CS296991A3 - Process for preparing covalent oligosaccharide conjugate and carrier protein - Google Patents

Description

-1-

Zlepšené vakcíny oligosacharidových konjugátů

Oblast vynálezu Předložený vynález se týká zlepšeného způsobu přípra-vy vakcin oligosacharidových konjugátů a dalším aspektemvynálezu jsou připravované vakcíny na bázi oligosachari-dů, které dávají monospecifickou a homogenní imunitní od-pověá na kapsulární polysacharidy. Specifické provedenívynálezu poskytuje vakcíny, které indukují imunitu k zave-deným serotypů, Streptococcus pneumoniae, které mohoubýt důležité pro použití u dětských pacientů jakož i upacientů starších a pacient^/s oslabenou imunitou, způsobe-nou slabostí nebo chorobou /včetně např. pacientjc, s AIDS/.

Dosavadní stav tedniky

Pneumococcus /Streptococcus pneumoniae/ je gram-po-zitivní kapsulující kok, který obvykle roste v párech nebokrátkých řetězcích. V diplokokové formě jsou přilehléokraje zaoblené a opačné konce nepatrně zašpičatělé a orga-nismus dostává lancetovitý tvar.

Pneumokoky mohou být rozdělena do serotypů podle kom-plexních polysacharidů, které tvoří jejich kapsule. Byloidentifikováno 84 serotypů působením typově-specifickéhoantisera, Neufeldoveu potlačovací reakcí. Všechny jsou pročlověka patogenní, ale typy 1,3,4,7,8,9 a 12 jsou nejčas- těji nacházeny v klinické praxi. Typy 6, 14, 19 a 23 často způsobují pneumonii a otitis media u dětí, ale jsou méněběžné než u dospělých /Aistrian, 1983, v "Harrison*s Princip-les of Tnternal "iedicine", Petersdorf a spol., vyd., 10. vydá-ní, McGraw Hili Book Co.,, New York str, 918-922/. Pneumo-kokus je jedním ze tří patogenů, odpovídajících za pneumonii, -2- sepsi a meningitidu dětí /McMllan, 1982, v "Core Text-book of Pediatrics, Kaye a spol., vyd., Second -Mition, J.B. Lippincott Co., Philadelphie, str. 498/.

Mezi osoby s vyšším rizikem rozvinutí pneumokokovéinfekce patří pacienti s chronickými systémovými chorobamijako jsou choroby srdeční, chronické bronchopulmonálníchoroby, jaterní choroby, ledvinové nedostatečnosti a nádo-ry. Je doporučováno, aby těmto osobám byla podána vakcínaproti pneumokokové infekci. Pro tento účel jsou vhodnédvacet tři vakcíny, obsahující kapsulární polysacharidypneumokokových typů 1,2,3,4,5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A,12F, 14, 15B, 17P, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F /kte-ré zahrnují serotypy nebo skupiny odpovědné za 90 procentvážných pneumokokových onemocnění v USA a zbytku světa/

ne , Lederle Laboratories/, ^činnost těchto vakcin u dětí je sporná, protože u dětí mladších šesti let se imunolo-gické odpovědi na různé kapsulární antigeny rozvíjejí vrůznou dobu jako výsledek charakteristiky zrání imunitní-ho systému a ochrana může mít kratší trvání než je pozo-rováno u dospělých /Harrison a spol., ibid/. Ačkoliv rela-tivně málo pneumokokovým serotypů, je přičítáni takovývýznam pro většinu pediatrických pneumokokových infekcí/Gray a spol., 1979, J.Infect.Disease 140:979-983/, tytozahrnují typy, pro které vývoj lidské protilátkové odpovědina čištěné kapsulární polysacharidy použité jako vakcinyje pomalejší /Anderson a Betts, 1989, Pediatrie ínfec.Dis.J. 8:S50-S53; Borgono a spol., 1978, Proč.Soc.Exp. Biol.Med. 157:148-154/.

Imunní odpovědi u dětí na Haemophilus Lnfluenzae bkapsulární polysacharidy byly dosaženy spojením kapsulární-ho antigenu s proteinovým nosičem za vzniku "konjugátu"vakciny, předpokládá se, že helper efekt T-lymfoc.ytů jeindukován proteinovým nosičem a je odpovědný za rozvinutí -3- imunity /Robbins a spol., 1984 v "Bacterial Vaccines",Germanier, vyd. .Academie Press, New York, str.289-316/, viztaké Cruse a Lewis, 1989 v "Conjugate Vaccines" vyd. Cru-se a Lewis, Karger, Basel, str.1-10/. Podobný postup bylřízen směrem k produkci pneumokokových vakcin. Různí badatelé izolovali a čistili intaktní kapsulár-ní polymery, které^mohou být použité v nebo jako vakciny.Např. US patent č. 4220717 popisuje postup pro izolacia čištění imunologicky aktivního polyribosyl-ribitol-fosfá-tu /PRP/ z kapsulórního polymeru H-influenzae b. -^áleUS patent 4210641 se týká pólysacharidových extraktů z H.Influenzae, majících zjevnou molekulovou hmotnost většínež 200 000 daltonů a složených hlavně z galaktozy, glu-kózy a mannozy a obsahujících malé množství os aminů. Několik výzkumníků využilo těchto a jiných intaktníchkapsulárních polymerů k formulacím pro dosažení lepšíchimunologických odpovědí. Například US patent 4196192 uvá-dí vakcínu, obsahující čištěný intaktní PRP a celé buňkyBordetella pertussis ve vakcinovém přípravku, ^ento postupke zvýšení imunogenicity dosáhl zvýšených hladin anti-PRP aanti-pertussis protilátek u mladých savců.

Nosičové proteiny mohou působit více než zvýšení imu-nogenicity konjugovaných kapsulárních polymerů. Mohou takéučinit hapteny imunogenickými. Hapteny jsou definoványjako molekuly, které se mohou vázat specificky na protilát-ku nebo lymfocytový receptor, ale nemohou samy způsobitimunitní odpověň /tj. samy nejsou imunogenní/. X vyvoláníimunní odpovědi musí být malé molekuly nízké molekulovéhmotnosti a slabé imunogenicity, nazývané hapteny, spojo-vány ve větší molekuly nebo připojovány na nosič, kterým jeobvykle heterologní protein. Injekce komplexu hapten-nosičvyvolá pak zvýšení produkce protilátek B-lymfocyty, z nichž -4- některé budou schopné vazby na volné, nespojené haptenovémolekuly.

Mezi prvními hapteny, které byly studovány, byly azo-barvivové sloučeniny jako je anilin nebo o-aminobenzoovákyselina. Landsteiner a Dampl /1918. Z.Immun.Forsch 26: 293/ připojovali tyto sloučeniny diazotací k sérovým protei-nům. Po injikaci těchto uměle připravených azoproteinůkrálíkům se rozvinulo srážení protilátek, které byly spe-cifické pro připojené chemické skupiny.

Jinými příklady haptenových sloučenin jsou dinitro-fenol, který se stává imunogenním připojením jako dinitro-fenylová /DNP/ skupina k hovězímu sérovému albuminu nebok hovězímu gamma globulinu /BGG/ a diethylamid kyselinylysergové. Dokonce formaldehyd se může chovat jako hapten,osoby vystavené výparům formaldehydu z produktů nebo v la-boratořích se stávají citlivými na tuto sloučeninu, násle-dující formylací jejich endogenních makromolekul in vivo.

Haptenické chování není omezeno na malé organické mo-lekuly a polypeptidové hormony až do velikosti inzulínujsou často slabě, pokud vůbec jsou, imunogenní. K získánivysokých titrů protilátek k těmto hormonům je tedy nezbyt-né je konjugovat na nosičovou molekulu /nebo vytvořit mo-lekuly spojováním mnoha těchto polypeptidů dohromady/.

Volba nosičové molekuly je zejména zajímavá v tom,že nosič hraje více než transportní roli. Ovary a ^enaceraff/1963, Proč.Soc.Exp.Biol.Med. 114:723/ toto prokázali inji-kováním DNP-BCG králíkům. Injekce množství imunogenickéhomateriálu zvířatům vyprodukuje imunologickou "pamět" pů-sobení. Jestliže je druhá injekce dána později, pak je zdemnohem více mohutných imunitních odpovědí. Vskutku, když -5-

Ovary θ Benaceraff indikovali DNP-BCG znovu, byla zde silnásekundární odpověď, která vedla k výrazně zvýšené hladiněprotilátek jak proti DNP tak BCGt ALe když byla provedenadruhá injekce místo uvedené s DNP-vaječným albuminem, bylazaznamenána slabší anti-DNP protilátková odpověď· Rozdílyv odpovědi byly způsobeny tím, co nazýváme nosičový efekta zdá se, že zahrnuje T-helper lymfocyty. Předběžné důkazy ukazují, že všechny proteiny nemohoubýt stejně efektivními nosičovými proteiny pro dané hapteny.Robbins a spol.,/Infect.Immun.40:245-256/ předkládá dataz experimentálních vakcin protein-polysacharidových konju-gátů, ve kterých stejný polysacharidový hapten byl konju-gován s různými proteinovými nosiči a pak byla kvantifiko-vána protilátková odpověď. Významné rozdíly byly zazname-nány v množství generovaných anti-haptenových protilátek,a indikovaly významnou roli nosičů.

Pokud jde o pneumokokální vakcíny podrobněji, Lín aLee /1982, Immunology 46:333/ studovali imunní odpovědidospělých a mladých myší, vystavených typu 6A a 19F polysa-charidů jakož i 19P konjugovanému na protein. Významněvyšší IgM a IgG2 titry protilátek byly indukovány u myší,které obdržely 19F-polysacharid-protein konjugáty, než ukontrolní skupiny, která dostala 1 9F polysacharid samostatně uiní badatelé studovali konjugáty kapsulárních polyme-rů s přenašečovými proteiny za účelem zvýšení protilátkovéformace tak zvaným "nosičovým efektem". Například Schneer-son a spol., Journal of Experimental ^edicine 152:361-376/1980/ popisují H.influenzae b polymer-protein konjugáty,u kterých objevili, že vyvolávají imunitu k invazním choro-bám vyvolaným H.influenzae b. Odkazy, dokumentující imuno-logické chování kapsulárních polymerů vztažené na věk dětí -6- a snaží se překonat tuto závislost na věku konjugací in-taktních kapsulárních polymerů s různými proteiny, včetněsérového albuminu, Limulus polyphemus hemocyaninu a difte-rického toxinu. Metoda konjugace zahrnuje použití spojova-cího činidla jako je adipický dihydrazid.

Geyer a spol., ^ed.Mcrobiol.Immunol. 165:171-288/1979/, připravili konjugáty určitých fragmentů kapsulárníchpolysacharidů ^lebsiella pneumoniae s nitrofenyl-ethylamino-vým linkerem redukční aminací a derivatizovaný cukr bylpak připojen k proteinům za použití azo-kopulace. US patent 4057685 ^clntirea z 9.května 1974 se týkáEscherichia coli lipopolysacharidů se sníženou toxicitoukovalentně navázaných na proteinový antigen reakcí s halo-gen acylh alogenidem. US patent 4356170 Jenningse a spol., ze 27. května1981, zvěř.26.října 1982 se týká přípravy polysacharid-proteinových konjugátů redukční aminací.

Aidersen /1983, Infection and Immunity 39:233-238/ setýká konjugátů mezi oligosacharidy z kapsulárního polysachari-du Haemophilus influenzae typ b a CRM^y, netoxickým aleantigenně identickou variantou difterického toxinu.

Snippe a spol. /1983, Infection and Immunity 42:842-844/ se týká semisyntetické vakciny pro Streptococcus pneu-moniae typ 3, ve které hexasacharid izolovaný z částečnéhokyselého hydrolyzátu kapsulárního polysacharidů S3 bylnavázán ke stearylaminu redukční aminací a pak inkorporovándo liposomů. U výsledné vakciny konjugát/liposom bylo po-zorováno, že indukuje ochranu pro S.pneumoniae typ 3 u myší. -7- US patent 4663160 Tssye a spol., podaný 14.března 1983, udělený 5.května 1987, se týká bakterie, ve které je deto- xifikovaný polysacharid z gram-negativní bakterie kovalent- ně navázán k detoxifikovanému proteinu ze stejného druhu gram-negativní bakterie spojením uhlíku 4-12. US patent 4619828 Gordona, podaný 5.ledna 1984, udělený28.října 1986 se týká konjugátů mezi polysacharidovými mole-kulami z patogenních bakterií jako je ^aemophilus influenzae6y Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Esche-richia coli a antigenů závislých na T buňkách jako jsoudifterické a tetanové toxoidy. US patent 4808700 áadersona a Clementse, podaný 10.srpna 1984, udělený 28. února 1989 a US patent 4761283 4a-dersona, podaný 28.března 1986, udělený 2.srpna 1988 se týkákovalentního spojení fragmentů kapsulárních polymerů k bak-teriálním toxinům, toxoinům nebo vazebným podjednotkámpomocí redukční aminace. US patent č. 4711779 Porroa a spol, podaný 2.července1986, udělený 8. prosince 1987 se týká vakcin glykoprotei-nových konjugátů, majících trivalentní imunogenickou akti-vitu a zahrnujících antigenní determinanty z kapsulárníchpolysacharidů gram-pozitivních bakterií a gram-negativníchbakterií jakož i bud CRM^?, tetanický toxoid nebo per-tusis toxin. Příprava konjugátových vakcin, ve kterých haptenykapsulárních polysacharidů jsou připojeny k nosičovým pro-teinům, zahrnuje následující postupy; i/ musí být připraven kapsulární polysacharid, ii/ jestliže má být použit fragment polysacharidů, musí býtseparován z intaktního polysacharidů -8- iii/ sacharid musí být aktivován nebo učiněn být schopnýmkonjugace, tj.musí být generovány skupiny schopnékovalentní vazby k proteinu iv/ sacharid je konjugovén k proteinu. Různé metody známé v oboru pro provedení těchto čtyřkroků jsou uvedeny v tabulce I. 9 Ό 4< vy báze za pří-tomnosti redukč- 53 Λ* S « 4 Pffl © ©P? Wo p Ρχ Ό ρ-ω · o 4> 4)

O

d Ό -P c P •d -P c; O Oj O Ch to O· o bJ ω P) (TX Oj σ\ flX P> VI P • bJ Ό P • Cb •d ffl • _A © • ΓΟ © N •P σ\ p p VI • o © IV • o © • bJ M P VI κη *· P VI • A P • • P • ffl —* «-Α C-I _* \O 3 o \O © MO 00 • 00 P 00 bJ —* P ffl Ό P 00 P ffl IV (Λ *d u O «· H O Ό • O 4« P Px <! *d ffl 4 © <5 O <3 ρ- ω φ 4 P Pi P o αχ o P P αχ ’< •d ffl © ffl P o Px V s 4 P Cb P

ffl <1 CJ. 4 -d <1 CJ. d ©, řr ©X o M P ©X o 's o π d P Oj P P P O< P P p Ό Px P N< Px P bX P P ffl Px ffl P ffl <3 P P. P O <3 ©X &amp; P o <3 ©x 8 8 Oj p Q. P P <0 © Es* p? © 8 «<3 © ffl <«í © ffl P Oj © o. © o. O 00 P o (fc P P «3 © P © P ^x P P << P P O © P o © P ď 4 p· 4 O O

P P >d P P o* P P © P 4< P © P © o © P N P 4 Ol P B P P O •d σ P ffl P P

4X

I

IV &amp; s

«X 3

P

O CJ. Φ £3 00PT © Ό Cb4 ©

o 4I P < ©

I o ff 8

P &amp; O ffl

Oj «. Pω Ό

Pi 4< p · © o

P

P et o

(X

P

I o ffl

P

P

K o

P

I

N © Ό 4<

Px

I o CJ. © K* Ό 4

O

I w —$

©X Φ»I ffl -‘pr iv<3 4 T3 4<

P

I

Px

I ta Pť

P

I g« O* fflo cj. 4 ΡχO o 5 Η"o. pr 4 «<

5 T

ES ffl o © 4

P N< Ρχ

I 4 © O« &amp; o

Es

Px

O fd Es4 CJ. S- £

© fflP op ©P «-3 a cr &amp; ffl -10- νθ -j o O P CO rv —* 03 -Ρ» α IV •ο -Ρ* C o 4 Π) 03 Φ 00 o 00 ω 00 ο σ> ω P m N x • • o o • Cb co (TO Ω < o IV es I—1 00 Ρ —* • VO Ρ 9 m £3 φ • • Φ -o φ ο VI 00 03 *0 Φ P P —» —* 0 o cť • • IV C+ P P co «X Ch vo vo Φ o Φ —* 00 Φ Φ <+ P s • 00 00 P *· Ρ Ό • «φ Ρ £j O VI Ό -Ρ» í+ «+ 00 —* C+ 9 O ® o M co P σ\ Μ0 Ω O 4> 4 P < w Q. 00 ο P CJ. P Φ 4 H- ω P P αχ 0. P 4 (X ® c+ o ου Φ fC< O ω Ο Φ 4 H 03 *· H O* o Ρ Ρ Φ «< ¢+ • • P Cb c+ P 3 H- αχ O t+ Φ O Η o o o

I 4 ρ O Ch t) ? > 8H-

fcrj OJ h θ'H- <+ f

Η- PH

Tabulka 1 /pokračování/ Φ - <4 Οι ο ω Ρ φ X Β Η CX Η- ΟΧ Ρ Ρ ΙΑ Ε S- Ρ* Ρ &amp; Η> 4< 4 Η- Ο 4 1—1 «Α ο Ν ο 03 Φ

P O <J Ω Ο Ρ 4 Ο S5 <4 $ Ν Ω Ρ Η- 1—1 X Ρ Ο £ ου Ρ X 00 Ρ to Cb IV <4 Ρ Ρ Ρ Η ΙΑ ο 4< Ρ. Ο φ Φ Ρ Ο Cb «« Ρ Ρ. ΙΑ 1—’ ο Η 0 4 Μ* 4 X αχ ο Ρ <<4 «Ί- ο Η- θ Φ ««4 Ο ο <+ φ φ 4 Ο ο (V Ο Ν < C0 Η ω αχ 0 co Φ Ρ Ρ ο ο Η Ρ Φ φ Μ- •ρ Ρ Ο <<! ω Φ 4 Ρ ο Ν Οι φ Ο Ρ ρ φ <-Ι- X Φ Ρ* Φ βΚ Ρ Ρ» Ρ< tsx Ρ Ο Φ Ν ΙΑ φ Φ Η- IV 0 Η ο <+ 4 Ο Ρ CJ. Ρ «+ ο Φ Ο <4 φ Μ- Ρ CJ. 4< Φ C+ «< ο Ν <4 CX Ρ Cb Ο • Cb π- ο Η- Ο Ρ Φ Ρ Cb Ρ ου 4 ο Ρ ΙΑ Μ φ Η- Η ΙΑ φ Ρ» ο 0 | σ ω Η- 0 Ρ Ν ο ο <+ 0 Ρ Ρ ο Μ- 4 ΙΑ αχ ς Ρ φ ¢+ Ρ Φ Cb Ο Ρ* 0 » C0 0 ΙΑ Ρ φ cr φ Μ X Mj ΓΙ- 4 1—1 Ο Ο 4 Ο ο Ολ £ Ο. X Η- Οι < g Φ ου 0 3 0 4 Ο 03 Ο φ Ρ Ρ 4 § l-j 1 <+ Ο Ρ·

N

O Ον Ρ &amp; Ρ ΓΙ- Ο (V Μ σ C+· 05 IV «3 φ 4 CJ. φ- C0 X -4 Ο <<4 ο Ο W ο Μ- ο ο ο Οι Η- Φ 1 Ρ ο Ο· Ρ <4 ρ» ρ Ν< 4 9 Η- Ρ Ρ Η- 4 X 00 φ Ρ Ο Μ* 4 Ν< αχ —* CJ. Ρ ο Ρ Ρ C-I. 4 Ρ αχ Ο ο CJ. Ω 00 Η- Η- 0 \ο Ρ αχ &amp; ο Φ Ρ Ο ο «+ φ φ Ρ Οι ί+ ->q ου Μ C0 Ο ου <+ «ί Ρ φ ΓΙ- 4 ου Οι Ρ ΙΑ Ρ ο IV ο. <+ ΙΑ φ Φ αχ X Ο ο Ρ Ρ <4 1 4 Η· ο Η- Ρ* Η- 0 0 *4 ΙΑ α χ Η> φ οχ IV Η· Ν φ Ρ X ω Ρ· Ρ» φ- Ρ ο 4 Ρ ο. 03 Ρ ο. ¢+ ω Ρ Cb © Ρ 4> ο rl- Ρ 4 α> 4 Ρ Ρ C+ 4< Ρ 0 ο φ Ρ Φ Φ Φ CJ. θ' X Η· αχ ο Ν ω X Οι \ Ρ 4< Οι Μ Ν Φ Η Φ Ρ* σ © 4) Ρ Ρ ο ΙΑ ρ Η· Ρ· ΙΑ 0 ο ο αχ << 4< 1 1 Ρ Οι X 4 I Μ· <χ <4 Ρ Ρ ο θ' Ρ Οι 1 1 ΙΑ φ

I 11 Ό *0 00 K> o -p G 0 • • o ~4 ω Φ O -< a —* p rv • co —· *0 § M • —» P -<1 ID O P —Λ VO ffl -4 P 0 ►i \0 00 5 kO Φ P· Φ 00 CTv p 0 φ *0 M P· P Φ P •u O 0 O o P O 01 0 «<J o rtx 4 •0 o Ό o o • O σ\ 0 (X 05 co •

Tabulka 1 /pokračování/ LJ Ό X* 0. o •0 <O 0< «< m o O 4< P> OJ P o 5 P· a tr <0 p o o 0* φ o —· H o H O —'X H (X o ax 0 φ • (X o ax P· o o N< P· o 0 tr o<<< • ΓΟ 0* B 0 • o ξ O IX O O o Ο» o P ffi 0 •a o o 0 CD 0 o O t—1 • Ό o t-> P <<x N Φ o\ N Φ 5 1 Φ CO co «4 i-b 0 •0 0 \ σ Ό 0 OD X* 0 \ x* co tr 0 CO 0 co 3 64 m 0 0 O o o Px O 0< P· X- O 0 o tSJ< CDx pr CDx Px X^ t—1 Oj § O 0 0 Px Φ p CO CO Φ 0 0 o. P· 0 H 0 0 <i P o> n K> 0 Pf o 01 0- o O P X- P· Φ P 0 CDx 0 P- *0 0 *0 0 Φ P· Φ P· o Φχ CK IX <4 0* O CDx < H P· 0« φ CO P· Px P· Px P· Px 01 <x p. 0 X B 0 0 05 Φ N i H o P· • 0 P* cx 3 0 O 0 O Φ o P· P· P· Px O 3 Φ (X 0 0 0 O< N Φ 0 0* 0* 0 ·< 0 3 01 0 P P· 3 0 o Px CDx φ N Px 0. fV \ 0. Px CDx P· 0 O Φ Px << 0 Φ P· CQ 3 0 0 Φ 0 CO M 0 0 O m 3 0 o· w N co 0. 0j O 0. 0i p O 8. P· 0 CJ. O S Φ Φ § Ό O 0 P p o 0 CO Φ C H* 0 0 O Px 01 0 *0 0» P P- O H o O Φ CJ. X* 0 0 <: P· CDx 0< O 0 O 0< 0 Φ 0 0 -P Φ co σ ca S 4 Px o *·· 0 *§ Px s s 0» 0 0 O P 0· Px P Φ CO Px Φχ 0* cr o • PT o 0 3 O P· 1 P g· Px 0< P· 0 CX 05 0 § <J o P O 0 *0 0 P· 0* Φ 0J Φ 0 0 0 0 o Φχ 3 φ \ o O Px I O 0 0 P· Φ 3 \ P· Φχ O 64 1 \ 1 0 1 1 O IX e CJ. 3 o Φ 3 0* 1 Φ 0* P· &amp; Px Φ 0 0J CDx o 0 o t+ o Φ 0 P· Px ,0* 1 0 0* 1 0 B N xr 0i 0. *0 o P P X* 0 3 «< O O 0< Φ Φ o 0 P· O 0 o o o O 0« P· P 0 3 0 OQ 3 X 0 < 0. 1 P· 0 p < 0 CJ. φ ox Φ p o CJ. Φχ P· 0 o 0< c P P- 0 o P· 0 1 CO Φ P> Px OT 0· σχ P· co 01 OQ p 0 CO P O << O. o P 0 O P· M 0 O < P< P* pr P· <1 O P> H CDx co CD φχ 64 CDx 0 P H) p 0 0 0* Φ 0 O ΠΧ o O O H O O X CO H> 0 Ό nk 3 P* P X* O ID 0 0< pr V) Px cx P· X Ό O Px CO 0 o P· 0< 64 1 P 01 s 1 • 1 1 P· Ξ ι —

VjD -12-

Podstata vynálezu Předložený vynález se týká kovalentního navázání oligosacharidů odvozených z bakteriálních kapsulárních poly-sacharidů na proteinový nosič za použití nové metody.

Tento postup dovoluje účinnou syntézu glykokonjugátůpři produkční rychlos i výrazně vyšší než dříve použí-vané metody. Glykokonjugáty podle vynálezu mohou být užityv přípravě vakcin a mohou se projevit jako imunogenické. ve výhodném provedení se předložený vynález týkáprodukce glykokonjugátů, které inkorporovaly oligosacha-ridy odvozené z kapsulárních polysacharidů Střeptococcuspneumoniae. Metoda podle vynálezu má za výsledek účinnouprodukci glykokonjugátů S. pneumoniae ve vysokých výtěž-cích, které mohou být použity ve vakcínových přípravcíchznačné důležitosti pro pediatrickou populaci, ve kterévelká část nejrozšířenějších chorob je spojena s infekcí S.pneumoniae. Sylo objeveno, že imunogenní konjugáty jsouméně závislé na věku než kapsulární polysacharidy samot-né a že jsou užitečné pro aktivní imunizaci velmi mladýchteplokrevných savců proti systémovým infekcím příslušnouenkapsulovanou bakterií. V dalším aspektu vynálezu bylo objeveno, že glyko-konjugáty podle vynálezu překvapivě vyvolávají monospe- cifickou a homogenní imunitní odpověď, která může výhod- * ně zabraňovat vyvolání autoimunních reakcí a odvozenýchpost-vakcínových syndromů. Důležité je, že imunogenní konjugáty podle vynálezuneobsahují potenciálně toxická spojovací činidla jako jedihydrazid kyseliny adipové nebo p-nitrofenylethylamin,které byly použity v konjugaci karbohydrátu k proteinu. -13-

Zkrátký a definiceí CRM1Qrz netoxický protein antigenně křížově reaktivníi y i s difterickým toxinem DMSO dimethylsulfoxid DP stupen polymerace * MIC minimální inhibiční koncentrace SD stupeň substituce SIDEA sukcinimidyldiester kyseliny adipové SIDES sukcinimidyldiester kyseliny jantarové

Popis připojených obrázků

Obr.1 Obecná strategie syntézy konjugátů oligosacharid-protein A. Polysacharidy o vysoké molekulové hmotnosti se kyselehydrolyzují za vzniku oligos ach.aridů o průměrné mo-lekulové hmotnosti 2,5 x 1θλ B. Oligosacharidy jsou /1/ aktivovány reakcí s diamino-ethanem /HgN/CHg/^NHg/ při pH=9, redukovány pyridinbo-rohydridem /PyBH^/, pak /2/ reagují se sukcinimidyl-diesterem adipové kyseliny /SIDEA/ v dimethylsulfoxi-du /DMSO/. C. Aktivované oligosacharidy jsou připojeny k proteino-vému nosiči přes lysinové zbytky.

Obr.2 Použití "na míru šitého" spaceru ve spojovacímpostupu A. Glykokonjugát připravený dřívějším způsobem jak je popsáno Porroem a spol., /1935/, Mol.Immunol. 22:907-919, s amidovým spojením /šipka/ mezi oligosacharidema linkerem čtyř atomů kyseliny adipové. Celková délkaspaceru je přibližně 10,4 . B. Glykokonjugát vytvořený podle předloženého vynálezu, ve kterém dva uhlíkové zbytky /šipka, formované diaminoethanem/ a amidová vazba, existují mezi oligosacharidem -14- a linkery dvou atomů kyseliny jantarové, vytvořenými reak-cí se SIDES. Celková délka spaceru je přibližně 10 nm. C. Glykokonjugát vytvořený podle předloženého vynálezu, ve kterém dva uhlíkové zbytky /šipka, vytvořené diamino-ethanem/ a amidová vazba, existují mezi oligosachari-dem a Styřahlíkatým zbytkem adipové kyseliny, vytvo-řeným reakcí se SIDEA. Celková délka spaceru je přib-ližně 14,5 nm.

Obr.3. Schopnost konjugace CEM^? k aktivovaným oligosa- charidům, obsahujícím spacery adipová kyselina ver-sus jantarová kyselina. Elektroforéza produktů kon-jugačních reakcí na SDS-polyakrylamidovém gelu /vy-barveno stříbrem/. A. Dráha 1 -standardy molekulové hmotnosti /92,5 K, 66,2 K45,0 K, 31,0 K, 21,5 V.

Dráha 2: ΟΕΜ^γ /1 /Ug/ refrenční.

Oráha 3: Konjugovaný oligosacharid óA-CEM^y s kyseli-nou jantarovou jako spacerem /2 /Ug/ /poměr 1:1monoester/celkové aminoskupiny CEM^y v 50¾ DMSO/·

Dráha 4: Konjugovaný oligosacharid 6A-CEM^y s kyseli-nou jantarovou jako spacerem /2 /Ug/ /poměr 1 :2monoester/celkové aminoskupiny ΟΕΜ^γ v 50% DMSO/.

Dráha 5: Konjugovaný oligosacharid 6A-CBM^y s kyse-linou adipovou jako spacerem /2 /Ug/ /poměr 1:2monoester/celkové aminoskupiny CEM^? v 50% DMSO/.

Dráha 6: konjugovaný oligosacharid 14-CBM^^ s kyseli-nou jantarovou jako spacerem /2 yug/ /poměr 1:4monoester/celkové aminoskupiny CEM^? v 50% DMSO/.

Dráha 7: konjugovaný oligosacharid 19Ρ-0ΕΜ^γ s kyse-linou jantarovou jako spacerem /2 /Ug/ /poměr:1:4monoester/celkové aminoskupiny CEM^y za nepří-tomnosti 50% DMSO/. -15-

Dráha 8: Konjugovaný oligosacharid 23F-CEM19γ s kyseli-nou jantarovou jako spacerem /2 /Ug/ /poměr: 1:2 monoester/celkové aminoskupiny CEM^y v 50%míso/.

Dráha 9: CEM^y /1 yug/ referenční. B.

Dráha 1: CEM^y /1 /Ug/ referenční.

Dráha 2: CRM^y refrenční /1 /Ug, rozdílný nd dráhy 1/Dráha 3: konjugovaný oligosacharid 23F-CEM^9y s kyselinou adipovou jako spacerem /2 y-ug/ /poměr: 1:2 mono-ester/celkové aminoskupiny CEM^y v 50% DMSO/.

Dráha 4: Standardy mol. hmotnosti /92,5 K, 66,2 K, 45,0 K,31,0 K, 21 ,5 K/·

Dráha 5: Konjugovaný oligosacharid 23F-CEM^9y s kyselinouadipovou jako spacerem /2 /Ug/ /poměr: 1:2 mono-ester/celkové aminoskupiny CEM:M^9y v 50 % DMSO/.

Dráha 6: CEM^y /1 /Ug/ referenční CEM197 referenční /1 /Ug, rozdílný od srovnávacídráhy 1/

Dráha 7: Konjugovaný oligosacharid 6A-CEM^9y s kyselinouadipovou jako spacerem /2 /Ug/. C.

Dráha 1: Standardy molekulové hmotnosti /92,5 K, 66,2 H,45,0 K, 31,0 K, 21,5 K/

Dráha 2: CEM^y /1 /Ug/ referenční. jOráha 3: konjugovaný oligosacharid 6Α-ΟΕΜ^θγ s kyselinouadipovou jako spacerem /2 /Ug/

Dráha 4: konjugovaný oligosacharid 14-CEM^y s kyselinouadipovou jako spacerem /2 /Ug/

Dráha 5: konjugovaný oligosacharid 19F-CBM^9y s kyselinouadipovou jako spacerem /2 /Ug/ -16-

Dráha 6: Xonjugovaný oligosacharid 23F-CEM^y s kyselinouadipovou jako spacerem /2 /Ug/

Dráha 7: ^“arkery molekulové hmotnosti /92,5 X, 66,2 X, 45,0 X, 31,0 X, 21,5 X/

Obr.4 Xráličí IgG odpověď na konjugáty S.pneumoniae oligosacharid óA-CRM^y* Inhibiční ELIS A analýzahodnoty afinity IgG isotypu indukované kapsulárnímipolys ech aridy. A. Typ 6 A kapsulárního polysacharidu B. Typ 6A oligosacharidu /SP= 10? ve volné formě nebokonjugovaný k C. Typ 14 oligos acharidu /DP = 12/ aktivovaný molekulo-vým spacerem nebo konjugovaný k CRM^?.

Detailní popis vynálezu* Předložený vynález se týká kovalentního připojeníoligosacharidů odvozených od bakteriálních kapsulárníchpolysacharidů k proteinovým nosičům; způsob podle vynálezugeneruje nové glykokonjugáty novými způsoby.

Pro zřejmost a bez jakéhokoliv omezení, je detailnípopis vynálezu rozdělen na následující sekce*i/ příprava oligosacharidů ii/ aktivace oligosacharidů iii/ konjugace oligosacharidů k proteinu iv/ imunochemická charakterizace glykokonjugátů v/ vakcinový přípravek a podání vi/ využití vakcin konjugátů pneumokokálních oligos sa-charidů. Příprava oligosacharidů.

Kapsulární polysacharid.y vysoké molekulové hmotnostimohou být obchodně dostupné /Anerican ‘^ype Cul ture Collec -tion /ATCC/ /Rockville, níD//, nebo získány metodami popsanými -17-

Porroem a spol., 1983» J.Biol.Stand. 11:65-71· Mohou býtpoužity jakékoliv polysacharidy zahrnující, sle neomezu-jící se na ně, ty, které byly nalezeny v pouzdrech Strep-tococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Neisseriameningitidis, Eseherichia coli, Salmonella typhi, Strep-tococcus mutans, Crjaptococcus neoformans, Klebsiellapneumoniae, Staphylococcus aureus a Pseudomonas aerugi-nosa.

Aitigenní fragmenty s nejméně jedním redukujícímkoncem mohou být získány z kapsulárních polymerů různýmimetodami, závisejícími na strukturních vlastnostech jed-notlivých kapsulárních polymerů, iiimitní oxidační štěpe-ní jodistanem /nebo podobnými činidly/ oddělí aldehydo-vé konce; dojde tak k omezení na polymery, mající vici-nální dihydroxyskupiny na necyklických zbytvích. Bydro-lýza glykosidických vazeb poskytne redukovaný cukerný ko-nec. Taková hydrolýza může být nejepecifičtěji provedenaenzymatickou cestou glykosidázami, ale toto použití jeomezeno na relativně malý počet kapsulárních polymerů,např. Streptococcus pneumoniae 8, pro které jsou glyko-sidázy známé. Kyselá hydrolýza je běžně používána pro hyd-rolýzu glykosidických vazeb. Užití tohoto postupu je ome-zeno, jestliže polymer obsahuje vůči kyselině citlivéneglykosodické vazby nebo když polymer obsahuje na kyse-linu citlivé můstkové vazby důležité pro antigenní specifitu.

Ve specifických provedeních podle vynálezu S. pneu-moniae typ 6 A kapsulární polysacharid může být hydrolyzo-ván v přibližně 10"^ M octové kyselině při asi 100 °C poasi 30 hodin; kapsulární polysacharid S.pneumoniae typ 14může být hydrolyzován v přibližně 0,5 M kyselině trifluor-octové při asi 70 °C po asi 7 hodin; polysacharid S.pneu-moniae typ 19P může být hydrolyzován v přibližně 10”^ M -18- kyselině octové při asi 50 °C po dobu asi 48 hodin; apolysacharid S.peumoniae typ 23P může být hydrolyzovénv přibližně 0,25 M kyselině trifluoroctové při asi 70 °Cpo asi 3 hodiny. ^odle předloženého vynálezu, oligosacharidy, kteréjsou konjugovány k proteinu, výhodně obsahují mezi třemia šesti opakujícími se jednotkami /nebo mezi asi desetia třiceti monosacharidovými zbytky/ a nejvýhodněji obsa-huje mezi třemi a čtyřmi opakujícími se jednotkami /neboasi patnást monosacharidových zbytků/ jako oligosachari-dy této délky inkorporované do glykokonjugátů, se projevi-ly jako optimálně imunogenické.

Oligosacharidy mohou být aktivovány způsobem redukčníaminace s následující reakcí s bifunkční molekulou jakoje diester, aniž by byl považován za omezení. Znázorněnímetody podle vynálezu je uvedeno na obr. 1 a v tabulce II,která porovnává metodu popsanou Porroem a spol., 1985,

Mol.Immunol. 22:907-919. Doba pro aktivaci za použitípředchozího postupu byla 7 až 14 dnů, podle předloženéhovynálezu byla zkrácena na 15 minut. Doba pro redukci podlepředchozího postupu byla 7 až 14 dnů, podle předloženéhovynálezu byla zkrácena na 48 hodin. Předložený vynález te-dy vyžaduje o 12 až 26 dnů méně pro kompletní průběh nežproces předcházející. Toto je důležitáv výhoda, protoževystavení karbohydrátů zvýšené teplotě jako je 50 °C,může vést k degradaci. -19-

Tabulkall

Chemická aktivace koncové redukční jednotky S.pneumo-niae oligosacheridů

Parametry dřívější postup navrhovaný postup zaváděná skupina nh2 nh/ch2/2nh2 činidlo /pH/ amoniakální pufr diaminoethan /9/ teplota aktivace 50 °C 100 °C doba|aktivace 7-14 dnů 15 minut rigdukční činidlo Na kyanoborohydrid pyridinboran teplota redukce 50 °C 50 °C doba redukce 7-14 dnů 48 hodin výsledný produkt oligo-NH2 oligo-NH/CHg/gNHg aktivační bifunkč- ní spacer SIDEA /sukcinimidyl-diester adipové ky-seliny SIDES nebo SIDEA/sukcinimidyl di-ester jantarovénebo adipové ky-seliny/ teplotareakce 25 °C 4 °C reakční doba 4 hodiny 2 hodiny výsledný produkt oligo-NH-monoester o1igo-NH/CHg/gNH-monoester účinnost reakce 25-30 % 70 % -20-

Podle metody podle vynálezu je redukční aminacekoncové redukční skupiny oligosacharidu provedena za po-užití molekuly, obsahující dvě aminoskupiny. Ve výhodnémprovedení vynálezu je reduční aminace provedena reakcídaného molárního množství oligosacharidu s diaminoetha-novým roztokem v 10X molárním přebytku v 0,2ifl XHgPO^při pH asi 9 a při teplotě přibližně 25 až 100 °C a vý-hodně 100 °C po dobu mezi asi 1 až 60 minutami a výhodněasi 15 minut, ^oté může být přidáno molární množství py-ridinboranu ekvivalentní 25násobku molární koncentraceoligosacharidu v použitém postupu a reakce se provedepři teplotě 25 až 100 °C, výhodně při 50 °C po dobu 1 až72 hodin, výhodně přibližně 48 hodin. Výsledný produkt redukční aminace může pak reago-vat s bifunkční molekulou, kde každá funkční skupina jeschopná reakce jak s koncovou aminoskupinou aktivovanéhooligosacharidu tak i s aminoskupinou přítomnou ve struktu-ře proteinového nosiče. Tato bifunkční molekula může takposloužit ke vzájemnému spojení oligosacharidů a protei-nového nosiče. Ve výhodném provedení vynálezu je toutobifunkční skupinou diester, přesněji diester kyseliny adi-pové, u kterého bylo prokázáno spojení s účinnější gly-kosylací proteinu. Výhodně se ve specifickém provedenívynálezu oligosacharid, podrobený redukční aminaci jak jepopsána výše, dále podrobí reakci se sukcinimidyldieste-rem kyseliny jantarové nebo výhodněji adipové. x‘ato reakcemůže být nejlépe provedena s aminovaným oligosacharidemv molární koncentraci /jako aminoskupin/ ekvivalentní asi1 až 5 násobku molární koncentrace SILEA /nebo SIDES/v roztoku dimethylsalfoxidu /DMSO/ při teplotě 0 až 25 °Ca výhodně asi 4 °c po dobu 0,5 až 5 hodin, nejlépe asi 2hodiny. Aktivovaný oligosacharid může být pak oddělen srá-žením za použití 1,4-dioxanu /80 % obj./obj./, který takéoddělí v supernatentu přebytek SIDEA /nebo SIDES/. -21-

Proteiny, které mohou být použity podle vynálezu,zahrnují protein, jehož podání mladým savcům je bez rizikaa který může posloužit jako imunologicky účinný protei-nový nosič. V provedení podle vynálezu mohou být použityproteiny buněčného povrchu, membránové proteiny, toxiny atoxoidy. Kriteria pro bezpečnost budou zahrnovat absenciprimární toxicity a minimální riziko alergické reakce.Difterické a tetanické toxoidy plně splňují tato kriteria;tyto jsou po vhodné přípravě netoxické a výskyt alergickýchreakcí je přijatelně nízký. Ačkoliv riziko alergické reak-ce může být určující pro dospělé, je minimální pro děti. V souladu s dalším výhodným provedením vynálezu, vhodnéproteinové nosiče zahrnují, ale nejsou na ně omezeny Salmo-nella flagelin, Hemophilis pilin, Hemophilus 15 kDa, 28-30 kDa a 40 kDa membránové proteiny, tepelně labilní ente-rotoxin LTB Escherichia coli, cholera toxin a virové pro-teiny, zahrnující proteiny rotaviru VP7 a respirační syn-ciální virus F a G. V "nosičovém efektu" se stává slabý antigen navázá-ním na silnější antigen jako nosič /tj. na heterologní pro-tein/ více imunogenickým, než když byl přítomen sám. Jest-liže zvíře bylo dříve imunizováno samotným nosičem, můžebýt zvíře "pnfcmed" a produkovat zvýšenou imunitní odpo-věd nejen na nosičový antigen, ale také na navázanou hapte-novou skupinu, ^ěti jsou pravidelně imunizovány tetanický-mi a difterickými toxoidy. Tak mohou být vybaveny propříští přítomnost kapsulárních antigenů konjugovaných s jedním z těchto toxoidů.

Obecně, každý heterologní protein může posloužit jakonosičový antigen. Nicméně jisté bakteriální toxiny jako te-tanický a difterický, mohou mít navíc výhodu v tom, že jsousloženy ze dvou částí, z nichž jedna /vazebná podjednotkj^má vysokou afinitu pro navázání na buněčné povrchy buněksavců. Pochopitelně, konjugace na takový "v-zebný protein" -22- může dovolit naváženému antigenu efektivnější iniciaciodpovědi v buňkách imunitního systému.

Proteinovými nosiči, na které jsou konjugovány kap-sulární polymery, mohou být přirozené toxiny nebo deto-xifikované toxiny /toxoidy/. Tak mohou být relativněnovými mutačními technikami produkovány geneticky změněnéproteiny, které jsou antigenně podobné toxinům již neto-xickým. Týto jsou nazývýny “křížově reaktivní materiály”/cross reacting materials/ nebo CEM. CEM^y je však bez-cenný, nebot má jedinou změnu aminokyseliny vzhledem k / nativnímu difterickému toxinu a imunologicky se od nějneliší.

Konjugace kapsulárních polymerů s přírodními toxinymůže redukovat toxicitu, ale významná toxicita může býtzachována. Tak další detoxifikace proteinových toxinůpoužívá formalín, který reaguje s volnou aminoskupinouproteinu. Reziduální toxicita může stále být zachována.Mimoto je možná spontánní detoxifikace jednotlivého podí-lu vakcíny a zachovává se výsledek spojený s tímto postu-pem. 4Lternativně může být přírodní toxin detoxifikovánformalinem za vzniku konvenčního toxoidu před konjugacís kepsulárními polymery, ^icméně prvotní zpracování for-malinem redukuje počet volných sminoskupin vhodných proreakci s redukujícími skupinami fragmentu kapsulárníhopolymeru. CEM tak mají významné výhody v tom, že nemajížádnou toxicitu dokud žádná z jejich aminoskupin není obsa-zena formalinem. Další výhodou je, že při práci s CEMneexistuje žádné bionebezpečí. V případě CElfl^y, který je imunologicky identický snativním toxinem, zpracování s formalinem /ačkoliv zde není -23- nutná detoxifikace/ značně zvyšuje imunologickou odpověď.

Je zde domněnka, že je to způsobeno stabilizací molekulyproti degradaci mechanismem látky a/nebo agregace křížovévazby /imunogenicita částic se zvyšuje s velikostí/·»

Ze všech výše uvedených důvodů jsou tetanické adifterické toxiny prvními kandidáty pro proteinové nosi-če, ještě jsou zde další, které mohou být vhodné. Ačkolivtyto další nemusí mít průběh bezpečnosti objevený pro dif-terii a tetanus, mohou zde být jiné nepřekonatelné důvodyk jejich použití. A‘apříklad mohou být efektivnější jakonosiče, nebo může být rozhodující ekonomika produkce, ^alšíkandidáti pro nosiče zahrnují toxiny pseudomonas, staphy-lococcus, streptococcus, pertussis a Sscherichia coli. ve specifickém provedení vynálezu, mohou být aktivova-né oligosacharidy připojeny k proteinu, který byl čištěn následovně: CEM^y, produkovaný kmenem Corynebacterium diphteriae,může být oddělen z kultivačního media průchodem bakteriál-ní kultury membránou Millipore, vysrážením proteinu z fil-trátu a čištěním CEM^gy iontovýměnnou chromatografií, jakje popsáno dýže. Alternativně, v podstatě čistý CEM^y mů-že být získán metodou známou v oboru.

Aktivované oligosacharidy mohou být kovalentně navázá-ny na nosičivý protein za přítomnosti organického rozpouš-tědla a popřípadě dalšího činidla /jako je kondenzační či-nidlo/ za účelem podpory spojení terminálních funkčníchskupin / aktivovaného oligodacharidu k proteinu, ^e speci-fickém, výhodném provedení podle vynálezu, aktivovaný oli-gosacharid nesoucí terminální esterovou skupinu může býtkovalentně navázán na volné aminoskupiny, které jsou pří-tomny na proteinovém nosiči následovně: -24-

Aktivovaný oligosaeharid může být rozpuštěn v dimethyl-sulfoxidu a pak přidán do vodného roztoku proteinového no-siče /například, ale bez omezení, do CRM^q? v koncentra-ci asi 2 mg/ml/ tak, že molární poměr monoester-aktivo-vaný oligosacharid/celkové aminoskupiny v proteinovém no-siči je asi 1:2 a konečná koncentrace E&amp;1SQ je asi 50 %obj./obj. Xonjugační reakce se provádí při 4 °C a ačkolivje reakce téměř kompletní za asi 2 hodiny, je vhodné ne-chat reakci probíhat přes noc za účelem zvýšení výtěžkureakce na nejvyšší hodnoty pro každý typ specifického gly-kokonjugátu. ^akto získaný glykokonjugát se pak čistí gelo-vou chromatografií.

Pro syntézu monovalentní vakcíny může být k proteinukonjugován oligosaeharid získaný z jednoho serotypu bak-terie. Pro syntézu multivalentních vakcín, mohou být gly-kokonjugáty získány připojením směsi oligosacharidů, získa-ných s bakterií různých druhů nebo rozdílných šerotypů, kproteinovému nosiči. Alternativně, glykokonjugáty získanéreakcí jednoho typu oligosacharidů s proteinovým nosičemv separátních reakcích za použití různých oligosacharidů,mohou být smíseny. i4ultivalentní vakcína může obsahovatproteinový nosič, nesoucí homogenní nebo heterologní popu-laci připojených oligosacharidů.

Ověření imunogenicity glykokonjugátů produkovanýchvýše uvedenou metodou může být testováno na vhodném zvíře-cím systému dříve, než budou podány lidem, itfezi tato zví-řata patří/bez omezeni na ně/ králíci,prasata, morčata, my-ši, krysy nebo kozy. Ve specifickém provedení vynálezu mohoubýt králíci /přibližně 2 kg/ podkožně naočkováni glykopro-teinovými konjugáty za nebo bez přítomnosti aluminiumfosfá-tu nebo hydroxidu. Přibližně 2,5 /Ug oligosacharidů vytvo-ří dávku pro 2kg králíka. Titr protilátek pak může býthodnocen testem ELISA nebo jinou metodou v oboru známou.Protože protilátky, vytvářené ke glykokonjugátům podle vy- -25- nálezu mohou být neschopné imuneprecipitace antigenu,nejsou doporučovány pro zjištění titrů protilátkovézkoušky, závislé na imunoprecipitaci.

Vhodným nosným mediem pro formulaci vakcín jsou sali-nický roztok ^ufrovaný fosforečnanem sodným /pH 7,4/ nebo0,125M gel fosfátu hlinitého suspendovaný v salinickémroztoku pufrovaném fosforečnanem sodným na pH 6 a jináběžná media·

Obecně, vakcíny, obsahující od asi 5 ao asi 100 /Ug,výhodně asi 10 až 50 ^ug oligosacharidu, jsou vhodné prozvýšení účinné hladiny protilátek proti kapsulárním po-lymerům u mladých teplokrevných savců. xochopitelně, přes-ná dávka bude určena rutinními experimenty dávka/odpověčí.Koncentrace glykoproteinových konjugátů pro přípravuvakcín pro děti je zahrnuta v rozmezí 25 až 200 ^ug oli-gosachsridu. Větší dávky mohou být podávány na základě tě-lesné hmotnosti. U několika menších dávek podávaných postupně se očekávají vyšší účinky než u stejného množství kon-jugátu podaného v jedné injekci.

Vakcíny podle vynálezu mohou být podávány teplokrev-ným savcům jakéhokoliv věku a jsou zejména přizpůsobeny kindukci aktivní imunizace proti systémovým infekcím u mla-dých savců, vyvolaný patogeny Baemophilus influenzae typ b,Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Neisseria me-ningitidis a Pseudomonas aeruginosa.

Podle vynálezu mohou být vakcíny podávány subkutánně,intravenozně, intramuskulárně, intraperitoneálně, orálně,nebo intranasálně. Vakcíny mohou obsahovat glykokonjugát vrozpuštěné nebo mikropartikulární formě nebo inkorporovanýdo mikrokuličen nebé mikrovesikul, včetně liposomů. -26-

Ve výhodných provedích podle vynálezu jsou glykokon-jugátové vakcíny namířené proti opouzdřeným patogenním bak-teriím použity pro ochranu citlivých jedinců před rozvi-nutím infekcí, způsobených těmito agens. '“ezi citlivé je-dince jsou zařazeny děti s nezralým imunitním systémem,aspleničtí jedinci jakož i další jedinci s oslabeným imunit-ním systémem nebo chronickou chorobou, zejména syndromemzískané imunodeficience /AIDS/, hematopoetickou maligni-tou, diabetem, chronickými srdečními chorobami, chronic-kými plicmími chorobami a srpkovitou anemií. Glykokonju-gáty podle vynálezu, podle síly jejich konjugace? na protei-nový nosič, zvyšují imunogenicitu oligosacharidů, kterénesou·

Tak mohou být glykokonjugáty podle vynálezu použityv očkování k získání ochrany proti infekci kteroukoliv zbakterií, která vlastní polysacharidové pouzdro, zahrnujícíStřeptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Esche-richia coli, Neisseria meningitidis, ^almonella typhi,Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, ^lebsiellapneumoniae, Staphylococcus aureus a Fseudomonas aerugenosa.Kmeny S.pneumoniae zvláště virulentní u dětí, specificképro tento vynález zahrnují typy 1,2,3,4,5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 a 33F.

Vakcíny podle vynálezu mohou být použity k indukcimonospecifické a homogenní imunitní odpovědi. Monospecific-ká imunitní odpověd je spojena s množstvím výhod, zahrnujícív to poskytnutí protilátek s i/ homogenní specifitou, ve které vlastně všechny protiláát-ky jsou namířeny proti specifickému epitopu a jsou charak-terizovány stejnou afinitou konstantní hodnoty, ii/vysokou afinitou konstantní hodnoty s vyšší antibakte-riální aktivitou, -27- iii/ zvýšenou cílovou specifitou a absencí křížové reak-tivity s hostitele se týkajícími antigeny a i v/ sníženouaktivací komplementu způsobenou snížením srážecí aktivi-ty monospecifických protilátek, takéo vedoucí k bezpečnévakcíně. Dále může být předložený vynález použit k produkcivakcín, které rozpoznávají peptidy nebo lipooligosacha-ridy nebo jiné povrchové oligosacharidové hapteny navá-zané, metodami podle vynálezu, na proteinový nosič, la-kové vakcíny mohou být například použity k indukci imu-nity k nádorovým buňkám, nebo v produkci protinádorovýchprotilátek konjugováných na chemoterapeutické nebo bio-aktivní činidlo. Aiti-nádorová aktivita může být vyvolá-na navázáním nádor-specifického antigenu, nebo jeho epi-topu, na proteinový nosič použitím metod podle vynálezu. Přiklad provedení vynálezu Vývoj multivalentní vakcíny pneumokokálních oligosachari-dových konjugátů 1. Příprava polysacharidu

Hapsulární polysacharid S.pneumoniae typ 6 A, kapsulární polysacharid S.pneumoniae typ 14, kapsulární polysacha-rid S.pneumoniae typ 19P a kapsulární polysacharid- S.pneumoniae typ 23F byly získány z AneriKan Type CultureCollection. 2. Hydrolýza polysacharidu

21. Hydrolýza polysacharidu S.pneumoniae typ 6A

Dva miligramy kapsulárního polysacharidu typu 6A S.pneumoniae byly rozpuštěny v 1 ml vodného roztoku, obsa-hujícího 10 mži kyseliny octové o pH = 3,4, pak hydrolyzo-vány v zatavených ampulích ponořených do olejové lázně při -28- teplotě 100 °C po dobu 30 hodin. Výsledné oligosacharidybyly pak odděleny z re akční směsi chromatografií přesSephadex G15 /Pharmacia, Uppsala/ kondiciovaný 15 mM roz-tokem ^aCl při pH 7,0 a 4 °C.

Chromatografické eluenty pak byly analyzovány postu-pem podle -^abata /1964 v "Experimental Immunochemistry”,vyd.S. A.ftabat a Mpyer, str. 538-541/, Chen a spol. /1956,Aial.Chem. 28:1756-1758/ a Porra a spol. /19817 Aial.Biochem118:301-306/ pro zjištění přítomnosti methyl-pentóz, fos-foru a redukujících skupin, např. aldehydových skupin. Aia-zou byl zjištěn poměr methylpentoza/aldehyd 3,96, methyl-pentoza/fosfor 0,96 a fosfor aldehyd 4,12.

Gelová chromatografie na Sephadexu G-50 Superfine/Pharmacia/ za použití pufru potvrdila distribuční konstan-tu /kd/ 0,538 /hexozou/, odpovídající molekulové hmotnostipřibližně 2,500. NMR, plynová chromatografie a stechiometrická analýzyindikují, že oligosacharidy obsahují asi 3 až 4 základníopakující se jednotky, mezi kterými byla nalezena galakto-za, která je imunodominantním cukrem. 2.2. Hydrolýza polysacharidu S.pneumoniae typ 14

Lva miligramy kapsulárního polysacharidu typu 14 S.pneumoniae byly rozpuštěny v 1 ml vodného roztoku, obsa-hujícího 0,5 M trifluoroctové kyseliny, pak byly hydroly-zovány v zatavených ampulích ponořených do olejové lázněpři teplotě 70 °C po sedm hodin. Výsledné oligosacharidypak byly odděleny z re akční směsi chromatografií na Sepha-dexu G15 /Pharmacia, Uppsala/, kondiciovaném 15 mM rozto-kem NaCl při pH 7,0 při 4 °C.

Chromatografické eluenty pak byly analyzovány na ob- -29- sáh hexosaminu a aldehydu a bylo zjištěno, že poměr he-xosmaminu k aldehydu je 3,17. Plynová chromatografie astechiometrická analýza indikují molekulovou velikost od-povídající třem až čtyřem základním opakujícím se jed-notkám. Odstranění větvení galaktozy podle plynové chro-matografie bylo pod 10 %. Gelová chromatografie naSephadexu G-50 Superfine /Pharmacia/ za použití 15 mM NaClpři pH 7,0 zjistila pro oligosacharidy, distribuční kon-stantu /kd/ 0,30 definovanou jako celková hexoza.

2·3· Hydrolýza polysacharidu S.pneumoniae typ 19F

Dva miligramy kapsulárního polysacharidu typu 19F S.pneumoniae byly rozpuštěny v 1 ml vodného roztoku, obsa-hujícího kyselinu octovou /10 mM/, pH = 3,4, pak byly hyd-rolyzovány v zatavených ampulích ponořených do olejovélázně při teplotě 50 °C po dobu třicetdevět hodin. Výs-ledné oligosacharidy pak byly odděleny z reakční směsichromatografií na Sephadexu G-15 /Pharmacia, Uppsala/,kondiciovaném 15 mM roztokem NaCl při pH 7,0 při 4 °C.

Chromatografické eluenty pak byly analyzovány postu-py podle Kabata /1964, v "Experimental Immunochemistry”,vyd E.A.Pabat a Mayer, str. 538-541/, Chen a spol. /1956,Aial.Chem. 28:1756-1758/ a Porroa spol. /1981/, Aial.Biochem. 118:301-306/ pro zjištění přítomnosti methyl-pen-toz, fosforu a redukujících skupin, např. aldehydovýchskupin, •‘ftalýza zjistila poměr methyl-pentoza/redukovanámethylpentoza 3,5 a poměr methyl-pentoza/fosfor 3,2.

Gelová chromatografie na Sephadexu G-50 Superfine/Pharmacia/ zjistila oligosacharidovou Kd=0,46 /celko-vá hexoza/ a kombinovaná analýza plynová chromatografie astechiometrie potvrzují velikost odpovídající třem ažčtyřem opakujícím se jednotkám. -30-

2.4. Hydrolýza polysacharidu S.pneumoniae typ 23F

Dva miligramy kapsulárního polysacharidu S.pneumo-niae typ 23F bylo rozpuštěno v 1 ml vodného roztoku 0,25Mkyseliny trifluoroetové,pak hydrolyzováno v zatavenýchampulích ponořených v olejové lázni při teplotě 70 °C podobu tří hodin. Vzniklé oligosacharidy byly pak z reakčnísměsi odděleny chromatografií přes Sephadex G15 /Pharma-cia, Uppsala/ kondiciovsný 15 mM roztokem haCl při pH = 7,0 při 4 °C.

Chromatografické eluenty pak byly analyzovány postupypodle &amp;abata /1964, v MExperimental Immunochemistry,", vyd. E. A.Rabat a Meyer, str. 538-541/, Chena a spol./1956, Aial.Chem. 28:1756-1758/ a Porroa a spol. /1981, Aial.Eiochem.118^301-306/, pro zjištění přítomnosti methylpentoz, fos-foru a redukčních skupin, např. aldehydových skupin. Aia-lýza zjistila poměr hexoza/aldehyd 4,5 - 4,5, poměr hexoza/methylpentoza 2,3 a poměr fosfor/ aldehyd 2,9.

Plynověchromatografická a stechiometrická analýzapotvrzují přítomnost mezi 3,5 a 4,5 základními opakujícímise jednotkami.Odstranění rozvětvení rhamnozy bylo podleplynové chromatografie menší než devět pročet.

Uelová chromatografie ne °ephadexu G-50 Superfine/Pharmacia/ stanovila distribuční konstantu /Xd/ 0,38 /ja-ko hexoza/. xmunochemická charakteristika oligosacharidových haptenů S.pneumoniae

Schopnost oligosacharidů typu 6A, 14, 19F a 22F S.pneumoniae reagovat s protilátkami namířenými proti intaktnímkapsulárním pólysacharidům byla testována, jak je popsáno -31-

Porroem a spol. /1985, Mol.Immunol.22:907-919/, použitímtechniky, která měří schopnost haptenu /tj. oligosachari-du/ inhibovat homologní antigeny /kapsulární polysachari-dy/ v protilátkoví imunoprecipitační reakci /nízká mole-kulová hmotnost haptenů nedává imunoprecipitační reakcipři testování na homologní protilátky/.

Metoda nazývaná "diferenciální elektroforéza" bylaprovedena následovně: detičkový nosič z plastické hmoty proimunoelektroforézu obsahuje tři 1% /hmotn./obj,/ agarozovékompartmenty /^garoza M-LKB, Bromma, švédsko/. První kom-partmen obsahuje 0,05 % /obj./obj./ referenčního antisérake kapsulárnímu polysacharidu. Druhý kompartment obsahu-je 0,05 % /obj./obj./ referenčního antiséra ke kapsulární-mu polysacharidu, který byl před tím inkubován se známýmmnožstvím referenčního kapsulárního polysacharidu při 37 °Cpo 15 minut. Třetí kompartmenfobsahuje 0,05 % /obj./obj./referenčního antiséra ke kapsulárnímu polysacharidu, kterýbyl dříve inkubován se známým množstvím oligosacharidové-ho haptenu.Pak byla provedena elektroforetická separacekapsulárního polysacharidu ve čtyřech pokusech dvojnásobněředěných roztoků při 70 V/cm ve 20 mM tris-barbiturátovémpufru, pH=8,8 po dobu 90 minut, ^o elektroforéze bylydestičky vybarveny stříbrem, sušeny a vyhodnoceny. Inhi-bice oligosacharidovými molekulami byla zjištěna při vyš-ším "raketovém" imunosrážení, které se objevilo v kompart-mentu, obsahujícím referenční antiséeum pře-inkubováné shaptenem. minimální inhibiční koncentrace haptenu byla vy-počtena jako aICHa = CHa 7^hHa kde CHa = koncentrace haptenu zkoušená v gelu h^g = úsek na přímce stanovený jako výška získaných "raketových" imunoprecipitátů, jestliže byl v gelu referenční antigen a -32- ^Ha = na determinovaný výškou “raketových" imunoprecipitátů, získanýchjestliže byl zkoušený hapten v gelu.

Byly testovány oligosacharidové hapteny různé veli-kosti.

Schopnost oligosacharidů blokovat imunoprecipitacikapsulárních polysacharidů specifickými protilátkami by-la také testována neelektroforetickou metodou radiálníimunodifuze. ^odle této metody inhibice oligosacharido-vou molekulou byla zřejmá z většího poloměru imunopreci-pitátu vytvořeného difúzí antigenu /kapsulárního polysacha-ridu/ 1 % hmotn./obj. agarozou, obsahující specifickouprotilátku předem ínkubovanou s daným množstvím inhibitoru/oligisacharidu/. Jakmile je experimentálně nalezena mini-mální slučovací koncentrace /Minimal Combining Concentra-tion - MCC/, vypočte se specifita podle uvedeného vzorce:

Specifita = MC%/Ps/

MCC

Ha/oligo/ -33-

Tabulka III

Imunochemická charakterizace oligosacharidových haptenů S.pneumoniae

Oligosacharid

typ MH

6A 2 1,5-K

3.5 2,5K

10 7,OK

14 5 3,5K

15 10,4K

19F 3,5 2,2K

23F CH^COOH/hyd/ 3 2,3K

6 4,5K

TFA/hyd/ 4,5 3,4K

9.5 7,2K n.t. - netestovatelné

34ICps/MICHp/ AiccpsAiccHp/DIEP IRID 10’3 10’3 10"1 10“3 XI · t · 10"1 n.t. 10'1 ΙΟ’3 10~4 ,0-3 10”2 10’1 10"1 10”4 5x1 o“3 10“1 10"1 DIEP = diferenciální imunoelektroforéza IRID = inhibice radiální imunodifuze MIC - minimální inhibiční koncentraceMCC - minimální spojovací koncentrace

Aktivace koncové redukující jednotky oligosacharidů S.pneumoni ae.

Oligosacharidové hapteny, získané výše, byly rozpuště-ny ve vodě na konečnou koncentraci asi 5 mg/ml. Ke každé-mu roztoku byl na každý mililitr objemu roztoku přidán 0,1ml 0,2 M dihydrogenfosforečnanu draselného a pH bylo zvý-šeno na 9,2 až 9,4 potřebným množstvím diaminomethanu /obec-ně je vyžadován objem 2 /Ul diaminomethanu na každý mili-litr roztoku/. Směs byla udržována na 100 °C 15 minut, potéto době bylo přidáno množství asi 4 ^ul pyridinboranu nakaždý mililitr objemu roztoku. pH bylo upraveno na 9,2 1N -34- hydroxidem sodným. Směs pak byla přehesena v zatavenéampuli do olejové lázně udržované na 50 °C pro příštích48 hodin, Rotom byl aminoaktivovaný oligosacharidový roztokneutralizován 1N HC1 a čištěn na Sephadexu G-15 Superfi-ne /15 mM NaCl, pH 7,01/. Oddělené chromatografické frakcebyly spojeny a lyofilizovány. Rak byl lyofilizovaný zby-tek rozpuštěn v DMSO na koncentraci 10 mg/ml a přidán kmolárnímu množství SIDEA /nebo SIDES/, odpovídajícímu5:1 mol/mol poměru s ohledem na množství aminoskupin pří-tomných v lyofilizované sloučenině. Reakce probíhala přiteplotě místnosti po 4 hodiny a pak byla přidána k roztoku4 objemu 1,4-dioxanu /konečná koncentrace 80 % v 1,4-di-oxanu/ za účelem vysrážení esteru aktivovaného oligosacha-ridu. Sraženina oddělená odstředěním byla promyta třikrát1 ,4-dioxanem a udržována při -20 °C nebo nižší než bylapoužitá teplota v konjugačním proce^su. Výtěžek aktivační-ho procesu pro každý ze čtyř oligosacharidů je uvedenv tabulce TV.

xabulka IV .Aktivace oligosacharidu S.pneumoniae: výtěžek procesu/% hmotn./hmotn./ Šero typ oligo-NH/CH^^N^ oligo-NH/CHg/gNH-mono- ester obecně 6A 75 93 70 14 73 90 ^6 19F 100 100 100 23F 50 90 45 Xg/+s.od./ 74,5/+20/ 93,3/+4,7/ 70/+23/ -35-

Konjugace aktivovaného oligosacharidu k CRM^ ^proteinuPříprava CRM^? proteinu CRM1O7, produkovaný Corynebacterium diphtheriae C7tx-197/' /B /t byl oddělen z kultivačního media molekulární filtrací za použití membrány Millipore XM-50 /NMWL 5x10“^/.Protein byl pak vysrážen přidáním nasyceného roztoku sí-ranu amonného k filtrátu /až 65% hmotn./obj./. Vysráženýprotein byl oddělen odstředěním a znovu rozpuštěn v 0,01Mfosfátovém pufru /pH=7,2/. -^alší čištění CRM^? bylo provedeno iontovýměnnouchromatografií za páužití 2,5 x 100 cm DEAE -Sepharose6B/CL sloupce /Pharmacia, Uppsala/ kondiciovaného v 0,01Mfosfátovém pufru při pH 7,2, za použití 0,09M NaCl v 0,01Mfosfátovém pufru jako elučním činidle. SDS elektroforéza na pólyakrylamidovém gelu za redukč-ních podmínek /Pappenheimer a spol., 1972, Immunochem, 9 i891-906/ indikuje, že 80 % získaného CEM^? bylo ve své na-tivní molekulární formě. Čistota proteinu byla přibližně400 flukulačního limitu /Lf/ na miligram.

Konjugace aktivovaných oligosacharidů

Konjugační proces spočívá ve spojování; monosukcin-imidylesterem aktivovaných oligosacharidových haptenů kepsilon-aminoskupině lysinových zbytků nosičového proteinu

Dimethylsulfoxid, obsahující monosukcinimidylesterem/adipové kyseliny/ aktivované oligosacharidy S.pneumoniaetyp 6A, 14, 19F a 23F kapsulárních polysacharidů byl pakpřidán k 0,1M hydrogenuhličitanovému roztoku pH=8,0, obsa-hujícímu 2 mg/ml pro přípravu, který byl 50% ve vodě a ve kterém je molární poměr esterem aktivovaného oligosa-charidu k nosičovému proteinu 1:2. -36-

Takto získaná směs byla udržována za mírného míchá-ní při 4 °C po 15 hodin. Oligos acgaridy každého ze čtyřserotypů byly konjugovány na protein v oddělených reak-cích. Shrnutí fyzikálně-chemických charakteristik získa-ných oligosacharidů je uvedeno v tabulce V.

Tabulka V

Charakteristika glykokonjugátů

Šero typ LP oligo MHoligo SíRkonjugátu SD /SDSxPAGE/ /mol oligo/ mol protein#/hmotn./hmotn./ konj. ___prot. 6 A 3 2,1K 77,6K 7 100 14 5 3,5K 85,1K 6 100 19P 3 1,9K 69,2K 4 100 23F 6 4,5K 85,OK 5 100

Porovnání účinnosti konjugace používající jako linkerusukcinimidyldiesteru adipové kyseliny a sukcinimidyl-diesteru jantarové kyseliny .Aktivované oligásacharidy vzniklé reakcí se sukcin-imidyldiesterem jantarové kyseliny /SIDES/ měly strukturu O 0 Q U _ oligos acharid-NH/CH2/2NH-C/CH2/2C-O-N f oz zatímco oligosacharidy vzniklé reakcí se sukcinimidyl-diesterem adipové kyseliny /SIDE/ měly strukturu -37- 0 O - o 1 igo s ac h arid-NH/C Ho/o NH-C /CH„/, C - 0-N2 2 2 4 \ a získávají se tak vazby různé velikosti mezi oligosa-charidem a konjugovaným proteinem /viz obr.2/. Eýla hodno-cena účinnost konjugace používající SIDES a SIDEA aktivo-vané oligosacharidy. Jak je uvedeno na obr.3-A, B a C, jedině když vazba byla odvozena od SIDEA zdál se být proteinv plně glykosylované formě /nebyly detegovány žádné nebomálo volných vazeb CRM^^/.

Imunogenicita glykokonjugátů S.pneumoniae

Bylo připraveno několik přípravků ze čtyř glykokon- jugátů antigenů a testováno na králících / podle seznamuuvedeného v tabulce VI/:typově specifické glykokonjugá-ty v monovalentním přípravku /2,5 nebo 5,0 ^ug oligosacha-ridu na dávku/ nebo multivalentním přípravku /2,5 /Ug kaž-dého oligosacharidu na dávku/ s a bez hydroxidu hlinitéhojako minerálního adjuvans / pouze v multivalentním pří-pravku v dávce 1 mg byl podáván/. Xompletní absorpce čtyřglykokonjugátů k hydroxidu hlinitému se vyskytla za zvole-ných podmínek, poněvadž zpracování supernatantu multiva-lentního přípravku bu5 elektroforézou SDS na polyakryl-amidovém gelu nebo raketovým imunoelektroforézou nezjisti-lo žádné detegovatelné množství volného proteinu, průměrnádávka každého glykokonjugátů, obsahuje přibližně 2,5 yugoligosacharidu a 13 /Ug nosičového proteinu /srov- natelné s průměrnou dávkou lidské vakcinace difterickýmtoxoidem/. imunizační soubor zahrnuje primární dávku a dvěboosterové dávky po 4 týdnech. Odběry krve byly provedenyv týdnu 0, 4, 6 a 10. -38-

Tabulka VI

Imunizační soubor pro králíky a myši a dávky vakcínIminuzace v týdnu 0, 4, 8odběr krve v týdnu 0,4, 6, 10 A. Rozpustný monovalentní /jeden typ/ přípravek 1 dávka /0,5 ml/: 2,5 /Ug oligosacharid a 13 /ug /5 Lř/ CRM197 1 dávka /0,5 ml/: 5,0 /Ug oligosacharid a26 /Ug /10 Lf/ CRM197 B. Rozpustný polyvalentní /směs 4 typů/ přípravek 1 dávka /0,5 ml/t 2,5 /Ug typově specifický oligo /Tot χ 10 /Ug oligos/ a celkem 52 /Ug/20 Lf/ CRM197 C· Al/OH/^-ads polyvalentní /směs 4 typů/ přípravek 1 dávka /0,5 ml/: 2,5 /Ug typově specifický oligo /Tot = 10 /Ug oligo/ a celkem 52 /Ug/20 Lf/ CRM197 s 1 mg AL/OH/^ -39-

Tabulka VII představuje RIA /FARR metoda/ hodnocenémnožství typově specifických protilátek jakož i počet od-povědí na počet imunizovaných zvířat. Poměr /R/ indikujenásobek zvýšení dosažený po každé imunizační dávce.

Tabulka VIII představuje ELISA titry vyjádřené jakoIgG isotyp Ab §akoŽ i počet odezev na počet imunizovanýchzvířat. Poměry -R^ -R2 -R^ znamenají násobek zvýšení titrůpo každé imunizační dávce, zatímco poměry R^, -Rg, -R^indikují násobek zvýšení v titrech pro danou imunizačnídávku vzhledem k pře-titru. Tabulka IX uvádí kvalitativnívýsledky jako fuknci indukovaných IgG protilátek v pozná-vání pólysacharidové kapsule žijících streptokoků /Quellungreakce nebo Nuefeldův test/.

Tabulka X ukazuje neutralizační titry difterickéhotoxinu indukované u králíků proteinovým CRM^y nosičem,podle zkoušky Věro buňkami. I když jako kontrola bylo po-užito referenční PDA antisérum, mohou být také titry vyjád-řeny v yu/ml. -40- * * ¢+ * * Mi ¢+ 9 σκ X * t-' t-0 N O Px * t 0 <+ Ml 0 O X X 0 0< 0 Ο» o H 0 0 0 9 c+ 0 co X rtx OH P- ¢+ <J T3 P- PST —> os X O X O< O -P® > —* a 0 CJ. CJ. O O PT bJ OX l·—1 co 0X o 03 0 < Φ o a c+ ftx 0 X pr 0 0 0< X cr CJ. IV —» 0 0 c+ φ n o 0 bJ vO OH 0 < 0 CK5 03 P® 0 —* 0 0® 0 O N -p® 0 c+ O O 0 0 0 OX CJ. o H> H O 9 0< < 0 on ¢+ c+ P- Ρ- <+ 0 P® o pr H φ X 0¾ ΟΗ Φ X 0 0 o X P- 0 O o P- ♦ 0 Pt PT 0 co CO 0 0 QX OH O 0 Os 03 0 0 < o Φ Pš* > O o 0 PT 0* O O X 0* 0* O N< X • 9 9 9 0 0 0 a Φ CJ. o 0® 0 0 S X O t-r 0 H P- P- —» c+ 0 OH X 0 0. a VO OH X P- 03® 9 0 0® 0® X P* 0< o t+ o 0® • X pr 0 H 9 9 9 ΡΓ OH X® X φ< OX OX H o P CJ. 0 9 pr X 0 Φ 4 0 0 0 o Pf 0 O X® 0 0 § 0 o 0® Os <$ 0® 0® P- CJ. Pí* 9 w 0 CO 9 9 N 0 o φ< X® c+ σκ φ< 0 OH 0 0 *0 0 0 0 O 0X CJ. 0 -0 0 Φ t+ 0 C+ o • Φ til til OH P- % 0 < ta 01 O OX c+ <+ II II cr «+ 0 X CO VI bJ f+ co 0® 0® Ό 0 X® 03 cr Cb 0· «1 <1 co 0 0 uo c+ 0 CJ. 0 0 P· Φ o 0Π ct- O N 3 -p® 0 O - 0 0 n 0 £ 03 Φ -P® 0® CO X 9 r+ 9 0 X 0 Φ< 0 R 4 Ml 0 Φ® • O t* VO 0 X • (TX 0 řc c+ φ X O < no •t. co 0 P> X w R 0 Ρ- pr VI X O no ΟΗ 0 o 0 Co O < X w a co OX 0 X φ 0) o OH bJ 0 VI o φ , rf- • 0· 0 O 0 P- P® H a % Ρ- co <J P- ΟΗ o CO a O 0 • 0® í+ co CT X® 0 o o 0 Cb o Φ 0 0 0* 2 H 0 0 0 pr CJ. 0 Φχ o Φ O P- a a H> 0 0 O O +® 0 "0 c+ 0 9 O pr Φ< fX 0 os *0 Φ 0 c+ 03 0® ι

c+ c+ rh rh Os ití X X H 03 0 0 O T3 σ 0 no —A —A os —* 0* P> b? M0 -P® > -P® O pr 0 0 a •“J ω -A w o < so o H Φ H 0 0 0 0 0 c+ W Φ® • • • • X® o no a a a a a N b c+ • • • • φ ti ►0 P- 0 0 t+ Cfl Pť 0 O f+ o X 0 <S * 03® 03 H pt 0 0 0 0 Hj Φ 0 • • • • -P® O 0 23® a a a a 0 <+ H • • • • 9 0 P® 03 rtx P? 0® -P® no —* O 0 bu VI a P- o • o o Os N 9 X a X X a 0 «α • —X no Φ 0 X X X X® P- os σ\ OS o N X X X 0* O _A _A -P® 0 —4 2 -P® X M0 SO 03 0 o VI VI VI —A X® X X X X 0 o —* OS no OS O 0* X X X X CO * vi os Os Os P- * X X X X m o O < t-1 X® Ρ- c+ ΟΗ 0 0 0 0 X® Ό O • • • • a 0 CO a a a a φ O 0 • • • • 0 c+ O Φ cr O P- 03 0 0 P- Η» O a no VI O S X 00 X X bo 0 * bJ no X 00 9 —-* * X X X X -F® 03 SO Mi bJ OS bd VI X X X X X CO M Os cn OS VI • X X X X O •Ό ►-i bJ P- Φ *· a 0 0 w —A w no W Os * 9 • II O II o II SO o a —X 00 no bú o O X 0 • X «« X X R ρ- v σ\ •P® VI X ω X X X O φ v VI VI ps X X X c+ -P® — t J X —» Ό no W —» W no o -P® II 00 II —A II OS Os —X 00 —x Os -P® X *· X X «· X VI -q VI VI bJ VI X X X X VI VI VI VI X X -41-

Tabulka VIII ELISA výsledky IgG isotypu Ab titrů* indukovaných multi-valentní vakcinou, obsahující glykokonjugáty S.pneuminiaeDP=3+6 kapsulárních oligosacharidů typ 6 A, 14, 19F, 23F,adsorbované na minerální přísadu Al/OH/^

Pre-titr počátek l.booster 2.booster /týden 0/ /týden 4/ /týden 6/ /týden 11/

typ 6 A Z 50/0/5/> 96,0 4,800/5/5/ 51,200/5/5/ 130,000/5/5/R2=10,7 /^< 0,01/ R3=2,5 /^<0,01/ R*>1 ,027 R^ > 2,600 typ 14

typ 19F < 50/0/5/ 360/5/5/ 4,480/5/5/ 19,0Q/5/5/

Rj>7,2 Rp=12,4/<«0,01/ R.=4,4 Λ* 0,01/ R*> 89,3 R’>396,0 <50/0/5/ 2,080/5/5/ 18,560/5/5/ 35,200/5/5/ R1>41,6 R2=9,0 0,01/ R3=1,9A< 0,01/ R*>371,2 R*> 704,0 typ 23F < 50/0/5/ ^>17,6 880/5/5/ 1,280/5/5/ 11,880** R2=1,5 /<<0,01/ R3=9,3 /«0,01/r'>25,6 R3> 237,6 *Titry vyjádřeny jako geometrický průměr reciproční hodnotynejvyššího ředění séra vykazující ABS hodnotu dvojnásob-nou vzhledem k reakčnímu základu. 7 závorkách je uváděnpočet zvířat /respondenti k celkově injektováným/. xxHodnota představuje titr neobvykle vysokých respondujícíchkrálíků. Vyřazením dvou z pěti imunizovaných králíků, nej-lepšího a nejhoršího respondenta, jsou získány výsledkyzbylých tří králíků pro serotyp 23F: -42-

Pokračování k tabulce VIII: týden 0 týden 4 týden 6 týden 11 "50/0/5/ 667/3/3/ 1,333/3/3/ 2,667/3/3/ H1>13,3 fi2=2,0 /o<< 0,01/ R3= 2,0 /*< 0,01/ *2^26,7 R^>53,3

Tabulka IX

Imunologická funkčnost králičího séra 4b k SP=3-6 oligo- konjugovaným k CRM Qr_

1 7 I kvalitativní analýza /potlačení reakce* pro kapsulární zjištění/ typ 6A S.pneumoniae: pozitivní reakce typ 14 S.pneumoniae: pozitivní reakce typ 19P S.pneumoniae: pozitivní reakce typ 23? S.pneumoniae: pozitivní reakce x?rovedeno podle metody Aistriana /1976/, Mt.Sinai J.med43:699-709. -43-

Tabulka X 4itidif terické titryK ve zkoušce vero buňkami, indukovanéu králíků imunizovaných multivalentními glykokonjugátysyntetizovanými s oligosacharidy S.pneumoniae kovalentněpřipojenými k nosičovému proteinu CRM^Oy rozpustná forma < 10

Pre-titr počátek l.booster 2.booster /týden 0/ /týden 4/ /týden 6/ /týden 11/ ^L/OH/3-ads <10 FDA ref.antisérum obsahujenu při ředění 1/8000. < 10 25 /0,019 1 ,920/1 ,4 /u/ml/ /u/ml/ R=2,5 R=77,0 20 1,280 3,840 /0,015 /u/ml/ /2,9 /u/ml/ R=64,0 R=3,0 6 /u/ml a poskytuje 50% ochra- x Titry vyjádřeny jako reciproká hodnota ředění,ke které- v mu pool antiséra vakazuje 50% ochranu k buňkám,3ak oehodnoceno H-leucineatou inkorporací po vystavení buněkdifterickému toximu. čísla v závorkách znamenají titry v /u/ml stanovenéza použití FDA referenčního antiséra jako kontroly. -44-

Qligosacharidy délky řetězce SP = 10-20 jsou sub-optimálně imunogenní. ^ly syntetizovány dvě skupiny vakcín glykokonjugá-tů v souladu se schématem syntézy, popsaným supra, ale zapoužití sacharidů typu 6A, 14, 19F a 23F S.pneumoniae sedvěma různými "rozsahy hodnot" délky řetězce a to SP = 3-5 a BP= 10 - 20. Otázkou pak je, zda oligosacharid s délkouřetězce SP= 20 nebo více, bude také optimálně imunogenní /přikonjugaci na selektovaný CRM^y proteinový nosič/ ve vzta-hu k počátku a zvýšení schopnosti ve srovnání s mnohem krat-šími řetězci, jako jsou SP = 3 oligosacharidy.

Králíci byli imunizováni podle protokolu popsa-néhov tabulce VI. Jak vyplývá ze srovnání výsledků uvedenýchv tabulkách XII a XIII, které se týkají výsledků ELISA IgG iso-typových antigenních titrů, indukovaných rozpustnými oli-gosacharidy S.pneumoniae s SP= 10-14 a 5P= 3-6, jakož itěmi, které jsou uvedeny v tabulkách XIV a XV, které setýkají výsledků ELIS A IgG titrů isotypových protilátek in-dukovaných oligosacharidy S.pneumoniae s SP = 10 - 14 aSP= 3-6,adsorbovaných na 4L/0H/^, SP=10-14 nebylo spojenose zvýšením imunogenicity. Fextern je, že vyvolání a zvýše-ni aktivity IgG SP=3-5 oligosacharidovými konjugáty bylomnohem větší, než aktivita pozorovaná při použití oligo-sacharidových konjugátů SP= 10-14. Ne náhodou byly všechnyčtyři zkoumané karbohydrátové struktury spojeny se stejný-mi výsledky. Dále, neutralizace difterického toxinu glyko-konjugáty s BP= 10-14 byla shledána méně efektivní než ta,která byla dosažena použitám glykokonjugátů s SP= 3-6/tabulka XVI/. Tak oligosacharidy délky řetězce SP=10-20jsou funkční v konjugátech podle předkládaného vynálezu, ačko-liv oligosacharidy DP= 3-6 vyvolávají vyšší titry protilá-tek. -45-

Tabulka XI

Imunizační soubor pro králíky

Modely glykokonjugátů byly injektovány v dávce 2,5 /Ugkarbohydrátu. Poněvadž testované modely se liší pouze vdélce řetězce kovalentně spojených oligosacharidů, byloodpovídající množství proteinového nosiče: dávka kar- dávka pro-bohydrátu teinového nosiče /jjug/ //ug/ EP = 3-6 2,5 12,5 oligo-CRM^y EP = 10-14 2,5 2,5

Imunizace v týdnech ¢,4 a 8. ©dběr krve v týdnech 0,4 a 10. hmotn.po-měr /hmotn./hmotn./_ 0,2 1,0 -46-

Τεbulka XII ELIS A výsledky IgG isotypu Ab titrů indukovaných mul-tivalentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S.pneumonise ĎP= 10-14 kapsulárních oligosacharidů typ 6A,14, 19F, 23P v rozpustné formě

Pre-titr počátek l.booster 2.booster /týden 0/ /týden typ 6A <100 <100 typ 14 <100 300 typ 19F <100 <100 typ 23F * 100 <100 4/ /týden 6/ /týden 10/<1000 500 /2/5/ 2400/3/5/ 4600/3/5/-<100 <100 ^100 <100

Tabulka XIII ELIS A výsledky IgG isotyp Ab titrů indukovaných multi-valentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S.pneumoniae ĎP= 3-6 kapsulárních oligosacharidů typ 6A,14, 19F, 23P v rozpustné formě

Pre-titr počátek l.booster 2.booster /týden 0/ /týden 4/ /týden 6/ /týden 11/ typ 6A < 50 <200 967/6/6/R3= 8,8/<*< 8500/6/6/ 0,01/ typ 14 * 50 1800 3266/3/6/ 3650/4/6/ typ 19F <50 < 50 675/4/6/ 1750/6/6/ typ 23F < 50 < 50 <50 < 50 -47-

Tabulka XIV ELIS A výsledky IgG isotyp Ab titrů indukovaných multi-valentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S.pneumoniaetyp 6A, 14, 19F, 23F adsorbované na minerální

přísadu AL/OH/-J

Pre-titr počátek l.booster 2.booster /týden 0/ /týden 4/ /týden 6/ /týden 10/ typ 6 A <100V 2,4 240/5/5/ 900/5/5/ R2= 3,8/^< 0,01/ R*> 9,0 500/5/5/ typ 14 < 100 300/5/5/ 1040/5/5/ 8480/5/5/ Rp3,0 R2= 3,5 /«0,01/ Ry= 8,2/t<< 0,01/ R2>> 10,4 Rj>84,9 typ 19F <100 <100 400/1/5/ 800/1/5/ typ 23F <100 <100 <100 200/1/5/ -48-

Tabulka XV

Tabulka IV. ELIS A výsledky IgG isotyp Ab titrůx induko-vaných multivalentní vakcinou, obsahující gl.ykokonjugáty^.pneumoniae SP = 3-6 kapsulárních oligosacharidů typ 6A,14, 19F, 23? adsorbované na minerální přísadu Al/OH/^

Pre-titr/týden 0/ počátek/týden 4/ 1.booster/týden 6/ 2.booster/týden 11/ typ 6A <50/0/5/ 4800/5/5/ 51200/5/5/ 130000/5/5/

Rt>96,0 R2=10,7%C<0,01/R3= 2,5/oL< 0,01/ R*> 1 ,027 R'>2,600 typ 14 < 50/0/5/ 360/5/5/ 4480/5/5/ 19800/5/5/ R ? 7,2 R2=12,4A<O,O1/ R3=4,4/oÍ< 0,01/ R2>89,3 R3 >396,0 typ 19? 50/0/5/ 2080/5/5/ 18560/5/5/ 35200/5/5/

Rj>41,6 R2=9,0/« 0,01/ R3«1 ,9/Z< 0,01/ R2>371,2 R'>704,0 typ 23F 50/0/5/ 880/5/5/ 1280/5/5/ 11880/5/5/ R{>17,6 R2=1 ,5/^<0,0l/ R3=9,3/<<0,01/ R'->25,6 R* $237,6

Aitry vyjádřeny jako geometrický průměr reciproké hod-noty nejvyšsího ředění séra, vykazující A3S hodnotudvojnásobnou k reakčnímu základu. V závorkách je uvedenpočet zvířat /responednti k celkem injektovaným/. -49-

Tabulka XVI

In vitro neutralizace* difterického toxinu sérem krá-líků imunizovaných S. pneumoniae oligosacharid-CRM, i y t glykokon^ugáty

Pre-titr počátek 1.booster 2.booster /týden 0/ /týden 4/ /týden 6/ /týden 10/ ĎP= 3-6 oligo-CRM^yí rozpustný <1/10 <1/10 1 ,20 1/1,280 /0,03 0/ml/ /2,05 0/ml/ Al/OH/^ads <1/10 1/10 1/640 1/2,560 /0,016 0/ml/ /1 ,02 0/ml/ /4,10 0/ml/ ĎP= 10-14 oligo-CRlí^^: » rozpustný <1/10 <1/10 <1/10 1/10 /0,016 0/ml/ Al/OH/^ads <1/10 <1/10 1/40 1/80/ /0,06 0/ml/ /0,13 0/ml/ y

Titry vyjádřeny jako reciproké hodnoty ředění, jejichžpool králičího antiséra vykazuje 5O?6 ochranu k buňkám,hodnoceno podle ^H-leucinové inkorporace po vystavení bu-něk difterického toxinu. čísla v závorkách vyjadřují titryv /Ug/ml jak je stanoveno FDA referenčním antisérem jakokontrolou. říPL hodnoceno u lidí: 0,01 ^ug/ml -50- -‘munní odpověď ηε gl.ykokonjugáty je monospecifickáa homogenní. dorovnání výsledků uvedených v tabulce VII ε VIII,které se týkají protilátkových titrů určených pomocíradioimunoaňalýzy /RIA/ a pomocí testu ELISA odhaluje, žeRIA hodnocené titry byly nižší než ELISA hodnocené titry.Toto pozorování společně s absencí imunoprecipitátů v aga-rozovém gelu, užitém pro radiální imunodifuzi a "raketo-vou" elektroforézovou analýzu antiglykokonjugátového anti-séra, dokázaly, že králičí antiséra k S.pneumoniaeoligosacharid-CRM1αγ konjugéty, obsahují vysoce specifickéIgG isotypové protilátky, které byly nevhodné ke sráženívlastních čištěných karbohydrátových polymerů, použitýchke generování oligosacharidů.

Absence srážení protilátek v antiséru je indikací monospecificity, tj. protilátka poznává pouze jeden epitop vantigenním repertoáru dané molekuly /Berzofsky-Schechter, 1981,Molecular Immunol. 18:751-763/· Srážení antigen-pro-tilátkových komplexů potřebuje mřížkovou formaci ke genero-vání trojrozměrné, větvené sítě spojených molekul proti-látky a antigenu. ?ro výskyt tohoto je požadovaná multi-valenčnost jak protilátky tak antigenu, více než jednaprotilátka musí být schopna se nevázat na jednu antigennímolekulu současně. Nedostatek pozorovatelné imunoprecipi-tace ±xk, vyskytující se mezi králičím antisérem k S.pneumoniae oligosacharid-CRM^y konjugátům a homolognímčištěným kapsulárním polysacharidem vysoké molekulárníhmotnosti je výrazným indikátorem, že antiséra obsahovalaprotilátky specifické pro karbohydrátové polymery, jak uka-zuje ELISA a inhibiční ELISA analýzy/, ale řízené pouze najeden determint /epitop/ polysacharidu. -51- ^romě projevování imunoprecipitační aktivity je hete-rogenní populace protilátek také obyčejně spojena s násle-dujícími vlastnostmi: jednotlivý epitop antigenu užitýna vyvolání protilátkové odpovědi nemůže kompletně inhibo-vat vazbu celé pojbukace protilátek na kompletní antigen,ale bude inhibovat pouze ty protilátky, které jsou navázá-»ny na jeden epitop, nechávaje ostatní protilátky volně senavázat na zbývající epitopy přítomné na kompletnímantigenu. Populace protilátek může být hodnocena díky hetero-genitě ELIS A-inhibiční zkouškou. V této zkoušce je měře-na schopnost populace protilátek vázat se na kompletní anti-gen za přítomnosti inhibitoru vazby antigen/protilátky tak,jak izoluje epitopy antigenu. Znázorněno graficky, kdyžvazba protilátky na značený kompletní antigen je měřena zapřítomnosti zvýšené koncentrace neznačeného kompletníhoantigenu a je generována sigmaidální křivka, která můžebýt použita jako standardní křivka pro vazbu antigen/pro-tilátra. Jestliže je populace protilátek heterogenní, vaz-ba mezi protilátkou a kompletním antigenem může být plněinhibována přidáním jednoho antigenního epitopu a standardníkřivka vazby antigen/ protilátka je pouze částečně posu-nuta /částečně přesahující nebo částečně paralelní/ jakojiné interakce antigen/protilátka, zřejmé ze spojení stestovanými epitopy, převažuje. Opačně, vazba homolognípopulace protilátek na antigen může být plně inhibována při-dáním izolovaného epitopu; standardní vazebná křivka anti-gen/protilátka pro homologní populaci protilátek bude přesahující nebo paralelní ke křivce generované přidáním izolova-rného epitomu, odpovídajícímu populační specifitě.

Experimentálně, testováním S.pneumoniae glvkokonjugá-ty indukovaly IgG tímto způsobem, byla pozorována afinitavzorku, odpovídající té, která byla předpokládána pro ho-mogenní populaci protilátek /obr.4/. Gligosacharid 6A -52- S.pneumoniae /buď v konjugovsné nebo v nekonjugované formě/byl spojen sigmoidální křivkou vazebné inhibice přibližněparalelní s křivkou získanou použitím serotypu 6A kapsulární-ho polysacharidu s vysokou molekulovou hmotností. Jakbylo očekáváno, heterologní /typ 14/ oligosacharid, v buďvolné /linker-aktivované/ nebo konjugované formě, neinhibo-val IgG isotypovou populaci specifickou pro typ 6A antigenu.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ N i fi O K ϊ ¢££00

   1. Způsob přípravy kovalentního konjugátu oligosachari-du a nosičového proteinu, vyznačující s tím, že zahrnuje následující stupně: i/ reakci oligosacharidu, majícího terminální redukující seskupinu s diaminoethanem za přítomnosti pyridinbora-nu, takže probíhá reduktivní aminace, a ii/ reakci aminovaného oligosacharidavého produktu z od-stavce i/ s molekulou, obsahující dvě funkční skupiny,z nichž jedna je schopna reakce s terminální skupinouaktivovaného oligosacharidu a druhá je schopna reakce suvedeným nosičovým proteinem a iii/ reakci aktivovaného oligosacharidavého produktu zodstavce ii/ s uvedeným nosičovým proteinem takže do-chází ke spojení.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující setím, že reduktivní aminace se provádí při teplotě asi100 °C.
3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující setím, že reakce s pyridinboranem se provádí za teploty asi50 °C.
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující setím, že molekula, obsahující dvě funkční skupiny ze stup-ně ii/ je diester.
5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující setím, že molekula, obsahující dvě funkční skupiny ze stup-ně ii/ je diester adipové kyseliny nebo diester jantarovékyseliny. -54-
6. 6. Způsob podle nároku 1,2,3,4, nebo 5, v y z n a-Sující se tím, že oligosacharid je odvozen zeώtreptococcus pneumoniae kapsulárního polysacharidu.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující setím, že oligosacharid je odvozen od Streptococcus pneu-moniae, selektivního serotypu vybraného ze skupiny, zahr-nující typy 1,2,3,4,5,6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14., 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F.
8. 8. Způsob podle nároku 1,2,3,4,5,6,7,^ nebo 9, vyznačující se tím, že oligosacharid je odvo-zen od kapsulárního polysacharidu z bakterií vybraných zeskupiny, zahrnující Haemophilus influenzae, Nesseria menin-gitidis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella t.yphi, Escheri-chia coli, ‘-'treptococcus mutans, ^ryptococcus neoformans,Slebsiella pneumoniae a Staphylococcus aureus.
9. 9. Způsob podle nároku 1,2,3,4,5,6,7 nebo 8, vyzna-čující se tím, že nosičovým proteinem je CRM^y.
10. 10. Způsob podle nároku 1,2,3,4,5,6,7,8 nebo 9, vyzna-čující se tím, že nosičový protein je vybrán zeskupiny, zahrnující ^almonella flagelin, Haemophilus pillin,Haemophilus 15 kDa, 28-30 kDa nebo 40 kDa membránový pro-tein, Escherichia coli tepelně labilní enterotoxin LTB, dif-terický toxin, tetanový toxin, cholerový toxin, proteinrotaviru VP7 a protein respiračního syncytiálního viru F nebo G.