MXPA06006406A - Inhibidores de receptores de factor de crecimiento endotelial vascular tipo 2. - Google Patents

Inhibidores de receptores de factor de crecimiento endotelial vascular tipo 2.

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MXPA06006406A
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kdr
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Elena Getmanova
Martin C Wright
Al Harris
Ai Ching Lim
Jochim Gokemeijer
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Abstract

La presente descripcion se refiere a polipeptidos de enlace del receptor vascular del factor de crecimiento del endotello (VEGFR) y metodos para utilizar estos polipeptidos para inhibir las actividades biologicas por los factores vasculares del crecimiento del endotelio (VEGFs). La presente descripcion tambien proporciona varias mejoras relacionadas con los polipeptidos de enlace de un solo dominio.

Description

INHIBI DORES DE RECEPTORES DE FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR TIPO 2 SOLICITU DES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de EE. UU . No. 60/527,886, titulada "Inhibidores de Receptores de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular" y presentada el 5 de Diciembre de 2003. Todas las enseñanzas de la solicitud anteriormente referida se incorporan en la presente para referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a nuevos polipéptidos de unión de receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y métodos para utilizar estos polipéptidos para inhibir las actividades biológicas mediadas por factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGFs). La angiogenesis es el proceso mediante el cual se forman nuevos vasos sanguíneos de los capilares pre-existentes o vénulas post capilares; es un componente importante de varios procesos fisiológicos incluyendo ovulación, desarrollo embriónico, reparación de heridas, y generación vascular colateral en el miocardio. La angiogenesis también es central para un número de condiciones patológicas tales como el crecimiento tumoral y metástasis, retinopatía diabética, y degeneración macular. En la mayoría de los casos, el proceso comienza con la activación de células endoteliales vasculares existentes en respuesta a una variedad de citoquinas y factores de crecimiento. En cáncer, las citoquinas liberadas de tumor o factores angiogénicos estimulan las células endoteliales vasculares al interactuar con los receptores de superficie celular específica. Las células endoteliales activadas secretan enzimas que degradan la membrana basal de los vasos, permitiendo la invasión de las células endoteliales en el tejido tumoral. Una vez situadas, las células endoteliales se diferencian para formar nuevos retoños de vasos de vasos pre-existentes. Los nuevos vasos sanguíneos proporcionan nutrientes al tumor, facilitando el crecimiento adicional, y también proporcionan una vía para la metástasis. A la fecha, se han identificado numerosos factores angiogénicos, incluyendo el factor particularmente potente VEGF. VEGF se purificó inicialmente de los medios condicionados de células folículoestrelladas y de una variedad de estirpes de célula. Más recientemente un número de homólogos estructurales y formas alternativamente divididas de VEGF se han identificado. Las diversas formas de VEGF se unen como ligantes de alta afinidad a un juego de receptores VEGF (VEGFRs). VEGFRs son receptores de quinasa de tirosina, varios de los cuales son reguladores importantes de angiogenesis. La familia VEGF incluye 3 sub-tipos principales: VEGFR-1 , VEGFR-2 (también conocido como Receptor de Dominio de I nserción de Quinasa, "KDR", en humanos), y VEGFR-3. Entre las formas VEGF, VEGF-A, VEGF-C y VEGF-D se conoce que unen y activan VEGFR-2. VEGF, actuando a través de sus receptores cognados, pueden funcionar como un mitógeno específico endotelial durante la angiogenesis. Además, existe evidencia sustancial de que VEGF y VEGFRs se regulan en condiciones caracterizadas por angiogenesis inadecuada, tal como cáncer, como resultado, un gran interés de investigación se ha enfocado en la identificación de terapéuticos que tienen como objetivo e inhiben VEGF o VEGFR. Los procedimientos terapéuticos actuales que tienen como objetivo o inhiben VEGF o VEGFR incluyen anticuerpos, péptidos, e inhibidores de quinasa de molécula pequeña. De estos, los anticuerpos son las más ampliamente utilizados para el reconocimiento in vivo y la inhibición de ligantes y receptores celulares. Los anticuerpos altamente específicos se han utilizado para bloquear la interacción de receptor-ligante, neutralizando de tal modo la actividad biológica de los componentes, y también para suministrar específicamente los agentes tóxicos a las células que expresan el receptor cognado sobre su superficie. A pesar de ser eficaces, los anticuerpos son grandes, moléculas complejas que dependen de la expresión de células de mam ífero recombinantes par ala producción. Los anticuerpos también originan una variedad de efectos secundarios que frecuentemente son indeseables, incluyendo la activación de trayectorias de complemento y citotoxicidad celular dirigida por anticuerpos. Como resultado, permanece la necesidad de terapéuticos eficaces que puedan inhibir específicamente las trayectorias de VEGF/VEGFR como un tratamiento para los desórdenes caracterizados por angiogenesis inadecuada, tal como cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En parte, esta descripción proporciona nuevos, polipéptidos de dominio único que se unen a receptores VEGFR-2, particularmente VEGFR-2 humano (también conocido como KDR) y VEGFR-2 de ratón (también conocido como Flk-1 ). Las proteínas de unión VEGFR-2 descritas en la presente pueden utilizarse, por ejemplo, para detectar VEGFR-2 in vivo o in Vitro. Adicionalmente, ciertas proteínas de unión VEGFR-2 descritas en la presente pueden utilizarse para tratar enfermedades asociadas con la actividad biológica mediada por VEGFR-2. Por ejemplo, KDR media los efectos pro-angiogénicos de VEGF, y de acuerdo con lo anterior, ciertas proteínas de unión de KDR de la descripción pueden utilizarse para inhibir la angiogenesis en un paciente humano. Ciertas proteínas de unión VEGFR-2 de la descripción pueden utilizarse para tratar desórdenes tales como cánceres, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes y retinopatías. Varios desórdenes relacionados a la hiperproliferación de células de un tejido incluirán un componente angiogénico, y de esta manera se espera que ciertas proteínas de unión VEGFR-2 descritas en la presente puedan utilizarse para tratar tales desórdenes. Un polipéptido de dominio único descrito en la presente generalmente será un polipéptido que se une a un objetivo, tal como VEGFR-2, y en donde la actividad de unión objetivo situada dentro de un dominio estructural único, según se diferencia de, por ejemplo, los anticuerpos y anticuerpos de cadena única, en donde la actividad de unión de antígeno generalmente se contribuye tanto por un dominio variable de cadena pesada como un dominio variable de cadena ligera. La descripción también proporciona proteínas más grandes que pueden comprender polipéptidos de dominio único que se unen al objetivo. Por ejemplo, una pluralidad de polipéptidos de dominio único pueden conectarse para crear una molécula compuesta con avidez aumentada. De igual forma, un polipéptido de dominio único puede unirse (por ejemplo, como una proteína de fusión) a cualquier número de otros polipéptidos. En ciertos aspectos un polipéptido de dominio único puede comprender al menos cinco a siete filamentos beta o tipo beta entre al menos dos placas beta, según se ejemplifica por dominios de inmunoglobulina y tipo inmunoglobulina. Un filamento tipo beta es una cadena de aminoácidos que participa en la estabilización de un polipéptido de dominio único pero no necesariamente adopta una conformación de filamento beta. Si un filamento tipo beta participa en la estabilización de la proteína puede valorarse al suprimir la cadena o alterar la secuencia de la cadena y si la estabilidad de proteína se disminuye. La estabilidad puede valorarse mediante, por ejemplo, la desnaturalización térmica y estudios de renaturalización. Preferentemente, un polipéptido de dominio único incluirá no más de dos filamentos tipo beta. Un filamento tipo beta usualmente no adoptará una conformación alfa-helicoidal pero puede adoptar una estructura de serpentín aleatorio. En el contexto de un dominio de inmunoglobulina o un dominio tipo inmunoglobulina, un filamento tipo beta más frecuentemente se presentará en la posición en la estructura que podría de otra forma ocuparse por el filamento beta más N-terminal o el filamento beta más C-terminal. Una cadena de aminoácidos que, si se sitúa en el interior de una secuencia de proteína podría formar normalmente un filamento beta, puede, cuando se sitúa en una posición más cercana a una terminal N o C, adoptar una conformación que no es claramente un filamento beta y se refiere en la presente como filamento tipo beta. En ciertas modalidades, la descripción proporciona polipéptidos de dominio único que se unen a VEGFR-2. Preferentemente, los polipéptidos de dominio único se unen a KDR humano, Flk-1 humano, o ambos. Un polipéptido de dominio único puede comprender entre aproximadamente 80 y aproximadamente 1 50 aminoácidos que tienen una organización estructural que comprende: al menos siete filamentos beta o filamentos tipo beta distribuidos entre al menos dos placas beta, y al menos una parte de ciclo conectando dos filamentos beta o filamentos tipo beta, cuya parte de ciclo participa en la unión a VEGFR-2. En otras palabras, una parte de ciclo puede unir dos filamentos beta, dos filamentos tipo beta o un filamento beta y un filamento tipo beta. Típicamente, una o más de las partes de ciclo participarán en unión VEGFR-2, a pesar de que es posible que una o más de las partes de filamento beta o tipo beta también participarán en la unión de VEGFR-2, particularmente aquellas partes de filamento beta o tipo beta que se sitúan más cerca de las partes de ciclo. Un polipéptido de dominio único puede comprender una unidad estructural que es un dominio de inmunoglobulina o un dominio tipo inmunoglobulina. Un polipéptido de dominio único puede unirse a cualquier parte de VEGFR-2, a pesar de que los polipéptidos que se unen a un dominio extracelular de un VEGFR-2, se prefieren. La unión puede valorarse en términos de constantes de equilibrio (por ejemplo, disociación, KD), y en términos de constantes de cinética (por ejemplo, constante de velocidad activa, kactiva y constante de velocidad inactiva, k¡nact¡va). Un polipéptido de dominio único típicamente se seleccionará para unirse a VEGFR-2 con una KD de menos de 1 0"6M, o menos de 10"7M, 5x1 0"8M, 10"8M o menos 1 0"9M. Los polipéptidos de unión de VEGFR-2 pueden competir para la unión con uno, dos o más miembros de la familia de VEGF, particularmente VEGF-A, VEGF-C y VEGF-D y pueden inhibir uno o más casos biológicos mediados por VEGFR-2, tal como la proliferación de las células endoteliales, permeabilización de los vasos sanguíneos y la motilidad aumentada en las células endoteliales. Los polipéptidos de unión de VEGFR-2 pueden utilizarse para propósitos terapéuticos así como también para cualquier propósito que incluya la detección o unión de VEGFR-2. Los polipéptidos para uso terapéutico generalmente tendrán una K de menos de 5x1 0"8M, menos de 1 0"8M o menos de 10"9M, a pesar de que los valores K más altos pueden tolerarse en donde la k¡nact¡va es lo suficientemente baja o la kact?va es lo suficientemente alta. En ciertas modalidades, un polipéptido de dominio único que se une a VEGFR-2 comprenderá una secuencia de unión de VEGFR-2 de consenso seleccionada del grupo que consiste de: SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO:2, SEQ I D NO:3 y SEQ I D NO:4. Preferentemente, tal secuencia se situará en un ciclo, particularmente en el ciclo FG. En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio único comprende un dominio variable de inmunoglobulina (Ig). El dominio variable Ig , por ejemplo, puede seleccionarse del grupo que consiste de: un dominio VL humano, un dominio VH humano y un dominio VH H camelid. Uno, dos, tres o más ciclos del dominio variable Ig pueden participar en la unión a VEGFR-2, y típicamente cualquiera de los ciclos conocidos como CDR1 , CDR2 o CDR3 participarán en la unión de VEGFR-2. En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio único comprende un dominio tipo inmunoglobulina. Uno, dos, tres o más ciclos del dominio tipo inmunoglobulina pueden participar en la unión a VEGFR-2. Un dominio tipo inmunoglobulina preferido es un dominio tipo l l l de fibronectina (Fn3). Tal dominio puede comprender, en cuanto a la terminal N a terminal C, un filamento beta o tipo veta, A; un ciclo, AB; un filamento beta, B; un ciclo, BC; un filamento beta C; un ciclo CD; un filamento beta D; un ciclo DE; un filamento beta F; un ciclo FG, y un filamento beta o tipo beta G. Véase Figura 22 para un ejemplo de la organización estructural. Opcionalmente, cualquiera o todos los ciclos AB, BC, CD, DE, EF, y FG pueden participar en la unión de VEGFR-2, a pesar de que los ciclos preferidos son BC, DE y FG. Un dominio Fn3 preferido es un dominio Fn3 derivado de fibronectina humana, particularmente el 10° dominio Fn3 de fibronectina, referido como 10Fn3. Deberá señalarse que ninguno de los polipéptidos de unión VEGFR-2 descritos en la presente tienen una secuencia de aminoácido que sea idéntica a 10Fn3 nativo; la secuencia se ha modificado para obtener las proteínas de unión VEGFR-2, pero las proteínas que tienen las características estructurales básicas de 10Fn3, y particularmente aquellas que retienen la homología de secuencia reconocible al 10Fn3 nativo se refieren sin embargo en la presente como "polipéptidos 10Fn3". Esta nomenclatura es similar a aquella encontrada en el campo de anticuerpo en donde, por ejemplo, un dominio VL de anticuerpo recombinante generado contra una proteína objetivo particular puede no ser idéntico a cualquier dominio VL que se presenta naturalmente pero sin embargo la proteína reconoce una proteína VL. Un polipéptido 10Fn3 puede ser al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o 90% idéntico al dominio 1 0Fn3 humano, mostrado en la SEQ ID NO:5. La mayoría de la variabilidad se presentará en uno o más de los ciclos. Cada uno de los filamentos beta o tipo beta de un polipéptido 0Fn3 puede consistir esencialmente de una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a la secuencia de un filamento beta o tipo beta correspondiente de SEQ I D NO:5, con la condición de que tal variación no rompe la estabilidad del polipéptido en las condiciones fisiológicas. Un polipéptido 10Fn3 puede tener una secuencia en cada uno de los ciclos AB, CD, y EF que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90% , 95% o 100% idéntica a la secuencia de un ciclo correspondiente de SEQ I D NO:5. En varios casos, cualquiera o todos los ciclos BC, DE y FG se conservarán escasamente en relación a SEQ I D NO:5. Por ejemplo, todos los ciclos BC, DE y FG pueden ser menores a 20%, 10% o 0% idénticos a sus ciclos correspondientes en la SEQ I D NO:5. En ciertas modalidades, la descripción proporciona un polipéptido no anticuerpo que comprende un dominio que tiene un pliegue tipo inmunoglobulina que se une a VEGFR-2. El polipéptido no anticuerpo puede tener un peso corporal de menos de 20 kDa, o menos de 1 5 kDa y generalmente se derivará (mediante, por ejemplo, alteración de la secuencia de aminoácidos) de una referencia, o "microandamio", proteína, tal como un microandamio Fn3. El polipéptido no anticuerpo puede unir VEGFR-2 con una KD menor a 1 0"6M, o menor a 1 0"7M, menor a 5x1 0"8M, menor a 10"8M o menor a 10"9M. La proteína de referencia no alterada ya sea no se unirá de modo significativo a VEGFR o se unirá con una K de más de 10"6M. El ' polipéptido no anticuerpo puede inhibir la señalización VEGF, particularmente en donde el polipéptido no anticuerpo tiene una KD de menos de 5x1 0"8M, menos de 1 0"8M o menos de 10"9M, a pesar de que los valores KD más altos pueden tolerarse en donde la K¡naot a es lo suficientemente baja (por ejemplo, menos de 5x1 0"4s"1). El pliegue tipo inmunoglobulina puede ser un polipéptido 10Fn3.
En ciertas modalidades, la descripción proporciona un polipéptido que comprende un dominio único que tiene un pliegue de inmunoglobulina que se une a VEGFR-2. El polipéptido puede tener un peso molecular de menos de 20 kDa, o menos de 15 kDa y generalmente se derivará (por ejemplo, mediante alteración de la secuencia de aminoácidos) de un dominio variable de una inmunoglobulina. El polipéptido puede unir VEGFR-2 con una K menor a 10"6M, o menor a 1 0"7M, menor a 5x1 0"8M, menor a 10"8M o menor a 1 0"9M. El polipéptido puede inhibir la señalización de VEGF, particularmente en donde el polipéptido tiene una K de menos de 5x1 0"8M, menor a 1 0"8M o menor a 1 0"9M , a pesar de que los valores KD más altos pueden tolerarse en donde la k¡nactiVa es lo suficientemente baja o en donde la kactiVa es lo suficientemente alta. En ciertas modalidades preferidas, un polipéptido de dominio único que tiene un pliegue de inmunoglobulina derivado de un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y capaz de unirse a VEGFR-2 puede comprender una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ I D NOs: 241 -31 0. En ciertas modalidades preferidas, la descripción proporciona polipéptidos de unión VEGFR-2 que comprenden la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 92-194. En el caso de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ I D NO: 1 94, una porción PEG u otra porción de interés, puede unirse covalentemente a la cisteína en la posición 93. La porción PEG puede también unirse covalentemente a una porción amina en el polipéptido. La porción amina puede, por ejemplo, ser una amina primaria encontrada en la terminal N de un polipéptido o un grupo amina presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En ciertas modalidades, la porción PEG se une a una posición en el polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) la terminal N; b) entre la terminal N y el filamento beta o filamento tipo beta de mayor terminal N, c) un ciclo colocado sobre un lado del polipéptido opuesto al sitio de unión objetivo; d) entre la terminal C y el filamento beta o filamento tipo beta de mayor terminal C; y e) en la terminal C. En ciertos aspectos, la descripción proporciona secuencias de péptido cortas que median la unión de VEGFR-2. Tales secuencias pueden mediar la unión de VEGFR-2 en una forma aislada o cuando se insertan en una estructura de proteína particular, tal como un dominio de inmunoglobulina o tipo inmunoglobulina. Los ejemplos de tales secuencias incluyen aquellas descritas como SEQ I D NOs: 1 -4 y otras secuencias que son al menos 85%, 90%, o 95% idénticas a las SEQ I D NOs: 1 -4 y retienen la actividad de unión de VEGFR-2. De acuerdo con lo anterior, la descripción proporciona polipéptidos sustancialmente puros que comprenden una secuencia de aminoácido que es al menos 85% idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ I D NOs: 1 -4, en donde dicho polipéptído se une a un VEGFR-2 y compite con una especie VEGF para unirse a VEGFR-2. Los ejemplos de tales polipéptidos incluyen un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80%, 85%, 90%o, 95%, o 1 00% idéntica a una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 6-183, 186-197, y 199. Preferentemente tal polipéptido inhibirá una actividad biológica de VEGF y puede unirse a VEGFR-2 con una K menor a 10"6M, o menor a 10"7M, menor a 5x1 0"8M, menor a 10"8M o menor a 10"9M. En ciertas modalidades, cualquiera de los polipéptidos de unión VEGFR-2 descritos en la presente pueden unirse a una o más porciones adicionales, incluyendo, por ejemplo, una porción que también se une a VEGFR-2 (por ejemplo, un segundo polipéptido de unión VEGFR-2 diferente o idéntico), una porción que se une a un objetivo diferente (por ejemplo, para crear un agente de unión de especificidad dual) , una porción de marcado, una porción que facilita la purificación de proteína o una porción que proporciona farmacocinética mejorada. La farmacocinética mejorada puede valorarse de acuerdo a la necesidad terapéutica percibida. Frecuentemente es deseable aumentar la biodisponibilidad y/o aumentar el tiempo entre dosis, posiblemente al aumentar el tiempo que una proteína permanece disponible en el suero después de dosificarse. En algunos casos, es deseable mejorar la continuidad de la concentración de suero de la proteína a través del tiempo (por ejemplo, reducir la diferencia en la concentración de suero de la proteína de manera corta después de la administración y de manera corta antes de la siguiente administración) . Las porciones que tienen a disminuir la evacuación de una proteína de la sangre incluyen polietilénglicol, azúcares (por ejemplo, ácido siálico), y las porciones de proteína bien toleradas (por ejemplo, fragmento Fe o albúmina de suero). El polipéptido de dominio único puede unirse a una porción que reduce la velocidad de evacuación del polipéptido en un mamífero (por ejemplo, ratón, rata o humano) por más de tres veces en relación al polipéptido no modificado. Otras mediciones de farmacocinética mejorada puede incluir vida media en suero, que se divide frecuentemente en una fase alfa y una fase beta. Cualquiera o ambas fases pueden mejorarse de manera significativa por adición de una porción adecuada. En donde se emplea polietilénglicol, una o más moléculas PEG pueden unirse a diferentes posiciones en la proteína, y tal unión puede lograrse por reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. La pegilación puede lograrse por pegilación dirigida por sitio, en donde un grupo reactivo adecuado se introduce en la proteína para crear un sitio en donde la pegilación preferentemente se presenta. En una modalidad preferida, la proteína se modifica a fin de tener un residuo de cisteína a una posición deseada, permitiendo la pegilación dirigida por sitio en la cisteína. PEG puede variar ampliamente en peso molecular y puede ser ramificado o lineal. Notablemente, la presente descripción establece que la pegilación es compatible con la actividad de unión objetivo de polipéptidos 10Fn3 y, además, esa pegilación no mejora la farmacocinética de tales polipéptidos. De acuerdo con lo anterior, en una modalidad, la descripción proporciona formas pegiladas de polipéptidos 10Fn3, sin considerar el objetivo que puede unirse por tales polipéptidos.
En ciertas modalidades, la descripción proporciona una formulación que comprende cualquiera de los polipéptidos de unión VEGFR-2 descritos en la presente. Una formulación puede ser una formulación terapéutica que comprende un polipéptido de unión VEGFR-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una formulación también puede ser una formulación de combinación, que comprende un agente activo adicional, tal como un agente anti-cáncer o un agente anti-angiogénico. En ciertos aspectos, la descripción proporciona métodos para utilizar una proteína de unión VEGFR-2 para inhibir una actividad biológica VEGF en una célula o para inhibir una actividad biológica mediada por VEGFR-2. La célula puede situarse in vivo o ex vivo, y puede ser, por ejemplo, una célula de un organismo viviente, una célula cultivada o una célula en una muestra de tejido. El método puede comprender contactar dicha célula con cualquiera de los polipéptidos inhibidores de VEGFR-2 descritos en la presente, en una cantidad y por un tiempo suficiente para inhibir tal actividad biológica. En ciertos aspectos, la descripción proporciona métodos para tratar un sujeto que tiene una condición que responde a la inhibición de VEGF o VEGFR-2. Tal método puede comprender administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de cualquiera de los polipéptidos inhibidores de VEGFR-2 descritos en la presente. Una condición puede ser una que se caracterice por la angiogenesis inadecuada. Una condición puede ser una condición hiperproliferativa. Los ejemplos de condiciones (o desórdenes) adecuadas para el tratamiento incluyen desórdenes autoinmunes, desórdenes inflamatorios, retinopatías (particularmente retinopatías proliferativas), y cánceres. Cualquiera de los polipéptidos inhibidores de VEGFR-2 descritos en la presente pueden utilizarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un desorden, particularmente un desorden seleccionado del grupo que consiste de: un desorden autoinmune, un desorden inflamatorio, una retinopatía, y un cáncer. En ciertos aspectos, la descripción proporciona métodos para detectar VEGFR-2 en una muestra. Un método puede comprende contactar la muestra con un polipéptido de unión de VEGFR-2 descrito en la presente, en donde dicho contacto se lleva a cabo bajo condiciones que permiten la formación de complejo VEGFR-2-polipéptido; y detectar dicho complejo, detectando de tal modo dicho VEGFR-2 en dicha muestra. La detección puede llevarse a cabo utilizando cualquier técnica conocida en la materia, tal como, por ejemplo, radiografía, ensayo inmunológico, detección de fluorescencia, espectroscopia de masa, o resonancia de plasmón de superficie. . La muestra frecuentemente será mediante una muestra biológica, tal como una biopsia, y particularmente una biopsia de un tumor, un tumor sospechoso o un tejido sospechoso de superar la angiogenesis no deseada. La muestra puede ser de un humano o de otro mamífero. El polipéptido de unión de VEGFR-2 puede marcarse con una porción de marcado, tal como una porción radioactiva, una porción fluorescente, una porción cromogénica, una porción quimioluminescente, o una porción hapteno. El polipéptido de unión VEGFR-2 puede inmovilizarse en un soporte sólido. Otro aspecto de la descripción se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en la presente. En ciertas modalidades, un ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de cualquiera de las SEQ I D NOs: 6-1 83, 1 86-1 97, 1 99 y 241 -528. En ciertas modalidades, un ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza en condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico de SEQ I D NO: 184 y codifica un polipéptido que se une a KDR humano con una KD de menos de 1 x1 0-6M. En las modalidades particulares, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 184 y SEQ I D NO: 1 85. Un aspecto adicional de la descripción se refiere a un vector de expresión que comprende un ácido nucleico unido operativamente con un promotor, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido descrito en la presente. Otro aspecto de la descripción se refiere a una célula que comprende un ácido nucleico descrito en la presente. También se proporciona un método para producir el polipéptido que une VEGFR-2, por ejemplo, KDR, comprendiendo: expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la descripción. En ciertas modalidades, el ácido nucleico puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de cualquiera de las SEQ I D NOs: 6-183, 1 86-197, 199 y 241 -528. En ciertas modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia que se hibridiza en condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico de SEQ I D NO: 184. En ciertas modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 84 y SEQ ID NO: 185. En ciertas modalidades, el ácido nucleico se expresa en una célula. Alternativamente, el ácido nucleico se expresa en un sistema libre de células. En ciertos aspectos, la descripción proporciona descubrimientos que pueden ser aplicables a cualquier polipéptido 1 0Fn3, sin considerar a cuál objetivo el polipéptido se elabora para unirse. Según se señala anteriormente, la descripción demuestra que PEG puede utilizarse exitosamente para mejorar la farmacocinética de un polipéptido 1 0Fn3, mientras que no interfiere de modo significativo con la unión objetivo. De acuerdo con lo anterior, la descripción proporciona polipéptidos 10Fn3 pegilados que se unen al objetivo y tienen farmacocinética mejorada en relación al polipéptido no pegilado. En una modalidad adicional, la descripción demuestra que una supresión de los primeros ocho aminoácidos de un polipéptido 10Fn3 puede aumentar la afinidad de unión de objetivo. De acuerdo con lo anterior, la descripción proporciona polipéptidos 10Fn3 que carecen de los ocho aminoácidos adicionales (aminoácidos numerados en referencia a la secuencia de SEQ I D NO:5). Se entiende que uno o dos aminoácidos pueden agregarse de regreso a la forma suprimida del polipéptido a fin de facilitar la traducción y procesamiento adecuado. La descripción demuestra que la administración subcutánea de un polipéptido 10Fn3 da como resultado la liberación retardada de polipéptido en la corriente sanguínea y una concentración de suero máxima reducida del polipéptido 10Fn3. De acuerdo con lo anterior, la descripción proporciona métodos para administrar un polipéptido 10Fn3 a un paciente mediante una administración subcutánea. Esta vía de administración puede ser útil para lograr una liberación retardada en relación a la administración intravenosa, y/o para reducir la concentración de suero máxima del polipéptido 1 0Fn3 por al menos 25% o al menos 50% en relación a la concentración de suero máxima lograda por administración intravenosa de una dosificación igual. El polipéptido 10Fn3 administrado puede unirse a una porción que aumenta la vida media de suero (o reduce la velocidad de evacuación, o afecta de igual forma otro parámetro farmacocinética) del polipéptido 10Fn3, tal como porción polietilénglicol. Preferentemente, el polipéptido 10Fn3 administrado comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 60%, 65%, 70% , 75%, 80% , 85%, 90% idéntica a SEQ ID NO:5. En ciertos aspectos, la descripción proporciona polipéptidos de dominio único que se unen a una proteína objetivo preseleccionada de un primer mamífero y a un homólogo del mismo de un segundo mamífero. Tales polipéptidos de dominio único son particularmente útiles en donde el primer mamífero es un humano y el segundo mamífero es un mamífero deseable en el cual conducir la prueba preclínica, tal como un ratón, ratón, conejillo de indias, perro, o primate no humano. La descripción demuestra que los polipéptidos de dominio único pueden elaborarse para tener tal especificidad dual, y que la especificidad dual simplifica el desarrollo del fármaco al permitir la prueba del mismo polipéptido en las células humanas, sujetos humanos y modelos de animal. Preferentemente, las proteína objetivo del primer mam ífero y el homólogo del mismo del segundo mamífero son lo suficientemente similares en la secuencia de aminoácido para permitir la generación de los polipéptidos de especificidad dual. Por ejemplo, la proteína objetivo preseleccionada y el homólogo del segundo mamífero puede compartir al menos 80%, 90%), o 95% de identidad a través de una región de al menos 50 aminoácidos, y opcionalmente puede compartir al menos 80%, 90%, o 95% de identidad a través de la secuencia de proteína completa o a través de la secuencia del dominio extracelular, en el caso de una proteína de membrana. Un polipéptido de dominio único con su tipo de característica de unión de especificidad dual puede comprender un domino de inmunoglobulina o tipo inmunoglobulina, y preferentemente se unirá tanto al objetivo humano preseleccionado como al homólogo del mismo con una constante de disociación de menos de 1 x1 0"6M, 1 x10"7M, 5x10-8M, 1 x10"8M o 1 x10"9M.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 A-1 D son gráficas e imágenes que muestran la caracterización de los clones únicos de unión de KDR de la Ronda 6 de la selección de KDR. La Figura 1 A es una gráfica que muestra la unión específica de proteínas de unión basadas en fibronectina a 25 nM de KDR-Fc analizada en ensayo de unión de equilibrio radioactivo. La Figura 1 B es una gráfica que muestra la inhibición de unión específica de KDR-Fc y proteínas de unión basadas en fibronectina seleccionadas en la presencia de 100 pliegues en exceso de VEGF-|65. Según se muestra en esta figura, ciertas proteínas de unión unieron KDR-Fc competitivamente con VEGF165 mientras que otras, ejemplificadas por el clon 8, no compitieron con VEGF165. La Figura 1 C es una gráfica que muestra la inhibición de interacción de KDR-Fc con VEGF165 inmovilizado en la presencia de proteínas de unión basadas en fibronectina seleccionadas analizadas en BIAcore. La Figura 1 D es una imagen que muestra la unión de VR28 a células de control y de expresión de KDR detectadas por inmunofluorescencia. La Figura 2 es una gráfica que muestra la configuración de selección para la maduración de afinidad del aglutinante VR28 KDR. Mostrada a la izquierda se encuentra la unión del clone VR28 a KDR-Fc y Flk1 -Fc (muy baja, barra no marcada). Mostrada en el centro se encuentra la unión de un grupo mutagenizado crudo y rondas ricas subsecuentemente en KDR-FC. Mostrada a la derecha se encuentra la unión de rondas ricas adicionales a Flk-1 -Fc. La unión se estimó en el ensayo de unión de equilibrio radioactivo como un porcentaje de salida, utilizando 1 nM de KDR-Fc o Flk1 -Fc. Las Figuras 3A y 3B son gráficas que muestran la caracterización de los clones únicos de unión de KDR de la Ronda 4 de la maduración de afinidad anti-KDR de aglutinante VR28. La Figura 3A muestra la unión de saturación de VR28 (-«-) y K1 maduro de afinidad (- A -), K6 (- T -) , K9 (- * -), K10 (-•-), K12 (-o-), K13 (-?-), K14 (-?-), K1 5 (-0-), a KDR-Fc en ensayo de unión de equilibrio radioactivo. La Figura 3b muestra la unión de clones con y sin la supresión de la terminal N a KDR-Fc. La supresión ? 7-8 en la terminal N de proteínas de unión basadas en fibronectina mejoró la unión mejorada a KDR-Fc. La Figura 4 es una gráfica que muestra la unión de los clones seleccionados a KDR y Flk-1 . La unión específica de VR28 y los clones seleccionados después de cuatro rondas de maduración de afinidad a KDR humano (clones K) y siete rondas de maduración de afinidad a humano (KDR) y ratón (flk-1 ) (clones E). Las quimeras VEGFR-2-Fc se compararon en ensayo de unión de equilibrio radioactivo. La información representa un promedio de 3 experimentos independientes. Según se muestra aquí, la maduración contra las proteínas de VEGFR-2 tanto de ratón como de humano produce los aglutinantes que se unen a ambas proteínas. Las Figuras 5A y 5B son gráficas que muestran la caracterización de clones únicos de unión de VEGFR-2 de la Ronda 7 de la maduración de afinidad de aglutinante VR28. La unión de saturación de clones VR28 (-*-) y E3 maduro de especificidad (- A -), E5 (- T -), E6 (- •* -), E9 (-•-), E 18 (-D-), E1 9 (-?-), E26 (-?-), E26 (-0-), E28 (-o), E29 (-x-) a KDR (Figura 5A) y Flk1 (Figura 5B)-Fc quimeras se probó en el ensayo de unión de equilibrio radioactivo.
Las Figuras 6A y 6B son gráficas que muestran la caracterización de la unión de VEGFR-2 mediante clones únicos de la Ronda 7 de maduración de afinidad del aglutinante VR28. La Figura 6A muestra la importancia de arginina en las posiciones 79 y 82 en aglutinantes con especificidad dual a VEGFR-2 humano y de ratón para la unión a VEGFR-2 de ratón (Flk1 ). Cuando cualquiera de estas posiciones se reemplazó por aminoácido diferente a R (X79=E, Q, W, P; X82=L, K), unión a Flk1 pero no a KDR significativamente se redujo. La Figura 6B muestra la importancia de todos los tres ciclos variables (BC, DE y FG) de proteínas de unión basadas en fibronectina KDR par ala unión al objetivo en estas proteínas. La sustitución de cada ciclo en un tiempo mediante secuencia NNS afectó la unión a KDR y Flk1 . La información de unión es un promedio de los clones E6 y E26. Las Figuras 7A y 7B son gráficas que muestran la unión de las proteínas de unión basadas en fibronectina seleccionadas a células CHO que expresan el receptor KDR humano (Figura 7A) y quimera EpoR-Flk1 (Figura 7B). Se probaron las proteínas de microandamio basadas en fibronectina E 18 (-«-) y E19 (- A -) , E26 (-T -), E29 (- * -), y WT (-D-) . La no unión a células de CHO de control se observó (dato son mostrados). Las Figuras 8A y 8B son gráficas que muestran la inhibición de proliferación inducida por VEGF de células Ba/F3-KDR (Figura 8A) y Ba/F3-Flk1 (Figura 8B), expresando KDR y Flk1 en la presencia de diferentes cantidades de proteínas de unión basadas en fibronectina: E 1 8 (-«-), E1 9 (- A -), E26 (- T -), E29 (- * -), M5 (-•-), WT (-a-) y anti-KDR o anti-flkl Ab (-?-). La información representa un promedio de 2 experimentos independientes. La Figura 9 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de proliferación HUVEC en la presencia de diferentes cantidades de proteínas de microandamio basadas en fibronectina: E18 (-«-), E 1 9 (- A -) , E26 (- T -), E29 (- -), M5 (-•-), WT (-p-). La información representa un promedio de 2 experimentos independientes. Según se muestra, las proteínas de unión KDR presentaron una reducción en la proliferación por aproximadamente 40%. La Figura 1 0 es un grupo de gráficas que muestran el repliegue reversible de M5FL en el regulador optimizado. La Figura 1 1 es una imagen que muestra el análisis SDS-PAGE de formas pegiladas de M5FL. M, marcadores de peso molecular [Sea Blue Plus, Invitrogen]; -, M5FL solo; 20, M5FL con 20 kD de PEG; 40, M5FL con 40 kD de PEG. La Figura 12 es una gráfica que muestra la inhibición de la proliferación inducida por VEGF de las células Ba/F3-KDR con diferentes cantidades de M5FL (- * -), M5FL PEG20 (-«-) y M5FL PEG40 (- A -), respectivamente. La pegilación tiene poco o nada de efecto en la actividad de M5FL en este ensayo. La Figura 1 3 muestra el análisis western de la señalización de VEGFR-2 en células endoteliales fosfo VEGFR-2 -Visualización de VEGFR-2 fosforilado. Control de carga de VEGFR-2 - Muestra. Fosfo ERK1 /2 - Visualización de ERK1 /2 fosforilado (MAPK). ERK1 -control de carga de muestra. Los resultados demostraron que 130 pM CT-01 bloquea la activación de VEGFR-2 y señalización por VEGF-A. La Figura 14 muestra que varias moléculas derivadas de 10Fn3 (por ejemplo, M5FL, F1 0, CT-01 ) pueden bloquear la señalización de VEGF-A y VEGF-D. La Figura 15 muestra una comparación de 125l nativo, CT-01 pegilado administrado i.v. & i. p. CT-01 es una proteína 12 kDa. Se evacúa rápidamente de la sangre. La adición de 40 kDa de PEG reduce su velocidad de evacuación y aumenta la AUC por 10 pliegues. La vida medida de 16 hr en ratas es equivalente a 2X dosificación por semana en humanos. Vía de administración: i. p. CT-01 -PEG40 tiene una AUC que es solamente 50% de una administración i.v. La Figura 16 muestra la distribución de tejido de 125l- CT01 PEG40 en ratas normales. La distribución de tejido de 125l-CT01 PEG40 indica la secreción principalmente por medio del hígado y secundariamente por medio del riñon. Esto se espera para la forma PEG de alto peso molecular. La acumulación a plazo no largo de CT-01 PEG40 se detecta. La Figura 17 es una vista esquemática del Ensayo Miles que mide la permeabilidad vascular. La Figura 18 muestra que CT-01 bloquea VEGF in vivo utilizando el Ensayo Miles. Los resultados indican que 5 mg/kg de CT01 -PEG40 bloquea el cambio de VEGF.
La Figura 1 9 muestra que CT-01 inhibe el crecimiento de tumor utilizando el Ensayo de Tumor de Melanoma Murino B16-F1 0. La Figura 20 muestra que CT-01 inhibe el crecimiento de tumor utilizando Glioblastoma Humano U87. Las Figuras 21 A y 21 B muestran las secuencias de polipéptidos de unión VEGFR que se basan en una estructura/microandamio) de cadena ligera de anticuerpo (SEQ ID NOs: 241 -31 0). La Figura 22 muestra la organización estructural para un polipéptido de dominio único que tiene un pliegue de inmunoglobulina (un dominio VH de una inmunoglobulina, lado izquierdo) y un polipéptido de dominio único que tiene un pliegue tipo inmunoglobulina (un dominio 10Fn3, lado derecho).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Vista General Esta especificación describe, entre otras cosas, la identificación y producción de nuevos polipéptidos de domino único que se unen a los receptores VEGFR-2. VEGFR-2, también llamado KDR en humanos y Flk-1 en ratones, es el mediador primario para los efectos pro-angiogénicos de la señalización de VEGF. VEGFR-2 se une y se activa por VEGF-A, VEGF-C y VEGF-D. En las células endoteliales, la activación de VEGFR-2 estimula la proliferación celular y migración, y in vivo, la activación VEGFR-2 dispara la angiogenesis y aumenta la permeabilidad de la vasculatura. La angiogenesis aumentada se establece bien como una característica importante de crecimiento tumoral y varias retinopatías, mientras que la permeabilidad aumentada de la vasculatura es un caso importante en varias respuestas inflamatorias. La presente descripción proporciona cientos de polipéptidos de dominio único que se unen a VEGFR-2, varios de los cuales se muestran en actividad de combatiente de VEGF in Vitro y/o in vivo. Los polipéptidos de dominio único que tienen actividad de combatiente de VEGF serán útiles en numerosas aplicaciones terapéuticas. Los anticuerpos anti-KDR se han establecido como que tienen utilidad in vivo contra las enfermedades y condiciones que varían de cánceres y complicaciones dándose como resultado de cánceres para retinopatías proliferativas, desórdenes inflamatorios y fibrosis. En base a los datos presentados aquí in vivo y in Vitro, se espera que los polipéptidos de dominio único serán útiles en el tratamiento del mismo espectro de desórdenes. Además de las aplicaciones terapéuticas, los polipéptidos de dominio único de unión VEGFR-2 pueden utilizarse en cualquier circunstancia en donde sea deseable detectar VEGFR-2. Por ejemplo, varias células germinales expresan VEGFR-2, incluyendo las células particularmente útiles de linajes hematopoyéticos. Los polipéptidos de unión KDR pueden utilizarse, particularmente en un formato marcado, para detectar células germinales y facilitar el sorteo celular. Los polipéptidos de unión VEGFR-2 marcados, in vivo, pueden utilizarse para representar por imágenes los tejidos en los cuales se expresa VEGFR-2. La expresión de VEGFR-2 elevado puede ser característica de tejidos que experimentan niveles particularmente altos de actividad angiogénica o inflamatoria. Los análisis histológicos de muestras de tejido también pueden ser benéficos de la detección de VEGFR-2. Por ejemplo, puede ser deseable detectar la expresión de VEGFR-2 en una biopsia tumoral a fin de valorar la probable efectividad de una terapia anti-VEGFR-2 o anti-VEGF. De manera interesante, varias de las proteínas de unión VEGFR-2 descritas en la presente se unen a VEGFR-2 con constantes de disociación nanomolar y todavía fallan en tener un efecto importante en casos biológicos mediados por VEGFR-2. De acuerdo con lo anterior, tales proteínas de unión pueden ser útiles para las técnicas de visualización in vivo o técnicas de marcado de célula, en donde frecuentemente será deseable marcar selectivamente las células que expresan un VEGFR-2 sin originar una perturbación importante de eventos mediados por VEGFR-2. La descripción describe el uso de una tecnología de despliegue in Vitro, denominada PROfusion™, que explota las fusiones de proteína-ácido nucleico (fusiones de proteína ARN-y ADN-) para identificar nuevos polipéptidos de dominio único y motivos de aminoácido que son importantes para unirse a VEGFR-2. La tecnología de fusión de proteína-ácido nucleico es una tecnología de despliegue que covalentemente acopla una proteína a su formación genética codificadora. La tecnología PROfusion™ se utilizó para seleccionar colecciones de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de dominio único construidos utilizando un microandamio basado en el dominio tipo tres de fibronectina humana (10Fn3) o construido de los dominios variables de cadenas ligeras de anticuerpo. Los polipéptidos expresados, denominados una "biblioteca" de proteínas de microandamio, se seleccionaron para polipéptidos que podrían unir VEGFR-2 con alta afinidad. Aislamos de esta biblioteca de proteínas de microandamio nuevos polipéptidos de dominio único que se unen a VEGFR-2 y que, en algunos casos, inhiben las actividades biológicas de VEGF. Además, se descubrió que varios ciclos independientemente aleatorios situados en microandamios de inmunoglobulina o tipo inmunoglobulina tendieron a converger a un grupo relacionado de secuencias de consenso que participaron en la unión de VEGFR-2. Por lo tanto, se espera que los polipéptidos que tienen estas secuencias de consenso serán útiles como aglutinantes VEGFR-2 aún cuando se separen del contexto de proteína en los cuales se identificaron. Véase, por ejemplo, SEQ ID NOs. 1 -4. Tales polipéptidos pueden utilizarse como independientes, los aglutinantes de VEGFR-2 de péptido pequeño o pueden situarse en otras proteínas, particularmente proteínas que comparten un pliegue de inmunoglobulina o tipo inmunoglobulina. Según se discute anteriormente, la presente descripción demuestra que los polipéptidos de dominio único que tienen ciertas propiedades deseables, tales como unión de alta afinidad a VEGFR-2, efectos antagonistas con respecto a uno o más de VEGF-A, C- o -D y farmacocinética mejorada, pueden utilizarse como agentes anti-cáncer eficaces. Mientras que se espera que la efectividad de tales polipéptidos como agentes anti-cáncer se relacione al papel de angiogénesis en cáncer, no deseamos someternos a ningún mecanismo en particular. Formalmente es posible que los presentes polipéptidos de dominio único sean eficaces contra los cánceres por razones no relacionadas a los procesos angiogénicos. A nuestro entendimiento, la presente descripción representa el primer esfuerzo exitoso para utilizar un polipéptido basado en Fn3 para lograr un efecto terapéutico in vivo. Varias de las mejoras y descubrimientos hechos en el logro de efectividad in vivo serán ampliamente aplicables a otros polipéptidos basaos en Fn3. En otras palabras, a pesar de que las propiedades de unión de ligante de un polipéptido basado en Fn3 generalmente se determinarán por un número relativamente pequeño de aminoácidos situados en regiones de ciclo accesible solvente, otras características, tales como características farmacocinéticas, de polipéptidos basados en Fn3 tenderán a determinarse por la mayoría de la proteína que no se incluye directamente en la unión de ligante y que se conserva de proteína a proteína sin considerar la proteína objetivo. Este ha sido el caso con los anticuerpos, en donde unos pocos ciclos, llamados regiones CDR, median la unión de antígeno, mientras que otras características del comportamiento de anticuerpos in vivo se dictan mayormente por las regiones de estructura conservada y dominios constantes. Por "inhibir" se entiende una reducción medible en un fenómeno, frecuentemente utilizada en referencia a cualquiera de los siguientes: la interacción de VEGF con un VEGFR, angiogenesis mediada por VEGF o VEGFR, angiogenesis, síntomas de angiogenesis, la viabilidad de células que contienen VEGFR, la viabilidad de células Ba/F3 dependientes de VEGF, o proliferación celular mediada por VEGF o VEGFR según se compara a una muestra de control no tratada con el polipéptido. Un polipéptido inhibirá una actividad mediada por VEGFR-2 o VEGF si la reducción en la actividad o interacción es al menos 1 0%, preferentemente 20%, 30%, 40% o 50%, y más preferentemente 60%, 70%, 80%, 90% o más. Por "actividad biológica de VEGF" se entiende cualquier función de cualquier miembro de familia VEGF que actúa a través de cualquier receptor VEGF, pero particularmente señalándose a través de un receptor VEGFR-2. La familia VEGF incluye VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, y factor de crecimiento placental (PIGF), así como también varias formas alternativamente divididas de VEGF incluyendo VEGF121 , VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206 (Tischer er al. , J. Biol. Chem, 266: 1 1 947-1 1 954, 1 991 ). La familia VEGFR de receptores de quinasa de tirosina incluye VEGFR-1 (también conocida como Flt-1 ), VEGFR-2 (también conocida como KDR (forma humana) o Flk-1 (forma de ratón)), y VEGFR-3 (también conocida como Flt-4). Los ligantes de VEGF se unen a los receptores VEGF para inducir, por ejemplo, angiogenesis, vasculogenesis, proliferación de célula endotelial, vasodilatación, y migración celular. Los ligantes VEGF también pueden inhibir la apoptosis a través de la unión a sus receptores cognados. Se cree que VEGFR-2 es el VEGFR más incluido en angiogenesis. La actividad biológica mediada por un KDR o VEGFR-2 es cualquier función biológica en la cual VEGFR-2 o KDR participa de manera importante, de tal forma que el antagonismo de VEGFR-2 o KDR origina una reducción medible en la actividad biológica. La actividad biológica de VEGF y VEGFR puede medirse por ensayos estándar conocidos en la materia. Los ejemplos incluyen ensayos de unión de ligante y análisis de trazos Scatchard; ensayos de dimerización de receptor; ensayos de fosforilación celular; ensayos de fosforilación de quinasa de tirosina (véase por ejemplo Meyer eí al. , Ann. N.Y. Acad. Sci. 995:200-207, 2003); ensayos de proliferación de célula endotelial tales como experimentos de conteo celular y marcado BrdU; ensayos de proliferación celular dependiente de VEGF; y ensayos de angiogénesis. Los métodos para medir la angiogenesis son estándares, y se describen, por ejemplo, en Jain eí al. , (Nat. Rev. Cáncer 2:266-276, 2002). La angiogenesis puede ensayarse al medir el número de segmentos de vaso sanguíneo no ramificados (número de segmentos por área de unidad), la densidad vascular funcional (longitud total de vaso sanguíneo prefusionado por área de unidad), el diámetro de vaso, la formación de canales vasculares, o la densidad de volumen de vaso (total de volumen de vaso sanguíneo calculado en base a la longitud y diámetro de cada segmento por área de unidad). Los ensayos ejemplares para la proliferación mediada por VEGF y angiogenesis pueden encontrarse en U.S. P. N 6,559, 126, Lyden eí al. , Nature Medicine 7: 1 1 94 (2001 ), Jacob eí al. , Exp. Pathol. 15: 1234 (1 978) y Bae eí al. , J. Biol. Chem. 275: 1 3588 (2000). Estos ensayos pueden realizarse utilizando ya sea receptor o ligante purificado o ambos, y pueden realizarse in Vitro o in vivo. Estos ensayos pueden también realizarse en células que utilizan un ligante o receptor genéticamente introducido o que se presenta naturalmente o ambos. Un polipéptido que inhibe la actividad biológica de VEGF originará una reducción de al menos 10%>, preferentemente 20%, 30%, 40%, o 50% y más preferentemente 60%, 70%, 80%>, 90%o o mayor reducción en la actividad biológica de VEGF. La inhibición de la actividad biológica puede también medirse por el IC50. Preferentemente, un polipéptido que inhibe la actividad biológica de VEGF o VEGFR-2 tendrá un IC50 de menos de 100 nM, más preferentemente menos de 1 0 nM y más preferentemente menos de 1 nM. 2. Polipéptidos La metodología descrita en la presente se ha utilizado exitosamente para desarrollar polipéptidos de unión VEGFR-2 de dominio único derivados de dos grupos relacionados de estructuras de proteína: aquellas proteínas que tienen un pliegue de inmunoglobulina y aquellas proteínas que tienen un pliegue tipo inmunoglobulina. Por un "polipéptido" se entiende cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, sin considerar la longitud, modificación de posttraducción, o función. "Polipéptido", "péptido", y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales tales como aquellos descritos en U .S. P. N . 6,559, 126, incorporada en la presente para referencia. Los polipéptidos también pueden modificarse en cualquiera de una variedad de maneras químicas estándares (por ejemplo, un aminoácido puede modificarse con un grupo protector; el aminoácido de terminal carboxi puede elaborarse en un grupo amida terminal; el residuo de terminal amino puede modificarse con grupos para, por ejemplo, mejorar la lipofilicidad, o el polipéptido puede glicosilarse químicamente o de otra forma modificarse para aumentar la estabilidad o vida media in vivo) . Las modificaciones de polipéptido pueden incluir la unión de otra estructura tal como un compuesto cíclico u otra molécula para el polipéptido y también pueden incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o L o D). El término "polipéptido de dominio único" se utiliza para indicar que la actividad de unión objetivo (por ejemplo, actividad de unión VEGFR-2) del polipéptido objeto se sitúa dentro de un dominio estructural único, como forma diferenciada, por ejemplo, anticuerpos y anticuerpos de cadena única, en donde la actividad de unión de antígeno se contribuye generalmente tanto por un dominio variable de cadena pesada como un dominio variable de cadena ligera. Se contempla que una pluralidad de polipéptidos de dominio único de la clase descrita en la presente podría conectarse para crear una molécula compuesta con actividad aumentada. De igual forma, un polipéptido de dominio único puede unirse (por ejemplo, como una proteína de fusión) a cualquier número de otros polipéptidos, tales como polipéptidos fluorescentes, polipéptidos de objetivo y polipéptidos que tienen un efecto terapéutico distinto. Los polipéptidos de dominio único de microandamio ya sea de inmunoglobulina o tipo inmunoglobulina tenderán a compartir ciertas características estructurales. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender entre aproximadamente 80 y aproximadamente 150 aminoácidos, cuyos aminoácidos se organizan estructuralmente en un grupo de filamentos beta o tipo beta, formando placas beta, en donde los filamentos beta o tipo beta se conectan al intervenir partes de ciclo. Los ejemplos de la organización estructural para el dominio variable de cadena pesada y el domino 10Fn3 se muestran en la Figura 22. Las placas beta forman el núcleo estable de los polipéptidos de dominio único, mientras que se crean dos "lados" compuestos de los ciclos que conectan los filamentos beta o tipo beta. Según se describe en la presente, estos ciclos pueden variarse para crear sitios de unión de ligante normalizados, y, con control adecuado, tales variaciones pueden generarse sin romper la estabilidad global de la proteína. En los anticuerpos, tres de estos ciclos son las Regiones de Determinación de Complementariedad bien conocidas (o "CDRs"). Los microandamios para la formación de polipéptidos de dominio único deberán ser altamente solubles y estables en condiciones fisiológicas. Los ejemplos de microandamios de inmunoglobulina son el microandamio VH o VL de dominio único, así como también un dominio VHH de camelid de dominio único (una forma de dominio pesado variable encontrado en camelids) u otros dominios variables de inmunoglobulina encontrados en naturaleza o elaborados en el laboratorio. En el formato de dominio único descrito en la presente, un polipéptido de inmunoglobulina necesariamente no forma un dímero con un segundo polipéptido a fin de lograr la actividad de unión. De acuerdo con lo anterior, cualquiera de tales polipéptidos que contienen naturalmente una cisteína que media la degradación de disulfuro a una segunda proteína puede alterarse para eliminar la cisteína. Alternativamente, la cisteína puede retenerse para utilizarse en la conjugación de porciones adicionales, tales como PEG, al polipéptido de dominio único. Otros microandamios pueden ser proteínas de microandamio de no anticuerpo. Por "dominio o proteína de microandamio de no anticuerpo" se entiende un polipéptido de no anticuerpo que tiene una pliegue tipo inmunoglobulina. Por "pliegue tipo inmunoglobulina" se entiende un dominio de proteína de entre aproximadamente 80-1 50 residuos de aminoácidos que incluye dos capas de placas beta antiparalelas, y en los cuales, los lados hidrofóbicos planos de las dos placas beta se envasan entre sí. Un ejemplo de tal microandamio es la "proteína de microandamio basada en fibronectina", mediante lo cual se entiende un polipéptido basado en un dominio tipo l l l de fibronectina (Fn3). Fibronectina es una proteína grande que juega papeles esenciales en la formación de aglomerante extracelular e interacciones de célula-célula; consiste de varias repeticiones de tres tipos (tipos I , I I , y l l l) de pequeños dominios (Barón eí al. , 1991 ). Fn3 por sí misma es el paradigma de una gran subfamilia que incluye partes de moléculas de adhesión celular, hormona de superficie celular y receptores de citoquina, chaperona, y dominios de unión de carbohidratos. Para revisiones véase Bork & Doolittle, Proc Nati Acad Sci USA 1992 Oct 1 ; 89(1 9):8990-4; Bork eí al. , J Mol Biol. 1 994 Sep 30; 242(4):309-20; Campbell & Spitzfaden, Structure. 1 994 Mayo 15; 2(5):333-7; Harpez & Chothia, J Mol Biol. 1994 Mayo 13; 238(4):528-39) . Preferentemente, la proteína de microandamio basada en fibronectina es un microandamio "10Fn3", mediante el cual se entiende una variante de polipéptido en el décimo módulo de la proteína tipo l l l de fibronectina humana en la cual uno o más de los ciclos accesibles solventes se ha seleccionado al azar o mutado, particularmente uno o más de los tres ciclos identificados como el ciclo BC (aminoácidos 23-30), ciclo DE (aminoácidos 52-56) y ciclo FG (aminoácidos 77-87) (el esquema de numeración se basa en la secuencia en el dominio Tipo l l l décimo de fibronectina humana, con los aminoácidos Val-Ser-As-Val-Pro representando los aminoácidos números 1 -5). La secuencia de aminoácido del módulo décimo tipo silvestre del dominio tipo l l l de fibronectina humana es: VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISI NYRT (SEQ ID NO: 5). De esta manera, el ciclo BC tipo silvestre comprende la secuencia de DAPAVTR; el ciclo DE tipo silvestre comprende la secuencia de GSKST; el ciclo FG tipo silvestre comprende la secuencia de GRDSPASSKP. Las secuencias que flanquean los ciclos BC, DE y FG también se denominan estructuras 1 , 2, 3 y 4, por ejemplo, en las Tablas 1 -3. Una variedad de microandamios 10Fn3 mutantes mejorados se han identificado. Un Asp7 modificado, que se reemplaza por un residuo de aminoácido no negativamente cargado (por ejemplo, Asn, Lys, etc.). Ambas de estas mutaciones tienen el efecto de promotor mayor estabilidad del 10Fn3 mutante en pH neutral según se compara a la forma tipo silvestre. Una variedad de alteraciones adicionales en el microandamio 10Fn3 que son ya sea benéficos o neutrales, se han descrito. Véase, por ejemplo, Batori eí al. , Protein Eng . 2002 Dic; 15(12): 1 015-20; Koide eí al. , Biochemistry 2001 Ago 28; 40(34): 10326-33. Adicionalmente, varias nuevas modificaciones al microandamio 10Fn3 se describen aquí. De importancia particular, se descubrió que una supresión de los primero 8 aminoácidos de 10Fn3 humano tipo silvestre condujo a la unión VEGFR-2 rigurosamente tres veces mejorada. Debido a que los primeros 8 aminoácidos tienden a plegarse en una posición que se encuentra cercana a los ciclos BC, DE y FG, se espera que esta mutación también mejorará la unión objetivo en otros microandamios 10Fn3 seleccionados para la unión a diferentes objetivos. De acuerdo con lo anterior, uno puede construir una biblioteca de ácidos nucleico que codifican el microandamio 10Fn3 que carece de los primeros 8 aminoácidos y conduce a la selección en esta biblioteca mejorada. Tanto las proteínas 10Fn3 tipo silvestre como variantes se caracterizan por la misma estructura, principalmente siete secuencias de dominio de filamento beta (designado A a través de y seis regiones de ciclo (ciclo AB, ciclo BC, ciclo CD, ciclo DE, ciclo EF, y ciclo FG) que conectan las siete secuencias de dominio de filamento beta. Los filamentos beta colocados más cerca de las terminales N y C pueden adoptar una formación tipo beta en solución. En SEQ I D NO:5, el ciclo AB corresponde a los residuos 1 5-16, el ciclo BC corresponde a residuos 22-30; el ciclo CD corresponde a residuos 39-45, el ciclo DE corresponde a residuos 51 -55, el ciclo EF corresponde a residuos 60-66, y el ciclo FG corresponde a residuos 76-87. Según se muestra en la Fig. 22, el ciclo BC, ciclo DE, y ciclo FG todos se ubican en el mismo extremo del polipéptido. De igual forma, los microandamios de inmunoglobulina tienden a tener al menos siete filamentos beta o tipo beta, y frecuentemente nueve filamentos beta o tipo beta. Un polipéptido de domino único descrito en la presente puede tener al menos cinco a siete filamentos beta o tipo beta distribuidos entre al menos dos placas beta, y al menos una parte de ciclo que conecta dos filamentos beta o tipo beta, cuya parte de ciclo participa en la unión a VEGFR-2, particularmente KDR, con la unión caracterizada por una constante de disociación que es menor a 1 x10" 6M, y preferentemente menor a 1 x1 0"8M. Según se describe en la presente, los polipéptidos que tienen una constante de disociación de menos de 5x1 0"9M son particularmente deseables para uso terapéutico in vivo para inhibir la señalización VEGF. Los polipéptidos que tienen una constante de disociación de entre 1 x1 0"6M y 5x1 0"9M pueden ser deseables para utilizarse en la detección o marcado, ex vivo o in vivo, proteínas VEGFR-2. Opcionalmente, la proteína de unión VEGFR-2 se unirá específicamente a VEGFR-2 en relación a otras proteínas relacionadas de la misma especie. Por "unirse específicamente" se entiende un polipéptido que reconoce e interactúa con una proteína objetivo (por ejemplo, VEGFR-2) pero que sustancialmente no reconoce e interactúa con otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica. En las modalidades preferidas, un polipéptido de la invención se unirá específicamente a VEGFR-2 con una KD al menos tan estrecho como 500 nM. Preferentemente, el polipéptido unirá específicamente un VEGFR con una KD de 1 pM a 500 nM, más preferentemente 1 pM a 1 00 nM, más preferentemente 1 pM a 1 0 nM, y más preferentemente 1 pM a 1 nM o menos. En general, una biblioteca de polipéptidos de dominio único de microandamio se selecciona para identificar las variantes de polipéptido específicas que pueden unirse a un objetivo seleccionado. Estas bibliotecas, por ejemplo, pueden ser bibliotecas de despliegue de fago o bibliotecas PROfusion™. En una modalidad ejemplar, hemos explotado una nueva tecnolog ía de despliegue de fusión de proteína de ARN in vivo para aislar los polipéptidos que se unen tanto a VEGFR-2 de ratón (Flk-1 ) como humano (KDR) e inhiben las actividades biológicas dependientes de VEGF. Estos polipéptidos se identificaron de las bibliotecas de proteínas de microandamio basadas en fibronectina (Koide eí al. JMB 284: 1 141 (1 998)) y las bibliotecas de los dominios VL en los cuales la diversidad de CDR3 se ha aumentado al cambiar con los dominios CDR3 de una población de las moléculas VH. 10Fn3 comprende aproximadamente 94 residuos de aminoácido, según se muestra en SEQ ID NO:5. Además, según se describe anteriormente, las secuencias de aminoácido en la terminal N de 10Fn3 también pueden mutarse o suprimirse. Por ejemplo, lo aleatorio de los ciclos BC, DE y FG puede presentarse en el contexto de un 1 0Fn3 de longitud completa o en el contexto de una 10Fn3 que tiene una supresión o mutación de 1 -8 aminoácidos de la terminal N. Por ejemplo, la posición L en la posición 8 puede mutarse a una Q. Después de lo aleatorio para crear una biblioteca diversa, las proteínas de microandamio basadas en fibronectina pueden utilizarse en un ensayo de selección para seleccionar los polipéptidos con una alta afinidad para una proteína, en este caso VEGFR. (Para una descripción detallada de la tecnología de fusión de proteína de ARN y métodos de selección de la biblioteca de proteína de microandamio basada en fibronectina véase Szostak eí al. Patentes de EE. UU. Nos. 6,258,558; 6,261 ,804; 6,214,553; 6,281 ,344; 6,207,446; 6, 51 8,01 8; Publicación PCT Números WO 00/34784; WO 01 /64942; WO 02/032925; y Roberts and Szostak, Proc Nati. Acad. Sci. 94: 1 2297-12302, 1 997, incorporadas en la presente para referencia).
Para la selección inicial descrita en la presente, tres regiones de 1 0Fn3 en las posiciones 23-29, 52-55 y 77-86 se seleccionaron al azar y se utilizaron para la selección in Vitro contra el dominio extracelular de VEGFR-2 humano (aminoácidos 1 -764 de KDR fusionada a IgG I Fc humana). Utilizando el despliegue de mARN (fusión de proteína de ARN) y la selección in Vitro, mostramos una biblioteca basada en 10Fn3 con aproximadamente tres trillones de variantes. La selección inicial identificó los polipéptidos con afinidad moderada (KD=10-200 nM) que compitió con VEGF para la unión a KDR (VEGFR-2 humano). Por consecuencia, un clon único (KD= 1 -1 3 nM) de la selección inicial se sometió a mutagénesis y selección adicional. Este proceso de maduración de afinidad produjo nuevos polipéptidos de unión de VEGFR con constantes de disociación entre 60 pM a 2 nM. Los aglutinantes KDR se muestran en la Tabla 3. Además, también aislamos los polipéptidos que podrían unirse a Flk-1 , el homólogo de KDR de ratón, de las poblaciones mutagenizadas de los aglutinantes KDR que inicialmente no tuvieron afinidad de unión detectable para Flk-1 , dando como resultado el aislamiento de los polipéptidos que muestran especificidades duales para VEGFR-2 tanto humano como de ratón. Estos polipéptidos se muestran para unir las células que despliegan dominios extracelulares Flk-1 o KDR. Estos también inhibieron el crecimiento celular en un ensayo de proliferación dependiente de VEGF. Los polipéptidos que se unen a KDR y Flk-1 se muestran en la Tabla 2, mientras que una selección de aglutinantes KDR preferidos y aglutinantes KDR/Flk-1 se muestran en la Tabla 1 . Utilizando los polipéptidos de unión de VEGFR-2 identificados en estas selecciones se determinaron las secuencias de consenso de aminoácido de ciclo FG requeridas para la unión de los polipéptidos a la VEGFR-2. Las secuencias se enlistan como SEQ ID NOs: 1 -4 de abajo. Los polipéptidos de unión de VEGFR-2, tales como aquellos de SEQ ID NOs: 1 -4, pueden formularse solos (como péptidos aislados), como parte de un polipéptido de dominio único 10Fn3, comparte de una fibronectina de longitud completa (con una terminal amino de longitud completa o una terminal amino suprimida) o un fragmento de la misma, en el contexto de una inmunoglobulina (particularmente una inmunoglobulina de dominio único), en el contexto de otra proteína que tiene un pliegue tipo inmunoglobuilina, o en el contexto de otra, proteína no relacionada. Los polipéptidos pueden también formularse como parte de una proteína de fusión con una proteína heteróloga que no se une por sí misma a o contribuye en la unión a una VEGFR. Además, los polipéptidos de la invención también pueden fusionarse a ácidos nucleicos. Los polipéptidos también pueden elaborarse como monómeros, dímeros, o multímeros. Las secuencias de los Péptidos de Unión VEGFR-2 Consenso Preferidos: SEQ I D NO: 1 - (L/M)GXN(G/D)(H/R)EL(L/M)TP [X puede ser cualquier aminoácido; (/) representa el aminoácido alternativo para la misma posición] SEQ I D NO:2 - XERNGRXL(L/M/N)TP [X puede ser cualquier aminoácido; (/) representa el aminoácido alternativo para la misma posición] SEQ ID NO:3 - (D/E)GXNXRXXIP [X puede ser cualquier aminoácido; (/) representa el aminoácido alternativo para la misma posición] SEQ I D NO:4 - (D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)I P [X puede ser cualquier aminoácido; (/) representa el aminoácido alternativo para la misma posición] Secuencias de los Polipéptidos 10Fn3 de Unión VEGFR-2 Preferidos: SEQ I D NO:6 EVVAATPTSUJSWRHPHFPTRY?SrryGETGGNSPVQEFI^ PGVOYlirGYAVTMG YeHBIXTOIS?tlY T SEQ I D NO:7 EWAAi iIIS RHFHFFTTt^^ H?VDY??GGYAVTOGINGQHLLVPISINYET SEQ I D NO:8 SEQ ID NO:9 EVVAAWTS ^ IOffiHHrTOYYE^ PGVDyiTJOyAVTAGW DHEtHPISINYRT SEQ ID NO:10 EV?AA PXSI^IS ÍIHPHFFGRYYR??GETGGNSPVQEFI?P QPPTATÍS P VD TITGYAVTSGHQ^H I?OTJSIEYS.T SEQ ID NO:11 EVVAATFTSI ^ lUíPHF YYim?GErGGNSPVQBFrWI^P rATB^ PGVDYT??YAWAGYNDQ?MTPISINYRT SEQ ID NO:12 EVVAATPTSIXIS RHPHFI^^ PGVDY?TGYAVTFGLYGKBLLIPISINY T SEQ ID NO:13 EW TFTSI ISWi PHFPmYYRIT ffiT^ PGVTYTp,GYAVTTGPí®MXFVPISp T SEQ ID NO:14 PGVDYipGYAVTDVYNDHEIKIPISINY T SEQ ID NO:15 EWAATTTSLUS MffHE YYH??YGCTGGNSPV EFr QI^ PGVDY?TGYAVTOGKDGltVIJTPISlNY T SEQ ID NO:16 PGVDY?GGYAVTEVH DRBIKWÍSINYRT SEQ ID NO:17 EVVAAT?l^LLlSWRHPHFp YYiOT?GBTGGNSPVQEFrW'I^P TA GL PGV YIlTGYAVTQAKFJeVLYTPISINYRT SEQ ID NO:18 PGVDY?TGYAVTREBN HBL ?P?SM?ÍIT SEQ ID NO:19 PGVDY?TGYAVT^TBNíaiPIMrPISINY T SEQ ID NO:20 EVVAAIPTSI lS^riuHPHP YYEp?GBTGGNSPV E SEQ ID NO:21 VSDV miEWAh ISU WBMi YYMíYÚEffi TA?SG CPGVDYTGGGYAVIVAOM?HILIGPISINYRT SEQ ID NO:22 VSDWRDI^EVVAA FGS?IJSWRHPHFPT YYRIGYGETGGNSPVQE GW PPAATSGUPGVDYTGGGYAVTMAQSGHEL GPISIN?LT SEQ ID NO:24 E A?TTCSL ISWi PHFFraY^ PGVDY?TGYAVWEÍÍ?ÍGRVIJS GPIS SEQ ID NO:25 PGVDYpiGYAVTVERNGíOilMíPIglKY T SEQ ID NO:33 BVVAATPT$IXlS RHPHEP YYRp?GBTGGNSPVQSTVPi ¿P P^ DYTITOYAVTlJB NGÍtEU^rPISINY T SEQ ID NO:45 E AA?^IIJSWRHPHFPTRY?IUT^ PG\FY?TGYAVIBE3?NGRTLR*IPIS] YRT SEQ ID NO:53 HVVAATPTSiiis iUiPH KYY^ I^V Y?IG AVTV??^?RVI rPISINYRT SEQ ID NO:57 PGVDY ?-GYAVGVERNGRE IPJSINY T SEQ ID NO:62 EVVAATFTSÍlJSWRiíPHFPIRYYRjrrYG 'GGNSPV E^^ PGYDYTp,GYAVILERNG EIAíVPISíN¥ T SEQ ID NO:63 E AA??SIIJS RHPBFPTRYYR^ PGV©YTrTGYAVTIX3Rf^RKU»tWISiNYRT SEQ ID NO:68 EVVAATP?SU^S^rKíiPHEPTRYYiarrGErG^ PGVT?YIIGGYAVIDGQNGMI ÍWISINYRT SEQ ID NO:91 EWAATPTSU S ?ümPHEP YYRIWGET KK?»FYTrfGYAVT%?HWHGRELMTPSINYRT SEQ ID NO:92 EWAATPTSIJ^WIUÍPÍßfFpiYYiü YGETGGlíSPV PGVDYTGGGYAVTEE NG VL GPISINYRT SEQ ID NO:93 EW l?TSlAB WiPHFíraYYRI^^ ?GVDYT 3YAVTV GHTLMIPIS?NYRT SEQ ID NO:94 EWAATPKI JS RHPHEPmYYRp fGETíK^ PGVDYTJTGYAVTVEENGR LMTPISINYRT SEQ ID NO:95 EWAATPTSIilS RHPHF??i^^^ TOVDYTETGYAVT ERNGQVIÍTPISttiYRT SEQ ID NO:96 PGVDYpiGYAVTVBKNGQVL?TPISlNYR.T SEQ ID NO:97 E A SL ?SWímPHFPra iOTYGEFG^^ PJVDYTITGYAVI^GYKDHEILIJPISINYRT SEQ ID NO:98 EWAAT i^ ^HFBraYYRIIYGErG NSPVQE^^ PGVDYTlTí3YAVTLGRNDIÜlLtWISlNYRT SEQ ID NO:99 EVVAATPTSI rS RHPOTPTRYYBpYGETG®SPVQ VDYTITGYAVllXiPNDRlL ÍIPKINYItT SEQ ID NO:100 EVVAAlFES IJSWRKPÍffFmYYRrrYGETGG^PVQEFr^ PGVDY?TOYAVTGARDGHEILTPISINYRT SEQ ID NO:101 rcVDY?TGYAVTLEQNGRELMWISIN?RT SEQ ID NO:102 PGVDYmGYAVTVEENGRVLNTPISI YRT SEQ ID NO:103 EVVAAT rSL ffi RHPHFFTRY p?GlTGGNSPVQEFIWLQPPTÁTISGIX PGVDY?TGYAV?JEPNGRYIMVPISINYRT SEQ ID NO:104 EVVAATPTSIIJSWRHPHEP YY G KS SPVQE l T ^^ PGVDYTr YAVTEGRNGREIJEPIS» ?.T SEQ ID NO:154 VSDVTRD EVVAATÍ^S US RHPHEFGRYY^IW AATSQ^PGWí Tir YA T^Eiüí iffilJWßlN? T SEQ ID NO:156 VSDWRDIBVVAATPTSUiSWRHPHFmYYRlTYGETGGNSPVQEF^ AATKGIJKP OY ITGY V Ei^GRElJp'P yRT SEQ ID NO:172 VSDVPRDLEVVAAWlSIXISWRHPHEPTHYYRrFYG^^ SEQ ID NO:173 VSDWRDI^ AATTi iS RHPHFP?HYY?ÜT^^ PAATKGlXPGVDYTl GYAVTKi SGRBUFTPBINYRT SEQ ID NO:175 VSDWRD VYAATPT^LUS RHPHFP HYYiUTYGErGGl^PVQB PAA?SG O'GVDYGI?YAVTIÍR GREE GPISIÍYRT SEQ ID NO:177 VSDVPi?iJSWA TP?Sr WRHP?FFmYY SEQ ID NO:180 TGAT?SGI^PGVDYT?'GYAVTWERNGREIÍTPISDIYRT SEQ ID NO:181 TVA?SGLK?GVDYTJTGYAVTlJER??REl TISINYRT SEQ ID NO:186 L PGVDYT??YAVTDGRNGKL SIPIS TE©KPSQ SEQ ID NO:187 MGEWAAIPlS USWRHP?fiFPmYYHIIYGETGG SPV EFTTLQ^ IJíPGVDYTlTVYAVTDGRNGRIJ^IPISINYRtómKP^ SEQ ID NO:188 SEQ ID NO:189 IJ[PGVDYTITVYAVTTX3WNGRIiSIPISINYRT SEQ ID NO:190 UtPGVDYTTTVYAVTEGP?lERSLFIPISINYRT SEQ ID NO.191 MVSDWIFJUB AATÍ^Si L^ PPTATISGI-KPGVDYTIIVYAVTEGPNE?^UFISI YRT SEQ I D NO: 192 (Un forma de núcleo del polipéptido referido como en ia presente como CT-101 ): EWAATPTSI ?SWIHPHFPTRYYR? PGVT>YTITv?AVTD( lNGRLLSIPISBÍYRT La molécula CT-01 anterior tiene una supresión de los primeros 8 aminoácidos y pueden incluir los aminoácidos adicionales en la terminal N o C. Por ejemplo, una secuencia MG adicional puede colocarse en la terminal N. El M se dividirá usualmente, dejando una GEV... secuencia en la terminal N. La re-adición de los 8 aminoácidos normales en la terminal N también produce una proteína de unión KDR con propiedades deseables. La metionina de terminal N generalmente se divide para producir una secuencia: VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSI PISI NYRT (SEQ I D NO: 1 93). Un polipéptido descrito en la presente puede modificarse por una o más sustituciones conservadoras, particularmente en partes de la proteína que no se espera que interactúen con una proteína objetivo. Se espera que tanto como 5%, 10%, 20% o aún 30% o más de los aminoácidos en una inmunoglobulina o dominio tipo inmunoglobulina pueden alterarse por una sustitución conservadora sin alterar sustancialmente la afinidad de la proteína para el objetivo. Puede ser de tal forma que tales cambios alterarán la inmunogenicidad del polipéptido in vivo, y en donde la inmunogenicidad se reduce, de tal forma que los cambios serán deseables. Según se utiliza en la presente, las "sustituciones conservadoras" son residuos que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes. Es decir, una sustitución conservadora y su residuo de referencia tienen tamaño similar, carga eléctrica, propiedades químicas incluyendo la habilidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o lo similar. Las sustituciones conservadoras preferidas son aquellas que cumplen los criterios definidos por una mutación de punto aceptada en Dayhoff eí al. , Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 (1 978 & Supp.). Los ejemplos de sustituciones conservadoras son sustituciones dentro de los siguientes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina. Los polipéptidos descritos en la presente también pueden modificarse a fin de mejorar la potencia, biodisponibilidad, estabilidad química, y/o eficacia. Por ejemplo, dentro una modalidad de la invención los péptidos de D-aminoácido, secuencias de péptido retroenantio pueden generarse a fin de mejorar la bioactividad y estabilidad química de una estructura de polipéptido (véase, por ejemplo, Juvvadi eí al. , J . Am. Chem. Soc. 1 1 8:8989-8997, 1 996; Freidinger eí al. , Science, 21 0:656-658, 1 980). Los intereses de lactam (véase, Freidinger, supra) y/o aminoácidos azabicicloalcano como subrogados de dipéptido pueden también utilizarse para mejorar las propiedades biológicas y farmacológicas de los péptidos nativos (véase, por ejemplo, et al. , Tetrahedron 53: 12789-1 2854, 1 997). Los subrogados de enlace amida, tales como tiaminas, aminas secundarias y terciarias, heterociclos entre otros (véase revisión en Spatola, A. F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins" Weinstein , B. Ed. Marcel Dekker, New York, 1 989 Vol. 7, pp 267-357) también pueden utilizarse para prevenir la degradación enzimática del elemento principal de polipéptido dando como resultado de tal modo la actividad mejorada. La conversión de los polipéptidos lineales a análogos de polipéptido cíclicos también puede utilizarse para mejorar la estabilidad metabólica, ya que los polipéptidos cíclicos son mucho más sensibles a la degradación enzimática (véase, generalmente, Veber, eí al. , Nature 292:55-58, 1 981 ). Los polipéptidos también pueden modificarse utilizando cubierta de grupo extremo y amidas a fin de disminuir o prevenir el metabolismo y mejorar la lipofilicidad. Los dímeros del péptido unido por varios enlazadoras también pueden mejorar la actividad y especificidad (véase, por ejemplo: Y. Shimohigashi eí al. , in Peptide Chemistry, 1 988, Proceedings of the 26th Symposium on Peptide Chemistry, Tokio, Octubre 24-26, pgs. 47-50, 1 989). Por ejemplos adicionales de modificaciones de polipéptido, tales como aminoácidos no naturales, véase U .S. P. N. 6,559, 1 26. Para utilizarse in vivo, una forma adecuada para pegilación puede generarse. Por ejemplo, una extremo de termino C que comprende una cisteína se agregó y se expresó, según se muestra abajo por una CT-01 de carecer los ochos aminoácidos de terminal N (EI DKPCO se agrega en la terminal C). GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTA TISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSI PISI NYRTEI DKPCQ (SEQ ID NO: 194). La forma pegilada de esta molécula se utiliza en los experimentos in vivo abajo descritos. Una forma de control con una serina en lugar de una cisteína también se utilizó: GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTA TISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSI PISI NYRTEI DKPSQ (SEQ I D NO: 195). Los mismos extremos de terminal C también pueden agregarse a las formas CT-01 que tienen los ocho aminoácidos de N-terminal, tal como se muestra en SEQ I D NO: 1 93. Las variantes adicionales con propiedades de unión KDR deseables se aislaron. La siguiente secuencia de núcleo tiene un ciclo FG de cierta forma de diferente, y puede expresarse con, por ejemplo, una secuencia MG de terminal N, una secuencia de terminal N que restaura los 8 aminoácidos suprimidos, y/o un extremo de terminal C para proporcionar una cisteína para pegilación.
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTYVPLQPPTA TISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFI PISI NYRT (SEQ ID NO: 196). Otra tal variante tiene la secuencia de núcleo: VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISI NYRT (SEQ I D NO: 1 97). Adicionalmente, los polipéptidos de inmunoglobulina de dominio único preferidos en una estructura Vi. se aislaron por metodología similar y se describen en la Figura 21 . También se incluyen en la presente invención son secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente. Según se aprecia por aquellos expertos en la materia, debido a que la tercera degeneración base, casi cada aminoácido puede representarse por más de un codón triple en una secuencia de nucleótidos codificadora. Además, los cambios de par base menores pueden darse como resultado de la sustitución conservadora en la secuencia de aminoácido codificada pero no se espera que alteren sustancialmente la actividad biológica del producto de gen. Por lo tanto, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en la presente puede modificarse ligeramente en secuencia y todavía codificar su producto de gen respectivo. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse como polipéptidos de plomo que pueden mutarse además y seleccionarse para los polipéptidos que unen VEGFR con una afinidad aún mayor. En un ejemplo, un polipéptido descrito en la presente se utiliza como un polipéptido de plomo que se muta o se selecciona al azar además para producir los polipéptidos con las mutaciones de aminoácido distintas del polipéptido de plomo. Los polipéptidos seleccionados al azar adicionales pueden utilizarse así para seleccionar los polipéptidos que inhiben la actividad biológica de VEGF según se describe en la presente (por ejemplo, se unen a un VEGFR y bloquean la unión de VEGF al mismo receptor). 3. Ácidos Nucleicos y Producción de los Polipéptidos Los polipéptidos de la presente invención pueden producirse utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la materia. En un ejemplo, los polipéptidos se producen por métodos de ADN recombinantes al insertar una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un cADN) que codifica el polipéptido en un vector de expresión recombinante y que expresa la secuencia de ADN bajo condiciones que promueven la expresión. Los ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido CT-01 descrito en la presente son: SEQ I D NO: 1 84 atg c -tt fls^^gc acc ciceagccttó aítaattaccgcacagaaattgacaaaccatgccag SEQ I D NO: 185 g pgaa tfgftgc cgiK& a^ cctfaiacctggtgttj ttaf**^^ nttajttt?ccgcaca Los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los diversos polipéptidos descritos en la presente pueden sintetizarse químicamente. El uso de codón puede seleccionarse a fin de mejorar la expresión en una célula. Tal uso de codón dependerá del tipo de célula seleccionado. Los modelos de uso de codón especializado se han desarrollado para E. coli y otras bacterias, así como también las células de mamífero , células de planta, células de levadura y células de insecto. Véase por ejemplo: Mayfield eí al. , Proc. Nati Acad Sci USA 2003 Ene 21 ; 100(2):438-42; Sinclair eí al. , Protein Expr. Purif. 2002 Oct; 26(1 ):96-105; Conell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct; 12(5):446-9; Makrides eí al. , Microbiol Rev. 1996 Sep:60(3):512-38, y Sharp eí al. Yeast 1 991 Oct; 7(7):657-78. Las técnicas generales para la manipulación de ácido nucleico se describen por ejemplo en Sambrook eí al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ed. , 1989, o F. Ausubel eí al. , Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-lnterscience: New York, 1 987) y actualizaciones periódicas, incorporadas en la presente para referencia. El ADN que codifica el polipéptido se une operativamente a elementos reguladores traductores y transcripcionales derivados de genes de mam ífero, virales, o de insecto. Tales elementos reguladores incluyen un promotor transcripcional, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión ribosomales de mARN adecuados, y secuencias que controlan la terminación de transcripción y traducción. La habilidad de duplicarse en un huésped, usualmente conferida por un origen de duplicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes se incorporan adicionalmente. El ADN recombinante también puede incluir cualquier tipo de secuencia tag de proteína que puede ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de tags de proteína incluyen pero no se limitan a una tag de histidina, una tag FLAG, una tag myc, una tag HA, o una tag GST. Los vectores de expresión y clonación adecuados para utilizares con huéspedes celulares bacterianos, fungióos, de levadura y de mamífero pueden encontrarse en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985), la descripción relevante de la cual se incorpora en la presente para referencia. La construcción de expresión se introduce en la célula huésped que utiliza un método adecuado para la célula huésped, según será aparente para un experto en la materia. Una variedad de métodos para introducir ácidos nucleicos en las células huésped se conoce bien en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, electroporación; transfección que emplea cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (en donde el vector es un agente infeccioso). Las células huésped incluyen procariotas, células de levadura, de mamífero, o células bacterianas. Las bacterias adecuadas incluyen organismos de gramo negativo o gramo positivo, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. Levadura, preferentemente de la especie Saccharomyces, tal como S. cerevisiaie, también pueden utilizarse para la producción de polipéptidos. Diversos sistemas de cultivo de célula de insecto o de mamífero también pueden emplearse para expresar proteínas recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan por Luckow y Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988). Los ejemplos de estirpes de célula huésped de mamífero adecuados incluyen células endoteliales, células de riñon de mono COS-7, CV-1 , células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), células de riñon embriónicas humanas, HeLa, 293, 293T, y estirpes de célula BHK. Los polipéptidos purificados se preparan al cultivar los sistemas huésped/vector adecuados para expresar las proteínas recombinantes. Para varias aplicaciones, el tamaño pequeño de varios de los polipéptidos descritos en la presente podría hacer la expresión en E. coli como el método para expresión preferido. La proteína se purifica así del medio de cultivo o extractos de célula. Las proteínas descritas en la presente también pueden producirse utilizando los sistemas de traducción de célula. Para tales propósitos, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido deben modificarse para permitir la transcripción in vivo para producir mARN y para permitir la traducción libre de célula del mARN en el sistema libre de célula particular que se utiliza (eucariótica tal como un sistema de traducción libre de célula de levadura o de mam ífero o procariótica tal como un sistema de traducción libre de célula bacteriana). - ßO - Los polipéptidos de unión de VEGFR también pueden producirse por síntesis química (por ejemplo, por los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. , 1984. , The Pierce Chemical Co. , Rockford, I L). Las modificaciones para la proteína también pueden producirse por la síntesis química. El polipéptido de la presente invención puede purificarse por los métodos de aislamiento/purificación para proteínas generalmente conocidas en el campo de química de proteína. Los ejemplos no limitantes incluyen extracción, recristalización, salado (por ejemplo, con sulfato de amonio o sulfato de sodio), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de absorción, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inverso, filtración de gel, cromatografía de permeación de gel, cromatografía de afinidad, electroforesis, distribución de contracorriente o cualquiera de las combinaciones de estas. Después de la purificación, los polipéptidos pueden intercambiarse en diferentes reguladores y/o concentrarse por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, filtración y diálisis. El polipéptido purificado es preferentemente al menos 85% puro, más preferentemente al menos 95% puro, y más preferentemente al menos 98% puro. Sin considerar el valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido es lo suficientemente puro para utilizarse como un producto farmacéutico. 4. Modificaciones de Polipéptidos Post-Traductoras En ciertas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención pueden además comprender modificaciones post-traductoras. Las modificaciones de proteína post-traductoras ejemplares incluyen fosforilacdión, acetilación, mutilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, glicosilación , carbonización, sumoilación, biotinilación o adición de una cadena lateral de polipéptido o de un grupo hidrofóbico. Como resultado, los polipéptidos solubles modificados pueden contener elementos no aminoácido, tal como lípidos, poli- o mono-sacárido, y fosfatos. Una forma preferida de glicosilación es sialilación, que conjuga una o más porciones de ácido siálico para el polipéptido. Las porciones de ácido siálico mejoran la solubilidad y vida media de suero mientras que también se reduce la posible inmunogenicidad de la proteína. Veáse, por ejemplo, Raju eí al. Biochemistry, 2001 Jul 31 :40(30):8868-76. Los efectos de tales elementos de no aminoácido en la funcionalidad de un polipéptido pueden probarse para su papel antagonizante en función de VEGFR-2 o VEGF, por ejemplo, su efecto inhibidor en angiogénesis o en crecimiento tumoral. En una modalidad específica de la presente invención, las formas modificadas de los polipéptidos solubles sujeto comprenden la unión de los polipéptidos solubles sujeto a los polímeros no proteínicos. En una modalidad específica, el polímero es polietilénglicol ("PEG"), polipropilénglicol, o polioxialcanos, en la manera según se establece en las Pat. de EE. U U Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301 , 144; 4,670,417; 4,791 , 1 92 o 4, 1 79,337. Los ejemplos del polipéptido modificado de la invención incluyen M5FL PEGilado y CT-01 PEGilado. PEG es un polímero soluble en agua, bien conocido que es comercialmente disponible o puede prepararse por polimerización de abertura de anillo de etilénglicol de acuerdo a los métodos bien conocidos en la materia (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academia Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161 ). El término "PEG" se utiliza ampliamente para comprender cualquier molécula de polietilénglicol, sin considerar el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y puede representarse por la fórmula: X-O(CH2CH2O)n-1 CH2CH2OH (1 ), en donde n es 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo C-?-4. En una modalidad, el PEG de la invención termina en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("PEG metoxi"). Un PEG puede contener además grupos químicos que sean necesarios para las reacciones de unión; lo cual da como resultado la síntesis química de la molécula; o que es un separador para la distancia óptima de las partes de la molécula. Además, tal PEG puede consistir de una o más cadenas laterales de PEG que se unen juntas. PEGs con más de una cadena PEG se llaman PEGs ramificados o multiarmados. PEGs ramificados pueden prepararse, por ejemplo, por la adición de óxido de polietileno a diversos polioles, incluyendo glicerol, pentaeritrol, y sorbitol. Por ejemplo, un PEG ramificado de cuatro brazos puede prepararse por pentaeritriol y óxido de etileno. PEG ramificado se describen en, por ejemplo, EP-A 0 473 084 y Pat. de EE. UU No. 5,932,462. Una forma de PEGs incluye dos cadenas laterales PEG (PEG2) unidas por medio de los grupos amino primarios de una lisina (Monfardini, C , eí al. , Bioconjugate Chem . 6 (1 995) 62-69). A pesar de que PEG se conoce bien, este es, de nuestro conocimiento, la primera demostración que un polipéptido 10Fn3 pegilado puede pegilarse y retener la actividad de unión de ligante. En una modalidad preferida, el polipéptido 10Fn3 pegilado se produce por pegilación dirigida por sitio, particularmente por conjugación de PEG a una porción de cisteína en la terminal N o C. De acuerdo con lo anterior, ia presente descripción proporciona un polipéptido 10Fn3 de unión objetivo con propiedades farmacocinéticas mejoradas, el polipéptido comprendiendo: un dominio 10Fn3 que tiene de aproximadamente 80 a aproximadamente 150 aminoácidos, en donde al menos uno de los ciclos de dicho dominio 1 0Fn3 participan en unión objetivo; y una porción de PEG covalentemente unida, en donde dicho "polipéptido Fn3 se une al objetivo con KD de menos de 100 nM y tiene una velocidad de evacuación de menos de 30 mL/hr/kg en un mamífero. La porción PEG puede unirse al polipéptido 10Fn3 por pegilación dirigida por sitio, tal como por unión a un residuo Cys, en donde el residuo Cys puede colocarse en la terminal N del polipéptido 10Fn3 o entre la terminal N y la terminal más N, filamento beta o tipo beta o en la terminal C del polipéptido 10Fn3 o entre la terminal C y la terminal más C filamento beta o tipo beta. Un residuo Cys puede situarse en otras posiciones así también, particularmente cualquiera de los ciclos que no participan en la unión objetivo. Una porción PEG puede también unirse por otra química, incluyendo por conjugación a aminas. La conjugación de PEG para péptidos o proteínas generalmente ¡ncluye la activación de PEG y acoplamiento de los intermediarios PEG activados directamente a las/los proteínas/péptidos objetivo o a un enlazador, el cual se activa subsecuentemente y se acopla a proteínas/péptidos objetivo (véase Aubuchowski, A eí al. , J. Biol. Chem. , 252, 3571 (1 977) y J. Biol. Chem. , 252, 3582 (1 977), Zalipsky, eí al. , y Harris eí al. , in: Poly(ethyleneglicol) Chemistry. Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M . Harris ed.), Plenum Press: New York, 1 992; Cap.21 y 22). Se señala que un polipéptido de unión que contiene una molécula PEG también se conoce como una proteína conjugada, mientras que la proteína que carece de una molécula PEG unida puede referirse como sin conjugar. Una variedad de formas de masa molecular de PEG puede seleccionarse, por ejemplo, de aproximadamente 1 ,000 Daltonas (Da) a 1 00,000 Da (n es 20 a 2300), para conjugarse para polipéptidos de unión de VEGFR-2. El número de unidades de repetición "n" en el PEG se aproxima para la masa molecular descrita en Saltonas. Se prefiere que la masa molecular combinada de PEG en un enlazador activado sea adecuada para uso farmacéutico. De esta manera, en una modalidad, la masa molecular de las moléculas PEG no excede 100,000 Da. Por ejemplo, si tres moléculas PEG se unen a un enlazador, en donde cada molécula PEG tiene la misma masa molecular de 12,000 Da (cada n es aproximadamente 270) , entonces la masa molecular total de PEG en el enlazador es aproximadamente 36,000 Da (total n es aproximadamente 820). Las masas moleculares de PEG unidas al enlazador también pueden ser diferentes, por ejemplo, de tres moléculas en un enlazador dos moléculas PEG pueden ser 5, 000 Da cada una (cada n es aproximadamente 1 10) y una molécula PEG puede ser 12,000 Da (n es aproximadamente 270). En una modalidad específica de la invención, un polipéptido de unión de VEGFR-2 se une covalentemente a un grupo de poli(etilénglicol) de la fórmula: — CO — (CH2)X — (OCH2CH2)m— OR, con el — CO (es decir, carbonilo) del grupo poli(etilénglicol) formando un enlace amida con uno de los grupos amino del polipéptido de unión; R siendo alquilo inferior; x siendo 2 o 3; m siendo de aproximadamente 450 a aproximadamente 950; y n y m seleccionándose de tal forma que el peso molecular del conjugado menos el polipéptido de unión es de aproximadamente 1 0 a 40 kDa. En una modalidad, un grupo e-am ino de polipéptido de unión de una lisina es e I grupo amino disponible (libre). Los conjugados anteriores pueden presentarse específicamente por la fórmula (I I): P— NHCO— (CH2)X— (OCH2CH2)m— OR (I I), en donde P es el grupo de un polipéptido de unión según se describe en la presente, (es decir, sin el grupo amino o grupos amino que forman un enlace de amida con el carbonilo mostrado en la fórmula (II); y en donde R es alquilo inferior; x es 2 o 3; m es de aproximadamente 450 a aproximadamente 950 y se selecciona de tal forma que el peso molecular del conjugado menos el polipéptido de unión es de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 kDa. Según se utiliza en la presente, los rangos dados de "m" tienen un significado orientacional. Los rangos de "m" se determinan en cualquier caso, y exactamente, por el peso molecular del grupo PEG. Un experto en la materia puede seleccionar una masa molecular adecuada para PEG, por ejemplo, en base a cómo el polipéptido de unión pegilado se utilizará terapéuticamente, la dosis deseada, tiempo de circulación, resistencia a proteolisis, inmunogenicidad, y otras proteínas, véase N.V. Catre, Advanced Drug Delivery Reviews 10:91-114 (1993). En una modalidad de la invención, las moléculas PEG pueden activarse para reaccionar los grupos amino en un polipéptido de unión, tal como con lisinas (Bencham C.O. eí al. Anal Biochem, 131, 25 (1983); Veronese, F.M. eí al. Appl Biochem., 11, 141 (1985); Zalipsky, S. eí al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999); Zalipsky, S. eí al., Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgado, C. eí al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990)). En una modalidad específica, los esteres de carbonato de PEG se utilizan para formar los conjugados de polipéptido de unión de PEG. N,N'-disuccin¡midilcarbonato (DSC) puede utilizarse en la reacción con PEG para formar carbonato de succinimidilo PEG mezclado activo que puede reaccionarse subsecuentemente con un grupo nucleófilico de un enlazador o un grupo amino de un polipéptido de unión (véase, Pat. de EE. UU . Nos. 5,281 ,698 y Pat. de EE. UU. No. 5,932,462). En un tipo similar de reacción, 1 , 1 '-(dibenzotriazolil)carbonato y di-(2-piridil)carbonato pueden reaccionarse con PEG para formar carbonato mezclado de benzotriazolilo de PEG y piridilo de PEG (Pat. de EE. UU . No. 5,382,657), respectivamente. La pegilación de un polipéptido 10Fn3 puede realizarse de acuerdo a los métodos del estado de la técnica, por ejemplo, por reacción del polipéptido de unión con PEGs electrofílicamente activos (suministrador: Shearwater Corp. , USA, www.shearwatercorp.com). Los reactivos PEG preferidos de la presente ¡nvención son, por ejemplo, propionatos N-hidroxisuccinimidilo (PEG-SPA), butanoatos (PEG-SBA), propionato succinimidilo de PEG o N-hidroxisuccinimidas ramificadas tales como mPEG2-NHS (Monfardini, C , eí al. , Bioconjugate Chem. 6 (1 995) 62-69) . Tales métodos pueden utilizarse para pegilarse en un grupo e-amino de un polipéptido de unión lisina o el grupo amino de terminal N del polipéptido de unión. En otra modalidad, las moléculas PEG pueden acoplarse a grupos de sulhidrilo en un polipéptido de unión (Sartore, L. eí al. , Appl. Biochem. Biotechnol. , 27, 45 (1 991 ); Morpurgo eí al. , Biocon. Chem . , 7, 363-368 (1996); Godson eí al. , Bio/Technology (1990) 8, 343; Patente de EE. UU. No. 5,766, 897). Las Patentes de EE. U U. Nos. 6,61 0,281 y 5,766,897 describe especies de PEG reactivas ejemplares que pueden acoplarse a grupos sulfihidrilo. En algunas modalidades en donde las moléculas PEG se conjugan para residuos de cisteína en un polipéptido de unión, los residuos de cisteína son nativos para el polipéptido de unión, mientras que en otras modalidades, uno o más residuos de cisteína se elaboran en el polipéptido de unión. Las mutaciones pueden introducirse en una secuencia codificadora de polipéptido de unión para generar residuos de cisteína. Esto podría lograrse, por ejemplo, al mutar uno o más residuos de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros residuos hidrofílicos. Preferentemente, el residuo a mutar para cisteína es un residuo expuesto a la superficie. Los algoritmos se conocen bien en la materia para pronosticar la accesibilidad de superficie de residuos basados en secuencia primaria o una proteína. Alternativamente, los residuos de superficie pueden pronosticarse al comparar las secuencias de aminoácido de los polipéptidos de unión, dado que la estructura cristalina de la estructura en base a la cual los polipéptidos de unión se diseñan e incluyen se ha resuelto (véase Himanen eí al. , Nature. (2001 ) 20-27; 414 (6866):933-8) y de esta manera los residuos expuestos a la superficie se identificaron. En una modalidad, los residuos de cisteína se introducen en los polipéptidos de unión en o cerca de la terminal C y/o N , o dentro de las regiones de ciclo. En algunas modalidades, el polipéptido de unión pegilado comprende una molécula PEG covalentemente unida al grupo amino alfa del aminoácido de terminal N. La aminación reductiva de terminal N específica de sitio se describe en Pepinsky eí al. (2001 ) J PET, 297, 1 059, y Pat. de EE. UU. No. 5,824,784. El uso de un aldehido de PEG para la aminación reductiva de una proteína que utiliza otros grupos amino nucleófilicos disponibles se describe en la Pat. de EE. UU. No. 4, 002,531 , en Wieder eí al. (1 979) J. Biol. Chem. 254, 12579, y en Chamow eí al. , (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133. En otra modalidad, el polipéptido de unión pegilado comprende una o más moléculas PEG covalentemente unidas a un enlazador, el cual a su vez se une al grupo amino alfa del residuo de aminoácido en terminal N del polipéptido de unión. Tal procedimiento se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2002/0044921 y en WO 94/01451 . En una modalidad, un polipéptido de unión se pegilata en la terminal C. En una modalidad específica, una proteína se pegilata en la terminal C por la introducción de azido-metionina de terminal C y la conjugación subsecuente de un compuesto metil-PEG-triarilfoina por medio de la reacción de Staudinger. El método de conjugación de terminal C se describe en Cazalis eí al. , PEGilación Específica de Sitio de Terminal C de una Mutante de Trombomodulación Truncado con Retención de Bioreactividad Completa, Bioconjug Chem. 2004; 15(5): 1 005-1 009. La monofosforilación de un polipéptido de unión también puede producirse de acuerdo a los métodos generales descritos en WO 94/01451 . WO 94/01451 describe un método para preparar un polipéptido recombinante con un grupo reactivo de alfa-carbono de aminoácido de terminal modificado. Las etapas del método incluyen formar el polipéptido recombinante y protegerlo con uno o más grupos protectores biológicamente agregados en la alfa-amina de terminal N y alfa-carboxilo de terminal C. El polipéptido puede reaccionarse así con agentes protectores químicos para proteger selectivamente los grupos de cadena lateral reactivos y prevenir de tal modo los grupos de cadena lateral de modificarse. . El polipéptido se divide así con un reactivo de división específico para el grupo protector biológico para formar un grupo reactivo de alfa-carbono de aminoácido de terminal sin proteger. El grupo reactivo de alfa-carbono de aminoácido de terminal sin proteger se modifica con un agente modificador químico. El polipéptido de copia única terminalmente modificado protegido por cadena lateral se desprotege así en los grupos de cadena lateral para formar un polipéptido de copia única recombinante terminalmente modificado. El número y la secuencia de etapas en el método pueden variarse para lograr la modificación selectiva en el aminoácido de terminal N y/o C del polipéptido. La proporción de un polipéptido de unión a PEG activado en la reacción de conjugación puede ser de aproximadamente 1 :0.5 a 1 :50, entre de aproximadamente 1 : 1 a 1 :30, o de aproximadamente 1 :5 a 1 : 15. Diversos reguladores acuosos pueden utilizarse en el método actual para catalizar la adición covalente de PEG para el polipéptido de unión. En una modalidad, el pH de un regulador utilizado es de aproximadamente 7.0 a 9.0. En otra modalidad, el pH se encuentra en un rango ligeramente básico, por ejemplo, de aproximadamente 7.5 a 8.5. Los reguladores que tienen un pKa cercano a un rango de pH neutral pueden utilizarse, por ejemplo, regulador de fosfato. Las técnicas de purificación y separación convencionales conocidas en la materia pueden utilizarse para purificar el polipéptido de unión PEGilado, tal como exclusión de tamaño (por ejemplo, filtración de gel) y cromatografía de intercambio de iones. Los productos también pueden separarse utilizando SDS-PAGE. Los productos que pueden separarse incluyen polipéptido de unión mono-, di-, tri-, poli- y sin-pegilarse, así también como PEG libre. El porcentaje de mono-PEG-conjugados puede controlarse al agruparse las fracciones más amplias alrededor del valor máximo de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente noventa por ciento de mono-PEG-conjugados representa un buen balance de producción y actividad. Las composiciones en las cuales, por ejemplo, al menos noventa y dos por ciento o al menos noventa y seis por ciento de los conjugados son especies mono-PEG, pueden desearse. En una modalidad de esta invención, el porcentaje de conjugados mono-PEG es de noventa por ciento a noventa y seis por ciento. En una modalidad, el polipéptido de unión PEGilado de la invención contiene uno, dos o más porciones PEG. En una modalidad, la (s) porción (es) de PEG se une (n) a un residuo de aminoácido el cual se encuentra sobre la superficie de la proteína y/o lejos de la superficie que contacta el ligante objetivo. En una modalidad, la masa molecular total o combinada de PEG en el polipéptido de unión de PEG es de aproximadamente 3,000 Da a 60,000 Da, opcionalmente de aproximadamente 10,000 Da a 36,000 Da. En una modalidad, el PEG en un polipéptido de unión pegilado es un PEG de cadena recta, sustancialmente lineal. En una modalidad de la invención, el PEG en polipéptido de unión pegilado no se hidroliza del residuo de aminoácido pegilado utilizando un ensayo de hidroxilamina, por ejemplo, 450 mM de hidroxilamina (pH 6.5) durante 8 a 16 horas a temperatura ambiente, y de esta manera es estable. En una modalidad, más de 80% de la composición es polipéptido de unión de mono-PEG estable, más preferentemente al menos 90% , y más preferentemente al menos 95%. En otra modalidad, los polipéptidos de unión pegilados de la invención preferentemente retendrán al menos 25%, 50%, 60%, 70% al menos 80%, 85%, 90% , 95% o 1 00% de la actividad biológica asociada con la proteína no modificada. En una modalidad, la actividad biológica se refiere a su habilidad para unirse a VEGFR-2, según se ensaya por KD, kactiV0 o k¡nactivo- En una modalidad específica, la proteína de polipéptido de unión pegilado muestra un aumento en unión a VEGFR en relación al polipéptido de unión no pegilado. La velocidad de evacuación de suero de polipéptido modificado por PEG puede reducirse por aproximadamente 1 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o aún 90%, en relación a la velocidad de evacuación del polipéptido de unión sin modificar. El polipéptido modificado por PEG puede tener una vida media (t1 2) que se mejora en relación a la vida media de la proteína sin modificar. La vida media de polipéptido de unión de PEG puede mejorarse por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 00%, 125%, 1 50%, 1 75%, 200%, 250%, 300%, 400% o 500%, o aún por 1 000% en relación a la vida media se determina in vitro, tal como en solución de salina regulada o en suero. En otras modalidades, la vida media de proteína es una vida media in vivo, tal como la vida media de la proteína en el suero u otro fluido corporal de un animal. 5. Formulaciones Terapéuticas y Modos de Administración La presente invención caracteriza los métodos para tratar condiciones o prevenir pre-condiciones que responden a una inhibición de actividad biológica de VEGF. Los ejemplos preferidos son condiciones que se caracterizan por angiogenesis inadecuada. Las técnicas y dosificaciones para la administración varían dependiendo del tipo de polipéptido específico y la condición específica que se trata pero puede determinarse fácilmente por el experto. En general, las agencias reguladoras requieren que un reactivo de proteína a utilizarse como un terapéutico se formule a fin de tener niveles aceptablemente bajos de pirógenos. De acuerdo con lo anterior, las formulaciones terapéuticas generalmente se administran de otras formulaciones porque son sustancialmente libres de pirógeno, o al menos contienen no más de niveles aceptables de pirógeno según se determina por la agencia reguladora adecuada (por ejemplo, FDA). Las composiciones terapéuticas de la presente ¡nvención pueden administrarse con un diluyente farmacéuticamente aceptable, vehículo, o excipiente, en forma de dosis de unidad. La administración puede ser parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea), oral, o local, como ejemplos no limitantes. Además, cualquier técnica de terapia de gen, utilizando ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la ¡nvención, puede emplearse, tal como suministro de ADN desnudo, genes recombinantes y vectores, suministro basado en célula, incluyendo manipulación ex vivo de células de paciente, y lo similar. La composición puede encontrarse en la forma de una pildora, tableta, cápsula, líquido, o tableta de liberación sostenida para la administración oral; o un líquido para administración intravenosa, subcutánea o parenteral; gel, loción, ungüento, crema, o un polímero u otro vehículo de liberación sostenida para administración local. Los métodos bien conocidos en la materia para elaborar formulaciones se encuentran, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed. , ed A. R. Gennaro AR. 2000, Lippincott Williams & Wiikins, Filadelfia, PA). Las formulaciones para la administración parenteral, por ejemplo, pueden contener excipientes, agua estéril, salina, polialquilenoglicoles tales como polietilénglicol, aceites de origen vegetal, o naftalenos hidrogenados. El polímero lactido biodegradable, compatible, copolímero de láctido/glicólido, o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno pueden utilizarse para controlar la liberación de los compuestos. Las formulaciones nanoparticuladas (por ejemplo, nanopartículas biodegradables, nanopartículas líquidas sólidas, liposomas) pueden utilizarse para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de acetato etileno-vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. La concentración del compuesto en la formulación varía dependiendo de un número de factores, incluyendo la dosificación del fármaco a administrar, y la vía de administración. El polipéptido puede administrarse opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, tal como sales de adición de ácido no tóxico o complejos metálicos que se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición acida incluyen ácidos orgánicos tales como ácidos acéticos, lácticos, pamoicos, maleicos, cítricos, málicos, ascórbicos, succínicos, benzoicos, palmíticos, subéricos, salicílicos, tartáricos, metanosulfónicos, toluenosulfónicos, o trifluoroacéticos o lo similar; ácidos poliméricos tales como ácido tánnico, carboximetilcelulosa, o lo similar; y ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico, ácido hidrobrómico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, o lo similar. Los complejos metálicos incluyen zinc, hierro, y lo similar. En un ejemplo, el polipéptido se formula en la presencia de acetato de sodio para aumentar la estabilidad térmica.
Las formulaciones para uso oral incluyen tabletas que contienen el (los) ingrediente (s) activo (s) en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o rellenadores inertes 5 (por ejemplo, sucosa y sorbitol), agentes lubricantes, glidantes, y antiadhesivos (por ejemplo, sulfato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados, o talco). Las formulaciones para uso oral también pueden proporcionarse como tabletas masticables, o como cápsulas de 10. gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, o como cápsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una dosis que produce los efectos terapéuticos para los cuales se administra. 15 La dosis exacta dependerá del desorden a tratar, y puede lograrse por un experto en la materia utilizando las técnicas conocidas. En general, el polipéptido se administra a aproximadamente 0.01 /g/kg a aproximadamente 50 mg/kg por día, preferentemente 0.01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg por día, más preferentemente 0.1 mg/kg a 20 aproximadamente 20 mg/kg por día. El polipéptido puede darse diariamente (por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces diaria) o menos frecuentemente (por ejemplo, una vez cada otro día, una vez o dos veces a la semana, o mensualmente). Además, según se conoce en la materia, los ajustes para la edad así también 25 el peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, interacción de fármaco, y la severidad de la enfermedad puede ser necesaria, y será alcanzable con la experimentación rutinaria por aquellos expertos en la materia. 6. Usos ejemplares Las proteínas de unión VEGFR-2 descritas en la presente y sus variantes relacionadas son útiles en un número de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Estas incluyen la inhibición de la actividad biológica de VEGF al competir por o bloquear la unión a VEGFR-2 así como también el suministro de porciones de imagen o citotóxicas para células, preferentemente células que expresan VEGFR-2. La estructura estable y de tamaño pequeño de estas moléculas puede ser particularmente valuable con respecto a la elaboración del fármaco, la rápida evacuación del cuerpo para ciertas aplicaciones en donde la evacuación rápida se desea o la formulación en nuevos sistemas de suministro que son adecuados o mejorados utilizando una molécula con tales características. Sobre la base de su eficacia como inhibidores de actividad biológica de VEGF, los polipéptidos de la invención son eficaces contra un número de condiciones asociadas con angiogenesis adecuada, incluyendo pero no limitándose a desórdenes autoinmunes (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio o psoriaris); desórdenes cardiacos (por ejemplo, aterosclerosis o restenosis de vaso sanguíneo), retinopatías (por ejemplo, retinopatías proliferativas generalmente, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada a la edad o glaucoma neurovascualr), enfermedad renal (por ejemplo, retinopatía diabética, nefrosclesoris maligna, síndromes de microangipatía trombótica; rechaza de transplante; enfermedad renal inflamatoria; glomerulonefritis; glomerulonefritis mesangioproliferativa; síndrome hemolítico-urémico; y nefrosclerosis hipertensa); hemangioblastoma; hemangiomas; hiperplasias de tiroide; transplantes de tejido; inflamación crónica; síndrome de Meig; efusión pericardial; efusión pleural; enfermedades autoinmunes; diabetes; endometriosis; asma crónico; fibrosis indeseable (particularmente fibrosis hepática) y cáncer, así como también complicaciones que se originan de cáncer, tal como efusión pleural y ascitis. Preferentemente, los polipéptidos de unión de VEGFR de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de prevención de enfermedades hiperproliferativas o cáncer y el esparcimiento metastático de cánceres. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen vesícula, sangre, hueso, cerebro, mama, cartílago, colon, riñon, hígado, pulmón, nudo linfático, tejido nervioso, ovario, pancreático, próstata, músculo esquelético, piel, médula espinal, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, traquea, tracto urogenital, uretra, útero, o cáncer vaginal. Las condiciones tratables adicionales pueden encontrarse en U.S. P. N. 6,524,583, incorporada en la presente para referencia. Otras referencias que describen usos para los polipéptidos de unión de VEGFR-2 incluyen: McLeod DS eí al. , Invest Ophtalmol Vis Sci. 2002 Feb; 43(-2):474-82; Watanabe eí al. , Exp. Dermatol. 2004 Nov; 1 3(1 1 ):671 -81 ; Yoshiji H eí al. , Gut. 2003 Sep; 52(9): 1347-54; Verheul eí al. , Oncologist, 2000; 5 Suppl 1 :45-50; Boldicke eí al. , Stem Cells. 2001 ; 1 9(1 ):24-36. Según se describe en la presente, las enfermedades asociadas a angiogenesis incluyen, pero no se limitan a, cáncer dependiente de angiogenesis, incluyendo, por ejemplo, tumores sólidos, tumores nacidos por sangre tales como leucemias, y metástasis de tumor; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas biogénicos; desórdenes inflamatorios tales como inflamación inmune y no inmune; reumatismo articular crónico y psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares; por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis miocardial; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofiliacas; angiofibroma; y granulación de heridas y cicatrización de heridas; scleroderma de psoriasis telangiectasia, granuloma biogénico, colaterales coronarios, angiogenesis de extremidad isquémica, enfermedades corneales, rubeosis, artritis, neovasculariación diabética, fracturas, vasculogenesis, hematopoyesis. Un polipéptido de unión de VEGFR-2 puede administrase solo o en combinación con una o más terapias adicionales tales como radioterapia de quimioterapia, inmunoterapia, intervención quirúrgica, o cualquier combinación de estas. La terapia a largo plazo es igualmente posible como que es terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, según se describe anteriormente. En ciertas modalidades de tales métodos, uno o más agentes terapéuticos de polipéptido pueden administrarse, juntos (simultáneamente) o en diferentes momentos (secuencialmente) . Además, los agentes terapéuticos de polipéptido pueden administrarse con otro tipo de compuestos para tratar cáncer o par inhibir la angiogenesis. En ciertas modalidades, los agentes terapéuticos sujeto de la invención pueden utilizarse solos. Alternativamente, los agentes sujeto pueden utilizarse en combinación con otros procedimientos terapéuticos anti-cáncer convencionales dirigidos al tratamiento o prevención de desórdenes proliferativos (por ejemplo, tumorales). Por ejemplo, tales métodos pueden utilizarse en prevención de cáncer profiláctico, prevención de recurrencia de cáncer y metástasis después de la cirug ía, y como un adyuvante de otra terapia de cáncer convencional. La presente invención reconoce que la efectividad de terapias de cáncer convencionales (por ejemplo, quimioterapia, terapia por radiación, fototerapial, inmunoterapia, y cirugía) pueden mejorarse a través del uso de un agente terapéutico de polipéptido sujeto. Un amplio grupo de compuestos convencionales se ha mostrado que tiene actividades anti-neoplásticas. Estos compuestos se han utilizado como agentes farmacéuticos en quimioterapia para comprimir los tumores sólidos, prevenir la metástasis y el crecimiento adicional, o reducir el número de células malignas en malignidades de médula ósea o leucémicas. A pesar de que la quimioterapia ha sido eficaz en el tratamiento de diversos tipos de malignidades, varios compuestos anti-neoplásticos inducen efectos secundarios indeseables. Se ha mostrado que cuando dos o más diferentes tratamientos se combinan, los tratamientos pueden trabajar sinergísticamente y permiten la reducción de dosis de cada uno de los tratamientos, reduciendo de tal modo los efectos secundarios nocivos ejercidos por cada compuesto en dosis más altas. En otros casos, las malignidades que son refractivas a un tratamiento pueden responder a una terapia de combinación de dos o más diferentes tratamientos. Cuando un agente terapéutico de polipéptido de la presente invención se administra en combinación con otro agente anti-neoplástico convencional, ya sea concomitantemente o secuencialmente, tal agente terapéutico puede encontrarse para mejorar el efecto terapéutico del agente anti-neoplástico o superar la resistencia celular a tal agente anti-neoplástico. Esto permite la reducción de dosis de un agente anti-neoplástico, reduciendo de tal modo los efectos secundarios indeseables, o restaura la efectividad de un agente anti-neoplástico en células resistentes. Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse para la terapia anti-tumoral combinatoria incluyen, meramente para ilustrar: aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, bcg, bicalutamida, bleomicina, buserelin, busulfan, campotecin, capecitabina, carplatin, carmustine, clorambucil, cisplatin, cladribina, clodronato, colquicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunoribicina, dienestro, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramustina, etoposida, exemestano, filgastrim , fludarabina, fludrocortisona, fluorouracil, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, genisteina, goserelina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, interferona, irinotecan, ironotecan, letrozol, leucovorin, leuprolido, elvamisol, lomustina, mecloroetamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotide, oxaliplatin, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfimer, procarbazina, raltritexed, rituximab, streptozocin, suramin, tamoxifen, temozolomida, teniposida, testosterona, tioguanina, tiotepa, bicloruro de titanoceno, topotecan, trastuzumab, tretinoin, vinblastina, vincristina, vindesina, y vinorelbina. Ciertos compuestos anti-tumorales quimioterapéuticos pueden catalogarse por su mecanismo de acción en, por ejemplo, los siguientes grupos: anti-metabolitos/agentes anti-cáncer, tales como análogos de pirimidina (5-fluorouracil, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodeoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimicóticos incluyendo productos naturales tales como alcaloides vinca (vinblastina, vincristina, y vinorelbina), disruptores de microtúbulos tales como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposida, teniposida), agentes de daño de ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfan, camptotecina, carboplatiná, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, citoxan, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilmetilaminaoaliplatina, ifosfamida, melfalan, mercloroetamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotero, teniposida, trietilenotiofosforamida y etoposida (VP16)); antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza sistemáticamente L-asparagina y priva las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes anti-plaquetas; agentes de alquilación antiproliferativos/antimicóticos tales como mostazas de nitrógeno (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalan, clorambucil), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), alquil sulfonatos-busulfan, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, streptozocin), trazenos-dacarbazimida (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimicóticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatina, carboplatina), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminogluteimida; hormonas, análogos de hormona (estrógeno, tamoxifen, goserelin, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintéticas y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tales como activador de plasminogen de tejido, estreptoquinasa y uroquinasa) , aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes antisecretores (breveldin); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimo (FK-506), sirolimo (rapamicina) , azatioprina, mofetil micofenolato); compuestos anti-angiogénicos (TNP-470, genistein) e inhibidores de factor de crecimiento (por ejemplo, inhibidores VEGF, inhibidores de factor de crecimiento de fibroblasto (FGF); bloqueador de receptor angiotensina; donadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores de ciclo celular e inductores de diferenciación (tretinoin); inhibidores de mTOR, inhibidores de topoisomerasa (doxorubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina, eniposide, epirubicina, etoposide, idarubicina y mitoxantrona, topotecan, irinotecan) , corticoesteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona, y prenisolona) ; inhibidores de quinasa de transducción de señal de factor de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial y activadores de caspasa; y disruptores de cromatina. En ciertas modalidades, los compuestos farmacéuticos que pueden utilizarse para la terapia anti-angiogénesis combinatoria incluyen: (1 ) inhibidores de liberación de "moléculas angiogénicas", tales como bFGF (factor de crecimiento de fibroblasto básico); (2) neutralizadores de moléculas angiogénicas, tales como anticuerpos anti-/?dFGF; y (3) inhibidores de respuesta de célula endotelial para estímulos angiogénicos, incluyendo inhibidor de colagenasa, inhibidores de cambio de membrana basal, esteroides angiostáticos, inhibidores de angiogenesis derivada de lo fúngico, factor de plaquetas 4, trombospondina, fármacos de artritis tales como D-penicilamina y tiomalato oro, análogos de vitamina D3, alfa-interferona, y lo similar. Para los inhibidores propuestos adicionales de angiogenesis, véase Blood eí al. , Bioch. Biophys. Acta. , 1 032:89-1 18 (1 990), Moses eí al. , Science, 248: 1408-141 0 (1 990), Ingber eí al. , Lab. Invest. , 59:44-51 (1 988), y Pat. de EE. UU . Nos. 5,092,885, 5, 1 12,946, 5, 1 92,744, 5,202,352, y 6573256. Además, existe una amplia variedad de compuestos que pueden utilizarse para inhibir la angiogenesis, por ejemplo, la proteína endostatina o derivados, fragmentos de unión de lisina de angiostatina, compuestos promotores de melanina o melanina, fragmentos de plasminogen (por ejemplo, Kringles 1 -3 de plasminogen), subunidades de tropoina, antagonistas de vitronectina ,ßz, péptidos derivados de Saposina B, antibióticos o análogos (por ejemplo, tetraciclina, o neomicina), composiciones que contienen dienogest, compuestos que comprenden un núcleo inhibidor MetAP-2 acoplado a un péptido, el compuesto EM-138, calcona y sus análogos, e inhibidores de naaladasa. Véase, por ejemplo, Pat. de EE. U U. Nos. 6,395,71 8, 6,462,075, 6,465,431 , 6,475,784, 6,482,802, 6,482,81 0, 6,500,431 , 6,500,924, 6,518,298, 6,521 ,439, 6,525,01 9, 6,538, 1 03, 6,544,758, 6,544,947, 6,548,477, 6,559, 126, y 6,569,845. Dependiendo de la naturaleza de la terapia de combinación, la administración de los agentes terapéuticos de polipéptido de la invención pueden continuarse mientras que la otra terapia se está administrando y/o de allí en adelante. La administración de los agentes terapéuticos de polipéptido puede hacerse en una dosis única, o en múltiples dosis. En algunos casos, la administración de los agentes terapéuticos de polipéptido se comienza al menos varios días antes de la terapia convencional, mientras que en otros casos, la administración se inicia ya sea inmediatamente antes o al momento de la administración de la terapia convencional. Las proteínas de unión de VEGFR-2 descritas en la presente pueden también marcarse de manera detectable y utilizarse para contactar las células que expresan VEGFR-2 para aplicaciones de representación por imágenes o aplicaciones de diagnóstico. Para propósitos de diagnóstico, el polipéptido de la invención se inmoviliza preferentemente sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos preferidos incluyen columnas (por ejemplo, columnas de afinidad, tales como columnas de afinidad basadas en azarosa), microchips, o perlas. En un ejemplo de una aplicación de diagnóstico, una muestra biológica, tal como suero o una biopsia de tejido, de un paciente que se sospecha que tiene una condición caracterizada por angiogenesis inadecuada se contacta con un polipéptido marcado de manera detectable de la invención para detectar los niveles de VEGFR-2. Los niveles de VEGFR-2 detectados se comparan así a niveles de VEGFR-2 detectados en una muestra normal también contactada con el polipéptido marcado. Un aumento de al menos 1 0%, 20%, 30%, 40% , 50% , 60%, 70%, 80% o 90% en los niveles de VEGFR-2 puede considerarse un indicador de diagnóstico de una condición caracterizada por angiogenesis inadecuada. En ciertas modalidades, los polipéptidos de unión de VEGFR-2 de la invención se unen además a una marca que es capaz de detectarse (por ejemplo, la marca puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o co-factor de enzima). La porción activa puede ser un agente radioactivo, tal como: metales pesados radioactivos tales como quelatos de hierro, quelatos radiaoctivos de gadolinio o manganeso, emisores de positrón de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono, o galio, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 123l , 125l , 1 31 l , 132l , o 99Tc. Un agente de unión fijo a tal porción puede utilizarse como un agente de representación por imágenes y se administra en una cantidad eficaz para uso de diagnóstico en un mamífero tal como un humano y la localización y acumulación del agente de representación por imágenes se detecta así. La localización y acumulación del agente de representación por imágenes puede detectarse por radioscintigrafía, representación por imágenes de resonancia magnética nuclear, tomografía computarizada o tomografía de emisión de positrón. La inmunoescintigrafía que utiliza polipéptidos de unión de VEGFR-2 dirigidos a VEGFR puede utilizarse para detectar y/o diagnosticar los cánceres y vasculatura. Por ejemplo, cualquier polipéptido de unión contra el marcador de VEGFR- 2 marcado con "Tecnetio, 1 1 1 l ndio, o 125Yodo puede utilizarse eficazmente para tal representación por imágenes. Según será evidente para aquel experto, la cantidad de radioisótopo a administrar es dependiente del radioisótopo. Aquellos que tienen experiencia ordinaria en la materia pueden formular fácilmente la cantidad del agente de representación por imágenes a administrar en base a la actividad específica y energía de un radionúclido dado utilizado como la porción activa. Típicamente, 0.1 -1 00 milicuries por dosis de agente de representación por imágenes, preferentemente 1 -1 0 milicuries, más frecuentemente 2-5 milicuries, se administran. De esta manera, las composiciones de acuerdo a la presente invención útiles como agentes de representación de imágenes que comprenden una porción de objetivo conjugada a una porción de radioactiva comprenden 0.1 -100 milicuries, en algunas modalidades preferentemente 1 -1 0 milicuries, en algunas modalidades preferentemente 2-5 milicuries, en algunas modalidades más preferentemente 1 -5 milicuries. Los polipéptidos de unión de VEGFR-2 de la presente invención pueden también utilizarse para suministrar agentes terapéuticos adicionales (incluyendo pero no limitándose a compuestos de fármaco, compuestos quimioterapéuticas, y compuestos radioterapéuticos) a una célula o tejido que expresa VEGFR-2. En un ejemplo, el polipéptido de unión de VEGFR-2 se fusiona a un agente quimioterapéutico para el suministro objetivo del agente quimioterapéutico para una célula tumoral o tejido que expresa VEGFR-2.
Los polipétidos de unión de VEGFR-2 de la presente invención son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéutica. Por ejemplo, pueden utilizarse para aislar y/o purificar el receptor o partes del mismo, y para estudiar la estructura del receptor (por ejemplo, conformación) y función. En ciertos aspectos, los diversos polipéptidos de unión de la presente invención pueden utilizarse para detectar o medir la expresión de VEGFR-2, por ejemplo, en células endoteliales (por ejemplo, células endoteliales venosas), o en células transfectadas con un gen VEGFR-2. De esta manera, también tienen utilidad en aplicaciones tales como sorteo y representación por imágenes de célula (por ejemplo, citometría de flujo, y sorteo de célula activada de fluorescencia), para propósitos de diagnóstico o investigación . En ciertas modalidades, los polipéptidos de unión de fragmentos de los mismos pueden marcarse o no marcarse para propósitos de diagnóstico. Típicamente, los ensayos de diagnóstico comprenden detectar la formación de un complejo que se da como resultado de la unión de un polipéptido de unión a VEGFR-2. Los polipéptidos de unión o fragmentos pueden marcarse directamente, similares a los anticuerpos. Una variedad de marcas pueden emplearse, incluyendo, pero no limitándose a, radionúclidos, fluorescentes, enzimas, sustratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima y ligantes (por ejemplo, biotina, haptenos). Numerosos inmunoensayos adecuados se conocen por el experto en la materia (véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. Nos. 3,817,827; 3,850,752; 3,901 ,654, y 4,098,876). Cuando no se marcan, los polipéptidos de unión pueden utilizarse en ensayos, tales como ensayos de aglutinación. Los polipéptidos de unión sin marcar también pueden utilizarse en combinación con otro (uno o más) reactivo adecuado que puede utilizarse para detectar el polipéptido de unión, tal como un reactivo de anticuerpo marcado con el polipéptido de unión u otro reactivo adecuado (por ejemplo, proteína marcada A). En una modalidad, los polipéptidos de unión de la presente invención pueden utilizarse en inmunoensayos de enzima, en donde los polipéptidos sujeto se conjugan para una enzima. Cuando una muestra biológica que comprende una proteína de VEGFR-2 se combina con los polipéptidos de unión sujeto, la unión se presenta entre los polipéptidos de unión y la proteína de VEGFR-2. En una modalidad, una muestra que contiene células que expresan una proteína de VEGFR (por ejemplo, células endoteliales) se combina con los anticuerpos sujeto, , y la unión se presenta entre los polipéptidos de unión y las células que llevan una proteína de VEGFR-2 reconocida por el polipéptido de unión. Estas células unidas pueden separarse de reactivos sin unir y la presencia del conjugado de polipéptido-enzima de unión específicamente unido a las células puede determinarse, por ejemplo, al contactar la muestra con un sustrato de la enzima que produce un color u otro cambio detectable cuando se acciona sobre la enzima. En otra modalidad, los polipéptidos de unión sujeto pueden no marcarse, y un segundo, polipéptido no marcado (por ejemplo, un anticuerpo) puede agregarse lo cual reconoce el polipéptido de unión sujeto. En ciertos aspectos, los equipos para utilizarse en la detección de la presencia de una proteína VEGFR-2 en una muestra biológica también puede prepararse. Tales equipos incluirán un polipéptido de unión VEGFR-2 que se une a una proteína VEGFR-2 o parte de dicho receptor, así como también uno o más reactivos ancilares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre el polipéptido de unión y la proteína de receptor o partes de la misma. Las composiciones de polipéptido de la presente invención pueden proporcionarse en forma liofilizada, ya sea solas o en combinación con anticuerpos adicionales específicos para otros epítopos. Los polipéptidos y/o anticuerpos de unión, que pueden marcarse o no marcarse, pueden incluirse en los equipos con ingredientes adjuntos (por ejemplo, reguladores, tales como Tris, fosfato y carbonato, estabilizadores, excipientes, biocidas y/o proteínas inertes, por ejemplo, albúmina de suero de bovino). Por ejemplo, los polipéptidos y/o anticuerpos de unión pueden proporcionarse como una mezcla liofilizada con los ingredientes adjuntos, o los ingredientes adjuntos pueden proporcionarse por separado para combinación por el usuario. Generalmente estos materiales adjuntos se presentarán en menos de aproximadamente 5% en peso en base a la cantidad de polipéptido de unión o anticuerpo activo, y usualmente se presentará en una cantidad total de al menos aproximadamente 0.001 % en peso en base a la concentración de anticuerpo o polipéptido. En donde un segundo anticuerpo capaz de unirse al polipéptido de unión se emplea, tal anticuerpo puede proporcionarse en el equipo, por ejemplo, en un contenedor o frasco separado. El segundo anticuerpo, si se presenta, se marca típicamente, y puede formularse en una manera análoga con las formulaciones de anticuerpo anteriormente descritas. De igual forma, la presente invención también se refiere a un método para detectar y/o cuantificar la expresión de VEGFR-2, en donde una composición que comprende una célula o fracción de la misma (por ejemplo, fracción de membrana) se contacta con un polipéptido de unión que se une a VEGFR-2 o parte del receptor bajo condiciones adecuadas para unirse al mismo, y la unión se monitorea. La detección del polipéptido de unión, indicadora de la formación de un complejo entre el polipéptido de unión y VEGFR-2 o una parte de la misma, indica la presencia del receptor. La unión de un polipéptido a la célula puede determinarse por métodos estándares, tales como aquellos descritos en los ejemplos de trabajo. El método puede utilizarse para detectar la expresión de VEGFR-2 en células de un individuo. Opcionalmente, una expresión cuantitativa de VEGFR-2 en la superficie de células endoteliales puede evaluarse, por ejemplo, por la citometría de flujo, y la intensidad de coloración puede correlacionarse con la susceptibilidad de enfermedad, progreso o riesgo. La presente invención también se refiere a un método para detectar la susceptibilidad de un mamífero a ciertas enfermedades. Para ilustrar, el método puede utilizarse para detectar la susceptibilidad de un mam ífero a enfermedades que avanzan en base a la cantidad de VEGFR-2 en células y/o el número de células positivas de VEGFR-2 en un mamífero. En una modalidad, la invención se refiere a un método para detectar la susceptibilidad de un mamífero a un tumor. En esta modalidad, una muestra a probar se contacta con un polipéptido de unión que se une a VEGFR-2 o parte de la misma bajo condiciones adecuadas para la unión a la misma, en donde la muestra comprende células que expresan VEGFR-2 en individuos normales. La unión y/o cantidad de unión se detecta, que indica la susceptibilidad del individuo a un tumor, en donde los niveles más altos de receptor se correlacionan con la susceptibilidad aumentada del individuo a un tumor.
EJEMPLOS: Los siguientes ejemplos son para los propósitos de ilustrar la invención, y no deberán interpretarse como limitantes: Ejemplo 1 . Identificación Inicial de moléculas de unión KDR Una biblioteca de aproximadamente variantes de fusión de proteína de ARN 1 013 se construyó en base al microandamio del décimo dominio tipo 3 de fibronectina humana con tres regiones aleatorias en las posiciones 23-29, 52-55 y 77-86 (nos. de aminoácido se refieren como SEQ I D NO:5) (biblioteca de tres ciclos; Xu eí al. , Chemistry & Biology 9:933-942, 2002). Las bibliotecas similares se construyeron conteniendo regiones aleatorias solamente en las posiciones 23-29 y 77-86 (biblioteca de dos ciclos) o solamente en las posiciones 77-86 (biblioteca de un ciclo). Una mezcla de estas tres bibliotecas se utilizó para la selección in vitro contra el dominio extracelular de VEGFR-2 humana (KDR, dominio extracelular, residuos 1 -764 fusionado a lgG1 Fe humana). Para los propósitos de esta aplicación, las posiciones de aminoácido de los ciclos se definirá como residuos 23-30 (Ciclo BC), 52-56 (Ciclo DE) y 77-87 (Ciclo FG). La población de unión objetivo se analizo por secuencia de ADN después de seis rondas de selección y se encontró que era diversa, con algunos duplicados presentes. Las proteínas codificadas por quince clones independientes se seleccionaron para la unión a KDR (Figura 1 A) y los mejores aglutinantes se analizaron subsecuentemente para la inhibición de unión objetivo en la presencia de VEGF (Figura 1 B). Se identificaron múltiples clones que inhibieron la unión de KDR-VEGF, sugiriendo que estos clones unieron KDR en o cerca del sitio de unión de ligante natural (VEGF). La habilidad de dos de las moléculas de unión (VR28 y VR12) para inhibir directamente la interacción de VEGF-KDR se evaluó en un ensayo BIAcore utilizando VEGF inmovilizado y una fase móvil que contiene KDR-Fc con o sin una proteína de unión seleccionada. VR28 y, a un grado menor, VR12, pero no un clon de no competencia (VR1 7), inhibió la unión de KDR a VEGF en una manera dependiente de dosis (Figura 1 C). Finalmente, además de la unión a KDR recombinante purificado, VR28 también apareció para unirse a células CHO que expresan KDR, pero no para controlar las células CHO (Figura 1 D).
La secuencia de los ciclos de unión del clon VR28 se muestra en la primera fila de la Tabla 4. Mientras que VR28 no fue el clon más abundante en la población de unión secuenciada (una copia de 28 clones secuenciados), su afinidad de unión a KDR fue la mejor entre los clones probados de su población de unión, con una constante de disociación de 1 1 -1 3 nM determinada en un ensayo de unión de equilibrio radioactivo (Figura 3 y la Tabla 5) y ensayos BIAcore (Tabla 7). No hubo cambios de 10Fn3 tipo silvestre en la parte de microandamio restante de la molécula (siguiendo la corrección de un cambio de microandamio incidental en la posición 69 que no tuvo efecto en la unión). Sin embargo, VR28 mostró la poca inhibición de señalización de VEGF-KDR en un ensayo de proliferación de célula dependiente de VEGF. De esta manera, mientras que la selección de la biblioteca natural produjo miméticos de anticuerpo que interfirieron con la interacción entre VEGF y KDR en estudios de unión bioquímica, las mejoras de afinidad fueron útiles para neutralizar la función en un ensayo de transducción de señal biológica.
Ejemplo 2. Maduración de Afinidad de Clon VR28 Una estrategia de mutagenesis que se enfoca en alterar las secuencias solamente en los ciclos de unión, se empleó. Para probar inicialmente qué ciclos fue más probable que dieran como resultado una mejora, PCR hipermutagénico dirigido por ciclo se llevó a cabo para introducir hasta 30% de mutaciones independientemente en cada ciclo de VR28. Después de tres rondas de selección contra KDR, los múltiples clones con unión mejorada a KDR-Fc se observaron. El análisis de secuencia de los grupos de selección revelaron que la mayoría de mutaciones se acumularon en el ciclo FG mientras que los ciclos BC y DE permanecieron casi intactos. Este resultado indicó que el ciclo FG fue el objetivo más adecuado para la modificación adicional. Por consecuencia, una nueva biblioteca de aproximadamente 1 012 variantes se construyó al alterar la secuencia de VR28 en el ciclo FG utilizando mutagenesis de oligonucleótido. Par cada una de las posiciones de ciclo FG (residuos 77-86 [VAQNDHELIT (SEAQ ID NO: 1 98)] así como también la siguiente Prolina [residuo 87]), una mezcla 50:50 del ADN codificador de VR28 y NNS se introdujo en cada posición. El análisis de secuencia de ADN de una muestra al azar de aproximadamente 80 clones reveló un promedio de seis cambios de aminoácido por clon según se esperaba. Las concentraciones KDR-Fc inferiores se utilizaron durante la selección para favorecer los clones con mejores afinidades hacia el objetivo. El perfil de la unión de objetivo durante las cuatro rondas de selección se muestra en la Figura 2. Después de cuatro rondas de selección, la población de unión se subclonó y se analizó. La Tabla 5 y la Figura 3A resumen las mediciones de afinidad de clones de unión individuales. Las constantes de unión medidas para KDR-Fc variaron de <0.4 a <1 .8 nM, una mejora 10-30 sobre VR28 (1 1 nM). El análisis de secuencia, algo del cual se muestra en la Tabla 4 (clones K), reveló que mientras que la población de unión fue diversa, varios motivos de consenso podrían identificarse entre los clones. Más notablemente, Pro87 y Leu84 se encontraron en casi todos los clones (como en VR28), sugiriendo que estos residuos pueden ser esenciales para la estructura del sitio de unión. Un aminoácido positivamente cargado en la posición 82 parece requerirse ya que solamente los cambios de H82K y H82R se observaron en los clones secuenciados y un aminoácido alifático estuvo predominante en la posición 78. D81 se mutó frecuentemente a un G, dando como resultado la pérdida de carga negativa en esta posición y una ganancia en flexibilidad. Además, la velocidad de mutación global en la población seleccionada fue comparable al grupo antes de la selección, que sugirió que el ciclo FG está muy abierto a cambios. Varios residuos en la terminal N del dominio 10Fn3 de fibronectina humana se ubican en proximidad cercana al ciclo GF, según se sugiere por las determinaciones estructurales (Main eí al. , Cell 71 :671 -678, 1 992). La proximidad cercana de las dos regiones podría potencialmente tener un impacto negativo en la unión objetivo. Dos mutaciones incidentales en la región de terminal N, L8P y L8Q, dio como resultado la mejor unión a KDR en un número de clones seleccionados, presuntamente debido a un cambio de la ubicación de la terminal N en relación al ciclo FG. Para probar más el impacto de la terminal N, creamos moléculas de unión para 23 diferentes aglutinantes de KDR en los cuales los primeros ocho residuos de terminal N antes de la placa ß se suprimieron. Comparamos así la unión objetivo a las contrapartes no suprimidas. En promedio, la unión a KDR-Fc fue de aproximadamente 3 veces mejor con la supresión, según se muestra en la Figura 3B.
Ejemplo 3. Selección de aglutinantes con especificidades duales a VEGFR-2 humana (KDR) y de ratón (Flk-1 ). VR28 y la mayoría de las variantes maduradas por afinidad (clones K) fallaron en unir el homólogo de ratón de KDR, Flkl , según se muestra en la Figura 4. Sin embargo, ya que KDR y Flkl comparten un alto nivel de identidad de secuencia (85%, Claffey, eí al. , J . Biol. Chem . 267: 16317-16322 (1992), Shima eí al. , J. Biol. Chem. 271 :3877-3883 (1996)), es concebible aislar los miméticos de anticuerpo que pueden unir tanto KDR como Flkl . Tales aglutinantes duales fueron deseables debido a que podrían permitir a la misma molécula probarse en estudios funcionales en modelos de animal y subsecuentemente en humanos. La población de clones siguiente a la mutagenesis de ciclo FG y selección contra KDR para cuatro rondas se seleccionó además contra Flkl por un adicional de tres rondas. Según se muestra en la Figura 2, un aumento en la unión a Flkl se observó de la Ronda 5 a la Ronda 7, indicando enriquecimiento de aglutinantes Flkl . El análisis de unión para clones individuales múltiples reveló que en contraste a los clones seleccionados contra KDR solamente (clones K) , la mayoría de los clones derivados de selección adicional contra Flkl (clones E) son capaces de interactuar tanto con KDR como Flkl . Las constantes de unión a ambos objetivos, según se determina utilizando un ensayo de unión de equilibrio radioactivo (Tabla 6 y Figura 5) y BIAcore (Tabla 7), indican que los clones individuales fueron capaces de unirse a ambos objetivos con altas afinidades. Por ejemplo, E 1 9 tiene un Kd de 60 pM a KDR, y 340 pM a Flk-1 . Estos resultados demuestran que una estrategia de interruptor objetivo simple en el proceso de selección, presuntamente a través de las presiones de selección ejercidas por ambos objetivos, ha permitido el aislamiento de moléculas con especificidades de unión duales tanto a KDR como FLK-1 de una población mutagenizada de VR28, un aglutinante KDR moderado que no fue capaz de unirse a Flk-1 . Las proteínas de unión basadas en fibronectina seleccionadas son altamente específicas para VEGFR-2 (KDR) a medida que nada de unión sustancial a VEGFR1 se observó en concentración de objetivo alta. El análisis de secuencia reveló algunos motivos similares a aquellos observados en el grupo de aglutinante KDR (Leu y Pro en residuos 84 y 87 respectivamente; aminoácido positivamente cargado en el residuo 82, predominante Arg) y de cierta forma no se mantuvieron (alifático en la posición 78) . Además, el motivo ERNGR (residuos 78-82) se presentó en casi toda la unión de clones a Flk-1 (Tabla 4): este motivo fue raramente discernible en el grupo de unión de KDR. R79 y R82 parece que son particularmente importantes para la unión de alta afinidad a Flk-1 , ya que la unión a Flk-1 , pero no KDR, se reduce mayormente cuando un residuo diferente se presenta en esta posición (Figura 6A). Para determinar la importancia de cada grupo en la unión a KDR y Flk-1 , los ciclos de clones E6 y E26 mostrados en la Tabla 4, se sustituyeron un ciclo a la vez por secuencia aleatoria NNS. Según se muestra en la Figura 6B, después de la sustitución, las proteínas ya no son capaces de unir ya sea KDR o Flk-1 . Estos resultados indican que cada grupo se requiere para la unión a los objetivos, sugiriendo una participación cooperativa de todos los tres grupos en la interacción con los objetivos. Una estrategia de mutagenesis alternativa se empleó independientemente para producir clones capaces de unirse a ambos objetivos. El clon L590(8)L (Tabla 4), el producto de maduración de afinidad PCR hipermutagénica de VR28 que inhibe KDR con alta afinidad (Kd=2 nM ; Tabla 7) y Flk-1 con escasa afinidad (Kd>300 nM), se seleccionó como un punto de inicio. Los primeros seis aminoácidos del ciclo FG se seleccionaron al azar completamente (NNS) dejando los siguientes cinco residuos (ELFTP) intactos. Después de seis rondas de selección contra Flk-1 , el grupo de unión se volvió a seleccionar al azar en el ciclo DE (posiciones 52-56) y la selección se realizó por tres rondas adicionales contra Flk-1 y una ronda contra KDR. Un número de moléculas de alta afinidad tanto a KDR como Flk-1 se obtuvieron de esta manera (Tablas 4 y Figura 4). Por ejemplo, clon M5FL, mientras que se retiene la alta afinidad de unión a KDR (Kd=890 pM), puede unir Flk-1 a una Kd de 2.1 nM, una mejora de 1 000 pliegues sobre el clon original. De manera interesante, el motivo ERNGR, encontrado en las moléculas de unión de Flk-1 seleccionadas de una población mutagenizada de VR28, también se presentó en múltiples clones derivados de mutagénesis 159Q(8)L y selección, en lugar de una selección al azar completa de esta región del ciclo FG. El aislamiento de moléculas de unión similares de dos bibliotecas independientes sugiere que el proceso de maduración de afinidad es robusto para el aislamiento de motivos de unión de Flk-1 óptimos ubicados en el ciclo FG.
Ejemplo 4. Unión de superficie de célula y neutralización de actividad VEGF in vitro. La funcionalidad de las moléculas de unión KDR y Flk-1 en un sistema de modelo de cultivo celular se evaluó con moléculas de unión que produjeron E. coli. Utilizando un sistema de detección que consiste de un anticuerpo murino tag anti-His6 (las proteínas expresadas E. coli se expresaron con una tag His) y un anticuerpo fluorescentemente marcado anti-murino, las moléculas de unión se mostró que se unieron específicamente a células de mam ífero que expresan KDR o Flk-1 con EC50s nanomolares bajos (Figura 7 y Tabla 8). De manera más importante, utilizando las células BA/F3 recombinantes (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GMBH) que expresan el dominio Flk-1 o KDR extracelular unido al dominio de señalización de receptor de eritropoyetina, estas moléculas inhibieron la proliferación celular estimulada por VEGF en una forma dependiente de dosis, con IC50 3-1 2 nM para las células que expresan KDR, y 2-5 mM para células que expresan Flk-1 . La potencia de inhibición parece que es similar para controlar los anticuerpos monoclonales anti-Flk-1 y anti-KDR, según se muestra en la Figura 8 y la Tabla 9. Un número de clones se probaron además para la inhibición de VEGF del crecimiento de células H UVEC (Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana). Las células HUVEC son células humanas naturales que se relacionan cercanamente a las células en el cuerpo que responden a VEGF. Según se muestra en la Figura 9 y la Tabla 1 0, las proteínas de unión basadas en fibronectina también fueron activas en la inhibición de la actividad de VEGF en este sistema de célula derivado de humano mientras que la proteína de microandamio basada en fibronectina tipo silvestre fue inactiva.
Ejemplo 5: Estabilidad Térmica y Repliegue Reversible de Proteína M5FL La estabilidad térmica de aglutinante KDR M5FL se estableció utilizando la calorimetría de exploración diferencial (DSC). Bajo las condiciones de regulador de PBS estándar (fosfato de sodio pH 7.4, 150 mM de NaCI), M5FL se encontró que tenía transición de fusión térmica no reversible única a 56°C. Por consecuencia, el acetato de sodio pH 4.5 se identificó como un regulador favorable para la solubilidad de proteína M5FL. Los experimentos DSC en este regulador (1 00 mM) demostraron que M5FL es más estable bajo estas condiciones (Tm=67-77°C) y que la transición de fusión es reversible (Figura 10) . Las transiciones térmicas reversibles se han utilizado para identificar las condiciones favorables que soportan el almacenamiento a largo plazo de terapéuticos de proteína (Remmele eí al. , Biochemistry 38:5241 (1 999), de tal modo que pH 4.5 de Na-acetato se ha identificado como un regulador optimizado para almacenar la proteína M5FL.
Ejemplo 6. Unión in vitro y Actividad Basada en célula de Proteína M5FL PEGilada La proteína M5FL se produjo en un sistema de expresión E. coli con una extensión de C-terminal para producir la siguiente secuencia de proteína (extensión de C-terminal subrayada con Cys1 00 sombreada; un porcentaje importante de proteína se produce con la metionina inicial removida): MGVSI?Wi LEWA TP?SL KWRI©^ HHHH<SEQH>K0 1 9) El sulfhidrilo único del residuo de cisteína en la posición 100 se utilizó para acoplar las variantes PEG utilizando química de maleimida estándar para producir dos diferentes formas PEGiladas de M5FL. Tanto 20 kD PEG lineal como una 40 kD PEG ramificada (Shearwater Corporation) se conjugaron a M5FLA para producir M5FL-PEG20 y M5FL-PEG40, respectivamente. Las formas de proteína PEGiladas se purificaron de proteína sin tratar y PEG por cromatografía de intercamio de iones. El enlace covalente de las dos formas PEG de M5FL se verificó por SDS-PAGE (Figura 1 1 ) y espectrometría de masa. Las mediciones de afinidad in vivo se hicieron utilizando la resonancia de plasmón de superficie (SPR) (BIAcore) tanto con proteínas objetivo de receptor VEGF de ratón como humano inmovilizadas por medio de la química amida en el chip BIAcore. Para ambas proteínas objetivo, se encontró que las formas M5FL 20 y 40 kD PEGiladas tenían velocidades activas más lentas (ka) ren relación a M5FL sin modificar con poco efecto en velocidades inactivas (kd; Tabla 1 1 ). La funcionalidad de las preparaciones M5FL PEGiladas se probó utilizando el sistema Ba/F3 descrito en el Ejemplo 4. La Figura 12 muestra un diagrama de A490 (representando el grado de proliferación celular) como una función de concentración de cada uno de los aglutinantes. Las curvas fueron casi idénticas, indicando que hubo poco efecto de PEGilación en la actividad biológica de cualquiera de las formas PEGiladas. La kactiva, kinactiva, y KD se analizaron por un subgrupo de polipéptidos de unión de KDR y se compararon a los EC50 para el ensayo de inhibición de VEGF basado en célula BaF3. Los diagramas scatter mostraron que kactiva se correlacionó bien con el EC50, mientras que kinactiva se correlacionó escasamente. Más del 90% de proteínas de unión de KDR con un kactiva de 105s-1 o más tuvo un EC50 de 10 mM o menos. KD es una proporción de kactiva y kinactiva, y, según se espera, muestra un grado intermedio de correlación con EC50. Varias de las proteínas de unión de KDR, incluyendo CT-01 , se valoraron para la unión a VEGFR-1 , VEGFR-2 y VEGFR-3. Las proteínas mostraron un alto grado de selectividad para VEGFR-2.
Ejemplo 6: Preparación de Proteína de Unión KDR CT01 Bloquea Señalización VEGFR-2 en Células Endoteliales Humanas. Siguiendo las metodologías descritas en los Ejemplos precedentes, las proteínas de unión KDR basadas 10Fn3 adicionales se generaron. Según se describe para el desarrollo de la proteína M5FL en el Ejemplo 5, anterior, las proteínas se probaron para KD contra KDR humana y Flk-1 humana utilizando el ensayo de unión BIAcore y para IC50 en un ensayo de Ba/F3. Una proteína denominada CT-01 mostró propiedades deseables en cada uno de estos ensayos y se utilizó en análisis adicional. El clon inicial del cual CT-1 01 se derivo tuvo una secuencia: GBWAA?TSIXIS KHPHFFraYY^^ KP^VDYpTVYAVTDGWNGR SlPlSM¥RT (SEQ IPM flQ).
La maduración de afinidad según se describe anteriormente produjo una forma de núcleo de CT-1 01 : La molécula CT-01 anterior tiene una supresión de los primeros 8 aminoácidos y puede ncluir aminoácidos adicionales en la terminal C o N. Por ejemplo, una secuencia MG adicional, puede colocarse en la terminal N. La M usualmente se dividirá, dejando una secuencia GEV... en la terminal N. La re-adición de los 8 aminoácidos normales en la terminal N también produce una proteína de unión KDR con propiedades deseables. La metionina N-terminal se divide generalmente para producir una secuencia: VSD RD1£WAATPTSLUSWRHPHF^ TATISGIKPGVDYITrVYAYpXJKKGI^ (SEQ EL>NO:193).
Para utilizarse una forma in vivo, adecuada para PEGilación puede generarse. Por ejemplo, un extremo de terminal C que comprende una cisteína se agregó y se expresó, según se muestra abajo por una forma que carece de los ocho de aminoácidos de terminal N.
KTOVBYTII VTDG S-lIiSffíS^ Tbe La forma PEGilada de esta molécula se utiliza en los experimentos in vivo abajo descritas. Una forma de control con una serina en lugar de una cisteína también se utilizó: KPGVDYTIIVYAVTD^gNQ l EISINYRTEI PS (SEQ ID NCM95).
Los mismos extremos de terminal C también pueden agregarse a las formas CT-01 que tienen los ocho aminoácidos de terminal N, tal como se muestra en SEQ I D NO: 1 93. Las variantes adicionales con propiedades de unión de KDR deseables, se aislaron. La siguiente secuencia de núcleo tiene un ciclo FG de cierta forma diferente, y puede expresarse con, por ejemplo, una secuencia MG de terminal N , una secuencia de terminal N que restaura los 8 aminoácidos suprimidos, y/o un extremo de terminal C para proporcionar una cisteína para PEGilación.
E AATi?reilJSWRHP??FP?tYYim?G^ PGVDYOTVYÁVTeGPHERSLFIPISllv Y T (SEQ ID NOílSd). . Otra tal variante tiene la secuencia de núcleo: TATBGl^l^GVPYICTWAV EGPÍiE SLF?PISINYRT (SEQ ID NO;19?>.
Una comparación de estas variantes muestra una secuencia de consenso para el ciclo FG de D/E)GXNXRXXIP (SEQ I D NO:3). Con mayor particularidad, la secuencia de consenso puede expresarse como (D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)I P (SEQ I D NO:4).
Ejemplo 7: CT-01 Bloquea Señalización de VEGFR-2 en Células Endoteliales Humanas. Según se muestra en la Figura 13, la señalización de VEGF-A a través de VEGFR-2 se media por fosforilación del dominio intracelular de VEGFR-2, seguido por la activación de la trayectoria que incluye fosfolipasa gamma C (PLC?), Quinasa de Proteína C (PKC), Raf-1 , MEK1 /2, ERK1 /2, conduciendo a la proliferación de célula endotelial. Para valorar si los aglutinantes de KDR descritos en la presente inhibieron la activación de esta trayectoria de señalización, las Células Endoteliales Microvasculares Humanas se trataron con un polipéptido de unión VEGFR (por ejemplo, CT-01 ) por 30 min y se estimularon con VEGF-A por 5 min. Los lisatos de célula total se analizaron por SDS-PAGE y análisis western, utilizando los anticuerpos específicos para fosfo-VEGFR-2, VEGFR-2 no fosforoso, fósforo-ERK1 /2 y no-fosfo-ERK1 /2. Según se muestra en la Figura 1 3, 1 30 pM CT-01 inhibe la formación de fósforo-VEGFR-2 y también reduce la formación del ERK1 /2 fosforilatado río abajo. ERK1 /2 fosforilatado no se elimina completamente, probablemente debido al hecho de que ERK1 /2 recibe señales de un número de trayectorias de señalización adicionales.
Ejemplo 8: Proteínas de Unión KDR basadas en Fibronectina Rompen la Señalización por VEGF-A y VEGF-D. VEGFR-2 es un receptor para tres especies de VEGF, VEGF-A, VEGF-C y VEGF-D. Los experimentos se condujeron para evaluar los efectos de las proteínas de unión de KDR basadas en fibronectina en señalización mediad por VEGF-A y VEGF-D a través de KDR. Una estirpe de célula Ba/F3 dependiente de la señalización mediada por Flk-1 se generó. Según se muestra en el panel izquierdo de la Figura 14, la viabilidad celular podría mantenerse al tratar las células con VEGF-A o VEGF-D, a pesar de que los niveles significativamente mayores de VEGF-D se requirieron. Según se muestra en el panel medio de la Figura 14, las células se mantuvieron en la presencia de 15 ng/ml de VEGF-A y se contactaron con las proteínas M5FL o CT-01 descritas en la presente, o con el anticuerpo DC-101 y anti-Flk-1 . Cada reactivo invirtió la viabilidad celular mediada por VEGF-A, indicando que la señalización de VEGF-A a través de Flk-1 se bloqueó. Según se muestra en el panel derecho de la Figura 14, las células se mantuvieron en la presencia de 300 ng/ml de VEGF-D y se contactaron con las proteínas M5FL o F10 descritas en la presente, o con un anticuerpo anti-VEGF-A. M5FL y FG 10 invirtieron la viabilidad celular mediada por VEGF-D, indicando que la señalización de VEGF-D a través de Flk-1 se bloqueó. El anticuerpo anti-VEGF-A no tuvo efecto, demostrando la especificidad del ensayo.
Ejemplo 9: Farmacocinética Estudios de Farmacocinética: CT-01 nativo o una forma pegilada (40 kDa PEG, CT-01 PEG40) se pusieron en yodo con 125l . 1 0-20 mCi de proteínas con yodo se inyectaron en ratas macho adultas ya sea i.v. o i.p. y los niveles de proteínas con yodo se determinaron en los tiempos indicados. Para los estudios de distribución de tejido, las ratas se sacrificaron a los 15 min , 2 hr y 6 hr y los niveles de radioactividad se determinaron. Véase Figuras 15 y 16. CT-01 si modificar es una proteína 12 kDa que se evacúa rápidamente de la sangre. El valor de área-bajo-curva valor (AUC) es 14.6 hr* mg/mL con una evacuación de 69.9 mL/hr/kg, una máxima concentración de suero de 9.1 mg/ml. La vida media inicial (a) es 0.3 horas y la vida media de segunda fase (ß) es 13.5 horas. Por comparación, CT-01 PEGilado i.v. tuvo presencia mayormente aumentada en la sangre, mayormente debido a una reducción dramática en la fase inicial de evacuación. El AUC se aumenta más de 1 0 veces a 193, la velocidad de evacuación se reduce por más de 1 0 veces a 5.2, la Cmax es 12.9 mg/mL. La vida media a se aumenta a 1 hora, y la ß se aumenta a 16.2 horas. Estas farmacocinéticas en las ratas son equivalentes a un régimen de dosificación dos veces a la semana en humanos, una velocidad de dosificación que se encuentra bien dentro de los rangos aceptables. La administración intraperitoneal (i. p.) de CT-01 PEGilado tiene farmacocinética tipo recipiente. No hubo aguja inicial en la concentración de sangre de CT-01 . A su vez, la cantidad de CT-01 se construyó más lentamente y se redujo lentamente. Tal farmacocinética puede ser deseable en donde existe interés por los efectos secundarios del aguja inicial en la concentración de CT-01 en la administración intravenosa. Es probable que otros agentes basados 10Fn3 podrían mostrar comportamiento similar en la administración i. p. De acuerdo con lo anterior, esto puede ser un modo generalizable para lograr un efecto de dosificación retardada en tiempo con agentes basados en 10FN3. Según se muestra en la Figura 1 6, el hígado es la vía principal para la secreción de la forma PEGilada de CT-01 . No se detectó la acumulación a largo plazo de CT-01 . Se obtuvieron resultados similares utilizando un CT-01 conjugada a 20 kDa de porción PEG.
Ejemplo 1 0: Eficacia In Vivo de CT-01 . El ensayo Miles, según se señala en la Figura 17, se utiliza para evaluar los parámetros de Dosis, Horario y Administración para los estudios de eficacia tumorales. Los ratones hembra Balb/c se inyectaron i. p. con regulador o CT-01 PEG40 en 1 , 5 y 20 mg/kg. La administración focal intradérmica de VEGF-A en la piel de espalda induce la pérdida de vasos de tinte azul Evans (Figura 17 y 1 8). Los ratones tratados con un agente de unión KDR mostraron una reducción estadísticamente importante en el nivel de pérdida de vaso mediada por VEGF. Tanto 5 mg/kg como 20 mg/kg de dosis con CT-01 mostraron resultados importantes. Por lo tanto, una dosis de 5 mg/kg se seleccionó para estudios de modelo de tumor de ratón.
Ejemplo 1 1 : CT-01 Inhibe el Crecimiento de Tumor Ensayo de Tumor de Melanoma Murino B16-F1 0: Las células tumorales de melanoma murino 2x1 06 B16-F1 0 se implantaron subcutáneamente en ratones macho C57/BL en el Día 1 . En el día 6 se detectó una masa palpable. En el día 8 cuando los tumores fueron de tamaño medible, las inyecciones i. p. diarias ya sea de vehículo de control, 5, 1 5, o 40 mg/kg de CT-01 PEG40 se iniciaron. La dosis inferior 5 mg/kg redujo el crecimiento tumoral. En el día 18, los ratones tratados con 15 y 40 mg/kg mostraron 50% y 60%> de reducción en el crecimiento tumoral. Véase Figura 1 9. Ensayo de Glioblastoma Humano U87: Las células tumorales de glioblastoma humano 5x106 U87 se implantaron subcutáneamente en ratones macho desnudos. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 50 mm3 el tratamiento comenzó (día 0). Vehículo control, 3, 1 0, o 30 mg/kg de CT-01 PEG40 se inyectaron i.v. cada día (EOD). El anticuerpo DC101 anti-Flk-1 se inyectó en 40 mg/kg dos veces a la semana según se publicó para su horario de dosis óptima. La dosis más baja 3 mg/kg redujo el crecimiento de tumor. En el día 12, los ratones tratados con 10 y 30 mg/kg mostraron 50% de reducción en el crecimiento de tumor. Véase Figura 20. La efectividad es comparable a aquella del anticuerpo anti-Flk-1 . Los siguientes materiales y métodos se utilizaron para los experimentos descritos en los Ejemplos 1 -1 1 .
Proteínas recombinantes: VEGF165 humana recombinante, VEGF164 murino, neurotrofina-4 humana (NT4), quimeras 2Fc de receptor de factor de crecimiento endotelial vascular de ratón y humano (KDR-Fc y Flk-1 -Fe) se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis, MN). La biotinilación de las proteínas objetivo se llevó a cabo en 1 xPBS a 4°C por 2 horas en la presencia de EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce, I L). El exceso de EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin se removió por diálisis contra 1 x PBS. El nivel de biotinilación se determinó por espectroscopia de masa y las concentraciones de proteína objetivo se determinaron utilizando Ensayo Plus de Proteína Coomassie (Pierce, I L).
Cebadores: Los siguientes oligonucleótidos se prepararon por síntesis química para uso eventual en construcción de biblioteca y mutagénesis de clones seleccionados.
T7 TMV Fn: 5* GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CA TTA CTA TTT ACAATTACAATGQírtTCTGAT 'p,CC AGG3, (SEQIDNOSOí) T7 TMV supresión de terminal - N: 5> GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAÁ TTA CTA TTT AC ATT ACÁ ATG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC CTA 3* (SEQ B NO202) MK16S-4 A20: 5' TTT TTT TTT TTT TTT TJT TTÁ AAT AGC GGA TGC CIT (SEQIDNO£03) delantero terminal - N: 5* ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC CTA CTG ATC AGC TGG 3* (SEQ D NO:204) inverso BCDE 5' AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT TCC TCC TGT TTC TCC GTA AGT GAT CCT GTA ATA TCT 3' (SEQ ID NO:205> delantero BCDE: 5' AGA TAT TAC AGG ATC ACT TAC GGA GAA ACÁ GGA GGA AAT AGC CCT GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCT 3' (SEQ ID NO:2Q6) inverso DEFG: 5* AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC TCC AGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AGC TGT 3' (SEQ ID NO:207) delantero DEFG: 5' ACÁ GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGA GTT GAT TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3' (SEQ ID NO:208) PoIyA: terminal - c 5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTG TCG TCG TCG TCC TTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG GAA AT 3' (SEQ ID NO:209) H«3'FLAGSTOP: 5' TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTG TCG TCG TCG TCC TTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG G 3* {SEQ ID N02IO) VR28FG-5 : 5' GTG TAT GCTGTC ACr 123 145 463 665 165465 163425625645 447 ATT TCC ATT AAT TAC 3', (SEQ ID NO:211) en donde 1 =62.5%G + 12.5%A + 12.5%T + 12.5%C; 2=2.5%G + 12.5%A + 62.5%T + 12.5%C; 3=75%G + 25%C; 4=12.5%G + 2.5%A + 12.5%T + 62.5%C; 5=25%G + 75%C; 6= 12.5%G + 62.5%A + 12.5%T + 12.5%C; 7=25%G + 50%A + 25%C.
P1U2: 5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CA TTA CTÁ TTT ACÁ ATT CTA TCA ATA CAÁ TGG TGT CTG ATG TG CCG 3* (SEQ ID N0:2Í2) F2: 5' CCA GGA GAT CAG CAG GGA GGT CGG GGT GGC AGC CAC CAC TTC CAG GTC GCG CGG CÁC ATC AGA CAC CAT TGT V (SEQ D3 NO:2?3) BÍ5& S* ACC TCC CTG CTG ATC TCC TGG CGC CAT CCG CAT TTT CCG ACC CGC TAT TAC CG€ ATC ACT TAC G (SEQ ID' N0:214) F4; 5* CAC AGT GAA CT€ CTG GAC CGG GCT ATT G€C TCC TGT TTC GCC GTA AGT GAT GCG GTA ATA GCG 3* (SEQ BD NQ215) F5159; 5' CGG TCC AGG AGT TCA CTG TGC CGC TGC AGC CGC CGG CGG CTACeATC GCGGCCTTA AAC C 3* (SEQ 1DNGÍ2MÍJ FS-XS: 5* OS GTC CAG OAG TTC ACT GTG CCG NNS NNS NNS NNS NNS GCT ACC TCAGCGGCCITAAACC3*(SE IDN0:2Í7) F6: 5' AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC GOC AGG ITT AAG GCC GCT GAT GGT AG35 (SEQIDNO¡218) F7XS159: 5* ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT NNS NNS NNS NNS NNS NNS GAA CTG TTT ACC CCA ATT TCC ATC AAC TAC CGC ACÁ GAC TAC AAG3'(SEQIDN0:219} FS: 5* AAA TAG CGG ATG CGC GTT TGT TCT GAT CTT CCT TAT TTA TGT GAT GAT GGT GGT GAT GCT TGT CGT CGT CGT CCT TGT AGTCTGTGC GGT AGTTGAT3' (SE I ND220) C2asaIA2fc 5' TTT TTT TTT TTT ITT TTT TTA AAT AGC GGA TGC GCG TTT GTT CTG ATC TTC 3' (SEQ ID NO:221) C2RT: 5' GCG CGT TTG TTC TGA TCT TCC 3' (SEQ ID NQ:222} in erso hfo Be. 5* TGCC TCC TGT TTC GCC GTÁ A€J GAT GCG GTA ATA GCG SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN CCA GCT GAT CAG CAG 3' {SEQ E NG223) inverso foi DE: 5* GAT GGX AGC TGT SNN SNN SNN SNN AGG CAC AGT GAA CIC CTG GAC AGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCC 3* (SEQ ID NOr22) mversohfoi FG: 5' GTGCGGTA ATT AAT GGA AAT TGG SNN SNN SNN SNN SN SNNSN SNNSNNTSíiNAGTGAC AGC ATACAC3" (SE IDNO:225) m BCDE: 5*CCTOT0trTCTC€ AAGTG3*CSE lBNCfc22 del BCDE: 5* CACTTA CGG AGA AAC AGG AGG 3* (SEQ © k22?) delantero hfoi DE-FG- 5* ACÁ GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGC G?T GAT TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3* {SEQ ID NG:228) Frontal inverso FG: 5» AGT GAC AGC ATA CAC AGT 3' (SEQ ID NO.-229) PoIyA inverso hf01 RT Flag: 5* TTT TTT TTT T?T TTT TTT TTA AÁT AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT GCG GTA ATT AAT GGA 3' (SEQIDNO:230) 5-M-hKDR-lB? 5' TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAÁ GGT GCTG 3' (SEQ ID NO:231) 3-EPO*?KDR-23?2B: 5* AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT TCC AAG TTC GTC TTT TCC 3* (SEQ ID NO?32) 5-RknKDR-l; 5* TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAÁ GGC GCT G 3* (SEQ ID NOáE33) 3-EPQ/mKBR*2312: 5' AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT TCC AAG TTG GTC TTT TCC 3* <SBQfl> NG:23 > 5-RI-feTrfcB-!;*** TAG AGA ATT CAT GAT GTC GTC CTG GAT AAG GT 3' (SEQ IB Q335) 3-EpsRMHtB-13Mk 5' AGG GAG AGC GTC AGG ATO AGA TGT TCC CGA CCG GTT TTA 3* (SEQ ID N0 236? 5-bKDR lPCM274B; 5' GGA AAA GAC GAA CTT GGA ACT CAT CCT GAC GCT CTC CCT ' (SEQ ID N£k237) S-mKDR/EP?-2274; S1 GGA AAA GAC CAÁ CTT GGA ACT CAT CCT GAC GCTCTCCCT3> (SE ? NO,<238) 3-XHG-EPQR-30€& 5* TAG ACT CGA GTC AAG AGC AAG CCA CAT AGCT 3' (SE IDNa239) 5fhTrfcB/EpoR-1274: 5' TAA AAC CGG TCG GGA AC TCT CAT CCT GAC GCT CTC CCT 3' (SEQ ID N024D) Reguladores Los siguientes reguladores se utilizaron en los experimentos descritos en la presente. Regulador A (1 00 mM de TrisHCl, 1 M de NaCI, 0.05% de Tween-20, pH 8.0); Regulador B (1X PBS, 0.02% de Tritón X100); Regulador C (100 mM de TrisHCl, 60 mM de EDTA, 1 M de NaCI, 0.05% de TritonXl OO, pH 8.0; Regulador Ca (100 mM de TrisHCl, 1 M de NaCI, 0.05% de TritonXl OO, pH 8.0); • Regulador D (2M de NaCI, 0.05% de Tritón); Regulador E (1 X PBS, 0.05% de TritonXl OO, pH 7.4); Regulador F (1 X PBS, 0.05% de Tritón X100, 1 00 mM de imidazol, pH 7.4); Regulador G (50 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 0.02% de TritonX-1 00, 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino, 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, pH 7.4); Regulador H (50 mM de H EPES, 150 mM de NaCI, 0.02% de TritonXl OO, pH 7.4); Regulador I (1 x PBS, 0.02% de TritonX-100, 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino, 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, pH 7.4); Regulador J (1 xPBS, 0.02% de TritonX-1 00, pH 7.4); Regulador K (50 mM de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 5% de glicerol, 5 mM de CHAPS, 25 mM de imidazol, Cocktail de I nhibidor Proteasa Completo™ 1 x (Roche), pH 8.0); Regulador L (50 mM de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 25 mM de imidazol, pH 8.0); Regulador M (1 xPBS, pH 7.4, 25 mM de imidazol, pH 7.4); Regulador N (1 xPBS, 250 mM de imidazol, pH 7.4); Regulador O (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 0.005% de Tween 20, pH 7.4).
Construcción de biblioteca primaria: La construcción de la biblioteca utilizando el décimo dominio de fibronectina humana como un microandamio se describió previamente (Xu eí al. , 2002, supra). Tres regiones de ciclo, correspondientes a las posiciones 23-29, 52-55 y 77-86, respectivamente, se seleccionaron al azar utilizando NNS (mezclas de núcleotido estándar, en donde N=mezcla equimolar de A, G, T, C; S=mezcla equimolar de G y C) como el esquema codificador. Las bibliotecas similares se construyeron conteniendo regiones aleatorias solamente en las posiciones 23-29 y 77-86 (biblioteca de dos ciclos) solamente en las posiciones 77-86 (biblioteca de un ciclo). Estas bibliotecas se mezclaron en aproximadamente cantidades equimolares. Esta biblioteca mezclada contuvo clones ~1 x1 013 y se utilizó en la selección de KDR que identificó VR28.
Construcción de bibliotecta mutagénica: PCR hipermutagénico. La mutación de microandamio T(69) en clon VR28 se corrigió de regreso a la secuencia tipo silvestre por PCR (véase abajo) y no se observó cambio en las características de unión de aglutinante VR28 a KDR. Las mutaciones se introdujeron en las regiones de ciclo de VR28 utilizando las condiciones anteriormente descritas (Vartanian eí al. , Nuc. Acid Res. 24:2627-2631 , 1 996). Tres rondas de PCR hipermutagénico se condujeron en un templado VR28 utilizando los pares de cebador que flanquea cada ciclo (N-terminal delantero/BCDE inverso, BCDE delantero/DEFG inverso, DEFG delantero/terminal C poIyA). Los fragmentos resultantes se colocaron utilizando la extensión recubierta y PCR con cebadores de flanqueo T7TMVFn y MK1 65-4 A20. La secuenciación de ADN de los clones de la reacción de PCR final confirmó la colocación correcta de la biblioteca. Hasta 30% de la velocidad de mutagénesis se observó en las regiones de ciclo, según se comparó a 1 .5% en las regiones de microandamio. Mutagénesis Oligo. . La mutagénesis Oligo del ciclo FG de VR28 por PCR utilizó el cebador VR28FG, cebador inverso DEFG y cebadores de flanqueo. En cada posición de nucleótido que codifica el ciclo FG, VR28FG-50 contuvo 50% del nucleótido VR28 y 50% de una mezcla equimolar de todos los cuatro nucleótidos (N) o de G o C (S). Este esquema se diseño para dar como resultado aproximadamente 67% de los aminoácidos del ciclo FG de VR28 reemplazándose por otro aminoácido que se confirmó por la secuenciación de ADN . Sub-bibliotecas aleatorias 159 (Q8L). La mutagénesis oligo del ciclo FG de Clon 1 59 (Q8L) clon, una extensión de tres etapas y amplificación se realizó. Para la primera extensión, los pares de cebadores (a: FI U/2/F2. b: F3159/F4; c: F5159/F6, d: F7X6159/F8 se mezclaron en concentraciones iguales (1 00 pmol cada una) y se amplificaron por 1 0 ciclos. Para la segunda extensión, 1 /20 de las primeras reacciones se combinaron (a/b y . c/d) y la amplificación se continúo por otros 1 0 ciclos. Para desviar la amplificación a favor de la extensión en lugar del re-amasamiento de los fragmentos completamente complementarios, una amplifiación lineal de los productos de construcción medida (0.5 pmol cada uno) se realizó por un adicional de 20 ciclos utilizando 50 pmol ya sea de cebador delantero F1 U2 para el fragmento ab, o el cebador inverso C2asaiA20 para el fragmento cd. Finalmente, los fragmentos de construcción media extendida ab y cd se combinaron y se amplificaron por 20 ciclos sin ninguno de los componentes adicionales. El cebador 7FX6159 contuvo N NS en cada una de las primeras 6 posiciones codificadoras de Clon 1 59 (Q8L) y fue idéntico de otra forma al Clon 159 (Q8L)[. La correcta colección de la biblioteca 1 59 (Q8L)-FGX6 se confirmó por la secuenciación de ADN de clones de la reacción de PCR final. La sub-biblioteca contuvo clones ~1 x109. Para la selección al azar del grupo DE del grupo de selección de post ronda 6 (PR6) de la biblioteca (Q8L)-FGX6, dos fragmentos de construcción media se prepararon por PCR utilizando los cebadores F1 U2/F4 y F5X5/C2asaiA20. El cebador F5X5 contuvo NNS en las cuatro posiciones del ciclo DE así como también en la posición 56. Después, los fragmentos extendidos ab y cd se combinaron y se amplificaron por 20 ciclos sin ninguno de los componentes adicionales.
Introducción de mutaciones de punto, supresión y secuencias de ciclo al azar (NNS) en proteínas de microandamio basadas en fibronectina: La mutación de microandamio T(69)l de aglutinante VR28 se corrigió de regreso a la secuencia tipo silvestre en PCR de dos etapas utilizando el clon VR28 como un templado. Los fragmentos de construcción media, obtenidos con cebadores N-terminal delantero/DEGF inverso y DEFGdelantero/C-terminal polvA. se combinaron y el clon VR28 total (I69T) (designado como VRI28 en el texto) se construyó utilizando los cebadores T7TMV Fn y MK1 65-4 A20. La corrección de las mutaciones de terminal N en el clon 159 (Q8 a L) se realizó por PCR con cebadores N-terminal delantero/DEGF inverso y DEFGdelantero/C-terminal polvA seguido por extensión con cebadores T7TMV y MK165-4 A20. La introducción de supresión ?1 -8 en la N-terminal de proteínas de microandamio basadas en fibronectina se realizó por la amplificación utilizando cebadores supresión de N-terminal T7TMV v MK165-4 A20. Todas las construcciones se verificaron y/o analizaron por secuenciación de ADN. Todas las construcciones y bibliotecas mutagénicas contuvieron promotor T7 TMV en la región de flanqueo 5' y secuencias de tag His6 y tag Flag en la región de flanqueo 3' para la producción de fusión de proteína de ARN y la purificación in vitro.
Producción de fusión de proteína de ARN Para cada ronda de selección ADN PCR se transcribió utilizando el equipo de transcripción MegaScript (Ambion) a 37°C por 4 horas. El ADN templado se removió por digestión DNasal (Ambion) a 37°C por 20 minutos. El ARN se purificó por extracción de fenol/cloroformo seguida por filtración de gel en una columna NAP-25 (Amersham). El enlazador polimérico PEG 6/10 (5 Pso u age gga uge XXX XXX CC Pu 3', en donde Pso=C6-Psoralen, u, a, g, c=2'OMe-ARN, C=amididaes estándar, X: Separador Fosforamidita 9 (9-O-Dimetoxitritil-trietilénglicol, 1 -[(2-cianoetil)-(N, N-diisopropil)]-fosforamidita); Pu=Puromicina-CPG) se sintetizó según se describió previamente (Kurz eí al. Nuc. Acid Res. 28: 83, 2000). El enlazador se amasó para la biblioteca ARN en 0.1 M de NaCI, 25 mM de TrisCH, pH 7.0, por reducción de temperatura de gradiente de 85°C a 4°C. El enlazador y ARN se degradaron así al exponerse a la luz UV (365 nm) por 15 minutos. La mezcla degradada (600 pmol de ARN) se incluyó en una reacción de traducción in vitro utilizando el equipo de traducción de lisato de reticulocito de conejo (Ambion) en la presencia de metionina 35S-marcada a 30°C por 60 minutos. Para mejorar la formación de fusión, 0.5 M de KCl y 0.05 M de MgCI2, se agregaron a la reacción y se incubaron por 30 minutos a 4°C. Las moléculas de fusión se purificaron utilizando la cromatografía de oligo-dT celulosa (Sigma) como sigue. La traducción y mezcla de fusión se diluyó en regulador A (1 00 mM de TrisHCl, 1 M de NaCI, 0.05% de Tween-20, pH 8.0) y se agregó a oligo-dT-celulosa. La mezcla se giró a 4°C por 1 hora y se transfirió a una columna giratoria. Las perlas oligo-dT-celulosa se lavaron en la columna con 1 0 volúmenes de columna de regulador A y se eluyeron con 3 volúmenes de columna de H2O. La reacción de transcripción inversa se condujo con equipo de Transcripción I nversa SuperScript I I (I nvitrogen) por 1 hora a 42°C utilizando el cebador Hu3'FLAGSTOP. Para reducir la unión no específica potencial a través de las cisteínas reactivas los grupos tiol se reaccionaron con 1 mM de ácido 2-nitro-5-tiocianatobenzoico (NTCB) o N-etilmaleimida (NEM) alternativamente durante el curso de la selección. La reacción se llevó a cabo por 1 hora a temperatura ambiente. Las moléculas de fusión se purificaron además por la cromatografía de afinidad anti-FLAG utilizando M2 agarosa (Sigma). Las perlas M2 se agregaron a la reacción y se giraron en el regulador B (1 X PBS, 0.02% de Tritón X100) por 1 hora a 4°C. Entonces las perlas se aplicaron a una columna giratoria, se lavaron con 5 volúmenes de columna de regulador B y moléculas de fusión se eluyeron con 3 volúmenes de columna de 100 µM de péptido FLAG DYKDDDK (Sigma) en regulador G. La producción de fusión se calculó en base a la actividad específica medida por conteo de escintilación de 35S-metionina en las muestras. Para la biblioteca aleatoria 159 (Q58L), la fusión de proteína de ARN se preparó utilizando un procedimiento aerodinámico, semi-automático en un Kingfisher™ (ThermoLabSystems). Las etapas fueron similares al procedimiento descrito anteriormente excepto para varias etapas abajo descritos. La purificación de las moléculas de fusión de proteína de ARN se realizó en regulador C (100 mM de TrisHCl, 60 mM de EDTA, 1 M de NaCI, 0.05% de Tritón X100, pH 8.0) en perlas oligo dT magnéticas (GenoVision). Las perlas se lavaron con 1 0 volúmenes de reacción de regulador Ca (1 00 mM de TrisHCl, 1 M de NaCI, 0.05% de Tritón X100, pH 8.0) y las proteínas de fusión se eluyeron con un volumen de H2O. La transcripción inversa (RT) se condujo utilizando cebador C2RT. Las proteínas de fusión se purificaron además por cromatografía de afinidad de His-tag utilizando perlas magnéticas de Ni-NTA (Qiagen). La reacción RT se incubó con perlas Ni-NTA en regulador D (2M de NaCI, 0.05%) de Tritón) por 20 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron así con 10 volúmenes de reacción de regulador E (1 XPBS, 0.05% de Tritón X100, pH 7.4) y moléculas de fusión se eluyeron con un volumen de regulador F (1 X PBS, 0.05% de Tritón X100, 100 mM de imidazol, pH 7.4).
Selección: Selección primaria contra KDR. La biblioteca de fusión (clones ~1 03 en 1 ml) se incubó con 150 µ\ de perlas de Proteína A (Dynal) que se pre-inmovilizó con 200 nM de lgG1 humano por 1 hora a 30°C antes de la selección para reducir la unión no específica tanto a perlas de proteína A como Fe (preclaro). La sobrenadante se incubó así en regulador G (50 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 0.02% de TritonX-1 00, 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino, 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, pH 7.4) con químiera KDR-Fc por 1 hora a 30°C con rotación de final-sobre-final. Las concentraciones finales de KDR-Fc fueron 250 nM para la Ronda 1 , 1 00 nM para rondas 2-4 y 1 0 nM para rondas 5 y 6. El objetivo se capturó en 300 µ\ de perlas de Proteína A (Ronda 1 ) o 1 00 µ\ de perlas de Proteína A (Rondas 2-6) por 30 minutos a 30°C con rotación de final-sobre-final y perlas se lavaron 5 veces con 1 ml de regulador G (50 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 0.02% de TritonX-100, pH 7.4). Las moléculas de fusión unidas se eluyeron con 100 µl de 0.1 M de KOH en 50 µl de 1 M de TrisHCl, pH 8.0. El ADN se amplificó de elusión por PCR utilizando cebadores de flanqueo T7TMV y MK1 65-4 A20. La maduración de especificidad y afinidad de aglutinante KDR VR28. El clon VR28 se mutagenizó por PCR hipermutagénico o mutagénesis oligo-dirigida según se describe anteriormente y las sub-bibliotecas de fusión se construyeron. Siguiente la pre-evacuación con la selección de perlas de Proteína A se realizó en el regulador 1 (1 xPBS, 0.02% de TritonX-1 00, 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino, 0.1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, pH 7.4) para cuatro rondas de acuerdo al procedimiento anteriormente descrito. ADN se amplificó de elusión por PCR utilizando cebadores T7TMVFn y MK1 65-4A20. Las concentraciones de objetivo inferiores (0.1 nM de KDR para las primeras cuatro rondas de selección) se utilizaron para las bibliotecas derivadas de mutagénesis oligo y después 1 mM de ratón VEGFR-2 (Flk-1 ) se introdujo por tres rondas adicionales de selección. Los cebadores T7TMVsupresión N-terminal y MK1 65-4A20 se utilizaron para PCR en las últimas 3 rondas. Para la maduración de especificidad de aglutinante KDR 159 las primeras 6 posiciones del ciclo FG de clon 159Q(8)L se seleccionaron al azar por PCR según se describe anteriormente. La unión de la sub-biblioteca de fusión para VEGFR-2 de ratón biotinilado (70 nM) se realizó en regulador 1 a temperatura ambiente por 30 minutos. El resto del procedimiento de selección se continuó en Kingfisher™ (ThermoLabSystems). El objetivo biotinilado se capturó en 50 µ\ de perlas magnéticas revestidas de streptavidina (Dynal) y las perlas se lavaron con 1 0 volúmenes de regulador I y un volumen de regulador J (1 xPBS, 0.02% de TritonX-1 00, pH 7.4). Las moléculas de fusión unidas se eluyeron con 1 00 µl de 0.1 M de KOH en 50 µl de 1 M de TrisHCl, pH 8.0. ADN se amplificó de elusión por PCR utilizando cebadores FIU2 y C2asaiA20. Después de cuatro rondas de selección una selección de velocidad apagada/reunión contra 7 nM de Flk-1 se aplicó por otras rondas como sigue. Después de la reacción de unión con Flk-1 de ratón biotinilado había avanzado por 30 minutos, un exceso de 100 veces de Flk-1 no biotinilado se agregó y la reacción se continuó por otras 6 horas para dejar el tiempo para los aglutinantes débiles para disociar. El objetivo biotinilado se capturó en 50 µ\ de perlas de streptavidina (Dynal) y las perlas se lavaron 5 veces con 1 ml de regulador J. Las moléculas de fusión unidas se eluyeron por incubación a 75°C por 5 minutos. El sobrenadante se sometió a re-unión a 7 nM de Flk-1 y el procedimiento de selección estándar se continuó. ADN del grupo de elusión final se sometió a randomización de grupo DE (véase arriba) y sub-biblioteca de fusión se seleccionó contra 7 nM de VEGF-R2 de ratón por tres rondas. En la cuarta ronda una selección de velocidad de apagada se aplicó con re-unión a 1 nM de VEGF-R2 humano. El ADN final se amplificó de elución por PCR utilizando cebadores F1 U2 y C2asai20.
Ensayo de Unión de Equilibrio Radioactivo Para preparar las proteínas de unión marcas 35S-marcadas para análisis, mARN se preparó según se describe anteriormente para la producción de fusión de ARN pero la etapa de ligación de enlazador se omitió. El mARN se expresó utilizando equipo de traducción de lisato de reticulocito de conejo (Ambion) en la presencia de Met marcado 35S a 30°C por 1 hora. La proteína expresada se purificó en perlas Flag M2-agarosa (Sigma) según se describe anteriormente. Este procedimiento produjo la proteína codifica sin el extremo de ácido nucleico. En un ensayo de unión directo, las fusiones VEGF-R2-Fc en concentraciones variando de 0 a 200 nM se agregaron a una concentración constante de la proteína purificada (0.2 o 5 nM) y se incubaron a 30°C por 1 hora en regulador B. Los complejos de recepto-aglutinante se capturaron utilizando perlas magnéticas de Proteína A por otros 1 0 minutos a temperatura ambiente utilizando un Kingfisher™. Las perlas se lavaron con seis volúmenes de reacción de regulador B. La proteína se eluyó de las perlas con 100 µL de 0.1 M de KOH. 50 µL de la mezcla de reacción y la elución se secaron sobre una LumaPlaca-96 (Packard) y la cantidad de 35S en la placa se midió utilizando un instrumento TopCount NXT (Packard) . La cantidad de proteína de microandamio en base a fibronectina unida al objetivo se estimó como un porcentaje de radioactividad eluida de las perlas magnéticas de Proteína A en comparación a la radioactividad en la mezcla de reacción. La unión no específica de proteínas de microandamio en base a fibronectina a las perlas se determinó al medir la unión en la ausencia de KDR-Fc y representó menos de 1 -2% de la entrada. La unión específica se obtuvo a través de la resta de unión no específica de unión total. La información se analizó utilizando el software GraphPad Prizm (GraphPad Software, Inc. , San Diego, CA), se fijó utilizando una ecuación de unión no lineal, un sitio.
Expresión y purificación de aglutinantes de proteína de microandamio basada en fibronectanina soluble: Para la expresión en residuos E. coli 1 -1 01 de cada clon seguido por la tag His6 se clonaron en un vector derivado por pET9d y se expresaron en células E. coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen). 20 ml de cultivo durante la noche se utilizó para inocular 1 litro de medio LB conteniendo 50 µg/ml de kanamicina y 34 µg/mL de cloromfenicol. El cultivo creció a 37°C hasta A60o 0.4-0.6. Después de la inducción con 1 mM de isopropil- ?-tiogalactosido (I PTG, Invitrogen), el cultivo creció por otras 3 horas a 37°C y se colectó por centrifugación por 30 minutos a 3,000 g a 4°C. La pastilla de célula se volvió a suspender en 50 mL de regulador lisis K (50 mM de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 5% de glicerol, 5 mM de CHAPS, 25 mM de imidafzol, 1 x de Cocktail de Inhibidor de Proteasa Completo™ (Roche), pH 8.0) Regulador L, y se sonifica en hielo a 80W por cuatro 15 segundos pulsos separados por pausas de diez segundos. La fracción soluble se separó por centrifugación por 30 minutos a 30,000 g a 4°C. El sobrenadante se giró por 1 hora a 4°C con 1 0 mL de Resina de Afinidad de Metal SuperflowTM TALÓN™ (Clontech) pre-equilibrada con regulador L lavada (50 mM de NaH2PO4, 0.5M de NaCI, 5% de glicerol, 25 mM de imidazol, pH 8.0). La resina se lavó así con 1 0 volúmenes de columna de regulador L y 30 volúmenes de columna de regulador M (1xPBS, pH 7.4, 25 mM de ¡midazol, pH 7.4). La proteína se eluyó con 5 volúmenes de columna de regulador N (1 xPBS, 250 mM de imidazol, pH 7.4) y se dializó contra 1 xPBS a 4°C. Cualquier precipitado se removió al filtrarse a 0.22 µm (Millipore).
Análisis BIAcore de las proteínas de microandamio en base a fibronectina soluble: La cinética de unión de las proteínas de unión de proteínas de microandamio basadas en fibronectina hacia el objetivo se midió utilizando biosensor BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor). Las fusiones VEGF-R2-Fc de ratón y humano se inmovilizaron sobre un chip sensor CM5 y las proteínas de unión solubles se inyectaron a concentraciones que varían de 0 a 1 00 nM en regulador O (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 0.005% de Tween 20, pH 7.4). Los sensorgramas se obtuvieron a cada concentración y se evaluaron utilizando un programa. La evaluación BIA 2.0 (BIAcore), para determinar las constantes de velocidad ka (kact¡vo) y kd (kinactivo)- La constante de afinidad, KD se calculó de la proporción de la proporción de las constantes de velocidad k¡nactivolkact¡vo- Para los experimentos de inhibición, VEGF165 humano se inmovilizó sobre una superficie de chip CM-5 y KDR-Fc se inyectó a una concentración de 20 nM en la presencia de diferentes concentraciones a una concentración cuando solamente 50% de la unión de KDR-Fc al chip, se observó.
Repliegue Reversible de un Polipéptido de Unión A VEGFR: El análisis de calorimetría de exploración diferencial (DSC) se realizó en la proteína M5FL en 100 mM de regulador de acetato de sodio (pH 7.4) . Una ejecución DSC inicial (Exploración 1 ) se realizó en un calorímetro N-DSC I I (Calorimetría Sciences Corp) al inclinar la temperatura de 5-95°C a una velocidad de 1 grado por minuto, seguido por una exploración inversa (no mostrada) de regreso a 1 0 grados, seguido por una segunda ejecución (Exploración 2). Bajo estas condiciones, los datos se ajustaron mejor utilizando un modelo de dos transiciones (Tm=77°C y 67°C utilizando el software Orgin (OrginLab Corp)). Véase Figura 1 0.
PEGilación de la Proteína M5FL: La forma C100 de la proteína M5FL, que tiene la secuencia completa de M5FL con la Ser en la posición 1 00 mutada a una Cisteína incluyendo His-tag de C-terminal adicional se utilizó para purificar la proteína. La proteína M5FL-C1 00 purificada se modificón en el residuo de cisteína única al conjugar varias formas PEG derivadas de maleimida (Shearwater). Las proteínas reaccionadas resultantes se ejecutaron en un 4-1 2% de gel de poliacrilamida (Figura 1 1 ).
Construcción de estirpes de célula: Construcción de plásmido. Los plásmidos, que codifican los receptores quiméricos compuestos de los dominios de transmembrana y citoplásmicos del receptor de eritropoyetina humana (EpoR) fusionado a los dominios extracelulares de KDR, Flk-1 , o TrkB humano se construyeron por un procedimiento PCR de dos etapas. Los productos PCR que codifican los dominios extracelulares se amplificaron de los plásmidos que codifican el gen de receptor completo: KDR (aminoácidos 1 a 764) se derivó de clon PR1371 _H 1 1 (OriGene Technologies Rockville MD) con cebadores 5-RI-hKDR-1 B/3-EPO/hKDR-2312B, flk-1 (aminoácidos 1 a 762) se derivó del clon #4238984 (IMAGE) con cebadores 5-RI-mKDR-1 /3-EPO/mKDR-2312, y TrkB humano (de aminoácidos 1 a 430) de clon #X75958 (I nvitrogen Genestorm) con cebadores 5-Ri-hTrkB-1 /3-EpoR/hTrkB-1 31 0. Los productos PCR que codifican la transmembrana de EpoR y dominios citoplásmicos (aminoácidos 251 a 508) se amplificaron de clon #M60459 (Invitrogen Genestorm) con el cebador común 3-XHO-EpoR-3066 y uno de los tres cebadores específicos de gen 5-hKDR/EPO-2274B (KDR), 5-mKDR/EPO-2274 (flk-1 ), y 5'-hTrkB/EpoR-1274 (TrkB humano), que agregó una secuencia corta complementaria al final del producto PCR de fragmento de receptor. Segundo, los productos PCR que codifican las dos mitades de los genes quiméricos se mezclaron y se amplificaron con 3-KHO-EpoR-3066 y los cebadores 5' (5-RI-hKDR-1 B, 5-RI-mKDR-1 , y 5-RI-hTrkB-1 ) específicos para cada gen utilizado en el ciclo previo de amplificación. Los productos PCR resultantes se digirieron con EcoRI y Soy y se clonaron en pcADN3.1 (+) (Invitrogen) para generar los plásmidos phKEd (KDR humano/EpoR fusión), pmKE2 (flk-1 /EpoR fusión), y phTE (TrkB/EpoR fusión). Construcción de estirpes de célula para citometría de flujo. Las células CHO-K1 (Colección de Cultivo Tipo Americano, Manasas, VA) se transfectaron establemente utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) ya sea con pcADN3.1 (I nvitrogen) solo, pmKE2 solo, o una mezcla de pcADN3.1 y un plásmido que codifica KDR humano de longitud completa (Origene Inc. , clon PR1 371 -H 1 1 ). Los transfectantes estables se seleccionaron y se mantuvieron en la presencia de 0.5 mg/ml de Geneticin (Invitrogen). El clon que expresa KDR humano designado CHO-Flk y la población que expresa VEGFR-2 murino/EpoR-químera designada CHO-Flk se obtuvieron por sorteo de célula activada por fluorescencia de la población transfectada siguiendo la coloración con un antisuero policlonal anti-KDR (R&D Systems). Las estirpes de célula CHO-KDR y CHO-Flk crecieron rutinariamente en medio Tagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco) complementado con 1 0%) (v/v) de suero de bovino fetal (FBS), 0.5 mg/ml de Geneticina, 1 00 U/ml de penicilina, 0.25 //g/ml de anfotericina B, 100 µg/ml de streptomicina y 2 mM de L-glutamina.
Construcción de estirpes de célula Ba/F3. Las estirpes de célula que podrían proliferar en respuesta a la unión de VEGF por VEGFR-2 se construyeron por transfección de la estirpe de célula pre-B murino Ba/F3 (DSMZA, Braunscheweig , Alemania) con phKEd o pmKE2, quimeras de receptor consistentes de los dominios extracelulares del receptor de eritropoyetina humana (véase arriba). Las células Ba/F3 se mantuvieron en medio de Ba/F3 mínimo (RPMI-1640 (Gibco) conteniendo 1 0% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 0.25 //g/ml de anfotericina B, 1 00 //g/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) complementado con 10% de medio acondicionado de células WEHI-3B (DSMZ; crecido en medio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco)/10% de FBS/25 //M /?-mercaptoetanol) como una fuente de factores de crecimiento esenciales. Siguiendo la electroporación con los plásmidos pm KE2 o phKE8, transfectantes estables se seleccionaron en 0.75 mg/ml de Geneticina. Las poblaciones resistentes de geneticina se transfirieron a medio Ba/F3 mínimo que contiene 100 ng/ml de VEGF165 humana (R&D) Systems), y las poblaciones dependientes de VEGF resultantes se designaron Ba/F3-Flk y Ba/F3-KDR. La estirpe de célula de control que expresa un receptor TrkB quimérico (Ba/F3-TrkB) que podría ser responsivo a estimulación por NT-4, el ligante natural para TrkB se construyó de igual forma utilizando phTE de plásmido y NT-4 humano (R&D Systems).
Análisis de unión de superficie de célula de proteínas de microandamio basadas en fibronectina: La unión de proteína de microandamio basada en fibronectina a Flk-1 y KDR de superficie de célula se analizó simultáneamente en células de control y que expresan VEGF-R2 mediante citometría de flujo. Las células CHO-pcADN3 (Control) se liberaron de sus platos con tripsina-EDTA, se lavaron en PBS de Dulbecco sin calcio y magnesio (D-PBS"; I nvitrogen), y se colorearon por 30 minutos a 37°C con 1 .5 µM CMTMR (5-(y-6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)-tetrametilrodamida) (Molecular Probes). Las células se lavaron en D-PBS" y se incubaron por un adicional de 30 minutos a 37°C, y después se volvieron a suspender en regulador de bloqueo (D-PBS710% de suero de bovino fetal) en hielo. Las células CHO-KDR o CHO-Flk se trataron idénticamente excepto que CMTMR se omitió. 75,000 de células CHO-pcADN3 tintados con CMTMR se mezclaron con un número igual de células CHO-KDR o CHO-Flk sin colorear en cada célula de una placa de 96 cavidades de parte inferior V. Todos los anticuerpos y las proteínas de microandamio basadas en fibronectina se diluyeron en 25 / l/cavidad de regulador de bloqueo, y cada tratamiento se condujo por 1 hora a 4°C. Las mezclas de célula se colorearon con las proteínas de microandamio basadas en fibronectina con marca His6, se lavaron dos veces con D-PBS" frío, y después se trataron con 2.5 //g/ml anti-His6 MAb (R&D Systems), se lavaron, y se colorearon con 4 //g/ml de anticuerpo anti-ratón conjugado por Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Para las células tratadas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-KDR (Accurate Chemical, Westbury, NY) o un anticuerpo policlonal de cabra anti-flk-1 (R&D Systems), la etapa anti-His6 se omitió, y la unión de anticuerpo se detectó con el anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 adecuado por especie (Molecular Probes) . Siguiendo la coloración, las células se volvieron a suspender en 200 / I/cavidad de D-PBS71 % de FBS/1 //g/ml de 7-aminoactinomicina D (7-AAD; Molecular Probes) y se analizaron por citometría de flujo en un FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA) equipado con un láser 488 nM. Siguiendo la abertura para excluir las células muertas (7-AAD positivos), las células que expresan VEGFR-2 y las células CHO-pcADN3 se midieron independientemente para fluorescencia Alexa Fluor 488 al abrirse en las poblaciones positivas o negativas CMTMR, respectivamente. Los experimentos de control mostraron que la coloración con CMTMR no interfirió con la detección de anticuerpos conjugados Alexa Fluor 488 sobre la superficie de las células tintadas. La unión de superficie de célula también se valoró por microscopía de fluorescencia utilizando los anticuerpos secundarios anteriormente descritos. Para estos estudios, los anticuerpos se diluyeron en D-PBS que contiene calcio y magnesio (D-PBS+)/10% de FBS. Las células crecieron en placas de 24 o 96 cavidades, y siguiendo la coloración se mantuvieron en D-PBS+ para la observación en un microscopio de fluorescencia invertida.
Ensayo de Proliferación de Célula Ba/F3: Las células Ba/F3 se lavaron tres veces en medio Ba/F3 m ínimo y se volvió a suspender en el mismo medio que contiene 15.8 ng/m ,l de factor de proliferación (células VEGF165 humano, VEGF16 murino, o hNT-4 para Ba/F3-KDR, Ba/F3-Flk, o Ba/F3-TrkB, respectivamente), y 95 µl conteniendo 5 x 1 04 de células Ba/F3-KDR o 2 x 104 de células Ba/F3-Flk o Ba/F3-TrkB se agregaron por cavidad a una placa de cultivo de 96 cavidades. 5 µ\ de diluciones seriales de proteína de prueba en PBS se agregó a cada cavidad por un volumen final de 1 00 µ\ de medio Ba/F3/5% de PBS/15 ng/ml de factor de crecimiento. Después de la incubación por 72 horas a 37°C, la proliferación se midió por adición de 20 µ\ de Reactivo de Una Solución Acuosa CellTiter 96® (Promega) a cada cavidad, la incubación por 4 horas a 37°C, y medición de la absorción a 490 nm utilizando un lector de placa de microconcentración (Molecular Dynamics).
Ensayo de Proliferación de Célula HUVEC: Las células HUVEC (Clonetics, Walkersville, MD) de paso 2-6 crecieron en medio EGM-2 (Clonetics). 5000 células/cavidad se volvieron a suspender en 200 µ\ de medio de inanición (volúmenes iguales de DMEM (Gibco) y medio F-12K (ATCC), complementado con 0.2%) de suero de bovino fetal y 1 x de solución de penicilina/streptomicina/fungizona (Gibco)), se lamina en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades y se incubaron por 48 horas. Las proteínas de unión basadas de fibronectina se agregaron a las cavidades y se incubaron por 1 hora a 37°, y después VEGF165 humano se agregó a una concentración final de 1 6 ng/ml. Después de 48 horas de incubación, la viabilidad celular se midió por adición de 30 //I/cavidad de una mezcla de 1 .9 mg/ml de reactivo MTS Acuoso CellTiter96® (Promega) con 44 //g/ml de metosulfato de fenazina (Sigma) y medición de absorción a 490 nm según se describe anteriormente para las células Ba/F3.
Ejemplo 12: Polipéptidos de Unión VEGFR Basados en Cadena Ligera de Anticuerpo Las Figuras 21 A y 21 B muestran secuencias de aminoácido de polipéptidos de unión VEGR (SEQ ID NOs: 241 -310) en base a una estructura/microandamio de región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL). Las proteínas de dominio variable de cadena ligera se generaron utilizando el sistema PROfusion™, según se describe anteriormente, para utilizarse con proteínas derivadas de 10Fn3. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan de tal modo para referencia en tu totalidad. ? co rO ro O) o Oí Ol ? co rO rO Ol O Ol Ol O rO rO Oí O Ol Ol 4. rO ro ro 01 o Ol Ol -t- Oí -fc- cn ?o ro s? o Ol Ol .fc- •^i ro ro Ol o 01 Ol 4^ 00 6H " egi - Tabla 4: Secuencias de clones de un ion VEGF-RZ caracterizado. Clon Ciclo BC (23-30) Cid o DE (52-56) Ciclo FG (77-87) VR28 RH PHFPTR LQPPT VAQNDHELITP K1 RHPHFPTR LQPPT HEL TP K6 RHPHFPTR LQPPT L TP K9 RH PHFPTR LQPPT EL P K1 0 RH PHFPTR LQPPT ND L VP K12 RH PHFPTR LQPPT NDHE TP K1 3 RH PHFPTR LQPPT A HEL TP K14 RHPHFPTR LQPPT NDHEL I P K1 5 RHPHFPTR LQPPT D E TP 159 (Q8L) RHPHFPTR LQPPA MAQSGH ELFTP E3 RH PHFPTR LQPPT ND L P E5 RHPHFPTR LQPPT QN L P E6 RHPHFPTR LQPPT N L P E9 RH PHFPTR LQPPT N L TP E18 RHPHFPTR LQPPT V N EL TP E 1 9 RHPHFPTR LQPPT V N L TP E25 RHPHFPTR LQPPT N EL TP E26 RHPHFPTR LQPPT V N EL TP E28 RHPHFPTR LQPPT N EL VP E29 RHPHFPTR LQPPT V N L TP M 1 RHPHFPTR LQP ND ELFTP M2 RH PHFPTR LQPPA NG ELFTP M3(D60) RH PHFPTR LQPPA NG ELFTP M4 RHPHFPTR LQPPA G ELFTP M5 FL RH PHFPTR LQPP NG ELFTP M6 RHPHFPTR LQPPA G ELFTP M7 RHPHFPTR LQP NG ELFTP M8 RHPHFPTR LQPPA SC ELFTP WT DAPAVTVR GSKST GRGDSPASSKP Tabla 5: Afinidades de los aglutinantes de trinectina a KDR-Fc determinadas en ensayo de unión de equilibrio radioactivo Clon KDR (kd, nM) VR28 1 1 .0+0.5 K1 <0.6+0.1 K6 <0.9+0.1 K9 <1 .8+0.4 K10 <0.6 + 0.1 K12 <0.6 + 0.1 K13 <0.6 + 0.1 K14 <0.6+0.1 K1 5 <0.4+0.1 Tabla 6: Afinidades de los aglutinantes de trinectina a KDR y FIK-1 determinadas en ensayo de unión de equilibrio radioactivo. Clon KDR (kd, nM) Flk-1 (Kd, nM) VR28 11.0+0.5 nd* E3 <1.0+0.2 5.4+1 .5 E5 <0.4+0.1 3.2+0.3 E6 <0.4+0.1 7.1 +1 .1 E9 2.4+0.3 < 1 .4+0.1 E18 <1.2+0.2 <0.5+0.1 EE1199 <<11..33++00..22 <0.7+0.1 E25 <1.6+0.4 <1.3+0.2 E26 <1.7+0.4 2.0+0.3 E28 <1.6+0.4 2.1+0.6 E29 <1.5+0.4 <0.9+0.2 nd* - La unión no se detecta a 1 00 nM de objetivo.
Tabla 7: Determinación de Ka, Kd y Kd por ensayo BIAcore Clon Objetivo ka (1/M*s)x10 kd(1/s)x10+d Kd (nM) E6 KDR 89 6.7 0.08 Flk-1 67 136.0 2.02 E18 KDR 26 12.1 0.46 Flk-1 60 19.5 0.33 E19 KDR 30 1.7 0.06 Flk-1 66 22.3 0.34 E25 KDR 25 5.2 0.21 Flk-1 50 37.8 0.76 E26 KDR 11 5.8 0.51 Flk-1 22 47.7 2.14 E29 KDR 36 7.0 0.19 Flk-1 79 28.8 0.37 • M5FL KDR 10 9.2 0.89 Flk-1 28 58.2 2.10 VR28 KDR 3 34 13 159(Q8L) KDR 5 10 2 Tabla 8: Unión a células que expresan KDR (CHOKDR) y FIK-1 (CHO- FIK-1) Clon CHO KDR CHO Flk-1 (EC50, nM) (EC50, nM) E18 4.2 + 1.0 0.9+0.4 E19 7.6+1.7 5.3+2.5 E26 2.6+1.2 1.3 + 0.7 E29 2.3+1.0 0.6 + 0.1 WT no no Tabla 9: Inhibición de proliferación inducida por VEGF de células que expresan CDR (Ba/F3-KDR) y FIK-1 (Ba/F3-FIK). Clon Ba/F3-kdr (IC50, nM) Ba/F3-Flk (IC50, nM) E18 5.4+1.2 2.4+0.2 E19 12.3+2.6 5.8+1.0 E26 3.2+0.5 5.3+1.7 E29 10.0+2.1 4.7 + 1.2 M5FL 3.9+1.1 5.1+0.2 WT no no Anti-KDR Ab 17.3+7.7 ND Anti-Flk-1 Ab ND 15.0+3.2 Tabla 10: Inhibición de proliferación inducida por VEGF de células HUVEC.
Clon (IC50, nM) E18 12.8+4.6 E19 11.8+2.7 E26 14.0+5.9 E29 8.4+0.8 M5FL 8.5+2.8 WT no Tabla 11

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Un polipéptido de dominio único sustancialmente puro que se une a KDR humana, el polipéptido comprendiendo entre aproximadamente 80 y aproximadamente 150 aminoácidos que tienen una organización estructural que comprende: a) al menos cinco a siete filamentos beta o filamentos tipo beta distribuidos entre al menos dos placas beta, y b) al menos una parte de ciclo que conecta dos filamentos que son filamentos beta o filamentos tipo beta, cuya parte de ciclo participa en la unión a KDR, en donde el polipéptido de dominio único se une a un dominio extracelular de la proteína de KDR humana con una constante de disociación (KD) de menos de 1 x10"6M. 2. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 , en donde el polipéptido de dominio único comprende un dominio variable de inmunoglobulina. 3. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 2, en donde el dominio variable de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de: un dominio V humano, un dominio VH humano y un dominio VHH camelid. 4. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 2, en donde el polipéptido comprende tres partes de ciclo que participan en la unión a KDR, y en donde cada una de dichas partes de ciclo conecta dos filamentos beta. 5. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 , en donde el polipéptido de dominio único comprende un dominio tipo inmunoglobulina. 6. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 5, en donde el dominio tipo inmunoglobulina es un dominio tipo l l l fibronectina (Fn3). 7. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 , en donde el dominio Fn3 comprende, en orden de terminal N a terminal C; a) un filamento beta o filamento tipo beta, A; b) un ciclo, AB; c) un filamento beta, B; d) un ciclo, BC; e) un filamento beta, C; f) un ciclo CD; g) un filamento beta D; h) un ciclo DE; i) un filamento beta F; j) un ciclo FG; y k) un filamento beta o filamento tipo beta, G. 8. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 7, en donde el ciclo FG participa en la unión de KDR. 9. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 7, en donde los ciclos BC, DE y FG participan en la unión de KDR. 10. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 9, en donde cada uno de los filamentos beta consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de un filamento beta correspondiente de SEQ ID NO:5. 1 1 . El polipéptido de dominio único según la reivindicación 10, en donde cada uno de los ciclos AB, CD y EF consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de un ciclo correspondiente de SEQ I D NO:5. 12. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 , en donde el polipéptido de dominio único comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:5. 1 3. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 5, en donde el polipéptido comprende tres partes de ciclo que participan en la unión a KDR, cada parte de ciclo conectando dos filamentos que son beta o filamentos tipo beta. 14. El polipéptido de dominio único según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en donde un ciclo que participa en la unión de KDR tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO:2, SEQ I D NO:3, y SEQ ID NO:4. 15. El polipéptido de dominio único según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 3, en donde el polipéptido se une a una porción que reduce la velocidad de evacuación del polipéptido en un mamífero por más de tres veces en relación al polipéptido sin modificar. 16. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 5, en donde la porción que reduce la velocidad de ecuación es una porción de polietilénglicol. 17. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 6, en donde la porción de polietilénglicol tiene un peso molecular de entre 2 y 1 00 kDa. 18. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 6, en donde la porción de polietilénglicol se une covalentemente a una porción de tiol o una porción amina en el polipéptido de dominio único. 19. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 1 , en donde el polipéptido se une a una porción marcada. 20. El polipéptido de dominio único según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en donde el polipéptido de dominio único se une a un dominio extracelular de la proteína de KDR humana con una constante de disociación (KD) de menos de 1 x1 0"7M e inhibe la actividad de VEGF mediada por KDR. 21 . El polipéptido de dominio único según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en donde el polipéptido de dominio único une KDR competitivamente con la isoforma VEGF 65 de VEGF-A. 22. El polipéptido de dominio único según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en donde el polipéptido de dominio único une KDR competitivamente con VEGF-A y VEGF-D. 23. El polipéptido de dominio único según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, en donde el polipéptido de dominio único también se une a un dominio extracelular del Flkl de ratón con una KD de menos de 1 x1 0"6. 24. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192. 25. El polipéptido según la reivindicación 24, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1 93. 26. Un polipéptido según la reivindicación 24 comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 94. 27. El polipéptido según la reivindicación 26, en donde una porción de polietilénglicol se une covalentemente al residuo de cisteína en la posición 93. 28. El polipéptido según la reivindicación 27, en donde la porción de polietilénglicol tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 1 0 kDa a aproximadamente 60 kDa. 29. Un polipéptido sustancialmente puro que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 85% idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ I D NOS: 1 -4, en donde dicho polipéptido se une a KDR y compite por la unión a KDR con VEGF-A. 30. Un polipéptido sustancialmente puro según la reivindicación 29 comprendiendo una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a la secuencia de cualquiera de las SEQ I D NOs:6-183, 1 86-1 97, y 1 99. 31 . El polipéptido según la reivindicación 30, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de cualquiera de las SEQ I D NOs: 6-1 83, 1 86-1 97, y 1 99. 32. El polipéptido según la reivindicación 29, en donde dicho polipéptido inhibe una actividad biológica de VEGF. 33. El polipéptido según la reivindicación 29, en donde dicho polipéptido une dicha KDR con una K de 50 nM o menos. 34. El polipéptido según la reivindicación 29, en donde el polipéptido se une a un dominio extracelular de la proteína de KDR humana con una constante de disociación (KD) de menos de 1 x10"7M e inhibe la actividad de VEGF mediada por KDR. 35. Una composición terapéutica que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 y 24-34, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 36. Un método para inhibir la actividad biológica de VEGF en una célula que comprende contactar dicha célula con un polipéptido de la reivindicación 20 en una cantidad y por un tiempo suficiente para inhibir dicha actividad biológica de VEGF. 37. Un método para tratar un sujeto que tiene una condición que responde a la inhibición de VEGF, dicho método comprendiendo administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido de la reivindicación 20, en donde dicho polipéptido inhibe una actividad biológica de VEGF. 38. El método según la reivindicación 37, en donde dicha condición es una condición caracterizada por angiogenesis adecuada. 39. El método según la reivindicación 38, en donde dicha condición es una condición hiperproliferativa. 40. El método según la reivindicación 38, en donde dicha condición se selecciona del grupo que consiste de: un desorden autoinmune, un desorden inflamatorio, una retinopatía, y un cáncer. 41 . Un método para detectar VEGFR-2 en una muestra dicho método comprendiendo: a) contactar dicha muestra con el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 3 y 24-34, en donde dicho contacto se lleva a cabo bajo condiciones que permiten la formación del complejo de polipéptido-VEGFR-2; y b) detectar dicho complejo, detectando de tal modo dicho VEGFR-2 en dicha muestra. 42. El método según la reivindicación 41 , en donde dicha detección se lleva a cabo utilizando una técnica seleccionada del grupo que consiste de radiografía, ensayo inmunológico, detección dé fluorescencia, espectroscopia de masa, o resonancia de plasmón de superficie. 43. El método según la reivindicación 41 , en donde dicha muestra es una muestra biológica. 44. El método según la reivindicación 41 , en donde dicha muestra biológica es una muestra tomada de un humano, y en donde dicho VEGFR-2 es KDR. 45. El método según la reivindicación 41 , en donde dicho polipéptido se marca de manera detectable con una porción marcada. 46. El método según la reivindicación 45, en donde dicha porción marcada se selecciona del grupo que consiste de: una porción radioactiva, una porción fluorescente, una porción cromogénica, una porción quimiluminescente, y una porción de hapteno. 47. El método según la reivindicación 41 , en donde dicho polipéptido se inmoviliza sobre un soporte sólido. 48. Un polipéptido 10Fn3 de unión de objetivo con propiedades de farmacocinética mejorada, el polipéptido comprendiendo: a) un dominio 10Fn3 que tiene de aproximadamente 80 a aproximadamente 1 50 aminoácidos, en donde al menos uno de los ciclos de dicho dominio 10Fn3 participa en la unión de objetivo; y b) una porción de polietilénglicol (PEG) covalentemente unida, en donde dicho polipéptido Fn3 se une al objetivo con una KD de menos de 100 nM y tiene una velocidad de evacuación de menos de 30 mL/hr/kg en un mamífero. 49. El polipéptido 0Fn3 según la reivindicación 48, en donde la porción PEG se une a un grupo tiol o un grupo amina. i \ 50. El polipéptido 10Fn3 según la reivindicación 48, en donde la porción PEG se une al polipéptido Fn3 mediante pegilación dirigida por sitio. 51 . El polipéptido 10Fn3 según la reivindicación 50, en donde la porción PEG se une a un residuo Cys. 52. El polipéptido 1 0Fn3 según la reivindicación 48, en donde una porción PEG se une en una posición en el polipéptido 10Fn3 seleccionado del grupo que consiste de: a) la terminal N ; b) entre la terminal N y el filamento beta o filamento tipo beta de más terminal N; c) un ciclo colocado sobre un lado del polipéptido opuesto al sitio de unión de objetivo; d) entre la terminal C y el filamento beta o filamento tipo beta de más terminal CM y e) en la terminal C. 53. El polipéptido 1 0Fn3 según la reivindicación 48, en donde la porción PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 1 00 kDa. 54. El polipéptido 1 0Fn3 según la reivindicación 48, en donde el polipéptido 1 0Fn3 comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 60% idéntica a SEQ I D NO:5. 55. Un método para administrar un polipéptido 10Fn3 a un paciente a fin de lograr una liberación retardada en relación a la administración intravenosa, el método compr ndiendo: administrar el polipéptido 10Fn3 subcutáneamente, logrando de tal modo una liberación retardada en la corriente sanguínea en relación a la administración intravenosa. 56. El método según la reivindicación 55, en donde la administración subcutánea del polipéptido 1 0Fn3 logra una máxima concentración de suero del polipéptido 1 0Fn3 que es menor a la mitad de la máxima concentración lograda por la administración intravenosa de una dosis igual. 57. El método según la reivindicación 55, en donde el polipéptido 10Fn3 se une a una porción que aumenta la vida media de suero del polipéptido 0Fn3. 58. El método según la reivindicación 57, en donde la porción es una porción de polietilénglicol. 59. El método según la reivindicación 55, en donde el polipéptido 10Fn3 comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 60% idéntica a la SEQ I D NO:5. 60. Un polipéptido de dominio único sustancialmente puro que se une a una proteína objetivo humana preseleccionada y un homólogo de la misma de una especie no humana, el polipéptido comprendiendo entre aproximadamente 80 y aproximadamente 150 aminoácidos que tienen una organización estructural que comprende: a) al menos cinco a siete filamentos beta o filamentos tipo beta distribuidos entre al menos dos placas beta, y b) al menos una parte de ciclo que conecta dos filamentos que son filamentos beta o filamentos tipo beta, cuya parte de ciclo participa en la unión a la proteína objetivo humana preseleccionada y el homólogo de la misma, en donde el polipéptido de dominio único se une a la proteína objetivo humana preseleccionada y al homólogo de la misma con una constante de disociación (K ) de menos de 5x1 0"8M ,. y en donde el homólogo es al menos 80% idéntico a través de una secuencia de al menos 100 aminoácidos a la proteína objetivo humana preseleccionada. 61 . El polipéptido de dominio único según la reivindicación 60, en donde el polipéptido de dominio único comprende un dominio variable de inmunoglobulina. 62. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 61 , en donde el dominio variable de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de: un dominio VL humano, un dominio VH humano y un dominio VH H camelid. 63. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 61 , en donde el polipéptido comprende tres partes de ciclo que participan en la unión a la proteína objetivo humana preseleccionada, y en donde cada parte de ciclo se encuentra conectando filamentos que son filamentos beta o filamentos tipo beta. 64. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 60, en donde el polipéptido de dominio único comprende un dominio tipo inmunoglobulina. 65. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 64, en donde el dominio tipo inmunoglobulina es un dominio tipo l l l fibronectina (Fn3). 66. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 65, en donde el dominio Fn3 comprende, en orden de terminal N a terminal C; a) un filamento beta o filamento tipo beta, A; b) un ciclo, AB; c) un filamento beta, B; d) un ciclo, BC; e) un filamento beta, C; f) un ciclo CD; g) un filamento beta D; h) un ciclo DE; i) un filamento beta F; j) un ciclo FG; y k) un filamento beta o filamento tipo beta, G. 67. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 66, en donde el ciclo FG participa en la unión de proteína objetivo. 68. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 66, en donde los ciclos BC, DE y FG participan en la unión de proteína objetivo. 69. El polipéptido de dominio único según la reivindicación 66, en donde cada uno de los filamentos beta o filamentos tipo beta consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de un filamento beta correspondiente de SEQ I D NO:5. 70. Un ácido nucleico comprendiendo una secuencia codificadora del polipéptido de la reivindicación 1 . 71 . El ácido nucleico según la reivindicación 70, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de cualquiera de las SEQ ID NOs: 6-183, 186-1 97, 1 99 y 241 -31 0. 72. Un ácido nucleico comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza en condiciones rigurosas a una secuencia de ácido nucleico de SEQ I D NO: 184 y codifica un polipéptido que se une a KDR humano con una KD de menos de 1 x1 0" 6M. 73. El ácido nucleico según la reivindicación 72, en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 184 y SEQ I D NO: 185. 74. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 71 unido operativamente con un promotor. 75. Una célula comprendiendo el ácido nucleico de la reivindicación 72. 76. Un método para producir el polipéptido que une KDR, comprendiendo: expresar un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora del polipéptido de la reivindicación 1 . 77. El método según la reivindicación 76, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de cualquiera de SEQ I D NOs: 6-1 83, 1 86-197, 1 99 y 241 -31 0. 78. El método según la reivindicación 76, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que hibridiza en condicione rigurosas a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 184. 79. El método según la reivindicación 76, en donde el ácido nucleico se expresa en una célula. 80. El método según la reivindicación 76, en donde el ácido nucleico se expresa en un sistema libre de células.
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Families Citing this family (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3614866B2 (ja) 1997-06-12 2005-01-26 リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイティド 人工抗体ポリペプチド
US6416950B1 (en) 1998-12-02 2002-07-09 Phylos, Inc. DNA-protein fusions and uses thereof
ATE556713T1 (de) 1999-01-13 2012-05-15 Bayer Healthcare Llc Omega-carboxyarylsubstituierte-diphenyl- harnstoffe als p38-kinasehemmer
US8124630B2 (en) 1999-01-13 2012-02-28 Bayer Healthcare Llc ω-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
CA2416219C (en) 2000-07-11 2016-10-11 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
ES2282299T3 (es) 2000-10-20 2007-10-16 EISAI R&amp;D MANAGEMENT CO., LTD. Compuestos aromaticos con anillos de nitrogeno como agentes anticancerigenos.
AU2003209116A1 (en) 2002-02-11 2003-09-04 Bayer Pharmaceuticals Corporation Aryl ureas with angiogenesis inhibiting activity
AU2003243436A1 (en) 2002-06-06 2003-12-22 Shohei Koide Reconstituted polypeptides
JPWO2004080462A1 (ja) 2003-03-10 2006-06-08 エーザイ株式会社 ｃ−Ｋｉｔキナーゼ阻害剤
PT1636585E (pt) 2003-05-20 2008-03-27 Bayer Pharmaceuticals Corp Diarilureias com actividade inibidora de cinase
CN100450998C (zh) 2003-11-11 2009-01-14 卫材R&D管理有限公司 脲衍生物的制备方法
SG149004A1 (en) * 2003-12-05 2009-01-29 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
JP4834553B2 (ja) 2004-09-17 2011-12-14 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 医薬組成物
JP4989476B2 (ja) 2005-08-02 2012-08-01 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質の効果を検定する方法
KR20080077360A (ko) * 2005-11-02 2008-08-22 바이엘 헬스케어 엘엘씨 암의 예측 및 예후 방법, 및 암 치료 모니터링
RU2448708C3 (ru) * 2006-05-18 2017-09-28 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Противоопухолевое средство против рака щитовидной железы
JP5368096B2 (ja) 2006-08-28 2013-12-18 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 未分化型胃癌に対する抗腫瘍剤
EP2727936B1 (en) 2006-11-22 2016-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR
KR101445892B1 (ko) 2007-01-29 2014-09-29 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 미분화형 위암 치료용 조성물
WO2008097497A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company Vegf pathway blockade
CN101143894A (zh) * 2007-06-22 2008-03-19 中国药科大学 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
US20100255514A1 (en) 2007-08-16 2010-10-07 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
JP5769417B2 (ja) * 2007-08-16 2015-08-26 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マギル ユニバーシティ 腫瘍細胞由来微小胞
EP2197476A2 (en) * 2007-08-20 2010-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Use of vegfr-2 inhibitors for treating metastatic cancer
AU2008319298B2 (en) 2007-10-31 2014-07-31 Medimmune, Llc Protein scaffolds
CA2704000C (en) 2007-11-09 2016-12-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex
WO2009073115A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with mtor inhibitors
CL2008003561A1 (es) * 2007-11-30 2010-02-05 Glaxo Group Ltd Construccion de union a il - 13 que comprende a lo menos un dominio simple (dab) de anticuerpo injertado en un anticuerpo monoclonal ( mabdab); polinucleotido y celula huesped; procedimiento para preparar la construccion; composicion farmaceutica que la comprende y uso para tratar cancer o enfermedades inflamatorias.
WO2009079587A2 (en) * 2007-12-18 2009-06-25 Schering Corporation Biomarkers for sensitivity to anti-igf1r therapy
EA201000979A1 (ru) * 2007-12-27 2011-02-28 Новартис Аг Улучшенные связывающие молекулы на основе фибронектина и их применение
WO2009102421A2 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind egfr
PT2274331E (pt) * 2008-05-02 2014-02-27 Novartis Ag Moléculas de ligação baseadas em fibronectina melhoradas e suas utilizações
KR20110010758A (ko) 2008-05-06 2011-02-07 글락소 그룹 리미티드 생물학적 활성제의 캡슐화
PE20091931A1 (es) 2008-05-22 2009-12-31 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de dominio de armazon basadas en fibronectina multivalentes
CN102227638B (zh) * 2008-09-30 2015-05-20 Abbvie公司 Rna展示的改良方法
WO2010048588A2 (en) * 2008-10-23 2010-04-29 Massachusetts Institute Of Technology Directed engagement of activating fc receptors
RS55218B1 (sr) * 2008-10-31 2017-02-28 Janssen Biotech Inc Kompozicije fibronektin tip iii skalno baziranih domena, metode i upotrebe
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
NZ592591A (en) * 2008-11-03 2012-04-27 Molecular Partners Ag Binding proteins comprising ankyrin repeast domains that inhibit the vegf-a receptor interaction
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
AR074777A1 (es) 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
EP2396000A1 (en) * 2009-02-11 2011-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with temozolomide
WO2010097394A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs
US20110305693A1 (en) 2009-02-24 2011-12-15 Glaxo Group Limited Anitigen-binding constructs
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
JP5797565B2 (ja) 2009-03-11 2015-10-21 プロメディオール， インコーポレイテッド 過敏性障害（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に対する処置および診断方法
CA2755047C (en) 2009-03-11 2018-12-04 Promedior, Inc. Treatment methods for autoimmune disorders
US8067201B2 (en) * 2009-04-17 2011-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protein refolding
WO2011012646A2 (en) 2009-07-28 2011-02-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Non-invasive in vivo optical imaging method
EP2464663A4 (en) * 2009-08-13 2013-05-29 Massachusetts Inst Technology RECOMBINANT PROTEINS COMPRISING MUTANT DOMAINS OF FIBRONECTIN
WO2011051327A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Small antibody-like single chain proteins
ES2860453T3 (es) 2009-10-30 2021-10-05 Novartis Ag Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de la fibronectina de tipo III
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
JP5850860B2 (ja) 2010-01-28 2016-02-03 グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｄ１２７結合タンパク質
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
KR20130010461A (ko) 2010-02-18 2013-01-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｉｌ―２３에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
CN107098958B (zh) 2010-03-26 2021-11-05 达特茅斯大学理事会 Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
BR112012026003B1 (pt) 2010-04-13 2022-03-15 Medimmune, Llc Estrutura multimérica recombinante específica trail r2, seu uso, bem como composição
KR20130056871A (ko) 2010-04-13 2013-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｐｃｓｋ９에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
AU2011245225B2 (en) 2010-04-30 2015-09-17 Janssen Biotech, Inc. Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
KR20130036012A (ko) 2010-05-07 2013-04-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 생체외 세포의 검출을 위한 진단 방법
CN103180339B (zh) * 2010-05-26 2016-04-27 百时美施贵宝公司 具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
UY33421A (es) 2010-06-03 2011-12-30 Glaxo Wellcome House Proteinas de union al antígeno humanizados
US9012458B2 (en) 2010-06-25 2015-04-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination
PT2643352T (pt) 2010-11-23 2018-08-01 Glaxo Group Ltd Proteínas de ligação a antigénio para a oncostatina m (osm)
US20130236467A1 (en) 2010-11-24 2013-09-12 Jeremy Griggs Multispecific antigen binding proteins targeting hgf
SI2697257T1 (sl) 2011-04-13 2017-02-28 Bristol-Myers Squibb Company FC fuzijski proteini, ki vsebujejo nove linkerje ali razmestitve
CN105601741A (zh) 2011-04-15 2016-05-25 卡姆普根有限公司 多肽和多核苷酸及其用于治疗免疫相关失调和癌症的用途
CA2828946C (en) 2011-04-18 2016-06-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for tumor
US20140187488A1 (en) 2011-05-17 2014-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
ES2953190T3 (es) 2011-05-27 2023-11-08 Glaxo Group Ltd Proteínas de unión a BCMA (CD269/TNFRSF17)
ES2841809T3 (es) 2011-06-03 2021-07-09 Eisai R&D Man Co Ltd Biomarcadores para pronosticar y evaluar el grado de respuesta de sujetos con cáncer de tiroides y de riñón a compuestos de lenvatinib
EP4151785A1 (en) 2011-09-27 2023-03-22 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type iii repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces
AU2012323316B2 (en) 2011-10-11 2017-08-10 Viela Bio, Inc. CD40L-specific Tn3-derived scaffolds and methods of use thereof
AU2012327878A1 (en) 2011-10-28 2014-05-29 Patrys Limited PAT-LM1 epitopes and methods for using same
JP2015504038A (ja) 2011-10-31 2015-02-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 低減した免疫原性を有するフィブロネクチン結合ドメイン
PT2814843T (pt) 2012-02-13 2020-06-18 Agency Science Tech & Res Anticorpos monoclonais humanos neutralizantes de il-b
WO2013138338A2 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apoliporotein d
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
PT2846836T (pt) 2012-05-07 2019-10-29 Allergan Inc Método de tratamento de dmi em doentes refratários à terapia anti-vegf
WO2013177187A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with extended-pk il-2 and therapeutic agents
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CA2884704C (en) 2012-09-07 2023-04-04 Randolph J. Noelle Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
ES2879387T3 (es) 2012-09-13 2021-11-22 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina
WO2014072306A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
MX2015004979A (es) 2012-12-21 2015-07-17 Eisai R&D Man Co Ltd Forma amorfa de derivado de quinolina y metodo para su produccion.
US20150361159A1 (en) 2013-02-01 2015-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins
ES2814558T3 (es) 2013-02-06 2021-03-29 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de dominio de fibronectina tipo III con solubilidad mejorada
EP3744728A1 (en) 2013-02-12 2020-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
ES2645634T3 (es) 2013-02-12 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Métodos de replegado de proteínas a elevado pH
US20140242083A1 (en) * 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
WO2014165093A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
AU2014266223B2 (en) 2013-05-14 2020-06-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds
US9388222B2 (en) 2013-10-06 2016-07-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified Pseudomonas exotoxin A
EP3718558A1 (en) 2013-10-08 2020-10-07 Promedior, Inc. Methods for treating fibrotic cancers
EP3074038B1 (en) 2013-11-28 2019-01-02 CSL Limited Method of treating diabetic nephropathy
KR20160096194A (ko) 2013-12-18 2016-08-12 씨에스엘 리미티드 상처 치료 방법
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
MX369173B (es) 2013-12-24 2019-10-30 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos y fragmentos anti-vista.
JP6644701B2 (ja) 2014-03-20 2020-02-12 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 安定化したフィブロネクチンベーススキャフォールド分子
IL275497B (en) 2014-03-20 2022-09-01 Bristol Myers Squibb Co Serum proteins with type iii fibronectin binding domains
CN107073109B (zh) 2014-06-11 2021-08-06 凯西·A·格林 Vista激动剂和拮抗剂抑制或增强体液免疫的用途
AU2015301753B2 (en) 2014-08-12 2021-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with IL-2 and integrin-binding-Fc-fusion protein
WO2016025645A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker
ES2926687T3 (es) 2014-08-28 2022-10-27 Eisai R&D Man Co Ltd Derivado de quinolina muy puro y método para su producción
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
BR112017006602A2 (pt) 2014-10-01 2017-12-19 Medimmune Llc método de conjugação de um polipeptídeo
WO2016059602A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
HUE049982T2 (hu) 2014-11-14 2020-11-30 Hoffmann La Roche TNF-családba tartozó ligandum-trimert tartalmazó antigénkötõ molekulák
EA037590B1 (ru) 2014-11-25 2021-04-19 Бристол-Майерс Сквибб Компани Связывающиеся с pd-l1 полипептиды на основе 10fn3 домена для визуализации
BR112017010414A2 (pt) 2014-11-25 2018-05-15 Bristol-Myers Squibb Company métodos e composições para radiomarcação com 18f de substâncias biológicas
WO2016090347A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Immunext, Inc. Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators
KR20160075107A (ko) * 2014-12-19 2016-06-29 주식회사 이노테라피 페길화된 vegf 트랩 및 이의 제조방법
HUE064614T2 (hu) 2015-02-25 2024-04-28 Eisai R&D Man Co Ltd Eljárás egy kinolin-származék keserû ízének elnyomására
KR102662228B1 (ko) 2015-03-04 2024-05-02 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 vegfr/fgfr/ret 티로신 키나제 억제제의 조합
AU2016241499B2 (en) 2015-03-31 2020-12-17 Ildong Pharm Co., Ltd. Pharmaceutical composition for preventing and treating eye diseases, containing, as active ingredient, fusion protein in which tissue-penetrating peptide and anti-vascular endothelial growth factor preparation are fused
AU2016279474B2 (en) 2015-06-16 2021-09-09 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anticancer agent
BR112017027870A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista
ES2951260T3 (es) 2015-09-01 2023-10-19 Il Dong Pharma Composición para su uso en el tratamiento del cáncer o de una enfermedad relacionada con la angiogénesis que comprende una proteína de fusión de un péptido de penetración tumoral y un agente anti-VEGF
KR20180056701A (ko) 2015-09-23 2018-05-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 패스트-오프 레이트 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3356403A2 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
MX2018004157A (es) 2015-10-07 2019-04-01 F Hoffmann ­La Roche Ag Anticuerpos biespecificos con tetravalencia para un receptor de fnt coestimulador.
BR112018016461A2 (pt) 2016-02-12 2019-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
MX2018012469A (es) 2016-04-15 2019-07-04 Immunext Inc Anticuerpos vista antihumanos y uso de los mismos.
EP3455254B1 (en) 2016-05-11 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
WO2017210335A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics
WO2017210302A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Pet imaging with pd-l1 binding polypeptides
WO2018050902A2 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Quadrucept Bio Limited Multimers, tetramers & octamers
CN110023339A (zh) 2016-09-23 2019-07-16 Csl有限公司 凝血因子结合蛋白及其应用
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
WO2018111976A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Pd-l1 binding fibronectin type iii domains
JP7104703B2 (ja) 2016-12-14 2022-07-21 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｃｄ８ａ結合フィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン
EP3554561B1 (en) 2016-12-14 2023-06-28 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
TW201829469A (zh) 2017-01-03 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 包含抗4-1bb純系20h4.9之雙特異性抗原結合分子
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
WO2018132516A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Nodus Therapeutics Combination tumor treatment with an integrin-binding-fc fusion protein and immune modulator
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
MA49039A (fr) 2017-04-04 2020-02-12 Hoffmann La Roche Nouvelles molécules bispécifiques de liaison à l'antigène capables de se lier spécifiquement à cd40 et à fap
SG11201909154SA (en) 2017-04-05 2019-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
JP7228163B2 (ja) * 2017-04-11 2023-02-24 国立研究開発法人産業技術総合研究所 レクチンの固定化方法
AR111963A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Univ California Método y moléculas
WO2019036605A2 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Massachusetts Institute Of Technology MULTIPLE SPECIFICITY BINDING AGENTS OF CXC CHEMOKINES AND USES THEREOF
JP2020537668A (ja) 2017-10-18 2020-12-24 シーエスエル リミティド ヒト血清アルブミン変異体およびその使用
US20210324108A1 (en) 2017-11-01 2021-10-21 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific 2+1 contorsbodies
EP3703746A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
DK3717011T3 (da) 2017-11-29 2023-01-09 Csl Ltd Fremgangsmåde til behandling eller forebyggelse af iskæmi-reperfusionsskade
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
PE20210652A1 (es) 2018-04-13 2021-03-26 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
CN112424228A (zh) 2018-07-04 2021-02-26 豪夫迈·罗氏有限公司 新型双特异性激动性4-1bb抗原结合分子
CN112654641A (zh) 2018-10-01 2021-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 具有与cd40的三价结合的双特异性抗原结合分子
JP7221379B2 (ja) 2018-10-01 2023-02-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子
TW202030204A (zh) 2018-12-21 2020-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 靶向腫瘤之超促效cd28抗原結合分子
WO2020127618A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
EP3914289A1 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Massachusetts Institute of Technology Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade
GB201903767D0 (en) 2019-03-19 2019-05-01 Quadrucept Bio Ltd Multimers, tetramers & octamers
WO2020208049A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising lipocalin muteins
TW202115124A (zh) 2019-06-26 2021-04-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合至cea之新穎抗原結合分子
WO2020260326A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
US11781138B2 (en) 2019-10-14 2023-10-10 Aro Biotherapeutics Company FN3 domain-siRNA conjugates and uses thereof
JP2022551204A (ja) 2019-10-14 2022-12-07 アロ・バイオセラピューティクス・カンパニー Ｃｄ７１結合フィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン
AU2020404453B2 (en) 2019-12-20 2022-12-08 Hudson Institute of Medical Research CXCL10 binding proteins and uses thereof
WO2021174045A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Radiolabeled fibronectin based scaffolds and antibodies and theranostic uses thereof
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
US20220017637A1 (en) 2020-06-23 2022-01-20 Hoffmann-La Roche Inc. Agonistic cd28 antigen binding molecules targeting her2
WO2021260064A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3/anti-cd28 bispecific antigen binding molecules
JP2023549316A (ja) 2020-11-16 2023-11-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｆａｐを標的としたｃｄ４０アゴニストとの併用療法
EP4274658A1 (en) 2021-01-06 2023-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
CN113151126B (zh) * 2021-02-10 2023-08-08 大连大学 一种高表达n-糖基化抗vegfr2单体拟抗体的重组渗漏菌株、其构建方法及应用
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
WO2022243261A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
AR126009A1 (es) 2021-06-02 2023-08-30 Hoffmann La Roche Moléculas agonistas de unión al antígeno cd28 que se dirigen a epcam
WO2023279092A2 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
CN117715936A (zh) 2021-07-28 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的方法和组合物
TW202340248A (zh) 2021-12-20 2023-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 促效性ｌｔｂｒ抗體及包含其之雙特異性抗體
WO2023186756A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Interferon gamma variants and antigen binding molecules comprising these
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof
WO2024092717A1 (zh) * 2022-11-04 2024-05-10 庄伟哲 纤维黏蛋白第iii型结构域衍生的蛋白质及其应用
GB202216503D0 (en) 2022-11-05 2022-12-21 Quadrucept Bio Ltd Non-human vertebrates & cells

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5770697A (en) * 1986-11-04 1998-06-23 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US5641648A (en) * 1986-11-04 1997-06-24 Protein Polymer Technologies, Inc. Methods for preparing synthetic repetitive DNA
US5514581A (en) * 1986-11-04 1996-05-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer
US6018030A (en) * 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US4863457A (en) 1986-11-24 1989-09-05 Lee David A Drug delivery device
US4997652A (en) 1987-12-22 1991-03-05 Visionex Biodegradable ocular implants
US5164188A (en) 1989-11-22 1992-11-17 Visionex, Inc. Biodegradable ocular implants
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
KR0185215B1 (ko) 1990-11-30 1999-05-01 요시다 쇼오지 서방성 안구삽입용 약제
US5235041A (en) * 1990-12-28 1993-08-10 Protein Polymer Technologies, Inc. Purification of structurally ordered recombinant protein polymers
US5792742A (en) * 1991-06-14 1998-08-11 New York University Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin
WO1994017097A1 (en) * 1993-01-19 1994-08-04 Regents Of The University Of Minnesota Synthetic fibronectin fragments as inhibitors of retroviral infections
DE69425411T2 (de) 1993-02-26 2001-02-08 Santen Pharmaceutical Co Ltd Biologisch abbaubarer sklerastopfen
US5443505A (en) 1993-11-15 1995-08-22 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible ocular implants
US5516522A (en) 1994-03-14 1996-05-14 Board Of Supervisors Of Louisiana State University Biodegradable porous device for long-term drug delivery with constant rate release and method of making the same
US5869079A (en) 1995-06-02 1999-02-09 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Formulation for controlled release of drugs by combining hydrophilic and hydrophobic agents
US6369116B1 (en) 1995-06-02 2002-04-09 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Composition and method for treating glaucoma
GB9618960D0 (en) * 1996-09-11 1996-10-23 Medical Science Sys Inc Proteases
US5922676A (en) * 1996-09-20 1999-07-13 The Burnham Institute Methods of inhibiting cancer by using superfibronectin
WO1998031794A1 (fr) * 1997-01-17 1998-07-23 Toa Gosei Co., Ltd. Polypeptide liant le facteur vegf
EP0971946B1 (en) 1997-01-21 2006-07-05 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US6261804B1 (en) * 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
JP4187277B2 (ja) * 1997-04-30 2008-11-26 エンゾン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
JP3614866B2 (ja) * 1997-06-12 2005-01-26 リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイティド 人工抗体ポリペプチド
US6159722A (en) * 1997-12-03 2000-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Chimeric serine proteases
IL138668A0 (en) 1998-04-03 2001-10-31 Phylos Inc Addressable protein arrays
JP4108827B2 (ja) 1998-05-28 2008-06-25 大日本印刷株式会社 無機質系化粧板
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
EP2154535A1 (en) 1998-12-10 2010-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR100816572B1 (ko) 1999-04-28 2008-03-24 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-ｖｅｇｆ 항체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
DE60034566T2 (de) 1999-07-27 2008-01-03 Adnexus Therapeutics, Inc., Waltham Peptidakzeptor ligationsverfahren
EP1268544A2 (en) * 2000-03-31 2003-01-02 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
CA2412664A1 (en) * 2000-06-15 2001-12-20 Board Of Regents The University Of Texas System Regulatable, catalytically active nucleic acids
CA2416219C (en) 2000-07-11 2016-10-11 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
EP2141243A3 (en) 2000-10-16 2010-01-27 Brystol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7598352B2 (en) * 2000-11-17 2009-10-06 University Of Rochester Method of identifying polypeptide monobodies which bind to target proteins and use thereof
ATE306951T1 (de) 2000-11-29 2005-11-15 Allergan Inc Verhinderung von transplantatabstossung im auge
WO2002081497A2 (en) 2001-04-04 2002-10-17 University Of Rochester αξβ3 INTEGRIN-BINDING POLYPEPTIDE MONOBODIES AND THEIR USE
AU2002342672A1 (en) 2001-09-11 2003-03-24 Nascacell Gmbh Method for screening for inhibitors of protein/protein interaction and corresponding ribozymes
AU2003213687A1 (en) 2002-03-04 2003-09-22 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to kdr and uses thereof
AU2003243436A1 (en) 2002-06-06 2003-12-22 Shohei Koide Reconstituted polypeptides
US7053701B2 (en) 2003-11-04 2006-05-30 Vice Michael W Power amplifier output stage with multiple power states and improved efficiency
US20080220049A1 (en) 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
SG149004A1 (en) 2003-12-05 2009-01-29 Bristol Myers Squibb Co Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20050244469A1 (en) 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Extended therapeutic effect ocular implant treatments
US20070059336A1 (en) 2004-04-30 2007-03-15 Allergan, Inc. Anti-angiogenic sustained release intraocular implants and related methods
WO2005110374A1 (en) 2004-04-30 2005-11-24 Allergan, Inc. Intraocular drug delivery systems containing a therapeutic component, a cyclodextrin, and a polymeric component
US20060182783A1 (en) 2004-04-30 2006-08-17 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems
AU2005294382A1 (en) 2004-10-04 2006-04-20 Qlt Usa, Inc. Ocular delivery of polymeric delivery formulations
US20070072933A1 (en) 2005-09-26 2007-03-29 Peyman Gholam A Delivery of an ocular agent
MX339797B (es) 2005-10-18 2016-06-10 Allergan Inc Terapia ocular que usa derivados glucocorticoides que penetran selectivamente los tejidos del segmento posterior.
US20070099879A1 (en) 2005-10-31 2007-05-03 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Method of using calcitriol for treating intraocular diseases associated with angiogenesis
AU2007293169A1 (en) 2006-02-02 2008-03-13 Allergan, Inc. Compositions and methods for the treatment of ophthalmic disease
WO2008031098A1 (en) 2006-09-09 2008-03-13 The University Of Chicago Binary amino acid libraries for fibronectin type iii polypeptide monobodies
EP2727936B1 (en) 2006-11-22 2016-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR
WO2008097497A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company Vegf pathway blockade
US11078262B2 (en) 2007-04-30 2021-08-03 Allergan, Inc. High viscosity macromolecular compositions for treating ocular conditions
US20090176654A1 (en) 2007-08-10 2009-07-09 Protelix, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US8680019B2 (en) 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
EP2197476A2 (en) 2007-08-20 2010-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Use of vegfr-2 inhibitors for treating metastatic cancer
CA2697992C (en) * 2007-10-04 2017-08-22 Zymogenetics, Inc. B7 family member zb7h6 and related compositions and methods
AU2008319298B2 (en) 2007-10-31 2014-07-31 Medimmune, Llc Protein scaffolds
WO2009073115A1 (en) 2007-11-28 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with mtor inhibitors
AU2008345674A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Ortho Biotech Inc. Alternative scaffold protein fusions phage display via fusion to pIX of M13 phage
EA201000979A1 (ru) 2007-12-27 2011-02-28 Новартис Аг Улучшенные связывающие молекулы на основе фибронектина и их применение
WO2009102421A2 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins that bind egfr
PT2274331E (pt) 2008-05-02 2014-02-27 Novartis Ag Moléculas de ligação baseadas em fibronectina melhoradas e suas utilizações
PE20091931A1 (es) 2008-05-22 2009-12-31 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de dominio de armazon basadas en fibronectina multivalentes
RS55218B1 (sr) 2008-10-31 2017-02-28 Janssen Biotech Inc Kompozicije fibronektin tip iii skalno baziranih domena, metode i upotrebe
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
US20110275535A1 (en) 2008-12-16 2011-11-10 Novartis Ag Yeast Display Systems
EP2396000A1 (en) 2009-02-11 2011-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with temozolomide
JP5873335B2 (ja) 2009-02-12 2016-03-01 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド フィブロネクチンｉｉｉ型ドメインに基づくスカフォールド組成物、方法及び使用
US8067201B2 (en) 2009-04-17 2011-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protein refolding
EP2464663A4 (en) 2009-08-13 2013-05-29 Massachusetts Inst Technology RECOMBINANT PROTEINS COMPRISING MUTANT DOMAINS OF FIBRONECTIN
ES2860453T3 (es) 2009-10-30 2021-10-05 Novartis Ag Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de la fibronectina de tipo III
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
US20110123545A1 (en) 2009-11-24 2011-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of vegfr2 and igf1r inhibitors for the treatment of proliferative diseases
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
US8961977B2 (en) 2010-02-12 2015-02-24 University Of Rochester Antigenic mimics of discontinuous epitopes of pathogen recognized by broadly neutralizing antibodies
KR20130010461A (ko) 2010-02-18 2013-01-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｉｌ―２３에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
KR20130056871A (ko) 2010-04-13 2013-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｐｃｓｋ９에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
BR112012026003B1 (pt) 2010-04-13 2022-03-15 Medimmune, Llc Estrutura multimérica recombinante específica trail r2, seu uso, bem como composição
AU2011245225B2 (en) 2010-04-30 2015-09-17 Janssen Biotech, Inc. Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
CN103180339B (zh) 2010-05-26 2016-04-27 百时美施贵宝公司 具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质
CN107903321A (zh) 2010-07-30 2018-04-13 诺华有限公司 纤连蛋白摇篮分子和其库
CN103380143B (zh) 2010-12-22 2016-01-06 百时美施贵宝公司 结合il-23的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白质
SI2697257T1 (sl) 2011-04-13 2017-02-28 Bristol-Myers Squibb Company FC fuzijski proteini, ki vsebujejo nove linkerje ali razmestitve
US20140187488A1 (en) 2011-05-17 2014-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
EP2710382B1 (en) 2011-05-17 2017-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Improved methods for the selection of binding proteins
EP4151785A1 (en) 2011-09-27 2023-03-22 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type iii repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces

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