KR100671263B1

KR100671263B1 - 진세노사이드 알에이치1을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100671263B1
Application number: KR1020050031521A
Authority: KR
Inventors: 지근억; 박명수; 지현
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2007-01-19
Also published as: KR20060109187A

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rh1을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼 추출물을 비피도박테리움 속의 미생물과 반응시킴으로써 인삼의 대사산물인 진세노사이드 Rh1을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면 다양한 식품 미생물들이 특정한 진세노사이드 산물을 생산한다는 사실로부터 유산균의 일종으로 식용이 가능한 비피도박테리움 속의 미생물을 이용하여 인삼의 대사산물인 활성형의 진세노사이드 Rh1을 효과적으로 생산할 수 있으며, 또한 식품 미생물에 의한 인삼 사포닌의 전환 경로를 밝힘으로써 진세노사이드 기질과 특정 미생물 효소를 적절히 조합하여 원하는 기능에 맞는 생산물을 얻을 수 있으므로, 본 발명의 방법은 활성형의 진세노사이드를 포함하는 다양한 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

진세노사이드 알에이치1을 생산하는 방법{Method of Producing Ginsenoside Rh1}

도 1은 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의해 전환된 진세노사이드(ginsenoside)의 TLC 프로필(profile)을 보여주는 사진으로, 화살표는 Rb1 아래에 존재하는 스팟(spot)을 가리킨다.

도 2는 조(crude) 미생물 효소에 의해 전환된 진세노사이드의 TLC 프로필을 보여주는 사진으로, 화살표는 Rb1 아래에 존재하는 스팟을 가리킨다.

도 3은 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의한 Rb1의 전환 경로를 보여주는 흐름도이다.

도 4는 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의한 Rb2의 전환 경로를 보여주는 흐름도이다.

도 5는 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의한 Rc의 전환 경로를 보여주는 흐름도로서, 실선 화살표는 주(main) 경로를 가리키고, 점선 화살표는 부(minor) 경로를 가리킨다.

도 6은 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의한 Re의 전환 경로를 보여주는 흐름도로서, 실선 화살표는 주 경로를 가리키고, 점선 화살표는 부 경로를 가리 킨다.

본 발명은 진세노사이드 Rh1을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼 추출물을 비피도박테리움 속의 미생물과 반응시킴으로써 인삼의 대사산물인 진세노사이드 Rh1을 생산하는 방법에 관한 것이다.

인삼(the root of Panax ginseng C.A. Meyer. Araliaceae)은 중국, 한국, 일본 등의 아시아 국가에서 전통적으로 각종 질병의 치료에 사용되어 온 약재 중 하나이다. 이러한 인삼의 주요 활성 성분인 인삼 사포닌(saponin)(진세노사이드)은 항노화, 항염증, 중추 신경계와 심혈관계 및 면역계에서의 항산화 활성(Wu JY, et al., J. Immunol., 148:1519-25, 1992; Lee FC., Facts about ginseng, the elixir of life. Hollyn International. New Jersey, 1992; Huang KC., The pharmacology of Chinese herbs. CRC Press. Florida, 1999), 항당뇨 활성(Chang HM., Pharmacology and application of Chinese material medica. Vol1. World Scientific. Singapore, 1986) 및 항종양 활성(Sato K, et al., Biol. Pharm. Bull. 17:635-9, 1994; Mochizuki M, et al., Biol. Pharm. Bull. 18:1197-1202, 1995) 등과 같은 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.

현재까지 30여 종이 넘는 진세노사이드가 인삼 사포닌으로부터 분리·동정되었으며, 담마란(dammarane) 골격을 가진 아글리콘(aglycone)을 포함하는 글리코사이드(glycoside)인 진세노사이드에는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd와 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Re와 Rg1이 대부분을 차지하고 있다(화학식 1 참조).

화합물	R1	R2	R3
20(S)-프로토파낙사디올 형
진세노사이드 Rb1	O-Glc(2-1)Glc	H	O-Glc(6-1)Glc
Rb2	O-Glc(2-1)Glc	H	O-Glc(6-1)Arap
Rc	O-Glc(2-1)Glc	H	O-Glc(6-1)Araf
Rd	O-Glc(2-1)Glc	H	O-Glc
F2	O-Glc	H	O-Glc
Rh2	O-Glc	H	OH
화합물 K	OH	H	O-Glc
O (Ⅰ)	O-Glc	H	O-Glc(6-1)Arap
Y (Ⅱ)	OH	H	O-Glc(6-1)Arap
Mc (Ⅲ)	OH	H	O-Glc(6-1)Araf
Mc1 (Ⅳ)	O-Glc	H	O-Glc(6-1)Araf
20(S)-프로토파낙사트리올 형
진세노사이드 Re	OH	O-Glc(2-1)Rha	O-Glc
Rf	OH	O-Glc(2-1)Glc	OH
Rg1	OH	O-Glc	O-Glc
Rg2	OH	O-Glc(2-1)Rha	OH
F1	OH	OH	O-Glc
Rh1	OH	O-Glc	OH

한편, 진세노사이드는 섭취 후 사람의 장내 미생물에 의해 대사되어 그 대사산물이 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Karikura M, et al., Chem. Pharm. Bull, 39:2357-61, 1991; Kanaoda M, et al., J. Tradit. Med. 11:241-5, 1994; Akao T, et al., Biol. Pharm. Bull. 21:245-9, 1998). 예를 들어, 프로토파낙사디올계 사포닌인 Rb1, Rb2, Rc는 사람의 장내 세균에 의해 20-O-β-D-글루코피라노실(glucopyranosyl)-20(S)-프로토파낙사디올(IH-901, 화합물 K)로 대사되고(Hasegawa H, et al., Planta Medica 63:463-40, 1997; Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 프로토파낙사트리올계 사포닌인 Re와 Rg1은 장내세균에 의해 진세노사이드 Rh1이나 진세노사이드 F1으로 대사되며(Hasegawa H, et al., Planta Medica 62:453-7, 1996; Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 이렇게 전환된 화합물 K, Rh1 및 F1은 다양한 생리활성을 나타낸다. 구체적으로, 화합물 K는 종양의 침입을 막거나 염색체 변형과 종양형성을 예방함으로써 항전이 또는 항암 효과를 유도한다고 알려져 있으며(Wakabayashi C, et al., Oncol. Res. 9:411-7, 1998; Lee SJ, et al., Cancer Lett. 144:39-43, 1999), Rh1은 각종 암세포의 성장에 대한 세포독성 효과(Odashima S, et al., Cancer Res. 45:2781-4, 1985; Ota T, et al., Cancer Res. 47:3863-7, 1987; Lee HY, et al., Differentiation mechanism of ginsenosides in cultured murine F9 teratocarcinoma stem cells. Proc. 6th Int. Ginseng symp. Seoul 127-31, 1993) 및 항알레르기, 항염증 활성(Park EK, et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 133:113-120, 2004)을 가진다. 또한, F1은 자외선-B-유도성 세포의 죽음을 상당히 감소시키며, 자외선 B의 조사에 의한 아폽토시스(apoptosis)로부터 Bcl-2와 Brn-3a의 발현을 하부-조절(down-regulation)시킴으로써 인간 HaCaT 각질세포를 보호할 수 있음이 알려져 있다(Lee EH, et al., J. Invest. Dermatol. 121:607-13, 2003).

이러한 이유로 진세노사이드를 그의 대사산물로 전환시키려는 노력들이 광범위하게 시도되었다. 일부 연구자들은 화학적 합성, 약산 가수분해, 알칼리 분해 등으로 진성 프로사포제닌(genuine prosapogenin) 또는 사포제닌을 생산하려 하였다(Han BH, et al., Planta Medica 44:146-9, 1982; Chen Y, et al., Chem. Pharm. Bull. 35: 1653-5, 1987; Elyakov GB, Atopkina LN, Uvarova NI. Synthesis of the ginseng glycosides and their analogs. Proc. 6th Int. Ginseng Symp. Seoul 74-83, 1993). 그러나, 이러한 방법들은 에피머화(epimerization), 수화(hydration), 히드록실화(hydroxylation) 등과 같은 여러 가지 부반응을 야기시키므로, 최근에는 효소(Ko SR, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:2739-43, 2000; Ko SR, et al., Planta Med. 69:285-6, 2003)와 장내세균(Hasegawa H, et al., Planta Medica 63:463-40, 1997; Bae EA, et al., J. Microbial. Biotechnol. 13:9-14, 2003) 등을 이용한 온화한 조건에서 진세노사이드를 전환시키는 방법들이 다양하게 연구되고 있다. 그러나, 이러한 분야에 대한 연구는 아직 부족한 상태이고, 현재 몇몇 생물 전환체가 보고되어 있기는 하지만 모두 일부 미생물에 국한된 전환 경로가 연구되어 있을 뿐이다. 또한, 인삼 사포닌을 전환하기 위해 사용된 미생물들은 대부분 식용가능하지 않은 유박테리움 종(Eubacterium sp.), 푸소박테리움 종(Fusobacterium sp.) 또는 박테로이데스 종(Bacteroides sp.) 등으로서, 이로부터 생산된 대사산물들을 실생활에 이용하기 어렵다는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 인삼 진세노사이드 대사산물 제조 방법상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 유산균의 일종으로서 식용이 가능한 비피도박테리움 속의 미생물을 이용하여 인삼의 대사산물인 진세노사이드 Rh1을 효과적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 추출물을 비피도박테리움 속의 미생물과 반응시킴으로써 인삼의 대사산물인 진세노사이드 Rh1을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 방법에 있어서, 인삼 추출물은 인삼을 물 또는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 저급 알코올을 이용하여 추출함으로써 제조될 수 있다. 또한, 비피도박테리움 속의 미생물로는 비피도박테리움 sp. Int57 및 비피도박테리움 sp. SJ32를 단독, 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 비피도박테리움 롱검 SJ32 (Bifidobacterium longum SJ32)은 2995년 3월 17일자로 한국미생물보존센타에 기탁 하였다. (KFCC 11350P)상기 미생물은 미생물의 배양액 형태로 사용되어도 무방하지만, 상기 미생물을 파쇄하여 제조되는 조(crude) 미생물 효소의 형태로 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 진세노사이드 Rh1의 제조에 사용되는 인삼 진세노사이드는 진세노사이드 Re 또는 Rg1인 것이 바람직하지만, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.

또한, 진세노사이드 Rh1의 제조에 사용되는 원료인 상기 인삼 추출물은 물이나 완충용액과 같은 수성용매 및/또는 유기용매를 추가로 포함할 수 있다. 상기 수성용매로는 pH 3 내지 8, 바람직하게는 pH 4 내지 6 범위의 포스페이트 완충용액, 구연산 완충용액을 사용할 수 있고, 상기 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 저급 알코올과 톨루엔, 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 화합물을 사용할 수 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 유기용매는 수성용매에 0 내지 50 중량% 정도 혼합되는 것이 좋으나, 유기용매의 혼합 비율은 반응에 사용되는 고농도의 인삼 진세노사이드 원료 물질을 용해시킬 수 있고, 효소의 활성을 저하시키지 않는 범위에서 사용한다. 최적의 용매조건을 얻기 위해서는 수성 완충용액만 사용하는 것보다 유기용매를 적절히 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같이 유기용매를 혼합하여 사용하는 것은 효소 반응에 의해 생성되는 중간 반응물의 용해도를 증가시킴으로써 최종 산물인 진세노사이드 Rh1의 수율을 향상시키기 위한 것이다.

아글리콘(aglycone) 형태의 진세노사이드는 혈류를 통해 더 쉽게 흡수되어 활성형의 화합물로 작용한다고 알려져 있으며(Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 장내 미생물은 섭취된 진세노사이드를 더 활성있는 형태로 전환시킬 수 있다(Bae EA, et al., Biol. Pharm. Bull. 23:1481-5, 2000). 따라서, 특정한 미생물을 사용하여 인삼 사포닌을 대사시킴으로써 목적하는 기능에 맞는 특정한 진세노사이드 전환체를 얻을 수 있게 된다.

본 발명에서는 비피도박테리움 속의 미생물을 이용하여 인삼 사포닌을 활성형인 형태로 전환시키고자 하였으며, 미생물 배양액을 이용한 실험에서는 비피도박테리움 sp. Int57의 진세노사이드 전환 능력이 발효과정 중 가장 큰 것으로 나타났다. 그러나, β-글루코시다제(glucosidase)를 유도하기 위해 셀로바이오스(cellobiose)를 첨가함에도 불구하고 화합물 K는 생성되지 않았다(도 1 참조).

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 미생물 세포를 파쇄한 후 조(crude) 미생물 효소의 형태로 사용한 경우, 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에서 상대적으로 많은 양의 화합물 K가 생성되었으며(도 2 참조), 이전의 문헌에서보다 생산성이 높았다(Bae EA, et al., Arch. Pharm. Res. 27:61-7, 2004). 이것은 미생물 배양액에서 살아있는 미생물을 이용하여 진세노사이드를 전환시키는 것보다는 미생물 효소를 이용하여 전환시키는 것이 더 효과적이라는 것을 보여준다. 비피도박테리움 속의 미생물 중에서 비피도박테리움 sp. Int57이 진세노사이드를 화합물 K로 전환시키는 능력이 가장 컸다. 상기 결과들은 다양한 식품 미생물의 글루코시다제(glucosidase)가 진세노사이드의 전환경로에서 다른 특이성을 보여준다는 것을 의 미한다.

식품 미생물에 의한 인삼 사포닌인 진세노사이드의 전환 경로를 조사한 결과, 진세노사이드 Rb1의 경우 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의해 최종산물로 화합물 K가 생산되었다(도 3 참조). Bae 등은 Rb1과 Rb2가 사람의 장내미생물에 의해서는 Rh2로 전환되지 않는다고 보고한 바 있다(Bae EA, et al., Biol. Pharm. Bull. 25:58-63, 2000). Rb1과 Rb2는 위에서 Rg3으로 전환된 후 장에서 Rh2의 형태로 흡수되는데 이것은 박테로이드(Bacteroide) spp., 푸소박테리움(Fusobacterium) spp. 및 비피도박테리움 spp.의 미생물들이 Rg3를 Rh2로 전환시키기 때문에 가능하다고 하였다. 그렇지 않다면, Rb1과 Rb2는 사람의 장에서 화합물 K로 전환되어야 할 것이다. 모든 균주들은 Rb1의 C-20에 결합되어 있는 젠티바이오스(gentiobiose)의 글루코스(glucose)를 가수분해한 후 C-3에 결합되어 있는 소포로즈(sophorose)의 글루코스를 가수분해하였는데, 이러한 결과는 푸소박테리움 K-60과 박테로이드 spp.가 전환의 첫번째 단계에서 C-3에 결합되어 있는 소포로즈의 글루코스를 가수분해하여 지페노시드(gypenoside) ⅩⅦ을 생산한 것과는 다른 결과이다(Bae EA, et al., Biol. Pharm. Bull. 25:58-63, 2000).

Rb2의 전환에서는 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32 모두 높은 pNPAp α-아라비노피라노시다제(arabinopyranosidase) 활성을 나타내었으며, Rb2의 C-3에 있는 β-D-글루코스(1-2)-β-D-글루코스-O- 의 글루코스 유니트보다는 C-20에 있는 α- L-아라비노스(1-6)-β-D-글루코스-O 의 아라비노스 유니트를 더 잘 분해하였는데, 상기 결과는 pNPAp α-아라비노피라노시다제 활성과 Rb2의 α-아라비노피라노스 가수분해 활성이 모든 미생물에서 일치함을 의미한다(도 4 참조).

Rc의 전환경로를 연구한 결과, 비피도박테리움 Int57 및 SJ32은 Rc의 C-3에 존재하는 β-D-글루코스(1-2)-β-D-글루코스-O- 에 대한 β-글루코시다제 활성보다 C-20의 α-L-아라비노스(1-6)-β-D-글루코스-O- 에 대한 α-아라비노퓨라노시다제 활성이 더 높았다. 즉, pNPAf의 α-아라비노퓨라노시다제 활성과 Rc의 α-아라비노퓨라노즈 활성이 일치하였다(도 5 참조).

Re의 전환에서는 특이적인 경로를 보여주었는데, pNPR α-람노시다제 활성을 가진 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32이 Rg2나 Re의 α-람노스를 가수분해함으로써 Rh1을 생산하였다. 상기 결과는 pNPR α-람노시다제 활성이 Re의 α-람노시다제 활성과 일치한다는 것을 의미한다(도 6 참조).

흥미로운 사실은, 사포닌 골격에 하나의 당을 가지고 있는 진세노사이드는 미생물 효소에 의해 더 이상 분해되지 않는다는 것이다. 예를 들어, 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32에 의해 생성된 화합물 K에 결합되어 있는 C-20의 β-글루코스뿐만 아니라 Rh1에 결합되어 있는 C-6의 β-글루코스도 더 이상 분해되지 않았다. 따라서, 최종 전환 산물을 결정하는 중요한 단계는 중간기질에 대한 효소의 입체특이적 친화도가 될 수도 있다.

본 발명에서는 다양한 식품 미생물들이 특정한 진세노사이드 산물을 생산한다는 사실로부터 진세노사이드 기질과 특정 미생물 효소를 적절히 조합함으로써 콤원하는 기능에 맞는 생산물을 얻을 수 있는 생물전환 프로세스를 개발할 수 있음을 확인하였다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 미생물 및 효소에 의한 인삼 추출물과 진세노사이드의 전환 효율 측정

<1-1> 재료

표준 진세노사이드 Rb1, Rc, Re는 시그마(Sigma Chemical, St. Louis, MO., USA)에서 구입하였고, 진세노사이드 Rb2, F2, Rg2, Rh1, Rh2는 LKT 래버러토리(Laboratories Inc., St. Paul, Minnesota, USA)에서 구입하였다. 또한, 진세노사이드 Rg1은 와코 퓨어 화학회사(Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan)로부터 구입하였고, 진세노사이드 Rd, Rg3는 비티진(BTGin, Chungnam, Korea)에서 구입하였다. 아울러, 진세노사이드 Rf는 한국과학기술원(KIST)의 분자신경물리생의학연구소(Molecular Neurophysiology Biomedical Research Center, Seoul, Korea)로부터 입수하였고, 화합물 K는 경희대 약대(Seoul, Korea)로부터 입수한 것을 사용하였다. 6년근 미삼은 서울의 경동시장에서 구입하였다.

<1-2> 미생물의 종류와 생장 조건

실험에는 비피도박테리움 속 미생물인 비피도박테리움 sp. Int57 및 비피도박테리움 sp. SJ32을 사용하였다(Park SY, et al., Int. J. Food Microbiol. 46:231-41, 1999)(KFCC 11350P). 비피도박테리움 롱검 SJ32 (Bifidobacterium longum SJ32)은 2995년 3월 17일자로 한국미생물보존센타에 기탁하였다. (KFCC 11350P) 상기 미생물들은 0.05% (w/v) L-시스테인-HCl이 포함된 MRS 배지(Hardy, Santa Maria, CA., USA)(표 1 참조)에서 혐기적인 조건으로 37℃에서 하루동안 배양하였고, 이것을 다시 MRS 배지에 계대배양한 후 인삼 추출물과 배양하거나 미생물 추출물을 만드는데 사용하였다.

성분	리터당 함량
효모 추출물 쇠고기 추출물 고기 펩톤 아세트산 나트륨 제2인산나트륨 구연산 암모늄 황산 마그네슘 막레익산 활산 망간 덱스트로즈 트윈 80	10.0 g 10.0 g 10.0 g 5.0 g 2.0 g 2.0 g 1.0 ㎎ 0.1 ㎎ 0.05 ㎎ 20.0 g 10.0 ㎎

<1-3> 조(crude) 미생물 효소의 제조

배양한 세포를 원심분리로 수거한 후(4℃, 3,000 x g에서 30분) 50 mM 포스페이트 버퍼(pH 6.0)로 두 번 세척하였다. 상기 세포를 50 ㎖의 50 mM 포스페이트 버퍼로 현탁시킨 후 세포 파쇄기(Stansted fluid power, Essex, UK)로 파쇄하여 조 미생물 효소를 제조하였다.

<1-4> 인삼 추출물의 제조

5 g의 인삼분말에 30배의 80% 메탄올을 넣고 80℃에서 1시간 동안 추출한 후 여과하였다. 여과하고 남은 분말에 다시 20배의 80% 메탄올을 넣고 추출한 후 다시 여과하였다. 동일한 방법으로 한번 더 반복 추출한 후 메탄올을 모두 제거하였고(evaporator, Lab. Companion; Jeiotech, Kimpo, Korea), 여기에 10배의 물을 가하여 인삼 추출물을 제조하였다.

<1-5> 미생물의 효소활성 측정

효소활성은 p-니트로페닐(nitrophenyl)-α-D-글루코피라노시드(glucopyranoside), p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드, p-니트로페닐-α-D-갈락토피라노시드(galactopyranoside), p-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드, p-니트로페닐-α-D-만노피라노시드(mannopyranoside), p-니트로페닐-β-D-만노피라노시드, p-니트로페닐-α-L-람노피라노시드(rhamnopyranoside), p-니트로페닐-β-D-글루쿠로나이드(glucuronide), p-니트로페닐-β-D-셀로바이오사이드(cellobioside), p-니트로페닐-α-D-자일로피라노시드(xylopyranoside), p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드, p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드(arabinofuranoside), p-니트로페닐-α-L-아라비노피라노시드(arabinopyranoside), p-니트로페닐-β-L-아라비노피라노시드(Sigma Chemical, St. Louis, MO., USA) 등의 기질을 가수분해하여 p-니트로페놀(nitrophenol, pNP)이 떨어져 나와 반응동안 생성된 양으로 측정하였다. 구체적으로, 80 ㎕의 조 미생물 효소를 20 ㎕의 5 mM 기질에 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시켰으며, 100 ㎕의 0.5 M Na₂CO₃ 을 넣어 반응을 종결시켰다. 떨어져 나온 pNP는 450 nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기(Bio-RadModel Benchmark, Tokyo, Japan)로 측정하였으며, 효소 활성도는 다음과 같이 표기하였다(++++, 매우 높음; +++, 높음; ++, 보통; +, 낮음; /, 매우 낮음; -, 검출 안됨). 효소 활성의 1 유니트(unit)는 1분에 기질 1 μmol 을 가수분해시키는 효소의 양으로 정의하였다.

그 결과, 상기 미생물들은 높은 β-글루코시다제(glucosidase) 활성을 나타내었으며, SJ32가 β-아라비노피라노시다제(arabinopyranosidase) 활성을 보이지 않는 것을 제외하고는 비피도박테리움 sp. Int57와 SJ32의 효소활성 패턴이 거의 비슷하였다(표 2). 비피도박테리움 sp. Int57은 SJ32보다 α-아라비노퓨라노시다제(arabinofuranosidase)와 α-(아라비노피라노시다제(arabinopyranosidase) 활성이 높았고, 두 미생물 모두 α-아라비노퓨라노시다제 활성보다 α-아라비노피라노시다제 활성이 더 높게 나타났다.

효소의 활성	Int57	SJ32
α-글루코시다제	++	+++
β-글루코시다제	+++	+++
α-갈락토시다제	+++	+++
β-갈락토시다제	+++	+++
α-만노시다제	-	-
β-만노시다제	-	-
α-람노시다제	-	-
β-글루쿠로니다제	-	-
β-셀로바이오시다제	-	-
α-자일로시다제	-	-
β-자일로시다제	+++	+++
α-아라비노퓨라노시다제	+++	++
α-아라비노피라노시다제	+++	++
β-아라비노피라노시다제	++	-

<1-6> 미생물 배양액에서의 인삼 추출물의 전환 측정

7 ㎖의 MRS 배지에 상기 실시예 <1-4>에서 제조한 1 ㎖의 인삼 추출물을 넣은 후 500 ㎕의 세포 현탁액을 접종하고 혐기적으로 37℃에서 72시간동안 배양하였다. 그 후, 1 ㎖의 배지를 200 ㎕의 n-BuOH로 추출하였고, 이것을 TLC (thin layer chromatography)와 HPLC (high performance liquid chromatography)로 분석하였다.

<1-6-1> TLC에 의한 진세노사이드의 분석

TLC는 실리카 겔 60F254 플레이트(Merck, Darmstadt, Germany)에서 하기의 전개용매를 사용하여 수행하였다: CHCl₃-MeOH-H₂O (63:35:10, v/v, lower phase). 용매를 전개한 후 10% H₂SO₄를 뿌리고 건조시켰다(110℃, 10분). 진세노사이드와 변환된 진세노사이드는 공지된 진세노사이드 표준물질(standard)을 이용하여 확인 및 분석하였다.

<1-6-2> HPLC에 의한 진세노사이드의 분석

HPLC 급의 아세토니트릴, 이소프로판올 및 물은 J.T. 베이커(Phillipsburg, Lopatcong Township, N.J., USA)에서 구입하였다. HPLC 분석에는 Alltech Model 526 HPLC pump (Alltech Associates, Inc., Waukegan Road, Deerfield, I.L., U.S.A.), 표준-상(normal-phase) 칼럼(Prevail Carbohydrate ES, 5 ㎛, 250 ㎜ X 4.6 ㎜, Alltech), Alltech ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) 800, Allchrom™ 및 Allchrom™ Plus 소프트웨어(software)를 사용하였다. 이동상의 유속은 0.8 ㎖/분 으로 하였고, 농도구배(gradient)를 걸어 (A) 아세토니트릴-이소프로판올-물(80:15:5)과 (B) 아세토니트릴-이소프로판올-물(67:12:21) 용매를 하기와 같은 프로그램에 의해 실시하였다: 0-28분, 75% A - 25% B에서 15% A - 85% B의 선형 농도구배; 28-35분, 15% A - 85% B에서 20% A - 80% B의 선형 농도구배; 35-45분, 20% A - 80% B에서 25% A - 75% B의 선형 농도구배; 45-50분, 25% A - 75% B에서 10% A - 90% B의 선형 농도구배; 50-51분, 10% A - 90% B에서 0% A - 100% B의 선형 농도구배; 51-57분, 0% A - 100%B 에서 75% A - 25% B의 선형 농도구배. 반응물의 n-BuOH 분획은 진공(Speed vacuum concentrator 4080 C, Biotron, Inc., Bucheon, Korea) 상태에서 모두 건조시켰고, 메탄올에 녹여 필터(Millex SLLHR04NL, 0.45㎛ PTFE, 4㎜-LH; Millipore, Bedford, Mass., USA)한 후 사용하였다. 이후, ELSD 검출기로 성분을 분석하였으며, 정량적인 데이터는 공지된 진세노사이드 표준물질과 비교함으로써 확인하였다. 모든 실험은 세 번 반복적으로 실시하였다.

그 결과, Rb2 와 Rc가 Rd로 전환되었고 Rd는 더 이상 가수분해 되지 않았으며, 흥미롭게도 TLC상에서 Rb1 아래에 새로운 스팟이 발견되었다. SJ32는 Rb2가 Rd로 전환되지 않은 것을 제외하고는 비피도박테리움 sp. Int57과 거의 동일한 TLC 패턴을 나타내었다. 비피도박테리움 sp. SJ32가 Rc를 Rb2보다 빨리 가수분해하였다는 사실은 비피도박테리움 sp. SJ32가 진세노사이드에 α-아라비노피라노시다제 보다는 α-아라비노퓨라노시다제 활성을 더 높게 보였다는 것을 의미한다. 이는, pNP 기질을 사용하여 효소활성을 측정하였을 때 p-니트로페닐-α-L-아라비노피라노시드(pNPAp) α-아라비노피라노시다제 활성이 p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드(pNPAf) α-아라비노퓨라노시다제 활성보다 높았던 것과는 다른 결과이다. 두가지 미생물 모두 Rb1을 가수분해하지는 못하였다 (도 1).

<1-7> 조 미생물 효소에 의한 인삼 추출물과 진세노사이드의 전환

50 ㎕의 20 mM 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 0.05 ㎎의 진세노사이드가 포함된 반응액과 50 내지 2,000 ㎕의 조 미생물 효소가 포함된 반응액(100 내지 2,050 ㎕)을 37℃에서 24 내지 72시간동안 반응시켰다. 인삼 추출물 50 ㎕와 500 ㎕의 조 미생물 효소의 반응물(550 ㎕)은 37℃에서 72시간동안 반응시켰다. 반응물은 200 ㎕의 n-BuOH로 추출하였고, 상기 실시예 <1-6>과 동일한 방법으로 TLC와 HPLC로 분석하였다.

그 결과, 비피도박테리움 sp. Int57은 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rf를 완전히 가수분해하여 F2와 화합물 K를 생성하였다. 또한, 느린 속도이긴 하지만 Re를 가수분해시켜 Rh1을 생성하였다. 비피도박테리움 sp. SJ32는 Rd가 약하게 가수분해된 것을 제외하고는 비피도박테리움 sp. Int57과 거의 유사한 결과를 보였다(도 2).

또한, 미생물이 진세노사이드를 화합물 K로 전환시키는 능력을 알아보기 위해 HPLC 분석을 통해 화합물 K를 정량한 결과, 두 미생물 중에서 비피도박테리움 sp. Int57이 더 높은 활성을 보였다(표 3).

미생물	화합물 K
미생물	농도(μM)	함량(%)
Int57	1428ㅁ72	74ㅁ2
SJ32	884ㅁ40	53ㅁ2

<실시예 2> 식품 미생물에 의한 프로토파낙사디올계 사포닌의 전환 경로 조사

<2-1> 식품 미생물에 의한 Rb1의 전환 경로

다양한 진세노사이드 전환체들을 TLC와 HPLC 분석에 의해 확인하였으며, 이때 가열된 효소에 의해서는 진세노사이드의 전환이 일어나지 않았다. 비피도박테리움 sp. Int57 및 SJ32는 Rd와 F2를 거쳐 Rb1을 화합물 K로 전환시켰다(도 3). 비피도박테리움 sp. Int57은 60 유니트의 효소를 사용했을 때 SJ32보다 화합물 K의 생성능이 더 높았다(표 4). 두 미생물 모두 Rb1-Rd-F2의 경로를 거쳤다. 두 미생물 효소들은 F2의 C-3를 선택적으로 가수분해 하였으며, 최종 생산물로 화합물 K를 얻을 수 있었다. 두 미생물 모두 처음 단계에서 젠티바이오스(gentibiose) 단위로부터 포도당을 가수분해하였다. 효소 추출물의 농도를 높게 하거나 반응시간을 길게 해도 더 이상의 전환은 일어나지 않았다.

미생물	화합물 K의 농도(μM)
Int57	170ㅁ1
SJ32	165ㅁ1

<2-2> 식품 미생물에 의한 Rb2의 전환 경로

비피도박테리움 sp. Int57과 SJ32는 Rd와 F2를 거쳐 Rb2를 화합물 K로 전환시켰다. 비피도박테리움 sp. SJ32보다 pNPAp α-아라비노피라노시다제 활성이 더 높았던 비피도박테리움 sp. Int57은 Rb2의 α-아라비노피라노즈를 더 쉽게 가수분해하여 Rd로 보다 잘 전환시켰다. 상기 결과는 인삼 추출물을 비피도박테리움 sp. Int57 또는 SJ32와 함께 MRS 배지에서 배양했을 때 비피도박테리움 sp. Int57이 SJ32보다 Rb2를 Rd로 더 잘 전환시켰던 것과 일치하는 결과이다(도 4).

<2-3> 식품 미생물에 의한 Rc의 전환 경로

비피도박테리움 sp. Int57과 SJ32는 Rc를 Rd와 F2를 거쳐 화합물 K로 전환시켰다. 비피도박테리움 sp. SJ32보다 pNPAf α-아라비노퓨라노시다제 활성이 높았던 비피도박테리움 sp. Int57은 Rc의 α-아라비노퓨라노즈를 비피도박테리움 sp. SJ32보다 더 쉽게 가수분해하여 Rd로 잘 전환시켰다(도 5).

<실시예 3> 식품 미생물에 의한 프로토파낙사트리올계 사포닌 Re의 전환 경로 조사

Re의 전환에서는 비피도박테리움 sp. Int57와 SJ32가 Re의 C-20에 결합되어 있는 히드록실 그룹에 연결된 β-글루코시드 결합을 우선 가수분해하여 Rg2를 생산하고, 이후 Rg2의 C-6에 있는 히드록실 그룹에 결합되어 있는 -O-β-D-글루코스(2-1)-α-L-람노즈 결합을 가수분해하여 Rh1을 생산하였다. Re를 가수분해하는 데에는 Rb1보다 더 많은 미생물 파쇄액이 요구되었다. 비피도박테리움 sp. Int57과 SJ32는 30분 반응시에는 p-니트로페닐-α-L-람노피라노시드(pNPR) α-람노시다제 활성을 보이지 않았으나, 1시간 반응 후에는 pNPR α-람노시다제 활성을 나타내었으며, 최종 산물로 Rh1을 생산하였다(도 6).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법은 유산균의 일종으로서 식용이 가능한 비피도박테리움 속의 미생물을 이용하여 인삼의 대사산물인 활성형의 진세노사이드 Rh1을 효과적으로 생산할 수 있으며, 또한 식품 미생물에 의한 인삼 사포닌의 전환 경로를 밝힘으로써 진세노사이드 기질과 특정 미생물 효소를 적절히 조합하여 원하는 기능에 맞는 생산물을 얻을 수 있다.

Claims

인삼 추출물을 비피도박테리움 sp. Int57 및 비피도박테리움 sp. SJ32 (KFCC 11350P )의 단독, 또는 혼합 미생물비피도박테리움 속의 미생물을 파쇄하여 제조되는 조(crude) 미생물 효소의 형태로 반응시킴으로써 화학식 1로 표시되는 인삼의 대사산물인 진세노사이드 Rh1을 생산하는 방법:

[화학식 1]

상기에서, R1 및 R3은 OH이고, R2는 O-Glc이다.
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제 1항에 있어서, 상기 인삼 추출물은 수성용매 및/또는 유기용매를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 수성용매는 pH 3 내지 8 범위의 포스페이트 완충용액 및 구연산 완충용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올로 구성된 군으로부터 선택되는 저급 알코올, 톨루엔, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.