WO2006115155A1 - リポソーム含有製剤およびその製造方法 - Google Patents

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WO2006115155A1
WO2006115155A1 PCT/JP2006/308272 JP2006308272W WO2006115155A1 WO 2006115155 A1 WO2006115155 A1 WO 2006115155A1 JP 2006308272 W JP2006308272 W JP 2006308272W WO 2006115155 A1 WO2006115155 A1 WO 2006115155A1
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WO
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ribosome
water
phospholipid
membrane
lipid
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PCT/JP2006/308272
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English (en)
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Inventor
Takeshi Wada
Yasuyuki Motokui
Eiichi Ueda
Original Assignee
Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a ribosome-containing preparation having a high drug encapsulation rate and containing ribosome, and a ribosome-containing preparation obtained by the method.
  • Ribosomes are closed membranes of bilayer membranes (ribosome membranes) formed mainly by phospholipids, and have a structure and functions similar to those of biological membranes. It is. Ribosomes can be constructed in a capsule structure that holds a water-soluble encapsulating substance in the aqueous phase inside or an oil-soluble encapsulating substance in the lipid bilayer membrane. It has been actively studied.
  • the drug cannot be sufficiently encapsulated in the ribosome, and it is necessary to administer a large amount of the ribosome-containing preparation, resulting in an excessive burden on the patient.
  • a ribosome-containing preparation having a high contrast medium encapsulating rate has been demanded.
  • Patent Document 3 discloses a method of producing a liposome using supercritical carbon dioxide instead of an organic solvent.
  • various production conditions can be set, and the retention efficiency (encapsulation rate) of the encapsulated substance can be improved relatively easily as compared with the conventional ribosome production method. If the encapsulation rate of the encapsulated substance is high, the target part in the body Even if a small amount of ribosome is incorporated into the position, the desired effect can be obtained. For this reason, it is expected as a preparation method for DDS (Drag Delivery System, the same shall apply hereinafter) formulations.
  • DDS Drop Delivery System
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2619037
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 7-316079
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-119120
  • Non-patent literature l Pharm Tech Japan 19 ⁇ , No. 5, 91-100 (2003)
  • the present invention addresses the above-described demand and proposes a method for producing a ribosome in which a water-soluble drug is efficiently encapsulated in a liposome without using an organic solvent, and a preparation containing the ribosome.
  • a formulation in which the water-soluble drug is a non-ionic compound is a highly safe X-ray contrast agent with good visualization of cancer tissue and easy excretion
  • a method for producing a ribosome-containing preparation according to the present invention comprises:
  • the ribosome The membrane constituent component is characterized in that it contains at least a phospholipid having a transition temperature.
  • the production method may be characterized in that the ribosome membrane component contains at least a phospholipid having a transition temperature.
  • This suspension may be a suspension prepared by mixing a ribosome membrane component and an aqueous drug solution and then fed into the pressure vessel.
  • the transition temperature is preferably in the range of 22 to 60 ° C.
  • the pressure is 50 to 90 ° C. and a pressure of 0.01 to 0.8 MPa. It is preferable to further include a fourth step of filtering an aqueous dispersion of liposome encapsulating a water-soluble drug and sizing into a ribosome having an average particle size of 0.05 to 0.8 ⁇ m.
  • the third step or the fourth step it is desirable to have a step of concentrating the aqueous dispersion of ribosome encapsulating the water-soluble drug by ultrafiltration. After ultrafiltration, steam sterilization at 115 to 140 ° C may be performed.
  • the encapsulation rate of the water-soluble drug in the ribosome (that is, the ratio of the water-soluble drug encapsulated in the ribosome to the total amount of the water-soluble drug) can be increased to 25 to 35%. .
  • the concentration (mol ZL) of the water-soluble drug in the aqueous phase inside and outside the ribosome membrane is substantially the same. That is, the concentration of the water-soluble drug (1) in the aqueous phase outside the ribosome membrane
  • concentration of the water-soluble drug (2) in the aqueous phase in the ribosome membrane is preferably substantially the same. More preferably, the ratio of the concentration of (1) to the concentration of (2) is in the range of 0.95-1.05.
  • the ribosome whose lipid membrane is composed of 2 to 10 membranes occupies at least 70%.
  • the ribosome membrane component includes at least a phospholipid, a cationic lipid, a lipid having a polyethylene glycol (PEG) group and a lipid containing a sterol, and a phospholipid (PEG-phospholipid (PEG (polyethylene Does not include glycerin), sterols have a molar ratio of 100/60 to 100/90, and has a phospholipid (no PEG-phospholipid) / polyethylene glycol group The lipid molar ratio is 100/5 to 100/25.
  • the ribosome-containing preparation obtained by the above production method, and its preferred V, as a mode the water-soluble drug is a non-ionic type compound and one or more physiologically acceptable preparations. Also included are ribosome-containing preparations that are auxiliary agents and used as X-ray contrast agents.
  • the ribosome-containing preparation of the present invention encapsulates a water-soluble drug, preferably a non-ionic compound, at a high encapsulation rate of 25 to 35% in a ribosome, which is a microcarrier, and efficiently carries it. To give targeting.
  • the ribosome has beneficial properties for use in an X-ray contrast medium!
  • a ribosome-containing contrast agent is superior in contrast performance compared to a conventional contrast agent, and enables a low dose.
  • the preparation of the present invention is produced without using any highly toxic chlorinated solvent and other organic solvents, toxicity and side effects are much reduced as compared with conventional ribosome-containing preparations. Therefore, the burden on the patient receiving the administration is small.
  • Ribosome membranes are sometimes referred to as “lipid membranes”. “Encapsulated” in a ribosome means that it is encapsulated in the ribosome It shall include both the state associated with the phospholipid membrane or existing in the aqueous phase (internal aqueous phase) confined within the phospholipid membrane. “Cancer” refers to a malignant tumor, sometimes simply “tumor”.
  • the ribosome is substantially a dissolution aid based on a method for preparing ribosome using supercritical diacid-carbon as an admixture (hereinafter referred to as supercritical carbon dioxide method). It is prepared by a method that does not use At that time, the water-soluble drug and the formulation aid are encapsulated in the ribosome membrane.
  • the constituent components of the ribosome membrane are characterized by containing at least a phospholipid having a transition temperature.
  • the encapsulated water-soluble drug, the ribosome membrane component, the ribosome production method, the ribosome-containing preparation production, and the liposome-containing X-ray contrast agent will be described in this order.
  • a liposome-containing preparation in which a water-soluble drug is encapsulated in a lipid membrane can be obtained.
  • the water-soluble drug is not particularly limited, and includes substances widely used in pharmaceuticals.
  • water-soluble drugs used in the present invention include contrast compounds, anti-cancer compounds, antioxidant compounds, antibacterial compounds, anti-inflammatory compounds, blood circulation promoting compounds, whitening compounds, rough skin prevention compounds, anti-aging compounds, hair growth. Accelerating compounds, moisturizing compounds, hormonal agents, vitamins, pigments, and proteins.
  • the ribosome-containing preparation of the present invention is particularly preferably used as a contrast agent or an anticancer agent.
  • contrast materials are preferable, and particularly preferable contrast materials are water-soluble nonionic compounds.
  • Preferable iodo compounds include iomeprol, iopamidel, ihexol, iopromide, ioxylan, iotasol, iotrolan and iodixanol. These compounds can be used alone or in combination of two or more. Moreover, it is not limited to the illustration.
  • a pharmaceutical preparation can be prepared by separating and removing the pharmaceutical substance that is not encapsulated. Many. In fact, even if liposomes that achieve nearly 100% encapsulation are separated, then the encapsulated components of the ribosome suspension formulation will leak over time An example has been reported (Betageri, GV Drug Devel. Ind. Pharm. 19, 531-539 (1993)). This phenomenon is based on the instability of the ribosome structure due to the osmotic effect.
  • the X-ray contrast medium that is one embodiment of the ribosome-containing preparation of the present invention usually also contains an iodine compound that is not encapsulated in the ribosome.
  • the ratio (encapsulation rate) of the contrast material encapsulated in the ribosome must also be considered.
  • the X-ray contrast medium of the present invention is characterized in that it is contained in 65-80 mass% ribosome of the water-soluble iodine compound, is in a form, and exists in an aqueous medium in which the ribosome is suspended. ing.
  • Preparations with substantially or most iodo compounds encapsulated in ribosomes are possible, but such preparations have osmotic pressure differences, ribosome morphology and stability, efficiency of encapsulation, and imaging ability of the formulation. Considering these factors, they are not particularly excellent in practical use as actual preparations.
  • a iodide system encapsulated in the ribosome is used.
  • the amount of compound is rather limited. That is, it is desirable that it is 10 to 35% by mass, preferably 10 to 30% by mass, more preferably 15 to 25% by mass of the total compound in the X-ray contrast medium.
  • the encapsulation rate of iodine compounds at the time of formulation preparation is substantially the same as the encapsulation rate at the time of use. It is preferable from the viewpoint of quality control. As a result of the decrease in ribosome encapsulation during storage and storage, the imaging performance is also affected, depending on the product or storage period.
  • the ribosome-containing preparation produced by the method of the present invention is characterized in that a water-soluble drug is encapsulated in the aqueous phase inside and outside the lipid membrane and contains ribosome substantially free of an organic solvent.
  • a water-soluble drug in the form of being encapsulated in a ribosome as a microcarrier allows efficient delivery to the target organ or tissue lesion.
  • a preferred embodiment of the ribosome used in the present invention has a form and structure designed as an optimal ribosome for an X-ray contrast medium.
  • Such ribosomes have improved lipid stability over time and in blood because their lipid membranes are composed essentially of several membranes, and the force also increases the inclusion rate of contrast media. This improves the contrast performance of the contrast agent.
  • a targeting function can be imparted by appropriately designing the particle size of a ribosome encapsulating a water-soluble drug and its lipid membrane. It is desirable to consider both passive targeting and active targeting, especially for systemic administration.
  • the former can control its in vivo behavior through adjustment of ribosome particle size, lipid composition, charge, and the like. Adjustment to narrow the ribosome particle size within a range can also be easily performed.
  • desired properties can be imparted by changing the type and composition of phospholipids and coexisting substances.
  • the adoption of active targeting which allows for a higher degree of delivery selectivity and accumulation, should also be considered for the mobilization and distribution of administered ribosomes.
  • introducing a polyalkyleneoxide polymer chain or a polyethylene glycol group on the surface of the ribosome membrane is beneficial because the induction to the target site can be controlled.
  • ribosomes that have not reached the affected area such as cancer tissue do not accumulate in normal tissues, but are relatively quickly decomposed and excreted outside the body. This can be achieved by appropriately controlling the stability of the ribosome in relation to the extravasation time. Such clearance control ensures that there are no side effects in the free form.
  • Another effect of the DDS dosage form that encapsulates sex drugs in ribosomes can be expected. For example, when water-soluble nonionic compound is encapsulated in ribosome, iodine compound is deposited nonspecifically in liver, spleen, kidney, etc., and it is difficult to fall into a situation where it takes time to decompose and excrete. Become. For this reason, harmful effects caused by staying in the body and delayed side effects can be prevented.
  • Lipid membrane components constituting the ribosomal lipid membrane include at least phospholipids, glycolipids, sterols, glycols, cationic lipids, lipids having a polyethylene glycol group (for example, PEG-phospholipids, etc.)
  • phospholipids and Z or glycolipids are preferably used as the lipid membrane components of liposomes contained in the ribosome-containing preparation of the present invention.Lecithin and lysolecithin that can also be used as a neutral phospholipid, such as soybean and egg yolk. And Z or derivatives of these hydrogenates and hydroxides.
  • phospholipids include egg yolk, soybean or other animal or plant derived power, or semi-synthetic phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, synthetic The resulting phosphatidic acid, dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dimyristolphosphatidylcholine (DMPC), dioleylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylglycerol (D PPG), distearoylphosphatidylserine ( DSPS), distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), dipalmitoylphosphatidylinositol (DPPI), distearoylphosphatidylinositol (DPPI), di
  • the phospholipids of the lipid membrane constituting the ribosome of the present invention contain at least a phospholipid having a transition temperature.
  • the “(phase) transition temperature” of a phospholipid is a temperature at which a phase transition between both the gel and liquid crystal states that the phospholipid can take. The measurement is by differential thermal analysis using a differential scanning calorimeter (DSC).
  • Dimyristoylphosphatidylcholine (transition temperature, the same below, 23-24 ° C), dipalmitoylphosphatidylcholine (41.0-41.5 ° C), hydrogenated soybeans as phospholipids having a phase transition point in the range of 22-60 ° C Lecithin (53 ° C), hydrogenated soybean phosphatidylcholine (54 ° C), distearoyl phosphati Illustrative is zircoline (54.1-58.0 ° C).
  • DOTAP Trimethylammonium propane
  • DOGS Dioctadecylamidoglycyls Permine
  • DDAB Dimethyldioctadecylammobromide
  • DO TMA Trimethylammonium chloride
  • DO TMA 2, 3 Dioleyloxy— N— [2 (Spermine-carboxamido) ethyl] — N, N Dimethyl— 1-propane amyl trifluoroacetate ( DOSPA) and N— [1— (2,3 dimyristyloxy) propyl] N, N dimethyl N— (2 hydroxyethyl) ammobromide (DMRIE).
  • Cationic phospholipids include esters of phosphatidic acid and amino alcohols, such as esters of dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA) or distearoyl phosphatidic acid (D SPA) and hydroxyethylene diamine. .
  • DPPA dipalmitoyl phosphatidic acid
  • D SPA distearoyl phosphatidic acid
  • hydroxyethylene diamine a distearoyl phosphatidic acid
  • These cationic lipids should be contained in an amount of 0.1 to 5% by mass with respect to the total lipid amount, preferably 0.3 to 3% by mass with respect to the total lipid amount, more preferably 0.5 to 2% by mass with respect to the total lipid amount.
  • These phospholipids are usually used alone, but may be used in combination of two or more. However, when two or more kinds of charged phospholipids are used, it is desirable to use negatively charged phospholipids or positively charged phospholipids from the viewpoint of preventing ribosome aggregation. When neutral phospholipids and charged phospholipids are used in combination, the mass ratio is usually 200: 1 to 3: 1, preferably 100: 1 to 4: 1, and more preferably 40: 1 to 5: 1. The
  • glycolipids include glycated oral lipids such as digalatatosyl diglyceride and galactosyl diglyceride sulfate, galactosyl ceramide, galactosyl ceramide sulfate, latatosyl ceramide, gandarioside G7, gandarioside G6, and sulphingo lumber Can be mentioned.
  • glycated oral lipids such as digalatatosyl diglyceride and galactosyl diglyceride sulfate, galactosyl ceramide, galactosyl ceramide sulfate, latatosyl ceramide, gandarioside G7, gandarioside G6, and sulphingo lumber Can be mentioned.
  • sterols that act as lipid membrane stabilizers such as cholesterol and dihydrocholesterol, cholesterol and sterol, phytosterol, sitosterol, stigmasterol, campesterol, cholestanol, or lanosterol Etc.
  • sterol derivatives such as l-O-sterol darcoside, l-O-sterol maltoside or l-O-sterol galactoside have been shown to be effective in stabilizing ribosomes (JP-A-5-245357). .
  • cholesterol is particularly preferable.
  • Cholesterol in the ribosome membrane can also serve as an anchor for introducing polyalkylene oxide.
  • a novel functional substance can be used as a component for ribosome formation, in which various functional substances can be covalently fixed to the end of a polyoxyalkylene chain. Cholesterol derivatives are disclosed.
  • the amount of sterols used is such that the molar ratio of phospholipid (excluding PEG-phospholipid) / sterols is 100/60 to 100/90, preferably 100/70 to 100/85. This molar ratio is based on the amount of phospholipid excluding PEG-phospholipid. When the molar ratio is less than 100/60, stability due to sterols that improve the dispersibility of the mixed lipid is not sufficiently exhibited.
  • glycols may be added as a constituent of the ribosome membrane.
  • glycols include ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol
  • glycols to be used is desirably 0.01 to 20% by mass, preferably 0.5 to 10% by mass, based on the total mass of lipid.
  • a phospholipid or compound having a polyalkylene oxide (polyoxyalkylene chain) (PAO) group or a similar group, which is a polymer chain is added to a ribosome membrane.
  • PAO polyalkylene oxide
  • PEG polyethylene glycol
  • ribosomes have been shown to be able to maintain blood concentration over a long period of time by increasing the stability in blood by forming a hydration layer by introducing PEG groups and showing a hydrophilic tendency ( Biochim. Biophys. Acta., 1066,
  • the function can be adjusted by changing the length of the unit and the ratio of introduction as appropriate.
  • PEG group polyethylene glycol having 10 to 3,500, preferably 100 to 2000, oxyethylene units is suitable.
  • the amount used is 1 to 40% by mass, preferably 5 to 25% by mass, based on the lipid constituting the liposome.
  • a known technique can be used for PEGylation of the ribosome.
  • PEG phospholipid may be used as a lipid having a polyethylene glycol group. As will be described later, this is a force that also acts as a solubilizing agent when phospholipids are mixed with supercritical diacid-carbon.
  • AO represents an oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms
  • n is the average number of moles of the oxyalkylene group, and is 1 to 2000, preferably 10 to 500, more preferably 20 to 200. It is a positive integer.
  • Y represents a hydrogen atom, an alkyl group (for example, an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms which may be branched) or a functional functional group.
  • Examples of the oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms include, for example, an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxytrimethylene group, an oxytetramethylene group, an oxy-1-ethylethylene group, ; L, 2-dimethylethylene group and the like can be mentioned.
  • n 2 or more
  • the types of oxyalkylene groups may be the same or different. In the latter case, it may be added in a random manner or a block shape.
  • the oxyalkylene group is preferably one in which ethylene oxide is attached alone. In this case, n is preferably 10 or more.
  • ethylene oxide is added in an amount of 20 mol% or more, preferably 50 mol% or more.
  • a ribosome containing a block copolymer of polyethylene oxide and polypropylene oxide is a preferred embodiment of the present invention.
  • the functional functional group represented by Y is for attaching a "functional substance" such as a sugar, a sugar protein, an antibody, a lectin, or a cell adhesion factor to the end of the polyalkyleneoxide chain. Examples thereof include amino groups, oxycarboximidazole groups, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -hydroxysuccinimide groups, and functional groups rich in reactivity.
  • Liposomes in which a polyfunctional oxide chain is immobilized by binding a "functional substance" to the tip in addition to the effect of introducing the polyalkylene oxide chain, for example, as a “recognition element”, actions such as specific organ directivity and tumor tissue directivity are sufficiently exerted.
  • a “recognition element” actions such as specific organ directivity and tumor tissue directivity are sufficiently exerted.
  • anti-tumor monoclonal antibodies corresponding to tumor-specific antigens present only in tumor cells can be bound to ribosome membranes as functional substances, resulting in ribosomes with higher target selectivity (for example, Japanese Patent Laid-Open No. 11-28087)
  • a phospholipid or compound having a polyalkyleneoxide group can be used alone or in combination of two or more. Its content is the total amount of ribosomal membrane components, 0.001 to 50 mol%, preferably from 0.01 to 25 mol 0/0, more preferably 0.1 to 10 mol 0/0.
  • dialkyl phosphates such as dicetyl phosphate, which are negatively charged substances
  • aliphatic amines such as stearylamine
  • the adjustment of the size and distribution of ribosomes as fine particles is closely related to a high drug encapsulation rate, targeting property, and delivery efficiency.
  • the particle size is determined by freezing the dispersion containing the ribosome containing the water-soluble drug, then depositing carbon on the fractured interface, and observing this carbon with an electron microscope (freezing fracture TEM method). Can be measured.
  • the “average particle diameter” refers to a simple average of a certain number of observed liposome particles, for example, 20 diameters. This is usually the same or almost similar to the “center particle size”, which is the most common particle size in the particle size distribution.
  • ribosomes are prepared by appropriately adjusting the average particle size according to the use, preferably in the range of 0.05 to 0.8 / ⁇ ⁇ .
  • ribosome is preferred, and the average particle size is 0.2 ⁇ m to 0.8 ⁇ m. This is because if the ribosome encapsulating the water-soluble iodine compound is in this range, it becomes a target of capture engulfment by non-tumor tissue by multi-reticular endothelial cells and the contrast with tumor tissue becomes clear. .
  • the ribosome used in the contrast medium for the liver should have as little PEG as possible on its surface.
  • ribosome tumorigenic In order to make a ribosome tumorigenic based on the "EPR effect (Enhanced permeability and retention)" using the bloodstream, its average particle size is 0.1 to 0.2 ⁇ m, More preferably, the thickness is 0.11 to 0.13 ⁇ m. For example, by aligning the average particle size of ribosomes in the range of 0.11 to 0.13 / ⁇ ⁇ , it becomes possible to selectively concentrate ribosome-containing preparations on cancer tissues.
  • ribosomes are prepared by first containing lipid membrane components such as phospholipids, cationic lipids, and sterols together with organic solvents (eg, cycloform, dichloromethane, ethyl ether, carbon tetrachloride, ethyl acetate, dioxane, THF, etc.) without exception. Begin by mixing and dissolving in. In particular, chlorinated solvents are often used. Such ribosome preparations always contain organic solvents.
  • organic solvents eg, cycloform, dichloromethane, ethyl ether, carbon tetrachloride, ethyl acetate, dioxane, THF, etc.
  • the method of preparing ribosomes using supercritical diacid-carbon is relatively easy to handle because it is relatively inactive, with a critical temperature of 31.1 ° C and a critical pressure of 7.38 MPa. Even though it is harmless to the human body, high-purity fluids are cheap and easily available It can be said that this is a more attractive manufacturing method.
  • the use of ethanol or the like is recommended in order to disperse lipids in supercritical carbon dioxide efficiently. (See Patent Document 1).
  • the present situation requires a plurality of steps and a long time treatment.
  • Such residual organic solvents, especially chlorinated organic solvents are concerned about adverse effects on living organisms, such as side effects.
  • the production method of the present invention is a method developed so that a ribosome having an optimum form and structure can be produced for an X-ray contrast medium having a particularly high dose compared with a normal pharmaceutical. That is, the ribosome produced by the method using supercritical diacid-carbon is substantially free of chlorinated solvents, ethanol and other organic solvents, and has various desirable characteristics for encapsulating water-soluble drugs, That is, it is shown that the ribosome production rate, the encapsulation rate of the encapsulated drug, and the retention rate of the encapsulated drug in the ribosome are higher than those of the conventional method. Furthermore, application on an industrial scale is also possible. “Substantially” means that the upper limit of the concentration of residual organic solvent in the liposome-containing preparation is 10 IX g / L.
  • the first step and the second step have the following two types depending on the mixing order.
  • the water-soluble property is 50-90 ° C and 0.01-0.8 MPa.
  • the aqueous dispersion of liposome encapsulating the water-soluble drug may be subjected to a step of concentrating by performing ultrafiltration. Further, after the ultrafiltration, steam sterilization may be performed at 115 to 140 ° C.
  • the molar ratio of phospholipid (excluding PEG-phospholipid) / sterols is 100/60 to 100/90, phospholipid (excluding PEG-phospholipid) / polyethylene glycol group
  • phospholipid (excluding PEG-phospholipid) / polyethylene glycol group A ribosome-containing preparation characterized by having a lipid molar ratio of 100/5 to 100/25 and having at least 70% of liposomes composed of 2 to 10 lipid membranes. can get.
  • a ribosome membrane component liquefied carbon dioxide, and an aqueous drug solution (containing a water-soluble drug and a formulation aid) are mixed in a pressure vessel. Based on two methods.
  • phospholipids and a substance having a lipid membrane stabilizing action are added as lipid components constituting the ribosome membrane, and liquid oxalate-carbon is added, preferably under strong stirring conditions. Mix under.
  • Cationic lipids, lipids having a polyethylene glycol group, sterols, and the like are added as substances having a lipid membrane stabilizing effect.
  • the phospholipids various phospholipids including at least one phospholipid having a transition temperature in the range of 22 to 60 ° C. are preferable. Under the pressure and temperature in the range described later, the liquid oxalic acid carbon is brought into a supercritical state or a subcritical state.
  • a ribosome membrane component and supercritical (or subcritical) carbon dioxide are mixed thoroughly and dissolved or dispersed. Alternatively, these compounds may be added to and mixed with liquid oxalate carbon in a pressure vessel in advance, and then mixed in a supercritical state by adjusting temperature and pressure.
  • Water-soluble drugs encapsulated in supercritical carbon dioxide containing phospholipids and lipid membrane stabilizing substances A micelle is formed by introducing an agent, for example, an aqueous drug solution containing a nonionic type compound and a formulation aid.
  • a ribosome membrane component at least one selected from phospholipids, cationic lipids, lipids having a polyethylene dallicol group and sterols and a water-soluble drug, preferably a water-soluble drug and a formulation aid Liquefied carbon dioxide is supplied into a pressure vessel containing a suspension mixed with a pharmaceutical aqueous solution, and is preferably mixed and dispersed under strong stirring, and then heated and pressurized to exceed the liquefied carbon dioxide.
  • a micelle may be formed by bringing the mixture into a critical state and further mixing under strong stirring.
  • the suspension is prepared by mixing the liposomal membrane components and the aqueous drug solution in a pressure vessel. Instead, such a suspension is prepared separately and then supplied into the pressure vessel.
  • the efficiency of encapsulation of the encapsulated substance in the ribosome also depends on the ratio of the total lipid amount of the lipid for the ribosome membrane to the ratio of supercritical diacid-carbon and the aqueous solution containing the encapsulated substance. It is.
  • the total amount of lipid here is the total mass of all phospholipids, sterols and other added lipids constituting the ribosome membrane. In order to form several ribosomes rather than most ribosome membranes, the amount of lipid added may be 1.5 to 2.5 times greater than the amount of lipids conventionally used.
  • the carbon dioxide is finally mixed and dispersed at a ratio of 0.075 to 0.125 parts by mass, preferably 0.08 to 0.1 parts by mass with respect to 1 part by mass of carbon dioxide. If the amount of lipid is too large, there is a risk that lipid will remain undissolved during ribosome production.
  • the lipid molecules may be aligned by the following strong stirring, even if a lipid phase containing the above lipids is present.
  • the encapsulation rate will increase.
  • the emulsification of lipid and supercritical diacid-carbon is promoted by the presence of a lipid having a PEG group as described below without adding ethanol or the like.
  • “Strong stirring” preferably has a different range depending on the volume of the mixed solution and the stirring means.
  • a substantially cylindrical stirrer having a length of 15 mm and a diameter of 5 mm is used, and a rotational speed of 400 to 4000 rpm, preferably 1000 to 1500 rpm, particularly preferably using a magnetic stirrer. Means stirring at 1200-1400 rpm.
  • the stirring condition satisfies the following formula.
  • the time for the strong stirring is appropriately set according to the amount of the mixed solution and the amount of lipid desired to be 1 to 120 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
  • the time for the strong stirring includes the time for supplying the aqueous chemical solution.
  • the stirring means is not particularly limited, but a normal stirrer such as a magnetic stirrer, a homogenizer, a homomixer, or an ultra mixer may be used.
  • Lipids including phospholipids, cationic lipids, and cholesterol are hardly soluble or dispersible in any of supercritical carbon dioxide and water.
  • a compound having a hydroxyl group that is, a hydroxyl group-containing compound
  • the hydrophilic group for example, a hydroxyl group, a polyol group, a polyalkylene glycol ether group
  • a compound having a combination such as polyol Z polydalicol ether group.
  • a hydroxyl group-containing compound that can actually be used as a solubilizing agent, it is desirable that it has an affinity for lipid membrane components such as phospholipids and cholesterol and is sufficiently mixed therewith. Further, in order to disperse and dissolve the lipid membrane component well in polar liquefied carbon dioxide, an amphiphilic compound having appropriate hydrophilicity and hydrophobicity is preferable.
  • an amphiphilic compound having appropriate hydrophilicity and hydrophobicity is preferable.
  • a more preferable solubilizing agent in view of efficacy and safety is a compound having a polyethylene glycol or polyethylene glycol group.
  • a compound having a polyethylene glycol group is preferably a lipid having a polyethylene glycol group, such as PEG-phospholipid.
  • Polyethylene glycol having 10 to 3500, preferably 100 to 2000, oxyethylene units is suitable.
  • the compound having a hydroxyl group should be used as a solubilizing agent in a ratio of 0.01 to 1% by mass, preferably 0.1 to 0.8% by mass, of the diacid-carbon that is in the supercritical state or subcritical state.
  • the compound having a hydroxyl group is a lipid having a polyethylene glycol group
  • the molar ratio of phospholipid (excluding PEG-phospholipid) / lipid having a polyethylene glycol group is preferably 100/5 to 100/25, preferably Is between 100/5 and 100/10.
  • ethanol promotes dissolution or dispersion of lipids in supercritical carbon dioxide.
  • a two-phase system consisting of a diacid-carbon region containing cholesterol, phospholipids, etc. and a water region containing mainly PEGylated phospholipids and water-soluble drugs is formed.
  • the emulsification of critical diacid-carbon proceeds and lipid micelles are formed.
  • ribosomes with a single lipid membrane are mainly prepared.
  • a lipid having a polyethylene glycol group acts to promote emulsification in place of a solubilizing agent such as ethanol.
  • a solubilizing agent such as ethanol.
  • Water-soluble drugs and PEGylated phospholipids dissolve or disperse in the aqueous phase to lower the surface tension of the water, and a lipid phase in which phospholipids, cholesterol, and other substances are gathered is formed, and is supercritical. It becomes a three-phase system with an acid-carbon phase.
  • the temperature of carbon dioxide in the supercritical state (including subcritical state) used in the production method of the present invention is generally a force set to 32 to 70 ° C, preferably 32 to 65 ° C, more preferably Is 45-65 ° C.
  • the transition temperature is + 10 ° C or less, preferably the transition temperature is + 5 ° C or less, and more preferably is almost the transition temperature. It is desirable to set.
  • the phospholipid having the transition temperature becomes a liquid crystal state and the fluidity increases, and the phospholipid is efficiently mixed with the supercritical diacid-carbon.
  • ribosomes were prepared at 50-80 ° C.
  • the present inventors have found that even if the temperature of carbon dioxide in the supercritical state is near the phospholipid transition temperature as described above, the phospholipid cannot be denatured because excessive heat is not applied. It was found that lipids are regularly arranged to form a ribosome membrane.
  • the pressure is suitably selected within the above temperature range, but the suitable pressure of supercritical carbon dioxide is 5 to 50 MPa, preferably 10 to 30 MPa.
  • ribosome membrane components, supercritical carbon dioxide, and aqueous drug solution are charged.
  • water is added to the system if necessary to reduce the pressure in the pressure vessel.
  • an aqueous dispersion of liposome containing a water-soluble drug and the like is prepared.
  • the ribosome is phase-inverted to the aqueous phase, so simply discharging the carbonic acid carbon dioxide produces an aqueous dispersion in which the ribosome containing the water-soluble drug is dispersed.
  • the water-soluble drug exists in the aqueous phase inside the ribosome in addition to the external aqueous phase of the ribosome, and is in an “encapsulation” state.
  • the aqueous dispersion of ribosome obtained in the third step is 0.1 to 3 hours, preferably 10 to 60 minutes at a transition temperature of the phospholipid of the ribosome membrane component to (the transition temperature +10) ° C. May be incubated.
  • a transition temperature of the phospholipid of the ribosome membrane component to (the transition temperature +10) ° C. May be incubated.
  • separation and dispersion of ribosomes that have aggregated and become agglomerated are promoted.
  • the rearrangement of lipid molecules having increased fluidity within the lipid membrane occurs during the subsequent pressure filtration treatment in the fourth step, and a stable membrane structure is formed. As it is formed, the inclusion of water-soluble drugs is promoted.
  • the ribosome particle size can be adjusted by changing the formulation or process conditions. For example, when the pressure in the supercritical state is increased, the particle size of the ribosome formed is reduced. In order to make the particle size distribution of the ribosome to be produced in a narrower range, it may be filtered through a polycarbonate membrane or a cellulose membrane.
  • an aqueous dispersion of ribosome obtained by adjusting the pressure vessel to atmospheric pressure by introducing air or the like (third step) is used to prepare a plurality of filtration membranes having a pore size of 0.1 to 1.0; ⁇ ⁇ . Through.
  • this filter membrane polycarbonate type, cellulose type, etc.
  • the pressure extrusion filtration operation is performed at 50 to 90 ° C, preferably 55 to 85 ° C, under a pressure of 0.01 to 1.0 MPa, preferably 0.01 to 0.8 MPa.
  • the phospholipid having the transition temperature becomes a liquid crystal state and the fluidity increases.
  • the phospholipid of the lipid membrane constituting the ribosome Since phospholipids having a transition temperature are at least included in the class, even a relatively high-viscosity ribosome dispersion containing a water-soluble drug has a particle size without causing clogging of the filter. A complete ribosome can be made.
  • the operation for sizing is performed, for example, by passing through a hydrostatic extruder equipped with a filter having a pore diameter of 0.1 to 1 ⁇ m as a filtration membrane.
  • the filter is forced to pass through various hydrostatic extruders such as “Etastruder” (trade name, manufactured by NOF Ribosome), “Lonizer” (trade name, manufactured by Nomura Microscience).
  • Testruder trade name, manufactured by NOF Ribosome
  • “Lonizer” trade name, manufactured by Nomura Microscience
  • the present inventors have found that in addition to the above sizing, the encapsulation rate of the water-soluble drug increases.
  • the ribosome formed is not a single membrane (Non-patent Document 1) as reported previously, but is a multi-layer membrane.
  • Non-patent Document 1 As a result of the pressure extrusion operation described above, even in ribosomes composed of multi-layer membranes, membranes that are easily peeled off from the outer layer fall off, and membrane structure reconstruction and sizing occurs, including reconstitution of lipid membranes. This is probably because ribosomes consisting of 10 membranes are generated.
  • the encapsulation rate of the encapsulated substance in the ribosome can be improved and the liposome can be made into fine particles without substantially using an organic solvent-based solubilizing agent such as ethanol. be able to. Furthermore, since there is no possibility that the film strength is lowered by the remaining dissolution aid, the storage stability of ribosome is excellent. In addition to an increase in the encapsulation rate, there are also advantages in that it is possible to adjust the concentration of the water-soluble drug present outside the ribosome, exchange the ribosome dispersion, and remove unwanted substances. If necessary, before filtering with a filtration membrane having the above pore diameter, filtration may be performed with a filtration membrane of about 1.0 to 2.0 / ⁇ ⁇ , and sizing may be performed in advance to remove undesirable substances.
  • This step is a step of concentrating the filtrate containing the formed ribosome.
  • Liposo The aqueous dispersion is filtered through a filtration membrane as described above, and if necessary, further purified by removing the powerful drug contained in the ribosome by methods such as ultrafiltration, centrifugation, and gel filtration. May be.
  • the ultrafiltration can be performed using a normal ultrafiltration membrane and apparatus.
  • a membrane made of a resin such as acrylic-tolyl copolymer, aromatic nylon, polysulfone, polyvinylidene fluoride, polyethersulfone, and polyimide can be used.
  • the cut-off molecular weight of these ultrafiltration membranes is desirably 10,000 to 20,000.
  • the operation of ultrafiltration is 20-30 ° C, preferably 25 ° C, under pressure of 0.01-0.5MPa, preferably 0.1-0.45MPa, dead-end filtration system force recovered under, or cross-flow
  • the filtration method is used. Or the power that can be done quickly, even if the processing volume is very small! / Even if it is centrifugal ultrafiltration that facilitates filtration with a convenient centrifugal operation.
  • the encapsulation rate of the water-soluble drug in the liposome (that is, the ratio of the water-soluble drug encapsulated in the ribosome to the total amount of the water-soluble drug) is 25. Can be increased to ⁇ 35%.
  • the water-soluble drug outside the liposome moves to the secondary side of the ultrafiltration membrane along with salts and aqueous media.
  • the concentration of the water-soluble drug decreases, whereas the ribosome concentration increases.
  • the encapsulation rate increases.
  • Concentration by the ultrafiltration method may be carried out after the third step.
  • the meaning of the concentration operation for extrusion filtration which is the fourth step, using an etastruder or the like that is performed subsequently. Have.
  • ultrafiltration is performed again after the fourth step.
  • Concentrate the solution by ultrafiltration until a predetermined ribosome concentration is reached, and then mix the formulation adjuvants such as commonly used diluents as appropriate to obtain final concentrations for each of the ribosome, drug, and formulation adjuvant. Further adjustments may be made.
  • concentrate the aqueous dispersion of liposomes to reduce the volume and lyophilize the force ribosome to produce a powder. Forms of ribosomes can also be obtained efficiently. If ribosomes are lyophilized, resuspend them in an aqueous medium immediately before use.
  • steam sterilization may be performed at 115 to 140 ° C, preferably 118 to 125 ° C, more preferably 121 ° C. As a result, a sterile preparation is obtained and transferred to the packaging process.
  • the ribosome produced by the method of the present invention is substantially 2 to 10 membranes, preferably 2 to several membranes (eg, 3, 4, 5 or 6 membranes). It is a ribosome that also has power. Such a ribosome is produced as a main component in the production method according to the above steps (i) to (v). “Substantially” means that in the ribosome-containing preparation of the present invention, ribosomes composed of 2 to 10 membranes are at least 70%, preferably at least 80% of the total ribosomes contained in the preparation. More preferably 80 to 98%.
  • a single-membrane ribosome is a ribosome composed of a membrane (unilamellar vesicle) having a single phospholipid bilayer.
  • This is composed of a phospholipid bilayer in which a replica is generally recognized as one layer in observation with a transmission electron microscope (TEM) by the Freeze fracture replication force method. That is, the observed particle trace on the carbon film is determined as a single film when there is no level difference, and the case where two or more levels are observed is determined as a “multilayer film”.
  • Ribosomes composed of two or three membranes are stronger than single membrane ribosomes and should not break even with the sizing treatment performed in the fourth step above.
  • Single-membrane ribosomes are known to be produced by water-based phase separation using supercritical carbon dioxide as a lipid membrane component solvent, and particularly when ethanol is used as a dissolution aid. Can be made.
  • the ribosome production method by the conventional Bangham method or reverse phase evaporation method (REV method)
  • a considerable proportion of ribosomes consisting of multilamellar vesic les (MLV) of various sizes and forms It often exists in.
  • Single- or multi-membrane ribosomes also have the advantage that the dose of ribosomes, in other words, the amount of lipids administered, does not increase compared to MLV.
  • Ribosomes with few lipid membranes especially single-walled ribosomes with a large particle size, LUV (Large unilamellar vesicles), provide a larger inclusion capacity than multilamellar ribosomes.
  • LUV Large unilamellar vesicles
  • the encapsulation rate of water-soluble drugs is good Even with a single membrane or several membranes of ribosome, the stability of the ribosome decreases if the mass of the encapsulated compound is relatively large. In particular, a tendency to be vulnerable to rapid changes in ionic strength was observed.
  • the ribosome membrane contains a compound having a polyalkyleneoxide group (for example, phospholipid), sterols, glycols and the like to stabilize the lipid membrane. As a result, it was found that the prepared ribosome is stable against salt shock.
  • the ribosome-containing preparation of the present invention can be produced by a technique known in the art using the above-mentioned ribosome and further using one or more kinds of physiologically acceptable formulation aids.
  • the formulation of the present invention contains formulation aids in the aqueous phase inside the lipid membrane of the ribosome and in an aqueous medium that suspends the ribosome.
  • This formulation aid is a substance that is added together with a water-soluble drug when formulating a ribosome, and various substances are used as necessary based on conventional formulation manufacturing techniques.
  • various physiologically acceptable buffering agents, edetic acid chelating agents such as EDTANa-Ca and EDTANa
  • Inorganic salts pharmacologically active substances (eg vasodilators, coagulation inhibitors, etc.), osmotic pressure regulators, stabilizers, antioxidants (eg ⁇ -tocofurol, ascorbic acid), viscosity regulators, storage Examples include agents.
  • pharmacologically active substances eg vasodilators, coagulation inhibitors, etc.
  • osmotic pressure regulators eg ⁇ -tocofurol, ascorbic acid
  • viscosity regulators storage Examples include agents.
  • an amine buffer and a chelating agent are included.
  • a water-soluble amine buffer and carbonate buffer are preferably used as the ⁇ buffer.
  • Particularly preferred are ammine-based buffers, with trometamol being particularly preferred.
  • the chelating agent is preferably EDTANa—Ca (calcium edetate 2
  • the "aqueous medium” is a water-based solvent that dissolves or suspends a water-soluble drug, a nonionic type compound, a formulation aid or the like. Use sterilized pyrogen-free water.
  • the aqueous solution other than the aqueous phase inside the ribosome lipid membrane also contains the above-mentioned water-soluble drug and formulation aid, more preferably, the aqueous phase inside and outside the lipid membrane Water-soluble drug has substantially the same concentration
  • the structural stability of the ribosome can be maintained without causing a significant osmotic pressure difference between the inside and outside of the membrane. Instability caused by the osmotic pressure effect of the ribosome can be prevented even during the storage period, and the retention stability of the water-soluble drug in the ribosome is improved.
  • the pH range of the solution or suspension is preferably 6.5 to 8.5, more preferably 6.8 to 7.8 at room temperature.
  • the preferred buffer is a buffer having a negative temperature coefficient as described in US Pat. No. 4,278,654.
  • the amine-based buffer has a property satisfying such requirements, and is preferably Tris. This type of buffer has a low pH at the autoclave temperature, which increases the stability of the ribosome-containing formulation in the autoclave, while returning to a physiologically acceptable pH at room temperature.
  • the formulations of the present invention are preferably formulated as a sterilized form.
  • a sterile preparation is obtained by sterile filtration, autoclaving, or heat sterilization.
  • the mass of ribosomal membrane lipid in addition to the encapsulation efficiency of the water-soluble drug and the stability of the encapsulation, the mass of ribosomal membrane lipid must be considered. As the mass of ribosomal membrane lipids increases, the viscosity of the product increases. As for the amount of drug encapsulated in the ribosome, all the drugs (including non-ionic compound compounds and formulation aids) in the aqueous solution encapsulated in the ribosome are 1-8, Preferably, it is contained in a mass ratio (g / g) of 3 to 8, more preferably 5 to 8.
  • the mass ratio of all drugs encapsulated in the ribosome is less than 1, it will contain a relatively large amount of lipid, increasing the viscosity of the preparation, resulting in poor drug delivery efficiency.
  • Single-membrane or several-membrane ribosomes are advantageous because of their excellent inclusion volume and delivery efficiency.
  • the total mass ratio of all drugs to ribosomal membrane lipids exceeds 8, the ribosome will also be structurally unstable, and drug diffusion and leakage outside the ribosomal membrane will be injected during storage or in vivo. Inevitable even after.
  • the ribosome-containing preparation obtained by the production method according to the present invention is within the scope of the present invention.
  • a preferred embodiment of the ribosome-containing preparation of the present invention is that the water-soluble drug is a non-ionic type
  • the concentration depends on the purpose of the imaging, the site, the nature of the compound in the imaging agent, and the patient's condition and can be adjusted as needed.
  • the optimum dose of X-ray contrast media is usually set individually considering the above conditions. For this reason, the total amount of iodine-based compounds inside and outside the ribosome may be set to the same level as conventional doses.
  • the X-ray contrast agent of the present invention is usually 40 to 450 mglZmL, preferably 70 to 400 mglZmL, and preferably contains a contrasting substance in the ribosome as the dose content of a 10 to 300 mL formulation solution. From the viewpoint of the efficiency of encapsulation, it is in the range of 100 to 350 mglZmL, particularly preferably 150 to 300 mglZmL. In addition, it is preferable that the aqueous phase inside and outside the lipid membrane contains the iodo compound and the formulation aid at substantially the same concentration.
  • the total lipid content in the X-ray contrast medium of the present invention is 20 to 100 mg / mL contrast medium, preferably 20 to 80 mg / mL contrast medium.
  • the term “total lipid” in this case is meant to include all types of lipids such as phospholipids, sterols and glycols constituting ribosomes. Such total lipids may be generally regarded as the amount of ribosomes contained in the contrast agent. Because of the various forms of liposomes, the total lipid content simply does not correspond to the number of ribosomes. According to the production method of the present invention, ribosome formation was performed efficiently, and the encapsulation rate tended to increase as the lipid amount increased up to a certain amount.
  • the X-ray contrast medium of the present invention is used for either systemic administration or local administration. Preferably, it is intravenously administered systemically as an injection or infusion. In the case of local administration to a site where direct administration is not possible, administration can be performed by a technique known in the art using, for example, a catheter or other appropriate drug delivery system.
  • the viscosity of the liposomal dispersion of the present invention is 30 mPa at 37 ° C. 's or less, preferably 25 mPa's or less. Within such a range, there is no practical problem (Patent Document 1).
  • the osmolarity of the X-ray contrast agent is typically 250 to 500 mosmol / L, preferably 290 to 350 mosmol / L.
  • the contrast agent is dissolved or suspended in a medium at a concentration that provides the isotonic solution.
  • the contrast material is poorly soluble, so the contrast material alone cannot provide an isotonic solution. If this is the case, other non-toxic water-soluble materials such as Sugars such as sodium, mannitol, glucose, sucrose and sorbitol may be added to the medium.
  • DMPC dimyristoylphosphatidylcholine
  • PE G—phospholipid manufactured by NOF Corporation,
  • a contrast medium solution containing JPiohexol (concentration of 300 mg I / mL), tro
  • Example 3 A mixture of 368.4 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), 147.4 mg of cholesterol, 11 g of PE G—phospholipid (manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT DSPE-020CN) was charged into a special stainless steel autoclave, and then liquid diacid 13g of carbon was put into a supercritical state at 50 ° C and 12MPa. Next, while stirring inside the container, add a contrast medium solution (containing JPiohexol (concentration 300 mgI / mL), trometamol 1 mg / mL, calcium edetate disodium O.lmg / mL), lOmL.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • PE G—phospholipid manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT DSPE-020CN
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • PE G—phospholipid manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT DSPE
  • the obtained dispersion was heated to 80 ° C. and pressure-filtered with a polycarbonate filter manufactured by Advantech, 0.8 m and 0.4 m in the same manner as in Example 3, to obtain a ribosome dispersion containing a contrast medium solution. Obtained.
  • the dispersion was concentrated by ultrafiltration using an ultrafilter (manufactured by Advantec, molecular weight cut off 20,000) to obtain a concentrated ribosome dispersion.
  • Distearoylphosphatidylcholine 396.6mg, cholesterol 147.4mg, PEG-phospholipid (Nippon Yushi Co., Ltd., SUNBRIGHT DSPE-020CN) 111.5mg, and contrast agent solution (JP ), Containing trometamol lmg / mL, calcium edetate disodium O.lmg / mL), lOmL made of stainless steel
  • JP contrast agent solution
  • DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholine
  • a contrast agent solution JP iopamidol: 300 mg I / mL concentration
  • a ribosome dispersion containing a contrast medium solution was obtained.
  • This mixture was heated to 80 ° C., and pressure-filtered with a polycarbonate filter manufactured by Advantech, 0.8 ⁇ m and 0.4 m in the same manner as in Example 3 to obtain a ribosome-containing contrast agent.
  • DMPC dimyristoylphosphatidylcholine
  • PE G—phospholipid manufactured by NOF Corporation,
  • the particle size (particle size) and polydispersity index were measured at 25 ° C using a dynamic light scattering particle size analyzer (Sysmetas, Malvem HPPS) for a dispersion containing ribosome encapsulating a water-soluble drug. Measured below.
  • the particle size indicates the average particle size by z-average.
  • the polydispersity index indicates the polydispersity, and the closer to the polydispersity index power, the more monodisperse the particle size distribution is.

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Abstract

本発明は、以下の工程を含むリポソーム含有製剤の製造方法により、水溶性薬剤を効率よく内包したリポソーム含有製剤を提供するものである。 　（i）圧力容器内で32～65°Cの下、リポソーム膜構成成分と超臨界二酸化炭素とを混合して懸濁液を得る第１工程、 （ii）次いで、該懸濁液に薬剤水溶液を添加して混合する第２工程、 （iii）その後、該圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することにより、該水溶性薬剤が内包されたリポソームの水性分散液を調製する第３工程、 （iv）前記の第３工程の後で、0.1～1μｍの孔径を有するろ過膜を装着した静圧式押出装置で、該水溶性薬剤が内包されたリポソームの水性分散液をろ過して、平均粒径が0.05～0.8μｍのリポソームに整粒する第４工程、 　第３工程または第４工程の後、該水溶性薬剤が内包されたリポソームの水性分散液を限外ろ過を行なうことにより濃縮する。

Description

明 細 書
リボソーム含有製剤およびその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、薬物の内包率が高 、リボソームを含むリボソーム含有製剤の製造方法 および該方法により得られたリボソーム含有製剤に関する。
背景技術
[0002] リボソームは、主にリン脂質によって形成される二分子膜 (リボソーム膜)の閉鎖小 胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有するために従来カゝら注目されてきた材 料である。リボソームは、内部に有する水相に水溶性の封入物質を、あるいは脂質二 分子膜内部には油溶性の封入物質を保持するというカプセル構造を構築できること から、薬物送達システム（DDS)への応用が盛んに研究されている。
[0003] 封入物質が内包されたリボソームを調製するには、従来から Bangham法や逆相蒸 発法 (REV法)などが用いられている。これらの方法では、素材としての安全性が高く 、生体内で適度な分解性を有するリボソームの中に封入物質を内包させるにもかか わらず、その調製過程において、リン脂質の溶剤として有機溶媒を使用する。そのた め、上記方法で得られるリボソーム含有製剤においては有機溶媒の残留が避けられ ず、リボソームの特性、安定性に問題が残る (例えば、特許文献 1参照)。さらにどうし ても残存する溶剤の毒性があると 、う理由で実用化に至って ヽな 、のが現状である（ 例えば、特許文献 2参照)。
[0004] 従来の方法では、リボソーム内に薬物を充分に内包させることができず、リボソーム 含有製剤を大量に投与する必要があるため患者に過度の負担となる問題があった。 とりわけ治療用薬剤に比べて投与量が多くなる診断用造影剤への応用を考えた場合 、造影物質の内包率が高いリボソーム含有製剤が求められていた。
[0005] 一方、特許文献 3には、有機溶媒の代わりに超臨界二酸ィ匕炭素を用いて、リポソ一 ムを製造する方法が開示されている。この方法では製造条件を種々設定することが 可能であり、従来のリボソームの製造方法に比べて比較的容易に封入物質の保持効 率（内包率)を向上させることができる。封入物質の内包率が高いと、体内の目標部 位に取り込まれたリボソームが少量であったとしても所望の効果を得ることができる。 このため DDS (Drag Delivery System、以下同じ）製剤の調製方法として期待さ れている。しかし、超臨界二酸化炭素と脂質、封入物質の混和に際してエタノールな どの溶解助剤の使用が望まれており、有機溶媒を全く使用せずに内包率の高いリポ ソームは作製できない (非特許文献 1参照)。薬物などをリボソーム内に内包させても
、溶解助剤の残留のためにリボソーム膜の強度が低下し、時間経過とともに外部へ 漏出する可能性も考慮されねばならない。したがって、薬剤を効率よくリボソームに内 包させる方法とともに、経時安定的にそれを保持し、血中滞留性を改善することがで きる剤形、製剤組成の改良、および製剤の安全性の向上について、引き続き特別の 要求が存在する。
特許文献 1：特許 2619037号公報
特許文献 2：特開平 7-316079号公報
特許文献 3：特開 2003-119120号公報
非特許文献 l : Pharm Tech Japan 19卷、 5号、 91〜100 (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は上記の要請に取り組むものであり、有機溶媒を全く使用しないでリポソ一 ム内に水溶性薬剤を効率よく内包したリボソーム、ならびにこれを含有する製剤の製 造方法を提案する。特にその水溶性薬剤が非イオン型ョウド系化合物である製剤は 、がん組織の良好な描出性、容易な排泄性を有する安全性の高い X線造影剤である
課題を解決するための手段
[0007] 本発明によるリボソーム含有製剤の製造方法は、
(i)圧力容器内で 32〜65°Cの下、リボソーム膜構成成分と超臨界二酸化炭素とを混 合して懸濁液を得る第 1工程と、
(ii)次いで、該懸濁液に薬剤水溶液を添加して混合する第 2工程と、ならびに
(iii)その後、該圧力容器内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出することにより、該水溶性薬 剤が内包されたリボソームの水性分散液を調製する第 3工程と、を有し、該リボソーム 膜構成成分には、少なくとも転移温度を有するリン脂質が含まれることを特徴としてい る。
[0008] あるいは、
(i)リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合することにより得られた懸濁液を収容 している圧力容器内に、液ィ匕ニ酸ィ匕炭素を供給する第 1工程と、
(ii)次いで、前記の懸濁液と液ィ匕ニ酸ィ匕炭素とを混合しながら、該圧力容器内を 32 〜65°Cの下、加圧して液化二酸化炭素を超臨界二酸化炭素とする第 2工程と、なら びに
(iii)その後、該圧力容器内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出することにより、該水溶性薬 剤が内包されたリボソームの水性分散液を調製する第 3工程と、を有し、該リボソーム 膜構成成分には、少なくとも転移温度を有するリン脂質が含まれることを特徴とする 製造方法であってもよい。この懸濁液は、リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混 合して調製され、次 、で圧力容器内に供給された懸濁液であってもよ 、。
[0009] また、前記転移温度は、 22〜60°Cの範囲にあることが望ましい。
[0010] 前記第 3工程の後、該リボソーム膜構成成分のリン脂質の転移温度〜該転移温度
+ 10°Cで、 0.1〜3時間インキュベートしてもよい。
[0011] 前記第 3工程の後で、 0.1-1 μ mの孔径を有するろ過膜を装着した静圧式押出装 置を用いて、 50〜90°C、 0.01〜0.8MPaの圧力下で、該水溶性薬剤が内包されたリポ ノームの水性分散液をろ過して、平均粒径が 0.05〜0.8 μ mのリボソームに整粒する 第 4工程をさらに有することが好ま 、。
[0012] 前記の第 3工程または第 4工程の後、該水溶性薬剤が内包されたリボソームの水性 分散液を、限外ろ過を行なうことにより濃縮する工程を有することが望ましい。限外ろ 過の後に、 115〜140°Cで蒸気滅菌してもよい。
[0013] 前記のろ過により、水溶性薬剤のリボソームへの内包率 (すなわち、水溶性薬剤全 量に対するリボソームに内包される水溶性薬剤の比率)を 25〜35%まで上昇させるこ とがでさる。
[0014] 前記リボソーム膜内外の水相における水溶性薬剤の濃度 (モル ZL)が実質的に同 じであることが望ましい。すなわち、リボソーム膜外の水相にける水溶性薬剤（1)の濃 度と、リボソーム膜内の水相にける水溶性薬剤（2)の濃度が実質的に同じであること が好ましいということである。より好ましくは、（2)の濃度に対する（1)の濃度の比率が 0. 95-1. 05の範囲内にある場合である。
[0015] 前記の工程により作製されたリボソームのうち、その脂質膜が 2〜10枚膜で構成さ れるリボソームが少なくとも 70%を占めていることを特徴としている。
[0016] また、前記リボソーム膜構成成分として、少なくともリン脂質、カチオン性脂質、ポリ エチレングリコール (PEG)基を有する脂質およびステロール類を含む脂質を含み、 リン脂質 (PEG-リン脂質 (PEG (ポリエチレングリコール)を有するリン資質を意味す る、以下同じ）を含まず) /ステロール類のモル比が 100/60〜100/90、リン脂質 (PEG -リン脂質を含まず) /ポリエチレングリコール基を有する脂質のモル比が 100/5〜100 /25である。
[0017] 本発明には、上記の製造方法で得られるリボソーム含有製剤、ならびにその好まし V、態様として、水溶性薬剤が非イオン型ョウド系化合物および 1種類以上の生理的 に許容される製剤助剤であり、 X線造影剤として用いられるリボソーム含有製剤も含ま れる。
発明の効果
[0018] 本発明のリボソーム含有製剤は、水溶性薬剤、好ましくは非イオン型ョウド系化合 物をマイクロキヤリヤーであるリボソーム内に 25〜35%の高い内包率で内包させ、しか も効率よく担持させることによってターゲティング性を付与している。
[0019] 特に上記リボソームは、 X線造影剤への使用に対しても有益な特性を備えて!/、る。
リボソーム含有造影剤は従来の造影剤に比べて造影性能に優れており、低用量ィ匕を 可能とする。
[0020] 本発明の製剤は、毒性の高いクロル系溶剤およびその他の有機溶剤を全く使用せ ずに製造されるため、従来のリボソーム含有製剤に比べて毒性、副作用がはるかに 軽減されている。したがって、その投与を受ける患者の負担は少ない。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 本明細書において、亜臨界状態を含めて超臨界状態とする。リボソーム膜を「脂質 膜」ということもある。リボソーム内に「内包」されるとは、リボソーム内に封入されてその リン脂質膜と会合しているか、またはリン脂質膜内部に閉じ込められている水相（内部 水相）中に存在している状態の両方を含むものとする。また、「がん」は、悪性腫瘍を 指し、単に「腫瘍」ということもある。
[0022] リボソーム製剤の製造方法
本発明によるリボソーム含有製剤の製造方法にぉ 、て、リボソームは超臨界二酸ィ匕 炭素を混和媒体としたリボソームの調製方法 (以下、超臨界二酸化炭素法）に基づき 、実質的に溶解助剤を用いない方法により調製される。その際に水溶性薬剤および 製剤助剤をリボソーム膜内に内包させる。そのリボソーム膜の構成成分には、少なくと も転移温度を有するリン脂質を含むことを特徴としている。以下、内包される水溶性 薬剤、リボソーム膜構成成分、リボソームの製造方法、リボソーム含有製剤の製造、リ ポソームを含有する X線造影剤の順に説明する。
[0023] 水溶性薬剤
本発明のリボソーム製造方法により、水溶性薬剤が脂質膜内に内包されたリポソ一 ム含有製剤ができる。水溶性薬剤としては特に限定されず、広く医薬品に使用される 物質が挙げられる。例えば、本発明で用いられる水溶性薬剤としては、造影化合物、 抗がん化合物、抗酸化化合物、抗菌化合物、抗炎症化合物、血行促進化合物、美 白化合物、肌荒れ防止化合物、老化防止化合物、発毛促進化合物、保湿化合物、 ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などが挙げられる。
[0024] 本発明のリボソーム含有製剤は、特に造影剤、または抗がん剤として用いることが 望ましい。中でも造影物質が好適であり、特に好ましい造影物質は、水溶性の非ィォ ン型ョウド系化合物である。好ましいヨウド系化合物として、ィォメプロール、ィォパミド ール、ィォへキソール、ィォプロミド、ィォキシラン、ィオタスル、ィオトロランまたはィ ォジキサノールなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよぐあるいは 2 種以上を組み合わせて用いてもょ 、。またその例示に限定されるものではな 、。
[0025] 医薬物質の DDSにおいては、リボソーム内に封入することにより副作用が軽減され 、内包化により得る利益を一層増すために、内包されていない医薬物質を分離除去 して製剤を調製することが多い。実際には、ほぼ 100%の封入が達成されたリポソ一 ムが分離されても、その後、リボソーム懸濁製剤の封入成分が時間とともに漏失する 例が報告されている（Betageri, G. V. Drug Devel. Ind. Pharm. 19, 531-539(1993)) 。この現象は、浸透圧効果によるリボソーム構造の不安定ィ匕に基づく。また WO88/09 165のリボソーム調製物のように、リボソーム内部のみに X線造影物質を有する造影 剤をオートクレープ滅菌すると、造影物質がリボソーム外に漏れ出てしまうことが報告 されている (特許文献 2)。逆に内包化されていない遊離の造影物質を含む製剤の診 断的意義が論じられた (特表平 9-505821号公報)。これは造影剤固有の使用態様に 根ざすものであり、リボソームに内包されな力つた医薬ィ匕合物を所期の目的からは無 用のものとする立場とは区別される。
[0026] 本発明のリボソーム含有製剤の一態様である X線造影剤は、通常、リボソームに内 包されていないヨウド系化合物もまた含む。このような造影剤にあっては、リボソーム 内に内包されている造影物質の割合（内包率)も考慮されねばならない。本発明の X 線造影剤では、前記水溶性ヨウド系化合物の 65〜80質量％力 リボソームに内包さ れて 、な 、形態にあり、リボソームを懸濁する水性媒体中に存在することを特徴とし ている。実質的にほとんど、または大半のヨウド系化合物がリボソーム内に内包されて いる製剤も可能であるが、そうした製剤は、浸透圧差、リボソームの形態と安定性、内 包化させる効率、製剤の造影能なども考えると現実の製剤として実用上、特に優れる わけではない。
[0027] 本発明のリボソーム含有 X線造影剤において、ヨウド系化合物を効率的に内包化し 、これを担持するリボソームの経時的不安定化を防止するために、リボソーム内に封 入されるョウド系化合物の量は、むしろ限定的である。すなわち X線造影剤における 全ョウド系化合物の 10〜35質量％、好ましくは 10〜30質量％、より好ましくは 15〜25 質量％であることが望ましい。造影剤において、リボソーム内に封入されたヨウド系化 合物の割合力 全体の 5〜30質量％ (好ましくは 5〜25質量％)であれば、残り 70〜95 質量％ (好ましくは 75〜95質量％)が存在するリボソーム外の水性分散液へ流出する 量については実質的に無視できる。したがって、ヨウド系化合物をカプセルィ匕したリ ポソームの浸透圧効果による不安定ィ匕を防止でき、リボソームにおける造影物質の 経時的な保持安定性は向上する。このことは、リボソーム含有 X線造影剤でも、製剤 調製時におけるヨウド系化合物の内包率と使用時における内包率が実質的に同一 に保たれることを意味し、品質管理の観点からも好ましい。リボソームへの内包率が 貯蔵'保管の間に低下する結果、製剤ごとにまたは保管期間ごとに異なっては、その 造影性能も影響を受ける。
[0028] リボソーム膜構成成分
本発明の方法により製造されるリボソーム含有製剤は、脂質膜内外の水相に水溶 性薬剤などを内包し、実質的に有機溶媒を含まないリボソームを含有することを特徴 としている。すなわち水溶性薬剤をマイクロキヤリヤーとしてのリボソーム内に封入した 形態で使用することにより、標的の臓器、組織の病巣へ効率よく送達させることを図つ ている。特に本発明に用いられるリボソームの好ましい態様は、 X線造影剤用に最適 なリボソームとして設計された形態、構造を有する。そのようなリボソームは、その脂質 膜が実質的に数枚膜で構成されるために経時的な安定性および血中での安定性が 改善されており、し力も造影物質の内包率を高めることにより造影剤の造影性能を向 上させている。
[0029] 本発明のリボソーム含有製剤において、水溶性薬剤を内包するリボソームの粒径 およびその脂質膜を適切に設計することによりターゲティング機能を付与することが できる。特に全身投与の場合には、受動的ターゲティングおよび能動的ターゲティン グいずれも考慮することが望ましい。前者は、リボソームの粒径、脂質組成、荷電など の調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リボソーム粒径を狭 、範囲 に揃える調整もまた容易に行うことができる。リボソーム膜表面の設計では、リン脂質 の種類と組成、共存物質を変えることにより所望の特性を付与することができる。さら に投与されたリボソームの体内移動と分布に関して、より高度な送達選択性と集積性 を可能とする能動的ターゲティングの採用もまた検討されるべきである。一例として、 リボソーム膜表面にポリアルキレンォキシド高分子鎖またはポリエチレングリコール基 を導入することは、標的部位への誘導を制御し得るために有益である。
[0030] 他方、がん組織などの患部に到達しな力つたリボソームは、正常な組織には集積す ることなく、比較的速やかに分解されて体外に排泄される。これはリボソームを設計す る際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能 である。そうしたクリアランスの制御により、遊離形態では副作用が皆無ではない水溶 性薬剤をリボソームに内包させる DDS剤形のもう一つの効果が期待できる。例えば 水溶性の非イオン型ョウド系化合物をリボソームに内包させると、ヨウド系化合物が肝 臓、脾臓、腎臓などに非特異的に沈着して、分解，排泄に時間が力かる事態に陥りに くくなる。このため徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止でき る。
[0031] リボソームの脂質膜を構成する脂質膜成分には、少なくともリン脂質、糖脂質、ステ ロール類、グリコール類、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質（ 例えば PEG-リン脂質などが含まれる。本発明のリボソーム含有製剤に含まれるリポソ ームの脂質膜成分として、一般にリン脂質および Zまたは糖脂質が好ましく使用され る。好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄など力も得られるレシチン、リゾレシチン および Zまたはこれらの水素添加物、水酸ィ匕物の誘導体を挙げることができる。
[0032] その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来する力、または 半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホ スファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールァミン、スフインゴミエリン、合成 により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、ジステ ァロイルホスファチジルコリン（DSPC)、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC)、ジ ォレイルホスファチジルコリン（DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（D PPG)、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS)、ジステアロイルホスファチジルグ リセロール（DSPG)、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI)、ジステアロイ ルホスファチジルイノシトール（DSPI)、ジパルミトイルホスフチジン酸（DPPA)、ジステ ァロイルホスファチジン酸（DSPA)などが挙げられる。
[0033] 本発明のリボソームを構成する脂質膜のリン脂質類には、転移温度を有するリン脂 質が少なくとも含まれていることが望ましい。リン脂質の「(相)転移温度」とは、リン脂 質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示 差走査熱量計 (DSC)を使用する示差熱分析による。 22〜60°Cの範囲にある相転 移点を有するリン脂質として、ジミリストイルホスファチジルコリン (転移温度、以下同じ 、 23〜24°C)、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5°C)、水素添加大豆レ シチン（53°C)、水素添カ卩大豆ホスファチジルコリン（54°C)、ジステアロイルホスファチ ジルコリン（54.1〜58.0°C)などが例示される。
[0034] 本発明において使用するカチオン性脂質として、 1、 2 ジォレオィルォキシ 3—
(トリメチルアンモ-ゥム）プロパン（DOTAP)、 N、 N ジォクタデシルアミドグリシルス ペルミン（DOGS)、ジメチルジォクタデシルアンモ-ゥムブロミド（DDAB)、 N— [1— ( 2、 3 ジォレイルォキシ）プロピル]— N、 N、 N トリメチルアンモ -ゥムクロリド（DO TMA)、 2、 3 ジォレイルォキシ— N— [2 (スペルミン—カルボキサミド）ェチル]— N 、 N ジメチル— 1—プロパンアミ-ゥムトリフルォロアセテート（DOSPA)および N— [ 1— (2、 3 ジミリスチルォキシ）プロピル] N、 N ジメチルー N— (2 ヒドロキシェ チル）アンモ-ゥムブロミド（DMRIE)などが挙げられる。
[0035] カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とァミノアルコールとのエステル、例え ばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA)もしくはジステアロイルホスファチジン酸（D SPA)とヒドロキシエチレンジァミンとのエステルなどが挙げられる。これらのカチオン 性脂質は全脂質量に対し 0.1〜5質量％、好ましくは全脂質量に対し 0.3〜3質量％、 より好ましくは全脂質量に対し 0.5〜2質量％の割合で含有するように添加すればよい
[0036] これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、 2種以上併用してもよい。ただし 2 種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷の リン脂質同士で使用することが、リボソームの凝集防止の観点力も望ましい。中性リン 脂質と荷電リン脂質を併用する場合、質量比として通常、 200 : 1〜3： 1、好ましくは 1 00 : 1〜4 : 1、ょり好ましくは40 : 1〜5 : 1でぁる。
[0037] 糖脂質としては、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルな どのグリセ口脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラタトシル セラミド、ガンダリオシド G7、ガンダリオシド G6、ガンダリオシド G4などのスフインゴ糖月旨 質などを挙げることができる。
[0038] リボソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えるこ ともできる。例えば、脂質膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロ 一ノレ、ジヒドロコレステロ一ノレ、コレステロ一ノレエステノレ、フィトステロ一ノレ、シトステロ ール、スチグマステロール、カンペステローノレ、コレスタノール、またはラノステロール などが挙げられる。また l— O—ステロールダルコシド， l— O—ステロールマルトシド または l— O—ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリボソームの安定 化に効果があることが示されている（特開平 5-245357号公報)。これらの中で、特にコ レステロールが好ましい。
[0039] リボソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンォキシド導入用のアンカーにも なり得る。特開平 09— 3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、種々の機 能性物質を共有結合により固定ィ匕することができ、リボソーム形成用の成分として利 用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。
[0040] ステロール類の使用量として、リン脂質 (PEG-リン脂質を含まず) /ステロール類の モル比が 100/60〜100/90、好ましくは 100/70〜100/85である。このモル比は、 PEG -リン脂質を除くリン脂質量を基準としている。モル比が 100/60未満であると混合脂質 の分散性を向上させるステロール類による安定ィ匕が充分に発揮されない。
[0041] 上記ステロール類の他にリボソーム膜の構成成分として、グリコール類をカ卩えてもよ い。リボソームを作製する際に、リン脂質などともにグリコール類を添加すると、リポソ ーム内での水溶性ヨウド系化合物の保持効率が上昇する。グリコール類として、ェチ レングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコーノレ
、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、 1,4-ブタンジオールなどが挙げられ る。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して 0.01〜20質量％、好ましくは 0. 5〜10質量％の割合が望ましい。
[0042] 本発明のリボソーム含有製剤の意図する目的に応じて、高分子鎖であるポリアルキ レンォキシド (ポリオキシアルキレン鎖）（PAO)基または類似の基を有するリン脂質ま たは化合物を、リボソーム膜の一成分として使用してもよい。ポリアルキレンォキシド 基またはポリエチレングリコール (PEG)基をリボソーム膜表面に付けることにより、崩 壊、凝集といったリボソーム自体の不安定性が解決され、経時安定性も改善される。 さらに新たな機能をリボソームに付与することができる。例えば、 PEG化リボソームに は免疫系から認識されに《なる効果が期待できる。さらにリボソームは、 PEG基の導 入により水和層が形成されて親水的傾向を示すことにより、血中安定性を増して長時 間にわたり血液中の濃度を維持できることが明らかになつている（Biochim. Biophys. Acta., 1066,
29-36(1991)) oよって一（CH CH O) —Hであらわされる PEG基のォキシエチレン
2 2 η
単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる
。 PEG基として、ォキシエチレン単位が 10〜3500、好ましくは 100〜2000のポリエチレ ングリコールが好適である。ポリエチレングリコールを使用する場合の使用量は、該リ ポソームを構成する脂質に対して 1〜40質量％、好ましくは 5〜25質量％含むのがよ い。リボソームの PEG化には、公知の技術を利用することができる。好ましくは PEG リン脂質を、ポリエチレングリコール基を有する脂質として用いてもよい。これは、後 述するように、リン脂質などを超臨界二酸ィ匕炭素に混合する際に、溶解助剤的な作 用も示す力 である。
[0043] 上記ポリエチレングリコールに代わり、公知の各種ポリアルキレンォキシド基、一（A O) Yをリボソーム膜表面に導入してもよい。ここで AOは炭素数 2〜4のォキシァ ルキレン基を表し、 nはォキシアルキレン基の平均付カ卩モル数であり、 1〜2000、好ま しくは 10〜500、さらに好ましくは 20〜200の正の整数である。また、 Yは、水素原子、 アルキル基 (例えば炭素数 1〜5の、分岐していてもよい脂肪族炭化水素基)または 機能性官能基を表す。
[0044] 炭素数 2〜4のォキシアルキレン基 (AOで表される）として、例えばォキシエチレン 基、ォキシプロピレン基、ォキシトリメチレン基、ォキシテトラメチレン基、ォキシ 1 ェチルエチレン基、ォキシ一； L, 2—ジメチルエチレン基などが挙げられる。
[0045] nが 2以上の場合、ォキシアルキレン基の種類は、同一のものでも異なるものでもよ い。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。ポリ アルキレンォキシド鎖に親水性を付与する場合、ォキシアルキレン基としてはェチレ ンォキシドが単独で付カ卩したものが好ましぐこの場合、 nが 10以上のものが好ましい 。また種類の異なるアルキレンォキシドを付加する場合、エチレンォキシドが 20モル %以上、好ましくは 50モル％以上付カ卩しているのが望ましい。ポリアルキレンォキシド 鎖に親油性を付与する場合には、エチレンォキシド以外のォキシアルキレン基の付 加モル数を多くする。例えばポリエチレンォキシドとポリプロピレンォキシドとのブロッ ク共重合物を含有するリボソームは、本発明の好ましい態様である。 [0046] 上記の Yで表される機能性官能基は、ポリアルキレンォキシド鎖の先端に糖、糖タ ンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」を付するためのもの で、例えばアミノ基、ォキシカルボ-ルイミダゾール基、 Ν-ヒドロキシコハク酸イミド基 、つた反応性に富む官能基が挙げられる。
[0047] 先端に「機能性物質」を結合して 、るポリアルキレンォキシド鎖が固定化されたリポ ソームは、ポリアルキレンォキシド鎖導入の効果に加えて、「機能性物質」の機能、例 えば「認識素子」として特定臓器指向性、腫瘍組織指向性などの作用が充分に発揮 される。腫瘍組織指向性を付与するには、腫瘍細胞のみに存在する腫瘍特異抗原 に対応する抗腫瘍モノクローナル抗体を、機能性物質としてリボソーム膜に結合させ ると、よりターゲット選択性の高いリボソームとなる（例えば、特開平 11-28087号公報）
[0048] リボソーム膜へのポリアルキレンォキシド鎖の導入は、公知の技術を利用することが できる。ポリアルキレンォキシド基を有するリン脂質または化合物は、一種類を単独で 使用することができ、あるいは二種以上のものを組み合わせて使用することもできる。 その含有量は、リボソーム膜構成成分の合計量に対し、 0.001〜50モル％、好ましく は 0.01〜25モル0 /0、より好ましくは 0.1〜10モル0 /0である。
[0049] 他に添加できる化合物として、負荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン 酸ジアルキルエステルなど、正電荷を与える化合物としてステアリルァミンなどの脂肪 族ァミンが例示される。
[0050] 本発明のリボソーム含有製剤において、微細粒子としてのリボソームのサイズとその 分布の調整は、高い薬剤の内包率、ターゲティング性、送達効率と密接に関わって いる。粒径 (粒子径）は水溶性薬剤を内包するリボソームを含む分散液を凍結し、そ の後破砕した界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること (凍 結破砕 TEM法）により測定することができる。ここで「平均粒径」とは、観察されたリポ ソーム粒子の一定の個数、例えば 20個の径の単純平均を指している。これは粒径分 布で最も出現頻度の高い粒径を言う「中心粒径」と、通常一致するか、または概ね近 似している。
[0051] 受動的ターゲティング能力をリボソームに持たせるには、リボソームを作製する際に 、その粒径のサイズを適切に揃えて調製することが必要になる。特許 2619037号公報 には、粒径 3 μ m以上のリボソームを排除することにより、肺の毛細血管におけるリポソ ームの不都合な滞留が回避されると記載されている。しかし、 0.5〜3 mの粒径範囲 のリボソームは、必ずしも自然に向腫瘍性とはならない。本発明のリボソーム含有製 剤においては、その用途に応じて平均粒径を、好ましくは 0.05〜0.8 /ζ πιの範囲内で 適宜調整してリボソームを作製する。
[0052] 例えば、肝臓の撮像を目的とする X線造影剤の場合、リボソームの好ま 、平均粒 径は、 0.2 μ m〜0.8 μ mである。水溶性ヨウド系化合物を内包するリボソームがこの範 囲のサイズであれば、非腫瘍組織に多 ヽ細網系内皮細胞による捕獲貪食の対象に なり、腫瘍組織とのコントラストが明瞭となるためである。なお肝臓用の造影剤に使用 するリボソームは、その表面にある PEGは、なるべく少ない方が望ましい。
[0053] 血流を利用する「EPR効果 (Enhanced permeability and retention,透過性の亢進 および滞留）」に基づいてリボソームを向腫瘍性とするためには、その平均粒径を 0.1 〜0.2 μ m、より好ましくは 0.11〜0.13 μ mとすることが望ましい。例えばリボソームの 平均粒径を 0.11〜0.13 /ζ πιの範囲に揃えることにより、リボソーム含有製剤をがん組 織へ選択的に集中させることが可能となる。
[0054] リボソームの製造方法
リボソームを作製する方法として、これまで種々の方法が提案されている。作製方法 が異なると、最終的にでき上がったリボソームの形態および特性も著しく異なることが 多い（特開平 6-80560号公報)。そのため所望するリボソームの形態、特性に応じて 製造方法が選択される。一般にリボソームの調製は、まずリン脂質、カチオン性脂質 、ステロールといった脂質膜成分を、ほとんど例外なく有機溶媒 (例えばクロ口ホルム 、ジクロロメタン、ェチルエーテル、四塩化炭素、酢酸ェチル、ジォキサン、 THFなど） とともに容器中で混合、溶解することから始まる。特にクロル系溶媒がよく用いられて いる。このようなリボソームの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。
[0055] 他方、超臨界二酸ィ匕炭素を利用してリボソームを調製する方法は、二酸化炭素の 臨界温度が 31.1°C、臨界圧力が 7.38 MPaと比較的扱いやすぐ不活性なガスゆえ 残存しても人体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由に より魅力ある製造方法であると言える。し力しながら、例え有機溶媒を使用しないとす る従来の超臨界二酸化炭素法でも、脂質類を超臨界二酸化炭素に効率よく分散さ せるためにエタノールなどの使用が推奨されて 、た (非特許文献 1参照)。残存する これらの有機溶媒を除去するために、複数の工程および長時間の処理を要している のが現状である。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒については、生 体に及ぼす悪影響、例えば副作用が懸念される。
[0056] 本発明の製造方法は、通常の医薬品と比べてとりわけ投与量の多い X線造影剤用 に最適な形態、構造を有するリボソームを製造できるように開発された方法である。 すなわち、超臨界二酸ィ匕炭素を用いる方法により作製されたリボソームは、実質的に クロル系溶剤、エタノールおよびその他の有機溶媒を含有せず、水溶性薬剤を内包 するのに種々の好ましい特性、すなわち、従来法に比べてリボソームの生成率、封入 する薬物の内包率、内包されている薬物のリボソーム内の保持率が高いことが示され ている。さらに工業的スケールでの応用も可能である。なお「実質的に」とは、リポソ一 ム含有製剤における残存有機溶媒の濃度の上限値が 10 IX g/Lであることを意味する
[0057] 本発明によるそのリボソームの製造方法において、第 1工程および第 2工程は、混 合順序の相違より、次の 2通りがある。
[0058] (i)圧力容器内で 32〜65°Cの下、リボソーム膜構成成分と超臨界二酸化炭素とを混 合して懸濁液を得る第 1工程
(ii)次 、で、該懸濁液に薬剤溶水溶液を添加して混合する第 2工程
あるいは次の順序でもよい。
[0059] (i)リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合することにより得られた懸濁液を収 容している圧力容器内に、液ィ匕ニ酸ィ匕炭素を供給する第 1工程
(ii)次いで、前記の懸濁液と液ィ匕ニ酸ィ匕炭素とを混合させながら、該圧力容器内を 32〜65°Cの下、加圧して液化二酸化炭素を超臨界二酸化炭素とする第 2工程 さらに次の第 3工程および第 4工程が続く。
[0060] (iii)その後圧力容器内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、水溶性薬剤、好ましくは 水溶性薬剤および製剤助剤を内部に含有するリボソームの水性分散液を作製する 第 3工程
(iv)前記の第 3工程の後で、 0.1-1 μ mの孔径を有するろ過膜を装着した静圧式 押出装置で、 50〜90°C、 0.01〜0.8MPaの圧力下で、該水溶性薬剤が内包されたリ ポソームの水性分散液をろ過して、平均粒径が 0.05〜0.8 μ mのリボソームに整粒す る第 4工程。
[0061] 前記の第 3工程または第 4工程の後、引き続き該水溶性薬剤が内包されたリポソ一 ムの水性分散液は、限外ろ過を行なうことにより濃縮する工程を行なってもよい。さら に前記限外ろ過の後、 115〜140°Cで蒸気滅菌してもよい。
[0062] これらの工程によりリン脂質 (PEG-リン脂質を含まず) /ステロール類のモル比が 10 0/60〜100/90、リン脂質 (PEG-リン脂質を含まず) /ポリエチレングリコール基を有す る脂質のモル比が 100/5〜100/25であり、脂質膜が 2〜10枚膜で構成されるリポソ一 ムが少なくとも 70%を占めていることを特徴とするリボソーム含有製剤が得られる。
[0063] 以下、各工程について説明する。
'第 1工程および第 2工程
第 1および第 2工程では、圧力容器内で、リボソーム膜構成成分と、液化二酸化炭 素と、薬剤水溶液 (水溶性薬剤および製剤助剤を含有する)とを混合するが、その添 加順序に基づ 、て 2方法に別れる。
[0064] 圧力容器にリボソーム膜を構成する脂質成分としてリン脂質類および脂質膜の安 定化作用を有する物質を加え、さらに液ィ匕ニ酸ィ匕炭素を添加して、好ましくは強撹拌 条件下で混合する。脂質膜の安定ィ匕作用を有する物質として、カチオン性脂質、ポリ エチレングリコール基を有する脂質、ステロール類などを加える。リン脂質類としては 、 22〜60°Cの範囲にある転移温度を有する少なくとも 1種以上のリン脂質を含む各 種のリン脂質が好ましい。後記の範囲にある圧力および温度のもとに液ィ匕ニ酸ィ匕炭 素を超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。リボソーム膜構成成分と超臨界 (もしくは 亜臨界)状態の二酸化炭素とを充分に混合して、溶解または分散させる。または予め 圧力容器内にある液ィ匕ニ酸ィ匕炭素に、これらの化合物を加えて混合し、次いで温度 、圧力を調整して超臨界状態にして混合してもよい。引き続き生成したリン脂質およ び脂質膜安定化物質などを含有する超臨界二酸化炭素中に、内包させる水溶性薬 剤、例えば非イオン型ョウド系化合物および製剤助剤を含む薬剤水溶液を導入する ことによりミセルを形成させる。
[0065] あるいは、リボソーム膜構成成分としてリン脂質、カチオン性脂質、ポリエチレンダリ コール基を有する脂質およびステロール類力 選ばれる少なくとも 1つと、水溶性薬 剤、好ましくは水溶性薬剤および製剤助剤を含む薬剤水溶液とを混合した懸濁液を 収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給し、好ましくは強撹拌下で、混 合し分散させ、次いで加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、さらに強撹 拌下で混合することによりミセルを形成させてもよい。前記懸濁液は圧力容器内でリ ポソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合して調製されるが、代わりにそうした懸濁 液を別途に調製して、次 、で圧力容器内に供給してもよ ヽ。
[0066] 封入物質のリボソーム内への内包化の効率は、リボソーム膜用脂質の全脂質量と、 超臨界二酸ィ匕炭素との比率、封入物質などを含む水溶液との比率によっても左右さ れる。ここでいう全脂質量とは、リボソーム膜を構成するリン脂質類、ステロール類、そ の他の添加した脂質類すベてを対象とした総和の質量である。大部分のリボソーム 力 枚膜よりはむしろ数枚膜のリボソームとして形成させるために、添加する脂質量は 、従来使用されている脂質量よりも 1.5〜2.5倍多くしてもよい。具体的には強撹拌下 で、最終的に二酸化炭素、 1質量部に対して、脂質、 0.075〜0.125質量部、好ましく は 0.08〜0.1質量部の割合で混合し分散させる。脂質量が多すぎると、リボソーム作 成時には脂質の溶け残りが生じるおそれがある。し力しながら撹拌当初は上記脂質 を含む脂質相が存在してもよぐ次のような強撹拌により、脂質分子が配列する、 CO
2
Z水の界面を多数生じさせて脂質の小ミセルが多数形成されれば内包率も上昇する こととなる。脂質と超臨界二酸ィ匕炭素との乳化は、エタノールなどを添加しなくとも下 記のように PEG基を有する脂質の存在で促進される。
[0067] 「強撹拌」とは、混合溶液の容量や撹拌手段によって好ま ヽ範囲が異なる。例え ば、混合溶液の容量が 10〜100mL程度の場合において、長さ 15mm、直径 5mmの略 円柱状の撹拌子を用い、マグネチックスターラーで回転数 400〜4000rpm、好ましく は 1000〜1500rpm、特に好ましくは 1200〜1400rpmで撹拌することを意味する。なお 、混合溶液の容量や撹拌手段が上記とは異なる場合であっても、前記撹拌条件で混 合溶液に与えられるせん断力等を考慮して、適宜撹拌条件を定めることが好まし ヽ。 具体的には、撹拌条件が以下の式を満たすことが特に好ましい。
[0068] 式： C = N X V "°-15
C：撹拌子または撹拌羽根の回転数回転数 (rpm)
V：混合溶液の容量 (L)
N : 300〜3000
また、強撹拌の時間は、 1〜120分間、好ましくは 5〜60分間であることが望ましぐ混 合液量、脂質量に応じて適宜設定する。なお、上記強撹拌の時間には、薬剤水溶液 を供給する時間も含む。
[0069] このような条件を満たす強撹拌下で、リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素 とを所定の時間混合することにより、リボソームの生成効率が良くなり、水溶性薬剤の 内包率がより高いリボソームを含有する水性分散液を得ることができる。撹拌手段とし て、特に限定されないが、マグネチックスターラー、ホモジナイザー、ホモミキサー、ゥ ルトラミキサーなど、通常の撹拌機を使用してもよい。
[0070] リン脂質、カチオン性脂質、コレステロールを含む脂質類は、そもそも超臨界二酸 化炭素、水のいずれにも溶けにくいし、分散もしにくい。所望する形態のリボソームが 効率的に形成されるためには、脂質類が超臨界二酸ィ匕炭素中に良好に分散し、両 者間の乳化が進んで均質な状態を形成することが重要な鍵である。そのための溶解 助剤 (または助溶剤、分散促進剤）として、ヒドロキシル基を有する少なくとも 1種の化 合物を利用して溶解、分散または混合をすることが好ましい。
[0071] ヒドロキシル基を有する化合物 (すなわちヒドロキシル基含有化合物）には、親水性 基として例えば、ヒドロキシル基、ポリオール基、ポリアルキレングリコールエーテル基
、またはポリオール Zポリダリコールエーテル基などの組み合わせを、有する化合物 が含まれる。実際に溶解助剤として使用できるヒドロキシル基含有ィ匕合物としては、リ ン脂質、コレステロールなどの脂質膜成分と親和性を示し、これらと充分混合するも のが望ましい。さらに、脂質膜成分を極性の液化二酸化炭素中に良好に分散させ、 溶解させるためには、適度の親水性と疎水性を兼ね備えた両親媒性のものが好適で ある。 [0072] 上記のヒドロキシル基を有する化合物において、さらに残存する溶解助剤の毒性を も懸念する場合には、安全性の観点から、低級アルコールなどを用いないことが望ま しい。したがって、効力および安全性を考慮してより好ましい溶解助剤は、ポリエチレ ングリコールまたはポリエチレングリコール基を有する化合物である。ポリエチレンダリ コール基を有する化合物として、具体的にはポリエチレングリコール基を有する脂質 、例えば PEG—リン脂質が好ましい。そのォキシエチレン単位が 10〜3500、好ましく は 100〜2000のポリエチレングリコールが適する。
[0073] このようなヒドロキシル基を有する化合物を 1種または 2種以上併用することは、内包 率を向上させるために望ましい。ヒドロキシル基を有する化合物を、超臨界状態もしく は亜臨界状態にする二酸ィ匕炭素の 0.01〜1質量％、好ましくは、 0.1〜0.8質量％の 割合で溶解助剤として使用するのがよい。ヒドロキシル基を有する化合物が、ポリエ チレングリコール基を有する脂質である場合、リン脂質 (PEG-リン脂質を含まず) /ポ リエチレングリコール基を有する脂質のモル比が 100/5〜100/25、好ましくは 100/5〜 100/ 10である。
[0074] 溶解助剤としてエタノールなどを用いる従来の超臨界二酸ィ匕炭素法では、エタノー ルが、超臨界二酸化炭素中へ脂質類が溶解もしくは分散することを促進する。その 結果、コレステロールとリン脂質などを含有する二酸ィ匕炭素領域と、主に PEG化リン 脂質および水溶性薬剤を含有する水の領域からなる 2相系を形成し、これが撹拌さ れると超臨界二酸ィ匕炭素の乳化が進行し、脂質のミセルが形成される。最終的には 、 1枚膜の脂質膜を有するリボソームが主として調製されて 、る。
[0075] これに対し本発明の方法では、リボソーム膜構成成分としてのポリエチレングリコー ル基を有する脂質 (例えば PEG—リン脂質)が、エタノールなどの溶解助剤に代わつ て乳化促進作用をする。水溶性薬剤および PEG化リン脂質が水相に溶解もしくは分 散して水の表面張力を下げるとともに、リン脂質およびコレステロールなどが集まった 脂質相もまた形成され、脂質類をほとんど含まない超臨界二酸ィ匕炭素の相との 3相 系の状態となる。撹拌により超臨界二酸ィ匕炭素の乳化が進行するが、界面を従来法 よりも多く形成することとなり、そうした多数の界面に脂質が配列して脂質単膜を形成 する。特に脂質量を多くして上記の強撹拌を行なう条件下では、ミセルが均一で小さ いものが多数生成する。
[0076] 結局、エタノールなどが存在してもしなくとも、超臨界二酸化炭素の乳化が起きて脂 質ミセルが形成される点では同じであるが、強撹拌を行なう本発明の方法では、均一 な微小ミセルが効率的に形成されるため、その後の二酸ィ匕炭素の排出によって誘発 される、脂質単膜から脂質二分子膜の形成の過程において、水溶性薬剤の内包率 は、例えば 17%から 21%へと高くなる。エタノールなどを用いる従来の超臨界二酸ィ匕 炭素法では、主に 1枚膜リボソームが形成されるのに対し、本発明の方法では、脂質 量を増やしたので 2枚膜から 10枚膜までの多重膜リボソームを主体に形成される。こ のように、脂質量、撹拌条件および溶解助剤を変更することにより、内包率の向上と、 生成したリボソームの形態が異なることが注目される。さらに驚くべきことにこのような 多重膜リボソームにおいては、整粒工程で再び内包率の上昇が観察され、膜の再構 成が起きて 、ることが示唆される。
[0077] 本発明の製造方法で使用する超臨界状態 (亜臨界状態を含む)の二酸化炭素の 温度は、一般には 32〜70°Cに設定される力 好ましくは 32〜65°C、より好ましくは 45 〜65°Cである。リボソーム膜構成成分に転移温度を有するリン脂質が含まれる場合、 「転移温度 + 10°C」以下、好ましくは「転移温度 + 5°C」以下、さらに好ましくは「ほぼ 転移温度」となるように設定することが望ましい。従来は、リン脂質の転移温度よりも高 い温度に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となって流動性が高まり 、リン脂質が超臨界二酸ィ匕炭素と効率良く混合されるとして、リボソームの調製が 50 〜80°Cで行われていた。しかし本発明者らは、超臨界状態の二酸化炭素の温度を、 上記のようにリン脂質の転移温度付近であっても、リン脂質に過度の熱が力からない ため変性することがなぐさらにリン脂質が規則的に配列してリボソーム膜が生成され ることを見出した。乳化促進のために強撹拌の操作を行なう状況下では、局所的過 熱を軽減する意味からも上記の温度範囲を採用することが望ましい。また、上記温度 範囲において適宜選択されるが、超臨界状態の二酸ィ匕炭素の好適な圧力は、 5〜50 MPa、好ましくは 10〜30 MPaである。
'第 3工程
第 3工程では、リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素と、薬剤水溶液とを充 分に混合した後に、系内に必要であれば水を加えて、圧力容器内を減圧する。この 混合溶液力ゝらニ酸ィ匕炭素を排出することにより、水溶性薬剤などが内包されたリポソ ームの水性分散液が調製される。この過程でリボソームは水相に転相していると推定 されるため、二酸ィ匕炭素を排出するだけで、水溶性薬剤を内包するリボソームが分散 している水性分散液が生成する。リボソーム内部にも上記水溶液が封入されているた め、水溶性薬剤はリボソームの外部水相のほかにリボソーム内部の水相に存在し、「 内包」の状態にある。
前記第 3工程で得られたリボソームの水性分散液を、該リボソーム膜構成成分のリ ン脂質の転移温度〜 (該転移温度 + 10) °Cで、 0.1〜3時間、好ましくは 10〜60分間、 インキュベートしてもよい。上記条件でのインキュベーションを行なうことにより、例え ば、凝集して塊状になったリボソームの離反、分散が促される。このような追加操作を 行なうことにより、その後に行なわれる第 4工程の加圧ろ過処理の間に、流動性が増 した脂質分子の脂質膜内での再配置が起こって、安定な膜構造が形成されるととも に水溶性薬剤の内包が促進される。
'第 4工程
リボソームの粒径の調整は、処方またはプロセス条件を変更することにより行なうこ とができる。例えば、上記の超臨界状態の圧力を大きくすると形成されるリボソームの 粒径は小さくなる。作製するリボソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリ カーボネート膜、セルロース系の膜などでろ過してもよい。第 4工程では、圧力容器 内を空気などの導入により大気圧に調整すること (第 3工程）により得られたリボソーム の水性分散液を、 0.1〜1.0 ;ζ πιの孔径を有する複数のろ過膜を通す。このろ過膜とし ては、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができ、孔 径は大きいものから小さいものへと順次小さくしていくことが好ましぐ最終的には 0.05 〜0.4 /ζ πι、好ましくは0.1〜0.4 111、さらに好ましくは 0.15〜0.2 mの範囲まで孔径 を小さくしていくことが望ましい。加圧押出しろ過の操作は、 50〜90°C、好ましくは 55 〜85°Cで、 0.01〜1.0MPa、好ましくは 0.01〜0.8MPaの圧力下で行なわれる。リン脂 質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となり、流 動性が高まる。本発明の製造方法において、リボソームを構成する脂質膜のリン脂質 類には、転移温度を有するリン脂質が少なくとも含まれているため、水溶性薬剤を封 入した比較的粘度の高いリボソーム分散液であっても、フィルターの目詰まりを起こ すことなく粒径の揃ったリボソームを作製することができる。
整粒のための操作は、例えばろ過膜として 0.1〜1 μ mの孔径のフィルターを装着し た静圧式押出装置に通すことにより行われる。各種の静圧式押出装置、例えば「エタ ストルーダ」（商品名、 日油リボソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイ エンス製)などを使用して、フィルターを強制的に通過させる。静圧式押出装置に通 すことにより、粒径分布が狭い範囲に揃ったリボソームを効率よく調製することができ る。さらに小さい平均粒径に揃えるには、 0.45 mなどのフィルターでろ過する。加圧 ろ過操作は、必要であれば繰り返し実施される。この押出しろ過法については、例え ば Biochim.
Biophys.Acta 557卷, 9ページ (1979)に記載されている。このような「押出し」操作を取 り入れることにより、本発明者らは上記サイジングに加えて、水溶性薬剤の内包率が 上昇することを見出した。第 1工程において脂質量を通常よりも多く使用した場合、形 成されるリボソームは既に報告されているような 1枚膜 (非特許文献 1)ではなく多重層 膜が多い。上記の加圧押出し操作により、多重層膜からなるリボソームにおいても、 外層のはがれやすい膜が脱落するとともに脂質膜の再構成を含む膜構造の再構築 および整粒ィ匕が起きて、 2枚〜 10枚膜からなるリボソームが生成しているためと推測さ れる。さらにこのような処理を行うことにより、実質的にエタノールなどの有機溶媒系の 溶解助剤を用いなくても、封入物質のリボソーム内への内包率が向上するとともに、リ ポソームを微細粒子化することができる。さらに、残存する溶解助剤により膜強度が 低下するおそれもないため、リボソームの保存安定性に優れる。内包率の上昇の他 に、リボソーム外に存在する水溶性薬剤の濃度の調整、リボソーム分散液の交換、望 ましくない物質の除去も併せて可能になるという利点もある。なお、必要であれば上 記孔径のろ過膜でろ過する前に、 1.0〜2.0 /ζ πι程度のろ過膜でろ過し、サイジングゃ 、望ましくない物質の除去を予備的に行ってもよい。
•濃縮工程
本工程は、形成されたリボソームを含有する濾過液を濃縮する工程である。リポソ一 ムの水性分散液を上記のようにろ過膜でろ過し、必要に応じてさらに限外ろ過、遠心 分離、ゲルろ過などの方法により、リボソーム内に内包されな力つた薬剤を除去して 精製してもよい。本発明の方法では、水溶性薬剤が内包されたリボソームの水性分 散液を前記の第 3工程または第 4工程の後に、限外ろ過を行なうことにより濃縮するこ とが好ましい。
[0080] 限外ろ過は、通常の限外ろ過膜および装置を使用して行なうことができる。限外ろ 過膜として、アクリル-トリル共重合体、芳香族ナイロン、ポリサルホン、ポリフッ化ビ- リデン、ポリエーテルサルホン、ポリイミドなどの榭脂からなる膜が利用できる。これら の限外ろ過膜のカットオフ分子量は、 10,000〜20,000が望ましい。限外ろ過の操作は 、 20〜30°C、好ましくは 25°Cで、 0.01〜0.5MPa、好ましくは 0.1〜0.45MPaの圧力下 、下で回収するデッドエンドのろ過方式力、またはクロス ·フローのろ過方式で行なう。 あるいは迅速で行なえる力 処理容量が極めて少な!/ヽ場合に好都合な遠心操作で ろ過を促進する遠心式限外ろ過であってもよ 、。
[0081] 本発明による製造方法では、これらのろ過操作を行なうことにより、水溶性薬剤のリ ポソームへの内包率 (すなわち、水溶性薬剤全量に対するリボソームに内包される水 溶性薬剤の比率)を 25〜35%まで上昇させることができる。限外ろ過による濃縮で、リ ポソーム外にある水溶性薬剤は、塩類、水性媒体などともに限外ろ過膜の二次側に 移行する。これに対し、高分子のために膜を透過しないリボソームを含有している水 性媒体においては、水溶性薬剤の濃度は減少し、反対にリボソームの濃度が上昇す る。結局、リボソーム内に内包されている水溶性薬剤は、リボソーム膜内にそのまま保 持されているために、内包率は増大することとなる。
[0082] 限外ろ過法による濃縮を第 3工程の後に実施してもよぐこの場合には続いて行な われるエタストルーダなどを用いる、第 4工程となる押出しろ過のための濃縮操作の 意味をもつ。そうした中間的な濃縮をする場合にも第 4工程の後に再び限外ろ過を 実施することとなる。また所定のリボソーム濃度となるまで限外ろ過法により濃縮し、さ らに通常使用される希釈剤等の製剤補助剤を適宜混合して、リボソーム、薬剤、製剤 助剤のそれぞれの濃度について最終的な調整をさらに行なってもよい。また、リポソ ームの水性分散液を濃縮して容量を減らして力 リボソームを凍結乾燥させて、粉末 形態のリボソームを効率よく得ることもできる。リボソームを凍結乾燥した場合には、使 用直前に水性媒体などで再懸濁させて用 、る。
[0083] さらに前記限外ろ過の後、 115〜140°C、好ましくは 118〜125°C、より好ましくは 121 °Cで蒸気滅菌してもよい。これによつて無菌調製品が得られ、包装工程に移される。
[0084] 本発明の方法により製造されるリボソームは、実質的に 2枚膜〜 10枚膜、好ましくは 2枚膜〜数枚膜 (例えば 3枚、 4枚、 5枚または 6枚の膜)力もなるリボソームである。こ のようなリボソームは、上記工程 (i)〜(v)による製造方法において主成分として生成 する。「実質的に」とは、本発明のリボソーム含有製剤において、 2枚から 10枚の膜で 構成されるリボソームを、製剤中に含まれる全リボソームのうち、少なくとも 70%、好ま しくは少なくとも 80%を占めることを意味し、 80〜98%含むことがより好ましい。
[0085] これに対して 1枚膜のリボソームは、リン脂質二重層が一層としてなる膜 (unilamellar vesicle)で構成されるリボソームである。これは凍結かつ断（Freeze fracture )レプリ 力法による透過型電子顕微鏡 (TEM)による観察において、レプリカが概ね 1つの層 として認められるリン脂質二重層により構成されているものである。すなわち、観察し たカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものが 1枚膜と判定され、 2つ 以上の段差が認められるものは「多重層膜」と判定される。 2枚もしくは 3枚の膜で構 成されるリボソームは、 1枚膜リボソームよりも強度が増しており、上記の第 4工程で実 施される整粒処理でも壊れな ヽ。
[0086] 1枚膜リボソームは、脂質膜成分の溶媒として超臨界二酸化炭素を使用し、水によ る相分離方式により生成することが知られ、特にエタノールを溶解助剤として用いると 、効率よく作製できる。これに対して従来の Bangham法や逆相蒸発法 (REV法)などに よるリボソーム作製方法によると、様々なサイズ、形態の多重層膜 (multilamellar vesic les; ML V)からなるリボソームがかなりの割合で存在することが多い。 1枚膜または数 枚膜のリボソームは、 MLVと比較して、リボソームの投与量、換言すると投与脂質量 が大きくならな 、と 、う利点もある。
[0087] リボソーム膜の脂質膜枚数が少ない数枚膜のリボソーム、特に粒径の大きい 1枚膜 リボソームである LUV (Large unilamellar vesicles)は、多重層膜リボソームに比べて、 大きい内包容量を提供するという利点がある。反面、水溶性薬剤の内包率が良好な 1枚膜または数枚膜のリボソームでも、内包する化合物の質量が相対的に多過ぎると リボソームの安定性は低下する。特にイオン強度の急激な変化には脆弱である傾向 が観察されていた。本発明の製剤に使用するリボソームの作製では、 2枚膜〜 10枚 膜構造のリボソーム、好ましくは数枚膜リボソームが効率よく形成されるように超臨界 二酸ィ匕炭素法およびその後の整粒工程を改良している。さらにリボソーム膜にポリア ルキレンォキシド基を有する化合物（例えばリン脂質）、ステロール類、グリコールなど を含有させて、脂質膜の安定ィ匕を図っている。その結果、作製されたリボソームは、 塩ショックに対しても安定的であることが判明した。
[0088] リボソーム含有製剤の製造
本発明のリボソーム含有製剤は、上記リボソームを含み、さらに 1種類以上の生理 的に許容され得る製剤助剤を用いて、当業界において公知の技術により製造するこ とができる。本発明の製剤は、リボソームの脂質膜内部の水相およびリボソームを懸 濁する水性媒体中に製剤助剤を含有している。この製剤助剤は、リボソームの製剤 化に際し、水溶性薬剤とともに添加される物質であり、これまでの製剤製造技術に基 づ 、て各種の物質が必要に応じて使用される。具体的には生理学的に許容される 各種の緩衝剤、 EDTANa—Ca、 EDTANaなどといったェデト酸系のキレート化剤
2 2
、無機塩類、薬理的活性物質 (例えば血管拡張剤、凝固抑制剤など)、さらには浸透 圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤（例えば α -トコフ ロール、ァスコルビン酸）、粘度 調節剤、保存剤なども挙げられる。好ましくは、アミン系緩衝剤およびキレート化剤を ともに含めるのがよい。 ρΗ緩衝剤として、水溶性アミン系緩衝剤および炭酸塩系緩 衝剤が好ましく用いられる。特に好ましくはァミン系緩衝剤であり、中でもトロメタモー ルが望ましい。キレートイ匕剤は好ましくは、 EDTANa—Ca (ェデト酸カルシウム 2ナト
2
リウム)である。
[0089] また、「水性媒体」とは、水溶性薬剤もしくは非イオン型ョウド系化合物、製剤助剤な どを溶解もしくは懸濁する水をベースとする溶媒である。その水は、滅菌した発熱物 質を含まない水を使用する。リボソーム脂質膜内部の水相以外の水溶液 (すなわち 該リボソームを懸濁する水性媒体）にも上記の水溶性薬剤および製剤助剤が含まれ ている場合、より好ましくは、脂質膜内外の水相に水溶性薬剤が実質的に同一の濃 度で含有されている態様であり、そうした場合には該膜内外で著しい浸透圧差が生 じることはなぐリボソームの構造安定性が保たれる。貯蔵期間中でもリボソームの浸 透圧効果による不安定ィ匕を防止でき、リボソーム内における水溶性薬剤の保持安定 性は向上する。
[0090] 上記溶液もしくは懸濁液の好ましい pH範囲は、室温で 6.5〜8.5、さらに好ましくは 6 .8〜7.8である。造影物質が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場 合、好ましい緩衝液は、米国特許第 4278654号に記載されているような負の温度係数 を有する緩衝液である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、 好ましくはトリス (TRIS)である。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低い pH を有し、このことがオートクレープ中のリボソーム含有製剤の安定性を増し、他方、室 温では生理的に許容される pHに戻る。したがって、注射用無菌製剤を製造するため に、リボソーム調製物をオートクレープ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定 性なども確保できる。本発明の製剤は、好ましくは滅菌した形態として上巿される。そ の場合、滅菌ろ過、オートクレープ滅菌、または加熱滅菌により無菌製剤を得る。
[0091] 本発明において、水溶性薬剤の内包効率および内包の安定性に加えてリボソーム の膜脂質の質量も考慮されねばならない。リボソームの膜脂質の質量が多くなると製 剤の粘度が大きくなる。リボソーム内への薬剤の封入量として、リボソーム内に封入さ れた水溶液中に、全薬剤 (非イオン型ョウド系化合物および製剤助剤を含む）がリポ ソーム膜脂質に対して、 1〜8、好ましくは 3〜8、より好ましくは 5〜8の質量比（g/g)で 含有されていることが望ましい。リボソーム内に内包された全薬剤の質量比が 1未満 であると、比較的多量の脂質を含有することとなり、製剤の粘度は増大し、結果的に 薬剤の送達効率が悪くなる。 1枚膜もしくは数枚膜のリボソームは、内包容積および 送達効率に優れるため有利である。反対に、リボソーム膜脂質に対する全薬剤の封 入質量比が 8を超えると、リボソームは構造的にも不安定となり、リボソーム膜外への 薬剤の拡散、漏出は、貯蔵中または生体内に注入された後でも避けられない。
[0092] X線造影剤
本発明による製造方法で得られるリボソーム含有製剤は、本発明の範囲内にある。 本発明のリボソーム含有製剤の好ま 、態様は、水溶性薬剤が非イオン型ョウド系 化合物であり、かつ、 1種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有し、 X線造影 剤として用いられるリボソーム含有製剤である。その濃度は、撮像の目的、部位、造 影剤中の化合物の性質、および患者の状態に依存し、必要に応じて調節することが できる。また X線造影剤の至適投与量は上記条件を勘案して個々に設定するのが通 例である。このためリボソーム内外のヨウド系化合物の総量力 従来の投与量と同程 度になるようにしてもよい。余りに高濃度の溶液とすると、リボソーム同士の凝集、粘 度の増大という不都合な事態も起こり得る。本発明の X線造影剤は、ョウド含有量とし て、通常、想定される 10〜300mLの製剤溶液の投与量では、 40〜450mglZmLであり 、好ましくは 70〜400mglZmL、リボソーム内への造影物質を内包する効率の観点か らは 100〜350mglZmL、特に好ましくは、 150〜300mglZmLの範囲である。また、前 記脂質膜内外の水相に、ヨウド系化合物および製剤助剤がそれぞれ実質的に同一 の濃度で含有されることが好まし 、。
[0093] 本発明の X線造影剤における全脂質の含有量は、 20〜100 mg/mL造影剤、好ま しくは 20〜80 mg/mL造影剤である。この場合の「全脂質」とは、リボソームを構成す るリン脂質、ステロール、グリコールといったすベての種類の脂質類を含める意味で ある。そうした全脂質は、造影剤に含まれるリボソームの量と概ね見なしてもよい。リポ ノームの形態には種々あるために、全脂質量は単純にリボソームの数には対応しな い。本発明による製造方法によれば、リボソームの形成が効率的に行われ、ある量ま では脂質量を多くするほど内包率も増加する傾向にあった。
[0094] 本発明の X線造影剤は、全身投与または局所投与いずれにも使用される。好ましく は注射剤または点滴注入剤として全身的に静注投与される。直接投与ができない部 位へ局所的に投与する場合は、例えばカテーテルまたは他の適当な薬物送達シス テムなどを用いて、当業界で公知の技術により投与を行うことができる。注入抵抗を 少なくして患者の苦痛を軽減し、血管外漏出の危険を回避するため、本発明のリポソ ーム分散液の粘度 (ォストワルド法で測定した場合）は、 37°Cで、 30 mPa' s以下、好 ましくは 25 mPa' s以下、である。このような範囲内では実用上問題ないとされる（特許 文献 1)。また X線造影剤の浸透圧モル濃度は、典型的には 250〜500 mosmol/L,好 ましくは 290〜350 mosmol/Lである。投与する造影剤のォスモル濃度が高いと、心臓 •循環系の負担が大きい。血液と等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提 供する濃度で、造影剤を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。例えば造影物質の溶解 性が低 、ために造影物質だけでは等張液を提供できな 、場合、等張の溶液もしくは 懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、例えば塩ィ匕ナトリウムのごとき 塩類、マン-トール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添カロし てもよい。
実施例
本発明を以下の実施例によって、具体的に説明する。実施例は実例を挙げて説明 しょうとするものであり、本発明の範囲を何ら限定しょうとする意図のものではない。
[実施例 1]
ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC) 340.2mgと、コレステロール 147.4mg、 PE G—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mgの混合物 をステンレス製の特製オートクレープに仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gをカロえ、 33°C、 12MPaの超臨界状態にした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶 液（日局ィォパミドール溶液（ョウド濃度 300mgI/mL)、トロメタモールを lmg/mL、ェデ ト酸カルシウム 2ナトリウム 0.1mg/mLを含有）、 10mLを定量ポンプで連続的に注入し た。注入終了後、系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポ ソーム分散液を得た。
[実施例 2]
ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC) 396.6mgと、コレステロール 147.4mg、 P EG—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mgの混合 物をステンレス製の特製オートクレープに仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gをカロえ 、 65°C、 12MPaの超臨界状態にした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶 液（日局ィォへキソール（ョウド濃度 300mgI/mL)、トロメタモールを lmg/mL、ェデト酸 カルシウム 2ナトリウム O.lmg/mLを含有）、 10mLを定量ポンプで連続的に注入した。 注入終了後、系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソ一 ム分散液を得た。
[実施例 3] ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 368.4mgと、コレステロール 147.4mg、 PE G—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mgの混合物 をステンレス製の特製オートクレープに仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gをカロえ、 50°C、 12MPaの超臨界状態にした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶 液（日局ィォへキソール（ョウド濃度 300mgI/mL)、トロメタモールを lmg/mL、ェデト酸 カルシウム 2ナトリウム O.lmg/mLを含有）、 lOmLを定量ポンプで連続的に注入した。 注入終了後、系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソ一 ム分散液を得た。得られた分散液を 80°Cまで加熱し、アドバンテック社製のポリカー ボネート'フィルター、 0.8 mおよび 0.4 mを用いた静圧式押出装置で加圧濾過し て造影剤溶液を含有するリボソーム分散液を得た。
[実施例 4]
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 368.4mgと、コレステロール 147.4mg、 PE G—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mgの混合物 をステンレス製の特製オートクレープに仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gをカロえ、 50°C、 12MPaの超臨界状態にした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶 液（日局ィォへキソール（ョウド濃度 150mgI/mL)、トロメタモールを lmg/mL、ェデト酸 カルシウム 2ナトリウム O.lmg/mLを含有）、 lOmLを定量ポンプで連続的に注入した。 注入終了後、系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、分散液を得た。
得られた分散液を 80°Cまで加熱し、実施例 3と同様にしてアドバンテック社製のポリ カーボネート'フィルター、 0.8 mおよび 0.4 mで加圧濾過して造影剤溶液を含有 するリボソーム分散液を得た。この分散液に対して、ウルトラフィルター（アドバンテツ ク社製、分画分子量 20,000)を用いて限外濾過することにより濃縮されたリボソーム分 散液を得た。
[実施例 5]
ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC) 396.6mgと、コレステロール 147.4mg、 P EG—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mg、およ び造影剤溶液（日局ィオメプロール（ョウド濃度 300mgI/mL)、トロメタモールを lmg/m L、ェデト酸カルシウム 2ナトリウム O.lmg/mLを含有）、 lOmLをステンレス製の特製ォ 一トクレーブに仕込み、よく混合し懸濁液を得た。次いで容器内を撹拌しながら、液 体二酸ィ匕炭素 13gを加え、 60°C、 12MPaの超臨界状態とした。二酸化炭素注入後、 系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、分散液を得た。
[0097] 得られた分散液を 80°Cまで加熱し、実施例 3と同様にしてアドバンテック社製のポリ カーボネート'フィルター、 0.8 mおよび 0.4 mで加圧濾過して造影剤溶液を含有 するリボソーム分散液を得た。この分散液を、 45°Cで 1時間インキュベートし、目的の リボソーム分散液を得た。 [比較例 1]
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 368.4mgと、コレステロール 147.4mg、 PE G—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mgの混合物 をクロ口ホルムとエタノールと水との混合物（重量比 100 : 20 : 0.1) 10mLをメスフラスコ 中で混合した。この混合物を湯浴 (65°C)上で加熱し、溶液をロータリーエバポレータ で溶媒を蒸発させた。残渣をさらに 2時間、真空乾燥して、脂質フィルムを形成させた 。ここに、さらに造影剤溶液（日局ィォパミドール:ョウド濃度 300mgI/mL) 10mLを混合 し、この混合物を 50°Cに加熱しながらミキサーで約 10分間撹拌した。さらに撹拌する ことにより造影剤溶液を含有するリボソームの分散液を得た。この混合物を 80°Cまで 加熱し、実施例 3と同様にしてアドバンテック社製のポリカーボネート'フィルター、 0.8 μ mおよび 0.4 mで加圧濾過してリボソーム含有造影剤を得た。
[比較例 2]
ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC) 340.2mgと、コレステロール 147.4mg、 PE G—リン脂質（日本油脂株式会社製、 SUNBRIGHT DSPE- 020CN) 111.5mgの混合物 をステンレス製の特製オートクレープに仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gをカロえ、 70°C、 12MPaの超臨界状態にした。次いで容器内を撹拌しながら、さらに造影剤溶 液（日局ィォパミドール溶液（ョウド濃度 300mgI/mL)、トロメタモールを lmg/mL、ェデ ト酸カルシウム 2ナトリウム O.lmg/mLを含有）、 10mLを定量ポンプで連続的に注入し た。注入終了後、系内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポ ノームの分散液を得た。
[0098] [表 1] 容器温度 内包率平均粒径 多分散 リ ン脂質 ェクス トルーダ * *
(。c ) ( % ) ( m) 指数 実施例 1 DMPC 33 なし 16 1 .213 0.830 実施例 2 DSPC 65 なし 19 0.948 0.435 実施例 3 DPPC 50 あり 24 0.274 0.051 実施例 4 DPPC 50 あり 34 0.271 0.066 実施例 5 DSPC 60 あり 17 0.298 0.013 比較例 1 * DPPC 50 あり 5 0.585 0.189 比較例 2 DMPC 70 なし 3 1 .346 0.933
*バンガム法による * *加圧濾過の使用 [評価]
<リボソームの平均粒径および多分散指数 >
粒径 (粒子径)および多分散指数は、水溶性薬剤を内包するリボソームを含む分散 液を、動的光散乱粒径測定器 (シスメッタス社、 Malvem HPPS)を用いて、 25°Cの条 件下で測定した。粒径は z平均による平均粒子サイズを示す。多分散指数は多分散 度を示し、多分散指数力 に近いほど、その粒度分布が単分散であることを示す。

Claims

請求の範囲
[1] (i)圧力容器内で 32〜65°Cの下、リボソーム膜構成成分と超臨界二酸化炭素とを混 合して懸濁液を得る第 1工程と、
(ii)次いで、該懸濁液に薬剤水溶液を添加して混合する第 2工程と、ならびに
(iii)その後、該圧力容器内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出することにより、該水溶性薬 剤が内包されたリボソームの水性分散液を調製する第 3工程と、を有し、該リボソーム 膜構成成分には、少なくとも転移温度を有するリン脂質が含まれることを特徴とするリ ポソーム含有製剤の製造方法。
[2] (i)リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合することにより得られた懸濁液を収容 している圧力容器内に、液ィ匕ニ酸ィ匕炭素を供給する第 1工程と、
(ii)次いで、前記の懸濁液と液ィ匕ニ酸ィ匕炭素とを混合しながら、該圧力容器内を 32 〜65°Cの下、加圧して液化二酸化炭素を超臨界二酸化炭素とする第 2工程と、なら びに
(iii)その後、該圧力容器内を減圧して二酸ィ匕炭素を排出することにより、該水溶性薬 剤が内包されたリボソームの水性分散液を調製する第 3工程と、を有し、該リボソーム 膜構成成分には、少なくとも転移温度を有するリン脂質が含まれることを特徴とするリ ポソーム含有製剤の製造方法。
[3] 前記の第 3工程の後で、 0.1-1 μ mの孔径を有するろ過膜を装着した静圧式押出 装置を用いて、 50〜90°C、 0.01〜0.8MPaの圧力下で、該水溶性薬剤が内包された リボソームの水性分散液をろ過して、平均粒径が 0.05〜0.8 μ mのリボソームに整粒 する第 4工程をさらに有することを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2項に記載 のリボソーム含有製剤の製造方法。
[4] 前記の第 3工程または第 4工程の後、該水溶性薬剤が内包されたリボソームの水性 分散液を、限外ろ過を行なうことにより濃縮する工程を有することを特徴とする請求の 範囲第 3項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。
[5] 前記のろ過により、水溶性薬剤のリボソームへの内包率を 25〜35%まで上昇させる ことを特徴とする請求の範囲第 4項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。
[6] 前記限外ろ過の後、 115〜140°Cで蒸気滅菌することを特徴とする請求の範囲第 4 項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。
[7] 前記第 3工程の後、該リボソーム膜構成成分のリン脂質の転移温度〜該転移温度
+ 10°Cで、 0.1〜3時間インキュベートすることを特徴とする請求の範囲第 1項または 第 2項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。
[8] 前記リボソーム膜内外の水相における水溶性薬剤の濃度が実質的に同じであるこ とを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか 1項に記載のリボソーム含有 製剤の製造方法。
[9] 前記懸濁液が、リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合して調製され、次!、で 圧力容器内に供給された懸濁液であることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の リボソーム含有製剤の製造方法。
[10] 前記の転移温度が、 22〜60°Cの範囲にあることを特徴とする請求の範囲第 1項また は第 2項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。
[11] 前記の工程により作製されたリボソームのうち、その脂質膜が 2〜10枚膜で構成さ れるリボソームが少なくとも 70%を占めていることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至 第 10項のいずれか 1項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。
[12] 前記リボソーム膜構成成分として、少なくともリン脂質、カチオン性脂質、ポリエチレ ングリコール (PEG)基を有する脂質およびステロール類を含む脂質を含み、リン脂 質 (PEG-リン脂質を含まず) /ステロール類のモル比が 100/60〜100/90、リン脂質（ PEG-リン脂質を含まず) /ポリエチレングリコール基を有する脂質のモル比が 100/5 〜100/25であることを特徴とする請求の範囲第 11項に記載のリボソーム含有製剤の 製造方法。
[13] 請求の範囲第 1項乃至第 12項のいずれ力 1項に記載された製造方法で得られるこ とを特徴とするリボソーム含有製剤。
[14] 水溶性薬剤が、非イオン型ョウド系化合物および 1種類以上の生理的に許容される 製剤助剤であり、 X線造影剤として用いられることを特徴とする請求の範囲第 13項に 記載のリボソーム含有製剤。
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