ES2676732T3 - Anticuerpos anti-IL-6 humanizados, composiciones, métodos y usos - Google Patents

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Vedrana Stojanovic-Susulic
Raymond W Sweet
Susan H. Tam
Sheng-Jiun Wu
Jing Yang
David Matthew Marquis
Eric Michael Smith
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Abstract

Un anticuerpo anti IL-6 aislado, con regiones marco y constantes completamente humanas, que comprende: (i) una región variable de cadena ligera, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región determinante de la complementariedad 1 (CDRL1) de la SEC ID Nº:3, una secuencia de aminoácidos de la CDRL2 de la SEC ID Nº:21, una secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de la SEC ID Nº:29, y una región variable de la cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región determinante de la complementariedad 1 (CDRH1) de la SEC ID Nº:39, una secuencia de aminoácidos de la CDRH2 de la SEC ID Nº:59, y una secuencia de aminoácidos de la CDRH3 de la SEC ID Nº:89; o (ii) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:3, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:21, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:41, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:75, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:89; o iii) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:15, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:27, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:35, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:47, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:57, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:91; o iv) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:15, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:17, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:45, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:59, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:89; o (v) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:7, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID Nº:21, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:41, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:75, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:87; en donde dicho anticuerpo se une a IL-6 humana o un fragmento de la misma con una afinidad de 0,1-9,9 x 10-14 como se determina mediante el método Kinexa m

Description

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Anticuerpos anti-IL-6 humanizados, composiciones, métodos y usos
Descripción
ÁMBITO DEL INVENTO
El presente invento trata de anticuerpos, incluidas las fracciones o variantes que se indican, específicas para por lo menos una proteína IL-6 o un fragmento de la misma, y ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos anti-IL-6, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células hospedadoras y métodos para su creación y su uso, incluidas formulaciones terapéuticas, administración e instrumentos.
ANTECEDENTES
IL-6 es una citoquina pro inflamatoria pleiotrópica producida y segregada por una amplia variedad de tipos celulares, especialmente células que presentan antígenos, células T y B. IL-6 está implicada en actividades tan diversas como el crecimiento y diferenciación de células B, activación de células T, hematopoyesis, activación osteoclástica, crecimiento de queratinocitos, crecimiento neuronal y activación de hepatocitos. IL-6 se une a IL-6R de transmembrana o soluble y señala a través de gp130, compartido por otras citoquinas.
IL-6 juega un papel importante en las anomalías de células B, tal y como se demuestra en el lupus eritematoso sistémico, el mieloma múltiple y los trastornos linfoproliferativos. De forma similar, IL-6 también está implicada en la patogénesis de trastornos autoinmunes e inflamatorios como la artritis reumatoide y la osteoartritis. Recientemente, las pruebas indirectas sugieren una asociación entre IL-6 y trastorno obstructivo pulmonar crónico y resistencia a la insulina en diabetes de tipo 2. IL-6 tiene tanto efecto pro-inflamatorio como anti-inflamatorio en el sistema inmunológico, indicando que es probable que esta citoquina tenga un papel central en la regulación de la respuesta fisiológica a la enfermedad. Por lo tanto, IL-6 podría proporcionar beneficios terapéuticos en una amplia variedad de tipos de enfermedades.
Se ha observado un aumento en la producción de IL-6 en varias enfermedades, entre las que se incluyen: enfermedad de Alzheimer, trastornos autoinmunes, como artritis reumatoide, inflamación, infarto de miocardio, enfermedad de Paget, osteoporosis, tumores sólidos (carcinoma de célula renal), cánceres prostáticos y de vejiga, cánceres neurológicos y malignidad de célula B (por ejemplo, enfermedad de Casteleman, ciertos linfomas, leucemia linfocítica crónica y mieloma múltiple). La investigación ha indicado que IL-6 está unida a la patogénesis de muchas de esas enfermedades, especialmente el cáncer y, por lo tanto, el bloqueo de IL-6 debería traducirse en beneficios en el ámbito clínico.
Se han desarrollado anticuerpos murinos, quiméricos y otros anti-IL-6 no humanos (por ejemplo, WO 2004/039826 y EP 0783893); de todas formas, podrían tener una potencia y eficacia limitadas, podrían activar con frecuencia una respuesta inmunitaria inaceptable (por ejemplo, inmunogenicidad) y/o necesitar una dosificación elevada (ver, Trikha et al., Clin. Can. Res. 9, 4653-4665, oct. 2003). Por ejemplo, los anticuerpos que contienen fracciones no humanas con frecuencia producen una respuesta inmunitaria en humanos. En consecuencia, la administración repetida de anticuerpos no es adecuada como terapia y la depuración de la circulación mediada por complejos inmunitarios de anticuerpos puede reducir la potencia/efectividad del anticuerpo. La enfermedad del suero y la anafilaxis son dos ejemplos de situaciones que puede provocar la administración repetida de anticuerpos con fracciones no humanas. A este respecto, se necesita un anticuerpo anti-IL-6 con un menor potencial para la inmunogenicidad, por ejemplo, más tolerable en humanos y que sea más potente de forma que necesite una dosis menor en comparación con los anticuerpos anti-IL-6 utilizados previamente.
RESUMEN DEL INVENTO
El invento proporciona un anticuerpo de IL-6 aislado con regiones marco y constantes completamente humanas, que comprende:
(i) una región variable de cadena ligera, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región determinante de la complementariedad 1 (CDRL1) de la SEC ID N°:3, una secuencia de aminoácidos de la CDRL2 de la SEC ID N°:21, una secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región determinante de la complementariedad 1 (CDRH1) de la SEC ID N°:39, una secuencia de aminoácidos de la CDRH2 de la SEC ID N°:59, y una secuencia de aminoácidos de la CDRH3 de la SEC ID N°:89; o
(ii) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:3, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:21, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:41, la CDRH2 comprende la
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secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:75, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:89; o
(iii) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:15, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:27, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:35, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:47, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:57, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:91; o
(iv) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:15, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:17, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:45, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:59, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:89; o
(v) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:7, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:21, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:41, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:75, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:87; en donde dicho anticuerpo se une a IL-6 humana o un fragmento de la misma con una afinidad de 0,1-9,9 x 10-14 como se determina mediante el método Kinexa™.
El invento también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un anticuerpo del
invento.
El invento también proporciona un vector aislado de ácido nucleico que incluye la molécula aislada de ácido nucleico del invento.
El invento también proporciona una célula hospedadora procariótica o eucariótica que incluye la molécula aislada de ácido nucleico del invento.
El invento también proporciona un método para producir por lo menos un anticuerpo IL-6, que incluye el traslado de las moléculas de ácido nucleico del invento in vitro, in vivo o in situ, de forma que el anticuerpo IL-6 se exprese en cantidades detectables o recuperables.
El invento también proporciona un compuesto que incluye por lo menos un anticuerpo aislado IL-6 del invento y por lo menos un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente.
El invento también proporciona una composición que incluye por lo menos un anticuerpo aislado IL-6 del invento para su uso en terapia.
El invento también proporciona un anticuerpo del invento para su uso en un método para el diagnóstico o tratamiento de una afección relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano o animal, donde la afección relacionada con IL-6 se selecciona a partir del grupo de: obesidad, enfermedad inmunológica, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa o enfermedad maligna y una enfermedad neurológica.
El invento también proporciona un artículo de fabricación para uso farmacéutico o diagnóstico humano, que incluye un material de empaquetado y un envase que incluye una solución o forma liofilizada de un anticuerpo iL-6 del invento.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el enlace de anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos anti-IL-6 a complejos IL- 6/IL-6R.
La Figura 2 muestra el epítopo de enlace para el anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana del presente invento.
La Figura 3 demuestra que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibe la secreción de MCP-1 estimulado por IL-6 a partir de células U937 tal y como se han medido por ELISA.
La Figura 4 muestra que el anticuerpo de ingeniería humana anti-lL-6 inhibe IL-6 y la secreción de SAA estimulada por IL-1p a partir de células HepG2 tal y como se han medido por ELISA.
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Las Figuras 5A y 5B muestran que el anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana bloqueó la fosforilación de stat3 mediada por IL-6 de la forma medida por análisis de Western Blot que se ha mostrado a través de electroforesis de gel.
La Figura 6 muestra la inhibición por medio de anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana y quimérico de producción de SAA humano IL-6-inducido en ratones Balb/C.
La Figura 7 muestra la inhibición de la producción de anticuerpos de anti-dsADN por anti-IL-6 mAb en ratones NZB/W F1.
La Figura 8A muestra el efecto de IL-6 en presencia y ausencia de anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana sobre la fosforilación de Akt inducida por insulina.
La Figura 8B muestra un análisis por Western blot del efecto de IL-6 en presencia y ausencia de anticuerpos anti-IL-6 de fabricación humana sobre fosforilación de Akt inducida por insulina.
La Figura 9 muestra los resultados del ensayo de enlace de ELISA descrito en el Ejemplo 3.
La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo de anti-proliferación utilizando la línea de célula dependiente IL-6 descrita en el Ejemplo 3.
La Figura 11A muestra activación de cinasa PI3 en hepatocitos de rata tratados con insulina, proteína IL-6 y anticuerpos anti-IL-6.
La Figura 11B muestra el control del estudio de la activación de cinasa PI3 en hepatocitos de rata.
La Figura 12A muestra el efecto de IL-6 sobre la señalización en hepatocitos de rata a respecto de la fosforilación inducida por insulina de IR.
La Figura 12B muestra el efecto de IL-6 sobre la señalización en hepatocitos de rata a respecto de la fosforilación inducida por insulina de Akt.
La Figura 13A muestra el nivel de glucosa en ratones DIO tras tratamiento con anticuerpo anti-IL-6.
La Figura 13B muestra el nivel de insulina en ratones DIO tras tratamiento con anticuerpo anti-IL-6.
La Figura 13C muestra el índice de la evaluación de modelo homeostático (HOMA) en ratones DIO tras tratamiento con anticuerpo anti-IL-6.
Las Figuras 14A-F muestran los niveles de lípidos antes y después de tratamiento con anticuerpo anti-IL-6.
La Figura 15 muestra el calendario de tratamiento de ratones con anti IL-6 mAb para una prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa (ipGTT).
DESCRIPCIÓN DEL INVENTO
El presente invento proporciona anticuerpos anti-IL-6 aislados, recombinantes y/o sintéticos, así como compuestos y codificaciones de moléculas de ácido nucleico que incluye por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un anticuerpo anti-IL-6. El presente invento también incluye, entre otros, métodos para crear y utilizar dichos ácidos nucleicos y anticuerpos, incluidos compuestos e instrumentos diagnósticos y terapéuticos.
De la forma en que se usa aquí, un “anticuerpo anti-IL-6”, “anticuerpo IL-6”, “fracción de anticuerpo anti-IL- 6” o “fragmento de anticuerpo anti-IL-6” y/o “variante de anticuerpo anti-IL-6” y similares incluyen cualquier proteína o péptido que contenga moléculas que comprendan por lo menos una fracción de una molécula de inmunoglobulina, como por ejemplo, entre otras, por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una fracción de enlace a un ligando, una cadena pesada o región variable de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región marco, o cualquier fracción de las mismas o por lo menos una fracción de un receptor IL-6 o proteína de enlace, que puede incorporarse a un anticuerpo del presente invento. Dicho anticuerpo también podría afectar a un ligando específico, como por ejemplo, entre otros, donde dicho anticuerpo module, disminuya, aumente, antagonice, agonice, mitigue, alivie, bloquee, inhiba, anule y/o interfiera con por lo menos una actividad o enlace IL-6, o con actividad de receptor IL-6 o enlace, in vitro, in situ y/o in vivo. A modo de ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 adecuado, fracción especificada o variante del presente invento puede enlazar por lo menos una molécula IL-6, o sus porciones especificadas, variantes o áreas de los mismos. Un anticuerpo anti-IL-6 adecuado, una porción especificada o una variante también podría afectar por lo menos a una de las actividades o funciones de IL-6, como por ejemplo, entre otros, ARN, ADN o síntesis de proteína, liberación de IL-6, señalización de receptor de IL-6, división de membrana IL-6, actividad de IL-6, producción de IL-6 y/o síntesis.
El término “anticuerpo” también incluye anticuerpos, fragmentos de digestión, fracciones y especificadas y sus variantes, incluidos similares a los anticuerpos o que incluye fracciones de anticuerpos que mimetizan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o fracción del mismo, incluidos anticuerpos de cadena única y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de enlace de antígeno que se unen a un mamífero IL-6. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpo capaces de enlazarse a IL-6 o fracciones de los mismos entre las que se incluyen, entre otros, Fab (por ejemplo, por digestión de papaína), Fab' (por ejemplo, por digestión de pepsina y reducción parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, por digestión de pepsina), facb (por ejemplo, por digestión de plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión de pepsina, reducción parcial y reagregación), fragmentos de Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular), se encompasan por el invento (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).
Dichos fragmentos pueden producirse por división enzimática, técnicas sintéticas o recombinantes, como las conocidas en este ámbito y/o como se describe en el presente documento. También se pueden producir
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anticuerpos en varias formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los que se ha introducido un codón de parada o más en dirección ascendente a respecto de la ubicación natural de parada. Por ejemplo, un gen de combinación que codifica una porción de cadena pesada F(ab')2 pueden diseñarse para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y/o la región de articulación de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos pueden enlazarse químicamente por medio de técnicas convencionales o pueden prepararse como proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética.
En el presente documento, el término “anticuerpo de ingeniería humana” es un anticuerpo con por lo menos marcos humanos completos y regiones constantes (dominios Cl, Ch (por ejemplo, Ch1, Ch2, Ch3), y articulación), y CDRs derivados de anticuerpos de enlace de antígeno. Los marcos humanos completos incluyen marcos que se corresponden con secuencias de línea germinal humana así como secuencias con mutaciones somáticas. Los CDRs podrían derivarse de uno o más CDRs que se unen a IL-6 en el contexto de cualquier marco de anticuerpo. Por ejemplo, los CDRs del anticuerpo de ingeniería humana del presente invento podrían derivarse de CDRs que unen IL-6 en el contexto de un marco de anticuerpo de ratón y a continuación se manipulan para enlazar IL-6 en el contexto de un marco humano completo. Con frecuencia el anticuerpo de ingeniería humana es sustancialmente no- inmunogénico en humanos.
De forma similar, los anticuerpos designan a primates (mono, mandril, chimpancé, etc.), roedores (ratón, rata, conejo, cobaya, hámster y semejantes) y otros mamíferos designan a dichos anticuerpos específicos de especies, sub-géneros, géneros, sub-familias, y familias. Además, los anticuerpos quiméricos pueden incluir cualquier combinación de los anteriores. Dichos cambios o variaciones podrían retener o reducir la inmunogenicidad en humanos y otras especies en relación con anticuerpos no modificados. Así, un anticuerpo de ingeniería humana es diferente de un anticuerpo quimérico o humanizado.
Se señala que se puede producir un anticuerpo de ingeniería humana por parte de un animal no humano o célula procariótica o eucariótica capaz de expresar genes de inmunoglobulina rearreglada funcionalmente humana o de ingeniería humana (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera). Además, cuando un anticuerpo de ingeniería humana es un anticuerpo de cadena ligera, puede incluir un péptido vinculador que no se encuentra en anticuerpos nativos humanos. Por ejemplo, un Fv puede incluir un péptido vinculador, como desde dos hasta aproximadamente ocho glicinas u otros residuos de aminoácido, que conecta la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Se considera que dichos péptidos vinculadores son de origen humano.
Los anticuerpos biespecíficos, los heterospecíficos, heteroconjugados u otros anticuerpos similares también se pueden usar y son monoclonales, preferiblemente, humanos, de ingeniería humana, o humanizados, anticuerpos que tienen características de enlace para por lo menos dos antígenos diferentes. En este caso, una de las características de enlace se da por lo menos para una proteína IL-6, el otro es para cualquier otro antígeno. En este ámbito se conocen métodos para realizar anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas pesadas tienen características diferentes (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la selección aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta normalmente se realiza por pasos de cromatografía por afinidad. Se detallan procedimientos similares, por ejemplo, en WO 93/08829, Patentes de los EE. UU. n°, 6210668, 6193967,6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083,5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al, EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology [Métodos de enzimología] 121:210 (1986).
Los anticuerpos anti-IL-6 útiles en los métodos y compuestos del presente invento podrían caracterizarse por uniones de alta afinidad a IL-6 y, opcional y preferiblemente, por tener un bajo nivel de toxicidad. En concreto, un anticuerpo, fragmento especificado o variante del invento, donde los componentes individuales, como la región variable, la región constante y el marco, de forma individual y/o colectiva, de forma opcional y preferiblemente poseen un bajo nivel de inmunogenicidad, es útil en el presente invento. Los anticuerpos que se pueden usar en el invento pueden ser caracterizados por su capacidad para tratar pacientes durante períodos prolongados con un alivio cuantificable de los síntomas y un nivel de toxicidad bajo y/o aceptable. Un nivel bajo o aceptable de inmunogenicidad y/o una alta afinidad, así como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos que se consigan. En este documento, "nivel bajo de inmunogenicidad" se define como la incidencia de niveles valorables de anticuerpos del anticuerpo anti-IL-6 en pacientes tratados con anticuerpo anti-IL-6 que se produce en menos del 25 % de los pacientes tratados y preferiblemente en menos del 10 % de los pacientes tratados con la dosis recomendada durante el curso recomendado de la terapia durante el período del tratamiento.
Los ácidos nucleicos aislados del presente invento pueden usarse para la producción de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 o una de sus variantes especificadas, que se puede usar para medir o incidir sobre una célula, tejido, órgano o animal (incluidos mamíferos y humanos), para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de por lo menos una afección IL-6, seleccionada de entre
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el grupo (sin limitarla a él) de: trastorno o enfermedad inmunológica, trastorno o enfermedad cardiovascular, trastorno o enfermedad infecciosa, maligna y/o neurológica, u otra afección relacionada con IL-6 conocida o especificada.
Dicho método puede incluir la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento, alivio, prevención, o reducción de los síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede incluir una cantidad de aproximadamente entre 0,001 y 500 mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), múltiple o continua, o conseguir una concentración en suero de 0,01-5000 pg/ml por administración única, múltiple o continua o cualquier rango eficaz o valor del mismo, que se realizará y definirá utilizando métodos conocidos de la forma descrita en el presente documento o en las técnicas correspondientes.
Anticuerpos del presente invento - Producción y generación
Por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 del presente invento podría producirse por una línea de célula, una línea de célula mixta, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, tal y como se conoce ampliamente. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology [Métodos actuales de biología molecular], John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: manual de laboratorio], 2a edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual [Anticuerpos, manual de laboratorio], Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology [Protocolos actuales de inmunología], John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science [Protocolos actuales de la ciencia de las proteínas], John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Los anticuerpos de ingeniería humana que son específicos de las proteínas humanas IL-6 o sus fragmentos pueden crearse contra un antígeno inmunogénico apropiado, como una proteína IL-6 aislada y/o una porción de la misma (incluidas las moléculas sintéticas, como los péptidos sintéticos). Pueden crearse otros anticuerpos específicos o generales de mamíferos. La preparación de antígenos inmunogénicos y la producción de anticuerpos monoclonales puede llevarse a cabo utilizando cualquier técnica apropiada.
En una de las aproximaciones, se produce un hibridoma fusionando una línea de célula inmortal adecuada (por ejemplo, una línea de célula de mieloma, como por ejemplo, entre otras, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, M0LT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A, u otros semejantes, o heteromilomas, productos de su fusión o cualquier célula o célula de fusión derivada de ellas, o cualquier otra línea de células adecuada, de la forma conocida en este ámbito) (ver, por ejemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com, y otras similares), con anticuerpos que produzcan células, como por ejemplo, entre otras, bazo aislado o clonado, sangre periférica, linfa, amígdalas, u otra célula inmune o B que contenga células, o cualquier otra célula que exprese cadena pesada o ligera constante o variable o marco o secuencias CDR, ya sea como ácido nucleico endógeno o heterólogo, recombinante o endógeno, viral, bacteriano, algal, procariótico, anfibio, insecto, reptil, pescado, mamífero, roedor, equino, ovino, cabra, oveja, primate, eucariota, ADN, cADN o rADN genómicos, ADN o ARN mitocondrial, ADN o ARN cloroplástico, hnARN, mARN, tARN, de cadena única, doble o triple, hibridizado y otros semejantes o cualquier combinación de los mismos. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, y Colligan, Immunology [Inmunología], supra, capítulo 2.
Los anticuerpos que producen células también pueden obtenerse a partir de la sangre periférica o, preferiblemente, del bazo o de los ganglios linfáticos, de humanos o de otros animales adecuados que hayan sido inmunizados con el antígeno de interés. Cualquier otra célula hospedadora adecuada también se puede usar para expresar ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, del presente invento. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes pueden aislarse usando afecciones de cultivos selectivos u otros métodos conocidos adecuados, y clonarse por medio de dilución limitante o separación de células, o por otros métodos conocidos. Las células que producen anticuerpos con la especificidad buscada pueden seleccionarse por medio de un ensayo apropiado (por ejemplo, ELISA).
También se pueden usar métodos para la ingeniería o humanización de anticuerpos no-humanos o humanos y son bien conocidos en este ámbito. Un anticuerpo humanizado o procesado podría tener uno o más residuos de aminoácido a partir de una fuente que sea no-humana, por ejemplo, entre otros, ratones, ratas, conejos, primates no humanos u otros mamíferos. Estos residuos de aminoácidos no humanos a los que con frecuencia se denominan residuos "importados", que normalmente se obtienen de una variable "importada" o constante u otro ámbito de una secuencia humana conocida.
Se describen secuencias humanas conocidas de Ig, por ejemplo, en www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast;
www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-
cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php;
www.kabatdatabase.com/top.html;
ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat;
www.sciquest.com;www.abcam.com;
www.anticuerporesource.com/onlinecomp.html;
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www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html;
www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com;www.nal.usda.gov/awic/pubs/anticuerpo;
www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com;www.cancerresearchuk.org;www.biotech.ufl.edu;
www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/~jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu;
www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www. ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;
http://www. bioinf.org.uk/abs; anticuerpo.bath.ac.uk;
www.unizh.ch;
www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s;
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html;
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;
www.jerini.de; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest [Secuencias de proteínas de interés inmunológico], Departamento de Salud de los EE. UU. (1983).
Dichas secuencias importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar el enlace, afinidad, tasa de subida, tasa de bajada, avidez, especificidad, media vida, o cualquier otra característica adecuada de las conocidas en la materia. En general, los residuos de CDR están implicados directa y notablemente en la influencia sobre el enlace de antígenos. En consecuencia, parte o todas las secuencias CDR no- humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no-humanas de las regiones variables y constantes podrían sustituirse con aminoácidos humanos o de otros tipos.
Los anticuerpos también se podrían humanizar o procesar o los anticuerpos humanos procesarse con retención de alto nivel de afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos procesados humanizados (o humanos) o los anticuerpos procesados podrían prepararse por medio de un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales y procesados usando modelos tridimensionales de las secuencias parental, procesada y humanizada. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina suelen estar disponibles y son habituales para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que ilustran y muestran posibles estructuras tridimensionales para secuencias seleccionadas de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, por ejemplo, el análisis de residuos que tienen influencia sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de enlazar su antígeno. De esta forma, los residuos marco (FR) pueden seleccionarse y combinarse a partir del consenso e importar secuencias de forma que se consiga la característica deseada de los anticuerpos, como un aumento de la afinidad por el antígeno(s) objetivo.
Además, el anticuerpo IL-6 de ingeniería humana presentado en este documento podría incluir un marco de cadena ligera de línea germinal humana. En ciertas realizaciones, la secuencia cadena ligera de línea germinal se selecciona a partir de secuencias de VK humano que incluyen, entre otras, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, LI, L10, LI 1, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4, y O8. En ciertas realizaciones, este marco de cadena ligera humana de línea germinal se selecciona a partir de Vl-11, Vl-13, Vl-16, Vl-17, Vl-18, Vl-19, Vl-2, Vl-20, Vl-22, Vl-3, Vl-4, VI- 5, Vl-7, VI-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2- 8, V3-2, V3-3, V3-4, V4- 1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 y V5-6. Ver PCT WO 2005/005604 para una descripción de las diferentes secuencias de línea germinal.
En otras realizaciones, el anticuerpo de ingeniería humana IL-6 descrito en este documento podría incluir un marco de línea germinal humana de cadena pesada. En ciertas realizaciones, este marco de cadena pesada humana de línea germinal se selecciona a partir de VH1-18, VH1-2, VH1- 24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 y VH7-81. Ver PCT WO 2005/005604 para una descripción de las diferentes secuencias de línea germinal.
En ciertas realizaciones, la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada incluye una región marco o por lo menos una porción de una región marco (por ejemplo, que contenga 2 o 3 subregiones, como FR2 y FR3). En ciertas realizaciones, por lo menos FRL1, FRL2, FRL3, o FRL4 será completamente humano. En otras realizaciones, por lo menos FRH1, FRH2, FRH3, o FRH4 es totalmente humano. En algunas realizaciones, por lo menos FRL1, FRL2, FRL3, o FRL4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o incluye secuencias humanas de consenso para el marco concreto (disponible fácilmente en las fuentes de las secuencias conocidas de Ig humano descritas antes). En otras realizaciones, por lo menos FRH1, FRH2, FRH3, o FRH4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana) o incluye secuencias humanas de consenso para el marco concreto. En las realizaciones preferidas, la región marco es una región marco humana (por ejemplo, las regiones de marco humano que se muestran en las Tablas 13 y 14). En algunas realizaciones, la región marco incluye SECS con N° ID: 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, o combinaciones de las mismas.
La humanización o procesado de los anticuerpos del presente invento puede llevarse a cabo utilizando cualquier método conocido, como por ejemplo, entre otros, los descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321:522
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(1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentes de los EE. UU. N°: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, W090/14430, EP 229246.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo incluye una región Fc modificada (por ejemplo, mutada). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc se ha modificado para reducir o mejorar las funciones efectoras del anticuerpo. En algunas realizaciones, la región Fc es un isotipo seleccionado a partir de IgM, IgA, IgG, IgE, u otro isotipo.
De forma alternativa o adicional, podría ser útil combinar modificaciones de aminoácido con una o más modificaciones de aminoácido que modifiquen el enlace de unión de Clq y/o la función de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de la región Fc de una molécula de enlace con IL-6. El polipéptido de inicio de interés concreto podría ser uno que se una con Clq y muestre citotoxicidad dependiente de complementos. Los polipéptidos con actividad de enlace de Clq pre-existente, que podrían también tener la capacidad de mediar cDc, podrían modificarse de forma que una de esas actividades o ambas se mejoren. Las modificaciones de aminoácidos que alteran Clq y/o modifican su función de citotoxicidad dependiente de complemento se describen, por ejemplo, en W00042072.
Tal y como se ha presentado, se puede diseñar una región de Fc de ingeniería humana de anticuerpo IL- 6 del presente invento con función efectora alterada, por ejemplo, modificando el enlace Clq y/o enlace de FcyR y por lo tanto cambiando la actividad CDC y/o la actividad ADCc. “Las funciones efectoras" son responsables de activar o disminuir una actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Entre los ejemplos de funciones efectoras se incluyen, entre otros: enlace Clq; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); enlace de receptor Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación inferior de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; bCr), etc. Dichas funciones efectoras podrían necesitar que la región Fc se combine con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio de anticuerpo variable) y puede evaluarse usando varios ensayos (por ejemplo, ensayos de enlace Fc, ensayos ADCC, ensayos CDC, etc.).
Por ejemplo, se puede generar una variante de región Fc de anticuerpo de ingeniería humana IL-6 con enlace de Clq mejorado y enlace de FcyRIII mejorado (por ejemplo, que tengan ambos actividad ADCC mejorada y actividad CDC mejorada). De forma alternativa, si se desea que la función efectora se reduzca o extirpe, una variante de región Fc puede modificarse con actividad de CDC reducida y/o actividad de ADCC reducida. En otras realizaciones, solo una de esas actividades podría incrementarse, y, opcionalmente, también la otra actividad reducirse (por ejemplo, para generar una variante de región Fc con actividad de ADCC mejorada, pero con actividad CDC reducida y viceversa).
Las mutaciones de Fc también se pueden modificar para cambiar su interacción con el receptor de Fc neonatal (FcRn) y mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Se ha descrito una colección de variantes de Fc humano con enlace mejorado al FcRn (Shields et al., (2001). High resolution mapping of the binding site on human IgGl for FcyRI, FcyRII, FcyRIII, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the FcyR [Mapeo de alta resolución de la ubicación de enlace en IgGl humano para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn y diseño de variantes de IgGl con enlace mejorado al FcyR], J. Biol. Chem. 276:6591-6604).
Otro tipo de sustitución de aminoácido sirve para modificar el patrón de glucosilación de la región de Fc de anticuerpo IL-6 de ingeniería humana. La glucosilación de una región de Fc normalmente de enlace-N o de enlaceO. Enlace-N hace referencia al enlace de la fracción del carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La glucosilación de enlace-O se refiere al enlace de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, los más habituales serina o treonina, aunque también se podrían utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Las secuencias de reconocimiento de unión enzimática de la fracción de carbohidrato a las secuencias péptidas de la cadena lateral de asparagina son asparagina-X-serina y asparagina-X- treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. De esa forma, la presencia de cualquiera de esas secuencias de péptidos en un polipéptido crea una ubicación potencial de glucosilación.
El patrón de glucosilación podría verse alterado, por ejemplo, al eliminar una o más ubicaciones de glucosilación encontradas en el polipéptido, y/o añadir una o más ubicaciones de glucosilación que no están presentes en el polipéptido. La adición de ubicaciones de glucosilación a la región de Fc de un anticuerpo de ingeniería humana IL-6 se consigue satisfactoriamente modificando la secuencia de aminoácido de forma que contenga una o más de las anteriormente descritas secuencias de tripéptidos (para ubicaciones de glucosilación de enlace-N). Una variante de glucosilación ejemplar tiene una sustitución de residuo de aminoácido de Asn 297 de la cadena pesada. La alteración también podría hacerse por medio de la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido original (para ubicaciones de glucosilación de enlace-O). De manera adicional, un cambio de Asn 297 a Ala puede retirar una de las ubicaciones de glucosilación.
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En ciertas realizaciones, el anticuerpo IL-6 del presente invento se expresa en células que expresan beta (l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III), de forma que GnT III añade GlcNAc al anticuerpo IL-6. Se proporcionan métodos para producir anticuerpos de esa forma en WO/9954342, WO/03011878, documento de patente 20030003097A1, y Umana et al., Nature Biotechnology [Biotecnología de la naturaleza], 17:176-180, feb. 1999. Un anticuerpo humano anti-IL-6 podría generarse por inmunización de un animal transgénico (por ejemplo, ratón, rata, hámster, primate no humano y otros similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal y como se describe en este documento o de la forma conocida en este ámbito. Las células que producen un anticuerpo humano anti-IL-6 pueden aislarse de dichos animales e inmortalizarse usando métodos adecuados, como los métodos descritos en este documento.
Los ratones transgénicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se unen a antígenos humanos pueden producirse por métodos conocidos (por ejemplo, entre otros, Patentes de los EE. UU. N°: 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 y 5.789.650 publicado en Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 Bl, Kucherlapate et al. EP 0710 719 Al, Surani et al. Patente de EE. UU. N° 5.545.807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 Bl, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acid Research [Investigación de ácido nucleico] 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(l):65-93 (1995) y Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)). Generalmente, estos ratones incluyen por lo menos un transgen que incluye ADN de por lo menos un lugar de inmunoglobulina humana que está reorganizado funcionalmente, o que puede reorganizarse funcionalmente. Las ubicaciones de inmunoglobulina endógena en dichos ratones pueden alterarse o borrarse para eliminar la capacidad del animal de producir anticuerpos codificados por genes endógenos.
La investigación de anticuerpos para enlace específico a proteínas similares o fragmentos puede conseguirse de forma adecuada usando bibliotecas de péptidos. Este método implica la investigación de grandes colecciones de péptidos buscando miembros individuales que tengan la función o estructura deseadas. La investigación de anticuerpos sobre bibliotecas de péptidos es bien conocida en este ámbito. Las secuencias de péptidos mostradas pueden tener una longitud de entre 3 y 5000 o más aminoácidos, frecuentemente entre 5-100 aminoácidos, y muchas veces entre 8 y 25 aminoácidos de longitud. Además de los métodos sintéticos químicos directos para generar bibliotecas de péptidos, se han descrito varios métodos de ADN recombinante. Un tipo implica la exposición de una secuencia de péptido en la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de péptido concreta que se presenta. Dichos métodos se describen en las publicaciones de patentes PCT n° 91/17271, 91/18980, 91/19818 y 93/08278.
Otros sistemas para generar bibliotecas de péptidos tienen aspectos tanto de métodos de síntesis química in vitro y recombinantes. Véanse las publicaciones de patentes PCT n° 92/05258, 92/14843 y 96/19256. Véanse también las patentes de los EE. UU. N° 5.658.754 y 5.643.768. Las bibliotecas de presentación de péptidos, vectores y kits de investigación se encuentran disponibles comercialmente de proveedores como Invitrogen (Carlsbad, CA) y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n° 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, asignado a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, asignado a Dyax, 5427908, 5580717, asignado a Afrymax; 5885793, asignado a Cambridge Antibody Technologies; 5750373, asignado a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, asignado to Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; o Sambrook, supra. Los anticuerpos del presente invento también se pueden preparar usando por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que codifica ácido nucleico para producir animales transgénicos o mamíferos, como cabras, vacas, caballos, ovejas, conejos y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Dichos animales pueden proporcionarse usando métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, entre otros, patentes de los EE. UU. N° 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5.304.489 y otros similares presentados en este documento.
Los anticuerpos presentados en este documento pueden también prepararse usando por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que codifica ácido nucleico para proporcionar plantas transgénicas y células de plantas cultivadas (por ejemplo, entre otras, tabaco y maíz) que producen dichos anticuerpos, porciones especificadas o variantes de las partes de las plantas o en células cultivadas de los mismos. Únicamente a modo de ejemplo, las hojas de tabaco transgénico que expresan proteínas recombinantes se han usado con éxito para proporcionar grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, usando un impulsor inducible. Véase, por ejemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) y referencias allí citadas. Además, el maíz transgénico se ha usado para expresar proteínas de mamíferos a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Ver, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) y referencias allí citadas. Los anticuerpos también se han producido en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas que incluyen fragmentos de anticuerpo, como anticuerpos de cadena única (scFv's), incluidas las semillas de tabaco y tubérculo
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de patata. Véase, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) y referencias allí citadas. Así, los anticuerpos del presente invento también pueden producirse usando plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos. Ver también, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (oct., 1999), Ma et al, Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); y referencias allí citadas.
Los anticuerpos presentados aquí pueden enlazar IL-6 humano con una amplia gama de afinidades (Kd). En una de las realizaciones preferidas, por lo menos un mAb humano del presente invento podría enlazar IL-6 humano con alto nivel de afinidad. Por ejemplo, un mAb humano de ingeniería humana puede enlazar a IL-6 humano con un Kd igual o menor de aproximadamente 10'7 M, como por ejemplo, entre otros, 0,1-9,9 (o cualquier rango o valor del mismo) X 10'7, 10'8, 10'9, 10'1°, 10-11, 10'12, 10'13, 10'14, 10'15 o cualquier rango o valor de los mismos, determinado por resonancia plasmónica de la superficie o el método Kinexa, practicado por expertos en la materia.
La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse de forma experimental usando cualquier método adecuado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, et al, “Anticuerpo-Antigen Interactions” [Interacciones anticuerpo-antígeno] en Fundamental Immunology [Inmunología fundamental], Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, nY (1984); Kuby, Janis Immunology [Inmunología], W. H. Freeman y Company: New York, NY (1992); y los métodos allí descritos). La afinidad medida de una interacción concreta anticuerpo-antígeno puede variar si se mide bajo afecciones diferentes (por ejemplo, concentración salina, pH). Así, la medición de afinidad y otros parámetros relacionados con el enlace de antígenos (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) preferiblemente se realizan con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado, como el descrito en el presente documento.
Pueden llevarse a cabo ensayos competitivos con el anticuerpo del presente invento para determinar qué proteínas, anticuerpos, y otros antagonistas compiten por enlazarse a iL-6 con el anticuerpo del presente invento y/o comparten la región de epítopo. Estos ensayos conocidos por cualquiera que tenga un conocimiento normal de la materia evalúan la competición entre antagonistas o ligandos por un número limitado de ubicaciones de enlace en una proteína. La proteína y/o anticuerpo se ha inmovilizado o insolubilizado antes o después de la competición y la muestra enlazada a IL-6 se separa a partir de la muestra no enlazada, por ejemplo, decantando (donde la proteína/anticuerpo se ha preinsolubilizado) o centrifugando (donde la proteína/anticuerpo se precipitó tras la reacción competitiva). Además, el enlace competitivo podría verse determinado por si la función se ver alterada por el enlace o falta de enlace del anticuerpo a la proteína, por ejemplo, si la molécula del anticuerpo inhibe o potencia la actividad enzimática de, por ejemplo, una etiqueta. Podrían usarse ELISA y otros ensayos funcionales, como se conoce en este ámbito.
Los anticuerpos anti-IL-6 presentados en este documento tienen las secuencias que se muestran en las Tablas 1-5 y 12-14. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 presentado en este documento tiene una de las secuencias de cadena ligera CDR secuencias que se muestran en la Tabla 1 (por ejemplo, CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y una de las secuencias de la cadena pesada CDR que se muestran en la Tabla 2 (por ejemplo, CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Más específicamente, un anticuerpo anti-IL-6 (molécula AME- A9) tiene el CDRL1 de la SEC ID N°: 15, cDrL2 de la SEC ID N°: 27, CDRL3 de la SEC ID N°: 35, CDRH1 de la SEC ID N°:4 7, CDRH2 de la SEC ID N°: 61, CDRH3 de la SEC ID N°:9 1.
Moléculas de ácido nucleico
Usando la información que se proporciona en este documento, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican por lo menos 70-100 % de los aminoácidos contiguos de por lo menos una de las regiones variables de cadenas ligeras de SEC ID N°: 93, 97 y 101, entre otras secuencias presentadas aquí, y por lo menos una de las regiones variables de la cadena pesada de SEC ID N°: 95, 99 y 103, entre otras secuencias presentadas aquí, fragmentos especificados, variantes o secuencias de consenso de los mismos, o un vector depositado que incluye por lo menos una de esas secuencias, una molécula de ácido nucleico del presente invento que codifica por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 puede obtenerse usando descritos en el presente documento o por técnicas conocidas.
Las moléculas de ácido nucleico del presente invento pueden estar en forma de ARN, como mARN, hnARN, tARN o cualquier otra forma, o en forma de ADN, incluidos, entre otros, cADN y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El ADN puede ser de triple cadena, de doble cadena o de cadena única o cualquier combinación de los anteriores. Cualquier porción de por lo menos una cadena del ADN o ARN puede ser la cadena de codificación, también conocida como cadena de sentido, o puede ser la cadena de no codificación, también denominada cadena anti-sentido.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas presentadas en este documento pueden incluir moléculas de ácido nucleico que incluye un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente, con un intrón o más, por ejemplo, entre otros, por lo menos una porción especificada de por lo menos un CDR, como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de por lo menos una cadena pesada (por ejemplo, SEC ID N°: 38, 40, 42, 44, etc.) o cadena ligera (por ejemplo, SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, etc.); moléculas de ácido nucleico que incluyen la secuencia de codificación de un anticuerpo anti-IL-6 o
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región variable (por ejemplo, región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 94, 98 y 102, entre otras secuencias presentadas en este documento, y regiones variables de cadena pesada de SEC ID N°: 96, 100 y 104); y moléculas de ácido nucleico que incluyen una secuencia de nucleótido claramente diferente de las descritas anteriormente que, debido a la degeneración del código genético, siguen codificando por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como se describe en este documento y/o como se conoce en este ámbito. Por supuesto, el código genético es bien conocido en esta técnica. Así, sería rutinario para alguien experto en la materia generar dichas variantes de ácido nucleico degenerado que codifican anticuerpos específicos anti-IL-6s del presente invento. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., supra, y dichas variantes de ácido nucleico se incluyen en el presente invento.
Tal y como se indica en este documento, las moléculas de ácido nucleico del presente invento que incluyen un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6 pueden incluir, entre otras, las que codifican la secuencia de aminoácido de un fragmento de anticuerpo, por sí mismo; la secuencia de codificación del anticuerpo completo o una porción del mismo; la secuencia de codificación de un anticuerpo, fragmento o porción, así como secuencias adicionales, como la secuencia de codificación de por lo menos una señal íder o péptido de fusión, con o sin las secuencias de codificación adicionales anteriormente mencionadas, como por lo menos un intrón, junto con secuencias adicionales de no-codificación, incluidas, entre otras, secuencias de no-codificación de 5' y 3', como las secuencias transcritas no trasladadas que tienen un papel en transcripción, procesamiento mARN, incluido empalme y señales de poliadenilación (por ejemplo, el enlace de ribosoma y estabilidad de mARN); una secuencia de codificación adicional que codifica aminoácidos adicionales, como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Así, la secuencia que codifica un anticuerpo puede fusionarse a una secuencia de marcador, como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo fusionado que incluye un fragmento o porción de anticuerpo.
Polinucleótidos que se hibridan de forma selectiva a un polinucleótido de la forma descrita en el presente documento
También se presentan ácidos nucleicos aislados que hibridizan bajo afecciones de hibridación selectiva a un polinucleótido presentado en este documento. Así, los polinucleótidos de esta realización pueden usarse para aislar, detectar, y/o cuantificar ácidos nucleicos que incluyen dichos polinucleótidos. Por ejemplo, esos polinucleótidos pueden usarse para identificar, aislar, o amplificar clones de longitud parcial o completa en una biblioteca depositada. En algunas realizaciones, los polinucleótidos son genómicos o secuencias de cADN aisladas, o complementarios de otra forma a un cADN de una biblioteca de ácido nucleico humano o mamífero.
Preferiblemente, la biblioteca de cADN incluye por lo menos un 80 % de secuencias de longitud completa, preferiblemente, por lo menos un 85 % o 90 % de secuencias de longitud completa, y, más preferiblemente, por lo menos un 95 % de secuencias de longitud completa. Las bibliotecas de cADN pueden normalizarse para incrementar la realización de secuencias raras. Las afecciones de hibridación de nivel de endurecimiento bajo o moderado se usan normalmente, pero no solo, con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida en relación con secuencias complementarias. Las afecciones de nivel de endurecimiento moderado y elevado podrían usarse para secuencias de mayor identidad. Las afecciones de bajo nivel de endurecimiento permiten la hibridación selectiva de secuencias que tienen por lo menos una identidad de secuencia del 70 % y pueden usarse para identificar secuencias ortólogas o parálogas.
De manera opcional, estos polinucleótidos codificarán por lo menos una porción de un anticuerpo codificado por los polinucleótidos descritos en este documento. Los polinucleótidos presentados abarcan secuencias de ácido nucleico que se pueden usar para hibridación a un polinucleótido que codifica un anticuerpo del presente invento. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra.
Construcción de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos aislados del presente invento pueden construirse utilizando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación y/o (d) combinaciones de las mismas, de forma bien conocida en este ámbito.
Los ácidos nucleicos pueden incluir secuencias además de un polinucleótido del presente invento. Por ejemplo, una ubicación de multi-clonación que comprende una o más ubicaciones de restricción de endonucleasa puede insertarse en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleótido. Además, las secuencias trasladables pueden insertarse para ayudar en el aislamiento del polinucleótido trasladado del presente invento. Por ejemplo, una secuencia de marcador de hexa-histidina proporciona un medio adecuado para la purificación de las proteínas del presente invento. El ácido nucleico del presente invento, sin incluir la secuencia de codificación, podría ser un vector, adaptador o vinculador para clonar y/o expresar un polinucleótido del presente invento.
Pueden añadirse secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o expresión para mejorar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar al aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción
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del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y vinculadores es bien conocido en este ámbito (véase, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra).
Métodos recombinantes para la construcción de ácidos nucleicos
Los compuestos de ácido nucleico aislado de este invento, como ARN, cADN, ADN genómico, o cualquier combinación de los mismos, puede obtenerse a partir de fuentes biológicas usando cualquier cantidad de métodos de clonación conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las sondas de oligonucleótido que hibridan de forma selectiva, en afecciones severas, a los polinucleótidos del presente invento se usan para identificar la secuencia deseada en una biblioteca de cADN o de ADN genómico. El aislamiento de ARN y la construcción de bibliotecas de cADN y genómicas, son bien conocidas por los conocedores de estas técnicas (véase, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra)
Métodos de de investigación y aislamiento de ácido nucleico
Una biblioteca de cADN o genómica puede investigarse usando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido del presente invento, como los presentados en este documento. Las sondas pueden usarse para hibridar con secuencias de ADN genómico o cADN para aislar genes homólogos en el mismo organismo o en otros diferentes. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden usar varios grados de endurecimiento de la hibridación; la hibridación o el medio de lavado pueden ser endurecedores. Al irse endureciendo las afecciones para la hibridación, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y el objetivo para que se produzca la formación doble. El grado de endurecimiento puede controlarse por uno o más de los siguientes elementos: temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizador, como la formamida. Por ejemplo, la dureza de la hibridación se modifica de forma adecuada cambiando la polaridad de la solución reactiva a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida dentro del rango de 0 % a 50 %. El grado de complementariedad (identidad de la secuencia) necesario para un enlace detectable variará de acuerdo con la estringencia del medio de hibridación y/o medio de lavado. El grado óptimo de complementariedad será 100 % o 70 - 100 %, o cualquier rango o valor del mismo. De todas formas, debe entenderse que las variaciones menores de las secuencias en las sondas y cebadores se puede compensar reduciendo la dureza de la hibridación y/o del medio de lavado.
Los métodos de amplificación del ARN o ADN son bien conocidos en este ámbito y se pueden usar de acuerdo con el presente invento sin demasiada experimentación, en base a la formación y directrices que se presentan en este documento.
Entre los métodos conocidos de amplificación de ADN o ARN se incluyen, entre otros, reacción de cadena de polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, patentes de los EE. UU. n° 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, a Mullis, et al.; 4.795.699 y 4.921.794 a Tabor, et al; 5.142,033 to Innis; 5.122.464 a Wilson, et al.; 5.091.310 a Innis; 5.066.584 a Gyllensten, et al; 4.889.818 a Gelfand, et al; 4.994.370 a Silver, et al; 4.766.067 a Biswas; 4.656.134 to Ringold) y amplificación mediada por ARN que usa ARN anti-sentido a la secuencia objetivo como modelo para síntesis de aDn de doble cadena (patente de los EE. UU. n° 5.130.238 a Malek, et al, con NASBA como nombre comercial). (Véase, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra.)
Por ejemplo, la tecnología de reacción de cadena de polimerasa (PCR) puede usarse para amplificar las secuencias de polinucleótidos del presente invento y genes relacionados directamente a partir de bibliotecas de ADN genómico o cADN. PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican para la expresión de las proteínas, para hacer ácidos nucleicos para su uso como sondas para detectar la presencia deseada de mARN en muestras, para la secuenciación de ácido nucleico o para otros propósitos. Se encuentran ejemplos de técnicas que permitirían guiar a conocedores de la materia en métodos de amplificación in vitro en Berger, supra, Sambrook, supra, y Ausubel, supra, así como Mullís, et al., patente de los EE. UU. n° 4.683.202 (1987); y Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications [Protocolos PCR, guía para métodos y aplicaciones], Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). En este ámbito se conocen los kits que se encuentran disponibles comercialmente para la amplificación genómica de PCR. Véase, por ejemplo, Advantage- GC Genomic PCR Kit (Clontech). Además, por ejemplo, la proteína T4 de gen 32 (Boehringer Mannheim) puede usarse para mejorar el rendimiento de productos de PCR larga.
Métodos sintéticos para la construcción de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos aislados del presente invento también se pueden preparar por medio de síntesis química directa por métodos conocidos (véase, por ejemplo, Ausubel, et al., supra). La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de cadena única, que se puede convertir a ADN de doble cadena por hibridación con una secuencia complementaria, o por polimerización con una polimerasa de ADN usando la cadena única como modelo. Un experto en la materia reconocería que mientras la síntesis química del ADN se puede limitar a secuencias de aproximadamente 100 o más bases, se pueden obtener secuencias más largas por la ligadura de secuencias más cortas.
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Casetes de expresión recombinante
El presente invento también proporciona casetes de expresión recombinante que incluye un ácido nucleico del presente invento. Una secuencia de ácido nucleico del presente invento, por ejemplo, un cADN o una secuencia genómica que codifica un anticuerpo del presente invento, puede usarse para construir una casete de expresión recombinante que se puede introducir en por lo menos una de las células hospedadoras que se deseen. Una casete de expresión recombinante normalmente incluirá un polinucleótido del presente invento enlazado de forma operativa a las secuencias regulatorias de iniciación transcripcional que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedadora pretendida. Tanto los promotores heterólogos como no-heterólogos (por ejemplo, endógeno) pueden usarse para la expresión directa de los ácidos nucleicos del presente invento.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados que sirven como agente promotor, o de mejora, u otros elementos pueden introducirse en la posición adecuada (ascendente, descendiente o en el intrón) de una forma no-heteróloga de un polinucleótido del presente invento para regular en dirección ascendiente o descendiente la expresión de un polinucleótido del presente invento. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden modificarse in vivo in vivo o in vitro por mutación, eliminación y/o sustitución.
Vectores y células hospedadoras
El presente invento también tiene relación con los vectores que incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico del presente invento, células hospedadoras que se modifican genéticamente con los vectores recombinantes, y la producción de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por técnicas recombinantes, bien conocidas en este ámbito. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra.
Los polinucleótidos pueden enlazarse a un vector que contenga un marcador seleccionable para su propagación en un anfitrión. Generalmente, se introduce un vector plásmido en un precipitado, como un fosfato de calcio precipitado, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro usando una línea celular de empaquetado adecuado y a continuación transducirse a las células hospedadoras.
La inserción de ADN debería estar enlazada de forma operativa a un promotor adecuado. La construcción de la expresión contendrá ubicaciones para la iniciación, terminación de la transcripción y, en la región transcrita, una ubicación de enlace de ribosoma para su conversión. La porción de codificación de las transcripciones maduras expresadas por las construcciones incluirán, preferiblemente, una transcripción que se iniciaría al principio y un codón de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) posicionado de forma apropiada al final del mARN que se va a convertir, siendo UAA y uAg preferibles para la expresión celular de mamíferos o eucariotas.
Los vectores de expresión preferiblemente (de forma opcional) incluirán por lo menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen, por ejemplo, entre otros, metotrexato (MTX), reductasa de dehidrofolato (DHFR, patente de los EE. UU. n° 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), resistencia al cultivo de célula eucariota de ácido micofenólico o sintetasa de glutamina (GS, patente de los EE. UU. n° 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) y genes de resistencia de tetraciclina o ampicilina para el cultivo de E. coli y otras bacterias o procarióticos. Los medios de cultivo adecuados y afecciones de las células hospedadoras antes descritas son conocidos en este ámbito. Los vectores adecuados serán evidentes fácilmente para el experto en la materia. La introducción de una construcción de vector en una célula hospedadora puede lograrse por transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por dextrano-DEAE, transfección catiónica mediada por lípido, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos. Dichos métodos están descritos por ejemplo en Sambrook, supra, capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, capítulos 1, 9, 13, 15, 16.
Por lo menos un anticuerpo del presente invento puede expresarse en forma modificada, como proteína de fusión, y puede incluir tanto señales de secreción como regiones funcionales adicionales de heterólogo. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, aminoácidos con carga particular, pueden añadirse al término-N de un anticuerpo para mejorar su estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante su posterior manipulación y almacenamiento. Además, las fracciones de péptido pueden añadirse a un anticuerpo del presente invento para facilitar la purificación. Dichas regiones pueden retirarse antes de la preparación final de un anticuerpo o por lo menos un fragmento de las mismas. Dichos métodos están descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, como Sambrook, supra, capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, capítulos 16, 17 y 18.
Los expertos en la materia son conocedores de los muchos sistemas disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína del presente invento. De forma alternativa, ácidos nucleicos del presente invento pueden expresarse en una célula hospedadora activándose (por medio de manipulación) en una célula hospedadora que contiene ADN endógeno que codifica un anticuerpo del presente invento. Dichos métodos son bien conocidos en este ámbito, por ejemplo, tal y como se describe en las patentes de los EE. UU. n° 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 y 5.733.761.
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Ilustrativas de los cultivos celulares útiles para la producción de los anticuerpos, porciones especificadas o variantes de las mismas, son las células de mamífero. Los sistemas celulares de mamíferos con frecuencia tendrán la forma de monocapas de células aunque también se pueden usar suspensiones de células de mamíferos o biorreactores. Se han desarrollado varias líneas de células hospedadoras adecuadas capaces de expresar proteínas glicosiladas intactas, que incluyen COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, aTcC cRl-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26) líneas celulares, células Cos-7, células ChO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, células 293, células HeLa y otras similares, que están disponibles a partir de, por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (
www.atcc.org). Las células hospedadoras preferibles incluyen células de origen linfoide, como células de mieloma y linfoma. Se prefieren especialmente las células hospedadoras P3X63Ag8.653 (Número de entrada ATCC CRL-1580) y células SP2/0-Agl4 (Número de entrada ATCC CrL-1851). En una de las realizaciones que se prefieren, la célula recombinante es una P3X63Ab8.653 o una célula SP2/0-Agl4.
Los vectores de expresión para esas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de expresión, como por ejemplo, entre otros, un origen de una replicación; un promotor (por ejemplo, promotores tardíos o iniciales de Sv40, el promotor CMV (patentes de los Ee. UU. n° 5.168.062; 5.385.839), un promotor HSV tk, un promotor pgk (cinasas de fosfoglicerato), un promotor EF-1 alfa (patente de los EE. UU. n° 5.266.491), por lo menos un promotor de inmunoglobulina humana; un mejorador, y/o ubicaciones de procesamiento de información, como ubicaciones de enlace de ribosoma, ubicaciones de empalme de ARN, ubicaciones de poliadenilación (por ejemplo, una ubicación de adición SV40 T Ag poli A), y secuencias de terminación transcripcional. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Otras células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas del presente invento son conocidas y/o disponibles, por ejemplo, a partir del Catálogo de la Colección de Cultivos Tipo Americanos de Líneas Celulares e Hibridomas (
www.atcc.org) u otras fuentes conocidas o comerciales.
Cuando se usan células hospedadoras eucariotas, las secuencias de terminación de poliadenilación o transcripción normalmente se incorporan al vector. Un ejemplo de secuencia de terminación es la secuencia de poliadenilación a del gen de la horma del crecimiento bovino. También se pueden incluir secuencias para empalmar de forma exacta la transcripción. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Además, las secuencias de genes que van a controlar la replicación en la célula hospedadora pueden incorporarse al vector, por técnicas conocidas.
Purificación de un anticuerpo
Un anticuerpo anti-IL-6 puede recubrirse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos conocidos entre los que se incluyen, entre otros, purificación de proteína A, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía por intercambio de anión o catión, cromatografía fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía por hidroxilapatita y cromatografía por lectina. También se puede usar para la purificación la cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"). Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology [Protocolos actuales en inmunología], o Current Protocols in Protein Science [Protocolos actuales en ciencia de las proteínas], John Wiley & Sons, NY, Ny, (1997-2001), por ejemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10.
Los anticuerpos del presente invento incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un anfitrión eucariota, que incluye, por ejemplo, levadura, células de especies de planta superior, insectos y mamíferos. Dependiendo del anfitrión que se haya utilizado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo del presente invento puede glicosilarse o no-glicosilarse, pero se prefiere el glicosilado. Dichos métodos se describen en muchos manuales estándar de laboratorio, como Sambrook, supra, secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science [Ciencia de las proteínas], supra, capítulos 12-14.
Anticuerpos anti-IL-6s
Un anticuerpo anti-IL-6 presentado en este documento incluye cualquier proteína o molécula que contenga péptidos que incluya por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, como por ejemplo, entre otras, por lo menos una porción de enlace de ligando (LBP), como por ejemplo, entre otras, una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de enlace a ligando del mismo, una cadena pesada o región variable de cadena ligera, una región marco (por ejemplo, FR1, FR2, FR3, FR4 o un fragmento de las mismas, o como se muestra en las SEC ID N°: 105-112, de forma opcional que incluye por lo menos una sustitución, inserción o eliminación), una región constante de cadena pesada o cadena ligera, (por ejemplo, que incluye por lo menos una CHI, articulaciónl, articulación2, articulación3, articulación4, CH2 o CH3 o fragmentos de las mismas, que a demás podría comprender por lo menos una sustitución, inserción o eliminación), o cualquier porción de los mismos, que puede incorporarse a un anticuerpo presentado en este documento. Un anticuerpo presentado en este documento puede incluir o derivarse de cualquier mamífero, como por ejemplo, entre otros, un
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humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate o cualquier combinación de los mismos y otros similares.
Los anticuerpos aislados del presente invento incluyen las secuencias de anticuerpo de aminoácidos presentados en este documento codificados por cualquier polinucleótido adecuado o cualquier anticuerpo aislado o preparado. Preferiblemente, el anticuerpo humano o fragmento de enlace al antígeno une IL-6 humano y, por lo tanto, neutraliza parcial o notablemente por lo menos una actividad biológica de la proteína. Un anticuerpo, o porción especificada o variante de los mismos, que neutraliza parcialmente o preferiblemente de forma notable por lo menos una actividad biológica de por lo menos una proteína IL-6 o fragmento puede enlazar la proteína o fragmento y por lo tanto inhibir actividades mediadas por el enlace de IL-6 al receptor IL-6 o a través de otros mecanismos dependientes o mediados por IL-6. Tal y como se usa en este documento, el término “anticuerpo de neutralización” hace referencia a un anticuerpo que puede inhibir una actividad dependiente de IL-6 aproximadamente en un 20-120 %, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % o más dependiendo del ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-IL-6 de inhibir una actividad dependiente de IL-6 se evalúa preferiblemente por lo menos por una proteína adecuada IL-6 o ensayo receptor, como se describe en este documento y/o por técnicas conocidas. Un anticuerpo humano del invento puede ser de cualquier tipo (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) o isotipo y puede incluir una cadena ligera de kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo humano incluye una cadena pesada de IgG o un fragmento definido, por ejemplo, por lo menos uno de los isotipos, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 (por ejemplo, yI, y2, y3 o y4). Se pueden preparar anticuerpos de este tipo usando un ratón transgénico u otro mamífero transgénico no humano que incluye por lo menos transgenes de una cadena ligera humana (por ejemplo, IgG, IgA y IgM) como los descritos en este documento y/o por técnicas conocidas. En otra realización, el anticuerpo anti-humano IL-6 humano incluye una cadena pesada IgGl y una cadena ligera IgGl.
Por lo menos un anticuerpo del invento une por lo menos un epítopo específico a por lo menos una proteína IL-6, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los anteriores. Ese como mínimo un epítopo puede comprender por lo menos una región de enlace al anticuerpo que incluye por lo menos una porción de la proteína, cuyo epítopo es preferiblemente comprendido de por lo menos una porción extracelular, soluble, hidrofílica, externa o citoplásmica de la proteína. Ese como mínimo un epítopo especificado puede comprender cualquier combinación de lo menos una secuencia de aminoácido de por lo menos 1-3 aminoácidos a la porción especificada entera de aminoácidos contiguos de SEC ID N°: 115, por ejemplo), residuos de aminoácido 151-178, más específicamente, residuos 171-182.
Generalmente, el anticuerpo humano o fragmento de enlace de antígeno presentado en este documento incluirá una región de enlace de antígeno que incluye por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) o variante de por lo menos una región de cadena pesada variable y por lo menos una región determinante de la complementariedad humana (CDR1, CDR2 y CDR3) o variante de por lo menos una región variable de cadena ligera. Las secuencias CDR podrían derivarse de secuencias de línea germinal humana o coinciden exactamente con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, pueden usarse los CDRs de una biblioteca sintética derivados de los CDRs del ratón original. Esos CDRs podrían formarse por la incorporación de sustituciones conservadoras a partir de la secuencia original del ratón. Únicamente a modo de ejemplo, el anticuerpo o porción o variante de enlace de antígeno puede comprender por lo menos uno de los CDR3 de cadena pesada que tenga una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consta de SEC ID N°: 79, 81, 83, 85, 87, 89 y 91, y/o un CDR3 de cadena ligera que tenga una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consta de SEC ID N°: 29, 31, 33 y 35. En una realización concreta, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno puede tener una región de enlace de antígeno que incluye por lo menos una porción de por lo menos una cadena pesada CDR (por ejemplo, CDR1, CDR2 y/o CDR3) con la secuencia de aminoácido de los CDRs 1, 2, y/o 3 correspondientes (por ejemplo, SEC ID N°:37, 49 y 79). En otra realización concreta, el anticuerpo o porción de enlace de antígeno o variante puede tener una región de enlace de antígeno que comprenda por lo menos una porción de por lo menos un CDR de cadena ligera (por ejemplo, CDR1, CDR2 y/o CDR3) que tenga la secuencia de aminoácido de los CDRs 1, 2 y/o 3 correspondientes (por ejemplo, SEC ID N°: 1, 17 y 29).
En una de las realizaciones preferidas, los tres CDRs de cadena pesada y los tres CDRs de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno tienen la secuencia de aminoácido del CDR correspondiente de por lo menos uno de los siguientes mAb AME-A9, AME-lb, AME-18a, AME-22a, AME-20b, AME-23a y AME-19a, de la forma descrita en este documento. Dichos anticuerpos pueden prepararse uniendo químicamente las diversas porciones (por ejemplo, CDRs, marco) del anticuerpo usando técnicas convencionales, preparando y expresando una (por ejemplo, una o más) molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo usando técnicas convencionales de tecnología de ADN recombinante o usando otro método adecuado.
El anticuerpo anti-IL-6 puede incluir por lo menos uno entre: cadena pesada o región variable de cadena ligera con secuencia de aminoácido definida. Por ejemplo, en una de las realizaciones preferidas, el anticuerpo anti- IL-6 incluye por lo menos uno entre: por lo menos una región variable de cadena pesada, que podría tener una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consta de SEC ID N°:95, 99, 103, 118, 122, 126 y 130 y/o por lo menos una región variable de cadena ligera, que podría tener una secuencia de aminoácido seleccionada
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a partir del grupo que consta de SEC ID N°: 93, 97, 101, 116, 120, 124 y 128. Los anticuerpos que se unen al IL-6 humano y que incluyen una cadena pesada definida o una región variable de cadena ligera pueden prepararse utilizando métodos adecuados, como muestra de fago (Katsube, Y., et al, IntJMol. Med, l(5):863-868 (1998)) o métodos que emplean animales transgénicos, con técnicas conocidas y/o de la forma descrita en este documento. Por ejemplo, un ratón transgénico, que incluye un transgene de cadena pesada de cadena de inmunoglobina redistribuido de forma funcional y un transgen que incluye ADN de una ubicación de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede reorganizarse de forma funcional, puede inmunizarse con IL-6 humano o un fragmento del mismo para provocar la producción de anticuerpos. Si se desea, las células que producen anticuerpos pueden aislarse y los hibridomas u otras células inmortalizadas productoras de anticuerpos pueden prepararse de la forma descrita en este documento y/o con técnicas conocidas. De forma alternativa, el anticuerpo, porción especificada o variante puede expresarse usando el ácido nucleico de codificación o una porción suya en una célula hospedadora adecuada.
Códigos de aminoácidos
Los aminoácidos crean anticuerpos anti-IL-6s del presente invento con frecuencia se abrevian. Las designaciones de aminoácidos pueden indicarse designando el aminoácido por su código de letra única, su código de tres letras, nombre, o codón (o codones) de tres nucleótidos, de forma comprensible en este ámbito (ver Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Célula (Biología molecular de la célula), Tercera Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Un anticuerpo anti-IL-6 del presente invento puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones o adiciones, ya sea por mutaciones naturales o por manipulación humana, tal y como se especifica en el presente documento. Los aminoácidos de un anticuerpo anti-IL-6 el presente invento que son esenciales para su funcionamiento se pueden identificar por técnicas conocidas, como mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis de exploración de alanina (por ejemplo, Ausubel, supra, capítulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina simple en todos los residuos de la molécula. Se busca entonces actividad biológica en las moléculas mutantes resultantes, como por ejemplo, sin excluir otros, por lo menos una actividad neutralizadora de IL-6. Las ubicaciones críticas para el enlace de anticuerpos también se pueden identificar por medio de análisis estructural, como cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado de fotoafinidad (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
Los anticuerpos anti-IL-6s presentados en este documento pueden incluir, entre otros, por lo menos una porción, secuencia o combinación seleccionada a partir de 5 hasta todos los aminoácidos contiguos de por lo menos una de las SEC ID N°: 91, 93, 95, 97, 99, etc.
Las variantes no limitadoras que pueden mejorar o mantener por lo menos una de las actividades indicadas incluyen, entre otros, cualquiera de los polipéptidos anteriores, que también incluye por lo menos una mutación correspondiente a por lo menos una sustitución de los residuos modificados entre las secuencias presentadas de variantes de aminoácido.
Un anticuerpo anti-IL-6 también podría incluir un polipéptido con una secuencia de aminoácido que varía a partir de la secuencia de los aminoácidos contiguos de por lo menos uno de: SEC ID N°: 95, 99 y 103, etc (por ejemplo, una o más sustituciones conservadoras a partir de las secuencias indicadas en este documento). Además, en este documento se presentan variantes de la secuencia de aminoácido de una región variable de cadena ligera de SEC ID N°: 93, 97 o 101, o la secuencia de aminoácido de una cadena pesada de SEC ID N°: 79, 81, 83, 85, 87, 89 o 91.
Como comprenderán los expertos, el presente invento incluye por lo menos un anticuerpo del presente invento biológicamente activo. Los anticuerpos activos biológicamente tienen una actividad específica de por lo menos 20 %, 30 % o 40 % y preferiblemente, por lo menos 50 %, 60 %, o 70 %, y todavía más preferible, por lo menos del 80 %, 90 %, o 95 %-1000 % o más de eso que el anticuerpo nativo (no-sintético), endógeno o relacionado y conocido. Los métodos para probar y cuantificar las medidas de actividad enzimática y especificidad de sustrato son bien conocidos en este ámbito.
En otro aspecto, el invento se relaciona con anticuerpos humanos y fragmentos de enlace con antígeno, de la forma descrita en este documento, modificados por el enlace covalente de una fracción orgánica. Dicha modificación puede producir un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno con propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, aumento de media vida de suero in vivo). La fracción orgánica puede ser un grupo polimérico lineal o hidrofílico ramificado, grupo de ácidos grasos, o grupo de éster de ácidos grasos. En ciertas realizaciones, el grupo polimérico hidrofílico puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 800 a aproximadamente 120.000 Dalton y puede ser un glicol polialcano (por ejemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG)), carbohidrato de polímero, polímero de aminoácido o pirolidona de polivinilo, y el ácido graso o grupo de éster de ácido graso puede comprender entre aproximadamente ocho hasta aproximadamente cuarenta átomos de carbono.
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Los anticuerpos modificados y los fragmentos de enlace de antígeno del invento pueden incluir una o más fracciones orgánicas que están enlazadas de forma covalente, directa o indirectamente, al anticuerpo. Cada fracción orgánica enlazada a un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del invento podrían de forma independiente ser un grupo polimérico hidrofílico, un grupo de ácido graso o un grupo de éster de ácido graso. En este documento, el término “ácido graso” abarca ácidos mono-carboxílicos y ácidos di-carboxílicos. “Grupo polimérico hidrofílico”, usado en este texto, hace referencia al polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polisilina es más soluble en agua que en octano. Así, un anticuerpo modificado por la unión covalente de polisilina se incluye en el invento. Los polímeros hidrofílicos adecuados para la modificación de anticuerpos del invento pueden ser lineales o ramificados e incluir, por ejemplo, polialcan glicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilen glicol (mPEG), PPG y otros similares), carbohidratos (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y otros similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartata y otros similares), óxidos de polialcano (por ejemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno y otros similares) y pirolidona de polivinilo. Preferiblemente, el polímero hidrofílico que modifica el anticuerpo del invento tiene un peso molecular de aproximadamente entre 800 y 150.000 Dalton con entidad molecular independiente. Por ejemplo, se puede usar PEG5000 y PEG20.000, donde el subíndice es la media del peso molecular del polímero en Dalton. El grupo polimérico hidrofílico puede sustituirse con entre uno y seis grupos de alquilo, ácido graso o de éster de ácido graso. Los polímeros hidrofílicos que se sustituyen con un grupo de ácido graso o de éster de ácido graso se pueden preparar usando los métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que incluye un grupo de amina se puede acoplar a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso, y un carboxilato activado (por ejemplo, activado con diimizadola N, N-carbonilo) en un ácido graso o éster de ácido graso pueden acoplarse a un grupo de hidroxilo en un polímero.
Los ácidos grasos y ésteres de ácido graso adecuados para modificar anticuerpos del invento pueden saturarse o contener una o más unidades de insaturación. Entre los ácidos grasos adecuados para modificar los anticuerpos del invento se incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n- octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, arachidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), c/'s-A9-octadecanoate (C18, oleato), todos c/s-A5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanedioico, ácido tetradecanedioico, ácido octadecanedioico, ácido docosanedioico y otros similares. Entre los ésteres de ácidos grasos adecuados se incluyen los mono ésteres de ácidos dicarboxílicos que incluyen un grupo lineal o grupo bajo ramificado de alquilo. El grupo bajo de alquilo puede incluir entre uno y aproximadamente doce, y preferiblemente entre uno y seis átomos de carbono.
Los anticuerpos humanos modificados y los fragmentos de enlace de antígeno pueden prepararse usando métodos adecuados, como por ejemplo por la reacción de uno o más agentes modificadores. Un “agente modificador” en este texto, hace referencia a un grupo orgánico adecuado (por ejemplo, polímero hidrofílico, un ácido graso, un éster de ácido graso) que incluye un grupo de activación. Un "grupo de activación" es una fracción química o grupo funcional que puede, en afecciones concretas, reaccionar con un segundo grupo químico formando así un enlace covalente entre el agente modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos de activación reactivos a amina incluyen grupos electrofílicos, como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, yodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y otros similares. Los grupos de activación que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acrilolilo, disulfidos de piridilo, 5-tiol-2-tiol de ácido nitrobenzoico (TNB-tiol) y otros similares. Un grupo funcional de aldehído puede acoplarse a moléculas que contengan amina- o hidrazida, y un grupo de azida puede reaccionar con un grupo trivalente de fósforo para formar fosforamidato o enlaces de fosforimida. Los métodos adecuados para introducir grupos de activación en moléculas son conocidos en este ámbito (véase por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques [Técnicas de bioconjugados], Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo de activación puede enlazarse directamente al grupo orgánico (por ejemplo, polímero hidrofílico, ácido graso, éster de ácido graso), o a través de una fracción vinculadora, por ejemplo, un grupo de C1-C12 divalente donde uno o más átomos de carbono pueden sustituirse por un heteroátomo, como el oxígeno, nitrógeno o azufre. Entre las fracciones vinculadoras adecuadas se incluyen, por ejemplo, glicol de tetraetileno, - (CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-O-CH-NH-. Los agentes modificadores que incluyen una fracción vinculadora se pueden producir, por ejemplo, reaccionando una mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilenediamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de l-etilo-3-(3- dimetilaminopropilo) carbodiimida (EDC) para formar un enlace de amida entre la amina libre y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc puede retirarse del producto tratándolo con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que puede acoplarse a otro carboxilato, de la forma descrita, o puede reaccionarse con anhídrido maleico y el producto resultante puede ciclizarse para producir un derivado de maleimido activado del ácido graso (véase, por ejemplo, Thompson, et al., WO 92/16221.)
Los anticuerpos modificados del invento pueden producirse reaccionando un anticuerpo humano o fragmento de enlace de antígeno con un agente modificador. Por ejemplo, las fracciones orgánicas pueden enlazarse al anticuerpo de forma no específica para la ubicación usando un agente modificador reactivo de amina, por ejemplo, un éster NHS de PEG. Los anticuerpos humanos modificados o fragmentos de enlace antígeno también se pueden preparar reduciendo enlaces de disulfuro (por ejemplo, enlaces de disulfuro del interior de la cadena) de un anticuerpo o fragmento de enlace antígeno. El anticuerpo reducido o fragmento de enlace de antígeno entonces podría reaccionarse con un agente modificador reactivo de tiol para producir el anticuerpo modificado del invento.
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Los anticuerpos humanos modificados y los fragmentos de unión de antígeno que incluyen una fracción orgánica enlazada a ubicaciones específicas de un anticuerpo del presente invento pueden prepararse usando métodos adecuados, como proteolisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 5968 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456- 463 (1997)), y los métodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques [Técnicas de bioconjugados], Academic Press: San Diego, CA (1996).
Anticuerpos anti-idiotipo para compuestos de anticuerpo anti-IL-6
Además de los anticuerpos monoclonales anti-IL-6, en este documento también se presenta un anticuerpo anti-idiotípico (anti-id) específico de dichos anticuerpos. Un anticuerpo anti-id es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente a la región de enlace antígeno de otro anticuerpo. El anti-id puede prepararse inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, ratones) como fuente del anticuerpo de Id con el anticuerpo o un CDR que contenga una región de la misma. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizador y producir un anticuerpo anti-id. El anticuerpo anti-id también se podría usar como "inmunogene" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal, produciendo lo que se denomina un anticuerpo anti-anti-Id.
También se presenta en este documento por lo menos un compuesto de anticuerpo anti-IL-6 que incluye por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis o más anticuerpos anti-IL-6 de los mismos, de la forma descrita aquí y/o con técnicas conocidas que se proporcionan en un compuesto, mezcla o forma que no se produce de forma natural. Dichos compuestos incluyen composiciones que no se producen naturalmente que incluyen por lo menos una o dos variantes, dominios, fragmentos o variantes específicas de longitud completa, C- y/o N-terminalmente eliminados, de la secuencia de aminoácido de anticuerpo anti-IL-6 seleccionada a partir del grupo que consta de 70-100 % de los aminoácidos contiguos de SEC ID N°: 1-114 y 116-138, o fragmentos específicos, dominios o variantes de los mismos. Las composiciones preferidas de anticuerpo anti-IL-6 incluyen por lo menos uno o dos fragmentos, dominios o variantes de longitud completa como por lo menos un CDR o LBP que contenga porciones de la secuencia de anticuerpo anti-IL-6 descrita en este documento, por ejemplo, 70-100 % de SEC ID N°: 15, 27, 35, 47, 61 y 91, o fragmentos, dominios o variantes especificadas de los mismos. Se consideran todavía mejor las composiciones que incluyen, por ejemplo, 40-99 % de por lo menos uno de 70-100 % de SEC ID N°: 93, 95, 97, 99, 101, 103, etc., o fragmentos, dominios o variantes específicas de los mismos. Dichos porcentajes de las composiciones se refieren a peso, volumen, concentración, molaridad o molalidad de soluciones líquidas o sólidas, mezclas, suspensiones, emulsiones, partículas, polvo o coloides, por técnicas conocidas o de la forma descrita en este documento.
Composiciones de anticuerpos que incluyen ingredientes activos terapéuticamente
Las composiciones de anticuerpos del invento podrían también comprender una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto o proteína seleccionada a partir de por lo menos uno de los siguientes: medicamento antiinfeccioso, medicamento del sistema cardiovascular (CV), medicamento del sistema nervioso central (CNS), medicamento del sistema nervioso autónomo (ANS), medicamento del tracto respiratorio, medicamento del tracto gastrointestinal (GI), medicamento hormonal, medicamento para el equilibrio de líquidos o electrolitos, medicamento hematológico, antipleonástico, medicamento de inmunomodulación, medicamento oftalmológico, óptico o nasal, medicamento tópico, medicamento nutricional u otros similares. Dichos medicamentos son bien conocidos en este ámbito, incluidas formulaciones, indicaciones, dosificaciones y administración para cada uno de ellos presentada aquí (véase, por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs [Manual de medicamentos para enfermería 2001], 21a edición, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001 [Guía de medicamentos para profesionales de la salud], ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT).
Los medicamentos antiinfecciosos pueden ser por lo menos uno seleccionado de entre: amebicidas o por lo menos un antiprotozoario, antihelmínticos, antifúngicos, antipalúdicos, antituberculosis o por lo menos un antilepra, aminoglucósidos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, antivirales, antiinfecciosos macrólidos, y varios antiinfecciosos. El medicamento puede por lo menos ser uno de los siguientes: inotrópicos, antiarrítmicos, antianginosos, antihipertensivos, antilipémicos y otros medicamentos cardiovasculares. El medicamento del CNS puede ser por lo menos uno de los siguientes: analgésicos no narcóticos o por lo menos uno de los siguientes: antipiréticos, antiinflamatorios no esteroideos, analgésicos narcóticos o por lo menos un opiáceo, sedantes hipnóticos, anticonvulsivos, antidepresivos, medicamentos anti ansiedad, antipsicóticos, estimulantes del sistema nervioso central, antiparkinsonianos y otros medicamentos del sistema nervioso central. El medicamento para ANS puede ser por lo menos uno de los siguientes: colinérgicos (parasimpatomiméticos), anti-colinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpatolíticos), relajantes musculares y bloqueadores neuromusculares. El medicamento del tracto respiratorio puede ser por lo menos uno de los siguientes: antihistamínicos, broncodilatadores, expectorantes o por lo menos un antitusivo y varios medicamentos respiratorios. El medicamento del tracto GI puede ser por lo menos uno de los siguientes: antiácido o por lo menos un adsorbente o por lo menos un antiflatulento, enzima digestiva o por lo menos un solubilizador de cálculos biliares, antidiarreico,
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laxante, antiemético y medicamentos antiulcerosos. El medicamento hormonal puede ser por lo menos uno de los siguientes: corticosteroides, andrógenos o por lo menos un esteroide anabólico, estrógeno o por lo menos una progestina, gonadotropina, medicamento antidiabético o por lo menos un glucagón, hormona del tiroides, antagonista de hormona del tiroides, hormona pituitaria y medicamento tipo paratiroides. El medicamento para el equilibrio de fluidos y electrolito puede ser por lo menos uno de los siguientes: diuréticos, electrolitos o por lo menos una solución de reposición, acidificante o por lo menos un alcalinizador. El medicamento hematológico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hematínicos, anticoagulantes, derivados sanguíneos y enzimas trombolíticas. Los antineoplásicos pueden ser por lo menos uno de los siguientes: medicamentos alquilantes, antimetabolitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que modifican el equilibrio hormonal y otros antineoplásicos. El medicamento de inmunomodulación puede ser por lo menos uno de los siguientes: inmunosupresores, vacunas, por lo menos un toxoide, antitoxina o por lo menos un contraveneno, suero inmune y modificadores de la respuesta biológica. Los medicamentos oftálmicos, óticos y nasales pueden ser por lo menos uno de los siguientes: antiinfecciosos oftálmicos, antiinflamatorios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstrictores oftálmicos, varios oftálmicos, óticos y medicamentos nasales. El medicamento tópico puede ser por lo menos uno de los siguientes: antiinfecciosos locales, escabicidas o por lo menos un pediculicida o corticoesteroide tópico. El medicamento nutricional puede ser por lo menos uno de los siguientes: vitaminas, minerales o calóricos. Véase, por ejemplo, los contenidos del Manual de medicamentos de enfermería 2001, supra.
El como mínimo un amebicida o antiprotozoario puede por lo menos ser uno de los siguientes: atovaquona, hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazola, hidrocloruro de metronidazola e isentionato de pentamidina. El por lo menos un antelmíntico puede ser por lo menos uno de los siguientes: mebendazol, pamoato de pirantel y tiabendazol. El por lo menos un antifúngico puede ser por lo menos uno de los siguientes: anfotericina B, complejo de sulfato de colesterol de anfotericina B, complejo lípido de anfotericina B, liposomal de anfotericina B, fluconazol, flucitosina, micro-griseofulvina, ultramicro-griseofulvina, itraconazol, ketoconazol, nistatina y hidrocloruro de terbinafina. El por lo menos un antipalúdico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquinas, hidrocloruro de mefloquina, fosfato primaquina, pirimetamina y pirimetamina con sulfadoxina. El por lo menos un antituberculoso o antilepra puede ser por lo menos uno de los siguientes clofazimina, cicloserina, dapsona, hidrocloruro de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampina, rifapentina y sulfato de estreptomicina. El por lo menos un aminoglucosida puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de amikacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina y sulfato de tobramicina. El por lo menos un elemento de penicilina puede ser por lo menos uno de los siguientes: amoxicilina/potasio de clavulanato, trihidrato de amoxicilina, ampicilina, sodio de ampicilina, trihidrato de ampicilina, sodio de ampicilina /sodio de sulbactam, sodio de cloxacilina, sodio de dicloxacilina, sodio de mezlocilina, sodio de nafcilina, sodio de oxacilina, benzatina de penicilina G, potasio de penicilina G, procaína de penicilina G, sodio de penicilina G, potasio de penicilina V, sodio de piperacilina, sodio de pieracilina/sodio de tazobactamo, disodio de ticarcilina y disodio de ticarcilina/potasio de clavulanato. El por lo menos un cefalosporino puede ser por lo menos uno de los siguientes: cefaclor, cefadroxil, sodio de cefazolina, cefdinir, hidrocloruro de cefepima, cefixima, sodio de cefmetazol, sodio de cefonicid, sodio de cefoperazona, sodio de cefotaxima, disodio de cefotetán, sodio de cefoxitina, proxetil de cefpodoxima, cefprozil, ceftazidima, ceftibutén, sodio de ceftizoxima, sodio de ceftriaxona, axetil de cefuroxima, sodio de cefuroxime, hidrocloruro de cefalexín, monohidrato de cefalexín, cefradine y loracarbef. El por lo menos un elemento de tetraciclina puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de demeclocilclina, calcio de doxiciclina, hiclato de doxiciclina, hidrocloruro de doxiciclina, monohidrato de doxiciclina, hidrocloruro de minociclina e hidrocloruro de tetraciclina. La por lo menos una sulfonamida puede ser por lo menos una de las siguientes: co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, y acetilo de sulfisoxazol. El por lo menos una fluoroquinolona puede ser por lo menos uno de los siguientes mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, hidrocloruro de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, y mesilato de trovafloxacina. El por lo menos un elemento de fluoroquinolona puede ser por lo menos uno de los siguientes mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, hidrocloruro de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, y mesilato de trovafloxacina. El por lo menos un antiviral puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de abacavir, sodio de aciclovir, hidrocloruro de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, sodio de fomivirsen, sodio de foscamet, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudina/zidovudina, mesilato de nelfmavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, hidrocloruro de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, stavudina, hidrocloruro de valaciclovir, zalcitabina, zanamiviry zidovudina. El por lo menos un elemento de macrolina antiinfecciosa puede por lo menos ser uno de los siguientes: azitromicina, claritromicina, diritromicina, base de eritromicina, estolato de eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, lactobionato de eritromicina y estearato de eritromicina. El por lo menos un elemento infeccioso general puede ser por lo menos uno de los siguientes aztreonam, bacitracina, sucinato de sodio de cloranfenicol, hidrocloruro de clindamicina, hidrocloruro de palmitato de clindamicina, fosfato de clindamicina, sodio de imipenem y cilastatina, meropenem, macrocristales de nitrofurantoína, microcristales de nirofurantoína, quinupristina/dalfopristina, hidrocloruro de espectinomicina, trimetoprim e hidrocloruro de vancomicina. (Véase, por ejemplo, pp. 24-214 del Manual de medicamentos de enfermería 2001).
El por lo menos un inotrópico puede ser por lo menos uno de los siguientes: lactato de amrinona, digoxina, y lactato de milrinona. El por lo menos un antiarrítmico puede ser por lo menos uno de los siguientes adenosina, hidrocloruro de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretilio, hidrocloruro de diltiazem, disopiramida, fosfato de
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disopiramida, hidrocloruro de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, hidrocloruro de udocaína, hidrocloruro de mexiletina, hidrocloruro de moricizina, fenitoína, sodio de fenitoína, hidrocloruro de procainamida, hidrocloruro propafenona, hidrocloruro de propranolol, bisulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, hidrocloruro de tocainida e hidrocloruro de verapamil. El por lo menos un antianginal puede ser por lo menos uno de los siguientes: besilato de amlodipidina, nitrito de amilo, hidrocloruro de bepridilo, hidrocloruro de diltiazem, dinitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida, nadolol, hidrocloruro de nicardipina, nifedipina, nitroglicerina, hidrocloruro de propranolol, verapamil e hidrocloruro de verapamil. El por lo menos un antihipertensivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de acebutolol, besilato de amlodipina, atenolol, hidrocloruro de benazepril, hidrocloruro de betaxolol, fumarato de bisoprolol, ciletexil de candesartano, captopril, hidrocloruro de carteolol, carvedilol, clonidina, hidrocloruro de clonidina, diazoxida, hidrocloruro de diltiazem, mesilato de doxazosina, enalaprilat, maleato de enalapril, mesilato de eprosartano, felodipina, mesilato de fenoldopam, sodio de fosinopril, acetato de guanabenz, sulfato de guanadrel, hidrocloruro de guanfacina, hidrocloruro de hidralazina, irbesartano, isradipina, hidrocloruro de labetalol, lisinopril, potasio de losartano, metildopa, hidrocloruro de metildopato, succinato de metoprolol, tartrato de metoprolol, minoxidil, hidrocloruro de moexipril, nadolol, hidrocloruro de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, sodio de nitroprusida, sulfato de penbutolol, erbumina de perindopril, mesilato de fentolamina, pindolol, hidrocloruro de prazosina, hidrocloruro de propranolol, hidrocloruro de quinapril, ramipril, telmisartan, hidrocloruro de terazosina, maleato de timolol, trandolapril, valsarían e hidrocloruro de verapamil. El por lo menos un antilipémico puede ser por lo menos uno de los siguientes: calcio de atorvastatina, sodio de cerivastatina, colestiramina, hidrocloruro de colestipol, fenofibrato (micronizado), sodio de fluvastatina, gemfibrozil, lovastatina, niacina, sodio de pravastatina y simvastatina. El por lo menos un medicamento general CV puede ser por lo menos uno de los siguientes: abciximab, alprostadil, hidrocloruro de arbutamina, cilostazol, bisulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, hidrocloruro de midodrina, pentoxifilina, hidrocloruro de ticlopidina e hidrocloruro de tirofibano (véase, por ejemplo, pp. 215-336 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un analgésico no narcótico o antipirético puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetaminofeno, aspirina, trisalicilato de magnesio de colina, diflunisal y salicilato de magnesio. El por lo menos un medicamento antiinflamatorio no esteroideo puede ser por lo menos uno de los siguientes: celecoxib, potasio de diclofenaco, sodio de diclofenaco, etodolaco, calcio de fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, trihidrato de sodio de indometacina, ketoprofeno, trometamina de ketorolac, nabumetona, naproxeno, sodio de naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib y sulindac. El por lo menos un narcótico o analgésico opiáceo puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de alfentanil, hidrocloruro de buprenorfina, tartrato de butorfanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína, citrato de fentanilo, sistema transdérmico de fentalino, fentanilo transmucosal, hidrocloruro de hidromorfona, hidrocloruro de meperidina, hidrocloruro de metadona, hidrocloruro de morfina, sulfato de morfina, tartrato de morfina, hidrocloruro de nalbufina, hidrocloruro de oxicodona, pectinato de oxicodona, hidrocloruro de oximorfona, hidrocloruro de pentazocina, hidrocloruro de pentazocina e hidrocloruro de naloxona, lactato de pentazocina, hidrocloruro de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, hidrocloruro de remifentanil, citrato de sufentanil e hidrocloruro de tramadol. El por lo menos un sedante hipnótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrato de cloral, estazolam, hidrocloruro de flurazepam, pentobarbital, sodio de pentobarbital, sodio de fenobarbital, sodio de secobarbital, temazepam, triazolam, zaleplon y tartrato de zolpidem. El por lo menos un anticonvulsivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: sodio de acetazolamida, carbamazepina, clonazepam, dipotasio de clorazepato, diazepam, sodio de divalproex, etosuximda, sodio de fosfenitoína, gabapentina, lamotrigina, sulfato de magnesio, fenobarbital, sodio de fenobarbital, fenitoína, sodio de fenitoína, sodio de fenitoína (ampliado), primidona, hidrocloruro de tiagabina, topiramato, sodio de valproato y ácido valproico. El por lo menos un antidepresivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, hidrocloruro de bupropion, bromhidrato de citalopram, hidrocloruro de clomipramina, hidrocloruro de desipramina, hidrocloruro de doxepina, hidrocloruro de fluoxetina, hidrocloruro de imipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, hidrocloruro de nefazodona, hidrocloruro de nortriptilina, hidrocloruro de paroxetina, sulfato de fenelzina, hidrocloruro de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina e hidrocloruro de venlafaxina. El por lo menos un medicamento anti ansiedad puede ser por lo menos uno de los siguientes: alprazolam, hidrocloruro buspirona, clordiazepoxida, hidrocloruro de clordiazepoxida, dipotasio de clorazepato, diazepam, hidrocloruro de doxepina, embonato de hidroxizina, hidrocloruro de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, mefrobamato, hidrocloruro de midazolam y oxazepam. El por lo menos un medicamento antipsicótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de clorpromazina, clozapina, decanoato de fluphenazina, enantato de fluephenazina, hidrocloruro de fluphenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de haloperidol, hidrocloruro de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, hidrocloruro de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumarato de quetiapina, risperidona, hidrocloruro de tioridazina, tiothixena, hidrocloruro de tiothixena e hidrocloruro de trifluoperazina. El por lo menos un estimulante del sistema nervioso central puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, hidrocloruro de doxapram, hidrocloruro de metamfetamina, hidrocloruro de metilfenidato, modafinil, pemolina e hidrocloruro de fentermina. El por lo menos un antiparkinsoniano puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de amantadina, mesilato de benztropina, hidrocloruro de biperideno, lactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapona, levodopa, mesilato de pergolida, dehidrocloruro de pramipexole, hidrocloruro de ropinirol, hidrocloruro de selegilina, tolcapona e hidrocloruro de trihexifenidilo. El por lo menos un medicamento general del sistema nervioso central puede ser por lo menos uno de
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los siguientes: hidrocloruro de bupropion, hidrocloruro de donepezil, droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de litio, citrato de litio, hidrocloruro de naratriptano, polacrilex de nicotina, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptan, monohidrato de hidrocloruro de sibutramina, succinato de sumatriptano, hidrocloruro de tacrina y zolmitriptano (véase, por ejemplo, pp. 337-530 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un colinérgico (por ejemplo, parasimatomimético) puede ser por lo menos uno de los siguientes: cloruro de betanecol, cloruro de edrofonio, bromuro de neostigmina, metilsulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmina y bromuro de piridostigmina. El por lo menos un anticolinérgico puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de atropina, hidrocloruro de diciclomina, glicopirrolato, hiosciamina, sulfato de hiosciamina, bromuro de propantelina, escopolamina, butilbromuro de escopolamina e hidrobromuro de escopolamina. El por lo menos un adrergénico (simpatomimético) puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de dobutamina, hidrocloruro de dopamina, bitartrato de metaraminol, bitartrato de norepinefrina, hidrocloruro de fenilerfrina, hidrocloruro de pseudoefedrina y sulfato de pseudoefedrina. El por lo menos un bloqueador adrenérgico (simpatolítico) puede ser por lo menos uno de los siguientes: mesilato de dehidroergotamina, tartrato de ergotamina, maleato de metisergida e hidrocloruro de propranolol. El por lo menos un relajante muscular puede ser por lo menos uno de los siguientes: baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, hidrocloruro de ciclobenzaprina, sodio de dantroleno, metocarbamol e hidrocloruro de tizanidina. El por lo menos un bloqueador neuromuscular puede ser por lo menos uno de los siguientes: besilato de atracurio, besilato de cisatracurio, cloruro de doxacurio, cloruro de mivacurio, bromuro de pancuronio, bromuro de pipecuronio, bromuro de rapacuronio, bromuro de rocuronio, cloruro de succinilcolina, cloruro de tubocurarina y bromuro de vecuronio (véase, por ejemplo, pp. 531-84 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un antihistamínico puede ser por lo menos uno de los siguientes: maleato de bronfeniramina, hidrocloruro de cetirizina, maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, hidrocloruro de ciproheptadina, hidrocloruro de difenhidramina, hidrocloruro de fexofenadina, loratadina, hidrocloruro de prometazina, teoclato de prometazina e hidrocloruro de triprolidina. El por lo menos un broncodilatador puede ser por lo menos uno de los siguientes: albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartrato de epinefrina, hidrocloruro de epinefrina, bromuro de ipratropio, isoproterenol, hidrocloruro de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, hidrocloruro de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafato de salmeterol, sulfato de terbutalina y teofilina. El por lo menos un expectorante o antitusivo puede ser por lo menos uno de los siguientes: benzonatato, fosfato de codeína, sulfato de codeína, hidrobromuro de dextrametorfano, hidrocloruro de difenhidramina, guaifenesina e hidrocloruro de hidromorfona. El por lo menos un medicamento respiratorio general puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetilcisteína, dipropionato de beclometasona, beractante, budesonida, calfactante, sodio de cromolino, alfa domasa, sodio de epoprostenol, flunisolida, propionato de fluticasona, sodio de montelukast, sodio de nedocromil, palivizumab, acetonida de triamcinolona, zafirlukast y zileutón (véase, por ejemplo, pp. 585-642 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un antiácido, adsorbente o antiflatulento puede ser por lo menos uno de los siguientes: carbonato de aluminio, hidróxido de aluminio, carbonato de calcio, magaldrato, hidróxido de magnesio, óxido de magnesio, simeticona y bicarbonato de sodio. La por lo menos una enzima digestiva o solubilizador de cálculos biliares puede ser por lo menos uno de los siguientes: pancreatina, pancrelipasa, y ursodiol. El por lo menos un antidiarreico puede ser por lo menos uno de los siguientes: atapulguita, subsalicilato de bismuto, policarbofilo de calcio, hidrocloruro de difenoxilato y sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreótido, tintura de opio y tintura de opio (alcanforado). El por lo menos un laxante puede ser por lo menos uno de los siguientes: bisocodil, policarbofilo de calcio, cascara sagrada, fluidoextracto aromático de cascara sagrada, fluidoextracto de cascara sagrada, aceite de ricino, calcio de docusato, sodio de docusato, glicerina, lactulosa, citrato de magnesio, hidróxido de magnesio, sulfato de magnesio, metilcelulosa, aceite mineral, polietilenglicol o solución de electrolito, psilio, senna y fosfatos de sodio. El por lo menos un antiemético puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de clorpromazina, dimenhidrinato, mesilato de dolasetron, dronabinol, hidrocloruro de granisetron, hidrocloruro de meclizina, hidrocloruro de metocloproamida, hidrocloruro de ondansetron, perfenazina, proclorperazina, edisilato de proclorperazina, maleato de proclorperazina, hidrocloruro de prometazina, escopolamina, maleato de tietilperazina e hidrocloruro de trimetobenzamida. El por lo menos un medicamento antiulceroso puede ser por lo menos uno de los siguientes: cimetidina, hidrocloruro de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, sodio de rabeprozol, citrato de bismuto de rantidina, hidrocloruro de ranitidina y sucralfato (véase, por ejemplo, pp. 643-95 de Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un corticosteroide puede ser por lo menos uno de los siguientes: betametasona, acetato de betametasona o fosfato de sodio de betametasona, fosfato de sodio de betametasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato de sodio de hidrocortisona, succinato de sodio de hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato de sodio de metilprednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato de sodio de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triamcinolona, acetonida de triamcinolona y diacetato de triamcinolona. El por lo menos un esteroide andrógeno o anabólico puede ser por lo menos uno de los siguientes: danazol, fluoximesterona,
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metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona y sistema transdérmico de testosterona. El por lo menos un estrógeno o progestina puede ser por lo menos uno de los siguientes: estrógenos esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistema transdérmico de acetato de estradiol/noretindrona, valerato de estradiol, estrógenos (conjugados), estropipato, estradoiol de etinilo, estradiol y desogestrel de etinilo, estradiol de etinilo y diacetato de etinodiol, estradiol de etinilo y desogestrel, estradiol de etinilo y diacetato de etinodiol, estradiol de etinilo y levonorgestrel, estradiol de etinilo y noretindrona, estradiol de etinilo y acetato de norethindrona, estradiol de etinilo y norgestimata, estradiol de etinilo y norgestrel, estradiol de etinilo y noretindrona y acetatoy fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medroxiprogesterona, mestranol y noretindrona, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel y progesterona. La por lo menos una gonadroptropina puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetato de ganirelix, acetato de gonadorelina, acetato de histrelina y menotropinas. El por lo menos un antidiabético o glucagón puede ser por lo menos uno de los siguientes: acarbosa, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagón, gliburida, insulinas, hidrocloruro de metformina, miglitol, hidrocloruro de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona y troglitazona. La por lo menos una hormona tiroidea puede ser por lo menos uno de los siguientes sodio de levotiroxina, sodio de liotironina, liotrix y tiroidea. El por lo menos un antagonista de hormona tiroidea puede ser por lo menos uno de los siguientes metimazol, yoduro de potasio, yoduro de potasio (solución saturada), propiltiouracil, yodo radioactivo (yoduro de sodio 131I) y solución yodada fuerte. La por lo menos una hormona pituitaria puede ser por lo menos uno de los siguientes: corticotropina, cosintropina, acetato de desmofresina, acetato de leuprolida, corticotropina repositoria, somatrem, somatropina y vasopresina. El por lo menos un medicamento tipo paratiroideo puede ser por lo menos uno de los siguientes: calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (de salmón), calcitriol, dehidrotacisterol y disodio de etidronato (véase, por ejemplo, pp. 696-796 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un diurético puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetazolamida, sodio de acetazolamida, hidrocloruro de amilorida, bumetanida, clortalidona, sodio de etacrinato, ácido etacrínico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espironolactona, torsemida, triamtereno, y urea. El por lo menos un electrolito o solución de reposición puede ser por lo menos uno de los siguientes: acetato de calcio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, lactato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), fosfato de calcio (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (bajo peso molecular), hetaalmidón, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de potasio, bicarbonato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, inyección de Ringer, inyección de Ringer (lactato) y cloruro de sodio. El por lo menos un acidificador o alcalinizador puede ser por lo menos uno de los siguientes: bicarbonato de sodio, lactato de sodio y trometamina. (Véase, por ejemplo, pp. 797-833 of Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un hematínico puede ser por lo menos uno de los siguientes: fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (secado), dextrano de hiero, sorbitol de hierro, complejo de hierro polisacárido y complejo de gluconato férrico de sodio. El por lo menos un anticoagulante puede ser por lo menos uno de los siguientes: sodio de ardeparina, sodio de dalteparina, sodio danaparoide, sodio de enoxaparina, calcio de heparina, sodio de heparina y solución de warfarina. El por lo menos un derivado de la sangre puede ser por lo menos uno de los siguientes: albúmina 5 %, albúmina 25 %, factor antihemofílico, complejo coagulante anti-inhibidor, antitrombina III (humana), factor IX (humano), complejo factor IX y fracciones de proteína de plasma. La por lo menos una enzima trombolítica puede por lo menos ser uno de los siguientes: alteplasa, anistreplasa, reteplasa (recombinante), estreptocinasa y urocinasa (véase, por ejemplo, pp. 834-66 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un medicamento alquilante puede ser por lo menos uno de los siguientes: busulfano, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, hidrocloruro mecloretamina, melfalán, hidrocloruro de melfalán, estreptozocina, temozolomida y tiotepa. El por lo menos un antimetabolito puede ser por lo menos uno de los siguientes: capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracil, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, sodio de metotrexato y tioguanina. El por lo menos un antineoplástico antibiótico puede ser por lo menos uno de los siguientes sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato liposomal de daunorubicina, hidrocloruro de daunorubicina, hidrocloruro de doxorubicina, hidrocloruro liposomal de doxorubicina, hidrocloruro de epirubicina, hidrocloruro de idarubicina, mitomicina, pentostatina, plicamycina y valrubicina. El por lo menos un antineoplástico que modifica el equilibrio hormonal puede ser por lo menos uno de los siguientes: anastrozol, bicalutamida, fosfato de sodio de estramustina, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona y citrato de toremifeno. El por lo menos un antineoplástico general puede ser por lo menos uno de los siguientes: asparaginasa, bacilo Calmette-Guerin (BCG) (intravesical vivo), dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, hidrocloruro de gemcitabina, hidrocloruro de irinotecano, mitotano, hidrocloruro de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargasa, sodio de porfímero, hidrocloruro de procarbazina, rituximab, teniposida, hidrocloruro de topotecano, trastuzumab, tretinoína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina (véase, por ejemplo, pp. 867-963 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un inmunosupresor puede ser por lo menos uno de los siguientes: azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab, globulina inmune de linfocito, muromonab-CD3, mofetil de micofelonato, hidrocloruro mofetil de micofelonato, sirolimus y tacrolimus. La por lo menos una vacuna o toxoide puede ser por lo menos uno
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de los siguientes: vacuna de BCG, vacuna de la cólera, toxoides de difteria y tétanos (adsorbido), toxoides de difteria y tétanos y vacuna adsorbida de tos ferina celular, toxoides de difteria y tétanos y vacuna de la tos ferina de célula completa, vacunas conjugadas de hemofilia b, vacuna de hepatitis A (inactivada), vacuna de hepatitis B (recombinante), vacuna del virus de la gripe 1999-2000 de tipos trivalentes A & B (antígeno de superficie purificada), vacuna del virus de la gripe 1999-2000 de tipos trivalentes A & B (subvirión - o subvirión purificado), vacuna del virus de la gripe 1999-2000 tipos trivalentes A & B (virión completo), vacuna del virus de encefalitis japonesa (inactivada), vacuna de la enfermedad de Lyme (OspA recombinante), vacuna del virus de sarampión y paperas y rubeola (vivo), vacuna del virus de sarampión y paperas y rubeola (vivo atenuado), vacuna del virus del sarampión (vivo atenuado), vacuna de polisacárido meningocócico, vacuna del virus de las paperas (vivo), vacuna de la peste, vacuna de pneumococo (polivalente), vacuna del poliovirus (inactivado), vacuna del poliovirus (vivo, oral, trivalente), vacuna de la rabia (adsorbido), vacuna de la rabia (células diploides humanas), vacuna del virus de la rubeola y paperas (vivo), vacuna del virus de la rubeola (vivo, atenuado), toxoide del tétanos (adsorbido), toxoide del tétanos (fluido), vacuna tifoidea (oral), vacuna tifoidea (parenteral), vacuna de polisacárido tifoide Vi, vacuna del virus de la varicela y vacuna de la fiebre amarilla. La por lo menos una antitoxina o antiveneno puede ser por lo menos uno de los siguientes: antiveneno de la araña viuda negra, antiveneno de Crotalidae (polivalente), antitoxina de la difteria (equino), y antiveneno de Micrurus fulvius. El por lo menos un suero inmune puede ser por lo menos uno de los siguientes: globulina inmune de citomegalovirus (intravenoso), globulina inmune de hepatitis B (humana), globulina intramuscular inmune, globulina intravenosa inmune, globulina inmune de la rabia (humana), globulina intravenosa inmune del virus respiratorio sincicial (humana), globulina inmune Rhü(D) (humana), globulina inmune intravenosa Rhü(D) (humana), globulina inmune del tétanos (humano), y globulina inmune de varicela-zoster. La por lo menos un modificador de respuesta biológica puede ser por lo menos uno de los siguientes: aldesleukin, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatiramer para inyección, interferón alfacon-1, interferón alfa-2a (recombinante), interferón alfa- 2b (recombinante), interferón beta-la, interferón beta-1b (recombinante), interferón gamma-lb, hidrocloruro de levamisol, oprelvequina y sargramostim (véase, por ejemplo, las pp. 964-1040 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un antiinfeccioso oftálmico puede seleccionarse a partir de: bacitracina, cloranfenicol, hidrocloruro de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina 0,3 %, sulfato de polimixina B, sodio de sulfacetamida 10 %, sodio de sulfacetamida 15 %, sodio de sulfacetamida 30 %, tobramicina y vidarabina. El por lo menos un antiinflamatorio oftálmico puede ser por lo menos uno de los siguientes: dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona, sodio de diclofenaco 0,1 %, fluorometolona, sodio de flurbiprofeno, trometamina de ketorolaco, acetato de prednisolona (suspensión) y fosfato de sodio de prednisolona (solución). El por lo menos un miótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: cloruro de acetilocolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), yoduro de ecotiofato, pilocarpina, hidrocloruro de pilocarpina y nitrato de pilocarpina. El por lo menos un midriático puede ser por lo menos uno de los siguientes: sulfato de atropina, hidrocloruro de ciclopentolato, hidrocloruro de epinefrina, borato de epinefrilo, hidrobromuro de homatropina, hidrocloruro de fenilefrina, hidrobromuro de escopolamina y tropicamida. El por lo menos un vasoconstrictor oftálmico puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro de nafazolina, hidrocloruro de oximetazolina e hidrocloruro de tetrahidrozolina. El por lo menos un oftálmico general puede ser por lo menos uno de los siguientes: hidrocloruro apraclonidina, hidrocloruro de betaxolol, tartrato de brimonidina, hidrocloruro de carteolol, hidrocloruro de dipivefrina, hidrocloruro de dorzolamida, difumarato de emedastina, sodio de fluorescina, fumarato de ketotifeno, latanoprost, hidrocloruro de levobunolol, hidrocloruro de metipranolol, cloruro de sodio (hipertónico) y maleato de timolol. El por lo menos un ótico puede ser por lo menos uno de los siguientes: ácido bórico, peróxido de carbamida, cloranfenicol y oleato- condensado de polipéptido de trietanolamina. El por lo menos un medicamento nasal puede ser por lo menos uno de los siguientes: dipropionato de beclometasona, budesónida, sulfato de efedrina, hidrocloruro de epinefrina, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocloruro de nafazolina, hidrocloruro de oximetazolina, hidrocloruro de fenilefrina, hidrocloruro de tetrahidrozolina, acetonida de triamcinolona e hidrocloruro de xilometazolina (véase, por ejemplo, las pp. 1041-97 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
El por lo menos un antiinfeccioso local puede ser por lo menos uno de los siguientes: acyclovir, anfotericina B, crema con ácido acelaico, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, ketoconazol, acetato de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina, hidrocloruro de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de plata, hidrocloruro terbinafina, terconazol, hidrocloruro de tetraciclina, tioconazol y tolnaftate. El por lo menos un escabicida o pediculicida puede ser por lo menos uno de los siguientes: crotamitón, lindano, permetrina y piretrin. El por lo menos un corticosteroide tópico puede ser por lo menos uno de los siguientes: dipropionato de bemetasona, valerato de betametasona, propionato de clobetasol, desonide, desoximetasona, dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona, diacetato de diflorasona, acetonida de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocorisona, furoato de mometasona y acetonida de triamcinolona (véase, por ejemplo, las pp. 1098-1136 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
La por lo menos una vitamina o mineral puede ser por lo menos uno de los siguientes: vitamina A, complejo de vitamina B, cianocobalamina, ácido fólico, hidroxocobalamina, calcio leucovorina, niacina, niacinamida, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, hidrocloruro de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecalciferol, ergocalciferol,
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análogo de vitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de vitamina K, fitonadiona, floruro de sodio, floruro de sodio (tópico), oligoelementos, cromo, cobre, yodo, manganeso, selenio y zinc. El por lo menos un calórico puede ser por lo menos uno de los siguientes: infusiones de aminoácido (cristalinas), infusiones de aminoácido en dextrosa, infusiones de aminoácido con electrolitos, infusiones de aminoácido con electrolitos en dextrosa, infusiones de aminoácido para fallo hepático, infusiones de aminoácido para estrés metabólico alto, infusiones de aminoácido para fallo renal, dextrosa, emulsiones grasas y triglicéridos de cadena media (véase, por ejemplo, las pp. 1137-63 del Manual de medicamentos para enfermería 2001).
Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 del presente invento también pueden incluir por lo menos uno de cualquier cantidad adecuada y eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en contacto o administrado a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia, que también podría comprender por lo menos uno de los siguientes: por lo menos un antagonista TNF (por ejemplo, entre otros, un antagonista TNF químico o proteína, anticuerpo o fragmento de TNF monoclonal o policlonal, un receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de su fusión o un antagonista de pequeña molécula TNF, por ejemplo, proteína I o II de unión de TNF (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept, CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept y otros similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofín, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, antifúngico, antiparasitario, antiviral, carbapenem, cefalosporia, flurorquinolona, macrólido, penicilina, sulfonamida, tetracyilina, otro antimicrobiano), un antipsoriásico, un corticosteriode, un esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, un eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un medicamento hormonal sustitutivo, un modulador de receptores de estrógeno, un midriático, un ciclopégico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, agente antimaníaco, un antipsicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolino, una epinefrina o similar, domasa alfa (Pulmozima), una citoquina o un antagonista de citoquina. Entre los ejemplos de dichas citoquinas se incluyen, entre otros, cualquiera entre IL-1 a IL-23 (por ejemplo, IL-1, IL-2, etc.). Las dosis adecuadas son bien conocidas en este ámbito. Véase, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], 2a edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000 [Farmacopea de bolsillo Tarascón 2000], edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000).
Dichos anticancerígenos o antiinfecciosos también pueden incluir moléculas de toxinas que se asocian, unen, co-formulan o co-administran con por lo menos un anticuerpo del presente invento. La toxina podría actuar para eliminar de forma selectiva la célula o tejido patológico. La célula patológica puede ser un cáncer u otra célula. Dichas toxinas pueden ser, entre otros, una toxina purificada o recombinante o fragmento de toxina que incluye por lo menos un dominio citotóxico funcional de toxina, por ejemplo, seleccionado a partir de por lo menos uno de los siguientes: ricino, toxina de la difteria, toxina de veneno una toxina bacteriana. El término toxina también incluye tanto las endotoxinas como exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus de producción natural, mutante o recombinante que podría causar cualquier afección patológica en humanos y otros mamíferos, incluido el shock por toxina, que puede provocar la muerte. Dichas toxinas podrían incluir, entre otros, enterotoxina termolábil de E. coli enterotoxigénica (LT), enterotoxina termoestable (ST), citotoxina Shigella, enterotoxinas Aeromonas, toxina-1 de síndrome de shock tóxico (TSST-1), enterotoxina Estafilocócica A (SEA), B (SEB), o C (SEC), enterotoxinas Estreptocócicas y otros similares. Dichas bacterias incluyen, entre otros, cepas de una especie de E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enterohemorrágico (por ejemplo, cepas del serotipo 0157:H7), especies de Estafilococo (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, y Shigella sonneí), especies de Salmonela (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridiumperfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacterfetus), especies de Heliobacter, (por ejemplo, Heliobacterpylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y Estreptococos. Véase, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE [MEDICINA INTERNA], 3a ed., pp. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control [Infecciones bacterianas en humanos: epidemiología y control], 2a. ed., pp. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases [Principios y práctica de enfermedades infecciosas], 3a ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual [Manual Merck], 16a ed., Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology [Inmunología de microbiología], 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990).
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Los compuestos, composiciones o combinaciones de anticuerpo anti-IL-6 del presente invento también pueden incluir al menos un auxiliar adecuado, como, entre otros, diluyente, aglutinante, estabilizador, tampones, sales, disolvente lipofílico, conservante, adyuvante o similares. Se prefieren los auxiliares aceptables farmacéuticamente. En esta técnica se conocen ejemplos (no limitativos) y métodos de preparación de dichas soluciones estériles como, entre otros, en Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences [Ciencia farmacéutica de Remington], 18a Edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Se pueden seleccionar de forma rutinaria portadores adecuados farmacéuticamente que sean adecuados para la forma de administración, solubilidad y/o estabilidad del anticuerpo anti-IL-6, fragmento o composición variante de la forma bien conocida en este ámbito o como se describe en este documento.
Entre los excipientes farmacéuticos y aditivos útiles en la presente composición se incluyen, entre otros, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (por ejemplo, azúcares, incluidos los monosacáridos, di-, tri-, tetra- y oligosacáridos; azúcares derivados, como alditores, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes individualmente o en combinación, que incluyen solo o en combinación un 1-99,99 % por peso o volumen. Entre los ejemplos de excipientes de proteínas se incluyen albúmina sérica, como albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y similares. Entre los componentes de aminoácidos/anticuerpos representativos, que también pueden funcionar con capacidad amortiguadora, se incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo y similares. Uno de los aminoácidos que se prefieren es la glicina.
Entre los excipientes de carbohidratos adecuados para su uso en el invento se incluyen, por ejemplo, monosacáridos como la fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, como la rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y los alditoles, como el manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de carbohidrato que se prefieren para su uso en el presente invento son el manitol, la trehalosa y la rafinosa.
Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 también pueden incluir un tampón o agente de ajuste del pH; normalmente, el tampón es una sal preparada a partir de un ácido orgánico o base. Entre los tampones representativos se incluyen las sales de ácidos orgánicos, como las sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o el ácido Itálico; Tris, hidrocloruro de trometamina o tampones de fosfato. Los tampones que se prefieren para su uso en las presentes composiciones son las sales de ácidos orgánicos, como el citrato.
Además, las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 del invento pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos, como las polivinilopirrolidonas, ficolls (un azúcar polimérico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina), glicoles de polietileno, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoactivos (por ejemplo, polisorbatos, como “TWEEN 20” y “TWEEN 80”), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol), y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).
Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos adicionales conocidos adecuados para su uso en el anticuerpo anti-IL-6, porción o variaciones de su composición de acuerdo con el invento con conocidos, por ejemplo, de la forma indicada en “Remington: The Science & Practice of Pharmacy” [«Remington: la ciencia y la práctica de la farmacia»], 19a ed., Williams & Williams, (1995) y en “Physician's Desk Reference” [Referencia de escritorio del médico], 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Los materiales portadores o excipientes que se prefieren son carbohidratos (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes poliméricos. Una molécula portadora, a modo de ejemplo, es el mucopolisacárido, ácido hialurónico, que podría ser útil para la administración intraarticular.
Formulaciones
Como se ha indicado, el invento proporciona formulaciones estables, que preferiblemente incluyen un tampón de fosfato con salino o una sal escogida, así como soluciones conservadas y formulaciones que contengan un conservante, así como formulaciones conservadas multi-uso adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en una formulación aceptable farmacéuticamente. Las formulaciones conservadas contienen por lo menos un conservante conocido o uno que podría seleccionarse del siguiente grupo: por lo menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito de fenilomercúrico, fenixietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal, polímeros o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Cualquier concentración adecuada o mezcla puede usarse por técnicas conocidas, como aproximadamente 0,0015 % o cualquier rango, valor o fracción de los mismos. Algunos ejemplos (no limitativos) son, sin conservante, aproximadamente 0,1-2 % m-cresol (por ejemplo, 0,2, 0,3,
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0,4, 0,5, 0,9, 1,0 %), aproximadamente 0,1-3 % alcohol bencílico (por ejemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5 %), aproximadamente 0,001-0,5 % timerosal (por ejemplo, 0,005, 0,01), aproximadamente 0,001-2,0 % fenol (por ejemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,0005-1,0 % alquilparabeno(s) (por ejemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0 %) y similares.
Como se ha indicado anteriormente, el invento proporciona un artículo manufacturado, que incluye material de empaquetado y por lo menos un vial que incluye una solución de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 con los tampones y/o conservantes indicados, opcionalmente un diluyente acuoso, donde dicho material de empaquetado incluye una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse por un período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o más. El invento también incluye un artículo manufacturado, que incluye material de empaquetado, un primer vial que tiene liofilizado por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y un segundo vial que incluye un diluyente acuoso del tampón o conservante prescrito, donde dicho material de empaquetado incluye una etiqueta que indica al paciente que reconstituir el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solución que puede mantenerse por un período de veinticuatro horas o más.
El por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se utiliza de acuerdo con el presente invento puede producirse por medios recombinantes, entre ellos a partir de células de mamífero célula o preparaciones transgénicas, o puede purificarse a partir de otras fuentes biológicas, como las descritas en este documento o por técnicas conocidas.
El rango de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en el producto del presente invento incluye cantidades que producen tras la reconstitución, en un sistema húmedo/seco, concentraciones de entre aproximadamente 1,0 pg/ml y aproximadamente 1000 mg/ml, aunque las concentraciones mayores y menores son manejables y dependen de la vía de administración que se pretenda, por ejemplo, las formulaciones en solución serán diferentes de los parches transdérmicos o de métodos pulmonar, transmucoso, osmótico o micro bomba.
Preferiblemente, el diluyente acuoso podría también comprender un conservante aceptable farmacéuticamente. Entre los conservantes que se prefieren se incluyen los seleccionados a partir del grupo que consta de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquiloparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, desidroacetato de sodio y timerosal o mezclas de los mismos. La concentración de conservantes que se usan en la formulación es una concentración suficiente para producir un efecto anti-microbiano. Dichas concentraciones dependen del conservante que se haya seleccionado y el técnico podrá definirlas fácilmente.
Otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, tampones, antioxidantes y mejoradores de los conservantes, puede añadirse (y sería preferible hacerlo) al diluyente. Un agente de isotonicidad, como la glicerina, se usa habitualmente a concentraciones conocidas. Preferiblemente, se añade un tampón tolerado fisiológicamente para proporcionar un control mejorado del pH. Las formulaciones pueden cubrir un rango mayor de pHs, como desde pH 4 hasta aproximadamente pH 10 y los rangos que se prefieren van desde aproximadamente pH 5 hasta aproximadamente pH 9, y un rango que se prefiere todavía más de aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 8.0. Preferiblemente, las formulaciones del presente invento tienen un pH entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.8. Entre los tampones que se prefieren se incluyen tampones de fosfato, preferiblemente, fosfato de sodio, especialmente, salino tamponado de fosfato (PBS).
Otros aditivos, como los solubilizadores aceptables farmacéuticamente como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán), Tween 40 (polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitán), F68 Plurónico (copolímeros de bloque de polioxietileno polioxipropileno) y PEG (polietilenglicol) o tensoactivos no iónicos, como polisorbato 20 o 80 o poloxamer 184 o 188, polils Pluronic®, otros co-polímeros de bloque y queladores, como EDTA y EGTA, podrían añadirse también a las formulaciones o compuestos para reducir la agregación. Estos aditivos son especialmente útiles si se usa una bomba o recipiente plástico para administrar la formulación. La presencia de tensoactivos aceptables farmacéuticamente mitiga la propensión de la proteína a la agregación.
Las formulaciones del presente invento pueden prepararse por un proceso que incluye la mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y un conservante seleccionado del grupo que consta de: fenol, m-cresol, p-cresol, ocresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno, (metilo, etilo, propilo, butilo y semejantes), cloruro del benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y conservante en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos convencionales para la disolución y la mezcla. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en solución tamponada con el conservante deseado en una solución tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el conservante a las concentraciones que se buscan. Un técnico en la materia reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden de adición de los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH al que se prepara la formulación son factores que se pueden optimizar para la concentración y vía de administración.
Las formulaciones reivindicadas pueden suministrarse a pacientes como soluciones claras o en forma de
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viales de tipo dual, que incluyen un vial liofilizado de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferiblemente, un tampón de fosfato y/o salino y una sal seleccionada, en un diluyente acuoso. Independientemente de si es un vial de solución única un vial dual que necesita reconstitución, puede reutilizarse múltiples veces y puede ser suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento para un paciente y de esa forma puede proporcionar un régimen de tratamiento más adecuado que los disponibles actualmente.
Los presentes artículos manufacturados que se reivindican son útiles para su administración en un período que varía desde el momento inmediato a veinticuatro horas o más. En consecuencia, los artículos manufacturados que se reivindican ofrecen ventajas significativas para el paciente. Las formulaciones del invento podrían almacenarse de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2° C hasta aproximadamente 40° C y mantener la actividad biológica de la proteína durante largos períodos de tiempo, permitiendo etiquetar el paquete con una indicación de que la solución puede guardarse y/o usarse en un período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o más. Si se usa el diluyente conservado, dicha etiqueta puede incluir un uso hasta 1-12 meses, medio año, año y medio, y/o dos años.
Las soluciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 del invento pueden prepararse por medio de un proceso que incluye la mezcla de por lo menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se lleva a cabo usando procedimientos de disolución y mezcla convencionales. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de por lo menos un anticuerpo en agua o tampón en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y, de forma opcional, un conservante o tampón a las concentraciones deseadas. Alguien que tenga un conocimiento normal de esta la materia reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a los que se prepara la formulación, son factores que pueden optimizarse para la concentración y vías de administración que se usen.
Los productos reivindicados pueden administrarse a pacientes en forma de soluciones claras o de viales duales que incluyen un vial de liofilizado por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. Independientemente de si es una solución única o un vial dual que necesita reconstitución, puede reutilizarse en múltiples ocasiones y puede ser suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples del tratamiento de un paciente, por lo que proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que los que se encuentran disponibles actualmente.
Los productos reivindicados pueden suministrarse a pacientes de forma indirecta, suministrando a farmacias, clínicas o otras instituciones e instalaciones similares, soluciones claras o viales duales que incluyen un vial de lioflizado de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. La solución clara en este caso puede ser de hasta un litro o incluso de mayor tamaño, proporcionando un gran reservorio a partir del cual se pueden recuperar porciones menores de por lo menos una solución de anticuerpo una o más veces para transferirlas a viales de menor tamaño y que la farmacia o clínica pueda suministrarlos a sus clientes y/o pacientes.
Los instrumentos reconocidos que incluyen sistemas de vial único incluyen instrumentos de lápiz inyector para la administración de una solución, lápices BD, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J- tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo, fabricados o desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, Nj,
www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland,
www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (
www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK,
www.weston- medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN,
www.mediject.com) y otros instrumentos similares. Los instrumentos reconocidos que incluyen un sistema vial dual incluyen los sistemas de lápiz inyector para reconstituir un medicamento liofilizado en un cartucho para la administración de la solución reconstituida, como el HumatroPen®. Entre los ejemplos de otros instrumentos adecuados se incluyen jeringuillas precargadas, auto- inyectores, inyectores sin aguja y conjuntos de infusión IV sin aguja.
Los productos que se reivindican en el presente documento incluyen material de empaquetado. Este material proporciona, además de la información indicada por las agencias reguladoras, las afecciones con las que se puede usar el producto. El empaquetado del presente invento proporciona instrucciones al paciente para reconstituir el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solución y usar la solución en un período de 2-24 horas o mayor para el producto de dos viales, húmedo/seco. Para el vial único, producto en solución, la etiqueta indica que dicha solución puede usarse durante un período de 2-24 horas o mayor. Los productos que se reivindican en este documento son útiles para el uso farmacéutico en humanos del producto.
Las formulaciones del presente invento pueden prepararse por medio de un proceso que incluye la mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y un tampón seleccionado, preferiblemente, un tampón de fosfato que contenga salino o una sal seleccionada. La mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y el tampón en un diluyente acuoso se lleva a cabo usando disolución y procedimientos convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad medida de por lo menos un anticuerpo en agua o tampón se combina con el
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agente tampón que se desee en agua en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y tampón en las concentraciones que se deseen. Alguien con un conocimiento normal de la materia reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a los que se prepara la formulación, son factores que se pueden optimizar para la concentración y medios de administración que se hayan usado.
Las formulaciones estables o conservadas que se reivindican pueden suministrarse a los pacientes en forma de soluciones claras o viales duales que incluyen un vial de liofilizado de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo vial que contiene un conservante o tampón y excipientes en un diluyente acuoso. Ya sea un vial de solución única o un vial dual que necesite reconstitución puede reutilizarse en múltiples ocasiones y puede ser suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento de un paciente y por lo tanto proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que los disponibles actualmente.
Otras formulaciones o métodos para estabilizar el anticuerpo anti-IL-6 podrían tener como resultado solo una solución clara de polvo liofilizado que incluye el anticuerpo. Entre las soluciones no claras están las formulaciones que incluyen suspensiones de partículas, dichas partículas serían una composición que contenga el anticuerpo anti-IL-6 en una estructura de dimensión variable y conocida diversamente como microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanoesfera o liposoma. Estas formulaciones de partículas relativamente homogéneas, esencialmente esféricas, que contienen un agente activo pueden formarse contactando una fase acuosa que contenga el agente activo y un polímero y una fase no-acuosa seguida de la evaporación de la fase no acuosa para causar la coalescencia de partículas a partir de la fase acuosa como se indica en la patente de EE. UU. n° 4.589.330. Las micropartículas porosas pueden prepararse usando una primera fase que contenga un agente activo y un polímero dispersado en un disolvente continuo y que retire dicho disolvente de la suspensión por liofilización o dilución-extracción-precipitación como se indica en la patente de EE. UU. n° 4.818.542. Los polímeros que se prefieren para dichas preparaciones son copolímeros o polímeros naturales o sintéticos que se seleccionan a partir del grupo que consta de gelatina agar, almidón, arabinogalactano, albúmina, colágeno, ácido poliglicólico, poliácido láctico, glicólido-L(-) láctido poli(episilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido láctico), poli(epsilon- caprolactona-CO-ácido glicólico), poli(B-hidroxi ácido butírico), óxido polietileno, polietileno, poli(alquilo-2- cianoacrilato), poli(hidroxietilo metacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietilo DL-aspartamida), poli(éster urea), poli(L-fenilalanina/etileno glicol/l,6-diisocianatohexano) y poli(metil metacrilato). Los polímeros que se prefieren son los poliésters, como el ácido poliglicólico, el ácido poliláctico, el glicólido-L(-) láctido poli(episilon- caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido láctico) y poli(epsilon-caprolactona-CO-ácido glicólico. Los solventes útiles para disolver el polímero y/o el activo incluyen: agua, hexafluoroisopropanol, metilenocloruro, tetrahidrofurano, hexano, benceno o sesquihidrato de hexafluoroacetona. El proceso para dispersar la fase activa con una segunda fase podría implicar forzar la presión de dicha primera fase a través de un orificio en un pulverizado para afectar a la formación de gotas.
Las formulaciones en polvo seco podrían ser resultado de procesos diferentes de la liofilización, como secado por pulverización o extracción por solvente por evaporación o por precipitación de una composición cristalina seguida de un paso o más para retirar el solvente acuoso o no acuoso. La preparación de una preparación de anticuerpo por secado por pulverización se explica en la patente de los EE. UU. 6.019.968. Los compuestos de polvo seco basados en anticuerpos podrían producirse por soluciones de secado por pulverización o lodos del anticuerpo y, opcionalmente, excipientes, en un disolvente en enfermedades para proporcionar un polvo seco respirable. Los disolventes podrían incluir compuestos polares, como agua y etanol, que podrían secarse rápidamente. La estabilidad del anticuerpo podría mejorarse llevando a cabo el procedimiento de secado por pulverización en ausencia de oxígeno, como en una capa de nitrógeno o usando nitrógeno como gas secante. Otra formulación relativamente seca es una dispersión de un grupo de microestructuras perforadas en un medio de suspensión que normalmente comprenda un propulsor de hidrofluoroalcano como se explica en WO 9916419. Las dispersiones estabilizadas podrían administrarse al pulmón del paciente usando un inhalador dosificado. El equipo útil para la fabricación comercial de medicamentos secados por pulverización lo fabrica Buchi Ltd. o Niro Corp.
Por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 en las formulaciones estables o conservadas o en las soluciones que se describen en este documento pueden administrarse a un paciente de acuerdo con el presente invento a través de varios métodos de administración incluida inyección SC o IM; transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótico, cartucho, microbomba u otros medios apreciados por los expertos en la materia y que son conocidos.
Aplicaciones terapéuticas
En este documento se presenta un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, por técnicas conocidas o como se ha descrito en este documento, usando por lo menos un anticuerpo IL-6 del presente invento, por ejemplo, administrando o contactando con la célula, tejido, órgano, animal, o paciente con una cantidad terapéutica efectiva de anticuerpo IL-6. También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente que incluya, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: obesidad,
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enfermedad de tipo inmune, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa, enfermedad maligna o enfermedad neurológica.
En este documento también se presenta un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad inmune relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente incluidos, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatía seronegativa, osteoartritis, osteolisis, aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, nefritis lúpica, síndrome antifosfolípido, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/ granulomatosis de wegener, sarcoidosis, orquitis/procedimientos de inversión de vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica de contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, transplantes, rechado de transplante de órgano, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, septicemia, sepsis de gram positivo, sepsis de gram negativo, sepsis de cultivo negativo, sepsis fúngico, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococcemia, trauma/hemorragia, quemaduras, exposición a radiación ionizante, pancreatitis aguda, síndrome de dificultad respiratoria adulta, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, enfermedad de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefritis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxis sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechado de injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de transplante renal, rechazo de transplante de corazón, rechazo de transplante de hígado, rechazo de transplante de páncreas, rechazo de transplante de pulmón, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de transplante de cartílago, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de transplante de paratiroides, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad anti-receptores, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynaud, diabetes tipo B resistente a insulina, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad tipo III, síndrome POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal y síndrome de cambios cutáneos), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal, síndrome de cambios cutáneos, síndrome antifosfolípido, pénfigo, escleroderma, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitíligo, vasculitis, síndrome de cardiotomía post-MI, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis de hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a medicamentos, metabólico/idiopático, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, déficit de alfa-1-antitripsina, retinopatía diabética, tiroiditis de hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotálamo-pituitaria-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar crónica neonatal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), linfohistiocitosis familiar hematofagocítica, afecciones dermatológicas, psoriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, fallo renal agudo, hemodiálisis, uremia, toxicidad, pre-eclampsia, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citoquina, quimioterapia, terapia de radiación (por ejemplo, se incluyen, entre otros, astenia, anemia, caquexia y similares), intoxicación crónica por salicilato y similares. Véase, por ejemplo, el Manual Merck, ediciones l2a-17a Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], Wells et al., eds., 2a ed., Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).
También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluidos, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: síndrome de aturdimiento cardiaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, embolia, derrame isquémico, hemorragia, síndrome coronario agudo, arteriosclerosis, aterosclerosis, restenosis, enfermedad arteriosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, síncope, conmoción, sífilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardíaca, cor pulmonale, hipertensión pulmonar primaria, arritmias cardíacas, latidos auriculares ectópicos, aleteo auricular, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), síndrome post perfusión, respuesta inflamatoria a derivación cardiopulmonar, taquicardia auricular caótica o multifocal, taquicardia normal de QRS estrecho, arritmias específicas, fibrilación ventricular, arritmias del haz de His, bloqueo atrioventricular, bloqueo de rama, trastorno isquémico de miocardio, cardiopatía isquémica, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatía, cardiomiopatía dilatada congestiva, cardiomiopatía restrictiva, valvulopatía, endocarditis, enfermedad pericárdica, tumores cardiacos, aneurismas aórtico y periférico, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad arteriosclerótica periférica, tromboangeitis obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, fenómeno y síndrome de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístua arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina inestable, lesión de isquemia, síndrome post bombeo, lesión de isquemia-reperfusión y similares. Dicho método podría también comprender la administración de una cantidad eficaz de una composición or compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia.
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También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad infecciosa relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, entre otras, por lo menos una de las siguientes: infección bacteriana aguda o crónica, procesos infecciosos parasitarios agudo y crónico, incluidas las infecciones bacterianas, víricas y fúngicas, infección por VIH/neuropatía VIH, meningitis, hepatitis (por ejemplo, A, B o C o similares), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, e. coli 0157:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, dengue hemorrágico, leishmaniosis, lepra, síndrome del shock tóxico, miositis por estreptococo, gangrena gaseosa, tuberculosis microbacteriana, mycobacterium avium intracellulare, neumonía pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionella, enfermedad de Lyme, gripe A, virus de epstein-barr, síndrome hemafagocítico viral, encefalitis viral/meningitis aséptica y similares.
También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad maligna relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: leucemia, leucemia aguda, leucemia aguda linfoblástica (ALL), leucemia linfocítica aguda, B- célula, T-célula o FAB ALL, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena aguda, leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas, síndrome mielodiplástico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma no-hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplástico/hipercancemia maligna, tumores sólidos, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer no poliposo hereditario, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma de célula renal, cáncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastática, resorción ósea relacionada con cáncer, dolor óseo relacionado con cáncer y similares.
También se presenta en este documento un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad neurológica relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluidas, entre otras, por lo menos una de las siguientes: enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, dolor de cabeza por migraña, complejo de demencia del SIDA, enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidal y cerebeloso, como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales; trastornos de movimientos hipercinéticos, como corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento inducidos por medicamentos, como los inducidos por medicamentos que bloquean los receptores de dopamina CNS; trastornos del movimiento hipocinético, como la enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares, como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia y trastorno mitocondrial multisistémico); trastornos de núcleo desmielinizante, como esclerosis múltiple, mielitis transversal aguda; y trastornos de la unidad motora, como atrofias musculares neurogénicas (degeneración celular del hom anterior, como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; Síndrome de Down de mediana edad; síndrome de cuerpos de Lewy difusos; demencia senil de cuerpos de Lewy; síndrome Wemicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz; demencia pugilística; lesiones neurotraumáticas (por ejemplo, lesiones de médula espinal, lesión cerebral, conmoción cerebral, conmoción repetitiva); dolor; dolor inflamatorio; autismo; depresión; derrame cerebral; trastornos cognitivos; epilepsia y similares. Dicho método podría también incluir la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo TNF o porción especificada o variante de una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia. Véase, por ejemplo, el Manual Merck, 16a ed., Merck & Company, Rahway, NJ (1992).
También se presenta un método para modular o tratar por lo menos una herida, trauma o lesión en un tejido u otra afección crónica relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluidos, entre otros, por lo menos uno de los siguientes: lesión corporal o trauma asociado con cirugía oral incluida cirugía periodontal, extracción/es dentaria(s), tratamiento de endodoncia, inserción de implantes dentales, aplicación y uso de prótesis dentarias; o donde la herida se seleccione a partir del grupo que consta de: heridas asépticas, heridas por contusión, heridas por incisión, heridas por laceración, heridas no penetrantes, heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas por pinchazo, heridas con sepsis, infartos y heridas subcutáneas; o donde la herida se seleccione a partir del grupo que consta de: úlceras isquémicas, úlceras por presión, fístulas, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas de sitio donante; o donde la herida sea una herida aftosa, una herida traumática o una herida asociada con herpes.
Las heridas y/o úlceras normalmente se encuentran salientes de la piel o en una superficie mucosa o como resultado de un infarto en un órgano (“derrame”). Una herida podría ser resultado de un defecto de tejido blando o una lesión o una afección subyacente. En el presente contexto, el término “piel” hace referencia a la superficie exterior del cuerpo de un animal, incluidos humanos, y abarca piel intacta o casi intacta así como superficie cutánea
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lesionada. El término “mucosa” hace referencia a mucosa to intacta o dañada de un animal, como un humano, y podría ser mucosa oral, bucal, auditivo, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal o rectal.
En el presente contexto el término “herida” denota una lesión corporal con interrupción de la integridad normal de las estructuras del tejido. El término también pretende abarcar el término “llaga”, “lesión”, “necrosis” y “úlcera”. Normalmente, el término “llaga” es una palabra popular para casi cualquier lesión de la piel o membranas mucosas y el término “úlcera” es un defecto local o excavación de la superficie de un órgano o tejido, que se produce por el desprendimiento de tejido necrótico. Lesión generalmente hace referencia a cualquier defecto de un tejido. Necrosis hace referencia a tejido muerto resultante de una infección, lesión, inflamación o infartos.
El término “herida” usado en este contexto se refiere a cualquier herida (ver más adelante una clasificación de las heridas) a cualquier estadio concreto del proceso de cura, incluido el estadio antes de que se haya iniciado cualquier cura o incluso antes de que se realice una herida específica como una incisión quirúrgica (tratamiento profiláctico). Entre los ejemplos de heridas que se pueden evitar y/o tratar se encuentran, por ejemplo, heridas asépticas, heridas por contusión, heridas por incisión, heridas por laceración, heridas no penetrantes (por ejemplo, heridas en las que no hay una alteración de la piel pero hay una lesión en estructuras subyacentes), heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas de punción, heridas de sepsis, heridas subcutáneas, etc. Entre los ejemplos de llagas se encuentran las llagas por presión, aftas, llagas de cromo, llagas frías, llagas de presión, etc. Entre los ejemplos de úlceras se encuentran, por ejemplo, la úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera isquémica hipertensiva, úlcera por estasis, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical y úlceras venéreas, por ejemplo, provocadas por gonorrea (incluida uretritis, endocervicitis y proctitis). Las afecciones relacionadas con heridas o llagas que podrían tratarse con éxito son: quemaduras, ántrax, tétanos, gangrena gaseosa, escarlatina, erisipela, sycosis barbae, foliculitis, impetigo contagiosa o impetigo bullosa, etc. Con frecuencia hay un cierto solapamiento en el uso de los términos “herida” y “úlcera” y “herida” y “llaga” y, además con frecuencia los términos se usan aleatoriamente. Por lo tanto, como se ha mencionado, en el presente contexto el término “herida” incluye los términos “úlcera”, “lesión”, “llaga” e “infarto,” y los términos se usan indistintamente a no ser que se indique lo contrario.
Los tipos de heridas que se van a tratar incluyen también (i) heridas generales, como por ejemplo, heridas quirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquémicas, térmicas, químicas y ampollosas; (ii) heridas específicas de la cavidad oral, como por ejemplo, heridas post-extracción, heridas endodóncicas, especialmente en conexión con tratamiento de quistes y abscesos, úlceras y lesiones de origen bacteriano, vírico o autoinmune, heridas mecánicas, químicas, termales, infecciosas y liquenoides; herpes ulceroso, estomatitis aftosa, gingivites ulcerosa necrotizante aguda y síndrome de boca ardiente son ejemplos específicos; y (iii) heridas en la piel, como por ejemplo, neoplasma, quemaduras (por ejemplo, químicas, termales), lesiones (bacteriana, vírica, autoinmune), mordeduras e incisiones quirúrgicas. Otra forma de clasificación de las heridas es: (i) pequeñas pérdidas de tejido debidas a incisiones quirúrgicas, abrasiones menores y mordeduras menores, o (ii) pérdidas significativas de tejido. El último grupo incluye úlceras isquémicas, llagas de presión, fístulas, laceraciones, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas del área donante (en tejidos blandos y duros) e infartos.
Otras heridas importantes son las heridas como las úlceras isquémicas, llagas de presión, fístulas, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas del área donante. Las úlceras isquémicas y llagas de presión son heridas que normalmente solo se curan muy lentamente y especialmente en dichos casos un proceso de cura mejorado y más rápido es sin duda de gran importancia para el paciente. Además, los costes que implica el tratamiento de pacientes que sufren esos tipos de heridas se reducen notablemente cuando se mejora la cura y se realiza de más rápidamente.
Las heridas del área donante son heridas que, por ejemplo, se producen en conexión con la retirada de tejido duro de una parte del cuerpo a otra parte del cuerpo, por ejemplo, en conexión con un transplante. Las heridas resultantes de esas operaciones son muy dolorosas y por lo tanto una mejora en la cura es muy valiosa. El término “piel” se usa en un sentido muy amplio e incluye la capa epidérmica de la piel y — en los casos en los que la superficie de la piel está dañada en mayor o menor medida — también la capa dérmica de la piel. Aparte del stratum comeum, la capa epidérmica de la piel es la capa exterior (epitelial) y la capa de tejido conectivo más profunda de la piel se denomina dermis.
También se presenta aquí un método para modular o tratar osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, nefritis lúpica, diabetes mellitus tipo II y trastorno pulmonar obstructivo crónico, entre las otras enfermedades indicadas anteriormente como relacionadas con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente incluidos, entre otros, por lo menos una enfermedad tipo inmune, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa, maligna y/o neurológica. Dicho método podría incluir la administración de una cantidad eficaz de por lo menos una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia.
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Cualquiera de los métodos presentados en este documento puede incluir la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método podría también comprender la coadministración o terapia de combinación para tratar dichas enfermedades o trastornos, donde la administración de dicho por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, porción específica o variante de los mismos, también incluye la administración, previa, simultáneamente y/o posterior, de por lo menos uno de los siguientes por lo menos un antagonista TNF (por ejemplo, entre otros, un químico TNF o antagonista proteico, monoclonal TNF o anticuerpo o fragmento policlonal, un receptor TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de fusión de los mismos, o un antagonista TNF de molécula pequeña, por ejemplo, proteína de unión TNF I o II (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept (Enbrel™), adalimulab (Humira™), CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercept y similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofín, aurotioglucosa, azatioprina, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), relajante muscular, narcótico, medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINEs), analgésico, anestésico, sedante, anestésico local, bloqueante neuromuscular, antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, antifúngico, antiparasitario, antivírico, carbapenem, cefalosporina, flurorquinolona, macrólido, penicilina, sulfonamida, tetraciclina, otro antimicrobiano), antipsoriásico, corticosteriode, esteroide anabólico, agente diabético, mineral, nutricional, agente tiroideo, vitamina, hormona relacionada con el calcio, antidiarreico, antitusivo, antiemético, antiulceroso, laxante, anticoagulante, eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukine), inmunización, inmunoglobulina, inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), hormona de crecimiento, medicamento sustitutivo hormonal, modulador de los receptores de estrógeno, midriático, ciclopégico, agente alquilante, antimetabolito, inhibidor mitócico, radiofarmacéutico, antidepresivo, agente antimaníaco, antipsicótico, ansiolítico, hipnótico, simpaticomimético, estimulante, donepezil, tacrina, medicación de asma, agnista beta, esteroide inhalado, inhibidor de leucotrieno, metiloxantina, cromolina, epinefrina o similar, domasa alfa (Pulmozyme), citoquina o antagonista de citoquina. Las dosis adecuadas son conocidas. Véase, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], 2a edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000 [Farmacopea de bolsillo de Tarascón, 2000], edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs [Manual de medicamentos], 21a ed., Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001 [Guía de medicamentos para profesionales de la salud, 2001], ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ.
Los antagonistas TNF adecuados para composiciones, terapia combinada, coadministración, y/o instrumentos del presente invento (que también comprende por lo menos un anticuerpo, porción especificada y variante de los mismos del presente invento), incluyen, entre otros, anticuerpos anti-TNF (por ejemplo, por lo menos un antagonista TNF como se ha definido), fragmentos de unión de antígeno de los mismos, y moléculas receptoras que se unen específicamente a TNF; compuestos que evitan y/o inhiben la síntesis de TNF, la liberación de TNF o su acción sobre células objetivo, como as talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxiflina y rolipram), agonistas de receptor de adenosina A2b y mejoradores de receptores de adenosina A2b; compuestos que evitan y/o inhiben señalización de receptores TNF, como inhibidores de cinasa por proteína activada por mitógeno (mAp); compuestos que bloquean y/o inhiben la división de membrana TNF, como inhibidores de metaloproteinasa; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad de TNF, como inhibidores de la enzima de conversión de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o la síntesis de TNF, como inhibidores de cinasa MAP.
Tal y como se usan en este documento, un " anticuerpo de factor de necrosis tumoral”, “anticuerpo TNF”, “anticuerpo TNFa”, o fragmento o similar disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la actividad de TNFa in vitro, in situ y/o, preferiblemente, in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo humano TNF adecuado puede unir TNFa e incluye anticuerpos anti-TNF, fragmentos de unión de antígeno de los mismos y mutantes especificados o sectores de los mismos que se unen específicamente a TNFa. Un anticuerpo o fragmento TNF adecuado también puede disminuir, bloquear, anular, interferir, evitar y/o inhibir TNF ARN, ADN o síntesis de proteínas, liberación de TNF, señalización de receptor TNF, división de membrana TNF, actividad TNF, producción TNF y/o síntesis.
Un ejemplo de un anticuerpo o antagonista TNF es el anticuerpo quimérico cA2. En este ámbito se han descrito otros ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-TNF que se pueden usar (véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. n° 5.231.024; Moller, A. et al., Citoquina 2(3): 162-169 (1990); solicitud de los EE. UU. N° 07/943.852 (emitida el 11 de septiembre de 1992); Rathjen et al., publicación internacional n°WO 91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991); Rubin et al, publicación de patente europea n° 0 218 868 (publicada el 22 de abril de 1987); Yone et al., patente europea n° 0 288 088 (26 de octubre de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847- 854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); y Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).
Moléculas receptoras TNF
Las moléculas receptores TNF útiles que se prefieren son las que unen TNFa con alto nivel de afinidad (véase, por ejemplo, Feldmann et al., publicación internacional n° WO 92/07076 (publicada el 30 de abril de 1992);
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Schall et al., Cell [Célula] 67:361-370 (1990); y Loetscher et al., Cell [Célula] 67:351-359 (1990)) y podrían poseer un bajo nivel de inmunogenicidad. En concreto, los receptores de superficie celular de TNF 55 kDa (p55 TNF-R) y el 75 kDa (p75 TNF-R) son útiles. Las formas truncadas de esos receptores, que incluye los dominios extracelulares (ECD) de los receptores o porciones funcionales de los mismos (véase, por ejemplo, Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)), también son útiles. Las formas truncadas de los receptores TNF, que incluye ECD, se han detectado en orina y suero como proteínas inhibitorias de unión 30 kDa y 40 kDa TNFa (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)). Las moléculas multiméricas de receptor TNF y las moléculas de fusión de inmunoreceptor TNF y derivados y fragmentos o porciones de los mismos son otros ejemplos de moléculas receptoras de TNF que son útiles en los métodos y compuestos que se presentan aquí.
Las moléculas multiméricas receptoras de TNF incluyen todas o una porción funcional del ECD de dos o más receptores de TNF unidos por medio de un vinculador polipéptido o más u otros vinculadores no péptidos, como el polietilenglicol (PEG). Un ejemplo de dicha molécula de fusión de inmunoreceptor TNF es la proteína de fusión de receptor TNF/fusión de IgG. Las molécula de fusión de inmunoreceptor TNF y los métodos para su producción se han descrito anteriormente (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58:10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215- 219 (1994); Butler et al., Citoquina d(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., patente de los EE. UU. n° 5.447.851; y solicitud de los EE. UU. n° 08/442.133 (emitida el 16 de mayo de 1995)). También se pueden encontrar métodos para la producción de moléculas de fusión de inmunoreceptores en Capon et al., patente de los EE. UU. n° 5.116.964; Capon et al., patente de los EE. UU. n° 5.225.538; y Capon et al., Nature 337:525-531 (1989).
Las citoquinas incluyen cualquier citoquina conocida. Véase, por ejemplo, CopewithCitoquinas.com. Los antagonistas de citoquinas incluyen, entre otros, cualquier anticuerpo, fragmento o mimético, cualquier receptor soluble, fragmento o mimético, cualquier antagonista de pequeña molécula o cualquier combinación de los mismos.
Tratamientos terapéuticos
Cualquier método presentado en este documento puede incluir un método para tratar un trastorno mediado por IL-6, que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición o compuesto farmacéutico que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método podría incluir también la co-administración o terapia combinada para tratar dichas enfermedades o trastornos, donde la administración de dicho por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, porción especificada o variante de los mismos, también incluye la administración antes, durante y/o después, de por lo menos uno de los siguientes: un medicamento antiinfeccioso, un medicamento de sistema cardiovascular (CV), un medicamento del sistema nervioso central (CNS), un medicamento del sistema nervioso autónomo (ANS), un medicamento del tracto respiratorio, un medicamento del tracto gastrointestinal (GI), un medicamento hormonal, un medicamento para el equilibrio de fluido o electrolito, un medicamento hematológico, un antineoplásico, un medicamento de inmunomodulación, un oftálmico, ótico o nasal, un medicamento tópico, un medicamento nutricional o similares, por lo menos un antagonista TNF (por ejemplo, entre otros, un anticuerpo o fragmento TNF, un receptor soluble TNF o fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista de molécula pequeña de TNF), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), relajante muscular, narcótico, medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINEs), analgésico, anestésico, sedante, anestésico local, bloqueante neuromuscular, antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, antifúngico, antiparasitario, antivírico, carbapenem, cefalosporina, flurorquinolona, macrólido, penicilina, sulfonamida, tetraciclina, otro antimicrobiano), antipsoriásico, corticosteriode, esteroide anabólico, agente diabético, agente mineral, nutricional, tiroideo, vitamina, hormona relacionada con el calcio, antidiarreico, antitusivo, antiemético, antiulceroso, laxante, anticoagulante, eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukine), inmunización, inmunoglobulina, inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), hormona del crecimiento, medicamento hormonal sustitutivo, modulador de receptores de estrógeno, midriático, cicloplégico, agente alquilante, antimetabolito, inhibidor mitótico, radiofarmacéutico, antidepresivo, agente anti maníaco, antipsicótico, ansiolítico, hipnótico, simpatomimético, estimulante, donepezil, tacrina, medicación para asma, agonista beta, esteroide inhalado, inhibidor de leucotriena, metilxantina, cromolina, epinefrina o similares, alfa domasa (Pulmozyme), una citoquina o antagonista de citoquina. Dichos medicamentos son bien conocidos en este ámbito, incluidas sus formulaciones, indicaciones, dosificación y administración para cada uno de los presentados (véase, por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs [Manual de medicamentos para enfermería, 2001], 21a ed., Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001 [Guía de medicamentos para profesionales de la salud, 2001], ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmacotherapy Handbook [Manual de farmacoterapia], Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT).
Normalmente, el tratamiento de afecciones patológicas se efectúa administrando una cantidad o dosis eficaz de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 de un total, como media, que cubra un rango de aproximadamente 0,01 a 500 miligramos de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por kilogramo de paciente por dosis, y, preferiblemente, desde por lo menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramos anticuerpo/kilogramo de
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paciente por administración única o múltiple, dependiendo de la actividad específica del agente activo que contenga la composición. De forma alternativa, la concentración de suero efectivo puede incluir una concentración de suero de 0,1-5000 |jg/ml por administración única o múltiple. Los facultativos médicos conocen las dosis adecuadas que dependerán, sin duda, del estado concreto de la enfermedad, de la actividad específica de la composición que se administra y del paciente concreto que esté a tratamiento. En algunos casos, para obtener la cantidad terapéutica que se desea puede ser necesaria una administración repetida, administraciones individuales repetidas de una dosis concreta medida o monitorizada, donde las administraciones individuales se repitan hasta que se consiga la dosis diaria o el efecto deseado.
Las dosis que se prefieren podrían incluir aproximadamente 0,1-99 y/o 100-500 mg/kg/administración, o cualquier rango, valor o fracción de los mismos, o obtener una concentración de suero de aproximadamente una concentración de suero de 0,1 -5000 jg/ml por administración única o múltiple, o cualquier rango, valor o fracción de los mismos. El rango de dosificación preferible para el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento va entre aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 3, aproximadamente 6 o aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal del paciente.
De forma alternativa, la dosis administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, como las características farmacodinámicas del agente concreto y su vía y ruta de administración; edad, estado y peso del recipiente; naturaleza y alcance de los síntomas, tipo de tratamiento simultáneo, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Normalmente, una dosificación de ingrediente activo puede ser de aproximadamente entre 0,1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente 0,1 a 50, y preferiblemente de 0,1 a 10 miligramos por kilogramo por administración o en forma de liberación sostenida será eficaz para obtener los resultados deseados.
Únicamente a modo de ejemplo (no limitativo), el tratamiento de humanos o animales puede suministrarse en dosificación única o periódica de por lo menos un anticuerpo del presente invento de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg o cualquier rango, valor o fracción de los mismos al día, por lo menos uno de los días del 1- 40, o de forma alternativa o adicional, por lo menos una de las semanas de la 1 - 52, o de forma alternativa o adicional, por lo menos uno de los años 1-20, o cualquier combinación de los mismos, usando dosificación única, infusión o dosis repetidas.
Las formas de dosificación (composición) adecuadas para la administración interna normalmente contienen desde aproximadamente 0,001 miligramos hasta aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o recipiente. En esos compuestos farmacéuticos el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,5-99,999 % por peso en base al peso total de la composición.
Para administración parenteral, el anticuerpo puede formularse en forma de solución, suspensión, emulsión, partícula, polvo o polvo liofilizado en asociación, o administrado separadamente, con un vehículo parenteral aceptable farmacéuticamente. Entre los ejemplos de dichos vehículos se encuentra el agua, salino, solución de Ringer, solución de dextrosa y aproximadamente 1- 10 % de albúmina de suero humano. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos adicionales que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza por medio de técnicas conocidas o adecuadas.
Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences [Ciencia farmacéutica de Remington], A. Osol, texto estándar de referencia en este ámbito.
Vías alternativas de administración
Hay muchos modos conocidos y desarrollados de administración de cantidades eficaces farmacéuticamente de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 de acuerdo con el presente invento. Mientras la administración pulmonar se usa en la siguiente descripción, se podrían usar otras vías de administración con resultados adecuados. Los anticuerpos IL-6 del presente invento pueden administrarse en un portador, en forma de solución, emulsión, coloide o suspensión o en forma de polvo seco, usando cualquiera de varios instrumentos y métodos adecuados para la administración por inhalación u otros modos descritos en este documento o conocidos.
Formulaciones y administración parenteral
Las formulaciones por administración parenteral pueden contener como excipientes habituales agua estéril o salino, glicoles de polialquileno, como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las suspensiones acuosas o aceitosas para su inyección pueden prepararse usando un emulsificador o humidificador adecuado y un agente de suspensión, de acuerdo con métodos conocidos. Los agentes para inyección pueden ser un agente diluyente no tóxico, no administrable oralmente, como solución acuosa, solución inyectable estéril o suspensión en un disolvente. Como vehículo utilizable o disolvente, se permiten agua, solución de Ringer, salino isotónico, etc.; como disolvente normal o en suspensión puede usarse aceite estéril no volátil. Para estos fines, puede usarse cualquier tipo de aceite no volátil y ácido graso, incluidos aceites grasos naturales o sintéticos o
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semisintéticos o ácidos grasos; mono- o di- o tri-glicéridos naturales o sintéticos. La administración parental es una técnica conocida e incluye, entre otros, medios convencionales de inyección, un instrumento de inyección sin aguja a presión de gas como se describe en la patente de los EE. UU. n° 5.851.198, y un instrumento perforador láser como el descrito en la patente de los EE. UU. n° 5.839.446.
Administración alternativa
También se presenta en este documento la administración de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por vía parenteral, cubcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardiana, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica. Por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 puede prepararse para usarla en administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otro tipo de administración, concretamente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para su uso en administración vaginal o rectal, concretamente en formas semisólidas, como, entre otras, cremas y supositorios; para administración bucal o sublingual, como, entre otros, en forma de tabletas o cápsulas; o intranasalmente, como, entre otras, la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o agentes concretos; o transdérmicamente, como, entre otros, un sistema de administración en gel, pomada, loción, suspensión o por parche con mejoras químicas, como dimetilsulfóxido para modificar la estructura cutánea o aumentar la concentración de medicamentos en el parche transdérmico (Junginger, et al. In "Drug Permeation Improvement" ["Mejora de la permeabilidad de los medicamentos"] Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), o con agentes oxidizantes que permiten la aplicación sobre la piel de formulaciones que contienen péptidos (WO 98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear vías de transporte transitorias, como electroporación, o para aumentar la movilidad de medicamentos cargados a través de la piel, como iontoforesis, o aplicación de ultrasonidos, como sonoforesis (patentes de los EE. UU. n° 4.309.989 y 4.767.402).
Administración pulmonar/nasal
Para la administración pulmonar, preferiblemente, por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 se administra en tamaño de partículas eficaz para alcanzar las vías aéreas bajas del pulmón o senos. De acuerdo con el invento, por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 podría administrarse por cualquiera de varios instrumentos de inhalación o nasales conocidos para la administración de un agente terapéutico por inhalación. Estos instrumentos capaces de depositar formulaciones de depósito por aerosol en la cavidad nasal o los alveolos de un paciente incluyen inhaladores dosificados, nebulizadores, generadores de polvo seco, pulverizadores y similares. También son conocidos otros instrumentos adecuados para dirigir la administración pulmonar o nasal de anticuerpos. Todos dichos instrumentos pueden usar formulaciones adecuadas para la administración de anticuerpos en un aerosol. Dichos aerosoles pueden comprender soluciones (acuosas y no acuosas) o partículas sólidas.
Los dosificadores como el inhalador dosificado Ventolin® normalmente usan un gas propulsor y necesitan que se los accione durante la inspiración (véase, por ejemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros™ inhaler (Dura), comercializados por Inhale Therapeutics, y el inhalador en polvo Spinhaler® (Fisons), funcionan por el accionamiento por la respiración de un polvo mezclado (EE. UU. 4668218 Astra, patente europea 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, EE. UU. 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, Ultravent® (Mallinckrodt) y Acorn II® (Marquest Medical Products) (Ee. UU. 5404871 Aradigm, WO 97/22376), producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores dosificados, inhaladores en polvo seco, etc. Generan aerosoles de pequeñas partículas.
Preferiblemente, una composición que incluye por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 se administra por medio de un inhalador de polvo seco o pulverizador. Un instrumento de inhalación para la administración de por lo menos un anticuerpo del presente invento tiene varias características que lo hacen preferible. Por ejemplo, la administración por medio de un instrumento de inhalación es fiable, reproducible y exacta, lo que resulta una ventaja. El inhalador podría también administrar pequeñas partículas secas, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 pm, preferiblemente aproximadamente 1-5 pm, para una buena respirabilidad.
Administración de composiciones de anticuerpo IL-6 en forma de aerosol
Un aerosol que incluya una composición de anticuerpo IL-6 puede producirse forzando una suspensión o solución de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a través de un pulverizador a presión. El tamaño y la configuración del pulverizador, la presión aplicada y la cantidad de administración de líquido puede elegirse para conseguir la salida y el tamaño de partículas que se desee. Se puede producir un electrospray, por ejemplo, por medio de un campo eléctrico en conexión con una capilarización o pulverizador. Las partículas de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 administradas por aerosol tienen un tamaño de partículas menor de aproximadamente 10 pm,
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preferiblemente, en el rango entre 1 |jm y aproximadamente 5 |jm, y todavía mejor entre 2 |jm y aproximadamente 3 |jm, lo que resulta una ventaja.
Las formulaciones de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 adecuadas para su uso con atomizador normalmente incluyen composiciones de anticuerpo en solución acuosa a una concentración de aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 100 mg de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 por ml de solución de mg/gm, o cualquier rango, valor o fracción de los mismos. La formulación puede incluir agentes como un excipiente, un tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensoactivo, y preferiblemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o agente para la estabilización de la composición del anticuerpo, como un tampón, un agente reductor, una proteína a granel o un carbohidrato. Las proteínas a granel útiles a la hora de formular composiciones de anticuerpo incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos habituales que son útiles a la hora de formular composiciones de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La formulación de composición de anticuerpos también puede incluir un tensoactivo, que puede reducir o evitar la agregación inducida por la superficie de la composición del anticuerpo provocada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Se pueden usar varios tensoactivos convencionales, como ésteres y alcoles de polioxietileno de ácido graso y ésteres de polioxietileno de sorbitol de ácido graso. Las cantidades generalmente variarán en un rango de entre 0,001 y 14 % por el peso de la formulación. Los tensoactivos que se prefieren para el objeto de este invento son el monooleato de sorbitán polioxietilenado, polisosrbato 80, polisorbato 20 y similares. También se pueden incluir en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína, como anticuerpos IL-6, o porciones o variantes especificadas.
Administración de composiciones de anticuerpo IL-6 por nebulizador
Las composiciones de anticuerpo del invento pueden administrarse por un nebulizador, como un nebulizador de chorro o ultrasónico. Normalmente, en un nebulizador de chorro, se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire a alta velocidad a través de un orificio. Al expandirse el gas pasada la boquilla, se crea un área de baja presión, que lanza una solución de composición de anticuerpo a través de un tubo capilar conectado a un reservorio líquido. El caudal líquido del tupo capilar se corta en filamentos y gotas inestables al salir del tubo, creando el aerosol. Se puede usar una gran variedad de configuraciones, tasas de flujo y tipos de deflector para conseguir las características de funcionamiento que se deseen a partir de un determinado nebulizador de chorro. En un nebulizador ultrasónico, se usa energía eléctrica de alta frecuencia para crear energía mecánica de vibración, normalmente usando un transductor piezoeléctrico. Esta energía se transmite a la formulación de la composición del anticuerpo directamente o a través de un fluido acoplante, creando un aerosol que incluye la composición del anticuerpo. Las partículas de la composición de anticuerpo administradas por un nebulizador tienen un tamaño de partícula menor de aproximadamente 10 jim, preferiblemente en el rango de aproximadamente 1 jim a aproximadamente 5 jim, y todavía más preferible, entre 2 jim y aproximadamente 3 jim.
Las formulaciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 adecuado para su uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, normalmente incluyen una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de por lo menos un anticuerpo de proteína anti-IL-6 por ml de solución. La formulación puede incluir agentes como un excipiente, un tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensoactivo, y preferiblemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o agente de estabilización de por lo menos un anticuerpo de composición anti-IL-6, como un tampón, agente reductor, una proteína a granel o un carbohidrato. Las proteínas a granel útiles en la formulación de por lo menos un anticuerpo de composiciones anti-IL-6 incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos habitualmente útiles en la formulación de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La por lo menos una formulación de anticuerpo anti-IL-6 también puede incluir un tensoactivo, que puede reducir o evitar la agregación inducida por la superficie de lo menos un anticuerpo anti-IL-6 causada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Pueden usarse varios tensoactivos convencionales, como ésteres de ácido graso de polioexietileno y alcoholes, y ésteres de ácido graso sorbital de polioxietileno. Las cantidades generalmente estarán en un rango de entre 0,001 y 4 % por peso de la formulación. Los tensoactivos que se prefieren para el objeto de este son: mono-oleato de sorbitán de polioxietileno, polisorbato 80, polisorbato 20 o similares. También pueden incluirse en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína, como proteína de anticuerpo.
Administración de composiciones de anticuerpo IL-6 por inhalador dosificado
En un inhalador dosificado (MDI), un propulsor, por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 y cualquier excipiente u otro aditivo se ubican en un depósito como mezcla incluyendo un gas comprimido licuado. La actuación de la válvula dosificadora libera la mezcla en forma de aerosol, preferiblemente con partículas en el rango de menos de unos 10 jim, preferiblemente entre aproximadamente 1 jim hasta unos 5 jim, y más preferible, aproximadamente 2 jm hasta unos 3 jm. El tamaño de partículas del aerosol que se desee puede obtenerse usando una formulación de composición de anticuerpo producida por varios métodos conocidos por los expertos en la materia, incluidos molienda de chorro, secado por pulverización, condensación de punto crítico o similares. Entre los inhaladores
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dosificados se incluyen los fabricados por 3M o Glaxo que usen un propulsor de hidrofluorocarbono. Las formulaciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 para su uso con un instrumento inhalador o dosificado generalmente incluirán un polvo fino que contenga por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propulsor con la ayuda de un tensoactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional utilizado para este objeto, como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarbono, incluido triclorofluorometano, diclorofifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluroalcano-227) o similares. Preferiblemente, el propulsor será un hidrofluorocarbono. El tensoactivo puede elegirse para estabilizar el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como suspensión en el propulsor, para proteger el agente activo contra la degradación química y similares. Entre los tensoactivos adecuados se incluye el trioleato de sorbitán, lecitina de soja, ácido oleico o similares. En algunos casos, se prefieren los aerosoles de solución que usan solventes, como el etanol. También se pueden incluir en la formulación otros agentes conocidos para la formulación de una proteína. Alguien que tenga un conocimiento general en esta área reconocerá que los métodos presentados en este documento pueden conseguirse por medio de la administración pulmonar de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 por medio de instrumentos que no están descritos aquí.
Formulaciones y administración oral
Las formulaciones para la administración oral se basan en la coadministración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y tensoactivos noiónicos, como éter oleico de polioxietileno y éter n-hexadecilpolietileno) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, así como la co-administración de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. Las formulaciones para la administración de agentes hidrofílicos, incluidas proteínas y anticuerpos y una combinación de por lo menos dos tensoactivos destinados a administración oral, bucal, mucosal, nasal, pulmonar, de la transmembrana vaginal o rectal se explican en la patente de los EE. UU. n° 6.309.663. El compuesto constituyente activo de la forma de dosificación de tipo sólido para administración oral puede mezclarse con por lo menos un aditivo, que incluye sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidón, agar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arábiga, gelatina, colágeno, caseína, albúmina, polímero sintético o semisintético y glicérido. Estas forma de dosificación también pueden contener otros tipos de aditivos, por ejemplo, agente de dilución inactivo, lubricante, como estearato de magnesio, parabeno, agente conservante, como ácido sórbico, ácido ascórbico, .alfa.-tocoferol, antioxidante como cisteína, desintegrador, aglutinante, espesante, agente tamponador, agente edulcorante, agente saborizante, agente perfumante, etc.
Los comprimidos y pastillas también se pueden procesar en preparaciones con cubierta protectora. Entre las preparaciones líquidas para su administración oral se incluyen: preparados en emulsión, sirope, elixir, suspensión y solución aceptables para uso médico. Estos preparados pueden contener agentes de dilución inactivos que se usan normalmente en dicho ámbito, por ejemplo, agua. Los liposomas también se han descrito como sistemas de administración de medicamentos para insulina y heparina (patente de los EE. UU. n° 4.239.754). Más recientemente se han usado microesferas de polímeros artificiales de aminoácidos mezclados (proteinoides) para administrar productos farmacéuticos (patente de los EE. UU. n° 4.925.673). Además, los compuestos portadores descritos en la Patente de los EE. UU. n° 5.879.681 y la patente de los eE. UU. n° 5.5.871.753 que se usan para administrar agentes biológicamente activos de forma oral son conocidos en este ámbito.
Formulaciones y administración de la mucosa
Una formulación para la administración oral de un agente bioactivo encapsulado en un excipiente o más de polímeros biocompatibles o copolímero, un polímero biodegradable o copolímero, que proporciona microcáptulas que debido al tamaño adecuado de las microcápsulas resultantes tiene como resultado que el agente alcanza y es tomado por el folliculi lymphatic aggregati, conocido también como "placa de Peyer" o "GALT" del animal sin pérdida de efectividad debido a que el agente ha pasado a través del tracto gastrointestinal. Se pueden encontrar folliculi lymphatic aggregati similares en los tubos branquiales (BALT) y el intestino grueso. Los tejidos anteriormente descritos se denominan generalmente tejidos linforeticulares asociados a la mucosa (MALT). Para la absorción a través de superficies mucosas, composiciones y métodos de administración por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 incluye una emulsión que incluye un grupo de partículas de submicrón, una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo y una fase acuosa continua, que promueve la absorción a través de las superficies mucosas consiguiendo la mucoadhesión de las partículas de la emulsión (Patente de los EE. UU. n° 5.514.670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones del presente invento pueden incluir rutas de administración corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para administración vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquileneglicoles, vaselina, manteca de cacao y similares. Las formulaciones para administración intranasal pueden ser sólidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas o aceitosas de gotas nasales. Para la administración bucal, los excipientes incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidón pregelinatinado y similares (Patente de los EE. UU. n° 5.849.695).
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Formulaciones y administración transdérmica
Para su administración transdérmica, el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 se encapsula en un instrumento para su administración, como un liposoma o nanopartículas poliméricas, micropartículas, microcápsulas o microesferas (denominadas globalmente micropartículas, a no ser que se indique lo contrario). Se conocen varios instrumentos adecuados, incluidas micropartículas a base de polímeros sintéticos, como ácidos de polihidroxi, como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos, poliortoésteres, polianhídridos y polifosfacenos y polímeros naturales, como colágeno, poliaminoácidos, albúmina y otras proteínas, alginato y otros polisacáridos y combinaciones de los mismos (patente de los EE. UU. n° 5.814.599).
Formulaciones y administración prolongada
Podría ser preferible administrar los compuestos del presente invento al sujeto en períodos de tiempo prolongado, por ejemplo, durante períodos de una semana a un año a partir de una única administración. Pueden usarse varias formas de dosificación de liberación lenta, por depósito o por implante. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica aceptable farmacéuticamente de los compuestos que tiene un nivel bajo de solubilidad en los fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adición ácida con un ácido polibásico, como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos mono- o di-sulfónicos de naftaleno, ácido poligalaturónico y similares; (b) una sal con un catión de metal polivalente, como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares, o con un catión orgánico formado a partir de, por ejemplo, N,N'-dibenzilo- etilenediamina o etilenediamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, a una sal de tanato de zinc. Además, los compuestos del presente invento o, preferiblemente, una sal relativamente insoluble, como las que se acaban de describir, puede formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monostearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para inyección. Las sales que se prefieren son sales de zinc, sales de tanato de zinc, sales de pamoato y similares. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para inyección contendría el compuesto o sal dispersada para encapsulación en un polímero de degradación lenta, no tóxico, no antígeno, como polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo como se describe en la patente de los EE. UU. n° 3.773.919. Los compuestos o, preferiblemente, las sales relativamente insolubles, como las anteriormente descritas, también se pueden formular en gránulos de silástico de matriz de colesterol, especialmente para uso en animales. Se conocen otras formulaciones de liberación lenta, depósito o por implante, por ejemplo, liposomas gaseosos o líquidos (patente de los EE. UU. n° 5.770.222 y "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems" [Sistemas de administración de medicamentos por liberación prolongada], J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
Una vez descrito el invento en términos generales, se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ejemplo y no son limitativos.
Indicaciones
Artritis reumatoide (RA)
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad sistémica inflamatoria crónica con características autoinmunes. Se explicarán ciertas características de la RA a través de una acción de IL-6 no regulada.
Las acciones de IL-6 que tienen una relevancia potencial en RA incluyen la inducción de hipergammaglobulinemia policlonal y producción de autoanticuerpos (factor reumatoide), a través de las acciones de IL-6 como factor de diferenciación de una célula B; la promoción del desarrollo de una célula T citotóxica, conjuntamente con IL-2; la producción de proteínas de fase aguda (CRP, SAA, fibrinógeo), a través de actividad estimulante de hepatocito; activación osteoclástica, que lleva a osteoporosis periarticular y destrucción ósea; la inducción de trombocitosis, a través de acción como factor de diferenciación de megacariocito; y regulación de VEGF, y por lo tanto angiogénesis potencial, en combinación con IL-1p y TNFa.
IL-6 se produce por fibroblastos sinoviales de RA estimulados por TNFa o IL-1, y está presente a altos niveles de concentración tanto en el fluido sinovial (SF) como en suero en RA. Existe una correlación entre los niveles de suero y los indicios clínicos / de laboratorio de actividad de enfermedad.
Se ha estudiado Anti-IL-6/IL-6R mAbs en varios estudios clínicos en pacientes con RA activo. Más adelante se describen los resultados actualizados.
Estudios de fase I/II
En el primero de esos estudios, se administró diariamente un murino anti-IL-6 mAb (BE-8) durante 10 días consecutivos en 5 pacientes con RA y se asoció con una mejora clínica transitoria y en laboratorio (9) (Wendling, D; et al. 1993 J. Rheumatol. 20:259). El mAb (MRA; Chugai) anti-IL-6R (80kDa) humanizado se investigó en diversos estudios de fase I/II en pacientes con RA. En el primero, se administró MRA o infusión de IV en dosis de 1-50 mg
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una o dos veces a la semana, con un tratamiento de mantenimiento de 50 mg por semana hasta 6 meses. Tuvo como resultado una disminución rápida en las mediciones de la fase aguda, proteína C-reactiva (CRP) y fibrinógeno, y en fiebre baja, cansancio y escalas clínicas, como rigidez matutina y recuento de articulaciones hinchadas y dolorosas. También se detectaron mejorías en anemia, trombocitosis e hipergammaglobulinemia. En un estudio posterior, se trató a 45 pacientes con una infusión única de IV MRA en una dosis de 0,1-10 mg/kg, y tuvo como resultado una tendencia de mejora en puntuaciones clínicas a niveles más altos de dosis, más reducción en reactivos de fase aguda.
Estudios de fase II
En el primero de esos estudios, se trató a 15 pacientes con MRA (dosificación de 2, 4 o 8 mg/kg quincenal durante 24 semanas) y dieron respuestas de ACR20 en 13/15 en la semana 24, con normalización de CRP/suero amiloide A (SAA). Aunque no ha habido problemas importantes en cuanto a la seguridad aguda, hasta dos tercios de los pacientes mostraron niveles marcadamente superiores de colesterol LDL. En un segundo estudio de fase II, 164 se trató a pacientes con RA resistente a DMARDs con placebo o MRA por infusión IV (dosificación 4 o 8 mg/kg, cada 4 semanas durante 3 meses) y mostraron tasas de respuesta de ACR20 la semana 12 del 11 %, 57 % y 78 % para placebo, 4 y 8 mg/kg, respectivamente. Finalmente, 359 pacientes con RA activo recibieron únicamente MTX (10-25 mg/semana), solo MRA (niveles de dosificación 2, 4 o 8 mg/kg, administrados mensualmente por medio de infusión IV) o MTX más MRA. MRA y MRA + MTX fueron más eficaces que solo MTX, como determina la respuesta ACR20.
Lupus eritematoso sistémico (LES)
El LES es una enfermedad crónica, potencialmente mortal, autoinmune con múltiples manifestaciones proteicas. Se desconoce la etiología. Una característica de la enfermedad implica hipoproliferación, activación y producción de autoanticuerpo de célula B contra varios auto antígenos.
IL-6 induce a las células B a diferenciarse en células de formación de anticuerpos. En LES, aumenta la producción de autoanticuerpos (ANA, anti-dsADN) por esas células de formación de anticuerpos y deposición de complejo inmune. IL-6 promueve el desarrollo de célula T citotóxica, aumenta los reactivos de fase aguda hepática, la proliferación de célula mesangial, el crecimiento de queratinocitos, la diferenciación y trombosis de megacariocíticos.
Los niveles de IL-6 se elevan tanto en los pacientes de LES como en los modelos murinos de SLE. Se demostró que la unión de receptores de IL-6 en células B induce la diferenciación terminal de células B en células de producción de autoanticuerpo. Linker-Israeli et al. (Linker-Israeli M et al., 1991 J Immunol 147:117-123) han mostrado disminuciones en la producción espontánea de anticuerpo policlonal cuando se usaron anticuerpos de neutralización en IL-6. Kitani y otros (Kitani A, et al., 1992 Clin Exp Immunol 88: 75-83) respaldaron estos hallazgos demostrando que la producción de célula T in vitro de of IL-6 duplicado en cultivos de LES y que las células LES B tenían cinco veces más producción IL-6 que las células B de control. De todas formas, la producción patológica de autoanticuerpos en LES no solo se limita a los efectos de IL-6. También se ha estudiado el papel del receptor de IL- 6. Nagafuchi y otros han mostrado receptor IL-6 hasta la regulación en la mayoría de células LES B vs. células B normales. Los anticuerpos de receptor de anti-IL-6 inhibieron la diferenciación terminal de dichas células B en células de formación de anticuerpos. El papel del receptor de IL-6 soluble en LES todavía no se ha determinado.
Diabetes Mellitus de Tipo II (T2DM)
Se cree que la resistencia a la insulina (pérdida de efecto de la insulina) y pérdida de la función de la célula- p (déficit funcional de las células-p pancreáticas en la secreción de insulina) son las causas principales del desarrollo de T2DM. La resistencia a la insulina se manifiesta en forma de incapacidad de los tejidos periféricos de responder adecuadamente la insulina, provocando un aumento de los niveles de glucosa en sangre. Al aumento de la resistencia a la insulina y los niveles de glucosa en la sangre sigue una hipersecreción de insulina por células-p pancreáticas en las primeras fases de la enfermedad. Al progresar T2DM, se deteriora la capacidad de las células-p para segregar insulina.
Los mecanismos subyacentes responsables del desarrollo de la resistencia a la insulina no están claros. La afección asociada más habitualmente al desarrollo de T2DM es la obesidad e incluso una pequeña pérdida de peso mejora de forma significativa los niveles de glucosa en pacientes con T2DM.
Tanto la obesidad como la resistencia a la insulina/hiperinsulinemia, en combinación con dislipidemia, disminución de la tolerancia a la glucosa e hipertensión han caracterizado la the afección denominada síndrome metabólico. La progresión natural de síndrome metabólico a T2DM predispone a los individuos al desarrollo de cambios micro- y macro- vasculares que podrían conducir a enfermedad cardiovascular (CV) y en última instancia la muerte. Se ha sugerido que las principales relaciones entre T2DM y la enfermedad CV podrían ser la obesidad, la resistencia a la insulina y la hiper-insulinemia.
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El tejido adiposo se ha identificado como uno de los órganos principales que regula el metabolismo, y es tanto un depósito de energía como un órgano endocrino que segrega numerosas moléculas implicadas en la regulación de sensibilidad de insulina. Además de leptina, resistina, adiponectina y TNFa, el tejido adiposo segrega IL-6, lo que se ha sugerido que representa la unión entre obesidad, inflamación, T2DM y enfermedad cardiovascular (CV).
Se ha documentado una correlación positiva entre la adiposidad y los niveles de IL-6. Es posible que el aumento del tejido adiposo en la obesidad proporcione un aumento prolongado en IL-6 circulante que podría disminuir la sensibilidad a la insulina promoviendo la inflamación en tejidos que responden a la insulina o causan resistencia a la insulina interfiriendo la actividad y la expresión de proteínas implicadas en la cascada de señalización de insulina. Existen datos in vitro e in vivo que apoyan o se oponen al papel potencial de IL-6 en el desarrollo de resistencia a la insulina.
Los datos in vitro que usan sistemas celulares bien definidos, incluido hígado (HepG2)(44), grasa (3T3L1) o células de islote pancreático de rata aislado muestran un efecto negativo directo de IL-6 sobre la señalización de insulina, absorción de glucosa y secreción de insulina, respectivamente. Por otro lado, los datos obtenidos a partir de experimentos realizados en biopsias de músculo esquelético sugieren que IL-6 podría aumentar la absorción de glucosa en el músculo que se ejercita.
Los datos in vivo de la asociación entre niveles de IL-6 y sensibilidad de insulina se mezclan de la misma forma. Los modelos de sobre-expresión de IL-6 o de ablación completa sugieren que la inhibición completa de la actividad IL-6 podría no tener un efecto beneficioso. Por ejemplo, en ratones diabéticos no obesos (NOD) transgénicos, la sobre-expresión de IL-6 humano retrasa la aparición de diabetes y prolonga la supervivencia. Además, los datos de ratones nulos para IL-6 sugieren que IL-6 podría tener un papel en la regulación del equilibrio energético, ya que esos animales desarrollan obesidad de aparición tardía y niveles de glucosa más altos.
En humanos, una mutación que se produce de forma natural dentro de la región del promotor IL-6 provoca un aumento de la tasa de secreción de IL-6. Esta mutación se ha asociado tanto con un aumento como con una disminución de la sensibilidad a insulina.
En otro grupo de experimentos, se ha evaluado el efecto de IL-6 exógeno. En sujetos normales, la administración de IL-6 provocó aumentos en los niveles de glucosa sin afectar a las concentraciones de insulina en plasma, mientras que en los pacientes de cáncer, la adición de IL-6 aumentó el almacenamiento de glucosa. Además, se ha examinado la correlación entre los niveles de IL-6 y la resistencia a la insulina. Los datos de esos experimentos sugieren que tanto en hombres como en mujeres, los altos niveles circulantes de IL-6 se correlacionaron con una resistencia a la insulina más alta aunque todavía no se ha determinado una relación de causa-efecto.
Se ha indicado que IL-6 tiene un papel importante en el desarrollo de resistencia a asociado con obesidad. De todas formas, existen datos in vitro e in vivo contradictorios que tanto apoyan o contradicen su papel potencial en la resistencia a la insulina.
Osteoartritis (OA)
La OA es un trastorno articular crónico y degenerativo, caracterizado por la pérdida de cartílago articular y cambios relacionados en el hueso subcondral. Aunque se observan grados variables de inflamación en artroscopia o en muestras de biopsia sinovial, la enfermedad no es principalmente inflamatoria. Más bien se cree que se origina a partir de cambios en el condrocito y/o en el metabolismo osteoblástico. TNF, IL-1 e IL-6 son las citoquinas que se asocian más claramente con esos cambios.
IL-6 es detectable en el fluido sinovial de pacientes con OA, aunque a niveles que están sustancialmente por debajo de los que se ven en artropatías inflamatorias (Bertazzolo, N. et al. 1994 Agents and Actions [Agentes y acciones] 41: 90-92). Se reconoce que IL-6 es un estímulo principal para la síntesis de proteínas en fase hepática aguda, y los niveles de CRP se asocian con la presencia de OA de rodilla, incluso después de haber tenido en cuenta la asociación conocida entre CRP y obesidad (Mohtai, M. et al. 1996 J Orthopedic Research [Investigación ortopédica] 14: 67-73).
IL-6 se expresa en condrocitos a partir de cartílago OA, pero no de cartílago normal (Sowers, M. et al. 2002 Osteoarthritis and Cartilage [Osteoatritis y cartílagos] 10: 595-601). En experimentos que investigan los efectos del estrés mecánico sobre la expresión de las citoquinas de condrocito in vitro, la tensión de cizallamiento inducida por fluidos claramente aumentó IL-6 mARN y la proteína. Esto sugiere que la expresión de IL-6 en cartílago de OA podría ser resultado de una carga mecánica. También podría producirse IL-6 en respuesta a la acción de IL-1 sobre condrocitos (Dozin, B. et al. 2002 Matrix Biology [Biología de matriz] 21:449-459).
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En otros experimentos, IL-6, en combinación con sIL-6R, provocó la inhibición de síntesis de proteoglicano por condrocitos articulares humanos cultivados ex vivo, aunque el efecto fue modesto en comparación con el de IL-1 (Gueme, P. et al. 1999 Matrix Biology [Biología de matriz] 18: 253-260).
Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD)
La COPD es una enfermedad caracterizada por la limitación del flujo aéreo que no es totalmente reversible. La limitación del flujo aéreo normalmente es progresiva y se asocia con una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones a partículas y gases nocivos (Pauwels RA et al. 2001 AmJ.Respir Crit Care Med 163:1256-1276). La COPD se caracteriza por la aceleración en el deterioro normal de la función pulmonar con la edad. La limitación del flujo aéreo lentamente progresiva provoca invalidez y muerte prematura. La COPD es una causa principal de muerte y discapacidad, pero solo se ha explorado recientemente de forma amplia desde una perspectiva celular y molecular (Barnes P. J. et al. 2003 Eur Respir J 22:672-688). En COPD, hay una inflamación crónica que provoca el estrechamiento fijo de pequeñas vías aéreas y la destrucción alveolar (enfisema). La respuesta inflamatoria se caracteriza por un aumento del número de macrófagos alveolares, neutrófilos y linfocitos-T citotóxicos y la liberación de mediadores inflamatorios múltiples (quimioquinas, citoquinas, factores del crecimiento y lípidos). Un nivel más alto de estrés oxidativo podría aumentar la inflamación. También aumenta la elastolisis y los indicios de la implicación de varias enzimas elastolíticas. La inflamación y la proteólisis en COPD es una amplificación de la respuesta inflamatoria normal al humo del tabaco. En contraste con el asma, la inflamación parece ser resistente a los corticosteroides (Barnes P.J. et al. 2003).
En modelos animales, la exposición a endotoxina bacteriana o liposacáridos (LPS) y al humo del tabaco provocan neutrofilia y un aumento de la producción de IL-6 en el fluido del lavado broncoalveolar (BAL) (Underwood D.C. et al. 2000 AJPLCMP 279:L895-902). La sobre-expresión de IL-6 en pulmones de ratón provoca enfisema (Kuhn III Ch. et al. 2000 AJRCMB 22:289-295). En humanos, el volumen expiratorio forzado en un segundo (FEV1) tiene una correlación inversa con los niveles de IL-6 e IL-8 y con el conteo de células polimorfonucleares en el BAL (Soler N. et al. 1999 Eur Respir J 14:1015-1022). Los niveles de plasma TNFa, IL-6 y CRP aumentan en sujetos con COPD de leve a grave (YasudaN. et al. 1998 Respir Med 92:993-999).
El agravamiento agudo de COPD se define como un empeoramiento prolongado de la afección del paciente, desde el estado estable y por más allá de las variaciones normales del día a día, que es agudo a su aparición y necesita un cambio de la medicación normal (Burge S. et al. 2003 Eur Respir J 21: Suppl. 41, 46s-53s). Aunque el aumento de los síntomas y el empeoramiento de la función pulmonar son una causa común de admisión hospitalaria (aproximadamente 500.000 al año en los EE. UU.), los mecanismos subyacentes celular y molecular no se han investigado ampliamente y apenas se comprenden (Wedzicha, J.A. 2002 Chest 121: 136S-141S). Los agravamientos agudos pueden ser prolongados y tener un efecto profundo sobre la calidad de vida, y podrían acelerar la progresión de COPD (Soto F.J. et al. 2003 Pulm Med 9:117-124). Las afecciones respiratorias son las causas más comunes de agravamientos de COPD. La mayoría de esas infecciones son provocadas por bacterias, pero muchas de ellas son debidas a infecciones víricas, especialmente rinovirus (Soto F.J. et al. 2003). Los factores medioambientales, los contaminantes atmosféricos y la temperatura también podrían tener un papel.
Durante el agravamiento, se produce un aumento en los neutrófilos y las concentraciones de IL-6, IL-8, TNFa y LTB4 en el esputo de pacientes con COPD. Algunos pacientes con COPD entre moderado y grave son propensos a agravamientos frecuentes (tres o más agravamientos al año). Este grupo de pacientes (“agravadores frecuentes”) tiene un nivel más alto de IL-6 y un nivel más bajo de inhibidor de proteasa leucocitaria secretora incluso cuando COPD es estable (Bhowmik A. et al. 2000 Thorax 55: 114-120; Gompertz S. et al. 2001 Thorax 56: 36-41; Gompertz S. et al. 2001 EurRespirJ 17: 1112-1119).
Hay otros mecanismos, como estrés oxidativo y colonización bacteriana, también implicados en la patofisiología del agravamiento de COPD.
Ejemplo 1: Clonación y expresión de los anticuerpos IL-6 en células de mamíferos
Un vector de expresión de mamífero típico contiene por lo menos un elemento promotor, que media la iniciación de la transcripción de mARN, la secuencia de codificación del anticuerpo, y las señales necesarias para la terminación de la transcripción y poliadenilación de la transcripción. Otros elementos son mejoradores, secuencias Kozak y secuencias de intervención flanqueadas por ubicaciones de donante y de aceptador para la unión de ARN. La transcripción altamente eficaz puede conseguirse con los promotores iniciales y tardíos de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRS) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HI VI y el promotor inicial del citomegalovirus (CMV). De todas formas, también se pueden usar elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humana). Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica del presente invento incluyen, por ejemplo, vectores, como as pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, cA), pcADN3.1 (+/-), pcADN/Zeo (+/-) o pcADN3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSvL y PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSv2dhfr (ATCC 37146) y pBc12MI (AtCc 67109). Las células de mamíferos adecuados y otras células hospedadoras incluyen Hela, 293, H9 humanas y células Jurkat, NIH3T3 de ratón y células Cl27, Cos 1, Cos
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7 y CV 1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO). De forma alternativa, el gen puede expresarse en líneas celulares estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable, como dhfr, gpt, neomicina o higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas.
El gen transfectado también se puede amplificar para expresar grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otra selección útil de marcadores es la sintasa de glutamina de enzima (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Usando esos marcadores, las células de mamífero se cultivan en un medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen los genes amplificados integrados en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO con frecuencia se usan para la producción de anticuerpos.
Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus Rous Sarcoma (Cullen, et al., Mol. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) más un fragmento del mejorador CMV (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Las ubicaciones de clonación múltiple, por ejemplo, con las ubicaciones de división de enzima de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen, además del 3' intron, la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata.
Clonación y expresión de células CHO
El vector pC4 puede usarse para la expresión de anticuerpo de IL-6. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhff (ATCC n° de acceso 37146). El plásmido contiene el gen de ratón DHFR bajo el control del promotor inicial de SV40. El ovario de hámster chino u otras células que no tienen actividad de hidrofolato que se transfectan con esos plásmidos pueden seleccionarse cultivando las células en un medio selectivo (por ejemplo, alpha minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes DHFR en células resistentes a metotrexato (MTX) se ha documentado ampliamente (véase, por ejemplo, F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M. J. Page y M. A. Sydenham, Biotechnology [Biotecnología] 9:64-68 (1991)). Las células cultivadas en concentraciones de MTX en aumento desarrollan resistencia al medicamento sobre-produciendo la enzima objetivo, DHFR, como resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si un segundo gen está unido al gen DHFR, normalmente se co-amplifica y sobre-expresa. Se conoce que este enfoque puede usarse para desarrollar líneas celulares que portan más de 1.000 copias de los genes amplificados. Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen líneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en un cromosoma o más de la célula hospedadora.
También se pueden usar para la expresión promotores de alta eficacia distintos del promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR) del Virus Rous Sarcoma, por ejemplo, el promotor de p-actina humana, el promotor SV40 inicial o promotores tardíos de las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, HIV y HTLVI. Los sistemas de expresión genética de Clontech Tet-Off y Tet-On y otros sistemas similares pueden usarse para expresar el anticuerpo IL-6 en una forma regulada de células de mamífero (M. Gossen y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para la poliadenación de mARN, también se pueden usar otras señales, por ejemplo, a partir de la hormona de crecimiento humana o genes de globina. Las líneas celulares estables que portan un gen de interés integrado en los cromosomas también se pueden seleccionar a la co-transfección con un marcador seleccionable, como gpt, G418 o higromicina. Es conveniente usar más de un marcador seleccionable al inicio, por ejemplo, G418 más metotrexato. El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de restricción y a continuación se desfosforila usando fosfotasa intestinal de becerro por procedimientos conocidos. El vector entonces se aisla a partir de un 1 % de gel de agarosa.
Se usa la secuencia de ADN que codifica el anticuerpo IL-6 completo, por ejemplo, como se presenta en la SEC ID N°: 98 y 96, que corresponde a las regiones variables HC y LC de un anticuerpo IL-6 del presente invento, respectivamente, de acuerdo con los pasos de métodos conocidos. El ácido nucleico aislado que codifica una región constante humana adecuada (por ejemplo, regiones HC y LC) también se usa en este constructo.
Las regiones variable aislada y constante que codifican ADN y el vector desfosforilado entonces se ligan a la ligasa T4 de ADN. A continuación se transforman células de E. coli HB101 o azules XL-1 y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en plásmido pC4 que usa, por ejemplo, análisis de enzima de restricción.
Las células de ovario de hámster chino (CHO) que no tienen un gen de DHFR activo se usan para la transfección. 5 microgramos de la expresión de plásmido pC4 se cotransfectan con 0,5 microgramos del plásmido pSV2-neo usando lipofectina. El plásmido pSV2neo contiene un marcador seleccionable dominante, el neo gen a de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluido G418. Las células se cultivan en alfa menos MEM complementado con 1 microgramo/ml G418. Tras 2 días, las células se tripsinizan y
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cultivan en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) en alfa menos MEM complementada con 10, 25, o 50 ng/ml de metotrexato más 1 microgramo/ml G418. Tras aproximadamente 10-14 días, se tripsinizan clones sencillos y a continuación se cultivan en placas petri de 6 recipientes en matraces de 10 ml que usan diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las concentraciones más altas de metotrexato a continuación se transfieren a nuevas placas de 6 recipientes que contienen incluso mayores concentraciones de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100 - 200 mM. Se analiza la expresión del producto genético deseado, por ejemplo, por SDS-PAGE y Western blot o por análisis de HPLC de fase inversa.
Ejemplo 2 - Construcción y examen de anticuerpo anti-IL-6
Se construyeron y se analizó la actividad de variantes del anticuerpo IL-6 (clon AME-A9). En este ejemplo y en otros puntos de este documento, los CDRs son como ha definido Kabat con la excepción de CDRH1, que es la suma de las definiciones de Rabat y Chothia. La longitud de CDRH2 hizo necesario construir dos bibliotecas independientes para cubrir el área completa. Los clones de interés se secuenciaron y se caracterizaron con ELISA y se determinaron en un ensayo de base celular y constantes cinéticas.
En la Figura 9 se muestra un ejemplo de una ELISA realizado con los IgGs purificados. ELISA generalmente usó placas de microtitulación Costar 3366 recubiertas con un anticuerpo kappa de cabra antihumano. Se incubaron diluciones de Fab (o IgG) en los recipientes recubiertos durante 1 hr a 22° C. Los recipientes se lavaron a continuación con PBS, 0,1 % Tween 20 y se añadió IL-6 biotilinado a 200 ng/ml durante 1 hora. Tras el lavado, se añadió un conjugado de fosfatasa alcalina de NeutrAvidin y se incubó durante 1 hora a 22° C. Se añadió un sustrato colorimétrico tras lavado extensivo y se determinó la unión con IL-6. Una variación de este ELISA incluyó un paso de lavado extendido en un vaso de pBs, 0,01 % de BSA a 37° C tras la incubación biotinilada de IL-6, por ejemplo, un paso de lavado extendido de 18 horas.
Varios de los reactivos IL-6 de ingeniería humana generados de anticuerpos monoclonales IgG del invento tienen constantes de afinidad entre 1x109 y 9x1012. Los altos niveles de afinidad de esos anticuerpos monoclonales de ingeniería humana los hacen adecuados para aplicaciones terapéuticas en enfermedades dependientes de IL-6, patologías o afecciones relacionadas.
Se obtuvieron múltiples variantes de anticuerpo anti-IL6 de ingeniería humana modificando una o más de las regiones CDR del anticuerpo. La siguiente Tabla 3 muestra un resumen de las mutaciones beneficiosas que se encontraron en las bibliotecas CDR individuales (los cambios en los aminoácidos son relativos a la variante AME- A9). Además, la Tabla 13 muestra las secuencias de aminoácido para las CDRs de cadena ligera y pesada con las posibles posiciones de sustitución (marcadas con “X”).
Se construyó una biblioteca “combinatorial” en base a los mejores clones (por ejemplo, variantes) que se encontraron en las bibliotecas CDR individuales. La Tabla 4 muestra las mutaciones que se incluyeron en la biblioteca “combinatorial”. La biblioteca combinatorial se evaluó y caracterizó como se ha descrito. Las mutaciones que se encontraron en seis de los mejores clones se muestran en la siguiente Tabla 5A, mientras que los números de ID de la secuencia de los CDRs de esos clones se muestran en la Tabla 5B.
Ensayos de anti-IL-6 IgGs en un ensayo de base celular
Se estudió la capacidad de los anticuerpos anti-IL-6 quiméricos y anti-IL-6 de ingeniería humana (clon AME-19a) para evitar el crecimiento de una línea celular dependiente de IL-6. Las células 7TD1 se prensaron en una placa Costar 3610 96 a 200 células por recipiente. Se añadieron a las placas anticuerpos, diluidos en un medio de iMdM, seguido de la adición de IL-6 humano a una concentración final de 500 pg/ml y se incubaron placas en un incubador de cultivo de tejido durante 64-72 horas. En ese momento, se añadieron 50 pl de tampón de lisis celular a partir del kit ATPlite (Packard Bioscience) a todos los recipientes y las placas se agitaron durante 3 minutos. Se añadieron 50 pl de sustrato ATPlite y las placas cubiertas se agitaron 1 minuto. Se determinó la quimioluminiscencia en un luminómetro.
Los resultados de un ensayo de base celular se muestran en la Figura 10, y los valores EC50 calculados se muestran en la Tabla 6. El valor EC50 de los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 es 2,7 x 10'11 M (4,09 ng/ml) y el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (clon AME-19a) es 2,7 x 10'12 M (0,41 ng/ml). El valor EC50 del anticuerpo de ingeniería humana muestra una mejora de un aumento de aproximadamente 10, aunque podría ser posible obtener una mejora de aproximadamente 10 a 60, incluidos los valores que intervienen en el valor EC50.
Ejemplo 3 - Cinética de unión de los anticuerpos anti-humanos IL-6 de ingeniería humana.
El análisis de ELISA confirma que el anticuerpo purificado a partir de esas células hospedadoras unen IL-6 en una forma dependiente de la concentración. En este caso, se mide la afinidad del anticuerpo para este cognato
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antígeno (epítopo). Se obtienen las constantes de unión cuantitativa usando análisis por BIAcore y el instrumento KinExA 3000. Los resultados indican que varios de los anticuerpos monoclonales de ingeniería humana tienen muy alta afinidad con Kd en el rango de 1x10-9 a 3x10-14
Se llevó a cabo un inmuno ensayo de enzima (ELA) que usa anticuerpos monoclonales anti-humanos IL-6 (AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a y AME-23a) y CNTO 328 usado como control positivo para detectar la unión de IL-6 al receptor soluble IL-6, sIL-6R. El receptor humano soluble IL-6, sIL-6R, y IL-6 humano recombinante se obtuvieron a partir de sistemas R&D (Minneapolis, MN) (Catálogo#227-SR-025 y 206-IL-010, respectivamente). Se obtuvo peroxidasa de unión de IgG de rábano con cabra anti-humana (cadena H+L) de Jackson Immunoresearch (West Grove, PA) (Catálogo # 109-035-003). Se obtuvieron comprimidos de peróxido de hidrógeno y OPD de Sigma (St. Louis, MO) (Catálogo #H-1009 y P-8287, respectivamente).
Inmunoensayo de unión de enzima para formación de complejo sgp80/IL-6/anti-IL-6 mAb
Se recubieron placas Costar EIA (Coming/Costar, Acton, MA) (Catálogo #9018) con sIL-6R (10 pg/ml en PBS, 100 pl/recipiente) durante la noche a 4° C. Las placas se lavaron en 0,15 M de salino con 0,02 % (w/v) Tween 20 y las placas se bloquearon con 1 % (w/v) de BSA en PBS, 200 pl/recipiente durante una hora a temperatura ambiente. Los recipientes se volvieron a lavar en formato secuencial incubado con 200 ng/ml de IL-6 humano (100 pl/recipiente) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo a todos los recipientes en diluciones seriales en aumentos de 10 a partir de una concentración de inicio de 10 pg/ml en 100 pl/recipiente durante una hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, los recipientes se incubaron con cabra con IgG antihumano de unión de (H+L)-HRP, (10 pg/ml en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los recipientes se lavaron y se añadió una solución de 100 pl/recipiente de sustratos de citrato-fosfato (0,1 M de ácido cítrico y 0,2 M de fosfato de sodio, 0,01 % H2O2 y 1 mg/ml de OPD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró al añadir 25 pl/recipiente de 4 N de ácido sulfúrico y el OD490 se leyó por medio de un lector de placa ELISA automatizado (Molecular Devices Spectromax Plus, Sunnyvale, CA).
Para testar el efecto de la preincubación de IL-6 con anticuerpos anti hIL-6 monoclonales o CNTO 328, se incubaron 200 ng/ml IL-6 (100 pl) con diluciones en diez aumentos de anticuerpo (100 pl), comenzando por 10 pg/ml durante una hora a temperatura ambiente. Esta mezcla pre-incubada a continuación se incubó con sIL-6R durante una hora a temperatura ambiente y se detectó el complejo sIL-6R/IL-6/anti humano IL-6 usando IgG anti-humano de cabra unido con (H+L)-HRP, (10 pg/ml en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las afecciones del ensayo restantes fueron las mismas descritas en el párrafo anterior.
Los estudios previos han mostrado que CNTO 328 puede detectar IL-6 cuando se captura por sIL-6R recubierto una placa EIA. Además, AME-A9, AME-A16, AME-18a, AME-20b, AME-22a y AME-23a pueden detectar IL-6 unido a sgp80 (sIL-6R) de forma dependiente de la dosis usando EIA. Cada anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana se evaluó en referencia a CNTO 328. De todas formas, la preincubación de IL-6 y de cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti hIL-6 incluye la capacidad de sIL-6R de unir a IL-6.
Medición de constantes cinéticas para anti-IL-6 IgGs
El instrumento KinExA 3000, fabricado por Sapidyne, se utilizó para medir la cinética de la unión. Brevemente, IL-6 humana se acopló de forma covalente a gotas de alzactona y la unión de IgG libres a las gotas se detectó en el instrumento. Para medir el KD, se incubaron tubos individuales que contenían una concentración constante de 0,5, 1 o 5 pM de IgG con IL-6 humano diluido serialmente de forma decreciente durante 3-4 días a 20° C en 0,1 % de BSA, PBS. Se usó un total de 13 tubos para cada determinación de Kd. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 se usaron a una concentración constante de 5 pM y se incubaron tubos individuales con 0-200 pM de IL-6. Se configuraron de forma similar incubaciones para los otros IgGs. Tras la incubación, se determinó el IgG libre para cada ejemplo equilibrado en el instrumento KinExA 3000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de Kd se determinaron por medio del software KinExA 3000 usando el equipo KinExA 3000, como se describe a continuación más detalladamente.
Para medir kon, se mezclaron IgGs individuales a 200 pM con 100-200 pM de IL-6 humano y se detectó el IgG no ligado uniendo a IL-6 humano acoplado de forma covalente a gotas de alzactona en el equipo KinExA 3000. Se realizaron varias mediciones temporales. Los datos resultantes se usaron para calcular el kon con el software KinExA 3000. Se calculó koff usando la fórmula KD = kf/kon. En la Tabla 7 se muestra un resumen de las constantes cinéticas de anti-IL-6 IgGs.
Ejemplo 4: caracterización in vitro de anticuerpo anti-IL-6
Se llevaron a cabo estudios in vitro para caracterizar la secuencia, especificidad del epítopo, afinidad y actividad biológica del anticuerpo anti-IL-6.
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El análisis de secuencia confirma que el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento (representado en diferentes variantes/clones) contiene marcos completamente humanos. La Tabla 5a muestra un total de 10 residuos de aminoácidos cambiados tanto en la cadena ligera como la pesada de CDR1, 2, y 3 en el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento (en diferentes variantes del anticuerpo) en comparación con los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 (descritos en PCT WO 04/039826).
Especificidad de epítopo
El anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 reconocen un epítopo similar en IL-6 humano. Estos anticuerpos no compiten con el ratón comercial anti-humano IL-6 mAb de R&D Systems #MAB-206, lo que sugiere que reconocen un epítopo que es diferente del de R&D anti-IL-6 mAb. El anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 no compiten con la rata anti-humana IL-6 mAb de R&D.
Se capturó IL-6 humano (200 ng/ml) por medio de anti-IL-6 mAb unido por placa (ratón anti-humano IL-6 mAb, MAB-206, que se ha usado solo como mAb unido por placa para capturar IL-6 humano) (10 pg/ml) y diluciones seriales del anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 se añadieron entonces a la placa, como se indica a lo largo del eje X. La unión a IL-6 se midió en forma de aumento en OD490 junto con el eje Y. Tanto el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento como los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 muestran una unión dependiente a la dosis a IL-6.
Inversamente, el anticuerpo anti-IL-6 del presente invento y los anticuerpos quiméricos anti-IL-6 se unen competitivamente al IL-6 humano, sugiriendo que las dos moléculas comparten un epítopo de unión similar sobre IL- 6. La IL-6 humana (200 ng/ml) fue capturada por MAB-206 de unión por placa (10 pg/ml). A continuación, se añadieron a la placa diluciones seriales del anticuerpo anti-IL-6 del presente invento como se indica a lo largo del eje X y 50 ng/ml de anticuerpos anti-IL-6 quiméricos biotinilados. La unión de anticuerpos anti-IL-6 quiméricos biotinilados a IL-6 se detectó por streptavidina-HRP y se midió con lecturas OD490 a lo largo del eje Y.
Además, los anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos muestran propiedades similares para la unión al complejo sIL-6/sIL-6R (Figura 1). El anticuerpo anti-IL-6 del presente invento une a complejo sIL-6/SIL-6R. El receptor IL-6 soluble (sIL-6R) se recubrió en la placa a concentración de 10 pg/ml. A continuación se añadió IL-6 humano a la placa a concentración de 200 ng/ml. A continuación se añadieron a la placa diluciones seriales del anticuerpo anti-IL-6 del presente invento o del anticuerpo quimérico anti-IL-6, como se indica a lo largo del eje X y la unión al complejo IL-6/sIL-6R se detectó usando IgG HRP-anti-humano y se midió con lecturas OD490 a lo largo del eje Y.
Para confirmar mejor las conclusiones anteriores, se llevó a cabo una inspección de reactividad por especies cruzadas usando sobrenadante condicional que contenía IL-6 generado a partir de LPS y PBMCs estimulados por IFNy de diferentes especies en un ensayo de proliferación de base celular 7TD1 (línea celular de hibridoma murino dependiente de IL-6). Se ha demostrado que el anticuerpo de ingeniería humana del invento neutraliza la actividad del sobrenadante condicionado en la estimulación de proliferación de células 7TD1 a partir de varias especies de primates, entre las que se incluyen los humanos, tití, macaco cangrejero, chimpancé, macaco Rhesus, babuino, macaco cola de cerdo sureño y tití cabeza blanca, y mostraron un patrón de reactividad de cruce de especias similar en comparación al anticuerpo quimérico (Tabla 8).
Finalmente, cuando el mapeamiento de epítopos se llevó a cabo usando el método de digesto tríptico, se observó el mismo epítopo de unión para los anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos en IL-6 humano y está situado en los residuo de expansión de los aminoácidos Helix D 168-184 (Figure 3). Análisis de mutación recientes han confirmado que los residuos 179 y 182 son esenciales para que el anticuerpo del invento se una a IL-6. El epítopo (residuos de aminoácido 168-184) se identificó como la superficie de IL-6 que retenía deuterio en presencia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6.
Actividad biológica
La potencia de neutralización de IL-6 del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 se determinó por medio de un bioensayo 7TD1 de base celular. El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 demostró una potencia de neutralización de 10 aumentos mayor que el anticuerpo quimérico anti-IL-6 en el ensayo de proliferación celular 7TD1. Las células 7TD1 se estimularon con 500 pg/ml de hIL-6 en presencia de diluciones seriales de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 o anticuerpos quiméricos anti-IL-6 o control de isotipo mAb durante 72 horas. La proliferación celular se midió en conteos por segundo, como indica el eje Y. Las barras de erro indican el SD de muestras duplicadas. Un círculo cerrado indica células sin IL-6; un círculo abierto indica células estimuladas con 500 pg/ml de hIL-6.
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El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 también inhibe la producción de proteína-1 (MCP-1) de monocito inducido por IL-6 a partir de células U937 (Figura 3) y la producción de suero amiloide A (SAAO inducido por IL-6/IL-Ip a partir de células de hepatoma humano HepG2 (Figura 4). La Figura 3 demuestra que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibe la secreción de MCP-1 estimulado por IL-6 a partir de células U937. Se trataron 5 x 105 células/recipiente con 1 ng/ml de hIL-6 y diluciones seriales de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 durante 72 horas. Se analizaron los supernadantes de cultivo celular en triplicados por ELISA para ver la presencia de MCP-1.
La Figura 4 muestra que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibe la secreción de AAA estimulada por IL-1p e IL-6 a partir de células HepG2. 2,25 x 105 células se estimularon con 100 ng/ml de hIL-6, 200 ng/ml de sIL-6R y 1 ng/ml de IL-Ip en presencia de diluciones seriales de anticuerpos de ingeniería humana anti-IL-6 durante 24 horas. A continuación se analizaron los supernadantes de cultivo celular en duplicados por medio de ELISA para ver la presencia de SAA.
Fosforilación de Stat3 dependiente de IL-6
Para evaluar la capacidad del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 para bloquear la cascada de señalización resultante de la unión de IL-6 a IL-6R y gp130, se llevó a cabo un ensayo de inmuno-precipitación para testar el efecto de fosforilación de STAT3 dependiente de IL-6 sobre células THP-1, que expresan gp130 en la superficie celular.
Los mAbs se filtraron y se esterilizaron y almacenaron en PBS a 4° C. Se usaron IL-6 humano recombinante (206-IL-010) y sIL-6R (227-SR-025) a partir de sistemas R&D (Minneapolis, MN). Se obtuvieron medios de RPMI (11875-085), suero bovino fetal inactivado por calor (16000-069), L-Glutamina (25030-081), aminoácidos no esenciales (11140-050) y piruvato de sodio (11360-070) a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). También se usó TBS (10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl).
Se testó THP-1, una línea celular de leucemia monocítica aguda humana recibida de bancos celulares de investigación, y resultó ser negativa para micoplasma y libre de bacterias. Estas células se cultivaron en un medio de RPMI con un 10 % de suero bovino fetal, 2mM de glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. Las células se subcultivaron o recogieron cuando los cultivos alcanzaron una confluencia de aproximadamente el 85 %. Las células se dividieron rutinariamente 1:5 cada tres días.
Para fosforilación de tirosina se cultivaron células hasta una confluencia del 80-90 % en matraces T- 225. El medio se retiró y se sustituyó con otro frescon sin suero e incubado toda la noche. Tras la falta de suero, se recogieron las células de cada matraz, se granularon y se volvió a suspender una concentración final de 20x106 células por afección en un medio de 0,5 ml sin suero.
Se preincubó RhIL-6 (0,1 pg/ml) a 37° C durante 15 minutos con los siguientes reactivos: medio de 0,5 ml solo, anti-IL-6 Ab (10 pg/ml); y sIL-6r (0,2 pg/ml). A continuación se añadieron SIL-6R (0,2 pg/ml) y anti-IL-6 Ab (10 pg/ml) a células preincubadas con anti-IL-6 Ab y sIL-6R, respectivamente, para incubación a 37° C durante 15 minutos. A continuación se combinaron las células con un medio como control negativo y el complejo IL-6/Ab/sIL-6R y se incubaron a 37° C durante 6 minutos. Las células se lavaron dos veces en TBS helado y los gránulos celulares se procesaron como se ha descrito en la Sección 5.4 o se almacenaron a -70° C.
Para inmunoprecipitación, se lisaron los gránulos celulares en 1 ml de tampón de lisis (50 mM Tris, pH 7.5, 300 mM NaCl, 0,5 % Triton-X-100) (T-9284, Sigma, St. Louis, MO) que contienen comprimido de cóctel de inhibidor de proteasa completo (1697498, Roche, Basilea, Suiza). Las células se agitaron 30 segundos y se incubaron a -70° C durante 20-60 minutos. Se retiraron los residuos celulares por centrifugación a 13.000 rpm durante 20 minutos. Para reducir el tintado de entorno no específico, las muestras se pre-aclararon por incubavión con 2 IgG de conejo pg (I5006, Sigma, St. Louis, MO) más 50 pl de agarosa de proteína A (SC-2001, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 hr a 4° C en un mezclador orbital. Las gotas de agarosa se retiraron por centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos. Los lisados aclarados se transfirieron a tubos e micro-centrifugado y se incubaron con anti- STAT3 (2 pg/ml) (SC-7179, Santa Cruz Biotechnology) toda la noche a 4° C en un mezclador orbital, seguido de la adición de 50 p de gotas de agarosa de proteína A y se incubaron durante 2 horas a 4° C en un agitador orbital. Las gotas de agarosa se recogieron por un centrifugado a 2500 rpm durante 5 minutos y se lavaron 5 veces en TBS congelado a 4° C. A continuación se volvió a suspender las gotas de agarosa en 40 pl de tampón de muestra de Laemmli más DTT (NP0007-465030, Invitrogen, Carlsbad, CA) y se calentaron a 95° C durante 5 minutos.
Las muestras se resolvieron en un gel de 3-8 % de NuPage Bis-Tris (EA0375BOX, Invitrogen, Carlsbad, CA) con un tampón (NP0002-465026, Invitrogen, Carlsbad, CA) a 100 V durante 1 hora. Las proteínas se transfirieron a una membrana Nitrocellulose (LC2001, Invitrogen, Carlsbad, CA) usando un tampón de transferencia (NP0006-465029, Invitrogen, Carlsbad, CA) a 30 V durante 1 hora. Las membranas se bloquearon en leche en polvo libre de grasa al 10 % (Nestle, Glendale, California) en TBS-T durante la noche a 4° C. Tras varios lavados en TBS-T a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con ratón monoclonal anti-p-STAT3 Ab (SC-8059, Santa Cruz
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Los resultados mostraron que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 bloquearon la fosforilación mediada por IL-6 de stat3, un componente clave en la vía de señalización de IL-6 (Figuras 5A y 5B). El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe la fosforilación de stat3 inducida por IL- 6/sIL-6r. La fosforilación de stat3 inducida por IL-6/sIL-6R recombinante humana se detectó en células THP-1 (Figura 5B). La adición de 10 |jg/ml de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) o anticuerpos quiméricos anti-IL-6 inhibió por completo la fosforilación de stat3 (Figura 5B). La Figura 5A muestra la presencia de una cantidad similar de proteína stat3 no fosforilada e todas las muestras, correspondiendo a los diferentes clones de anti-il-6 de ingeniería humana. En este documento, CNT0328 (o 328) designa los anticuerpos quiméricos, humano-murino (también denominados tipo silvestre (WT)), 150 designa clon AME-22a, 143 designa clon AME-23a, 140 designa clon AME-20b, 136 designa clon AME-19a, 130 designa clon AME-18a, 106 designa clon AME-A16, 104 designa clon AME-A9.
Eficacia in vivo de anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana
La eficacia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 se evaluó en dos modelos in vivo diferentes. Primero, se testaron los efectos del anticuerpo IL-6 de ingeniería humana y quimérico y se compararon en un ensayo de angiogénesis en Matrigel de inducción de IL-6 humano en ratones. En el tampón de Matrigel se incluyeron 200 ng/ml de IL-6 humano. A cada uno de los ratones se inyectaron dos tampones Matrigel. Grupos de seis ratones recibieron una inyección i.v de 1, 3, o 6 mg/kg de anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana o quiméricos. Se administró PBS o un isotipo de control mAb también a los grupos de control. Se retiraron los tampones el día 7 y se midió la angiogénesis en base al contenido de hemoglobina, longitud de microvasos, y número de microvasos en los tampones. Los resultados demostraron que el IL-6 humano (grupo PBS) estimulaba la angiogénesis en el modelo de tampón de Matrigel según las medidas de los tres parámetros.
El anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe el número medio de microvasos en tampones de Matrigel. Además, el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe la longitud media de los microvasos en tampones de Matrigel. Además, el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19A) inhibe el nivel de hemoglobina en tampones de Matrigel.
Además, tanto los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana (AME-19A) como quiméricos inhibieron de forma dependiente de la dosis la angiogénesis mediada por IL-6 en ratones. Finalmente, los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana y quiméricos exhibieron una actividad comparable en la inhibición de angiogénesis inducida por IL-6 a 6 mg/kg, la mayor dosis testada. Aunque los anticuerpos anti-IL6 quiméricos inhibieron de forma significativa la angiogénesis humana inducida por IL-6 a 3 mg/kg de la forma medida por la longitud de los vasos y el número de vasos, no se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana y quiméricos en esas dosis.
Se desarrolló otro modelo in vivo para evaluar en mayor medida el efecto del anticuerpo anti-IL-6 de ingeniería humana sobre la producción en ratones Balb/C de proteína A amiloide de suero (SAA) en un reactivo de fase aguda inducido por IL-6 humano. Los ratones recibieron una administración i.p. 0,01, 0,5 o 5 mg/kg de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 4 horas antes de la administración i.v. de 5 jg/kg de IL-6 humano (Figure 6). Se usó como control PBS y control mAb de isotipo. Los niveles de suero SAA se determinaron a 16 horas tras la inyección de IL-6. Tanto los anticuerpo s anti-IL-6 de ingeniería humana como los quiméricos inhibieron de forma significativa la producción de SAA humano inducido por IL-6en ratones Balb/C a 0,5 y 5 mg/kg, y el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibió de forma significativa la producción de SAA a la dosis más baja testada. De todas formas, no se observaron diferencias estadísticas significativas entre los anticuerpos anti-IL-6 de ingeniería humana y quiméricos en las tres dosis testadas (Figura 6).
La Figura 6 muestra que el anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 inhibe la producción de SAA humano inducido por IL-6. Cada punto representa el valor medio de SAA para cada animal y la línea representa la media de todos los puntos de datos para cada grupo. Se llevó a cabo la comparación por pares y se usaron intervalos de confianza de Tukey simultáneos al 95 % para controlar el error tipo I general. (** p<0,001, *p<0,05).
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Ejemplo 5 - Razones terapéuticas para mAb anti-IL-6
Artritis reumatoide. Efecto de mAb anti-IL-6 sobre artritis inducida por colágeno (CIA) - modelo animal de artritis reumatoide
Modelos de enfermedad in vivo preclínicos
Se ha buscado IL-6 en varios modelos in vivo. O bien se usó el anticuerpo rata anti-ratón IL-6 en modelos murinos estándar o anti-IL-6R humanizado (80kDa) mAb (MRA; Chugai) en modelos de primates y en el modelo SCID humano/ratón. En artritis murina inducida por colágeno (CIA), anti-IL-6 fue eficaz en la prevención de la enfermedad si se usó de forma temprana (día 0 o 3 tras la inmunización por colágeno), pero no en puntos más tardíos. En el modelo de transplante humano/ratón SCID, en el que se transplanta tejido sinovial humano a ratones inmunodeficientes, el tratamiento por MRA produjo una contracción de implantes del tejido y redujo las células inflamatorias y osteoclastos. En CIA en monos cynomolgus, MRA inhibió el desarrollo de artritis y mejoró las medidas en fase aguda.
El efecto de un anti-ratón IL-6 mAb sustituto sobre el desarrollo de la enfermedad se ha evaluado en un modelo de CIA. Los resultados indican que la administración i.p. del anti ratón IL-6 a 1 mg/ratón/semana antes de la inducción de la enfermedad suprimió de forma significativa el desarrollo de la artritis inducida por colágeno como refleja la clara reducción en la gravedad de la enfermedad. Se indujo artritis a ratones d 8 semanas de edad tipo DBA/1 LacJ con 100 |jg de colágeno bovino tipo II en adyuvante de Freund completo (FCA) de forma intradérmica en la base de la cola. Se monitorizó clínicamente a los ratones diariamente durante la aparición de la enfermedad. Se administró anti-IL-6 mAb o control de isotipo mAb i.p. 2 días antes de la inducción de CIA y a continuación semanalmente 1 mg/ratón. Los marcadores de artritis se determinaron en base a la inflamación, eritema y desfiguración articular.
Los datos histopatológicos confirmaron la observación clínica de que la inyección semanal i.p. de mAb antiratón IL-6 mejoraron de forma significativa los parámetros de artritis inducida por colágeno. Todos los parámetros de artritis que se examinaron, incluida la respuesta inflamatoria (sinovitis y formación de pannus) y los cambios erosivos (erosiones y estructura articular general) mejoraron de forma significativa en ratones tratados con IL-6 anti-ratón en comparación con los animales de control tratados con mAb. El mAb anti-IL-6 suprimió la artritis a un nivel histopatológico. La sinovitis se marcó en base al espesor de la membrana sinovial; la formación de pannus se marcó en base al alcance del pannus en relación con el espacio articular; y las erosiones se marcaron en base al alcance en el cartílago y el hueso subcondral.
La pérdida de proteínas de matriz del cartílago se redujo de forma significativa en ratones tratados con IL-6 mAb anti-ratón. Se examinaron secciones articulares representativas obtenidas a partir de animales de control y tratados con anti-IL-6 mAb al final del estudio (día 53) por medio de Toluidine Blue con tintado para la matriz del cartílago.
El análisis por Micro-CT apoyó la observación clínica de que el efecto de la terapia anti ratón IL-6 se ejerció a nivel de la progresión de la enfermedad dentro de la articulación individual. La inspección visual de imágenes típicas 3D CT indica el marcado grado de cambios erosivos que se producen en el grupo tratado por mAb del control de isotipo en comparación con los cambios inflamatorios del tejido blando predominantemente leve. Los experimentos se llevaron a cabo con animales representativos tratados con mAb de control y animales tratados con IL-6 mAb anti-ratón.
Lupus. Efecto de anti-IL-6 sobre ratones NZBAV F1 Modelos de enfermedad pre-clínicos in vivo
Existen modelos murinos para SLE y tienen estrechas similitudes con la enfermedad humana. Los estudios de cadenas de MRL/lpr y NZB/W F1 han demostrado hiperproliferación de células B, producción de anticuerpos y deposición de complejos inmunes que tienen un gran parecido con la enfermedad humana. Se ha demostrado que anti-IL-6 mAb es eficaz en la inhibición de la producción de autoanticuerpos, reduciendo la proteinuria y mejorando la supervivencia animal en ratones NZBAV F1.
Se ha estudiado en ratones NZB/W F1 el efecto de un anti-ratón IL-6 mAb sustituto sobre el desarrollo de la enfermedad del lupus. Los resultados preliminares han demostrado que la administración i.p. del IL-6 mAb anti-ratón a l mg/ratón/semana for 22 semanas ha suprimido la producción de autoanticuerpos anti-dsADN, un autoanticuerpo patógeno principal en este modelo de enfermedad (Figura 7). Los niveles de autoanticuerpo anti-dsADN en animales tratados con anti-IL-6 mAb fueron más bajos de forma uniforme a lo largo de todo el estudio en comparación con los animales tratados con salino y Ab de control.
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Como se ha indicado, la Figura 7 muestra la inhibición de la producción de anticuerpos anti-dsADN por anti- IL-6 mAb en ratones NZBAY F1. Un valor Individual de O.D. para cada una de las muestras se normalizó a un suero de control positivo y se presentó en forma de % de control positivo. Cada uno de los grupos representa el % de control positivo de cada muestra y la línea representa la media de todos los puntos de datos de cada uno de los grupos. Una diferencia significativa se indica en forma de * p<0,01.
Además, el mAb anti-IL-6 inhibió la proliferación de células B y redujeron los daños renales cuando se examinó un pequeño subconjunto de los animales. Mientras que no hubo diferencias significativas en la proliferación de células T entre los diferentes grupos de tratamiento al final del estudio, la proliferación de células B inducida por anti-IgM y anti-CD40 fue más baja en ratones tratados con anti-IL-6 mAb en comparación con los tratados con salino en el tiempo, específicamente, tras 34 semanas. Este resultado es coherente con la reducción de la producción de anticuerpos anti-dsADN que se han informado anteriormente y sugiere que las células B auto reactivas podrían ser los objetivos directo y dominante del tratamiento anti-IL-6 mAb.
El análisis histopatológico indicó que los animales del estudio podrían categorizarse en 3 grupos de gravedad de la enfermedad renal (leve, moderada y grave) (Tabla 9). La patología de enfermedad renal en ratones NZB/W F1 indican hiperplasia linfoide mezclada y deposición de complejo inmune en la membrana de base glomerular.
Los animales tratados con anti-IL-6 mAb desarrollaron enfermedad renal menos grave. La hiperplasia linfoide mezclada perivascular y la deposición de proteínas estaban ausentes en los animales tratados con anti-IL-6 mAb mientras que los animales tratados con salino Ab de control desarrollaron hiperplasia linfoide mixta perivascular moderada y grave. Además, la deposición de complejo inmune en la membrana de base glomerular fue leve en los animales tratados con anti-IL-6 mAb en comparación con los de los otros dos grupos de tratamiento. La disección del mecanismo de acción de anti-IL-6 mAb sobre B, T y funciones de célula macrófaga se lleva a cabo porque estas células juegan un papel fundamental en la patogénesis de SLE.
Diabetes Mellitus de Tipo II
Se ha indicado que IL-6 juega un papel importante en el desarrollo de resistencia a la insulina asociada con obesidad. De todas formas, los datos in vitro e in vivo generados hasta el momento tanto apoyan como contradicen su papel potencial en la resistencia a la insulina.
Experimentos in vitro
Se han llevado a cabo experimentos para entender mejor los efectos que podría tener IL-6 sobre la señalización de insulina y sobre los efectos y función biológica de la insulina, como la absorción de glucosa, regulación genética y mecanismos relacionados usando modelos in vitro de tejidos que respondan a la insulina (células 3T3 LI para tejido adiposo, células HepG2 para células hepáticas, células C2C12 para músculo esquelético) y modelos in vivo de resistencia a la insulina y T2DM, como ratones db/db.
Los datos in vitro sugieren que IL-6 ejerce su efecto principal en la señalización de insulina en el hígado. El tratamiento con IL-6 de las células HepG2 produce la inhibición de fosforilación de Akt inducida por insulina. Este efecto inhibitorio de IL-6 sobre la señalización de insulina se ve bloqueado por un anticuerpo anti-IL-6. Los cambios del metabolismo de glucosa y los efectos de la insulina en el hígado se ha sugerido que son los factores del desarrollo de la resistencia a la insulina y el T2D. Los efectos de IL-6 sobre la señalización de insulina en células 3T3 LI (línea celular de adipocito) y C2C12 (líneas celulares de músculo esquelético) se examinan para determinar los mecanismos de IL-6 sobre T2D.
3T3 L1. Se llevaron a cabo experimentos usando línea celular de adipocito de ratón 3T3 L1. Se evaluó en células 3T3 L1 diferenciadas al 90 %, el efecto de IL-6 sobre la absorción de glucosa inducida por insulina. En estos experimentos, el tratamiento con 10 ng/ml of TNFa durante 24 horas inhibe de forma constante la absorción de glucosa inducida por insulina, mientras que 20 ng/ml de IL-6 no tuvieron efecto. Estos datos sugieren que la actividad de IL-6 sobre el tejido adiposo no es el mecanismo principal de la resistencia a la insulina mediada por IL-6, sino que el tejido adiposo podría ser una fuente principal de IL-6 que interfiere con la sensibilidad a la insulina en el hígado y el músculo. Se obtuvieron los mismos datos usando adipocitos humanos primarios diferenciados a partir de depósitos subcutáneos. Los efectos de IL-6 sobre la absorción de glucosa usando adipocitos primarios humanos a partir de un depósito de grasa visceral se investigan porque dicho depósito podría ser más relevante para la resistencia a la insulina asociada a la obesidad.
HepG2. Las células HepG2 se eligieron como representante in vitro del tejido del hígado. Las células HepG2 son líneas celulares de hepatoma humano de las que se ha mostrado previamente el efecto de IL-6 sobre la señalización de insulina. En los experimentos, 20 ng/ml de IL-6 bloquearon la fosforilación de Akt inducida por insulina, una quinasa crucial en la vía de señalización de la insulina, y el efecto máximo se observó tras 60 minutos de incubación; esto es coherente con los resultados informados en la bibliografía científica.
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La fosforilación de Akt sobre células HepG2 sub-confluyentes en placas de 10 cm se midió tras incubación de rh IL-6 (20 ng/ml) durante 30, 60, 90 y 120 minutos. Durante los últimos 5 minutos de incubación, se añadieron 0,5 nM, 1 nM y 5 nM de insulina para inducir la fosforilación de Akt. Las células se lisaron usando tampón de lisado RIPA modificado y la fosforilación Akt se midió usando ELISA Ser-Fosfo-Akt. Se obtuvieron resultados usando kits ELISA pAkt y Akt (BioSource). Pasados 60 minutos de tratamiento IL-6, en presencia de una concentración fisiológica de insulina (0,5-1 nM), se inhibió la fosforilación de Akt -50 % en comparación con el grupo de control. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA.
Efectos del anticuerpo IL-6
Se midió la capacidad del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 para inhibir los efectos de IL-6 sobre la fosforilación de Akt inducida por insulina. 20 pg/ml de anticuerpos de ingeniería humana anti-IL-6 pudieron inhibir los efectos de IL-6 en células HepG2. Las Figuras 8A y 8B muestran el efecto de IL-6 en presencia y ausencia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 sobre la fosforilación de Akt inducida por insulina.
En la imagen superior, (Figura 8A), los datos representan la media +/- SEM. (* Significativo en comparación (+) insulina, IL-6, P=0,029; ** Significativo en comparación con (+) insulina +IL-6, P= 0,02). Las células HepG2 sub- confluyentes se trataron con 20 ng/ml de IL-6 durante 60 minutos. Durante los últimos 5 minutos de tratamiento, se añadió 1 nM de insulina y las células se lisaron usando tampón RIPA modificado. Las muestras se analizaron por ELISA que detecta la fosforilación a Ser 473 de Akt. Todos los datos se normalizaron a Akt total medido por ELISA. El tratamiento AME-19a pudo restaurar la señalización de Akt normal.
En la imagen inferior (Figura 8B), se muestra un western blot representativo. Las bandas superiores incluyen muestras tratadas con IL-6 (20 ng/ml, 60 min, 5 min con 1 nM de insulina), AME-19a (20 ug/ml +/- IL-6 a 20 ng/ml durante 60 minutos, 5 minutos con 1 nM de insulina) o tampón. Se sondó el blot con anticuerpo anti-fosfo Ser/Akt (panel superior) (pS473, Biosource). Las bandas inferiores (el mismo blot se retiró y re-sondó con anti-Akt de Bio Source) demuestran que se cargó por cada carril una proteína equivalente.
Método: se cultivaron células HEPG2 en 100 mm de placas de cultivo de tejido hasta su confluencia. Las células se dejaron durante la noche en DMEM-1 % BSA. AME-19a (20 ug/ml) se incubó en células durante ~30 minutos antes de la adición de IL-6. IL-6 (20 ng/ml) +/- AME-19a (20 ug/ml) se incubaron durante ~30 minutos antes de la adición a las células. Las muestras se incubaron en células durante 60 minutos, a 37° C; a continuación se añadió 1 nM de insulina (concentración final) a las células durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Las células se lavaron inmediatamente con 3 enjuagues de PBS helado. Las placas se congelaron hasta el lisado. El Fosfo Akt y el Akt total se determinaron usando kits ELISA (BioSource y Sigma). Referencia: JJ Senn, PJ Kover, IA Nowak y RA Mooney. Interleukin 6 induces cellular insulin resistance in hepatocytes. Diabetes. [La interleuquina 6 induce la resistencia celular a la insulina en hepatocitos. Diabetes] 51:3391-3399, 2002.
Hepatocitos primarios en ratas
Los hepatocitos primarios representan un sistema in vitro más relevante adecuado para inspeccionar el efecto de IL-6 y anticuerpos anti-IL-6 (u otros antagonistas de IL-6) sobre la señalización de insulina y el efecto de la insulina sobre la producción de glucosa en hígado. Para determinar la activación de cinasa PI3 (PI3K) en hepatocitos de rata tratados con insulina, se trataron células aisladas IL-6 y/o IL-6 mAh con insulina en presencia y ausencia de 5 ng/ml IL-6 y la fosforilación del receptor de insulina, IRS-1 (Figura 12A), y Akt (Figura 12B) se determinaron usando ensayos ELISA y análisis Western blot. Además, se examinaron los efectos de IL-6 sobre asociación estimulada por insulina IRSl/p85 (Figuras 11A y B). Los experimentos se llevaron a cabo de la siguiente manera:
Se equilibraron hepatocitos primarios de rata (de ~2 meses) en 6 placas recubiertas con colágeno durante la noche en un medio de Hepatocima. El día siguiente, se mantuvieron las células durante 6 horas en un estreptococo DMEM-1 % BSA-penn; a continuación se incubaron con hIL-6 (5 ng/ml); anticuerpo anti-IL-6 (AME-19a) (20 ng/ml) o anticuerpo anti-IL-6 (AME-19a) +hIL-6 durante 90 minutos a 37° C. Las células se pretrataron durante 1 hora con anticuerpo anti-IL-6 (AME-19a) antes de añadir la combinación. La combinación también se preincubó antes de añadirla a las células. Se añadieron 5 nM de insulina (de BioSource) a las células durante 5 minutos; a continuación se aspiraron las células y se lisaron inmediatamente con tampón de extracción BioSource + inhibidores de proteasa. Los lisados se centrifugaron y los supernadantes se diluyeron 1:10 y se inspeccionaron en ELISAs (de Biosource).
Asociación IRSl/p85:
Se incubaron durante la noche cantidades equivalentes de proteína (45 pg) con 2 pg de anticuerpo policlonal anti-IRS-1 (de Upstate, Elemento #06-248). A continuación se inmunoprecipitaron las muestras con gotas de proteína A durante 1 hora y se eluyeron con 3x de tampón de muestra para sDS-PAGE. Las muestras IP se pusieron en 4-12 % de gel SDS-Page y a continuación se transfirieron a membrana para análisis por Western blot.
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Las membranas se sondaron con: (1) 1:100 dilución de p85 mAb (de Upstate, Elemento #05-217) para p85 asociado con IRS-1, por ejemplo, el PI3K activo (como se muestra en la FIG. 11 A); y (2) 1:600 de dilución de IRS-1 mAb (de BD Biosciences, Elemento #611395) para IRS-1 total como control de carga (como se ve en la FIG. 11B).
Los datos indican que el tratamiento IL-6 provoca una disminución de la fosforilación inducida por insulina de IR, IRS-1 y Akt. Este efecto de IL-6 se abolió cuando las el anticuerpo anti-IL-6 (clone AME-19a) penetró las células. Además, IL-6 inhibió la asociación de p85 (subunidades de PI3K) inducida por insulina con IRS-1. Again, this effect of IL-6 was inhibited by pretratamiento with anticuerpo anti-IL-6.
Experimentos in vivo
Los efectos de IL-6 sobre la sensibilidad a la insulina no se han experimentado ampliamente en animales. Para evaluar si la terapia anti-IL-6 mejoraría la sensibilidad a la insulina y T2Dm, se trataron ratones db/db y machos C57/B16 con dieta con altos niveles de grasa con anticuerpo comercial anti-ratón IL-6 (obtenido de R&D Systems).
Ratones db/db
Los efectos del tratamiento anti IL-6 se inspeccionan usando ratones db/db de diferentes edades. Los ratones entre 8-10 semanas de edad se caracterizan por hiperinsulinemia y resistencia a la insulina, representando los estadios iniciales de la enfermedad, mientras que los ratones de 12-14 semanas de edad se caracterizan por niveles de glucosa elevados, además de hiperinsulinemia, representando los estadios avanzados de T2DM. Ambos grupos de edad de los ratones se usan para investigar la capacidad de la terapia anti IL-6 para mejorar la sensibilidad a la insulina y el control glucémico en test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT).
Los ratones db/db tienen señalización de leptina no funcional debido a la mutación dentro del receptor de leptina. Estos ratones desarrollan obesidad, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina al envejecer los ratones, y los primeros síntomas se detectarían cuando los ratones tuviesen 6-8 semanas. Se trataron dos grupos de ratones de diferentes edades - 8 y 12 semanas - con 5 mg/kg de anti IL-6 mAb y se llevó a cabo un test de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT) un día y 7 días tras el tratamiento. El calendario de tratamiento se ve en la Figura 15.
En animales de 8 semanas de edad, el tratamiento con anti IL-6 mAb no tuvo efecto sobre la eliminación de glucosa durante GTT. El tratamiento anti IL-6 mAb provocó una mejora en la tolerancia a la glucosa (GT) en animales de 12 semanas de edad, aunque el efecto no fue significativo estadísticamente (p=0,063). Esta mejora en GTT se vio el día 7 tras el tratamiento. Además, se analizaron muestras de suero antes y después de completar el estudio para ver sus perfiles de adipocina y adiponectina. Los niveles de IL-6, TNFa y MCP-1 estaban por debajo de los niveles de detección. Estos datos, conjuntamente con los resultados de ipGTT podrían sugerir que: los animales db/db no son un buen modelo para el estudio de los efectos de anti IL-6 sobre la resistencia a la insulina; y los niveles de tejido IL-6 son más relevantes para un posible papel de IL-6 en el desarrollo de T2DM resistente a la insulina.
Obesidad inducida por la dieta (DIO) - Modelo animal para resistencia a la insulina y obesidad
Se alimentó a ratones macho C57/B1 con una dieta que incluye un 60 % de grasa durante 20-35 semanas. Desarrollaron obesidad (el peso corporal medio era de 50,5 gramos) y un aumento en los niveles de glucosa de en ayunas (FBG >145 mg/dl). Además, se deterioró su GT. Los animales DIO se trataron con 10 mg/kg de anti IL-6 Ab murino (R&D Systems). Globalmente, recibieron 50 mg/kg de anti IL-6 mAb durante 3 semanas. Se llevó a cabo ipGTT tras las 2 primeras dosis (día 5), tras la 4a dosis (días 12 y 16) y tras la 5a dosis (día 23). Al mismo tiempo, se obtuvo sangre para medir las adipocitoquinas y adiponectina.
El tratamiento anti IL-6 no mejoró los niveles de tolerancia de glucosa los días 5 y 12; pero cuando se llevó a cabo los días 16 y 23, se observó una mejora en la eliminación de glucosa así como en la excursión de niveles de glucosa. Esta mejora alcanzó significación estadística a 39, 60 y 90 minutes durante GTT.
En otro grupo de experimentos, se trató a animales DIO semanalmente (2 dosis durante la primera semana y 1 dosis cada semana durante las 4 semanas siguientes) con 10 y 20 mg/kg de anti IL-6 Ab y 20 mg/kg de IgG de control de isotipo vía ruta i.p. Se llevaron a cabo perfiles HOMA-IR (tras 2, 4 y 6 semanas de tratamiento), ipGTT, ipITT y adipocina (tras 6 semanas de tratamiento).
Análisis HOMA-IR sobre animales DIO tratados con anti-IL-6 Ab:
En estos estudios, hubo una disminución en los niveles de insulina y glucosa en ayunas en animales DIO tratados con 10 y 20 mg/kg de anti-IL-6 Ab murino y control de isotipo. Los animales se purgaron y los niveles de insulina y glucosa en ayunas se determinaron usando glucosa Trace/DMA (ox) (thermo Electron Corp) y ELISA de insulina de rata ultra sensible (Crystal Chem), respectivamente. Estos valores se usaron para determinar HOMA-IR. El índice HOMA-IR refleja el estado de la sensibilidad a la insulina y se correlaciona bien con las conclusiones del
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estudio de sujeción. HOMA-IR se calcula por medio de la fórmula: (glucosa en ayunas (mM) X Insulina en ayunas (mIU/Lit))/22,5 (Figuras 13 A, B y C).
Las mejoras en HOMA-IR se observaron tras 2, 4 y 6 semanas de tratamiento (las Figuras 13A-C muestran los datos tras 6 semanas de tratamiento). Al final del estudio, se llevaron a cabo ipGTT y ipITT. En ambos estudios, el tratamiento anti-IL-6 (20 mg/ml) mejoró de forma significativa la excursión y la eliminación de glucosa en comparación con animales tratados con el isotipo.
Los análisis de adipocina y citoquina de muestras de suero a partir de animales de control y tratados con anti-IL-6 indicaron que la neutralización de IL-6 provocó un descenso en los niveles de IL-6 circulante y TNFa junto con la tendencia de disminución de MCP-1 y niveles de resistina. En otro grupo de datos, los niveles de adiponectina aumentaron con el tratamiento anti-IL-6.
Se llevó a cabo el análisis histológico de muestras de hígado a partir de los grupos de tratamiento y control. Las muestras se tintaron con tinte Oil Red O para determinar el contenido lípido de las parénquimas del hígado. El contenido lípido del hígado en los animales DIO se redujo en respuesta al tratamiento con anticuerpo murino anti-IL- 6.
El tintado revela que el 34 % de las muestras de hígado tratadas con el vehículo estaban relacionadas con lípidos en animales no tratados y solo un 8 % en 20 mg/kg de animales tratados con anti-IL-6 (Figuras 14A-F). Las Figuras 14A y D representan el grupo de control; Las Figuras 14B y E representan los animales DIO no tratados; y las Figuras 14C y F representan los animales tratados con anti-IL-6. El aumento de contenido lípido en el hígado se ha asociado con el desarrollo de resistencia a la insulina y Diabetes Mellitus Tipo 2. Así, es posible que la neutralización de IL-6 provoque la mejora de la sensibilidad a la insulina y T2DM afectando al metabolismo lípido del hígado. Estos datos conjuntamente sugieren claramente el papel de IL-6 en la patología de la Diabetes Tipo 2 y que la neutralización de IL-6 podría mejorar la sensibilidad a la insulina.
Estudios adicionales
Se monitorizan los efectos de IL-6 en presencia o ausencia del anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 sobre la fosforilación IRS1 estimulada por insulina, asociación con p85/PI3K, receptores de insulina (IR) fosforilación, síntesis de glucógeno y la implicación de señalización SOCS3 y STAT en células HepG2. Otros experimentos adicionales examinan el efecto de IL-6 sobre la secreción de insulina inducida por glucosa a partir de islotes pancreáticos. Los datos publicados hasta la fecha describen tanto el efecto inhibitorio como estimulante de IL-6 sobre la secreción de insulina a partir de islotes de rata. Islotes de rata recientemente aislados (de Liefscann) se tratan con IL-6 y anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 (AME-19a) en presencia o ausencia de glucosa. Se miden los niveles de insulina segregados a partir de islotes en varios tratamientos.
C2C12. Las células C2C12 se usan para estudiar el efecto de la insulina sobre el músculo esquelético. Se llevan a cabo experimentos para examinar la expresión de IRS1 y Glut4, fosforilación IRS 1 inducida por insulina y los efectos de IL-6 sobre la acción de la adiponectina.
Ventajas:
La inhibición de la actividad de IL-6 por parte del anticuerpo IL-6 del presente invento podría representar un avance terapéutico significativo porque podrá mejorar la sensibilidad a la insulina y el control metabólico sin los efectos secundarios de los productos existentes. Además, las terapias actuales apenas controlan la inflamación sistémica, que se sugiere que podría ser la causa subyacente de T2DM, y complicaciones diabéticas asociadas. Una terapia como el anticuerpo IL-6 del presente invento, además del aumento de la sensibilidad a insulina, se esperaría que inhibiese la inflamación sistémica y evitase el desarrollo de complicaciones diabéticas.
El número de pacientes afectados por T2DM está aumentando y se estima que en 2025 llegará a 300 millones de individuos. Podría usarse un anticuerpo anti IL-6 como monoterapia o en combinación con otras OAD ya existentes, como sulfonilureas, biguanidas (por ejemplo, Metphormin), tiazolidinediones, meglitinida (por ejemplo, repaglinida), inhibidores de alfa-glucosidasa (por ejemplo, acarbosa). Además, podría usarse en combinación con insulina u otras terapias, para mejorar la sensibilidad a insulina y control glucémico y para evitar los casos de hipoglucemia asociados con el tratamiento por insulina. También se espera que además de la mejora de la sensibilidad a insulina y la regulación de los niveles de glucosa en T2D y pacientes de síndrome metabólico, la terapia anti IL-6 tuviera un efecto beneficioso sobre los cambios de CV que se observan con frecuencia en esos pacientes. Véase: Saltiel, AR, y Kahn, CR. 2001. Nature 414:799-806; Hansen, BC., 1995. Diabetes Care [Cuidado de la diabetes] 18:A2-A9; Diabetes Prevention Program research group [Grupo de investigación del programa de prevención de la diabetes]. 2002. New Engl. J Med., 346:393-403; Hansen, BC., 2000, Ann New York Academy of Science, 892:1-24; Hsueh, WA., y Quinones, MJ., 2003, Am. J. Cardiology [Cardiología], 93: 10J-17J; Resnick, HE and Howard, BV., 2002, Ann. Rev. Med., 53:245-267; Komer, J. and Aronne, L., 2003, J Clin. Invest., 111(5):565- 570; Skoog, T., et al., 2001. Diabetology [Diabetología], 44:654:655; Fernandez-Real, JM., y Ricart W., 2003, Endocrine Reviews, 24(3):278-301; Fernandez-Real, JM., et al., 2001, J Clin Endocrinol Metab., 86:1154-1159.; 10a.
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Fried, S., et al., 1998. J Clin Endocrinol Metab., 83:847-850; Senn, JJ., et al., 2002, Diabetes, 51:3391-3399; Rotter V., et al, 2003, JBC in press, Manus.#301977200; 12a. Stouthard, JM., et al., 1996, BBRC, 220:241-245; Southern C., et al., 1990, Biochem J., 272:243-245; Sandler, S., et al., 1990, Endocrinology [Endocrinología], 126:1288-1294 Pedersen, BK., et al., 2001, J Physiol., 536:329-337; DiCosmo, BF, et al., 1994, Int. Immunol., 6:1829-1837 Wallenius, V., et al., 2002, Nature Medicine, 8:75-79; Vozarova , B., et al., 2003, Human Genetic, 112:409-413 Kubaszek, A., et al., 2003, Diabetes, 52:558-461; Tsigos, C., et al., 1997, J Clin Endocrinol Metab, 82:4167-4170 Stoutharad, JM., et al., 1995, Am J Physiol., 268;E813-E819; Kern, PA., et al., 2001, Am J Physiol Endocrinol Metab. 280:E745-E751; Bastard, JP., et al., 2000, J Cion Endocrinol Metab., 85:3338-3342; and Bastard, JP., et al, 2002, J Clin. Endocrinol. Metab., 87:2084-2089.
TABLA 1 -CDRs de cadena ligera
N° DE ID DE SEC
Nombre CDR* Clon Secuencia
N° DE ID DE SEC:l
CDRLl 33 SASHSVSYMY
N° DE ID DE SEC:2
CDRL1 33 AGTGCCAGCCATAGTGTAAGTTACATGTAC
N° DE ID DE SEC: 3
CDRLl 34 SASISVSYMY
N° DE ID DE SEC:4
CDRLl 34 AGTGCCAGCAT TAGTGTAAGT TACATGTAC
N° DE ID DE SEC:5
CDRLl 35 SARSSVSYMY
N° DE ID DE SEC: 6
CDRLl 35 AGTGCCCGGTCAAGTGTAAGTTACATGTAC
N° DE ID DE SEC::7
CDRLl 36 SASYSVSYMY
N° DE ID DE SEC: 8
CDRLl 36 AGTGCCAGC TATAGT GTAAGT TACATGTAC
N° DE ID DE SEC:9
CDRLl 37 SASSSVFYMY
N° DE ID DE SEC: 10
CDRLl 37 AGTGCCAGCTCAAGT GTATTTTACATGTAC
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N° DE ID DE SEC
Nombre CDR* Clon Secuencia
N° DE ID DE SEC: 11
CDRLl 39 SGSSYVSYMY
N° DE ID DE SEC: 12
CDRL1 39 AGTGGCAGCTCATATGTAAGTTACATGTAC
N° DE ID DE SEC: 13
CDRLl 40 SALSSVSYMY
N° DE ID DE SEC: 14
CDRLl 40 AGTGCCCTGTCAAGTGTAAGTTACATGTAC
N° DE ID DE SEC: 15
CDRLl A9 SASSSVSYMY
N° DE ID DE SEC: 16
CDRLl A9 AGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTAC
N° DE ID DE SEC: 17
CDRL2 41 DFSNLAS
N° DE ID DE SEC: 18
CDRL2 41 GACTTTTCCAACCTGGCTTCT
N° DE ID DE SEC: 19
CDRL2 43 DLSNLAS
N° DE ID DE SEC:20
CDRL2 43 GACCTGTCCAACCTGGCTTCT
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N° DE ID DE SEC
Nombre CDR* Clon Secuencia
N° DE ID DE SEC:21
CDRL2 44 DMSNLAS
N° DE ID DE SEC: 22
CDRL2 44 GACATGTCCAACCTGGCTTCT
N° DE ID DE SEC:23
CDRL2 46 DTSNLTS
N° DE ID DE SEC:24
CDRL2 46 GACACATCCAACCTGACGTCT
N° DE ID DE SEC: 25
CDRL2 48 DTSELAS
N° DE ID DE SEC: 2 6
CDRL2 48 GACACATCCGAGCTGGCTTCT
N° DE ID DE SEC:27
CDRL2 A9 DTSNLAS
N° DE ID DE SEC:28
CDRL2 A9 GACACATCCAACCTGGCTTCT
N° DE ID DE SEC:29
CDRL3 49 MQWSGYPYT
N° DE ID DE SEC: 30
CDRL3 49 ATGCAGTGGAGTGGTTACCCATACACG
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N° DE ID DE SEC
Nombre CDR* Clon Secuencia
N° DE ID DE SEC: 31
CDRL3 50 CQWSGYPYT
N° DE ID DE SEC:32
CDRL3 50 TGTCAGTGGAGTGGTTACCCATACACG
N° DE ID DE SEC:33
CDRL3 52 SCWSGYPYT
N° DE ID DE SEC: 34
CDRL3 52 TCTGTGTGGAGTGGTTACCCATACACG
N° DE ID DE SEC: 3 5
CDRL3 A9 SQWSGYPYT
N° DE ID DE SEC:36
CDRL3 A9 TCTCAGTGGAGTGGTTACCCATACACG
N° DE ID DE SEC:138
CDRL3 Alt. QQWSGYPYT
*CDRs como los definidos por Kabat con la excepción del CDRH1, que es la suma de las definiciones de Rabat y Chothia.
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OV1 OVO 1101 OO 1V11 OVOOOOOlVl 1OV0
6Z ei-mao VQ :oas aa ai aa 0n
ACnVAlOMIO
6Z ei-mao 88 :oas aa ai aa 0n
OOVOVOIIOIOOIVIOVIOOOOOIVUOVO
QZ ei-mao Z8 :oas aa ai aa 0n
laiVAAOMIO
QZ ei-mao 1-8 :oas aa ai aa 0n
OVIOVOIIOIOOIVIOOIOOOOOIVUOVO
QZ ei-mao 08 :oas aa ai aa 0n
AaiVASOMIO
QZ ei-mao 6Z :oas aa ai aa 0n
OOOOOVOIOIOVO V01V01V10V100V00110V00010000010V11WW
(BZZ) □ + M + d ZHaao 8Z :oas aa ai aa 0n
OlAiaaAAlMSOOdSm
(BZZ) □ + M + d ZHaao zz :oas aa ai aa 0n
OOOOOVOIOIOVO VOIOIIVIOVIOOVOVIIOVOOOIOOOOOIOVIIWW
(b ez 'qoz) S + d ZHaao 9Z :oas aa ai aa 0n
OlAiaSAAlASOOdSm
(eez 'qoz) S + d ZHaao sz :oas aa ai aa 0n
epuanoas
uoio *aao ajqiuof\i oas aa ai aa «n
8U03-Z0-9U
Z99VQIV13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
N° DE ID DE SEC
Nombre CDR* Clon Secuencia
N° DE ID DE SEC: 87
CDRH3 31 QLWGYYALDF
N° DE ID DE SEC: 88
CDRH3 31 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTTT
N° DE ID DE SEC: 89
CDRH3 32 QLWGYYALDI
N° DE ID DE SEC:90
CDRH3 32 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACATT
N° DE ID DE SEC:91
CDRH3 A9 QLWGYYALDY
N° DE ID DE SEC:92
CDRH3 A9 CAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTAC
N° DE ID DE SEC: 114
CDRH3 Alt. GLWGYYALDY
*CDRs según la definición de Kabat con la excepción de CDRH1, que es la suma de las definiciones de Kabat y Chothia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
TABLA 3 - Mutaciones a partir de bibliotecas de CDR individual
Clon
CDRH1 Clon CDRL1
4
M34L 33 S27H
5
S31P 34 S27I
6
T28Q 35 S26R
8
F29T 36 S27Y
37 S30F
Clone
CDRH2 38 S27I
10
151A 39 A25G.S28Y
11
T57E 40 S26L
12
T57Y
14
Y56W Clone CDRL2
16
S52aP 41 T51F
17
Y59F 43 T51L
19
T64A 44 T51M
20
P60D 46 A55T
21
P60S 47 T51L
22
G65P 48 N53E
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
23
V63D
Clon CDRL3
Clon
CDRH3 49 Q89M
25
Y99S 50 Q89C
26
Y102T 52 Q90C
27
Y99S
29
Y99T
30
Y99N
31
Y102F
32
Y102I
TABLA 4 - Mutaciones incluidas en la biblioteca combinatoria
CDRH1
CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
T28Q
S52aP Y102F S27I T51F Q89M
S31P
Y56W Y102I S27Y T51M
P60S
V63D
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
TABLA 5A
Clones de biblioteca positiva
Ligero
Pesado
CDR~>
L1 L2 L3
H1
H2
WT~>CNT032B
S T Q T S ES Y P V
Clon
27 51 89 28 31 50 52a 56 60 63
AME-A9
S K
AME-16
S K P
AME-1 Ba AME-19a AME-20b AME-22a AME-23a
Y
Y
Q
Q
Q
Q
P
P
K
K
K
K
K
P
P
P
P
P
S
S
S
D
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
TABLA 5B - clones de anticuerpo de ingeniería humana anti-IL-6 y CDRs correspondientes
CDR-->
LI L2 L3 HI H2 H3
AME-A9
ID DE SEC: 15 ID DE SEC:27 ID DE SEC:35 ID DE SEC:47 ID DE SEC: 61 ID DE SEC:91
AME-16
ID DE SEC: 15 ID DE SEC:27 ID DE SEC: 3 5 ID DE SEC: 47 ID DE SEC:57 ID DE SEC:91
AME-18a
ID DE SEC: 15 ID DE SEC: 17 ID DE SEC:29 ID DE SEC:45 ID DE SEC:59 ID DE SEC: 89
AME-19a
ID DE SEC: 3 ID DE SEC:21 ID DE SEC: 29 ID DE SEC: 39 ID DE SEC: 59 ID DE SEC: 89
AME-20b
ID DE SEC: 3 ID DE SEC: 21 ID DE SEC:29 ID DE SEC:41 ID DE SEC:75 ID DE SEC: 89
AME-22a
ID DE SEC: 7 ID DE SEC: 17 ID DE SEC: 29 ID DE SEC:45 ID DE SEC: 77 ID DE SEC: 87
AME-23a
ID DE SEC: 7 ID DE SEC: 21 ID DE SEC: 29 ID DE SEC:41 ID DE SEC: 75 ID DE SEC: 87
Tabla 6 - Valores EC50
Clon
Valor de EC50
CNT0328
2,7 x 10-11 M
AME-19a
2,7 x 10-12 M (mejora en aumentos de 10)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
TABLA 7 - Constantes cinéticas para IgGs de Anti-IL-6
Tasa de mejora (en comparación con los ab quiméricos)
kon
(M-1
Sec-1)
Clon
Concentración de anticuerpos Kd
íeM_____________(eM
Tasa de mejora
koff (sec-1) (calculado)
Anticuerpos
numéricos
4,4 x 106
1,3 x 10-5
AME-16
0,83
3,6
1 x 106
0,22
8,3 x 10-7
AME-18a
0,5
0,12
25
2x 107
4,4
2,4 x 10-6
AME-19a
0,5
0,037
5,5 x 106
2 x 10-7
81,1
1,2
AME-20b
0,78
3,8
4,7 x 106
3,7 x 10-6
AME-22a
0,18
16,7
6 x 106
1,3
1,1 x 10-6
AME-23a
500
7,4 x 106
4,4 x 10-8
5
3
1
0,006
1JL
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 8 - Reactividad de cruce de especies de anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos
Especies Inhibición (Quiméricos y de ingeniería humana)
Humana +
Tití +
Cynomolgous +
Chimpancé +
Rhesus +
Babuino +
Cola de cerdo sureño +
Reacción cruzada
Cabeza blanca +
Desconocido
Conejo N/D
Perro -
Ratón -
Rata -
Cobaya -
No reactivas
Cerdo enano de Yucatán -
Reactividad de especies cruzadas del anticuerpo de ingeniería humana y quimérico. Los anticuerpos de ingeniería humana y quiméricos son capaces de neutralizar la proliferación de células 7TD1 estimuladas por supernadantes condicionados a partir de PBMCs de humanos, titís, mono cynomolgus, chimpancé, mono rhesus, babuino, mono cola de cerdo sureño y tití cabeza blanca. «+» positivo en ensayo de neutralización; «-» negativo en ensayo de neutralización; N/D, sin determinar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 9 - Impacto del tratamiento con anti-IL-6 mAb sobre patología renal en ratones NZB/W F1
Grupo de tratamiento
Grave* Moderado* Leve*
Salino (n=10)
60 % o 6/10 20 % o 2/10 20 % o 2/10
IgG de rata (n=10)
70 % o 7/10 30 % o 3/10 0 o 0/10
R&D IL-6anti-ratón (n=10)
10 % o 1/10 30 % o 3/10 60 % o 6/10
* Grave - Hiperplasia linfoide mixta perivascular, hipercelularidad mesangial, deposición proteica, deposición de complejo inmuno de membrana de base glomerular. Moderado - Hiperplasia linfoide mixta perivascular moderada, hipercelularidad mesangial moderada, deposición de complejo inmune de membrana de base glomerular, deposición no proteica. Leve - Hipercelularidad mesangial leve, deposición de complejo inmune de membrana de base glomerular, hiperplasia linfoide mixta no perivascular, deposición no proteica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 10 - Secuencias de región variable de clones
N° DE ID DE SEC
Clon Región V de Cadena Pesada (H) o ligera (L) Secuencia
93
A9 Cadena L AA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQW SGYPYTFGGGTKVEIK
94
Nucleótido de cadena L GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGA AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTAC ATGTACT GGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TGACACA TCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGG GACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT TTGCAG TTTATTACTGTTCTCAGTGGAGTGGTTACCCATACACGTTCGGC GGAGGG ACCAAGGTGGAGATCAAA
95
AA de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISSGGSYTYY PDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDYWGQGTTVTVSS
96
Nucleótido de cadena H GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCT TTGCCA TGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG TGGCCAAA ATTAGTAGTGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGACACTGTGAC GGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC AAATGA ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG ACAGTTA TGGGGGTACTATGCTCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGG TCACCGT CTCCTCA
97 19A AA de cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVS
5
YMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVEIK
98 Nucleótido GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC
10
de cadena L AGGGGA AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCATTAGTGTAAGTTACA TGTACT GGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TGACATG
15
TCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGG GACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT TTGCAG TTTATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATACACGTTCGGC
20
GGAGGG
25
99 AA de cadena H EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS PFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYY SDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS
30 35 40 45
100 Nucleótido de cadena H GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCCTT TTGCCA TGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG TGGCCAAA ATTAGTCCGGGTGGGAGTTGGACCTACTATTCTGACACTGTGAC GGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC AAATGA ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG ACAGTTA TGGGGGTACTATGCTCTTGACATTTGGGGCCAAGGGACCACGG TCACCGT CTCCTCA
101
23A AA de cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASYSVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW
50
SGYPYTFGGGTKVEIK
102 Nucleótido de cadena L GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGA
55
AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTATAGTGTAAGTTACA TGTACT GGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TGACATG TCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG
60
GGTCTGG GACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT TTGCAG TTTATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATACACGTTCGGC GGAGGG
65
ACCAAGGTGGAGATCAAA
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
103
AA de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSYTYY SDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDFWGQGTTVTVSS
104
Nucleótido de cadena H GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTTTAGTAGCT TTGCCA TGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGG TGGCCAAA ATTAGTCCGGGTGGGAGTTACACCTACTATTCTGACACTGTGAC GGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGC AAATGA ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG ACAGTTA TGGGGGTACTATGCTCTTGACTTTTGGGGCCAAGGGACCACGG TCACCGT CTCCTCA
116
AME-16 AA de cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQW SGYPYTFGGGTKVEIK
117
Nucleótido de cadena L ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC TCCCAGA TACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTG TCTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTCAAG TGTAAGT TACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC TCCTCAT CTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTC AGTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAA GATTTTGCAGTTTATTACTGTTCTCAGTGGAGTGGTTACCCATAC ACGTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
118
AA de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSYTYY PDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDYWGQGTTVTVSS
119
Nucleótido de cadena H ATGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA AGGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTT TAGTAGC TTTGCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTACACCTACTATCCTGAC ACTGTGA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ACAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACTACTGGGGCCAAGGG ACCACGG TCACCGTCTCCTCA
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
120
AME-18a AA de cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYDFSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVEIK
121
Nucleótido de cadena L ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC TCCCAGA TACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGT CTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTCAAG TGTAAGT TACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC TCCTCAT CTATGACTTCTCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCA GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA
122
AA de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS PFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYY SDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS
123
Nucleótido de cadena H ATGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA AGGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTT TAGTCCC TTTGCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTGGACCTACTATAGCGAC ACTGTGA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ACAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACATTTGGGGCCAAGGG ACCACGG TCACCGTCTCCTCA
124
AME-20b AA de cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVEIK
125
Nucleótido de cadena L ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC TCCCAGA TACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGT CTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCATTAG TGTAAGT TACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC TCCTCAT CTATGACATGTCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCA GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAA GATTTTGCAGTTTATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATA CACGTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
126
AA de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS SFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSYTYY SDTVTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS
127
Nucleótido de cadena H ATGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA AGGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTT TAGTAGC TTTGCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTACACCTACTATAGCGAC ACTGTGA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ACAGTTATGGGGGTACTATGCTCTTGACATTTGGGGCCAAGGG ACCACGG TCACCGTCTCCTCA
128
AME-22a AA de cadena L EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASYSVS YMYWYQQKPGQAPRLLIYDFSNLASGIPAR FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQW SGYPYTFGGGTKVEIK
129
Nucleótido de cadena L ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGC TCCCAGA TACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTG TCTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGCCAGCTACAG TGTAAGT TACATGTACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC TCCTCAT CTATGACTTCTCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCA GTGGCA GTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAA GATTTTGCAGTTTATTACTGTATGCAGTGGAGTGGTTACCCATA CACGTT CGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
130
AA de cadena H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS PFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYY PDTDTGRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCARQLWGYYALDFWGQGTTVTVSS
131
Nucleótido de cadena H ATGGAGTTTGGCCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGA AGGTGT CCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT CCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCAGTT TAGTCCC TTTGCCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGT GGCCAAAATTAGTCCCGGTGGGAGTTGGACCTACTATCCTGAC ACTGACA CGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACT GTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACT GTGCGAG ACAGTTATGGGGGTACTATGCTCTT GACTTCTGGGGCCAAGGG ACCACGG TCACCGTCTCCTCA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 11 - Secuencia de aminoácido de una región marco de L6 de cadena ligera humana con secuencias CDR etiquetadas intercaladas
(FRLl - N° DE ID DE SEC: 105) CDRL1 (FRL2 - N° DE ID DE SEC: 106)
CDRL2
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCXXXXXXXXXXWYQQKPGQAPRLLIYXXXXXXX
(FRL3 - N° DE ID DE SEC: 107) CDRL3 (FRL4 - N° DE ID DE SEC: 108)
GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCXXXXXXXXXFGGGTKVEIK
Tabla 12 - Secuencia de aminoácidos de una región marco de VH3-3 de pesada con secuencias CDR etiquetadas intercaladas
(FRHl - N° DE ID DE SEC: 109) CDRH1 (FRH2 - N° DE ID DE SEC: 110)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASXXXXXXXXXXWVRQAPGKGLEWVA
CDRH2 (FRH3 - N° DE ID DE SEC: 111)
XXXXXXXXXXXXXXXXXRFTISRADNKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
CDRH3 (FRH4 - N° DE ID DE SEC: 112)
XXXXXXXXXXW GQGTTVTVSS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 13 - Secuencias CDR
N° DE ID DE SEC
CDR Secuencia AA*
132
CDRL1 SX1X2X3X4VX5YMY
133
CDRL2 DX6SX7LX8S
134
CDRL3 X9X10WSGYPYT
135
CDRH1 GFX11X12SX13FAX14S
136
CDRH2 KX1 sSX16GGSX17X1aYX19X20DTX21 X22X23
137
CDRH3 QLWGX24 YALDX25
*X indica cualquier aminoácido adecuado con sustituciones de aminoácidos no ejemplo que se muestran en las secuencias presentadas en N° DE ID DE SEC: y en las Tablas 3, 4, 5A y 8. Además, X puede tener los siguientes valores: XI = A o G X2 = S o R Xa = H, I, S, o Y X4 = S o Y X5 = S o F Xa = F, L, M, o T X7 = N o E Xa = A o T X9 = M, C, o S X10 = Q o C XII = T or Q X12 = F, S, o T X13 = S o P X14 = L o M X15 = A o I X16 = S o P X17 = Y o W X18 = T, E, o Y X19 = Y o F X20 = P, S, D, o F X21 = V o D X22 = T o A X23 = G o P X24 = S, Y, T, o N X25 = Y, T, F, o I
limitativas y a modo de 1-92 de las Tablas 1 y 2
N° DE ID DE SEC:115 -SECUENCIA DE AMINOACIDO DE LA PROTEINA IL-6
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQ IRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCL VKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPD PTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Janssen Biotech, Inc. Applied Molecular Evolution, Inc.
<120> Anticuerpos Anti-IL-6, Composiciones, Métodos y Usos
<130> P064453EP
<140> PCT/US2006/016457 <141> 2006-04-28
<150> 60/676,498 <151> 2005-04-29
<150> 60/677,319 <151> 2005-05-03
<160> 138
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Ala Ser His Ser Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
<210>2 <211> 30 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400>2
agtgccagcc atagtgtaag ttacatgtac 30
<210>3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400>3
Ser Ala Ser lie Ser Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
<210>4 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400>4
agtgccagca ttagtgtaag ttacatgtac 30
<210>5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400>5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
<210>6 <211> 30 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400>6
agtgcccggt caagtgtaag ttacatgtac 30
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<400> 7
Ser Ala Ser Tyr Ser Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
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<400>8
agtgccagct atagtgtaag ttacatgtac 30
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<400> 9
Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met Tyr 15 10
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<400> 10
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<400> 11
Ser Gly Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
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<400> 12
agtggcagct catatgtaag ttacatgtac 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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<400> 13
Ser Ala Leu Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
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<400> 14
agtgccctgt caagtgtaag ttacatgtac 30
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<400> 15
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 15 10
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<400> 16
agtgccagct caagtgtaag ttacatgtac 30
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<400> 17
Asp Phe Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
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<400> 18
gacttttcca acctggcttc t 21
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<400> 19
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 21
<212>ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20
gacctgtcca acctggcttc t 21
<210> 21 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 21
Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
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<400> 22
gacatgtcca acctggcttc t 21
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<400> 23
Asp Thr Ser Asn Leu Thr Ser 1 5
<210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 24
gacacatcca acctgacgtc t 21
<210> 25 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 25
Asp Thr Ser Glu Leu Ala Ser 1 5
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<400> 26
gacacatccg agctggcttc t 21
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 27
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 28 <211> 21 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 28
gacacatcca acctggcttc t 21
<210> 29 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 29
Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
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<400> 30
atgcagtgga gtggttaccc atacacg 27
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<400> 31
Cys Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
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<400> 32
tgtcagtgga gtggttaccc atacacg 27
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<400> 33
Ser Cys Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 34 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 34
tctgtgtgga gtggttaccc atacacg 27
<210> 35 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 35
Ser Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 36 <211> 27 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 36
tctcagtgga gtggttaccc atacacg 27
<210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 37
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Leu Ser 15 10
<210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 38
ggattcacct ttagtagctt tgccctttct 30
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<400> 39
Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser 15 10
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<400> 40
ggattcacct ttagtccttt tgccatgtct 30
<210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gly Phe Gln Phe Ser Ser Phe Ala Met Ser 15 10
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<400> 42
ggattccagt ttagtagctt tgccatgtct 30
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<400> 43
Gly Phe Thr Thr Ser Ser Phe Ala Met Ser 15 10
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<400> 44
ggattcacca ctagtagctt tgccatgtct 30
<210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 45
Gly Phe Gln Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser 15 10
<210> 46 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 46
ggattccagt ttagtccttt tgccatgtct 30
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<400> 47
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Ser 15 10
<210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 48
ggattcacct ttagtagctt tgccatgtct 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 49
Lys Ala Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 50 <211> 51 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 50
aaagcgagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 51
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Glu Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 52 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 52
aaaattagta gtggtgggag ttacgagtac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 53
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr
15 10 15
Gly
<210> 54 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 54
aaaattagta gtggtgggag ttactattac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 55
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 56 <211> 51 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 56
aaaattagta gtggtgggag ttggacctac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 57
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 58 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 58
aaaattagtc cgggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 59
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 60 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 60
aaaattagtc cgggtgggag ttggacctac tattctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 61
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 62
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 51
<212>ADN
<213> Homo sapiens
<400> 62
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 63
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Phe Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 64 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 64
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tttcctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 65
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Ala 15 10 15
Gly
<210> 66 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 66
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtggctgg c 51
<210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asp Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 68 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 68
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatgatgaca ctgtgacggg c 51
<210> 69 <211> 17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 69
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 70 <211> 51 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 70
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tattctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 71
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Pro
<210> 72 <211> 51 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 72
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacgcc g 51
<210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 73
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Asp Thr 15 10 15
Gly
<210> 74 <211> 51 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 74
aaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgatacggg c 51
<210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 76 <211> 51 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 76
aaaattagtc cgggtgggag ttacacctac tattctgaca ctgtgacggg c 51
<210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 77
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Asp Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
<210> 78 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 78
aaaattagtc cgggtgggag ttggacctac tatgatgaca ctgtgacggg c 51
<210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 79
Gln Leu Trp Gly Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr 15 10
<210> 80 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 80
cagttatggg ggtcgtatgc tcttgactac 30
<210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 81
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Thr 15 10
<210> 82 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 82
cagttatggg ggtactatgc tcttgacacg 30
<210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 83
Gln Leu Trp Gly Thr Tyr Ala Leu Asp 1 5
Tyr
10
<210> 84 <211> 30 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 84
cagttatggg ggacttatgc tcttgactac 30
<210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 85
Gln Leu Trp Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Tyr 15 10
<210> 86 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 86
cagttatggg ggaattatgc tcttgactac 30
<210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 87
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe 15 10
<210> 88 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 88
cagttatggg ggtactatgc tcttgacttt 30
<210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 89
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp lie 15 10
<210> 90 <211> 30 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 90
cagttatggg ggtactatgc tcttgacatt 30
<210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 91
Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 15 10
<210> 92 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 92
cagttatggg ggtactatgc tcttgactac 30
<210> 93 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 93
Glu
lie Val Leu
1
Glu
Arg Ala Thr 20
Tyr
Trp Tyr 35 Gln
Asp
Thr 50 Ser Asn
Gly
Ser Gly Thr
65
Asp
Phe Ala Val
Phe
Gly Gly Gly 100

Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15

Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 25 30

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr 40 45

Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ser Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95
Thr Lys Val Glu lie Lys 105
<210> 94 <211> 318 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccaaca gaaacctggc 120

caggctccca ggctcctcat ctatgacaca tccaacctgg cttctggcat cccagccagg 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 240

gattttgcag tttattactg ttctcagtgg agtggttacc catacacgtt cggcggaggg 300

accaaggtgg agatcaaa 318
<210> 95 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 95
Glu
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5 10 15
Ser
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala
Lys lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65
70 75 80
Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr
Thr
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96 <211> 357 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 96
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctttgcca tgtcttgggt ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaaa attagtagtg gtgggagtta cctgacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc tgggggtact atgctcttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt
cctgagactc 60 ccgccaggct 120 cacctactat 180 ctcactgtat 240 gagacagtta 300 ctcctca 357
<210> 97 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 97
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser lie Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie
Tyr
35 40 45
Asp
Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65
70 75 80
Asp
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 98 <211> 318 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 98
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctctcctgca gtgccagcat tagtgtaagt caggctccca ggctcctcat ctatgacatg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc gattttgcag tttattactg tatgcagtgg accaaggtgg agatcaaa
ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 tacatgtact ggtaccaaca gaaacctggc 120 tccaacctgg cttctggcat cccagccagg 180 actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 240 agtggttacc catacacgtt cggcggaggg 300
318
<210> 99 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 99
Glu 1
Val Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15 Gly
Ser
Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Pro Phe
Ala
Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ala
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
Thr
50 Gly Arg Phe Thr lie 55 Ser Arg Asp Asn Ala 60 Lys Asn Ser Leu Tyr
65 Leu
Gln Met Asn Ser 70 Leu Arg Ala Glu Asp 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 80 Cys
Ala
Arg Gln Leu 85 Trp Gly Tyr Tyr Ala 90 Leu Asp lie Trp Gly 95 Gln Gly
Thr
Thr
Val 115 100 Thr Val Ser Ser 105 110
<210> 100 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
gaggtgcagc tggtggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagggaagg ggctggagtg tctgacactg tgacgggccg ctgcaaatga acagcctgag tgggggtact atgctcttga
<210> 101 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 101
tgggggaggc ttggtccagc cacctttagt ccttttgcca ggtggccaaa attagtccgg attcaccatc tccagagaca agccgaggac acggctgtgt catttggggc caagggacca
ctggggggtc cctgagactc 60 tgtcttgggt ccgccaggct 120 gtgggagttg gacctactat 180 acgccaagaa ctcactgtat 240 attactgtgc gagacagtta 300 cggtcaccgt ctcctca 357
Glu
lie Val Leu
1
Glu
Arg Ala Thr 20
Tyr
Trp Tyr 35 Gln
Asp
Met 50 Ser Asn
Gly
Ser Gly Thr
65
Asp
Phe Ala Val
Phe
Gly Gly Gly 100
Thr
Gln Ser Pro
5
Leu
Ser Cys Ser
Gln
Lys Pro Gly
Leu
Ala Ser 40 Gly
Asp
Phe 55 Thr Leu
Tyr
70 Tyr Cys Met
85
Thr
Lys Val Glu
Ala
Thr 10 Leu Ser
Ala 25
Ser Tyr Ser
Gln
Ala Pro Arg
lie
Pro Ala Arg 60
Thr
lie Ser 75 Ser
Gln lie 105
Trp 90 Lys Ser Gly
Leu
Ser Pro 15 Gly
Val
Ser 30 Tyr Met
Leu 45
Leu lie Tyr
Phe
Ser Gly Ser
Leu
Glu Pro Glu 80
Tyr
Pro Tyr 95 Thr
<210> 102 <211> 318 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 102
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga ctctcctgca gtgccagcta tagtgtaagt tacatgtact ggtaccaaca caggctccca ggctcctcat ctatgacatg tccaacctgg cttctggcat ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct gattttgcag tttattactg tatgcagtgg agtggttacc catacacgtt accaaggtgg agatcaaa
aagagccacc
gaaacctggc
cccagccagg
agagcctgaa
cggcggaggg
60
120
180
240
300
318
<210> 103 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 103
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5 10 15
Ser
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65
70 75 80
Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr
Thr
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 104 <211> 357 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 104
gaggtgcagc tggtggagtc tcctgtgcag cctctggatt ccagggaagg ggctggagtg tctgacactg tgacgggccg ctgcaaatga acagcctgag tgggggtact atgctcttga
tgggggaggc ttggtccagc ccagtttagt agctttgcca ggtggccaaa attagtccgg attcaccatc tccagagaca agccgaggac acggctgtgt cttttggggc caagggacca
ctggggggtc cctgagactc tgtcttgggt ccgccaggct gtgggagtta cacctactat acgccaagaa ctcactgtat attactgtgc gagacagtta cggtcaccgt ctcctca
60
120
180
240
300
357
<210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 105
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20
<210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 106
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr 15 10 15
<210> 107 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
15 10 15
Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 108
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 15 10
<210> 109 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 110 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 110
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 15 10
<210> 111 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 111
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30
<210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 112
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 113 <211> 17 <212> PRT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213>
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
Homo sapiens
113
Glu lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr 15 10 15
Gly
114 10 PRT
Homo sapiens 114
Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp 1 5
Tyr
10
115
212
PRT
Homo sapiens 115
Met 1
Asn Ser Phe Ser 5 Thr Ser
Gly
Leu Leu Leu 20 Val Leu Pro
Gly
Glu Asp 35 Ser Lys Asp Val
Ser
Ser 50 Glu Arg lie Asp Lys 55
Ser 65
Ala Leu Arg Lys Glu 70 Thr
Ser
Lys Glu Ala Leu 85 Ala Glu
Glu
Lys Asp Gly 100 Cys Phe Gln
Val
Lys lie 115 lie Thr Gly Leu
Leu
Gln 130 Asn Arg Phe Glu Ser 135
Met 145
Ser Thr Lys Val Leu 150 lie
Leu
Asp Ala lie Thr 165 Thr Pro
Thr
Lys Leu Gln 180 Ala Gln Asn
Leu Leu
lie Arg 210 Leu 195 Gln Arg Met Ser Phe Lys
116
106
PRT
Homo sapiens
Ala
Phe Gly 10 Pro Val Ala Phe Ser 15 Leu
Ala
Ala 25 Phe Pro Ala Pro Val 30 Pro Pro
Ala 40
Ala Pro His Arg Gln 45 Pro Leu Thr
Gln
lie Arg Tyr lie 60 Leu Asp Gly lie
Cys
Asn Lys Ser 75 Asn Met Cys Glu Ser 80
Asn
Asn
Leu 90 Asn Leu Pro Lys Met 95 Ala
Ser
Gly 105 Phe Asn Glu Glu Thr 110 Cys Leu
Leu 120
Glu Phe Glu Val Tyr 125 Leu Glu Tyr
Ser
Glu Glu Gln Ala 140 Arg Ala Val Gln
Gln
Phe Leu Gln 155 Lys Lys Ala Lys Asn 160
Asp
Pro Thr 170 Thr Asn Ala Ser Leu 175 Leu
Gln
Trp 185 Leu Gln Asp Met Thr 190 Thr His
Glu 200
Phe Leu Gln Ser Ser 205 Leu Arg Ala
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 1 5
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie
Tyr
35 40 45
Asp
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65
70 75 80
Asp
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 117 <211> 378 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 117

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccaaca gaaacctggc 180

caggctccca ggctcctcat ctatgacaca tccaacctgg cttctggcat cccagccagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 300

gattttgcag tttattactg ttctcagtgg agtggttacc catacacgtt cggcggaggg 360

accaaggtgg agatcaaa 378
<210> 118 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 118
Glu
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5 10 15
Ser
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65
70 75 80
Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr
Thr
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 119 <211> 414 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

atggagtttg gcctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac ctttagtagc tttgccatgt cttgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ggccaaaatt agtcccggtg ggagttacac ctactatcct 240

gacactgtga cgggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag acagttatgg 360

gggtactatg ctcttgacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 414
<210> 120 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 120
Glu
lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie
Tyr
35 40 45
Asp
Phe Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65
70 75 80
Asp
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 121 <211> 378 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 121

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccaaca gaaacctggc 180

caggctccca ggctcctcat ctatgacttc tccaacctgg cttctggcat cccagccagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 300

gattttgcag tttattactg tatgcagtgg agtggttacc catacacgtt cggcggaggg 360

accaaggtgg agatcaaa 378
<210> 122 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 122
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5 10 15
Ser
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65
70 75 80
Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp lie Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr
Thr
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 123 <211> 414 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 123

atggagtttg gcctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcca gtttagtccc tttgccatgt cttgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ggccaaaatt agtcccggtg ggagttggac ctactatagc 240

gacactgtga cgggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 300

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag acagttatgg 360

gggtactatg ctcttgacat ttggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 414
<210> 124 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 124
Glu
lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser lie Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie
Tyr
35 40 45
Asp
Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65
70 75 80
Asp
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 125 <211> 378 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
atggaagccc
gaaattgtgt
ctctcctgca
caggctccca
ttcagtggca
gattttgcag
accaaggtgg
<210> 126 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 126
Glu Val 1
Ser Leu Ala Met
Ala Lys 50
Thr Gly 65
Leu Gln Ala Arg Thr Thr
<210> 127 <211> 414 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 127
atggagtttg
gtgcagctgg
tgtgcagcct
gggaaggggc
gacactgtga
caaatgaaca
gggtactatg
cagcgcagct
tgacacagtc
gtgccagcat
ggctcctcat
gtgggtctgg
tttattactg
agatcaaa
tctcttcctc
tccagccacc
tagtgtaagt
ctatgacatg
gacagacttc
tatgcagtgg
ctgctactct
ctgtctttgt
tacatgtact
tccaacctgg
actctcacca
agtggttacc
ggctcccaga
ctccagggga
ggtaccaaca
cttctggcat
tcagcagcct
catacacgtt

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 5 10

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe 20 25
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

lie Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser 55 60

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 70 75

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90

Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp lie Trp 100 105
Val Thr Val Ser Ser 115
gcctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct ctggattcca gtttagtagc tttgccatgt cttgggtccg tggagtgggt ggccaaaatt agtcccggtg ggagttacac cgggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag ctcttgacat ttggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc
taccaccgga 60 aagagccacc 120 gaaacctggc 180 cccagccagg 240 agagcctgaa 300 cggcggaggg 360 378
Pro Gly Gly 15
Ser Ser Phe 30
Glu Trp Val
Asp Thr Val
Ser Leu Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Gly Gln Gly 110
ccagtgtgag 60 gagactctcc 120 ccaggct cea 180 ctactatagc 240 actgtatctg 300 acagttatgg 360 ctca 414
<210> 128 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 128
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Glu
lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1
5 10 15
Glu
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Tyr Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie
Tyr
35 40 45
Asp
Phe Ser Asn Leu Ala Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65
70 75 80
Asp
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 129 <211> 378 <212>ADN <213> Homo sapiens
<400> 129

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120

ctctcctgca gtgccagcta cagtgtaagt tacatgtact ggtaccaaca gaaacctggc 180

caggctccca ggctcctcat ctatgacttc tccaacctgg cttctggcat cccagccagg 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 300

gattttgcag tttattactg tatgcagtgg agtggttacc catacacgtt cggcggaggg 360

accaaggtgg agatcaaa 378
<210> 130 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 130
Glu
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1
5 10 15
Ser
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Pro Phe
20 25 30
Ala
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala
Lys lie Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Asp
50 55 60
Thr
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65
70 75 80
Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala
Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr
Thr
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131 <211> 414 <212> ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
atggagtttg
gtgcagctgg
tgtgcagcct
gggaaggggc
gacactgaca
caaatgaaca
gggtactatg
gcctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60 tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120 ctggattcca gtttagtccc tttgccatgt cttgggtccg ccaggctcca 180 tggagtgggt ggccaaaatt agtcccggtg ggagttggac ctactatcct 240 cgggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag acagttatgg 360 ctcttgactt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 414
<210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> sin determinar <222> (2) (3) (4) (5) (7)
<223> En donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural. <400> 132
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Tyr Met Tyr 15 10
<210> 133 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> sin determinar <222> (2) (4) (6)
<223> En donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural. <400> 133
Asp Xaa Ser Xaa Leu Xaa Ser 1 5
<210> 134 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> sin determinar <222> (1)(2)
<223> En donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural. <400> 134
Xaa Xaa Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> sin determinar <222> (3) (4) (6) (9)
<223> En donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural. <400> 135
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35
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60
65
Gly Phe Xaa Xaa Ser Xaa Phe Ala Xaa Ser 15 10
<210> 136 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> sin determinar
<222> (2) (4) (8) (9) (11) (12) (15) (16) (17)
<223> En donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural.
<400> 136
Lys Xaa Ser Xaa Gly Gly Ser Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Asp Thr Xaa Xaa 15 10 15
Xaa
<210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> sin determinar <222> (5) (10)
<223> En donde Xaa puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural.
<400> 137
Gln Leu Trp Gly Xaa Tyr Ala Leu Asp Xaa 15 10
<210> 138 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 138
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5
28

Claims (13)

  1. 5
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    15
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    65
    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo anti IL-6 aislado, con regiones marco y constantes completamente humanas, que comprende:
    (i) una región variable de cadena ligera, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región determinante de la complementariedad 1 (CDRL1) de la SEC ID N°:3, una secuencia de aminoácidos de la CDRL2 de la SEC ID N°:21, una secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región determinante de la complementariedad 1 (CDRH1) de la SEC ID N°:39, una secuencia de aminoácidos de la CDRH2 de la SEC ID N°:59, y una secuencia de aminoácidos de la CDRH3 de la SEC ID N°:89; o
    (ii) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:3, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:21, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:41, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:75, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:89; o
    (iii) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:15, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:27, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:35, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:47, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:57, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:91; o
    (iv) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:15, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:17, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:45, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:59, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:89; o
    (v) una región variable de cadena ligera, en la que la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:7, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de la de la SEC ID N°:21, la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:29, y una región variable de la cadena pesada en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:41, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:75, y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°:87;
    en donde dicho anticuerpo se une a IL-6 humana o un fragmento de la misma con una afinidad de 0,1-9,9 x 10-14 como se determina mediante el método Kinexa™.
  2. 2. El anticuerpo anti IL-6 de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las regiones marco son marcos de humanos de la línea germinal.
  3. 3. El anticuerpo anti IL-6 de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 1-2, en donde dicho anticuerpo modula al menos una actividad de un polipéptido de IL-6
  4. 4. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica al menso un anticuerpo anti IL-6 aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  5. 5. Un vector de ácido nucleico aislado que comprende la molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 4.
  6. 6. Una célula hospedadora procariota o eucariota que comprende la molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 4, opcionalmente en donde dicha célula hospedadora es al menos una seleccionada de COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, o células de linfoma.
  7. 7. Un método para producir al menos un anticuerpo anti IL-6, que comprende traducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 en condiciones in vitro, in vivo, o in situ, de tal manera que el anticuerpo anti IL-6 se expresa en cantidades detectables o recuperables, en donde el anticuerpo se produce en una célula animal no humana o procariota o eucariota.
  8. 8. Una composición que comprende al menos un anticuerpo anti IL-6 aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y al menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, comprendiendo opcionalmente además al menos un compuesto o polipéptido seleccionado de un marcador o indicador detectable, un antagonista de TNF, un fármaco anti-infeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV), un fármaco del sistema nervioso central (SNC), un fármaco del sistema nervioso autónomo (SNA), un fármaco del tracto
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    65
    respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (GI), un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluidos o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco inmunomodulador, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nutricional, una citoquina y un antagonista de citoquina.
  9. 9. Una composición que comprende al menos un anticuerpo anti IL-6 aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en terapia.
  10. 10. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en un método para diagnosticar una afección relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano o animal, en donde la afección relacionada con IL-6 se selecciona del grupo que consiste de obesidad, una enfermedad relacionada con el sistema inmune, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, o una enfermedad maligna y una enfermedad neurológica.
  11. 11. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en un método para tratar una afección relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano o animal, en donde la afección relacionada con IL-6 se selecciona del grupo que consiste de obesidad, una enfermedad relacionada con el sistema inmune, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, o una enfermedad maligna y una enfermedad neurológica.
  12. 12. El anticuerpo y su uso de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde
    (i) la afección relacionada con IL-6 se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, osteoartritis, osteólisis, aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, nefritis lúpica, diabetes melitus tipo 2, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y carcinoma de células renales; o
    (ii) el anticuerpo es adecuado para su administración en una cantidad eficaz de aproximadamente 0,1-100 mg/kilogramo de dicho animal; o
    (iii) el anticuerpo es adecuado para su administración por al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardiaco, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmico; o
    (iv) el anticuerpo es adecuado para su administración antes, concurrentemente o después de al menos una
    composición que comprende una cantidad eficaz de al menos un compuesto o polipéptido seleccionado de un de un marcador o indicador detectable, un fármaco anti-infeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV), un fármaco del sistema nervioso central (SNC), un fármaco del sistema nervioso autónomo (SNA), un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (GI), un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluidos o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco
    inmunomodulador, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nutricional, una citoquina y un antagonista de citoquina.
  13. 13. Un artículo de fabricación adecuado para uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material
    envasado y un recipiente que comprende una solución o una forma liofilizada de un anticuerpo anti IL-6 de acuerdo
    con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente en donde dicho recipiente es un componente de un dispositivo o sistema de administración parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular,
    intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico.
    FIG 1
    imagen1
    -s- CNTO 328 CNT0136
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