JP4167697B2

JP4167697B2 - 核酸検出用デバイス

Info

Publication number: JP4167697B2
Application number: JP2006111178A
Authority: JP
Inventors: 純岡田; 禎人本郷; 信弘源間
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2026-04-13
Also published as: JP2007285771A; US20070240985A1

Description

本発明は、核酸認識体を利用した電気化学応答による測定によって標的核酸を検出するための核酸検出用デバイスに関する。

近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となっている。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変化を検出することで、病気の発症前もしくは極めて初期の段階で診断や予測ができる。また、ヒトゲノムの解読と共に、遺伝子型と疾病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。従って、遺伝子の検出、遺伝子型の決定を簡便に行なうことは非常に重要である。

核酸検出法には、放射性同位体を使用するもの、蛍光色素ラベルを使用したものがある。前者は検出を行なう場所が限定され、また操作が煩雑である。後者は蛍光色素検出するための高価な装置が必要である。

これらの手法とは別に、電極の表面に固定化された核酸プローブに対して試料核酸をハイブリダイズさせた後、核酸認識体を添加し、電気化学的に核酸検出を行なう手法が確立されている。この核酸検出を電気化学的に行なう手法は、１枚のチップ上で複数の反応を行なう、「Lab-on-a-chip」に適していることから、様々な開発が進められている。最近では、この電気化学的に核酸検出を行なう手法における感度向上の手法として、微小な面積の電極を用いる手法が提案されている。
米国特許第５，７７６，６７２号米国特許第５，９７２，６９２号米国特許第６，２９４，６７０号特開２００４−３０９４６２号 E. Nebling, et.al, Anal. Chem. 2004 Feb 1; 76(3): 689-696

検出を電気的に行なうためには電極が必要となる。チップ上に簡便に電極を形成する手法はいくつかあるが、そのうちの一つとして、絶縁膜を用いる手法がある。基板上に形成された電極となる金属膜上に穴の開いた絶縁膜を形成し、その開口部で電極領域を規定する手法である。この手法を用いると、比較的容易にチップ上に電極や配線を形成することが可能である。

前述の感度向上の手法に従って微小な面積の電極を形成することを考えたとき、絶縁膜の膜厚と電極の径が同程度の大きさになってくると、電極周囲に存在する絶縁膜の壁が、電極での反応に与える影響が無視できなくなってくる。核酸の反応は液層での反応であるため、絶縁膜の壁が邪魔になって検出目的核酸を含む溶液や核酸認識体を含む溶液が電極に容易に到達できなくなってくる。

本発明は、このような実状を考慮してなされたものであり、その目的は、プローブ電極の面積が小さいながらもプローブ電極に溶液が到達しやすい核酸検出用デバイスを提供することである。

本発明は、電気化学応答を利用して核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスに向けられている。この核酸検出用デバイスは、検出目的核酸及び／または核酸認識体を含む溶液を流す流路と、前記流路内に設けられたプローブ電極とを有している。前記プローブ電極は、金属膜上に開口部を有する絶縁膜が積層されて形成され、前記開口から露出した前記金属膜部分である。

本発明によるある核酸検出用デバイスでは、前記流路は、前記溶液の流れ方向に平行な平坦面と、前記流れ方向に沿って前記平坦面から突出する斜面とを有し、前記プローブ電極は前記斜面に配置されており、前記平坦面に対して前記プローブ電極がなす角θ、前記流れ方向における前記開口の最大幅Ｒ、前記絶縁膜の膜厚ｄは、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たしている。

本発明による別の核酸検出用デバイスでは、前記絶縁膜は、前記溶液の流れ方向の、前記プローブ電極の上流側の膜厚ｄ１と下流側の膜厚ｄ２が、ｄ２＞ｄ１を満たしている。

本発明によるまた別の核酸検出用デバイスでは、前記流路は、前記溶液の流れ方向に平行な平坦面と、前記平坦面から突出した突出面を有する突出部とを有し、前記プローブ電極は前記突出面に配置されており、前記突出部の、前記溶液の流れ方向の、上流側の端から前記プローブ電極までの距離Ｌが、前記溶液の密度ρ、前記溶液の流速ｕ、前記溶液の粘度μ、前記流路の断面積Ｓ、前記流路の壁周辺長Ｌｐに対して、Ｌ＜０．０６５×Ｒｅ×Ｄ、Ｒｅ＝ρｕＤ／μ、Ｄ＝４Ｓ／Ｌｐを満たしている。

本発明によるさらに別の核酸検出用デバイスでは、前記絶縁膜は、前記プローブ電極を取り囲む電極領域を覆う第一部分と、前記電極領域の周りに位置する回路領域を覆う第二部分とを含み、前記第一部分は前記第二部分よりも膜厚が薄い。

本発明によるまたさらに別の核酸検出用デバイスでは、前記プローブ電極を取り囲む電極領域の周りに位置する回路領域の凹凸を被覆して設けられた、平坦面を有する平坦化層をさらに有し、前記平坦化層の前記平坦面の上に前記金属膜と前記絶縁膜が設けられている。

本発明によれば、プローブ電極の面積が小さいながらもプローブ電極に溶液が到達しやすい核酸検出用デバイスが提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

［第一実施形態]
図１は、電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスを示している。図１に示されるように、核酸検出用デバイス１００は、支持基板１０２と、支持基板１０２に設けられた複数の信号入出力用パッド１０６と、支持基板１０２に設けられた流路１１０と、流路１１０内に設けられた複数のプローブ電極Ｅとを有している。

流路１１０は、検出目的核酸を含む溶液や核酸認識体を含む溶液を流すためのものである。プローブ電極は、互いに間隔を置いて流路１１０に沿って列をなして配置されている。核酸検出用デバイス１００は、プローブ電極に加えて、図示していないが、電気化学応答を測定するための対極、好ましくは対極と参照極を流路１１０内に有している。プローブ電極と対極と参照極は、それぞれ、核酸検出用デバイス１００の内部あるいは表面に設けられた配線を介して信号入出力用パッド１０６と電気的に接続されている。

核酸検出用デバイス１００は公知の核酸検出装置に装着されて使用される。核酸検出装置は、流路１１０に対して溶液を送液したり、信号入出力用パッド１０６を介して電極に流れる電流を測定したりする。

図２は、図１に示されるプローブ電極を拡大して示している。図３は、図２のIII−III線に沿ったプローブ電極周辺部の断面を示している。図２と図３に示されるように、プローブ電極用にパターニングされた金属膜１２２の上に絶縁膜１２４が積層されている。絶縁膜１２４には、金属膜１２２を部分的に露出させる開口が形成されている。絶縁膜１２４の開口を介して露出した金属膜１２２の部分がプローブ電極Ｅとして機能する。つまり、核酸検出用デバイス１００は、プローブ電極Ｅとなる部分を含む金属膜１２２と、金属膜１２２の上に積層された絶縁膜１２４とを有し、絶縁膜１２４はプローブ電極Ｅを規定する開口を有している。

図４は、流路内における溶液の流れを模式的に示している。図４において、矢印の長さはその位置における溶液の流れの速度を反映している。流路内における溶液の流れは安定しており、溶液は流路にほぼ平行に流れる。このように安定した流れにおいては、図４から分かるように、溶液は、流路１１０の壁面つまり絶縁膜１２４の近くで遅く流れ、流路１１０の壁面つまり絶縁膜１２４から離れるにつれて速く流れる。

プローブ電極Ｅは、感度向上のために、面積が小さいとよい。つまり、プローブ電極Ｅの最大幅すなわち直径Ｒは小さいとよい。しかし、プローブ電極Ｅの直径Ｒが絶縁膜１２４の膜厚ｄと同程度の大きさになってくると、前述した安定した流れにおいては、プローブ電極Ｅの周囲に存在する絶縁膜１２４の壁が邪魔になって溶液が開口内に進入しにくくなり、従って溶液がプローブ電極Ｅの表面に到達しにくくなる。この現象による検出難易度の上昇は、核酸検出用プローブ固定化電極Ｅの直径Ｒが絶縁膜１２４の膜厚ｄの１００倍程度より小さくなってくると現れ始める。

本実施形態は、微小な面積のプローブ電極Ｅに対しても溶液を到達しやすくする構造に向けられている。図５は、本発明の第一実施形態による核酸検出用デバイスにおけるプローブ電極の周辺部分の断面を示している。また図６は、図５に示された断面を模式的に示している。

図５に示されるように、流路１１０は、溶液の設計した流れ方向に平行な平坦面を有する平坦部１１０ｆと、溶液の流れ方向に沿って平坦面から徐々に突出する斜面を有する傾斜部１１０ｓとを有している。プローブ電極Ｅは傾斜部１１０ｓの斜面に配置されている。

図６に示されるように、傾斜部１１０ｓの平坦面に対してプローブ電極Ｅがなす角θ、溶液の流れ方向における絶縁膜１２４の開口の最大幅Ｒ、絶縁膜１２４の膜厚ｄは、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たしている。この式を満たしている限り、図６から分かるように、溶液の設計した流れに平行であって絶縁膜１２４を横切ることなく金属膜１２２を横切る直線が存在する。従って、流れてくる溶液はプローブ電極Ｅに直接到達すると言える。その結果、溶液に含まれる検出目的核酸や核酸認識体がプローブ電極Ｅに供給される。

本実施形態の核酸検出用デバイスは以下のようにして作製される。

シリコン基板に対して、異方性エッチングを行い、基板面に対して、電極周辺領域が斜面となるように構造体を形成する。基板はシリコン以外にもガラス、樹脂等、限定されない。斜面の形成は、切削、射出成型等でも構わない。このとき斜面は、あらかじめ設計した流路の送液方向に対して、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たすように形成する。その後、金薄膜をスパッタにより形成する。蒸着あるいは印刷等により形成してもよい。その後、必要に応じて配線部分、パッド部分等をエッチングによりパターニングする。その後、絶縁膜を塗布により形成する。スパッタ、蒸着、印刷等により形成してもよい。その後、絶縁膜を選択的にエッチングして開口を形成し、金薄膜の一部を露出させて電極とする。開口の手法も特に問わない。

次に、核酸プローブを含む溶液を電極上に滴下することにより、電極上に核酸プローブを固定化してプローブ電極を形成する。核酸プローブは蒸着により固定化してもよい。別々な種類の核酸プローブを含む複数種類の溶液を別々な電極上に滴下することにより、複数の核酸を検出可能なデバイスが形成できる。

このようにして形成した構造体に、あらかじめ加工した流路構造を持つ部品を接着あるいは圧着して核酸検出用デバイスが完成する。流路構造を持つ部品を別に用意する代わりに、あらかじめ流路形状にエッチングあるいは切削した構造体に対して、上述した電極形成工程と核酸プローブ固定化工程を適用してもよい。

本実施形態の核酸検出用デバイスは以下のように使用される。

検出目的核酸を含む溶液を流路に流してハイブリダイゼーション反応を行なう。本実施形態の核酸検出用デバイスは電極周辺領域に傾斜部を有し、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たしているため、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給され、これにより微量な核酸でも十分にハイブリダイゼーション反応を行なえる。これに対して、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たさない場合、流れてきた溶液がプローブ電極に直接衝突し得ないため、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給されない。

次に、洗浄用バッファを流路に流して洗浄処理を行なう。このときも、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たしているため、洗浄用バッファがプローブ電極に効率良く供給され、これにより確実な洗浄が行なえる。

次に、核酸認識体を含む溶液を流路に流し、ハイブリダイゼーションした核酸と、核酸認識体との反応を行なう。このときも、ｔａｎθ＞ｄ／Ｒを満たしているため、核酸認識体がプローブ電極に効率良く供給され、これにより確実な反応を行なえる。

次に、核酸認識体について電気化学応答の測定を行なうことにより、核酸検出を行なう。

［第二実施形態]
本実施形態の核酸検出用デバイスの基本構造は第一実施形態と同様である。本実施形態は、微小な面積のプローブ電極Ｅに対しても溶液を到達しやすくする別の構造に向けられている。図７は、本発明の第二実施形態による核酸検出用デバイスにおけるプローブ電極の周辺部分の断面を示している。また図８は、図７に示された断面を模式的に示している。

図７に示されるように、プローブ電極Ｅを規定する絶縁膜１２４は、溶液の設計した流れ方向の上流側が薄く、下流側が厚く形成されている。つまり、絶縁膜１２４は、図８に示されるように、上流側の膜厚ｄ１と下流側の膜厚ｄ２が、ｄ２＞ｄ１を満たしている。この式を満たしている限り、図８から分かるように、溶液の設計した流れに平行であって上流側の絶縁膜１２４を横切ることなく下流側の絶縁膜１２４を横切る直線が存在する。従って、流れてくる溶液は下流側の絶縁膜１２４の壁面に直接当たると言える。その結果、流れが乱れるので、溶液に含まれる検出目的核酸や核酸認識体がプローブ電極Ｅに供給される。

基板に対して、金薄膜をスパッタにより形成する。蒸着あるいは印刷等により形成してもよい。その後、必要に応じて配線部分、パッド部分等をエッチングによりパターニングする。その後、絶縁膜を塗布により形成する。スパッタ、蒸着、印刷等により形成してもよい。その後、絶縁膜を選択的にエッチングして開口を形成し、金薄膜の一部を露出させて電極とする。開口の手法も特に問わない。このとき絶縁膜は、あらかじめ設計した流路の送液方向に対して、ｄ２＞ｄ１を満たすように形成する。

その後、第一実施形態と同様に、核酸プローブの固定化、流路の形成を行なう。

検出目的核酸を含む溶液を流路に流してハイブリダイゼーション反応を行なう。本実施形態の核酸検出用デバイスは絶縁膜がｄ２＞ｄ１を満たしているため、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給され、これにより微量な核酸でも十分にハイブリダイゼーション反応を行なえる。これに対して、絶縁膜がｄ２＞ｄ１を満たさない場合、流れてきた溶液がプローブ電極に十分に供給されないため、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給されない。

その後、第一実施形態と同様に、洗浄処理、核酸認識体との反応、電気化学応答の測定を行なうことにより、核酸検出を行なう。

［第三実施形態]
本実施形態の核酸検出用デバイスの基本構造は第一実施形態と同様である。本実施形態は、微小な面積のプローブ電極Ｅに対しても溶液を到達しやすくするまた別の構造に向けられている。図９は、本発明の第二実施形態による核酸検出用デバイスにおけるプローブ電極の周辺部分の断面を示している。図１０は、図９に示された構造の斜視図である。また図１１は、図９に示された断面を模式的に示している。

図９に示されるように、流路１１０は、溶液の設計した流れ方向に平行な平坦面を有する平坦部１１０ｆと、この平坦面から突出し、本図では前記平坦面と平行な突出面を有する突出部１１０ｐとを有している。図９と図１０に示されるように、プローブ電極Ｅは突出部１１０ｐの突出面に配置されている。

図１１に示されるように、溶液の設計した流れ方向に関して、突出部１１０ｐの上流側の端からプローブ電極Ｅまでの距離Ｌは、Ｌ＜０．０６５×Ｒｅ×Ｄを満たしている。ここで、Ｒｅ＝ρｕＤ／μ、Ｄ＝４Ｓ／Ｌｐであり、ρは溶液の密度、ｕは溶液の流速、μは溶液の粘度、Ｓは流路１１０の断面積、Ｌｐは流路１１０の壁周辺長である。

本実施形態の核酸検出用デバイスにおいて、溶液の流れは、突出部に達するまでは層流であり、突出部に衝突すると乱流に変わり、その後、再び層流に戻る。前述の不等式の右辺は、流体の流れが乱流から層流へと変化する距離として知られている。従って、距離Ｌが前述の不等式を満たしている限り、突出部１１０ｐの上流側の端に衝突して乱流になった溶液の流れは、乱流のままプローブ電極Ｅに到達する。このため、溶液に含まれる検出目的核酸や核酸認識体がプローブ電極Ｅに供給される。

距離Ｌの上限値は以下の考察に基づいて決めた。

管入り口から一様速度で流入すると、管壁に沿って境界層が発達し、それが厚みを増して中心部に達すると、管内の速度分布は一定（放物線速度分布など）になる。この十分に発達した流れ(Fully developed flow)に達するまでの区間を助走区間(entrance region)、その長さを助走距離Ｘ(inlet length)という。

層流の場合、Ｘ／ＤはＲｅの関数で、Boussinesqによると、Ｘ／Ｄ≧０．０６５×Ｒｅである。

管内流れが層流か乱流かは、次式で定義されるレイノルズ数(Reynolds number)と名づけられた無次元数Ｒｅの大きさにより判別される。

Ｒｅ＝ρｕｌ／μ
ここで、ｌは流れの代表長さ、代表流速ｕ、流体の密度ρ、粘度μである。Ｒｅ数は無次元数であるから同じ状態であれば使用する単位系にかかわらず値が同じである。管内の流れに対しては、流れの代表長さｌに管の内径Ｄを用いて、Ｒｅ＝ρｕＤ／μを用いる。

管路の断面が円形でない場合には、Ｒｅ中の代表長さとして次式で定義される相当直径(equivalent diameter)Ｄｅを用いれば乱流遷移、圧力損失などが円管と同様に取り扱える。

Ｄｅ＝４Ｓ／ｌｐ
ここで、Ｓは流れの断面積、ｌｐは流体が接触している固体壁周辺の長さすなわち浸辺長(wetted perimeter)である。

本実施形態の核酸検出用デバイスにおいて、距離Ｌが助走距離Ｘよりも小さければ、すなわちＬ＜Ｘであれば、突出部１１０ｐの上流側の端で発生した乱流は層流に戻る前にプローブ電極Ｅに到達する。Ｌ＜Ｘの式にＸ＝０．０６５×Ｒｅ×Ｄを代入して、前述の関係が得られる。ここで浸辺長ｌｐは、核酸検出用デバイスの構造に合わせて、流路の壁周辺長Ｌｐに置き換える。

基板に対して、エッチング、切削等を行い、基板面に対して、電極周辺領域が突出するように構造体を形成する。基板はシリコン以外にもガラス、樹脂等、限定されない。その後、基板に対して、金薄膜をスパッタにより形成する。蒸着あるいは印刷等により形成してもよい。その後、必要に応じて配線部分、パッド部分等をエッチングによりパターニングする。その後、絶縁膜を塗布により形成する。スパッタ、蒸着、印刷により形成してもよい。その後、絶縁膜を選択的にエッチングして開口を形成し、金薄膜の一部を露出させて電極とする。開口の手法も特に問わない。このとき開口は、あらかじめ設計した流路の送液方向に対して、Ｌ＜０．０６５×Ｒｅ×Ｄを満たすように形成する。

検出目的核酸を含む溶液を流路に流してハイブリダイゼーション反応を行なう。本実施形態の核酸検出用デバイスは電極周辺領域に突出部を有し、突出部の上流側の端からプローブ電極までの距離ＬがＬ＜０．０６５×Ｒｅ×Ｄを満たしている。このため、溶液の流れは、突出部の上流側の端に衝突して乱流になり、層流に戻る前にプローブ電極に到達する。その結果、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給され、これにより微量な核酸でも十分にハイブリダイゼーション反応を行なえる。溶液の流れが層流であると、流路の壁面近傍すなわちプローブ電極上では流速が小さくなり、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給されない。

［第四実施形態]
図１２は、電気化学的核酸検出を行なうための別の核酸検出用デバイスを示している。図１２に示されるように、核酸検出用デバイス２００は、支持基板２０２と、支持基板２０２に設けられた複数の信号入出力用パッド２０６と、支持基板２０２に設けられた流路２１０と、流路２１０内に設けられた複数のプローブ電極Ｅとを有している。

流路２１０は、検出目的核酸を含む溶液や核酸認識体を含む溶液を流すためのものである。プローブ電極Ｅは、互いに間隔を置いて流路２１０に沿って列をなして配置されている。

この核酸検出用デバイス２００は、核酸検出のために核酸認識体について電気化学応答を測定する回路が組み込まれている。回路は、プローブ電極用にパターニングされた金属膜が配置される電極領域ＥＡの周りに位置する回路領域ＣＡに形成されている。

図１３は、図１２に示された核酸検出用デバイスにおける電極領域と回路領域の断面を示している。図１３に示されるように、プローブ電極用にパターニングされた金属膜２２２の上に絶縁膜２２４が積層されている。絶縁膜２２４には、金属膜２２２を部分的に露出させる開口が形成されている。絶縁膜２２４の開口を介して露出した金属膜２２２の部分がプローブ電極Ｅとして機能する。つまり、核酸検出用デバイス２００は、プローブ電極Ｅとなる部分を含む金属膜１２２と、金属膜１２２の上に積層された絶縁膜２２４とを有し、絶縁膜２２４はプローブ電極Ｅを規定する開口を有している。

金属膜２２２は回路領域ＣＡに作り込まれた回路Ｃと電気的に接続されている。絶縁膜２２４を形成する前の構造体２２０において、通常、電極領域ＥＡの表面は平坦であるが、回路領域Ｃの表面には多くの凹凸が存在する。

電気化学応答の測定の感度向上のためには、プローブ電極Ｅは小さいことが好ましい。またプローブ電極Ｅに溶液中の検出目的核酸や核酸認識体が効率良く供給されるためには、絶縁膜２２４の膜厚は薄いことが好ましい。しかし、回路領域Ｃの表面には多くの凹凸が存在するため、薄い膜厚の絶縁膜２２４では凹凸の角の部分が露出しやすく、回路領域Ｃを確実に被覆することが難しい。従って、回路領域Ｃを確実に被覆するため、絶縁膜２２４はある程度厚い膜厚を必要とする。厚い膜厚の絶縁膜２２４は、溶液中の検出目的核酸や核酸認識体のプローブ電極Ｅへの到達を阻害する。

本実施形態は、凹凸を確実に被覆しながら、微小な面積のプローブ電極Ｅに対しても溶液を到達しやすくする構造に向けられている。図１４は、本発明の第四実施形態による核酸検出用デバイスにおける電極領域と回路領域の断面を示している。

図１４に示されるように、回路領域ＣＡに回路Ｃが作り込まれ、さらにプローブ電極用にパターニングされた金属膜２２２が形成された構造体２２０の表面に、絶縁膜２３４が形成されている。この絶縁膜２３４は、電極領域ＥＡを覆う部分２３４ａと、回路領域ＣＡを覆う部分２３４ｂとを含み、電極領域ＥＡを覆う部分２３４ａは回路領域ＣＡを覆う部分２３４ｂよりも膜厚が薄い。電極領域ＥＡを覆う絶縁膜２３４の薄い部分２３４ａは、プローブ電極Ｅを規定する開口を有している。

構造体２２０の回路領域ＣＡの表面の凹凸は絶縁膜２３４の厚い部分２３４ｂによって確実に被覆される。しかも、プローブ電極Ｅの周囲に存在する絶縁膜２３４ａは薄いので、溶液がプローブ電極Ｅに到達しやすい。

回路を含む半導体基板、あるいは凹凸を持つガラス、樹脂等の基板に対して、金薄膜をスパッタにより形成する。蒸着あるいは印刷等により形成してもよい。その後、必要に応じて配線部分、パッド部分等をエッチングによりパターニングする。その後、絶縁膜を塗布により形成する。スパッタ、蒸着、印刷等により形成してもよい。その後、絶縁膜を選択的にエッチングして開口を形成し、金薄膜の一部を露出させて電極とする。開口の手法も特に問わない。このとき絶縁膜は、電極領域ＥＡを覆う部分が回路領域を覆う部分よりも膜厚が薄くなるように形成する。その手順は特に限定されないが、例えば、比較的薄い第一の絶縁膜を形成し、電極を規定する開口を形成した後、比較的厚い第二の絶縁膜を形成し、第一の絶縁膜の開口よりも大きな開口を形成することにより実現できる。別の手順によれば、第一の絶縁膜と第二の絶縁膜の両方を形成し、第二の絶縁膜に電極よりも大きな開口を形成した後、第一の絶縁膜の電極を規定する開口を形成することによっても実現できる。また別の手順によれば、第二の絶縁膜を先に形成し、電極よりも大きな開口を形成した後、第一の絶縁膜を形成し、電極を規定する開口を形成することによっても実現できる。第一の絶縁膜と第二の絶縁膜は同種類でも異種類でも構わない。また、三種類以上の絶縁膜を用いても構わない。このような構造を持つことにより、電極を規定する第一の絶縁膜の膜厚を薄くできる。このとき凹凸の大きい部分は、厚い膜厚の絶縁膜を用いればよい。

その後、第一実施形態と同様に、核酸プローブの固定化を行なってプローブ電極を形成する。

検出目的核酸を含む溶液を流路に流してハイブリダイゼーション反応を行なう。プローブ電極を規定している絶縁膜が薄いので、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給され、これにより微量な核酸でも十分にハイブリダイゼーション反応を行なえる。

［第五実施形態]
本実施形態の核酸検出用デバイスの基本構造は第四実施形態と同様である。本実施形態は、凹凸を確実に被覆しながら、微小な面積のプローブ電極Ｅに対しても溶液を到達しやすくする別の構造に向けられている。図１５は、本発明の第五実施形態による核酸検出用デバイスにおける電極領域と回路領域の断面を示している。

図１５に示されるように、回路領域ＣＡに回路Ｃが作り込まれた構造体２４０の上に、平坦面を有する平坦化層２４２が設けられている。平坦化層２４２の上に、プローブ電極用にパターニングされた金属膜２２２と、電極領域ＥＡと回路領域ＣＡを覆う絶縁膜２４４とが積層されている。つまり核酸検出用デバイスは、金属膜２２２と絶縁膜２４４の下に設けられた、平坦面を有する平坦化層２４２を有している。平坦化層２４２は、回路Ｃと金属膜２２２を電気的に接続する金属部分２４２ａを含んでいる。

構造体２４０の回路領域ＣＡの表面の凹凸は平坦化層２４２によって確実に被覆される。また、平坦化層２４２の平坦面の上に金属膜２２２が積層され、金属膜２２２のパターニング後に絶縁膜２４４が積層される。このため、絶縁膜２４４は金属膜２２２だけを確実に被覆しさえすればよい。従って、絶縁膜２４４は薄い膜であってよく、これにより溶液がプローブ電極Ｅに到達しやすい。

回路を含む半導体基板、あるいは凹凸を持つガラス、樹脂等の基板に対して、凹凸を低減するため、平坦化処理を行なう。平坦化の手法は特に限定されないが、溶液、ガスを用いたエッチング、機械的な研磨でも構わない。その後、平坦化処理を行った層上に金薄膜をスパッタにより形成する。蒸着あるいは印刷等により形成してもよい。その後、必要に応じて配線部分、パッド部分等をエッチングによりパターニングする。その後、絶縁膜を塗布により形成する。スパッタ、蒸着、印刷等により形成してもよい。その後、絶縁膜を選択的にエッチングして開口を形成し、金薄膜の一部を露出させ電極とする。開口の手法も特に問わない。このとき、平坦化処理が施されていることにより、より薄い膜厚の絶縁膜を用いることができる。

検出目的核酸を含む溶液を流路に流してハイブリダイゼーション反応を行なう。プローブ電極を規定している絶縁膜が薄いため、溶液中に含まれる検出目的核酸がプローブ電極に効率良く供給され、これにより微量な核酸でも十分にハイブリダイゼーション反応を行なえる。

［実施例］
以下に、第三実施形態の核酸検出用デバイスの使用例を具体的に説明する。

１．核酸検出用デバイスの準備
第三実施形態で説明した要件を満たす構造の核酸検出用デバイス１と、その要件を満たさない構造の核酸検出用デバイス２とを作製した。核酸検出用デバイス１も核酸検出用デバイス２も複数種類の面積を持つ電極がそれぞれ２個ずつ同様に形成されている。

核酸検出用デバイス１と核酸検出用デバイス２の複数種類の面積の電極のそれぞれに以下の配列の核酸プローブを固定化した。

プローブＡ：gtttctgcac ccgga
プローブＢ：gtttctgcgc ccgga
核酸プローブを固定化した核酸検出用デバイス１と核酸検出用デバイス２に流路を同様に形成した。

２．核酸の各種反応を行なう。

プローブＡと相補的な配列を含む、以下の配列を持つ試料核酸を用いた。

試料核酸：ggcctccgct ctcgcttcgc ctctttcacc ccgcgcccag ccccgccccg cgccgcgaag aaatgaaact cacagaccct gtgctgaggg cggctccggg cgcagaaacg aaacctagct
核酸検出用デバイス１と核酸検出用デバイス２に対して、流路に試料核酸を含む２×ＳＳＣ溶液を送液し、３５℃で６０分静置することにより、試料核酸と核酸プローブのハイブリダイゼーション反応を行った。次に、０．２×ＳＳＣ溶液を送液し、３５℃で６０分静置することにより、洗浄反応を行った。次に核酸認識体としてヘキスト３３２５８を５０μＭ含むリン酸溶液を送液し、核酸とヘキスト３３２５８の反応を行った。

３．電気化学測定を行なう。

電気化学測定を行った結果を図１６に示す。横軸は電極面積であり、縦軸は、プローブＡを固定化した電極で得られた電流値を、プローブＢを固定化した電極で得られた電流値で割った値をプロットしたものである。核酸検出用デバイス２では、核酸検出用電極の面積が小さくなるにつれ、信号増加が減少し、検出が困難だが、核酸検出用デバイス１では、核酸検出用電極の面積が小さくても検出が可能となっている。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

電気化学的核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスを示している。図１に示されるプローブ電極を拡大して示している。図２のIII−III線に沿ったプローブ電極周辺部の断面を示している。流路内における溶液の流れを模式的に示している。本発明の第一実施形態による核酸検出用デバイスにおけるプローブ電極の周辺部分の断面を示している。図５に示された断面を模式的に示している。本発明の第二実施形態による核酸検出用デバイスにおけるプローブ電極の周辺部分の断面を示している。図７に示された断面を模式的に示している。本発明の第二実施形態による核酸検出用デバイスにおけるプローブ電極の周辺部分の断面を示している。図９に示された構造の斜視図である。図９に示された断面を模式的に示している。電気化学的核酸検出を行なうための別の核酸検出用デバイスを示している。図１２に示された核酸検出用デバイスにおける電極領域と回路領域の断面を示している。本発明の第四実施形態による核酸検出用デバイスにおける電極領域と回路領域の断面を示している。本発明の第五実施形態による核酸検出用デバイスにおける電極領域と回路領域の断面を示している。本発明の実施例において電気化学測定を行った結果を示している。

符号の説明

１００…核酸検出用デバイス、１０２…支持基板、１０６…信号入出力用パッド、１１０…流路、１１０ｆ…平坦部、１１０ｐ…突出部、１１０ｓ…傾斜部、１２２…金属膜、１２４…絶縁膜、２００…核酸検出用デバイス、２０２…支持基板、２０６…信号入出力用パッド、２１０…流路、２２０…絶縁膜を形成する前の構造体、２２２…金属膜、２２４…絶縁膜、２３４…絶縁膜、２３４ａ…電極領域を覆う部分、２３４ｂ…回路領域を覆う部分、２４０…回路が作り込まれた構造体、２４２…平坦化層、２４２ａ…金属部分、２４４…絶縁膜、Ｃ…回路、ＣＡ…回路領域、Ｅ…プローブ電極、ＥＡ…電極領域。

Claims

電気化学応答を利用して核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
検出目的核酸及び／または核酸認識体を含む溶液を流す流路と、
前記流路内に設けられたプローブ電極とを有し、
前記プローブ電極は、金属膜上に開口部を有する絶縁膜が積層されて形成され、前記開口部から露出した前記金属膜部分であり、
前記流路は、前記溶液の流れ方向に平行な平坦面と、前記流れ方向に沿って前記平坦面から突出する斜面とを有し、前記プローブ電極は前記斜面に配置されており、前記平坦面に対して前記プローブ電極がなす角θ、前記流れ方向における前記開口の最大幅Ｒ、前記絶縁膜の膜厚ｄは、
ｔａｎθ＞ｄ／Ｒ
を満たしている、核酸検出用デバイス。
電気化学応答を利用して核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
検出目的核酸及び／または核酸認識体を含む溶液を流す流路と、
前記流路内に設けられたプローブ電極とを有し、
前記プローブ電極は、金属膜上に開口部を有する絶縁膜が積層されて形成され、前記開口部から露出した前記金属膜部分であり、
前記絶縁膜は、前記溶液の流れ方向の、前記上流側の膜厚ｄ１と下流側の膜厚ｄ２が、
ｄ２＞ｄ１
を満たしている、核酸検出用デバイス。
電気化学応答を利用して核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
検出目的核酸及び／または核酸認識体を含む溶液を流す流路と、
前記流路内に設けられたプローブ電極とを有し、
前記プローブ電極は、金属膜上に開口部を有する絶縁膜が積層されて形成され、前記開口部から露出した前記金属膜部分であり、
前記流路は、前記溶液の流れ方向に平行な平坦面と、前記平坦面から突出した突出面を有する突出部とを有し、前記プローブ電極は前記突出面に配置されており、
前記突出部の、前記溶液の流れ方向の上流側の端から前記プローブ電極までの距離Ｌが、前記溶液の密度ρ、前記溶液の流速ｕ、前記溶液の粘度μ、前記流路の断面積Ｓ、前記流路の壁周辺長Ｌｐに対して、
Ｌ＜０．０６５×Ｒｅ×Ｄ
Ｒｅ＝ρｕＤ／μ
Ｄ＝４Ｓ／Ｌｐ
を満たしている、核酸検出用デバイス。
電気化学応答を利用して核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
検出目的核酸及び／または核酸認識体を含む溶液を流す流路と、
前記流路内に設けられたプローブ電極とを有し、
前記プローブ電極は、金属膜上に開口部を有する絶縁膜が積層されて形成され、前記開口部から露出した前記金属膜部分であり、
前記絶縁膜は、前記プローブ電極を取り囲む電極領域を覆う第一部分と、前記電極領域の周りに位置する回路領域を覆う第二部分とを含み、前記第一部分は前記第二部分よりも膜厚が薄い、核酸検出用デバイス。
電気化学応答を利用して核酸検出を行なうための核酸検出用デバイスであり、
検出目的核酸及び／または核酸認識体を含む溶液を流す流路と、
前記流路内に設けられたプローブ電極とを有し、
前記プローブ電極は、金属膜上に開口部を有する絶縁膜が積層されて形成され、前記開口部から露出した前記金属膜部分であり、
前記プローブ電極を取り囲む電極領域の周りに位置する回路領域の凹凸を被覆して設けられた、平坦面を有する平坦化層をさらに有し、前記平坦化層の前記平坦面の上に前記金属膜と前記絶縁膜が設けられている、核酸検出用デバイス。