TW201119673A - Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof - Google Patents

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TW201119673A
TW201119673A TW099129545A TW99129545A TW201119673A TW 201119673 A TW201119673 A TW 201119673A TW 099129545 A TW099129545 A TW 099129545A TW 99129545 A TW99129545 A TW 99129545A TW 201119673 A TW201119673 A TW 201119673A
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TW
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disease
antibody
antigen
binding protein
seq
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TW099129545A
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Tariq Ghayur
jun-jian Liu
Sharmila Manoj
Susan E Brophy
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Abbott Lab
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Publication date
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Description

201119673 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於結合至預防性或治療性藥劑之多價及多特 繼合蛋白、其製備方法，且特定言之係關於其用於診 斷、預防及/或治療急性及慢性發炎佐 &人疾病、癌症及其他疾 病之用途。 本申請案主張2009年9月la申請之美國臨時專利申請案 第6^238,908號及2009年10月15日申請之美國臨時專^申 請案第6W25U946號之優先權’其出於任何目的以全文引 用的方式明確併入本文中。 【先前技術】 此項技術中已知經工程改造蛋白質，諸如結合兩個或兩 個以上抗原之多特異性抗體。該等多特異性結合蛋白可使 用細胞融合、化學結合或重組DN A技術產生。 已使用四源雜交瘤技術（參看Milstein，C.及Cuello，A.C (1983) Nature 305(5934): 537-40)基於表現具有雙特異性抗 體之所需特異性之鼠類單株抗體（mAb)的兩種不同融合瘤 細胞株之體細胞融合產生雙特異性抗體。因為所得雜交融 合瘤（或四源雜交瘤）細胞株内兩種不同免疫球蛋白（Ig)重 鏈及輕鏈隨機配對，所以產生多達1 〇種不同Ig種類，其中 僅一者為功能性雙特異性抗體。錯配副產物之存在及產率 顯著降低意謂需完善純化程序。 亦可藉由使兩種不同mAb化學結合來產生雙特異性抗體 (參看 Staerz，U.D.等人，（1985) Nature 314(6012): 628-150428.doc 201119673 31)。此方法不產生同質製劑。其他方法已使用使兩種不 同mAb或較小抗體片段化學結合（參看Brennan，M等人， (1985) Science 229(4708): 81-3)。 用於產生雙特異性抗體之另一方法為將兩個親本抗體用 異雙功能交聯劑偶合，但所得雙特異性抗體具有顯著分子 異質性’因為交聯劑與親本抗體的反應並非定點反應。為 獲得更具同質性之雙特異性抗體製劑，已使兩個不同Fab 片段在其鉸鏈半胱胺酸殘基處以定點方式化學交聯（參看
Glennie，M.J.等人，（1987) J· Immunol. 139(7): 2367-75)。 但此方法產生Fab，2片段，而非完全IgG分子。 已開發出多種其他重組雙特異性抗體形式（參看
Kriangkum，J.等人，（2001) Biomol. Engin. 18(2): 31-40)。 其中’串聯單鏈Fv分子及雙功能抗體（diab〇dies)、及其多 種衍生物最為廣泛使用。慣常自兩個識別不同抗原的單鏈
Fv(scFv)片段開始建構此等分子（參看Economjdes，a.N.等 人，（2003) Nat. Med. 9(1): 47-52)。串聯scFv 分子（taFv)表 示以另一肽連接子簡單連接兩個scFv*子的直接形式。此 等串聯scFv分子中存在的兩個scFv片段形成單獨摺疊實 體。可使用多種連接子連接兩個scpv片段且連接子長度為 至多 63個殘基（參看 Nakanishi，K.等人，（2001) Ann. Rev. Immunol. 1 9: 423-74)。儘管親本scFv片段在細菌中通常可 以可浴形式表現’然而，通常觀測到串聯scFv分子在細菌 中形成不溶聚集體。因此，慣常應用再摺疊方案或使用哺 乳動物表現糸統產生可溶串聯SCFv分子。在最近研究中， 150428.doc 201119673 報導由轉殖基因兔及牛活體内表現針對CD28及黑素瘤相 關蛋白承糖之串聯scFv(參看Gracie, J.A.等人，（1999)】· Clin. Invest· 104(10): 1393-401)。在此構築體中，兩個 scFv分子由CH1連接子連接，且可見雙特異性抗體的血清 濃度尚達100 mg/L。使用多種策略，包括改變結構域順序 或使用具有不同長度或可撓性之中間連接子以允許在細菌 中可溶性表現。少數研究現已報導使用極短Ala3連接子或 φ 虽含甘胺酸/絲胺酸之長連接子在細菌中表現可溶串聯scFv 分子（參看 Leung，B.P.等人，（2000) j, Immun〇1 164(12): 0495-502 ; Ito, A.等人，（2003) j. Immun〇1 17〇(9): 48〇2_ 9 ; Kami, A.等人，（2002) j. Neur〇immun〇1 125(12): 134_ 4〇)。在最近研究中，使用含有長度為3或6個殘基的隨機 化中間連接子之串聯scFv譜系的噬菌體呈現，以增濃在細 菌中以可溶性或活性形式產生之彼等分子。此方法致使串 聯scFv分子與6個胺基酸殘基之連接子分離（參看Amdt，M • 及 Krauss，J. (2003) Methods Mol. Biol. 207: 3〇5_21)。不清 楚此連接子序列是否表示可溶性表現串聯scFv分子的通用 解決方案。然而，此研究證明串聯scFv分子之噬菌體呈現 與定向突變誘發之組合為增濃可以活性形式在細菌中表現 之此寻分子的有效工具。 雙特異性雙功能抗體（Db)利用雙功能抗體形式進行表 現。藉由使連接VH域與VL域之連接子長度減少至約5個殘 基’由scFv片段產生雙功能抗體（參看peipp, T. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-1 1)。此連接子 150428.doc 201119673 尺寸的減小便利於兩個多肽鏈藉由VH域與VL域交叉配對 進行二聚。藉由在同一細胞内表現兩個具有結構VHA-VLB 及 VHB-VLA(VH-VL 組態）或 VLA-VHB 及 VLB-VHA (VL-VH組態）之多肽鏈產生雙特異性雙功能抗體。過去已 產生多種不同雙特異性雙功能抗體，且其中多數在細菌中 以可溶性形式表現。然而，最近的比較研究證明，可變域 之取向可影響活性結合位點之表現及形成（參看Mack, M. 等人，（1995) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 92(15): 7021-5)。 然而，細菌中之可溶性表現代表優於串聯scFv分子的重要 優勢。然而，因為單個細胞内表現兩種不同多肽鏈，所以 無活性均二聚體可與活性雜二聚體一起產生。此需要執行 其他純化步驟，以獲得雙特異性雙功能抗體的同質製劑。 一種迫使產生雙特異性雙功能抗體之方法為產生杵臼結構 (knob-into-hole)的雙功能抗體（參看Holliger, P_等人， (1993) Proc· Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-8.18)。此 方法已關於針對HER2及CD3之雙特異性雙功能抗體得以證 實。在抗HER2或抗CD3可變域中，藉由將Val37換為Phe且 Leu45換為Trp在VH域中引入大杵狀結構，且藉由使Phe98 突變為Met且Tyr87突變為Ala在VL域中產生互補之臼狀結 構。藉由使用此方法，雙特異性雙功能抗體之產量可自親 本雙功能抗體的72%增至杵臼結構雙功能抗體的超過 90°/。。重要的是，產品收得率僅由於此等突變而略微降 低。然而，關於所分析之若干構築體觀測到抗原結合活性 降低。因此，此相.當精細的方法需要分析多種構築體以鑑 150428.doc 201119673 別產生結合活性無改變之雜二聚分子的彼等突變。此外， 該方法需要突變修飾免疫球蛋白序列之恆定區，從而形成 抗體序列的非自然及非天然形式，此可導致免疫原性提 高、活體内穩定性差以及不良藥物動力學。 單鏈雙功能抗體（scDb)表示改良雙特異性雙功能抗體樣 分子之形成的替代策略（參看Holliger，P.及Winter，G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30 ； Wu, A.M.等人，（1996) Immunotechnology 2(1):第 21-36 頁）。 藉由以長度為約1 5個胺基酸殘基之其他中間連接子連接兩 個形成雙功能抗體之多肽鏈產生雙特異性單鏈雙功能抗 體。因此，分子量對應於單體單鏈雙功能抗體（50-60 kDa) 之所有分子均為雙特異性的。若干研究已證明，雙特異性 單鏈雙功能抗體以可溶性及活性形式表現於細菌中，其中 大多數經純化分子以單體形式存在（參看Holliger, P.及 Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4)： 128-30 ; Wu, A.M.等人，（1996) 11111111111〇16(：]111〇1.2(1):21-36 ; Pluckthun，A.及 Pack, P. (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105 ; Ridgway，J.B.等人，（1996) Protein Engin. 9(7): 6 1 7-2 1)。因此’單鏈雙功能抗體組合串聯scFv(所有單體 均為雙特異性）及雙功能抗體（在細菌中可溶性表現）之優 勢。 新近已將雙功能抗體融合於Fc產生更多Ig樣分子，即聯 雙功能抗體（參看 Lu, D_ 等人，（2004) J. Biol. Chem. 279(4): 2856-65)。此外’已描述在IgG重鏈中包含兩個Fab重複單 150428.doc 201119673 70且結合四個抗原分子的多價抗體構築體（參看wo 0177342A1 ^ ^Miller, Κ.#Λ, (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61) 〇 此項技術中需要結合兩個或兩個以上抗原的經改良多價 結合蛋白。美國專利第7,612，181號提供新颖結合蛋白家 私e亥等結合蛋白以高親和力結合兩個或兩個以上抗原且 稱為雙可變域免疫球蛋白（DVD-IgTM)。本發明進—步提 供結合兩個或兩個以上抗原之新穎結合蛋白。 【發明内容】 本發明係關於結合兩個或兩個以上抗原之多價結合蛋 白本發明&供以咼親和力結合兩個或兩個以上抗原之新 穎結合蛋白家族。 在—實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白，其 中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C_(X2)n，其中vm為第 —可變域，VD2為第二可變域，C為恆定域，幻表示胺基 S夂或夕肽，X2表示Fc區，且η為〇或1。在一實施例中，6士 、、、〇 合蛋白中之VD1及VD2為重鏈可變域。在另一實施例中， 重鏈可變域係選自由以下組成之群：鼠類重鏈可變域、人 類重鏈可變域、CDR移植重鏈可變域及人類化重鏈可 變域。在另一實施例中’ VD 1與VD2結合相同抗原。在 另—實施例中，VD1與VD2結合不同抗原。在另一實施 例中’ C為重鏈恆定域。舉例而言，X1為連接子，其限 制條件為XI不為CH1。舉例而言，XI為選自由以下組成 之群的連接子：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: i)； 15〇428.d〇c 201119673
AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP (SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8)； RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARY (SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) ； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23) ； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25) ； GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ; TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27);及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。在 一實施例中，X2為Fc區。在另一實施例中，X2為變異Fc 區。 在一實施例中，本文揭示之結合蛋白包含多肽鏈，其中 該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為第一 重鏈可變域，VD2為第二重鏈可變域，C為重鏈恒定域， XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1，且X2為Fc區。 在一實施例中，結合蛋白中之VD1及VD2為輕鏈可變 域。在一實施例中，輕鏈可變域係選自由以下組成之群： 150428.doc -9- 201119673 鼠類輕鏈可變域、人類輕鏈可變域、CDR移植輕鏈可變域 及人類化輕鏈可變域。在一實施例中，VD1與VD2結合相 同抗原。在另一實施例中，VD 1與VD2結合不同抗原。在 一實施例中，C為輕鏈恆定域。在另一實施例中，XI為連 接子，其限制條件為XI不為CL1。在一實施例中，XI為選 自由以下組成之群的連接子：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2)； AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP(SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6)； RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8) ; RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9) ; SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) ； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25) ； GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27) ； A ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。在 一實施例中，結合蛋白不包含X 2。 在一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈包含相同連接子。 150428.doc -10- 201119673 在另一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈包含不同連接子。 在另一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈皆包含短（約6個胺 基酸）連接子。在另一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈皆 包含長（大於6個胺基酸）連接子。在另一實施例中’可變二 鏈包含短連接子且可變輕鏈包含長連接子。在另一實施例 中，可變重鏈包含長連接子且可變輕鏈包含短連接子。 在貫施例中，本文揭示之結合蛋白包含多肽鏈，其中 該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為第一 輕鏈可變域，VD2為第二輕鏈可變域，C為輕鏈恆定域， XI為連接子，其限制條件為χι不為CH1，且χ2不包含Fc 區0 在另一實施例中，本發明提供包含兩個多肽鏈之結合蛋 白，其中該第一多肽鏈包含VD1_(xl)n_VD2-C-(X2)n，其 中VD1為第一重鏈可變域，VD2為第二重鏈可變域，c為 重鏈恆定域，XI為連接子，其限制條件為幻不為chi，且 X2為Fc區；且該第二多肽鏈包含VDl_(xi)n_vDn (X2)n，其中VD1為第一輕鏈可變域，VD2為第二輕鏈可變 域，C為輕鏈恆定域，X1為連接子’其限制條件為幻不為 CH1，且X2不包含Fc區。在一特定實施例中，雙可變域 (DVD)結合蛋白包含四個多肽鏈，其中前兩個多肽鏈分別 包含VDl-(Xl)n_VD2_c_(X2)n，其中vm為第一重鏈可變 域’ VD2為第：重鏈可變域，c為重鏈恒定域，幻為連接 子其限制條件為X1不為CH1 ’且X2為Fc區；且後兩個多 肽鏈分別包含VD1_(xl)n_VD2_c_(X2)I1，其中VD1為第一 150428.doc 201119673 輕鏈可變域，VD2為第二輕鏈可變域，C為輕鏈恆定域， XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1，且X2不包含Fc 區。該雙可變域（DVD)蛋白質具有四個抗原結合位點。 在另一實施例中，本文揭示之結合蛋白結合一或多個標 靶。在一實施例中，標靶係選自由細胞激素、細胞表面蛋 白、酶及受體組成之群。在另一實施例中，結合蛋白調節 一或多種標靶之生物功能。在另一實施例中，結合蛋白中 和一或多種標乾。本發明之結合蛋白結合選自由以下組成 之群的細胞激素：淋巴介質、單核球激素、多肽激素、受 體、及腫瘤標記物。舉例而言，本發明之DVD-Ig能夠結 合以下中之兩者或兩者以上：CD-20、人類CD-19(CD-19 或 hCD-19)、小鼠 CD-19(mCD-19)、CD-80、CD-22、CD-40 、 人類CD-3(CD-3 或hCD-3) 、 小鼠CD-3(mCD-3) 、 人類 表皮生長因子受體2(HER-2)、表皮生長因子受體（EGFR)、 胰島素樣生長因子1，2(IGF1，2)、胰島素樣生長因子受體 (IGF 1R)、巨噬細胞刺激蛋白受體酪胺酸激酶（R〇N)、肝細 胞生長因子（HGF)、間葉細胞-上皮過渡因子（c-MET)、血 管内皮生長因子（VEGF)、果蠅δ同系物4(DLL4)、神經纖 毛蛋白1(NRP1)、胎盤生長因子（PLGF)、v-erb-b2禽類紅血 球胚細胞白血病病毒致癌基因同系物3(ErbB3)、及甲胺喋 。令（Methotrexate)(MTX)(亦參看表2)。在一特定實施例中， 結合蛋白結合選自由以下組成之群的標靶對：MTX與 mCD-3、MTX 與 mCD-19、MTX 與 hCD-3、MTX 與 hCD-19、MTX與 CD-20、MTX與 EGFR、及 MTX與 HER-2。 150428.doc •12- 201119673 在一實施例中，結合MTX與mCD-3之結合蛋白包含選自 由SEQ ID NO. 110及SEQ ID NO. 112組成之群的DVD重鏈 胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. Ill及SEQ ID NO. 113 組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結合 MTX與mCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 110之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 111之DVD輕鏈胺基酸序列。在 另一實施例中，結合MTX及mCD-3之結合蛋白具有反定向 且包含SEQ ID NO. 112之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 113之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第二實施例中，結合MTX及mCD-3之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 114及SEQ ID NO. 116組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 11 5及SEQ ID NO-117 組成 之群的 DVD輕鏈 胺基酸 序列。 在一實 施例中 ，結 合MTX及mCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 114之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 11 5之DVD輕鏈胺基酸序列。 φ 在另一實施例中，結合MTX及mCD-3之結合蛋白具有反定 向且包含SEQ ID NO. 11 6之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 11 7之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第三實施例中，結合MTX與mCD-3之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 118及SEQ ID NO. 120組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 119及SEQ ID NO. 121組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與mCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 118之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 11 9之DVD輕鏈胺基酸序列。 150428.doc 201119673 在另一實施例中，結合MTX與mCD-3之結合蛋白具有反定 向且包含SEQ ID NO. 120之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 121之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第四實施例中，結合MTX與mCD-3之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 122及SEQ ID NO. 124組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 123及SEQ ID NO. 125組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX及mCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 122之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 123之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與mCD-3之結合蛋白具有反定 向且包含SEQ ID NO. 124之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 125之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 126及SEQ ID NO. 128組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 127及SEQ ID NO. 129組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與mCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 126之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 127之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白具 有反定向且包含SEQ ID NO· 128之DVD重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 129之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第二實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 130及SEQ ID NO. 132組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 131及SEQ ID NO. 150428.doc -14- 201119673 133組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與mCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 130之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 131之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白具 有反定向且包含SEQ ID NO. 13 2之DVD重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 133之DVD輕鏈胺基酸序歹ij。 在第三實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 134及SEQ ID NO. 136組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 135及SEQ ID NO. 137組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與mCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 134之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 135之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白具 有反定向且包含SEQ ID NO. 13 6之DVD重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 13 7之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第四實施例中，結合MTX及mCD-19之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 138及SEQ ID NO. 140組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 13 9及SEQ ID NO. 141組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與mCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 138之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 139之DVD輕鏈胺基酸序 列。在另一實施例中，結合MTX與mCD-19之結合蛋白具 有反定向且包含SEQ ID NO. 140之DVD重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 141之DVD輕鏈胺基酸序列。 150428.doc 15 201119673 在一實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白包含選自 由SEQ ID NO. 142及SEQ ID NO. 144組成之群的DVD重鏈 胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 143及SEQ ID NO. 145 組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結合 MTX與hCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 142之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 143之DVD輕鏈胺基酸序列。在 另一實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白具有反定向 且包含SEQ ID NO. 144之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 145之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第二實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 146及SEQ ID NO. 148組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 147及SEQ ID NO. 1 49組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 146之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 147之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白具有反定 向且包含SEQ ID NO. 148之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 149之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第三實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 150及SEQ ID NO. 152組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 151及SEQ ID NO-153 組成 之群的 DVD輕鏈 胺基酸 序列。 在一實 施例中 ，結 合MTX與hCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 150之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 151之DVD輕鏈胺基酸序列。 I50428.doc •】6· 201119673 在另一實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白具有反定 向且包含SEQ ID NO. 152之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 153之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第四實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 154及SEQ ID NO. 156組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 155及SEQ ID NO. 1 57組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-3之結合蛋白包含SEQ ID NO. 154之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 155之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-3之結合蛋白具有反定 向且包含SEQ ID NO. 156之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 157之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 158及SEQ ID NO. 160組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 159及SEQ ID NO. 1 61組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 15 8之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 159之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白具有反 定向且包含SEQ ID NO. 160之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 161之DVD輕鏈胺基酸序歹，J。 在第二實施例中，結合MTX及hCD-19之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 162及SEQ ID NO. 164組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 163及SEQ ID NO. 150428.doc -17- 201119673 1 65組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 162之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 163之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白具有反 定向且包含SEQ ID NO· 164之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 165之DVD輕鏈胺基酸序列。 在第三實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 166及SEQ ID NO. 168組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 167及SEQ ID NO. 1 69組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 166之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 167之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白具有反 定向且包含SEQ ID NO. 168之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 169之DVD輕鏈胺基酸序歹ij。 在第四實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白包含 選自由SEQ ID NO. 170及SEQ ID NO. 172組成之群的DVD 重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 171及SEQ ID NO. 1 73組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-19之結合蛋白包含SEQ ID NO. 170之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 171之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-19之結合蛋白具有反 定向且包含SEQ ID NO. 172之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 173之DVD輕鏈胺基酸序列。 150428.doc -18- 201119673
在一實施例中，結合MTX與hCD-20之結合蛋白包含選 自由SEQ ID NO. 174及SEQ ID NO. 176組成之群的DVD重 鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 175及SEQ ID NO. 177組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中，結 合MTX與hCD-20之結合蛋白包含SEQ ID NO. 174之DVD重 鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 175之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中，結合MTX與hCD-20之結合蛋白具有反 定向且包含SEQ ID NO. 176之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 177之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，結合MTX與EGFR(序列3)之結合蛋白包 含選自由SEQ ID NO. 178及SEQ ID NO. 180組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 179及SEQ ID NO. 1 8 1組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，結合MTX與EGFR(序列3)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 178之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 179之DVD輕鏈 胺基酸序列。在另一實施例中，結合MTX與EGFR(序列3) 之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 180之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 181之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，結合MTX與Her-2(序列1)之結合蛋白包 含選自由SEQ ID NO. 182及SEQ ID NO. 184組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 183及SEQ ID NO. 1 85組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，結合MTX與Her-2(序列1)之結合蛋白包含SEQ ID NO. 182之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 183之DVD輕鏈 150428.doc -19- 201119673 胺基酸序列。在另一實施例中’結合ΜΤχ與Her-2(序列1) 之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 184之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 1 85之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，結合MTX與hCD-3(序列1)之結合蛋白包 含選自由SEQ ID NO. 186及SEQ ID NO. 188組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEq ID N〇 187及SEq ID NO. 1 89組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中’結合MTX與hCD-3(序列1)之結合蛋白包含SEq id NO-186 之 DVD 重鏈胺基酸序列及 SEq id NO: 187 之 DVD 輕鏈 胺基酸序列。在另一實施例中，結合Μτχ與hCD_3(序列i) 之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 188之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 189之DVD輕鏈胺基酸序列。 在另一實施例中’本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白， 其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n_VD2-C-(X2)n，其中；VD1 為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變 域；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗 體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變域；c為重鏈恆 定域；（Xl)n為連接子，其限制條件為（χι)η不為CH1，其 中該（Xl)n存在或不存在；且（乂二“為以區，其中該（乂2^存 在或不存在。在一實施例中，結合蛋白中不存在以區。 在另一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白， 其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n_VD2_c_(x2)n，其中VD1為 自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變 域；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗 150428.doc •20· 201119673 體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變域；c為輕鏈恒 定域；（X1)n為連接子，其限制條件為（Xl)n不為CH1，其 中該（Xl)n存在或不存在；且（χ2)η不包含Fc區其中該 (X2)n存在或不存在。在一實施例中，結合蛋白中不存在 (X2)n。 在另一貫施例中，本發明之結合蛋白包含第一及第二多 月太鏈’其中該第一多肽鏈包含第一 VDl-(Xl)n-VD2-C_ φ (X2)n，其中VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲 得之第一重鏈可變域；VD2為自可與第一親本抗體相同或 不同之第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可 變域；C為重鏈恆定域；（xl)n為連接子，其限制條件為 (Xl)n不為CH1，其中該（X1)n存在或不存在；且（X2)i^Fc 區，其中該（X2)n存在或不存在；且其中該第二多肽鏈包 含第二VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本 抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鍵可變域；VD2為自 φ 可與第一親本抗體相同或不同之第二親本抗體或其抗原結 合郤为獲彳于之第二輕鏈可變域；C為輕鏈恆定域；（X1 )n為 連接子’其限制條件為（Xl)n不為CH1，其中該（χ1)η存在 或不存在；且（Χ2)η不包含Fc區，其中該（χ2)η存在或不存 在。在另一實施例中’結合蛋白包含兩個第一多肽鏈及兩 個第二多肽鏈。在另一實施例中，第二多肽中不存在 (Χ2)η。在另一實施例中，若第一多肽中存在Fc區，則Fc 區係選自由原生序列Fc區及變異序列Fc區組成之群。在另 貫知例中’ Fc區係選自由以下组成之群：來自igG 1之Fc 150428.doc • 21 - 201119673 區、來自IgG2之Fc區、來自IgG3之Fc區、來自IgG4之Fc 區、來自IgA之Fc區、來自IgM之Fc區、來自IgE之Fc區及 來自IgD之Fc區。 在另一實施例中，本發明之結合蛋白為包含四個多肽鏈 且結合兩個抗原的DVD-Ig ’其中第一及第三多肽鏈各包 含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體 或其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變域；VD2為自可與 第一親本抗體相同或不同之第二親本抗體或其抗原結合部 分獲得之第二重鏈可變域；C為重鏈恆定域；（X1 )n為連接 子’其限制條件為（Xl)n不為CH1，其中該（Xl)n存在或不 存在；且（Χ2)η為Fc區’其中該（Χ2)η存在或不存在；且其 中第二及第四多肽鏈各包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n ,其 中VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕 鏈可變域；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變域；c為 輕鏈恆疋域；（X1 )n為連接子，其限制條件為（X丨）n不為 CH1，其中該（χι)η存在或不存在；且（χ2)η不包含區， 其中該（X2)n存在或不存在。 本發明提供一種藉由預選親本抗體製備DVD_Ig結合蛋 白之方法在一實施例中，製備結合兩個抗原之雙可變域 免疫球蛋白之方法包含以下步驟：a)獲得第一親本抗體或 其抗原結合部分’其結合第一抗原；b)獲得第二親本抗體 或其抗原結合部分，其結合第二抗原；c)建構第一及第三 多肽鍵，其各包含VD1_(xl)n_VD2心(Mb，其中彻為 I50428.doc 201119673 自S亥第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變 域；VD2為自可與第—親本抗體相同或不同之該第二親本 抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變域；c為重鏈 恆定域，（Xl)n為連接子，其限制條件為（χι)η不為chi， 其中§ΜΧ1)η存在或不存在；且（又之^為以區，其中該（χ2)η 存在或不存在；d)建構第二及第四多肽鏈，其各包含VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自該第一親本抗體或其 • 抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變域；VD2為自可與第一 親本抗體相同或不同之該第二親本抗體或其抗原結合部分 獲得之第二輕鏈可變域；C為輕鏈恆定域；（X丨）n為連接 子，其限制條件為（χΐ)η不為CH1，其中該（χι)η存在或不 存在，且（Χ2)η不包含Fc區，其中該（χ2)η存在或不存在； 及e)表現該第一多肽鏈' 該第二多肽鏈、該第三多肽鏈及 s玄第四多肽鏈；從而產生結合該第一抗原及該第二抗原之 DVD-Ig。 • 在另一實施例中，本發明提供產生結合兩個抗原且具有 所需特性之DVD-Ig的方法，該方法包含以下步驟：a)獲得 第一親本抗體或其抗原結合部分，其結合第一抗原且具有 至少一種由DVD-Ig展現之所需特性；b)獲得第二親本抗體 或其抗原結合部分，其可與第一親本抗體相同或不同、可 結合至第二抗原且具有至少一種由雙可變域免疫球蛋白展 現之所需特性；c)建構第一及第三多肽鏈，其包含vdi_ 心(χ2)η，其中；vm為自該第一親本抗體或 其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變域；VD2為自該第二 150428.doc •23· 201119673 親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變域；c為 重鏈恆定域；（χΐ)η為連接子，其限制條件為（χι)η不為 CH1 ’其中該（Xi)n#在或不存在；且（χ2)η為卜區，其中 該（Χ2)η存在或不存在；d)建構第二及第四多肽鏈其包 ;VD1為自該第一親本 輕鏈可變域；VD2為自 含 VDl-(Xl)n_VD2_C_(X2)n，其中 抗體或其抗原結合部分獲得之第一
可與第-親本抗體相同或不同之該第二親本抗體或其抗原 結合部分獲得之第二輕鏈可變域；c為輕鏈恆定域；（χι> 為連接子，其限制條件為（Χ1)η不為CH1 ,其中該（χι)η存 在或不存在；且（Χ2)η不包含以區，其中該（χ2)η存在或不 存在；e)表現該第一多肽鏈、該第二多肽鏈、該第三多肽 鏈及該第四多肽鏈；從而產生能夠結合該第一抗原及該第 二抗原且具有所需特性之雙可變域免疫球蛋白。
在一實施例中，本文揭示之第一及第二多肽鏈的vm係 自相同親本抗體或其抗原結合部分獲得。在另一實施例 中，本文揭*之第一及第二多月大鍵的VDI係自不同親本抗 體或其抗原結合部分獲得。在另—實施例中，本文揭示之 第一及第二多肽鏈的VD2係自相同親本抗體或其抗原結合 4 /刀獍付。在另一實施例中，本文揭示之第一及第二多肽 鏈的VD2係自不同親本抗體或其抗原結合部分獲得。 在一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分與第二 親本抗體或其抗原結合部分為相同抗體。在另一實施例 中，第一親本抗體或其抗原結合部分與第二親本抗體或其 抗原結合部分為不同抗體。 150428.doc -24 · 201119673 在一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分結合第 抗原’且第一親本抗體或其抗原結合部分結合第_ ^ 原。在—特定實施例中，第一抗原與第二抗原為相同2 原。在另一實施例中，親本抗體結合同—抗原上之不同抗 原決定基。在另一實施例中，第一抗原與第二抗原為不同 抗原。在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分 結合第一抗原之效能不同於第二親本抗體或其抗原結合部 Φ 分結合第二抗原之效能。在另-實施例中，第一親本抗體 或其抗原結合部分結合第一抗原之親和力不同於第二親本 抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之親和力。 在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分及第 二親本抗體或其抗原結合部分係選自由人類抗體、〇〇汉移 植抗體及人類化抗體組成之群。在一實施例中，抗原結合 部分係選自由以下組成之群：片段；片段即 包含兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接的片段之二價片 • 段；由^11域及CH1域組成之Fd片段；φ抗體單臂之¥[域 及VH域組成之卜片段；dAb片段；經分離互補決定區 (CDR) ’單鏈抗體；及雙功能抗體。 在另一實施例中，本發明之結合蛋白具有至少一種由第 -親本抗體或其抗原結合部分或第二親本抗體或其抗原結 合部分展現之所需特性。或者，第—親本抗體或其抗原結 合部分及第二親本抗體或其抗原結合部分具有至少一種由 雙可變域免疫球蛋白展現之所需特性。在一實施例中，所 需特性係選自—或多種抗體參數。在另一實施例中，抗體 150428.doc •25- 201119673 參數係選自由以下組成之群：抗原特異性'對抗原之親和 力、效能、生物功能、抗原決定基制 '穩定性、溶解 度、產生效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組 織交叉反㈣及直系同源抗原結合。在一實施例中，結合 蛋白為多價結合蛋白。在另一實施例中，結合蛋白為多特 異性結合蛋白。本文所述之多價及或多特異性結合蛋白具 有所需特性，尤其由治療觀點來看更是如此。舉例而言， 多價及或多特異性結合蛋白可⑴相較於二價抗體由表現抗 體所結合之抗原的細胞較快内化（及/或分解代謝）；⑺為· 促效劑抗體；及/或⑺誘導表現多價抗體結合之抗原之細 =的細胞死亡及/或細胞祠亡。提供多價及或多特異性結 口蛋白之至；一種抗原結合特異性的「親本抗體」可為由 表現抗體所結合之抗原的細胞内化(及/或分解代謝)之抗 體；及/或可為促效劑、料細胞死亡及/或誘導細胞〉周亡 之抗體’且如本文所述之多價及或多特異性結合蛋白可展 或夕種此等特性之改良。此外，親本抗體可能缺乏任 "或夕種此等特性，但在建構為如本文所述之多價結合鲁 蛋白時可具有此等特性。 σ 入在另-實施财，如以電浆共振所量測，本發明之結 對或多個標靶之結合速率（on rate)常數（κ〇η)選自 由以下組成之群：至少約1〇2 ΜΛ·1 ;至少約1〇3 Μ、·ι . 至少約1〇5M-V;及至少 實施例中，如表面電漿共振所量測，本發明之結合蛋白 或夕個標靶之結合速率常數（Kon)為：約1〇2 Μ-ι -丨 150428.doc •26· 201119673 、’-勺 10 M s ，約 i〇 M s 1至約 1〇4 M-i s-i ;約 1〇4 s_| 至 約 10 M s 1 ;或約 i〇5 m·1 s-i 至約 1〇6 s-i。 在另貫細i例中.，如表面電漿共振所量測，結合蛋白對 一或多個標靶之解離速率常數（K〇ff)選自由以下組成之 群：至多約10-3 S-1 ;至多約10_4，；至多約1〇·5 s_,;及至 多約10 6 S-1。在一實施例+，如表面電聚共振所量測，本 啦明之紇合蛋白對一或多個標靶解離速率常數為： 約1〇3 S·1至約10-4 S-1 ;約1〇.4 /至約1〇-5 s•卜或約1〇5 s」 至約 1(T6 s·1。 在另一實施例中，結合蛋白對一或多個標靶之解離常數 (KD)選自由以下組成之群：至多約l〇_7 Μ ;至多約w8 Μ ;至 多約10 Μ ;至多約1〇-丨。Μ ;至多約1〇-〗丨Μ ;至多約i〇 l2 t 及至多約1G·13 Μ。在-實施例中，本發明之結合蛋白對其 標乾之解離常數（Kd)為：約1()·7 Μ至約1().8 Μ ·’約W Μ至 約 1〇·9 Μ ;約 1(Γ9 Μ至約 1().1G Μ ;約 ΐ()·1()河至㈣"μ . 約ι〇_"Μ至約1().12μ;或約…、至約ι().13μ。 ， 在另一實施例中，本文所述之結合蛋白為進—步包含選 自由以下組成之群之試劑的接合物（叫吵⑷：免疫黏附 分子、顯影劑' 治療劑及細胞毒性劑。在-實施例中，顯 影劑係選自由以下組成之群：放射性標記、酶、螢光標 記：發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。在： :己實：例I。’顯5影劑為選自由以下組成之群的放射性標 呂己.H、 C、5S、90γ、99Tc、11%、1251、⑴卜
Ho及Sm。在另一較佳實施例中，治療劑或細胞毒性 150428.doc •27- 201119673 劑係選自由以下組成之群：抗代謝物、烷基化劑、抗生 素、生長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂 劑、蒽環黴素（anthracycline)、毒素及細胞凋亡劑。 在另一實施例中，本文所述之結合蛋白結合至細胞蛋白 及選自由以下組成之群的試劑：免疫黏附分子、顯影劑' 治療劑及細胞毒性劑。在一實施例中，顯影劑係選自由以 下組成之群：放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生 物發光標記、磁性標記及生物素。在另一實施例中，顯影 劑為選自由 90Y、"Tc、 以下組成之群的放射性標記：3H、"c、35s、 lnIn、125I、⑴I、"7Lu、166H(^153sm。在另
一較佳實施例中，治療劑或細胞毒性劑係選自由以下組成 之群：抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因子、細胞激 素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素及細 胞祠亡劑。
在另一實施例中，本文所述之結合蛋白為結晶結合蛋白 且以晶體形式存在。在一實施例中，晶體為無載劑醫藥控 制釋放晶體。在另__實施例中，肖晶結合蛋白具有比該結 合蛋白之可溶對應物長的活體内半衰期。在另一實施例 中’結晶結合蛋白保留生物活性。 士另-實施例中，本文所述之結合蛋白經糖基化。舉例 而言，糖基化為人類糖基化模式。 本毛月之—態樣係關於編碼任一種本文揭示之結合蛋白 的經分離核酸。另一實施例提供包含本文揭示之經分離核 酸的載體’其中該載體係選自由以下址成之群：喊Μ; 150428.doc •28· 201119673 pTT(Durocher 等人，（2002) Nucl. Acids Res. 30: 2); pTT3(具有其他多選殖位點之pTT) ·，pEFBOS(Mizushima, S.及 Nagata，S. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 17) ; pBV ; pJV ； pcDNA3.1 TOPO ; pEF6 TOPO及 pBJ。在一實施例 中，載體為美國專利公開案第2009/0239259號中揭示之載 體。 在另一態樣中，宿主細胞以本文揭示之載體轉型。在一 實施例中，宿主細胞為原核細胞。在另一實施例中，宿主 細胞為大腸桿菌。在相關實施例中，宿主細胞為真核細 胞。在另一實施例中’真核細胞係選自由原生生物細胞、 動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。在另一實施例 中’宿主細胞為哺乳動物細胞，包括（但不限於）CHO、 COS ’ NS0、SP2、PER.C6或諸如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)之真菌細胞；或諸如Sf9之昆蟲細胞。 在一實施例中’例如具有不同特異性之兩個或兩個以上 DVD-Ig係在單個重組宿主細胞中產生。舉例而言，抗體 混合物之表現已稱為〇lig0cl〇nicsTM(Merus b.V” The
Netherlands)，美國專利第 7,262,028號；第 7,429,486號。 本發明之另一態樣提供製造本文所揭示之結合蛋白的方 法，包含在足以產生結合蛋白的條件下在培養基中培養任 一種亦為本文揭示之宿主細胞。在一實施例中，此方法產 生之50%-75%結合蛋白為雙特異性四價結合蛋白。在一特 定實施例中，此方法產生之75%_9〇%結合蛋白為雙特異性 四^貝結合蛋白。在一特定實施例中，所產生之之 150428.doc -29- 201119673 結合蛋白為雙特異性四價結合蛋白。 一實施例提供用於釋放結合蛋白之組合物’其中該組合 物包含調配物，該調配物又包含本文揭示之結晶結合蛋 白，及一種成分，及至少一種聚合載劑。舉例而言，聚合 載劑包含選自由以下組成之群的一或多種聚合物：聚（丙 烯酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚（胺基酸）、聚（酐）、聚（縮 肽）、聚（醋）、聚（乳酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGA、聚 (b-羥基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二氧環己酮）、聚（乙二 醇）、聚（（羥丙基）甲基丙烯醯胺）、聚I；(有機）磷氮烯]、聚 (原酸酷）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸 酐-烷基乙烯基醚共聚物、氧化異丙烯多元醇類、白蛋 白、海藻酸鹽、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖 維蛋白、明膠、玻尿酸、寡醣 '甘胺基聚糖、硫酸多醣、 其摻合物及共聚物。舉例而言，該成分係選自由白蛋白' 蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基邛_環糊精、甲氧基 聚乙二醇及聚乙二醇組成之群。另一實施例提供用於治療 哺礼動物之方法包含向該哺乳動物投與有效量之本文 揭示之組合物的步驟。 本發明亦提供包含本文揭示之結合蛋白及醫藥學上可接 :之載Μ的4藥組合物。在另一實施例中，醫藥組合物包 “少種用於治療病症之其他治療劑。舉例而言，其他 藥劑係選自由以下έ志链· <卜、.且成之群.治療劑、顯影劑、細胞毒性 J血官生成抑制劑（包括（但不限於）抗VEGF抗體或 EGF trap)、激酶抑制劑（包括（但不限於帅尺及顶々抑 150428.doc •30· 201119673 制劑）、協同刺激分子阻斷劑（包括（但*限於）抗B7」、抗 B7.2、CTLA4_Ig、抗CD2G)、黏附分子阻斷劑（包括= 限於）抗LFA-mM、抗E/L選擇素抗體、小分子抑制劑）、 抗細胞激素抗體或其功能片段（包括（但不限於）抗US、 抗TNF、及抗IL-6/細胞激素受體抗體）、甲胺喋呤、環孢 素（cyclosporin)、雷帕黴素（rapamycin)、fk5〇6 7 可:=
標記或報導體、TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、、麻 醉藥、非類固醇消炎藥物（NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮 靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑 '抗牛 皮癬藥、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素^免 疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥 物、放射性藥品、抗抑鬱劑、抗精神病藥、興奮劑、哮喘 藥物、β促效劑、吸入類固_、腎上腺素或類似物、細： 激素及細胞激素拮抗劑。 在另一態樣中，本發明提供治療罹患本文揭示之結合蛋 白能夠結合之該（等）標靶為有害的病症之人類個體之方 法，包含向人類個體投與本文揭示之結合蛋白，從而抑制 人類個體中該（等）標靶之活性，且緩解多種症狀中之一種 或貫現治療。舉例而言，該病症係選自包含以下之群：關 節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、萊 姆關節炎（Lyme arthritis)、牛皮癖性關節炎、反應性關節 炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡症、克羅恩氏病 (CroWs disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依 賴性糖尿病、曱狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮癬 '皮 150428.doc -31- 201119673 炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應、與器 吕移植有關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、動脈粥樣 硬化、散播性血管内凝血、川崎氏病（Kawasaki，s disease)、格雷氏病（Grave，s disease)、腎病症候群、慢性 疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病（Wegener,s granul〇mat〇sis)、 亨偌-絲奇恩賴紫癜（Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微 性血管炎、慢性活動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中 毒性休克症候群、敗血症症候群、惡病質、傳染性疾病、 寄生蟲病、後天免疫缺之症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨 廷頓氏舞蹈病（Huntington's chorea)、帕金森氏病 (Parkinson's disease)、阿茲海默氏病（Aizheimer,s disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡 性病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾迪森氏病、偶發性j型多 腺體分泌不足症及II型多腺體分泌不足症、施密特氏症候 群（Schmidt's syndrome)、成人（急性）呼吸窘迫症候群、脫 髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病 (Reiter's disease)、牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節 病、腸病性滑膜炎、彼衣菌（chlamydia)、耶氏桿菌 (yersinia)及沙門氏邊（salmonella)相關之關節病、脊椎關 節病、動脈粥樣瘤病/動脈硬化、異位性過敏、自體免疫 大皰病、尋常天疱瘡、葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線狀IgA 病、自體免疫溶血性貧血、庫姆氏陽性溶血性貧血 (Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青 少年惡性貧血、肌痛腦炎/皇家自由病（Royal Free 150428.doc -32- 201119673 D1Sease)、性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發 »·更化ϋ肝炎、原因不明性自體免疫肝炎、後天免疫缺乏 病症候群、後天免疫缺乏相關疾病、β型肝炎、。型肝 炎、普通變異性免疫缺之症（普通變異性·球蛋白血症）、 擴張性心肌病、雖性不孕症、㈣功能衰竭1巢早衰、 纖U肺病、原因不明性纖維性肺泡炎、發炎後間質性 :門“生肺炎、、结締組織病相關之間質性肺病、混合 結締組織病相關之肺病、全身性硬化症相關之間質㈣ 病㉙風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡 症相關之肺病、皮肌炎/多發性肌炎相關之肺病、休格連 .氏病相關之肺病（Sj0gren,s disease associated lung ea^e)、僵直性脊椎炎相關之肺病、▲管炎擴散性肺 病3鐵血黃素沈積症（haemosiderosis)相關之肺病、藥物 :::間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、阻塞性細支 氣s人If性唁伊紅血球性肺炎、淋巴球浸潤性肺病、感 木後間虞f生肺病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、1型 自體免疫性肝炎（經典自體免疫或類狼瘡性肝炎）、2型自體 免疫性肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血糖 症B型胰島素抗性伴發黑色棘皮病、副甲狀腺低能症、 '移植有關之急性免疫疾病、與器官移植有關之慢性 免疫疾病、非炎性骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型 牛皮癖、2牛皮癖、特發性白血球減少病、自體免疫性 嗜：：球：少症、N〇s型腎病、血管球性腎炎、腎顯微性 血官炎、萊姆病（lyme disease) '盤狀紅斑狼瘡、特發性或 I50428.doc -33- 201119673 NOS型雄性不育症、精子自體免疫、多發性硬化症（所有 次型）、交感性眼炎、結締組織病繼發之肺高血壓、古巴 士德氏症候群（Goodpasture's syndr〇me)、結節性多動脈炎 之肺表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏病 (Still’s disease)、全身性硬化症、休格連氏症候群、高安 氏病（Takayasu，s disease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少 症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺病、曱狀腺 機能充進症、甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症（橋本 氏病（Hashimoto’s disease))、萎縮性自體免疫性甲狀腺低籲 能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性脈 管炎、白斑病急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精 誘發之肝損傷 '膽汁鬱滯、特質性肝病、藥物誘發之肝 炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌 (GBS)感染、精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂症）、型 及Th 1型；|導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼 痛）、及諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺 癌、印巢癌、前列腺癌及直腸癌之癌症及造也性惡性疾病 (白血病及淋巴瘤）、無p脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢 性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病 (ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性或慢性細菌感染、 急1·生胰腺x、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、 癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接 觸性皮膚炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥反應、 抗胰蛋白酶缺乏、肌肉萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、 150428.doc •34- 201119673 月I!角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏 反應、主動脈及周圍動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血 壓、動脈硬化症、動靜脈瘺、共濟失調、心房微顫(持續 陡或陣發性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、 骨移植物排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反應、束枝傳導 阻滯' 伯基特淋巴瘤（Burkittis lymph〇ma)、燒傷、心律不 1〜臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎 反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小腦病症、紊 亂性或多灶性心房心動過速、與化學療法有關之病症、慢 性髓細胞白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病 變、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、慢性阻塞性肺病 (COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰 竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原性心臟病、冠狀動脈疾 病庫貝氏病（Creutzfeldt-Jakob disease)、培養物陰性敗 血症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳擊員 癡呆、脫髓勒疾病、出血性登革熱（dengue hem〇rrhagic fever)皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿病（diabete、diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、泛發性路易體疾病 (Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性心肌病、基底 神經節病症、中年唐氏症候群（D〇wn，s SyndR)me化㈤心卜 age)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發之運 動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓炎、心内膜炎、内分泌 病、會厭炎、EB病毒感染（epStein-baiT virus infecti〇n)、 肢端紅痛症、錐體外及小腦病症、家族性噬血淋巴組織細 150428.doc -35- 201119673 胞瘤病、胎兒胸腺移植排斥反應、弗里德賴希氏共濟失調 (Friedreich’s ataxia)、功能性周圍動脈病症、真菌性敗血 症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織的 移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗血症（gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症、胞内生物體引起之肉芽腫、 毛細胞白血病、哈洛弗登-史巴茲氏蒼白球色素退化症 (Hallerrorden-Spatz disease)、喬本氏曱狀腺炎（hashirnoto，s
thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥反應、血色素沉著 症、血液透析、溶血性尿毒症候群/血栓溶解性血小板減 少性免癜、出血、A型肝炎、希氏束心律不整（His bundle arrythmias)、HIV 感染 /HIV 神經病、霍奇金病（H〇dgkinis disease)、過動性運動病症、過敏反應、過敏性肺炎、高 血壓、運動不足運動病症、下丘腦-垂體_腎上腺軸評估、 特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒 性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈發炎、&型流
感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎 缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎 青少年脊縫性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤（Kapos s —a)、f臟移植排斥反應、、退伍軍人病〇egi〇neiia) 利什曼體病（leishmaniasis)、麻風病、皮f脊趙系統 變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、癔疾、心 淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、腦膜炎、) 膜炎球“症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、粒線體 糸統病症、混合結締組織病、單株？球蛋白症、多發性 150428.doc -36· 201119673 髓瘤、多系統退化（曼切、代哲因-托馬斯、史德爾格及馬 查多-約瑟夫（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager 及 Machado-Joseph))、重症肌無力、禽細胞内分枝桿菌 (mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌 (mycobacterium tuberculosis)、骨髓發育不良症候群、心 肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病 '腎 炎、腎病、神經退化性疾病、I型神經原性肌肉萎縮、續· 中性球減少性發熱、非霍奇金淋巴瘤（n〇n_h〇dgkins lymphoma)、腹主動脈及其分支閉塞、閉塞性動脈病症、 okt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管複通術 (vasectomy reversal procedure)、器官腫大、骨質疏鬆症、 胰腺移植排斥反應、胰腺癌、副腫瘤症候群/惡性高血妈 症、副曱狀腺移植排斥反應、骨盆發炎疾病、常年性鼻 炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周圍血管疾病、 腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎（pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群（多發性神經病、器官 腫大、内分泌病、單株γ球蛋白症及皮膚變化症候群）、灌 注後症候群、泵後症候群' ΜΙ心切開術後症候群、子癇前 症、進行性核上性麻痹、原發性肺高血壓、放射療法、雷 諾現象（Raynaud's phenomenon)及疾病、雷諾病、雷弗素 姆氏病（Refsum’s disease)、規則狹窄qrs心動過速、腎血 管性高血壓、再灌注損傷、限制型心肌病、肉瘤、硬皮 病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆（Senile dementia 〇f Lewy body type)、血清陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧 15042B.doc •37- 201119673 血、皮膚同種異體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸 移植排斥反應、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失 調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性 硬化性全腦炎、昏厥、心血管系統梅毒、全身性過敏、全 身性發炎反應症候群、全身發作型青少年類風濕性關節 炎、T細胞或FAB ALL、毛細管擴張、血栓閉塞性血管 炎、血小板減少症、令毒 '移植、創傷/出血、m型過敏 反應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒症、尿敗血病、 蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、脈管炎、靜脈疾病、靜 脈血拴形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感染、病毒性 腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關之噬血細胞症候群、韋尼 克-科爾薩科夫症候群（Wernicke_K〇rsak〇ff syndr〇me)、威 爾遜氏病（WilS0n’s disease)、任何器官或組織的異種移植 物排斥反應、急性冠狀動脈症候群、急性特發性多神經 炎、急性發炎性脫髓鞘性多神經根神經病、急性局部缺 血、成人史提爾氏病（adult still、disease)、斑形脫髮、過 敏、抗蛾脂抗體症候群、再生不全性、動脈硬化症、 異位性«、異位性皮膚炎、自體免疫性皮膚炎、與鍵球 菌感染有關之自體免疫病症、自體免疫性腸病、自體免疫 性聽力損失、自體免疫淋巴組織增生症候群（ALps)、自體 免疫性心肌炎、自體免疫㈣巢早衰、驗炎、支氣管擴 張、大皰性類天疱瘡、心血管疾病、災難性抗磷脂症候 群、乳糜帛、頸椎關節病、慢性局部缺血、瘢痕性類天范 瘡、具有多發性硬化症風險之臨床單-症候群㈣、結 150428.doc •38· 201119673 膜炎、兒童期初發型精神病症、慢性阻塞性肺病 (COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網臈病變、糖尿 病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂、藥物誘發之免疫性溶血 性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内炎、上鞏膜炎、 多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠期類天疱瘡、格-巴 二氏症候群（Guillain-Barr6 Syndrome)(GBS)、枯草熱、休 斯症候群（Hughes Syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性 鲁 間質性肺炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶血性貧血 '包 涵體肌炎 '傳染性眼發炎疾病、發炎性脫髓鞘疾病、發炎 性心臟病、發炎性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾 燥性角膜結膜炎、庫斯毛爾氏病（Kussmaul disease)或庫斯 毛爾-米爾氏病（Kussmaul-Meier Disease)、蘭德里麻得 (Landry’s Paralysis)、郎格罕氏細胞組織細胞增多病 (Langerhan’s Cell Histiocytosis)、網狀青斑、黃斑退化、 顯微性多血管炎、白赫鐵列夫症（morbus bechterev)、運動 • 神經元病症、黏膜類天疱瘡、多器官衰竭、重症肌無力、 骨髓發育不良症候群、心肌炎、神經根病症、神經病、非 A非B型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節型 月 >'年類風濕性關節炎（pauciarticular jRA)、周圍動脈閉 塞丨生疾病（PAOD)、周圍血管疾病（PVD)、周圍動脈疾病 (PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈周圍 火）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型jra、 夕内分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多肌痛（pMR)、泵 後症候群、原發性帕金森氏症、前列腺癌及直腸癌及造血 150428.doc 39· 201119673 性惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球發育不 全、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹 窄、風濕性心臟病、S APHO(滑膜炎、痤瘡、腹跑病、骨 肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性病、休克肺、 鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚碎氧相 關之結締組織疾病、史奈登-威爾金森皮膚病（snedd〇n_ Wilkinson dermatosis)、強直性脊椎炎、史蒂芬_璦森症候 群（Stevens-Johnson syndrome，SJS)、全身性發炎反廣症 候群、顳動脈炎、弓形蟲性視網膜炎、中毒性表皮壞死溶 解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、i型過敏 反應、II型糖尿病、蓴麻疹、尋常性間質肺炎（υιρ)、脈管 炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳-原田症 候群（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群）、濕式 黃斑退化、傷口癒合、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節 病0 在一貫施例中，可以本發明之組合物及方法治療或診斷 之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌症，包括乳癌、 結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下嚥癌、食道癌、胃 癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌 (包括月癌、膀胱癌及尿道上皮癌）、雌性生殖道癌（包括子 宮頸癌、+宮癌&卵巢癌…以及絨膜癌及妊娠滋養細胞疾 病）、雄性生殖道癌（包括前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生 殖細胞腫瘤）、内分泌腺癌（包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂 體腺癌）及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤（包括骨骼 150428.doc -40- 201119673 及I人組織產生之彼等肉瘤以及卡波西氏肉瘤）、腦腫瘤、 腫瘤、眼腫瘤及腦脊膜腫瘤(包括星形細胞瘤、神經 膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、神經瘤、神經 母細胞瘤、神經鞘瘤及脊膜瘤）、由諸如白血病之造血性 惡性疾病引起的實體腫瘤，及淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤及# 霍奇金淋巴瘤）。 在貫把例中，本發明之抗體或其抗原結合部分在單獨 使用或與放射療法及/或其他化學治療劑組合使用時可用 於治療癌症或用於預防或抑制自本文所述之腫瘤轉移。 在另一態樣中，本發明提供治療罹患病症之患者的方 法其包含在投與如上文所述之第二藥劑之前、同時或之 後投與本文揭不之任一結合蛋白的步驟。在一特定實施例 中’第一藥劑係選自由以下組成之群：布地奈德 (budenoside)、表皮生長因子、皮質類固醇 '環孢素柳 氮磺胺。比啶（sulfasalazine)、胺基水楊酸鹽、6_巯基嗓吟、 硫唑嘌呤（azathioprine)、甲硝噠唑（metr〇nidaz〇le)、脂質 加氡酶抑制劑、美沙拉嗪（mesalamine)、奥沙拉唤 (olsalazine)、巴柳氮（balsalazide)、抗氧化劑、凝血脂素 抑制劑、IL-1受體拮抗劑、抗IL-Ιβ mAb、抗江_6或抗IL_6 受體mAb、生長因子、彈性蛋白酶抑制劑、。比咬基_咪。坐 化 $*、TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL_ 12、IL-13、IL_15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF之抗體或促效劑、CD2、CD3、CD4、 CD8、CD19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、 150428.doc -41 - 201119673 CD69、CD90或其配位體之抗體、曱胺喋呤、環孢素、 FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯（myc〇phen〇late mofetil)、來氟米特（leflunomide)、NSAID、布洛芬 (ibuprofen)、皮質類固醇、潑尼龍（prednis〇1〇ne)、碟酸二 酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上 腺素激導劑、IRAK、NIK、IKK、P38、MAP激酶抑制 劑、IL-Ιβ轉化酶抑制劑、TNFa轉化酶抑制劑、τ細胞信 號傳導抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑 嘌呤、6-酼基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細 胞激素受體、可溶性P55 TNF受體、可溶性p75 TNF受體、 sIL-lRI、SIL-1RII、SIL-6R、消炎性細胞激素、IL_4、 10、IL-11、IL-13及 TGFp。 在一特定實施例中，本文揭示之醫藥組合物係藉由至少 -種選自以下之模式投與患者：非經腸、纟下、肌肉内、 靜脈内、關節内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔 内、體腔内、小腦内、腦室内、結腸内、子宮頸内、胃工 内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹 膜内、前列腺内 '肺内、直腸内、腎内、視網膜内、脊椎 内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、快速注射、經陰 道、經直腸、經頰、舌下、鼻内及經皮。 本發明之-態樣提供至少—種針對至少—種本發明之結 合蛋白的抗個體基因型抗體。抗個體基因型抗體包括含有 以下分子之任何蛋白f或肽，該分子包含免疫球蛋白分子 之至少-部分’諸如（但不限於）重鏈或輕鏈之至少—個互 150428.doc 42- 201119673 補決定區（CDR)或其配位體結合部分、重鏈或輕鏈可變 區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區或其可併入本發明之結合 蛋白十的任何部分。 【實施方式】 本發明係關於結合兩個或兩個以上抗原之多價及/或多 特異性結合蛋白。特定言之，本發明係關於雙可變域免疫 球蛋白（DVD-Ig)及其醫藥組合物，以及用於製備該等 • DVD-Ig之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵 盍使用本發明DVD-Ig活體外或活體内偵測特異性抗原之 方法。 除非本文另外定義，否則關於本發明使用之科技術語將 具有一般技術者通常所瞭解之含義。術語之含義及範疇應 為清晰的，然@，若存在任何隱含歧彡，則本文中所提供 之定義優先於任何字典或外來定義。此外，除非上下文另 外要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單 鲁數在本申凊案中，除非另外說明，否則使用「或」意謂 及或j此外，使用術语「包括（including)」以及其他 形式，諸如「includes」及rinc】uded」不具有限制性。同 樣’除非另外明確說明，否則諸如「元件」或「組件」之 術語涵蓋包含-個單元之元件及組件及包含一個以上次單 元之元件及組件。 ,叙而§，本文所述之關於細胞及組織培養、分子生物 予免疫予、锨生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及 雜交所使用的命名法及其技術為此項技術中所熟知及常用 150428.doc *43- 201119673 之命名法及技術。除非另外說明，否則一般根據此項技術 中熟知之習知方法及如本說明書全文所引用及論述之多種 一般性及更為具體之參考文獻所描述執行本發明之方法及 技術。酶促反應及純化技術係根據製造商說明書，如此項 技術中通常所實現或如本文所述來執行。本文中所述之關 於分析化學'合成有機化學及醫學及藥物化學所使用之命 名法及其實驗室程序與技術為此項技術中所熟知及常用之 命名法及程序與技術。使用標準技術來進行化學合成、化 學分析、醫藥製備、調配及傳遞，以及患者之治療。 本發明可更容易地理解，所選擇之術語定義如下。 術語「多肽」係指.胺基酸之任何聚合鏈。術語「肽」及 蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦係指胺基酸之聚合
術語經分離蛋白質」或「經分離多肽 或多肽，其由於其起源或衍生來源而盥 夕肽」為以下蛋白質 不與其自然狀態中所 150428.doc • 44 - 201119673 伴ik之天料合組分締合； 他蛋白質.± 个3及自同—物種之其 在。因/ 物種之細胞表現；或在自然界中不存
在。因此，以务風+』λ L、_>·、丄 丨T P W 化千方式合成或在不同於兑妥 的細胞系統中人士、 其天然起源之細胞 〇成之多肽將與其天然締合組 使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術藉；:」 白皙眚暂μ 丁 a 柯田刀離亦可使蛋 貫貝上不含天然締合組分。
術°。目收」係指例如使用此項技術熟知之蛋白質纯化 技術藉由分離使化與铷^夕 蛋白貝，，.屯化 組分之過程。^貝MM多^實^不含天《合 二物：性」係指分子之任何-或多種固有生物特性 (如活體内可見之天然存在之特性，❹重組方式提供或 賦予之特性）。生物學特性包括（但不限於）結合受體；誘導 細胞增殖、抑制細胞生長、誘導其他細胞激素、誘導細胞 調亡、及酶促活性。生物活性亦包括Ig分子之活性。 關於抗體、蛋白f或肽與第二化學物質之相互作用的術 °°特異丨生結合」意謂該相互作用取決於化學物質上特定 結構（例如抗原決定子或抗原決定基）之存在；例如，抗體 識別且結合於特定蛋白質結構而非與蛋白質廣泛結合。若 抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含經標記 A」及抗體之反應令存在含抗原決定基a(或游離、未經 標記之A)之分子將減少與該抗體結合之經標記八的量。 術語「抗體」泛指包含四個多肽鏈（兩個重（H)鏈及兩個 輕（L)鏈）之任何免疫球蛋白（ig)分子或其保留Ig分子之必需 抗原決定基結合特徵之任何功能片段' 突變體、變異體或 J5042S.doc .45· 201119673 衍生物。該等突變體、變異體或衍生物抗體形式為此項技 術中所已知。下文論述其非限制性實施例。 在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區（本文中縮寫為 HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含3個結構域， CHI、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（本文中縮寫為 LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域 CL。可將VH及VL區進一步再分為高變區（稱為互補決定區 (CDR))，其間散佈有較為保守之區（稱為構架區（FR))。各 VH及VL由三個CDR及四個FR構成，該等域自胺基末端至 羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型（例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 及 IgY)、類別（例如 IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及 IgA2)或子類。 術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區，其 可由完整抗體之木瓜蛋白酶消化產生。Fc區可為原生序列 Fc區或變異Fc區。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恒定域 (CH2域及CH3域），且視情況包含CH4域。置換Fc部分中之 胺基酸殘基以改變抗體效應功能在此項技術中已知（美國 專利第5,648,260號及第5,624,821號）。抗體之Fc部分介導 若干重要效應功能，例如細胞激素誘導、ADCC、呑噬作 用、補體依賴細胞毒性（CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物 之半衰期/清除率。視治療目標而定，在一些情形下，此 等效應功能為治療性抗體所需，但在其他情形下可能並非 必要或甚至有害。某些人類IgG同型（尤其IgGl及IgG3)分 I50428.doc -46- 201119673 別經由結合於FcyR及補體Clq來介導ADCC及CDC。新生 兒Fc受體（FcRn)為確定抗體循環半衰期的重要組分。在另 一實施例中，置換抗體恆定區（例如抗體之Fc區）中的至少 一個胺基酸殘基，使得抗體之效應功能得以改變》免疫球 蛋白之兩個相同重鏈的二聚化由CH3域之二聚化介導，且 由鉸鏈區内之二硫鍵穩定化（Huber等人（1976) Nature 264: 415-20 ; Thies等人·（1999) J. Mol. Biol· 293: 67-79)。使鉸 鏈區内之半胱胺酸殘基突變以防止重鏈-重鏈二硫鍵，將 使CH3域之二聚化不穩定。已鑑別出負責CH3二聚化之殘 基（Dall’Acqua (1998) Biochem· 37: 9266-73)。因此，有可 能產生單價半Ig。有趣的是，已在自然界中發現IgG及IgA 子類兩者之此等單價半Ig分子（Seligman (1978) Ann. Immunol. 129: 855-70 ； Biewenga等人，（1983) Clin. Exp. Immunol. 5 1: 395-400)。已測得FcRn:Ig Fc區之化學計量為 2:l(West 等人.（2000) Biochem· 39: 9698-708)，且一半 FC 足以介導 FcRn結合（Kim 等人·（1994) Eur. J. Immunol. 24: 542-548)。干擾CH3域二聚化之突變可能不會對其FcRn結 合產生較大不利影響’此係因為對於CH3二聚化重要之殘 基位於CH3 b摺疊結構之内界面上，而負責！^^^結合之區 位於CH2-CH3域之外界面上。然而，半ig分子可能由於其 尺寸小於常規抗體而在組織穿透方面具有一定優勢。在一 實施例中，置換本發明結合蛋白之恆定區（例如Fc區）中的 至少一個胺基酸殘基，以致干擾重鏈之二聚化，從而產生 半DVD Ig分子。IgG之消炎活性完全視IgG Fc片段之N連 150428.doc • 47· 201119673 接聚糖的唾液酸化而定。已確定消炎活性之確切聚糖要 求，使得可產生適當IgGl Fc片段’藉此產生效能極大增 強之完全重組唾液酸化IgGl Fc(Anthony，R.M.等人，（2〇〇8) Science 320:373-376) °
術語抗體之「抗原結合部分」（或簡稱為「抗體部分」） 係指保留與抗原特異性結合之能力的抗體之一或多個片 段。已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執 行。該等抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特 異性形式；其與兩個或兩個以上不同抗原特異性結合。術 語抗體之「抗原結合部分」内所涵蓋之結合片段的實例包 括：（i) Fab片段’即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之 單價片段；（ii) F(ab·)2片段’即包含在鉸鏈區中經二硫橋 連接之兩個Fab片段的二價片段；（ni) Fd片段，其係由VH 及CH1結構域組成；（iv) Fv片段，其係由抗體之單臂之vL 及 VH 結構域組成；（v) dAb 片段（Ward (1989) Nature 341: 544-546 ; PCT公開案第WO 90/05144 A1號），其包含單一 可變結構域；及（vi)經分離互補決定區（CDR)。此外，儘管 Fv片段之兩個域（VL及VH)係由獨立基因編碼，但可使用 重組方法藉由合成連接子將其連接，使得能約製備為VL 區與VH區配對以形成單價分子之單一蛋白質鏈（稱為單鍵
Fv(scFv);參看例如 Bird 等人。（1988) Science 242: 423-426 ;及 Huston 等人。（1988) Proc· Natl. Acad. Sci. USA 8 5: 5 8 7 9 - 5 8 8 3)。該等單鏈抗體亦欲涵蓋於術語抗體之 「抗原結合部分」内。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如 150428.doc -48 - 201119673 雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH 及VL結構域表現於單個多肽鏈上，但使用過短以致相同 鍵上之兩個結構域之間不能配對的連接子，藉此迫使該等 結構域與另一鏈之互補結構域配對且形成兩個抗原結合位 點（參看例如 Holliger，p 等人，（1993) Pr〇c Natl. Acad· Sci. USA 90:6444-6448 ; P〇ljak，R.J 等人，（1994) structure 2:1121-1123)。該等抗體結合部分為此項技術中已知 (Kontermann 及 Dubel 編，Antibody Engineering (2001) Sprmger-Verlag. New Y〇rk·第 790 頁（ISBN 3-540-41354- 5))。此外’單鏈抗體亦包括「線抗體」，其包含與互補輕 鏈多肽一起形成一對抗原結合區的一對_聯Fv區段（VH_ CHl-VH-CHl)(Zapata 等人，（1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062及美國專利第5 641，87〇號）。 術s吾「多價結合蛋白」在本發明全文中用於表示包含兩 個或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。在一實施例中， 多價結合蛋白經工程改造成具有三個或三個以上抗原結合 位點且通常不為天然存在之抗體。術語「多特異性結合蛋 白」係指結合兩個或兩個以上相關或不相關標靶之結合蛋 白。本發明之雙可變域（DVD)結合蛋白包含兩個或兩個以 上抗原結合位點且為四價或多價結合蛋白。Dvd可為單特 異性的，亦即能夠結合一個抗原；或多特異性的，亦即能 夠結合兩個或兩個以上抗原。包含兩個重鏈Dvd多肽及兩 個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD-Ig。DVD-Ig之 每一半包含重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽，及兩個抗原結 15042S.doc -49- 201119673 合位點。各結合位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域，其中 母一抗原結合位點總計有6個CDR參與抗原結合。 術語「雙特異性抗體」係指藉由以下技術產生之全長抗 體：四源雜交瘤技術（參看Milstein，C.ACuell〇, A c
(1983) Nature 305(5934):第 537_54〇 頁）；使兩種不同單株 抗體化學結合（參看Staerz，U D等人，（1985) Nat咖 314(6012): 628-631);或將突變引入Fc區中之杵白結構技 術或類似方法（參看H〇lliger，P.等人，（1993) pr〇c NaU
Acad· Sci USA 90(14): 6444-6448) ’ 該等技術產生多種不 同免疫球蛋白物質，其中僅一者為功能性雙特異性抗體。 根據分子功能，雙特異性抗體在其兩個結合臂（一對 HC/LC)之一個臂上結合一個抗原（或抗原決定基），且在其 第二臂（一對不同的HC/LC)上結合不同抗原（或抗原決定 基）。根據此定義，雙特異性抗體具有兩個不同抗原結合 臂（在特異性及CDR序列方面），且對於其結合之各抗原而 言為單價的。 術》。 又重特異性抗體」係指可在兩個結合臂（一對 HC/LC)中之每一臂中結合兩個不同抗原（或抗原決定基）的 全長抗體（參看PCT公開案第w〇 〇2/〇2773號）。因此，雙重 特異性結合蛋白具有兩個具有相同特異性及相同CDR序列 之相同抗原結合臂’且對於其結合之各抗原而言為二價 的。 釔合蛋白之「功能性抗原結合位點」為結合標靶抗原之 •σ &位點。抗原結合位點之抗原結合親和力不一定與產生 150428.doc -50- 201119673 抗原結合位點之親本抗體一樣強，彳曰 、、，°合抗原之能力必須 可使用多種已知用於評價抗體與抗原姓人 、、·。σ <方法中之任一 者來量測。此外，本文之多價抗體之各 心谷抗原結合位點的抗 原結合親和力在數量上不必相同。
術居「細胞激素」為由-個細胞群體釋放且以細胞間 介體形式作用於另一細胞群體的蛋白質之通用術語。該等 細胞激素之實例為淋巴介質、單核球激素及傳統多肽激 素。細胞激素包括生長激素，諸如人類生長激素、n_曱硫 胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀 腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素；醣蛋白激 素，諸如促印泡激素（FSH)、促甲狀腺激素（TSH)及促黃體 激素（LH)，肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素； 胎盤生乳素；腫瘤壞死因子_α及腫瘤壞死因子_p ;苗勒氏 抑制物質（mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激 素相關肽；抑制素；活化素；血管内皮生長因子；整合 素·’血小板生成素（TPO);神經生長因子，諸如NGF-α ; 血小板生長因子；胎盤生長因子；轉化生長因子（TGF)， 諸如TGF-a及TGF-β ;胰島素樣生長因子-丨及胰島素樣生 長因子-11 ;紅血球生成素（EP0);骨生成誘導因子；干擾 素’諸如干擾素-a、干擾素-β及干擾素-γ ;群落刺激因子 (CSF)，諸如巨噬細胞—CSF(M-CSF);粒細胞巨噬細胞_ CSF(GM-CSF);及粒細胞-CSF(G-CSF);介白素（IL)，諸 如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、 150428.doc •51 · 201119673 IL-22、IL-23及IL-33 ;腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β;及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體（KL)。術語細胞 激素包括來自天然來源或重組細胞培養物之蛋白質，及原 生序列細胞激素之生物活性等效物。
術語「連接子」用於表示包含兩個或兩個以上經肽鍵連 接之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分之多 肽。該等連接子多肽為此項技術中所熟知（參看例如 Holliger，P.等人，（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ； Poljak, R.J·等人，（1994) Structure 2:1121-1123)。例示性連接子包括（但不限於）AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP(SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8) ; RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9)； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP (SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTPLKEAKVS 150428.doc •52· 201119673 (SEQ ID NO: 25) ； GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27)及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。 「免疫球蛋白怪定域」係指重鏈或輕鏈怪定域。人類 IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列為此項技術中所已知。 術語「單株抗體」或「mAb」係指自一群實質上同質之 抗體獲得的抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可以較少 量存在之可能天然存在之突變外皆相同。單株抗體針對單 一抗原具有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定 子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑對比，各mAb 針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」不應理解為需 要藉由任何特定方法製備抗體。 術語「人類抗體」意欲包括具有來源於人類生殖系免疫 球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明人類抗體可 例如在CDR且尤其CDR3中包括不由人類生殖系免疫球蛋 白序列編碼之胺基酸殘基（例如，藉由活體外隨機或位點 特異性突變誘發或藉由活體内體細胞突變引入之突變）。 然而，術語「人類抗體」並不欲包括來源於另一哺乳動物 物種（諸如小鼠）之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序 列上之抗體。 術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組方式製備、表 現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染至宿主細 胞中之重組表現載體表現之抗體（在下文章節II C中進一步 描述）、自重組組合人類抗體庫分離之抗體（Hoogenboom 150428.doc •53 - 201119673 H.R. (1997) ΊΓΙΒ Tech. 15:62-70 ; Azzazy Η·及 Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445 ; Gavilondo J.V.及 Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145 ；
Hoogenboom H.及 Chames P. (2000) Immunol. Today 21:371-378)、自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物（例 如小鼠）分離之抗體（參看Taylor，L· D.等人，（1992)>11^1_ Acids Res. 20:6287-6295 ; Kellermann S-A.及 Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnol. 13:593-597 ； Little M.等人（2000) Immunol. Today 2 1:364-370)、或藉由涉及 將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其 他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗 體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及值定 區。然而’在某些實施例中’使該等重組人類抗體進行活 體外突變誘發（或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，使 其進行活體内體細胞突變誘發）且因此，重組抗體之VH區 及VL區胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系及vl序列 且與人類生殖系VH及VL序列相關，但可能並非活體内天 然存在於人類抗體生殖系譜系内的序列。 「親和力成熟」抗體為在一或多個CDR中具有一或多處 變化之抗體，該（等）變化使得抗體對抗原之親和力相較於 不具有彼（等）變化之親本抗體得以改良。例示性親和力成 熟抗體對標靶抗原將具有奈莫耳或甚至皮莫耳（pic〇molar) 、及親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知的程序 製備。Marks等人，（1992) Bio/Technology 1〇: 779-783描述 I50428.doc 201119673 藉由VH及VL域改組進行親和力成熟。以下文獻描述了 CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發：Barbas等人，（1994)
Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-381 3 ; Schier 等人， (1995) Gene 169: 147- 155 ; Yelton 等人，（1995) j Immunol. 155: 1994-2004 ; Jackson 等人，（1995) j Immunol. 154(7): 3310-9 ;及 Hawkins 等人，（1992) J. Mol.
Biol. 226: 889-896，且在美國專利第6,914，128號中描述了 I 在選擇性突變誘發位置、接觸或超突變位置處以活性增強 型胺基酸殘基進行選擇性突變。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一物種之重鏈及輕鏈可 變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有 鼠類重鏈及輕鏈可變區連接至人類恆定區之抗體。 術浯「CDR移植抗體」係指包含來自一物種之重鏈及輕 鏈可變區序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列 經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有一或多個鼠 φ 類CDR(例如CDR3)已經人類CDR序列置換之鼠類重鏈及輕 鏈可變區之抗體。 術语「人類化抗體」係指包含來自非人類物種（例如小 鼠）之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH&/4VL序列的 至少-部分已經改變而更「類人類」，亦即更類似於人類 生殖系可變序列的抗體。一種類型之人類化抗體為cdr移 植抗體，其中將非人類CDR序列引入人類vh&vl序列中 以置換相應人類CDR序列。「人類化抗體」亦為免疫特異 性結合於相關抗原且包含實質上具有人類抗體胺基酸序列 150428.doc -55- 201119673 之構架（FR)區及實質上具有非人類抗體胺基酸序列之互補 決定區（CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片 段。術語「實質上」在CDR上下文中係指具有與非人類抗 體CDR之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至 少95%、至少98%或至少99°/。一致之胺基酸序列的CDR。 人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變域（Fab、Fab，、 F(ab’）2、FabC、Fv)之實質上全部’其中全部或實質上全 部CDR區對應於非人類免疫球蛋白（亦即供體抗體）之彼等 CDR區且全部或實質上全部構架區為人類免疫球蛋白共同 序列之彼等構架區。在一實施例中，人類化抗體亦包含免 疫球蛋白恆定區（Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定區）之至 少一部分。在一些實施例中’人類化抗體含有輕鏈以及至 少重鏈之可變域》抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈區、 CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含 有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類 化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈及/或 人類化重鏈之人類化可變域。 術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在 本文中可互換使用。此項技術中公認之此等術語係指相比 於抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺 基酸殘基可變（亦即高變）之胺基酸殘基的編號系統（Kabat 等人（1971) Ann. NY Acad，Sci_ 190:382-391 及 Kabat，Ε.Α· 等人 ’（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版’美國衛生及公共服務部（u.S. Department 150428.doc ·56· 201119673 ofHealth and HUman Services)，NIH公開案第 91_3242號）。 對於重鏈可變區而言，高變區範圍為CDR1之胺基酸位置 3 1至35，CDR2之胺基酸位置5〇至65，及CDR3之胺基酸位 置95至102。對於輕鏈可變區而言，高變區範圍為cdr12 胺基酸位置24至34，CDR2之胺基酸位置50至56，及CDR3 之胺基酸位置8 9至9 7。 術語「CDR」係指抗體可變序列内之互補決定區。重鏈 φ 及輕鏈之可變區中各存在三個CDR，各可變區之該三個 CDR指定為CDR1、CDR2A CDR3。術語「CDR組」係指存 在於單一可變區中結合抗原之三個CDR之群。此等CDr之 確切邊界已根據不同系統不同地加以界定。Kabat所述之 系統（Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immun〇i〇gicai Interest (美國國家衛生研究院（National lnstitutes of Health)，Bethesda，Md_ (1987)及（1991))不僅提供適用於抗 體之任何可變區的明確殘基編號系統，且亦提供界定三個 φ CDR之確切殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat cdr。
Chothia及同事（chothia及 Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917’ 及 Chothia 等人（1989) Nature 342: 877-883)發現
Kabat CDR内之某些子部分即使在胺基酸序列層面具有極 大多樣性’亦使用幾乎相同的肽主鏈構形。此等子部分指 定為LI、L2及L3或HI、H2及H3，其中「L」及「H」分別 表示輕鏈區及重鏈區。此等區可稱為Chothia CDR，其具 有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之 CDR之其他邊界已由 padiarl (1995) FASEB J. 9: 133-139及 150428.doc •57· 201119673
MacCallum (1996) J· Mol· Biol. 262(5): 732-45描述。其他 CDR邊界界定可能不嚴格遵循本文中之一種系統，但仍會 與Kabat CDR重疊，不過根據特定殘基或殘基群或甚至整 個.CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗研究結果，其可 能會縮短或延長。本文中所用之方法可利用根據此等系統 中之任一者所界定之CDR，但特定實施例使用Kabat或 Chothia界定之 CDR。 術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR之剩 餘序列。因為CDR序列之確切界定可由不同系統確定，所 以構架序列之含義遵循相應的不同解釋。六個CDR(輕鏈 之 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3，以及重鏈之 CDR-H1、 CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區在各鏈上 分成四個子區（FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於 FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於 FR3與FR4之間。在不將特定子區指定為FR1、FR2、FR3 或FR4之情形下，構架區當以其他名稱提及時代表天然存 在之單一免疫球蛋白鏈之可變區中之組合FR。FR代表四 個子區中之一者，且FR代表構成構架區之四個子區中之兩 個或兩個以上子區。 術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷 產生遺傳重排及突變以表現特定免疫球蛋白之成熟過程之 非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列（參看例如Shapiro等 人，（2002) Crit· Rev. Immunol. 22(3): 183-200 ;
Marchalonis 等人，（2001) Adv. Exp. Med. Biol· 484: 13- 150428.doc -58- 201119673 30)。本發明之多個實施例所提供之一個優點基於如下認 知.生殖系杬體基因比成熟抗體基因更可能保留物種中個 體之必需胺基酸序列結構特徵，因此當用於治療彼物種 時’不太可能認為其來自外來來源。 術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合抗原時抵消抗 原之生物活性。在一實施例中，中和結合蛋白結合細胞激 素且使其生物活性降低至少約2〇%、4〇%、60%、80%、 85%或85%以上。 術語「活性」包括諸如〇¥1)_：^對兩個或兩個以上抗原 之結合特異性及親和力的活性。 術語「抗原決定基」包括特異性結合於免疫球蛋白或τ 細胞受體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定 基決定子包括分子之化學活性表面基團（諸如胺基酸、糖 側鏈、磷醯基或磺醯基），且在某些實施例中，其可具有 特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗 φ 體所結合之抗原區。抗原決定基因此由已知結合至特異性 結合搭配物上之互補位點的抗原（或其片段）區之胺基酸殘 基組成。抗原性片段可含有一個以上抗原決定基。在某些 實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中 識別其標靶抗原時，則稱抗體特異性結合抗原。若抗體交 叉競爭（一抗體阻止另一抗體之結合或調節效應），則認為 抗體「結合於同一抗原決定基」。此外，抗原決定基之結 構疋義（重豐、類似、相同）提供很多資訊，但因為功能定 義涵蓋結構（結合）及功能（調節、競爭）參數，所以其通常 I50428.doc -59- 201119673 更有意義。
本文所用之術§吾「表面電浆共振」係指允許藉由（例如） 使用 BIAcore® 系統（BIAcore International AB, a GE
Healthcare company，Uppsala，Sweden and Piscataway，Nj) 偵測生物感測器基質内蛋白質濃度之改變來分析即時生物 特異性相互作用之光學現象。更多描述參看J0nsson, U等 人 ’（1993) Ann· Biol. Clin. 51:19-26 ; J5nsson，U.等人 (1991) Biotechniques 1 1:620-627 ; Johnsson，B.等人， (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 ;及 Johnnson，B.等人， (1991) Anal. Biochem. 198:268-277。 術語「Kon」係指如此項技術已知，結合蛋白（例如抗 體）與抗原締合形成例如抗體/抗原複合物之結合速率常 數。「Kon」亦稱為術語「結合速率常數」或「ka」，其 在本文中可互換使用。指示抗體與其標靶抗原之結合速率 或抗體與抗原之間的複合物形成速率之此值亦由以下方程 式展示： 抗體（「Ab」）+抗原（r Ag」）—Ab-Ag。 術語「koff」係指如此項技術已知，結合蛋白（例如抗 體）自例如抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。「K〇ff」 亦稱為術語「解離速率常數」或「kd」，其在本文中可互 換使用。此值指示抗體與其標靶抗原解離或複合物 隨時間分離成游離抗體及抗原之解離速率，如由以下方程 式所示：
Ab+Ag—Ab-Ag。 150428.doc 201119673 如本文可互換使用之術語「平衡解離常數」或「KD」 係指在滴定量測巾在平衡時獲得之值或藉由用解離速率常 數（Koff)除以結合速率常數（κ〇η)獲得之值。結合速率常 數:解離速率常數及平衡解離常數係用於表示抗體與抗原 之結合親和力。測定結合及解離速率常數之方法為此項技 術中所熟知的。使用基於螢光之技術可提供高靈敏度及檢 查平衡狀態生理緩衝液中之樣品的能力。可使用其他實驗
方法及儀器’諸如BIAc()re®(生物分子相互作用分析）檢定 (例如可自 BIACore lnternational AB，GE company, uppsala，Sweden購得之儀器）。另外亦可使用 可自 Sapidyne Instruments(B〇ise，Idah〇)購得之幻似八⑧ (動力學排除檢定）檢定。
於）以下：放射性同位素或放射性核種（例如A 「標記」及「可偵測標記」意謂連接於特定結合搭配物 (諸如抗體或分析物）例如以便使特異性結合對之成員（諸如 抗體及分析物）之間的反應變得可偵測的部分，且如此經 標記之特定結合搭配物（例如抗體或分析物）稱為「經可偵 測標記」。因此，術語「經標記結合蛋白」係指已併有標 記以便提供對結合蛋白之鑑別的蛋白f。在—實施例中了 ，記為能產生可用目測或儀器方式偵測出之信號之可偵測 標記物，例如併入經放射性標記之胺基酸或與連接於可由 經標記抗生物素蛋白(例如含有可以光學或比色法偵測之 螢光標記物或酶促活性之抗生蛋白鏈菌素)偵測之具有生 物素基部分之多肽。用於多肽之標記之實例包括⑽不限 150428.doc 61 99, 201119673 35 、原’螢光標記（例如FITC、若丹明（rh〇damine)及鋼系 金屬磷光體酶標記(例如辣根過氧化酶、勞光素酶、鹼 :生破酸酶)’·化學發光標記物；生物素基；由第二報導體 戠j之預定夕肽柷原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、二 杬體之、”σ合位點、金屬結合域及抗原決定基標籤）；及 諸：釓聲合物之磁化劑。通常用於免疫檢定之標記的代表 性實例包括發光部分（例如„丫 D定鏘（acHdinium)化合物）及發 營光之部分（例如蟹光素）。於本文中描述其他標記。就此 而σ邛力本身可能未經可偵測標記但在與另一部分反應 後可變得可谓測。使用「經可偵測標記」意欲涵蓋後一類 型之可偵測標記。 術語「接合物」係指結合蛋白（諸如抗體）化學連接於諸 如治療劑或細胞毒性劑之第二化學部分。本文所用之術語 「藥劑」表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由 生物材料製備之提取物。在一實施例中，治療劑或細胞毒 性劑包括（但不限於）百曰咳毒素（pertussis toxin)、紫杉醇 (taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽d (gramicidin D)、漠化乙鍵、吐根素（emetine)、絲裂黴素 (mitomycin)、依託泊苷（etoposide)、特諾波賽（tenoposide)、 長春新驗（vincristine)、長春驗（vinblastine)、秋水仙驗 (colchicin)、小紅莓（doxorubicin)、道諾黴素（daunorubicin)、 二經基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽 酿（mitoxantrone)、光神黴素（mithramycin)、放線菌素 150428.doc -62- 201119673 D(actin〇mycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡 因（procaine) ' 四卡因（tetracaine)、利多卡因（Hd〇caine)、 普秦洛爾（propranolol)及噪吟黴素（pUromyCin)以及其類似 物或同系物。當結合抗體在免疫檢定之情形中使用時，其 為用作偵測抗體之經可偵測標記抗體。 術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式存在之結合蛋 白（例如抗體）或其抗原結合部分。晶體為物質的一種固態 春 形式’其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶 體係由原子、離子、分子（例如蛋白質，諸如抗體）或分子 組裝體（例如抗原/抗體複合物）之規則的重複三維陣列構 成。此等二維陣列係根據此領域中充分瞭解之特定數學關 係排列。晶體中重複之基本單元或構建塊稱為不對稱單 元。以符合既定之定義明確的晶體學對稱性之排列重複不 對稱單元k供晶體之「單位晶胞」。在所有三個維度中藉 由規則平移重複單位晶胞提供晶體。參看Giege，R.及 # Ducruix^ Α· Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach,第 2 版，第 20 卜 16 頁， Oxford University Press，New York，New Y〇rk, (1999)。 術語「聚核苷酸」意謂兩個或兩個以上核苷酸（核糖核 苷鲅或去氧核苷酸或任一類核苷酸的經修飾形式）之聚合 形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。 術語「經分離聚核苷酸」將意謂一種聚核苷酸（例如基 因組、cDNA或合成來源者，或其某種組合），鑒於其來 源，該「經分離聚核苷酸」不與在自然界中可發現「經分 150428.doc -63- 201119673 離聚核苦酸」之整個聚核苦酸或其一部分締合；可操作地 連接至在自然界中不與其連接之聚核苷酸；或在自然界中 不作為較大序列之一部分存在。 術語「載體」意欲指一種能夠轉運已連接之另 核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指内部可接 合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病 毋載體’其中可將其他DNA區段接合至病毒基因組中。某 些載體此夠在引入§亥專載體之宿主細胞中自主複製（例如 具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體）。 其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞 中之後整合至宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組 一起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作地連接之 基因的表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」 (或簡稱為「表現載體」）。一般而言，適用於重扯dna^ 術中之表現載體通常呈質體形式。因為f體為㈣之最常 用形式’戶斤以在本說明書中，「質體」與「载體」可互換 使用U ’本發明意欲包括表5見載體之該等其他形式， 諸如起等效作用之病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病 毒、腺病毒及腺相關病毒）。 術語「可操作地連接」係指所述組分處於允許其按盆預 定方式起作用之關係中的併接叫 吏控制序列「可操作地連 接」至編碼序列係以使編石馬序列之表現在與控制序列相容 之條件下實現的方式接合。「可操作地連接」《序列包括 與相關基因鄰接之表現控制序列以及反式作用或在一定距 150428.doc -64 - 201119673 離外作用以控制相關基因的表現控制序列。術肖「表現控 制序列」係、指實現所接合之編碼序列表現及加卫所必需之 聚核Μ序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、 啟動子及強化子序列；有效RNA加1信號，諸如剪接及聚 腺苦酸化信m胞質mRNA穩定之序列；冑高轉譯效 率之序列(亦即Kozak共同序列）；增強蛋白質穩定性之序 列；及必要時增加蛋白質分泌之序列。該等控制序列之性
質視宿主生物體而不同；在原核生物中，料控制序列一 般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核 生物中，該等控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。 術語「控制序列」意欲包括對於表現及加工而言有必要存 在的組分，且亦可包括適宜存在之其他組分，例如前導序 列及融合搭配物序列。 「轉型」係指使外源⑽八進入宿主細胞中之任何過程。 可使用此項技術中熟知的多種方法在天然或人工條件下進 打轉型。轉&可憑藉將夕卜來核酸序列插入至原才玄生物或真 核生物宿主細胞中之任何已知方法進行。該方法係基於所 轉型之伯主細胞選擇且可包括（但不限於）病毒感染、電穿 孔、脂質體轉染及粒子轟擊。該#「轉型」細胞包括插入 之DNA能夠以自主複製f體或宿主染色體之—部分的形式 複製的穩定轉型細胞。其亦包括在有限時段内短暫表現所 插入之DNA或RNA的細胞。 術5吾「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）意欲指 已引入外源DNA之細胞。在一實施例中，帛主細胞包含兩 150428.doc -65- 201119673 個或兩個以上（例如多個）編碼抗體之核酸，諸如在例如美 國專利第7,262,028说中所述之宿主細胞。該等術語不僅欲 才曰特疋個體細月包，而且亦指該細胞之子代。因為某些修飾 可能因突變或環境影響而在繼代中發生，所以該子代實際 上可能不與親本細胞相同，但其仍包括在術語「宿主細 胞」之範疇内。在一實施例中，宿主細胞包括選自生物界 中之任一者的原核細胞及真核細胞。在另一實施例中，真 核、、’田胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一實 施例中，宿主細胞包括（但不限於）原核細胞株大腸桿菌； 哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2及 PER.C6 ;昆蟲細胞株Sf9 ;及真菌細胞釀酒酵母。 重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型可使用標準 技術進行（例如電穿孔、脂質體轉染）。酶促反應及純化技 術可根據製造商說明書或如此項技術中通常所實現或如本 文所述執行。上述技術及程序一般可根據此項技術中熟知 之習知方法及如本說明書全文所引用及論述之各種綜合性 參考文獻及更具體之參考文獻中所述執行。參看例如 Sambrook 等人，（1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, N.Y.) ° 如此項技術中已知之「轉殖基因生物體」係指具有含 有轉殖基因之細胞的生物體，其中引入生物體（或生物體 之祖先）中之轉殖基因表現並不在該生物體中天然表現之 多肽。「轉殖基因」為穩定且可操作地整合至發育成轉殖 150428.doc -66 - 201119673 基因生物體之細胞之基因組中，從而引導所編碼基因產物 於轉殖基因生物體之一或多種細胞類型或組織中表現的 DNA構築體。
術s吾「調控」與「調節」可互換使用，且係指改變或變 化相關分子之活性（例如細胞激素之生物活性）。調節可為 增加或降低相關分子之某一活性或功能之量值。分子之例 示性活性及功能包括（但不限於）結合特徵、酶促活性、細 胞受體活化及信號轉導。 相應地，術語「調節劑」為能夠使相關分子之活性或功 能（例如細胞激素之生物活性）改變或變化的化合物。舉例 而口，5周節劑可引起分子的某一活性或功能之量值相較於 在無該調節劑存在下㈣察到之活性或功能之量值增加或 減小。在某些實施例中，調節劑為降低·分子之至少一種活 性或功能之量值的抑制劑。例示性抑制劑包括(但不限於) 蛋白質、肽、抗體、肽體（peptib〇dy)、碳水化合物或小有 機分子。肽體描述於例如WO 〇 1/83525中。 術語「促效劑」係指當與相關分子接觸時引起分子的某 -活性或功能之量值相肖於在無促效劑存在下所觀察到之 活性或功能之量值增加的調節劑。相關特定促效劑可包括 (但不限於)多肽、核酸、碳水化合物或結合於抗原之任何 其他分子。 術術語拮抗劑」或「抑制 時引.起分子的某一活性或功能 在下所觀察到之活性或功能之 劑」係指當與相關分子接觸 之量值相較於在無拮抗劑存 里值降低的調節劑。相關特 150428.doc -67- 201119673 定拮抗劑包括阻斷或調節抗原之生物或免疫活性之拮抗 劑。抗原之括抗劑及抑制劑可包括（但不限於）蛋白質、核 酸、碳水化合物及結合於抗原之任何其他分子。 術語「有效量」係指足以降低或改善病症或其一或多種 症狀之嚴重程度及/或持續時間；抑制或預防病症進展； 引起病症消退；抑制或預防與病症相關之一或多種症狀復 發、發展、發作或進展；偵測病症，或增強或改良另一療 法（例如預防劑或治療劑）之預防或治療作用的療法之量。” 「患者」與「個體」在本文中可互使用’指動物，諸如 哺乳動物’包括靈長類動物(例如人類、猴及黑獲猩非 靈長類動物(例如乳牛、豬、駱駝 '美洲駝、，馬、山羊、 兔、綿羊、倉鼠、天竺鼠1、犬、大鼠、小鼠及崎）、 禽類（例如鴨或鶴則魚。較佳地，患者或個體為人類， 诸如正在針對疾病、病症或病狀進行治療或評估之人類、 患疾病、病症或病狀風險之人類、罹患疾病、病症 或病狀之人類，及/或正在針對疾 療之人類。 扃症或病狀進行治 術語「樣品」以其最廣泛意義使用。「 (但不限於)來自活物〇ivingthing)或先前為活物：二 的物質。該等活物包括(但不限於)人類、小；里 猴、犬、兔及其他動物。該等物質 鼠、 如全血)、血喂、血〜質。括(隹不限於)血液(例 } 水血清、尿液、羊水、说、.六 白血球、單杉r έ胎盆 月/之、内皮細胞、 早核、，，田胞、其他細胞、器官 結及脾臟。 、，且為、骨髓、淋巴 150428.doc •68· 201119673 組分」及「至少一種組分」一般係指可包括於套組中 乂根據本文所述之方法及此項技術中已知之其他方法檢定 測忒樣(諸如患者尿液、血清或血漿樣品）之捕捉抗體、 偵測或結合抗體、對照物、校正劑、-系列校正劑、靈敏 度’、且（sensitivity panei)、容器、緩衝液、稀釋劑、鹽、 酶、酶之輔因子、偵測試劑、預處理試劑/溶液、受質（例 如呈溶液形式）、停止溶液及其類似物。因此，在本發明 下文中 至少一種組分」及「組分」可包括如上之 多肽或其他分析物，諸如包含分析物（諸如多肽）之組合 物，其視情況諸如藉由結合於抗分析物（例如抗多肽）抗體 而固疋於固體支撐物上。一些組分可呈溶液形式或經凍乾 以在復原後用於檢定中。 對物」係指已知不含分析物（「陰性對照物」）或含 有刀析物（陽性對照物」）之組合物。陽性對照物可包含 已知濃度之分析物。「對照物」、「陽性對照物」及「校正 诏」在本文中可互換使用，才旨包含已知濃度之分析物的組 口物。@性對照物」可用於確定檢定效能特徵且為試劑 (例如分析物）之完整性的適用指示劑。 「預定截止」及「預定程度」-般係指用以藉由將檢定 結果相對於預定截止/程度進行比較來評估診斷/預後/治療 功效結果的檢定截止值，其中預定截止/程度已與各種臨 床參數（例如疾病之嚴重度、進展/無進展/改良等）相聯繫 或相關聯。儘管本發明可提供例示性預定程度，但眾所周 失戴止值可視免疫檢^之性f (例如所使用之抗體等）而變 150428.doc •69· 201119673 化。此外，針對其他免疫檢定來調適本發明以基於本發明 獲得用於彼等其他免疫檢定之免疫檢定特定截止值完全在 熟習此項技術者之普通技能内。儘管預定截止/程度之確 切值可隨檢定而變化，但如本文所述之相關性（若存在）應 普遍適用。 如本文所述之診斷檢定中所用之「預處理試劑」（例如 溶解、沈殿及/或增溶試劑）為使存在於測試樣品中之任何 細胞溶解及/或使存在於測試樣品中之任何分析物增溶的 試劑。如本文巾進-步料，並麵有樣品均必需預處 理。尤其’使分析物(例如相關多肽)增溶可能使分析物自 存在於樣品中之任何内源性結合蛋白釋放。預處理試劑可 為同質的（無需分離步驟）或異質的㈤要分離步驟藉由 使用異質預處理試劑，自泪丨丨q梯 w目判忒樣品移除任何沈澱之分析物 結合蛋白’隨後進行檢定之下—步驟。 「品質控制試劑」在本文所述之免疫檢定及套組的情形 下包括(但不限於)校正劑、對照物及靈敏度組。通常使用 「校正劑」或「標準物」（例如一或多個，諸如複數個）來 建立㈣分析物（諸如抗體或分析物）濃度之校正（標準）曲 線。或者，可使用接近預定陽性/陰性截止之單一校正 =°可聯合使用多個校正劑（亦即一種以上校正劑或不同 量之校正劑），以便構成「靈敏度組」。 風險」係指目前或在將來某個時點發生特定事件之可 能性或機率。「風險分層」係、指使得醫師可將患者分成具 有發展特定疾病、病症或病狀之低、巾、高或最高風險的 150428.doc 201119673 一系列已知臨床風險因子。 特異性」在特異性結合對之成員(例如抗原“ 料體U其抗原反應性片段）)之間的相互作用之情形下係) 心相互作用之選擇反應性。片語「特異性結合於」及㈡ 似片語係指抗體（或其抗原反應性片段）特異性結合於^斤 物（或其片段）且不特異性結合至其他實體之能力。 「特異性結合搭配物」&特異性結合對之成員。特显性 結合對包含兩個不同分子，其經由化學或物理方式彼此特 異性結合。因此，除常見免疫檢定之抗原與抗體特異性结 合對料，其他特異性結合對可包括生物素與抗生物素蛋 白（或抗生蛋白鏈菌素）；碳水化合物與凝集素；互補核苦 酸序列；效應分子與受體分子；㈣子與酶；酶抑制劑盘 酶；及其類似者。此外，特異性結合對可包括為初始特異 性結合成員之類似物的成員，例如分析物類似物。免疫反 應性特異性結合成員包括經分離或以重組方式產生之抗 原、抗原片段及抗體（包括單株及多株抗體）、以及其複: 物、片段及變異體（包括變異體片段）。 「變異體」意謂因胺基酸之添加（例如插入）、缺失或保 守性取代而在胺基酸序列不同於既定多肽(例如il_18、 BNP、NGAL或HIV多月太’或抗多肽抗體），但保留既定多 肽之生物活性（例如變異體IL_18可與抗IL]8抗體競爭結合 於IL-18)的多肽。此項技術中認為胺基酸之保守性取代（亦 即胺基酸經類似特性(例如親水性及帶電區域程度及分佈） 之不同胺基酸置換）通常涉及微小變化。如此項技術中所 150428.doc 201119673 瞭解’此等微小變化部分可由考慮胺基酸之親水指數來鑑 別（參看例如 Kyte等人，（1982) j M〇丨 Bi〇i 157: 1〇5_ 132)。胺基酸之親水指數係基於對其疏水性及電荷之考 慮。在此項技術中已知類似親水指數之胺基酸可經取代且 仍保留蛋白質功能。在一態樣中，具有親水指數士2之胺基 酸經取代。絲酸之親水性亦可用於顯示可產生保留生物 功能之蛋白質的取代。對肽之胺基酸親水性之考慮可計算 該肽之最大局部平均親水性，其為—種已經報導與抗原： 及免疫原性密切相關之有用測量（參看例如美國專利第 4’554’101號卜如此項技術中所瞭解’具有類似親水性值 之胺基St之取代可產生保留生物活性（例如免疫原性）之 肽。在一態樣中，用彼此親水性值在±2範圍内之胺基酸進 行取代。胺基酸之疏水性指數及親水性值皆受胺基酸之特 定側鏈影響。與該觀測結果一致，生物功能相容之胺基酸 取代經瞭解視胺基酸，尤其胺基酸側鏈之相對類似性（如 疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性所示）而定。「變 異體」亦可用於描述已經差異性處理（諸如蛋白質水解、 磷酸化或其他轉譯後修飾）但仍保留生物活性或抗原反應 性（例如結合於IL-18之能力）的多肽或其片段。除非另有相 反說明，否則本文中使用「變異體」意欲涵蓋變異體之片 段。 I· DVD結合蛋白之產生 本發明係關於結合一或多個標靶之雙可變域結合蛋白及 其製備方法。在一個實施例中，結合蛋白包含多肽鏈，其 150428.doc -72- 201119673 中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n ’其中VD1為第 一可變域，VD2為第二可變域，C為恆定域’ X1表示胺基 酸或多肽，X2表示Fc區，η為〇或1。本發明結合蛋白可使 用多種技術產生。本發明提供產生該結合蛋白之表現載 體、宿主細胞及方法。 Α.產生親本單株抗體 DVD結合蛋白之可變域可自親本抗體（包括結合相關抗 原之多株及mAb)獲得。此等抗體可天然存在或可藉由重 組技術產生。 MAb可使用此項技術中已知之多種技術製備，包括使用 融合瘤、重組及嗟菌體呈現技術或其組合。舉例而言，可 使用融合瘤技術製造mAb，包括此項技術中已知且例如在 以下文獻中教示之彼等融合瘤技術：Harlow等人，（1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版）；Hammerling 等人，（i 9g i).
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.)。術§吾「單株抗體」不限於經由融合瘤技 術產生之抗體。術語「單株抗體」係指來源於單一純系， 包括任何真核、原核或噬菌體純系之抗體，而非產生其之 方法。選擇融合瘤，選殖且針對包括旺盛融合瘤生長、高 抗體產量及如下文實例1論述之所需抗體特徵之所需特徵 進一步篩選。融合瘤可在同基因型動物 '缺乏免疫系統之 動物（例如裸小鼠）中活體内培養及擴增或在細胞培養物中 活體外培養及擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤之方法為— 150428.doc -73- 201119673 般技術者所熟知。在一特定實施例中，融合瘤為小鼠融合 瘤。在另一實施例中，融合瘤產生於非人類、非小鼠物種 中’諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。在另一實施例 中’融合瘤為人類融合瘤，其中將人類非分泌性骨髓瘤與 表現結合特異性抗原之抗體的人類細胞融合。 如美國專利第5,627,052號；PCt公開案第w〇 92/02551 號及Babc〇ck，J.S.等人，（1996) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 93: 7843-7848中所述，亦使用此項技術中稱為選擇淋巴細 胞抗體法（SLAM)之程序由單一經分離淋巴細胞產生重組 mAb。在此方法中，鑑別分泌相關抗體之單個細胞（例如 來源於經免疫動物之淋巴細胞），且藉由逆轉錄酶pCR自細 胞救援重鏈及輕鏈可變區cDNA。隨後可在適當免疫球蛋 白恆定區（例如人類恆定區）之情形下，於諸如c〇s或ch〇 細胞之哺乳動物宿主細胞中表現此等可變區。隨後可例如 藉由淘選經源自活體内選擇之淋巴細胞之經擴增免疫球蛋 白序列轉染的宿主細胞以分離出表現針對相關抗原之抗體 的細胞，對經轉染細胞於活體外進行進一步分析及選擇。 經擴增免疫球蛋白序列可在活體外諸如藉由活體外親和力 成熟法（諸如PCT公開案第w〇 97/29131號及第w〇 00/56772號中所述之方法）進一步操作。 單株抗體亦藉由以相關抗原使包含—些或全部人類免疫 球蛋白基因座的非人類動物免疫產生。在一實施例中，非 人類動物為XEN0M0USE轉殖基因小鼠，其為包含人類免 疫球蛋白基因座之大片段且缺乏小鼠抗體產生之經工程改 150428.doc •74- 201119673 造之小鼠品系。參看例如Green等人，（1994) Nature Genet· 7: 13-21及美國專利第5,916,771號；第5,939,598號；第 5,985,615 號；第 5,998,209 號；第 6,075,181 號；第 6,091，001號；第 6,1 14,598號及第 6,130,364號。亦參看？(：丁 公開案第WO 91/10741號；第WO 94/02602號；第WO 96/34096號；第 WO 96/33735 號；第 WO 98/16654號；第 WO 98/24893號；第 WO 98/50433號；第 WO 99/45031 號； 第 WO 99/53049號；第 WO 00/09560號及第 WO 00/037504 號。XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之成年 樣人類譜系且產生抗原特異性人類單株抗體。 XENOMOUSE轉殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及X 輕鏈基因座之百萬驗基（me gab as e)規模的生殖系構型YAC 片段而含有約80%人類抗體譜系。參看Mendez等人， (1997) Nature Genet. 15: 146-156 ; Green 及 Jakobovits (1998) J· Exp. Med. 1 88: 483-495。 亦可使用活體外方法來製備親本抗體，其中篩選抗體庫 以鑑別具有所需結合特異性之抗體。該篩選重組抗體庫之 方法為此項技術中所熟知且包括例如以下文獻中所述之方 法：Ladner等人，美國專利第5,223,409號；PCT公開案第 WO 92/18619號；第 WO 91/17271號；第 WO 92/20791 號； 第 WO 92/15679號；第 WO 93/01288號；第 WO 92/01047 號；第 WO 92/09690 號及第 WO 97/2913 1 號；Fuchs 等人， (1991) Bio/Technology 9·· 1370-1372; Hay 等人，（1992) Hum. Antibod· Hybridomas 3: 81-85 ; Huse等人；（1989) 150428.doc -75- 201119673
Science 246: 1275-1281 ; McCafferty 等人，（1990) Nature 348: 552-554; Griffiths 等人，（1993) EMBO J. 12: 725-734 ; Hawkins等人；（1992) J. Mol. Biol· 226: 889-896 ; Clackson等人，（1991) Nature 352: 624-628 ; Gram等人， (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 ； Garrad 等人，（1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom 等人，（1991) Nucl. Acid Res. 19: 4133-4137 ;及 Barbas 等 人，（1991) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 88: 7978-7982，及 美國專利公開案第2003/0186374號。 亦可使用此項技術中已知的多種噬菌體呈現法產生本發 明之親本抗體。在噬菌體呈現法令，功能性抗體域呈現於 載有編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子表面上。詳言 之 了利用5亥°益函體呈現由譜系或組合抗體庫（例如人類 或鼠類）表現之抗原結合域。可用抗原，例如使用經標記 抗原或結合或捕捉於固體表面或珠粒上之抗原來選擇或鑑 別表現結合相關抗原之抗原結合域的噬菌體。此等方法中 所用之。盆菌體通常為絲狀噬菌體，該噬菌體包括自Fab、 Fv或二硫化物穩定之Fv抗體域與噬菌體基因πΐ或基因VIII 蛋白質重組融合之噬菌體表現的以及Ml 3結合域。可用於 製備本發明抗體之噬菌體呈現法之實例包括以下文獻中揭 示之方法.Brinkman 等人，（1995) J. Immunol. Methods 182. 41-50 ’ Ames專人，（1995) J. Immunol. Methods 184: 177 186 ’ Kettleborough等人，（1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958 ; persic 等人，（1997) Gene 187: 9_18 ; Burton 等人， 150428.doc 201119673 (1994) Advances in Immunol. 57: 191-280 ; PCT申請案第 PCT/GB91/01 134號；PCT公開案第 WO 90/02809號；第 WO 91/10737號；第 WO 92/01047號；第 WO 92/18619號；第 WO 93/1 1236號；第 WO 95/15982號及第 WO 95/20401 號； 及美國專利第5,698,426號；第5,223,409號；第5,403,484 號；第 5,580,717號；第 5,427,908號；第 5,750,753 號；第 5,821,047 號；第 5,571,698 號；第 5,427,908 號；第 5,5 16,637 號；第 5,780,225 號；第 5,658,727 號；第 5,733,743號及第 5,969，108號。 如本文參考文獻中所述，在噬菌體選擇後，可自噬菌體 分離抗體編碼區且將其用於產生包括人類抗體之完整抗體 或任何其他所需抗原結合片段，且例如下文詳細描述，使 其於包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細 菌之任何所需宿主中表現。舉例而言，亦可使用此項技術 中已知之方法使用重組產生Fab、Fab1及F(ab，）2片段之技 術’諸如PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax等人， (1992) Bi〇Techniques 12(6): 864-869; Sawai 等人，（1995) AJRI 34·· 26-34;及 Better 等人，（1988) Science 240: 1041- 1043中揭示之方法。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的實 例包括美國專利第4,946,778號及第5,258,498號；Huston 寺人，（1991)，Methods Enzymol. 203:46-88 ; Shu 等人， (1993) proc· Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999 ;及 Skerra 等人，（1988) Science 240: 1038-1040 中所述之技 術。 150428.doc ·77· 201119673 可應用此項技術已知之篩選大型組合庫之其他方法替代 用噬菌體呈現篩選重組抗體庫來鑑別親本抗體。一種類型 之替代表現系統為如以下文獻中所述將重組抗體庫表現為 RNA-蛋白質融合體之表現系統：pCT公開案第w〇 98/31700號，及R〇berts，r w.&Szostak，J.W.(1997)Proc_ Natl· Acad. Sci. USA 94_· 12297-12302。在此系統中，在 mRNA與其藉由活體外轉譯在3’端具有嘌呤黴素（一種肽基 丈體抗生素）之合成mRNA而編碼之肽或蛋白質之間形成共 價融合體。因此，可基於所編碼之肽或蛋白質（例如抗體 或其部分）之特性（諸如抗體或其部分與雙重特異性抗原之 I合），自mRNA之複雜混合物（例如組合庫）中富集特異性 mRNA。可藉由如本文所述之重組方式（例如在哺乳動物宿 主細胞中）表現自該等庫篩選回收之編碼抗體或其部分之 核酸序列’且此外，可藉由再進行幾輪已在最初選擇之序 列中引入突變之mRNA-肽融合體的篩選或藉由如本文所述 使重組抗體活體外親和力成熟之其他方法使該等核酸序列 進一步親和力成熟。 在另一方法中，亦可使用此項技術中已知的酵母呈現法 產生親本抗體。在酵母呈現法中，使用遺傳學方法將抗體 域繫栓於酵母細胞壁且使其在酵母表面上呈現。詳言之， 可利用該酵母來呈現由譜系或組合抗體庫（例如人類或鼠 類）表現之抗原結合域。可用於製備親本抗體之酵母呈 現法的實例包括美國專利第6,699,658號中所揭示之方法。 本文所述之抗體可經進一步修飾產生CDR移植抗體及人 150428.doc -78- 201119673 類化親本抗體。CDR移植親本抗體包含來自人類抗體之重 鏈及輕鏈可變區序列，其中^及/或火的一或多個cDRg 經結合相關抗原之鼠類抗體之CDR序列置換。來自任何人 類抗體之構架序列可用作CDR移植之模板。然而，該構架 上之直鏈置換通常導致對抗原之結合親和力在—定程度上 損失。人類抗體與初始鼠類抗體之同源性愈高，組合鼠類 CDR與人類構架在CDR中引入可能降低親和力的失真之可 能性愈小。因此，在一實施例中，經選擇以置換除CDRi 外的鼠類可變構架之人類可變構架與鼠類抗體可變區構架 具有至少6 5 %序列一致性。在一實施例中，人類與鼠類可 變區除CDR之外具有至少70%序列一致性。在一特定實施 例中，人類與鼠類可變區除CDR之外具有至少75%序列一 致性。在另一實施例中，人類與鼠類可變區除CDR之外具 有至少80%序列一致性。此項技術中已知產生該等抗體之 方法（參看EP 239,400 ; PCT公開案第WO 91/09967號；及 美國專利第5,225,539號；第5,530,101號及第5,585,089 號）；面飾或表面重塑（EP 592,106 ; EP 5 19,596 ; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498; Studnicka 等人， (1994) Prot. Engineer· 7(6): 805-814 ;及 Roguska 等人， (1994) Proc· Acad. Sci· USA 91: 969-973);鏈改組（美國專 利第5,565,3 52號）；及抗個體基因型抗體。 人類化抗體為來自結合所需抗原之非人類物種的抗體分 子，且其具有一或多個來自非人類物種之CDR及來自人類 免疫球蛋白分子之構架區。已知人類Ig序列揭示於例如 150428.doc •79· 201119673
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Immunol. 28(4/5): 489-498 ； Studnicka等人，（1994) Prot. Engineer. 7(6): 805-814 ; Roguska等人，（1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973 ;PCT公開案第 WO 91/09967 號；第 US 98/16280號；第 US 96/18978號；第 US 91/09630 號；第 US 91/05939號；第 US 94/01234號；第 GB 89/01334 號；第 GB 91/01134 號；第 GB 92/01755 號；第 WO 90/14443號；第 WO 90/14424號；及第 WO 90/14430號；歐 洲專利公開案第EP 229246號；第EP 592，106號；第EP 519,596號；及第£? 239,400號；及美國專利第5,565,332 號；第 5,723,323 號；第 5,976,862號；第 5,824,514號；第 5,817,483 號；第 5,814,476 號；第 5,763，192 號；第 5,723,323 號；第 5,766,886 號；第 5,714,352 號；第 6,204,023 號；第 6，180,370 號；第 5,693,762 號；第 5,530，101 號；第 5,585,089 號；第 5,225,539 號及第 4,816,567 號。 B.選擇親本單株抗體之準則 150428.doc -82- 201119673 本發明之一實施例係關於選擇具有DVD-Ig分子所需之 至少一或多種特性的親本抗體。在一實施例中，所需特性 係選自一或多種抗體參數。在另一實施例中，抗體參數係 選自由以下組成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效 能、生物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解度、產生 效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交叉反 應性及直系同源抗原結合。 | B1·對抗原之親和力 治療性mAb之所需親和力可視抗原性質及所需治療終點 而定。在一實施例中，當單株抗體阻斷細胞激素-細胞激 素受體相互作用時’其具有較高親和力（Kd=〇 〇1〇 5〇 PM) ’因為該等相互作用通常為高親和力相互作用（例如 <pM-<nM範圍）。在該等情形下，mAb對其標靶之親和力 應等於或高於細胞激素（配位體）對其受體之親和力。另一 方面’親和力較小（>nM範圍）之mAb可在治療上有效用於 • 例如清除循環之潛在病原性蛋白質，該mAb例如結合、螯 合及清除Α-β類澱粉蛋白之循環物質的單株抗體。在其他 情形下，藉由定點突變誘發降低現有高親和力mAb之親和 力或使用對;乾具有較低親和力之mAb可用於避免潛在副 作用，例如高親和力mAb可螯合/中和其所有預期標靶，從 而完全消耗/消除所靶向之蛋白質的功能。在此情形下， 低親和力m A b可螯合/中和標靶中可能造成疾病症狀（病理 f生或過度產生之含量）之部分，從而使標無之一部分可繼 續執仃其正常生理功能。因此，有可能降mKd以調整劑量 150428.doc -83- 201119673 及/或降低副作用。親本mAb之親和力可能在適當耙向細胞 表面分子方面起作用以實現所需治療結果。舉例而言，若 標羊巴以尚密度表現於癌細胞上且以低密度表現於正常細胞 上，則較低親和力mAb將在腫瘤細胞上結合比在正常細胞 上數目較多之標靶，使得經由ADCC或CDC引起腫瘤細胞 /肖除’且因此可能產生所需治療效應.。因此，選擇具有所 需親和力之mAb可能與可溶性標靶與表面標靶兩者均相 關。 受體在與其配位體相互作用後引起之信號傳導可視受 體-配位體相互作用之親和力而定。類似地，可設想 對表面受體之親和力可決定細胞内信號傳導之性質及mAb 可傳遞促效劑#號還是傳遞拮抗劑信號。介導之信號 傳導的基於親和力之性質可影響其副作用概況。因此，需 要藉由活體外及活體内實驗仔細確定治療性單株抗體之所 需親和力及所需功能。 結合蛋白（例如抗體）之所需K d可視所需治療結果以實驗 方式確定。在一實施例中’選擇對特定抗原之親和力(Kd) 等於或大於DVD-Ig對同一抗原之所需親和力的親本抗 體^情既定DVD-Ig分子之親本抗體可為㈣抗體或不 同抗體。藉由Biaeore或另—類似技術評估抗原結合親和力 及動力學。在一實施例中’各親本抗體對其抗原之解離常 數（Kd)選自由以下組成之群：至多約1〇_7 M ;至多約8 m ; 至多約1〇9 Μ;至多約ίο’ M;至多約1〇-丨丨M;至多約ι〇•丨2 及至夕1G Μ。獲得VD1之第一親本抗體及獲得VD2之第 150428.doc •84· 201119673 一親本抗體可對各別抗 & 〜、有類似或不同親和力（KD)。如 表面電漿共振所量測， ^ 各親本抗體對抗原之結合速率常數 (Kon)選自由以下組成 •至>、約10 M.V1 ;至少約 1〇3 Μ-ι -1 至少約 104 M'V1 . - ’〉、約1〇3 Μ·丨，；及至少約1〇6 μ-】，。 獲得VD1之第一_太ρ w ^ ^ ’、几粗及獲得VD2之第二親本抗體可對 各別彳几原具有類彳^ $ T m 頰似或不同之結合速率常數（K〇n)。在一實 施例中，如表面雷喈妓丨 θ 电水，、振所置測，各親本抗體對抗原之解
離速率常數（K〇ff)選自 目由以下組成之群：至多約1〇·3 ,; 至多約1〇·4 S-1;至多約1〇·5 S.1;及至多約1〇.6〆。獲得 VDR第-親本抗體及獲得彻之第三親本抗體可對各別 抗原具有類似或不同解離速率常數（K〇ff)。 B2.效能 親本單株抗體之所需親和力/效能將視所f治療結果而 定。舉例而言，對於受體-配位體（R_L)相互作用，親和力 (kd)等於或大於R_L kd(pM範圍）。為簡單清除病理性循環 蛋白質，例如清除各種循環Α_β肽物質，kd可能處於低 範圍内。此外，Kd亦將視標靶是否表現相同抗原決定基之 多個複本而定，例如mAb靶向Αβ寡聚物中之構形抗原決定 基0 若VDI及VD2結合相同抗原但結合不同抗原決定基，則 DVD-Ig將含有4個結合相同抗原之位點，因此增大親和性 且從而增大DVD-Ig之表觀kd。在一實施例中，選擇kd等 於或小於DVD-Ig之所需kd的親本抗體。親本mAb之親和力 考慮因素亦可視DVD-Ig是否含有4個或4個以上相同抗原 150428.doc -85- 201119673 結合位點（亦即來自單個mAb之DVD-Ig)而定。在此情形 下，表觀kd由於親和性而大於mAb。該等DVD-Ig可用於使 表面受體交聯、增大中和效能、增強對病理性蛋白的清除 等。 在一實施例中，選擇對特異性抗原之中和效能等於或大 於DVD-Ig對相同抗原之所需中和潛力的親本抗體。可藉 由標靶依賴性生物檢定評估中和效能，其中適當類型之細 胞回應於標靶刺激而產生可量測信號（亦即增殖或細胞激 素產生），且由mAb對標把之中和可以劑量依賴性方式減 弱該信號。 B3.生物功能 單株抗體可潛在地執行若干功能。一些此等功能列於表 1中。此等功能可由活體外檢定（例如基於細胞之檢定及生 物化學檢定）及活體内動物模型來評估。 表1 :治療性抗體的一些潛在應用 標靶(類別） 作用機制(標靶） 可溶性(細胞激 素、其他） 中和活性(例如細胞激素） 增強清除(例如Αβ寡聚物） 增加半衰期(例如GLP 1) 細胞表面(受體、 其他） 促效劑(例如GLP1 R ; EPOR等） 拮抗劑(例如整合素等） 細胞毒素(CD 20等） 蛋白質沈積物 增強清除/降解(例如Αβ斑塊、澱粉樣蛋白沈積物） 可選擇具有本文實例中於表1中所述之不同功能的MAb 以實現所需治療結果。接著可以DVD-Ig形式使用兩種或 兩種以上所選親本單株抗體以在單一 DVD-Ig分子中實現 兩種不同功能。舉例而言，可藉由選擇中和特定細胞激素 150428.doc -86- 201119673 功能之親本mAb及選擇增強對病理性蛋白之清除的親本 mAb來產生DVD-Ig。類似地，可選擇識別兩種不同細胞表 面受體之兩種親本單株抗體，一種mAb對一種受體具有促 效劑功能，且另一種mAb對另一受體具有拮抗劑功能。此 等兩種各具有不同功能之所選單株抗體可用於建構單一 DVD-Ig分子，在單一分子中具有所選單株抗體之兩種不 同功能（促效劑及拮抗劑）。類似地，兩種各阻斷各別受體 配位體（例如EGF及IGF)之結合的針對細胞表面受體具有拮 抗性之單株抗體可以DVD-Ig形式使用。相反，可選擇拮 抗性抗受體mAb(例如抗EGFR)及中和抗可溶介體（例如抗 IGFl/2)mAb 來製備 DVD-Ig。 B4.抗原決定基識別： 蛋白質之不同區可執行不同功能。舉例而言，細胞激素 之特定區與細胞激素受體相互作用以引起受體活化，而蛋 白質之其他區可能為使細胞激素穩定所需。在此情形下， 可選擇特異性結合至細胞激素上之受體相互作用區之mAb 且因此阻斷細胞激素-受體相互作用。在一些情形下，例 如某些結合多個配位體之趨化因子受體情形下，可選擇結 合於僅與一種配位體相互作用之抗原決定基（趨化因子受 體上之區）的mAb。在其他情形下 > 雖然單株抗體可結合 於標靶上不直接負責蛋白質生理功能之抗原決定基，但使 mAb與此等區結合會干擾蛋白質的生理功能（位阻）或改變 蛋白質構形，使得蛋白質不能起作用（mAb與具有多個配 位體之受體結合會改變受體構形，使得任何一個配位體皆 150428.doc -87- 201119673 無法結合）。亦已鑑別出不阻斷細胞激素與其受體結合但 阻斷信號轉導之抗細胞激素單株抗體（例如125_2h，一種 抗 IL-1 8 mAb)。 抗原決定基及mAb功能之實例包括（但不限於）阻斷受體_ 配位體（R-L)相互作用（中和結合R_相互作用位點之mAb); 引起R-結合減少或無R-結合之位阻。雖然Ab可在除受體結 合位點以外之位點處結合標革巴，但仍因誘導構形變化且消 除功能（例如Xolair)，例如結合於R但阻斷信號傳導（125_ 2H)來干擾標靶之受體結合及功能。 在一實施例中’親本mAb需要靶向適當抗原決定基以實 現最大功效。該抗原決定基在DVD-Ig中應為保守的。mAb 之結合抗原決定基可由若干方法來確定，包括共結晶術、 mAb-抗原複合物之限制性蛋白質水解加上質譜肽圖分析 (mass spectrometric peptide mapping)(Legros V.等人， (2000) Protein Sci· 9: 1002-10)、噬菌體呈現肽庫 (0 Connor, K.Η.荨人，（2005) J. Immunol. Methods. 299: 21-35)以及突變誘發（Wu C.等人，（2〇〇3) j_ Iminunol. 170:5571-7)。 Β5·物理化學及醫藥特性： 以抗體進行治療性處理通常需要投與高劑量，通常為每 公斤數毫克（由於因分子量通常較大而以質量計之效能較 低）。為了調節患者順應性且為了適當處理慢性疾病療法 及門診患者治療，需要皮下（s.c )或肌肉内（i.m·)投與治療 性mAb。舉例而言，皮下投與之所需最大體積為約1 .〇 150428.doc -88- 201119673 mL ’且因此’需要>l 〇〇 mg/mL之濃度以限制每劑量之注 射次數。在一實施例中’以單劑量投與治療性抗體。然 而’該等調配物之開發受限於蛋白質-蛋白質相互作用（例 如潛在地增大免疫原性風險之聚集）及在加工及傳遞期間 之限制因素（例如黏度）。因此，臨床功效所需之大量及相 關開發限制因素會限制抗體調配物之潛能之充分利用及以 咼劑：S：方案皮下投藥。顯然蛋白質分子及蛋白質溶液之物 理化學及醫藥特性（例如穩定性、溶解度及黏度特徵）極為 重要。 B5.1.穩定性： 「穩定」抗體調配物為抗體在儲存後基本上保留其物理 穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性的調配物。可量測 在所選溫度下，所選時段内之穩定性。在一實施例中，調 配物中之抗體在室溫（約301 )下或在401下穩定至少1個月 及/或在約2 - 8 °C下穩定至少1年，諸如至少2年。此外，在 一實施例中’調配物在將調配物冷凍（至例如_70°c )及解凍 (下文稱作「凍/融循環」）後為穩定的。在另一實例中， 「穩定」調配物可為調配物中少於約1 〇%及少於約5%之蛋 白質以聚集體形式存在之調配物。 在各種溫度下在活體外長時段穩定之DVD-Ig為合乎需 要的。可藉由快速篩選在高溫下（例如在4〇。(：下）在活體外 穩定2-4週之親本mAb來達成此目的，且接著評估穩定 性。在2-8°C下儲存期間，蛋白質在至少12個月，例如至 少24個月内展現穩定性。穩定性（完整單體分子之百分比） 150428.doc •89· 201119673 可使用各種技術（諸如陽離子交換層析、尺寸排阻層析、 SDS-PAGE以及生物活性測試）來評估。關於可用於分析共 價及構形修飾之分析技術的更全面列舉，參看Jones，A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems ； Cleland, J. L.; Langer, R.編.Formulation and delivery of peptides and proteins， 第 1 版，Washington，ACS,第 22-45 頁；及 Pearlman，R.;
Nguyen, T. H.(1990) Analysis of protein drugs ； Lee, V. H. 編，Peptide and protein drug delivery，第 1版，New York，
Marcel Dekker，Inc.，第 247-301 頁。 異質性及聚集體形& :抗體之穩定性可使調配物可顯示 低於約10%，諸如低於約5%，諸如低於約2%，或在〇 5% 至1.5%之範圍内或更少之GMp抗體物質以聚集體形式存 在。尺寸排阻層析為-種靈敏、可再現且極穩固之偵測蛋 白質聚集體的方法。 s里·^外’在一實施例
， 1 nSL !X> ^ Hi 定。化學穩定性可由離子夺垃M 7 ,, 嘥于乂換層析（例如陽離子或陰凑 父換層析）、疏水性相互作用屛狀七 ^ 、 作用層析或啫如等電聚焦或j &屯泳之其他方法來測定。與办丨丨品 疋舉例而§，抗體之化學穩； 可使得在2-8。(：下儲存至少12個月 V ί2個月後，相較於儲存測, 之抗體溶液，陽離子交換層挤 又換層析中表不未經修飾之抗 值可能增加至多20%，$上以丄 w 诸如增加至多10%，或增加; 5 〇/〇 〇 - 在一實施例中 親本抗體呈現結構完整性 正確二硫鍵 150428.doc •90· 201119673 形成及正確摺疊：歸因於抗體二次或三次結構變化之化學 不穩定性可影響抗體活性。舉例而言，如由抗體活性所指 示之穩定性可使得在2-8。(：下儲存至少12個月後，相較於 儲存測試前之抗體溶液，抗體活性可能降低至多5〇%，諸 如降低至多3 0%、至多1 〇%，或降低至多5%或丨％。可使用 適合抗原結合檢定來測定抗體活性。 B5.2.溶解度： φ mAb之「溶解度」與正確摺疊之單體IgG的產生相關。 因此，可藉由HPLC評估IgG之溶解度。舉例而言，可溶性 (單體）IgG將在HPLC層析譜上產生單峰，而不溶（例如多聚 體及聚集體）IgG將產生複數個峰。因此熟習此項技術者將 月b夠使用常規HPLC技術偵測IgG溶解度的增加或降低。關 於可用於分析溶解度之分析技術的更全面列舉（參看J〇nes， A. G. (1993) Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London，London, UK.編者：Shamlou，p. Ayazi Pr〇cess • Solid-Liq. Suspensions, 93-117.出版商：Butterworth·
Heinemann，Oxford, UK ;及 Peariman 等人，（199〇) Adv in
Parenteral Sci. 4 (Pept. Protein Drug Delivery): 247-301)。 冶療性mAb之溶解度對於調配成足量給藥通常所需之高濃 度而言至關重要。如本文所概述，可能需要大於1〇〇 mg/mL之溶解度以適應有效抗體給藥。舉例而言，抗體溶 解度在研九初期可能不低於約5 mg/mL，在過程科學後期 不低於約25 mg/mL，或不低於約丨00 mg/mL，或不低於約 150 mg/mL。熟習此項技術者顯而易見，蛋白質分子之固 150428.doc 91 - 201119673 有特性對於蛋白質这、浪 解度、黏度）而言為重要的^化學特性（例如穩定性、溶 解存在多種可用作添加劑;而’熟習此項技術者應瞭 1，, 乂有利W響最終蛋白質調配物之 特U的賦形劑。此等賦形劑可包括 (例如醇類，諸如乙醇、. 鹽、檸檬酸鹽及胺基酸緩=衝劑·(·例如鱗酸鹽、乙酸 " t /夜），（出）糖或糖醇（例如斧 糖、海藻糖、果糖、棉子播 …、 甘路糖醇、山梨糖醇及聚葡 萄糖），（IV)界面活性劑（你丨 (幻如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯 '、聚山梨醇_、聚山梨醇_、及泊洛沙』 (P〇I〇Xa贿)）；（V)等張性調節劑⑽如，諸如NaCl之蹄、糖 及(W)其他賦形劑(例如防腐劑、養合劑、抗氧 化劑、整合物質（例如EDTA)、生物可降解聚合物及載劑分 子（例如HAS及PEG))。 黏度為與抗體製造及抗體加工（例如透渡/超遽）、填充_ 精整製程（栗送態樣、過遽態樣）及傳遞態樣（可注射性、完 善裝置傳遞)有關之極重要參數。低黏度使抗體之液體2 錢夠具有較高濃度。此使得可能以較小體積投與相同劑 量。小注射體積固有注射疼痛感覺較小之優勢，且溶液不 -定必需為等張的以減輕患者注射時之疼痛。抗體溶液之 黏度可使得在100 (1/s)之剪切速率下’抗體溶液黏度低於 200 mPa s，低於]25 mPa s，低於7〇 mpa s，及低於25⑽以 或甚至低於10 mPa s。 B 5.3·產生效率 在一實施例中，有效表現於哺乳動物細胞（諸如中國倉 I50428.doc -92· 201119673 鼠卵巢細胞（CHO))中之DVD-Ig的產生將需要兩種自身有 效表現於哺乳動物細胞中之親本單株抗體。來自穩定乳 動物細胞株（亦即CHO)之產率應高於約〇.5 g/L，高於約i g/L ’或在約2 g/L至約5 g/L或5 g/L以上之範圍内 (Kipriyanov，S.M.及 Little, M. (1999) Mol· Biotechnol 12. 173-201 ; Carroll, S·及 Al-Rubeai，Μ· (2004) Expert 〇pin
Biol. Ther. 4: 1821-9)。 在哺乳動物細胞中抗體及Ig融合蛋白之產生受若干因素 影響。經由併入強啟動子、強化子及選擇標記物對表現载 體進行工程改造，可使相關基因自整合載體複本之轉錄最 大化。對允§午南度基因轉錄之載體整合位點的鑑別可增加 蛋白質自載體表現（Wurm等人，（2004) Nature Biotechnol 22(1 1): 1393-1398)。此外，產生含量受抗體重鏈與輕鏈之 比率及蛋白質組裝與分泌過程中之各種步驟影響（Jiang等 人，（2006) Biotechnol· Prog· 22(1): 313-8)。 B 6.免疫原性 投與治療性mAb可能引起特定免疫反應發生（亦即形成 針對治療性mAb之内源性抗體）。在選擇親本單株抗體期 間應分析可能誘導免疫原性之潛在要素，且可採取降低該 風險之步驟以在DVD-Ig建構前最佳化親本單株抗體。已 發現來源於小鼠之抗體在患者中具有高度免疫原性。包含 小鼠可變區及人類恆定區之嵌合抗體的產生為降低治療性 抗體免疫原性之下一合乎邏輯之步驟（Morrison及Schlom， 1990)。或者，如由 Riechmann等人，（1988) Nature 332: 150428.doc -93- 201119673 323 3 27關於治療性抗體所述，可藉由將鼠類cDR序列轉 移至人類抗體構架中（重塑/CDR移植/人類化）來降低免疫
原性。另—方法稱為「表面重塑」或「面飾」，其以齧齒 動物可變輕鏈域及可變重鏈域起始，僅將表面可及之構架 胺基酸變為人類之構架胺基酸，同時CDR及内埋之胺基酸 仍來自親本备齒動物抗體（Roguska等人，（1996) Prot. Englneer 9: 895_9〇4)。在另一類型人類化中，一種技術僅 移植「特異性決定區」（SDR)而非移植整個cDR，該等 SDR定義為抗體與其標靶之結合中所涉及之cdr殘基子集 (Kashmiri 等人，（2〇〇5) Meth〇ds 36(1): 25_3句。此使得有必 要經由分析抗體·標靶複合物之可利用三維結構或對抗體 CDR殘基進行突變分析以確定與標乾相互作用之殘基來鑑 別SDR《者，相較於鼠類、嵌合或人類化抗體’完全人 類抗體可具有降低之免疫原性。
另-降低治療性抗體之免疫原性的方法為消除某些經預 測具有免疫原性之特異性序列。在—方法中，在人類中測 試第-代生物製劑且發現其具有不可接受之免疫原性後， 可對B細胞抗原決定基進行定位且接著進行改變以避免免 ㈣測°另—方法使用預測及移除潛在T細胞抗原決定基 之方法。已開發出計算方法來掃描且鑑別有可能結合於 MHC蛋白質之生物治療劑之狀序列⑴以贿等人，（細
Proteins 58: 53-69)。岑去，π 饨田讨从 ’次者，可使用基於人類樹突狀細胞之 方法鑑別潛在蛋白質過敏原中之CD4+ 了細胞抗原決定基 (Stickler等人，（2000) j Immun〇ther 8丄 150428.doc ·94· 201119673
Morrison及 J. Schlom，（1990) Important Adv. Oncol. 3-18 ; Riechmann 等人，（1988) Nature 332: 323-327; Roguska等 人，（1996) Protein Engineer. 9: 895-904 ; Kashmiri等人， (2005) Methods 36(1): 25-34 ; Desmet等人，（2005) Proteins 58. 53-69，及 Stickler 等人，（2000) J. Immunotherapy 23: 654-60.)。 B7.活體内功效
為產生具有所需活體内功效之DVD-Ig分子，重要的是 產生且選擇在以組合形式給予時具有類似所需活體内功效 的mAb。然而，在一些情形下，〇¥1)_1§可能展現2種獨立 mAb之組合無法貫現的活體内功效。舉例而言，DvD_ig可 使2個標靶緊密鄰近，從而產生由2個獨立mAb之組合無法 κ現的活性。其他所需生物功能描述於本文B 3章節中。具 有DVD-Ig分子中&需之特徵的親本抗體可基於諸如藥物 動力學以；組織分佈；可溶性標靶相對於細胞表面標靶； 及標靶濃度（可溶性）/密度（表面）之因素來選擇。 B 8 ·活體内組織分佈 為產生具有所需活體内組織分佈之DVD_ig分子，在一 實施例中，必需選擇呈右_介，&雨 有頒似所而之活體内組織分佈概況 之親本mAb。就此而言，轺太 親本mAb可為相同抗體或不同抗 體。或者，基於雙重特異性乾向策略之機制，在其他情形 下可能不需要選擇在以組合形式給予時具有同樣所需之活 體内組織分佈的親本mAb。 如在一結合組分使DVD-Ig 靶向一特異性位點，從@ 肿弟—結合組分引至同一標靶位 150428.doc •95· 201119673 點之则_Ig的情況τ即如此。）。舉例而言，麵七之— 結合特異性可靶向胰臟(胰島細胞），m寺異性可將 GLP1引至胰臟以誘導胰島素。 B9.同型： 在一實施例中，為了產生具有所需特性（包括（但不限於） 同型、效應功能及循環半衰期）之DVD_M +，視治療效 用及所需治療終點而定選擇具有適當以效應功能之親本 mAb。親本mAb可為相同抗體或不同抗體。存在5個主要 重鏈類別或同型，#中—些具有若干次型且此等類別或同 型决疋抗體分子之效應功能。此等效應功能存在於抗體分 子之鉸鏈區、CH2及CH3域中。然而，抗體分子之其他部 /刀中之殘基亦可能對效應功能有影響。鉸鏈區Fc效應功能 包括：⑴抗體依賴性細胞毒性；（Π)補體（ciq)結合、活化 及補體依賴性細胞毒性（CDC) ; (iii)對抗原_抗體複合物之 呑嗟/清除；及（iv)在一些情形下，細胞激素釋放。抗體分 子之此等Fc效應功能係經由Fc區與一組類別特異性細胞表 面受體之相互作用來介導。IgGl同型抗體最具活性，而 IgG2及IgG4具有最小效應功能或不具有效應功能。IgG抗 體之效應功能係經由與3種結構上同源之細胞fc受體類型 (及次型）(FcgRl、FcgRII及FcgRIII)相互作用來介導。可藉 由使下游鉸鏈區中為FcgR及C1 q結合所需之特定胺基酸殘 基（例如L234A、L235A)突變來消除IgGl之此等效應功 能。Fc區（尤其CH2-CH3域）中之胺基酸殘基亦決定抗體分 子之循環半衰期。此Fc功能係經由Fc區與新生兒fc受體 150428.doc -96- 201119673 (FcRn)之結人a a .爸 u 一’邊結合負責使抗體分子自酸性溶酶 體再循環回全身循環中。 mAb是否庳星古 〜有活性或非活性同型將視抗體之所需治療 終點而定。间刑々吐m 之使用及所需治療結果之一些實例列於下 文： -' ' a)右所而終，點為功能性中和可溶性細胞激素，則可使用非 -活性同型； • b)若所需結果為清除病理性蛋白，則可使用活性同型； C)若所需結果為清除蛋白質聚集體，則可使用活性同型； d) 右所而結果為结抗表面受體，則使用非活性同型（泰沙 比（Tysabri) ’ IgG4 ; 〇KT3，突變型 igGi” e) 右所而結果為消除標靶細胞，則使用活性同型（赫赛〉丁 (Herceptin) ’ igGi (且具有增強之效應功能））；及 f) 若所需結果為自循環清除蛋白f而不進人⑽中，則可 使用1gM同型（例如清除循環Ab肽物質）。 φ 親本mAb之Fc效應功能可由此項技術中熟知之各種活體 外方法來測定》 如所論述，對同型之選擇，及從而對效應功能之選擇將 視所需治療終點而定。在需要簡單中和循環標靶（例如阻 斷欠體-配位體相互作用）之情形下，可能不需要效應功 月b。在s亥等情形下，抗體之消除效應功能之同型或Fc區中 之犬變為合乎需要的。在消除標靶細胞為治療終點（例如 /肖除腫瘤細胞）之其他情形下，增強效應功能之同型或Fc 區中之犬父或去石凍糖基化（心-化⑶”丨^的丨為合乎需要的 150428.doc -97- 201119673 (Presta，G.L. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:640-656及 Satoh，M.等人，（2006) Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1161-11 73)。類似地，視治療效用而定，抗體分子之循環半衰 期可藉由在Fc區中引入特定突變來調節抗體-FcRn相互作 用而縮短/延長（Dall’Acqua, W.F.等人，（2006) J. Biol. Chem. 281: 235 14-23524 ; Petkova，S.B· (2006)等人， Internat. Immunol. 18:1759-1769 ; Vaccaro，C.等人，（2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18709-18714)。 關於DVD-Ig，可能需要確認關於影響正常治療性1T1Ab之 不同效應功能之殘基的公開資訊。在DVD-Ig形式中，除 經鑑別用於調節單株抗體效應功能之Fc區殘基以外之其他 (不同）Fc區殘基有可能會很重要。 總之，關於最終DVD-Ig形式中至關重要之Fc效應功能 (同型）之決定將視疾病適應症、治療標靶、及所需治療終 點及安全考慮因素而定。下文列出例示性適當重鏈及輕鏈 恆定區，包括（但不限於）： 〇 IgGl-異型：Glmz 〇 IgGl 突變體-A234，A235 o IgG2-異型：G2m(n-) 〇 K-Km3
Fc受體及Clq研究：可藉由（例如L234A、L235A)鉸鏈區 突變來消除以下可能性：由抗體與細胞膜上任何過度表現 之標靶複合引起的不合需要之抗體依賴性細胞介導之細胞 150428.doc •98- 201119673 毒性（ADCC)及補體依賴性細胞毒性（CDC)。預期存在於 mAb之IgG 1鉸鏈區中的此等經取代胺基酸會使mAb與人類 Fc受體（而非FcRn)之結合減少，因為認為FcgR結合發生於 IgG 1鉸鏈區上之重疊位點内。mAb之此特徵可使其安全概 況比含有野生型IgG之抗體有所改良。mAb與人類Fc受體 之結合可藉由流動式細胞量測實驗使用細胞株（例如THP-1、K562)及表現FcgRIIb(或其他FcgR)之經工程改造之 CHO細胞株來測定。相較於IgGl對照單株抗體，mAb展示 與FcgRI及FcgRIIa之結合降低，而與FcgRIIb之結合不受影 響。由抗原/IgG免疫複合物結合及活化Clq引發典型補體 級聯，及後續發炎性及/或免疫調節反應。IgG上之C 1 q結 合位點已定位至IgG鉸鏈區内之殘基。藉由Clq ELIS A評估 C 1 q與遞增濃度之mAb的結合。結果表明如所預期，當與 野生型對照IgGl之結合相比時，mAb不能結合Clq。總 之，L234A、L235A鉸鏈區突變消除mAb與FcgRI、 FcgRIIa及Clq之結合，但不影響mAb與FcgRIIb之相互作 用。此等資料表明雖然具有突變型Fc之mAb通常將在活體 内與抑制性FcgRIIb相互作用，但可能無法與活化FcgRI及 FcgRIIa受體或Clq相互作用。 人類FcRn結合：新生兒受體（FcRn)負責轉運IgG穿過胎 盤且控制IgG分子之分解代謝半衰期。可能需要增加抗體 之終末半衰期以改良功效，降低投藥之劑量或頻率，或改 良對標靶之定位。或者，可能適宜進行相反操作，亦即縮 短抗體之終末半衰期以降低全身暴露或改良標靶與非標靶 150428.doc -99- 201119673 結合比。調整IgG與其救助受體FcRn之間的相互作用可提 供增加或縮短IgG之終末半衰期的方式。循環中蛋白質（包 括IgG)在流體相令經由某些細胞（諸如血管内皮之細胞）之 微胞飲作用被吸收。IgG在内體中在略微酸性之條件（pH 6.0-6.5)下可結合&^且可再循環至細胞表面，在細胞表 面上其在幾乎中性條件(PH 7.0-7.4)下釋放。對FcRn8〇、 1 6、17上Fc區結合位點之定位展示在物種之間呈保守性之 2個組胺酸殘基（HiS310及HiS435)造成此相互作用之pH值依
賴性。使用嗟菌體呈現技術，鑑別增加與FcRn之結合且延 長小鼠IgG之半衰期的小鼠Fc區突變（參看vict〇r，g等人， (1997) Nature b— 15⑺：637 64())。亦已鑑別出可 增加人類IgG在pH 6.0下而非在pH 7 4下對FcRn之結合親和 力的Fc區突變（參看歸Acqua，wmiamF等人，（2〇〇2)j
工咖一.169(9):5171，。此外，在—種情形下對於 怪河猴F c Rn亦觀測到類似之p H值依賴性結合增加（高達2 7 倍）’且此使得值河猴之血清半衰期相較於親本⑽增加兩 倍（參看Hi_n，P.R.等人，（2〇〇4);Μ⑻， 6213-6216)。此等研究結果指示藉由調整^區與“Μ之相 互作用來延長抗體料劑之血浆半衰期為可行的。相反， 減弱與FcRn之相互作用的F F * 户用的大變可縮短抗體半衰期。 B.10.藥物動力學（ρκ): 在一實施例中，為產生罝古 王/、有所需樂物動力學概況之 DVD-Ig分子，選擇且右_ / 所為之藥物動力學概況之親 本mAb。一個考慮因素為對 1早株抗體之免疫原性反應（亦 I50428.doc -100- 201119673 即HAHA，人類抗人類抗體反應；HACA，人類抗嵌合抗 體反應）進一步使此等治療劑之藥物動力學複雜化。在一 實施例中，使用具有最低免疫原性或不具有免疫原性之單 株抗體建構DVD-Ig分子使得所得DVD-Ig亦將具有最低免 疫原性或不具有免疫原性。決定mAb之PK的一些因素包括 (但不限於）mAb之固有特性（VH胺基酸序列）、免疫原性、 FcRn結合及Fc功能。 $ 所選親本單株抗體之PK概況可輕易地在齧齒動物體内 測定，此係因為齧齒動物之PK概況與在石蟹獼猴 (cynomolgus monkey)及人類中單株抗體之PK概況密切相 關（或前者可精密預測後者）。PK概況係如實例1.2.2.3.A章 節中所述測定。 選擇具有所需pk特徵（及如本文所述之其他所需功能特 性）之親本單株抗體之後，建構DVD-Ig。因為DVD-Ig分子 含有兩個來自兩種親本單株抗體之抗原結合域，所以亦評 φ 估DVD-Ig之PK特性。因此，在測定DVD-Ig之PK特性時， 可使用基於來源於2種親本單株抗體之2個抗原結合域之功 能性來測定PK概況的PK檢定。可如實例1.2.2.3.A中所述 測定DVD-Ig之PK概況。可影響DVD-Ig之PK概況的其他因 素包括抗原結合域（CDR)定向、連接子尺寸及Fc/FcRn相互 作用。親本抗體之PK特徵可藉由評估以下參數來評價：吸 收、分佈、代謝及排泄。 吸收：迄今為止，治療性單株抗體係經由非經腸途徑 (例如靜脈内[IV]、皮下[SC]或肌肉内[IM])投與。在SC或 150428.doc -101 - 201119673 IM投與後，mAb主要經由淋巴路徑自胞間隙吸收至體循環 中。可飽和之體循環前蛋白水解降解可在血管外投與後產 生可變之絕對生物可㈣。通常，由於在較高劑量下蛋白 水解容量鮮，所以可誠収對生物可肖性隨單株抗體 劑量增加而增加。因為淋巴流體緩慢排入血管系統中 以mAb之吸收過程通常相當緩慢，且吸收持續時間可歷經 數小時至數天。單株抗體在sc投與後之絕對生物可用性一 般處於50%至100%之範圍β。在DVD_Ig構築體所乾向之 血腦屏障處介導轉運之結構的情形中，血㈣之循環時間 可能由於血腦屏障（BBB)處至CNS代謝區中之跨細胞轉運 的提高而降低’其中釋放DVD_Ig以使㈣經其第二抗原 識別位點相互作用。 分佈：在IV投與之後，單株抗體通常遵循以快速分佈相 開始’繼之以緩慢消除相之兩相血清(或血漿)濃度_時間概 況。-般而言，雙指數藥物動力學模型最佳描述此種藥物 動力學概況。mAb於中央室（Ve)中之分佈體積通常等於或 略高於血敵體積（2公升_3公升）。其他非經腸投與途徑（諸 如麗或SC)的血清（血聚）濃度相對於時間之概況的獨特兩 相模式可能不明顯’因為血清（血浆）濃度_時間曲線之分佈 相由長吸收部分掩蓋。包括物理化學特性、位點特異性及 標靶定向受體介導之吸收、組織結合能力及_劑量之多 種因素可影響mAb之生物分佈。—些此等因素可造成_ 生物分佈之非線性。 代謝及排f完整單株抗體由於分子尺寸而無法經由腎 150428.doc •102- 201119673 臟排泄至尿中。其主要藉由代謝（例如分解代謝）而失活。 對於基於IgG之、治療性單株抗體，半衰期通常在數小時或 1 -2天至20天以上之範圍内。mAb之消除可受多種因素影 響，包括（但不限於）對以1111受體之親和力、mAb之免疫原 性、mAb之糖基化程度、_對蛋自f水解之敏感性及受 體介導之消除。 B. 11 ·人類及毒理學物種之組織交叉反應性模式： 相同染色模式表明可以毒理學物種評價潛在人類毒 性。毒理學物種為用於研究無關毒性之彼等動物。 選擇滿足2個準則之個別抗體：⑴組織染色適合於已知 抗體標乾表現及⑺來自相同器官之人類組織與毒理學物種 組織之間的染色模式類似。 準則1 :免疫及/或抗體選擇通常使用重組或合成抗原（蛋 白質、％水化合物或其他分子）。結合於天然對應物及針 對無關抗原之反篩選通f為用於治療性抗體之㈣漏斗的 -部分H針對A量抗原.進行_選通常不切實際。因 此，使用來自所有主要器官之人類組織進行組織交叉反應 性研究可用於避免抗體與任何無關抗原之不合需要之結 合0 準則2:對人類及毒理學物種組織（石蟹獼猴、犬 '可能 為蔷齒動物及其他動物，如人類研究中般測試相同％或37 個組織）之tt較組織交叉反應性研究有助於驗證毒理學物 種之選擇。在對冷;東組織切片之典型組織交叉反應性研究 中，治療性抗體可展現與已知抗原之預期結合及/或基於 I50428.doc •103- 201119673 低相互作用程度（非特異性結合、與類似抗原之低結合程 度、基於低電平電荷之相互作用等）與組織以較低程度結 合。在任何情形下，最具相關性之毒理學動物物種為與人 類及動物組織之結合重合度最高的動物物種。
組織交又反應性研究遵循適當法規指南，包括EC CPMP 指南 ΙΠ/5271/94「Production and qUaiity contr〇1 〇f mAbs」及1997 US FDA/CBER「P〇ints t0 c〇nsider in the
Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」。在物鏡上固定在屍體解剖或活組織檢查 時獲知之人類組織冷;東切片（5 μη^ ’且乾燥。使用抗生物 素蛋白-生物素系統對組織切片進行過氧化酶染色❶Fda 才曰南「Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」〇 組織父叉反應性研究通常以兩個階段進行，其中第一階 段包括製成來自一個人類供者之32個組織（通常：腎上 腺、胃腸道、前列腺、膀胱、心臟、骨骼肌、血球、腎、 皮膚、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾臟、小腦、淋巴 結、睪丸、大腦皮質、卵巢、胸腺、結腸、胰臟、甲狀 腺、内皮、副甲狀腺、輸尿管、眼、垂體、子宮、輸卵管 及胎盤）的冷凍切片。在第二階段中，用來自3個無關成人 之多達38個組織（包括腎上腺、血液、血管、骨髓、小 腦、大腦、子宮頸、食道、眼、心臟、腎、大腸、肝、 肺、淋巴結、乳腺、卵巢、輪卵管、胰臟、副甲狀腺、周 邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液腺、皮膚、小腸、脊 150428.doc -104- 201119673 髓脾臟月、毛田、紋肌、睪丸、胸腺 '甲狀腺、扁桃體、 輸尿管、膀脱及子宮）進行完全交又反應性研究。通常以 最少2個劑量進行研究。 治療性抗體（亦即測試物品）及同型匹配對照抗體可經生 物素標記以用於抗生物素蛋白-生物素複合物（ABCM貞測； 其他债測方法可包括對經FITC(或以其他方式）標記之測試 物。。進订二次抗體偵測，或使未標記之測試物品與經標記 之抗人類IgG預複合。 。之在物鏡上固定在屍體解剖或活組織檢查時獲得 之人類組織冷凍切片(約5㈣，且乾燥。使用抗生物素蛋 白-生物素系統對組織切片進行過氧化酶染色。首先（在預 複合領測系統之情形下），#測試物品與經生物素標記之 ^杬人類IgG —起培育且形成免疫複合物。將測試物品 之最終濃度為2 Hg/mL及1〇吨/〇^之免疫複合物添加至物 鏡上的組織切片上，且接著使組織切片與抗生物素蛋白_ 生物素過氧化酶套組反應3〇分鐘。隨後，塗覆dab(3,3i_ 二胺基聯苯胺）（過氧化酶反應之受们，歷時4分鐘以進行 組織染色。抗原-瓊脂糖珠粒係用作陽性對照組織切片。 基於所彳响之標乾抗原的已知表現來判斷任何特異性染 色為預期反應性（例如符合抗原表現）或非預期之反應性。 針對強度及頻率，對任何經判斷具特異性之染色進行評 刀抗原或企π競爭或阻斷研究可進一步輔助確定所觀測 到的染色為特異性的或非特異性的。 若為現2種所選抗體滿足選擇準則（即組織染色適合及人 150428.doc •】05 · 201119673 類與毒理學動物特定組織之間的染色匹配），則可選擇其 用於DVD-Ig產生。 必需用最終DVD-Ig構築體重複組織交叉反應性研究， 但當此等研究遵循如本文所概述之相同方案時，對其之評 價更複雜，因為任何結合均可由2種親本抗體中之任一者 所致，且需要用複雜抗原競爭研究確定任何無法解釋之結 合。 顯而易見，若選擇如下2種親本抗體，則可極大簡化對 多特異性分子（如DVD-Ig)之組織交叉反應性研究的複雜操 作：（1)缺乏非預期之組織交叉反應性研究結果及（2)相應 人類與毒理學動物物種組織之間的組織交又反應性研究結 果存在適當類似性。 B.12.特異性及選擇性： 為了產生具有所需特異性及選擇性之DVD-Ig分子，需 要產生且選擇具有類似所需特異性及選擇性概況之親本 mAb。就此而言，親本mAb可為相同抗體或不同抗體。 對於DVD-Ig之特異性及選擇性的結合研究可因四個或 四個以上結合位點（每兩個針對一種抗原）而變得複雜。簡 言之，對DVD-Ig之使用酶聯免疫吸附檢定（ELISA)、 BIAcore、KinExA之結合研究或其他相互作用研究需要監 測1種、2種或2種以上抗原與DVD-Ig分子之結合。雖然 BIAcore技術可判定多種抗體之連續獨立結合，但較傳統 之方法（包括ELISA)或較現代之技術（諸如KinExA)卻不 能。因此，對各親本抗體進行仔細表徵至關重要。在已針 I50428.doc -106- 201119673 對特異性對各個抗體進行表徵後，對DVD-Ig分子中個別 結合位點之特異性保留的確認將極大簡化。 顯而易見’若針對特異性來選擇該2種親本抗體，之後 將其組合成DVD-Ig ’則測定DVD-Ig特異性之複雜操作將 極大簡化。 抗原-抗體相互作用研究可採取多種形式，包括多種典 型蛋白質-蛋白質相互作用研究、ELISA、質譜' 化學交 φ 聯、結合光散射之SEC、平衡透析、凝膠滲透、超濾、凝 膠層析、大區域分析型SEC、微量製備級超速離心（沈降平 衡）、光譜法、滴定微量熱法、沈降平衡（在分析型超速離 心機中）、沈降速度（在分析型離心機中）及表面電漿共振 (包括BIAcore)。相關參考文獻包括「Current Protocols in Protein Science，」 Coligan，J.E.等人（編）第 3 卷，第 19 章及 第 20 章，John Wiley & Sons Inc.出版，及「Current Protocols in Immunology,」Coligan，J.E·等人，（編）John _ Wiley & Sons Inc•出版，及其中包括之相關參考文獻。 全血中之細胞激素釋放：可藉由細胞激素釋放研究mAb 與人類血球的相互作用（Wing，M.G. (1995)Therapeut. Immunol. 2(4): 1 83-190 i 「Current Protocols in
Pharmacology，」 Enna，S.J.等人，（編）j〇hn Wiley & Sons Inc出版；Madhusudan，S. (2004) Clin. Cancer Res. 10(19): 6528-6534 ； Cox, J. (2006) Methods 38(4): 274-282 ； Choi, I. (2001) Eur. J. Immunol. 31(1): 94-106)。簡言之，各種 濃度之mAb與人類全血一起培育24小時。所測試之濃度應 150428.doc -107- 201119673 涵蓋包括模擬患者體内典型血液含量之最終濃度的寬範圍 (包括（但不限於）100 ng/ml-100 mg/ml)。培育後，分析上 清液及細胞溶解產物中IL-IRa、TNF-α、IL-lb、IL-6及IL-8之存在。比較mAb產生之細胞激素濃度概況與陰性人類 IgG對照組及陽性LPS或PHA對照組產生之概況。來自細胞 上清液及細胞溶解產物之mAb呈現之細胞激素概況與對照 人類IgG之概況相當。在一實施例中，單株抗體不與人類 ▲•球相互作用以自發釋放發炎性細胞激素。 DVD-Ig之細胞激素釋放研究由於四個或四個以上結合 位點（每2個針對一種抗原）而變得複雜。簡言之，如本文所 述之細胞激素釋放研究量測整個DVD-Ig分子對全血或其 他細胞系統之效應’但可判定引起細胞激素釋放之分子部 分。一旦偵測到細胞激素釋放’則必需確定DVD_Ig製劑 的純度’因為一些共純化細胞組分可獨自引起細胞激素釋 放。若純度並非問題，則可能需要使用DVD-Ig之斷裂（包 括（但不限於）移除Fc部分、分離結合位點等）、結合位點突 變誘發或其他方法來重疊合任何觀測結果。顯而易見，若 選擇缺乏細胞激素釋放之2種親本抗體，之後將其組合成 DVD-Ig ’則可極大簡化此複雜操作。 Β·13·與用於毒物學研究之其他物種的交叉反應性： 在一實施例中’選擇與適當毒理學物種（例如石蟹獼猴） 具有充分交叉反應性的個別抗體。親本抗體需要結合於直 系同源物種標靶（亦即石蟹獼猴）且引發適當反應（調節、中 和、活化）。在一實施例中，對直系同源物種標靶之交又 150428.doc •108· 201119673 反應性（親和力/效能）應在人類標靶之1 〇倍以内。實務上， 針對包括小鼠、大鼠、犬、猴（及其他非人類靈長類動物） 之多種物種以及疾病模型物種（亦即用於哮喘模型之錦羊） 評價親本抗體。親本單株抗體對毒理學物種之可接受交叉 反應性允許將來以同一物種進行DVD-Ig-Ig的毒理學研 究。出於彼原因，2種親本單株抗體應對常見毒理學物種 具有可接受之交叉反應性，從而允許以同一物種對DVD-Ig進行毒理學研究。 親本mAb可選自結合特異性標靶且在此項技術中熟知之 各種mAb。親本抗體可為相同抗體或不同抗體。此等包括 (但不限於）抗TNF抗體（美國專利第6,258,562號）；抗IL-12 及/或抗1!^12?40抗體（美國專利第6,914，128號）；抗11^-18 抗體（美國專利公開案第2005/0147610號）、抗C5、抗 CBL、抗 CD147、抗 gpl20、抗 VLA-4、抗 CDlla、抗 CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗CD-40(例如參看PCT公開 案第 WO 2007/124299 號）、抗 Id、抗 ICAM-1 、抗 CXCL13、抗 CD2、抗 EGFR、抗 TGF-P2、抗 HGF、抗 cMet、抗 DLL-4、抗 NPR1、抗 PLGF、抗 ErbB3、抗 E選擇 素、抗 Fact VII、抗 Her2/neu、抗 F gp、抗 CD11/18、抗 CD14、抗 ICAM-3、抗 RON、抗 SOST、抗 CD-19、抗 CD80(例如參看PCT公開案第WO 2003/039486號），抗 CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2整合素、抗α4β7、抗 CD52、抗HLA DR、抗CD22(例如參看美國專利第 5,789,554 號）、抗 CD20、抗 MIF、抗 CD64 (FcR)、抗 150428.doc -109- 201119673 TCRaP、抗 CD2、抗 Hep B、抗 CA 125、抗 EpCAM、抗 gpl20、抗 CMV、抗 gpllbllla、抗 IgE、抗 CD25、抗 CD33、抗 HLA、抗 IGF1，2、抗 IGFR、抗 VNR整合素、抗 IL-la、抗IL-Ιβ、抗IL-1受體、抗IL-2受體、抗IL-4、抗 IL-4受體、抗IL5、抗IL-5受體、抗IL-6、抗IL-8、抗IL-9、抗 IL-13、抗 IL-13 受體、抗 IL-17、抗 IL-6R、抗 RANKL、抗 NGF、抗 DKK、抗 ανβ3、抗 IL-17A、抗 IL23pl9 及抗 IL-23(參看 Presta，L.G. (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731-6 及 www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/ antibodies.html)。 親本mAb亦可選自各種批准使用、正經臨床試驗、或正 經開發供臨床使用之治療性抗體。該等治療性抗體包括 (但不限於）利妥昔單抗（rituximab，Rituxan®，IDEC/ Genentech/Roche)(參看例如美國專利第5,736,1 37號），一 種批准用於治療非霍奇金氏淋巴瘤之嵌合抗CD20抗體； HuMax-CD20，一種當前正由Genmab開發之抗CD20 ;美 國專利第5,500,362號所述之抗CD20抗體，八]^^-133(Applied Molecular Evolution) ； hA20(Immunomedics, Inc.) ; HumaLYM(Intracel)及 PRO70769(PCT 申請案第 PCT/US2003/040426)；曲妥珠單抗（trastuzumab ， Herceptin®，Genentech)(參看例如美國專利第 5,677，171 號），一種批准用於治療乳癌之人類化抗Her2/neu抗體；當 前正由Genentech開發之帕妥珠單抗（pertuzumab，rhuMab-2C4，Omnitarg®);抗 Her2 抗體（美國專利第 4,753,894 150428.doc -110- 201119673
號）；西妥昔單抗（cetuximab，Erbitux®，Imclone)(美國專 利第4,943,533號；？(：丁公開案第％〇 96/40210號），一種在 臨床試驗中之用於多種癌症之嵌合抗EGFR抗體；當前正 由 Abgenix-Immunex-Amgen 開發之 ABX-EGF(美國專利第 6,235,883號）；當前正由Genmab開發之HuMax-EGFr(美國 專利第 7,247,301 號）；425、EMD55900、EMD62000 及 EMD72000(MerckKGaA)(美國專利第 5,558,864號；Murthy 等人，（1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2): 549-60 ; Rodeck等人，（1987) J· Cell. Biochem. 35(4): 315-20 ; Kettleborough 等人，（1991) Protein Eng. 4(7): 773-83); ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT 公開案第 WO 95/20045 號；Modjtahedi 等人，（1993) J. Cell· Biophys· 22(1-3): 129-46; Modjtahedi等人，（1993) Br. J. Cancer 67(2): 247-53 ; Modjtahedi 等人，（1996) Br. J. Cancer 73(2): 228-35 ; Modjtahedi 等人，（2003) Int. J. Cancer 105(2): 273-80) ； TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba)(美國專利第 5,891,996號；美國專利第 6,506,883 號；Mateo 等人，（1997) Immunotechnol. 3(1): 71-81) ； mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth 等人，（2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44); KSB-102(KS Biomedix) ; MR1-1(IVAX，National Cancer Institute)(PCT 公開案第 WO 01/6293 1A2 號）；及 SC 100 (Scancell)(PCT公開案第WO 01/88138號）；阿來組單抗 150428.doc -Ill - 201119673 (alemtuzumab，Campath®，Millenium)，一 種當前批准用 於治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病之人類化mAb ;莫羅 莫那-CD3(muromonab-CD3，Orthoclone OKT3®)，一種由 Ortho Biotech/Johnson & Johnson開發之抗 CD3抗體；替伊 莫單抗（ibritumomab tiuxetan，Zevalin®)，一種由 IDEC/Schering AG開發之抗CD20抗體；吉妥單抗 (gemtuzumab ozogamicin ， Mylotarg®) ，一 種由
Celltech/Wyeth開發之抗CD33 (p67蛋白）抗體；阿法赛特 (alefacept，Amevive®)，一種由Biogen 開發之抗 LFA-3 Fc 融合物；由Centocor/Lilly開發之阿昔單抗（abciximab， ReoPro®);由 Novartis 開發之巴利昔單抗（basiliximab， Simulect®);由 Medimmune開發之帕利珠單抗（palivizumab， Synagis®);英利昔單抗（infliximab，Remicade®)，一種由 Centocor開發之抗TNFa抗體；阿達木單抗（adalimumab，
Humira®)，一種由Abbott開發之抗TNFa抗體
Humicade®，一種由Celltech開發之抗TNFa抗體；戈利木 單抗（golimumab，CNTO-148)，一種由 Centocor 開發之完 全人類TNF抗體；依那西普（etanercept，Enbrel®)，一種 由Immunex/Amgen開發之p75 TNF受體Fc融合物；來那西 普（lenercept)，一種先前由Roche開發之p55TNF受體Fc融 合物；ABX-CBL，一種正由Abgenix開發之抗CD147抗 體；ABX-IL8，一種正由Abgenix開發之抗IL8抗體；ABX-MA1，一種正由Abgenix開發之抗MUC18抗體；帕姆替珠 單抗（Pemtumomab，R1549，90Y-muHMFGl)，一種由 150428.doc -112- 201119673
Antisoma 開發之抗 MUCl ;塞來克斯（Therex)(Rl 550)，一 種正由Antisoma開發之抗MUC1抗體；正由Antisoma開發 之安吉奥單抗（AngioMab) (AS 1405);正由Antisoma開發之 HuBC-1 ;正由 Antisoma 開發之硫鉑（Thioplatin)(AS1407); Antegren®(那他珠單抗（natalizumab))，一 種正由 Biogen 開 發之抗 a-4-P-l(VLA-4)及 α-4-β-7 抗體；VLA-1 mAb，一種 正由Biogen開發之抗VLA-1整合素抗體；LTBR mAb，一 種正由Biogen開發之抗淋巴毒素β受體（LTBR)抗體；CAT-152 ， 一 種正由 Cambridge Antibody Technology開 發之抗 TGF-P2抗體；ABT 874 (J695)，一種正由Abbott開發之抗 IL-12 p40抗體；CAT-192，一 種正由 Cambridge Antibody Technology及 Genzyme開發之抗TGFpi抗體；CAT-213，一 種正由 Cambridge Antibody Technology開發之抗Eotaxinl 抗體；LymphoStat-B®，一 種正由 Cambridge Antibody Technology 及 Human Genome Sciences Inc.開發之抗 Blys 抗 體；TRAIL-RlmAb，一 種正由 Cambridge Antibody Technology 及 Human Genome Sciences, Inc.開發之抗 TRAIL-R1抗體；Avastin®貝伐單抗（Avastin® bevacizumab， rhuMAb-VEGF)，一 種正由 Genentech 開發之抗 VEGF 抗 體；正由Genentech開發之抗HER受體家族抗體；抗組織因 子（ATF)，一種正由Genentech開發之抗組織因子抗體； Xolair®(奥馬珠單抗（Omalizumab))，一 種正由 Genentech 開發之抗IgE抗體；Raptiva®(依法利珠單抗（Efalizumab))， 一種正由Genentech及Xoma開發之抗CD1 la抗體；正由 150428.doc -113- 201119673
Genentech及 Millenium Pharmaceuticals 開發之 MLN-02抗體 (先前為LDP-02) ; HuMax CD4，一種正由Genmab開發之 抗 CD4抗體；HuMax-IL15，一 種正由 Genmab及Amgen 開 發之抗IL15抗體；正由Genmab及Medarex開發之HuMax-Inflam ; HuMax-Cancer，一 種正由 Genmab 及 Medarex 及 Oxford GcoSciences開發之抗I型肝素酶抗體；正由Genmab
及Amgen開發之HuMax-Lymphoma ;正由Genmab開發之 HuMax-TAC ;正由 IDEC Pharmaceuticals開發之IDEC-131 及抗 CD40L 抗體；IDEC-151(克立昔單抗（Clenoliximab))， 一種正由 IDEC Pharmaceuticals開發之抗 CD4抗體；IDEC-114，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals開發之抗 CD80抗體； IDEC-152，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD23 ;正由IDEC Pharmaceuticals開發之抗巨嗤細胞遷移 因子（MIF)抗體；BEC2，一種正由Imclone開發之抗個體基 因型抗體；IMC-1C11，一種正由Imclone開發之抗KDR抗 體；DC101，一種正由Imclone開發之抗flk-Ι抗體；一種正 由Imclone開發之抗VE鈣黏素抗體；CEA-Cide®(拉貝珠單抗 (labetuzumab))，一種正由Immunomedics開發之抗癌胚抗原 (CEA)抗體；LymphoCide®(依帕珠單抗（Epratuzumab))， 一種正由Immunomedics開發之抗CD22抗體；正由
Immunomedics 開發之 AFP-Cide ;正由 Immunomedics 開發 之 MyelomaCide ;正由 Immunomedics 開發之 LkoCide ;正 由 Immunomedics開發之 ProstaCide ; MDX-010，一 種正由 Medarex開發之抗CTLA4抗體；MDX-060，一種正由 150428.doc -114- 201119673
Medarex開發之抗CD3 0抗體；正由Medarex開發之MDX-070 ;正由 Medarex 開發之 MDX-018 ;正由 Medarex 及 Immuno-Designed Molecules 開發之 〇sidem®(IDM-l)及抗 Her2抗體；HuMax®-CD4，一 種正由 Medarex 及 Genmab 開 發之抗CD4抗體，HuMax-IL15，一種正由Medarex及 Genmab開發之抗IL15抗體，CNTO 148，一種正由Medarex 及Centocor/J&J開發之抗TNFa抗體；CNTO 1275，一種正 由Centocor/J&J開發之抗細胞激素抗體；MOR101及 MOR102，正由MorphoSys開發之抗細胞間黏附分子_ 1(ICAM-1)(CD54)抗體；MOR201，一 種正由 MorphoSys 開 發之抗纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗體； Nuvion®(維西珠單抗（visilizumab))，一 種正由 Protein Design Labs開發之抗CD3抗體；HuZAF®，一種正由 Protein Design Labs開發之抗γ干擾素抗體；正由Protein Design Labs開發之抗 α5β1整合素；正由 Protein Design Labs開發之抗IL-1 2 ; ING-1，一種正由Xoma開發之抗Ep-CAM抗體；Xolair®(奥馬珠單抗（Omalizumab))，一種由 Genentech及Novartis開發之人類化抗IgE抗體；及 MLN01，一種正由X〇ma開發之抗β2整合素抗體。在另一 實施例中，治療劑包括KRN3 3 0(Kirin) ; huA3 3抗體（Α3 3 ’ Ludwig Institute for Cancer Research) ; CNTO 95(aV整合 素，Centocor) ; MEDI-522(aVp3整合素，Medimmune); 伏洛昔單抗（vol〇ciximab)(aVpl整合素，Biogen/PDL);人 類mAb 216(B細胞糖基化抗原決定基，NCI) ; BiTE 150428.doc ，115 - 201119673
ΜΤ103(雙特異性 CD19xCD3，Medimmune) ; 4G7xH22(雙 特異性 B 細胞 xFcyRl，Medarex/Merck KGa) ; rM28(雙特 異性CD28xMAPG，歐洲專利第EP 1444268號）； MDX447(EMD 82633)(雙特異性CD64xEGFR，Medarex); 卡妥索單抗（Catumaxomab，removab)(雙特異性EpCAMx抗 CD3，Trion/Fres);厄妥索單抗（Ertumaxomab)(雙特異性 HER2/CD3，Fresenius Biotech);奥戈伏單抗（oregovomab， OvaRex)(CA-125，ViRexx) ; Rencarex®(WX G250)(碳酸酐 酶 IX，Wilex) ; CNTO 888(CCL2，Centocor) ; TRC105 (CD105(endoglin)，Tracon) ; BMS-663513(CD137促效劑， Brystol Myers Squibb) ; MDX-1342(CD19，Medarex);西 利珠單抗（Siplizumab，MEDI-507)(CD2，Medimmune);奥 法木單抗（Ofatumumab，Humax-CD20)(CD20，Genmab); 利妥昔單抗（Rituxan)(CD20，Genentech);維塔珠單抗 (veltuzumab，hA20)(CD20，Immunomedics);依帕珠單抗 (CD22，Amgen);魯昔單抗（lumiliximab，IDEC 152) (CD23，Biogen);莫羅莫那-CD3(CD3，Ortho) ; HuM291 (CD3 fc 受體，PDL Biopharma) ; HeFi-l(CD30，NCI); MDX-060(CD30，Medarex) ; MDX-1401(CD30，Medarex); SGN-30(CD30，Seattle Genentics) ; SGN-33(林妥珠單抗 (Lintuzumab))(CD3 3 ，Seattle Genentics);紮木單抗 (Zanolimumab 5 HuMax-CD4)(CD4 5 Genmab) ； HCD122 (CD40，Novartis) ; SGN-40(CD40，Seattle Genentics); Campathlh(阿來組單抗）（CD52，Genzyme) ; MDX-1411 150428.doc -116- 201119673
(CD70 1 Medarex) hLLl(EPB-l)(CD74.38 5 Immunomedics) 加利昔單抗（Galiximab，IDEC-144)(CD80，Biogen); MT293(TRC093/D93)(裂解之膠原蛋白，Tracon); HuLuc63(CSl，PDL Pharma);伊普利單抗（ipilimumab， MDX-010)(CTLA4，Brystol Myers Squibb);川利木單抗 (Tremelimumab，替西單抗（Ticilimumab)，CP-675,2) (CTLA4，Pfizer) ; HGS-ETR1(馬帕木單抗（Mapatumumab)) (DR4 TRAIL-R1 促效劑，Human Genome Science/Glaxo Smith Kline) ; AMG-655(DR5，Amgen);阿普單抗（Apomab) (DR5，Genentech) i CS-1008(DR5 > Daiichi Sankyo)； HGS-ETR2(來沙木單抗（lexatumumab))(DR5 TRAIL-R2 促 效劑，HGS);西妥昔單抗（Erbitux)(EGFR，Imclone); IMC-11F8(EGFR，Imclone);尼妥珠單抗（Nimotuzumab) (EGFR，YM Bio);帕尼單抗（Panitumumab，Vectabix) (EGFR，Amgen);紫魯木單抗（Zalutumumab，HuMaxEGFr) (EGFR 5 Genmab) ； CDX-110(EGFRvIII > AVANT Immunotherapeutics)； 阿德木單抗（adecatumumab，MT201)(Epcam，Merck);依 決洛單抗（edrecolomab，Panorex，17-lA)(Epcam，Glaxo/ Centocor) ; MORAb-003(葉酸鹽受體 a，Morphotech) ; KW-2871(神經結醣脂 GD3，Kyowa) ; MORAb-009(GP-9， Morphotech) ; CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex);曲 妥珠單抗（赫賽汀（Herceptin))(HER2，Celldex);帕妥珠單 抗（rhuMAb 2C4)(HER2(DI)，Genentech);阿泊珠單抗 (apolizumab)(HLA-DRp鏈，PDL Pharma) ;AMG-479(IGF- 150428.doc -117- 201119673
1R，Amgen);抗 IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche) ; CP 751871(IGF1-R，Pfizer) ; IMC-A12(IGF1-R，Imclone); BIIB022(IGF-1R，Biogen) ； Mik-β-1 (IL-2Rb(CD 122)-Hoffman LaRoche) ; CNTO 328(IL6，Centocor);抗 KIR(1-7F9)(殺手細胞 Ig 樣受體（KIR)，Novo) ; Hu3S193(Lewis (y) ' Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research) ", hCBE-ll(LTpR > Biogen) ； HuHMFGl(MUCl > Antisoma/NCI)； RAV12(N連接碳水化合物抗原決定基，Raven) ; CAL(副曱 狀腺激素相關蛋白（PTH-rP)，University of California); CT-011(PD1，CureTech) ; MDX-1106(ono-4538)(PDl，Medarex/
Ono) ; MAb CT-011(PD1，Curetech) ; IMC-3G3(PDGFRa， Imclone);巴維昔單抗（bavituximab)(填脂酸絲胺酸， Peregrine) ; huJ591(PSMA，Cornell Research Foundation); muJ591(PSMA > Cornell Research Foundation) ； GC1008 (TGFb (pan)抑制劑（IgG4)，Genzyme);英利昔單抗 (Remicade)(TNFa，Centocor) ; Α27·15(轉鐵蛋白受體， Salk Institute，INSERN WO 2005/11 1082) ; Ε2·3(轉鐵蛋白 受體，Salk Institute)；貝伐單抗（阿瓦斯汀 (Avastin))(VEGF » Genentech) ； HuMV833(VEGF * Tsukuba Research Lab)PCT公開案第 WO/2000/034337號，University of Texas) ； IMC-18F1 (VEGFR1 > Imclone) ； IMC-1121(VEGFR2, Imclone)。 B.建構DVD分子： 雙可變域免疫球蛋白（DVD-Ig)分子經設計以藉由重組 150428.doc -118- 201119673 DNA技術使來自兩種親本單株抗體（其可相同或不同）之兩 個不同輕鏈可變域（VL)以串聯方式直接連接或經由短連接 子連接，接著為輕鏈恆定域，及視情況存在之Fc區。類似 地，重鏈包含兩個以申聯方式連接之不同重鏈可變域 (VH)，接著為恒定域CH1及Fc區（圖1A)。 可使用重組DNA技術自由本文所述之任一種方法產生之 親本抗體獲得可變域。在一實施例中，可變域為鼠類重鏈 或輕鏈可變域。在另一實施例中，可變域為CDR移植或人 類化重鏈可變域或輕鏈可變域。在一實施例中，可變域為 人類重鏈或輕鏈可變域。 在一實施例中，使用重組DNA技術使第一及第二可變域 彼此直接連接。在另一實施例中，可變域係經由連接子序 列連接。在一實施例中，兩個可變域連接。三個或三個以 上可變域亦可直接連接或經由連接子序列連接。可變域可 結合相同抗原或可結合不同抗原。本發明之DVD-Ig分子 可包括1個免疫球蛋白可變域及1個非免疫球蛋白可變域 (諸如受體之配位體結合域、或酶之活性域）。DVD-Ig分子 亦可包含兩個或兩個以上非Ig域。 連接子序列可為單個胺基酸或多肽序列。在一實施例 中，連接子序列係選自由以下組成之群： AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3)； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP(SEQ ID NO: 5)； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7)； 150428.doc -119- 201119673 RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8) ； RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10)； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) ； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25) ； GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ; TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27);及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。基 於對若干Fab分子之晶體結構分析選擇連接子序列。在Fab 或抗體分子結構中，可變域與CH1/CL恆定域之間存在天 然可撓性鍵聯。此天然鍵聯包含約10-12個胺基酸殘基， 由來自V域之C末端的4-6個殘基及來自CL/CH1域之N末端 的4-6個殘基提供。本發明之DVD Ig係分別使用CL或CH1 之N末端5-6個胺基酸殘基或11-12個胺基酸殘基作為DVD-Ig之輕鏈及重鏈中之連接子產生。CL或CH1域之N末端殘 基（尤其前5-6個胺基酸殘基）採用環構形而無穩固二級結 構，因此可用作2個可變域之間的可撓性連接子。CL或 CH1域之N末端殘基由於其為Ig序列之一部分而為可變域 之天然延長，且因此在很大程度上使任何可能由連接子及 150428.doc -120- 201119673 接點引起之免疫原性降至最低。 其他連接子序列可包括CL/CH1域之任何長度之任何序 列’但非CL/CH1域之所有殘基（例如CL/CH1域的前5-12個 胺基酸殘基）；輕鏈連接子可來自Ck或（：λ ;且重鏈連接子 - 可來源於任何同型之CH1，包括〇γ1、CY2、、 Cal、Ca2、CS、Cs及Cp。連接子序列亦可來源於其他蛋 白質，諸如Ig樣蛋白（例如TCR、FcR、KIR);基於G/s之 φ 序列（例如重複序列）（SEQ ID Ν〇··29);來源於鉸鏈區 之序列；及來自其他蛋白質之其他天然序列。 在一實施例中，使用重組DNA技術使恆定域連接至2個 連接之可變域上。在一實施例中，包含連接之重鏈可變域 的序列係連接至重鏈恆定域而包含連接之輕鏈可變域的序 列係連接至輕鏈恆定域。在一實施例中，恆定域分別為人 類重鏈恆定域及人類輕鏈恆定域。在一實施例中，dvd重 鏈係進一步連接至Fc區。Fc區可為原生序列以區或變異以 • 區。在另一實施例中，卜區為人類以區。在另一實施例 中，Fc 區包括來自 IgG1、IgG2、IgG3、ig(}4、1§八、 IgM、IgE 或 IgD之 Fc 區。 在另一實施例中，兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈dvd多 月太經組合形成DVD-Ig分子。表2列出適用於治療疾病（例如 治療癌症）之標靶的例示性抗體之¥11及VL區的胺基酸序 列。在Λ仏例中，本發明提供包含任何取向之表2中所 列VH及/或VL區中至少兩者的〇¥;〇。 150428.doc -121- 201119673 表2:用於產生DVD-Ig之抗體的VH及VL區之胺基酸序列 清單
SEQ ID No . ABT 唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 30 AB001VH VH CD20 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQT PGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS A 31 AB001VL VL CD20 QIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPG SSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAE DAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR 32 AB002VH VH CD3 (seq. 1) QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS 33 AB002VL VL CD3 (seq. 1) QIVLTQS PAIMSAS PGEKVTMTCRAS S SVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQWSSNPLTFGSGTKLEINR 34 AB003VH VH EGFR (seq. 1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIR QSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQF SLKLSSVTAADTAIYYCVKDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS 35 AB003VL VL EGFR {seq. 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKP GKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR 36 AB004VH VH HER2 (seq. 1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQA PGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 37 AB004VL VL HER2 (seq. 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR 38 AB005VH VH RON (seq. 1) EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQA PGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCARFSGWPNNYYYYGMDVWGQGTTV TVSS
-122- 150428.doc 201119673
SEQ ID Mo. ABT 唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 39 AB005VL VL RON (seq. 1) DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGFNYVDW YLQKPGQSPHLLIYFGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCMQALQTPPWTFGQGTKVEIRR 40 AB006VH VH CD-19 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQR PGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAY MQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSV TVSS 41 AB006VL VL CD-19 DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWY QQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIH PVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKR 42 AB007VH VH CD-80 qvqlqesgpglvkpsetlsltcavsggsisggygwgwirq PPGKGLEWIGSFYSSSGNTYYNPSLKSQVTISTDTSKNQF SLKLNSMTAADTAVYYCVRDRLFSVVGMVYNNWFDVWGPG VLVTVSS 43 AB007VL VL CD-80 ESALTQPPSVSGAPGQKVTISCTGSTSNIGGYDLHWYQQL PGTAPKLLIYDINKRPSGISDRFSGSKSGTAASLAITGLQ TEDEADYYCQSYDSSLNAQVFGGGTRLTVLG 44 AB008VH VH CD-22 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWLHWVRQA PGQGLEWIGYINPRNDYTEYNQNFKDKATITADESTNTAY MELSSLRSEDTAFYFCARRDITTFYWGQGTTVTVSS 45 AB008VL VL CD-22 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMSCKSSQSVLYSANHKNYLA WYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTET ISSLQPEDIATYYCHQYLSSWTFGGGTKLEIKR 46 AB009VH VH CD-40 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLY LQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSS ΑΊ AB009VL VL CD-40 DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIRR 48 AB010VH VH IGF1,2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQA TGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAY MELSSLRSEDTAVYYCARDPYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 150428.doc -123 - 201119673
SEQ ID No. ABT 唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 49 AB010VL VL IGF1,2 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNXENNHVSWYQQL PGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQ TGDEADYYCETWDTSLSAGRVFGGGTKLTVLG 50 AB011VH VH IGF1R (seq. 1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSYAMNWVRQA PGKGLEWVSAISGSGGTTFYADSVKGRFTISRDNSRTTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGWSDSYYYYYGMDVWGQGTT VTVSS 51 AB011VL VL IGF1R (seq. 1) DIQMTQFPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKP GKAPKRLIYAASRLHRGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP EDFATYYCLQHNSYPCSFGQGTKLEXKR 52 AB012VH VH HGF (seq. 1) QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQA PGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARDEYNSGWYVLFDYWGQGTLVTV SS 53 AB012VL VL HGF (seq. 1) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKP GKAPNLLIYEASSLQSGVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQANGFPWTFGQGTKVEIKR 54 AB013VH VH C-MET QVQLQQSGPELVRPGASVKWSCPASGYTFTSYWLHWVKKQ RPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPPNFKDKATLNVDRSSNT AYNLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVYVS S 55 AB013VL VL C-MET DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLVTSSQKNYLA WYQQKPQQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGDGTKLEIKR 56 AB014VH VH VEGF (seq. 1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQA PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAY LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVT VSS 57 AB014VL VL VEGF (seq. 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKP GKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR 58 AB015VH VH DLL-4 (seq. 1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDNWISWVRQA PGKGLEWVGYISPNSGFTYYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCARDNFGGYFDYWGQGTLVTVSS
150428.doc •124- 201119673
SEQ ID No. ABT唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 59 AB015VL VL DLL-4 (seq. 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATTYYCQQSYTGTVTFGQGTKVEIKR 60 AB016VH VH NRP1 (seq. 1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSEPISWVRQA PGKGLEWVSSITGKNGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCARWGKKVYGMDVWGQGTLVTVSS 61 AB016VL VL NRP1 (seq. 1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKP GKAPKLLIYGASSRASGVPSHFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYMSVPITFGQGTKVEIKR 62 AB033VH VH EGFR (seq. 2) QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQS PGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFF KMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA 63 AB033VL VL EGFR (seq. 2) DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVES EDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR 64 AB034VH VH RON (seq. 2) QVQLQESGPGLVKPSEILSLTCTVSGGSISSHYWSWVRQP PGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL NLSSVTAADTAVYYCARIPNYYDRSGYYPGYWYFDLWGRG TLVTVSS 65 AB034VL VL RON (seq. 2) QAVLTQPSSLSAPPGASASLTCTLRSGFNVDSYRISWYQQ KPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGI LLISGLQSEDEADYYCMIWHSSAWVFGGGTKLTVLR 66 AB035VH VH NRP1 (seq. 2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVSQISPAGGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCARELPYYRMSKVMDVQGQGTLVTV SS 67 AB035VL VL NRP1 (seq. 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYFSSYLAWYQQKP GKAPKLLIYGASSRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYLGSPPTFGQGTKVEIKR 68 AB039VH VH CD3 (seq. 2) QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQR PGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS 150428.doc -125 - 201119673
SEQ ID No. ABT 唯一ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 69 AB039VL VL CD3 (seq. 2) QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAE DAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR 70 AB047VH VH PLGF (seq. 1) QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKLA PGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTIDTSSSTAY MQLSSLTSEDTAVYFCVRDSPFFDYWGQGTLLTVSS 71 AB047VL VL PLGF (seq. 1) DIVLTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGMRKSFLA WYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVQAEDVAVYYCKQSYHLFTFGSGTKLEIKR 72 AB062VH VH ErbB3 (seq. 1) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQP PGKGLEWXGEXNHSGSTNYNPSLKSRVTISVETSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARDKWTWYFDLWGRGTLVTVSS 73 AB062VL VL ErbB3 (seq. 1) DIEMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSSNRNYLA WYQQNPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLT ISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPRTFGQGTKVEIKR 74 AB063VH VH ErbB3 (seq. 2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQA PGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTXSRDNAKNSLY LQMNSLRDEDTAVYYCARDRGDFDAFDIWGQGTMVTVSS 75 AB063VL VL ErbB3 (seq. 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTXTCQASQDITNYLNWYQQKP GKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYNCQQCENFPITFGQGTRLEIKR 76 AB064VH VH EGFR (seq. 3) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDFAWNWIRQ PPGKGLEWMGYISYSGNTRYQPSLKSRITISRDTSKNQFF LKLNSVTAADTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS 77 AB064VL VL EGFR (seq. 3) DIQMTQSPSSMSVSVGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKP GKSFKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQP E DFATYYCVQYAQFPWT FGGGTKLEIKR 78 AB067VH VH ErbB3 (seq. 3) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYVMAWVRQA PGKGLEWVSSISSSGGWTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCTRGLKMATIFDYWGQGTLVTVSS 79 AB067VL VL ErbB3 (seq. 3) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNVVSWYQQ HPGKAPKLIIYEVSQRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGL QTEDEADYYCCSYAGSSIFVIFGGGTKVTVLG 80 AB069VH VH DLL4 (seq. 2) QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQA PGQGLEWIGYISSYNGATNYNQKFKGRVTFTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSS
150428.doc •126· 201119673
SEQ ID No. ABT 唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 81 AB069VL VL DLL4 (seq. 2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWF QQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKR 82 AB070VH VH VEGF (seq. 2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISDYWIHWVRQA PGKGLEWVAGITPAGGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCARFVFFLPYAMDYWGQGTLVTVSS 83 AB070VL VL VEGF (seq. 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR 84 AB071VH VH VEGF (seq. 3) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTINASWIHWVRQA PGKGLEWVGAIYPYSGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCARWGHSTSPWAMDYWGQGTLVTVS S 85 AB071VL VL VEGF (seq. 3) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVIRRSLAWYQQKP GKAPKLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQSNTSPLTFGQGTKVEIKR 86 AB072VH VH DLL4 (seq. 3) EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVINWVKQK PGQGLEWIGLINPYNDGTKYNEKE'KVKATLTSDKSSSTAY MELSSLTSEDSAVYYCASYYYGSRYYFDYWGQGTTLTVSS 87 AB072VL VL DLL4 (seq. 3) DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKP GNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQT EDVATYYCQQYWSIPLTFGAGTKLELKR 88 AB073VH VH DLL4 (seq. 4) EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQS NGKSLEWIGNIDPYFGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAY MQLKSLTSEDSAVYYCARNYDYDGGCFDYWGQGTTLTVSS 89 AB073VL VL DLL4 (seq. 4) QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQE KPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGA QTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG 90 AB074VH VH PLGF (seq· 2) QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTYGIHWVRQS PGKGLEWLGVMWSGGDTDYDAAFISRLSISKDNSKSQVFF KMNSLQANDTGXYYCARYRFYGMDYWGQGTSVTVSS 91 AB074VL VL PLGF (seq. 2) AIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRFAWYQQKP GNAPRLLISGAASLEAGVPSRFSGSGSGQDYTLSITSLQT EDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEXKR 150428.doc -127- 201119673
SEQ ID No. ABT 唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 92 AB075VH VH IGF1R (seq. 2) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQA PGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARAPLRFLEWSTQDHYYYYYMDVW GKGTTVTVSS 93 AB075VL VL IGF1R (seq. 2) SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYATWYQQKPG QAPILVIYGENKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAE DEADYYCKSRDGSGQHLVFGGGTKLTVLG 94 AB077VH VH XGF1R (seq. 3) EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMHWVRQA PGKGLEWISVIDTRGATYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCARLGNFYYGMDVWGQGTTVTVSS 95 AB077VL VL IGF1R (seq. 3) EIVLTQSPGTLSVSPGERATLSCRASQSIGSSLHWYQQKP GQAPRLLIKYASQSLSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCHQSSRLPHTFGQGTKVEIKR 96 AB079VH VH HGF (seq. 2) EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWMHWVRQM PGKGLEWMGEINPTNGHTNYNPSFQGQVTISADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARNYVGSIFDYWGQGTLVTVSS 97 AB079VL VL HGF (seq. 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVVSYVSWYQQKP GKAPKLLIYGASNRNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCGQSYNYPYTFGQGTKLEIKR 98 AB080VH VH HER2 (seq. 2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQA PGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS 99 AB080VL VL HER2 (seq. 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKP GKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKR 100 AB110VH VH mCD3 EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHW VRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSR DNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQ GTMVTVSS 101 AB110VL VL mCD3 DIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWY QQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSS FTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKR
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SEQ ID No. ABT 唯一 ID 蛋白質區 序列 1234567890123456789012345678901234567890 102 AB114VH VH mCD19 EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMHF VKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATLTA DTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDYWGQ GVMVTVSS 103 AB114VL VL mCD19 DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAWY QQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQYS LKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKR 104 AB119VH VH MTX DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW1SI WIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITR DTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQ GTLVTVSA 105 AB119VL VL MTX DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNT YLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTQ LELKR 下文實例章節中提供結合特異性標靶之特異性DVD-Ig 分子及其製備方法的詳細描述。 C· DVD蛋白之產生
可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者製造本發 明結合蛋白。舉例而言，自宿主細胞表現，其中藉由標.準 技術將編碼D V D重鍵及D V D輕鍵之表現載體轉染至宿主細 胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋通常用於將外源 DN A引入原核生物或真核生物宿主細胞中之多種技術，例 如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技 術。儘管可能於原核生物或真核生物宿主細胞中表現本發 明之DVD蛋白’但DVD蛋白應表現於真核細胞（例如哺乳 -129- 150428.doc 201119673 動物宿主細胞）中，因為該等真核細胞（且尤其哺乳動物細 胞）比原核細胞更有可能組裝及分泌適當摺疊且具免疫活 性之DVD蛋白。 表現本發明重組抗體·之例示性哺乳動物宿主細胞包括中 國倉鼠卵巢（CHO)細胞（包括dhfr-CHO細胞，其係描述於
Urlaub 及 Chasin，（1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 中’例如如Kaufman, R.J.及Sharp, P.A. (1982) Mol. Biol. 159: 601-621中所述’其係與DHFR可選標記物 一起使用）、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、SP2及PER.C6細 胞。當將編碼DVD蛋白之重組表現載體引入哺乳動物宿主 細胞中時’藉由培養宿主細胞歷時足以使DVD蛋白在宿主 細胞中表現或足以將DVD蛋白分泌至使宿主細胞生長之培 養基中的時段來產生DVD蛋白。可使用標準蛋白質純化方 法自培養基回收DVD蛋白。 在用於重組表現本發明之DVD蛋白的例示性系統中，藉 由磷酸鈣介導之轉染將編碼DVD重鏈及DVD輕鏈兩者之重 組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體中， 來選擇已經該載體轉染之CHO細胞。培廣 培養所選擇之轉型體
150428.doc DVD重鏈與輕鏈基因各自可操作地連接於CMV強化子/ AdMLP啟動子調控元件以驅動基因之高水準轉錄。重組表 現載體亦運載DHFR基0，其允許使用曱胺嗓呤選擇/擴增 -130- 201119673 基回收DVD蛋白。本發明進一步提供合成本發明DVD蛋白 之方法，該方法藉由在適合培養基中培養本發明之宿主細 胞直至合成本發明之DVD蛋白來進行。該方法可進一步包 含自培養基分離DVD蛋白。 DVD-Ig之重要特徵在於其可以與習知抗體類似之方式 產生及純化。DVD-Ig之產生形成具有所需雙重特異性活 性之均質單一主要產物，而無對恆定區之任何序列修飾或
任何種類之化學修飾。其他先前所述之產生「雙特異 性」、「多特異性」及「多特異性多價」全長結合蛋白之 方法不產生單一主產4勿’而是引起細胞内產生或分泌產生 經組裝之非活性、單特異性、多特異性、多價全長結合蛋 白及具有不同結合位點組合之多價全長結合蛋白的混合 物。舉例而言，基於MUleUP⑽啊丁公開案第wc 2〇〇1/〇77342(A1)號）所述之設計’存在重鍵與輕鍵之㈣ 可能組合。因此，僅6.25%蛋白質可能呈所需之活性形 士，而與其他15種可能組合相比，並非為單—主要產物或 二-主產物。使用通常用於大規模製造之標準層析技術分 離蛋白質之所需完全活性形式與蛋白質之非活性及部分活 性形式仍有待證實。 令人驚訝的是，本發明之「雙重 丈里得異性多價全長結合蛋 人」之設計產生主要組裝成所需「雙重特異性多價全長結 口蛋白」的雙可變域輕鏈及雙可變域重鏈。 至少50%、至少75%及至少9〇% ，二、、且裝及經表現之雙 球蛋白分子為所需雙重特異性四價蛋白質。本 150428‘doc • 131 - 201119673 發明之此態樣尤其增進本發明之商業效用。因此，本發明 包括使雙可變域輕鏈及雙可變域重鏈在單細胞中表現以產 生「雙重特異性四價全長結合蛋白」作為單一主產物的方 法。 本發明提供使雙可變域輕鏈及雙可變域重鏈在單細胞中 表現以產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」作為「主產 物」的方法’其中6亥「主產物」占所有包含雙可變域輕鏈 及雙可變域重鏈之經組裝蛋白質之50%以上。 本發明提供使雙可變域輕鏈及雙可變域重鍵纟單細胞中 表現以產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」作為單一 γ主產物」的方法’其中該「主產物」占所有包含雙可變 域輕鏈及雙可變域重鏈之經組裝蛋白質之75%以上。 本發明提供使雙可變域輕鏈及雙可變域重鏈在單細胞中 表現以產生「雙重特異性四價全長結合蛋白」作為單一 「主產物」的方法，其中該「主產物」占所有包含雙Μ 域輕鏈及雙可變域重鍵之經組裝蛋白質之规以上。 II.衍生之DVD結合蛋白： -實施例提供本發明之結合蛋白經衍生化或連接於另一 功：分子(例如另一肽或蛋白質)的經標記結合蛋白。舉例 而5 ’可错由將本發明之結合蛋白與—或多個其他 體功能性連接（例如藉由化學 ^ ° 丞因融合、非並槽热 合或其他方式）爽种；i 士政。口 、k、’帝 万式）來何生本發明之經標記結合蛋白， 多個其他分子實體諸如另一 μ或 功τα 抗體（例如雙特異性抗體或雙 )、可伯測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導 I50428.doc •132- 201119673 結合蛋白與另一分子（諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組 胺酸標籤）締合之蛋白質或肽。 可用來衍生本發明之結合蛋白之適用可偵測劑包括螢光 化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光 素、右丹明、5-二曱胺萘磺醯氯、藻紅素及其類似物。 亦可用諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及 其類似酶之可偵測酶衍生結合蛋白。當用可偵測酶衍生結 合蛋白時，藉由添加其他試劑（酶使用該等試劑來產生可 偵測反應產物）對其加以偵測。舉例而言，當存在可偵測 劑辣根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺會產生 可偵測之有色反應產物。亦可以生物素衍生結合蛋白且 經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合來偵 測。 、 本發明之另一實施例提供一種結晶結合蛋白及包含該等 晶體之調配物及組合物。在一實施例中，結晶結合蛋白具 有比結合蛋白之可溶性對應物高之活體内半衰期。在另一 貫靶例中’結合蛋白在結晶後保留生物活性。 本發明之結晶結合蛋白可按照此項技術中已知之方法及 如PCT公開案第WO 〇2/072636號中所揭示產生。 本發明之另一實施例提供一種糖基化結合蛋白，其中抗 體或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。初期 活體内蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進一步加工。 詳言之，可酶促添加糖（糖基）殘基，此過程稱為糖基化。 所得具有共價連接之寡醣侧鏈之蛋白質稱為糖基化蛋白質 150428.doc -133- 201119673 或醣蛋白。抗體為在Fc域以及可變域中具有一或多個碳水 化合物殘基之醣蛋白。Fc域中之碳水化合物殘基對Fc域之 效應功能具有重要影響，而對抗體之抗原結合或半衰期影 響極小（R. Jefferis，R. (2〇〇5) Biotechnol. Prog. 21: 11_ 16)。相對而言，可變域之糖基化可對抗體之抗原結合活 性產生影響。可變域中之糖基化可能由於位阻作用而可能 對抗體結合親和力具有負面影響（Co，M.S.等人，（1993) Mol· Immunol. 3〇: 1361·1367)或導致對抗原之親和力增加 (Wallick，S.C.等人，（1988) Exp· Med. 168: 1099-1109; Wright, A.等人，（1991) EMBO J. l〇: 2717 -2723)。 本發明之一態樣係關於產生結合蛋白之〇連接或N連接 糖基化位點已突變之糖基化位點突變體。熟習此項技術者 可使用標準熟知技術產生該等突變體。保留生物活性但具 有增加或減小之結合活性的糖基化位點突變體為本發明之 另一目標。 在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分之糖基 化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化之抗體（亦即缺乏 糖基化之抗體）。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原 之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列 中之一或多個糖基化位點實現。舉例而言，可進行一或多 個胺基酸取代’其導致消除—或多個可變區糖基化位點從 而消除彼位點處之糖純。該㈣基化可增加抗體對抗原 之親和力。該種方法進一步描述於pcT公開案w〇 2003/016466A2及美國專利第5,714 35()號及第6 35〇,861號 150428.doc •134· 201119673 中。 或者或另外，可製備具有改變之糖基化類型的本發明之 經修飾結合蛋白，諸如海藻糖基殘基之量減少的低海藻糖 基化抗體（參看 Kanda，Y.等人，（2007) J. Biotech. 130(3): 300-3 10.)或平分型GlcNAc結構增加之抗體。已證明該等 經改變之糖基化模式增強抗體之ADCC能力。該等碳水化 合物修飾可藉由例如使抗體在糖基化機構改變之宿主細胞 鲁 中表現來貫現。此項技術中已描述糖基化機構改變之細胞 且其可用作表現本發明之重組抗體，由此產生糖基化改變 之抗體之宿主細胞。參看例如Shields, R. L.等人，（2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 ; Umana 等人，（1999) Nat Biotech. 17:176-1，以及歐洲專利第 EP 1 176 195 號及 pCT 公開案第WO 03/035835號及第WO 99/5434280號。 蛋白質糖基化視相關蛋白質之胺基酸序列以及表現該蛋 白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶 •(例如糖基轉移酶及醣苦酶）且具有不同的可利用受質（核苦 酸糖）。由於該等因素，蛋白質糖基化模式及糖基殘基之 組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發 明之糖基殘基可包括（但不限於）葡萄糖、半乳糖、甘露 糖、埤藻糖、η-乙醯基葡糖胺及唾液酸。在一實施例中， 糖基化結合蛋白包合ψ 掩基殘基以使得糖基化模式為人類
熟習此項技術者已 特徵。舉例而言， 知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白 在諸如酵母之微生物宿主中產生且利 150428.doc •135- 201119673 用酵母内源性途徑糖基化之治療性蛋自f的功 如咖細胞株之哺乳動物細胞中表現之相同蛋白質的功效 低1等醣蛋白亦可能在人财具#免疫原性且在投與後 展不降低之活體内半衰期。人類及其他動物中之特定受體 可識別特定糖基殘基且促進自a流中快速清除蛋白質。其 他不利作用可包括蛋自質摺疊、溶解性、對蛋自酶之敏感 度、運輸、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識 別、抗原性或過敏原性的改變。因此，醫師可能選擇具有 特定糖基化組成及模式（例如與人類細胞或預定個體動物 之物種特異性細胞中所產生者相同或至少類似的糖基化組 成及模式）之治療性蛋白質。 表現不同於宿主細胞之糖基化蛋白質的糖基化蛋白質可 藉由基因修飾宿主細胞以表現異源糖基化酶來實現。使用 此項技術中已知之技術，醫師可產生展現人類蛋白質糖基 化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌株進 行基因修飾以表現非天然存在之糖基化酶，以使得此等酵 母菌株中所產生之糖基化蛋白質（醣蛋白）展現與動物細胞 (尤其人類細胞）之蛋白質糖基化相同的蛋白質糖基化（美國 專利第7,449,308號及第7,029,872號；及PCT公開案第W〇 2005/100584號）。 除結合蛋白外’本發明亦係關於對本發明之該等結合蛋 白具有特異性之抗個體基因型（抗Id)抗體《抗Id抗體為識 別一般與另一抗體之抗原結合區締合之獨特決定子的抗 體。可藉由以結合蛋白或其含CDR之區域使動物免疫來製 150428.doc -136· 201119673 備抗id。經免疫動物將識別且回應免疫抗體之遺傳型決定 子且產生抗Id抗體。顯而易見，可能較易於產生併入 DVD-Ig分子中之兩種或兩種以上親本抗體的抗個體基因 型抗體，且藉由此項技術中充分瞭解之方法（例如 BIAcore、ELIS A)確認結合研究以驗證針對各親本抗體之 個體基因型具有特異性之抗個體基因型抗體在DVD_Ig之 情形下亦識別個體基因型（例如抗原結合位點）。針對DVD_ Ig之兩個或兩個以上抗原結合位點中每一者具有特異性之 抗個體基因型抗體提供量測患者血清中人類DVD-Ig之 DVD-Ig濃度的理想試劑；DVD_Ig濃度檢定可使用「夾心 檢定ELISA形式」建立，其中將針對第一抗原結合區之抗 體塗佈於固相（例如BIAcore晶片、ELISA板等）上，用沖洗 緩衝液沖洗，與血清樣品一起培育，再次沖洗，且最終與 針對另一抗原結合位點之另一抗個體基因型抗體一起培 月，δ亥另一抗個體基因型抗體本身經酶標記以定量結合反 應。在一實施例中，對於具有2個以上不同結合位點之 DVD-Ig，針對2個最外側（位於恆定區之最遠端及最近端） 結合位點的抗個體基因型抗體將不僅有助於測定人類血清 中之DVD-Ig濃度，且亦有助於證明分子在活體内之完整 性。各抗Id抗體亦可用作在另一動物中誘發免疫反應之 「免疫原」，從而產生所謂抗抗Id抗體。 此外，熟習此項技術者將瞭解可使用經基因工程改造以 表現各種糖基化酶之宿主細胞庫來表現相關蛋白質，以使 得該庫之成員宿主細胞產生具有變異糖基化模式之相關蛋 150428.doc -137- 201119673 白質。醫師隨後可選擇及分離具有特定新賴糖基化模式之 相關蛋白質。在-實施例中，具有經特定選擇之新顆糖基 化模式之蛋白質展現改良或改變之生物特性。 III. DVD-Ig之用途 黎於本發明之結合蛋白結合於兩個或兩個以上抗原之能 力’可使用該等結合蛋白以使用諸如酶聯免疫吸附檢定 (ELISA)、放射免疫檢定（RIA)或組織免疫組織化學之習知 免疫檢定偵測抗原（例如諸如血清或血漿之生物樣品中卜 _-Ig經可偵測物f直接或間接標記以便於偵測結合或 未結合抗體。適合可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光物 質、發光物質及放射性物質。適合酶之實例包括辣根過氧 化酶、驗㈣_、b•半乳糖㈣及乙醯膽㈣酶；適合 輔基複α物之貫例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物 素蛋白/生物素；適合登光物質之實例包括繳酮 (UmbelHfer〇ne)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二 氣三嗅基胺螢光素、丹醯氯及藻紅素；發光物質之實例包 括魯米諾（luminol);且適合放射性物質之實例包括3h、 14 … C、35 53e Sm 90
Y 99
Tc 125 13 177
Lu 56Ho 及 在κ轭例中，本發明之結合蛋白活體外及活體内中和 抗原活性。因此，該等DVD_Ig可用於在例如含有抗原之 細胞培養物中’在具有與本發明結合蛋白交叉反應之抗原 的人類個體或其他哺乳動物個體中抑制抗原活性。在另一 實施例中，本發明提供一種降低罹患抗原活性有害之疾病 150428.doc -138- 201119673 或病症的個體之抗原活性之方法。可出於治療目的向人類 個體投與本發明之結合蛋白。 術語「抗原活性有害之病症」意欲包括以下疾病及其他 病症，其中已展示或懷疑罹患該病症之個體中存在抗原為 造成該病症之病理生理的原因，或為促使該病症惡化之因 素。因此，抗原活性有害之病症為預期降低抗原活性會緩 解病症之症狀及/或進展的病症。該等病症可藉由例如罹 ^ 患該病症之個體之生物流體中抗原濃度增加（例如個體之 血清、血漿、滑液等中抗原濃度增加）來證實。可用本發 明結合蛋白治療之病症的非限制性實例包括下文及與本發 明抗體之醫藥組合物相關之章節中所論述的彼等病症。 本發明之DVD-Ig可結合一個抗原或多個抗原。該等抗 原包括（但不限於）以下資料庫中所列之標靶。此等標靶資 料庫包括下文所列之彼等： 治療性標乾<(http://xin.cz3_nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); ^ 細胞激素及細胞激素受體（http://www.cytokinewebfacts. com/、http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi及http:"cmbi. bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.ku mamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html); 趨化因子（http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/ CK/Chemokine.html); 趨化因子受體及〇?011(111^://。8卩.]116(^(：.1<；111113111〇1；〇-u.ac.jp/csp/Receptor.html，及 http://www.gpcr.org/7tm/); 嗅覺受體（Olfactory Receptor)(http://senselab.med.yale. 150428.doc -139- 201119673 edu/senselab/ORDB/default.asp)； 受體（http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); 癌症標把（http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); 作為潛在抗體標革巴之分泌蛋白（http://spd.cbi.pku.edu.cn/); 蛋白激酶（http://spd.cbi_pku.edu.cn/)及 人類 CD標記（http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/ CD—table_final_locked.pdf)及（Zola H，（2005) Blood 106: 3123-6) 〇 DVD-Ig適用作治療劑以同時阻斷兩種不同標把，從而 增強功效/安全性及/或增加患者覆蓋範圍。該等標靶可包 括可溶標把（例如TNF)及細胞表面受體標靶（例如veGFR及 EGFR)。其亦可用於誘導腫瘤細胞與τ細胞（例如Her2及 CD3)之間（對於癌症療法而言）、或自身反應性細胞與效應 細胞之間（對於自體免疫疾病或移植而言）、或任何標靶細 胞與效應細胞之間（為消除任何既定疾病中引起疾病之細 胞）的重導向細胞毒性。 此外’當DVD-Ig經設計以靶向同一受體上兩個不同抗 原決定基時’其可用於引發受體叢集及活化。此有益於製 備促效性及拮抗性抗GPCR治療劑。在此情形下，DVD-ig 可用於靶向一個細胞上的兩個不同抗原決定基（包括環區 及胞外域兩者上之抗原決定基）以實現叢集/信號傳導（兩個 細胞表面分子）或信號傳導（一個分子上）。類似地，D Ig分子可經設計以藉由靶向CTLA-4胞外域之兩個不同抗原 決定基（或同一抗原決定基之2個複本）引發CTLA-4接合及 150428.doc •140· 201119673 負信號，導致免疫反應下調。CTLA-4為用於治療性處理 多種免疫學病症的經臨床驗證之標靶。CTLA-4/B7相互作 用藉由削弱細胞週期進展、IL-2產生及T細胞在活化後的 增殖負調控T細胞活化，且CTLA-4(CD152)嚙合可下調T細 胞活化及促進誘導免疫耐受。然而，藉由CTLA-4之促效 性抗體嚙合削弱T細胞活化之策略已失敗，因為CTL A-4活 化需要接合。如晶體結構分析所證實，CTLA-4/B7之分子 相互作用為「斜拉鏈」陣列形式（Stamper (2001) Nature 410: 608)。然而，當前可獲得之CTLA-4結合試劑（包括抗 CTLA-4 mAb)均不具有接合特性。已進行多種嘗試來解決 此問題。在一種情形下，產生細胞成員結合之單鏈抗體， 且其顯著抑制小鼠之同種異體排斥（Hwang (2002) J. Immunol. 1 69: 63 3)。在另一種情形下，產生針對CTL A-4 之人工APC表面連接型單鏈抗體，且證明其削弱T細胞反 應（Griffin (2000) J. Immunol. 164: 4433)。在兩種情形 下，藉由在人工系統中緊密定位成員結合之抗體實現 CTLA-4接合。儘管此等實驗提供藉由引發CTLA-4負信號 傳導使免疫下調之概念驗證，但此等報導中所使用之試劑 不適於治療性用途。為此，可藉由使用靶向CTLA-4胞外 域之兩個不同抗原決定基（或同一抗原決定基之2個複本）的 DVD-Ig分子實現CTLA-4接合。基本原理為跨越IgG之兩個 結合位點的距離（約150-1 70A)過大以致無法活性接合 CTLA-4(2 個 CTLA-4均二聚體之間 30-50 A)。然而，DVD-Ig(—個臂）上兩個結合位點之間的距離短得多（亦在30-50 150428.doc • 141 - 201119673 A範圍内），從而允許適當接合CTLA-4。 類似地’ DVD-Ig可靶向細胞表面受體複合物之兩個不 同成員（例如IL-12R α及β)。此外，DVD-Ig可乾向cri及可 溶蛋白質/病原體，從而驅使快速清除標乾可溶性蛋白質/ 病原體。 此外，本發明之DVD-Ig可用於組織特異性傳遞（靶向組 織標記物及疾病介體以提高局部PK，從而具有較高功效及/ 或較低毒性），包括胞内傳遞（靶向内化受體及胞内分子）、 及傳遞至腦内（靶向轉鐵蛋白受體及CNS疾病介體以跨越血 腦屏障）。DVD-Ig亦可用作載體蛋白以經由結合於抗原之 非中和抗原決定基將彼抗原傳遞至特定位置及亦提高抗原 半衰期。此外，DVD-Ig可經設計以物理連接於植入患者 體内之醫學裝置或靶向此等醫學裝置（參看Burke，s e等 人，（2006) Adv. Drug Deliv· Rev. 58(3): 437_446 ;
Hildebrand，H. F.等人，（2006) Surface and c〇atings Technoh 200(22_23): 6318_6324 ; Wu，p 等人，（2〇〇6)
Bi_terials 27(1 1): 245〇_2467 ; Marques，a p 等人， (2005) Biodegrad. Syst. Tissue England Regen. Med. 377-397)。簡言之’將適當類型之細胞引導至醫藥植入部位可 促進癒合且修復正常組織功能。或者，亦提供對在裝置植 後藉由偶口於裝置上或乾向袭置之釋放之介體（包 括（但不限於）細胞激素）的抑制仙。舉例而t，介入心臟 病學多年來使用支架疏通阻塞之動脈及改善血液至心肌之 流動。然而，已知傳統裸金屬支架在一些患者體内會引起 150428.doc 201119673 再狹窄(所治療區域中之動脈再變狹窄)且可產生血液凝 塊。最近，已描述塗有抗咖4抗體之支架，其藉由捕捉 在整個血液中循環之内皮袓細胞（EPC)來減輕再狹窄且防 止出現金液凝塊。内皮細胞為内襯於血管内使血液順暢流 動之細胞。EPC黏附於支架之硬質表面上，形成光滑層， 該光滑層不僅促進癒合而且亦防止再狹窄及企液凝塊，與 使用支架相關之先前併發症（A〇ji等人，（2〇〇5)】Am C〇u • 以1^01· 45(10): I574—9)。除改良需要支架之患者的結果 以外，對需要心血管繞道手術之患者亦存在意義。舉例而 吕，塗有抗EPC抗體之修復血管管道（人工動脈）將消除使 用來自患者腿部或手臂之動脈用於繞道手術移植的需要。 此將減少手術及麻醉次數，繼而將減少冠狀動脈手術死 亡。以一疋方式設計DVD_Ig，該方式使得其結合於細胞 表面標記物（諸如CD34)以及已塗於植入之裝置上以促進細 胞募集之蛋白質（或任何種類之抗原決定基，包括（但不限 • 於）蛋白質、脂質及多醣）。該等方法一般亦可用於其他醫 學植入物。或者，可將DVD-Ig塗於醫學裝置上且在裝置 植入且自該裝置釋放所有DVD後（或可能需要其他新鮮 DVD-Ig之任何其他需求，包括已裝載之DVD_ig老化及變 性），可藉由向患者全身性投與新鮮DVD_Ig再裝載該裝 置，其中DVD-Ig經設計以一組結合位點結合於相關標靶 (細胞激素、細胞表面標記物（諸如CD34)等）且以另一組結 合位點結合於裝置上塗有之標靶（包括蛋白質，任何種類 之抗原決定基，包括（但不限於）脂質、多醣及聚合物）。此 150428.doc -143- 201119673 技術具有擴展經塗佈植入物之適用性的優勢。 A· DVD-Ig在各種疾病中之用途 本發明之DVD-Ig分子亦適用作治療各種疾病之治療性 分子。該等DVD分子可結合特定疾病中所涉及之一或多種 標靶。各種疾病中之該等標靶之實例描述如下。 1·人類自體免疫及發炎反應 一般自體免疫及發炎反應中涉及許多蛋白質，包括C5、 CCLl(I-309)、CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子）、 CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-ld)、CCL16(HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-l)、CCL20 (MIP_3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、 CCL26、CCL3(MIP-la)、CCL4(MIP-lb)、CCL5(RANTES)、 CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCLIO(IP-IO)、 CXCLll(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、 CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、 CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、 CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCRl(CCXCRl)、IFNA2、 IL10、IL13、IL17C、ILIA、IL1B、IL1F10、IL1F5、 IL1F6 、 IL1F7 、 IL1F8 、 IL1F9 、 IL22 、 IL5 、 IL8 、 IL9 、 LTA、LTB、MIF、SCYE1 (内皮單核細胞活化細胞激素）、 SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、 IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、 150428.doc •144- 201119673 C3、C4A、CEBPB ' CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、 IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAKI、IRAK2、 MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、 TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、 ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、 CD3Z 、 CD69 、 CD80 、 CD86 、 CNR1 、 CTLA4 、 CYSLTR1 、 FCER1A 、 FCER2 、 FCGR3A 、 GPR44 、
HAVCR2 、 OPRD1 、 P2RX7 、 TLR2 、 TLR3 、 TLR4 、 TLR5 、 TLR6 、 TLR7 、 TLR8 、 TLR9 、 TLR10 、 BLR1 、 CCL1 、 CCL2 、 CCL3 、 CCL4 、 CCL5 、 CCL7 、 CCL8 、 CCL11 、 CCL13 、 CCL15 、 CCL16 、 CCL17 、 CCL18 、 CCL19 、 CCL20 、 CCL21 、 CCL22 、 CCL23 、 CCL24 、 CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、 CCR7 、 CCR8 、 CCR9 、 CX3CL1 、 CX3CR1 、 CXCL1 、 CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、 CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、 XCL1 、XCL2、XCR1 、AMH、AMHR2、BMPR1A、 BMPR1B、BMPR2、C19orflO(IL27w)、CER1、CSF1、 CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、 IFNB1 、IFNG、IGF1 、ILIA、IL1B、IL1R1、IL1R2、 IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、 IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、 IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、 IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1 ' IL12RB2、IL13、 150428.doc -145 - 201119673 IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、 IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、 LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、 PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、 TGFB2 、 TGFB3 、 TGFBI 、 TGFBR1 、 TGFBR2 、 TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、 TNFRSF7 、 TNFRSF8 、 TNFRSF9 、 TNFRSF11A 、 TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、 VEGF、ZFPM2 及 RNF110(ZNF144)。在一態樣中，提供結 合一或多個本文所列標靶之DVD-Ig。 涵蓋能夠結合以下標靶對以浴療發炎疾病之DVD Ig : MTX 與 mCD-3 ; MTX與 mCD-19 ; MTX與 hCD-3 ; MTX與 hCD-19 ; MTX 與 CD-20 ; MTX 與 EGFR ;及 MTX 與 HER-2 ° 2.哮喘 過敏性哮喘之特徵在於存在嗜伊紅血球增多、杯狀細胞 化生、上皮細胞改變、氣管過度反應（AHR)，及Th2及Thl 細胞激素表現，以及血清IgE含量升高。目前廣泛認為氣 管發炎為哮喘發病機制之關鍵因素，涉及諸如T細胞、B細 胞、嗜伊紅血球、肥大細胞及巨噬細胞之發炎性細胞及其 分泌介體（包括細胞激素及趨化因子）的複雜相互作用。皮 質類固醇為當今用於哮喘之最重要消炎治療劑，然而其作 用機制非特異性，且存在安全性問題，尤其在青少年患者 群體。因此，有必要開發更特異及靶向性之療法。愈來愈 150428.doc •146· 201119673 多跡象表明IL-13在小鼠中模擬許多哮喘特徵，包括 AHR、黏液分泌過多及氣管纖維化，而與嗜伊紅血球發炎 無關（Finotto 等人，（2005) Int. Immunol. 17(8): 993-1007; Padilla等人，（2005) J. Immunol. 174(12): 8097-8105)。 已暗示IL- 1 3在引起哮喘相關之病理學反應中具有關鍵 作用。降低IL-13在肺中效應的抗仄-13 mAb療法之發展為 激勵人心的新方法’其作為哮喘之新穎治療具有相當大的 月’J景。然而’哮。而發病機制中亦涉及差異免疫球蛋白路徑 之其他介體，除IL-13外，阻斷此等介體可提供其他治療 益處。該等標靶對包括（但不限於）IL_i3及促發炎 (proinflammatory)細胞激素，諸如腫瘤壞死因子_a(TNF_ ex)。TNF-a可增強哮喘之發炎反應，且可能與疾病嚴重程 度相關聯（McDonnell 等人，（2001) progr. Respir Res 31: 247-250)。此表明阻斷IL-13及TNF-a兩者可能具有有益作 用’尤其在嚴重氣管疾病。在另一實施例中，本發明之 DVD-Ig結合標靶IL-13及TNFa，且用於治療哮喘。 可評估發炎及AHR之動物模型（諸如0VA誘導哮喘之小 鼠模型）在此項技術中已知’且可用於測定各種DVD-Ig分 子治療哮喘之能力。用於研究哮喘之動物模型揭示於
Coffman等人，（2005) J. Exp. Med. 201(12): 1875-1879; Lloyd 等人，（2001) Adv. Immunol. 77: 263-295; Boyce 等 人，（2005) J. Exp. Med. 201(12): 1869-1873 ;及 Snibson等 A, (2005) J. Brit. Soc. Allerg. Clin. Immunol. 35(2): 146-5 2中。除對此專彳示革巴對之常規安全性評估以外，免疫抑制 150428.doc -147- 201119673 程度之特定測試可能有必要且有助於選擇最佳標靶對（參 看 Luster 等人，（1994) Toxicology 92(1-3): 229-43 ; Descotes等人，（1992) Devel. Biol. Stand. 77: 99-102 ; Hart 寺人，（2001) J. Allerg· Clin. Immunol. 108(2): 250-257)。 基於本文揭示之基本原理且使用功效及安全性之相同評 價模型，可測定DVD-Ig分子可結合且適用於治療哮喘之 其他標靶對。在一實施例中，該等標靶包括（但不限於）IL_ 13與IL-Ιβ，因為比-ΐβ亦涉及於哮喘之發炎反應中；IL13 與炎症中涉及之細胞激素及趨化因子’諸如IL_ 13與IL-9 ; IL-13 與 IL-4 ; IL-13 與 IL-5 ; IL-13 與 IL-25 ; IL-13 與 TARC，IL-13 與 MDC ; IL-13 與 MIF ; IL-13 與 TGF-β ; IL- 13與LHR促效劑；化-^與以^ ; ILn與spRR2a ; ili3 與SPRR2b ;及IL-13與ADAM8。本發明亦提供結合哮喘中 ν及之選自由以下組成之群的一或多個標乾之〇VD_jg : mCD 3、mCD-19、hCD-3、hCD-19、CD-20、EGFR 及 HER-2。 3·類風濕性關節炎 —類風濕性關節炎（RA)為一種全身性疾病’其特徵在於關 節e膜中之慢性發炎反應，且與軟骨退化及近關節骨磨損 有關。患病關節中表現包括TNF、趨化因子及生長因子之 许夕促炎性細胞激素。向尺八小鼠模型全身性投與抗tnf抗 體或sTNFR融合蛋白顯示消炎及關節保護。藉由靜脈内投 與英利昔單抗（Harriman，G等人，（1999) Ann处議此 (曰刊1). 161-4)(—種嵌合抗tnf mAb)阻斷RA患者之 I50428.doc 201119673 TNF活性的臨床研究已提供證據表明TNF調控IL-6、IL-8、MCP-1及VEGF產生、免疫及發炎性細胞至關節中募 集、血管生成及降低基質金屬蛋白酶1及3血液含量。類風 濕性關節炎之發炎路徑的較佳理解導致鑑別類風濕性關節 炎中涉及的其他治療標靶。過去幾年中，已在隨機對照試 驗中測s式有鈾景之治療劑，諸如介白素-6拮抗劑（由 Chugai，Roche 研發之 IL-6 受體抗體 MRA(參看 Nishimoto, N. 等人，（2004) Arthrit. Rheum. 50(6): 1761-1769))、 CTLAAIg^5!巴西普（abatacept), Genovese, Μ.等人，（2005) N. Engl. J_ Med. 353: 1 1 14-23.)及抗Β細胞療法（利妥昔單 抗，Okamoto，Η.及 Kamatani，Ν. (2004) Ν. Engl. J. Med. 35 1: 1 909)。已鑑別出其他細胞激素，且已顯示其在動物 模型中具有益處’包括介白素_15(治療性抗體HuMax- IL_15、AMG 714(參看 Baslund，B.等人，（2005) Arthrit. Rheum. 5 2(9): 2686-2692))、介白素 _17及介白素 _18，且目 前正在進行此等試劑之臨床試驗。雙重特異性抗體療法組 合抗TNF及另一介體在提高臨床功效及/或患者覆蓋範圍方 面具有極大潛力。舉例而言，阻斷TNF及VEGF可能根除 炎症及血管生成，其皆涉及於RA病理生理學中。阻斷r a 中涉及之其他標靶對，包括（但不限於）IL_lb&IL_n。除 對此等標靶對之常規安全性評估以外，可能有必要針對免 疫抑制度進行特定測試且其有助於選擇最佳標靶對（參看
Luster 等人，（1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43 ; Descotes 等 人，（1992) Devel. Biol· Stand. 77: 99-102 ; Hart 等人， 150428.doc -149- 201119673 (2001) J. Allerg. Clin. Immunol. 108(2): 250-257) ° 可使用 臨床前動物RA模塑（諸如膠原蛋白誘導關節炎之小鼠模型） 評估DVD Ig分子是否將適用於治療類風濕性關節炎。其他 適用模型亦為此項技術中所熟知（參看Brand，D.D. (2005) Comp. Med. 55(2): 114-22)。基於人類親本抗體與小鼠直 系同源物之交叉反應性（例如人類與小鼠TNF、人類與小鼠 IL-1 5等之反應性）’可以「匹配之替代抗體」產生之DVD_ Ig分子進行小鼠CIA模型中之驗證研究；簡言之，基於兩 個（或兩個以上）小鼠標把特異性抗體之DVD-Ig可在可能的 程度上匹配用於人類DVD-k建構之親本人類抗體或人類 化抗體之特徵（類似親和力、類似中和效能、類似半哀期 等）。
4. SLE SLE之免疫病原性特點為多株B細胞活化’此導致高球 蛋白血症、產生自體抗體及形成免疫複合物。基本異常似 乎為T細胞由於全身性T細胞功能障礙而無法抑制禁忌B細 胞純系。此外’若干細胞激素（諸如IL_ 1 〇)以及起始第二信 號之協同刺激分子（諸如CD40A CD40L、B7及CD28及 CTLA-4)促進B細胞與τ細胞相互作用。此等相互作用以及 免疫複合物及細胞〉周亡物質的吞D莖細胞清除受損使免疫反 應及由此導致之組織損傷持續。以下標靶可涉及於SLE中 且可潛在地用於供治療性干預的DVD-Ig方法中：B細胞革巴 向療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、 HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5 、TNFRSF6、 150428.doc -150- 201119673 TNFSF5 、 TNFSF6 、 BLR1 、 HDAC4 、 HDAC5 、 HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、 SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、 TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、 HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、 INHBA 、 KLF6 、 TNFRSF7 、 CD28 、 CD38 、 CD69 、 CD80 、 CD83 、 CD86 、 DPP4 、 FCER2 、 IL2RA 、
TNFRSF8 、TNFSF7、CD24、CD37 、CD40、CD72、 CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、 MS4A1 、 ST6GAL1 、 CD1C 、 CHST10 、 HLA-A 、 HLA- DRA及NT5E.;協同刺激信號：CTLA4或B7.1/B7.2 ;抑制 B細胞存活：BlyS或BAFF ;補體失活：C5 ;細胞激素調 節：關鍵原理在於任何組織中之淨生物反應均係促炎性細 胞激素或消炎細胞激素局部含量之間的平衡結果（參看 Sfikakis, Ρ·Ρ·等人，（2005) Curr. Opin. Rheumatol· 17: 550-7)。SLE視作Th-2驅動之疾病，已證實其血清IL-4、IL-6、 IL-1 0升高。亦涵蓋結合一或多種選自由以下組成之群之 標靶的DVD-Ig : il-4、IL-6、IL-10、IFN-α、TNF-α、IL-1 b及IL-1 7。本文所述之標靶組合將增強針對slE之治療功 效’其可在多種狼瘡臨床前模型中得以測試（參看Peng， S.L. (2004) Methods Mol Med.;102:227-72)。基於人類親本 抗體與小鼠直系同源物之交叉反應性（例如人類與小鼠 CD20、人類與小鼠干擾素a等之反應性），可以「匹配之替 代抗體」產生之DVD-Ig分子進行小鼠狼瘡模型中之驗證 150428.doc • 151 · 201119673 研究；簡言之，基於兩個（或兩個以上）小鼠標免特異性抗 體之勵-Ig可在可能之程度上四配用於人類建構 之親本人類抗體或人類化抗體之特徵（類似親和力、類似 中和效能、類似半衰期等）。 5.多發性硬化症 多發性硬化症(MS)為病因基本上未知之一種複雜的人類 自體免疫型疾病。在整個神經系統中髓鞘鹼性蛋白 的免疫破壞為多發性硬化症之主要病理。MS為具有涉及 CD4 +及CD8+ T細胞浸潤之複雜病理及中枢神經系統内之 反應之疾病。細胞激素、反應性氮物質及協同刺激分子在 CNS中之表現皆已在MS中描述。主要考慮因素為促進產生 自體免疫的免疫機制。詳言之，抗原表現、細胞激素與白 血球相互作用及有助於平衡/調節其他τ細胞（諸如Thi及 Th2細胞）之調控性τ細胞為治療標靶鑑別之重要方面。 IL-12為由APC產生且促進Thl效應細胞分化之促炎性細 胞激素。IL-12在罹患MS之患者正形成之病變中以及在罹 患EAE之動物體内產生。先前已展示干擾IL_12路徑有效防 止齧齒動物之EAE，且使用抗IL-12 mAb活體内中和；[L- 1 2p40對普通狨猿之髓鞘誘發性eae模型中具有有益作 用。 TWEAK為TNF家族之成員，其組成性表現於中樞神經系 統（CNS)中，視細胞類型而定具有促炎性、增殖性或細胞 洞亡效應。其受體Fn 14係由内皮細胞、反應性星形膠質細 胞及神經元表現於CNS中。在實驗性自體免疫腦脊髓炎 150428.doc -152- 201119673 (EAE)期間，脊髓中之TWEAK及Fnl4 mRNA表現增加。對 C5 7BL/6小鼠之髓鞘寡樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG)誘 發之EAE進行抗TWEAK抗體治療在預致敏階段後治療小 鼠時會引起疾病嚴重度及白血球浸潤降低。 本發明之一態樣關於結合一或多個（例如2個）選自由以 下組成之群之標靶的DVD Ig分子：mCD-3、mCD-1 9、 hCD-3、hCD-19、CD-20、EGFR及 HER-2。一實施例包括 雙重特異性抗IL-12/TWEAK DVD Ig作為有益於治療MS之 治療劑。 若干用於評估DVD分子治療MS之適用性的動物模型為 此項技術所已知（參看Steinman. L.等人，（2005) Trends Immunol. 26(11): 565-71 ; Lublin, F.D.等人，（1985)
Springer Semin. Immunopathol. 8(3): 197-208 ; Genain， C-P. #A，（1997)J.Mol.Med.75(3):187-97;Tuohy,V.K. 等人，（1999) J. Exp· Med. 189(7): 1033-42; Owens, T.等 人，（1995) Neurol. Clin.l3(l): 51-73 ;及 Hart，B.A.等人， (2005) J. Immunol. 175(7): 4761-8)。基於人類親本抗體與 動物物種直系同源物之交叉反應性（例如人類與小鼠IL-12、人類與小鼠TWEAK等之反應性），可以「匹配之替代 抗體」產生之DVD-Ig分子進行小鼠EAE模型中之驗證研 究。簡言之，基於兩個（或兩個以上）小鼠標靶特異性抗體 之DVD-Ig可在可能的程度上匹配用於人類DVD-Ig建構之 親本人類抗體或人類化抗體之特徵（類似親和力、類似中 和效能、類似半衰期等）。相同概念適用於其他非齧齒動 150428.doc -153 - 201119673 物物種之動物模型，其中將選擇「匹配之替代抗體」產生 之DVD Ig用；^預期藥理學且可能的安全性研究。除對此 等標乾對之常規安全性評估料，有必要針對免疫抑制度 進行特定測試且其適用力選擇最佳標㈣（參看等 A, (1994) Toxicol. 92(1-3)： 229-43 ； Descotesf A, (1992) Devel. Biol. Stand. 77: 99-102 ； Jones, R. (2〇〇〇) IDrugs 3(4): 442-6)。 6.敗血症 敗血症之病理生理係由革蘭氏陰性生物體（脂多醣 [LPS]、月曰貝A、内毒素）及革蘭氏陽性生物體（脂磷壁酸 (lipoteichoic acid)、肽聚糖）之外膜組分起始。此等外膜組 分能夠結合於單核細胞表面上之cm4受體。根據最近描 述之toll樣受體，接著將信號傳遞至細胞，導致最終產生 促炎性細胞激素腫瘤壞死因子_a(TNF a)及介白素丨（化· 1)。嚴重發炎及免疫反應為敗血性休克之基本特徵，且在 由敗血症誘導之組織損傷、多器官衰竭及死亡之發病機制 中起重要作用。細胞激素（尤其腫瘤壞死因子（TNf)及介白 素（IL-1))已經展示為敗血性休克之關鍵介體。此等細胞激 素對組織具有直接毒性作用；其亦活化磷脂酶八2。此等及 其他效應導致血小板活化因子濃度增加、促進氧化氮合成 酶活性、促進嗜中性白血球之組織浸潤及促進嗜中性白血 球活性。 對敗血症及敗血性休克之治療仍為臨床難題，且以針對 發炎反應之生物反應調節劑（亦即抗TNF及抗MIF)進行之 150428.doc -154· 201119673 新近前瞻性試驗僅展示中等臨床益處。最近，關注轉向目 的在於逆轉免疫抑制伴發期之療法。對實驗動物及危重患 者之研究已表明淋巴器官及一些實質組織之細胞凋亡增強 促成此免疫抑制、無反應性及器官系統功能障礙。在敗血 症症候群期間，淋巴細胞細胞凋亡可由缺乏IL-2或由釋放 糖皮質激素、顆粒酶或所謂之「死亡」細胞激素（即腫瘤 壞死因子α或Fas配位體）引發。細胞凋亡經由胞内及/或粒 線體卡斯蛋白酶之自體活化繼續進行，該自體活化可受 Bcl-2家族之促細胞凋亡及抗細胞凋亡成員影響。在實驗 動物中，用細胞凋亡抑制劑治療不僅可防止淋巴細胞之細 胞凋亡；其亦可改良結果。儘管對抗細胞凋亡劑之臨床試 驗在很大程度上歸因於與其投與及組織靶向相關之技術困 難而難以進行，但抑制淋巴細胞細胞凋亡代表用於敗血症 患者之有吸引力的治療標靶。同樣，靶向發炎性介體及細 胞凋亡介體之雙重特異性藥劑可具有其他益處。本發明之 一態樣係關於結合一或多種選自由以下組成之群的涉及於 敗血症中之標靶（在一實施例兩種標靶）的DVD-Ig : TNF、 IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、 LPS、Toll 樣受體、TLR-4、組織因子、MIP-2、 ADORA2A、CASP1、CASP4、IL-10、IL-1B、NFKB1、 PROC、TNFRSF1A、CSF3、CCR3、IL1RN、MIF、 NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期 因子（midkine)、IRAKI、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1 及TREM1。該等DVD Ig對於敗血症之功效可在此項技術 150428.doc -155- 201119673 中已知之臨床前動物模型中評定（參看Buras，j A等人 (2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10):854-65及 Calandra T等 人，（2000) Nat Med. 6(2):164-70)。在一實施例中，使用針 對 MTX 與 mCD-3 ; MTX 與 mCD-19 ; MTX 與 hCD-3 ; MTX 與 hCD-19 ; MTX與 CD-20 ; MTX與 EGFR ;及 MTX與 HER- 2的本發明之d VD-Ig治療敗血症。 7·神經病症 7·1·神經退化性疾病 神經退化性疾病為慢性的（在該情形中，其通常為年齡 相關性的）或急性的（例如中風、創傷性腦損傷、脊髓損傷 等）。其特徵在於神經元功能進行性喪失（神經元細胞死 亡、脫髓鞘）、運動性喪失及記憶喪失。關於慢性神經退
I1生疾病（例如阿錄海默氏病）之基礎之機制的新興知識 不複雜病源學且已認可多種因素造成其產生及進展例 年齡、血糖狀況、類殿粉蛋白產生及多聚化、晚期糖基 終點產物（AGE)(其ά士人甘為
忙 八卉、·Ό σ其受體RAGE(AGE之受體））積聚 腦氧化應激增加、腦血流詈、 ! ir减v、包括發炎性細胞激素 趨化因子之釋放的神 啟京' ^ 人症、神經元功能障礙及微神經j 貝細胞活化。因此’此等 A ^ 寺^〖生神經退化性疾病代表多種; 胞類型與介體之間的 ' ^ ]複雜相互作用。針對該等疾病之治; 東略有限且主尊兔田 ΓΓ)ΎΜ 寺異性消炎劑（例如皮質類固醇 cox抑制劑）阻斷發 mx-h^ ^ ^ 或使用防止神經元喪失及/或‘ 觸功忐之樂劑。此等 a, , w 。療不此終止疾病進展。新近研究」 明更具靶向性之瘁沐 “（啫如針對可溶性A-b肽（包括A_b寡: 150428.doc -156· 201119673 形式）之抗體）不僅可有助於終止疾病進展且亦可有助於維 持記憶力。等初步觀測結果表明靶向一種以上疾病介體 (例如A-b及促炎性細胞激素（諸如TNF))之特異性療法對慢 性神經退化性疾病所提供的治療功效甚至比靶向單一疾病 機制（例如單獨可溶性A-b)所觀測到之治療功效更好。若 干用於評定DVD分子治療MS之適用性的動物模型為此項 技術所已知（參看Steinman. L.等人，（2005) Trends
Immunol· 26(11): 565-71 ; Lublin，F.D.等人，（1985)
Springer Semin. Immunopathol. 8(3): 197-208 ； Genain, C.P.等人，（1997) J. Mol. Med. 75(3): 187-97 ; Tuohy，V.K. 等人，（1999) J. Exp. Med. 189(7): 1033-42 ; Owens，T.等 人，（1995) Neurol. Clin.13(1): 51_73 ;及 Hart，BA 等人， (2005) J. Immunol. 175(7): 4761_8)。基於人類親本抗體與 動物物種直系同源物之交叉反應性（例如人類與小鼠IL_ 1 2、人類與小鼠TWEAK等之反應性），可以「匹配之替代 抗胆」產生之DVD-Ig分子進行小鼠eae模型中之驗證研 究。簡言之，基於兩個（或兩個以上）小鼠標靶特異性抗體 之DVD-Ig可在可能的程度上匹配用於人類DVDIg建構之 親本人類抗體或人類化抗體之特徵（類似親和力、類似中 和效能、類似半衰期等）。相同概念適用於其他非齧齒動 物物種之動物模型，其中將選擇「匹配之替代抗體」產生 之DVD-Ig用於預期藥理學及可能的安全性研究。除對此 等t乾對之^規·^全性評定以外’有必要針對免疫抑制程 度進行特疋及I 4且其有助於選擇最佳標乾對（參看Luster等 150428.doc -157- 201119673 人，（1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43 ; Descotes 等人，（1992)
Devel. Biol. Stand. 77: 99-102 ； Jones, R. (2000) IDrugs 3(4): 442-6)。 本發明之DVD-Ig分子可結合一或多種涉及於諸如阿茲 海默氏病之慢性神經退化性疾病中的標靶。該等標靶包括 (但不限於）涉及於AD發病機制中之任何可溶性或細胞表面 介體，例如AGE(S100 A、兩性黴素）、促炎性細胞激素（例 如IL-1)、趨化因子（例如MCP丨）、抑制神經再生之分子（例 如Nogo、RGM A)、增強神經突生長之分子（神經營養素 (neurotrophin))及可介導血腦屏障處之轉運的分子（例如轉 鐵蛋白受體、胰島素受體或RAGE)。DVD_Ig分子之功效可 在諸如過度表現類澱粉前驅蛋白或RAGE且形成阿茲海默 氏病樣症狀之轉殖基因小鼠的臨床前動物模型中得以驗 證。此外，可建構DVD_Ig分子且測試其在動物模型中之 功效，且可選擇最佳治療性DVD_Ig在人類患者中進行測 試。DVD-Ig分子亦可用於治療其他神經退化性疾病，諸 士帕金森氏病α_大·觸核蛋白（Alpha_Synuclein)涉及於帕 金森氏病的病理中。能夠靶向α_突觸核蛋白及發炎性介體 (諸如TNF、IL]、MCIM)之刪七可證明為帕金森氏病 之有效療法且涵蓋於本發明中。 7.2.神經元再生及脊髓損傷 儘管對病理機制的認識增加’但脊髓損傷(sc”仍為一 種破壞性病狀且代表特徵在於高醫藥需求之醫學適應症。 大多數脊髓損傷為挫傷或壓傷以發性損傷後通常為使初 150428.doc •158- 201119673 。員傷〜' 化且引起病變區域顯著擴大（有時1 〇倍以上）之繼 發性損傷機制（發炎性介體’例如細胞激素及趨化因子）。 SCI中之此等原發性及繼發性機制與其他方式（例如中風） 引=之腦損傷之機制極類似。不存在令人滿意之治療且高 ⑷里陕速A射甲潑尼龍為唯一在
損傷後8小時之窄時間窗内使用之治療。然而，此治療僅 意欲預防繼發性損傷而不引起任何顯著功能恢復。其由於 、乏月霍功效且不利作用嚴4 (如免疫抑制伴有後續感染 及嚴重、.且織病理學肌肉改變）而受到嚴厲批評。無其他刺 激内源再生潛能之藥物、生物劑或小分子獲批准，但近年 來有前景之治療原理及藥物候選物已在SCI動物模型中展 示功效。在很大程度上’人類SCI功能恢復之缺乏係由抑 制病㉔部位處、症痕組織中、髓鞘中以及損傷相關細胞上 之神經突生長之因子所引起。該等因子為髓鞘相關蛋白 N〇g〇A、0Mgg MAG、RGM A、疤痕相關 cspG(硫酸軟 骨素蛋白聚糖）及反應性星形膠質細胞上之抑制因子（一些 信號蛋白（semaphorin)及蝶素（ephrin))。然而，在病變部: 處不僅發現生長抑制性分子且亦發現神經突生長刺激因子 (如神經營養素、層黏連蛋白、L1及其他因子）。神經突生 長抑制性分子及生長促進分子之此組合可解釋阻斷如 NogoA或RGM A之單一因子會在齧齒動物SCI模型中引起 顯著功能恢復，因為減小抑制性影響可使平衡自生長抑制 作用轉向生長促進作用。然而，在阻斷單—神經突外生= 抑制分子下觀測到之恢復不完全。為實現更快且更顯著之 150428.doc •159- 201119673 恢復’可能需要阻斷兩種神經突外生長抑制分子（例如 Nogo及RGM A) ’或阻斷神經突外生長抑制分子且增強神 經突外生長增強分子（例如Nogo與神經營養素）之功能，或 阻斷神經突外生長抑制分子（例如N〇go)及促炎性分子（例 如 TNF)(參看 McGee，A.W.等人，（2003) Trends Neurosci. 26: 193 ; D〇meniconi，μ.等人，（2005) J. Neurol. Sci. 233: 43 ; Makwanal，M.等人，（2005) FEBS J. 272: 2628 ; Dickson，B.J. (2002) Science 298: 1959 ; Yu，F.及 Teng，H. 等人，（2005) J. Neurosci. Res. 79: 273 ; Karnezis，T.等人， (2004) Nature Neurosci. 7: 736 ; Xu，G.等人，（2004) J. Neurochem. 91: 1018) ° 在一態樣中，提供結合以下標靶對之DVD-Ig :諸如NgR 與 RGM A ; Nog〇A 與 RGM A ; MAG與 RGM A ; OMGp 與 RGM A ; RGM A與 RGM B ; CSPG與 RGM A ;聚集蛋白聚 糖（aggrecan)、中期因子、神經蛋白聚糖（neurocan)、多功 能蛋白聚糖（versican)、填酸蛋白聚糖（phosphacan)、Te38 與TNF-α;與促進樹突及軸突萌芽之抗體組合之Αβ球聚體 特異性抗體。樹突病理為AD之極早徵兆且已知NOGO Α限 制樹突生長。可將一個該類型之Ab與SCI-候選物（髓鞘-蛋 白質）Ab中之任一者組合。其他DVD-Ig標靶可包括NgR-p75 ' NgR-Troy ' NgR-Nogo66(Nogo) ' NgR-Lingo ' Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG及Omgp之任何組合。此外，標把 亦可包括涉及抑制神經突之任何可溶性或細胞表面之介 體，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、信號蛋白、蝶 150428.doc •160· 201119673 素、可溶A-b、促炎性細胞激素（例如αι)、趨化因子⑼ 如黯la)、抑制神經再生之分子。抗⑽~抗rgm A或類 似DVD_Ig分子之功效可在脊髓損傷之臨床前動物模型中 得以驗證。此外’可建構此等DVD_Ig分子且測試盆在動 物模型中之功效，且可選擇最佳治療性在人類患 者中進行測試。此外，可建構乾向單—受體（例如結合三
種配位體N〇g〇、001叩及MAG之N〇g〇受體以及結合A b及 S 100 A之RAGE)上之兩個$同配位體結合位點的dvd七分 子。此外，在如多發性硬化症之免疫疾病巾，例如n〇g〇及 n〇g〇受體之神經突外生長抑制劑亦在防止神經再生中起作 用。對n〇g〇-n〇g〇受體相互作用之抑制已在多發性硬化症 之動物模型中展示增強之恢復。因此，可阻斷一種免疫介 體（例如細胞激素，如IL_12)及神經突外生長抑制分子（例 如n〇g〇或RGM)功能的DVD_Ig分子之功效可提供比單獨阻 斷免疫或神經突外生長抑制分子之功效更快且更大之功 效0 一般而言，抗體不以有效及相關方式跨越血腦屏障 (BBB)。然而，在某些神經性疾病（例如中風、創傷性腦損 傷、多發性硬化症等）中，BBB可能受損且使DVD_ig及抗 體進入腦中之穿透作用增強。在未出現BBB滲漏之其他神 ，二病狀中，可使用對内源轉運系統之靶向，該等轉運系統 包括載體介導之轉運體（諸如葡萄糖及胺基酸載體）及BBB 血&内皮上的受體介導之轉胞吞作用（transcyt〇sis)介導之 細胞結構/受體，從而使跨BBB轉運DVD-Ig成為可能。 150428.doc 201119673 BBB處使該種轉運成為可能之結構包括（但不限於）胰島素 受體、轉鐵蛋白受體、LRP及RAGE。另外’另外’策略 使DVD-Ig亦能夠作為穿梭載體（shuttle)將潛在藥物（包括低 分子量藥物、奈米粒子及核酸）轉運至CNS中（Coloma，M.J. 等人，（2000) Pharm Res. 17(3):266-74: Boado，R.J.等人， (2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55) ° 8.踵瘤病症 單株抗體療法已顯現為癌症之重要治療模式（von Mehren Μ等人，（2003) Annu Rev Med.;54:343-69) 〇 抗體可 藉由誘導細胞凋亡、重導向細胞毒性、干擾配位體-受體 相互作用或阻止對贅生性表型關鍵之蛋白質表現來發揮抗 腫瘤作用。此外，抗體可靶向腫瘤微環境之組分，擾亂重 要結構，諸如腫瘤相關血管結構形成。抗體亦可靶向配位 體為生長因子之受體，諸如表皮生長因子受體。抗體因此 抑制刺激細胞生長之天然配位體結合於輕向之腫瘤細胞。 或者，抗體可誘導抗個體基因型網狀物、補體介導之細胞 毒性或抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。使用靶向兩種各別 腫瘤介體之雙重特異性抗體相較於單特異性療法將可能提 供其他益處。亦涵蓋結合以下標靶對來治療腫瘤疾病之 DVD Ig : IGF1 與 IGF2 ; IGF 1/2 與 HER-2 ; VEGFR 與 EGFR ; CD20 與 CD3 ; CD138 與 CD20 ; CD38 與 CD20 ; CD38 與 CD138 ; CD40 與 CD20 ; CD138 與 CD40 ; CD38 與 CD40 ; CD-20與 CD-19 ; CD-20與 EGFR ; CD-20與 CD-80 ; CD-20 與 CD-22 ; CD-3 與 HER-2 ; CD-3 與 CD-19 ; EGFR與 150428.doc -162- 201119673 HER-2 ; EGFR與 CD-3 ; EGFR與 IGF1，2 ; EGFR與 IGF1R ; EGFR 與 RON ; EGFR 與 HGF ; EGFR 與 c-MET ; HER-2 與 IGF1，2 ; HER-2 與 IGF1R ; RON 與 HGF ; VEGF 與 EGFR ; VEGF 與 HER-2 ; VEGF 與 CD-20 ; VEGF 與 IGF1，2 ; VEGF 與 DLL4 ; VEGF 與 HGF ; VEGF 與 RON ; VEGF 與 NRP1 ; CD20 與 CD3 ; VEGF 與 PLGF ; DLL4 與 PLGF ; ErbB3 與 EGFR ; HGF 與 ErbB3，HER-2 與 ErbB3 ; c-Met 與 ErbB3 ; • HER-2與 PLGF ; HER-2與 HER-2。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合VEGF與磷脂醯 絲胺酸；VEGF 與 ErbB3 ； VEGF 與 PLGF ； VEGF 與 R0B04 ； VEGF 與 BSG2 ； VEGF 與 CDCP1 ； VEGF 與 ANPEP ； VEGF 與 c-MET ； HER-2 與 ERB3 ; HER-2 與 BSG2 ； HER-2 與 CDCP1 ； HER-2 與 ANPEP ; EGFR 與 CD64 ; EGFR與 BSG2 ; EGFR與 CDCP1 ; EGFR與 ANPEP ; IGF1R與 PDGFR ; IGF1R與 VEGF ; IGF1R與 CD20 ; CD20 • 與 CD74 ; CD20與 CD30 ; CD20與 DR4 ; CD20與 VEGFR2 ; CD20 與 CD52 ; CD20 與 CD4 ; HGF 與 c-MET ; HGF 與 NRP1 ; HGF與磷脂醯絲胺酸；ErbB3與IGF1R ; ErbB3與 IGF1,2 ； c-Met^Her-2 ； c-Met# NRP1 ； c-Met^IGFlR ； IGF1，2 與 PDGFR ; IGF1，2 與 CD20 ; IGF1，2 與 IGF1R ; IGF2 與 EGFR ; IGF2 與 HER2 ; IGF2 與 CD20 ; IGF2 與 VEGF ; IGF2 與 IGF1R ; IGF1 與 IGF2 ; PDGFRa 與 VEGFR2 ; PDGFRa 與 PLGF ; PDGFRa 與 VEGF ; PDGFRa 與 c-Met ; PDGFRa與 EGFR ; PDGFRb與 VEGFR2 ; PDGFRb與 c-Met ; 150428.doc -163- 201119673 PDGFRb 與 EGFR ; RON與 c-Met ; RON與 MTSPl ; RON與 MSP ; RON 與 CDCP1 ; VGFR1 與 PLGF ; VGFR1 與 RON ; VGFR1 與 EGFR ; VEGFR2 與 PLGF ; VEGFR2 與 NRP1 ; VEGFR2 與 RON ; VEGFR2 與 DLL4 ; VEGFR2 與 EGFR ; VEGFR2與 R0B04 ; VEGFR2與 CD55 ; LPA與 SIP ; EPHB2 與 RON ; CTLA4 與 VEGF ; CD3 與 EPCAM ; CD40 與 IL6 ; CD40 與 IGF ; CD40 與 CD56 ; CD40 與 CD70 ; CD40 與 VEGFR1 ; CD40 與 DR5 ; CD40 與 DR4 ; CD40 與 APRIL ; CD40與 BCMA ; CD40與 RANKL ; CD28與 MAPG ; CD80與 CD40 ； CD80與 CD30 ; CD80與 CD33 ; CD80與 CD74 ; CD80與 CD2 ; CD80與 CD3 ; CD80與 CD19 ; CD80與 CD4 ; CD80 與 CD52 ; CD80 與 VEGF ; CD80 與 DR5 ; CD80 與 VEGFR2 ; CD22 與 CD20 ; CD22 與 CD80 ; CD22 與 CD40 ; CD22 與 CD23 ; CD22 與 CD33 ; CD22 與 CD74 ; CD22 與 CD19 ; CD22與 DR5 ; CD22 與 DR4 ; CD22與 VEGF ; CD22 與 CD52 ; CD30 與 CD20 ; CD30 與 CD22 ; CD30 與 CD23 ; CD30 與 CD40 ; CD30 與 VEGF ; CD30 與 CD74 ; CD30 與 CD19 ; CD30 與 DR5 ; CD30 與 DR4 ; CD30 與 VEGFR2 ; CD30 與 CD52 ; CD30 與 CD4 ; CD138 與 RANKL ; CD33 與 FTL3 ; CD33 與 VEGF ; CD33 與 VEGFR2 ; CD33 與 CD44 ; CD33 與 DR4 ; CD33 與 DR5 ; DR4 與 CD137 ; DR4 與 IGF1，2 ; DR4與 IGF1R ; DR4與 DR5 ; DR5 與 CD40 ; DR5 與 CD137 ; DR5 與 CD20 ; DR5 與 EGFR ; DR5 與 IGF1，2 ; DR5 與IGFR ; DR5與HER-2 ; EGFR與DLL4。其他標靶組合包 150428.doc -164- 201119673
括EGF/erb-2/erb-3家族中之一或多個成員。腫瘤疾病中所 涉及的DVD Ig可結合之其他標靶（一或多種）包括（但不限 於）選自由以下組成之群的彼等：CD52、CD20、CD19、 CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A ' ILIA、IL1B、IL2、 IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、 FGF10 、 FGF11 、 FGF12 、 FGF13 、 FGF14 、 FGF16 、 FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、 FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、 FGF8、FGF9、GRP ' IGF1、IGF2、IL12A、ILIA、 IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、 VEGF、CDK2、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、 IGF1R、IL2、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、 CDKN1C 、 CDKN2A 、 CDKN2B 、 CDKN2C 、 CDKN3 、 GNRH1、IGFBP6、ILIA、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、 TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、 CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENOl、ERBB2、ESR1、 ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、 NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、 FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、 TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、 INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、 NR2F6 、NR4A3 、 ESR1 、 ESR2 、NR0B1 、NR0B2 、 NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1 、NR2C2、 NR2E1 、NR2E3、NR2F1 、NR2F2、NR3C1 、NR3C2、 -165- 150428.doc 201119673 NR4A1 、 NR4A2 、 NR5A1 、 NR5A2 、 NR6A1 、 PGR 、 RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT卜、APOC1、 BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、 EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、 FGF14 、 FGF16 、 FGF17 、 FGF18 、 FGF2 、 FGF20 、 FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、 FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、 IGFBP6、IL12A、ILIA、IL1B、IL2、IL24、INHA、 INSL3 、 INSL4 、 KLK10 、 KLK12 、 KLK13 、 KLK14 、 KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、 MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1 、PAP、PLAU、PRL、 PSAP 、 SERPINA3 、SHBG、TGFA、TIMP3 、CD44 、 CDH1 、 CDH10 、 CDH19 、CDH20 、CDH7 、 CDH9 、 CDH1 、CDH10、CDH13 、CDH18、CDH19、CDH20、 CDH7、CDH8、CDH9、R0B02、CD44、ILK、ITGA1、
APC ' CD164 、COL6A1 、MTSS1 、PAP 、TGFB1I1 、 AGR2 、 AIG1 、 AKAP1 、 AKAP2 、 CANT1 、 CAV1 、 CDH12 、CLDN3 、CLN3 、CYB5 、CYC1 、DAB2IP、 DES 、 DNCL1 、 ELAC2 、 EN02 、 EN03 、 FASN 、 FLJ12584 、FLJ25530 、GAGEB1 、GAGEC1 、GGT1 、 GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、 KRT2A、MIB1 、PARTI、PATE、PCA3、PIAS2、 PIK3CG 、 PPID 、 PR1 、 PSCA 、 SLC2A2 、 SLC33A1 、 SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、 150428.doc -166- 201119673 ANGPTl、ANGPT2、ANPEP、ECGFl、EREG、FGFl、 FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、 NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、 ANGPTL3 、BAI1 、 COL4A3 、IL8 、LAMA5 、NRP1 、
NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、 SERPINF1 、TNFAIP2、CCL11 、CCL2、CXCL1 、 CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、 IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、 EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、 ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、 TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、 ITGAV 、 ITGB3 、 THBS1 、 THBS2 、 BAD 、 BAG1 、 BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、 CDH1(E-鈣黏素）、CDKNlB(p27Kipl)、CDKN2A(pl6INK4a)、 COL6A1、CTNNBl(b-索烴素）、CTSB(組織蛋白酶 B)、 ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSLl(FRA-l)、 GATA3、GSN(膠溶素）、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、 IL6ST(醣蛋白 130)、ITGA6(a6 整合素）、JUN、KLK5、 KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、 NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、 SERPINB5(乳腺絲抑蛋白）、SERPINEl(PAI-l)、TGFA、 THBS1(血小板反應蛋白-1)、TIE(Tie-l)、TNFRSF6(Fas)、 TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓撲異構酶 Iia)、TP53、AZGP1 (鋅-a-醣蛋白）、BPAG1(網蛋白（plectin))、CDKN1A 150428.doc -167- 201119673 (p21Wapl/Cipl)、CLDN7(緊密連接蛋白-7(claudin-7))、 CLU(凝聚素（clusterin))、ERBB2(Her-2) 、FGF1 、 FLRT1(纖維結合蛋白）、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、 ITGA6(a6 整合素）、ITGB4(b 4 整合素）、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛髮特異性II型角 蛋白）、MACMARCKS 、 MT3(金屬硫蛋白-III (metallothionectin-III))、MUC1(黏蛋白）、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1 D2(親脂素 B (lipophilin B))、SCGB2A1(乳腺珠蛋白 2(mammaglobin 2))、SCGB2A2(乳腺珠蛋白 1)、SPRRlB(Sprl)、THBS1、 THBS2、THBS4、及 TNFAIP2(B94)、RON、c-Met、 CD64、DLL4、PLGF、CTLA4、磷脂醯絲胺酸、R0B04、 CD80、CD22、CD40、CD23、CD28、CD80、CD55 ' CD38、CD70、CD74、CD30、CD138、CD56、CD33、 CD2、CD137、DR4、DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、 VEGFR1、MTSP1、MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、 EpCAM、PGE2、NKG2D、LPA、SIP、APRIL、BCMA、 MAPG、FLT3、PDGFRa、PDGFRp、ROR1、PSMA、 PSCA、SCD1 及 CD59。 IV.醫藥組合物 本發明亦提供包含本發明結合蛋白及醫藥學上可接受之 載劑的醫藥組合物。包含本發明結合蛋白之醫藥組合物係 用於（但不限於）診斷、偵測或監測病症；預防（例如抑制或 延緩疾病、病症或其他病狀發作）、治療、處理或改善病 150428.doc -168- 201119673 症或其-或多種症狀’·及/或研究。在—特定實施例中， 組合物包含-或多種本發明結合蛋白。在另一實施例中， 醫藥組合物包含一或多種本發明結合蛋白及除本發明έ士人 蛋白以外的-或多種用於治療病症的預防劑或治療劑。^ 一實施例中，預防劑或治療劑適用於或已用於或目前 於預防、治療、處理或改善病症或其一或多種症狀。根據 :等實施例’組合物可進-步包含載劑、稀釋劑或賦形 劑。 本發明之結合蛋白 τ併入適於向個體投與之醫藥組合物 中。通常，醫藥組合物包含t & 柳〇 3本發明之結合蛋白及醫藥 可接受之載劑。術語「盤藥與 理與Η… 樂學上可接受之載劑」包括在生 劑及抗真菌劑、等張及㈣屈心貝、包衣、抗細菌 吸收乙遲劑及其類似物。醫藥學上 可接受之載劑的實例句扭k 匕括水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生 理K鹽水、右旋糖、 /由、乙醇及其類似物中之一或多者 乂及其組合。在_此杳 ,,丄 ,二只轭例中，組合物中包括等張劑，例 如糖；諸如甘霞她# 藥風上可垃A 、山梨糖醇之多元醇；或氣化鈉。醫 潤:又之載劑可進-步包含微量輔助物質，諸如濕 f ?、防腐劑或緩衝液，其增強抗體或抗體部分 之存放期或有效性。 各種傳遞系統為p r. ^ -已知的且可用於投與一或多種本發明抗 體或一或多種 盖广 x月抗體與適用於預防、處理、治療或改 音網症或其一岑夕 囊封於脂質體：：！症狀？1防劑或治療劑的組合’例如 、粒、微膠囊中；可表現抗體或抗體片段 150428.doc •169- 201119673 之重組細胞；受體介導之内飲作用（參看例如Wu及Wu (1987) J. Biol· Chem. 262:4429-4432);建構作為逆轉錄病 毒或其他載體之一部分之核酸等。投與本發明之預防劑或 治療劑的方法包括（但不限於）非經腸投與（例如皮内、肌肉 内、腹膜内、靜脈内及皮下）、硬膜外投與、腫瘤内投與 及黏膜投與（例如鼻内及經口途徑）。此外，可例如藉由使 用吸入器或喷霧器及具有氣霧劑之調配物使用肺部投與。 例如參看美國專利第6,019,968號；第5,985,320號；第 5,985,309 號；第 5,934,272 號；第 5,874,064 號；第 5,855,913號；第 5,290,540號及第 4,880,078號；及卩(：丁公開 案第 WO 92/19244號；第 WO 97/32572號；第 WO 97/44013 號；第WO 98/3 1346號及第WO 99/66903號。在一實施例 中，使用Alkermes AIR®肺部藥物傳遞技術（Alkermes， Inc·，Cambridge，Mass.)投與本發明之結合蛋白、組合療法 或本發明之組合物。在一特定實施例中，肌肉内、靜脈 内、腫瘤内、經口、鼻内、肺部或皮下投與本發明之預防 劑或治療劑。預防劑或治療劑可藉由任何適宜途徑，例如 藉由輸注或快速注射、藉由經上皮或皮膚黏膜内層（例如 口腔黏膜、直腸及腸黏膜等）吸收投與且其可與其他生物 活性劑一起投與。投與可為全身性或局部投與。 在—實施例中，可使用如下方法靶向腫瘤細胞：使偶合 抗體之碳奈米管（CNT)與腫瘤細胞在活體外特異性結合， 繼而用近紅外（NIR)光對其進行高特異性切除術。舉例而 言，可使用經生物素標記之極性脂質來製備穩定、生物相 150428.doc •170· 201119673 容性、無細胞毒性之CNT分散液，接著使其連接於一或兩 種不同之針對一或多種腫瘤抗原（例如CD22)之經中性抗生 物素蛋白（neutralite avidin)衍生化之DVD Ig上 (Chakravarty, p.等人，（2〇〇8) Pr〇c NaU Acad
Sci. USA 105:8697-8702)。 在一特定實施例中，可能需要向需要治療之區域局部投 與本發明之預防劑或治療劑；此可藉由例如（但不限於）局 部輸注、注射或藉助於植入物（該植入物為多孔或非多孔 材料’包括膜及基質，諸如矽橡膠膜（siaiastic membrane)、聚合物、纖維基質（例如Tissuel(g))或膠原蛋白 基質）實現。在一實施例中，向個體之患病區域局部投與 有效量之一或多種本發明抗體拮抗劑以預防、治療、處理 及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，向個體之患 病區域局部投與有效量之一或多種本發明抗體與有效量之 一或多種除本發明結合蛋白以外的療法（例如一或多種預 防劑或治療劑）的組合以預防、治療、處理及/或改善病症 或其一或多種症狀。 在另一實施例中’預防劑或治療劑可以控制釋放或持續 釋放系統傳遞。在一實施例中，可使用泵來實現控制釋放 或持續釋放（參看Langer ’同上文；Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20 ; Buchwald 等人，（198〇)
Surgery 88: 507 ; Saudek等人，（1989) N. Engl. J. Med. 321: 574)。在另一實施例中’可使用聚合材料來實現本發明療 法之控制釋放或持續釋放（例如參看Medical Applicati〇ns 150428.doc -171 - 201119673 of Controlled Release, Langer及 Wise (編），CRC Pres.，Boca
Raton, Fla. (1974) ； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance，Smolen 及 Ball (編）， Wiley，New York (1984) ; Ranger 及 Peppas (1983) J.，
Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ;亦參看 Levy 等人，（1985) Science 228: 190 ; During等人，（1989)八1111· Neurol. 25: 351 ; Howard 等人，（1989) J. Neurosurg· 71: 105)；美國專利第5,679,377號；第5,916,597號；第 5,912,015號；第 5,989,463號及第 5，128,326號；及 PCT公開 案第WO 99/1 5 1 54號；第WO 99/20253號）。持續釋放調配 物中使用之聚合物的實例包括（但不限於）聚（曱基丙烯酸2-羥基乙酯）、聚（曱基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸）、聚（乙烯_ 共-乙酸乙烯酯）、聚（曱基丙烯酸）、聚乙交酯（PLG)、聚酸 酐、聚（N-乙烯基吡咯啶酮）、聚（乙烯醇）、聚丙烯醯胺、 聚（乙二醇）、聚丙交醋（PLA)、聚（丙交S旨-共-乙交 酉曰）(PLGA)及聚原酸g旨。在一實施例中，持續釋放調配物 中使用之聚合物為惰性的、不含可浸出雜質、儲存穩定、 無菌且生物可降解。在另一實施例中，控制釋放或持續 釋放系統可鄰近預防或治療標把放置’因此僅需要全身 劑置之一部分（例如參看 Goodson, Medical Applications of Controlled Release，同上文，第 2卷，第 115-138 頁 (1984)) 〇 控制釋放系統論述於 Langer (1990) Science 249: 1527- 1533之論述中。可使用熟習此項技術者已知之任何技術製 150428.doc 201119673 備包含一或多種本發明治療劑之持續釋放調配物。參看例 如美國專利第4,526,938號；PCT公開案第WO 91/05548 號；第 WO 96/20698 號；Ning 等人，（1996) 1^(11〇1;116犷3卩· Oncol. 39: 179-189 ; Song等人，（1995) PDA J. Pharma. Sci. Tech. 50:372-397 ; Cleek等人，（1997) pro. int，i. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854;及 Lam 等人， (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760 〇 在一本發明組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸的特定 貫施例中’可藉由將核酸建構為適當核酸表現載體之一部 为，且例如藉由使用逆轉錄病毒載體（參看美國專利第 4,980,286號）或藉由直接注射或藉由使用微粒轟擊（例如基 因搶；Biolistic，DUpont)或以脂質或細胞表面受體或轉染 劑包覆m將其與已知冑入核之同源盒樣狀連接投與 (例如參看Joliot等人，（1991)，Pr〇c _八⑽^ υ§Α • 88:1864_1868)將其投與以使其變為在細胞内，來活體内投 與核酸以促進其所編石馬之預防劑或治療劑表現。或者，可 將核酸引人胞内且藉由同源重喊其併人宿主細胞魏中 以供表現。 調配本發明之醫藥組合物使其與其預定投與途徑相容。 :與途徑之實例包括(但不限於)非經腸，例如靜脈内、皮 黏膜皮I亩經口、鼻内(例如吸入)、經皮(例如局部)、經 黏膜，及錄投與。在—特定實 規程序調配為料靜脈内、皮下、肌肉内、經/Hi 150428.doc • 173 - 201119673 局部投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈内投與之組 合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。需要時，組合物 亦可包括增溶劑及局部麻醉劑（諸如利多卡因（lignocaine)) 以減輕注射部位之疼痛。 若欲局部投與本發明組合物’則組合物可調^ ^ a均 乳膏、經皮貼片 '洗劑、凝膠、洗髮精、喷霧劑、氣霧 劑、溶液、乳液之形式或熟習此項技術者熟知之其他形 式。參看例如 Remington's Pharmaceutical Sciences _
Intr〇dUCtl〇n to PharmaceuticW D〇sage Forms，第 19版 Mack pub· c〇，East〇n，pa (1995)。在一實施例中，對於 =喷霧之局部劑型而言，使用包含與局部施用相容之第 ，或多種賦形劑且動力黏度大於水之黏稍至半固體或 =體形式。適合調配物包括（但不限於）溶液、懸浮液、對 腺礼膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似物，必要時 腐劑戍影響諸如滲透壓之各種特性之助劑(例如阴
部劑型劑：液或鹽)混合。其他適合局 性成… 氣霧劑製劑，其中在-實施例中，活 ?、固體或液體惰性載劑組合以與 (例如氣體始、隹… 呼奴丨王视貝 齊壓瓶（squeeze bottle)中。必要砗介 組合物及劑型中添加增職❹劑=亦可向“ 例“項技術中所熟知 ㈣其他成分之實 从本^明方法包含鼻内投與組人 氣霧劑形式、嗜I 。，則..且s物可調配成 嗔霧劑、薄霧或滴劑形式。詳言之，根據本 150428.doc -174- 201119673 發明使用之預防劑或治療劑可使用適合推進劑⑼如二氣 一既甲烧、三氯m、二氯四氟乙烧、二氧化碳或其他 適合氣體）以氣霧#丨切呈現形式自加麗包^喷霧器適 宜地傳遞。在加壓氣霧劑之情形下，可藉由提供閥門來確 定劑量單位以傳遞計量之量。可調配含有化合物與諸如乳 糖或澱粉之適合料基劑之粉末混合物的膠囊及藥筒（由 例如明膠構成）用於吸入器或吹入器。 若本發明方法包含經σ投與，則組合物可調配為經口之 錠劑、膠囊、扁膠劑、膠囊錠（gelcap)、溶液、懸浮液及 其類似物之形式。錠劑或膠囊可藉由習知方式用醫藥學上 可接受之賦形劑製備’料賦形劑諸如黏合劑(例如預膜 凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或經丙基甲基纖維素” 填充劑（例如乳糖、微晶纖維素或碟酸氣約）；潤滑劑⑽如 硬脂酸鎂、滑石或石夕石）；崩解劑（例如馬铃薯殿粉或乙醇 鲅為叙鈉），或濕潤劑（例如十二烷基硫酸鈉）。錠劑可藉由 此項技術中熟知之方法塗覆。用於經口投與之液體製^可 採取（但不限於）溶液、糖製或懸浮液形式，或其可以在使 用前以水或其他適合媒劑復原之乾燥產品形式提供。該等 液體製劑可藉由習知方式用醫藥學上可接受之添加劑來製 備，該等添加劑諸如懸浮劑（例如山梨糖醇糖槳、纖維素 衍生物或氫化可艮用脂肪）；乳化劑“列如卵磷脂或阿拉伯 膠)’非水f生媒劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或經分餾之 植物油）’及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲 酸丙酉旨或山梨酸）。適當時，製劑亦可含有緩衝鹽、調味 I50428.doc -175- 201119673 劑、著色劑及甜味劑。經口投與之製劑可經適當調配以供 緩慢釋放、控制釋放或持續釋放預防劑或治療劑。 本發明方法可包含例如藉由使用吸入器或喷霧器肺部投 與與氣霧劑一起調配之組合物。參看例如美國專利第 6,019’968 號；帛 5,985 32〇 號；第 5 985 3〇9 號；第 5’934,272 號；第 5,874,〇64 f虎；帛 5,855,913 號；第
5,290,540 5虎及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號；第㈣ 97/32572號；第鄭 97/44〇13號；第 WO 98/3 1346號及第w〇 99/6_號。在一特定實施例 中，使用Alkermes AIR⑧肺部藥物傳遞技術（a丨^廳，
Inc·’ Cambridge，Mass.)投與本發明結合蛋白、組合療法及 /或本發明組合物。 本&月方法可包含藉由注射（例如藉由快速注射或連續 輸注）投與經調配用於非經腸投與之組合物。用於注射之 調配物可以添加有防腐劑之單位劑型（例如於安瓶中或於 多劑量容器中）提供。組合物可採取諸如於油性或水性媒 劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮劑、 穩^劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可為在使 用前以適合媒劑（例如無菌無熱原f水）復原之粉末形式。 本發明方法可另外包含投與調配為錯槽式製劑之租八 物。該等長效調配物可藉由植人（例如皮下或肌肉内）絲 由肌肉内注射來投與。因此，例如組 議物質(例如調配為可接受之油中之乳液;二= 換树月曰-起調配；或調配成微溶衍生物（例如調配為微溶 150428.doc -176· 201119673 鹽）。 本發明方法涵蓋投與調配為中 藥學上可接受之紅〜认 次風形式之組合物。醫 ™·匕括與陰離子形成之趟，, 酸、磷酸、乙酸、蕈萨1 胤诸如衍生自鹽 之豳，諾寺之1’及與陽離子形成 之|邊如何生自氫氧化鈉、氫氧 — 风 化飼、氫氧化鐵、盈丙胺、一^卸、氣氧化錢、氫氧 胺舻^ # κ ” —乙^、2_乙基胺基乙醇、电 月女齩、普魯卡因等之鹽。 予、，且 一般而言，組合物之成分單獨 型（例如以乾焊凍n k g 。在一起之單位劑 之旦，〜 末或無水濃縮物形式）於指示活性劑 心=器(諸如安瓶或藥囊)t提供。當投與模式為 =二且&物可以含有無菌醫藥級水或生理食 21配。當投與模式為注射時，可提供注射用無菌水或 理艮鹽水之安瓿以便可在投與之前混合成分。 詳言之，本發明亦提供-或多種本發明之肋劑或 劑或醫藥組合物封裝於指示藥劑之量 ^ ^ dI置之推封容器（諸如安 瓿或藥囊）中。在一實施例中，—或多 次多種本發明之預防劑 或 療劑或醫藥組合物係以乾燥無菌康乾粉末或益水、農忙 物形式於密封容器中提供且其可復原（例如用水或生理2 鹽水）成適當濃度以向個體投與。在—實施例中， 種本發明之預防劑或治療劑或醫藥組合物係以乾燥無菌珠 乾粉末形式’以至少5mg、至少10mg、至少15邮:至’少 25叫、至少35邮、至少45叫、至少5()%、至少75叫 或至少100 mg之單位劑量於密封容器中提供。本發明之凍 乾預防劑或治療劑或醫藥組合物應在其初始容器中在 150428.doc -177- 201119673 至8 C下儲存，且本發明之預防劑或治療劑或醫藥組合物 應在復原後1週内，例如5天内、72小時内、48小時内、24 小時内、12小時内、6小時内、5 /J、 内投與。在-替代性實施例中，—或多種本發明之預防劑 或治療劑或醫藥組合物係以液體形式於指示藥劑之量及濃 度的㈣容器中提供。在一實施例中，所投與組合物之液 ut η 小日f内或1小時 體形式係以至少〇 25 mg/ml、至少〇 5 、至少丄 mg/ml、至少2·5 mg/ml、至少5 mg/m卜至少8 mg/m卜至 mg/ml、至少 15 mg/kg、至少 25 mg/ml、至少 50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少1〇〇 mg/mi於密封容器中提 供。液體形式應在其初始容器中在2〇c至8<t下儲存。 本發明之結合蛋白可併入適於非經腸投與之醫藥組合物 中。在一實施例中，抗體或抗體部分將製備為含有0^50 mg/ml結合蛋白之可注射溶液。可注射溶液可由燧石或琥
珀色小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型構 成。緩衝液可為L-組胺酸（1_5〇 mM)，最佳5_1〇 mM，pH 值為5.0至7.0(最佳為pH 6.0)。其他適合缓衝液包括（但不 限於）丁二酸鈉、擰檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可使用濃 度為0-300 mM(對於液體劑型而言最佳為15〇 mM)之氣化 鈉來調節溶液毒性。對於凍乾劑型而言可包括低溫保護 劑，主要為0-10%蔗糖（最佳為05%_1〇%^其他適合低溫 保濩劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型而言可包括增積 劑，主要為1%-10%甘露糖醇（最佳為2%_4%)。液體與凍乾 劑型中均可使用穩定劑，主要為丨_50 mM L_甲硫胺酸（最 150428.doc -178- 201119673 佳為5-10 mM)。其他適合增積劑包括甘胺酸及精胺酸（其 中任一者皆可以0-0.05%之濃度包括），及聚山梨醇酷_ 8〇(最佳以0.005%-0_01%之濃度包括）。其他界面活性劑包 括（但不限於）聚山梨醇酯20及BRIJ界面活性劑。製備成用 於非經腸投與之可注射溶液的包含本發明之結合蛋白的醫 藥組合物可進一步包含適用作佐劑之藥劑，諸如用於增加 /α療性蛋白質（例如抗體）之吸收或分散的藥劑。尤其適用 φ 之佐劑為玻尿酸酶，諸如Hylenex®(重組人類破尿酸酶）。 在可注射溶液中添加玻尿酸酶在非經腸投與後，尤其皮下 投與後改良人類生物可用性。其亦允許較高注射部位體積 (亦即大於1 mi)以及使疼痛及不適較少，及注射部位反應 發生率最低。（參看PCT公開案第W〇 2004/078140號及美 國專利公開案第2000/104968號）。 一本發明組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、 半固體及固體劑型，諸如液體溶液（例如可注射溶液及可 • 輸注溶液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質 體及柽劑。所選形式視投與及治療應用之預定模式而定。 典型組合物為可注射或可輸注溶液形式，諸如類似於彼等 以其他抗體使人類被動免疫所用之組合物的組合物。所選 投與模式為非經腸(例如靜脈内、皮下、腹膜内、肌肉内) 模式。在—實施例中’藉由靜脈内輸注或注射來投與抗 體。在另 ~ ^ ^ 具知例中’抗體係藉由肌肉内或皮下注射投 與。 療。物在製造及儲存條件下通常須無菌且穩定。組 150428.doc -179- 201119673 合物可調配為溶液、糌、 物濃声之宜#古皮 刀散液、脂質體或適於高藥 勿:度之其他有序結構。可藉由將所需量之活性化合物 分之組入偁. 本文列舉之一種成分或該等成 刀i，且合併入適當溶劍φ，^ 、 接者根據需要過濾滅菌來製備 可’主射冷液。一般而言，藉由將活性化合物併入含有 ==質及來自本文所列舉之成分之所需其他成分的 =媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之 無菌凍乾粉東之#似I ^ 月^ 1備方法為真空乾燥及喷霧乾 甘、、、i活性成分加來自其先前無菌過濾之溶液的任何 ”他所需成分之粉末。可例如藉由使用諸如㈣脂之衣 料’藉由維持所需粒度（在分散液情形下），及藉由使用界 面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合物之延長 D收可藉由在組合物中包括延緩吸收之藥劑(例如單硬脂 酸鹽及明膠）來達成。 曰 可藉由此項技術中已知之多種方法投與本發明之結合蛋 白’但在-實施例對於許多治療應用而言，投與途徑/ 模式為皮下注射、靜脈内注射或輸注。如熟f此項技術者 所應瞭解，投與途徑及/或模式將視所需結果而變化。在 某些實施例中’可用防止化合物快速釋放之載劑 性化合物，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片 及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合 物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白: 聚原酸酯及聚乳酸◎製備該等調配物之許多方法均已取得 專利權或通常為熟習技術者所已知。參看例如Sustahd 150428.doc •180· 201119673 and Controlled Release Drug Delivery Systems, j.r
Robinson編，Marcel Dekker, Inc.，New York, 1978。
在某些實施例中，本發明之結合蛋白可例如與惰性稀釋 劑或可吸收之可食用載劑一同經口投與。化合物（必要時 連同其他成分）亦可封閉於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓製 為錠劑或直接併人至個體飲食中。對於經口治療性投與而 言，化合物可併有賦形劑且以如下形式使用：可攝入錠 劑、經頻錠劑、糖衣錠、膠囊、_、懸浮液、糖聚、粉 片（wafer)及其類似形式。為了藉由非經腸投與之外的方式 投與本發明化合物，可能需要將化合物以防止其失活之材 料塗覆或將化合物與防止其失活之材料共同投與。 補充活性化合物亦可併入組合物中。在某些實施例中， 將本發明之結合蛋白與一或多種適用於與本發明結合蛋白 :起治療病症的其他治療劑共調配及/或共投與。舉例而 言’可將本發明之結合蛋白盥— >、A夕種結合其他標把之其 他4几體（例如結合其他細胎激去+ ^丄人 、田肥激素或結合細胞表面分子之抗 體)共調配及/或共投與。此外，-或多種本發明抗體可盘 兩種或兩種以上上述治療劑組合使用。該等組合療法可適 宜地利用較低劑量之所投盥 〜/α療劑’從而避免與各種單一 療法相關之可能毒性或併發症。 在某些實施例中，將社人I a^ 竹、、° 〇蛋白連接於此項技術中已知的 延長半衣期之媒介。該等媒介 ^ 寻姝；丨包括（但不限於）^域、聚乙 一醇及聚葡萄糖。該算拔八j 某"描述於例如美國專利第 6,660,843號及公開之pc 丁公 Λ间案第WO 99/25044號中。 150428.doc 201119673 在一特定實施例中，投與編碼本發明結合蛋白或本發明 之另一預防劑或治療劑的核酸序列以藉助於基因療法治 療、預防、處理或改善病症或其一或多種症狀。基因療法 係指藉由向個體投與已表現或可表現之核酸執行之療法。 在本發明之此實施例中，核酸產生介導預防或治療作用之 其所編碼之本發明之抗體或預防劑或治療劑。 可根據本發明使用此項技術中可利用之用於基因療法的 任何方法。基因療法之方法的综述參看G〇ldspiel等人， (1993) Clinical Pharmacy 12: 488-505 ; Wu及 Wu (1991)
Biotherapy 3: 87-95 ； Tolstoshev (1993) Ann. Rev.
Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 ； Mulligan (1993) Science 260: 926-932 ;以及 Morgan及 Anderson (1993) Ann. Rev Biochem. 62: 191-217 ; 5 月（1993) TIBTECH 11(5):155_ 215。可使用之重組DNA技術之領域中通常已知的方法描 述於 Ausubel 等人（編），Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，NY (1993);及 Kriegler，Gene
Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)中。基因療法之各種方法的詳細描述揭示 於美國專利公開案第200902975 14號中。 本發明之結合蛋白適用於治療該等結合蛋白所識別之標 乾有害的各種疾病。該等疾病包括（但不限於）類風濕關節 炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、萊姆 關節炎、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、 全身性紅斑狼瘡症、克羅恩氏病、潰癌性結腸炎、發炎性 150428.doc -182- 201119673 腸病、胰島素依賴性糖尿病、曱狀腺炎、哮喘、過敏性疾 病牛皮癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植 排斥反應'與器官移植有關之急性或慢性免疫疾病、肉狀 瘤病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、川崎氏病、格 雷氏病、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫 病、了偌-絲奇恩賴紫癜、腎顯微性血管炎、慢性活動型 肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、敗血 • 纟症候群、惡病質、傳染性疾病、寄生蟲病、後天免疫缺 乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森 氏病、阿茲海默氏病、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血 性貧血'惡性病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾迪森氏病、偶 發性1型多腺體分泌不足症及π型多腺體分泌不足症、施密 特氏症候群、成人（急性）呼吸窘迫症候群、脫髮、斑形脫 髮、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病、牛皮癬性關 即病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、披衣菌、耶 # 氏柃菌及沙門氏菌相關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣 瘤病/動脈硬化、異位性過敏、自體免疫大皰病、尋常天 范瘡、葉狀天范瘡、類天范瘡、線狀IgA病、自體免疫溶 血性貧血、庫姆氏陽性溶血性貧血、後天惡性貧血、青少 年惡性貧血、肌痛腦炎/皇家自由病、慢性皮膚㈣念珠 菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、原因不明性自 體免疫肝炎、後天免疫缺乏疾病症候群、後天免疫缺乏相 關疾病、B型肝炎、C型肝炎、普通變異性免疫缺乏症（普 通變異性低γ球蛋白血症）、擴張性心肌病、雌性不孕症、 150428.doc -183- 201119673 ㈣、卵巢早衰、纖維變性肺病、原因不明性纖 A、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織 :丙目之間質性肺病、混合結締組織病相關之肺病、全身 =化症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之間質 *病、全身性紅斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多發性 肌人相關之肺病、休格連氏病相關之肺病、僵直性脊椎炎 相3之肺病、血f炎擴散性肺病、含鐵血黃素沈積症相關 之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖維 化阻塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球性肺炎、淋巴球 浸潤性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節1、自體免 疫杜肝X、1型自體免疫性肝炎（經典自體免疫或類狼瘡性 肝人）2里自體免疫性肝炎（抗lkm抗體肝炎）、自體免疫 介導之低血糖症、B型姨島素抗性伴發黑色棘皮病、副甲 肖、夂低月卜症肖态g移植有關之急性免疫疾病、與器官移 植有關之k性免疫疾病、非炎性骨關節病、原發性硬化性 膽s炎、1型牛皮癣、2型牛皮癬、特發性白血球減少病、 自體免疫性嗜中性球減少症、N〇s型腎病、血管球性腎 炎、腎顯微性血管炎、萊姆病、盤狀紅斑狼瘡、特發性或 NOS型雄性不育症、精子自體免疫、多發性硬化症(所有 -人型）、父感性眼炎、結締組織病繼發之肺高血壓、古巴 士德氏症候群、結節性多動脈炎之肺表現、急性風濕熱、 類風濕性脊椎炎、史提爾氏病、全身性硬化症、休格連氏 症候群、高安氏病/動脈炎、自體免疫性血小板減少症、 特發性血小板減少症、自體免疫性曱狀腺病、甲狀腺機能 150428.doc -184- 201119673
几進症、甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症（橋本氏 病）、萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症、原發性黏液水 腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性脈管炎、白斑病急性肝 病，、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁 :滯特貝性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝 火、過敏症及哮喘、B群鏈球菌（GBS)感染、精神障礙⑼ 如抑鬱症及精神分裂症）、Th2型及Thl型介導之疾病、急 性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）、及諸如肺癌、乳癌、胃 癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸 癌之癌症及造血性惡性疾病（白血病及淋巴瘤）、無@脂蛋白 血症、手足發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血 病、急性淋巴母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病 (AML) '急性或慢性細菌感染、急性姨腺炎、急性腎衰 竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發 之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性鼻 炎、同種異體移植排斥反應、α_卜抗胰蛋白酶缺乏、肌肉 萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3 療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏反應、主動脈及周圍動 脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬化症.、動靜脈 瘺、共濟失調、心房微顫（持續性或陣發性）、心房撲動、 房至傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植物排斥反應、骨髓 移植（BMT)排斥反應、束枝傳導阻滯、伯基特淋巴瘤、燒 傷、心律不整、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心 肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小 150428.doc •185· 201119673 腦病症、紊亂性或多灶性心房心動過速、與化學療法有關 之病症、慢性髓細胞白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性 發炎性病變、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、慢性阻塞性 肺病（COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性心 臟哀竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原性心臟病、冠狀動 脈疾病、庫賈氏病、培養物陰性敗血症、囊腫性纖維化、 細胞激素療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫髓鞘疾病、出 血性登革熱、皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿病（diabete、 diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、泛發性路易體 疾病、擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏 症候群、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發之 運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓炎、心内膜炎 '内分 泌病、會厭炎、EB病毒感染、肢端紅痛症、錐體外及小腦 病症、家族性噬血淋巴組織細胞瘤病、胎兒胸腺移植排斥 反應、弗里德賴希氏共濟失調、功能性周圍動脈病症、真 菌性敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官 或組織的移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗血症、革蘭氏陽 性敗血症、胞内生物體引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈 洛弗登-史巴茲氏蒼白球色素退化症、喬本氏甲狀腺炎、 枯草熱、心臟移植排斥反應、血色素沉著症、血液透析、 浴血性尿毒症候群/血栓溶解性血小板減少性紫癜、出 血、A型肝炎、希氏束心律不整、HIV感染/川乂神經病、 霍奇金病、過動性運動病症、過敏反應、過敏性肺炎、高 血壓、運動不足運動病症、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、 150428.doc 201119673 纖維化、抗體介導之細胞毒 縮症、主動脈發炎、a塑流 特發性艾迪森氏病、特發性肺 性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎
感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、 缺血再灌注損傷'缺血性令風、青少年類風濕性關節炎、 青少年脊髓性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤 '腎臟移植排斥反 應退伍軍人病、利什曼體病、麻風病、皮質脊髓系統病 變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、瘧疾、惡性 淋巴瘤、惡性組織細胞增多，病、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦 膜炎球®血症、代謝性/特發性疾病、偏㈣、粒線體多 系統病症、混合結締組織病、單株γ球蛋白症多發性骨 趙：、多系統退化(曼切、代哲因_托馬斯、史德爾格及馬 查約瑟夫）、重症肌無力、禽細胞内分枝桿菌、結核分 枝桿菌、骨髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血病 症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、f炎、腎病、神經退化性 疾病I型神經原性肌肉萎縮、。耆中性球減少性發熱、非 霍奇金淋巴瘤、腹主動脈及其分支閉塞、閉塞性動脈病 症、0㈣療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管複通 術、器官腫大、”疏鬆症、胰腺移植排斥反應、胰腺 癌田丨腫瘤症候群/惡性高血約症、副曱狀腺移植排斥反 骨盆發炎疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥 ’硬化疾病、肖圍血管疾病、腹膜炎、惡性貧灰、卡氏肺 囊蟲肺炎、肺炎、P〇EMs症候群（多發性神經病、器官腫 大内分泌病、單株γ球蛋白症及皮膚變化症候群）、灌注 後症候群、栗後症候群、μι。切開術後症候群、子痛前 150428.doc -187- 201119673 症、進行性核上性麻痹、原發性肺高血壓、放射療法、雷 諾現象及疾病、雷諾病、雷弗素姆氏病、規則狹窄QRS心 動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制型心肌病、 肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆、血清 陰性關節病、.休克、鐮形細胞性貧血、皮膚同種異體移植 排斥反應、皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、實體腫 瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失調、脊髓小腦退化、鏈 球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性硬化性全腦炎昏厥、 心血管系統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、 全身發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB AL]L、 毛細管擴張、血栓閉塞性血管炎、血小板減少症、中毒、 移植、創傷/出血、III型過敏反應、IV型過敏、不穩定型 心絞痛、尿毒症、尿敗血病、蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈 曲張、脈管k、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫 動、病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒 相關之噬血細胞症候群、韋尼克_科爾薩科夫症候群、威 爾遜氏病、任何器官或組織的異種移植物排斥反應。（參 看PCT公開案第wo 2002/097048號；第WO 95/24918號及 第 WO 00/56772號）。 本發明DVD-Ig亦可治療以下疾病中之一或多者：急性 冠狀動脈症候群、急性特發性多神經炎、急性發炎性脫髓 鞘性多神經根神經病、急性缺血、成人史提爾氏病、斑形 脫髮、過敏、抗磷脂抗體症候群、再生不全性貧血、動脈 硬化症、異位性濕疹、異位性皮膚炎、自體免疫性皮膚 150428.doc •188- 201119673 、與鍵球函感染有關之自體免疫病症、自體免疫性聽力 損失、自體免疫淋巴組織增生症候群（ALPS)、自體免疫性 心肌炎、自體免疫性血小板減少症（AITP) '瞼炎、支氣管 也、張、大皰性蝴八% …… 人斯·丨土机，烟耻Ί%
群、乳糜满、頸椎關節病、慢性局部缺血、瘢痕性類天癌 瘡、具有多發性硬化症風險之臨床單一症候群（CIS)、結 膜炎、兒童期初發型精神病症、慢性阻塞性肺病 (COPD) '淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿 病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂、藥物誘發之免疫性溶血 性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内炎、上鞏膜炎、 多形性紅斑 '重症多形性紅斑、姓娠期類天疮瘡、格巴 二氏症候群(GBS)、枯草熱、休斯症候群、特發性帕金森 氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶 血、包涵體肌炎、傳染性眼發炎疾病、發炎性脫髓 靭疾病、發炎性心臟病、發& * 腎病、IPF/UIP、虹膜 炎角膜火、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛 m ^ r- 犀所毛爾氏病或庫斯毛 爾-未爾氏病、蘭德里麻療、 病、網狀青斑、黃…、亞 織細胞增多 赫鐵列夫症、運動袖铋_广十 佾注夕血官炎、白 中'·主疋病症、黏膜類天疱 竭、重症肋盔士 八艰康、多态官衷 自 显肌無力、骨髓發育不良症候淼 病症、神經病、非A心W "肌炎、神經根 非八非8型肝炎、葙抽破火 卵巢癌、少關節型青 、人、骨質溶解、 性疾病（PAOD)、周图& # 胃Ρ夂、周圍動脈閉塞 周圍血官疾病（PVD)、 (PAD)、靜脈炎 13圍動脈疾病 A 結即性多動脈炎（哎处r丨κ 1 4、，·σ卽性動脈周圍 I50428.doc -189- 201119673 炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型jra、 多内分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多肌痛（PMR)、栗 後症候群、原發性帕金森氏症、前列腺癌及直腸癌及造血 性惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球發育不 王原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹 窄:風濕性心臟病、SAPH0(滑膜炎、座瘡、腹跑病、骨 肥厚及月炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性病、休克肺、 鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相 關^結締Μ織疾病、史奈登·威爾金森皮膚病、強直性脊 椎炎、史蒂芬·瓊森症候群⑻s)、全身性發炎反應症候 群、顳動脈炎、弓形蟲性視網膜炎、中毒性表皮壞死溶 解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、丨型過敏 反應、11型糖尿病、蓴麻療、尋常性間質肺炎（UIP)、脈管 炎、春季結膜炎 '病毒性視網膜炎、沃格特-小柳_原田症 候群（VKH症候群）、濕式黃斑退化及傷口癒合。 本發明之結合蛋白可用於治療罹患自體免疫疾病，尤其 與人症有關之彼等’包括類風濕性關節炎、脊椎炎、過敏 症—自體免疫性糖尿病、自體免疫性葡萄膜炎之人類。在 只知例中’本發明之結合蛋白或其抗原結合部分係用於 治療類風濕性關節《、克羅恩氏病、多發性硬化症、胰島 素依賴性糖尿病及牛皮癬。 在實％例中，可以本發明之組合物及方法治療或診斷 之疾病包括(但不限於)原發性及轉移性癌症，包括乳癌、 結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下傷癌、食道癌、胃 150428.doc 201119673 癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌 L括月《膀胱癌及尿道上皮癌）、雌性生殖道癌（包括子 呂員在+呂癌及印巢癌、以及絨膜癌及姓娠滋養細胞疾 病）、雄性生殖道癌（包括前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生 殖細胞腫瘤）、内分泌腺癌（包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂 體腺癌）及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤（包括骨路 及4人組織產生之彼等肉瘤以及卡波西氏肉瘤卜腦腫瘤、 神經腫瘤、眼腫瘤及腦脊膜腫瘤（包括星形細胞瘤、神經 膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、神經瘤、神經 母細胞瘤、神經鞘瘤及脊膜瘤）、由諸如白血病之造血性 惡性疾病引起的實體腫瘤，及淋巴瘤（霍奇金淋巴瘤及非 霍奇金淋巴瘤）。 在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分在單獨 使用或與放射療法及/或其他化學治療劑組合使用時可用 於治療癌症或用於預防或抑制自本文所述之腫瘤轉移。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合預防劑或治療 劑及細胞蛋白，藉此提供至特定標靶器官、組織或細胞、 或某類組織或細胞的局部藥物傳遞。在一實施例中， DVD-Ig結合至細胞表面抗原及預防劑或治療劑。預防劑 或治療劑適用於預防、處理、治療或改善病症或其一或多 種症狀’例如脂質體粒子、微粒、微膠囊、能夠表現抗體 或抗體片段之重組細胞、乾細胞、受體介導之内飲作用 (參看例如 Wu及 Wu (1987) J. Biol. Chem· 262:4429-4432)、 肽、核酸（例如反義DND或RNA或其他遺傳療法）、肽核酸 150428.doc •19卜 201119673 (PNA)、奈米粒子、放射線治療劑、逆轉錄病毒或其他載 體、抗細菌劑、抗病毒劑、抗寄生物劑或抗真菌劑、抗贊 生劑、化學治療劑（諸如DNA烧基化劑、順鉑（cispiatin)、 卡鉑（carboplatin)、抗微管蛋白劑、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、多烯紫杉醇（docetaxel)、紫杉醇（tax〇1)、小 紅莓、吉西他濱（gemcitabine)、健擇（gemzar)、蒽環黴 素、阿德力黴素（adriamycin)、拓撲異構酶I抑制劑、拓撲 異構酶II抑制劑、5-氟尿嘧啶（5-FU)、甲醯四氫葉酸、伊 立替康（irinotecan)、受體酪胺酸激酶抑制劑（例如埃羅替 尼（erlotinib)、吉非替尼（gefitinib))、COX-2抑制劑（例如 塞内昔布（celecoxib))、激酶抑制劑、及siRNA、細胞激素 抑制性消炎藥（CSAID)。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至：曱胺嗓吟、6_ MP、硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪（mesalazine)、 奥沙拉嗪、氣喹/羥基氣喹、青黴胺（pencillamine)、硫代 蘋果酸鹽（aurothiomalate)、硫唑嘌呤、秋水仙鹼、皮質類 固醇、β-2腎上腺素受體促效劑（沙丁胺醇（salbutam〇丨广特 布他林（terbutaline)、沙美特羅（salmeteral))、黃嘌呤（茶鹼 (theophylline)、胺茶鹼（amin〇phyUine))、色甘酸鹽 (cromoglycate)、奈多羅米（ned〇cr〇mil) ' 酮替紛 (ket〇tifen) ' 異丙托銨（ipratropium)及氧托銨 (oxitropium)、環孢素、FK5〇6、雷帕黴素、黴酚酸嗎琳乙 酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬）、皮質類固醇（諸如潑 尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補 150428.doc •192· 201119673 體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾促炎性細胞激素（諸如 TNF_Ct或1L_1)信號傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、 p3 8或MAP激酶抑制劑）、IL_丨卩轉化酶抑制劑、TNFa轉化 酶（TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑（諸如激酶抑制 劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮續胺。比唆、硫吐嘌吟、6_騎 基嗓吟、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞激素受體 及其衍生物（例如可溶性ρ55或p75 TNF受體及衍生物 p75TNFRIgG(Enbrel Μ及 p55TNFRIgG(來那西 Lenercept))、 sIL-lRI、sIL-lRII及SIL-6R)、生長因子、細胞激素、細胞 毒性蛋白（例如TNF)、消炎性細胞激素（例如il-4、IL-1 0、 IL-11、IL-13及TGFP)、塞内昔布、葉酸、硫酸羥基氯 喹、羅非考昔（rofecoxib)、抗體或其衍生物或接合物（例如 英利昔單抗或利妥昔單抗）、萘普生（naproxen)、伐地考昔 (valdecoxib)、柳氮磺胺吡啶、曱潑尼龍、美儂西康 (meloxicam)、乙酸甲潑尼龍、硫代蘋果酸金鈉、阿司匹靈 (aspirin)、曲安奈德（triamcinolone acetonide)、萘確酸丙 氧芬（propoxyphene napsylate)/apap、葉酸鹽、萘 丁美酮 (nabumetone)、雙氣芬酸（diclofenac)、。比羅昔康 (piroxicam)、依託度酸（etodolac)、雙氯芬酸納（diclofenac sodium)、奥沙普嗓（oxaprozin)、鹽酸羥考酮（〇xyC〇done hcl)、氫可酮酒石酸氫鹽（hydrocodone bitartrate)/apap、雙 氯芬酸鈉/米索前列醇（misoProst〇l)、芬太尼（fentanyl)、人 類重組阿那白滯素（anakinra，human recombinant)、鹽酸曲 馬多（tramadol hcl)、雙水楊酯（salsalate)、舒林酸 150428.doc •193· 201119673 (sulindac)、氰姑胺素（cyanocobalamin)/fa/ °比。多醇 (pyridoxine)、乙醯胺苯盼（acetaminophen)、阿俞膦酸鈉 (alendronate sodium)、潑尼龍、硫酸嗎啡（morphine sulfate)、鹽酸利多卡因、°引°朵美辛（indomethacin)、硫酸 葡糖胺（glucosamine sulf)/軟骨素、鹽酸阿米曲替林 (amitriptyline hcl)、續胺鳴咬（sulfadiazine)、鹽酸經考酮/ 乙醯胺苯紛、鹽酸奥洛他定（olopatadine hcl)、米索前列 醇、萘普生納、奥美拉α坐（omeprazole)、環構酿胺 (cyclophosphamide)、利妥昔單抗、IL-1 TRAP、MRA、 CTLA4-IG ' IL-18 BP、抗 IL-18、抗 IL15、BIRB-796、 SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特 (Roflumilast)、IC-485、CDC-801及美索潘（Mesopram)。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至：非類固醇 消炎藥（NSAID);細胞激素抑制性消炎藥（CSAID);抗體 或其衍生物或接合物[例如CDP-571/BAY-10-3356(人類化 抗TNFa抗體；Celltech/Bayer); cA2/英利昔單抗（嵌合抗 TNFa抗體；Centocor) ; 75 kdTNFR-IgG/依那西普（75 kD TNF 受體-IgG融合蛋白；Immunex); 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ; IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長類動物化抗CD4抗體； IDEC/SmithKline) ; DAB 486-IL-2及 /或 DAB 389-IL-2(IL-2 融合蛋白；Seragen);抗 Tac(人類化抗 IL-2Ra ; Protein Design Labs/Roche)] ; IL-4(消炎性細胞激素；DNAX/ Schering) ; IL-10(SCH 52000 ;重組IL-10，消炎性細胞激 150428.doc •194· 201119673 素；DNAX/Schering) ; IL-4 ; IL-10及 /或 IL-4促效劑（例如 促效劑抗體）；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑；
Synergen/Amgen);阿那白滯素（Kineret®/Amgen) ; TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF結合蛋白）；R973401(IV型磷酸二酯 酶抑制劑）；MK-966(COX-2抑制劑）；伊洛前列素 (Iloprost);曱胺喋呤；沙立度胺（thalidomide)及沙立度胺 相關藥物（例如西爾金（Celgen));來氟米特（消炎藥及細胞 激素抑制劑）；胺甲環酸（tranexamic acid)(纖維蛋白溶酶原 活化抑制劑）；T-614(細胞激素抑制劑）；前列腺素e 1 ;替 尼達普（Tenidap)(非類固醇消炎藥）；萘普生（非類固醇消炎 藥）；美儂西康（非類固醇消炎藥）；布洛芬（非類固醇消炎 藥）；。比羅昔康（非類固醇消炎藥）；雙氣芬酸（非類固醇消 炎藥）；吲哚美辛（非類固醇消炎藥）；柳氮磺胺吡啶；硫唑 嘌呤；ICE抑制劑（酶介白素_ι β轉化酶之抑制劑）；zap_7〇 及/或lck抑制劑（酪胺酸激酶zap_70或lck之抑制劑）；VEGF 抑制劑及/或VEGF-R抑制劑（血管内皮細胞生長因子或血管 内皮細胞生長因子受體之抑制劑；血管生成抑制劑）；皮 質類固醇消炎藥（例如SB203580) ; TNF轉化酶抑制劑；抗 IL-12抗體或抗il- 1 8抗體或其衍生物或接合物；介白素_ 11 ;介白素-13 ;介白素_17抑制劑；金；青黴胺；氣喹； 苯丁酸氮芥（chlorambucil);羥基氣喹；環孢素；環磷醯 胺；全身淋巴照射；抗胸腺細胞球蛋白或抗Cd4抗體或其 衍生物或接合物；CD5毒素；經口投與之肽及膠原蛋白； 亂苯紫利二納（l〇benzarit disodium);細胞激素調控劑 150428.doc -195- 201119673 (CRA)HP228 及 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.)； ICAM-1反義硫代磷酸酯寡去氧核苷酸（ISIS 2302 ; Isis Pharmaceuticals，Inc.);可溶性補體受體 1(TP10 ; T Cell Sciences, Inc.);強的松（prednisone);肝蛋白（orgotein); 葡糖胺聚糖多硫酸鹽（glycosaminoglycan polysulphate);二 曱胺四環素（minocycline);抗IL2R抗體或其衍生物或接合 物；海洋生物及植物脂質（魚及植物種子脂肪酸；參看例 如 DeLuca等人，（1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777)，金諾分（auranofin);苯基丁氮 g同（phenylbutazone); 曱氣芬那酸（meclofenamic acid);氟芬那酸（flufenamic acid)，靜脈内免疫球蛋白；齊留通（ziieut〇n);阿紮立平 (azaribine);黴紛酸（mycophenolic acid)(RS-61443);他克 莫司（tacrolimus)(FK-506);西羅莫司（sir〇limus)(雷帕黴 素）；胺普立糖（amipril〇Se)(鹽酸胺普立糖（therafectin)); 克拉曲濱（cladribine)(2-氯去氧腺苷）；甲胺喋呤；心^抑 制劑（參看 Bruncko，Milan 等人，journal Medicinal
Chemistry (2007)，50(4)，641_662);抗病毒劑及免疫調節 劑。 在一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至一種以下藥劑 以治療類風濕性關節炎：例如KDR之小分子抑制劑；丁4_2 之小分子抑制劑；甲胺喋呤；強的松；塞内昔布；葉酸； 硫酸羥基氣喹；羅非考昔；依那西普或英利昔單抗或其衍 生物或接合物；來敗米特；萘普生；伐地考昔；柳氣確胺 吼咬；甲潑尼龍；布洛芬；美儂西康；乙酸甲潑尼龍；硫 150428.doc •196· 201119673
代蘋果酸金鈉；阿司匹靈；硫哇嘌呤；曲安奈德；萘續酸 丙氧芬/apap ;葉酸鹽；萘丁美酮；雙氣芬酸；D比羅昔康； 依託度酸；雙氯芬酸納；奧沙普嗪；鹽酸經考酮；氫可酮 酒石酸氫鹽/apap ;雙氯芬酸鈉/米索前列醇；芬太尼；人 類重組阿那白滯素；鹽酸曲馬多；雙水楊酯；舒林酸；氰 始胺素/fa/吡哆醇；乙醯胺苯酚；阿侖膦酸鈉；潑尼龍； 硫酸嗎啡；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/軟骨 素；環孢素；鹽酸阿米曲替林；磺胺嘧啶；鹽酸羥考酮/ 乙醯胺苯酚；鹽酸奥洛他定；米索前列醇；萘普生鈉；奥 美拉唑；黴酚酸嗎啉乙酯；環磷醯胺；利妥昔單抗或其衍 生物或接合物；IL-1 TRAP ; MRA ; CTLA4-Ig或其衍生物 或接合物；IL-18 BP ; IL-12/23 ;抗IL 18或其衍生物或接 合物，抗IL 15或其衍生物或接合物；BIRB 796 ; 8以〇_ 469 ; VX-702 ; AMG-548 ; VX-740 ;羅氟司特；Ic_485 ; CDC-801 ;及美索潘。 在另一實施例中’本發明之DVD_Ig結合至用於發炎性 腸病之治療劑：例如布地奈德；纟皮生長因子；皮質類固 •環抱素；柳氮績胺^定；胺基水揚酸鹽；6_琉基嗓 石爪坐不7 ’甲硝噠。坐，月旨質加氧酶抑制劑；美沙拉 奥沙拉嗪；巴柳氮；&氧化劑；凝血脂素抑制劑； IL-1受體括抗劑；抗江，mAb或其衍生物或接合物.广 IL-6 mAb或其衍生物或接合物；生長因子；彈性蛋白酶^ 制劑；吡啶基-味唑化合物；針對其他人類細胞 長因子（例如TNF、LT、化」、江_2、α·6、比_7 ^ 150428.doc ，197· 201119673 IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 及PDGF)之抗體或拮抗劑或其衍生物或接合物。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至細胞表面分子 (諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、 CD40 > CD45 ' CD69)；曱胺喋呤；環孢素；FK506 ;雷帕 黴素；黴酚酸嗎啉乙酯；來氟米特；NSAID，例如布洛 芬；皮質類固醇，諸如潑尼龍；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷 促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑；干擾 促炎性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號傳導之藥劑（例如 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）；IL-Ιβ轉化酶 抑制劑；TNFa轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑，諸 如激酶抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；柳氮續胺η比咬；硫唾 嘌呤；6-酼基嘌呤；血管收縮素轉化酶抑制劑；可溶性細 胞激素受體及其衍生物（例如可溶性ρ5 5或p75 TNF受體、 sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R);及消炎性細胞激素（例如几-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGFP);及 bcl-2抑制劑。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於克羅恩氏 病之治療劑：例如TNF拮抗劑（例如抗TNF抗體）、阿達木 單抗（PCT 公開案第 WO 97/2913 1 號；Humira)、 CA2(Remicade)、CDP 571、TNFR-Ig構築體（p75TNFRIgG (Enbrel)及p55TNFRIgG(來那西普）)抑制劑或其衍生物或接 合物及PDE4抑制劑。在一實施例中，本發明之DVD-Ig結 合至皮質類固醇，例如布地奈德及地塞米松 (dexamethasone)。在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至 150428.doc -198· 201119673 柳氮磺胺吡啶、5-胺基水揚酸及奥沙拉嗪，以及干擾諸如 IL-1之促炎性細胞激素合成或作用的藥劑（例如IL_丨β轉化 酶抑制劑及IL-lra)。在一實施例中，本發明之DVD_Ig結 合至T細胞信號傳導抑制劑，例如酪胺酸激酶抑制劑6_酼 基嘌呤。在一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至IL-11。 在一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至美沙拉嗪、強的 松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英利昔單抗或其衍生物或接合 • 物、甲潑尼龍丁二酸鈉、地芬諾酯（diphenoxylate)/硫酸阿 托品（atrop sulfate)、鹽酸洛哌丁胺 〇〇peramide hydrochloride)、曱胺喋呤、奥美拉唑、葉酸鹽、環丙沙星 (ciprofloxacin)/右旋糖-水、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、鹽酸 四環素（tetracycline .hydrochloride)、醋酸氟輕鬆 (fluocinonide)、甲硝噠唑、硫柳汞（thimer〇sal)/硼酸、消 膽胺（cholestyramine)/蔗糖、鹽酸環丙沙星、硫酸笑蒼驗 (hyoscyamine sulfate)、鹽酸哌替啶（meperidine φ hydrochl〇ride)、鹽酸咪達唑侖（midazolam hydrochloride)、 鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、鹽酸普敏太定（pr〇methazine hydrochloride)、磷酸鈉、磺胺甲噁唑（sulfameth〇xaz〇Ie)/ 甲氧苄胺嘧啶（trimethoprim)、塞内昔布、聚卡波非 (polycarbophil)、萘磺酸丙氧芬、氫化可的松 (hydrocortisone)、多維生素（multivitamin)、巴柳氮二鈉、 填酸可待因（codeine phosphate)/apap、鹽酸考來維命 (colesevelam hcl)、氰鈷胺素、葉酸、左氧氟沙星 (levoHoxacin)、曱潑尼龍、那他珠單抗或其衍生物或接合 150428.doc -199- 201119673 物及干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於多發性硬 化症之治療劑：例如皮質類固醇；潑尼龍；甲潑尼龍；硫 唑嘌呤.；環磷醯胺；環孢素；曱胺喋呤；4-胺基吡啶；賛 紮尼定（tizanidine);干擾素_pia(AVONEX; Biogen);干擾 素-pib(BETASERON ； Chiron/Berlex);干擾素 α-η3 (Interferon Sciences/Fujimoto);干擾素-a(Alfa Wassermann/ J&J);干擾素piA-IF(Serono/Inhale Therapeutics);聚乙二 醇化干擾素 a 2b(Enzon/Schering-Plough);共聚物 l(Cop-1 ;克帕松（COPAXONE) ; Teva Pharmaceutical Industries， Inc.);高壓氧；靜脈内免疫球蛋白；克拉曲濱 (clabribine);針對其他人類細胞激素或生長因子及其受體 (例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、 IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及 PDGF) 之抗體或拮抗劑或其衍生物或接合物。在一實施例中，本 發明之DVD-Ig結合至細胞表面分子，諸如CD2、CD3、 CD4 、 CD8 、 CD19 、 CD20 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配位體。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至曱胺喋呤、環孢 素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、 NSAID(例如布洛芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二 酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上 腺素激導劑、干擾促炎性細胞激素（諸如TNFct或IL-1)信號 傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制 150428.doc -200- 201119673 劑)、IL-Ιβ轉化酶抑制劑、TACE抑制劑、丁細胞户號 抑制劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮^胺 吼W票呤、6-疏基嘴吟、血管收縮素轉化酶抑制 劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物(例 激素（例如IL-4、IL_10、江七及⑺叫及以之抑制劑。
在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至用於多發性 硬化症之治療劑：例如干擾素—以例如IFNpia及ifn卩lb); 克帕松、皮質類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑（例如卡斯蛋白 酶-1抑制劑）、IL-1抑制劑、TNF抑制劑及針對CD4〇& CD80之抗體、及其衍生物或接合物。 在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至以下藥劑或 其衍生物或接合物：阿來組單抗、屈大麻酚（dr〇nabin〇1)、 尤利美（Unimed)、達利珠單抗（daciizumab)、米托蒽酿、 鹽酸紮利羅登（xaliproden hydrochloride)、胺吡啶 (fampridine)、乙酸格拉替美（giatiramer aCetate)、那他珠 單抗、西納吡哆（sinnabidol)、a-伊木諾金NNS03(a-immunokine NNS03)、ABR-215062、AnergiX.MS、趨化因 子受體拮抗劑、BBR-2778、卡拉脈素（caiagUaiine)、CPI-1189 、 LEM(脂 質體囊 封之米 托蒽醌） 、 THC.CBD(類 大麻酚 (cannabinoid)促效劑）、MBP-8298、美索潘（PDE4 抑制 劑）、MNA-7 1 5、抗IL-6受體抗體、萘羅瓦西（neurovax)、 0比非尼酮（pirfenidone)、阿羅曲普 1258(allotrap 1258)(RDP-1258)、sTNF-Rl、他侖帕奈（talampanel)、特 150428.doc -201 - 201119673 立氟胺（teriflunomide)、TGF-P2、替利莫肽（tiplimotide)、 VLA-4 拮抗劑（例如 TR-14035、VLA4 Ultrahaler、 Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素 γ 拮抗劑、IL-4 促效劑。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於心絞痛 之治療劑：例如硝化甘油（nitroglycerin)、單;δ肖酸異山梨醇 酉旨、丁 一酸美托洛爾（metoprolol succinate)、阿替洛爾 (atenolol)、酒石酸美托洛爾、苯磺酸胺氯地平（ami〇dipine besylate) ' 鹽酸地爾硫卓（diltiazem hydrochloride)、二石肖 酸異山梨醇酯、氣吡格雷硫酸氫鹽（cl〇pid〇grel bisulfate)、硕苯地平（nifedipine)、阿托伐他；:丁 |弓 (atorvastatin calcium)、氯化卸、°夫 °南苯胺酸 (furosemide)、辛伐他汀（simvastatin)、鹽酸維拉帕米 (verapamil hcl)、地高辛（digoxin)、鹽酸普萘洛爾、卡維 地洛（carvedilol)、賴諾普利⑴sin〇pri】）、螺内酯 (spironolactone)、氫氣苯噻噠嗪（hydrochl〇r〇thiazide)、順 丁烯二酸依拉普利（enalapril maleate)、納多洛爾 (nado丨〇1)、雷米普利（ramipri丨）、依諾肝素鈉（en〇xapadn sodium)、肝素鈉、顯沙坦（vaisartan)、鹽酸索他洛爾 (sotalol hydrochloride)、非諾貝特（fenofibrate)、依澤替米 貝（ezetimibe)、布美他尼（bumetanide)、氯沙坦鉀（i〇sartan potassium)、賴諾普利/氫氣苯噻噠嗪、非洛地平 (felodipine)、卡托普利（captoprii)、反丁烯二酸比索洛爾 (bisoprolol fumarate) ° 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於僵直性 150428.doc •202· 201119673 脊椎火之/σ療劑：例如布洛芬、雙氣芬酸及米索前列醇、 萘曰生美儂西康、吲哚美辛、雙氣芬酸、塞内昔布、羅 非考昔、柳氮磺胺吡啶、曱胺喋呤、硫唑嘌呤、二甲胺四 環素、強的松、依那西普、英利昔單抗、及其衍生物或接 合物。 在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至用於哮喘之 療丨例如4 丁胺醇（albuterol)、沙美特羅（saimeterol)/ 鼠替卡权（fluUcas〇ne)、孟魯司特鈉（m⑽teiukast sodium)丙酸氟替卡松、布地奈德（budesonide)、強的 松、赵奈甲酸沙美特羅、鹽酸左旋沙丁胺醇（levalbuterol hcl)、硫酸沙丁胺醇/異丙托錢、潑尼龍填酸納、曲安奈 德、一丙酸倍氯米松（beclomethasone dipropionate)、溴化 異丙托録、阿奇黴素（azithromycin)、乙酸吼布特羅 (pirbuterol acetate)、潑尼龍、無水茶鹼、曱潑尼龍丁二酸 鈉、克拉黴素（clarithromycin)、紮魯司特（zafirlukast) ' 反 丁稀一酸福莫特羅（formoterol fumarate)、流感病毒疫苗、 甲潑尼龍、三水合胺經苄青黴素（amoxicillin trihydrate)、 氟尼縮松（flunisolide)、過敏注射液、色甘酸鈉、鹽酸非 索非那定（fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松/薄荷 腦、胺經T青黴素/棒酸鹽（clavulanate)、左氧氟沙星、吸 入器輔助裝置、愈創甘油醚（guaifenesin)、地塞米松ί粦酸 納、鹽酸莫西沙星（moxifloxacin hcl)、鹽酸多西環素 (doxycycline hyclate)、愈創甘油醚 /d-曱嗎。南（d-methorphan)、p-麻黃素 /cod/氯芬那敏（chlorphenir)、加替 150428.doc •203 - 201119673 沙星（gatifloxacin)、鹽酸西替利嗓（cetirizine hydrochloride)、 糖酸莫美他松（mo met as one fur oat e)、經蔡甲酸沙美特羅、 本佐那S旨（benzonatate)、頭孢胺苄（cephalexin)、pe/氫可@同/ 鼠务那敏、鹽酸西替利嘻/假麻黃素（pSeud〇ephed)、苯腎 上腺素/cod/普敏太定、可待因/普敏太定、頭孢丙烯 (cefprozil)、地塞米松、愈創甘油喊/假麻黃素、氣芬尼拉 明（chlorpheniramine)/氫可酮、奈多羅米鈉、硫酸特布他 林、腎上腺素、甲潑尼龍、硫酸間羥異丙腎上腺素 (metaproterenol sulfate) ° 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於C〇PD之 治療劑：例如硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、溴化異丙托録、 沙美特羅/氟替卡松、沙丁胺醇、羥萘甲酸沙美特羅 '丙 酸氟替卡松、強的松、無水茶鹼、曱潑尼龍丁二酸鈉、孟 魯司特鈉、布地奈德、反丁烯二酸福莫特羅、曲安奈德、 左氧氟沙星、愈創甘油喊、阿奇徽素、二丙酸倍氣米松、 鹽酸左旋沙丁胺醇、氟尼縮松、頭孢曲松鈉（ceftHax〇ne sodium)、三水合胺羥苄青黴素、加替沙星、紮魯司特、 胺羥苄青黴素/棒酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氣芬尼拉明/氮 可酮、硫酸間經異丙腎上腺素、曱潑尼龍、糠酸莫美他 松、P-麻黃素/cod/氯芬那敏、乙酸吡布特羅、p_麻黃素/洛 拉他定（loratadine)、硫酸特布他林、噻托演銨（u〇tr〇pium bromide)、（R，R)-福莫特羅、TgAAT、西洛司特（Cil〇milast)、 羅氟i司特。 在另一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至用於hcV之 150428.doc • 204 , 201119673 治療劑’例如干擾素a-2a、干擾素a_2b、干擾素α、 干擾素a-nl、聚乙二醇化干擾素a_2a、聚乙二醇化干擾素 a-2b、病毒唑（ribavirin)、聚乙二醇化干擾素a_2b+病毒 唑、熙去氧膽酸（Ursodeoxycholic Acid)、甘草酸 (Glycyrrhizic Acid)、胸腺法新（Thymalfasin)、二鹽酸組胺 (Maxamine)、VX_497及藉由干預以下標靶用以治療hcv之 任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解螺旋酶、 HCV IRES(内部核糖體入口位點）。 在另一實施例中，本發明2DVD_Ig結合至用於特發性 肺纖維化之治療劑：例如強的松、硫唑嘌呤、沙丁胺醇、 秋水仙鹼、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干擾素、甲潑尼龍 丁二酸鈉、勞拉西泮（lorazepam)、呋喃苯胺酸、賴諾普 利、硝化甘油、螺内酯、環磷醯胺、溴化異丙托銨、放線 菌素d、阿替普酶（aiteplase)、丙酸氟替卡松、左氧氟沙 星、硫酸間羥異丙腎上腺素、硫酸嗎啡 '鹽酸羥考酮、氣 化鉀、曲安奈德、無水他克莫司、鈣、干擾素α、甲胺喋 - 呤、黴酚酸嗎啉乙酯、干擾素γ_丨β。 在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至用於心肌梗 塞之治療劑：例如阿司匹靈、硝化甘油、酒石酸美托洛 爾、依諾肝素鈉、肝素鈉、氣吡格雷硫酸氫鹽、卡維地 洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、丁二酸美托洛爾、華法林鈉 (warfarin sodium)、賴諾普利、單硝酸異山梨醇酯、地高 辛、呋喃苯胺酸、辛伐他汀、雷米普利、替奈普酶 (tenecteplase)、順丁烯二酸依拉普利、托西邁 150428.doc -205 - 201119673 (torsemide)、瑞替普酶（retavase)、氣沙坦鉀、鹽酸啥那普 利（quinapril hcl)/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依那普 利拉（enalaprilat)、鹽酸乙胺碘呋酮（ami〇dar〇ne hydrochloride)、m-水合鹽酸替羅非班（tir〇fiban hcl m_ hydrate)、鹽酸地爾硫卓、卡托普利、厄貝沙坦 (irbesartan)、纈沙坦、鹽酸普萘洛爾、福辛普利鈉 (fosinopril sodium)、鹽酸利多卡因、埃替菲巴肽 (eptifibatide)、頭孢唑林鈉（cefazoHn sodium)、硫酸阿托 品（atropine sulfate)、胺基己酸、螺内酯、干擾素、鹽酸 索他洛爾、氣化钟、多庫醋納（docusate sodium)、鹽酸多 巴酴丁胺（dobutamine hcl)、阿普 n坐命（aipraz〇iam)、普伐 他汀鈉（pravastatin sodium)、阿托伐他汀鈣、鹽酸咪達。坐 侖、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨醇酯、腎上腺素、鹽酸多 巴月女、比伐盧疋（bivalirudin)、羅素他汀（rosuvastatin)、依 澤替米貝/辛伐他汀、阿伐麥布（avasimibe)、卡立泊來德 (cariporide)、心臟幹細胞及生長因子。 在另一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至用於牛皮癬 之治療劑：例如KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小分子抑制 劑、約/白二醇（calcipotriene)、丙酸氣倍他索（clobetasol propionate)、曲安奈德、丙酸鹵貝他索（hal〇betas〇1 propionate)、他紫羅；丁（tazar〇tene)、甲胺0樂0令、醋酸說輕 、強化一丙酸倍他米松（betamethasone diprop augmented)、丙酮化氧新龍（fiu〇cin〇i〇ne acet〇nide)、阿曲 汀（acitretin) '植物性洗髮精（tar shamp〇〇)、戊酸倍他米 150428.doc -206· 201119673
松、糠酸莫美他松、酮康峻（ketoconazole)、普莫卡因 (pramoxine)/氟輕鬆、戊酸氫化可的松、氟氫縮松 (flurandrenolide)、尿素、倍他米松、丙酸氣倍他索/湖膚 劑、丙酸氟替卡松、阿奇黴素、氫化可的松、增濕配方 (moisturizing formula)、葉酸、地奈德（desonide)、π比美莫 司（pimecrolimus)、煤焦油（coal tar)、二乙酸二氟j 拉松 (diflorasone diacetate)、葉酸依那西普、乳酸、曱氧沙林 (methoxsalen) 、 he/ 鹼式沒食子酸鉍（bismuth subgal)/znox/resor、乙酸曱潑尼龍 '強的松、防曬劑、哈 西奈德（halcinonide)、水楊酸、蒽三酚（anthralin)、特戊酸 氯可托龍（clocortolone pivalate)、煤提取物、煤焦油/水楊 酸、煤焦油/水楊酸/硫、去經米松（desoximetasone)、安定 (diazepam)、潤膚劑、醋酸氟輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/ na lact、礦物油/花生油、石油/十四烧酸異丙酯、補骨脂 素（psoralen)、水楊酸、皂類/三漠沙命（tribromsalan)、硫 柳汞/硼酸 '塞内昔布、英利昔單抗、環孢素、阿法赛 特、依法利珠單抗、他克莫司、。比美莫司、PUVA、 UVB、柳氮磺胺吡啶。 在另一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至用於牛皮癬 性關節炎之治療劑：例如曱胺喋呤、依那西普、羅非考 昔、塞内昔布、葉酸、柳氮石黃胺》比咬、萘普生、來氣米 特、乙酸曱潑尼龍、吲哚美辛、硫酸羥基氯喹、強的松、 舒林酸、強化二丙酸倍他米松、英利昔單抗、甲胺嗓呤、 葉酸鹽、曲安奈德、雙氯芬酸、二甲亞颯、吡羅昔康、雙 150428.doc -207- 201119673 氣芬酸鈉、酮洛芬（ketoprofen)、美儂西康、曱潑尼龍、蔡 丁美酮、托美丁納（tolmetin sodium)、飼泊三醇、環抱 素、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、醋酸氟輕鬆、硫酸葡糖 胺、硫代蘋果酸金鈉、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、布洛芬、 利塞膦酸鈉（risedronate sodium)、磺胺嘧啶、硫鳥嗓吟 (thioguanine)、伐地考昔、阿法賽特、依法利珠單抗及bci_ 2抑制劑、或其衍生物或接合物。 在另一實施例中’本發明之DVD_Ig結合至用於再狹窄 之治療劑：例如西羅莫司' 太平洋紫杉醇、依維莫司 (everolimus)、他克莫司、唑他莫司（z〇tar〇Hmus)、乙醯胺 苯紛。 在另一貫施例中’本發明之DVD-Ig結合至用於坐骨神 經痛之治療劑：例如氫可酮酒石酸氳鹽/apap、羅非考昔、 鹽酸環苯紮林（cyclobenzaprine hcl)、甲潑尼龍 '萘普生、 布洛芬、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、塞内昔布、伐地考 昔、乙酸甲潑尼龍、強的松、磷酸可待因/apap '鹽酸曲馬 多/乙醯胺苯酚、美他沙酮（metaxal〇ne)、美儂西康、美索 巴莫（methocarbamol)、鹽酸利多卡因、雙氯芬酸鈉、加巴 喷丁（gabapentin)、地塞米松、肌安寧（caris〇pr〇d〇丨）、酮u各 酉义fe 丁二醇（ketorolac tromethamine)、吲"朵美辛、乙醯胺 苯酚、安定、萘丁美酮、鹽酸羥考酮、鹽酸替紮尼定、雙 乱备酉义納/米索則列醇、萘續酸丙氧芬/apap、asa/〇XyC〇d/ 羥考酮ter、布洛芬/氫可酮酒石酸氫鹽、鹽酸曲馬多、依 託度酸、鹽酸丙氧芬、鹽酸阿米曲替林、肌安寧/磷酸可 150428.doc 201119673 待因/asa、硫酸嗎_、多維生素、萘普生鈉、檸檬酸奥芬 那君（orphenadrine citrate)、替馬西泮（temazepam) 〇 在一實鈀例中，本發明之DVD-Ig結合至用於SLE(狼瘡） 之藥劑：例如NSAID，例如雙氣芬酸 '萘普生、布洛芬、 吡羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑，例如塞内昔布、羅 非考昔、伐地考昔，k癔劑，例如經基氯啥；類固醇，例 如強的松、潑尼龍、布地奈德、地塞米松；細胞毒性劑， 例如硫°坐嗓呤、環填醯胺、黴齡酸嗎淋乙醋、曱胺嗓吟； PDE4抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如驍悉（CeUcept)。在 一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至柳氮磺胺吡啶、5-胺 基水楊酸、奥沙拉嗓、依木蘭（Imuran)以及干擾諸如IL-1 之促炎性細胞激素合成、產生或作用的藥劑（例如卡斯蛋 白酶抑制劑，如IL-Ιβ轉化酶抑制劑及IL_lra)。在一實施 例中’本發明之DVD-Ig結合至T細胞信號傳導抑制劑（例如 酪胺酸激酶抑制劑）；或靶向T細胞活化分子之分子（例如 CTLA-4-Ig或B7家族抗體或PD-1家族）。在一實施例中，本 發明之DVD-Ig結合至IL-11或抗細胞激素抗體（例如芳妥珠 單抗（fonotolizumab)(抗IFNg抗體））或抗受體之受體抗體（例 如抗IL-6受體抗體）及針對B細胞表面分子之抗體。在一實 施例中，本發明之DVD-Ig結合至LJP 394(阿貝莫司 (abetimus));消耗B細胞或使B細胞失活之藥劑，例如抗 CD20抗體及BlyS ; TNF及bcl-2抑制劑，由於已證實bcl-2 在轉殖基因小鼠體内之過度表現產生狼瘡樣表型（參看 Marquina等人，（2004) J. Immunol. 172(11)，7177-7185)， 150428.doc -209- 201119673 因此預期抑制產生治療作用β 在一實施例中’本發明之DVD-Ig結合ΜΤΧ與細胞表面 分子，例如MTX 與 mCD-3 ; MTX 與 mCD-19 ; MTX 與 hCD-3，ΜΤΧ與 hCD-19 ; ΜΤΧ與 CD-20 ; ΜΤΧ與 EGFR ;及 ΜΤΧ 與 HER-2。 本發明之抗體或其抗原結合部分可與包括（但不限於）以 下之藥劑組合：抗贅生劑；放射療法；化學療法，諸如 DNA烧基化劑、順！自、卡麵、抗微管蛋白劑、太平洋紫杉 醇、多婦紫杉醇、紫杉醇、小紅每、吉西他濱、健擇、葱 環徽素、阿德力徽t、相撲異構酶I抑㈣、拓撲異構酶„ 抑制劑、5-氣尿㈣（5_FU)、甲醯四氫葉酸、伊立替康、 受體路胺酸激酶抑制劑(例如埃羅替尼、吉非替尼)、COX_ 2抑制劑（例如塞内昔布）、激酶抑制劑及s i RNA。 本發明之結合蛋白亦i 上外 之JL #么窳人一或夕種適用於治療各種疾病 之其他治療劑一起投與。 :I月之、”蛋白可單獨或組合使用以治療該等疾 應瞭解，結合蛋白可罝鉬 、 组合使用，，… 或與其他藥劑(例如治療劑) 的來選擇。舉例而言 預期目 ^ , 另—樂劑可為此項技術切蛊、备田 於治療由本發明抗體 適用 藥劑亦可為賦予治療έ且：物=病狀之治療劑。該另- 合物黏度之藥劑。…有盈屬性的藥劑，例如影響組 應進-步瞭解’欲包括於 目的之彼等組合。下立陆，+、 内之，、且δ為適於其預定 之藥劑為說明性的且不欲具有 I50428.doc -210- 201119673 限制性。作為本發明之一部分的組合可為本發明抗體及至 少一種選自以下清單之其他藥劑。若組合使得所形成之組 合物可執行其預定功能，則組合亦可包括一種以上其他藥 劑，例如兩種或三種其他藥劑。 治療自體免疫及發炎疾病之組合為非類固醇消炎藥（亦 稱作NSAID)，其包括如布洛芬之藥物。其他組合為皮質 類固醇，包括潑尼龍；可藉由在與本發明之DVD Ig組合治 療患者時逐漸減少所需之類固醇劑量來降低或甚至消除類 固醇使用之熟知副作用。可與本發明之抗體或抗體部分組 合之用於類風濕性關節炎之治療劑的非限制性實例包括以 下：細胞激素抑制性消炎藥（CSAID);針對其他人類細胞 激素或生長因子之抗體或拮抗劑，該等其他人類細胞激素 或生長因子為例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5 、 IL-6 、 IL-7 、 IL-8 、 IL-15 、 IL-16 、 IL-18 、 IL-21 、 IL-23、干擾素、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF。本發 明之結合蛋白或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子之 抗體組合，該等分子諸如CD2、CD3、CD4、CD8、 CD25 、 CD28 、 CD30 、CD40 、 CD45 、 CD69 、 CD80(B7.1)、CD8 6(B7.2)、CD90及 CTLA 或其西己位體，包 括 CD154(gp39 或 CD40L)。 治療劑之組合可在不同點干擾自體免疫及後續發炎性級 聯；實例包括TNF拮抗劑（如嵌合、人類化或人類TNF抗 體）、阿達木單抗（PCT公開案第WO 97/2913 1號）、 CA2(RemicadeTM)、CDP 571及可溶性 p55 或 p75 TNF 受體、 150428.doc -211 - 201119673 其衍生物（p75TNFRlgG(EnbrelTM)或 p55TNFRlgG(來那西 普）；以及TNFa轉化酶（TACE)抑制劑；類似地，IL]抑制 劑（介白素-1轉化酶抑制劑、IL-1RA等）可能由於相同原因 而為有效的。其他組合包括介白素11。另一組合包括可與 IL-12功能平行起作用、依賴於1]：_12功能起作用或與江_12 功能協同起作用的自體免疫反應關鍵作用者；尤其IL_ j 8 拮抗劑，包括IL-18抗體、可溶性IL-18受體及il-18結合蛋 白。已顯示IL-12及IL-18具有重疊但不同之功能，且兩者 之拮抗劑的組合可能最有效。另一組合為非消耗性抗cd4 抑制劑。其他組合包括協同刺激路徑CD8〇 (B7〗）或CD86 (B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶性受體及拮抗性配位 體。 本發月之尨合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如甲胺喋 。令、6-MP、硫唾嗓。令、柳氮石黃胺〇比。定、美沙拉。秦、奥沙拉 嗪、氣喧/經基氯:t、青黴胺、硫代蘋果酸鹽（肌肉内及經 口）、硫。坐。票吟、秋水仙驗、皮質類固醇（經口、吸入及局 部注射）、β-2腎上腺素受體促效劑（沙丁胺醇、特布他林、 沙美特羅）、黃嘌呤（芩鹼、吐父&、 (才、嶮胺余鹼）、色甘酸鹽、奈多羅 米、酮替酚、異丙托|安及氧 孔代缺 ％孢素、FK506、雷帕 黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、央惫伞 曰术亂未特、NS AID(例如布洛 芬）、皮質類固醇（諸如潑尼雜、r# ^. …颅尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷 促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑 1 月上腺素激導劑.、干擾 促炎性細胞激素（諸如TNF-a吱ILΛ A 1 號傳導之藥劑（例如 IRAK、NIK、IKK、p38 或 MAP激醢心 P激喊抑制劑）、IL-Ιβ轉化酶 150428.doc -212- 201119673 抑制劑、TNFa轉化酶（TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制 劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺。比 咬、硫峻嘌呤、6-巯基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、 可〉谷性細胞激素受體及其衍生物（例如可溶性ρ 5 5或ρ 7 5 TNF 受體及衍生物 p75TNFRIgG(EnbrelTM及 p55TNFRIgG(來 那西普））、sIL-lRI、SIL-1RII及SIL-6R)、消炎性細胞激素
(例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGFP)、塞内昔布、葉 酸、硫酸羥基氯喹、羅非考昔、依那西普、英利昔單抗、 萘普生、伐地考昔、柳氮磺胺吡啶、甲潑尼龍' 美儂西 康、乙酸甲潑尼龍、硫代蘋果酸金鈉、阿司匹靈、曲安奈 德、萘磺酸丙氧芬/apap、葉酸鹽、萘丁美酮、雙氣芬酸、 吼羅昔康、依託度酸、雙氣芬酸鈉、奥沙普嗪、鹽酸經考 酮、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、 芬太尼、人類重組阿那白滞素、鹽酸曲馬多、雙水楊酯、 舒林酸、氰鈷胺素/fa/吡哆醇、乙醯胺苯酚、阿侖膦酸 鈉、潑尼龍、硫酸嗎啡' 鹽酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸 葡糖胺/軟骨素、鹽酸阿米曲替林、磺胺嘧啶、鹽酸羥考 酮/乙醯胺苯酚' 鹽酸奥洛他定、米索前列醇、萘普生 鈉、奥美拉唑、環磷醯胺、利妥昔單抗、比-丨TRAp、 MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗 IL_18、抗化15、BIRb_ 796、SCIO-469、VX_702、amg_548、νχ·74〇、羅氣司 特、IC-485、CDC-801及美索潘。組合包括ψ胺嗓吟或來 氟米特，且在中度或重度類風濕性關節炎情形下，包括環 孢素。 150428.doc -213- 201119673 亦可與結合蛋白組合用於治療類風濕性關節炎之非限制 性其他藥劑包括（但不限於）以下：非類固醇消炎藥 (NSAID);細胞激素抑制性消炎藥（CSAID) ; CDP-571/BAY-10-3356(人類化抗 TNFa 抗體；Celltech/Bayer); cA2/英利昔單抗（嵌合抗TNFa抗體；Centocor) ; 75 kdTNFR-IgG/依那西普（75 kD TNF受體-IgG融合蛋白； Immunex ;參看例如（1994) Arthr. Rheum. 37: S295; (1996) J. Invest. Med. 44: 235A) ; 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ； IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長類動物化抗CD4抗體； IDEC/SmithKline ；參看例如（1995) Arthr. Rheum. 38: S185); DAB 486-IL-2及/或 DAB 389-IL-2(IL-2 融合蛋白； Seragen ;參看例如（1993) Arthrit. Rheum. 36: 1223);抗 Tac(人類化抗 IL-2Ra ; Protein Design Labs/Roche) ; IL-4(消炎性細胞激素；DNAX/Schering) ； IL-10(SCH 52000 ；重組 IL-10消炎性細胞激素；DNAX/Schering) ;IL-4 ; IL-10及/或IL-4促效劑（例如促效劑抗體）；IL-1RA(IL-1 受體拮抗劑；Synergen/Amgen); 阿那白滯素 (Kineret®/Amgen) ; TNF-bp/s-TNF(可溶性 TNF結合蛋白； 參看例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊））：S284; (1995) Amer. J. Physiol. - Heart and Circ. Physiol. 268: 37-42)； R973401(IV型磷酸二酯酶抑制劑；參看例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S282) ; MK-966(COX-2抑制劑；參看 例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S81);伊洛前列素 150428.doc -214- 201119673 看例如（1996) Anhr. Rheum. 39(9 (增刊）：S82);曱胺喋 呤；沙立度胺（參看例如〇996) Arthr Rheum MO (增刊）: S>282)及沙立度胺相關藥物（例如西爾金）；來氟米特（消炎 樂及細胞激素抑制劑；參看例如0996) Arthr. Rheum· 39(9 (增刊）：S131; (1996) Inflamm· Res· 45: 103-107);胺甲環 酸（纖維蛋白溶酶原活化抑制劑；參看例如（1996)
Rheum，39(9 (增刊）：S284) ; τ_614(細胞激素抑制劑；參看 φ 例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：S282);前列腺素 E1(參看例如（1996) Arthr Rheum 39(9 (增刊s282);替 尼達普（非類固醇消炎藥；參看例如（1996) Anhr 39(9 (增刊）：S28〇);萘普生（非類固醇消炎藥；參看例如 (1996) NeUro. Report 7: 12〇9_1213);美儂西康（非類固醇 消炎藥）；布洛芬（非類固醇消炎藥）；α比羅昔康（非類固醇 消炎藥）；雙氣芬酸（非類固醇消炎藥）；吲哚美辛（非類固 醇消炎藥）；柳氮磺胺。比啶（參看例如（丨996) Arthr φ 39(9 (增刊）：S28 1);硫β坐嘌呤（參看例如（1996) a池r RheUm. 39(9 (增刊）：S281) ; ICE抑制劑（酶介白素_ιρ轉化 酶之抑制劑）；Zap-70及/或lek抑制劑（酪胺酸激酶zap_7〇或 lck之抑制劑）；制劑及/或VEGF_R抑制劑（血管内 皮細胞生長因子或血管内皮細胞生長因子受體之抑制劑； 血管生成抑制劑）；皮質類固醇消炎藥（例如SB203580); TNF轉化酶抑制劑；抗比_12抗體；抗比_18抗體；介白素_ 11(參看例如（1996) Arthr. Rheum· 39(9 (增刊）：S296);介 白素-13(參看例如（1996) Arthr· Rheum. 39(9 (增刊）_ I50428.doc •215- 201119673 S308);介白素_i7抑制劑（參看例如（1996) Arthr. Rheum. 39(9 (增刊）：δ120);金；青黴胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羥 基氣喹；環孢素；環磷醯胺；全身淋巴照射；抗胸腺細胞 球蛋白；抗CD4抗體；CD5毒素；經口投與之肽及膠原蛋 白；氣苯紮利二鈉；細胞激素調控劑（CRA)HP228及 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.) ; ICAM-1 反義硫代 填酸醋春去氧核誓酸（ISIS 2302 ; Isis Pharmaceuticals, Inc.);可溶性補體受體 1(TP1〇 ; τ Cell Sciences，Inc.);強 的松；肝蛋白；葡糖胺聚糖多硫酸鹽；二曱胺四環素；抗 IL2R抗體；海洋生物及植物脂質（魚及植物種子脂肪酸； 參看例如 DeLuca等人，（1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777);金諾芬；苯基丁氮酮；曱氯芬那酸；氟芬 那酸；靜脈内免疫球蛋白；齊留通；阿紮立平；黴酚酸 (RS-61443);他克莫司（FK_5〇6);西羅莫司（雷帕黴素）； 胺普立糖（鹽酸胺普立糖克拉曲濱（2_氣去氧腺苷）；曱 胺嗓吟；bcl-2抑制劑（參看Brunck〇，M等人，（2〇07) j Med. Chem· 5 0(4): 641-662);及抗病毒劑及免疫調節劑。 在一貫施例中，結合蛋白或其抗原結合部分與一種以下 藥劑組合投與以治療類風濕性關節炎：KDR之小分子抑制 劑；Tie-2之小分子抑制劑；甲胺喋呤；強的松；塞内昔 布；葉酸；硫酸羥基氣喹；羅非考昔；依那西普；英利昔 單抗；來氣米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺胺《比啶；甲 潑尼龍’布洛芬；美儂西康；乙酸曱潑尼龍；硫代蘋果酸 金鈉，阿司匹靈；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘磺酸丙氧芬 150428.doc 201119673 /apap ;葉酸鹽；萘丁美酮；雙氯芬酸；β比羅昔康；依託度 酸；雙氯芬酸鈉；奥沙普嗪；鹽酸羥考酮；氫可酮酒石酸 氫鹽/apap ;雙氣芬酸鈉/米索前列醇；芬太尼；人類重組 阿那白滯素；鹽酸曲馬多；雙水楊酯；舒林酸；氰鈷胺素 /fa/。比哆醇；乙醯胺苯酚；阿侖膦酸鈉；潑尼龍；硫酸嗎 。非；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/軟骨素；環 孢素；鹽酸阿米曲替林；磺胺嘧啶；鹽酸羥考酮/乙醯胺 笨齡’鹽酸奥洛他定；米索前列醇；萘普生納；奥美拉 唾；黴酚酸嗎啉乙酯；環磷醯胺；利妥昔單抗； TRAP ; MRA ; CTLA4-IG ; IL-18 BP ; IL-12/23 ;抗 IL 18 ;抗 IL 15 ; BIRB-796 ; SCIO-469 ; VX-702 ; AMG-548 ; VX-740 ·’ 羅氟司特；iC_485 ; CDC-801 ;及美索 潘。 可與本發明之結备蛋白組合用於發炎性腸病之治療劑的 非限制性實例包括以下：布地奈德；表皮生長因子；皮質 類固醇；環孢素；柳氮磺胺吡啶；胺基水楊酸鹽；6-巯基 °票吟；硫唾嘌呤；甲硝噠唑；脂質加氧酶抑制劑；美沙拉 嗪；奧沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化劑；凝血脂素抑制劑； IL-1受體拮抗劑；抗mAb ;抗IL-6 mAb ;生長因 子，彈性蛋白扭抑制劑；吼α定基-咪唾化合物；針對其他 人類細胞激素或生長因子0lHaTNF、LT、IL-l、IL-2、IL- 6、IL-7、IL-8 ' IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、 GM CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明之抗體或 其抗原結合部分可與針對細胞表面分子（諸如cD2、cD3、 150428.doc -217- 201119673 CD4 、 CD8 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69、CD90)或其配位體之抗體組合。本發明之抗體或其 抗原結合部分亦可與以下之藥劑組合：諸如曱胺喋呤；環 孢素；FK506 ;雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯；來氟米特； NSAID，例如布洛芬；皮質類固醇，諸如潑尼龍；磷酸二 酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上 腺素激導劑；干擾促炎性細胞激素（諸如TNFα或IL-1)信號 傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、ρ3 8或MAP激酶抑制 劑）；IL-Ιβ轉化酶抑制劑；TNFa轉化酶抑制劑；T細胞信 號傳導抑制劑，諸如激酶抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；柳 氮石黃胺。比α定；硫唾嘌吟；6 -疏基°票吟；jk管收縮素轉化酶 抑制劑；可溶性細胞激素受體及其衍生物（例如可溶性P 5 5 或 p75 TNF受體、sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R);及消炎性 細胞激素（例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGFP);及 bcl-2抑制劑。 可與結合蛋白組合之用於克羅恩氏病之治療劑的實例包 括以下：TNF拮抗劑（例如抗TNF抗體）、阿達木單抗（PCT 公開案第 WO 97/29131 號；HUMIRA) 、 CA2 (REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig 構築體（p75TNFRIgG (ENBREL)及p55TNFRIgG(來那昔普））抑制劑及PDE4抑制 劑。本發明之抗體或其抗原結合部分可與皮質類固醇（例 如布地奈德及地塞米松）組合。本發明之結合蛋白或其抗 原結合部分亦可與以下藥劑組合：諸如柳氮磺胺吡啶、5-胺基水楊酸及奥沙拉嗪，以及干擾諸如IL-1之促炎性細胞 150428.doc •218- 201119673 激素合成或作用的藥劑（例如IL-1 β轉化酶抑制劑及iL_ Ira)。本發明之抗體或其抗原結合部分亦可與T細胞信號 傳導抑制劑（例如酪胺酸激酶抑制劑6-巯基嘌呤）一起使 用。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分可與IL-1 1組 合。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分可與以下組合： 美沙拉嗪、強的松、硫唑嘌呤、豌基嘌呤、英利昔單抗、 甲潑尼龍丁二酸鈉、地芬諾酯/硫酸阿托品、鹽酸洛派丁 胺、甲胺嗓呤、奥美拉嗤、葉酸鹽、環丙沙星/右旋糖_ 水、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、鹽酸四環素、醋酸氟輕鬆、 曱硝噠唑、硫柳汞/硼酸、消膽胺/蔗糖、鹽酸環丙沙星、 硫酸莨碧驗、鹽酸°底替咬、鹽酸咪達〇坐俞、鹽酸經考酮/ 乙醯胺苯酚、鹽酸普敏太定、磷酸鈉、磺胺曱噁唑/曱氧 苄胺嘧啶、塞内昔布、聚卡波非、萘磺酸丙氧芬、氫化可 的松、多維生素劑、巴柳氮二鈉、磷酸可待因/apap、鹽酸 考來維侖、氰鈷胺素、葉酸、左氧氟沙星、甲潑尼龍、那 他珠單抗及干擾素-γ。 可與本發明之結合蛋白組合用於多發性硬化症之治療劑 的非限制性實例包括以下：皮質類固醇；潑尼龍；甲潑尼 龍；硫。坐嘌呤；環磷醯胺；環孢素；曱胺喋呤；4-胺基吡 啶；替紮尼定；干擾素jla(AVONEX ; Biogen);干擾素-
Plb(BETASERON ; Chiron/Berlex);干擾素a-n3(Interferon Sciences/Fujimoto);干擾素_a(Aifa Wassermann/J&J);干 擾素 piA-IF(Serono/Inhale Therapeutics);聚乙二醇化干擾 素 a 2b(Enzon/Schering-Pl〇ugh);共聚物 l(Cop-l ;克帕 150428.doc •219· 201119673 松；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.);高壓氧；靜脈 内免疫球蛋白；克拉曲濱；及針對其他人類細胞激素或生 長因子及其受體 〇U°TNF、LT、IL-l、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明之結合蛋白 可與針對細胞表面分子（諸如CD2、CD3、CD4、CD8、 CD19 、 CD20 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69、CD80、CD86及CD90)及其配位體之抗體組合。本 發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如曱胺喋呤、環 孢素、F K 5 0 6、雷帕黴素、黴盼酸嗎淋乙S旨、來氟米特、 NS AID(諸如布洛芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二 酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上 腺素激導劑、干擾促炎性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號 傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制 劑）、IL-1 β轉化酶抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號傳導 抑制劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺 °比淀、硫。坐嗓吟、6 -疏基°票。令、血管收縮素轉化酶抑制 劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物（例如可溶性ρ 5 5或 p75 TNF受體、sil-1RI、sIL-lRII、及 SIL-6R)、消炎性細 胞激素（例如IL-4、IL-10、IL-13及TGFP)及bcl-2抑制劑。 可與本發明結合蛋白組合用於多發性硬化症之治療劑的 實例包括干擾素-β(例如IFNpia及IFNpib);克帕松、皮質 類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑（例如卡斯蛋白酶-1抑制劑）、 IL-1抑制劑、TNF抑制劑及針對CD40配位體及CD80之抗 150428.doc • 220· 201119673
本發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如阿來組單 抗、屈大麻酚、尤利美、達利珠單抗、米托蒽醌、鹽酸紮 利羅登、胺吡啶、乙酸格拉替美、那他珠單抗、西納吡 哆、a-伊木諾金 NNS03、ABR-215062、AnergiX.MS、趨 化因子受體拮抗劑、BBR-2778、卡拉胍素、CPI-1189、 LEM(脂質體囊封之米托蒽醌）、THC CBD(類大麻酚促效
劑）、MBP-8298、美索潘（PDE4抑制劑）、MNA-7 1 5、抗 IL- 6受體抗體、萘羅瓦西、。比非尼酮、阿羅曲普1258(11〇?- 125 8)、sTNF-Rl、他侖帕奈、特立氟胺、TGF-P2、替利 莫肽、VLA-4拮抗劑（例如 TR-14035、VLA4 Ultrahalei·、
Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑及几_4促效劑。 可與本發明之結合蛋白組合用於心絞痛之治療劑的非限 制性貫例包括以下：阿司匹靈、硝化甘油、單硝酸異山梨 醇酯、丁二酸美托洛爾、阿替洛爾、酒石酸美托洛爾、苯 磺酸胺氯地平、鹽酸地爾硫卓、二硝酸異山梨醇酯、氣吡 格雷硫酸氫鹽、硝苯地平、阿托伐他汀鈣、氣化鉀、呋喃 苯胺酸、辛伐他汀、鹽酸維拉帕米、地趟 爾、卡維地洛、賴諾普利、伽、氯氣苯‘二二 稀二酸依拉普利、納多洛爾、雷米普利、依諾肝素納、肝 素納、纖沙坦、鹽酸索他洛爾、非諾貝特、依澤替米貝、 布美他尼、氣沙坦鉀、賴諾普利/氫氯苯㈣。秦、非洛地 平、卡托普利及反丁稀二酸比衾洛_。 / 於僵直性脊椎炎之治療劑 可與本發明之結合蛋白组合用 150428.doc -221 - 201119673
的非限制性實例包括以下：布洛芬、雙氣芬酸 醇、奈普生、美儂西康、。引嗓美辛、雙 v、堂月J 布、羅非考昔、柳氮磺胺吡啶、甲胺喋呤、硫唑嘌一、二 甲胺四％素、強的松、依那西普及英利昔單抗。 可與本發明之結合蛋白組合用於哮喘 性實例包括以下：沙丁胺醇療劑的非限制 _ 丁胺私/少美特羅/氟替卡松、孟魯 司特納、丙酸氟替卡松、布地奈德、強的松、經萘曱酸沙 美特羅、鹽酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/異丙托錢、 潑尼龍磷酸鈉、曲安奈德、二丙酸倍氯米松、漠化異丙托 銨、阿奇黴素、乙酸吼布特羅、潑尼龍、無水茶驗、甲潑 尼龍丁二酸鈉、克拉黴素、紮魯司特、反丁烯二酸福莫特 羅、流感病毒疫苗、曱潑尼龍、三水合胺經节青黴素、氟 尼縮松、過敏注射液、色甘酸鈉、鹽酸非索非那定、氟尼 縮松/薄荷腦、阿莫西林/棒酸鹽、左氧氟沙星、吸入器輔 助裝置愈創甘油醚、地塞米松磷酸鈉、鹽酸莫西沙星、 夕西％素、愈創甘油醚/d_美沙芬、卜麻黃素氣芬 P敏加身々星、鹽酸西替利嗪、糠酸莫美他松、經萘曱 酸沙美特羅、苯佐那酯、頭孢胺苄、pe/氫可酮/氯芬那 敏、鹽酸西替利嗪/假麻黃素、苯腎上腺素/c〇d/普敏太 定、可待因/普敏太定、頭孢丙烯、地塞米松、愈創甘油 醚/假麻丙素、氣芬尼拉明/氫可酮、奈多羅米鈉、硫酸特 布他林、腎上腺素、子潑尼龍及硫酸間羥異丙腎上腺素。 可與本發明之結合蛋白組合之用於COPD之治療劑的非 限制性實例包括以下：硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、溴化異 150428.doc -222· 201119673 丙托銨、沙美特羅/氣替 贶θ卞松、沙丁胺醇、羥萘甲酸沙美 特羅、丙酸氟替卡松、％ 強的权、無水茶鹼、曱潑尼龍丁二 酸鈉、孟魯司特鈉、右沾太& 布地矿、德'反丁烯二酸福莫特羅、曲 安奈德、左氧氟沙星、俞音丨 卜 恕創甘油醚、阿奇黴素、二丙酸倍 氯米松、鹽酸左旋沙丁胺醇、氟尼縮松、頭孢曲松鈉、三 水合胺經节青黴素、加替沙星、t魯司特、阿莫西林/棒 酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氣芬尼拉明/氫可酮、硫酸間經
=腎上腺素、甲潑尼龍、糠酸莫美他松、p_麻黃素/c〇d/ 氣去那敏乙8夂。比布特羅、p_麻黃素/洛拉他定、硫酸特布 他林、噻托溴銨、(R，R)_福莫特羅、TgAAT、西洛司特及 羅氟司特。 於HCV之治療劑的非限制 、干擾素a-2b、干擾素α 可與本發明之結合蛋白組合用 性實例包括以下：干擾素a-2a 干擾素a-nl、聚乙二醇化干擾素a_2a、聚乙二醇化 干擾素a_2b、病毒唑、％乙二醇化干擾素a-2b+病毒唑、 A去氧膽I、甘草酸、胸腺法新、二鹽酸組胺、及 藉由干預以下標乾用以治療Hcv之任何化合物·· 聚合 酶HCV蛋白酶、HCv解螺旋酶及hcvires(内部核糖體 入口位點）。 可與本發明之結合蛋白組合用於特發性肺纖維化之治療 劑的非限制性實例包括以下：強的松、硫唑嘌呤、沙丁胺 醇、秋水仙鹼、硫酸沙丁胺醇 '地高辛、丫干擾素、甲潑 尼龍丁二酸鈉、勞拉西泮、呋喃苯胺酸、賴諾普利、硝化 甘油、螺内酯、環磷醯胺、溴化異丙托銨、放線菌素d、 150428.doc -223- 201119673 阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氧氟沙星、硫酸間羥異丙腎 上腺素、硫酸嗎啡、鹽酸羥考酮、氣化鉀、曲安奈德、無 水他克莫司、鈣、干擾素α、曱胺喋呤、黴酚酸嗎啉乙酯 及干擾素γ-1 β。 可與本發明之結合蛋白組合用於心肌梗塞之治療劑的非 限制性實例包括以下：阿司匹靈、硝化甘油、酒石酸美托 洛爾、依諾肝素鈉、肝素鈉、氣吡格雷硫酸氫鹽、卡維地 洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、丁二酸美托洛爾、華法林鈉、 賴諾普利、單硝酸異山梨醇酯、地高辛、呋喃苯胺酸、辛 伐他汀、雷米普利、替奈普酶、順丁烯二酸依拉普利、托 西邁、瑞替普酶、氣沙坦鉀、鹽酸喹那普利/mag以比、布 美他尼、阿替普酶、依那普利拉、鹽酸乙胺碘呋酮、…水 合鹽酸替羅非班、鹽酸地爾硫卓、卡托普利、厄貝沙坦、 纈沙坦、鹽酸普萘洛爾 '福辛普利鈉、鹽酸利多卡因、埃 替菲巴肽、頭孢唑林鈉、硫酸阿托品、胺基己酸、螺内 酯、干擾素、鹽酸索他洛爾、氯化鉀、多庫酯鈉、鹽酸多 巴齡丁胺阿曰，哇命、普伐他:T納、阿托伐他；丁約、鹽酸 咪達唑侖、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨醇酯、腎上腺素、 鹽酸多巴胺、比伐盧定、羅素他汀、依澤替米貝/辛伐他 汀、阿伐麥布及卡立泊來德。 可與本發明之結合蛋白組合用於牛皮癣之治療劑的非限 制性實例包括以下：KDR之小分子抑制劑、仏_2之小分子 抑制劑、鈣泊三醇、丙酸氣倍他索、曲安奈德、丙酸_貝 他索、他紮羅汀、甲胺喋呤、醋酸氟輕鬆、強化二丙酸倍 150428.doc -224- 201119673 他米松、丙自同化氟新龍、阿曲汀、植物性洗髮精、戊酸倍 他米松、糠酸莫美他松、酮康唑、普莫卡因/氟輕鬆、戊 酸氫化可的松、氟氫縮松、尿素、倍他米松、丙酸氣倍他 索/潤膚劑、丙酸氟替卡松、阿奇黴素、氫化可的松、増 濕配方、葉酸、地奈德、吡美莫司、煤焦油、二乙酸二氣 拉松、葉酸依那西普、乳酸、甲氧沙林、hc/鹼式沒食子 酸鉍/zn〇x/resor、乙酸甲潑尼龍、強的松、防曬劑、哈西 奈德、水楊酸、蒽三酚、特戊酸氯可托龍、煤提取物、煤 焦油/水揚酸、煤焦油/水楊酸/硫、去羥米松、安定、潤膚 劑、醋酸氟輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/na lact、礦物油/ 花生油、石油/十四烷酸異丙酯、補骨脂素、水楊酸 '矣 類/三溴沙侖、硫柳汞/硼酸、塞内昔布、英利昔單抗、瑨 孢素、阿法賽特、依法利珠單抗、他克莫司、吡美莫司、 PUVA、UVB及柳氮續胺°比。定。 可與本發明之結合蛋白組合用於牛皮癣性關節炎之治療 劑的非限制性實例包括以下：甲胺喋呤、依那西普、羅非 考昔、塞内昔布、葉酸、柳氮確胺β比咬、萘普生、來敗米 特、乙酸甲潑尼龍、°引D朵美辛、硫酸經基氣π奎、強的松、 舒林酸、強化二丙酸倍他米松、英利昔單抗、甲胺嗓吟、 葉酸鹽、曲安奈德、雙氣芬酸、二甲亞砜、吡羅昔康、触 氣芬酸鈉、酮洛芬、美儂西康、甲潑尼龍、萘丁美酮、技 美丁鈉、鈣泊三醇、環孢素、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、 醋酸氟輕鬆、硫酸葡糖胺、硫代蘋果酸金鈉、氫可_酒石 酸氫鹽/apap、布洛芬、利塞膦酸鈉、續胺喷咬、硫島嗓 150428.doc -225 - 201119673 呤、伐地考昔、阿法赛特、依法利珠單抗及bd_2抑制劑。 可與本發明之結合蛋白組合用於再狹窄之治療劑的非限 制性實例包括以下：西羅望引、士亚y , 四維兵y、太平洋紫杉醇、依維莫 司、他克莫司、唑他莫司及乙醯胺苯酚。 可與本發明之結合蛋白組合用於坐骨神經痛之治療劑的 非限制性實例包括以下：氫可酮酒石酸氫鹽〜邛、羅非考 昔、鹽酸環苯紮林、甲潑尼龍、萘普生、布洛芬、鹽酸經 考酮/乙醯胺苯酚、塞内昔布、伐地考昔、乙酸甲潑尼 龍、強的松、磷酸可待因/apap、鹽酸曲馬多/乙醯胺苯 酚、美他沙酮、美儂西康、美索巴莫、鹽酸利多卡因、雙 氣芬酸鈉、加巴喷丁、地塞米松、肌安寧、酮咯酸胺丁三 醇、吲哚美辛、乙醯胺苯酚、安定、萘丁美酮、鹽酸羥考 酮、鹽酸替紮尼定、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、萘績酸丙 氧芬/apap、asa/oxycod/羥考酮ter、布洛芬/氫可酮酒石酸 氫鹽、鹽酸曲馬多、依託度酸、鹽酸丙氧芬、鹽酸阿米替 林、肌安寧/填酸可待因/asa、硫酸嗎°非、多維生素、萘普 生鈉、檸檬酸奥芬那君及替馬西泮。 可與本發明之結合蛋白組合用於SLE(狼瘡）之治療劑的 實例包括以下：NSAID，例如雙氯芬酸、萘普生、布洛 芬、吡羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑，例如塞内昔 布、羅非考昔、伐地考昔；抗瘧劑’例如羥基氣喳；類固 醇，例如強的松、潑尼龍、布地奈德、地塞米松；細胞毒 性劑，例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、甲胺 喋呤；及PDE4抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如驍悉。本 150428.doc -226- 201119673 發明之結合蛋白亦可與以下之藥劑組合：諸如柳氮續胺。比 °定、5 -胺基水楊酸、奥沙拉嗪、依木蘭及干擾促炎性細胞 激素（諸如IL-1)合成、產生或作用之藥劑，例如卡斯蛋白 酶抑制劑’如IL-1 β轉化酶抑制劑及IL-1 ra。本發明之结合 蛋白亦可與T細胞信號傳導抑制劑（例如酪胺酸激酶抑制 劑）；或靶向T細胞活化分子之分子（例如CTLA-4-IgG或抗 B7家族抗體及抗PD-1家族抗體）一起使用。本發明之結合 ^ 蛋白可與1L-11或抗細胞激素抗體（例如芳妥珠單抗（抗IFNg 抗體））或抗受體之受體抗體（例如抗IL-6受體抗體）及針對B 細胞表面分子之抗體組合。本發明之抗體或其抗原結合部 分亦可與以下一起使用：LJP 394(阿貝莫司）；消耗B細胞 或使B細胞失活之藥劑，例如利妥昔單抗（抗CD2〇抗體）、 貝利單抗（lymphostat-B)(抗BlyS抗體）；TNF拮抗劑，例如 抗TNF抗體、阿達木單抗（PCT公開案第w〇 97/29131號； HUMIRA)、CA2(REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig構築體 φ (P75TNFRIgG(ENBREL)及 p55TNFRIgG(來那西普））；^ bC〖-2抑制劑，由於已證實bci_2在轉殖基因小氣體内之過 度表現產生狼瘡樣表型（參看Marquina, R.等人，（2〇〇4) j
Immunol· 172⑴）：7177·7185)，因此預期抑制產生治療作 用。 本發明之醫藥組合物可包括「、么、底古4 θ 「 ^ ，口療有效Ϊ j或「預防有 效量」之本發明結合蛋白。「治療有效量」係指在必需劑 量下且歷時必需時段有效達成所需治療效果之量。結合蛋 白之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可根據諸如疾 150428.doc -227. 201119673 病狀態、個體之年齡、性別及體重以及結合蛋白在個體中 引起所需反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為抗體 或抗體部分之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的 量。「預防有效量」係指在必需劑量下且歷時必需時段有 效達成所需預防結果之量。通常，因為在疾病早期階段之 前或在疾病早期階段時對個體使用預防劑量，所以預防有 效量將小於治療有效量。 可調節給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療或預防 反應）。舉例而言，可投與單次劑量，可隨時間投與若干鲁 分開劑量，或依治療情況之緊急性指示，可按比例減少或 增加劑量。出於易於投與且劑量均一之目的，將非經腸組 合物調配為單位劑型尤其適宜。術語「單位劑型」係指適 «作為體劑里用於欲治療哺乳動物個體的實體不連續單 元；各單元含有經計算以產生所需治療作用之預定量的活 性化合物與所需醫藥載劑之聯合。本發明之單位劑型的規 格由以下因素規定且直接取決於以下因素：⑷活性化合物 獨特特徵及奴達成之特定治療或預防作用；及⑻混配該籲 活性化合物以達成個體之治療靈敏度之技術中所固有之限 制。 々本發明結合蛋白之治療或預防有效量之一例示性非限制 I圍為〇· 1 20 mg/kg ’例如J」〇 mg/kg。應注意劑量值可能 隨待緩解之病狀的類型及嚴重程度而變化。應進一步瞭 解對於任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個體需 要及投與或監督組合物投與之個人的專業判斷隨時間而加 150428.doc -228· 201119673 以調整，且本文所述之劑量範圍僅供，、 制所主張之組合物的範疇或實施。 示而並非意欲限 對於熟習此項技術者而言將顯而易見， 發明方法的其他適合修改及改適顯而 ：所述之本 本發明之範疇的適合等效物或本 用不悖離 乂所揭不之實施例佳 現已詳細描述本發明，參考以下實 例進仃。 明，該等實例僅出於說明之目的包 ’月理解本發 明。 括在内且不欲限制本發 V.診斷 本文之揭示内容亦提供診斷應用。下文將對此 步闡述。 I.檢定方法
本發明亦提供使用至少一種如本文所述之DVD_Ig測定 測試樣品中分析物（或其片段）之存在、量或濃度的方法。 該方法十可使用此項技術中已知之任何適合檢定。實例包 括（但不限於）免疫檢定，諸如夾心免疫檢定（例如單株、多 株及/或D V D -1 g夾心免疫檢定或其任何變化形式（例如單株/ DVD-Ig、DVD-Ig/多株等）’包括放射性同位素偵測（放射 免疫檢定（RIA))及酶偵測（酶免疫檢定（EIA)或酶聯免疫吸 附檢定（ELISA)(例如 Quantjkine ELISA 檢定，R & d Systems, Minneapolis，MN))、競爭抑制免疫檢定（例如正 向及反向）、螢光偏振免疫檢定（FPIA)、酶倍增免疫檢定技 術（EMIT)、生物發光共振能量傳遞（BRET)及均質化學發 光檢定等。在基於SELDI之免疫檢定中，將特異性結合相 150428.doc •229- 201119673 活 關分析物（或其片段）之捕捉試劑連接於質譜探針（諸如. 化之蛋白質晶片陣列)表面。接著將分析物(或其片段)特里 性捕捉於生物晶片λ’且藉由質譜法债測所捕捉之分析物 (或其片段）。或者’可自捕捉試劑溶離分析物（或其片幻 且精由傳統MALDI(基質輔助雷射脫附/離子化）或藉由 SELDI加以制。化學發光微粒免疫檢定（尤其採用 獄删⑽自動分析儀（亀u LabGmQHes，滿州
Pd’ IL)之化學發光微粒免疫檢定)為較佳免疫檢 例。 舉例而言’在如本文所述之DVD_Ig用作免疫診斷試劑 及/或用於分析物免疫檢定套組中時，使用此項技術中孰 知之收集、處理及加工尿液、血液、灰清及灰襞及其他體 液之方法來實踐本發明。測試樣品除相關分析物以外亦可 包含其他部分’諸如抗體、抗原、半抗原、激素、藥物、 _、受體、蛋白質、肽、多肽、寡核苷酸及/或聚核苷 酸。舉例而言’樣品可為自個體獲得之全血樣品。在如本 文所述之免疫駭前可能必需或需要例如用預處理試劑處 理測試樣品(尤其全血)。即使在預處理並非必需之情形(例 如大多數尿液樣品）下，仍可視情況進行預處理（例如，作 為基於商業平台之方案的一部分）。 預處理試劑可為任何適於與本發明之免疫檢定及套組一 起使用之試劑。預處理視情況包含：（a)一或多種溶劑(例 如曱醇及乙二醇）及視情況選用之鹽，（b)_或多種溶劑及 鹽及視情況選用之清潔劑，（c)清潔劑，或（d)清潔劑及 150428.doc -230- 201119673 鹽。預處理試劑為此項技術中所已知，且可例如以如以下 文獻所述（例如參看Yatscoff等人，（199〇) CHn Chem 36: 1969-1973及 WaUemaCq 等人，（1999) CHn Chem 45 : 432 435)在 Abbott TDx、AxSYM® 及 ARCHITECT® 分析儀 (Abbott Labomodes’ Abbott Park，IL)上檢定所使用之形 式’及/或市售形式使用該預處理。&外，預處理可如美 國專利第5，13 5,875號、EU專利公開案第即0471293號、
吴國專利第6,660,843號及美國專利申請案第2〇_〇2〇4〇1 號中所述進行。預處理試劑可為異質試劑或同f試劑。 在使用異質預處理試劑下，預處理試劑使樣品中存在之 分析物結合蛋白（例如可結合至分析物或其片段之蛋白質） 沈澱。該預處理步驟包含藉由分離沈澱之分析物結合蛋白 與藉由將預處理劑添加至樣品中所形成之混合物的上清液 來移除任何分析物結合蛋白。在該檢定中，將不存在任何 結合合物上清㈣於檢定，直接進行至抗體捕捉 步驟。 在使用同質預處理試劑下，不存在該分離㈣。使測試 樣加與預處理試劑之整個混合物與分析物（或其片段）之娘 f記特異性結合搭配物(諸如經標記之抗分析物抗體(或其 :原反：性片段))接觸。通常在由第一特異性結合搭配物 足之月J或期間，將用於該檢定之預處理試劑於經預處理 合物中稀釋。儘管存在該稀釋，但在捕捉期 合物中仍存在（或殘留）一定量預處理試劑。 發明，經標記特異性結合搭配物可為DVD_Ig(或其 150428.doc -231 · 201119673 片段、變異體或變異體之片段）。 在異質形式中’在自個體獲得測試樣品後，製備第一液 f物。混合物含有待評估分析物（或其片段）之測試樣品及 第」寺異性結合搭配物’其中該第一特異性結合搭配物與 測试樣品中所含之任柯公祕 1 17刀析物形成第一特異性結合搭配 物刀析物複α物。第一特異性結合搭配物較佳為抗分析 物抗體或其m —特異性結合搭配物可為如本文所述 之^^Ig(或其片段、變異體或變異體之片段）。添加測試 樣扣及第-特異性結合搭配物以形成混合物之順序並非關 鍵所在車乂佳將第一特異性結合搭配物固定於固相上。用 於免疫檢定（用於第-特異性結合搭配物及視情況用於第 一特異性結合搭配物）之固相可為此項技術中已知之任何 固相’諸如（但不限於）磁性粒子、珠粒、試管、微量滴定 板、光析管、膜、骨架分子、薄膜、遽紙、圓盤及晶片。 开/成3有第-特異性結合搭配物-分析物複合物之混合 物後’使用此項技術中已知之任何技術自複合物移除任何 未結合之分析"例而言，可藉由洗務移除未結合之分 析物。然而’理想的是存在之第—特異性結合搭配物之量 超過測試樣品中存在之任何分析物，以使測試樣品中存在 之所有分析物皆與第一特異性結合搭配物結合。 移除任何未結合之分析物後，將第二特異性結合搭配物 添加至混合物中以形成第—特異性結合搭配物·分析物-第 二特異性結合搭配物複合物。第二特異性結合搭配物較佳 為結合至分析物上不同於第一特異性結合搭配物在分析物 150428.doc •232- 201119673 上所結合之抗原決定基之抗原決定基的抗分析物抗體。此 外，第二特異性結合搭配物亦較佳經如上文所述之可偵測 標記來標記或含有如上文所述之可偵測標記。第二特異性 結合搭配物可為如本文所述之DVD-Ig(或其片段、變異體 或變異體之片段）。 可使用此項技術中已知之任何適合之可偵測標記。舉例 而言’可偵測標記可為放射性標記（諸如3H、I25〗、35s、 14C、32p及33P)、酶標記（諸如辣根過氧化酶、鹼性過氧化 酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶及其類似物）、化學發光標記（諸 如0丫咬鑌醋（acridinium ester)、硫酯、或磺醯胺；魯来 諾、異魯米諾（isoluminol)、啡啶鏽酯（phenanthridinium ester)及其類似物）、螢光標記（諸如螢光素（例如5_螢光 素、6-羧基螢光素、3'6-羧基螢光素、5(6)-羧基螢光素、 6-六氣-螢光素、6-四氣螢光素、異硫氰酸螢光素及其類似 者））、若丹明、藻膽蛋白（phycobiliprotein)、R-藻紅素、 量子點（例如硫化鋅封端之硒化鎘）、測溫標記或免疫聚合 酶鏈反應標記。標記之引入、標記程序及對標記之偵測可 見 於 Polak 及 Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry,第 2版，Springer Verlag，Ν·Y. (1997) 及 Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)(其為由 Molecular Probes, Inc.，Eugene， t
Oregon出版之組合手冊及目錄）中。螢光標記可用於FPIA 中（參看例如美國專利第5,593,896號；第5,573,904號；第 5,496,925號；第5,359,093號及第5,352,803號）。吖啶鑌化 150428.doc -233 - 201119673 合物可在同質或異質化學發光檢定中用作可偵測標記（參 看例如 Adamczyk等人，（2006) Bioorg· Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328，Adamczyk等人，（2004)81〇〇犷吕.1^6(1.(11116111· Lett. 4: 23 13-23 17 ; Adamczyk 等人，（2004)31〇巧.1^64· Chem. Lett. 14: 3917-3921 ;及 Adamczyk等人，（2003) Org. Lett. 5: 3779-3782)。 較佳吖啶鏽化合物為吖。定鑌-9-曱醯胺。製備吖啶鑌9-曱 醯胺之方法係描述於Mattingly (1991) J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 ; Adamczyk 等人，（1998) J. Org. Chem· 63: 5636-5639 ; Adamczyk等人，（1999) Tetrahedron 55: 10899-10914 ; Adamczyk 等人，（1999) Org. Lett. 1: 779-781 ; Adamczyk 等人，(2000) Biocon. Chem. 11: 714-724 ; Mattingly 等人，Luminescence Biotechnology:
Instruments and Applications ; Dyke, K. V.編；CRC Press: Boca Raton,第 77-1 05 頁（2002) ; Adamczyk 等人，（2003) Org. Lett. 5: 3779-3782 ;及美國專利第 5,468,646號；第 5,543,524號及第5,783,699號中。另一較佳吖啶鏽化合物為 吖啶鑌-9-甲酸芳酯。吖啶鑌-9-甲酸芳酯之實例為1 0-曱基-9-(苯氧幾基）°丫°定钂H續酸鹽（可自Cayman Chemical，Ann Arbor, MI獲得）。製備吖啶鏽9-甲酸芳酯之方法係描述於 McCapra等人，(1965) Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 ； Razavi等人，（2000) Luminescence 15: 245-249 ; Razavi等 人，（2000) Luminescence 15: 239-244 ;及美國專利第 5,241，070號中。關於吖啶鑌-9-曱酸芳酯及其用途之其他 I50428.doc -234- 201119673 細節闡述於美國專利公開案第2〇08〇248493號中。 可根據 Adamczyk 等人，（2006) Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67中所述之方法進行化學發光檢定（例如，使用如上文 斤述之°丫。疋鑌或其他化學發光劑）。儘管可使用任何適合 之檢定形式，但微板化學發光計（Mithras LB-940, Berthold Teehnol〇gles u s a，llC，〇ak Ridge，TN)使得能夠快速檢 定多個小體積樣品。 φ 添加測§式樣品及特異性結合搭配物以形成用於化學發光 檢定之混合物之順序並非關鍵。若第一特異性結合搭配物 、、4諸如丫 <7定鑌化合物之化學發光劑可偵測標記則形成經 可偵測標記之第一特異性結合搭配物-分析物複合物。或 者若使用第二特異性結合搭配物且第二特異性結合搭配 物、諸如丫咬鑌化合物之化學發光劑可偵測標記，則形成 經可偵測標記之第一特異性結合搭配物_分析物-第二特異 性結合搭配物複合物。可使用此項技術中已知之任何技術 # (诸如洗滌）自混合物移除任何經標記或未經標記的未結合 之特異性結合搭配物。 在添加上述吖啶鑌化合物之前、同時或之後，可現場在 混合物中產生過氧化氫或可向混合物中提供或供應過氧化 氫（例如過氧化氫之來源為一或多種已知含有過氧化氫 之緩衝液或其他溶液）。過氧化氫可以多種方式（諸如為熟 習此項技術者所顯而易見之方式）現場產生。 在同時或隨後向樣品中添加至少一種鹼性溶液後，產生 、 &示分析物存在之可偵測信號，即化學發光信號。驗性溶 150428.doc • 235 - 201119673 液含有至少一種鹼且具有大於或等於10，較佳大於或等於 I2之PH值。鹼性溶液之實例包括（但不限於）氫氧化鈉、氫 氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銨、氫氧化鎂、碳酸鈉、碳酸 氫鈉、氫氧化鈣、碳酸鈣及碳酸氫鈣，添加至樣品中之鹼 性溶液之量視鹼性溶液之濃度而定。基於所用鹼性溶液之 濃度，热習此項技術者可輕易地確定添加至樣品中之鹼性 溶液之量。 可使用熟習此項技術者所已知之常規技術偵測所產生之 化學發光信號。基於所產生之信號強度，可定量樣品申分 析物之里。特疋言之，樣品中分析物之量與所產生之信號 強度成比例。可藉由將所產生光之量與分析物之標準曲線 相比較或藉由與參考標準物相比較來定量存在之分析物之 覃。可藉由質譜分析、重量分析法及此項技術中已知之其 他技術使用已知濃度之分析物的連續稀釋液或溶液產生標 準曲線。儘管上文著重描述使用吖啶鏽化合物作為化學發 光劑，但一般技術者可輕易地使此描述適合於使用其他化 學發光劑。 ’、 分析物免疫檢定一般可使用此項技術中已知之任何形式 (諸如（但不限於）夾心形式）來進行。特定而言在一種免 疫檢定形式中，採用至少2種抗體來分離及定量樣品中之 分析物，諸如人類分析物或其片段。更特定言之，至少2 種抗體結合於分析物（或其片段）上之不同抗原決定基以形 成免疫複合物，其稱作「夾心」。一般而言，在免疫檢定 中’可使用一或多種抗體來捕捉測試樣品中之分析物（或 150428.doc •236· 201119673 其片段）（此等抗體通常稱作「捕捉」抗體），且可使用一或 多種抗體以使可偵測（即可定量）標記結合於夾心（此等抗體 常稱作「偵測抗體」、「接合物」）。因此，在夾心免疫檢 定形式之上下文中，如本文所述之結合蛋白或DVD-Ig(或 其片段、變異體或變異體之片段）可用作捕捉抗體、偵測 抗體或兩者。舉例而言，一種具有可結合分析物（或其片 •k )上之第一抗原決定基之結構域的結合蛋白或DVD_Ig可 φ 用作捕捉劑及/或另一具有可結合分析物（或其片段）上之第 二抗原決定基之結構域的結合蛋白或DVD_Ig可用作偵測 劑。就此而言，具有可結合分析物（或其片段）上之第一抗 原決定基之第一結構域及可結合分析物（或其片段）上之第 一抗原決定基之第二結構域的結合蛋白或DVD-Ig可用作 捕捉劑及/或偵測劑。或者，一種具有可結合第一分析物 (或其片段）上之抗原決定基之第一結構域及可結合第二分 析物（或其片段）上之抗原決定基之第二結構域的結合蛋白 φ 或DVD-Ig可用作捕捉劑及/或偵測劑來偵測且視情況定量 兩種或兩種以上分析物。若分析物可能以一種以上形式 (諸如單體形式及二聚/多聚形式，其可為同聚（h〇m〇ineric) 或雜聚（heteromeric))存在於樣品中，則一種具有可結合僅 暴露於單體形式上之抗原決定基之結構域的結合蛋白或 DVD_Ig及另一種具有可結合二聚/多聚形式之不同部分上 之抗原決定基之結構域的結合蛋白或DVD-Ig可用作捕捉 劑及/或偵測劑，從而使得能夠偵測及視情況定量不同形 式之既定分析物。此外，使用單一結合蛋白或DVD-Ig中 150428.doc •237- 201119673 及/或在結合蛋白或DVD-Ig之間親和力有所不同之結合蛋 白或DVD-Ig可提供親和性優勢。在如本文所述之免疫檢 定之上下文令，將一或多個連接子併入結合蛋白或dvd_ Ig之結構中一般可能為有助的或合乎需要的。若存在連接 子，則最佳連接子應具有足夠長度及結構可撓性以使内部 結構域能夠結合抗原決定基以及外部結構域能夠結合另一 抗原決定基。就此而言，當結合蛋白或DVD_ig可結合兩 種不同分析物且一種分析物大於另一種時，則合乎需要的 是’由外部結構域結合較大分析物。 一般而言，可使待測試（例如懷疑含有）分析物（或其片 段）之樣品同時或連續及按任何順序與至少—種捕捉劑及 至少一種偵測劑（例如在捕捉及/或偵測劑包含多種試劑之 ㈣下’其可為第二制劑或第三㈣測劑或甚至依次編號 之藥劑）接觸。舉例而言，可使測試樣品首先與至少一種 捕捉劑接觸且接著（依序）與至少—觀_接觸。或者， 可使測試樣品首先與至少一種偵測劑接觸且接著（依序）盘 至少-種捕捉劑接觸。在另_替代方案中，可使測試樣品 同時與捕捉劑及偵測劑接觸。 在夾檢疋形式中，使懷疑含有分析物（或其片段）之樣 品首先與至少一種第-捕捉劑在使得形成第-試劑/分析 物複合物之條件下接觸。若使用-種以上捕捉劑，則形成 包含兩種或兩種以上插杰丨> & 捕捉训之第一捕捉劑/分析物複入 物。在夾心檢定中’以比測試樣品中預期之分析物(或： 片段)之最大量莫耳過量之量使用試劑(亦即較佳至少—種 150428.doc -238· 201119673 捕捉劑）。舉例而言，可使用每毫升緩衝液（例如微粒汾覆 緩衝液）約5微克至約1毫克試劑。 由於需要僅由一種抗體（亦即在本發明之上下文中 種結合蛋白及/或一種DVD-Ig)結合而常用於量測小分析物 之競爭抑制免疫檢定包含依序及經典形式。在依序競爭抑 制免疫檢定中，將相關分析物之捕捉劑塗佈於微量滴定板 之孔或其他固體支撐物上。當將含有相關分析物之樣品添 φ 加至孔中時，相關分析物結合於捕捉劑。洗滌後，將已知 S之能夠結合捕捉抗體之經標記（例如生物素或辣根過氧 化酶(HRP))分析物添加至孔中。有必要時使用酶標記之受 豸以產生信號。HRP之適合受質之實例為3,3，，5,5，四甲基 聯苯胺（TMB)。洗滌後，量測由經標記之分析物產生之信 號且該信號與樣品中分析物之量成反比。在經典競爭抑制 免疫檢定中，通常將相關分析物之抗體（在本發明之上下 文中，亦即結合蛋白及/4DVD_Ig)塗佈於固體支撐物（例 籲如微里滴定板之孔）上'然而，+同於依序競爭抑制免疫 檢定，同時將樣品及經標記之分析物添加至孔中。樣品中 之任^分析物與經標記之分析物競爭結合捕捉劑。洗務 後里測由經禚s己之分析物產生之信號且該信號與樣品中 刀析物之里成反比。當然，存在此等形式之許多變化形式 (例如，當結合於固體受質時，該形式為一步、兩步、延 遲兩V及其類似形式）’且―般技術者能識別出此等變化 形式。 視情況在使測試樣品與至少一種捕捉劑（例如 第一捕捉 150428.doc -239- 201119673 劑）接觸之前，可使至少—括^ 裡捕捉劑結合於固體支撐物 上，此便利於使第一試劑/八此此，丄 八μ/刀析物（或其片段）複合物與測試 樣品分離。捕捉劑所結合 口之又為可為便利於捕捉劑-分析 物複合物自樣品分離之任柄$人π a 何適合固體支撐物或固相。 實例包括培養板（諸如微嗇、、s — >、 x倣里滴定板）之孔、試管、多孔凝 膠（例如矽膠、瓊脂糖、平翁结上 虑匍甸糖或明膠）、聚合薄膜（例如 聚丙烯醯胺）、珠粒（例如聚笨乙稀珠粒或磁性珠粒）、渡紙/ 膜（例如石肖化纖維素或·）之條帶、微粒（例如乳㈣子、 可磁化微粒(例如具有氧化鐵或氧化鉻核心及均聚或雜聚 塗層及半徑為WH)微米之微粒）。受質可包含適合多孔材 料’其具有適於結合抗原之表面親和力及足以使偵測抗體 出入之孔隙率。儘管可使用呈水合狀態之凝膠狀材料，但 微孔材料一般為較佳的。該等多孔受質較佳為厚度為約 0.01 mm至約0.5 mm，較佳約（M mm之薄片形式。雖然微 孔尺寸可大不相同，但較佳微孔尺寸為約〇 〇25至約i 5
Pm，更佳為約0.15至約15 μιη。該等受質之表面可藉由使 抗體與受質共價鍵聯之化學製程被動塗佈或活化。引起抗 原或抗體與受質一般藉由經疏水力吸附而不可逆結合；或 者’可使用化學偶合劑或其他方式使抗體與受質共價結 合’其限制條件為該結合不干擾抗體結合分析物之能力。 或者’抗體（在本發明之上下文中，亦即結合蛋白及/或 DVD-Ig)可與微粒結合，該等微粒先前塗有抗生蛋白鏈菌 素（例如 DYNAL®磁性珠粒，Invitrogen，Carlsbad, CA)或生 物素（例如，使用p〇wer-BindTM-SA-MP抗生蛋白鏈菌素塗 150428.doc -240· 201119673 佈之微粒（Seradyn，Indianapolis，IN))或抗物種特異性單株 抗體（在本發明之上下文中，亦即結合蛋白及/或dvd_ Ig)。必要或需要時，受質（例如用於標記）可經衍生化以對 抗體（在本發明之上下文中，亦即結合蛋白或DVD_ig)上之 各種官能基具有反應性。該衍生化需要使用某些偶合劑， 其實例包括（但不限於）順丁烯二酸酐、N—羥基丁二醯亞胺 及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳化二亞胺。需要時，可 _ 使一或多種捕捉劑（諸如抗體（或其片段）（在本發明之上下 文中，亦即結合蛋白及/或DVD_Ig)，其各對分析物具有特 異性）連接於固相之不同物理或可達之位置上（例如呈生物 晶片組態）（參看例如美國專利第6,225，，號；pcT公開案 第WO 99/51773號’美國專利第6,329 2G9號；PCT&開案 第WO 00/56934號；及美國專利第5,242,828號）。若使捕捉 劑連接於作為固體支撐物之質错探針上，則可藉由雷射脫 附離子化質譜偵測結合於探針之分析物之量。或者，可用 •、經：或多種捕捉劑衍生化之不同珠粒填充單個管柱，從而 在單一位置上捕捉分析物（參見，基於經抗體衍生化之珠 粒的技術，例如Luminex(Austin，TX)之χΜΑρ技術）。 在使待檢定分析物（或其片段）之測試樣品與至少一種捕 捉劑(例如第-捕捉劑)接觸後，培育混合物以使形成第一 捕捉劑（或第若干捕捉劑）_分析物（或其片段）複合物。培育 可在約4.5至約10·〇2ρΗ值下，在約2。〇至約45它之溫度下 =行且歷經至少約1分鐘至約18小時，較佳約1分鐘至約24 刀鉍，取佳約4至約18分鐘之時段。本文所述之免疫檢定 150428.doc -241 - 201119673 可以一個步驟進行Γ音士田 + (μ明連、.只或同時將測試樣品、至少一 個：至少—㈣測劑全部添加至反應容器中)或以 一個以上步驟’諸如兩個步驟、三個步驟等進行。 後在第Γ)捕捉劑/分析物⑽ ,⑨°物與至少―種㈣劑在允許形成（第-或 第若干）捕捉劑/分析物（戍其 具片& )/第二偵測劑複合物之停 件下接觸。儘管為清接叔g ^ r ^ 月邊起見而虺以「第二」試劑(例如第 一债測劑）之名稱，但實際上甚/@ + 及/或㈣第|干試劑進行捕捉 種偵測劑可為用於免疫檢定之第二試 劑、第三試劑、第四試劑等。若使捕捉劑/分析物(或其片 段）複合物與—種以上偵測劑接觸，則形成（第-或第若干） 捕捉劑/分析物（或其片段）/(第若干）_劑複合物。如同捕 捉劑(例如第一捕捉劑)’當使至少-種(例如第二及任何隨 後編號）積測劑與捕捉劑/分析物（或其片段）複合物接觸 時’需要在與上文所述之條件類似的條件下培育-段時間 以形成（第-或第若干）捕捉劑/分析物（或其片段）/(第二或 第若干）偵測劑複合物。$ ,丨、 α物至乂 一種偵測劑較佳含有可偵測 標記。可债測標記可在（第一或第若干）捕捉劑/分析物（或 其片段）/(第二或第若干）偵測劑複合物形成之前、同時或 之後結合於至少一種偵測劑（例如第二偵測劑）。可使用此 項技術中已知之任何可偵測標記（參看上文論述，包括 Polak 及 Van Noorden (1997)&Haugland (Μ%)參考文獻卜 可债測標記可直接或經由偶合劑結合至試劑。可使用之 偶合劑之實例為舰叩_乙基_3_(3•二甲基胺基丙基）碳化 150428.doc -242· 201119673 一亞胺鹽酸鹽），其可自 Sigma-Aldrich，St. Louis，MO購 知可使用之其他偶合劑為此項技術所已知。使可彳貞測標 記結合至抗體之方法為此項技術所已知。此外，多種已含 有促成可偵測標記偶合於試劑之端基的可偵測標記可購得 或合成，諸如CPSP-吖啶鑌酯（亦即9-[N-甲苯磺醯基_N_(3_ 羧基丙基）]-1〇_(3_磺丙基）吖啶鑌甲醯胺）或spsp_"啶鏽酯 (亦即Nl 0-(3·續丙基）_N_(3_續丙基）吖啶鏽_9_甲醯胺）。 在定量標記之前，可將（但並非必需）（第一或第若干）捕 捉劑/为析物/(第二或第若干）偵測劑複合物與測試樣品之 剩餘部分分離。舉例而言，若至少一種捕捉劑（例如第一 捕捉劑，諸如本發明之結合蛋白及/或DVD_Ig)結合於固體 支撐物（諸如孔或珠粒），則分離可藉由移除流體（測試樣 品）以免與固體支撐物接觸來實現。或者，若至少第一捕 捉劑結合於固體支撐物，則其可同時與含有分析物之樣品 及至少一種第二偵測劑接觸以形成第一（第若干）試劑/分析 物/第二（第若干）試劑複合物，、繼而移除流體（測試樣品）以 免與固體支撐物接觸。若至少一種第一捕捉劑未結合於固 體支撐物’則無需自载樣品移除（第—或第若干）捕捉劑/ 分析物/(第二或第若干）彳貞測劑複合物以定量標記之量。 在經標記之捕捉劑/分析物/偵測劑複合物（例如第一捕捉 劑/分析物/第二價測劑複合物)形成後，使用此項技術中已 知之技術定量複合物中之標記之量。舉例而言，若使用酶 =記’則使經標記之複合物與標記之受質反應，產生可定 量反應’諸如顯色。若標記為放射性標記，則使用適合方 150428.doc •243· 201119673 式（諸如閃爍計數器）定量標記。若標記為螢光標記，則藉 由用單色光（其稱作「激發波長」）刺激標記且偵測由標記 回應刺激所發射之另一顏色（其稱作「發射波長」）來定量 標S己。若標記為化學發光標記，則藉由目測或使用光度 計、X射線膠片、高速攝影膠片、CCD攝像機等偵測所發 射之光來定量標記。在定量出複合物中標記之量之後，則 藉由適合方式，諸如藉由使用已使用已知濃度之分析物或 其片段之連續稀釋液產生之標準曲線來測定測試樣品中分 析物或其片段之濃度。除使用分析物或其片段之連續稀釋 液以外，可以重量分析方式、藉由質譜分析及藉由此項技 術中已知之其他技術產生標準曲線。 在採用ARCHITECT®分析儀之化學發光微粒檢定中’接 合物稀釋劑pH值應為約6.0 +/- 0.2，微粒塗覆緩衝液應維 持於約室溫下（亦即在約17。(：至約”它下），微粒塗覆緩衝 液pH值應為約6_5 +/- 0.2，且微粒稀釋劑pH值應為約78 +/- 0_2。固體較佳少於約0.2%，諸如少於約〇. 1 5%、少於 約0.14°/。'少於約0.13%、少於約〇.12%或少於約〇 11%，諸 如約0.10%。 FPIA係基於競爭性結合免疫檢定原理。經螢光標記之 化合物在由線性偏振光激發時將發射偏振度與其旋轉速率 成反比之螢光。當藉由線性偏振光激發經螢光標記之示縱 劑-抗體複合物時’所發射之光仍保持高度偏振，因為螢 光團在吸收光之時間與發射光之時間之間旋轉受限。當藉 由線性偏振光激發「游離」不縱劑化合物（亦即未结合至 150428.doc -244- 201119673 抗體之化合物）時，复旌鞔4 μ < 、疋轉比競爭性結合免疫檢定中所產 生之相應示蹤劑铺接合物(或根據本發明，示蹤劑-結合 蛋白及/或不縱劍-DVIMg)快得多。fpia由於不存在需要 特殊處理及處置之放射性物所 又㈣物貝而優於RIA。此外，即认為 可輕易且快速進行之同質檢定。 寥於^文，提供測定分析物（或其片段）於測試樣品中之 存^、f或漢度的方法。該方法包含藉由如下檢定來檢定 測試樣品之分析物（或盆g p、 片#又），該檢定⑴採用（i，）可結合於 “斤物之杬體 '抗體片段、可結合於分析物之抗體之變異 體、可結合於分析物之抗體變異體之片段、如本文所揭示 之結合蛋白、及可結合於分析物之dvd，或其片段、變 異體或變異體之片段)中之至少-者，及(Π,)至少一種可偵 ㈣記；且⑻包含將由可偵測標記產生作為分析物（或其 片#又）於測g式樣品中之存在、量或濃度的直接或間接指示 的信號與產生作為分析物（或其片段）於對照組或校正劑中 之存在、量或濃度之直接或間接指示的信號相比較。校正 劑視情况為-系列校正劑之一部分，其中各校正劑與其他 校正劑之分析物濃度不同。 ^方去可包含⑴使測試樣品與至少—種選自由以下組成 ;忐笙：析物(或其片段)之第一特異性結合搭配物接觸以 :人特異性結合搭配物/分析物(或其片段)複合物：可 結：至分析物之抗體、抗體片段；可結合至分析物之抗體 之艾：體’可結合至分析物之抗體變異體之片段；如本文 之 合蛋白，及可結合至分析物之DVD_Ig(或其片 150428.doc -245 - 201119673 段、變異體或變異體之片段）；（ii)使第一特異性結合搭配 物/分析物（或其片段）複合物與至少—種選自由以下組成之 群的分析物（或其片段）之第二特異性結合搭配物接觸以形 成第一特異性結合搭配物/分析物（或其片段}/第二特異性 結合搭配物複合物：可結合至分析物的經可偵測標記之抗 分析物抗體；經可偵測標記之抗分析物抗體片段；可結合 至分析物的經可偵測標記之抗分析物抗體變異體；可結合 至分析物的經可偵測標記之抗分析物抗體變異體片段；可 結合至分析物的如本文所揭示之經可偵測標記之結合蛋 白；及經可偵測標記之DVD_Ig(或其片段、變異體或變異 體之片段），及（111)藉由偵測或量測由（ii)中所形成之第二 特異性結合搭配物/分析物（或其片段）/第二特異性結合搭 配物複合物中之可偵測標記產生之信號來測定分析物於測 试樣品中之存在、量或濃度。至少一種針對分析物（或其 片段）之第一特異性結合搭配物及/或至少一種針對分析物 (或其片段）之第二特異性結合搭配物為如本文所揭示之結 合蛋白或如本文所述之DVD_Ig(或其片段、或變異體或^ 異體之片段）的方法可為較佳的。 或者，該方法可包含使測試樣品與至少一種選自由以下 組成之群的針對分析物（或其片段）之第一特異性結合搭配 物接觸：可結合至分析物之抗體、抗體之片段丨可結合至 /刀析物之抗體變異體；可結合至分析物之抗體變異體之片 段；如本文所揭示之結合蛋白、及DVD-Ig(或其片段、變 異體或變異體之片段）；且同時或依序以任-順序使測試 150428.doc *246- 201119673 樣扣與至-種第一特異性結合搭配物接觸，該至少一種 第二特異性結合搭配物可與分析物（或其片段）競爭結合至 至少一 #第一特異性結合搭配物且係冑自由Μ下組成之 群·可結合至第一特異性結合搭配物的經可偵測標記之分 析物、經可偵測標記之分析物片段；可結合至第一特異性 結合搭配物的經可偵測標記之分析物變異體；及可結合至 第-特異性結合搭配物的經可债測標記之分析物變異體片 φ 段。測試樣品中存在之任何分析物（或其片段}與至少-種 第二特異性結合搭配物彼此競爭以分別形成第一特異性結 合搭配物/分析物(或其片段)複合物及第一特異性結合搭配 物/第一特異性結合搭配物複合物。該方法進一步包含藉 由债測或量測由(Η)中所形成之第—特異性結合搭配詞 一特異性結合搭配物複合物中之可偵測標記所產生之信號 來測疋分析物於測試樣品中之存在、量或濃度其中由第 一特異性結合搭配物/第二特異性結合搭配物複合物中之 # 彳制標記產生之信號與測試樣品中分析物之量或濃度成 反比。 上述方法可進一纟包含對獲得測試樣品之患者之治療性/ 預防性處理的功效進行診斷、預後 步包含評估對產生測試樣品之患者之治療性 的功效，則該方法視情況進—步包含根據需要改變患者的 冶療性/預防性處理以改良功效。該方法可經改進用於自 動化系統或半自動化系統中。 更特定言之，提供測定抗原（或其片段）於測試樣品中之 150428.doc -247 - 201119673 存在里或濃度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定 測D式樣。π之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴採用至少一種結 σ蛋白及至V —種可偵測標記，及（ii)包含將可偵測標記 產生的作為抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量或濃 度之直接或間接指示的信號與所產生之作為抗原（或其片 段）於對照組或校正劑中之存在、量或濃度之直接或間接 指示的信號作比較。校正劑視情況為一系列校正劑的一部 分，在該系列校正劑中，各校正劑與系列中其他校正劑之 抗原（或其片段）之濃度不同。至少一種結合蛋白中之一者 (i’）包含多肽鏈，該多肽鏈包含VD1_(X1)n_vD2-C-(X2)n， 其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第 一重鏈可變域，VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之 第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二重鏈可變 域’ C為重鏈恆定域，（X1)n為視情況存在之連接子，且存 在時不為CH1 ’且（X2)n為視情況存在之fc區，且（u，）可結 合一對抗原。該方法可包含⑴使測試樣品與至少一種結合 至抗原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接觸，從而形 成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，（ii)使捕捉劑/抗原（或其 片段）複合物與至少一種包含可偵測標記且結合至捕捉劑 未結合之抗原（或其片段）上的抗原決定基之偵測劑接觸， 形成捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物，及（iii)基於 (ii)中形成之捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物中之可 偵測標記產生的信號測定抗原（或其片段）於測試樣品中之 存在、量或濃度’其中至少一種捕捉劑 '及/或至少—種债 150428.doc -248- 201119673 測劑為該$ ,1、 ^ ^ 種結合蛋白。或者，該方法可包含（i)使測 式樣品坐Φ J、 、 /、主夕—種結合至抗原（或其片段）上之抗原決定基 /捉A丨接觸’從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物， 同時或依序（以任何順序），使測試樣品與可與測試樣品 4何抗原（或其片段）競爭結合至該至少一種捕捉劑的 可偵測標記之抗原（或其片段）接觸，其中測試樣品中存在 之任何抗原（或其片段）與可偵測標記之抗原彼此競爭，分 φ 別形成捕捉劑7抗原（或其片段）複合物及捕捉劑/可偵測標 記之抗原（或其片段）複合物，及（Π)基於（ii)中形成之捕捉 劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合物中的可偵測標記產 生之k號測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量或 浪度，其中至少一種捕捉劑為該至少一種結合蛋白，且其 中捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合物中之可偵測 才示δ己產生之號與抗原（或其片段）於測試樣品中之量或濃 度成反比。測試樣品可來自患者’在此情形中，該方法可 Φ 進一步包含對患者進行診斷、預後或評定其治療性/預防 性處理之功效。若該方法進一步包含評定患者之治療性/ 預防性處理之功效’則該方法視情況進一步包含根據需要 改變患者之治療性/預防性處理以改良功效。該方法可經 改進用於自動化系統或半自動化系統中。 提供另一測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量 或濃度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定測試樣品 之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴採用至少一種結合蛋白及 至少一種可偵測標記’及（Π)包含將可偵測標記產生的作 150428.doc -249· 201119673 為抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量或濃度之直接 或間接指示的信號與所產生之作為抗原（或其片段）於對照 組或校正劑中之存在、量或濃度之直接或間接指示的信號 作比較。校正劑視情況為一系列校正劑的一部分，在該系 列校正劑中’各校正劑與系列中其他校正劑之抗原（或其 片段）之濃度不同。至少一種結合蛋白中之一者（丨，）包含多 肽鏈’該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1 為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一輕鏈可 變域，VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之第二親本 抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變域，C為輕 鏈恆定域，（Xl)n為視情況存在之連接子，且存在時不為 CH1 ’且（X2)n為視情況存在之卜區，且（Ηι)可結合一對抗 原。該方法可包含⑴使測試樣品與至少一種結合至抗原 (或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接觸，從而形成捕捉 劑/抗原（或其片段）複合物，（ii)使捕捉劑/抗原（或其片段） 複合物與至少一種包含可偵測標記且結合至捕捉劑未結合 之抗原（或其片段）上的抗原決定基之偵測劑接觸，形成捕 捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物，及（ni)基於（Η)中形 成之捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物中之可偵測標 記產生的信號測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、 量或濃度’其中至少一種捕捉劑及/或至少一種偵測劑為 該至少-種結合蛋白。或者’該方法可包含⑴使測試樣品 與至ν種、纟。合至抗原（或其片段）上之抗原決定基的捕捉 劑接觸，從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，且同時 150428.doc - 250· 201119673 或依序（以任何順序）使測試樣品與可與測試樣品中之任何 抗原（或^片·^)競爭結合於至少一種捕捉劑的可偵測標記 之抗原（或其片段）接觸，其中測試樣品中存在之任何抗原 (或其片段)與可偵測標記之抗原彼此競爭，分別形成捕捉 劑/抗原（或其片段）複合物及捕捉劑/可债測標記之抗原（或 其片段）複合物，及 (ϋ)基於（ϋ)中形成之捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片 鲁段）複合物中之可偵測標記產生的信號測定抗原（或其片段） 於測試樣品中之存在、量或濃度，其中至少一種捕捉劑為 〇亥至乂種、、’° δ蛋白，且其中捕捉劑/可债測標記之抗原 (或其片段）複合物中之可偵測標記產生之信號與抗原（或其 片段）於測S式樣品中之量或濃度成反比。若測試樣品係來 自患者，則該方法可進一步包含對患者進行診斷、預測或 評定其治療性/預防性處理之功效。若該方法進一步包含 評定患者之治療性/預防性處理之功效，則該方法視情況 鲁 進一步包含根據需要改變患者之治療性/預防性處理以改 良功效。該方法可經改進用於自動化系統或半自動化系統 中。 提供另一測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量 或濃度之方法。该方法包含藉由免疫檢定來檢定測試樣品 之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴採用至少一種結合蛋白及 至少一種可偵測標記，及（ii)包含將可偵測標記產生的作 為抗原（或其片'^又）於測试樣品中之存在、量或j農度之直接 或間接指示的信號與所產生之作為抗原（或其片段）於對照 150428.doc •251 · 201119673 組或校正劑中之存在、量或濃度之直接或間接指示的信號 作比較。校正劑視情況為U校正劑的—部分，在該系 列校正劑t，各校正劑與系列中其他校正劑之抗原（或其 片段）之濃度不同。至少—種結合蛋白中之一者⑺包含第 一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第—多肽鏈包含第—vm_ (Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第—親本抗體（或其抗 原結合部分）獲得之第—重鏈可變域，VD2為自可與第一親 本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲 得之第二重鏈可變域，C為重肢定域，（X1)n為視情況: 在之連接子，且存在時不為CH1，且（χ2)η為視情況存在之 FC區’且其中第二多肽鏈包含第二VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲 得之第一輕鏈可變域，VD2為自可與第一親本抗體相同或 不同的第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈 可變域，C為輕鏈恆定域’（xl)n為視情況存在之連接子， 且存在時不為CH1，且（Χ2)η為視情況存在之卜區，及（Η，) 可、’'。合一對抗原。該方法可包含⑴使測試樣品與至少一種 δ至抗原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接觸，從 而升^成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，（丨丨）使捕捉劑/抗原 (或其片段）複合物與至少一種包含可偵測標記且結合至捕 捉劑未結合之抗原（或其片段）上的抗原決定基之偵測劑接 觸’形成捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物，及（iii)基 於（11)中形成之捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物中之 可偵測標記產生的信號測定抗原（或其片段）於測試樣品中 150428.doc -252 - 201119673 之存在、量或濃度’其中至少一種捕捉劑及/或至少一種 4貞測劑為該至少一種結合蛋白。或者，該方法可包含⑴使 測試樣品與至少一種結合至抗原（或其片段）上之抗原決定 基的捕捉劑接觸，從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合 物’且同時或依序（以任何順序），使測試樣品與可與測試 樣品中之任何抗原（或其片段）競爭結合至該至少一種捕捉 «1的"T偵測標§己之抗原（或其片段）接觸，其中測試樣品中 存在之任何抗原（或其片段）與可偵測標記之抗原彼此競 爭’分別形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物及捕捉劑/可 偵測標記之抗原（或其片段）複合物，及（u)基於（丨丨）中形成 之捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合物中的可偵測 標記產生之信號測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存 在、量或濃度，其中至少一種捕捉劑為該至少一種結合蛋 白，且其中捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合物中 之可偵測標記產生之信號與抗原（或其片段）於測試樣品中 之里或/辰度成反比。若測試樣品係來自患者，則該方法可 進一步包含對患者進行診斷、預測或評定其治療性/預防 性處理之功效。若該方法進一步包含評定患者之治療性/ 預防性處理之功效，則該方法視情況進一步包含根據需要 改變患者之治療性/預防性處理以改良功效。該方法可經 改進用於自動化系統或半自動化系統中。 提供另一測定抗原（或其片段）於測試樣品令之存在、量 或濃度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定測試樣品 之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴採用至少一種可結合兩個 150428.doc -253 - 201119673 抗原之DVD-Ig及至少-種可偵測標記，及（η)包含將可僧 ㈣記產生的作為抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、 量或濃度之直接或間接指示的信號與所產生之作為抗原 (或其片段）於對照組或校正劑中之存在、量或濃度之直接 或間接指示的信號作比較。校正劑視情況為—系列校正劑 的-部分’在該系列校正劑中，純正劑與系列中其他校 正劑之抗原（或其片段）之濃度不同。至少一種DvD ig中之
一者（丨’）包含四個多肽鏈，其中第一多肽鏈及第三多肽鏈 包含第一 vm-(xl)n_VD2_c_(X2)n，其巾VDi為自第一親 本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一重鏈可變域，vD2 為自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其 抗原結合部分）獲得之第二重鏈可變域，c為重鏈恆定域， (Xl)n為視情況存在之連接子，且存在時不為chi，且
(X2)n為視情況存在之以區，且其中第二多肽鏈及第四多 肽鏈包含第二VD1_(X1)n心(χ2)η，其"⑴為自第 一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一輕鏈可變域， VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或 其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變域，C為輕鏈恆定 域，（Xl)n為視情況存在之連接子，且存在時不為chi，且 (X2)n為視情況存在之以區，及（H，）可結合兩個抗原（或其 片段）。該方法可包含⑴使測試樣品與至少一種結合至抗 原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接觸，從而形成捕 捉劑/抗原（或其片段）複合物，（Π)使捕捉劑/抗原（或其片 段）複合物與至少一種包含可偵測標記且結合至捕捉劑未 150428.doc • 254 · 201119673 、。口之抗原(或其片段)上的抗原決定基之偵測劑接觸，形 成捕捉月1 /抗原（或其片段㈣測劑複合物，及（出）基於⑴) 中幵/成之捕捉劑/抗原(或其片段"偵測劑複合物中之可偵 測標=產生的信!虎測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存 在里或/辰度，其中至少一種捕捉劑及/或至少一種偵測 4為.亥至）-種DVD_Ig。或者，該方法可包含⑴使測試 樣品與至少一種結合至抗原（或其片段）上之抗原決定基的 • #捉劑接觸’從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，且 同時或依續（以任何順序），使測試樣品與可與測試樣品中 之任何抗原（或其片段）競爭結合至該至少-種捕捉劑的可 偵測‘。己之抗原（或其片段）接觸，其中測試樣品中存在之 任何抗原（或其片段）與可偵測標記之抗原彼此競爭分別 形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物及捕捉劑/可偵測標記 之抗原（或其片段）複合物，及⑴）基於（Π)中形成之捕捉劑/ 可偵測橾s己之抗原（或其片段）複合物中的可偵測標記產生 • 之信號測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量或濃 度，其中至少一種捕捉劑為該至少一種DVD_Ig，且其中 捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合物中之可偵測標 記產生之信號與抗原（或其片段）於測試樣品中之量或濃度 成反比。若測試樣品係來自患者，則該方法可進一步包含 對患者進行診斷、預測或評估其治療性/預防性處理之功 效。若該方法進一步包含評定患者之治療性/預防性處理 之功效，則該方法視情況進一步包含根據需要改變患者之 治療性/預防性處理以改良功效。該方法可經改進用於自 150428.doc -255 - 201119673 動化系統或半自動化系統中。 關於檢定方法（及其套組），可使用可購得之抗分析物抗 體或如文獻中所述製造抗分析物之方法。各種抗體之供應 商包括（但不限於）Santa Cruz Biotechn〇i〇gy inc
Cruz，CA)、GenWay Biotech，Inc 叫队 ca)及
Systems (RDS; Minneapolis, MN)。 一般而言可使用預定含量作為評估檢定測試樣品之分析 物或”片·Μ例如用於偵測疾病或疾病風
基準。-般而言，在進行該種比較中，藉由在適二 進行特定檢U夠多讀來料預定含量，使得可建立分 析物存在、量或濃度與疾病 '病症或病狀之特定階段或二 點或與特定臨床指標之關聯或聯繫。通常，藉由檢定 個體（或健之群體）獲得職含量。所量測之分析物可包 括其片段、其降解產物及/或其酶裂解產物。 特疋5之’關於用於監測疾病進展及/或治療之預定含 量’分析物或其片段之量或濃度可「
「有利地改變」)或「不利」（「不利地改變」)有「:」;或 =:加」係指測試樣品中之量或濃度高於典型或正常‘ 里或祀圍(例如預定含量)’或高於另一參考含或 如初期或基線樣品)。術語「降低」或「減少：:圍⑽ 樣品中之量或濃度低於典型」’'曰/貝1 °式 含量），或低於另-灸考人曰^ 3里或關（例如預定 品術任「改Γ / 置或耗圍（例如初期或基線樣 )^改邊」係指樣品中之量或濃度 低）超出典型或正常含旦弋r 又（曰加或降 3里或I已圍（例如預定含量）或超出另一 150428.doc -256- 201119673 參考含2：或範圍（例如初期或基線樣品）。 刀析物之典型或正常含量或範圍係根據標準操作來定 義。由於分析物含量在一些情形下極低，所以當與典型或 瘍3 1或範圍，或參考含量或範圍相比在任何淨變化不 由貫驗誤差或樣品差異解釋時，可認為已發生所謂之改 3C之含置或改變。因此，將在特定樣品中所量測之含量與 在來自所謂正常個體之類似樣品中所測定之含量或含量範 圍相比較。在此上下文巾，舉例而言，「正常個體」為無 y偵’則疾病之個體’·且例如「正常」（有時稱作「對照」） 患者或群體分別為*展現可錢疾病之患者或群體。此 外，假定在大部分人類群體中通常未發現高含量之分析 物：則「正常個體」可視作分析物之量或濃度無實質可偵 k加或升咼之個體，且「正常」（有時稱作「對照」）患 者或群體為展現分析物之量或濃度無實質可偏測增加或升 高的患者或群體。「表面上正常之個體」W未評估分析 物或當前正評估分析物之個體。當分析物通常為不可偵測 、^ ^ 士正* 3里為零，或處於正常群體之約25%至約750/〇 範圍内）’但在蜊試樣品中偵測到分析物時，以及當分 析物以高於E赍人θ 田 、 3置之量存在於測試樣品中時，認為分析 物之含I Γ斗古 广^ 幵间」。因此，本發明尤其提供篩選罹患特定 疾病、病症或病狀或右 之個體的方法。卜Γ 或病狀之風險 似物。 檢疋方法亦可涉及檢定其他標記物及其類 因此，太立所；+、1 否罹患既定 迷之方法亦可用於確定個體是 150428.doc -257- 201119673 疾病、病症或病狀或有產生既定 險。特定言之，該方法可包八又疾病、病症或病狀之風 3彳下步驟. (a) 測定來自個體之測試樣品中八 或量（例如使用本文所述之方习斤物（或其片段）之濃度 法）；及 '或此項技術中已知之方 (b) 將步驟（a)中測定之分析物 定含量相比較，其中若步驟⑷/、片段）之漠度或量與預 量相對於敎含量而言為有利的分析物之濃度或 广广 广产斗、 、 則確定個體未罹患既定 ^妙而既义疾病、病症或病狀之風 — 之刀析物之濃度或量相對於預 疋3里而s為不利的’則確定個 十一士 疋個體罹患既定疾病、病症或 病狀或有m定疾病、病症或錄之風險。 此外，本讀供監測個體以之疾錢展μ法。該方 法最佳包含以下步驟： ⑷測定來自個體之測試樣品中分析物之濃度或量； (b)測定來自個體之隨後測試樣品中分析物之濃度或 量；及 (c)將如步驟（b)中所測定之分析物之濃度或量與步驟（&) 中所測定之分析物之濃度或量相比較，其中若步驟（b)中所 測疋之濃度或量在與步驟（a)中測定之分析物之濃度或量相 比較時無變化或為不利的’則確定該個體之疾病延續、進 展或惡化。相比而言，若步驟（b)中所測定之分析物之濃度 或里在與步驟（a)中所測疋之分析物之濃度或量相比較時為 有利的’則確定該個體之疾病已中止、消退或改良。 -258- 150428.doc 201119673 該方法視情況進一步包含將步驟（b)中所測定之分析物 之濃度或量與例如預定含量相比較。此外，兮古 唸万法視情况 包含若比較展示步驟（b)中所測定之分析物之濃度或量例如 相對於預定含量存在不利改變，則用一或多種醫藥組合物 治療個體一段時間。 1玉百眾組合 物治療之個體之治療。特定言之，該等方法涉及自個體獲 得第一測試樣品，隨後向個體投與一或多種醫藥組合物p 隨後，測定來自個體之第一測試樣品中分析物之濃度或量 (例如使用本文所述或如此項技術中已知之 / /S' ;。任剛定 分析物之濃度或量後，接著視情況將分析物之濃度或量與 預定含量相比較。若在第一測試樣品令所測定之分析= 濃度或量低於預定含量，則不用一或多種醫藥組合物 個體。然而，若在第一測試樣品中所測定之分析物之濃度 f量高於預；t含量’則用—或多種醫藥組合物治療個體: 奴時間。以-或多種醫藥組合物治療個體之時段可由 此項技術者來決定（例如該時段可為約7天至約 較= 為约14天至約！年）。 佳 2以-或^種醫藥組合物治療過程期間，接著自個體獲 付—及後續之測試樣品。測試樣品之數目及自個體獲得 该專測試樣品之時間並非關鍵所在。舉例而言，可在第— 次向個體投盥一式之&紋^ 〇 '、次夕種4樂組合物後7天獲得第二測試樣 口口 ’可在第一次向個體於盘 ^ ^咕一 U體技與一或多種醫藥組合物後2週獲 測試樣品，可在第-次向個體投與一或多種醫藥組 150428.doc -259- 201119673 合物後3週獲得第四測試樣品， 、 可在第一次向個體投與一 或多種醫藥組合物後4週獲得第五測試樣品等。 在自個體獲得各第二#你@ 或後續之測試樣品後，測定第二或 後續之測s式樣品中分析物之遺p θ , 1奶< /辰度或量（例如使用本文所述 或如此項技術中已知之方半 法）°接耆將在各第二及後續測 試樣品中所測定之分析物之濃度或量與在第—測試樣品 (例如最初視情況與預定会吾 頂疋3里相比較之測試樣品）中所測定 之分析物之濃度或量相比較。 右步驟（C)中所測定之分析物 之濃度或量在與步驟⑷中所測定之分析物之濃度或量相比 較時為有利的’則確定個體之疾病已中止、消退或改良， 且錢續向該個體投與步驟（b)之—或多種醫藥組合物。然 、^驟（e)巾所’収之濃度或量在與步驟⑷中所測定 之分析物之濃度或量相比較時無變化或為不利的則確定 個體之疾錢續、進展或惡化，且應以較高濃度之-或多 種在步驟⑻中向個體投與之醫㈣合物治療該個體或應以 -或多種不同於步驟（b)中向個體投與之—或多種醫藥組合 物的醫藥組合物治療該個體。特定言…用一或多種不 同於該個體先前所接受之-或多種醫藥組合物的醫藥組合 物j治療個體以減少或降低該個體之分析物含量。 、Γ般而言、，對於可能進行重複測試之檢定(例如監測疾 :進展及/或對冶療之反應)’在已自個體獲得第一測試樣 後&時間内獲传第二或後續測試樣品。特定言之可 在已自個體獲得第—測試樣品後數分鐘、數小時、數天、 數週或數年後獲得來自個體之第二測試樣品。舉例而言， 150428.doc 201119673 可在自個體獲得第—測試樣品後約1分鐘、約5分鐘、約10 分鐘、約1 5分鐘、約3 〇分鐘、約4 5分鐘、約6 〇分鐘、約2 小 時 ·> 約3小時 、約4小時 、約5小時、約6 + >時、約7小 時 、 約 8小時、 約9小時、 约10小時 、約11小 時、約12小 時 \ 約 1 3小時、 約14小時、 約1 5小時 、約16小 時、約17小 時 、 約 1 8小時、 約19小時、 約20小時 、約21小 時、約22小 時 > 約 23小時、 約24小時 、約2天、 約3天、 約4天、約5 天 約 6天、約7天、約2週 、約3週、 約4週、 約5週、約6 週 約 7週、約8週、約9週 、約10週 、約11週 、約12週、 約 13週 、約14週 、約15週、 約16週、 約17週、 約1 8週、約
19週、約20週、約21週、約22週、約23週、約24週、約25 週、約26週、約27週、約28週、約29週、約30週、約31 週、約32週、約33週、約34週、約35週、約36週、約37 週、約38週、約39週、約40週、約41週、約42週 '約43 週、約44週、約45週、約46週、約47週、約48週、約49 週、約50週、約51週、約52週、約15年、約2年、約2 5 年、約3.0年、約3.5年、約4·〇年、約4 5年、約5 〇年、約 5.5.年、約6.〇年、約6·5年、約7 〇年、約7 5年、約8 〇年、 約8.5年、約9.〇年、約9.5年或約1()()年之時段自個體獲得 第二測試樣品。 當上述檢定用於監測疾病進展時，可使用上述檢定來監 測罹患急性病狀之個體之疾病進展。急性病狀亦稱作嚴重 護理病狀，其係指危及生命之急性疾病或其他嚴重醫學病 狀’涉及例如心血管系統或排泄系統。嚴重護理病狀通常 150428.doc •261 - 201119673 係指需要在醫院機構（包括（但不限於）急救室、加護病房、 創傷中心或其他急救護理機構）中進行急性醫藥介入或由 護理人員或其他領域之醫務人員進行投藥的病狀。對於嚴 重護理病狀，一般在較短時間範圍内重複監測，即數分 鐘、數小時或數天（例如約丨分鐘、約5分鐘、約1〇分鐘、 約B分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約6〇分鐘、約2小時、 約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約蚪 時、約9小時、約1〇小時、約u小時、約12小時、約叫、 時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約… 時、約19小時、約20小時、約21小時、約^小時、約2 = 時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或 =天），且初始檢定同樣-般在疾病或絲發作之較 間範圍内，例如約數分鐘、數小時或數天内進行。 該等檢定料歸監藝患慢'1 切純錄之個體之 疾病進展。非嚴重護理或非急性病 例狀係私除危及生命之各 性疾病及其他嚴重醫學病狀(涉及例如心血管系統及 =糸統）以外的錢。非急性病狀通f包括具有較 k性持續時間之病狀。對於非急性病狀，—& ' 範圍内進行重複監測，例如數小時 奴在較長時間 致天、數週、數月十 數年（例如約1小時、約2小時、約3小 月或 J時 '約4小時、約5 時、約M、時、約7小時、約8小時、 、小 ,A11，士 、、勺9小時、約10小時、 約11小時、約12小時、約13小時、 奶士 、、勺14小時、約15小時'
約16小時、約17小時、約18小時、 T ^… 小時、約20小時、 約21小時、約22小時、約23小時、 Τ 于、·，勺24小時、約 150428.doc •262 · 201119673 天、約4天、約5天、約6天、約7天 '約2週、約3週、約4 週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約1〇週、約 11週、約1 2週、約13週、約丨4週、約1 5週、約1 6週、約1 7
週、约18週、約19週、約2〇週、約21週、約22週、約23 週、約24週、約25週、約26週、約27週、約“週、約29 週、約30週、約31週、約32週、約33週、約“週、约％ 週、約36週、約37週、約38週、約”週、約仆週、約41 週、約42週、約43週、約44週、約化週、約牝週、約47 週、約48週、約49週、約50週、約51週、約52週、約i 5 年、約2年、約2.5年、約3.〇年、約3 5年、約4 〇年、約4 5 年、約5.G年、約5.5.年、約6.〇年、約6 5年、約7 Q年約 7.5年、約8·〇年、約8.5年、約9.〇年、約9.5年或約1〇.〇 年），且初始檢定同樣一般在疾病或病狀發作之較長時間 範圍内，例如約數小時、數天、數月或數年内進行。 此外，可使用自個體獲得之第一測試樣品進行上述檢 定’其中該第-測試樣品係得自一種來源，諸如尿液、金 清或血漿。接著可視情況使用自個體獲得之第二測試樣品 重複上述檢定，其申該第二測試樣品係得自另一來源。舉 例而言，若第一測試樣品係自尿液獲得，貝,丨第二測試樣: 可自血清或血聚獲得。彳比較使用帛—測試樣品與第= 試樣品之檢定獲得之結果。該比較可用於評估個體之疾病 或病狀之狀態。 、’ 此外，本發明亦關於確定易患或罹患既定疾 Ϊ、7丙症或 病狀之個體是否將得益於治療之方法。特 。,本發明 150428.doc -263- 201119673 係關於分析物相伴診斷方法及產物。因此，如 皿測對個體之m療」之方法最佳另外選 或鑑別用於治療之候選者。 ㈡盘、擇 纟特疋實施例中，本發明亦提供確定罹患既定疾 ==或具有羅患既定疾病、病症或病狀之風險 療之候選者的方法。-般而言，個體 斷罹：：：疾病、病症或病狀之一些症狀或實際上已經診 -疋疾病、病症或病狀或有罹患既定疾病、病症或 病狀之風險的個II · g ㈣體’及/或如本文所述表現不利濃度 之为析物或其片段的個體。 该方法視情況包含如本文所述之檢定，其中在用 種醫藥組合物（例如十、甘Λ i 一 L /、用與涉及分析物之作用機制相關 之樂物免疫抑制治療或藉由免疫吸㈣療來 體之前及之後評估分析物，或其中在U療後評估分析物 且將分析物之濃度或量與預定含量相比較。在治療 測到之不利濃度或量之分析物確定該個體不會得益於接受 進步或繼續治療，而在治療後觀測到之有利濃度或量之 t析物確定該個體會得Μ接受進-步或繼續治療。此確 疋有助於f理臨床研究且提供改良之患者護理。 不言而喻，雖然本文之某些實施例在用於評估如本文所 述之既m病症或絲時為有益的，但可制檢定及 套組來評估其他疾病'病症及病狀中之分析物。檢定方法 亦可涉及檢定其他標記物及其類似者。 檢定方法亦可用於鑑別改善既^疾病、病症或病狀之化 150428.doc .264· 201119673 合物。舉例而言，可使表現分析物之細胞與候選化合物接 觸。可使用本文所述之檢定方法將與化合物接觸之細胞中 分析物之表現含量與對照細胞中之分析物表現含量相比 較。 B.套組 亦k供檢定測試樣品之分析物（或其片段）於測試樣品中 之存在 里或;1辰度之套組。該套組包含至少一種檢定測試 樣品之分析物（或其片段）之組分及檢定測試樣品之分析物 (或其片段）的說明書。至少一種檢定測試樣品之分析物（或 其片段）之組分可包括包含視情況固定於固相上之如本文 所揭不之結合蛋白及/或抗分析物DVD-Ig(或其片段、變異 體或變異體之片段）的組合物。 套組可包含至少一種藉由免疫檢定（例如化學發光微粒 免疫檢定）檢定測試樣品之分析物的組分及藉由免疫檢定 (例如化學發光微粒免疫檢定）檢定測試樣品之分析物的說 月曰舉例而§，套組可包含分析物之至少一種特異性结 合搭配物，諸如抗分析物單株/多株抗體（或其可結合至分 析物之片段，其可結合至分析物之變異體，或可結合至分 析物之變異體片段）、如本文所揭示之結合蛋白、或抗分 析物DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體片段），其任—者 句可、’歪可偵測;^ §己。或者或另外’套組可包含經可偵測標 己之刀析物(或其可結合至抗分析物單株，多株抗體、如本 文所揭不之結合蛋白、或抗分析物DVD-Ig(或其片段、變 H異體片段）之片段），其可與測試樣品中之任何分 150428.doc •265· 201119673 析物競爭結合於抗分析物單株/多株抗體 =其可結合至分析物之變異體，或可 文共肢片奴）、如本文所揭示之結合蛋白 析物DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體片段），其任一刀 可固定於固體支揮物上。套組可包含校正劑或對照物： 如經分離或純化之分析物。套組可包含至少—種」 檢定之容器（例如管、微量滴定板或條帶，其可能例如: 塗有第-特異性結合搭配物)；及/或緩衝液，諸如 衝液或洗㈣衝液，其任—者可以濃縮溶液之形式提供緩 可偵測標記(例如酶標記)之受質溶液；或停止溶液。套纽 較佳包含進行檢定所必需之所有組分，亦即試劑、標準 物、緩衝液、稀釋劑等。說明書可為紙張形式或電腦可讀 之形式，諸如磁碟、CD、DVD或其類似物。 月 更特定言之，提供用於檢定測試樣品之抗原（或其片段） 之套組。套組包含至少一種用於檢定測試樣品之抗原（或 其片段）的組分及檢定測試樣品之抗原（或其片段）之說明 書，其中該至少一種組分包括至少一種包含結合蛋白之組 合物’該結合蛋白（i，）包含多肽鏈，其包含vm_(xi)n_ VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合 部分）獲得之第一重鏈可變域，VD2為自可與第一親本抗體 相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第 二重鏈可變域，C為重鏈恆定域，（χ1)η為視情況存在之連 接子，且存在時不為CH1 ’且（Χ2)η為視情況存在之fc區， 及（ii1)可結合一對抗原，其中結合蛋白視情況經可偵測標 150428.doc •266- 201119673 記。 另外提供檢定測試樣品之抗原（或其片段）之另一套組。 套組包含至少一種用於檢定測試樣品之抗原（或其片段）的 組分及檢定測試樣品之抗原（或其片段）之說明書，其中該 至 >、一種組分包括至少一種包含結合蛋白之組合物，該結 合蛋白（i·)包含多肽鏈，其包含VDl-(Xi)n_VD2-C-(X2)n , 其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第 φ 一輕鏈可變域，VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的 第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變 域’ C為輕鏈恆定域’（χι)η為視情況存在之連接子且存 在時不為CH1，且（Χ2)η為視情況存在之以區，及（η，）可結 合一對抗原，其中結合蛋白視情況經可偵測標記。 另外提供檢定測試樣品之抗原（或其片段）之另一套組。 套組包含至少一種檢定測試樣品之抗原（或其片段）的組分 及檢疋測試樣品之抗原（或其片段）之說明書，其中該至少 • 一種組分包括至少一種包含結合蛋白之組合物，該結合蛋 白（i’）包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包 含第一 VDl-(Xl)n_VD2_C_(X2)n，其中VD1為自第一親本 抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一重鏈可變域，為 自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗 原結合部分）獲得之第二重鏈可變域，c為重鏈恒定域， (Xl)n為視情況存在之連接子，且存在時不為匚⑴，且 (X2)n為視情況存在之^區，且其中該第二多肽鏈包含第 二VDl-(Xl)n_VD2_c_(x2)n，其中VD1為自第—親本抗體 150428.doc -267- 201119673 (或其抗原結合部分）獲得之第一輕鏈可變域，VD2為自可 與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結 合部分）獲得之第二輕鏈可變域，C為輕鏈恆定域，（χηη 為視情況存在之連接子，且存在時不為CH1，且（Χ2)η為視 情況存在之Fc區’及（ii’）可結合一對抗原，其中結合蛋白 視情況經可偵測標記。 另外提供另一檢定測試樣品之抗原（或其片段）之套組。 套組包含至少一種檢定測試樣品之抗原（或其片段）的組分 及檢定測試樣品之抗原（或其片段）之說明書，其中該至少 一種組分包括至少一種包含DVD-Ig之組合物，該DVD-Ig(i')包含四個多肽鏈’其中第一及第三多肽鏈包含第一 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或 其抗原結合部分）獲得之第一重鏈可變域，VD2為自可與第 一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部 分）獲得之第二重鏈可變域，C為重鏈恆定域，（χι)η為可 視情況存在之連接子，且存在時不為CH1，且（χ2)η為視情 況存在之Fc區，且其中第二及第四多肽鏈包含第二VDl_ (Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或其抗 原結合部分）獲得之第—輕鏈可變域，VD2為自可與第一親 本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲 得之第二輕鏈可變域，輕鏈恆定域，（χι)η為視情況存 在之連接子，且存在時不為CH1，且（χ2)η為視情況存在之 Fc區，及（ii’）可結合兩個抗原（或其片段），其中1^〇_1^視 情況經可偵測標記。 150428.doc -268· 201119673 人任何抗體（諸如抗分析物抗體）、任何如本文所揭示之結 σ蛋白、任何抗分析物DVD Ig或示蹤劑可併有如本文所述 可偵測軚§己，諸如螢光團、放射性部分、酶、生物素/抗 生物素蛋白標記、發色團、化學發光標記或其類似者，或 套組可包括用於進行可伯測標記之試劑。抗體、校正劑及/ 或對…、物可提供於各別容器中或預先分配於適合之檢定形 式中’例如預先分配於微量滴定板中。 φ 套組視情況包括品質控制組分（例如靈敏度組、校正劑 及陽性對照）。品質控制試劑之製備為此項技術中所熟知 杬述於夕種免疫诊斷產品之說明書上。視情況使用靈敏 又且成員建立檢定效能特徵，且進一步視情況為免疫檢定 套組試劑之完整性及檢定標準化的適用指標。 套組亦可視情況包括其他進行診斷檢定或有助於品質控 制#價所需之試劑，諸如緩衝液、鹽、酶、酶輔因子、酶 文質、债測試劑及其類似物。套組中亦可包括其他組分， • 諸如緩衝液及用於分離及/或處理測試樣品之溶液（例如預 處理s式劑)。套組可另外包括一或多種其他對照物。套組 之一或多個組分可經;東乾，在該情形下，套組可進一步包 含適於復原；東乾組分之試劑。 套組之各種組分根據需要視情況提供於適合容器中，例 如微量滴定板。套組可進一步包括容納或儲存樣品之容器 (例如尿液樣品之容器或E)。適當時，套組視情況亦可含 有反應容器、混合容器及有助於製備試劑或測試樣品之其 他組分。套組亦可包括—或多種協助獲得測試樣品之儀 150428.doc -269- 201119673 器堵如/主射器、吸液管、钳子、量匙（measured spoon) 或其類似物。 右可彳貞測標§己為至少—種吖啶鏽化合物，則套組可包含 至夕種吖啶鏽-9-甲醯胺、至少一種吖啶鏽_9_曱酸芳酯 或八任何組合。右可偵測標記為至少一種吖啶鏽化合物， 則套組亦可包含過氧化氫之來源，諸如緩衝液、溶液及/ 或至J 一種鹼性溶液。必要時，套組可含有固相諸如磁 养子珠粒武官、微量滴定板、光析管、膜、骨架分 子、薄膜、濾紙、圓盤或晶片。 C.套組及方法之改進 藉由如本文所述之檢定（諸如免疫檢定）測定分析物於測 «式樣中之存在、里或濃度的套組（或其組分）以及方法可 ㈣進Μ於例如美國專利第5，G89,424號及第5，嶋，3〇9號 中所述且例如由Abbott Lab〇m〇ries(Abb〇tt以让化）以 廳祖们⑧出售之多種自動及半自動系統（包括固相包 含微粒之系統）中。 自動或半自動系統相較於非自動系統(例如EusA)的一 些差異包括連接有第一特異性結合搭配物(例如抗分析物 單株/多株抗體（或其片段、其變異體或其變異體片段）、如 本文所揭不之結合蛋白、或抗分析物DVD·!以或其片段、 其變異體或其變異體片段），任-方式皆可影響夹心形成 及分析物反應性）之受質；以及捕捉、偵測及/或任何視情 況存在之洗務步驟的時間長短及時序。儘管非自動形式 (諸如題A)可能需要與樣品與捕捉試劑一起培育相對較 150428.doc •270· 201119673 長時間（例如約2小時），但自動或半自動形式（例如 ARCHITECT®，Abbott Laboratories)可能具有相對較短之 培育時間（例如對於ARCHITECT® ’為約18分鐘）°類似 地，非自動形式（諸如ELISA)可培育偵測抗體（諸如接合物 試劑）歷時相對較長之培育時間（例如約2小時）’但自動或 半自動形式（例如ARCHITECT®)可能具有相對較短之培育 時間（例如對於ARCHITECT®，為約4分鐘）。 可自Abbott Laboratories獲得之其他平台包括（但不限 於）AxSYM®、IMx®(參看例如美國專利第5,294,404號）、 PRISM®、EIA(珠粒）及Quantum™ II以及其他平台。另 外，檢定、套組及套組組分可以其他形式使用’例如用於 電化學或其他掌上型或即時（point-of-care)檢定糸統。本發 明例如適用於執行夾心免疫檢定之商業Abbott Point of Care(i-STAT®，Abbott Laboratories)電化學免疫檢定系統 ° 免疫感應器及其製造方法及在單次用測試裝置中操作之方 法例如描述於美國專利第5,063,081號；第7,419,821號及第 7,6 82,833號；及美國專利公開案第20040018577號及第 20060160164號中。 詳言之，就改進分析物檢定以適合I-STAT®系統而言， 以下組態較佳。製造具有一對電流分析金工作電極及銀-氣化銀參考電極的微加工之矽晶片。在一個工作電極上， 將具有固定之抗分析物單株/多株抗體（或其片段、其變異 體或其變異體片段）、如本文所揭示之結合蛋白、或抗分 析物DVD-Ig(或其片段、其變異體或其變異體片段）之聚苯 150428.doc -271 - 201119673 乙烯珠粒（0.2 mm直徑）黏附於電極上經圖案化之聚乙烯醇 之聚合物塗層上。將此 流體形式I-STAT® 1£中 部分上，存在包合斟公 晶片組裝至具有適用於免疫檢定之 。在該匣之容納樣品之腔室壁的一 4刀上存在包含對分析物具特異性之結合搭配物（諸如 抗分析物單株/多株抗體（或其可結合分析物之片段、其變 異體或其變異體片段）、如本文所揭示之結合蛋白或抗分 析物DVD-Ig(或其可結合分析物之片段、其變異體或其變 異體片段），其任一者皆可經可偵測標記）之層。在該匣之 流體囊内為包括對胺基苯酚磷酸酯之水性試劑。 在操作中，將懷疑含有分析物之樣品添加至測試匡之容 納腔室中，且將匣插入LSTAT⑧讀取器中。在對分析物具 特異性之結合搭配物溶解於樣品中之後，職内之系元件 迫使樣品進人含有晶片之管道中。此時，將其振堡以促進 形成夾心。在檢定之倒數第二個步驟中，迫使流體自流體 囊流出且進入管道中以將樣品自晶片洗去且進入廢料腔室 中。在檢定之最終步驟中，鹼性磷酸酶標記與對胺基苯酚 磷酸酯反應以裂解磷酸酯基且使所釋放之對胺基苯酚在工 作電極處被電化學氧化。基於所量測之電流，讀取器能夠 藉助於嵌入算法及工廠確定之校正曲線來計算樣品中分析
例如用於洗滌、用作接合物稀釋劑、微粒稀釋劑及/或用 150428.doc -272- 201119673 作扠正劑稀釋劑的緩衝液。例示性接合物稀釋劑為某此套 組（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)中所用且含有 2 (N-嗎啉基）乙烷磺酸（MES)、鹽、蛋白質阻斷劑、抗微生 物劑及清潔劑之ARCHITECT®接合物稀釋劑。例示性校正 劑稀釋劑為某些套組（Abbott Lab〇rat〇ries, Abb〇tt 江） 中所用之ARCHITECT®人類校正劑稀釋劑，其包含含有 MES、其他鹽、蛋白質阻斷劑及抗微生物劑之緩衝液。另 外，如2008年12月31曰申請之美國專利申請案第 61/142,048號中所述，可例如在^如砸形式中使用連接 於信號抗體之核酸序列作為信號放大物獲得改良之信號產 生0 範例 熟習此項技術者應顯而易見，本文所述之方法的其他適 合之修改及改進為顯而易見的且可在不背離本發明或本文 所揭不之實施例所主張的範疇下使用適合之等效形式來進 仃。現已詳細描述本發明，參考以下實例將更清楚理解本 發月。亥#貫例僅出於說明之目的包括在内且+欲限制本 發明。 實例1 : DVD-Ig之設計、建構及分析 實例hi.用於鑑別及表徵親本抗體及DVD-Ig之檢定 除非另外說明’否則實例全文中使用以下檢定鑑別及表 徵親本抗體及DVD-Ig。 實例1.1.1 .用於測定親本抗體及DVD ig針對其標靶抗原 之結合及親和力之檢定 150428.doc - 273 - 201119673
實例1.1.1A:直接結合ELISA 篩選結合所需標靶抗原之抗體的酶聯免疫吸附檢定係如 下進行。在4°C下，以每孔100 pL含10 pg/ml所需標靶抗原 (R&D Systems, Minneapolis, MN)或所需標把抗原胞外域/Fc 融合蛋白（R&D Systems，Minneapolis, MN)或單株小鼠抗聚 組胺酸抗體（R&D Systems # MAB050，Minneapolis，MN)之 石||酸鹽缓衝生理食鹽水（10X PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, ΜΑ)塗覆高度結 合ELISA 板（Corning Costar # 3369，Acton, MA)隔夜。以含 有0.02% Tween20之PBS洗滌板四次。在室溫下，藉由添加 每孔300 μί阻斷溶液（在PBS中稀釋至2%的脫脂奶粉（nonfat dry milk powder)， 多個零售供應商）阻斷板歷時 1/2小 時。在阻斷後，以含有0.02% Tween 20之PBS洗滌板四次。 或者，向如上文所述塗覆有單株小鼠抗聚組胺酸抗體之 ELISA板中添加每孔100 μί 10 gg/ml組胺酸（His)標記之所 需標把抗原（R&D Systems，Minneapolis，MN)，且在室溫下 培育1小時。以含有0.02% Tween 20之PBS洗滌各孔四次。 向如上文所述製備之所需標靶抗原板或所需標靶抗原/ FC融合板或抗聚組胺酸抗體/His標記之所需標靶抗原板中 添加100 μΐ在如上文所述之阻斷溶液中稀釋之抗體或DVD-Ig製劑，且在室溫下培育1小時。以含有0.02% Tween 20之 PBS洗滌各孔四次。 向所需標靶抗原板或抗聚組胺酸抗體/組胺酸標記之所 需標靶抗原板的各孔中添加100 μι 10 ng/mL山羊抗人類 150428.doc •274- 201119673
IgG -FC特異性 HRP結合抗體（Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL)。或者，向所需標革巴抗原/FC融合板之各 孔中添加1 00 μΐ^ 1 0 ng/mL山羊抗人類IgG -κ輕鏈特異性 HRP 結合抗體（Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL)，且在室溫下培育1小時。以含有0.02% Tween 20之 PBS洗滌板4次。 向各孔中添加1 〇〇 pL增強之TMB溶液（Neogen Corp. #308177，K Blue, Lexington, KY)，且在室溫下培育 10 分 鐘。藉由添加50 pL 1 Ν硫酸停止反應。在450 nm之波長下 以分光光度法對板讀數。 有時在直接結合ELIS A中觀測不到結合，此可能因為在 塗覆於塑膠表面時，標靶抗原上之抗體結合位點「被遮 蔽」或抗原「變形」。DVD-Ig不能結合其標靶亦可能由於 直接結合ELISA形式對DVD-Ig施加之空間限制。在直接結 合ELISA形式中不結合之親本抗體及DVD-Ig可在其他 ELISA形式（諸如FACS、Biacore或生物檢定）中結合至標靶 抗原。亦可藉由調整DVD-Ig之兩個可變域之間的連接子 長度來修復DVD-Ig之不結合。
實例 1.1.1.B :捕捉 ELISA ELISA板（Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)與抗人類 Fc抗 體（PBS 中 5 pg/ml, Jackson Immunoresearch，West Grove, PA) —起在4°C下培育隔夜。在洗滌緩衝液（含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌板3次，且在25°C下在阻斷緩衝液 (含有1% BSA之PBS)中阻斷1小時。洗滌各孔3次，且向各 150428.doc - 275 - 201119673 孔中添加各抗體或DVD-Ig於含有0.1% BSA之PBS中的連續 稀釋液，且在25°C下培育1小時。洗滌各孔3次，且向板中 添加經生物素標記之抗原（2 nM)，且在25°C下培育1小時。 洗滌各孔3次，且接著在25°C下與抗生蛋白鏈菌素-HRP (KPL #474-3000，Gaithersburg, MD)— 起培育 1小時。洗蘇 各孔 3次，且每孔添加 100 μΐ ULTRA-TMB ELISA(Pierce， Rockford，IL)。顯色後，以1 N HCL停止反應且量測450 nM下之吸光度。 實例1.1.1.C :使用BIACORE技術之親和力測定 BIACORE方法： BIACORE檢定（Biacore，Inc，Piscataway，NJ)以結合速率 及解離速率常數之動力學量測測定抗體或DVD-Ig之親和 力。在25 C下，藉由基於表面電毀共振之量測以Biacore® 1000或 3000儀器（Biacore® AB，Uppsala，Sweden)使用流動 HBS-EP(10 mM HEPES [pH 7.4] > 150 mM NaCl ' 3 mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)測定抗體或DVD-Ig與標起 抗原（例如純化重組標靶抗原）之結合。所有化學品係獲自 Biacore® AB(Uppsala，Sweden)或獲自本文中所述之不同來 源。舉例而言，根據製造商說明書及程序使用標準胺偶合 套組將25 pg/ml於10 mM乙酸納（pH 4.5)中稀釋之約5000 RU山羊抗小鼠IgG(Fcy)片段特異性多株抗體（pierce
Biotechnology Inc，Rockford, IL)直接固定於CM5研究級生 物感測器晶片上。生物感測器表面上之未反應部分以乙醇 胺阻斷。流槽2及4中之經修飾羧曱基聚葡萄糖表面用作反 150428.doc - 276- 201119673 應表面。流槽1及3中不具有山羊抗小鼠IgG之未經修飾之 羧甲基聚葡萄糖用作參考表面。為進行動力學分析，使用 Biaevaluation 4_0.1軟體將自1:1朗繆爾結合模型（ι:ι
Langmuir binding model)導出之速率方程式同時擬合至所 有8次注射之締合相及解離相（使用整體擬合分析）。經純化 抗體或DVD-Ig稀釋於HEPES緩衝生理食鹽水中以於整個山 羊抗小鼠IgG特異性反應表面上捕捉。將待捕捉作為配位 體之抗體或DVD-Ig(25 Kg/ml)以5 μΐ/min之流動速率注射於 反應基質上。在25 μΐ/min之連續流動速率下測定結合及解 離速率常數ΚΜ·Υι)及k^s·1)。速率常數係在1〇_2〇〇 nM 範圍内之不同抗原濃度下進行動力學結合量測而產生。接 著藉由下式由動力學速率常數計算抗體或DVD_Ig與標 靶抗原之間的反應平衡解離常數（M) : KD=kt)ff/k()n。隨時間 變化記錄結合’且計算動力學速率常數。在此檢定中，可 量測到快達ΙΟ6 Μ·、·1之結合速率及慢至10·6 丨之解離速 率。 實例1.1.2 :用於測定親本抗體及DVD-Ig之功能活性的檢定 實例1.1.2.A:細胞激素生物檢定 藉由測定抗體或DVD-Ig之抑制潛力來分析抗細胞激素 或抗生長因子親本抗體或含有抗細胞激素或抗生長因子序 列之DVD-Ig抑制或中和標靶細胞激素或生長因子生物活 性的能力。舉例而言’可使用抗IL-4抗體抑制IL-4介導之 IgE產生的能力。舉例而言，藉由Fjc〇ii_paqUe密度離心， 隨後使用對人類slgD FITC標記之山羊F(ab)2抗體具特異性 150428.doc •277· 201119673 的 MACS 珠粒（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Germany)繼之以抗FITC MACS珠粒磁力分離自外周血液 (各別而言’白血球層）分離未經處理之人類B細胞。在 37°C下在5% C〇2存在下培養10天期間，磁力分選之未經處 理之B細胞在XV15中調整至每毫升3xl05個細胞，且以96 孔板中每孔1 00 μΐ接種於板中心的6 X6陣列中，周圍為以 PBS填充的孔。每種欲測試抗體各製備一個板，各板由未 經誘導對照物及經誘導對照物，以及抗體滴定液之一式五 份重複’各3個扎組成，該等抗體滴定液自7 gg/ml起始且 添加於50 μΐ四倍濃縮之預稀釋液中以3倍稀釋降至29 ng/ml最終濃度。為了誘導IgE產生，向各孔中添加2〇 ng/ml之rhIL-4加0.5 pg/ml最終濃度之抗CD40單株抗體 (Novartis, Basel，Switzerland)(各50 μΐ)，且在培養期結束 時藉由標準夾心式ELISA法測定IgE濃度。 實例1.1.2.B:細胞激素釋放檢定 分析親本抗體或DVD-Ig引起細胞激素釋放之能力。藉 由靜脈牙刺自二名健康供者抽取外周血液，並置於肝素化 真空採血管中。以RpMI_164〇培養基I:5稀釋全血，且以每 孔0.5 mL置於24孔組織培養板中。將抗細胞激素抗體（例 如抗IL-4)稀釋於RPMI-1640中，且以每孔05 m]L置於板 中，獲得200、1〇〇、50、10及1 pg/mL之最終濃度。培養 板中全血之最終稀釋度為1:10。LPS及PHA以2 jig/mL及5 Mg/mL最終濃度添加至各別孔中作為細胞激素釋放之陽性 對照。多株人類IgG用作陰性對照抗體。實驗一式兩份進 150428.doc •278· 201119673 行。將板在37°C下在5% C02下培育。24小時後，各孔之内 容物轉移至試管中，且在1200 i*pm下旋轉5分鐘。收集不 含細胞之上清液，且冷;東用於細胞激素檢定。留在板上及 試管中之細胞以0.5 mL溶胞溶液溶解，且置於-20°C下且解 凍。添加0.5 mL培養基（使體積達到與無細胞之上清液樣 品相同之量），且收集細胞製劑，且冷凍用於細胞激素檢 定。藉由ELISA檢定無細胞之上清液及細胞溶解產物的細 胞激素含量，例如 IL-8、IL-6、IL-Ιβ、IL-1RA或 TNF-α之 含量。 實例1.1.2.C:細胞激素交又反應性研究 分析針對相關細胞激素之抗細胞激素親本抗體或DVD-Ig與其他細胞激素交叉反應的能力。親本抗體或DVD-Ig固 定於Biacore生物感測器基質上。藉由首先以1〇〇 mM N-羥 基丁二醯亞胺（NHS)及400 mM N-乙基-N，-(3-二甲基胺基丙 基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)活化基質上之羧基，使抗人 類Fc mAb經游離胺基共價連接至聚葡萄糖基質。約5〇 濃度為25 pg/mL、稀釋於乙酸鈉中、ρΗ 4.5的各抗體或 DVD-Ig製劑注射至經活化生物感測器上，且蛋白質上之 游離胺直接結合於經_活化叛基。通常，固定5 〇 〇 〇共振單位 (RU)。未反應之基質EDC酿藉由注射1 μ乙醇胺失活。藉 由使用標準胺偶合套組固定人類IgG1/K製備第二流槽作為 參考標準。使用CM生物感測器晶片進行spR量測。將所有 欲在生物感測器表面上分析之抗原於含有〇 〇ι% p2〇之 HBS-EP操作緩衝液中稀釋。 150428.doc -279- 201119673 為了檢驗細胞激素結合特異性’將過量相關細胞激素 (100 nM，例如可溶性重組人類細胞激素）注射至固定抗細 胞激素親本抗體或DVD-Ig之整個生物感測器表面上（5分鐘 接觸時間）。在注射相關細胞激素之前及之後立即使HB S -EP緩衝液單獨流過各流槽。獲取基線值與對應於細胞激素 /主射元成後約3 0秒之點之間的信號淨差表示最終結合值。 此外’反應以共振單位為量度。在觀測到結合作用時，在 注射下一樣品之前，使用i 0 mM HC1使生物感測器基質再 生，或在基質上注射操作缓衝液。亦同時在經固定小鼠 IgGl/K參考表面上注射人類細胞激素（例如江_1〇1、iL-Ιβ、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、il-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、 IL-19、IL-20、IL-22、IL-23、IL-27、TNF-α、TNF-β 及 IFN-γ)以記錄任何非特異性結合背景。藉由製備參考及反 應表面，Biac〇re可自動從反應表面資料減去參考表面資 料’以消除大部分折射率變化及注射雜訊。因此，有可能 確定歸因於抗細胞激素抗體或DVD-Ig結合反應的真結合 反應。 當相關細胞激素注射至整個經固定抗細胞激素抗體上 時，觀測到顯著結合。1〇 mM HC1再生完全移除所有非共 價締合之蛋白質。感測器圖譜檢驗顯示經固定抗細胞激素 抗體或DVD-Ig與可溶性細胞激素之結合有力且穩固。在 用相關細胞激素確認預期結果後，分別針對各抗體或 DVE> Ig測έ式剩餘重組人類細胞激素組。記錄各注射循琿 150428.doc 201119673 曰。〇或未九合細胞激素的抗細胞激素抗體或〇乂〇&之 量使用—個獨立貝驗之結果測定各抗體或DvD_Ig之特 異性概況。選擇與相關細胞激素預期結合且未結合任何其 他細胞激素之抗體或DVD-Ig。 實例1.1.2.D :組織交又反應性 組織交又反應性研究分三個階段進行，卜階段包括32 種組織的冷;東切片，第二階段包括多達38種組織，且第三 φ P皆段包括如下文所述之來自三個不相關成體之其他組織。 研究通常以2個劑量進行。 階段1 :在物鏡上固定人類組織（在屍體解剖或活組織檢 一寺C得之來自一個人類供者之3 2種組織（通常：腎上 腺、胃腸道、前列腺、膀胱、心臟、骨骼肌、血細胞、 腎、皮膚、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾臟、小腦、淋 巴結、睪丸、大腦皮質、卵巢、胸腺、結腸、胰腺、甲狀 腺、内皮、副甲狀腺、輸尿管、眼、垂體、子宮、輸卵管 • 及胎盤））的冷凍切片（約5 Pm)且乾燥。使用抗生物素蛋白_ 生物素系統對組織切片進行過氧化酶染色。 階段2 :在物鏡上固定人類組織（在屍體解剖或活組織檢 查時獲彳于之來自3個不相關成人之3 8種組織（包括腎上腺、 血液、血管、骨髓、小腦、大腦、子宮頸、食道、眼、心 臟、腎、大腸、肝·、肺、淋巴結、乳腺、即巢、輸印管、 胰腺.、副曱狀腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液 腺 '皮膚、小腸、脊髓、脾臟·、胃、橫紋肌、睪丸、胸 腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀胱及子宮））的冷凍切片 150428.doc -281 - 201119673 (約5 μηι)且乾燥。使用抗生物辛 土似I赏臼-生物素系統對組織切 片進行過氧化酶染色。 階段3··在物鏡上固定石蟹獼魅織（在屍體解剖或活植 織檢查時獲得之來自3個不相關成年猴之％種组織（包括腎 上腺、血液、血管、骨髓、小腦、大腦、子宮頸、食道、 眼、心臟、腎、大腸、肝、肺、淋巴結、乳腺、印巢、輸 印管、胰腺、副甲狀腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列 腺、唾液腺、皮膚、小腸、脊髓 '脾臟、胃、橫紋肌、睪 丸胸腺、甲狀腺、爲桃體、輸尿管、膀耽及子宮））的冷 凍切片(約5且乾燥。使用抗生物素蛋白_生物素系統對 組織切片進行過氧化酶染色。 將抗體或DVD-Ig與經生物素標記之二次抗人類igG 一起 培育且形成免疫複合物。將抗體或DVD_Ig之最終濃度為2 Kg/mL及1〇 pg/mL之免疫複合物添加至物鏡上的組織切片 上，且接著使組織切片與抗生物素蛋白_生物素過氧化酶 套組反應30分鐘。隨後，塗覆DAB(3,3，_二胺基聯苯胺）（一 種過氧化酶反應之受質），歷時4分鐘以用於組織染色。使 用抗原-瓊脂糖珠粒作為陽性對照組織切片。標靶抗原及 人類血清阻斷研究用作其他對照。將抗體或DVD_Ig之最 終/辰度為2 pg/mL及1 〇 pg/mL之免疫複合物與標靶抗原（最 終濃度為100 Kg/ml)或人類血清（最終濃度1〇%)一起預培育 3 0女4里’且接著添加至物鏡上之組織切片上且接著使組 織切片與抗生物素蛋白-生物素-過氧化酶套組反應30分 鐘。隨後，塗覆DAB(3,3，-二胺基聯苯胺）（一種過氧化酶反 150428.doc -282· 201119673 應之受質），歷時4分鐘以進行組織染色。 基於所討論之料抗原的已知表現來判斷任何特異性执 色具有預期反應性（例如與抗原表現相符）或非預木 性。針對強度及頻率，對任何經判斷具特異性之染色進二 評分。階段2(人類組織）及階段3(石蟹獼猴組織）:間的:丁 織染色經判斷為類似或不同。 & 實例1.1.2.E:中和甲胺嗓吟 使4T1細胞生長至半匯合密度且使用〇 〇5%胰蛋白酶 (Gibco#25300)收集。以PBS洗滌細胞，計數且以每毫升 2E5個細胞再懸浮於檢定培養基中。將細胞以1〇〇吣之體 積及每孔2E4個細胞接種於％孔板（c〇star#3599)中。在檢 定培養基中將DVD-IgTM及對照IgG稀釋至4倍濃度且進行 1:3倍連續稀釋。在檢定培養基中將甲胺喋呤稀釋至4倍濃 度’直至0.1 μΜ。向接種之細胞中添加5〇 pL 〇乂0-1§1^達 到150 ηΜ-0.0025 nM之最終濃度。向接種之細胞中添加5〇 pL曱胺喋呤達到25 nM MTX之最終濃度。在37°C、5% C〇2下培育各板48小時。為了定量活力，向各孔中添加2〇 μί WST-1試劑（Roche目錄號11644807001)。在檢定條件下 培育各板3.5小時，且在OD 420-600 nm下在Spectromax 190 ELIS A板讀取器上讀數。表3中包括若干檢定之平均 IC50。 150428.doc - 283 - 201119673 表3 :使用MTX親本抗趙及DVD-Ig構築體之曱胺嗓呤中和 檢定 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變域 (VD) C末端可變域 (VD) N末端VDMTX中 和檢定IC50 nM C末端VDMTX中 和檢定IC50 nM AB119 MTX 10.51 DVD1211 EGFR(序列 3) MTX 3.9 DVD1213 Her2(序列 1) MTX 3.9 DVD1217 CD3(序列1) MTX 4.0 來自AB119之C末端位置含有VD之所有DVD-Ig在曱胺喋 吟中和檢定中均顯示中和。 實例1.1.2.F :單株抗體或DVD-Ig在活體外之腫瘤細胞生 長抑制作用。 將20 pL於D-PBS-BSA(具有0.1% BSA之杜爾貝科氏磷酸 鹽緩衝生理食鹽水（Dulbecco's phosphate buffered saline)) 中稀釋之單株抗體或DVD-Ig以200 μί中之0.01 pg/mL -1 00 pg/mL的最終濃度添加至人類腫瘤細胞中。將板在 3 7°C下在含濕氣5% C02氛圍中培育3天。根據製造商說明 書（Promega，Madison, WI)使用MTS試劑定量各孔中之活細 胞數目，以測定腫瘤生長抑制百分比。無抗體處理之孔用 作〇 %抑制之對照組物，而認為無細胞之孔顯示1 〇 〇 %抑 制。 實例1.1.2.G :親本抗體或DVD-Ig抗趙的活體外殺腫瘤作用 可分析結合於腫瘤細胞上之標把抗原的親本抗體或 DVD-Ig之殺腫瘤活性。簡言之’將親本抗體或DVD_Ig於 D-PBS-BSA(具有0.1 % BS A之杜爾貝科氏填酸鹽緩衝生理 150428.doc - 284 - 201119673 食鹽水）中稀釋且以0.01 Kg/mL至100 pg/mL(200 μί)之最終 濃度添加至人類腫瘤細胞中。將板在37°C下在含濕氣5% C02氛圍中培育3天。根據製造商說明書（Promega, Madison, WI)使用MTS試劑定量各孔中之活細胞數目，以測定腫瘤 生長抑制百分比。無抗體處理之孔用作0%抑制之對照 物，而認為無細胞之孔顯示1 00%抑制。
為了評定細胞凋亡，藉由以下方案測定卡斯蛋白酶-3活 化：在室溫下在振盪下，將96孔板中經抗體處理之細胞溶 解於 120 μΐ 1 X溶解緩衝液（1.67 mM Hepes，pH 7.4、7 mM KCU、0.83 mM MgCl2、0.11 mM EDTA、0.11 mM EGTA、 0.57% CHAPS、1 mM DTT、lx蛋白酶抑制劑混合錠劑； 無 EDTA ; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ)中歷時 20 分 鐘。在細胞溶解後，添加80 μΐ卡斯蛋白酶-3反應緩衝液 (48 mM Hepes，pH 7·5、252 mM蔗糖、0.1% CHAPS、4 mM DTT及 20 μΜ Ac-DEVD-AMC受質；Biomol Research Labs, Inc.，Plymouth Meeting, PA)，且將板在 37°C 下培育 2 小時。在1420 VICTOR多標籤計數器（Perkin Elmer Life Sciences, Downers Grove, IL)上使用以下設定對板讀數： 激發=3 60/40，發射=460/40。可見抗體處理之細胞之螢光 單位相對於同型抗體對照物處理之細胞增加，此指示細胞 凋亡。 實例1.1.2.H :藉由親本抗體或DVD-Ig構築體在活體外抑 制抗原誘導之受體磷酸化 可測試結合於細胞受體或其配位體之親本抗體或DVD- 150428.doc -285 - 201119673
Ig對受體活化之抑制作用。將於D-PBS-BSA(具有0.1% BSA之杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水）中稀釋之親本抗 體或 DVD-Ig以 〇·〇ι mg/mL至 100 mg/mL(180 mL)之最終濃 度添加至人類癌細胞中。將板在37°C下在含濕氣5% C02氛 圍中培育1小時。將最終濃度為1-iOO ng/mL(20 mL)之生長 因子（例如EGF)添加至細胞中持續5-15分鐘以刺激受體（例 如EGFR)自體碟酸化。無抗體處理之孔用作〇%抑制之對照 物，而認為無生長因子刺激之孔顯示1 〇〇%抑制。藉由與 細胞提取緩衝液（1〇 mM Tris，pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM NaF、1 mM原飢酸鈉、 1% Triton X-100、i〇%甘油、o.i% SDS及蛋白酶抑制劑混 合液）一起培育製得細胞溶解產物。舉例而言，根據製造 商說明書使用購自 R&D System(#DYC1095，Minneapolis， MN)之p-EGFR ELISA套組測定此等細胞溶解產物中之磷酸 化EGFR。 實例1.1.2.I :抗腫瘤細胞抗原抗體或DVD-Ig單獨或與化學 療法組合對人類癌異種移植物（皮下側位、正位或自發性 轉移）生長之功效 使人類癌細胞在組織培養燒瓶中活體外生長至99%活 力、85%匯合。對19至25公克之SCID小鼠（Charles Rivers Labs)在耳朵上做標記且刺毛。接著，在研究第〇天，以〇 2 ml 2xl〇6個人類腫瘤細胞（與基質膠（matrigel)成1:1)皮下接 種至小鼠右側腹。在將平均腫瘤體積為約150至2〇〇 mm3之 小鼠按尺寸匹配分入至各別小鼠籠中之後起始投與（ip， I50428.doc -286- 201119673 每週Q3D)媒劑（PBS)、抗體或DVD-Ig、及/或化學療法。 在接種後約第10天開始，藉由一對測徑規每週量測腫瘤兩 次’且根據下式計算腫瘤體積：V=LxW2/2(V :體積， mm3，L :長度，mm ; W :寬度，mm)。可見以單獨或與 化學療法組合之抗體或DVD-Ig處理之動物的腫瘤體積相 對於僅接收媒劑或同型對照mAb之動物的腫瘤有所減小。 實例1.1.2.J :如流動式細胞測量術所評定之單株抗體與人 類腫瘤細胞株表面的結合 自組織培養燒瓶收集過度表現相關細胞表面抗原之穩定 細胞株或人類腫瘤細胞株，且再懸浮於含有5%胎牛血清 之磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)(pBS/FBS)中。在染色之 前，將人類腫瘤細胞在冰上與（100 μ1)含5 μ§/πι1人類IgG之 PBS/FCS—起培育。在冰上，將丨_5><1〇5個細胞與含抗體或 DVD-Ig(2 pg/mL)之 PBS/FBS- 起培育 30_60分鐘。洗滌細 胞2次，且添加1〇〇 μι F(ab，）2山羊抗人類IgG、Fcy藻紅素 • 0:200 稀釋於 PBS 中）(Jacks〇n ImmunoResearch，West
Grove，PA，目錄號109_116-17〇)。在冰上培育儿分鐘後， 將細胞洗滌2次且再懸浮於PBS/FBS _。使用Bect〇n
Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson, San J〇se, CA)t 測螢光。 ^ 表4顯示〇¥1)_1§構築體之FACS資料。幾何平均值為n個 螢光信號之乘積（al X a2 X a3 •••an)的n_人根。採用對數轉 換之數據，使用幾何平均值来校正數據分佈之加權。表4 含有親本抗體及DVD-Ig構築體之FACS幾何平均值。 J50428.doc -287- 201119673 表4 : DVD-Ig構築體之螢光活化細胞分選 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變域 (VD) C末端可變域 (VD) FACS幾何平均值 N末端 FACS幾何平均值 C末端 AB002 CD3f序列1) 254 DVD1217 CD3(序列1) MTX 291 AB004 Her2〔序列 1) 88.3 DVD1213 Her2(序列 1) MTX 100.7 ] AB064 EGFRi 序列 3) 817.2 DVD1211 EGFR(序列 3) MTX 739.2 所有DVD-Ig均顯示結合於其細胞表面標靶。DVD-Ig之N 末端結構域與細胞表面上其標靶的結合與親本抗體一樣好 或更佳。結合可藉由調整連接子長度來恢復或改良。 實例1.1.2.K:如流動式細胞測量術所評定，曱胺喋呤藉由 DVD-Ig構築體定位於人類踵瘤細胞株表面 自組織培養燒瓶收集過度表現相關細胞表面抗原之穩定 細胞株或人類腫瘤細胞株，且再懸浮於含有5%胎牛血清 之磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)(PBS/FBS)中。在染色之 前，將人類腫瘤細胞在冰上與（100 μΐ)含5 pg/ml人類IgG之 PBS/FCS—起培育。在冰上，將1-5χ105個細胞與含抗體或 DVD-Ig(2 pg/mL)之 PBS/FBS— 起培育 30-60分鐘。將細胞 洗滌2次，且添加100 μΐ Alexa 488-曱胺。祟吟（1:200稀釋於 PBS中）（Invitrogen，Carlsbad，CA，目錄號 M23271)。在冰 上培育30分鐘後，將細胞洗滌2次且再懸浮於PBS/FBS 中。使用 Becton Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose，CA)量測螢光。 表5顯示DVD-Ig構築體之FACS資料。幾何平均值為n個 150428.doc -288 - 201119673 螢光信號之乘積（al x a2 x a3··. .an)的η次根。採用對數轉 換之數據’使用幾何平均值校正數據分佈之加權。下表含 有親本抗體及DVD-Ig構築體之FACS幾何平均值。 表5 :藉由DVD-Ig構築體之螢光活化細胞分選的甲胺喋呤 定位 親本抗體或 DVD-Ιε ID N末端可變域 (VD) C末端可變域 iVD) FACS幾何平均值 AB119 ΜΊ ΓΧ 0.16 AB004 Her2C序列 1) 0 DVD1213 Her2(序列 1) MTX 1.94 AB064 EGFRi 庠列 3) 0 AB119 ΜΊ ΓΧ 0 DVD1211 EGFR(序列 3) MTX 12.25 所有DVD-Ig均顯示甲胺喋吟定位於其細胞表面。結合 可藉由調整連接子長度來恢復或改良。 實例1.1.2丄：如共焦顯微術所評定，曱胺喋呤藉由DVD-Ig構築體定位於人類腫瘤細胞株表面 自組織培養燒瓶收集過度表現相關細胞表面抗原之穩定 細胞株或人類腫瘤細胞株，且再懸浮於含有5%胎牛血清 之磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)(PBS/FBS)中。在染色之 前，將人類腫瘤細胞在冰上與（100 μΐ)含5 pg/ml人類IgG之 PBS/FCS—起培育。在冰上，將1-5X105個細胞與含抗體或 DVD-Ig(2 pg/mL)之PBS/FBS—起培育 30-60分鐘。將細胞 洗滌2次，且添加1〇〇 μΐ Alexa 488-曱胺喋呤（1:200稀釋於 PBS 中）（lnvitrogen, Carlsbad, CA,目錄號 M23271)。在冰 上培育30分鐘後，將細胞洗滌2次且再懸浮於PBS中。 150428.doc -289- 201119673 實例1.2:針對相關人類抗原之親本單株抗體之產生 如下獲得能夠結合及中和相關人類抗原及其突變體之親 本小鼠mAb : 實例1·2·Α:以相關人類抗原使小鼠免疫 在第1天’在5隻6-8週大Balb/C小鼠、5隻C57B/6小鼠及 5又AJ小鼠中皮下注射20 pg與完全弗氏佐劑 佐劑（Qiagen，Valencia，CA)混合之重組經純化人類抗原（例 如IGF1、2)。在第24天、第38天及第49天，向相同小鼠皮 下注射20 pg與不完全弗氏佐劑或imrnunoeasy佐劑混合之 重組經純化人類抗原變異體。在第84天或第m天或第ι44 天’向小鼠靜脈内注射1 pg相關之重組經純化人類抗原。 實例1·2.Β :融合瘤之產生 根據 Kohler，G.及 Milstein (1975) Nature，256: 495所述之 確定方法使自實例1 _2.A中所述之經免疫小鼠獲得之脾細 胞與SP2/0-Ag-14細胞以5 :1比率融合以產生融合瘤。以每 孔2.5 X 1 〇6個脾細胞的密度將融合產物塗鋪於96孔板中含有 偶氮絲胺酸及次黃嘌呤之選擇培養基中。融合後7至i 〇 天’觀測到肉眼可見之融合瘤群落。藉由ELISA測試來自 含有融合瘤群落之各孔的上清液中針對相關抗原之抗體的 存在（如實例1.1 · 1所述）。接著測試呈現抗原特異性活性之 上清液的活性（如實例1.1.2之檢定所述），例如在生物檢定 中中和相關抗原之能力（諸如實例1.丨.2所述）。 實例1.2.C :針對相關人類標靶抗原之親本單株抗體之鑑 別及表徵 150428.doc •290· 201119673 實例1.2.C.1 :分析親本單株抗體中和活性 檢定融合瘤上清液中結合相關抗原、根據實例丨·2 A及 1.2.B產生、且亦可結合相關抗原之變異體（「抗原變異 體」）之親本抗體的存在。接著，在例如實例1.1.2之細胞 激素生物檢定中測試在兩個檢定中呈抗體陽性之上清液的 抗原中和效此。藉由有限稀釋按比例擴增且選殖在生物檢 定中IC5〇值小於1，000 pM，在一實施例中小於1〇〇 pM的融 合瘤產生抗體。融合瘤細胞擴增至含有10%低IgG胎牛血 清（Hyclone #SH30151，Logan, UT)之培養基中。收集平均 250 mL各融合瘤上清液（來源於純系種群），濃縮且藉由蛋 白質A親和力層析純化’如Harlow, E.及Lane, D. 1 988 「Antibodies: A Laboratory Manual」中所述❶例如使用如 實例1 · 1.2所述之細胞激素生物檢定測定經純化mAb抑制其 標乾抗原活性之能力。 實例I.2.C.2:分析親本單株抗體對相關石蟹獼猴標靶抗原 之交叉反應性 為了測定本文所述之所選mAb是否識別相關石蟹獼猴抗 原，使用重組石蟹獼猴標靶抗原如本文所述（實例丨丨丨B) 進行BIACORE分析。此外，亦可在細胞激素生物檢定（實 例1.1 ·2·Α)中量測mAb針對相關重組石蟹獼猴抗原之中和 效能。選擇具有良好石蟹獼猴交叉反應性之MAb(在一實 施例中’在針對人類抗原之反應性的5倍以内）用於進一步 表徵。 實例1.2.D:測定各鼠類抗人類單株抗體之可變區胺基酸 150428.doc •29卜 201119673 序列 如下進行重組抗人類小鼠mAb之cDNA分離、表現及表 徵。對於各胺基酸序列測定，藉由離心分離約1 X 1 〇6個融 合瘤細胞，且處理以根據製造商說明書使用Trizol(Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.)分離全部RNA。根據製造 商說明書使用Superscript第一股合成系統（Invitrogen, Carlsbad，CA)對全部RNA進行第一股DNA合成。使用寡 (dT)引發第一股合成以選擇聚（A)+ RNA。接著藉由PCR使 用經設計用於擴增鼠類免疫球蛋白可變區之引子（1笆-Primer Sets，Novagen, Madison，WI)來擴增第一股 cDNA 產 物。於於瓊脂糖凝膠上分解PCR產物、切下、純化且接著 以TOPO選殖套組次選殖至pCR2.1-TOPO載體（Invitrogen， Carlsbad, CA)中，且轉型至TOP10化學感受態大腸桿菌 (Invitrogen，Carlsbad, CA)中。對轉型體進行群落PCR以鑑 別含有插入物之純系。使用QIAprep Miniprep套組（Qiagen， Valencia，CA)自含有插入物之純系分離質體DNA。使用 Ml 3 正向引子及 Ml 3 反向弓| 子（Fermentas Life Sciences, Hanover MD)對質體中之插入物之兩股進行定序以確定可 變重鏈DNA序列或可變輕鏈DNA序列。鑑別mAb之可變重 鏈序列及可變輕鏈序列。在一實施例中，用於下一步發展 (人類化）之前導mAb組的選擇準則包括以下： 抗體不含任何N連接之糖基化位點（NXS)，CH2中之標準 NXS除外 除每一抗體中之正常半胱胺酸外，抗體不含任何其他半 150428.doc - 292 - 201119673 胱胺酸 比對抗體序列與最接近之人類生殖系序列之Vh及vl， 且應檢驗其他天然人類抗體中任何異常胺基酸之存在 若不影響抗體活性，則N末端麩醯胺酸（Q)換為麩胺酸 (E)。此將減少由Q環化引起之異質性 藉由質譜分析確認有效信號序列裂解。此可使用COS細 胞或2 9 3細胞物質進行 檢驗蛋白質序列之可能導致活性喪失之Asri去醯胺之 風險 抗體具有低聚集程度 抗體溶解度大於5-10 mg/mi(在研究階段）；大於25 mg/ml 根據動態光散射（DLS)測得抗體具有正常尺寸（5_6 ^旧） 抗體具有低電荷異質性 抗體缺乏細胞激素釋放（參看實例m.2 b) φ 抗體對預定細胞激素具有特異性（參看實例1.1.2.c) 抗體缺乏非預期組織交叉反應性（參看實例1. i · 2 ·D) 抗體對人類及石蟹獼猴組織交叉反應性之間具有類似性 (參看實例1.1.2.D) 實例1.2.2:重組人類化親本抗體 實例1.2.2.1:重組嵌合抗人類親本抗體之建構及表現 藉由在細菌中同源重組將編碼鼠類抗人類親本mAb之重 鏈恆定區的DNA置換為編碼含有2個鉸鏈區胺基酸突變之 人類IgGl恆定區的cDNA片段。此等突變為位置234(£1;編 150428.doc -293 - 201119673 號）處之白胺酸改變為丙胺酸及位置23s處之白胺酸改變為 丙胺酸（Lund等人·（1991) J. Immunol.: 147:2657)。此等抗 體中之每一者的輕鏈恆定區置換為人類κ恆定區。藉由共 轉染接合至pBOS表現質體中之嵌合重鏈及輕鏈cdna在 cos細胞中短暫表現全長嵌合抗體（Mizushima及Nagata (1990) Nucl. Acids Res.18: 5322)。藉由蛋白質a瓊脂糖凝 膠層析法純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液且藉由添加 酸緩衝液溶離已結合抗體。中和抗體且透析至PB$中。 編碼嵌合mAb之重鏈cDNA與其嵌合輕鏈cDNA(皆接合 至pBOS載體中）共轉染至C0S細胞中。藉由蛋白質a環脂 糖凝膠層析法純化含有重組喪合抗體之細胞上清液且藉由 添加酸緩衝液溶離已結合抗體。中和抗體且透析至pBs 中。 接著如實例1.1 1及1 · 1.2所述測試經純化嵌合抗人類親本 mAb的結合能力（藉由Biacore)及例如抑制細胞激素誘導之
IgE產生的功此活性。選擇維持親本融合瘤mAb活性之嵌 合mAb用於進一步開發。 實例1.2.2.2:人類化抗人類親本抗體之建構及表現 實例1·2·2.2·Α:選擇人類抗體構架 使用Vector ΝΤΙ軟體單獨比對各鼠類可變重鏈及可變輕 鏈基因序列與44個人類免疫球蛋白生殖系可變重鏈或46個 生殖系可變輕鏈序列（來源於NCBI Ig Blast網站 http:"www.ncbi.nlm.nih.govAgblast/retrieveig.htm 1.)。 基於胺基酸序列同源性、CDR群集分析' 所表現人類抗 150428.doc -294· 201119673 體之使用頻率及可獲得之關於人類抗體之晶體結構之資訊 進行人類化。考慮到對抗體結合、對及其他因素 的可能影響，纟鼠類與人類構架殘基不同之情況下，使鼠 類殘基突變成人類殘基，但有少數例外。基於對與鼠類抗 體可變區的實際胺基酸序列具有高度同源性（亦即序列類 似性）的人類生殖系抗體序列或其子群之分析來設計其他 人類化策略。
使用同源性模型化來鑑別預計對抗體組合位點cdr結構 至關重要的鼠類抗體序列特有之殘基。同源模型化為產生 蛋白質之近似二維座標的計算方法。初始座標來源及梵進 -步改進之指南為第二蛋白質(即參考蛋白質)，其三维座 標已知且序列與第-蛋白質之序列相_。使用兩種蛋白質 之序列之間的關係產生參考蛋白質與需要座標之蛋白質 (標乾蛋白質）之間的對應性。比對參考蛋白質及標乾蛋白 質之一級序列，其中兩種蛋白質之―致部分的座標自參考 蛋白質直接轉移至標靶蛋白質。自通用結構模板建構例如 由殘基突變、插入或缺失產生之兩種蛋白質之錯配部分的 絲且改進能量以確保與已轉移模型座標的—致性。 鼻蛋白質結構可績i隹—_1Κ -,Λ. ^ !進步改進或直接用於模型化研究。模 ^結構之品質由參考蛋白質與標乾蛋白質相關之論點的準 確性及建構序列比對之精確性決定。 對於鼠類mAb，使用BLAST搜尋與目測之么且人 1考胺基酸序列與㈣胺基酸序列之二二 致吐被視作嘗試執行同源性模型化之最低必要條 150428.doc •295 - 201119673 件。人工建構序列比對且以程式Jackal產生模型座標（參看
Petrey，D_ 等人，（2003) Proteins 53 (增刊 6): 430-435)。 所選抗體之鼠類及人類構架區之一級序列共有顯著一致 性。不同之殘基位置為在人類化序列中包括鼠類殘基以保 留鼠類抗體的所觀測到的結合效能之候選位置。人工建構 人類序列與鼠類序列之間不同之構架殘基的清單。表7顯 示針對此研究選擇之構架序列。 表6 :人類IgG重鍵恆定域及輕鏈恆定域之序列
蛋白質 SEQ ID NO 序列 12345678901234567890123456789012345678901 野生型hlgGl恆定區 106 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVPSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK 突變hlgGl恆定區 107 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK Ig κ但定區 108 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC I g λ值定區 109 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR SYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
指定構架殘基影響抗體之結合特性的可能性視其與CDR 殘基之鄰近性而定。因此’使用模型結構’根據距CDR中 之任何原子的距離排列鼠類序列與人類序列之間的不同殘 基。在任何CDR原子4.5 A範圍内的彼等殘基經鑑別為最重 要的殘基且推薦其作為人類化抗體中保留鼠類殘基（亦即 150428.doc -296· 201119673 回復突變）之候選殘基。 使用募核苷酸建構經電腦（In silico)建構之人類化抗 體。對於各可變區cDNA而言，設計6個各自具有6〇⑽個 核苷酸之寡核苷酸以在各寡核苷酸之5，及/或3，末端彼此重 疊20個核苷酸。在黏接反應中，組合所有6種寡核苷酸， 煮沸且在dNTP存在下使其黏接。添加DNA聚合酶丨（大 (Klenow)片段（New England Bi〇labs 綱〇21〇, BeveHey， φ MA·))以填充重疊募核苷酸之間的約4〇 bp間隙。使用兩個 含有與經修飾pBOS載體中之多選殖位點互補之懸垂序列 的最外側引子進行PCR以擴增整個可變區基因（Mizushima， S·及 Nagata，S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 17)。在瓊脂 糖凝膠上分離自各cDNA總成獲得之PCR產物且切出對應 於經預測可變區cDNA尺寸之條帶且將其純化。在細菌中 藉由同源重組將可變重鏈區同框插入至編碼含有2個鉸鏈 區胺基酸突變之人類IgG 1恆定區的cDNA片段上。此等突 • 變為位置234(EU編號）處之白胺酸改變為丙胺酸且位置235 處之白胺酸改變為丙胺酸（Lund等人.（1991) J. Immunol. 147: 265 7)。藉由同源重組將可變輕鏈區與人類κ恆定區同 框插入。分離細菌群落，且提取質體DNA。對整個cDNA 插入物定序。將對應於各抗體之正確人類化重鏈及輕鏈共 轉染至COS細胞中以短暫產生全長人類化抗人類抗體。藉 由蛋白質A瓊脂糖凝膠層析法純化含有重組嵌合抗體之細 胞上清液且藉由添加酸緩衝液溶離已結合抗體。中和抗體 且透析至PBS中。 150428.doc -297 - 201119673 實例1.2.2.3 :人類化抗體之表徵 例如使用如實例1.1.2.A所述之細胞激素生物檢定測定經 純化人類化抗體抑制功能活性之能力。使用如實例1 · 1 . 1 B 中所述之表面電漿共振（Biacore®)量測來測定人類化抗體 對重組人類抗原之結合親和力。排列來自生物檢定之IC5〇 值及人類化抗體之親和力。選擇完全保留親本融合瘤mAb 活性之人類化mAb作為用於進一步開發之候選物。對最適 宜的2-3個人類化mAb進行進一步表徵。 實例1.2.2.3.A :人類化抗體之藥物動力學分析 在史泊格多利（Sprague-Dawley)大鼠及石蟹獼猴中進行 藥物動力學研究《對雄性及雌性大鼠及石蟹獼猴靜脈内或 皮下給予4 mg/kg mAb之單一劑量，且使用抗原捕捉 ELISA分析樣品，且藉由非房室模型分析測定藥物動力學 參數。簡言之’用山羊抗生物素抗體（5 mg/ml，4。(：，隔 仪）塗覆ELISA板，用Superblock(Pierce)阻斷，且在室溫下 與含50 ng/ml經生物素標記之人類抗原之1〇% Superbl〇ck TTBS—起培育2小時。血清樣品經連續稀釋（〇 5%血清， TTBS中之10% Superblock)，且在室溫下在板上培育3〇分 鉍。以HRP標記之山羊抗人類抗體進行偵測，且藉助於標 準曲線使用四參數邏輯擬合測定濃度。藉由非房室模型使 用 WinNonhn軟體（Pharsight Corporation，Mountain View， CA)測定藥物動力學參數值。選擇具有良好藥物動力學概 況（T1/2為8-13天或更佳，具有低清除率及5〇_1〇〇%的極佳 生物可用性）之人類化mAb。 150428.doc -298- 201119673 實例1.2.2.3·Β :人類化單株抗體之物理化學及活體外穩定 性分析 尺寸排阻層析
用水稀釋抗體至2.5 mg/mL，且取20 mL在Shimadzu HPLC系統上使用TSK凝膠G3000 SWXL管柱（Tosoh Bioscience，目錄號k5539_〇5k)分析。使用211 硫酸 納、92 磷酸鈉（pH 7.0)以0.3 mL/min之流動速率自管柱 溶離樣品。HPLC系統操作條件如下： 211 mM Na2S04、92 mM Na2HP04*7H20，PH 7.0 等度 0.3 mL/min 280 nm 4°C 環境溫度 移動相： 梯度： 流動速率： 偵測器波長： 自動取樣器冷卻器溫度： 管枝烘箱溫度： 運作時間： 50分鐘 ::聚有：上述方案所測定以單體百分比(具有預期分子 度資料。。蛋M)表示之親本抗體及卿七構築體的純 150428.doc 201119673 表7:藉由尺寸排阻層析測定之親本抗體及DVD-Ig構築體 之純度 親本抗體或DVD-Ig ID N末端可變域 (VD) C末端可變域 (VD) 單體％(純度） AB119 MTX 100 DVD 1209 CD20 MTX 37.4 DVD1211 EGFR(序列 3) MTX 99.6 DVD1213 Her2(序列 1) MTX 98.5 DVD1217 CD-3(序列 1) MTX 93.2 DVD-Ig顯示極佳的SEC概況，其中多數DVD-Ig顯示 >90%單體。此DVD-Ig概況與關於親本抗體觀測到之概況 類似。
SDS-PAGE 在還原性條件及非還原性條件下藉由十二院基硫酸鈉_ 聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析抗體。使用阿達木 單抗（批號AFP04C)作為對照物。對於還原性條件，1:1混 合樣品與具有100 mM DTT之2X Tris甘胺酸SDS-PAGE樣品 緩衝液（Invitrogen，目錄號LC2676，批號1323208)，且在 60°C下加熱30分鐘。對於非還原性條件，1:1混合樣品與樣 品緩衝液且在100°C下加熱5分鐘。將經還原樣品（每泳道 10 mg)裝載於12%預製Tris甘胺酸凝膠（Invitrogen,目錄號 丑€60051)(^，批號6111021)上，且將未經還原之樣品（每泳 道10 mg)裝載至8 %-16%預製Tris甘胺酸凝膠（Invitrogen， 目錄號£0604513〇乂，批號6111021)上。使用866611^?1115 2(11^心〇呂611,目錄號1^5925，批號1351542)作為分子量標 記物。在XCell SureLock小單元凝膠盒（invitrogen,目錄號 150428.doc -300- 201119673 EI0001)中運作凝膠，且藉由首先施加電壓乃使樣品堆疊 於凝膠中，隨後施加恆定電壓1 25直至染料前沿到達凝膠 底部來分離蛋白質。所用之電泳緩衝液為自丨〇χ tris甘胺 酸SDS緩衝液（ABC，MPS_79_〇8〇1〇6)製備的π tHs甘胺酸 SDS緩衝液。用膠體藍染色劑（c〇u〇idal biue stain)(Invitrogen 目錄號 46_7〇15，46_7〇16)對凝膠染色隔 仪’且用Milli-Q水脫色直至背景透明。接著使用Epson
Expression掃描儀（型號 i68〇, S/N DASX003641)掃描經染 色凝膠。 沈降速度分析 將抗體裝載至三個標準雙區碳環氧樹脂（ep〇n)中心件中 之每一者的樣品室中。此等中心件具有12 cm之光徑長度 且經建造有藍寶石窗。使用PBS作為參考緩衝液且各腔室 含有 140 pL PBS。在 Beckman ProteomeLab XL-Ι分析型超 離心機（序號PL106C01)中使用4孔（AN-60Ti)轉子同時檢查 所有樣品。 運作條件經程式化，且使用prote〇rneLab(v5.6)執行離心 對照。在分析之前’使樣品及轉子熱平衡1小時 (20.〇±〇.i°C卜在3〇〇〇 rpm下執行適當室負荷之確認，且記 錄各室之單一掃描。沈降速度條件如下：
樣品室體積：420 mL 參考室體積：420 mL 溫度：20°C 轉子速度：35,000 rpm 150428.doc -301 - 201119673 時間：8:00小時 UV波長：280 nm 徑向步長：0.003 cm 資料收集：每步一個資料點，無信號平均。 總掃描數：100 完整抗體之LC-MS分子量量測 藉由LC-MS分析完整抗體之分子量。以水稀釋各抗體至 約1 mg/mL。使用具有蛋白質微捕集器（Michr〇m Bioresources, Inc,目錄號 004/25109/03)之 ll〇〇 HPLC(Agilent)系統脫鹽，且將5 mg樣品引入至API Qstar pulsar i質譜儀（Applied Biosystems)中。使用短梯度溶離樣 品。用移動相A(HPLC水中0.08% FA、0.02% TFA)及移動 相B(乙腈中0.08% FA及0.02% TFA)以50 mL/min之流動速 率運作梯度。質譜儀在4.5千伏喷霧電壓下操作，掃描範 圍為2000至3500質荷比。 抗體輕鏈及重鏈之LC-MS分子量量測 藉由LC-MS分析抗體輕鏈（LC)、重鏈（HC)及去糖基化 HC之分子量量測。以水稀釋抗體至1 mg/mL，且在37°C下 以最終濃度為10 mM之DTT使樣品還原為LC及HC歷時3〇分 鐘。為了使抗體去糖基化’將1〇〇 mg抗體與2 mL PNGase F、5 mL 10% N-辛基糖苷以100 mL之總體積在37°C下一起 培育隔夜。在去糖基化之後，在37°C下以最終濃度為1〇 mM之DTT使樣品還原30分鐘。使用具有C4管柱之Agilent 1100 HPLC系統(Vydac，目錄號214TP5115, S/N 060206537204069) 150428.doc -302 - 201119673 脫鹽’且將樣品（5 mg)引入至API Qstar pulsar i.質譜儀 (Applied Bi〇SyStems)中。使用短梯度溶離樣品。用移動相 A(HPLC水中0.08% FA、0.02% TFA)及移動相B(乙腈中 0.08 /ό FA及0.02% TFA)以50 mL/min之流動速率運作梯 度°質譜儀在4·5千伏噴霧電壓下操作，掃描範圍為800至 3500質荷比。 狀圖譜 在室溫下在75 mM碳酸氫銨中用最終濃度為6 Μ之鹽酸 脈使抗體變性15分鐘。在37°C下以最終濃度為1〇 DTT使變性樣品還原6〇分鐘，隨後在3Γ(：下在黑暗中以5〇 mM峡乙酸（IAA)使其烷基化歷時30分鐘。在烷基化之後， 在4C下針對4 L 10 mM碳酸氫銨透析樣品隔夜。以1 〇 mM 碳酸氫銨（]31^7.8)稀釋經透析樣品至1〇^/1111^，且在37。(：下 用騰蛋白酶（Pr〇mega，目錄號V5111)或Lys-C(Roche，目錄 號11 047 825 001)以i:2〇(w/w)胰蛋白酶/Lys-C:抗體比率消 化100 mg抗體達4小時。以1 mL 1 n HC1淬滅消化物。對 於使用質譜儀偵測法之肽圖譜，使用Agi丨ent 11 00 HPLC系 統在 C18 管柱（Vydac，目錄號 218TP51，S/N NE9606 10.3.5) 上藉由逆相高效液相層析（RPHPlc)分離40 mL消化物。以 使用移動相A(HPLC級水中0.02% TFA及0.08% FA)及移動 相B(乙腈中0.02% tFA及〇 〇8% FA)之梯度以5〇 mL/min之 流動速率下進行肽分離。API qstAR Pulsar i質譜儀在4.5 千伏喷霧電壓下及800至25〇〇質荷比之掃描範圍内以正離 子模式操作。 150428.doc - 303 - 201119673 二硫鍵定位 為了使抗體變性，將100 mL抗體與300 mL含8 Μ鹽酸胍 之100 mM奴酸鼠錢混合。檢驗pH值以確保其在7與8之 間，且使樣品在室溫下在最終濃度為6 Μ之鹽酸胍中變性 15分鐘。用Milli-Q水稀釋一部分變性樣品（1〇〇 mL)至600 mL，獲得1 Μ之最終鹽酸胍濃度。在37它下用胰蛋白酶 (Promega，目錄號 V5111，批號 22265901)或 Lys-C(Roche， 目錄號11047825001，批號12808000)以1:50胰蛋白酶或 1:50 Lys-C:抗體（w/w)比率（4.4 mg酶：220 mg樣品）消化樣品 (220 mg)約16小時。向樣品中再添加5 mg胰蛋白酶或Lys-C ’且於3 7 C下再進行消化2小時。藉由向各樣品中添加1 mL TFA來停止消化。在Agilent HPLC系統上使用C18管柱
(Vydac，目錄號218TP51 S/NNE020630-4-1A)藉由 RPHPLC 分離經消化之樣品。以與用於肽圖譜之梯度相同之梯度使 用移動相A(HPLC級水中0.02% TFA及〇 〇8% FA)及移動相 B(乙腈中0.02% TFA及〇.〇8% FA)以5〇 mL/min之流動速率 進行分離。HPLC操作條件與肽圖譜所用之操作條件相 同。API QSTAR i>ulsar if譜儀在4 5千伏噴霧電壓及_ 至2500質荷比之掃描範圍内以正離子模式操作。藉由匹配 所觀測之肽MW與經二硫鍵連接之姨蛋白酶肽或Lys_c狀的 預測MW來指定二硫鍵。 游離硫氫基之測定 用於定量抗體中之游離半胱胺酸的方法係基於愛耳門試 劑（EUmWs reagent5，％二硫基_雙（2硝基苯甲 150428.doc •304 - 201119673 酸）(DTNB))與硫氫基（SH)之反應，該反應產生特徵性發色 產物5-硫基-(2-硝基苯曱酸）（TNB)。反應以下式說明： DTNB + RSH ® RS-TNB + TNB-+H+ 使用Cary 50分光光度計量測TNB-在412 nm下之吸光 度。使用2-巯基乙醇（b-ME)稀釋液作為游離SH標準物繪製 吸光度曲線，且自樣品於4 1 2 nm下之吸光度測定蛋白質中 之游離硫氫基的濃度。 藉由以HPLC級水連續稀釋14.2 M b-ME直至0.142 mM的 最終濃度來製備b-ME標準儲備液。接著，一式三份製備 各濃度之標準物。使用amicon ultra 10,000 MWCO離心過 濾器（Millipore,目錄號 UFC801096，批號 L3KN525 1)將抗 體濃縮至10 mg/mL，且將缓衝液換為用於阿達木單抗之調 配緩衝液（5.5 7 mM填酸二氫納、8.69 mM填酸氫二鈉、 106.69 mM NaCl、1.07 mM檸檬酸納、6.45 mM檸檬酸、 66.68 mM甘露糖醇，pH 5.2、0.1%(w/v)Tween)。在室溫下 在振盪器上混合樣品20分鐘。接著，向各樣品及標準物中 添加180 mL 100 mM Tris緩衝液（pH 8.1)，隨後添加300 mL含2 mM DTNB之10 mM磷酸鹽缓衝液（pH 8.1)。在充分 混合之後，在Cary 50分光光度計上在4 12 nm下量測樣品 及標準物之吸光度。藉由繪製游離SH之量與b-ME標準物 之OD4i 2 nm之曲線獲得標準曲線。在減去空白後，基於此 曲線計算樣品之游離S Η含量。 弱陽離子交換層析 以10 mM磷酸鈉，pH 6.0稀釋抗體至1 mg/mL。使用 150428.doc - 305 - 201119673
Shimadzu HPLC系統用 WCX-10 ProPac分析型管柱（Dionex， 目錄號054993, S/N 02722)分析電荷異質性。將樣品裝載 於管柱上（80%移動相A(10 mM磷酸鈉，pH 6.0)及20°/。移動 相 B(10 mM磷酸鈉、500 mM NaCl，pH 6.0))，且以 1.0 mL/min之流動速率溶離。 募醣分佈 以2-胺基苯曱醯胺（2-AB)標記試劑衍生經PNGase F處理 抗體後釋放之寡醣。藉由正相高效液相層析（NPHPLC)分 離螢光標記之寡醣，且基於與已知標準物的滯留時間比較 表徵寡醣之不同形式。 首先以PNGaseF消化抗體，以自重鏈之Fc部分裂解N連 接之寡醣。將抗體（200 mg)與2 mL PNGase F及3 mL 10% N-辛基糖苦一起置於500 mL Eppendorf管中。添加填酸鹽 緩衝生理食鹽水使最終體積達到60 mL。將樣品在37°C下 在設定為700 RPM之Eppendorf恆溫混勻器中培育隔夜。作 為對照，亦使用PNGase F消化批號為AFP(MC之阿達木單 抗。 在PNGase F處理之後，將樣品在95°C下在設定為750 RPM之Eppendorf恆溫混勻器中培育5分鐘以沈澱出蛋白 質’接著將樣品置於1〇,〇〇〇 RPM下之Eppendorf離心機中 歷時2分鐘，以短暫離心（spin down)沈澱之蛋白質。將含 有寡醣之上清液轉移至500 mL Eppendorf管中且在65°C下 在speed-vac中乾燥。 使用購自Prozyme之2AB標記套組（目錄號GKK-404 ’批 150428.doc -306- 201119673 唬132026)以2AB標記寡醣。根據製造商說明書製備標記試 劑。將乙酸（150 mL·，於套組中提供）添加至DMS〇小瓶（於 套組中提供）中，且藉由將溶液上下抽吸若干次來混合。 將乙酸/DMSO混合物（1〇〇 mL)轉移至2-AB染料小瓶中（即 將使用之前）且混合直至染料完全溶解。接著將染料溶液 添加至還原劑小瓶（於套組中提供）中充分混合（標記試 劑）。向各乾燥寡醣樣品小瓶中添加標記試劑（5 mL)，且充 分混合。將反應小瓶置於設定為65。〇及7〇〇_8〇〇 rPM2 Eppendorf恆溫混勻器中以反應2小時。 在才示§己反應之後’使用來自proZymei GlyC〇ciean S匣 (目錄號GKI-4726)移除過量螢光染料。在添加樣品之前， 將該等匣以1 mL milli-Q水洗滌，隨後以1 mL 30%乙酸溶 液洗滌5次。在即將添加樣品之前，向匣中添加1 乙腈 (Burdick and Jackson,目錄號 ΑΗ015-4)。 在所有乙腈均已通過匣之後，將樣品點樣至剛洗滌之圓 盤中央，且使其吸附於圓盤上歷時1 0分鐘。用1 mL乙腈洗 滌圓盤，隨後以1 mL 96%乙腈洗滌5次。將匣置於15 mL Eppendorf管上，且以milli Q水洗滌3次（每次400 mL)來溶 離2-AB標記之寡醣。 使用連接於Shimadzu HPLC系統之Glyeosep N HPLC(目 錄號GKI-4728)管柱分離寡醣。Shimadzu HPLC系統由系統 控制器、脫氣器、二元系、具有樣品冷卻器之自動取樣 及螢光偵測器組成。 高溫下之穩定性 150428.doc -307- 201119673 抗體緩衝液為5.57 mM磷酸二氫鈉、8.69 mM磷酸氫二 納、106.69 mM NaCM、1.07 mM檸檬酸鈉、6_45 mM擰檬 酸、66.68 mM甘露糖醇、〇_1%(w/v)Tween(pH 5 2);或 1〇 mM組胺酸、10 硫胺酸、4%甘露糖醇（pH 5 9)，使用
Amicon超離心過濾器。以適當緩衝液將抗體最終濃度調整 至2 mg/mL。接著將抗體溶液過濾滅菌，且在無菌條件下 製備0.25 mL等分試樣。將等分試樣留置於_8〇〇c、5它、 25°C或40°C下歷時1、2或3週。在培育期結束時，藉由尺 寸排阻層析及SDS-PAGE分析樣品。 鲁 藉由SDS-PAGE在還原性及非還原性條件下分析穩定性 樣品。所用程序與本文所述相同。用膠體藍染色劑 (Invitrogen目錄號46-7015，46-7016)對凝膠染色隔夜，且 用MiUi-Q水脫色直至背景透明。接著使用Eps〇n表現掃描 儀（型號1680，S/N DASX003 641)掃描經染色凝膠。為了獲 付更咼靈敏度’使用銀染色套組（〇wl Scientific)對相同凝 膠進行銀染色’且使用製造商給出之推薦程序。 實例1.2.2.3.C .人類化單株抗體單獨或與化學療法之組合 對人類癌瘤異種移植物生長之功效 人類癌細胞在組織培養燒瓶中活體外生長至99%活力、 85%匯合。對19-25公克之SCID雌性或雄性小鼠（charles Rivers Labs)在耳朵上做標記且剃毛。接著，在研究第〇 天’以0.2 ml 2χΙΟ6個人類腫瘤細胞（與基質膠成1:1)皮下 接種至小鼠右側腹。在將平均腫瘤體積為約15〇至200 mm3 之小鼠按尺寸匹配分入至各別小鼠籠中之後起始投與 150428.doc •308· 201119673 (IP，每週Q3D)媒劑（PBS)、人類化抗體、及/或化學療 法。在接種後約第10天開始，藉由一對測徑規每週量測腫 瘤兩次，且根據下式計算腫瘤體積：V=LxW2/2(V :體 積，mm3 ; L :長度，mm ; W :寬度，mm)。可見以單獨 或與化學療法組合之mAb處理之動物的腫瘤體積相對於僅 接收媒劑或同型對照mAb之動物的腫瘤有所減小。 實例1.2.2.3.0:基於罗入08之重導向細胞毒性（1*<：1^)檢定
藉由陰性選擇增濃管柱（R&D Systems, Minneapolis, MN ;目錄號HTCC-525)自先前經冷凍分離之周邊血單核 細胞（PBMC)分離人類CD3+ T細胞。在塗覆有含10 pg/mL 抗 CD3(OKT-3，eBioscience, Inc., San Diego, CA)及 2 pg/mL抗 CD28(CD28.2，eBioscience, Inc., San Diego, CA) 之 D-PBS(Invitrogen，Carlsbad, CA)之燒瓶（通氣孑L 蓋， Corning, Acton，MA)中刺激T細胞 4天，且在含 30 U/mL IL-2(Roche)之完全 RPMI 1640 培養基（Invitrogen, Carlsbad, CA)中與 L-麩醯胺酸（55 mM β-ΜΕ，Pen/Strep，10% FBS) 一起培養。接著T細胞在用於檢定前在30 U/mL IL-2中靜 置隔夜。據製造商說明書將DoHH2或Raji標靶細胞以 PKH26(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)標記。整個rCTL檢 定中使用含有L-麩胺醯胺及10% FBS(Hyclone，Logan, UT) 之 RPMI 1640 培養基（無苯齡，Invitrogen, Carlsbad, CA)。 (參看 Dreier等人，（2002) Int J Cancer 100:690)。 效應T細胞（E)及標靶（T)分別以每孔105個細胞及每孔104 個細胞之最終細胞濃度接種於96孔板（Costar #3799, Acton, 150428.doc •309· 201119673 ΜΑ)中，產生10:1之Ε:Τ比。DVD-Ig分子經稀釋獲得濃度 依賴性滴定曲線。培育隔夜之後，使細胞集結成球且以D-PBS洗滌一次，隨後再懸浮於在D-PBS中含有0.1% BSA Invitrogen，Carlsbad, CA)、0.1%疊氮化鈉及 0.5 pg/mL姨化 丙錠（BD)之FACS緩衝液中。在第II型FACS Canto機 (Becton Dickinson，San Jose, CA)上收集 FACS 資料且在 Flowjo(Treestar)中分析。計算DVD-Ig處理之樣品中的活 標靶百分比除以總標靶百分比（對照組，未處理）以測定特 定溶解百分比。在Prism(Graphpad)中計算IC50。 實例1.2.2.3.E :抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC) 方法 收集標靶（例如DoHH2、A431及U87MGde2-7)細胞且以 1 0 mL RPMI無盼紅培養基（Invitrogen, Carlsbad, CA，目錄 號1 1835)洗滌，且在鈣黃綠素-AM(calcein-AM) eBioscience，San Diego, CA,目錄號 65-0853)中以每毫升 4X 106個細胞之濃度培育30分鐘。以1 OmL RPMI無酚紅10% FBS(Thermo Scientific HyClone, Logan, UT,目錄號 SH30070.03)洗滌標靶細胞3次，且以每孔180,000個細胞在 96孔圓底板中等分。抗體及DVD-Ig在RPMI無酚紅10% FBS中稀釋至1 0 mg/mL。自標靶細胞移除上清液，且添加 每孔30 mL經稀釋之抗體及DVD-Ig。在冰上培育細胞1小 時，且接著以每孔150 mL RPMI無酚紅10% FBS洗滌3次。 將細胞轉移至2 mL檢定阻斷劑中，且以每毫升1.33 X 105 個細胞之濃度再懸浮。將未活化之人類NK細胞（Astarte 150428.doc -310· 201119673
Biologies, Redmond，WA，目錄號1027)或活化之人類NK細 胞（内部供血程式，使用套組活化2週之PBMC，Myltenyi Biotech, Auburn，CA，目錄號 130-094-483)解凍，以 10 mL RPMI無酚紅ίο% fbS洗滌2次，且以每毫升1.2x106個細胞 再懸浮。接著藉由將75 mL ΝΚ細胞及75 mL標靶細胞轉移 至同一孔中，將NK細胞及標靶細胞以9:1之比率在96孔V 形底板上等分。向用於測定自發性鈣黃綠素-AM釋放之孔 中添加培養基而非NK細胞。向用於測定總溶解之孔中添 加 2% 氚核（Sigma-Aldrich，St. Louis, MO，目錄號 93443)而 非NK細胞。所有條件均以一式三份接種。在37。〇下培育 細胞2-2.5小時，且接著.在1300 rpm下短暫離心5分鐘。將 每孔100 mL上清液轉移至黑色低背景螢光板（black cliniplate)。在 2103 EnVision Multilabel 讀取器（Perkin Elmer，Waltham, ΜΑ)上對板讀數。 實例1.2.2.3.F : FcR結合法 將細胞（例如 FcRn: FcRnGPI-CHO、FcgRI: THP-1、
FcgRIIa: K562、FcgRIIb: CHO-FcgRII-b-1)以每孔 lxlO5個 細胞接種於96孔圓底板上。將抗體及DVD-Ig在FACS緩衝 液（含有1% FBS之PBS，對於FcRn樣品為pH 6.4，對於其 餘樣品為pH 7·4)申稀釋至1 〇〇 mg/ml。自細胞移除上清液 且向各孔中添加3 0 mL經稀釋抗體及DVD-Ig。將細胞與抗 體一起在4。(：下培育2小時。在培育後，以丨5〇 FACS缓
衝液（對於FcRn樣品為PH 6.4 ’對於其餘樣品為pH 7.4)洗 滌細胞3次。將細胞與1:125稀釋之r_PE結合之抗人類igG 150428.doc •311 201119673 F(Ab')2(Jackson Immuno Research, West Grove, PA,目錄 號109-116-1 70)—起再懸浮於50 μί FACS緩衝液（對於FcRn 樣品為pH 6.4’對於其餘樣品為pH 7.4)中’且在4C下培 育40分鐘。洗滌細胞3次’且最終再懸浮於100 mL FACS緩 衝液（對於FcRn樣品為pH 6.4，對於其餘樣品為pH 7.4) 中。在 FACSCalibur機（Becton Dickinson，San Jose, CA)上 操作樣品。針對FL2調整FACSCalibur設定使得無抗體處理 之對照樣品具有3之GMFI。隨後操作實驗樣品。使用 FlowJo軟體（Treestar，Inc，Ashland，OR)分析資料且如前向 及側向散射閘所指定測定活細胞之R_PE GMFI。 實例1.4 : DVD-Ig之產生 使用如本文所述選擇之兩個親本單株抗體建構結合兩個 抗原之DVD-Ig分子’ 一個親本抗體針對人類抗原A，且另 一親本抗體針對人類抗原B。 實例1.4.1 :具有兩個連接子長度之DVD-Ig之產生 使用含有在234及235處具有突變以消除八0(1；〇/〇0(^效應 功能之μΐ Fc的恆定區。產生四種不同抗A/B DVD-Ig構築 體：2種具有短連接子（SL)且2種具有長連接子（LL) ’各為 兩種不同結構域取向：Va-Vb-C及Vb-Va-C(參看表8)。來 源於人類Cl/Ck或CH1域之N末端序列的連接子序列如下： 對於DVDAB構築體： 輕鍵（若抗A具有λ).短連接子.QPKAAP(SEQ ID N〇: 15);長連接子：QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) 輕鏈（若抗A具有κ):短連接子：TVAAP(SEQ ID NO: 150428.doc -312- 201119673 13);長連接子：TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) 重鏈（γΐ):短連接子：ASTKGP(SEQ ID NO: 21);長連 接子：ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22) 對於DVDBA構築體： 輕鏈（若抗B具有λ):短連接子：QPKAAP(SEQ ID NO: 15);長連接子：QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) 輕鏈（若抗B具有k):短連接子：TVAAP(SEQ ID NO·· 13); 長連接子：TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)
重鏈（γΐ):短連接子：ASTKGP(SEQ ID NO: 21);長連接 子：ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22) 重鏈及輕鏈構築體經次選殖至pBOS表現載體中，且表現於 COS細胞中，隨後藉由蛋白質A層析純化。對經純化物質進行 SDS-PAGE及 SEC分析。 表8描述用於表現各抗A/B DVD-Ig蛋白的重鏈及輕鏈構 築體。 表8 :抗A/B DVD-Ig構築體
DVD-Ig蛋白 重鏈構築體 輕鏈構築體 DVDABSL DVDABHC-SL DVDABLC-SL DVDABLL DVDABHC-LL DVDABLC-LL DVDBASL DVDBAHC-SL DVDBALC-SL DVDBALL DVDBAHC-LL DVDBALC-LL 實例1.4.2 :針對DVDABSL及DVDABLL之DNA構築體分 子選殖： 為了產生重鏈構築體DVDABHC-LL及DVDABHC-SL， 使用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3'引子分別含有短/ 長連接子序列）來PCR擴增A抗體之VH域；同時使用特定引 150428.doc -313 · 201119673 子（對於SL/LL構築體而言，5'引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增Β抗體之VH域。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於後續重疊PCR反應之重疊模板。藉由使用標準同源重組 法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Sal I雙重消化pBOS-hCyl，z非a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為了產生輕鏈構築體DVDABLC-LL及DVDABLC-SL，使 用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3'引子分別含有短/長 連接子序列）來PCR擴增A抗體之VL域；同時使用特定引子 (對於SL/LL構築體而言，5'引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增B抗體之VL域。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於使用標準PCR條件進行之後續重疊PCR反應之重疊模 板。藉由使用標準同源重組法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Not I雙重消化PB0S-hCk哺乳動物表現載體（Abbott) 中。已使用類似方法產生如下所述之DVDBASL及 DVDBALL： 實例1.4.3 : DVDBASL及DVDBALL之DNA構築體分子選殖 為了產生重鏈構築體DVDBAHC-LL及DVDBAHC-SL， 使用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3'引子分別含有短/ 長連接子序列）來PCR擴增抗體B之VH域；同時使用特定引 子（對於SL/LL構築體而言，5'引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增抗體A之VH域。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 150428.doc •314· 201119673 於使用標準PCR條件進行之後續重疊PCR反應之重疊模 板。藉由使用標準同源重組法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Sal I雙重消化pBOS-hCYl,z非a哺乳動物表現載體 (Abbott)中。 為了產生輕鏈構築體DVDBALC-LL及DVDBALC-SL，使 用特定引子（對於SL/LL構築體而言，331子分別含有短/長 連接子序列）來PCR擴增抗體B之VL域；同時使用特定引子 (對於SL/LL構築體而言，5'引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增抗體A之VL域。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於使用標準PCR條件進行之後續重疊PCR反應之重疊模 板。藉由使用標準同源重組法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Not I雙重消化pBOS-hCk哺乳動物表現載體（Abbott) 中〇 實例1.4.4:其他DVD-Ig之建構及表現 實例1.4.4.1:0¥0-4載體構築體之製備 可藉由如上文所述製備融合瘤或可藉由定序已知抗體蛋 白質或核酸獲得併入DVD-Ig中之識別特定抗原或其抗原 決定基之特定抗體的親本抗體胺基酸序列。此外，已知序 列可自文獻獲得。可用該等序列藉由使用標準DNA合成或 擴增技術且使用標準重組DNA技術將所需抗體片段組裝至 表現載體中來合成核酸以供在細胞中表現。 舉例而言，自胺基酸序列測定核酸密碼子且由Blue Heron Biotechnology, Inc. (www.blueheronbio.com) Bothell, 150428.doc -315- 201119673 WA USA合成寡核苷酸DNA*將寡核苷酸組裝至300-2,000 個鹼基對雙股DNA片段中，選殖至質體載體中且驗證序 列。使用酶促方法組裝經選殖片段產生全基因且次選殖至 表現載體中。（參看 7,306,914 ; 7,297,541 ; 7,279,159 ; 7,150,969 ； 20080115243 ； 20080102475 ； 20080081379 ； 20080075690 ； 20080063780 ； 20080050506 ； 20080038777 ； 20080022422 ； 20070289033 ； 20070287170 ； 20070254338 ； 20070243194 ； 20070225227 ； 20070207171 ； 20070150976 ； 20070135620 ； 20070128190 ； 20070104722 ； 20070092484 ； 20070037196 ； 20070028321 ； 20060172404 ； 20060162026 ； 20060153791 ; 20030215458 ; 20030157643)。 將pHybE載體之組（美國專利申請案第61/021,282號）用於 親本抗體及DVD-Ig選殖。使用源自pJP183; pHybE-hCgl，z, 非-a V2之VI選殖具有野生型恆定區之抗體及DVD重鏈。 使用源自pJP191; pHybE-hCk V2之V2選殖具有κ恆定區之 抗體及DVD輕鏈。使用源自pJP192; pHybE-hCl V2之V3選 殖具有λ恆定區之抗體及DVD輕鏈。使用以λ信號肽及κ恆 定區構造之V4選殖具有λ-κ雜交V域之DVD輕鏈。使用以κ 信號肽及λ恆定區構造之V5選殖具有κ-λ雜交V域之DVD輕 鏈。使用源自pJP 1 83; pHybE-hCg 1 ,ζ,非-a V2之V7選殖具 有（234,23 5 AA)突變恆定區之抗體及DVD重鏈。 表9顯示用於選殖親本抗體以及DVD-Ig VH及VL鏈之載 體。 150428.doc -316- 201119673 表9:用於選殖親本抗體及DVD-Ig之載體
ID 重鏈載體 輕鏈載體 AB001 VI V2 AB002 VI V2 AB004 VI V2 AB006 VI V2 AB039 VI V2 AB064 VI V2 AB110 VI V2 AB114 VI V2 AB119 VI V2 DVD1011 VI V2 DVD1012 VI V2 DVD1013 VI V2 DVD1014 VI V2 DVD1015 VI V2 DVD1016 VI V2 DVD1017 VI V2 DVD1018 VI V2 DVD1019 VI V2 DVD 1020 VI V2 DVD1021 VI V2 DVD 1022 VI V2 DVD 1023 VI V2 DVD 1024 VI V2 DVD 1025 VI V2 DVD 1026 VI V2 DVD 1027 VI V2 DVD 1028 VI V2 DVD 1029 VI V2 DVD1030 VI V2 DVD 1031 VI V2 DVD 1032 VI V2 DVD 103 3 VI V2 DVD 1034 VI V2 DVD 103 5 VI V2 DVD 103 6 VI V2 DVD 103 7 VI V2 DVD 103 8 VI V2 DVD1039 VI V2 DVD 1040 VI V2 DVD 1041 VI V2 DVD 1042 VI V2 DVD 1208 VI V2 DVD 1209 VI V2 150428.doc -317· 201119673 ID 重鏈載體 輕鏈載體 DVD1210 VI V2 DVD1211 VI V2 DVD1212 VI V2 DVD1213 VI V2 DVD1216 VI V2 DVD1217 VI V2 實例1.4.4.2 :在293細胞中轉染及表現 藉由以含有相應輕鏈（LC)及重鏈（HC)核酸之質體短暫共 轉染HEK293(EBNA)細胞完成參考抗體及DVD-Ig之表現。 在C02培育器（8% C02、125 RPM、37°C)中振盪之燒瓶（2 L Corning 目錄號 431 198)中，以 0_5 L 規模在Freestyle 293 培 養基（Invitrogen，Carlsbad CA)中繁殖 HEK293(EBNA)細 胞。當培養物達到每毫升1 x 1 〇6個細胞之密度時，以轉染 複合物轉染細胞。藉由首先在25 ml Freestyle培養基中將 150 pg LC-質體與100 pg HC-質體混合在一起，隨後添加 500 μΐ PEI儲備溶液[儲備溶液：1 mg/ml(pH 7_0)Linear 2 5 kD a PEI，Polysciences目錄號23966]來製備轉染複合物。 藉由反轉來混合轉染複合物且在添加至細胞培養物中之前 在室溫下培育10分鐘。在轉染後，培養物在C02培育器 (8% C02、125 RPM、37°C )中繼續生長。轉染後24小時， 向培養物補充 25 ml 1 0% Tryptone N1 溶液（Organo Technie, La Courneuve France目錄號19553)。轉染後9天，藉由離心 (1 6,000 g，10分鐘）自培養物移除細胞，且將剩餘之上清 液無菌過濾、（Millipore HV Durapore Stericup，0.45 μηι)，且 置於4°C下直至開始純化步驟。
各抗體或DVD-Ig分別使用含有MabSelect SuRe樹脂（GE 150428.doc -318- 201119673
Healthcare)之拋棄式 1 ml填料塔（由 Orochem Technologies 填料）純化。管柱在PBS中預平衡，且接著以1 ml/min裝載 所收集之0.55 L樣品隔夜（1 5小時），使流過物循環回到饋 料容器中。在裝載步驟之後，以20 ml PBS洗滌管柱，且 藉由以4 ml/min饋入溶離缓衝液[50 mM檸檬酸pH 3.5]溶離 蛋白質，且將溶離份（1 ml)收集於已含有〇·2 ml 1.5 M Tris pH 8.2之試管中（使最終pH達到約6.0)。基於層析彙聚含有 抗體之溶離份，且透析至最終儲備緩衝液[1〇 mM檸檬酸、 10 mM Na2HP04，pH 6.0]中。透析後，使樣品經〇_22 μηι Steriflip(Millipore)過濾，且藉由吸光度測定蛋白質濃度 [Hewlett Packard 8453二極體陣列分光光度計]。對分析型 樣品（還原樣品及未還原樣品）進行SDS-PAGE分析以評定 最終純度，驗證適當尺寸之重鏈及輕鏈條帶之存在’且確 認無大量游離（例如未複合）輕鏈（在未還原樣品中）存在。 表10含有親本抗體或DVD-Ig構築體之產量數據’表示 為每公升2 9 3細胞中的毫克數。 表10 :親本抗體及DVD-Ig構築體於293細胞中之短暫表現產量 親本抗體或DVD-IgID N末端可變域 (VD) C末端可變域 (VD) 表現產量(mg/L) AB119 -NT ΓΧ 1.6 DVD 1208 MTX CD20 0 DVD 1209 CD20 MTX 0.12 DVD1210 MTX EGFR(序列 3) 0 DVD1211 — EGFR(序列力 MTX 1.94 DVD1212 MTX Her2(序列 1) U DVD1213 Her2(序列 1) MTX 2.6 DVD1216 MTX CD-3(序列υ U DVD1217 CD-3(序列 i) MTX U.jo 150428.doc -319- 201119673 所有DVD-Ig在293細胞中良好表現。DVD-Ig可輕易地經 蛋白質A管柱純化。在多數情形中，可自293細胞之上清液 輕易地獲得>5 mg/L經純化DVD-Ig。 實例1.4.5 : A/B DVD-Ig之表徵及前導選擇 在Biacore上針對蛋白質A及蛋白質B分析抗A/B DVD-Ig 之結合親和力。藉由Biacore上之多次結合研究檢驗DVD-Ig之四價特性。同時，分別藉由如本文所述之生物檢定評 定DVD-Ig針對蛋白質A及蛋白質B之中和效能。選擇最佳 保留初始親本mAb之親和力及效能之DVD-Ig分子用於如本 文所述對各mAb的深入物理化學及生物分析（大鼠PK)表 徵。基於分析之集合，使最終前導DVD-Ig進入CHO穩定 細胞株發展中，且來源於CHO之物質用於石蟹獼猴中之穩 定性、藥物動力學及功效研究，及預調配活性。 實例2:雙可變域免疫球蛋白（DVD-Ig)之產生及表徵 根據實例1.4.4.1藉由合成編碼DVD-Ig可變重鏈及DVD-Ig可變輕鏈序列之聚核苷酸片段且將片段選殖至pHybC-D2 載體中，產生使用具有已知胺基酸序列之親本抗體的雙可 變域免疫球蛋白（DVD-Ig)。如實例1·4·4·2中所述將DVD-Ig 構築體選殖至且表現於293細胞中。根據標準方法純化 DVD-Ig蛋白。如所指示，根據實例1.1_1及1.1.2所述之方 法確定功能特徵。下文提供用於本發明DVD-Ig之DVD-Ig VH及VL鏈。 150428.doc • 320- 201119673 實例2.1 :具有短-短連接子之甲胺喋呤及小鼠cd-3 DVD-Ig之產生 表11
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 110 DVD1011H AB119VH AB110VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPEVQLVESGGGLVQPGKSL KLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITS SSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKS EDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSS 111 DVD1011L AB119VL AB110VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLL工YKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDIQMTQSPSSLPASLGDRVTIN CQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADG VPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESED工GSYYCQQYY NYPWTFGPGTKLEIKR 112 DVD1012H AB110VH AB119VH EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMH WVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTV SRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNY WGQGTMVTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPSQSL SLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMGYIS YRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT EDTATYFCS SYGNYGAYSGQGTLVTVSA 113 DVD1012L AB110VL AB119VL DIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNW YQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRD SSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLE IKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQ SIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTQLELKR 321 · 150428.doc 201119673 實例2.2:具有長-長連接子之曱胺喋呤及小鼠CD-3 DVD-Ig之產生 表12
S£Q ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 114 DVD1013H AB119VH AB110VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPEVQLVESGGGL VQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLE SVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFL QMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSS 115 DVD1013L AB119VL AB110VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLPASL GDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYY TNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGS YYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKR 116 DVD1014H AB110VH AB119VH EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMH WVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTV SRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNY WGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPDVQLQESGPGL VKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTL EWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 117 DVD1014L AB110VL AB119VL DIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNW YQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRD SSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLE IKRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLGDQAS 工SCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGV YYCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR 322 -
150428.doc 201119673 實例2.3:具有長-短連接子之甲胺喋呤及小鼠CD-3 DVD-Ig之產生 表13
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外寸變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 118 DVD1015H AB119VH AB110VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPEVQLVESGGGL VQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLE SVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFL QMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSS 119 DVD1015L AB119VL AB110VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDIQMTQSPSSLPASLGDRVTIN CQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADG VPSRFSGSGSGRDSSFTXSSLESEDIGSYYCQQYY NYPWTFGPGTKLEIKR 120 DVD1016H AB110VH AB119VH EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMH WVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTV SRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNY WGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPDVQLQESGPGL VKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTL EWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 121 DVD1016L AB110VL AB119VL DIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNW YQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRD SSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLE IKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQ SIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTQLELKR 323 - 150428.doc 201119673 實例2.4 :具有短-長連接子之甲胺喋呤及小鼠CD-3 DVD-Ig之產生 表14
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 122 DVD1017H AB119VH AB110VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPEVQLVESGGGLVQPGKSL KLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITS SSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKS EDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSS 123 DVD1017L AB119VL AB110VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPD工QMTQSPSSLPASL GDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYY TNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGS YYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKR 124 DVD1018H AB110VH AB119VH EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMH WVRQAPGRGLESVAYITSSSINXKYADAVKGRFTV SRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNY WGQGTMVTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPSQSL SLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMGYIS YRGSTTHHPSLKSRXSITRDTSKNQFFLQLNSVTT EDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 125 DVD1018L AB110VL AB119VL DIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNW YQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRD SSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLE IKRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLGDQAS ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGV YYCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR 324- 150428.doc 201119673 實例2.5 :具有短-短連接子之甲胺喋呤及小鼠CD-I9 DVD-Ig之產生 表15
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 126 DVD1019H AB119VH AB114VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPEVQLQQSGAELVRPGTSV KLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLEWIGRIDP EDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYLKLSSLTS EDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSS 127 DVD1019L AB119VL AB114VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDIQMTQSPASLSTSLGETVTIQ CQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYGASDLQDG VPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGVYFCQQGL TYPRTFGGGTKLELKR 128 DVD1020H AB114VH AB119VH EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMH FVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATL TADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDY WGQGVMVTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPSQSL SLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMGYIS YRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT EDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 129 DVD1020L AB114VL AB119VL DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAW YQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQ YSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLE LKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQ SIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HV PLT FGAGTQLELKR 325· 150428.doc 201119673 實例2.6 :具有長-長連接子之甲胺喋呤及小鼠CD-19 DVD-Ig之產生 表16
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 130 DVD1021H AB119VH AB114VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPEVQLQQSGAEL VRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLE WIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYL KLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSS 131 DVD1021L AB119VL AB114VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPASLSTSL GETVTIQCQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYG ASDLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGV YFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKR 132 DVD1022H AB114VH AB119VH EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMH FVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATL TADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDY WGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPDVQLQESGPGL VKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTL EWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 133 DVD1022L AB114VL AB119VL DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAW YQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQ YSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLE LKRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLGDQAS ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGV YYCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR 326- 150428.doc 201119673 實例2.7 :具有長-短連接子之曱胺喋呤及小鼠CD-19 DVD-Ig之產生 表17
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 134 DVD1023H AB119VH AB114VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWXRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPEVQLQQSGAEL VRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLE WIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYL KLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSS 135 DVD1023L AB119VL AB114VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDIQMTQSPASLSTSLGETVTIQ CQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYGASDLQDG VPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGVYFCQQGL TYPRTFGGGTKLELKR 136 DVD1024H AB1X4VH AB119VH EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMH FVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATL TADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCXYGGYYFDY WGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPDVQLQESGPGL VKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTL EWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 137 DVD1024L AB114VL AB119VL DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAW YQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQ YSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLE LKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQ SIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTQLELKR 327· 150428.doc 201119673 實例2.8 :具有短-長連接子之甲胺喋呤及小鼠CD-19 DVD-Ig之產生 表18
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 123456789O1234567890123456789O12345 138 DVD1025H AB119VH AB114VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYXSYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPEVQLQQSGAELVRPGTSV KLSCKVSGDTITFYYMHFVKQRPGQGLEWXGRIDP EDESTKYSEKFKNKATLTADTSSNTAYLKLSSLTS EDTATYFCIYGGYYFDYWGQGVMVTVSS 139 DVD1025L AB119VL AB114VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPDIQMTQSPASLSTSL GETVTIQCQASEDIYSGLAWYQQKPGKSPQLLIYG ASDLQDGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSMQTEDEGV YFCQQGLTYPRTFGGGTKLELKR 140 DVD1026H AB114VH AB119VH EVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITFYYMH HVKQRPGQGLEWIGRIDPEDESTKYSEKFKNKATL TADTSSNTAYLKLSSLTSEDTATYFCIYGGYYFDY WGQGVMVTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPSQSL SLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMGYIS YRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT EDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 141 DVD1026L AB114VL AB119VL DIQMTQSPASLSTSLGETVTIQCQASEDIYSGLAW YQQKPGKSPQLLIYGASDLQDGVPSRFSGSGSGTQ YSLKITSMQTEDEGVYFCQQGLTYPRTFGGGTKLE LKRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLGDQAS ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGV YYCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR • 328-
150428.doc 201119673 實例2.9:具有短-短連接子之甲胺喋呤及人類CD-3(序列 2)DVD-Ig之產生 表19 '
S£Q ID NO DVD 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 142 DVD1027H AB119VH AB039VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQSGAELARPGASV KMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINP SRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTS EDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS 143 DVD1027L AB119VL AB039VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMT CSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGV PAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSS NPFTFGSGTKLEINR 144 DVD1028H AB039VH AB119VH QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATL TTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYC LDYWGQGTTLTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPS QSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMG YISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNS VTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 145 DVD1028L AB039VL AB119VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWY QQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSY SLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLE工 NRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQS IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLL工YKVSTRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSH VPLTFGAGTQLELKR 329- 150428.doc 201119673 實例2.10 :具有長-長-短連接子之甲胺喋呤及人類CD_3(序 列2)DVD-Ig之產生 表20
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 146 DVD1029H AB119VH AB039VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWXRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATVFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPQVQLQQSGAEL ARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLE WIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYM QLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLT VSS 147 DVD1029L AB119VL AB039VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPQIVLTQSPAIMSASP GEKVTMTCSAS S SVSYMNWYQQKSGT S PKRWIYDT SKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATY YCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR 148 DVD1030H AB039VH AB119VH QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWXGYINPSRGYTNYNQKFKDKATL TTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYC LDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPDVQLQESG PGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPG NTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQ FFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVT VSA 149 DVD1030L AB039VL AB119VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWY QQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSY SLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEI NRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASI SCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV STRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVY YCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR - 330- 150428.doc 201119673 實例2.11 :具有長-短連接子之甲胺喋呤及人類CD-3(序列 2)DVD-Ig之產生 表21
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 150 DVD1031H AB119VH AB039VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPQVQLQQSGAEL ARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLE WIGYINPSRGYTOYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYM QLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLT VSS 151 DVD1031L AB119VL AB039VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMT CSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGV PAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSS NPFTFGSGTKLEINR 152 DVD1032H AB039VH AB119VH QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTOYNQKFKDKATL TTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYC LDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPDVQLQESG PGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPG NTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQ FFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVT VSA 153 DVD1032L AB039VL AB119VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWY QQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSY SLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEI NRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQS 工VHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSH VPLTFGAGTQLELKR 331 - 150428.doc 201119673 實例2.12 :具有短-長連接子之曱胺喋呤及人類CD_3(序列 2)DVD-Ig之產生 表22
SEQ ID NO DVD可變_ 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 154 DVD1033H AB119VH AB039VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWXRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQSGAELARPGASV KMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWXGYINP SRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTS EDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS 155 DVD1033L AB119VL AB039VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPQIVLTQSPAIMSASP GEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDT SKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATY YCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR 156 DVD1034H AB039VH AB119VH QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGY工MPSRGYTNYMQKFKDKATL TTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYC LDYWGQGTTLTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPS QSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMG YISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNS VTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 157 DVD1034L AB039VL AB119VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWY QQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSY SLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLE工 NRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASI SCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV STRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVY YCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR 332 - 150428.doc 201119673 實例2.13 :具有短-短連接子之甲胺喋呤及人類CD-19 DVD-Ig之產生 表23
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 158 DVD1035H AB119VH AB006VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQSGAELVRPGSSV KISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWP GDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLAS EDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVS S 159 DVD1035L AB119VL AB006VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDILLTQTPASLAVSLGQRATIS CKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASN LVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHC QQSTEDPWTFGGGTKLEIKR 169 DVD1036H AB006VH AB119VH QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMN WVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATL TADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVG RYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPDVQLQESGPG LVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNT LEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFF LQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVS A 161 DVD1036L AB006VL AB119VL DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDS YLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSG SGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGG TKLEIKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVST RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPLTFGAGTQLELKR - 333 - 150428.doc 201119673 實例2.14:具有長-長連接子之甲胺喋呤及人類CD-19 DVD-Ig之產生 表24
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 162 DVD1037H AB119VH AB006VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPQVQLQQSGAEL VRPGSSVKXSCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLE WIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYM QLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQ GTSVTVSS 163 DVD1037L AB119VL AB006VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKXSRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPDILLTQTPASLAVSL GQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKL LIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKV DAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKR 164 DVD1038H AB006VH AB119VH QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMN WVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATL TADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVG RYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPXAPDVQ LQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWI RQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRD TSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQ GTLVTVSA 165 DVD1038L AB006VL AB119VL DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDS YLNWYQQIPGQPPKLLXYDASNLVSGIPPRFSGSG SGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLG DQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKL LIYKVSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR 334- 150428.doc 201119673 實例2.15 :具有長-短連接子之甲胺喋呤及人類CD-19 DVD-Ig之產生 表25
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 166 DVD1039H AB119VH AB006VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPQVQLQQSGAEL VRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLE WIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYM QLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQ GTSVTVSS 167 DVD1039L AB119VL AB006VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDILLTQTPASLAVSLGQRATIS CKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASN LVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHC QQSTEDPWTFGGGTKLEIKR 168 DVD1040H AB006VH AB119VH QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMN WKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATL TADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVG RYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPDVQ LQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNW工 RQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRD TSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQ GTLVTVSA 169 DVD1040L AB006VL AB119VL DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDS YLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSG SGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGG TKLEIKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVST RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPLTFGAGTQLELKR 335 - 150428.doc 201119673 實例2.16:具有短-長連接子之甲胺喋呤及人類CD-19 DVD-Ig之產生 表26
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 170 DVD104XH AB119VH AB006VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSXTSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQSGAELVRPGSSV KISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQXWP GDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLAS EDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVS S 171 DVD1041L AB119VL AB006VL DVLLTQ 工 PLSLPVSLGDQAS.ISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPSVFIFPPDILLTQTPASLAVSL GQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKL LIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKV DAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKR 172 DVD1042H AB006VH AB119VH QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMN WVKQRPGQGLEWIGQ工WPGDGDTNYNGKFKGKATL TADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVG RYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPDVQLQESGPG LVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNT LEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFF LQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVS A 173 DVD1042L AB006VL AB119VL DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDS YLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSG SGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPDVLLTQIPLSLPVSLG DQASISCRS SQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQS PKL LIYKVSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTQLELKR -336- 150428.doc 201119673 實例2.17 :具有短·短連接子之甲胺喋呤及人類CD_2〇 DVD-Ig之產生 表27
SCQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 17 4 DVD1208H AB119VH AB001VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQPGAELVKPGASV KMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYP GNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTS EDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA 175 DVD1208L AB119VL AB001VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPQIVLSQSPAILSPSPGEKVTMT CRASSSVSY工HWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGV PVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTS NPPTFGGGTKLEIKR 176 DVD1209H AB001VH AB119VH QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMH WVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATL TADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGD WYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPDVQLQESGPGLVK PSQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNW工RQFPGNTLEW MGYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQL NSVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 177 DVD1209L AB001VL AB119VL QIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTCRASSSVSYIHWF QQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSY SLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEI KRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQS IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSH VPLTFGAGTQLELKR 337- 150428.doc 201119673 實例2.18 :具有短-短連接子之甲胺喋呤及人類EGFR(序列 3)DVD-Ig之產生 表28
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 178 DVD1210H AB119VH AB064VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQESGPGLVKPSQTL SLTCTVSGYSISSDFAWNWIRQPPGKGLEWMGYIS YSGNTRYQPSLKSRITISRDTSKNQFFLKLNSVTA ADTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS 179 DVD1210L AB119VL AB064VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDIQMTQSPSSMSVSVGDRVTIT CHSSQDINSNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLDDG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYA QFPWTFGGGTKLEIKR 180 DVD1211H AB064VH AB119VH QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDFAW NWIRQPPGKGLEWMGYISYSGNTRYQPSLKSRITI SRDTSKNQFFLKLNSVTAADTATYYCVTAGRGFPY WGQGTLVTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPSQSL SLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMGYIS YRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTT EDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 181 DVD1211L AB064VL AB119VL DIQMTQSPSSMSVSVGDRVTITCHSSQDINSNIGW LQQKPGKSFKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGTD YTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKLE SIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTQLELKR - 338 - 150428.doc 201119673 實例2.19:具有短-短連接子之甲胺喋呤及人類jjeR-2(序 列1)DVD-Ig之產生 表29
S£Q ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 182 DVD1212H AB119VH AB004VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPEVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRA EDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS 183 DVD1212L AB119VL AB004VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCF'QGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG VPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHY TT P PT FGQGTKVE 工 KR 184 DVD1213H AB004VH AB119VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIH WVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKP SQSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWM GYISYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLN SVTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 185 DVD1213L AB004VL AB119VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTXTCRASQDVNTAVAW YQQKPGKAPKLLXYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVE IKRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQ SIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTQLELKR
339- 150428.doc 201119673 實例2.20 :具有短-短連接子之甲胺喋呤及人類CD-3(序列 1)DVD-Ig之產生 表30
SEQ ID NO DVD可變 域名稱 外可變域 名稱 内可變域 序列 12345678901234567890123456789012345 X86 DVD1216H AB119VH AB002VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSPYAW NWIRQFPGNTLEWMGYISYRGSTTHHPSLKSRISI TRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCSSYGNYGAY SGQGTLVTVSAASTKGPQVQLQQSGAELARPGASV KMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINP SRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTS EDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS 187 DVD1216L AB119VL AB002VL DVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGA GTQLELKRTVAAPQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMT CRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGV PYRFSGSGSGTSYSLTXSSMEAEDAATYYCQQWSS NPLTFGSGTKLEINR 188 DVD1217H AB002VH AB119VH QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATL TTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYC LDYWGQGTTLTVSSASTKGPDVQLQESGPGLVKPS QSLSLTCTVTGFSITSPYAWNWIRQFPGNTLEWMG YXSYRGSTTHHPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNS VTTEDTATYFCSSYGNYGAYSGQGTLVTVSA 189 DVD1217L AB002VL AB119VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWY QQKSGTSPKRWIVDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSY SLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGSGTKLEI NRTVAAPDVLLTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQS IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSH VPLTFGAGTQLELKR
實例2.21:用於選殖親本抗體及DVD-Ig序列之選殖載艎 序列 · 表31
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 VI 190 GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC •340- 150428.doc 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACC7VATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT GCAATATGATACTGGGGTTATTT^AGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGAC7WVTTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAT^TGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT 150428.doc -341 - 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC C7VAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGA/y\CAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAT^AAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTT^AACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTi\AATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCT^AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG
150428.doc •342· 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC V2 191 ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCT^ACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATT^ATCCTAGTGCAATATGA TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCC ACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAA TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGG ACTGTAAAATAAGGGTGTT^ATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCAC TGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGG7VATAC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTG GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATA TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCAT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAA TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGC ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCT AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA 150428.doc - 343 - 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCG GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGAT AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCAT GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGG TAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATT ATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTT GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATT TAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCC TTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCT^AGAGCTACC AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGi^AACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATT TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAG7U\GTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGT^AGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGT^ATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG
150428.doc - 344- 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCC AGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC V3 192 CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG aactaaacctgactacgacatctctgccccttcttcgcggggcagtgcatg TAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTA ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT GTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG CATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG GACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT 150428.doc -345 - 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG CTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAG AGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTA CCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGC TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGT AGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAG TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCT TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAA GATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTT TAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGA GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTC ACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGA TCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCG CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT7UVT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCT TCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTC TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGT AGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA?^ATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTA ACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA GCGT^ACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAG GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA GGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCC GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCT AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATG
150428.doc 346· 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGT CTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCAC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTG GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGT CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAG TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTG CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGA GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGC CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCA AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTT TGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAG ATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCC GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAG GCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGA AGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGACCT CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCTTC CTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG V4 193 ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGC7V7UVTCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT AT^AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GG7VAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACC7U\TATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAAT7VAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTT^AAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGC7\ATATGA TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC 150428.doc -347- 201119673
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150428.doc •348 · 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAG'GCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG gcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggt TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGT^AAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCT TCCTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG V5 194 CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCT7VATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG AACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATG TAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTA ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG 150428.doc 349 · 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATT^ATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT GTAAAATAAGGGTGTAAT7VACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG CATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG GACAi\ATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG CTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAG agattagggtagtatatgctatcctaatttatatctgggtagcatatacta CCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCT7VATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGC TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGT AGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAG TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCT TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAATVAGATGCTGAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAA GATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTT TAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGC71AGA GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTC ACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTT^ACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGA TCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCT^ATGGCAACAACGTTGCG CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCT TCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTC TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGT AGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATG7\ACGAAATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTA ACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA
I50428.doc • 350 - 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAG GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAT^ACGCCTGGTA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA GGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCC GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG71AAGCGGGCAG TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCT AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATG GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGT CTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCAC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTG GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGT CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAG TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTG CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGA GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGC CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCA AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTT TGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAG * ATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCC GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAG GCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGA AGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGACCT CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAG CTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC V7 195 GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACATW^CTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACZVAGTGC AAGGTCTCCAAC7\AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC 150428.doc •351 · 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789O123456789O1234567890123456789O12345678901 GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAG/^ATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT GCAATATGATACTGGGGTTATT7VAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACA7VAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG . CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GT^AGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA
150428.doc - 352- 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACT^ACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGT.TGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC T^ACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGC7^ACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGT^AAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG 150428.doc • 353 · 201119673
載體名 稱 SEQ ID NO 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC 本發明以全文引用的方式並有分子生物學及藥物傳遞領 域中熟知之技術。此等技術包括（但不限於）以下公開案中 所述之技術：
Ausubel 等人（編），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；
Ausubel，F.M.等人編，Short Protocols In Molecular Biology (第 4版 1999) John Wiley & Sons，NY. (ISBN 0-471-32938-X)；
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance，Smolen及 Ball (編），Wiley，New York (1984)；
Giege，R.及 Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach，第 2版， 第 20 1-16 頁，Oxford University Press, New York, New York, (1999)；
Goodson，Medical Applications of Controlled Release, 第 2卷，第 115-138 頁（1984);
Hammerling 等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)；
Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual，（Cold -354- 150428.doc 201119673
Spring Harbor Laboratory Press,第 2版 1988);
Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological
Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及（1991));
Kabat, E.A.等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第 91-3242號；
Kontermann 及 Dubel 編，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.第 790頁（ISBN 3-540-41354-5)。
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；
Lu 及 Weiner 編，Cloning and Expression Vectors for
Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA.第 298 頁（ISBN 1-881299-21-X);
Medical Applications of Controlled Release, Langer及 Wise (編），CRC Pres·，Boca Raton, Fla. (1974);
Old, R. W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (第 3 版 1985) Blackwell Scientific Publications，Boston. Studies in Microbiology;第 2 卷：第 409 頁（ISBN 0-632-01318-4)；
Sambrook, J.等人編，Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (第 2版 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.第 1-3卷（ISBN 0-87969-309-6); 150428.doc -355 - 201119673
Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems，J.R. Robinson編，Marcel Dekker, Inc·，New York， 1978
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (Horst Ibelgaufts翻譯）。第 634頁。（ISBN 0-89573-614-4)。 參考文獻併入 本申請案全文可能引用之所有引用參考文獻之内容（包 括參考文獻、專利、專利申請案及網站）以及其中所引用 之參考文獻係出於任何目的以全文引用的方式明確併入本 文中。除非另外說明，否則本發明之實施將使用此項技術 中熟知的免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術。 等效物 本發明可在不悖離其精神或基本特徵之情況下以其他特 疋形式實施。因此前述實施例在所有態樣中均為說明性而 非限制本文所述之本發明。因此本發明之範疇由隨附申請 專利範圍而非前述描述指定，此本文意欲涵蓋申請專 利範圍等效物之含義及範圍内的所有變化。 【圖式簡單說明】 圖1A為雙可變域⑴乂⑺—“構築體之示意圖’且展示自兩 個親本抗體產生DVD-Ig之策略； 圖為構築體DVDWg、DVD2_Ig、及兩個來自融合瘤 純系2D13.E3(抗-IL-la)及13F5.G5(抗-IL-Ιβ)之嵌合單特異 性抗體的示意圖。 150428.doc - 356 ·

Claims (1)

  1. 201119673 七、申請專利範圍： 1· 一種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中； VD1為第一重鍵可變域； VD2為第二重鍵可變域； C為重鏈恆定域； X1為連接子，限制條件為X1不為C Η1， Χ2為Fc區；及 ® η為0或1 ; 其中該結合蛋白結合選自由以下組成之群的抗原對： ΜΤΧ 與 mCD-3、ΜΤΧ 與 mCD-19、ΜΤΧ 與 hCD-3(序列 2)、MTX 與 hCD-19(序列 2)、MTX 與 CD-20、MTX 與 EGFR(序列 3)、MTX與 HER-2(序列 1)、及 MTX與 CD-3(序 列1)。 2·如請求項1之結合蛋白，其中VD1及VD2包含選自由以下 • 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 66、96、98、 100。 3. 一種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含vd i _ (Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中； VD 1為第一輕鏈可變域； VD2為第二輕鏈可變域； C為輕鏈恆定域； X1為連接子，限制條件為X i不為CHi ; X2不包含Fc區；及 150428.doc 201119673 η為0或1 ; 其中該結合蛋白結合選自由以下組成之群的抗原對： ΜΤΧ 與 mCD-3、ΜΤΧ 與 mCD-19、ΜΤΧ 與 hCD-3(序列 2)、MTX 與 hCD_19(序列 2)、MTX 與 CD-20、MTX 與 EGFR(序列 3)、MTX與 HER-2(序列 1)、及 MTX與 CD-3(序 列1)。 4. 如請求項3之結合蛋白，其中該VD1及VD2輕鏈可變域包 含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 67、 97、99及 101。 5. 如請求項1或3之結合蛋白，其中η為〇。 6. —種結合蛋白，其包含第—及第二多肽鏈，其中該第— 多狀鏈包含第一 VDl-(Xi)n_vD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一重鍵可變域； V D 2為第_—重鍵可變域. C為重鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為X1不為CH1; X2為Fc區；及 其中該第二多M 狀鏈包含第二 VDl-(Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中 VD1為第一輕鏈可變域. VD2為第二輕鏈可變域· C為輕鏈怪定域； XI為連接子， X2不包含Fc區 限制條件為XI不為 CH1 ； :及 150428.doc 201119673 η為0或1，其中s亥結合蛋白結合選自由以下組成之群 的抗原對：MTX 與 mCD-3、MTX 與 mCD-19、MTX 與 hCD-3(序列 2)、MTX與 hCD-1 9(序列 2)、MTX與 CD-20、 MTX與 EGFR(序列 3)、MTX與 HER-2(序列 1)、及 MTX與 CD-3(序列 1)。 7.如請求項6之結合蛋白’其中該等VD1及VD2重鏈可變域 包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 66、96、98、100 ’及其中該等VD1及VD2輕鏈可變域包 含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 67、 97、99及 101。 8·如請求項1、3或6之結合蛋白，其中XI或X2為選自由 SEQ ID NO 1-26組成之群的胺基酸序列。 9 _如請求項6之結合蛋白，其中該結合蛋白包含兩個第一 多肽鏈及兩個第二多肽鏈。 10. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該Fc區係選自由原 生序列Fc區及變異序列Fc區組成之群。 11. 如請求項1〇之結合蛋白，其中該Fc區係選自由igG1 ’、 IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及 IgD 的 Fc 區級成之 群。 12. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD1及該第二多肽鏈之該VD1係分別自相同第一及第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得。 13. 如請求項1、3或6之結合蛋白’其中該第一多肽鏈之該 VD1及該第二多肽鏈之該VD1係分別自不同第一及第二 150428.doc 201119673 親本抗體或其抗原結合部分獲得。 14·如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD2及該第二多肽鏈之該VD2係分別自相同第一及第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得。 15·如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD2及該第二多肽鏈之該VD2係分別自不同第一及第二 親本抗體或其抗原結合部分獲得。 1 6.如請求項13之結合蛋白，其中該第一及該第二親本抗體 結合該抗原上的不同抗原決定基。 17. 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之效能不同於該第二親本抗體 或其抗原結合部分結合該第二抗原之效能。 18. 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之親和力不同於該第二親本抗 體或其抗原結合部分結合該第二抗原之親和力。 19. 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 。卩分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體組成之群。 20. 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分、及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由以下組成之群：Fab片段；F(ab，）2片段，包含兩個Fab 片段在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之二價片段；由¥11域及 CH1域組成之Fd片段；由抗體單臂之域及vh域組成 之Fv片段；dAb片段；分離之互補決定區（cdr);單鏈抗 150428.doc 201119673 體；及雙功能抗體（diabody)。 2 1.如請求項丨、3或6之結合蛋白，其 Μ合蛋白且 少一種由該第一親本抗體或其抗原結合部分η /、 本抗體或其抗原結合部分展現之所需特性。或°亥第—親 22·如請求項21之結合蛋白，其中該所需特性 種抗體參數。 ，、選自一或多 23. 如請求項21之結合蛋白，其中該等抗體參數係選自由以 下組成之群：抗原特異性 '對抗原之親和力、效能、生 物功能、抗原決定基識別、穩定性、溶解度^生= 率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交又2 應性及直系同源（orth〇l〇gOUS)抗原結合。 24. —種結合兩個抗原之結合蛋白，其包含四個多肽鏈，其 中兩個多肽鏈包含乂〇1-(又1)11_乂02-(：-(乂2)11，其中 VD1為第一重鏈可變域； VD2為第二重鏈可變域； C為重鏈恆定域； XI為連接子’限制條件為幻不為CH1 ; X2為Fc區；及 其中兩個多肽鏈包含VDi_(xi)n_VD2-C-(X2)n，其中 VD 1為第一輕鏈可變域； VD2為第二輕鏈可變域 C為輕鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為χι不為CH1 ; X2不包含Fc區；及 150428.doc 201119673 η為0或1 ;其中該等VD1及VD2重鏈可變域包含選自由 以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 66、96、98、 100，及其中該等VD1及VD2輕鏈可變域包含選自由以下 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 67、97、99及 101 ° 2 5 · —種結合兩個抗原之結合蛋白，其包含四値多狀鍵，其 中兩個多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一重鏈可變域； VD2為第二重鏈可變域； C為重鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為XI不為CH1 ; X2為Fc區；及 η為0或1 ;及 其中兩個多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一輕鏈可變域； VD2為第二輕鏈可變域； C為輕鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為XI不為CH1 ; X2不包含fc區；及 η為0或1 ; 其中該DVD-Ig結合至少一個選自由以下組成之群的抗 原：小鼠CD-3、人類CD-3(序列2)、小鼠CD-19、人類 CD-19、CD-20、EGFR(序列 3)、Her-2(序列 1)、CD-3(序 列 1)及曱胺喋呤（methotrexate)(MTX)。 150428.doc 201119673 26.如請求項1、3、6、24或25之結合蛋白，其中該結合疋 白對該一或多個標靶具有選自由以下细成之群的 率⑽以⑷常數^⑽广至少約…^-今…至少約…吣^·^、 少約ι〇4Μ·Υ ;至少約105Μ·ν ;及至少約1()6μ^Ί 表面電漿共振所測量。 ^如請求項丨^ + ^或以之結合蛋白^中該結人蛋 白對該-或多繼具有選自由以下組成之群的解：速 率（off rate)常數（Koff):至多約1〇-3 s.,;至多約1〇 4 s丨 ”約1。、'及至多約10·?，如表面電毁共振:斤測 置。 从如請求項卜3、6、24或25之結合蛋白，其中該結合蛋 白對該-或多個標把具有選自由以下組成之群的解離常 數（KD):至多約10·7 Μ ;至多約1〇·8 μ ;至多約ι〇 9 μ ; 至多約Η)·、；至多約10-"Μ;至多約1〇_12 多 約10-丨3 Μ。 29· 一種結合蛋白接合物(—gw)，其包含如請求項1、 3、6、24或25中任-項之結合蛋白，該結合蛋白接合物 =步包含選自由以下組成之群的藥劑：免疫黏附分 子、顯影劑、治療劑及細胞毒性劑。 3〇.^求項29之結合蛋白接合物，其中該藥劑為選自由放 :標記、酶、榮光標記、發光標記、生物發光標記、 標記及生物素組成之群的顯影劑。 31.如請求項3〇之結合蛋白接合物，其中該顯影劑為選自由 以下組成之群的放射性標記：3只、、^、9〇Y、 150428.doc 201119673 yyT ill 、In ' 丨251、丨31I、丨77Lu、166Ho及 153Sm。 32. 士吻求項3〇之結合蛋白接合物其中該藥劑為選自由以 下、’且成之群的治療劑或細胞毒性劑：抗代謝物、烷基化 ⑷抗生素、生長因子、細胞激素（cytokine)、抗血管生 成劑抗有絲分裂劑、蒽環黴素（anthracycline)、毒素及 細胞)周亡劑。 33_如請求項！、3、6、以或。之結合蛋白，其中該結合蛋 ' 白為結晶結合蛋白。 34. 如吻求項33之結合蛋白，其中該晶體為無載劑醫藥控制 釋放晶體。 35. 如請求項33之結合蛋白，其中該結合蛋白具有比該結合 蛋白之可溶性對應物長的活體内半衰期。 36. 如請求項33之結合蛋白，其中該結合蛋白保留生物活 性。 37. —種經分離之核酸，其編碼如請求項i、3、6、以或乃 中任一項之結合蛋白胺基酸序列。 38. —種載體，其包含如請求項37之經分離之核酸。 39·如請求項38之載體，其中該載體係選自由pcDNA、 pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pCDNA3.1 Τ0Ρ0、 pEF6 TOPO及pBJ組成之群e 40. —種宿主細胞’其包含如請求項38之載體。 41. 如請求項40之宿主細胞’其中該宿主細胞為原核細胞。 42. 如請求項41之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌。 43. 如請求項40之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。 150428.doc 201119673 44. 如請求項43之宿主細胞，其中該真核細胞係選自由原生 生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。 45. 如請求項43之宿主細胞，其中該真核細胞為選自由哺乳 動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞組成之群的動物細胞。 46. 如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為ch〇細胞。 47·如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為c〇s。 48. 如明求項43之宿主細胞，其中該宿主細胞為酵母細胞。 49. 如請求項48之宿主細胞，其中該酵母細胞為釀酒酵母 {^acchar〇myces cerevisiae) 〇 5〇.如4求項45之宿主細胞，其中該宿车細胞為昆蟲sf9細 胞。 ' 王、&蛋《〜々成，卉a兮如請求項40至5〇中任 項之宿主細胞在培養基中在足以產生該結合蛋白 件下培養。 # 52·如請求項51之方法’其中所產生之該結合蛋白中 75%為雙特異性四價結合蛋白。 53.如請求項51之方法，其中所產生之該結合蛋 9〇%為雙特異性四價結合蛋白。 ’❶至 Μ.如請求項51之方法’其 95〇/οΑ^ 吓座生之忒、=蛋白中9〇%至 。為雙特異性四價結合蛋白。 55·種蛋白質，其係如請求項5 1之方法產生。 一種”組合物’其包含如請求項— 之結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。 項 ^长項56之醫藥組合物，其進一步包含至少—種其他 150428.doc 201119673 治療劑。 58. 如請求項57之醫藥組合物，其中該其他治療劑係選自由 以下組成之群：治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生 成抑制劑、激酶抑制劑、協同刺激（c〇_stimulati〇n)分子 阻斷劑、黏附分子阻斷劑、抗細胞激素抗體或其功能片 段、甲胺喋呤、環孢素（cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、 FK506、可偵測標記或報導體、TNF拮抗劑、抗風濕 藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥物 (NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神 經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬藥、皮質類固 醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫、免疫球蛋白、 免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥物、 抗抑鬱劑、抗精神病藥、興奮劑（stimulant)、哮喘藥 物、β促效劑（ag0nist)、吸入類固醇、腎上腺素或其類似 物、細胞激素及細胞激素拮抗劑。 59. —種如請求項1至36及乃中任一項之結合蛋白之用途， 其係用於製造治療個體之疾病或病症之藥物。 6〇·如請求項59之用途，其中該病症係選自包含以下之群： 類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血 吐關郎炎、萊姆關節炎（Lyme arthritis)、牛皮癖性關節 炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡症、 克羅恩氏病（Crohn’s disease)、潰癌性結腸炎 '發炎性腸 病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾 病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移 150428.doc 201119673 植排斥反應、與器官移植有關之急性或慢性免疫疾病、 肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、川崎氏 病（Kawasaki’s disease)、格雷氏病（Grave,s disease)' 腎 病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病 (Wegener’s granul〇matosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癖 (Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微性血管炎、慢性 活動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候 籲 群、敗血症症候群、惡病質、傳染性疾病、寄生蟲病、 後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞 蹈病（Himting-toiVs chorea)、帕金森氏病（Parkins〇nls disease)、阿兹海默氏病（Alzheimer’s disease)、中風、原 發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性病、心臟衰竭、 〜肌梗塞、艾迪森氏病（Addison's disease)、偶發性I型 多腺體分泌不足症（p〇lyglanduiar deficiency)及II型多腺 體分泌不足症、施密特氏症候群（Schmidt，s syndr〇me)、 φ 成人（急性）呼吸窘迫症候群、脫髮、斑形脫髮、血清陰 性關郎病、關卽病、萊特爾氏病（Reiter’s disease)、牛皮 癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎，披 衣菌（chlamydia)、耶氏桿菌（yersinia)及沙門氏菌 (salmonella)相關之關節病，脊椎關節病 '動脈粥樣瘤病/ 動脈硬化、異位性過敏、自體免疫大皰病、尋常天疱 瘡、葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線狀IgA病、自體免疫溶 血性貧血、庫姆氏陽性溶血性貧血（C〇〇mbs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性貧 150428.doc 201119673 血、肌痛腦炎/皇家自由病（R〇yal Free Disease)、慢性皮 膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、 原因不明性自體免疫肝炎、後天免疫缺乏疾病症候群、 後天免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、普通變異 性（common varied)免疫缺乏症（普通變異性低γ球蛋白血 症）、擴張性心肌病、雌性不孕症、卵巢功能衰竭、印巢 早衰、纖維變性肺病、原因不明性纖維性肺泡炎、發炎 後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織病相關之間質性 肺病、合結締組織病相關之肺病、全身性硬化症相關 之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全 身性紅斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多發性肌炎相關之 肺病、休格連氏病相關之肺病（Sj0gren,s disease associated lung disease)、僵直性脊椎炎相關之肺病、血 管炎擴散性肺病、含鐵血黃素沈積症（haem〇sider〇sis)相 關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖
    維化 '阻塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球性肺炎、 巴球浸潤性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎 自體免疫性肝炎、i型自體免疫性肝炎(經典自體免疫 類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性肝炎（抗[KM抗體 炎）、自體免疫介導之低血糖症、B型騰島素抗性伴里 棘皮病、副甲狀腺低能症、肖器官移植有關之急性免 :病、與器官移植有關之慢性免疫疾病、#炎性骨關 病、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮·、2型牛皮癬、 發性白血球減少病、自體免疫性嘻中性球減少症、N< i50428.doc 12 201119673 型腎病、血管球性腎炎、腎顯微性血管炎、萊姆病^e disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或N〇Ss雄性不育症、 精子自體免疫、多發性硬化症（所有次型）、交感性眼 炎、結締組織病繼發之肺高血壓、古巴士德氏症候群 (Goodpasture’s syndrome)、結節性多動脈炎之肺表現、 急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏病（StiU，s chsease)、全身性硬化症、休格連氏症候群、高安氏病 (Takayasu’s disease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少 症、特發性血小板減少症、自體免疫性曱狀腺病、甲狀 腺機能亢進症、曱狀腺腫性自體免疫性甲狀腺低能症（橋 本氏病（Hashimoto’s disease))、萎縮性自體免疫性甲狀 腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原 發性脈管炎' 白斑病、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝 硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁鬱滯、特質性肝病、藥 物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏症及哮喘、 B群鏈球菌（GBS)感染、精神障礙（例如抑鬱症及精神分 裂症）、Th2型及TM型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不 同形式之疼痛）’及癌症，諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱 癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌，及 造血惡性疾病（白血病及淋巴瘤），無β脂蛋白血症、手足 發甜、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性 淋巴母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性 或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心 房異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏 150428.doc 201119673 性結膜炎、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性鼻炎、同種異 體移植排斥反應、α-l-抗胰蛋白酶缺乏、肌肉萎縮性側 索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、 抗麟脂症候群、抗受體過敏反應、主動脈及周圍動脈 瘤、主動脈剝離、動脈高血壓、動脈硬化症、動靜脈 痛、共濟失調、心房微顧（持續性或陣發性）、心房撲 動、房室傳導阻滞、B細胞淋巴瘤、骨移植物排斥反 應、骨髓移植（BMT)排斥反應、束枝傳導阻滯、伯基特 淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma)、燒傷、心律不整、心臟頓 抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應、軟 骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小腦病症、齋亂性或 多灶性心房心動過速、與化學療法有關之病症、慢性髓 細胞白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、 慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、慢性阻塞性肺病 (COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰 竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原性心臟病、冠狀動脈 疾病、庫賈氏病（Creutzfeldt-Jakob disease)、培養物陰 性敗血症、囊腫纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳 擊員癡呆、脫髓鞘疾病、出血性登革熱（dengue hemorrhagic fever)、皮膚炎、皮膚病狀、糖尿病 (diabetes、diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、泛 發性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴張型充 血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群（D〇wn，s Syndrome in middle age)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物 150428.doc 14 201119673 誘發的藥物誘發運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓 炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、EB病毒（epstein-barr virus)感染、肢端紅痛症、錐體外及小腦病症、家 族性噬血淋巴組織細胞瘤病、胎兒胸腺移植排斥反應、 弗里德賴希氏共濟失調（Friedreich’s ataxia)、功能性周 圍動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小 球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥反應、革蘭氏陰 性敗血症（gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症、胞 内生物體引起之肉穿腫、毛細胞白血病、哈洛弗登-史巴 兹氏症（Hallervorden-Spatz disease)、喬本氏曱狀腺炎 (hashimoto’s thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥反應、 血色素沉著症、血液透析、溶血性尿毒症候群/血栓溶解 性血小板減少性紫癜、出血、A型肝炎、希氏束心律不 整（His bundle arrythmias)、HIV 感染/HIV神經病、霍奇 金氏病（Hodgkin’s disease)、過動性運動病症、過敏反 應、過敏性肺炎、高血壓、運動不足運動病症、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、特發性艾迪森氏病 '特發性肺纖維 化、抗體介導之細胞毒性、衰弱（Asthenia)、嬰兒脊髓性 肌萎縮症、主動脈發炎、a型流感、電離輻射曝露、虹 膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎 '缺血-再灌 ，谓1劳、块 企性中風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性肌萎 縮症、卡波西氏肉瘤（Kapc)si，s sareoma)、腎臟移植排斥 反應、退伍軍人病（legioneua)、利 1丨又體病 (le1Shmamasis)、麻風病、皮質脊髓系統 又 乃曰性水 150428.doc 15 201119673 、癔疾、惡性淋巴瘤 腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫 腦膜炎、腦膜炎球 惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤 菌血症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、粒線體多系統病 症、混合結締組織病、單株γ球蛋白，症、多發性骨髓 瘤、多系統退化（曼切、代哲因_托馬斯、史德爾格及馬 查多-約瑟夫（Mencel Dejerine_Th〇mas版心啊及 Machado-Joseph))、重症肌無力、禽細胞内分枝桿菌 (mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌 (mycobacterium tuberculosis)、骨髓發育不良症候群、心 肌梗塞、心肌缺血病症' 鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎 炎、腎病、神經退化性疾病、〗型神經原性肌肉萎縮、嗜 中性球減少性發熱、非霍奇金淋巴瘤（n〇n_h〇dgkins lymPh〇ma)、腹主動脈及其分支閉塞、閉塞性動脈病 症、okt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管複通 術（vasectomy reversal procedure)、器官腫大骨質疏鬆 症、膜腺移植排斥錢、姨腺癌、副腫瘤症候群/惡性高 血鈣症、副曱狀腺移植排斥反應、骨盆發炎疾病、常年 性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周圍血管 疾病、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎 (pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、p〇EMs症候群 (多發性神經病、器官腫大、内分泌病、單株γ球蛋白症 及皮膚變化症候群）、灌注後症候群、泵後症候群、μι 心切開術後症候群、子癇前症、進行性核上麻痹、原發 性肺高血壓、放射療法、雷諾現象（Raynaud，s 150428.doc • 16- 201119673 phenomenon)及疾病、雷諾病、雷弗素姆氏病（Refsum's disease)、規則狹窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再 灌注損傷、限制型心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈 病、路易體型老年癡呆（Senile Dementia of Lewy body type)、血清陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧血、皮膚 同種異體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸移植排 斥反應、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失調、 脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性硬 化性全腦炎、昏厥、心血管系統梅毒、全身性過敏、全 身性發炎反應症候群、全身發作型青少年類風濕性關節 炎、T細胞或FAB ALL、毛細管擴張、血栓閉塞性血管 炎、血小板減少症、中毒、移植、創傷/出血、ΠΙ型過敏 反應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒症、尿敗血 病、蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、脈管炎、靜脈疾 病、靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感 柒、病毋性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關之噬血細胞症 候群、韋尼克-科爾薩科夫症候群（Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾遜氏病（wilson，s disease)、任何器官或 組織的異種移植物排斥反應、急性冠狀動脈症候群、急 性特發性多神經炎、急性發炎性脫髓鞘性多神經根神經 病、急性局部缺血、成人史提爾氏病、斑形脫髮、過 敏、抗磷脂抗體症候群、再生不全性貧血 '動脈硬化 症、異位性濕疹、異位性皮膚炎、自體免疫性皮膚炎、 與鏈球g感染有關之自體免疫病症、自體免疫性腸病、 150428.doc 201119673 自體免疫性聽力損失、自體免疫淋巴組織增生症候群 (ALPS)二自體免疫性心肌炎、自體免疫性卵巢早衰、瞼 人支氣g擴張、大跑性類天癌瘡、心血管疾病、災難 ί月曰症候群、乳糜》寫、頸椎關節病、慢性局部缺 血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化症風險之臨床單 -症候群（CIS)、結膜炎、兒童期初發型精神病症、慢性 阻塞性肺病（COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜 病變、糖尿病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂、藥物誘發 之免疫溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内 炎、上鞏膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、姓娘類 天范瘡、格 巴氏症候群（Guillain-Barr6 syndrome) (GBS)、枯草熱、休斯症候群（Hughes syndr〇me)、特發 性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏 症、免疫溶血性貧血、包涵體肌炎、傳染性眼發炎疾 病、叙k性脫髓勒疾病、發炎性心臟病、發炎性腎病、 IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛 爾氏病（Kussmaul disease)或庫斯毛爾一米爾氏病 (Kussmaul-Meier disease) ' 蘭德里麻痹（Landry，s paralysis)、郎格罕氏細胞組織細胞增多病 cell histiocytosis)、網狀青斑、黃斑退化、顯微性多血 管炎、白赫鐵列夫症（morbus bechterev)、運動神經元病 症、黏膜類天疱瘡、多器官衰竭、重症肌無力、骨髓發 育不良症候群、心肌炎、神經根病症、神經病、非八非B 型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節型青少 150428.doc •18- 201119673 年類風濕性關節炎（pauciartjcular JRA)、周圍動脈閉荚 疾病（PAOD) '周圍血管疾病（pvD)、周圍動脈疾病 (PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性動脈周圍 炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型 JRA、多内分泌缺乏症候群、多肌炎、風濕性多肌痛 (PMR)、泵後症候群、原發性帕金森氏症、前列腺及直 腸癌及造血惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅 血球發育不全、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經 脊也k、再狹窄 '風濕性心臟病、Saph〇 (滑膜炎、痤 瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變 性病、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機 能不全 '聚石夕氧相關之結締組織疾病、史奈登_威爾金森 皮膚病（sneddon-wilkinson dermatosis)、強直性脊椎炎、 史蒂务-瓊森症候群（Stevens-Johnson syndrome，SJS)、 全身性發炎反應症候群、顳動脈炎、弓形蟲性視網膜 炎、中毒性表皮壞死溶解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤 壞死因子受體）、1型過敏反應、〗〗型糖尿病、蓴麻疹、 尋常性間質肺炎（UIP)、脈管炎、春季結膜炎、病毒性視 網膜炎、沃格特-小柳-原田症候群（V〇gt_K〇yanagi-Hauda syndmmeXVKH症候群）、濕式黃斑退化、傷口癒 合、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節病。 61.如請求項60之用途’其中該投與個體係由至少一種選自 以下之方式進行：非經腸、皮下、肌肉内、靜脈内、關 節内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、腔内、體腔 150428.doc •19· 201119673 内、小腦内、腦室内、結腸内、子宮頸内、胃内、肝 内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜 内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、視網膜内、脊椎 内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、快速注射 (bolus)、 經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻内及經皮。 62· —種產生結合兩個抗原之雙可變域免疫球蛋白之方法， 其包含以下步驟， a) 獲得結合第一抗原之第一親本抗體或其抗原結合部 分； b) 獲付結合第一抗原之第二親本抗體或其抗原結合部 分； c) 建構包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n之第一及第三多 肽鏈，其中 VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變域； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二重鏈可變域； C為重鏈恆定域； X1為連接子’限制條件為X1不為CH1 ; X2為F c區，及 η為0或1 ;及 d) 建構包含VDl-(X1)n_VD2_c_(X2)n之第二及第四多 肽鏈，其中 VD1為自該第一親本抗體或其抗原结合部分獲得之第 I50428.doc -20· 201119673 一輕鏈可變域； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二輕鏈可變域； C為輕鏈恒定域； X1為連接子，限制條件為X i不為CH1 ; X2不包含Fc區；及 η為0或1 ;及 e)表現該第一多肽鏈、該第二多肽鏈、該第三多肽鏈 及該第四多肽鏈； 使得產生結合該第一抗原及該第二抗原之雙可變域免疫 球蛋白，其中§亥結合蛋白結合選自由以下組成之群的抗 原對· MTX 與 mCD-3、MTX 與 mCD-19、MTX 與 hCD_ 3(序列 2) ' MTX與 hCD-19(序列 2)、MTX與 CD-20、MTX 與EGFR(序列3)、MTX與HER_2(序列十及町又與⑶· 3(序列1)。 63. 如吻求項62之方法’其中該等vd 1及VD2重鏈可變域包 3選自由以下組成之群的胺基酸序列：seq ID NO: 66、 96 98、1〇〇，其中s亥專vd 1及VD2輕鍵可變域包含選自 由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 67、97、99 及 101 〇 64. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 4刀’及δ亥第一親本抗體或其抗原結合部分係選自由人 類抗體' CDR移植抗體及人類化抗體組成之群。 65. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 150428.doc 21 201119673 部分、及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自由以 下組成之群：Fab片段；F(ab’）2片段，包含兩個Fab片段 在絞鏈區由二硫橋鍵連接之二價片段；由VH域及CH1域 組成之Fd片段；由抗體單臂之VL域及VH域組成之Fv片 段；d Ab片段；分離之互補決定區（CDR);單鏈抗體；及 雙功能抗體。 66.如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分具有至少一種該雙可變域免疫球蛋白展現之所需特 性。 67_如請求項62之方法’其中該第二親本抗體或其抗原結合 部分具有至少一種該雙可變域免疫球蛋白展現之所需特 性。 68. 如請求項62之方法，其中該卜區係選自由原生序列以區 及變異序列Fc區組成之群。 69. 如請求項62之方法，其中該&區係選自由、“Μ、 IgG3、IgG4、IgA、igM、IgE及 IgD的 Fc區組成之群。 7〇·如請求項66之方法，其中該所需特性係選自一或多種抗 體參數。 71. 如請求項67之方法，其中該所需特性係選自一或多種抗 體參數。 72. 如請求項7〇之方法’其中該等抗體參數係選自由以下組 成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物功 能、抗原決定基識別、穩定性、溶解度、產生效率、免 疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交又反應性及 150428.doc 201119673 直系同源抗原結合。 :明求項71之方法’其中該等抗體參數係選自由以下组 ^群：抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物功 :、抗原決定基識別、穩定性、溶解度、產生效率、免 ::性、藥物動力學、生物可用性、組織交又反應性及 直系同源抗原結合。 74·:=項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 :二合該第-抗原之親和力不同於該第二親本抗體或 八抗原結合部分結合該第二抗原之親和力。 75:請求項62之方法，其中該第-親本抗體或其抗原結合 B結合該第-抗原之效能不同於該第二親本抗體或其 抗原結合部分結合該第二抗原之效能。 76.-種產生結合兩個抗原且具有所需特性之雙可變域免疫 球蛋白之方法’其包含以下步驟， a) 獲得結合第一抗原且具有至少一種該雙可變域免疫 球蛋白展現之所需特性的第—親本抗體或其抗原结 分； 。〇 b) 獲得結合第二抗原且具有至少一種該雙可變域免疫 球蛋白展現之所需特性的第二親本抗體或其抗原处人: 分； σ α ° c)建構包含VDl-(Xl)n_VD2_c_(X2)n之第—及第三户 肽鏈，其中； 夕 VD1為自該第-親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變域； 150428.doc •23- 201119673 VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二重鏈可變域； C為重鏈恆定域； X1為連接子，限制條件為X丨不為Ch 1 ; X2為Fc區；及 η為0或1 ; d) 建構包含VDl-(Xi)n_VD2-C-(X2)n之第二及第四多 肽鏈，其中； VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一輕鏈可變域； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 二輕鏈可變域； C為輕鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為χι不為Chi ; X2不包含Fc區；及 η為0或1 ; e) 表現該第一多肽鏈、該第二多肽鏈、該第三多肽鏈 及該第四多肽鏈； 使得產生結合該第一抗原及該第二抗原且具有所需特性 之雙可變域免疫球蛋白，其中該結合蛋白結合選自由以 下組成之群的抗原對：Μτχ與mCD-3、MTX與mCD- 19、MTX 與 hCD-3(序列 2)、MTX 與 hCD-19(序列 2)、 MTX與 CD-20、MTX與 EGFR(序列 3)、MTX與 HER-2(序 列1)、及MTX與CD-3(序列1)。 150428.doc •24· 201119673 7 7 —種結合預防性或治療性藥物且結合至體内之特定位 置 '組織或細胞類型之結合蛋白，該結合蛋白包含多肽 鏈’其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中； VD1為第一重鏈可變域； VD2為第二重鏈可變域； C為重鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為χι不為CHi ; X2為Fc區；及 η為0或1 ; 其中。亥、”a s蛋白結合體内特定位置、組織或細胞類型之 抗原及預防性或治療性藥劑。 78·如请求項77之方法，其中該結合蛋白結合曱胺喋呤。 79種向體内之特疋位置、組織或細胞類型傳遞預防性或 療)·生藥物之方法，該方法包含向個體投與包含多肽鏈 之、·° 〇蛋白的步驟，其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中； VD1為第一重鏈可變域； VD2為第二重鏈可變域； C為重鏈恆定域； XI為連接子，限制條件為χι不為CH1; X2為Fc區；及 η為0或1 ; 其中該結合蛋白 抗原及預防性或 結合體内特定位置 治療性藥劑。 組織或細胞類型之 150428.doc 25
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