In
Anbetracht der wichtigen Rolle der NO-Synthase und Cyclooxygenase
in der Physiopathologie können
die Verbindungen wirksame und nützliche
Vorteile bei der Behandlung folgender Symptome bereitstellen:
- – Herzstörungen und
cerebrovasculäre
Störungen,
die beispielsweise Migräne,
Schlaganfall, Infarkte, Ischämie,
Sepsis, endotoxische und hemorrhagische Schocks, Schmerzen einschließen;
- – verschiedene
Entzündungsformen,
die beispielsweise akutes, rheumatisches Fieber, rheumatoide Arthritis
und andere Arthritistypen, Osteoarthrose, Asthma einschließen;
- – Immunstörungen,
die virale oder nichtvirale Infektionen, Autoimmunerkrankungen,
Arzneimittelmißbrauch,
Krebs und irgendwelche Pathologien, an denen beim Menschen oder
bei Tieren eine übermäßige Produktion
von Stickoxid und/oder Arachidonsäuremetaboliten beteiligt ist,
einschließen.
Inhibitoren
der Cyclooxygenase oder aspirinartige Arzneimittel, d.h. acetylsalicylsäureartige
und Salicylsäure,
methylierte Indolderivate, wie Indomethacin (DCI von 1-(4-Chlorbenzoyl)-5-methyoxy-2-methyl-1H-indol-3-essigsäure) und
Sulindac (DCI von 5-Fluor-2-methyl-1-[[4-(methylsul finyl)-phenyl]-methylen]-1H-inden-3-essigsäure), Derivate
von N-Phenylanthranilsäuren
(Meclofenamate, Fenamate), Propionsäurederivate wie Ibuprofen (DCI
von p-Isobutylhydratropsäure),
Naproxen und Fenoprofen, finden breite Anwendung und haben sich
weitgehend, jedoch mit einigen unerwünschten Nebenwirkungen bei
hohen Dosen, als wirksame Arzneimitteltherapie der Entzündung (R.
Flower, S. Moncada und J. Vane, Mechanism of action of aspirin-like
drugs – In
the pharmacological basis of therapeutics, Goodman and Gilman 1985,
29, 674-715) erwiesen. Des weiteren wurden diese Verbindungen sowohl
bei der akuten als auch prophylaktischen Behandlung der Migräne verwendet.
Der Wert dieser Arzneimittel ist ohne Frage, obwohl ihre therapeutischen
Reaktionen oft unvollständig
sind und sie von einigen Patienten nicht als angemessene Behandlung
betrachtet werden. In Anbetracht ihrer antiinflammatorischen und
Thrombocyten-Antiaggregat-Eigenschaften
sind diese Verbindungen auch bei der Thrombose und mit einer deutlichen
Verringerung von Oedemen bei Modellen einer Gehirnischämie verwendet
wurden und sind daher zur Behandlung und Vorbeugung von Infarkten,
Schlaganfall und cerebrovasculärer
Krankheiten (W.Armstrong Recent trends in research and treatment
of stroke, SCRIP, PJB publications, 1991) vorgeschlagen worden.
Die
biologische Aktivität
der Stickoxidsynthaseinhibitoren wurde erst kürzlich entdeckt und ihre potentielle
therapeutische Verwendung wird eben erst in Erwägung gezogen. Diese Substanzen,
deren Strukturen durch L-Argininanaloga dargestellt werden und die
in der deutschen Patentanmeldung P 4041283.0 beschrieben werden,
sind Inhibitoren der Stickoxid-(NO)-bildung. Das derzeitige Wissen über NO wurde
1991 von Moncada et al (s. Moncada, R.M.J. Palmer, E.A. Higgs. Nitric
oxide: Physiology, Pathophysiology, and Pharmacology, Pharmacological
reviews 43, 2, 109-142) ausführlich
besprochen. Kurz gesagt scheint es so, daß NO als Transduktionsmechanismus
für die
lösliche
Guanylatcyclase im Gefäßsystem,
den Thrombocyten, im Nervensystem und als auslösendes Molekül bei immunologischen
Reaktionen in vielen Zellen und Geweben einschließlich den
Macrophagen oder neutrophilen Lymphocyten dient. NO wird aus Arginin
durch ein Enzym, das NO-Synthase genannt wird, enzymatisch gebildet.
Dieses Enzym existiert in zwei Formen, einer konsitutiven und einer
induzierbaren, die beide durch L-Argininanaloga, wie unten definiert,
gehemmt werden. Bei einigen Pathologien kann eine übermäßige Produktion
von NO auftreten, wie es bereits beim Schock bewiesen wurde, wie
in der zuvor beschrieben Patentanmeldung beschrieben. In diesem
Zusammenhang sind die NO-Synthaseinhibitoren wirksame Arzneimittel
zur Verhinderung der vasculären
Folge und der Sterblichkeit aufgrund der Krankheit, insbesondere
wenn sie mit Cyclooxygenase-inhibitoren wie Aspirin, Indomethacin
oder Meclofenamat kombiniert werden. Solche gesundheitsfördende Wirkungen
der Kombination zweier Wirkprinzipien im selben Molekül werden
wahrscheinlich bei menschlichen Patienten angetroffen, die an Migräne, Schlaganfall,
Infarkten, cerebraler Ischemie, Schmerzen, Entzündungen und verschiedenen immunologischen
Krankheiten leiden. Die Assoziation von Stickoxidsynthaseinhibitor
und Cyclooxygenaseinhibitor wurde in der oben erwähnten Patentanmeldung
für die
Behandlung von Schockzuständen
beschrieben. Es wurde jedoch gefunden, daß die Kombination solcher Verbindungen
eine bessere synergistische Wirkung liefert als die Assoziation.
Die
Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel AB, die ein
Salz oder ein Amid sein können,
worin:
- – A
einen Cyclooxygenaseinhibitor darstellt, der eine zugängliche
Säurefunktion
aufweist, wobei der genannte Cyclooxygenaseinhibitor die allgemeine
Formel RCOOH aufweist, worin COOH für die zugängliche Säurefunktion und R für den passenden
Rest des Cyclooxygenaseinhibitors stehen und
- – B
die L-Form der Argininanaloga mit der Formel darstellt, worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Ethylgruppe
darstellt, R2 für ein Wasserstoffatom oder
eine Nitrogruppe steht und R3 eine Amino-,
Methylamino-, Ethylamino-, Hydrazino-, Methyl- oder Ethylgruppe
bedeutet, mit der Maßgabe,
daß, wenn
AB ein Salz ist, worin R2 für ein Wasserstoff
steht, R3 keine Aminogruppe darstellt.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird der Cyclooxygenaseinhibitor der allgemeinen Formel RCOOH ausge
wählt aus
Salicylsäure,
Acetylsalicylsäure,
Mefenaminsäure,
Ibuprofen, Indomethacin und Sulindac.
Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen
bereit, das die Stufe der Umsetzung einer Verbindung A oder einer
Vorstufe derselben, worin A die oben gegebene Definition besitzt, mit
einer Verbindung B oder einer Vorstufe derselben, worin B die oben
gegebene Definition besitzt, in im wesentlichen äquimolaren Anteilen unter geeigneten
Bedingungen umfaßt.
Insbesondere
umfaßt
das Verfahren zur Herstellung von Verbindungen in Form eines Salzes
der allgemeinen Formel
worin, R, R
1,
R
2 und R
3 die oben
gegebene Definition besitzen, die Umsetzung einer Verbindung der
allgemeinen Formel A oder eines Vorläufers derselben, worin A die
oben gegebene Definition besitzt mit einer Verbindung der Formel
B oder ei ner Vorstufe derselben, worin B die oben gegebene Definition
besitzt, in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und Alkohol
bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zum Siedepunkt des Reaktionsgemisches.
Die Vorstufe der Verbindung A kann ein Salz der Verbindung A sein,
wie beispielsweise das Natriumsalz. Des weiteren kann die Vorstufe
der Verbindung B beispielsweise das Acetat oder Hydrochlorid der
Verbindung B sein. Der im Gemisch mit Wasser verwendete Alkohol
kann Methanol oder Ethanol sein.
Insbesondere
umfaßt
das Verfahren zur Herstellung von Verbindungen in Form eines Amids
der allgemeinen Formel
worin, R, R
1,
R
2 und R
3 die oben
gegebene Definition besitzen, die Umsetzung einer Verbindung der
allgemeinen Formel B oder einer Vorstufe derselben in Acetonitril
bei einer Temperatur von 0°C
bis Raumtemperatur in Gegenwart einer Base mit der Vorstufe der
Verbindung A der Formel RCOX, worin R die oben gegebene Definition
besitzt und X für
ein Halogenatom steht. Die Vorstufe der Verbindung B kann beispielsweise
das Hydrochlorid einer solchen Verbindung B sein. Die Umsetzung
kann in Gegenwart von Triethylamin als Base durchgeführt werden.
Schließlich stellt
die Erfindung ein pharmazeutisches Präparat bereit, das eine wirksame
Menge der Verbindung der allgemeinen Formel AB in einem Gemisch
mit einem pharmazeutisch verträglichen
Verdünnungsmittel
oder Trägerstoff
enthält.
Die folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung.
Beispiel 1:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Acetysalicylsäure
- B
- = N-Monomethyl-L-arginin
(L-NMMA)
99
mg (0,52 mmol) L-NMMA und 95 mg (0,52 mmol) Acetylsalicylsäure wurden
in 10 ml Ethanol (95%) bei Raumtemperatur aufgelöst. Es wurde drei Stunden lang
bei Raumtemperatur gerührt.
Die Lösung
wurde zur Trockene eingeengt und der erhaltene Rückstand wurde mit 25 ml Wasser
behandelt, dann lyophilisiert, um 190 mg der gesuchten Verbindung
zu ergeben (farbloser Feststoff, Fp. = 170°C)
1H-NMR
(100 MHz, D2O):
7,80-6,60 (m, 4H, aromatisch);
3,50 (t, 1H, CHCO2H); 3,10 (m, 2H, CH 2-NH);
2,60 (s, 3H, CH3-NH); 2,15 (s, 3H, CH3-CO); 1,90-1,30 (m, 4H, CH-CH 2-CH 2).
Beispiel 2:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Salicylsäure
- B
- = N-Monomethyl-L-arginin
(L-NMMA)
0,52
mmol N-Monomethyl-L-argininacetat und 0,52 mmol Natriumsalz von
Salicylsäure
wurden bei Raumtemperatur in Wasser aufgelöst. Es wurde solange bei Raumtemperatur
gerührt
bis die Lösung
klar war. Das gebildete Natriumacetat wurde verworfen und die Lösung lyophilisiert,
um 160 mg der gewünschten
Verbindung zu ergeben (farbloser Feststoff, Fp. = 172-175°C)
1H-NMR (100 MHZ, D2O):
7,75-6,70
(m, 4H, aromatisch); 3,55 (t, 1H, CH-COOH); 3,00 (m, 2H, CH 2-NH);
2,60 (s, 3H, NH-CH 3);
1,90-1,30 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 3:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Acetylsalicylsäure
- B
- = N-ω-Nitro-L-arginin
(L-NO)
500
mg (2.28 mmol) N-ω-Nitro-L-arginin
und 411 mg (2.28 mmol) Acetylsalicylsäure wurden in einem Gemisch
aus Ethanol/H2O (100 ml/70 ml) in der Hitze
aufgelöst.
Es wurde eine Stunde lang unter Rückfluß gerührt. Die Lösung wurde zur Trockene eingeengt
und der erhaltene Rückstand
wurde mit 100 ml Wasser behandelt, dann lyophylisiert, um 900 mg
der ge wünschten
Verbindung zu ergeben (farbloser Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,85-6,70
(m, 4H, aromatisch); 3,70 (t, 1H, CH-COOH); 3,10 (m, 2H, CH 2-NH);
2,16 (s, 3H, CH3); 1,90-1,35 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 4:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Salicylsäure
- B
- = N-ω-Nitro-L-arginin
(L-NO)
500
mg (2.28 mmol) N-ω-Nitro-L-arginin
und 315 mg (2.28 mmol) Salicylsäure
wurden in einem Gemisch aus Ethanol/H2O
(100 ml/70 ml) in der Hitze gelöst.
Es wurde eine Stunde unter Rückfluß gerührt. Die Lösung wurde
zur Trockene eingeengt und der erhaltene Rückstand wurde mit 100 ml Wasser
behandelt, dann lyophilisiert, um 810 mg der gewünschten Verbindung zu ergeben
(Farbloser-Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,78-6,71
(m, 4H, aromatisch), 3,53 (t, 1H, CH-COOH),
3,11 (m, 2H, CH 2-NH),
2,00-1,30 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 5:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Acetysalicylsäure
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile, Acetylsalicylsäure und N-ω-Nitro-L-argininmethylester
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren
(Ausbeute 98,7
%);
(farbloser Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,8-6,70
(m, 4H, Ph); 3,80 (t, 1H, CH-CO2H); 3,65 (s, 3H, CO2CH 3);
3,10 (m, 2H, CH 2NH);
2,11 (s, 3H, CH 3CO); 1,90-1,35
(m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 6:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Indomethacin
- B
- = N-ω-Nitro-L-arginin
(L-NO)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile Indomethacin
und M-ω-Nitro-L-arginin
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 97,8 %);
(farbloser Feststoff, Fp. > 260°C).
1H- NMR (100 MHz, D2O):
7,70-6,35
(m, 7H, aromatisch); 3,95 (m, 1H, CH-COOH);
3,62 (s, 3H, CH3O); 3,35 (s, 2H, CH 2-COOH);
3,08 (m, 2H, CH 2-NH);
2,10 (2s, 3H, CH3-C=); 1,72-1,30 (m, 4H,
CH2-CH2).
Beispiel 7:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Sulindac
- B
- = N-ω-Methyl-L-arginin
(L-NMMA)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile des Natriumsalzes
von Sulindac und N-ω-Methyl-L-argininacetat
nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 98 %);
(orangefarbener
Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,45
(m, 4H, Ph-SO); 6,95-6,60 (m, 3H, Ph-F); 6,29 (m, 1H, =C-H); 3,15
(m, 5H, CH-COOH, CH 2-COOH, CH 2NH);
2,72 (s, 3H, CH 3-NH);
2,60 (s, 3H, CH3-SO); 1,83 (2s, 3H, CH3-C=); 1,40 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 8:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Ibuprofen
- B
- = N-ω-Nitro-L-arginin
(L-NO)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile Ibuprofen
und N-ω-Nitro-L-arginin
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 99 %);
(farbloser Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR(100 MHz, D2O):
7
(m, 4H, aromatisch); 3,6-3,3 (m, 2H, 2CHCO2H);
3,05 (m, 2H, CH2N); 2,35 (d, 2H, CH2 Ph); 1,8-1,3 (m, 5H, CH2-CH2 und CH(CH3)2); 1,2 (d, 3H,
CH-CH 3);
0,9 (d, 6H, 2CH3).
Beispiel 9:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Mefenamsäure
- B
- = N-ω-Nitro-L-arginin
(L-NO)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile Mefenamsäure und M-ω-Nitro-L-arginin
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 98 %) (farbloser
Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, CD3OD):
8
(m, 1H, H arom. von CO2H); 7,3-6,5 (m, 6H,
aromatisch); 3,6 (t, 1H, CHCO2H)); 3,3 (m, 2H, CH2NH);
2,2 und 2,3 (2s, 6H, 2CH3); 1,85-1,6 (m,
4H, CH2-CH2).
Beispiel 10:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Indomethacin
- B
- = N-ω-Methyl-L-arginin
(L-NMMA)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile des Natriumsalzes
von Indomethacin und N-ω-methyl-L-argininacetat
nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 99 %);
(gelber
Feststoff Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,70-6,35
(m, 7H, aromatisch); 3,67 (2s, 3H, CH3O);
3,47 (m, 1H, CH-COOH); 3,35
(s, 2H, CH 2-COOH);
2,97 (m, 2H CH 2-NH);
2,57 (s, 3H, CH 3-NH);
2,05 (2s, 3H, CH3-C=); 1,72-1,30 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 11:
Verbindung
AB in Salzform, worin :
- A
- = Sulindacac
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile des Natriumsalzes
von Sulindac und N-ω-Nitro-L-argininmethylester
Hydrochlorid nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren (Ausbeute
98,6 %);
(orangefarbener Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,30
(m, 4H, Ph-SO); 6,70 (m, 3H, Ph-F); 6,11 (m, 1H, =C-H); 3,78 (m,
1H, CH-COOH); 3,62 (s, 3H,
O-CH3); 3.18 (bs, 2H, CH 2-COOH); 3,00
(m, 2H, CH 2-NH);
2,61 (s, 3H, CH3-SO); 1,83 (bs, 3H, CH3-C=); 1,90-1,30 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 12:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Mefenamsäure
- B
- = N-ω-Methyl-L-arginin
(L-NMMA)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile Mefenamsäure und N-ω-Methyl-L-arginin
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 99 %);
(farbloser Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, CD3OD):
8
(m, 1H, H arom. von CO2H); 7,3-6,5 (m, 6H,
Ph); 3,56 (t, 1H, CHCO2H); 3,2 (m, 2H, CH 2NH); 2,85 (s,
3H, CH3NH); 2,2 und 2,3 (2s, 6H, 2CH3); 1,8-1,6 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 13:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Sulindac
- B
- = N-ω-Nitro-L-arginin
(L-NO)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile Sulindac
und N-ω-Nitro-L-arginin
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 98 %);
(orangefarbener
Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,30
(m, 4H, Ph-SO); 6,70 (m, 3H, Ph-F); 6,11 (m, 1H, =C-H); 3,78 (m,
1H, CH-COOH); 3,18 (bs, 2H,
CH 2-COOH);
3,00 (m, 2H, CH 2-NH);
2.61 (s, 3H, CH3-SO); 1,83 (bs, 3H, CH3-C=); 1,90-1,30 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 14:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Salicylsäure
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile des Natriumsalzes
von Salicylsäure
und N-ω-Nitro-L-argininmethylester
Hydrochlorid nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren (Ausbeute
97,8 %);
(farbloser Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,70-6,68
(m, 4H, Ph); 4,00 (t, 1H, CH-COOH);
3,65 (s, 3H, COOCH3); 3,11 (m, 2H, CH 2-NH);
2,00-1,30 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 15:
Verbindung
AB in Salzform, worin:
- A
- = Indomethacin
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
Diese
Verbindung wurde hergestellt durch Vermischen äquimolarer Anteile des Natriumsalzes
von Indomethacin und N-ω-Nitro-L-argininmethylester
Hydrochlorid nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren (Ausbeute
98,5 %);
(gelber Feststoff, Fp. > 260°C).
1H-NMR (100 MHz, D2O):
7,70-6,35
(m, 7H, aromatisch); 3,95 (m, 1H, CH-COOH);
3,67 (bs, 6H, CH3O, COOCH3);
3,35 (s, 2H, CH 2-COOH);
3,08 (m, 2H, CH 2-NH);
2,10 (2s, 3H, CH3-C=); 1,72-1,30 (m, 4H,
CH2-CH2).
Beispiel 16:
Verbindung
AB in Amidform, worin:
- A
- = Acetylsalicylsäure
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
N-ω-Nitro-L-argininmethylester
Hydrochlorid (1675 mg, 2.5 mmol) wurden in wasserfreiem Acetonitril (15
ml) suspendiert. Dann wurden 0.7 ml Triethylamin (5 mmol) unter
Rühren
zugegeben. Die resultierende klare Lösung wurde auf 0°C abge kühlt. Dann
wurde Acetylsalicylchlorid (0,5 g, 2,5 mmol) in Acetonitril (8 ml) zugegeben.
Es bildete sich ein Niederschlag. Es wurde zwei Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt.
Danach wurde der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat zur Trockene
eingeengt. Der erhaltene Rückstand
wurde auf einer Kieselsäuresäule chromatographiert
(CHCl3/MeOH 95/5 als Elutionsmittel), um
die gewünschte
Verbindung zu erhalten (73 %); (farbloser Feststoff, Fp. = 180°C).
1H-NMR (100 MHz, CDCl3/D2O):
8,10-6,90 (m, 4H, Ph); 4.,85 (m,
1H, CH-COOH); 3,82 (s, 3H,
OCH3); 3,40 (m, 2H, CH2-NH);
2,40 (s, 3H, CH3-CO); 2,20-1,50 (m, 4H,
CH2-CH2)
Beispiel 17:
Verbindung
AB in Amidform, worin:
- A
- = Sulindac
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
Diese
Verbindung wurde hergestellt unter Verwendung des Chlorids von Sulindac
und N-ω-Nitro-L-argininmethylester
nach dem in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren (Ausbeute 70 %);
(gelber
Feststoff, Fp. = 154-156°C).
1H-NMR (100 MHz, CDCl3/D2O):
7,30 (m, 4H, Ph-SO); 6,70 (m, 3H,
Ph-F); 6,11 (m, 1H, =C-H); 3,60 (s, 3H, OCH3);
3,15-3,05 (m, 5H, CH2CON, CHCO2CH3, CH2NH); 2,61 (s,
3H, CH3-SO); 2,05 (s, 3H, CH3C=);
1,8-1,3 (m, 4H, CH2-CH2).
Beispiel 18:
Verbindung
AB in Amidform, worin:
- A
- = Ibuprofen
- B
- = N-ω-Nitro-L-argininmethylester
(L-NAME)
Diese
Verbindung wurde unter Verwendung des Bromids von Ibuprofen und
N-ω-Nitro-L-argininmethylester
nach dem in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren hergestellt (Ausbeute
78 %); (farbloser Feststoff Fp. = 213°C).
1H-NMR
(100 MHz, CDCl3/D2O):
7
(m, 4H, Ph); 3,6 (s, 3H, OCH3); 3,5-3,3
(m, 2H, CHCON, CHCO2CH3);
3,10 (t, 2H, CH 2N);
2,35 (d, 2H, CH2, Ph); 1,8-1,3 (m, 5H, CH2-CH2; CH(CH3)2);
1,2 (d, 3H, CH-CH 3);
0,8 (d, 6H, 2CH3).
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
wurden in vitro und in vivo einigen biologischen Tests unterzogen,
um ihre Aktivität,
die Stickoxidsynthase (konstitutionell und induzierbar) und Cyclooxygenase
zu blockieren, zu beweisen. Des weiteren ist die Kombination biologisch
aktiver als die einfache Assoziation der zwei aktiven Prinzipien.
Ihre Aktivität
wurde auch in pathologischen Modellen an Tieren geprüft. Sie
wurden mit einer Referenzsubstanz wie Aspirin, Indomethacin und
L-NG-mono-Methylarginin
(L-NMMA) und der einfachen Assoziation dieser Verbindungen verglichen.
1. In vitro Wirkung der
konstitutiven NO-Synthase in der isolierten Rattenaorta:
Präparationen
einer isolierten Rattenaorta mit Endothel wurden wie zuvor beschrieben
(M. Auguet, S. Delaflotte, P.E. Chabrier and P. Braquet – Comparative
effects of endothelium and phorbol 12-13 dibutyrate in rat aorta,
Life Sciences, 1989, 45, 2051-2059) hergestellt.
Männliche
Sprague-Dawley-Ratten (270-360 g, Charles River, Paris) wurden durch
cervikale Dislocation getötet.
Die Thoraxaorta wurde entfernt und vom umgebenden Gewebe gereinigt.
2 mm breite Ringe wurden in Organbädern suspendiert, die 10 ml
einer physiologischen Lösung
(Zusammensetzung siehe unten) unter einer Spannung von 2g bei 37°C enthielten
und mit O2/CO2 (95
%/5 %) begast wurden. Die kontraktilen Reaktionen wurden gemessen,
indem Kraftverschiebungstransduktoren (Statham UC2)
verwendet wurden, die an einen Gold 8000 S-Polygraphen angeschlossen
waren. Es wurde ein Zeitraum von einer Stunde zur Einstellung des
Gleichgewichts vor dem Experiment gewährt. Die normale physiologische
Lösung
war zusammengesetzt aus (mM): NACl, 118; KCl, 4,7; CaCl2,
2,5; KH2PO4, 1,2;
MgSO4, 0,6; NaHCO3,
25; Glucose, 11. Nach der Einstellung des Gleichgewichts im normalen
Medium wurde die Präparation
einer nahezu maximalen Dosis (etwa 95 %) Phenylephrin (PE; 1μmol) unterworfen.
Als die Konzentration stabil war, wurde Carbachol (10 μMol) getestet,
um das Vorliegen oder die Abwesenheit des Endothels zu bewerten.
Nach
dem Waschen der Präparation
und einem weiteren Gleichgewichtszeitraum von 45 Minuten wurde die
Präparation
mit PE (1 μMol)
behandelt. Es wurde Carbachol (10 μMol) verabreicht, um eine maximale Entspannung
zu bewirken. Die Antagonisten wurden dann nach Art der Kumulativdosis
getestet. Die IC50 (50%ige inhibitorische
Konzentration) wurde zur Umkehrung der Carbacholentspannung berechnet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle in Paragraph 2 in der
ersten Spalte der Ergebnisse zusammengefaßt, die die Überschrift
trägt "Test auf konstitutive
NO-Synthase".
2. In vitro Wirkung von
induzierbarer NO-Synthase in isolierter Rattenaorta:
Wie
bereits veröffentlicht
(M. Auguet, J.M: Guillon, S. Delaflotte, E. Etiemble, P.E. Chabrier
and P. Braquet – Endothelium
independent protective effect of NG-monomethyl-L-arginine
on endotoxin-induced alterations of vascular reactivity, Life Sciences,
1991, 48, 189-193), wurden die Verbindungen an der isolierten Rattenaorta
eines Tieres getestet, das einem Elektroschock unterzogen worden
war.
Männlichen
Sprague-Dawley-Ratten (240-320 g) wurde intraperetoneal Endotoxin
(10 mg/kg) oder ein Lösungsmittel
(Salzlösung
1 mg/kg) injiziert. Drei Stunden später zeigten die mit Endotoxin
behandelten Tiere Zeichen einer Endotoxinämie einschließlich einer
Piloerection, Diarrhöe
und Lethargie. Die Ratten wurden durch cervikale Dislocation getötet. Die
Thoraxaorta wurde entfernt und vom umgebenden Gewebe gereinigt. 2
mm breite Ringe wurden unter einer Spannung von 2g in Organbädern suspendiert,
die 10 ml Krebs-Henseleit-Lösung
enthielten (mmol): NaCl, 118; KCl, 4,7; CaCl
2,
2,5; KH
2PO
4, 1,2;
MgSO
4, 1,2; NaHCO
3,
25; Glucose, 11. Diese Lösung
wurde kontinuierlich mit O
2/CO
2 (95
%/5 %) begast. Das Endothel wurde mechanisch aufgebrochen, indem
eine kleine Zange sachte auf der luminalen Oberfläche der
Ringe rollend bewegt wurde. Nach einem Gleichgewichtszeitraum von
90 Minuten wurde die Kontraktion durch Anwendung einer maximalen
Konzentration Phenylephrin (PE 1μM)
eingeführt.
Als die Kontraktionsstudien beendet waren, wurde Carbachol (10 μM) getestet,
um die Intaktheit des Endothels (11) zu verifizieren. 45 Minuten
vor der Anwendung von PE wurden Antagonisten in das Bad eingebracht
und die IC
50 berechnet. Die Ergebnisse sind
in der folgenden Tabelle in der zweiten Spalte der Ergebnisse zusammengefaßt, die
die Überschrift
trägt "Test auf induzierbare NO-Synthase".
3. In vitro Wirkung auf
induzierbare NO-Synthase in vasculären glatten Muskelzellen, die
mit Lipopolysacchariden (LPS) behandelt worden waren
Einige
der Verbindungen wurden weiterhin an glatten Muskelzellen in Kultur
getestet, wobei die NO-Synthase durch LPS (M. Auguet, M.O. Lonchampt,
S. Delaflotte, P.E. Chabrier and P. Braquet – FEBS Letters, 1992, in Bearbeitung)
induziert wurde.
Glatte
Muskelzellen wurden durch enzymatischen (Elastase und Collagenase)
Abbau der Rattenthoraxaorta, wie zuvor beschrieben (P.E: Chabrier,
R. Roubert, M.O. Lonchampt, P.
Plas
and P. Braquet – J.Biol.Chem.,
1988, 263, 13199-13202),
isoliert. Sie wurden vier Tage lang in DMEM mit 10%igem fötalem Kalbserum
kultiviert und zwischen Durchgang 3 und 7 verwendet. Zellenmonoschichten
wurden gewaschen und das Medium durch 2 ml DMEM ersetzt, welches
2mM Glutamin, Antibiotika, 0,1 mM Isobutylxanthin (IBMX) mit oder
ohne LPS (Escherichia Coli) enthielt. Nach 24 Stunden wurde cGMP aus
den Zellen extrahiert, indem das Medium schnell abgesaugt wurde
und 1 ml 0,1 n HCl zu jeder Vertiefung gegeben wurde. Die Proben
wurden eingefroren, bis cGMP durch einen Radioimmuntest (NEN-Kit)
bestimmt wurde. Zum Studium der inhibitorischen Wirkung wurden die
Zellen 24 Stunden lang in RPMI 1640 (die Konzentration von L-Arginin
betrug 1,2 mM) mit oder ohne LPS (0,1 μg/ml) inkubiert. IBMX (0,1 mM)
wurde 30 Minuten vor der cGMP-Extraktion
hinzugegeben, während
die getesteten Substanzen (10–4 M) vorhanden waren oder
nicht. Die Verringerung der cGMP Produktion wurde gemessen (% Verringerung)
und die erhaltenen Ergebnisse werden wie folgt zusammengefaßt.
4. In vitro-Wirkung auf
die durch Arachidonsäure
hervorgerufene Aggregation gewaschener Kaninchenthrombozyten
Dieses
Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Verbindungen auf die
Cyclooxygenase zu testen. Die Messung der Thrombocytenaggregation
wurde nach Cazenave et al (Ann. Biol. Chem. 1983, 41, 167-179) durchgeführt. Aus
der Auriculararterie eines männlichen
Neuseeland-Kaninchens (2,5 kg durchschnittliches Körpergewicht)
wurde auf ACD (Zitronensäure/Natriumcitrat/Dextrose)
als Anticoagulans Blut abgenommen. Die gewaschenen Thrombocyten
wurden vorbereitet und dann in die Küvette des Aggregometers (Coultronics
Chronolog Aggregometer) übergeführt. Die
Zugaben der Antagonisten und der Arachidonsäure (0,5 mM) wurde durchgeführt. Der
Prozentsatz der Transmission, der der Aggregation (oder ihrer Hemmung) entsprach,
wurde gemessen, um die IC50 zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind wie folgt zusammengefaßt, wobei die Abkürzung NA
nicht aktiv bedeutet.
5. In vitro Wirkung auf
die Nitritproduktion, die durch LPS + INFγ in einem J774 A-Monocyten/einer
Macrophagen-Zelllinie hervorgerufen wurde
Zellen
vom macrophagen Typ wie die J774 A1 Zelllinie sind in der Verwendung
interessant, da sie bei einer Entzündung wichtige Zellen sind
und große
Mengen NO- (aufgrund der Induktion der NO-Synthase) und Cyclooxygenaseprodukte
produzieren. Sie werden mit Lipopolysaccharid (LPS) in Gegenwart
von γ-Interferon (INFγ) aktiviert.
Dieser Test wurde verwendet, um die Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen
mit der Assoziation ihrer getrennten Stammverbindungen zu vergleichen.
Monocyten-/Macrophagenzellen
aus der Maus wurden in einem mit Dubecco's Medium modifizierten Eagle's Medium bei 37°C gezüchtet. Die
Zellen wurden auf Kulturplatten (NUNC) mit 24 Vertiefungen ausplattiert
und für
die Experimente in einer Konzentration von etwa 2 × 105 Zellen/Platte
verwendet. Die Zellen wurden mit LPS (1μg/ml) aus E. Coli (SO55:B5)
und mit recombinantem IFNγ (50
U/ml) aus der Maus aktiviert und dann in Gegenwart oder Abwesenheit
der Verbindungen inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Nitrit- (NO2-) Gehalte, die mit der Aktivierung der
NO-Synthase einhergingen, in den Kulturmedien mit dem colorimetrischen Verfahren
nach Green et al (L. Green, D. Wagner, J. Glogowski, P. Skipper,
J. Wishwok and S. Tannenbaum, Analysis of nitrate, nitrite and [15N]
nitrate in biological fluids. Analytical Biochemistry 126, 131-138,
1982) geprüft.
Die
NO2-Produktion war in Abwesenheit oder Anwesenheit
der Verbindungen nicht detektierbar, wenn die Zellen nicht aktiviert
wurden. In aktivierten Zellen betrug die IC50 für L-NMMA,
L-NO und L-NAME 8 × 10-6 M,
1,5 × 10-5
M bzw. 10-3 M, wohingegen die cyclooxygenasehemmenden Gegenspieler
Salicylsäure,
Acetylsalicylsäure,
Indomethacin, Meclofenamat praktisch inaktiv waren und eine nicht
signifikante Hemmung zwischen 0,5 bis 15 % ergaben.
Zur
Erläuterung
der potenteren Wirkung der Verbindungen im Vergleich mit einer Assoziation
sind in der folgenden Tabelle einige Beispiele angegeben. Es wird
der Prozentsatz der Hemmung der Nitritproduktion dargestellt, die
durch LPS + INF auf der J774-Zelllinie induziert worden ist:
Die
Ergebnisse zeigen, daß die
erfindungsgemäßen Verbindungen
bei gleichen Konzentrationen aktiver sind als die Assoziation der
getrennten Stammverbindungen, von denen sie stammen. Es zeigt sich
auch ein potenziernder Effekt der Kombination eines NO-Synthasehemmers
und eines Cyclooxygenasehemmers.
6. In vitro Wirkung auf
die Prostaglandinproduktion, die durch LPS + IFNγ auf
der J774A1-Monocvten-/Macrophagen-Zelllinie induziert worden ist
In
denselben Experimenten wie oben beschrieben wurden die Wirkungen
der erfindungsgemäßen Verbindungen
mit der Assoziation auf die Produktion von Cyclooxygenaseprodukten
verglichen, um zu verifizieren, ob die Steigerung der Aktivität der Verbindungen
auch mit der Cyclooxygenasehemmung einhergeht. Mengen eines der
durch die Zelllinie J774 A1 produzierten Hauptprodukte der Cyclooxygenase
(d.h. 6-keto-PGF1α), der stabile Metabolit
von PGI2, wurden durch einen speziellen
Radioimmuntest (NEN, NEK 025-Kit) geprüft.
Zunächst wurde
beobachtet, daß die
Freisetzung von 6-keto-PGF
in die Kulturmedien nicht durch L-NMMA, L-NAME oder L-NO beeinflußt wurde,
sondern in einer dosisabhängigen
Weise mit Indomethacin und Aspirin mit einer IC50 von
10–6M
und 10–5M
aufgehoben wurde.
Der
Prozentsatz der Hemmung der 6-keto-PG F1-Produktion, die durch LPS
+ INF in der J774A1-Zelllinie hervorgerufen wurde, ist in der folgenden
Tabelle dargestellt, die zeigt, daß die Kombinationen eine größere Attivität bietet
als die Assoziation.
7. In vitro
Wirkung auf die Nitritproduktion von aktivierten Maus-Macrophagen
Zur
Bestätigung
der mit der J774-Zelllinie erhaltenen Ergebnisse, die bei einem
Vergleich mit der Assoziation eines Cyclooxygenaseinhibitors mit
einem NO-Synthaseinhibitor
eine wirkungsvollere Aktivität
der synthetisierten Verbindungen zeigten, wurden auf aktivierten
Mausmacrophagen ähnliche
Experimente durchgeführt.
Peritoneale
Macrophagen wurden aus der Peritonealhöhle weiblicher BBA/2 Mäuse im Alter
von 7-8 Wochen 3 Tage nach der Injektion von Thioglycollat (3 %,
1,5 ml/Maus) erhalten. Die Macrophagen (2.105 Zellen/Vertiefung)
wurden bei 37°C
mit LPS (E.Coli: 0111B4) (0,1 μg/ml)
und rekombinantem Maus-INFγ (100 U/ml)
in den Vertiefungen einer Microplatte mit 96 Vertiefungen 20 Stunden
lang auf RPMI 1640, 10 % FBS, aktiviert, dann gewaschen und weitere
24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit
der verschiedenen Verbindungen inkubiert, und die Nitritgehalte
wurden in den Kulturmedien, wie bereits beschrieben, gemessen.
Der
Prozentsatz der Variation im Vergleich zur Kontrolle beträgt 56 %
für die
Kombination von Indomethacin und L-NMMA (d.h. Beispiel 10), 32 %
für die
Assoziation von Indomethacin und L-NMMA und weniger als 30 % für jede getrennte
Verbindung.
Darüber hinaus
beträgt
der Prozentsatz für
die Kombination von Indomethacin und L-NAME (d.h. Beispiel 15) 48
%, 25 für
Indomethacin und weniger als 15 % für L-NAME und die Assoziation.
8. In vitro Wirkung auf
die Letalität,
die durch NMDA (N-Methyl-D-aspartat) induziert wurde:
Glutamat
und Aspartat sind wichtige neuroexcitorische Mediatoren, die an
der cerebralen Ischämie
beteiligt sind. Ihre Wirkungen werden nämlich durch die Aktivierung
des NMDA Rezeptors vermittelt. Die i.v.-Injektionen einer hohen
Dosis NMDA führten
in weniger als 35 Sekunden bei den Mäusen zur Letalität. Jegliche Verbindungen,
die die Zeit der Letalität
bei diesem Test verzögern
können,
werden als potentielle antiischämische
Verbindungen betrachtet. Da die Wirkungen von Glutamat und Aspartat
möglicherweise
nicht durch eine verstärkte
Freisetzung von NO übertragen
werden, wurde dieser Test dazu verwendet, die Verbindungen einem
Screening zu unterziehen und die Wirkung einer Kombination und einer
Assoziation der getrennten Verbindungen in vivo zu differenzieren.
Männlichen
OF1-Mäusen
(20-22 g, Charles River) wurde 250 mg/kg NMDA (iv) eine Stunde nach
der oralen Verabreichung der Substanzen injiziert. Die Überlebenszeit
wurde gemessen.
Somit
ist die Kombination viel aktiver als die getrennten Verbindungen
allein oder in Assoziation. Dies zeigt auch einen Synergismus bei
der Kombination an.
9. In vivo Wirkung auf
den Gehirntod nach einer focalen cerebralen Ischämie bei Mäusen
Die
systemische, intraperetoneale (ip) Verabreichung der Verbindungen
wurde 5 Stunden nach der corticalen Infarktion, die durch Occlusion
der mittleren, cerebralen Arterie bei männlichen Schweizer Mäusen (20-22
g) nach Duverger et al. Pharmacology of cerebral ischemia in Krieglstein
and Oberpichler, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart,
1990, 409-413, verursacht wurde. 4 Tage später wurden die Mäuse getötet und
ihr Gehirn entfernt und eingefroren, um dann in coronale Scheiben
von 10 μm
Dicke geschnitten zu werden. Die Flächeninfarktion wurde durch
eine Bildanalyse gemessen. Die Verringerung des Infarktvolumens
wurde gemessen und mit einem nicht behandelten Tier verglichen.
Der angegebene Prozentsatz zeigte die mittlere Verringerung des
Infarkts von 6 Tieren pro Gruppe – MK 801. Als Kontrollsubstanz
wurde ein NMDA-Antagonist verwendet. Die erhaltene Ergebnisse lauten
wie folgt:
10. In vivo Wirkung auf
eine mit Endotoxin behandelte, punktierte Ratte
Wie
zuvor berichtet, besitzen die Assoziation eines NO-Synthaseinhibitors
und eines Cyclooxygenaseinhibitors einen synergistischen Effekt
bei der Wiederherstellung des Blutdruckes und der vasculären Reaktivität bei endotoxinischen
oder septischen Tieren.
Männliche
Sprague-Dawley-Ratten (Körpergewicht
280-320 g) wurden punktiert. Eine Stunde nach der Punktierung wurde
den Tieren 60 Minuten lang Endotoxin (EDTX, Escherichia Coli, Lipopolysaccharid,
O III, B = 300 μg/kg/Stunde)
verabreicht. Dies führte
zu einer wichtigen Hypotension und einem Verlust der vasculären Reaktivität gegenüber vasopressiven
Mitteln wie Methoxamin. Nach 60-minütiger Perfusion der Verbindungen
mit Endotoxin wurde eine Dosis-Antwortkurve
auf Methoxamin auf kumulative Weise aufge zeichnet, und ein ED
50-Wert (50% der wirksamen Dosis zur Wiederherstellung
der normalen Reaktion auf Methoxamin) wurde für jedes Tier durch eine Regressionsanalyse
bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse lauten folgendermaßen:
Toxikologie:
Die
Produkte wurden per os (p.o.) oder intraperetoneal (i.p.) an Gruppen
zu 10 Mäusen
in zunehmenden Dosen verabreicht. Die LD50 (50%ige
letale Dosis) der Tiere umfaßt
100 bis 1 000 per os und 150 bis 500 i.p.
Posologie:
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in einer Dosis von 1 bis 300 mg pro Tag verabreicht werden.