WO2002032564A1 - Procede et appareil de production de liposomes - Google Patents

Description

明細書

リボソームの製造方法およびその装置 技術分野

本発明は、 超臨界二酸化炭素を用いたリボソームの製造方法およびその装置に 関するものである。 背景技術

脂質 2分子膜であるリボソームは、 リボソーム内に各種の水溶性物質等を封入 できるため、 薬理活性物質を生体内に運ぶキャリアー材料等として用いられてい る。

リポソ一ムは、 両親媒性物質であるリン脂質のサスペンションを、 攪拌等の処 理を行うことにより得られる。リポソームを工業的に調製する方法としては、 ( 1 ) リン脂質または糖脂質のサスペンションを超音波で処理する超音波処理法、 （2 ) リン脂質または糖脂質と界面活性剤の混合ミセルを形成し界面活性剤を除去する 界面活性剤除去法、

( 3 ) 有機溶媒に溶かしたリン脂質または糖脂質溶液を水槽に注入して、 水と有 機溶媒の界面でリボソームを形成させる有機溶媒注入法、

( 4 ) リン脂質または糖脂質を懸濁した水溶液を凍結した後、 溶融して脂質二重 膜を形成し、 これをさらに凍結溶融してリボソームを形成させる凍結融解法、

( 5 ) 水に溶解しない有機溶媒に、 少量の水系溶媒を加え、 超音波をあてて WZ Oェマルジヨン（逆ミセル） を形成し、有機溶媒を減圧下で除去する逆相蒸発法、

( 6 ) 超臨界二酸化炭素とエタノールの混合流体にリン脂質または糖脂質を溶解 し、 減圧過程で保持対象水溶液を攪拌注入する超臨界二酸化炭素法 （特開平 6— 3 1 5 6 2 4号公報等） などが知られている。 なお、 超臨界二酸化炭素法の概略 を、 図 3を用いて詳しく説明する。 すなわち、 超臨界二酸化炭素とエタノールを それぞれポンプ 3 3， 3 2で送り、 リン脂質を充填したカラム 3 1へ通す。 リン 脂質は二酸化炭素とエタノールの混合流体に溶解した状態で減圧弁 3 4まで運ば れ、 減圧される。 減圧過程でリン脂質は析出するが、 このとき保持対象となる水 溶性物質を含む水相をポンプ 35を介して流入させ、 ミキサ一 36で攪拌するこ とにより、 リボソームをミキサー 36内で形成させる。

しかしながら、 上記従来技術には下記のような問題点が存在し、 工業的にリポ ソ一ムを製造する方法および装置は知られていなかった。

(1) 超音波処理法

調製したリボソームは、 サイズが 0. 002〜0. 2 mと比較的そろった一 枚膜リボソーム （SLV) が得られる利点があるものの、 リボソーム内の水溶性 物質の保持容量が低いという問題点がある。

(2) 界面活性剤除去法

界面活性剤を透析により除去しなければならないという問題点がある。

(3) 有機溶媒注入法

水溶性物質の保持効率が悪く、 有機溶媒の除去が必要となる問題点がある。

(4) 凍結融解法

保持効率が高いという利点があるが、 凍結するためのエネルギーコストがかさ むという問題点がある。

(5) 逆相蒸発法

保持効率が高いという利点があるが、 有機溶媒の除去が必要となる問題点があ る。

(6) 超臨界二酸化炭素法

特開平 6— 315624号公報等に記載された方法は、 超臨界状態においてリ ポソームを形成しているのではなく、超臨界流体を用いた急速膨張法（RES S) によるものである。 この方法は、 減圧により溶解度が急激に低下し、 微粒子状に 析出するリン脂質に水溶液を混合することによりリボソームを製造する方法であ る。

以上のように、 上記 （1) 〜 （6) の従来方法は、 数段階に分かれた操作が必 要であったり、 人体に有害な有機溶媒を使用することが多く、 また製造段階で有 機溶媒の除去などのために多量のエネルギーを必要とする欠点があった。 本発明が解決しょうとする課題は、 有害な有機溶媒を用いずに、 より少ないェ 程で、 保持効率の高いリボソームを形成する方法および装置を提供することにあ る。 発明の開示

本発明者らが、 鋭意研究を重ねたところ、 超臨界二酸化炭素を用いて、 一段で リボソームを製造する方法を見出し、 本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、 超臨界状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条件下の 二酸化炭素にリン脂質または糖脂質を溶解させた混合物中に、 封入物質を含む水 相を加えることを特徴とする封入物質を内包したリポソームの製造方法、 超臨界状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条件下の二酸化炭素にリン脂質 または糖脂質を均一に溶解させた混合流体を圧入する耐圧反応器と、 該耐圧反応 器内の混合物中へ、 水溶性または親水性の封入物質を含む水相を流入させる水相 流入手段を有することを特徴とする封入物質を内包したリポソ一ムの製造装置、 および耐圧反応器と、 該耐圧反応器へ、 超臨界状態または臨界点以上の温度もし くは圧力条件下の二酸化炭素を流入させる超臨界二酸化炭素流入手段と、 助溶媒 に均一に分散させたリン脂質または糖脂質を流入させるリン脂質等流入手段と、 封入物質を含む水相を流入させる水相流入手段を有することを特徴とする封入物 質を内包したリボソームの製造装置に関するものである ₆

本発明方法の特徴は、 超臨界状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条件下 の二酸化炭素にリン脂質を均一に溶解させた混合物中に、 水溶性または親水性の 封入物質を含む水相を加えて、 一段で封入物質を内包するリボソームを製造する ことにある。 本発明方法により製造したリボソームは、 保持効率が高いので、 従 来のリボソームに比べて、 より多量に封入物質を内包させることができる。 本発明における超臨界状態の二酸化炭素とは、 臨界温度 （3 0 . 9 8 ） およ び臨界圧力 （7 . 3 7 7 3 ± 0 . 0 0 3 O M P a ) 以上の超臨界状態にある二酸 化炭素を意味し、 臨界点以上の温度もしくは圧力条件下の二酸化炭素とは、 臨界 温度だけ、 あるいは臨界圧力だけが臨界条件を超えた条件下の二酸化炭素を意味 する （ただし、 もう片方が臨界条件をこえていないものである） 。 以下、 超臨界 状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条件下の二酸化炭素を 「超臨界二酸化 炭素」 と総称する。

本発明におけるリン脂質または糖脂質は、 脂質 2分子膜を形成しうる化合物で あれば特に限定されない。

リン脂質は、 ホスファチドともいわれ、 複合脂質のうちリン酸エステルおよび C一 P結合を持つ一群の物質の総称である。 本発明におけるリン脂質としては、 例えばホスファチジルコリン、 ホスファチジルェタノ一ルァミン、 ホスファチジ ルセリン、 ホスファチジン酸、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイ ノシトール、 カルジォピン、 卵黄レシチン、 水添卵黄レシチン、 大豆レシチン、 水添大豆レシチン等のグリセ口リン脂質、 スフインゴミエリン、 セラミドホスホ リルエタノールァミン、 セラミドホスホリルグリセロール等のスフィンゴリン脂 質を挙げることができる。

糖脂質としては、 例えばジガラクトシルジグリセリド、 ガラクトシルジグリセ リド硫酸エステル等のグリセ口脂質、 ガラクトシルセラミド、 ガラクトシルセラ ミド硫酸エステル、 ラクトシルセラミド、 ガンダリオシド G 7、 ガンダリオシド G 6、 ガンダリオシド G 4等のスフィンゴ糖脂質を挙げることができる。

リン脂質と超臨界二酸化炭素との均一混合物を調製するに際し、 助溶媒を用い ることが好ましい。 助溶媒を系に添加することにより、 超臨界二酸化炭素に対す る難溶性の封入物質の溶解度を増加させることができる。 助溶媒は超臨界二酸化 炭素に対して、 1 5 w t %以下添加すればよい。 1 5 w t %を超えるとエタノー ルの液相が析出するため好ましくない。 なお、 エタノールの添加はリボソームの 形成を阻害するためなるベく少ない方が好ましい。

このような目的で用いられる助溶媒としては、 例えばエチルアルコール等を挙 げることができる。

リン脂質と超臨界二酸化炭素の均一混合物に、 加える水相は、 リボソームに内 包させる封入物質を含むものである。

本発明における、 封入物質とは、 水溶性または親水性の物質であれば特に限定 されない。

水相の添加量は、 水が流動性をもって流入できる範囲で、 なおかつリボソーム の形成が阻害されない範囲で適宜選択すればよい。

水溶性または親水性の封入物質として、 以下のような薬理活性成分を挙げるこ とができる。

薬理活性成分としては、 例えば、 リン酸 L—ァスコルビルマグネシウム、 ァス コルビン酸グリコシド、 グリチルリチン酸ジカリウム、 ；3—グリチルレチン酸、 グリチルレチン酸アンモニゥム、 グリチルレチン酸ステアリル、 エスチン、 エス クリン、 パン卜テニルアルコール、 パントテン酸とその塩、 チアミン、 フラビン、 葉酸または抗生物質や、 少なくとも 1種以上の非ステロイド系抗炎症薬、 ケトプ 口フェン、 イブプロフェン、 ブフエキサマクまたはインドメ夕シン等のを挙げる ことができる。 本発明方法により、 これらの薬理活性成分を従来に比べて多量に リボソームへ内包することが可能となったため、 本発明のリボソームを外用剤に 利用した場合は経皮吸収の増加が、 内服薬に利用した場合は体内への吸収が増加 するものと期待される。

また本発明において、封入物質として以下の水溶性色素を挙げることができる。 水溶性色素としては、 たとえば赤色 1 0 4号、 赤色 2号、 赤色 3号、 青色 1号、 青色 2号、 黄色 4号、 黄色 5号、 緑色 3号、 カルミン、 カーサミン、 紅麹色素、 クチナシ色素、アントシァニン色素またはク口口フィル等を挙げることができる。 これらの水溶性色素は、 すぐに酸化されてしまったり、 退色するなど非常に不安 定であるが、 これらの水溶性色素をリボソーム中に内包させることにより、 安定 した色素を提供することができる。 なお、 リボソーム内における水溶性色素の耐 酸化性を向上させるために、 ァスコルビン酸またはその塩、 亜硫酸塩を酸化防止 剤として水相に添加してもよい。

本発明において、 封入物質が含まれる水相を構成する媒体としては、 蒸留水、 純水、 海洋深層水、 海洋深層水の限外濾過水等を挙げることができる。 特に、 海 洋深層水には繊維細胞の増殖作用があるため、 水相の媒体として海洋深層水を使 用することにより、 細胞増殖を促進しかつ、 経皮吸収のよいリボソームが得られ ることが期待される。

本発明方法において、 超臨界二酸化炭素とリン脂質の混合物に、 水相を加えて リボソームを製造するには、 超臨界状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条 件下の二酸化炭素と、 リン脂質または糖脂質、 必要であれば助溶媒の均一混合流 体を激しく攪拌している中に、 封入物質を含む水相を導入すればよい。 当初透明 であつた均一混合流体は水相の導入とともに徐々に白濁し （逆ミセルが形成され ていると考えられる） 、 さらに水相を導入すると超臨界二酸化炭素 （および逆ミ セル） への水の溶解限界を越えた時点で反応容器底部に白濁した水相が形成され る。 所定水相を注入した後、 減圧することにより均一なリボソームが得られる。 本発明方法により、 直径 5 0 η π！〜 8 0 0 n mの単層ラメラリボソームを製造 することができる。 本発明方法により、 7〜3 0 %という高い保持効率を有する リボソームを製造することができる。

本発明方法により製造したリボソームは、 リボソームの膜枚数が少ないため、 より生体膜に近い生体膜モデルとして有用と考えられる。 また、 本発明のリポソ ームは人体に対して有害な有機溶媒を使用していないため、 残存有機物の毒性が 内。 従って、 香粧品の有効成分を防ぐ基材、 もしくは経皮吸収を促進する製剤、 医薬品の有効成分の失活を防ぐ基材、 副作用を著しく低減する D D S製剤等とし て有用である。

以下に、 図面を用いて本発明のリボソームの製造装置および製造方法を説明す る。 図面の簡単な説明

図 1は、 本発明装置の第 1実施形態の一例を示すフロー図。

図 2は、 本発明装置の第 2実施形態の一例を示すフロー図。

図 3は、 本発明装置の第 1実施形態の一例を示すフロ一図。

図 4は、 従来の超臨界二酸化炭素法によるリボソームの製造方法を示すフロー 図。

図 5は、 実施例 1で調製したリボソームの透過型電子顕微鏡による撮影像を示 す図。

図 6は、 実施例 2で調製したリボソームの透過型電子顕微鏡による撮影像を示 す図。

図 7は、 実施例 3で調製したリポソームの透過型電子顕微鏡による撮影像を示 す図。

図 8は、 実施例 4で調製したリポゾームの脂質濃度と保持効率の関係を示すグ ラフ。

符号の説明

1 耐圧反応器

2 攪拌機

3 ポンプ

4 調圧弁

5 リポソ一ム

6 受け器

7 ポンプ

8 ポンプ 発明を実施するための最良の形態

(第 1実施形態）

図 1は、 本発明の第 1実施形態の一例を示すフロー図である。

本実施形態では、 あらかじめ超臨界二酸化炭素、 リン脂質または糖脂質、 およ び助溶媒の均一混合流体を耐圧反応器 1内へ圧入する。圧入した均一混合流体を、 攪拌機 2により激しく攪拌しながら、 そこへ、 封入物質を含む水相を、 水相流入 手段であるポンプ 3を介して耐圧反応器 1へ滴下させる。 水相を一定量滴下した 後、 減圧し耐圧反応器 1を開けると、 封入物質が内包されたリボソームが得られ る。

(第 2実施形態）

図 2は、 本発明の第 2実施形態の一例を示すフロ一図である。 図 1と同一の構 成要素には、 同一の符号を付している。

本実施形態でも、 あらかじめ超臨界二酸化炭素、 リン脂質または糖脂質、 およ び助溶媒の均一混合流体を耐圧反応器 1内へ圧入する。圧入した均一混合流体を、 攪拌機 2により激しく攪拌しながら、 そこへ、 封入物質を含む水相を、 水相流入 手段であるポンプ 3を介して耐圧反応器 1へ滴下させる。

第 1実施形態と異なるのは、 リボソーム排出手段として調圧弁 4を設けたこと である。 調圧弁 4により、 耐圧反応器 1内の圧力が一定圧力以上となった場合、 リボソーム 5が排出され、 受け器 6ヘリポソ一ム 5が貯留されるようになつてい る。

(第 3実施形態）

図 3は、 本発明の第 2実施形態の一例を示すフロー図である。 図 2と同一の構 成要素には、 同一の符号を付している。

図 3中、 8は助溶媒に均一に分散させたリン脂質または糖脂質を耐圧反応器 1 へ流入させるリン脂質等流入手段としてのポンプであり、 9は水溶性または親水 性の封入物質を含む水相を流入させる水相流入手段としてのポンプである。

本実施形態では、 耐圧反応器 1へ、 超臨界二酸化炭素、 リン脂質または糖脂質 と助溶媒、 および水相を、 ポンプ 7 , 8， 3により同時に流入させ、 攪拌機 2で 攪拌し、 リボソームを形成させるものである。

調圧弁 4により、 耐圧反応器 1内の圧力が一定圧力以上となった場合、 リポソ —ム 5が排出され、 受け器 6へリボソーム 5が貯留されるようになつている。 本実施形態の装置により、 リボソームを連続的に製造することが可能となる。 実施例

実施例 1、 比較例 1

図 1に示した製造装置を用いてリボソームを調製した。 耐圧反応器は S U S 3 0 4製のサフアイャ窓付きの容積可変セルを用いた （セルの内容積： 5 7 . 0 2 c m³) 。 耐圧反応器に D P P C (ジパルミトイルホスファチジルコリン） 0 . 0 1 4 gと超臨界二酸化炭素 1 3 . 7 4 9 g (圧力 2 0 0気圧、 温度 6 0 C) の混 合流体を仕込み、 激しく攪拌しながら、 3. 5%VC-PMG (リン酸— Lーァ スコルビルマグネシウム） 水溶液 2. 81mlを、 流速 0. 05 c cZmi nで ポンプにより注入し、 VC— PMGを内包するリボソームを調製した。 得られた リボソームの形状を透過型電子顕微鏡 （TEM) により観察した。 得られたリポ ソ一ムは、 その大きさが 100— 1000 nmの大きな一枚膜リボソーム （LU V： large unilamellar vesicle) であった。 その T EM撮影像を図 5に示す。 得られたリボソームの保持効率を定法であるグルコース透析法により求めた。 比較例 1として、 汎用される調製法である超音波処理法 （バンガム法） により調 製したリボソームの保持効率も求め、 その結果を表 1に示した。

表 1に示した結果から明らかなように、 超臨界二酸化炭素を用いた本発明の実 施例 1のリポソ一ムは、 従来の超音波法により調製した比較例 1のリボソームに 比して、 保持効率が 10倍以上であることが分かる。 実施例 2

図 2に示した製造装置を用いてリボソームを調製した。 耐圧反応器は実施例 1 と同じものを用いた。 耐圧反応器に水添大豆レシチン 0. 014g、 超臨界二酸 化炭素 13. 794 g (圧力 200気圧、 温度 60°C) およびエタノール 0. 9 6 gの混合流体を仕込み、 激しく攪拌しながら、 3. 5%VC-PMG (リン酸 L—ァスコルビルマグネシウム） 水溶液 2. 81mlを、 流速 0. 05 c c /m i nでポンプにより注入した。調圧弁の圧力を 200 kg f /cm²に設定し、 V C-PMGを内包するリボソームを得た。 得られたリポソ一ムの形状を透過型電 子顕微鏡 （TEM) により観察した。 得られたリボソームは、 その大きさが 10 0 - 1 0 0 0 nmの大きな一枚膜リボソーム （LUV ： large unilamellar vesicle) であった。 その TEM撮影像を図 6に示す。 実施例 3、 比較例 2

図 2に示した製造装置を用いてリボソームを調製した。 耐圧反応器は実施例 1 と同じものを用いた。 耐圧反応器に水添卵黄レシチン 0. 041 g、 超臨界二酸 化炭素 （圧力 200気圧、 温度 60 C) およびエタノール 0. 96 gの混合流体 を仕込み、 激しく攪拌しながら、 イブプロフェン 1 Omgと水 2. 8 lm lを混 合溶解させた水溶液を、 流速 0. 05 c c/m i nでポンプにより注入した。 調 圧弁の圧力を 200 k f /cm²に設定し、イブプロフェンを内包するリポソ一 ムを得た。 得られたリボソームの形状を透過型電子顕微鏡 （TEM) により観察 した。 得られたリボソームは、 その大きさが 100— 100 O nmの大きな一枚 膜リポソーム (L U V： 1 a r g e un i l ame l l a r ve s i c l e) であった。 その TEM撮影像を図 7に示す。

得られたリボソームを超遠心 （45000rpm) によりリボソーム中の内水相のみを 取り出し、 薬剤の定量を行った。 比較例 2として、 汎用される調整法である超音 波処理法 （バンガム法） により調製したリボソームの薬剤の定量を行った。 その 結果を表 2に示す。

表 2

表 2に示した結果から明らかなように、 超臨界二酸化炭素を用いた本発明の実 施例 3のリボソームは、 従来の超音波法により調製した比較例 2のリボソームに 比して、 リボソーム中における薬剤の含有量が 10倍以上であることが分かる。 実施例 4

実施例 1と同じ装置で、 下記条件によりリボソームを調製した。 調製条件；

温度 60°C、 圧力 200bar、 脂質 0. 0353 g、 エタノール （脂質を溶解させる為 に使用） 0. 7963g、 C 0 ₂ 12. 1849 g、 グルコース溶液の流速 0. lml/min 使用した脂質； D0PC ジォレイルホスファチジルコリン

DPPC ジパルミトイルホスファチジルコリン

DSPC ジステアロイルホスファチジルコリン 以上の条件下で超臨界リボソームの調製を行い、 各リボソームの保持効率を求 め、 その結果を図 8のグラフに示した。

縦軸に保持効率 (%) 、 横軸に添加している水の量に対する各脂質濃度をとる と、 いずれの場合においても、 一般の調製法であるバンガム法によって調製され たリボソームの保持効率（2〜3 % ) に比べ、 高い値を示していることが分かる。 産業上の利用可能性

本発明方法および本発明装置により、 保持効率の高いリボソームが、 一段で効 率的に製造できるようになった。 本発明方法により製造されたリボソームは保持 効率が高いため、 本発明のリボソームを外用剤に利用した場合は経皮吸収の増加 が、 内服薬に利用した場合は体内への吸収が増加する。

水相の媒体として、海洋深層水またはその逆浸透濾過水を使用することにより、 細胞増殖を促進しかつ、 経皮吸収のよいリボソームが得られる。

Claims

,ss求の範囲

( 1 ) 超臨界状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条件下の二酸化炭素と リン脂質または糖脂質の均一混合流体中に、 封入物質を含む水相を加えることを 特徴とする封入物質を内包したリボソームの製造方法。

( 2 ) 前記混合流体が助溶媒を含むことを特徴とする請求項 1に記載のリポソ ームの製造方法。

( 3 ) 前記水相が海洋深層水または海洋深層水の逆浸透膜濾過水を含むことを 特徴とする請求項 1または請求項 2に記載のリポゾームの製造方法。

( 4 ) 封入物質が、 少なくとも 1種の水溶性または親水性の薬理活性成分であ ることを特徴とする請求項 1ないし請求項 3のいずれか 1項に記載のリポソーム の製造方法。

( 5 ) 封入物質が、 少なくとも 1種の水溶性色素であることを特徴とする請求 項 1ないし請求項 3のいずれか 1項に記載のリポソ一ムの製造方法。

( 6 ) ァスコルピン酸またはその塩、 亜硫酸塩を酸化防止剤として水相に含有 することを特徴とする請求項 5に記載のリポソ一ムの製造方法。

( 7 ) 超臨界状態または臨界点以上の温度もしくは圧力条件下の二酸化炭素と リン脂質または糖脂質の均一混合流体を圧入する耐圧反応器と、 該耐圧反応器内 の混合流体中へ、 封入物質を含む水相を流入させる水相流入手段を有することを 特徴とする封入物質を内包したリボソームの製造装置。

( 8 ) 耐圧反応器と、 該耐圧反応器へ、 超臨界状態または臨界点以上の温度も しくは圧力条件下の二酸化炭素を流入させる超臨界二酸化炭素流入手段と、 助溶 媒に均一に分散させたリン脂質または糖脂質を流入させるリン脂質等流入手段と、 封入物質を含む水相を流入させる水相流入手段を有することを特徴とする封入物 質を内包したリボソームの製造装置。

( 9 ) リポゾーム排出手段を設けたことを特徴とする請求項 7または請求項 8 に記載したリボソームの製造装置。