WO2017221869A1 - 置換された多環性ピリドン誘導体の製造方法およびその結晶 - Google Patents

置換された多環性ピリドン誘導体の製造方法およびその結晶 Download PDF

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formula
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摂也 芝原
伸明 福井
利克 牧
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塩野義製薬株式会社
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a substituted polycyclic pyridone derivative and crystals thereof. Specifically, the present invention relates to a method for producing a substituted polycyclic pyridone derivative having cap-dependent endonuclease inhibitory activity and an intermediate thereof.
  • Example 3 of Patent Document 1 a method for producing a polycyclic pyridone derivative using a pyrone derivative and a pyridone derivative is described.
  • Examples 165 of Patent Documents 2 and 3 describe a method for producing a polycyclic pyridone derivative using a pyridone derivative.
  • Patent Documents 1 to 3 describe that optical purity decreases when a polycyclic pyridone derivative protected with a benzyl group is used in the step of coupling an optically active polycyclic pyridone derivative and a thiepine derivative. It has not been. On the other hand, there is no description or suggestion that when a coupling reaction is performed using a polycyclic pyridone derivative protected with a hexyl group, the coupling reaction proceeds with good yield without a decrease in optical purity.
  • the reaction in which the protecting group of the polycyclic pyridone derivative is exchanged from a protecting group other than an unsubstituted alkyl group to an unsubstituted alkyl group, the reaction can be carried out in the presence of a magnesium salt with a high yield and without a decrease in optical purity. There is no mention or suggestion of progression.
  • Example 21 of Patent Document 1 describes a step of coupling a polycyclic pyridone derivative protected with a benzyl group and a benzhydryl derivative. In this production method, there is no description or suggestion of the step of exchanging the protecting group of the polycyclic pyridone derivative.
  • Example 175 of Patent Document 2 a step of coupling a substituted tricyclic pyridone derivative and a benzhydryl derivative is described. In this production method, there is no description or suggestion of the step of exchanging the protecting group of the tricyclic pyridone derivative.
  • Examples 583 and 584 of Patent Document 2 describe a process of coupling a substituted tricyclic pyridone derivative and a thiepine derivative. In this production method, there is no description or suggestion about a step of exchanging the protecting group of the tricyclic pyridone derivative or a decrease in optical purity.
  • a compound represented by the formula (V) or (VI) has cap-dependent endonuclease inhibitory activity, and / or treatment of symptoms and / or diseases induced by infection with influenza virus and / or Useful as a preventive agent is described in PCT / JP2016 / 63139.
  • the object of the present invention is shown herein by substituted polycyclic pyridone derivatives having cap-dependent endonuclease inhibitory activity of formula (V) or (VI) and formula (II) or (IV). To provide a new and useful process for the preparation of such intermediates.
  • the present inventors have found that the optical purity of the optically active substituted cyclic pyridone derivative is lowered in the step of coupling the optically active substituted tricyclic pyridone derivative and the thiepine derivative.
  • R 3 is hydrogen, R 4 is hydrogen; The production method of the above-mentioned (6), wherein R 5 is fluorine and R 6 is fluorine.
  • the value of 2 ⁇ of powder X-ray diffraction is 7.1 ⁇ 0.2 °, 9.3 ⁇ 0.2 °, 12.6 ⁇ 0.2 °, 14.1 ⁇ 0.2 °, 17 .7 ⁇ 0.2 °, 18.7 ⁇ 0.2 °, 19.2 ⁇ 0.2 °, 22.2 ⁇ 0.2 °, 25.4 ⁇ 0.2 °, 27.7 ⁇ 0.
  • the polycyclic pyridone derivative represented by the formula (V) or (VI) can be efficiently produced with high optical purity.
  • FIG. It is a powder X-ray-diffraction data of compound (V). It is the result of having measured the plasma concentration transition of the compound (V) about the compound (VI) which made the compound (V) into the prodrug after oral administration to a rat under non-fasting. It is the result of having measured the plasma concentration transition of the compound shown by the compound (VI) after orally administering to a rat non-fasting about the compound shown by the compound (VI) which compounded the compound (V). .
  • Alkyl means straight-chain or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, and includes alkyl having 1 to 4 carbon atoms, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, and the like. For example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl and the like can be mentioned.
  • protecting groups other than unsubstituted alkyl in R 1 include benzyl.
  • Examples of the unsubstituted alkyl in R 2 include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl, and n- Propyl, isobutyl, hexyl and the like are preferable, and hexyl is particularly preferable.
  • the “protecting group other than unsubstituted alkyl” is not particularly limited as long as it is a protecting group other than the above “alkyl” that is deprotected in the presence of a sodium salt and / or magnesium salt.
  • a protecting group other than the above “alkyl” that is deprotected in the presence of a sodium salt and / or magnesium salt.
  • substituted alkyl etc. are mentioned, Preferably benzyl etc. are mentioned.
  • Sodium salt is not particularly limited as long as “protecting group other than alkyl” is deprotected. Examples thereof include sodium hydroxide, sodium hydride, sodium isopropyl oxide, sodium tert-pentoxide, isopropylmagnesium chloride and the like. Preferred examples include sodium tert-pentoxide, isopropylmagnesium chloride and the like, and isopropylmagnesium chloride is particularly preferred.
  • R 1 includes hydrogen or a protecting group other than unsubstituted alkyl.
  • R 1 includes hydrogen or a protecting group other than unsubstituted alkyl.
  • R 2 includes unsubstituted alkyl.
  • R 2 Preferred embodiments of R 2 include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl and the like.
  • Propyl, isobutyl, hexyl and the like are preferable, and hexyl is particularly preferable.
  • a preferred embodiment of the “sodium salt and / or magnesium salt” is preferably “magnesium salt”, more preferably isopropyl magnesium chloride, cyclohexyl magnesium chloride, and the like, and particularly preferably isopropyl magnesium chloride.
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 each independently include hydrogen or halogen, and the number of halogens in R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is 1 or 2.
  • a preferred embodiment of R 3 includes hydrogen.
  • a preferred embodiment of R 4 includes hydrogen.
  • a preferred embodiment of R 5 includes fluorine.
  • a preferred embodiment of R 6 includes fluorine.
  • “the number of halogens in R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is 1 or 2” means one or two of R 3 , R 4 , R 5 and R 6. Means one is halogen.
  • reacting a compound with a compound includes reacting a salt thereof or a solvate thereof.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound according to the present invention include a compound according to the present invention, an alkali metal (for example, lithium, sodium, potassium, etc.), an alkaline earth metal (for example, calcium, barium, etc.), Magnesium, transition metals (eg, zinc, iron, etc.), ammonia, organic bases (eg, trimethylamine, triethylamine, dicyclohexylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, meglumine, ethylenediamine, pyridine, picoline, quinoline, etc.) and amino acids Or inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, hydroiodic acid, etc.) and organic acids (eg, formic acid, acetic acid, propionic acid, trifluoroacetic acid, citric acid) Acid, lactic acid, tartaric acid, oxalic acid, maleic acid, Le
  • salts with hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, tartaric acid, methanesulfonic acid and the like can be mentioned. These salts can be formed by a commonly performed method.
  • alkali metal for example, lithium, sodium, potassium and the like
  • alkaline earth metal for example, calcium, barium and the like
  • magnesium transition metal
  • transition metal for example
  • zinc, iron, etc. are preferable, and alkali metals (for example, lithium, sodium, potassium, etc.) and alkaline earth metals (for example, calcium, barium, etc.) are more preferable.
  • the compound according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may form solvates (for example, hydrates and the like) and / or crystal polymorphs, and the present invention includes such various solvates. And crystalline polymorphs.
  • the “solvate” may be coordinated with an arbitrary number of solvent molecules (for example, water molecules) with respect to the compound according to the present invention.
  • solvent molecules for example, water molecules
  • the compound according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof When the compound according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is left in the air, it may absorb moisture and adsorbed water may adhere or form a hydrate. In some cases, the compound according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is recrystallized to form a crystal polymorph.
  • crystal means a substance having an ordered long range of molecular structure.
  • the crystallinity of the crystalline form can be measured by a number of techniques including, for example, powder X-ray diffraction, moisture adsorption, differential, calorimetric analysis, solution colorimetry, and dissolution characteristics.
  • a crystalline organic compound is composed of a large number of atoms periodically arranged in a three-dimensional space.
  • Structural periodicity typically develops physical properties that are clearly distinguishable by most spectroscopic probes (eg, X-ray diffraction, infrared spectra, Raman spectra, and solid state NMR).
  • spectroscopic probes eg, X-ray diffraction, infrared spectra, Raman spectra, and solid state NMR.
  • powder X-ray diffraction XRPD is one of the most sensitive analytical methods for measuring the crystallinity of solids.
  • Amorphous solids typically exhibit a broad XRPD pattern, called a halo pattern, due to the absence of a wide range of repeating crystal lattices.
  • each crystal body can be identified and distinguished from other crystal bodies by the presence of a characteristic diffraction peak.
  • a characteristic diffraction peak as used herein is a peak selected from the observed diffraction pattern.
  • the characteristic peaks are selected from about 20 in the diffraction pattern, more preferably about 10 and most preferably about 5.
  • the relative intensities of the peaks shown in the tables and figures below can vary depending on a number of factors, such as the crystal orientation effect on the x-ray beam, the purity of the material being analyzed or the crystallinity of the sample. It has been.
  • the peak position can also be shifted based on the variation in sample height.
  • the crystal of the present invention can also be specified by a thermal analysis technique.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • DSC is one of the main measurement methods of thermal analysis, and is a method of measuring the thermal properties of a substance as an aggregate of atoms and molecules.
  • DSC measures the change in calorie with temperature or time of the pharmaceutically active ingredient and plots the obtained data against temperature or time to obtain a differential scanning calorie curve. From the differential scanning calorimetry curve, it is possible to obtain information on the onset temperature when the pharmaceutically active ingredient melts, the maximum value of the endothermic peak curve accompanying melting, and the enthalpy.
  • Method for producing the compound of the present invention A general method for producing the compound of the present invention is illustrated below. Extraction, purification, and the like may be performed in a normal organic chemistry experiment. The synthesis of the compound of the present invention can be carried out in consideration of techniques known in the art.
  • the raw material compounds commercially available compounds, those described in the present specification, those described in the literature cited in the present specification, and other known compounds can be used.
  • a salt of the compound of the present invention if the compound of the present invention is obtained in the form of a salt, it can be purified as it is, and if it is obtained in a free form, it can be dissolved in an appropriate organic solvent. Alternatively, it may be suspended and an acid or base is added to form a salt by an ordinary method.
  • the compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof may exist in the form of adducts (hydrates or solvates) with water or various solvents, and these adducts are also included in the present invention. Is included.
  • the production method of the present invention can be carried out as follows, for example.
  • First step (Wherein R 1 is hydrogen or a protecting group other than unsubstituted alkyl, and R 2 is unsubstituted alkyl.)
  • This is a step of obtaining a compound represented by the formula (II) by reacting a compound represented by the formula (I) with an alcohol represented by the formula: R 2 —OH in the presence of a sodium salt and / or a magnesium salt.
  • the solvent is not particularly limited as long as it allows the above process to proceed efficiently. Examples include dichloromethane, toluene, tetrahydrofuran, and the like, and the reaction can be performed alone or in combination or without solvent.
  • tetrahydrofuran is used.
  • the sodium salt and / or magnesium salt include sodium hydroxide, sodium hydride, sodium isopropoxide, sodium tert-pentoxide, isopropylmagnesium chloride, cyclohexylmagnesium chloride and the like.
  • isopropyl magnesium chloride is used.
  • the reaction may be performed using 0.1 mole equivalent to 5 mole equivalent, preferably 0.3 mole equivalent to 0.5 mole equivalent, relative to Compound (I).
  • the reaction temperature is not particularly limited, it can be generally performed at about 0 to 100 ° C., preferably 0 ° C. to room temperature.
  • the reaction time is not particularly limited but is usually 0.5 to 24 hours, preferably 1 to 10 hours.
  • Second step (Wherein R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen or halogen, and the number of halogens in R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is 1 or 2) Other symbols have the same meaning as above.)
  • a compound represented by formula (IV) is obtained by reacting a compound represented by formula (II ′) with a compound represented by formula (III) in the presence of a condensing agent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it allows the above process to proceed efficiently.
  • Examples include ethyl acetate, cyclohexane, isopropyl acetate, propyl acetate, toluene, 1,4-dioxane, DMA, DMF, toluene, heptane, cyclopentyl methyl ether, and the like. These can be used alone or in combination. Preferably, a mixed solvent of ethyl acetate and cyclohexane is used.
  • the condensing agent examples include propylphosphonic anhydride, methanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, p-toluenesulfonic acid monohydrate, 10-camphorsulfonic acid, concentrated sulfuric acid, dichloroacetic acid, and tetramethylammonium hydrogen sulfate. Can be used alone or in combination. Preferably, a mixture of propylphosphonic anhydride and methanesulfonic acid is used.
  • the reaction may be performed using 1 molar equivalent to 5 molar equivalents, preferably 1 molar equivalent to 3 molar equivalents, relative to compound (II ′).
  • the reaction temperature is not particularly limited, it can be generally performed at about 0 to 100 ° C., preferably 0 ° C. to room temperature.
  • the reaction time is not particularly limited but is usually 0.5 to 24 hours, preferably 1 to 10 hours.
  • the solvent is not particularly limited as long as it allows the above process to proceed efficiently.
  • N-methylpyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
  • N-methylpyrrolidone is used.
  • the metal salt include lithium chloride and lithium bromide.
  • lithium chloride is used.
  • the reaction may be performed using 1 molar equivalent to 20 molar equivalents, preferably 5 molar equivalents to 10 molar equivalents, relative to compound (IV).
  • the reaction temperature is not particularly limited, it can be generally carried out at about 0 to 100 ° C., preferably room temperature to 100 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, but is usually 0.5 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • Compound (V ′ ′′) can be obtained by a general method for converting the hydroxyl group of compound (IV ′′) to an ester group or an ether group.
  • a general method for converting the hydroxyl group of compound (IV ′′) to an ester group or an ether group For example, the methods described in Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons), Prog. Med. 5: 2157-2161 (1985), and Supply by The British Library-“The world's Knowledge” can do.
  • the “diastereomer ratio” indicates, for example, the HPLC area percentage ratio of the two stereoisomers shown below in the case of a compound represented by the following formula.
  • the compound of formula (V) is useful for symptoms and / or diseases induced by influenza virus. For example, cold-like symptoms with fever, chills, headache, muscle pain, general malaise, airway inflammation such as sore throat, nasal discharge, nasal congestion, cough, sputum, gastrointestinal symptoms such as abdominal pain, vomiting, diarrhea, It is effective for treating and / or preventing complications associated with secondary infections such as acute encephalopathy and pneumonia and improving symptoms.
  • the compound represented by the formula (VI) has advantages such as high oral absorption, good bioavailability, good clearance, and high pulmonary migration.
  • the compound represented by the formula (V) has effects such as high inhibitory activity against cap structure-dependent endonuclease, which is a virus-specific enzyme, and high selectivity, it can be a pharmaceutical with reduced side effects. Furthermore, the compound represented by the formula (V) and / or the compound represented by the formula (VI) has high metabolic stability, high solubility, high oral absorption, good bioavailability, and good clearance. High lung migration, long half-life, high non-protein binding rate, low hERG channel inhibition, low CYP inhibition, CPE (Cytopathic Effect) cytopathic effect, and / or It also has advantages such as being negative in the phototoxicity test, Ames test, and genotoxicity test, or having no toxicity such as liver damage. Therefore, the compound represented by the formula (V) and / or the compound represented by the formula (VI) can be an excellent pharmaceutical product.
  • the compound represented by the formula (V) and / or the compound represented by the formula (VI) can be administered orally or parenterally.
  • the compound represented by the formula (V) and / or the compound represented by the formula (VI) is a usual preparation, for example, a solid agent such as a tablet, powder, granule or capsule; It can also be used as any dosage form of a suspension; or a liquid such as a syrup or elixir.
  • parenteral administration the compound represented by the formula (V) and / or the compound represented by the formula (VI) can be used as an aqueous or oily suspension injection or nasal solution.
  • a pharmaceutical composition containing a compound represented by formula (V) and / or a compound represented by formula (VI) is a therapeutically effective amount of a compound represented by formula (V) and / or a compound represented by formula (VI).
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent e.g., a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the dose of the compound represented by the formula (V) and / or the compound represented by the formula (VI) varies depending on the administration method, the patient's age, body weight, condition, and type of the disease.
  • About 0.05 mg to 3000 mg, preferably about 0.1 mg to 1000 mg per day for an adult may be administered in divided portions if necessary. In the case of parenteral administration, about 0.01 mg to 1000 mg, preferably about 0.05 mg to 500 mg is administered per day for an adult.
  • the present invention includes not only a crystal in which the diffraction angle of the peak in powder X-ray diffraction completely coincides but also a crystal in which the diffraction angle of the peak coincides with an error of about ⁇ 0.2 °.
  • TG / DTA Measurement of TG / DTA TG / DTA of the crystals obtained in each example was measured. A sample was weighed on an aluminum pan and measured in an open system. The measurement conditions are shown below. Equipment: TG / DTA7200 manufactured by Hitachi High-Tech Science Co., Ltd. Measurement temperature range: 30 °C -250 °C Temperature rising rate: 10 ° C./min Generally, measurement by TG / DTA may cause an error within a range of ⁇ 2 ° C. Therefore, the measured value by TG / DTA includes a numerical value within a range of about ⁇ 2 ° C.
  • Moisture absorption / desorption isotherm measurement The moisture adsorption / desorption isotherm of the crystal obtained in each example was measured. A sample was weighed and measured in a sample pan. The measurement conditions are shown below. Apparatus: Surface Measurement Systems Ltd. DVS Advantage Measurement points: from 0% RH to 95% RH every 5%. Then from 95% RH to 0% RH every 5%: 25 ° C or 60 ° C
  • DSC Differential Scanning Calorimetry
  • Example 1 Production Method of Compound 3 Step 1 Production Method of Compound 3 DMA (300 mL) was added to Compound 1 (100.00 g, 406 mmol) and stirred.
  • Sodium hydrogen carbonate (44.41 g, 529 mmol), dimethyl sulfate (58.91 g, 467 mmol) and DMA (100 mL) were added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 7 hours.
  • Synthetic hydrochloric acid (16.90 g) and water (500 g) were added to the reaction mixture, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate (1000, 550 mL). The organic layer was washed with 5% brine (300 g) and water (300 g).
  • the solvent was distilled off to a liquid weight of about 500 g by concentration under reduced pressure. Furthermore, ethyl acetate (350 mL) was added to the concentrated solution, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 500 g by concentration under reduced pressure. DMA (300 mL) was added to the concentrated liquid, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 400 g by concentration under reduced pressure. After adding pyridine p-toluenesulfonic acid (265.42 g) and DMA (100 mL) to the concentrate, the temperature of the reaction solution was raised to 60 ° C.
  • Step 2 Production Method of Compound 8 Ethanol (20 mL) and water (20 mL) were added to Compound 6 (20.02 g, 71.68 mmol) and stirred. The reaction was warmed to 60 ° C. A 60% hydrazine monohydrate aqueous solution (8.99 g, 107.7 mmol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 4 hours. Water (40 mL) was added to the reaction solution, cooled to 30 ° C., and 17% aqueous potassium hydroxide solution (92.12 g) was added. The reaction solution was extracted four times with methylene chloride (120, 78, 78, 78 mL).
  • the organic layer was washed with water (20 mL), and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 160 g by concentration under reduced pressure.
  • THF 100 mL was added to the concentrate, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 40 g by concentration under reduced pressure.
  • THF 100 mL was added to the concentrate, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 40 g by concentration under reduced pressure.
  • THF (20 mL) was added to the concentrate, and 15 g of a THF solution of compound 7 was obtained by concentration under reduced pressure.
  • Step 3 Production Method of Compound 9
  • Acetonitrile (170 mL) and water (30 mL) were added to Compound 8 (19.99 g, 40.7 mmol) and stirred.
  • the temperature of the reaction solution was raised to 60 ° C., and methanesulfonic acid (11.70 g, 121.7 mmol) was slowly added.
  • the reaction solution was stirred at 60 ° C. for 6 hours and then cooled to 25 ° C.
  • a 30% aqueous sodium hydroxide solution (15.91 g) was added to the reaction mixture, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 100 g by concentration under reduced pressure.
  • Step 2 Production Method of Compounds 13 and 9
  • ethyl acetate (120 mL) and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene 530 mg, 3.5 mmol
  • the temperature of the reaction solution was raised to 30 ° C., and a mixed solution of methanol (1.67 g) and ethyl acetate (43 mL) was slowly added.
  • the reaction solution was stirred at room temperature for 1 hour, and the resulting white precipitate was collected by filtration.
  • the obtained crystals were washed with ethyl acetate (60 mL) and dried to obtain white crystals of compound 13 (11.06 g, yield 45%).
  • the concentrated solution was heated to 60 ° C., and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (19.01 g, 124.9 mmol) was added.
  • the reaction was stirred at 60 ° C. for 3.5 hours and cooled to 40 ° C.
  • To the reaction solution was added 5.8% aqueous hydrochloric acid (50.40 g), and the mixture was cooled to 25 ° C. to obtain a solution of 314.96 g
  • a part of the solution (158.86 g) was concentrated under reduced pressure, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 85 g.
  • the concentrated solution was stirred at 20 ° C. for 2 hours, and then water (28 mL) was added.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the solvent was distilled off to a liquid weight of about 100 g.
  • the concentrated solution was stirred at 20 ° C. for 1 hour, and the precipitated pale yellowish white crystals were collected by filtration.
  • the obtained crystals were washed with water (42 mL) and dried to give Compound 9 (5.93 g, yield 42%) as pale yellowish white crystals.
  • Step 2 Production method of compound 16 Toluene (17.8 mL), thiophenol (3.90 g, 35.4 mmol) and D-camphorsulfonic acid (1.16 g, 5.0 mmol) were added to the toluene solution of compound 15 obtained above and stirred. The temperature was raised to 60 ° C. The reaction was stirred at 60 ° C. for 4 hours and then cooled to 5 ° C. A 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution (10 mL) was added to the reaction solution, and the temperature was raised to 25 ° C.
  • reaction solution was extracted with toluene (10 mL), and the obtained organic layer was washed with 2 mol / L sodium hydroxide aqueous solution (5 mL) and water (10 mL). After concentration under reduced pressure, toluene was added to obtain a toluene solution of compound 16.
  • Step 3 Method for Producing Compound 17
  • Toluene 25 mL was added to aluminum chloride (5.52 g, 41.4 mmol), and the mixture was stirred and cooled to 0 ° C.
  • a toluene (10 mL) solution of 1,1,3,3-tetramethyldisiloxane (5.56 g, 41.4 mmol) was added dropwise to the reaction solution, and the temperature was raised to 25 ° C.
  • the toluene solution of compound 16 obtained above was slowly added to the reaction solution, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2.5 hours.
  • 15% aqueous sulfuric acid 35 mL was added and stirred, and then separated into an organic layer and an aqueous layer.
  • the obtained organic layer was washed twice with water (20 mL). The solvent was distilled off to a liquid weight of about 16 g by concentration under reduced pressure. Heptane (40 mL) was slowly added to the concentrate, and after cooling to 0 ° C., the resulting white precipitate was collected by filtration. The obtained solid was washed with heptane (20 mL) and then dried to obtain Compound 17 (7.20 g, yield 81.3%) as a white solid.
  • Step 4 Production Method of Compound 18 Polyphosphoric acid (425.0 g) was heated to 80 ° C. and stirred. Compound 17 (85.0g) was added there, and it heated up to 120 degreeC, and the reaction liquid was stirred at 120 degreeC for 3 hours. The reaction was cooled to 80 ° C. and water (200 mL) was added slowly. The reaction mixture was cooled to 30 ° C., water (850 mL) was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate (850 mL). The organic layer was washed with water (425 mL) and 10% aqueous sodium bicarbonate solution (255 mL).
  • Step 5 Method for Producing Compound 19
  • Sodium borohydride (234.0 mg, 6.2 mmol) was suspended in 0.5% aqueous sodium hydroxide solution (1.8 mL) to prepare a sodium borohydride suspension.
  • 2-propanol (20 mL) and water (2.25 mL) were added and stirred, and the temperature was raised to 40 ° C.
  • the sodium borohydride suspension prepared above was slowly added to the reaction solution. The reaction was stirred at 40 ° C. for 1.5 hours and cooled to 25 ° C. Water (32 mL) was added to the reaction mixture, and a mixture of water (6.7 mL) and 62% aqueous sulfuric acid (460 mg) was further added.
  • Example 5 Production Method of Compound (V) and Compound (VI) Step 1-1 Production Method of Compound 20
  • 1-Hexanol (22.5 g, 220 mmol) and THF (24.6 g) were mixed and the temperature was adjusted to 20 ° C.
  • a THF solution of isopropylmagnesium chloride (2 mol / L, 7.2 g, 14.7 mmol) was added to the mixture to prepare a magnesium hexoxide solution.
  • 1-Hexanol (22.5 g, 220 mmol) was added to compound 13 (12.0 g, 36.7 mmol) and stirred, and the temperature was adjusted to 20 ° C.
  • the magnesium hexoxide solution prepared above was added to the obtained slurry.
  • the reaction solution was stirred at 20 ° C.
  • Step 1-2 Production Method of Compound 20
  • the reaction was carried out using a THF solution (16.2 wt%, 0.4 eq) of cyclohexyl magnesium chloride instead of the THF solution (0.4 eq) of isopropyl magnesium chloride.
  • Step 1-3 Production Method of Compound 20
  • 1-Hexanol (27.5 g, 270 mmol) was added to compound 13 (4.91 g, 15.0 mmol) and stirred, and the temperature was adjusted to 0 ° C.
  • To the resulting slurry was added sodium tert-pentoxide in THF (1.4 mol / L, 45.0 mmol). After stirring the reaction solution at 0 ° C. for 2.5 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and the yield of Compound 20 was measured.
  • Step 2 Method for producing mesylate salt of compound 21
  • Compound 19 (8.0 g, 30.3 mmol), ethyl acetate (48.7 g) and cyclohexane (14.1 g) were added to compound 20 (12.0 g, 24.3 mmol) and stirred at 25 ° C. did. 50 (w / w)% T3P ethyl acetate solution (20.91 g, 32.9 mmol) was added, followed by methanesulfonic acid (3.5 g, 36.4 mmol). The temperature was raised to 60 ° C. and stirred for 24 hours. After cooling to 25 ° C., THF (32.0 g) and water (24.0 g) were added.
  • a 24% aqueous sodium hydroxide solution (30.8 g) was slowly added, and after standing, the organic layer and the aqueous layer were separated. The organic layer was washed twice with 7% brine (60.0 g). To the obtained solution was added a mixed solution of cyclohexane (9.3 g), ethyl acetate (32.1 g) and methanesulfonic acid (2.80 g, 29.1 mmol). The mixture was stirred at 25 ° C. for 2 hours, and the resulting white precipitate was collected by filtration.
  • Step 3 Production Method of Compound (V) N-methylpyrrolidone (52.4 g) was added to compound 21 (15.0 g, 22.6 mmol) and stirred. Lithium chloride (8.6 g, 203.3 mmol) was added, and the temperature was raised to 75 ° C. The mixture was stirred at 75 ° C for 20 hours and then cooled to 40 ° C. Acetonitrile (20.0 g) was added, and water (11.6 g) was further added. After cooling to 30 ° C. and stirring for 30 minutes, water (142.5 g) was added slowly. After stirring for 1 hour and a half at 30 ° C., the resulting white precipitate was collected by filtration.
  • Step 4 Production Method of Compound (VI) To a suspension of compound (V) (1.00 g, 2.07 mmol) in DMA (5 ml) was added chloromethyl methyl carbonate (0.483 g, 3.10 mmol) and potassium carbonate. (0.572 g, 4.14 mmol) and potassium iodide (0.343 g, 2.07 mmol) were added, and the mixture was heated to 50 ° C. and stirred for 6 hours. Furthermore, DMA (1 ml) was added to the reaction solution and stirred for 6 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature, DMA (6 ml) was added, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 5 min and filtered.
  • Example 6 Production method of compounds 33 to 41 and diastereomeric ratio thereof Step 1 Production Method of Compounds 24 to 32 Compounds 24 to 32 were synthesized according to Steps 1-1, 1-2, 1-3 of Example 5 and conventional methods.
  • Step 2 Production Method of Compounds 33 to 41 According to Step 2 of Example 5 above, Compounds 24 to 32 and Compound 19 were reacted, the reaction solution was analyzed by HPLC, and the diastereomeric ratio of Compounds 33 to 41 was measured.
  • Compound 33a Retention time 6.4 min / Compound 33b: Retention time 6.7 min
  • Compound 34a Retention time 8.9 min / Compound 34b: Retention time 9.3 min
  • Compound 35a Retention time 9.8 min / Compound 35b: Retention time 10.1 min
  • Compound 37a Retention time 12.5 min /
  • Compound 37b Retention time 12.8 min
  • Compound 38a Retention time 13.4 min / Compound 38b: Retention time 13.8 min
  • Compound 39a Retention time 8.7 min / Compound 39b: Retention time 9.0 min
  • Compound 40a Retention time 9.9 min / Com
  • Test Example 1 Measurement of cap-dependent endonuclease (CEN) inhibitory activity 1) Preparation of substrate The 5′-terminal G was modified by phosphorylation, and the 2′-position hydroxyl group was modified by methoxylation. 30mer RNA (5'-pp- [m2'-O] GAA UAU (-Cy3) GCA UCA CUA GUA AGC UUU GCU CUA-BHQ2-3 ': U3 with Cy3 labeling and 3' end with BHQ2 labeling: Nippon Bioservice And the cap structure was added using the ScriptCap system manufactured by EPICENTRE (product is m7G [5 ']-ppp- [5'] [m2'-O] GAA UAU (-Cy3 ) GCA UCA CUA GUA AGC UUU GCU CUA (-BHQ2) -3 ').
  • RNP was prepared from virus particles according to a conventional method (reference: VIROLOGY (1976) 73, p327-338 OLGA M. ROCHOVANSKY). Specifically, A / WSN / 33 virus 1 ⁇ 10 3 PFU / mL, 200 ⁇ L was inoculated into 10-day-old chicken eggs and cultured at 37 ° C. for 2 days.
  • the virus particles were purified by ultracentrifugation using 20% sucrose, solubilized using TritonX-100 and lysolecithin, and then the RNP fraction (50% by ultracentrifugation using a 30-70% glycerol density gradient). ⁇ 70% glycerol fraction) was collected and used as an enzyme solution (containing approximately 1 nM PB1, PB2, PA complex).
  • Enzyme reaction solution (composition: 53 mM Tris-hydrochloride (pH 7.8), 1 mM MgCl 2 , 1.25 mM dithiothreitol, 80 mM NaCl, 12.5% glycerol, enzyme solution 0.15 ⁇ L on polypropylene 384-well plate ) was dispensed in 2.5 ⁇ L. Next, 0.5 ⁇ L of DMSO was added to the test compound solution 0.5 ⁇ L diluted stepwise with dimethyl sulfoxide (DMSO), the positive control (PC) and the negative control (NC) and mixed well.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • PC positive control
  • NC negative control
  • Test Example 2 CPE inhibitory effect confirmation test ⁇ Material> ⁇ 2% FCS E-MEM (adjusted by adding kanamycin and FCS to MEM (Minimum Essential Medium) (Invitrogen)) ⁇ 0.5% BSA E-MEM (adjusted by adding kanamycin and BSA to MEM (Minimum Essential Medium) (Invitrogen)) ⁇ HBSS (hanks' Balanced Salt Solution) MDBK cells The cell number was adjusted to an appropriate number (3 ⁇ 10 5 / mL) with 2% FCS E-MEM. MDCK cells After washing twice with HBSS, it was adjusted to an appropriate cell number (5 ⁇ 10 5 / mL) with 0.5% BSA E-MEM.
  • ⁇ Operation procedure> As the test sample dilution and dispensing culture, 2% FCS E-MEM was used when MDBK cells were used, and 0.5% BSA E-MEM was used when MDCK cells were used.
  • the same culture solution was used for dilution of virus, cells, and test samples.
  • a test sample was diluted in advance to an appropriate concentration with a culture solution, and a 2- to 5-fold serial dilution series was prepared in a 96-well plate (50 ⁇ L / well). Two sheets for anti-Flu activity measurement and cytotoxicity measurement were prepared. Triplicate measurements were performed for each drug.
  • Trypsin was added to the cells to a final concentration of 3 ug / mL only for anti-Flu activity measurement.
  • -Influenza virus dilution and dispensing In advance, influenza virus was diluted to an appropriate concentration with a culture solution, and dispensed into a 96-well plate containing a test sample at 50 ⁇ L / well. The culture solution was dispensed at 50 ⁇ L / well on the cytotoxicity measurement plate.
  • -Cell dilution and dispensing Cells adjusted to an appropriate number of cells were dispensed at 100 ⁇ L / well into 96-well plates containing test samples. The mixture was mixed with a plate mixer and cultured in a CO 2 incubator.
  • Both for anti-Flu activity measurement and cytotoxicity measurement were cultured for 3 days.
  • ⁇ Dispensing of WST-8 The 96-well plate cultured for 3 days was observed with the naked eye and under a microscope to confirm the morphology of the cells and the presence or absence of crystals. The supernatant was removed so as not to suck cells from the plate.
  • WST-8 Kit was diluted 10-fold with the culture solution, and 100 ⁇ L of this WST-8 solution was dispensed into each well. After mixing with a plate mixer, the cells were cultured for 1 to 3 hours in a CO 2 incubator.
  • 10 uL of 10% SDS solution was dispensed into each well after culturing to inactivate the virus.
  • -Measurement of absorbance The absorbance of the mixed 96-well plate was measured with EnVision at two wavelengths of 450 nm / 620 nm.
  • Test Example 1 CEN IC50
  • Test Example 2 CPE EC50
  • CEN cap-dependent endonuclease
  • Test Example 3 CYP Inhibition Test O-deethylation of 7-ethoxyresorufin as a typical substrate metabolic reaction of human major CYP5 molecular species (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4) using commercially available pooled human liver microsomes (CYP1A2), methyl-hydroxylation of tolbutamide (CYP2C9), 4′-hydroxylation of mephenytoin (CYP2C19), O-demethylation of dextromethorphan (CYP2D6), and hydroxylation of terfenadine (CYP3A4), respectively.
  • the degree to which the amount of metabolite produced was inhibited by the compound (V) was evaluated.
  • reaction conditions were as follows: substrate, 0.5 ⁇ mol / L ethoxyresorufin (CYP1A2), 100 ⁇ mol / L tolbutamide (CYP2C9), 50 ⁇ mol / L S-mephenytoin (CYP2C19), 5 ⁇ mol / L dextromethorphan (CYP2D6), 1 ⁇ mol / L terfenadine (CYP3A4); reaction time, 15 minutes; reaction temperature, 37 ° C .; enzyme, pooled human liver microsome 0.2 mg protein / mL; compound concentration of compound (V) 1, 5, 10, 20 ⁇ mol / L ( 4 points).
  • each of 5 types of substrates, human liver microsomes and compound (V) is added to 50 mmol / L Hepes buffer in the above composition, and NADPH as a coenzyme is added to serve as an indicator.
  • resorufin CYP1A2 metabolite
  • CYP1A2 metabolite resorufin in the centrifugation supernatant was quantified with a fluorescent multi-label counter
  • tolbutamide hydroxide CYP2C9 metabolite
  • mephenytoin 4 ′ hydroxide CYP2C19 metabolite
  • Dextrorphan CYP2D6 metabolite
  • terfenadine alcohol CYP3A4 metabolite
  • Intravenous administration was carried out from the tail vein using a syringe with an injection needle.
  • the bioavailability (BA) of the compound represented by the formulas (V) and (VI) was calculated from the AUC of the oral administration group and the intravenous administration group.
  • the prodrug has improved bioavailability compared to the parent compound. Therefore, the compound represented by the formula (VI) is excellent in oral absorption, and can be a medicament useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for symptoms and / or diseases induced by infection with influenza virus.
  • Test Example 5 Metabolic stability test A commercially available pooled human liver microsome and compound (V) are reacted for a certain period of time, and the residual ratio is calculated by comparing the reaction sample with the unreacted sample, and the degree to which compound (V) is metabolized in the liver Evaluated.
  • the compound (V) in the centrifugal supernatant was quantified by LC / MS / MS, and the remaining amount of the compound (V) after the reaction was calculated with the compound amount at 0 minute reaction as 100%.
  • the hydrolysis reaction was carried out in the absence of NADPH, and the glucuronic acid conjugation reaction was carried out in the presence of 5 mmol / L UDP-glucuronic acid instead of NADPH. Thereafter, the same operation was carried out.
  • the residual rate in oxidative metabolism at a compound concentration of 2 ⁇ mol / L is shown.
  • CYP3A4 Fluorescence MBI Test is a test for examining the enhancement of CYP3A4 inhibition of compound (V) by metabolic reaction.
  • 7-Benzyloxytrifluoromethylcoumarin (7-BFC) is debenzylated by the CYP3A4 enzyme (E. coli expression enzyme) to produce a fluorescent metabolite 7-hydroxytrifluoromethylcoumarin (7-HFC).
  • CYP3A4 inhibition was evaluated using 7-HFC production reaction as an index.
  • reaction conditions are as follows: substrate, 5.6 ⁇ mol / L 7-BFC; pre-reaction time, 0 or 30 minutes; reaction time, 15 minutes; reaction temperature, 25 ° C. (room temperature); CYP3A4 content (E. coli expression enzyme), Pre-reaction 62.5 pmol / mL, reaction 6.25 pmol / mL (10-fold dilution); compound concentration of compound (V), 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ⁇ mol / L (6 points).
  • NADPH is also added to the remaining pre-reaction solution to start the pre-reaction (pre-reaction is present), and after pre-reaction for a predetermined time, one plate is diluted to 1/10 with the substrate and K-Pi buffer.
  • a control (100%) was obtained by adding only DMSO, which is a solvent in which compound (V) was dissolved, to the reaction system, and the residual activity (%) when compound (V) was added at each concentration was calculated.
  • IC 50 was calculated by inverse estimation using a logistic model using the inhibition rate. The case where the difference in IC 50 values was 5 ⁇ mol / L or more was designated as (+), and the case where it was 3 ⁇ mol / L or less was designated as ( ⁇ ). (result) Compound (V): ( ⁇ )
  • Test Example 7 Fluctuation Ames Test The mutagenicity of compound (V) was evaluated. Twenty microliters of Salmonella typhimurium TA98, TA100) cryopreserved was inoculated into 10 mL liquid nutrient medium (2.5% Oxoid nutritive broth No. 2) and cultured at 37 ° C. for 10 hours before shaking. For the TA98 strain, 9 mL of the bacterial solution was centrifuged (2000 ⁇ g, 10 minutes) to remove the culture solution.
  • Micro F buffer K 2 HPO 4 : 3.5 g / L, KH 2 PO 4 : 1 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 : 1 g / L, trisodium citrate dihydrate: 0.
  • MicroF containing 110 mL Exposure medium Biotin: 8 ⁇ g / mL, Histidine: 0.2 ⁇ g / mL, Glucose: 8 mg / mL) suspended in 25 g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 0: 0.1 g / L) Buffer).
  • the TA100 strain was added to 120 mL of Exposure medium with respect to the 3.16 mL bacterial solution to prepare a test bacterial solution.
  • DMSO solution of compound (V) maximal dose 50 mg / mL to several-fold dilution at 2-3 times common ratio
  • DMSO as negative control
  • 50 ⁇ g / mL for TA98 strain under non-metabolic activation conditions as positive control
  • 4-Nitroquinoline-1-oxide DMSO solution 0.25 ⁇ g / mL 2- (2-furyl) -3- (5-nitro-2-furyl) acrylamide DMSO solution for TA100 strain, metabolic activation conditions
  • TA98 strain 40 ⁇ g / mL 2-aminoanthracene DMSO solution and for TA100 strain, 20 ⁇ g / mL 2-aminoanthracene DMSO solution, respectively, 12 ⁇ L and test bacterial solution 588 ⁇ L (under metabolic activation conditions, test bacterial solution 498 ⁇ L) And S9 mix (90 ⁇ L of mixed solution) were mixed, followed by shaking culture at 37 ° C.
  • the indicator medium (MicroF buffer containing biotin: 8 ⁇ g / mL, histidine: 0.2 ⁇ g / mL, glucose: 8 mg / mL, bromocresol purple: 37.5 ⁇ g / mL).
  • the mixture was mixed with 2300 ⁇ L, dispensed into a microplate in a volume of 50 ⁇ L (48 wells / dose), and statically cultured at 37 ° C. for 3 days.
  • Test Example 8 hERG Test
  • HEK293 cells expressing human ether-a-go-related gene (hERG) channels were used in the ventricular repolarization process.
  • I Kr delayed rectifier K + current
  • Test Example 9 Solubility test The solubility of the compound (V) was determined under the condition of addition of 1% DMSO. Prepare a 10 mmol / L compound solution in DMSO, and add 2 ⁇ L of the compound (V) solution to JP-1 solution (2.0 g of sodium chloride and 7.0 mL of hydrochloric acid to make 1000 mL), JP-2 solution (1 volume of water is added to 1 volume of a solution obtained by dissolving 3.40 g of potassium dihydrogen phosphate and 3.55 g of anhydrous disodium hydrogen phosphate in water to 1000 mL) and adding to 198 ⁇ L. After shaking at room temperature for 1 hour, the mixture was filtered.
  • JP-1 solution 2.0 g of sodium chloride and 7.0 mL of hydrochloric acid to make 1000 mL
  • JP-2 solution (1 volume of water is added to 1 volume of a solution obtained by dissolving 3.40 g of potassium dihydrogen phosphate and 3.55 g of anhydrous disodium
  • Test Example 10 Powder solubility test An appropriate amount of compound (V) was placed in an appropriate container, and JP-1 solution (2.0 g of sodium chloride, water added to 7.0 mL of hydrochloric acid to make 1000 mL) was added to each container. JP-2 Solution (500 mL of pH 6.8 phosphate buffer was added with 500 mL of water), 20 mmol / L sodium taurocholate (TCA) / JP-2 solution (JP-2 solution was added to 1.08 g of TCA to make 100 mL). 200 ⁇ L each was added. When the entire amount was dissolved after the addition of the test solution, the compound (V) was appropriately added. The mixture was sealed and shaken at 37 ° C.
  • JP-1 solution 2.0 g of sodium chloride, water added to 7.0 mL of hydrochloric acid to make 1000 mL
  • JP-2 Solution 500 mL of pH 6.8 phosphate buffer was added with 500 mL of water
  • Test Example 11 Ames Test Ames test was performed using Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 and Escherichia coli WP2uvrA as test strains under non-metabolic activation conditions and metabolic activation conditions by the preincubation method. It was carried out and the presence or absence of gene mutagenicity of the compound according to compound (V) was examined. (result) Compound (V): ( ⁇ )
  • Test Example 12 Photohemolysis test Compound (V) was dissolved at a desired concentration, and 0.1 to 0.0008% concentration of erythrocyte suspension (2.5 v / v%) prepared from sheep defibrinated blood on a microplate. And UV irradiation (10 J / cm 2 , 290 to 400 nm) in the UVA and UVB regions using an ultraviolet fluorescent lamp (GL20SE lamp, Sankyo Electric and FL20S-BLB lamp, Panasonic). The mixed solution after light irradiation was collected and centrifuged. The supernatant after centrifugation was collected and transferred to a microplate, and then the absorbance (540 or 630 nm) of the supernatant was measured and a determination was made based on the absorbance.
  • FIGS. 7 and 8 show the changes in plasma concentrations of compound (V) and compound (VI) after oral administration to rats in a non-fasted state for compound (VI) obtained by prodrugizing compound (V). Results are shown. In addition, since the concentration of compound (VI) in the whole plasma sample was not more than the lower limit of quantification, compound (VI), which is a prodrug of compound (V), was rapidly obtained in vivo after administration. (See FIG. 8).
  • the prodrug compound was absorbed into the body after oral administration and quickly converted into the parent compound in blood. Therefore, the compound represented by the formula (V) or (VI) can be a medicament useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for symptoms and / or diseases induced by infection with influenza virus.
  • the compound and the production method according to the present invention are useful as an intermediate for producing a compound useful as a therapeutic and / or preventive agent for symptoms and / or diseases induced by infection with influenza virus.
  • the compound represented by the formula (V) and the compound represented by (VI) can be produced efficiently.

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Abstract

置換された多環性ピリドン誘導体の製造方法を提供する。 式（Ｉ）：（式中、Ｒ１は水素、または非置換アルキル以外の保護基である。）で示される化合物を、ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩存在下、 式：Ｒ２－ＯＨ （式中、Ｒ２は非置換アルキルである。）で示される化合物と反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：（式中、Ｒ２は上記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。

Description

置換された多環性ピリドン誘導体の製造方法およびその結晶
　本発明は、置換された多環性ピリドン誘導体の製造方法およびその結晶に関する。詳しくは、キャップ依存的エンドヌクレアーゼ阻害活性を有する置換された多環性ピリドン誘導体およびその中間体の製造方法に関する。
　特許文献１の実施例３には、ピロン誘導体およびピリドン誘導体を用いた多環性ピリドン誘導体の製造方法が記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　特許文献２および３の実施例１６５には、ピリドン誘導体を用いた多環性ピリドン誘導体の製造方法が記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　しかしながら、特許文献１～３には光学活性な多環性ピリドン誘導体とチエピン誘導体とをカップリングさせる工程において、ベンジル基で保護された多環性ピリドン誘導体を用いると光学純度の低下することは記載されていない。一方、ヘキシル基で保護された多環性ピリドン誘導体を用いてカップリング反応を行うと光学純度の低下なく、収率よくカップリング反応が進行することについては記載も示唆もされていない。さらに多環性ピリドン誘導体の保護基を非置換アルキル基以外の保護基から非置換アルキル基に交換する反応において、マグネシウム塩存在下で反応を行うと、高収率かつ光学純度の低下なく反応が進行することは記載も示唆もされていない。
　特許文献１の実施例２１に記載の製造方法は、ベンジル基で保護された多環性ピリドン誘導体とベンズヒドリル誘導体とをカップリングさせる工程が記載されている。この製造方法では、多環性ピリドン誘導体の保護基を交換する工程については記載も示唆もされていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　特許文献２の実施例１７５には、置換された３環性ピリドン誘導体とベンズヒドリル誘導体とをカップリングさせる工程が記載されている。この製造方法では、３環性ピリドン誘導体の保護基を交換する工程については記載も示唆もされていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　特許文献２の実施例５８３および５８４には、置換された３環性ピリドン誘導体とチエピン誘導体とをカップリングさせる工程が記載されている。この製造方法では、３環性ピリドン誘導体の保護基を交換させる工程や光学純度が低下することについては記載も示唆もされていない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
国際公開第２０１０／１１０４０９号パンフレット 国際公開第２０１０／１４７０６８号パンフレット 国際公開第２０１２／０３９４１４号パンフレット
　本明細書中、式（Ｖ）または（ＶＩ）で示される化合物が、キャップ依存的エンドヌクレアーゼ阻害活性を有し、インフルエンザウイルスに感染することより誘発される症状及び／又は疾患の治療及び／又は予防剤として有用であることがＰＣＴ／ＪＰ２０１６／６３１３９に記載されている。
　本発明の目的は、本明細書中、式（Ｖ）または（ＶＩ）で示されるキャップ依存的エンドヌクレアーゼ阻害活性を有する置換された多環性ピリドン誘導体および式（ＩＩ）または（ＩＶ）で示されるその中間体の新規で有用な製造方法を提供することである。
　本発明者らは、光学活性な置換３環性ピリドン誘導体とチエピン誘導体とをカップリングさせる工程において、光学活性な置換環性ピリドン誘導体の光学純度が低下することを見出した。
　ベンジル基など非置換アルキル以外の保護基からヘキシル基に交換することにより、光学純度を低下させることなく、光学活性な置換３環性ピリドン誘導体とチエピン誘導体とのカップリング反応を進行させる製造方法を見出した。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、Ｒ１は水素、または非置換アルキル以外の保護基である。）
で示される化合物を、ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩存在下、
式：Ｒ２－ＯＨ
（式中、Ｒ２は非置換アルキルである。）
で示される化合物と反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、Ｒ２は上記と同意義である。）
で示される化合物の製造方法。
（２）マグネシウム塩存在下で反応させることを特徴とする、上記（１）記載の製造方法。
（３）塩化イソプロピルマグネシウム存在下で反応させることを特徴とする、上記（１）記載の製造方法。
（４）Ｒ１がベンジルである、上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）Ｒ２がヘキシルである、上記（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
で示される化合物と
式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはハロゲンであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のハロゲンの数は、１または２である）
で示される化合物を反応させることを特徴とする、式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中の記号は上記と同意義である）
で示される化合物の製造方法。
（７）Ｒ３が水素であり、
Ｒ４が水素であり、
Ｒ５がフッ素であり、かつ
Ｒ６がフッ素である、上記（６）記載の製造方法。
（８）上記（１）～（７）のいずれかに記載の製造方法を含有する、式（Ｖ）または式（ＶＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
で示される化合物の製造方法。
（９）式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
で示される化合物、またはその塩。
（１０）トシル酸塩である、上記（９）記載の化合物の塩。
（１１）上記（１０）記載の塩の結晶。
（１２）粉末Ｘ線回折の２θの値が、５．９±０．２°、８．４±０．２°、１１．６±０．２°、１２．７±０．２°、１３．１±０．２°、１５．７±０．２°から選択される２つ以上の２θを有する、上記（１１）記載の結晶。
（１３）粉末Ｘ線回折の２θの値が、５．９±０．２°、８．４±０．２°、１１．６±０．２°、１２．７±０．２°、１３．１±０．２°、１５．７±０．２°の２θを有する、上記（１１）記載の結晶。
（１４）図４に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（１１）記載の結晶。
（１５）式（ＩＶ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
で示される化合物、またはその塩。
（１６）塩がメシル酸塩である、上記（１５）記載の化合物の塩。
（１７）上記（１６）記載の塩の結晶。
（１８）粉末Ｘ線回折の２θの値が、７．１±０．２°、９．３±０．２°、１２．６±０．２°、１４．１±０．２°、１７．７±０．２°、１８．７±０．２°、１９．２±０．２°、２２．２±０．２°、２５．４±０．２°、２７．７±０．２°、２８．５±０．２°、３７．８±０．２°から選択される２つ以上の２θを有する、上記（１７）記載の結晶。
（１９）粉末Ｘ線回折の２θの値が、７．１±０．２°、９．３±０．２°、１２．６±０．２°、１４．１±０．２°、１７．７±０．２°、１８．７±０．２°、１９．２±０．２°、２２．２±０．２°、２５．４±０．２°、２７．７±０．２°、２８．５±０．２°、３７．８±０．２°の２θを有する、上記（１７）記載の結晶。
（２０）示差走査熱量測定において、融点が２１９℃±２℃である、上記（１７）記載の結晶。
（２１）図５に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（１７）記載の結晶。
（２２）式（ＶＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
で示される化合物、またはその塩。
（２３）上記（２２）記載の化合物の１水和物。
（２４）粉末Ｘ線回折の２θの値が５．４±０．２°、７．５±０．２°、８．４±０．２°、１０．６±０．２°、１１．９±０．２°、１３．５±０．２°、２０．２±０．２°および２２．９±０．２°から選択される２つ以上の２θを有する、上記（２３）記載の１水和物。
（２５）粉末Ｘ線回折の２θの値が５．４±０．２°、７．５±０．２°、８．４±０．２°、１０．６±０．２°、１１．９±０．２°、１３．５±０．２°、２０．２±０．２°および２２．９±０．２°の２θを有する、上記（２３）記載の１水和物。
（２６）図１に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（２３）記載の１水和物。
（２７）式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
で示される化合物の溶媒和物。
（２８）上記式（ＶＩＩＩ）で示される化合物の１／２水和物。
（２９）粉末Ｘ線回折の２θの値が、９．５±０．２°、１３．４±０．２°、１８．０±０．２°、１９．３±０．２°、２１．２±０．２°、２２．５±０．２°、２２．８±０．２°、２３．６±０．２°、２７．５±０．２°、２８．１±０．２°から選択される２つ以上の２θを有する、上記（２８）記載の１／２水和物。
（３０）粉末Ｘ線回折の２θの値が、９．５±０．２°、１３．４±０．２°、１８．０±０．２°、１９．３±０．２°、２１．２±０．２°、２２．５±０．２°、２２．８±０．２°、２３．６±０．２°、２７．５±０．２°、２８．１±０．２°の２θを有する、上記（２８）記載の１／２水和物。
（３１）図２に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（２８）記載の１／２水和物。
（３２）式（ＩＸ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物。
（３３）上記式（ＩＸ）で示される化合物の結晶。
（３４）粉末Ｘ線回折の２θの値が、７．１±０．２°、１４．１±０．２°、１５．１±０．２°、２１．０±０．２°、２１．２±０．２°、２２．９±０．２°、２３．４±０．２°から選択される２つ以上の２θを有する、上記（３３）記載の結晶。
（３５）粉末Ｘ線回折の２θの値が、７．１±０．２°、１４．１±０．２°、１５．１±０．２°、２１．０±０．２°、２１．２±０．２°、２２．９±０．２°、２３．４±０．２°の２θを有する、上記（３３）記載の結晶。
（３６）図３に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（３３）記載の結晶。
（３７）式（Ｖ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
で示される化合物またはその製薬上許容される塩の、結晶。
（３８）粉末Ｘ線回折の２θの値が、９．６±０．２°、１０．９±０．２°、１７．８±０．２°、２１．５±０．２°、２２．１±０．２°、２３．５±０．２°および２４．８±０．２°から選択される２つ以上の２θを有する、上記（３７）記載の化合物の結晶。
（３９）粉末Ｘ線回折の２θの値が、９．６±０．２°、１０．９±０．２°、１７．８±０．２°、２１．５±０．２°、２２．１±０．２°、２３．５±０．２°および２４．８±０．２°の２θを有する、上記（３７）記載の化合物の結晶。
（４０）図６に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（３７）記載の化合物の結晶。
　本発明の方法を用いることにより、式（Ｖ）または（ＶＩ）で示される多環性ピリドン誘導体を高い光学純度で効率よく製造することができる。
化合物３の粉末Ｘ線回折データである。 化合物９の粉末Ｘ線回折データである。 化合物１３の粉末Ｘ線回折データである。 化合物２０のトシル酸塩の粉末Ｘ線回折データである。 化合物２１のメシル酸塩の粉末Ｘ線回折データである。 化合物（Ｖ）の粉末Ｘ線回折データである。 化合物（Ｖ）をプロドラッグ化した化合物（ＶＩ）について、非絶食下でラットに経口投与した後の、化合物（Ｖ）の血漿中濃度推移を測定した結果である。 化合物（Ｖ）をプロドラッグ化した化合物（ＶＩ）で示される化合物について、非絶食下でラットに経口投与した後の、化合物（ＶＩ）で示される化合物の血漿中濃度推移を測定した結果である。
　以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は特に断りのない限り、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わせて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
　「からなる」という用語は、構成要件のみを有することを意味する。
　「含む」という用語は、構成要件に限定されず、記載されていない要素を排除しないことを意味する。
　「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含する。フッ素および塩素が好ましく、特にフッ素が好ましい。
　「アルキル」とは、炭素数１～６の直鎖または分枝状のアルキルを意味し、炭素数１～４のアルキル、炭素数１～３のアルキル等を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等が挙げられる。
　Ｒ１における非置換アルキル以外の保護基としては、ベンジルが挙げられる。
　Ｒ２における非置換アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられ、ｎ－プロピル、イソブチル、ヘキシル等が好ましく、ヘキシルが特に好ましい。
　「非置換アルキル以外の保護基」とは、ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩存在下で脱保護される、上記「アルキル」以外の保護基であれば特に限定されない。例えば、置換アルキル等が挙げられ、好ましくは、ベンジル等が挙げられる。
　「ナトリウム塩」とは「アルキル以外の保護基」が脱保護されれば特に限定されない。例えば、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムイソプロピルオキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ペントキサイド、塩化イソプロピルマグネシウム等が挙げられる。好ましくは、ナトリウムｔｅｒｔ－ペントキサイド、塩化イソプロピルマグネシウム等が挙げられ、特に塩化イソプロピルマグネシウムが好ましい。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６および「ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩」の好ましい態様を以下に示す。下記の可能な組合せの化合物が好ましい。
　Ｒ１としては、水素、または非置換アルキル以外の保護基が挙げられる。
　Ｒ１の好ましい態様としては、非置換アルキル以外の保護基が好ましく、ベンジルが特に好ましい。
　Ｒ２としては、非置換アルキルが挙げられる。
　Ｒ２の好ましい態様としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等が挙げられ、ｎ－プロピル、イソブチル、ヘキシル等が好ましく、ヘキシルが特に好ましい。
　「ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩」の好ましい態様としては、「マグネシウム塩」が好ましく、イソプロピルマグネシウムクロリド、シクロヘキシルマグネシウムクロリド等がさらに好ましく、イソプロピルマグネシウムクロリドが特に好ましい。
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６としては、それぞれ独立して、水素またはハロゲンが挙げられ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のハロゲンの数は、１または２である。
　Ｒ３の好ましい態様としては、水素が挙げられる。
　Ｒ４の好ましい態様としては、水素が挙げられる。
　Ｒ５の好ましい態様としては、フッ素が挙げられる。
　Ｒ６の好ましい態様としては、フッ素が挙げられる。
　本明細書中、「Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のハロゲンの数は、１または２である」とは、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの１つまたは２つがハロゲンであることを意味する。
　なお、本明細書中、化合物と化合物を反応させることには、その塩またはそれらの溶媒和物を反応させることを含む。
　本発明に係る化合物の製薬上許容される塩としては、例えば、本発明に係る化合物と、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、バリウム等）、マグネシウム、遷移金属（例えば、亜鉛、鉄等）、アンモニア、有機塩基（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、エチレンジアミン、ピリジン、ピコリン、キノリン等）およびアミノ酸との塩、または無機酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、臭化水素酸、リン酸、ヨウ化水素酸等）、および有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、マンデル酸、グルタル酸、リンゴ酸、安息香酸、フタル酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等）との塩が挙げられる。特に塩酸、硫酸、リン酸、酒石酸、メタンスルホン酸との塩等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。
　式（Ｖ）で示される化合物の製薬上許容される塩としては、特にアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、バリウム等）、マグネシウム、遷移金属（例えば、亜鉛、鉄等）が好ましく、さらにはアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、バリウム等）が好ましい。
　本発明に係る化合物またはその製薬上許容される塩は、溶媒和物（例えば、水和物等）および／または結晶多形を形成する場合があり、本発明はそのような各種の溶媒和物および結晶多形も包含する。「溶媒和物」は、本発明に係る化合物に対し、任意の数の溶媒分子（例えば、水分子等）と配位していてもよい。本発明に係る化合物またはその製薬上許容される塩を、大気中に放置することにより、水分を吸収し、吸着水が付着する場合や、水和物を形成する場合がある。また、本発明に係る化合物またはその製薬上許容される塩を、再結晶することで結晶多形を形成する場合がある。
　以下に本発明の結晶体を特定する方法につき説明する。
　特に言及がなければ、本明細書中および特許請求の範囲記載の数値は、おおよその値である。数値の変動は、装置キャリブレーション、装置エラー、物質の純度、結晶サイズ、サンプルサイズ、その他の因子に起因する。
　本明細書中で用いる「結晶」とは、秩序だった長い範囲の分子構造を有する物質を意味する。結晶形態の結晶化度は、例えば、粉末Ｘ線回折、水分吸着、示差、熱量分析、溶液比色、溶解特性を含めた多くの技術によって測定することができる。
　一般に結晶性有機化合物は、３次元空間に周期的に配列された多数の原子よりなる。構造周期性は、通例、ほとんどの分光学的プローブ（例えば、Ｘ線回折、赤外スペクトル、ラマンスペクトルおよび固体ＮＭＲ）によって明確に区別可能な物理的特性を発現する。
　中でも粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）は、固体の結晶性を測定するための最も感度の良い分析法のうちの１つである。Ｘ線が結晶に照射されると、結晶格子面で反射し、互いに干渉しあい、ブラッグ則よって予測される条件を満たす方向の回折線のみ強度が増大し、それ以外は打ち消しあって観測されない。一方、非晶質固体については広範囲の秩序だった回折線は認められない。非晶質固体は、通常、反復する結晶格子の広い範囲の秩序が不存在であるため、ハローパターンと呼ばれるブロードなＸＲＰＤパターンを示す。
　本出願で開示する多環性ピリドン誘導体、中間体、その塩および／またはそれらの溶媒和物の結晶形態は、好ましくは、区別可能な粉末Ｘ線回折プロフィールを有する。例えば、化合物（V）の場合、好ましくは、特徴的な回折ピークの存在によって各結晶体を特定し、他の結晶体と区別することができる。本明細書中で用いる特徴的な回折ピークは、観察された回折パターンから選択されるピークである。好ましくは、特徴的なピークは、回折パターンにおける約２０本、より好ましくは約１０本、最も好ましくは約５本から選択される。
　一般に、後述の表及び図において表示されるピークの相対強度は、多くの因子、例えばＸ線ビームに対する結晶の配向効果、分析される物質の純度又はサンプルの結晶化度によって変動し得ることが知られている。また、ピーク位置についても、サンプル高の変動に基づいてシフトし得る。さらに、異なる波長を使用して測定するとブラッグ式（ｎλ=２ｄｓｉｎθ）に従って異なるシフトが得られるが、このような別の波長の使用により得られる別のＸＲＰＤパターンも、本発明の範囲に含まれる。
　本発明の結晶体は熱分析の手法によっても特定することができる。
　ＤＳＣ（示差走査熱量測定）
　ＤＳＣは、熱分析の主要な測定方法のひとつで、原子・分子の集合体としての物質の熱的性質を測定する方法である。ＤＳＣにより、医薬活性成分の温度又は時間に係る熱量の変化を測定し、得られたデータを温度又は時間に対してプロットすることにより示差走査熱量曲線が得られる。示差走査熱量曲線より、医薬活性成分が融解する際のオンセット温度、融解に伴う吸熱ピーク曲線の最大値ならびにエンタルピーに関する情報を得ることができる。
（本発明の化合物の製造法）
　本発明の化合物の一般的製造法を以下に例示する。また、抽出、精製などは、通常の有機化学の実験で行う処理を行えばよい。
　本発明の化合物の合成は、当該分野において公知の手法を参酌しながら実施することができる。
　原料化合物は、市販の化合物、本明細書において記載されたもの、本明細書において引用された文献に記載されたもの、およびその他の公知化合物を利用することができる。
　本発明の化合物の塩を取得したいとき、本発明の化合物が塩の形で得られる場合には、そのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有機溶媒に溶解もしくは懸濁させ、酸又は塩基を加えて通常の方法により塩を形成させればよい。
　また、本発明の化合物及びその製薬上許容される塩は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物ないし溶媒和物）の形で存在することもあるが、これら付加物も本発明に包含される。
　「くさび形」および「破線」は絶対立体配置を示す。
　本発明の製造方法は、例えば、以下のように実施することができる。
第１工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（式中、Ｒ１は水素、または非置換アルキル以外の保護基であり、Ｒ２は非置換アルキルである。）
　式（Ｉ）で示される化合物をナトリウム塩および/またはマグネシウム塩存在下、式：Ｒ２－ＯＨで示されるアルコールと反応させることにより式（ＩＩ）で示される化合物を得る工程である。
　溶媒としては、上記工程を効率よく進行させるものであれば特に制限されない。ジクロロメタン、トルエン、テトラヒドロフラン等が挙げられ、単独もしくは混合、または無溶媒下で反応させることができる。好ましくは、テトラヒドロフランが挙げられる。
　ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩としては、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ペントキシド、塩化イソプロピルマグネシウム，塩化シクロヘキシルマグネシウム等が挙げられる。好ましくは、塩化イソプロピルマグネシウムが挙げられる。化合物（Ｉ）に対して０．１モル当量～５モル当量、好ましくは０．３モル当量～０．５モル当量用いて反応させればよい。
　反応温度は、特に制限されないが通常、約０～１００℃、好ましくは、０℃～室温で行うことができる。
　反応時間は、特に制限されないが通常、０．５時間～２４時間、好ましくは、１～１０時間である。
第２工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはハロゲンであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のハロゲンの数は、１または２である。その他の記号は上記と同意義である。）
　式（ＩＩ’）で示される化合物を、縮合剤存在下、式（ＩＩＩ）で示される化合物と反応させることにより、式（ＩＶ）で示される化合物を得る工程である。
　溶媒としては、上記工程を効率よく進行させるものであれば特に制限されない。酢酸エチル、シクロヘキサン、酢酸イソプロピル、酢酸プロピル、トルエン、１，４－ジオキサン、DMA、DMF、トルエン、ヘプタン、シクロペンチルメチルエーテル等が挙げられ、単独または混合して用いることができる。好ましくは、酢酸エチルとシクロヘキサンの混合溶媒が挙げられる。
　縮合剤としては、プロピルホスホン酸無水物、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物、１０－カンファ―スルホン酸、濃硫酸、ジクロロ酢酸、硫酸水素テトラメチルアンモニウム等が挙げられ、単独または混合して用いることができる。好ましくは、プロピルホスホン酸無水物とメタンスルホン酸の混合が挙げられる。化合物（ＩＩ’）に対して１モル当量～５モル当量、好ましくは１モル当量～３モル当量用いて反応させればよい。
　反応温度は、特に制限されないが通常、約０～１００℃、好ましくは、０℃～室温で行うことができる。
　反応時間は、特に制限されないが通常、０．５時間～２４時間、好ましくは、１～１０時間である。
第３工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（式中の記号は上記と同意義である。）
　式（ＩＶ）で示される化合物を、金属塩と反応させることにより、式（ＩＶ’’）で示される化合物を得る工程である。
　溶媒としては、上記工程を効率よく進行させるものであれば特に制限されない。Ｎ－メチルピロリドン、N, N-ジメチルホルムアミド、N, N-ジメチルアセトアミド等が挙げられ、単独または混合して用いることができる。好ましくは、Ｎ－メチルピロリドンが挙げられる。
　金属塩としてはとしては、塩化リチウム、臭化リチウムが挙げられる。好ましくは、塩化リチウムが挙げられる。化合物（ＩＶ）に対して、１モル当量～２０モル当量、好ましくは５モル当量～１０モル当量用いて反応させればよい。
　反応温度は、特に制限されないが通常、約０～１００℃、好ましくは、室温～１００℃で行うことができる。
　反応時間は、特に制限されないが通常、０．５時間～４８時間、好ましくは、１２～２４時間である。
第４工程
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中、Ｐｒはエステル基またはエーテル基等のヒドロキシ基の保護基であり、その他の記号は上記と同意義である。）
　化合物（ＩＶ’’）のヒドロキシル基をエステル基またはエーテル基に変換する一般的な方法によって化合物（Ｖ’’’）を得ることができる。
例えば、Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green(John Wiley & Sons)、Prog.Med.5:2157-2161(1985)、およびSupplied by The British Library‐“The world's Knowledge”等に記載の方法を利用することができる。

　本明細書において「ジアステレオマー比」とは、例えば、次式で示される化合物の場合、下記に示す２つの立体異性体のＨＰＬＣ面積百分率比を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　式（Ｖ）で示される化合物は、インフルエンザウイルスにより誘発される症状及び／又は疾患に有用である。例えば、発熱、悪寒、頭痛、筋肉痛、全身倦怠感などを伴う風邪様症状や、咽頭痛、鼻汁、鼻閉、咳、痰などの気道炎症状、腹痛、嘔吐、下痢といった胃腸症状、さらに、急性脳症、肺炎などの二次感染を伴う合併症の治療及び／又は予防、症状改善に有効である。
　式（ＶＩ）で示される化合物は、経口吸収性が高い、良好なバイオアベイラビリティーを示す、良好なクリアランスを示す、肺移行性が高いなどの利点を有するため、優れた医薬品となりうる。
　式（Ｖ）で示される化合物は、ウイルス特異的な酵素であるキャップ構造依存的エンドヌクレアーゼに対する阻害活性が高く、選択性が高いなどの効果を有するため、副作用が軽減された医薬品となりうる。
　さらに、式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物は、代謝安定性が高い、溶解度が高い、経口吸収性が高い、良好なバイオアベイラビリティーを示す、良好なクリアランスを示す、肺移行性が高い、半減期が長い、非タンパク結合率が高い、ｈＥＲＧチャネル阻害が低い、ＣＹＰ阻害が低い、ＣＰＥ（ＣｙｔｏＰａｔｈｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ、細胞変性効果）抑制効果が認められ、及び／又は光毒性試験、Ａｍｅｓ試験、遺伝毒性試験で陰性を示す、もしくは肝障害などの毒性を有さない等の利点も有する。したがって、式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物は、優れた医薬品となりうる。
　式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物を含有する医薬組成物は、治療有効量の式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物を製薬上許容される担体又は希釈剤とともに組み合わせる（例えば混合する）ことによって製造される。
　式（Ｖ）で示される化合物および/又は式（ＶＩ）で示される化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態及び疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり約０．０５ｍｇ～３０００ｍｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ～１０００ｍｇを、要すれば分割して投与すればよい。また、非経口投与の場合、成人１日あたり約０．０１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ～５００ｍｇを投与する。
　以下に本発明の実施例、参考例および中間体合成例、ならびに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
　参考例および実施例で得られたＮＭＲ分析は、４００ＭＨｚで行い、ＤＭＳＯ－ｄ６、ＣＤＣｌ３を用いて測定した。
粉末Ｘ線回折パターンの測定
　日本薬局方の一般試験法に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、各実施例で得られた結晶の粉末Ｘ線回折測定を行った。測定条件を以下に示す。
（装置）
リガク社製ＭｉｎＦｌｅｘ６００ＲＩＮＴ－ＴＴＲＩＩＩ
（操作方法）
検出器：高速一次元検出器（Ｄ／ＴｅｃＵｌｔｒａ２）および可変ナイフエッジ
測定法：反射法
光源の種類：Ｃｕ管球
使用波長：ＣｕＫα線
管電流：１０ｍＡ、または１５ｍＡ
管電圧：３０Ｋｖ、または４０Ｋｖ
試料プレート：アルミニウム、またはガラス
Ｘ線の入射角（θ）：３－４０°、サンプリング幅：０．０１°、または
Ｘ線の入射角（θ）：４－４０°、サンプリング幅：０．０２°
　一般に、粉末Ｘ線回折における回折角度（２θ）は±０．２°の範囲内で誤差が生じ得るので、回折角度の値は±０．２°程度の範囲内の数値も含む。したがって、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角度が完全に一致する結晶だけでなく、ピークの回折角度が±０．２°程度の誤差で一致する結晶も本発明に含まれる。
（カール・フィッシャー法による水分量の測定方法）
　水分については，日本薬局方 一般試験法 水分（電量滴定）より試験を行った。ただし、陽極液として三菱化学製アクアミクロン（登録商標）AX，陰極液としてアクアミクロン（登録商標）CXUを用いた。
　一般に、カール・フィッシャー法による水分測定は±０．３％の範囲内で誤差が生じ得るので、水分含量の値は±０．３％程度の範囲内の数値も含む。
ＴＧ／ＤＴＡの測定
　各実施例で得られた結晶のＴＧ／ＤＴＡの測定を行った。アルミニウムパンに試料を量り、開放系にて測定した。測定条件を以下に示す。
装置：日立ハイテクサイエンス社製ＴＧ／ＤＴＡ７２００
測定温度範囲：３０℃－２５０℃
昇温速度：１０℃／分
　一般に、ＴＧ／ＤＴＡによる測定は±２℃の範囲内で誤差が生じ得るので、ＴＧ／ＤＴＡによる測定値は±２℃程度の範囲内の数値も含む。
水分吸脱着等温線測定（ＤＶＳ）　　　　　　
　各実施例で得られた結晶の水分吸脱着等温線測定を行った。サンプルパンに試料を量り取り測定を行った。測定条件を以下に示す。
装置：Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｔｄ．社製　ＤＶＳ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ
測定ポイント：０％ＲＨから５％ごとに９５％ＲＨまで．その後９５％ＲＨから５％ごとに０％ＲＨまで
温度：２５℃または６０℃
示差走査熱量（ＤＳＣ）の測定
　各実施例で得られた結晶のＤＳＣの測定を行った。ステンレススチールパンに試料を量り、簡易密封して測定した。測定条件を以下に示す。
装置：ＭＥＴＴＬＥＲ　ＴＯＬＥＤＯ　ＤＳＣ８２２ｅ
測定温度範囲：３０℃－３００℃
昇温速度：１０℃／分
雰囲気：Ｎ２　４０ｍＬ／分
　一般に、示差走査熱量（ＤＳＣ）による測定は±２℃の範囲内で誤差が生じ得るので、示差走査熱量（ＤＳＣ）による測定値は±２℃程度の範囲内の数値も含む。
　実施例中の各用語の意味は以下のとおりである。
ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｔ３Ｐ：プロピルホスホン酸無水物　（環状トリマー）
実施例１　化合物３の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
工程１　化合物３の製造方法
　化合物１（100.00g, 406 mmol）にDMA（300mL）を加えて撹拌した。炭酸水素ナトリウム（44.41 g, 529 mmol）、ジメチル硫酸（58.91 g, 467 mmol）およびDMA（100mL）を加えて25℃で7時間撹拌した。反応液に合成塩酸（16.90 g）および水（500 g）を加え、酢酸エチル（1000，550mL）で2回抽出した。有機層を5%食塩水（300g）および水（300g）で洗浄した。減圧濃縮により、液重量を約500gまで溶媒を留去した。さらに濃縮液に酢酸エチル（350mL）を加え、減圧濃縮により、液重量を約500gまで溶媒を留去した。濃縮液にDMA（300mL）を加え、減圧濃縮により液重量を約400gまで溶媒を留去した。濃縮液にピリジンパラトルエンスルホン酸（265.42g）およびDMA（100mL）を加えた後、反応液を60℃に昇温した．その後、反応液にカルバジン酸tert-ブチル（69.80 g, 528 mmol）のDMA（100mL）溶液を6時間かけてゆっくりと加えた。反応液を60℃で3時間撹拌し、25℃まで冷却した。反応液にエタノール（100mL）および水（290 mL）を加えた後、30℃まで昇温した。反応液にエタノール（100mL）および水（520mL）の混合液をゆっくりと加えた。反応液を0℃まで冷却した後に、0℃で1時間半撹拌した。生じた淡黄白色沈殿をろ取した。得られた固体をエタノール（480mL）および水（720mL）の混合液で洗浄し、乾燥することにより、化合物３の１水和物（122.70g、収率77%）を淡黄白色固体として得た。

1H-NMR（400MHz, CDCl3）δ：1.45 (s, 9H), 3.77 (s, 3H), 5.26 (s, 2H), 6.39 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.27-7.47 (m, 6H), 7.64-8.23 (br s, 1H)
粉末Ｘ線回折２θ（°）：５．４、７．５、８．４、１０．６、１１．９、１３．５、２０．２、２２．９
　化合物３の粉末Ｘ線回折結果を図１に示す。
カールフィッシャー法による水分量の測定結果：４．５％
実施例２　化合物９の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 工程１　化合物６の製造方法
　化合物４（20.00g、104.6mmol）に化合物５（28.29g,167.4mmol ）およびDMA（65mL）を加えて撹拌した。反応液を40℃まで昇温した後、ナトリウムtert-ブトキシド（15.09g、 157.0mmol）をゆっくりと加えた。反応液を40℃で3時間撹拌した後、20℃に冷却した。反応液に酢酸（3.14g）および10%食塩水（64g）を加え、酢酸エチル（60mL）で2回抽出した。有機層に水（144mL）を加えて0℃まで冷却した。生じた淡黄白色沈殿をろ取した。得られた固体をメタノール（5.4g）および水（48.6g）の混合液で洗浄し、乾燥することにより、化合物６（20.44g、収率78%）を淡黄白色固体として得た。
 1H-NMR（CDCl3）δ：3.34 (s, 6H), 3.53 (d, J = 5.2Hz，2H), 3.76 (t, J = 5.6Hz, 2H), 3.90 (t, J = 5.6Hz, 2H), 4.43 (t, J = 5.2Hz, 1H), 7.70-7.73 (m, 2H), 7.84-7.87 (m, 2H)
工程２　化合物８の製造方法
　化合物６（20.02 g, 71.68 mmol）にエタノール（20mL）および水（20mL）を加えて撹拌した。反応液を60℃まで昇温した。反応液に60%ヒドラジン一水和物水溶液（8.99 g、 107.7 mmol）を加えた後、60℃で4時間撹拌した。反応液に水（40mL）を加え、30℃まで冷却した後、17%水酸化カリウム水溶液（92.12 g）を加えた。反応液を塩化メチレン（120, 78, 78, 78 mL）で4回抽出した。有機層を水（20mL）で洗浄し、減圧濃縮により液重量を約160gまで溶媒を留去した。濃縮液にTHF（100mL）を加え、減圧濃縮により液重量を約40gまで溶媒を留去した。濃縮液にTHF（100mL）を加え、減圧濃縮により液重量を約40gまで溶媒を留去した。濃縮液にTHF（20mL）を加え，減圧濃縮により15gの化合物７のTHF溶液を得た。
　化合物３（10.00g、 25.5mmol）に上記の化合物７のTHF溶液（14.71g）、THF（7g）および1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン（379.0mg）を加えて撹拌した。反応を60℃まで昇温した後、60℃で24時間撹拌した。反応液を25℃まで冷却した後、水（28g）および酢酸（3.72g）を加えた。反応液を酢酸エチル（50,30mL）で2回抽出し、有機層を5%炭酸水素ナトリウム水溶液（30g）および水（28g）で洗浄した。減圧濃縮により液重量を約36gまで溶媒を留去した。反応液に酢酸エチルを加え、減圧濃縮により液重量を約36gまで溶媒を留去した。濃縮液にヘプタン（65mL）を加え、5℃まで冷却した。5℃で1時間撹拌した後、生じた淡黄白色沈殿をろ取した。得られた固体をヘプタン（32mL）および酢酸エチル（14mL）の混合液で洗浄し、乾燥することにより、化合物８（10.10g、収率81%）を淡黄白色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：1.44 (s, 9H), 3.32-3.48 (m, 12H), 4.41 (t, J = 5.2Hz, 1H), 5.29 (s, 2H), 6.38 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.11-7.50 (m, 7H), 8.46 (s, 1H).
工程３　化合物９の製造方法
　化合物８（19.99g, 40.7mmol）にアセトニトリル（170mL）および水（30mL）を加えて撹拌した。反応液を60℃まで昇温し、メタンスルホン酸（11.70g, 121.7mmol）をゆっくりと加えた。反応液を60℃で6時間撹拌した後、25℃まで冷却した。反応液に30%水酸化ナトリウム水溶液（15.91g）を加え、減圧濃縮により液重量を約100gまで溶媒を留去した。濃縮液に水（50mL）を加えて減圧濃縮により液重量を約100gまで溶媒を留去した。濃縮液を25℃で30分間撹拌した後、生じた黄色沈殿をろ取した。得られた固体を水（40mL）で洗浄し，乾燥することにより、化合物９の０．５水和物（10.43g、収率76%）を黄色結晶として得た．
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：2.95 (ddd, J = 13.7, 12.3, 4.3 Hz, 1H), 3.13 (dd, J = 11.2, 10.0 Hz, 1H), 3.44 (td, J = 11.9, 3.1 Hz, 1H), 3.96-4.08 (m, 2H), 4.14 (dd, J = 13.9, 2.4 Hz, 1H), 4.80 (ddd, J = 12.6, 9.9, 4.5 Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 6.22 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.24-7.41 (m, 4H), 7.52-7.60 (m, 2H), 7.69 (d, J = 7.6 Hz , 1H)
粉末Ｘ線回折２θ（°）：９．５、１３．４、１８．０、１９．３、２１．２、２２．５、２２．８、２３．６、２７．５、２８．１
　化合物９　の粉末Ｘ線回折結果を図２に示す。
カールフィッシャー法による水分量の測定結果：2.8％
実施例３　化合物１３の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 工程１　化合物１１および１２の製造方法
　化合物９の０．５水和物（30.00g, 89.2mmol）に酢酸エチル（87mL）、50(w/w)%T3P酢酸エチル溶液（145.80g, 229.1mmol）を加えて撹拌した。反応液を60℃まで昇温し、トリエチルアミン（18.55g, 183.3mmol）を加えた後、(R)-(+)-テトラヒドロフラン-2-カルボン酸（12.24g, 105.4mmol）をゆっくりと加えた。反応液を60℃で4時間半撹拌し、0℃まで冷却した後、生じた淡黄色沈殿をろ取した。得られた固体を酢酸エチル（120mL）で洗浄することにより、化合物１１（18.34g、未乾燥）を淡黄色固体として得た。また、ろ液と洗液を混合して、化合物１２の酢酸エチル溶液（358.60g）を得た。
工程２　化合物１３および９の製造方法
　化合物１１（15.28g）に酢酸エチル（120mL）および1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン（530mg, 3.5mmol）を加えて撹拌した。反応液を30℃まで昇温し、メタノール（1.67g）および酢酸エチル(43mL)の混合液をゆっくりと加えた。反応液を室温で1時間撹拌し、生じた白色沈殿をろ取した。得られた結晶を酢酸エチル（60mL）で洗浄し、乾燥することにより、化合物１３（11.06g、収率４５％）の白色結晶を得た。
　1H-NMR（CDCl3）δ：2.84-2.92 (m, 2H), 3.45 (td, J = 3.2Hz, 12.0Hz,  1H), 3.82 (dd, J = 4.0Hz, 11.2Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 4.4Hz, 11.6Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 2.8Hz, 13.6Hz, 1H), 4.47-4.54 (m, 1H), 4.96 (d, J = 9.6Hz, 1H), 5.27 (d, J = 10.0Hz, 1H), 5.76 (d, J = 13.2Hz, 1H), 6.19 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.30-7.38 (m, 3H), 7.59 (dd, J = 1.6Hz, 8.0Hz, 2H).
粉末Ｘ線回折２θ（°）：７．１、１４．１、１５．１、２１．０、２１．２、２２．９、２３．４
　化合物１３の粉末Ｘ線回折結果を図３に示す。
化合物１２の酢酸エチル溶液（334.69g）を減圧留去し、液重量を約170gまで溶媒を留去した。濃縮液を25℃に調整して撹拌した。反応液にアセトニトリル（224mL）、水（56mL）および24%水酸化ナトリウム水溶液（150g）をゆっくりと加え、有機層と水層に分離した。得られた水層に水（14mL）を加えた後、アセトニトリル（168mL）で抽出を2回行った。有機層を併せて減圧留去し、液重量を約250gまで溶媒を留去した。濃縮液を60℃まで昇温し、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン（19.01g, 124.9mmol）を加えた。反応液を60℃で3時間半撹拌し、40℃まで冷却した。反応液に5.8%塩酸水（50.40g）を加え、25℃まで冷却し314.96 g の溶液を得た．溶液の一部（158.86g）を減圧濃縮し、液重量を約85gまで溶媒を留去した。濃縮液を20℃で2時間撹拌した後、水（28mL）を加えた。反応液を減圧濃縮し液重量を約100gまで溶媒を留去した。濃縮液を20℃で1時間撹拌した後、析出した淡黄白色結晶をろ取した。得られた結晶を水（42mL）で洗浄し、乾燥することにより、化合物９（5.93g、収率42%）を淡黄白色結晶として得た。
実施例４　化合物１９の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
工程１　化合物１５の製造方法
　THF（25mL）にジイソプロピルアミン（7.69g, 76.0mmol）を加えて撹拌し、－40℃まで冷却した。反応液に1.6mol/L n-ブチルリチウム（43.5mL, 69.6 mmol）をゆっくりと加えた後、0℃にて1時間撹拌した。－40℃に冷却し，3,4-ジフロオロ安息香酸（5.00g, 31.6mmol）のTHF（25mL）溶液をゆっくりと加えた。反応液を－40℃にて1時間撹拌し、N,N-ジメチルホルムアミド（5.74g, 78.5mmol）をゆっくりと加えた。反応液に6mol/L 塩酸水（34.25mL）を加え、25℃まで昇温した後、有機層と水層に分離した。得られた水層を酢酸エチル（15mL）で抽出した。有機層を合わせた後、水（5mL）で洗浄した。減圧濃縮した後、残渣にトルエンを加えることにより、化合物１５のトルエン溶液を得た。
工程２　化合物１６の製造方法
　上で得た化合物１５のトルエン溶液に、トルエン（17.8mL）、チオフェノール（3.90g, 35.4mmol）およびD-カンファースルホン酸（1.16g, 5.0mmol）を加えて撹拌し、60℃に昇温した。反応液を60℃で4時間撹拌した後、5℃まで冷却した。反応液に2mol/L水酸化ナトリウム水溶液（10mL）を加え、25℃まで昇温した。反応液をトルエン（10mL）で抽出し、得られた有機層を2mol/L水酸化ナトリウム水溶液（5mL）および水（10mL）で洗浄した。減圧濃縮した後、トルエンを加えることにより、化合物１６のトルエン溶液を得た。
工程３　化合物１７の製造方法
　塩化アルミニウム（5.52g, 41.4mmol）にトルエン（25mL）を加えて撹拌し、0℃まで冷却した。反応液に1,1,3,3-テトラメチルジシロキサン（5.56g, 41.4mmol）のトルエン（10mL）溶液を滴下し、25℃まで昇温した。反応液に上で得た化合物１６のトルエン溶液をゆっくりと加え、25℃で2時間半撹拌した。反応液に15%硫酸水（35mL）を加えて撹拌した後、有機層と水層に分離した。得られた有機層を水（20mL）で2回洗浄した。減圧濃縮により、液重量を約16gまで溶媒を留去した。濃縮液にヘプタン（40mL）をゆっくりと加え、0℃まで冷却した後、生じた白色沈殿をろ取した。得られた固体をヘプタン（20mL）で洗浄した後、乾燥することにより、化合物１７（7.20g、収率81.3％）を白色固体として得た．
1H-NMR（CDCl3）δ：4.61 (d, J = 1.6Hz, 2H), 7.09-7.15 (m, 1H), 7.23-7.27 (m, 3H), 7.34-7.37 (m, 2H) , 7.84-7.88 (m, 1H)
工程４　化合物１８の製造方法
　ポリリン酸（425.0g）を80℃に昇温して撹拌した。そこへ化合物１７（85.0g）を加えて120℃まで昇温し、反応液を120℃で3時間撹拌した。反応液を80℃まで冷却し、水（200mL）をゆっくりと加えた。反応液を30℃まで冷却し、水（850mL）を加え、酢酸エチル（850mL）で抽出した。有機層を水（425mL）および10%炭酸水素ナトリウム水溶液（255mL）で洗浄した。溶媒を減圧濃縮により留去し、得られた残渣にヘプタン（340mL）を加えた。溶媒を減圧濃縮により留去し、得られた残渣にヘプタン（85mL）を加えた。反応液を30℃で30分間撹拌した後、生じた褐色沈殿をろ取した。得られた固体をヘプタン（42mL）で洗浄した後、乾燥することにより、化合物１８（72.0g、収率91％）を褐色固体として得た．
1H-NMR（CDCl3）δ：4.14 (d, J = 1.0Hz, 2H), 7.09-7.18 (m, 1H), 7.27-7.33 (m, 1H), 7.34-7.45 (m, 3H) , 8.19 (dd, J = 8.5Hz, 1.4Hz, 1H)
工程５　化合物１９の製造方法
　水素化ホウ素ナトリウム（234.0mg, 6.2mmol）を0.5%水酸化ナトリウム水溶液（1.8mL）に懸濁させ、水素化ホウ素ナトリウム懸濁液を調製した。化合物１８(4.5g,17.2mmol)に2-プロパノール（20mL）および水（2.25mL）を加えて撹拌し、40℃まで昇温した。反応液に上記で調製した水素化ホウ素ナトリウム懸濁液をゆっくりと加えた。反応液を40℃で1時間半撹拌し、25℃まで冷却した。反応液に水（32mL）を加え、更に水（6.7mL）および62%硫酸水（460mg）の混合液を加えた。反応液を5℃まで冷却し、生じた褐色沈殿をろ取した。得られた固体を水（18mL）で洗浄した後、乾燥することにより、化合物１９（4.4g、収率97％）を褐色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：2.67 (d, J = 3.8Hz, 1H), 4.20 (dd, J = 14.4, 1.4Hz, 2H), 4.68 (dd, J = 14.5, 1.3Hz, 2H), 7.02 (dt, J = 9.7, 8.3Hz, 1H), 7.12-7.21 (m, 4H), 7.44-7.49 (m, 1H)
実施例５　化合物（Ｖ）および化合物（ＶＩ）の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
工程１－１　化合物２０の製造方法
　1-ヘキサノール（22.5g, 220mmol）とTHF（24.6g）を混合して、20℃に温度を調節した。混合液にイソプロピルマグネシウムクロリドのTHF溶液（2mol/L, 7.2g, 14.7mmol）を加えて、マグネシウムヘキソキシド溶液を調製した。
　化合物１３（12.0g, 36.7mmol）に1-ヘキサノール（22.5g, 220mmol）を加えて撹拌し、20℃に温度を調節した。得られたスラリー液に上で調製したマグネシウムヘキソキシド溶液を加えた。反応液を20℃にて4時間撹拌した後、クエン酸水溶液（クエン酸1水和物3.1g，水36g）と混合した。THF（10.7g）で抽出し、得られた有機層を水（24g）で洗浄した。減圧濃縮により、液重量を約55gまで溶媒を留去した。得られた液にパラトルエンスルホン酸のTHF溶液（パラトルエンスルホン酸1水和物7.0g，テトラヒドロフラン42.8g）を加えた。減圧濃縮により，液重量を約61gまで溶媒を留去した。THF（42.7g）を加え、減圧濃縮により、液重量を約61gまで溶媒を留去した。50℃まで昇温した後、メチルtert-ブチルエーテル（133.0g）を加え、10℃まで冷却した。10℃にて1時間半撹拌し、生じた白色沈殿をろ取した。メチルtert-ブチルエーテル（40.0g）と酢酸エチル（16.0g）の混合液で、得られた固体を洗浄した後、乾燥することにより、化合物２０のトシル酸塩（15.8g、収率87.2％）を白色結晶として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.25-1.34 (m, 4H), 1.34-1.43 (m, 2H), 1.76-1.85 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 3.04 (ddd, J = 13.6, 11.7, 4.3 Hz, 3H), 3.36 (dd, J = 11.6, 10.0 Hz, 3H), 3.43 (ddd, J = 13.6, 12.0, 4.4 Hz, 3H), 4.00 (dd, J = 11.7, 4.3 Hz, 1H), 4.06-4.18 (m, 4H), 4.80 (br, ｓ, 1H), 7.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 8.40 (br, s, 1H).
粉末Ｘ線回折２θ（°）：５．９、８．４、１１．６、１２．７、１３．１、１５．７
　化合物２０の粉末Ｘ線回折結果を図４に示す。
工程１－２　化合物２０の製造方法
　上記工程１－１において、イソプロピルマグネシウムクロリドのTHF溶液（0.4eq）の代わりに、シクロヘキシルマグネシウムクロリドのTHF溶液（16.2wt%, 0.4eq）を用いて反応させ、HPLCにより反応液を分析し，化合物２０生成率を測定した。
化合物２０のＨＰＬＣ面積百分率：９０．９％（ＲＴ＝１１．０ｍｉｎ）
その他は、上記工程１－１と同様の方法である。
（測定条件）
（１）カラム：Ｘ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ＣＳＨ　Ｃ１８　（３．５μｍ　ｉ．ｄ．４．６ｘ１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：１．０　ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ；
移動相：［Ａ］０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］アセトニトリル
５分間、１５％溶媒［Ｂ］を維持し、１０分間で１５％－６０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、２分間で６０％－８５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、３分間、８５％溶媒［Ｂ］を維持した。
工程１－３　化合物２０の製造方法
　化合物１３（4.91g, 15.0mmol）に1-ヘキサノール（27.5g, 270mmol）を加えて撹拌し、0℃に温度を調節した。得られたスラリー液にナトリウムtert-ペントキシドのTHF溶液 (1.4mol/L, 45.0mmol) を加えた。反応液を0℃にて2.5時間撹拌した後、HPLCにより反応液を分析し，化合物２０生成率を測定した。
化合物２０のＨＰＬＣ面積百分率：93.3％(RT=9.5min)
（測定条件）
（１）カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＢ　（５．０μｍ　ｉ．ｄ．４．６ｘ２５０ｍｍ）（ＤＡＩＣＥＬ）
流速：１．０　ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ；
移動相：［Ａ］０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］アセトニトリル
５分間、３５％溶媒［Ｂ］を維持し、６分間で３５％－８５％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、２分間、８５％溶媒［Ｂ］を維持した。
　上記に示すように、マグネシウム塩またはナトリウム塩を用いて反応を行うと良好な収率で反応が進行することが分かった。特にイソプロピルマグネシウムクロリドを用いた場合に高収率で目的物を得ることが出来た。
工程２　化合物２１のメシル酸塩の製造方法
　化合物２０（12.0g, 24.3mmol）に化合物１９（8.0g, 30.3mmol）、酢酸エチル（48.7g）およびシクロヘキサン（14.1g）を加えて25℃で撹拌した。50(w/w)%Ｔ３Ｐ酢酸エチル溶液（20.91g, 32.9mmol）を加え、次にメタンスルホン酸（3.5g, 36.4mmol）を加えた。60℃に昇温し、24時間撹拌した。25℃に冷却後、THF（32.0g）および水（24.0g）を加えた。24%水酸化ナトリウム水溶液（30.8g）をゆっくりと加え、静置後、有機層と水層に分離した。有機層を7%食塩水（60.0g）で2回洗浄した。得られた溶液にシクロヘキサン（9.3g）、酢酸エチル（32.1g）およびメタンスルホン酸（2.80g, 29.1mmol）の混合溶液を加えた。25℃にて2時間撹拌し、生じた白色沈殿をろ取した。酢酸エチル（43.3g）で、得られた固体を洗浄した後、乾燥することにより、化合物２１のメシル酸塩（13.65g、収率84.6％）を白色結晶として得た．
1H-NMR (DMSO-d6)δ: 0.90 (3H, t, J = 6.0 Hz), 1.29-1.36 (4H, m), 1.39-1.49 (2H, m), 1.67-1.79 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.94 (1H, br s), 3.30 (1H, td, J = 11.6, 2.4 Hz), 3.51 (1H, t, J = 10.4 Hz), 3.66 (1H, dd, J = 11.2, 2.8 Hz), 3.92-4.01 (2H, m), 4.07 (1H, d, J = 14.3 Hz), 4.20 (1H, s), 4.42-4.52 (1H, m), 5.43 (1H, dd, J = 14.4, 2.1 Hz), 5.79-5.83 (2H, m), 6.81 (1H, td, J = 7.6, 1.2 Hz), 6.96 (1H, dd, J = 7.8, 1.0 Hz), 7.09 (1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.12-7.18 (1H, m), 7.32 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.37-7.49 (2H, m)

粉末Ｘ線回折２θ（°）：７．１、９．３、１２．６、１４．１、１７．７、１８．７、１９．２、２２．２、２５．４、２７．７、２８．５、３７．８
　化合物２１の粉末Ｘ線回折結果を図５に示す。
ＤＳＣ：Ｏｎｓｅｔ　２１６℃，　Ｐｅａｋ　２１９℃
工程３　化合物（Ｖ）の製造方法
　化合物２１（15.0g, 22.6mmol）にN-メチルピロリドン（52.4g）を加えて撹拌した。塩化リチウム（8.6g, 203.3mmol）を加えて75℃まで昇温した。75℃で20時間撹拌し、その後40℃まで冷却した。アセトニトリル（20.0g）を加え、さらに水（11.6g）を加えた。30℃まで冷却し、30分間撹拌した後、水（142.5g）をゆっくりと加えた。30℃で1時間半撹拌した後、生じた白色沈殿をろ取した。2-プロパノール（60.1g）で得られた固体を洗浄した後、乾燥することにより、化合物（Ｖ）（9.91g、収率90.7％）を白色結晶として得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 3.00 (td, J = 11.8, 3.2 Hz, 1H), 3.46 (td, J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 3.59 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 12.2, 3.0 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 11.0, 3.0 Hz, 1H), 4.07 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.58 (dd, J = 10.0, 2.8 Hz, 1H), 4.67 (dd, J = 13.6, 2.0 Hz, 1H), 5.26-5.30 (m, 2H), 5.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.83-6.87 (m, 1H), 6.99-7.04 (m, 2H), 7.07-7.15 (m, 3H).
粉末Ｘ線回折２θ（°）：９．６、１０．９、１７．８、２１．５、２２．１、２３．５、２４．８
　化合物（Ｖ）の粉末Ｘ線回折結果を図６に示す。
工程４　化合物（ＶＩ）の製造方法
　化合物（Ｖ）（１．００ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（５ｍｌ）の懸濁液に、クロロメチルメチルカルボネート（０．４８３ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（０．５７２ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（０．３４３ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を加え、５０℃に昇温し６時間攪拌した。さらに反応液に、ＤＭＡ（１ｍｌ）を加え６時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、ＤＭＡ（６ｍｌ）を加え５０℃で５分間攪拌し、ろ過した。得られたろ液に、氷冷下、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水（１０ｍｌ）及び水（４ｍｌ）を滴下し、１時間攪拌した。析出した固体をろ取し、６０℃にて３時間減圧乾燥を行い、化合物（ＶＩ）（１．１０ｇ、１．９３ｍｍｏｌ、収率９３％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ　（ＤＭＳＯ－Ｄ６）　δ：　２．９１－２．９８　（１Ｈ，　ｍ），　３．２４－３．３１　（１Ｈ，　ｍ），　３．４４　（1H, t, J = 10.4 Hz), 3.69 (1H, dd, J = 11.5, 2.8 Hz), 3.73 (3H, s), 4.00 (1H, dd, J = 10.8, 2.9 Hz), 4.06 (1H, d, J = 14.3 Hz), 4.40 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.45 (1H, dd, J = 9.9, 2.9 Hz), 5.42 (1H, dd, J = 14.4, 1.8 Hz), 5.67 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.72-5.75 (3H, m), 6.83-6.87 (1H, m), 7.01 (1H, d, J = 6.9 Hz), 7.09 (1H, dd, J = 8.0, 1.1 Hz), 7.14-7.18 (1H, m), 7.23 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.37-7.44 (2H, m).
1H-NMR (DMSO-D6）δ: 2.91-2.98 (1H, m), 3.24-3.31 (1H, m), 3.44 (1H, t, J = 10.4 Hz), 3.69 (1H, dd, J = 11.5, 2.8 Hz), 3.73 (3H, s), 4.00 (1H, dd, J = 10.8, 2.9 Hz), 4.06 (1H, d, J = 14.3 Hz), 4.40 (1H, d, J = 11.8 Hz), 4.45 (1H, dd, J = 9.9, 2.9 Hz), 5.42 (1H, dd, J = 14.4, 1.8 Hz), 5.67 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.72-5.75 (3H, m), 6.83-6.87 (1H, m), 7.01 (1H, d, J = 6.9 Hz), 7.09 (1H, dd, J = 8.0, 1.1 Hz), 7.14-7.18 (1H, m), 7.23 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.37-7.44 (2H, m).
実施例６　化合物３３～４１の製造方法およびそれらのジアステレオマー比
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　工程１　化合物２４～３２の製造方法
　上記実施例５の工程１－１、１－２、１－３および常法に従い、化合物２４～３２を合成した。
　工程２　化合物３３～４１の製造方法
　上記実施例５の工程２に従い、化合物２４～３２と化合物１９を反応させ、ＨＰＬＣにより反応液を分析し、化合物３３～４１のジアステレオマー比を測定した。
化合物３３ａ：保持時間６．４ｍｉｎ／化合物３３ｂ：保持時間６．７ｍｉｎ
化合物３４ａ：保持時間８．９ｍｉｎ／化合物３４ｂ：保持時間９．３ｍｉｎ
化合物３５ａ：保持時間９．８ｍｉｎ／化合物３５ｂ：保持時間１０．１ｍｉｎ
化合物３６ａ：保持時間１０．７ｍｉｎ／化合物３６ｂ：保持時間１１．１ｍｉｎ
化合物３７ａ：保持時間１２．５ｍｉｎ／化合物３７ｂ：保持時間１２．８ｍｉｎ
化合物３８ａ：保持時間１３．４ｍｉｎ／化合物３８ｂ：保持時間１３．８ｍｉｎ
化合物３９ａ：保持時間８．７ｍｉｎ／化合物３９ｂ：保持時間９．０ｍｉｎ
化合物４０ａ：保持時間９．９ｍｉｎ／化合物４０ｂ：保持時間１０．２ｍｉｎ
化合物４１ａ：保持時間１０．６ｍｉｎ／化合物４１ｂ：保持時間１１．０ｍｉｎ

（測定条件）
カラム：ＫＩＮＥＴＥＸ （登録商標）（２．６μｍ　Ｃ１８　ｉ．ｄ．４．６ｘ１００ｍｍ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）
流速：１．０　ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２５４ｎｍ；
移動相：［Ａ］０．１％ギ酸含有水溶液、［Ｂ］０．１％ギ酸含有アセトニトリル
２５％溶媒［Ｂ］より開始し、１０分間で２５％－７０％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、８分間、７０％溶媒［Ｂ］を維持した。
試験例１：キャップ依存的エンドヌクレアーゼ（ＣＥＮ）阻害活性の測定
１）基質の調製
　5’末端のGを2リン酸化修飾、且つ2’位の水酸基をメトキシル化修飾し、5’末端から6番目のUをCy3標識、3’末端をBHQ2標識した30merRNA（5’-pp-[m2’-O]GAA UAU（-Cy3） GCA UCA CUA GUA AGC UUU GCU CUA-BHQ2-3’：日本バイオサービス社製）を購入し、EPICENTRE社製のスクリプトキャップ(ScriptCap)システムを使ってcap構造を付加した（産物はm7G [5’]-ppp-[5’] [m2’-O]GAA UAU（-Cy3） GCA UCA CUA GUA AGC UUU GCU CUA（-BHQ2）-3’）。これを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて分離・精製し、基質として使用した。
２）酵素の調製
　RNPは定法に従いウイルス粒子から調製した（参考文献：VIROLOGY(1976) 73, p327-338 OLGA M. ROCHOVANSKY）。具体的にはA/WSN/33ウイルス1x103 PFU/mL、200μLを10日齢発育鶏卵に接種し、37℃で2日間培養後、鶏卵のしょう尿液を回収した。20%スクロースを用いた超遠心分離によりウイルス粒子を精製し、TritonX-100とリソレシチンを用いてウイルス粒子を可溶化後、30-70%グリセロール密度勾配を用いた超遠心分離によりRNP画分(50～70％グリセロール画分)を採取し、酵素液（約1nMのPB1・PB2・PA複合体を含む）として使用した。
３）酵素反応
　ポリプロピレン製の384穴プレートに酵素反応液（組成： 53 mM Tris-塩酸塩 (pH7.8)、1mM MgCl2、1.25 mM ジチオスレイトール、80mM NaCl、12.5％グリセロール、酵素液0.15μＬ）を2.5μＬ分注した。次にジメチルスルホキシド(DMSO)で段階的に希釈した被検化合物溶液0.5μＬ、ポジティブコントロール(PC)及びネガティブコントロール(NC)には、DMSO 0.5μＬを加え、よく混合した。次に基質溶液（1.4nM基質RNA、0.05%Tween20）2μＬを加えて反応を開始し、室温で60分間インキュベートした後、反応液1μＬを10μＬ のHi-Di Formamide溶液（サイジングマーカーとしてGeneScan 120 Liz Size Standardを含む：アプライドバイオシステム（ABI）社製。）に加え、反応を停止した。NCは反応開始前にEDTA（4.5mM）を加えることで予め反応を停止させた（表記濃度は全て終濃度である）。
４）阻害率（IC50値）の測定
　反応停止させた溶液を85 ℃で5分間加熱し、氷上で2分間急冷後、ABI PRIZM 3730ジェネティックアナライザで分析した。解析ソフトABI Genemapperによりキャップ依存的エンドヌクレアーゼ産物のピークを定量し、PC、NCの蛍光強度をそれぞれ0％阻害、100％阻害として被検化合物のCEN反応阻害率(％)を求めた後、カーブフィッティング ソフトウェア （XLfit2.0：Model 205（IDBS社製）など）を使ってIC50値を求めた。
試験例２：ＣＰＥ抑制効果確認試験
＜材料＞
・2% FCS E-MEM（MEM(Minimum Essential Medium)（Invitrogen）にカナマイシン及びFCSを添加して調整）
・0.5% BSA E-MEM（MEM(Minimum Essential Medium)（Invitrogen）にカナマイシン及びBSAを添加して調整）
・HBSS(hanks' Balanced Salt Solution)
・MDBK細胞
2% FCS E-MEMにて適当細胞数（3×105 /mL）に調整した。
・MDCK細胞
HBSSにて2回洗った後、0.5% BSA E-MEMにて適当細胞数（5×105 /mL）に調整した。
・Trypsin溶液
Trypsin from porcine pancreas（SIGMA）をPBS(-)にて溶解し、0.45umのフィルターにてフィルトレーションした。
・EnVision（PerkinElmer）
・WST-8 Kit（キシダ化学）
・10% SDS溶液
＜操作手順＞
・被験試料の希釈、分注
培養液として、MDBK細胞使用時には2% FCS E-MEMを使用し、MDCK細胞使用時には0.5% BSA E-MEMを用いた。以下、ウイルス・細胞・被験試料の希釈に対し、同様の培養液を使用した。
予め被験試料を培養液で適度な濃度に希釈し、96 wellプレートに2～5倍段階希釈系列を作製した(50μL/well)。抗Flu活性測定用、細胞毒性測定用の2枚作製した。各薬剤について3重測定を実施した。
MDCK細胞使用時には、抗Flu活性測定用にのみ、細胞にTrypsinを最終濃度3ug/mLとなるように添加した。
・インフルエンザウイルスの希釈、分注
予め、インフルエンザウイルスを培養液で適当な濃度に希釈し、被験試料が入った96 wellプレートに50μL/wellずつ分注した。細胞毒性測定用のプレートには、培養液を50μL/wellずつ分注した。
・細胞の希釈、分注
適当細胞数に調整した細胞を、被験試料が入った96 wellプレートに100μL/wellずつ分注した。
プレートミキサーで混和し、CO2インキュベーターで培養した。抗Flu活性測定用、細胞毒性測定用共に、3日間培養した。
・WST-8の分注
3日間培養した96 wellプレートを肉眼、顕微鏡下で観察し、細胞の形態・結晶の有無等を確認した。プレートから細胞を吸わないように上清を除いた。
WST-8 Kitを、培養液にて10倍希釈し、このWST-8溶液を各wellに100μLずつ分注した。プレートミキサーにて混和の後、CO2インキュベーターで1～3時間培養した。
抗Flu活性測定用プレートについては、培養後、各wellに10% SDS溶液を10uLずつ分注し、ウイルスを不活化した。
・吸光度の測定
混和した96wellプレートを、EnVisionで450 nm/620 nmの2波長で吸光度を測定した。 
＜各測定項目値の算出＞
次の様な計算式に基づきMicrosoft Excelまたは同等の計算処理能力を有するプログラムを使用し算出した。
・50% インフルエンザ感染細胞死阻害濃度 (EC50)算出
EC50 = 10Z 
Z = (50% - High %) / (High % -Low %) x {log(High conc.) - log(Low conc.)} + log(High conc.)
　化合物（Ｖ）について、試験例１および試験例２の測定結果を以下に示す。
試験例１（ＣＥＮ　ＩＣ５０）：１．９３ｎＭ、
試験例２（ＣＰＥ　ＥＣ５０）：１．１３ｎＭ
　以上の結果から、式（Ｖ）で示される化合物は高いキャップ依存的エンドヌクレアーゼ（ＣＥＮ）阻害活性、および／または高いＣＰＥ抑制効果を示すため、インフルエンザウイルスに感染することより誘発される症状及び／又は疾患の治療及び／又は予防剤として有用な医薬となり得る。
　以下に、化合物（Ｖ）および化合物（ＶＩ）の生物試験例を記載する。
試験例３：ＣＹＰ阻害試験
　市販のプールドヒト肝ミクロソームを用いて、ヒト主要ＣＹＰ５分子種（ＣＹＰ１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４）の典型的基質代謝反応として７－エトキシレゾルフィンのＯ－脱エチル化（ＣＹＰ１Ａ２）、トルブタミドのメチル－水酸化（ＣＹＰ２Ｃ９）、メフェニトインの４’－水酸化（ＣＹＰ２Ｃ１９）、デキストロメトルファンのＯ脱メチル化（ＣＹＰ２Ｄ６）、テルフェナジンの水酸化（ＣＹＰ３Ａ４）を指標とし、それぞれの代謝物生成量が化合物（Ｖ）によって阻害される程度を評価した。
　反応条件は以下のとおり：基質、０．５μｍｏｌ／Ｌ　エトキシレゾルフィン（ＣＹＰ１Ａ２）、１００μｍｏｌ／Ｌ　トルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９）、５０μｍｏｌ／Ｌ　Ｓ－メフェニトイン（ＣＹＰ２Ｃ１９）、５μｍｏｌ／Ｌ　デキストロメトルファン（ＣＹＰ２Ｄ６）、１μｍｏｌ／Ｌ　テルフェナジン（ＣＹＰ３Ａ４）；反応時間、１５分；反応温度、３７℃；酵素、プールドヒト肝ミクロソーム０．２ｍｇ　タンパク質／ｍＬ；化合物（Ｖ）の化合物濃度、１、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ（４点）。
　９６穴プレートに反応溶液として、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に各５種の基質、ヒト肝ミクロソーム、化合物（Ｖ）を上記組成で加え、補酵素であるＮＡＤＰＨを添加して、指標とする代謝反応を開始した。３７℃、１５分間反応した後、メタノール／アセトニトリル＝１／１（Ｖ／Ｖ）溶液を添加することで反応を停止した。３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心後、遠心上清中のレゾルフィン（ＣＹＰ１Ａ２代謝物）を蛍光マルチラベルカウンタで定量し、トルブタミド水酸化体（ＣＹＰ２Ｃ９代謝物）、メフェニトイン４’水酸化体（ＣＹＰ２Ｃ１９代謝物）、デキストロルファン（ＣＹＰ２Ｄ６代謝物）、テルフェナジンアルコール体（ＣＹＰ３Ａ４代謝物）をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで定量した。
　化合物（Ｖ）を溶解した溶媒であるＤＭＳＯのみを反応系に添加したものをコントロール（１００％）とし、溶媒に加えた化合物（Ｖ）の各濃度における残存活性（％）を算出し、濃度と抑制率を用いて、ロジスティックモデルによる逆推定によりＩＣ５０を算出した。
（結果）
化合物（Ｖ）：５種　＞２０μｍｏｌ／Ｌ
試験例４：ＢＡ試験
経口吸収性の検討実験材料と方法
（１）使用動物：マウスあるいはＳＤラットを使用した。
（２）飼育条件：マウスあるいはＳＤラットは、固形飼料および滅菌水道水を自由摂取させた。
（３）投与量、群分けの設定：経口投与、静脈内投与を所定の投与量により投与した。以下のように群を設定した。（化合物ごとで投与量は変更有）
　経口投与　１～３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２～３）
　静脈内投与　０．５～１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２～３）
（４）投与液の調製：経口投与は溶液または懸濁液として投与した。静脈内投与は可溶化して投与した。
（５）投与方法：経口投与は、経口ゾンデにより強制的に胃内に投与した。静脈内投与は、注射針を付けたシリンジにより尾静脈から投与した。
（６）評価項目：経時的に採血し、血漿中式（Ｖ）および（ＶＩ）で示される化合物の化合物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。
（７）統計解析：血漿中式（Ｖ）および（ＶＩ）で示される化合物の化合物濃度推移について、非線形最小二乗法プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）を用いて血漿中濃度‐時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、経口投与群と静脈内投与群のＡＵＣから式（Ｖ）および（ＶＩ）で示される化合物のバイオアベイラビリティ（ＢＡ）を算出した。
（結果）
化合物（Ｖ）：４．２％
化合物（ＶＩ）：１４．９％
　以上の結果から、プロドラッグは、親化合物よりもバイオアベイラビリティが向上した。
　したがって、式（ＶＩ）で示される化合物は、経口吸収性に優れ、インフルエンザウイルスに感染することより誘発される症状及び／又は疾患の治療及び／又は予防剤として有用な医薬となり得る。
試験例５：代謝安定性試験
　市販のプールドヒト肝ミクロソームと化合物（Ｖ）を一定時間反応させ、反応サンプルと未反応サンプルの比較により残存率を算出し、化合物（Ｖ）が肝で代謝される程度を評価した。
　ヒト肝ミクロソーム０．５ｍｇタンパク質／ｍＬを含む０．２ｍＬの緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化マグネシウム）中で、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮＡＤＰＨ存在下で３７℃、０分あるいは３０分間反応させた（酸化的反応）。反応後、メタノール／アセトニトリル＝１／１（ｖ／ｖ）溶液の１００μＬに反応液５０μＬを添加、混合し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。その遠心上清中の化合物（Ｖ）をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて定量し、反応後の化合物（Ｖ）の残存量を０分反応時の化合物量を１００％として計算した。なお、加水分解反応はＮＡＤＰＨ非存在下で、グルクロン酸抱合反応はＮＡＤＰＨに換えて５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＵＤＰ－グルクロン酸の存在下で反応を行い、以後同じ操作を実施した。
（結果）化合物濃度２μｍｏｌ／Ｌでの酸化的代謝における残存率を示す。
化合物（Ｖ）：９０．１％
試験例６：ＣＹＰ３Ａ４蛍光ＭＢＩ試験
　ＣＹＰ３Ａ４蛍光ＭＢＩ試験は、代謝反応による化合物（Ｖ）のＣＹＰ３Ａ４阻害の増強を調べる試験である。ＣＹＰ３Ａ４酵素（大腸菌発現酵素）により７－ベンジルオキシトリフルオロメチルクマリン（７－ＢＦＣ）が脱ベンジル化されて、蛍光を発する代謝物７－ハイドロキシトリフルオロメチルクマリン（７－ＨＦＣ）が生じる。７－ＨＦＣ生成反応を指標としてＣＹＰ３Ａ４阻害を評価した。
　反応条件は以下のとおり：基質、５．６μｍｏｌ／Ｌ　７－ＢＦＣ；プレ反応時間、０または３０分；反応時間、１５分；反応温度、２５℃（室温）；ＣＹＰ３Ａ４含量（大腸菌発現酵素）、プレ反応時６２．５ｐｍｏｌ／ｍＬ、反応時６．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ（１０倍希釈時）；化合物（Ｖ）の化合物濃度、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ（６点）。
　９６穴プレートにプレ反応液としてＫ－Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．４）中に酵素、化合物（Ｖ）の溶液を上記のプレ反応の組成で加え、別の９６穴プレートに基質とＫ－Ｐｉ緩衝液で１／１０希釈されるようにその一部を移行し、補酵素であるＮＡＤＰＨを添加して指標とする反応を開始し（プレ反応無）、所定の時間反応後、アセトニトリル／０．５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシアミノメタン）＝４／１（Ｖ／Ｖ）を加えることによって反応を停止した。また残りのプレ反応液にもＮＡＤＰＨを添加しプレ反応を開始し（プレ反応有）、所定時間プレ反応後、別のプレートに基質とＫ－Ｐｉ緩衝液で１／１０希釈されるように一部を移行し指標とする反応を開始した。所定の時間反応後、アセトニトリル／０．５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシアミノメタン）＝４／１（Ｖ／Ｖ）を加えることによって反応を停止した。それぞれの指標反応を行ったプレートを蛍光プレートリーダーで代謝物である７－ＨＦＣの蛍光値を測定した。（Ｅｘ＝４２０ｎｍ、Ｅｍ＝５３５ｎｍ）
　化合物（Ｖ）を溶解した溶媒であるＤＭＳＯのみを反応系に添加したものをコントロール（１００％）とし、化合物（Ｖ）をそれぞれの濃度添加したときの残存活性（％）を算出し、濃度と抑制率を用いて、ロジスティックモデルによる逆推定によりＩＣ５０を算出した。ＩＣ５０値の差が５μｍｏｌ／Ｌ以上の場合を（＋）とし、３μｍｏｌ／Ｌ以下の場合を（－）とした。
（結果）
化合物（Ｖ）：（－）
試験例７：Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ　Ａｍｅｓ　Ｔｅｓｔ
　化合物（Ｖ）の変異原性を評価した。
　凍結保存しているネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＴＡ９８株、ＴＡ１００株）２０μＬを１０ｍＬ液体栄養培地（２．５％　Ｏｘｏｉｄ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　Ｎｏ．２）に接種し３７℃にて１０時間、振盪前培養した。ＴＡ９８株は９ｍＬの菌液を遠心（２０００×ｇ、１０分間）して培養液を除去した。９ｍＬのＭｉｃｒｏ　Ｆ緩衝液（Ｋ２ＨＰＯ４：３．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物：０．２５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０：０．１ｇ／Ｌ）に菌を懸濁し、１１０ｍＬのＥｘｐｏｓｕｒｅ培地（ビオチン：８μｇ／ｍＬ、ヒスチジン：０．２μｇ／ｍＬ、グルコース：８ｍｇ／ｍＬを含むＭｉｃｒｏＦ緩衝液）に添加した。ＴＡ１００株は３．１６ｍＬ菌液に対しＥｘｐｏｓｕｒｅ培地１２０ｍＬに添加し試験菌液を調製した。化合物（Ｖ）のＤＭＳＯ溶液（最高用量５０ｍｇ／ｍＬから２～３倍公比で数段階希釈）、陰性対照としてＤＭＳＯ、陽性対照として非代謝活性化条件ではＴＡ９８株に対しては５０μｇ／ｍＬの４－ニトロキノリン－１－オキシドＤＭＳＯ溶液、ＴＡ１００株に対しては０．２５μｇ／ｍＬの２－（２－フリル）－３－（５－ニトロ－２－フリル）アクリルアミドＤＭＳＯ溶液、代謝活性化条件ではＴＡ９８株に対して４０μｇ／ｍＬの２－アミノアントラセンＤＭＳＯ溶液、ＴＡ１００株に対しては２０μｇ／ｍＬの２－アミノアントラセンＤＭＳＯ溶液それぞれ１２μＬと試験菌液５８８μＬ（代謝活性化条件では試験菌液４９８μＬとＳ９　ｍｉｘ　９０μＬの混合液）を混和し、３７℃にて９０分間、振盪培養した。化合物（Ｖ）を暴露した菌液４６０μＬを、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ培地（ビオチン：８μｇ／ｍＬ、ヒスチジン：０．２μｇ／ｍＬ、グルコース：８ｍｇ／ｍＬ、ブロモクレゾールパープル：３７．５μｇ／ｍＬを含むＭｉｃｒｏＦ緩衝液）２３００μＬに混和し５０μＬずつマイクロプレートに分注し（４８ウェル／用量）、３７℃にて３日間、静置培養した。アミノ酸（ヒスチジン）合成酵素遺伝子の突然変異によって増殖能を獲得した菌を含むウェルは、ｐＨ変化により紫色から黄色に変色するため、１用量あたり４８ウェル中の黄色に変色した菌増殖ウェルを計数し、陰性対照群と比較して評価した。変異原性が陰性のものを（－）、陽性のものを（＋）として示す。
（結果）
化合物（Ｖ）：（－）
試験例８：ｈＥＲＧ試験
　化合物（Ｖ）の心電図ＱＴ間隔延長リスク評価を目的として、ｈｕｍａｎ　ｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　（ｈＥＲＧ）チャンネルを発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、心室再分極過程に重要な役割を果たす遅延整流Ｋ＋電流（ＩＫｒ）への化合物（Ｖ）の作用を検討した。
　全自動パッチクランプシステム（ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ　７０００Ａ、ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）を用い、ホールセルパッチクランプ法により、細胞を－８０ｍＶの膜電位に保持した後、＋４０ｍＶの脱分極刺激を２秒間、さらに－５０ｍＶの再分極刺激を２秒間与えた際に誘発されるＩＫｒを記録した。発生する電流が安定した後、化合物（Ｖ）を目的の濃度で溶解させた細胞外液（ＮａＣｌ：１３５　ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ：５．４　ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４：０．３ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：１．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：１ｍｍｏｌ／Ｌ、グルコース：１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）：１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝７．４）を室温で、１０分間細胞に適用させた。得られたＩＫｒから、解析ソフト（ＤａｔａＸｐｒｅｓｓ　ｖｅｒ．１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、保持膜電位における電流値を基準に最大テール電流の絶対値を計測した。さらに、化合物（Ｖ）適用前の最大テール電流に対する阻害率を算出し、媒体適用群（０．１％ジメチルスルホキシド溶液）と比較して、化合物（Ｖ）のＩＫｒへの影響を評価した。
（結果）化合物濃度０．３～１０μｍｏｌ／Ｌでの阻害率を示す。
化合物（Ｖ）：７．９％
試験例９：溶解性試験
　化合物（Ｖ）の溶解度は、１％ＤＭＳＯ添加条件下で決定した。ＤＭＳＯにて１０ｍｍｏｌ／Ｌ化合物溶液を調製し、化合物（Ｖ）の溶液２μＬをそれぞれＪＰ－１液（塩化ナトリウム２．０ｇ、塩酸７．０ｍＬに水を加えて１０００ｍＬとする）、ＪＰ－２液（リン酸二水素カリウム３．４０ｇおよび無水リン酸水素二ナトリウム３．５５ｇを水に溶かし１０００ｍＬとしたもの１容量に水１容量を加える）１９８μＬに添加した。室温で１時間振盪させた後、混液を濾過した。各濾液をメタノール／水＝１／１（Ｖ／Ｖ）にて１０倍希釈し、絶対検量線法によりＬＣ／ＭＳを用いて濾液中濃度を測定した。
（結果）
化合物（Ｖ）：４２．２μｍｏｌ／Ｌ
試験例１０：粉末溶解度試験
　適当な容器に化合物（Ｖ）を適量入れ、各容器にＪＰ－１液（塩化ナトリウム２．０ｇ、塩酸７．０ｍＬに水を加えて１０００ｍＬとした）、ＪＰ－２液（ｐＨ６．８のリン酸塩緩衝液５００ｍＬに水５００ｍＬを加えた）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　タウロコール酸ナトリウム（ＴＣＡ）／ＪＰ－２液（ＴＣＡ１．０８ｇにＪＰ－２液を加え１００ｍＬとした）を２００μＬずつ添加した。試験液添加後に全量溶解した場合には、適宜、化合物（Ｖ）を追加した。密閉して３７℃で１時間振とう後に濾過し、各濾液１００μＬにメタノール１００μＬを添加して２倍希釈を行った。希釈倍率は、必要に応じて変更した。気泡および析出物がないことを確認し、密閉して振とうした。絶対検量線法によりＨＰＬＣを用いて化合物（Ｖ）を定量した。
（結果）
化合物（Ｖ）：ＪＰ－１液；７．１μｇ／ｍＬ、ＪＰ－２液４．４μｇ／ｍＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴＣＡ／ＪＰ－２液１６．１μｇ／ｍＬ
試験例１１　Ａｍｅｓ試験
　サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＷＰ２ｕｖｒＡを試験菌株として用い、プレインキュベーション法による非代謝活性化条件下および代謝活性化条件下においてＡｍｅｓ試験を実施し、化合物（Ｖ）に係る化合物の遺伝子突然変異誘発性の有無を調べた。
（結果）
化合物（Ｖ）：（－）
試験例１２　光溶血試験
　化合物（Ｖ）を目的の濃度で溶解させ、マイクロプレート上において、ヒツジ脱繊維血から調製した０．１～０．０００８％濃度の赤血球浮遊液（２．５ｖ／ｖ％）と混合し、紫外線蛍光ランプ（ＧＬ２０ＳＥランプ、三共電気およびＦＬ２０Ｓ―ＢＬＢランプ、パナソニック）を用いてＵＶＡおよびＵＶＢ領域での光照射（１０　Ｊ／ｃｍ２、２９０～４００ｎｍ）を行った。光照射終了後の混合液を採取し、遠心を行った。遠心後の上清を採取しマイクロプレートに移した後、上清の吸光度（５４０または６３０ｎｍ）を測定、吸光度を基にした判定を行った。５４０および６３０ｎｍでの吸光度は、それぞれ生体膜損傷（光溶血率％）および脂質膜過酸化（メトヘモグロビン産生）の指標とした。光溶血率が１０％未満であり、６３０ｎｍでの吸光度の変化量が０．０５未満の場合を（－）とし、光溶血率が１０％以上であり、６３０ｎｍでの吸光度の変化量が０．０５以上の場合を（＋）とした。
（結果）
化合物（Ｖ）：（－）
　図７および８は、化合物（Ｖ）をプロドラッグ化した化合物（ＶＩ）について、非絶食下でラットに経口投与した後の、化合物（Ｖ）および化合物（ＶＩ）の血漿中濃度推移を測定した結果を示している。
　また、化合物（ＶＩ）は、全血漿サンプル中の濃度は定量下限以下であったことから、化合物（Ｖ）のプロドラッグである、化合物（ＶＩ）は、投与後生体内で速やかに化合物（Ｖ）に変化していることが分かる（図８参照）。
　これらの試験結果から、プロドラッグ化された化合物は、経口投与後に体内に吸収され、血中で速やかに親化合物に変換されることが判明した。したがって、式（Ｖ）または（ＶＩ）で示される化合物は、インフルエンザウイルスに感染することより誘発される症状及び／又は疾患の治療及び／又は予防剤として有用な医薬となり得る。
試験例１３　静脈内投与試験
静脈内投与試験の検討実験材料と方法
（１）使用動物：ＳＤラットを使用した。
（２）飼育条件：ＳＤラットは、固形飼料および滅菌水道水を自由摂取させた。
（３）投与量、群分けの設定：所定の投与量により静脈内に投与した。以下のように群を設定した。（化合物ごとで投与量は変更有）
　静脈内投与　０．５～１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２～３）
（４）投与液の調製：静脈内投与は可溶化して投与した。
（５）投与方法：静脈内投与は、注射針を付けたシリンジにより尾静脈から投与した。
（６）評価項目：経時的に採血し、血漿中化合物（Ｖ）の化合物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。
（７）統計解析：血漿中化合物（Ｖ）の化合物濃度推移について、非線形最小二乗法プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）を用いて全身クリアランス（ＣＬtoｔ）及び消失半減期（ｔ１／２，ｚ）を算出した。
（結果）
化合物（Ｖ）：
ＣＬtoｔ：１６．４ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ
ｔ１／２，ｚ：３．４時間
　以上の結果から、式（Ｖ）で示される化合物は、全身クリアランスが低く、半減期が長い化合物であることが判明した。
　したがって、式（Ｖ）で示される化合物は、持続性に優れ、インフルエンザウイルスに感染することより誘発される症状及び／又は疾患の治療及び／又は予防剤として有用な医薬となり得る。
　本発明に係る化合物および製造方法は、インフルエンザウイルスに感染することより誘発される症状及び／又は疾患の治療及び／又は予防剤として有用な化合物を製造するための中間体として有用である。本発明方法により、効率的に、式（Ｖ）で示される化合物および（ＶＩ）で示される化合物を製造することができる。

Claims (15)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、Ｒ１は水素、または非置換アルキル以外の保護基である。）で示される化合物を、ナトリウム塩および/またはマグネシウム塩存在下、
    式：Ｒ２－ＯＨ
    （式中、Ｒ２は非置換アルキルである。）で示される化合物と反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、Ｒ２は上記と同意義である。）で示される化合物の製造方法。
  2. マグネシウム塩存在下で反応させることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
  3. 塩化イソプロピルマグネシウム存在下で反応させることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
  4. Ｒ１がベンジルである、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. Ｒ２がヘキシルである、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 式（ＩＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    で示される化合物と式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはハロゲンであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のハロゲンの数は、１または２である）で示される化合物を反応させることを特徴とする、式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    （式中の記号は上記と同意義である）
    で示される化合物の製造方法。
  7. Ｒ３が水素であり、
    Ｒ４が水素であり、
    Ｒ５がフッ素であり、かつ
    Ｒ６がフッ素である、請求項６記載の製造方法。
  8. 請求項１～７のいずれかに記載の製造方法を含有する、式（Ｖ）または式（ＶＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    で示される化合物の製造方法。
  9. 式（ＩＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    で示される化合物、またはその塩。
  10. トシル酸塩である、請求項９記載の化合物の塩。
  11. 請求項１０記載の塩の結晶。
  12. 式（ＩＶ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    で示される化合物、またはその塩。
  13. 塩がメシル酸塩である、請求項１２記載の化合物の塩。
  14. 請求項１３記載の塩の結晶。
  15. 式（Ｖ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    で示される化合物またはその製薬上許容される塩の、結晶。
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