CN110123826B - 一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蓝莓花色苷‑壳寡糖复合物及其制备方法和应用，属于食品加工领域。一种蓝莓花色苷‑壳寡糖复合物的制备方法，包括如下工艺步骤：将蓝莓花色苷溶液与壳寡糖溶液混合均匀后得混合溶液，向混合溶液中加入戊二醛，反应，得蓝莓花色苷‑壳寡糖复合物溶液，干燥，得蓝莓花色苷‑壳寡糖复合物固体粉末。本发明所述方法将天然水果蓝莓中提取的蓝莓花色苷与动物性副产物虾蟹壳酶解产物壳寡糖有效复合，此复合物无毒、无味，同时具有抗肿瘤作用，可作为一种天然抗肿瘤复合物用于功能性食品并在医学领域中具有潜在的研究价值。

Description

一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物及其制备方法和应用，属于食品加工领 域。
背景技术
蓝莓(blueberry)属杜鹃花科越桔属植物，起源于北美，多年生灌木小浆果果树。全 世界分布的越橘属植物可达400余种，主产于美国又被称为美国蓝莓。我国野生蓝莓 主要产在长白山、大兴安岭和小兴安岭林区，且大部分在大兴安岭地区。近几年来才 成功进行人工驯化培植，我国对蓝莓的研究始于20世纪80年代初，是由吉林农业大 学小浆果研究所率先进入蓝莓研究领域，并第一个建立了蓝莓产业化生产基地。花色 苷(Anthocyanins)是一种重要的天然水溶性色素，是蓝莓中的主要功效成分。蓝莓花 色苷具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌、以及调节肠道微生物等多种生理功能。因此 蓝莓被世界粮农组织推荐为五大健康水果之一。蓝莓花色苷因其具有天然的高抗氧化 活性，具有极高的潜在利用价值。
壳寡糖又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是由壳聚糖降解制成，是甲壳素、壳聚糖产 品的升级产品，经生物酶技术降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量低， 其水溶性较好、功能作用大、生物活性高，容易被生物体吸收利用，纯天然、无辐射、 无污染、无添加等特点。也是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖，是动物 性纤维素。壳寡糖是由来源于虾蟹壳的壳聚糖降解成的带有氨基的小分子寡糖。
目前，蓝莓深加工产品较多，其加工过程中与蔗糖结合相对较多，传统的加工方式大多做饮料、果浆等产品，而作为功能性产品相对较少。传统加工过程中蓝莓花色 苷稳定性差，易发生降解，因此限制了蓝莓花色苷功能性产品的研发。
发明内容
为了解决传统加工过程中蓝莓花色苷稳定性差的问题，本发明提供一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法。该方法通过将蓝莓花色苷与壳寡糖的结合，获得蓝莓花 色苷-壳寡糖复合物，不仅提高了花色苷的稳定性，同时所得复合物还具有抗肿瘤增殖 能力，充分发挥了二者的功能性。本发明所述方法采用天然物质为原料，制备所得复 合物具有极好的水溶性，易被人体消化吸收，无毒无副作用，能够有效的抑制肝癌细 胞的增殖能力。
一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法，包括如下工艺步骤：
将蓝莓花色苷溶液与壳寡糖溶液混合均匀后得混合溶液，向混合溶液中加入戊二醛，反应，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，干燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固 体粉末。
本发明所述莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法涉及工艺步骤均在室温下进行。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述反应条件为 700～1400r/min搅拌速度下进行反应1～3h。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，将蓝莓花色苷溶液与壳寡糖溶液混合均匀可采取滴加、搅拌、超声等技术手段实现。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法一个优选的技术方案如下：
一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法，包括下述工艺步骤：
步骤1，将壳寡糖溶液分为两份，将第一份壳寡糖溶液与蓝莓花色苷溶液混合均匀后，得反应液；
步骤2，再将第二份壳寡糖溶液与步骤1所得反应液混合均匀后，加入戊二醛溶液，反应，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，干燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固 体粉末。
进一步地，第一份壳寡糖溶液与第二份壳寡糖溶液的体积比为1:1。
进一步地，所述步骤1中，所述混合条件为：700～1400r/min搅拌速度下搅拌 10～30min；优选为：1000r/min搅拌速度下搅拌10min。
进一步地，所述步骤2中，所述混合条件为：700～1400r/min搅拌速度下搅拌 30～60min；1000r/min搅拌速度下搅拌30min。
进一步地，所述步骤2中，所述反应条件为：优选为1000r/min搅拌速度下进行 反应2h。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，所述混合优选先利用超声方式混合后再进行搅拌，如，步骤1中，优选将混和后的溶液超声至少15min后进行 搅拌。
本发所述搅拌操作均在现有技术公开的搅拌装置中进行，优选磁力搅拌器。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述蓝莓花色苷与壳寡糖的质量比为1～5:1；最优选为1:1。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述蓝莓花色苷与戊二醛的质量比为50～70:1；最优选为50:1。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述壳寡糖溶液浓度为0.5mg/mL。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述蓝莓花色苷溶液浓度为0.5mg/mL。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述戊二醛以戊二醛溶液的形式加入混合溶液中，进一步地，所述戊二醛溶液的质量浓度为0.1％。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，优选所述干燥为：将蓝莓花色苷-壳寡糖复合溶液置于培养皿中，放入真空冷冻干燥机中处理24小时，处理后 收集干燥粉密封保存，真空处理条件为：真空度80～120℃、板温38～42℃、室温-42～-35℃ 下处理。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，所述壳寡糖可商业购得，也可按下述方法制得：取浓度为1％的壳聚糖溶液100mL调节pH值为5.5，使其在45℃ 的恒温水浴锅中保温10min，加入浓度为10％的壳聚糖酶和甲壳胺酶(1:1)混合酶液 1mL，振荡，每隔10min取出1mL的溶液，使其与等量的2％的氢氧化钠溶液反应， 如有残留的壳聚糖沉淀则反应继续，当没有沉淀产生时，向反应中加入10mL的2％的 氢氧化钠溶液终止反应，真空干燥得到固体粉末。
本发明所述蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法中，所述蓝莓花色苷按下述方法制得：将新鲜冷冻蓝莓果打浆，将蓝莓果浆按料液比为1:10加入体积分数60％的盐 酸酸化乙醇溶液(所述体积分数60％的盐酸酸化乙醇溶液按下述方法配置：向体积分 数为60％的乙醇溶液中加入质量浓度为0.1％的盐酸，调节溶液的pH值至3)中，并 调节pH值为3，超声波振荡90min辅助提取(设置功率为500W)，提取温度为40℃， 收集滤液，室温条件下减压浓缩得到红色粗提液；将所得粗提液过AB-8大孔树脂柱 纯化，将AB-8大孔树脂湿法装入1.8*30cm的柱中，填充高度为2/3柱高，将蓝莓花 色苷粗提液用恒流泵注入，动态吸附上样流速设定为2BV/h，上样量为490mL，洗脱 流速2BV/h，吸附平衡后，用2BV的蒸馏水冲洗蓝莓花色苷粗提液中杂质，最后用无 水乙醇进行洗脱。40℃下减压浓缩得到蓝莓花色苷浓缩液，真空干燥得到紫黑色粉末。
所述AB-8大孔树脂在上柱前优选进行预处理，具体为：将AB-8大孔树脂用无 水乙醇活化后放置24小时，使其溶胀，用玻璃棒轻轻搅动以除去表面的树脂，用蒸馏 水重复洗涤到无醇为止，用3％的盐酸浸泡1d，再用3％的NaOH溶液浸泡1d，再用 蒸馏水水洗至中性。
本发明的另一目的是提供由上述方法制得的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在制备预防癌症的制剂中的应用。
进一步地，所述癌症为肝癌。
本发明的有益效果为：本发明所述方法将天然水果蓝莓中提取的蓝莓花色苷与动物性副产物虾蟹壳酶解产物壳寡糖有效复合，此复合物无毒、无味，同时具有抗肿瘤 作用，可作为一种天然抗肿瘤复合物用于功能性食品，并在医学领域中具有潜在的研 究价值。本发明所述方法通过优化花色苷提取纯化的条件，使其与壳寡糖有效复合， 提高了蓝莓花色苷的稳定性，所得复合物在蓝莓深加工领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物细胞毒性图；
图2为实施例1所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物抑制HepG2细胞增殖图；
图3为实施例2所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物细胞毒性图；
图4为实施例2所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物抑制HepG2细胞增殖图；
图5为实施例3所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物细胞毒性图；
图6为实施例3所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物抑制HepG2细胞增殖图；
图7为pH1.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图8为pH1.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图9为pH2.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图10为pH2.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图11为pH3.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图12为pH3.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图13为pH4.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图14为pH4.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图15为pH5.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图16为pH5.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图17为pH6.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图18为pH6.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图
图19为pH7.0蓝莓花色苷在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图；
图20为pH7.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在不同温度下加热4h蓝莓花色苷残留率的变化图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞毒性的研究按下述方法进行：选取HepG2肝癌细胞，以4*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行 孵育24小时，孵育后用pbs缓冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物 溶液，在37℃下进行孵育24小时，通过测定20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、 100μg/mL复合物细胞毒性。对照相为按下述方法所得细胞液：选取HepG2肝癌细胞， 以4*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs 缓冲溶液洗1次。结果显示：与对照相比，蓝莓花色苷浓度的吸光度控制在10％以内， 被认为是此物质无细胞毒性的。
下述实施例中，蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞抗增殖的研究：选取HepG2肝癌细胞，以2.5*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时， 孵育后用pbs缓冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，在37℃ 下进行孵育72小时，测定抗增殖能力。
下述实施例中所述“混合酶液”为质量浓度为10％的壳聚糖酶和甲壳胺酶混合酶水溶液，其中壳聚糖酶和甲壳胺酶总浓度为10％，壳聚糖酶与甲壳胺酶的质量比为1:1。
下述实施中，将得到的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液冷冻干燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固体粉末，具体操作如下：将蓝莓花色苷-壳寡糖复合溶液置于培养皿中， 放入真空冷冻干燥机中处理24小时，处理后收集干燥粉密封保存，真空处理条件为： 真空度100°，板温40℃，室温-38℃下处理24小时。
下述实施例中，所用调整pH值的试剂为2mol/L的盐酸和2mol/L的氢氧化钠溶 液。
实施例1
首先挑选出饱满、无病虫害和机械损伤的冷冻蓝莓，用清水冲洗干净，置于4℃ 环境下低温解冻，将其放入榨汁机中压榨破碎，准备称取果浆5g，以料液比为1:10 加入体积分数60％的盐酸酸化的乙醇溶液中，调节pH值为3，超声波振荡90min辅 助提取(设置功率为500W)，提取温度为40℃，收集滤液，室温条件下减压浓缩得到 红色粗提液。将上述得到的粗提液，经过AB-8大孔树脂纯化。AB-8大孔树脂用无水 乙醇活化后放置24小时，使其溶胀，用玻璃棒轻轻搅动以除去表面的树脂，用蒸馏水 重复洗涤到无醇味为止，用3％的盐酸浸泡1d，再用3％的NaOH溶液浸泡1d，再用 蒸馏水水洗至中性。湿法装入1.8*30cm的柱中，填充高度为2/3柱高，将蓝莓花色苷 粗提液用恒流泵注入，动态吸附上样流速设定为2BV/h，上样量为490mL，洗脱流速 2BV/h，吸附平衡后，用2BV的蒸馏水冲洗蓝莓花色苷粗提液中的糖等杂质，最后用 无水乙醇进行洗脱。40℃下减压浓缩得到蓝莓花色苷浓缩液，真空干燥得到紫黑色蓝 莓花色苷粉末，备用。
准确量取浓度为1％的壳聚糖溶液100mL调节pH值为5.5，使其在45℃的恒温 水浴锅中保温10min，加入混合酶液1mL，使其振荡，每隔10min取出1mL的溶液， 使其与等量的2％的氢氧化钠溶液发生反应，如有残留的壳聚糖沉淀则反应继续，当 没有沉淀产生时，向反应中加入10mL的2％的氢氧化钠溶液终止反应，真空干燥得到 固体粉末。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的合成：准确称50mg蓝莓花色苷固体粉末加水定容至100mL，准确称取壳寡糖固体粉末50mg加水定容至100mL，吸取壳寡糖溶液50mL 置于100mL的蓝莓花色苷溶液中超声处理15min，将二者进行混合，置于磁力搅拌器 中1000r/min搅拌速度下搅拌10min，再加入50mL的壳寡糖溶液置于反应溶液中，磁 力搅拌器中1000r/min搅拌速度下搅拌30min，加入质量浓度为0.1％的戊二醛溶液 1mL，1000r/min转速下磁力搅拌2h，得到蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，冷冻干燥， 得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固体粉末。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞毒性的研究：选取HepG2肝癌细胞，以 4*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs缓 冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物，在37℃下进行孵育24小时， 通过测定浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL蓝莓花色 苷-壳寡糖复合物细胞毒性，结果显示：与对照相比，蓝莓花色苷-壳寡糖复合物浓度 的吸光度控制在10％以内，被认为此物质无细胞毒性。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞抗增殖的研究：选取HepG2肝癌细胞，以2.5*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs 缓冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物，在37℃下进行孵育72小时， 通过测定浓度分别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL蓝莓花色 苷-壳寡糖复合物抗增殖能力，结果显示：此复合物在此条件下有抗增殖能力。试验 结果见图1和图2。
实施例2
首先挑选出饱满、无病虫害和机械损伤的冷冻蓝莓，用清水冲洗干净，置于4℃ 环境下低温解冻，将其放入榨汁机中压榨破碎，准备称取果浆5g，以料液比为1:5加 入体积分数50％的盐酸酸化的乙醇溶液中，调节pH值为2，超声波振荡60min辅助 提取(设置功率为500W)，提取温度为35℃，收集滤液，室温条件下减压浓缩得到红 色粗提液。将上述得到的粗提液，经过D101大孔树脂纯化。D101大孔树脂用无水乙 醇活化后放置24小时，使其溶胀，用玻璃棒轻轻搅动以除去表面的树脂，用蒸馏水重 复洗涤到无醇味为止，用3％的盐酸浸泡1d，再用3％的NaOH溶液浸泡1d，再用蒸 馏水水洗至中性。湿法装入1.8*30cm的柱中，填充高度为2/3柱高，将蓝莓花色苷粗 提液用恒流泵注入，动态吸附上样流速设定为1BV/h，上样量为490mL，洗脱流速 1BV/h，吸附平衡后，用1.5BV的蒸馏水冲洗蓝莓花色苷粗提液中的糖等杂质，最后 用无水乙醇进行洗脱。40℃下减压浓缩得到蓝莓花色苷浓缩液，真空干燥得到紫黑色 蓝莓花色苷粉末，备用。
准确量取浓度为1％的壳聚糖溶液100mL调节pH值为5，使其在40℃的恒温水 浴锅中保温20min，加入混合酶液1mL，使其振荡，每隔8min取出1mL的溶液，使 其与等量的2％的氢氧化钠溶液发生反应，如有残留的壳聚糖沉淀则反应继续，当没 有沉淀产生时，向反应中加入10mL的2％的氢氧化钠溶液终止反应，真空干燥得到固 体粉末。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的合成：准确称50mg蓝莓花色苷固体粉末加水定容至100mL，准确称取壳寡糖固体粉末50mg加水定容至100mL，吸取壳寡糖溶液30mL 置于60mL的蓝莓花色苷溶液中超声处理15min，将二者进行混合，置于磁力搅拌器 中1000r/min搅拌速度下搅拌10min，再加入30mL的壳寡糖溶液置于反应溶液中，磁 力搅拌器中1000r/min搅拌速度下搅拌30min，加入质量浓度0.1％的戊二醛溶液 0.6mL，1000r/min转速下磁力搅拌2h，得到蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，冷冻干 燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固体粉末。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞毒性的研究：选取HepG2肝癌细胞，以 4*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs缓 冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物，在37℃下进行孵育24小时， 通过测定浓度分别为10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL、90μg/mL蓝莓花色苷 -壳寡糖复合物细胞毒性，结果显示：与对照相比，蓝莓花色苷-壳寡糖复合物浓度的 吸光度控制在10％以内，被认为此物质无细胞毒性。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞抗增殖的研究：选取HepG2肝癌细胞，以2.5*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs 缓冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物，在37℃下进行孵育72小时， 通过测定浓度分别为10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL、90μg/mL蓝莓花色苷 -壳寡糖复合物抗增殖能力，结果显示：此复合物在此条件下有抗增殖能力。试验结 果见图3和图4。
实施例3
首先挑选出饱满、无病虫害和机械损伤的冷冻蓝莓，用清水冲洗干净，置于4℃ 环境下低温解冻，将其放入榨汁机中压榨破碎，准备称取果浆5g，以料液比为1:15 加入体积分数70％的盐酸酸化的乙醇溶液中，调节pH值为4，超声波振荡120min辅 助提取(设置功率为500W)，提取温度为45℃，收集滤液，室温条件下减压浓缩得到 红色粗提液。将上述得到的粗提液，经过X-5大孔树脂纯化。X-5大孔树脂用无水乙 醇活化后放置24小时，使其溶胀，用玻璃棒轻轻搅动以除去表面的树脂，用蒸馏水重 复洗涤到无醇味为止，用3％的盐酸浸泡1d，再用3％的NaOH溶液浸泡1d，再用蒸 馏水水洗至中性。湿法装入1.8*30cm的柱中，填充高度为2/3柱高，将蓝莓花色苷粗 提液用恒流泵注入，动态吸附上样流速设定为3BV/h，上样量为490mL，洗脱流速 3BV/h，吸附平衡后，用2.5BV的蒸馏水冲洗蓝莓花色苷粗提液中的糖等杂质，最后 用无水乙醇进行洗脱。40℃下减压浓缩得到蓝莓花色苷浓缩液，真空干燥得到紫黑色 蓝莓花色苷粉末，备用。
准确量取浓度为1％的壳聚糖溶液100mL调节pH值为6，使其在50℃的恒温水 浴锅中保温30min，加入混合酶液1mL，使其振荡，每隔12min取出1mL的溶液， 使其与等量的2％的氢氧化钠溶液发生反应，如有残留的壳聚糖沉淀则反应继续，当 没有沉淀产生时，向反应中加入10mL的2％的氢氧化钠溶液终止反应，真空干燥得到 固体粉末。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的合成：准确称50mg蓝莓花色苷固体粉末加水定容至100mL，准确称取壳寡糖固体粉末50mg加水定容至100mL，吸取壳寡糖溶液40mL 置于80mL的蓝莓花色苷溶液中超声处理15min，将二者进行混合，置于磁力搅拌器 中1000r/min搅拌速度下搅拌10min，再加入40mL的壳寡糖溶液置于反应溶液中，磁 力搅拌器中1000r/min搅拌速度下搅拌30min，加入质量浓度为0.1％的戊二醛溶液 0.8mL，1000r/min转速下磁力搅拌2h，得到蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，冷冻干 燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固体粉末。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞毒性的研究：选取HepG2肝癌细胞，以 4*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs缓 冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物，在37℃下进行孵育24小时， 通过测定浓度分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL蓝莓花色 苷-壳寡糖复合物细胞毒性，结果显示：与对照相比，蓝莓花色苷-壳寡糖复合物浓度 的吸光度控制在10％以内，被认为此物质无细胞毒性。
蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对肝癌细胞抗增殖的研究：选取HepG2肝癌细胞，以2.5*104、/孔的细胞浓度进行接种100μL，在37℃下进行孵育24小时，孵育后用pbs 缓冲溶液洗1次，加100μL的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物，在37℃下进行孵育72小时， 通过测定浓度分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL蓝莓花色 苷-壳寡糖复合物抗增殖能力，结果显示：此复合物在此条件下有抗增殖能力。试验 结果见图5和图6。
稳定性研究结果下：
配制质量浓度为1mg/mL的蓝莓花色苷溶液和质量浓度为1mg/mL(该浓度以溶 液中蓝莓花色苷计)的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，用2mol/L盐酸和2mol/L氢 氧化钠溶液调节pH值，分别配成pH值分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的 溶液，分别放置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的恒温水浴锅中，避光加热 4h，每隔1h测定14组溶液中花色苷含量。其中，质量浓度为1mg/mL(该浓度以溶 液中蓝莓花色苷计)的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液按下述方法配置：将实施例1 最终所得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液用水稀释，再用2mol/L的盐酸将其pH值调 至4.5，获得溶液中蓝莓花色苷浓度为1mg/mL的溶液。
结果如图7～20所示为不同pH值和温度处理后蓝莓花色苷与蓝莓花色苷-壳寡糖复合物样品中花色苷的含量。不同pH值条件下，蓝莓花色苷随着加热强度和加热时 间的变化发生了不同程度的降解，随着加热时间的延长，花色苷含量下降，温度越高， 降解越快。当低温时，随着加热时间的延长花色苷降解缓慢，当温度达到90℃花色苷 降解显著高于其他温度。50℃下加热4h，pH1.0～7.0蓝莓花色苷溶液中蓝莓花色苷含 量分别为78.8％；81.0％；85.5％；82.6％；79.7％；52.0％；25.1％的花色苷残留率。50℃ 下加热4h，pH1.0～7.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液中蓝莓花色苷含量分别为83.8％； 85.1％；86.7％；86.6％；86.1％；56.4％；40.0％的花色苷残留率。90℃下加热4h，pH1.0～7.0 蓝莓花色苷溶液中蓝莓花色苷含量分别为40.4％；44.7％；51.9％；45.3％；26.5％；7.92％； 0％的花色苷残留率。90℃下加热4h，pH1.0～7.0蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液中蓝莓 花色苷含量分别为46.5％；50.0％；58.7％；56.4％；35.8％；12.3％；0.73％。上述图 7～20可以明显看出，经加热处理的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液中蓝莓花色苷含量 较蓝莓花色苷纯品溶液中花色苷的含量高，说明蓝莓花色苷-壳寡糖复合物对花色苷具 有保护作用，提高了蓝莓花色苷的稳定性。

Claims (8)

1.一种蓝莓花色苷-壳寡糖复合物的制备方法，其特征在于：将蓝莓花色苷溶液与壳寡糖溶液混合均匀后得混合溶液，向混合溶液中加入戊二醛，反应，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，干燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固体粉末，
所述蓝莓花色苷与壳寡糖的质量比为1～5:1；所述蓝莓花色苷与戊二醛的质量比为50～70:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应条件为700～1400r/min搅拌速度下进行反应1～3h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述壳寡糖溶液浓度为0.5mg/mL；所述蓝莓花色苷溶液浓度为0.5mg/mL；所述戊二醛以戊二醛溶液的形式加入混合溶液中，戊二醛溶液的质量浓度为0.1％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括下述工艺步骤：
步骤1，将壳寡糖溶液分为两份，将第一份壳寡糖溶液与蓝莓花色苷溶液混合均匀后，得反应液；
步骤2，再将第二份壳寡糖溶液与步骤1所得反应液混合均匀后，加入戊二醛溶液，反应，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物溶液，干燥，得蓝莓花色苷-壳寡糖复合物固体粉末。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：第一份壳寡糖溶液与第二份壳寡糖溶液的体积比为1:1。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述干燥为：将蓝莓花色苷-壳寡糖复合溶液置于培养皿中，放入真空冷冻干燥机中处理24小时，处理后收集干燥粉密封保存，真空处理条件为：真空度80～120℃、板温38～42℃、室温-42～-35℃下处理。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1，所述混合条件为：700～1400r/min搅拌速度下搅拌10～30min；所述步骤2，所述混合条件为：700～1400r/min搅拌速度下搅拌30～60min。
8.权利要求1～7任一项所述方法制得的蓝莓花色苷-壳寡糖复合物在制备预防癌症的制剂中的应用，其特征在于：所述癌症为肝癌。
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