KR20100014544A - 세포의 입체 구조체의 제조 방법 - Google Patents

세포의 입체 구조체의 제조 방법 Download PDF

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고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
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Abstract

본 발명에 의해, 임의의 3 차원 공간에 각종 세포를 세포 덩어리로서 배치하고, 세포만으로 구성되는 원하는 형상의 입체 구조체를 제조하는 방법이 제공된다. 또, 본 발명에 의해, 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 지지체로서, 기판과, 세포 덩어리를 관통시키기 위한 사상체 또는 침상체를 구비하는 지지체가 제공된다. 상기 지지체는, 필요에 따라, 분리 가능한 기판을 덮는 시트를 구비한다. 또한, 상기 지지체를 사용하여 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 방법 및 입체적인 세포 구축물을 제조하는 방법도 제공된다.

Description

세포의 입체 구조체의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCTION OF THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF CELLS}
본 발명은 각종 세포를 임의의 3 차원 공간에 배치하고, 세포만으로 구성되는 입체 구조체를 제조하는 방법, 및 그 방법에 의해 제조되는 세포 구축물에 관한 것이다.
손실된 장기의 재생을 목표로, 세포를 환부에 이식하는 재생 의료가 실용화되고 있다. 종래, 대형의 기관·장기를 재생시키려면, 세포의 체내에서의 족장(足場)이 되는 흡수성 재료가 필수로 여겨졌다. 이들 흡수성 재료는, 동물에서 유래하는 콜라겐이나, 가수 분해하는 합성 폴리머의 사용이 시도되었으나, 안전성, 비용면 등에서 아직 충분한 성과를 얻지 못했다. 그래서 발명자들은 세포만으로 입체 구조체를 만드는 방법을 개발하였다 (「조직 플러그의 제조 방법」, 특허문헌 1). 이 방법에서는, 주형 내에 세포 덩어리를 흘려 넣음으로써 종래 매우 곤란한 것으로 여겼던 대형 세포만으로 이루어지는 구조체의 제조에 성공하였다. 이 발명은 동물 실험에 의해 유효성이 확인되어, 임상 응용으로의 전단계까지 발전되어 주목받고 있다.
상기 세포 플러그의 제조 방법에 의하면, 상이한 계통의 세포 덩어리를 배양 용기 등에 순서대로 흘려 넣음으로써 지층과 같은 복합적인 세포 구조체를 제조할 수는 있다. 그러나, 장기는 더욱 복잡한 세포의 배열 구조를 가지고 있기 때문에, 더욱 임의의 배열 구조를 취할 수 있는 세포 플러그의 제조 방법의 개발이 필요한 것으로 되어 있다. 또, 세포 구조체가 대형, 복잡화됨으로써 구조체 내부로의 배양액 공급 (배양시), 또, 혈관 유도로의 확보가 필요하고, 향후 대형 장기 재생을 실시하려면, 더욱 개량이 필요해진다.
최근, 37 도 부근에서 경화되고, 저온이 되면 액상화된다는 특수한 젤라틴이 개발되었다 (감온성 젤라틴). 이 젤라틴에 세포를 부착시켜 세포 시트를 제조하고, 그리고 세포 시트끼리를 쌓아 겹쳐 세포의 입체 구조체를 만드는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 이 수법에서는 세포 구조체 내부로의 배양액의 공급이 곤란하고, 구조체의 두께는 2 밀리 정도가 한계이다. 또 이 수법에 의하면, 구조체가 완성된 후에 온도를 낮춰 감온성 젤라틴을 액체로 한 후, 구조체 내부로부터 젤라틴을 회수할 수 있다. 그러나, 구조체 내부로부터 완전히 젤라틴을 회수할 수 있을지는 의문이고, 잔류 젤라틴에 의해 체내에서의 이물질 반응 등의 부작용이 우려된다 (비특허문헌 1).
(특허문헌 1) 일본 공개특허공보 2004-357694호
(비특허문헌 1) 메비올 (등록상표) 젤을 사용한 연골 조직의 재생, 인터넷 <URL : HYPERLINK
"http://www.mebiol.co.jp/rd-img/nankotu.pdf"
http://www.mebiol.co.jp/rd-img/nankotu.pdf>
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 각종 세포를 임의의 3 차원 공간에 배치하고, 세포만으로 구성되는 입체 구조체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 본 발명의 임시 고정용의 지지체를 사용함으로써, 각종 세포를 임의의 3 차원 공간에 배치하고, 세포만으로 구성되는 입체 구조체를 제조하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 지지체로서,
기판과,
세포 덩어리를 관통시키기 위한 사상체 또는 침상체를 구비하는 지지체.
(2) 상기 사상체 또는 침상체가 상기 기판의 거의 법선 방향으로 배치되어 이루어지는 (1) 에 기재된 지지체.
(3) 상기 기판을 덮는 시트를 추가로 구비하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 지지체.
(4) 상기 사상체 또는 침상체가 세포 비접착성인 것인 (1) 또는 (2) 에 기재된 지지체.
(5) 상기 사상체 또는 침상체는, 세포 덩어리를 관통시켰을 때에 이웃하는 세포 덩어리와 접촉할 수 있는 간격으로 위치 결정되어 있는 (1) 또는 (2) 에 기재된 지지체.
(6) 상기 시트가 세포 비접착성인 것인 (3) 에 기재된 지지체.
(7) 상기 시트는 상기 기판에 고정된 상기 사상체 또는 침상체가 그 시트를 관통할 수 있도록, 구멍을 갖거나, 또는 메시 형상으로 되어 있는 (3) 에 기재된 지지체.
(8) 상기 세포 덩어리가 스페로이드인 (1) 또는 (2) 에 기재된 지지체.
(9) 상기 침상체가 원추형인 (1) 또는 (2) 에 기재된 지지체.
(10) 상기 사상체 또는 침상체가 폴리프로필렌제, 나일론제, 또는 스테인리스제인 (1) 또는 (2) 에 기재된 지지체.
(11) 상기 시트가 불소 가공 또는 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 가공된 것인 (3) 에 기재된 지지체.
(12) 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 방법으로서,
a) 세포 덩어리를 형성시키는 공정,
b) (1) 에 기재된 지지체의 사상체 또는 침상체에, 형성된 세포 덩어리를 관통시키는 공정, 및
c) 그 관통시킨 세포 덩어리끼리를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법.
(13) 세포 구축물의 제조 방법으로서,
a) 세포 덩어리를 형성시키는 공정,
b) (1) 에 기재된 지지체의 사상체 또는 침상체에, 형성된 세포 덩어리를 관통시키는 공정,
c) 그 관통시킨 세포 덩어리끼리를 접촉시키는 공정, 및
d) 접촉시킨 세포 덩어리를 회수하는 공정을 포함하는 상기 방법.
(14) 상기 세포 덩어리는, 상기 사상체 또는 침상체의 길이 방향으로 연속하며 접촉하도록 관통되는 (12) 또는 (13) 에 기재된 방법.
(15) 상기 접촉시킨 세포 덩어리의 회수가, 융합시킨 세포 덩어리로부터 지지체를 인발하는 공정에 의해 달성되는 (13) 에 기재된 방법.
(16) 상기 세포 덩어리가 스페로이드인 (12) ∼ (15) 중 어느 1 항에 기재된 방법.
(17) (12) ∼ (15) 중 어느 1 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 세포 구축물.
(18) 상기 세포 구축물이 동 종류의 세포에 의해 구성된 것인 (17) 에 기재된 세포 구축물.
(19) 상기 세포 구축물이 복수 종류의 세포에 의해 구성된 것인 (17) 에 기재된 세포 구축물.
(20) 의료용 또는 실험용으로 사용되는 (17) ∼ (19) 중 어느 1 항에 기재된 세포 구축물.
(21) 관절 재생에 사용되는 (20) 에 기재된 세포 구축물.
발명의 효과
본 발명에 의해, 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 지지체, 및 상기 지지체를 사용하여 각종 세포를 임의의 3 차원 공간에 배치하고, 세포 덩어리끼리가 융합/결합되어 구조체가 형성된 후에, 지지체를 뽑아냄으로써, 이물질이 잔류하지 않고 세포만으로 이루어지는 세포 구축물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 세포 덩어리 (스페로이드) 는, 근접한 상태에서 방치하면 융합되는 것으로 알려져 있지만, 본 발명의 지지체 및 방법을 사용함으로써, 스페로이드의 융합에 의해 형성되는 구축물의 형상을 제어하고, 임의의 3 차원 공간에 세포 덩어리를 원하는 대로 배치할 수 있게 되었다. 또, 본 발명의 방법에 의해, 세포 구조체 내부 (세포 덩어리에 의해 구축된 구조체의 내벽부) 에 세포 덩어리를 배치하지 않고 공극(터널) 을 형성할 수 있게 되어, 그 터널부에 배양액을 공급할 수 있다. 그 결과, 대형 세포 구조체를 형성할 수 있게 된다. 이와 같이 하여 얻어진 세포 구조체는, 예를 들어 기관 또는 장기의 재생을 목적으로 한 의료용의 세포 이식에 사용할 수 있다. 또, in vitro 에서의 약제 스크리닝 등의 연구용의 기관·장기의 시뮬레이터에도 사용할 수 있다.
도 1A 는, 본 발명의 지지체를 나타낸다.
도 1B 는, 기판의 기저면 상에 시트를 구비하는 본 발명의 지지체를 나타낸다.
도 1C 는, 여러 가지 형태의 사상체 또는 침상체를 갖는 본 발명의 지지체를 나타낸다.
도 1D 는, 침상체가 원추형인 실시형태의 도면을 나타낸다.
도 1E 는, (예를 들어, 스토퍼 등을 이용하여) 사상체의 일단을 고정시키고, 타단으로부터 세포 덩어리를 관통시키는 예를 나타내는 도면이다.
도 1F 는, 세포 덩어리를 사상체에 통과시키고, 실을 긴장시킨 상태에서 고정시켜 세포 덩어리를 배열시킨 예를 나타내는 도면이다.
도 2A 는, 세포 덩어리 (스페로이드) 가, 본 발명의 지지체에 적용되는 도면을 나타낸다.
도 2B 는, 로봇 아암을 사용하여 세포 덩어리를 침상체에 적용하는 도면을 나타낸다.
도 2C 는, 본 발명의 지지체 상에 관통시킨 세포 덩어리를 옆에서 관찰한 도이다.
도 2D 는, 본 발명의 지지체 상에 관통시킨 세포 덩어리의 사시도이다.
도 3A 는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 덩어리를 회수하는 공정의 예이다.
도 3B 는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 덩어리의 예를 나타내는 도면이다.
도 4A 는, 2 종류의 세포 덩어리에 의해 구성되는 세포 구축물의 1 개의 예를 나타내는 도면이다.
도 4B 는, 2 종류의 세포 덩어리에 의해 구성되는 세포 구축물의 다른 예를 나타내는 도면이다.
도 4C 는, 2 종류의 세포 덩어리에 의해 구성되는 세포 구축물의 다른 예를 나타내는 도면이다.
도 4D 는, 세포 덩어리 내에 공간을 갖는 세포 구축물의 다른 예를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 융합된 세포 덩어리의 현미경 사진의 도면이다.
도 6 은, 본 발명의 세포 구축물을 얻기 위한 1 개의 실시예에 있어서, 세포 덩어리가 얻어지기까지의 흐름을 시간 경과적으로 나타낸 도면이다.
도 7A ∼ 도 7E 는, 본 발명에 따라 세포 덩어리를 융합시켜, 현미경 관찰을 실시한 도면이다.
도 8 은, 세포 구조체의 내부를 관찰하기 위한 단면도이다.
도 9A 는, 바늘을 꿴 봉합실에 세포 덩어리를 관통시킨 도면이다.
도 9B 는, 바늘을 꿴 봉합실을 이용하여 세포 구축물을 얻을 때까지의 흐름을 시간 경과적으로 나타낸 도면이다.
도 9C 는, 본 발명의 세포 구축물의 일례이다.
부호의 설명
10:지지체 본체, 11:기판, 12:사상체 또는 침상체, 13:시트
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 본 발명의 실시형태에 대해 설명한다. 이하의 실시형태는, 본 발명을 설명하기 위한 단순한 예시로서, 본 발명을 이 실시형태에만 한정하는 것은 의도되지 않는다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 여러 가지 형태로 실시할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 간행물, 예를 들어, 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은, 그 전체가 본 명세서에 있어서 참조로서 도입된다. 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 2007-094313호 명세서 (출원일:2007년 3월 30일) 의 내용을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 지지체
본 발명의 지지체 중 하나의 실시형태를 도 1A 및 도 1B 에 나타낸다. 도 1A 에 있어서, 지지체 본체 (10) 는, 기판 (11) 및 사상체 또는 침상체 (12) 를 갖는다. 지지체 본체 (10) 는, 임의의 형상의 기판 (11) 과, 기판 (11) 상에 사상체 또는 침상체 (12) 를 구비한다. 도 1A 는, 사상체 또는 침상체가, 기판의 기저면의 거의 법선 방향으로 배치되어 이루어지는 양태의 일례이다. 기판 (11) 과 사상체 또는 침상체 (12) 는, 그 전체가, 별도의 부품으로 구성되어 고정되어 있어도 되고, 예를 들어 열가소성 수지 등으로 일체화되어 제조되어 있어도 된다. 또, 지지체가 갖는 사상체 또는 침상체의 수는 1 이상이고, 원하는 임의의 수의 사상체 또는 침상체를 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서 사용되는 경우, 어구 「거의 법선 방향」이란, 사상체 또는 침상체의 길이 방향의 각도가, 기판 (11) 의 기저면에 대해 거의 90° 인 임의의 각도 방향을 의미하고, 바람직하게는 90° 를 의미한다. 다른 실시형태에 있어서, 기판 (11) 은, 기판의 사상 체 또는 침상체가 존재하는 측의 표면을 덮는 시트 (13) 를 추가로 구비한다 (도 1B). 시트 (13) 의 표면적은, 기판 (11) 의 기저면의 표면적보다 작아도 되고, 동일해도 되고, 또는 커도 되는데, 사상체 또는 침상체가 존재하는 영역의 기저면을 덮고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태로서, 사상체 또는 침상체를 법선 방향이 아닌, 비법선 방향 (예를 들어, 법선 방향으로부터 각도를 갖는 방향) 으로 배치할 수도 있다. 「비법선 방향」의 사상체 또는 침상체의 각도는, 지지체 본체 (10) 에 대해 1° ∼ 89° 의 범위에서 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 10°, 20°, 30°, 40°, 50°, 60°, 70° 및 80° 등을 들 수 있다. 또, 「비법선 방향」의 사상체 또는 침상체는, 지지체로부터 일정 방향으로 직선 형상으로 연신되어 있는 경우도 있고, 원 혹은 타원의 호의 일부 등과 같이 비직선적으로 연신되어 있는 경우도 있다 (도 1C). 1 개의 지지체 상에 존재하는 사상체 또는 침상체의 형상은, 1 개의 형태로 통일시킬 필요는 없고, 여러 가지 형태의 사상체 또는 침상체를 조합하여 사용할 수도 있다 (도 1C). 이들 양태로서는, 법선 방향의 사상체 또는 침상체와 비법선 방향으로 일정 각도를 갖는 사상체 또는 침상체를 조합한 지지체, 법선 방향의 사상체 또는 침상체와 원호의 일부에 대응하는 궤적을 갖는 사상체 또는 침상체를 조합한 지지체, 및 법선 방향의 사상체 또는 침상체와 비법선 방향으로 일정 각도를 갖는 사상체 또는 침상체와 원호의 일부에 대응하는 궤적을 갖는 사상체 또는 침상체를 조합한 지지체 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 사상체 또는 침상체를 곡선 형상으로 하고, 이것을 원주 상에 배치하여 아치를 형성하고, 그 아치를 따라 세포 덩어리를 관통시켜 융합시키면, 예를 들어, 볼(bowl) 형상의 세포 구축물을 구축할 수 있다. 또, 사상체 또는 침상체를 직선 형상의 것으로 하면, 배치의 방법에 따라 원추형, 중공 형상, 혹은 피라미드 형상의 형상으로 할 수 있다. 복수 형태의 사상체 또는 침상체를 조합하여 사용함으로써, 복잡한 형상의 세포 구축물을 형성할 수 있다.
사상체 또는 침상체 (12) 및 시트 (13) 는, 모두 세포 비접착성의 재질인 것이 바람직하다. 기판도 세포 비접착성인 것이 바람직한데, 지지체에 시트 (13) 를 사용하는 경우에는, 세포 덩어리는 기판 (11) 에 직접 접촉하지 않기 때문에, 그 재질은 상관없다. 용어 「세포 비접착성」이란, 세포가, 세포 외 접착 인자를 개재하여 벽면에 부착되는 것을 저지할 수 있는 성질을 의미하고, 세포 비접착성의 기능을 부여하는 물질 (예를 들어, 불소) 을 코팅한 소재 등이 상기 성질을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 사상체 또는 침상체 (12) 는, 폴리프로필렌제, 나일론제, 또는 스테인리스제이다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 시트 (13) 는, 불소 가공 또는 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 폴리머 가공된 것이다 (폴리헤마(poly-HEMA) 가공). 본 발명의 사상체 또는 침상체 (12) 및 시트 (13) 는, 테플론 (등록상표), poly-HEMA, 아크릴판, 염화 비닐판, ABS 수지판, 폴리에스테르계 수지판, 폴리카보네이트판 등의 수지, PP (폴리프로필렌), ABS (아크릴니트릴부타디엔스티렌), PE (폴리에틸렌), POM (폴리아세탈), PC (폴리카보네이트), PEEK (폴리에테르에테르케톤), MCN (모노머캐스팅나일론), 6N (6 나일론), 66N (66 나일론) 등의 엔지니어링플라스틱이어도 된다. 이들 소재 이외에도, 세포 접착성을 저하시킨 소재가 사용될 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 지지체는, 생체 흡수성 재료인 것을 사용하는 것도 생각할 수 있는데, 생체 흡수성 재료를 사용하면, 분해산물이나, 다 녹지 못한 잔류물이 남아 독성을 발생시킬 가능성이 있기 때문에, 생체 흡수성 재료가 아닌 상기 소재인 것이 바람직하다.
상기 사상체 또는 침상체 (12) 는, 세포 덩어리를 이른바 꼬치 형상으로 관통시키기 위한 봉 형상체이고, 각 사상체 또는 침상체는, 관통시킨 세포 덩어리가 그 인접하는 사상체 또는 침상체에 관통시킨 세포 덩어리와 접촉하여 융합할 수 있는 간격을 두고 서로 위치 결정되어 있다. 사상체 또는 침상체는, 예를 들어 격자 형상으로 규칙적으로 배치되어도 되고, 랜덤으로 배치되어도 된다. 사상체 또는 침상체끼리의 간격은, 그곳을 관통시키는 세포 덩어리의 크기에 따라 변동할 수 있는데, 바람직하게는, 세포 덩어리 직경의 거의 100 % ∼ 110 % 의 길이로 규정된다. 예를 들어, 세포 덩어리의 직경이 1 ㎜ 인 경우, 사상체 또는 침상체끼리의 간격은 약 1 ㎜ ∼ 1.1 ㎜ 인 것이 바람직하다.
사상체 또는 침상체 (12) 의 단면의 직경은, 세포 덩어리를 파괴하지 않고, 그리고 세포 덩어리의 융합을 방해하지 않는 한, 임의의 값을 취할 수 있다. 또, 하나의 실시형태에 있어서, 침상체 (12) 는, 뿔체의 바닥면을 기판 (11) 의 기저면에 접하는 원추체이다 (도 1D). 시트 (13) 는, 기판 (11) 의 기저면의 거의 법선 방향으로 배치되는 사상체 또는 침상체가 이 시트를 관통할 수 있도록, 구멍을 갖거나, 또는 메시 형상으로 되어 있어, 기판 (11) 및 사상체 또는 침상체 (12) 로부터 분리할 수 있다. 침상체 (12) 가 원추형인 특정한 실시형태 (도 1D) 는, 침상체로부터의 시트 분리가 용이하게 이루어질 수 있다는 점에서 바람직하다. 본 발명의 지지체는, 주로, 원하는 형상의 세포 구축물을 얻기 위해, 세포 덩어리끼리가 융합될 때까지의 임시 고정을 위해 사용된다. 몇 가지 양태에 있어서는, 본 발명의 지지체에 세포 구축물을 유지한 채로, 장기 시뮬레이터 등으로 하여 사용할 수도 있다. 이 경우에는, 지지체를 세포 구축물로부터 인발해도 되고, 인발하지 않아도 된다.
또, 다른 실시형태에 있어서, 사상체 (12) 는, 예를 들어, 봉합실 등이어도 된다. 바람직하게는, 이 사상체로서 바늘을 꿴 봉합실을 사용할 수 있다. 예를 들어, 실의 일단을 기판 상에 고정시키고, 타단을 예리한 형상 (예를 들어, 바늘) 으로 함으로써, 사상체에 세포 덩어리를 관통시키는 것을 보다 용이하게 할 수 있다 (도 1E). 또, 세포 덩어리를 실에 통과시키고, 실을 긴장시킨 상태에서 고정시켜 세포 덩어리를 배열시킬 수도 있다 (도 1F). 제 1 기판 상에 일단을 고정시킨 실에, 소정의 복수개의 세포 덩어리를 순서대로 관통시켜 꼬치 상태로 한 후, 세포를 관통시키는 데 사용한 실의 선단을 제 2 기판 상에 고정시킬 수도 있다. 또, 제 1 기판과 제 2 기판 사이의 거리에 대해 충분히 긴 실을 사용하여, 세포 덩어리를 관통시킨 실을 제 1 기판과 제 2 기판 사이에서 수 회 왕복시켜, 이웃하는 세포 덩어리와 접촉할 수 있는 간격이 되도록 고정시킬 수도 있다.
2. 세포 덩어리
세포는, 부유계 세포와 부착 의존성 세포로 크게 분류되고, 전자에는 혈액계 나 면역계의 세포가 속하며, 후자에는 피부나 뼈 등의 세포가 속한다. 피부나 뼈 등의 세포는, 배양액 중에서 떠 있는 상태에서는 죽어 버리고, 유리 등 샬레에 부착시킴으로써 증식시킬 필요가 있다. 이 때문에, 테플론 (등록상표) 가공된 플레이트 상에서 세포를 배양하면, 세포는 족장을 구하여 서로 접착되어, 세포 응집 덩어리 즉 스페로이드가 형성된다. 게다가 스페로이드끼리가 접착되어 융합되면 스페로이드는 더욱 큰 형상이 된다. 예를 들어, 세포 비접착성의 플레이트에 세포를 파종하여 배양하면, 세포는 자연스럽게 응집되어 스페로이드가 형성된다. 스페로이드가 형성될 때까지의 배양 시간은 6 ∼ 24 시간, 바람직하게는 24 ∼ 48 시간이다. 세포 덩어리의 제조 방법은, 상기의 방법에 한정되지 않고, 선회되는 용액 중에 세포 현탁액을 넣은 선회 배양법, 시험관에 세포 현탁액을 넣어 원심 분리기로 침전시키는 방법, 혹은 알기네이트 비즈법 등, 다수의 이미 알려진 방법이 있다. 균질한 세포 덩어리를 대량으로 처리 및 회수할 수 있는 점에서, 발수성이나 세포 비접착성의 멀티 웰에 세포 현탁액을 넣는 방법이 효율적이어서 바람직하다.
최근, 간엽계 간세포로부터 연골 세포로의 분화시에는, 세포-세포끼리의 접착이 스위치가 되어 콜라겐 등의 발현이 개시되는 것이 시사되는 보고가 있었다 (Yoon YM, J Cell Biochem 2002; 87(3):342-59). 이런 점에서, 세포를 스페로이드로 하여 세포끼리를 접착시킴으로써 세포는 세포 주기의 정지기(靜止期)로 이행되어 단백질의 생산이 증가되는 것으로 생각할 수 있다. 따라서, 세포를 단백질 생산이 증가되는 정지기로 유도하기 위해, 세포를 일단 스페로이드로 하고 나 서 소정의 형상으로 형성하는 것은 바람직하다. 또한, 세포를 정지기로 유도하고 나서 분화시키는 것을 「세포가 증식 사이클에서 벗어나, 세포 분화로 이행된다」라고 한다.
스페로이드에 적절한 세포는, 간세포 (ES 세포, 장대혈 유래 세포, 미분화 간엽계 간세포 등) 등의 미분화 세포 또는 그 분화형 세포이다. 골아 세포, 연골 세포, 지방 세포는, 미분화 간엽계 간세포로부터 용이하게 분화 유도할 수 있기 때문에, 이들의 분화 유도된 세포 (관절 연골 세포, 골세포 등) 도 사용할 수 있다. 또, 성체 간엽계 간세포를 사용할 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 제조되는 세포 구축물을, 입체적 형상을 갖는 조직편의 생성에 응용하는 경우를 생각하면, 이와 같이 입체적으로 구축되는 조직으로서는, 중배엽계의 조직을 중심으로 하여, 관절 연골, 뼈 외, 유방 등의 지방 조직, 인대, 건(腱), 치아, 귓바퀴, 코 등을 들 수 있고, 중배엽계에 그치지 않고, 간장, 췌장이나 혈관, 신경 등 거의 모든 접착계 세포 역시 사용할 수 있다. 또, 스페로이드는, 반드시 단일한 종류의 세포의 응집체로서 형성될 필요는 없고, 스페로이드가 형성되는 한, 복수 종류의 세포종으로 형성되어도 된다. 이와 같은 키메라 형상의 스페로이드를 이용하여, 본 발명의 세포 구축물을 제조할 수도 있다.
간엽계 간세포는, 피검 동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 모르모트, 개, 돼지, 염소, 소 등의 실험 동물) 또는 인간의 골수로부터 Dexter 법, 자기 비즈법, 셀 소팅법 등의 공지 수법에 의해 채취할 수 있다. 또, 피부, 피하 지방, 근육 조직 등에서 간엽계 간세포를 채취할 수도 있다.
3. 세포 덩어리를 배치하는 방법
본 발명에 의하면, 본 발명의 지지체를 사용하여 세포 덩어리를 지지체 상의 임의의 위치 공간에 배치할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, a) 세포 덩어리를 형성시키는 공정, b) 상기 지지체의 사상체 또는 침상체에, 형성된 세포 덩어리를 관통시키는 공정, 및 c) 그 관통시킨 세포 덩어리끼리를 접촉시키는 공정을 포함한다. 제 1 세포 덩어리를 형성시키는 공정에 있어서, 예를 들어, 선회되는 용액 중에 세포 현탁액을 넣음으로써, 세포 덩어리가 형성된다. 이어서, 제 1 공정에 의해 형성된 세포 덩어리 (즉, 스페로이드) 를, 지지체 상의 사상체 또는 침상체에 관통시킨다. 이 공정은, 예를 들어, 세포 덩어리를 함유하는 피펫의 선단을 침상체의 선단을 향하여, 피펫의 선단과는 반대측에서부터 압력을 가하여 세포 덩어리를 밀어냄으로써 실시될 수 있다 (도 2A). 밀어내어진 세포 덩어리는, 침상체에 꽂혀 소정의 위치에 고정된다. 혹은, 다른 실시형태에 있어서, 이 공정은, 세포 덩어리를 탑재한 소형의 로봇 아암을 이용하여, 침상체 상으로부터 세포 덩어리를 관통시킴으로써 달성될 수 있다 (도 2B). 또, 핀셋 등으로 세포 덩어리를 고정시켜, 사상체 (바람직하게는, 바늘을 꿴 실) 를 세포 덩어리에 관통시킬 수도 있다. 단, 본 발명의 방법은, 이와 같은 공정에 한정되는 것은 아니다. 세포 덩어리는, 1 개의 사상체 또는 침상체 상에 복수의 세포 덩어리가 접촉하도록 (이른바 단자 형상으로) 관통시킨다 (도 2C). 세포 덩어리끼리의 접촉에 의해, 세포 덩어리는 세로 방향 (수직 방향 (예를 들어, z 방향)) 으로 융합될 수 있다. 또, 각 사상체 또는 침상체는, 세포 덩어리를 관통시켰을 때 에 이웃하는 세포 덩어리와 접촉할 수 있는 간격으로 위치 결정되어 있으므로, 가로 방향 (수평 방향 및 안쪽 방향 (예를 들어, x 방향 및 y 방향)) 으로도 접촉하여 융합될 수 있다. 따라서, 이들 세포 덩어리 융합을 통하여, 본 발명의 지지체 상에 세포로 이루어지는 입체 구조체가 구축된다 (도 2D).
4. 세포 구축물을 제조하는 방법
본 발명은, 본 발명의 지지체를 사용하여 세포 구축물을 제조하는 방법을 제공한다. 세포 구축물의 제조는, 상기에 기재된 순서에 따라 접촉하여 융합된 세포 덩어리를 회수함으로써 달성된다. 이 세포 덩어리의 회수는 융합시킨 세포 덩어리로부터 지지체를 인발하는 공정에 의해 달성된다 (도 3A). 이 세포 덩어리로부터 지지체를 인발하는 것은, 세포 덩어리를 핀셋 등으로 직접 고정시켜 융합한 세포 덩어리로부터 사상체 또는 침상체를 인발하여 달성되는 경우도 있고, 혹은 지지체로부터 시트를 분리하는 공정에 의해 달성되는 경우도 있다. 시트의 분리는, 고정된 시트로부터 지지체를 인발함으로써 실시되어도 되고, 고정된 지지체로부터 시트를 분리함으로써 실시되어도 된다. 이들 일련의 공정을 포함하는 방법에 의해, 원하는 대로 공간적으로 배치된 임의의 형상의 세포 구축물이 제공된다 (도 3B).
5. 세포 구축물
본 발명의 세포 구축물은, 동 종류의 세포만으로 구성되어도 되고, 또는 복수 종류의 세포를 함유해도 된다. 본 명세서에 있어서 사용되는 경우, 용어 「동 종류의 세포」란, 단일종의 동일한 조직 또는 기관 등에서 유래하는 기능적으로 동등한 세포를 의미한다. 복수 종류의 세포를 함유하는 세포 구축물은, 상이한 종류의 세포로 각각 형성된 세포 덩어리 (예를 들어, a 세포로 이루어지는 세포 덩어리 A 와 b 세포로 이루어지는 세포 덩어리 B) 를, 본 발명의 지지체에 적용함으로써 얻을 수 있다. 여기에서, a 세포와 b 세포는, 그들의 세포 덩어리끼리가 융합되는 한, 임의의 세포일 수 있다. a 세포와 b 세포는, 예를 들어, 동종의 상이한 조직 (또는 기관) 유래의 세포이어도 되고, 이종의 동일한 조직 (또는 기관) 유래의 세포이어도 되고, 이종의 상이한 조직 (또는 기관) 유래의 세포이어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 지지체에 있어서 격자 형상으로 배치된 제 1 열의 침상체 군에 세포 덩어리 A 를 관통시키고, 제 2 열의 침상체 군에 세포 덩어리 B 를 관통시켜 그것들을 융합시키면, 세포 덩어리 A 와 세포 덩어리 B 로 이루어지는 키메라 형상의 세포 구축물이 제공될 수 있다 (도 4A). 또 다른 실시형태에 있어서, 상기와 같은 제 1 열, 제 2 열에 더하여, 제 3 열의 침상체 군에 세포 덩어리 A, 제 4 열의 침상체 군에 세포 덩어리 B (이하, 동일) 와 교대로 양방의 세포 덩어리를 적용함으로써, 세포 덩어리 A 와 세포 덩어리 B 가 교대로 층을 이루는 구축물을 제조할 수 있다 (도 4B). 또, 1 개의 침상체에 관통시키는 세포 덩어리의 종류를 바꿀 수도 있다 (도 4C). 동일한 방법으로, 세포 덩어리 A 와 세포 덩어리 B 를 원하는 비율로 원하는 위치의 침상체에 적용함으로써, 키메라 형상 세포 구축물의 입체 구조의 구성을 제어할 수 있다. 사용되는 상이한 종류의 세포는 2 종류에 한정되지 않아, 3 종류 이상의 세포를 이용해도 된다.
또 다른 실시형태에 있어서는, 본 발명의 방법에 의해, 세포 구축물의 내부에 세포가 존재하지 않는 간극 공간을 갖는 세포 구축물을 제조할 수 있다. 이 세포 구축물은, 본 발명의 지지체에 세포를 적용할 때에, 모든 세포를 연속적으로 접촉시키는 것이 아니라, 침상체 상에 있어서 간극 공간이 소망되는 영역을 제외하고, 그 주위에 세포 덩어리를 배치하여 융합시킴으로써 제공될 수 있다. 이 세포 구축물 내부의 간극 공간은 임의로 설계할 수 있는데, 바람직하게는 구조물 벽면이 세포 덩어리로 구성되고, 그 내부가 공동이 되도록 통형상 (터널 형상) 의 형태로 할 수 있다 (도 4D). 이와 같은 간극 공간을 세포 구축물의 내부에 형성함으로써, 그 공간을 통과하여 배양액에 함유되는 영양분이나 산소 등을 세포 덩어리 내부의 세포에까지 송달할 수 있게 되므로, 간극 공간을 갖는 세포 구축물은, 더욱 체적이 큰 세포 구축물을 제조하는 것이 필요해지는 국면에 있어서 유리하다.
6. 의료용 또는 실험용 세포 구축물
본 발명의 세포 구축물은, 재생 의료용 또는 실험용으로 사용할 수 있다. 연골 세포의 세포 덩어리를 이용하여 세포 구축물을 형성시키면, 그 구축물은, 소모된 관절부, 혹은 사고 등의 원인으로 잃게 된 관절부에 이식함으로써, 관절의 재생 의료에 이용할 수 있다.
상기한 예와는 별도로, 현재, 간세포를 함유하는 스페로이드의 연구가 활발하게 실시되고 있다. 따라서, 간세포의 세포 덩어리를 이용하여 세포 구축물을 형성시킴으로써, 형성된 세포 구축물은 간장의 재생 의료에 이용할 수 있다.
단, 본 발명의 구축물은, 상기 장기 또는 기관에 한정되는 것이 아니고, 재 생 의료가 요망되는 모든 장기 및 기관을 대상으로 할 수 있다.
또한, 3 차원 구조를 갖는 스페로이드는, 종래의 2 차원 배양물과 비교하여, 대부분의 세포에 있어서 in vivo 에서의 거동을 더욱 잘 반영할 수 있는 것으로 알려져 있고, 스페로이드를 사용한 종양-면역 세포의 상호 작용의 연구나 약물 개발을 위한 스크리닝 등이 보고되어 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제조되는 세포 구축물은, 인공 장기에 대한 응용을 비롯하여, 여러 가지 세포 어세이, 스크리닝 등의 실험에도 사용할 수 있다.
실시예
1. 스페로이드 제조
토끼의 골반으로부터 채취한 골수 유래 간엽계 간세포를 단층 배양하였다. 최종적으로 간엽계 간세포를 15 ㎝ 디쉬 1 장당 1.0×106 개 얻었다. 이 세포를 트립신 처리하여 세포 현탁액으로 하고, 스미토모 베이크라이트사 제조 스페로이드플레이트에 각각 1.0×105 개의 세포가 들어가도록 파종하였다. 그 후, 37 ℃, 5 % CO2 의 조건 하에서 배양을 실시하고, 다음날에는 직경이 평균 0.3 ㎜ 인 세포 덩어리를 제조하였다.
2. 세포 구축물의 제조 (1)
테루모사 제조의 33 G 주사 바늘 (상품명 나노패스) 의 스테인리스제 바늘 부분을 4 개 평행하게, 미츠비시 웰파마사 제조의
Figure 112009058393012-PCT00001
-트리인산칼슘 (상품명 바이오펙스 R) 에 고정시켜 지지체를 제조하였다. 실체 현미경으로 관찰하면서, 예리 한 핀셋을 이용하여, 스페로이드를 지지체에 고정시킨 스테인리스제의 바늘 끝으로 1 개씩 찔렀다. 찌른 후, 37 ℃, 5 % CO2 의 조건 하에서 배양을 실시하고, 약 2 일 후, 인접하는 스페로이드끼리가 세로 방향 및 가로 방향의 어느 방향으로도 융합 (결합) 된 세포 구조체를 확인할 수 있었다 (도 5).
3. 세포 구축물의 제조 (2)
테루모사 제조의 33 G 주사 바늘 (상품명 나노패스) 의 스테인리스제 바늘 부분을 3×3 의 격자 형상 0.4 ㎜ 간격으로 합계 9 개 법선 방향으로, 미츠비시 웰파마사 제조의
Figure 112009058393012-PCT00002
-트리인산칼슘 (상품명 바이오펙스 R) 에 고정시켜 지지체를 제조하였다. 이 지지체의 상면에는, 파르콘사 제조 필터 (상품명 셀컬쳐인서트; 폴리에틸렌테레프탈레이트) 사이즈 8.0㎛ 상품 번호 353093) 를 바늘에 관통시키고, 바늘의 기부에 배치하였다. 상기의 「1. 스페로이드 제조」항의 기재와 동일하게 하여 제조한 스페로이드 (약 50 개) 를, 실체 현미경으로 관찰하면서, 예리한 핀셋을 이용하여 지지체의 바늘에 1 개씩 찔렀다 (도 6, a). 찌른 후, 37 ℃, 5 % CO2 의 조건 하에서 배양을 실시하고, 약 3 일 후, 인접하는 스페로이드끼리가 세로 방향 및 가로 방향 중 어느 방향으로도 융합 (결합) 된 세포 구조체를 확인하였다 (도 6, b). 세포 구조체를 확인한 후, 예리한 핀셋을 이용하여, 미리 지지체와 세포 구축물 사이에 세팅한 필터를, 융합된 세포 구축물과 함께, 지지체로부터 천천히 제거하여 세포 구축물을 회수하였다 (도 6, c). 얻어진 세포 구축물은 1 개의 큰 융합 덩어리 (직경 약 3 ㎜) 였다 (도 6, d 및 e).
4. 세포 구축물의 제조 (3)
Invitrogen 사 제조의 생세포 라벨링용 키트 시리즈인 Qtracker (상품명) 655 (적색) 와 565 (녹색) 의 2 종류를 각각 별도로, 간엽계 간세포에 넣고, 각각 형광 현미경 하에서 적색, 녹색으로 발색하는 스페로이드를 준비하였다.
상기 서술한 4 개 바늘을 고정시킨 지지체에, 실체 현미경으로 관찰하면서, 예리한 핀셋을 이용하여, 각각의 스페로이드를 지지체에 고정시킨 스테인리스제의 바늘 끝에 적색 녹색 교대로 1 개씩 찔렀다. 찌른 후, 37 ℃, 5 % CO2 의 조건 하에서 배양을 실시하고, 약 2 일 후, 인접하는 스페로이드끼리가 세로 방향 및 가로 방향 중 어느 방향으로도 융합 (결합) 된 세포 구조체를 확인할 수 있었다 (도 7A, a). 또한 형광 현미경으로 관찰하면, 목적 대로의 배색을 가진 세포 구조체를 확인할 수 있었다 (도 7A, b).
테루모사 제조의 33 G 주사 바늘 (상품명 나노패스) 의 스테인리스제 바늘 부분을 5×5 의 격자 형상 0.4 ㎜ 간격으로 합계 25 개 법선 방향으로, 미츠비시 웰파마사 제조의
Figure 112009058393012-PCT00003
-트리인산칼슘 (상품명 바이오펙스 R) 에 고정시켜 지지체를 제조하였다. 이 지지체의 상면에는, 파르콘사 제조 필터 (상품명 셀컬쳐인서트; 폴리에틸렌테레프탈레이트) 사이즈 8.0 ㎛ 상품 번호 353093) 를 바늘에 관통시키고, 바늘의 기부에 배치하였다. 이 지지체를 이용하여, 이하의 여러 가지 형태의 세포 구축물을 제조하였다 (도 7B ∼ 도 7D).
도 7B : 십자 모양
정육면체 모양의 세포 구축물을 제조하여, 적색을 발색하는 스페로이드를 십자 모양으로 배치하였다.
도 7C :
혈관계의 세포를 정점과 중심에 배치한 간장의 조직 (간소엽) 을 이미지하여 4 모퉁이의 정점 및, 면의 중심에 적색을 발색하는 스페로이드를 배치하였다.
도 7D :
정육면체 모양의 세포 구축물을 제조하여, 적색을 발색하는 스페로이드를 십자 모양으로 배치하였다.
테루모사 제조의 33 G 주사 바늘 (상품명 나노패스) 의 스테인리스제 바늘 부분을 직경 0.3 밀리의 원과, 직경 0.7 밀리의 2 중의 동심원 상에 배치하고, 미츠비시 웰파마사 제조의
Figure 112009058393012-PCT00004
-트리인산칼슘 (상품명 바이오펙스 R) 에 고정시켜 지지체를 제조하였다. 2 색을 띈, 내부에 공동을 가진 원기둥 형상의 세포 구조체를 제조하였다. 이것은 내측이 혈관 내피, 외측이 평활근으로 이루어지는 혈관을 모방하고 있다 (도 7E).
상기 서술한 2 색의 스페로이드로 십자 형상의 모양을 가진 세포 구조체를 액체 질소에 넣고, 순간 동결시켰다. 동결된 구조체를 절편으로 하고 단면을 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 세포 구조체 내부에는 혈관이 배치되지 않아, 내부의 세포가 영양 부족으로 세포사(死)에 빠져, 구조체 내부가 용해되어 공동이 형성되는 것이 우려되었는데, 절편에서 관찰하는 한, 공동은 존재하지 않고, 거의 모든 세포의 생존이 확인되었다 (도 8).
5. 세포 구축물의 제조 (4)
BD FalconTM 셀 스트레이너 (형번 352360) 의 바닥면의 메시 일부를 직사각형으로 커팅하여 제거하였다. 셀 스트레이너를 반전하고, 커팅된 메시의 단부에 바늘을 꿴 봉합실 (알프레서파마사 제조 네스코스처 사이즈 9-0 나일론) 의 일단을 실체 현미경 하에서 연결하여 실 고정시켰다. 상기의 「1. 스페로이드 제조」항의 기재와 동일하게 하여 제조한 스페로이드를, 실체 현미경으로 관찰하면서, 예리한 핀셋을 이용하여, 바늘을 꿴 봉합실 (9-0 나일론의 선단 (즉, 바늘 끝)) 로부터 관통시켜 3 개의 스페로이드를 융합할 수 있게 인접시켰다. 실을 처음으로 묶은 메시 단끝(斷端)의 반대측에 묶고, 동일하게 3 개의 스페로이드를 관통시켜, 합계 3 개 왕복시켰다 (도 9A).
스페로이드가 관통한 실의 세로 방향뿐만 아니라, 가로 방향으로도 각 스페로이드가 융합할 수 있도록 실을 조절하여 배치하였다 (도 9B 의 a1 및 a2). 찌른 후, 37 ℃, 5 % CO2 의 조건 하에서 배양을 실시하고, 다음날에는, 인접한 스페로이드끼리가 융합되기 시작하는 것이 관찰되었다 (b1 및 b2). 약 3 일 후, 인접하는 스페로이드끼리가 세로 방향 및 가로 방향 중 어느 방향으로도 융합 (결합) 된 세포 구조체를 확인하였다 (c1 및 c2). 세포 구조체를 확인한 후, 실을 커팅하고, 핀셋으로 세포 구조체를 누르면서, 구조체 중에 남아 있는 실을 인발하여 세포 구축물을 회수하였다 (d1 및 d2). 얻어진 세포 구축물은 1 개의 큰 융합 덩어리였다 (도 9C).

Claims (21)

  1. 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 지지체로서,
    기판과,
    세포 덩어리를 관통시키기 위한 사상체 또는 침상체를 구비하는 지지체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 사상체 또는 침상체가 상기 기판의 거의 법선 방향으로 배치되어 이루어지는 지지체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 기판을 덮는 시트를 추가로 구비하는 지지체.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 사상체 또는 침상체가 세포 비접착성인 것인 지지체.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 사상체 또는 침상체는, 세포 덩어리를 관통시켰을 때에 이웃하는 세포 덩어리와 접촉할 수 있는 간격으로 위치 결정되어 있는 지지체.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 시트가 세포 비접착성인 것인 지지체.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 시트는 상기 기판에 고정된 상기 사상체 또는 침상체가 그 시트를 관통할 수 있도록, 구멍을 갖거나, 또는 메시 형상으로 되어 있는 지지체.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포 덩어리가 스페로이드인 지지체.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 침상체가 원추형인 지지체.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 사상체 또는 침상체가 폴리프로필렌제, 나일론제, 또는 스테인리스제인 지지체.
  11. 제 3 항에 있어서,
    상기 시트가 불소 가공 또는 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 가공된 것인 지지체.
  12. 세포 덩어리를 임의의 공간에 배치하기 위한 방법으로서,
    a) 세포 덩어리를 형성시키는 공정,
    b) 제 1 항에 기재된 지지체의 사상체 또는 침상체에, 형성된 세포 덩어리를 관통시키는 공정, 및
    c) 그 관통시킨 세포 덩어리끼리를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법.
  13. 세포 구축물의 제조 방법으로서,
    a) 세포 덩어리를 형성시키는 공정,
    b) 제 1 항에 기재된 지지체의 사상체 또는 침상체에, 형성된 세포 덩어리를 관통시키는 공정,
    c) 그 관통시킨 세포 덩어리끼리를 접촉시키는 공정, 및
    d) 접촉시킨 세포 덩어리를 회수하는 공정을 포함하는 상기 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 덩어리는, 상기 사상체 또는 침상체의 길이 방향으로 연속하며 접촉하도록 관통되는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 접촉시킨 세포 덩어리의 회수가, 융합시킨 세포 덩어리로부터 지지체를 인발하는 공정에 의해 달성되는 방법.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 덩어리가 스페로이드인 방법.
  17. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 세포 구축물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포 구축물이 동 종류의 세포에 의해 구성된 것인 세포 구축물.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포 구축물이 복수 종류의 세포에 의해 구성된 것인 세포 구축물.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    의료용 또는 실험용으로 사용되는 세포 구축물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    관절 재생에 사용되는 세포 구축물.
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