos variantes, dominios, fragmentos o variantes especificas de longitud completa, C-ylo N-terminalmente eliminados, de la secuencia de aminoácido de anticuerpo anli-IL-6 seleccionada a partir del grupo que consta de 70-100 % de los aminoácidos contiguos de SEC ID W 1-114 Y 116-138, o fragmentos específicos, dominios o variantes de los mismos. Las composiciones preferidas de anticuerpo anti-IL-6 incluyen por lo menos uno o dos fragmentos, dominios o variantes de longitud completa como por lo menos un CDR o LBP que contenga porciones de la secuencia de anticuerpo anti-IL-6 descrita en este documento, por ejemplo, 70-100 % de SEC ID N°: 15, 27, 35, 47, 61 Y 91, o fragmentos, dominios o variantes especificadas de los mismos. Se consideran todavia mejor las composiciones que incluyen, por ejemplo, 40-99 % de por lo menos uno de 70-100 % de SEC ID N°: 93, 95, 97, 99, 101, 103, etc., o fragmentos, dominios o variantes especificas de los mismos. Dichos porcentajes de las composiciones se refieren a peso, volumen, concentración, molaridad o molalidad de soluciones liquidas o sólidas, mezclas, suspensiones, emulsiones, particulas, polvo o coloides, por técnicas conocidas o de la forma descrita en este documento.

Composiciones de ant icuerpos que incluyen ingredientes activos terapéutica mente

Las composiciones de anticuerpos del invento podrían también comprender una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto o proterna seleccionada a partir de por lo menos uno de los siguientes: medicamento antiinfeccioso, medicamento del sistema cardiovascular (CV), medicamento del sistema nervioso central (CNS), medicamento del sistema nervioso autónomo (ANS), medicamento del tracto respiratorio, medicamento del tracto gastrointestinal (GI), medicamento hormonal, medicamento para el equilibrio de liquidos o electrolitos, medicamento hematológico, antipleonástico, medicamento de inmunomodulación, medicamento oftalmológico, óptico o nasal, medicamento tópico, medicamento nutricional u otros similares. Dichos medicamentos son bien conocidos en este ámbito, incluidas formulaciones, indicaciones, dosificaciones y administración para cada uno de ellos presentada aqur (véase. por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs [Manual de medicamentos para enfermeria 2001j, 21' edición, Springhouse Carp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001 [Guía de medicamentos para profesionales de la saludj, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-HaU, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapiaj. Wells et al., ed .• Appleton & Lange, $tamfOrd. CT).

Los medicamentos antiinfecciosos pueden ser por lo menos uno seleccionado de entre: amebicidas o por lo menos un antiprotozoario, antihelminticos, antifúngicos, antipalúdicos, antituberculosis o por lo menos un antilepra, aminoglucósidos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, antivirales, antiinfecciosos macrólidos, y varios antiinfecciosos. El medicamento puede por lo menos ser uno de los siguientes: inotrópicos, antiarrrtmicos, antianginosos, antihipertensivos, antilipémicos y otros medicamentos cardiovasculares. El medicamento del CNS puede ser por lo menos uno de los siguientes: analgésicos no narcóticos o por lo menos uno

de los siguientes: antipiréticos, antiinflamatorios no esteroideos, analgésicos narcóticos o por lo menos un opiáceo, sedantes hipnóticos, anticonvulsivos, antidepresivos, medicamentos anti ansiedad, antipsicóticos, estimulantes del sistema nervioso central, antiparkinsonianos y otros medicamentos del sistema nervioso central. El medicamento para ANS puede ser por lo menos uno de los siguientes: colinérgicos (parasimpatomiméticos), anti-colinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpatoliticos), relajantes musculares y bloqueadores neuromusculares. El medicamento del tracto respiratorio puede ser por lo menos uno de los siguientes: antihistaminicos, broncodilatadores, expectorantes o por lo menos un antitusivo y varios medicamentos respiratorios. El medicamento del tracto GI puede ser por lo menos uno de los siguientes: antiácido o por lo menos un adsorbente

o por lo menos un antiflatulento, enzima digestiva o por lo menos un solubilizador de cálculos biliares, antidiarreico, laxante, antiemético y medicamentos antiulcerosos. El medicamento hormonal puede ser por lo menos uno de los siguientes: corticosteroides, andrógenos o por lo menos un esteroide anabólico, estrógeno o por lo menos una progestina, gonadotropina, medicamento antidiabético o por lo menos un glucagón, hormona del tiroides, antagonista de hormona del tiroides, hormona pituitaria y medicamento tipo paratiroides. El medicamento para el equilibrio de fluidos y electrolito puede ser por lo menos uno de los siguientes: diuréticos, electrolitos o por lo menos una solución de reposición, acidificante o por lo menos un alcalinizador. El medicamento hematológico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hematinicos, anticoagulantes, derivados sanguineos y enzimas trombolilicas. Los antineoplásicos pueden ser por lo menos uno de los siguientes: medicamentos alquilantes, antimetabolitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que modifican el equilibrio hormonal y otros antineoplásicos. El medicamento de inmunomodulación puede ser por lo menos uno de los siguientes: inmunosupresores, vacunas, por lo menos un toxoide, antitoxina o por lo menos un contraveneno, suero inmune y modificadores de la respuesta biológica. Los medicamentos oftálmicos, óticos y nasales pueden ser por lo menos uno de los siguientes: antiinfecciosos oftálmicos, antiinflamatorios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstrictores oftálmicos, varios oftálmicos, óticos y medicamentos nasales. El medicamento tópico puede ser por lo menos uno de los siguientes: antiinfecciosos locales, escabicidas o por lo menos un pediculicida o corticoesteroide tópico. El medicamento nutricional puede ser por lo menos uno de los siguientes: vitaminas, minerales o calóricos. Véase, por ejemplo, los contenidos del Manual de medicamentos de enfermeria 2001, supra.

El como minimo un amebicida o antiprotozoario puede por lo menos ser uno de los siguientes: atovaquona, hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazola, hidrodoruro de metronidazola e isentionato de pentamidina. El por lo menos un antelmíntico puede ser por lo menos uno de los siguientes: mebendazol, pamoato de pirantel y tiabendazol. El por lo menos un antifúngico puede ser por lo menos uno de los siguientes: anfotericina B, complejo de sulfato de colesterol de anfotericina B, complejo lipido de anfotericina B, liposomal de anfotericina B, fluconazol, flucitosina, micro-g riseofulvina, ultramicro-griseofulvina, itraconazol, ketoconazol, nistatina y hidrodoruro de terbinafina. El por lo menos un antipalúdico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de doroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquinas, hidrocloruro de mefloquina, fosfato primaquina, pirimetamina y pirimetamina con sulfadoxina. El por lo menos un antituberculoso o antilepra puede ser por lo menos uno de los siguientes clofazimina, cicloserina, dapsona, hidrocloruro de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampina, rifapentina y sulfato de estreptomicina. El por lo menos un aminoglucosida puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de amikacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina y sulfato de tobramicina. El por lo menos un elemento de penicilina puede ser por lo menos uno de los siguientes: amoxicilinafpotasio de clavulanato, trihidrato de amoxicilina, ampicilina, sodio de ampicilina, trihidrato de ampicilina, sodio de ampicilina {sodio de sulbactam, sodio de cloxacilina, sodio de dicloxacilina, sodio de mezlocilina, sodio de nafcilina, sodio de oxacilina, benzatina de penicilina G, potasio de penicilina G, procaina de penicilina G, sodio de penicilina G, potasio de penicilina V, sodio de piperacilina, sodio de pieracilinafsodio de tazobactamo, disodio de ticarcilina y disodio de ticarcil ina{potasio de clavulanato. El por lo menos un cefalosporino puede ser por lo menos uno de los siguientes: cetador, cefadroxil, sod io de cefazolina, cefd inir, hidrocloruro de cefepima, cefixima, sodio de cefmetazol, sodio de cefoniCid, sodio de cefoperazona, sodio de cefotaxima, disodio de cefotetán, sodio de cefoxitina, proxetil de cefpodoxima, cefprozil, ceftazidima, ceftibutén, sodio de ceftizoxima, sodio de ceftriaxona, axetil de cefuroxima, sodio de cefuroxime, hidrocloruro de cefalexin, monohidrato de cefalexin, cefradine y loracarbef. El por lo menos un elemento de tetraciclina puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de demeclocilclina, calcio de doxiciclina, hiclato de doxiciclina, hidrocloruro de doxiciclina, monohidrato de doxiciclina, hidrocloruro de minociclina e hidrocloruro de tetraciclina. La por lo menos una sulfonamida puede ser por lo menos una de las siguientes: co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sUlfisoxazol, y acetilo de sulfisoxazol. El por lo menos una fluoroquinolona puede ser por lo menos uno de los siguientes mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, hidrocloruro de lomefloxacina, ácido nalidixico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, y mesilato de trovafloxacina. El por lo menos un elemento de f1uoroquinolona puede ser por lo menos uno de los siguientes mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, hidrocloruro de lomefloxacina, ácido nalidixico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, y mesilato de trovafloxacina. El por lo menos un antiviral puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de abacavir, sodio de aciclovir, hidrocloruro de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, sodio de fomivirsen, sodio de foscamet, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudinafzidovudina, mesilato de nelfmavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, hidrocloruro de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, stavudina, hidrocloruro de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir y zidovudina. El por lo menos un elemento de macrolina antiinfecciosa puede por lo menos ser uno de los siguientes: azitromicina, claritromicina, diritromicina, base de eritromicina, estolato de eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, lactobionato de eritromicina y estearato de eritromicina. El por lo menos un elemento infeccioso general puede ser por lo menos uno de los siguientes

aztreonam, bacitracina, sucinato de sodio de cloranfenicol, hidrocloruro de clindamicina, hidrocloruro de palmitato de clindamicina, fosfato de clindamicina, sodio de imipenem y cilastatina, meropenem, macrocristales de nitrofuranto¡na, microcristales de nirofurantoina, quinupristina/dalfopristina, hidrocloruro de espectinomicina, trimetoprim e hidrocloruro de vancomicina. (Véase, por ejemplo, pp. 24-214 del Manual de medicamentos de enfermería 2001 ).

El por lo menos un inotrópico puede ser por lo menos uno de los siguientes: lactato de amrinona, digoxina, y lactato de milrinona. El por lo menos un antiarritmico puede ser por lo menos uno de los siguientes adenosina, hidrocloruro de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretilio, hidrocloruro de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, hidrocloruro de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, hidrocloruro de udocaína, hidrocloruro de mexiletina, hidrocloruro de moricizina, fenito¡na, sodio de fenitoina, hidrocloruro de procainamida, hidrocloruro propafenona, hidrocloruro de propranolol, bisulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, hidrocloruro de tocainida e hidrocloruro de verapami!. El por lo menos un antianginal puede ser por lo menos uno de los siguientes: besilato de amlodipidina, nitrito de amilo, hidrocloruro de bepridilo, hidrocloruro de dilliazem, dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida, nadolol, hidrocloruro de nicardipina, nifedipina, nitroglice rina, hidrocloruro de propranolol, verapamil e hidrocloruro de verapamil. El por lo menos un antihipertensivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de acebutolol, besilato de amlodipina, atenolol, hidrocloruro de benazepril, hidrocloruro de betaxolol, fumarato de bisoprolol, ciletexil de candesartano, captopril, hidrocloruro de carteolol, carvedilol, clonidina, hidrocloruro de clonidina, diazoxida, hidrocloruro de diltiazem, mesilato de doxazosina, enalaprilat, maleato de enalapril, mesilato de eprosartano, felodipina, mesilato de fenoldopam, sodio de fosinopril, acetato de guanabenz, sulfato de guanadrel, hidrocloruro de guanfacina, hidrocloruro de hidralazina, irbesartano, isradipina, hidrocloruro de labetalol, lisinopril, potasio de losartano, metildopa, hidrocloruro de metildopato, succinato de metoprolol, tartrato de metoprolol, minoxidil, hidrocloruro de moexipril, nadolol, hidrocloruro de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, sodio de nitroprusida, sulfato de penbutolol, erbumina de perindopril, mesilato de fentolamina, pindolol, hidrocloruro de prazosina, hidrocloruro de propranolol, hidrocloruro de quinapril, ramipril, telmisartan, hidrocloruro de terazosina, maleato de timolol, trandolapril, valsartan e hidrocloruro de verapamil. El por lo menos un antilipémico puede ser por lo menos uno de los siguientes: calcio de atorvastatina, sodio de cerivastatina, colestiramina, hidrocloruro de colestipol, fenofibrato (micronizado), sodio de fluvastatina, gemfibrozil, lovastatina, niacina, sodio de pravastatina y simvastatina. El por lo menos un medicamento general CV puede ser por lo menos uno de los siguientes: abciximab, alprostadil, hidrocloruro de arbutamina, cilostazol, bisulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, hidrocloruro de midodrina, pentoxifilina, hidrocloruro de ticlopidina e hidrocloruro de tirofibano (véase, por ejemplo, pp. 215-336 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).

El por lo menos un analgésico no narcótico o antipirético puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetaminofeno, aspirina, trisalicilato de magnesio de colina, diflunisal y salicilato de magnesio. El por lo menos un medicamento antiinflamatorio no estero ideo puede ser por lo menos uno de los siguientes: celecoxib, potasio de diclofenaco, sodio de diclofenaco, etodolaco, calcio de fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, trihidrato de sodio de indometacina, ketoprofeno, trometamina de ketorolac, nabumetona, naproxeno, sodio de naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib y sulindac. El por lo menos un narcótico o analgésico opiáceo puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de alfentanil, hidrocloruro de buprenorfina, tartrato de butorfanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína, citrato de fentanilo, sistema transdérmico de fentalino, fentanilo transmucosal, hidrocloruro de hidromorfona, hidrocloruro de meperidina, hidrocloruro de metadona, hidrocloruro de morfina, sulfato de morfina, tartrato de morfina, hidrocloruro de nalbufina, hidrocloruro de oxicodona, pectinato de oxicodona, hidrocloruro de oximorfona, hidrocloruro de pentazocina, hidrocloruro de pentazocina e hidrocloruro de naloxona, lactato de pentazocina, hidrocloruro de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, hidrocloruro de remifentanil, citrato de sufentanil e hidrocloruro de tramado!. El por lo menos un sedante hipnótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrato de cloral, estazolam, hidrocloruro de flurazepam, pentobarbital, sodio de pentobarbital, sodio de fenobarbital, sodio de secobarbital, temazepam, triazolam, zaleplon y tartrato de zolpidem. El por lo menos un anticonvulsivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: sodio de acetazolamida, carbamazepina, clonazepam, dipotasio de clorazepato, diazepam, sodio de divalproex, etosuximda, sodio de fosfenitoina, gabapentina, lamotrigina, sulfato de magnesio, fenobarbital, sodio de fenobarbital, fenitoina, sodio de fenitoina, sodio de fenitoína (ampliado), primidona, hidrocloruro de tiagabina, topiramato, sodio de valproato y ácido valproico. El por lo menos un antidepresivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, hidrocloruro de bupropion, bromhidrato de citalopram, hidrocloruro de clomipramina, hidrodoruro de desiprarnina, hidrocloruro de doxepina, hidrocloruro de nuoxetina, hidrocloruro de irniprarnina, pamoato de imipramina, mirtazapina, hidrocloruro de nefazodona, hidrocloruro de nortriptilina, hidrocloruro de paroxetina, sulfato de fenelzina, hidrocloruro de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina e hidrocloruro de venlafaxina. El por lo menos un medicamento anti ansiedad puede ser por lo menos uno de los siguientes: alprazolam, hidrocloruro buspirona, clOrdiazepoxida, hidrocloruro de clordiazepoxida, dipotasio de clorazepato, diazepam, hidrocloruro de doxepina, embonato de hidroxizina, hidrocloruro de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, mefrobamato, hidrocloruro de midazolam y oxazepam. El por lo menos un medicamento antipsicótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de clorpromazina, clozapina, decanoato de fluphenazina, enantato de fluephenazina, hidrocloruro de fluphenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de haloperidol, hidrocloruro de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, hidrocloruro de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumarato de quetiapina, risperidona, hidrocloruro de tioridazina, tiothixena, hidrocloruro de tiothixena e hidrocloruro de trifluoperazina. El por lo menos un estimulante del sistema

nervioso central puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de deXlroanfetamina, hidrocloruro de doxapram, hidrocloruro de metamfetamina, hidrocloruro de metilfenidato, modafinil, pemolina e hidrocloruro de fentermina. El por lo menos un antiparkinsoniano puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de amantadina, mesilato de benztropina, hidrodoruro de biperideno, lactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-Ievodopa, entacapona, levodopa, mesilato de pergolida, dehidrocloruro de pramipexole, hidrocloruro de ropinirol, hidrocloruro de selegilina, tofcapona e hidrocloruro de trihexifenidilo. El por lo menos un medicamento general del sistema nervioso central puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrodoruro de bupropion, hidrodoruro de donepezil, droperidol, maleato de f1uvoxamina, carbonato de litio, citrato de litio, hidrodoruro de naratriptano, polacrilex de nicotina, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptan, monohidrato de hidrocloruro de sibutramina, succinato de sumatriptano, hidrocloruro de tacrina y zolmitriptano (véase, por ejemplo, pp. 337-530 del Manual de medicamentos para enfenneria 2001).

El por lo menos un colinérgico (por ejemplo, parasimatomimético) puede ser por lo menos uno de los siguientes: cloruro de betanecol, cloruro de edrofonio, bromuro de neostigmina, metilsulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmina y bromuro de piridostigmina. El por lo menos un anticolinérgico puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de atropina, hidrocloruro de diciclomina, glicopirrolato, hiosciamina, sulfato de hiosciamina, bromuro de propantelina, escopolamina, butilbromuro de escopolamina e hidrobromuro de escopolamina. El por lo menos un adrergénico (simpatomimético) puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de dobutamina, hidrodoruro de dopamina, bitartrato de metaraminol, bitartrato de norepinefrina, hidrodoruro de fenilerfrina, hidrocloruro de pseudoefedrina y sulfato de pseudoefedrina. El por lo menos un bloqueador adrenérgico (simpatolitico) puede ser por lo menos uno de los siguientes: mesilato de dehidroergotamina, tartrato de ergotamina, maleato de metisergida e hidrodoruro de propranolol. El por lo menos un relajante muscular puede ser por lo menos uno de los siguientes: bactofeno, carisoprodol, ctorzoxazona, hidrocloruro de ciclobenzaprina, sodio de dantroleno, metocarbamol e hidrocloruro de tizanidina. El por lo menos un bloqueador neuromuscular puede ser por lo menos uno de los siguientes: besilato de atracu rio, besilato de cisatracurio, cloruro de doxacurio, cloruro de mivacurio, bromuro de pancuronio, bromuro de pipecuronio, bromuro de rapacuronio, bromuro de rocuronio, cloruro de succinilcolina, doruro de tubocura rina y bromuro de vecuronio (véase, por ejemplo, pp. 531-84 del Manual de medicamentos para enfennería 2001 ).

El por lo menos un antihistamínico puede ser por lo menos uno de los siguientes: maleato de bronfeniramina, hidrodoruro de cetirizina, maleato de dorfeniramina, fumarato de clemastina, hidrodoruro de ciproheptadina, hidrodoruro de difenhidramina, hidrocloruro de fexofenadina, loratadina, hidrocloruro de prometazina, teoclato de prometazina e hidrocloruro de triprolidina. El por lo menos un broncodilatador puede ser por lo menos uno de los siguientes: albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartrato de epinefrina, hidrocloruro de epinefrina, bromuro de ipratropio, isoproterenol, hidrocloruro de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, hidrocloruro de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafato de salmeterol, sulfato de terbutalina y teofilina. El por lo menos un expectorante o antitusivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: benzonatato, fosfato de codeina, sulfato de codeina, hidrobromuro de dextrametorfano, hidrocloruro de difenhidramina, guaifenesina e hidrocloruro de hidromorfona. El por lo menos un medicamento respiratorio general puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetilcisteína, dipropionato de beclometasona, beractante, budesonida, calfactante, sodio de cromolino, alfa domasa, sodio de epoprostenol, flunisolida, propionato de f1uticasona, sodio de montelukast. sodio de nedocromil, palivizumab, acetonida de triamcinolona, zafirtukast y zileutón (véase, por ejemplo, pp. 585-642 del Manual de medicamentos para enfenneria 2001).

El por lo menos un antiacido, adsorbente o antiflatulento puede ser por lo menos uno de los siguientes: carbonato de aluminio, hidróxido de aluminio, carbonato de calcio, magaldrato, hidróxido de magnesio, óxido de magnesio, simeticona y bicarbonato de sodio. La por lo menos una enzima digestiva o solubilizador de cálculos biliares puede ser por lo menos uno de los siguientes: pancreatina, pancrelipasa, y ursodiol. El por lo menos un antidiarreico puede ser por lo menos uno de los siguientes: atapulguita, subsalicilato de bismuto, policarbofilo de calcio, hidrocloruro de difenoxilato y sulfato de atropina, loperamida, acetato de octre6tido, tintura de opio y tintura de opio (alcanforado). El por lo menos un laxante puede ser por lo menos uno de los siguientes : bisocodil, policarbofilo de calcio, cascara sagrada, fluidoextracto aromático de cascara sagrada, f1uidoeXlracto de cascara sagrada, aceite de ricino, calcio de docusato, sodio de docusato, glicerina, lactulosa, citrato de magnesio, hidróxido de magnesio, sulfato de magnesio, metilcelulosa, aceite mineral, polietilenglicol o solución de electrolito, psilio, senna y fosfatos de sodio. El por lo menos un antiemético puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de clorpromazina, dimenhidrinato, mesilato de dolasetron, dronabinol, hidrocloruro de granisetron, hidrocloruro de meclizina, hidrocloruro de metocloproamida, hidrodoruro de ondansetron, perfenazina, prodorperazina, edisilato de prodorperazina, maleato de prodorperazina, hidrocloruro de prometazina, escopolamina, maleato de tietilperazina e hidrodoruro de trimetobenzamida. El por lo menos un medicamento antiulceroso puede ser por lo menos uno de los siguientes: cimetidina, hidrocloruro de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, sodio de rabeprozol, citrato de bismuto de rantidina, hidrocloruro de ranitidina y sucralfato (véase, por ejemplo, pp. 643-95 de Manual de medicamentos para enfennería 2001). El por lo menos un corticosteroide puede ser por lo menos uno de los siguientes: betametasona, acetato de betametasona o fosfato de sodio de betametasona, fosfato de sodio de betametasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato de sodio de hidrocortisona, succinato

de sodio de hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato de sodio de metilprednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato de sodio de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triamcinolona, acetonida de triamcinolona y diacetato de lriamcinolona. El por lo menos un esteroide andrógeno o anabólico puede ser por lo menos uno de los siguientes: danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona y sistema transdérmico de testosterona. El por lo menos un estrógeno o progestina puede ser por lo menos uno de los siguientes: estrógenos esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistema Iransdérmico de acetato de estradiollnoretindrona, valerato de estradiol, estrógenos (conjugados), estropipato, estradoiol de etinilo, estradioJ y desogestrel de etinilo, estradiol de etinilo y diacetato de etinodiol, estradiol de etinilo y desogestrel, estradiol de etinilo y diacetato de etinodiol, estradiol de etinilo y levonorgestrel, estradiol de etinilo y noretindrona, estradiol de etinilo y acetato de norethindrona, estradiol de etinilo y norgestimata, estradiol de etinilo y norgestrel, estradiol de etinilo y noretindrona y acetatoy fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medroxiprogesterona, mestranol y noretindrona, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel y progesterona. La por lo menos una gonadroptropina puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetato de ganirelix, acetato de gonadorelina, acetato de histrelina y menotropinas. El por lo menos un antidiabético

o glucagón puede ser por lo menos uno de los siguientes: acarbosa, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagón, gliburida, insulinas, hidrocloruro de metformina, miglitol, hidrocloruro de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona y troglitazona. La por lo menos una hormona tiroidea puede ser por lo menos uno de los siguientes sodio de levotiroxina, sodio de liotironina, liotrix y tiroidea. El por lo menos un antagonista de hormona tiroidea puede ser por lo menos uno de los siguientes metimazo~ yoduro de potasio, yoduro de potasio (solución saturada), propiltiouracil, yodo radioactivo (yoduro de sodio 13 1) Y solución yodada fuerte. La por lo menos una hormona pituitaria puede ser por lo menos uno de los siguientes: corticotropina, cosintropina, acetato de desmofresina, acetato de leuprolida, corticotropina repositoria, somatrem, somatropina y vasopresina. El por lo menos un medicamento tipo paratiroideo puede ser por lo menos uno de los siguientes: calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (de salmón), calcitriol, dehidrotacisterol y di sodio de etidronato (véase, por ejemplo, pp. 696-796 del Manual de medicamentos para enfermeria 2001).

El por lo menos un diurético puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetazolamida, sodio de acetazolamida, hidrocloruro de amilorida, bumetanida, clortalidona, sodio de etacrinato, ácido etacrinico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espironolactona, torsemida, triamtereno, y urea. El por lo menos un electrolito o solución de reposición puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetato de calcio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, lactato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), fosfato de calcio (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (bajo peso molecular), hetaalmidón, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de potasio, bicarbonato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, inyección de Ringer, inyección de Ringer (lactato) y cloruro de sodio. El por lo menos un acidificador o alcalinizador puede ser por lo menos uno de los siguientes: bicarbonato de sodio, lactato de sodio y trometamina. (Véase, por ejemplo, pp. 797-833 of Manual de medicamentos para enfermeria 2001).

El por lo menos un hematinico puede ser por lo menos uno de los siguientes: fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (secado), dextrano de hiero, sorbitol de hierro, complejo de hierro polisacárido y complejo de gluconato férrico de sodio. El por lo menos un anticoagulante puede ser por lo menos uno de los siguientes: sodio de ardeparina, sodio de dalteparina, sodio danaparoide, sodio de enoxaparina, calcio de hepa rina, sodio de heparina y solución de warfarina. El por lo menos un derivado de la sangre puede ser por lo menos uno de los siguientes: albúmina 5 %, albúmina 25 %, faclor antihemofilico, complejo coagulante anti-inhibidor, antitrombina 111 (humana), factor IX (humano), complejo factor IX y fracciones de proteina de plasma. La por lo menos una enzima trombolitica puede por lo menos ser uno de los siguientes: alteplasa, anistreplasa, reteplasa (recombinante), estreptocinasa y urocinasa (véase, por ejemplo, pp. 834-66 del Manual de medicamentos para enfermeria 2001).

El por lo menos un medicamento alquilante puede ser por lo menos uno de los siguientes: busulfano, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, hidrocloruro mecloretamina, melfalán, hidrocloruro de melfalán, estreptozocina, temozolomida y tiotepa. El por lo menos un antimetabolito puede ser por lo menos uno de los siguientes: capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracil, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, sodio de metotrexato y tioguanina. El por lo menos un antineoplástico antibiótico puede ser por lo menos uno de los siguientes sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato liposomal de daunorubicina, hidrocloruro de daunorubicina, hidrocloruro de doxorubicina, hidrocloruro liposomal de doxorubicina, hidrocloruro de epirubicina, hidrocloruro de idarubicina, mitomicina, pentostatina, plicamycina y valrubicina. El por lo menos un antineoplástico que modifica el equilibrio hormonal puede ser por lo menos uno de los siguientes: anastrozol, bicalutamida, fosfato de sodio de estramustina, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona y citrato de toremifeno. El por lo menos un antineoplástico general puede ser por lo menos uno de los siguientes: asparaginasa, bacilo Calmette-Guerin (BCG) (intravesical vivo), dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, hidrocloruro de gemcitabina, hidrocloruro de irinotecano, mitotano, hidrocloruro de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargasa, sodio de porfimero, hidrocloruro de procarbazina, rituximab, teniposida, hidrocloruro de topotecano, trastuzumab, tretinoína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincrislina y tartrato de vinorelbina (véase, por ejemplo, pp. 867-963 del Manual de medicamentos para enfermeria 2001).

El por lo menos un inmunosupresor puede ser por lo menos uno de los siguientes: azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab, globulina inmune de linfocito, muromonab-CD3, mofetil de micofelonato, hidrocloruro mofetil de micofelonato, sirolimus y tacrolimus. La por lo menos una vacuna o toxoide puede ser por lo menos uno de los siguientes: vacuna de BCG, vacuna de la cólera, toxoides de difteria y tétanos (adsorbido), toxoides de difteria y tétanos y vacuna adsorbida de tos ferina celular, toxoides de difteria y tétanos y vacuna de la tos ferina de célula completa, vacunas conjugadas de hemofilia b, vacuna de hepatitis A (inactivada), vacuna de hepatitis B (recombinante), vacuna del virus de la gripe 1999-2000 de tipos trivalentes A & B (antigeno de superficie purificada), vacuna del virus de la gripe 1999-2000 de tipos trivalentes A & B (subvirión -o subvirión purificado), vacuna del virus de la gripe 1999-2000 tipos trivalentes A & B (virión completo), vacuna del virus de encefalitis japonesa (inactivada), vacuna de la enfermedad de Lyme (OspA recombinante), vacuna del virus de sarampión y paperas y rubeola (vivo), vacuna del virus de sarampión y paperas y rubeola (vivo atenuado), vacuna del virus del sarampión (vivo atenuado), vacuna de polisacárido meningocócico, vacuna del virus de las paperas (vivo), vacuna de la peste, vacuna de pneumococo (polivalente), vacuna del poliovirus (inactivado), vacuna del poliovirus (vivo, oral, trivalente), vacuna de la rabia (adsorbido), vacuna de la rabia (células diploides humanas), vacuna del virus de la rubeola y paperas (vivo), vacuna del virus de la rubeola (vivo, atenuado), toxoide del tétanos (adsorbido), toxoide del tétanos (fluido), vacuna tifoidea (oral), vacuna tifoidea (parenteral), vacuna de polisacárido tifoide Vi, vacuna del virus de la varicela y vacuna de la fiebre amarilla. La por lo menos una antitoxina o antiveneno puede ser por lo menos uno de los siguientes: antiveneno de la araña viuda negra, antiveneno de Crotalidae (polivalente), antitoxina de la difteria (eqUino), y antiveneno de Micrvrus fulvius. El por lo menos un suero inmune puede ser por lo menos uno de los siguientes: globulina inmune de citomegalovirus (intravenoso), globulina inmune de hepatitis B (humana), globulina intramuscular inmune, globulina intravenosa inmune, globulina inmune de la rabia (humana), globulina intravenosa inmune del virus respiratorio sincicial (humana), globulina inmune Rho(D) (humana), globulina inmune intravenosa Rho(D) (humana), globulina inmune del tétanos (humano), y globulina inmune de varicela-zoster. La por lo menos un modificador de respuesta biológica puede ser por lo menos uno de los siguientes: aldesleukin, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatiramer para inyección, interferón alfacon-I, interferón alfa-2a (recombinante), interferón alfa2b (recombinante), interferón beta-la, interferón beta-lb (recombinante), interferón gamma-lb, hidrocloruro de levamisol, oprelvequina y sargramostim (véase, por ejemplo, las pp. 964-1040 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).

El por lo menos un antiinfeccioso oftálmico puede seleccionarse a partir de: bacitracina, cloranfenicol, hidrocloruro de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina 0,3 %, sulfato de pOlimixina B, sodio de sulfacetamida 10 %, sodio de sulfacetamida 15 %, sodio de sulfacetamida 30 %, tobramicina y vidarabina. El por lo menos un antiinflamatorio oftálmico puede ser por lo menos uno de los siguientes: dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona, sodio de diclofenaco 0,1 %, fluorometolona, sodio de flurbiprofeno, trometamina de ketorolaco, acetato de prednisolona (suspensión) y fosfato de sodio de prednisolona (solución). El por lo menos un miótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: cloruro de acetilocolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), yoduro de ecotiofato, pilocarpina, hidrocloruro de pilocarpina y nitrato de pilocarpina. El por lo menos un midriático puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de atropina, hidrocloruro de ciclopentolato, hidrocloruro de epinefrina, borato de epinefrilo, hidrobromuro de homatropina, hidrocloruro de fenilefrina, hidrobromuro de escopolamina y tropicamida. El por lo menos un vasoconstrictor oftálmico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de nafazolina, hidrocloruro de oximetazolina e hidrocloruro de tetrahidrozolina. El por lo menos un oftálmico general puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro apraclonidina, hidrocloruro de betaxolol, tartrato de brimonidina, hidrocloruro de carteolol, hidrocloruro de dipivefrina, hidrocloruro de dorzolamida, difumarato de emedastina, sodio de fluorescina, fumarato de ketotifeno, latanoprost, hidrocloruro de levobunolol, hidrocloruro de metipranolol, cloruro de sodio (hipertónico) y maleato de timolol. El por lo menos un ótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: ácido bórico, peróxido de carbamida, cloranfenicol y oIeatocondensado de polipéptido de trietanolamina. El por lo menos un medicamento nasal puede ser por lo menos uno de los siguientes: dipropionato de beclometasona, budesónida, sulfato de efedrina, hidrocloruro de epinefrina, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocloruro de nafazolina, hidrocloruro de oximetazolina, hidrocloruro de fenilefrina, hidrocloruro de tetrahidrozolina, acetonida de triamcinolona e hidrocloruro de xilometazolina (véase, por ejemplo, las pp. 1041-97 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).

El por lo menos un antiinfeccioso local puede ser por lo menos uno de los siguientes: acyclovir, anfotericina B, crema con ácido acelaico, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, ketoconazol, acetalo de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina, hidrocloruro de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de plata, hidrocloruro terbinafina, terconazol, hidrocloruro de tetraciclina, tioconazol y tolnaftate. El por lo menos un escabicida o pediculicida puede ser por lo menos uno de los siguientes: crotamitón, lindano, permetrina y piretrin. El por lo menos un corticosteroide tópico puede ser por lO menos uno de los siguientes: dipropionato de bemetasona, valerato de betametasona, propionato de clobetasol, desonide, desoximetasona, dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona, diacetato de diflorasona, acetonida de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocorisona, furoato de mometasona y acetonida de triamcinolona (véase, por ejemplo, las pp. 1098-1136 del Manual de medicamentos para enfermeria 2001).

La por lo menos una vitamina o mineral puede ser por lo menos uno de los siguientes: vitamina A, complejo de vitamina B, cianocobalamina, ácido fólico, hidroxocobalamina, calcio leucovorina, niacina, niacinamida, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, hidrocloruro de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecalciferol, ergocalciferol, análogo de vitamina O, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de vitamina K, filonadiona, floruro de sodio, floruro de sodio (tópiCO), oligoelementos, cromo, cobre, yodo, manganeso, selenio y zinc. El por lo menos un calórico puede ser por lo menos uno de los siguientes: infusiones de aminoácido (cristalinas), infusiones de aminoácido en dextrosa, infusiones de aminoácido con electrolitos, infusiones de aminoácido con electrolitos en dextrosa, infusiones de aminoácido para fallo hepático, infusiones de aminoácido para estrés metabólico alto, infusiones de aminoácido para fallo renal, dextrosa, emulsiones grasas y triglicéridos de cadena media (véase, por ejemplo, las pp. 1137-63 del Manual de medicamentos para enfermeria 2001).

Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 del presente invento también pueden incluir por lo menos uno de cualquier cantidad adecuada y eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en contacto o administrado a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia, que también podría comprender por lo menos uno de los siguientes: por lo menos un antagonista TNF {por ejemplo, entre otros, un antagonista TNF químico o proteína, anticuerpo o fragmento de TNF monoclonal o policlonal, un receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de su fusión o un antagonista de pequeña molécula TNF, por ejemplo, proterna I o 11 de unión de TNF (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept, COP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept y otros similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofín, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, antifúngico, antiparasitario, antiviral, carbapenem, cefalosporia, flurorquinolona, macrólido, penicilina, sulfonamida, tetracyilina, otro antimicrobiano ), un antipsoriásico, un corticosteriode, un esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, un eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un medicamento hormonal sustitutivo, un modulador de receptores de estrógeno, un midriático, un ciclopégico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, agente antimaniaco, un antipsic6tico, un ansiolílico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolino, una epinefrina o similar, domasa alfa (Pulmozima), una citoquina o un antagonista de citoquina. Entre los ejemplos de dichas citoquinas se incluyen, entre otros, cualquiera entre IL-1 a IL-23 (por ejemplo, IL-1 , IL-2, etc.). Las dosis adecuadas son bien conocidas en este ámbito. Véase, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapial, 2' edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); POR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000 [Farmacopea de bolsillo Tarascón 2000l, edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Dichos anticancerigenos o antiinfecciosos también pueden incluir moléculas de toxinas que se asocian, unen, coformulan o co-administran con por lo menos un anticuerpo del presente invento. La toxina podria actuar para eliminar de forma selectiva la célula o tejido patológico. La célula patológica puede ser un cáncer u otra célula. Dichas toxinas pueden ser, entre otros, una toxina purificada o recombinante o fragmento de toxina que incluye por lo menos un dominio citotóxico funcional de toxina, por ejemplo, seleccionado a partir de por lo menos uno de los siguientes: ricino, toxina de la difteria, toxina de veneno una toxina bacteriana. El término toxina también incluye tanto las endotoxinas como exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus de producción natural, mutante o recombinante que podría causar cualquier afección patológica en humanos y otros mamiferos, incluido el shock por toxina, que puede provocar la muerte. Dichas toxinas podrian incluir, entre otros, enterotoxina termolábil de E. coli enterotoxigénica (LT), enterotoxina termoestable (ST), citotoxina Shigella, enterotoxinas Aeromonas, toxina-1 de sindrome de shock tóxico (TSST-1), enterotoxina Estafilocócica A (SEA), B (SEB), o C (SEC), enterotoxinas Estreptocócicas y otros similares. Dichas bacterias incluyen, entre otros, cepas de una especie de E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enterohemorrágico (por ejemplo, cepas del serotipo 0157:H7), especies de Estafilococo (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella nexneri, Shigella boydii, y Shigella sonnei), especies de Salmonela (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridiumperfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacterfetus), especies de Heliobacter, (por ejemplo, Heliobacterpylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y Estreptococos. Véase, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE [MEDICINA INTERNAl, 33 ed., pp. 1-13, Litlle, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacteriallnfections of Humans: Epidemiology and Control [Infecciones bacterianas en humanos: epidemiología y controll, 23. ed., pp. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al, Principies and Practice of Infectious Diseases [Principios y práctica de enfermedades infecciosasl, 3' ed., Churchill Livingstone, New York. (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual [Manual Merckl, 163 ed., Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS

Microbiology Immunology [Inmunología de microbiología), 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990).

Los compuestos, composiciones o combinaciones de anticuerpo anti-IL-6 del presente invento también pueden incluir al menos un auxiliar adecuado, como, entre otros, diluyente, aglutinante, estabilizador, tampones, sales, disolvente lipofilico, conservante, adyuvante o similares. Se prefieren los auxiliares aceptables farmacéuticamente. En esta técnica se conocen ejemplos (no limitativos) y métodos de preparación de dichas soluciones estériles como, entre otros, en Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences [Ciencia farmacéutica de Remington), 18· Edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Se pueden seleccionar de forma rutinaria portadores adecuados farmacéuticamente que sean adecuados para la forma de administración, solubilidad y/o estabilidad del anticuerpo anti-IL-6, fragmento o composición variante de la forma bien conocida en este ámbito o como se describe en este documento.

Entre los excipientes farmacéuticos y aditivos útiles en la presente composición se incluyen, entre otros, proteinas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (por ejemplo, azúcares, incluidos los monosacáridos, di-, tri-, tetra-y oligosacáridos; azúcares derivados, como alditores, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes individualmente o en combinación, que incluyen solo o en combinación un 1-99,99 % por peso o volumen. Entre los ejemplos de excipientes de proteinas se incluyen albúmina sérica, como albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y similares. Entre los componentes de aminoácidos/anticuerpos representativos, que también pueden funcionar con capacidad amortiguadora, se incluyen alanina, glicina, arginina, betarna, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisterna, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo y similares. Uno de los aminoácidos que se prefieren es la glicina.

Entre los excipientes de carbohidratos adecuados para su uso en el invento se incluyen, por ejemplo, monosacáridos como la fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, como la rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y los alditoles, como el manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de carbohidrato que se prefieren para su uso en el presente invento son el manitol, la trehalosa y la rafinosa.

Las composiciones de anticuerpo anli-IL-6 también pueden incluir un tampón o agente de ajuste del pH; normalmente, el tampón es una sal preparada a partir de un ácido orgánico o base. Entre los tampones representativos se incluyen las sales de ácidos orgánicos, como las sales de ácido crtrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartá rico, ácido succínico, ácido acético o el ácido ftálico; Tris, hidrocloruro de trometamina o tampones de fosfato. Los tampones que se prefieren para su uso en las presentes composiciones son las sales de ácidos orgánicos, como el citrato. Además, las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 del invento pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos, como las polivinilopirrolidonas, ficons (un azúcar polimérico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, como 2-hidroxipropil-¡3ciclodextrina), glicoles de polietileno, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lensoactivos (por ejemplo, polisorbatos, como -lWEEN 20" Y "lWEEN 80"), lípidos (por ejemplo, fosfolipidos, ácidos grasos), esleroides (por ejemplo, colesterol), y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).

Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos adicionales conocidos adecuados para su uso en el anticuerpo anti-IL-6, porción o variaciones de su composición de acuerdo con el invento con conocidos, por ejemplo, de la forma indicada en -Remington: The Science & Practice of Pharmacy" [((Remington: la ciencia y la práctica de la farmacia»), 19' ed., Williams & Williams, (1995) y en · Physician's Desk Reference" [Referencia de escritorio del médico), 5~ ed ., Medícal Economícs, Montvale, NJ (1998). Los materiales portadores o excipíentes que se prefieren son carbohidratos (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes poliméricos. Una molécula portadora, a modo de ejemplo, es el mucopolisacárido, ácido hialurónico, que podría ser útil para la administración intraarticular.

Formul aciones

Como se ha indicado, el invento proporciona formulaciones estables, que preferiblemente incluyen un tampón de fosfato con salino o una sal escogida, asr como soluciones conservadas y formulaciones que contengan un conservante, así como formulaciones conservadas mulli-uso adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en una formulación aceptable farmacéuticamente. Las formulaciones conservadas contienen por lO menos un conservante conocido O uno que podrra seleccionarse del siguiente grupo: por lo menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencilico, nitrito de fenilomercúrico, fenixietanol, formaldehido, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, bulilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal, polímeros o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Cualquier concentración adecuada o mezcla puede usarse por técnicas conocidas, como aproximadamente 0,0015 % o cualquier rango, valor o fracción de los mismos. Algunos ejemplos (no limitativos) son, sin conservante, aproximadamente 0,1-2 % m-cresol (por ejemplo, 0,2, 0,3, 0.4,0,5,0,9,1,0 %), aproximadamente 0,1-3 % alcohol bencílico (por ejemplo, 0,5, 0,9, 1,1,1,5,1,9,2,0,2,5 %),

aproximadamente 0,001-0,5 % timerosal (por ejemplo, 0,005, 0,01), aproximadamente 0,001-2,0 % fenol (por ejemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,0005-1,0 % alquilparabeno(s) (por ejemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002,0,005,0,0075,0,009,0,01,0,02,0,05,0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0 %) Y similares.

Como se ha indicado anterionnente, el invento proporciona un articulo manufacturado, que incluye material de empaquetado y por lo menos un vial que incluye una solución de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 con los tampones y/o conservantes indicados, opcionalmente un diluyente acuoso, donde dicho material de empaquetado incluye una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse por un periodo de 1, 2, 3, 4, S, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o más. El invento también incluye un articulo manufacturado, que incluye material de empaquetado, un primer vial que tiene liofilizado por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y un segundo vial que incluye un diluyente acuoso del tampón o conservante prescrito, donde dicho material de empaquetado incluye una etiqueta que indica al paciente que reconstituir el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solución que puede mantenerse por un periodo de veinticuatro horas o más.

El por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se utiliza de acuerdo con el presente invento puede producirse por medios recombinantes, entre ellos a partir de células de mamifero célula o preparaciones transgénicas, o puede purificarse a partir de otras fuentes biológicas, como las descritas en este documento o por técnicas conocidas.

El rango de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en el producto del presente invento incluye cantidades que producen tras la reconstitución, en un sistema húmedo/seco, concentraciones de entre aproximadamente 1,0 ~g/ml y aproximadamente 1000 mgfml, aunque las concentraciones mayores y menores son manejables y dependen de la via de administración que se pretenda, por ejemplo, las formulaciones en solución serán diferentes de los parches transdérmicos o de métodos pulmonar, transmucoso, osmótico o micro bomba. Preferiblemente, el diluyente acuoso podria también comprender un conservante aceptable farmacéuticamente. Entre los conservantes que se prefieren se incluyen los seleccionados a partir del grupo que consta de fenOl, mcresol, p-cresol, o-<:resol, clorocresol, alcohol bencilico, alquiloparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, desidroacetato de sodio y timerosal o mezclas de los mismos. La concentración de conservantes que se usan en la fonnulación es una concentración suficiente para producir un efecto anti-microbiano. Dichas concentraciones dependen del conservante que se haya seleccionado y el técnico podrá definirlas fácilmente.

Otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, tampones, antioxidantes y mejoradores de los conservantes, puede añadirse (y seria preferible hacerlo) al diluyente. Un agente de isotonicidad, como la glicerina, se usa habitualmente a concentraciones conocidas. Preferiblemente, se añade un tampón tolerado fisiológicamente para proporcionar un control mejorado del pH. Las formulaciones pueden cubrir un rango mayor de pHs, como desde pH 4 hasta aproximadamente pH 10 Y los rangos que se prefieren van desde aproximadamente pH 5 hasta aproximadamente pH 9, Y un rango que se prefiere todavia más de aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente

8.0. Preferiblemente, las formulaciones del presente invento tienen un pH entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.8. Entre los tampones que se prefieren se incluyen tampones de fosfato, preferiblemente, fosfato de sodio, especialmente, salino tamponado de fosfato (PBS).

Otros aditivos, como los solubilizadores aceptables farmacéutica mente como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán), Tween 40 (polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitán), F68 Plurónico (copolimeros de bloque de polioxietileno polioxipropileno) y PEG (polietilenglicol) o tensoactivos no iónicos, como polisorbato 20 o 80 o poloxamer 184 o 188, polils PluroniC®, otros co-polimeros de bloque y queladores, como EDTA y EGTA, podrian af'iadirse también a las fonnulaciones o compuestos para reducir la agregaCión. Estos aditivos son especialmente útiles si se usa una bomba o recipiente plástico para administrar la fonnulación. La presencia de tensoactivos aceptables farmacéuticamente mitiga la propenSión de la protelna a la agregación.

Las formulaciones del presente invento pueden prepararse por un proceso que incluye la mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y un conservante seleccionado del grupo que consta de: fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencilico, alquilparabeno, (metilo, etilo, propilo, butilo y semejantes), cloruro del benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y conservante en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos convencionales para la disolución y la mezcla. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en solución tamponada con el conservante deseado en una solución tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la proteina y el conservante a las concentraciones que se buscan. Un técnico en la materia reconocerla las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden de adición de los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH al que se prepara la formulación son faclores que se pueden optimizar para la concentración y via de administración.

Las formulaciones reivindicadas pueden suministrarse a pacientes como soluciones claras o en forma de viales de tipo dual, que incluyen un vial liofilizado de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferiblemente, un tampón de fosfato y/o salino y una sal seleccionada, en un diluyente acuoso. Independientemente de si es un vial de solución única un vial dual que

necesita reconstitución, puede reutilizarse múltiples veces y puede ser suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento para un paciente y de esa forma puede proporcionar un régimen de tratamiento más adecuado que los disponibles actualmente.

Los presentes articulas manufacturados que se reivindican son útiles para su administración en un periodo que varia desde el momento inmediato a veinticuatro horas o mas. En consecuencia, los articulas manufacturados que se reivindican ofrecen ventajas significativas para el paciente. Las formulaciones del invento podrian almacenarse de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2~ C hasta aproximadamente 40~ C y mantener la actividad biológica de la proteina durante largos periodos de tiempo, permitiendo etiquetar el paquete con una indicación de que la solución puede guardarse y/o usarse en un periodo de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o mas. Si se usa el diluyente conservado, dicha etiqueta puede incluir un uso hasta 1-12 meses, medio año, año y medio, y/o dos años.

Las soluciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 del invento pueden prepararse por medio de un proceso que incluye la mezcla de por lo menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se lleva a cabo usando procedimientos de disolución y mezcla convencionales. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de por lo menos un anticuerpo en agua o tampón en cantidades suficientes para proporcionar la proteina y, de forma opcional, un conservante o tampón a las concentraciones deseadas. Alguien que tenga un conocimiento normal de esta la materia reconoceria las va riaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a los que se prepara la formulación, son factores que pueden optimizarse para la concentración y vias de administración que se usen.

Los productos reivindicados pueden administrarse a pacientes en forma de soluciones claras o de viales duales que incluyen un vial de liofilizado por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. Independientemente de si es una solución única o un vial dual que necesita reconstitución, puede reutilizarse en múltiples ocasiones y puede ser suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples del tratamiento de un paciente, por lo que proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que los que se encuentran disponibles actualmente.

Los productos reivindicados pueden suministrarse a pacientes de forma indirecta, suministrando a farmacias, clínicas o otras instituciones e instalaciones similares, soluciones claras o viales duales que incluyen un vial de lioflizado de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. La solución clara en este caso puede ser de hasta un litro o incluso de mayor tamaño. proporcionando un gran reservorio a partir del cual se pueden recuperar porciones menores de por lo menos una solución de anticuerpo una o más veces para transferirlas a viales de menor tamaño y que la farmacia o clínica pueda suministrarlos a sus clientes y/o pacientes.

Los instrumentos reconocidos que incluyen sistemas de vial único incluyen instrumentos de lápiz inyector para la administración de una solución, lápices BO, BO Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humal ro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, Jtip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo, fabricados o desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Oiselronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products. Weston Medical (Peterborough, UK, www.westonmedical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com) y otros instrumentos similares. Los instrumentos reconocidos que incluyen un sistema vial dual incluyen los sistemas de lápiz inyector para reconstituir un medicamento liofilizado en un cartucho para la administración de la solución reconstituida, como el HumatroPen®. Entre los ejemplos de otros instrumentos adecuados se incluyen jeringuillas precargadas. autoinyectores, inyectores sin aguja y conjuntos de infusión IV sin aguja.

Los productos que se reivindican en el presente documento incluyen material de empaquetado. Este material proporciona, además de la información indicada por las agencias reguladoras, las afecciones con las que se puede usar el producto. El empaquetado del presente invento proporciona instrucciones al paciente para reconstituir el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solución y usar la solución en un período de 2-24 horas o mayor para el producto de dos viales, húmedo/seco. Para el vial único, producto en solución, la etiqueta indica que dicha solución puede usarse durante un período de 2-24 horas o mayor. Los productos que se reivindican en este documento son útiles para el uso farmacéutico en humanos del producto.

Las formulaciones del presente invento pueden prepararse por medio de un proceso que incluye la mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y un tampón seleccionado, preferiblemente. un tampón de fosfato que contenga salino O una sal seleccionada. La mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y el tamp6n en un diluyente acuoso se lleva a cabo usando disolución y procedimientos convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad med ida de por lo menos un anticuerpo en agua o tampón se combina con el agente tampón que se desee en agua en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y tampón en las concentraciones que se deseen. Alguien con un conocimiento normal de la materia reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a los que se prepara la formulación, son factores que se pueden optimizar para la concentración y medios de adm inistración que se hayan usado.

Las formulaciones estables o conservadas que se reivindican pueden suministrarse a los pacientes en forma de soluciones claras o viales duales que incluyen un vial de liofilizado de por lo menos un anlicuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene un conservante o tampón y excipientes en un diluyente acuoso. Ya sea un vial de solución única o un vial dual que necesite reconstitución puede reutilizarse en múltiples ocasiones y puede ser suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento de un paciente y por lo tanto proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que los disponibles actualmente.

Otras formulaciones o métodos para estabilizar el anticuerpo anti-IL-6 podrían tener como resultado solo una solución clara de polvo liofilizado que incluye el anticuerpo. Entre las soluciones no elaras están las formulaciones que incluyen suspensiones de partículas, dichas particulas serían una composición que contenga el anticuerpo antiIL-6 en una estructura de dimensión variable y conocida diversamente como microesfera, micropartícula, nanoparticula, nanoesfera o liposoma. Estas formulaciones de particulas relativamente homogéneas, esencialmente esféricas, que contienen un agente activo pueden formarse contactando una fase acuosa que contenga el agente activo y un polímero y una fase no-acuosa seguida de la evaporación de la fase no acuosa para causar la coalescencia de particulas a partir de la fase acuosa como se indica en la patente de EE. UU. nO 4.589.330. Las micropartículas porosas pueden prepararse usando una primera fase que contenga un agente activo y un polímero dispersado en un disolvente continuo y que retire dicho disolvente de la suspenSión por liofilización o diluciónextracción-precipitación como se indica en la patente de EE. UU. nO 4.818.542. Los polímeros que se prefieren para dichas preparaciones son copolímeros o polimeros naturales o sintéticos que se seleccionan a partir del grupo que consta de gelatina agar, almidón, arabinogalactano, albúmina, colágeno, ácido poliglicólico, poliácido láelico, glicólido-L(-) láctido poli(episilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido láctico), poli(epsilon-caprolactonaCO-ácido glicólico), poli(B-hidroxi ácido butirico), óxido polietileno, polietileno, poli(alquilo-2-cianoacrilato), poli(hidroxietilo metacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietilo DL-aspartamida), poli(éster urea), poli(L-fenilalanina/etileno glicolll,6-diisocianatohexano) y poli(metil metacrilato). Los polímeros que se prefieren son los poliésters, como el ácido poliglicólico, el ácido poliláctico, el glicólido-L(-) láctido poli(episilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido láctico) y poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido gliCÓlico. Los solventes útiles para disolver el polímero yfo el activo incluyen: agua, hexafluoroisopropanol, metilenocloruro, tetrahidrofurano, hexano, benceno o sesquihidrato de hexafluoroacetona. El proceso para dispersar la fase activa con una segunda fase podría implicar forzar la presión de dicha primera fase a través de un orificio en un pulverizado para afectar a la formación de gotas.

Las formulaciones en polvo seco podrían ser resultado de procesos diferentes de la liofilización, como secado por pulverización o extracción por solvente por evaporación o por precipitación de una composición cristalina seguida de un paso o más para relirar el solvente acuoso o no acuoso. La preparación de una preparación de anticuerpo por secado por pulverización se explica en la patente de los EE. UU. 6.019.968. Los compuestos de polvo seco basados en anticuerpos podrían producirse por soluciones de secado por pulverización o lodos del anticuerpo y, opcionalmente, excipientes, en un disolvente en enfermedades para proporcionar un polvo seco respirable. Los disolventes podrían incluir compuestos polares, como agua y etanol, que podrían secarse rápidamente. La estabilidad del anticuerpo podría mejorarse llevando a cabo el procedimiento de secado por pulverización en ausencia de oxígeno, como en una capa de nitrógeno o usando nitrógeno como gas secante. Otra formulación relativamente seca es una dispersión de un grupo de microestructuras perforadas en un medio de suspensión que normalmente comprenda un propulsor de hidrofluoroalcano como se explica en WO 9916419. Las dispersiones estabilizadas podrían administrarse al pulmón del paciente usando un inhalador dosificado. El equipo útil para la fabricación comercial de medicamentos secados por pulverización lo fabrica Buchi Ud. o Niro Corp.

Por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en las formulaciones estables o conservadas o en las soluciones que se describen en este documento pueden administrarse a un paciente de acuerdo con el presente invento a través de varios métodos de administración incluida inyección SC o 1M; transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótico, cartucho, microbomba u olros medios apreciados por los expertos en la materia y que son conocidos.

Aplicaciones terapéuticas

En este documento se presenta un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, por técnicas conocidas o como se ha descrito en este documento, usando por lo menos un anticuerpo IL-6 del presente invento, por ejemplo, administrando o contactando con la célula, tejido, órgano, animal, o paciente con una cantidad terapéutica efectiva de anticuerpo IL-6. También se presenta en este documento un método para modUlar O tratar por lo menos una enfermedad relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente que incluya, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: obesidad, enfermedad de tipo inmune, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa, enfermedad maligna o enfermedad neurológica.

En este documento también se presenta un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad inmune relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente incluidos, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, artritis

psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatia seronegativa, osteoartritis, osteolisis, aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, nefritis lúpica, sindrome antifosfolipido, iridociclitisfuveitisfneuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémicaf granulomatosis de wegener, sarcoidosis, orquitisfprocedimientos de inversión de vasectomia, enfermedades alérgicasfatópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica de contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, transplantes, rechado de transplante de órgano, enfermedad de injerto contra huésped, slndrome de respuesta inflamatoria sistémica, septicemia, sepsis de gram positivo, sepsis de gram negativo, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngico, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococcemia, traumafhemorragia, quemaduras, exposición a radiación ionizante, pancreatitis aguda, sindrome de dificultad respiratoria adulta, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologlas inflamatorias crónicas, sarcoidosis, enfermedad de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefritis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxis sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolltica, trombocitopenia, rechado de injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de transplante renal, rechazo de transplante de corazón, rechazo de transplante de hlgado, rechazo de transplante de páncreas, rechazo de transplante de pulmón, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de transplante de cartilago, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de transplante de paratiroides, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad anti-receptores, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynaud, diabetes tipo B resistente a insulina, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad tipo 111, sindrome POEMS (pOlineuropaUa, organomegalia, endocrinopatia, gamopaUa monoclonal y sindrome de cambios cutáneos), polineuropatia, organomegalia, endocrinopalia, gamopatia monoclonal, sindrome de cambios cutáneos, slndrome antifosfolipido, pénfigo, escleroderma, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitiligo, vasculitis, slndrome de cardiotomla post-MI, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis de hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granUlomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a medicamentos, metabólico/idiopático, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, déficit de alfa-1-antitripsina, retinopaUa diabética, tiroiditis de hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotálamo-pituitaria-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis qulstica, enfermedad pUlmonar crónica neonatal, enfermedad pUlmonar obstructiva crónica (COPO), linfohistiocitosis familiar hematofagocitica, afecciones dermatológicas, psoriasis, alopecia, slndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, fallo renal agudo, hemodiálisis, uremia, toxicidad, pre-eclampsia, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citoquina, quimioterapia, terapia de radiación (por ejemplo, se incluyen, entre otros, astenia, anemia, caquexia y similares), intoxicación crónica por salicilato y similares. Véase, por ejemplo, el Manual Merck, ediciones 128 _178 Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], Wells et al., eds., 23 ed., Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).

También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluidos, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: slndrome de aturdimiento cardiaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardIaca congestiva, embolia, derrame isquémico, hemorragia, slndrome coronario agudo, arteriosclerosis, aterosclerosis, restenosis, enfermedad arteriosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, sIncope, conmoción, slfilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardiaca, cor pulmonale, hipertensión pUlmonar primaria, arritmias cardIacas, latidos auriculares ectópicos, aleteo auricular, fibrilación auricular (sostenida o paroxlstica), slndrome post perfusión, respuesta inflamatoria a derivación cardiopulmonar, taquicardia auricular caótica o multifocal, taquicardia normal de QRS estrecho, arritmias especificas, fibrilación ventricular, arritmias del haz de His, bloqueo atrioventricular, bloqueo de rama, trastorno isquémico de miocardio, cardiopatia isquémica, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada congestiva, cardiomiopatia restrictiva, valvulopatia, endocarditis, enfermedad pericárdica, tumores cardiacos, aneurismas aórtico y periférico, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad arteriosclerótica periférica, tromboangeitis obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, fenómeno y slndrome de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fistua arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina inestable, lesión de isquemia, slndrome post bombeo, lesión de isquemia-reperfusión y similares. Dicho método podrla también comprender la administración de una cantidad eficaz de una composición or compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia .

También se presenta en este documento un métooo para mooular o tratar por lo menos una enfermedad infecciosa relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, entre otras, por lo menos una de las siguientes: infección bacteriana aguda o crónica, procesos infecciosos parasitarios agudo y crónico, incluidas las infecciones bacterianas, viricas y fúngicas, infección por VIHfneuropatla VIH, meningitis, hepatitis (por ejemplo, A, B

o C o similares), artritis séptica, peritonitis, neumonia, epiglotitis, e. coli 0157:h7, sindrome urémico hemoliticofpúrpura trombocitopénica trombolitica, mala ria, dengue hemorrágico, leishmaniosis, lepra, slndrome del shock tóxico, miositis por estreptococo, gangrena gaseosa, tuberculosis microbacteriana, mycobacterium avium intracellulare, neumonia pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitisfepididimitis, legionella,

enfermedad de Lyme, gripe A, virus de epstein-ba rr, sindrome hemafagocitico viral, encefalitis viral/meningitis aséptica y similares.

También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad maligna relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: leucemia, leucemia aguda, leucemia aguda linfoblástica (ALL), leucemia linfocitica aguda, B-célula, Tcélula o FAB ALL, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena aguda, leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocitica crónica (CLL), leucemia de células pilosas, síndrome mielodiplástico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma no-hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofarrngeo, histiocitosis maligna, sindrome paraneoplásticolhipercancemia maligna, tumores sólidos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer no poliposo hereditario, linfoma de Hodgkin, cáncer de higado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma de célula renal, cáncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, mela noma maligno, hemangioma, enfermedad metastática, resorción ósea relacionada con cáncer, dolor óseo relacionado con cáncer y similares.

También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad neurológica relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, induidas, entre otras, por lo menos una de las siguientes: enfermedades neurodegenerativas, esderosis múltiple, dolor de cabeza por migraña, complejo de demencia del SIDA, enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidal y cerebeloso, como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales; trastornos de movimientos hipercinéticos, como corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento inducidos por medicamentos, como los inducidos por medicamentos que bloquean los receptores de dopamina CNS; trastornos del movimiento hipocinético, como la enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares, como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine-Thomas, ShiDrager, y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia y trastorno mitocondrial multisistémico); trastornos de núcleo desmielinizante, como esclerosis múltiple, mielitis transversal aguda; y trastornos de la unidad motora, como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del hom anterior, como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; Sindrome de Down de mediana edad; síndrome de cuerpos de Lewy difusos; demencia senil de cuerpos de Lewy; sindrome Wemicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de CreutzfeldtJakob; panencefalitis esclerosante sUbaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz; demencia pugilistica; lesiones neurotraumáticas (por ejemplo, lesiones de médula espinal, lesión cerebral, conmoción cerebral, conmoción repetitiva); dolor; dolor inflamatorio; autismo; depresión; derrame cerebral; trastornos cognitivos; epilepsia y similares. Dicho método podria también incluir la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo TNF o porción especificada o variante de una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia. Véase, por ejemplo, el Manual Merck, 16a ed., Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

También se presenta un método para modular o tratar por lo menos una herida, trauma o lesión en un tejido u otra afección crónica relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluidos, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: lesión corporal o trauma asociado con cirugia oral incluida cirugía periodontal, extracciónfes denta ria(s), tratamiento de endodoncia, inserción de implantes dentales, aplicación y uso de prótesis dentarias; o donde la herida se seleccione a partir del grupo que consta de: heridas asépticas, heridas por contusión, heridas por incisión, heridas por laceración, heridas no penetrantes, heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas por pinchazo, heridas con sepsis, infartos y heridas subcutáneas; o donde la herida se seleccione a partir del grupo que consta de: úlceras isquémicas, úlceras por presión, fístulas, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas de sitio donante; o donde la herida sea una herida aftosa, una herida traumática o una herida asociada con herpes.

Las heridas yfo úlceras normalmente se encuentran salientes de la piel o en una superficie mucosa o como resultado de un infarto en un órgano ("derrame"). Una herida podría ser resultado de un defecto de tejido blando o una lesión o una afección subyacente. En el presente contexto, el término ~piel" hace referencia a la superficie exterior del cuerpo de un animal, incluidos humanos, y abarca piel intacta o casi intacta asi como superficie cutánea lesionada. El término -mucosa" hace referencia a mucosa lo intacta o dañada de un animal, como un humano, y podria ser mucosa oral, bucal, auditivo, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal o rectal.

En el presente conlexto el término "herida" denota una lesión corporal con interrupción de la integ ridad normal de las

estructuras del tejido. El término también pretende abarcar el término ~lIaga", ~lesi6n", ~necrosis" y ~úlcera".

Normalmente, el término -llaga" es una palabra popular para casi cualquier lesión de la piel o membranas mucosas y el término -úlcera" es un defecto local o excavación de la superficie de un órgano o tej ido, que se produce por el desprendimiento de tejido necrÓtico. Lesión generalmente hace referencia a cualquier defecto de un tejido. Necrosis hace referencia a tejido muerto resultante de una infección, lesión, inflamación o infartos.

El término -herida" usado en este contexto se refiere a cualquier herida (ver más adelante una clasificación de las heridas) a cualquier estadio concreto del proceso de cura, incluido el estadio antes de que se haya iniciado cualquier cura o incluso antes de que se realice una herida específica como una incisión quirúrgica (tratamiento profiláctico). Entre los ejemplos de heridas que se pueden evitar ylo tratar se encuentran, por ejemplo, heridas asépticas, heridas por contusión, heridas por incisión, heridas por laceración, heridas no penetrantes (por ejemplo, heridas en las que no hay una alteración de la piel pero hay una lesión en estructuras subyacentes), heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas de punción, heridas de sepsis, heridas subcutáneas, etc. Entre los ejemplos de llagas se encuentran las llagas por presión, aftas, llagas de cromo, llagas frías, llagas de presión, etc. Entre los ejemplos de úlceras se encuentran, por ejemplo, la úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera isquémica hipertensiva, úlcera por estasis, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical y úlceras venéreas, por ejemplo, provocadas por gonorrea (incluida uretritis, endocervicitis y proctitis). Las afecciones relacionadas con heridas o llagas que podrían tratarse con éxito son: quemaduras, ántrax, tétanos, gangrena gaseosa, escarlatina, erisipela, sycosis barbae, foliculitis, impetigo contagiosa o impetigo bullosa, etc. Con frecuencia hay un cierto solapamiento en el uso de los términos "herida" y "úlcera" y -herida" y -llaga" y, además con frecuencia los términos se usan aleatoriamente. Por lo tanto, como se ha mencionado, en el presente contexto el término ~herida" incluye los términos "úlcera", "lesión", "llaga" e -infarto," y los términos se usan indistintamente a no ser que se indique lo contrario.

Los tipos de heridas que se van a tratar incluyen también (i) heridas generales, como por ejemplo, heridas quirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquémicas, térmicas, quimicas y ampollosas; (ii) heridas especificas de la cavidad oral, como por ejemplo, heridas post-extracción, heridas endodóncicas, especialmente en conexión con tratamiento de quistes y abscesos, úlceras y lesiones de origen bacteriano, virico o autoinmune, heridas mecánicas, químicas, termales, infecciosas y liquenoides; herpes ulceroso, estomatitis aftosa, gingivites ulcerosa necrotizante aguda y síndrome de boca ardiente son ejemplos específicos; y (iii) heridas en la piel, como por ejemplo, neoplasma, quemaduras (por ejemplo, químicas, termales), lesiones (bacteriana, vírica, autoinmune), mordeduras e incisiones quirúrgicas. Otra forma de clasificación de las heridas es: (i) pequeñas pérdidas de tejido debidas a incisiones quirúrgicas, abrasiones menores y mordeduras menores, o (ii) pérdidas significativas de tejido. El último grupo incluye úlceras isquémicas, llagas de presión, fistulas, laceraciones, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas del área donante (en tejidos blandos y duros) e infartos.

Otras heridas importantes son las heridas como las úlceras isquémicas, llagas de presión, fístulas, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas del área donante. Las úlceras isquémicas y llagas de presión son heridas que normalmente solo se curan muy lentamente y especialmente en dichos casos un proceso de cura mejorado y más rápido es sin duda de gran importancia para el paciente. Además, los costes que implica el tratamiento de pacientes que sufren esos tipos de heridas se reducen notablemente cuando se mejora la cu ra y se realiza de más rápidamente.

Las heridas del área donante son heridas que, por ejemplo, se producen en conexión con la retirada de tejido duro de una parte del cuerpo a otra parte del cuerpo, por ejemplo, en conexión con un transplante. Las heridas resultantes de esas operaciones son muy dolorosas y por lo tanto una mejora en la cura es muy valiosa. El término ~piel" se usa en un sentido muy amplio e incluye la capa epidérmica de la piel y -en los casos en los que la superficie de la piel esta dañada en mayor o menor medida -también la capa dérmica de la piel. Aparte del stratum comeum, la capa epidérmica de la piel es la capa exterior (epitelial) y la capa de tejido conectivo más profunda de la piel se denomina dermis.

También se presenta aquí un método para modular o tratar osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, nefritis lúpica, diabetes mellitus tipo 11 y trastorno pulmonar obstructivo crónico, entre las otras enfermedades indicadas anteriormente como relacionadas con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente incluidos, entre otros, por lo menos una enfermedad tipo inmune, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa, maligna ylo neurológica. Dicho método paclria incluir la administración de una cantidad eficaz de por lo menos una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia.

Cualquiera de los métodos presentados en este documento puede incluir la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método podría también comprender la coadministración o terapia de combinación para tratar dichas enfermedades o trastornos, donde la administración de dicho por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, porción especifica o variante de los mismos, también incluye la administración, previa, simultáneamente ylo posterior, de por lo menos uno de los siguientes por lo menos un antagonista TNF (por ejemplo, entre otros, un químico TNF o antagonista proteico, monoclonal TNF o anticuerpo

o fragmento policlonal, un receptor TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o pa5) o fragmento, polipéptidos de fusión de los mismos, o un antagonista TNF de molécula pequeña, por ejemplo, proteína de unión TNF I o 11 (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept (EnbreITld) , adalimulab (Humira""), CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept y similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofín, aurotioglucosa, azatioprina, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), relajante muscular, narcótico, medicamento

antiinflamatorio no esteroideo (AINEs), analgésico, anestésico, sedante, anestésico local, bloqueante neuromuscular, antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, antifúngico, antiparasitario, antivirico, carbapenem, cefalosporina, flurorquinolona, macrólido, penicilina, sulfonamida, tetraciclina, otro antimicrobiano), antipsoriásico, corticosteriode, esteroide anabólico, agente diabético, mineral, nutricional, agente tiroideo, vitamina, hormona relacionada con el calcio, antidiarreico, antitusivo, antiemético, antiulceroso, laxante, anticoagulante, eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukine), inmunización, inmunoglobulina, inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), hormona de crecimiento, medicamento sustitutivo hormonal, modulador de los receptores de estrógeno, midriático, ciclopégico, agente alquilante, antimetabolito, inhibidor mitócico, radiofarmacéutico, antidepresivo, agente antimaniaco, antipsicótico, ansiolitico, hipnótico, simpaticomimético, estimulante, donepezil, tacrina, medicación de asma, agnista beta, esteroide inhalado, inhibidor de leucotrieno, metiloxantina, cromolina, epinefrina o similar, domasa alfa (Pulmozyme), citoquina o antagonista de citoquina. Las dosis adecuadas son conocidas. Véase, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], 28 edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000 [Farmacopea de bolsillo de Tarascón, 2000], edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs [Manual de medicamentos], 21' ed., Springhouse Corp ., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001 [Guia de medicamentos para profesionales de la salud, 2001], ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ.

Los antagonistas TNF adecuados para composiciones, terapia combinada, coadministración, y/o instrumentos del presente invento (que también comprende por lo menos un anticuerpo, porción especificada y variante de los mismos del presente invento), incluyen, entre otros, anticuerpos anti-TNF (por ejemplo, por lo menos un antagonista TNF como se ha definido), fragmentos de unión de antígeno de los mismos, y moléculas receptoras que se unen especificamente a TNF; compuestos que evitan y/o inhiben la sintesis de TNF, la liberación de TNF o su acción sobre células objetivo, como as talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxiflina y rolipram), agonistas de receptor de adenosina A2b y mejoradores de receptores de adenosina A2b; compuestos que evitan y/o inhiben señalización de receptores TNF, como inhibidores de cinasa por proteína activada por mitógeno (MAP); compuestos que bloquean yfo inhiben la división de membrana TNF, como inhibidores de metaloproteinasa; compuestos que bloquean yfo inhiben la actividad de TNF, como inhibidores de la enzima de conversión de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o la síntesis de TNF, como inhibidores de cinasa MAP.

Tal y como se usan en este documento, un " anticuerpo de factor de necrosis tumoral", "anticuerpo TNF", "anticuerpo TNFa", o fragmento o similar disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la actividad de TNFa in vitro, in situ y/o, preferiblemente, in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo humano TNF adecuado puede unir TNFa e incluye anticuerpos anti-TNF, fragmentos de unión de antígeno de los mismos y mutantes especificados o secto res de los mismos que se unen especifica mente a TNFa. Un anticuerpo o fragmento TNF adecuado también puede disminuir, bloquear, anular, interierir, evitar y/o inhibir TNF ARN, ADN o sintesis de proteinas, liberación de TNF, señalización de rece ptor TNF, división de membrana TNF, actividad TNF, producción TNF y/o síntesis.

Un ejemplo de un anticuerpo o antagonista TNF es el anticuerpo quimérico cA2. En este ámbito se han descrito otros ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-TNF que se pueden usar (véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. nO 5.231.024; Móller, A. et al., Citoquina 2(3): 162-169 (1990); solicitud de los EE. UU. N° 07/943.852 (emitida el 11 de septiembre de 1992); Rathjen et al., publicación internacional nO WO 91 /02078 (publicada el 21 de febrero de 1991); Rubin et al, publicación de patente europea nO O 218 868 (publicada el 22 de abril de 1987); Yone et al., patente europea nO O 288 088 (26 de octubre de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); y Hirai, el al ., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).

Moléculas receptoras TNF

Las moléculas receptores TNF útiles que se prefieren son las que unen TNFa con alto nivel de afinidad (véase, por ejemplo, Feldmann et al., publicación internacional nO WO 92/07076 (publicada el 30 de abril de 1992); Schalt et al., Cell [Célula] 67:361-370 (1990); y Loetscher et al., Cell [Célula] 67:351-359 (1990» y podrían poseer un bajo nivel de inmunogenicidad. En concreto, los receptores de superficie celular de TNF 55 kDa (p55 TNF-R) Yel 75 kDa (p75 TNF-R) son útiles. Las formas truncadas de esos receptores, que incluye los dominios extracelulares (ECD) de los receptores o porciones funcionales de los mismos (véase, por ejemplo, Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831840 (1994)), también son útiles. Las formas truncadas de los receptores TNF, que induye ECD, se han detectado en orina y suero como proteinas inhibitorias de unión 30 kDa y 40 kDa TNFa (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990». Las moléculas mulliméricas de receptor TNF y las moléculas de fusión de inmunoreceptor TNF y derivados y fragmentos °porciones de los mismos son otros ejemplos de moléculas receptoras de TNF que son útiles en los métodos y compuestos que se presentan aquí.

Las moléculas multiméricas receptoras de TNF incluyen todas o una porción funcional del ECD de dos o más receptores de TNF unidos por medio de un vinculador polipéptido o más u otros vinculadores no péptidos, como el polietilenglicol (PEG). Un ejemplo de dicha molécula de fusión de inmunoreceptor TNF es la proteina de fusión de

receptor TNFlfusión de IgG. Las molécula de fusión de inmunoreceptor TNF y los métodos para su producción se han descrito anterionnente (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 58:10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :215-219 (1994); Butler et al., Citoquina d(6):616-623 (1994); 8aker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., patente de los EE. UU. nO 5.447.851; y solicitud de los EE. UU. nO 081442.133 (emitida el 16 de mayo de 1995»). También se pueden encontrar métodos para la producción de moléculas de fusión de inmunoreceptores en Capon et al., patente de los EE. UU. nO 5.116.964; Capon et al., patente de los EE. UU. nO

5.225.538; y Capon et al., Nature 337:525-531 (1989).

Las citoquinas incluyen cualquier citoquina conocida. Véase, por ejemplo, CopewithCitoquinas.com. Los antagonistas de citoquinas incluyen, entre otros, cualquier anticuerpo, fragmento o mimético, cualquier receptor soluble, fragmento o mimético, cualquier antagonista de pequeña molécula o cualquier combinación de los mismos.

Tratamientos terapéuticos

Cualquier método presentado en este documento puede incluir un método para tratar un trastorno mediado por IL-6, que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método podría incluir también la co-administración o terapia combinada para tratar dichas enfermedades o trastornos, donde la administración de dicho por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, porción especificada o variante de los mismos, también incluye la administración antes, durante y/o después, de por lo menos uno de los siguientes: un medicamento antiinfeccioso, un medicamento de sistema cardiovascular (CV), un medicamento del sistema nervioso central (CNS), un medicamento del sistema nervioso autónomo (ANS), un medicamento del tracto respiratorio, un medicamento del tracto gastrointestinal (GI), un medicamento hormonal, un medicamento para el equilibrio de fluido o electrolito, un medicamento hematológico, un antineoplásico, un medicamento de inmunomodulación, un oftálmico, ótico o nasal, un medicamento tópico, un medicamento nutricional

o similares, por lo menos un antagonista TNF (por ejemplo, entre otros, un anticuerpo o fragmento TNF, un receptor soluble TNF o fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista de molécula pequeña de TNF), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), relajante muscular, narcótico, medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINEs), analgésico, anestésico, sedante, anestésico local, bloqueante neuromuscular, antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, antifúngico, antiparasitario, antivirico, carbapenem, cefalosporina, flurorquinolona, macrólido, penicilina, sulfonamida, tetraciclina, otro antimicrobiano), antipsoriásico, corticosteriode, esteroide anabólico, agente diabético, agente mineral, nutricional, tiroideo, vitamina, hormona relacionada con el calcio, antidiarreico, antitusivo, antiemético, antiulceroso, laxante, anticoagulante, eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukine), inmunización, inmunoglobulina, inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), honnona del crecimiento, medicamento honnonal sustitutivo, modulador de receptores de estrógeno, midriático, cicloplégico, agente alquilante, antimetabolito, inhibidor mitótico, radiofarmacéutico, antidepresivo, agente anti maniaco, antipsicótico, ansiolítico, hipnótico, simpatomimético, estimulante, donepezil, tacrina, medicación para asma, agonista beta, esteroide inhalado, inhibidor de leucotriena, metilxantina, cromolina, epinefrina o similares, alfa domasa (Pulmozyme), una citoquina o antagonista de citoquina. Dichos medicamentos son bien conocidos en este ámbito. incluidas sus fonnulaciones, indicaciones, dosificación y administración para cada uno de los presentados {véase. por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs (Manual de medicamentos para enfennería, 2001j, 21 3 ed., Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001 ; Health Professional's Drug Guide 2001 (Gura de medicamentos para profesionales de la salud, 2001j, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmacotherapy Handbook (Manual de fannacoterapiaj, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT).

Normalmente, el tratamiento de afecciones patológicas se efectúa administrando una cantidad o dosis eficaz de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 de un total, como media. que cubra un rango de aproximadamente 0,01 a 500 miligramos de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por kilogramo de paciente por dosis, y, preferiblemente, desde por lo menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramos anticuerpo/kilogramo de paciente por administración única o múltiple, dependiendo de la actividad específica del agente activo que contenga la composición. De fonna alternativa, la concentración de suero efectivo puede incluir una concentración de suero de 0,1-5000 ¡..Iglml por administración única o múltiple. Los facultativos médicos conocen las dosis adecuadas que dependerán, sin duda, del estado concreto de la enfermedad, de la actividad especifica de la composición que se administra y del paciente concreto que esté a tratamiento. En algunos casos, para obtener la cantidad terapéutica que se desea puede ser necesaria una administración repetida, administraciones individuales repetidas de una dosis concreta medida o monitorizada, donde las administraciones individuales se repitan hasta que se consiga la dosis diaria o el efecto deseado.

Las dosis que se prefieren podrian incluir aproximadamente 0,1-99 yfo 100-500 mg/kg/administración, o cualquier rango, valor o fracción de los mismos, o obtener una concentración de suero de aproximadamente una concentración de suero de 0,1 -5000 ¡..Ig/ml por administración única o múltiple, o cualquier rango, valor o fracción de los mismos. El rango de dosificación preferible para el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento va entre

aproximadamente 1 mgfkg hasta aproximadamente 3, aproximadamente 6 o aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal del paciente.

De forma altemativa, la dosis administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, como las caracteristicas farmacodinámicas del agente concreto y su via y ruta de administración; edad, estado y peso del recipiente; naturaleza y alcance de los sintomas, tipo de tratamiento simultáneo, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Normalmente, una dosificación de ingrediente activo puede ser de aproximadamente entre 0,1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente 0,1 a SO, y preferiblemente de 0,1 a 10 miligramos por kilogramo por administración o en forma de liberación sostenida será eficaz para obtener los resultados deseados. Únicamente a modo de ejemplo (no limitativo), el tratamiento de humanos o animales puede suministrarse en dosificación única o periódica de por lo menos un anticuerpo del presente invento de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg o cualquier rango, valor o fracción de los mismos al dia, por lo menos uno de los días del 1-40, o de forma alternativa o adicional, por lo menos una de las semanas de la 1 -52, o de forma alternativa o adicional, por lo menos uno de los años 1-20, o cualquier combinación de los mismos, usando dosificación única, infusión o dosis repetidas.

Las formas de dosificación (composición) adecuadas para la admin istración interna normalmente contienen desde aproximadamente 0,001 miligramos hasta aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o recipiente. En esos compuestos farmacéuticos el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,5-99,999 % por peso en base al peso total de la composición.

Para administración parenteral, el anticuerpo puede formularse en forma de solución, suspensión, emulsión, particula, polvo o polvo liofilizado en asociación, o administrado separadamente, con un vehiculo parenteral aceptable farmacéutica mente. Entre los ejemplos de dichos vehiculos se encuentra el agua, salino, solución de Ringer, solución de dextrosa y aproximadamente 1-10 % de albúmina de suero humano. También se pueden usar liposomas y vehiculos no acuosos. El vehiculo o polvo liofilizado puede contener aditivos adicionales que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza por medio de técnicas conocidas o adecuadas.

Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences [Ciencia farmacéutica de Remington], A. Osol, texto estándar de referencia en este ámbito.

Vías alternativas de administración

Hay muchos modos conocidos y desarrollados de administración de cantidades eficaces farmacéuticamente de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 de acuerdo con el presente invento. Mientras la admin istración pulmonar se usa en la siguiente descripción, se podrian usar otras vias de administración con resultados adecuados. Los anticuerpos IL6 del presente invento pueden administrarse en un portador, en forma de solución, emulsión, coloide o suspenSión o en forma de polvo seco, usando cualquiera de varios instrumentos y métodos adecuados para la administración por inhalación u otros modos descritos en este documento o conocidos.

Formulaciones y administración parenteral

Las formulaciones por administración parenteral pueden contener como excipientes habituales agua estéril o salino, glicoles de polialquileno, como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las suspensiones acuosas o aceitosas para su inyección pueden prepararse usando un emulsificador o humidificador adecuado y un agente de suspenSión, de acuerdo con métodos conocidos. Los agentes para inyección pueden ser un agente diluyente no tóxico, no administrable oralmente, como solución acuosa, solución inyectable estéril o suspensión en un disolvente. Como vehiculo utilizable o disolvente, se permiten agua, solución de Ringer, salino isotónico, etc.; como disolvente normal o en suspensión puede usarse aceite estéril no volátil. Para estos fines, puede usarse cualquier tipo de aceite no volátil y ácido graso, incluidos aceites grasos naturales o sintéticos o semisintéticos o ácidos grasos; mono-o di-o tri-glicéridos naturales o sintéticos. La administración parental es una técnica conocida e incluye, entre otros, medios convencionales de inyección, un instrumento de inyección sin aguja a presión de gas como se describe en la patente de los EE. UU. nO 5.851.198, y un instrumento perforador láser como el descrito en la patente de los EE. UU. nO 5.839.446.

Administración alternativa

También se presenta en este documento la administración de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por via parenteral, cubcuténea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardiana, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica. Por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 puede prepararse para usarla en administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otro tipo de administración, concretamente en forma de soluciones o

suspensiones líquidas; para su uso en administración vaginal o rectal, concretamente en formas semisólidas, como, entre otras, cremas y supositorios; para administración bucal o sublingual, como, entre otros, en forma de tabletas o cápsulas; o intranasalmente, como, entre otras, la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o agentes concretos;

o transdérmicamente, como, entre otros, un sistema de administración en gel, pomada, loción, suspensión o por parche con mejoras químicas, como dimetilsulfóxido para modificar la estructura cutánea o aumentar la concentración de medicamentos en el parche transdérmico {Junginger, et al. In "Drug Permeation Improvement" ["Mejora de la permeabilidad de los medicamentosl Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), o con agentes oxidizantes que permiten la aplicación sobre la piel de formulaciones que contienen péptidos (WO 98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear vías de transporte transitorias, como electroporación, o para aumentar la movilidad de medicamentos cargados a través de la piel, como iontoforesis, o aplicación de ultrasonidos, como sonoforesis (patentes de los EE. UU. nO 4.309.989 y 4.767.402).

Administración pulmonar/nasal

Para la administración pulmonar, preferiblemente, por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 se administra en tamaño de partículas eficaz para alcanzar las vías aéreas bajas del pulmón o senos. De acuerdo con el invento, por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 podría administrarse por cualquiera de varios instrumentos de inhalación o nasales conocidos para la administración de un agente terapéutico por inhalación. Estos instrumentos capaces de depositar formulaciones de depósito por aerosol en la cavidad nasal o los alveolos de un paciente incluyen inhaladores dosificados, nebulizadores, generadores de polvo seco, pulverizadores y similares. También son conocidos otros instrumentos adecuados para dirigir la administración pUlmonar o nasal de anticuerpos. Todos dichos instrumentos pueden usar formulaciones adecuadas para la administración de anticuerpos en un aerosol. Dichos aerosoles pueden comprender soluciones (acuosas y no acuosas) o particulas sólidas.

Los dosificadores como el inhalador dosificado Ventolin® normalmente usan un gas propulsor y necesitan que se los accione durante la inspiración (véase, por ejemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros™ inhaler (Dura), comercializados por Inhale Therapeutics, y el inhalador en polvo Spinhaler® (Fisons), funcionan por el accionamiento por la respiración de un polvo mezclado (EE. UU. 4668218 Astra, patente europea 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, EE. UU. 5458135 Inhale, WO 94106498 Fisons). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, Ultravent® (MaUinckrodt) y Acorn II® (Marquest Medical Products) (EE. UU. 5404871 Aradigm, WO 97/22376), producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores dosificados, inhaladores en polvo seco, etc. Generan aerosoles de pequeñas partículas. Preferiblemente, una composición que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 se administra por medio de un inhalador de polvo seco o pulverizador. Un instrumento de inhalación para la administración de por lo menos un anticuerpo del presente invento tiene varias características que lo hacen preferible. Por ejemplo, la administración por medio de un instrumento de inhalación es fiable, reproducible y exacta, lo que resulla una ventaja. El inhalador podría también administrar pequeñas partículas secas, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 IJm, preferiblemente aproximadamente 1-51Jm, para una buena respirabilidad .

Administración de composiciones de anticuerpo Il-6 en forma de aerosol

Un aerosol que incluya una composición de anticuerpo IL-6 puede producirse forzando una suspenSión o solución de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a través de un pulverizador a presión. El tamaño y la configuración del pulverizador, la presión aplicada y la cantidad de administración de liquido puede elegirse para conseguir la salida y el tamaño de partículas que se desee. Se puede producir un electrospray, por ejemplo, por medio de un campo eléctrico en conexión con una capilarización o pulverizador. Las particulas de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 administradas por aerosol tienen un tamaño de partículas menor de aproximadamente 10 IJm, preferiblemente, en el rango entre 1 IJm y aproximadamente 5 IJm, y todavia mejor entre 2 IJm y aproximadamente 3 IJm, lo que resulla una ventaja.

Las formulaciones de por lo menos una composición de anticuerpo anti-ll-6 adecuadas para su uso con atomizador normalmente incluyen composiciones de anticuerpo en solución acuosa a una concentración de aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 100 mg de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 por mi de solución de mg/gm, o cualquier rango, valor o fracción de los mismos. La formulación puede incluir agentes corno un excipiente, un tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensoactivo, y preferiblemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o agente para la estabilización de la composición del anticuerpo, como un tampón, un agente reductor, una proteina a granel o un carbohidrato. Las proteinas a granel útiles a la hora de formular composiciones de anticuerpo incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos habituales que son útiles a la hora de formular composiciones de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La formulación de composición de anticuerpos también puede incluir un tensoactivo, que puede reducir o evitar la agregación inducida por la superficie de la composición del anticuerpo provocada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Se pueden usar varios tensoactivos convencionales, como ésteres ya!coles de polioxietileno de ácido graso y ésteres de polioxietileno de sorbitol de ácido graso. Las cantidades generalmente variarán en un rango de entre 0,001 y 14 % por el peso de la formulación. Los tensoactivos que se prefieren para el objeto de este invento son el monooleato de sorbitán polioxietilenado, polisosrbato 80, polisorbato 20 y similares.

También se pueden incluir en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína, como anticuerpos IL-6, o porciones o variantes especificadas.

Administración de composiciones de anticuerpo Il-6 por nebulizador

Las composiciones de anticuerpo del invento pueden administrarse por un nebulizador, como un nebulizador de chorro o ultrasónico. Normalmente, en un nebulizador de chorro, se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire a alta velocidad a través de un orificio. Al expandirse el gas pasada la boquilla, se crea un área de baja presión, que lanza una solución de composición de anticuerpo a través de un tubo capilar conectado a un reservorio liquido. El caudal liquido del tupo capilar se corta en filamentos y gotas inestables al salir del tubo, creando el aerosol. Se puede usar una gran variedad de configuraciones, tasas de flujo y tipos de deflector para conseguir las caracteristicas de funcionamiento que se deseen a partir de un determinado nebulizador de chorro. En un nebulizador ultrasónico, se usa energia eléctrica de alta frecuencia para crear energía mecanica de vibración, normalmente usando un transductor piezoeléctrico. Esta energía se transmite a la formulación de la composición del anticuerpo directamente o a través de un fluido acoplante, creando un aerosol que incluye la composición del anticuerpo. Las particulas de la composición de anticuerpo administradas por un nebulizador tienen un tamaño de particula menor de aproximadamente 10 IJm, preferiblemente en el rango de aproximadamente 1 IJm a aproximadamente 51Jm, y todavia más preferible, entre 2IJm y aproximadamente 31Jm.

Las formulaciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 adecuado para su uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, normalmente incluyen una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de por lo menos un anticuerpo de proteina anti-IL-6 por mi de solución. La formulación puede incluir agentes como un excipiente, un tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensoactivo, y preferiblemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o agente de estabilización de por lo menos un anticuerpo de composición anti-IL-6, como un tampón, agente reductor, una proteina a granel o un carbohidrato. Las proteinas a granel útiles en la formulación de por lo menos un anticuerpo de composiciones anti-IL-6 incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos habitualmente útiles en la formulación de por lo menos un anticuerpo antiIL-6 incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La por lo menos una formulación de anticuerpo anti-IL-6 también puede incluir un tensoactivo, que puede reducir o evitar la agregación inducida por la superficie de lo menos un anticuerpo anti-IL-6 causada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Pueden usarse varios tensoactivos convencionales, como ésteres de ácido graso de polioexietileno y alcoholes, y ésteres de ácido graso sorbital de polioxietileno. Las cantidades generalmente estaran en un rango de entre 0,001 y 4 % por peso de la formulación. Los tensoactivos que se prefieren para el objeto de este son: monooleato de sorbitán de polioxietileno, polisorbato 80, polisorbato 20 o similares. También pueden incluirse en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína, como proteina de anticuerpo.

Administración de composiciones de anticuerpo IL-6 por inhalador dosificado

En un inhalador dosificado (MOl), un propulsor, por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y cualquier excipiente u otro aditivo se ubican en un depósito como mezcla incluyendo un gas comprimido licuado. La actuación de la válvula dosificadora libera la mezcla en forma de aerosol, preferiblemente con partículas en el rango de menos de unos 10 IJm, preferiblemente entre aproximadamente 1 IJm hasta unos 5 IJm, y más preferible, aproximadamente 2 IJm hasta unos 3 IJm. El tamaño de particulas del aerosol que se desee puede obtenerse usando una formulación de composición de anticuerpo producida por varios métodos conocidos por los expertos en la materia, incluidos molienda de chorro, secado por pulverización, condensación de punto crítico o similares. Entre los inhaladores dosificados se incluyen los fabricados por 3M o Glaxo que usen un propulsor de hidrofluorocarbono. Las formulaciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 para su uso can un instrumento inhalador o dosificado generalmente incluirán un polvo fino que contenga por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propulsor con la ayuda de un tensoactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional utilizado para este objeto, como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarbono, incluido triclorofluorometano, diclorofifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1 ,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluroalcano-227) o similares. Preferiblemente, el propulsor será un hidrofluorocarbono. El tensoactivo puede elegirse para estabilizar el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como suspensión en el propulsor, para proteger el agente activo contra la degradación química y similares. Entre los tensoactivos adecuados se incluye el trioleato de sorbitán, lecitina de soja, ácido oleioo

o similares. En algunos casos, se prefieren los aerosoles de solución que usan solventes, como el etanol. También se pueden incluir en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína. Alguien que tenga un conocimiento general en esta área reconocerá que los métodos presentados en este documento pueden conseguirse por medio de la administración pulmonar de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 por medio de instrumentos que no están descritos aquí.

Formulaciones y administración oral

Las formulaciones para la administración oral se basan en la coadministración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y tensoactivos noiónicos, como éter oleico de polioxietileno y éter n-hexadecilpolietileno) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, asi oomo la ca-administración de inhibidores enzimaticos

(por ejemplo, inhibidores de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (OFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. Las formulaciones para la administración de agentes hidrofilicos, incluidas proternas y anticuerpos y una combinación de por lo menos dos tensoactivos destinados a administración oral, bucal, mucosal, nasal, pulmonar, de la transmembrana vaginal o rectal se explican en la patente de los EE. UU. nO 6.309.663. El compuesto constituyente activo de la forma de dosificación de tipo sólido para administración oral puede mezclarse con por lo menos un aditivo, que incluye sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, mallitol, dextrano, almidón, agar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arábiga, gelatina, colágeno, caserna, albúmina, polímero sintético o semisintético y glicérido. Estas forma de dosificación también pueden contener otros tipos de aditivos, por ejemplo, agente de dilución inactivo, lubricante, como estearato de magnesio, parabeno, agente conservante, como ácido sórbico, ácido ascórbico, .alfa.-tocoferol, antioxidante como cisterna, desintegrador, aglutinante, espesante, agente tamponador, agente edulcorante, agente saborizante, agente perfumante, etc.

Los comprimidos y pastillas también se pueden procesar en preparaciones con cubierta protectora. Entre las preparaciones líquidas para su administración oral se incluyen: preparados en emulsión, sirope, elixir, suspensión y solución aceptables para uso médico. Estos preparados pueden contener agentes de dilución inactivos que se usan normalmente en dicho ámbito, por ejemplo, agua. Los liposomas también se han descrito como sistemas de administración de medicamentos para insulina y heparina (patente de los EE. UU. nO 4.239.754). Más recientemente se han usado microesferas de polímeros artificiales de aminoácidos mezclados (proteinoides) para administrar productos farmacéuticos (patente de los EE. UU. nO 4.925.673). Además, los compuestos portadores descritos en la Patente de los EE. UU. nO 5.879.681 y la patente de los EE. UU. nO 5.5.871.753 que se usan para administrar agentes biológicamente activos de forma oral son conocidos en este ámbito.

Formulaciones y ad ministración de la mucosa

Una formulación para la administración oral de un agente bioactivo encapsulado en un excipiente o más de polímeros biocompatibles o copolimero, un polímero biodegradable o copolimero, que proporciona microcáptulas que debido al tamano adecuado de las microcápsulas resultantes tiene como resultado que el agente alcanza y es tomado por el folliculi Iymphatic aggregati, conocido también como "placa de Peyer" o RGAL T" del animal sin pérdida de efectividad debido a que el agente ha pasado a través del tracto gastrointestinal. Se pueden encontrar folliculi Iymphatic aggregati similares en los tubos branquiales (BAL T) Y el intestino grueso. Los tejidos anteriormente descritos se denominan generalmente tejidos linforeticulares asociados a la mucosa (MAL T). Para la absorción a través de superficies mucosas, composiciones y métodos de administración por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 incluye una emulsión que incluye un grupo de partrculas de submicrón, una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo y una fase acuosa continua, que promueve la absorción a través de las superficies mucosas consiguiendo la mucoadhesión de las partículas de la emulsión (Patente de los EE. UU. nO 5.514.670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones del presente invento pueden incluir rutas de administración comeal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para administración vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquileneglicoles, vaselina, manteca de cacao y similares. Las formulaciones para administración intranasal pueden ser sólidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas o aceitosas de gotas nasales. Para la administración bucal, los excipientes incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidón pregelinatinado y similares (Patente de los EE. UU. nO 5.849.695).

Formulaciones y adminístración transdérmica

Para su admi nistración transdérmica, el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 se encapsula en un instrumento para su administración, como un liposoma o nanoparticulas poliméricas, microparticulas, microcápsulas o microesferas (denominadas globalmente micropartrculas, a no ser que se indique lo contrario). Se conocen varios instrumentos adecuados, incluidas micropartículas a base de polímeros sintéticos, como ácidos de polihidroxi, como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos, poliortoésteres, polianhídridos y polifosfacenos y polímeros naturales, como colágeno, poliaminoácidos, albúmina y otras proteínas, alginato y otros polisacáridos y combinaciones de los mismos (patente de los EE. UU. nO 5.814.599).

Formulaciones y administración prolongada

Podría ser preferible administra r los compuestos del presente invento al sujeto en períodos de tiempo prolongado, por ejemplo, durante períodos de una semana a un año a partir de una única administración. Pueden usarse varias formas de dosificación de liberación lenta, por depósito o por implante. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica aceptable farmacéuticamente de los compuestos que tiene un nivel bajo de solubilidad en los fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adición ácida con un ácido polibásico, como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos mono

o di-sulfónicos de naftaleno, ácido poligalaturónico y similares; (b) una sal con un catión de metal polivalente, como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, niquel, cadmio y similares, o con un catión orgánico formado a partir de, por ejemplo, N,N'-dibenzilo-etilenediamina o etilenediamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, a una sal de tanato de zinc. Además, los compuestos del presente invento o, preferiblemente, una sal

relativamente insoluble, como las que se acaban de describir, puede formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monostearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para inyección. Las sales que se prefieren son sales de zinc, sales de tanato de z.inc, sales de pamoato y similares. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para inyección contendría el compuesto o sal dispersada pa ra encapsulación en un polímero de degradación lenta, no tóxico, no antigeno, como polímero de ácido polilacticolácido poliglicólico, por ejemplo como se describe en la patente de los EE. UU. nO 3.773.919. Los compuestos o, preferiblemente, las sales relativamente insolubles, como las anterionnente descritas, también se pueden formular en gránulos de silástico de matriz. de colesterol, especialmente para uso en animales. Se conocen otras fonnulaciones de liberación lenta, depósito o por implante, por ejemplo, liposomas gaseosos o líquidos (patente de los EE. UU. nO 5.770.222 y ·Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems· [Sistemas de administración de medicamentos por liberación prolongada], J. R. Robinson OO ., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Una vez. descrito el invento en términos generales, se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ejemplo y no son limitativos.

Indicaciones

Artritis reumatoide IRA)

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad sistémica inflamatoria crónica con caracteristicas autoinmunes. Se explicarán ciertas caracteristicas de la RA a través de una acción de IL-6 no regulada.

Las acciones de IL-6 que tienen una relevancia potencial en RA incluyen la inducción de hipergammaglobulinemia policlonal y producción de autoanticuerpos (factor reumatoide), a través de las acciones de IL-6 como factor de diferenciación de una célula B: la promoción del desarrollo de una célula T citotóxica, conjuntamente con IL-2; la producción de proteinas de fase aguda (CRP, SAA, fibrinógeo), a través de actividad estimulante de hepatocito; activación osteoclástica, que lleva a osteoporosis periarticular y destrucción ósea; la inducción de trombocitosis, a través de acción como factor de diferenciación de megacariocito; y regulación de VEGF, y por lo tanto angiogénesis potencial, en combinación con IL-l~ y TNFa.

IL-6 se produce por fibroblastos sinoviales de RA estimulados por TNFa o IL-1, y está presente a alias niveles de concentración tanto en el fluido sinovial (SF) como en suero en RA. Existe una correlación entre los niveles de suero y los ind icios cl inicos 1de laboratorio de actividad de enfennedad. Se ha estudiado Anti-IL-6f1L-6R mAbs en varios estudios clinicos en pacientes con RA activo. Más adelante se describen los resultados actualizados.

Estudios de fase /111

En el primero de esos estudios, se administró diariamente un murino anti-IL-6 mAb (BE-S) durante 10 dias consecutivos en 5 pacientes con RA y se asoció con una mejora clinica transitoria y en laboratorio (9) (Wendling, D; et al. 1993 J. Rheumatol. 20:259). El mAb (MRA; Chugai) anti-IL-6R (SOkDa) humanizado se investigó en diversos estudios de fase 1111 en pacientes con RA. En el primero, se administró MRA o infusión de IV en dosis de 1-50 mg una o dos veces a la semana, con un tratamiento de mantenimiento de 50 mg por semana hasta 6 meses. Tuvo como resultado una disminución rápida en las mediciones de la fase aguda, proteina C-reactiva (CRP) y fibrinógeno, y en fiebre baja, cansancio y escalas clinicas, como rigidez. matutina y recuento de articulaciones hinchadas y dolorosas. También se detectaron mejorías en anemia, trombocitosis e hipergammaglobulinemia. En un estudio posterior, se trató a 45 pacientes con una infusión única de IV MRA en una dosis de 0,1-10 mg/kg , y tuvo como resultado una tendencia de mejora en puntuaciones clínicas a niveles más altos de dosis, más reducción en reactivos de fase aguda.

Estudios de fase 11

En el primero de esos estudios, se trató a 15 pacientes con MRA (dosificación de 2, 4 o 8 mg/kg quincenal durante 24 semanas) y dieron respuestas de ACR20 en 13/15 en la semana 24, con normalización de CRP/suero amiloide A (SAA). Aunque no ha habido problemas importantes en cuanto a la segu ridad aguda, hasta dos tercios de los pacientes mostraron niveles marcadamente superiores de colesterol LDL. En un segundo estudio de fase 11, 164 se trató a pacientes con RA resistente a DMARDs con placebo o MRA por infusión IV (dosificación 4 o S mgfkg, cada 4 semanas durante 3 meses) y mostraron tasas de respuesta de ACR20 la semana 12 del 11 %, 57 % Y 78 % para placebo, 4 y 8 mgfkg, respectivamente. Finalmente, 359 pacientes con RA activo recibieron únicamente MTX (10-25 mg/semana), solo MRA (niveles de dosificación 2, 4 o S mg/kg, administrados mensualmente por medio de infusión IV) o MTX más MRA. MRA Y MRA + MTX fueron más eficaces que solo MTX, como determina la respuesta ACR20.

Lupus eritematoso sistémico (LES)

El LES es una enfermedad crónica, potencialmente mortal, autoinmune con múltiples manifestaciones proteicas. Se desconoce la etiolog¡a. Una caracteristica de la enfermedad implica hipoproliferación, activación y producción de autoanticuerpo de célula B contra varios auto antrgenos.

IL-6 induce a las células B a diferenciarse en células de formación de anticuerpos. En LES, aumenta la producción de autoanticuerpos (ANA, anti-dsADN) por esas células de formación de anticuerpos y deposición de complejo inmune. IL-6 promueve el desarrollo de célula T citotóxica, aumenta los reactivos de fase aguda hepática , la proliferación de célula mesangial, el crecimiento de queratinocitos, la diferenciación y Irombosis de megacariocílicos.

Los niveles de IL-6 se elevan tanto en los pacientes de LES como en los modelos murinos de SLE. Se demostró que la unión de receptores de IL-6 en células B induce la diferenciación terminal de células B en células de producción de auloanticuerpo. Linker-Israeli el al. (Linker-Israeli M et al., 1991 J Immunol 147:117-123) han mostrado disminuciones en la producción espontanea de anticuerpo polidonal cuando se usaron anticuerpos de neutralización en IL-6. Kitani y otros (Kitani A, et al., 1992 Clin Exp Immunol 88: 75-83) respaldaron estos hallazgos demostrando que la producción de célula T in vitro de of IL-6 duplicado en cultivos de LES y que las células LES B tenían cinco veces más producción IL-6 que las células B de control. De todas formas, la producción patológica de autoanticuerpos en LES no solo se limita a los efectos de IL-6. También se ha estudiado el papel del receptor de IL

6. Nagafuchi y otros han mostrado receptor IL-6 hasta la regulación en la mayor¡a de células LES B vs. células B normales. Los anticuerpos de receptor de anti-IL-6 inhibieron la diferenciación terminal de dichas células B en células de formación de anticuerpos. El papel del receptor de IL-6 soluble en LES todav¡a no se ha determinado.

Diabetes Mellitus de Tipo 11 (T20M)

Se cree que la resistencia a la insulina (pérdida de efecto de la insulina) y pérdida de la función de la célula-¡3 (déficit funcional de las células-¡3 pancreáticas en la secreción de insulina) son las causas principales del desarrollo de T2DM. La resistencia a la insulina se manifiesta en forma de incapacidad de los tejidos periféricos de responder adecuadamente la insulina, provocando un aumento de los niveles de glucosa en sangre. Al aumento de la resistencia a la insulina y los niveles de glucosa en la sangre sigue una hipersecreción de insulina por células-¡3 pancreáticas en las primeras fases de la enfermedad. Al progresar T20M, se deteriora la capacidad de las células-¡3 para segregar insulina.

Los mecanismos subyacentes responsables del desarrollo de la resistencia a la insulina no están claros. La afección asociada más habitualmente al desarrollo de T2DM es la obesidad e incluso una pequeña pérdida de peso mejora de forma significativa los niveles de glucosa en pacientes con T2DM.

Tanto la obesidad como la resistencia a la insulinafhiperinsulinemia, en combinación con dislipidemia, disminución de la tolerancia a la glucosa e hipertensión han caracterizado la the afección denominada sindrome metabólico. La progresión natural de sindrome metabólico a T20M predispone a los individuos al desarrollo de cambios micro-y macro-vasculares que podrían conducir a enfermedad cardiovascular (CV) y en última instancia la muerte. Se ha sugerido que las principales relaciones entre T2DM y la enfermedad CV podrían ser la obesidad, la resistencia a la insulina y la hiper-insulinemia.

El tejido adiposo se ha identificado como uno de los órganos principales que regula el metabolismo, y es tanto un depósito de energía como un órgano endocrino que segrega numerosas moléculas implicadas en la regulación de sensibilidad de insulina. Además de leptina, resistina, adiponectina y TNFa, el tejido adiposo segrega IL-6, lo que se ha sugerido que representa la unión entre obesidad, inflamación, T20M y enfermedad cardiovascular (CV).

Se ha documentado una correlación posítíva entre la adiposidad y los niveles de IL-6. Es posible que el aumento del tejido adiposo en la obesidad proporcione un aumento prolongado en IL-6 circulante que podr¡a disminuir la sensibilidad a la insulina promoviendo la inflamación en tejidos que responden a la insulina o causan resistencia a la insulina interfiriendo la actividad y la expresión de proteínas implicadas en la cascada de senalización de insulina. Existen datos in vitro e in vivo que apoyan o se oponen al papel potencial de IL-6 en el desarrollo de resistencia a la insulina.

Los datos in vitro que usan sistemas celulares bien definidos, incluido higado (HepG2){44), grasa (3T3L 1) o células de islote pancreático de rata aislado muestran un efecto negativo directo de IL-6 sobre la senalización de insulina, absorción de glucosa y secreción de insulina, respectivamente. Por otro lado, los datos obtenidos a partir de experimentos realizados en biopsias de músculo esquelético sugieren que IL-6 podría aumentar la absorción de glucosa en el músculo que se ejercita.

Los datos in vivo de la asociación entre niveles de IL-6 y sensibilidad de insulina se mezclan de la misma forma. Los modelos de sobre-expresión de IL-6 o de ablación completa sugieren que la inhibición completa de la actividad IL-6 podría no tener un efecto beneficioso. Por ejemplo, en ratones diabéticos no obesos (NOO) transgénicos, la sobreexpresión de IL-6 humano retrasa la aparición de diabetes y prolonga la supervivencia. Además, los datos de ratones nulos para IL-6 sugieren que IL-6 podr¡a tener un papel en la regulación del equilibrio energético, ya que esos animales desarrollan obesidad de aparición tardía y niveles de glucosa mas altos.

En humanos, una mutación que se produce de forma natural dentro de la región del promotor IL-6 provoca un aumento de la tasa de secreción de IL-6. Esta mutación se ha asociado tanto con un aumento como con una disminución de la sensibilidad a insulina.

En otro grupo de experimentos, se ha evaluado el efecto de IL-6 exógeno. En sujetos normales, la administración de IL-6 provocó aumentos en los niveles de glucosa sin afectar a las concentraciones de insulina en plasma, mientras que en los pacientes de cáncer, la adición de IL-6 aumentó el almacenamiento de glucosa. Además, se ha examinado la correlación entre los niveles de IL-6 y la resistencia a la insulina. Los datos de esos experimentos sugieren que tanto en hombres como en mujeres, los altos niveles circulantes de IL-6 se correlacionaron con una resistencia a la insulina más alta aunque todavia no se ha determinado una relación de causa-efecto.

Se ha indicado que IL-6 tiene un papel importante en el desarrollo de resistencia a asociado con obesidad. De todas formas. existen datos in vitro e in vivo contradictorios que tanto apoyan o contradicen su papel potencial en la resistencia a la insulina.

Osteoartritis lOA)

La OA es un trastomo articular crónico y degenerativo, caracterizado por la pérdida de cartilago articular y cambios relacionados en el hueso subcondral. Aunque se observan grados variables de inflamación en artroscopia o en muestras de biopsia sinovial, la enfermedad no es principalmente inflamatoria. Más bien se cree que se origina a partir de cambios en el condrocito y/o en el metabolismo osteoblástico. TNF, IL-1 e IL-6 son las citoquinas que se asocian más claramente con esos cambios.

IL-6 es detectable en el fluido sinovial de pacientes con OA, aunque a niveles que están sustancialmente por debajo de los que se ven en artropatias inflamatorias (Bertazzolo, N. el al. 1994 Agents and Actions [Agentes y acciones]

41: 90-92). Se reconoce que IL-6 es un estímulo principal para la síntesis de proteínas en fase hepática aguda, y los niveles de CRP se asocian con la presencia de OA de rodilla, incluso después de haber tenido en cuenta la asociación conocida entre CRP y obesidad (Mohtai, M. et al. 1996 J Orthopedic Research [Investigación ortopédica] 14, 67-73).

IL-6 se expresa en condrocitos a partir de cartílago DA, pero no de cartílago normal (Sowers, M. el al. 2002 Osteoarthritis and Cartilage [Dsteoatritis y cartílagos] 10: 595-601). En experimentos que investigan los efectos del estrés mecánico sobre la expresión de las citoquinas de condrocito in vitro, la tensión de cizallamiento inducida por fluidos claramente aumentó IL-6 mARN y la proteína. Esto sugiere que la expresión de IL-6 en cartílago de OA podría ser resultado de una carga mecánica. También podría producirse IL-6 en respuesta a la acción de IL-1 sobre condrocitos (Oozin, B. et al. 2002 Matrix Biology [Biologia de matriz] 21 :449-459).

En otros experimentos, IL-6, en combinación con sIL-6R, provocó la inhibición de síntesis de proteoglicano por condrocitos articulares humanos cultivados ex vivo, aunque el efecto fue modesto en comparación con el de IL-1 (Gueme, P. et al. 1999 Matrix Biology [Biología de matriz] 18: 253-260).

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPO)

La COPO es una enfermedad caracterizada por la limitación del flujo aéreo que no es totalmente reversible. La limitación del flujo aéreo normalmente es progresiva y se asocia con una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones a particulas y gases nocivos (Pauwels RA et al. 2001 AmJ.Respir Cril Care Med 163:1256-1276). La COPO se caracteriza por la aceleración en el deterioro normal de la función pulmonar con la edad. La limítación del flujo aéreo lentamente progresiva provoca invalidez y muerte prematura. La COPO es una causa principal de muerte y discapacidad, pero solo se ha explorado recientemente de forma amplia desde una perspectiva celular y molecular (Barnes P. J. et al. 2003 Eur Respir J 22:672-688). En COPO, hay una inflamación crónica que provoca el estrechamiento fijo de pequeñas vías aéreas y la destrucción alveolar (enfisema). La respuesta inflamatoria se caracteriza por un aumento del numero de macrófagos alveolares, neutr6fiJos y linfocitos-T citotóxicos y la liberación de mediadores inflamatorios múltiples (quimioquinas, citoquinas, factores del crecimiento y lípidos). Un nivel más alto de estrés oxidativo podría aumentar la inflamación. También aumenta la elastolisis y los indicios de la implicación de varias enzimas elastoliticas. La inflamación y la proteólisis en COPO es una amplificación de la respuesta inflamatoria normal al humo del tabaco. En contraste con el asma, la inflamación parece ser resistente a los corticosteroides (Barnes P.J. et al. 2003). En modelos animales, la exposición a endoloxina bacteriana o liposacáridos (LPS) y al humo del tabaco provocan neutrofilia y un aumento de la producción de IL-6 en el fluido del lavado broncoalveolar (SAL) (Underwood O.C. et al. 2000 AJPLCMP 279:L895-902). La sobre-expresión de IL-6 en pulmones de ratón provoca enfisema (Kuhn 111Ch. el al. 2000 AJRCMB 22:289-295). En humanos, el volumen expi ratorio forzado en un segundo (FEV1) tiene una correlación inversa con los niveles de IL-6 e IL-8 y con el conteo de células polimorfonudeares en el BAL (Soler N. et al. 1999 Eur Respir J 14:1015-1022). Los niveles de plasma TNFa, IL-6 y CRP aumentan en sujetos con COPO de leve a grave (YasudaN. et al. 1998 Respir Med 92:993-999).

El agravamiento agudo de COPO se define como un empeoramiento prolongado de la afección del paciente, desde el estado estable y por más allá de las variaciones normales del dia a dia, que es agudo a su aparición y necesita un cambio de la medicación normal (Burge S. et al. 2003 Eur Respir J 21: Suppl. 41 , 46s-53s). Aunque el aumento de los síntomas y el empeoramiento de la función pulmonar son una causa común de admisión hospitalaria (aproximadamente 500.000 al año en los EE. UU.), los mecanismos subyacentes celular y molecular no se han investigado ampliamente y apenas se comprenden (Wedzicha, J.A. 2002 Chest 121 : 136S-141S). Los agravamientos agudos pueden ser prolongados y tener un efecto profundo sobre la calidad de vida, y podrían acelerar la progresión de COPO (Soto F.J. et al. 2003 Pulm Med 9:117-124). Las afecciones respiratorias son las causas más comunes de agravamientos de COPO. La mayoría de esas infecciones son provocadas por bacterias, pero muchas de ellas son debidas a infecciones víricas, especialmente rinovirus (Soto F.J. et al. 2003). Los factores medioambientales, los contaminantes atmosféricos y la temperatura también podrían tener un papel.

Durante el agravamiento, se produce un aumento en los neutrófilos y las concentraciones de IL-6, IL-8, TNFa y L TB4 en el esputo de pacientes con COPO. Algunos pacientes con COPo entre moderado y grave son propensos a agravamientos frecuentes (tres o más agravamientos al año). Este grupo de pacientes ("agravadores frecuentes") tiene un nivel más alto de IL-6 y un nivel más bajo de inhibidor de proteasa leucocitaria secretora incluso cuando COPO es estable (Bhowmik A. et al. 2000 Thorax 55: 114-120; Gompertz S. et al. 2001 Thorax 56: 36-41; Gompertz

S. et al. 2001 EurRespir J 17: 1112-1119).

Hay otros mecanismos, como estrés oxidativo y colonización bacteriana, también implicados en la patofisiologia del agravamiento de COPO.

Ejemplo 1: Clonación y expresión de los anticuerpos Il-6 en células de mamíferos

Un vector de expresión de mamifero ti pico contiene por lo menos un elemento promotor, que media la iniciación de la transcripción de mARN, la secuencia de codificación del anticuerpo, y las señales necesarias para la terminación de la transcripción y poliadenilación de la transcripción. Otros elementos son mejoradores, secuencias Kozak y secuencias de intervención flanqueadas por ubicaciones de donante y de aceptador para la unión de ARN. La transcripción altamente eficaz puede conseguirse con los promotores iniciales y tardios de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRS) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HI VI Y el promotor inicial del citomegalovirus (CMV). De todas formas, también se pueden usar elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humana). Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica del presente invento incluyen, por ejemplo, vectores, como as plRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PlXSN, o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcADN3.1 (+1-), pcADN/Zeo (+f-) o pcADN3.1 /Hygro (+f-) (Invitrogen), PSVL y PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células de mamíferos adecuados y otras células hospedadoras incluyen Hela, 293, H9 humanas y células Jurkat, NIH3T3 de ratón y células CI27, Cos 1, Cos 7 Y CV 1, células aC1 -3 de codomiz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO). De forma alternativa, el gen puede expresarse en lineas celulares estables que conlienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable, como dhfr, gpt, neomicina o higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado lambién se puede amplificar para expresar grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar lineas celulares que portan varios cienlos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otra selección útil de marcadores es la sintasa de glutamina de enzima (GS) (Murphy, el al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbinglon, el al., BiofTechnology 10:169-175 (1992)). Usando esos marcadores, las células de mamífero se cultivan en un medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas lineas celulares conlienen los genes amplificados inlegrados en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO con frecuencia se usan para la producción de anticuerpos.

Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (L TR) del virus Rous Sarcoma (Cullen, et al., Mol. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) más un fragmento del mejorador CMV (Boshart, et al., Cell 41 :521-530 (1985». Las ubicaciones de clonación múltiple, por ejemplo, con las ubicaciones de división de enzima de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facililan la clonación del gen de inlerés. Los vectores contienen, además del 3' intron, la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata .

Clonación y expresión de células CHO

El vector pC4 puede usarse para la expresión de anticuerpo de IL-6. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhff (ATCe nO de aCceso 37146). El plásmidO contiene el gen de ratón DHFR baja el control del promotor inicial de SV40. El ovario de hámster chino u otras células que no tienen actividad de hidrofolato que se transfectan con esos plásmidos pueden seleccionarse cultivando las células en un medio selectivo (por ejemplo, alpha minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes DHFR en células resistentes a metotrexato (MTX) se ha documentado ampliamente (véase, por ejemplo, F. W. AIt, el al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. el Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M. J. Page y M. A. Sydenham, Biotechnology [Biolecnologia] 9:64-68 (1991». Las células cultivadas en concentraciones de MTX en aumento desarrollan resistencia al medicamento sobre

produciendo la enzima objetivo, oHFR, como resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si un segundo gen está unido al gen oHFR, nonnalmente se co-amplifica y sobre-expresa. Se conoce que este enfoque puede usarse para desarrollar lineas celulares que portan más de 1.000 copias de los genes amplificados. Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen lineas celulares que contienen el gen amplificado integrado en un cromosoma o más de la célula hospedadora. También se pueden usar para la expresión promotores de alta eficacia distintos del promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR) del Virus Rous Sarcoma, por ejemplo, el promotor de ~-actina humana, el promotor SV40 inicial

o promotores tardios de las repeticiones tenninales largas de otros retrovirus , por ejemplo, HIV y HTLVI. Los sistemas de expresión genética de Clontech Tet-Off y Tet-On y otros sistemas similares pueden usarse para expresar el anticuerpo IL-6 en una forma regulada de células de mamlfero (M. Gossen y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para la poliadenación de mARN, también se pueden usar otras señales, por ejemplo, a partir de la hormona de crecimiento humana o genes de globina. Las lineas celulares estables que portan un gen de interés integrado en los cromosomas también se pueden seleccionar a la co-transfección con un marcador seleccionable, como gpt, G418 o higromicina. Es conveniente usar más de un marcador seleccionable al inicio, por ejemplo, G418 más metotrexato. El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de restricción y a continuación se desfosforila usando fosfotasa intestinal de becerro por procedimientos conocidos. El vector entonces se aisla a partir de un 1 % de gel de agarosa.

Se usa la secuencia de AoN que codifica el anticuerpo IL-6 completo, por ejemplo, como se presenta en la SEC ID N°: 98 y 96, que corresponde a las regiones variables HC y LC de un anticuerpo IL-6 del presente invento, respectivamente, de acuerdo con los pasos de métodos conocidos. El ácido nucleico aislado que codifica una región constante humana adecuada (por ejemplo, regiones HC y LC) también se usa en este constructo.

Las regiones variable aislada y constante que codifican ADN y el vector desfosforilado entonces se ligan a la ligasa T4 de AoN. A continuación se transforman células de E. coli HB101 o azules XL-1 y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en plásmido pC4 que usa, por ejemplo, análisis de enzima de restricción.

Las células de ovario de hámster chino (CHO) que no tienen un gen de DHFR activo se usan para la transfección. 5 microgramos de la expresión de plásmido pC4 se cotransfectan con 0,5 microgramos del plásmido pSV2-neo usando lipofectina. El plásmido pSV2neo contiene un marcador seleccionable dominante, el neo gen a de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluido G418. Las células se cultivan en alfa menos MEM complementado con 1 microgramo/ml G418. Tras 2 días, las células se tripsinizan y cultivan en placas de donación de hibridoma (Greiner, Alemania) en alfa menos MEM complementada con 10, 25, 050 ng/ml de metotrexato más 1 microgramofml G418. Tras aproximadamente 10-14 dlas, se tripsinizan dones sencillos y a continuación se cultivan en placas petri de 6 recipientes en matraces de 10 mi que usan diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM ). Los clones que crecen a las concentraciones más altas de metotrexato a continuación se transfieren a nuevas placas de 6 recipientes que contienen incluso mayores concentraciones de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100 -200 mM. Se analiza la expresión del producto genético deseado, por ejemplo, por SDS-PAGE y Western blot o por análisis de HPLC de fase inversa.

Ejemplo 2 -Construcción y examen de anticuerpo anti-IL-6

Se construyeron y se analizó la actividad de variantes del anticuerpo IL-6 (clon AME-A9). En este ejemplo y en otros puntos de este documento, los CDRs son como ha definido Kabat con la excepCión de CoRH1, que es la suma de las definiciones de Rabat y Chothia. La longitud de CDRH2 hizo necesario construir dos bibliotecas independientes para cubrir el área completa. Los clones de interés se secuenciaron y se caracterizaron con ELISA y se detenninaron en un ensayo de base celular y constantes cinéticas.

En la Figura 9 se muestra un ejemplo de una ELlSA realizado con los IgGs purificados. ELlSA generalmente usó placas de microtitulación Costar 3366 recubiertas con un anticuerpo kappa de cabra antihumano. Se incubaron diluciones de Fab (o IgG) en los recipientes recubiertos durante 1 hr a 22~ C. Los recipientes se lavaron a continuación con PBS, 0,1 % Tween 20 y se añadió IL-6 biotilinado a 200 ngfml durante 1 hora. Tras el lavado, se añadió un conjugado de fosfatasa alcalina de NeutrAvidin y se incubó durante 1 hora a 22~ C. Se añadió un sustrato colorimétrico tras lavado extensivo y se determinó la unión con IL-6. Una variación de este ELlSA incluyó un paso de lavado extendido en un vaso de PBS, 0,01 % de BSA a 37~ e tras la incubación biotinilada de IL-6, por ejemplo, un paso de lavado extendido de 18 horas.

Varios de los reactivos IL-6 de ingenierla humana generados de anticuerpos monoclonales 19G del invento tienen constantes de afinidad entre 1xl0g y 9xl012. Los altos niveles de afinidad de esos anticuerpos monoclonales de ingenierla humana los hacen adecuados para aplicaciones terapéuticas en enfennedades dependientes de IL-6, patologías o afecciones relacionadas.

Se obtuvieron múltiples variantes de anticuerpo anti-IL6 de ingenierla humana modificando una o más de las regiones CDR del anticuerpo. La siguiente Tabla 3 muestra un resumen de las mutaciones beneficiosas que se encontraron en las bibliotecas CoR individuales {los cambios en los aminoácidos son relativos a la variante AME

A9). Además, la Tabla 13 muestra las secuencias de aminoácido para las CDRs de cadena ligera y pesada con las posibles posiciones de sustitución (marcadas con "X").

Se construyó una biblioteca ·combinatoria!" en base a los mejores dones (por ejemplo, variantes) que se encontraron en las bibliotecas CDR individuales. La Tabla 4 muestra las mutaciones que se incluyeron en la biblioteca "combinatoria!". La biblioteca combinatorial se evaluó y caracterizó como se ha descrito. Las mutaciones que se encontraron en seis de los mejores clones se muestran en la siguiente Tabla 5A, mientras que los números de ID de la secuencia de los CDRs de esos clones se muestran en la Tabla 5B.

Ensayos de anti-IL-6 '9Gs en un ensayo de base celular

Se estudió la capacidad de los anticuerpos anti-IL-6 quiméricos y anti-IL-6 de ingenieria humana (don AME-19a) para evitar el crecimiento de una linea celular dependiente de IL-6. Las células nD1 se prensaron en una placa Costar 3610 96 a 200 células por recipiente. Se añadieron a las placas anticuerpos, diluidos en un medio de IMDM, seguido de la adición de IL-6 humano a una concentración final de 500 pgfml y se incubaron placas en un incubador de cultivo de tejido durante 64-72 horas. En ese momento, se añadieron 50 ¡JI de tampón de lisis celular a partir del kit ATPlite (Packard Bioscience) a todos los recipientes y las placas se agitaron durante 3 minutos. Se añadieron 50 ¡JI de sustrato ATPlite y las placas cubiertas se agitaron 1 minuto. Se detenninó la quimioluminiscencia en un luminómetro.

Los resultados de un ensayo de base celular se muestran en la Figura 10, y los valores EC50 calculados se muestran en la Tabla 6. El valor EC50 de los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 es 2,7 M (4,09 ngfml) y el

x 10-11

anticuerpo de ingenierra humana anti-IL-6 (clan AME-1ga) es 2,7 x 10.12 M (0.41 ngfml). El valor EC50 del anticuerpo de ingenierra humana muestra una mejora de un aumento de aproximadamente 10, aunque podda ser posible obtener una mejora de aproximadamente 10 a 60, incluidos los valores que intervienen en el valor ECso.

Ejemplo 3 -Cinética de unión de los anticuerpos anti-humanos Il-6 de ingeniería humana.

El análisis de ELlSA confinna que el anticuerpo purificado a partir de esas células hospedadoras unen IL-6 en una forma dependiente de la concentración. En este caso, se mide la afinidad de! anticuerpo para este cognato antigeno (epitopo). Se obtienen las constantes de unión cuantitativa usando análisis por BIAcore y el instrumento KinExA 3000. Los resultados indican que varios de los anticuerpos monoclonales de ingeniería humana tienen muy alta afinidad con Kd en el rango de 1x10-9 a 3x10·14 .

Se llevó a cabo un inmuno ensayo de enzima (ELA) que usa anticuerpos monoclonales anti-humanos IL-6 (AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a y AME-23a) y CNTO 328 usado como control positivo para detectar la unión de IL-6 al receptor soluble IL-6, sIL-6R. El receptor humano soluble IL-6, sIL-6R, y IL-6 humano recombinante se obtuvieron a partir de sistemas R&D (Minneapolis, MN) (Catálogo#227-SR-025 y 206-IL-010, respectivamente). Se obtuvo peroxidasa de unión de IgG de rábano con cabra anti-humana (cadena H+L) de Jackson Immunoresearch (West Grove, PA) (Catálogo # 109-035-003). Se obtuvieron comprimidos de peróxido de hidrógeno y OPD de Sigma (SI. Louis, MO) (Catálogo #H-1009 y P-8287, respectivamente).

Inmunoensayo de unión de enzima para fonnación de complejo sgp80flL-6/anti-IL-6 mAb

Se recubieron placas Costar EIA (Coming/Costar, AClon, MA) (Catálogo #9018) con sIL-6R (10 ¡Jg/ml en PBS, 100 ¡Jlfrecipiente) durante la noche a 4G C. Las placas se lavaron en 0,15 M de salino con 0,02 % (w/v) Tween 20 y las placas se bloquearon con 1 % (w/v) de BSA en PBS, 200 ¡JI/recipiente durante una hora a temperatura ambiente. Los recipientes se volvieron a lavar en formato secuencial incubado con 200 ng/ml de IL-6 humano (100 ¡Jlfrecipiente) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo a todos los recipientes en diluciones seriales en aumentos de 10 a partir de una concentración de inicio de 10 ~g/ml en 100 ¡JI/recipiente durante una hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, los recipientes se incubaron con cabra con IgG antihumano de unión de (H+L)-HRP, (10 ¡Jg/ml en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los recipientes se lavaron y se añadió una solución de 100 ¡Jlfrecipiente de sustratos de citrato-fosfato (0,1 M de ácido citrico y 0,2 M de fosfato de sodio, 0,01 % H202 Y 1 mgfml de OPD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró al añadir 25 ¡Jlfrecipiente de 4 N de ácido sulfúrico y el OD490 se leyó por medio de un lector de placa ELlSA automatizado (Molecular Devices Spectromax Plus, Sunnyvale, CA).

Para testar el efecto de la preincubación de IL-6 con anticuerpos anti h1L-6 monoclonales o CNTO 328, se incubaron 200 ng/mI IL-6 (100 ¡JI) con diluciones en diez aumentos de anticuerpo (100 fJl), comenzando por 10 fJ9 /ml durante una hora a temperatura ambiente. Esta mezcla pre-incubada a continuación se incubó con sIL-6R durante una hora a temperatura ambiente y se detectó el complejo sIL-6RfIL-6/anti humano IL-6 usando IgG anti-humano de cabra unido con {H+L}-HRP, (10 ¡Jglml en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las afecciones del ensayo restantes fueron las mismas descritas en el párrafo anterior.

Los estudios previos han mostrado que CNTO 328 puede detectar IL-6 cuando se captura por sIL-6R recubierto una placa EIA. Además, AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a y AME-23a pueden detectar IL-6 unido a

sgp80 (sIL-6R) de forma dependiente de la dosis usando EIA. Cada anticuerpo anti-IL-6 de ingenieria humana se evaluó en referencia a CNTQ 328. Oe todas formas, la preincubación de IL-6 y de cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti hIL-B incluye la capacidad de sIL-6R de unir a IL-6.

Medición de constantes cinéticas para anti-IL-6 IgGs

El instrumento KinExA 3000, fabricado por Sapidyne, se utilizó para medir la cinética de la unión. Brevemente, IL-6 humana se acopló de forma covalente a gotas de alzactona y la unión de IgG libres a las gotas se detectó en el instrumento. Para medir el KO , se incubaron tubos individuales que contenian una concentración constante de 0,5, 1 05 pM de IgG con IL-6 humano diluido serialmente de forma decreciente durante 3-4 dias a 200 C en 0,1 % de BSA, PBS. Se usó un total de 13 tubos para cada determinación de Kd. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 se usaron a una concentración constante de 5 pM Y se incubaron tubos individuales con 0-200 pM de IL-6. Se configuraron de forma similar incubaciones para los otros IgGs. Tras la incubación, se determinó el IgG libre para cada ejemplo equilibrado en el instrumento KinExA 3000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de Kd se determinaron por medio del software KinExA 3000 usando el equipo KinExA 3000, como se describe a continuación más detalladamente.

Para medir kon, se mezclaron IgGs ind ividuales a 200 pM con 100-200 pM de IL-6 humano y se detectó el IgG no ligado uniendo a IL-6 humano acoplado de forma cava lente a gotas de alzactona en el equipo KinExA 3000. Se realizaron varias mediciones temporales. Los datos resultantes se usaron para calcular el kon con el software KinExA 3000. Se calculó kon usando la fórmula KO = konIkon. En la Tabla 7 se muestra un resumen de las constantes cinéticas de anti-IL-6 IgGs.

Ejemplo 4: caracterización in vitro de anticuerpo anti-IL-6

Se llevaron a cabo estudios in vitro para caracterizar la secuencia, especificidad del epitopo, afinidad y actividad biológica del anticuerpo anti-IL-6.

mAb de inqenierra humana

El análisis de secuencia confirma que el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento (representado en diferentes variantes/clones) contiene marcos completamente humanos. La Tabla 5a muestra un total de 10 residuos de aminoácidos cambiados tanto en la cadena ligera como la pesada de COR1, 2, y 3 en el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento (en diferentes variantes del anticuerpo) en comparación con los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 (descritos en PCT WQ 04f039826).

Especificidad de eprtooo

El anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 reconocen un epitopo similar en IL6 humano. Estos anticuerpos no compiten con el ralón comercial anti-humano IL-6 mAb de R&D Systems #MAB206, lo que sugiere que reconocen un epitopo que es diferente del de R&D anti-IL-6 mAb. El anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 no compiten con la rata anti-humana IL-6 mAb de R&O.

Se capturó IL-6 humano (200 ngfml) por medio de anti-IL-6 mAb unido por placa (ratón anti-humano IL-6 mAb, MAB206, que se ha usado solo como mAb unido por placa para capturar IL-6 humano) (10 jJgfml) y diluciones seriales del anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 se añadieron entonces a la placa, como se indica a lo largo del eje X. La unión a IL-6 se mid ió en forma de aumento en 00490 junto con el eje Y. Tanto el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento como los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 muestran una unión dependiente a la dosis a IL-6.

Inversamente, el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 se unen competitivamente a11L-6 humano, sugiriendo que las dos moléculas comparten un eprtopo de unión similar sobre IL

6. La IL-6 humana (200 ngfml) fue capturada por MAB-206 de unión por placa (10 jJgfml). A continuación, se añadieron a la placa diluciones seriales del anticuerpo anti-IL-6 del presente invento como se indica a lo largo del eje X Y 50 ng/ml de anticuerpos anti-IL-6 quiméricos biotinilados. La unión de anticuerpos anti-IL-6 quiméricos biotinilados a IL-6 se detectó por streptavidina-HRP y se midió con lecturas 00490 a lo largo del eje Y.

Además, los anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos muestran propiedades similares para la unión al complejo sI L-6/sIL-6R (Figura 1). El anticuerpo anti-IL-6 del presente invento une a complejo sIL-6/SIL-6R. El receptor IL-6 soluble (sIL-6R) se recubrió en la placa a concentración de 10 ¡.Jgfml. A continuación se añadió IL-6 humano a la placa a concentración de 200 nglml. A continuación se añadieron a la placa diluciones seriales del anticuerpo anti-IL-6 del presente invento o del anticuerpo quimérico anti-IL-6, como se indica a lo largo del eje X y la unión al complejo IL-6fsIL-6R se detectó usando IgG HRP-anti-humano y se midió con lecturas 00490 a lo largo del eje Y.

Para confirmar mejor las conclusiones anteriores, se llevó a cabo una inspección de reactividad por especies cruzadas usando sobrenadante condicional que contenia IL-6 generado a partir de LPS y PBMCs estimulados por IFNy de diferentes especies en un ensayo de proliferación de base celular 7TD1 (linea celular de hibridoma murino dependiente de IL-6). Se ha demostrado que el anticuerpo de ingeniería humana del invento neutraliza la actividad del sobrenadante condicionado en la estimulación de proliferación de células 7TD1 a partir de varias especies de primates, entre las que se incluyen los humanos, titi, macaco cangrejero, chimpancé, macaco Rhesus, babuino, macaco cola de cerdo sureño y titi cabeza blanca, y mostraron un patrón de reactividad de cruce de especias similar en comparación al anticuerpo quimérico (Tabla 8).

Finalmente, cuando el mapeamiento de epitopos se llevó a cabo usando el método de digesto triptico, se observó el mismo epitopo de unión para los anticuerpos de ingenieria humana y quiméricos en IL-6 humano y está situado en los residuo de expansión de los aminoácidos Helix D 168-184 (Figure 3). Análisis de mutación recientes han confirmado que los residuos 179 y 182 son esenciales para que el anticuerpo del invento se una a IL-6. El epitopo (residuos de aminoácido 168-184) se identificó como la superficie de IL-6 que retenia deuterio en presencia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6.

Actividad biológica

La potencia de neutralización de IL-6 del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 se determinó por medio de un bioensayo 7TD1 de base celular. El anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 demostró una potencia de neutralización de 10 aumentos mayor que el anticuerpo quimérico anti-IL-6 en el ensayo de proliferación celular 7TD1. Las células 7TD1 se estimularon con 500 pgfml de h1L-6 en presencia de diluciones seriales de anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 o anticuerpos quiméricos anti-IL-6 o control de isotipo mAb durante 72 horas. La proliferación celular se midió en conteos por segundo, como indica el eje Y. Las barras de erro indican el SD de muestras duplicadas. Un circulo cerrado indica células sin IL-6; un circulo abierto indica células estimuladas con 500 pgfml de hIL-6.

El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 también inhibe la producción de proteína-1 (MCP-1) de monocito inducido por IL-6 a partir de células U937 (Figura 3) y la producción de suero amiloide A {SAAO inducido por IL-6f1L113 a partir de células de hepatoma humano HepG2 (Figura 4). La Figura 3 demuestra que el anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 inhibe la secreción de MCP-1 estimulado por IL-6 a partir de células U937. Se trataron 5 x 105 células/recipiente con 1 ngfml de h1L-6 y diluciones seriales de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 durante 72 horas. Se analizaron los supernadantes de cultivo celular en triplicados por ELlSA para ver la presencia de MCP-1.

La Figura 4 muestra que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibe la secreción de AAA estimulada por IL113 e IL-6 a partir de células HepG2. 2,25 x 105células se estimularon con 100 ngfml de hIL-6, 200 ngfml de sIL-6R y 1 ngfml de IL-113 en presencia de diluciones seriales de anticuerpos de ingenieria humana anti-IL-6 durante 24 horas. A continuación se analizaron los supemadantes de cultivo celular en duplicados por medio de ELlSA para ver la presencia de SAA.

Fosforilación de Stat3 dependiente de IL-6

Para evaluar la capacidad del anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 para bloquear la cascada de señalización resultante de la unión de IL-6 a IL-6R y gp130, se llevó a cabo un ensayo de inmuno-precipitación para testar el efecto de fosforilación de STAT3 dependiente de IL-6 sobre células THP-1, que expresan gp130 en la superficie celular.

Los mAbs se filtraron y se esterilizaron y almacenaron en PBS a 4° C. Se usaron IL-6 humano recombinante (206-IL010) Y sIL-6R (227-SR-025) a partir de sistemas R&D (Minneapolis, MN). Se obtuvieron medios de RPMI (11875085), suero bovino fetal inactivado por calor (16000-069), L-Glutamina (25030-081), aminoácidos no esenciales (11140-050) y piruvato de sodio (11360-070) a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). También se usó TBS (10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCI).

Se testó THP-1, una linea celular de leucemia monocítica aguda humana recibida de bancos celulares de investigación, y resultó ser negativa para micoplasma y libre de bacterias. Estas células se cultivaron en un medio de RPMI con un 10 % de suero bovino fetal, 2mM de glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. Las células se subcultivaron o recogieron cuando los cultivos alcanzaron una confluencia de aproximadamente el 85 %. Las células se dividieron rutina riamente1:5 cada tres días.

Para fosforilación de tirosina se cultivaron células hasta una confluencia del 80-90 % en matraces T-225. El medio se retiró y se sustituyó con otro frescon sin suero e incubado toda la noche. Tras la falta de suero, se recogieron las células de cada matraz, se granularon y se volvió a suspender una concentración final de 20x106 células por afección en un medio de 0,5 mi sin suero.

Se preincubó RhIL-6 (0,1 ¡Jgfml) a 3r e durante 15 minutos con los siguientes reactivos: medio de 0,5 mi solo, antiIL-6 Ab (10 ¡Jgfml); y sIL-6R (0,2 ¡Jgfml). A continuación se añadieron SIL-6R (0,2 ¡Jgfml) y anti-IL-6 Ab (10 ¡Jglml) a

células preincubadas con anti-IL-6 Ab y sIL-6R, respectivamente, para incubación a 3]0 C durante 15 minutos. A continuación se combinaron las células con un medio como control negativo y el complejo IL-6fAb/sIL-6R y se incubaron a 3r C durante 6 minutos. Las células se lavaron dos veces en TBS helado y los gránulos celulares se procesaron como se ha descrito en la Sección 5.4 o se almacenaron a -70~ C.

Para inmunoprecipitaci6n, se lisaron los gránulos celulares en 1 mi de tampón de lisis (50 mM Tris, pH 7.5, 300 mM NaCl, 0,5 % Triton-X-100) (T-9284, Sigma, SI. Louis, MO) que contienen comprimido de cóctel de inhibidor de proteasa completo (1697498, Rache, Basilea, Suiza). Las células se agitaron 30 segundos y se incubaron a -70~ C durante 20-60 minutos. Se retiraron los residuos celulares por centrifugación a 13.000 rpm durante 20 minutos. Para reducir el tintado de entamo no especifico, las muestras se pre-aclararon por incubavión con 2 IgG de conejo pg (15006, Sigma, SI. Louis, MO) más 50 1.11 de agarosa de proteina A (SC-2001, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 hr a 4~ C en un mezclador orbital. Las gotas de agarosa se retiraron por centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos. Los lisados aclarados se transfi rieron a tubos e micro-centrifugado y se incubaron con antiSTAT3 (2 jJgfml) (SC-7179, $anta Cruz Biotechnology) toda la noche a 40 C en un mezclador orbital, seguido de la adición de 50 1.1 de gotas de agarosa de proteina A y se incubaron durante 2 horas a 4~ e en un agitador orbital. Las gotas de agarosa se recogieron por un centrifugado a 2500 rpm durante 5 minutos y se lavaron 5 veces en TBS congelado a 40 C. A continuación se volvió a suspender las gotas de agarosa en 40 1.11 de tampón de muestra de Laemmli más OTT (NP0007-465030, Invitrogen, Carlsbad, CA) y se calentaron a 950 C durante 5 minutos.

Las muestras se resolvieron en un gel de 3-8 % de NuPage Bis-Tris (EA0375BOX, Invitrogen, Carlsbad, CA) con un tampón (NP0002-465026, Invitrogen, Carlsbad, CA) a 100 V durante 1 hora. Las proteinas se transfi rieron a una membrana Nitrocel1ulose (LC2001, Invitrogen, Ca r1sbad, CA) usando un tampón de transferencia (NP0006-465029, Invitrogen, Ca r1sbad, CA) a 30 V durante 1 hora. Las membranas se bloquearon en leche en polvo libre de grasa al 10 % (Nestle, Glendale, California) en TBS-T durante la noche a 40 C. Tras varios lavados en TBS-T a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con ratón monoclonal anti-p-STAT3 Ab (SC-8059, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), que se diluyó 1:1000 en TBS-T durante 4 horas a 40 C en un agitador orbital. Tras varios lavados, las membranas se incubaron con IgG-HRP de mono anti-ratón (1:1000) (SC-2318, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a temperatura ambiente durante 2 horas en un mezclador orbital. Tras varios lavados, se detectaron las muestras usando Reactivos para detección ECLplus de Western Blot y un kit de análisis (RPN2108, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) tras el protocolo del fabricante y visualización por exposición a film ECL. Las membranas se retiraron de Ab sumergiéndolas en 100 mM de DTI, 2 % de SDS, 62,S % de mM TrisHCI, pH 6.7 a 1000 C durante 30 minutos con agitación. A continuación, se lavaron las membranas en TBS-T y se bloquearon durante la noche con la leche en polvo libre de grasa al 10 %. Las membranas se lavaron e incubaron con anti-STAT3 (1 :1000) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) en TBS-T durante 2 horas a 40 C, se lavaron 5 veces seguido de incubación de 1 hora con IgG-HRP de cabra anti-ratón (1 :1 000) (SC2030, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y se detectaron usando ECLplus. Todas las membranas se retiraron de forma rutinaria y se volvieron a sondar con $TAT3 para demostrar la presencia de proteina STAT3.

Los resultados mostraron que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 bloquearon la fostorilación mediada por IL-6 de stat3, un componente clave en la vía de señalización de IL-6 (Figuras 5A y 5B). El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe la fosforilación de stat3 inducida por IL-6/sIL-6R. La fostorilación de stat3 inducida por IL-6fsIL-6R recombinante humana se detectó en células THP-1 (Figura 5B). La adición de 10 jJg/ml de anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 (AME-19A) o anticuerpos quiméricos anti-IL-6 inhibió por completo la fostorilación de stat3 (Figura 58). La Figura 5A muestra la presencia de una cantidad similar de proteína stat3 no fosforilada e todas las muestras, correspondiendo a los diferentes clones de anti-il-6 de ingenieria humana. En este documento, CNT0328 (o 328) designa los anticuerpos quiméricos, humano-murino {también denominados tipo silvestre (WT)), 150 designa clan AME-22a, 143 designa clan AME-23a, 140 designa clan AME-20b, 136 designa clan AME-19a, 130 designa clan AME-18a, 106 designa clan AME-A 16, 104 designa clan AME-A9.

Eficacia in vivo de anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana

La eficacia del anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 se evaluó en dos modelos in vivo diferentes. Primero, se testaron los efectos del anticuerpo IL-6 de ingenieria humana y quimérico y se compararon en un ensayo de angiogénesis en Matrigel de inducción de IL-6 humano en ratones. En el tampón de Matrigel se incluyeron 200 ngfml de IL-6 humano. A cada uno de los ratones se inyectaron dos tampones Matrigel. Grupos de seis ratones recibieron una inyección Lv de 1, 3, 06 mgfkg de anticuerpo anti-IL-6 de ingenieria humana o quiméricos. Se administró PBS o un isotipo de control mAb también a los grupos de control. Se retiraron los tampones el dia 7 y se midió la angiogénesis en base al conten ido de hemoglobina, longitud de microvasos, y número de microvasos en los tampones. Los resultados demostraron que e11L-6 humano (grupo PBS) estimulaba la angiogénesis en el modelo de tampón de Matrigel según las medidas de los tres para metros.

El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe el número medio de microvasos en tampones de Matrigel. Además, el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe la longitud media de los microvasos en tampones de Matrigel. Además, el anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe el nivel de hemoglobina en tampones de Matrigel.

Además, tanto los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana (AME-19A) como quiméricos inhibieron de forma dependiente de la dosis la angiogénesis mediada por IL-6 en ratones. Finalmente, los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana y quiméricos exhibieron una actividad comparable en la inhibición de angiogénesis inducida por IL-6 a 6 mglkg, la mayor dosis testada. Aunque los anticuerpos anti-IL6 quiméricos inhibieron de forma significativa la angiogénesis humana inducida por IL-6 a 3 mg/kg de la forma medida por la longitud de los vasos y el número de vasos, no se detectaron diferencias estadrsticamente significativas entre los anticuerpos anti-IL-6 de ingenieria humana y quiméricos en esas dosis.

Se desarrolló otro modelo in vivo para evaluar en mayor medida el efecto del anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana sobre la producción en ratones Balb/C de proteina A amiloide de suero (SAA) en un reactivo de fase aguda inducido por IL-6 humano. Los ratones recibieron una administración i.p. 0,01, 0,5 o 5 mgfkg de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 4 horas antes de la administración i.v. de 5 ¡Jg/kg de IL-6 humano (Figure 6). Se usó como control PBS y control mAb de isotipo. Los niveles de suero SAA se determinaron a 16 horas tras la inyección de IL-6. Tanto los anticuerpo s anti-IL-6 de ingenieria humana como los quiméricos inhibieron de forma significativa la producción de SAA humano inducido por IL-6en ratones BalbfC a 0,5 y 5 mg/kg, y el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibió de forma significativa la producción de SAA a la dosis más baja testada. De todas formas, no se observaron diferencias estadísticas significativas entre los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana y quiméricos en las tres dosis testadas (Figura 6).

La Figura 6 muestra que el anticuerpo de ingenieria humana anti-IL-6 inhibe la producción de SAA humano inducido por IL-6. Cada punto representa el valor medio de SAA para cada animal y la linea representa la media de todos los puntos de datos para cada grupo. Se llevó a cabo la comparación por pares y se usaron intervalos de confianza de Tukey simultáneos al 95 % para controlar el error tipo I general. (" p<O,001, ·p<O,05).

Ejemplo 5 -Razones terapéutícas para mAb anti-IL-6

Artritis reumatoide. Efecto de mAb anti-IL-6 sobre artritis inducida por colágeno ICIAl -modelo animal de artritis reumatoide Modelos de enfermedad in vivo precHnicos

Se ha buscado IL-6 en varios modelos in vivo. O bien se usó el anticuerpo rata anti-ratón IL-6 en modelos murinos estándar o anti-IL-6R humanizado (80koa) mAb (MRA; Chugai) en modelos de primates y en el modelo SClo humanofratón. En artritis murina inducida por colágeno (CIA), anti-IL-6 fue eficaz en la prevención de la enfermedad si se usó de forma temprana (dia °o 3 tras la inmunización por colágeno), pero no en puntos más tardlos. En el modelo de transplante humanolratón SClo, en el que se transplanta tejido sinovial humano a ratones inmunodeficientes, el tratamiento por MRA produjo una contracción de implantes del tejido y redujo las células inflamatorias y osteoclastos. En CIA en monos cynomolgus, MRA inhibió el desarrollo de artritis y mejoró las medidas en fase aguda.

El efecto de un anti-ratón IL-6 mAb sustituto sobre el desarrollo de la enfermedad se ha evaluado en un modelo de CIA. Los resultados indican que la administración i.p. del anti ratón IL-6 a 1 mglratón/semana antes de la inducción de la enfermedad suprimió de forma significativa el desarrollo de la artritis inducida por colágeno como refleja la clara reducción en la gravedad de la enfermedad. Se indujo artritis a ratones d 8 semanas de edad tipo DBN1 LacJ con 100 ¡Jg de colágeno bovino tipo 11 en adyuvante de Freund completo (FeA) de forma intradérmica en la base de la cola. Se monitorizó cHnicamente a los ratones diariamente durante la aparición de la enfermedad. Se administró antiIL-6 mAb o control de isotipo mAb i.p. 2 días antes de la inducción de CIA y a continuación semanalmente 1 mg/ratón. Los marcadores de artritis se determinaron en base a la inflamación, eritema y desfiguración articular.

Los datos histopatológicos confirmaron la observación clínica de que la inyección semanal i.p. de mAb anti-ratón IL-6 mejoraron de forma significativa los parámetros de artritis inducida por colágeno. Todos los parámetros de artritis que se examinaron, incluida la respuesta inflamatoria (sinovitis y formación de pannus) y los cambios erosivos (erosiones y estructura articular general) mejoraron de forma significativa en ratones tratados con IL-6 anti-ratón en comparación con los animales de control tratados con mAb. El mAb anti-IL-6 suprimió la artritis a un nivel histopatológico. La sinovitis se marcó en base al espesor de la membrana sinovial; la formación de pannus se marcó en base al alcance del pannus en relación con el espacio articular; y las erosiones se marcaron en base al alcance en el cartilago y el hueso subcondral. La pérdida de proteínas de matriz del cartrlago se redujo de forma significativa en ratones tratados con IL-6 mAb anti-ratón. Se examinaron secciones articulares representativas obtenidas a partir de animales de control y tratados con anti-IL-6 mAb al final del estudio (dia 53) por medio de Toluidine Blue con tintado para la matriz del cartilago.

El análisis por Micro-CT apoyó la observación cHnica de que el efecto de la terapia anti ratón IL-6 se ejerció a nivel de la progresión de la enfermedad dentro de la articulación individual. La inspección visual de imágenes típicas 3D Cl indica el marcado grado de cambios erosivos que se producen en el grupo tratado por mAb del control de isotipo en comparación con los cambios inflamatorios del tejido blando predominantemente leve. Los experimentos se llevaron a cabo con animales representativos tratados con mAb de control y animales tratados con IL-6 mAb antiratón.

LUpUS. Efecto de anti-IL-6 sobre ratones NZSAV F1

Modelos de enfermedad pre-clínicos in vivo

Existen modelos murinos para SLE y tienen estrechas similitudes con la enfermedad humana. Los estudios de cadenas de MRUlpr y NZS/W F1 han demostrado hiperproliferación de células S, producción de anticuerpos y deposición de complejos inmunes que tienen un gran parecido con la enfermedad humana. Se ha demostrado que anti-IL-6 mAb es eficaz en la inhibición de la producción de autoanticuerpos, reduciendo la proteinuria y mejorando la supervivencia animal en ratones NZSAV F1.

Se ha estudiado en ratones NZBIIA' F1 el efecto de un anti-ratón IL-6 mAb sustituto sobre el desarrollo de la enfermedad del lupus. Los resultados preliminares han demostrado que la administración i.p. dellL-6 mAb anti-ratón a I mg/ratón/semana for 22 semanas ha suprimido la producción de autoanticuerpos anti-dsADN, un autoanticuerpo patógeno principal en este modelo de enfermedad (Figura 7). Los niveles de autoanticuerpo anti-dsADN en animales tratados con anti-IL-6 mAb fueron más bajos de forma uniforme a lo largo de todo el estudio en comparación con los animales tratados con salino y Ab de control.

Como se ha indicado, la Figura 7 muestra la inhibición de la producción de anticuerpos anti-dsADN por anti-IL-6 mAb en ratones NZSAY F1. Un valor Individual de 0.0. para cada una de las muestras se normalizó a un suero de control positivo y se presentó en forma de % de control positivo. Cada uno de los grupos representa el % de control positivo de cada muestra y la línea representa la media de todos los puntos de datos de cada uno de los grupos. Una diferencia significativa se indica en forma de • p<O,01.

Además, el mAb anti-IL-6 inhibió la proliferación de células S y redujeron los daños renales cuando se examinó un pequeño subconjunto de los animales. Mientras que no hubo diferencias significativas en la proliferación de células T entre los diferentes grupos de tratamiento al final del estudio, la proliferación de células S inducida por anti-lgM y anti-CD40 fue más baja en ratones tratados con anti-IL-6 mAb en comparación con los tratados con salino en el tiempo. especifica mente, tras 34 semanas. Este resultado es coherente con la reducción de la producción de anticuerpos anti-dsADN que se han informado anteriormente y sugiere que las células S auto reactivas podrían ser los objetivos directo y dominante dellratamienlo anti-IL-6 mAb.

El análisis histopatológico indicó que los animales del estudio podrían categorizarse en 3 grupos de gravedad de la enfermedad renal (leve, moderada y grave) (Tabla 9). La patología de enfermedad renal en ratones NZSIIA' F1 indican hiperplasia linfoide mezclada y deposición de complejo inmune en la membrana de base glomerular.

Los animales tratados con anti-IL-6 mAb desarrollaron enfermedad renal menos grave. La hiperplasia linfoide mezclada perivascular y la deposición de proteínas estaban ausentes en los animales tratados con anti-IL-6 mAb mientras que los animales tratados con salino Ab de control desarrollaron hiperplasia linfoide mixta perivascular moderada y grave. Además, la deposición de complejo inmune en la membrana de base glomerular fue leve en los animales tratados con anti-IL-6 mAb en comparación con los de los otros dos grupos de tratamiento. La disección del mecanismo de acción de anti-IL-6 mAb sobre S, T Y funciones de célula macrófaga se lleva a cabo porque estas células juegan un papel fundamental en la patogénesis de SLE.

Diabetes Mellitus de Tipo II

Se ha indicado que IL-6 juega un papel importante en el desarrollo de resistencia a la insulina asociada con obesidad. De todas formas, los datos in vitre e in vivo generados hasta el momento tanto apoyan como contradicen su papel potencial en la resistencia a la insulina.

Experimentos in vitro

Se han llevado a cabo experimentos pa ra entender mejor los efectos que podria tener IL-6 sobre la señalización de insulina y sobre los efectos y función biológica de la insulina, como la absorción de glucosa, regulación genética y mecanismos relacionados usando modelos in vitro de tejidos que respondan a la insulina (células 3T3 LI para tejido adiposo, células HepG2 para células hepáticas, células C2C12 para músculo esquelético) y modelos in vivo de resistencia a la insulina y T2DM, como ratones dbfdb.

Los datos in vitro sugieren que IL-6 ejerce su efecto principal en la señalización de insulina en el hígado. El tratamiento con IL-6 de las células HepG2 produce la inhibición de fosforilación de Akt inducida por insulina. Este efecto inhibitorio de IL-6 sobre la señalización de insulina se ve bloqueado por un anticuerpo anti-IL-6. Los cambios del metabolismo de glucosa y los efectos de la insulina en el higado se ha sugerido que son los factores del desarrollo de la resistencia a la insulina y el T2D. Los efectos de IL-6 sobre la señalización de insulina en células 3T3 LI (linea celular de adipocito) y C2C12 (lineas celulares de músculo esquelético) se examinan para determinar los mecanismos de IL-6 sobre T2D.

3T3 L 1. Se llevaron a cabo experimentos usando linea celular de adipocito de ratón 3T3 L 1. Se evaluó en células 3T3 L 1 diferenciadas al 90 %, el efecto de IL-6 sobre la absorción de glucosa inducida por insulina. En estos experimentos, el tratamiento con 10 ngfml of TNFo durante 24 horas inhibe de forma constante la absorción de glucosa inducida por insulina, mientras que 20 ngfml de IL-6 no tuvieron efecto. Estos datos sugieren que la actividad de IL-6 sobre el tejido adiposo no es el mecanismo principal de la resistencia a la insulina mediada por IL-6, sino que el tejido adiposo podria ser una fuente principal de IL-6 que interfiere con la sensibilidad a la insulina en el higado y el músculo. Se obtuvieron los mismos datos usando adipocitos humanos primarios diferenciados a partir de depósitos subcutáneos. Los efectos de IL-6 sobre la absorción de glucosa usando adipocitos prima rios humanos a partir de un depósito de grasa visceral se investigan porque dicho depósito podría ser más relevante para la resistencia a la insulina asociada a la obesidad.

HepG2. Las células HepG2 se eligieron como representante in vitro del tejido del hígado. Las células HepG2 son lineas celulares de hepatoma humano de las que se ha mostrado previamente el efecto de IL-6 sobre la señalización de insulina. En los experimentos, 20 ngfml de IL-6 bloquearon la fosforilación de Akt inducida por insulina, una quinasa crucial en la vía de señalización de la insulina, y el efecto máximo se observó tras 60 minutos de incubación; esto es coherente con los resultados informados en la bibliografía cientifica.

La fosforilación de Akt sobre células HepG2 sUb-confluyentes en placas de 10 cm se midió tras incubación de rh IL-6 (20 ngfml) durante 30, 60, 90 Y 120 minutos. Durante los últimos 5 minutos de incubación, se añadieron 0,5 nM, 1 nM y 5 nM de insulina para inducir la fosforilación de Akl. Las células se lisa ron usando tampón de lisado RIPA mod ificado y la fosforilación Akt se midió usando ELlSA Ser-Fosfo-Akl. Se obtuvieron resultados usando kits ELlSA pAkt y Akt (BioSource). Pasados 60 minutos de tratamiento IL-6, en presencia de una concentración fisiológica de insulina (0,5-1 nM), se inhibió la fosforilación de Akt -50 % en comparación con el grupo de control. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA.

Efectos del anticuerpo IL-6

Se midió la capacidad del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 para inhibir los efectos de IL-6 sobre la fosforilación de Akt inducida por insulina. 20 jJgfml de anticuerpos de ingenieria humana anti-IL-6 pudieron inhibir los efectos de IL-6 en células HepG2. Las Figuras 8A y 88 muestran el efecto de IL-6 en presencia y ausencia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 sobre la fosforilación de Akt inducida por insulina.

En la imagen superior, (Figura 8A), los datos representan la media +f-SEM. (-Significativo en comparación (+) insulina, IL-6, P=0,029; •• Significativo en comparación con (+) insulina +IL-6, P= 0,02). Las células HepG2 subconfluyentes se trataron con 20 ngfml de IL-B durante BO minutos. Durante los últimos 5 minutos de tratamiento, se añadió 1 nM de insulina y las células se lisaron usando tampón RIPA modificado. Las muestras se analizaron por ELlSA que detecta la fosforilación a Ser 473 de Akl. Todos los datos se nonnalizaron a Akt total medido por ELlSA. El trata miento AME-19a pudo restaurar la señalización de Akt nonnal.

En la imagen inferior (Figura 8B), se muestra un westem blot representativo. Las bandas superiores incluyen muestras tratadas con IL-6 (20 ngfml, 60 min, 5 min con 1 nM de insulina), AME-19a (20 ugfml +f-IL-6 a 20 ngfml durante 60 minutos, 5 minutos con 1 nM de insulina) o tampón. Se sondó el blol con anticuerpo anti-fosfo SerfAkt (panel superior) (pS473, Biosource). Las bandas inferiores (el mismo blol se retiró y re-sondó con anti-Akt de Bio Source) demuestran que se cargó por cada carril una proteina equivalente.

Método: se cultivaron células HEPG2 en 100 mm de placas de cultivo de tejido hasta su confluencia. Las células se dejaron durante la noche en DMEM-1 % BSA. AME-19a (20 ugfml) se incubó en células durante -30 minutos antes de la adición de IL-B. IL-B (20 ngfml) +f-AME-19a (20 ugJml) se incubaron durante -30 minutos antes de la adición a las células. Las mueslras se incubaron en células durante 60 minutos, a 3r C; a continuación se añadió 1 nM de insulina (concentración final) a las células durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Las células se lavaron inmediatamente con 3 enjuagues de PBS helado. Las placas se congelaron hasta el lisado. El Fosfo Akt y el Akt total se determinaron usando kits ELlSA (BioSource y Sigma). Referencia: JJ Senn, PJ Kover, lA Nowak y RA Mooney. Interleukin 6 induces cellular insulin resistance in hepatocytes. Diabetes. [La interleuquina 6 induce la resistencia celular a la insulina en hepatocitos. Diabetes] 51 :3391-3399, 2002.

Hepatocitos primarios en ratas

Los hepatocitos primarios representan un sistema in vitro más relevante adecuado para inspeccionar el efecto de IL6 y anticuerpos anti-IL-6 (u airas antagonistas de IL-6) sobre la señalización de insulina y el efecto de la insulina sobre la producción de glucosa en higado. Para detenninar la activación de cinasa PI3 (PI3K) en hepatocitos de rata tratados con insulina, se trataron células aisladas IL-6 yfo IL-6 mAh con insulina en presencia y ausencia de 5 ngfml IL-6 y la fosforilación del receptor de insulina, IRS-1 (Figura 12A), y Akt (Figura 12B) se determinaron usando ensayos ELlSA y análisis Westem blol. Además, se examinaron los efectos de IL-6 sobre asociación estimulada por insulina IRSlfp85 (Figuras 11A y B). Los experimentos se llevaron a cabo de la siguiente manera: Se equilibraron hepatocitos primarios de rata (de -2 meses) en 6 placas recubiertas con colágeno durante la noche en un medio de Hepatocima. El dia siguiente, se mantuvieron las células durante 6 horas en un estreptococo DMEM

1 % BSA-penn; a continuación se incubaron con h1L-6 (5 ng/ml ); anticuerpo anti-IL-6 (AME-19a) (20 ng/ml ) o anticuerpo anti-IL-6 (AME-19a) +hIL-6 durante 90 minutos a 3r C. Las células se pretrataron durante 1 hora con anticuerpo anti-IL-6 (AME-19a) antes de afiadir la combinación. La combinación también se preincubó antes de afiadirla a las células. Se afiadieron 5 nM de insulina (de BioSource) a las células durante 5 minutos; a continuación se aspiraron las células y se lisa ron inmediatamente con tampón de extracción BioSource + inhibidores de proteasa. Los lisados se centrifugaron y los supemadantes se diluyeron 1 :10 y se inspeccionaron en ELlSAs (de Biosource).

Asociación IRSl/p85:

Se incubaron durante la noche cantidades equivalentes de proteina (45 IJgl con 2 IJg de anticuerpo polidonal antiIRS-1 (de Upstate, Elemento #06-248). A continuación se inmunoprecipitaron las muestras con gotas de prote¡na A durante 1 hora y se eluyeron con 3x de tampón de muestra para SOS-PAGE. Las muestras IP se pusieron en 4-12 % de gel SDS-Page y a continuación se transfirieron a membrana para anál isis por Westem blol. Las membranas se sondaron con: (1) 1:100 dilución de p8S mAb (de Upstate, Elemento #05-217) para p85 asociado con IRS-1, por ejemplo, el PI3K activo (como se muestra en la FIG. 11 A); Y (2) 1 :600 de dilución de IRS-1 mAb (de BO Biosciences, Elemento #611395) para IRS-1total como control de carga (como se ve en la FIG. 11B).

Los datos indican que el tratamiento IL-6 provoca una disminución de la fosforilación inducida por insulina de IR, IRS-1 y Akl. Este efecto de IL-6 se abolió cuando las el anticuerpo anti-IL-6 (clone AME-19a) penetró las células. Además, IL-6 inhibió la asociación de pa5 (subunidades de PI3K) inducida por insulina con IRS-1. Again, this effect of IL-6 was inhibited by pretratamiento with anticuerpo anti-IL-6.

Experimentos in vivo

Los efectos de IL-6 sobre la sensibilidad a la insulina no se han experimentado ampliamente en animales. Para evaluar si la terapia anti-IL-6 mejoraria la sensibilidad a la insulina y T2DM, se trataron ratones dbfdb y machos C57fB16 con dieta con altos niveles de grasa con anticuerpo comercial anti-ratón IL-6 (obtenido de R&D Systems).

Ratones dbldb

Los efectos del tratamiento anti IL-6 se inspeccionan usando ratones dbfdb de diferentes edades. Los ratones entre 8-10 semanas de edad se caracterizan por hiperinsulinemia y resistencia a la insulina, representando los estadios iniciales de la enfermedad, mientras que los ratones de 12-14 semanas de edad se caracterizan por niveles de glucosa elevados, además de hiperinsulinemia, representando los estadios avanzados de T2DM. Ambos grupos de edad de los ratones se usan para investigar la capacidad de la terapia anti IL-6 para mejorar la sensibilidad a la insulina y el control glucémico en test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT).

Los ratones db/db tienen señalización de leptina no funcional debido a la mutación dentro del receptor de leptina. Estos ratones desarrollan obesidad, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina al envejecer los ratones, y los primeros sintomas se detectarian cuando los ratones tuviesen 6-8 semanas. Se trataron dos grupos de ratones de diferentes edades -8 Y 12 semanas -con 5 mgfkg de anti IL-6 mAb y se llevó a cabo un test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT) un dia y 7 d¡as tras el tratamiento. El calendario de tratamiento se ve en la Figura 15.

En animales de 8 semanas de edad, el tratamiento con anti IL-6 mAb no tuvo efecto sobre la eliminación de glucosa durante GTT. El tratamiento anti IL-6 mAb provocó una mejora en la tolerancia a la glucosa (GT) en animales de 12 semanas de edad, aunque el efecto no fue significativo estadistica mente (p=0,063). Esta mejora en GTT se vio el dia 7 tras el tratamiento. Además, se analizaron muestras de suero antes y después de completar el estudio para ver sus perfiles de adipocina y adiponectina. Los niveles de IL-6, TNFa y MCP-1 estaban por debajo de los niveles de detección. Estos datos, conjuntamente con los resultados de ipGTT podr¡an sugerir que: los animales db/db no son un buen modelo para el estudio de los efectos de anti IL-6 sobre la resistencia a la insulina; y los niveles de tejido IL6 son más relevantes para un posible papel de IL-6 en el desarrollo de T2DM resistente a la insulina.

Obesidad inducida por la dieta fDIOl -Modelo animal para resistencia a la insulina y obesidad

Se alimentó a ratones macho C57/B1 con una dieta que incluye un 60 % de grasa durante 20-35 semanas. Desarronaron obesidad (el peso corporal medio era de 50,5 gramos) y un aumento en los niveles de glucosa de en ayunas (FBG >145 mgfdl). Además, se deterioró su GT. Los animales DIO se trataron con 10 mgfkg de anti IL-6 Ab murino (R&D Systems). Globalmente, recibieron 50 mgJkg de anti IL-6 mAb durante 3 semanas. Se llevó a cabo ipGTT tras las 2 primeras dosis (d¡a 5), tras la 48dosis (dias 12 y 16) Y tras la 58 dosis (d¡a 23). Al mismo tiempo, se obtuvo sangre para medir las adipocitoquinas yadiponectina.

El tratamiento anti IL-6 no mejoró los niveles de tolerancia de glucosa los dias 5 y 12; pero cuando se llevó a cabo los dias 16 y 23, se observó una mejora en la eliminación de glucosa asi como en la excursión de niveles de glucosa. Esta mejora alcanzó significación estad¡s!ica a 39, 60 Y 90 minutes durante GTT.

En otro grupo de experimentos, se trató a animales DIO semanalmente (2 dosis durante la primera semana y 1 dosis cada semana durante las 4 semanas siguientes) con 10 y 20 mgfkg de anti IL-6 Ab Y 20 mgfkg de IgG de control de isotipo vía I1Jta i.p. Se llevaron a cabo perfiles HOMA-IR (tras 2, 4 Y 6 semanas de tratamiento), ipGTI, iplTT Y adipocina (tras 6 semanas de tratamiento).

Análisis HOMA-IR sobre animales DIO tratados con antí-IL-6 Ab:

En estos estudios, hubo una disminución en los niveles de insulina y glucosa en ayunas en animales DIO tratados con 10 y 20 mg/kg de anti-IL-6 Ab murino y control de isotipo. Los animales se purgaron y los niveles de insulina y glucosa en ayunas se detenninaron usando glucosa TracefDMA (ox) (thenno Electron Corp) y EL1SA de insulina de rata ultra sensible (Crystal Chem) , respectivamente. Estos valores se usaron para determinar HOMA-IR. El índice HOMA-IR refleja el estado de la sensibilidad a la insulina y se correlaciona bien con las conclusiones del estudio de sujeción. HOMA-IR se calcula por medio de la fórmula: (glucosa en ayunas (mM) X Insulina en ayunas {mIUfLit))/22,5 (Figuras 13 A, B Y C).

Las mejoras en HOMA-IR se observaron tras 2, 4 Y 6 semanas de tratamiento (las Figuras 13A-C muestran los datos tras 6 semanas de tratamiento). Al final del estudio, se llevaron a cabo ipGTT y iplTI. En ambos estudios, el tratamiento anti-IL-6 (20 mglml) mejoró de forma significativa la excursión y la eliminación de glucosa en comparación con animales tratados con el isotipo. Los análisis de adipocina y citoquina de muestras de suero a partir de animales de control y tratados con anti-IL-6 indicaron que la neutralización de IL-6 provocó un descenso en los niveles de IL-6 circulante y TNFa junto con la tendencia de disminución de MCP-1 y niveles de resistina. En otro grupo de datos, los niveles de adiponectina aumentaron con el tratamiento anti-IL-6.

Se llevó a cabo el aná lisis histológico de muestras de higado a partir de los grupos de tratamiento y control. Las muestras se tintaron con tinte Oil Red O para determinar el contenido lipido de las parénquimas del hígado. El contenido lipido del hígado en los animales DIO se redujo en respuesta al tratamiento con anticuerpo murino anti-IL

6.

El tintado revela que el 34 % de las muestras de hígado tratadas con el vehículo estaban relacionadas con lipidos en animales no tratados y solo un 8 % en 20 mglkg de animales tratados con anti-IL-6 (Figuras 14A-F). las Figuras 14A y D representan el grupo de control; Las Figuras 149 y E representan los animales DIO no tratados; y las Figuras 14C y F representan los animales tratados con anti-IL-6. El aumento de contenido lípido en el hígado se ha asociado con el desarrollo de resistencia a la insulina y Diabetes Mellitus Tipo 2. Asi, es posible que la neutralización de IL-6 provoque la mejora de la sensibilidad a la insulina y T2DM afectando al metabolismo lípido del hígado. Estos datos conjuntamente sugieren claramente el papel de IL-6 en la patología de la Diabetes Tipo 2 y que la neutralización de IL-6 podria mejorar la sensibilidad a la insulina.

Estudios adicionales

Se monitorizan los efectos de IL-6 en presencia o ausencia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 sobre la fosforilación IRS1 estimulada por insulina, asociación con p85/PI3K, receptores de insulina (IR) fosforilación, síntesis de glucógeno y la implicación de señalización SOCS3 y STAT en células HepG2. Otros experimentos adicionales examinan el efecto de IL-6 sobre la secreción de insulina inducida por glucosa a partir de islotes pancreáticos. Los datos publicados hasta la fecha describen tanto el efecto inhibitorio como estimulante de IL-6 sobre la secreción de insulina a partir de islotes de rata. Islotes de rata recientemente aislados (de Liefscann) se tratan con IL-6 y anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19a) en presencia o ausencia de glucosa. Se miden los niveles de insulina segregados a partir de islotes en varios tratamientos.

C2C12. Las células C2C12 se usan para estudiar el efecto de la insulina sobre el músculo esquelético. Se llevan a cabo experimentos para examinar la expresión de IRS1 y Glut4, fosforilación IRS 1 inducida por insulina y los efectos de IL-6 sobre la acción de la adiponectina.

Ventajas:

La inhibición de la actividad de IL-6 por parte del anticuerpo IL-6 del presente invento podria representar un avance terapéutico significativo porque podrá mejorar la sensibilidad a la insulina y el control metabólico sin los efectos secundarios de los productos existentes. Además, las terapias actuales apenas controlan la inflamación sistémica, que se sugiere que podria ser la causa subyacente de T2DM, y complicaciones diabéticas asociadas. Una terapia como el anticuerpo IL-6 del presente invento, además del aumento de la sensibilidad a insulina, se esperaría que inhibiese la inflamación sistémica y evitase el desarrollo de complicaciones diabéticas.

El número de pacientes afectados por T2DM está aumentando y se estima que en 2025 llegará a 300 millones de individuos. Podria usarse un anticuerpo anti IL-6 como monoterapia o en combinación con otras OAD ya existentes, como sulfonilureas, biguanidas (por ejemplo, Metphormin), tiazolidinediones, meglitinida (por ejemplo, repaglinida), inhibidores de alfa-glucosidasa (por ejemplo, acarbosa). Además, podria usarse en combinación con insulina u otras

5 10 15 20: lerapias, para mejora r la sensibilidad a insulina y conlrol glucémico y pa ra evitar los casos de hipoglucemia asociados con ellralamienlo por insulina. También se espera que además de la mejora de la sensibilidad a insulina y la regulación de los niveles de glucosa en T2D y pacientes de síndrome melabólico, la terapia anti IL-6 tuviera un efeclo beneficioso sobre los cambios de CV que se observan con frecuencia en esos pacientes. Véase: Saltiel , AR, y Kahn , CR. 2001 . Nature 414:799-806; Hansen, BC. , 1995. Diabetes Ca re [Cu idado de la diabetes] 18:A2-A9; Diabetes Prevention Program research group [Grupo de investigación del prog rama de prevención de la diabetes]. 2002. New Engl. J Med ., 346 :393-403 ; Hansen, BC. , 2000, Ann New York Academy of Science, 892 :1-24; Hsueh , WA. , y Ou inones, MJ., 2003, Am . J. Ca rdiology [Ca rdiología], 93 : 10J-17J ; Resn ick, HE and Howa rd, BV., 2002, Ann. Rev . Med., 53:245-267; Komer, J. and Aronne , L. , 2003, J elin. Invesl., 111 (5):565-570; Skoog, T. , el al., 2001. Diabetology [Diabetología], 44 :654 :655; Femandez-Real. JM., y Ricart W., 2003, Endocrine Reviews, 24(3):278-301 ; Fernandez-Real, JM. , et al., 2001 , J Clin Endocrinol Metab., 86 :1154-1159.; 10a. Fried, S. , et al., 1998. J Clin Endocrinol Melab., 83 :847-850; Senn, JJ., el al. , 2002, Diabeles, 51 :3391-3399; Rolter, V., el al , 2003, JBC in press, Manus.#301977200; 12a. Sloulhard, JM., el al., 1996, BBRC, 220 :241-245; Soulhern, C., et al. , 1990, Biochem J., 272 :243-245; Sandler, S. , et al. , 1990, Endocrinology [Endocrinolog ia], 126:1288-1294; Pedersen , BK., et al., 2001 , J Physiol., 536 :329-337; DiCosmo, BF, el al. , 1994, Inl. Immunol., 6:1829-1837; Wallenius, V., el al. , 2002, Nalure Medicine, 8:75-79; Voza rova , B. , el al. , 2003 , Human Genelic, 112:409-413 ; Kubaszek, A., et al., 2003 , Diabetes, 52 :558-461 ; Tsigos, e ., el al., 1997, J elin Endocrinol Melab, 82 :4167-4170 ; Sloulharad, JM. , el al. , 1995, Am J Physiol., 268 ;E813-E819; Kern , PA. , et al. , 2001 , Am J Physiol Endocrinol Melab., 280:E745-E751 ; Bastard, JP., el al. , 2000, J Cion Endocrinol Melab., 85:3338-3342; and Baslard, JP ., el al, 2002, J. Clin. Endocrinol. Melab., 87 :2084-2089.

25

30

35

40

45

50

55

TABLA 1 -CDRs de cadena ligera

N° DE ID DE $EC: Nombre COR* Clon ¡secuencia

N° DE ID DE SEC:I: CDRU 33 fSASHSVSYMY

N° DE ID DE SEC:2: CDRL1 33 ~GTGCCAGCCATAGTGTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC: 3: CDRU 34 ¡SASISVSYMY

N° DE ID DE SEC:4: CDRU 34 ~GTGCCAGCATTAGTGTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC:5: CDRU 35 fSARSSVSYMY

N° DE ID DE SEC: 6: CDRU 35 ~GTGCCCGGTCAAGTGTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC::7: CDRU 36 r ASYSVSYMY

N° DE ID DE SEC: 8: CDRU 36 ~GTGCCAGC TATAGT GTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC:9: CDRU 37 ¡SASSSVFYMY

N° DE ID DE SEC: 10: CDRU 37 ~GTGCCAGCTCAAGTGTATTTTACATGTAC

N° DE ID DE $ EC: Nombre F o R" Clon Secuencia

N° DE ID DE SEC: 11: jCDRLI 39 SGSSYV$YMY

N° DE ID DE SEC: 12: FoRL1 39 fGTGGCAGCTCATATGTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC: 13: FoRU O SALSSVSYMY

N° DE ID DE SEC: 14: DRLI ~O ~GTGCCCTGTCAAGTGTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC: 15: jCDRLI fA9 SASSSV$YMY

N° DE ID DE SEC: 16: ~oRU 1A9 IAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTAC

N° DE ID DE SEC: 17: FoRL2 ~1 DFSNLAS

N° DE ID DE SEC: 18: FoRL2 ~1 GACTTTTCCAACCTGGCTTCT

N° DE ID DE SEC: 19: ~DRL2 3 DLSNLAS

N° DE ID DE SEC:20: FoRL2 ~3 GACCTGTCCAACCTGGCTTCT

N° DE ID DE SEC: Nombre f: ORo Clon ¡Secuencia

N° DE ID DE $EC:21: FDRL2 4 DM$NLA$

N° DE ID DE SEC: 22: FDRL2 4 pACATGTCCAACCTGGCTTCT

N° DE ID DE SEC:23: pORL2 6 OTSNLTS

N° DE ID DE $EC:24: DRL2 6 pACACATCCAACCTGACGTCT

N° DE ID DE SEC: 25: pORL2 8 OTSELAS

N° DE ID DE SEC: 26: pORL2 8 pACACATCCGAGCTGGCTTCT

N° DE ID DE SEC:27: FDRL2 9 OT$NLA$

N° DE ID DE SEC:28: pORL2 A9 rACACATCCAACCTGGCTTCT

N° DE ID DE SEC:29: pORL3 9 MQWSGYPYT

N° DE ID DE SEC: 30: pORL3 9 ~TGCAGTGGAGTGGTTACCCATACACG

N° DE ID DE SEC: Nombre CDR* ¡Clan Secuencia

N° DE ID DE SEC: 31: CDRL3 ~O CQWSGYPYT

N° DE ID DE SEC:32: CDRL3 ~O GTCAGTGGAGTGGTTACCCATACACG

N° DE ID DE SEC:33: lODRL3 ~2 SCWSGYPYT

N° DE ID DE SEC: 34: CDRL3 ~2 CTGTGTGGAGTGGTTACCCATACACG

N° DE ID DE SEC: 3 5: lODRL3 f"9 SQWSGYPYT

N° DE ID DE SEC:36: CDRL3 f"9 CTCAGTGGAGTGGTTACCCATACACG

N° DE ID DE SEC: 138: DRL3 11 . QQWSGYPYT

CDRs como los definidos por Kabat con la excepció n del CDRH1, que es la suma de las definiciones de Raba! y Chothia.

TABLA 2 -Cadena pesada CDRs

N° DE ID DE SEC: Nombre CORo Ion Secu e ncia

N° DE ID DE SEC:37: CDRHI GFTFSSFALS

N° DE ID DE SEC: 38: CDRHI GGATTCACCTTTAGTAGCTTTGCCCTTTCT

N° DE ID DE SEC:39: CDRH1 ~ GFTF$PFAM$

N° DE ID DE SEC:40: CDRHI ~ GGATTCACCTTTAGTCCTTTTGCCATGTCT

N° DE ID DE SEC:41: CDRHI ~ GFQFSSFAMS

N° DE ID DE SEC: 42: CDRHI ~ GGATTCCAGTTTAGTAGCTTTGCCATGTCT

N° DE ID DE SEC:43: CDRHI ~ GFTTSSFAMS

N° DE ID DE SEC:44: CDRHI ~ GGATTCACCACTAGTAGCTTTGCCATGTCT

N° DE ID DE SEC:4S: CDRHl p+P GFQFSPFAMS

N° DE ID DE SEC:46: CDRHI p+ P GGATTCCAGTTTAGTCCTTTTGCCATGTCT

N° DE ID DE SEC:4?: CDRHI ~9 GFTFSSFAMS

N° DE ID DE SEC:48: CDRHI ~9 GGATTCACCTTTAGTAGCTTTGCCATGTCT

N° DE ID DE SEC:49: CDRH2 10 KASSGGSYTYVPOTVTG

N° DE ID DE SEC:50: CDRH2 10 AAAGCGAGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGA CACTGTGACGGGC

N° DE ID DE SEC: 51: CDRH2 11 KISSGGSYEYYPDTVTG

N° DE ID DE SEC: 52: CDRH2 11 ~~AGTAGTGGTGGGAGTTACGAGTACTATCCTGA CACTGTGACGGGC

N° DE ID DE SEC

N° DE ID DE SEC: 53

N° DE ID DE SEC: 54

N° DE ID DE SEC: 55

N° DE ID DE SEC: 56

N° DE ID DE SEC: 57 N° DE ID DE SEC: 58

N° DE ID DE SEC:59

N° DE ID DE SEC: 60

N° DE ID DE SEC: 61

N° DE ID DE SEC: 62

Nombre COR*

CDRH2

Clon

,.

P +W -+-S (18a, 19a)

P +W + S (18a,

19a)

1"9 1"9

Secuencia

KISSGGSYYYYPDlVTG

~TTAGTAGTGGTGGGAGTTACTATTACTATCCT

GA

CACTGTGACGGGC

KISSGGSWTYYPDlVTG

~TTAGTAGTGGTGGGAGTTGGACCTACTATCCT

GA CACTGTGACGGGC

KISPGGSYTYYPDTVTG

~TTAGTCCGGGTGGGAGTTACACCTACTATCCT

GA

CACTGTGACGGGC

K1SPGGSWTVY$DTVTG

~TTAGTCCGGGTGGGAGTTGGACCTACTATTCT

GA CACTGTGACGGGC

KISSGGSYTYYPDlVTG

~:rAGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCT

GA CACTGTGACGGGC

N° OE 10 OE SEC: Nombre COR* ~I on Secuencia

N° DE ID DE SEC: 113: CDRH2 lA"· EISSGGSYTYYPDTVTG

N° DE ID DE SEC ·~3: CDRH2 17 KISSGGSYTYFPOTVTG

N' DE ~EC,64 ID DE: CDRH2 17 ~~AGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTTTCCTGA CACTGTGACGGGC

N° DE ID DE SEC ·~5: CDRH2 19 KISSGGSYTYYPDTVAG

N° DE ID DE SEC :~6: CDRH2 19 AAAATTAGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGA CACTGTGGCTGGC

N' DE ID DE ~EC'67: CDRH2 ~O KISSGGSYTYYDDTVTG

N° DE ID DE SEC :~8: CDRH2 ~O ~~AGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATGATGA CACTGTGACGGGC

N° DE ID DE SEC ·~9: CDRH2 ~1 KISSGGSYTYYSDTVTG

N' DE ID DE ~EOO: CDRH2 ~1 ~~AGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATTCTGA CACTGTGACGGGC

~~ DE ID DE SEC ·: CDRH2 ~2 KISSGGSYTYYPDTVTP

N' DE ~E02 ID DE: CDRH2 ~2 ~~AGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGA CACTGTGACGCCG

N' DE ID DE ~E03: CDRH2 ~3 KISSGGSYTYYPDTDTG

~; DE ID DE SEC :CDRH2: 3 ~~AGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGA CACTGATACGGGC

N° DE ID DE $EC: Nombre COR* leIon Secuencia

N° DE ID DE SEC: 5: CDRH2 P + S 20b, 23a) KISPGGSYTYVSDlVTG

N° DE ID DE SEC: 6: CDRH2 P + S 20b, 23 al ~:rAGTCCGGGTGGGAGTTACACCTACTATTCTGA CACTGTGACGGGC

N° DE ID DE SEC: 7: CDRH2 p + W + D 22a) KISPGGSWTYYDDlVTG

N° DE ID DE SEC: 8: CDRH2 P + W + D 22a) ~TTAGTCCGGGTGGGAGTTGGACCTACTATGATGA CACTGTGACGGGC

N° DE ID DE SEC: 9: CDRH3 ~5 QLWGSYALDY

N° DE ID DE SEC: O: CDRH3 ~5 CAGTTATGGGGGTCGTATGCTCTTGACTAC

N° DE ID DE SEC: ~1: CDRH3 ~6 QLWGYVALDT

N° DE ID DE SEC: ~2: CDRH3 ~6 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACACG

N° DE ID DE SEC: 3: CDRH3 ~9 QLWGlYALDY

N° DE ID DE SEC: ~4: CDRH3 F9 CAGT TATGGGGGAC T TAT GC TeT T GAG TAG

N° DE ID DE SEC: 5: CDRH3 pO QLWGNYALDY

N° DE ID DE SEC: 6: CDRH3 pO CAGTTATGGGGGAATTATGCTCTTGACTAC

N° DE ID DE SEC: Nombre CDR* Clan Secuencia

N° DE ID DE SEC : 7: CDRH3 31 QLWGYYALDF

N° DE ID DE SEC : ~8: CDRH3 31 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTTT

N° DE ID DE SEC: 9: CDRH3 32 QLWGYYALDI

N° DE ~EC,90 ID DE: CDRH3 32 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACATT

N' DE ID DE fEC'91: CDRH3 ~9 QLWGYVALDY

N' DE ID DE ~EC,92: CDRH3 1'9 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTAC

N° DE ID DE SEC : 114: CDRH3 ~It. GLWGVYALDY

CDRs según la defi nición de Kabat con la excepción de CDRH 1, que es la suma de las definiciones d Kabal y Cholhia

TABLA 3 -Mutaciones a partir de bibliotecas de CDR individual

Io n: CDRH1 Ion IcDRL1

M34L: 3 ~27H

S31P: 4 ~271

28Q: 5 ~26R

F29T: 6 ~27Y

7: ~30F

lone: CDRH2 8 ~271

10: 151A 9 !'>5G.S28Y

11: ~57E O ~26L

12: ~57Y

14: Cf56W Clone F ORL2

16: S52aP 1 51F

17: 59F 3 51L

19: ~64A 4 1r51M

O: P60D 6 r-55T

1: P60S 7 ~51L

2: G65P 8 N53E

5: 123

~I on

~5

15: ~6

~7

129

25: ~O p1

~2

~63D

CDRH3

"99S " ' 02T

99S "99T "99N

102F

" ' 021

Clon

~9

50 52

Clon

CDRL3

Q89M

Q89C

Q90C

CDRL3

TABLA 4 -Mutaciones incluidas en la biblioteca combinatoria

CDRH1: CDRH2 CDRH 3 CDRL1 CDRL2 CDRL3

28Q: S52aP Y102F S271 51F Q89M

S31 P: "56W 1021 S27Y 51M

P60S

~63D

TABlA5A

Clones de biblioteca positiva

Ligero Pesado

COR-->: L 1 L2 L3 H1 H2 H3

WT--> CNT032B: S 27 T 51 Q B9 T S 2B 31 ES Y 50 52a 56 P 60 V 63 G 95 Y 102

Clan

AME -A9 AME-16: S S K K P Q Q

AME-1Ba AME-19a AME-20b AME-22a AME-23a: I F 1M I M M I M M Y F M Y M M Q p I K P W P K P W Q K P Q P K P W Q K P S S S S I Q Q Q O Q Q I I I F F

TABLA 5B -clones de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 y CDRs correspondientes

CDR-->: LI L2 L3 HI H2 H3

AME·A9: ID DE SEC: 15 ID DE SEC:27 ID DE SEC:35 ID DE SEC:47 ID DE SEC: 61 ID DE SEC:91

AME-16: ID DE SEC: 15 ID DE SEC:27 ID DE SEC: 3 5 ID DE SEC: 47 ID DE SEC:57 ID DE SEC:91

AME-18a: ID DE SEC: 15 ID DE SEC: 17 ID DE SEC:29 ID DE SEC:45 ID DE SEC:59 ID DE SEC: 89

AME-19a: ID DESEC: 3 ID DE SEC:21 ID DE SEC: 29 ID DE SEC: 39 ID DE SEC: 59 ID DE SEC: 89

AME-20b: ID DESEC: 3 ID DE SEC: 21 ID DE SEC:29 ID DE SEC:41 ID DE SEC:75 ID DE SEC: 89

AME-22a: ID DESEC: 7 ID DE SEC: 17 ID DE SEC: 29 ID DE SEC:45 ID DESEC: 77 ID DE SEC: 87

AME-23a: ID DESEC: 7 ID DE SEC: 21 ID DE SEC: 29 ID DE SEC:41 ID DE SEC: 75 ID DE SEC: 87

Tabla 6 -Valores ECso

F'on: EC"

F NT0328: ,7 x 1011 M

I"ME.19a: ,7 , 1 0.12 M (mejora en umentos de 10)

TA BLA 7 -Constantes cinéticas para 19Gs de Anti-IL-6

)0": Concentración de n~~uerposI,p. 5 ~.) asa de mejora en comparación on los ab uiméricos) "(M·1 Sec·1) asa de mejora 1 koll (sec·1 ) calculad'o) 1,3 x 10-5 asa de mejora 1

nticuerpos uméricos: 1 .4 x 106

ME·16: 1 ~, S3 ,6 1 x 106 ,22 ,3 x 10. 7 15,7

ME·18a: r,5 ~, 1 2 5 12x 101 ,4 .4 x 10~ 5,4

ME·19a: r,5 ~, 037 1,1 5,5 x 106 1,2 x 10.1 5

ME·20b: 1 ~, 7S ,S ,7 x 106 1 3,7 x 10~ 3,5

ME-22a: 1 ~,18 16,7 ~ x 106 1,3 1 ,1 x10~ 11 ,8

ME·23a: 1 ,006 00 7,4 x 106 1,6 .4 x 10~ 95

Tabla B -Reactividad de cruce de especies de anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos

ESDecies: Ilnhibición (Quiméricos y d ingeniería humana)

Reacción cruzada: Humana +

ití: +

Cynomolgous: +

himpancé: +

Rhesus: +

Babuino: +

Cola de cerdo sureño: +

Cabeza blanca: +

Desconocido: onejo NID

Perro: ·

Ratón: ·

Rata: ·

Cobaya: ·

No reactivas: Cerdo enano de Yucatán ·

Reactividad de especies cruzadas del anticuerpo de ingeniería humana y quimérico. Los anticuerpos de ingenier¡a humana y quiméricos son capaces de neutralizar la proliferación de células 7TD1 estimuladas por supemadantes condicionados a partir de PBMCs de humanos, titis, mono cynomolgus, chimpancé, mono rhesus, babu ino, mono cola de cerdo sureFio y titi cabeza blanca. ((+» positivo en ensayo de neutralización; ((-)) negativo en ensayo de neutralización; NID, sin determinar.

Tabla 9 -Impacto del tratamiento con anti-IL-6 mAb sobre patologia renal en ratones NZB/W F1

Grupo de tratamiento: Grave* Moderado* Leve*

atino (n=10): 0%06f10 120 % o 2f10 0%o2f10

IgG de rata (n=10): 70%07f10 PO%03f10 o Of1 O

R&D IL-6anti-ratón (n=10): 10 %01110 ~0%03f10 0%o6f10

Grave Hiperplasia linfoide mixta perivascular, hipercelularidad mesangial, deposición proteica, deposició e complejo inmuno de membrana de base glomerular. Moderado -Hiperplasia linfoide mixta perivascular moderada, hipercelularidad mesangial moderada, eposición de complejo inmune de membrana de base glomerular, deposición no proteica. eve -Hipercelularidad mesang ial leve, deposición de complejo inmune de membrana de base glomerular, lioemlasia linfoide mixta no oerivascular deoosición no oroteica.

Tabla 10 -Secuencias de región variable de clones

N° DE ID DE SEC: Clon Region V d Cadena Pesada (H o ligera (l) Secueneia

~3: f"9 Cadena L ~ EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCSASSSVS IYMYWYQQKPGQAPRLUYDTSNLASGIPAR FSGSGSGTOFTL TISSLEPEDFAVYVCSQW SGYPYTFGGGTKVEIK

~4: Nucleótido de cadena L GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC i'GGGGA fAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTAC i"TGTACT GGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA GACACA CCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGG ~CAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT GCAG ~!,TTACTGTTCTCAGTGGAGTGGTTACCCATACACGTTCGGC GGAGGG rCCAAGGTGGAGATCAAA

~5: f"A. d cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISSGGSYTYY POTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED AVYYCARQLWGYYALDYWGQGTIVlVSS

~6: Nucleótido de cadena H GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCT ~GCCA ~~TCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG GGCCAAA ~TTAGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGACACTGTGAC GGGCCG ~:rCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC ~TGA ~~AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG 1'CAGTTA ~GGGGGTACTATGCTCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGG CACCGT CTCCTCA

65 15

97: 19A AA d cadena L E1VLTQSPATLSLSPGERATLSCSAS1SVS !vMYWYQQKPGQAPRLUYDMSNLASG1PAR FSGSGSGTDFTLT1SSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVE1K

~8: Nucleótido de cadena L GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC V'GGGGA ~9AGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCATTAGTGTAAGTTACA GTACT GGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA GACATG CCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGG GACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT ~GCAG ~~TTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATACACGTTCGGC GGAGGG

~9: AA cadena H d EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS PFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYY SDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED AVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS

100: Nucleótido de cadena H GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCCTT ~GCCA GTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG h-GGCCAAA ~:rAGTCCGGGTGGGAGTTGGACCTACTATTCTGACACTGTGAC GGGCCG ~:rCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC i'w'TGA ~~AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG ¡"CAGTIAITGGGGGTACTATGCTCTTGACATTTGGGGCCAAGGGACCACGG CACCGT CTCCTCA

101: 3A AA d cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASYSVS !YMYWYQQKPGQAPRLUYDMSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVEIK

102: Nucleótido de cadena L GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC V'GGGGA ~?AGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTATAGTGTAAGTTACA GTACT GGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA GACATG CCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGG ~CAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT GCAG ~ATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATACACGTTCGGC GGAGGG ~CCAAGGTGGAGATCAAA

65 15

103: f"A de ¡C adena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSYTYY SDTVTGRFTI$RADNKNSL YLQMN$LRAED AVYYCARQLWGYYALDFWGQGTTVTVSS

10': Nucleótido ~e cadena H GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGTC ~[GAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTTTAGTAGCTGeCA ~~TCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG GGCCAAA ~TTAGTCCGGGTGGGAGTTACACCTACTATTCTGACACTGTGAC GGGCCG ~TTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC !MATGA ~~AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG !"CAGTIA ~GGGGGTACTATGCTCTTGACnnTGGGGCCAAGGGACCACGG CACCGT CTCCTCA

11 6: ME-16 f"A de je adena L EIVL TQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVS iYMYWYQQKPGQAPRLLlYOTSNLASGIPAR FSGSGSGT DFTL TISSLEPEDFAVYYCSQW SGYPYTFGGGTKVEIK

11 7: Nucleótido ~e cadena L ~!GGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC CCCAGA ACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTG IrCTITGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTCAAG GTAAGT ~ACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC CCTCAT CTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTC i"GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAA GATTTTGCAGTTTATTACTGTTCTCAGTGGAGTGGTTACCCATAC ~CGTI CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

11 8: f"A. de ¡C adena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAK ISPGGSYTYY POTVTGRFTISRAONKNSLYLQMNSLRAEO AVYYCARQLWGYYALOYWGQGTTVTVSS

11 .: ~~Cl eót¡dO e cadena H ~TGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA ~GGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTT AGTAGC ~GCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGAC i"CTGTGA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ~~AGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTACTGGGGCCAAGGG ¡'CCACGG CACCGTCTCCTCA

65 15

12.: AME-18a fA" de jeadena L EIVlTQSPATLSLSPGERATlSCSASSSVS M'l'WYQQKPGQAPRLLIYOF$NLASGIPAR FSGSGSGTOFTL TISSLEPEDFAVYVCMQW SGYPYTFGGGTKVEIK

121: ~:Cl eótido e cadena L ~TGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC CCCAGA ACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTG CTITGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTCAAG h'GTAAGT ACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC ceTCAT CTATGACTTCTCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCA GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA

122: fA" de ¡Cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS PFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYY SDlVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED AVYVCARQLWGYVALDIWGQGTlVlVSS

123: Nucleótido ~e cadena H r.TGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA f'GGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTT AGTCCC ~?CCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTGGACCTACTATAGCGAC V-CTGTGA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ~~AGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACATTTGGGGCCAAGGG ~CCACGG ITCACCGTCTCCTCA

12.: AME -20b fA" de ¡Cadena l ~~VLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVS MYWYQQKPGQAPRLUYOMSNLASG IPAR FSGSGSGTOFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVE IK

125: Nucleótido ~e cadena L ~¿GGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC CCCAGA ACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTG CTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCATTAG GTAAGT ITACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC CCTCAT CTATGACATGTCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCA GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAA GATTTTGCAGTTTATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATA CACGTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

126 127 12. 12. 130 131: f"ME-22a AA de cadena H Nucleót ido de cade na H AA de cadena L Nucleót ido de cadena L AA de cadena H Nucleót ido de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSYTVY $DlVTGRFTI$RADNKN$LYLQMN$LRAED AVVYCARQLWGVYALDIWGQGTIVlVSS ~TGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA ~GGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG ~:GGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTT AGTAGC ~_GCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTACACCTACTATAGCGAC !"CTGTGA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ~CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACATTTGGGGCCAAGGG 1'CCACGG CACCGTCTCCTCA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASYSVS !vMYWYQQKPGQAPRLLlYDFSNLASGIPAR FSGSGSGTOFTLT1SSLEPEDFAVYVCMQW SGYPYTFGGGTKVE 1K ~TGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC CCCAGA ~~CCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTG CrnGT ~¿CCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTACAG GTAAGT ACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC CCTCAT CTATGACTTCTCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCA GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAA GATTTTGCAGTTTATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATA CACGTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS PFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYY PDTOTGRFT1SRAONKNSLYLQMNSLRAEO AVYVCARQLWGYVALOFWGQGTTVTVSS ~TGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA i"GGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTT AGTCCC ~~CCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTGGACCTACTATCCTGAC !"CTGACA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ~?AGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTTCTGGGGCCAAGGG ~CCACGG fTCACCGTCTCCTCA

Tabla 11 -Secuencia de aminoácido de una región marco de L6 de cadena ligera humana con secuencias CoR etiquetadas intercaladas (FRLI -N° DE ID DE SEC: 105) CoRL1 (FRL2 -N° DE ID DE SEC: 106) CoRL2

5 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCXXXXXXXXXXWYQQKPGQAPRLLlYXXXXXXX (FRL3 -N° DE ID DE SEC: 107) CORL3 (FRL4 -N° DE ID DE SEC: 108) GI P ARFSGSGSGTOFTLTISSLEPEDFAVYYCXXXXXXXXXFGGGTKVEIK

Tabla 12 -Secuencia de aminoácidos de una región marco de VH3-3 de pesada con secuencias COR

10 etiquetadas intercaladas (FRHI -N° DE ID DE SEC : 109) CoRH1 (FRH2 -N° DE ID DE SEC: 110) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASXXXXXXXXXXWVRQAPGKGLEWVA CoRH2 (FRH3 -N° DE ID DE SEC: 111) XXXXXXXXXXXXXXXXXRFTISRAONKNSLYLQMNSLRAEOTAVYYCAR

15 CoRH3 (FRH4 -N° DE ID DE SEC: 112) XXXXXXXXXXWGQGTTVTVSS

Tabla 13· Secuencias CDR

N° DE ID DE EC: CoR Secuencia AA*

132: CDRL1 S!I!2!3~V!5YMY

133: CDRL2 D&S! 7L&S

134: CDRL3 ! 9! IOWSGYPYT

135: CDRH1 GF! 11! 11S! 13FA!14S

136: CDRH2 K!l sS!'6GGS!17!18Y!19~DT!21 ~2!.23

137: CDRH3 QLWG!z4 YALD!25

X indica cualquier aminoácido adecuado con sustituciones de aminoácidos no limitativas y a modo de jemplo que se muestran en las secuencias presentadas en N° DE ID DE SEC: 1-92 de las Tablas 1 y 2 en las Tablas 3, 4, 5A Y 8. Además, X puede tener los siguientes valores: 1 =AoG :;2=SoR 3 = H, 1, S, o Y ~~ SoY 5 =S o F 6 = F, L, M, o T :"':7=NoE 8 = Aa T 9 =M, C, OS 10 =QOC 11 = Tora 12 = F, S, o T 13 =SOP :;14 =LoM 15 = Aa I 16 = SaP 17 =YOW 18 = T, E, o Y 19 =YoF :ro = P, S, D, o F :;21 =VoD 22 =ToA 23 =GOP 24 = S, Y, T, o N 25 = Y, T, F, o I N° DE ID DE SEC:115 SECUENCIA DE AMINOÁCIDO DE LA PROTEíNA IL·6 MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQ IRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETeL KIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVUQFLQKKAKNLDAITTPD PTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLlLRSFKEFLQSSLRALRQM

LISTADO DE SECUENCIAS

5: <110> Cenlocor, Inc. Applied Molecular Evolution, Ine. <120> Anticuerpos Anti-IL-6, compuestos , métodos y usos

<130> CEN5094 PCT

<140> PCTfUS2006f016457 <141> 2006-04-28

15: < 150> 60/676,498 <151> 2005-04-29

<150> 60/677,319 <151 > 2005-05-03

<160> 138

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

25: <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Hamo sapiens

<400> 1

Ser Ala 1: Ser Bis Ser Val Ser Tyr Met Tyr s J.O

35: <210> 2 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 2 agtgccagcc atagtgtaag ttacatgtac: 30

45: <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Hamo sapiens

<400> 3

Ser Ala Ser I le Ser val Ser 1 5: Tyr Met Tyr 1 0

55: <210> 4 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 4 agtgccagca ttagtgtaag Itacatgtac: 30

65: <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

75

Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10

<210> 6 <21 1>30

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 6 agtgcccggt caagtgtaag ttacatgtac 30

<210> 7

<21 1> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 7

Se r Ala Ser Tyr Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10

<210> 8

<211> 30

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 8 agtgccagct atagtgtaag ttacatgtac 30

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 9

Ser Ala Ser Ser Ser Va l Phe Tyr Met Tyr 1 5 10

<210> 10

<21 1> 30

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 10 agtgccagct caagtgtatt ttacatgtac 30

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 11

Ser Gly Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10

<210> 12 <21 1>30

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 12 agtggcagct catatgtaag ttacatgtac 30

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 13

Ser Ala Leu Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 S 10

<210> 14

<211> 30

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 14 aglgccclgl caaglgtaag ttacalglac 30

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 15

25 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10

<210> 16

<211> 30

<212> AON

<213> Horno sapiens

35 <400> 16 aglgccagcl caaglglaag lIacalgtac 30

<210> 17 <211>7

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 17

Asp Phe Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 18

<211 > 21

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 18 gacllllcca acclggctlc I 21

<210> 19 <211>7

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 19

Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 65

<210> 20

<211>21 <212> ADN <213> Horno sapiens

5: <400> 20 gacctgtcca acctggcnc t 21

<210> 21 <211>7 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 21

15: Asp Met 1 Ser Asn Leu 5 Ala Ser

<210> 22 <211>21 <212> ADN <213> Horno sapiens

25: <400> 22 gacatgtcca acctggcttc t <210> 23 <211>7 <212> PRT <213> Horno sapiens 21

<400> 23

35: Asp Thr 1 Ser Asn Leu 5 Thr Ser

<210> 24 <211 > 21 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 24 gacacatcca acctgacgtc t: 21

45: <210> 25 <211>7 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 25

55: <210> 26 <211>21 <212> AON <213> Horno sapiens ASp 1 Thr Ser Glu"Leu Ala Ser 5

<400> 26 gacacatccg agctggcttc t: 21

65: <210> 27 <211 > 7 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 27

5

<210> 28 <211 > 21 <212> ADN <213> Horno sapiens

15: <400> 28 gacacalcca acclggcltc I 21

<210> 29 <211>9 <212>PRT <213> Horno sapiens

<400> 29

25

<210> 30 <211> 27 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 30 algcagtgga glggltaccc alacacg

35: <210> 31 <211>9 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 31

45: <210> 32 <211 > 27 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 32 Iglcaglgga glggllaccc alacacg

55: <210> 33 <211>9 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 33

65: <210> 34 <211>27 <212> ADN

ASp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5

Cys Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5

Ser Cys Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<213> Horno sapiens

<400> 34

Iclglglgga glggtlaccc atacacg 27 5

<2 10> 35

<211> 9

<2 12> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 35

Ser Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 36

<211> 27

<2 12> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 36 Iclcaglgga glggltaccc alacacg 27

<210> 37 25 <211> 10

<2 12> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 37

Sl y Pne Thr phc Ser Ser Ph~ Ala Leu Ser 1 5 10

<210> 38 35 <211> 30

<212> ADN

<2 13> Horno sapiens

<400> 38 ggattcaccl t1aglagctllgcccltlct 30

<2 10> 39

<211> 10

<212> PRT 45 <2 13> Horno sapiens

<400> 39

Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser 1 5 10

<210> 40 <2 11 >30

<212> ADN 55 <2 13> Horno sapiens

<400> 40 ggatlcacct t1agtccttt Igccalgtcl 30

<2 10>4 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

65 <400> 41

Gly Phe Gln Phe Ser Ser Phe ~a ~et Ser 1 S 1.0

<2 10> 42 <2 11 > 30 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 42 ggattccagt ttagtagclltgccatgtct: 30

<2 10> 43 <2 11 > 10 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 43

Gly Phe ~: Thr Thr Ser Ser Phe Ala Met Ser S 10

<210> 44 <211>30 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 44 ggallcacca ctagtagctt tgccatgtct: 30

<210> 45 <21 1> 10 <212> PRT <2 13> Horno sapiens

<400> 45

Gly Phe 1: Gln Phe Ser Pro Phe Ala S Met Ser 1 0

<400>: 46 ggallccagt ttagtccttt tgccatgtct 30

<210> 46

<211> 30

<2 12> ADN

<213> Horno sapiens

<210> 47 <211>10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 47

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Ser 1 S 10

<210> 48

<21 1> 30

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 48 ggattcacct ttagtagctt tgccalglct: 30

5: <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 49

Lys Ala Ser Ser Gly Gl y 1 S Gly: Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp 10 Thr Val Tbr 15

15: <210>50 <211>51 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 50 aaagcgagta glgglgggag ttacacclac lalcclgaca ctglgacggg c: 51

2 5: <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 51

Lys 1 Gly: Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Glu Tyr Tyr Pro Asp Thr 5 10 Val Thr 15

35: <210> 52 <211> 51 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 52 aaaaltagla glggtggga9 Itacgaglac lalcctgaca clglgacggg e: 51

4 5: <2 10> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 53

Lys 1 Gl y: Ile s e r Ser Gl y S Gly Ser Tyr Tyr Tyr 1 0 Tyr Pr o Asp Thr val 15 Thr

55: <210> 54 <211>51 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 54 aaaattagta gtggtgggag ttactattac tatcctgaca ctgtgacggg e: 51

<210>55 <211> 17 <212> PRT <213> Horno sapiens

65: <400> 55

Lys Ile Ser Ser Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Gly

<210> 56

<211 > 51

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 56 aaaattagta gtggtgggag ttggacctac tatcctgaca ctgtgacggg e 51

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400>~.57u _____• ________ _

1 5 10 15 Gly

<210> 58 <211>51

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 58 aaaattagtc cgggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg e 51

<210>59

<211> 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 59

1 S 10 15

Gly

-: ~-------------

<210>60 <211>51

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 60 aaaattagtc cgggtgggag ttggacctac tattctgaca ctgtgacggg e 51

<210> 61

<211 > 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 61

LYIJ Ile ser Ser Gly Gly Ser Tyr Tbr Tyr Tyr Pro Asp ThI:' val Thr 1 5 10 15 Gly

<210> 62

<211 > 51

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 62 aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg e 51

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 63

Lys Ile Ser Ser Gly Gl y Ser Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Gl y

<210> 64 <211>51

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 64 aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tttcctgaca ctgtgacggg e 51

<210> 65

<211> 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 65

_'b __ ___ ____ _

~~ ~~

1 5 10 15 Gly

<210> 66

<211 > 51

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 66 aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtggctgg e 51

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 67

Lys I le Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asp Asp Thr V~l Thr 1 5 10 15 Olv

<210> 68

<211 > 51

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 68 aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatgatgaca ctgtgacggg e 51

<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 69

Lys xl e Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Gl y

<210> 70 <211>51

<212> AON

<213> Horno sapiens

5: <400> 70 aaaaltagta glgglgggag ltacacctac tatlclgaca clglgacggg e <210> 71 <211 > 17 <212> PRT <213> Horno sapiens 51

15: <400> 71 Lys Ile Ser Ser Gly G1y Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Pro <210> 72 <211>51 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 72 aaaallagla glgglgggag lIacacclac talcclgaca clglgacgcc 9: 51

25: <210> 73 <211>17 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 73

Lys 1 Gly: Ile Ser Ser G1y Gly Ser Tyr Tbr Tyr Tyr Pro ABP Tbr Asp Tbr 5 10 15

35: <210> 74 <211> 51 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 74 aaaallagla gtgglgggag tlacacclac latcclgaca clgalacggg e: 51

45: <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 75

Lys 1 Gly: Ile Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val S 10 15 Tbr

55: <210>76 <211>51 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 76 aaaallagtc cggglgggag ttacacctac lattclgaca clgtgacggg e: 51

65: <210> 77 <211 > 17 <212> PRT <213> Horno sapiens

5: <400> 77 Lys Ile 1 Gly Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr 5 Tyr 1 0 Tyr Asp Asp Thr Val Tbr 15

<210> 78 <211>51 <212> AON <213> Homosapiens

<400> 78 aaaaltaglc cggglgggag ttggacclac talgalgaca clglgacggg e: 51

15: <210>79 <211 > 10 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 79

CHn 1: Le u Trp Gly Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr S 10

25: <210> 80 <211>30 <212> ADN <213> Horno sapiens

<400> 80 cagllalggg ggtcgtalgc tcllgactac: 30

35: <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Horno sapiens

<400> 81

Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu ASp Thr 1 S 10

45: <210> 82 <211> 30 <212> ADN <213> Horno sapiens <400> 82 cagllatggg gglaclatgc Icttgacacg 30

<210> 83 <211 > 10 <212> PRT <213> Horno sapiens

55: <400> 83 Gln Leu 1 Trp Gly Thr Tyr Ala Leu Asp Tyr S 10

<210> 84 <211 > 30 <212> ADN <213> Horno sapiens

65: <400> 84 cagllatggg ggacttatgc Icttgaclac <210> 85 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 85

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<212> ADN

<213> Horno Sapiens

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<213> Horno sapiens

<400> 87

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<212> ADN

<213> Horno sapiens

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<210> 89

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<213> Horno sapiens

<400> 89

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<212> ADN

<213> Horno sapiens

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<210> 91

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 91

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<210> 92

<211> 30

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 92

cagttatggg ggtactatgc tcttgactac 30

<210> 93

<211> 106

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 93

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1. 5 10 15 Glu Arg A1a Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg LeU Leu Ile 'l'yr 35 40

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<210> 94 <211>318

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 94

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<210> 95

<211> 119

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 95

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85 90 9S Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln aly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser "S

<210> 96

<211> 357

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 96

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<210> 97

<211> 106 5 <212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 97

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1 10 Glu Arg Al. Thr Leu Ser Cys Ser Al. Ser ne Ser Val Ser Tyr" Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gl n Ly' Pro Gly Gln Al. Pro Arg Leu Leu n e Tyr 3S 45

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<210> 98 25 <211>318

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 98

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gtgccagcat tagtgtaagt tacatgtact ggtaccaaca gaaacctggc 120 caggctccca ggctcctcat ctatgacatg tccaacctgg cttctggcat cccagccagg 180 ttc8gtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 240

35 gattttgcag tttattactg tatgcagtg9 agtggttacc catacacgtt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaa 318

<210> 99

<211> 119 40 <219> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 99

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<212> ADN

<213> Horno sapiens

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<210> 101

<211> 106

<212> PRT

<213> Horno sapiens

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<210> 102 <211>318

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 102

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<210> 103

<211> 119

<212> PRT 45 <213> Horno sapiens

<400> 103

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<213> Horno sapiens

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<213> Horno sapiens

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<213> Horno sapiens

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<213> Horno sapiens

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<212> PRT

<213> Horno sapiens

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<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 109

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<213> Horno sapiens

<400> 110

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<213> Horno sapiens

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<213> Horno sapiens

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<213> Horno sapiens

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<213> Horno sapiens

<400> 115

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<210> 116

<211> 106

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<213> Horno sapiens

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<210> 117

<211> 378

<212> ADN

<213> Horno sapiens

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<210> 118

<211> 119

<212> PRT

<213> Horno sapiens

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<212> ADN

<213> Horno sapiens

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<211> 106

<212> PRT

<213> Horno sapiens

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<210> 121

<211> 378

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<400> 121

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<211> 119

<212> PRT

<213> Horno sapiens

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<211> 106

<212> PRT

<213> Horno sapiens

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<211> 378

<212> AON

<213> Horno sapiens

25 <400> 125

atggaagccc cagogcagct t ctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccllgccllcc ctgtctttgt ctccllgggga allgllgccacc 120 ctctcctgcll gtgccllgcat tllgtgtllagt tllcatgtllct ggtllccllacll gllllllcctggc 180 cllggCtcccll ggctcctcllt ctatgllcatg tccaacctgg cttctggcllt cccagccllgg 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacagllcttc actctcaccll tcagcllgcct agagcctgaa 300 gattttgcllg tttllttactg tlltgcagtgg agtggttllcc clltllcacgtt oggcggagg9 360 IlCCllllggtgg aglltclllla

<210> 126

<211> 119 35 <212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 126

Glu Val Gln Leu val Glu Ser Gly Oly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 :1.5 Ser Leu Arg Leu Ser Cye Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Phe 20 25 lO

~___~_---~_~~~_ftl

35 .0 .5

50 55 ISO

-_.~------------~

65 70 75 80

-----: ~----~----

85 90 95

--------: =---~--

Ala Arg Gln Leu Trp Qly Tyr Tyr Ala LeU Asp Ile Trp Gly Gln Oly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

no

55 <210> 127 <211>414

<212> AON

<213> Horno sapiens

<400> 127

atggagtttg gcctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctg9attcca 9tttagtagc tttgccat9t cttgggtccg cC8ggctcca 1BO

99gaagg9gc tggagtgg9t g9ccaaaatt agtcccggtg 9gagttacac ctactatagc 240

65 gacactgtga c999Ccg~tt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgag8gc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag acagttatgg 31S0 999tactatg ctcttgacat ttggggccaa 99gaccacgg tcaccgtctc ctca 414

<210> 128

<211> 106

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 128

Glu. 11e Val ,""u Thr .'0 'or 0<0 Ala TnrLeu. Sor ""u Sor Pro aly 1 S alu. Arg ala rhr ...u '"' Cy. ,., Ala ,., " Tyr 'or Val 'er Tyr" Me. 3010 " >ro Glyaln Ala Pro Lou "'u no Tyr

Tyr Trp Tyr al. 010 Ly. " ~

ah ,,. Oly

M, Pho Sor" ......u "

SO 55

Phe Thr Lou

Oly Sor Oly Thr "'"

15 " " Met

""' Ph. Ala Val Tyr TyJ: cys Pbo G1y Gly Oly Tbr" Ly8 Val Olu

lOO

<210> 129 20 <211> 378

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 129

atggaagecc cagcgcagct gólaatt:gtgt tgacacagtc ctctcct 9ca gtgccagcta caggctccca ggctcctcllt tteAgt9gca gtg99tct99 gattttgcag tttattactg

accaaggtgg agatCaaa

<210> 130

<211> 119 35 <212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 130

tct.cttcctc tccagccacc cagtgt.aagt ctatgllcttc gacagaettc tatgcagtQg

Uo Pro Ala Arg "Pha Ser Gly Sor 60 Thr Ile Ser Ser Leu Olu Pro Olu

010 Trp Ser Oly Tyr 0<0 Tyr Thr

" "

U. Ly. lO<

" "

ct:gctactct ggctcccaga taccaccgga et.gtetttgt ctccag99ga aagagccacc " tacatgtaet ggtaccaaea gaaacctggc '"

l80

tCCllacctgg cttct:ggcat cccllgcca99

acteteaeca tcagcagcct. agagectgaa '" lO' agtggttace eatacacgtt eggcggaggg '60 378

5 10 15 ~ -~--~-----------Leu ser CY8 Ala Ala Ser Oly Phe alo Pha Pro Phe

Ser Leu. Arg ser 20 2S 30 Ala Mel: ser Trp val Arg aln Ala Pro Oly Lys Oly LeU Glu Trp Val 35 40 45

Ala LY8 Ile Sar PrO Gly aly Ser Trp Thr ~Tyr Pro ABp Thr Aap 50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp ABn Ala Ly. ABn Ser Lou Tyr 70 75 LeU Gl.n Met ASO Ser Leu Arg 1>.1 . Glu As¡> Thr Ala Val Tyr Tyr cyll"

8S 90

50 "

AlA Arg alo LeU Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp phe Trp Gly alo aly 100 105 no Thr Thr val Thr Val Ser Ser

as

55 <210> 131 <211>414

<212> AON

<213> Horno sapiens

60 <400> 131

a.t99a9tttg 9cct9agc tg 99ttttcctt gtl:gctattt t.agaaggtgt: ccagtgtgag gt:gcagcl:gg tggagtct.gg g99a99cl:t9 gt:ccagcctg gggggt:ccct gagact.etce "120 egtgcagcct ctggattcca gtttagtccc tttgccatgt cttgggtecg ccag9ct.eca 180 999aa9gggc t9ga9t9gge ggceallaatt agtcccggtg ggagtegglllc ctactatcct

65 gaeaetgaea cgggccgatt caeeatetec agagacaaeg ccaagaacte actgtatetg '"'

lO' caaatgaaea gcctgagagc cgaggacac9 gcegtgtatt actgtgcgag acagttatg9 36' 999tactatg cecttgaett ct9gggeeaa 9g9aecacgg tcaccgtctc ctca '"

<210> 132

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<220>

<221> Incierto

<222> (2) (3) (4) (5) (7)

<223> Donde Xaa puede ser cualquiera de los aminoácidos que se producen de forma natural.

<400> 132

Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Tyr Met Tyr 1 S 10

<210> 133 <211>7

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<220>

<221> Incierto

<222> (2)(4)(6)

<223> Donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos que se producen de forma natura1.

<400> 133

Asp Xaa Ser xaa Leu xaa Ser 1 S

<210> 134 <211>9

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<220>

<221> Incierto

<222> (1 )(2)

<223> Donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos que se producen de forma natural.

<400> 134

Xaa Xaa Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 S

<210> 135

<211> 10

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<220>

<221> Incierto

<222> (3)(4)(6)(9)

<400> 135 Oly Phe Xaa Xaa Ser Xaa Phe ~l. Xaa Ser 1 S

<210> 136

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Incierto

<222> (2)(4)(8)(9)(11 )(12)(15)(16)(17)

<400> 136

Lye 1 X..: X~~ Ser xaa Gly Gly Ser xaa 5 xaa Tyr 10 xaa Xaa Asp Thr Xaa X.a 15

5 10 15: <210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Horno sapiens <220> <221> Incierto <222> (5)( 10) <223> Donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos que se producen de forma natural. <400> 137 Gln Leu Trp Gly Xaa Tyr Ala Leu Asp Xaa 1 S 10

20 25: <210> 138 <211>9 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 138 Gln Gln Trp Ser Gly Tyr 1 S Pro Tyr Thr

30

35

40

45

50

55

Claims

REIVINDICACIONES

l. Un anticuerpo IL-6 aislado que induye:

(i) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con N° DE ID DE SEC: 101 y una 5 secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con N° DE ID DE SEC: 103;

(ii) Una secuencia de aminoocido de región variable de cadena ligera con N° DE ID DE SEC: 124 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con N° DE ID DE SEC: 126;

(iii) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con N° DE ID DE SEC: 116 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con N° DE ID DE SEC: 118;

10 (iv) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con N° DE ID DE SEC: 120 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con N° DE ID DE SEC: 122;

(v) Una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con N° DE ID DE SEC: 128 y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con N° DE ID DE SEC: 130; o

(vi)

una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera con W DE ID DE SEC: 97 y una 15 secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada con N° DE ID DE SEC: 99.
2. El anticuerpo IL-6 de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo modula por lo menos una actividad de por lo menos un polipéptido IL-6.

20 3. El anticuerpo IL-6 de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde dicho anticuerpo tiene un valor EC50 de aproximadamente 2,7 x 10-11 M o menos.
4. El anticuerpo IL-6 de acuerdo con la reivindicación 3, donde el valor de EC50 es de aproximadamente 2,7 x
10.12

o menos.
5. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifique por lo menos un anticuerpo aislado IL-6 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. Un vector de ácido nucleico aislado que induya la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la 30 reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora procariótica o eucariota que incluya la molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 5.

35 8. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicha célula hospedadora es por lo menos uno de los siguientes: células CaS-1, CaS-7, HEK293, BHK21, CHa, BSC-1, Hep G2, 653, SP2IO, 293, HeLa, de mieloma, de linfoma o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada a partir de ellos.
9. Un método para la producción de por lo menos un anticuerpo IL-6, que incluye la traslación de la molécula

40 de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 en condiciones in vitro, in vivo o in situ en no humanos de forma que el anticuerpo IL-6 se expresa en cantidades detectables o recuperables.
10. Un compuesto que incluye por lo menos un anticuerpo IL-6 aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10, incluido también por lo menos un compuesto o polipéptido seleccionado a partir de un marcador o indicador detectable, un antagonista TNF, un medicamento antiinfeccioso, un medicamento del sistema cardiovascular (CV), un medicamento del sistema nervioso central (CNS), un medicamento del sistema nervioso autónomo (ANS), un medicamento del tracto respiratorio, un

50 medicamento del tracto gastrointestinal (GI), un medicamento hormonal, un medicamento para el equilibrio de fluidos

o electrolito, un medicamento hematológico, un antineoplásico, un medicamento de inmunomodulación, un medicamento oftálmico, ótico o nasal, un medicamento tópico, un medicamento nutricional, una citoquina y un antagonista de citoquina.

55 12. Un compuesto que incluye por lo menos un anticuerpo IL-6 aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en terapia.
13. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un método para el diagnóstico °tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano o animal, donde la

60 enfermedad relacionada con IL-6 se selecciona a partir del grupo que consta de obesidad, enfermedad de tipo inmune, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa, o una enfermedad maligna y enfermedad neurológica.
14.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, donde la enfermedad relacionada con IL-6 se selecciona a partir del grupo que consta de artritis reumatoide, osteoartritis, osteolisis, aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, nefritis lúpica, diabetes melitus tipo 2, enfermedad pUlmonar obstructiva crónica y carcinoma de célula renal.
15.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, dondde dicha cantidad eficaz es de aproximadamente 0,001 -50 mg/kilogramo de dichas células, tejidos, órganos o animales.
16.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, donde la vía de contacto o administración es por lo menos un modo seleccionado entre los siguientes: parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratóracico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmico.
17.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, que también incluye la administración, previamente, simultánea o tras dicho contacto o administración, de por lo menos un compuesto que incluye una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto o polipéptido seleccionado a partir de un marcador o indicador detectable, un medicamento anti-infeccioso, un medicamento del sistema cardiovascular (CV), un medicamento del sistema nervioso central (CNS), un medicamento del sistema nervioso autónomo (ANS), un documento del tracto respiratorio, un medicamento del tracto gastrointestinal (GI), un medicamento hormonal, un medicamento para el equilibrio de fluidos o eleclrolito, un medicamento hematológico, un antineoplásico, un medicamento de inmunomodulación, un medicamento oftálmico, ótico o nasal, un medicamento tópico, un medicamento nutricional, una citoquina y un antagonista de citoqu ina.
18.

Un instrumento médico, que incluye un anticuerpo IL-6 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14, donde dicho instrumento es adecuado para el contacto o la administración de dicho anticuerpo IL-6 por medio de por lo menos una de las siguientes vias: parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.
19.

Un articulo manufacturado para uso farmacéutico o diagnóstico, que incluye material de empaquetado y un envase que incluye una solución o forma liofilizada de un anticuerpo IL-6 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
20.

El artículo manufacturado de la reivindicación 19, donde dicho envase es un es un elemento de un instrumento o sistema de administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosoa, intracavitaria, intraceliaJ, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardial, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

2 1. El anticuerpo IL-6 aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que incluya una secuencia de aminoácido de región variable de cadena ligera codificada por una de las secuencias de nucleótido de las SECS CON N° DE ID: 98, 102,117, 121,125 Y 129 Y una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada codificada por una de las secuencias de nucleótido con N° DE ID DE SECS: 100, 104, 119, 123, 127 Y 131.