TW200531979A - Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors - Google Patents

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TW200531979A
TW200531979A TW093137723A TW93137723A TW200531979A TW 200531979 A TW200531979 A TW 200531979A TW 093137723 A TW093137723 A TW 093137723A TW 93137723 A TW93137723 A TW 93137723A TW 200531979 A TW200531979 A TW 200531979A
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polypeptide
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kdr
rhphfptr
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TW093137723A
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Yan Chen
Elana Getmanova
Martin Wright
Alan S Harris
Jochem Gokemeijer
Ai Ching Lim
Lin Sun
Michael Wittekind
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Compound Therapeutics Inc
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200531979 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本揭示内容係關於新穎血管内皮生長因子受體（vegfr) 結合多肽及使用該等多肽來抑制由血管内皮生長因子 (VEGF)調控之生物活性之方法。 【先前技術】 血管新生（Angiogenesis)係由先前存在的毛細管或後毛 細管小靜脈形成新血管的過程；其為許多生理過程包括排 印、胚胎發育、創傷修復及心肌中側枝（c〇Uateral)A管產生 的重要組份。血管新生亦對許多病理狀態例如腫瘤生長及 轉移、糖尿病性視網膜病及黃斑退化係重要的。在許多情 況下，該過程開始於存在的血管内皮細胞響應多種細胞激 素及生長因子而活化。在癌症中，腫瘤釋放細胞激素或血 官新生因子藉由與特異細胞表面受體相互作用來刺激血管 内皮細胞。活化的内皮細胞分泌酶降解血管基膜（basement membrane)，使内皮細胞侵入腫瘤組織。一旦定位，内皮細 胞分化以形成先前存在血管的新血管分枝。新血管為腫瘤 提供營養物質，促進進一步生長且亦為轉移提供路徑。 到目丽為止已驗明諸多血管新生因子，包括尤其有效的 因子VEGF。VEGF最初係自濾泡星狀細胞之經調節之培養 基（conditioned media)且自多種細胞株純化而來。最近，已 驗明VEGF之許多結構同系物及其它剪接（spHced)形式。各 種形式的VEGF作為高親和力配位體結合至一組vegf受體 (VEGFR) ° VEGFR為酪胺酸激酶受體，其中許多為血管新 97816.doc 200531979 生的重要調節因子。VEGFR家族包括3種主要亞型： VEGFR-1、VEGFR-2(在人類中亦稱為激酶插入域受體， ’’KDR”）及 VEGFR-3。在 VEGF形式中，已知 VEGF-A、VEGF-C 及VEGF-D結合且活化VEGFR-2。 VEGF通過其同源受體起作用，可在血管新生期間充當内 皮特異有絲分裂原（mitogen)。另外，有實質跡象表明VEGF 及VEGFRs在特徵為不適當血管新生之病症（例如癌症）中 將上調。因此，大量研究集中於驗明可標靶並抑制VEGF或 VEGFR治療劑。 目前標靶或抑制VEGF或VEGFR之治療方法包括抗體、肽 及小分子激酶抑制劑。在該等方法中，抗體最廣泛用於活 體内識別及抑制配位體及細胞受體。高特異抗體用於阻斷 受體-配位體相互作用，進而中和組份之生物活性，且亦用 於特異地將毒劑傳遞至在其表面上表現同源受體之細胞。 儘管有效，但抗體係依產製賴於重組哺乳動物細胞中之表 現而產生的大而複雜之分子。抗體亦引起多種通常不良之 副作用，包括活化補體路徑及抗體導向之細胞相關細胞毒 性。因此，仍需要可特異地抑制VEGF/VEGFR路徑之有效 治療劑以作為用於特徵為不適當血管新生之失調症（例如 癌症）的療法。 【發明内容】 部份本揭示内容提供結合至VEGFR-2受體，特定而言人 類VEGFR-2(亦稱為KDR)及小鼠VEGFR-2(亦稱為Flk-Ι)之 新穎單域多肽。本文所述之VEGFR-2結合蛋白質可用於（例 97816.doc 200531979 如）偵測活體内或活體外VEGFR_2。另外，本文所述之某些 VEGFR-2結合蛋白質可用於治療與vegfr_2_調控之生物 活性相關聯之疾病。例如，KDR調控VEGF之促血管新生效 應且因此’本揭示内容之某些KDR結合蛋白質可用於抑 制人類患者的血管新生。本揭示内容之某些vEGFR_2結合 蛋白貝可用於治療例如癌症、發炎疾病、自體免疫疾病及 視、’罔膜病之失凋症。許多與組織細胞過度增殖有關之失調 症將包括血管新生組份，且因此吾人預期本文所述之某些 VEGFR_2結合蛋白質可用於治療該等失調症。 在某些貫施例中，本揭示内容提供結合至VEGFR-2之單 域夕肽。較佳之單域多肽結合至人類KDR、小鼠Flk_l或兩 者。單域多肽可包含介於約8〇個與約15〇個之間之胺基酸， 該等胺基酸具有如下結構組織，其&含：分絲至少二層0 片層之間之至少七條β鏈，及至少一個連接兩條β鏈之環部 分，該環部分參與結合至VEGFR-2。儘管0鏈部分中之一或 多個將亦可參與VEGFR_2結合，尤其彼等位於最接近環部 分之β鏈部分，但通常，環部分中之一或多個將參與 VEGFR-2結合。單域多肽可包含免疫球蛋白域或類免疫球 蛋白域之結構單元。儘管結合至VEGFR-2之細胞外區域之 多肽係較佳的，但單域多肽可結合至VEGFR_2之任何部 刀結合可依據平衡常數（例如解離常數KD)及依據動力學 常數（例如結合速率常數合及脫離速率常數k脫離）來評析。 通常選擇單域多肽以小於1〇-6 Μ，或小於ίο·7 Μ、5χ1〇·8 M、 10 8M，或小於丨…“之。結合至veGFr_2。為了與受體結 97816.doc 200531979 合，VEGFR-2結合多肽可VEGF家族之一個、兩個或多個成 員，尤其係VEGF-A、VEGF-C及VEGF-D相競爭且可抑制一 或多個VEGFR-2-調控之生物事件，例如内皮細胞增殖，血 管滲透性及内皮細胞活動力。VEGFR-2結合多肽可用於治 療之目的，同時亦用於任何涉及偵測VEGFR-2之目的。儘 管當k脫離足夠低時（例如小於5xl0_4 s'1)可容許較高的KD 值，但用於治療之多肽通常具有小於5x10_8M、小於1〇-8Μ 或小於ΙΟ·9 Μ之KD。某些實施例中，結合至VEGFR-2之單 域多肽將包含選自下列各序列組成之群之一致VEGFR-2結 合序列：SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID ΝΟ··3及 SEQ ID NO:4。該序列較佳地將位於環，尤其係FG環中。 在某些實施例中，單域多肽包含免疫球蛋白（Ig)可變域。 該Ig可變域可（例如）選自下列各域組成之群：人類VL域，人 類VH域及駱駝科（camelid)VHH域。Ig可變域之一個、兩個、 三個或三個以上環可參與結合至VEGFR-2，且通常任何稱 為CDR1、CDR2或CDR3之環將參與VEGFR-2結合。 在某些實施例中，單域多肽包含類免疫球蛋白域。類免 疫球蛋白域之一個、兩個、三個或三個以上環可參與結合 至VEGFR-2。較佳之類免疫球蛋白域係纖維黏連蛋白第III 型（Fn3)域。該域以自N-端至C-端之順序可包含β鏈，A ;環， AB ; β鏈，B ;環，BC ; β鏈 C ;環 CD ; β鏈 D ;環 DE ; β鏈 F ; 環FG ;及β鏈G。參看圖22之結構組織之實例。儘管較佳之 環為BC、DE及FG，但視需要，AB、BC、CD、DE、EF及 FG環中任何或所有環可參與VEGFR-2結合。較佳之Fn3域 97816.doc 200531979 係衍生自人類纖維黏連蛋白之Fn3域，尤其係纖維黏連蛋白 之第10個Fn3域，稱為i〇Fn3。應注意，本文所揭示之 VEGFR-2結合多肽均不具有與天然i〇Fn3相同的胺基酸序 列；已將該序列修飾以獲得VEGFr_2結合蛋白質，但具有 1〇Fn3之基本結構特性的蛋白質，且尤其係彼等保留可識別 的對於天然10Fn3而言之序列同源性之蛋白質在本文中仍 稱為Fn3多肽’’。該命名法類似於在抗體領域中所發現的 彼叩名法’例如’為對抗特定乾蛋白質而產生之重組抗體 VL域可不同於任何天然發生之％域，但該蛋白質仍可識別 為乂!^蛋白質。10Fn3多肽可與以SEQ m n0:5所示之人類 1〇Fn3域至少 60%、65%、70%、75%、80〇/〇、85%或 90〇/〇相同。 通常终多變異將在一或多個環中發生。i〇Fn3多肽之各條p 鍵基本上可由與SEQ ID NO:5之相應β鏈的序列至少80〇/〇、 85%、90%、95%或1〇〇%相同之胺基酸序列組成，其限制條 件為在生理狀態下該變異不破壞多肽之穩定性。1〇Fn3多肽 在AB、CD及EF環之各環中可具有基本上由與SEQ m N〇: 5 之相應環的序列至少80%、85%、90%、95%或1〇〇%相同之 胺基酸序列組成之序列。在許多情況下，BC、de&fg環 中任何或所有環相對於SEQ ID n〇:5而言之守恆性較差。例 如所有BC、DE及FG環將與其SEQ ID NO:5中相應環小於 20%、10% 或 〇%相同。 在某些實施例中，本揭示内容提供結合至VEGFR-2的包 含具有類免疫球蛋白折疊之域之非抗體多肽。該非抗體多 狀可具有小於20或小於15 kDa之分子量且通常衍生自（例 97816.doc -10- 200531979 如藉由改變胺基酸序列）基準（reference)，或π支架 (scaffold)”，蛋白質，例如Fn3支架。該非抗體多肽可以小 於l〇-6M，或小於1(Γ7Μ，小於5χ10·8Μ，小於i〇_8m或小於 10_9 Μ之Kd結合VEGFR-2。未改變的基準蛋白質將不會有 意義地結合至VEGFR-2或以大於10_6 Μ之KD結合。儘管當 k脫離足夠低時（例如小於5x1 (T4 s-1)可容許較高的KD值，但尤 其當非抗體多狀具有小於5X10 8 Μ，小於1 〇-8 Μ或小於10-9 Μ 之KD時，該非抗體多肽可抑制VEGF訊號傳輸。該類免疫球 蛋白折疊可為1GFn3多肽。 在某些貫施例中，本揭示内容提供結合至VEGFR-2之包 含具有免疫球蛋白折疊之單域的多肽。該多肽可具有小於 20或小於15 kDa之分子量且通常衍生自（例如藉由改變胺 基酸序列）免疫球蛋白之可變域。該多肽可以小於1〇_6 M，
募肽序列。在隔離形式或插入特定蛋白 -2結合之短 貝結構（例如免疫球 97816.doc 200531979 蛋白或類免疫球蛋白域）時，該等序列可調控VEGFR-2結 合。該等序列之實例包括所揭示為SEq ID NOs:l-4之彼 等，及與SEQIDNOs:l-4至少85%、9〇〇/0或95%相同且保留 VEGFR-2結合活性的其它序列。因此本揭示内容提供幾乎 完全純的多肽，其包含與SEQ ID 之任一序列至少 85%相同之胺基酸序列，其中該多肽結合至vegfr_2且與 VEGF物質競爭以結合至VEGFR_2。該等多肽之實例包括其 中包含與一如下胺基酸序列至少8〇%、85%、9〇%、95%或 loo%相同之胺基酸序列的多肽，該胺基酸序列與seq NOs.6 183、186-197及199之任一序列至少85%相同。該多 肽較佳地將抑制VEGF之生物活性，且可以小於ig.6m，或 小於10 Μ ’小於5χ1()·8 M ’小於1〇·8 m或小於ig_9 μ之h 結合至VEGFR-2。 在某些實施例中，本文所述之任何vegfr_2結合多狀可 結合至一或多個額外之部分，包括（例如）亦結合至vegfr_2 之部分（例如第：#同或不同之vegfr_2結合多肽）、結合至 不同乾之部分（例如建置雙 劑Η票記㈣、促Μ ⑷生（duai_sp滅吻結合 % V 貝炖化之部分或提供改良之藥物 ^ 良之樂物動力學可根據所獲知之治療需 要加以評析。通常需 燎而 之時間’其可藉由增加在給率後蛋白質…力，魏 之時間來實現。在=負在血清中保持可用 在-定時間内之遠； 改良蛋白質血清濃度 樂珂即刻蛋白質血清 h、下久、七 辰度之差異）。傾向於減緩自血液中清 97816.doc -12- 200531979 除蛋白質之部分包括聚乙二醇、糖及耐受良好之蛋白質部 刀（例如Fe片段或血清白蛋白）。可將單域多肽附接至如下部 分，相對於未經修飾多肽而言，該部分可降低小鼠、大鼠 或人，中多肽之清除率三倍以上。其它經改良藥物動力學 之度量可包括血清半衰期，其通常劃分成〇1相及口相。可藉 由添加合適之部分顯著地改良二相中之一或兩者。當使用 聚乙二醇時，可將一或多個pEG分子附接在蛋白質中之不 同4置且17亥附接可藉由與胺、硫醇或其它合適之反應基 團反應達成。聚乙二醇化可藉由位點導向之聚乙二醇化達 成，其中將合適之反應性基團引入蛋白質。在一較佳之實 施例中，修飾蛋白質以具有處於所需位置之半胱胺酸殘 基從而允許對於半胱胺酸進行位點導向聚乙二醇化。 之刀子畺可廣泛地變化且可為支鏈或直鏈。值得注意地， 本揭示内容證實聚乙二醇化與i〇Fn3多肽之靶結合活性係 相谷的且另外1乙一醇化確貫改良該等多狀之藥物動力 學。因此’在一實施例中，本揭示内容提供i〇Fn3多肽之聚 乙二醇化形式，而不管可由該等多肽結合之靶為何。 在某些實施例中，本揭示内容提供包含本文所揭示之任 何VEGFR-2結合多肽之調配物。調配物可為包含vegfR-2 結合多肽及醫藥上可接受之載劑之治療調配物。調配物亦 可為組合調配物，包括額外之活性劑例如抗癌劑或抗血管 新生劑。 在某些態樣中，本揭示内容提供使用VEGFR-2結合蛋白 質抑制細胞中VEGF生物活性之方法。該細胞可位於活體内 97816.doc -13- 200531979 或活體外’且可為(例如)活有機體之細胞、培養 織樣本中之細胞。，亥方法可包含使本文所揭示之任何 VEGFR-2抑制多肽以足以抑制該vegf生物活性之數量 曰τΓ間接觸該細胞。 在某些態樣中，本揭示内容提供用於治療具有對抑制 :EGF有反應病症之受治者之方法。該方法可包含將有效劑 量之本文所述之任何VEGF抑制多肽投予該受治者。病^ 可為特徵為不適當血管新生之病,症。病症可為過度增殖^ 病症適口 /σ療之病症（或失調症）之實例包括自體免疫失調 症fx人|±失凋症、視網膜病（尤其係增殖性視網膜病）及癌 症。本文所述之任何VEGFR-2抑制多肽可用於製備供治2 廷自由下列各失調症組成之群之失調症之醫藥品：自體免 疫失调症、發炎性失調症、視網膜病及癌症。 在某些態樣中，本揭示内容提供偵測樣本tvEGFR_2之 方法。該方法可包含將樣本與本文所述2VEGFR_2結合多 肽接觸，其中該接觸可於允許多肽-VEGFR_2複合物形成之 條件下進行；且偵測該複合物，藉此偵測該樣本中之該 VEGFR-2。偵測可使用任何在此項技術中已知之技術進 行，諸如（例如）放射線攝影術、免疫檢定法、螢光偵測、質 譜分析法或表面電漿共振。該樣本通常藉由生物樣本，例 士活體切片核查，且尤其係腫瘤、疑似腫瘤或疑似經受非 吾人所樂見之血管新生之組織之活體切片檢查。該樣本可 源自人類。VEGFR-2結合多肽可以標記部分標記，例如放 射性部分、螢光部分、發色部分、化學發光部分或半抗原 97816.doc -14- 200531979 部分。VEGFR-2結合多肽可固定於固體承載體上。 在某些態樣中，本揭示内容提供可用於任何10Fn3多肽之 發現，而不管多肽經設計以結合之靶為何。如上所提及， 本揭示内容證明PEG可成功地用於改良10Fn3多肽之藥物動 力學’同時不會有意義地干擾靶結合。因此，本揭示内容 提供結合至靶且相對於非聚乙二醇化多肽具有改良藥物動 力學之聚乙二醇化10Fn3多肽。在另一實施例中，本揭示内 谷證明GFn3多肽之前八個胺基酸之缺失可增加革巴結合親 和力。因此，本揭示内容提供無起始八個胺基酸之i〇Fn3多 肽，其具有根據SEQIDNo:5序列之編號。當然可將一或兩 個胺基酸加入多肽之缺失形式中之原處，以促進轉譯及適 當之處理。本揭示内容證明多肽之皮下投用引起多肽 之延緩釋放進入血流中且減小i〇Fn3多肽之最大血清濃 度。因此，本揭示内容提供藉由皮下投用將1〇Fn3多肽投予 病人之方法。該投用路徑可適用於達成相對於靜脈内投用 之延緩釋放，及/或相對於靜脈内投用相同劑量達成之最大 血清濃度而言減小多肽之最大血清濃度至少25%或至 少50%。㈣之10Fn3多月太可附接可增加、3多月太之血清半 衰期（或減小清除率，或類似地影響另一藥物動力學參數) 的部分，例如聚乙二醇部分。投用之>3多狀較佳地包含 70%、75%、80%、85%、 與 SEQ ID NO:5 至少 60%、65% 9 0 %相同之胺基酸序列。 在某些態樣中’本揭示内容提供單域多肽，其結合至預 選自第-哺乳動物之乾蛋白質及其來自第二哺乳動物之同 97816.doc -15- 200531979 系物。時該第-哺乳動物係人類且該第二哺乳動物係所需 進行臨床前測試之哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、犬 或^人類靈長類動物時，該等單域多肽尤其適用。本揭示 内容證明可將單域多肽設計成具有該雙重特異性，且該雙 重特異性藉由允許在人類細胞、人類受治者及動物模型中 /則4相同多肽來簡化藥物研發。較佳地，預選自第一哺乳 動物之乾蛋白質及其來自第二哺乳動物之同系物的胺基酸 序列十分類似，以允許產生雙重特異性多肽。例如，預選 之靶蛋白貝及來自第二哺乳動物之同系物可遍及至少％個 胺基酸之區域而共有至少80%、90%或95%之同一性，且視 情況可遍及整個蛋白質序列或（在膜蛋白質情況下）遍及細 胞外域之序列而共有至少80%、90%或95¼之同一性。具有 a亥類型雙重特異性結合特性之單域多肽可包含免疫球蛋白 或類免疫球蛋白域，且較佳地將以小於1χ1〇_6Μ、1χ1〇_7Μ、 5x10 Μ、1χ1〇8Μ41χ1〇-9μ之解離常數結合至預選之人 類靶蛋白質及其同系物兩者。 【實施方式】 1.綜述 本說明書描述（尤其係）結合至VEGFR-2受體之新穎、單 域多肽之驗明及產製。VEGFR-2，在人類亦稱為KDR及在 小鼠稱為Flk-Ι，係用於VEGF訊號傳輸之促血管新生效應之 主要調控體。VEGFR-2由VEGF-A、VEGF-C及VEGF-D結合 且活化。在内皮細胞，VEGFR-2活化刺激細胞增殖及遷移， 且在活體内VEGFR-2活化觸發血管新生且增加維管結構滲 97816.doc -16- 200531979 透性。增加之血管新生被很好地證實為腫瘤生長及各種視 網膜病之重要特徵，而增加之維管結構滲透性為許多發炎 反應中之顯著事件。 本揭示内容提供數以百計結合至VEGFR-2之單域多肽， 其中許多展示活體外及/或活體内VEGF拮抗劑活性。具有 VEGF拮抗劑活性之單域多肽將適用於許多治療應用。已證 實抗-KDR抗體具有活體内對抗自癌症及由癌症引起之併 發症至增殖性視網膜病、發炎性失調症及纖維化之範圍内 之疾病及病症之效用。基於本文所提交之活體内及活體外 資料，吾人預期單域多肽將適用於治療相同範圍之失調症。 除治療應用之外，VEGFR-2結合單域多肽可用於任何需 要偵測VEGFR-2之情況。例如，許多幹細胞表現VEGFR-2， 包含尤其適用之造血系統細胞。KDR結合多肽可用於（尤其 係以經標記之格式）偵測幹細胞及促進細胞分類。活體内， 標記之VEGFR-2結合多肽可用於為表現VEGFR-2之組織造 影。高VEGFR-2表現為經歷尤其高等級血管新生或發炎活 動之組織的特性。組織樣本之組織學分析亦可受益於偵測 VEGFR-2。例如，可能需要在腫瘤活體切片檢查中偵測 VEGFR-2表現以評析抗VEGFR-2或抗VEGF療法之可能有 效性。令人關注地，在本文中揭示之許多VEGFR-2結合蛋 白質以奈莫耳（nanomolar)之解離常數結合至VEGFR-2但不 具有對VEGFR-2調控之生物事件之顯著影響。因此，當經 常需要有選擇地標記表現VEGFR-2之細胞而無需引起對 VEGFR-2調控事件之顯著干擾時，該等結合蛋白質可適用 97816.doc -17- 200531979 於活體内視覺化技術或細胞標記技術。 本揭示内容描述了稱為PR〇fusi〇nTM之活體外顯現技術 之用途，其利用核酸-蛋白質融合（RNA-及DNA-蛋白質融合） 以驗明用於結合至VEGFR-2重要之新穎單域多肽及胺基酸 主結構（motif)，核酸-蛋白質融合技術係將蛋白共價偶合至 其編碼基因資訊之顯現技術。PR〇fusionTM技術用於筛選編 碼單域多肽之核酸之集合，該等單域多肽係使用基於人類 纖維黏連蛋白第三型域（i〇Fn3)之支架而建構或自抗體輕鏈 之了麦域建構。將表現之多肽（稱為支架蛋白質之，’庫，，）篩選 以獲得可以高親和力結合VEGFR-2之多肽。吾人自該支架 蛋白貝庫中分離出結合至VEGFR-2且在某些情況下抑制 VEGF生物活性之新穎單域多肽。此外，吾人發現許多位於 免疫球蛋白或類免疫球蛋白支架中之獨立無規化環傾向於 彙聚成參與VEGFR-2結合之一致序列之相關集合。因此， 吾人預期，即使當具有該等一致序列之多肽自周圍蛋白質 (於其中該等多肽得以驗明）中分離，其亦將適用於作為 VEGFR-2結合劑。該等多肽可用作獨立之小肽vegfr_2結 合劑或可位於其它蛋白質中，尤其係共有免疫球蛋白或類 免疫球蛋白折疊之蛋白質中。 如以上所論述的，本揭示内容證明具有某些所需性質， Η、、、σ 口至VEGFR-2之高親和力，關於VEGF-A、_〇或-〇中 種或多種之拮抗劑效應及改良藥物動力學之單域多肽 可用作有效之抗癌劑。儘管吾人預期該等多肽作為抗癌劑 之有效性與癌症中血管新生之作用有關，但吾人不期望束 978l6.doc •18- 200531979 缚於任何特定機制。形式上，可能本單域多肽有效抗癌之 原因與血管新生過程無關。 據吾人所知，本揭示内容代表第一次成功使用基於Fn3 之多肽以達成活體内治療效應的努力。許多用於達成活體 内有效性之改良及發現將廣泛應用於其它基於Fn3之多 肽。換言之，儘管基於Fn3之多肽之配位體結合性質通常由 位於溶劑可接近環區域之相對少數胺基酸決定，但基於Fn3 之多肽之其它特徵（例如藥物動力學特徵）傾向於由不直接 涉及配位體結合且不管靶蛋白質為何而在各個蛋白質之間 守恆的蛋白質中主要部分所決定。此即為抗體之情況，其 中少數稱為CDR區域之環調控抗原結合，而活體内抗體行 為之其它特徵主要由守恆的框架區域及恆定域所控制。 π抑制π意謂現象中可量測之減少，本文中通常用於涉及 任何如下現象：與未經多肽處理之對照樣本比較而言， VEGF與VEGFR相互作用、VEGF-或VEGFR調控之血管新 生、血管新生、血管新生之症狀、含VEGFR細胞之生存能 力或VEGF-或VEGFR調控之細胞增殖。若活性或相互作用 之減少至少為10%，較佳為20%、30%、40%或50°/〇，且更 佳為60%、70°/〇、80%、90%或更多，則多肽將抑制VEGF-或VEGFR-2調控之活性。 ” VEGF生物活性π意謂通過任何VEGF受體作用之任何 VEGF家族成員之任何功能。VEGF家族包括VEGF-A、 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及月台盤生長因子（P1GF)，亦包 括VEGF之各種其它剪接形式，包括VEGF121、VEGF145、 97816.doc -19- 200531979 VEGF165、VEGF189及 VEGF206(Tischer 等人，J. Biol· Chem， 266:11947-1 1954, 1991)。酪胺酸激酶受體之VEGFR家族包 括VEGFR· 1 (亦稱為Fit-1)、VEGFR-2(亦稱為KDR(人類形式） 或Flk-1 (小鼠形式））及VEGFR-3(亦稱為Flt-4)。VEGF配位體 結合至VEGF受體以誘導（例如）血管新生、血管產生、内皮 細胞增殖、血管舒張及細胞遷移。VEGF配位體亦可通過結 合至其同源受體抑制細胞凋零。VEGFR-2據信為最常涉及 血管新生之VEGFR。VEGFR-2或KDR調控之生物活性係 VEGFR-2或KDR顯著參與於其中以致於對VEGFR-2或KDR 之括抗作用引起生物活性之可量測減少的任何生物功能。 VEGF及VEGFR之生物活性可藉由此項技術中已知之標準 檢定法來量測。實例包括配位體結合檢定法及Scatchard點 陣圖分析法；受體二聚化檢定法；細胞磷酸化檢定法；酪 胺酸激酶磷酸化檢定法（例如參看Meyer等人，Ann· N.Y. Acad. Sci· 995:200-207，2003);内皮細胞增殖檢定法例如 BrdU標記及細胞計數試驗；依賴VEGF之細胞增殖檢定法； 及血管新生檢定法。用於量測血管新生之方法係標準的， 且描述於例如 Jain 等人（Nat. Rev· Cancer 2:266-276，2002) 〇 血管新生可藉由量測無分支血管區段數（每單位面積之區 段數）、功能血管密度（每單位面積之灌注血管總長度）、血 管直徑、血管通道之形成或血管容積密度（每單位面積基於 每區段長度及直徑計算之總血管容積）來檢定。用於VEGF 調控之增殖及血管新生之示範性檢定法可在美國專利案第 6,559，126號，Lyden等人，Nature Medicine 7:1194 (2001)， 97816.doc -20- 200531979
Jacob等人，Exp. Pathol. 15:1234(1978)及肠等人，】Bi〇i
Chem.275:13588 (2000)中找到。言亥等檢定法可使用純化之 受體或配位體之一或兩者均使用來進行，且可在活體外或 活體内進行。該等檢定法可在細胞中使用基因引入或自然 發生之配位體或受體或兩者進行。抑制vegf生物活性之多 肽將引起VEGF生物活性減少至少1G%，較佳鳩、3〇%、 40〇/。或5G%，且更佳6G%、7G%、嶋、9()%或更多。生物活 性之抑制亦可藉由J C 5 0量測。抑制v E G F生物活性之多肽較 佳具有小於ΙΟΟηΜ之IC50,更佳為小於1〇nM且最佳為小於 1 nM 〇 2·多肽 本文所述之方法學已成功用於研發源自兩種相關蛋白質 結構群組之單域VEGFR-2結合多R :具有免疫球蛋白折疊 之彼等蛋白質且具有類免疫球蛋白折疊之彼等蛋白質。，，多 肽’’意謂兩或兩個以上胺基酸之任何序列，而不管長度、後 轉譯修飾或功能如何。”多肽”、，，肽，，及，，蛋白質，，在本文中可 交換使用。多肽可包括天然胺基酸及例如彼等描述於美國 專利第6,559，126號（其以引用之方式併入本文中）中之非天 然胺基酸。多肽亦可以多種標準化學方法之任一方法來修 飾（例如，胺基酸可以保護基團修飾；羧基末端胺基酸可修 飾成末端醯胺基；胺基末端殘基可以基團修飾來例如增強 親脂性；或多肽可以化學方法糖基化或以其它方法修飾以 支曰加％疋性或活體内半衣期）。多肽修飾可包括將另一、纟士構 例如環狀化合物或其它分子附接至該多肽且亦可包括含改 97816.doc -21 - 200531979 變組態（亦即R或S ;或！^D)之一或多個胺基酸之多肽。術 5吾單域多肽''用於指示本多肽之vegfr_^s合活性位於自 (例如）抗體及單鏈抗體分化而來的單域中，該等抗體及單鏈 抗體中抗原結合活性通常由重鏈可變域及輕鍵可變域兩者 提供。吾人預期可將複數個本文所揭示種類之單域多肽連 接以建置具有增強親抗原性之複合分子。同樣地，單域多 肽可附接（例如作為融合蛋白質）至任何數目之其它多狀，例 如螢光多月太、標乾多肽及具有明顯不同治療效果之多狀。 具有免疫球蛋白或類免疫球蛋白支架兩者之一之單域多 肽傾向於共有某些結構特徵。例如，多肽可包含在約80與 、.勺150個之間之胺基酸，將胺基酸在結構上組織成—組p 鏈=成β片層’其中β鏈藉由介入環部分連接。重鍵可變 域及>3域結構組織之實例顯示於圖…β片層形成單域 多肽之穩定核心’同時建置由連接ρ鏈之環組成之兩"面"。 如本文所述’該等環可改變以建置定製之配位體結合位 點’且以適當控制而無需破壞蛋白質之總體穩定性即可產 生該等改變。在抗體中，該等環中之三個係熟知之互補決 定區（或nCDRn)。 用於形成單域多肽之支架應在生理條件下高度可溶且穩 定。免疫球蛋白支架之實例為單域Vi^Vl支架，以及單域 路乾科VHH域（在‘㈣科中發現之可變重域形式）或其它在 自然界中發現的或在實驗室中設計的免疫球蛋白可變域。 在本文所揭示之單域格式中，免疫球蛋白多肽不需與第二 多肽形成二聚體以達成結合活性。因Λ，天然地包含調控 97816.doc -22 - 200531979 二硫化物交聯至第二蛋白質之半胱胺酸的任何該等多肽可 改變以除去半胱胺酸。或者，可保留半胱胺酸用於將其它 部分（例如PEG)共軛至單域多肽。 其它支架可為非抗體支架蛋白質。”非抗體支架蛋白質或 域”意謂具有類免疫球蛋白折疊之非抗體多肽。類免疫球蛋 白折疊意謂約80個至150個之間之胺基酸殘基之蛋白質 域，其包括兩層反向平行（antiparallel)2 β片層，且其中兩 層β片層之平坦、疏水面彼此相對壓擠。該支架之實例為 ”基於纖維黏連蛋白之支架蛋白質"，其意謂基於纖維黏連 蛋白第III型域（Fn3)之多肽。纖維黏連蛋白為一大蛋白質， 其在細胞外間質形成及細胞-細胞相互作用中起重要作 用；其由許多重複之三種類型（Ι、Π及川型）小域組成（Bar〇n 等人’ 1991)。Fn3本身係大亞家族之範例，其包括細胞黏 附分子、細胞表面激素及細胞激素受體、伴彳呂蛋白 (chaperoning)及碳水化合物結合域之部分（參看B〇rk &
Doolittle，1992 ; Jones，1993 ; Bork等人，1994 ·，Campbell & Spitzfaden，1994 ; Harpez & Chothia，1994之綜述）。 基於纖維黏連蛋白之支架蛋白質較佳為"1〇Fn3 ”支架，其 意謂基於人類纖維黏連蛋白III型蛋白質之第十模組之多肽 變體’在其中一或多個溶劑可接近環已無規化或突變，尤 其係驗明為BC環（胺基酸23-30)、DE環（胺基酸52-56)及FG 環（胺基酸77-87)之三個環中之一或多個（編號方案為基於 人類纖維黏連蛋白之第十III型域上之序列，且胺基酸顯_ 絲-天-結員-脯表示胺基酸編號1 -5)。人類纖維黏連蛋白第jh 97816.doc -23- 200531979 型域之野生型第十模組之胺基酸序列為： VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSP ASSKPISINYRT(SEQ ID NO:5)。因此，野生型BC環包含 DAPAVTVR序歹ij ;野生型DE環包含GSKST序歹ij ;野生型FG 環包含GRGDSPASSKP序列。側接BC、DE及FG環之序列亦 稱為框架1、2、3及4，例如在表2中。 已驗明多種改良突變之1GFn3支架。修飾之天（Asp)7由非 負電荷胺基酸殘基（例如冬、離等）置換。該等突變與野生型 形式比較均具有於中性pH促進突變1GFn3更高穩定性之效 果。已揭示1GFn3支架中之多種有益的或中性的額外變種。 參看例如 Batori 等人，Protein Eng. 2002 年 12 月；15(12): 1015-20 ; Koide等人，Biochemistry 2001 年 8 月 28 日；40(34): 10326-33 。 另外本文揭示了 1GFn3支架之若干新穎修飾。尤其重要 地，吾人已發現野生型人類1GFn3之前8個胺基酸之缺失導 致大概三倍改良VEGFR-2結合。因為前8個胺基酸傾向於折 疊入接近BC、DE及FG環之位置，吾人預期該突變亦將改 良在其它選擇用於結合至不同靶之1GFn3支架中之靶結 合。因此吾人可構建編碼無前8個胺基酸之1GFn3支架之核 酸庫且在該改良庫中進行篩選。
變異的及野生型1GFn3蛋白質均具有相同結構之特徵，即 七個β鏈域序列（自A開始標定及連接七個β鏈域序列之六個 環區域（ΑΒ環、BC環、CD環、DE環、EF環及FG環）。在SEQ 97816.doc -24- 200531979 ID N〇:5中，AB環對應於殘基15_16，bc環對應於殘基 22-30，CD環對應於殘基39_45，DE環對應於殘基51_55， efj衣對應於殘基60_66aFG環對應於殘基76_87。如圖u中 所示，BC環、DE環及FG環均位於多肽之相同末端。類似 的，免疫球蛋白支架傾向於具有至少七條(3鏈，且通常為九 條β鏈。 本文所揭示之單域多肽可具有至少七條ρ鏈分佈於至少 兩個β片層之間，及至少一個連接兩條p鏈的環部分，該環 部分筝與結合至VEGFR-2，特定言之KDR，其結合特徵為 解離常數小於lxl(T6 M，且較佳小於1χ1〇·8 M。如本文所 述，尤其需要具有小於5χ10-9Μ解離常數之多肽用於抑制活 體内VEGF訊號傳輸之治療使用。需要具有1χ1〇·6 “與化 1〇 Μ之間之解離常數之多肽可用於偵測或標記活體外或 活體内VEGFR_2蛋白質。 相對於來自相同種類之其它相關蛋白質而言，vegfr_2 …β蛋白質視情況可特異結合至VEGFR-2。，，特異結合”意 δ月識別且與靶蛋白質（例如VEGFR-2)相互作用但實質上不 識別且不與樣本（例如生物樣本）中其它分子相互作用之多 肽。在較佳實施例中，本發明之多肽將以至少緊密度為5〇〇 ηΜ之Kd4寸異結合VEGFR。較佳地，多肽將以i ^^至5〇〇 ηΜ 之Kd将異結合VEGFR，更佳為} 至1⑼，更佳為i ρΜ 至10 ηΜ且隶佳為1 ρΜ至1 ηΜ或更低。 通$，將支架單域多肽庫篩選以驗明可結合至選定靶之 斗寸兴多肽變體。該等庫可為（例如）噬菌體顯現庫或 97816.doc -25- 200531979 PROfusionTM 庫。 在一示範性實施例中，我們已使用新穎活體外RNA-蛋白 質融合顯現技術來分離結合至人類（KDR)及小鼠 (Flk-l)VEGFR-2且抑制依賴VEGF之生物活性之多肽。該等 多肽自基於纖維黏連蛋白之支架蛋白質庫（Koide等人，JMB 284:1 141 (1998))及其中CDR3之多樣性已藉由與VH分子群 之CDR3域交換來增加之VL域庫中驗明。如SEQ ID No:5中 所示，1GFn3包含大約94個胺基酸殘基。 另外，如上所述，1GFn3 N-端之胺基酸序列亦可突變或缺 失。例如，BC、DE及FG環之無規化可發生在全長1GFn3情 況中或具有N-端1-8胺基酸之缺失或突變之1GFn3情況中。例 如，在8位置之L可突變為Q。在無規化以建置多樣庫後， 基於纖維黏連蛋白之支架蛋白質可用於筛選檢定法以選擇 對蛋白質（在此情況下為VEGFR)具有高親和力之多肽。 (RNA-蛋白質融合技術及基於纖維黏連蛋白之支架蛋白質 庫篩選方法之詳細描述參看Szostak等人，美國專利第 6,258,558 ; 6,261,804 ； 6,214,553 ； 6,281,344 ； 6,207,446 ； 6,518,018號；PCT公開案第 WO 00/34784 ; WO 01/64942 ; WO 02/032925 號；及 Roberts與 Szostak，Proc Natl· Acad· Sci. 94:12297-123 02, 1997，其以引用之方式併入本文中。） 對於本文所述之起始選擇，將1GFn3在23-29、52-5 5及 77-86位置之三個區域無規化且用於活體外選擇對抗人類 VEGFR-2之細胞夕卜域（融合至人類IgGIFc之KDR之1-764胺 基酸）。使用mRNA顯現（RNA-蛋白質融合）及活體外選擇， 97816.doc -26- 200531979 吾人以大約十萬億變體來取樣基於1GFn3之庫。起始選擇驗 明與VEGF競爭以便結合至KDR(人類VEGFR-2)的具有中等 親和力（Kd=10-200 nM)之多肽。隨後將起始選擇之單純系 (Kd=l 1-1 3 nM)經受突變且進一步選擇。該親和力成熟過程 產生新的解離常數在60 pM至2 nM之間之VEGFR結合多 肽。另外，吾人亦將可結合至Flk-Ι (小鼠KDR同系物）之多 肽自最初沒有結合至Flk-1之可偵測親和力之KDR結合體之 突變群中分離，導致展示對於人類及小鼠VEGFR-2之雙重 特異性多肽之分離。該等多肽顯示結合顯現KDR或Flk-Ι細 胞外域之細胞。其亦在依賴VEGF之增殖檢定法中抑制細胞 生長。結合至人類或小鼠VEGFR-2兩者之一或兩者之多肽 在表1及2中列出且某些較佳多肽在表3中列出。 使用在該等選擇中驗明之VEGFR-2結合多肽，吾人測定 了用於將多肽結合至VEGFR-2所需的FG環胺基酸一致序 列。該等序列如以下SEQ ID NOs:l-4列出。 VEGFR-2結合多肽（例如SEQ ID NOs:l-4之彼等VEGFR-2 結合多肽）可單獨調配（作為分離之募肽），作為1GFn3單域多 肽之部分，作為全長纖維黏連蛋白（具有全長胺基端或缺失 胺基端）之部分，或其片段，在免疫球蛋白（尤其係單域免疫 球蛋白）之情況中，在另一具有類免疫球蛋白折疊之蛋白質 之情況中，或在另一無關蛋白質之情況中。多肽亦可調配 為具有本身不結合至或促進結合至VEGFR之異質蛋白質其 的融合蛋白質之部分。另外，本發明之多肽亦可融合至核 酸。多肽亦可調配為單體、二聚體或多聚體。 978i6.doc -27- 200531979 表1顯示SEQIDNOs:l-2之序列。 表2-3顯示VEGFR-2結合多肽序列之實例（SEQ ID NOs: 3-183)。表1-3於’’實例•’結尾附錄於本文中。 較佳之一致VEGFR-2結合寡肽之序列： SEQ ID NO:l - (L/M)GXN(G/D)(H/R)EL(L/M)TP [X可為任何胺基酸；（/)表示相同位置之替代性胺基酸]
SEQ ID NO:2 - XERNGRXL(L/M/N)TP
[X可為任何胺基酸；（/)表示相同位置之替代性胺基酸]
SEQ ID NO:3 - (D/E)GXNXRXXIP
[X可為任何胺基酸；（/)表示相同位置之替代性胺基酸] SEQ ID NO:4 - (D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)IP [X可為任何胺基酸；（/)表示相同位置之替代性胺基酸] 較佳之VEGFR-2結合1GFn3多肽之序列： SEQ ID NO:6 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTMGLYGHELLTPISINYRT SEQ ID NO:7 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTDGENGQFLLVPISINYRT SEQ ID NO:8 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTMGPNDNELLTPISINYRT SEQ ID NO:9
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL 97816.doc -28- 200531979 QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTAGWDDHELFIPISINYRT SEQ ID NO:10 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTSGHNDHMLMIPISINYRT SEQ ID NO:ll
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTAGYNDQILMTPISINYRT SEQ ID NO:12 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTFGLYGKELLIPISINYRT SEQ ID NO:13 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTTGPNDRLLFVPISINYRT SEQ ID NO:14
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTDVYNDHEIKTPISINYRT SEQ ID NO:15 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTDGKDGRVLLTPISINYRT SEQ ID NO:16 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTEVHHDREIKTPISINYRT SEQ ID NO:17
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL 97816.doc -29- 200531979 QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTQAPNDRVLYTPISINYRT SEQ ID N〇：18 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTREENDHELLIPISINYRT SEQ ID NO: 19
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVTHNGHPLMTPISINYRT SEQ ID NO:20
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL
QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLALKGHELLTPISINYRT SEQ ID NO:21
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVAQNDHELITPISI
NYRT SEQ ID NO:22
VSDVPRDL/QEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGN SPVQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYTITGYAVTMAQSGHELFT PISINYRT SEQ ID NO:24 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVERNGRVLMTPISINYRT SEQ ID NO:25
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL
QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVERNGRHLMTPISINYRT 97816.doc -30- 200531979 SEQ ID NO:33 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLERNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO:45 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTEERNGRTLRTPISINYRT SEQ ID NO:53
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVERNDRVLFTPISINYRT SEQ ID NO:57 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVERNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO:62
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLERNGRELMVPISINYRT SEQ ID NO:63 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTDGRNDRKLMVPISINYRT SEQ ID NO:68 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTDGQNGRLLNVPISINYRT SEQ ID N〇:91
EVVAATPTSLLISWRHHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVP
LQPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVHWNGRELMTPISINYRT 978l6.doc -31 - 200531979 SEQ ID NO:92 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTEEWNGRVLMTPISINYRT SEQ ID NO:93 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVERNGHTLMTPISINYRT SEQ ID NO:94
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVEENGRQLMTPISINYRT SEQ ID NO:95 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLERNGQVLFTPISINYRT SEQ ID NO:96
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVERNGQVLYTPISINYRT SEQ ID NO:97 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTWGYKDHELLIPISINYRT SEQ ID NO:98 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLGRNDRELLTPISINYRT SEQ ID NO:99
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL
QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTDGPNDRLLNIPISINYRT 97816.doc -32- 200531979 SEQ ID N0:100 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL ‘
QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTFARDGHEILTPISINYRT SEQ ID NO:101 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL · QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLEQNGRELMTPISINYRT . SEQ ID NO:102 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL ·
QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTVEENGRVLNTPISINYRT SEQ ID NO:103 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTLEPNGRYLMVPISINYRT SEQ ID NO:104
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL
QPPTATISGLKPGVDYTITGYAVTEGRNGRELFIPISINYRT SEQ ID NO:154 φ
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYTITGYAVTWERNGRELFTPI SINYRT - SEQ ID NO:156 .
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYTITGYAVTKERNGRELFTPIS
INYRT SEQ ID NO:172 97816.doc -33- 200531979
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYTITGYAVTTERTGRELFTPISI
NYRT SEQ ID NO:173
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYTITGYAVTKERSGRELFTPIS
INYRT SEQ ID NO:175
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTHYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPPAATISGLKPGVDYTITGYAVTLERDGRELFTPIS
INYRT SEQ ID NO:177 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSP VQEFTVPLQPPLATISGLKPGVDYTITG/VYAVTKERNGRELFTP IS INYRT SEQ ID NO:180
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPTTATISGLKPGVDYTITGYAVTWERNGRELFTPIS
INYRT SEQ ID NO:181
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSP
VQEFTVPLQPTVATISGLKPGVDYTITGYAVTLERNDRELFTPIS
INYRT SEQ ID NO:186 97816.doc -34- 200531979
MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV
PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEI
DKPSQ SEQ ID NO:187
MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV
PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEI
DKPCQ SEQ ID NO:188 MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGN SPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIP ISINYRTEIDKPSQ SEQ ID NO:189 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGWNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO:190 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT SEQ ID NO:191
MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGN
SPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPI
SINYRT SEQ IDNO:192(本文中稱為CT-322之多肽的核心形式）：
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPL
QPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 97816.doc -35- 200531979 上述CT-322分子缺失前8個胺基酸且可在Ν·或C-端包括 額外之胺基酸。例如額外之MG序列可置放於N-端。Μ通常 將分解掉，在Ν-端留下GEV···序列。在Ν-端重添加正態8個 胺基酸亦產生具有所需性質之KDR結合蛋白質。通常將Ν-端之甲硫胺酸分解掉以產生如下序列： VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGR LLSIPISINYRT (SEQ ID ΝΟ:193)。 亦可修飾本發明之多肽以改良效價、生物可利用度、化 學穩定性及/或功效。例如，在本發明之一實施例中可產生 D-胺基酸肽或後對映異構（retroenantio)肽序列以改良多肽 結構之生物活性及化學穩定性（參看例如Juvvadi等人，J. Am. Chem. Soc. 118:8989-8997，1996 ; Freidinger 等人， Science，210:656-658，1980)。亦可使用内酸胺限制體（參看 前述Freidinger)，及/或氮雜二環烧胺基酸作為二肽替代物 來改良天然肽之生物及藥理性質（參看例如Hanessian等 人，Tetrahedron 53:12789-12854，1997)。 醯胺鍵替代物例如硫代醯胺、二級及三級胺、雜環及其 它（參看 Spatola，A· F·之’’Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins” Wenstein，B. Ed. Marcel Dekker，New York，1983年第7卷，267-357頁中之綜述）亦可 用於阻止多肽主鏈之酶降解進而引起改良之活性。因為環 狀多肽對酶降解不太敏感，所以將直鏈多肽轉化為環狀多 肽類似物亦可用於改良代謝穩定性（通常參看Veber等人， 97816.doc -36- 200531979
Nature 292:55-58, 1981)。 亦可使用末端基團將多肽修飾封端為酯及醯胺以減緩或 防止新陳代謝及增強親脂性。由各種連接體附接之肽之二 聚體亦可增強活性或特異性（參看例如Y. Shimohigashi等 人，Peptide Chemistry 1988，Proceedings of the 26th Symposium on Peptide Chemistry，Tokyo，10月 24-26 日， 47-50頁，1989)。多肽修飾之其它實例例如非天然胺基酸， 參看美國專利第6,559，126號。 為了在活體内使用，可產生適用於聚乙二醇化之形式。 例如添加含半胱胺酸之C-末端尾域且表現為如以下之無八 個N-末端胺基酸之形式。 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISIN YRTEIDKPCQ (SEQ ID NO:194)。該分子之聚乙二醇化形式 用於描述於以下之活體内試驗。亦使用具有絲胺酸而非半 胱胺酸之對照形式： GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISIN YRTEIDKPSQ (SEQ ID NO:195)。 亦可將相同C-末端尾域添加至具有N-末端八個胺基酸之 CT-3 22形式，例如在SEQ ID NO:193中顯示的CT-322形式。 將具有所需KDR結合性質之額外變體分離。下列核心 序列具有些許不同之FG環，且可與（例如）N-末端MG序 列、恢復8個缺失胺基酸之N-末端序列及/或提供半 97816.doc -37- 200531979 胱胺酸用於聚乙二醇化的c-末端尾域一起表現。
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFT
VPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINY RT(SEQIDNO:196)。另一此種變體具有如下核心序列：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG
NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERS LFIPISINYRT (SEQ ID NO:197)。 另外，較佳之單域免疫球蛋白多狀揭示於圖21中。 在本發明中亦包括編碼本文所述之任何多肽之核酸序 列。如熟習此項技術者瞭解的，因為第三鹼基簡幷 (degeneracy)，幾乎每個胺基酸可由編碼核苷酸序列中一個 以上三聯密碼子表示。另外，微量鹼基對變化可引起編碼 之胺基酸序列中之守恆性取代但不期望幾乎完全改變基因 產物之生物活性。因此，編碼本文所述之多肽之核酸序列 可在序列上輕微修飾但仍編碼其各自基因產物。 另外，本發明之多肽可用作引導多肽，其可進一步突變 且篩選以獲得以甚至更大親和力結合VEGFR之多肽。在一 實例中，本文所述之多肽用作引導多肽，其進一步突變或 無規化以產生具有不同於引導多肽之胺基酸突變之多肽。 接著進一步無規化之多肽可用於筛選如本文所描述之抑制 VEGF生物活性之多肽（例如結合至VEGFR且阻斷VEGF結 合至相同受體）。 3·核酸與多肽之產製 本發明之多肽可使用此項技術中已知之任何標準方法產 978l6.doc -38- 200531979 製。 在一實例中，多肽藉由將編碼多肽之核酸序列（例如 cDNA)插入重組表現載體且在促進表現情況下表現DNA序 列之重組DNA方法來產製。核酸處理之一般技術描述於例 如以引用之方式併入本文中之Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年第 2版，或 F· Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing^ Wiley-Interscience: New York，1987)及週期更新。編碼多肽之DNA 可操作地連接至源自哺乳動物、病毒或昆蟲基因之合適之 轉錄或轉譯調節成分。該等調節成分包括轉錄啟動子，控 制轉錄之可選操縱子，編碼合適之mRNA核糖體結合位點之 序列，及控制轉錄及轉譯終止之序列。另外併入通常由複 製之起點賦予的在宿主中複製之能力，及促進轉殖體之識 別的選擇基因。 重組DNA亦可包括任何類型之可用於純化蛋白質之蛋白 質標簽序列。蛋白質標簽之實例包括但不限於組胺酸標 簽、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽或GST標簽。使用細菌、 真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主之適當選殖及表現載體可 發現於 Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevier， New York，1 98 5)，其相關揭示内容以引用之方式併入本文 中 〇 使用熟習此項技術者顯而易見的適於宿主細胞之方法將 表現結構引入宿主細胞中。多種用於將核酸引入宿主細胞 97816.doc -39- 200531979 之方法在此項技術中已知，包含但不限於電穿孔法；使用 氣化鈣、氯化铷、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質轉染； 微彈轟擊（miCroprojectile bombardment);脂粒轉染及感染 (其中載體為感染劑）。 合適之宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或 細菌細胞。合適之細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機 體，例如E.大腸桿菌或芽胞桿菌屬（BaciUus spp)。較佳來 自酵母菌（Saccharomyces)屬（例如釀酒酵母菌（s. cerevisiae))之酵母亦可用於產製多肽。各種哺乳動物或昆 蟲細胞培養物系統亦可用於表現重組蛋白質。用於在昆蟲 細胞中產製異質蛋白質之桿狀病毒系統由Luck^2 Summers 綜述（Bio/Techn〇1〇gy，6:47, 1988)。合適之哺乳動 物宿主細胞株之實例包括内皮細胞、c〇s_7猴腎細胞、 CV-1、L細胞、C127、3丁3、中國倉鼠印巢（ch〇)、人類胚 腎細胞、HeLa、293、2931及醜細胞株。藉由培養合適 之宿主/载體系統以表現重組蛋白質來製備純化之多狀。對 於許多應用而言，小尺寸的許多如本文所揭示之多肽在作 為表現之較佳方法的Ε·大腸桿菌中進行表現。接著將蛋白 質自培養基質或細胞提取物中純化。 、本，文所揭示之蛋白f亦可❹細胞_轉譯系統產製。為達 成該等目的’編碼多狀之核酸必須加以修飾以允許在活體 外轉錄以產製讀NA且允許中所用衫無細胞系統中完成 禮财之無細胞轉繹（真核系統例如哺乳動物或酵母無細胞 轉譯系統或原核系統例如細菌無細胞轉譯系統）。 97816.doc -40- 200531979 VEGFR結合多狀亦可藉由化學合成法產製（例如在“仙 Phase Peptide Synthesis，1984 年第二版，The pierce
Chemical Co.，Rockford，IL描述之方法）。蛋白質之修飾亦 可藉由化學合成法產製。 本發明之多肽可藉由通常在蛋白質化學領域已知之蛋白 質分離/純化方法來純化。非限制之實例包含萃取、再結 晶、鹽析（例如以硫酸銨或硫酸鈉）、離心、透析、超濾、吸 附層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、正相層析法、 逆相層析法、凝膠過濾、凝膠滲透層析法、親和力層析法、 電泳、逆流分配法或該等之任何組合。純化後，可將多肽 交換至不同緩衝液及/或藉由多種在此項技術中已知之任 何方法濃縮，包括但不限於過濾及透析。 純化之多肽較佳為至少85%純，更佳為至少95%純，且最 佳為至少98%純。不管純度之精確數值，多肽用作醫藥產 品係足夠純的。 4·多肤之後轉譯修飾 在某些貫施例中，本發明之結合多肽可另外包含後轉譯 修飾。示範性後轉譯蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲 基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、相撲化 (〇yiatlon)、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基。結果， =飾之可/令多肽可含非胺基酸成分例如脂質、多或單醣及 η -夂S日糖基化之較佳形式為涎液酸化，其將一或多種涎 液酉夂部分共輛至多肽。；延液酸部分改良溶解性及血清半衰 /月同Τ亦減 > 蛋白質之可能免疫原性。在多肽官能基上之 97816.doc -41 - 200531979 該等非胺基酸成分之效應可經測試以呈現其對VEGFR-2或 VEGF功能之拮抗作用，例如其對血管新生或腫瘤生長之抑 制效應。 在本發明之一特定實施例中，本可溶多肽之修飾形式包 含將本可溶多肽連接至非蛋白質聚合物。在一特定實施例 中，該聚合物為聚乙二醇（”PEG”）、聚丙二醇或聚烷二醇， 其形式陳述於美國專利第4,640,835 ; 4,496,689 ; 4,301，144 ; 4,670,417 ; 4,791，192 或 4，179,337號中。本發明 之修飾多肽之實例包括聚乙二醇化M5FL及聚乙二醇化 CT-322。 PEG係熟知之水可溶聚合物，其在市面上有售或可根據 在此項技術中熟知之方法將乙二醇開環聚合來製備 (Sandler及 Karo ’ Polymer Synthesis，Academic Press，New
York，第3卷，138-161頁）。術語"PEG”廣泛用於涵蓋任何 聚乙二醇分子，無需考慮尺寸或在PEG末端之修飾，且可 由下式表示：Χ-ΟβΗ/Η^Ι^ΗΑΙ^ΟΗΟ)，其中n為2〇 至23 00且X為Η或末端修飾，例如C1 _4烧基。在一實施例中， 本發明之PEG在一末端以羥基或甲氧基為端基，亦即X為η 或CH〆”甲氧基PEG”）。PEG可含用於結合反應所必需；由 分子之化學合成產生；或為分子各部分之最佳距離之間隔 體之其它化學基團。另外，該PEG可由一或多個連接在一 起之PEG側鏈組成。具有多於一個PEG鏈之PEG稱為多臂或 分支鏈PEG。分支鏈PEG可藉由（例如）將聚氧化乙烯添加至 各種多元醇（包括甘油、異戊四醇及山梨糖醇）中來製備。例 97816.doc -42- 200531979 如，四臂分支鏈PEG可自異戊四醇及環氧乙烷製備。分支 鏈PEG描述於例如EP-A 0 473 084及美國專利第5,932,462 號。PEG之一種形式包括經由離胺酸之第一胺基連接之兩 仏 PEG側鍵（PEG2)(Monfardini，C·等人，Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69) 〇 儘管PEG係吾人所熟知的，但據吾人所知這是第一次表 明聚乙二醇化之10Fn3多肽可聚乙二醇化且保留配體結合 活性。在一較佳實施例中，聚乙二醇化之i〇Fn3多肽藉由位 點導向聚乙二醇化產生，尤其藉由將PEG共軛至N_或C-端 之半胱胺酸部分。因此本揭示内容提供具有改良藥物動力 子特性之革巴結合F η 3多狀’該多狀包含：具有約§ 〇至約15 〇 個胺基酸之1 GFn3域，其中該1 GFn3域之至少一環參與革巴結 合；及一共價結合PEG部分，其中該i〇Fn3多肽以小於丨〇〇 nM 之KD結合至I巴且在大鼠或人類具有小於3〇 mL/hr/kg之清除 率。可藉由位點導向聚乙二醇化將PEG部分附接至10Fn3多 肽，例如藉由附接至Cys殘基，其中該cys殘基可位於10Fn3 多肽之N-端或在N_端與最冰端0鏈之間或在ι〇Ρη3多肽之C-端或在N-端與最C-端β鏈之間。Cys殘基亦可位於其它位 置’尤其係在不參與乾結合之任何環。 PEG共軛至肽或蛋白質通常涉及pEG之活化及將活化之 PEG中間體直接偶合至靶蛋白質/肽或至連接體，接著將連 接體活化且偶合至靶蛋白質/肽（參看Abuchowski，A.等 人，J· Biol. Chem·，252, 3571 (1977)及 J. Biol· Chem·，252, 3582 (1977)，Zalipsky 等人及 Harris等人，於p〇ly (ethylene 97816.doc -43- 200531979 glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications: (Je M. Harris編著）Plenum Press: New York，1992 ; 21 及 22 章）。吾人注意到含PEG分子之結合多肽亦稱作共軛蛋白 質，但無附接PEG分子之蛋白質可稱為非共軛。 可選擇PEG之多種分子質量形式，例如自約1，000道爾頓 (Dalton)(Da)至 100,000 Da(n 為 20 至 2300)，用於共軛至 VEGFR-2結合多肽。PEG中之重複單元數”n’f對於以道爾頓 描述之分子質量進行概算。最好在活化連接體上組合PEG 分子質量適合於藥物用途。因此，在一實施例中，PEG分 子之分子質量不超過1〇〇,〇〇〇 Da。例如，若三個PEG分子附 接至連接體，其中每個PEG分子具有12,000 Da之相同分子 質量（每個η約為270)，則連接體上PEG之總分子質量為約 36.000 Da(總η約為820)。附接至連接體之PEG之分子質量 亦可不同，例如連接體上之三個分子中兩個分子每個可為 5.000 Da(每個η約為110)且一個PEG分子可為12,000 Da(n約 為 270)。 在本發明之一特定實施例中，VEGFR-2結合多肽共價連 接至式為-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR之一聚乙二醇基團， 聚乙二醇基團之-CO(亦即羰基）與結合多肽之一胺基形成 醯胺鍵；R為低碳數烷基；X為2或3 ; m為自約450至約950 ; 且選擇η及m以使共軛體減去結合多肽之分子量為自約10至 40 kDa。在一實施例中，結合多肽之ε-胺基之離胺酸為可用 之（游離）胺基。 更具體言之，以上共軛體可藉由式（II)表示·· P-NHCO- 97816.doc -44- 200531979 (CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(II)，其中P為本文所述之結合多肽 之基團，（亦即無與在式（II)中顯示之羰基形成醯胺鍵之該 胺基或該等胺基）；且其中R為低碳數烷基；X為2或3 ; m為 自約450至約950且加以選擇以使共軛體減去結合多肽之分 子量為自約10至約40 kDa。如本文所使用之所給’’m”之範圍 具有定向涵義。”mn之範圍在任何情況下係確定的，且確切 地由PEG基團之分子量決定。 熟習此項技術者可選擇PEG之合適分子質量，例如基於 在治療上如何使用聚乙二醇化之結合多肽、所需劑量、循 環時間、耐蛋白水解性、免疫原性及其它需要考慮因素。 關於PEG之論述及其用於增強蛋白質特性，參看Ν· V. Katre， Advanced Drug Delivery Reviews 10:91-114 (1993) ° 在本發明之一實施例中，可將peg分子活化以便與結合 多肽上之胺基（例如與離胺酸）反應（Bencham C. 0·等人， Anal· Biochem·，131，25 (1983) ; Veronese，F. M.等人，Appl. Biochem·，11，141 (1985); Zal ip sky，S·等人，Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999) ; Zalipsky，S.等人，Europ. Polym. J·，19, 1 177-1 183 (1983) ; Delgado，C.等人，Biotechnology and Applied Biochemistry，12，1 19-128 (1990)) o 在一特定實施例中，PEG之碳酸酯用於形成PEG-結合多 肽共軛體。N，N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯（DSC)可用於與PEG 反應以形成活性混合PEG-琥珀醯亞胺基碳酸酯，其可隨後 與附接體之親核性基團或結合多肽之胺基反應（參看美國 97816.doc -45- 200531979 專利第5,281，698號及美國專利第5,932,462號）。在類似類型 之反應中，1，Γ-(二苯幷三唑基）碳酸酯及二-(2-吡啶基）碳酸 酯可分別與PEG反應以形成PEG-苯幷三唑基及PEG-吡啶基 混合碳酸酯（美國專利第5,382,657號）。 1GFn3多肽之聚乙二醇化可根據目前此項技術條件下之 方法來進行，例如藉由結合多肽與親電活性PEG反應（供應 商：Shearwater Corp·，USA，www.shearwatercorp.com) 〇 本 發明之較佳PEG試劑為例如N-羥基琥珀醯亞胺基丙酸酯 (PEG-SPA)、丁酸酯（PEG-SBA)、PEG-琥珀醯亞胺基丙酸酉旨 或分支鏈N-經基琥珀醯亞胺例如mPEG2-NHS(Monfardini， C·等人，Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。該等方法可 用於結合多肽離胺酸之ε-胺基或結合多肽之N-末端胺基之 聚乙二醇化。 在另一實施例中，PEG分子可偶合至結合多肽上之硫氫 基（Sartore，L·等人，Appl. Biochem· Biotechnol·，27，45 (1991) ;Morpurgo等人，Biocon· Chem·，7，363-368 (1996); Goodson 等人，Bio/Technology (1990) 8, 343 ;美國專利第 5,766,897 號）。美國專利第6,610,281號及第5,766,897號描述可偶合至 硫氫基之示範性反應性PEG種類。 在其中PEG分子共軛至結合多肽上之半胱胺酸殘基的某 些實施例中，半胱胺酸殘基在該結合多肽中本來就有的， 然而在其它實施例中，一或多個半胱胺酸殘基設計入結合 多肽。可將突變引入結合多肽編碼序列以產生半胱胺酸殘 基。這可藉由例如將一或多個胺基酸殘基突變至半胱胺酸 97816.doc -46 - 200531979 來達成。用於突變至半胱胺酸殘基之較佳胺基酸包括絲胺 酸、蘇胺酸、丙胺酸及其它親水性殘基。待突變至半胱胺 -欠之較彳土殘基為表面曝露之殘基。用於基於一級序列或蛋 白質來預測殘基之表面可接近性之演算法在此項技術中熟 另外’鐾於设計及開發結合多肽所依據之框架之晶體 、、、° 構已解析（參看 Himanen等人，Nature. (2001) 20-27; 414 (6866): 933-8)且因此已驗明表面曝露之殘基，表面殘基可 藉由比較結合多肽之胺基酸序列來預測。在一實施例中， 將半胱胺酸殘基於或靠近N—及/或c_端或在環區域内引入 結合多肽。 在某些實施例中，聚乙二醇化之結合多肽包含共價附接 至N-末端胺基酸之α胺基的Peg分子。位點特異斗末端還原 胺化描述於Pepinsky等人，（2001)JPET，297，1059及美國專 利第5,824,784號。利用其它可用之親核性胺基來將PEG_醛 用於蛋白質還原胺化描述於美國專利第4,0〇2,53 1號， Wiedei*等人，（1979) J. Biol· Chem. 254，12579及 Chamow等 人，（1994) Bioconjugate Chem. 5，133 〇 在另一實施例中，聚乙二醇化之結合多肽包含一或多個 共"ί貝附接至連接體的P E G分子’連接體依序在結合多狀之 Ν-端附接至胺基酸殘基之α胺基。該方法揭示於美國專利公 開案第 2002/00449：21 號及第 WO 94/01451 號。 在一實施例中，結合多肽在C-端聚乙二醇化。在一特定 實施例中，藉由引入C -末端疊氮基甲硫胺酸及隨後通過施 陶丁格（Staudinger)反應共軛甲基-PEG-三芳基膦化合物將 97816.doc -47- 200531979 蛋白質在c-端聚乙二醇化。該c-末端共軛方法描述於 Cazalis 等人，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity，Bioconjug Chem· 2004; 15(5): 1005-1009。 結合多肽之單聚乙二醇化亦可根據WO 94/01451描述之 一般方法產生。WO 94/01451描述用於製備具有修飾末端胺 基酸α碳反應基團之重組多肽之方法。該方法之步驟涉及形 成重組多肽且在Ν-末端α胺及C-末端α羧基一或多個生物地 添加之保護基團來保護該多肽。接著可將多肽與化學保護 劑反應以有選擇地保護反應側鏈基團且因此防止側鏈基團 被修飾。接著將多肽以對生物保護基團特異之分解試劑分 解以形成無保護之末端胺基酸01碳反應基團。將該無保護之 末端胺基酸α碳反應基團以化學修飾劑修飾。接著將側鏈受 保護之末端修飾單拷貝（single c〇py)多肽在側鏈基團去保 護以形成末端修飾重組單拷貝多肽。在該方法中步驟之數 目及序列可變化以達成在多狀之N_及/仏末端胺基酸之 選擇性修飾。 在共輛反應中結合多肽與活化PEG之比率可自約1:〇5至 B0,自約1:1至1:30之間，或自約1:5至1:15。可在本方法 中使用各種水性緩衝液以催化PEG共價添加至結合多狀。 在-實施例中，使用之緩衝液之PH值自約7輕9口〇。在另 一實施例巾’ pH在稍呈驗性範列如自約75至8卜 可使用具有接近中性ρΗ範圍之pKa的緩衝液，例如梅 緩衝液。 97816.doc -48- 200531979 在此項技術中已知之習知分離及純化技術可用於純化聚 乙二醇化結合多肽，例如尺寸排除法（例如凝膠過濾）及離子 交換層析法。亦可使用SDS-PAGE來分離產物。可分離之產 物包括單、二、三、多及非聚乙二醇化之結合多肽，以及 游離PEG。對單PEG共軛體之百分比的控制可藉由集中廣泛 溶離份在溶離峰周圍以增加單PEG在組合物中之百分比來 進行。約百分之九十單PEG共軛體表示產量與活性之良好 平衡。其中（例如）至少百分之九十二或至少百分之九十六之 共軛體為單PEG種類的組合物可為所需要的。在本發明之 一實施例中單PEG共軛體之百分比為自百分之九十至百分 之九十六。 在一實施例中，本發明之聚乙二醇化結合多肽含一、二 或多個PEG部分。在一實施例中，該（等）PEG部分結合至在 蛋白質表面上之胺基酸殘基及/或遠離接觸靶配位體之表 面之胺基酸殘基。在一實施例中，PEG-結合多肽中組合或 總的PEG分子質量為自約3,000 Da至60,000 Da，視情況可 自約10,000 Da至3 6,000 Da。在一實施例中，聚乙二醇化結 合多肽中之PEG基本為線性（linear)、直鏈（straight-chain) PEG。 在本發明之一實施例中，使用經胺檢定法（例如450 mM 羥胺（pH 6.5)於室溫下經過8至16小時）聚乙二醇化結合多 肽中之PEG未自聚乙二醇化胺基酸殘基水解，且因此穩 定。在一實施例中，組合物之大於80%為穩定之單PEG結合 多肽，更佳為至少90%且最佳為至少95%。 978i6.doc -49- 200531979 在另一實施例中，本發明之聚乙二醇化結合多肽較佳保 留至少 25%、50%、60%、70%，最少 80% ' 85%、90%、95% 或100%與未修飾蛋白質相關聯之生物活性。在一實施例 中，生物活性係指其結合至VEGFR-2之能力，其如藉由 KD、k,结合或k脫離所評析。在一特定實施例中，聚乙二醇化 結合多肽蛋白質顯示相對於未聚乙二醇化結合多肽結合至 VEGFR之增強。 在一較佳實施例中，PEG結合多肽具有相對於未修飾蛋 白質之半衰期之增強之半衰期（ti/2)。較佳地，PEG結合多 肽之半衰期相對於未修飾結合多肽之半衰期增強至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400% 或5 00%，或甚至為1000%。在某些實施例中，蛋白質半衰 期在活體外決定，例如在缓衝鹽水溶液或血清中。在其它 實施例中，蛋白質半衰期為活體内半衰期，例如在動物血 清中或其它體液中蛋白質之半衰期。 5·治療調配物及投藥模式 本發明以治療對抑制VEGF生物活性有反應之病症或防 止對抑制VEGF生物活性有反應之前病症之方法為特徵。較 佳之實例為不適當之血管新生為特性的病症。投藥技術及 劑量視特異多肽之類哲及治療之特異病症而變化但可易於 由熟練此項技術者決定。通常，管理機構要求待用作治療 劑之蛋白質試劑加以調配以使其具有可接受之低含量熱 原。因此，治療調配物通常不同於其它調配物之處係在於， 97816.doc -50· 200531979 □為〃基本上無熱原，或至少含有不超過可接受含量之熱 原此可接叉含量係由適當管理機構（例如FDA)決定。 、本發明之治療組合^可與醫藥i可接受之稀釋齊！、載劑 或賦形^以單位劑型投用。投藥方式可為非經腸方式（例如 #脈内皮下）、經口或經局部，此為非限制之實丫列。另外， 可知用其中使用編碼本發明之多肽之核酸的任何基因治療 技術，例如裸DNA傳遞、重組基因及載體、基於細胞之傳 遞（包括在活體外處理患者細胞）及其類似技術。 組合物可為用於口服投藥之丸劑、錠劑、膠囊、液體或 持續釋放錠劑之形式；或用於靜脈内、皮下或非經腸投藥 之液體，用於局部投藥之凝膠、洗劑、膏劑、霜劑或聚合 物或其它持續釋放媒劑。 此項技術中熟知之用於製造調配物之方法發現於例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy^^ 20 版，ed· A.R· Gennaro AR·，2000, Lippinccm Williams &
Wilkins，Philadelphia，PA)。用於非經腸投藥之調配物可含 有例如賦形劑、無菌水、鹽水、聚伸烷二醇例如聚乙二醇、 源於植物之油或氫化萘。生物相容的、生物降解的交酷聚 合物、交酯/乙交酯共聚物或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物 可用於控制化合物之釋放。奈米微粒調配物（例如生物降解 之奈米微粒、固體脂質奈^微粒、脂質體）可用於控制化合 物之生物分佈。其它可能適用之非經腸傳遞系統包括乙稀_ 乙酸乙烯酯共聚物微粒、滲透泵、可植入輸注系統及脂質 體。調配物中化合物之濃度之變化視許多因素而定，包括 97816.doc -51- 200531979 待投用藥物劑量及投用途徑。 多肽視情況可作為醫藥上可接受之鹽投藥，例如在醫藥 工業中常用之無毒酸加成鹽或金屬錯合物。酸加成鹽之實 例包括有機酸例如乙酸、乳酸、雙羥萘酸、順丁烯二酸、 檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、 辛二酸、水揚酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸 或其類似物；聚合酸例如鞣酸（tannicacid)、魏甲基纖維素 或其類似物；及無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或 其類似物。金屬錯合物包括辞、鐵及其類似物。在一實例 中’多肽在乙酸鈉存在下調配以增強熱穩定性。 用於口服使用之調配物包括含有與無毒醫藥上可接受之 賦形劑混合之活性成分之錠劑。該等賦形劑可為（例如）惰性 稀釋劑或填充劑（例如蔗糖及山梨糖醇）、潤滑劑、助流劑及 抗黏著劑（例如硬脂酸鎮、硬脂酸辞、硬脂酸、二氧化石夕、 氫化植物油或滑石粉）。 用於口服使用之調配物亦可作為咀嚼錠劑提供，或作為 其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合的硬明膠膠囊，或作 為其中活性成分與水或油性媒質混合的軟明膠膠囊。 治療有效劑量係指產生投藥所欲達成之治療效果之劑 量。確切劑量視治療之失調症而定，且可由熟習此項技術 者使用已知之技術來確定。通常，多肽每天投用約0.01
Kg/kg至約 50 mg/kg，較佳為每天 〇·〇 1 mg/kg至約 30 mg/kg， 最佳為每天〇·1 mg/kg至約20 mg/kg。該多肽可每天給藥（例 如每天一次、兩次、三次或四次）或不太頻繁（例如每隔一天 97816.doc •52- 200531979 一次、每週一次或兩次、或每月一次）。另外，如此項技術 中已知，可根據年齡以及體重、一般健康狀況、性別、飲 良、投樂日守間、藥物相互作用及疾病嚴重程度作必要之調 整’且該調整由熟習此項技術者以常規試驗確定。 6·示範性使用 本文所述之VEGFR-2結合蛋白質及其相關變體在許多治 療及#斷應用中適用。該等包括藉由競爭或阻斷結合至 VEGFR-2來抑制VEGF之生物活性，同時亦傳遞細胞毒素或 造影部分至細胞（較佳為表現VEGFR-2之細胞）。 該等分子之小尺寸及穩定結構可對製造藥物尤其有價 值用於某些品要快速清除之應用之自體内快速清除，或 調配入合適之或使用具有該等特性的分子改良之新穎傳遞 系統。 根據其作為VEGF生物活性抑制劑之功效，本發明之多肽 有效對抗許多與不適當之血管新生相關聯之病症，包括但 不限於自體免疫失調症（例如類風濕性關節炎、發炎性腸病 或牛皮癬）；心臟失調症（例如動脈粥樣硬化或血管再狹 窄）；視、網膜病（例士口-般性增殖性視網膜病、糖尿病性視網 膜病、年齡相關之黃斑退化或新生血管性青光眼），腎病（例 如糖尿病腎病、惡性腎硬化、血栓形成之微血管病變徵候 群；移植排斥反應，·炎性腎病；絲球體腎炎；㈣增殖性 絲球體腎炎（meSangi〇prollferative 出… 血性尿毒徵候群及高血壓腎硬化）；成血管細胞瘤；血; 瘤；甲狀腺增生；組織移植；慢性炎症；梅格斯氏徵候群 97816.doc -53 - 200531979 (Meigs’s syndrome);心包膜積水（pericardial effusion);肋 膜積水（pleural effusion);自體免疫疾病；糖尿病；子宮内 膜異位；慢性哮喘；不良纖維化（尤其係肝纖維化）及癌症， 及由癌症引起之併發症，例如肋膜積水及腹水。本發明之 VEGFR-結合多肽較佳地可用於治療或防止過度增殖性疾 病或癌症及癌症之轉移擴散。癌症之非限制實例包括膀 胱、血液、骨、腦、乳房、軟骨、結腸腎、肝、肺、淋巴 結、神經組織、卵巢、胰腺、前列腺、骨路肌、皮膚、脊 髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、 輸尿管、尿道、子宮或陰道癌。另外可治療之病症可見於 以引用之方式併入本文中之美國專利第6,524,583號。其它
·· McLeod DS 4田述VEGFR-2結合多狀之用途之參照案包括 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci·，2〇〇2年2月；43(2): 474-82 ; Watanabe 等人，Exp Dermat〇1，2〇〇^u 月； 13(11):671-81 ; Y0Shiji H等人，Gut·，2〇〇3 年 9 月；52(9): 1347-54； Verheul# A ^ Oncologist.，2000 ; 5 Suppl 1:45-50 ；
Boldicke等人，Stem Cells·，2〇〇1 ; 19(i):24 36。 如本文所述，血管新生相關之疾病包括但不限於，依賴 於血管新生之癌症，包括（例如）實體腫瘤、造企腫瘤（例如 白血病)及腫瘤轉移；良性腫瘤例如血管瘤、聽神經瘤、神 經纖維瘤、沙眼及化膿性肉芽腫；發炎性失調症例如免疫 及非免疫炎症；慢性關節風濕病和牛皮癖；眼之企管新生 疾病例如糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、黃斑退化、 角膜移植排斥反應、新生血管性青光眼、晶體後纖維組織 97816.doc -54- 200531979 增生（retrolental fibr〇p丨asia)、虹膜紅變（灿⑶仏）· Osh Webber徵候群；心肌血管新生；動脈粥樣斑血管新生；毛 細管擴張；血友病M節（hemophiliac j〇int);血管纖維瘤及 創:肉芽形成與創口瘢合；毛細管擴張性牛皮癬硬皮病、 化膿丨生肉芽腫、冠脈側枝、缺血性肢部血管新生、角膜疾 病、虹膜紅變、關節炎、糖尿病性血管新生、骨折、血管 舍生、造血（hematopoiesis)。 VEGFR-2結合多肽可單獨投用或與_或多個另外之療法 、且口例如化學療法放射線療法、免疫療法、外科手術介 入或該等之任何組合。作為如上所述之其它治療策略^ 佐療法的長期療法同樣可與該多肽組合。 a亥寻方法之某些實施例中，可一起（同時）或在不同時間 (依序地）投用-或多個多肽治療劑。另外，多狀治療劑可與 另一類型用於治疼步 ^ 麇癌症或用於抑制血管新生的化合物一起 投用。 貫施例中，本發明之本治療劑可單獨使用。或者
本劑可與其它習知 A 之針對b療或防止增殖性失調症 腫瘤）的抗癌治療方法細人 万去組合使用。例如，該等方法
防性的癌症防止、阶μ主，丄々广—— ^ ^ fJ 其它習知之癌症療法之彳:發及癌症轉移及❸ 本發明本發㈣為可通過使月 彳肽化療劑增強習知之癌症療法（例如 法、放射線療法、夯日刀 ^ ^ . 丹 性。 先^療法、免疫療法及外科手術）之有交 廣泛系列之習知 化合物已顯示具有抗腫瘤 活性 該等化 97816.doc -55- 200531979 合物已在化學療法中用醫藥劑以縮小實體腫瘤、防止轉移 及進-：生長或減少白血病或骨髓惡性腫瘤中惡性細胞數 目》化學療法已經對治療各種類型惡性腫瘤有效，但
峰多抗Μ瘤化合物弓I T W A “勿引起不良之副作用。已顯示當兩或兩種 以上不同治療劑相組合時，該等治療劑可協同作用且使每 個療劑之劑$降低，進而降低由每個化合物在高劑量下 引起之有害副作用。在其它情況下，難以用治療劑治癒之 心I·生腫瘤可對兩或兩種以上不同治療劑之組合療法起反 應。 备本發明之多肽治療劑與其它習知之抗腫瘤劑或相伴或 依序而組合投用時，可發現該治療劑增強抗腫瘤劑之治療 效應或克服細胞對該抗腫瘤劑之抗性。這允許減小抗腫瘤 劑之劑量，進而減少不良之副作用或於抵抗細胞中恢復抗 腫瘤劑之有效性。 可用於組合之組合性抗腫瘤療法之醫藥化合物包括（僅 舉例ΰ兒明）·胺魯米特（aminoglutethimide)、胺苯。丫 σ定 (amsacrine)、安美達錠（anastrozole)、天冬醯胺酶、卡介苗 (beg)、比卡魯胺（bicalutamide)、博萊黴素（bleomycin)、布 舍瑞林、白消安、喜樹驗（campothecin)、卡西他賓 (capecitabine)、卡鉑（carboplatin)、卡氮芥（carmustine)、苯 丁酸氮芥、順翻（cisplatin)、克拉屈濱（cladribine)、氯屈膦 酸鹽（clodronate)、秋水仙驗、環填醯胺、環丙氯地孕_ (cyproterone)、阿糖胞普（cytarabine)、達卡巴嗪 (dacarbazine)、放線菌素 D、道諾黴素（daunorubicin)、雙烯 97816.doc -56- 200531979 雌紛（dienestrol)、己烯雌紛（diethylstilbestrol)、多烯紫杉 醇（docetaxel)、多浠紫杉醇、表柔比星（epirubicin)、雌二醇、 雌莫司汀（estramustine)、依託泊苷（etoposide)、依西美坦 (exemestane)、非格司亭（filgrastim)、敗達拉賓（fludarabine) 、氟氫可的松（fludrocortisone)、敗尿嘴唆（fluorouracil)、 氟經曱睪酮（fluoxymesterone)、默他胺（flutamide)、吉西他 濱、4,5,6-三羥基異黃酮（genistein)、戈舍瑞林、羥基腺、 伊達比星（idarubicin)、異環構醢胺、伊馬替尼（imatinib)、 干擾素、伊立替康（irinotecan)、伊羅替康（ironotecan)、來 曲唾（letrozole)、甲酷四氣葉酸（leucovorin)、亮丙立德 (leuprolide)、左口米口坐（levamisole)、洛莫司、;丁（lomustine)、 氮芬（mechlorethamine)、甲經孕 _ (medroxyprogesterone)、 甲地孕酮（megestrol)、美法余（melphalan)、魏σ票呤 (mercaptopurine)、疏乙石黃酸鈉（mesna)、甲胺嗓呤 (methotrexate)、絲裂黴素（mitomycin)、米托坦（mitotane)、 米托蒽藏（mitoxantrone)、尼魯米特（nilutamide)、諾考達唾 (nocodazole)、奥曲肽（octreotide)、奥賽力翻（oxaliplatin)、 紫杉醇、帕米膦酸鹽（pamidronate)、戊糖苦（pentostatin)、 普卡黴素（plicamycin)、外吩姆（porfimer)、甲基苄肼 (procarbazine)、雷替曲占（raltitrexed)、利妥昔單抗 (rituximab)、鏈脲黴素（streptozocin)、蘇拉明（suramin)、三 苯氧胺（tamoxifen)、替莫嗤胺（temozolomide)、替尼泊甙 (teniposide)、睪固 _ (testosterone)、硫鳥 ϋ票呤（thioguanine) 、三胺硫石粦（thiotepa)、二氯二茂鈥（titanocene dichloride)、 97816.doc -57- 200531979 拓朴替康（topotecan)、曲妥珠單抗（trastuzumab)、維甲酸 (tretinoin)、長春驗（vinblastine)、長春新驗（vincristine)、 去乙酿長春新驗（vindesine)及長春瑞賓（vinorelbine)。 某些化學治療抗腫瘤化合物可藉由其作用機理分類為例 如下列群：抗代謝物/抗腫瘤劑，例如嘧啶類似物（5-氟尿嘧 淀、敗尿脫氧核皆（floxuridine)、卡西他賓（capecitabine)、 吉西他濱（gemcitabine)及阿糖胞苦（cytarabine))及ϋ票吟類似 物、葉酸鹽（folate)拮抗劑及相關抑制劑（巯嘌呤、硫鳥嘌 呤、戊糖苷及2-氯化脫氧腺苷（克拉屈濱））；抗增生性/抗有 絲分裂劑包括天然產物例如長春花生物鹼（長春鹼、長春新 鹼及長春瑞賓）、微管破裂劑例如紫杉烷（紫杉醇、多烯紫杉 醇）、長春新驗、長春驗、諾考達唾、艾普塞隆（epothilones) 及溫諾平（navelbine)、表鬼臼素（epidipodophyllotoxins)(依 託泊苷、替尼泊甙）、DNA破壞劑（放線菌素、胺苯吖啶、 蒽環黴素、博萊黴素、白消安、喜樹鹼、卡鉑、苯丁酸氮 Y、順翻、環填醯胺、環碟醯胺（cytoxan)、放線菌素、道 諾黴素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺奥賽力鉑 (hexamethylmelamineoxaliplatin)、異環麟醯胺、美法侖、 氮芥（merchlorehtamine)、絲裂黴素、米托蒽醌、亞硝基脲、 晋卡黴素、曱基节肼、紫杉醇、歐洲紫杉醇（taxotere)、替 尼泊甙、塞替派及依託泊苷（VP 16));抗生素例如放線菌素 (放線菌素D)、道諾黴素、多柔比星（阿黴素（adriamycin))、 伊達比星、蒽環黴素、米托蒽醌、博萊黴素、普卡黴素（光 輝黴素（mithramycin))及絲裂黴素；酶類（L-天冬醯胺酶其全 97816.doc -58- 200531979 身地代謝L-天冬醯胺酸且奪去不具有合成其自身天冬醯胺 酸能力之細胞）；抗血小板劑；抗增生/抗有絲分裂烧化劑例 如氮务子氣（氮芥、環蛾酸胺及類似物，美法侖、苯丁酸氮 芥）’乙烯亞胺及曱基三聚氰胺（六甲基三聚氰胺及三胺硫 鱗）、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝基脲（卡氮芥（BCNU)及類似 物’鏈脲黴素）、達卡巴唤（trazenes-dacarbazinine)(DTIC); 抗增生/抗有絲分裂之抗代謝物例如葉酸類似物（甲胺喋 吟），鈾金屬配位錯合物（順翻、卡翻）、甲基苄肼、經基脲、 米托坦、胺魯米特；激素、激素類似物（雌激素、三苯氧胺、 戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特）及芳香酶抑制劑（來曲唑、 女美達録：），抗/旋劑（肝素、合成肝素鹽及其它凝血酶之抑制 劑）；纖維蛋白溶解劑（例如組織血纖維蛋白溶酶原活化劑、 鏈激酶及尿激酶）、阿斯匹林、雙嘧達莫（dipyridam〇le)、噻 氯匹啶（ticlopidine)、氯吡格雷（cl〇pid〇grel)、阿昔單抗 (abciximab);抗轉移劑；抗分泌劑布瑞汀（breveldin);免疫 抑制劑（環孢黴素、他克莫司（tacr〇Umus)(FK_5〇6)、西羅莫 司（sirolimns)(雷帕黴素（rapamycin))、硫唑嘌呤 (azathioprine)、黴酚酸酯（myc〇phen〇iate 則如1));抗血管 新生化合物TNP-470、4,5,6-三經基異黃酮）及生長因子抑制 劑（例如VEGF抑制劑、纖維母細胞生長因子（fgf)抑制劑” 血管收縮素受體阻斷劑；氧化—氮供體；反義寡核苦酸； 抗體（曲妥珠單抗）；細胞週期抑制劑及分化誘導物（維甲 酸）；mT〇R抑制劑、抬撲異_抑制劑（多$比星（阿黴素）、 月女苯丫。疋、吾树鹼、道諾黴素、放線菌素d、艾尼泊甙 97816.doc •59· 200531979 (eniposide)、表柔比星、依託泊苷、伊達比星及米托蒽醌、 拓朴替康、伊立替康）、皮質類固醇（可的松、地塞米松 (dexamethasone)、氫化可的松（hydroc〇rtis〇ne)、甲基強的 松（methylpednisolone)、強的松（pjrednis〇ne)及潑尼龍 (prenisolone));生長因子訊號轉導激酶抑制劑；粒線體功 月b IV Μ誘導物及脱冬狀酶（caspase)活化劑；及染色質破裂 劑。 在某些實施例中，可用於組合之抗血管新生療法之醫藥 化合物包括：（1)釋放”血管新生分子，，之抑制劑，例如 bFGF(基本纖維母細胞生長因子）；（2)血管新生分子之中和 劑，例如抗pbFGF抗體；及（3)内皮細胞響應血管新生刺激 之抑制劑，包括膠原酶抑制劑、基膜翻轉（turn〇ver)抑制劑、 血管抑素留類、源自真菌之血管新生抑制劑、血小板因子 4、凝血栓蛋白、關節炎藥物例如〇青黴胺及硫丁二酸金 (gold thiomalate)、維生素h類似物、α干擾素及類似物。 其它建議之血管新生抑制劑參看Bi〇od等人，Bi〇ch. Biophys. Acta·，1032:89-118 (199〇)，M〇ses等人，以^⑽， 248:1408-1410 (1990)，lngber等人，Lab· Invest，59:44-51 (1988)及美國專利第 5,〇92,885、5，112,946、5，192,744、 5,202,352及6573256號。另外，存在廣泛種類可用於抑制血 I新生之化5物，例如内皮生長抑素（encj〇statin)蛋白或衍 生物、血官抑素之離胺酸結合片段、黑色素或促黑色素化 合物、血纖維蛋白溶酶原片段（例如血纖維蛋白溶酶原之半 光胺酸捲曲區1-3)、肌鈣蛋白亞基、玻璃連結蛋白αν(33之拮 97816.doc -60- 200531979 抗劑、衍生自Saposin B之肽、抗生素或類似物（例如四環素 或新黴素）、含地諾孕素之組合物、含有偶合至肽之MetAP-2 抑制核心之化合物、化合物EM-13 8、查耳酮（chalcone)及其 類似物及那拉達斯（naaladase)抑制劑。例如參看美國專利第 6,395,718、6,462,075、6,465,431、6,475,784、6,482,802、 6,482,810、6,500,431、6,500,924、6,518,298、6,521，439、 6,525,019、6,538，103、6,544,758、6,544,947、6,548,477、 6,559，126及 6,569,845號。 視組合療法之性質而定，當正投用另一療法及/或在投用 另一療法後可繼續投用本發明之多肽治療劑。多肽治療劑 之投用可以單劑量或多劑量進行。在某些情況下，在其它 習知之療法前至少幾天開始投用多肽治療劑，而在其它情 况下，投藥開始於習知療法投用之前即刻或當時。 亦可偵測地標記本文所述之VEGFR-2結合蛋白質且用於 接觸表現VEGFR-2之細胞用於造影應用或診斷應用。用於 分斷目的，本發明之多肽較佳地固定於固體載體上。較佳 之固體載體包括管柱（例如親和力管柱，例如瓊脂糖基親和 力管柱）、微晶片或球珠。 在診斷應用之一實例中，將懷疑具有特徵為不適當血管 '斤生之病症的患者之生物樣本(例如血清或組織活活體切 片L·、本每明之可偵測標§己之多肽接觸以偵測含 常樣本中所偵測之VEGFR-2含量比較。 少增長 10%、20%、30%、40%、50%、 量。接著將㈣之VEGFR-2含量與亦與標記多肽接觸之正 VEGFR-2含量中至 60%、70%、80%或 97816.doc -61 · 200531979 90 /°可考慮特徵為不適當之血管新生之病症之診斷指示。 某些實施例中，將本發明之VEGFR_2結合多肽進一步附 接至可偵測之標記（例如該標記可為放射性同位素、螢光化 合物、酶或酶輔因子）。該活性部分可為放射劑，例如··放 射性重金屬例如鐵螯合劑、釓或錳之放射性螯合劑、氧、 氮、鐵、碳、或鎵之正子發射體，43K、52Fe、57以、67CU、 67Ga、“Ga、⑵j、125l、131l、，或。固定至該部分之 結合體可用作造影劑且以一有效量投予哺乳動物（例如人 類）用於診.斷用途，且接著偵測造影劑之定位及積累。該造 影劑之定位與積累可藉由放#閃燦攝影術、核磁共振造 影、電腦斷層攝影術或正子發射斷層攝影術。使用vegfr_2 結合多肽導向V E G F R之免疫閃燥攝影術可用於债測及/或 診斷癌症及維管結構。例如，任何對抗以"鍀、U1銦或丨μ 峨標記之VEGFR-2標記物之結合多R可有錢用於該造 影。如對熟習此項技術者係明顯的，投用放射性同位素之 量視放射性同位素而定。具有此項技術之普通技術者根據 所給用作活性部分之放射性核素之特異活性及能量可不難 調配造影劑之投用量。通常投用每劑量毫居裏，較 佳為…毫居裏，最通常2_5毫居裏之造影劑。因此根縣 發明用作包含共辆至放射性部分之標乾部分之造影劑之电 合物包含0.H00毫居裏，在某些實施例中較佳為毫居 裏，在某些實施例中較佳為2_5毫居裏，在某些實施例 佳為1-5毫居裏。 本發明之VEGFRI合多肽亦可用於傳遞另外之治療劑 97816.doc -62- 200531979 (包括但不限於藥物化合物、化學治療化合物及放射治療化 合物）至表現VEGFR-2之細胞或組織。在一實例中， VEGFR-2結合多肽融合至化學治療劑以將化學治療劑靶向 傳遞至表現VEGFR-2之腫瘤細胞或組織。 本發明之VEGFR-2結合多肽用於多種應用，包括研究、 #斷及治療應用。例如，其可用於分離及/或純化受體或其 部分’並研究受體結構（例如構造）及功能。 在某些態樣中，本發明之各種結合多肽可用於偵測或量 測VEGFR-2之表現，例如在内皮細胞（例如靜脈之内皮細胞） 上，或在轉染VEGFR-2基因之細胞上。因此，為達診斷或 研究目的，其亦在例如細胞分類及造影（例如流式細胞計數 法及金光活化之細胞分類）之應用中有效用。 在某些實施例中，為達診斷之目的，可標記或不標記結 合多肽或其片段。通常，診斷檢定法必需偵測由結合多肽 結合至VEGFR-2引起之錯合物之構造。類似於抗體可直接 標記結合多肽或片段。可使用多種標記，包括但不限於放 射性核素、螢光劑、酶類、酶受質、酶辅因子、酶抑制劑 及配位體（例如生物素、半抗原）。許多合適之免疫檢定法為 熟習此項技術者所已知（例如見美國專利第3,8ΐ7 Μ? · 3,850,752; 359() 1，654及4，_，876號）。當未標記時，結合多 ，可用於檢定法，例如凝集檢定法。未標記之結合多肽可 與其它（一或多種）可用於偵測結合多肽之合適之試劑組合 使用，例如與結合多肽反應之標記抗體或其它合適之試劑 (例如標記蛋白質A)0 ^ 978l6.doc -63 - 200531979 在一貫施例中’本發明之結合多肽可用於酶免疫檢定 法，其中將本多肽共軛至酶。當包含VEGFR-2蛋白質之生 物樣本與本結合多肽組合時，結合發生在結合多肽與 VEGFR-2蛋白質之間。在一實施例中，含表現VEGFR_2蛋 白質之細胞（例如内皮細胞）之樣本與本抗體組合，且結合發 生在結合多肽與承載由結合多肽識別之VEGFR-2蛋白質之 細胞之間。該等結合細胞可自未結合之試劑分離，且可藉 由（例如）將樣本與當由酶作用時產生色彩或其它可價測之 變化之酶受質接觸來測定特異結合至細胞之結合多肽_酶 共軛體之存在。在另一實施例中，本結合多肽可為不標記 的，且可添加識別本結合多肽之第二經標記之多肽（例如抗 體）。 在某些態樣中，亦可製備用於偵測生物樣本中vegfr_2 蛋白質存在之套組。該等套組將包括結合至VEGFR-2蛋白 或該受體之部分之VEGFR-2結合多月太，以及_或多種適合 於债測在結合多肽與受體蛋白或其部分之間之錯合物之存 ，的輔佐試劑。本發明之多肽組合物可以;東乾形式提供， ::地或與另外之對其它抗原決定基特異之抗體組合。結 口夕肽及/或抗體可為標記或未標記的，可與輔助成分（例 :，緩衝液例如Tris、磷酸鹽及碳酸醋、穩定劑、賦形劑、 殺，物劑及/或惰性蛋白質例如牛血清白蛋白）包括於該等 ^組中。例如’結合多肽及/或抗體可提供作為具有輔助成 東乾混合物，或該㈣助成分可單獨提供以由使用者 、、且口。通常該等輔助物質將以活性結合多肽或抗體之量計 97816.doc -64- 200531979 小於約5重量％存在，且通常將以多肽或抗體濃度計至少約 0.001重量％之總量存在。當使用能夠結合至結合多肽之第 二抗體時’該抗體可在套組中提供，例如於獨立管形航戍 容器中。該第二抗體如果存在則通常被標記，且可以上述 抗體調配物之類似方式來調配。 同樣地’本發明亦係關於積測及/或定量表現VegfR-2之 方法，其中將包含細胞或其部份（例如膜部份）之組合物與結 合至VEGFR-2或受體部分之結合多肽在適於結合至彼 件下接觸，且結合被監測。進行結合多肽之偵測，當其指 示在結合多肽與VEGFR-2或其部分之間錯合物之形成時， 即指示受體之存在。多肽結合至細胞可由標準方法測定， 例如彼等工作實例中所述。該方法可用於偵測來自個體之 細胞上VEGFR-2之表現。視情況可藉由（例如）流式細胞計數 法评估VEGFR-2在内皮細胞表面上之定量表現，且染色強 度可與疾病易感性、進展或危險相關聯。 本發明亦係關於偵測哺乳動物對某些疾病之易感性之方 法。為了舉例說明，該方法可用於偵測哺乳動物對如下疾 病之易感性，該疾病進展基於哺乳動物中細胞上所出現 VEGFR-2之量及/或VEgFR-2陽性細胞數目。在一實施例 中，本發明係關於偵測哺乳動物對腫瘤易感性之方法。在 忒κ 例中，將測試樣本與結合至vegfr-2或其部分之結 合多肽在適於結合至彼之條件下接觸，其中該樣本包含在 正#個體中表現VEGFR-2之細胞。偵測結合及/或結合量指 示個體對腫瘤之易感性，其中高含量之受體與個體對腫瘤 97816.doc -65- 200531979 之易感性增高相關聯。 實例·· 下列實例係為達成說明本發明之目的，且不應解釋為具 限制性。 實例1 ·· KDR結合分子之起始驗明 大約1013RNA-蛋白質融合變體之庫係基於人類纖維黏連 蛋白之第十個3型區域之支架建構的，其三個無規化區域在 23-29、52-55及77-86位置（胺基酸序號稱作SEQ ID NO:5)(三 環庫：Xu等人，Chemistry & Biology 9:933-942, 2002)。建 構僅在位置23-29及77-86(兩環庫）或僅在位置77-86(—環庫） 含無規化區域之類似庫。該等三個庫之混合物用於對抗人 類VEGFR-2之細胞外域之活體外選擇（KDR，細胞外域，融 合至人類IgGl Fc的殘基1-764)。為達成該申請案之目的， 環之胺基酸位置將定義為殘基23-30(BC環），52-56(DE環） 及77-87(FG環）。在六次選擇循環後藉由DNA定序來分析靶 結合群，且發現其係多樣的，具有一些複本存在。篩選由 十五個獨立純系編碼之蛋白質用於結合至KDR，（圖1A)且 隨後分析最佳結合體在VEGF存在下用於抑制靶結合（圖 1B)。驗明抑制KDR-VEGF結合之多個純系，此提示該等純 系在或接近天然配位體（VEGF)結合位點處結合KDR。兩個 結合分子（VR28及VR12)直接抑制VEGF-KDR相互作用之能 力以使用固定之VEGF及包含具有或不具有選擇之結合蛋 白質之KDR-Fc之移動相的BIAcore檢定法來評估。VR28及 (更小之程度下）VR12(但無競爭之純系（VR17)無效）抑制 97816.doc -66- 200531979 KDR以劑量依賴方式結合至VEGF(圖1C)。最終，除了結合 至純化之重組KDR，VR28似乎亦結合至表現KDR之重組 CHO細胞，但不結合至對照CHO細胞（圖1D)。 VR28純系之結合環之序列顯示於表4之第一列中。 儘管VR28在定序之結合群中不是最豐富純系（28個定序 純系中之一個複本），但其結合至KDR之親和力在該結合群 中之測試純系中係最佳的，具有由在放射性平衡結合檢定 法（圖3及表5)及BIA核心檢定法（表7)測定之11-13 nM之解 離常數。在分子之其餘支架部分沒有不同於野生型1GFn3的 變化（隨後在位置69對結合沒有影響的偶然支架變化進行 校正之後）。然而，在依賴VEGF細胞增殖檢定法中VR28幾 乎不顯示抑制VEGF-KDR訊號傳輸。因此，儘管自天然庫 之選擇產生在生物化學結合研究中干擾VEGF與KDR之間 之相互作用的抗體模擬劑時，但親和力改良對生物訊號轉 導檢定法中之中和功能係適用的。 實例2 :純系VR28之親和力成熟化 採用集中於僅在結合環中改變序列之突變策略。為了初 始測試哪些環更可能引起改良，進行環導向超突變PCR以 獨立將高至30%突變引入每個VR28環。在三次選擇對抗 KDR之循環後，觀察到具有改良之結合至KDR-Fc之多個純 系。選擇池之序列分析揭示大多數突變在FG環積聚而BC及 DE環保持幾乎原樣。該結果指示FG環係作進一步修飾之最 合適革巴。 隨後，大約1〇12變體之新庫藉由使用募核苷酸突變改變 97816.doc -67- 200531979 FG環中VR28之序列來構建。每個FG環位置（殘基 77-86[VAQNDHELIT(SEQ ID NO:198)]及下列脯胺酸[殘基 87])，將VR28-編碼DNA與NNS之50:5〇混合物引入每個位 置。大約80個純系之無規化樣本之DNA序列分析揭示如預 期之每純系平均六個胺基酸變化。在選擇期間將更低之 KDR-Fc濃度用於促進產生對靶具有較佳親和力之純系。在 四次選擇循環期間靶結合之概況顯示於圖2中。在選擇之四 次循環之後，將結合群進行次選殖（subclone)及分析。表5 及圖3 A總結各個結合純系之親和力量測。量測之結合至 KDR-Fc之常數介於<0.4至<1·8 nM之範圍内，其係優於 VR28(11 nM)之 10-30改良。 一些序列分析顯示於表4中（K純系），該等序列分析揭示 儘管結合群係多樣的，但若干一致主結構可在純系中驗 明。最值得注意地，Pro87及Leu84發現於幾乎所有純系（如 VR28中），提示該等殘基可對結合位點之結構係關鍵的。因 為僅H82K或H82R變化在定序純系中可見且脂肪族胺基酸 在位置78係主要的，所以在位置82之正電荷胺基酸看起來 係所需要的。D8 1通常突變為G，引起在該位置負電荷損失 且可撓性增益。另外，選擇群中之總突變率與選擇前之池 係相當的，其提示FG環非常容易變化。 人類纖維黏連蛋白之1GFn3域N端之若干殘基位於緊密接 近FG環之處，如由結構測定（structural determination)所提 示的（Main等人，Cell 71:671-678，1992)。兩個域之緊密接 近可潛在地對靶結合產生負面影響。N末端域之兩個偶然突 97816.doc -68- 200531979 變，L8P及L8Q，引起在許多選擇之純系中更好地結合至 KDR，此大概歸因於相對於FG環之N端之位置變化。為進 一步測試N端之影響，吾人建置結合分子用於23個不同KDR 結合體，在其中β片層前之N末端之前八個殘基缺失。吾人 接著將靶結合與未缺失之對應部分比較。平均起來，結合 至KDR-Fc比缺失的好3倍，如圖3Β中所示。 實例3 ··對人類（KDR)及小鼠（Flk-l)VEGFR-2具有雙重特異 性之結合體之選擇 VR28及大多數親和力成熟之變體（K純系）未能結合KDR 之小鼠同系物，Flkl，如在圖4中所示。然而，因為KDR及 Flkl共有高度之序列一致性（85%，Claffey等人，J· Biol· Chem. 267:16317-16322 (1992) ^ Shima^ A ^ J. Biol. Chem. 271:3 877-3 8 83 (1996))，可設想分離可結合KDR及Flkl之抗 體模擬劑。因為其允許在動物模型及隨後在人類中進行相 同分子之功能研究之測試，所以該等雙重結合體係所需要 的。 FG環突變及抗KDR選擇四個循環之後，純系之群進一步 抗Flkl選擇另外三個循環。如圖2中所示，結合至Flkl之增 加在循環5至循環7中觀察到，指示Flkl結合體之富集。用 於多個單獨純系之結合分析揭示其與僅對抗KDR(K純系） 選擇之純系對比，大多數衍生自對抗Flkl(E純系）之另外選 擇之純系可與KDR及Flkl相互作用。至兩個靶之結合常數 使用放射性平衡結合檢定法（表6及圖5)且BIAcore(表7)測 定，其揭示各個純系可以高親和力結合兩個靶。 97816.doc -69- 200531979 例如，E19對KDR具有60 pM之Kd，且對Flk-l具有340 pM。該等結果證明選擇過程中之單靶轉換策略，大概通過 由兩個靶施加之選擇壓力，已使具有結合至KDR及Flkl之 雙重特異性分子自VR28(不能結合Flkl之中等KDR結合體） 之突變群中分離。選定之基於纖維黏連蛋白之結合蛋白質 係對VEGFR-2(KDR)高特異，而在高靶濃度下未觀察到實質 性結合至VEGFR1。 序列分析揭示某些主結構類似於在KDR結合體池中觀察 之彼等（分別於殘基84及87的Leu及Pro ;於殘基82的正電荷 胺基酸，主要為Arg)及某些主結構未被保存（位置78之脂肪 族）。另外，主結構ERNGE(殘基78-82)存在於幾乎所有結合 至Flk-l之純系中（表4);於KDR結合池中幾乎不能辨別此主 結構。R79及R82對高親和力結合至Flk-l似乎尤其重要，此 歸因於當不同殘基存在於該位置時結合至Flk-l (而非KDR) 大大降低（圖6A)。為了測定每個環結合至KDR及Flk-l之重 要性，顯示於表4之純系E6及E26之環由NNS無規化序列每 次一環地取代。如圖6B中所示’在取代後該等蛋白質不能 夠結合KDR或Flk-l中之任一種。該等結果指示為了結合至 革巴需要每個環，提示所有三個環合作參與與革巴相互作用。 獨立地使用替代突變策略以產生能結合至兩個革巴之純 系。選擇純系159Q(8)L(表4)作為起始點’其為VR28之超突 變PCR親和力成熟化之產物，其以高親和力（Kd=2 nM ;表 7)結合KDR及以低親和力（Kd>3〇〇〇 nM)結合Flk-1。將FG環 之前六個胺基酸完全無規化（NNS)’留下下列五個完整之胺 97816.doc -70- 200531979 基酸（ELFTP)〇在對抗Flk-l之選擇六次循環後，於DE環（位 置52-56)將結合池重新無規化，且以另外三次對抗卩11^1循 環及一次對抗KDR循環進行選擇。如此獲得許多結合至 KDR及Flk-Ι之高親和力分子（表4及圖4)。例如，當保持結 合至KDR之高親和力（Kd=890 pM)時，純系M5FL可以2.1 nM之Kd結合Flk-；l，其改良為原始純系之1000倍。令人關注 地，發現於選自VR28之突變群中之Flk-Ι結合分子之 ERNGR主結構亦存在於衍生自純系159Q(8)L突變及選擇之 多純系中，不論該FG環區域是否完全無規化。自兩個獨立 庫分離類似結合分子提示用於分離位於FG環中之最佳 Flk-1結合主結構之親和力成熟化過程係強有效的。 實例4:細胞表面結合及活體外VEGF活性之中和 細胞培養物模型系統中KDR及Flk-Ι結合分子之官能度 係由E.大腸桿菌產生之結合分子評估。使用由抗His6標簽 鼠科之抗體（E.大腸桿菌表現蛋白質係以His標簽表現）及抗 鼠科之螢光標記之抗體組成之偵測系統，結合分子顯示特 異地結合至以低奈莫耳EC50s表現KDR或Flk-Ι之哺乳動物 細胞（圖7及表8)。 更重要地，使用表現連接至紅細胞生成素受體訊號傳輸 域之細胞夕卜KDR或Flk-Ι域之重組BA/F3細胞（DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，該等分子以劑量依賴方式抑制VEGF刺激之細胞增 殖，且IC50係以3-12 nM用於KDR表現細胞及2-5 nM用於 F lk-1表現細胞。如圖8及表9所示，抑制之效價似乎類似於 97816.doc -71 - 200531979 對照組抗KDR與抗Flk-l單株抗體。 進一步測試許多純系用於VEGF-抑制HUVEC細胞（人類 臍靜脈内皮細胞）之生長。HUVEC細胞係緊密相關於體内響 應VEGF之細胞的天然人類細胞。如圖9及表10所示，纖維 蛋白質結合基結合蛋白質於此源自人類之細胞系統中亦對 抑制VEGF活性有效，而野生型纖維黏連蛋白基支架蛋白質 係無效。 實例5:熱穩定性及M5FL蛋白質之可逆再折疊 應用差示掃描熱量測定（DSC)確定KDR-結合體M5FL之 熱穩定性。在標準之PBS緩衝液條件（磷酸鈉pH 7.4、150 mM NaCl)中，發現於56°C下M5FL具有單一不可逆熱熔合轉 變。隨後，將乙酸鈉pH 4.5驗明為用於M5FL蛋白質溶解性 之有利緩衝液。此緩衝液（100 mM)中DSC試驗證明M5FL在 該等條件（Tm=67-77°C )下更穩定且該熔合轉變係可逆的 (圖10)。可逆之熱轉變已用於驗明支持蛋白質治療劑長期儲 存之有利條件（Remmele等人，Biochemistry 38:5241 (1999)) ，因此已驗明醋酸鈉pH 4.5作為最優化緩衝液用於儲存 M5FL蛋白質。 實例6:聚乙二醇化M5FL蛋白質之活體外結合及細胞基活性 於E·大腸桿菌表現系統中產製M5FL蛋白質，其係藉由C-端延伸以產生下列蛋白質序列（以具影線之Cys 100產生經 下劃線之C-端延長；由起始移除曱硫胺酸產製顯著百分比 之蛋白質）：
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGET 97816.doc -72- 200531979 GGNSPVQEFTVPLQPPLATISGLKPGVDYTITVYAVTKERN GRELFTPISINYRTEIDKPCQHHHHHH (SEQ ID NO:199) 使用標準順丁烯二醯亞胺化學反應，將位置100半胱胺酸 殘基之單硫氫基用於偶合至PEG變體，以產生兩種不同之 M5FL聚乙二醇化形態。直鏈20 kD PEG與支鏈40 kD PEG (Shearwater Corporation)共輥於 M5FL 以分別產製 M5FL-PEG20及M5FL-PEG40。藉由陽離子交換層析法自未反應之 蛋白質及PEG中純化聚乙二醇化蛋白質形式。M5FL之兩個 PEG形式之共價鍵由SDS-PAGE(圖11)及質譜分析法來驗 證。 使用表面電漿共振（SPR)(BIAcore)以經由醯胺化學反應 固定於BIAcore晶片上的人類及小鼠VEGF-受體革巴蛋白進 行活體外親和力量測。對於兩個乾蛋白，發現20及40 kD聚 乙二醇化M5FL形式兩者相對於未修飾之M5FL而言具有較 慢結合速率（ka)且對脫離速率（kd ;表11)幾乎無影響。 使用實例4中描述之Ba/F3系統測試聚乙二醇化M5FL製 劑之官能度。圖12顯示A490(表示細胞增殖裎度）作為各個 結合體濃度之函數的曲線。該曲線幾乎相同，其指示了聚 乙二醇化對任一聚乙二醇化形式之生物活性幾乎無影響。 實例6:KDR結合蛋白質CT-322之製劑阻斷了人類内皮細胞 中VEGFR-2訊號傳輸 根據描述於前面實例之方法，生成另外之1GFn3基KDR結 合蛋白質。如以上實例5中為開發M5FL蛋白質所描述，使 用BIAcore結合檢定法測試蛋白質以獲得對抗人類KDR及 97816.doc -73- 200531979 小鼠Flk-l的KD且由Ba/F3檢定法測試獲得IC50。稱作 CT-322之蛋白質該等檢定法之各個中展示所需之性質並用 於進一步分析。 衍生自CT-322之初始純系具有如下序列： GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGWNGRLLSIPISI NYRT (SEQ ID N0:200)。FG環序列經下劃線。 如以上描述之親和力成熟產生CT-322之核心形式： EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFT VPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISIN YRT (SEQ ID NO:192)。 上述CT-3 22分子缺失前八個胺基酸且於N-或C-端可包括 另外之胺基酸。例如，另外之MG序列可置放於N-端。通常 Μ將被分解，於N-端留下GEV...序列。於N-端再添加之八個 胺基酸亦產生具有需要性質之KDR結合蛋白質。通常Ν-端 甲硫胺酸分解以產生如下序列： VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGR LLSIPISINYRT (SEQ ID ΝΟ:193)。 可生成適合於聚乙二醇化之形式以用於活體内。例如， 加入並表現包含半胱胺酸之C-端尾域，如下所示用於缺少 八個Ν-端胺基酸之形式。
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEF
TVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISIN 97816.doc -74- 200531979 YRTEIDKPCQ (SEQ ID NO:194)。 此分子之聚乙二醇化形式用於下述之活體内試驗。亦使 用以絲胺酸代替半胱胺酸之對照形式： GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISIN YRTEIDKPSQ (SEQ ID NO:195)。 亦可將相同之C-端尾域加入具有N-端八個胺基酸之 CT-322形式，例如SEQIDNO:193中所示。 將具有所需KDR結合性質之另外之變體分離。下列核心 序列具有些許不同之FG環，且可與（例如）N_末端MG序列、 恢復8個缺失胺基酸之N-末端序列及/或提供半胱胺酸用於 聚乙二醇化的C-末端尾域一起表現。 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT (SEQ ID NO: 196)。另一該變體具有如下核心序列： VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERS LFIPISINYRT (SEQ ID NCK197)。 該等變體之比較顯示FG環之一致序列：D/E) GXNXRXXIP (SEQ ID NO:3)。藉由更大特定性，一致序列 可表現為（D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)IP (SEQ ID NO:4)。 實例7 : CT_322阻斷人類内皮細胞中VEGFR_2訊號傳輸 如圖13所示，藉由VEGFR-2細胞内區域之磷酸化作用來 調控通過VEGFR-2所進行之VEGF-A訊號傳輸，接著活化涉 97816.doc -75- 200531979 及磷脂酶C伽瑪（ΡΙΧγ)、蛋白質激酶C(PKC)、Raf-l、 MEK1/2、ERK1/2之路徑，導致内皮細胞增殖。 為了評析本文所揭示之KDR結合體是否抑制此訊號傳輸 路徑之活化，將人類微血管内皮細胞用VEGFR結合多肽（例 如，CT-322)處理30 min並用VEGF-A刺激5 min。藉由 SDS-PAGE及西方（轉潰）分析，使用對磷VEGFR-2、非磷 VEGFR-2、磷ERK1/2及非磷ERK1/2具特異性之抗體分析所 有之細胞溶胞液。 如圖13所示，130pMCT-322抑制磷VEGFR-2之形成且亦 減少後續（downstream)磷酸化ERK1/2之形成。未完全消除 磷酸化ERK1/2，可能歸因於自許多另外之訊號傳輸路徑接 收訊號之事實。 實例8 :纖維黏連蛋白基KDR結合蛋白質破壞由VEGF-A及 VEGF-D進行之訊號傳輸 VEGFR-2 係三種 VEGF 物質（VEGF-A、VEGF-C 及 VEGF-D) 之受體。進行試驗以評估纖維黏連蛋白基KDR結合蛋白質 對VEGF-A及VEGF-D通過KDR調控訊號傳輸之影響。 產生依靠Flk-Ι調控訊號傳輸的Ba/F3細胞株。如圖14之左 側晝面所示，藉由以VEGF-A或VEGF-D處理細胞以保持細 胞生存能力，儘管顯著地需要高含量之VEGF-D。 如圖14之中間畫面所示，將細胞保持於15 ng/ml VEGF-A 之存在下，並與本文所揭示之M5FL或CT-322蛋白質，或與 DC-101抗Flk-Ι抗體接觸。各個試劑逆轉了 VEGF-A-調控細 胞生存能力，指示阻斷通過Flk-Ι所進行之VEGF-A訊號傳 97816.doc -76- 200531979 輸。 如圖14之右側畫面所示，將細胞保持於3〇〇 ng/ml VEGF-D之存在下，並與本文所揭示之M5FL或F10蛋白質， 或與抗VEGF-A抗體接觸。M5FL及F10逆轉了 VEGF-D調控 細胞生存能力，指示阻斷通過Flk-Ι所進行之VEGF-D訊號 傳輸。抗VEGF-A抗體不具有效應，證明檢定法之特異性。 實例9:藥物動力學 藥物動力學研究：將天然CT-322或聚乙二醇化形式（4〇 kDaPEG、CT-322PEG40)用 1251蛾化。將 10_20mCi礙化蛋白 質以i.v·或i.p·任一種方式注入成年公鼠體内，且於指示之 時間測定峨化蛋白質含量。為了組織分佈研究，於丨5 min、 2 hr或6 hr殺死鼠並測定放射性等級。見圖15與16。未修飾 之CT-322係12 kDa蛋白質，其可快速自血中清除。曲線下 面積（AUC)值為 14.6 hr*mg/mL且清除率為 69·9 mL/hr/kg， 最大血清濃度為9.1mg/ml。初始半衰期（〇〇為〇3小時且第二 階段半衰期（β)為13.5小時。根據比較，iv·存在於血中之聚 乙二醇化CT-322極大增高，主要歸因於初始階段中清除率 明顯減少。AUC增加10倍以上達到193,減少清除率1〇倍以 上達到5.2，Cmax係12.9mg/mL。α半衰期增加至丨小時，且 β增加至16.2小時。氣中該等藥物動力學相當於人類中每週 兩次之給藥方案，此係較好地處於可接受之範圍内的給藥 速率。 聚乙二醇化CT_3222腹膜内（i.p.)投藥具有類似儲集層之 藥物動力學。CT-322之血液濃度不存在初始峰值。實情為 97816.doc -77- 200531979 CT-322之量積聚較慢並緩慢減少。當擔心靜脈内投藥時會 產生來自CT-322濃度中初始峰值的副作用的時候，該等藥 物動力學可能是合乎需要的。可能其它1()FN3基藥劑在^ 投藥中將展示類似之行為。因此，其可為藉由1〇FN3基藥劑 達成時間延遲給藥效應之可推廣模式。 如圖16所示，肝係用於分泌CT_322之聚乙二醇化形式之 主要途徑。未偵測到CT-322之長期積累。 使用共軛於20 kDa PEG部分的CT-322獲得類似結果。 實例10 ·· CT-322之活體内功效 如圖17之概述，Miles檢定法用於評估為了進行腫瘤功效 研究所使用之劑量、時間表及投藥參數。在VEGF攻毒之前 4 hr將緩衝液或CT-322PEG4〇以！、5及2〇 mg/kg ip注入
Balb/c母鼠。VEGF_A2皮内局部投藥入背部皮膚誘發伊文 思監（Evans blue)染料之金管滲出（圖17及18)。 用KDR結合劑處理之小鼠在統計學上顯示vegf調控之 血管滲出程度之顯著減少。5 mg/kg& 2〇 mg/kg劑量之 CT-322顯示了顯著之結果。因此，選擇5mg/kg劑量用於小 鼠腫瘤模型研究。 實例11 : CT-322抑制腫瘤生長 B 1 6-F 10鼠科之黑素瘤腫瘤檢定法： 第一天將2x10 B16-F 10鼠科之黑素瘤腫瘤細胞於皮下植 入C57/BL公鼠。第六天偵測到明顯之腫塊。第八天當腫瘤 為可量測之尺寸時，開始每天i.p·注射媒劑對照物、5、i 5 或40 mg/kg CT-322PEG40。最低劑量5 mg/kg減少腫瘤生 97816.doc -78- 200531979 長第十八天用15及40 mg/kg處理之小鼠顯示腫瘤生長 減少50%與66%。見圖19。 U87人類神經膠母細胞瘤檢定法： 將5x 1 〇 U87人類神經膠母細胞瘤腫瘤細胞於皮下植入 裸么亂。當腫瘤體積達到約5〇 mm3時處理開始（第零天）。 每隔天.注射媒劑對照物、3、10或30 mg/kg CT-322PEG40。按照其最佳劑量時間表所公佈的，以4〇 mg/kg每週兩次注射抗^丨抗體Dcl〇1。最低劑量3 減少腫瘤生長。第十二天，用1〇及3〇 mg/kg處理之小鼠顯 不腫瘤生長減少50%。見圖2〇。療效與抗Flk-1抗體之療效 相當。 將下列物質及方法用於實例1-1]L所揭示之試驗。 重組蛋白質： 自R&D系統（Minneapolis，MN)購買重組人類VEGF165、 鼠科VEGF164、人類神經滋養因子-4(ΝΤ4)、人類及小鼠血 管内皮生長因子受體-2 Fc嵌合體（KDR-Fc及Flk-1-Fc)。於 EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-LC-生物素（Pierce，IL)之存在 下’將靶蛋白之生物素化於4°C lxPBS中進行2小時。藉由相 對於lxPBS之透析移除過量之EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-生物素。藉由質譜分析法測定生物素化之程度並使 用庫馬斯（Coomassie)蛋白質附加檢定法（Pierce，IL)測定革巴 蛋白濃度。 引子： 下列募核苷酸由化學合成製備以最終用於選定純系之庫 97816.doc -79- 200531979 建構及突變中。 T7 TMV Fn ： 5f GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG 3f (SEQ ID NO:201)
T7 TMV N-端缺失：5f GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC CTA 3f (SEQ ID NO:202) MK165-4 A20 ： 5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC 3’ (SEQ ID NO:203) N-端前置：5’ ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC CTA CTG ATC AGC TGG 3? (SEQ ID NO:204) BCDE反置：AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT TCC TCC TGT TTC TCC GTA AGT GAT CCT GTA ATA TCT 3’（SEQ ID NO:205) BCDE前置·· 5’ AGA TAT TAC AGG ATC ACT TAC GGA GAA ACA GGA GGA AAT AGC CCT GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCT 31 (SEQ ID NO:206) DEFG反置·· 5f AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC TCC AGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AGC TGT 3’（SEQ ID NO:207)
DEFG前置：5’ ACA GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGA GTT GAT TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 97816.doc -80- 200531979 3f (SEQ ID NO:208)
C-端 polyA : 5’ TTT TTT TTT TTT TTT TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTG TCG TCG TCG TCC TTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG GAA AT 31 (SEQ ID NO:209) Hu3fFLAGSTOP ： 5f TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTG TCG TCG TCG TCC TTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG G 3, (SEQ ID NO:210) VR28FG-50 ： 5f GTG TAT GCT GTC ACT 123 145 463 665
165 465 163 425 625 645 447 ATT TCC ATT AAT TAC 31， (SEQ ID NO:211)，其中 1=62.5%G+12.5%A+12.5%T+ 12.5%C ； 2=2.5%G+12.5%A+62.5%T+12.5%C ； 3=75%G+ 25%C； 4=12.5%G+12.5%A+12.5%T+62.5%C； 5=25%G+75%C ；6=12.5%G+62.5%A+12.5%T+12.5%C； 7: 25%G+50%A+25%C F1U2 : 5, TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA
TTT ACA ATT CTA TCA ATA CAA TGG TGT CTG ATG TG
CCG 3' (SEQ ID NO:212)
F2 : 5’ CCA GGA GAT CAG CAG GGA GGT CGG GGT GGC AGC CAC CAC TTC CAG GTC GCG CGG CAC ATC AGA CAC CAT TGT 31 (SEQ ID NO:213) F3159： 5f ACC TCC CTG CTG ATC TCC TGG CGC CAT CCG CAT TTT CCG ACC CGC TAT TAC CGC ATC ACT TAC G 3, (SEQ ID NO:214)
F4 ： 5f CAC AGT GAA CTC CTG GAC CGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCC GTA AGT GAT GCG GTA ATA GCG 3, 97816.doc -81- 200531979 (SEQ ID NO:215) F5159 ： 5f CGG TCC AGG AGT TCA CTG TGC CGC TGC AGC CGC CGG CGG CTA CCA TCA GCG GCC TTA AAC C 3f (SEQ ID NO:216) F5-X5 ： 5f CG GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCG NNS NNS -NNS NNS NNS GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CC 3f , (SEQ ID NO:217) F6 ： 5f AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC GCC AGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AG 3f (SEQ ID NO:218) F7X6159 ： 5f ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT NNS NNS NNS NNS NNS NNS GAA CTG TTT ACC CCA ATT TCC ATC AAC TAC CGC ACA GAC TAC AAG 3? (SEQ ID NO:219) F8 ： 5f AAA TAG CGG ATG CGC GTT TGT TCT GAT CTT CCT TAT TTA TGT GAT GAT GGT GGT GAT GCT TGT CGT · CGT CGT CCT TGT AGT CTG TGC GGT AGT TGA T 3f (SEQ ID NO:220) C2asaiA20 ： 5? TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC . GGA TGC GCG TTT GTT CTG ATC TTC 3f (SEQ ID NO:221)
C2RT ： 5f GCG CGT TTG TTC TGA TCT TCC 3f (SEQ ID NO:222)
hfOl BC反置：5’ TGCC TCC TGT TTC GCC GTA AGT GAT GCG GTA ATA GCG SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN 97816.doc -82 - 200531979 CCA GCT GAT CAG CAG 3f (SEQ ID NO:223)
hfOl DE反置：5f GAT GGT AGC TGT SNN SNN SNN SNN
AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCC 3f (SEQ ID NO:224)
hfOl FG反置：5* GT GCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN AGT GAC AGC ATA CAC 3f (SEQ ID NO:225) BCDE rev ： 5f CCT CCT GTT TCT CCG TAA GTG 3f (SEQ ID NO:226) BCDEfor: 5’ CAC TTA CGG AGA AAC AGG AGG 3* (SEQ ID NO:227) hfOl DE-FG前置：5f ACA GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGC GTT GAT TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3f (SEQ ID NO:228) 前 FG反置：5’ AGT GAC AGC ATA CAC AGT 3f (SEQ ID NO:229)
hfOl RT旗幟（Flag) PolyA反置：51 TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT GCG GTA ATT AAT GGA 3’（SEQ ID NO:230) 5-RI-hKDR-lB ： 5f TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAA GGT GCTG 3’（SEQ ID NO:231)
3-EPO/hKDR-2312B : 5f AGG GAG AGC GTC AGG ATG
AGT TCC AAG TTC GTC TTT TCC 3f (SEQ ID NO:232) 5-RI-mKDR-l ·· 5, TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAA GGC 97816.doc -83 - 200531979 GCT G 3f (SEQ ID NO:233)
3-EPO/mKDR-2312 ： 5? AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT
TCC AAG TTG GTC TTT TCC 3f (SEQ ID NO:234) 5-RI-hTrkB-l ： 5f TAG AGA ATT CAT GAT GTC GTC CTG GAT AAG GT 31 (SEQ ID NO:235)
3-EpoR/hTrkB-1310： 5f AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGA
TGT TCC CGA CCG GTT TTA 3f (SEQ ID NO:236) 5-hKDR/EPO-2274B ： 5f GGA AAA GAC GAA CTT GGA ACT
CAT CCT GAC GCT CTC CCT 3,（SEQ ID NO:237) 5-mKDR/EPO-2274 ： 5f GGA AAA GAC CAA CTT GGA ACT CAT CCT GAC GCT CTC CCT 3,（SEQ ID NO:238) 3-XHO-EpoR-3066 ： 5f TAG ACT CGA GTC AAG AGC AAG CCA CAT AGCT 3,（SEQ ID NO:239) 5，hTrkB/EpoR-1274 ·· 5’ TAA AAC CGG TCG GGA ACA TCT CAT CCT GAC GCT CTC CCT 3’（SEQ ID NO.240) 緩衝液
將下列緩衝液應用於本文所描述之試驗中。緩衝液A( 100 mM TrisHCl、1 M NaCl、0.05% Tween-20、pH 8.0);緩衝 液B(1X PBS、0.02% Triton X100);緩衝液 C(100 mM TrisHCl 、60 mM EDTA、1 M NaCl、0.05% Triton X100、pH 8.0); 緩衝液 Ca(100 mM TrisHC卜 1 M NaCn、0.05% Triton X100、 pH 8·0);緩衝液D(2 M NaCl、0.05% Triton);緩衝液E(1X PBS、0.05% Triton XI00、pH 7.4);緩衝液F(IX PBS、0·05% Triton X100、100 mM咪唑、pH 7·4);緩衝液 G(50 mM HEPES 200531979 、150 mM NaC卜 0.02% Triton X-100、1 mg/ml牛血清白蛋 白質、0.1 mg/ml鮭魚精 DNA、pH 7.4);緩衝液H(50 mM HEPES、150 mM NaC卜 0.02% Triton X-100、pH 7·4);緩 衝液 I(lx PBS、0.02% Triton X-100、1 mg/ml 牛血清白蛋白 質、0.1 mg/ml鮭魚精 DNA、pH 7.4);緩衝液 J( lx PBS、0.02% Triton X-100、pH 7.4);緩衝液K(50 mM NaH2P04、0.5 M NaCM、5%甘油、5 mM CHAPS、25 mM咪唑、lx Complete™ 蛋白質酶抑製劑雞尾酒（Roche)，pH 8.0);缓衝液L(50 mM NaH2P04、0.5 M NaCl、5%甘油、25 mM哺唾、pH 8.0); 緩衝液M(lx PBS、pH 7.4、25 mM咪唑、pH 7.4);緩衝液 N(lx PBS、25 0 mM咪唑、pH 7·4);缓衝液 0(10 mM HEPES、 150 mM NaC卜 0.005% Tween-20、pH 7.4)。 起始庫建構： 先前描述了使用人類纖維黏連蛋白之第十區域作為支架 之庫建構（Xu等人，2002，見上述）。使用作為編碼方案的 NNS(標準核苷酸混合物，其中N=A、G、T、C之等莫耳混 合物；S = G及C之等莫耳混合物）分別使三個環域（對應於位 置23-29、52-55及77-86)無規化。建構相似之庫，其含有僅 於位置23-29及77-86(二環庫）或僅於位置77_86(—環庫）之 無規化區域。將該等庫大約等莫耳之量混合。此混合庫含 有〜1χ1013純系且用於驗明VR28之KDR選擇。 突變庫建構：
超突變PCR藉由PCR(見下文）將VR28純系中支架突變 T(69)I向後校正為野生型序列，並觀察VR28結合體與KDR 97816.doc -85- 200531979 之結合特性無改變。使用前面描述之條件（Vartanian等人，
Nuc. Acid Res. 24:2627-2631，1996)將突變引入VR28之環 · 域。使用側接各個環之引子對（N-端前置/BCDE反置、BCDE . 前置/DEFG反置、DEFG前置/C-端polyA)於VR28模板上進 行超突變PCR之三個循環。使用重疊延伸及PCR以側接引子 - T7TMV Fn及MK165-4 A20組裝所得片段。來自最終PCR反 . 應之純系之DNA定序分析證明庫之校正組裝。與支架域中 1.5%比較，在環域觀察到多達30%突變率。 $ 募核苷酸突變。VR28之FG環之寡核苷酸突變藉由PCR利 用VR28FG-50引子，DEFG反置引子及側接引子。在編碼FG 環之各個核苷酸位置上，引子VR28FG-50含有50%VR28核 苷酸及50%全部四種核苷酸（N)或為G或C(S)之等莫耳混合 物。設計此方案以引起VR28 FG環之大約67°/◦胺基酸由另一 胺基酸無規化置換，此由DNA定序分析證實。 159(Q8L)無規化子庫。將純系159(Q8L)純系FG環之寡核 苦酸突變執行三步延伸並擴增。第一延伸，於相等濃度（各 籲 為 100 pmol)中混合引子對（a:FlU2/F2、b:F3159/F4、 c:F515 9/F6、CLF7X6159/F8)並擴增十個循環。第二延伸， 組合第一反應之l/20(a/b及c/d)並繼續擴增另外十循環。為 ％ 了使擴增偏向有利於延伸而不是全部互補片段之再黏合 . (anneal)，利用50 pmol之F1U2前置引子用於片段ab或 C2asaiA20反置引子用於片段cd中之任一種，將半建構產物 (各為0.5 pmol)之線性擴增另外執行二十個循環。最終，延 伸之半建構片斷ab及cd經組合並在無任何另外之組份下， 97816.doc -86- 200531979 擴增二十個循環。引子F7X6159在純系159(Q8L)之各個前六 個編碼位置包含NNS且另外等同於系159(Q8L)。藉由來自 最終PCR反應之純系之DNA定序分析證實庫159(Q8L)-FGX6之校正組裝。該子庫包含〜ΐχ1〇9純系。 為了 159(Q8L)-FGX6庫之後循環6(PR6)選擇池之DE環之 無規化，藉由PCR利用引子F1U2/F4及F5X5/C2asaiA20製備 兩個半建構片段。該F5X5引子於DE環之四個位置及位置56 包含NNS。接著，延伸之片斷ab及cd經組合並在無任何另 外之組份下擴增二十個循環。 將點突變、缺失、無規（NNS)環序列引入纖維黏連蛋白基 支架蛋白質： 在兩步式PCR中利用VR28純系作為模板將VR28結合體 之支架突變T(69)I向後校正為野生型序列。將藉由引子N-端前置/DEFG反置及DEFG前置/C-端polyA獲得之半建構片 段組合，並利用引子T7TMV Fn及MK165-4 A20建構整個 VR28(I69丁）純系（於本文中標定為VR28)。藉由PCR以引子 N-端前置/C-端polyA接著藉由引子T7TMV Fn及MK165_4 A20延伸來校正純系159(Q8至L)中之N-端突變。 利用引子T7TMV N-端缺失及MK165-4 A20藉由擴增執 行將缺失Δ1-8引入纖維黏連蛋白基支架蛋白質之N-端。
藉由兩步式PCR執行含有NNS環序列之E純系嵌合體之 建構。利用引子T7TMV N-端缺失/BCDE rev(a·· E純系之BC 環）；N-端前置/hfOl BC反置（b: BC NNS) ; BCDE for/Fr*ont FG反置（c: E純系之DE環）；BCDE for/ hfOl DE反置（d: DE 97816.doc -87- 200531979 NNS) ; hfOl DE-FG前置/hfOl RT-Flag PolyA反置（e: E純系 之 FG) ; hfOl DE-FG前置 / hfOl FG 反置（f: FG NNS)將環域 擴增。組合片段b/c/e、a/d/e、a/c/f並藉由利用引子T7Tmv N-端缺失及hfOl RTFlag PolyA反置延伸並擴增來建構整個 池。 藉由DNA定序分析驗證及/或分析全部建構。全部建構及 突變庫含有位於5’側接域之T7TMV啟動子及位於3’侧接域 之Flag標籤或His6標籤序列用於RNA-蛋白質融合產製及活 體外純化。 RNA蛋白質融合產製 對於各選擇循環，利用MegaScript轉錄套組（Ambion)於37 °C下轉錄PCR DNA 4小時。藉由DNase I(Ambion)消化作用 於37°C經20分鐘移除模板DNA。藉由酚/氣仿萃取，接著於 NAP-25管柱（Amersham)上藉由凝膠過濾來純化RNA。如先 前所描述（Kurz等人，Nuc. Acid Res· 28:83，2000)合成嗓呤 黴素連接子 PEG 6/10(5’ Pso u age gga ugc XXX XXX CC Pu 3^，其中 Pso=C6-補骨脂素（Psoralen)、u、a、g、c= 2’OMe-RNA，O標準醯胺化物（amidities)，X :間隔子亞磷 醯胺9(9-0-二甲氧基三苯甲基-三乙二醇，i-[(2-氰乙 基）-(N，N-二異丙基）]-亞鱗醯胺）；Pu=嘌呤黴素-CPG)。於 0.1 M NaCM、25 mM TrisHCn、pH 7.0中，藉由自 85°C 至 4°c 梯度降溫將連接子黏合至庫RNA。接著藉由曝露於紫外光 (3 65 nm)15分鐘使連接子與RNA交聯。交聯之混合物（600 pmol RNA)包括於活體外轉譯反應中，此反應係使用兔網狀 97816.doc -88- 200531979 紅血球溶胞液轉譯套組（Ambion)在35S-標記之甲硫胺酸存 在下於30°C經60分鐘。為提高融合形成，將0.5 M KC1及0.05 M MgCl2加入反應並於4°C培養30分鐘。如下利用寡聚脫氧 胸苷酸纖維素（Sigma)層析法純化融合分子。將轉譯及融合 混合物稀釋入緩衝液A(100 mM TrisHCl、1 M NaCl、0.05% Tween-20、pH 8.0)並加入寡聚脫氧胸苷酸纖維素。將漿狀 液於4°C旋轉1小時並轉移至旋轉管柱。用10管柱體積之緩 衝液A洗滌管柱上之寡聚脫氧胸苷酸纖維素珠粒並用3管柱 體積之H20溶離。利用引子Hu3’FLAGSTOP由Superscript II 反轉錄套組（In vitro gen)於42 °C進行反轉錄反應1小時。為了 減少通過反應性半胱胺酸之潛在非特異結合，硫醇基團與1 mM 2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（NTCB)或N-乙基順丁烯二醯亞 胺（NEM)兩者之一在選擇之過程中反應。於室溫下進行反 應1小時。藉由抗FLAG親和力層析法使用M2瓊脂糖（Sigma) 進一步純化該融合分子。將M2珠粒加入反應並於4°C在緩 衝液B( lx PBS，0.02% Triton XI00)中旋轉1小時。接著將珠 粒施加於旋轉管柱，用5管柱體積缓衝液B洗滌，並於緩衝 液G中用3管柱體積100 μΜ Flag肽DYKDDDDK(Sigma)溶離 融合分子。根據藉由樣本中35S-甲硫胺酸之閃爍計數量測的 特異活性計算融合產量。 對於159(Q8L)無規化庫，使用高效半自動化程序於 KingfisherTM(ThermoLabSystems)中製備RNA蛋白質融合。 除了以下描述之幾個步驟外，該等步驟類似於上述程序。 於磁性寡聚脫氧胸苷酸珠粒（GenoVision)上緩衝液C(100 97816.doc -89- 200531979 mM TrisHC卜 60 mM EDTA、1 M NaC卜 0.05% Triton X100、 pH 8.0)中執行RNA蛋白質融合分子之純化。將珠粒用10反 應體積之緩衝液Ca(100 mM TrisHCl，1 M NaCl，0.05% Triton XI00, pH 8·0)洗滌並將融合蛋白質用1體積H20溶離。利用 引子C2RT進行反轉錄（RT)。藉由His標籤親和力層析法使用 Ni-NTA磁性珠粒（Qiagen)進一步純化融合蛋白質。用 Ni-NTA珠粒將RT反應於室溫培養於缓衝液D(2 M NaCn， 0·05% Triton)中20分鐘，接著用10反應體積緩衝液Ε( 1χ PBS，0.05% Triton X100，pH 7.4)洗滌珠粒並將融合分子 用 1 體積緩衝液F(lx PBS，0.05% Triton X100，100 mM味 唾，pH 7.4)溶離。 選擇： 對抗KDR之初始選擇。將融合庫（1 ml中〜1013純系）與i50 μΐ蛋白質Α珠粒（Dynal)進行培養，在選擇之前該等珠粒於3〇 °C用200 nM人類IgGl預固定1小時以降低非特異結合至蛋 白質A珠粒與Fc蛋白質（預清除）。接著將上清液於30°C緩衝 液 G 中（50 mM HEPES，150 mM NaC卜 0.02% Tdton X-loo， 1 mg/ml牛血清白蛋白質，0·1 mg/mlli魚精DNA，pH 7.4) 與KDR-Fc嵌合體培養1小時並顛倒旋轉。KDR-Fc之最終濃 度對於循環1為250 nM，循環2-4為100 nM及循環5與6為1〇 nM。於30°C在300 μΐ蛋白質A珠粒（循環1)或100 μΐ蛋白質A 珠粒（循環2-6)上顛倒旋轉30分鐘俘獲靶，並用1 ml緩衝)夜 G(50 mM HEPES，150 mM NaC卜 0.02% Triton X-100，pJl 7 · 4)洗(條珠粒五次。用10 0 μΐ 0 · 1 Μ KOH將結合融合分子溶 97816.doc -90- 200531979 離至50 μΐ 1 M TrisHCl，pH 8.0中。藉由使用側接引子 T7TMV Fn 及 MK165-4 A20 之 PCR 自溶離擴增 DNA。 KDR結合體VR28之親和力及特異性成熟如上述藉由超 突變PCR或寡核苷酸導向突變使純系VR28突變，並建構融 合子庫。對於蛋白質A珠粒進行預清除之後，於緩衝液I中 (lxPBS，0.02% Triton X-100，1 mg/ml牛血清白蛋白質，0.1 mg/ml鮭魚精DNA，pH 7.4)將選擇根據上述程序執行四個 循環。藉由使用引子T7TMV Fn及MK165-4 A20之PCR自溶 離擴增DN.A。將較低靶濃度（0.1 nMKDR用於前四個選擇循 環）用於衍生自寡核苷酸突變之庫，且接著引入1 nM小鼠 VEGF-R2(Flk-l)用於另外三個選擇循環。引子T7TMV Ν_ 端缺失及ΜΚ1 65-4 Α20係用於後三個循環中之PCR。 對於KDR結合體159之特異性成熟，如上所描述將純系 159 Q(8)L之FG環之前六個位置由PCR無規化。於室溫將融 合子庫與生物素化小鼠VEGF-R2(70 nM)之結合於緩衝液I 中執行 30 分鐘。於 KingfisherTM(ThermoLabSystems)中繼續 其餘之選擇程序。於50 μΐ經抗生蛋白鏈菌素（streptavidin) 塗布之磁性珠粒（Dynal)上俘獲生物素化靶，並將珠粒用10 體積緩衝液I及1體積緩衝液J(lxPBS，0.02% Triton X_l〇〇， pH 7.4)洗滌。將結合融合分子用100 μ1 0.1 Μ KOH溶離至 5〇· μΐ 1 M TrisHC卜 pH 8.0 中。使用引子 F1U2及 C2asaiA20 藉由PCR自溶離擴增DNA。經四次選擇循環後，對如下另 外兩次循環施行抵抗7 nM Flk-Ι的脫離率/再結合選擇。與 生物素化小鼠Flk-Ι之結合反應已進行30分鐘後，加入100 97816.doc -91 - 200531979 倍過量之非生物素化Flk-l並將反應繼續另外6小時以允許 適當時間使弱結合體解離。於50 μΐ抗生蛋白鏈菌素珠粒 (Dynal)上俘獲生物素化靶，並將珠粒用1 ml緩衝液J洗滌五 次。藉由培養於75°C下5分鐘，將結合融合分子溶離。使上 清液經受與7 nM Flk-l再結合並繼續標準選擇程序。將最終 溶離池之DNA經受DE環無規化（見下面）並對融合子庫進行 三個循環的對抗7 nM小鼠VEGF-R2的選擇。第四循環時， 藉由再結合至1 nM人類VEGF-R2施行脫離率選擇。藉由使 用引子F1U2及C2asaiA20之PCR自溶離擴增最終DNA。 放射性平衡結合檢定法： 為了製備35S標記結合蛋白質用於分析，如上用於RNA蛋 白質融合產製所描述來製備mRNA，但省略了連接子接合步 驟。使用兔網狀紅血球溶胞液轉譯套組（Ambion)在35S-標記 之Met存在下於30°C經1小時表現mRNA。如上所描述將表 現蛋白質於M2-瓊脂糖Flag珠粒（Sigma)上純化。此程序產 生無核酸尾域之編碼蛋白質。直接結合檢定法中，將濃度 自0至200 nM之範圍内的VEGF-R2-FC融合物加入恆定濃度 之純化蛋白質（0.2或0.5 nM)並於30°C下在緩衝液B中培養1 小時。使用蛋白質A磁性珠粒另外10分鐘於室溫使用 KingfiSherT、^獲受體結合體複合物。用六反應體積之緩衝 液仏先滌珠粒。將蛋白質用100 pL 0.1 Μ KOH自珠粒中溶 離。將50 μΙ>反應混合物及溶離物於LumaPlate-96(Packard) 上乾燥並使用TopCount NXT儀器（Packard)量測盤上35S之 量。結合至靶的纖維黏連蛋白基支架蛋白質之量估算為自 97816.doc -92- 200531979 蛋白質A磁性珠粒溶離之放射能與反應混合物中之放射能 相比之百分數。纖維黏連蛋白基支架蛋白質與珠粒之非特 異結合係藉由量測無KDR-Fc之情況下的結合來測定並表 示小於1-2%之輸入量。通過自全部結合減去非特異結合獲 得特異結合。使用 GraphPad Prizm軟體（GraphPad Software Inc，San Diego, CA)分析資料，該等資料使用一位點、非線 性結合方程擬合。 可溶纖維黏連蛋白基支架結合體之表現與純化： 為了表現於E.大腸桿菌中，繼之以His6標籤的各個純系殘 基1-101選殖入pET9d-衍生載體並表現於E·大腸桿菌 BL2 1 (DE3)pLysS細胞（Invitrogen)中。將 20 ml 隔夜培養物用 於接種包含50 pg/mL卡那黴素（kanamycin)與34 pg/mL氯黴 素之1公升LB培養基。將該培養物於37°C下生長至A600 0·4-0.6。引入1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苦（IPTG，Invitrogen) 後，將該培養物於37°C下生長另外3小時並於3,000 g 4°C下 離心經30分鐘收集。將細胞小球再懸浮於50 mL溶解緩衝液 K 中（50 mM NaH2P〇4，〇·5 M NaC卜 5%甘油，5 mM CHAPS， 25 mM咪唑，lx Complete™蛋白質酶抑制劑雞尾酒（R〇che) ，pH 8·0)並於冰上80 W下用四次15秒脈衝進行超音波處 理，該等脈衝由10秒暫停分離。將可溶部分於30000 g 4。(： 下離心經30分鐘分離。於4°C將上清液與用洗滌緩衝液L(5〇 mM NaH2P〇4，〇·5 M NaCl，5%甘油，25 mM咪唑，pH 8.0) 預平衡之10 mL TALONtm 屬親和力樹脂 (Clontech)旋轉1小時。接著將樹脂用1 〇管柱體積之緩衝液l 97816.doc -93- 200531979 及30官柱體積之緩衝液M(lxPBs，pH 7·4，25 mM咪唑，pH 7.4)洗務。用5管柱體積之緩衝液^(1乂？則，25〇1111^口米唾， pH 7·4)溶離蛋白質並於4°C下相對於lxPBS進行透析。藉由 於0.22 pm(Mmipore)過濾來移除所有沉澱物。 可溶纖維黏連蛋白基支架蛋白質之BIAcore分析： 使用 BIAcore 2000生物傳感器（pharmacia Biosensor)量測 纖維黏連蛋白基支架蛋白質與靶結合之蛋白的結合動力 學。將人類及小鼠VEGF-R2-Fc融合物固定於CM5傳感器晶 片上，並將可溶結合蛋白質以自〇至1〇〇 nM範圍内之濃度注 入緩衝液0 中（10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.005% Tween 20，pH 7·4)。達成各個濃度下之感應譜並使用程式（ΒΙΑ Evaluation 2·0 (BIAcore))評估以測定速率常數ka(k結合）及 kd(k脫離）。自速率常數k脫離/k結合之比計算親和力常數KD。 對於抑制試驗，將人類VEGF165固定於CM-5晶片表面， 並於自0至100 nM範圍内之可溶結合蛋白質之不同濃度存 在下注入20 nM濃度之KDR_Fc。當觀察到僅50% KDR-Fc結 合至晶片時，測定此濃度下之IC50。 VEGFR結合多肽之可逆再折疊： 於100 mM乙酸鈉緩衝液（pH 4.5)中對M5FL蛋白質執行差 示掃描熱量測定（DSC)分析。藉由以每分鐘1度之速度使溫 度自5°C勻變至95°C於N-DSC II熱量計中執行初始之DSC運 作（掃描1)，接著反向掃描（未圖示）至10度，接著第二次運 作（掃描2)。在該等條件中，使用兩個過渡模型（使用Orgin 軟體（OrginLab Corp)Tm=77°C 及 67°C )擬合資料。見圖 10。 97816.doc -94- 200531979 M5FL蛋白質之聚乙二醇化： M5FL蛋白質之C100形式具有完全之M5FL序列，且其所 具有的於位置100的Ser突變為半胱胺酸，該蛋白質形式包 括另外之C端His標籤用於純化蛋白質。藉由共輛各種順丁 烯二醯亞胺衍生之PEG形式（Shearwater)於單一之半胱胺酸 殘基處修飾純化之M5FL-C100蛋白質。將所得反應蛋白質 於4-12%聚丙烯醯胺凝膠上運作（圖11)。 細胞株之建構： 質體建構。由質體所編碼之嵌合受體係由融合至KDR、 Flk-1或人類TrkB之細胞外區域的人類紅細胞生成素受體 (EpoR)跨膜及細胞質區域組成，該質體藉由兩步式PCR程 序建構。將編碼細胞外區域之PCR產物自編碼整個受體基 因之質體擴增：KDR(胺基酸1至764)由引子5-RI-hKDR-lB/ 3-EPO/hKDR-2312B 衍生自純系 PR1371 一Hll (OriGene Technologies、Rockville、MD)，flk-l(胺基酸 1至 762)由弓| 子 5-RI-mKDR-l/3-EPO/mKDR-2312衍生自純系 #4238984 (IMAGE)，且人類TrkB(自胺基酸1至430)由弓|子 5-RI-hTrkB-l/3-EpoR/hTrkB-1310 衍生自純系 #X75958 (Invitrogen Genestorm)。將編碼EpoR跨膜及細胞質區域（胺 基酸251至508)之PCR產物由共同引子3-XHO-EpoR-3066及 三個基因特異引子之一（5-hKDR/EPO-2274B(KDR)、 5-mKDR/EPO-2274(flk-l)及 5fhTrkB/EpoR-1274(人類 TrkB)) 自純系#M60459(Invitrogen Genestorm)擴增，其中基因特異 引子添加了與受體片段PCR產物之末端互補的短序列。第 97816.doc -95- 200531979 二，將編碼嵌合基因之兩半部分的PCR產物混合並用對於 先前擴增循環所用之各個基因呈特異性的3-XHO-EpoR-3066擴增及 5’引子（5-RI-hKDR-lB、5-RI-mKDR-l 及 5-RI-hTrkB-l)來擴增。所得PCR產物由EcoRI及Xhol消化並 選殖入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)以產生質體phKE8(人類 KDR/EpoR 融合物）、pmKE2(flk-l/EpoR 融合物）、及 phTE(TrkB/EpoR融合物）。 建構細胞株用於流式細胞計數法。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)僅以 pcDNA 3.1(Invitrogen)、僅以 pmKE2 或以pcDNA 3· 1與編碼全長人類KDR(Origene Inc·，純系 PR1371-H11)之質體的混合物穩定地轉染CHO-K1細胞 (American Type Culture Collection，Manassas，VA)。選擇 穩定轉染體並保持於0.5 mg/ml Geneticin(Invitrogen)中。用 抗KDR多株抗血清（R&D Systems)染色之後，藉由轉染群之 螢光活化細胞分類獲得人類KDR表現純系（標定為 CHO-KDR)及鼠科VEGFR-2/EpoR嵌合體表現群（標定為 CHO_Flk)。在補充有 10%(v/v)胎牛血清（FBS)、0.5 mg/ml Geneticin、100 U/ml青黴素、0.25 pg/ml 兩性黴素B、100 pg/ml鏈黴素及2 Mm L-麩聽胺酸的Dulbecco氏改質之Eagle 氏培養基中（DMEM ; Gibco)常規地生長CHO-KDR及 CHO-Flk細胞株。
Ba/F3細胞株之建構藉由PhKE8或pmKE2轉染鼠科前-B 細胞株Ba/F3(DSMZ、Braunschweig、Germany)來建構響應 於VEGFR-2之VEGF結合而增殖的細胞株，phKE8或pmKE2 97816.doc -96- 200531979 係由融合至人類紅細胞生成素受體（見上文）跨膜及細胞質 區域的人類或鼠科VEGFR-2之細胞外區域組成的嵌合體。 將Ba/F3細胞保存於基本Ba/F3培養基中（RPMI-1640(Gibco) 包含10% FBS、100 U/ml青黴素、0.25 pg/ml兩性黴素B、 100 pg/ml鏈黴素及2 mM L-麩醯胺酸），其補充以來自 WEHI-3B細胞（DSMZ ;生長於Iscove氏改質之Dulbecco氏培 養基（Gibco)/10% FBS/25 μΜ β-Μ基乙醇）之10%條件培養 基作為基本生長因子之來源。在以質體pmKE2或phKE8電 穿孔之後，於0.75 mg/ml Geneticin上選擇穩定轉染。將抗 Geneticin之群轉移至包含100 ng/ml人類VEGF165之基本 Ba/F3培養基（R&D Systems)，並所得之VEGF依賴之群標定 為 Ba/F3-Flk 及 Ba/F3-KDR。表現嵌合TrkB 受體（Ba/F3_TrkB) 之對照細胞株同樣地使用質體phTE及人類NT-4(R&D Systems)建構，其中嵌合TrkB受體可響應作為TrkB之天然 配位體的NT-4的刺激。 纖維黏連蛋白基支架蛋白質之細胞表面結合之分析： 同時對於VEGF-R2表現及對照組細胞，藉由流式細胞計 數法分析纖維黏連蛋白基支架蛋白質與細胞-表面KDR及 Flk-Ι之結合。藉由胰蛋白質酶-EDTA將CHO-pcDNA3細胞 (對照組）自其培養皿中釋放，於無弼及鎂之Dulbecco氏 PBS(D-PBS' ； Invitrogen)中洗條，且於 37 °C 用 1 ·5 μΜ CMTMR(5-(及-6)-(((4-氯甲基）苯甲醯基）胺基）-四甲基若丹 明（tetramethylrhodamine))(Molecular Probes)染色 30分鐘。 將細胞於D-PBS—中洗滌並進一步於37°C培養30分鐘，且接 97816.doc -97- 200531979 著於冰上再懸浮於阻斷緩衝液中（D-PBS710%胎牛血清）。 除了省去CMTMR，同等地處理CHO-KDR或CHO-Flk細胞。 在V底部96孔板之各個孔中，用相等量未染色之CHO-KDR 或 CHO-Flk細胞混合 75,000個 CMTMR 染色 CHO-pcDNA3 細 胞。於25 μΐ/孔之阻斷緩衝液中稀釋所有抗體及纖維黏連蛋 白基支架蛋白質，並於4°C將各個處理進行1小時。將細胞 混合物用His6標籤之纖維黏連蛋白基支架蛋白質染色，用 冷D-PBS·洗滌兩次，且接著用2.5 gg/ml抗His6 MAb(R&D Systems)處理，洗條，並用 4 pg/mlAlexa Fluor 488-共輛之 抗小鼠抗體（Molecular Probes)染色。對於經抗KDR小鼠單 株抗體（Accurate Chemical，Westbury，NY)或抗 flk-Ι 羊多 株抗體（R&D Systems)處理之細胞，省去抗His6步驟，並用 物種適宜之Alexa Fluor 488共輛之二次抗體（Molecular Probes)偵測抗體結合。染色之後，將細胞再懸浮於200 μΐ/ 孔 D-PBS71% FBS/1 pg/ml 7-胺基放線菌素 D(7_AAD ; Molecular Probes)中，並於配備 488 nM 雷射之 FACSCalibur (Becton Dickinson，San Jose，CA)上由流式細胞計數法分 析。門控以排除死細胞（7-AAD正性）後，藉由分別對於 CMTMR負性或正性群門控來獨立地量測VEGFR-2表現細 胞及CHO-pcDNA3細胞的Alexa Fluor 488螢光。對照組試驗 顯示用CMTMR染色不干擾於染色細胞表面之Alexa Fluor 488共軛抗體之偵測。 亦可藉由螢光顯微法使用上述之二次抗體評析細胞表面 結合。為了該等研究，於包含鈣及鎂（D-PBS+)/10% FBS之 97816.doc -98- 200531979 D-PBS中稀釋抗體。將細胞生長於24-或96_孔板上，且在染 色之後保持於D-PBS+中用於倒立螢光顯微鏡上之觀察。 Ba/F3細胞增殖檢定法： 將Ba/F3細胞於基本Ba/F3培養基中洗滌三次，並再懸浮 於包含15_8 ng/ml增殖因子（人類VEGF165、鼠科VEGF164或 hNT-4分別用於 Ba/F3-KDR、Ba/F3_Flk或 Ba/F3-TrkB細胞） 之相同培養基中，且將包含5xl04 Ba/F3-KDR細胞或2xl04 Ba/F3-Flk或Ba/F3-TrkB細胞之95 μΐ加入96-孔組織培養板 之每個孔中。將PBS中5 μΐ連續稀釋之測試蛋白質加入各個 孔中達成100 μΐ最終體積之Ba/F3培養基/5% PBS/15 ng/ml 生長因子。於37°C培養72小時後，藉由向各個孔中加入20 μΐ CellTiter 96® Aqueous單溶液試劑（Promega)，於 37°C 培養 4 小時，並使用微量滴定板讀取器（Molecular Dynamics)於490 nm量測吸光率來量測增殖。 HUVEC細胞增殖檢定法： 將來自 2_6 繼代之 HUVEC 細胞（Clonetics，Walkersville， MD)生長於EGM-2培養基中（Clonetics)。將5000個細胞/孔 再懸浮於200 μΐ饑餓培養基（相等體積之DMEM(Gibco)與 F-UK培養基（ATCC)，其用0.2%胎牛血清及lx青黴素/鏈黴 素/兩性黴素B溶液（Gibco)補充），塗於96孔組織培養板中並 培養48小時。將纖維黏連蛋白基結合蛋白質加入孔中並於 3 7°C培養1小時，且接著將人類VEGF165加至16 ng/ml之最終 濃度。經48小時培養後，藉由加入1.9 mg/ml CellTiter96® AQueous MTS試劑（Promega)與44 pg/ml甲基硫酸啡嗓 97816.doc -99- 200531979 (Sigma)之30 μΐ/孔混合物，並如上所描述於490 nm量測 B a/F 3細胞吸光率來量測細胞生存能力。 實例12 :抗體輕鏈基VEGFR結合多肽 圖21A及2 1B顯示基於抗體輕鏈可變區（VL)框架/支架之 VEGFR結合多肽之胺基酸序列（SEQ ID NOs:241-310)。 使用PROfusionTM系統產生輕鏈可變區蛋白質，如上所描 述用於1GFn3衍生蛋白質。 本文所述之所有參照案之全文以引用之方式併入本文 中〇 表 1 FG環 Motifs FG環
位置 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 人類結合劑 L/M G X N G/D H/R E L L/M T P 人類及鼠結合劑 X E R N G R X L L/M/N T P 97816.doc 100- 200531979 表1 KDR結合劑 SEQ ID NO 純系名稱 N-端 BC環 DE環 FG環 結合至 1nM KDR, % Kd KDR, 3 K1 Del 1*8 RHPHFPTR LQPPT M a L Y G H E t L T Ρ 46 0.55 4 K2 Del 1-8 RHPHFPTR LQPFT D Q E N G Q F L L V Ρ 48 1.19 5 Κ5 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPFT M G P N D N E L L 了 Ρ 47 1,54 6 Κ3 De!i-8 RHPHFPTR LQPPT A G W D iD丨 H ) E t F i ρ 45 1.15 7 3 9PR4 〇0l 1-8 RHPHFPTR LQrFT V E Q D G H V L Y I Ρ 44 8 2 el Ε6 PR4 Del1-8 RHPHFfnTR y»>Fr M G K N G N E L L T Ρ 43 9 3 3PR4 Del i-a ^HPHFinrR LQFFT P G P G D R E L I T Ρ 42 10 2 01 F8 PR4 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPPT A Q P G A H E L· L 了 Ρ 42 11 4 3PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT M A Q N N 较 E L· L T Ρ 42 12 a 3PR4 Pel 1-8 RHPHFPTR LQFPT M A Q Y G R E L L 了 Ρ 41 ;13 Κ7 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPPT S Θ H N D H M L M I Ρ 40 2,2 :14 3 11 PR4 Del RHPHFPTR LQPPT L A H N G N e L L T Ρ 39 丨15 3 4PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT V A W N Q H E L· M T Ρ 38 16 Κ4 Del i<8 RHPHFPTR LQPPT A G Y N D Q ! L M T Ρ 38 1,95 :17 2 e! FT PM Deli-8 RHPHFPTR LQPPT V G L 托 0 U E L F V Ρ 36 18 2 «ID3PR4 0^1.8 RHPHFPTR LQPPT s G L N B R V L F I Ρ 38 19 3 SPR4 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPPT G P N 0 R E L L T Ρ 37 20 3 3PR4 D«11-8 RHPHFPTR LQPPT L G H N 0 R E L L T Ρ 37 21 3 3PR4 Del 1*8 RHPHFPTR LQPPT t G L H 0 R E L M T Ρ 36 22 1 e! G10 PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT M A Q N G H K L M T Ρ 36 23 KS Pel 1^8 RHPHFPTR LQPPT F G L Y G K E L L I Ρ 35 1,8 24 2 d!E4 PR4 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPPT V H W H G H E L M 丁 Ρ 34 25 2 «1 Ca PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT G F m A H E L m V Ρ 34 26 2 el C11 PR4 Del i-a RHPHFPTR LQPPT A G L n E H E" L L 誦 Ρ 34 27 2 e! D10 PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT L A 0 N A R E L L τ Ρ Μ 28 2 el H5 PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT L G K D V R B L L τ Ρ 34 29 3 7PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT L S D s G H A L F τ Ρ 34 30 2 eJE3 PR4 DeM-3 RHPHFPTR LQPPT L G P Y E H B L L 了 Ρ 33 31 Κ10 DeM-6 RHPHFPTR LQPPT T Q P N 0 R L L F V Ρ 33 0.57 32 2 a! BS PR4 DeM-8 RHPHFPTR LQPPT A G R H D H E L I I Ρ 33 33 3 12FR4 DeM.8 RHPHFPTR LQPPT i G P H N H E L L 了 Ρ 33 i 34 2 e! 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I Ρ 28 101 - 97816.doc 200531979 表1 KDR結合劑 [ [ 匚 c [ □ [ G c 口 sm ID NO 結合1 純系名稱 N-端 BC環 DE環 FG環 KDR,% KdKD 较， rtM 54 3 12FR4 Del 1<β RHFHFPTR LQPFT IT αΠ ΤΓ l"1 N E ：L L L P 2S 55 4 5PR4 Del 1*8 RHPHFPTR LQPPT T g" ΤΓ w Dl ΪΓ F IT F t" F 27 56 m Del 1*8 RHPHFPTR LQFPT ¥ w D I G" w Ψ L F T- F 27 0J3 ：57 3 SPR4 DeI1-a RHFHFPTR tQPPT T G F r F w Q L F Tj P 27 58 3 5PR4 Dei 1-0 RHPHFPTR LQPPT Έ A" [ G** R E ΪΓ w r 27 ：59 3 SPR4 Dei 1-β RHPHFPTR LOPFT Ύ a" w F w r Γ L T F" 27 60 2 ef Fit FR4 De!i*d RMPHFFTR tQPFT ¥ 0 r W w T 1 F 27 丨61 IT 8PR4 Del 1-8 RHPHFPTR tQPPT K N W H w IT r T* F" 26 62 2 ^ C5 PR4 De!1-a RHPHFPTR LQPFT Γρ w ΪΓ E L M v_ P 26 63 K15 OeM^a RHPHFPTR LQPPT E Ψ FT w e" 厂 IT f" F 25 0.35 ：64 3 1PR4 Dei 1-a RHPHFPTR LQPFT T K W w E Γ r T P 25 65 3 5PR4 Dei 1-S RHPHFPTR LQPPT T A n n JL ε t"" F 25 66 4 11 PR4 D$ii-a RHPHFPTR LQPPT ¥ A- H ΪΓ ΪΓ tr T E 25 67 K11 0«M-a RHPHFPTR tQPPT 互 F W w L· L T P 24 1.16 66 3D12PR3 Def 1"β RHFHFPTR LQPPT T W w R Q* IT ΤΓ Ψ F 24 69 2： 0IH12PR4 DeM-e RHPHFPTR LQPPT X o' w H E L L T P 24 70 SPR4 Del RHPHFPTR LQPPT ¥ G] T Q Ψ L L T 24 71 3 SPR4 Del 1*8 RHPHFPTR LQPPT 丁 w [ w u _ L w T 24 72 ~ eIE6 PR4 Del 1-β RHPHFPTR LQPPT I K H w R Γ Γ T P 24 73 T 5刚 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT V A ΏΓ G R B r T t" P 23 74 3A3 PR3 Dei 1-e RHPHFPTR LQPPT T _ w w w w 1 厂 r r 2S 75 3A2PR3 〇«! i*a RHPHFPTR LQPFT w s" w w w in r L F 23 76 [ 11 PR4 I Db\ 1-e RHPHFPTR LQPPT T T" w w w 11 L w P 23 77 |1 e!A2 PR4 | D«i 1-a RHPHFPTR LQPPT ¥ T H G H Q IT F" T E 23 78 2 WT RHPHFPTR LQPPT Y T w w w E ~ w T P 22 79 [ 1FR4 ο夺 i i«a RHPHFPTR LQPFT "F F w F w u w T F 22 SO el G11 PRA Dei 1«a RHPHFPTR LQPPT G o" w w w v" IL^ M T" P 22 81 T el F5 PR4 Del 1-a RHPHFPTR LQPPT T" T w w w b" IT* IT T** P 22 S2 |1 «IE7PR4 I m i-8 RHPHFPTR LQPFT ¥ T H w B L [F T F 22 S3 2 4-PR4 WT RHPHFPTR LQPPT IT w w w w jE_ L w T F 22 84 »1F6 PR4 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPFT IT g" w w w ΪΓ ε L· Ψ Γ F" 72 85 Τ' 10PR4 De_1»8 RHFHFPTR LQPFT "a fT w F a" e" IT ~ T F 21 ：m T 9PR4 Dei 1*8 RHPHFPTR LQPPT T F O' w F w |E L L T P 21 87 12 PR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPFT "v 5Γ W w F w r Γ； Y_ T F 21 85 [ 10PR4 Del 1*8 RHFHFPTR LQPPT ΤΓ Γ Q T "W w IT IT T p- 21 m [ elH9 ΡΠ4 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPPT ¥ g" W [ 0 HL E F V F 20 90 3 8PR4 Del 1-8 RHPHFPTR ΙΛΡΡΤ "v" 互 E w r r" ΪΓ r T F 20 91 T e!A5 PR4 Del 1<8 RHPHFPTR tQPFT 1 N of H w Q F T F 20 92 3B5 PR3 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT of w w ΪΓ T El XT L F 20 93 307 PR3 Dei 1*8 RHPHFPTR LQPFT 互 w Γ w w w w Γ T*- r 20 94 3G2 PR3 Del 1-8 RHPHFPTR LQPFT T" w F" s F" fif T _ T P 20 95 K14 Del 1-8 RHPHFPTR LOPPT 互 T E~ w cT ΪΓ E U" L 厂 P 20 0.57 96 4 12PR4 Dei 1-8 RHPHFPTR LQPPT T" "a of w w H T Γ Γ T P 20 97 F 8PR4 Del 1-a RHPHFPTR LQPFT ! 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表1 KDR結合劑 SEQ ID NO 純系名稱 N-端 BC環 DE環 FG環 1 _ KDR,% KdKtm, rtM 207 3F1 PR3 Del l«d RHPHFPTR LQPPT L T H H E a Y F 了 P 9 208 2Gt PR3 WT RHFHFFTR LQPFT E i Y H D H E L M T 尹 9 209 3 11PIM Dei 1-a RHPHFPTR UCtPPT 減 A Q H D H E L 1 TH P 9 210 2 eiH2 FR4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT V s Q Y β H E L 1 T Ψ 8 211 1 etC10 PR4 Del 1*8 RHPHFPTR LQPFT V A K N D H E L 1 T P 8 212 4D2 PR3 D0ii-e RHPHFPTR LQPPT V A Q N N H E L l T P 8 213 4ASPR3 Dai i*e RHPHFPTR LQPFT V A a H D H E L L 了 F a 214 2F3 PR3 WT RHPHFPTR LQPFT t S H Y a K E L· R IT P 8 215 4A2 PR3 Del RHPHFPTR LQPPT V A a N A H E L M T P 8 216 4G4PR3 DeM-a RHPHFPTR toprr L 0 a N D H E L· L T Ψ 8 217 1 祕 7PR4 Del1»a RHPHFFTR LQPPT V A Q N D H E L K T P a 21B 3 12PR4 Del 1^8 RHPHFPTR tQPPT 0 ε Q N D Y E L L V ? 7 219 2 0 l F12F R4 Del 1-8 RHPHFPTR LQPFT L T a H D H E L L T Ψ T 220 4E2PR3 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT M A Q N D H E L· 1 rr Ψ 7 221 ： 2C5 PR3 WT RHPHFPTR LQPPT E A P H G R E L· R iT P 1 222 2 WT RHPHFPTR LQPPT V G P T D H E L L IT P 1 223 1 0lHB PR4 Del 1-a RHPHFPTR LQPPT V G a Y D H E L ! 了 P $ 224 4A3PR3 Del 1-8 RHPHFPTR LQPPT V A Q 0 E H e丨 L 1 T Ψ 6 225 2Ct2 PR3 WT RHPHFPTR tQPPT D A a N V Q A P 1 A Q 6 226 2G12 PR3 WT RHPHFPTR LQPPT S G a M D H A L L 1 P 6 227 2 11-PR4 WT RHPHFPTR LQPPT E D 歷 R IV L W L N 了 了 e 228 2 7-PR4 WT RHPHFPTR LQPFT W D Q n G H V L L T P 5 229 2 T-PR4 wr RHPHFPTR LQPPT L G L R D R g 1 F V P 5 230 2C8 PR3 WT RHPHFPTR LQPPT V ε P N G H K L A 1 P 5 231 3 SPIU Define RHPHFPTR tQPFT F G a N Θ K B \ F R 1 P 5 2 4-FR4 WT RHPHFPTR LQPFT $ 0 H N Θ H E V M 了 P 4 233 2 6-PR4 WT RHPHFPTR LQPPT L G w H D H E t Y 1 P 4 234 2 5-PR4 WT RHPHFPTR LQPPT L G K D V R E : L L T P Z 235 2IF10 WT RHPHFPTR LQPPT L A L F D H E : L L 了 F 3 236 VR28 WT RHPHFPTR ΙΛΡΡΤ V A Q N D H E L I T P 3 11 237 15» WT RHPHFPTR LOPPA M A Q S 6 H E L F T P 105- 97816.doc 200531979
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表4 :特徵化VEGF-R2結合純系之序列 純系 BC 環(23-30) DE 環(52-56) FG 環(77-87) VR28 RHPHFPTR LQPPT VAQNDHELITP K1 RHPHFPTR LQPPT K6 RHPHFPTR LQPPT υ^τίττ K9 RHPHFPTR LQPPT ΙΒϋΙΜΒίΕΐ^Βρ K10 RHPHFPTR LQPPT WiiNDHfcJiVP K12 RHPHFPTR LQPPT —ndheBtp K13 RHPHFPTR LQPPT IaUMhelItp K14 RHPHFPTR LQPPT H|ndhel|ip K15 RHPHFPTR LQPPT 159(Q8L) RHPHFPTR LQPPA lAQ_LFTP E3 RHPHFPTR LQPPT ΜΒνπρΜρ E5 RHPHFPTR LQPPT 琴。nItMp E6 RHPHFPTR LQPPT jSMlNiPMr lip E9 RHPHFPTR LQPPT BMBlItp E18 RHPHFPTR LQPPT vM>JMelStp E19 RHPHFPTR LQPPT υ^μΜτΙΙτρ E25 RHPHFPTR LQPPT Bn&elItp E26 RHPHFPTR LQPPT vS^njIkt 邏 tp E28 RHPHFPTR LQPPT E29 RHPHFPTR LQPPT v^nBUtp Ml RHPHFPTR LQPTV MndIeotp M2 RHPHFPTR LQPPA 灘 L!TP M3(D60) RHPHFPTH LQPPA MnsIelitp M4 RHPHFPTH LQPPA HBIIeletp M5FL RHPHFPTR LQPPL IBnIIelItp M6 RHPHFPTH LQPPA —KIeiJtp M7 RHPHFPTR LQPTT ^N&iELKTP M8 RHPHFPTH LQPPA IsgIelftp WT VSDVPRDLEVVAATPTSLLISwDAPiAVTyRYYRITYGETGGNSPVQEFrVpGSKSTATISGLKPGVDYTITV /YAVrQitGj^pA$jSKPlSINYRT 112- 97816.doc 200531979 表5 :放射性平衡結合檢定法中測定特立尼丁（trinectin) 結合體與KDR-Fc之親和力 純系 KDR(Kd，nM) VR28 11·0±0·5 K1 <0·6±0·1 K6 <0·9±0·1 K9 <1·8±0·4 K10 <0_6±0·1 K12 <0·6 土 0.1 K13 <0·6±0·1 K14 <0·6±0·1 K15 <0·4±0·1 表6 :放射性平衡結合檢定法中測定特立尼丁結合體與 KDR及Flk-Ι之親和力 純系 KDR(Kd，nM) Flk_l(Kd，nM) VR28 11.0土0.5 nd* E3 <1·0±0·2 5·4 土 1.5 E5 <0.4 土 (Μ 3·2±0·3 E6 <0·4±0·1 7·1±1·1 E9 2.4±0.3 <1·4±0·1 E18 < 1 ·2±0·2 <0·5±0·1 E19 <1·3±0·2 <0.7 土 0] E25 <1.6±0·4 <1·3±0·2 E26 <1·7±0·4 2·0 土 0·3 E28 <1·6±0·4 2·1±0·6 E29 <1.5±0·4 <0.9 士 0·2 nd*- 未偵測 100 ηΜ靶之結合 97816.doc -113 - 200531979 表7 :藉由BIAcore檢定法測定ka 、kd 及 Kd 純系 靶 ka (1/M*s) x 10-4 Kd(l/s)x 10+5 Kd (nM) E6 KDR 89 6.7 0.08 Flk-1 67 136.0 2.02 E18 KDR 26 12.1 0.46 Flk-1 60 19.5 0.33 E19 KDR 30 1.7 0.06 Flk-1 66 22.3 0.34 E25 KDR 25 5.2 0.21 Flk-1 50 37.8 0.76 E26 KDR 11 5.8 0.51 Flk-1 22 47.7 2.14 E29 KDR 36 7.0 0.19 Flk-1 79 28.8 0.37 M5FL KDR 10 9.2 0.89 Flk-1 28 58.2 2.10 VR28 KDR 3 34 13 159(Q8L) KDR 5 10 2 表8 : 細胞 結合至 KDR(CHO KDR)與 Flk-l(CHO Flk-1)表現 純系 CHO KDR (EC50，nM) CHO Flk-1(EC50，nM) E18 4·2±1·0 0·9±0·4 E19 7.6±1.7 5·3±2.5 E26 2.6±1.2 1·3±0·7 E29 2·3±1·0 0·6±0·1 WT 無 無 97816.doc -114- 200531979 表 9 ··抑制 KDR(Ba/F3-KDR)及 Flk-l(Ba/F3-Flk)表現細 胞之VEGF誘導增殖 系屯糸 Ba/F3-KDR (IC50，nM) Ba/F3-Flk (IC50，nM) E18 5·4±1·2 2·4 土 0·2 E19 12·3士2·6 5·8±1·0 E26 3·2 土 0.5 5.3±1·7 E29 10.0±2.1 4·7±1·2 M5FL 3·9±1·1 5·1±0·2 WT 無 無 Anti-KDRAb 17·3±7·7 ND Anti-Flk-1 Ab ND 15.0土3.2 表10 ··抑制HUVEC細胞之VEGF誘導增殖 純系 (IC50，nM) Ε18 12·8±4·6 Ε19 11·8±2·7 Ε26 14·0土5·9 Ε29 8.4±0.8 M5FL 8.5±2.8 WT 益 97816.doc 115- 200531979 表11 hKDR Flk-1 ka(l/Ms) xlO'4 kd(l/s) xlO5 KD(nM) ka(l/Ms) xlO-4 kd(l/s) xlO5 KD(nM) M5FL C100 7.4 6.7 0.9 14.6 30 2.1 M5FL 20 K PEG 0.9 5.4 5.9 2.4 55 22.8 M5FL 40 K PEG 0.5 5.9 1.3 1.0 54 57.1 【圖式簡單說明】 圖1A-1D為描述來自KDR選擇第6次循環之KDR-結合單 純系特性之圖表及影像。圖1A為顯示基於纖維黏連蛋白之 結合蛋白質特異結合至25nMKDR-Fc圖表，此結合係以放 射性平衡結合檢定法來分析。圖1B為顯示於100倍過量之 VEGF165存在下抑制KDR-Fc與所選擇之基於纖維黏連蛋白 之結合蛋白質的特異結合的圖表。如該圖中所示，某些結 合蛋白質與VEGF165競爭結合KDR-Fc，而以純系8為例之其 它則不與VEGF165競爭。圖1C為顯示於所選擇之基於纖維黏 連蛋白之結合蛋白質存在下抑制KDR-Fc與固定之VEGF165 相互作用之圖表，此抑制係於BIAcore中分析。圖1D為顯示 VR28結合至KDR-表現及對照細胞之影像，此結合係由免疫 螢光法來偵測。 圖2為顯示VR28 KDR結合體之親和力成熟之選擇概況之 97816.doc -116- 200531979 圖表。左邊顯示為VR28純系結合至KDR-Fc及Flkl-Fc(非常 低，未標記之條）。中間顯示為粗誘變池與隨後之富集循環 結合至KDR-Fc。右邊顯示為另外富集循環結合至 Flk-1-Fc。於放射性平衡結合檢定法中將結合估算為使用1 nM KDR-Fc或Flkl-Fc之輸入量的百分比。 圖3A及3B為描述來自VR28結合體之抗-KDR親和力成熟 第4次循環KDR-結合單純系之特性的圖表。圖3A顯示於放 射性平衡結合檢定法中VR28(-·-)與親和力成熟化之 ΚΙ(-Α-) -Κ6(-Τ·) ^ Κ9(-Φ-) ^ Κ10(-·-) > K12(-D-) ^ Κ13(-Δ-)、K14(-V-)、K15(_0_)之飽和結合至KDR_Fc。圖 3B顯示具有及不具有N_端缺失之純系結合至KDR-Fc。於基 於纖維黏連蛋白之結合蛋白質之N-端缺失Δ1-8改良了結 合至KDR-Fc。資料表示23個獨立之具有及不具有N-端缺失 之純系之平均KDR-Fc結合。 圖4為顯示選擇之純系結合至KDR及Flk-Ι之圖表。在四 次循環之親和力成熟之後VR28及選定之純系特異結合至 人類KDR(K純系）且七次循環親和力成熟化之後結合至人 類（KDR)及小鼠（Flk-1)(E純系）。將VEGFR-2-Fc嵌合體於放 射性平衡結合檢定法中比較。資料表示3個獨立試驗之平均 值。如本文所示，抗小鼠及人類VEGFR-2蛋白質之成熟化 產生結合兩種蛋白質之結合體。 圖5A與5B為顯示來自VR28結合體之親和力成熟化第7次 循環之VEGFR-2-結合單純系之特性的圖表。以放射性平衡 結合檢定法測試VR28(-·-)及特異性成熟化之E3(-A-)、 97816.doc -117- 200531979 E5(-l)、E6(i)、E9(-·-)、E18(-tl·)、Ε19(-Δ-)、 E25(-V-)、E26(-〇-)、E28〇〇-)、E29(-X-)純系飽和結合至 KDR(圖 5A)與 Flkl(圖 5B)-Fc 嵌合體。 圖6A與6B為顯示藉由來自VR28結合體之親和力成熟化 第7次循環之單純系進行VEGFR-2結合之特性的圖表。圖6A 顯示對人類及小鼠VEGFR-2具有雙重特異性之結合體之位 置79及82上之精胺酸對於結合至小鼠VEGFR-2(Flkl)之重 要性。當該等位置中任一位置除R(X79=E、Q、W、P;X82=L、 K)外由胺.基酸置換時，結合至Flkl但不是KDR明顯地減 少。圖6B顯示KDR基於纖維黏連蛋白之結合蛋白質之所有 三個可變環（BC、DE與FG)對於結合至靶之重要性。每個環 每次由NNS序列取代影響結合至KDR及Flkl。結合資料為 自E6與E26純系之平均值。 圖7A與7B為顯示選擇之基於纖維黏連蛋白之結合蛋白 質結合至表現人類KDR受體（圖7A)及EpoR-Flkl嵌合體（圖 7B)之 CHO 細胞之圖表。測試 E18(-·-)、E19(-A-)、 E26(-Y-)、E29(-t)及WT(-[l·)基於纖維黏連蛋白之支架蛋 白質。未觀察到結合至對照CHO細胞（資料未圖示）。 圖8A與8B為顯示表現KDR及Flkl之Ba/F3-KDR(圖8A)與 Ba/F3-Flkl(圖8B)細胞由VEGF誘導之增殖受到抑制之圖 表，此抑制係發生於不同量之基於纖維黏連蛋白之結合蛋 白質存在下：E18(-·-)、E19(-A-)、E26(-V-)、E29(-^-)、 M5(-·-)、WT(-IU_)及抗 KDR 或抗 Flk-1 Ab(-A-)。資料表示 2個獨立試驗之平均值。 97816.doc -118- 200531979 圖9為顯示於不同量之基於纖維黏連蛋白之支架蛋白質 存在下HUVEC增殖檢定結果之圖表：E18(-·-)、E19(-A-)、 E26(-T-)、E29(-^_)、M5(-春-)、WT(-[l·)。資料表示 2 個獨 立試驗之平均值。如所示，KDR結合蛋白質引起增殖減少 大約40%。 圖10為一組顯示在最佳緩衝液中M5FL之可逆再折疊之 圖表。 圖11為顯示M5FL之聚乙二醇化形式之SDS_PAGE分析影 像。Μ，分子量標記物[Sea Blue Plus，Invitrogen] ; -，M5FL 單獨；20，具有 20 kD PEG之M5FL ; 40，具有 40 kD PEG 之M5FL。
圖12為顯示分別以不同量之M5FL(-·-)、M5FL PEG20 (--)及 M5FL PEG40(-i^-)抑制由 VEGF誘導之 Ba/F3_KDR 細胞增殖之圖表。在該檢定中聚乙二醇化對M5FL活性有微 弱或沒有影響。 圖13顯示内皮細胞中VEGFR-2訊號傳輸之西方（轉潰）分 析法（western analysis)。鱗 VEGFR-2-填酸化 VEGFR-2 之視 覺化。VEGFR-2 —樣本裝載對照物。磷ERK1/2-磷酸化 ERK1/2之視覺化。ERK1-樣本裝載對照物。結果證明13 0 pM CT-3 22阻斷藉由VEGF-A之VEGFR-2活化及訊號傳輸。 圖14顯示各種10FN3-衍生之分子（例如M5FL、F10、 CT-322)可阻斷VEGF-A及VEGF-D訊號傳輸。 圖1 5顯示比較i.v· & i.p.投用1251天然、聚乙二醇化之 CT-3 22。CT-3 22為12 kDa蛋白質。其可於血液中迅速清除。 97816.doc -119- 200531979 添加40 kDa PEG減少其清除率且增加1〇倍AUC。大鼠中16 hr之半衰期等效於人類每週2X劑量。投藥途徑：i.p. CT-322-PEG40具有僅為i.v.投藥之50%的AUC。 圖16顯示正常大鼠中125I-CT322PEG40之組織分佈。1251 -CT322PEG40之組織分佈顯示主要通過肝其次通過腎分 泌。此情況對高分子量PEG形式而言係吾人所預期的。未 偵測到CT-322PEG40之長期積聚。 圖1 7為Miles檢定法量測血管滲透性之示意圖。 圖18顯示使用Miles檢定法於活體内CT-322阻斷VEGF。 結果指示5 mg/kg CT322-PEG40阻斷VEGF攻毒。 圖19顯示使用B16-F10鼠黑色素瘤檢定法CT-322抑制腫 瘤生長。 圖20顯示使用U87人類神經膠母細胞瘤CT-322抑制腫瘤 生長 圖21A及21B顯示基於抗體輕鏈框架/支架之VEGFR結合 多肽之序列（SEQ ID NOs:241-310)。 圖22顯示具有免疫球蛋白折疊（免疫球蛋白之VH域，左 側）之單域多肽及具有類免疫球蛋白折疊（1GFN3域，右側） 之單域多肽之結構組織。 97816.doc -120-

Claims (1)

  1. 200531979 十、申請專利範園： 1· 一種結合至人類KDR之大體上純的單域多肽，該多肽包 含介於約80與約15〇個之間之胺基酸，其所具有之結構組 織包含： ' β分佈於至少二層β片層之間的至少七條β鏈，及 b)至少一個連接兩條β鏈之環部分，該環部分參與結合至 KDR， ° 其中該單域多肽以小於丨><10·6 Μ之解離常數（Kd)結合至 該人類KDR蛋白質之細胞外域。 2·如請求項丨之單域多肽，其中該單域多肽包含免疫球蛋白 可變域。 3 .如明求項1之單域多肽，其中該免疫球蛋白可變域係選自 下列各域組成之群：人類Vl域、人類vH域及駱駝科vhh 域。 4.如明求項2之單域多肽，其中該多肽包含參與結合至KDR 之二個環部分，每個環部分連接兩條β鏈。 5 ·如明求項1之單域多肽，其中該單域多肽包含類免疫球蛋 白域。 6·如清求項丨之單域多肽，其中該類免疫球蛋白域為纖維黏 連蛋白第111型（Fn3)域。、 7·如明求項1之單域多肽，其中該Fn3域以自N-端至C-端之 次序包含， a) — β鏈，A ; b) 一環，AB ; 97816.doc 200531979 C) 一 β鏈，B ; d) — 環，BC ; e) — β鏈 C ; f) 一環 CD ; g) — β鏈 D ; h) — 環 DE ; i) 一 β鏈 F ; j) 一環FG ;及 k) 一 β鏈 G。 8·如明求項7之單域多肽，其中該環FG參與KDR結合。 9. 如响求項7之單域多肽，其中該等環bC、de及FG參與KDR 結合。 10. 如明求項9之單域多肽，其中每條β鏈基本上由與SEQ ID N〇:5之相應β鏈之序列至少8〇%相同的胺基酸序列組成。 U·如請求項10之單域多肽，其中該等環AB、CD及EF中每個 環基本上由與SEQ ID N〇:5之相應環之序列至少8〇%相同 的胺基酸序列組成。 月长員1之單域多肽，其中該單域多肽包含與ID N〇·5之序列至少60%相同之胺基酸序列。 13.如:求項5之單域多肽，其中該多肽包含參與結合至KDR 之三個環部分，每個環部分連接兩條β鏈。 14·如明求項！之單域多月太，其中參與奶反結合之環具有選自 下列各序列組成之群之序列：SEQidn〇:1、⑴ ^EQID N0:3^SEQID NO:4〇 97816.doc 200531979 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 如請求項1之單域多肽， 對於未經修飾多肽而言 多肽之清除率三倍以上 如請求項15之單域多肽 乙二醇部分。 其中將該多肽附接至一部分相 ，該部分可減小大鼠或人類中該 ，其中減小該清除率之部分為聚 其中该聚乙一醇部分具有介於2 如請求項16之單域多肽， 與100 kDa之間之分子量 ^凊求項16之單域多肽，其中該聚乙二醇部分在該單域 多肽中共價鍵結至半胱胺酸之硫醇部分。 如=求項i之單域多肽，其中該多肽附接至_標記部分。 士明求項1之單域多肽，其中該單域多肽以小於1 x i 0_7 Μ 之解離常數（kd)及小於5xl(^ s.i之脫離速率常數（kd)結合 至4人類KDR蛋白質之細胞外域且抑制KDR調控之 VEGF活性。 如請求項1之單域多肽，其中該單域多肽與VEGFim競爭 結合KDR。 如請求項1之單域多肽，其中該單域多肽與veGF-a& VEGF_D競爭結合kdR。 如明求項1之單域多肽，其中該單域多肽亦以小於1X1 〇_6 之KD結合至小鼠Flk 1之細胞外域。 一種多肽，其包含SEqIDNO:192之胺基酸序列。 如請求項24之多肽，其中該多肽包含SEq ID no: 193之胺 基酸序列。 一種多肽，其包含SEQIDNO:194之胺基酸序列。 97816.doc 200531979 27·如請求項26之多肽，其中聚乙二醇部分係共價結合至位 置93之半胱胺酸殘基。 28_如請求項27之多肽，其中該聚乙二醇部分具有介於約1〇 kDa至約60 kDa範圍内之分子量。 29. —種大體上純的多肽，其包含與SEQ ID NOs: 1-4之任一序 列至少85%相同之胺基酸序列，其中該多肽結合至KDR 且與VEGF-A競爭結合至KDR。 3 0.如請求項29之大體上純的多肽，其包含與SEQ ID NOs:6-l_83、186-197及199之任一序列至少85%相同之胺 基酸序列。 31·如請求項30之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NOs:6-183、 186-197及199之任一序列。 3 2·如請求項29之多肽，其中該多肽抑制VEGF之生物活性。 33.如请求項29之多肽，其中該多肽以5〇 nM或更小之尺!)結合 該 KDR 〇 34·如凊求項29之多肽，其中該多肽以小於1χ1〇·7 M之解離常 數（KD)及小於5xl0·4 s-i之脫離速率常數（k。^結合至該人 類KDR蛋白貝之細胞外域且抑制KDR調控之活性。 35· -種治療調配物，其包含如請求項中任一項之多狀及 一醫藥上可接受之載劑。 36· -種抑制細財VEGF生物活性之方法，纟包含將如請求 項1 34中任一項之多狀以足以抑制該生物活性之劑 量及時間接觸該細胞。 3 7· —種用於治療具有對抑制 了彳卩制VEGF有反應之病症之患者之 97816.doc 200531979 方法，該方法包含將有效劑量之如請求項^34中任一項之 夕肽杈予该患者，其中該多肽抑制VEGf之生物活性。 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 如明求項37之方法’其中該病症係特徵為不適當之血管 新生之病症。 如清求項38之方法’其中該病症係過度增殖性病症。 如明求項38之方法’其中該病症選自下列各病症組成之 自體免疫失調症、發炎性失調症、視網膜病及癌症。 :種^請求項1·34中任—項之多肽之用途，係用於製備供 治療選自下列各失調症組成之群之失調症之醫藥品：自 體免疫失調症、發炎性失調症、視網膜病及癌症。 —種偵測樣本中VEGFR-2之方法，該方法包含： a)將該樣本與如請求項…中任—項之多肽接觸，其中該 接觸係在可形成多肽_VEGFR_2複合物之條件下進行； 且 ， )偵/則忒複合物，藉此偵測該樣本中之該VEGFR_2。 如明求項42之方法，其中該偵測係使用選自下列各技術 組成之群之技術進行：放射線攝影術、免疫學檢定法、 佘光偵測、質譜分析術或表面電漿共振。 如請求項42之方法，其中該樣本為生物樣本。 汝明求項42之方法，其中該生物樣本為取自人類之樣 本’且其中該VEGFR-2為KDR。 。月求項42之方法，其中該多肽係以標記部分可偵測地 T不 δυ ° 如明求項46之方法，其中該標記部分係選自下列各部分 97816.doc 200531979 組成之群：放射性部分、螢光部分、發色部分、化學發 光部分及半抗原部分。 48. 如請求項42之方法，其中將該多肽固定於固體載體上。 49. 一種具有改良藥物動力學特性之起結合i〇Fn3多肽，該多 肽包含： a) 具有約80至約150個胺基酸之i〇Fn3區域，其中該iGFn3 域之至少一個環參與革巴結合；及 b) 一共價結合之聚乙二醇（PEG)部分， 其中該Fn3多肽以小於100 nMiKD結合至靶且在大鼠或 人類中具有小於30 mL/hr/kg之清除率。 5 0·如請求項49之10Fn3多肽，其中該peg部分藉由位點導向 聚乙二醇化附接至該Fn3多肽。 51·如請求項50之10Fn3多肽，其中該PEG部分附接至Cys殘 基。 52·如請求項51之10Fn3多肽，其中該Cys殘基係位於該10Fn3 多肽之N-末端或介於該N-末端與該最N-末端β鏈之間。 53. 如請求項51之1#113多肽，其中該Cys殘基位於該10Fn3多 肽之C-末端或介於該〇末端與該最C-末端β鏈之間。 54. 如請求項49之10Fn3多肽，其中該PEG部分具有介於約2 kDa與約1〇〇 kDa之間之分子量。 55·如請求項49之10Fn3多肽，其中該10Fn3多肽包含與SEQ ID NO:5至少60%相同之胺基酸序列。 5 6 · —種將1 GFn3多肽投予患者以達成相對於靜脈内投予之延 緩釋放之方法，該方法包含：經皮下投予該1()Fn3多肽， 97816.doc 200531979 藉此達成相對於靜脈内投予之延緩釋放進入血液。 7· 項56之方法，其中該1〇Fn3多月太之皮下投藥達成該 肽之表大血清濃度，其係靜脈内投予相同劑量所 達成之最大血清濃度的一半以下。 月长員56之方法，其中該1〇Fn3多肽附接至增加該i〇Fn3 多肽之血清半衰期之部分。 59.如請求項58之方法，其中該部分為聚乙二醇部分。 60·如明求項56之方法，其中該1〇Fn3多肽包含與IQ紙5 至少60%相同之胺基酸序列。 61.種大體上純的單域多狀，其結合至預選定之人類乾蛋 白質及其來自非人類物種之同系物，該多肽包含介於約 8〇與約15G個之間之胺基酸，其所具有之結構組織包含： ^分佈於至少兩層β片層之間的至少七條β鏈，及 b)至少一個連接兩條β鏈之環部分，該環部分參與結合至 該預選定之人類靶蛋白質及其同系物， 〇 其中該單域多肽以小於5χ1()·8 Μ之解離f數㈣結合至 該預選定之人類靶蛋白質及其同系物，且其中該同系物 遍及至少100個胺基酸之序列與該預敎之人類乾蛋白 質至少80%相同。 62·如請求項6 1之單域多肽 白可變域。 其中該單域多肽包含免疫球蛋 63.如請求項62之單域多肽’其中該免疫球 自下列各域組成之群：人類m HH τ八螭VL域、人類vH域及駱駝科v 域0 97816.doc 200531979 64·如請求項62之單域多肽，其中該多肽包含參與結合至該 預選定之人類靶蛋白質及其同系物之三個環部分，每個 環部分連接兩條β鏈。 65.如請求項61之單域多肽，其中該單域多肽包含類免疫球 蛋白域。 6 6.如請求項6 5之單域多肽，其中該類免疫球蛋白域為纖維 黏連蛋白第III型（Fn3)域。 67·如請求項66之單域多肽，其中該Fn3域自N-端至C-端之次 序包含： a) — β鍵，A ; b) — 環，AB ; c) 一 β鏈，B ; d) — 環，BC ; e) — β鍵 C ; f) 一環 CD ; g) — β鏈 D ; h) — 環 DE ; i) 一 β鏈 F ; j) 一環FG ;及 k) 一 β鏈 G。 68. 如請求項67之單域多肽，其中該環FG參與KDR結合。 69. 如請求項67之單域多肽，其中該等環BC、DE及FG參與 KDR結合。 70. 如請求項66之單域多肽，其中每條β鏈基本上由與SEQ ID 97816.doc 200531979 71. 72. 73. 74. 75. 76. NO:5之相應β鏈之序列至少80%相同胺基酸序列組成。 一種核酸，其包含編碼如請求項1-34、49-5 5及61-70中任 一項之多狀之序列。 一種表現載體，其包含可操作地與啟動子連接之如請求 項71之核酸。 一種細胞，其包含如請求項7 1之核酸或如請求項72之表 現載體。 一種產生如請求項1-34、49-55及61-70任一項之多肽之方 法，其包含： a) 提供包含編碼如請求項1-34、49-55及61-70任一項之多 肽之序列的核酸； b) 表現步驟a)之核酸以產生該多肽。 如請求項74之方法，其中步驟a)之核酸表現於細胞中。 如請求項74之方法，其中步驟a)之核酸表現於無細胞系統 中。 97816.doc
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