DE60007306T2 - Verwendung von mikrofluidischen systemen zur elektrochemischen detektion von zielanalyten - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von Analysen, insbesondere Mikrofluidikvorrichtungen zum Detektieren von Zielanalyten.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es bestehen einige Tests und Sensoren für die Detektion der Gegenwart und/oder Konzentration spezifischer Substanzen in Flüssigkeiten und Gasen. Viele davon beruhen auf spezifischen Liganden/Antiliganden-Reaktionen als Detektionsmechanismus. Es ist bekannt, dass sich Substanzpaare (d.h. die Bindungspaare oder Liganden/Antiliganden) aneinander binden, während sie sich in geringem Ausmaß oder überhaupt nicht an andere Substanzen binden. Darauf basieren einige Techniken, die sich dieser Bindungspaare zwecks Detektierens der Komplexe bedienen. Sie erfolgen im Allgemeinen, indem eine Komponente des Komplexes in einer bestimmten Weise markiert wird, um den gesamten Komplex detektierbar zu machen; dies erfolgt z.B. unter Anwendung von Radioisotopen, fluoreszierenden und anderen optisch aktiven Molekülen, Enzymen usw.
  • Es besteht eine deutliche Tendenz in Richtung Verkleinerung bzw. Miniaturisierung dieser Sensoren, um damit sowohl die Sensitivität zu verbessern als auch die Reagenskosten zu senken. Es wurden einige Mikrofluidikvorrichtungen entwickelt, die im Allgemeinen einen festen Träger mit Mikrokanälen umfassen, wobei sie diverse Kammern, Pumpen, Reaktionskammern u.dgl. verwenden. Siehe z.B. EP 0637996 B1 ; EP 0637998 B1 ; WO 96/39260; WO 97/16835; WO 98/13683; WO 97/16561; WO 97/43629; WO 96/39252; WO 96/15576; WO 96/15450; WO 97/37755 und WO 97/27324; sowie die US-Patente 5.304.487; 5.071.531; 5.061.336; 5.747.169; 5.296.375; 5.110.745; 5.587.128; 5.498.392; 5.643.738; 5.750.015; 5.726.026; 5.635.358; 5.126.022; 5.770.029; 5.631.337; 5.569.364; 5.135.627; 5.632.876; 5.593.838; 5.585.069; 5.637.469; 5.486.335; 5.755.942; 5.681.484; und 5.603.351.
  • US-Patent 5.856.174 offenbart eine integrierte Vorrichtung mit einer Reihe von Elektroden für die elektrophoretische Bewegung von Nucleinsäureproben. Die Nucleinsäure wird optisch mittels Laser detektiert, um fluoreszierende Marker zu aktivieren; Arrays werden mittels CCD oder einem konfokalen Mikroskop abgebildet.
  • WO 98/31839 offenbart ein Verfahren zum Detektieren von Nucleinsäure unter Verwendung selbstassemblierter Monoschichten, wobei die Nucleinsäure mittels einer Veränderung der Impedanz detektiert wird, die mit einer durch die Nucleinsäure angesprochenen elektronischen Schaltung assoziiert ist.
  • WO 98/12539 offenbart eine Multi-Bereich-Konfiguration zur Verwendung im diagnostischen Bereich, wobei hier Chemilumineszenz eingesetzt wird, um Analyten von Interesse zu detektieren.
  • Es besteht jedoch die Notwendigkeit, einen Mikrofluidikbiosensor zu entwickeln, der die Analyten elektronisch detektieren kann.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 zeigt einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. 1A stellt einen festen Träger 5 dar, der eine Probeneinlassöffnung 10, einen ersten Mikrokanal 15 und ein Speichermodul 25 (z.B. für Testreagenzien) mit einem zweiten Mikrokanal 20 besitzt. Der zweite Mikrokanal (20B) kann in direktem Flüssigkeitskontakt mit dem eine Detektionselektrode 35 umfassenden Detektionsmodul 30 oder (20A) in Kontakt mit dem ersten Mikrokanal 15 stehen. 1B zeigt eine Probenhandhabungskammer 40 und eine zweite Speicherkammer 25A mit einem Mikrokanal 20 zur Probenhandhabungskammer 40. Beispielsweise könnte die Probenhandhabungskammer 40 eine Zelllysekammer sein, und die Speicherkammer 25A könnte Lysereagenzien enthalten. 1C veranschaulicht eine Probenhandhabungskammer 40, die eine Zelleinfangkammer oder -anreicherungskammer ist, wobei eine zusätzliche Reagenzspeicherkammer 25B für Elutionspuffer vorgesehen ist. 1D zeigt die Hinzufügung eines Reaktionsmoduls 45 mit einem Speichermodul 25C, z.B. zur Speicherung von Amplifikationsreagenzien. Das gegebenenfalls vorhandene Entsorgungs modul 26 ist über einen Mikrokanal 27 mit dem Reaktionsmodul 45 verbunden. Alle diese Ausführungsform können überdies Ventile, Entsorgungskammern und Pumpen, einschließlich zusätzliche Elektroden, umfassen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine in Anspruch 1 offenbarte Mikrofluidikvorrichtung bereit.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines Analyten nach Anspruch 24 bereit.
  • Die Erfindung stellt Mikrofluidikkassetten oder -vorrichtungen, die dazu dienen können, einige Manipulationen mit einer Probe durchzuführen, bereit, um schließlich zur Detektion oder Quantifizierung von Zielanalyten zu gelangen. Diese Manipulationsschritte können die Zellhandhabung (Zellkonzentration, Zelllyse, Zellentfernung, Zelltrennung usw.), die Trennung des erwünschten Zielanalyten von anderen Probenbestandteilen, chemische oder enzymatische Reaktionen am Zielanalyten, die Detektion des Zielanalyten usw. umfassen. Die Vorrichtungen der Erfindung können Folgendes umfassen: eine oder mehrere Kammern für die Probenmanipulation, Entsorgung oder Reagenzien; Mikrokanäle zu und zwischen diesen Kammern, einschließlich Mikrokanäle mit elektrophoretischen Trennmatrizen; Ventile zur Steuerung der Flüssigkeitsbewegung; on-chip-Pumpen wie z.B. elektroosmotische, elektrohydrodynamische oder elektrokinetische Pumpen; sowie Detektionssysteme mit Elektroden, wie dies weiter unten ausführlich beschrieben ist. Die Vorrichtungen der Erfindung können solcherart konfiguriert sein, dass eine oder mehrere Proben oder Analyten manipuliert werden können.
  • Im Allgemeinen enthalten die Mikrofluidikvorrichtungen der Endung Elektrodenarrays, wie sie in folgenden Publikationen beschrieben sind: WO 98/20162; WO 98/12430; WO 98/57158; WO 99/57317; WO 99/67425; PCT US 99/25464; WO 99/57319; und PCT US 99/21683; und U.S.S.N. 08/911.589; 09/452.277; und 09/472.657.
  • Die Mikrofluidikvorrichtungen der Erfindung dienen zum Detektieren von Zielanalyten in Proben. Unter „Zielanalyt" oder „Analyt" bzw. grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken versteht man jedes Molekül, jede Verbindung oder jedes Teilchen, das bzw. die detektiert werden soll. Wie weiter unten dargelegt, binden sich Zielanalyten vorzugsweise an Bindungsliganden, wie dies weiter oben beschrieben ist. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können zahlreiche Analyten unter Anwendung der vorliegenden Verfahren detektiert werden; im Grunde genommen kann jeder Zielanalyt, für den ein hierin beschriebener Bindungsanalyt gebildet werden kann, unter Anwendung der Verfahren der Erfindung detektiert werden.
  • Geeignete Analyten sind z.B. organische und anorganische Moleküle einschließlich Biomoleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Analyt Folgendes sein: ein Umweltschadstoff (z.B. Pestizide, Insektizide, Toxine usw.); eine Chemikalie (z.B. Lösungsmittel, Polymere, organische Materialien usw.); therapeutische Moleküle (z.B. Therapeutika, Drogen, Antibiotika usw.); Biomoleküle (z.B. Hormone, Cytokine, Proteine, Lipide, Kohlenhydrate, Zellmembranantigene und -rezeptoren (neurale, hormonale, Nährstoff- und Zelloberflächenrezeptoren) oder ihre Liganden usw.); Vollzellen (z.B. prokaryotische Zellen wie etwa pathogene Bakterien und eukaryotische Zellen wie etwa Säugetiertumorzellen); Viren (z.B. Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren usw.); und Sporen usw. Besonders bevorzugte Analyten sind Umweltschadstoffe; Nucleinsäuren; Proteine (z.B. Enzyme, Antikörper, Antigene, Wachstumsfaktoren, Cytokine usw.); Therapeutika und Drogen; Zellen; sowie Viren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure. Unter „Nucleinsäure" oder „Oligonucleotid" oder grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken versteht man hierin zumindest zwei Nucleotide, die kovalent aneinander gebunden sind. Eine Nucleinsäure der Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen, obwohl in einigen Fällen – wie nachstehend ausgeführt – Nucleinsäureanaloga enthalten sind, die alternierende Rückgrate aufweisen können, umfassend z.B. Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10), 1925 (1993), und die dort angeführten Literaturhinweise; Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14, 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Thiophosphat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und US-Patent 5.644.048), Dithiophosphat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptidnucleinsäure-Rückgrate und -Bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992), Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996)), von denen alle hierin durch Verweis aufgenommen sind. Andere analoge Nucleinsäuren sind jene mit positiven Rückgraten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995)); nichtionischen Rückgraten (US-Patente 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 und 4.469.863); Kiedroswshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y.S. Sanghui und P. Dan Cook, Hg.; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Rückgraten, wie sie z.B. in US-Patenten 5.235.033 und 5.034.506 sowie Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y.S. Shanghui und P. Dan Cook, Hg., beschrieben sind. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbozyklische Zucker enthalten, sind auch innerhalb der Definition von Nucleinsäuren enthalten (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., 169 – 176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga sind in Rawls, C. & E. News, 2. Juni 1997, S. 35, beschrieben. Alle diese Publikationen sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen. Diese Modifikationen des Ribose-Phosphat-Rückgrats können vorgenommen werden, um die Hinzufügung von Elektronentransfergruppen zu erleichtern oder um die Stabilität und Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen bzw. zu verlängern.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, sind alle diese Nucleinsäureanaloga hierin geeignet. Darüber hinaus können Gemische natürlich vorkommender Nucleinsäuren und Analoga davon gebildet werden; z.B. kann an der Bindungsstelle einer leitenden Oligomer- oder Elektronentransfergruppe eine analo ge Struktur verwendet werden. Alternativ dazu können Gemische unterschiedlicher Nucleinsäureanaloga sowie Gemische von natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und Analoga davon gebildet werden.
  • Besonders bevorzugt sind Peptidnucleinsäuren (PNA), was Peptidnucleinsäureanaloga einschließt. Diese Rückgrate sind im Wesentlichen unter neutralen Bedingungen nichtionisch – im Gegensatz zum stark geladenen Phosphodiesterrückgrat natürlich vorkommender Nucleinsäuren. Dies hat zwei Vorteile. Erstens weist das PNA-Rückgrat verbesserte Hybridisierungskinetik auf. PNA weisen stärkere Veränderungen der Schmelztemperatur (Tm) für falsch gepaarte im Vergleich zu perfekt gepaarten Basenpaaren auf. DNA und RNA weisen typischerweise einen Abfall der Tm von 2°C – 4°C für eine interne Fehlpaarung auf. Im Fall des nichtionischen PNA-Rückgrats ist der Abfall näher bei 7°C – 9°C. Dies ermöglicht eine bessere Detektion von Fehlpaarungen. Infolge der nichtionischen Beschaffenheit ist die Hybridisierung der an diese Rückgrate gebundenen Basen gegenüber Salzkonzentration relativ unempfindlich. Dies ist besonders in den Systemen der Erfindung von Vorteil, da eine reduzierte Salzhybridisierungslösung einen geringeren Faraday-Strom aufweist als eine physiologische Salzlösung (im Bereich von 150 mM).
  • Die Nucleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig sein, oder sie können Abschnitte doppel- oder einzelsträngiger Sequenz enthalten. Die Nucleinsäure kann DNA, sowohl genomische als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid sein, wobei die Nucleinsäure jede beliebige Kombination von Desoxyribo- und Ribonucleotiden und jede beliebige Kombination von Basen enthält, z.B. Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xathanin, Hypoxathanin, Isocytosin, Isoguanin usw. Der Ausdruck „Nucleosid" umfasst hierin Nucleotide und Nucleosid- und Nucleotidanaloga sowie modifizierte Nucleoside wie z.B. Amino-modifizierte Nucleoside. Darüber hinaus umfasst „Nucleosid" nicht-natürlich vorkommende Analogstrukturen. Somit werden z.B. die einzelnen Einheiten einer Peptidnucleinsäure mit jeweils einer Base als Nucleoside bezeichnet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Detektieren von Zielnucleinsäuren bereit. Unter „Zielnucleinsäure" oder „Zielsequenz" bzw. grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken dafür ist eine Nucleinsäuresequenz auf einem Einzelstrang von Nucleinsäure zu verstehen. Die Zielsequenz kann ein Abschnitt eines Gens, einer Regulationssequenz, genomische DNA, cDNA, RNA (z.B. mRNA und rRNA) o.dgl. sein. Sie kann jede beliebige Länge aufweisen, wobei zu beachten ist, dass längere Sequenzen spezifischer sind. In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, die Nucleinsäureprobe in Fragmente von 100 bis 10.000 Basenpaare aufzugliedern oder zu spalten, wobei in einigen Ausführungsformen Fragmente von etwa 500 Basenpaaren vorzuziehen sind. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, kann die komplementäre Zielsequenz jede Form annehmen. Beispielsweise kann sie in einer größeren Nucleinsäuresequenz enthalten sein, d.h. in der Gesamtheit oder in einem Teil eines Gens oder mRNA, eines Restriktionsfragments einer Plasmid- oder genomischen DNA u.dgl.
  • Wie dies weiter unten ausführlich erläutert ist, werden Sonden (z.B. Primer) gebildet, um sie an Zielsequenzen zu hybridisieren und dadurch die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenz in einer Probe zu bestimmen. Im Allgemeinen wird dieser Terminus von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung verstanden.
  • Die Zielsequenz kann auch aus verschiedenen Zieldomänen bestehen; in einem „Sandwich"-Test beispielsweise (wie unten ausgeführt) kann eine erste Zieldomäne einer Probenzielsequenz an eine Einfangsonde oder einen Abschnitt einer Einfang-Extendersonde hybridisieren, eine zweite Zieldomäne kann an einen Abschnitt einer Amplifikationssonde, Markersonde oder eine andere Einfang- oder Einfang-Extendersonde usw. hybridisieren. Darüber hinaus können die Zieldomänen aneinander grenzen (d.h. benachbart) oder voneinander getrennt sein. Wenn z.B. Ligationskettenreaktions- (LCR-) Techniken angewendet werden, kann ein erster Primer an eine erste Zieldomäne und ein zweiter Primer an eine zweite Zieldomäne hybridisieren; entweder sind die Domänen benachbart, oder sie können durch ein oder mehrere Nucleotide voneinander getrennt sein (in Kombination mit der Verwendung einer Polymerase und dNTP, wie dies ausführlich weiter unten dargelegt ist).
  • Die Ausdrücke „erste/r/s" und „zweite/r/s" sollen den Sequenzen keine Orientierung hinsichtlich der 5'-3'-Orientierung der Zielsequenz verleihen. Unter der Annahme bei spielsweise einer 5'-3'-Orientierung der komplementären Zielsequenz kann sich die erste Zieldomäne entweder 5' von der zweiten Domäne oder 3' von der zweiten Domäne befinden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt ein Protein. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, gibt es eine große Anzahl möglicher proteinhaltiger Zielanalyten, die mittels der vorliegenden Erfindung detektiert werden können. Unter „Proteinen" oder grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken dafür versteht man hierin Proteine, Oligopeptide und Peptide, Derivate und Analoga, z.B. Proteine mit nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäureanaloga, sowie peptidomimetische Strukturen. Die Seitenketten können entweder in (R)- oder in (S)-Konfiguration auftreten. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Wie dies weiter unten dargelegt ist, kann es wünschenswert sein, wenn das Protein als Bindungsligand verwendet wird, Proteinanaloga zu verwenden, um den Abbau durch Probenverunreinigungen zu verlangsamen.
  • Geeignete Proteinzielanalyten sind u.a. (1) Immunglobuline, insbesondere IgE, IgG und IgM, insbesondere therapeutisch oder diagnostisch relevante Antikörper, u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) Antikörper gegen Humanalbumin, Apolipoproteine (z.B. Apolipoprotein E), choriales Human-Gonadotropin, Cortisol, α-Fetoprotein, Thyroxin, Schilddrüsen-Stimulationshormon (TSH), Antithrombin, Antikörper gegen Pharmazeutika (z.B. antiepileptische Medikamente (Phenyltoin, Primidon, Carbariezepin, Ethosuximid, Valproinsäure und Phenobarbitol), kardioaktive Medikamente (Digoxin, Lidocain, Procainamid und Disopyramid), Bronchodilatatoren (Theophylin), Antibiotika (Chloramphenicol, Sulfonamide), Antidepressiva, Immunsuppressiva, Suchtmittel (Amphetamin, Methamphetamin, Cannabinoide, Kokain und Opiate) und Antikörper gegen verschiedene Viren (z.B. Orthomyxoviren (z.B. Influenzavirus), Paramyxoviren (z.B. respiratorischer Synzytialvirus, Mumpsvirus, Masernvirus), Adenoviren, Rhinoviren, Coronaviren, Reoviren, Togaviren (z.B. Rubellavirus), Parvoviren, Pockenviren (z.B. Variolavirus, Vaccinavirus), Enteroviren (z.B. Poliovirus, Coxsackievirus), Hepatitisviren (A, B und C), Herpesviren (z.B. Herpes-simplex-Virus, Varicella-zoster-Virus, Zytomegalievirus, Epstein-Barr-Virus), Rotaviren, Norwalk-Viren, Hantavirus, Arenavirus, Rhabdovirus (z.B. Tollwutvirus), Retroviren (z.B. HIV, HTLV-I und -II), Papovaviren (z.B. Papillomavirus), Polyomaviren und Picornaviren u.dgl.) sowie Bakterien (z.B. eine Vielzahl pathogener und nicht-pathogener Prokaryoten von Interesse wie etwa Bacillus; Vibrio, z.B. V. cholerae; Escherichia, z.B. enterotoxigene E. coli; Shigella, z.B. S. dysenteriae; Salmonella, z.B. S. typhi, Mycobacterium, z.B. M. tuberculosis, M. leprae; Clostridium, z.b. C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens; Cornyebacterium, z.B. C. diphteriae; Streptococcus, S. pyogenes, S. pneumoniae; Staphylococcus, z.B. S. aureus; Haemophilus, z.B. H. influenzae; Neisseria, z.B. N. meningitidis, N. gonorrhoeae; Yersinia, z.B. G. lamblia Y. pestis, Pseudomonas, z.B. P. aeruginosa, P. putida; Chlamydia, z.B. C. trachomatis; Bordetella, z.B. B. pertussis; Treponema, z.B. T. palladium; u.dgl.); (2) Enzyme (und andere Proteine), u.a. (aber nicht beschränkt auf) Enzyme, die als Indikatoren oder für die Behandlung von Herzkrankheit verwendet werden, z.B. Kreatin-Kinase, Lactat-Dehydrogenase, Aspartatamino-Transferase, Troponin T, Myoglobin, Fibrionogen, Cholesterin, Triglycerzide, Thrombin, Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA); Indikatoren von Bauchspeicheldrüsenerkrankungen, z.B. Amylase, Lipase, Chymotrypsin und Trypsin; Leberfunktionsenzyme und -proteine, z.B. Cholinesterase, Bilirubin und alkalische Phosphatase; Aldolase, Prostansäure-Phosphatase, endständige Desoxynucleotidyl-Transferase sowie bakterielle und virale Enzyme wie etwa HIV-Protease; (3) Hormone und Cytokine (viele davon dienen als Liganden für Zellrezeptoren) wie z.B. Erythropoietin (EPO), Thrombopoietin (TPO), die Interleukine (einschließlich IL-1 bis IL-17), Insulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (einschließlich IGF-1 und -2), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), transformierende Wachstumsfaktoren (einschließlich TGF-α und TGF-β), Human-Wachstumshormon, Transferrin, EGF, Lipoprotein geringer Dichte, Lipoprotein hoher Dichte, Leptin, VEGF, PDGF, ziliarer neurotropher Faktor, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH); Calcitonin, choriales Humangonadotropin, Cortisol, Östradiol, Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), leutinisierendes Hormon (LH), Progesteron und Testosteron; und (4) andere Proteine (z.B. α-Fetoprotein, karzinoembryonales Antigen CEA, Krebsmarker usw.).
  • Außerdem können beliebige der Biomoleküle, für die Antikörper detektierbar sind, auch direkt detektiert werden; d.h. die Detektion von Viren- oder Bakterienzellen sowie Suchtmitteln usw. kann direkt erfolgen.
  • Geeignete Zielanalyten sind z.B. Kohlenhydrate, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Marker für Brustkrebs (CA15-3, CA 549, CA 27.29), mit Mucin-ählichem Karzinom assoziiertes Antigen (MCA); Eierstockkrebs (CA125), Bauchspeicheldrüsenkrebs (DE-PAN-2), Prostatakrebs (PSA), CEA sowie kolorektales und Pankreaskarzinom (CA 19, CA 50, CA242).
  • Diese Zielanalyten sind z.B. Metallionen, insbesondere Schwer- und/oder toxische Metalle, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Aluminium, Arsen, Cadmium, Selen, Kobalt, Kupfer, Chrom, Blei, Silber und Nickel.
  • Diese Zielanalyten können in jeder beliebigen Anzahl unterschiedlicher Probentypen vorhanden sein, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) in Körperflüssigkeiten wie z.B. Blut, Lymphflüssigkeit, Speichel, Vaginal- und Analsekretionen, Harn, Stuhl, Schweiß und Tränen, sowie in festen Geweben wie z.B. Leber, Milz, Knochenmark, Lunge, Muskel, Gehirn usw.
  • Demzufolge stellt die Erfindung Mikrofluidikvorrichtungen zum Detektieren von Zielanalyten bereit, die ein festes Substrat umfassen. Das feste Substrat kann aus einer Vielzahl an Materialien bestehen und in unterschiedlicher Weise konfiguriert sein, wie dies hierin dargelegt und für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Außerdem kann eine einzelne Vorrichtung aus mehr als einem Substrat bestehen; z.B. kann eine „Probenbehandlungs"-Kassette vorliegen, die eine Schnittstelle mit einer getrennten „Detektions"-Kassette bildet; eine unbehandelte Probe wird der Probenbehandlungskassette zugesetzt und manipuliert, um die Probe auf die Detektion vorzubereiten; sie wird aus der Probenbehandlungskassette entfernt und der Detektionskassette zugeführt. Es kann eine zusätzliche funktionelle Kassette vorhanden sein, in die die Vorrichtung passt – beispielsweise ein Heizelement, das in Kontakt mit der Probenkassette gebracht wird, um Reaktionen wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchzuführen. In einigen Fällen kann ein Teil des Substrats entfernbar sein; z.B. kann die Probenkassette eine abnehmbare Detektionskassette aufweisen, so dass die gesamte Probenkassette nicht mit der Detektionsvorrichtung in Kontakt steht. Siehe z.B. US-Patent 5.603.351 und PCT US 96/17116.
  • Die Zusammensetzung des festen Substrats hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z.B. von den Techniken zur Herstellung der Vorrichtung, von der Verwendung der Vorrichtung, von der Zusammensetzung der Proben, vom zu detektierenden Analyten, von der Größe der Kammern und Mikrokanäle, von der Gegenwart oder Abwesenheit elektronischer Komponenten usw. Im Allgemeinen sollten die Vorrichtungen der Erfindung auch leicht sterilisierbar sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann das feste Substrat aus einer Vielzahl an Materialien bestehen, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) aus Silicium wie etwa Siliciumwafern, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Glas und Quarzglas, Galliumarsenid, Indiumphosphid, Aluminium, Keramik, Polyimid, Quarz, Kunststoffen, Harzen und Polymeren, z.B. Polymethylmethacrylat, Acrylharzderivate, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polycarbonat, Polystyrol und anderen Styrolcopolymeren, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Superlegierungen, ZirKaloy, Stahl, Gold, Silber, Kupfer, Wolfram, Molybdän, Tantal, KOVAR, KEVLAR, KAPTON, MYLAR, Messing, Saphir usw. Hochqualitative Glase wie z.B. hochschmelzendes Borsilicat oder Quarzgläser sind möglicherweise aufgrund ihrer UV-durchlässigen Eigenschaften vorzuziehen, wenn Probenmanipulationsschritte Technologien auf Lichtbasis erfordern. Außerdem können – wie dies hierin offenbart ist – Teile der Innenflächen der Vorrichtung mit einer Vielzahl an Beschichtungen überzogen sein, um die nichtspezifische Bindung zu reduzieren und die Bindung von Bindungsliganden zu ermöglichen (aus Gründen der Bioverträglichkeit, des Flusswiderstands usw.).
  • Die Vorrichtungen der Erfindung können in unterschiedlicher Weise hergestellt werden, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Siehe z.B. WO 96/39260, das die Bildung von flüssigkeitsdichten elektrischen Leitungen betrifft; US-Patent 5.747.169 betreffend Abdichtung; EP 0637996 B1 ; EP 0637998 B1 ; WO 96/39260; WO 97/16835; WO 98/13683; WO 97/16561; WO 97/43629; WO 96/39252; WO 96/15576; WO 96/15450; WO 97/37755 und WO 97/27324; sowie die US-Patente 5.304.487; 5.071.531; 5.061.336; 5.747.169; 5.296.375; 5.110.745; 5.587.128; 5.498.392; 5.643.738; 5.750.015; 5.726.026; 5.635.358; 5.126.022; 5.770.029; 5.631.337; 5.569.364; 5.135.627; 5.632.876; 5.593.838; 5.585.069; 5.637.469; 5.486.335; 5.755.942; 5.681.484; und 5.603.351. Geeignete Herstellungstechniken hängen wiederum von der Auswahl des Substrats ab, doch bevorzugte Verfahren sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) eine Vielzahl an mikromaschinellen Bearbeitungs- und Mikrofabrikationsverfahren, z.B. Filmablagerungsverfahren wie etwa Rotationsbeschichten, chemische Gasphasenabscheidung, Laserproduktion, fotolithografische und andere Ätztechniken unter Anwendung nasschemischer Verfahren oder Plasmaverfahren, Prägen, Spritzgussformen und Bindungstechniken (siehe US-Patent 5.747.169). Außerdem gibt es Druckverfahren zur Schaffung der erwünschten Flüssigkeitsleitwege, d.h. Muster von bedrucktem Material können den direktionalen Flüssigkeitstransport ermöglichen. Somit kann die sich bildende „Druckfarbe" dazu dienen, einen Strömungskanal zu definieren. Außerdem kann die Verwendung unterschiedlicher „Druckfarbe" oder „Pasten" unterschiedliche Strömungseigenschaften unterschiedlicher Teile der Wege nach sich ziehen. Beispielsweise können Materialien dazu verwendet werden, die RF-Werte von gelöstem Produkt/Lösungsmittel zu verändern (d.h. das Verhältnis der von einem bestimmten gelösten Produkt zurückgelegten Entfernung zur von einer Lösungsmittelfront zurückgelegten Entfernung). Gedruckte Flüssigkeitsleitwege können z.B. mit einer oder mehreren gedruckten Schichten) gebildet werden, die aus zwei unterschiedlichen Materialien besteht bzw. bestehen, wobei auch unterschiedliche Flüssigkeitstransportraten bereitgestellt werden. Flüssigkeitsleitwege aus mehreren Materialien kommen dann in Frage, wenn es wünschenswert ist, die Retentionszeiten von Reagenzien in Flüssigkeitsleitwegen zu modifizieren. Außerdem können gedruckte Flüssigkeitsleitwege Regionen mit Reagenssubstanzen vorsehen, indem die Reagenzien in den „Druckfarben" oder in einem nachfolgenden Druckschritt bereitgestellt werden. Siehe z.B. US-Patent 5.795.453.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das feste Substrat zur Handhabung einer einzelnen Probe konfiguriert, die eine Vielzahl an Zielanalyten enthalten kann. Eine einzelne Probe wird der Vorrichtung zugeführt, wobei die Probe entweder für die pa rallele Verarbeitung zwecks Detektieren der Analyten allquotiert oder die Probe reihenverarbeitet werden kann, wobei in diesem Fall individuelle Ziele in Reihenform detektiert werden. Außerdem können Proben regelmäßig oder aus unterschiedlichen Positionen für In-line-Sampling entfernt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das feste Substrat zur Handhabung mehrerer Proben konfiguriert, wobei jede davon einen oder mehrere Zielanalyten enthalten kann. Im Allgemeinen wird in dieser Ausführungsform jede Probe individuell manipuliert; d.h. die Manipulationen und Analysen erfolgen parallel, wobei vorzugsweise kein Kontakt oder keine Kontaminierung dazwischen besteht. Alternativ dazu können einige gemeinsame Schritte durchgeführt werden; z.B. kann es wünschenswert sein, unterschiedliche Proben getrennt zu verarbeiten, aber alle Zielanalyten auf einer einzelnen Detektionselektrode zu detektieren, wie weiter unten beschrieben.
  • Außerdem ist zu beachten, dass zwar ein Großteil der vorliegenden Beschreibung die Verwendung flacher Substrate mit Mikrokanälen und Kammern betrifft, aber auch andere Geometrien in Frage kommen. Beispielsweise können zwei oder mehrere flache Substrate übereinander gestapelt sein, um eine dreidimensionale Vorrichtung zu bilden, die Mikrokanäle aufweisen kann, in denen auf einer Ebene oder zwischen unterschiedlichen Ebenen Strömung stattfinden kann; ebenso können sich Kammern über zwei oder mehrere Substrate erstrecken, um größere Probenvolumen zuzulassen. Daher können beispielsweise beide Seiten eines Substrate geätzt werden, um Mikrokanäle zu enthalten; siehe z.B. US-Patente 5.603.351 und 5.681.484.
  • Somit enthalten die Vorrichtungen der Erfindung zumindest einen Mikro- oder Strömungskanal, der das Strömen der Probe von der Probeneinlassöffnung zu den anderen Komponenten oder Modulen des Systems ermöglicht. Die Sammlung von Mikrokanälen und Kammern wird auf dem Gebiet der Erfindung manchmal als „Mesomaßstabs-Flusssystem" bezeichnet. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig ist, können die Strömungskanäle in unterschiedlicher Weise – ja nach Verwendungszweck des Kanals – konfiguriert sein. Es kann sich z.B. ein einzelner Strömungskanal, der an der Probeneinlassöffnung beginnt, in eine Vielzahl an kleineren Kanälen aufteilen, so dass die ursprüngliche Probe in diskrete Unterproben für die parallele Verarbeitung oder Analyse unterteilt wird. Alternativ dazu können mehrere Strömungskanäle aus unterschiedlichen Modulen, z.B. aus der Probeneinlassöffnung und einem Reagensspeichermodul, gemeinsam in eine Mischkammer oder eine Reaktionskammer münden. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, gibt es viele mögliche Konfigurationen; es ist entscheidend, dass die Strömungskanäle die Bewegung von Probe und Reagenzien von einem Teil der Vorrichtung in einen anderen ermöglichen. Beispielsweise können die Weglängen der Strömungskanäle im Bedarfsfall verändert werden; wenn etwa Mischen und zeitlich abgestimmte Reaktionen erforderlich sind, kommen längere und manchmal gewundene Strömungskanäle in Frage.
  • Im Allgemeinen werden die Mikrofluidikvorrichtungen der Erfindung als Vorrichtungen im „Mesomaßstab" bezeichnet. Die Vorrichtungen sind typischerweise in einem Maßstab ausgelegt, der sich für die Analyse von Mikrovolumen eignet, obwohl in einigen Ausführungsformen große Proben (z.B. cm3-Proben) zwecks nachfolgender Analyse in der Vorrichtung verkleinert werden. „Mesomaßstab" bezeichnet hierin Kammern und Mikrokanäle, die Querschnittsdimensionen in der Größenordnung von 0,1 μm bis 500 μm aufweisen. Die Strömungskanäle und Kammern im Mesomaßstab besitzen bevorzugte Tiefen in der Größenordnung von 0,1 μm bis 100 μm, typischerweise 2 μm bis 50 μm. Die Kanäle besitzen bevorzugte Breiten in der Größenordnung von 2,0 μm bis 500 μm, noch bevorzugter 3 μm bis 100 μm. Für zahlreiche Anwendungen eignen sich Kanäle von 5 μm bis 50 μm. In vielen Anwendungen kommen jedoch größere Maßstabsdimensionen (im Millimeterbereich) in Frage. Ebenso besitzen die Kammern in den Substraten oft größere Dimensionen, d.h. im Maßstab einiger Millimeter.
  • Zusätzlich zum Strömungskanalsystem sind die Vorrichtungen der Erfindung konfiguriert, eine oder mehrere einer Vielzahl an Komponenten aufzuweisen, die hierin als „Module" bezeichnet werden, die je nach der Verwendung in jeder beliebigen Vorrichtung vorhanden sind. Zu diesen Molekülen zählen u.a. (sind jedoch nicht beschränkt auf) Probeneinlassöffnungen; Probeneinlass- oder -sammelmodule; Zellhandhabungsmodule (z.B. für Zelllyse, Zellentfernung, Zellkonzentration, Zelltrennung oder Zelleinfang, Zellwachstum usw.); Trennmodule, z.B. für Elektrophorese, Dielektrophorese, Gelfiltration, lonenaustausch/Affinitätschromatographie (Einfangen und Freisetzen) usw.; Reaktionsmodule für die chemische oder biologische Modifikation der Probe, z.B. die Amplifikation des Zielanalyten (wenn beispielsweise der Zielanalyt Nucleinsäure ist, kommen Amplifikationstechniken zur Anwendung, z.B. (jedoch nicht beschränkt auf) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangumlagerungs-Amplifikation (SDA) und Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA)), chemische, physikalische oder enzymatische Spaltung oder Veränderung des Zielanalyten oder chemische Modifikation des Ziels; Flüssigkeitspumpen; Flüssigkeitsventile; thermische Heiz- und Kühlmodule; Speichermodule für Testreagenzien; Mischkammern; und Detektionsmodule.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung zumindest eine Probeneinlassöffnung für die Einführung der Probe in die Vorrichtung. Sie kann ein Teil eines Probeneinlass- oder -sammelmoduls oder getrennt davon sein; die Probe kann also direkt von der Probeneinlassöffnung in eine Trennkammer geführt oder in einer Probensammelkammer vorbehandelt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung ein Probensammelmodul, das dazu dienen kann, die Probe gegebenenfalls zu konzentrieren oder anzureichern; siehe z.B. US-Patent 5.770.029 einschließlich der Besprechung von Anreicherungskanälen und Anreicherungsmitteln.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung ein Zellhandhabungsmodul. Dies ist besonders dann von Nutzen, wenn die Probe Zellen umfasst, die entweder den Zielanalyten enthalten oder entfernt werden müssen, um den Zielanalyten zu detektieren. Somit kann z.B. die Detektion bestimmter Antikörper im Blut die Entfernung von Blutzellen erfordern, um so eine wirksame Analyse zu ermöglichen, oder die Zellen (und/oder der Zellkern) müssen vor dem Detektieren lysiert werden. In diesem Zusammenhang zählen zu „Zellen" eukaryotische und prokaryotische Zellen sowie virale Teilchen, die möglicherweise Behandlung vor der Analyse erfordern, z.B. die Freisetzung von Nucleinsäure aus einem viralen Teilchen vor der Detektion von Zielsequenzen. Darüber hinaus können Zellhandhabungsmodule auch ein stromabwärts gelegenes Mittel zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwe senheit von Zellen verwenden. Geeignete Zellhandhabungsmodule sind u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) Zelllysemodule, Zellentfernungsmodule, Zeltkonzentrationsmodule und Zelltrennungs- oder -einfangmodule. Außerdem steht wie in allen Modulen der Erfindung das Zellhandhabungsmodul über einen Strömungskanal mit zumindest einem anderen Modul der Erfindung in Flüssigkeitskommunikation.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Zellhandhabungsmodul ein Zelllysemodul. Wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können Zellen je nach Zelltyp in unterschiedlicher Weise lysiert werden. In einer Ausführungsform (siehe EP 0637998 B1 und US-Patent 5.635.358) kann das Zelllysemodul Zellmembrandurchstoßende Fortsätze aufweisen, die sich von einer Oberfläche des Zellhandhabungsmoduls aus erstrecken. Wenn Flüssigkeit durch die Vorrichtung gedrückt wird, brechen die Zellen auf. Ebenso kann dies mittels scharfkantiger Teilchen erfolgen, die im Zellhandhabungsbereich eingeschlossen sind. Alternativ dazu kann das Zelllysemodul einen Bereich mit eingeschränkter Querschnittsdimension umfassen, was zur Zelllyse bei Druckausübung führt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zelllysemodul ein Zelllysemittel wie z.B. Guanidiumchlorid, chaotrope Salze, Enzyme wie z.B. Lysozyme usw. In einigen Ausführungsformen kann – z.B. im Falle von Blutzellen – eine einfache Verdünnung mit Wasser oder Puffer zu hypotoner Lyse führen. Das Lysemittel kann in Lösungsform, gespeichert innerhalb des Zelllysemoduls oder in einem Speichermodul und in das Lysemodul gepumpt, vorliegen. Alternativ dazu kann das Lysemittel in fester Form vorliegen, die nach Einführung der Probe in Lösung aufgenommen wird.
  • Das Zelllysemodul kann gegebenenfalls auch entweder intern oder extern ein Filtermodul für die Entfernung von Zelltrümmern enthalten. Dieser mikrofabrizierte Filter kann zwischen dem Zelllysemodul und dem anschließenden Modul positioniert sein, damit die Entfernung der lysierten Zellmembran und anderer Zelltrümmerkomponenten ermöglicht wird; Beispiele für geeignete Filter sind aus EP 0637998 B1 ersichtlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Zellhandhabungsmodul ein Zelltrennungs- oder -einfangmodul. Diese Ausführungsform verwendet einen Zelleinfangbereich, umfassend Bindungsstellen, die zur reversiblen Bindung eines Zelloberflächenmoleküls fähig sind, damit die selektive Isolation (oder Entfernung) eines bestimmten Zelltyps aus der Probenpopulation stattfinden kann – z.B. von weißen Blutzellen für die Analyse chromosomaler Nucleinsäure oder von Untergruppen weißer Blutzellen. Diese Bindungsgruppen können entweder auf der Oberfläche des Moduls oder auf einem im Modul eingeschlossenen Teilchen (d.h. einer Perle) durch physikalische Absorption oder durch kovalente Bindung immobilisiert sein. Geeignete Bindungsgruppen hängen vom zu isolierenden oder zu entfernenden Zelltyp ab und umfassen im Allgemeinen Antikörper und andere Bindungsliganden wie etwa Liganden für Zelloberflächenrezeptoren usw. Somit kann ein bestimmter Zelltyp aus einer Probe vor der weiteren Handhabung entfernt werden, oder der Test ist ausgebildet, den erwünschten Zelltyp spezifisch zu binden, die nicht-erwünschten Zelltypen abzuwaschen, gefolgt von entweder Freisetzung der gebundenen Zellen durch Zugabe von Reagenzien oder Lösungsmitteln, physikalischer Entfernung (d.h. höheren Flussraten oder Drücken) oder sogar In-situ-Lyse.
  • Alternativ dazu kann man ein „Zellsieb" verwenden, um Zellen auf der Grundlage ihrer Größe voneinander zu trennen. Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, z.B. durch Erhebungen auf der Oberfläche, die Größenausschluss ermöglichen, durch eine Reihe sich verengender Kanäle, einen Überlauf oder durch eine Diafiltrationsvorrichtung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Zellhandhabungsmodul ein Zellentfernungsmodul. Dieses kommt dann in Frage, wenn die Probe Zellen enthält, die im Test nicht erforderlich oder unerwünscht sind. Im Allgemeinen erfolgt die Zellentfernung auf Basis von Größenausschluss des oben erwähnten „Siebens", wobei die Kanäle, die zu klein für die Zellen sind, aus dem Zellhandhabungsmodul führen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Zellhandhabungsmodul ein Zellkonzentrationsmodul. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkun dig ist, erfolgt dies unter Anwendung von „Siebverfahren", z.B. um die Zellen von einem großen Probenflüssigkeitsvolumen vor der Lyse zu konzentrieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung ein Trennmodul. Die Trennung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass zumindest eine Komponente der Probe von den anderen Komponenten der Probe getrennt wird. Dies kann je nach Test die Trennung oder Isolation des Zielanalyten oder die Entfernung von Verunreinigungen umfassen, die die Analyse des Zielanalyten beeinträchtigen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Trennmodul ein chromatographieartiges Trennmedium wie z.B. absorptive Phasenmaterialien, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Umkehrphasenmaterialien (z.B. C8- oder C18-beschichtete Teilchen usw.), lonenaustauschmaterialien, Affinitätschromatographie-Materialien wie z.B. Bindungsliganden usw. Siehe US-Patent 5.770.029.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Trennmodul Bindungsliganden, wie dies allgemein hierin in Zusammenhang mit der Zelltrennung oder Analytendetektion skizziert ist. In dieser Ausführungsform werden die Bindungsliganden innerhalb des Trennmoduls (wiederum entweder auf der Innenfläche des Moduls, auf einem Teilchen wie z.B. einer Perle, einem Filament oder einer Kapillare, die im Modul eingeschlossen sind, beispielsweise mittels einer Fritte) immobilisiert (wiederum entweder durch physikalische Absorption oder kovalente Bindung, siehe unten). Geeignete Bindungsgruppierungen hängen von der zu isolierenden oder zu entfernenden Probenkomponente ab. Unter „Bindungsligand" oder grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken davon ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die zur Bindung einer Komponente der Probe dient – entweder handelt es sich dabei um eine Verunreinigung (zur Entfernung) oder um den Zielanalyten (zur Anreicherung). In einigen Ausführungsformen dient der Bindungsligand, wie nachstehend ausgeführt, zum Sondieren der Gegenwart des Zielanalyten, und der Bindungsligand bindet an den Analyten.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, hängt die Zusammensetzung des Bindungsliganden von der zu trennenden Probenkomponente ab. Es sind Bindungsliganden für eine Vielzahl an Analyten bekannt, oder sie können unter Anwendung bekannter Techniken problemlos gebildet werden. Wenn beispielsweise die Komponente ein Protein ist, enthalten die Bindungsliganden Proteine (insbesondere Antikörper oder Fragmente davon wie etwa FAb usw.) oder kleine Moleküle. Wenn die Probenkomponente ein Metallion ist, umfasst der Bindungsligand im Allgemeinen herkömmliche Metallionliganden oder Chelatbildner. Bevorzugte Bindungsligandenproteine sind z.B. Peptide. Wenn z.B. die Komponente ein Enzym ist, sind zweckmäßige Bindungsliganden Substrate und Inhibitoren. Antigen-Antikörper-Paare, Rezeptorliganden und Kohlenhydrate sowie ihre Bindungspartner sind ebenfalls geeignete Komponenten-bindende Liganden-Paare. Der Bindungsligand kann Nucleinsäure sein, wenn Nucleinsäure-Bindungsproteine die Ziele sind; alternativ dazu können – wie dies allgemein in US-Patenten 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und verwandten Patenten beschrieben ist – Nucleinsäure-„Aptomere" für die Bindung an praktisch jeden Zielanalyten entwickelt werden. Es gibt zahlreiche Publikationen, die sich mit der Entwicklung von Bindungspartnern auf der Basis kombinatorischer Chemieverfahren beschäftigen. Wenn in dieser Ausführungsform der Bindungsligand eine Nucleinsäure ist, sind bevorzugte Zusammensetzungen und Verfahren PCT US 97/20014 zu entnehmen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung der Probenkomponente an den Bindungsliganden spezifisch, und der Bindungsligand ist Teil eines Bindungspaars. Unter „spezifischer Bindung" ist hierin zu verstehen, dass der Ligand die Komponente, z.B. den Zielanalyten, mit einer Spezifität bindet, die ausreicht, um zwischen dem Analyten und anderen Komponenten oder Verunreinigungen der Testprobe zu differenzieren. Die Bindung sollte ausreichen, um den Bedingungen des Trennungsschritts oder Tests, einschließlich der Waschschritte zur Entfernung nichtspezifischer Bindung, standzuhalten. In einigen Ausführungsformen, z.B. bei der Detektion bestimmter Biomoleküle, betragen die Dissoziationskonstanten des Analyten zum Bindungsliganden weniger als etwa 10–4 – 10–6 M–1; vorzugsweise weniger als etwa 10–5 – 10–9 M–1, insbesondere weniger als etwa 10–7 – 10–9 M–1.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, hängt die Zusammensetzung des Bindungsliganden von der Zusammensetzung des Zielanalyten ab. Es sind Bindungsliganden für eine Vielzahl an Analyten bekannt, oder sie können unter Anwendung bekannter Techniken problemlos gebildet werden. Wenn z.B. der Analyt eine einzelsträngige Nucleinsäure ist, ist der Bindungsligand im Allgemeinen eine im Wesentlichen komplementäre Nucleinsäure. Ebenso kann der Analyt ein Nucleinsäure-Bindungsprotein sein, und der Einfangbindungsligand ist entweder eine einzelträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure; alternativ dazu kann der Bindungsligand ein Nucleinsäure-Bindungsprotein sein, wenn der Analyt eine einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäure ist. Wenn der Analyt ein Protein ist, enthalten die Bindungsliganden Proteine oder kleine Moleküle. Bevorzugte Bindungsligandenproteine sind z.B. Peptide. Wenn z.B. der Analyt ein Enzym ist, sind geeignete Bindungsliganden Substrate, Inhibitoren und andere Proteine, die das Enzym binden, d.h. Komponenten eines Multi-Enzym- (oder Multi-Protein-) Komplexes. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können beliebige zwei Moleküle, die sich vorzugsweise spezifisch assoziieren, entweder als Analyt oder als Bindungsligand verwendet werden. Zweckmäßige Analyt-Bindungsligand-Paare sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Antikörper/Antigene, Rezeptoren/Liganden, Proteine/Nucleinsäuren; Nucleinsäuren/Nucleinsäuren, Enzyme/Substrate und/oder Inhibitoren, Kohlenhydrate (z.B. Glycoproteine und Glycolipide)/Lectine, Kohlenhydrate und andere Bindungspartner, Proteine/Proteine; und Proteine/kleine Moleküle. Es kann sich um Sequenzen der Wildform oder um abgeleitete Sequenzen handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungsliganden Abschnitte (insbesondere die extrazellulären Abschnitte) von Zelloberflächenrezeptoren, die bekanntermaßen multimerisieren; Beispiele sind der Wachstumshormonrezeptor, Glucosetransporter (insbesondere GLUT4-Rezeptor), Transferrinrezeptor, epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor, Rezeptor für Lipoproteine niedriger Dichte, Rezeptor für Lipoproteine hoher Dichte, Leptinrezeptor, Interleukinrezeptoren wie z.B. IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-15- und IL-17-Rezeptoren, VEGF-Rezeptor, PDGF-Rezeptor, EPO-Rezeptor, TPO-Rezeptor, ziliarer neurotropher Faktorrezeptor, Prolactinrezeptor und T-Zellen-Rezeptoren.
  • Wenn die durch den Bindungsliganden gebundene Probenkomponente der Zielanalyt ist, kann sie zwecks Detektion gegebenenfalls freigesetzt werden; dies erfolgt – je nach Stärke der Bindungswechselwirkung – unter Anwendung beliebiger bekannter Techniken; dazu zählen Veränderungen des pH-Werts, der Salzkonzentration, der Temperatur usw. oder die Zugabe konkurrierender Liganden, Detergenzien, chaotroper Mittel, organischer Verbindungen oder Lösungsmittel usw.
  • In einigen Ausführungsformen kann bevorzugte Bindung von Molekülen an Oberflächen mittels Beschichtungsmittel oder Pufferbedingungen erreicht werden; z.B. können DNA und RNA je nach Bedingungen unterschiedlich an Glasoberflächen gebunden werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Trennungsmodul ein Elektrophoresemodul, wie dies allgemein in US-Patenten 5.770.029, 5.126.022, 5.631.337, 5.569.364, 5.750.015 und 5.135.627 beschrieben ist. In der Elektrophorese werden Moleküle vor allem durch unterschiedliche elektrophoretische Mobilitäten aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekulgröße, Form und/oder Ladung voneinander getrennt. Mikrokapillarröhrchen wurden in letzter Zeit zur Verwendung in der Mikrokapillar-Gelelektrophorese (Hochleistungs-Kapillarelektrophorese oder HPCE) verwendet. Ein Vorteil von HPCE besteht darin, dass die Wärme, die durch das angelegte elektrische Feld entsteht, infolge der großen Oberfläche wirksam abgeleitet wird, wodurch die Trennung rasch stattfinden kann. Das Elektrophoresemodul dient dazu, Probenkomponenten durch Anlegen eines elektrischen Felds voneinander zu trennen, wobei die Bewegung der Probenkomponenten entweder auf ihre Ladung oder – je nach Oberflächenchemie des Mikrokanals – auf den Haupt-Flüssigkeitsfluss infolge von elektroosmotischem Fluss (EOF) zurückzuführen ist.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, kann das Elektrophoresemodul zahlreiche Formen aufweisen; im Allgemeinen umfasst es einen elektrophoretischen Mikrokanal und zugehörige Elektroden, um ein elektrisches Feld an den elektrophoretischen Mikrokanal anzulegen. Flüssigkeitsableitungen und Flüssigkeitsbehälter sind gegebenenfalls vorhanden.
  • Die Elektroden umfassen Elektrodenpaare – ausgebildet entweder als Einzelpaar (siehe US-Patente 5.126.022 und 5.750.015) oder als mehrere Paare. Einzelpaare besitzen im Allgemeinen eine Elektrode an jedem Ende des elektrophoretischen Wegs. Mehrere Elektrodenpaare können dazu dienen, die Bewegung von Probenkomponenten präzise zu steuern, so dass die Probenkomponenten kontinuierlich mehreren elektrischen Feldern ausgesetzt sind (entweder gleichzeitig oder hintereinander).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können auch elektrophoretische Gelmedien verwendet werden. Durch Variieren der Porengröße der Medien, durch Verwendung von zwei oder mehr Gelmedien unterschiedlicher Porosität und/oder durch Vorsehen eines Porengrößengradienten kann die Trennung von Probenkomponenten maximiert werden. Gelmedien für Trennungszwecke basierend auf Größe sind bekannt; Beispiele dafür sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Polyacrylamid und Agarose. Eine bevorzugte elektrophoretische Trennmatrix ist in US-Patent 5.135.627 beschrieben, die die Verwendung einer „Mosaikmatrix", gebildet durch Polymerisieren einer Dispersion von Mikrodomänen („Dispersoide") und einer Polymermatrix, erläutert. Dies ermöglicht bessere Trennung von Zielanalyten, insbesondere von Nucleinsäuren. US-Patent 5.569.364 beschreibt Trennmedien für die Elektrophorese, umfassend vernetzte Gelteilchen im Größenbereich von Submikron bis über Mikron, die in Mikrofluidiksystemen eingesetzt werden. US-Patent 5.631.337, das hierin durch Verweis aufgenommen ist, erläutert die Verwendung von thermoreversiblen Hydrogelen, umfassend Polyacrylamid-Rückgrate mit N-Substituenten, die zur Bereitstellung von Wasserstoffbindungsgruppen für die verbesserte elektrophoretische Trennung dienen. Siehe auch US-Patente 5.061.336 und 5.071.531, die Verfahren zum Gießen von Gelen in Kapillarröhren betreffen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung ein Reaktionsmodul. Dieses kann entweder die physikalische, chemische oder biologische Veränderung einer oder mehrerer Probenkomponenten vorsehen. Alternativ dazu kann ein Reaktionsmodul vorhanden sein, in dem der Zielanalyt eine zweite Gruppe verändert, die dann detektiert werden kann; wenn z.B. der Zielanalyt ein Enzym ist, kann die Reaktionskammer ein Enzymsubstrat umfassen, das nach Modifi kation des Zielanalyten detektiert werden kann. In dieser Ausführungsform kann das Reaktionsmodul die notwendigen Reagenzien enthalten, oder sie können in einem Speichermodul gespeichert und gegebenenfalls – wie hierin ausgeführt – in das Reaktionsmodul gepumpt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Reaktionsmodul eine Kammer für die chemische Modifikation der Gesamtheit oder eines Teils der Probe. Beispielsweise kann chemische Spaltung von Probenkomponenten (CNBr-Spaltung von Proteinen usw.) oder chemische Vernetzung erfolgen. PCT US 97/07880 listet eine große Anzahl möglicher chemischer Reaktionen auf, die in den Vorrichtungen der Erfindung durchgeführt werden können, z.B. Amidbildung, Acylierung, Alkylierung, reduktive Aminierung, Mitsunobu-, Diels-Alder- und Mannich-Reaktionen, Suzuki-Stille-Kopplung, chemisches Markieren usw. US-Patente 5.616.464 und 5.767.259 beschreiben eine Variation von LCR, die eine „chemische Ligation" von Sorten vorsieht. In dieser Ausführungsform wird ähnlich wie bei LCR ein Primerpaar verwendet, wobei der erste Primer im Wesentlichen komplementär zu einer ersten Domäne des Ziels ist und der zweite Primer im Wesentlichen komplementär zu einer angrenzenden zweiten Domäne des Ziels ist (doch wenn – in Bezug auf LCR – eine „Lücke" besteht, können eine Polymerase und dNTP zugesetzt werden, um diese Lücke zu „füllen"). Jeder Primer besitzt einen Abschnitt, der als „Seitenkette" dient, die die Zielsequenz nicht bindet und als eine Hälfte einer Stammstruktur agiert, die nicht-kovalent durch Wasserstoffbindung, Salzbrücken, Van-der-Waals-Kräfte usw. wechselwirkt. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden im Wesentlichen komplementäre Nucleinsäuren als Seitenketten. Somit werden nach Hybridisierung der Primer an die Zielsequenz die Seitenketten der Primer in räumliche Nähe gebracht, und wenn die Seitenketten auch Nucleinsäuren umfassen, können sie Seitenketten-Hybridisierungskomplexe bilden. Zumindest eine der Seitenketten der Primer umfasst einen aktivierbaren Vernetzer, der im Allgemeinen kovalent an die Seitenkette gebunden ist und der bei Aktivierung zu chemischer Vernetzung oder chemischer Ligation führt. Die aktivierbare Gruppe kann jede Gruppe umfassen, die Vernetzung der Seitenketten ermöglicht; es können Gruppen enthalten sein, die chemisch, photonisch und thermisch aktiviert sind, wobei photoaktivierbare Gruppen bevorzugt sind. In einigen Ausführungsformen reicht eine einzelne aktivierbare Gruppe auf einer der Seitenketten aus, um Vernetzung mittels Wechselwirkung mit einer funktionellen Gruppe auf der anderen Seitenkette hervorzurufen; in anderen Ausführungsformen sind aktivierbare Gruppen auf jeder Seitengruppe erforderlich. Außerdem kann die Reaktionskammer chemische Gruppierungen für den Schutz oder das Entschützen bestimmter funktioneller Gruppen, wie z.B. von Thiolen oder Aminen, enthalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Reaktionsmodul eine Kammer für die biologische Veränderung der Gesamtheit oder eines Teils der Probe. Beispiele dafür sind enzymatische Verfahren wie etwa Nucleinsäureamplifikation, Hydrolyse von Probekomponenten oder die Hydrolyse von Substraten durch ein Zielenzym, die Zugabe oder die Entfernung detektierbarer Marker, die Zugabe oder die Entfernung von Phosphatgruppen usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure, und die biologische Reaktionskammer ermöglicht die Amplifikation der Zielnucleinsäure. Geeignete Amplifikationstechniken sind Ziel- und Sondenamplifikation, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangumlagerungs-Amplifikation (SDA), sich selbst unterhaltende Sequenzreplikation (3SR), QB-Replikase-Amplifikation (QBR), Reparaturkettenreaktion (RCR), Zyklierungssondentechnologie oder -Reaktion (CPT oder CPR) und Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA). Techniken unter Anwendung dieser Verfahren und die Detektionsmodule der Erfindung sind in PCT US 99/01705 beschrieben. In dieser Ausführungsform umfassen die Reaktionsreagenzien im Allgemeinen zumindest ein Enzym (üblicherweise Polymerase), Primer und Nucleosidtriphosphate.
  • Allgemeine Techniken für die Nucleinsäureamplifikation sind weiter unten erläutert. In den meisten Fällen werden doppelsträngige Nucleinsäuren denaturiert, um sie einzelsträngig zu machen und dadurch die Hybridisierung der Primer und anderer Sonden der Erfindung zu ermöglichen. Eine bevorzugte Ausführungsform sieht die Durchführung eines thermischen Schritts vor, im Allgemeinen durch Erhöhen der Reaktionstemperatur auf etwa 95 °C, obwohl auch pH-Wert-Veränderungen und andere Techniken wie etwa die Verwendung zusätzlicher Sonden oder Nucleinsäurebindungsproteine in Frage kommen.
  • Eine Sondennucleinsäure (hierin auch als Primernucleinsäure bezeichnet) wird dann mit der Zielsequenz in Kontakt gebracht, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Unter „Primernucleinsäure" ist hierin eine Sondennucleinsäure zu verstehen, die an einen bestimmten Abschnitt, d.h. eine Domäne, der Zielsequenz hybridisiert. Sonden der Erfindung sind ausgebildet, gegenüber einer Zielsequenz komplementär zu sein (entweder gegenüber der Zielsequenz der Probe oder gegenüber anderen Sondensequenzen, wie dies nachstehend ausgeführt wird), so dass die Hybridisierung der Zielsequenz und der Sonden der Erfindung stattfindet. Wie dies unten erläutert wird, muss diese Komplementarität nicht perfekt sein; es kann eine beliebige Anzahl an Basenpaar-Fehlpaarungen geben, die die Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und den einzelsträngigen Nucleinsäuren der Erfindung beeinträchtigen. Doch wenn die Anzahl an Mutationen so groß ist, dass sogar unter den am wenigsten strengen Hybridisierungsbedingungen keine Hybridisierung stattfinden kann, ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz. Somit ist unter „im Wesentlichen komplementär" hierin zu verstehen, dass die Sonden gegenüber den Zielsequenzen ausreichend komplementär sind, um unter normalen Reaktionsbedingungen zu hybridisieren.
  • Zahlreiche Hybridisierungsbedingungen sind hierin möglich, z.B. Bedingungen hoher, mittlerer und geringer Strenge; siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, 1989, und Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hg. Strenge Bedingungen sind sequenzabhängig und hängen von den jeweiligen Umständen ab. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Ausführliche Informationen über die Hybridisierung von Nucleinsäuren finden sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen sind strenge Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5 °C – 10 °C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) der jeweiligen Sequenz bei einem definierten lonenstärke-pH-Wert liegt. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter/m lonenstärke, pH-Wert und Nucleinsäurekonzentration), bei der 50 % der zum Ziel komplementären Sonden bei Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren (da die Zielsequenzen bei Tm im Überschuss vorhanden sind, sind 50 % der Sonden bei Gleichgewicht besetzt). Strenge Bedingungen sehen vor, dass die Salzkonzentration unter etwa 1,0 Natriumion (oder andere Salze) liegt und typischerweise von etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumion-Konzentration reicht (bei pH 7,0 – 8,3) und dass die Temperatur zumindest etwa 30 °C für kurze Sonden (z.B. 10 – 50 Nucleotide) und zumindest etwa 60 °C für lange Sonden (z.B. mehr als 50 Nucleotide) beträgt. Strenge Bedingungen können auch durch Zugabe destabilisierender Mittel wie z.B. Formamid erreicht werden. Die Hybridisierungsbedingungen können auch variieren, wenn ein nicht-ionisches Rückgrat, d.h. PNA, verwendet wird, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist. Außerdem können nach der Zielbindung Vernetzer zugesetzt werden, um die zwei Stränge des Hybridisierungskomplexes zu vernetzen, d.h. kovalent zu binden.
  • Somit erfolgen die Tests im Allgemeinen unter strengen Bedingungen, die die Bildung des Hybridisierungskomplexes nur in Gegenwart eines Ziels ermöglichen. Die Strenge kann gesteuert werden, indem ein Parameter, d.h. eine thermodynamische Variable, während eines Schritts verändert wird; Beispiele dafür sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Temperatur, Formamidkonzentration, Salzkonzentration, pH-Wert der chaotropen Salzkonzentration, Konzentration des organischen Lösungsmittels usw.
  • Diese Parameter können auch zur Steuerung nichtspezifischer Bindung dienen, wie dies allgemein in US-Patent 5.681.697 erläutert ist. Es kann demnach wünschenswert sein, bestimmte Schritte unter Bedingungen höherer Strenge durchzuführen, um die nichtspezifische Bindung zu reduzieren.
  • Die Größe der Primernucleinsäure kann variieren, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist; sie liegt im Allgemeinen zwischen 5 und 100 Nucleotiden in der Länge. Primer zwischen 10 und 100 sind vorzuziehen, zwischen 15 und 50 besonders vorzuziehen und von 10 bis 35 am meisten vorzuziehen, wobei dies vom Verwendungszweck und von der Amplifikationstechnik abhängt. Außerdem können die unterschiedlichen Amplifikationstechniken weitere Kriterien an die Primer stellen, wie dies weiter unten ausführlich dargelegt ist.
  • Sobald der Hybridisierungskomplex zwischen dem Primer und der Zielsequenz gebildet ist, dient ein Enzym, das manchmal als „Amplifikationsenzym" bezeichnet wird, zur Modifikation des Primers. Wie für alle hierin beschriebenen Verfahren können die Enzyme zu jedem Zeitpunkt während des Tests zugesetzt werden – entweder vor, während oder nach der Zugabe der Primer. Die Identifikation des Enzyms hängt von der angewendeten Amplifikationstechnik ab, wie dies weiter unten detailliert geschildert ist. Ebenso hängt die Modifikation, wie dies weiter unten ausgeführt ist, von der Amplifikationtechnik ab, obwohl im Allgemeinen der erste Schritt aller Reaktionen hierin eine Verlängerung des Primers ist, d.h. es werden dem Primer Nucleotide zugesetzt, um ihn zu verlängern.
  • Sobald das Enzym den Primer modifiziert hat, um einen modifizierten Primer zu bilden, wird der Hybridisierungskomplex dissoziiert. Im Allgemeinen werden die Amplifikationsschritte über einen Zeitraum wiederholt, der einige Zyklen ermöglicht – dies hängt von der Anzahl an Kopien der ursprünglichen Zielsequenz und von der Sensitivität der Detektion ab, wobei Zyklen von 1 bis einige Tausend, vorzugsweise von 10 bis 100, noch bevorzugter von 20 bis 50, reichen.
  • Nach einer zweckmäßigen Amplifikationsdauer wird der modifizierte Primer in ein Detektionsmodul befördert und in einen Testkomplex inkorporiert, wie weiter unten ausführlicher ausgeführt wird. Der Testkomplex ist kovalent an eine Elektrode gebunden und umfasst zumindest eine Elektronentransfergruppierung (ETM), die unten beschrieben ist. Der Elektronentransfer zwischen der ETM und der Elektrode wird dann detektiert, um die Gegenwart oder die Abwesenheit der ursprünglichen Zielsequenz anzuzeigen, wie unten beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikation die Zielamplifikation. Die Zielamplifikation umfasst die Amplifikation (Replikation) der zu detektierenden Zielsequenz, so dass die Anzahl an Kopien der Zielsequenz erhöht wird. Geeignete Ziel amplifikationstechniken sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) PCR, SDA und NASBA.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielamplifikationstechnik PCR. PCR wird sehr häufig angewendet und beschrieben und sieht Primerverlängerung kombiniert mit zyklischer Wärmebeanspruchung vor, um eine Zielsequenz zu amplifizieren; siehe US-Patente 4.683.195 und 4.683.202 sowie PCR Essential Data, J.W. Wiley & Sons, C.R. Newton, Hg., 1995. Außerdem gibt es einige Variationen von PCR, die hierin auch in Frage kommen, z.B. „quantitative kompetitive PCR" oder „QC-PCR", „AP-PCR" (PCR mit an verschiedenen Stellen im Genom bindenden Primern), „Immuno-PCR", „Alu-PCR", „PCR-Einzelstrang-Konformationspolymorphismus" oder „PCR-SSCP", „Revers-Transkriptase-PCR" oder „RT-PCR", „Biotin-Einfang-PCR", „Vectoretten-PCR", „Panhandle-PCR" und „PCR-Select-cDNA-Subtration" u.dgl.
  • Im Allgemeinen kann PCR wie folgt beschrieben werden. Eine doppelsträngige Zielnucleinsäure wird denaturiert (im Allgemeinen durch Erhöhen der Temperatur) und dann in Gegenwart eines Überschusses eines PCR-Primers gekühlt, der dann an den ersten Zielstrang hybridisiert. Eine DNA-Polymerase dient dann dazu, den Primer zu verlängern, was zur Synthese eines neuen Strangs führt, der einen Hybridisierungskomplex bildet. Die Probe wird dann wieder erhitzt, um den Hybridisierungskomplex zu dissoziieren, und der Vorgang wiederholt. Unter Verwendung eines zweiten PCR-Primers für den komplementären Zielstrang tritt rasche und exponentielle Amplifikation ein. Somit sind die PCR-Schritte Denaturieren, Anellieren und Verlängern. Die Details von PCR sind allgemein bekannt und sehen die Verwendung thermostabiler Polymerase wie z.B. Taq-I-Polymerase und zyklische Wärmebeanspruchung vor.
  • Demzufolge erfordert die PCR-Reaktion zumindest einen PCR-Primer und eine Polymerase. Mesomaßstabs-PCR-Vorrichtungen sind in US-Patenten 5.498.392 und 5.587.128 sowie in WO 97/16561 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielamplifikationsverfahren SDA. SDA wird allgemein von Walker et al. in Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995, und in US-Patenten 5.455.166 und 5.130.238 beschrieben.
  • Im Allgemeinen kann SDA wie folgt beschrieben werden. Eine einzelsträngige Zielnucleinsäure, üblicherweise eine DNA-Zielsequenz, wird mit einem SDA-Primer in Kontakt gebracht. Ein „SDA-Primer" besitzt im Allgemeinen eine Länge von 25 – 100 Nucleotiden, wobei SDA-Primer mit etwa 35 Nucleotiden vorzuziehen sind. Ein SDA-Primer ist gegenüber einer Region am 3'-Ende der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär, und der Primer besitzt eine Sequenz an seinem 5'-Ende (außerhalb der Region, die zum Ziel komplementär ist), die eine Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuclease ist (manchmal hierin als „Nick-Enzym" oder „Nick-Endonuclease" bezeichnet; Erklärung siehe unten). Der SDA-Primer hybridisiert dann an die Zielsequenz. Das SDA-Reaktionsgemisch enthält auch eine Polymerase (eine „SDA-Polymerase", wie dies weiter unten ausgeführt ist) und ein Gemisch aller vier Desoxynucleosid-Triphosphate (auch als Desoxynucleotide oder dNTP bezeichnet, d.h. dATP, dTTP, dCTP und dGTP), wobei zumindest eine Spezies davon ein substituiertes oder modifiziertes dNTP ist; somit wird der SDA-Primer modifiziert, d.h. verlängert, um einen modifizierten Primer zu bilden, der manchmal hierin als „neu synthetisierter Strang" bezeichnet wird. Das substituierte dNTP ist solcherart modifiziert, dass es die Spaltung im Strang, der das substituierte dNTP enthält, hemmt, aber nicht die Spaltung auf dem anderen Strang hemmt. Beispiele für geeignete substituierte dNTP sind u.a. 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-Thiotriphosphat), 5-Methyldesoxycytidin-5'-triposphat, 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat und 7-Deaza-2'-desoxyguanosin-5'triphosphat. Außerdem kann die Substitution des dNTP nach der Inkorporation in einen neu synthetisierten Strang auftreten. Es kann z.B. eine Methylase verwendet werden, um Methylgruppen dem synthetisierten Strang zuzusetzen. Wenn außerdem alle Nucleotide substituiert sind, kann die Polymerase 5'-3'-Exonuclease-Aktivität aufweisen. Wenn jedoch weniger als alle Nucleotide substituiert sind, besitzt die Polymerase vorzugsweise keine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Endung offenkundig ist, kann das Erkennungsstellen/Endonuclease-Paar aus einer Vielzahl bekannter Kombinationen bestehen. Die Endonuclease ist ausgewählt, einen Strang entweder an der Erkennungsstelle oder 3' oder 5' davon entfernt zu spalten, ohne die komplementäre Sequenz zu spalten (entweder da das Enzym nur einen Strang spaltet oder aufgrund der Inkorporation der substituierten Nucleotide). Geeignete Erkennungsstellen/Endonuclease-Paare sind auf dem Gebiet allgemein bekannt; geeignete Endonucleasen sind z.B. (jedoch nicht darauf beschränkt) Hindl, Hindll, Aval, Fnu4Hl, Tthlll, Ncll, BstXI, Baml usw. Eine Tabelle mit geeigneten Enzymen und ihren korrespondierenden Erkennungsstellen sowie den zu verwendenden modifizierten dNTP findet sich in US-Patent 5.455.166.
  • Eine genickte Polymerase (eine „SDA-Polymerase") dient dazu, den neu genickten Strang 5'–3' zu verlängern, wodurch ein weiterer neu synthetisierter Strang entsteht. Die ausgewählte Polymerase sollte in der Lage sein, die 5'-3'-Polymerisation an einer Nickstelle einzuleiten, sie sollte auch den polymerisierten Strang stromab vom Nick verlagern, und sie sollte keine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität aufweisen (dies kann darüber hinaus durch Zugabe eines Blockierungsmittels erreicht werden). Demnach sind geeignete Polymerasen in SDA u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, SEQUENASE 1.0 und SEQUENASE 2.0 (U.S. Biochemcial), T5-DNA-Polymerase und Phi29-DNA-Polymerase.
  • Demzufolge erfordert die SDA-Reaktion – die folgende Reihenfolge ist willkürlich – einen SDA-Primer, eine SDA-Polymerase, eine Nick-Endonuclease und dTNP, von denen zumindest eine Spezies modifiziert ist.
  • Im Allgemeinen erfordert SDA kein Thermozyklieren. Die Reaktionstemperatur ist im Allgemeinen hoch genug, um nichtspezifische Hybridisierung zu verhindern, aber niedrig genug, um spezifische Hybridisierung zu ermöglichen; dies erfolgt im Allgemeinen je nach Enzymen von etwa 37 °C bis etwa 42 °C.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann wie in den meisten der hierin dargelegten Amplifikationstechniken eine zweite Amplifikationsreaktion unter Verwendung der komplementären Zielsequenz durchgeführt werden, was zu einer substanziellen Steigerung der Amplifikation während eines eingestellten Zeitraums führt. Eine zwei te Primernucleinsäure wird an eine zweite Zielsequenz hybridisiert, die im Wesentlichen zur ersten Zielsequenz komplementär ist, um einen zweiten Hybridisierungskomplex zu bilden. Die Zugabe des Enzyms, gefolgt von der Dissoziation des zweiten Hybridisierungskomplexes, führt zur Erzeugung einiger neu synthetisierter zweiter Stränge.
  • Auf diese Weise werden einige Zielmoleküle gebildet und in ein weiter unten beschriebenes Detektionsmodul übertragen. Wie dies nachstehend ausführlich dargelegt ist, können diese Reaktionen (d.h. die Produkte dieser Reaktionen) auf unterschiedliche Weisen detektiert werden. Im Allgemeinen kann entweder direkte oder indirekte Detektion der Zielprodukte erfolgen. Die „direkte" Detektion erfordert in diesem Zusammenhang wie im Fall der anderen hierin dargelegten Amplifikationsstrategien die Inkorporation eines Markers (hier einer ETM) in die Zielsequenz, wobei die Detektion entweder gemäß „Mechanismus-1" oder gemäß „Mechanismus-2" (siehe unten) vonstatten geht. In dieser Ausführungsform kann bzw. können die ETM in dreierlei Art inkorporiert werden: (1) Die Primer umfassen die ETM, z.B. gebunden an die Base, eine Ribose, ein Phosphat oder an analoge Strukturen in einem Nucleinsäureanalog; (2) es werden modifizierte Nucleoside verwendet, die entweder an der Base oder der Ribose (oder in analogen Strukturen in einem Nucleinsäureanalogon) mit der bzw. den ETM modifiziert sind; diese ETM-modifizierten Nucleoside werden dann in die Triphosphatform umgewandelt und durch eine Polymerase in den neu synthetisierten Strang inkorporiert; (3) ein ETM-„Schwanz" kann – wie dies unten dargelegt ist – angefügt werden. Alle diese Verfahren führen zu einem neu synthetisierten Strang, der ETM umfasst, der bzw. die direkt – wie unten beschrieben – detektierbar ist bzw. sind.
  • Alternativ dazu findet die indirekte Detektion als Sandwich-Test statt, wobei die neu synthetisierten Stränge weniger oder keine ETMs enthalten. Die Detektion erfolgt dann unter Verwendung von Markersonden, die die ETM(s) umfassen; diese Markersonden hybridisieren entweder direkt an den neu synthetisierten Strang oder an Zwischensonden wie z.B. Amplifikationssonden, wie unten ausführlicher erläutert wird. In diesem Fall sind es die ETMs auf den Markersonden, die zur Detektion verwendet werden (Erklärung siehe unten).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielamplifikationstechnik NASBA. NASBA ist allgemein in US-Patent 5.409.818 und in „Profiting from Gene-based Diagnostics", CTB International Publishing Inc., N.J., USA, 1996, beschrieben.
  • Im Allgemeinen kann NASBA wie folgt beschrieben werden. Eine einzelsträngige Zielnucleinsäure, üblicherweise eine RNA-Zielsequenz (manchmal hierin als „erste Zielsequenz" oder „erstes Templat" bezeichnet), wird mit einem ersten NASBA-Primer in Kontakt gebracht. Ein „NASBA-Primer" besitzt im Allgemeinen eine Länge von 25 – 100 Nucleotiden, wobei NASBA-Primer mit etwa 50 – 75 Nucleotiden vorzuziehen sind. Der erste NASBA-Primer ist vorzugsweise ein DNA-Primer, der an seinem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die im Wesentlichen komplementär zum 3'-Ende des ersten Templats ist. Der erste NASBA-Primer besitzt einen RNA-Polymerase-Promotor an seinem 5'-Ende. Der erste NASBA-Primer wird dann an das erste Templat hybridisiert, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden. Das NASBA-Reaktionsgemisch enthält auch ein Revers-Transkriptase-Enzym (eine „NASBA-Revers-Transkriptase") und ein Gemisch von vier dNTPs, so dass der erste NASBA-Primer modifiziert, d.h. verlängert, wird, um einen modifizierten ersten Primer zu bilden, der einen Hybridisierungskomplex von RNA (das erste Templat) und DNA (den neu synthetisierten Strang) umfasst.
  • Unter „Revers-Transkriptase" oder „RNA-gelenkter DNA-Polymerase" ist hierin ein Enzym zu verstehen, das DNA aus einem DNA-Primer und einem RNA-Templat synthetisieren kann. Geeignete RNA-gelenkte DNA-Polymerasen sind u.a. Vogel-Myloblastose-Virus-Revers-Transkriptase („AMV-RT") und Moloney-Maus-Leukämievirus-RT.
  • Zusätzlich zu den oben aufgelisteten Komponenten enthält die NASBA-Reaktion ein RNA-Abbauenzym, das hierin manchmal auch als Ribonuclease bezeichnet wird und RNA eines RNA:DNA-Hybrids ohne Hydrolysieren von einzel- oder doppelsträngiger RNA oder DNA hydrolysiert. Geeignete Ribonucleasen sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) RNase H aus E. coli und Kalbsthymus.
  • Die Ribonuclease baut das erste RNA-Templat im Hybridisierungskomplex ab, was eine Dissoziation des Hybridisierungskomplexes bewirkt und einen ersten einzelsträngigen, neu synthetisierten DNA-Strang liefert, der manchmal hierin als „zweites Templat" bezeichnet wird.
  • Außerdem umfasst die NASBA-Reaktion auch einen zweiten NASBA-Primer, der im Allgemeinen DNA enthält (obwohl wie für alle hierin angeführten Sonden, einschließlich Primern, Nucleinsäureanaloga verwendet werden können). Dieser zweite NASBA-Primer besitzt an seinem 3'-Ende eine Sequenz, die im Wesentlichen mit dem 3'-Ende des zweiten Templats komplementär ist, und enthält auch eine Antisense-Sequenz für einen funktionellen Promotor und die Antisense-Sequenz einer Transkriptionsinitiationsstelle. Somit enthält diese Primersequenz – wenn sie als Templat für die Synthese des dritten DNA-Templats verwendet wird – ausreichend Informationen, um die spezifische und effiziente Bindung einer RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription an der erwünschten Stelle zu ermöglichen. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden den Antisense-Promotor und die Transkriptionsinitiationsstelle von T7-RNA-Polymerase, obwohl andere RNA-Polymerase-Promotoren und Initiationsstellen ebenfalls verwendet werden können (Erklärung siehe unten).
  • Der zweite Primer hybridisiert an das zweite Templat, und eine DNA-Polymerase, die auch als „DNA-gerichtete DNA-Polymerase" bezeichnet wird (auch in der Reaktion vorhanden), synthetisiert ein drittes Templat (einen zweiten neu synthetisierten DNA-Strang), was in einem zweiten Hybridisierungskomplex resultiert, der zwei neu synthetisierte DNA-Stränge umfasst.
  • Schließlich führt das Vorsehen einer RNA-Polymerase und der erforderlichen vier Ribonucleosidtriphosphate (Ribonucleotide oder NTPs) zur Synthese eines RNA-Strangs (eines dritten neu synthetisierten Strangs, der im Wesentlichen der gleiche ist wie das erste Templat). Die RNA-Polymerase, die hierin manchmal als „DNA-gerichtete RNA-Polymerase" bezeichnet wird, erkennt den Promotor und initiiert RNA-Synthese in spezifischer Weise an der Initiationsstelle. Außerdem synthetisiert die RNA-Polymerase vorzugsweise mehrere RNA-Kopien pro DNA-Doppelstrang. Bevorzugte RNA-Polymerasen sind u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) T7-RNA-Poly merase und andere Bakteriophagen-RNA-Polymerasen, einschließlich jener von Phage T3, Phage ΦII, Slamonella-Phage sp6 oder Pseudomonas-Phage gh-1.
  • Demzufolge erfordert die NASBA-Reaktion – in willkürlicher Reihenfolge – einen ersten NASBA-Primer, einen zweiten NASBA-Primer, umfassend eine Antisense-Sequenz eines RNA-Polymerase-Promotors, eine RNA-Polymerase, die den Promotor erkennt, eine Revers-Transkriptase, eine DNA-Polymerase, ein RNA-Abbauenzym, NTPs und dNTPs (zusätzlich zu den unten angeführten Detektionskomponenten).
  • Diese Komponenten ergeben ein einzelnes RNA-Ausgangstemplat, das einen einzelnen DNA-Doppelstrang erzeugt; da dieser DNA-Doppelstrang jedoch zur Bildung mehrerer RNA-Stränge führt, die wieder zur Initiation der Reaktion verwendet werden können, schreitet die Amplifikation rasch voran.
  • Wie hierin ausgeführt, kann die Detektion der neu synthetisierten Stränge in unterschiedlicher Weise erfolgen. Die direkte Detektion kann im Detektionsmodul erfolgen, wenn die neu synthetisierten Stränge ETM-Marker umfassen – entweder durch Inkorporation in die Primer oder durch Inkorporation modifizierter markierter Nucleotide in den wachsenden Strang. Alternativ dazu kann – wie dies weiter unten ausführlich geschildert wird – die indirekte Detektion unmarkierter Stränge (die nun im Detektionsmodus als „Ziele" dienen) unter Anwendung mehrerer Sandwichtest-Konfigurationen erfolgen. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, ist es vorzuziehen, DNA-Stränge während NASBA zu detektieren, da die Gegenwart von Ribonuclease die RNA-Stränge möglicherweise labil macht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikationstechnik Signalamplifikation. Diese sieht die Verwendung einer begrenzten Anzahl an Zielmolekülen als Template vor, um entweder mehrere Signalisierungssonden zu erzeugen oder den Einsatz mehrerer Signalisierungssonden zu ermöglichen. Die Signalamplifikationsstrategien umfassen LCR, CPT und die Verwendung von Amplifikationssonden in Sandwichtests.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Signalamplifikationsverfahren LCR. Das Verfahren kann in zwei unterschiedlichen Weisen durchgeführt werden. In einer ersten Ausführungsform wird nur ein Strang einer Zielsequenz als Templat für die Ligation verwendet; alternativ dazu können beide Stränge benutzt werden. Siehe die allgemeinen Ausführungen in US-Patenten 5.185.243 und 5.573.907; EP 0320308 B1 ; EP 0336731 B1 ; EP 0439182 B1 ; WO 90/01069; WO 89/12696; und WO 89/09835 sowie U.S.S.N. 60/078.102 und 60/073.011.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die einzelsträngige Zielsequenz eine erste Zieldomäne und eine zweite Zieldomäne, und es werden eine erste LCR-Primer- und eine zweite LCR-Primer-Nucleinsäure zugesetzt, die im Wesentlichen mit der jeweiligen Zieldomäne komplementär sind und somit an die Zieldomänen hybridisieren. Diese Zieldomänen können direkt angrenzend, d.h. benachbart, sein, oder sie sind durch einige Nucleotide voneinander getrennt. Wenn sie nicht zusammenhängend sind, werden die Nucleotide gemeinsam mit Mitteln zur Verbindung von Nucleotiden zugesetzt, wie z.B. Polymerase, wodurch die Nucleotide an einen der Primer angefügt werden. Die zwei LCR-Primer werden dann kovalent gebunden, z.B. unter Anwendung eines Ligase-Enzyms, wie dies auf dem Gebiet allgemein bekannt ist. Dadurch entsteht ein erster Hybridisierungskomplex, der die ligierte Sonde und die Zielsequenz umfasst. Dieser Hybridisierungskomplex wird dann denaturiert (dissoziiert) und das Verfahren wiederholt, um einen Pool ligierter Sonden zu bilden. Außerdem kann es wünschenswert sein, wenn die nachstehend beschriebenen Detektionssonden eine Fehlpaarung an der Sondenverbindungsstelle aufweisen, so dass die Detektionssonde nicht als Ligationstemplat verwendet werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die LCR für zwei Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz. Die Zielsequenz wird denaturiert, und zwei Gruppen an Sonden werden zugesetzt – eine Gruppe (s.o.) für einen Strang des Ziels und eine davon getrennte Gruppe (d.h. dritte und vierte Primersonden-Nucleinsäuren) für den anderen Strang des Ziels. In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren die erste und die dritte Sonde, und es hybridisieren auch die zweite und die vierte Sonde, so dass Amplifikation eintreten kann. Wenn die erste und die zweite Sonde gebunden wurden, kann die ligierte Sonde nun als Templat verwendet werden (zusätz lich zur zweiten Zielsequenz), um die dritte und die vierte Sonde zu binden. Die ligierte dritte und die vierte Sonde dienen zusätzlich zum ersten Zielstrang als Templat für die Bindung der ersten und der zweiten Sonde. Auf diese Weise kann exponentielle statt lineare Amplifikation erfolgen.
  • Wie oben ausgeführt kann die Detektion der LCR-Reaktion direkt erfolgen, wenn ein oder beide Primer zumindest eine ETM umfasst bzw. umfassen, oder sie kann unter Anwendung von Sandwichtests indirekt mittels zusätzlicher Sonden erfolgen – die ligierten Sonden können als Zielsequenzen dienen, und die Detektion kann Amplifikationssonden, Einfangsonden, Einfang-Extendersonden, Markersonden und Marker-Extendersonden usw. verwenden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Signalamplifikationstechnik CPT. Die CPT-Technologie ist in einigen Patenten und Patentanmeldungen beschrieben, z.B. in den US-Patenten 5.011.769, 5.403.711, 5.660.998 und 4.876.187 sowie in den PCT-Anmeldungen WO 95/05480, WO 95/1416 und WO 95/00667 und U.S.S.N. 09/014.304.
  • Im Allgemeinen kann CPT wie folgt beschrieben werden. Ein CPT-Primer (hierin manchmal auch als „spaltbarer Primer" bezeichnet) umfasst zwei durch eine spaltbare Bindung voneinander getrennte Sondensequenzen. Der CPT-Primer ist im Wesentlichen zur Zielsequenz komplementär und hybridisiert somit an sie, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Die spaltbare Bindung wird dann gespalten, ohne die Zielsequenz abzuspalten, was zur Trennung der zwei Sondensequenzen führt. Die zwei Sondensequenzen können somit leichter vom Ziel dissoziiert werden und die Reaktion beliebig oft wiederholt werden. Der abgespaltete Primer wird dann wie hierin beschrieben detektiert.
  • Unter „spaltbarer Bindung" ist hierin eine Bindung innerhalb der spaltbaren Sonde zu verstehen, die gespalten werden kann, wenn die Sonde Teil eines Hybridisierungskomplexes ist, d.h. wenn ein doppelsträngiger Komplex entsteht. Es ist wichtig, dass die spaltbare Bindung nur die spaltbare Sonde und nicht die Sequenz spaltet, an die sie hybridisiert ist (d.h. entweder die Zielsequenz oder eine Sondensequenz), so dass die Zielsequenz in der Reaktion für die Amplifikation des Signals erneut verwendet werden kann. Die spaltbare Bindung kann hierin jede verknüpfende chemische Struktur sein, die zwei Sondensequenzen miteinander verbindet und in der Lage ist, ohne Spaltung der Sondensequenzen oder der Sequenz, an die die spaltbare Sonde hybridisiert ist, selektiv gespalten zu werden. Die spaltbare Bindung kann eine Einzelbindung oder eine aus mehreren Einheiten bestehende Sequenz sein. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können einige mögliche spaltbare Bindungen verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die spaltbare Bindung RNA. Dieses oben beschriebene System beruht auf der Tatsache, dass bestimmte doppelsträngige Nucleasen, insbesondere Ribonucleasen, RNA-Nucleoside aus dem RNA:DNA-Hybridisierungskomplex nicken oder herausschneiden. Von besonderem Nutzen in dieser Ausführungsform ist RNAseH, Exo III und Revers-Transkriptase.
  • In einer Ausführungsform besteht die gesamte spaltbare Sonde aus RNA, wobei das Nicken besonders dann erleichtert wird, wenn es mit einer doppelsträngigen Ribonuclease wie etwa RNAseH oder Exo III erfolgt. RNA-Sonden, die zur Gänze aus RNA-Sequenzen bestehen, sind besonders geeignet, da sie erstens leichter enzymatisch produziert werden können und zweitens mehr Spaltungsstellen besitzen, die für das Nicken oder Spalten durch ein Nickmittel wie z.B. die Ribonucleasen zugänglich sind. Somit beruhen zur Gänze aus RNA bestehende spaltbare Sonden nicht auf einer spaltbaren Bindung, da die spaltbare Bindung in der Sonde inhärent ist.
  • Wenn in einer bevorzugten Ausführungsform die spaltbare Bindung eine Nucleinsäure wie z.B. RNA ist, können die Verfahren der Erfindung zum Detektieren von Fehlpaarungen herangezogen werden, wie dies in US-Patent 5.660.988 und WO 95/14106 allgemein beschrieben ist. Diese Verfahren zum Detektieren von Fehlpaarungen beruhen auf der Tatsache, dass sich die RNAseH nicht an einen RNA:DNA-Doppelstrang binden und/oder ihn spalten kann, wenn in der Sequenz Fehlpaarungen vorhanden sind. Somit sind in den NA1-R-NA2-Ausführungsform NA1 und NA2 Nicht-RNA-Nucleinsäuren, vorzugsweise DNA. Vorzugsweise liegt die Fehlpaarung innerhalb des RNA:DNA-Doppelstrangs vor, doch in einigen Ausführungsformen be findet sich die Fehlpaarung in einer benachbarten Sequenz in unmittelbarer Nähe der erwünschten Sequenz – nahe genug, um RNAseH zu beeinflussen (im Allgemeinen innerhalb von ein oder zwei Basen). Somit ist in dieser Ausführungsform die spaltbare Bindung der Nucleinsäure solcherart ausgebildet, dass die Sequenz der spaltbaren Bindung die jeweils zu detektierende Sequenz, d.h. den Bereich der vermeintlichen Fehlpaarung, widerspiegelt.
  • In einigen Ausführungsformen der Detektion von Fehlpaarungen ist die Produktionsrate der freigesetzten Fragmente solcherart, dass die Verfahren im Wesentlichen ein ja/nein-Ergebnis liefern, wodurch die Detektion von praktisch jedem freigesetzten Fragment die Gegenwart der erwünschten Zielsequenz anzeigt. Wenn jedoch nur eine minimale Fehlpaarung vorliegt (z.B. eine 1-, 2- oder 3-Basen- Fehlpaarung oder eine 3-Basen-Deletion), wird ein bestimmtes Maß an gespaltenen Fragmenten produziert, obwohl die Zielsequenz nicht vorhanden ist. Somit wird die Produktionsrate gespaltener Fragmente und/oder die Endmenge der gespaltenen Fragmente quantifiziert, um die Gegenwart oder die Abwesenheit des Ziels anzuzeigen. Außerdem kann die Verwendung sekundärer und tertiärer spaltbarer Sonden in der vorliegenden Ausführungsform besonders nützlich sein, da sie die Differenzen zwischen einer perfekten Paarung und einer Fehlpaarung amplifizieren kann. Diese Verfahren eignen sich besonders für die Bestimmung homozygoter oder heterozygoter Zustände eines Patienten.
  • In dieser Ausführungsform ist ein wichtiges Merkmal der spaltbaren Bindung, dass ihre Länge durch die vermutete Differenz zwischen dem Ziel und der Sonde bestimmt wird. Insbesondere bedeutet dies, dass die spaltbare Bindung eine ausreichende Länge aufweisen muss, damit sie die vermutete Differenz umfasst, und doch kurz genug sein muss, um nicht „spezifisch" an das ausgewählte Nucleinsäuremolekül hybridisieren zu können, wenn die vermutete Differenz vorhanden ist; eine solche unerwünschte Hybridisierung würde die Exzision und somit die Spaltung von spaltbaren Bindungen ermöglichen, obwohl das ausgewählte Nucleinsäuremolekül nicht vollkommen komplementär zur Nucleinsäuresonde ist. Somit besitzt in einer bevorzugten Ausführungsform die spaltbare Bindung eine Länge von 3 bis 5 Nucleotiden, so dass eine vermutete Nucleotiddifferenz von 1 Nucleotid bis zu 3 Nucleotiden in der spaltbaren Bindung enthalten ist und sich 0, 1 oder 2 Nucleotide auf beiden Seiten der Differenz befinden.
  • Wenn demnach die spaltbare Bindung Nucleinsäure ist, verwenden bevorzugte Ausführungsform von 1 bis etwa 100 Nucleotide, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 20, noch bevorzugter von etwa 5 bis etwa 10.
  • CPT kann enzymatisch oder chemisch durchgeführt werden. Zusätzlich zu RNAseH gibt es mehrere andere Spaltmittel, die sich zur Spaltung von spaltbaren Bindungen von RNA (oder anderen Nucleinsäuren) eignen. Beispielsweise wurde über verschiedene chemische Nucleasen berichtet; siehe z.B. Sigman et al., Annu. Rev. Biochem. 59, 207 – 236 (1990); Sigman et al., Chem. Rev. 93, 2295 – 2316 (1993); Bashkin et al., J. Org. Chem. 55, 5125 – 5132 (1990); und Sigman et al., Nucleic Acids and Molecular Biology, Bd. 3, F. Eckstein und D.M.J. Lilley, Hrsg., Springer-Verlag, Heidelberg 1989, S. 13 – 27.
  • Spezifische RNA-Hydrolyse ist auch ein gut erforschter Bereich; siehe z.B. Chin, Acc. Chem. Res. 24, 145 – 152 (1991); Breslow et al., Tetrahedron 47, 2365 – 2376 (1991); Anslyn et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36, 432 – 450 (1997); und die dort angeführten Publikationen, die alle hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind. Reaktive Phosphatzentren sind bei der Entwicklung spaltbarer Bindungen ebenfalls von Interesse; siehe Hendry et al., Prog. Inorg. Chem.: Bioinorganic Chem. 31, 201 – 258 (1990).
  • Aktuelle Verfahren für die ortsgerichtete RNA-Hydrolyse umfassen die Konjugation einer reaktiven Gruppierung, die zur Spaltung von Phosphodiesterbindungen fähig ist, mit einem Erkennungselement, das zur sequenzspezifischen Hybridisierung an RNA fähig ist. In den meisten Fällen ist ein Metallkomplex kovalent an einem DNA-Strang gebunden, der einen stabilen Heterodoppelstrang bildet. Nach der Hybridisierung wird eine Lewis-Säure in unmittelbarer Nähe des RNA-Rückgrats gebracht, um die Hydrolyse durchzuführen; siehe Magda et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 7439 (1994); Hall et al., Chem. Biology 1, 185 – 190 (1994); Bashkin et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 5981 – 5982 (1994); Hall et al., Nucleic Acids Res. 24, 3522 (1996); Magda et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 2293 (1997); und Magda et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 6947 (1997).
  • In ähnlicher Weise wurde aufgezeigt, dass DNA-Polyamin-Konjugate ortsgerichtete RNA-Strang-Spaltung hervorrufen; siehe z.B. Yoshinari et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 5899 – 5901 (1991); Endo et al., J. Org. Chem. 62, 846 (1997); und Barbier et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 3511 – 3515 (1992).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die spaltbare Bindung nicht notwendigerweise RNA. Beispielsweise können spaltbare chemische Gruppierungen dazu dienen, basische Stellen in Nucleinsäuren zu spalten; siehe Belmont et al., New J. Chem. 21, 47 – 54 (1997); und die dort angeführten Publikationen, die alle ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen sind. Ebenso kommen lichtspaltbare Gruppierungen, z.B. unter Verwendung von Übergangsmetallen, in Frage; siehe Moucheron et al., Inorg. Chem. 36, 584 – 592 (1997).
  • Andere Ansätze beruhen auf chemischen Gruppierungen oder Enzymen; siehe z.B. Keck et al., Biochemistry 34, 12029 – 12037 (1995); Kirk et al., Chem. Commun., in Druck (1998); auf der Spaltung von G-U-Basenpaaren durch Metallkomplexe; siehe Biochemistry 31, 5423 – 5429 (1992); auf Diaminkomplexen für die Spaltung von RNA; Komiyama et al., J. Org. Chem. 62, 2155 – 2160 (1997); und Chow et al., Chem. Rev. 97, 1489 – 1513 (1997); sowie die dort angeführten Literaturhinweise.
  • Der erste Schritt des CPT-Verfahrens erfordert das Hybridisieren eines primären spaltbaren Primers (auch als primäre spaltbare Sonde bezeichnet) an das Ziel. Dies erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur, die sowohl die Bindung der längeren primären Sonde als auch die Dissoziation der kürzeren gespaltenen Abschnitte der primären Sonde ermöglicht, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Wie hierin dargelegt, kann dies in Lösung erfolgen, oder es können entweder das Ziel oder eine oder mehrere der spaltbaren Sonden an einen festen Träger gebunden sein. Beispielsweise ist es möglich, „Ankersonden" auf einem festen Träger oder der Elektrode zu verwenden, die im Wesentlichen zu einem Abschnitt der Zielsequenz komplementär sind (vorzugsweise handelt es sich um eine Sequenz, die nicht die gleiche Sequenz ist, an die sich eine spaltbare Sonde bindet).
  • Ebenso besitzt – wie dies hierin dargelegt ist – eine bevorzugte Ausführungsform eine oder mehrere spaltbare Sonden, die an einen festen Träger wie z.B. einer Perle gebunden ist bzw. sind. In dieser Ausführungsform diffundiert das lösliche Ziel, so dass die Bildung des Hybridisierungskomplexes zwischen der löslichen Zielsequenz und der an den Träger gebundenen spaltbaren Sonde ermöglicht wird. In dieser Ausführungsform kann es wünschenswert sein, zusätzliche spaltbare Bindungen in den spaltbaren Sonden vorzusehen, um die Freisetzung zweier oder mehrerer Sondensequenzen zu ermöglichen, so dass mehr als eine Sondensequenz pro spaltbarer Sonde detektiert werden kann, wie dies hierin beschrieben wird, und auf diese Weise das Signal maximiert werden kann.
  • In dieser Ausführungsform (und in anderen hierin vorgestellten Techniken) sehen bevorzugte Verfahren Schneid- oder Schertechniken vor, um die die Zielsequenz enthaltende Nucleinsäureprobe zu einer Größe zu schneiden, die ausreichende Diffusion der Zielsequenz in die Perlenoberfläche ermöglicht. Dies kann bewerkstelligt werden, indem die Nucleinsäure durch mechanische Kräfte geschoren oder die Nucleinsäure mittels Restriktions-Endonucleasen gespalten wird. Alternativ dazu kann ein das Ziel enthaltende Fragment unter Verwendung von Polymerase, Primern und der Probe als Templat erzeugt werden (z.B. im Fall von PCR). Darüber hinaus ist auch die Amplifikation des Ziels mittels PCR oder LCR oder verwandter Verfahren möglich; dies eignet sich besonders dann, wenn die Zielsequenz in der Probe in einer extrem niedrigen Anzahl an Kopien vorhanden ist. Ebenso sind auf dem Gebiet zahlreiche Techniken bekannt, um die Misch- und Hybridisierungsrate zu steigern, z.B. Schütteln, Erhitzen, Techniken zur Erhöhung der Gesamtkonzentration wie etwa Fällen, Trocknen, Dialyse, Zentrifugieren, Elektrophorese, magnetische Perlenkonzentration usw.
  • Im Allgemeinen werden die spaltbaren Sonden in einem Molüberschuss in ihre Ziele eingebracht (einschließlich der Zielsequenz oder anderer spaltbarer Sonden, z.B. wenn sekundäre oder tertiäre spaltbare Sonden verwendet werden); das Verhältnis zwischen spaltbarer Sonde und Ziel beträgt vorzugsweise zumindest 100:1, noch bevorzugter etwa zumindest 1000:1 und am bevorzugtesten zumindest etwa 10.000:1. In einigen Ausführungsformen ist der Überschuss von Sonde:Ziel viel größer. Außerdem können Verhältnisse wie diese für alle hierin offenbarten Amplifikationstechniken verwendet werden.
  • Sobald der Hybridisierungskomplex zwischen der primären spaltbaren Sonde und dem Ziel gebildet ist, wird der Komplex Spaltungsbedingungen ausgesetzt. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, hängt dies von der Zusammensetzung der spaltbaren Sonde ab: Wenn es sich um RNA handelt, wird RNAseH eingeführt. Es ist zu beachten, dass unter bestimmten Umständen, wie sie z.B. allgemein in WO 95/00666 und in WO 95/00667 beschrieben sind, die Verwendung eines doppelsträngigen Bindungsmittels wie z.B. RNAseH die Fortsetzung der Reaktion bei Temperaturen sogar über der Tm des Hybridisierungskomplexes aus primärer Sonde und Ziel ermöglichen kann. Demzufolge kann die Zugabe von spaltbarer Sonde zum Ziel entweder vor jener des Spaltungsmittels und vor der Einstellung der Spaltbedingungen erfolgen, oder es können die Sonden in Gegenwart des Spaltmittels oder unter Spaltbedingungen zugesetzt werden.
  • Die Spaltbedingungen führen zur Trennung der zwei (oder mehrerer) Sondensequenzen der primären spaltbaren Sonde. In der Folge bleiben die kürzeren Sondensequenzen nicht mehr an der Zielsequenz hybridisiert, wodurch der Hybridisierungskomplex dissoziiert; die Zielsequenz bleibt somit intakt. Die optimale Temperatur zur Durchführung der CPT-Reaktionen liegt im Allgemeinen bei etwa 5 °C bis etwa 25 °C unter den Schmelztemperaturen des Sonde-Ziel-Hybridisierungskomplexes. Dies sorgt für rasche Hybridisierungsrate und hohen Spezifitätsgrad für die Zielsequenz. Die Tm des jeweiligen Hybridisierungskomplexes hängt von der Salzkonzentration, dem G-C-Gehalt und der Länge des Komplexes ab, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • Während der Reaktion kann es – wie im Falle der anderen hierin vorgestellten Amplifikationstechniken – notwendig sein, die Spaltung der Sonde und der Zielsequenz durch nichtspezifische Nucleasen zu unterdrücken. Solche Nucleasen werden im All gemeinen während der Isolation der DNA durch Heiz- oder Extraktionsverfahren aus der Probe entfernt. Einige Inhibitoren einzelsträngiger Nucleasen, wie z.B. Vanadat, die Inhibitoren it-ACE und RNAsin, ein Plazentaprotein, üben keinen Einfluss auf die Aktivität von RNAseH aus. Dies ist je nach Reinheit der RNAseH und/oder der Zielprobe möglicherweise nicht notwendig.
  • Diese Schritte werden wiederholt, damit die Reaktion über einen Zeitraum fortschreiten kann. Die Reaktion wird üblicherweise etwa 15 Minuten bis etwa 1 Stunde lang durchgeführt. Im Allgemeinen wird jedes Molekül der Zielsequenz zwischen 100- und 1000-mal während dieses Zeitraums umgesetzt, wobei dies von der Länge und Sequenz der Sonde, den spezifischen Reaktionsbedingungen und dem Spaltverfahren abhängt. Für jede Kopie der Zielsequenz, die in der Testprobe vorhanden ist, werden 100 bis 1000 Moleküle durch RNAseH gespalten. Höhere Amplifikationswerte können erreicht werden, indem man die Reaktion länger ablaufen lässt oder indem man sekundäre, tertiäre oder quaternäre Sonden verwendet, wie dies hierin veranschaulicht wird.
  • Nach Abschluss der Reaktion (wird im Allgemeinen anhand des Zeitraums oder der Menge der Spaltung bestimmt) müssen die ungespaltenen spaltbaren Sonden vor der Detektion entfernt oder neutralisiert werden, so dass sich die ungespaltene Sonde nicht an eine Detektionssonde bindet, was falsch-positive Signale hervorrufen würde. Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, wie dies weiter unten allgemein beschrieben ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Trennung durch Verwendung eines festen Trägers (entweder eine Innenfläche der Vorrichtung oder in der Vorrichtung eingeschlossene Perlen), der die primäre Sonde enthält, erleichtert. Wenn demnach die spaltbaren Sonden an den festen Träger gebunden sind, kann der Fluss der Probe an diesem festen Träger vorbei zur Entfernung der ungespaltenen Sonden führen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beruht die Trennung auf Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte, um die längere ungespaltene Sonde von den kürzeren ge spaltenen Sondensequenzen zu trennen, wie dies auf dem Gebiet bekannt und hierin beschrieben ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beruht die Trennung auf der Fällung mit starker Säure. Dies eignet sich zur Trennung längerer Fragmente (mit im Allgemeinen mehr als 50 Nucleotiden) von kürzeren Fragmenten (von im Allgemeinen etwa 10 Nucleotiden). Die Einführung einer starken Säure wie z.B. Trichloressigsäure in die Lösung (im Allgemeinen aus einem Speichermodul) bewirkt die Ausfällung der längeren Sonde, während die kleineren gespaltenen Fragmente in Lösung bleiben. Die Verwendung von Fritten oder Filtern kann den Niederschlag entfernen, und die gespaltenen Sondensequenzen können quantifiziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die spaltbare Sonde sowohl eine ETM als auch einen Affinitätsbindungsliganden oder eine Affinitätsbindungsgruppierung, so dass ein Affinitätsträger dazu dient, die Trennung durchzuführen. In dieser Ausführungsform ist es wichtig, dass die zur Detektion verwendete ETM nicht auf der gleichen Sondensequenz positioniert ist, die die Affinitätsgruppierung enthält, so dass die Entfernung der ungespaltenen Sonde und der die Affinitätsgruppe enthaltenden gespaltenen Sonde nicht alle detektierbaren ETMs entfernt. Alternativ dazu darf die spaltbare Sonde keine kovalent gebundene ETM enthalten, jedoch nur einen Affinitätsmarker. Geeignete Affinitätsgruppen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Biotin, Avidin, Streptavidin, Lectine, Haptene, Antikörper usw. Der Bindungspartner der Affinitätsgruppierung ist an einen festen Träger gebunden (wiederum handelt es sich entweder um eine Innenfläche der Vorrichtung oder um in der Vorrichtung eingeschlossene Perlen), und der Fluss der Probe an diesem Träger vorbei dient dazu, die ungespaltenen Sonden herauszuziehen, wie dies auf dem Gebiet bekannt ist. Die gespaltenen Sondensequenzen, die die Affinitätsgruppierung nicht enthalten, bleiben in Lösung und können dann – wie unten dargelegt – detektiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist – ähnlich wie in der obigen Ausführungsform – eine Trennsequenz von Nucleinsäuren in der spaltbaren Sonde enthalten, die während der Reaktion nicht gespalten wird. Eine zur Trennsequenz komplementäre Nucleinsäure wird an einen festen Träger gebunden und dient als Einfangsequenz. Vorzugsweise wird die Trennsequenz den spaltbaren Sonden zugesetzt und wird nicht von der Zielsequenz erkannt, so dass die generalisierte Einfangsequenz in unterschiedlichen Tests verwendet werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die ungespaltene Sonde durch die Zugabe einer im Wesentlichen komplementären Neutralisierungsnucleinsäure, die im Allgemeinen aus einem Speichermodul stammt, neutralisiert. Dies eignet sich besonders in Ausführungsformen, die Einfangsequenzen, Trennsequenzen und Ein-Schritt-Systeme vorsehen, da das Komplement zu einer Einfangsequenzen enthaltenden Sonde Hybridisierungskomplexe bildet, die infolge ihrer Länge stabiler sind als der aus gespaltener Sondensequenz und Detektionssonde bestehende Komplex. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, ist die vollständige Entfernung der ungespaltenen Sonde nicht erforderlich, da die Detektion auf Elektronentransfer durch Nucleinsäure beruht; es ist hingegen wichtig, dass die ungespaltene Sonde nicht zur Bindung an eine Detektionselektrodensonde zur Verfügung steht, die für gespaltene Sequenzen spezifisch ist. Somit erfolgt in einer Ausführungsform dieser Schritt im Detektionsmodul, und die Neutralisierungsnucleinsäure ist eine Detektionssonde auf der Oberfläche der Elektrode und befindet sich an einer getrennten „Adresse", so dass das Signal aus dem Neutralisierungshybridisierungskomplex nicht zum Signal der gespaltenen Fragmente beiträgt. Alternativ dazu kann die Neutralisierungsnucleinsäure an einen festen Träger gebunden sein; die Probe fließt an der Neutralisierungsfläche vorbei, um die Reaktion zu quenchen, und tritt somit nicht in das Detektionsmodul ein.
  • Nach der Entfernung oder Neutralisierung der ungespaltenen Sonde wird die Detektion mittels Zugabe der gespaltenen Sondensequenzen zum Detektionsmodul fortgesetzt (siehe unten), das entweder mit „Mechanismus-1 "- oder „Mechanismus-2"-Systemen arbeitet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden keine Sonden höherer Ordnung verwendet, und die Detektion basiert auf der oder den Sondensequenzen) des primären Primers. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumindest eine, vor zugsweise mehr, sekundäre Sonden (hierin auch als sekundäre Primer bezeichnet) verwendet. Die sekundären spaltbaren Sonden können der Reaktion in unterschiedlicher Weise zugesetzt werden. Es ist entscheidend, dass die sekundären spaltbaren Sonden an der Hybridisierung an den ungespaltenen primären Sonden gehindert werden, da dies die Erzeugung eines falsch-positiven Signals bewirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die primären und sekundären Sonden an feste Träger gebunden. Erst nach Hybridisierung der primären Sonden mit dem Ziel – was zur Spaltung und Freisetzung primärer Sondensequenzen aus der Perle führt – können sich die nun diffusionsfähigen primären Sondensequenzen an die sekundären Sonden binden. Die primären Sondensequenzen dienen ihrerseits als Ziele für die sekundären spaltbaren Sonden, was die Spaltung und Freisetzung sekundärer Sondensequenzen nach sich zieht. In einer alternativen Ausführungsform erfolgt die gesamte Reaktion in Lösung. In dieser Ausführungsform werden primäre Sonden zugesetzt, die Reaktion wird für einige Zeit durchgeführt, und die ungespaltenen primären spaltbaren Sonden werden entfernt (s.o.}. Die sekundären Sonden werden dann zugesetzt und die Reaktion fortgesetzt. Die sekundären ungespaltenen Sonden werden anschließend entfernt und die gespaltenen Sequenzen detektiert, wie dies allgemein hierin erläutert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumindest eine, vorzugsweise mehr, tertiäre Sonden verwendet. Die tertiären spaltbaren Sonden können der Reaktion in unterschiedlicher Weise zugesetzt werden. Es ist wichtig, dass die tertiären spaltbaren Sonden an der Hybridisierung an die ungespaltenen sekundären Sonden gehindert werden, da dies die Erzeugung eines falsch-positiven Signals bewirkt. Diese Verfahren werden im Allgemeinen gemäß den obigen Ausführungen durchgeführt. Es können ebenso quaternäre Sonden verwendet werden.
  • Somit erfordert CPT – wiederum in willkürlicher Reihenfolge – einen ersten CPT-Primer, der eine erste Sondensequenz umfasst, eine spaltbare Bindung und eine zweite Sondensequenz; sowie ein Spaltmittel.
  • Auf diese Weise führt CPT zur Erzeugung einer großen Menge gespaltener Primer, die dann – wie unten ausgeführt – detektiert werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Signalamplifikationsverfahen ein „Sandwichtest", wie er allgemein in folgenden Publikationen beschrieben ist: U.S.S.N. 60/073.011; US-Patente 5.681.701, 5.597.909, 5.545.730, 5.594.117, 5.591.584, 5.571.670, 5.580.731, 5.571.670, 5.591.584, 5.624.802, 5.635.352, 5.594.118, 5.359.100, 5.124.246 und 5.681.697. Obwohl Sandwichtests keine Veränderung von Primern bewirken, können sie als Signalamplifikationstechniken angesehen werden, da mehrere Signale (d.h. Markersonden) an ein einzelnes Ziel gebunden sind, was zur Amplifikation des Signals führt. Sandwichtests werden dann durchgeführt, wenn die Zielsequenz wenige oder keine ETM-Marker enthält, d.h. wenn eine sekundäre Sonde mit den ETM-Markern zur Erzeugung des Signals herangezogen wird.
  • Wie hierin angeführt, ist zu beachten, dass die Sandwichtests zur Detektion primärer Zielsequenzen (z.B. aus einer Patientenprobe) oder als Verfahren zum Detektieren des Produkt einer Amplifikationsreaktion (s.o.) dienen; somit kann jeder der oben erwähnten neu synthetisierten Stränge, z.B. mittels PCR, LCR, NASBA, SDA usw., als „Zielsequenz" in einem Sandwichtest verwendet werden.
  • Im Allgemeinen können Sandwich-Signalamplifikationstechniken wie folgt beschrieben werden. Die unten beschriebenen Reaktionen können entweder im Reaktionsmodul erfolgen, wobei anschließend die Übertragung in das Detektionsmodul zwecks Detektion stattfindet, oder sie erfolgen im Detektionsmodul, dem die erforderlichen Komponenten zugesetzt sind; um Missverständnisse auszuschließen, werden sie nachstehend erläutert.
  • Als vorbereitende Maßnahme können, wie dies ausführlich unten beschrieben ist, Einfang-Extendersonden der Zielsequenz zugesetzt werden, damit die Bindung an eine Elektrode im Detektionsmodul stattfindet.
  • Die Verfahren umfassen die Zugabe einer Amplifikatorsonde, die an die Zielsequenz hybridisiert ist, wobei dies entweder direkt oder durch die Verwendung einer oder mehrerer Marker-Extendersonden erfolgt (auf diese Weise wird die Bildung „generischer" Amplifikatorsonden ermöglicht). Vorzugsweise enthält die Amplifikatorsonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen, obwohl in einigen Ausführungsformen – wie nachstehend geschildert – die Amplifikatorsonde nur eine einzelne Amplifikationssequenz oder zumindest zwei Amplifikationssequenzen enthalten kann. Die Amplifikatorsonde kann einige unterschiedliche Formen annehmen: eine verzweigte Konformation, eine Dendrimerkonformation oder eine lineare „Kette" von Amplifikationssequenzen. Markersonden mit ETMs hybridisieren dann an die Amplifikationssequenzen (oder es hybridisieren in einigen Fällen die Markersonden direkt an die Zielsequenz), und die ETMs werden unter Verwendung der Elektrode detektiert, wie dies unten veranschaulicht ist.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können die Systeme der Erfindung unterschiedliche Konfigurationen aufweisen. Im Allgemeinen gibt es drei geeigneten Systemtypen, die verwendet werden können: (1) „Nicht-Sandwichsysteme" (hierin auch als „direkte" Detektion bezeichnet), worin die Zielsequenz selbst mit ETMs markiert wird (entweder da die Primer ETMs umfassen oder infolge der Inkorporation von ETMs in den neu synthetisierten Strang); (2) Systeme, in denen sich Markersonden direkt an die Zielanalyten binden; und (3) Systeme, in denen sich Markersonden indirekt an die Zielsequenzen binden, z.B. durch Verwendung von Amplifikatorsonden.
  • Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine Amplifikatorsonde umfassen. Unter „Amplifikatorsonde" oder „Nucleinsäuremultimer" oder „Amplifikationsmultimer" bzw. grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken versteht man hierin eine Nucleinsäuresonde, die zur Erleichterung der Signalamplifikation dient. Amplifikatorsonden umfassen zumindest eine einzelsträngige Nucleinsäure-Sondensequenz (Definition siehe unten) und zumindest eine einzelsträngige Nucleinsäure-Amplifikationssequenz, wobei eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen vorzuziehen ist.
  • Amplifikatorsonden umfassen eine erste Sondensequenz, die entweder direkt oder indirekt dazu dient, an die Zielsequenz zu hybridisieren. Die Amplifikatorsonde selbst kann eine erste Sondensequenz aufweisen, die im Wesentlichen zur Zielsequenz komplementär ist, oder sie besitzt eine erste Sondensequenz, die im Wesentlichen zu einem Abschnitt einer zusätzlichen Sonde komplementär ist (in diesem Fall als Marker-Extendersonde bezeichnet, die einen ersten Abschnitt besitzt, der im Wesentlichen zur Zielsequenz komplementär ist). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz.
  • Im Allgemeinen besitzt – wie dies für alle hierin vorgestellten Sonden gilt – die erste Sondensequenz eine Länge, die ausreicht, um Spezifität und Stabilität zu verleihen. Somit sind die Sondensequenzen der Erfindung, die ausgebildet sind, um an eine andere Nucleinsäure zu hybridisieren (d.h. Sondensequenzen, Amplifikationssequenzen, Abschnitte oder Domänen größerer Sonden), zumindest etwa 5 Nucleoside lang, vorzugsweise zumindest 10 Nucleoside, am bevorzugtesten zumindest etwa 15 Nucleoside.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Amplifikatorsonden – oder beliebige andere Sonden der Erfindung – Haarnadel-Stammschleifenstrukturen in Abwesenheit ihres Ziels aufweisen. Die Länge der doppelsträngigen Stammsequenz ist solcherart ausgewählt, dass die Haarnadelstruktur in Gegenwart des Ziels nicht bevorzugt ist. Die Verwendung dieser Sondentypen kann in den Systemen der Erfindung oder in anderen Nucleinsäure-Detektionssystemen zu einer signifikanten Reduktion an nichtspezifischer Bindung und somit zu einer Erhöhung des Signal/ Rausch-Verhältnisses führen.
  • Im Allgemeinen umfassen diese Haarnadelstrukturen vier Komponenten. Die erste Komponente ist eine Zielbindungssequenz, d.h. eine Region, die zum Ziel komplementär ist (die die Probenzielsequenz oder eine andere Sondensequenz sein kann, an die Bindung erwünscht ist); die Länge beträgt etwa 10 Nucleoside, vorzugsweise etwa 15 Nucleoside. Die zweite Komponente ist eine Schleifensequenz, die die Bildung von Nucleinsäureschleifen erleichtern kann. Insbesondere vorzuziehen sind in dieser Hinsicht Wiederholungen von GTC (bildet im Fall des Fragile-X-Syndroms Kehren). (Wenn PNA-Analoga verwendet werden, sind möglicherweise Kehren mit Prolinresten zu bevorzugen.) Im Allgemeinen werden drei bis fünf Wiederholungen verwendet, wobei vier bis fünf vorzuziehen sind. Die dritte Komponente ist eine selbstkomplementäre Region, die einen ersten Abschnitt, der zu einem Abschnitt der Zielsequenzregion komplementär ist, und einen zweiten Abschnitt, der einen ersten Abschnitt der Markersonden-Bindungssequenz umfasst, besitzt. Die vierte Komponente ist zu einer Markersonde (oder zu einer anderen Sonde) im Wesentlichen komplementär. Die vierte Komponente umfasst außerdem ein „kohäsives Ende", d.h. einen Abschnitt, der nicht an einen anderen Abschnitt der Sonde hybridisiert, und enthält vorzugsweise die meisten – wenn nicht sogar alle – ETMs. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können beliebige oder alle der hierin beschriebenen Sonden konfiguriert sein, Haarnadeln in Abwesenheit ihrer Ziele zu bilden (einschließlich der Amplifkator-, Einfang-, Einfangextender-, Marker- und Markerextender-Sonden).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere unterschiedliche Amplifikatorsonden verwendet, jede mit ersten Sondensequenzen, die an einen unterschiedlichen Abschnitt der Zielsequenz hybridisieren. Es gibt demnach mehr als ein Amplifikationsniveau: Die Amplifikatorsonde liefert Signalamplifikation infolge einer Vielzahl an Markierereignissen, und es werden mehrere unterschiedliche Amplifikatorsonden – jede mit dieser Vielzahl an Markern – für jede Zielsequenz verwendet. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden somit zumindest zwei unterschiedliche Pools an Amplifikatorsonden, wobei jeder Pool eine unterschiedliche Sondensequenz für die Hybridisierung an unterschiedliche Abschnitte der Zielsequenz aufweist; die einzige echte Einschränkung hinsichtlich der Anzahl unterschiedlicher Amplifikatorsonden ist die Länge der ursprünglichen Zielsequenz. Außerdem ist es möglich, dass die unterschiedlichen Amplifikatorsonden verschiedene Amplifikationssequenzen enthalten, obwohl dies im Allgemeinen nicht vorzuziehen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert die Amplifikatorsonde nicht an die Probenzielsequenz direkt, sondern an einen ersten Abschnitt der Marker-Extendersonde. Dies ist besonders insofern nützlich, als die Verwendung „generischer" Amplifikatorsonden ermöglicht wird, d.h. von Amplifikatorsonden, die mit einer Vielzahl unterschiedlicher Ziele verwendet werden können. Dies kann wünschenswert sein, da mehrere der Amplifikatorsonden spezielle Synthesetechniken erfordern. Somit ist die Zugabe einer relativ kurzen Sonde als Marker-Extendersonde vorzuziehen. Die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde ist zu einem ersten Abschnitt oder einer ersten Domäne einer ersten einzelsträngigen Markerextender-Nucleinsäuresonde im Wesentlichen komplementär. Die Marker-Extendersonde enthält auch einen zweiten Abschnitt oder eine zweite Domäne, die zu einem Abschnitt der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär ist. Beide Abschnitte besitzen vorzugsweise eine Länge von zumindest etwa 10 bis etwa 50 Nucleotiden, wobei ein Bereich von etwa 15 bis etwa 30 vorzuziehen ist. Die Ausdrücke „erster/erste/erstes" und „zweiter/zweite/zweites" sollen in Bezug auf die 5'-3'-Orientierung der Ziel- oder Sondensequenzen keinerlei Sequenzorientierung verleihen. Unter der Annahme einer 5'-3'-Orientierung der komplementären Zielsequenz z.B. kann sich der erste Abschnitt entweder 5' vom zweiten Abschnitt oder 3' vom zweiten Abschnitt befinden. Aus praktischen Gründen ist die Reihenfolge der Sondensequenzen hierin im Allgemeinen von links nach rechts dargestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann mehr als ein Marker-Extendersonde-Amplifikatorsonde-Paar verwendet werden. Es können somit mehrere Marker-Extendersonden verwendet werden, wobei jede einen Abschnitt besitzt, der zu einem anderen Abschnitt der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär ist; dies kann als weiteres Amplifikationsniveau dienen. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet somit Pools von zumindest zwei Marker-Extendersonden, wobei die obere Grenze von der Länge der Zielsequenz gebildet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird mehr als eine Marker-Extendersonde mit einer einzelnen Amplifikatorsonde verwendet, um nichtspezifische Bindung zu reduzieren; dies ist allgemein in US-Patent 5.681.697 beschrieben. In dieser Ausführungsform hybridisiert ein erster Abschnitt der ersten Marker-Extendersonde an einen ersten Abschnitt der Zielsequenz, und der zweite Abschnitt der ersten Marker-Extendersonde hybridisiert an eine erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde. Ein erster Abschnitt der zweiten Marker-Extendersonde hybridisiert an einen zweiten Abschnitt der Zielsequenz, und der zweite Abschnitt der zweiten Marker-Extendersonde hybridisiert an eine zweite Sondensequenz der Amplifikatorsonde. Diese bilden Strukturen, die manchmal als „Kreuzform"-Strukturen oder -Konfigurationen bezeich net werden; ihr Zweck besteht im Allgemeinen darin, Stabilität zu verleihen, wenn große verzweigte oder dendrimere Amplifikatorsonden verwendet werden.
  • Außerdem können, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, die Marker-Extendersonden mit einer Präamplifikatorsonde (siehe unten) – eher als direkt mit der Amplifikatorsonde – wechselwirken.
  • Wie oben skizziert, verwendet eine bevorzugte Ausführungsform mehrere unterschiedliche Amplifikatorsonden, jeweils mit ersten Sondensequenzen, die an einen unterschiedlichen Abschnitt der Marker-Extendersonde hybridisieren. Außerdem ist es – wie oben erwähnt – auch möglich, dass die unterschiedlichen Amplifikatorsonden verschiedene Amplifikationssequenzen enthalten, obwohl dies im Allgemeinen nicht vorzuziehen ist.
  • Zusätzlich zur ersten Sondensequenz umfasst die Amplifikatorsonde auch zumindest eine Amplifikationssequenz. Eine „Amplifikationssequenz" oder ein „Amplifikationssegment" bzw. grammatikalisch gleichwertige Ausdrücke ist hierin eine Sequenz, die entweder direkt oder indirekt dazu verwendet wird, sich an einen ersten Abschnitt einer Markersonde zu binden, wie dies ausführlich unten erklärt wird (obwohl sich in einigen Fällen die Amplifikationssequenz an eine Detektionssonde binden kann). Vorzugsweise umfasst die Amplifikatorsonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen, wobei etwa 3 bis etwa 1000 vorziehen, etwa 10 bis etwa 100 besonders vorzuziehen und etwa 50 besonders vorzuziehen sind. In einigen Fällen – z.B. bei Verwendung linearer Amplifikatorsonden – sind 1 bis etwa 20 vorzuziehen und etwa 5 bis etwa 10 besonders vorzuziehen.
  • Die Amplifikationssequenzen können in unterschiedlicher Weise miteinander verbunden sein, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Sie können kovalent direkt miteinander oder, mit dazwischen liegenden Sequenzen oder chemischen Gruppierungen, über Nucleinsäurebindungen, wie z.B. Phosphodiesterbindungen, PNA-Bindungen usw., oder durch zwischengeschaltete Verbindungsmittel, wie z.B. Aminosäure-, Kohlenhydrat- oder Polyolbrücken, oder durch andere Vernetzer oder Bindungspartner verknüpft sein. Die Verbindungsstelle(n) können an den Enden eines Segments und/oder an einem oder mehreren internen Nucleotiden im Strang positioniert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Amplifikationssequenzen über Nucleinsäurebindungen gebunden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden verzweigte Amplifikatorsonden verwendet (siehe die allgemeine Beschreibung in US-Patent 5.124.246, das hierin durch Verweis aufgenommen ist). Verzweigte Amplifikatorsonden können „gabelähnliche" oder „kammähnliche" Konformationen aufweisen. „Gabelähnlich" verzweigte Amplifikatorsonden besitzen im Allgemeinen drei oder mehr Oligonucleotidsegmente, die von einem Ursprungspunkt ausgehen, um eine verzweigte Struktur zu bilden. Der Ursprungspunkt kann ein weiteres Nucleotidsegment oder ein multifunktionelles Molekül sein, an das zumindest drei Segmente kovalent oder fest gebunden sein können. „Kammartig" verzweigte Amplifikatorsonden besitzen ein lineares Rückgrat mit einer Vielzahl an Seitenketten-Oligonucleotiden, die sich vom Rückgrat erstrecken. In beiden Konformationen hängen die Seitensegmente normalerweise von einem modifizierten Nucleotid oder einer anderen organischen Gruppierung mit den geeigneten funktionellen Gruppen zur Bindung von Oligonucleotiden ab. Außerdem steht in beiden Konformationen eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen für die direkte oder indirekte Bindung an Detektionssonden zur Verfügung. Im Allgemeinen werden diese Strukturen in Einklang mit auf dem Gebiet bekannten Verfahren unter Einsatz modifizierter multifunktioneller Nucleotide gebildet; siehe z.B. US-Patente 5.635.352 und 5.124.246.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Dendrimer-Amplifikatorsonden verwendet, die allgemein in US-Patent 5.175.270 beschrieben sind. Dendrimer-Amplifikatorsonden besitzen Amplifikationssequenzen, die mittels Hybridisierung gebunden sind, und weisen somit Abschnitte doppelsträngiger Nucleinsäuren als Komponente ihrer Struktur auf. Die Außenfläche der Dendrimer-Amplifikatorsonde besitzt eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden lineare Amplifikatorsonden verwendet, die individuelle Amplifikationssequenzen besitzen, die entweder direkt oder mit kurzen dazwischen liegenden Sequenzen an den Enden miteinander verknüpft sind, um ein Polymer zu bilden. Wie bei den anderen Amplifikatorkonfigurationen kann es zusätzliche Sequenzen oder Gruppierungen zwischen den Amplifikationssequenzen geben. Außerdem können – wie hierin dargelegt – lineare Amplifikationssonden Haarnadel-Stammschleifenstrukturen bilden.
  • In einer Ausführungsform besitzt die lineare Amplifikatorsonde eine einzelne Amplifikationssequenz. Dies kann dann von Vorteil sein, wenn Zyklen von Hybridisierung/Dissoziation auftreten, wodurch ein Pool von Amplifikatorsonden entsteht, der an das Ziel hybridisiert und dann entfernt wurde, damit sich mehr Sonden binden können, oder wenn eine große Anzahl an ETMs für jede Markensonde verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch umfassen lineare Amplifikatorsonden eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen.
  • Außerdem kann die Amplifikatorsonde vollkommen linear, vollkommen verzweigt, vollkommen dendrimer oder jede Kombination davon sein.
  • Die Amplifikationssequenzen der Amplifikatorsonde dienen – entweder direkt oder indirekt – dazu, sich an eine Markersonde zu binden und somit Detektion zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Amplifikationssequenzen der Amplifikatorsonde zu einem ersten Abschnitt der Markersonde im Wesentlichen komplementär. Alternativ dazu werden Amplifikator-Extendersonden verwendet, die einen ersten Abschnitt, der sich an die Amplifikationssequenz bindet, und einen zweiten Abschnitt, der sich an den ersten Abschnitt der Markersonde bindet, besitzen.
  • Außerdem können die Zusammensetzungen der Erfindung „Präamplifikator"-Moleküle umfassen, die als Brückengruppierung zwischen den Marker-Extendermolekülen und den Amplifikatorsonden dienen. Auf diese Weise werden mehr Amplifikatoren und somit mehr ETMs schließlich an die Detektionssonden gebunden. Präamplifikator-Moleküle können entweder linear oder verzweigt sein und enthalten typischerweise etwa 30 – 3000 Nucleotide.
  • Somit sind die Markersonden entweder zu einer Amplifikationssequenz oder zu einem Abschnitt der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär. Demzufolge können die Markersonden in unterschiedlicher Weise konfiguriert sein, wie dies hierin allgemein beschrieben ist; dies hängt davon ab, ob ein Mechanismus-1- oder ein Mechanismus-2-Detektionssystem Anwendung findet (Erklärung weiter unten).
  • Die Detektion der Amplifikationsreaktionen der Erfindung einschließlich der direkten Detektion von Amplifikationsprodukten und der indirekten Detektion unter Einsatz von Markersonden (d.h. Sandwichtests) erfolgt durch Detektieren von Testkomplexen mit ETMs, die in unterschiedlicher Weise an den Testkomplex gebunden sein können, wie dies weiter unten dargelegt wird.
  • Wie in US-Patent 5.587.128 beschrieben, kann die Reaktionskammer eine Zusammensetzung umfassen (entweder in Lösung oder an der Oberfläche der Reaktionskammer geheftet), die die Hemmung einer Amplifikationsreaktion durch die Zusammensetzung der Kammer verhindert. Beispielsweise können die Wandflächen mit einem Silan überzogen werden, z.B. unter Verwendung eines Silanisierungsreagens wie z.B. Dimethylchlorsilan; sie können auch mit einem siliconisierenden Reagens wie etwa AquasilTM oder SurfacilTM (Pierce, Rockford, IL, USA), die Organosilane mit einer hydrolysierbaren Gruppe sind, beschichtet sein. Diese hydrolysierbare Gruppe kann in Lösung hydrolysieren, um ein Silanol zu bilden, das polymerisieren und einen fest gebundenen Film über die Kammeroberfläche spannen kann. Die Beschichtung kann auch ein Blockiermittel enthalten, das mit dem Film reagieren kann, um die Hemmung weiter zu verringern; geeignete Blockiermittel sind Aminosäurepolymere und Polymere wie etwa Polyvinylpyrrolidon, Polyadenylsäure und Polymaleinimid. Alternativ dazu kann für Siliciumsubstrate ein Siliciumoxidfilm auf den Wänden vorhanden sein, oder die Reaktionskammer kann mit einem relativ inerten Polymer wie etwa Polyvinylchlorid überzogen sein. Es kann ferner wünschenswert sein, blockierende Polynucleotide zuzusetzen, um Bindungsstellen auf der Kammeroberfläche zu besetzen.
  • In dieser und in anderen Ausführungsformen kann ein thermisches Modul verwendet werden, das entweder Teil der Reaktionskammer oder getrennt davon ist, aber in räumliche Nähe zum Reaktionsmodul gebracht werden kann. Geeignete thermische Module sind in den US-Patenten 5.498.392 und 5.587.128 sowie in WO 97/16561 beschrieben und können elektrische Widerstandsheizelemente, gepulste Laser oder andere Quellen elektromagnetischer Energie umfassen, die auf die Reaktionskammer gerichtet sind. Man beachte auch, dass es bei Verwendung von Heizelementen wünschenswert sein kann, dass die Reaktionskammer relativ seicht ist, um so die Wärmeübertragung zu vereinfachen; siehe US-Patent 5.587.128.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die biologische Reaktionskammer die enzymatische Spaltung oder Modifikation des Zielanalyten. Beispielsweise können Restriktions-Endonucleasen dazu dienen, Zielnucleinsäuren mit Zielsequenzen, z.B. genomischer DNA, in kleinere Fragmente aufzuspalten, um entweder die Amplifikation oder die Detektion zu erleichtern. Alternativ dazu kann – wenn der Zielanalyt ein Protein ist – dieser durch eine Protease gespalten werden. Andere Arten enzymatischer Hydrolyse sind auch möglich, wobei dies von der Zusammensetzung des Zielanalyten abhängt. Wie hierin dargelegt, kann der Zielanalyt ein Enzym umfassen, und die Reaktionskammer umfasst ein Substrat, das dann zur Bildung eines detektierbaren Produkts gespalten wird.
  • In einer Ausführungsform enthält das Reaktionsmodul eine Kammer für die physikalische Änderung eines Teils oder der Gesamtheit der Probe, z.B. für das Scheren genomischer oder großer Nucleinsäuren, für die nucleare Lyse, Ultraschall usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung zumindest eine Flüssigkeitspumpe. Pumpen fallen im Allgemeinen in zwei Kategorien: „on-chip" und „off-chip"; d.h. die Pumpen (im Allgemeinen Pumpen auf Elektrodenbasis) können in der Vorrichtung selbst oder auf einem Apparat vorhanden sein, in die die Vorrichtung passt, so dass die Ausrichtung der erforderlichen Strömungskanäle und somit das Pumpen von Flüssigkeiten stattfinden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pumpen auf der Vorrichtung selbst vorhanden. Diese Pumpen sind im Allgemeinen Pumpen auf Elektrodenbasis; d.h. das Anlegen elektrischer Felder kann dazu dienen, sowohl geladene Teilchen als auch das Lösungsmittel je nach Zusammensetzung der Probe und der Vorrichtung zu bewegen. Geeignete On-chip-Pumpen sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) elektroosmotische (EO-) Pumpen und elektrohydrodynamische (EHD-) Pumpen; diese Pumpen auf Elektrodenbasis werden auf dem Gebiet der Erfindung manchmal als „elektrokinetische (EK-) Pumpen" bezeichnet. Alle diese Pumpen beruhen auf Konfigurationen von Elektroden, die entlang eines Strömungskanals positioniert sind, so dass die die Probenkomponenten umfassenden Flüssigkeiten gepumpt werden können. Wie dies auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben wird, sind die Konfigurationen für jede dieser Pumpen auf Elektrodenbasis geringfügig unterschiedlich; z.B. hängt der Wirkungsgrad einer EHD-Pumpe vom Abstand zwischen den Eeltkroden ab, wobei Folgendes gilt: Je näher sie aneinander liegen, desto weniger Spannung muss angelegt werden, um das Strömen von Flüssigkeit zu bewirken. Alternativ dazu sollte im Falle von EO-Pumpen der Abstand zwischen den Elektroden größer sein (bis zu der halben Länge des Kanals, in dem die Flüssigkeiten befördert werden), da die Elektrode nur an der Kraftanwendung und nicht – wie bei EHD-Pumpen – an der Bildung von Ladungen, auf die die Kraft einwirkt, beteiligt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine EO-Pumpe verwendet. Die Elektroosmose (EO) beruht auf der Tatsache, dass die Oberfläche vieler Festkörper, z.B. Quarz, Glas u.dgl., in Gegenwart ionischer Materialien negativ oder positiv geladen wird. Die geladenen Oberflächen ziehen entgegengesetzt geladene Gegenionen in wässrigen Lösungen an. Das Anlegen von Spannung führt zur Wanderung der Gegenionen zur entgegengesetzt geladenen Elektrode und auch zur Bewegung des Großteils der Flüssigkeit. Die Volumensflussrate ist proportional zum Strom, und der in der Flüssigkeit erzeugte Volumensfluss ist auch proportional zur angelegten Spannung. Der elektroosmotische Fluss eignet sich für leitfähige Flüssigkeiten und üblicherweise nicht für nicht-polare Lösungsmittel. EO-Pumpen sind in US-Patenten 4.908.112 und 5.632.876, in PCT US 95/14586 sowie in WO 97/43629 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine EHD-Pumpe verwendet. Im Falle von EHD übertragen Elektroden in Kontakt mit der Flüssigkeit Ladung, wenn Spannung angelegt wird. Diese Ladungsübertragung tritt entweder durch Übertragung oder Entfernung eines Elektrons auf die oder von der Flüssigkeit auf, so dass Flüssigkeit von der ladenden Elektrode zur entgegengesetzt geladenen Elektrode strömen kann. EHD-Pumpen können dazu dienen, Widerstands-Flüssigkeiten wie z.B. nicht-polare Lösungsmittel zu pumpen. EHD-Pumpen sind in US-Patent 5.632.876 beschrieben.
  • Die Elektroden der Pumpen besitzen vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 25 μm bis etwa 100 μm, noch bevorzugter von etwa 50 μm bis etwa 75 μm. Vorzugsweise ragen die Elektroden von der Spitze eines Strömungskanals bis zu einer Tiefe von etwa 5 bis etwa 95 %, vorzugsweise von etwa 25 bis etwa 50 %, der Kanaltiefe. Außerdem kann – wie in PCT US 95/14586 beschrieben – ein internes Pumpsystem auf Elektrodenbasis in ein Flüssigkeitsverteilungssystem der Vorrichtungen der Erfindung integriert sein, wobei die Flussratensteuerung an mehreren Pumpenstellen und mit weniger komplexer Elektronik erfolgt, wenn die Pumpen durch Anlegen gepulster Spannungen über die Elektroden betrieben werden; dies hat die folgenden zusätzliche Vorteile: leichte Integration in Systeme hoher Dichte, weniger Elektrolyse an den Elektroden, Reduktionen der Wärmekonvektion in der Nähe der Elektroden, die Möglichkeit der Verwendung einfacherer Treiber und die Möglichkeit der Verwendung einfacher und komplexer Pulswellengeometrien.
  • Die Spannungen, die an die Elektroden anzulegen sind, um das Strömen von Flüssigkeit zu bewirken, hängen von der Geometrie der Elektroden und den Eigenschaften der zu befördernden Flüssigkeiten ab. Die Strömungsrate der Flüssigkeiten ist eine Funktion der Amplitude der zwischen den Elektroden angelegten Spannung, der Elektrodengeometrie und der Flüssigkeitseigenschaften, die problemlos für jede Flüssigkeit bestimmbar sind. Testspannungen können bis zu etwa 1500 V reichen, doch eine Betriebsspannung von etwa 40 bis 300 V ist wünschenswert. Es wird im Allgemeinen ein analoger Treiber verwendet, um die an die Pumpe von einer Gleichstromquelle aus angelegte Spannung zu variieren. Es wird für jede Flüssigkeit eine Übertragungsfunktion experimentell als jene angelegte Spannung bestimmt, die die erwünschte Strömung oder den erwünschten Flüssigkeitsdruck der im Kanal beförderten Flüssigkeit bewirkt. Ein analoger Treiber ist jedoch im Allgemeinen für jede Pumpe entlang des Kanals erforderlich und eignet sich als Betriebsverstärker.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine mikromechanische Pumpe (entweder on- oder off-chip) verwendet, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Off-chip-Pumpe verwendet. Beispielsweise können die Vorrichtungen der Erfindung in ein Gerät eingepasst sein, so dass sie darin stecken und festgehalten werden; dieses Gerät kann dafür sorgen, dass die Öffnungen (d.h. Probeneinlassöffnungen, Flüssigkeitseinlassöffnungen und Abfallauslassöffnungen) und Elektrodenanschlüsse ausgerichtet sind. Das Gerät kann Pumpen enthalten, die die Probe zur Vorrichtung befördern; beispielsweise können sie Zellen enthaltende Proben in Zelllysemodule mit Fortsätzen befördern, um nach Anlegen von ausreichend Flüssigkeitsdruck Zelllyse zu bewirken. Solche Pumpen sind auf dem Gebiet allgemein bekannt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung zumindest ein Flüssigkeitsventil, das das Strömen von Flüssigkeit in das oder aus dem Modul der Vorrichtung steuert oder den Fluss in einen oder mehrere Kanäle ablenkt. Es sind auf dem Gebiet der Erfindung zahlreiche Ventile bekannt. In einer Ausführungsform kann das Ventil z.B. eine Kapillarschranke enthalten, die allgemein in PCT US 97/07880 beschrieben ist. In dieser Ausführungsform mündet der Kanal in einen größeren Raum, der ausgebildet ist, die Bildung einer energieminimierenden Flüssigkeitsoberfläche zu begünstigen, z.B. einen Meniskus an der Öffnung. Vorzugsweise enthalten die Kapillarschranken einen Damm, der die vertikale Höhe des Kanals unmittelbar vor der Öffnung zu einem größeren Raum wie z.B. eine Kammer anhebt. Außerdem kann – wie in US-Patent 5.858.195 erläutert – eine Art „virtuelles Ventil" verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung Dichtungsöffnungen, um das Einströmen von Flüssigkeiten wie z.B. Proben in die Module der Erfindung zu ermöglichen, wobei die Öffnungen danach geschlossen werden, um Verlust der Probe zu vermeiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung zumindest ein Speichermodul für Testreagenzien. Diese Speichermodule sind mit anderen Modulen des Systems mit Strömungskanälen verbunden, und viele weisen Kammern oder erweiterte Strömungskanäle auf. Sie können eine beliebige Anzahl an Reagenzien, Puffern, Enzymen, elektronischen Mediatoren, Salzen usw. enthalten, z.B. gefriergetrocknete Reagenzien.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung ein Mischmodul; wiederum können die Mischmodule wie die Speichermodule erweiterte Strömungskanäle (insbesondere für zeitlich abgestimmtes Mischen geeignet) oder Kammern sein. Insbesondere im Fall erweiterter Strömungskanäle können Fortsätze auf der Seite des Kanals vorhanden sein, um das Mischen zu bewirken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Vorrichtungen der Erfindung ein Detektionsmodul. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die für die Detektion biologischer Zielanalytspezies wie z.B. Nucleinsäuren und Proteine in Frage kommen. Im Allgemeinen beruht das Detektionsmodul auf den Ausführungen in folgenden Publikationen: US-Patent 5.591.578; 5.824.473; 5.770.369; 5.705.348; und 5.780.234; US-Seriennummer 09/096.593; 08/911.589; 09/135.183; und 60/105.875; sowie PCT-Anmeldungen US 97/20014 und US 98/12082. Das System kann allgemein wie folgt beschrieben werden. Ein Zielanalyt wird in das Detektionsmodul eingebracht und mit anderen Komponenten vereinigt, um einen Testkomplex zu bilden; dies erfolgt in unterschiedlicher Weise, wie weiter unten ausführlich beschrieben. Die Testkomplexe umfassen ETMs, die an den Testkomplex in unterschiedlicher Weise gebunden sein können, wie dies ebenfalls weiter unten ausführlich erläutert ist. Im Allgemeinen gibt es zwei grundsätzliche Detektionsmechanismen. In einer bevorzugten Ausführungsform beruht die Detektion einer ETM auf dem Elektronentransfer durch die gestapelten π-Orbitale doppelsträngiger Nucleinsäure. Dieser Grundmechanismus ist in US-Patenten 5.591.578, 5.770.369 und 5.705.348 sowie PCT US 97/20014 beschrieben und wird hierin als „Mechanismus-1" bezeichnet. Frühere Arbeiten zeigten, dass der Elektronentransfer durch die gestapelten π-Orbitale doppelsträngiger Nucleinsäuren rasch und durch die einzelsträngige Nucleinsäure deutlich langsamer stattfinden kann. Demzufolge kann dies als Grundlage für einen Test dienen. Durch Anfügen von ETMs (entweder kovalent an einen der Stränge oder nicht-kovalent an den Hybridisierungskomplex unter Einsatz von Hybridisierungsindikatoren, siehe unten) an eine Nucleinsäure, die über ein leitendes Oligomer an eine Detektionselektrode gebunden ist, kann Elek tronentransfer zwischen der ETM und der Elektrode durch die Nucleinsäure und das leitende Oligomer detektiert werden.
  • Dies kann erfolgen, wenn der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist; alternativ dazu wird ein Nicht-Nucleinsäurezielanalyt gemeinsam mit einem optionalen Einfang-Bindungsliganden (zum Binden des Zielanalyten an der Detektionselektrode) und einem löslichen Bindungsliganden verwendet, der einen Nucleinsäure-„Schwanz" aufweist, der sich dann entweder direkt oder indirekt an eine Detektionssonde auf der Oberfläche binden kann, um die Detektion durchzuführen.
  • Alternativ dazu kann die ETM nicht notwendigerweise mittels Elektronentransfer durch Nucleinsäure, sondern direkt unter Einsatz leitender Oligomere detektiert werden; die Elektronen aus den ETMs müssen, anders ausgedrückt, nicht durch die gestapelten π-Orbitale wandern, um ein Signal zu erzeugen. Stattdessen kann die Gegenwart von ETMs auf der Oberfläche einer selbstassemblierten Monoschicht (SAM), die leitende Oligomere umfasst, direkt detektiert werden. Dieses grundsätzliche Prinzip wird hierin als „Mechanismus-2" bezeichnet. Nach Bindung eines Zielanalyten wird ein eine ETM umfassender löslicher Bindungsligand zur Oberfläche gebracht, und die Detektion der ETM kann stattfinden – vermutlich durch das leitende Oligomer zur Elektrode. Im Wesentlichen besteht die Funktion der die leitenden Oligomere umfassenden SAM darin, die elektronische Oberfläche der Elektrode zu „heben", während nach wie vor die Vorteile der Abschirmung der Elektrode vor Lösungskomponenten sowie der Reduktion des Ausmaßes nichtspezifischer Bindung an die Elektroden bereitgestellt werden. Anders interpretiert besteht die Funktion des Bindungsliganden darin, Spezifität für die Rekrutierung von ETMs an der Oberfläche zu bieten, wo sie mittels leitender Oligomere mit elektronisch exponierten Termini detektiert werden können.
  • Somit wird in beiden Ausführungsformen ein Testkomplex gebildet, der eine ETM enthält, die dann unter Einsatz der Detektionselektrode detektiert wird.
  • Das vorliegende System ist besonders in Anordnungsformaten nützlich, in denen eine Matrix adressierbarer mikroskopischer Detektionselektroden (hierin im Allgemeinen als „Felder", „Adressen" oder „Mikropositionen" bezeichnet) vorliegt.
  • Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Detektieren von Zielanalyten in Probenlösungen unter Einsatz einer Elektrode bereit. Falls erforderlich, wird der Zielanalyt unter Anwendung bekannter Techniken hergestellt, im Allgemeinen innerhalb der oben beschriebenen Vorrichtungen. Beispielsweise kann die Probe behandelt werden, um die Zellen zu lysieren; dabei kommen bekannte Lysepuffer, Ultraschallbehandlung, Elektroporation usw. zum Einsatz, und die Reinigung findet dann wie benötigt statt, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist.
  • Die Detektionsmodule der Erfindung umfassen Elektroden. Unter „Elektroden" ist hierin eine Zusammensetzung zu verstehen, die – wenn sie an eine elektronische Vorrichtung angeschlossen ist – einen Strom oder eine Ladung abfühlen und ihn bzw. sie in ein Signal umwandeln kann. Alternativ dazu kann eine Elektrode als eine Zusammensetzung definiert sein, die ein Potential an Elektronen anlegen kann und/oder Elektronen zu oder von Spezies in der Lösung leiten kann. Demnach ist eine Elektrode eine ETM, wie dies hierin beschrieben ist. Bevorzugte Elektroden sind auf dem Gebiet bekannt; dazu zählen u.a. bestimmte Metalle und ihre Oxide, z.B. Gold; Platin; Palladium; Silicium; Aluminium; Metalloxidelektroden wie z.B. Platinoxid, Titanoxid, Zinnoxid, Indiumzinnoxid, Palladiumoxid, Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Molybdänoxid (Mo2O6), Wolframoxid (WO3) und Rutheniumoxide; und Kohlenstoff (z.B. Glaskohlenstoffelektroden, Graphit und Kohlenstoffpaste). Bevorzugte Elektroden sind Gold-, Silicium-, Platin-, Kohlenstoff- und Metalloxidelektroden, wobei Gold besonders vorzuziehen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Elektroden auf einem Substrat ausgebildet. Die vorliegende Beschreibung betrifft allgemein die Bildung von Goldelektroden, aber wie für den Fachkundigen offensichtlich ist, kommen auch andere Elektroden in Frage. Das Substrat kann eine Vielzahl an Materialien umfassen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, wobei Leiterplatten- (PCB-) Materialien besonders vorzuziehen sind. Zweckmäßige Substrate sind u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) Glasfaser, Teflon, Keramik, Glas, Silicium, Glimmer, Kunststoff (z.B. Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polycarbonat, Polyurethane, TeflonTM und Derivate davon usw.), GETEK (eine Mischung von Polypropylenoxid und Glasfaser) usw.
  • Im Allgemeinen sind PCB-Materialien bevorzugt. Leiterplattenmaterialien sind jene, die ein Isoliersubstrat umfassen, das mit einer leitenden Schicht überzogen ist und unter Anwendung von Lithografieverfahren verarbeitet wird, insbesondere mittels Fotolithografietechniken, um die Elektrodenmuster und Verdrahtungen (auf dem Gebiet manchmal auch als Anschlüsse bezeichnet) zu bilden. Das Isoliersubstrat ist im Allgemeinen – aber nicht immer – ein Polymer. Wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können eine oder mehrere Schichten verwendet werden, um entweder „zweidimensionale" Platten (z.B. alle Elektroden und Verdrahtungen liegen in einer Ebene) oder „dreidimensionale" Platten (die Elektroden befinden sich auf einer Oberfläche, und die Verdrahtungen können durch die Platte hindurch zur anderen Seite führen) zu bilden. Dreidimensionale Systeme beruhen häufig auf der Anwendung von Bohren oder Ätzen, gefolgt vom Elektroplattieren mit einem Metall wie etwa Kupfer, so dass durch die Platte führende Verdrahtungen entstehen. Leiterplattenmaterialien sind oft mit einer Folie versehen, die bereits am Substrat klebt (z.B. Kupferfolie), wobei gegebenenfalls zusätzliches Kupfer wie benötigt zugeführt wird (z.B. für die Verdrahtungen), beispielsweise mittels Elektroplattieren. Die Kupferoberfläche muss dann möglicherweise aufgeraut werden, z.B. durch Ätzen, um die Bindung der Klebeschicht zu ermöglichen.
  • In einigen Ausführungsformen ist Glas unter Umständen als Substrat nicht vorzuziehen.
  • Demnach stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform Biochips (die manchmal hierin als „Chips" bezeichnet werden) bereit, umfassend Substrate, die aus einer Vielzahl an Elektroden – vorzugsweise Goldelektroden – bestehen. Die Anzahl an Elektroden entspricht jener der Reihen. Jede Elektrode umfasst vorzugsweise eine selbstassemblierte Monoschicht, wie dies hierin beschrieben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine der Monoschichten bildenden Spezies einen Einfangliganden, wie dies hierin beschrieben ist. Außerdem besitzt jede Elektrode eine Verdrahtung, die an einem Ende der Elektrode befestigt und schließlich an eine Vorrichtung angeschlossen wird, die die Elektrode steuern kann. Somit kann man auf jede Elektrode unabhängig zugreifen.
  • Das Substrat kann Teil einer größeren Vorrichtung sein, die eine Detektionskammer umfasst, die ein bestimmtes Probenvolumen der Detektionselektrode aussetzt. Im Allgemeinen reicht die Detektionskammer von etwa 1 nl bis 1 ml, wobei etwa 10 μl bis 500 μl vorzuziehen sind. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können je nach Versuchsbedingungen und Test kleinere oder größere Volumina gewählt werden.
  • In einigen Ausführungsform sind die Detektionskammer und die Elektrode Teil einer Patrone, die in eine Vorrichtung eingesetzt werden kann, die elektronische Komponenten umfasst (Beispiele dafür sind Gleichstrom/Wechselstrom-Spannungsquelle, Amperemeter, Prozessor, Ablese-Display, Temperatursteuerung, Lichtquelle usw.). In dieser Ausführungsform sind die Verdrahtungen für jede Elektrode solcherart positioniert, dass nach Einsetzen der Patrone in die Vorrichtung Verbindungen zwischen den Elektroden und den elektronischen Komponenten hergestellt werden.
  • Die Detektionselektroden auf Leiterplattenmaterial (oder anderen Substraten) werden im Allgemeinen auf unterschiedliche Weise gefertigt. Im Allgemeinen verwendet man Gold hoher Reinheit, das mittels Vakuumabscheidungsverfahren (Sputtern und Verdampfen) oder durch Lösungsabscheidung (Elektroplattieren oder stromlose Verfahren) auf eine Oberfläche abgeschieden werden kann. Bei Durchführung von Elektroplattieren muss das Substrat zu Beginn ein leitendes Material umfassen; Glasfaserleiterplatten sind häufig mit Kupferfolie versehen. Oft wird – je nach dem Substrat – eine Klebeschicht zwischen dem Substrat und Gold verwendet, um gute mechanische Stabilität zu gewährleisten. Somit verwenden bevorzugte Ausführungsformen eine Ablagerungsschicht aus Haftmetall wie z.B. Chrom, Titan, Titan/Wolfram, Tantal, Nickel oder Palladium, die – wie oben in Zusammenhang mit Gold beschrieben – abgeschieden werden kann. Wenn elektroplattiertes Metall (entweder das Haftmetall oder das Elektrodenmetall) verwendet wird, können kornverfeinernde Additive, die häufig auf dem Gebiet als Glanzbildner bezeichnet werden, gegebenenfalls zugesetzt werden, um die Oberflächen-Abscheidungseigenschaften zu modifizieren. Bevorzugte Glanzbildner sind Gemische organischer und anorganischer Spezies, wobei Kobalt und Nickel vorzuziehen sind.
  • Im Allgemeinen weist die Klebeschicht eine Dicke von etwa 100 Å bis etwa 25 μm auf (1000 Mikrozoll). Wenn das Haftmetall elektrochemisch aktiv ist, muss das Elektrodenmetall in einer Dicke beschichtet sein, die das „Durchbluten" verhindert; wenn das Haftmetall elektrochemisch nicht aktiv ist, kann das Elektrodenmetall dünner sein. Im Allgemeinen wird das Elektrodenmetall (vorzugsweise Gold) in Dicken im Bereich von etwa 500 Å bis etwa 5 μm (200 Mikrozoll) abgelagert, wobei etwa 30 Mikrozoll bis etwa 50 Mikrozoll vorzuziehen sind. Im Allgemeinen wird das Gold abgelagert, um Elektroden zu erzeugen, deren Größe von etwa 5 μm bis etwa 5 mm, vorzugsweise von etwa 100 bis 250 μm, im Durchmesser reicht. Die somit geformten Detektionselektroden werden dann vorzugsweise gereinigt und SAMs zugesetzt, wie dies weiter unten erläutert ist.
  • Die vorliegende Beschreibung bietet Verfahren zur Herstellung eines Substrats, das eine Vielzahl an Goldelektroden umfasst. Die Verfahren umfassen das Auftragen eines Haftmetalls wie z.B. Nickel oder Palladium (gegebenenfalls mit einem Glaznbildner) auf das Substrat. Elektroplattieren ist vorzuziehen. Das Elektrodenmetall, vorzugsweise Gold, wird dann (wiederum vorzugsweise mittels Elektroplattieren) auf das Haftmetall aufgebracht. Dann werden die Muster der Vorrichtung, umfassend die Elektroden und ihre zugehörigen Verdrahtungen, unter Anwendung lithografischer Techniken, insbesondere fotolithografischer Techniken (auf dem Gebiet allgemein bekannt), und mittels nasschemischen Ätzens erzeugt. Häufig wird ein nicht-leitendes chemisch widerstandsfähiges Isoliermaterial wie z.B. eine Lötmaske oder Kunststoff unter Anwendung dieser fotolithografischen Verfahren aufgebracht, wobei nur die Elektroden und ein Verbindungspunkt zu den Anschlüssen freiliegend bleiben; die Anschlüsse selbst sind im Allgemeinen beschichtet.
  • Die Verfahren werden mit der Zugabe von SAMs fortgesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform dienen Tropfabscheidungstechniken dazu, die erforderliche Chemie zuzusetzen, d.h. die Monoschicht bildenden Spezies, von denen eine vorzugsweise eine Einfangligand umfassende Spezies ist. Tropfabscheidungstechniken sind auf dem Gebiet zur Herstellung von „Punkt"-Anordnungen allgemein bekannt. Dies erfolgt, um jeder Elektrode eine andere Zusammensetzung hinzuzufügen, d.h. um eine Anordnung zu bilden, die aus unterschiedlichen Einfangliganden besteht. Alternativ dazu kann die SAM-Spezies für jede Elektrode identisch sein, wobei dies mittels eines Tropfabscheidungsverfahrens oder durch Eintauchen des gesamten Substrats oder einer Substratoberfläche in die Lösung erfolgt.
  • Die hierin beschriebenen Elektroden werden als flache Oberfläche dargestellt, was nur eine von mehreren Konformationen der Elektrode darstellt und nur für schematische Zwecke verwendet wird. Die Konformation der Elektrode ändert sich mit der verwendeten Detektionsmethode. Beispielsweise können glatte flache Elektroden für optische Detektionsmethoden oder wenn Anordnungen von Nucleinsäuren hergestellt werden, wodurch adressierbare Stellen zur Synthese und Detektion benötigt werden, bevorzugt sein. Alternativ dazu kann für einzelne Sondenanalyse die Elektrode in der Form eines Rohres sein, wobei SAMs, die leitfähige Oligomere und Nucleinsäuren umfassen, an die innere Oberfläche gebunden sind. Elektrodenspiralen können in einigen Ausführungsformen ebenfalls bevorzugt sein. Dies erlaubt ein Maximum der Oberfläche, die Nucleinsäuren enthält, die einem kleinen Volumen der Probe auszusetzen sind.
  • Die Detektionselektrode umfasst eine selbstassemblierte Monoschicht (SAM), die leitende Oligomere umfasst. Unter „Monoschicht" oder „selbstassemblierter Monoschicht" bzw. „SAM" versteht man hierin eine relativ geordnete Anordnung von Molekülen, die spontan auf eine Oberfläche chemisorbiert werden, worin die Moleküle etwa parallel zueinander und annähernd senkrecht zur Oberfläche orientiert sind. Jedes der Moleküle enthält eine funktionelle Gruppe, die an der Oberfläche haftet, und einen Abschnitt, der mit benachbarten Molekülen in der Monoschicht wechselwirkt, um die relativ geordnete Anordnung zu bilden. Eine „gemischte" Monoschicht umfasst eine heterogene Monoschicht, d.h. in der zumindest zwei unterschiedliche Mo leküle die Monoschicht bilden. Die SAM kann leitende Oligomere alleine oder ein Gemisch leitender Oligomere und Isolatoren umfassen. Wie dies hierin erläutert ist, kann der Wirkungsgrad der Zielanalytbindung (z.B. der Oligonucleotidhybridisierung) steigen, wenn sich der Analyt in einem Abstand von der Elektrode befindet. Nichtspezifische Bindung von Biomolekülen, einschließlich der Zielanalyten, an eine Elektrode wird im Allgemeinen verringert, wenn eine Monoschicht vorhanden ist. Somit erleichtert eine Monoschicht, dass der Abstand zwischen dem Analyten und der Elektrodenoberfläche aufrechterhalten wird. Außerdem dient eine Monoschicht dazu, geladene Spezies von der Elektrodenoberfläche fern zu halten. Somit trägt diese Schicht dazu bei, elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden und den ETMs oder zwischen der Elektrode und geladenen Spezies im Lösungsmittel zu verhindern. Ein derartiger Kontakt kann das Ergebnis eines direkten „Kurzschlusses" oder eines indirekten Kurzschlusses über geladene Spezies sein, die in der Probe vorhanden sein können. Demzufolge ist die Monoschicht vorzugsweise dicht in einer einheitlichen Schicht auf der Elektrodenoberfläche gepackt, so dass nur eine minimale Anzahl an „Löchern" besteht. Die Monoschicht dient demnach als physikalische Schranke, die Lösungsmittelzugänglichkeit zur Elektrode blockiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Monoschicht leitfähige Oligomere. Unter „leitfähigem bzw. leitendem Oligomer" ist hierin ein im Wesentlichen leitendes Oligomer (vorzugsweise linear) zu verstehen, wobei einige Ausführungsformen davon in der Literatur as „molekulare Drähte" bezeichnet werden. Unter „im Wesentlichen leitend" ist hierin zu verstehen, dass das Oligomer Elektronen bei 100 Hz übertragen kann. Im Allgemeinen besitzt das leitfähige Oligomer im Wesentlichen überlappende π-Orbitale, d.h. konjugierte π-Orbitale, wie sie z.B. zwischen den monomeren Einheiten des leitenden Oligomers auftreten, obwohl das leitende Oligomer auch eine oder mehrere Sigma- (σ-) Bindungen enthalten kann. Außerdem kann ein leitendes Oligomer funktionell durch seine Fähigkeit definiert sein, Elektronen in eine zugehörige ETM zu injizieren oder Elektronen aus einer zugehörigen ETM zu erhalten. Ferner ist das leitende Oligomer leitender als Isolatoren (wie hierin definiert). Die leitenden Oligomere der Erfindung sind von elektroaktiven Polymeren zu unterscheiden, die selbst Elektronen abgeben oder annehmen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die leitenden Oligomere eine Leitfähigkeit S von zwischen etwa 10–6 bis etwa 104 Ω–1cm–1, wobei etwa 10–5 bis etwa 103 Ω–1cm–1 vorzuziehen sind. Diese S-Werte werden für Moleküle berechnet, die von etwa 20 Å bis etwa 200 Å reichen. Wie unten beschrieben, besitzen Isolatoren eine Leitfähigkeit S von etwa 10–7 Ω–1cm–1 oder weniger, vorzugsweise weniger als etwa 10–8 Ω–1cm–1. Siehe für allgemeine Ausführungen Gardner et al., Sensors and Actuators A 51, 57 – 66 (1995), hierin durch Verweis aufgenommen.
  • Erwünschte Eigenschaften eines leitenden Oligomers sind hohe Leitfähigkeit, ausreichende Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und/oder Wasser für die Synthese und die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung sowie vorzugsweise chemische Beständigkeit gegenüber den Reaktionen, die i) während der Bindungsligandsynthese (d.h. Nucleinsäuresynthese, so dass Nucleoside mit den leitenden Oligomeren dem Nucleinsäuresynthetisierer während der Synthese der Zusammensetzungen der Erfindung zugesetzt werden können), ii) während der Bindung des leitenden Oligomers an eine Elektrode oder iii) während der Bindungstests auftreten können. Außerdem sind leitende Oligomere, die die Bildung von SAMs fördern, vorzuziehen.
  • Die Oligomere der Erfindung umfassen zumindest zwei monomere Untereinheiten, wie dies hierin beschrieben ist. Wie dies ausführlich weiter unten dargelegt ist, umfassen Oligomere Homo- und Heterooligomere sowie Polymere.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das leitende Oligomer die nachstehend dargestellte Struktur:
  • Figure 00680001
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können alle der hierin dargestellten Strukturen zusätzliche Atome oder Strukturen aufweisen; d.h. das leitende Oligomer von Struktur 1 kann an ETMs wie z.B. Elektroden, Übergangsmetallkomplexe, organische ETMs und Metallocene sowie an Bindungsliganden wie z.B. Nucleinsäuren oder an mehrere davon gebunden sein. Sofern dies nicht anders angeführt ist, sind die hierin dargestellten leitenden Oligomere an der linken Seite an eine Elektrode gebunden; wie aus Struktur 1 ersichtlich, ist demnach das linke „Y" mit der Elektrode wie hierin beschrieben verbunden. Wenn das leitende Oligomer an einen Bindungsliganden gebunden werden soll, wird das rechte „Y" -falls vorhanden – an den Bindungsliganden gebunden, z.B. an eine Nucleinsäure (entweder direkt oder durch Verwendung eines Linkers, wie dies hierin beschrieben ist).
  • In dieser Ausführungsform ist Y eine aromatische Gruppe, n eine ganze Zahl von 1 bis 50, g entweder 1 oder 0, e eine ganze Zahl von 0 bis 10 und m 0 oder 1. Wenn g = 1 ist, ist B-D eine Bindung, die mit benachbarten Bindungen konjugieren kann (hierin auch als eine „konjugierte Bindung" bezeichnet), vorzugsweise ausgewählt aus Acetylen, Alken, substituiertem Alken, Amid, Azo, -C=N- (einschließlich -N=C-, -CR=N- und -N=CR-), -Si=Si- und -Si=C- (einschließlich -C=Si-, -Si=CR- und -CR=Si-). Wenn g = 0 ist, ist e vorzugsweise 1, D ist vorzugsweise Carbonyl oder eine Heteroatomgruppierung, worin das Heteroatom aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Silicium oder Phosphor ausgewählt ist. Somit sind geeignete Heteroatomgruppierungen u.a. -NH und -NR, worin R wie hierin definiert ist; substituierter Schwefel; Sulfonyl- (-SO2-), Sulfoxid (-SO-); Phosphinoxid (-PO- und -RPO-); und Thiophosphin (-PS- und -RPS-). Wenn jedoch das leitende Oligomer an eine Goldelektrode gebunden werden soll (siehe oben), sind Schwefelderivate nicht vorzuziehen.
  • Unter „aromatischer Gruppe" oder grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken ist hierin eine aromatische monocyclische oder polycyclische Kohlenwasserstoffgruppierung, die im Allgemeinen 5 – 14 Kohlenstoffatome (obwohl größere polycyclische Ringstrukturen hergestellt werden können) enthalten, und jedes beliebige carbocyclische Keton- oder Thioketonderivat davon zu verstehen, worin das Kohlenstoffatom mit der freien Valenz ein Teil eines aromatischen Rings ist. Aromatische Gruppen sind Arylengruppen und aromatische Gruppen mit mehr als zwei entfernten Atomen. Für die Zwecke dieser Anmeldung umfasst aromatisch hierin auch heterocyclisch. „Heterocyclus" oder „Heteroaryl" steht hierin für eine aromatische Gruppe, in der 1 – 5 der angezeigten Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom ersetzt sind, ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Bor und Silicium, worin das Atom mit der freien Valenz ein Teil eines aromatischen Rings ist, sowie für jedes beliebige heterocyclische Keton- und Thioketonderivat davon. Somit umfasst der Heterocyclus Folgendes: Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Pyrimidinyl, Oxalyl, Indolyl, Purinyl, Chinolyl, Isochinolyl, Thiazolyl, Imidozyl usw.
  • Es ist zu beachten, dass die aromatischen Y-Gruppen des leitenden Oligomers unterschiedlich sein können, d.h. das leitende Oligomer kann ein Heterooligomer sein. Ein leitendes Oligomer kann ein Oligomer einer einzelnen Art von Y-Gruppen oder von mehreren Arten von Y-Gruppen umfassen.
  • Die aromatische Gruppe kann mit einer Substitutionsgruppe substituiert sein, die hierin allgemein als R bezeichnet wird. R-Gruppen können wie benötigt zugesetzt werden, um die Bepackung der leitenden Oligomere zu beeinflussen, d.h. R-Gruppen können dazu dienen, um die Assoziation der Oligomere in der Monoschicht zu verändern. R-Gruppen können auch aus folgenden Gründen zugesetzt werden: 1) Änderung der Löslichkeit des Oligomers oder von die Oligomere enthaltenden Zusammensetzungen; 2) Änderung der Konjugation oder des elektrochemischen Potentials des Systems; und 3) Änderung der Ladung oder Eigenschaften auf der Oberfläche der Monoschicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist es – wenn das leitende Oligomer mehr als drei Untereinheiten umfasst – sind R-Gruppen bevorzugt, um die Löslichkeit erhöhen, wenn die Lösungssynthese abgeschlossen ist. Die R-Gruppen und ihre Positionen sind jedoch ausgewählt, um die Bepackung der leitenden Oligomere auf einer Oberfläche, insbesondere innerhalb einer Monoschicht, minimal zu beeinflussen, wie dies nachstehend erläutert wird. Im Allgemeinen werden nur kleine R-Gruppen innerhalb der Monoschicht verwendet, wobei größere R-Gruppen üblicherweise oberhalb der Oberfläche der Monoschicht auftreten. Somit ist die Bindung von Methylgruppen an den Abschnitt des leitenden Oligomers innerhalb der Monoschicht zwecks Steigerung der Löslichkeit vorzuziehen, wobei die Bindung längerer Alkoxygruppen, z.B. C3 bis C10, vorzugsweise oberhalb der Monoschichtoberfläche erfolgt. Im Allgemei nen bedeutet dies für die hierin beschriebenen Systeme, dass die Bindung von sterisch signifikanten R-Gruppen – je nach der durchschnittlichen Länge der die Monoschicht bildenden Moleküle – nicht auf den ersten zwei oder drei Oligomeruntereinheiten erfolgt.
  • Geeignete R-Gruppen sind u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) Wasserstoff, Alkyl, Alkohol, aromatische Verbindungen, Amino, Amido, Nitro, Ether, Ester, Aldehyde, Sulfonyl, Siliciumgruppierungen, Halogene, schwefelhaltige Gruppierungen, phosphorhaltige Gruppierungen und Ethylenglykole. In den hierin dargestellten Strukturen ist R Wasserstoff, wenn die Position unsubstituiert ist. Man beachte, dass bestimmte Positionen zwei Substitutionsgruppen (R und R') ermöglichen, in welchem Fall die Rund R'-Gruppen entweder gleich oder voneinander verschieden sein können.
  • Unter „Alkylgruppe" oder grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken ist hierin eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe zu verstehen, wobei unverzweigte Alkylgruppen vorzuziehen sind. Wenn sie verzweigt sind, können sie an einer oder mehreren Positionen und – sofern nicht anders angegeben – an jeder beliebigen Position verzweigt sein. Die Alkylgruppe kann etwa 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatome enthalten (C1 – C30), wobei eine bevorzugte Ausführungsform von etwa 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatome (C1 – C20) verwendet; etwa C1 bis etwa C12 bis etwa C15 ist vorzuziehen, C1 bis C5 ist besonders vorzuziehen, obwohl in einigen Ausführungsformen die Alkylgruppe viel größer sein kann. In der Definition einer Alkylgruppe sind auch Cycloalkylgruppen wie etwa C5- und C6-Ringe sowie heterocyclische Ringe mit Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthalten. Zu Alkyl zählt auch Heteroalkyl, wobei Heteroatome von Schwefel, Sauerstoff, Stickstoff und Silicium vorzuziehen sind. Zu Alkyl zählen substituierte Alkylgruppen. Unter „substituierten Alkylgruppen" ist eine Alkylgruppe zu verstehen, die außerdem eine oder mehrere Substitutionsgruppierungen „R" (Definition s.o.) umfasst.
  • Unter „Aminogruppen" oder grammatikalisch gleichwertigen Ausdrücken sind hierin -NH2-, -NHR- und -NR2-Gruppen zu verstehen, wobei R wie oben definiert ist.
  • Unter „Nitrogruppe" ist hierin eine -NO2-Gruppe zu verstehen.
  • Unter „schwefelhaltigen Gruppierungen" sind hierin Verbindungen zu verstehen, die Schwefelatome enthalten, u.a. Thia-, Thio- und Sulfoverbindungen, Thiole (-SH und -SR) sowie Sulfide (-RSR-). Unter „phosphorhaltigen Gruppierungen" sind hierin Verbindungen zu verstehen, die Phosphor enthalten, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Phosphine und Phosphate. Unter „siliciumhaltigen Gruppierungen" sind hierin Silicium enthaltende Verbindungen zu verstehen.
  • Unter „Ether" ist hierin eine -O-R-Gruppe zu verstehen. Bevorzugte Ether umfassen Alkoxygruppen, wobei -O-(CH2)2CH3 und -O-(CH2)4CH3 vorzuziehen sind.
  • Unter „Ester" ist hierin eine -COOR-Gruppe zu verstehen.
  • Unter „Halogen" ist hierin Brom, lod, Chlor oder Fluor zu verstehen. Bevorzugte substituierte Alkyle sind teilweise oder vollständig halogenierte Alkyle wie etwa CF3 usw.
  • Unter „Aldehyd" sind hierin -RCHO-Gruppen zu verstehen.
  • Unter „Alkohol" sind hierin -OH-Gruppen sowie Alkylalkohole -ROH zu verstehen.
  • Unter „Amido" sind hierin -RCONH- oder RCONR-Gruppen zu verstehen.
  • Unter „Ethylenglykol" oder „(Poly)ethylenglykol" ist hierin eine -(O-CH2-CH2)n-Gruppe zu verstehen, obwohl jedes Kohlenstoffatom der Ethylengruppe auch einzeln oder doppelt mit dem oben definierten R substituiert sein kann, d.h. -(O-CR2-CR2)n. Ethylenglykolderivate mit anderen Heteroatomen anstelle von Sauerstoff (d.h. -(N-CH2-CH2)n oder -S(CH2-CH2)n oder mit Substitutionsgruppen) sind auch vorzuziehen.
  • Bevorzugte Substitutionsgruppen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Alkoxygruppen, wie etwa -O-(CH2)2CH3 und -O-(CH2)4CH3, sowie Ethylenglykol und Derivate davon.
  • Bevorzugte aromatische Gruppen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Phenyl, Naphthyl, Naphthalin, Anthracen, Phenanthrolin, Pyrrol, Pyridin, Thiophen, Por phyrine und substituierte Derivate davon, einschließlich der Derivate mit kondensiertem Ring.
  • Wenn in den hierin dargestellten leitenden Oligomeren g = 1 ist, ist B–D eine Bindung, die zwei Atome oder chemische Gruppierungen miteinander verknüpft. In einer bevorzugten Ausführungsform ist B–D eine konjugierte Bindung, die überlappende oder konjugierte π-Orbitale enthält.
  • Bevorzugte B-D-Bindungen sind ausgewählt aus Acetylen (-C≡C, auch Alkin oder Ethin genannt), Alken (-CH=CH-, auch als Ethylen bezeichnet), substituiertem Alken (-CR=CR-, -CH=CR und -CR=CH-), Amid (-NH-CO- und -NR-CO- oder -CO-NH- und -CO-NR-), Azo (-N=N-), Estern und Thioestern (-CO-O-, -O-CO-, -CS-O- und -O-CS-) und anderen konjugierten Bindungen wie z.B. (-CH=N-, -CR=N-, -N=CH- und -N=CR-), (-SiH=SiH-, -SiR=SiH- und -CR=SiR-), (-SiH=CH-, -SiR=CH, -SiH=CR-, -SiR=CR-, -CH=SiH-, -CR=SiH-, -CH=SiR- und -CR=SiR-). Besonders bevorzugte B-D-Bindungen sind Acetylen, Alken, Amid und substituierte Derivate von diesen drei Verbindungen sowie Azo. Besonder bevorzugte B-D-Bindungen sind Acetylen, Alken und Amid. Die an die Doppelbindungen gebundenen Oligomerkomponenten können in trans- oder cis-Konformation oder Gemischen vorliegen. Somit kann entweder B oder D Kohlenstoff, Stickstoff oder Silicium enthalten. Die Substitutionsgruppen sind wie oben in Zusammenhang mit R definiert.
  • Wenn im leitenden Oligomer von Struktur 1 g = 0 ist, ist e vorzugsweise 1, und die D-Gruppierung kann Carbonyl oder eine Heteroatomgruppierung (s.o.) sein.
  • Wie oben für die Y-Ringe ausgeführt können innerhalb jedes einzelnen leitenden Oligomers die B-D-Bindungen (oder D-Gruppierungen, wenn g = 0 ist) gleich sein, oder es kann zumindest eine unterschiedlich sein. Wenn z.B. m = 0 ist, kann die endständige B-D-Bindung eine Amidbindung und der Rest der B-D-Bindungen Acetylenbindungen sein. Wenn Amidbindungen vorhanden sind, sind im Allgemeinen so wenig Amidbindungen wie möglich vorzuziehen, doch in einigen Ausführungsformen sind alle B-D-Bindungen Amidbindungen. Wie oben in Zusammenhang mit den Y-Ringen beschrieben, kann eine Art von B-D-Bindung im leitenden Oligomer innerhalb einer Monoschicht (siehe unten) und eine andere Art oberhalb der Monoschicht vorhanden sein, um z.B. der Nucleinsäurehybridisierung mehr Flexibilität zu verleihen, wenn die Nucleinsäure über ein leitendes Oligomer gebunden wird.
  • In den hierin angeführten Strukturen ist n eine ganze Zahl von 1 bis 50, obwohl längere Oligomere ebenfalls verwendet werden können (siehe z.B. Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33(13), 1360 (1994)). Ohne sich auf eine Theorie beschränken zu wollen, scheint Folgendes zuzutreffen: Damit die Hybridisierung von Nucleinsäuren an eine Oberfläche wirkungsvoll abläuft, sollte die Hybridisierung in einem Abstand von der Oberfläche stattfinden, d.h. die Kinetik der Hybridisierung nimmt als Funktion des Abstands von der Oberfläche zu, insbesondere bei langen Oligonucleotiden mit 200 bis 300 Basenpaaren. Wenn demnach eine Nucleinsäure über ein leitendes Oligomer gebunden wird, wie dies weiter unten ausführlich dargestellt ist, ist die Länge des leitenden Oligomers solcherart, dass das nächste Nucleotid der Nucleinsäure etwa 6 bis etwa 100 Å (obwohl Abstände bis zu 500 Å in in Frage kommen) von der Elektrodenoberfläche entfernt ist, wobei ein Abstand von etwa 15 bis etwa 60 Å bevorzugt ist und ein Abstand von etwa 25 bis etwa 60 Å besonders bevorzugt ist. Demzufolge hängt n von der Größe der aromatischen Gruppe ab, reicht aber im Allgemeinen von etwa 1 bis etwa 20, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 15, noch bevorzugter von etwa 3 bis etwa 10.
  • In den hierin offenbarten Strukturen ist m entweder 0 oder 1. Wenn m = 0 ist, kann das leitende Oligomer in der B-D-Bindung oder D-Gruppierung enden, d.h. das D-Atom ist entweder direkt oder über einen Linker an die Nucleinsäure gebunden. In einigen Ausführungsformen, z.B. wenn das leitende Oligomer an ein Phosphat des Ribosephosphat-Rückgrats einer Nucleinsäure gebunden ist, können zusätzliche Atome wie z.B. ein Linker vorhanden sein, die zwischen dem leitenden Oligomer und der Nucleinsäure gebunden sind. Wie weiter unten beschrieben kann das D-Atom das Stockstoffatom der Amino-modifizierten Ribose sein. Alternativ dazu kann – wenn m = 1 ist – das leitende Oligomer in Y, einer aromatischen Gruppe, enden, d.h. die aromatische Gruppe ist an die Nucleinsäure oder den Linker gebunden.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können viele verschiedene mögliche leitende Oligomere verwendet werden. Dazu zählen leitende Oligomere, denen die Formeln der Struktur 1 und Struktur 8 entsprechen, sowie andere leitende Oligomere, die auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, z.B. Verbindungen umfassend kondensierte aromatische Ringe oder Teflon®-artige Oligomere, z.B. -(CF2)n-, -(CHF)n- und -(CFR)n-. Siehe z.B. Schumm et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 33, 1361 (1994); Grosshenny et al., Platinum Metals Rev. 40(1), 26 – 35 (1996); Tour, Chem. Rev. 96, 537 – 553 (1996); Hsung et al., Organometallics 14, 4808 – 4815 (1995); und die dort angeführten Literaturhinweise.
  • Besonders bevorzugte leitende Oligomere dieser Ausführungsform sind nachstehend angeführt:
  • Figure 00750001
  • Struktur 2 ist Struktur 1, wenn g = 1 ist. Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 2 sind: e = 0, Y ist Pyrrol oder substituiertes Pyrrol; e = 0, Y ist Thiophen oder substituiertes Thiophen; e = 0, Y ist Furan oder substituiertes Furan; e = 0, Y ist Phenyl oder subsituiertes Phenyl; e = 0, Y ist Pyridin oder substituiertes Pyridin; e = 1, B-D ist Acetylen, und Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl (siehe Struktur 4 weiter unten). Eine bevorzugte Ausführungsform von Struktur 2 liegt auch vor, wenn e = 1 ist (siehe nachstehende Struktur 3):
  • Figure 00750002
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 3 sind: Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl, und B-D ist Azo; Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl, und B-D ist Acety len; Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl, und B-D ist Alken; Y ist Pyridin oder substituiertes Pyridin, und B-D ist Acetylen; Y ist Thiophen oder substituiertes Thiophen, und B-D ist Acetylen; Y ist Furan oder substituiertes Furan, und B-D ist Acetylen; Y ist Thiophen oder Furan (oder substituiertes Thiophen oder Furan), und B-D sind alternierende Alken- und Acetylenbindungen.
  • Die meisten der hierin gezeigten Strukturen verwenden ein leitendes Oligomer gemäß Struktur 3. Beliebige Oligomere der Struktur 3 können jedoch mit beliebigen anderen hierin dargestellten Strukturen substituiert sein, d.h. mit Oligomer gemäß Struktur 1 oder 8 oder mit einem anderen leitenden Oligomer, wobei die Verwendung dieser Struktur 3 den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken soll.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 3 sind die nachstehend angeführten Strukturen 4, 5, 6 und 7.
  • Figure 00760001
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 4 sind: n = 2, m = 1, und R ist Wasserstoff; n = 3, m = 0, und R ist Wasserstoff; und die Verwendung von R-Gruppen zur Steigerung der Löslichkeit.
  • Figure 00760002
  • Wenn die B-D-Bindung eine Amidbindung ist (wie in Struktur 5), sind die leitenden Oligomere Pseudopeptidoligomere. Obwohl die Amidbindung in Struktur 5 mit dem Carbonyl auf der linken Seite dargestellt ist (d.h. -CONH-), kann auch das Gegenteil zutreffen, d.h. -NHCO-. Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 5 sind: n = 2, m = 1, und R ist Wasserstoff; n = 3, m = 0, und R ist Wasserstoff (in dieser Ausführungsform kann der endständige Stickstoff (das D-Atom) der Stickstoff der Amino-modifizierten Ribose sein); und die Verwendung von R-Gruppen zur Steigerung der Löslichkeit.
  • Figure 00770001
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 6 sind: n = 2, das zweite n = 1, m = 0, und alle R-Gruppen sind Wasserstoff, oder die Verwendung von R-Gruppen zur Steigerung der Löslichkeit.
  • Figure 00770002
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 7 sind: das erste n = 3, das zweite n ist von 1 – 3, wobei m entweder 0 oder 1 ist, und die Verwendung von R-Gruppen zur Steigerung der Löslichkeit.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das leitende Oligomer die in Struktur 8 gezeigte Struktur:
  • Figure 00770003
  • In dieser Ausführungsform steht C für Kohlenstoffatome, n ist eine ganze Zahl von 1 – 50, m = 0 oder 1, J ist ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Silicium, Phosphor, Schwefel, Carbonyl oder Sulfoxid, und G ist eine Bindung, ausgewählt aus Alkan, Alken oder Acetylen, so dass gemeinsam mit den zwei Kohlenstoffatomen die C-G-C-Gruppe Folgendes ist: ein Alken (-CH=CH-), substituiertes Alken (-CR=CR-) oder Gemische davon (-CH=CR- oder -CR=CH-), Acetylen (-C≡C-) oder Alkan (-CR2-CR2-, wobei R entweder Wasserstoff oder eine Substitutionsgruppe ist, wie dies hierin beschrieben ist). Die G-Bindung jeder Untereinheit kann die gleich wie oder anders als die G-Bindungen anderer Untereinheiten sein; abwechselnde Oligomere von Alken- und Acetylen-Bindungen können verwendet werden usw. Wenn G eine Alkanbindung ist, sollte die Anzahl an Alkanbindungen im Oligomer auf einem Minimum gehalten werden, wobei etwa 6 oder weniger Sigma-Bindungen pro leitendem Oligomer vorzuziehen sind. Alkenbindungen sind vorzuziehen und hierin allgemein beschrieben, obwohl Alkan- und Acetylenbindungen in jeder hierin beschriebenen Struktur oder Ausführungsform substituiert sein können, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist.
  • In einigen Ausführungsformen – z.B. wenn keine ETMs vorhanden sind – ist zumindest eine der G-Bindungen keine Alkanbindung, wenn m = 0 ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist in Struktur 8 m = 0. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist m = 0, und G ist eine Alkenbindung, wie dies aus Struktur 9 ersichtlich ist:
  • Figure 00780001
  • Das Alkenoligomer von Struktur 9 und andere hierin offenbarte Beispiele dafür sind im Allgemeinen in der bevorzugten trans-Konfiguration dargestellt, obwohl Oligomere von cis oder Gemischen von trans und cis auch in Frage kommen. Wie oben können R-Gruppen zugesetzt sein, um die Bepackung der Zusammensetzungen auf einer Elektrode, die Hydrophilie oder die Hydrophobie des Oligomers und die Flexibilität, d.h. die Rotations-, Torsions- oder Längsflexibilität des Oligomers, zu modifizieren. n ist wie oben definiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist R Wasserstoff, obwohl R auch Alkylgruppen und Polyethylenglykole oder Derivate sein kann.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das leitende Oligomer ein Gemisch unterschiedlicher Arten von Oligomeren sein, z.B. der Strukturen 1 und 8.
  • Besonders zur Verwendung mit Systemen der Mechanismus-2 umfasst die Monoschicht leitende Oligomere, und der Terminus zumindest einiger der leitenden Oligomere in der Monoschicht liegt elektronisch frei. Unter „elektronisch freiliegend" versteht man hierin das Folgende: Nachdem eine ETM in unmittelbare Nähe des Terminus gebracht und die Einleitung mit dem entsprechenden Signal erfolgte, kann ein von der Gegenwart der ETM abhängiges Signal detektiert werden. Die leitenden Oligomere können endständige Gruppen aufweisen oder nicht. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht keine zusätzliche endständige Gruppe, und das leitende Oligomer endet mit einer der in Strukturen 1 bis 9 gezeigten Gruppen, z.B. einer B-D-Bindung wie etwa einer Acetylenbindung. Alternativ dazu wird – in einer bevorzugten Ausführungsform – eine endständige Gruppe zugegeben, die hierin manchmal als „Q" dargestellt ist. Eine endständige Gruppe kann aus verschiedenen Gründen verwendet werden: Sie trägt z.B. zur elektronischen Verfügbarkeit des leitenden Oligomers für die Detektion von ETMs bei, oder sie modifiziert die Oberfläche der SAM aus anderen Gründen, z.B. zur Verhinderung nichtspezifischer Bindung. Wenn beispielsweise der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist, können negativ geladene Gruppen auf dem Terminus vorhanden sein, um eine negativ geladene Oberfläche zu bilden, so dass – falls die Nucleinsäure DNA oder RNA ist – die Nucleinsäure abgestoßen oder daran gehindert wird, sich auf der Oberfläche niederzulassen, um so die Hybridisierung zu vereinfachen. Bevorzugte endständige Gruppen sind -NH3, -OH, – COOH und Alkylgruppen wie etwa -CH3 sowie (Poly)alkyloxide wie etwa (Poly)ethylenglykol, wobei -OCH2CH2OH, -(OCH2CH2O)2H, -(OCH2CH2O)3H und -(OCH2CH2O)4H vorzuziehen sind.
  • In einer Ausführungsform ist es möglich, Gemische leitender Oligomere mit unterschiedlichen Arten endständiger Gruppen zu verwenden. Somit können z.B. einige der endständigen Gruppen die Detektion vereinfachen, und einige können nichtspezifische Bindung verhindern.
  • Es ist zu beachten, dass die Monoschicht unterschiedliche leitende Oligomerspezies umfassen kann, obwohl vorzugsweise die unterschiedlichen Spezies so ausgewählt sind, dass eine einigermaßen gleichförmige SAM gebildet werden kann. Wenn z.B. Einfangbindungsliganden wie etwa Nucleinsäuren kovalent über leitende Oligomere an die Elektrode gebunden sind, ist es möglich, eine Art von leitendem Oligomer vorzusehen, das zur Bindung der Nucleinsäure dient, wobei die andere Art die Funktion hat, die ETM zu detektieren. Ebenso kann es wünschenswert sein, Gemische von leitenden Oligomere unterschiedlicher Längen in der Monoschicht vorzusehen, um auf diese Weise nichtspezifische Signale zu reduzieren. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden leitende Oligomere, die unterhalb der Oberfläche des Rests der Monoschicht, d.h. unterhalb der gegebenenfalls verwendeten Isolatorschicht, oder unterhalb einer Fraktion der anderen leitenden Oligomere enden. Die Verwendung unterschiedlicher leitender Oligomere kann erfolgen, um die Bildung der Monoschicht zu erleichtern oder Monoschichten mit modifizierten Eigenschaften herzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Monoschicht außerdem Isolatorgruppierungen umfassen. Unter „Isolator" ist hierin ein im Wesentlichen nichtleitendes Oligomer zu verstehen, das vorzugsweise linear ist. Unter „im Wesentlichen nicht-leitend" ist hierin zu verstehen, dass der Isolator Elektronen bei 100 Hz nicht überträgt. Die Elektronentransferrate durch den Isolator ist vorzugsweise niedriger als die Rate durch die hierin beschriebenen leitenden Oligomere.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die Isolatoren eine Leitfähigkeit von S von etwa 10–7Ω–1cm–1 oder weniger, vorzugsweise von weniger als etwa 10–8 Ω–1cm–1. In Gardner et al., s.o., finden sich allgemeine Ausführungen dazu.
  • Im Allgemeinen sind Isolatoren Alkyl- oder Heteroalkyloligomere oder Gruppierungen mit Sigma-Bindungen, obwohl jedes beliebige Isolatormolekül aromatische Gruppen oder eine oder mehrere konjugierte Bindungen enthalten kann. Unter „Heteroalkyl" ist hierin eine Alkylgruppe zu verstehen, die zumindest ein Heteroatom, d.h. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Silicium oder Bor, in der Kette besitzt. Alternativ dazu kann der Isolator dem leitenden Oligomer ähneln und außerdem ein oder mehrere Heteroatome oder Bindungen aufweisen, die dazu dienen, den Elektronentransfer, vorzugsweise wesentlich, zu hemmen oder zu verlangsamen.
  • Geeignete Isolatoren sind auf dem Gebiet bekannt, u.a. -(CH2)n-, -(CRH)n- und -(CR2)n-, Ethylenglykol oder Derivate unter Verwendung anderer Heteroatome anstelle von Sauerstoff, d.h. Stickstoff oder Schwefel (Schwefelderivate sind nicht vorzuziehen, wenn die Elektrode aus Gold besteht).
  • Wie im Fall der leitenden Oligomere können die Isolatoren mit den hierin definierten R-Gruppen substituiert sein, um die Bepackung der Gruppierungen oder leitenden Oligomere auf einer Elektrode, die Hydrophilie oder Hydrophobie des Isolators und die Flexibilität, d.h. die Rotations-, Torsions- oder Längsflexibilität, des Isolators zu modifizieren. Beispielswiese können verzweigte Alkylgruppen verwendet werden. Die Isolatoren können endständige Gruppen (s.o.) enthalten, insbesondere um die Oberfläche der Monoschicht zu beeinflussen.
  • Die Länge der die Monoschicht bildenden Spezies variiert je nach Bedarf. Wie oben dargestellt, scheint die Bindung von Zielanalyten (z.B. die Hybridisierung von Nucleinsäuren) in einem Abstand von der Oberfläche wirkungsvoller zu sein. Die Spezies, an die die Einfangbindungsliganden gebunden werden (wie unten erläutert kann es sich entweder um Isolatoren oder leitende Oligomere handeln), können im Wesentlichen die gleiche Länge aufweisen wie die Monoschichten-bildenden Spezies, oder sie können länger als diese sein; dies hat zur Folge, dass die Einfangbindungsliganden für das Hybridisierungslösungsmittel zugänglicher sind. In einigen Ausführungsformen können die leitenden Oligomere, an die die Einfangbindungsliganden gebunden sind, kürzer als die Monoschicht sein.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können die tatsächlichen Kombinationen und Verhältnisse unterschiedlicher die Monoschicht bildender Spezies stark variieren; sie hängen davon ab, ob Mechanismus-1 oder Mechanismus-2 zur Anwendung kommt und ob ein Ein-Elektrodensystem oder ein Zwei-Elektrodensysteme verwendet wird, wie dies ausführlich unten erläutert ist. Im Allgemeinen sind für Mechanismus-2-Systeme Drei-Komponenten-Systeme vorzuziehen, wobei die ersten Spezies einen Spezies enthaltenden Einfangbindungsliganden umfassen (wird als Einfangsonde bezeichnet, wenn der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist), der über einen Isolator oder ein leitendes Oligomer an die Elektrode gebunden ist. Die zweiten Spezies sind die leitenden Oligomere, und die dritten Spezies sind Isolatoren. In dieser Ausführungsform können die ersten Spezies von etwa 90 % bis etwa 1 %, vorzugsweise von etwa 20 % bis etwa 40 %, umfassen. Wenn die Zielanalyten Nucleinsäuren sind, ist ein Wert von etwa 30 % bis etwa 40 % für kurze Oligonucleotidziele und von etwa 10 % bis etwa 20 % für längere Ziele besonders vorzuziehen. Die zweiten Spezies können von etwa 1 % bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 20 % bis etwa 90 %, noch bevorzugter von etwa 40 % bis etwa 60 %, umfassen. Die dritten Spezies können von etwa 1 % bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 20 % bis etwa 40 %, noch bevorzugter von etwa 15 % bis etwa 30 %, umfassen. Bevorzugte Verhältnisse zwischen ersten, zweiten und dritten Spezies sind 2:2:1 für kurze Ziele und 1:3:1 für längere Ziele, wobei eine Gesamt-Thiolkonzentration (wenn sie dazu dient, diese Spezies zu binden, wie dies weiter unten ausführlich erläutert wird) im Bereich von 500 μM bis 1 mM liegt und vorzugsweise 833 μM beträgt.
  • Alternativ dazu können Zwei-Komponenten-Systeme Anwendung finden. In einer Ausführungsform sind – zur Verwendung in Mechanismus-1- oder Mechanismus-2-Systemen – die zwei Komponenten die ersten und die zweiten Spezies. In dieser Ausführungsform können die ersten Spezies von etwa 1 % bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 1 % bis etwa 40 %, noch bevorzugter von etwa 10 % bis etwa 40 %, umfassen. Die zweiten Spezies können von etwa 1 % bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 10 % bis etwa 60 %, noch bevorzugter von etwa 20 % bis etwa 40 %, umfassen. Alternativ dazu können bei Anwendung von Mechanismus-1-Systemen die zwei Komponenten die ersten und die dritten Spezies sein. In dieser Ausführungs form können die ersten Spezies von etwa 1 % bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 1 % bis etwa 40 %, noch bevorzugter von etwa 10 % bis etwa 40 %, umfassen. Die zweiten Spezies können von etwa 1 % bis etwa 90 %, vorzugsweise von etwa 10 % bis etwa 60 %, noch bevorzugter von etwa 20 % bis etwa 40 %, umfassen.
  • Die kovalente Bindung der leitenden Oligomere und Isolatoren an die Elektrode kann auf unterschiedliche Weise erfolgen; dies hängt von der Elektrode und den Zusammensetzungen der Isolatoren und leitenden Oligomere ab. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungslinker mit kovalent gebundenen Nucleosiden oder Nucleinsäuren (hierin offenbart) kovalent an eine Elektrode gebunden. Ein Ende des Terminus des Bindungslinkers ist somit an das Nucleosid oder die Nucleinsäure gebunden, das andere an eine Elektrode. In einigen Ausführungsformen ist es unter Umständen wünschenswert, dass der Bindungslinker an eine andere Position als den Terminus gebunden ist oder dass man sogar einen verzweigten Bindungslinker vorsieht, der an eine Elektrode an einem Terminus und an zwei oder mehr Nucleoside an anderen Termini gebunden ist; dies ist jedoch nicht vorzuziehen. Der Bindungslinker kann auch an zwei Stellen an die Elektrode gebunden sein, wie dies allgemein in den Strukturen 11 – 13 dargestellt ist. Im Allgemeinen wird eine Art von Linker verwendet (siehe „A" in nachstehender Struktur 10, worin „X" das leitende Oligomer ist, „I" ein Isolator ist und die schraffierte Fläche die Elektrode ist):
  • Figure 00830001
  • In dieser Ausführungsform ist A ein Linker oder Atom. Die Auswahl von „A" hängt teilweise von den Eigenschaften der Elektrode ab. A kann z.B. eine Schwefelgruppierung sein, wenn eine Goldelektrode verwendet wird.
  • Alternativ dazu kann – bei Verwendung von Metalloxidelektroden – A eine Silicium(Silan-) Gruppierung sein, die an den Sauerstoff des Oxids gebunden ist (siehe z.B. Chen et al., Langmuir 10, 3332 – 3337 (1994); Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78, 195 – 201 (1977); beide Publikationen sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen). Wenn Elektroden auf Kohlenstoffbasis verwendet werden, kann A eine Aminogruppierung sein (vorzugsweise ein primäres Amin; siehe z.B. Deinhammer et al., Langmuir 10, 1306 – 1313 (1994)). Somit sind bevorzugte A-Gruppierungen u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Silangruppierungen, Schwefelgruppierungen (z.B. Alkylschwefelgruppierungen) und Aminogruppierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Epoxid-artige Bindungen mit Redoxpolymeren, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, nicht verwendet.
  • Obwohl hierin als einzelne Gruppierung vorgestellt, können die Isolatoren und leitenden Oligomere mit mehr als einer „A"-Gruppierung an die Elektrode gebunden sein; die „A"-Gruppierungen können gleich oder unterschiedlich sein. Wenn demnach die Elektrode z.B. eine Goldelektrode und „A" ein Schwefelatom oder eine Schwefelgruppierung ist, können mehrere Schwefelatome dazu dienen, das leitende Oligomer an die Elektrode zu binden, wie dies allgemein in nachstehenden Strukturen 11, 12 und 13 dargestellt ist. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, sind auch andere Strukturen möglich. In Strukturen 11, 12 und 13 ist die A-Gruppierung nur ein Schwefelatom, doch substituierte Schwefelgruppierungen kommen auch in Frage.
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Es ist auch zu beachten, dass es ähnlich wie in Struktur 13 unter Umständen möglich ist, ein leitendes Oligomer vorzusehen, das in einem einzelnen Kohlenstoffatom endet, wobei drei Schwefelgruppierungen an die Elektrode gebunden sind. Außerdem können – obwohl dies nicht immer hierin so dargestellt ist – die leitenden Oligomere und Isolatoren auch eine „Q"-Endgruppe umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Elektrode eine Goldelektrode, und die Bindung erfolgt über eine Schwefelbindung, wie dies auf dem Gebiet allgemein bekannt ist, d.h. die A-Gruppierung ist ein Schwefelatom oder eine Schwefelgruppierung. Obwohl die genauen Eigenschaften der Gold-Schwefel-Bindung nicht bekannt sind, gilt diese Bindung für die Zwecke der Erfindung als kovalent. Eine repräsentative Struktur ist Struktur 14, in der das leitende Oligomer von Struktur 3 zur Anwendung kommt, obwohl wie bei allen der hierin offenbarten Strukturen beliebige leitende Oligomere oder Kombinationen leitender Oligomere in Frage kommen. Beliebige der leitenden Oligomere oder Isolatoren können auch die hierin erläuterten endständigen Gruppen umfassen. Struktur 14 zeigt den „A"-Linker, der nur ein Schwefelatom umfasst, doch es können auch weitere Atome vorhanden sein (d.h. Linker vom Schwefel zum leitenden Oligomer oder Substitutionsgruppen). Außerdem zeigt Struktur 14 das Schwefelatom, das an die aromatischen Y-Gruppe gebunden ist, doch ist für Fachleute auf dem Gebiet zu beachten, dass es auch an die B-D-Gruppe (d.h. einem Acetylen) gebunden sein kann.
  • Figure 00850002
  • Im Allgemeinen sind Thiolbindungen vorzuziehen, wenn zwei Elektrodensätze verwendet werden (die Detektionselektroden mit den SAMs werden bei hohen elektrophoretischen Spannungen von mehr als 800 oder 900 mV nicht verwendet; sie bewirken Oxidation der Thiolbindung und den Verlust der SAM). Wenn ein Elektrodensatz verwendet wird, werden niedrigere elektrophoretische Spannungen angelegt, wie dies allgemein weiter unten beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Elektrode eine Kohlenstoffelektrode, d.h. eine Glaskohlenstoffelektrode, und die Bindung erfolgt über einen Stickstoff einer Amingruppe. Eine repräsentative Struktur ist Struktur 15. Wiederum können weitere Atome vorhanden sein, d.h. Z-Linker und/oder Endgruppen.
  • Figure 00860001
  • In Struktur 16 stammt das Sauerstoffatom aus dem Oxid der Metalloxidelektrode. Das Si-Atom kann auch andere Atome enthalten, d.h. es kann eine Substitutionsgruppen enthaltende Siliciumgruppierung sein. Andere Bindungen für SAMs an andere Elektroden sind auf dem Gebiet bekannt; siehe z.B. Napier et al., Langmuir (1997), wo die Bindung an Indiumzinnoxid-Elektroden und auch die Chemisorption von Phosphaten an eine Indiumzinnoxid-Elektrode beschrieben sind (Referat von H. Holden Thorpe, CHI Konferenz, 4. – 5. Mai 1998).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Detektionselektrode überdies einen Einfangbindungsliganden, der vorzugsweise kovalent gebunden ist. Im Allgemeinen ist in den meisten der hierin offenbarten Mechanismus-2-Ausführungsformen werden zumindest zwei Bindungsliganden pro Zielanalytmolekül verwendet – ein „Einfang"- oder „Anker"-Bindungsligand (hierin auch als „Einfangsonde" bezeichnet, insbesondere unter Bezugnahme auf einen Nucleinsäurebindungsliganden), der an die hierin beschriebenen Detektionselektrode gebunden ist, und ein löslicher Bindungsligand, der sich unabhängig an den Zielanalyten bindet und entweder direkt oder indirekt zumindest eine ETM umfasst.
  • Somit werden in bevorzugten Ausführungsformen – obwohl dies nicht erforderlich ist – die Zielsequenzen auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Dies erfolgt vorzugsweise unter Einsatz von Einfangsonden und gegebenenfalls unter Einsatz einer oder mehrerer Einfang-Extendersonden. Wenn nur Einfangsonden verwendet werden, ist es notwendig, eindeutige Einfangsonden für jede Zielsequenz zu besitzen; d.h. die Oberfläche muss spezifisch ausgebildet sein, um eindeutige Einfangsonden zu enthalten. Alternativ dazu können Einfang-Extendersonden verwendet werden, die eine „universelle" Oberfläche ermöglichen, d.h. eine Oberfläche, die einen einzelnen Typ von Einfangsonde enthält, die zum Detektieren beliebiger Zielsequenzen verwendet werden kann. „Einfang-Extendersonden" besitzen einen ersten Abschnitt, der an die Gesamtheit oder einen Teil der Einfangsonde hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt, der an einen ersten Abschnitt der Zielsequenz hybridisiert. Dies gestattet dann die Erzeugung spezifisch ausgebildeter löslicher Sonden, was – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Endung offenkundig ist – im Allgemeinen einfacher und weniger kostspielig ist. Wie dies hierin veranschaulicht ist, können zwei Einfang-Extendersonden verwendet werden. Dies wurde im Allgemeinen deshalb durchgeführt, um Testkomplexe zu stabilisieren (z.B. wenn die Zielsequenz groß ist oder wenn große Amplifikatorsonden – insbesondere verzweigte oder Dendrimer-Amplifikatorsonden – verwendet werden).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuren nach der Bildung der SAM zugegeben, wie dies hierin beschrieben ist. Dies kann auf unterschiedliche Weise erfolgen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist.
  • In einer Ausführungsform werden leitende Oligomere mit endständigen funktionellen Gruppen gebildet, wobei bevorzugte Ausführungsformen aktivierte Carboxylate und Isothiocyanate verwenden, die mit primären Aminen reagieren, die unter Einsatz eines aktivierten Carboxylats auf die Nucleinsäure aufgebracht werden. Diese zwei Reagenzien besitzen den Vorteil, dass sie in wässriger Lösung stabil sind, doch mit primären Alkylaminen reagieren. Die primären aromatischen Amine sowie die sekundären und tertiären Amine der Basen sollten jedoch nicht reagieren, wodurch stellenspezifische Addition von Nucleinsäuren auf die Oberfläche ermöglicht wird. Dies ermöglicht das Tupfen von Sonden (entweder von Einfang- oder von Detektionssonden oder von beidem) auf die Oberfläche, wobei hier bekannte Verfahren zur Anwendung kommen (Tintenstrahl, Betupfen usw.).
  • Außerdem existieren einige Nicht-Nucleinsäureverfahren, die zur Immobilisierung einer Nucleinsäure auf einer Oberfläche dienen können. Beispielsweise können Bindungspartnerpaare verwendet werden, d.h. ein Bindungspartner ist an den Terminus eines Bindungslinkers (siehe unten) gebunden, der andere am Ende der Nucleinsäure. Des kann auch ohne Verwendung einer Nucleinsäure-Einfangsonde erfolgen; ein Bindungspartner dient als Einfangsonde, der andere ist entweder an die Zielsequenz oder die Einfang-Extendersonde gebunden. Entweder umfasst die Zielsequenz den Bindungspartner, oder eine Einfang-Extendersonde, die an die Zielsequenz hybridisiert, umfasst den Bindungspartner. Geeignete Bindungspartnerpaare sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Haptenpaare wie z.B. Biotin/Streptavidin; Antigene/Antikörper; NTA/Histidin-Marker usw. Im Allgemeinen sind kleinere Bindungspartner vorzuziehen, so dass die Elektronen von der Nucleinsäure in das leitende Oligomer gelangen können und die Detektion ermöglicht werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zielsequenz selbst modifiziert, um einen Bindungspartner zu enthalten; der Bindungspartner wird über ein modifiziertes Nucleotid gebunden, das enzymatisch an die Zielsequenz gebunden werden kann, z.B. während eines PCR-Zielamplifikationsschritts. Alternativ dazu sollte der Bindungspartner leicht an die Zielsequenz gebunden werden können.
  • Alternativ dazu kann eine Einfang-Extendersonde verwendet werden, die einen Nucleinsäureabschnitt für die Hybridisierung an das Ziel sowie einen Bindungspartner aufweist (z.B. kann die Einfang-Extendersonde einen Nicht-Nucleinsäureabschnitt wie etwa einen Alkyllinker umfassen, der zur Bindung eines Bindungspartners verwendet wird). In dieser Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die doppelsträngige Nucleinsäure des Ziels und die Einfang-Extendersonde zwecks Stabilität miteinander zu vernetzen, z.B. unter Verwendung von Psoralen, wie dies auf dem Gebiet bekannt ist.
  • In einer Ausführungsform wird das Ziel nicht unter Verwendung von Einfangsonden an die Elektrodenoberfläche gebunden. Es ist in dieser Ausführungsform wie bei allen anderen hierin angeführten Tests wichtig, dass überschüssige Markersonden vor der Detektion entfernt werden und dass sich der Testkomplex in der Nähe der Oberfläche befindet. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, kann dies in anderer Weise erreicht werden. Beispielsweise kann der die ETMs umfassende Testkomplex auf Perlen vorhanden sein, die der die Monoschicht umfassenden Elektrode zugesetzt werden, und dann werden die Perlen unter Anwendung auf dem Gebiet allgemein bekannter Verfahren in die Nähe der Elektrodenoberfläche gebracht; dazu zählen Schwerkraftsetzung der Perlen auf der Oberfläche, elektrostatische oder magnetische Wechselwirkungen zwischen Perlenkomponenten und der Oberfläche, wobei hier die Bindungspartnerbindung wie oben angewendet wird. Alternativ dazu kann nach der Entfernung überschüssiger Reagenzien wie z.B. überschüssiger Markersonden der Testkomplex hinunter auf die Oberfläche gedrückt werden, z.B. indem das System mit einer Spannung gepulst wird, die dazu ausreicht, den Testkomplex auf die Oberfläche zu drücken.
  • Bevorzugte Ausführungsformen verwenden jedoch Testkomplexe, die über Nucleinsäure-Einfangsonden gebunden sind.
  • Im Allgemeinen ermöglicht der Einfangbindungsligand die Bindung eines Zielanalyten an die Detektionselektrode, um die Detektion durchzuführen. Wie dies ausführlich unten beschrieben ist, kann die Bindung des Zielanalyten an den Einfangbindungsliganden direkt (d.h. der Zielanalyt bindet sich an den Einfangbindungsligan den) oder indirekt (ein oder mehrere Einfang-Extenderliganden können verwendet werden) erfolgen.
  • Das Verfahren zur Bindung der Einfangbindungsliganen an den Bindungslinker (entweder einen Isolator oder leitenden Oligomer) erfolgt im Allgemeinen gemäß auf dem Gebiet bekannter Techniken und hängt sowohl von der Zusammensetzung des Bindungslinkers als auch von jener der Einfangbindungsliganden ab. Im Allgemeinen werden die Einfangbindungsliganden durch Einsatz funktioneller Gruppen an den Bindungslinker gebunden, die dann für die Bindung verwendet werden können. Bevorzugte funktionelle Gruppen zur Bindung sind Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen. Diese funktionellen Gruppen können entweder direkt oder indirekt durch Verwendung eines Linkers, der manchmal hierin als „Z" bezeichnet wird, gebunden werden. Linker sind auf dem Gebiet allgemein bekannt; z.B. homo- oder heterobifuktionale Linker (siehe Katalog der Pierce Chemical Company 1994, Abschnitt über Vernetzer, S. 155 – 200). Bevorzugte Z-Linker sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Alkylgruppen (z.B. substituierte Alkylgruppen und Alkylgruppen mit Heteroatomgruppierungen), wobei kurze Alkylgruppen, Ester, Amid, Amin, Epoxygruppen und Ethylenglykol und Derivate vorzuziehen und Propyl, Acetylen und C2-Alken besonders vorzuziehen sind. Z kann auch eine Sulfongruppe sein, die Sulfonamidbindungen bildet.
  • Auf diese Weise können Einfangbindungsliganden zugesetzt werden, die Proteine, Lectine, Nucleinsäuren, kleine organische Molelküle, Kohlenhydrate usw. umfassen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet proteinhaltige Einfangbindungsliganden. Wie dies auf dem Gebiet bekannt ist, können beliebige Techniken angewendet werden, um einen proteinhaltigen Einfangbindungsliganden an einen Bindungslinker zu binden. Unter „Protein" sind hierin Proteine, Polypeptide und Peptide zu verstehen. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Peptidbindungen oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen bestehen. Die Seitenketten können entweder in (R)- oder in (S)-Konfiguration vorliegen. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Wenn nicht-natürlich vorkommende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Amino säuresubstituenten verwendet werden, z.B. um In-vivo-Abbau zu verhindern oder zu verlangsamen. Es stehen eine Vielzahl an Techniken zur Verfügung, um Gruppierungen an Proteine zu addieren.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Nucleinsäuren als Einfangbindungsliganden. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, gelten viele der nachstehend beschriebenen Techniken in ähnlicher Weise für Nicht-Nucleinsäuresysteme.
  • Die Einfangsonden-Nucleinsäure wird über einen „Bindungslinker" kovalent an die Elektrode gebunden, welcher Linker entweder ein leitendes Oligomer (für Mechanismus-1-Systeme erforderlich) oder ein Isolator sein kann. Unter „kovalent gebunden" ist hierin zu verstehen, dass zwei Gruppierungen durch zumindest eine Bindung aneinander gebunden sind, z.B. σ-Bindungen, π-Bindungen und Koordinationsbindungen.
  • Somit ist ein Ende des Bindungslinkers an eine Nucleinsäure (oder einen anderen Bindungsliganden) und das andere Ende an die Elektrode gebunden (obwohl es sich – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – weder im ersten noch im zweiten Fall um den exakten Terminus handeln muss). Somit kann jede der hierin offenbarten Strukturen außerdem eine Nucleinsäure umfassen, die als Endgruppe wirkt. Die vorliegende Erfindung stellt demnach Zusammensetzungen, die Nucleinsäuren umfassen, die kovalent an Elektroden gebunden sind, bereit; dies ist allgemein aus nachstehender Struktur 17 ersichtlich:
  • Figure 00910001
  • In Struktur 17 stellen die schraffierten Markierungen auf der linken Seite eine Elektrode dar. X ist ein leitendes Oligomer und I ein Isolator (wie hierin definiert). F1 ist eine Verbindung, dank der die kovalente Bindung der Elektrode und des leitenden Oligomers oder Isolators möglich ist; Beispiele dafür sind Bindungen, Atome oder Linker, wie sie hierin beschrieben sind, z.B. „A" (Definition siehe unten). F2 ist eine Verbindung, die die kovalente Bindung des leitenden Oligomers oder Isolators an die Nucleinsäure ermöglicht; sie kann eine Bindung, ein Atom oder eine Verknüpfung sein, wie sie hierin beschrieben sind. F2 kann Teil des leitenden Oligomers, Teil des Isolators, Teil der Nucleinsäure oder exogen davon sein (wie hierin für „Z" definiert).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Einfangsonden-Nucleinsäure über ein leitendes Oligomer kovalent an die Elektrode gebunden. Die kovalente Bindung der Nucleinsäure und des leitenden Oligomers kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung über eine Bindung an der Base des Nucleosids, eine Bindung am Rückgrat der Nucleinsäure (entweder Ribose, Phosphat oder eine analoge Gruppe eines Nucleinsäure-analogen Rückgrats) oder einen Übergangsmetallliganden vor, wie dies weiter unten beschrieben ist. Die nachstehend offenbarten Techniken sind allgemein für natürlich vorkommende Nucleinsäuren beschrieben, doch ist zu beachten, dass auch ähnliche Techniken mit Nucleinsäureanaloga und in einigen Fällen mit anderen Bindungsliganden angewendet werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das leitende Oligomer an die Base eines Nucleosids der Nucleinsäure gebunden. Dies kann je nach dem Oligomer in unterschiedlicher Weise durchgeführt werden, wie dies weiter unten erläutert ist. In einer Ausführungsform ist das Oligomer an ein endständiges Nucleosid gebunden, d.h. entweder am 3'- oder am 5'-Nucleosid der Nucleinsäure. Alternativ dazu ist das leitende Oligomer an ein internes Nucleosid gebunden.
  • Der Punkt der Bindung an die Base variiert und hängt von der Base ab. Im Allgemeinen ist die Bindung an jeder beliebigen Position möglich. In einigen Ausführungsformen, z.B. wenn die die ETMs enthaltende Sonde für die Hybridisierung (d.h. Mechanismus-1-Systeme) verwendet wird, ist es vorzuziehen, die Bindung an Positionen vorzunehmen, die nicht an der Wasserstoffbindung an der komplementären Base beteiligt sind. Somit erfolgt im Allgemeinen die Bindung an die 5- oder 6-Position von Pyrimidinen wie z.B. Uridin, Cytosin und Thymin. Für Purine wie z.B. Adenin und Guanin erfolgt die Bindung vorzugsweise über die 8-Position. Die Bindung an Nicht-Standardbasen erfolgt vorzugsweise an den vergleichbaren Positionen.
  • In einer Ausführungsform ist die Bindung direkt, d.h. es befinden sich keine Atome zwischen dem leitenden Oligomer und der Base. In dieser Ausführungsform sind z.B. leitende Oligomere mit endständigen Acetylenbindungen direkt an die Base gebunden. Struktur 18 ist ein Beispiel für diese Verbindung, wobei ein leitendes Oligomer von Struktur 3 und Uridin als Base verwendet werden, obwohl auch andere Basen und leitende Oligomere in Frage kommen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist.
  • Figure 00930001
  • Es ist zu beachten, dass die hierin angeführten Pentose-Strukturen Wasserstoff, Hydroxy, Phosphate oder andere Gruppen wie z.B. gebundene Aminogruppen aufweisen können. Außerdem werden die vorliegenden Pentose- und Nucleosidstruktuen unkonventionell – als Spiegelbild der normalen Darstellung – gezeigt. Die Pentose- und Nucleosidstrukturen können an jeder beliebigen Position auch zusätzliche Gruppen enthalten, z.B. Schutzgruppen, wie sie z.B. während der Synthese erforderlich sein können.
  • Die Base kann gegebenenfalls zusätzliche Modifikationen aufweisen, d.h. die Carbonyl- oder Amingruppen können geändert oder geschützt sein, wie dies z.B. aus Fig. 3 oder Fig. 10 ersichtlich ist.
  • In einer alternativen Ausführungsform betrifft die Bindung eine beliebige Anzahl unterschiedlicher Z-Linker, einschließlich der Amid- und Aminbindungen, wie dies allgemein in Struktur 19 dargestellt ist; es werden Uridin als Base und ein Oligomer gemäß Struktur 3 verwendet.
  • Figure 00940001
  • In dieser Ausführungsform ist Z ein Linker. Vorzugsweise ist Z ein kurzer Linker mit etwa 1 bis etwa 10 Atomen, vorzugsweise 1 bis 5 Atomen, die Alken-, Alkinyl-, Amin-, Amid-, Azo-, Iminbindungen usw. enthalten können. Linker sind auf dem Gebiet bekannt, z.B. homo- oder heterobifunktionelle Linker (siehe den Katalog der Pierce Chemical Company, Abschnitt über Vernetzer, S. 155 – 200 (1994); hierin durch Verweis aufgenommen). Bevorzugte Z-Linker sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Alkylgruppen (einschließlich substituierter Alkylgruppen und Alkylgruppen mit Heteroatomgruppierungen), wobei kurze Alkylgruppen, Ester, Amid, Amin, Epoxygruppen und Ethylenglykol sowie Derivate vorzuziehen und Propyl, Acetylen und C2-Alken besonders vorzuziehen sind. Z kann auch eine Sulfongruppe sein, die Sulfonamidbindungen bildet (siehe unten).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung der Nucleinsäure und des leitenden Oligomers mittels Bindung an das Rückgrat der Nucleinsäure. Dies kann auf unterschiedliche Weise geschehen, z.B. durch Bindung an eine Ribose des Ribose-Phosphat-Rückgrats oder an das Phosphat des Rückgrats oder andere Gruppen analoger Rückgrate.
  • Es ist an dieser Stelle zu beachten, dass die Bindungsstelle in dieser Ausführungsform das endständige 3'- oder 5'-Nucleotid oder ein internes Nucleotid sein kann, wie dies nachstehend ausführlich erklärt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das leitende Oligomer an die Ribose des Ribose-Phosphat-Rückgrats gebunden. Dies kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Wie dies auf dem Gebiet bekannt ist, können Nucleoside gebildet werden, die entweder an der 2'- oder 3'-Position der Ribose mit Aminogruppen, Schwefelgruppen, Silicongruppen, Phosphorgruppen oder Oxogruppen modifiziert sind (Imazawa et al., J. Org. Chem. 44, 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42(4), 714 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36(2), 250 (1971); McGee et al., J. Org. Chem. 61, 781 – 785 (1995); Mikhailopulo et al., Liebigs Ann. Chem, 513 – 519 (1993); McGee et al., Nucleosides & Nucleotides 14(6), 1329 (1995), von denen alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Diese modifizierten Nucleoside dienen dann dazu, die leitenden Oligomere hinzuzufügen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Amino-modifizierte Nucleoside. Diese Amino-modifizierten Ribosen können dann zur Bildung von Amid- oder Aminbindungen an die leitenden Oligomeren herangezogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminogruppe direkt an die Ribose gebunden, obwohl – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – kurze Linker wie jene, die hierin für „Z" beschrieben sind, zwischen der Aminogruppe und der Ribose vorhanden sein können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Amidbindung für die Bindung an die Ribose verwendet. Vorzugsweise ist – wenn das leitende Oligomer der Strukturen 1 – 3 verwendet wird – m = 0, wodurch das leitende Oligomer in der Amidbindung endet. In dieser Ausführungsform ist der Stickstoff der Aminogruppe der Amino-modifizierten Ribose das „D"-Atom des leitenden Oligomers. Somit ist eine bevorzugte Bindung dieser Ausführungsform in Struktur 20 dargestellt (unter Verwendung des leitenden Oligomers gemäß Struktur 3).
  • Figure 00960001
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Endung offenkundig ist, besitzt Struktur 20 eine endständige Bindung als Amidbindung fixiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Heteroatomverbindung verwendet, z.B. Oxo, Amin, Schwefel usw. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet eine Aminverbindung. Wie oben in Zusammenhang mit den Amidbindungen ausgeführt, kann für Aminbindungen der Stickstoff der Amino-modifizierten Ribose das „D"-Atom des leitenden Oligomers sein, wenn das leitende Oligomer gemäß Struktur 3 verwendet wird. Strukturen 21 und 22 zeigen demnach Nucleoside mit den leitenden Oligomeren gemäß Struktur 3 bzw. 9, wobei der Stickstoff als Heteroatom verwendet wird; es kommen allerdings auch andere Heteroatome in Frage.
  • Figure 00960002
  • In Struktur 21 sind vorzugsweise weder m noch t 0. Ein bevorzugtes Z steht hierin für eine Methylengruppe oder andere aliphatische Alkyllinker. 1, 2 oder 3 Kohlenstoffe an dieser Position sind aus synthetischen Gründen besonders nützlich.
  • Figure 00960003
  • In Struktur 22 ist Z wie oben definiert. Geeignete Linker sind Methylen und Ethylen.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist das leitende Oligomer über das Phosphat des Ribose-Phosphat-Rückgrats (oder Analogs) einer Nucleinsäure kovalent an die Nucleinsäure gebunden. In dieser Ausführungsform ist die Bindung direkt, sie verwendet einen Linker, oder sie erfolgt über Amidbindung. Struktur 23 zeigt eine direkte Bindung, Struktur 24 die Bindung über eine Amidbindung (beide verwenden das leitende Oligomer von Struktur 3, obwohl auch die leitenden Oligomere gemäß Struktur 8 möglich sind). Strukturen 23 und 24 stellen das leitende Oligomer an der 3'-Position dar, obwohl auch die 5'-Position möglich ist. Außerdem zeigen sowohl Struktur 23 als auch 24 natürlich vorkommende Phosphodiesterbindungen, obwohl – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – Nicht-Standardanaloga von Phosphodiesterbindungen ebenfalls geeignet sind.
  • Figure 00970001
  • Wenn in Struktur 23 das endständige Y vorhanden ist (d.h. m = 1), ist vorzugsweise Z nicht vorhanden (d.h. t = 0). Wenn das endständige Y nicht vorhanden ist, ist Z vorzugsweise vorhanden.
  • Struktur 24 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform, worin die endständige B-D-Bindung eine Amidbindung ist, das endständige Y nicht vorhanden ist und Z ein Linker ist (wie hierin definiert).
  • Figure 00980001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das leitende Oligomer über einen Übergangsmetallliganden kovalent an die Nucleinsäure gebunden. In dieser Ausführungsform ist das leitende Oligomer kovalent an einen Liganden gebunden, der ein oder mehrere der Koordinationsatome für ein Übergangsmetall bereitstellt. In einer Ausführungsform besitzt der Ligand, an den das leitende Oligomer gebunden ist, auch die gebundene Nucleinsäure, wie dies allgemein aus nachstehender Struktur 25 ersichtlich ist. Alternativ dazu ist das leitende Oligomer an einen Liganden gebunden, und die Nucleinsäure ist an den anderen Liganden gebunden; dies ist allgemein in nachstehender Struktur 26 dargestellt. Somit ist in Gegenwart des Übergangsmetalls das leitende Oligomer kovalent an die Nucleinsäure gebunden. Beide dieser Strukturen zeigen leitende Oligomere gemäß Struktur 3, obwohl auch andere Oligomere geeignet sind. Strukturen 25 und 26 sind zwei repräsentative Strukturen.
  • Figure 00980002
  • In den hierin offenbarten Strukturen ist M ein Metallatom, wobei Übergangsmetalle vorzuziehen sind. Geeignete Übergangsmetalle zur Verwendung hierin sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Cadmium (Cd), Kupfer (Cu), Kobalt (Co), Palladium (Pd), Zink (Zn), Eisen (Fe), Ruthenium (Ru), Rhodium (Rh), Osmium (Os), Rhenium (Re), Platin (Pt), Scandium (Sc), Titan (Ti), Vanadium (V), Chrom (Cr), Mangan (Mn), Nickel (Ni), Molybdän (Mo), Technetium (Tc), Wolfram (W) und Iridium (Ir). Die erste Reihe an Übergangsmetallen, die Platinmetalle (Ru, Rh, Pd, Os, Ir und Pt) sowie Fe, Re, W, Mo und Tc sind vorzuziehen. Besonders vorzuziehen sind Ruthenium, Rhenium, Osmium, Platin, Kobalt und Eisen.
  • L sind die Co-Liganden, die die Koordinationsatome für die Bindung des Metallions bereitstellen. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, hängen die Anzahl und die Beschaffenheit der Co-Liganden von der Koordinationszahl des Metallions ab. Ein-, zwei- oder mehrzähnige Co-Liganden können an jeder beliebigen Position verwendet werden. Wenn z.B. das Metall eine Koordinationszahl von 6 hat, ergeben L aus dem Terminus des leitenden Oligomers, L aus der Nucleinsäure und r insgesamt 6. Wenn daher das Metall eine Koordinationszahl von 6 besitzt, kann r von 0 (wenn alle Koordinationsatome durch die anderen zwei Liganden bereitgestellt werden) bis 4 (wenn alle Co-Liganden einzähnig sind) reichen. Somit reicht r im Allgemeinen von 0 bis 8, wobei dies von der Koordinationszahl des Metallions und der Auswahl der anderen Liganden abhängt.
  • In einer Ausführungsform besitzt das Metallion eine Koordinationszahl von 6, und sowohl der an das leitende Oligomer gebundene Ligand als auch der an die Nucleinsäure gebundene Ligand sind zumindest zweizähnig; r ist vorzugsweise 0, 1 (d.h. der verbleibende Co-Ligand ist zweizähnig) oder 2 (zwei einzähnige Co-Liganden werden verwendet).
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können die Co-Liganden gleich oder voneinander verschieden sein. Geeignete Liganden fallen in zwei Kategorien: Liganden, die Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Kohlenstoff- oder Phosphoratome (je nach dem Metallion) als Koordinationsatome verwenden (in der Literatur allgemein als σ-Donoren bezeichnet), und metallorganische Liganden wie z.B. Metallocenliganden (in der Literatur allgemein als π-Donoren bezeichnet, hierin als Lm angeführt). Geeignete spendende Stickstoff-Liganden sind auf dem Gebiet allgemein bekannt; Beispiele sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) NH2; NHR; NRR'; Pyridin; Pyrazin; Isonicotinamid; Imidazol; Bipyridin und substituierte Derivate von Bipyridin; Terpyridin und substituierte Derivate; Phenanthroline, insbesondere 1,10-Phenanthrolin (abgekürzt phen) und substituierte Derivate von Phenanthrolinen wie z.B. 4,7-Dimethylphenanthrolin und Dipyridol[3,2-a:2'3'-c]phenazin (abgekürzt als dppz); Dipyridophenazin; 1,4,5,8,9,12-Hexaazatriphenylen (abgekürzt als hat); 9,10-Phenanthrenchinondiimin (abgekürzt als phi); 1,4,5,8-Tetraazaphenanthren (abgekürzt als tap); 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan (abgekürzt als cyclam), EDTA, EGTA und Isocyanid. Substituierte Derivate, einschließlich kondensierter Derivate, kommen ebenfalls in Frage. In einigen Ausführungsformen können Porphyrine und substituierte Derivate der Porphyrinfamilie verwendet werden. Siehe z.B. Comprehensive Coordination Chemistry, Wilkinson et al., Hrsg., Pergamon Press, 1987, Kapitel 13.2 (S. 73 – 98); 21.1 (S. 813 – 898) und 21.3 (S. 915 – 957); alle sind ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
  • Geeignete σ-Donor-Liganden unter Verwendung von Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor sind auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise finden sich geeignete Kohlenstoff-σ-Donoren in Cotton und Wilkinson, Advanced Organic Chemistry, 5. Ausgabe, John Wiley & Sons, 1988, hierin durch Verweis aufgenommen; siehe z.B. S. 38. Zweckmäßige Sauerstoffliganden sind Kronenether, Wasser und andere auf dem Gebiet bekannte Substanzen. Phosphine und substituierte Phosphine kommen auch in Frage; siehe S. 38 der obigen Publikation von Cotton und Wilkinson.
  • Die Sauerstoff-, Schwefel-, Phosphor- und Stickstoff-abgebenden Liganden sind solcherart gebunden, dass die Heteroatome als Koordinationsatome dienen können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden metallorganische Liganden verwendet. Zusätzlich zu rein organischen Verbindungen zur Verwendung als Redoxgruppierungen und verschiedenen Übergangsmtall-Koordinationskomplexen mit δ-gebundenem organischem Ligand mit Donoratomen als heterocyclische oder exocyclische Substituenten steht eine Vielzahl an metallorganischen Übergangsmetallverbindungen mit π-gebundenen organischen Liganden zur Verfügung (siehe Advanced Inorganic Chemistry, 5. Ausgabe, Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, Kapitel 26; Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2. Auflage, 1992, VCH; und Comprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982 – 1994, Abel et al., Hrsg., Bd. 7, Kapitel 7, 8, 10 & 11, Pergamon Press, hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen). Solche metallorganischen Liganden umfassen cyclische aromatische Verbindungen wie z.B. das Cyclopentadienid-Ion [C5H5(-1)] und verschiedene ringsubstituierte und ringkondensierte Derivate, z.B. das Indenylid-(-1)-Ion, das eine Klasse von Bis(Cyclopentadienyl)-Metallverbindungen (d.h. Metallocene) liefert; siehe z.B. Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 104, 1882 – 1893 (1982); und Gassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108, 4228 – 4229 (1986). Davon sind Ferrocen [(C5H5)2Fe] und seine Derivate prototypische Beispiele, die in einer Vielzahl an chemischen (Connelly et al., Chem. Rev. 96, 877 – 910 (1996)) und elektrochemischen (Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23, 1 – 93, und Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24, 87) Elektrontransfer- oder „Redox"-Reaktionen verwendet wurden. Metallocenderivate einer Vielzahl der Übergangsmetalle der ersten, zweiten und dritten Reihe sind potenzielle Kandidaten als Redoxgruppierungen, die entweder an den Ribosering oder die Nucleosidbase der Nucleinsäure kovalent gebunden sind. Andere potenziell geeignete metallorganische Liganden sind cyclische Arene wie etwa Benzol, um Bis(aren)metallverbindungen und ihre ringsubstituierten und ringkondensierten Derivate zu liefern, von denen Bis(benzol)chrom ein prototypisches Beispiel ist. Andere acyclischen π-gebundenen Liganden wie z.B. das Allyl(-1)-Ion oder Butandien liefern potenziell geeignete metallorganische Verbindungen, wobei alle derartige Liganden gemeinsam mit anderen π-gebundenen und δ-gebundenen Liganden die allgemeine Klasse metallorganischer Verbindungen ausmachen, in denen eine Metall-Kohlenstoff-Bindung besteht. Elektrochemische Studien verschiedener Dimere und Oligomere solcher Verbindungen mit überbrückenden organischen Liganden sowie zusätzlichen nicht-überbrückenden Liganden (mit und ohne Metall-Metall-Bindungen) sind potenzielle Kandidaten für Redoxgruppierungen in der Nucleinsäureanalyse.
  • Wenn ein oder mehrere der Co-Liganden ein metallorganischer Ligand ist bzw. sind, ist der Ligand im Allgemeinen über eines der Kohlenstoffatome des metallorganischen Liganden gebunden, obwohl die Bindung auch unter Verwendung anderer Atome für heterocyclische Liganden erfolgen kann. Bevorzugte metallorganische Liganden sind Metallocenliganden, z.B. substituierte Derivate und die Metallocenophane (siehe S. 1174 der oben angeführten Publikation von Cotton und Wilkinson). Beispielsweise können Derivate von Metallocenliganden wie z.B. Methylcyclopentadienyl (wobei mehrere Methylgruppen vorzuziehen sind, z.B. Pentamethylcyclopentadienyl) dazu verwendet werden, die Stabilität des Metallocens zu steigern. In einer bevorzugten Ausführungsform ist nur einer der zwei Metallocenliganden eines Metallocens derivatisiert.
  • Wie hierin beschrieben, kann jede beliebige Kombination von Liganden verwendet werden. Bevorzugte Kombinationen sind: a) alle Liganden sind Stickstoff-abgebende Liganden; b) alle Liganden sind metallorganische Liganden; und c) der Ligand . am Terminus des leitenden Oligomers ist ein Metallocenligand, und der von der Nucleinsäure bereitgestellte Ligand ist ein Stickstoff-abgebender Ligand, wobei die anderen Liganden gegebenenfalls entweder Stickstoff-abgebende Liganden, Metallocenliganden oder ein Gemisch davon sind. Diese Kombinationen sind in repräsentativen Strukturen unter Verwendung des leitenden Oligomers gemäß Struktur 3 in den Strukturen 27 (mit Phenanthrolin und Amino als repräsentative Liganden), 28 (mit Ferrocen als Metall-Ligand-Kombination) und 29 (mit Cyclopentadienyl und Amino als repräsentative Liganden) dargestellt.
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform zeigen die hierin verwendeten Liganden. geänderte fluoreszierende Eigenschaften (in Abhängigkeit vom Redoxzustand des chelatisierten Metallions). Wie unten ausgeführt, dient dies somit als zusätzlicher Modus der Detektion des Elektronentransfers zwischen der ETM und der Elektrode.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist – wie dies weiter unten ausführlich dargestellt ist – der an die Nucleinsäure gebundene Ligand eine Aminogruppe, die an die 2'- oder 3'-Position einer Ribose des Ribose-Phosphat-Rückgrats gebunden ist. Dieser Ligand kann eine Vielzahl an Aminogruppen enthalten, um einen mehrzähnigen Liganden zu bilden, der das Metallion bindet. Andere bevorzugte Liganden sind Cyclopentadien und Phenanthrolin.
  • Die Verwendung von Metallionen zur Verbindung von Nucleinsäuren kann als interne Steuerung oder Kalibrierung des Systems dienen, um die Anzahl verfügbarer Nucleinsäuren auf der Oberfläche einzuschätzen. Wenn aber – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – Metallionen zur Verbindung der Nucleinsäuren mit den leitenden Oligomeren herangezogen werden, ist es im Allgemeinen Dies gilt allgemein, um auf diese Weise in der Lage zu sein, die Gegenwart der Einfangsonde von der Gegenwart der Zielsequenz zu unterscheiden. Dies kann für die Identifizierung, Kalibrierung und/oder Quantifizierung nützlich sein. Somit kann die Menge an Einfangsonde auf einer Elektrode mit der Menge hybridisierter doppelsträngiger Nucleinsäure verglichen werden, um die Menge an Zielsequenz in einer Probe zu ermitteln. Dies ist signifikant, da somit die interne Steuerung bzw. Kontrolle des Sensors oder Systems ermöglicht wird. Auch ist eine Messung entweder vor der Zugabe des Ziels oder danach auf dem gleichen Molekül möglich, wie es für die Detektion verwendet wird – man verlässt sich also nicht auf ein ähnliches, aber eigentlich unterschiedliches Steuer- bzw. Kontrollsystem. Somit können die für die Detektion tatsächlich verwendeten Moleküle vor jedem Versuch quantifiziert werden. Dies ist ein beträchtlicher Vorteil gegenüber Verfahren des Stands der Technik.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Einfangsonden-Nucleinsäuren (oder andere Bindungsliganden) über einen Isolator kovalent an die Elektrode gebunden. Die Bindung von Nucleinsäuren (und anderen Bindungsliganden) an Isolatoren wie z.B. Alkylgruppen ist allgemein bekannt und kann an die Base oder das Rückgrat erfolgen, einschließlich an die Ribose oder das Phosphat für diese Gruppierungen enthaltende Rückgrate, oder an alternierende Rückgrate für Nucleinsäureanaloga.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können auf der Oberfläche eine oder mehrere unterschiedliche Einfangsondenspezies vorhanden sein. In einigen Ausführungsformen kann eine Art von Einfangsonde oder eine Art von Einfang-Extendersonde vorhanden sein, wie dies detailliert unten dargestellt ist. Alternativ dazu können unterschiedliche Einfangsonden oder eine Einfangsonde mit einer Vielzahl unterschiedlicher Einfang-Extendersonden verwendet werden. Es ist möglicherweise wünschenswert (insbesondere im Fall von Nucleinsäureanalyten und Bindungsliganden in Mechanismus-2-Systemen), zusätzliche Einfangsonden zu verwenden, die relativ kurze Sondensequenzen umfassen, die dazu dienen können, Komponenten des Systems, z.B. die Rekrutierungslinker, „niederzuheften" und dadurch die Konzentration von ETMs auf der Oberfläche zu erhöhen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung Substrate bereit, die für Zielanalyt-Detektionssysteme geeignet sind und die zumindest eine Detektionselektrode umfassen, die aus Monoschichten und Einfangbindungsliganden besteht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen außerdem eine Lösung oder einen löslichen Bindungsliganden, obwohl – wie dies ausführlich weiter unten in Zusammenhang mit Mechanismus-1-Sytemen dargestellt ist – die ETMs in Form nicht-kovalent gebundener Hybridisierungsindikatoren zugesetzt sein können. Lösungsbindungsliganden ähneln insofern Einfangbindungsliganden, als sie sich vorzugsweise spezifisch an Zielanalyten binden. Der Lösungsbindungsligand kann der gleiche wie der Einfangbindungsligand oder verschieden davon sein. Im Allgemeinen sind die Lösungsbindungsliganden nicht direkt an die Oberfläche gebunden, obwohl dies möglich ist. Der Lösungsbindungsligand umfasst entweder direkt einen Rekrutierungslinker, der zumindest eine ETM enthält, oder der Rekrutierungslinker bindet sich entweder direkt oder indirekt an den Lösungsbindungsliganden.
  • Es sind hierin „Lösungsbindungsliganden", „lösliche Bindungsliganden", „Signalträger", „Markersonden" oder „Markerbindungsliganden" mit Rekrutierungslinkern, die kovalent gebundene ETMs umfassen, bereitgestellt. Ein Abschnitt der Markensonde oder des Lösungsbindungsliganden bindet sich direkt oder indirekt an den Zielanalyten, und ein Abschnitt umfasst einen kovalent gebundene ETMs enthaltenden Rekrutierungslinker. In einigen Systemen, z.B. in Mechanismus-1-Nucleinsäuresystemen, können sie gleich sein. In Mechanismus-1-Systemen umfasst der Rekrutierungslinker Nucleinsäure, die an Detektionssonden hybridisiert. Die Ausdrücke „Elektronendonorgruppierung", „Elektronenakzeptorgruppierung" und „ETMs" oder grammatikalisch gleichwertige Varianten davon beziehen sich auf Moleküle, die zum Elektronentransfer unter bestimmten Bedingungen fähig sind. Es ist zu beachten, dass die Elektronendonor- und Elektronenakzeptor-Fähigkeiten relativ sind; ein Molekül, das ein Elektron unter bestimmten Versuchsbedingungen verlieren kann, kann ein Elektron unter anderen Versuchsbedingungen aufnehmen. Es ist ferner zu beachten, dass die Anzahl möglicher Elektronendonorgruppierungen und Elektronenakzeptorgruppierungen sehr hoch ist; Fachleute auf dem Gebiet von Elektronentransferver bindungen können einige Verbindungen der Erfindung verwenden. Bevorzugte ETMs sind u.a. Übergangsmetallkomplexe, organische ETMs und Elektroden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ETMs Übergangsmetallkomplexe. Übergangsmetalle sind jene, deren Atome eine partielle oder komplette d-Elektronenhülle aufweisen. Hierin geeignete Übergangsmetalle sind oben angeführt.
  • Die Übergangsmetalle sind mit einer Vielzahl an Liganden (L, siehe obige Definition) komplexiert, um zweckmäßige Übergangsmetallkomplexe zu bilden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind.
  • Zusätzlich zu Übergangsmetallkomplexen können hierin andere organische Elektronendonoren und -akzeptoren kovalent an die Nucleinsäure gebunden sein. Diese organischen Moleküle sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Riboflavin, Xanthenfarbstoffe, Azinfarbstoffe, Acridinorange, N,N'-Dimethyl-2,7-diazapyreniumdichlorid (DAP2+), Methylviologen, Ethidiumbromid, Chinone wie z.B. N,N'-Dimethylanthra(2,1,9-def:6,5,10-d'e'f)düsochinolindichlorid (ADIQ2+); Porphyrine ([Meso-tetrakis(N-methyl-x-pyridinium)porphyrintetrachlorid], Varlaminblau-B-hydrochlorid, Bindschedler-Grün; 2,6-Dichlorindophenol, 2,6-Dibromphenolindophenol; Brilliant-Crest-Blau (3-Amino-9-dimethylamino-10-methylphenoxyazinchlorid), Methylenblau; Nilblau A (Aminoaphthodiethylaminophenoxazinsulfat), Indigo-5,5',7,7'-tetrasulfonsäure, Indigo-5,5',7-trisulfonsäure; Phenosafranin, Indigo-5-monosulfonsäure; Safranin T; Bis(dimethylglyoximat)-eisen(II)-chlorid; Indulinscharlach, Neutralrot, Anthracen, Coronen, Pyren, 9-Phenylanthracen, Rubren, Binaphthyl, DPA, Phenothiazen, Fluoranthen, Phenanthren, Chrysen, 1,8-Diphenyl-1,3,5,7-octatetracen, Naphthalin, Acenaphthalin, Perylen, TMPD sowie Analoga und substituierte Derivate dieser Verbindungen.
  • In einer Ausführungsform sind die Elektronendonoren und Elektronenakzeptoren Redoxproteine, wie dies auf dem Gebiet bekannt ist. Redoxproteine sind jedoch in vielen Ausführungsformen nicht vorzuziehen.
  • Die Auswahl spezifischer ETMs wird von der Art der angewendeten Elektronentransferdetektion beeinflusst, wie dies allgemein oben dargelegt ist. Bevorzugte ETMs sind Metallocene, wobei Ferrocen besonders vorzuziehen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere ETMs verwendet. Wie aus den Beispielen ersichtlich, sorgt die Verwendung mehrerer ETMs für Signalamplifikation und somit empfindlichere Detektionsgrenzen. Wie unten besprochen, kann zwar die Verwendung mehrerer ETMs auf Nucleinsäuren, die an komplementäre Stränge hybridisieren, Senkungen der Tm-Werte der Hybridisierungskomplexe bewirken (in Abhängigkeit von der Anzahl, der Bindungsstelle und dem Abstand zwischen der Vielzahl an ETMs), doch ist dies kein Faktor, wenn die ETMs auf dem Rekrutierungslinker angeordnet sind (d.h. im „Mechanismus-2"-System), da hier keine Hybridisierung an eine komplementäre Sequenz stattfindet. Demzufolge sind mehrere ETMs vorzuziehen, wobei zumindest etwa 2, noch bevorzugter zumindest etwa 10, am bevorzugtesten zumindest etwa 20 bis 50, ETMs pro Rekrutierungslinker vorhanden sind. In einigen Fällen kann eine sehr große Anzahl an ETMs (50 bis 1000) verwrendet werden.
  • Es sind somit Lösungsbindungsliganden oder Markersonden mit kovalent gebundenen ETMs bereitgestellt. Das Verfahren zur Bindung der ETM an den Lösungsbindungsliganden variiert abhängig vom Detektionsmodus (d.h. Mechanismus-1- oder Mechanismus-2-System) und der Zusammensetzung des Lösungsbindungsliganden. Wie dies detailliert unten dargestellt ist, wird in Mechanismus-2-Systemen der Abschnitt des Lösungsbindungsliganden (oder der Markersonde), der die ETM umfasst, als „Rekrutierungslinker" bezeichnet, und er kann entweder Nucleinsäure oder Nicht-Nucleinsäure enthalten. Bei Mechanismus-1-Systemen muss der Rekrutierungslinker Nucleinsäure sein.
  • Somit besteht – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – eine Vielzahl an möglichen Konfigurationsmöglichkeiten, die verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rekrutierungslinker Nucleinsäure (einschließlich der Analoga), und die Bindung der ETMs kann über (1) eine Base; (2) das Rückgrats, einschließlich der Ribose, des Phosphats oder vergleichba rer Strukturen in Nucleinsäureanaloga; (3) Nucleosidersetzung (siehe unten); oder (4) Metallocenpolymere (siehe unten) erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rekrutierungslinker Nicht-Nucleinsäure und kann entweder ein Metallocenpolymer oder ein Polymer vom Alkyltyp (z.B. ein Heteroalkyl, siehe unten), umfassend ETM-Substitutionsgruppen, sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rekrutierungslinker eine Nucleinsäure und umfasst kovalent gebundene ETMs. Die ETMs können an Nucleoside innerhalb der Nucleinsäure an einer Vielzahl an Positionen gebunden sein. Bevorzugte Ausführungsformen sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) (1) die Bindung an die Base des Nucleosids, (2) die Bindung der ETM als Basenersatz, (3) die Bindung an das Rückgrat der Nucleinsäure, z.B. entweder an eine Ribose des Ribose-Phosphat-Rückgrats oder an eine Phosphatgruppierung oder an analoge Strukturen in Nucleinsäureanaloga, und (4) die Bindung über Metallocenpolymere.
  • Außerdem kann es – wie dies unten erläutert ist – wünschenswert sein, falls der Rekrutierungslinker Nucleinsäure ist, sekundäre Markersonden zu verwenden, die einen ersten Abschnitt, der an einen Abschnitt der primären Markersonden hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt, der einen hierin definierten Rekrutierungslinker umfasst, aufweisen. Dies ähnelt der Verwendung einer Amplifikatorsonde, außer dass sowohl die primären als auch die sekundären Markersonden ETMs umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ETM an die Base eines Nucleosids gebunden, wie dies allgemein oben in Zusammenhang mit dem leitenden Oligomer beschrieben ist. Die Bindung kann an ein internes Nucleosid oder ein endständiges Nucleosid erfolgen.
  • Die kovalente Bindung an die Base hängt teilweise von der gewählten ETM ab, doch im Allgemeinen ähnelt sie der Bindung leitender Oligomere an Basen (s.o.). Die Bindung erfolgt im Allgemeinen an eine beliebige Position der Base. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ETM ein Übergangsmetallkomplex, wodurch die Bindung eines geeigneten Metallliganden an die Base zur kovalenten Bindung der ETM führt. Alternativ dazu können ähnliche Arten von Verbindungen für die Bindung organi scher ETMs verwendet werden, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist.
  • In einer Ausführungsform können die C4-gebundene Aminogruppe von Cytosin, die C6-gebundene Aminogruppe von Adenin oder die C2-gebundene Aminogruppe von Guanin als Übergangsmetallligand verwendet werden.
  • Aromatische Gruppen enthaltende Liganden können über Acetylenbindungen gebunden sein, wie dies auf dem Gebiet bekannt ist (siehe Comprehensive Organic Synthesis, Trost et al., Hrsg., Pergamon Press, Kapitel 2.4: Coupling Reactions Between sp2 and sp Carbon Centers, Sonogashira, S. 521 – 549 sowie S. 950 – 953, hiemit durch Verweis aufgenommen). Struktur 30 ist eine repräsentative Struktur in Gegenwart des Metallions und anderer notwendiger Liganden; Struktur 30 zeigt Uridin, doch sind – wie bei allen hierin vorgestellten Strukturen – beliebige andere Basen ebenfalls möglich.
  • Figure 01090001
  • La ist ein Ligand, der Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- oder Phosphor-abgebende Liganden oder metallorganische Liganden wie etwa Metallocenliganden enthalten kann. Geeignete La-Liganden sind u.a. (jedoch nicht bescränkt auf) Phenanthrolin, Imidazol, bpy und terpy. L und M sind wie oben definiert. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wiederum offenkundig, dass ein Linker („Z") zwischen dem Nucleosid und der ETM vorhanden sein kann.
  • Wie im Fall der leitenden Oligomere kann die Bindung über einen Linker erfolgen, der eine Amidbindung verwenden kann (allgemeine Ausführungen dazu finden sich in Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 7221 – 7226 (1989); Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 7226 – 7232 (1989), von denen beide ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind). Diese Strukturen sind allgemein in nachstehender Struktur 31 dargestellt, in der wiederum Uridin als Base verwendet wird; andere Basen kommen aber wie oben ebenfalls in Frage.
  • Figure 01100001
  • In dieser Ausführungsform ist L ein Ligand wie oben definiert, wobei Lr und M ebenfalls wie oben definiert sind. Vorzugsweise ist L Amino, phen, byp und terpy.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die an ein Nucleosid gebundene ETM ein Metallocen; d.h. das L und das Lr aus Struktur 31 sind beide Metallocenliganden, und Lm ist wie oben beschrieben. Struktur 32 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform, worin das Metallocen Ferrocen und die Base Uridin ist, wobei auch andere Basen in Frage kommen.
  • Figure 01100002
  • Vorläufige Daten legen nahe, dass Struktur 32 cyclisieren können, wobei das zweite Acetylenkohlenstoffatom den Carbonylsauerstoff angreift und eine Furan-ähnliche Struktur bildet. Bevorzugte Metallocene sind Ferroce, Kobaltocen und Osmiumocen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ETM an eine Ribose an jeder beliebigen Position des Ribose-Phosphat-Rückgrats der Nucleinsäure gebunden, d.h. entweder am 5'- oder am 3'-Terminus jedes internen Nucleosids. Ribose kann in diesem Fall Ribose-Analoga umfassen. Wie dies auf dem Gebiet bekannt ist, können Nucleoside, die entweder an der 2'- oder an der 3'-Position der Ribose modifiziert sind, gebildet werden, wobei Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphor-enthaltende Modifikationen möglich sind. Amino-modifizierte und Sauerstoff-modifizierte Ribose ist vorzuziehen. Siehe für allgemeine Ausführungen PCT WO 95/15971. Diese Modifikationsgruppen können als Übergangsmetallligand oder als chemisch funktionelle Gruppierung zur Bindung anderer Übergangsmetallliganden und metallorganischer Liganden oder auch als organische Elektronendonorgruppierungen verwendet werden, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. In dieser Ausführungsform kann ein Linker, wie er hierin für „Z" dargestellt ist, oder ein leiten- des Oligomer zwischen der Ribose und der ETM verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen sehen die Bindung an die 2'- oder 3'-Position der Ribose vor, wobei die 2'-Position vorzuziehen ist. Die in Strukturen 13, 14 und 15 gezeigten leitenden Oligomere können z.B. durch ETMs ersetzt werden; alternativ dazu können die ETMs an den freien Terminus des leitenden Oligomers addiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dient ein Metallocen als ETM und ist über eine Amidbindung gebunden, wie dies aus nachstehender Struktur 33 ersichtlich ist. Das Beispiel zeigt die Synthese einer bevorzugten Verbindung, wenn das Metallocen Ferrocen ist.
  • Figure 01110001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Aminbindungen verwendet, wie dies allgemein in Struktur 34 dargestellt ist.
  • Figure 01120001
  • Z ist ein Linker (wie hierin definiert), wobei 1 – 16 Atome vorzuziehen und 2 – 4 Atome besonders vorzuziehen sind; t ist entweder 1 oder 0.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Oxobindungen verwendet, wie dies allgemein in Struktur 35 dargestellt ist.
  • Figure 01120002
  • In Struktur 35 ist Z ein hierin definierter Linker, und t ist entweder 1 oder 0. Bevorzugte Z-Linker sind Alkylgruppen wie etwa Heteroalkylgruppen, z.B. (CH2)n und (CH2CH2O)n, wobei n von 1 – 10 vorzuziehen ist, n von 1 – 4 besonders vorzuziehen ist und n = 4 am bevorzugtesten ist.
  • Bindungen unter Einsatz anderer Heteroatome sind ebenfalls möglich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine ETM an ein Phosphat an jeder beliebigen Position des Ribose-Phosphat-Rückgrats der Nucleinsäure gebunden. Dies kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. In einer Ausführungsform können Phosphodiesterbindungs-Analoga wie z.B. Phosphoramid- oder Phosphoramidit-Bindungen in eine Nucleinsäure inkorporiert sein, worin das Heteroatom (d.h. Stickstoff) als Übergangsmetallligand dient (siehe PCT-Veröffentlichung WO 95/15971). Alternativ dazu können die in Strukturen 23 und 24 gezeigten leitenden Oligomere durch ETMs ersetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Zusammensetzung die in Struktur 36 gezeigte Zusammensetzung.
  • Figure 01130001
  • In Struktur 36 ist die ETM über eine Phosphatbindung gebunden, wobei dies im Allgemeinen über einen Linker Z erfolgt. Bevorzugte Z-Linker sind Alkylgruppen, z.B. Heteroalkylgruppen wie etwa (CH2)n, (CH2CH2O)n, wobei n von 1 – 10 vorzuziehen ist, n von 1 – 4 besonders vorzuziehen ist und n = 4 am bevorzugtesten ist.
  • Wenn in Mechanismus-2-Systemen die ETM an die Base oder das Rückgrat des Nucleosids gebunden ist, ist es möglich, die ETM über „Dendrimer"-Strukturen zu binden, wie dies ausführlich unten erläutert wird. Wie dies allgemein aus Fig. 8 ersichtlich ist, können Linker auf Alkylbasis dazu dienen, mehrere verzweigte Strukturen, die eine oder mehrere ETMs am Terminus jedes Zweigs umfassen, zu schaffen. Im Allgemeinen erfolgt dies durch Bildung von Verzweigungspunkten, die mehrere Hydroxygruppen enthalten (sie können gegebenenfalls dann dazu verwendet werden, zusätzliche Verzweigungspunkte hinzuzufügen). Die endständigen Hydroxygruppen können dann in Phosphoramiditreaktionen verwendet werden, um ETMs zu addie ren, wie dies allgemein weiter unten für die Nucleosidersetzung und Metallocenpolymer-Reaktionen beschrieben ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine ETM wie z.B. ein Metallocen als „Nucleosidersatz" verwendet, der als ETM dient. Beispielsweise ist der Abstand zwischen den zwei Cyclopentadienringen von Ferrocen ähnlich wie der orthogonale Abstand zwischen zwei Basen in einer doppelsträngigen Nucleinsäure. Zusätzlich zu Ferrocen können andere Metallocene verwendet werden, z.B. luftstabile Metallocene wie etwa jene, die Kobalt oder Ruthenium enthalten. Somit können Metallocengruppierungen in das Rückgrat einer Nucleinsäure inkorporiert sein, wie dies allgemein in Struktur 37 (Nucleinsäure mit einem Ribose-Phosphat-Rückgrat) und Struktur 38 (Peptidnucleinsäure-Rückgrat) ersichtlich ist. Strukturen 37 und 38 zeigen Ferrocen, obwohl – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – auch andere Metallocene in Frage kommen. Im Allgemeinen sind luftstabile Metallocene vorzuziehen, z.B. Metallocene unter Einsatz von Einsatz von Ruthenium und Kobalt als Metall.
  • Figure 01140001
  • In Struktur 37 ist Z ein oben definierter Linker, wobei im Allgemeinen kurze Alkylgruppen, einschließlich Heteroatomen wie etwa Sauerstoff, vorzuziehen sind. Entscheidend ist im Allgemeinen die Länge des Linkers, so dass minimale Störungen der doppelsträngigen Nucleinsäure zu verzeichnen sind, wie dies detailliert weiter unten dargestellt ist. Somit sind Methylen, Ethylen, Ethylenglykole, Propylen und Butylen vorzuziehen; Ethylen und Ethylenglykol sind besonders vorzuziehen. Darüber hinaus kann jeder Z-Linker gleich oder unterschiedlich sein. Struktur 37 veranschaulicht ein Ribose-Phosphat-Rückgrat, obwohl – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – Nucleinsäureanaloga auch in Frage kommen, z.B. Ribose-Analoga und Phosphatbindungsanaloga.
  • Figure 01150001
  • In Struktur 38 sind bevorzugte Z-Gruppen wie oben angeführt, wobei jeder Z-Linker gleich oder unterschiedlich sein kann. Wie oben sind auch Nucleinsäureanaloga geeignet.
  • Obwohl die obigen Strukturen und Ausführungen Metallocene darstellen, insbesondere Ferrocen, kann die gleiche allgemeine Idee auf die Addition von ETMs (zusätzlich zu Metallocenen) als Nucleosidersatz oder in Polymer-Ausführungsformen angewendet werden, wie dies unten veranschaulicht ist. Wenn z.B. ETM ein anderer Übergangsmetallkomplex als ein Metallocen ist, der einen, zwei oder drei (oder mehr) Liganden umfasst, können die Liganden funktionalisiert werden, wie dies für das Ferrocen dargestellt ist, um die Addition von Phosphoramiditgruppen zuzulassen. Insbesondere sind in der vorliegenden Ausführungsform Komplexe vorzuzie hen, die zumindest zwei Ring-Liganden (z.B. Aryl und substituiertes Aryl) umfassen, wobei jeder der Liganden funktionelle Gruppen zur Bindung über Phosphoramiditchemie enthalten. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, kann diese Art von Reaktion, die Polymere von ETMs entweder als Abschnitt des Rückgrats der Nucleinsäure oder als „Seitengruppen" der Nucleinsäuren schafft, um die hierin erzeugten Signale amplifizieren zu können, mit praktisch jeder ETM durchgeführt werden, die solcherart funktionalisiert werden kann, dass sie die korrekten chemischen Gruppen enthält.
  • Durch Einsetzen eines Metallocens wie z.B. Ferrocen (oder anderer ETM) in das Rückgrat einer Nucleinsäure werden somit Nucleinsäureanaloga hergestellt; d.h. die Erfindung stellt Nucleinsäuren mit einem zumindest ein Metallocen umfassenden Rückgrat bereit. Dies ist von Nucleinsäuren mit an das Rückgrat gebundenen Metallocenen zu unterscheiden, d.h. wo die Bindung über eine Ribose, ein Phosphat usw. erfolgt. Zwei Nucleinsäuren, die jeweils aus einer traditionellen Nucleinsäure oder einem Analog bestehen (Nucleinsäuren umfassen in diesem Fall ein einzelnes Nucleosid), können über ein Metallocen kovalent aneinander gebunden werden. Anders ausgedrückt wird ein Metallocenderivat oder substituiertes Metallocen bereitgestellt, worin jeder der zwei aromatischen Ringe des Metallocens eine Nucleinsäure-Substituentengruppe besitzt.
  • Wie dies ausführlicher unten erläutert wird, ist es möglich, mehr als ein Metallocen in das Rückgrat zu inkorporieren – entweder mit Nucleotiden dazwischen und/oder mit benachbarten Metallocenen. Wenn benachbarte Metallocene an das Rückgrat addiert werden, ähnelt dies dem weiter unten als „Metallocenpolymere" beschriebenen Verfahren, d.h. es gibt Bereiche von Metallocenpolymeren innerhalb des Rückgrats.
  • Zusätzlich zu den Nucleinsäure-Substituentengruppen ist es in manchen Fällen auch wünschenswert, weitere Substituentengruppen einem oder beiden der aromatischen Ringe des Metallocens (oder der ETM) zuzusetzen. Da diese Nucleosidersetzungen im Allgemeinen Teil der Sondensequenzen sind, die mit im Wesentlichen komplementärer Nucleinsäure zu hybridisieren sind, z.B. einer Zielsequenz oder einer anderen Sondensequenz, ist es möglich, Substituentengruppen an die Metallocenringe zu addieren, um die Wasserstoffbindung zu der Base oder den Basen auf dem gegenüberliegenden Strang zu vereinfachen. Sie können an jede beliebige Position auf den Metallocenringen addiert werden. Zweckmäßige Substituentengruppen sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Amidgruppen, Aminogruppen, Carbonsäuren und Alkohole, einschließlich substituierter Alkohole. Außerdem können diese Substituentengruppen auch über Linker gebunden sein, obwohl dies im Allgemeinen nicht vorzuziehen ist.
  • Substituentengruppen auf einer ETM, insbesondere Metallocenen wie etwa Ferrocen, können zugesetzt sein, um die Redoxeigenschaften der ETM zu verändern. In einigen Ausführungsformen ist es – wie dies weiter unten ausführlich dargelegt ist – möglicherweise wünschenswert, unterschiedliche ETMs vorzusehen, die in unterschiedlicher Weise (d.h. Basen- oder Ribose-Bindung), auf unterschiedliche Sonden oder aus unterschiedlichen Gründen (z.B. Kalibrierung oder als interner Standard) gebunden sind. Die Addition von Substituentengruppen zum Metallocen kann die Differenzierung zweier unterschiedlicher ETMs ermöglichen.
  • Um diese Metallocen-Rückgrat-Nucleinsäureanaloga zu schaffen, stellt die Erfindung auch Komponenten bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Phosphoramiditmetallocene bereit, wie sie in Struktur 39 allgemein dargestellt sind:
  • Figure 01170001
  • In Struktur 39 ist PG eine Schutzgruppe, die sich im Allgemeinen in der Nucleinsäuresynthese eignet, wobei DMT, MMT und TMT vorzuziehen sind. Die aromatischen Ringe können entweder die Ringe des Metallocens oder aromatische Ringe von Liganden für Übergangsmetallkomplexe oder andere organische ETMs sein. Die aromatischen Ringe können gleich oder unterschiedlich sein, und sie können – wie hierin besprochen – substituiert sein. Struktur 40 zeigt das Ferrocenderivat.
  • Figure 01180001
  • Diese Phosphoramiditanaloga können Standard-Oligonucleotidsynthesen unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren zugesetzt werden.
  • Struktur 41 zeigt das Ferrocen-Peptidnucleinsäure- (PNA-) Monomer, das unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren PNA-Synthese zugesetzt werden kann.
  • Figure 01180002
  • In Struktur 41 eignet sich die PG-Schutzgruppe zur Verwendung in der Peptidnucleinsäure-Synthese, wobei MMT, boc und Fmoc vorzuziehen sind.
  • Diese gleichen Zwischenprodukte können zur Herstellung von ETM oder Metallocenpolymeren verwendet werden, die an Nucleinsäuren addiert werden, eher als als Rückgratersatz, wie die weiter unten genauer beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere zur Verwendung in Mechanismus-2-Systemen, sind die ETMs als Polymere, z.B. als Metallocenpolymere, in einer „verzweigten" Konfiguration, ähnlich den Ausführungsformen mit „verzweigter DNA" hierin und wie in US-Patent 5.124.246 beschrieben, unter Verwendung Einsatz modifizierter funktionalisierter Nucleotide gebunden. Das Grundprinzip ist das Folgende: Ein modifiziertes Phosphoramiditnucleotid wird erzeugt, das schließlich eine freie Hydroxygruppe enthalten kann, die zur Bindung von Phosphoramidit-ETMs wie z.B. Metallocenen verwendet werden kann. Diese freie Hydroxygruppe könnte an der Base oder am Rückgrat vorhanden sein, z.B. an der Ribose oder dem Phosphat (obwohl, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, Nucleinsäureanaloga mit anderen Strukturen auch in Frage kommen). Das modifizierte Nucleotid ist in eine Nucleinsäure inkorporiert, und allfällige Hydroxyschutzgruppen werden entfernt, wodurch das freie Hydroxyl übrig bleibt. Nach der Zugabe einer Phosphoramidit-ETM wie z.B. eines Metallocens (siehe obige Strukturen 39 und 40) werden ETMs wie etwa Metallocen-ETMs zugesetzt. Zusätzliche Phosphoramidit-ETMs wie etwa Metallocene können zugesetzt werden, um „ETM-Polymere" zu bilden, z.B. „Metallocenpolymere", wie sie in Fig. 9 mit Ferrocen dargestellt sind. Außerdem ist es in einigen Ausführungsformen wünschenswert, die Löslichkeit der Polymere zu erhöhen, indem eine „Verkappungsgruppe" an die endständige ETM im Polymer addiert wird, z.B. eine Endphosphatgruppe an das Metallocen. Andere geeignete die Löslichkeit verstärkende „Verkappungsgruppen" sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Man beachte, dass diese die Löslichkeit steigernden Gruppen an die Polymere an anderen Stellen addiert werden können, z.B. an die Ligandringe, z.B. an die Metallocene, wie dies hierin beschrieben ist.
  • In dieser Ausführungsform wird die 2'-Position einer Ribose eines Phosphoramiditnucleotids zunächst funktionalisiert, um eine geschützte Hydroxygruppe zu enthalten (in diesem Fall über eine Oxobindung, obwohl auch beliebige andere Linker verwendet werden können, wie dies hierin allgemein für Z-Linker beschrieben ist). Das geschützte modifizierte Nucleotid wird dann unter Anwendung von herkömmlicher Phosphoramiditchemie in eine wachsende Nucleinsäure inkorporiert. Die Schutzgruppe wird entfernt und die freie Hydroxygruppe wiederum unter Einsatz herkömmlicher Phosphoramiditchemie dazu verwendet, ein Phosphoramiditmetallocen wie etwa Ferrocen zu addieren. Eine ähnliche Reaktion ist für Nucleinsäureanaloga möglich. Unter Verwendung der Peptidnucleinsäuren und des Metallocenmonomers (siehe Struktur 41) könnten z.B. Peptidnucleinsäurestrukturen mit Metallocenpolymeren erzeugt werden.
  • Somit stellt die Erfindung Rekrutierungslinker von Nucleinsäuren bereit, die „Zweige" von Metallocenpolymeren umfassen. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden auch Metallocenpolymere mit einer Länge von 1 bis etwa 50 Metallocenen, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 20 Metallocenen, noch bevorzugter von etwa 5 bis etwa 10 Metallocenen.
  • Wenn der Rekrutierungslinker Nucleinsäure ist, ist jede Kombination von ETM-Bindungen möglich. Wie hierin offenbart, können bei Verwendung von Mechanismus-1-Systemen Cluster von ETMs enthaltenden Nucleosiden die Tm der Hybridisierung der Sonde an ihre Zielsequenz senken; im Allgemeinen sind demnach in Mechanismus-1-Systemen die ETMs über die Länge der Sequenz beabstandet, oder es werden nur wenige von ihnen verwendet.
  • In Mechanismus-1-Systemen können nicht-kovalent gebundene ETMs verwendet werden. In einer Ausführungsform ist die ETM ein Hybridisierungsindikator. Hybridisierungsindikatoren dienen als ETM, die vorzugsweise mit doppelsträngiger Nucleinsäure assoziiert ist; die Zugabe erfolgt üblicherweise reversibel und ähnlich dem Verfahren von Millan et al., Anal. Chem. 65, 2317 – 2323 (1993); Millan et al., Anal. Chem. 66, 2943 – 2948 (1994), wobei beide Publikationen hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind. In dieser Ausführungsform können Anstiege der lokalen Konzentration von ETMs infolge der Assoziation des ETM-Hybridisierungsindikators mit doppelsträngiger Nucleinsäure auf der Oberfläche unter Einsatz der Monoschichten überwacht werden, die die leitenden Oligomere umfassen. Hybridisierungsindikatoren umfassen Interkalatoren sowie kleine und/oder große Furchenbindungsgruppierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform können Interkalatoren verwendet werden; da die Interkalation im Allgemeinen nur in Gegenwart doppelsträngiger Nucleinsäure auftritt, konzentrieren sich die ETMs nur in Gegenwart doppelsträngiger Nucleinsäuren. Interkalations-Übergangsmetallkomplex-ETMs sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Große oder kleine Furchenbindungsgruppierungen wie z.B. Methylenblau können in dieser Ausführungsform ebenfalls verwendet werden.
  • Die Systeme der Erfindung können nicht-kovalent gebundene ETMs verwenden, wie dies allgemein in Napier et al., Bioconj. Chem. 8, 906 (1997) (hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen) beschrieben ist. In dieser Ausführungsform können Veränderungen des Redoxzustands bestimmter Moleküle infolge der Gegenwart von DNA (d.h. Guaninoxidation durch Rutheniumkomplexe) unter Verwendung der SAMs, die auch leitende Oligomere umfassen, detektiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rekrutierungslinker nicht Nucleinsäure, sondern kann jeder beliebige Linker oder jedes beliebige Polymer sein. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, kann im Allgemeinen jeder Linker oder jedes Polymer, das so modifiziert werden kann, dass er bzw. es ETM enthält, verwendet werden. Im Allgemeinen sollten die Polymere oder Linker ausreichend löslich sein und geeignete funktionelle Gruppen für die Addition von ETMs aufweisen.
  • Ein „Rekrutierungspolymer" umfasst hierin zumindest zwei oder drei Untereinheiten, die kovalent gebunden sind. Zumindest ein Teil der monomeren Untereinheiten enthalten funktionelle Gruppen für die kovalente Bindung von ETMs. In einigen Ausführungsformen dienen Kopplungsgruppierungen dazu, die Untereinheiten kovalent mit den ETMs zu verbinden. Bevorzugte funktionelle Gruppen für die Bindung sind Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, wobei Aminogruppen besonders vorzuziehen sind. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, sind viele verschiedene Rekrutierungspolymere möglich.
  • Geeignete Linker sind u.a. (jedoch nicht darauf beschränkt) Alkyllinker (einschließlich Heteroalkyl wie etwa (Poly)ethylenglykol-artige Strukturen), substituiertes Alkyl, Arylalkyllinker usw. Wie oben bezüglich der Polymere umfassen die Linker eine oder mehrere funktionelle Gruppen für die Bindung von ETMs, wobei dies – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – durch Verwendung von homo- oder heterobifunktionellen Linkern erfolgt, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind (siehe Pierce Chemical Company, Katalog 1994, Abschnitt über Vernetzer, S. 155 – 200, hierin durch Verweis aufgenommen).
  • Geeignete Rekrutierungspolymere sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) funktionalisierte Styrole wie etwa Aminostyrol, funktionalisierte Dextrane und Polyaminosäuren. Bevorzugte Polymere sind Polyaminosäuren (sowohl Poly-D-Aminosäuren als auch Poly-L-Aminosäuren) wie z.B. Polylysin, wobei Polymere mit Lysin und anderen Aminosäuren besonders vorzuziehen sind. Wie oben erwähnt, sind in einigen Ausführungsformen geladene Rekrutierungslinker vorzuziehen, z.B. wenn nicht-geladene Zielanalyten detektiert werden sollen. Andere zweckmäßige Polyaminosäuren sind Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Copolymere von Lysin und Glutamin- oder Asparaginsäure, Copolymere von Lysin mit Alanin, Tyrosin, Phenylalanin, Serin, Tryptophan und/oder Prolin.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Rekrutierungslinker ein Metallocenpolymer, wie dies oben beschrieben ist.
  • Die Bindung der Rekrutierungslinker an den ersten Abschnitt der Markersonde, d.h. an den Abschnitt, der entweder direkt oder indirekt an den Zielanalyten bindet, hängt von der Zusammensetzung des Rekrutierungslinkers ab, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Wenn der Rekrutierungslinker Nucleinsäure ist, wird er im Allgemeinen während der Synthese des ersten Abschnitts der Markersonde, gegebenenfalls mit der Inkorporation von ETMs enthaltenden Nucleosiden, gebildet. Alternativ dazu können der erste Abschnitt der Markersonde und der Rekrutierungslinker getrennt gebildet und dann gebunden werden. Beispielsweise kann ein überlappender Komplementaritätsabschnitt vorliegen, der einen Abschnitt doppelsträngiger Nucleinsäure bildet, die dann chemisch vernetzt werden kann, z.B. unter Einsatz von Psoralen, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • Wenn Nicht-Nucleinsäure-Rekrutierungslinker vewendet werden, erfolgt die Bindung des Linkers/Polymers des Rekrutierungslinkers im Allgemeinen unter Anwendung herkömmlicher chemischer Techniken, wie sie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung kennen. Wenn z.B. Linker auf Alkylbasis verwendet werden, kann die Bindung der Bindung von Isolatoren an Nucleinsäuren ähneln.
  • Außerdem ist es möglich, Rekrutierungslinker vorzusehen, die Gemische von Nucleinsäuren und Nicht-Nucleinsäuren sind – entweder in linearer Form (d.h. Nucleinsäuresegmente, die mit Alkyllinkern verbunden sind) oder in verzweigter Form (Nucleinsäuren mit Alkyl-„Verzweigungen", die ETMs enthalten und zusätzlich verzweigt sein können).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, z.B. wenn der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist, kann die Zielsequenz selbst anstelle des Rekrutierungslinkers einer Markersonde die ETMs tragen. Beispielsweise ist es – wie dies unten genauer erläutert wird – möglich, Triphosphatnucleotide mit ETMs der Erfindung enzymatisch an eine wachsenden Nucleinsäure zu addieren, z.B. während einer PCR. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, zeigte sich zwar, dass mehrere Enzyme modifiziere Nucleotide im Allgemeinen tolerieren, dass aber einige der modifizierten Nucleotide der Erfindung, z.B. die Ausführungsform des „Nucleosidersatzes" und vermutlich einige der Phosphatbindungen, von den Enzymen erkannt werden können oder nicht, um die Inkorporation in eine wachsende Nucleinsäure zu ermöglichen. Daher erfolgen bevorzugte Bindungen in dieser Ausführungsform an die Base oder Ribose des Nucleotids.
  • Die PCR-Amplifikation einer Zielsequenz führt – wie dies auf dem Gebiet allgemein bekannt ist – zu Zielsequenzen mit ETMs, die im Allgemeinen zufällig in die Sequenz inkorporiert sind. Das System der Erfindung kann dann so konfiguriert sein, dass es die Detektion unter Einsatz dieser ETMs ermöglicht.
  • Alternativ dazu ist es – wie dies detailliert unten dargelegt ist – möglich, Nucleotide mit ETMs an den Terminus einer Nucleinsäure enzymatisch zu addieren, z.B. als Zielnucleinsäure. In dieser Ausführungsform wird ein wirksamer „Rekrutierungslinker" an den Terminus der Zielsequenz addiert, die dann zur Detektion verwendet werden kann. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen unter Verwendung von Elektroden, die Monoschichten leitender Oligomere und Einfangsonden umfassen, sowie Zielsequenzen bereit, die einen ersten Abschnitt, der zur Hybridisierung an eine Komponente eines Testkomplexes fähig ist, und einen zweiten Abschnitt, der nicht an eine Komponente eines Testkomplexes hybridisiert, beinhalten, und umfasst zumindest eine kovalent gebundene Elektronentransfergruppierung. Ebenso stehen Verfahren, die diese Zusammensetzungen verwenden, zur Verfügung.
  • Es ist auch möglich, mit Sondensequenzen verbundene ETMs vorzusehen, d.h. Sequenzen, die ausgebildet sind, an komplementäre Sequenzen zu hybridisieren, d.h. in Mechanismus-1-Sequenzen, obwohl dies auch in Mechanismus-2-Systemen erfolgen kann. Somit können ETMs auch an Nicht-Rekrutierungslinker addiert werden. Beispielsweise können ETMs an Abschnitte von Markersonden addiert werden, die an Komponenten des Testkomplexes hybridisieren, z.B. an den ersten Abschnitt, oder die Zielsequenz (s.o.). Diese ETMs können in einigen Ausführungsformen für die Elektronentransferdetektion herangezogen werden, in einigen wieder nicht; dies hängt von der Position und dem System ab. Wenn in einigen Ausführungsformen z.B. die zufällig inkorporierte ETMs enthaltende Zielsequenz direkt an die Einfangsonde hybridisiert wird, können ETMs im Abschnitt vorhanden sein, die an die Einfangsonde hybridisieren. Wenn die Einfangsonde an die Elektrode über ein leitendes Oligomer gebunden ist, können diese ETMs dazu dienen, den Elektronentransfer zu detektieren, wie dies bereits beschrieben wurde. Alternativ dazu können diese ETMs nicht spezifisch detektiert werden.
  • Wenn in einigen Ausführungsformen der Rekrutierungslinker Nucleinsäure ist, kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, dass einige oder alle der Rekrutierungslin ker doppelsträngig sind, z.B. in Mechanismus-2-Systemen. In einer Ausführungsform kann ein zweiter Rekrutierungslinker vorhanden sein, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Rekrutierungslinker ist und an den ersten Rekrutierungslinker hybridisieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erste Rekrutierungslinker die kovalent gebundenen ETMs. In einer alternativen Ausführungsform enthält der zweite Rekrutierungslinker die ETMs, und der erste Rekturierungslinker enthält sie nicht; die ETMs werden durch Hybridisierung des zweiten Rekrutierungslinkers an den ersten auf der Oberfläche rekrutiert. In einer weiteren Ausführungsform umfassen sowohl der erste als auch der zweite Rekrutierungslinker ETMs. Es ist zu beachten, dass – wie oben erläutert – Nucleinsäuren, die eine große Anzahl an ETMs umfassen, möglicherweise nicht hybridisieren, d.h. die Tm kann abnehmen (dies hängt von der Bindungsstelle und den Eigenschaften der ETM ab). Wenn im Allgemeinen mehrere ETMs auf hybridisierenden Strängen verwendet erden, d.h. in Mechanismus-1-Systemen, sind es im Allgemeinen weniger als etwa 5, vorzugsweise weniger als etwa 3. Alternativ dazu sollten die ETMs ausreichend weit voneinander beabstandet sein, so dass die dazwischen liegenden Nucleotide ausreichend hybridisieren können, damit zufrieden stellende Kinetik gegeben ist.
  • Somit stellt die Beschreibung Zusammensetzungen bereit, die Detektionsetektroden mit Monoschichten umfassen, die leitende Oligomere beinhalten, im Allgemeinen Einfangsonden, ferner umfassend entweder Zielsequenzen oder Markersonden mit ETMs enthaltenden Rekrutierungslinkern. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung dazu verwendet, Zielanalyten in einer Probe zu detektieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure, und es werden Zielsequenzen detektiert.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können die Systeme der Erfindung eine große Anzahl unterschiedlicher Konfigurationen aufweisen. Im Allgemeinen gibt es drei geeignete Systemtypen: (1) Systeme, in denen die Zielsequenz selbst mit ETMs markiert ist; dieser Typ eignet sich im Allgemeinen für Nucleinsäuresysteme; (2) Systeme, in denen sich Markersonden direkt an die Zielanalyten binden; und (3) Systeme, in denen Markersonden indirekt an die Zielsequenzen gebunden sind, z.B. unter Einsatz von Amplifikatorsonden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Zielsequenzen selbst ETMs. Wie oben angeführt, kann dies mit Zielsequenzen erreicht werden, die ETMs aufweisen, die an einer beliebigen Anzahl an Positionen inkorporiert sind (s.o.). In dieser Ausführungsform ist wie in den anderen Ausführungsformen des Systems die 3'-5'-Orientierung der Sonden und Ziele solcherart ausgewählt, dass die ETM enthaltenden Strukturen (d.h. die Rekrutierungslinker oder Zielsequenzen) so nahe an der Oberfläche der Monoschicht wie nur möglich und in der richtigen Orientierung angeordnet sind. Dies kann über Bindung durch Isolatoren oder leitende Oligomere erfolgen, wie dies allgemein aus den Figuren ersichtlich ist. Außerdem können – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – mehrere Einfangsonden verwendet werden, z.B. in einer Konfiguration, in der die 5'-3'-Orientierung der Einfangsonden unterschiedlich ist, oder wo „Schleifen" von Zielen entstehen, wenn mehrere Einfangsonden verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren die Markersonden direkt an die Zielsequenzen. In diesen Ausführungsformen wird die Zielsequenz vorzugsweise auf der Oberfläche mittels Einfangsonden, z.B. Einfang-Extendersonden, immobilisiert; dies ist aber nicht erforderlich. Markersonden dienen dann dazu, die ETMs in die Nähe der Oberfläche der Monoschicht zu bringen, die leitende Oligomere umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Markersonden verwendet; d.h. Markersonden sind solcherart ausgebildet, dass der Abschnitt, der an die Zielsequenz hybridisiert, für eine Anzahl verschiedener Markersonden unterschiedlich sein kann, so dass Amplifikation des Signals eintritt, da mehrere Markersonden für jede Zielsequenz binden können. Somit ist – wie aus den Figuren ersichtlich – n eine ganze Zahl von zumindest 1. Je nach der erwünschten Empfindlichkeit, der Länge der Zielsequenz, der Anzahl an ETMs pro Markersonde usw. reicht n vorzugsweise von 1 bis 50, noch bevorzugter von etwa 1 bis etwa 20, am bevorzugtesten von etwa 2 bis etwa 5. Außerdem können – falls „generische" Markersonden erwünscht sind – Marker-Extendersonden verwendet werden, wie dies weiter unten allgemein in Zusammenhang mit der Verwendung von Amplifikatorsonden besprochen wird.
  • Wie oben ist im Allgemeinen in dieser Ausführungsform die Konfiguration des Systems und der Markersonden solcherart ausgebildet, dass die ETMs so nahe wie möglich an der Monoschichtenoberfläche rekrutiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Markersonden indirekt an die Zielsequenz hybridisiert. Die vorliegende Erfindung findet daher in neuartigen Kombinationen von Signalamplifikationstechnologien und Elektronentransferdetektion auf Elektroden Anwendung, die sich besonders für Sandwich-Hybridisierungstests eignen, wie dies allgemein aus den Figuren für die Nucleinsäure-Ausführungsformen ersichtlich ist; es können ähnliche Systeme für Nicht-Nucleinsäure-Zielanalyten entwickelt werden. In diesen Ausführungsformen sind die Amplifikatorsonden der Erfindung entweder direkt oder indirekt an die Zielsequenz in einer Probe gebunden. Da die Amplifikatorsonden vorzugsweise eine relativ große Anzahl an Amplifikationssequenzen enthalten, die zur Bindung von Markersonden zur Verfügung stehen, nimmt das detektierbare Signal signifikant zu, wodurch die Detektionsgrenzen des Ziels deutlich verbessert werden können. Diese Marker- und Amplifikatorsonden sowie die hierin beschriebenen Detektionsverfahren können in im Wesentlichen jedem bekannten Nucleinsäure-Hybridisierungsformat verwendet werden, z.B. in jenen, wo das Ziel direkt an eine feste Phase gebunden wird, oder in Sandwich-Hybridisierungstests, in denen das Ziel an eine oder mehrere Nucleinsäuren gebunden wird, die sich ihrerseits an die feste Phase binden.
  • Im Allgemeinen können diese Ausführungsformen wie folgt beschrieben werden (unter besonderer Bezugnahme auf Nucleinsäuren). Eine Amplifikatorsonde wird an die Zielsequenz entweder direkt oder mittels einer Marker-Extendersonde hybridisiert, wodurch „generische" Amplifikatorsonden erzeugt werden können. Die Zielsequenz wird vorzugsweise – aber nicht verpflichtend – auf der Elektrode unter Einsatz von Einfangsonden immobilisiert. Vorzugsweise enthält die Amplifikatorsonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen, obwohl in einigen Ausführungsformen – wie dies unten beschrieben ist – die Amplifikatorsonde nur eine einzelne Amplifikationssequenz aufweisen kann. Die Amplifikatorsonde kann unterschiedliche Formen annehmen; entweder eine verzweigte Konformation, eine Dendrimer-Konformation der eine lineare „Kette" von Amplifikationssequenzen. Diese Amplifikationssequenzen werden dazu verwendet, Hybridisierungskomplexe mit Markersonden zu bilden, und die ETMs können mittels der Elektrode detektiert werden.
  • Die hierin offenbarten Reaktionen können in unterschiedlicher Weise erfolgen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Verbindungen der Reaktion können gleichzeitig oder hintereinander in jeder beliebigen Reihenfolge zugesetzt werden, wobei bevorzugte Ausführungsformen unten erläutert werden. Außerdem kann die Reaktion eine Vielzahl anderer Reagenzien vorsehen, die in den Tests enthalten sein können. Dazu zählen Reagenzien wie etwa Salze, Puffer, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien usw., die zur Erleichterung optimaler Hybridisierung und Detektion und/oder zur Reduktion nichtspezifischer oder Hintergrundwechselwirkungen verwendet werden können. Reagenzien, die den Wirkungsgrad des Tests steigern, z.B. Protease-Inhibitoren, Nuclease-Inhibitoren, antimikrobielle Mittel usw., können ebenfalls verwendet werden (dies hängt von den Probenherstellungsverfahren und der Reinheit des Ziels ab).
  • Im Allgemeinen sind die Verfahren wie folgt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ziel in das Detektionsmodul bewegt. Im Allgemeinen können zwei Vertahren durchgeführt werden. Die Testkomplexe (siehe unten) werden zuerst gebildet (d.h. alle löslichen Komponenten werden entweder gleichzeitig oder hintereinander kombiniert, einschließlich der Einfang-Extendersonden, Markersonden, Amplifikationssonden, Marker-Extendersonden usw.); dies erfolgt „stromauf" vom Detektionsmodul, und dann wird der Komplex der Oberfläche zwecks nachfolgender Bindung an eine Detektionselektrode zugegeben. Alternativ dazu kann das Ziel zugesetzt werden, wo es den Einfangbindungsliganden bindet, und dann werden die weiteren Komponenten zugesetzt. Diese letztere Vorgangsweise wird nachstehend eingehend besprochen, doch es können beide Verfahren durchgeführt werden. Einige Komponenten können zugesetzt und elektrophoresiert und anschließend weitere Komponenten zugesetzt werden; z.B. kann der Zielanalyt mit jeder beliebigen Einfang-Extendersonde kombiniert und dann transportiert werden usw. Außerdem können – wie dies hierin dargestellt ist – „Waschschritte" unter Einleitung von Puffer in das Detektionsmodul erfolgen, wobei überschüssige Reagenzien (ungebundene Analyten, überschüssige Sonden usw.) aus der Oberfläche getrieben werden können.
  • Die Probe wird der Elektrode im Detektionsmodul zugeführt und dann immobilisiert oder an die Detektionselektrode gebunden. In einer Ausführungsform erfolgt dies durch Bildung eines Bindungskomplexes (hierin häufig als Hybridisierungskomplex bezeichnet, wenn Nucleinsäurekomponenten verwendet werden) zwischen einer Einfangsonde und einem Abschnitt des Zielanalyten. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Einfang-Extenderbindungsliganden (hierin auch als Einfang-Extendersonden bezeichnet); in dieser Ausführungsform entsteht ein Bindungskomplex zwischen einem Abschnitt der Zielsequenz und einem ersten Abschnitt einer Einfang-Extendersonde, und ein zusätzlicher Bindungskomplex entsteht zwischen einem zweiten Abschnitt der Einfang-Extendersonde und einem Abschnitt der Einfangsonde. Zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen verwenden weitere Einfangsonden, wodurch ein Bindungskomplex zwischen einem Abschnitt der Zielsequenz und einem ersten Abschnitt einer zweiten Einfang-Extendersonde sowie ein Bindungskomplex zwischen einem zweiten Abschnitt der zweiten Einfang-Extendersonde und einem zweiten Abschnitt der Einfangsonde entstehen.
  • Alternativ dazu erfolgt die Bindung der Zielsequenz an die Elektrode gleichzeitig mit den anderen Reaktionen.
  • Das Verfahren wird gegebenenfalls mit der Einführung von Amplifikatorsonden fortgesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Amplifikatorsonde eine erste Sondensequenz, die im Wesentlichen zu einem Abschnitt der Zielsequenz komplementär ist, und zumindest eine Amplifikationssequenz.
  • In einer Ausführungsform ist die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde an die Zielsequenz hybridisiert, und jede unhybridisierte Amplifikatorsonde wird entfernt. Dies erfolgt im Allgemeinen unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren und hängt von der Art des Tests ab. Wenn die Zielsequenz auf einer Oberfläche wie z.B. einer Elektrode immobilisiert wird, erfolgt die Entfernung überschüssiger Reagenzien im Allgemeinen mittels eines oder mehrerer Waschschritte, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. In dieser Ausführungsform kann das Ziel auf jedem festen Träger immobilisiert sein. Wenn die Zielsequenz nicht auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann die Entfernung überschüssiger Reagenzi en wie z.B. der Sonden der Erfindung durchgeführt werden, indem die Probe am festen Träger vorbeiströmt, der komplementäre Sequenzen zu den Sonden umfasst, so dass sich die überschüssigen Sonden an den festen Träger binden.
  • Das Reaktionsgemisch wird dann Bedingungen ausgesetzt (Temperatur, hoher Salzgehalt, pH-Wert-Änderungen usw.), unter denen die Amplifikatorsonde von der Zielsequenz dissoziiert und die Amplifikatorsonde gesammelt wird. Diese kann dann einer Einfangsonden für die Amplifikatorsonde umfassenden Elektrode (mit hinzugefügten Markersonden) zugesetzt werden, und die Detektion findet statt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein größerer Sondenpool gebildet, indem mehr Amplifikatorsonde der Zielsequenz zugesetzt wird und indem die Hybridisierungs/Dissoziationsreaktionen wiederholt werden, um einen größeren Pool an Amplifikatorsonde zu erzeugen. Dieser Pool der Amplifikatorsonde wird dann einer Amplifikatoreinfangsonden umfassenden Elektrode (mit hinzugefügten Markersonden) zugesetzt und die Detektion fortgesetzt.
  • In dieser Ausführungsform ist es vorzuziehen, dass die Zielsequenz auf einem festen Träger einschließlich einer Elektrode unter Anwendung der hierin offenbarten Verfahren immobilisiert wird. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können auch andere Techniken zur Bindung an feste Trägern zur Anwendung kommen, z.B. die Bindung an Glas, Polymere usw. Es ist möglich, die Reaktion auf einem festen Träger durchzuführen und dann die gepoolte Amplifikatorsonde einer Elektrode zwecks Detektion zuzusetzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Amplifikatorsonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen.
  • In einer Ausführungsform wird die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde an die Zielsequenz hybridisiert und unhybridisierte Amplifikatorsonde entfernt. Wiederum verwenden bevorzugte Ausführungsformen immobilisierte Zielsequenzen, worin die Zielsequenzen durch Hybridisierung mit an die Elektrode gebundenen Einfangsonden stattfindet oder die Hybridisierung an Einfang-Extendersonden erfolgt, die ih rerseits mit den immobilüserten Einfangsonden hybridisieren, wie dies hierin beschrieben ist. Im Allgemeinen werden in diesen Ausführungsformen die Einfangsonden und die Detektionssonden auf der Elektrode, im Allgemeinen an der gleichen „Adresse", immobilisiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde an einen ersten Abschnitt zumindest einer Marker-Extendersonde hybridisiert, und ein zweiter Abschnitt der Marker-Extendersonde ist an einen Abschnitt der Zielsequenz hybridisiert. Andere bevorzugte Ausführungsformen verwenden mehr als eine Marker-Extendersonde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Amplifikationssequenzen der Amplifikatorsonde direkt zur Detektion verwendet – dies erfolgt durch Hybridisieren zumindest einer Marker-Sondensequenz.
  • Die vorliegende Beschreibung stellt somit Testkomplexe bereit, die als Minimum eine Zielsequenz und eine Markersonde umfassen. „Testkomplex" bedeutet hierin die Sammlung von Bindungs- oder Hybridisierungskomplexen, die Analyten, wie z.B. Bindungsliganden und Ziele, umfassen, wodurch Detektion ermöglicht wird. Die Zusammensetzung des Testkomplexes hängt von der Verwendung der unterschiedlichen hierin offenbarten Sondenkomponenten ab. Die Testkomplexe können die Zielsequenz, Markersonden, Einfang-Extendersonden, Marker-Extendersonden und Amplifikatorsonden enthalten (s.o.), wobei dies von der jeweils verwendeten Konfiguration abhängt.
  • Die Tests werden üblicherweise unter strengen Bedingungen durchgeführt, was die Bildung des Markersonden-Bindungskomplexes nur in Gegenwart vom Ziel ermöglicht. Die Strenge kann durch Veränderung eines Schrittparameters gesteuert werden, der eine thermodynamische Variable darstellt, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Temperatur, Formamidkonzentration, Salzkonzentration, chaotrope Salzkonzentration, pH-Wert, organische Lösungsmittelkonzentration usw. Die Strenge kann auch die Durchführung eines elektrophoretischen Schritts vorsehen, um nichtspezifische Materialien (d.h. jene niedriger Strenge) von der Detektionselektrode zu entfernen.
  • Diese Parameter können auch dazu dienen, nichtspezifische Bindung zu steuern, wie dies allgemein in US-Patent 5.681.697 beschrieben ist. Somit kann es wünschenswert sein, bestimmte Schritte unter Bedingungen hoher Strenge durchzuführen, z.B. wenn ein anfänglicher Hybridisierungsschritt zwischen der Zielsequenz und den Marker-Extender- und Einfang-Extendersonden stattfindet. Die Durchführung dieses Schritts unter Bedingungen, die spezifische Bindung begünstigen, kann die Reduktion nichtspezifischer Bindung ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Nucleinsäure-Ausführungsform läuft – wenn alle der hierin beschriebenen Komponenten verwendet werden – ein bevorzugtes Verfahren wie folgt ab. Einzelsträngige Zielsequenz wird unter Hybridisierungsbedingungen mit den Einfang-Extendersonden und den Marker-Extendersonden inkubiert. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt diese Reaktion in Gegenwart der Elektrode mit immobilisierten Einfangsonden, obwohl sie auch in zwei Schritten durchgeführt werden kann, wobei anfänglich die Inkubation und anschließend die Zugabe zur Elektrode stattfinden. Überschüssige Reagenzien werden abgewaschen und Amplifikatorsonden dann zugesetzt. Wenn Präamplifikatorsonden verwendet werden, können diese entweder vor den Amplifikatorsonden oder gleichzeitig mit diesen zugesetzt werden. Überschüssige Reagenzien werden abgewaschen und die Markersonden dann zugesetzt. Überschüssige Reagenzien werden abgewaschen, und die Detektion verläuft wie unten beschrieben.
  • In einer Ausführungsform werden einige Einfangsonden (oder Einfangsonden und Einfang-Extendersonden), die jeweils im Wesentlichen komplementär zu einem unterschiedlichen Abschnitt der Zielsequenz sind, verwendet.
  • Bei Verwendung von Amplifikatorsonden ist – wie dies hierin dargelegt ist – das System im Allgemeinen solcherart konfiguriert, dass nach Markersondenbindung die die ETMs umfassenden Rekrutierungslinker entweder in der Nähe der Monoschichtenoberfläche, die leitende Oligomere enthält (Mechanismus-2), oder in der Nähe der Detektionssonden positioniert werden. Im Fall von Mechanismus-2-Systemen kann – wenn die ETMs über Strukturen vom „Dendrimer"-Typ (s.o.) gebunden sind – die Länge der Linker vom Nucleinsäure-Bindungspunkt bis zu den ETMs variieren, ins besondere je nach Länge der Einfangsonde, wenn Einfang-Extendersonden verwendet werden. Längere Einfangsonden mit Einfangextendern können dazu führen, dass die Zielsequenzen von der Oberfläche weiter weg „gehalten" werden, als dies bei kürzeren Einfangsonden der Fall ist. Die Zugabe zusätzlicher Linkersequenzen zwischen der Sondennucleinsäure und den ETMs kann bewirken, dass die ETMs räumlich näher an der Oberfläche sind, was zu besseren Ergebnissen führt. Im Fall von Mechanismus-1-Systemen können die Länge des Rekrutierungslinkers, die Länge der Detektionssonde und ihr Abstand optimiert werden.
  • Außerdem können – falls dies erwünscht ist – hierin verwendete Nucleinsäuren vor der Detektion miteinander ligiert werden, indem molekularbiologische Standardverfahren wie z.B. die Verwendung einer Ligase angewendet werden. Auf Wunsch können, um die Stabilität zu steigern, Vernetzer zugesetzt sein, um die Strukturen stabil zu halten.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können die hierin offenbarten Systeme, die in Zusammenhang mit Nucleinsäuren beschrieben sind, auch für andere Zielanalyten verwendet werden.
  • Die Zusammensetzungen werden im Allgemeinen so synthetisiert, wie dies hierin und in den U.S.S.N. 08/743.798, 08/873.978, 08/911.085 und PCT US 97/20014 offenbart ist; es werden im Allgemeinen auf dem Gebiet bekannte Verfahren verwendet. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, betreffen viele der weiter unten beschriebenen Verfahren Nucleinsäuren mit einem Ribose-Phosphat-Rückgrat. Wie jedoch oben erläutert, können viele andere Nucleinsäureanaloga verwendet werden, von denen einige möglicherwiese weder Ribose noch Phosphat im Rückgrat enthalten. In diesen Ausführungsformen erfolgt die Bindung an anderen Positionen als an die Base in Abhängigkeit vom Rückgrat, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Beispielsweise kann die Bindung an die Kohlenstoffatome des PNA-Rückgrats (siehe unten) oder an einen der beiden Termini der PNA erfolgen.
  • Die Zusammensetzungen können auf unterschiedliche Weise gebildet werden. In einem bevorzugten Verfahren wird ein an ein Nucleosid gebundenes leitendes Oligomer synthetisiert, wobei zusätzliche Nucleoside zugesetzt werden, um die Einfangsonde herzustellen, gefolgt von der Bindung an die Elektrode. Alternativ dazu kann die gesamte Einfangsonde hergestellt und dann das vervollständigte leitende Oligomer zugesetzt werden, gefolgt von der Bindung an die Elektrode. Alternativ dazu wird eine Monoschicht eines leitenden Oligomers (einige davon besitzen funktionelle Gruppen zur Bindung von Einfangsonden) zunächst an die Elektrode gebunden, gefolgt von der Bindung der Einfangsonde. Die letzten beiden Verfahren sind möglicherweise dann vorzuziehen, wenn leitende Oligomere verwendet werden, die in den Lösungsmitteln und unter den in der herkömmlichen Nucleinsäuresynthese herrschenden Bedingungen nicht stabil sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Detektionsmodul-Zusammensetzungen der Erfindung zunächst durch Bildung des leitenden Oligomers, das kovalent an das Nucleosid gebunden ist, gefolgt von der Addition zusätzlicher Nucleoside zur Bildung einer Einfangsondennucleinsäure, hergestellt, wobei der letzte Schritt die Zugabe des leitenden Oligomers zur Elektrode umfasst.
  • Die Bindung des leitenden Oligomers an das Nucleosid kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Teil oder die Gesamtheit des leitenden Oligomers zunächst synthetisiert (im Allgemeinen mit einer funktionellen Gruppe am Ende zwecks Bindung an die Elektrode), die dann an das Nucleosid gebunden wird. Zusätzliche Nucleoside werden dann wie benötigt zugesetzt, wobei der letzte Schritt im Allgemeinen die Bindung an die Elektrode ist. Alternativ dazu werden Oligomereinheiten unter Zugabe weiterer Nucleoside und der Bindung an die Elektrode einzeln an das Nucleosid addiert. Einige repräsentative Synthesen sind aus den Figuren von PCT US 97/20014 ersichtlich.
  • Das leitende Oligomer wird dann an ein Nucleosid gebunden, das eine (oder mehr) Oligomereinheiten enthalten kann, die – wie hierin angeführt – gebunden sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung an eine Ribose des Ribose-Phosphat-Rückgrats, einschließlich Amid- und Aminbindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen zumindest eine Methylengruppe oder andere kurze aliphatische Alkylgruppen (als Z-Gruppe) zwischen dem an die Ribose gebundenen Stickstoff und dem aromatischen Ring des leitenden Oligomers vor.
  • Alternativ dazu erfolgt die Bindung über ein Phosphat des Ribose-Phosphat-Rückgrats, wie dies allgemein in PCT US 97/20014 dargelegt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung über die Base. In einer bevorzugten Ausführungsform können vor der Zugabe der leitenden Oligomere der Base Schutzgruppen zugesetzt werden, wie dies allgemein auf dem Gebiet bekannt ist. Außerdem können die Palladium-Kreuzkopplungsreaktionen modifiziert werden, um Dimerisierungsprobleme zu vermeiden, z.B. die Dimerisierung zweier leitender Oligomere statt der Kopplung an die Base.
  • Alternativ dazu kann die Bindung an die Base durch Ausbildung des Nucleosids mit einer Einheit des Oligomers, gefolgt von der Zugabe anderer, erfolgen.
  • Sobald die modifizierten Nucleoside vorbereitet, geschützt und aktiviert sind, können sie vor der Bindung an die Elektrode unter Anwendung herkömmlicher Synthesetechniken in unterschiedlicher Weise in ein wachsendes Oligonucleotid inkorporiert werden (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK 1984; Eckstein).
  • In einer Ausführungsform werden eines oder mehrere modifizierte Nucleoside in die Triphosphatform umgewandelt und unter Anwendung molekularbiologischer Standardtechniken, wie z.B. mittels Verwendung der Enzym-DNA-Polmerase I, T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase, Revers-Transkriptase und RNA-Polymerasen, in eine wachsende Oligonucleotidkette inkorporiert. Für die Inkorporation eines 3'-modifizierten Nucleosids in eine Nucleinsäure kann endständige Desoxynucleotidyl-Transferase verwendet werden (Ratliff, Terminal deoxynucleotidyltransferase, The Enzymes, Bd. 14A, P.D. Boyer, Hrsg., S. 105 – 118, Academic Press, San Diego, CA, USA 1981). Somit stellt die Erfindung Desoxyribonucleosidtriphosphate bereit, die eine kovalent gebundene ETM enthalten. Bevorzugte Ausführungsformen sehen die ETM-Bindung an die Base oder an das Rückgrat vor, wie z.B. Ribose (vorzugsweise an die 2'-Position), wie dies allgemein aus nachstehenden Strukturen 42 und 43 ersichtlich ist.
  • Figure 01360001
  • In einigen Ausführungsformen kann es daher möglich sein, die ETMs umfassenden Nucleinsäuren in situ zu erzeugen. Beispielsweise kann eine Zielsequenz an eine Einfangsonde (z.B. an der Oberfläche) solcherart hybridisieren, dass der Terminus der Zielsequenz freiliegt, d.h. unhybridisiert ist. Die Zugabe von Enzym und mit ETMs markierten Triphosphatnucleotiden ermöglicht die In-situ-Entstehung des Markers. Ebenso kann die Verwendung markierter, durch Polymerasen erkannter Nucleotide gleichzeitige PCR und Detektion ermöglichen; die Zielsequenzen werden in situ produziert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das modifizierte Nucleosid in die Phosphoramidit- oder H-Phosphonatform umgewandelt, die dann in Festphasen- oder Lösungssynthesen von Oligonucleotiden verwendet werden. Auf diese Weise wird das modifizierte Nucleosid – entweder zwecks Bindung an die Ribose (d.h. Amino- oder Thiol-modifizierte Nucleoside) oder an die Base – entweder an der internen Position oder am 5'-Terminus in das Oligonucleotid inkorporiert. Dies erfolgt im Allgemeinen auf zwei unterschiedliche Arten. Es wird die 5'-Position der Ribose mit 4',4-Dimethoxytrityl (DMT) geschützt, gefolgt von der Reaktion entweder mit 2-Cyanoethoxy-bis-diisopropylaminophosphin in Gegenwart von Diisopropylammoniumtetrazolid oder durch Reaktion mit Chlordiisopropylamino-2'-cyanoethoxyphosphin, um das auf dem Gebiet bekannte Phosphoramidit zu ergeben; es können allerdings auch andere, Fachleuten bekannte Verfahren durchgeführt werden. Siehe den obigen Verweis auf Gait; Caruthers, Science 230, 281 (1985); wobei beide Publikationen hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind.
  • Für die Bindung einer Gruppe an den 3'-Terminus sieht ein bevorzugtes Verfahren die Bindung des modifizierten Nucleosids (oder des Nucleosidersatzes) an Träger aus Glas mit kontrollierten Poren (CPG) oder anderen oligomeren Trägern vor. In dieser Ausführungsform wird das modifizierte Nucleosid am 5'-Ende mit DMT geschützt und dann mit Aktivierung mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt. Die resultierende Succinylverbindung wird an CPG oder andere oligomere Träger gebunden, wie dies auf dem Gebiet bekannt ist. Weitere Phosphoramiditnucleoside werden nach dem Entschützen (entweder modifiziert oder unmodifiziert) an das 5'-Ende addiert. Somit stellt die Erfindung leitende Oligomere oder Isolatoren bereit, die kovalent an Nucleoside gebunden sind, die an feste oligomere Träger wie z.C. CPG gebunden sind, sowie Phosphoramiditderivate der Nucleoside der Erfindung.
  • Die Beschreibung stellt ferner Verfahren zur Herstellung von Markersonden mit Rekrutierungslinkern, die ETMs umfassen, bereit. Diese synthetischen Reaktionen hängen von der Eigenschaft des Rekrutierungslinkers und der Bindungsart der ETM ab, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Für Nucleinsäure-Rekrutierungslinker werden die Markersonden im Allgemeinen – wie hierin beschrieben – mit der Inkorporation von ETMs an eine oder mehreren Positionen gebil det. Wenn ein Übergangsmetallkomplex als ETM verwendet wird, kann die Synthese in unterschiedlicher Weise erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bzw. werden der Ligand bzw. die Liganden an ein Nucleosid addiert, gefolgt vom Übergangsmetallion, und dann wird das Nucleosid mit dem gebundenen Übergangsmetallkomplex an ein Oligonucleotid addiert, d.h. durch Zugabe zum Nucleinsäuresynthetisierer. Alternativ dazu kann bzw. können der Ligand bzw. die Liganden gebunden werden; daran schließen sich die Inkorporation in eine wachsende Oligonucleotidkette und die Zugabe des Metallions an.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die ETMs an eine Ribose des Ribose-Phosphat-Rückgrats gebunden. Dies findet im Allgemeinen so statt, wie es hierin für leitende Oligomere beschrieben ist (siehe die Ausführungen hierin und PCT WO 95/15971), wobei Amino-modifizierte oder Oxo-modifizierte Nucleoside entweder an der 2'- oder an der 3'-Position der Ribose verwendet werden. Die Aminogruppe kann dann entweder als Ligand (z.B. als Übergangsmetallligand zur Bindung des Metallions) oder als chemisch funktionelle Gruppe verwendet werden, die zur Bindung anderer Liganden oder organischer ETMs dient, z.B. über Amidbindungen, wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist. Beispielsweise beschreiben die Beispiele die Synthese von Nucleosiden mit einer Vielzahl von ETMs, die über die Ribose gebunden sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die ETMs an ein Phosphat des Ribose-Phosphat-Rückgrats gebunden. Wie hierin dargelegt, kann dies unter Einsatz von Phosphodiesteranaloga wie z.B. Phosphoramiditbindungen (siehe die allgemeinen Ausführungen in PCT WO 95/15971) oder in ähnlicher Weise wie in PCT US 97/20014 erfolgen, wo das leitende Oligomer durch einen Übergangsmetallliganden, einen Übergangsmetallkomplex oder eine organische ETM ersetzt ist.
  • Die Bindung an andere Rückgrate, z.B. Peptidnucleinsäuren oder andere Phosphatbindungen, erfolgt gemäß Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden ETMs an eine Base des Nucleosids gebunden. Dies kann in unterschiedlicher Weise durchgeführt werden. In einer Ausführungsform werden Aminogruppen der Base – entweder natürlich vorkommend oder gemäß den hierin beschriebenen Verfahren zugesetzt (siehe z.B. die Figuren) – entweder als Liganden für Übergangsmetallkomplexe oder als chemisch funktionelle Gruppe verwendet, die verwendet werden können, um andere Liganden, z.B. über eine Amidbindung, oder organische ETMs zu addieren. Dies erfolgt gemäß Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Alternativ dazu sind Nucleoside, die Halogenatome enthalten, die an den heterocyclischen Ring gebunden sind, im Handel erhältlich. Acetylen-gebundene Liganden können unter Einsatz halogenierter Basen zugesetzt werden, wie dies allgemein bekannt ist; siehe z.B. Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36(34), 6017 – 6020 (1995); Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36(2), 3489 – 3490 (1995); und Tzalis et al., Chem. Communications (in Druck; 1996). Siehe auch die Figuren und Beispiele, die die Synthese von Metallocenen (in diesem Fall Ferrocen) beschreiben, die über Acetylenbindungen an die Basen gebunden sind.
  • In einer Ausführungsform werden die Nucleoside mit Übergangsmetallliganden, inkorporiert in eine Nucleinsäure, gebildet und dann das Übergangsmetallion und die verbleibenden notwendigen Liganden zugesetzt, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. In einer alternativen Ausführungsform werden das Übergangsmetallion und zusätzliche Liganden vor der Inkorporation in die Nucleinsäure zugesetzt.
  • Sobald die Nucleinsäuren der Endung mit kovalent gebundenem Bindungslinker (d.h. entweder einem Isolator oder einem leitenden Oligomer) gebildet sind, wird der Bindungslinker an die Elektrode gebunden. Das Verfahren variiert abhängig von der Art der verwendeten Elektrode. Wie dies hierin beschrieben ist, sind die Bindungslinker im Allgemeinen mit einem endständigen „A"-Linker versehen, um die Bindung an die Elektrode zu vereinfachen. Für die vorliegenden Zwecke wird eine Schwefel-Gold-Bindung als kovalente Bindung betrachtet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind leitende Oligomere, Isolatoren und Bindungslinker kovalent über Schwefelbindungen an die Elektrode gebunden. Überra schenderweise sind jedoch herkömmliche Schutzgruppen für die Bindung von Molekülen an Goldelektroden im Allgemeinen nicht ideal – weder für die Syntehse der hierin beschriebenen Zusammensetzungen noch für das Vorsehen in Oligonucleotid-Synthesereaktionen. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung neuartige Verfahren für die Bindung leitender Oligomere an Goldelektroden unter Einsatz unüblicher Schutzgruppen wie z.B. Ethylpyridin und Trimethylsilylethyl (siehe die Figuren) bereit. Wenn jedoch die leitenden Oligomere keine Nucleinsäuren enthalten, kommen – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – herkömmliche Schutzgruppen wie etwa Acetylgruppen u.dgl. in Frage. Siehe die oben angeführte Publikation von Greene et al.
  • Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Untereinheit des leitenden Oligomers, die das Schwefelatom zur Bindung an die Elektrode umfasst, mit einer Ethylpyridin- oder Trimethylsilylethylgruppe geschützt. Betreffend die erste Vorgangsweise erfolgt dies im Allgemeinen durch In-Kontakt-Bringen der das Schwefelatom enthaltenen Untereinheit (vorzugsweise in Form eines Sulfhydryls) mit einer Vinylpyridingruppe oder einer Vinyltrimethylsilylethylgruppe unter Bedingungen, unter denen sich eine Ethylpyridingruppe oder Trimethylsilylethylgruppe an das Schwefelatom addiert.
  • Die Untereinheit enthält auch im Allgemeinen eine funktionelle Gruppierung zur Bindung zusätzlicher Untereinheiten, und somit werden zusätzliche Untereinheiten gebunden, um das leitende Oligomer zu bilden. Das leitende Oligomer wird dann an ein Nucleosid gebunden, und es werden zusätzliche Nucleoside gebunden. Die Schutzgruppe wird anschließend entfernt und die kovalente Schwefel-Gold-Bindung durchgeführt. Alternativ dazu kann das gesamte oder ein Teil des leitenden Oligomers gebildet und dann entweder eine ein geschützes Schwefelatom enthaltende Untereinheit oder ein Schwefelatom addiert und dann geschützt werden. Das leitende Oligomer wird dann an ein Nucleosid gebunden, und es werden zusätzliche Nucleoside gebunden. Alternativ dazu wird das an eine Nucleinsäure gebundene leitende Oligomer gebildet und dann entweder eine ein geschütztes Schwefelatom enthaltende Untereinheit oder ein Schwefelatom addiert und anschließend geschützt. Alternativ dazu kann die Ethylpyridinschutzgruppe wie oben verwendet, doch nach einem oder mehreren Schritten entfernt und mit einer Standardschutzgruppe wie z.B. einem Disulfid ersetzt werden. Somit kann die Ethylpyridin- oder Trimethylsilylethylgruppe als Schutzgruppe für einige der synthetischen Reaktionen dienen und dann entfernt und mit einer herkömmlichen Schutzgruppe ersetzt werden.
  • Unter „Untereinheit" eines leitenden Polymers ist hierin zumindest die Gruppierung des leitenden Oligomers zu verstehen, an die das Schwefelatom gebunden ist, obwohl zusätzliche Atome vorhanden sein können, einschließlich funktioneller Gruppen, die die Addition zusätzlicher Komponenten des leitenden Oligomers ermöglichen, oder zusätzlicher Komponenten des leitenden Oligomers. Somit umfasst eine Untereinheit zumindest die erste Y-Gruppe, wenn die Oligomere gemäß Struktur 1 verwendet werden.
  • Ein bevorzugtes Verfahren umfasst das Folgende: 1) Addition einer Ethylpyridin- oder Trimethylsilylethylschutzgruppe an ein Schwefelatom, das an eine erste Untereinheit eines leitenden Oligomers gebunden ist, im Allgemeinen durch Addition einer Vinylpyridin- oder Trimethylsilylethylgruppe zu einem Sulfhydryl; 2) Addition zusätzlicher Untereinheiten zur Bildung des leitenden Oligomers; 3) Addition zumindest eines ersten Nucleosids zum leitenden Oligomer; 4) Addition zusätzlicher Nucleoside zum ersten Nucleosid, um eine Nucleinsäure zu bilden; 5) Bindung des leitenden Oligomers an die Goldelektrode. Dies kann auch in Abwesenheit von Nucleosiden erfolgen.
  • Das obige Verfahren kann auch zur Bindung von Isolatormolekülen an eine Goldelektrode herangezogen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Monoschicht, die leitende Oligomere – und gegebenenfalls Isolatoren – umfasst, an dier Elektrode addiert. Im Allgemeinen ist der chemische Vorgang der Addition ähnlich wie jener bzw. identisch zu jenem bei der Addition leitender Oligomere an die Elektrode, d.h. es wird ein Schwefelatom zur Bindung an eine Goldelektrode verwendet usw. Zusammensetzungen mit Monoschichten zusätzlich zu den leitenden Oligomeren (kovalent an Nucleinsäuren gebunden) können gemäß zumindest einem von fünf unterschiedlichen Verfahren hergestellt werden: (1) Addition der Monoschicht, gefolgt von der Addition des Bindungslinker-Nucleinsäure-Komplexes; (2) Addition des Bindungslinker-Nucleinsäure-Komplexes, gefolgt von der Addition der Monoschicht; (3) gleichzeitige Addition der Monoschicht und des Bindungslinker-Nucleinsäure-Komplexes; (4) Bildung einer Monoschicht (unter Anwendung von 1, 2 und 3), umfassend die Bindungslinker, die in einer funktionellen Gruppierung enden, die sich zur Bindung einer vervollständigten Nucleinsäure eignet; oder (5) Bildung einer Monoschicht, die Bindungslinker enthält, die in einer funktionellen Gruppierung enden, die sich zur Nucleinsäuresynthese eignet, d.h. die Nucleinsäure wird auf der Oberfläche der Monoschicht gemäß einem auf dem Gebiet bekannten Verfahren synthetisiert. Solche zweckmäßigen funktionellen Gruppierungen sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Nucleoside, Aminogruppen, Carboxygruppen, geschützte Schwefelgruppierungen oder Hydroxygruppen für Phosphoramiditadditionen. Die Beispiele beschreiben die Bildung einer Monoschicht auf einer Goldelektrode unter Awnendung des bevorzugten Verfahrens (1).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäure eine Peptidnucleinsäure oder ein Peptiducleinsäureanalogon. In dieser Ausführungsform stellt die Erfindung Peptidnucleinsäuren mit zumindest einer kovalent gebundenen ETM oder zumindest einem kovalent gebundenen Bindungslinker bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Gruppierungen kovalent an eine monomere Untereinheit der PNA gebunden. Unter „monomerer Untereinheit von PNA" versteht man hierin das -NH-CH2CH2-N(COCH2-Base)-CH2-CO-Monomer oder PNA-Derivate (hierin in der Definition von „Nucleosid" enthalten). Beispielsweise kann die Anzahl an Kohlenstoffatomen im PNA-Rückgrat geändert werden; siehe für allgemeine Ausführungen Nielsen et al., Chem. Soc. Rev., 73 (1997), in der einige PNA-Derivate offenbart sind (hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen). Die Amidbindung, die die Base an das Rückgrat bindet, kann ebenfalls modifiziert werden – es kommen zu diesem Zweck Phosphoramid- und Sulfuramidbindungen in Frage. Alternativ dazu sind die Gruppierungen an eine interne monomere Untereinheit gebunden. Unter „intern" ist hierin zu verstehen, dass die monomere Untereinheit weder die N-terminate monomere Untereinheit noch die C-terminale monomere Untereinheit ist. In dieser Ausführungsform können die Gruppierungen entweder an eine Base oder an das Rückgrat der monomeren Untereinheit gebunden sein. Die Bindung an die Base erfolgt so, wie dies hierin und in der Literatur erläutert ist. Im Allgemeinen werden die Gruppierungen an eine Base addiert, die dann in eine PNA inkorporiert wird (siehe Ausführungen hierin). Die Base kann entweder geschützt (erforderlich für die Inkorporation in die PNA-Synthesereaktion) oder derivatisiert werden (um Inkorporation zu ermöglichen; dies erfolgt entweder vor der Addition des chemischen Substituenten oder danach). Der Schutz und die Derivatisierung der Basen ist in PCT US 97/20014 beschrieben. Die Basen können dann in monomere Untereinheiten inkorporiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gruppierungen kovalent an das Rückgrat des PNA-Monomers gebunden. Die Bindung erfolgt im Allgemeinen an den unsubstituierten Kohlenstoffatomen der monomeren Untereinheit, vorzugsweise den α-Kohlenstoff des Rückgrats, obwohl die Bindung entweder an den Kohlenstoff-1- oder -2-Positionen oder am α-Kohlenstoff der Amidbindung, die die Base an das Rückgrat bindet, auch denkbar ist. Im Fall von PNA-Analoga können auch andere Kohlenstoffe oder Atome substituiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Gruppierungen an das α-Kohlenstoffatomen addiert – entweder an eine endständige monomere Untereinheit oder an eine interne.
  • In dieser Ausführungsform wird eine modifizierte monomere Untereinheit mit einer ETM oder einem Bindungslinker oder einer funktionellen Gruppe für ihre Bindung synthetisiert und die Base dann addiert; anschließend kann das modifizierte Monomer in eine wachsende PNA-Kette inkorporiert werden.
  • Die monomeren Untereinheiten mit kovalent gebundenen Gruppierungen werden – sobald sie gebildet sind – unter Anwendung der von Will et al., Tetrahedron 51(44), 12069 – 12082 (1995), und Vanderlaan et al., Tett. Let. 38, 2249 – 2252 (1997), beschriebenen Techniken in eine PNA inkorporiert. Diese Verfahren ermöglichen die Addition chemischer Substituenten an Peptidnucleinsäuren ohne Zerstörung der chemischen Substituenten.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können Elektroden gebildet werden, die jede beliebige Kombination von Nucleinsäuren, leitenden Oligomeren und Isolatoren aufweisen können.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können überdies einen oder mehrere Marker an jeder beliebigen Position enthalten. Unter „Marker" ist hierin ein Element (z.B. ein Isotop) oder eine chemische Verbindung zu verstehen, das bzw. die gebunden ist, um die Detektion der Verbindung zu ermöglichen. Bevorzugte Marker sind radioaktive Isotopenmarker sowie gefärbte oder fluoreszierende Farbstoffe. Die Marker können an jeder beliebigen Position in die Verbindung inkorporiert sein. Außerdem können die Zusammensetzungen der Erfindung auch andere Gruppierungen wie etwa Vernetzer enthalten, um die Vernetzung des Ziel-Sonden-Komplexes zu vereinfachen. Siehe z.B. Lukhtanov et al., Nucl. Acids Res. 24(4), 683 (1996), und Tabone et al., Biochem 33, 375 (1994); beide Publikationen sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
  • Sobald die Zusammensetzungen gebildet sind, kommen sie für einige hierin beschriebene Anwendungen in Frage. Insbesondere eignen sie sich für Bindungstests für die Detektion von Zielanalyten, vor allem Nucleinsäure-Zielsequenzen. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können Elektroden erzeugt werden, die eine einzelne Spezies oder einen einzelnen Bindungsliganden oder mehrere Bindungsligandenspezies, d.h. in einem Anordnungsformat, aufweisen.
  • Außerdem ermöglicht – wie dies hierin erläutert ist – die Verwendung eines festen Trägers wie z.B. einer Elektrode die Durchführung dieser Tests in einem Anordnungsformat. Beispielsweise ist die Verwendung von Oligonucleotid-Anordnungen auf dem Gebiet allgemein bekannt. Außerdem gibt es Techniken zum „Adressieren" von Positionen innerhalb einer Elektrode und zur Oberflächenmodifikation von Elektroden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden demnach Anordnungen unterschiedlicher Bindungsliganden (z.B. Nucleinsäuren) auf die Elektrode aufgebracht, wobei jeder von ihnen über einen Bindungslinker kovalent an die Elektrode gebunden ist. In dieser Ausführungsform kann die Anzahl der unterschiedlichen Bindungsliganden stark variieren – sie reicht von 1 bis zu Tausenden, wobei etwa 4 bis etwa 100.000 vorzuziehen und etwa 10 bis etwa 10.000 besonders vorzuziehen ist.
  • Sobald die Testkomplexe der Erfindung gebildet sind, die als Minimum einen Zielanalyten und eine Markersonde umfassen, wird die Detektion mit elektronischer Initiation fortgesetzt. Ohne sich auf einen Mechanismus oder eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, beruht die Detektion auf dem Übergang von Elektronen von der ETM auf die Elektrode, einschließlich über den „π-Weg".
  • Die Detektion des Elektronentransfers, d.h. die Gegenwart von ETMs, wird im Allgemeinen elektronisch initiiert, vorzugsweise mit Spannung. Ein Potential wird an den Testkomplex angelegt. Die genaue Steuerung und Variationen des angelegten Potentials können über einen Potentiostaten und entweder ein Drei-Elektroden-System (eine Bezugselektrode, eine Proben- (bzw. Arbeitselektrode) und eine Gegenelektrode) oder ein Zwei-Elektroden-System (eine Proben- und eine Gegenelektrode) erfolgen. Dies ermöglicht die Abstimmung des angelegten Potentials mit einem Peakpotential des Systems (teilweise abhängig von der Auswahl der ETMs und teilweise vom verwendeten leitenden Oligomer, von der Zusammensetzung und Integrität der Monoschicht und davon, welche Art von Bezugselektrode verwendet wird. Ferrocen ist – wie hierin angeführt – eine bevorzugte ETM.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Co-Reduktionsmittel oder Co-Oxidationsmittel (kollektiv ein Co-Redoxmittel) als zusätzliche Elektronenquelle oder -senke verwendet. Siehe die allgemeinen Ausführungen in Sato et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 66, 1032 (1993); Uosaki et al., Electrochimica Acta 36, 1799 (1991); und Alleman et al., J. Phys. Chem. 100, 17050 (1996); alle diese Publikationen sind hierin durch Verweis aufgenommen. In einigen Fällen wird eine Kupferelektrode verwendet, die als katalytische Elektrode dient, wodurch in situ Co-Reduktionsmittel oder Co-Oxidationsmittel gebildet werden. Siehe Fingal et al., Anal. Chem. 69, 4828 (1997); hierin durch Verweis aufgenommen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Eingangselektronenquelle in Lösung bei der Initiation des Elektronentransfers verwendet, vorzugsweise wenn Initiation und Detektion mittels Gleichstrom oder mittels Wechselstromfrequenzen, wo die Diffusion nicht limitierend ist, erfolgen. Im Allgemeinen verwenden – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – bevorzugte Ausführungs formen Monoschichten, die ein Minimum an „Löchern" aufweisen, so dass Systemkurzschlüsse vermieden werden. Dies kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Eingangselektronenquelle verwendet, die ein niedrigeres oder ähnliches Redoxpotential aufweist wie die ETM der Markersonde. Somit werden bei Spannungen oberhalb des Redoxpotentials der Eingangselektronenquelle sowohl die ETM als auch die Eingangselektronenquelle oxidiert und können demnach Elektronen abgeben; die ETM gibt ein Elektron an die Elektrode ab, die Eingangsquelle an die ETM. Beispielsweise besitzt Ferrocen – als ETM, die an die Zusammensetzungen der Erfindung gebunden ist (siehe Beispiele) – ein Redoxpotential von etwa 200 mV in wässriger Lösung (dieser Wert kann sich in Abhängigkeit davon, woran das Ferrocen gebunden ist, sowie in Abhängigkeit von der Bindungsart und der Gegenwart allfälliger Substitutionsgruppen signifikant ändern). Ferrocyanid, eine Elektronenquelle, besitzt ebenfalls ein Redoxpotential von etwa 200 mV (in wässriger Lösung). Demzufolge wird bei oder oberhalb von Spannungen von etwa 200 mV Ferrocen in Ferricenium umgewandelt, und dies sorgt für den Übergang eines Elektrons auf die Elektrode. Nun kann das Ferricyanid oxidiert werden, um ein Elektron auf die ETM zu übertragen. Auf diese Weise dient die Elektronenquelle (oder das Co-Reduktionsmittel) dazu, das im System erzeugte Signal zu amplifizieren, da die Elektronenquellenmoleküle rasch und wiederholt Elektronen an die an die Nucleinsäure gebundene ETM abgeben. Die Rate der Elektronenabgabe oder Elektronenaufnahme ist durch die Diffusionsrate des Co-Reduktionsmittels und den Elektronentransfer zwischen dem Co-Reduktionsmittel und der ETM beschränkt, was wiederum durch die Konzentration, Größe usw. beeinflusst wird.
  • Alternativ dazu werden Eingangselektronenquellen verwendet, die niedrigere Redoxpotentiale besitzen als die ETM. Bei Spannungen, die unterhalb des Redoxpotentials der ETM, aber oberhalb des Redoxpotentials der Elektronenquelle liegen, ist die Eingangsquelle wie z.B. Ferrocyanid nicht in der Lage, oxidiert zu werden und somit nicht in der Lage, ein Elektron an die ETM abzugeben, d.h. es tritt kein Elektronentransfer ein. Sobald Ferrocen oxidiert ist, liegt ein Weg für den Elektronentransfer vor.
  • In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird eine Eingangselektronenquelle verwendet, die ein höheres Redoxpotential besitzt als die ETM der Markersonde. Beispielsweise besitzt Luminol, eine Elektronenquelle, ein Redoxpotential von etwa 720 mV. Bei Spannungen über dem Redoxpotential der ETM, jedoch unterhalb des Redoxpotentials der Elektronenquelle, d.h. 200 – 720 mV, wird das Ferrocen oxidiert, und es überträgt über das leitende Oligomer ein einzelnes Elektron auf die Elektrode. Die ETM kann jedoch keine Elektronen aus der Luminol-Elektronenquelle aufnehmen, da die Spannungen niedriger sind als das Redoxpotential von Luminol. Beim oder über dem Redoxpotential von Luminol jedoch überträgt dieses dann ein Elektron auf die ETM, wodurch ein rascher und wiederholter Elektronentransfer ermöglicht wird. Auf diese Weise dient die Elektronenquelle (oder das Co-Reduktionsmittel) dazu, das im System erzeugte Signal zu amplifizieren, da die Elektronenquellenmoleküle Elektronen rasch und wiederholt an die ETM der Markensonde abgeben.
  • Luminol hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nach Oxidation eine chemilumineszierende Spezies wird (siehe Jirka et al., Analytica Chimica Acta 284, 345 (1993)), wodurch die Photodetektion des Elektronentransfers von der ETM auf die Elektrode ermöglicht wird. Solang das Luminol die Elektrode nicht direkt kontaktieren kann, d.h. in Gegenwart der SAM, so dass es keinen wirksamen Elektronentransferweg zur Elektrode gibt, kann Luminol nur durch Übertragung eines Elektrons auf die ETM auf der Markersonde oxidiert werden. Wenn die ETM nicht vorhanden ist, d.h. wenn die Zielsequenz nicht an die Zusammensetzung der Erfindung hybridisiert ist, wird Luminol nicht signifikant oxidiert, was zu geringer Photonenemission und somit zu einem schwachen – oder überhaupt nicht vorhandenen – Signal vom Luminol führt. In der Gegenwart des Ziels wird ein viel stärkeres Signal erzeugt. Somit ist das Ausmaß der Luminoloxidation durch Photonenemission ein indirektes Maß für die Fähigkeit der ETM, Elektronen an die Elektrode abzugeben. Da die Photonendetektion im Allgemeinen empfindlicher ist als die elektronische Detektion, kann die Empfindlichkeit des Systems erhöht werden. Anfängliche Ergebnisse legen nahe, dass Lumineszenz möglicherweise von Wasserstoffperoxid-Konzentration, pH-Wert und Luminolkonzentration abhängig sind, wobei diese nicht-linear zu sein scheint.
  • Geeignete Elektronenquellenmoleküle sind auf dem Gebiet allgemein bekannt; Beispiele sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Ferricyanid und Luminol.
  • Alternativ dazu könnten Ausgangselektronenakzeptoren oder -senken verwendet werden, d.h. die obigen Reaktionen könnten umgekehrt ablaufen, wobei die ETM wie z.B. ein Metallocen ein Elektron von der Elektrode aufnimmt und es in das Metallicenium umgewandelt wird, wobei der Ausgangselektronenakzeptor dann das Elektron rasch und wiederholt aufnimmt. In dieser Ausführungsform ist Kobalticenium die bevorzugte ETM.
  • Die Gegenwart der ETMs auf der Oberfläche der Monoschicht kann in unterschiedlicher Weise detekiert werden. Es steht eine Vielzahl an Detektionsverfahren zur Verfügung, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) die optische Detektion (infolge der Spektralveränderungen nach Änderungen der Redoxzustände), z.B. Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Lumineszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz und Brechungsindex; und die elektronische Detektion, u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Amperometrie, Voltammetrie, Kapazitanz und Impedanz. Diese Verfahren umfassen zeit- oder frequenzabhängige Techniken auf der Basis von Gleich- oder Wechselströmen, gepulste Verfahren, Lock-in-Techniken, Filtern (Hochpass, Tiefpass, Bandpass) und zeitaufgelöste Techniken wie z.B. zeitauflösende Fluoreszenz.
  • In einer Ausführungsform führt die effiziente Übertragung von Elektronen von der ETM auf die Elektrode zu stereotypen Veränderungen im Redoxzustand der ETM. In zahlreichen ETMs, z.B. in den Komplexen von Ruthenium mit Bipyridin-, Pyridin- und Imidazolringen, sind diese Veränderungen des Redoxzustands mit Veränderungen der Spektraleigenschaften assoziiert. Signifikante Unterschiede der Extinktion werden zwischen reduzierten und oxidierten Zuständen für diese Moleküle beobachtet. Siehe z.B. Fabbrizzi et al., Chem. Soc. Rev., 197 – 202 (1995). Diese Unterschiede können mittels eines Spektralphotometers oder eines einfachen Photoelektronenvervielfachers überwacht werden.
  • In dieser Ausführungsform enthalten mögliche Elektronendonoren und Elektronenakzeptoren alle oben angeführten Derivate für die Photoaktivierung oder -initiation. Be vorzugte Elektronendonoren und Elektronenakzeptoren weisen nach Oxidation und Reduktion charakteristisch starke Spektralveränderungen auf, was zur hochempfindlichen Überwachung des Elektronentransfers führt. Bevorzugte Beispiele dafür sind Ru(NH3)4py und Ru(bpy)2im. Man beachte, dass nur der Donor oder Akzeptor, der durch Extinktion überwacht wird, ideale Spektraleigenschaften aufweisen muss.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Elektronentransfer fluorimetrisch detektiert. Zahlreiche Übergangsmetallkomplexe, z.B. jene von Ruthenium, besitzen typische Fluoreszenzeigenschaften. Daher kann die Änderung des Redoxzustandes der Eletkronendonoren und Elektronenakzeptoren (an die Nucleinsäure gebunden) überaus empfindlich mittels Fluoreszenz kontrolliert werden, z.B. mit Ru(4,7-biphenyl2-phenanthrolin)3 2+. Die Erzeugung dieser Verbindung kann unter Anwendung herkömmlicher Fluoreszenztestverfahren leicht bestimmt werden. Beispielsweise kann laserinduzierte Fluoreszenz in einem Standard-Einzellenfluorimeter, einem „On-line"-Durchflussfluorimeter (z.B. an einem Chromatographiesystem befestigt) oder einem Mehrproben-„Plattenlesegerät", wie es für 96-Napf-Immuntests zur Anwendung kommt, aufgezeichnet werden.
  • Alternativ dazu kann Fluoreszenz uner Verwendung von Faseroptiksensoren mit Nucleinsäuresonden (in Lösung oder an die Faseroptik gebunden) gemessen werden. Die Fluoreszenz wird unter Einsatz eines Photoelektronenvervielfachers oder eines anderen an der Faseroptik angeschlossenen Lichtdetektionsinstruments überwacht. Der Vorteil dieses Systems besteht darin, dass sehr kleine Probenvolumina getestet werden können.
  • Außerdem eignen sich Scanning-Fluoreszenzdetektoren wie z.B. Fluorlmager (vertrieben von Molecular Dynamics) hervorragend dazu, die Fluoreszenz modifizierter Nucleinsäuremoleküle zu überwachen, die auf festen Oberflächen angeordnet sind. Der Vorteil dieses Systems ist die große Anzahl an Elektronentransfersonden, die sofort unter Einsatz von Chips gescannt werden können, die mit Tausenden getrennter Nucleinsäuresonden überzogen sind.
  • Viele Übergangsmetallkomplexe weisen Fluoreszenz mit großen Stokes-Verschiebungen auf. Zweckmäßige Beispiele sind Bis- und Trisphenanthrolinkomplexe sowie Bis- und Trisbipyridylkomplexe von Übergangsmetallen wie etwa Ruthenium (siehe A. Juris, V. Balzani et al., Coord. Chem. Rev. V. 84, 85 – 277 (1988)). Bevorzugte Beispiele weisen wirksame Fluoreszenz (mit recht hohen Quantumausbeuten) sowie niedrige Reorganisationsenergien auf. Dazu zählen Ru(4,7-Biphenyl2-phenanthrolin)3 2+, Ru(4,4'-Diphenyl-2,2'-bipyridin)3 2+ und Platinkomplexe (siehe Cummings et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 1949 – 1960 (1996); hierin durch Verweis aufgenommen). Alternativ dazu kann eine mit Hybridisierung assoziierte Reduktion der Fluoreszenz unter Anwendung dieser Systeme gemessen werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform dient Elektrochemilumineszenz als Basis der Elektronentransferdetektion. In einigen ETMs wie z.B. Ru2+(bpy)3 geht direkte Lumineszenz Hand in Hand mit dem Zerfall des angeregten Zustands. Veränderungen dieser Eigenschaft sind mit Nucleinsäurehybridisierung assoziiert und können mit. einem einfachen Photoelektronenverfielfacher überwacht werden (siehe G.F. Blackburn, Clin. Chem. 37, 1534 – 1539 (1991); und Juris et al., s.o.).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird elektronische Detektion angewendet, umfassend Amperometrie, Voltammetrie, Kapazitanz und Impedanz. Geeignete Techniken sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Elektrogravimetrie; Coulometrie (z.B. Coulometrie mit gesteuertem Potential und Coulometrie mit konstantem Strom); Voltametrie (zyklische Voltametrie, Pulse-Voltametrie (Normal-Pulse Voltametrie, rechteckige Pulse-Voltametrie, Differential-Pulse-Voltametrie, Osteryoung-Rechteckswellen-Voltametrie und coulostatische Pulstechniken)); Strippinganalyse (anodische Strippinganalyse, kathodische Strippinganalyse, Rechteckswellen-Strippingvoltammetrie); Leitfähigkeitsmessungen (elektrolytische Leitfähigkeit, direkte Analyse); zeitabhängige elektrochemische Analysen (Chronoamperometrie, Chronopotentiometrie, zyklische Chronopotentiometrie und Amperometrie, Wechselstrompolographie, Chronogalvametrie und Chronocoulometrie); Wechselstromimpedanzmessung; Kapazitanzmessung; Wechselstromvoltametrie; und Photoelektrochemie.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Überwachung des Elektronentransfers mittels amperometrischer Detektion. Dieses Detektionsverfahren umfasst das Anlegen eines Potentials (im Vergleich zu einer getrennten Bezugselektrode) zwischen der an Nucleinsäure konjugierten Elektrode und einer Bezugs- bzw. Gegenelektrode in der die Zielgene von Interesse enthaltenden Probe. Elektronentransfer unterschiedlicher Wirkungsgrade wird in Proben in Gegenwart oder Abwesenheit von Zielnucleinsäure induziert; d.h. die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielnucleinsäure und somit der Markersonde kann zu unterschiedlichen Strömen führen.
  • Die Vorrichtung zur amperometrischen Messung des Elektronentransfers sieht empfindliche Stromdetektion vor und enthält ein Mittel zur Steuerung des Spannungspotentials, üblicherweise einen Potentiostaten. Diese Spannung wird in Bezug auf das Potential des Elektronendonorkomplexes auf der Markersonde optimiert. Mögliche Elektronendonorkomplexe sind die oben erwähnten, wobei Komplexe von Eisen, Osmium, Platin, Kobalt, Rhenium und Ruthenium vorzuziehen und Eisenkomplexe besonders vorzuziehen sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden alternative Elektronendetektionsverfahren angewendet. Beispielsweise umfassen potentiometrische (oder voltammetrische) Messungen Nicht-Faraday-Prozesse (kein Nettostromfluss) und werden üblicherweise in pH- und anderen lonendetektoren verwendet. Ähnliche Sensoren dienen dazu, den Elektronentransfer zwischen der ETM und der Elektrode zu überwachen. Außerdem könnten andere Eigenschaften von Isolatoren (z.B. Widerstand) und von Leitern (z.B. Leitfähigkeit, Impedanz und Kapazitanz) dazu dienen, den Elektronentransfer zwischen ETM und der Elektrode zu überwachen. Schließlich erzeugt jedes System, das einen Strom erzeugt (z.B. Elektronentransfer), auch ein kleines Magnetfeld, das in einigen Ausführungsformen überwacht werden kann.
  • Man beachte, dass ein Vorteil der in den Zusammensetzungen der Erfindung beobachteten schnellen Raten des Elektronentransfers darin besteht, dass die Zeitauflösung das Signal/Rausch-Verhältnis von Überwachungen auf der Basis der Extinktion, Fluoreszenz und elektronischem Strom deutlich verbessern kann. Die raschen Raten des Elektronentransfers der Erfindung führen zu hohen Signalen und stereoty pen Verzögerungen zwischen der Einleitung und dem Abschluss des Elektronentransfers. Dies erfolgt durch Amplifizieren von Signalen bestimmter Verzögerungen, z.B. durch Anwendung gepulster Initiation des Elektronentransfers und mittels „Lockin"-Detektionsamplifikatoren und Fourier-Transformierten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Elektronentransfer unter Anwendung von Wechselstromverfahren initiiert. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, scheinen die an eine Elektrode gebundenen ETMs im Allgemeinen ähnlich auf eine Wechselstromspannung über eine Schaltung anzusprechen, die Widerstände und Kondensatoren enthält. Im Grunde genommen kann jedes Verfahren als Detektionsbasis herangezogen werden, das die Bestimmung der Art dieser Komplexe ermöglicht, die als Widerstand und Kondensator fungieren. Traditionelle elektrochemische Theorien, wie sie z.B. von Laviron et al., J. Electroanal. Chem. 97, 135 (1979), und Laviron et al.,J. Electroanal. Chem. 105, 35 (1979), beide hierin durch Verweis aufgenommen, dargelegt sind, können die hierin beschriebenen Systeme nicht präzise modellieren, außer für sehr kleine EAC (weniger als 10 mV) und relativ große Molekülmengen. Der Wechselstrom (I) wird durch die Laviron-Gleichung nicht präzise beschrieben. Dies kann teilweise auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass diese Theorie von einer unbegrenzten Elektronenquelle und -senke ausgeht, was auf viele aktuelle Systeme nicht zutrifft.
  • Es wurden daher alternative Gleichungen entwickelt; dies erfolgte auf der Grundlage der Nernst-Gleichung und unter Anwendung der ersten Prinzipien zur Entwicklung eines Modells, das die Ergebnisse besser simulieren kann. Die Anmelder gingen folgendermaßen vor: Die Nernst-Gleichung, nachstehende Gleichung 1, beschreibt das Verhältnis zwischen oxidierten (O) und reduzierten (R) Molekülen (Anzahl an Molekülen = n) bei jeder beliebigen Spannung und Temperatur, da nicht jedes Molekül beim gleichen Oxidationspotential oxidiert wird.
  • Figure 01520001
  • EDC ist das Elektrodenpotential, E0 ist das formale Potential des Metallkomplexes, R ist die Gaskonstante, T ist die Temperatur in Grad Kelvin, n ist die Zahl übertragener Elektronen, F ist die Faraday-Konstante, [O] ist die Konzentration oxidierter Moleküle, und [R] ist die Konzentration reduzierter Moleküle.
  • Die Nernst-Gleichung kann – wie aus Gleichungen 2 und 3 ersichtlich – umgeformt werden:
  • Figure 01530001
  • EDC ist die Gleichstromkomponente des Potentials.
  • Figure 01530002
  • Gleichung 3 kann aus praktischen Gründen wie folgt mittels Normalisierung der Konzentration auf 1 umgeformt werden (siehe Gleichungen 4, 5 und 6). Dies erfordert die anschließende Multiplikation um die Gesamtanzahl an Molekülen.
  • Figure 01530003
  • Wenn man Gleichungen 5 und 6 in Gleichung 3 einsetzt und da nF/RT = 38,9 V–1 (bei n = 1), erhält man Gleichungen 7 und 8, die [O] bzw. [R] definieren.
  • Figure 01540001
  • Unter Berücksichtigung der Erzeugung eines Faraday-Wechselstroms muss das Verhältnis zwischen [O] und [R] bei jedem Potential ermittelt werden. Bei einem bestimmten EDC mit einem angelegten EAC (siehe die vorliegenden Ausführungen) befinden sich an der Spitze von EAC mehr Moleküle im oxidierten Zustand, da die Spannung auf der Oberfläche nun (EDC + EAC) beträgt; am Boden befinden sich mehr im reduzierten Zustand, da die Spannung niedriger ist. Daher wird der Wechselstrom bei einem bestimmten EDC sowohl von Gleich- und Wechselstromspannungen als auch von der Form der Nernst-Kurve bestimmt. Wenn die Anzahl oxidierter Moleküle am Boden des AC-Zyklus von der Menge an der Spitze des AC-Zyklus subtrahiert wird, erhlt man die gesamte Veränderung in einem bestimmten AC-Zyklus, wie dies allgemein in Gleichung 9 zum Ausdruck kommt. Die Division durch 2 liefert dann die Wechselstromamplitude.
  • Figure 01540002
  • Gleichung 10 beschreibt somit den resultierenden Wechselstrom:
  • Figure 01550001
  • Wie aus Gleichung 11 ersichtlich, ist der gesamte Wechselstrom die Anzahl an Redoxmolekülen (C) mal der Faraday-Konstante (F) mal der Wechselstromfrequenz (w) mal 0,5 (zur Berücksichtigung der Wechselstromamplitude) mal den in obiger Gleichung 7 abgeleiteten Verhältnissen. Die Wechselstromspannung wird durch den Durchschnitt angenähert (EAC2/π).
  • Figure 01550002
  • Unter Anwendung von Gleichung 11 wurden Simulationen unter Einsatz eines steigenden Überpotentials (Wechselstromspannung) generiert. Fig. 22A zeigt eine dieser Simulationen, während Fig. 22B eine auf traditioneller Theorie basierende Simulation veranschaulicht. Die Fig. 23A und 23B zeigen tatsächliche Versuchsdaten unter Verwendung des Fc-Drahts von Beispiel 7 (aufgetragen mit der Simulation); sie veranschaulichen außerdem, dass das Modell sehr gut mit den Versuchsdaten zusammenpasst. In einigen Fällen ist der Strom kleiner als vorhergesagt, doch dies wird offenbar durch Ferrocenabbau bewirkt, dem man in unterschiedlicher Weise entgegenwirken kann. Gleichung 11 berücksichtigt weder die Wirkung der Elektronentransferrate noch die Instrumentenfaktoren. Die Elektronentransferrate ist wichtig, wenn die Rate an die angelegte Frequenz herankommt oder unterhalb dieser Frequenz liegt. Somit könnte der echte iAC-Wert eine Funktion aller drei Faktoren sein (siehe Gleichung 12).
  • Figure 01560001
  • Diese Gleichungen können dazu dienen, die erwarteten Wechselströme in Systemen, die Eingangssignale mit Gleich- und Wechselstromkomponenten umfassen, zu modellieren und zu prognostizieren. Wie oben skizziert, modellieren traditionelle Theorien diese Systeme überraschenderweise überhaupt nicht (außer bei sehr niedrigen Spannungen).
  • Im Allgemeinen zeigen nichtspezifisch gebundene Markersonden/ETMs Differenzen der Impedanz (d.h. höhere Impedanzen), als wenn die ETMs enthaltenden Markersonden spezifisch in der korrekten Orientierung gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das nichtspezifisch gebundene Material abgewaschen, was zu einer unendlich hohen tatsächlichen Impedanz führt. Somit bietet die Wechselstromdetektion – wie dies allgemein unten besprochen wird – mehrere Vorteile, z.B. eine höhere Empfindlichkeit und die Fähigkeit, Hintergrundrauschen „herauszufiltern". Insbesondere können Veränderungen der Impedanz (z.B. der Volumensimpedanz) wie z.B. zwischen der nichtspezifischen Bindung von ETM-hältigen Sonden und der zielspezifischen Testkomplexbildung überwacht werden.
  • Demzufolge ändert sich bei Anwendung der Wechselstrominitiations- und -detektionsverfahren die Frequenzreaktion des Systems infolge der Gegenwart der ETM. Unter „Frequenzreaktion" ist hierin eine Modifikation von Signalen aufgrund von Elektronentransfer zwischen der Elektrode und der ETM zu verstehen. Diese Modifikation hängt von der Signalfrequenz ab. Eine Frequenzreaktion enthält Wechselströme bei einer oder mehreren Frequenzen, Phasenverschiebungen, Gleichstromoffsetspannungen, Faraday-Impedanz usw.
  • Sobald der Testkomplex einschließlich der Zielsequenz und der Markensonde gebildet ist, wird ein erstes elektrisches Eingangssignal an das System angelegt, vorzugsweise zumindest über die Probenelektrode (die die Komplexe der Erfindung enthält) und die Gegenelektrode, um Elektronentransfer zwischen der Elektrode und der ETM einzuleiten. Drei-Elektroden-Systeme können ebenfalls verwendet werden, wobei die Spannung an die Bezugs- und Arbeitselektroden angelegt wird. Das erste Eingangssignal umfasst zumindest eine Wechselstromkomponente. Die Wechselstromkomponente kann variable Amplitude und Frequenz aufweisen. Im Allgemeinen reicht zur Verwendung hierin die Wechselstromamplitude von etwa 1 mV bis etwa 1,1 V, wobei etwa 10 mV bis etwa 800 mV vorzuziehen und von etwa 10 mV bis etwa 500 mV besonders vorzuziehen ist. Die Wechselstromfrequenz reicht von etwa 0,01 Hz bis etwa 100 Hz, vorzugsweise von etwa 10 Hz bis etwa 10 MHz, noch bevorzugter von etwa 100 Hz bis etwa 20 MHz.
  • Die Verwendung von Kombinationen von Gleich- und Wechselstromsignalen bietet eine Reihe an Vorteilen, darunter die überraschende Empfindlichkeit und Signalmaximierung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erste Eingangssignal eine Gleichstromkomponente und eine Wechselstromkomponente. Eine Wechselstromoffsetspannung zwischen der Probe und der Gegenelektrode wird über das elektrochemische Potential der ETM abgesucht (bei Verwendung von Ferrocen z.B. reicht das Absuchen von im Allgemeinen 0 bis 500 mV); alternativ dazu wird die Arbeitselektrode geerdet und die Bezugselektrode von 0 bis –500 mV abgesucht. Das Absuchen dient dazu, die Gleichstromspannung zu identifizieren, bei der die maximale Reaktion des Systems festgestellt wird. Dies erfolgt im Allgemeinen (ungefähr) beim elektrochemischen Potential der ETM. Solbald die Spannung bestimmt ist, können entweder ein Absuchen oder eine oder mehrere einheitliche Gleichstromoffsetspannungen stattfinden bzw. angelegt werden. Die Gleichstromoffsetspannungen von etwa –1 V bis etwa +1,1 V sind vorzuziehen; noch bevorzugter reichen sie von etwa –500 mV bis etwa +800 mV, am bevorzugtesten von etwa –300 mV bis etwa 500 mV. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gleichstromoffsetspannung nicht 0. Zusätzlich zur Gleichstromoffsetspannung wird eine Wechselstromkomponente variabler Amplitude und Frequenz angelegt. Wenn die ETM vorhanden ist und auf die Wechselstromstörung ansprechen kann, wird infolge von Elektronentransfer zwischen der Elektrode und der ETM Wechselstrom erzeugt.
  • Für definierte Systeme kann es ausreichend sein, ein einziges Eingangssignal anzulegen, um zwischen der Gegenwart und Abwesenheit der Nucleinsäure der ETM (d.h. Gegenwart der Zielsequenz) zu differenzieren. Alternativ dazu kann eine Vielzahl von Eingangssignalen angelegt werden. Wie hierin offenbart, kann dies unterschiedliche Formen aufweisen, z.B. unter Einsatz mehrerer Frequenzen, mehrerer Gleichstromoffsetspannungen, mehrerer Wechselstromamplituden oder Kombinationen von einigen oder allen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden demnach mehrere Gleichstromoffsetspannungen verwendet, obwohl – wie oben erwähnt – Gleichstromspannungs-Absuchungen vorzuziehen sind. Dies kann bei einer einzigen Frequenz oder bei zwei oder mehr Frequenzen erfolgen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Wechselstromamplitude variiert. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, scheint die Steigerung der Amplitude die Antriebskraft zu erhöhen. Höhere Amplituden, die zu höheren Überpotentialen führen, liefern höhere Elektronentransferraten. Im Allgemeinen liefert daher das gleiche System bei jeder einzelnen Frequenz eine verbesserte Reaktion (d.h. höhere Ausgangssignale), da bei dieser Frequenz höhere Überpotentiale verwendet werden. Die Amplitude kann daher bei hohen Frequenzen gesteigert werden, um die Elektronentransferrate durch das System zu erhöhen, was höherer Empfindlichkeit führt. Außerdem kann dies z.B. dazu dienen, Reaktionen in langsameren Systemen hervorzurufen, z.B. in jenen, die keine optimalen räumlichen Konfigurationen aufweisen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Messungen des Systems zumindest bei zwei getrennten Amplituden oder Überpotentialen vorgenommen, wobei Messungen bei einer Vielzahl an Amplituden vorzuziehen sind. Wie oben erwähnt, können Veränderungen der Reaktion aufgrund von Veränderungen der Amplitude die Grundlage der Identifizierung, Kalibrierung und Quantifizierung des Systems bilden. Außerdem können eine oder mehrere Wechselstromfrequenzen verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform variiert die Wechselstromfrequenz. Bei unterschiedlichen Frequenzen reagieren unterschiedliche Moleküle in unterschiedlicher Weise. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, erhöht die Steigerung der Frequenz im Allgemeinen den Ausgangsstrom. Wenn jedoch die Frequenz über der Rate liegt, bei der sich Elektronen zwischen der Elektrode und der ETM fortbewegen, führen höhere Frequenzen zu einem Verlust oder einer Abnahme des Ausgangssignals. Die Frequenz wird dann an einem gewissen Punkt über der Rate des Elektronentransfers zwischen der ETM und der Elektrode liegen, und dann fällt auch das Ausgangssignal.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Detektion eine Einzelmessung des Ausgangssignals bei einer Frequenz. Die Frequenzantwort des Systems in Abwesenheit der Zielsequenz und somit in Abwesenheit der die ETMs enthaltenden Markersonde kann davor als ein Wert ermittelt werden, der bei einer bestimmten hohen Frequenz sehr niedrig ist. Auf der Basis dieser Information zeigt jede Antwort bei einer bestimmten Frequenz die Gegenwart des Testkomplexes. Jede Reaktion bei einer bestimmten Frequenz ist – anders ausgedrückt – charakteristisch für den Testkomplex. Somit ist es möglicherweise nur notwendig, eine einzelne hohe Eingangsfrequenz zu verwenden, und jede Änderung der Frequenzantwort ist ein Indikator dafür, dass die ETM und somit auch die Zielsequenz vorhanden ist.
  • Außerdem erlaubt die Anwendung von Wechselstromtechniken die signifikante Reduktion von Hintergrundsignalen bei jeder einzelnen Frequenz – und dies infolge anderer Funktionseinheiten als der ETMs, d.h. aufgrund des „Aussperrens" oder „Filterns" unerwünschter Signale. Die Frequenzantwort eines Ladungsträgers oder redoxaktiven Moleküls in Lösung ist durch den Diffusionskoeffizienten und den Ladungstransferkoeftizienten beschränkt. Bei hohen Frequenzen kann ein Ladungsträger nicht rasch genug diffundieren, um seine Ladung auf die Elektrode zu übertragen, und/oder die Ladungstransferkinetik ist unter Umständen nicht schnell genug. Dies ist besonders in Ausführungsformen signifikant, die keine guten Monoschichten aufweisen, d.h. partielle oder unzureichende Monoschichten besitzen, wo das Lösungsmittel der Elektrode zugänglich ist. Wie oben erwähnt, kann in Gleichstromtechniken die Gegenwart von „Löchern", in denen die Elektrode dem Lösungsmittel zugänglich ist, zu Lösungsladungsträgern führen, die das System „kurzschließen", d.h. die Elektrode erreichen und Hintergrundsignal erzeugen. Unter Anwendung der vorliegenden Wechselstromtechniken jedoch können eine oder mehrere Frequenzen ausgewählt werden, die eine Frequenzantwort einer oder mehrerer Ladungsträger in Lösung verhindern – ob nun eine Monoschicht vorhanden ist oder nicht. Dies ist besonders signifikant, da zahlreiche biologische Flüssigkeiten wie z.B. Blut beträchtliche Mengen an redoxaktiven Molekülen besitzen, die amperometrische Detektionsverfahren beeinträchtigen können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Messungen des Systems bei zumindest zwei getrennten Frequenzen vorgenommen, wobei Messungen bei mehreren Frequenzen vorzuziehen sind. Eine Vielzahl an Frequenzen umfasst einen Scan. Beispielsweise ergibt die Messung des Ausgangssignals, z.B. des Wechselstroms, bei niedriger Eingangsfrequenz von z.B. 1 – 20 Hz und der Vergleich der Antwort mit dem Ausgangssignal bei hoher Frequenz wie z.B. 10 – 100 Hz eine Frequenzantwortdifferenz zwischen der Gegenwart und Abwesenheit der ETM. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Frequenzantwort bei zumindest zwei, vorzugsweise bei zumindest etwa fünf, noch bevorzugter bei zumindest etwa zehn, Frequenzen bestimmt.
  • Nach der Übertragung des Eingangssignals zur Initiation des Elektronentransfers wird ein Ausgangssignal empfangen oder detektiert. Die Gegenwart und Größenordnung des Ausgangssignals hängt von einigen Faktoren ab, einschließlich vom Überpotential bzw. von der Amplitude des Eingangssignals; von der Frequenz des Eingangswechselstromsignals; von der Zusammensetzung des dazwischen liegenden Mediums; vom Gleichstromoffset; von der Systemumgebung; von der Beschaffenheit der ETM; vom Lösungsmittel; sowie von der Art und Konzentration von Salz. Bei einem bestimmten Eingangssignal hängen die Gegenwart und die Größenordnung des Ausgangssignals im Allgemeinen von der Gegenwart oder Abwesenheit der ETM, von der Positionierung und vom Abstand der ETM von der Oberfläche der Monoschicht sowie von der Eigenschaft des Eingangssignals ab. In einigen Ausführungsformen ist es unter Umständen möglich, zwischen nichtspezifischer Bindung von Markersonden und der Bildung zielspezifischer Testkomplexe mit Markersonden auf der Basis von Impedanz zu unterscheiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Ausgangssignal einen Wechselstrom. Wie oben erwähnt, hängt die Größenordnung des Ausgangsstroms von einigen Parametern ab. Durch Variieren dieser Parameter kann das System in unterschiedlicher Weise optimiert werden.
  • Im Allgemeinen reichen die hierin erzeugten Wechselströme von etwa 1 Femtoampere bis etwa 1 Milliampere, wobei Ströme von etwa 50 Femtoampere bis etwa 100 Mikroampere vorzuziehen und von etwa 1 Picoampere bis etwa 1 Mikroampere besonders vorzuziehen sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ausgangssignal in der Wechselstromkomponente relativ zum Eingangssignal phasenverschoben. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, scheinen die Systeme der vorliegenden Erfindung ausreichend einheitlich zu sein, um Detektion auf der Basis von Phasenverschiebung zu ermöglichen. Die komplexen Biomoleküle der Erfindung, durch die Elektronentransfer eintritt, reagieren homogen auf den Wechselstromeingang (ähnlich wie elektronische Standardkomponenten), so dass eine Phasenverschiebung bestimmt werden kann. Dies kann als Grundlage der Detektion zwischen der Gegenwart und Abwesenheit der ETM und/oder der Unterschiede zwischen der Gegenwart zielspezifischer Testkomplexe mit Markersonden und nichtspezifischer Bindung der Markersonden an die Systemkomponenten dienen.
  • Das Ausgangssignal ist charakteristisch für die Gegenwart der ETM, d.h. das Ausgangssignal ist charakteristisch für die Gegenwart des zielspezifischen Testkomplexes, der Markersonden und ETMs umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Basis der Detektion ein Unterschied der Faraday-Impedanz des Systems infolge der Bildung des Testkomplexes. Die Faraday-Impedanz ist die Impedanz des Systems zwischen der Elektrode und der ETM. Die Faraday-Impedanz unterscheidet sich deutlich von der Volumens- oder dielektrischen Impedanz, die die Impedanz der Volumenslösung zwischen den Elektroden ist. Viele Faktoren können die Faraday- Impedanz verändern, die aber die Volumensimpedanz nicht beeinflussen können (umgekehrt gilt dies ebenso). Somit besitzen die Testkomplexe mit den Nucleinsäuren im vorliegenden System eine bestimmte Faraday-Impedanz, die u.a. vom Abstand zwischen der ETM und der Elektrode, von ihren elektronischen Eigenschaften und von der Zusammensetzung des dazwischen liegenden Mediums abhängt. Von Bedeutung hierin ist, dass die Faraday-Impedanz zwischen der ETM und der Elektrode deutlich unterschiedlich ist – je nachdem ob die Markersonden mit den ETMs spezifisch oder nichtspezifisch an die Elektrode gebunden sind.
  • Demzufolge stellt die vorliegende Beschreibung elektronische Vorrichtungen oder Geräte zur Detektion von Analyten unter Verwendung der hierin vorgestellten Zusammensetzungen bereit. Die Vorrichtung enthält eine Testkammer zur Aufnahme einer Probenlösung, die zumindest eine erste Mess- oder Probenelektrode und eine zweite Mess- oder Gegenelektrode aufweist. Es eignen sich Drei-Elektroden-Systeme. Die erste und die zweite Messelektrode stehen in Kontakt mit einem Probenaufnahmebereich, so dass in Gegenwart einer flüssigen Probe die zwei elektrophoretischen Elektroden in elektrischem Kontakt stehen können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Vorrichtung auch Detektionselektroden mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure-Einfangsonde, die kovalent über einen Bindungslinker gebunden ist, und einer Monoschicht, die leitende Oligomere umfasst, wie dies hierin beschrieben ist.
  • Die Vorrichtung umfasst ferner eine Wechselstromspannungsquelle, die elektrisch mit der Testkammer, d.h. mit den Messelektroden, verbunden ist. Vorzugsweise kann die Wechselstromspannungsquelle auch Gleichstromoffsetspannung liefern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung außerdem einen Prozessor, der zum Vergleich des Eingangssignals mit dem Ausgangssignal fähig ist. Der Prozessor ist an die Elektroden gekoppelt und konfiguriert, ein Ausgangssignal zu empfangen und somit die Gegenwart der Zielnucleinsäure zu detektieren.
  • Somit können die Zusammensetzungen der Erfindung in einer Vielzahl an Forschungsgebieten, im klinischen Bereich, in der Qualitätskontrolle oder in Feldversuchen eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden für die genetische Diagnose herangezogen. Beispielsweise können Sonden unter Anwendung der hierin offenbarten Techniken hergestellt werden, um Zielsequenzen zu detektieren, z.B. das Gen für Nicht-Polypose-Darmkrebs, das BRCA1-Brustkrebsgen, P53, ein mit einer Vielzahl an Karzinomen assoziiertes Gen, das Apo-E4-Gen, das ein erhöhtes Alzheimer-Risiko anzeigt (dies ermöglicht leichtes präsymptomatisches Screening von Patienten), das Gen für Mutationen bei zystischer Fibrose sowie andere auf dem Gebiet bekannte Sequenzen.
  • In einer weiteren Ausführungsform erfolgt virale und bakterielle Detektion unter Anwendung der Komplexe der Erfindung. In dieser Ausführungsform sind Sonden ausgebildet, Zielsequenzen aus einer Vielzahl an Bakterien und Viren zu detektieren. Beispielsweise beruhen aktuelle Blut-Screeningverfahren auf der Detektion von Anti-HIV-Antikörpern. Die hierin offenbarten Verfahren ermöglichen das direkte Screening klinischer Proben zur Detektion von HIV-Nucleinsäuresequenzen, insbesondere von hochkonservierten HIV-Sequenzen. Außerdem ermöglicht dies die direkte Kontrolle bzw. Überwachung von zirkulierendem Virus in einem Patienten, d.h. ein verbessertes Verfahren zur Beurteilung des Wirkungsgrads antiviraler Therapien. Viren, die mit Leukämie, HTLV-I und HTLV-II assoziiert sind, können auf diese Weise detektiert werden. Bakterielle Infektionen wie etwa Tuberkulose, Clymidia und andere sexuell übertragbare Krankheiten können ebenfalls detektiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuren der Erfindung als Sonden für toxische Bakterien beim Screenen von Wasser- und Nahrungsmittelproben verwenden. Beispielsweise können Proben behandelt werden, um die Bakterien einer Lyse zu unterziehen, um ihre Nucleinsäure freizusetzen, und dann Sonden, die ausgebildet sind, Bakterienstämme zu erkennen; Beispiele dafür sind u.a. (jedoch nicht beschränkt auf) Erregerstämme wie Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholereae, Leishmania, enterotoxische Stämme von E. coli sowie Bakterien der Legio närskrankheit. Ebenso können „Bioreparatur"-Strategien unter Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung bewertet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden für das in der Gerichtsmedizin angewendete „DNA-Fingerprintverfahren" verwendet, wo an einem Tatort sichergestellte DNA mit den von Opfern und Verdächtigen entnommenden Proben verglichen wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden in einer Anordnung für das Sequenzieren durch Hybridisierung verwendet.
  • Somit stellt die vorliegende Beschreibung extrem spezifische und empfindliche Sonden bereit, die in einigen Ausführungsformen Zielsequenzen ohne Entfernung der unhybridisierten Sonde detektieren können. Dies eignet sich zur Bildung automatisierter Gensondentests.
  • Alternativ dazu eignen sich die hierin beschriebenen Zusammensetzungen zum Detektieren erfolgreicher Genamplifikation in PCR, wodurch erfolgreiche PCR-Reaktionen als Indikator für die Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielsequenz fungieren können. PCR kann in diesem Zusammenhang in unterschiedlicher Weise eingesetzt werden. Beispielsweise erfolgt in einer Ausführungsform die PCR-Reaktion gemäß einer auf dem Gebiet bekannten Vorgangsweise, und sie wird dann einer Zusammensetzung der Erfindung, umfassend die Zielnucleinsäure mit einer ETM (über ein leitendes Oligomer kovalent an eine Elektrode gebunden), mit anschließender Detektion an die Zielsequenz addiert. Alternativ dazu efolgt PCR unter Verwendung von mit einer ETM markierten Nucleotiden – entweder in Gegenwart von oder mit anschließender Addition an eine Elektrode mit einem leitenden Oligomer und einer Zielnucleinsäure. Die Bindung des ETMs enthaltenden PCR-Produkts an die Elektrodenzusammensetzung ermöglicht die Detektion mittels Elektronentransfer. Schließlich kann die über ein leitendes Polymer an die Elektrode gebundene Nucleinsäure ein PCR-Primer sein (mit der Addition eines zweiten mit einer ETM markierten Primers). Die Verlängerung führt zu doppelsträngiger Nucleinsäure mit einer ETM und Elektro de (kovalent gebunden). Auf diese Weise wird die Erfindung für die PCR-Detektion von Zielsequenzen verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Anordnungen für die mRNA-Detektion herangezogen. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet entweder Einfangsonden oder Einfang-Extendersonden, die in der Nähe des 3'-Polyadenylierungsschwanzes der mRNAs hybridisieren. Dies ermöglicht die Verwendung einer Spezies von Zielbindungssonde für die Detektion, d.h. die Sonde enthält einen poly-T-Abschnitt, der sich an den poly-A-Schwanz des mRNA-Ziels bindet. Im Allgemeinen enthält die Sonde einen zweiten Abschnitt, vorzugsweise nicht-poly-T, der sich an die Detektionssonde (oder eine andere Sonde) bindet. Dies ermöglicht die Bildung einer Zielbindungssonde, wodurch auch das Ausmaß an anderer Sondensynthese eingeschränkt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligationsverfahren die Schaffung „universeller" Anordnungen. Diese Ausführungsform betrifft Monoschichten, die Einfangsonden umfassen, die Restriktionsendonuclease-Enden enthalten (siehe Fig. 6). Durch Einsatz komplementärer Abschnitte von Nucleinsäuren entsteht eine Anordung, die eine beliebige Anzahl an Restriktionsendonuclease-Stellen umfasst, während die „kohäsiven Enden" übrig bleiben. Die Behandlung einer Zielprobe mit einer oder mehr dieser Restriktionsendonucleasen ermöglicht die Bindung der Ziele an die Anordnung. Dies kann erfolgen, ohne die Sequenz des Ziels zu kennen. Die Zielsequenzen können unter Anwendung von Standardverfahren wie z.B. Ligasen wunschgemäß ligiert und detektiert werden, wobei hier entweder Standardmarker oder die Verfahren der Erfindung zur Anwendung kommen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die zur sensitiven Detektion von Nucleinsäure beitragen können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden weniger als etwa 10 × 106 Moleküle detektiert, vorzugsweise weniger als etwa 10 × 105, noch bevorzugter weiger als etwa 10 × 104, noch bevorzugter weniger als etwa 10 × 103, am bevorzugtesten weniger als etwa 10 × 102. Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, geht man dabei von einer 1:1-Korrelation zwi schen Zielsequenzen und Reportermolekülen aus; wenn mehr als ein Reportermolekül (d.h. Elektronentransfergruppierung) für jede Zielsequenz verwendet wird, steigt die Empfindlichkeit.
  • Während die Detektionsgrenzen derzeit auf der Grundlage der veröffentlichten Elektronentransferrate durch DNA – etwa 1 × 105 Elektronen/s/Doppelstrang für eine 8-Basenpaar-Trennung (siehe Meade et al., Angew. Chem. Eng. Ed. 34, 352 (1995)) – und hoher Antriebskräfte bewertet werden, sollten Wechselstromfrequenzen von etwa 100 kHz möglich sein. Wie die vorläufigen Ergebisse zeigen, ist der Elektronentransfer durch diese Systeme einigermaßen wirkungsvoll, was zu fast 100 × 103 Elektronen/s und zu einer potentiellen Femtoampere-Empfindlichkeit für sehr wenige Moleküle führt.
  • Wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist, können die Module der Erfindung in unterschiedlicher Weise konfiguriert sein – dies hängt von der Anzahl und Größe der Proben sowie der Anzahl und Art erwünschter Manipulationen ab. Es sind in den Figuren mehrere bevorzugte Ausführungsformen dargestellt.
  • Wie hierin dargelegt, können die Vorrichtungen der Erfindung in Kombination mit Geräten für die Beförderung und Aufnahme in die und aus den Vorrichtungen verwendet werden. Das Gerät kann eine „Einpass- oder Steckstelle" für die Positionierung und Befestigung der Vorrichtungen) und das Ausrichten der gegebenenfalls vorhandenen Ein- und Auslassöffnungen enthalten. Das Gerät kann ferner Pumpen („Offchip-Pumpen") und Mittel zur Betrachtung des Inhalts der Vorrichtungen enthalten, z.B. Mikroskope, Kameras usw. Das Gerät kann außerdem elektrische Kontakte im Steckbereich aufweisen, die mit Kontakten zusammenpassen, die in die Chipstruktur integriert sind, um Heizung oder Elektrophorese mit Energie zu versorgen. Das Gerät kann mit herkömmlichen Schaltungssensoren in Kommunikation mit Sensoren in der Vorrichtung für Wärmeregulierung, z.B. PCR-Wärmeregulierung, versehen sein. Die Vorrichtung kann außerdem ein Computersystem umfassen, das einen Mikroprozessor für die Steuerung der verschiedenen Module des Systems sowie für die Datenanalyse umfasst.

Claims (44)

  1. Mikrofluidikvorrichtung zum Detektieren eines Zielanalyts in einer Fluidprobe, umfassend: a) einen festen Träger (5); b) eine in diesem festen Träger ausgebildete Probenhandhabungskammer (40) zum Aufnehmen und Speichern der Probe; c) eine Probeneinlassöffnung (10) in diese Mikrofluidikvorrichtung; d) einen ersten in diesem festen Träger ausgebildeten Mikrokanal (15), der sich zwischen der Probenhandhabungskammer und der Probeneinlassöffnung erstreckt; e) ein Detektionsmodul (30), das eine in diesem festen Träger ausgebildete Detektionskammer und eine in dieser Detektionskammer positionierte Detektionselektrode (35) umfasst, wobei die Detektionselektrode mit einer selbst zusammengesetzten Monoschicht und einem Bindungsliganden ausgestattet ist; und f) einen zweiten in diesem festen Träger ausgebildeten Mikrokanal (20), der sich zwischen der Probenhandhabungskammer und der Detektionskammer erstreckt, so dass die Fluidprobe dazwischen fließen kann.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Detektionsmodul (30) eine Anordnung von Elektroden (35) umfasst, die jeweils eine selbst zusammengesetzte Monoschicht und einen Bindungsliganden umfassen.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Detektionselektrode (35) eine flache, leitfähige Elektrode umfasst.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, worin die flache, leitfähige Elektrode Gold umfasst.
  5. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Mikrofluidikvorrichtung so konfiguriert ist, dass sie in eine zweite Vorrichtung eingesetzt werden kann, die eine elektronische Komponente umfasst, und worin die Detektionselektrode elektronisch an eine Verbindungsleitung angeschlossen ist, die beim Einsetzen der Mikrofluidikvorrichtung in die zweite Vorrichtung eine Verbindung mit der elektronischen Komponente herstellt.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 5, worin die elektronische Komponente aus der aus einer Gleichstrom/Wechselstrom-Spannungsquelle, einem Amperemeter, einem Prozessor und einem Ablese-Display bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  7. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Probenhandhabungskammer (40) außerdem zumindest ein erstes Reagens umfasst.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin das Reagens ein Zelllysierungsmittel umfasst.
  9. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die außerdem ein Filter umfasst, das zum Entfernen von Zelltrümmern angepasst ist, wobei das Filter zwischen der Probenhandhabungskammer und dem zweiten Mikrokanal positioniert ist.
  10. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Probenhandhabungskammer (40) außerdem einen Zelleinfangbereich umfasst.
  11. Vorrichtung nach Anspruch 10, worin der Zelleinfangbereich Bindungsgruppierungen umfasst, die auf der Oberfläche von Kügelchen immobilisiert sind.
  12. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Probenhandhabungskammer (40) außerdem ein Zelltrennmodul umfasst.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, worin das Zelltrennmodul einen elektrophoretischen Mikrokanal und Elektroden umfasst.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 13, worin das Zelltrennmodul außerdem elektrophoretische Gelmedien umfasst.
  15. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die außerdem ein Reaktionsmodul (45) mit einer in dem festen Träger ausgebildeten Reaktionskammer umfasst, worin ein dritter Mikrokanal das Reaktionsmodul mit dem Probenhandhabungsmodul und ein vierter Mikrokanal das Reaktionsmodul mit dem Detektionsmodul verbindet.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Reaktionsmodul außerdem Reagenzien zur Nucleinsäureamplifikation umfasst.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin das Reaktionsmodul außerdem eine elektrische Widerstandsheizung umfasst.
  18. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Probenhandhabungsmodul (40) außerdem eine elektrische Widerstandsheizung umfasst.
  19. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die außerdem eine Pumpe umfasst, um die Probe durch die Mikrofluidikvorrichtung strömen zu lassen.
  20. Vorrichtung nach Anspruch 19, worin die Pumpe eine elektroosmotische (EO-) Pumpe oder eine elektrohydrodynamische (EHD-) Pumpe ist.
  21. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die außerdem ein Ventil umfasst.
  22. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Bindungsligand eine Nucleinsäure ist.
  23. Verfahren zum Detektieren eines Zielanalyts in einer Probe, umfassend: a) das Einführen der Probe in eine Probeneinlassöffnung (10) einer Mikrofluidikvorrichtung mit einem festen Träger (5), umfassend: i) eine in diesem festen Träger ausgebildete Probenhandhabungskammer (40) zum Aufnehmen und Speichern der Probe; ii) einen ersten in diesem festen Träger ausgebildeten Mikrokanal (15), der sich zwischen der Probenhandhabungskammer und der Probeneinlassöffnung erstreckt und eine Fließverbindung zwischen diesen herstellt; iii) ein Detektionsmodul (30), das eine in diesem festen Träger ausgebildete Detektionskammer und eine in dieser Detektionskammer positionierte Detektionselektrode (35) umfasst, wobei die Detektionselektrode mit einer selbst zusammengesetzten Monoschicht und einem Bindungsliganden ausgestattet ist; und iv) einen zweiten in diesem Trägerelement ausgebildeten Mikrokanal (20), der sich zwischen der Probenhandhabungskammer und der Detektionskammer erstreckt, so dass die Fluidprobe darin fließen kann; und b) den Nachweis der Gegenwart des Zielanalyts.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Verfahren außerdem das Anordnen eines Reagens in der Probenhandhabungskammer (40) umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Reagens ein Zelllysierungsmittel umfasst.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin das Verfahren außerdem das Abfiltrieren von Zelltrümmern umfasst.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, worin die Probenhandhabungskammer (40) außerdem einen Zelleinfangbereich umfasst.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, worin der Zelleinfangbereich Bindungsgruppierungen umfasst, die auf der Oberfläche von Kügelchen immobilisiert sind.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, worin die Probenhandhabungskammer (40) außerdem ein Zelltrennmodul umfasst.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, worin das Zelltrennmodul einen elektrophoretischen Mikrokanal und Elektroden umfasst.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, worin das Zelltrennmodul außerdem elektrophoretische Gelmedien umfasst.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, worin die Vorrichtung außerdem ein Reaktionsmodul mit einer in dem festen Träger ausgebildeten Reaktionskammer umfasst, worin ein dritter Mikrokanal das Reaktionsmodul mit dem Probenhandhabungsmodul und ein vierter Mikrokanal das Reaktionsmodul mit dem Detektionsmodul verbindet.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, das außerdem das Anordnen von Reagenzien zur Nucleinsäureamplifikation in dem Reaktionsmodul umfasst.
  34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, worin das Reaktionsmodul außerdem eine elektrische Widerstandsheizung umfasst.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 34, worin das Probenhandhabungsmodul (40) außerdem eine elektrische Widerstandsheizung umfasst.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin die Vorrichtung außerdem eine Pumpe umfasst, um die Probe durch die Mikrofluidikvorrichtung strömen zu lassen.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Pumpe eine elektroosmotische (EO-) Pumpe oder eine elektrohydrodynamische (EHD-) Pumpe ist.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 37, worin die Vorrichtung außerdem ein Ventil umfasst.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 38, worin der Bindungsligand eine Nucleinsäure ist.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 39, worin das Detektionsmodul (30) eine Anordnung von Elektroden (35) umfasst, die jeweils eine selbst zusammengesetzte Monoschicht und einen Bindungsliganden umfassen.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 40, worin die Detektionselektrode (35) eine flache, leitfähige Elektrode umfasst.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, worin die flache, leitfähige Elektrode Gold umfasst.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 42, worin die Detektionselektrode (35) außerdem eine Verbindungsleitung umfasst, wobei das Verfahren außerdem das Einsetzen der Mikrofluidikvorrichtung in eine zweite Vorrichtung umfasst, die eine elektronische Komponente umfasst, so dass die Verbindungsleitung eine Verbindung mit der elektronischen Komponente herstellt.
  44. Verfahren nach Anspruch 43, worin die elektronische Komponente aus der aus einer Gleichstrom/Wechselstrom-Spannungsquelle, einem Amperemeter, einem Prozessor und einem Ablese-Display bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
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