CN101778576A - 稳定化的花色素甙组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了稳定化的花色素甙组合物，制备该组合物的方法以及使用该组合物治疗不同痛苦的方法。本发明描述了含有花色素甙和促稳定化合物的独特的组合物，以使所述双组分的组合保证了所述的花色素甙不轻易地遭受降解，诸如氧化，pH值不稳定等等。

Description

稳定化的花色素甙组合物
相关文献的交叉引用
本申请要求下列专利申请的优先权：美国序列号12/047,993，2008年3月13日递交；美国序列号60/895,034，2007年3月15日递交；美国序列号60/952,113，2007年7月26日递交；美国序列号60/985,603，2007年11月5日递交；上述每一申请的内容通过引用的方式被完整地合并于此。
技术领域
本发明主要涉及用于使花色素甙和花色素稳定的方法和组合物。
背景技术
花色素甙是水溶性的颜料，其决定着众多的花朵、水果和叶片诱人的颜色。通常，它们可以通过酸化的含醇的溶剂从植物中提取得到，并且许多在商业上用作食物着色剂。他们经常被作为稀释剂的麦芽糊精稀释后供应，稀释后的浓度适合于饮料或其它食物，例如谷类食品。
花色素，花色素甙的糖甙配基部分，具有如通式I所示的基本结构。
Figure G2008800120877D00011
通式I
典型实例是：花青素(在3，5，7，3′，4′位羟基化)，翠雀素(在3，5，7，4′，5′位羟基化)和天葵素(在3，5，7，3′位羟基化)。羟基基团通常被糖基化(如花色素甙)和/或甲氧基化(如：二甲翠雀素在3′和5′位的羟基被取代，以及甲基花青素和3′-甲花翠素在3′位的羟基被取代)。
花色素甙是2-苯基苯并吡喃离子或花(色)
Figure G2008800120877D00012
盐的多羟基和多甲氧基的衍生物的水溶性的糖甙。个体的花色素甙在分子中存在的羟基基团的数目，这些羟基基团的甲基化程度，连接于该分子的糖的特性、编号和位置，以及该分子中连接于该糖的脂肪酸或芳香酸的编号和特性上有不同。数以百计的花色素甙已经通过光谱测定工具分离和化学表征。花青素和它们的衍生物是存在于蔬菜、水果和花朵中最普遍的花色素甙。
花色素甙共有一个基本炭架，氢、羟基或甲氧基可在其如上所述六个不同位置上被发现。在水果和蔬菜中，六个基本花色素甙化合物占主导地位，它们在位于炭环上的羟基基团数目和这些羟基基团的甲基化程度两方面有不同。连接于炭架的糖的身份、编号和位置也是变化的；可以连接于碳-3、碳-5，在某些时候的碳-7的最普遍的糖是葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖或半乳糖。在这个基础上，鉴别单糖甙、二糖苷和三糖甙是有可能的。
另一个重要的有助于区别花色素甙化学结构的变量是可能存在糖组成部分上的酰化的酸。最常见的酰化剂是咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和P-香豆酸，虽然脂肪酸，例如醋酸、苹果酸、丙二酸、草酸和丁二酸也能够发生酰化。直到三个酰化酸能够同时存在。
由于它们特殊的化学结构，花色素甙和花色素具有缺少一个电子的特性，这使它们对于活性氧基团或分子(ROS)，亦称自由基，很有活性；它们因此被认为是强大的天然的抗氧化剂。
花色素甙，部分地由于它们化学结构的特性，趋向于非稳定以及对降解作用易受影响。另外，花色素甙的稳定性受到pH值、为期数月的储存、储存温度、酶的存在、光、氧、以及蛋白质、类黄酮和矿物质存在的影响。
更特别地是，由于花色素甙对pH变化敏感，它们的生物利用率很低。花色素甙通常在pH值为3.5及以下是稳定的，因此在胃中是稳定的。然而，它们在较高的pH值下降解，比如对于肠道(pH＝7)较为典型的那些pH，因此有益的吸收和营养价值大大地减少。
所以，存在一种提供稳定化的花色素甙的组合物和/或方法的需要。
简要说明
本发明意外地提供了稳定的花色素甙组合物，制备这种组合物的方法，以及应用这种组合物治疗不同痛苦的方法。本发明提供了含有花色素甙和促稳定化合物的独特的组合物，这样，两个组分的结合保证了花色素甙不易遭受降解。直到本发明产生之前，众所周知，花色素甙将在暴露于环境应力下降解，例如空气、光、蛋白质或酶。更伤脑筋的是花色素甙在具有中性或碱性pH的溶液中的不稳定性。
本发明意外地提供了半胱氨酸与花色素甙组合物(无论它是花色素或花色素甙)结合的应用，相对于摄取没有半胱氨酸存在的花色素甙组合物的受试者，其促进增加了至少两倍数量的花色素甙向处于危急中的受试者的传递。已经意外发现，在有半胱氨酸参与下，4小时之后，被传递的花色素甙血药浓度的水平，是没有半胱氨酸参与下传递的花色素甙血药浓度的至少两倍。所以，通过让受试者服用有效量的花色素甙和半胱氨酸，本发明提供了一种提高受试者体内可生物利用的花色素甙数量的方法。给药可以任何方式，但通常优选口服。在一实施例中，花色素甙对半胱氨酸的比值为大约10∶大约1，以重量份计。
一方面，本发明提供了一种稳定化的花色素甙提取组合物，其包括一种花色素甙提取物和一种具有至少一个-SH基团的促稳定化合物。促稳定化合物的适当例子包括(还原态)谷胱甘肽、二氢硫辛酸、半胱氨酸、酵母提取物和其混合物。
虽然有差不多数以千计的花色素甙提取物，但其全部应被认为包括在本说明书范围内，一定行业的花色素甙提取物的恰当例子包括欧洲越桔提取物、黑醋栗提取物、蔓越橘提取物、黑大豆提取物、越橘提取物、蓝莓提取物和其两者或两者以上的混合物。
一方面，促稳定化合物对花色素甙提取物的比值为大约10∶大约1，优选大约0.5∶大约5，更优选大约1∶大约1。
另一方面，该稳定化的花色素甙提取组合物对于暴露于具有pH大约为2或更高的含水环境中的降解是稳定的，比如pH大约为3，pH大约为4，pH大约为5，pH大约为6，pH大约为7，pH大约为8，pH大约为9，pH大约为10，pH大约为11，pH大约为12乃至更高，如14。
另一个方面，该稳定化的花色素甙提取物是一种花色素甙。
另一个方面，该稳定化的花色素甙提取物是一种花色素。
在本发明其它方面，该稳定化的花色素甙提取物包括一种或多种花色素甙，说得更精确些就是花葵素、甲基花青素、花青素、二甲翠雀素、3′-甲花翠素、翠雀素的糖甙。
本发明也涉及制备所述的稳定化的花色素甙组合物的方法。
本发明进一步涉及不同疾病的治疗方法，该方法要求服用一定治疗性有效量的所述稳定化的花色素甙组合物。
因此，本发明进一步提供可生物利用的稳定化的花色素甙组合物。
虽然公开了多个实施例，根据以下详细说明，本发明仍将有其它实施例对本领域技术人员是显而易见的。因为将是显而易见的，本发明可包含不同的显而易见的方面的改变，均没有离开本发明的本质和范围。因此，详细说明将被认为在本质上是解说性的和非限制性的。
附图说明
图1提供了在1mMolar浓度的谷胱甘肽或DHLA溶液中花青素-3-O-葡糖甙缺乏红移的证据。
图2提供了在1mMolar浓度的谷胱甘肽或DHLA溶液中花青素-3-O-葡糖甙缺乏增色移位的证据。
图3提供了欧洲越桔提取物(不受保护的)中残留的花色素甙百分比。
图4提供了受DHLA保护的欧洲越桔提取物与图3中不受保护的欧洲越桔提取物中残留的花色素甙百分比的对比。
图5提供了受GSH保护的欧洲越桔提取物与图3中不受保护的欧洲越桔提取物中残留的花色素甙百分比的对比。
图6A-6D提供了DHLA保护的欧洲越桔提取物的降解动力学的比较。
图7提供了受谷胱甘肽保护或不受谷胱甘肽保护的翠雀素-3-O-半乳糖甙的比较降解动力学。
图8提供了受谷胱甘肽保护或不受谷胱甘肽保护的3′-甲花翠素-3-O-半乳糖甙的比较降解动力学。
图9提供了受谷胱甘肽保护或不受谷胱甘肽保护的翠雀素-3-O-半乳糖甙的比较降解动力学。
图10提供了受谷胱甘肽保护或不受谷胱甘肽保护的花青素-3-O-半乳糖甙在两个pH值下的比较降解动力学。
图11提供了受DHLA保护的欧洲越桔中15种花色素甙的降解对比。
图12提供了受谷胱甘肽(GSH)保护的欧洲越桔中15种花色素甙的降解对比。
图13表明了在37℃、pH为7，并有谷胱甘肽保护的条件下，主要花色素甙(红醋栗)在缓冲溶液中相对时间的稳定性。
图14表明了CaCo-2细胞在37℃和pH为7的条件下，有谷胱甘肽保护的主要-花色素甙(红醋栗)在培养基中相对时间的稳定性。
图15表明了主要-花色素甙进入CaCo-2细胞的细胞吸收。
图16提供了欧洲越桔花色素甙在有/无谷胱甘肽存在下的降解(37℃、pH＝7.0下，1小时)。
图17表明了欧洲越桔花色素甙在有/无谷胱甘肽存在下进入CaCo-2细胞的细胞吸收。
图18提供了所述CaCo-2实验的HPLC分析的梯度分布。
图19是pH为3-11范围内残留比值的图示，以说明GSH处理后的欧洲越桔提取物的稳定性和GSH没有处理的欧洲越桔提取物的不稳定性(在相同的pH值)。
图20是一定pH范围内GSH保护作用的图示。
图21是样品20070601新鲜溶液在零时的HPLC色谱图。
图22是样品20070601在37℃4小时后的HPLC色谱图。
图23是样品20070602新鲜溶液在零时的HPLC色谱图。
图24是样品20070602在37℃4小时后的HPLC色谱图。
图25提供了样品20070601在37℃下零时和4小时后的HPLC峰值比较。
图26提供了样品20070602在37℃下零时和4小时后的HPLC峰值比较。
图27提供了用欧洲越桔提取物或用本发明所述的欧洲越桔/半胱氨酸组合物处理后，人血浆中观测到的花色素的比较。
图28a和28b分别地提供了用欧洲越桔提取物或用本发明所述的欧洲越桔/半胱氨酸组合物处理后，人血浆中观测到的总花青素和总翠雀素的比较。
图29提供了用欧洲越桔提取物或用本发明所述的欧洲越桔/半胱氨酸组合物处理后，人血浆中观测到的总3′-甲花翠素的比较；上部虚线代表欧洲越桔/半胱氨酸组合；下层的短折线代表的仅是欧洲越桔提取物。
图30提供了用欧洲越桔提取物或用本发明所述的欧洲越桔/半胱氨酸组合物处理后，人血浆中观测到的总甲基花青素的比较；上部虚线代表欧洲越桔/半胱氨酸组合；下层的短折线代表的仅是欧洲越桔提取物。
图31提供了用欧洲越桔提取物或用本发明所述的欧洲越桔/半胱氨酸组合物处理后，人血浆中观测到的总二甲翠雀素的比较；上部虚线代表欧洲越桔/半胱氨酸组合；下层的短折线代表的仅是欧洲越桔提取物。
图32提供了在第1天观测到的欧洲越桔提取物与欧洲越桔提取物/半胱氨酸的组合物中的花青素、翠雀素、3′-甲花翠素、甲基花青素和二甲翠雀素的最大浓度的比较。
图33提供了在第7天观测到的欧洲越桔提取物与欧洲越桔提取物/半胱氨酸的组合物中的花青素、翠雀素、3′-甲花翠素、甲基花青素和二甲翠雀素的最大浓度的比较。
图34提供了在第1天观测到的欧洲越桔提取物与欧洲越桔提取物/半胱氨酸的组合物中的花青素、翠雀素、3′-甲花翠素、甲基花青素和二甲翠雀素的AUC0-inf的比较。
图35提供了在第7天观测到的欧洲越桔提取物与欧洲越桔提取物/半胱氨酸的组合物中的花青素、翠雀素、3′-甲花翠素、甲基花青素和二甲翠雀素的AUC0-inf的比较。
图36A提供了没有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总花青素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图36B提供了有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总花青素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图37A提供了没有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总翠雀素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图37B提供了有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总翠雀素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图38A提供了没有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总3′-甲花翠素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图38B提供了有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总3′-甲花翠素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图39A提供了没有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总甲基花青素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图39B提供了有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总甲基花青素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图40A提供了没有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总二甲翠雀素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
图40B提供了有半胱氨酸保护的欧洲越桔提取物，在4小时、第1天、第7天的总二甲翠雀素的血液浓度，在第4天的两个点分别代表0时和0.5小时。
详细描述
本发明涉及包含一种或多种花色素甙和一种或多种促稳定化合物的组合物。由于所述的花色素甙在规定的时期内不轻易地降解，因而所述的组合物是“稳定的”。
在说明书和权利要求书中，术语″包括″和″包含″是开放式术语并应解释为″包括，但不限于...″。这些术语包含进一步限制性的术语″实质上由...组成″和″由...组成″。
必须注意的是，除非上下文以另外方式明确规定，如在这里和附加的权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数内涵。术语″a″(″an″)、″一个或多个″和″至少一个″在这里也可以互换使用。也要注意的是术语″包含″、″包括″、″以...为特征″和″具有″可以互换使用。
除非以另外方式限定，在这里使用的所有技术和学术术语，与本发明所属领域的普通技术人员的普遍理解一样，具有相同的含义。在这里明确提到的所有出版物和专利，通过引证的方式，处于全部目的，被合并为一个整体；这些目的包括描述和披露在可能与本发明有联系的出版物上被报道的化学制品、仪器、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都将被用作指示所述领域的技术水平。在这里没有任何内容被推论为承认本发明没有资格预料由于在先发明公开的所述内容。
一方面，本发明提供了一种稳定化的花色素甙组合物，其包括一种花色素甙提取物和一种具有至少一个-SH基团的促稳定化合物。
在这里使用的术语“花色素甙“意指包括糖基化的花色素(花色素甙)以及所述花色素甙的糖甙配基(花色素)。贯穿整个说明书，对糖基化花色素的引证经常被提及，但除非另外注明，决不应被推论为限制。两者之中任一术语在哪里被使用，除非另外注明，该术语是可互换地被使用并意指包括糖基化的部分以及糖基物质本身。
花色素，花色素甙的糖基化部分，具有一如通式II所示的基本结构
Figure G2008800120877D00051
通式II
  花色素   R1   R2   R3   R4   R5   R6   R7
  Auantinidin   H   OH   H   OH   OH   OH   OH
  花青素   OH   OH   H   OH   OH   H   OH
  翠雀素   OH   OH   OH   OH   OH   H   OH
  Europinidin   OCH3   OH   OH   OH   OCH3   H   OH
  Luteolinidin   OH   OH   H   H   OH   H   OH
  花葵素   H   OH   H   OH   OH   H   OH
  二甲翠雀素   OCH3   OH   OCH3   OH   OH   H   OH
  甲基花青素   OCH3   OH   H   OH   OH   H   OH
  3’-甲花翠素   OH   OH   OCH3   OH   OH   H   OH
  Rosinidin   OCH3   OH   H   OH   OH   H   OCH3
这里R1至R7提供了花色素的代表性实例。
所述的糖基化形态的花色素甙比花色素有更好的水溶性和稳定性。花色素甙通过它们包含的糖基单元的数量进行分类。单糖甙包括一个糖的部分，其主要与该糖甙配基的3-位羟基相连。双糖甙一般包含3位和5位羟基的位置的两个单糖，个别包含3位和7位羟基位置的两个单糖。三糖甙一般具有3位上的两个糖单元和5位或者7位上的一个糖。在3位、4位和/或5位的糖基化也是可能的。
花色素甙中最普遍的糖包括单糖葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖。花色素甙最经常发现的双糖和三糖是芸香二糖、葡糖β葡糖苷、sambubiose和glucorutinose。
花色素甙可以和羧酸中的一个或多个羟基发生酰化。所述的酸最为常见的是连接于单糖的6位，但是单糖的2、3和4位也是可能的。常见的脂肪酸包括丙二酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸和草酸。常见的芳香酚酸和脂肪族二羧酸包括香豆酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸和五倍子酸。
所述的术语“提取物“意指为从植物来源获得的花色素甙物质，比如叶片、嫩枝、树皮、根、茎、种子、花、浆果、果实，比如，通过常规分离方法从适当的植物来源得到，但需要注意的是，并非限于此处的那些描述。有不同的方法适用于本领域技术人员所了解的花色素甙。这些方法的一部分被描述在，例如，美国专利5,817,354；美国专利5,200,186；美国专利5,912,363；美国专利4,211,577；美国专利4,302,200(每个通过引用的方式被合并)。
包含花色素甙的适当的植物实例包括，但是不限于，果实、蔬菜、花和从后面组群中挑选出来的其它植物，该组群由Acer macrophyllum、Acerplatanoides、金虎尾、Ajuga reptans、苹果、杏、Artictbramble、鳄梨、香蕉、伏牛花、大麦、Begonia semperfiorens、雏菊、白芨、欧洲越桔，黑豆、黑大豆、黑色、蓝色和紫色马铃薯、黑莓、蓝莓、笃斯越桔、博伊森树莓、荞麦、可可、茶、虉草、高加索蓝莓、蜡梅、芹菜、甜樱桃、樱桃、桂樱、菊苣、细香葱、花楸果、欧亚山茱萸、矢车菊、枸子属植物、越橘、酸果蔓、岩高兰、菊花、Cynomorium coccineum、大丽花、矮接骨木、鹿果、石斛属、矮化山茱萸、Echinaceapurpea、茄子、接骨木、fababean、八角金盘、费约果、无花果树、大蒜、大丁草、人参、朝鲜蓟、醋栗、葡萄、番石榴、山楂、木槿或者洛神葵、hibiscus Sabdaiffa、伞房花越桔、蜀葵、忍冬、牵牛花、玉蝉花、爪哇李、洋姜、kokum、Laeliocattleya、小扁豆、大杨莓、lupine、荔枝、玉蜀黍、芒果、倒捻子、maqui、紫罗兰、绿绒蒿属、Metrosideros excelsa、粟、花楸、桑树、桃金娘、橄榄树、洋葱、橙、观赏樱桃、西番莲果、豌豆、桃子、花生、梨树、紫苏属、矮牵牛花、蝶兰、Phalsa、牵牛属、菠萝、阿月浑子树、李子、石榴、Phragmites australis、紫色胡萝卜、温柏、兔眼越橘、萝卜、红醋栗、黑覆盆子、红球甘蓝、水稻、大黄、rosehip、黑麦、番红花、瓶子草属、荚迷属落叶灌木、Sophronitis coccinea、高粱、sparkleberry、草莓、Fragada Vesca、甘蔗、向日葵、甜樱桃、甘薯、tamarillo、罗望子、芋头、酸樱桃、Tulip greigii、芜菁甘蓝、睡莲、锦带花属、小麦、茭白、美女樱、山药和其混合物组成。
虽然有差不多数以千计的花色素甙提取物，但其全部应被视为包括在本说明书所述范围内，特定行业的花色素甙提取物的适当例子包括欧洲越桔提取物、黑醋栗提取物、酸果蔓提取物、黑大豆提取物、越橘提取物、蓝莓提取物和其两个或多个的混合物。
有代表性地，提取物通过不同方法被浓缩以提供一种富含花色素甙的溶液。例如，通过分子量分离，超滤可用于除去不需要的部分。过滤产生的保留物可作为液体储存，或者，例如，通过喷雾干燥、冷冻干燥、急骤干燥、流化床干燥、环式干燥、盘式干燥、真空干燥、高频干燥或者微波干燥，可以进一步浓缩为粉末。最后，所述的提取物应该含有至少10％重量计的花色素甙。市场上可买到的花色素甙可以从诸如Artemis International、Fort Wayne、Indiana获得。商业上得到的花色素甙提取物应含有至少10％重量计的花色素甙。所述的提取物因此包含花色素甙和其它植物物质，例如其它类黄酮、糖、等等。
花色素甙提取物可通过一种或多种所述领域中已知的方法进一步纯化，诸如色谱法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、结晶、亲和色谱法、分配色谱法等等。特定花色素甙的鉴定可通过那些为本领域技术人员所知的方法实现，1H核磁共振、化学降解、色谱和光谱，尤其是用于分离后的花色素甙化合物表征的同核和异核二维核磁共振技术。
术语“纯化的”或者“分离的”被用于提及如上所述花色素甙提取物的一种或多重花色素甙的提纯和/或分离。再一次利用所述领域中已知的常规方法，所述的花色素甙提取物的不同组分可被分离成为纯净物质。一方面，本发明所述提取物中的花色素甙实质上是通过本领域已知技术纯化和分隔的。经纯化的化合物的纯度一般至少为大约90％，优选至少大约95％，最优选至少大约99％并且更多优选至少大约99.9％(例如大约100％)，按重量计算。
根据本发明所述，花色素甙提取物包含一个或多个花色素甙和/或花色素，其由甲基花青素、花青素、天葵素、翠雀素、3′-甲花翠素的、二甲翠雀素、apigenindin、auratinidin、eapensinidin、europinidin、三甲花翠素、6-羟基花青素、木樨黄定、5-甲基花青素、pulchellidin、rosinidin、tricetnidin、其衍生物和混合物构成的组群中挑选出来。在一个实施例中，花色素甙和花色素是从花青素、甲基花青素、二甲翠雀素、3′-甲花翠素、翠雀素中选出来的，他们的配醣衍生物和在其中混合物。在另一个实施例中，所述的提取物包含至少一个基于花青素的花色素甙。
用于本发明的花色素甙，描述于此，包括但不限于：花青素-3-葡萄糖甙、花青素-3-葡萄糖基芸香甙、花青素-3-龙胆二糖甙、花青素-3-芸香糖甙、花青素-3-苯乙腈葡糖苷、花青素-3-苯乙腈葡糖苷-5-葡萄糖甙、花青素-3-半乳糖甙、甲基花青素-3-芸香糖甙、甲基花青素-3-葡萄糖甙、甲基花青素-3-半乳糖甙、甲基花青素、花青素、花青素-3-槐糖甙、花葵素、翠雀素、翠雀素-3-葡萄糖甙、翠雀素-3-半乳糖甙、3’-甲花翠素、3’-甲花翠素-3-葡萄糖甙、3’-甲花翠素-3-半乳糖甙、二甲花翠素、二甲花翠素-3-阿拉伯糖甙、二甲花翠素-3-葡萄糖甙、二甲花翠素-3-半乳糖甙、山萘酚、橘皮甙、龙胆翠雀花素、桔梗花色甙、cinerarin等等。
来自不同植物的花色素甙的适合实例包括但不限于如下物质：大叶槭，花青素衍生物，挪威槭，花青素-3-(2″，3″-双没食子酰-β-吡喃葡萄糖(3％)，花青素-3-(2″-没食子酰-β-吡喃葡萄糖(37％)，花青素-3-β-吡喃葡萄糖甙(60％)，金虎尾，Malpighia marginata，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，紫唇草，花青素-3-(二-对-香豆酰)槐糖甙-5-葡萄糖甙，苹果，海棠，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-木糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素3-木糖甙，杏，杏，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3葡萄糖甙，Artie bramble，悬钩子属，鳄梨，鳄梨属，乙酰花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素3-半乳糖甙，花青素-3-半乳糖甙，香蕉，野芭蕉，拔蕉/野蕉，Barberrv，小檗属，花青素-葡萄糖甙，花青素-葡萄糖甙，大麦，大麦，花青素和氰化糖甙，豆，Pheseolus vulgaris(several cultivars)，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，四季秋海棠，花青素衍生物，Benibana-cha，茶，花青素-3-O-β-D-半乳糖甙，花青素-3-O-β-D-半乳糖甙，雏菊，3-花青素-3-衍生物，白芨，乙酰化花青素3，7，3′-三葡萄糖甙衍生物，越桔，欧洲越橘，Artemis/Iprona；Indena，花青素-3-半乳糖甙(22％)；花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-葡萄糖甙(9％)，花青素-3-葡萄糖甙，黑豆，菜豆，花青素-3-葡萄糖甙(96％)，花青素-3-葡萄糖甙，黑莓(欧洲及美洲)，Moriferiveri，欧洲木莓/露莓，美洲黑莓，高大黑莓，沙黑莓，长毛根螨，R.trivials，花青素-葡萄糖甙(70-100％)，花青素-葡萄糖甙，花青素-芸香甙，黑葡萄，很多种类，黑马铃薯，马铃薯，花青素-糖甙，黑树莓，黑帽莓，花青素-桑布双糖甙(20％)；花青素-桑布双糖甙，花青素-木糖基芸香甙(40％)；花青素-葡萄糖甙，花青素-葡萄糖甙，(17％)，花青素-芸香甙(23％)，黑大豆，大豆，花青素-3-葡萄糖甙(96％)，花青素-3-葡萄糖甙，蓝莓，Five common Vaccinium spp，花青素-葡萄糖甙(3％)；花青素-葡萄糖甙，花青素-半乳糖甙(3％)，花青素半乳糖甙，花青素-阿拉伯糖甙(3％)，花青素-3-阿拉伯糖甙，笃斯越橘，笃斯越橘，花青素-3-葡萄糖甙(14％)，花青素-3-葡萄糖甙(14％)，花青素-阿拉伯糖甙(10％)，花青素-3-阿拉伯糖甙(10％)，花青素-3-半乳糖甙(6.5％)，花青素-3-半乳糖甙(6.5％)，博伊森莓，新西兰，花青素-3-槐糖甙(44.5％)，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙(26.4％)，花青素-3-糖基芸香甙(25.8％)，花青素-芸香甙(3.3％)，荞麦，Fagopyrum species，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素3-半乳糖甙，花青素-3-半乳糖甙，可可树，可可，花青素-3-葡萄糖甙(疑似)，花青素-3-葡萄糖甙(疑似)，芹菜，芹菜属，月桂樱，月桂樱，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，菊苣，Cichorium intybus，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，细香葱，Allium schoenoprasum，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-乙酰葡萄糖甙，花青素-3-(6-丙二酰基葡萄糖甙)，花青素-3-(3，6-二丙二酰基葡萄糖甙)，阿隆尼亚苦味果，黑果腺肋花楸，Artemis/lprona，花青素-3-半乳糖甙(64.5％)，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙(28.9％)，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-葡萄糖甙(2.4％)，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-木糖甙(4.2％)，花青素-3-木糖甙，咖啡，小果咖啡cv.Bourbon Vermelho，花青素-3-糖甙，花青素3，5-二糖甙，花青素-3-糖甙，枸子，枸子属，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素-3-半乳糖甙，越橘，V.vitis-idaea，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，蜡梅，花青素-3-O-葡萄糖甙，花青素-3-O-葡萄糖甙，乙酰花青素-3-O-葡萄糖甙，花青素糖甙，蔓越橘(美洲和欧洲)，蔓越橘，蔓越莓，花青素-半乳糖甙(16-24％)，花青素-半乳糖甙，蔓越莓/小红果，花青素-阿拉伯糖甙(13-25％)，花青素-阿拉伯糖甙，岩高兰，岩高兰，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素-3-槐糖甙，菊花，Dendranthema Grandifiorum，花青素-3-O-(6′-O-丙二酰-β-吡喃葡萄糖甙，醋栗(红的和黑的)，Ribes rubrum，R.nigrum，花青素-葡萄糖甙(2-10％)，花青素-葡萄糖甙，花青素-接骨木二糖甙，花青素-芸香甙(8-17％)，花青素-接骨木二糖甙(9-31％)，花青素-槐糖甙(4-9％)，花青素-木糖基芸香甙(28-73％)，花青素-葡萄糖基芸香甙(14-28％)，Cyneinonurn coccineum，花青素-3-O-葡萄糖甙(92％)，花青素-3-O-葡萄糖甙(92％)，花青素-3-O-(6-O-鼠李糖基葡萄糖甙(8％)，矮接骨木，Sambucus ebulus，花青素-3-木糖基葡萄糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙-5-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-阿拉伯糖葡萄糖甙，石斛兰，石斛兰属，花青素衍生物，御膳桔，Comus suecica，花青素-3-葡萄糖甙(4％)，花青素-3-葡萄糖甙(4％)，花青素-3-半乳糖甙(16％)，2-花青素衍生物(80％)，Echinacea，Echinacea spp.，接骨木，Sambucus nigra，Artemis/lprona，花青素-3-葡萄糖甙(42％)，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙(43％)，花青素-3，5-二葡萄糖甙(2％)，花青素-3-接骨木二糖甙-5-葡萄糖甙(9％)，龙胆，花青素-3-O-β-D-葡萄糖甙和3种其它衍生物，花青素-3-O-β-D-葡萄糖甙，八角金盘，花青素-3-半乳糖木糖甙，非油果，凤榴，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，无花果，无花果，花青素-3-鼠李糖葡萄糖甙，花青素3，5-二葡萄糖甙，花青素3-葡萄糖甙，连翘，intermedia cv，SpringGlory，花青素衍生物，大蒜，Allium sativum，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，单乙酰化花青素-3-葡萄糖甙，三乙酰化花青素-3-葡萄糖甙，人参，Panax ginseng，Panaxquinquefolius，花青素-3-O-β-D-吡喃木糖基-(12)-β-D-吡喃葡萄糖甙，朝鲜蓟，Cynara scolymus，花青素-3-咖啡酰葡萄糖甙，花青素-3-咖啡酰槐糖甙，花青素-3-二咖啡酰槐糖甙，醋栗，Ribes spp.，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，葡萄，Vinis vinifera，花青素-3-单葡萄糖甙，花青素-3-单葡萄糖甙，花青素-3-单葡萄糖甙-乙酸酯，花青素-3-单葡萄糖甙-ρ-香豆酸酯，番石榴，Psidiumguajavica，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，山楂，Crataegus spp.，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，木槿或洛神葵，Hibiscussabdariffa，花青素-接骨木二糖甙(30％)，蜀葵，Althaea rosea，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素-3-葡萄糖甙，其它花青素葡萄糖甙，金银花，Lonicera nitida，花青素-3-芸香甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，葛尾属，花菖蒲，花青素3RG，花青素3RG5G，花青素3Rgac5G，Ipornoeapurpurea，六乙酰化花青素-3-槐糖甙-5-葡萄糖甙，爪哇李，Mytciana jaboticaba，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，洋姜，Helianthus tuberosus，Kokum，印度藤黄，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙，Laelioeattleya cv Mini purple，乙酰化花青素衍生物，Lactuca saliva，花青素-3-O-(6″-丙二酰葡萄糖甙)，罗甘莓植物，Rubus loganbaccus，花青素-槐糖甙(48.1％)，花青素-葡萄糖甙，花青素-葡萄糖甙(21.6％)，花青素-芸香甙(6.2％)，羽扇豆，Lupinus spp，花青素糖甙，Lyehee，荔枝，Litchi chinensis，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素-3-半乳糖甙，玉米，Zea mays，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-(6″-丙二酰葡萄糖甙)，花青素-3-(3″，6″二丙二酰-葡萄糖甙)，芒果，Mangifera indica，(花青素糖甙，莽吉柿，Garcina mangostana，花青素-3-槐糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，智利酒果，Aristotella chilensis，花青素-3-，5-二葡萄糖甙，紫罗兰，四酰化花青素-3-接骨木双糖甙-5-葡萄糖甙，稷，Pernnisetum americanum，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花揪果，山梨属，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素-3-β-D-吡喃葡萄糖甙，桑葚，黑桑，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素-3-槐糖甙，爱神木果实，Myrtuscommunis，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-二葡萄糖甙，橄榄，木樨榄，花青素-3-芸香甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素衍生物，洋葱，Allium sepa，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-二葡萄糖甙，花青素-3-laminarioside，橙子，Citrus sinensis，花青素-3-葡萄糖甙(95％)，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，西番莲果，百香果，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，豌豆，Pisum sativum，花青素-3-槐糖甙，花青素-3-接骨木二糖甙-5-葡萄糖甙，桃，Prunus persica，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素衍生物，花生，Arachis hypogaea，花青素葡萄糖甙，梨，Pyrus communis，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，紫苏，Perilla frutescens，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素-3，5-衍生物，矮牵牛花，花青素-3-芸香甙，捕鱼木，Grewia spp，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，菠萝，Anans comosus，花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-半乳糖甙，阿月浑子，Pistacia vera，Pragmites australis，花青素-3-衍生物，李子，2000亚种，15种，花青素-葡萄糖甙(37％)，花青素葡萄糖甙，花青素-芸香甙(45％)，石榴，Punica granatam，花青素-葡萄糖甙(30％)，花青素-葡萄糖甙，花青素-二葡萄糖甙(17％)，紫胡萝卜，Daucus carota，花青素-葡萄糖甙，花青素-葡萄糖甙，花青素-葡萄糖基半乳糖甙，花青素-半乳糖甙，花青素-二半乳糖甙，花青素-半乳糖甙，温柏树，Cydonia oblonga，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素衍生物，萝卜，Raphanus sativus，酰化花青素-3-槐糖甙-5-葡萄糖甙，酰化花青素-3-二葡萄糖甙-5-葡萄糖甙，红球甘蓝，Brassica oleracea var capitata，花青素糖甙，芦苇，Phalaris arundinacea，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-(6″-丙二酰葡萄糖甙)，花青素-3-(3″，6″二丙二酰-葡萄糖甙)，洋葱，Allium cepa，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，酰化花青素-3-葡萄糖甙衍生物，红矮牵牛花，Petunia spp，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-槐糖甙，红树莓，Rubus idaeus，花青素-葡萄糖甙(17％)，花青素-葡萄糖甙，花青素-芸香甙(7％)，花青素-槐糖甙(50％)，花青素糖基芸香甙(26％)，花青素-二葡萄糖甙，大黄，Rneum spp，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，稻，Oryza spp，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-鼠李糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，刺玫果，Rosa canina，花青素-3-芸香甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3，5-二葡萄糖甙，黑麦，Secale cereale，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-鼠李糖基葡萄糖甙，花青素-3-鼠李糖二葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，花青素-3-芸香甙衍生物，花青素-3-龙胆二糖甙，莢蒾，Viburnum spp，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-阿拉伯糖基接骨木二糖甙，高粱，Sorghum bicolor，花青素，花青素糖甙，Sparkleberry，臼莓，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-阿拉伯糖甙，花青素-3-半乳糖甙，草莓，Fragaria ananassa，花青素-葡萄糖甙(minor)，花青素-葡萄糖甙，向日葵，Hellanthus annuus，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，酰化花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-木糖甙，花青素-3-木糖甙，酰化花青素-3-木糖甙，花青素-3-香草基接骨木二糖甙，甜樱桃，Prunus avintn，花青素-葡萄糖甙，花青素-葡萄糖甙，花青素-芸香甙；花青素-3-槐糖甙，甘薯，Ipornoea batatas Sophronitis coccinea，花青素衍生物，五酰化花青素-3，3′，7-三葡萄糖甙，番茄或西红柿树，Cyphomandrea betacea，花青素-3-芸香甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，罗望子，Tamarindus indica，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，芋头，Colocasia esculenta，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，酸樱桃(balaton)，Prunus cerasus cv.Balaton，营养物，花青素-3-芸香甙-己糖(75％)，花青素-3-芸香甙-戊糖(3％)，花青素-3-芸香甙(18％)，蒙特默伦西樱桃，Prunus cerasus cv Montmorency，营养物，花青素-3-槐糖甙(80％)，花青素-3-葡萄糖甙(20％)，花青素-3-葡萄糖甙(20％)，郁金香，Tulipa spp，花青素-3-O-(6″-鼠李糖基葡萄糖甙)，花青素-3-O-衍生物，芜菁，brissica rapa，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-二葡萄糖甙-5-葡萄糖甙，荷花，Nymphasa alba，花青素-3-O-(6″-乙酰基-β-galactopyrosinase(23％)，花青素-3-O-半乳糖甙(2％)，花青素-3-O-半乳糖甙(2％)，锦带花，花青素-3-O-葡萄糖甙，花青素-3-O-葡萄糖甙，花青素-3-O-葡萄糖甙木糖，小麦，Triticum spp，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，酰化花青素葡萄糖甙，花青素-3-芸香甙，酰化花青素-3-芸香甙，花青素-3-龙胆二糖，野生稻，水生菰，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-鼠李糖基葡萄糖甙，山药，Dioscoracea spp，花青素-3，5-二葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-葡萄糖甙，花青素-3-鼠李糖基葡萄糖甙，花青素-3-龙胆二糖甙，酰化花青素葡萄糖甙。
此处使用的术语“花色素甙“不仅意指花色素甙单体，而且涉及二聚和多聚(也就是包含3-20个花色素单体残基)形态的花色素甙和无色花色素(又名黄烷-3，4-二醇)。所述的花色素甙可含有取代基(例如烷基、烷氧基等等)和特别是可以被如上所述的氧-糖基化。
所述的组合物中的花色素甙可以是单独的花色素甙，或者含有花色素甙的混合物。特别地，该花色素甙是从由二甲翠雀素、花青素、翠雀素、甲基花青素、天葵素和3′-甲花翠素以及它们的葡萄糖甙组成的组群中选出来的。一个典型实例是二甲翠雀甙(二甲翠雀素二葡糖苷)氯化物，其以纯化形态可在市场上买到。另外，花色素甙可以通过含有花色素甙的植物提取得到，例如如上所述的葡萄、黑色胡萝卜、红球甘蓝、黑莓、黑加仑、酸果蔓等等。
此处使用的短语“稳定化的花色素甙组合物“意指花色素甙，或者作为糖甙(花色素甙)，或者作为糖甙配基(花色素)，例如，在大约37℃，pH值大约为7.0，从花色素甙最初的百分比开始，经过至少大约3.5小时，剩余了至少大约50％未降解的花色素甙。同样，该短语包括pH值大约为4、5、6、8时有相似的稳定性。
此处使用的术语“促稳定化合物“意指包括具有至少一个-SH基团的那些化合物。不被理论约束，人们相信巯基和花色素甙之间发生了相互作用，以致于含有的巯基基团被氧化(经常形成二硫化物，-S-S-)并且花色素甙接收随后释放的一个氢原子。
促稳定化合物的适当的实例包括酵母提取物(例如啤酒酵母)，二氢硫辛酸；二氢硫辛酸盐，诸如氨基酸盐；半胱氨酸；半胱氨酸衍生物，诸如N-乙酰半胱氨酸；谷胱甘肽，谷胱甘肽盐；巯基蛋白酶，诸如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶以及它们的混合物；巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵了的牡蛎提取物，豆腐乳，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或其混合物。
一方面，该促稳定化合物/花色素甙的摩尔比大约为0.1-10之间，更优选大约为0.5-5之间，进一步优选大约为1。
不被理论约束，以下是关于本发明意外的一个独特发现的说明。花色素甙通过形成无色衍生物来表现对pH值改变是敏感的。花(色)
Figure G2008800120877D00091
阳离子和醌式碱是有色的，并且该平衡一般不受两者是pH值依赖性[pH值小于2]的影响。(见示意图1)人们相信这个平衡是很快形成的，而且该反应是可逆的。在适当的条件下，水的“进攻”产生一系列无色的衍生物(甲醇假碱，查尔酮)。反应进程的这个部分是缓慢的，并且不是常态可逆的。褪色过程在pH值大于3.5的情况下开始发生。通过分子保护防止水的进攻，提供了本说明书自始至终描述的花色素甙的稳定。示意图1
Figure G2008800120877D00101
基于理论，辅色作用(描述在“辅色素“存在下，花色素甙增强的稳定性)的已知现象产生了向红效应(最大波长向较高波长的移动)和增色效应(对于相同浓度，最大的波长处的吸收增加)。因此，巯基化合物是否能作为辅色素着手开始澄清。
基于理论，花色素甙能通过自缔合作用增强他们的稳定性。浓度越高，自缔合作用的可能性越大。自缔合作用发生在溶液浓度约大于0.0001M的溶液中。自缔合作用可以帮助遮蔽巯基化合物的保护效应；因此要在不同浓度下研究该保护效应。
基于理论，辅助着色作用应该产生红移(最大波长向较高波长的移动)和吸收增强(对于相同浓度，最大的波长处的吸收增加)。
如图1和2所示，目前基于UV光谱学的研究发现DHLA(二氢硫辛酸)既不产生红移或者增色效应，GSH(谷胱甘肽)也不产生红移或者增色效应。因此，稳定性增加很可能另外的机理有关。
如图1和2所示，刚刚溶解的花青素-3-O-葡萄糖甙(受保护和不受保护)的光谱特性就最大波长的改变对于不同pH值而言是一致的。
欧洲越桔提取物(不同浓度，摩尔浓度以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)的稳定性，借助紫外光谱测量特定pH值对应的最大波长处的吸收，在谷胱甘肽或者二氢硫辛酸存在/不存在的情况下进行研究。
如图3，4和5，本研究表明在所有受试浓度下，特别是在pH值大于5-6的情况下，花色素甙在谷胱甘肽(0.65mmolar)和二氢硫辛酸(1.44mmolar)保护下避免了降解。不同受试pH值下，无保护溶液和受保护溶液的最大波长没有不同。既然可以看出花青素葡萄糖甙存在下增色效应没有发生，那么含有巯基的保护剂的稳定作用被认为是与辅助着色作用不同的。
通过紫外光谱，在不同pH值以及不存在/存在二氢硫辛酸(1.44mmolar溶液)的情况下，研究了0.0001摩尔浓度(以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)的欧洲越桔提取物相对时间的稳定性。
图6A-6D所示的实验表明了，在不受保护的花色素甙迅速降解的pH值(pH值大于5-6)中，二氢硫辛酸保护了花色素甙。最有趣的是，当用统计模型(回归分析)拟合这些数据时，不受保护的降解动力学适合线性回归，而二氢硫辛酸保护下的降解动力学适合指数回归分析。这指明了一种建立于时间的保护机理。
在pH值＝7，25℃，存在/不存在谷胱甘肽(0.65mmolar溶液)的条件下培养之后，通过HPLC研究了欧洲越桔提取物中挑选的花色素甙的降解动力学。
在选定的时间点，通过HPLC检验了翠雀素-3-O-半乳糖甙(对降解很敏感)、3′-甲花翠素-3-O-半乳糖甙(中等敏感度)和花青素-3-O-半乳糖甙(相当稳定)的峰面积(参见图7、8和9)。在谷胱甘肽存在的情况下，观察到的促稳定特性与指数回归分析吻合地很好。因此推断该保护机理与辅助着色作用是不同的，并涉及一种相对时间而建立的保护效应的机理是合理的。
花青素-3-O半乳糖甙(0.001摩尔溶液)在pH值＝3.1或pH值＝7.0时溶解，每个条件下分别存在含有/不含有二氢硫辛酸(1.44mm总计lar溶液)的对比。平行测定培养通过高压液相色谱法，在25℃下在3天内进行。
如图10所示，二氢硫辛酸的作用具有令人惊讶的长效。在pH＝7.0，25℃，培养3天之后，在二氢硫辛酸存在下，发现大约47％的花青素-3-O-半乳糖苷，而无保护的样品几乎是0％的花青素-3-O-半乳糖苷。对于pH＝3.1的条件下，分别的对比含量是95％和61％。
通过高压液相色谱，研究了有/无二氢硫辛酸(图11)和谷胱甘肽(图12)保护的欧洲越桔提取物中的花色素甙的降解动力学。
评价的焦点是，在某种程度上，花色素的基本骨架是否涉及所述的保护效应。当关注得到的结果时，巯基化合物的保护效应，与不受保护的降解的敏感度呈负相关，似乎是合理的。花色素的骨架越是敏感，谷胱甘肽或者二氢硫辛酸的保护效应就越好。观察到谷胱甘肽的绝对作用略微好些。
下表记录了存在于欧洲越桔提取物中的花色素的取代型式：
  花色素   取代型式(B-环)
  翠雀素   3′，4′，5′OH
  3’-甲花翠素   3′-OCH3，4′，5′OH
  二甲翠雀素   3′，5′-OCH3，4′OH
  花青素   3′，4′OH
  甲基花青素   3′-OCH3，4′OH
如上表所述，存在与(a)降解作用有关的结构和(b)保护机理的证据。首先，花色素甙的取代基的数量有一定作用，其次，在相同数量的取代基的情况下，甲氧基-基团的存在影响着稳定性。
最敏感的花色素是翠雀素，在B环上带有3个羟基基团。最稳定的是甲基花青素，带有1个羟基基团和1个甲氧基基团(优于花青素中的2个羟基基团)。
推荐的新发现的机理被认为与花(色)
Figure G2008800120877D00111
离子在pH值＝7.0时的稳定性有关。所有受试化合物均带有羧酸基团和游离的巯基基团。
半胱氨酸具有二个与花色素甙结合的定位点。第一，存在所述巯基部分的强相互作用(可能与花色素在4位乃至到糖的部分有紧密的联系)，第二，所述的羧酸官能保护了所述的阳离子的部分。
相似的机理被推荐适用于二氢硫辛酸。巯基的存在被认为是锚定了二氢硫辛酸和花色素，以使所述的羧基官能团可以帮助保护该分子。或许，和半胱氨酸中的单独巯基相比，二氢硫辛酸相对于半胱氨酸的增强作用可以被归为两个巯基的更稳定的“缔合作用”。
Figure G2008800120877D00121
相似地，描绘与还原态谷胱甘肽的反应是有可能的。既然这样，通过两个羧酸官能团替代一个，得到了较高的活性。
Figure G2008800120877D00122
所述的机理被认为是与花(色)
Figure G2008800120877D00123
离子被用作自由基清除剂时的反应级联有关。
受试的2个R-SH/R-SS-R化合物的氧化还原电位低于花色素甙的氧化还原电位。例如，2个GSH/GSSG＝～-0.22V，而所述的氧化还原电位A-OH/A＝O＝～0.20-0.75V(见下文)。
以下反应说明了花色素甙的清除特性：
Figure G2008800120877D00131
R＝H，花色素；R＝糖，花色素甙
Figure G2008800120877D00132
醌-/半醌结构(有色产品，实例)。
这些(半)奎宁的稳定性被认为与取代型式有关，因为醌结构要求4′-取代。一旦所述的醌形成，逆转产生花(色)结构的反应是不大可行的。另一方面，任何在5′-位置的取代，阻碍了所述的半醌的形成。
那也许解释了为什么3′-OH和4′-甲氧基取代结构好象是最稳定的：它形成了一个半醌，其不能被水攻击而形成无色产品。这样的半醌可能或多或少容易再转变到所述的花(色)
Figure G2008800120877D00134
阳离子。
通过以下反应，花色素/花色素甙(A-OH)被转变为半醌/醌(A＝O)：
A-OH→A＝O+H++e-
R-SH化合物经历了以下反应：
全部过程：2RSH→R-SS-R+2H++2e-
细节：R-SH→R-S-+H+→R-S°+e-+H+
2R-S°→R-SS-R(RS°...基团)
这样的机理指出了1∶1消耗的过程，2分子花色素甙能从2分子R-SH形成1分子R-SS-R，余下的作为半醌。
如果没有发生替换反应，以下反应cascade是合理的：
在中性pH值下，R-SH和花色素甙的结合过程中，R-SH主要转变为R-S°。
R-S°的一部分是被花色素甙(A-OH)清除的，A-OH从而转变为A＝O半-醌，再一次产生R-SH。
在ph值＝7时，A＝O通过消耗R-SH再转变为A-OH，然后按照已知方式最终渐渐降解。
促稳定化合物的适当的实例包括酵母提取物，二氢硫辛酸；二氢硫辛酸盐，诸如氨基酸盐；半胱氨酸，半胱氨酸衍生物，诸如N-乙酰半胱胺酸；谷胱甘肽，谷胱甘肽的盐；SH-蛋白酶，诸如木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶，木瓜凝乳蛋白酶，和它的混合物；巯基蛋白酶、巯基金属蛋白酶、含有半胱氨酸的缩氨酸、含有谷胱甘肽的缩氨酸、发酵的牡蛎提取物、豆腐乳、含巯基壳聚糖、含巯基凝胶或者其混合物。
一方面，所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约在0.1-10之间，优选在0.5-5之间，更优选为1。
另一方面，所述的稳定化的花色素甙提取组合物对暴露于含水环境中的降解是稳定的，该环境的pH值大约为2、3、4、5等等，直至14，例如，pH值为7或更大。
另一方面，所述的稳定化的花色素甙(anthocyanin)提取物是花色素甙(anthocyanoside)。
另一方面，所述的稳定化的花色素甙提取物是花色素。
在本发明所述的其它方面，所述的稳定化的花色素甙提取物包括一种或多种花色素甙，也就是花葵素、甲基花青素、花青素、二甲翠雀素、3′-甲花翠素、翠雀素的糖甙。
本发明也涉及此处描述的稳定化的花色素甙的制备方法。
本发明提供的促稳定化合物可以和含有植物原料的花色素甙一起，在提取和/或制造过程中混合，从而减少或者去除所述花色素甙的氧化破坏，该氧化破坏通常发生在处理过程、甚至在存储过程中。例如一个或多个促稳定化合物，以这里通常描述的比例，在提取过程中加入到所述的提取介质(溶剂)中，所述的提取过程可参照2002年2月14日公开的美国专利2002/0018821，发明人是Chrystele Soulier etal.，该专利中所述的含量以其整体被合并于此。
典型地，所述的花色素甙提取物直接与所述的促稳定化合物混合。这可以通过将作为固体的两种原料简单混合、研磨、合并等方式实现，或者通过将其溶解在溶剂内实现，例如水。额外的添加剂，诸如载体、维生素、抗氧化剂等等，按照本说明书中以下描述，可以通过常规方法添加到所述的混合物中。
在一个实施例中，含有花色素甙的红色果实提取物，溶解于水溶液，并按照本说明书所描述，用含巯基促稳定化合物选择性处理。所述的水提物被冷却至其达到一个低于15℃的均一温度。所述的提取物被过滤，并按照本说明书所描述，用含巯基促稳定化合物选择性处理，所得到的渗透液被回收并载入大孔交联聚合树脂。所述的树脂然后被软化水冲洗，按照本说明书所描述，用含巯基促稳定化合物选择性处理，然后得到的树脂用醇洗提液洗提，其可以按照本说明书所描述，用含巯基促稳定化合物选择性处理。得到的洗脱液被浓缩，按照本说明书所描述，用含巯基促稳定化合物选择性处理，然后干燥。
在另外的实施例中，所述的稳定处理过程在一种含醇的红色果实提取物中进行，该提取物根据下列过程得到。首先果肉从整个红色果实中分离，然后所述的果肉被置于含醇的提取溶液中，该溶液可以选择性地包含一种本说明书所述的含巯基促稳定化合物。固相与从液相分离，然后所述的液相可以用本说明书所述的含巯基促稳定化合物选择性处理。所述液相包含的酒精残留的主要部分在真空下被蒸发，以便获得一种含醇的浓缩物。
用于醇提的溶剂可便利地从甲醇、乙醇、丁醇以及丙酮中选取。
在实践中，所述的醇提在室温下，以至少两个连续的步骤进行，每个步骤各持续20分钟。然后溶剂被蒸发掉。另外，不从单独的果肉，而从整个果实中，也能实现所述花色素甙的提取。
根据本发明所述，稳定处理的过程，可以市售水果的提取物开始，或者以预先纯化的花色素甙提取物开始，其分别以液体或者粉末形态供应。假如这样的话，所述的果实提取物或者预先纯化的提取物，在纯化步骤以前，或者用酒精溶解，优选甲醇，或者用水溶解，并用本说明书所述含巯基促稳定化合物处理。
在本发明所述的纯化过程中，所述的红色果实提取物被便利地冷却至提取物达到均一的小于10℃的温度，优选小于5℃，所述的温度保持至少大约12小时。
关于所述水提物或醇提物的过滤步骤，它可以用纤维素过滤器或者不锈钢金属丝网进行，截取0-100微米之间或等效的部分。
为了进一步提高所述最终提取物中的稳定化的花色素甙的滴定量和浓度，从树脂中洗提稳定化的花色素甙所用的醇溶液是乙醇的水溶液，其乙醇浓度在10％-90％之间，优选接近于40％。
得到的所述稳定化的洗脱液，在30℃附近的受控温度下被浓缩，然后冷冻干燥或喷雾干燥，以便获得一种稳定化的粉末。
在一个实施例中，例如，欧洲越桔提取物的浓缩物和盐酸L-半胱氨酸盐被合并(9∶1，重量份)，然后喷雾干燥以提供一种粉末态的稳定化欧洲越桔提取物。通常，所述的欧洲越桔提取物与游离半胱氨酸的比例大约是10∶1重量份。
通过服用一定治疗有效量的所述的稳定化的花色素甙组合物，本发明进一步涉及不同疾病的治疗方法。疾病包括，增加的抗氧化剂量的需要，疼痛的减轻，炎症。疼痛的减轻或者消除包括疼痛的不同型式，包括关节炎、痛经、头痛、关节痛、肌肉疼痛、骨关节炎、老年黄斑病变(AMD)、白内障、视网膜病、及其组合。
因此，本发明进一步提供了可生物利用的稳定化的花色素甙组合物，其对治疗本说明书所述的不同的苦痛有作用。所述的稳定化的花色素甙组合物可通过如下文论述的许多方法用于治疗。
令人惊讶地是，本发明提供了半胱氨酸与花色素甙组合物(无论它是花色素还是花色素甙)的混合物的应用，其有助于提高危急中的受试者的花色素甙的传递，相对于摄取无半胱氨酸存在的花色素甙组合物的受试者，花色素甙的传递至少提高了两倍数量。已经意外地发现，有半胱氨酸存在的花色素甙的血药浓度，在用药4小时后，至少是没有半胱氨酸情况下传递的花色素甙的血药浓度的至少两倍。因此，本发明通过给受试者服用一定有效量的花色素甙和半胱氨酸，提供了一种提高受试者体内可生物利用的花色素甙的数量的方法。用药可以是以任何手段，但是通常优选口服。
在一个实施例中，所述的花色素甙与半胱氨酸的比例大约是10-0.1，更具体的是大约10-0.5，更加具体的是大约10-1，以重量计。重要的是注意没有应用半胱氨酸的情况下，如本说明书中描述的实施例表明，花色素甙的生物利用率显著地减少。
用药之后，有半胱氨酸存在的花色素甙的生物利用率的增量，通常是单独服用花色素甙的生物利用率的至少两倍。理论上，通过混入半胱氨酸提高生物利用率，导致所述的生物利用率超过没有包含半胱氨酸的等效的花色素甙的3倍、4倍、5倍、10倍和20倍。这是一个意外的发现。
本发明所述的组合物可以被合并进入不同的食物、饮料、小吃等等。一方面，所述的组合物可以在消费之前，撒在食品上。如果撒在食品上，适当的载体，如淀粉、蔗糖或者乳糖，可用于帮助分散所述的稳定化的花色素甙组合物的浓度，使其易于应用到所述的食品中。
本发明所述的组合物也可以在不同的预制食品中，作为添加剂被提供。针对本申请的该目的，预制食品意指任何天然食品、加工食品、日常饮食或非日常饮食食品，其中已经添加了本发明所述的组合物。本发明所述的组合物可以直接被合并进入许多预制好的日常饮食食品，包括但不限于日常饮食饮料、饮食棒和预制好的冰冻食物。此外，本发明所述的组合物可以被合并进入许多预制好的非日常饮食产品中，包括但不限于糖果，快餐产品，诸如炸马铃薯片，预制好的肉类产品，乳制品，奶酪，酸奶，运动食品，蛋黄酱，色拉味调料，面包和任何其它含有脂肪或油的食物。如本说明书中使用的，术语“食品”指的是适于人或动物消费的任何物质。
本发明所述的组合物可以被添加至不同的饮料，诸如果汁、奶昔、乳制品等等。
优选的服用方法是口服。本发明所述的组合物可以用适合的载体制成配方，适合的载体如淀粉、药片中的蔗糖或乳糖、胶囊、溶液、糖浆和乳剂。本发明所述的药片或胶囊可以用肠溶衣包覆，该肠溶衣溶解于pH值大约为6.0-7.0的环境。适合的肠溶衣是醋酸纤维素，其在小肠溶解但不在胃里溶解。
进入软胶囊中的，本发明所述组合物的配方可以通过许多本领域已知方法实现。所述配方经常包含一种可接受的载体，如油，或其它悬浮剂或乳化剂。
适合的可选择的载体包含但不限于，例如，脂肪酸，其来自任何来源的酯和盐，不受限地包括天然的或合成的油，脂肪，蜡或者它们的组合。此外，所述的脂肪酸可以不受限地来自非氢化的油，部分氢化的油，完全氢化的油或者它们的组合。非限制性的脂肪酸(他们的酯和盐)的典型来源包含植物油，鱼油或海洋生物油脂，canola油，植物油，红花油，葵花油，旱金莲种子油，芥菜籽油，橄榄油，芝麻油，豆油，玉米油，花生油，棉花子油，米糠油，巴巴苏棕榈果油，棕榈油，low erucic菜籽油，棕榈仁油，羽扇豆油，椰子油，亚麻籽油，月见草油，荷荷巴油，小麦胚油，动物脂，牛脂，黄油，鸡油，猪油，乳品乳脂，牛油树脂或它们的。
具体的非限制性典型的鱼油或海洋生物油来源包含甲壳水生动物油，金枪鱼油，鲭鱼油，鲑鱼油，鲱鱼油，凤尾鱼油，青鱼油，鳟鱼油，沙丁鱼油或者它们的组合。特别地，所述脂肪酸的来源是鱼油或海洋生物油(DHA或EPA)，豆油或亚麻籽油。另外，或与上述被确定的载体之一结合，蜂蜡能被用做适合的载体，以及诸如硅石(二氧化硅)的悬浮剂。
本发明所述的配方也被看作保健食品。术语“保健食品”在所述的领域是公认的并被用来描述食物中具体的化合物，其可以预防疾病或改善不良状况。
本发明所述的配方可以进一步包含不同的组分以帮助促使稳定，或者帮助促进本发明有益组合物的组分的生物利用率，或者作为辅助营养素进入个人的日常饮食。适合的添加剂可以包含维生素和生物学上可接受的矿物质。维生素的非限制性实例包含维生素A，B族维生素，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K和叶酸。矿物质的非限制性实例包含铁，钙，镁，钾，铜，铬，锌，钼，碘，硼，硒，锰，它们的衍生物或者它们的组合。这些维生素和矿物质可以不受限制地来自于任何来源或者来源的组合。非限制性的B族维生素不受限制地包含硫胺，烟雾胺，吡哆醇，核黄素，氰钴维生素，生物素，泛酸或它们的组合。
不同的添加剂可以被合并进入本发明组合物。本发明组合物的可选择的添加剂不受限制地包含，透明质酸，磷脂，淀粉，糖，脂肪，抗氧化剂，氨基酸，蛋白质，调味品，着色剂，水解淀粉和它们的衍生物或它们的组合。
如本说明书中使用的，术语“抗氧化剂”在本领域中是公知的，指的是那些阻止或延迟化合物的氧化变质的合成或天然物质。典型的抗氧化剂包含生育酚，类黄酮，儿茶酚，过氧化物歧化酶，卵磷脂，γ-谷维素；维生素，诸如维生素A、维生素C(抗坏血酸)和维生素E和β-胡萝卜素；天然组分，诸如在迷迭香和山楂提取物中发现的camosol，camosic酸和rosmanol，诸如在葡萄籽或松树皮提取物以及绿茶提取物中发现的原花色素。
包含本发明所述的稳定化花色素甙组合物的组合物可以通过传统方法制得，如混合，溶解，造粒，糖衣丸制造，研磨成粉，乳化，制成胶囊，包埋或升华干燥过程。所述组合物可以使用传统方法配制，利用一种或多种生理学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂，以便于将稳定化花色素甙组合物制成能被使用的配制品。
本发明所述的组合物可以采取适于任何有效服用方式的形式，包括，例如，口服，口腔用药，内吸收，注射，透过皮肤起作用，直肠吸收，阴道吸收等等，或者适于通过吸入或者注气服用的形式。
内吸收的配方包含那些用于注射给药的设计，例如，皮下注射，静脉注射，肌肉注射，鞘内注射或腹腔内注射，以及那些设计用于透过皮肤起作用的用药方式，经粘膜吸收，口服或肺部吸收的用药方式。
有效的注射用配制品包含含水媒介或油性媒介中的所述稳定化花色素甙组合物的无菌的悬浮液，溶液或乳剂。所述的组合物也可以包含复配助剂，诸如悬浮剂，促稳定剂和/或分散剂。所述用于注射的配方可以单位剂量形式存在，例如，安瓿或multidose容器，并可包含添加的防腐剂。
另外，所述注射用配方可以粉末形式提供，用于在使用前和适合的媒介物一起恢复原状，包括但不限于，无菌无热原的水，缓冲溶液，葡萄糖溶液等等。所述稳定化的花色素甙组合物可以通过任何的已知的技术被干燥，诸如冻干法，并在使用前恢复原状。
对于经粘膜吸收用药，适于透过屏障的渗透剂被用于所述的配方。这样的渗透剂在所属技术领域中是已知的。
对于口服，本发明的组合物可以采取锭剂，片剂或胶囊的形式，例如，通过传统方法和药学上可接受的赋形剂进行制备，所述的赋形剂诸如粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；装填物(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；分解质(例如，马铃薯淀粉或羟基淀粉乙酸钠)；或者润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。所述片剂可以通过所属领域众所周知的方法，例如，用糖，薄膜或肠溶衣包覆。
用于口服的液体药剂可以采取例如酏剂，溶液，糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以作为一种干燥的产品存在，在使用前与水或其它适合的媒介物还原配制。这样的液体药剂可以通过传统方法与药学上可接受的添加剂制备得到，所述的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水媒介物(例如，杏仁油，油酯，乙醇，或精馏植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基p-羟基安息香酸盐或山梨酸)。所述的配制品也可以酌情包含缓冲盐，防腐剂，调味品，着色剂和甜味剂。
用于口服的配制品可以按照众所周知的方式，适当地配制，以实现稳定化花色素甙组合物的受控释放。
对于口腔用药，所述的组合物可以采取片剂或锭剂的形式，以传统方法配制而成。
对于直肠和阴道途径的用药，稳定化花色素甙组合物可被配制为溶液(用于保留灌肠法)，栓剂或膏剂，其含有传统的栓剂基质，诸如可可脂或其它甘油酯。
对于鼻部给药或者通过吸入或吹入的给药，所述的稳定化花色素甙组合物可以借助于适合的抛射剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，碳氟化合物，二氧化碳或其它适合的气体，从密封容器或喷雾器中以气溶胶喷射的形式，被方便地传递。就加压气雾剂而言，所述的剂量单位，可以通过提供一个阀来决定所释放的计量数量。供吸入器或吹药器(例如由凝胶组成的胶囊和药盒)用的胶囊和药盒可以复配含有粉末混合物，该粉末混合物由所述化合物和适合的粉末基料组成，诸如乳糖或淀粉。
为了持续传递，所述的稳定化花色素甙组合物可以作为用于植入给药或肌肉注射给药的储存制品被配制。所述的稳定化花色素甙组合物可以与适合的聚合材料或者疏水材料(例如，在可接受的油中作为乳剂)或离子交换树脂，或者作为微溶的衍生物，例如，作为一种微溶的盐，进行配制。另外，作为一种吸盘或膜片制造的透过皮肤起作用的输送系统能被使用，其缓慢释放所述稳定化花色素甙组合物用于经皮吸收。至此，渗透增强剂可用于促进所述稳定化花色素甙组合物的皮肤渗透。适合的皮肤膜片被描述在例如美国专利5,407,713；美国专利5,352,456；美国专利5,332,213；美国专利5,336,168；美国专利5,290,561；美国专利5,254,346；美国专利5,164,189；美国专利5,163,899；美国专利5,088,977；美国专利5,087,240；美国专利5,008,110；和美国专利4,921,475。
另外，可以采用其它的传递系统。脂质体和乳剂是被熟知的传递载体，其可用于传递稳定化花色素甙组合物。确定的有机溶剂，诸如二甲亚砜(DMSO)，也可以被采用，虽然通常以大的毒性为代价。
所述的组合物，如果需要，可以存在于一种包装或者分配器装置中，其可以包含一种或多种含有所述稳定化花色素甙组合物的单位剂量型式。所述的包装可以，例如，含有金属或者塑料薄片，诸如泡罩包装。所述的包装或分配器装置可以附有药的服用说明。
软凝胶或软胶胶囊可以被制备，例如，不受限制地，通过在适当的媒介物(例如，米糠油和/或蜂蜡)中分散所述成分，以形成一种高粘度混合物。然后这些混合物与凝胶一同被做成胶囊，基于软凝胶工业技术人员所知的薄膜应用技术和机械设备。所述胶囊成型后被干燥至恒重。典型地，所述胶囊的重量大约在100-2500毫克之间，优选在大约1500-1900毫克之间，更准确地说在大约1500-2000毫克之间。
例如，当制备软凝胶壳时，所述的壳可以包含大约20-70％的凝胶，通常还有增塑剂和大约5-60％按重量计算的山梨醇。所述软胶胶囊的充填料是液体(主要是载体，诸如米糠油或者小麦胚油和/或蜂蜡，如果需要的话)并可以包含除所述稳定化花色素甙组合物以外的亲水性的基质。所述亲水性基质，如果存在的话，是具有大约200-1000平均分子量的聚乙二醇。进一步的组分可选择的是增稠剂和/或乳化剂。在一个实施例中，所述的亲水性基质包括具有大约200-1000平均分子量的聚乙二醇，5-15％的甘油，和5-15％按重量计算的水。所述聚乙二醇也可以搀杂丙二醇和/或碳酸丙烯。
在另外实施例中，所述的软凝胶胶囊是从凝胶、甘油、水和不同添加剂制备得到的。典型地，所述凝胶的百分比(按重量计算)在大约30-50％之间，优选为大约35-15之间，更优选大约42％。所述配方包括大约15-25％重量百分数之间的甘油，更优选的在大约17-23％重量百分数之间，以及最优选的为大约20％重量百分数甘油。
所述胶囊的剩余部分典型地是水。该数量在大约15-40％重量百分数之间变化，更优选在30-35％重量百分数之间，最优选为大约35％重量百分数。该胶囊的其他部分通常可以在大约2-10％重量百分数之间变化，由调味剂、糖、着色剂、等等或它们的组合组成。在该胶囊加工之后，最终胶囊的含水率经常是在大约5-10重量百分数之间，更具体的在大约7-12重量百分数，更准确地说在大约9-10重量百分数之间。
至于制造，标准软壳胶囊制造技术可用于制备该软壳产品是可预期的。有效的制造技术的实例是平板法，R.P.Scherer开创的旋转冲模过程工艺，应用Norton胶囊设备的过程工艺，以及Accogel设备和Lederle开发的过程工艺。这些过程工艺每个都是成熟技术，并对任何一个希望制备软胶胶囊的人，都可广泛得到。
所述乳化剂可用于促进溶解软胶囊内的组分。表面活性剂、乳化剂、或泡腾剂的特定例子包括D-山梨醇、乙醇、角叉菜胶、聚羧乙烯、羧甲基纤维素钠、瓜耳豆胶、甘油、脂肪酸甘油酯、胆固醇、白蜂蜡、丁二酸二辛基磺酸钠、蔗糖脂肪酸酯、十八醇、硬脂酸、聚氧乙烯(40)硬脂酸盐、失水山梨醇倍半油酸酯、鲸蜡醇、明胶、失水山梨醇脂肪酸酯、滑石、失水山梨醇三油酸酯、石蜡、马铃薯淀粉、羟丙基纤维素、丙二醇、丙二醇脂肪酸酯、果胶、聚氧乙烯(105)聚氧丙烯(5)乙二醇、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)乙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯60、聚山梨醇酯80、聚乙二醇400、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、甲基纤维素、失水山梨醇单油酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、十二烷基二甲胺氧化物溶液、十二烷基硫酸钠、聚桂醇、干燥碳酸钠、酒石酸、氢氧化钠、精制大豆卵磷脂、大豆卵磷脂、碳酸钾、碳酸氢钠、中链甘油三酸酯、柠檬酸酐、棉籽油-大豆油混合物，和液体石蜡。
本发明也提供了已包装制剂，其包括本发明所述组合物以及该产品在适当条件下的使用说明书。典型情况下，无论其以什么形式，该已包装制剂是用于有使用需要的个体。典型情况下，其剂量要求为一天大约1到大约4次用量。
虽然本发明描述了本发明所述组合物用于治疗不同的症状的软胶囊制剂、使用、制造和包装，但不应认为其仅限于软胶囊。本发明可吸收的组合物可以以如上所述的传统的片剂、丸剂、锭剂、酏剂、乳液、硬胶囊、液体、悬浮液等剂型传递。
本发明所述的稳定化花色素甙组合物，或者它们的组合物，通常以一定有效剂量用于完成所述的预期结果，例如以一定有效剂量治疗或者预防与发炎有关的症状。所述的组合物可以有疗效地服用以实现治疗学目的，或者预防性地实现预防疾病的目的。依据治疗目的，是指被处理的潜的紊乱的根除或者改善，和/或一个或多个与潜在紊乱有联系的症状的根除或者改善，以使该病人报告在感受或症状上的改善，尽管该病人仍可能经受该潜在紊乱的折磨。例如，不仅当该潜在症状被根除或改善时，而且当该病人报告与病痛有关的身体不适的严重程度或持续时间减小时，本发明组合物的服用，对遭受病痛折磨的病人提供了治疗学的效益。
对于预防性用药，该组合物可用于处于逐步显示出前述症状之一的风险中的病人。
该组合物服用的剂量将依赖多种因素，包括，例如，接受治疗的特定征兆，给药方式，无论所期望的效果是预防性的还是治疗性的，接受治疗的征兆的严重程度以及病人的年龄和体重等等。有效剂量的确定处于所属领域技术人员的能力范围之内。
稳定化花色素甙组合物的总剂量将代表性地处于0.0001mg/kg/天或0.001mg/kg/天或0.01mg/kg/天到100mg/kg/天范围之内，但是，根据其它因素中的组分活性、其生物利用率、给药方式以及上述讨论过的多种因素，其可以更高或更低。用药剂量和间隔可单独调整，以使所述化合物的血药浓度足以维持治疗性或预防性效果。例如，根据其他情况中的给药方式、被治疗的特定适应症和医嘱，所述化合物可以每周服用一次，每周服用数次(例如，每隔一天)，每日服用一次或每日服用多次。所属领域技术人员不需要非常规实验就可以优化有效局部用量。
下列从1到91段，连续列举了本发明的不同的方面。在一个实施例中，在第一段(1)，本发明提供了一种稳定化的花色素甙提取组合物，其包含一种花色素甙提取物和一种含有至少一个-SH的促稳定化合物，并规定该促稳定化合物不是谷胱甘肽。
2.段落1中的稳定化花色素甙提取组合物，在其中的促稳定化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
3.段落1或2中的稳定化花色素甙提取组合物，在其中花色素甙提取物是欧洲越桔提取物，黑醋栗提取物，酸果蔓提取物，黑大豆提取物，越橘提取物，蓝莓提取物或者它们的两个或多个的混合物。
4.段落1-3中的任何一种稳定化花色素甙提取组合物，在其中的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.1-10。
5.段落1-4中的任何一种稳定化花色素甙提取组合物，在其中所述的组合物对于暴露于具有pH大约为2-12之间的含水环境中的降解是稳定的。
6.段落1-5中任何一种稳定化花色素甙提取组合物，在其中的花色素甙提取物包含一种花色素甙。
7.段落1中的稳定化花色素甙提取物，在其中所述的花色素甙提取物包括一种花色素甙。
8.段落7中的稳定化花色素甙提取物，在其中所述的花色素甙是花葵素，甲基花青素，花青素，二甲翠雀素，3′-甲花翠素，翠雀素的糖甙或者它们两个或多个糖甙的混合物。
9.一种稳定化花色素甙提取组合物，其包含一种花色素甙提取物和一种具有至少一个-SH基团的促稳定化合物。
10.段落9中的稳定化花色素甙提取组合物，在其中所述的促稳定化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，谷胱甘肽，谷胱甘肽的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
11.段落9或10中的稳定化花色素甙提取组合物，在其中所述的花色素甙提取物是欧洲越桔提取物，黑醋栗提取物，酸果蔓提取物，黑大豆提取物，越橘提取物，蓝莓提取物或者它们的两个或多个的混合物。
12.段落9-11中的任何一种稳定化花色素甙提取组合物，在其中的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.1-10。
13.段落9-12中的任何一种稳定化花色素甙提取组合物，在其中所述的组合物对于暴露于具有pH大约为2-12之间的含水环境中的降解是稳定的。
14.段落9-13中的任何一种稳定化花色素甙提取物，在其中所述的花色素甙提取物包含一种花色素甙。
15.段落9中所述的稳定化花色素甙提取物，在其中所述的花色素甙提取物包括一种花色素甙。
16.段落15中所述的稳定化花色素甙提取物，在其中所述的花色素甙是花葵素，甲基花青素，花青素，二甲翠雀素，3′-甲花翠素，翠雀素的糖甙或者它们的两个或多个糖甙的混合物。
17.一种使花色素甙提取组合物稳定的方法，其包含一个将花色素甙提取物与足量的具有至少一个-SH基团的促稳定化合物混合的步骤，并规定所述的促稳定化合物不是还原态谷胱甘肽，以使所述的花色素甙提取物稳定。
18.段落17所述的方法，在其中所述的促稳定化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
19.段落17或18中任何一个所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物是欧洲越桔提取物，黑醋栗提取物，酸果蔓提取物，黑大豆提取物，越橘提取物，蓝莓提取物或者它们的两个或多个的混合物。
20.段落17-19中任何一个所述的方法，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.1-10。
21.段落17-20中任何一个所述的方法，在其中所述的组合物对于暴露于具有pH大约为2-12之间的含水环境中的降解是稳定的。
22.段落17-21中任何一个所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物包含一种花色素甙。
23.段落17所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物包括一种花色素甙。
24.段落23所述的方法，在其中所述的花色素甙是花葵素，甲基花青素，花青素，二甲翠雀素，3′-甲花翠素，翠雀素的糖甙或者它们的两个或多个糖甙的混合物。
25.段落17所述的方法，在其中所述的稳定化的花色素甙提取组合物在周围环境条件下至少一天是稳定的。
26.段落22所述的方法，在其中所述的稳定化花色素甙在pH值为7时至少6小时是稳定的。
27.段落26所述的方法，在其中所述的稳定化花色素甙在pH值为7的条件下，大约在4小时内至少维持以糖甙形式存在的50％的花色素甙。
28.一种使花色素甙提取组合物稳定的方法，其包含一个将花色素甙提取物与足量的具有至少一个-SH基团的促稳定化合物混合的步骤，以使所述的花色素甙提取物稳定。
29.段落28所述的方法，在其中所述的促稳定化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，谷胱甘肽，谷胱甘肽的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
30.段落28或29所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物是欧洲越桔提取物，黑醋栗提取物，酸果蔓提取物，黑大豆提取物，越橘提取物，蓝莓提取物或者它们的两个或多个的混合物。
31.段落28-30中任何一个所述的方法，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.1-10。
32.段落28-30中任何一个所述的方法，在其中所述的组合物对于暴露于具有pH大约为2-12之间的含水环境中的降解是稳定的。
33.段落28-32中所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物包含一种花色素甙。
34.段落28所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物包括一种花色素甙。
35.段落34所述的方法，在其中所述的花色素甙是花葵素，甲基花青素，花青素，二甲翠雀素，3′-甲花翠素，翠雀素的糖甙或者它们的两个或多个糖甙的混合物。
36.段落28所述的方法，在其中所述的稳定化花色素甙提取组合物在周围环境条件下至少一天是稳定的。
37.段落33所述的，在其中所述的稳定化的花色素甙在pH值为7时至少6小时是稳定的。
38.段落37所述的方法，在其中所述的稳定化的花色素甙在pH值为7的条件下，大约在4小时内至少维持以糖甙形式存在的50％的花色素甙。
39.一种pH值稳定化的花色素甙提取组合物，其包含一种花色素甙提取物和一种具有至少一个-SH基团的促稳定化合物。
40.段落39所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的促稳定化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，谷胱甘肽，谷胱甘肽的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
41.段落39或40任何一个所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的花色素甙提取物是欧洲越桔提取物，黑醋栗提取物，酸果蔓提取物，黑大豆提取物，越橘提取物，蓝莓提取物或者它们的两个或多个的混合物。
42.段落39-41中任何一个所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.1-10。
43.段落39-42中任何一个所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的组合物对于暴露于具有pH大约为2-12之间的含水环境中的降解是稳定的。
44.段落39-43中任何一个所述的pH值稳定化的花色素甙提取，在其中所述的花色素甙提取物包含一种花色素甙。
45.段落39所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的花色素甙提取物包括一种花色素甙。
46.段落45所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的花色素甙是花葵素，甲基花青素，花青素，二甲翠雀素，3′-甲花翠素，翠雀素的糖甙或者它们的两个或多个糖甙的混合物。
47.段落39所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的稳定化的花色素甙提取物在周围环境条件下至少一天是稳定的。
48.段落44所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的稳定化的花色素甙在pH值为7时至少6小时是稳定的。
49.段落48所述的pH值稳定化的花色素甙提取组合物，在其中所述的稳定化的花色素甙在pH值为7的条件下，大约在4小时内至少维持以糖甙形式存在的50％的花色素甙。
50.一种pH值稳定化的花色素甙提取组合物的制备方法，其包含一种花色素甙提取物和一种具有至少一个-SH基团的促稳定化合物，以使所述的花色素甙提取物稳定。
51.段落50所述的方法，在其中所述的促稳定化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，谷胱甘肽，谷胱甘肽的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
52.段落50或51中任何一个所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物是欧洲越桔提取物，黑醋栗提取物，酸果蔓提取物，黑大豆提取物，越橘提取物，蓝莓提取物或者它们的两个或多个的混合物。
53.段落50-52中任何一个所述的方法，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.1-10。
54.段落50-53中任何一个所述的方法，在其中所述的组合物对于暴露于具有pH大约为2-12之间的含水环境中的降解是稳定的。
55.段落50-54中任何一个所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物包含一种花色素甙。
56.段落50所述的方法，在其中所述的花色素甙提取物包括一种花色素甙。
57.段落56所述的方法，在其中所述的花色素甙是花葵素，甲基花青素，花青素，二甲翠雀素，3′-甲花翠素，翠雀素的糖甙或者它们的两个或多个糖甙的混合物。
58.段落50所述的方法，在其中所述的稳定化花色素甙提取组合物在周围环境条件下至少一天是稳定的。
59.段落55所述的方法，在其中所述的稳定化的花色素甙在pH值为7时至少6小时是稳定的。
60.段落59所述的方法，在其中所述的稳定化的花色素甙在pH值为7的条件下，大约在4小时内至少维持以糖甙形式存在的50％的花色素甙。
61.一种对受试者提供一种有疗效剂量的稳定化的花色素甙组合物的方法，其包含给受试者服用一定有疗效剂量的稳定化的花色素甙组合物的步骤，其在段落1-16或段落39-49中的任何一段中得到描述。
62.一种治疗动脉硬化的方法，其包含给受试者服用一定有疗效剂量的稳定化的花色素甙组合物的步骤，其在段落1-16或段落39-49中的任何一段中得到描述。
63.一种提高或者保持细胞内花色素甙的抗氧化剂浓度的方法，其包含服用一定有疗效剂量的稳定化的花色素甙组合物的步骤，其在段落1-16或段落39-49中的任何一段中得到描述。
64.一种减轻或者减少疼痛的方法，其包含服用一定有疗效剂量的稳定化的花色素甙组合物的步骤，其在段落1-16或段落39-49中的任何一段中得到描述。
65.段落4，12或者42中任何一个所述的稳定化的花色素甙提取物，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是0.5-5。
66.段落4，12或者42中任何一个所述的稳定化的花色素甙提取物，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约是1。
67.段落1-16或39-49中任何一个所述的稳定化的花色素甙提取物，在其中所述的稳定化的花色素甙提取物是药丸，药片，粉末，颗粒，薄膜，膏剂，乳膏剂，糊剂，溶液，混合剂，糖浆，粘胶，乳浊液，酊剂，酒精酊剂，涂料或煎剂的形式。
68.段落1-16或39-49中所述的稳定化的花色素甙提取物，进一步包含一种生理学上可接受的佐剂。
69.段落68所述的稳定化的花色素甙提取物，在其中所述的佐剂是稀释剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，基料，调味剂，甜味剂，着色剂，防腐剂，抗氧化剂，表面修饰剂，成膜材料，溶剂，增溶剂，润湿剂，吸收剂，过滤助剂，乳化剂，表面活性剂，悬浮剂，增粘剂，增塑剂，螯合剂，雾化推进剂，发泡剂，酸化剂，碱化剂，缓冲剂或它们的混合物。
70.段落20，31或者53中任何一个所述的方法，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约为0.5-5。
71.段落20，31或者53中任何一个所述的方法，在其中所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比大约为1。
72.段落65或66中任何一个所述的稳定化的花色素甙提取物，在其中所述的半胱氨酸的衍生物是N-乙酰半胱胺酸，以及所述的巯基蛋白酶是木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶，木瓜凝乳蛋白酶或者它们的混合物。
73.一种富含花色素甙的提取物的稳定方法，其包含该步骤：
将富含花色素甙的提取物与至少一个具有至少一个-SH基团的促稳定化合物接触，在其中，所述的促稳定化合物可以与所述的花色素甙，可以在提取过程中的任何时间接触。
74.根据段落73所述的方法，在其中所述的具有至少一个-SH基团的化合物是酵母提取物，二氢硫辛酸，半胱氨酸，谷胱甘肽或者它们的混合物。
75.段落73所述的方法，在其中所述的具有至少一个-SH基团的促稳定化合物与所述的花色素甙化合物的摩尔比在大约0.1-10之间。
76.段落75所述的方法，在其中所述的摩尔比在大约0.5-5之间。
77.段落75所述的方法，在其中所述的摩尔比大约是1。
78.段落73-77中任何一个所述的方法，在其中所述的具有至少一个-SH基团的化合物，在与所述的富含花色素甙的提取物接触之前，被添加到所述的萃取溶剂中。
79.段落73-77中任何一个所述的方法，在其中所述的具有至少一个-SH基团的化合物，在所述的富含花色素甙的提取物与萃取溶剂合并后，被添加到所述的萃取溶剂中。
80.一种治疗老年黄斑病变(AMD)，白内障，或者视网膜病的方法，其包含给有需要的受试者服用一定有疗效剂量的稳定化的花色素甙组合物的步骤，其在段落1-16或段落39-49中的任何一段中得到描述。
81.一种稳定化的欧洲越桔组合物，其包含欧洲越桔提取物和半胱氨酸。
82.段落81所述的稳定化的欧洲越桔组合物，在其中所述的欧洲越桔提取物与半胱氨酸的比例大约是10-1重量比。
83.段落81或82中任何一个所述的稳定化的欧洲越桔组合物，在其中所述的被喷雾干燥。
84.段落81-83中任何一个所述的稳定化的欧洲越桔组合物，在其中所述的稳定化的组合物，在至少大约6个月时，通过HPLC分析测定，保持至少大约80％的最初的花色素甙。
85.一种提高花色素甙组合物的生物利用率的方法，其包含给受试者提供一种花色素甙组合物的步骤，该花色素甙组合物包含花色素甙和具有至少一个-SH基团的化合物，在其中，与缺少具有至少一个-SH基团的化合物的花色素甙组合物的样本相比，受试者体内所述的花色素甙的数量被提高至少两倍。
86.段落85所述的方法，在其中所述的花色素甙原料是一种提取物。
87.段落86所述的方法，在其中所述的提取物是欧洲越桔提取物。
88.段落85所述的方法，在其中所述的花色素甙原料与所述的具有至少一个-SH基团的化合物的比例大约在10∶0.1和1∶1重量比之间。
89.段落87所述的方法，在其中所述的欧洲越桔提取物中的花色素甙与所述的具有至少一个-SH基团的化合物的比例大约在10-1之间。
90.段落85所述的方法，在其中，服用4小时后，在有半胱氨酸存在情况下的花色素甙的血药浓度，是没有具有至少一个-SH基团的化合物存在情况下的花色素甙的血药浓度的至少两倍。
91.段落85-90中任何一个所述的方法，在其中所述的具有至少一个-SH基团的化合物是酵母，二氢硫辛酸，二氢硫辛酸的衍生物，半胱氨酸，半胱氨酸的衍生物，谷胱甘肽，谷胱甘肽的衍生物，巯基蛋白酶，巯基金属蛋白酶，含有半胱氨酸的缩氨酸，含有谷胱甘肽的缩氨酸，发酵的牡蛎提取物，含巯基壳聚糖，含巯基凝胶或者它们的混合物。
下列实施例对本发明不意谓着限制，而是对本发明提供额外的信息和支持。
出现的涉及欧洲越桔提取物和红醋栗提取物的示范性部分如下表如所示：
 制造商s   批号
  欧洲越桔提取物  Omya-Peralta GmbH   BB0823-1
  红醋栗提取物  Omya-Peralta GmbH   BC6006
实施例1
样品a)60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol花色素甙，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线并搅拌至完全溶解。立即取1mL样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙(新样品)的含量。剩余溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。其后另外的样品(空白试样)，代表不受保护的降解，取样并酸化。
样品b)20mg还原态L-谷胱甘肽(0.065mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。然后添加60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)，并向烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
样品c)30mg二氢硫辛酸(0.144mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。然后添加60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)，并向烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
4小时后，取样品并立即用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙的含量。降解用各个样品的峰的峰面积的减小来表示(以4小时后剩余％计算)。
根据下表推断，当和空白样品(不受保护的)对比，在pH值＝7.0，37℃下，花色素甙实质上在二氢硫辛酸或者谷胱甘肽存在的情况下，是更稳定的。4小时后，空白试样显示大约25％的残留花色素甙被观测到，而受保护的样品产生超过60％的残留花色素甙。30mg二氢硫辛酸的保护效能比得上20mg谷胱甘肽。所述的保护效能似乎是与基本花色素甙-骨架有关系，通过翠雀素葡萄糖甙举例说明，当和花青素葡萄糖甙对比，翠雀素葡萄糖甙保护的不太好。对于每个受试的个体花色素甙，观测保护效应，例如，当和空白试样对比时，更多花色素甙残留。表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00231
Dp...翠雀素，Cn...花青素，Pt...3′-甲花翠素，Pe...甲基花青素，Mv...二甲翠雀素，Gal...半乳糖甙，Glc...葡萄糖甙，Ara...阿拉伯糖甙
如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
实施例2
样品a)60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol花色素甙，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线并搅拌至完全溶解。立即取1mL样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙(新样品)的含量。剩余溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存，并且每15分钟采样1mL(空白试样)，代表不受保护的降解。对于选定的花色素甙，通过HPLC分析样品。
样品b)20mg还原态L-谷胱甘肽(0.065mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。添加60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)，并向该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存。每15分钟取样1mL并对选定的花色素甙通过HPLC进行分析。
根据下表推断，当和空白样品(不受保护的)对比，在pH值＝7.0，37℃下，花色素甙实质上在谷胱甘肽存在的情况下，是更稳定的。如选定的花色素甙相对时间的相对衰退表明，保护作用在溶解之后立即开始，并持续至少4小时。该保护作用再次被认为与花色素甙-骨架有关，举例说明，在培养4小时30分钟后，翠雀素-3-O-半乳糖残留65％，3′-甲花翠素-3-O-半乳糖残留67％和花青素-3-O-半乳糖残留77％。对于每个受试的个体花色素甙，观测保护效应，例如，当和空白试样对比时，更多花色素甙残留。表，在37℃培养后的花色素甙(空白试样)的峰面积
Figure G2008800120877D00241
-...没有取样表，在37℃培养后的花色素甙(谷胱甘肽保护样品)的峰面积表，在37℃培养4.30小时后的花色素甙残留％
Figure G2008800120877D00252
如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。[0300]实施例3
样品a)60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线并搅拌至完全溶解。立即取1mL样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙(新样品)的含量。剩余溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。其后采样并酸化(空白试样)，代表不受保护的降解。
样品b)20mg还原态L-谷胱甘肽(0.065mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝70)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)，并向该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
样品c)20mg二氢硫辛酸(0.096mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)，并向该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
样品d)20mg L-半胱氨酸(0.165mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)，并向该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
4小时后，取样品并立即用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙的含量。降解用各个样品的峰的峰面积的减小来表示(以4小时后剩余％计算)。
根据下表，确定了当和空白样品对比时，在pH值＝7.0，37℃下，花色素甙实质上在二氢硫辛酸，谷胱甘肽或者L-半胱氨酸存在的情况下，是更稳定的。4小时后，空白试样中有9.5-33.4％的花色素甙残留被观测到，而受谷胱甘肽保护的样品产生了50.4-65.0％花色素甙残留。对于二氢硫辛酸，比较数字是36.7-38.9％。对于每个受试的个体花色素甙，观测保护效应，例如，当和空白试样对比时，更多花色素甙残留被观测到。表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00261
Dp...翠雀素，Cn...花青素，Glc...葡萄糖甙，Rut...芸香糖甙如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
实施例4
样品a)60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线并搅拌至完全溶解。该溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。其后采样并酸化(空白试样)，代表不受保护的降解。
样品b-e)5，10，20或60mg二氢硫辛酸(0024-0.288mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝70)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。向每个烧瓶添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)。该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
样品f-i)5，10，20或60mg谷胱甘肽(0.016-0.192mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。向每个烧瓶添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)。该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
样品j-m)5，10，20或60mg L-半胱氨酸(0.041-0.492mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。向每个烧瓶添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)。该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
4小时后，取样品并立即用蚁酸酸化至PH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙的含量。降解用4种主要花色素甙(Dp-3-O-Glc，Dp-3-O-Rut，Cn-3-O-Glc，Cn-3-O-Rut)的峰面积之和的减小来表示，以4小时后剩余％计算。
根据下表，确定了花色素甙实质上是以剂量依赖方式，受二氢硫辛酸，谷胱甘肽或者L-半胱氨酸保护的。表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00271
表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00272
表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00273
如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
实施例5
样品a)60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0037mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线并搅拌至完全溶解。立即取1mL样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙的含量。剩余溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存，并且每15分钟取样1mL(空白试样)，代表不受保护的降解。样品对选定的花色素甙通过HPLC进行分析。
样品b)20mg还原态L-谷胱甘肽(0.065mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。添加60mg红醋栗提取物[35％花色素甙](0.037mmol，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)，并向该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存。每15分钟进行采样并对选定的花色素甙，通过HPLC分析样品。
根据下表，确定了当和空白样品对比时，在pH值＝7.0，37℃下，花色素甙实质上在谷胱甘肽存在的情况下，是更稳定的。如花色素甙相对时间的比较衰退表明，保护作用在溶解之后立即开始，并持续至少4小时。与翠雀素-葡萄糖甙对比，花青素-葡萄糖甙的保护的改善，例证了该保护作用可能取决于花色素甙-骨架有关。然而，当空白样与受保护的样品比较时，翠雀素-葡萄糖甙实质上比花青素-葡萄糖甙受到了更好的保护。
对于每个受试的个体花色素甙，观测保护效应，例如，当和空白试样对比时，更多花色素甙残留被观测到。表，37℃培养后的花色素甙的峰面积(空白样品)
Figure G2008800120877D00281
表，37℃培养后的花色素甙的峰面积(GSH保护样品)表，37℃培养4小时后残留的花色素甙％
Figure G2008800120877D00283
如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
实施例6
样品a)5mg翠雀素氯化物(0.015mmol)被转移进入100ml烧瓶，溶解于1mL甲醇并添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线。样品在37℃带有搅拌条件下保存。在溶解之后，培养15分钟，1，2和3小时后，立即取样。样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析。
样品b)5mg二甲翠雀素氯化物(0.014mmol)被转移进入100ml烧瓶，溶解于1mL甲醇并添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线。样品在37℃带有搅拌条件下保存。在溶解之后，培养1，2和3小时后，立即取样。样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析。
样品c)5mg翠雀素氯化物(0.015mmol)与10mg谷胱甘肽(0.032mmol)被转移进入100ml烧瓶，溶解于1mL甲醇并添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线。样品在37℃带有搅拌条件下保存。在溶解之后15分钟，培养1，2和3小时后取样。样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析。
样品d)5mg二甲翠雀素氯化物(0.014mmol)与10mg谷胱甘肽(0.032mmol)被转移进入100ml烧瓶，溶解于1mL甲醇并添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线。样品在37℃带有搅拌条件下保存。在溶解之后15分钟，培养1，2和3小时后取样。样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析。
根据下表断定谷胱甘肽没有充分保护游离的花色素甙骨架。谷胱甘肽与翠雀素或二甲翠雀素之间的摩尔比率高于2∶1，其表明缺乏活性不是与谷胱甘肽的低浓度有关系。游离花色素甙的衰退几乎不受谷胱甘肽存在的影响，其与用带有相同骨架的花色素葡萄糖甙的观察结果相反。表，翠雀素与二甲翠雀素在37℃培养后的峰面积
Figure G2008800120877D00291
BLD...低于检测极限，NA...不适用如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
实施例7
样品a)60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol花色素甙，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值被调至如下值)至刻度线并搅拌至完全溶解。该溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。其后取样(空白试样)，代表不受保护的降解，并用蚁酸酸化至pH值＝1.0。
样品b)20mg还原态L-谷胱甘肽(0.065mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值被调节至如下值)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)被添加至该烧瓶，并向烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
4小时后，取样品并立即用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙的含量。降解用4个花色素甙的峰面积之和的减小来表示，以4小时后剩余％计算。
根据下表确定了谷胱甘肽保护花色素甙，特别是在花色素甙对降解(pH值大于5)敏感的pHs值-范围内。并非意外的是，在较低的pH值下，在这样的pH值下花色素甙本身是稳定的，保护作用被减弱。表，在37℃培养4小时后的花色素甙残留％
Figure G2008800120877D00301
如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
保护效应是一参数，其通过受保护样品的残留比例除以空白试样(在选定的pH值下，没有还原态谷胱甘肽存在的欧洲越桔提取物)的残留比例，计算得到。从而该差异表明了，在大约3-11之间的pH值范围内，还原态L-谷胱甘肽(GSH)对欧洲越桔提取物中的花色素甙的稳定性的作用。
被注意到的是，到当pH值上升，提取物的降解增加。在全部测试pH值中，L-谷胱甘肽(GSH)保护了花色素甙。另外，保护效应与pH值一起提高。如上表和图19与20所示，在碱性环境中，谷胱甘肽具有更大的稳定作用。
实施例8
样品a)60mg谷胱甘肽(0.192mmol)被转移进入100ml烧瓶，溶解并添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线。样品在37℃带有搅拌条件下保存。在溶解之后，培养1，2，3和4小时后，立即取样。样品用HPLC分析GSH与GSSG(代表GSH的氧化形式)。
样品b)60mg还原态L-谷胱甘肽(0.192mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。添加60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)，向该烧瓶添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)至刻度线，在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存。在溶解之后，培养1，2，3和4小时后，立即取样。样品用HPLC分析GSH与GSSG(代表GSH的氧化形式)。
根据下表确定了谷胱甘肽在37℃的含水的缓冲溶液(pH值＝7.0)中，被氧化为氧化型谷胱甘肽。欧洲越桔提取物的添加对谷胱甘肽至氧化型谷胱甘肽的氧化加速了大约2-3倍，表明欧洲越桔提取物对于氧化还原反应担当了伙伴的角色。根据这个结果，电偶谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽显然具有一个相当低的氧化还原电势，其产生氧化态谷胱甘肽和还原态花色素甙。表，谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的峰面积，以及在37℃，pH值＝7.0的缓冲液中培养后的峰面积比值。
Figure G2008800120877D00302
表，谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的峰面积，以及在37℃，pH值＝7.0，欧洲越桔提取物存在下的缓冲液中培养后的峰面积比值。
Figure G2008800120877D00311
如下所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
红醋栗提取物的稳定性
120mg红醋栗提取物/100mL的溶液30mg谷胱甘肽(GSH)/100mL一起，在作为培养基的缓冲溶液(pH值＝7.0)中培养，被用于CaCo-2吸收试验。
这些研究提供了在谷胱甘肽存在下，用于CaCo-2测试的，在分析方法和培养基方面的选定的红醋栗的主要-花色素甙的稳定/降解的信息。
翠雀素-3-O-葡萄糖甙(Dp-Glc)，翠雀素-3-O-芸香糖甙(Dp-Rut)以及花青素-3-O-芸香糖甙(Cn-Rut)被选择用于分析。
这些研究显示，接受研究的两种翠雀素-葡萄糖甙，比花青素-芸香糖甙对降解更加敏感。Dp-glc在规定条件下比Dp-rut更敏感。接受研究的全部花色素甙在类似肠液的培养基中，比在缓冲溶液中略加稳定(见图13和14)。该稳定性的提高很可能由复合介质(最终再循环谷胱甘肽)中推定的促稳定组分的存在所导致。
CaCo-2细胞与120mg红醋栗提取物和30mg谷胱甘肽/100mL介质一起，在37℃培养2小时。在30，60和120分钟时，处置3个点板试样，通过收集培养基并提取被吸收进入细胞的花色素甙，进行分析。
如图15所示，接受研究的3个花色素甙全部被吸收进入CaCo-2细胞。对于Cn-Rut，在培养60分钟之后，观察到最大吸收。在这个时间点，CaCo-2细胞中的花色素甙的回收率接近于培养基上层清液中测定浓度的2.5％。最有趣的是，该吸收％类似于缓冲介质和培养基(无细胞)中的花色素甙的稳定性。进一步观测到，对于所有花色素甙，最大吸收在培养60分钟后出现。
60mg欧洲越桔提取物±30mg谷胱甘肽/100mL细胞-游离培养基在37℃保存1小时。在培养期之前或之后，针对欧洲越桔提取物中的15种花色素甙进行样品分析。
这个研究提供了，在CaCo-2测试期间适用的条件下，有关在培养基(pH值＝7.0)中花色素甙的基本稳定性的信息。其次，阐明了谷胱甘肽对稳定性的作用。
如图16所示，所有花色素甙通过谷胱甘肽趋于稳定。对于翠雀素-葡萄糖甙，观测到了最显著的稳定化作用。这具有重要性，因为就pH值＝7.0时的降解而言，翠雀素-葡萄糖甙是最敏感的欧洲越桔葡萄糖甙。根据这个分析研究，根据pH值＝7.0时的降解，确定了谷胱甘肽保护花色素甙。此外，人们注意到谷胱甘肽保护了存在于欧洲越桔中的所有花色素-结构。
保护作用的详细分析显示，在保护效力和花色素的化学结构之间存在一种趋势。翠雀素，最敏感的结构，在最大程度上趋于稳定，而对于最稳定的结构(花青素)，该保护作用相对较低。总之，接受研究的所有花色素甙，在pH值＝7.0，37℃，谷胱甘肽存在1小时的条件下，其降解小于25％。
CaCo-2细胞与60mg欧洲越桔提取物一起，在有/无30mg谷胱甘肽/100mL介质的情况下，在37℃培养1小时。其后处置3个点板试样，通过收集培养基并提取被吸收进入细胞的花色素甙，进行分析。
如图17所示，接受研究的所有欧洲越桔花色素甙在谷胱甘肽的存在下，有更好的吸收。这表明了一种增强的的吸收和花色素甙与谷胱甘肽的稳定化作用之间的相互关系。最有可能的解释是，花色素甙的吸收程度取决于培养媒介中有效花色素甙的浓度。换句话说，该花色素甙的吸收可能依赖于细胞外部与内部之间的浓度梯度(外部浓度越高，吸收越多)。因为显示出谷胱甘肽提高了细胞外部的花色素甙的稳定性，所以进入细胞的吸收遵循了被推荐的理论。
实施例9
样品a)60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol花色素甙，以花青素-3-O-芸香糖甙表示)与60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)被添加到一个100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。立即取1mL样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙(新样品)的含量。剩余溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。其后另外的样品(空白试样)，代表不受保护的降解，取样并被酸化。
样品b)20mg还原态L-半胱氨酸(0.065mmol)与60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)被添加到一个100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。然后添加60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)进入该烧瓶，并搅拌至完全溶解，然后在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
4小时后，取样并立即用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并通过HPLC分析花色素甙的含量。降解被表示为单独峰的峰面积的减小(以4小时后的剩余％计算)。
根据下表推断，当和空白(不受保护的)样品对比时，花色素甙实质上在pH值＝7.0，370C，L-半胱氨酸存在下更稳定。在4小时后，该空白试样显示大约25％的花色素甙残留被观测到，而受保护的样品产生了超过65％的花色素甙残留。表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00321
Dp...翠雀素，Cn...花青素，Glc...葡萄糖甙，Gal...半乳糖甙如上所述HPLC分析法准备样品。测试稳定性的样品被立即酸化(阻止降解)并在未稀释的情况下进样，以下提供了详细说明。
实施例10
样品a)60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol花色素甙，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)被添加到一个100mL烧瓶中，并添加磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)，搅拌至完全溶解。立即取1mL样品用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙(新样品)的含量。剩余溶液在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。其后另外的样品(空白试样)，代表不受保护的降解，取样并酸化。
样品b-e)5，10，20或60mg L-半胱氨酸(0.041-0.492mmol)被添加到一个含有60mL磷酸钠缓冲液(5％[重量份]，pH值＝7.0)的100mL烧瓶中，并搅拌至完全溶解。向每个烧瓶添加60mg欧洲越桔提取物[37％花色素甙](0.048mmol花色素甙，以花青素-3-O-葡萄糖甙表示)。然后搅拌至欧洲越桔提取物溶解，并在37℃(水浴)和带有搅拌条件下保存4小时。
4小时后，取样品并立即用蚁酸酸化至pH值＝1.0，并用HPLC分析花色素甙的含量。降解用所有花色素甙的峰面积之和的减小来表示，以4小时后剩余％计算。
根据下表，确定了花色素甙实质上是以剂量依赖方式，受L-半胱氨酸保护。表，在37℃培养4小时后的花色素甙的峰面积
Figure G2008800120877D00322
实施例11
原料
欧洲越桔胶囊，由Omnica GmbH提供，样品编号：20070601和20070602。
样品编号20070601只含有欧洲越桔提取物，作为空白试样。
样品编号20070602含有欧洲越桔提取物和10％半胱氨酸。
5％磷酸钠缓冲液
分析方法
安捷伦1100HPLC，在530nm进行UV-VIS检测。
实验
向100mL烧瓶中添加60.0g的5％磷酸钠缓冲液(pH值＝7.0)和来自胶囊的60.0mg欧洲越桔提取物粉末。该溶液被超声处理至所有固体完全溶解。立即取样，然后该烧瓶被放置于370C水浴并保持4小时，以测定花色素甙的残留比例。
结果和结论
HPLC数据
HPLC面积被用作化合物含量的计量标准
该含量不包括非取代的花色素基
两个胶囊(20070601和20070602)的比较
下表和图21-26提供了通过利用半胱氨酸帮助稳定欧洲越桔提取物的佐证。
批号   初始含量0时刻   终点含量4小时 残留百分比％
  20070601   5327   1382   25.9
  20070602   5008   3510   70.1
HPLC数据
Figure G2008800120877D00331
HPLC色谱的峰鉴别
  峰No.   花色素甙
  1   翠雀素-3-O-半乳糖甙
  2   翠雀素-3-O-葡糖甙
  3   花青素-2-O-半乳糖甙
  4   翠雀素-3-O-阿拉伯糖甙
  5   花青素-3-O-葡糖甙
  6   3’-甲花翠素-3-O-半乳糖甙
  7   花青素-3-O-阿拉伯糖甙
  8   3’-甲花翠素-3-O-葡糖甙
  9   甲基花青素-3-O-半乳糖甙
  10   3’-甲花翠素-3-O-阿拉伯糖甙
  峰No.   花色素甙
  11   甲基花青素-3-O-葡糖甙
  12   二甲翠雀素-3-O-半乳糖甙
  13   甲基花青素-3-O-阿拉伯糖甙
  14   二甲翠雀素-3-O-阿拉伯糖甙
  15   二甲翠雀素-3-O-葡糖甙
方法
CaCo-2细胞的培养[0380]CaCo-2细胞在Dulbeccos′s Modified Eagle培养基中培养，该培养基含有20％胎儿牛血清，1.2％非必需氨基酸，0.83mM L-谷酰胺，1.2％青霉素-链霉素和0.1％巯基乙醇，该培养是在5％二氧化碳和95％空气的环境中进行，环境温度37℃。
细胞在75cm2的培养瓶(T75)里生长，一星期后再次培养(每隔一天用PBS缓冲液冲洗，用胰蛋白酶洗除并转移到一新的培养瓶中)。[0380]CaCo-2实验
对于实验，细胞以每一点板3×105细胞的密度被种入6个点板中，并在5％二氧化碳和95％空气的环境中，37℃下生长7到8天，直至融合。细胞用PBS缓冲液冲洗，用4mL含有欧洲越桔(30-60mg/100mL培养基)或红醋栗提取物(30-60mg/100mL培养基)的培养基进行培养30，60或120分钟。对于稳定性实验，使用含有30mg谷胱甘肽/100mL的培养基。
在相应的培养时间之后，从每个点板取900μL培养基并与100μL蚁酸混合。用PBS缓冲液冲洗细胞并用1mL 10％蚁酸洗除细胞。细胞被超声处理3次，每次30秒，离心10分钟并摈弃小球。上层清液用作HPLC测试样品。
用于比较，花色素甙的稳定性被测试，在无细胞的培养基中，37℃，0-120分钟之间。如上所述，培养基用蚁酸稳定。
HPLC分析法(原料，仪器和方法)
乙腈，甲醇(HPLC级)，蚁酸(AR)，蒸馏水。对照标准：花青素-3-O-葡萄糖甙(Cl salt，Item1201，Polyphenols Laboratories AS，挪威)
泵：Merck Quaternary Gradient pump 6200
自动进样器：Merck AS 2000，
检测器：HP-MVD 1050设置于520nm
柱：Bischoff，Hypersil ODS，250×4.6mm
流动相：A：蚁酸/水＝10/90
B：甲醇/乙腈/蚁酸/水＝20/20/10/50
梯度分布：(参见图18)
流速：1.5mL/min
注射体积：20μL
温度：45℃
检测波长：520nm
校正：用花青素-3-O-葡萄糖甙5点校正
定量：根据线性回归分析外部标准化。相对花青素-3-O-葡萄糖甙确定所有单独的花色素甙的响应因子。
标准品制备(花青素-3-O-葡萄糖甙)
转移适当数量的标准品进入一个10mL烧瓶并溶于1mL甲醇。烧瓶用10％磷酸添至刻度线。在10％磷酸中制备稀释液。
样品制备
在用蚁酸稳定花色素甙之后，分析来自培养实验的测试溶液(有/无细胞和有/无稳定剂)。样品在注射进入HPLC-系统之前，被过滤至澄清。
例如，0.500g欧洲越桔提取物被溶解于有2％HCl的10mL甲醇中，并超声处理2分钟。1mL溶液被转移进入一个10mL烧瓶中，并用10％磷酸稀释至刻度线。样品注入HPLC-系统。
数据评估
降解％以得到的初始数值的％表示
进入细胞的吸收％指的是在相应时间内，培养基中得到的数量与细胞中发现的数量的比值。
不同pH值条件下的稳定的花色素甙
原材料
欧洲越桔提取物，20070602，Omnica GmbH
还原态-谷胱甘肽，Bio-Chemical reagent
磷酸钠缓冲液，pH值从3.0至11.0
20mg还原态L-谷胱甘肽被添加到一个含有60mL 5％磷酸钠缓冲液(适当pH值)的100mL烧瓶中。在固体完全溶解后，带着搅拌添加60mg欧洲越桔提取物并放入37℃水浴。来自不同pH值缓冲溶液的样品被取出并按照如上所述的方法用HPLC分析。
实施例12
产品(欧洲越桔提取物，Omnica GmbH(汉堡))被调节至37％(m/m)花色素甙。根据新鲜欧洲越桔中花色素甙的平均含量0.3-0.4％(m/m)，该提取物代表一种100∶1的浓缩物。提取物中剩余的63％大部分以存在于新鲜浆果中的蛋白质和碳水化合物表示。500mg欧洲越桔提取物和带有50mg L-半胱氨酸的500mg欧洲越桔被合并用来制造以下使用的欧洲越桔/半胱氨酸组合。以下记录的欧洲越桔提取物是上述没有添加半胱氨酸的产品。
12名志愿者连续7天接受欧洲越桔提取物。为期1周的清洗期后，相同志愿者连续7天接受欧洲越桔/半胱氨酸组合。
该设计是一随机交叉观测。
在相应处理的第1天(处理之前和处理后0.5，1.5，2.5和4小时)，第4天(处理前和处理后0.5小时)和第7天(处理之前和处理后0.5，1.5，2.5和4小时)进行血浆样品取样。
该研究的主要目标是测定存在于两种组成中的花色素甙的血浆水平。
在首轮分析中，存在于血浆中的全部花色素甙通过固态提取方式被提取，并在收集之后水解产生花色素。这个程序被选用来提供有关来自两种组成的欧洲越桔花色素甙的有效吸收的信息，并用来避免由于被吸收的化合物的新陈代谢引发的错误结论。每个代谢物(也就是葡糖苷酸)不会被视为来自该组成的吸收，虽然其效能归于花色素骨架而不在于具体的甙化方式。
该分析包含540nm的UV-检测的HPLC。定量评价以带有可信的花色素标准品的外部标准化为基准。该方法的回收率用翠雀素-3-O-葡萄糖甙和花青素-3-O-葡萄糖甙评价。在空白血浆加入这两种欧洲越桔花色素甙，以和该研究样品相同的方式被提取和水解。回收率显示为＞95％。该研究样品的稳定性被外标的空白血浆样品所证实，其被与该研究样品完全相同的方式处理和储存。
应用标准品非分割方法计算药代动力学参数。缩写词列表ANOVA............方差的分析Ara..................阿拉伯糖AUC...............曲线下面积AUC(0-inf)...........0点至无穷大区间的AUCAUC(0-t).............0点至最后测试点区间的AUCAUC(0-4h)..........0点至8小时区间的曲线下面积β.....................消除速度常数Cmax...............获得的最大血药浓度Cn....................花青素CV...................变异系数Dp...................翠雀素Gal..................半乳糖Glc...................葡萄糖HPLC...............高效液相色谱MS..................质谱Mv...................二甲翠雀素Pe..................甲基花青素Pt..................3’-甲花翠素t1/2...................终点血药浓度半衰期Tmax................最大血药浓度时间点(Cmax)UV..................紫外
研究结果：
图27-40表明，当和来自没有添加半胱氨酸的欧洲越桔样品对比，欧洲越桔/半胱氨酸组合在血浆中的花色素浓度的数量增加了至少两倍。在总花色素含量以及单独花色素含量上可以看到这一点。
下表提供了对存在于欧洲越桔中的5种花色素(也就是花青素[Cn]，翠雀素[Dp]，3′-甲花翠素[Pt]，甲基花青素[Pe]和二甲翠雀素[Mv])进行测量的血药浓度的平均值±标准偏差(s.d.)。总花青素血药浓度(ng/mL)，平均值±标准偏差
Figure G2008800120877D00361
BLD...低于检测极限(＜1ng/mL)，n.a....不适用总翠雀素血药浓度(ng/mL)，平均值±标准偏差总3’-甲花翠素血药浓度(ng/mL)，平均值±标准偏差
Figure G2008800120877D00372
总二甲翠雀素血药浓度(ng/mL)，平均值±标准偏差
Figure G2008800120877D00373
Figure G2008800120877D00381
总甲基花青素血药浓度(ng/mL)，平均值±标准偏差
Figure G2008800120877D00382
下表提供了由观测的平均血药浓度计算得到的药代动力学参数。对总花青素计算得到的药代动力学参数对总翠雀素计算得到的药代动力学参数
Figure G2008800120877D00384
对总3′-甲花翠素计算得到的药代动力学参数
Figure G2008800120877D00391
对总二甲翠雀素计算得到的药代动力学参数
Figure G2008800120877D00392
对总甲基花青素计算得到的药代动力学参数
Figure G2008800120877D00393
实施例13
样品制备
样品A与实施例1中的空白样相同。
样品B：48mg(9.5％按重量计的还原态谷胱甘肽)啤酒酵母提取物被添加到一个含有60mL 5％磷酸钠缓冲液(pH值＝7.0)的100mL烧瓶中。该溶液被搅拌均匀，然后添加60mg(0.049mmol花色素甙)欧洲越桔提取物并搅拌均匀。样品被放置进入在37℃水浴，在搅拌下保存4小时。通过HPLC监测降解比率分析。
样品C：除啤酒酵母提取物的数量是120mg外，其制备与样品B相同。[0433]结果：
  样品   A   B  C
  残留率   22.1％   50.9％  77.9％
HPLC测试参数与上述实施例相同。
本实施例说明了啤酒酵母提取物在减少样品中花色素甙成分的降解过程中的积极保护作用。
虽然本发明已经描述了优选实施例，但是本领技术人员将认识到产生于形式和细节上的变化并不离开本发明的主旨和范围。本说明书自始至终引用的所有参考资料，包括背景技术中的那些参考资料，均以其完整形式合并于此。
通过只是运用常规试验方法，那些本领域技术人员将认识到，或能够探知很多等同于本发明于此明确描述的具体的实施例的内容。这些等同方案被规定包含于下述权利要求书的范围内。

Claims (27)

1.一种稳定化的花色素甙提取组合物，其含有花色素甙提取物和含有-SH基团的促稳定化合物。
2.根据权利要求1所述的稳定化花色素甙提取组合物，其促稳定化合物是酵母提取物、二氢硫辛酸、二氢硫辛酸衍生物、半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、谷胱甘肽、谷胱甘肽衍生物、巯基蛋白酶、巯基金属蛋白酶、含有半胱氨酸的缩氨酸、含有谷胱甘肽的缩氨酸、发酵的牡蛎提取物、含巯基壳聚糖、含巯基凝胶或者其混合物。
3.根据权利要求1所述的稳定化花色素甙提取组合物，其花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
4.根据权利要求2所述的稳定化花色素甙提取组合物，其花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
5.根据权利要求1所述的稳定化花色素甙提取组合物，其促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
6.根据权利要求4所述的稳定化花色素甙提取组合物，其稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
7.根据权利要求1所述的稳定化花色素甙提取组合物，所述的组合物在pH为2-12之间的含水环境中是稳定的。
8.一种使花色素甙提取组合物稳定的方法，包括将花色素甙提取物和足量的，含有至少一个-SH基团的促稳定化合物混合的步骤，以使花色素甙稳定。
9.根据权利要求8所述的方法，所述的促稳定化合物是酵母提取物、二氢硫辛酸、二氢硫辛酸衍生物、半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、谷胱甘肽、谷胱甘肽衍生物、巯基蛋白酶、巯基金属蛋白酶、含有半胱氨酸的缩氨酸、含有谷胱甘肽的缩氨酸、发酵的牡蛎提取物、含巯基壳聚糖、含巯基凝胶或者其混合物。
10.根据权利要求8所述的方法，所述的花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
11.根据权利要求9所述的方法，所述的花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
12.根据权利要求8所述的方法，所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
13.根据权利要求11所述的方法，所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
14.根据权利要求8所述的方法，所述的稳定化花色素甙提取组合物在环境条件下至少1天是稳定的。
15.一种pH稳定化的花色素甙提取组合物，其含有花色素甙提取物和含有-SH基团的促稳定化合物。
16.根据权利要求15所述的pH稳定化花色素甙提取组合物，其促稳定化合物是酵母提取物、二氢硫辛酸、二氢硫辛酸衍生物、半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、谷胱甘肽、谷胱甘肽衍生物、巯基蛋白酶、巯基金属蛋白酶、含有半胱氨酸的缩氨酸、含有谷胱甘肽的缩氨酸、发酵的牡蛎提取物、含巯基壳聚糖、含巯基凝胶或者其混合物。
17.根据权利要求15所述的pH稳定化花色素甙提取组合物，其花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
18.根据权利要求16所述的pH稳定化花色素甙提取组合物，其花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
19.根据权利要求15所述的pH稳定化花色素甙提取组合物，所述的稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
20.根据权利要求18所述的pH稳定化花色素甙提取组合物，所述的稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
21.一种提高花色素甙生物利用度的方法，包括给受试者提供一种含有花色素甙和含有至少一个-SH基团化合物的花色素甙组合物的步骤，相对于缺乏含有至少一个-SH基团的化合物的花色素甙组合物的样本，其受试者体内花色素甙的数量增加至少2倍。
22.根据权利要求21所述的方法，其促稳定化合物是酵母提取物、二氢硫辛酸、二氢硫辛酸衍生物、半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、谷胱甘肽、谷胱甘肽衍生物、巯基蛋白酶、巯基金属蛋白酶、含有半胱氨酸的缩氨酸、含有谷胱甘肽的缩氨酸、发酵的牡蛎提取物、含巯基壳聚糖、含巯基凝胶或者其混合物。
23.根据权利要求21所述的方法，其花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
24.根据权利要求22所述的方法，其花色素甙提取物是欧洲越橘提取物、黑醋栗提取物、蔓越桔提取物、黑大豆提取物、越桔提取物、蓝莓提取物或其两种或多种混合物。
25.根据权利要求21所述的方法，所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
26.根据权利要求24所述的方法，所述的促稳定化合物与花色素甙提取物的摩尔比为0.1-10。
27.根据权利要求21所述的方法，所述的花色素甙在含有至少一个-SH基团的化合物存在下，给药4小时之后，花色素甙的血药浓度是在没有含有至少一个-SH基团的化合物存在情况下的花色素甙的血药浓度的至少2倍。
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