WO2002053722A1

WO2002053722A1 - Ginsenoside glycosidase hydrolisant le ginsenoside glycosyle et son utilisation

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Publication number: WO2002053722A1
Application number: PCT/CN2000/000744
Authority: WO
Inventors: Fengxie Jin; Hongshan Yu
Original assignee: Fengxie Jin; Hongshan Yu
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2002-07-11
Also published as: CN1479787A; US20040028671A1; CN1479787B; JP4953547B2; US7759101B2; DE60040875D1; EP1354944B1; JP2004519224A; EP1354944A4; EP1354944A1; ATE414764T1

Description

发明领域

本发明涉及水解人参中含量较高的皂甙糖基以制备生理活性高的稀有皂甙的人参皂甙糖苷酶。本发明还涉及所述人参皂甙糖苷酶的用途。

发明背景

人参是已有几千年历史的中草药材，是滋补强壮的药材。常用的药用人参是人参（ ^"a;c gz we«g C. A. Meyer)、美国参（ panax quinquefolium L. ) ^ 三七参 (Panax natoginseng、竹节参 (Panax japoniciis ) 禾口其他人参属 (Panax genus ) 植物。

人参植物中最重要的有效成分是人参皂甙，已发现的人参皂甙已有 30 余种。人参皂甙可分为三种类型：原人参二醇类皂甙 (Protopanaxdiol Type ginsenoside, PPD)、原人参三醇类鸟武 (Protopanaxtriol Type ginsenoside, PPT)和齐壤果酸类皂甙。人参皂甙 Ra„ Ra₂, Ra₃， Rb„ Rb₂, Rb₃, Rc, Rd， F₂， Rg₃, Rg₅， R ₂, 和 Rh₃ 是原人参二醇类皂甙；人参皂甙 Re, Rg_l5 Rg₂, Rg₄， Rh_l3 Rh₄是原人参三醇类皂甙； Ro 等皂甙是人参齐墩果酸类皂甙。其中，人参皂甙 Ra_{l 5} Ra₂， Ra₃, Rb_{l 5} Rb₂, Rb₃, Rc, Rd, F₂， Re, Rg是达玛 20(S)-皂甙 ( Dammarane 20(S)-saponins)，人参皂甙 Rg₃、 Rg₂、 Rg₂、 Rh,具有 20(S)和 20(R)异构体。主要的人参皂甙化学结构如下：原人参二醇类皂甙原人参三醇类皂甙

R. R₂ R, R₂

Rb, -glc²-glc -glc⁶-glc Re -glc²-rha -glc

Rb₂ -glcj-glc -glc⁶-ara(pyr) Rg. -glc

R'」 gic:-gic -glc^-ar-^fur) Rg₂ -glc²-rha H(20-S和 20-R)

Rd -glc Rh, -glc H(20-S和 20-R)

F2 -glc -glc

Rg₃ -glc -glc H (20-S和 20-R)

Rh₂ -glc H (20-S和 20-R)

C-K H -glc

在人参中含量较高的皂甙是 Ra、 Rb Rb₂、 Rc、 Rd、 Re 和！？^等皂甙，而 Rg₃、 Rg₂、 Rg₅、 Rh₂、 Rhp Rh₃和 ₄等皂甙是只有在野山参和红参中存在的稀有皂甙。这些稀有皂甙往往具有较高的生理活性：如 Rii₂、 ^^和 R_g3皂甙具有很强的抗癌作用，但无副作用。 R 和 Rg₂等具有较好的软化血管的作用。这些稀有皂甙对现代医学和保健食品意义很大。但是，这些稀有皂甙从红参和野山参中提取很困难的，因为这些红参和野山.参原料贵 _; 稀有皂甙含量只有十万分之几，因此，从红参和野山参中提取稀有皂甙是不大可能的。

曾经有人尝试过用化学方法合成人参稀有皂甙 Rh₂，但收率很低（刘维差等：沈阳药学院学报， 1， 14(1988) )；也有人提出过酸碱处理人参皂甙制备稀有皂甙（N. Kondo et.al.: Chem. Pharm. Bull" 21, 2702 (1973))，但其反应选择性差、收率低。日本学者研究过人参皂甙在人体肠道内的代谢变化（M.Kanaoka et.al.: J.Tradional medicinen, 11,241(1994))。

迄今为止，大量制备稀有皂甙的种种尝试均未获得令人满意的结果，因此仍需要一种新的大量制备稀有皂甙的新措施。而本发明人从微生物、人参植物、麦麸、杏仁、麦芽和动物肝中发现了能水解人参皂甙糖基的新酶类，用这种人参皂甙酶处理人参中含量较高的 Ra、 Rb_P Rb₂、 Rc、 Rd,、 Re和 1¾等皂甙，可大量地制备各种稀有皂甙。

因此，本发明的一个目的是提供一类新的能水解人参皂甙糖基而制备稀有皂甙的酶，本文中命名为人参皂甙糖苷酶 (Ginsenoside-glycosidases)。

本发明的再一目的是提供所述人参皂甙糖苷酶的用途。

发明概述

本发明涉及一种新的能水解人参皂甙糖基而制备稀有皂甙的酶，命名为人参皂甙糖苷酶 (Ginsenoside-glycosidases)。本发明的酶存在于微生物、人参植物、麦麸、杏仁、麦芽和动物肝中，用这种人参皂甙糖苷酶处理人参中含量较高的 Ra、 Rbp Rb₂、 Rc、 Rd、 Re、 Rg^D其他容易得到的皂甙 1¾₂和 1 _§3等皂甙，可制备稀有皂甙 Rl Rh₂、 C-K、 Rg₂、 Rg₃、 F₂、 R_gl、 Rd 以及甙元和其异构体皂甙，从而能大量地得到红参和野山参的稀有皂甙成分和其他稀有皂甙。 . 本发明的人参皂甙糖苷酶根据水解人参皂甙糖基反应的差别共分为四种类型，即人参皂甙糖苷酶 I、人参皂甙糖苷酶 II、人参皂甙糖苷酶 III和人参皂甙 -a-鼠李糖苷酶，其中：

人参皂甙糖苷酶 I 能水解人参皂甙 Ra、 Rbj. Rb₂、 Rc,、 Rd 的 β-葡萄糖苷键、 β-木糖苷键、 α-阿拉伯糖苷键；

人参皂甙糖苷酶 II 能水解人参皂甙 Ra、 Rb Rb₂、 Rc、 Rd 的第 20碳原子 20-C的 β-葡萄糖苷键、 β-木糖苷键、 α-阿拉伯糖苷键生成 Rd皂甙；

人参皂甙糖苷酶 ΠΙ 能水解人参皂甙的第 3 碳原子上的双葡萄糖基和皂甙元之间的糖苷键；

人参皂甙 -α-鼠李糖苷酶能水解人参皂甙 Re和 Rg₂的第碳上的 α-鼠李糖苷键，分别生成 Rg n R ,皂甙。

利用这四种酶的混合物或者单个酶来处理人参中含量较高的 Ra、 R Rb₂、 Rc、 Rd、 Re和 R_gl等皂甙糖基，可制备各种稀有皂甙。

本发明还涉及所述本发明的人参皂甙糖苷酶的用途，例如用于处理人参中含量较高的皂甙和其他容易得到的人参皂甙等以制备稀有、有用的皂甙；处理人参混合总皂甙，制备稀有皂甙含量较高的人参混合皂甙；处理人参粉制备稀有皂甙含量较高的人参制品。

本发明的人参皂甙糖苷酶与传统的以纤维素、半纤维素等多糖类基础的纤维素酶和半纤维素酶是不一样的：纤维素酶和半纤维素酶只能水解纤维素和半纤维素等多糖类的糖苷键，而本发明的人参皂甙糖苷酶能水解人参达玛皂甙元配糖体的糖苷键。例如， β-葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21)能水解纤维素和纤维二糖的 β-葡萄糖苷键，不能水解人参皂甙第三碳原子的 β-葡萄糖苷键。其原因是，传统的纤维素和半纤维素酶水解糖类糖苷键；但是本发明的人参皂甙糖苷酶能水解具有 30 个碳原子的皂甙元配糖体的糖苷键。

本发明的详细描述

本发明的人参皂甙糖苷酶类经过提纯酶蛋白、特性研究之后发现，根据水解糖基反应至少有四种不同的酶类：即人参皂甙糖苷酶 I、人参皂甙糖苷酶 II、人参皂甙糖苷酶 III和人参皂甙 -C - 鼠李糖苷酶等：人参皂甙糖苷酶 I能水解人参皂甙 Ra、 Rb、 Rb₂、 Rc、 Rd 的 β-葡萄糖苷键、 β-木糖苷键、 α-阿拉伯糖苷键；人参皂甙糖苷酶 II 能水解人参皂甙 Ra、 Rb Rb₂、 Rc、 Rd 的第 20 碳原子 20-C的 β-葡萄糖苷键、 β-木糖苷键、 ct-阿拉伯糖苷键生成 Rd皂甙；人参皂甙糖苷酶 III能水解人参皂甙的第 3碳原子上的双葡萄糖基和皂甙元之间的糖苷键，使 Rd皂甙变成 C-K; 人参皂甙 -a-鼠李糖苷酶能水解人参皂甙 Re和 Rg₂的第 6碳上的 α-鼠李糖苷键，分别生成 Rg^n Rli,皂甙。

本发明的人参皂甙糖苷酶可以用于：处理人参中含量较高的皂甙 *其他容易得到的人参皂甙等，制备稀有、有用的皂甙；处理人参混合总皂甙，制备稀有皂甙含量较高的人参混合皂甙；处理人参粉制备稀有皂甙含量较高的人参制品。

本发明的人参皂甙糖苷酶类可来源于微生物培养、人参植物、杏仁、麦麸、杏仁、麦芽和动物肝等。所述的微生物包括细菌、链霉菌、酵母、曲霉和担子菌等。微生物培养制备酶时，可以加入人参浸出物或者人参粉方法提高产酶量；微生物可以液态或者固态培养；固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后、离心除渣得酶液。人参植物和动物肝破碎、用缓冲液浸出、离心除渣得酶液。麦麸、麦芽和脱脂杏仁用缓冲液浸出、离心除渣得酶液。这些酶也可以加入硫酸铵或者酒精的方法沉淀酶蛋白、再用缓冲液溶解、除渣得到皂甙糖苷酶得浓缩液。

根据酶的来源不同而本发明的人参皂甙糖苷酶所包括的四种酶类含量不一样。

本发明的这些皂甙糖苷酶可直接处理皂甙，制备稀有皂甙；根据目的产物的不同、可用提纯后的酶，也可以用不提纯的酶。这些酶的反应条件是 pH 2-11 , 温度 5~70 °C。皂甙浓度为 0.001%〜20%。酶反应底物是所有原人参二醇类和原人参三醇类皂甙；酶反应产物是包括所有部分或者全部皂甙糖基改变后生成的皂甙次生产物，如 Rhp Rh₂、. C-K、 Rg₂、 Rg₃、 F₂、 R_gl、 Rd 等皂甙、以及甙元和酶反应过程中产生的异构体皂甙。

以下通过附图和实施例更详细地描述本发明，其中：图 1 示出本发明的人参皂甙糖苷酶 I水解原人参二醇类皂甙的机理。

图 2示出本发明的人参皂甙糖苷酶 II水解原人参二醇类皂甙的机理。

图 3示出本发明的人参皂甙糖苷酶 III水解人参皂甙的机理。图 4示出本发明的人参皂甙 -ex-鼠李糖苷酶的水解机理。

图 5示出了 20(S)-和 20(R)-型人参皂甙的结构图。实施例 1 微生物人参皂甙糖苷酶的制备

1、黑曲霉的人参皂甙糖苷酶

菌种是黑曲霉 Aspergillus niger FFCCDL-48g (FFCCDL, 大连轻工业学院菌种保藏所)。

1 -1、酶的制备

将含 3% (重量）麦麸水提取物和 1% (重量）人参根水提取物的液体培养基 220毫升放入于 1000毫升三角瓶中，接种所述黑曲霉菌种，共接种 10个三角瓶。在 30°C摇床培养 54小时，离心除菌，从 10个三角瓶中得到约 2000毫升上清液。然后，在上清液中边搅拌加入硫酸铵的粉末到饱和度 65%，在 4°C放置过夜，离心收集蛋白质沉淀。沉淀中加入 80 毫升的蒸馏水装入到透析袋中，对 0.01 M和 pH 5 的醋酸缓冲液透析。离心除去非溶解物，用 0.01 M和 pH 5 的醋酸缓冲液调整，得到 200毫升粗酶液，用于人参皂甙糖基的水解和酶蛋白的提纯。酶液可重复制备。

1-2、黑曲霉酶液对人参皂甙的水解

将 lOOmg人参皂甙 Rbp Rb₂、 Rc、 Rd和 lOmg人参皂甙 Rg₃ 分别溶于 10ml的 0.01M和 pH5.0醋酸缓冲液中，分别加入 10ml 粗酶液，在 30°C反应 18小时，然后加入 10ml 正丁醇终止反应，产物皂甙转入正丁醇层。用薄层层析（TLC ) 法检测（Merck, 60-F254硅胶板；展开剂为氯仿：甲醇：水 =70 : 30： 5 )。用 Shimadzu TLC扫描仪 CS-930检测的 TLC结果如下表 1所示。

表 1 表明：黑曲霉所产的酶能水解原二醇类人参皂甙（PPD， Protopanaxdiol type ginsenoside ) 的糖基，水解程度高达 90%以上； 1 等水解成 Rh₂皂甙的转化率高达 50%以上；酶反应主要产物是人参皂甙 F₂， C-K, Rh₂和皂甙元。该酶对人参皂甙 Ra,， Ra₂ 和 Ra₃的水解反应、与 Rt^皂甙酶反应类似。

从上述试验得知，黑曲霉的人参皂甙糖苷酶至少具有以下的酶活性：具有水解 PPD皂甙第三碳位上 β - ( 1—2) -D-葡萄糖基的活性和水解皂甙元上的 β -D-葡萄糖苷键的活性；具有水解第二十碳位上 - ( 1 -6 ) -D-葡萄糖苷键、 a - ( 1→6 ) -L-阿拉伯糖苷键和 6) 木糖苷键的活性。表 ι、黑曲霉的人参皂甙糖苷酶对不同原人参二醇类皂甙糖基的的水解

在 pH 5.0, 30°C酶反应 18小时；酶对 Ra,、 Ra₂、 1^₃皂甙的水解结果（未示出）和 Rbl结果相似这种人参皂甙糖苷酶的生成受到人参提取物或者人参皂甙的诱导：如果培养基中加诱导物 --人参提取物或者皂甙，产酶增高；如果不加诱导物，人参皂甙糖苷酶的产量下降。

1-3、黑曲霉人参皂甙糖苷酶的性质

为了弄清黑曲霉的人参皂甙糖苷酶酶性质，试验了温度， pH 值，金属离子以及反应时间对酶反应的影响。温度对酶反应的影响：

温度对酶水解原人参二醇类人参皂甙糖基的影响，用 100 毫克 Rt^皂甙，按 1-2的条件试验；其结果如表 2所示: 表 2、温度对黑曲霉的酶水解人参皂甙 Rb,的影响

反应条件： Rb 浓度， 0.5%; 在在 pH 5.0， 30°C酶反应 18小时表 2表明：在温度 30〜60Ό之间，酶水解皂甙较好；在温度 30~50°C之间，产物人参皂甙 F d C-K的产量较高；在 20〜50 °C内，随着温度的升高，水解产物人参皂甙 C-K 的产量也越高。由表 2可知，若想得到较多的 F₂，酶反应温度必须控制在 30〜40 °C。若想得到较多的人参皂甙 C-K,酶反应温度必须控制在 40〜50 °C。当酶反应温度为 20和 60°C时，会获得较多的人参皂甙 Rd。而人参皂甙 1 _§3,1¾1₂和皂甙元的产量较低。温度对酶水解人参皂甙 Ra， Rb₂， Rc和 Rd的影响与水解人参皂甙 Rbi反应类似。

pH值对酶反应的影响： pH值对皂甙酶水解人参皂甙 Rbi的影响见表 3 。

表 3、 pH对黑曲霉的酶水解人参皂甙 Rb,的影响

酶反应 R 浓度 0.5%, 在 30Ό酶反应 18小时表 3的结果表明：在 pH4〜7之间人参皂甙 F₂的产量较高；而且， pH 值越高人参皂甙 C-K， 1 11₂和皂甙元的产量越高。 pH 值对酶水解人参皂甙 Ra, Rb₂, Rc和. Rd的影响与水解 Rb,类似。反应时间的影响：反应时间对酶水解原人参二醇类皂甙的影响见表 4。

表 4、反应时间对酶水解人参皂甙 Rb,的影响

酶反应 Rb,浓度 0.5% , 酶反应在 pH5和 30°C 由表 4可知：在反应的初始阶段，人参皂甙！？^第 20碳位的葡萄糖基被水解，转化为 Rd，随着反应时间延长的逐渐增加， Rd的产量也越来越少， F₂和 C-K含量增高；当反应时间达到 12-24 小时时，人参皂甙？₂的产量多；人参皂甙 C-K、 Rh₂和皂甙元的产量随着反应时间的增加。反应时间对酶水解人参皂甙 Ra、 Rb₂、 Rc和 Rd的影响，同水解的结果类似。金属离子对酶反应的影响：金属离子对酶水解原二醇类人参皂甙的影响见表 5。表 5、金属离子对酶水解人参皂甙 Rb,的影响

Rb,浓度， 0.5%; 酶反应在 pH5.0和 30°C反应 18小时表 5 的实验结果表明： Ca⁺⁺和 Mg^能轻微的加快酶水解人参皂甙 Rb 的速度， Qi⁺⁺和 Pb⁺⁺等金属离子抑制酶反应。金属离子对酶水解人参皂甙 Ra， Rb₂, Rc和 Rd的影响与 Rb,的结果类似。

1-4、黑曲霉菌酶的提纯

由黑曲霉制得的上述酶液 10ml上 DEAE-纤维素 DE-52柱（ Φ 1.5 X 6.7 cm, Pharmacia) 吸附酶蛋白。然后用 0.02M的 NaCl和 pH5的醋酸缓冲液配成的梯度液 ( 0.06, 0.12， 0.18， 0.24, 0.3 , 0.4, 0.5， 0.6M) 梯度洗脱。

. DEAE-纤维素柱上洗脱的第 36和 54管流分在聚丙烯酰胺凝胶 SDS 电泳（李建武等：生物化学试验原理和方法，北京大学出版社， p82-100(1997) ) 上呈现单点，其酶对人参皂甙的水解作用结果如表 6和 7所示。第 36管的酶（人参皂甙糖苷酶 I) 对人参皂甙的水解作用

Rb,， Rb,, Rc和 Rd的浓度， 0.5 %； Rg₃, F,, Rh₂， C-K 和 Rg₂, 0.05%；在 pH5.0、 30 °C 反应 18小时； Ra类皂甙反应与 Rb,结果相似。

DEAE-纤维素柱上洗脱的第 36管流分，即用 0.12M NaCl梯度洗脱的第 36管流分，经过冻干，作聚丙烯酰胺 SDS电泳为单点，其分子量为 51,000，因此其酶是纯酶，命名为人参皂甙糖苷酶 I，其酶活性，如表 6所示。

从表 6中可以看出，第 36管流分的酶（即人参皂甙糖苷酶 I) 能水解 ,皂甙的第 20碳原子上的 20-C β -(1— 6)-D-葡萄糖苷键，也能水解 Rc和 Rb₂皂甙的 20-C a -(l→6)-L-阿拉伯糖苷键，能水解 Ra类皂甙的 20-C 的 β -(1— 6)-D-木糖苷键；也能水解二醇类皂甙、如 Ra皂甙类、 Rb Rb₂、 Rc、 Rd和 Rg₃上第 3-C上的 β -(1— 2)-D-葡萄糖苷键；也对二醇类的 3-C皂甙元上的 β -D- 葡萄糖基和 20-C 的皂甙元 β葡萄糖基也有轻微的水解作用。人参皂甙糖苷酶 I的水解机理如图 1所示。人参皂甙糖苷酶 I也能水解对硝基苯酚基 -β-葡萄糖苷、 β-木糖苷、 ot-阿拉伯糖苷、 β-半乳糖苷；但不能水解硝基苯酚基 -a-鼠李糖苷。

人参皂甙糖苷酶 Π: DEAE-纤维素柱上洗脱的第 54管流分、即 0.18 Μ的 NaCl洗脱的流分第 54管，经过冻干，作 SDS电泳为单点，其分子量为 90，000，所对应的酶被命名为人参皂甙糖苷酶 II，它只能水解 Rb!的 20-C β -(1— 6)-葡萄糖苷键、 Ra类皂甙 β -(1— 6)-木糖苷键和 Rb₂,Rc 的 20-C α -(1→6)-阿拉伯糖苷键，并将它们转化为 Rd_; 轻微水解 Rd皂甙生成 Rg_{3 ;} 不水解人参皂甙的原人参二醇类皂甙的 3-C 的 β -(1— 2)-葡萄糖苷键。人参皂甙糖苷酶 II反应机理，如图 2所示。

人参皂甙糖苷酶 III是用高效液相蛋白制备色谱仪（BioRad) 提纯的：分离柱为 Bio-Scale Q; 每试管收集量为 2 毫升。将上述 1-1 方法制备的黑曲霉菌酶液 1 毫升上样，然后用 25mM和 pH7.4的 Tri-HCl缓冲液、含 0.5M的 NaCl的 25mM和 pH7.4的 Tri-HCl缓冲液梯度洗脱；第 18管的酶液在 SDS 电泳上单点，说明是纯酶，命名为人参皂甙糖苷酶 III。该酶能水解皂甙元 3-C 双葡萄糖基，使 Rd和 R&皂甙各变成 C-K和皂甙元，其反应机理如图 3所示。

小结上述的黑曲霉菌的三种类型人参皂甙糖苷酶的性质如表 7所示。表 7、从黑曲霉菌制得三种人参葡萄糖苷酶性质

1-5、人参皂甙糖苷酶与纤维素 β -葡萄糖苷酶的差异

为了观察本发明的人参皂甙糖苷酶和已知的外切纤维素酶之间的差异，人参皂甙糖苷酶和已知的纤维素 β -葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21)相比较，以 0.5%的人参皂甙 Rb D Rd为底物在 pH5.0、 30°C反应 18小时；结果如表 8所示。

从梭菌属 Chlostridun thermocopiriae) 制得的纤维素 -β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21), 以及从芽孢杆菌属 (Bacillus sp.AX) 制得的纤维素葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21) 等三个纤维素 -β-葡萄糖苷酶不能水解任何人参皂甙糖苷键;只有杏仁纤维素 - β -葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21)能轻微水解 Rl Rb₂和 Rc上的第 20-C的糖基生成 Rd皂甙，不能水解第 3-C上的葡萄糖基，这与人参皂甙糖苷酶 II相似，然而人参皂甙酶 II轻微地水解 Rd，这是与杏仁纤维素 -β-葡萄糖苷酶的区别点。因此，纤维素 -β-葡萄糖苷酶

(EC 3.2.1.21) 性质和人参皂甙糖苷酶 I有完全不一样的区别。

从梭菌属 ( Chlostridun thermocopiriae) 制得的外切纤维素酶

(纤维二糖生成酶），以纤维二糖为单位切割纤维糊精，但不能水解皂甙 Rd的 3-C的二糖键，与人参皂甙糖苷酶 III截然不同。从而证明了：本发明的人参皂甙糖苷酶类是与传统的纤维素- β - 葡萄糖苷酶和纤维二糖生成酶不同类型的酶。

表 8、人参皂甙葡萄糖苷酶于其他类似酶的比较

Rb,和 Rd的浓度， 0.5 %；在 pH5.0、 30°C酶反应 18小时,

2、米曲霉菌的人参皂甙糖苷酶

2-1 酶的制备

在 1000毫升三角瓶中装入 220毫升 1% (重量）人参水浸出物和 3% (重量）麦麸浸出物的培养基，用米曲霉^^ ergzY/^ oryzae FFCCDL-39g (大连轻工业学院菌种保藏所）接种 10个这样的三角瓶，在 30 °C摇床培养 64小时。离心除菌，从 10个三角瓶中得到约 2000 毫升上清液。然后，在上清液中边搅拌加入硫酸铵的粉末到饱和度 65%，在 4°C放置过夜，离心收集蛋白质沉淀。沉淀中加入 80毫升的蒸馏水装入到透析袋中，在 0.01 M和 pH 5 的醋酸缓冲液中透析，离心除去非溶解物，用 0.01 M和 pH 5 的醋酸缓冲液调整，得到 200毫升粗酶液，可用于皂甙水解和酶的提纯。酶液可重复制备。

将 lOOmg的人参皂甙 Rb_P Rb₂、 Rc、 Re、 Rd和 lOmg的人参皂甙 Rg₃和 ^^₂与 10ml的 0.01M， pH5 的醋酸缓冲液混合后，加入上述米曲霉菌的 10ml粗酶液在 30°C下反应 18 小时。然后加入 10ml正丁醇混合、静置两小时，用 TLC检测正丁醇层的成分（薄层层析： 60-F₂₅₄硅胶板（Merck) ; 溶剂为氯仿：甲醇：水 =70:30:5 ) , 用 TLC检测仪 CS-930 (日本岛津公司）检测板上皂甙含量如表 9所示：

表 9、米曲霉菌的酶对不同人参皂甙的水解结果（％)

在 pi- 1 5.0 和 30 °C ¾反应 18小吋

从表 9 中可以看到：米曲霉的人参皂甙糖苷酶水解原人参二醇类皂甙糖基的酶性质，如反应 pH值，温度和反应时间都与黑曲霉的酶相似。唯一不同的是，从黑曲霉制得的酶不能水解皂甙 Re和 1¾的 6-C的 c l→2)-L-鼠李糖苷键，而来自米曲霉菌的人参皂甙糖苷酶能水解并生成 R_gl和 Rhi皂甙。由此证明了米曲霉的人参皂甙糖苷酶不仅含有黑曲霉的酶的人参皂甙糖苷酶 I、人参皂甙糖苷酶 II、人参皂甙糖苷酶 III 等酶的活性，又具有人参皂甙 -a-(l— 2)-L-鼠李糖苷酶即人参皂甙 -α-鼠李糖苷酶的活性。

2-2、人参皂甙 - α -鼠李糖苷酶的提纯及性质的研究

为了研究 A. oryzae 的人参皂甙 - α -鼠李糖苷酶的性质，用 BioRad 蛋白层析制备仪（ Biologic Medium Pressure Chromatography ) 从米曲霉的酶分离提纯了人参皂甙 - α -鼠李糖苷酶。分离柱 Bio-Scale Q2 ( BioRad) ; 酶液进样量为 1ml; 流动相速度 1毫升 /分钟；流动相为 25mM、 pH8.2 Tris-HCl缓冲液和 25mM、 pH8.2 Tris-HCl +0.5M NaCl缓冲液梯度洗脱。每管收集量为 2毫升 /管。

所收集的洗脱液分别测定酶活，结果在第 16 管流分有人参皂甙 - α -鼠李糖苷酶活性，其人参皂甙 - α -鼠李糖苷酶在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上为电泳单点，其分子量是 53， 000，说明第 16管流分酶是提纯的酶。

纯化后的人参皂甙- α -鼠李糖苷酶能水解人参皂甙 Re和 Rg₂ 的 6-C (第 6碳位上)的 a -L-鼠李糖苷键，分别生成 R_gl Γ0ι_{1 0} 其酶反应活力较高的 pH为 4〜7 (最适 pH为 5 ) ; 酶反应活力较高的温度是 30~50°C (最适温度为 40°C )。纯化的人参皂甙 - α -鼠李糖苷酶只水解原人参三醇类皂甙（PPT) 6-C中的 α -L-鼠李糖苷键，不水解人参皂甙中其它糖苷键。人参皂甙 α -L-鼠李糖苷酶水解 Re和 1^₂皂甙的机理如图 4所示。 3、细菌的人参皂甙糖苷酶

含 0.5% (重量）人参水浸出物、 1 % (重量）麦麸水浸出物和 0.3% (重量）胰蛋白胨、 pH7.2的培养基中接高温好氧菌

^.JF(Fengxie Jin et al.， J. Gen. Appl. Microbiol., 36， 415-434， 1990) ,在 60 °C下通风搅拌培养 36小时。离心除菌，取上清液 1000 毫升，加 3000毫升 95%乙醇使酶沉淀， 4°C下保存过夜，离心收集沉淀。然后，将此酶蛋白沉淀溶于 50 毫升的 0.01M、 _PH5 的醋酸缓冲溶液，离心除不溶性物，即得到粗酶液。

取 10ml酶液与 10ml 0.5%Rd的醋酸缓冲溶液（含 20%乙醇） 70°C下反应 16小时。 TLC检测结果表明： 60%的 Rd转化为人参皂甙 F₂,说明细菌人参皂甙糖苷酶能水解人参皂甙 Rd第三碳位上 β - ( 1—2 ) -葡萄糖苷键。该酶也能水解人参皂甙尺的3 - ( 1 —2 ) -葡萄糖苷键，变成 Rh₂皂甙。

该酶的最适反应温度 70°C，最适 pH6.0。

4、来源于酵母的人参皂甙糖苷酶

在含 2% (重量）人参水浸出物和 8% (重量）麦芽汁的培养基上， 30°C摇床培养假丝酵母 Candida sp. FFCCDL-2g (大连轻工业学院菌种保藏所） 56小时，离心取上清 500ml，加 (NH₄)₂S0₄ 粉末至饱和度为 65%， 4°C保存过夜，离心收集沉淀，在 0.01M pH5 的醋酸缓冲溶液中透析，离心除去杂质，得到 25毫升酶液。

取 10ml酶液与 10ml 0.5%Rd的醋酸缓冲溶液 60°C下反应 12 小时。 TLC检测结果表明： 73%的 Rd转化为人参皂甙 F₂，说明该酶能水解人参皂甙 Rd 的 3-C (第三碳位)上的 β - ( 1—2 ) -葡萄糖苷键。该酶也能水解人参皂甙《^₃的3 - ( 1—2 ) -葡萄糖苷键，变成 Rh₂皂甙。

该酶的最适反应温度为 45 °C，最适 pH为 5.5。 5、链霉菌的人参皂甙糖苷酶

含 1 % (重量）人参水浸出物， 3% (重量）麦麸水浸出物的产酶培养基中接链霉菌 sp.FFCCDL-2g (大连轻工业学院菌种保藏所），在 30°C下培养菌种 48小时，离心取上清液 300 毫升，加 (NH₄)₂S0₄粉末至饱和度为 70%使酶沉淀， 4°C下保存过夜，离心收集沉淀。在 0.01M、 pH5 的醋酸缓冲溶液中透析，除去杂质，得到 15毫升酶液。

取 10ml酶液与 10毫升 l%Rd的醋酸缓冲溶液（含 20%乙醇） 50°C下反应 20小时。 TLC检测结果表明： 50%的 Rd转化为人参皂甙 F₂，说明链霉菌酶能水解人参皂甙 Rd第三碳位上 β - ( 1—2 ) -葡萄糖苷键。该酶最适反应温度 50°C，最适 pH5.5。

6、担子菌的人参皂甙糖苷酶

将担子菌 Tremella sp.FFCCDL-12g 菌株（大连轻工业学院菌种保藏所）在含有 125g人参粉， 374g麦麸和 500毫升水的固体培养基中培养 5到 7天。然后把 0.01M， pH5.0的醋酸缓冲溶液 2500毫升加入到固体培养基中静置 2 小时。离心去除不溶物后，得约 2000毫升浸出液；加 (NH₄)₂S0₄粉末到浸出液中，搅拌使硫酸铵的饱和度达到 70%，在 4°C静置过夜，离心收集蛋白，在 0.01M 的 pH5的醋酸缓冲液下透析。然后用 0.01M、 pH5醋酸缓冲液稀释至 150毫升，除去不溶物，即得到酶液。

把从担子菌得到的酶液 10 毫升与 10 毫升 1%的 Rl^溶液 ( 0.01M、 pH5的醋酸缓冲溶含 20%乙醇）混合，在 40°C反应 20 小时。反应完毕后，用 TLC检测产物。人参皂甙 Rt^反应生成 25% 的 Rd， 40%的？₂和 35%的 C-K。这些结果证明：这种酶可以酶解 3碳位上的 β -葡萄糖苷键，及 20碳位上的葡糖苷键。反应的最佳温度是 50Ό，最佳 ρΗ值是 5.5。从以上实验可得出如下结论：微生物如细菌、链霉菌、酵母、霉菌和担子菌等均产人参皂甙糖苷酶；这些菌类生成人参皂甙糖苷酶时，加入人参提取物会提高产酶量。本发明的人参皂甙糖苷酶类与传统的纤维素酶（纤维素 - β -葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21)、纤维二糖生成酶）在酶反应性质方面不同。本发明的人参皂甙糖苷酶根据酶水解皂甙糖基反应而至少分为四种类型：即人参皂甙糖苷酶 I，人参皂甙糖苷酶 II，人参皂甙糖苷酶 III和人参皂甙 - α - 鼠李糖苷酶。实施例 2 人参植物的人参皂甙糖苷酶

2-1. 酶的提取和纯化

将 200g新鲜的人参根粉碎，力 Π 600毫升 0.02M、 pH5 的醋酸缓冲液，在 40°C下浸 2 小时，过滤得到上清液。在上清液中加入 (NH₄)₂S0₄缓慢加入至 70%饱和，在 4°C下过夜，离心收集蛋白沉淀。将蛋白沉淀溶于 15 毫升的蒸馏水中，在 0.02M 的 Tris-HCl (pH7.4 ) 缓冲液中透析，离心去除不溶物后，将体积调整到 20毫升。

将 5 毫升的酶液在 DEAE-纤维素 DE-25 柱 (Whatman, Φ 1.4 X 6.7cm)吸附后，用 0.02M、 pH7.4的 Tris-HCl中含有 KC1浓度 0.06、 0.12、 0.18和 0.24M的溶液，对吸附酶的柱进行梯度洗脱。洗脱后检测各个流分对皂甙酶解，结果第 37 管流分的酶可以水解皂甙 Rd的第 3碳位上的双糖和皂甙元之间的葡萄糖苷键，将 Rd转化为 C-K; 第 52管流分酶可以水解 Rd皂甙第 3碳位上的 β - ( 1—2) 葡萄糖苷键、将 Rd转化为 F₂，也可以水解 Rb和 Rc 皂甙第 20碳位上的糖苷键，将 Rb和 Rc转化为 F₂。结果如表 10。表 10、从人参植物提纯的酶对人参皂甙的水解

皂甙底物浓度，0.5 %; 在 pH 5.0、 50°C反应 18小时。从表 10 中可见， DEAE-纤维素柱洗脱得到的第 52管流分的酶可以水解 Rl 1»₂和 Rc皂甙第 20碳位上的糖苷键，也可以水解 3碳位上的 β - ( 1— 2)葡萄糖苷键。第 52管流分的酶在 SDS 聚丙烯酰胺电泳上为单点，分子量为 59,000。所以第 52 管流分的酶是人参皂甙糖苷酶 I类型。但是，和从黑曲霉制得的人参皂甙糖苷酶 I相比较，人参植物的人参皂甙糖苷酶 I类型的分子量略大，不水解皂甙元直接结合的糖苷键。提纯后的流分第 37 管的酶可以水解皂甙 Rd第 3碳位的双糖与皂甙元之间的糖苷键，生成 C-K皂甙,它属于人参皂甙糖苷酶 III类型。

钙离子对两种酶都有促进作用，而铜离子对两种酶有抑制作用，提纯后酶的特性如下表 11所示-

实施例 3 从麦麸提取的人参皂甙糖苷酶

3-1、酶的提取

500g麦麸中加入 2500毫升 0.02M、 pH5的醋酸缓冲液，在 40°C提取 2小时，过滤得上清液约 2000毫升。上清液缓慢搅拌加入（NH₄) ₂S0₄至 70%饱和度，在 4°C下过夜，离心收集蛋白沉淀。将其蛋白沉淀溶于 80ml蒸馏水中，在 0.02M、 pH5.0的醋酸缓冲液中透析。离心去除不溶物后，调整体积至 200ml，即为酶液。

3-2、酶的性质

将 10毫升的上述酶液与 10毫升 1%皂甙底物的醋酸缓冲液混合，在 40°C下反应 20小时；然后， TLC检测产物，结果如表 12 所示：表 12、由麦麸皂甙糖苷酶对皂甙的水解作用

皂甙底物，0.5 %; 在 pH，5.0、 4(TC酶反应 20小时从表中可以看出，麦麸酶可以水解皂甙 Rd第 3碳位的葡萄糖苷键，变成 F_{2 ;}. 也可以水解 Rbp ₂和 Rc第 20碳、第 3碳位上的糖苷键，生成 F₂。

该酶最适 pH值是 5.0; 最佳反应温度是 40°C ; 二价铁离子和镁离子可激活酶，二价铜离子抑制酶活性。实施例 4 其他来源的人参皂甙糖苷酶

4-1、麦芽：将 200克麦芽粉碎，加入 1000毫升 0.01M、 pH5 的醋酸缓冲液常温下浸出 2小时，过滤除渣，上清液中加入 3倍体积的乙醇，静止过夜，收集沉淀。沉淀中加入 50毫升 0.01M、 pH5 的醋酸缓冲液，除去不溶物，得到酶液。酶液 10毫升与 10 毫升 1%的 RT^溶液（0.01M、 pH5 的醋酸缓冲溶含 20%乙醇）混合，在 40°C反应 20小时，用 TLC检测产物。结果， 95%以上的人参皂甙 Rb,水结成 Rd， F₂、 C-K和 Rg3等皂甙。这些结果证明：这种酶可以酶解人参皂甙第 3碳位上的 β -葡萄糖苷，及 20 碳位上的糖苷键。

4- 2、动物肝脏： 100克牛肝破碎，加入 300毫升 0.01Μ、 ρΗ5 的醋酸缓冲液常温下浸出 2 小时，离心除渣，加 ( ¾ ^0₄粉末至饱和度为 70%使酶沉淀， 4°C下保存过夜，离心收集沉淀。在 0.01M、 pH5的醋酸缓冲溶液中透析，除去杂质，得到 15毫升酶液。取 10ml酶液与 10毫升 Ι Ι Ι^的醋酸缓冲溶液（含 20%乙醇） 40°C下反应 20小时。 TLC检测结果表明： 50%的 Rt^转化为低糖的人参皂甙，说明动物肝中含有人参皂甙糖苷酶。

4-3、植物种子-杏仁：脱脂后的 100克杏仁粉碎，加入 300 毫升 0.01M、 pH5的醋酸缓冲液常温下浸出 2小时，离心除渣，加 (NH₄)₂S0₄粉末至饱和度为 60%使酶沉淀， 4°C下保存过夜，离心收集沉淀。在 0.01M、 pH5的醋酸缓冲溶液中透析，除去杂质，得到 30毫升酶液。取 10ml酶液与 10毫升 /oRbi的醋酸缓冲溶液（含 20%乙醇） 50Ό下反应 14小时。 TLC检测结果表明： 40% 的 Rb,转化为低糖的人参皂甙，说明杏仁中含有人参皂甙糖苷酶。实施例 5 用人参皂甙糖苷酶制备稀有皂甙含量较高的人参混合皂甙和人参制品

5- 1、制备稀有皂甙含量较高的人参混合皂甙

人参叶混合皂甙 4克溶解在 100毫升的 0.01M、 pH5 的醋酸缓冲液中，再加入 100毫升实施例 1的 1-2部分制得的米曲霉酶液，在 30Ό反应 4小时，用 100毫升水饱和正丁醇萃取两次，合并正丁醇减压蒸干，可得 3.3克皂甙。用 TLC分析结果，稀有皂甙 Rg₃、 Rg₂、 Rh₂、的含量提高了几十倍。 5-2、制备稀有皂甙含量较高的人参制品

人参粉 4克中加入 4毫升 20%乙醇，再加入 4毫升实施例 1 的 1-2部分制得的米曲霉酶液；在 30°C反应 12小时，减压蒸干，即得稀有皂甙含量较高的人参制品。经过 TLC分析结果， Rg₃、 Rg₂、 R ₂、！^^的含量提高了几十倍。

5-3、酶反应所得皂甙分子的化学结构

从原人参二醇类皂甙经酶反应产生的皂甙 Rd、 Rg₃、 F₂、 ₂、 C-K以及二醇皂甙元，由原人参三醇类皂甙经酶反应产生的 R_gl、 Rg₂、 R ,以及三醇皂甙元，用硅胶柱不同比例的氯仿和甲醇洗脱方法（张书臣主编：中国人参，上海科技教育出版社， 1992， P108-110), 分离制备皂甙产物的单体，再经结晶方法，制得纯净的酶反应人参皂甙产物。

用高效液相色谱法，拆分人参皂甙 Rg₃, Rg₂， Rh₂, Rh,的 20(S) 和 20(R)的异构体。高效液相色谱仪的型号是 Waters Model-520(来源？），检测波长为 203 nm, 柱为 C-18柱（中国科学院大连化学物理研究所生产）；流动相为乙腈：乙醇 = 6: 4。

分离提纯得到酶反应产物的各皂甙单体的化学结构是用核磁共振 (NMR)和质谱法测得的。所使用核磁共振仪器为 Bruker DR X 400, 溶剂为吡啶 -d₅。质谱仪为 JEOL DX X 400, 方法为快速原子冲击法 (FAB-MS)。

所测的得酶反应产物人参皂甙 Rd、 Rg₃、 F₂、 R ₂、 C-K, Rg Rg₂、 R !和皂甙元的质谱、 "H-NMIU ¹³C-NMR谱图和现有技术中的文献 ( J.H. Park等： A new processed ginseng with fortified activity in Advances in Ginseng Research-Proceedings of the 7^th International Symposium on Ginseng, Sep 22-25， 1998, pl46-159; Tanak 0·, Kasai R.: (1984)， Saponins of ginseng and related plants in Progress in the Chemistry of Organic Natural Products (Herz W" Grisebach H,， Kirby G.W., Tamm Ch.， eds), Vol.46, pi- 65. ) 上的谱图一样；其 ¹³C-NMR谱图的数据，如表 12所示。表 12 中所示的人参皂甙的结构说明，酶反应产生的人参皂甙 Rd、 F₂、 C-K和 R_gl皂甙都是 20(S)-构型皂甙；但是酶反应产生的 Rg₃、 Rg₂、 10¾和 Rhi皂甙有 20(S)-构型和 20 R)-构型。以上结果都证明：酶反应生成人参皂甙 Rd，F₂,C-K和！_§1的过程主要产生 20 (S) -人参皂甙。可是，对 Rg₃,Rg₂,R ;^n 的酶解生成 20( S )和 20(R)- 人参皂甙的混合物。 20(S)-和 20(R)-型人参皂甙的结构图见图 .5。

Claims

权利要求

1、人参皂甙糖苷酶类，其反应底物是所有原人参二醇类皂甙和原人参三醇类皂甙，酶反应产物是包括所有部分或者全部皂甙糖基改变后生成的皂甙次生产物，如 Rhp R ₂、 C-K、 Rg₂、 Rg₃、 F₂、 Rg_P Rd 等皂甙、以及甙元和酶反应过程中产生的异构体皂甙，所述的人参皂甙糖苷酶来源于微生物培养物包括霉菌、细菌、酵母、担子菌，人参植物，杏仁，麦麸，麦芽和动物肝，其通过如下方法制得：

以液态或者固态培养所述微生物，其中固态培养之后用缓冲液浸出、离心除渣得酶液；液态培养后，离心除渣得酶液；或者将人参植物或动物肝破碎，用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；或者

将麦麸、麦芽和杏仁用缓冲液浸出，离心除渣得酶液；其中任选地包括加入硫酸铵或者乙醇而沉淀酶蛋白，再用缓冲液溶解，除渣得到所述人参皂甙糖 ¾^酶的浓缩液，

其中所述缓冲液为醋酸、磷酸、 Tris、 NaCl 等缓冲液，缓冲液浓度为 0.001-1M, pH为 2—11。

2、如权利要求 1 所述的人参皂甙糖苷酶类，其包括四种类型的酶：

人参皂甙糖苷酶 I，反应温度为 5— 70°C , 反应 pH为 2— 11，能水解人参皂甙 Ra、 Rb Rb₂、 Rc，、 Rd 的 β-葡萄糖苷键、 β-木糖苷键、 C -阿拉伯糖苷键；

人参皂甙糖苷酶 II，反应温度为 5— 70°C，反应 pH为 2—11，能水解人参皂甙 Ra、 Rb^ Rb₂、 Rc、 Rd的第 20碳原子 20-C的 β-葡萄糖苷键、 β-木糖苷键、 α-阿拉伯糖苷键生成 Rd皂甙；

人参皂甙糖苷酶 III，反应温度为 5— 70°C，反应 pH为 2— 11，能水解人参皂甙的第 3碳原子上的双葡萄糖基和皂甙元之间的糖苷键；

人参皂甙 -α-鼠李糖苷酶，反应温度为 5— 70°C , 反应 pH 为 2- 11 , 能水解人参皂甙 Re和 Rg₂的第 6碳上的 a-鼠李糖苷键，分别生成 ^^和！^^皂甙。

3、如权利要求 1所述的人参皂甙糖苷酶，其来自黑曲霉。

4、如权利要求 1所述的人参皂甙糖苷酶，其来自米曲霉。

5、如权利要求 1一 4 所述的人参皂甙糖苷酶在制备人参稀有皂甙中的应用。

6、如权利要求 1一 4 所述的人参皂甙糖苷酶在处理人参混合总皂甙以制备稀有皂甙含量较高的人参混合皂甙中的应用。

7、如权利要求 1一 4 所述的人参皂甙糖苷酶在处理人参粉制备稀有皂甙含量较高的人参制品中的应用。