PT793646E - Carboxilatos de aminoguanidina destinados ao tratamento de diabetes mellitus nao-insulinodependente - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "CARBOXILATOS DE AMINOGUANIDINA DESTINADOS AO TRATAMENTO DE DIABETES MELLITUS NÃO-INSULINODEPENDENTE" A presente invenção refere-se a carboxilatos de aminoguanidina e à sua utilização no tratamento de: diabetes mellitus não-insulinodependente (DMNID); problemas diabéticos resultantes da glicosilação não-enzimática excessiva de proteínas em diabetes mellitus não-insulinodependente e insulinodependente; baixa tolerância à glucose, e obesidade.

CONTEXTO DA INVENÇÃO

Diabetes mellitus não-insulinodependente, ou DMNID, e diabetes Tipo II são sinónimos. Os doentes que sofrem de DMNID apresentam uma concentração de glucose no sangue anormalmente elevada em jejum e uma captação celular retardada de glucose após refeições ou após um teste de diagnóstico conhecido por teste de tolerância à glucose. A DMNID é diagnosticada com base em critérios reconhecidos (American Diabetes Association, Physician’s Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician’s Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988).

Diabetes mellitus insulinodependente, ou DMID, e diabetes Tipo I são sinónimos. Os doentes que sofrem de DMID apresentam uma concentração de glucose no sangue anormalmente elevada em jejum e uma captação celular retardada de glucose após refeições ou após um teste de diagnóstico conhecido por teste de tolerância à glucose. A DMID é diagnosticada com base em critérios reconhecidos (American Diabetes Association, Physician’s Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988).

Ocorre baixa tolerância à glucose quando a taxa de remoção metabólica de glucose no sangue é inferior à que normalmente se verifica na população em geral, 2

depois de ter sido administrada uma dose padrão de glucose por via oral ou parentérica (American Diabetes Association, Physician’s Guide to Non-Insulin-Dependcnt (Type II) Diabetes, 1988). Baixa tolerância à glucose pode ocorrer em casos de DMNID, DM1D, diabetes gestacional e obesidade. Baixa tolerância à glucose também pode ocorrer em indivíduos que não satisfaçam os critérios de diagnóstico para estes estados de enfermidade A baixa tolerância à glucose em indivíduos nSo-diobcticos é um factoi de predisposição para o desenvolvimento de DMNED. Λ obesidade c um estado no qual se verifica um aumento do teor de gordura no corpo, que resulta num peso excessivo acima dos padrões aceites para a idade, género, altura c constituição do corpo (Bray, Obesity, An Endocrine Perspective, p. 2303, Multihormonal Systems and Disorders (1989)). Os padrões aceites têm sido determinados pela experiência de mortalidade em casos de seguros de vida e pela incidência de morbidez relativamente à composição do corpo. A mortalidade excessiva que se verifica em indivíduos obesos resulta de doenças para as quais esses indivíduos são propensos pelo seu estado. Nessas doenças incluem-se cancro, doenças cardiovasculares, doenças digestivas, doenças respiratórias e diabetes mellitus.

Em doentes com hiperglicémia crónica, como a que ocorre na diabetes não-insulinodependente e na diabetes insulinodependente, ocorrem ligações cruzadas em proteína dependente de glucose numa taxa excessiva relativamente à norma (Bunn, American Journal of Medicine, Vol. 70, p. 325, 1981), o que resulta em alterações da estrutura terciária de proteínas (Brownlee, Capítulo 18, Diabetes Mellitus, p. 279, 1990). A glicosilação não-enzimática excessiva de proteínas contribui para problemas diabéticos e problemas de envelhecimento em humanos não-diabéticos, como neuropatia, nefropatia, retinopatia, hipertensão e arterosclerose (Brownlee, 1990, supra). A hiperglicémia é definida como uma concentração de glucose no sangue excessiva relativamente à norma aceite para a população em geral (American Diabetes Association, Physidan’s Guide to Non-Insulin-Dependent (Type Π) Diabetes, 1988). 3

Se bem que a relação entre estes estados seja conhecida, seria vantajoso dispor de um medicamento que pudesse tratá-los ou prcveni-los a todos. O ácido 3-(l-(aminometxl)hidrazino)propanóico vem referido em JP 54128523 (Çhem. Abstr. 92:75899h) como sendo um fungicida e um insecticida. A síntese de N-aminoguanilglicina e N-aminoguanil-DL-fenilalanina vem referida cm: Oaule, J. Chem. Ber. 1968, 101, 1195. Certos derivados alquílicos da aminoguanidina são descritos na patente US-A-5 272 165, intitulada “Inhihiting advanced glycosylation of body proteins - using 2-alkylidene-amino:guanidine deriv., used e.g. for treating diabetic side-effects or esp. preventing tooth staining”. Análogos aminoguanidínicos da arginina são revelados nas patentes DE-A-4244539 e WO-A-9104023. A patente US-A-5 132 453 revela que a N6-(hidrazinoiminometil)lisina é útil como inibidor da formação de óxido nítrico e para o tratamento da hipertensão. A patente EP-A-0230037 revela certos derivados novos da guanidina 2-substituída com actividade anti-isquémica e cardioprotectora. A patente US-A-3 412 105 revela P-aril-N-guanidino-(P-alaninas ou a-carboxi-P-alaninas) como inibidores MAO (monoaminoxidase) e hipotensores de actuação prolongada.

As patentes US-A-5130324 e EP-A-0222313 revelam métodos para a inibição da glicosilação não-enzimática de proteínas. Compostos relevantes incluem um grupo aminoguanidina e um grupo carboxilo.

RESUMO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, compostos originais têm fórmula I ou Π

AG-(CH2)n-C02R1 I

AG-CHR^COaR1 U onde AG é N-aminoguanidina, Ν,Ν’-diaminoguanidina ou N,N’,N”-triaminoguanidina; onde n é um inteiro de 1-5; onde R1 é hidrogénio, fenilo, alquilo C1-C5 ou alquilo Ci-C3fenilo, e 4 i * / / \ onde R2 é fenilo, alquilo Ci-Ci0 ou alquilo CrC5fenilo; com as condições seguintes: a) na fórmula I, quando n é 2 ou 3, R1 não é hidrogénio; b) na fórmula I, quando n é um, R1 não é metilo; c) na fórmula II, quando R2 é etilo ou fenilo, R1 não é hidrogénio, e d) o composto não ó N-ominoguanilglicina ou N-ammogumul-DL-fenilalanina.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, um composto utilizado para o fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção da diabetes mellitus não-insulinodependente ou da obesidade tem fórmula III

HN=C(NH2)-NH-N=CR3-COOH onde R3 é hidrogénio, metilo, etilo, Ct^fenilo ou n-hexilo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Para as fórmulas genéricas I e II, a ligação do fragmento AG não é especificada, isto é, a ligação ao carbono adjacente pode ocorrer em qualquer um dos átomos de azoto do fragmento AG. Os átomos de azoto restantes do fragmento AG não estão substituídos. A quantidade de átomos de carbono das metades que contêm carbono é indicado por um prefixo “Cj-Cj”, onde i é o número mais baixo de átomos de carbono e j é o número mais elevado de átomos de carbono.

Exemplos de grupos alquilo com 1 a 10 átomos de carbono incluem, por exemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, isoamilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo e outras formas isoméricas daqueles.

Exemplos de sais de adição ácidos fannaceuticamente aceitáveis incluem: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canfossulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodedlsulfato, 5 etanossulfonato, fumarato, gluco-heptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, hidrobromcto, hidroiodeto, 2-hidroxietanossulfonalo, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, tosilato e undecanoato.

Relativamente aos compostos de fórmula Ι-ΙΠ, a dose a utilizar situa-se entre 0,1 e 100 mg/kg do peso do corpo diariamente. A dose preferida é 1-50 mg/kg/dia. A administração pode ser feita por via oral, par entérica, intranasal, bucal, sublingual, intrarectal ou transdérmica. É preferida a via oral.

Entre os compostos desta invenção, representados pelas fórmulas genéricas I e Π, são especialmente preferidos os compostos descriminados nas reivindicações 2 e 3, e são preferivelmente utilizados no tratamento de DMNID e problemas associados.

Os compostos preferidos de fórmula Π1 para utilização na invenção são apresentados na Reivindicação 5.

Certos compostos de fórmulas I e II são excluídos por condição, uma vez que não exibiram actividade à dose mais elevada que foi testada. Tais compostos são: H2N-C(=NH)-NH-NH-CH2-CH2-COOH H2N-C(=NH)-NH-NH-CH2-COOCH3 H2N-C(=NH)-NH-NH-CH(CH3)-COOH H2N-C(=NH)-NH-NH-CH(Fenilo)-COOH H2N-N=C(NH2)-NH-CH2-CH2-CH2-COOH

Certos compostos relacionados também não são considerados activos à dose mais elevada que foi testada: H2N-C(=NH)-N(CH3)-N=CH-COOH.0,5H2SO4

02N-N=C(NH2)-NH-N=CH-C00H

H3C-N=C(NH2)-NH-N=CH-COOH

H2C=N-NH-C(=NH)-NH-CH2-COOH

02N-NH-C(=NH)-NH-CH2-C00H 6

A presente invenção fornece compostos originais e conhecidos com propriedades an ti diabéticas surpreendentes e inesperados. A administração dos compostos desta invenção a pequenos ratos KKAy numa dose, aproximadamente, de 100-500 mg/kg/dia resulta em melhoria parcial ou completa da hiperglicémia neste modelo roedor de diabetes mellitus não-insulinodepeudeule (ver Chang, Wyse, Copeland, Peterson e Ledbetter, Diabetes 1985, p. 466, 1986). Os ratos KKAy são insulinoresistentes (Chang et al., supra) e a descoberta de que, nestes animais, o nível de glucose no sangue em desjejum sofre redução indica que, muito provavelmente, a resistência à insulina é menor após tratamento com os compostos reivindicados. Os pequenos ratos KKAy são obesos em comparação com os pequenos ratos normais exogâmicos (Chang et al., supra), e a administração de compostos da invenção resulta em perda de peso. A administração de N-(di-hidrazinometileno)glicina, o composto preferido nesta série, a pequenos ratos KKAy diabéticos durante 4 dias reduziu o nível de glucose no sangue em desjejum dos animais (ver Tabela 1). Uma dose de 60 mg/kg/dia produziu um decréscimo de 35% no nível de glucose no sangue, estatisticamente significativo em comparação com o controle. Doses mais elevadas produziram decréscimos ainda maiores na concentração de glucose no sangue. O ácido 3-guanidinopropiónico a 500 mg/kg/dia produziu uma diminuição na concentração de glucose no sangue aproximadamente semelhante à que foi conseguida com 60 mg/kg/dia de N-(di-hidrazinometileno)glicina. A administração de N-(di-hidrazinometileno)glicina a pequenos ratos KKAy diabéticos durante 4 dias reduziu o peso dos animais (ver Tabela 1). Uma dose de 100 mg/kg/dia produziu um decréscimo de 4% no peso do corpo, estatisticamente significativo em comparação com o controle. Doses mais elevadas produziram uma redução ainda maior do peso excessivo dos ratos KKAy. O ácido 3-guanidinopropiónico a 500 mg/kg/dia produziu uma diminuição no peso dos ratos KKAy aproximadamente semelhante à que foi conseguida com 100 mg/kg/dia deN-(di-hidrazinometileno)glicina. 7

A administração de N-(di-hidrazinometileno)glicina a pequenos ratos C57BL normais a 100 mg/kg reduziu a concentração dc glucose no sangue em jejum destes animais (Tabela 2). A administração de N-(di-hidrazmometileno)glicina a pequenos ratos KKAy diabéticos ou a pequenos ratos C57BL normais a 100 mg/kg resulta numa tolerância maior à glucose, como mostrado pelos níveis mais baixos de glucose no sangue após injecção de uma dose dc teste padrão de glucose (Tabela 2). A glicosilação não-enzimática de proteínas é o passo inicial para ligações cruzadas em proteína dependente de glucose (Brownlee, supra). A glicosilação não-enzimática da albumina no soro humano sofre redução pela acção de N-(di-hidrazãnometileno)glicma, N-(hidrazinoiminomctil)glicina e monocloridrato do ácido [2-(aminoiminometil)hidrazino]acético in vitro (Tabela 3). A aminoguanidina, relativamente à qual foi previ amente mostrado que inibe a glicosilação não-enzimática de proteínas in vitro (Khatami, Suldan, David, Li e Rockey, Life Sciences, vol. 43, p. 1725-1731, 1988) e in vivo (Brownlee, supra), também se mostra eficaz neste ensaio (Tabela 3). Neste ensaio, o ácido 3-guanidinopropiónico não afectou a glicosilação não-enzimática da albumina.

Em doentes com diabetes mellitus, há várias disfunções metabólicas cuja correcção consistiria num benefício terapêutico: o nível anormalmente elevado de glucose no sangue nos estados de desjejum e jejum, a remoção retardada de glucose da corrente sanguínea (American Diabetes Association, Physician’s Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician’s Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988) e a glicosilação excessiva de proteínas que contribui para o desenvolvimento de problemas diabéticos (Brownlee, supra). Além disso, a obesidade está frequentemente associada à diabetes mellitus não-insulinodependente e agrava o metabolismo alterado da glucose nestes doentes (Horton e Jeanrenaud, Capítulo 27, Obesity and Diabetes Mellitus, 1990). O tratamento óptimo para a diabetes mellitus não-insulinodependente corrigiria todas estas disfunções. A glicosilação excessiva de proteínas, como a que pode ocorrer em doentes com diabetes 8 mellitus não-insulinodependente e diabetes mellitus insulinodependente, pode ser prevenida bloqueando a reacção química entre glucose e moléculas de proteína (Brownlee, supra) e reduzindo a elevação anormal da concentração de glucose no sangue no estado diabético (Holman e Tumer, Diabetic Medicine, 5: 582-588, 1988; Benjamin e Sacks, Clin. Chem., 4015: 683-687, 1994). O tratamento mais desejável consistiria cm actuar por ambos os métodos, de modo a reduzir mais completamente a taxa de glicosilação não-enzimática de proteínas. A capacidade dos compostos reivindicados para realizar eficazmente múltiplas insuficiências metabólicas associadas à diabetes mellitus e para prevenir insuficiências metabólicas por mais do que um mecanismo distingue claramente as suas acções farmacológicas das de outros compostos de guanidina anteriormente reivindicados como tratamentos para a diabetes mellitus. Os compostos reivindicados são inesperadamente superiores à aminoguanidina, diaminoguanidina, ácido 3-guanidinopropiónico e metformma no tratamento da DMNID, porque oferecem um espectro de actividades desejáveis mais completo e são eficazes em doses mais baixas.

Os compostos reivindicados oferecem vantajens inesperadas no tratamento da diabetes mellitus, em comparação com a diaminoguanidina e aminoguanidina^ uma vez que os compostos reivindicados exercem uma acção metabólica para reduzir a concentração excessiva de glucose no sangue e também bloqueiam directamente a glicosilação não-enzimática de proteínas. Os compostos reivindicados são inesperadamente superiores à aminoguanidina e diaminoguanidina no tratamento da baixa tolerância à glucose ou da obesidade, uma vez que a aminoguanidina e diaminoguanidina não são eficazes relativamente a estas disfunções. A aminoguanidina e diaminoguanidina inibem a glicosilação não-enzimática de proteínas in vitro e a formação de produtos finais de glicosilação avançada in vivo (Kumari, Umar, Bansal e Sahib, Diabetes, 40: 1079-1084, 1991). Com base na sua actividade inibidora da glicosilação não-enzimática de proteínas, tem sido sugerido que a aminoguanidina é útil no tratamento da diabetes (Brownlee, supra). A aminoguanidina não exerce efeito no nível de glucose no sangue de roedores ou ratos normais tomados diabéticos por injecção de aloxana ou estreptozotocina (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra; 9

Yagihashi, Kamijo, Baba, Yagihashi e Nagai, Diabetes, 41: 47-52, 1992; Edelstein e Bruwnlee, Diabetologia, 35: 96-97, 1992; Oxlund e Andreassen, Diabetologia, 35: 19-25, 1992). A diaminoguanidina não exerce efeito no nível de glucose no sangue de ratos normais ou aloxana-diabéticos (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra). A aminoguanidina não exerce efeito no peso de ratos normais ou diabéticos (Kumari, Uiuai, Bancai, Saliib, supra; Yagihashi, Kamijo, Baba, Yagihashi e Nagai, supra; Oxlund e Andreassen, Diabetologia, 35: 19-25, 1992) nem provoca um aumento de peso cm humanos e ratos (Baylin, Horakova e Beaven, Experientia, 31: 562, 1975). A diaminoguanidina não afecta o peso de ratos normais ou aloxana-diabéticos (Kumari, Umar, Bansal, Sahib, supra). Ainda está para ser demonstrado um efeito exercido pela aminoguanidina ou diaminoguanidina sobre a tolerância à glucose.

Os compostos reivindicados são inesperadamente superiores ao ácido 3-guanidinopropiónico no tratamento da diabetes mellitus, uma vez que o último é menos poderoso no controle da hiperglicémia e não tem capacidade para inibir a glicosilação não-enzimática de proteínas. Os compostos reivindicados são inesperadamente superiores ao ácido 3-guanidinopropiónico no tratamento da baixa tolerância à glucose ou da obesidade, devido à maior potência destes compostos. Foi previamente mostrado que o ácido 3-guanidinopropiónico reduz a hiperglicémia e o peso excessivo do corpo e melhora a tolerância à glucose em roedores diabéticos (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse e de Souza, J. Pharm. and Exp. Iherapeutics, 266: 1454-1462, 1993). O composto preferido nesta reivindicação, N-(di-hidrazinometileno)glicina, é mais poderoso do que o ácido 3-guanidinopropiónico na redução do nível anormalmente elevado de glucose no sangue e na redução do peso de pequenos ratos KKAy. Para reduzir o nível de glucose no sangue de ratos KKAy em 20% foram necessários 130 mg/kg/dia deste último composto. Conseguiu-se atingir uma redução semelhante do nível de glucose no sangue com uma dose de 30 mg/kg/dia de N-(di-hidrazinometileno)glicina. A administração de N-(di-hidrazinometileno)glicina a ratos KKAy a 60 mg/kg/dia revelou-se aproximadamente tão eficaz como 500 mg/kg/dia de ácido 3-guanidinopropiónico. O ácido 3-guanidinopropiónico aumenta a tolerância à glucose em pequenos ratos KKAy diabéticos quando administrado na ração na forma de uma mistura a 1%, o que forneceria uma dose, aproximadamente, de 1000 mg/kg/dia 10

(Patente Estados Unidos 5 132 324). Por comparação, a N-(di-hidrazinometileno)glicina aumentou a tolerância à glucose em pequenos ratos C57BL normais e KKAy diabéticos quando administrada a 100 mg/kg/dia. Relativamente à redução do peso do corpo, 100 mg/kg/dia de N-(di-hidrazinometileno)glicina revelou-se uma dose aproximadamente tão eficaz como 500 mg/kg/dia de ácido 3-guanidinopropiónico. O ácido 3-guanidinopiopiónico nãu inibe a glicosilação não-enzimática da albumina in vitro, em contraste com os compostos reivindicados.

Os compostos reivindicados são inesperadamente superiores à metformina no tratamento da diabetes mellitus, intolerância à glucose e obesidade, uma vez que o último é menos poderoso do que os compostos reivindicados quando testado no mesmo modelo animal. Além disso e relativamente à sua eficácia para reduzir o peso do corpo e prevenir a glicosilação não-enzimática de proteínas, os dados divulgados para a metformina são contraditórios e não revelam um resultado consistente. Foi previamente mostrado que a metformina reduz a hiperglicémia em doentes diabéticos não-insulinodependentes quando administrada a 1000-3000 mg/dia, e aumenta a taxa de remoção de glucose nos referidos doentes quando administrada a 1500-2500 mg/dia (Bailey, Diabetes Care, 15: 755-772,1992). Os roedores são menos sensíveis do que os humanos à metformina e, por esse motivo, são necessárias doses mais elevadas (com base no peso do corpo) para se manifestarem efeitos glicémicos (Bailey, Flatt, Wilcock e Day, Frontiers in Diabetes Research, pp. 277-282, 1990; Penicaud, Hitier, Ferre e Girard, Biochem. J. 262: 881-885, 1989). A administração oral crónica de metformina reduz a hiperglicémia quando administrada a ratos neonatais estreptozotocina-diabéticos a 100 mg/kg/dia (Rossetti, DeFronzo, Gherzi, Stein et al., Metabolism, 39: 425-435, 1990), a pequenos ratos DBM a 400 mg/kg/dia (Bailey, Flatt, Wilcock e Day, supra), a ratos Zucker fa/fa a 350 mg/kg/dia (Penicaud, Hitier, Ferre e Girard, supra) e a pequenos ratos KKAy a 300 mg/kg/dia ou mais (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse e de Souza, supra). A administração oral crónica de metformina não afectou a concentração de glucose no sangue em pequenos ratos normais que receberam 250 mg/kg/dia, em pequenos ratos estreptozotocina-diabéticos que receberam 250 mg/kg/dia (Bailey, Flatt, Wilcock e Day, supra) ou em pequenos ratos diabéticos ob/ob que receberam 250 mg/kg/dia (Bailey, Flatt e Ewan, Arch. Int, Pharmacodyn., 282: 233- 11 11

I 239, 1986). A administração precisa de 264 mg/kg de metformina ou do seu análogo buformina a 132 mg/kg não afeciou o nível de glucose no sangue de ratos (Tutwiler e Bridi, Diabetes, 27: 868-876, 1978). Quando o composto preferido nesta reivindicação, N-(di-hidrazinometileno)glicina, foi testado em pequenos ratos KKAy, revelou-se mais poderoso do que a metformina na redução de níveis anormalmente elevados de glucose no sangue neste modelo. A redução em 25% do nível de glucose no sangue de ratos KKAy necessitou de 300 mg/kg/dia de metformina (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse e de Souza, supra). Atingiu-se uma redução semelhante no nível de glucose no sangue com uma dose de 30-60 mg/kg/dia de N-(di-hidrazinometileno)glicina. Relativamente a um aumento da tolerância à glucose, foi afirmado que a metformina não afecta a tolerância à glucose em ratos normais quando administrada numa dose de 750 mg/kg (Tutwiler e Bridi, supra) ou em pequenos ratos normais quando administrada a 50 mg/kg (Bailey, Flatt, Wilcock e Day, supra). Quando administrada a pequenos ratos normais ou a ratos estreptozotocina-diabéticos a 250 mg/kg, a tolerância oral à glucose aumentou (Bailey, Flatt, Wilcock e Day, supra). Em comparação, a N-(di-hidrazinometileno)glicina aumentou a tolerância à glucose quando administrada a pequenos ratos C57BL normais ou KKAy diabéticos numa dose mais baixa, 100 mg/kg. Relativamente à redução do peso do corpo, foi afirmado que a metformina causa perda de peso em doentes diabéticos não-insulinodependentes tratados durante um ano (Bailey, supra), ou que não tem um efeito significativo no peso do corpo de doentes diabéticos não-insulinodependentes e obesos tratados durante um período de tempo semelhante (Multi-centre Study, Diabetologia, 24: 404-411, 1983). A metformina não causou perda de peso em pequenos ratos diabéticos ob/ob quando administrada a 240 mg/kg/dia ou em pequenos ratos estreptozotocina-diabéticos quando administrada a 60 mg/kg/dia (Lord, Atkins e Bailey, Diabetologia, 25: 108-113, 1983). A metformina provocou perda de peso estatisticamente significativa em pequenos ratos KKAy tratados com 1700 mg/kg/dia do composto, mas o mesmo já não aconteceu quando foram administradas doses mais baixas (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse e de Souza, supra). Em comparação, quando a N-(di-hidrazinometileno)glicina foi administrada a pequenos ratos KKAy a 100 mg/kg/dia, revelou-se aproximadamente tão eficaz como a metformina, a 1700 mg/kg/dia, a produzir perda de peso nesta estirpe de pequenos ratos obesos (Meglasson, Wilson, Yu, Robinson, Wyse e de Souza, supra). Foi afirmado que 12 Λ

a metformina inibe a glicosilação não-enziraática de membranas de plasma de eritrócitos a concentrações de 0,5 e 5 micromoles por litro, com base na sua capacidade para prevenir o decréscimo dos parâmetros de ordem de espectroscopia de ressonância paramagnética electrónica de membranas de plasma incubadas com glucose in vitro (Freisleben, Ruckert, Wiemsperger e Zimmer, Biochemical Pharmacology, 43: 1185-1194, 1992). Em concentrações mais elevadas, 50 e 100 micromoles por litro, a metformina evidenciou o efeito reverso e deu origem a parâmetros de ordem muito baixos. Assim, prever-se se a metformina atenuaria ou agravaria a glicosilação não-enzimática de proteínas em doentes diabéticos dependeria da concentração de metformina no soro dos doentes tratados. Em diabéticos humanos aos quais foi administrado oralmente 1 grama de metformina, a concentração média de plasma Cmax é 3,24 microgramas por mililitro (ou 25 micromoles por litro) (Tucker, Casey, Phillips, Connor et al., Br. J. Clin. Pharmacol., 2: 235-246,1981) e, assim, situa-se a meio termo entre a concentração mais elevada que evidenciou reduzir a glicosilação não-enzimática de eritrócitos e a concentração mais baixa que evidenciou estimular o processo. Com base nos níveis publicados de metformina no plasma em doentes diabéticos, não pode tirar-se nenhuma conclusão sobre se a metformina inibiria a glicosilação não-enzimática de proteínas ou se, de alguma maneira, agravaria o processo quando administrada a doentes como terapia. Métodos gerais para a preparação dos compostos desta invenção são esboçados nos Esquemas 1-4. Exemplos específicos para um certo número destas técnicas podem ser encontrados nos procedimentos experimentais apresentados na Descrição das Especificações Preferidas. Os compostos da invenção podem ser preparados utilizando outros reagentes e materiais de partida. As referências seguintes discutem procedimentos relativos às sínteses gerais dos compostos desta invenção.

Esquema 1: Gante, J. Chem. Ber. 1968,101, 1195. Armarego, W.L.F.; Kobayashi, T. J. Chem. Soc. (C) 1971, 238. Evans, D.A.; Britton, T.C.; Dorow, R.L.; Dellaria, J.F. J. Am. Chem. Soc. 1986,108, 6395. Evans, D.A.; Britton, T.C.; Dorow, R.L.; Dellaria, J.F. Tetrahedron 1988,44, 5525. 13

Esquema 3: Gut, J.; Hesoun, D.; Novacek, A. Coll. Czech. Chem. Comm. 1966, 31, 2014. Miura, K., Ikeda, M.; Kondo, T.; Setogawa, K. Chem. Abstr. 1962, 56: 4767b. Pankaskie, M.; Abdel-Monem, M.M. J. Pharm. Sei. 1980,69,1000.

Esquema 4: Lee, K.; Kim, S.; Um, H.; Park, H. Synthesis 1989, 638. Reddy, T.I.; Dhawal, D.M., Rajappa, S. Tetrahedron 1993, 49, 2101.

Protocolos dc Rastreio In Vivo e In Vitro. DESCRIÇÃO DAS ESPECIFICAÇÕES PREFERIDAS Os procedimentos experimentais que se seguem são exemplos específicos que descrevem a preparação de um determinado número de compostos da invenção. EXEMPLO 1: Ácido [2-(aminoiminometil)hidrazino]acético

Saponificou-se cloridrato do hidrazinoacetato de etilo (7,73 g, 50 mmol) por refluxo em 100 ml de NaOH IN durante 2 h. À solução quente adicionou-se sulfato de 2-metil-2-tiopseudoureia (6,95 g, 50 mmol) e a solução refluiu durante 2 h adicionais. Concentrou-se a mistura para ~l/2 volume, quando precipitou um sólido branco. A solução foi arrefecida e filtrada, produzindo 3,34 g de um sólido branco. Recristalização a partir de água rendeu 2,41 g (36%) de ácido [2-(aminoiminometil)hidrazino]acético na forma de um sólido branco muito cristalino. P.F.: 247-248°C (dec.); Ή RMN: (D20) 5 3,40 (s, 2H). EXEMPLO 2: Monocloridrato do ácido [2-(aminoiminometil)hidrazino] acético A uma solução em agitação de monocloridrato, mono-hidrato do ácido [(aminoiminometil)hidrazono]acético (10 g, 60 mmol) em metanol (300 ml) adicionou-se Pd-C a 10% (0,25 g) e a mistura foi hidrogenada a 207 kPa (30 psi) durante a noite. A mistura foi filtrada e o solvente foi evaporado até à secura. O resíduo foi recristalizado a partir de EtOH, produzindo 4,2 g (42%) do composto do título na forma de um sólido branco (p.f. 163-165°C). *H RMN (D20) δ 3,68 (s, 2H). 14 14

EXEMPLO 3: Monocloridrato do éster fenilmetílico do (mninoiuuiiometil)hiclrazino]acético Fez-se borbulhar HC1 (g) numa suspensão de (aminoiminometil)hidrazino]acético (2,00 g, 15,2 mmol) em álcool benzílico (30 ml). A reacção foi agitada durante cerca de uma hora até ficar tudo em solução. Precipitou-se o produto cm bruto por adição de EI2O. Este material foi recristalizado a partir de MeOH/EtOAc, produzindo monocloridrato do éster fenilmetílico do ácido [2-(aminoiminometil)hidrazino]acctico (3,20 g, 82%) na forma de um sólido branco cristalino. P.F.: 162-164°C; 'H RMN (CD3OD): δ 3,69 (s, 2H), 5,24 (s, 2H), 7,34-7,42 (m, 5H). EXEMPLO 4: Ácido a-hidrazinobenzenopropanóico

Uma solução dc LDA (50 ml de uma solução 1,5M em THF) em 250 ml de THF seco foi arrefecida até -78°C. A este preparado adicionou-se gota-a-gota uma solução de hidrocinamato de etilo (12,0 ml, 68,2 mmol) em 250 ml de THF seco. Agitou-se a solução a -78°C durante 30 min. Adicionou-se gota-a-gota uma solução de azodicarboxilato di-íerf-butílico (18,84 g, 81,8 mmol) em 100 ml de THF seco. Após 10 min, a reacção foi bruscamente arrefecida pela adição de 14 ml de HO Ac e deixou-se aquecer até à temperatura ambiente. Dividiu-se a mistura entre Et20 e água. Extraiu-se a camada aquosa com Et20 (3 x 100 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com NaHCOj aq. saturado (2 x 100 ml) e água salgada (1 x 100 ml), foram secas em sulfato de sódio e condensadas. O produto em bruto foi cromatografado em sílica (hexano/EtOAc 90/10), produzindo 15,33 g (55%) do éster hidrazínico bis-BOC protegido. O éster foi recolhido em 200 ml de CH2CI2. A este preparado adicionaram-se 120 ml de ácido trifluoracético. Agitou-se a mistura durante 2 h à temperatura ambiente. Após remoção do solvente, 0 produto em bruto foi recolhido em 75 ml de NaOH IN e refluiu durante 2 h. A solução foi arrefecida, extraída com Et20, neutralizada, condensada para metade do volume, arrefecida e filtrada. O sólido acastanhado resultante foi agitado durante 5 min em z-PrOH em ebulição, para remover impurezas coloridas. Por filtração e secagem obtiveram-se 3,35 g (27%) de ácido a-hidrazinobenzenopropanóico na forma de um sólido branco. P.F.: 198-201°C (dec). *H RMN: (D20) δ 7,41-7,29 (m, 5H), 3,89 (dd, J=7, 6 Hz, 1H), 3,23-3,08 (m, 211). 15

EXEMPLO 5: Ácido a-[2-(aminoiminometil)hidrazino]benzenopropanóico mono-hidratado

Aqueceu-se uma solução de ácido a-hidrazinobenzenopropanóico (3,00 g, 16,7 mmol) e sulfato de 2-metil-2-tíopseudoureia (2,55 g, 18,3 mmol) em 17 ml de NaOH IN para refluir durante 2 h. A mistura foi neutralizada com HC1 3N e foi concentrada até começar a precipitar (ca. 1/2 volume). O produto em bruto foi filtrado e recristalizado a partir de água, produzindo 1,81 g (49%) de ácido a-[2-(aminoiminometil)hidrazino]benzenopropanóico mono-hidratado na forma de um mono-hidrato. P.F.: 127-130°C (dec). ‘H RMN: (D20) δ 7,40-7,27 (m, 5H), 3,60 (dd, J=8, 6 Hz, 1H), 3,04 (dd, J=14, 6 Hz, 1H), 2,86 (dd, J=14, 8 Hz, 1H). Ácido 2-[2-(aminoiminometil)hidrazino]propanóico

Uma mistura de 10,0 g (55,4 mmol) de cloridrato do ácido 2-[(aminoiminometil)hidrazono]propanóico (J. Pharmaceut. Sei. 1980, 69, 1000-1004), 1,5 g de paládio em carbono a 10% e 300 ml de água destilada foi agitada vigorosamente à pressão de hidrogénio de 345 kPa (50 psi) durante 16 h a 25°C. A mistura foi filtrada. Adicionaram-se ao filtrado 75 g de resina de permuta catiónica fortemente acídica na forma hidrogenada Dowex IR118H. A mistura foi agitada durante 1 hora e depois foi filtrada. Lavou-se a resina com três porções de 150 ml de água destilada. Pôs-se de parte a combinação de filtrado e lavagens e lavou-se a resina com cinco porções de 200 ml de piridina a 20% (vol/vol) em água destilada. Combinaram-se estas lavagens e evaporou-se o solvente a pressão reduzida (25°C, 1 torr). Dissolveu-se o pó branco resultante em 30 ml de água destilada em refluxo e diluiu-se a solução resultante com 90 ml de etanol absoluto quente. Deixou-se arrefecer a mistura até 25°C e, após 24 h, o precipitado formado foi recolhido por filtração. O sólido foi seco (20 torr/50°C/24 horas), produzindo 3,8 g do composto do título na forma de um sólido branco, p.f. 239-241°C. EXEMPLO 6: Mono-hidrobrometo do ácido [l-(ammoiminometil)hidrazino]acético A uma suspensão em agitação de bicarbonato de aminoguanidina (100 g, 734 mmol) em água (200 ml) adicionou-se ácido bromoacético (100 g, 720 mmol). Após a efervescência inicial, a solução homogénea refluiu durante a noite, arrefeceu até à 16

temperatura ambiente e o solvente foi evaporado até à secura. O resíduo foi suspenso cm EtOII (200 ml) c foi sonicado. Fillrou-se o sólido, produzindo 13,6 g (9%) do composto do título na forma de um sólido branco (p.f. 163-165°C). *H RMN (D2O) δ 4,25 (s, 2H). EXEMPLO 7. Ácido 3-[[immo[(l-metUetilideno)hidrazino]metil]aminojpropanóico

Dissolveu-se β-alanina (6,00 g, 67,5 mmol) em 67,5 ml de NaOH IN. A este preparado adicionou-se hidroiodeto de N-amino-S-metilisotioureia (15,69 g, 67,5 mmol). Λ mistura foi aquecida e refluiu durante 1,5 h. Removeu-se 0 solvente. O produto cm bruto foi recolhido em ca. 50 ml de água e adicionaram-se 50 ml de acetona. Por remoção do solvente obteve-se um sólido laranja que foi cromatografado em sílica (CHClj/MeOH 80/20 seguido de CHCla/MeOH 60/40), produzindo 5,88 g (47%) de ácido 3-[[imino[(l-metiletilideno)hidrazino]metil]amino]propanóico na forma de um sólido laranja pálido. P.F. ~125°C (dec). *H RMN: (D20) δ 3,36 (t, J=6 Hz, 2H), 2,35 (t, J=6 Hz, 2H), 1,87 (s, 3H), 1,80 (s, 3H). EXEMPLO 8: N-(hidrazinoiminometil)-P-alanina

Dissolveu-se ácido 3-[[imino[(l-metiletilideno)hidrazino]metil]amino]propanóico (5,88 g, 31,61 mmol) em 125 ml de água e aqueceu-se a 60°C durante 72 h. O solvente foi evaporado e o produto foi agitado numa mistura de EtOH e MeOH 4:1. O precipitado resultante laranja pálido foi filtrado, lavado com etanol e seco, produzindo 3,16 g (68%) de N-(hidrazinoiminometil)-p-alanina na forma de um sólido laranja pálido. P.F. 177-179°C. lH RMN: (D20) δ 3,39 (t, J=6 Hz, 2H), 2,42 (t, J=6 Hz, 2H). EXEMPLO 9: N-(di-hidrazinometileno)-l-alanina

A uma suspensão de L-alanina (10,0 g, 0,11 mol) e trietilamina (33,5 ml, 0,24 mol) em EtOH (90 ml) e H20 (6 ml) foi adicionado dissulfureto de carbono (7,2 ml, 0,12 mol). Após agitação durante a noite, adicionou-sc à solução amarela iodelo de metilo (7,5 ml, 0,12 mol). A mistura foi agitada durante 1 h e foi concentrada para formar uma pasta. Dissolveu-se 0 resíduo em H20 (25 ml) e adicionou-se HC1 concentrado até à acidez. A mistura foi extraída com Et20 (3 x 100 ml) e a fase orgânica foi seca (MgS(>4) e concentrado, produzindo 18,4 g (93%) do diliocarbamatO 17 17

1 / correspondente na forma de um sólido amarelo pálido com bom grau de pureza. Obteve-se uma amostra analiticamente pura por recristalização a partir de Et20/hexano: p.f. 90-92°C; ‘H RMN (D20) δ 4,89 (q, 7=7 Hz, 1H), 2,59 (s, 3H), 1,52 (d, 7=7 Hz, 3H). A uma solução do ditiocarbamato (5,0 g, 28 mmol) em cloreto demetileno (50 ml) a 0°C foi adicionado trifluorometanossulfonato de metilo (3,5 ml, 31 mmol). A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 20 h. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida até se formar um óleo incolor. Dissolveu-se o óleo resultante em H20 (5 ml) e adicionou-se NaOH 1,0M (28 mmol). A mistura foi extraída com EtOAc (3 x 100 ml) e a fase orgânica foi seca (MgSC>4). Após filtração, removeu-se o solvente in vacuo para se obter um óleo espesso e viscoso. Dissolveu-se o óleo em EtOH absoluto (25 ml) e adicionou-se hidrazina anidra (4,4 ml, 0,14 mol). Agitou-se a mistura durante 1,5 h e o sólido formado (2,5 g) foi recolhido por filtração. O pó branco foi sujeito a purificação suplementar por cristalização a partir de H2O/IPA, produzindo 2,2 g (49%) da diaminoguanidina na forma de um pó branco: p.f. 174-176°C (dec.); *H RMN (D20) δ 3,69 (q, 7=7 Hz, 1H), 1,20 (d, 7=7 Hz, 3H). EXEMPLO 10: N-(di-hidrazinometileno)-p-alanina

Por um procedimento análogo ao empregue para a N-(di-hidrazinometileno)-l-alanina, converteu-se a β-alanina em N-(di-hidrazinometileno)-p-alanina (p.f. 192°C, dec.). *H RMN (D20) 3,40 (t, 2H, J=7 Hz), 2,48 (t, 2H, J=7 Hz). EXEMPLO 11: N-(di-hidrazinometileno)glicina

Uma solução de tiocarbo-hidrazida metilada (25,0 g, 101 mmol) e glicina (6,314 g, 83,98 mmol) em água (50 ml) e NaOH 12,5N (8,89 ml, 111 mmol) foi agitada em atmosfera de azoto a 75-80°C durante 3 horas. Arrefeceu-se a solução em gelo enquanto ainda em atmosfera de azoto, antes de se adicionar etanol absoluto em porções (550 ml em porções de 50 ml), agitando entre cada adição até à precipitação completa. Λ mistura foi então agitada durante 15 min a 0°C antes de ser filtrada. O sólido recolhido foi lavado exaustivamente com etanol absoluto. Por secagem obteve-se um pó levemente rosado (8,04 g). O sólido em bruto foi dissolvido em água (30 ml), foi filtrado para remover algum material fino insolúvel e depois foi diluído com etanol absoluto para 18

perfazer um volume de 250 ml. A precipitação iniciou-se quase imediatamente e foi acelerada por sonicação duiauie alguns segundos. Depois de permanecer à temperatura ambiente durante 10 min, a mistura foi filtrada, produzindo um pó rosa pálido (5,25 g, 42%, p.f. 200°C, dec.). Ή RMN (D20) 3,78 (s). EXEMPLO 12: Ácido [2-(lddi'aziuoiuimomelil)hidrazino]acético

Saponificou-se cloridrato de hidrazinoacetato de etilo (9,28 g, 60 mmol) por refluxo em 120 ml de NaOH IN durante 2 h. À solução quente adicionou-se hidroiodeto de N-amino-S-metilisotioureia (13,98 g, 60 mmol) e a solução refluiu durante mais 2 h. Removeu-se o solvente. Dissolveu-se o produto em bruto em metanol e filtrou-se para remover o NaCl. O filtrado foi condensado e seco em alto vácuo. O resíduo foi então agitado com 150 ml de MeOH durante a noite. Filtrou-se o sólido branco resultante. Este sólido refluiu em 100 ml de MeOH durante 2 h, para remover quaisquer impurezas. A mistura foi então arrefecida e filtrada. O sólido resultante foi seco in vacuo, produzindo 2,14 g (24%) de ácido [2-(hidrazinoiminometil)bidrazino]acético na forma de um sólido quase branco. P.F. 201-203°C (dec). *H RMN: (DzO) δ 3,39 (s, 2H). EXEMPLO 13: N-(di-hidrazinometileno)-d-alanma A uma suspensão de D-alanina (1,8 g, 20 mmol) e trietilamina (6,1 ml, 44 mmol) em EtOH (15 ml) e H20 (1 ml) foi adicionado dissulfureto de carbono (1,3 ml, 22 mmol). Após agitação durante a noite, adicionou-se à solução amarela iodeto de metilo (1,4 ml, 22 mmol). A mistura foi agitada durante 1 h e foi concentrada para formar uma pasta. Dissolveu-se o resíduo em H20 e adicionou-se HC1 concentrado até à acidez. A mistura foi extraída com éter metil-/-butílico (3 x 50 ml); a fase orgânica foi seca (MgS04) e concentrada, produzindo um óleo amarelo que solidificou por sonicação seguida da adição de uma pequena quantidade de hexano. Por secagem suplementar obteve-se 2,9 g de um sólido amarelo. O produto foi sujeito a purificação suplementar por recristalização (Et20/hexano), produzindo 1,67 g (47%) do composto identificado como composto A da Tabela 4 na forma de um sólido creme: p.f. 89-91°C; *H RMN (D20) δ 4,67 (m, 1H), 2,39 (s, 3H), 1,32 (d, 7=7,0 Hz, 3H). 19

A uma solução do ditiocarbamato do Composto A da Tabela 4 (15,1 g, 84,3 mmol) em cloreto dc mctilcno (170 ml) a 0nC adicionou-se trifluorornetanossulfonato de metilo (10,5 ml, 92,7 mmol). A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 20 h. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, produzindo um óleo incolor. Dissolveu-se o óleo resultante em H2O (40 ml) e adicionou-se NaOH 1,0M (84,3 mmol). À mistura foi extraída com EtOAc (3 x 200 111I) e a fase orgânica foi seca (MgSC>4). Após filtração, removeu-se 0 solvente in vacuo para se formar um óleo espesso e viscoso. Dissolveu-se o óleo em EtOH absoluto (85 ml) e adicionou-se hidrazina anidra (13,2 ml, 0,42 mol). A mistura foi agitada durante 1,5 h e o sólido formado (7,5 g) foi recolhido por filtração. O pó branco foi sujeito a purificação suplementar por cristalização a partir de H2O/IPA, produzindo 6,48 g (48%) do composto do título na forma de um pó branco: p.f. 175-177°C; *H RMN (D20) δ 3,69 (q, 7=7 Hz, 1H), 1,20 (d, 7=7 Hz, 3H). EXEMPLO 14: N-(di-hidrazinometileno)valina A uma suspensão de L-valina (5,0 g, 42,7 mmol) e trietilamina (13,1 ml, 93,9 mmol) em EtOH (30 ml) e H2O (2 ml) adicionou-se dissulfureto de carbono (2,8 ml, 47,0 mmol). Após agitação durante a noite, adicionou-se à solução amarela iodeto de metilo (2,9 ml, 47,0 mmol). A mistura foi agitada durante 2 h e foi concentrada para formar uma pasta. Dissolveu-se o resíduo em H2O (10 ml) e adicionou-se HC1 concentrado até à acidez. A mistura foi extraída com Et20 (3 x 100 ml) e a fase orgânica foi seca (MgSC>4) e concentrada, produzindo um óleo amarelo que, depois de cultivado, formou um sólido amarelo. O sólido foi suspenso em hexano e foi filtrado, produzindo 7,7 g do Composto B da Tabela 4 na forma de um sólido quase branco. Arrefeceu-se o filtrado até 0°C, produzindo uma segunda colheita de 0,27 g do Composto B da Tabela 4 (7,97 g no total, 90%) na forma de um sólido branco: p.f. 76-78°C; *H RMN (CDC13) δ 5,30 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 1,08 (d, 7=7,0 Hz, 3H), 1,04 (d, 7=7,0 Hz, 3H).

A uma solução do Composto B da Tabela 4 (8,0 g, 38,6 mmol) em cloreto de metileno (60 ml) a 0°C adicionou-se trifluorornetanossulfonato de metilo (4,8 ml, 42,5 mmol). A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 20 h. A 20 mistura foi concentrada sob pressão reduzida, produzindo um óleo incolor. Dissolveu-se o óleo resultante cm H2O (10 ml) e adicionou-se NaOH 1,0M (38,6 ml). A mistura foi extraída com EtOAc (3 x 100 ml) e a fase orgânica foi seca (MgSO^. Após filtração, removeu-se o solvente in vacuo para se formar um óleo espesso e viscoso. Dissolveu-se o óleo em álcool isopropílico (150 ml) e adicionou-se hidrazina mono-hidratada (9,4 ml, 0,19 mol). Agitou-se a mistura durante 2 h e adicionou-se THF, produzindo um sólido mais filtrável. A filtração produziu 2,4 g (33%) do composto do título na forma de um sólido branco ligeiramente higroscópico: p.f. 112-116°C; *H RMN (D2O) δ 3,70 (d, > 5,0 Hz, IH), 2,20 (m, 1H), 0,97 (d, >7,0 Hz, 3H), 0,94 (d, >7,0 Hz, 3H). EXEMPLO 15: Ácido [l-(aminohidrazonometil)liidrazino]acético (É favor reportar-se ao Esquema 5). PREPARAÇÃO DE 9 A uma suspensão em agitação de cloridrato de hidrazinoacetato de etilo (5,0 g, 32,34 mmol) e N-metilmorfolina (3,26 g, 32,34 mmol) a 0°C adicionou-se N-(benziloxicarboniloxi)succinimida sólida (8,06 g, 32,34 mmol). Deixou-se aquecer a mistura até à temperatura ambiente durante a noite e removeu-se o solvente in vacuo. O resíduo foi suspenso entre EtOAc/H20, as camadas foram agitadas vigorosamente e as camadas orgânicas foram separadas e secas em Na2S04. O solvente foi removido e o resíduo foi cromatografado via cromatografia “flash” em S1O2 (eluente hexano/EtOAc 4:1), produzindo 5,7 g (70%) do composto do título na forma de um sólido branco: p.f. 95-97°C. O resíduo nas reacções subsequentes foi purificado por recristalização a partir de EtOAc/hexano, produzindo o composto do título com um rendimento ligeiramente inferior. 'H RMN (CDCI3) δ 1,27 (t, >7 Hz, 3H), 3,66 (s, 2H), 4,19 (q, >7 Hz, 2H), 5,13 (s, 2H), 6,77 (brs, 1H), 7,33 (m, 5H). PREPARAÇÃO DE 10 A uma suspensão em agitação do Preparado 9 (3,0 g, 11,89 mmol) em EtOH (30 ml) à temperatura ambiente adicionou-se NaOH aquoso (IN, 11,89 ml). À mistura adicionou-se ainda H20 (10 ml) e agitou-se durante 1 h (a mistura tomou-se numa solução homogénea e depois precipitou um sólido). Adicionou-se HC1 aquoso (IN, 11,89 ml), removeu-se o etanol in vacuo e extraiu-se a fase aquosa com EtOAc (2 x 100 21

ml). As camadas orgânicas foram combinadas, foram secas em Na2S04 e o solvente foi removido, produzindo 2,31 g (87%) do composto do título na forma de um sólido branco: p.f. 131-133°C. 'H RMN (CD3OD) δ 3,59 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 7,37 (m, 5H). PREPARAÇÃO DEU A uma suspensão em agitação do Preparado 10 (25,44 g, 112,7 mmol) em EtOAc (500 ml) adicionou-sc isotiocianato de trimetilsililo (14,79 g, 112,7 mmol) e aqueceu-se a mistura em refluxo suave (80°C) durante a noite. A solução resultante foi arrefecida até à temperatura ambiente e foi lavada com H2O (2 x 100 ml). A camada orgânica foi separada, foi seca em Na2S04 e o solvente foi evaporado até à secura. Dissolveu-se o resíduo oleoso em CH2CI2 e deixou-se ficar à temperatura ambiente durante 3 min; nesse intervalo de tempo formou-se um sólido. O sólido foi filtrado, lavado com CH2CI2 (100 ml) e seco in vacuo. Formou-se uma pasta com o sólido em EtOAc quente (300 ml), para dissolver quaisquer produtos secundários com enxofre, e triturou-se com hexano (200 ml), produzindo 17,1 g do composto do titulo (53%) na forma de um sólido branco: p.f. 148-149°C. 'H RMN (CD3OD) δ 5,20 (s, 2H), 7,30 (m, 5H), CH2 remanescente não observável. PREPARAÇÃO DE 12 A uma solução em agitação do Preparado 11 (5,0 g, 17,64 mmol) em EtOH (150 ml) à temperatura ambiente adicionou-se iodeto de metilo (2,73 g, 19,41 mmol); a solução resultante ficou em agitação durante a noite. O solvente foi removido in vacuo, produzindo 7,50 g (quant.) do composto do título na forma de uma espuma amarela. !H RMN (CD3OD) δ 2,69 (brs, 0,6H), 2,84 (brs, 0,4H), 4,40-4,70 (m, 2H), 5,31 (brs, 2H), 7,46 (m, 5H). PREPARAÇÃO DE 13 A uma solução com agitação vigorosa do Preparado 12 (25,5 g, 60 mmol) em H20 (100 ml) à temperatura ambiente adicionou-se lentamente hidrazina hidratada (6,06 g, 120 mmol), até ter sido adicionada metade da quantidade. À massa sólida que se formou adicionou-se H20 (10 ml) e os sólidos foram partidos mecanicamente com uma espátula. A hidrazina remanescente foi então adicionada e a solução foi agitada 22

vigorosamente durante 1 hora. A mistura heterogénea foi sonicada e continuou-se a agitação até sc formar uma massa espessa. Adicionou-se EtOH (50 ml), o sólido foi filtrado, lavado com EtOH e seco in vacuo, produzindo 9,24 g (55%) do composto do título na forma de um sólido branco: p.f. 168-170°C. *H RMN (D2O) δ 3,86 (brs, 1H), 4,21 (brs, 1H), 5,17 (s, 2H), 7,39 (s, 5H). Ácido [l-(liídrazinoiminometil)hidrazino]acético A uma solução do Preparado 13 (9,20 g, 32,71 mmol) em Me0H/H20 (400 ml, ~2:1 v/v) adicionou-se Pd-C a 10% (1,0 g) e a mistura foi hidrogenada a 30 psi durante 4 horas. Filtrou-se o catalisador através de uma tora diatomácea e adicionou-se novamente Pd-C a 10% (1,0 g). A mistura foi hidrogenada a 207 kPa (30 psi) durante 2,5 horas e determinou-se estar completa por TLC (eluente QkCfe/MeOH/HCQjH 85:14:1). Filtrou-se a mistura através de uma terra diatomácea e removeu-se o solvente até ~50 ml, quando precipitou um sólido. O sólido foi filtrado, lavado com uma quantidade mínima de H2O e seco in vacuo, produzindo 3,60 g (75%) do composto do título na forma de um sólido quase branco: p.f. 196-198°C. Obteve-se uma segunda colheita por concentração do filtrado até se formar um sólido. A filtração rendeu 0,90 g (19%, rendimento total: 94%) de material adicional com um ponto de fusão idêntico. *H RMN (D20) δ 4,06 (s, 2H).

TESTES BIOLÓGICOS

Testou-se a capacidade dos compostos da presente invenção para reduzir a glucose no sangue e o peso do corpo da forma seguinte.

Os pequenos ratos KKAy são modelos roedores de DMNID e de obesidade (Chang, Wyse, Copeland, Peterson e Ledbetter, 1986). Obteve-se uma amostra sanguínea pré-tratamento da cavidade retro-orbital; agruparam-se os ratos em grupos de 6 de modo que o nível médio pré-tratamento de glucose no sangue fosse o mesmo, em média, em todos os grupos. Os compostos de teste foram misturados na ração numa concentração de 0,5% e os ratos consumiram a dieta ad libitum. Os ratos de controle receberam ração sem suplemento. No Dia 0, os ratos foram pesados e receberam ração 23 % *^3kcr de controle ou ração suplementada com os compostos de teste. Após 3 dias de consumo de ração do controle ou ração suplementada com os compostos de teste obteve-se uma amostra sanguínea para determinação da concentração de glucose, e os animais foram pesados para se determinar a perda de peso. Mediu-se o consumo de alimento pesando o alimento fornecido no início do estudo e o alimento remanescente no fim do estudo. Calculou se o consumo dc alimento subtraindo o peso do remanescente ao peso do alimento fornecido. Calculou-se a admissão de drogas multiplicando o consumo de alimento por 0,5%. Por este método determinou-se que a admissão de drogas foi, aproximadamente, 500 mg/kg/dia. Os dados relativos à glucose no sangue estão expressos como a concentração média de glucose no sangue no grupo de teste dividida pelo nível médio de glucose no sangue no grupo de controle (tratamento/controle ou T/C). Os compostos que forneceram valores de T/C iguais ou inferiores a 0,90 são considerados agentes anti-hiperglicémicos activos. Os dados relativos à perda de peso estão expressos na forma da alteração percentual do peso do corpo. Os compostos que provocaram um decréscimo do peso do corpo de 1% ou mais relativamente ao controle após três dias são considerados agentes anti-obesidade activos. 24 24

TABELA 1

Resposta a Dose para Redução de Hiperglicémia e Obesidade em Pequenos Ratos KKAy por Administração Oral de N-(di-hidrazinometileno)glicina

Os ratos KKAy foram tratados com N-(di-hidrazinomctileno)gliciiia como descrito acima, com a excepção de o composto ter sido misturado na ração a 0,03, 0,06, 0,10, 0,20,0,30 e 0,40%, de modo a fornecer doses diárias, aproximadamente, de 30, 60,100, 200, 300 e 400 mg/kg. Os ratos de controle receberam ração sem suplemento. Para efeitos de comparação com a N-(di-hidrazinometileno)glicina, administrou-se ácido 3-guanidinopropiónico (3-GPA) como uma mistura a 0,5% na ração (dose aproximada, 500 mg/kg/dia). Os dados estão apresentados na forma da alteração percentual da concentração de glucose no sangue e do peso do corpo no Dia 3, comparado com o Dia -1 do estudo. Médias ± E.P.M. para n=6 ratos/grupo. A significância estatística foi determinada por análise da variância, utilizando software JMP 3.0.2 (SAS Institute). *, P < 0,05 vs. Zero; % significativamente inferior a 3-GPA (P < 0,05).

Adição Alteração % Glucose no Sangue Alteração % Peso Zero -5,8±7,1 -0,71 ±0,65 N-(di-hidrazinometileno)glicina 0,03% -13,5±10,5 -0,92±0,35 N-(di-hidrazinometileno)glicina 0,06% -34,9±17,1* -1,1512,11 N-(di-hidrazinometileno)glicina 0,10% -4,0416,4* -4,04±0,76 N-(di-hidrazinometileno)glicina 0,2% -69,913,2*, -8,22±1,05* N-(di-hidrazinometileno)glicina 0,3% -70,4±1,5*, -9,9411,62*, N-(di-hidrazinometileno)glicina 0,4% -70,3+3,9*, -10,310,97*, 3-GPA 0,5% -38,4+4,4* -5,410,81 * *, P < 0,05 vs. Zero 1, significativamente inferior a 3-GPA (P < 0,05) 25

TABELA 2

Aumento da Tolerância Intrapcritoncol à Glucose A tolerância à glucose foi medida em pequenos ratos C57BL não-diabéticos e em pequenos ratos KKAy diabéticos. A dose foi administrada aos animais por gavagem oral, com água destilada (Controle) ou 100 mg/kg de N-(di-lúdrazmometileno)glicma; depois jejuaram durante 16-17 horas. As amostras de sangue para a determinação de glucose foram obtidas da cavidade retro-orbital. As amostras foram obtidas imediatamente antes da administração de 2 g/kg de glucose I.P. (Tempo=0) e 30, 60 e 90 minutos após a injecção. A glucose no sangue foi determinada usando um autoanalisador de glucose. Os dados estão expressos como médias ± E.P.M. para 5-6 ratos por grupo. A significância estatística foi determinada por análise da variância, utilizando software JMP 3.0.2 (SAS Institute). *, P < 0,05 vs. Controle.

Estirpe de Ratos Grupo Tempo (min.) Glucose no Sangue (mg/dl) C57BL Controle 0 143±8 30 233±14 60 240±8 90 226+9 N-(di-hidrazino metileno)glicina 0 114+9* 30 174±17* 60 153+7* 90 161+19* KKAy Controle 0 188±43 30 487±10 60 469±20 90 486126 N-(di-hidrazino metiienojglicina 0 115116 (P=0,12 vs. controle 30 383138* 60 396163 90 392+67 26 26

s / / TABELA 3

Inibição da Glicosilação Não-Enzimática de Proteínas A glicosilação não-enzimática de proteínas foi medida utilizando métodos estabelecidos (Dolhofer e Wieland, 1979; Khatami, Suldan, David, Li e Rockey, 1988). Determinou-sc a incorporação dc [14C]-D-glucose 100 rnM na albumina do soro humano dissolvendo albumina do soro humano (Sigma Chemical Co.), [14C]-glucose e glucose numa solução de soro fisiológico e incubando a solução resultante a 37°C durante 8 dias. Os compostos de teste foram adicionados à solução a 19,1 mM. Determinou-se a glicosilação da albumina precipitando a proteína com 1 volume de ácido tricloroacético a 12%, centrifugando, e lavando a pílula duas vezes com ácido tricloroacético a 6%, com centrifugação após cada lavagem. A pílula lavada foi solubilizada, adicionou-se cintilante e determinou-se a incorporação da glucose com marcação radioactiva por contagem de cintilações líquidas. Os dados estão expressos como a percentagem de [14C]-glucose incorporada na albumina (média de 2 medições). A significância estatística foi determinada por análise da variância, utilizando software JMP 3.0.2 (SAS Institute).

Substância Adicionada Controle (Zero)

Aminoguanidina Acido 3-guanidinopropiónico N -(di-hidrazinometileno)glicina N-(hidrazinoiminometil)glicina Monocloridrato do Ácido Acético % de P4C1-glucose Incorporada 1,50 0,96 (P < 0,05 vs. Controle) 1,52 0,81 (P < 0,05 vs. Controle) 1,21 (P < 0,05 vs. Controle) 1,29 (P < 0,10 vs. Controle) 27 TABELA 4

Compostos Intermediários

H3C-S

H

Composto A

Composto B 28ESQUEMA 1 S Hkl_ H2N-N n-r Η H Mel R - Η. NH2

I

s~ch3 i H2N—N N-R Η H

Hl

Η H2NN—X NaOH -co2h

H

, N—X—C02H

h2 n—x—co2h NaOH

h2n-n H N Ã

N-R H

N^x—co2h H2N~N^N—R Η H

X 2'n R2 —CH- 29 29 Br' ço2h

ESQUEMA 2

NH

H2N—N ^Nu H "co2h

NH ly*— NNNH2 30 ESQUEMA 3

31 ESQUEMA 4 Η2Ν\χ^°°2Η 1) CS, 2) Mel

H Μβ5γ.Ν^002Η s

Mel

MeSv^\/C02H SMe

H2N-NH2 Na0H

,NH h2n R2 x= (CH2)n- , — CH- 32

ESQUEMA 5 H J? H2N^ ^ I . HCI CBZOSu i 55% O H JJ CBZN n/HsOB H . aq. NaOH | quant CBZ N"" H OL OH I TMSNCS t 65%

1 9 12 11 I ° CBZ N-^N>s—

H I

CH31 | EtOH CH, 12 ®YNHo CBZN''N'^^c • Hl

HjNNHj, | 47% NH, I HN,

,NH

T CBZN""Nv^"^N 12

H H„ OH 10% Pd-C MeOH H20

,N^ ✓NH 65% W' Y o

Lisboa, 5 ' OEL *

H2N v ^OH

-0-<Jk'AO

Maria Silvina Ferrcira ADVOGADA Agonte Oficial de Propriedade Industrial R. Castilho. 50 - 5? - 1250 - 071 LISBOA Tel. 2138150 50 - Fax. 21 383 11 50

Claims (6)

1

REIVINDICA ÇÕES 1. Composto de fórmula I ou II

2. AG-(CH2)„-C02R1 ag-chr2-co2r‘ I Π onde AG é (a) N-aminoguanidina (b) Ν,Ν’-diaminoguanidina, ou (c) N,N ’ ,N”-triammoguanidina; onde n é um inteiro de 1-5; onde R1 é (a) hidrogénio, (b) fenilo, (c) alquilo Ci-C5, ou (d) alquilo Ci-C3fenilo, e onde R2 é (a) fenilo, (b) alquilo Cj-Cio, ou (c) alquilo Ci-Csfenilo, com as condições seguintes: (a) na fórmula I, quando n é 2 ou 3, R1 não é hidrogénio; (b) na fórmula I, quando n é 1, R1 não é metilo; (c) na fórmula II, quando R2 é etilo ou fenilo, R1 não é hidrogénio, e (d) o composto não é N-aminoguanilglicina ou N-aminoguanil-DL- fenilalanina.

3. Composto da Reivindicação 1, seleccionado entre ácido [2-(aminoixninometil)hidrazino]acético, o respectivo monohidreto, e o respectivo monocloridrato do éster fenilmetílico, ácido a-[2-(aminoiminometil)hidrazino]benzenopropanóico mono-hidratado, 7 1

/ / mono-hidrobrometo do ácido [l-(aminoiminometil)hidrazmo]acético, N-(hidrazinoiminometil)-P-alanina, N-(di-hidrazinometileno)glicinaj ácido [2-(Mdrazinoiminometil)hidrazino]acético, N-(di-hidrazinometileno)-P-alanina, N (di hidrazinomctilcno)-L-alanina, mistura racémica de HN=C(NH2)-NH-NH-CH(CH3)-COOH, N-(di-hidrazinometileno)-d-aIanina e N-(di-hidrazinometileno)valina.

4. Composto da Reivindicação 1, seleccionado entre ácido [2-(aminoiminometil)hidrazino]acético e respectivo monocloridrato, N-(di-hidrazinometileno)glicina, ácido [2-(hidrazinoiminometil)hidrazino]acético e ácido [l-(hidrazinoiminometil)hidrazino]acético.

5. Utilização de um composto para o fabrico de um medicamento para tratamento ou prevenção da diabetes mellitus não-insulinodependente ou da obesidade, onde o composto tem a fórmula III HN=C(NH2)-NH-N=CR3-COOH onde R3 é H, metilo, etilo, benzilo ou n-hexilo. Maria Siivina Fcrrcir.a ADVOGADA Agente Uticial de Pi opriedodo IntfustriaL. R. Castilho. 50-5!- 1250 - 071-L1SB0A Tel. 21 38150 50 - Fax. 21383 1150

6. Utilização da Reivindicação 4, onde o composto é seleccionado entre monocloridrato do ácido [(aminoiminometil)hidrazono]acético, monocloridrato do ácido 2-[(aminoiminometil)hidrazono]propanóico, monocloridrato do ácido 2-[(aminoiminometil)hidrazono]butanóico, N-(hidrazinoiminometil)glicina e respectivo cloridrato (2:1), ácido a-[(aminoiminometil)hidrazono]benzenopropanóico e ácido 2-[(aminoiminometil)hidrazono]octanóico. . Lisboa, 5 _ DE2 2001