CN101679947B - 细胞立体构造体的生产方法 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，可以提供在任意的三维空间以细胞团的形式配置各种细胞，制作仅由细胞构成的希望形状的立体构造体的方法。此外，根据本发明，可以提供用于将细胞团配置于任意的空间的、具备基板和用于串起细胞团的线状体或针状体的支持体。上述支持体视需要具备可取下的覆盖基板的薄片。而且，本发明还提供使用上述支持体用于将细胞团配置于任意的空间的方法以及生产立体细胞构筑物的方法。

Description

细胞立体构造体的生产方法
技术领域
本发明涉及：将各种细胞配置于任意的三维空间，制作仅由细胞构成的立体构造体的方法，以及采用该方法制作的细胞构筑物(構築体)。
背景技术
以再生失去的脏器为目标，将细胞移植至患处的再生医疗正在逐步实用化。传统上，为了再生大型器官/脏器，需要吸收性材料作为细胞在体内的锚地(足場)。作为这些吸收性材料，尝试使用了动物来源的胶原、水解的合成聚合物，但在安全性、成本等方面未能取得满意效果。因而，发明人等开发出了仅使用细胞来制作立体构造体的方法(“组织填充物的生产方法”，专利文献1)。在该方法中，通过使细胞团流入型模中，在传统上极其困难的大型的仅由细胞构成的构造体的制作方面，取得了成功。该发明的有效性通过动物实验得以确认，并且已经发展到面向临床应用的前期阶段，因而广受瞩目。
根据上述细胞填充物(cell plug)的制作方法，通过使不同系统的细胞团按顺序流入培养容器等中，能够制作出像地层那样的复合细胞构造体。但是，脏器具有更加复杂的细胞排列结构，因而有必要进一步开发可以采取任意排列结构的细胞填充物的制作方法。此外，由于细胞构造体的大型、复杂化，必须要确保向构造体内部的培养液供给(培养时)、以及血管的诱导路径，今后为了进行大型脏器再生，有必要做进一步改良。
近年来，已经开发出在37度附近固化、而在低温时液化的特殊明胶(温敏型明胶)。已经进行了使细胞粘附在明胶上来制作细胞薄片、并进一步将细胞薄片之间层叠起来制作细胞立体构造体的尝试。但是，在该方法中，向细胞构造体内部的培养液供给是困难的，而且构造体的厚度方面似乎存在2毫米左右的界限。此外，根据该方法，在构造体制备完成后，似乎可以降低温度使温敏型明胶液化，然后从构造体内部回收明胶。然而，是否可以从构造体内部完全地将明胶回收还存在疑问，而残留明胶引起的体内异物反应等副作用是令人恐惧的(非专利文献1)。
(专利文献1)特开2004-357694号公报
(非专利文献1)メビオ一ル(注册商标)ジエルを用いた软骨組織の再生、インタ一ネツト<URL：HYPERLINK″http://www.mebiol.co.jp/rd-img/nankotu.pdf″http://www.mebiol.co.jp/rd-img/nankotu.pdf>
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是：提供将各种细胞配置于任意的三维空间、制作仅由细胞构成的立体构造体的方法。
解决问题的方法
本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果通过使用本发明的临时固定用支持体，在将各种细胞配置于任意的三维空间、制作仅由细胞构成的立体构造体方面取得了成功，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)一种支持体，其是用于将细胞团配置于任意的空间的支持体，该支持体具备：
基板和用于将细胞团(細胞塊，cell clusters)串起来(貫通させる)的线状体或针状体。
(2)(1)所述的支持体，其中，所述线状体或针状体配置在所述基板的近似法线方向(ほぼ法腺方向，almost perpendicular direction)上。
(3)(1)或(2)所述的支持体，其还具备覆盖所述基板的薄片(シ一ト，sheet)。
(4)权利要求1或2所述的支持体，其中，所述线状体或针状体是非细胞粘着性的。
(5)(1)或(2)所述的支持体，其中，以下述间隔来确定所述线状体或针状体的位置，所述间隔使得将细胞团串起来时，相邻细胞团能够接触。
(6)(3)所述的支持体，其中，所述薄片是非细胞粘着性的。
(7)(3)所述的支持体，其中，所述薄片具有孔或呈网眼状，使得固定于所述基板的所述线状体或针状体能够穿透该薄片。
(8)(1)或(2)所述的支持体，其中，所述细胞团是球状体(スフエロイド，spheroid)。
(9)(1)或(2)所述的支持体，其中，所述针状体是圆锥形的。
(10)(1)或(2)所述的支持体，其中，所述线状体或针状体是聚丙烯制、尼龙制或不锈钢制的。
(11)(3)所述的支持体，其中，所述薄片经过了氟加工或聚甲基丙烯酸羟乙酯加工。
(12)用于将细胞团配置于任意的空间的方法，所述方法包括：
a)形成细胞团的步骤，
b)用权利要求1所述的支持体的线状体或针状体将所形成的细胞团串起来的步骤，
和
c)使该串起来的细胞团之间相接触的步骤。
(13)细胞构筑物的生产方法，所述方法包括：
a)形成细胞团的步骤，
b)用权利要求1所述的支持体的线状体或针状体将所形成的细胞团串起来的步骤，
c)使该串起来的细胞团之间相接触的步骤，和
d)回收接触的细胞团的步骤。
(14)(12)或(13)所述的方法，其中，所述细胞团被串起来，使得它们在所述线状体或针状体的长度方向上连续并彼此接触。
(15)(13)所述的方法，其中，所述接触的细胞团的回收是通过从融合的细胞团上拉掉支持体的步骤来实现的。
(16)(12)～(15)中任一项所述的方法，其中，所述细胞团是球状体。
(17)采用(12)～(15)中任一项所述的方法制作的细胞构筑物。
(18)(17)所述的细胞构筑物，所述细胞构筑物是由同一种类的细胞构成的。
(19)(17)所述的细胞构筑物，所述细胞构筑物是由多个种类的细胞构成的。
(20)(17)～(19)中任一项所述的细胞构筑物，其用于医疗用途或实验用途。
(21)(20)所述的细胞构筑物，其用于关节的再生。
发明效果
根据本发明，可以提供：用于将细胞团配置于任意的空间的支持体，以及用于制作没有异物残留的、仅由细胞构成的细胞构筑物的方法，所述方法中，使用上述支持体将各种细胞配置于任意的三维空间，在细胞团之间彼此融合/结合而形成构造体后，再拔去支持体。已知细胞团(球状体)如果以近接状态放置就会发生融合，但通过使用本发明的支持体和方法，能够控制通过球状体的融合而形成的构筑物的形状，在任意的三维空间中以所希望的状态配置细胞团。此外，通过本发明的方法，能够不在细胞构造体内部(由细胞团构建而成的构造体的内壁部)配置细胞团而是设置空隙(隧道)，并能够从该隧道部供给培养液。其结果是，能够形成大型的细胞构造体。这样获得的细胞构造体，可以在例如以器官或脏器的再生为目的的医疗用细胞移植中使用。此外，还可以在用于体外药物筛选等研究的器官/脏器模拟物方面使用。
附图说明
图1A示出了本发明的支持体。
图1B示出了基板的基底面上具备薄片的本发明的支持体。
图1C示出了具有各种类型的线状体或针状体的本发明的支持体。
图1D是显示针状体为圆锥形的实施方式的图。
图1E示出了：(使用例如塞子(stopper)等)将线状体的一端固定、从另一端使其串起细胞团的例子。
图1F示出了：将细胞团串在线状体上，在使线拉紧的状态下将其固定，并使细胞团进行排列的例子。
图2A示出了：将细胞团(球状体)应用于本发明的支持体。
图2B示出了：使用机器人手臂(robot arm)将细胞团应用于针状体。
图2C为从侧面观察串在本发明的支持体上的细胞团的图。
图2D为串在本发明的支持体上的细胞团的立体图。
图3A为回收采用本发明的方法制作的细胞团的步骤的例子。
图3B示出了：采用本发明的方法制作的细胞团的例子。
图4A示出了：由2种细胞团构成的细胞构筑物的1个例子。
图4B示出了：由2种细胞团构成的细胞构筑物的另一个例子。
图4C示出了：由2种细胞团构成的细胞构筑物的另一个例子。
图4D示出了：在细胞团内具有空间的细胞构筑物的另一个例子。
图5为发生了融合的细胞团的显微镜照片的图。
图6按时间顺序显示了在用于获得本发明的细胞构筑物的1个实施例中，直至获得细胞团的流程。
图7A～图7E显示了根据本发明使细胞团融合，并进行显微镜观察。
图8为用于观察细胞构造体的内部的截面图。
图9A为使带针的缝合线串起细胞团的图。
图9B按时间顺序显示了使用带针的缝合线直至获得细胞构筑物的流程。
图9C为本发明的细胞构筑物的一个例子。
符号说明
10：支持体本体；11：基板；12：线状体或针状体；13：薄片
发明的具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。以下的实施方式仅是用于说明本发明的示例，并非意味本发明受这些实施方式的限定。本发明在不超出其要旨的范围内，可以以各种方式实施。
而且，本说明书中引用的所有出版物、例如现有技术文献和公开公报、专利公报及其它专利文献，均全文并入本说明书中作为参考。本说明书包括作为本申请优先权基础的特愿2007-094313号说明书(申请日：2007年3月30日)的内容。
以下，对本发明进行详细说明。
1.支持体
本发明的支持体的1个实施方式示于图1A和图1B。在图1A中，支持体本体10具有基板11和线状体或针状体12。支持体本体10具备任意形状的基板11，基板11上具备线状体或针状体12。图1A为线状体或针状体配置在基板的基底面的近似法线方向的形态的一个例子。基板11和线状体或针状体12，整体而言可以由独立的部件构成并固定在一起，也可以由例如热可塑性树脂等一体式地制作而成。此外，支持体所具有的线状体或针状体的数目为1个以上，可以使用希望的任意数目的线状体或针状体。在本说明书中使用时，语句“近似法线方向”是指：线状体或针状体的长度方向与基板11的基底面所成的角度为约90°的任意角度的方向，优选是指90°。在其它实施方式中，基板11还具备薄片13，该薄片13覆盖基板的存在有线状体或针状体的一侧的表面(图1B)。薄片13的表面积可以小于、等于或大于基板11的基底面的表面积，但优选存在覆盖线状体或针状体的区域的基底面。
作为本发明的其它形态，可以不将线状体或针状体配置在法线方向，而是将其配置在非法线方向(例如，与法线方向成角度的方向)。“非法线方向”的线状体或针状体的角度可以在相对于支持体本体10为1°～89°的范围内适宜选择，可以列举出例如10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°和80°等。此外，“非法线方向”的线状体或针状体可以从支持体上朝一定方向以直线状伸出，也可以像圆或者椭圆的弧的一部分等那样以非直线状伸出(图1C)。存在于1个支持体上的线状体或针状体的形状，没有必要统一为1个类型，也可以组合使用各种类型的线状体或针状体(图1C)。作为它们的形态，可以列举出：组合使用法线方向的线状体或针状态与在非法线方向上具有一定角度的线状体或针状体的支持体，组合使用法线方向的线状体或针状体与具有对应于圆弧的一部分的轨迹的线状体或针状体的支持体，以及，组合使用法线方向的线状体或针状态、在非法线方向具有一定角度的线状体或针状体与具有对应于圆弧的一部分的轨迹的线状体或针状体的支持体等，但不限于此。例如，使线状体或针状体为曲线状，将其配置在圆周上而形成弓形结构(ア一チ)，沿该弓形结构将细胞团串起来并使之融合，就可以构建例如碗状的细胞构筑物。此外，如果线状体或针状体为直线状，则根据配置方式可以使之为圆锥形、中空状或者金字塔状等形状。通过组合使用多种类型的线状体或针状体，可以形成复杂形状的细胞构筑物。
针状体或针状体12和薄片13均优选为非细胞粘着性材质。基板也优选为非细胞粘着性，但当在支持体中使用薄片13时，细胞团不与基板11直接接触，因此对基板11的材质没有限定。术语“非细胞粘着性”是指：能够阻止细胞通过细胞外粘着因子附着在壁面上的性质，涂布了赋予非细胞粘着性机能的物质(例如氟)的材料等具有上述性质。在优选的实施方式中，线状体或针状体12为聚丙烯制、尼龙制或不锈钢制。在其它优选实施方式中，薄片13是经过了氟加工或聚甲基丙烯酸羟乙酯聚合物(Polyhydroxyethylmethacrylate polymer)加工(聚HEMA(poly-HEMA)加工)的薄片。本发明的线状体或针状体12和薄片13可以是特氟隆(注册商标)、poly-HEMA、丙烯酸板、氯乙烯板、ABS树脂板、聚酯类树脂板、聚碳酸酯板等树脂，PP(聚丙烯)、ABS(丙烯腈丁二烯苯乙烯)、PE(聚乙烯)、POM(polyacetal聚缩醛)、PC(聚碳酸酯)、PEEK(聚醚醚酮)、MCN(单体流延尼龙，monomer casting nylon)、6N(6尼龙)、66N(66尼龙)等工程塑料。除了这些材料以外，还可以使用降低细胞粘着性的材料，对其没有限定。作为上述支持体，虽然也可以考虑使用生物体吸收性材料，但如果使用生物体吸收性材料，则会残留分解产物、未溶尽的残留物，有引发毒性的可能性，因此优选不是生物体吸收性材料。
上述线状体或针状体12是用于将细胞团串成所谓的串儿(串刺し)状的棒状体，各线状体或针状体的定位相互隔开间隔，所述间隔使得串起来的细胞团能够与串在相邻的线状体或针状体上的细胞团接触并发生融合。线状体或针状体可以呈例如棋盘格状规则地配置，也可以无规配置。线状体或针状体之间的间隔可以根据串在其上的细胞团的大小而变化，优选规定为细胞团直径的约100％～110％的长度。例如，细胞团的直径为1mm时，线状体或针状体之间按得间隔优选为约1mm～1.1mm。
线状体或针状体12的截面的直径可以取任意值，只要不破坏细胞团、妨碍细胞团的融合即可。此外，在1个实施方式中，针状体12为圆锥体，其中，锥体的底面与基板11的基底面相接(图1D)。薄片13具有孔或呈网眼状，使得配置在基板11的基底面的近似法线方向上的线状体或针状体能够穿过该薄片，能够从基板11和线状体或针状体12上将薄片13取下。优选针状体12为圆锥形的实施方式(图1D)，因为能够容易地将薄片从针状体取下。本发明的支持体主要是为了获得希望形状的细胞构筑物，而用于在细胞团之间发生融合之前的临时固定。在若干形态中，还可以在本发明的支持体上保持细胞构筑物，而作为脏器模拟物等使用。在这种情况下，可以将支持体从细胞构筑物上取下，也可以不将支持体从细胞构筑物上取下。
此外，在其它实施方式中，线状体12也可以是例如缝合线等。优选地，作为该线状体，可以使用带针的缝合线。例如，通过将线的一端固定在基板上、并使另一端为尖锐的形状(例如针)，能够更容易地将细胞团穿在线状体上(图1E)。此外，还可以将细胞团串在线上，以拉紧状态将线固定，从而使细胞团排列起来(图1F)。还可以先将指定的多个细胞团依次串在一端固定于第1基板上的线上，使之呈串儿状，然后再将用于串起细胞的线的尖端固定在第2基板上。此外，使用相对于第1基板与第2基板之间的距离为充分长的线，将串有细胞团的线在第1基板与第2基板之间数次往复，来进行固定，使得出现相邻的细胞团能够实现接触的间隔。
2.细胞团
细胞大体上可分类为悬浮细胞和锚地依赖性细胞，血液类或免疫类细胞属于前者、皮肤、骨格等的细胞属于后者。皮肤、骨格等的细胞如果在培养液中悬浮就会死亡，其必须要附着在玻璃等平皿上才能增殖。因而，如果在经过特氟隆(注册商标)加工的平板上培养细胞，则细胞会寻找锚地，相互粘着连合在一起，形成细胞聚集体(凝集塊)即球状体。进而，如果球状体之间粘着融合，则球状体会变成更大的形状。例如，如果在非细胞粘着性的平板上播种细胞来进行培养，则细胞会自然聚集形成球状体。到球状体形成为止的培养时间为6～24小时，优选24～48小时。细胞团的制作方法并不限于上述方法，还已知有多种方法，例如：向旋转的溶液中加入细胞悬浊液的旋转培养法，向试管中加入细胞悬浊液、再用离心分离器进行沉淀的方法，或者海藻酸盐珠法等。从能够大量地处理和回收均质的细胞团的角度来看，在防湿性、非细胞粘着性的多孔板上加入细胞悬浊液的方法是有效率的，因而优选。
近年来，有报告提示：在间充质干细胞(mesenchymal stem cells)向软骨细胞分化时，以细胞-细胞之间的粘着为开关，胶原等开始表达(Yoon YM，J Cell Biochem 2002；87(3)：342-59)。由此可以认为：通过将细胞做成球状体、使细胞之间发生粘着，细胞进入细胞周期的稳定期(静止期)，蛋白质的生产增加。因而，为了将细胞诱导至蛋白质产生增加的稳定期，优选将细胞先做成球状体，再形成指定的形状。而且，先将细胞诱导至稳定期再使其分化，这称为“细胞脱离增殖循环、进入细胞分化”。
适于球状体的细胞是干细胞(ES细胞、脐带血来源的细胞、未分化间充质干细胞等)等未分化细胞或它们的分化型细胞。成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞可以容易地由未分化间充质干细胞分化诱导出来，因而，还可以使用这些分化诱导细胞(关节软骨细胞、骨细胞等)。此外，还可以使用成体间充质干细胞。因而，考虑到将本发明中制作的细胞构筑物应用于具有立体形状的组织片的生成的情况，作为这样的立体构建的组织，以中胚叶系的组织为代表，可以列举出关节软骨、骨，以及乳房等脂肪组织，韧带、腱、齿、耳廓(耳介)、鼻等；而且，不仅限于中胚叶系，还可以使用肝脏、胰脏、血管、神经等几乎所有的粘着细胞。此外，球状体并非一定要以单一种类的细胞的聚集体的形式形成，只要能形成球状体，还可以由多个种类的细胞来形成。使用这样的嵌合型球状体，也可以生产本发明的细胞构筑物。
间充质干细胞可以从受试动物(例如、小鼠、兔、大鼠、豚鼠、犬、猪、羊、牛等的实验动物)或人的骨髓中采用Dexter法、磁珠法、细胞分选法等公知方法来采集。此外，还可以从皮肤、皮下脂肪、肌肉组织等采集间充质干细胞。
3.配置细胞团的方法
根据本发明，可以使用本发明的支持体将细胞团配置于支持体上的任意位置空间。因而，本发明的方法包括：a)形成细胞团的步骤、b)将形成的细胞团串在上述支持体的线状体或针状体上的步骤、和c)使该串好的细胞团之间接触的步骤。在第1步骤、即形成细胞团的步骤中，可以通过例如向旋转的溶液中加入细胞悬浊液来形成细胞团。然后，将通过第1步骤形成的细胞团(即球状体)串在支持体上的线状体或针状体上。该步骤例如可以这样实施：将含细胞团的移液管的尖端对准针状体的尖端，在与移液管的尖端相反的一侧施加压力，从而挤出细胞团(图2A)。挤出的细胞团穿在针状体上，从而被固定在指定的位置。或者，在其它实施方式中，该步骤如下实现：使用加载有细胞团的小型机器人手臂，从针状体的上部串入细胞团(图2B)。此外，还可以用镊子等将细胞团固定住，并使用线状体(优选为带针的线)将细胞团串起来。但是，本发明的方法不受这样的步骤的限定。将细胞团串在1根线状体或针状体上，使得多个细胞团之间接触(即所谓的米面团子(団子)状)(图2C)。通过细胞团之间的接触，细胞团可以在纵方向(垂直方向(例如z方向))上融合。此外，对各线状体或针状体的位置进行设定，使它们的间隔能够在将细胞团串起来时、使其与相邻的细胞团接触，因此，在横方向(水平方向和纵深方向(例如，x方向和y方向))也可以接触并融合。因而，通过这些细胞团融合，可以在本发明的支持体上构建由细胞构成的立体构造体(图2D)。
4.生产细胞构筑物的方法
本发明提供使用本发明的支持体来生产细胞构筑物的方法。细胞构筑物的生产可以通过回收按上述规程接触并融合的细胞团来实现。细胞团的回收可以通过从融合了的细胞团上拔去支持体的步骤实现(图3A)。从细胞团拔去支持体，可以通过从用镊子等将细胞团直接固定并融合而成的细胞团上拔去线状体或针状体来实现，或者也可以通过从支持体上取下薄片的步骤来实现。取下薄片，可以通过从固定的薄片上拔去支持体来进行，也可以通过从固定的支持体上分离薄片来进行。通过包括这些一系列步骤的方法，可以提供在空间上按所希望的那样配置的任意形状的细胞构筑物(图3B)。
5.细胞构筑物
本发明的细胞构筑物可以仅由同一种类的细胞构成，或者也可以包含多个种类的细胞。当在本说明书中使用时，术语“同一种类的细胞”是指：单一种类的相同组织或器官等来源的功能上等同的细胞。包含多个种类的细胞的细胞构筑物，可以通过将由不同异种类的细胞分别形成的细胞团(例如，由a细胞构成的细胞团A与由b细胞构成的细胞团B)应用于本发明的支持体来获得。这里，a细胞和b细胞可以是任意的细胞，只要它们的细胞团之间能够融合即可。a细胞与b细胞，可以是例如不同组织(或器官)来源的同种细胞，也可以是相同组织(或器官)来源的异种细胞，还可以是不同组织(或器官)来源的异种细胞。在1个实施方式中，在本发明的支持体上配置成棋盘格状的第1列针状体群串起细胞团A，第2列针状体群串起细胞团B，并使它们融合，这样可以提供由细胞团A和细胞团B构成的嵌合型细胞构筑物(图4A)。在进一步的实施方式中，通过在上述的第1列、第2列的基础上，第3列针状体群串起细胞团A、第4列针状体群串起细胞团B(下同)......，这样交互地应用两种细胞团，可以制作出由细胞团A和细胞团B交互地形成层的构筑物(图4B)。此外，还可以改变串连在一根针状体上的细胞团的种类(图4C)。通过以相同的方法，将细胞团A与细胞团B按希望的比例应用于希望位置上的针状体，可以控制嵌合状细胞构筑物的立体结构的构成。使用的不同种类的细胞不限于2种，还可以使用3种以上的细胞。
在其它实施方式中，根据本发明的方法，可以生产在细胞构筑物的内部具有不存在细胞的间隙空间的细胞构筑物。该细胞构筑物可以这样来提供：在将细胞应用于本发明的支持体时，并不是使全部细胞连续地接触，而是在针状体上留出希望成为间隙空间的区域，而在其周围配置细胞团，并进行融合。该细胞构筑物内部的间隙空间可以任意地设计，但优选可以设计为结构物壁面由细胞团构成、而其内部为空洞的筒状(隧道状)形态(图4D)。通过将这样的间隙空间设置在细胞构筑物的内部，可以通过该空间将培养液中所含的营养成分、氧等输送至细胞团内部的细胞，因而，具有间隙空间的细胞构筑物，在必须制作体积更大的细胞构筑物的情况下是有利的。
6.医疗用或实验用细胞构筑物
本发明的细胞构筑物可以用于再生医疗用或实验用。如果使用软骨细胞的细胞团来形成细胞构筑物，则通过将该构筑物移植到损耗的关节部、或者因事故等原因失去的关节部，就可以用于关节的再生医疗。
除上述例子以外，现在包含肝细胞的球状体的研究十分盛行。因而，通过使用肝细胞的细胞团来形成细胞构筑物，形成的细胞构筑物可以用于肝脏的再生医疗。
但是，本发明的构筑物并不限于上述脏器或器官，可以以希望再生医疗的所有脏器以及器官为对象。
而且，已知对于多种细胞而言，与传统的二维培养物相比，具有三维结构的球状体能够更好地反映体内行为，已有报道称：使用球状体进行了肿瘤-免疫细胞相互作用研究、用于药物开发的筛选等。因而，通过本发明生产的细胞构筑物，除了代表性的在人工脏器中的应用之外，还可以在各种细胞测定、筛选等实验中使用。
实施例
1.球状体制作
对采集自兔骨盆(骨盤)的骨髓来源间充质干细胞进行了单层培养。最终，得到了1.0x106个/15cm培养皿的间充质干细胞。将该细胞用胰蛋白酶进行处理，得到了细胞悬浊液，将其播种在住友Bakelite公司制造的球状体平板上，每平板加入1.0x105个细胞。然后，在37℃、5％CO2的条件下进行培养，于翌日制作好了直径平均为0.3mm的细胞团。
2.细胞构筑物的制作(1)
将Terumo公司制造的33G注射针(商品名Nanopath)的不锈钢制针部分以4根平行的方式固定在三菱WELL PHARMA公司制造的α-磷酸三钙(トリリン酸カルシウム，tricalcium phosphate)(商品名BIOPEX R)上，制作了支持体。在立体显微镜下进行观察，同时用尖锐的镊子将球状体一个一个地串在固定于支持体上的不锈钢制针尖上。串入后，在37℃、5％CO2的条件下进行培养，约2天后，可以确认得到了细胞构造体，所述细胞构造体中，相邻球状体之间在纵方向和横方向中的任何方向上均发生了融合(结合)(图5)。
3.细胞构筑物的制作(2)
将合计9根Terumo公司制造的33G注射针(商品名Nanopath)的不锈钢制针部分，以3x3的棋盘格状、间隔0.4mm的形式，沿法线方向固定在三菱WELL PHARMA公司制造的α-磷酸三钙(商品名BIOPEX R)上，制作了支持体。在该支持体的上表面上，使针穿透FALCON公司制造的滤膜(商品名CELL CULTURE INSERT；聚对苯二甲酸乙二醇酯，尺寸8.0μm，商品号353093)，将该滤膜配置在针的底部。在用立体显微镜进行观察的同时，将像上述“1.球状体制作”一项中记载的那样制作的球状体(约50个)用尖锐的镊子一个一个地串在支持体的针上(图6、a)。串入后，在37℃、5％CO2的条件下进行培养，约3天后，可以确认得到了细胞构造体，所述细胞构造体中，相邻球状体之间在纵方向和横方向中的任何方向上均发生了融合(结合)(图6、b)。在确认了细胞构造体后，使用尖锐的镊子，将预先设置在支持体与细胞构筑物之间的滤膜与融合的细胞构筑物一起，从支持体上缓慢地拔去，回收了细胞构筑物(图6、c)。所得细胞构筑物是1个大融合团块(直径约3mm)(图6、d和e)。
4.细胞构筑物的制作(3)
将Invitrogen公司制造的活细胞标记用试剂盒系列的Qtracker(商品名)655(红色)和565(绿色)这2种分别单独地加入间充质干细胞，准备了在荧光显微镜下分别呈红色、绿色的球状体。
对于前述的固定有4根针的支持体，在用立体显微镜进行观察的同时，用尖锐的镊子将各种球状体一个一个地、红绿交互地串在固定于支持体的不锈钢制的针尖上。串入后，在37℃、5％CO2的条件下进行培养，约2天后，可以确认得到了细胞构造体，所述细胞构造体中，相邻球状体之间在纵方向和横方向中的任何方向上均发生了融合(结合)(图7A、a)。而且，用荧光显微镜进行观察，则可以确认得到了具有所希望的颜色分布的细胞构造体(图7A、b)。
将合计25根Terumo公司制造的33G注射针(商品名Nanopath)的不锈钢制针部分，以5x5的棋盘格状、间隔0.4mm的形式，沿法线方向固定在三菱WELL PHARMA公司制造的α-磷酸三钙(商品名BIOPEX R)上，制作了支持体。在该支持体的上表面上，使针穿透FALCON公司制造的滤膜(商品名CELL CULTURE INSERT；聚对苯二甲酸乙二醇酯，尺寸8.0μm，商品号353093)，将该滤膜配置在针的底部。使用该支持体，制作了以下各种形态的细胞构筑物(图7B～图7D)。
图7B：十字图案
制作立方体状的细胞构筑物，其中，将呈红色的球状体配置成十字状。
图7C：
呈现(イメ一ジ)将血管系的细胞配置在顶点和中心的肝脏组织(肝小叶)，其中，在四角的顶点和面的中心配置呈红色的球状体。
图7D：
制作立方体状的细胞构筑物，其中，将呈红色的球状体配置成十字状。
将Terumo公司制造的33G注射针(商品名Nanopath)的不锈钢制针部分配置在直径0.3毫米的圆和直径0.7毫米的双重同心圆上，将其固定在三菱WELL PHARMA公司制造的α-磷酸三钙(商品名BIOPEX R)上，制作了支持体。制作了呈双色的(2色さし)、内部具有空洞的圆柱状细胞构造体。该细胞构造体模仿的是内侧为血管内皮、外侧为平滑肌的血管(图7E)。
将前述的具有十字状图案的双色球状体细胞构造体投入液氮中，进行瞬间冷冻。将冷冻好的构造体制成切片，在荧光显微镜下观察其截面。细胞构造体内部没有配置血管，存在内部的细胞因营养不足而发生细胞死亡、构造体内部溶解形成空洞的担忧，但实际上，在切片观察的范围内，不存在空洞，可以确认基本上全部的细胞均是存活的(图8)。
5.细胞构筑物的制作(4)
截除BD FalconTM细胞滤过器(型号352360)的底面的一部分网眼，使截除的部分呈长方形。将细胞滤过器反转过来，在立体显微镜下，将带针的缝合线(ALFERSA PHARMA公司制造NESCO SUTURE尺寸9-0尼龙)的一端连结线固定在截好的网眼的端部。在用立体显微镜进行观察的同时，使用尖锐的镊子将像上述的“1.球状体制作”一项中记载的那样制作的球状体，从带针的缝合线(9-0尼龙)的尖端(即针尖)串起来，并使3个球状体以可融合的状态相邻。将线连结在最初连结上的网眼截断端的相反侧，同样地串上3个球状体，往返式地进行，合计为3根(图9A)。
调节线来进行配置，使得球状体不仅在串连的线的纵方向上可融合，而且在横方向上各球状体也可融合(图9B的a1和a2)。串入后，在37℃、5％CO2的条件下进行培养，翌日观察到相邻的球状体之间开始发生融合(b1和b2)。约3天后，可以确认得到了细胞构造体，所述细胞构造体中，相邻球状体之间在纵方向和横方向中的任何方向上均发生了融合(结合)(c1和c2)。在确认了细胞构造体后，将线剪断，在用镊子按住细胞构造体的同时，拉去残留在构造体中的线，回收了细胞构筑物(d1和d2)。所得细胞构筑物为1个大的融合团块(图9C)。

Claims (17)

1.一种支持体，其用于将细胞团配置于任意的空间，该支持体具备：
基板，以及
用于将细胞团串起来的线状体或针状体，所述线状体或针状体使用降低细胞粘着性的材料。
2.权利要求1所述的支持体，其中，所述线状体或针状体配置在所述基板的近似法线方向。
3.权利要求1或2所述的支持体，其还具备覆盖所述基板的薄片，该薄片覆盖基板的存在有线状体或针状体的一侧的表面，且所述线状体或针状体是非细胞粘着性的。
4.权利要求1或2所述的支持体，其中，所述线状体或针状体是非细胞粘着性的。
5.权利要求1或2所述的支持体，其中，以下述间隔来设定所述线状体或针状体的位置，所述间隔使得在将细胞团串起来时，相邻的细胞团能够接触，且所述线状体或针状体是非细胞粘着性的。
6.权利要求3所述的支持体，其中，所述薄片具有孔或呈网眼状，使得固定于所述基板的所述线状体或针状体能够穿透该薄片。
7.权利要求1或2所述的支持体，其中，所述细胞团为球状体。
8.权利要求1或2所述的支持体，其中，所述针状体为圆锥形。
9.权利要求1或2所述的支持体，其中，所述线状体或针状体是聚丙烯制、尼龙制或不锈钢制的。
10.权利要求3所述的支持体，其中，所述薄片为经过了氟加工或聚甲基丙烯酸羟乙酯加工的薄片。
11.一种用于将细胞团配置于任意的空间的方法，该方法包括：
a)形成细胞团的步骤，
b)用权利要求1所述的支持体的线状体或针状体将所形成的细胞团串起来的步骤，
和
c)使该连起来的细胞团之间彼此接触的步骤。
12.一种生产细胞构筑物的方法，该方法包括：
a)形成细胞团的步骤，
b)用权利要求1所述的支持体的线状体或针状体将所形成的细胞团串起来的步骤，
c)使该串起来的细胞团之间彼此接触的步骤，和
d)回收接触的细胞团的步骤。
13.权利要求11或12所述的方法，其中，将所述细胞团串起来，使得它们在所述线状体或针状体的长度方向上连续地彼此接触。
14.权利要求12所述的方法，其中，所述接触的细胞团的回收是通过从融合的细胞团上取下支持体的步骤来实现的。
15.权利要求11或12所述的方法，其中，所述细胞团为球状体。
16.权利要求13所述的方法，其中，所述细胞团为球状体。
17.权利要求14所述的方法，其中，所述细胞团为球状体。
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