ES2936077T3

ES2936077T3 - Método para producir un derivado de piridona policíclico sustituido y un cristal del mismo

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Publication number: ES2936077T3
Application number: ES17815337T
Authority: ES
Inventors: Setsuya Shibahara; Nobuaki Fukui; Toshikatsu Maki; Kosuke Anan
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2037-06-19
Also published as: PL3473629T3; SI3473629T1

Abstract

Se proporciona un método para producir un derivado de piridona policíclica sustituida. Un método para producir un compuesto representado por la fórmula (II), que se caracteriza porque un compuesto representado por la fórmula (I) se hace reaccionar con un compuesto representado por la fórmula R2-OH (donde R2 representa un grupo alquilo no sustituido) en presencia de una sal de sodio y/o una sal de magnesio. (En la fórmula (I), R1 representa un átomo de hidrógeno o un grupo protector que no sea un grupo alquilo no sustituido). (En la fórmula (II), R2 es como se definió anteriormente). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir un derivado de piridona policíclico sustituido y un cristal del mismo

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un proceso para preparar derivados de piridona policíclicos sustituidos y cristales de los mismos. Específicamente, la presente invención se refiere a un proceso para preparar derivados de piridona policíclicos sustituidos que tienen actividad inhibidora de endonucleasa dependiente de caperuza e intermedios de los mismos.

[Antecedentes de la técnica]

El documento WO2010/110409 (documento de patente 1) desvela cribe un proceso para preparar un derivado de piridona policíclico usando un derivado de pirona y un derivado de piridona (Ejemplo 3).

[Producto quím. 1]

El documento WO2010/147068 (documento de patente 2) y el documento WO2012/039414 (documento de patente 3) desvelan un proceso que usa un derivado de piridona para la preparación de un derivado de piridona policíclico (Ejemplo 165).

[Producto quím. 2]

Sin embargo, los documentos de patente 1 a 3 no describen que el uso de un derivado de piridona policíclica protegida con bencilo en una etapa de acoplamiento de un derivado de piridona policíclica ópticamente activa con un derivado de tiepina reduzca la pureza óptica del producto. Además, no hay descripción ni sugerencia en los documentos de patente 1 a 3 de que la reacción de acoplamiento transcurra con buen rendimiento sin reducción de la pureza óptica cuando la reacción de acoplamiento se lleva a cabo usando un derivado de piridona policíclica protegida con hexilo. Además, no hay descripción ni sugerencia de que la reacción transcurra con alto rendimiento sin reducción de la pureza óptica cuando la reacción se lleva a cabo en presencia de una sal de magnesio en la reacción para intercambiar el grupo protector en el derivado de piridona policíclica de un grupo protector distinto de alquilo sin sustituir a alquilo sin sustituir.

El documento de patente 1 desvela el siguiente proceso que comprende una etapa de acoplamiento de un derivado de piridona policíclica protegida con bencilo con un derivado de benzhidrilo (Ejemplo 21). Sin embargo, no hay descripción ni sugerencia de ninguna etapa para intercambiar el grupo protector en el derivado de piridona policíclica.

[Producto quím. 3]

El documento de patente 2 desvela una etapa de acoplamiento de un derivado de piridona tricíclico sustituido con un derivado de benzhidrilo (Ejemplo 175). Sin embargo, no hay descripción ni sugerencia de ninguna etapa para intercambiar el grupo protector en el derivado de piridona tricícMca.

[Producto quím. 4]

El documento de patente 2 desvela una etapa de acoplamiento de un derivado de piridona tricíclico sustituido con un derivado de tiepina (Ejemplos 583 y 584). Sin embargo, no hay descripción ni sugerencia de ninguna etapa para intercambiar el grupo protector del derivado de piridona tricíclica o reducción de la pureza óptica.

[Producto quím. 5]

[Documentos de la técnica anterior]

[Documentos de patente]

WO2010/110409

WO2010/147068

WO2012/039414

[Sumario]

[Problema técnico]

El documento WO 2016/175224 describe que el compuesto, que es el compuesto de fórmula (V) o (VI) como se desvela en el presente documento, tiene una actividad inhibidora de endonucleasa dependiente de la caperuza y es útil como agente terapéutico y/o profiláctico para los síntomas y/o enfermedades causadas por la infección del virus de la gripe.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un proceso novedoso y útil para la preparación de derivados de piridona policíclicos sustituidos de fórmula (V) o (VI) que tienen actividad inhibidora de endonucleasa dependiente de caperuza e intermedios de los mismos de fórmula (II) o (IV).

[Solución al problema]

Los presentes inventores han descubierto que se produce una reducción en la pureza óptica de un derivado de piridona cíclica sustituida ópticamente activa en una etapa de acoplamiento de un derivado de piridona tricíclica sustituida ópticamente activa con un derivado de tiepina.

Los presentes inventores también han encontrado un proceso para lograr una reacción de acoplamiento de un derivado de piridona tricíclico sustituido ópticamente activo con un derivado de tiepina sin causar una reducción de la pureza óptica, mediante el intercambio de un grupo protector distinto del alquilo no sustituido, tales como el grupo bencilo, al grupo hexilo.

La presente invención se refiere a lo siguiente. Los párrafos (22)-(36) no están de acuerdo con la invención como se reivindica.

(1) Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (II):

[Producto quím. 6]

en donde R2 es alquilo sin sustituir,

caracterizado por hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (I):

[Producto quím. 7]

en donde R1 es hidrógeno o un grupo protector que no sea alquilo sin sustituir,

con un compuesto de la fórmula: R2-OH, en donde R2 es como se ha definido anteriormente, en presencia de una sal de sodio y/o una sal de magnesio; en donde la o cada sal de sodio y/o sal de magnesio se selecciona de hidróxido sódico, hidruro sódico, isopropóxido sódico, ferc-pentóxido sódico, cloruro de isopropilmagnesio y cloruro de ciclohexilmagnesio.

(2) El proceso de acuerdo con (1) en donde la reacción se lleva a cabo en presencia de una sal de magnesio. (3) El procedimiento de acuerdo con (1), en donde la reacción se lleva a cabo en presencia de cloruro de isopropilmagnesio.

(4) El proceso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3) en donde R1 es bencilo.

(5) El proceso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (4) en donde R2 es hexilo.

(6) Un proceso para preparar un compuesto de fórmula (IV):

[Producto quím. 8]

en donde R3, R4, R5 y R6 cada uno es independientemente hidrógeno o halógeno, siempre que uno o dos de R3, R4, R5 y R6 es halógeno,

caracterizado por hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (II'):

[Producto quím. 9]

con un compuesto de la fórmula (III):

[Producto quím. 10]

en donde R3, R4, R5 y R6 son como se han definido anteriormente.

(7) El proceso de acuerdo con (6) en donde R3 es hidrógeno, R4 es hidrógeno, R5 es flúor y R6 es flúor.

(8) Un proceso para preparar el compuesto de fórmula (V) o fórmula (VI):

[Producto quím. 11]

el cual comprende el proceso de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (7).

(9) Un compuesto de la fórmula (II'):

[Producto quím. 12]

o una sal del mismo.

(10) La sal del compuesto de acuerdo con (9) que es un tosilato.

(11) Un cristal de la sal de acuerdo con (10).

(12) El cristal de acuerdo con (11) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo en donde los ángulos de difracción (20) de al menos dos picos se seleccionan del grupo que consta de 5,9 ± 0,2°, 8,4 ± 0,2°, 11,6 ± 0,2°, 12,7 ± 0,2°, 13,1 ± 0,2° y 15,7 ± 0,2°.

(13) El cristal de acuerdo con (11) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos en los ángulos de difracción (20) de 5,9 ± 0,2°, 8,4 ± 0,2°, 11,6 ± 0,2°, 12,7 ± 0,2°, 13,1 ± 0,2° y 15,7 ± 0,2°. (14) El cristal de acuerdo con (11) caracterizado por un espectro de difracción de rayos X de polvo sustancialmente idéntico al de la Figura 4.

(15) Un compuesto de la fórmula (IV'):

[Producto quím. 13]

o una sal del mismo.

(16) La sal del compuesto de acuerdo con (15) que es un mesilato.

(17) Un cristal de la sal de acuerdo con (16).

(18) El cristal de acuerdo con (17) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo en donde los ángulos de difracción (20) de al menos dos picos se seleccionan del grupo que consta de 7,1 ± 0,2°, 9,3 ± 0,2°, 12,6 ± 0,2°, 14,1 ± 0,2°, 17,7 ± 0,2°, 18,7 ± 0,2°, 19,2 ± 0,2°, 22,2 ± 0,2°, 25,4 ± 0,2°, 27,7 ± 0,2°, 28,5 ± 0,2° y 37,8 ± 0,2°.

(19) El cristal de acuerdo con (17) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos en los ángulos de difracción (20) de 7,1 ± 0,2°, 9,3 ± 0,2°, 12,6 ± 0,2°, 14,1 ± 0,2°, 17,7 ± 0,2°, 18,7 ± 0,2°, 19,2 ± 0,2°, 22,2 ± 0,2°, 25,4 ± 0,2°, 27,7 ± 0,2°, 28,5 ± 0,2° y 37,8 ± 0,2°.

(20) El cristal de acuerdo con (17) que tiene un punto de fusión de 219 °C ± 2 °C en una calorimetría diferencial de barrido.

(21) El cristal de acuerdo con (17) caracterizado por un espectro de difracción de rayos X de polvo sustancialmente idéntico al de la Figura 5.

(22) Un compuesto de la fórmula (VII):

[Producto quím. 14]

o una sal del mismo.

(23) Un monohidrato del compuesto de acuerdo con (22).

(24) El monohidrato de acuerdo con (23) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo en donde los ángulos de difracción (20) de al menos dos picos se seleccionan del grupo que consta de 5,4 ± 0,2°, 7,5 ± 0,2°, 8,4 ± 0,2°, 10,6 ± 0,2°, 11,9 ± 0,2°, 13,5 ± 0,2°, 20,2 ± 0,2° y 22,9 ± 0,2°.

(25) El monohidrato de acuerdo con (23) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos en los ángulos de difracción (20) de 5,4 ± 0,2°, 7,5 ± 0,2°, 8,4 ± 0,2°, 10,6 ± 0,2°, 11,9 ± 0,2°, 13,5 ± 0,2°, 20,2 ± 0,2° y 22,9 ± 0,2°.

(26) El monohidrato de acuerdo con (23) caracterizado por un espectro de difracción de rayos X de polvo sustancialmente idéntico al de la Figura 1.

(27) Un solvato del compuesto de la fórmula (VIII):

[Producto quím. 15]

(28) Un 1/2 hidrato del compuesto de la fórmula (VIII).

(29) El 1/2 hidrato de acuerdo con (28) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo en donde los ángulos de difracción (20) de al menos dos picos se seleccionan del grupo que consta de 9,5 ± 0,2°, 13,4 ± 0,2°, 18,0 ± 0,2°, 19,3 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,5 ± 0,2°, 22,8 ± 0,2°, 23,6 ± 0,2°, 27,5 ± 0,2° y 28,1 ± 0,2°.

(30) El 1/2 hidrato de acuerdo con (28) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos en los ángulos de difracción (20) de 9,5 ± 0,2°, 13,4 ± 0,2°, 18,0 ± 0,2°, 19,3 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,5 ± 0,2°, 22,8 ± 0,2°, 23,6 ± 0,2°, 27,5 ± 0,2° y 28,1 ± 0,2°.

(31) El 1/2 hidrato de acuerdo con (28) caracterizado por un espectro de difracción de rayos X de polvo sustancialmente idéntico al de la Figura 2.

(32) Un compuesto de la fórmula (IX):

[Producto quím. 16]

una sal del mismo o un solvato del mismo.

(33) Un cristal de un compuesto de la fórmula (IX).

(34) El cristal de acuerdo con (33) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo en donde los ángulos de difracción (20) de al menos dos picos se seleccionan del grupo que consta de 7,1 ± 0,2°, 14,1 ± 0,2°, 15,1 ± 0,2°, 21,0 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,9 ± 0,2° y 23,4 ± 0,2°.

(35) El cristal de acuerdo con (33) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos en los ángulos de difracción (20) de 7,1 ± 0,2°, 14,1 ± 0,2°, 15,1 ± 0,2°, 21,0 ± 0,2°, 21,2 ± 0,2°, 22,9 ± 0,2° y 23,4 ± 0,2°.

(36) El cristal de acuerdo con (33) caracterizado por un espectro de difracción de rayos X de polvo sustancialmente idéntico al de la Figura 3.

(37) Un cristal del compuesto de la fórmula (V):

[Producto quím. 17]

(38) El cristal de acuerdo con (37) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo en donde los ángulos de difracción (20) de al menos dos picos se seleccionan del grupo que consta de 9,6 ± 0,2°, 10,9 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 21,5 ± 0,2°, 22,1 ± 0,2°, 23,5 ± 0,2° y 24,8 ± 0,2°.

(39) El cristal del compuesto de acuerdo con (37) caracterizado por un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos en los ángulos de difracción (20) de 9,6 ± 0,2°, 10,9 ± 0,2°, 17,8 ± 0,2°, 21,5 ± 0,2°, 22,1 ± 0,2°, 23,5 ± 0,2° y 24,8 ± 0,2°.

(40) El cristal del compuesto de acuerdo con (37) caracterizado por un espectro de difracción de rayos X de polvo sustancialmente idéntico al de la Figura 6.

De acuerdo con el proceso de la presente invención, un derivado de piridona policíclica de fórmula (V) o (VI) puede prepararse eficientemente con alta pureza óptica.

[Breve descripción de los dibujos]

La Fig. 1 es un patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 3.

La Fig. 2 es un patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 9.

La Fig. 3 es un patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 13.

La Fig. 4 es un patrón de difracción de rayos X de polvo de un tosilato del compuesto 20.

La Fig. 5 es un patrón de difracción de rayos X de polvo de un mesilato del compuesto 21.

La Fig. 6 es un patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto (V).

La Figura 7 es un transcurso temporal de la concentración en plasma del compuesto de fórmula (V) después de la administración oral del compuesto de fórmula (VI), que es un profármaco del compuesto de fórmula (V), a ratas en condiciones de no ayuno.

La Figura 8 es un transcurso temporal de la concentración en plasma del compuesto de fórmula (VI) después de la administración oral del compuesto de fórmula (VI), que es un profármaco del compuesto de fórmula (V), a ratas en condiciones de no ayuno.

[Descripción detallada de las realizaciones preferidas]

Los significados de los términos usados en el presente documento se explican a continuación. A menos que se especifique lo contrario, cada término tiene el mismo significado cuando se usa solo o en combinación con otros términos.

La expresión "que consta de" significa tener solo los elementos descritos.

La expresión "que comprende" significa no limitarse a los elementos descritos y no excluir elementos no descritos. "Halógeno" incluye flúor, cloro, bromo o yodo. Son preferibles el flúor y el cloro, y el flúor es particularmente preferible. "Alquilo" significa un alquilo C1 a C6 lineal o ramificado, e incluye alquilo C1 a C4, alquilo C1 a C3 y similares. Algunos ejemplos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo y similares.

Ejemplo del grupo protector distinto del alquilo sin sustituir de R1 incluye bencilo.

Ejemplo del alquilo sin sustituir de R2 incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo y isohexilo; y son preferibles n-propilo, isobutilo, hexilo y similares; y hexilo es particularmente preferido.

El "grupo protector distinto del alquilo sin sustituir" no está limitado siempre que sea un grupo protector distinto del "alquilo" anterior y se retire en presencia de sal de sodio y/o sal de magnesio. El ejemplo incluye alquilo sustituido y similares, preferentemente bencilo y similares.

La "sal de sodio" no está limitada siempre que sea capaz de eliminar el "grupo protector distinto del alquilo". Sin embargo, en la presente invención, la sal de sodio se selecciona entre hidróxido sódico, hidruro sódico, isopropil óxido sódico y tere-pentóxido sódico. Una sal de sodio preferida es el tere-pentóxido sódico.

Ciertas sales de magnesio también pueden usarse en la presente invención. En particular, se puede usar cloruro de isopropilmagnesio o cloruro de ciclohexilmagnesio.

Las realizaciones preferidas de R1, R2, R3, R4, R5, R6 y "sal de sodio y/o sal de magnesio" se describen a continuación. Son preferibles los compuestos que tienen una posible combinación de las siguientes realizaciones.

R1 incluye hidrógeno o un grupo protector que no sea alquilo sin sustituir. En una realización preferida, R1 es un grupo protector distinto de alquilo sin sustituir y particularmente se prefiere bencilo.

R2 incluye alquilo sin sustituir. En una realización preferida, R2 incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo y similares, y son preferibles n-propilo, isobutilo, hexilo y similares y es particularmente preferible el hexilo.

En una realización preferida, "sal de sodio y/o sal de magnesio" es preferentemente "sal de magnesio" y es cloruro de isopropilmagnesio o cloruro de ciclohexilmagnesio. El cloruro de isopropilmagnesio es particularmente preferible. R3, R4, R5 y R6 cada uno de es independientemente hidrógeno o halógeno y el número de halógenos en R3, R4, R5 y R6 es uno o dos.

En una realización preferida, R3 es hidrógeno.

En una realización preferida, R4 es hidrógeno.

En una realización preferida, R5 es flúor.

En una realización preferida, R6 es flúor.

La expresión "el número de halógenos en R3, R4, R5 y R6 es uno o dos", como se usa en el presente documento, significa que uno o dos de R3, R4, R5 y R6 es halógeno.

En la presente descripción, hacer reaccionar un compuesto con un compuesto incluye hacer reaccionar una sal de tal compuesto o un solvato del mismo.

Los ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la presente invención incluyen sales con metales alcalinos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, etc.), metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio, bario, etc.), magnesio, metales de transición (por ejemplo, cinc, hierro, etc.), amoniaco, bases orgánicas (por ejemplo, trimetilamina, trietilamina, diciclohexilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, meglumina, etilendiamina, piridina, picolina, quinolina, etc.) o aminoácidos o sales de ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido carbónico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido yodhídrico, etc.) o ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido trifluoroacético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido mandélico, ácido glutárico, ácido málico, ácido benzoico, ácido Itálico, ácido ascórbico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido etansulfónico, etc.), particularmente, pueden mencionarse sales con ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico y similares. Estas sales se pueden formar de acuerdo con los métodos convencionales.

Los ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de fórmula (V) incluyen sales con metales alcalinos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, etc.), metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio, bario, etc.), magnesio, metales de transición (por ejemplo, cinc, hierro, etc.) y sales con metales alcalinos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, etc.) y son preferibles sales con metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio, bario, etc.). El compuesto de la presente invención o una de sus sales farmacéuticamente aceptables puede formar un solvato, tal como un hidrato, y/o un polimorfo cristalino, y la presente invención incluye diversos solvatos así como polimorfos cristalinos.

Los "solvatos" pueden ser aquellos en los que cualquier número de moléculas de disolvente (por ejemplo, moléculas de agua o similares) están coordinadas con el compuesto de la presente invención. Cuando el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se deja reposar en la atmósfera, puede absorber agua, dando como resultado la unión del agua adsorbida o la formación de hidratos. De manera adicional, el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede recristalizarse para formar un polimorfismo cristalino.

A continuación se ilustra un método para caracterizar el cristal de la presente invención. A menos que se mencione lo contrario, los valores numéricos en la descripción y las reivindicaciones son valores aproximados. Los valores numéricos pueden variar debido a la calibración del instrumento, el error del instrumento, la pureza del material, el tamaño del cristal, el tamaño de la muestra y otros factores.

El término "cristal" como se usa en el presente documento significa un material que tiene una estructura molecular ordenada de largo alcance. El grado de cristalinidad de la forma cristalina se puede medir mediante una serie de técnicas que incluyen, por ejemplo, difracción de rayos X en polvo, adsorción de humedad, análisis diferencial, análisis calorimétrico, colorimetría de solución, propiedades de disolución.

En general, un compuesto orgánico cristalino está formado por un gran número de átomos dispuestos periódicamente en un espacio tridimensional. La periodicidad estructural normalmente manifiesta distintas propiedades físicas que son claramente distinguibles por la mayoría de las sondas espectroscópicas (por ejemplo, difracción de rayos X, espectros infrarrojos, espectros Raman y RMN de estado sólido).

Entre otros, Se reconoce que la difracción de rayos X en polvo (XRPD) es uno de los métodos más sensibles para determinar la cristalinidad de los sólidos. Los rayos X que se irradian a los cristales se reflejan en los planos de la red cristalina y se interfieren entre sí. Después, solo se intensifican las líneas de difracción en la dirección que cumplen las condiciones predichas por la ley de Bragg, y la intensidad de las líneas de difracción de orden se anula y no se observa. Por otro lado, en el caso de los sólidos amorfos, no se observan las líneas de difracción ordenadas en un amplio intervalo. Los sólidos amorfos generalmente exhiben un amplio patrón de XRPD llamado patrón de halo debido a la ausencia del orden de largo alcance de la red cristalina repetitiva.

Una forma cristalina de los derivados de piridona policíclicos, productos intermedios, sales de los mismos y/o solvatos de los mismos descritos en esta descripción tiene preferentemente un perfil de difracción de rayos X en polvo distinguible. Por ejemplo, una forma cristalina del compuesto de fórmula (V) se puede distinguir preferentemente por la presencia de picos de difracción característicos. Los picos de difracción característicos como se usan en el presente documento son los seleccionados de un patrón de difracción observado. Preferentemente, los picos de difracción característicos se seleccionan del patrón de difracción entre aproximadamente veinte picos, más preferentemente aproximadamente diez picos y lo más preferentemente aproximadamente cinco picos.

En general, se sabe que las intensidades relativas de varios picos en las tablas y figuras que se muestran a continuación pueden variar debido a una serie de factores, como los efectos de orientación de los cristales en el haz de rayos X, la pureza del material a analizar o el grado de cristalinidad de la muestra. Las posiciones de los picos también pueden cambiar por variaciones en la altura de la muestra. Además, una medición con una longitud de onda diferente dará como resultado un cambio diferente según la ecuación de Bragg (nA=2d sen 0). Tales patrones XPRD obtenidos usando una longitud de onda diferente están dentro del alcance de la presente invención.

La forma cristalina de la presente invención se puede caracterizar mediante análisis térmico. DSC (calorimetría diferencial de barrido)

La DSC es uno de los principales métodos de medición para el análisis térmico y un método para medir las propiedades térmicas de la sustancia como un agregado de átomos/moléculas. Se puede obtener una curva de calorimetría de barrido diferencial midiendo el cambio de la capacidad calorífica sobre la temperatura o el tiempo de un ingrediente activo farmacéutico por DSC, y representando gráficamente los datos obtenidos en temperaturas o tiempos. La información de la temperatura de inicio, el máximo endotérmico y la entalpía de fusión de un principio activo farmacéutico se puede obtener a partir de una curva de calorimetría diferencial de barrido.

(Preparación de compuesto de la presente invención)

A continuación se ejemplifica un método general para la preparación del compuesto de la presente invención. Además, la extracción, purificación y similares pueden llevarse a cabo mediante métodos convencionales practicados en experimentos de química orgánica.

La síntesis del compuesto de la presente invención puede llevarse a cabo con referencia a métodos conocidos en la técnica.

Como compuesto de materia prima, pueden utilizarse compuestos comercialmente disponibles, compuestos descritos en la presente descripción, compuestos descritos en las referencias citadas en la presente descripción y otros compuestos conocidos.

Si se desea una sal del compuesto de la presente invención, se puede purificar como en el caso de que el compuesto de la presente invención se obtenga en forma de sal. En caso de que el compuesto se obtenga en forma libre, se disuelve o suspende en un disolvente orgánico adecuado y se le añade un ácido o una base para formar una sal por un método ordinario.

De manera adicional, el compuesto de la presente invención y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo pueden existir en forma de aducto con agua o varios disolventes (hidrato o solvato). La presente invención también incluye tales aductos.

La cuña y las líneas punteadas indican configuración absoluta.

El proceso de la presente invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, como sigue a continuación.

Etapa 1

[Producto quím. 18]

en donde R1 es hidrógeno o un grupo protector distinto de alquilo sin sustituir y R2 es alquilo sin sustituir.

En esta etapa, un compuesto de fórmula (I) se hace reaccionar con un alcohol de fórmula: R2-OH en presencia de una sal de sodio y/o una sal de magnesio seleccionada de hidróxido sódico, hidruro sódico, isopropóxido sódico, terc-pentóxido sódico, cloruro de isopropilmagnesio y cloruro de ciclohexilmagnesio para dar un compuesto de fórmula (II). El disolvente no está limitado siempre que permita que el proceso anterior se lleve a cabo de manera eficiente. Los ejemplos de tal disolvente incluyen diclorometano, tolueno, tetrahidrofurano y similares, que pueden usarse solos o en combinación. La reacción se puede llevar a cabo en una sola mezcla de disolventes o sin disolvente. El disolvente preferido es tetrahidrofurano.

La sal de sodio y/o la sal de magnesio es hidróxido sódico, hidruro sódico, isopropóxido sódico, terc-pentóxido sódico, cloruro de isopropilmagnesio o cloruro de ciclohexilmagnesio. Se prefiere el cloruro de isopropilmagnesio. La sal puede usarse en una cantidad de 0,1 a 5 equivalentes molares, preferentemente de 0,3 a 0,5 equivalentes molares, del compuesto (I).

La temperatura de reacción no está limitada, pero la reacción generalmente se puede llevar a cabo entre aproximadamente 0 y 100 °C, preferentemente entre 0 °C y la temperatura ambiente.

El tiempo de reacción no está limitado, pero la reacción normalmente se puede realizar durante 0,5 horas a 24 horas, preferentemente durante 1 a 10 horas.

Etapa 2

en donde R3, R4, R5 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno o halógeno siempre que uno o dos de R3, R4, R5 y R6 sean halógeno. Otros símbolos son los definidos anteriormente.

En esta etapa, un compuesto de fórmula (II') se hace reaccionar con un compuesto de fórmula (III) en presencia de un agente de condensación para obtener un compuesto de fórmula (IV).

El disolvente no está limitado siempre que permita que la etapa anterior se lleve a cabo de manera eficiente. El ejemplo del disolvente incluye acetato de etilo, ciclohexano, acetato de isopropilo, acetato de propilo, tolueno, 1,4-dioxano, DMA, DMF, tolueno, heptano, ciclopentil metil éter y similares, que se pueden usar individualmente o en combinación. La reacción se puede llevar a cabo en una sola mezcla de disolventes o sin disolvente. El disolvente preferido es un disolvente mixto de acetato de etilo y ciclohexano.

Los ejemplos del agente de condensación incluyen anhídrido propilfosfónico, ácido metanosulfónico, ácido trifluoroacético, monohidrato de ácido p-toluenosulfónico, ácido 10-alcanforsulfónico, ácido sulfúrico concentrado, ácido dicloroacético, hidrogenosulfato de tetrametilamonio y similares, y se pueden usar solos o en combinación, preferentemente, una mezcla de mezcla de propilfosfónico anhídrido y ácido metanosulfónico. El agente de condensación se puede usar en una cantidad de 1 a 5 equivalentes molares, preferentemente de 1 a 3 equivalentes molares, del compuesto (II').

La temperatura de reacción no está particularmente limitada, pero la reacción generalmente se puede llevar a cabo entre aproximadamente 0 y 100 °C, preferentemente entre 0 °C y la temperatura ambiente.

Etapa 3

[Producto quím. 20]

En esta etapa, se hace reaccionar un compuesto de fórmula (IV) con una sal metálica para obtener un compuesto de fórmula (IV").

El disolvente no está limitado siempre que permita que el proceso anterior se lleve a cabo de manera eficiente. Los ejemplos de tal disolvente incluyen N-metilpirrolidona, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida y similares, que se pueden usar individualmente o en combinación. Se prefiere la N-metilpirrolidona.

Los ejemplos de la sal metálica incluyen cloruro de litio y bromuro de litio y similares, y se prefiere el cloruro de litio. La sal metálica puede usarse en una cantidad de 1 a 20 equivalentes molares, preferentemente de 5 a 10 equivalentes molares, del compuesto (IV).

La temperatura de reacción no está particularmente limitada, pero la reacción normalmente se puede llevar a cabo entre aproximadamente 0 y 100 °C, preferentemente entre temperatura ambiente y 100 °C.

El tiempo de reacción no está limitado, pero la reacción normalmente se puede realizar durante 0,5 horas a 48 horas, preferentemente durante 12 a 24 horas.

Etapa 4

[Producto quím. 21]

en donde Pr es un grupo protector para un grupo hidroxi, tal como un grupo éster o un grupo éter, y las otras variables son como se han definido anteriormente.

En esta etapa, el compuesto (V'") se puede obtener según un método convencional para convertir el grupo hidroxilo del compuesto (IV") en un grupo éster o un grupo éter. Se pueden encontrar ejemplos de tal método Protective Groups in Organic Synthesis, Theodora W Green (John Wiley & Sons), Prog. Med 5: 2157-2161 (1985) y suministrado por The British Library-"The world's Knowledge".

Como se usa en el presente documento, "relación de diastereoisómeros" se refiere a la relación del porcentaje de área de HPLC entre los dos estereoisómeros que se muestran a continuación.

[Producto quím. 22]

El compuesto de fórmula (V) es útil para síntomas y/o enfermedades inducidas por virus de la gripe. Es útil para el tratamiento, la prevención y/o el alivio de los síntomas, por ejemplo, síntoma de resfriado relacionado con fiebre, escalofríos, cefalea, dolor muscular y sensación de inutilidad generalizada, inflamación de las vías respiratorias tales como dolor de garganta, secreción nasal, nariz congestionada, tos, flema, síntoma gastrointestinal tales como dolor de estómago, emesis, diarrea, además, enfermedad concomitante relacionada con una infección secundaria tales como encefalopatía aguda, neumonía.

El compuesto representado por la fórmula (VI) puede ser un excelente medicamento porque tiene ventajas tales como alta capacidad de absorción oral, buena biodisponibilidad, buena eliminación, alta migración pulmonar y similares.

El compuesto representado por la fórmula (V) puede ser un medicamento con efectos secundarios reducidos porque tiene una alta actividad inhibidora de la endonucleasa dependiente de la caperuza, que es una enzima específica de virus y, por lo tanto, tiene un efecto altamente específico.

Adicionalmente, el compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) son excelentes en términos de estabilidad metabólica, alta solubilidad, alta capacidad de absorción oral, buena biodisponibilidad, buena eliminación, alta transitividad pulmonar, larga semivida, alta tasa de unión a no proteínas, baja inhibición del canal hERG, baja inhibición de CYP, efecto de supresión del CPE (CytoPathic Effect) y/o en que también tiene la ventaja de que es negativo en la prueba de fototoxicidad, prueba de Ames, prueba de genotoxicidad o no tiene toxicidad tal como daño hepático. Por lo tanto, el compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) pueden ser un medicamento excelente.

El compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) pueden administrarse por vía oral o parenteral. Para la administración oral, el compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) pueden usarse en cualquier forma de formulaciones habituales, por ejemplo, formulaciones en una forma sólida tales como comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas; formulaciones en una forma líquida tales como formulación acuosa; suspensión oleaginosa; jarabe o elixir. Para la administración parenteral, el compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) pueden usarse en forma de inyección de suspensión acuosa u oleaginosa o gotas nasales. En la preparación de una formulación tal, pueden usarse opcionalmente excipientes, agentes aglutinantes, lubricantes, disolventes acuosos, disolventes oleaginosos, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes convencionales y similares. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) puede prepararse combinando (por ejemplo, mezclando) una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Para la administración oral, la dosificación diaria del compuesto de fórmula (V) y/o el compuesto de fórmula (VI) puede ser de aproximadamente 0,05-3000 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1-1000 mg por día para un adulto, mientras que dicha dosificación varía dependiendo de la vía de administración de la misma, la edad, el peso corporal, las condiciones del paciente y la enfermedad en el paciente. La dosis puede dividirse para la administración, si es necesario. En el caso de administración parenteral, la dosis diaria para un adulto puede estar entre aproximadamente 0,01-1000 mg, con preferencia aproximadamente 0,05-500 mg.

[Ejemplos]

La presente invención se explica con más detalle con referencia a los Ejemplos, Ejemplos de referencia, Ejemplos de preparación para intermedios y Ejemplos de prueba.

El análisis de RMN en los Ejemplos de referencia y los Ejemplos se realizó usando DMSO-d6, CDCh a 400 MHz.

Patrón de difracción de rayos X en polvo

El análisis de difracción de rayos X de polvo del cristal obtenido en cada Ejemplo se realizó de acuerdo con el método de análisis de difracción de rayos X de polvo en las Pruebas Generales de la Farmacopea Japonesa bajo las siguientes condiciones.

(Dispositivo)

MinFlex600 RINT-TTRIII (Rigaku)

(Método)

Detector: Detector unidimensional de alta velocidad (D/TecUltra 2) y filo de cuchilla variable

Método de medición: método de reflexión

Tipo de fuente de luz: bulbo de Cu

Longitud de onda del tratamiento: Rayo CuKa

Corriente del tubo: 10 mA o 15 mA

Voltaje del tubo: 30 Kv o 40 Kv

Placa de muestra: aluminio o vidrio

Ángulo de incidencia de rayos X (0): 3-40°, anchura de muestreo: 0,01° o

Ángulo de incidencia de rayos X (0): 4-40°, anchura de muestreo: 0,02°

En general, dado que los ángulos de difracción (20) en la difracción de rayos X en polvo pueden implicar errores dentro de ± 0,2°, los valores del ángulo de difracción incluyen valores dentro del intervalo de aproximadamente ± 0,2°. Por lo tanto, la presente invención incluye no sólo cristales en los que los ángulos de difracción de los picos en la difracción de rayos X en polvo coinciden completamente, sino también cristales en los que los ángulos de difracción de los picos coinciden con errores de aproximadamente ± 0,2°.

(Medición del contenido de agua por el método de Karl Fischer)

El contenido de agua se determinó de acuerdo con las Pruebas generales para la determinación de agua (titulación coulombimétrica) en la Farmacopea japonesa. Se usó Aquamicron™ AX (Mitsubishi Chemical Corporation) como solución de anolito y Aquamicron™ CXU como solución de catolito.

En general, una medición del contenido de agua por el método de Karl Fischer puede implicar un error dentro del intervalo de ± 0,3 %. En consecuencia, un valor específico de contenido de agua medido debe abarcar cualquier valor dentro del intervalo de ± 0,3 %.

Mediación de TG/DTA

Se realizó la medición de TG/DTA de los cristales obtenidos en cada ejemplo. Se pesó una muestra en un plato de aluminio y se midió en un sistema abierto. Las condiciones de medición se muestran a continuación.

Aparato: TG/DTA 7200 (Hitachi High-Tech Science)

Intervalo de medición de temperatura: 30 °C-250 °C

Velocidad de calentamiento: 10 °C/min

En general, la medición de TG/DTA puede implicar un error dentro del intervalo de ± 2 °C. En consecuencia, un valor específico medido debe abarcar cualquier valor dentro del intervalo de ± 2 °C.

Sorción dinámica de vapor (DVS)

Se llevó a cabo un análisis dinámico de sorción de vapor de los cristales obtenidos en cada ejemplo. Se pesó una muestra en una bandeja de muestra y se midió en las condiciones siguientes.

Aparato: DVS Advantage (Surface Measurement Systems Ltd.)

Punto de medición: de RH al 0 % a RH al 95 % escalonada 5 %, después RH al 95 % a RH al 0 % escalonada 5 % Temperatura: 25 °C o 60 °C

Medición de calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Se realizó la medición DSC de los cristales obtenidos en cada ejemplo. Se pesó una muestra en un platillo de acero inoxidable con sello hermético y se midió en las siguientes condiciones.

Aparato: METTLER TOLEDO DSC 822e

Intervalo de medición de temperatura: 30 °C-300 °C

Velocidad de calentamiento: 10 °C/min

Atmósfera: N240 ml/min

En general, la calorimetría diferencial de barrido (DSC) puede implicar un error dentro del intervalo de ± 2 °C. En consecuencia, un valor específico medido por calorimetría diferencial de barrido (DSC) debe abarcar cualquier valor dentro del intervalo de ± 2 °C.

El significado de cada término en los Ejemplos es el que se indica a continuación.

DMA: N,N-dimetilacetamida

THF: tetrahidrofurano

T3P: propilfosfónico anhídrido (trímero cíclico)

Ejemplo 1: Preparación del compuesto 3

[Producto quím. 23]

Etapa 1: Compuesto 3

Se añadió DMA (300 ml) al compuesto 1 (100,00 g, 406 mmol) y la mezcla se agitó. Se añadieron hidrogenocarbonato sódico (44,41 g, 529 mmol), sulfato de dimetilo (58,91 g, 467 mmol) y DMA (100 ml) y se agitó a 25 °C durante 7 horas. Se añadieron ácido clorhídrico sintético (16,90 g) y agua (500 g) a la mezcla de reacción y la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo (1000 y 550 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera al 5 % (300 g) y agua (300 g). La capa orgánica combinada se concentró a aproximadamente 500 g a presión reducida. Se añadió acetato de etilo (350 ml) al concentrado y la solución resultante se concentró a aproximadamente 500 g a presión reducida. Se añadió DMA (300 ml) al concentrado y la solución resultante se concentró a aproximadamente 400 g a presión reducida. Se añadieron p-toluenosulfonato de piridinio (265,42 g) y DMA (100 ml) al concentrado y la mezcla de reacción se calentó a 60 °C. Una solución de carbazinato de tere-butilo (69,80 g, 528 mmol) en DMA (100 ml) se añadió lentamente a la mezcla de reacción durante 6 horas. La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 3 horas y se enfrió a 25 °C. Se añadieron etanol (100 ml) y agua (290 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla de reacción se calentó a 30 °C. Una mezcla de etanol (100 ml) y agua (520 ml) se añadió lentamente a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y después se agitó a 0 °C durante 1,5 horas. El precipitado resultante de color blanco amarillento pálido se recogió por filtración. El sólido resultante se lavó con una mezcla de etanol (480 ml) y agua (720 ml) y se secó para dar monohidrato del compuesto 3 (122,70 g, rendimiento del 77 %) en forma de un sólido de color blanco amarillento pálido.

RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5:1,45 (s, 9H), 3,77 (s, 3H), 5,26 (s, 2H), 6,39 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,27-7,47 (m, 6H), 7,64 8,23 (s a, 1H)

Difracción de rayos X en polvo 20 (°): 5,4, 7,5, 8,4, 10,6, 11,9, 13,5, 20,2, 22,9

El patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 3 se muestra en la Fig. 1.

Contenido de agua por el método de Karl Fischer: 4,5 %

Ejemplo 2: Preparación del compuesto 9

[Producto quím. 24]

Etapa 1: Compuesto 6

Se añadieron el compuesto 5 (28,29 g, 167,4 mmol) y DMA (65 ml) al compuesto 4 (20,00 g, 104,6 mmol) y la mezcla se agitó. Después de que la mezcla se calentase a 40 °C, se añadió lentamente tere-butóxido sódico (15,09 g, 157,0 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 3 horas y después se enfrió a 20 °C. Se añadieron ácido acético (3,14 g) y una solución acuosa al 10 % de cloruro sódico (64 g) a la mezcla de reacción y la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo (60 ml). Se añadió agua (144 ml) a la capa orgánica combinada y la mezcla se enfrió a 0 °C. El precipitado resultante de color blanco amarillento pálido se recogió por filtración. El sólido resultante se lavó con una mezcla de metanol (5,4 g) y agua (48,6 g) y se secó para dar el compuesto 6 (20,44 g, rendimiento del 78 %) en forma de un sólido de color blanco amarillento pálido.

RMN 1H (CDCla) 5: 3,34 (s, 6H), 3,53 (d, J = 5,2 Hz, 2H), 3,76 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,90 (t, J = 5,6 Hz, 2 H), 4,43 (t, J = 5,2 Hz, 1 H), 7,70 - 7,73 (m, 2 H), 7,84 - 7,87 (m, 2 H)

Etapa 2 Compuesto 8

Se añadieron etanol (20 ml) y agua (20 ml) al compuesto 6 (20,02 g, 71,68 mmol) y la mezcla se agitó. La mezcla se calentó a 60 °C. La mezcla se añadió con una solución acuosa al 60 % de monohidrato de hidrazina (8,99 g, 107,7 mmol) y se agitó a 60 °C durante 4 horas. Después de la adición de agua (40 ml) seguido de enfriamiento a 30 °C, se añadió una solución acuosa al 17 % de hidróxido potásico (92,12 g) a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se extrajo cuatro veces con cloruro de metileno (120, 78, 78, 78 ml). La capa orgánica combinada se lavó con agua (20 ml) y se concentró a aproximadamente 160 g a presión reducida. Se añadió THF (100 ml) al concentrado y la mezcla se concentró a aproximadamente 40 g a presión reducida. Se añadió THF (100 ml) al concentrado y la mezcla se concentró a aproximadamente 40 g a presión reducida. Se añadió THF (20 ml) al concentrado y la mezcla se concentró a aproximadamente 15 g a presión reducida para obtener 15 g de una solución del compuesto 7 en THF.

La solución de THF anterior del compuesto 7 (14,71 g), THF (7 g) y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno (379,0 mg) se añadieron al compuesto 3 (10,00 g, 25,5 mmol) y la mezcla se agitó. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y después se agitó a 60 °C durante 24 horas. Después de que la mezcla de reacción se enfriara a 25 °C, se añadieron agua (28 g) y ácido acético (3,72 g). La mezcla de reacción se extrajo dos veces con acetato de etilo (50, 30 ml) y la capa orgánica se lavó con una solución acuosa al 5 % de hidrogenocarbonato sódico (30 g) y agua (28 g). La capa orgánica se concentró a aproximadamente 36 g a presión reducida. Se añadió acetato de etilo a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se concentró a aproximadamente 36 g a presión reducida. Se añadió heptano (65 ml) al concentrado y la mezcla se enfrió a 5 °C. Después de agitar a 5 °C durante 1 hora, el precipitado resultante de color blanco amarillento pálido se recogió por filtración. El sólido resultante se lavó con una mezcla de heptano (32 ml) y acetato de etilo (14 ml) y se secó para obtener el compuesto 8 (10,10 g, rendimiento del 81 %) en forma de un sólido de color blanco amarillento pálido.

RMN 1H (CDCla) 5:1,44 (s, 9H), 3,32-3,48 (m, 12H), 4,41 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 5,29 (s, 2H), 6,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,11 7,50 (m, 7H), 8,46 (s, 1H).

Etapa 3: Compuesto 9

Se añadieron acetonitrilo (170 ml) y agua (30 ml) al compuesto 8 (19,99 g, 40,7 mmol) y la mezcla se agitó. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y se añadió lentamente ácido metanosulfónico (11,70 g, 121,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 6 horas y después se enfrió a 25 °C. Se añadió una solución acuosa al 30 % de hidróxido sódico (15,91 g) a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se concentró a aproximadamente 100 g a presión reducida. Se añadió agua (50 ml) al concentrado y la mezcla resultante se concentró a aproximadamente 100 g a presión reducida. Después de agitar el concentrado a 25 °C durante 30 minutos, el precipitado resultante de color amarillo se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con agua (40 ml) y se secó para obtener 0,5 hidrato del compuesto 9 (10,43 g, rendimiento del 76 %) en forma de cristales de color amarillo.

RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), 5: 2,95 (ddd, J = 13,7, 12,3, 4,3 Hz, 1H), 3,13 (dd, J = 11,2, 10,0 Hz, 1H), 3,44 (td, J = 11,9, 3,1 Hz, 1H), 3,96-4,08 (m, 2H), 4,14 (dd, J = 13,9, 2,4 Hz, 1H), 4,80 (ddd, J = 12,6, 9,9, 4,5 Hz, 1H), 5,08 (s, 2H), 6,22 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,24-7,41 (m, 4H), 7,52-7,60 (m, 2H), 7,69 (d, J = 7,6 Hz, 1H)

Difracción de rayos X en polvo 20 (°): 9,5, 13,4, 18,0, 19,3, 21,2, 22,5, 22,8, 23,6, 27,5, 28,1

El patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 9 se muestra en la Fig. 2.

Contenido de agua por el método de Karl Fischer: 2,8 %

[Producto quím. 25]

Etapa 1: Compuestos 11 y 12

Se añadieron acetato de etilo (87 ml) y una solución de T3P acetato de etilo al 50 % (p/p) (145,80 g, 229,1 mmol) a 0,5 hidrato del compuesto 9 (30,00 g, 89,2 mmol) y la mezcla se agitó. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C, se añadió trietilamina (18,55 g, 183,3 mmol) y después se añadió lentamente ácido (R)-(+)-tetrahidrofurano-2-carboxílico (12,24 g, 105,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 4,5 horas y después se enfrió a 0 °C y el precipitado resultante de color amarillo pálido se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con acetato de etilo (120 ml) para obtener el compuesto 11 (18,34 g, sin secar) en forma de un sólido de color amarillo pálido. También, el filtrado y la solución de lavado se combinaron para obtener una solución de acetato de etilo del compuesto 12 (358,60 g).

Etapa 2: Compuestos 13 y 9

Se añadieron acetato de etilo (120 ml) y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno (530 mg, 3,5 mmol) al compuesto 11 (15,28 g) y la mezcla se agitó. La mezcla de reacción se calentó a 30 °C y se añadió lentamente una mezcla de metanol (1,67 g) y acetato de etilo (43 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y el precipitado resultante de color blanco se recogió por filtración. Los cristales obtenidos se lavaron con acetato de etilo (60 ml) y se secaron para obtener cristales de color blanco del compuesto 13 (11,06 g, rendimiento del 45 %).

RMN 1H (CDCl3) 8: 2,84-2,92 (m, 2H), 3,45 (td, J = 3,2 Hz, 12,0 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 4,0 Hz, 11,2 Hz, 1H), 3,92 (dd, J = 4,4 Hz, 11,6 Hz, 1H), 4,13 (dd, J = 2,8 Hz, 13,6 Hz, 1H), 4,47-4,54 (m, 1H), 4,96 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,76 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 6,19 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,30-7,38 (m, 3H), 7,59 (dd, J = 1,6 Hz, 8,0 Hz, 2H).

Difracción de rayos X en polvo 20 (°): 7,1, 14,1, 15,1,21,0, 21,2, 22,9, 23,4

El patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 13 se muestra en la Fig. 3.

Una solución del compuesto 12 en acetato de etilo (334,69 g) se concentró a aproximadamente 170 g a presión reducida. La solución concentrada se agitó a 25 °C. Se añadió lentamente acetonitrilo (224 ml), agua (56 ml) y una solución acuosa al 24 % de hidróxido sódico (150 g) a la mezcla y después, se separó en la capa orgánica y la capa acuosa. Se añadió agua (14 ml) a la capa acuosa y se extrajo dos veces con acetonitrilo (168 ml). La capa orgánica combinada se concentró a aproximadamente 250 g a presión reducida. El concentrado se calentó a 60 °C y se añadió 1,8-diazabiciclo[5.4.0]-7-undeceno (19,01 g, 124,9 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 3,5 horas y después se enfrió a 40 °C. Se añadió ácido clorhídrico acuoso al 5,8 % (50,40 g) a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se enfrió a 25 °C para obtener una solución (314,96 g). Se concentró una porción de la solución (158,86 g) a aproximadamente 85 g a presión reducida. El concentrado se agitó a 20 °C durante 2 horas y se añadió agua (28 ml). La mezcla de reacción se concentró a aproximadamente 100 g a presión reducida. Después de agitar el concentrado a 20 °C durante 1 hora, los cristales precipitados de color blanco amarillento pálido se recogieron por filtración. Los cristales obtenidos se lavaron con agua (42 ml) y se secaron para obtener el compuesto 9 (5,93 g, rendimiento del 42 %) en forma de cristales de color blanco amarillento pálido.

Ejemplo 4: Compuesto 19

[Producto quím. 26]

Etapa 1: Compuesto 15

Se añadió diisopropilamina (7,69 g, 76,0 mmol) a THF (25 ml), y la mezcla se agitó y se enfrió a -40 °C. Después de la adición de n-butil litio 1,6 mol/l (43,5 ml, 69,6 mmol), la mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 1 hora. La mezcla se enfrió a -40 °C y se añadió lentamente una solución de ácido 3,4-difluorobenzoico (5,00 g, 31,6 mmol) en THF (25 ml). La mezcla de reacción se agitó a -40 °C durante 1 hora y se añadió lentamente N,N-dimetilformamida (5,74 g, 78,5 mmol). A la mezcla de reacción, se le añadió ácido clorhídrico acuoso 6 mol/l (34,25 ml) y la mezcla se calentó a 25 °C y se separó en la capa orgánica y la capa acuosa. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (15 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (5 ml). Después de la concentración a presión reducida, se añadió tolueno al residuo para obtener una solución de tolueno del compuesto 15.

Etapa 2: Compuesto 16

Se añadieron tolueno (17,8 ml), tiofenol (3,90 g, 35,4 mmol) y ácido D-alcanforsulfónico (1,16 g, 5,0 mmol) a la solución anterior del compuesto 15. La mezcla se agitó y se calentó a 60 °C. La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 4 horas y después se enfrió a 5 °C. Se añadió una solución 2 mol/l de hidróxido sódico (10 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se calentó a 25 °C. La mezcla de reacción se extrajo con tolueno (10 ml) y la capa orgánica se lavó con hidróxido sódico 2 mol/l (5 ml) y agua (10 ml). Después de la concentración de la capa orgánica a presión reducida, se añadió tolueno para obtener una solución de tolueno del compuesto 16.

Etapa 3: Compuesto 17

Una mezcla de cloruro de aluminio (5,52 g, 41,4 mmol) y tolueno (25 ml) se agitó y se enfrió a 0 °C. Una solución de 1,1,3,3-tetrametildisiloxano (5,56 g, 41,4 mmol) en tolueno (10 ml) se añadió gota a gota a la mezcla de reacción y la mezcla se calentó a 25 °C. La solución de tolueno anterior del compuesto 16, se añadió lentamente a la mezcla de reacción y la mezcla se agitó a 25 °C durante 2,5 horas. Después de la adición de una solución acuosa al 15 % de ácido sulfúrico (35 ml) la mezcla se agitó y después se separó en la capa orgánica y la capa acuosa. La capa orgánica se lavó dos veces con agua (20 ml). La solución se concentró a aproximadamente 16 g a presión reducida. Se añadió lentamente heptano (40 ml) al concentrado y se enfrió a 0 °C. El precipitado resultante de color blanco se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con heptano (20 ml) y después se secó para obtener el compuesto 17 (7,20 g, rendimiento del 81,3 %) en forma de un sólido de color blanco.

RMN 1H (CDCla) 8:4,61 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,09-7,15 (m, 1H), 7,23-7,27 (m, 3H), 7,34-7,37 (m, 2H), 7,84-7,88 (m, 1H)

Etapa 4: Compuesto 18

Se agitó ácido polifosfórico (425,0 g) y se calentó a 80 °C. Se añadió el compuesto 17 (85,0 g), y la mezcla se calentó a 120 °C y se agitó a 120 °C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 80 °C y se añadió lentamente agua (200 ml). La mezcla de reacción se enfrió a 30 °C y se añadió agua (850 ml). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (850 ml). La capa orgánica se lavó con agua (425 ml) y una solución acuosa al 10 % de hidrogenocarbonato sódico (255 ml). El disolvente se evaporó a presión reducida y se añadió heptano (340 ml) al residuo obtenido. El disolvente se evaporó a presión reducida y se añadió heptano (85 ml) al residuo obtenido. Después de agitar la mezcla de reacción a 30 °C durante 30 minutos, el precipitado resultante de color pardo se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con heptano (42 ml) y después se secó para obtener el compuesto 18 (72,0 g, rendimiento del 91 %) en forma de un sólido de color pardo.

RMN 1H (CDCl3) 8:4,14 (d, J = 1,0 Hz, 2H), 7,09-7,18 (m, 1H), 7,27-7,33 (m, 1H), 7,34-7,45 (m, 3H), 8,19 (dd, J = 8,5 Hz, 1,4 Hz, 1H)

Etapa 5: Compuesto 19

Se suspendió borohidruro sódico (234,0 mg, 6,2 mmol) en una solución acuosa al 0,5 % de hidróxido sódico (1,8 ml) para preparar una suspensión de borohidruro sódico. Se añadieron 2-propanol (20 ml) y agua (2,25 ml) al compuesto 18 (4,5 g, 17,2 mmol). La mezcla se agitó y se calentó a 40 °C. La suspensión anterior de borohidruro sódico se añadió lentamente a la mezcla. La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante 1,5 horas y se enfrió a 25 °C. se añadió agua (32 ml) a la mezcla de reacción, seguido de la adición de una solución mezcla de agua (6,7 ml) y una solución acuosa al 62 % de ácido sulfúrico (460 mg). La mezcla de reacción se enfrió a 5 °C y el precipitado resultante de color pardo se recogió por filtración. El sólido se lavó con agua (18 ml) y después se secó para obtener el compuesto 19 (4,4 g, rendimiento del 97 %) en forma de un sólido de color pardo.

RMN 1H (CDCl3) 8: 2,67 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 14,4, 1,4 Hz, 2H), 4,68 (dd, J = 14,5, 1,3 Hz, 2H), 7,02 (dt, J = 9,7, 8,3 Hz, 1H), 7,12-7,21 (m, 4H), 7,44-7,49 (m, 1H)

Ejemplo 5: Compuestos (V) y (VI)

[Producto quím. 27]

Etapa 1-1: Compuesto 20

Se combinaron 1-hexanol (22,5 g, 220 mmol) y THF (24,6 g) y la temperatura de la mezcla se ajustó a 20 °C. Se añadió una solución de cloruro de isopropilmagnesio en THF (2 mol/l, 7,2 g, 14,7 mmol) a la mezcla para preparar una solución de hexóxido de magnesio.

Se añadió 1-hexanol (22,5 g, 220 mmol) al compuesto 13 (12,0 g, 36,7 mmol) con agitación y la temperatura de la mezcla se ajustó a 20 °C. La solución anterior de hexóxido de magnesio se añadió a la suspensión resultante del compuesto 13. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 4 horas y después se añadió una solución acuosa de ácido cítrico (3,1 g de monohidrato de ácido cítrico y 36 g de agua). La mezcla se extrajo con THF (10,7 g) y la capa orgánica se lavó con agua (24 g). La capa orgánica se concentró a aproximadamente 55 g a presión reducida. Se añadió una solución de ácido p-toluenosulfónico en THF (7,0 g de monohidrato de ácido p-toluenosulfónico y 42,8 g de THF) al concentrado resultante. La mezcla se concentró a aproximadamente 61 g a presión reducida. Se añadió THF (42,7 g) al concentrado y la mezcla resultante se concentró a aproximadamente 61 g a presión reducida. Después de calentar la mezcla a 50 °C, se añadió metil ferc-butil éter (133,0 g). La mezcla resultante se enfrió a 10 °C y se agitó a 10 °C durante 1,5 horas. El precipitado resultante de color blanco se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con una mezcla de metil ferc-butil éter (40,0 g) y acetato de etilo (16,0 g) y se secó para obtener el tosilato del compuesto 20 (15,8 g, rendimiento del 87,2 %) en forma de cristales de color blanco.

RMN 1H (CDCla) 8: 0,88 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,25-1,34 (m, 4H), 1,34-1,43 (m, 2H), 1,76-1,85 (m, 2H), 2,34 (s, 3H), 3,04 (ddd, J = 13,6, 11,7, 4,3 Hz, 3H), 3,36 (dd, J = 11,6, 10,0 Hz, 3H), 3,43 (ddd, J = 13,6, 12,0, 4,4 Hz, 3H), 4,00 (dd, J = 11,7, 4,3 Hz, 1H), 4,06-4,18 (m, 4H), 4,80 (a, s, 1H), 7,16 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 8,40 (a, s, 1H).

Difracción de rayos X en polvo 20 (°): 5,9, 8,4, 11,6, 12,7, 13,1, 15,7

El patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 20 se muestra en la Fig. 4.

Etapa 1-2: Compuesto 20

Se llevó a cabo una reacción como se describe en la Etapa 1-1 usando una solución de cloruro de ciclohexilmagnesio en THF (16,2 % en peso, 0,4 equiv.) en lugar de la solución de cloruro de isopropilmagnesio en THF (0,4 equiv.) y la mezcla de reacción se analizó por HPLC para determinar la velocidad de formación del compuesto 20.

Porcentaje de área de HPLC del compuesto 20: 90,9 % (Tr = 11,0 min) Los otros procedimientos fueron los mismos que se describen en la Etapa 1-1.

(Condición de medición)

(1) Columna: X Select™ CSH C18 (3,5 pm d.i. 4,6 x 100 mm) (Waters)

Caudal: 1,0 ml/min; longitud de onda de detección UV: 254 nm; Fase móvil:

[A]solución acuosa al 0,1 % de ácido fórmico, [B] Programa de gradiente de acetonitrilo: (Concentración de [B]) 15 %-15 % 5 min; 15 %-60 % 10 min; 60 %-85 % 2 min; 85 %-85 % 3 min.

Etapa 1-3: Compuesto 20

Se añadió 1-hexanol (27,5 g, 270 mmol) al compuesto 13 (4,91 g, 15,0 mmol) y la mezcla se agitó. La temperatura de la mezcla se ajustó a 0 °C. Se añadió una solución de ferc-pentóxido sódico en THF (1,4 mol/l, 45,0 mmol) a la suspensión resultante. Después de agitar a 0 °C durante 2,5 horas, la mezcla de reacción se analizó por HPLC para determinar la velocidad de formación del compuesto 20.

Porcentaje de área de HPLC del compuesto 20: 93,3 % (Tr = 9,5 min)

(Condición de medición)

(1) Columna: CHIRALPAK™ IB (5,0 pm d.i. 4,6 x 250 mm) (DAICEL)

Caudal: 1,0 ml/min; longitud de onda de detección UV: 254 nm; Fase móvil: [A] ácido fórmico al 0,1 %, [B] Programa de gradiente de acetonitrilo:

mantenido con disolvente [B] al 35 % durante 5 min; gradiente lineal con disolvente [B] del 35 % al 85 % durante 6 min; y mantenido con disolvente [B] al 85 % durante 2 min.

Como se ha mostrado anteriormente, se encontró que la reacción transcurría con buen rendimiento cuando se usaba una sal de magnesio o una sal de sodio. El producto deseado se obtuvo con alto rendimiento, especialmente cuando se usa cloruro de isopropilmagnesio.

Etapa 2: Mesilato del compuesto 21

Se añadieron el compuesto 19 (8,0 g, 30,3 mmol), acetato de etilo (48,7 g) and ciclohexano (14,1 g) al compuesto 20 (12,0 g, 24,3 mmol) y la mezcla se agitó a 25 °C. Se añadió una solución al 50 % (p/p) de T3P acetato de etilo (20,91 g, 32.9 mmol) seguido de la adición de ácido metanosulfónico (3,5 g, 36,4 mmol). La mezcla se calentó a 60 °C y se agitó durante 24 horas. Después de enfriar a 25 °C, se añadieron THF (32,0 g) y agua (24,0 g) y después se añadió lentamente una solución acuosa al 24 % de hidróxido sódico (30,8 g). Después de sedimentar, la mezcla se separó en la capa orgánica y la capa acuosa. La capa orgánica se lavó dos veces con una solución acuosa al 7 % de cloruro sódico (60,0 g). Una solución de ácido metanosulfónico (2,80 g, 29,1 mmol) en ciclohexano (9,3 g) y acetato de etilo (32,1 g) se añadió a la capa orgánica combinada. La mezcla se agitó a 25 °C durante 2 horas y el precipitado resultante de color blanco se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con acetato de etilo (43,3 g) y después se secó para obtener mesilato del compuesto 21 (13,65 g, rendimiento del 84,6 %) en forma de cristales de color blanco.

RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,90 (3H, t, J = 6,0 Hz), 1,29-1,36 (4H, m), 1,39-1,49 (2H, m), 1,67-1,79 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,94 (1H, s a), 3,30 (1H, td, J = 11,6, 2,4 Hz), 3,51 (1H, t, J =10,4 Hz), 3,66 (1H, dd, J = 11,2, 2,8 Hz), 3,92-4,01 (2H, m), 4,07 (1H, d, J =14,3 Hz), 4,20 (1H, s), 4,42-4,52 (1H, m), 5,43 (1H, dd, J = 14,4, 2,1 Hz), 5,79-5,83 (2H, m), 6,81 (1H, td, J = 7,6, 1,2 Hz), 6,96 (1H, dd, J = 7,8, 1,0 Hz), 7,09 (1H, J = 8,0, 1,6 Hz), 7,12-7,18 (1H, m), 7,32 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,37-7,49 (2H, m)

Difracción de rayos X en polvo 20 (°): 7,1, 9,3, 12,6, 14,1, 17,7, 18,7, 19,2, 22,2, 25,4, 27,7, 28,5, 37,8

El patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 21 se muestra en la Fig. 5.

CDB: Inicio 216 °C, Pico 219 °C.

Etapa 3: Compuesto (V)

Se añadió cloruro de litio (8,6 g, 203,3 mmol) a una mezcla de N-metilpirrolidona (52,4 g) y el compuesto 21 (15,0 g, 22,6 mmol) y la mezcla resultante se calentó a 75 °C. La mezcla se agitó a 75 °C durante 20 horas y después se enfrió a 40 °C. Se añadió acetonitrilo (20,0 g) a la mezcla de reacción, seguido de la adición de agua (11,6 g). Después de enfriar la mezcla a 30 °C y agitar durante 30 minutos, se añadió lentamente agua (142,5 g). Después de agitar a 30 °C durante 1,5 horas, el precipitado resultante de color blanco se recogió por filtración. El sólido obtenido se lavó con 2-propanol (60,1 g) y después se secó para obtener el compuesto (V) (9,91 g, rendimiento del 90,7 %) en forma de cristales de color blanco.

RMN 1H (CDCl3) 8: 3,00 (td, J = 11,8, 3,2 Hz, 1H), 3,46 (td, J = 12,0, 2,8 Hz, 1H), 3,59 (t, J = 10,0 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 12,2, 3,0 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 11,0, 3,0 Hz, 1H), 4,07 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 4,58 (dd, J = 10,0, 2,8 Hz, 1H), 4,67 (dd, J = 13,6, 2,0 Hz, 1H), 5,26-5,30 (m, 2H), 5,75 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,83-6,87 (m, 1H), 6,99 7,04 (m, 2H), 7,07-7,15 (m, 3H).

Difracción de rayos X en polvo 20 (°): 9,6, 10,9, 17,8, 21,5, 22,1, 23,5, 24,8

El patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto (V) se muestra en la Fig. 6.

Etapa 4: Compuesto (VI)

Se mezclaron clorometil metil carbonato (0,483 g, 3,10 mmol), carbonato potásico (0,572 g, 4,14 mmol) y yoduro potásico (0,343 g, 2,07 mmol) con una suspensión del compuesto (V) (1,00 g, 2,07 mmol) en DMA (5 ml). La mezcla se calentó a 50 °C y se agitó durante 6 horas. Se añadió DMA (1 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se agitó durante 6 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió DMA (6 ml). La mezcla se agitó a 50 °C durante 5 minutos y después se filtró. Se añadieron gota a gota ácido clorhídrico 1 mol/l (10 ml) y agua (4 ml) al filtrado obtenido en enfriamiento con hielo, y después, la mezcla se agitó durante 1 hora. El sólido precipitado se recogió por filtración y se secó a presión reducida a 60 °C durante 3 horas para obtener el compuesto (VI) (1,10 g, 1,93 mmol, rendimiento del 93 %).

RMN 1H (DMSO-D6) 8: 2,91-2,98 (1H, m), 3,24-3,31 (1H, m), 3,44 (1H, t, J = 10,4 Hz), 3,69 (1H, dd, J = 11,5, 2,8 Hz), 3,73 (3H, s), 4,00 (1H, dd, J = 10,8, 2,9 Hz), 4,06 (1H, d, J =14,3 Hz), 4,40 (1H, d, J = 11,8 Hz), 4,45 (1H, dd, J = 9,9, 2.9 Hz), 5,42 (1H, dd, J = 14,4, 1,8 Hz), 5,67 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,72-5,75 (3H, m), 6,83-6,87 (1H, m), 7,01 (1H, d, J = 6,9 Hz), 7,09 (1H, dd, J = 8,0, 1,1 Hz), 7,14-7,18 (1H, m), 7,23 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,37-7,44 (2H, m). RMN 1H (DMSO-D6) 8: 2,91-2,98 (1H, m), 3,24-3,31 (1H, m), 3,44 (1H, t, J =10,4 Hz), 3,69 (1H, dd, J = 11,5, 2,8 Hz), 3,73 (3H, s), 4,00 (1H, dd, J = 10,8, 2,9 Hz), 4,06 (1H, d, J = 14,3 Hz), 4,40 (1H, d, J =11,8 Hz), 4,45 (1H, dd, J = 9,9, 2,9 Hz), 5,42 (1H, dd, J = 14,4, 1,8 Hz), 5,67 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,72-5,75 (3H, m), 6,83-6,87 (1H, m), 7,01 (1H, d, J = 6,9 Hz), 7.09 (1H, dd, J = 8,0, 1,1 Hz), 7,14-7,18 (1H, m), 7,23 (1H, d, J =7,8 Hz), 7,37-7,44 (2H, m).

Ejemplo 6: Preparación de los compuestos 33 a 41 y relación diastereoisomérica de los mismos

[Producto quím. 28]

Compuesto (II) Compuesto (IV) R2 % de relación de rendimiento diastereoisómeros a:b

Etapa 1: Compuestos 24 a 32

Los compuestos 24 a 32 se prepararon de acuerdo con las Etapas 1-1, 1-2 y 1-3 del Ejemplo 5, así como con métodos convencionales.

Etapa 2: Compuestos 33 a 41

Con el procedimiento de la Etapa 2 descrito en el Ejemplo 5, cada uno de los compuestos 24 a 32 se hizo reaccionar con el compuesto 19, y la mezcla de reacción se analizó por HPLC para determinar la relación de diastereoisómeros de los compuestos 33 a 41.

Compuesto 33a: Tr 6,4 min / Compuesto 33b: Tr 6,7 min

Compuesto 34a: Tr 8,9 min / Compuesto 34b: Tr 9,3 min

Compuesto 35a: Tr 9,8 min / Compuesto 35b: Tr 10,1 min

Compuesto 36a: Tr 10,7 min / Compuesto 36b: Tr 11,1 min

Compuesto 37a: Tr 12,5 min / Compuesto 37b: Tr 12,8 min

Compuesto 38a: Tr 13,4 min / Compuesto 38b: Tr 13,8 min

Compuesto 39a: Tr 8,7 min / Compuesto 39b: Tr 9,0 min

Compuesto 40a: Tr 9,9 min / Compuesto 40b: Tr 10,2 min

Compuesto 41a: Tr 10,6 min / Compuesto 41b: Tr 11,0 min

(Tr: tiempo de retención en la medición de HPLC)

(Condición de medición)

Columna: KINETEX™ (2,6 pm C18 d.i. 4,6 x 100 mm) (Shimadzu)

Caudal: 1,0 ml/min; longitud de onda de detección UV: 254 nm; Fase móvil: [A]solución acuosa al 0,1 % de ácido fórmico, [B] ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo

Programa de gradiente: comenzó con disolvente [B] al 25 %; gradiente lineal con disolvente [B] del 25 % al 70 % durante 10 min; y mantenido con disolvente [B] al 70 % durante 8 min.

Ejemplo de prueba 1: Medición de la actividad inhibidora de endonucleasa dependiente de la caperuza (CEN)

1) Preparación de sustrato

Un 30mero de ARN (5'-pp-[m2'-O]GAA UAU(-Cy3) GCA UCA CUA GUA AGC UUU GCU CUA-BHQ2-3', Japan Bioservice), en donde G en el extremo 5' se ha modificado con difosfato, el grupo hidroxi en la posición 2' se ha modificado por metoxilación, U en la sexta posición desde el extremo 5' se ha marcado con Cy3 y el extremo 3' se ha marcado con BHQ2, se compró y se añadió una estructura de caperuza usando el sistema ScriptCap fabricado por EPICENTER para dar al producto m7G [5']-ppp-[5'] [m2'-O]GAA UAU(-Cy3) GCA UCA CUA GUA AGC UUU GCU CUA(-BHQ2)-3'). El producto se aisló y se purificó por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se usó como sustrato.

2) Preparación de enzima

RNP se preparó a partir de una partícula de virus de acuerdo con el método convencional (Referencia: VIROLOGY (1976) 73, p327-338 OLGA M. ROCHOVANSKY). Específicamente, se inoculó huevo de gallina embrionado de 10 días de edad con virus A/WSN/33 (1 x 103 UFP/ml, 200 pl). Después de la incubación a 37 °C durante 2 días, se recuperó el líquido alantoideo del huevo de gallina. Una partícula vírica se purificó por ultracentrifugación con sacarosa al 20 %, se solubilizó con TritonX-100 y lisolecitina y se recogió una fracción de RNP (50-70 % de fracción de glicerol) mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad con glicerol al 30-70 % y se usó como solución enzimática (que contenía aproximadamente 1 nM de complejo PB1/PB2/PA).

3) Reacción enzimática

2,5 pl de solución de reacción enzimática (Trisclorhidrato 53 mM (pH 7,8), MgCh 1 mM, ditiotreitol 1,25 mM, NaCl 80 mM, glicerol al 12,5%, 0,15 pl de solución enzimática) se dispensaron en una placa de polipropileno de 384 pocillos. Después, se añadieron 0,5 pl de una solución de compuesto de prueba que se había diluido en serie con dimetil sulfóxido (DMSO) a la placa. Para el control positivo (PC) y el control negativo (NC), se añadieron 0,5 pl de DMSO a la placa, respectivamente. Las soluciones se mezclaron bien. Después, se añadieron 2 pl de solución de sustrato (ARN sustrato 1,4 nM, Tween 20 al 0,05 %) para iniciar la reacción. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos, se añadió 1 pl de la solución de reacción a 10 pl de una solución de formamida Hi-Di (que contenía GeneScan 120 Liz Size Standard como un marcador de tamaño: fabricado por Applied Biosystem (ABI)) para inactivar la reacción. Para el NC, la reacción se inactivó añadiendo EDTA (4,5 mM) por adelantado antes del inicio de la reacción (las concentraciones indicadas son la concentración final).

4) Medición de la velocidad de inhibición (valor de CI⁵⁰)

La solución de reacción como se inactivó anteriormente se calentó a 85 °C durante 5 minutos y después se enfrió rápidamente en hielo durante 2 minutos y se analizó en un ABI PRIZM 3730 Genetic Analyzer. El máximo del producto de endonucleasa dependiente de la caperuza se cuantificó mediante el programa informático de análisis ABI Genemapper. Se determinó la relación de inhibición de la reacción CEN (%) del compuesto de prueba, siendo la intensidad de fluorescencia de PC y NC 0 % de inhibición y 100 % de inhibición, respectivamente y los valores de CI⁵⁰se determinaron usando un programa informático de ajuste de curvas (XLfit 2.0: Modelo 205 (IDBS)).

Ejemplo de prueba 2: Efecto de supresión de CPE

• E-MEM con FCS al 2 % (preparado añadiendo kanamicina y FCS a MEM (Medio Esencial Mínimo) (Invitrogen)) • E-MEM con BSA al 0,5 % (preparado añadiendo kanamicina y BSA a MEM (Medio Esencial Mínimo) (Invitrogen)) • HBSS (solución salina equilibrada de Hanks)

• Células MDBK (ajustadas al número de célula apropiado (3 x 105/ml) con FCS al 2 % E-MEM)

• Células MDCK (preparadas lavando dos veces con HBSS y ajustadas al número de células adecuado (5 x 105/ml) con BSA al 0,5 % E-MEM)

• Solución de tripsina (Se disolvió tripsina de páncreas porcino (SIGMA) en PBS(-) y se filtró con un filtro de 0,45 |jm) • EnVision (PerkinElmer)

• Kit WST-8 (Kishida Chemical Co., Ltd.)

• Solución de SDS al 10%

<Métodos>

Dilución y dispensación de la muestra de prueba

Como un medio de cultivo, se usó FCS al 2 % E-MEM para las células MDBK y BSA al 0,5 % E-MEM para las células MDCK. Se usó el mismo medio de cultivo para la dilución del virus, las células y las muestras de prueba.

La muestra de prueba se diluyó preliminarmente con un medio de cultivo a una concentración adecuada y se preparó una serie de diluciones en serie de 2 a 5 veces (50 jl/pocillo) en una placa de 96 pocillos. Se prepararon dos juegos de placas para la medición de la actividad antigripal y la medición de la citotoxicidad, respectivamente. Las mediciones se realizaron en triplete para cada fármaco.

Cuando se usan células MDCK para medir la actividad antigripal, se añadió tripsina a las células de tal manera que la concentración final fuera de 3 ug/ml.

Dilución y dispensación del virus de la gripe

Los virus de la gripe se diluyeron a una concentración adecuada con un medio de cultivo y se distribuyeron a razón de 50 jl/pocillo en una placa de 96 pocillos que contenía la muestra de prueba. A la placa para medir la citotoxicidad, se dispensaron 50 jl/pocillo de la solución de cultivo.

Dilución y dispensación de células

Las células se diluyeron al número de células apropiado y se dispensaron a razón de 100 jl/pocillo en una placa de 96 pocillos que contenía la muestra de ensayo.

El cultivo celular se mezcló usando un mezclador de placas y se incubó en una incubadora de CO². Las células se cultivaron durante 3 días para la medición de actividad antigripal y la medición de citotoxicidad.

Dispensación de WST-8

Una placa de 96 pocillos cultivada durante 3 días se observó a simple vista y al microscopio para comprobar la morfología de las células y la presencia o ausencia de cristales. El sobrenadante se retiró para no inhalar las células de la placa.

Se diluyó un kit WST-8 10 veces con medio de cultivo y se dispensaron 100 j l de solución WST-8 en cada pocillo. Después de mezclar usando una mezcladora de placas, las células se incubaron en una incubadora de CO²durante 1 a 3 horas.

Para medir la actividad antigripal, después de que se incubara la placa, se dispensó solución de SDS al 10 % (10 jl) en cada pocillo para inactivar el virus.

Medición de absorbancia

Después de mezclar en una placa de 96 pocillos, la absorbancia se midió en un EnVision a dos longitudes de onda de 450 nm/620 nm.

<Cálculo de valores de medición>

Los valores se calcularon usando Microsoft Excel o un programa que tuviera la capacidad equivalente de cálculo y procesamiento, basándose en la siguiente ecuación.

Cálculo de la concentración eficaz para lograr una inhibición del 50 % de la muerte de célula infectada con gripe (CE⁵⁰) CE50 = 10z

Z = (50 % - % de alta)/(% de alta - % de baja) * {log(Conc. alta) - log(Conc. baja)} log(Conc. alta) Los resultados del Ejemplo de prueba 1 y el Ejemplo de prueba 2 para el Compuesto (V) se muestran a continuación.

Ejemplo de prueba 1 (CEN CI 50): 1,93 nM,

Ejemplo de prueba 2 (CPE CE 50): 1,13 nM

Los resultados anteriores revelaron que el compuesto de fórmula (V) muestra una alta actividad inhibidora de la endonucleasa dependiente de la caperuza (CEN) y/o un alto efecto inhibidor de CPE y, por lo tanto, es útil como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de síntomas y/o enfermedades inducidas por la infección por el virus de la gripe.

Los ejemplos de pruebas biológicas de los Compuestos (V) y (VI) se describen a continuación.

Ejemplo de prueba 3: Prueba de inhibición de CYP

Usando microsoma hepático humano combinado disponible en el mercado y empleando, como una referencia, reacciones típicas del metabolismo del sustrato de las cinco principales formas de enzimas CYP humanas (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4), es decir, O-desetilación de 7-etoxiresorufina (CYP1A2), metilhidroxilación de tolbutamida (CYP2C9), 4'-hidroxilación de mefenitoína (CYP2C19), O-desmetilación de dextrometorfano (CYP2D6) e hidroxilación de terfenedina (CYP3A4), se evaluó el grado de inhibición por el Compuesto (V) para la producción de cada metabolito.

Las condiciones de reacción fueron como sigue:

Sustrato: etoxirresorufina 0,5 pmol/l (CYP1A2), tolbutamida 100pmol/l (CYP2C9), S-mefenitoína 50 pmol/l (CYP2C19), dextrometorfano 5 pmol/l (CYP2D6), terfenedina 1 pmol/l (CYP3A4); Tiempo de reacción: 15 minutos; Temperatura de reacción: 37 °C; Enzima: microsoma hepático humano combinado 0,2 mg de proteína/ml; Concentración de Compuesto (V): 1, 5, 10, 20 pmol/l (cuatro puntos).

Para cada una de las cinco sustancias, se preparó una solución de reacción en una placa de 96 pocillos añadiendo el sustrato, microsoma hepático humano y Compuesto (V) a 50 mmol/l de tampón Hepes en la proporción descrita anteriormente. NADPH, que es un cofactor, se añadió para iniciar la reacción del metabolismo. Después de incubar a 37 °C durante 15 minutos, se añadió una solución de metanol/acetonitrilo = (1/1 (v/v)) para inactivar la reacción. Después de centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos, la resorufina (metabolito CYP1A2) en el sobrenadante se midió mediante un contador multimarcador fluorescente y la hidroxitolbutamida (metabolito CYP2C9), la 4'-hidroximefenitoína (metabolito CYP2C19), el dextrorfano (metabolito CYP2D6) y el alcohol de terfenadina (metabolito CYP3A4) se midieron mediante CL/EM/EM.

Como un control, se añadió DMSO (el disolvente para disolver el Compuesto (V)) únicamente al sistema de reacción. La actividad restante (%) del Compuesto (V), con respecto al control (100 %), se calculó en cada concentración del compuesto y la CI⁵⁰se calculó por presunción inversa mediante un modelo logístico usando la concentración y la tasa de inhibición.

(Resultado)

Compuesto (V): > 20 pmol/l para las cinco formas enzimáticas

Ejemplo de prueba 4: Prueba BA

Materiales y métodos para estudios de absorción oral

(1) Animal: ratón o rata SD

(2) Condición de cría: se permitió que el ratón o la rata SD tomaran libremente alimento sólido y agua del grifo esterilizada.

(3) Dosis y agrupación: administrado por vía oral o intravenosa a una dosis predeterminada; la agrupación es como sigue (La dosis depende del compuesto)

Administración oral: 1 a 30 mg/kg (n=2 a 3)

Administración intravenosa: 0,5 a 10 mg/kg (n=2 a 3)

(4) Preparación de la solución de dosificación: una solución o un estado de suspensión para administración oral; un estado solubilizado para administración intravenosa

(5) Método de administración: administración gástrica forzada mediante sonda oral para administración oral; administración desde la vena caudal con una jeringa equipada con aguja para administración intravenosa (6) Criterio de valoración: se recogió sangre a lo largo del tiempo y se midió la concentración en plasma de los Compuestos (V) y (VI) mediante CL/EM/EM.

(7) Análisis estadístico: con respecto a la transición de la concentración en plasma de los Compuestos (V) y (VI), el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo (AUC) se calculó mediante el programa de mínimos cuadrados no lineales WinNonlin™ y la biodisponibilidad (BA) de los Compuestos (V) y (VI) se calculó a partir de las AUC del grupo de administración oral y grupo de administración intravenosa.

(Resultado)

Compuesto (V): 4,2 %

Compuesto (VI): 14,9 %

Los resultados anteriores revelaron que el profármaco tiene una biodisponibilidad mejorada sobre el compuesto parental.

En consecuencia, el compuesto de fórmula (VI) es excelente en absorción oral y es útil como medicamento en el tratamiento y/o la prevención de síntomas y/o enfermedades inducidas por la infección con el virus de la gripe.

Ejemplo de prueba 5: Prueba de estabilidad del metabolismo

El compuesto (V) se hizo reaccionar con microsomas hepáticos humanos agrupados disponibles en el mercado durante un cierto tiempo. La tasa restante del compuesto se calculó comparando la muestra que había reaccionado y la muestra que no había reaccionado para evaluar el grado de metabolismo del Compuesto (V) en el hígado.

El compuesto se hizo reaccionar en 0,2 ml de tampón (Tris-HCl 50 mmol/l pH 7,4, cloruro potásico 150 mmol/l, cloruro de magnesio 10 mmol/l) que contiene 0,5 mg de proteína/ml de microsomas hepáticos humanos a 37 °C durante 0 minutos o 30 minutos en presencia de NADPH 1 mmol/l (reacción oxidativa). Después de la reacción, se añadieron 50 |jl de la solución de reacción a 100 j l de metanol/acetonitrilo = 1/1 (v/v), se mezclaron y se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos. La cantidad de Compuesto (V) en el sobrenadante se midió por CL/EM/EM y se calculó la tasa restante del compuesto después de la reacción, siendo la cantidad del compuesto en el minuto 0 del tiempo de reacción del 100 %. La reacción de hidrólisis se llevó a cabo en ausencia de NADPH, y la reacción de glucuronidación se llevó a cabo en presencia de 5 mmol/l de ácido UDP-glucurónico en lugar de NADPH y el procedimiento posterior se llevó a cabo de la misma manera que se describe.

(Resultados)

La tasa restante en el metabolismo oxidativo a 2 jmol/Ll del compuesto se muestra a continuación.

Compuesto (V): 90,1 %

Ejemplo de prueba 6: Prueba MBI fluorescente de CYP3A4

La prueba MBI fluorescente de CYP3A4 investiga la mejora de la inhibición de CYP3A4 por el Compuesto (V) en la reacción del metabolismo. La 7-benciloxitrifluorometilcumarina (7-BFC) se desbenciló mediante la enzima CYP3A4 (enzima expresada en Escherichia coli) y se produjo un metabolito, 7-hidroxitrifluorometilcumarina (7-HFC) que emite luz fluorescente. La prueba se realizó usando la reacción de producción de 7-HFC como un índice.

Las condiciones de reacción fueron como sigue:

Sustrato, 7-BFC 5,6 pmol/l; tiempo de pre-reacción, 0 o 30 minutos; tiempo de reacción, 15 minutos; temperatura de reacción, 25 °C (temperatura ambiente); contenido de CYP3A4 (expresado en Escherichia coli), 62,5 pmol/ml en pre reacción, 6,25 pmol/ml en la reacción (a una dilución de 10 veces); concentración de Compuesto (V), 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 pmol/l (seis puntos).

Una solución de pre-reacción que contenía la enzima y el Compuesto (V) en tampón K-Pi (pH 7,4) como se ha descrito anteriormente se añadió a una placa de 96 pocillos. Una parte de la solución se transfirió a otra placa de 96 pocillos y se diluyó 1/10 con un sustrato y tampón K-Pi. NADPH, como un cofactor, se añadió para iniciar la reacción (sin preincubación) y se añadió acetonitrilo/Tris (trishidroxiaminometano) 0,5 mol/l = 4/1 (V/V) para inactivar la reacción después de la incubación durante un tiempo predeterminado. También, a otra solución de preincubación se añadió NADPH para iniciar la preincubación (con preincubación). Después de la preincubación durante un tiempo predeterminado, una parte de la solución se transfirió a otra placa y se diluyó 1/10 con un sustrato y tampón K-Pi para iniciar la reacción. Después de la reacción durante un tiempo predeterminado, se añadió acetonitrilo/Tris (trishidroxiaminometano) 0,5 mol/l = 4/1 (V/V) para inactivar la reacción. Para cada una de las placas en las que se realizó la reacción, el valor de fluorescencia del metabolito 7-HFC se midió mediante un lector de placas fluorescentes (Ex = 420 nm, Em = 535 nm).

Como un control de la actividad restante, se añadió DMSO (es decir, el disolvente para disolver el Compuesto (V)) únicamente al sistema de reacción, y se calculó la actividad restante (%) para cada concentración de Compuesto (V) en la solución. El valor de CI⁵⁰se calculó por presunción inversa por modelo logístico usando la concentración y la tasa de inhibición. Una diferencia de 5 pM o más en los valores de CI⁵⁰se definió como (+) y una diferencia de 3 pM o menos se definió como (-).

(Resultados)

Compuesto (V): (-)

Ejemplo de prueba 7: Prueba de Ames de Fluctuación

Se evaluó la mutagenicidad del Compuesto (V).

Cada 20 pl de Salmonella typhimurium congelada (cepa TA98 y TA100) se inoculó en 10 ml de medio nutritivo líquido (2,5 % de caldo nutritivo Oxoid N.° 2) y los cultivos se incubaron a 37 °C en agitación durante 10 horas. El cultivo TA98 (9 ml) se centrifugó (2000 x g, 10 minutos) para retirar el medio y las bacterias se suspendieron en 9 ml de tampón Micro F (K²HPO⁴: 3,5 g/l, KH²PO⁴: 1 g/l, (N H ^S O ⁴: 1 g/l, citrato trisódico dihidrato: 0,25 g/l, MgSO4^7H2O: 0,1 g/l). La suspensión se añadió a 110 ml de medio de exposición (tampón Micro F que contiene biotina: 8 pg/ml, histidina: 0,2 pg/ml, glucosa: 8 mg/ml). El cultivo TA100 (3,16 ml) se añadió a 120 ml de medio de exposición para preparar la solución bacteriana de prueba. La solución bacteriana de prueba (588 pl), o en el caso del sistema de activación metabólica, una solución mixta de la solución bacteriana de prueba (498 pl) y la mezcla S9 (90 pl) se mezcló con cada 12 pl de las siguientes soluciones: Compuesto (V) en DMSO, diluido en serie 2 o 3 veces en varias etapas desde la dosis máxima de 50 mg/ml; DMSO como control negativo; 50 pg/ml de 4-nitroquinolina-1-óxido en DMSO como control positivo para TA98 sin sistema de activación metabólica; 0,25 pg/ml de 2-(2-furil)-3-(5-nitro-2-furil)acrilamida en DMSO como control positivo para TA100 sin sistema de activación metabólica; 40 pg/ml de 2-aminoantraceno en DMSO como control positivo para TA98 con sistema de activación metabólica; o 20 pg/ml de 2-aminoantraceno en DMSO como control positivo para TA100 con sistema de activación metabólica. La mezcla se incubó a 37 °C con agitación durante 90 minutos. La solución bacteriana expuesta de esta manera al Compuesto (V) (460 pl) se añadió a 2300 pl de medio indicador (tampón Micro F que contiene biotina: 8 pg/ml, histidina: 0,2 pg/ml, glucosa: 8 mg/ml, Púrpura de bromo cresol: 37,5 pg/ml) y cada 50 pl de la mezcla se dosificó en una microplaca (48 pocillos por dosis). Después de un cultivo estacionario a 37 °C durante 3 días, un pocillo que contiene bacterias, que ha adquirido una capacidad proliferativa por mutación en el gen que codifica el aminoácido (histidina) sintetasa, cambia el color de púrpura a amarillo debido al cambio de pH. Se contó el número de pocillos amarillos entre los 48 pocillos por dosis para evaluar la mutagenicidad comparándolos con el grupo de control negativo. (-) significa que la mutagenicidad es negativa y (+) significa positiva.

(Resultado)

Compuesto (V): (-)

Ejemplo de prueba 8: prueba de hERG

Con el fin de evaluar el riesgo de una prolongación del intervalo QT de un electrocardiograma, los efectos del compuesto (V) en la corriente del rectificador retardado K+ (IKr), que desempeña una función importante en el proceso de repolarización ventricular, se investigó usando células HEK293 que expresan canal del gen humano relacionado con éter a-go-go (hERG).

Usando un sistema de pinzamiento zonal automatizado (PatchXpress 7000A, Axon Instruments Inc.), una célula se mantuvo a un potencial de membrana de -80 mV mediante el método de pinzamiento zonal de células enteras. La IKr inducida por estimulación de pulso de despolarización a 40 mV durante 2 segundos y, además, la estimulación de impulsos de repolarización a -50 mV durante 2 segundos se registraron. Después de estabilizarse la corriente generada, una solución extracelular (NaCl: 135 mmol/l, KCl: 5,4 mmol/l, NaH²PO⁴: 0,3 mmol/l, C a C h ^^O : 1,8 mmol/l, MgCl²'⁶H²O: 1 mmol/l, glucosa: 10 mmol/l, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazin etanosulfónico): 10 mmol/l, pH=7,4) que contenía el Compuesto (V) a una concentración diana se aplicó a la célula a temperatura ambiente durante 10 minutos. Desde la Ik según se registra, se determinó un valor absoluto de la corriente máxima de cola basándose en el valor de corriente al potencial de membrana en reposo usando un programa informático de análisis (DataXpress ver.1, Molecular Devices Corporation). Además, se calculó la tasa de inhibición de la corriente máxima de cola antes de aplicar el Compuesto (V) y se comparó con el grupo al que se le aplicó el vehículo (solución de dimetilsulfóxido al 0,1 %) para evaluar la influencia del Compuesto (V) en Ikr.

(Resultado)

La tasa de inhibición de 0,3 a 10 pmol/l del compuesto se muestra a continuación.

Compuesto (V): 7,9 %

Ejemplo de prueba 9: Ensayo de solubilidad

La solubilidad del Compuesto (V) se determinó en condiciones de adición de DMSO al 1 %. Se preparó una solución de 10 mmol/l del compuesto en DMSO y se añadieron respectivamente 2 j l de la solución del Compuesto (V) a 198 j l de la solución de JP-1 (2,0 g de cloruro de sodio, 7,0 ml de ácido clorhídrico y agua hasta alcanzar los 1000 ml) y solución de JP-2 (3,40 g de dihidrogenofosfato potásico y 3,55 g de hidrogenofosfato sódico anhidro disueltos en agua hasta alcanzar 1000 ml, seguido de la adición de 1 volumen de los cuales a 1 volumen de agua). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla se filtró. El filtrado se diluyó diez veces con metanol/agua = 1/1 (v/v) y la concentración del compuesto en el filtrado se midió usando CL/EM mediante el método de calibración absoluta. (Resultado)

Compuesto (V): 42,2 jmol/l

Ejemplo de prueba 10: Prueba de solubilidad en polvo

Se colocaron cantidades apropiadas de Compuesto (V) en recipientes apropiados. A los respectivos recipientes se añadieron 200 j l de solución de JP-1 (cloruro sódico 2,0 g, ácido clorhídrico 7,0 ml y agua hasta llegar a 1000 ml), 200 j l de solución de JP-2 (se añadieron 500 ml de agua a 50 ml de tampón fosfato (pH 6,8)) y 200 j l de solución de taurocolato de sodio (TCA)/JP-220 mmol/l (TCA 1,08 g y agua hasta llegar a 100 ml). Si el Compuesto (V) se disolvió por completo después de añadirlo a la solución de prueba, el Compuesto (V) se añadió adicionalmente según fuera apropiado. Los recipientes se sellaron y se agitaron durante 1 hora a 37 °C. Las mezclas se filtraron y se añadieron 100 j l de metanol a cada uno de los filtrados (100 j l) de tal manera que los filtrados se diluyeron dos veces. La relación de dilución se cambió si fue necesario. Se observaron las diluciones en busca de burbujas y precipitados y después los recipientes se sellaron y agitaron. La cuantificación del Compuesto (V) se realizó por HPLC con un método de calibración absoluta.

(Resultado)

Compuesto (V): Solución de JP-1; 7,1 jg/ml, Solución de JP-24,4 jg/ml, TCA 20 mmol/l/solución de JP-2 16,1 jg/m l Ejemplo de prueba 11 prueba de Ames

Se realizó la prueba de Ames usando Salmonellas (Salmonella typhimurium) TA 98, TA100, TA1535 y TA1537 y Escherichia coli WP2uvrA como cepa de prueba con o sin activación metabólica en la preincubación para comprobar la presencia o ausencia de mutagenicidad génica del Compuesto (V).

(Resultado)

Compuesto (V): (-)

Ejemplo de prueba 12: prueba de fotohemólisis

El compuesto (V) se disolvió a una concentración predeterminada y se mezcló en una microplaca con una suspensión de glóbulos rojos del 0,1 al 0,0008 % (2,5% v/v) preparada a partir de sangre de oveja desfibrinada ovina. La irradiación de luz en las regiones de longitud de onda UVA y UVB (10 J/cm2, 290-400 nm) usando una lámpara fluorescente ultravioleta (lámpara GL20SE, Sankyo Denki y lámpara FL20S-BLB, Panasonic). La solución mixta después de la irradiación se recogió y centrifugó. Después de la centrifugación, el sobrenadante se recogió y se transfirió a una microplaca y se midió la absorbancia (a 540 o 630 nm) del sobrenadante. La absorbancia a 540 y 630 nm se usó como índice del daño biológico de la membrana (% de hemólisis leve) y la peroxidación de la membrana lipídica (producción de metahemoglobina), respectivamente. (-): menos del 10 % para la tasa de fotohemólisis y menos del 0,05 para el cambio de absorbancia a 630 nm; (+): 10 % o más para la tasa de fotohemólisis y 0,05 o más para el cambio de absorbancia a 630 nm.

(Resultado)

Compuesto (V): (-)

La Figura 7 y la Figura 8 muestran el transcurso del tiempo de la concentración en plasma del Compuesto (V) y su profármaco Compuesto (VI) después de la administración oral del Compuesto (VI) a ratas sin ayunar.

La concentración del Compuesto (VI) en la muestra de plasma estuvo por debajo del límite de cuantificación, lo que indica que el Compuesto (VI), que es un profármaco del Compuesto (V), se convirtió en el Compuesto (V) in vivo rápidamente después de la administración (véase la Figura 8).

Los resultados de estas pruebas revelan que un compuesto profármaco se absorbió en el cuerpo después de la administración oral y se convirtió rápidamente en su compuesto parental en la sangre. Por lo tanto, los Compuestos (V) y (VI) son útiles como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de síntomas y/o enfermedades inducidas por la infección por el virus de la gripe.

Ejemplo de prueba 13: Prueba de administración intravenosa Materiales y Métodos

(1) Animal de prueba: Ratas SD

(2) Condiciones de crianza: Las ratas SD permitieron el libre acceso a alimentos sólidos y agua del grifo estéril. (3) Ajuste de dosis y agrupación: Administrado por vía intravenosa de acuerdo con una dosificación predeterminada. Los grupos se establecieron como sigue (la dosis se puede cambiar para cada compuesto). Administración intravenosa: 0,5 a 1 mg/kg (n = 2 a 3)

(4) Preparación del líquido de administración: Solubilizado para administración intravenosa.

(5) Método de administración: De la vena de la cola con una jeringa equipada con aguja.

(6) Criterio de valoración: se recogió sangre a lo largo del tiempo y se midió la concentración en plasma del Compuesto (V) mediante CL/EM/EM

(7) Análisis estadístico: La eliminación corporal total (CLtot) y la semivida de eliminación (t1/2, z) se calcularon usando el programa de mínimos cuadrados no lineales WinNonlin™ a partir del curso temporal de la concentración del Compuesto (V) en plasma.

(Resultado)

Compuesto (V):

CLtot: 16,4 ml/min/kg

t1/2, z: 3,4 horas

Los resultados anteriores revelaron que el Compuesto (V) tiene una eliminación del cuerpo completo baja y una semivida larga.

En consecuencia, el Compuesto (V) puede ser un fármaco que es excelente en persistencia y útil como medicamento para el tratamiento y/o la prevención de síntomas y/o enfermedades inducidas por la infección por el virus de la gripe. El compuesto y el proceso de la presente invención son útiles como un intermedio para producir un compuesto útil como un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de síntomas y/o enfermedades inducidas por la infección por el virus de la gripe. De acuerdo con el método de la presente invención, el compuesto de fórmula (V) y el compuesto de fórmula (VI) pueden producirse eficientemente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (II):

en la que R2 es alquilo sin sustituir;

caracterizado por hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (I):

en la que R1 es hidrógeno o un grupo protector que no sea alquilo sin sustituir, con un compuesto de la fórmula:

R2-OH,

en la que R2 es como se ha definido anteriormente, en presencia de una sal de sodio y/o una sal de magnesio; en donde la o cada sal de sodio y/o sal de magnesio se seleccionan de hidróxido sódico, hidruro sódico, isopropóxido sódico, ferc-pentóxido sódico, cloruro de isopropilmagnesio y cloruro de ciclohexilmagnesio.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la reacción se lleva a cabo en presencia de una sal de magnesio.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la reacción se lleva a cabo en presencia de cloruro de isopropilmagnesio.

4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde R1 es bencilo.

5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde R2 es hexilo.

6. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (IV):

en la que R3, R4, R5 y R6 son, cada uno independientemente, hidrógeno o halógeno, siempre que uno o dos de R3, R4, R5 y R6 sean halógeno;

caracterizado por hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (II'):

con un compuesto de la fórmula (III):

en la que R3, R4, R5 y R6 son como se han definido anteriormente.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde R3 es hidrógeno, R4 es hidrógeno, R5 es flúor y R6 es flúor.

8. Un proceso para preparar el compuesto de la fórmula (V) o de la fórmula (VI):

que comprende el proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un compuesto de la fórmula (II'):

o una sal del mismo.

10. La sal del compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, que es un tosilato.

11. Un cristal de la sal de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un compuesto de la fórmula (IV'):

o una sal del mismo.

13. La sal del compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, que es un mesilato.

14. Un cristal de la sal de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Un cristal del compuesto de la fórmula (V):