CN113481274A - 一种酶法制备人参皂苷f1的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，提供了一种酶法制备人参皂苷F1的方法及其应用，所述方法直接采用糖苷水解酶BglSK水解糖基实现皂苷之间的转化，反应时间短，成本低，反应条件更温和，F1粗品中的副产物含量少，容易纯化，原料转化率、纯度和产率均有提升。同时制备得到的人参皂苷F1能够降低血脂含量，减少白色脂肪沉积，降低血糖，改善胰岛素抵抗，加速能量消耗，具有作为降血脂、降血糖和减肥药物的良好潜力。

Description

一种酶法制备人参皂苷F1的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种酶法制备人参皂苷F1的方法及其应用。
背景技术
肥胖症是一种慢性代谢性疾病，指的是机体脂肪分布异常和(或)堆积过多、体重增加。肥胖也是心脑血管疾病、II型糖尿病、骨关节病等发生的危险因素。肥胖导致一系列并发症或相关疾病，影响人类寿命、导致人类生活质量下降。
肥胖的发生是由于机体内热量的摄入大于消耗，造成体内脂肪堆积过多。研究证实体内的脂肪组织可以分为两大类：分布于皮下、肠系膜等部位的白色脂肪组织(Whiteadipose tissue，WAT)和存在于颈部周围、肩胛间、肋骨周围等部位少量的棕色脂肪组织(Brown adipose tissue，BAT)。通常所称肥胖是WAT过多堆积体内造成的；而BAT是寒冷适应条件下非战栗产热的主要器官，可以通过消耗能量、产热来维持机体的能量代谢平衡。
肥胖发病机制复杂，目前尚无一个很好的药物靶点。在减肥药物开发过程中，很多药物都通过作用于神经摄食中枢发挥作用，可能伴随抑郁和焦虑的副作用；同时研究人员对作用于外周的药物在多种组织中的机理了解不够透彻，可能出现意外的副作用，如肽激素类似物的免疫原性风险等。然而从新的角度——能量平衡来看，通过增大机体能量消耗以达到减重的效果可以成为一个新的肥胖治疗策略，为潜在减肥药物的发现提供了新的方向。
人参(PanaxginsengC.A.Mey.)是五加科(Araliaceae)人参属(Panax)草本植物，是产于我国东北地区的一味名贵药材。如今，人参成为全世界使用最广泛的中草药之一。人参含有多种有效成分，包括人参皂苷、人参多糖、肽、氨基酸、微量元素及有机酸等，其中人参皂苷是人参的主要活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳和提高人体免疫力的作用。人参皂苷是由糖基通过糖苷键与人参皂苷元相连构成的糖苷类化合物。其糖链的组成与药理学活性具有密切的关系。根据含量不同，可分为主要人参皂苷(如Rb1、Rb2、Rc、Rd等)和稀有人参皂苷(Rg3、Rh1、F1、CK等)，其中人参皂苷F1是三醇型人参皂苷。人参皂苷F1是人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的肠内菌代谢产物，在天然药材中含量较低，目前仅在人参叶及花中分离得到过。人参中人参皂苷的含量占2-4％，皂苷种类较多，已经鉴定的种类有70余种。人参皂苷F1在诸多方面具有较强的药理活性：人参皂苷F1被吸收到血液中，可以在其中发挥雌激素作用；它也表现出抗癌作用，显示出对B16细胞增殖的强烈抑制作用；它具有抗衰老和抗氧化作用，并且对CYP3A4的活性具有竞争性抑制作用，对CYP2D6的活性具有较弱的抑制作用；人参皂苷F1对于角质形成细胞也具有较好的保护作用等等。
研究表明稀有皂苷含量在野生人参中很少甚至没有。而这些稀有皂苷相比于糖基化的人参具有较好的药理学活性。但由于含量低，制备和生产受到限制。酶法制备稀有人参皂苷有专一的选择性、高效的转化率和产率，是很有潜力的方法。因此，可以通过酶法选择性水解原有人参皂苷的糖基来制备稀有人参皂苷是非常有必要的。
CN105418718A公开以人参花为原料，经过醇提，硅胶柱层析和MCIGEL柱层析，重结晶的方法，得到了一种新化合物6'-丙二酸单甲酯酰基人参皂苷F1。CN105601693A公开从人参花中提取F1，有机溶剂萃取过硅胶柱层析并进行分离纯化，得到人参皂苷F1单体。申请公布号为CN108623650A、CN108727457A、CN109021053A公开用人参花蕾为原材料，用有机溶剂提取得到总提物，用大孔树脂和有机溶剂结合方法除杂浓缩，然后用有机溶剂高速逆流分离，三篇专利方法相同，分别得到6’-乙酰基人参皂苷F1、6’-丙二酰甲酰基人参皂苷F1和3-乙酰基人参皂苷F1。这些方法得到的基本都是带有基团的F1(F1衍生物)，而不是单体人参皂苷F1。现也有人参皂苷利用酶进行转化制备稀有人参皂苷F1，CN101012473公开用生物转化技术制备人参皂苷F1，原料为人参三醇组皂苷或人参单体皂苷Rg1生成F1并进行纯化，选用的菌株为平滑青霉或疣孢漆斑菌。CN105648021B公开用三醇类皂苷，分别与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应，得到人参稀有皂苷F1。但是这些用生物学方法制备F1的专利都是以细菌或是真菌发酵制得，制备工艺复杂，对反应条件要求较高，原料的转化率低，得到的副产物多，人参皂苷F1纯度不好，产率低。因此，提供一种酶法制备人参皂苷F1的方法，从而提高原料的转化率以及产物的纯度和产率，减少得到的副产物显得非常必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶法制备人参皂苷F1的方法，能够提高原料的转化率，减少得到的副产物，同时提高单体人参皂苷F1的纯度和产率。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种酶法制备人参皂苷F1的方法，具体包括以下步骤：
将三醇组人参皂苷、糖苷水解酶BglSK和缓冲液混合进行水解，水解液经离心得到沉淀，所述沉淀经除蛋白、纯化即得所述人参皂苷F1。
优选的，所述缓冲液为20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
优选的，所述三醇组人参皂苷的浓度为(15-25)mg/mL。
优选的，所述糖苷水解酶BglSK的加入量为2-4kU/g原料。
优选的，所述水解的pH为7-9，所述水解的温度为30-40℃。
优选的，所述水解的时间为2.5-4d。
优选的，所述离心的离心力为4000-8000rcf，所述离心的时间为10-30min。
优选的，所述除蛋白的溶剂为80％-95％乙醇。
本发明还提供了上述方法制备得到的人参皂苷F1在制备降血糖或降血脂药物中的应用。
本发明还提供了上述方法制备得到的人参皂苷F1在制备减肥药物中的应用。
本发明提供了一种酶法制备人参皂苷F1的方法，直接采用糖苷水解酶BglSK水解糖基实现皂苷之间的转化，反应时间短，成本低，反应条件更温和，FI粗品中的副产物含量少，容易纯化，能够显著提高制备人参皂苷F1的原料转化率、人参皂苷F1的纯度和产率。同时制备得到的人参皂苷F1能够降低血脂含量，减少白色脂肪沉积，降低血糖，改善胰岛素抵抗，加速能量消耗，具有作为降血脂、降血糖和减肥药物的良好潜力。
附图说明
图1为不同的浓度的三七三醇组皂苷对Rg1转化率的影响；其中，横坐标为三七三醇组皂苷浓度，纵坐标为Rg1转化率。
图2为不同的加酶量和水解时间对Rg1转化率的影响；其中，横坐标为水解时间，纵坐标为Rg1转化率。
图3为不同的pH对Rg1转化率的影响；其中，横坐标为pH，纵坐标为Rg1转化率。
图4为不同的水解温度对Rg1转化率的影响；其中，横坐标为水解温度，纵坐标为Rg1转化率。
图5为纯化后BglSK酶电泳图；其中，1为诱导前BglSK酶；2为诱导后BglSK酶；3为纯化后的BglSK酶。
图6为不同成分的高效液相色谱图；其中，A为人参皂苷F1对照品色谱图；B为三七三醇组皂苷原料的色谱图；C为人参皂苷F1粗品的色谱图；D为纯化后人参皂苷F1的色谱图。
图7为人参皂苷F1对小鼠能量代谢的影响；其中，A-B为人参皂苷F1对小鼠产热量的影响；C-D为人参皂苷F1对小鼠氧气摄入量的影响；E-F为人参皂苷F1对小鼠二氧化碳产生量的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种酶法制备人参皂苷F1的方法，具体包括以下步骤：
将三醇组人参皂苷、糖苷水解酶BglSK和缓冲液混合进行水解，水解液经离心得到沉淀，所述沉淀经除蛋白、纯化即得所述人参皂苷F1。本发明中，所述糖苷水解酶BglSK能够特异性水解人参皂苷Rg1的C-6位糖基，从而制备得到本发明所述人参皂苷F1，具体原理如下：
Figure BDA0003147051190000051
本发明中，所述三醇组人参皂苷优选为三七三醇组皂苷。本发明对所述三七三醇组皂苷的来源并没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。在本发明的具体实施例中，所述三七三醇组皂苷购自宁波金艾农生物科技有限公司，其中Rg1含量为54.3％。本发明中，所述三醇组人参皂苷的浓度优选为(15-25)mg/mL。
为确定所述三醇组人参皂苷的浓度，在其他原料及实验条件均确定的基础上，测定不同三醇组人参皂苷的浓度对Rg1转化率的影响，具体步骤如下：
1)制备50mL反应体系：由三七三醇组皂苷、5kU糖苷水解酶BglSK和pH8.0、20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液组成；其中，设置三七三醇组皂苷添加量分别为0.75g、1g、1.25g、1.5g和1.75g，对应其浓度分别为15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL和35mg/mL；
2)将反应体系置于35℃恒温摇床，170rpm反应7d；
3)反应结束后，取200uL反应液，冻干，加入1mL甲醇复溶，6000rcf离心5min，使用0.22μm有机滤膜过滤，取10μL进样进行高效液相检测，计算Rg1转化率，检测结果如附图1所示。
由附图1可知，原料浓度为(15-25)mg/mL时，反应液中Rg1在7d时转化率超过95％，当浓度进一步提高时，Rg1在7d时转化率仍低于70％。
本发明中，所述缓冲液优选为Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，所述Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度优选为10-100mM，更优选为20mM。本发明中，所述糖苷水解酶BglSK的加入量优选为2-4kU/g原料，更优选为3kU/g原料。本发明对所述糖苷水解酶BglSK的来源并没有特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述糖苷水解酶BglSK优选为经重组制备获得。本发明中，所述水解的pH优选为7-9，更优选为8；所述水解的温度优选为30-40℃，更优选为35℃；所述水解的时间优选为2.5-4d，更优选为3d。
为确定所述糖苷水解酶BglSK的加入量和水解的时间，在其他原料及实验条件均确定的基础上，测定不同糖苷水解酶BglSK的加入量或不同水解时间对所述Rg1转化率的影响，具体步骤如下：
1)制备50mL反应体系：由1.25g三七三醇组皂苷、糖苷水解酶BglSK和pH8.0、20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液组成；其中，糖苷水解酶BglSK添加量分别为1.25kU、2.5kU、3.75kU和5kU，对应每克原料重组酶添加量分别为1kU、2kU、3kU和4kU；
2)将反应体系置于35℃恒温摇床，170rpm反应，反应时间分别1d、2d、3d、4d和5d；
3)反应结束后，取200uL反应液，冻干，加入1mL甲醇复溶，6000rcf离心5min，使用0.22μm有机滤膜过滤，取10μL进样进行高效液相检测，计算Rg1转化率，检测结果如附图2所示。
由附图2可知，相对每克原料添加糖苷水解酶BglSK 3kU，反应时间3d有利于提高Rg1的转化率；减少加酶量会减低Rg1转化率，而增加酶量无法进一步提高转化率反而增添成本。
为确定所述水解的pH，在原料及实验条件均确定的基础上，测定不同pH对所述Rg1转化率的影响，具体步骤如下：
1)制备50mL反应体系：由0.5g三七三醇组皂苷、2kU糖苷水解酶BglSK和缓冲液组成；其中，缓冲液为pH5.0、20mM NaAc-H Ac缓冲液、pH6.0、20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、pH7.0、20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、pH8.0、20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、pH9.0、20mMGlycine-NaOH缓冲液；
2)将反应体系置于37℃恒温摇床，170rpm反应1d；
3)反应结束后，取200uL反应液，冻干，加入1mL甲醇复溶，6000rcf离心5min，使用0.22μm有机滤膜过滤，取10μL进样进行高效液相检测，计算Rg1转化率，检测结果如附图3所示。
由附图3可以看出，pH值为8.0时，糖苷水解酶BglSK对人参皂苷Rg1的转化率最高。
为确定所述水解的温度，在原料及实验条件均确定的基础上，测定不同温度对所述Rg1转化率的影响，具体步骤如下：
1)制备50mL反应体系：由0.5g三七三醇组皂苷、2kU糖苷水解酶BglSK和pH8.0、20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液组成；
2)将反应体系置于恒温摇床，170rpm反应24h，反应温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃；
3)反应结束后，取200μL反应液，冻干，加入1mL甲醇复溶，6000rcf离心5min，使用0.22μm有机滤膜过滤，取10μL进样进行高效液相检测，计算Rg1转化率，检测结果如附图4所示。
由附图4可以看出，水解的温度为35℃时，糖苷水解酶BglSK对人参皂苷Rg1的转化率最高。
本发明中，所述水解液经离心得到沉淀，所述离心的离心力优选为4000-8000rcf，更优选为6000rcf，所述离心的时间优选为10-30min，更优选为15min。
本发明中，所述除蛋白的溶剂优选为80％-95％乙醇。本发明所述除蛋白的方法包括如下步骤：向沉淀中加入80％-95％乙醇，冷凝回流条件下进行一次加热搅拌，离心得上清和沉淀1；所得沉淀1中加入80％-95％乙醇，冷凝回流条件下进行二次加热搅拌，离心得上清，合并两次上清，干燥得人参皂苷F1粗品。
本发明中，一次加热搅拌时，所述沉淀与所述乙醇的质量体积比优选1g：5mL-1g：20mL，更优选为1g:10mL；二次加热搅拌时，所述沉淀1与所述乙醇的质量体积比优选为1g：5mL-1g：20mL，更优选为1g:5mL。本发明中，所述加热的温度优选为55-65℃，更优选为60℃；所述加热的时间优选为0.5-1.5h，更优选为1h。本发明中，所述离心的离心力优选为5500-6500rcf，更优选为6000rcf，所述离心的时间优选为13-20min，更优选为15min。本发明对所述干燥的方法并没有特殊限定，采用本领域常规的干燥方法即可。
本发明所述人参皂苷F1粗品还需要经过纯化得到本发明所述的人参皂苷F1。本发明对所述纯化的方法并没有特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述纯化的方法优选为硅胶柱层析法。本发明中，所述纯化后的人参皂苷F1的纯度大于95％。
本发明还提供了上述方法制备得到的人参皂苷F1在制备降血糖或降血脂药物中的应用。
本发明还提供了上述方法制备得到的人参皂苷F1在制备减肥药物中的应用。
在本发明的具体实施例中，奥利司他、小鼠和人参皂苷PPT的来源如下：
奥利司他(Orlistat)：Aladdin，O159936；
肥胖小鼠(B6/JGpt-Lepem1Cd25/Gpt，简写ob/ob)：江苏集萃药康生物科技有限公司，T001461；
正常小鼠(C57BL/6JGpt，简写C57BL/6J)：江苏集萃药康生物科技有限公司，N000013；
人参皂苷PPT：成都曼思特生物科技有限公司，A0249；人参皂苷PPT的结构式如式I所示：
Figure BDA0003147051190000091
下面结合部分实施例对本发明进行进一步的详细描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1糖苷水解酶BglSK的制备
(一)重组载体的构建
人工合成序列表中(GenBank登陆号为ACZ20402.1)所示的DNA分子(即糖苷水解酶编码基因，将该基因记为BglSK基因，片段大小为1857bp)，以该DNA分子为模板，利用引物正向引物：5'-GGTTCCGCGTGGATCCCCCACTCCCCTGACCACCCTGACC-3'(下划线为限制性内切酶BamHI的识别序列)和反向引物：5'-GATGCGGCCGCTCGAGTCAGATGCTCAGCCCGTGCCCCAC-3'(下划线为限制性内切酶XhoI的识别序列)进行PCR扩增，得到PCR产物。
将所得PCR产物利用BamHI和XhoI进行双酶切，将所得酶切后片段与PGEX-4T-1经BamHI和XhoI进行双酶切得到的载体骨架相连，得到重组载体，将所得序列正确的重组载体记为PGEX-4T-1-BglSK。
(二)BglSK酶的制备
将所得PGEX-4T-1-BglSK导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，记为BL21-PGEX-4T-1-BglSK。将BL21-PGEX-4T-1-BglSK接种于含有卡那霉素的LB培养基中，在37℃下培养，直至培养物达到的OD600为0.6时，向培养体系中加入在培养体系中浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，将培养体系于25℃下继续培养24小时诱导蛋白质表达，培养结束后将培养体系在4℃下以6000rcf离心15min，收集菌体。
将所得菌体用100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤两次后，将其重悬于该缓冲液中，得到菌体悬液。将所得菌体悬液通过超声破碎细胞得到破碎产物，将所得破碎产物以26000rcf4℃离心30min，收集上清液，得到粗细胞提取物。将所得粗细胞提取物使用，获得纯化的α-L-鼠李糖苷酶。电泳检测如附图5所示，纯化的BglSK的纯度高，且条带大小正确。
(三)糖苷水解酶BglSK的酶活性检测
1、制备反应体系：反应体系为100μL，由10μL待测样品(纯化的糖苷水解酶的稀释液(用超纯水稀释至5倍)或IPTG诱导后总蛋白溶液的稀释液(用超纯水稀释至5倍)、10μL浓度为5mM的pNP-β-D-Glu(Sigma公司的产品)水溶液和80μLpH 8.0、25mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液组成。
2、将步骤1制备的体系置于35℃条件下，反应10min。
3、完成步骤2后，加入100μL浓度为0.5M的NaOH水溶液终止反应，然后6000rcf离心10min，收集上清并经0.45μm的有机滤膜过滤，收集滤液。
4、完成步骤3后，检测滤液在405nm处的吸光值；根据pNP标准曲线，获得待测样品的糖苷水解酶酶活力。进一步获得纯化的糖苷水解酶BglSK和IPTG诱导后总蛋白溶液的酶活力。
5、用考马斯亮蓝G250法分别测定纯化的糖苷水解酶BglSK和IPTG诱导后总蛋白溶液的总蛋白含量，进一步获得纯化的糖苷水解酶BglSK和IPTG诱导后总蛋白溶液的比活力。
结果表明，IPTG诱导后总蛋白溶液的比活力为12U/mg，纯化的糖苷水解酶BglSK的比活力为35U/mg，糖苷水解酶BglSK具有糖苷水解酶活性。
糖苷水解酶BglSK的酶活单位(U)定义为：在35℃条件下，每分钟催化对硝基苯基α-L-葡萄糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNP-β-D-Glu)生成1μmol pNP所需要的酶量为1U。
实施例2
制备人参皂苷F1的方法：
1、水解：在2L锥形瓶内加入500mL 20mM pH8.0磷酸缓冲液，投入25g三七三醇组皂苷(宁波金艾农生物科技有限公司，Rg1含量为54.3％)，加入80kU糖苷水解酶BglSK，添加缓冲液将体系补足至1L。将锥形瓶置于恒温摇床中，在35℃，170rpm条件下反应72h。
2、离心：将反应液转入离心杯中，6000rcf，25℃离心15min，弃去上清，收集沉淀。
3、除蛋白质：向沉淀中加入250mL95％乙醇，搅拌均匀，60℃加热1h，离心15min(6000rcf，25℃)，收集上清，沉淀中加入125mL95％乙醇，25℃搅拌均匀，离心收集上清，合并两次上清。使用旋转蒸发仪将上清减压浓缩至固体或粉末状，最后放入真空干燥箱内进行干燥，获得人参皂苷F1粗品。
4、纯化：使用硅胶柱对粗品人参皂苷F1进行纯化，使用正相硅胶粉(200-300目)，硅胶质量为400g，玻璃柱规格为8×24cm，采用等度洗脱，流动相为甲醇：乙醇：乙酸乙酯＝3：7：60(体积比)，湿法上样，流速为16mL/min，用玻璃试管收集流出液，每份收集15mL，TLC检测收集液，将检测结果为纯F1的收集液合并，干燥即得本发明所述人参皂苷F1。
实施例3
利用高效液相色谱法对实施例2所述三七三醇组皂苷、人参皂苷F1粗品及F1纯品进行检测，通过比较待测样品与标准品F1的峰面积计算F1含量。
色谱条件如下：
L-3000高效液相色谱系统(购自普源精电科技股份有限公司)，采用C18反相层析柱(4.6mm×250mm，5m)。乙腈-水溶液作为洗脱剂，线性梯度洗脱，0-10min，22.5％乙腈；10-40min，22.5％-70％乙腈；40-50min，100％乙腈。上样量：200g，柱温：30℃，流速：0.8mL/min，检测器：UV-VIS检测器，203nm处检测吸收值。
本实施例中人参皂苷F1标准品为中国药品生物制品检定所的产品，F1含量93.5％。所述三七三醇组皂苷、人参皂苷F1粗品及F1纯品高效液相色谱图分别如附图6B-D所示。经计算，人参皂苷F1含量及产率如下表1所示。
表1人参皂苷F1含量及产率
Figure BDA0003147051190000121
由附图6C可以看出，转化过程中，Rg1被完全转化，生成大量F1和少量Rh1，少量Re被转化为Rg2，转化产物主要由F1组成，同时含有少量的Re、Rg2和Rg1，转化产物(人参皂苷F1粗品)组成如下表2所示：
表2人参皂苷F1粗品组成
Figure BDA0003147051190000122
实施例4
将实施例2中所述本发明制备人参皂苷F1的方法与现有的制备人参皂苷F1的方法相比(其中，方法1参见《固定化β-葡萄糖苷酶制备人参皂苷F1的研究》，张琪等，中国抗生素杂志，2012,37(001):49-55。方法2参见《人参三醇类皂苷水解酶的研究》，许郁峰，大连工业大学，2012。方法3参见《生物转化法制备人参皂苷F1及Rh1的研究》，王宇，大连工业大学。方法4参见《真菌EST-I及EST-II对人参皂苷Rg1定向转化为人参皂苷F1的研究》，吴秀丽等，沈阳药科大学学报，2008)，经统计分析得到下表3：
表3制备人参皂苷F1的不同方法比较
Figure BDA0003147051190000123
Figure BDA0003147051190000131
实施例5
将实施例2的人参皂苷F1溶解于DMSO中，配制成4mg/mL人参皂苷F1储备液；将人参皂苷PPT溶解于DMSO中，配制成4mg/mL人参皂苷PPT储备液；将奥利司他溶解于H2O中，配制成4mg/mL奥利司他储备液；室温保存。
将8只4周龄雄性C57BL/6J小鼠作为第1组，不做给药处理。选取40只4周龄雄性ob/ob小鼠分为5组，每组8只，分别进行以下处理：第2组，不做给药处理，为空白对照组；第3组，5％DMSO以等体积连续腹腔注射5周，作为阴性对照；第4组，奥利司他(Orlistat)以20mg/kg/d的剂量连续腹腔注射5周，作为阳性对照；第5组，实施例2的人参皂苷F1以20mg/kg/d的剂量，采用腹腔注射的方式连续给药5周；第6组，人参皂苷PPT以20mg/kg/d的剂量，采用腹腔注射的方式连续给药5周。给药组的每只小鼠每天均给药1次。其中，将DMSO溶于dH2O中，得到DMSO浓度为5％(1mLDMSO/9mLdH2O)溶液，记为5％DMSO。
分组后给药前上午9点用血糖仪(强生，OneTouch UltraEasy)检测空腹血糖，然后称体重。自给药始，每周监测空腹血糖一次，固定于上午9点用血糖仪(强生，OneTouchUltraEasy)检测，且每周监测小鼠体重一次。给药结束后小鼠眼球取血，检测血清INS(Insulin，胰岛素)、TG(Triglyceride，甘油三酯)、NEFA(Non-esterified fatty acid，游离脂肪酸)、TC(Total cholesterol，总胆固醇)含量。第5周给药结束后处死小鼠，取性腺白色脂肪(gWAT)和腹股沟白色脂肪(iWAT)，并称重。
血清INS、TG、NEFA、TC含量的检测分别采用IBL公司的胰岛素试剂盒(Mouse InsElisa Kit)(货号YX-091419M)以及南京建成生物工程研究所的甘油三酯试剂盒(TG,A110-1-1)、游离脂肪酸试剂盒(NEFA,A042-2-1)和总胆固醇试剂盒(TC,A111-1)进行。
计算体重降低率、空腹血糖降低率：
体重降低率＝药物处理组小鼠体重变化值/未给药处理组小鼠体重变化值×100％，体重变化值＝第5周给药结束后体重-给药前体重；
空腹血糖降低率＝(给药后小鼠血糖-分组后给药前小鼠血糖)/分组后给药前小鼠血糖×100％。
利用SPSS统计软件，进行ANOVA-one way统计学分析，第5周给药结束后各指标的结果如表4所示。
表4人参皂苷F1对肥胖小鼠代谢指标的影响
Figure BDA0003147051190000141
Figure BDA0003147051190000151
表4中，结果以mean±SD表示；*是与第3组相比显著性分析结果，*：p<0.05；**：p<0.01，***：p<0.001。
其中，C57BL/6J为第1组，即C57BL/6J不给药处理组；ob/ob为第2组，即ob/ob不给药处理空白对照组；ob+DMSO为第3组，即ob/ob阴性对照组；ob+Orlistat为第4组，即ob/obOrlistat处理组；ob+F1为第5组，即ob/ob人参皂苷F1处理组；ob+PPT为第6组，即ob/ob人参皂苷PPT处理组。
由上述表4可以看出，对于ob/ob小鼠，各指标变化情况如下：
(1)从体重降低率分析，与第3组小鼠相比，人参皂苷F1给药后小鼠体重增长非常缓慢，体重降低率为29.33％。从白色脂肪重量分析，与第3组小鼠相比，人参皂苷F1给药后小鼠的gWAT和iWAT重量均显著减少，而Orlistat给药后小鼠的gWAT和iWAT重量均无显著变化，说明人参皂苷F1可以显著降低小鼠的体重和白色脂肪重量。
(2)从血糖降低率分析，与第3组小鼠相比，人参皂苷F1给药后小鼠血糖显著下降，降低率为46.65％，而Orlistat给药后小鼠的血糖降低率仅为32.23％，说明人参皂苷F1在降血糖中具有显著的效果。
(3)从胰岛素含量分析，与第3组小鼠相比，人参皂苷F1给药后小鼠血清胰岛素含量显著减少，为84.10mIU/L，说明人参皂苷F1可以改善胰岛素抵抗。
(4)从血脂含量分析，与第3组小鼠相比，人参皂苷F1给药后小鼠血清中TG和NEFA水平显著降低，而TC含量没有显著变化，说明人参皂苷F1还具有降血脂的作用。
可见，腹腔注射人参皂苷F1可以减轻肥胖小鼠体重，降低血脂含量，减少白色脂肪沉积，降低血糖，改善胰岛素抵抗，即本发明所述的人参皂苷F1具有降血糖以及降血脂的作用，具有作为降血糖、降血脂或减肥药物的潜质。而人参皂苷PPT不能降低肥胖小鼠体重，不能降低血脂含量，血糖水平无显著变化。
实施例6
采用与实施例4相同的给药方法，给药第5周后用代谢笼——CLAMS实验动物检测系统(Coulumbus，美国)检测小鼠氧耗量、活动量等指标，其中，CLAMS实验动物检测系统能够排除活动度这一因素对实验小鼠机体代谢率的影响。在将小鼠放入代谢笼之前，预先单笼饲养小鼠适应1周，放入代谢笼后小鼠适应24小时，之后开始记录24小时的氧耗量(VO2)、CO2呼出量(VCO2)、活动度(xAMB)及产热率(HEAT)。实验结果采用GraphPad Prism 6.0或excel 2010软件进行数据分析和作图，实验结果如附图7所示。
由附图7结果可知，人参皂苷F1处理组小鼠的产热量在各检测时间点均明显高于第3组(即阴性对照组)小鼠(图7中A)，经统计学分析两组小鼠昼夜的产热量差异有统计学意义(图7中B)。CLAMS实验动物检测系统结果显示人参皂苷F1处理组ob/ob小鼠的氧气消耗量和二氧化碳呼出量均高于第3组(即阴性对照组)小鼠，而且差异具有统计学意义(图7C-F)。可以证明，人参皂苷F1处理组小鼠机体产热量增多，氧气消耗量及二氧化碳呼出量升高，本发明制备得到的人参皂苷F1可以增高实验小鼠的代谢率。而肥胖的发生是由于能量的摄入大于输出所致，代谢率增加可使能量在相同状态下更多以热能的方式散失，进而使体重下降，因此本发明所述人参皂苷F1具有加速能量消耗的的作用，能够作为减肥药物的活性成分。
由上述实施例可知，本发明所述的酶法制备人参皂苷F1的方法，直接采用糖苷水解酶BglSK水解糖基实现皂苷之间的转化，反应时间短，成本低，反应条件更温和，F1粗品中的副产物含量少，容易纯化，能够显著提高制备人参皂苷F1的原料转化率、人参皂苷F1的纯度和产率。同时制备得到的人参皂苷F1能够降低血脂含量，减少白色脂肪沉积，降低血糖，改善胰岛素抵抗，加速能量消耗，具有作为降血脂、降血糖和减肥药物的良好潜力。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种酶法制备人参皂苷F1的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将三醇组人参皂苷、糖苷水解酶BglSK和缓冲液混合进行水解，水解液经离心得到沉淀，所述沉淀经除蛋白、纯化即得所述人参皂苷F1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三醇组人参皂苷的浓度为(15-25)mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖苷水解酶BglSK的加入量为2-4kU/g原料。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解的pH为7-9，所述水解的温度为30-40℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解的时间为2.5-4d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的离心力为4000-8000rcf，所述离心的时间为10-30min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除蛋白的溶剂为80％-95％乙醇。
9.权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的人参皂苷F1在制备降血糖或降血脂药物中的应用。
10.权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的人参皂苷F1在制备减肥药物中的应用。
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