RU2562862C2 - Конъюгаты меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами - Google Patents

Конъюгаты меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами Download PDF

Info

Publication number
RU2562862C2
RU2562862C2 RU2012123007/10A RU2012123007A RU2562862C2 RU 2562862 C2 RU2562862 C2 RU 2562862C2 RU 2012123007/10 A RU2012123007/10 A RU 2012123007/10A RU 2012123007 A RU2012123007 A RU 2012123007A RU 2562862 C2 RU2562862 C2 RU 2562862C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
cysteine
antibodies
zirconium
protein
Prior art date
Application number
RU2012123007/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012123007A (ru
Inventor
Херман ДЖИЛЛ
Джагатх Р. ДЖУНУТУЛА
Генри Б. ЛОУМЭН
Ян МАРИК
Джефф ТИНИАНОУ
Саймон УИЛЛЬЯМС
Original Assignee
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Инк.
Publication of RU2012123007A publication Critical patent/RU2012123007A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2562862C2 publication Critical patent/RU2562862C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1051—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from breast, e.g. the antibody being herceptin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/04—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids
    • C07C259/06—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids having carbon atoms of hydroxamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению меченых антител, и может быть использовано для диагностики. Антитела конструируют с заменой одной или нескольких аминокислот исходного антитела на не являющиеся перекрестно связанными, высокореакционноспособные цистеиновые аминокислоты. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами (Ab) конъюгируют с одной или несколькими метками с комплексом циркония (Z) через линкер (L) для получения конъюгатов меченных цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами, обладающих формулой I: Ab-(L-Z)p, где p представляет собой 1-4. Изобретение позволяет повысить эффективность диагностики за счет использования меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами для получения изображений. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 29 ил., 12 табл., 23 пр.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки США, имеющей серийный № 12/612912 и поданной 5 ноября 2009 г, являющейся частичным продолжением заявки США, имеющей серийный № 12/399241 и поданной 6 марта 2009 г, являющейся продолжением заявки США, имеющей серийный № 11/233258 и поданной 22 сентября 2005 г., в настоящее время заявка США 7521541, поданная 21 апреля 2009 г., а также по пункту 35 USC § 119(e) испрашивается приоритет Предварительной патентной заявки США, имеющей серийный № 60/612468 и поданной 23 сентября 2004 г., и Предварительной патентной заявки США, имеющей серийный № 60/696353 и поданной 30 июня 2005 г., полное содержание каждой из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится, главным образом, к сконструированным антителам с реакционноспособными остатками цистеина, и более конкретно, к антителам с терапевтическими или диагностическими применениями. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами можно конъюгировать с химиотерапевтическими средствами, токсинами, аффинными лигандами, такими как биотин, и метками для детекции, такими как радиоактивные изотопы и флуорофоры. Изобретение также относится к способам использования антител и соединений - конъюгатов антитело-лекарственное средство для диагностики или лечения клеток млекопитающих или связанных с ними патологических состояний in vitro, in situ и in vivo.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Получение изображений на молекулярном уровне является важным инструментом для разработки и оценки новых лекарственных средств. Иммуно-позитронная эмиссионная томография (ИммуноПЭТ) представляет собой быстро развивающийся способ отслеживания и количественной оценки моноклональных антител (mAb) in vivo, поскольку в нем эффективно скомбинирована высокая чувствительность ПЭТ с высокой чувствительностью mAb. ИммуноПЭТ приближается к тому, чтобы стать клиническим способом выбора для неинвазивной диагностики, обеспечивающим «всеобъемлющее иммуногистохимическое окрашивание in vivo» (van Dongen GA, et al. «ImmunoPET: a navigator in monoclonal antibody development and applications» Oncologist 2007;12: 1379-89). Поскольку для ИммуноПЭТ необходимо присоединение позитронно-активного радиоизотопа к намеченной специфической молекуле, необходимо, чтобы биологическое время полужизни молекулы совпадало со временем полужизни радиоактивного изотопа (Verel I, et al. «The promise of immuno-PET in radioimmunotherapy» J Nucl Med 2005; 46 Suppl 1: 164S-71S). Хотя антитела (~150 кДа) обладают временем полужизни в сыворотке в диапазоне от суток до недель, получение изображений, как правило, обеспечивает максимальные соотношения сигнала к фону через 2-6 суток после введения метки на основе антител, что требует использования радиоактивных изотопов, таких как 89Zr и 124I со временем полужизни 3,3 суток и 4,2 суток, соответственно. К сожалению, время полужизни легко доступного 64Cu (12,7 ч) является слишком коротким для получения изображений с хорошим контрастом в эти временные рамки.
Разработка средств на основе Mab для получения изображений при позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) (Иммуно-ПЭТ) продолжает являться многообещающим инструментом для локализации и количественного определения молекулярных мишеней и может улучшать клиническую диагностику патологических состояний (van Dongen et al (2007) Oncologist 12;1379-89; Williams et al (2001) Cancer Biother Radiopharm 16:25-35; Holliger et al (2005) Nat Biotechnol 23: 1126-36). ПЭТ представляет собой способ получения изображений на молекулярном уровне, все больше используемый для детекции заболеваний. Системы получения изображений ПЭТ создают изображения на основе распределения позитронно-активных изотопов в ткани пациента. Изотопы, как правило, вводят пациенту посредством инъекции молекул-зондов, содержащих позитронно-активный изотоп, такой как F-18, C-11, N-13 или O-15, ковалентно присоединенный к молекуле, поддающейся легкому метаболизму или локализации в организме (например, глюкоза), или химически связывающейся с участками рецепторов внутри организма. В некоторых случаях изотоп вводят пациенту в виде ионного раствора или посредством ингаляции. Небольшие средства для получения изображения иммуно-ПЭТ, такие как Fab-фрагменты антител (50 кДа) или диатела, спаренные димеры ковалентно связанной VH-VL области Mab, 55 кДа (Shively et al (2007) J Nucl Med 48: 170-2), могут являться особенно пригодными, поскольку они обладают коротким временем полужизни, высоким проникновением в ткани, и достигают оптимального соотношения опухоли к фону между двумя и четырьмя часами после инъекции, облегчая использование изотопов с коротким временем полужизни, таких как широкодоступный 18F (109,8 мин).
Иод 124 (124I) присоединяли к антителу 3F9 и использовали для дозиметрической оценки радиммунотерапии нейробластомы (Larson SM, et al «PET scanning of iodine-124-3F9 as an approach to tumor dosimetry during treatment planning for radioimmunotherapy in a child with neuroblastoma» J Nucl Med 1992;33:2020-3). Позже, с возникновением более сложных инструментов ПЭТ и улучшенных способов мечения радиоактивным иодом, 124I использовали в многочисленных исследованиях иммуноПЭТ (Verel I, et al «High-quality 124I-labelled monoclonal antibodies for use as PET scouting agents prior to 131I-radioimmunotherapy» European journal of nuclear medicine и molecular imaging 2004; 31:1645-52; Lee FT et al «Immuno-PET of human colon xenograft-bearing BALB/c nude mice using 124I-CDR-grafted humanized A33 monoclonal antibody» J Nucl Med 2001;42:764-9; Sundaresan G, et al. «124I-labeled engineered anti-CEA minibodies and diabodies allow high-contrast, antigen-specific small-animal PET imaging of xenografts in athymic mice» J Nucl Med 2003; 44:1962-9; Jain M and Batra SK. «Genetically engineered antibody fragments and PET imaging: a new era of radioimmunodiagnosis» J Nucl Med 2003; 44:1970-2; Gonzalez Trotter DE et al. «Quantitation of small-animal (124)I activity distributions using a clinical PET/CT scanner» J Nucl Med 2004; 45:1237-44; Robinson MK, et al. «Quantitative immuno-positron emission tomography imaging of HER2-positive tumor xenografts with an iodine-124 labeled anti-HER2 diabody» Cancer Res 2005; 65:1471-8; Jayson GC et al. «Molecular imaging and biological evaluation of HuMV833 anti-VEGF antibody: implications for trial design of antiangiogenic antibodies» J Natl Cancer Inst 2002; 94:1484-93; Divgi CR, et al. «Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial» Lancet Oncol 2007; 8:304-10). Несмотря на относительно простые способы мечения радиоактивным иодом, доступные для присоединения 124I к mAb, важные ограничения замедляют повсеместное доклиническое использование этого радиоактивного изотопа. Следует отметить, что схема распада комплекса включает позитроны с высокой энергией (β+ макс. 1,5 и 2,1 МэВ), что отрицательно влияет на разрешение микроПЭТ для мелких животных. Кроме того, интернализованные меченные иодом белки подвергаются ферментативному деиодированию с быстрым выведением свободного иодида из клеток-мишеней, что приводит к тому, что изображения ПЭТ не отражают действительного поглощения mAb «Perera RM et al. «Internalization, intracellular trafficking, and biodistribution of monoclonal antibody 806: a novel anti-epidermal growth factor receptor antibody» Neoplasia (New York, N.Y 2007;9: 1099-110). Использование 89Zr преодолевает эти недостатки, поскольку позитроны, испускаемые при распаде 89Zr (β макс. 897 кэВ), обеспечивают разрешение микроПЭТ, сравнимое с 18F и 11C (приблизительно 1 мм). Метаболиты интернализованных 89Zr-mAb отслеживают также внутри клеток в лизосомах, обеспечивая лучшую корреляцию действительного поглощения mAb с получением изображений ПЭТ (van Dongen GA, et al. «Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications» Oncologist 2007;12: 1379-89).
Общепринятые средства присоединения, т.е., связывания посредством ковалентных связей, метки, такой как радиоактивный изотоп, флуоресцентный краситель или группа лекарственного средства, к антителу, как правило, приводит к гетерогенной смеси молекул, где группы метки присоединены к ряду участков антитела. Например, цитотоксические средства как правило, конъюгируют с антителами через многочисленные остатки лизина в антителе, получая гетерогенную смесь конъюгата антитело-лекарственное средство. В зависимости от условий реакции, гетерогенная смесь, как правило, содержит распределение антител с присоединенными от 0 до приблизительно 8 или более групп лекарственного средства. Кроме того, в пределах каждой подгруппы конъюгатов с определенным целочисленным соотношением групп лекарственного средства к антителу, присутствует потенциально гетерогенная смесь, где группа лекарственного средства присоединена к различным участкам антитела. Аналитические и препаративные способы являются неадекватными для разделения и характеризации видов молекул конъюгата антитело-лекарственное средство внутри гетерогенной смеси, полученной в результате реакции конъюгации. Антитела представляют собой большие, сложные и структурно разнообразные биомолекулы, часто со множеством реакционноспособных функциональных групп. Их реакционная способность по отношению к линкерным реагентам и промежуточным соединениям лекарственное средство-линкер зависит от таких факторов, как pH, концентрация, концентрация соли и сорастворители. Более того, способ многоступенчатой конъюгации может являться невоспроизводимым из-за сложностей в контролировании условий реакции и характеризации реагентов и промежуточных соединений.
Тиолы цистеина являются реакционноспособными при нейтральном pH, в отличие от большинства аминов, которые являются протонированными и менее нуклеофильными при pH около 7. Поскольку свободные тиоловые (RSH, сульфгидрильные) группы являются относительно реакционноспособными, белки с остатками цистеина часто существуют в их окисленной форме в виде связанных дисульфидными мостиками олигомеров или имеют дисульфидные группы, образующие внутренние мостики. Внеклеточные белки, как правило, не имеют свободных тиолов (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, at page 55). Количество свободного тиола в белке можно оценивать общепринятым анализом Элмана. Иммуноглобулин M является примером пентамера, связанного дисульфидными связями, в то время как иммуноглобулин G является примером белка с внутренними дисульфидными мостиками, связывающими субъединицы вместе. В белках, подобных этим, необходимо восстановление дисульфидных связей с помощью такого реагента, как дитиотреитол (DTT) или селенол (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304: 147-156), для получения реакционноспособного свободного тиола. Этот способ может приводить к потере третичной структуры и антигенсвязывающей специфичности антитела.
Тиоловые группы остатков цистеина антител, как правило, являются более реакционноспособными, т.е. более нуклеофильными, по отношению к электрофильным реагентам для конъюгации, чем аминогруппы или гидроксильные группы антител. Остатки цистеина вводили в белки способами генной инженерии для формирования ковалентных присоединений к лигандам или для формирования новых внутримолекулярных дисульфидных связей (Better et al (1994) J. Biol. Chem. 269(13):9644-9650; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; US 6248564). Однако, конструирование тиоловых групп цистеина посредством мутации различных аминокислотных остатков белка до цистеиновых аминокислот потенциально является проблематичным, в частности, в случае неспаренных (свободных Cys) остатков или остатков, относительно доступных для реакции или окисления. В концентрированных растворах белка, в периплазме E. coli, культуральных супернатантах, или частично или полностью очищенном белке, неспаренные остатки Cys на поверхности белка могут спариваться и окисляться с формированием межмолекулярных дисульфидных мостиков, и таким образом, димеров или мультимеров белка. Формирование дисульфидных димеров делает новые Cys нереакционноспособными для конъюгации с лекарственным средством, лигандом или другой меткой. Более того, если в белке с помощью окисления образуется внутримолекулярная дисульфидная связь между новым сконструированным Cys и существующим остатком Cys, обе группы Cys недоступны для участия в активном участке и взаимодействий. Более того, белок может становиться неактивным или неспецифическим из-за неправильного сворачивания или потери третичной структуры (Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9).
Сайт-специфическая конъюгация является предпочтительной по сравнению с модификацией случайных аминогрупп, поскольку она позволяет химическую модификацию в участке, отдаленном от участка связывания, обеспечивая полное сохранение биологической активности и позволяя контроль над возможным количеством добавленных простетических групп. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами разработаны в форме FAB-фрагментов антител (тиоFab) и экспрессированы в форме полноразмерных, моноклональных (тиоMab) антител IgG. См.: US 7521541; Junutula JR et al. «Rapid identification of reactive cysteine residues for site-specific labeling of antibody-Fabs» J Immunol Methods 2008; 332:41-52; Junutula JR et al. «Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index» (2008) Nat Biotechnol. 26:925-32, содержание которых приведено в качестве ссылки. Антитела ТиоFab и ТиоMab конъюгировали посредством линкеров на тиолах нового введенного цистеина с помощью вступающих в реакцию с тиолом линкерных реагентов и реагентов лекарственное средство-линкер для получения конъюгатов с лекарственным средством сконструированного антитела с цистеиновыми заменами (Тио ADC) с противораковыми свойствами, включая анти-MUC16 (US 2008/0311134), анти-CD22 (US 2008/0050310), анти-ROBO4 (US 2008/0247951), анти-TENB2 (US 2009/0117100), анти-CD79B (US 2009/0028856; US 2009/0068202) Тио ADC.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соединения по изобретению включают сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, где одна или несколько аминокислот исходного антитела заменены на свободную аминокислоту цистеин. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, обладающих значением реакционной способности тиола в диапазоне от 0,6 до 1,0. Свободная аминокислота цистеин представляет собой остаток цистеина, введенный при конструировании в исходное антитело и не являющийся частью дисульфидного мостика.
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами могут являться пригодными для диагностики и лечения злокачественных опухолей и включают антитела, специфические для рецепторов поверхности клеток и трансмембранных рецепторов, и для опухолеассоциированных антигенов (TAA). Такие антитела можно использовать в форме голых антител (не конъюгированных с группой лекарственного средства или метки) или в форме конъюгатов антитело-цирконий (AZC).
Варианты осуществления способов получения и скрининга сконструированных антител с цистеиновыми заменами включают варианты, где исходное антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как hu4D5Fabv8. Исходное антитело может представлять собой также слитый белок, содержащий альбуминсвязывающую пептидную последовательность (ABP). Исходное антитело может представлять собой также гуманизированное антитело, выбранное из huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (трастузумаб).
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами по изобретению можно сайт-специфическим и эффективным образом присоединять к вступающему в реакцию с тиолом реагенту. Вступающий в реакцию с тиолом реагент может представлять собой содержащий радиоактивный изотоп реагент, мультифункциональный линкерный реагент, связывающий метку реагент, содержащий флуорофор реагент или промежуточное соединение лекарственное средство-линкер.
Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами можно метить поддающейся детекции меткой, иммобилизовывать на твердофазной подложке и/или конъюгировать с группой лекарственного средства.
Другой аспект изобретения относится к меченному цирконием сконструированному антителу с цистеиновыми заменами, содержащему сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и комплексом циркония (Z), обладающему формулой I:
Figure 00000001
где p представляет собой 1-4.
Другой аспект изобретения относится к меченному десферриоксамином сконструированному антителу с цистеиновыми заменами, содержащему сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и группой десферриоксамина (Df), обладающему формулой II:
Figure 00000002
где L-Df выбран из:
Figure 00000003
где волнистая линия обозначает присоединение к антителу (Ab); и
p представляет собой 1-4.
Другой аспект изобретения относится к реагенту для мечения десферриоксамином, выбранному из структур:
Figure 00000004
где R выбран из:
Figure 00000005
.
Другой аспект изобретения относится к способу получения меченного десферриоксамином сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, содержащего сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и группой десферриоксамина (Df), обладающего формулой II:
Figure 00000006
где L-Df выбран из:
Figure 00000007
где волнистая линия обозначает присоединение к антителу (Ab); и
p представляет собой 1-4;
где способ включает реакцию композиции, выбранной из структур:
Figure 00000008
где R выбран из:
Figure 00000009
со сконструированным антителом с цистеиновыми заменами, имеющим одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, посредством чего получают меченное десферриоксамином сконструированное антитело с цистеиновыми заменами.
Другой аспект изобретения относится к способу получения меченного цирконием сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, содержащего сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и комплексом циркония (Z), обладающего формулой I:
Figure 00000010
где p представляет собой 1-4;
где способ включает образование комплекса содержащего цирконий реагента с меченным десферриоксамином сконструированным антителом с цистеиновыми заменами, содержащим сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и группой десферриоксамина (Df), обладающим формулой II:
Figure 00000011
где L-Df выбран из:
Figure 00000012
где волнистая линия обозначает присоединение к антителу (Ab); и
p представляет собой 1-4;
посредством чего получают меченное десферриоксамином сконструированное антитело с цистеиновыми заменами.
Другой аспект изобретения относится к способу получения изображения, включающему:
введение меченного цирконием сконструированного антитела с цистеиновыми заменами животному; и
детекцию in vivo присутствия меченного цирконием сконструированного антитела с цистеиновыми заменами посредством получения изображений,
где меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), имеющее одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, конъюгированных с одним или несколькими комплексами циркония (Z) посредством линкера (L) и имеющее формулу I:
Figure 00000013
где p представляет собой 1-4.
Другой аспект изобретения относится к диагностическим применениям соединений и композиций, описанных в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фигуре 1A показано трехмерное представление фрагмента антитела hu4D5Fabv7 в координатах кристалла, полученных с помощью рентгеновского излучения. Положения в структуре иллюстративных сконструированных остатков Cys тяжелой и легкой цепей пронумерованы (в соответствии с последовательной системой нумерации).
На фигуре 1B показана схема последовательной нумерации (верхний ряд), начиная с N-конца, по сравнению со схемой нумерации Kabat (нижний ряд) для 4D5v7fabH. Вставки с нумерацией по Kabat обозначены a, b, c.
На фигурах 2A и 2B показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для hu4D5Fabv8 и Cys мутантных (ТиоFab) фаговых вариантов hu4D5Fabv8: (A) небиотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 и (B) биотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 (B) посредством анализа PHESELECTOR для взаимодействий с BSA (незакрашенный столбец), HER2 (заштрихованный столбец) или стрептавидином (закрашенный столбец).
На фигурах 3A и 3B показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для hu4D5Fabv8 (слева) и Cys мутантных (ТиоFab) вариантов hu4D5Fabv8: (A) небиотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 и (B) биотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 посредством анализа PHESELECTOR для взаимодействий с: BSA (незакрашенный столбец), HER2 (заштрихованный столбец) и стрептавидином (незакрашенный столбец). Варианты легкой цепи расположены на левой стороне, а варианты тяжелой цепи расположены на правой стороне. Реакционная способность тиола = OD450нм для связывания стрептавидина ÷ OD450нм для связывания HER2 (антитела).
На фигуре 4A показаны значения относительной доступности поверхности остатков в hu4D5Fabv8 дикого типа. Участки легкой цепи расположены на левой стороне, а участки тяжелой цепи расположены на правой стороне.
На фигуре 4B показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для вариантов биотинилированного hu4D5Fabv8 (слева) и Cys мутанта (ТиоFab) hu4D5Fabv8 при взаимодействиях с HER2 (сутки 2), стрептавидином (SA) (сутки 2), HER2 (сутки 4) и SA (сутки 4). Cys варианты фаг-hu4D5Fabv8 выделяли и хранили при 4°C. На сутки 2 или сутки 4 проводили конъюгацию с биотином с последующими анализами PHESELECTOR для мониторирования их взаимодействия с Her2 и стрептавидином, как описано в примере 2, и тестировали стабильность реакционноспособных тиоловых групп на сконструированных вариантах ТиоFab.
На фигуре 5 показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для конъюгированного с биотин-малеимидом-hu4D5Fabv8 (A121C) и небиотинилированного hu4D5Fabv8 дикого типа при связывании со стрептавидином и HER2. Каждый Fab тестировали при 2 нг и 20 нг.
На фигуре 6 показан анализ ELISA с детекцией оптической плотности при 450 нм для биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8 дикого типа (wt), и цистеиновых мутантов ABP-hu4D5Fabv8 V110C и A121C при связывании с кроличьим альбумином, стрептавидином (SA) и HER2.
На фигуре 7 показан анализ ELISA с детекцией оптической плотности при 450 нм для цистеиновых мутантов (вариантов ТиоFab) биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8: (слева направо) варианты с одним Cys ABP-V110C, ABP-A121C и варианты с двойным Cys ABP-V110C-A88C и ABP-V110C-A121C при связывании с кроличьим альбумином, HER2 и стрептавидином (SA), и использовании в качестве зондов Fab-HRP или SA-HRP.
На фигуре 8 показано связывание фага с биотинилированным ТиоFab и антитела против фага с HRP с HER2 (вверху) и стрептавидином (внизу).
На фигуре 13A показано графическое изображение связывания биотинилированного антитела с иммобилизованным HER2, со связыванием меченного HRP вторичного антитела для детекции оптической плотности.
На фигуре 13B показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для конъюгированных с биотином-малеимидом вариантов тио-трастузумаба и небиотинилированного трастузумаба дикого типа при связывании с иммобилизованным HER2. Слева направо: V110C (один cys), A121C (один cys), V110C/A121C (двойной cys) и трастузумаб. Каждый вариант тио-IgG и трастузумаб тестировали при 1, 10 и 100 нг.
На фигуре 14A показано графическое изображение связывания биотинилированного антитела с иммобилизованным HER2, со связыванием биотина с анти-IgG-HRP для детекции оптической плотности.
На фигуре 14B показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для конъюгированных с биотин-малеимидом вариантов тио-трастузумаба и небиотинилированного трастузумаба дикого типа при связывании с иммобилизованным стрептавидином. Слева направо: V110C (один cys), A121C (один cys), V110C/A121C (двойной cys) и трастузумаб. Каждый вариант тио-IgG и трастузумаб тестировали при 1, 10 и 100 нг.
На фигуре 15 показан общий способ подготовки сконструированного антитела с цистеиновыми заменами (ТиоMab), экспрессированного из культуры клеток, для конъюгации.
На фигуре 16 показан анализ электрофорезом в невосстанавливающем (вверху) и восстанавливающем (внизу) денатурирующем полиакриламидном геле вариантов 2H9 ТиоMab Fc (слева направо, дорожки 1-9): A339C; S337C; S324C; A287C; V284C; V282C; V279C; V273C, и 2H9 дикого типа после очистки на иммобилизованном белке A. Дорожка справа представляет собой маркер размера, указывающий на то, что интактные белки составляют приблизительно 150 кДа, фрагменты тяжелой цепи приблизительно 50 кДа, и фрагменты легкой цепи приблизительно 25 кДа.
На фигуре 17A показан анализ электрофорезом в невосстанавливающем (слева) и восстанавливающем (+DTT) (справа) денатурирующем полиакриламидном геле вариантов 2H9 ТиоMab варианты (слева направо, дорожки 1-4): L-V15C; S179C; S375C; S400C, после очистки на иммобилизованном белке A.
На фигуре 17B показан анализ электрофорезом в невосстанавливающем (слева) и восстанавливающем (+DTT) (справа) денатурирующем полиакриламидном геле вариантов 2H9 и 3A5 ТиоMab, после очистки на иммобилизованном белке A.
На фигуре 18 показан анализ вестерн-блоттингом вариантов биотинилированного Тио-IgG. Варианты ТиоMab 2H9 и 3A5 анализировали электрофорезом в восстанавливающем денатурирующем полиакриламидном геле, белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве зондов для анализа присутствия антитела и конъюгированного биотина служили анти-IgG-HRP (вверху) и стрептавидин-HRP (внизу), соответственно. Дорожка 1: 3A5 H-A121C. Дорожка 2: 3A5 L-V110C. Дорожка 3: 2H9 H-A121C. Дорожка 4: 2H9 L-V110C. Дорожка 5: 2H9 дикого типа.
На фигуре 19 показан анализ ELISA связывания вариантов биотинилированного 2H9 со стрептавидином посредством использования в качестве зонда анти-IgG-HRP и измерения оптической плотности при 450 нм (верхняя столбчатая диаграмма). Нижняя схематическая диаграмма изображает дизайн эксперимента, используемый для анализа ELISA.
На фигуре 20 показаны бифункциональные реагенты для присоединения хелатирующего агента для 89Zr десферриоксамина B (Df, вверху) к белкам с использованием реакционноспособных по отношению к аминогруппам линкеров, TFP-N-SucDf и Df-Bz-NCS (в центре), и реакционноспособных по отношению к тиолу линкеров, Df-Chx-Mal, Df-Bac и Df-lac (внизу).
На фигуре 21 показано получение Df-Chx-Mal, Df-Bac, Df-Iac и конъюгация с тио-трастузумабом через остатки Cys, включенные в тяжелую цепь Fab. Условия реакции: i. DIEA, DMF/H2O (10:1), RT, 0,5-1 ч; ii. DIEA, DMF, 0°C, 4 ч; iii. pH 7,5, RT, 1 ч; iv. pH 9, RT, 5 ч; v. pH 9, RT, 2 ч.
На фигуре 22 показано образование хелатов оксалата циркония-89 с меченным десферриоксамином сконструированным антителом с цистеиновыми заменами, таких как варианты Df-линкер-трастузумаба, содержащие четыре линкера: N-Suc, Bz-SCN, Chx-малеимид (CHx-Mal), или ацетил (Ac).
На фигуре 23 показан масс-спектрометрический анализ восстановленных антител, показывающий отдельные сигналы от легкой и тяжелой цепей. A: тио-трастузумаб, B: Df-Ac-тио-трастузумаб (с использованием Df-Bac), и C: Df-Ac-тио-трастузумаб (с использованием Df-Iac), и D: Df-Chx-Mal-тио-трастузумаб.
На фигуре 24 показана стабильность 89Zr-Chx-Mal-тио-трастузумаба (незакрашенные круги) и 89Zr-Df-Ac-тио-трастузумаба (закрашенные круги) в сыворотке мыши при 37°C (n=3).
На фигуре 25 показаны репрезентативные изображения целого организма (проекция максимальной интенсивности), полученные через 96 часов после болюсной инъекции в хвостовую вену 100 мКи 89Zr-трастузумаба, полученного с использованием четырех различных линкеров (Bz-SCN, N-Suc, Chx-Mal и Ac).
На фигуре 26 показано поглощение in vivo в избранных тканях через 24, 96 и 144 часа после инъекции, как измерено посредством ПЭТ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
В настоящее время приведены подробные ссылки на конкретные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы в сопровождающих структурах и формулах. В то время как изобретение описано в отношении перечисленных вариантов осуществления, понятно, что они не предназначены для ограничения изобретения этими вариантами осуществления. С другой стороны, изобретение предназначено, чтобы включать все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено формулой изобретения.
Специалисту в данной области известно множество способов и материалов, подобных или эквивалентных описанным в настоящем документе, которые можно использовать в практике настоящего изобретения. Настоящее изобретение никаким образом не ограничено описанными способами и материалами.
Если не определено иначе, технические и научные термины, используемые в настоящем документе, обладают таким же значением, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение, и соответствует: Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; и Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не указано иначе, следующие термины и фразы, как применяют в настоящем документе, предназначены, чтобы обладать следующими значениями:
При использовании торговых наименований в настоящем документе, авторы настоящего изобретения подразумевают независимое включение состава продукта под торговым наименованием, аналога патентованного лекарственного средства и активного фармацевтического ингредиента(ингредиентов) продукта под торговым наименованием.
Термин «антитело» в настоящем документе используют в самом широком смысле, и он конкретно охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антитела, пока они обладают желательной биологической активностью (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут являться мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов. Антитело представляет собой белок, образуемый иммунной системой, способный узнавать и связывать специфический антиген. (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Антиген-мишень, как правило, обладает несколькими участками связывания, называемыми также эпитопами, узнаваемыми CDR множества антител. Каждое антитело, которое специфически связывается с отличным эпитопом, обладает отличной структурой. Таким образом, один антиген может иметь более одного соответствующего антитела. Антитело включает полноразмерную молекулу иммуноглобулина или иммунологически активную часть полноразмерной молекулы иммуноглобулина, т.е., молекулы, содержащей антигенсвязывающий участок, содержащий антигенсвязывающий участок, иммуноспецифически связывающий антиген интересующей мишени или его часть, где такие мишени включают в качестве неограничивающих примеров, клетку или клетки злокачественных опухолей, продуцирующие аутоиммунные антитела, ассоциированные с аутоиммунным заболеванием. Иммуноглобулин, описанный в настоящем документе, может относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, и IgA), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекулы иммуноглобулина. Иммуноглобулины могут происходить из любых видов. В одном аспекте, однако, иммуноглобулин имеет человеческое, мышиное или кроличье происхождение.
«Фрагменты антител» содержат часть полноразмерного антитела, как правило, его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела; миниантитела (Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323), фрагменты, полученные из экспрессирующей библиотеки Fab, анти-идиотипические (анти-Id) антитела, CDR (определяющую комплементарность область) и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеуказанного, специфически связывающиеся с антигенами клеток злокачественных опухолей, вирусными антигенами или антигенами микроорганизмов, молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.
Термин «моноклональное антитело», как применяют в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, являясь направленными против одного антигенного участка. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, включающих различные антитела, нацеленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело нацелено против отдельной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела являются преимущественными в том смысле, что их можно синтезировать без контаминации другими антителами. Определение «моноклональные» указывает на характер антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением можно получать способом гибридомы, впервые описанным Kohler et al (1975) Nature 256:495, или их можно получать способами рекомбинантной ДНК (см., например: US 4816567; US 5807715). Моноклональные антитела можно выделять также из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol, 222:581-597.
Моноклональные антитела в настоящем документе конкретно включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи(цепей) является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, так же как фрагменты таких антител, пока они обладают желательной биологической активностью (US 4816567; и Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Интересующие химерные антитела в настоящем документе включают «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из не относящегося к человеку примата (например, обезьяны Старого Света, обезьяны и т.д.), и человеческие последовательности константной области.
«Интактное антитело» в настоящем документе представляет собой антитело, содержащее домены VL и VH, а также константный домен (CL) легкой цепи и константные домены тяжелой цепи CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой константные домены с природной последовательностью (например, константные домены с человеческой природной последовательностью) или вариант их аминокислотной последовательности. Интактное антитело может обладать одной или несколькими «эффекторными функциями», которые относятся к тем видам биологической активности, которую можно приписать константной области Fc (природной последовательности Fc-области или варианту аминокислотной последовательности Fc-области) антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание Fc рецептора; антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; и понижающую регуляцию рецепторов поверхности клеток, таких как B-клеточный рецептор и BCR.
В зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов их тяжелых цепей, интактные антитела можно отнести к различным «классам». Существует пять главных классов интактных иммуноглобулинов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно далее разделить на «подклассы» (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Формы Ig включают модификации шарнира или бесшарнирные формы (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310).
«Рецептор ErbB» представляет собой рецепторную протеинтирозинкиназу, принадлежащую к семейству рецепторов ErbB, члены которого являются важными медиаторами роста, дифференцировки и выживаемости клеток. Семейство рецепторов ErbB включает четыре отдельных члена, включая рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 или p185neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2). Панель анти-ErbB2 антител охарактеризована с использованием линии клеток опухоли молочной железы человека SKBR3 (Hudziak et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172. Максимальное ингибирование получено с антителом, называемым 4D5, ингибирующим пролиферацию клеток на 56%. Другие антитела в панели в этом анализе уменьшали пролиферацию клеток в меньшей степени. Кроме того, обнаружено, что антитело 4D5 сенсибилизирует линии клеток опухоли молочной железы со сверхэкспрессией ErbB2 к цитотоксическим эффектам TNF-α (US 5677171). Анти-ErbB2 антитела, обсуждаемые в Hudziak et al., дополнительно охарактеризованы в Fendly et al (1990) Cancer Research 50: 1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9: 1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465; и Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394.
Рецептор ErbB, как правило, содержит внеклеточный домен, который может связывать лиганд ErbB; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный домен тирозинкиназы; и карбоксил-концевой сигнальный домен, несущий несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Рецептор ErbB может представлять собой рецептор ErbB с «природной последовательностью» или «вариант его аминокислотной последовательности». Предпочтительно, рецептор ErbB представляет собой рецептор ErbB человека с природной последовательностью. Соответственно, «член семейства рецепторов ErbB» представляет собой EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 или любой другой рецептор ErbB, который известен в настоящее время или который будет идентифицирован в будущем.
Термины «ErbB1», «рецептор эпидермального фактора роста», «EGFR» и «HER1» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к EGFR, как описано, например, в Carpenter et al (1987) Ann. Rev. Biochem., 56:881-914, включая их встречающиеся в природе мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, как в Humphrey et al (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 87:4207-4211). Термин erbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт EGFR. Антитела против HER1 описаны, например, в Murthy et al (1987) Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560 и в WO 95/25167.
Термин «ERRP», «родственный EGF-рецептору белок», «родственный EGFR белок» и «родственный рецептору эпидермального фактора роста белок» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к ERRP, как описано, например, в US 6399743 и в Публикации США № 2003/0096373.
Выражения «ErbB2» и «HER2» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к белку HER2 человека, описанному, например, в Semba et al (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:6497-6501 и Yamamoto et al (1986) Nature, 319:230-234 (номер доступа в Genebank X03363). Термин «erbB2» относится к гену, кодирующему ErbB2 человека, и «neu» относится к гену, кодирующему p185neu крысы. Предпочтительным ErbB2 является природная последовательность ErbB2 человека.
«ErbB3» и «HER3» относятся к полипептиду рецептора, как описано, например, в Патентах США №№ 5183884 и 5480968, а также в Kraus et al (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:9193-9197. Антитела против ErbB3 известны в данной области и описаны, например, в Патентах США №№ 5183884, 5480968 и в WO 97/35885.
Термины «ErbB4» и «HER4» в настоящем документе относятся к полипептиду рецептора, как описано, например, в Патентной заявке EP № 599274; Plowman et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750; и Plowman et al (1993) Nature 366:473-475, включая их изоформы, например, как описано в WO 99/19488. Антитела против HER4 описаны, например, в WO 02/18444.
Антитела против рецепторов ErbB являются коммерчески доступными из ряда источников, включая, например, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.
Термин «вариант аминокислотной последовательности» относится к полипептидам, обладающим аминокислотными последовательностями, отличающимися до некоторой степени от полипептида с природной последовательностью. Обычно варианты аминокислотной последовательности обладают по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности по меньшей мере с одним связывающим рецептор доменом природного лиганда ErbB или по меньшей мере с одним связывающим лиганд доменом природного рецептора ErbB, и предпочтительно, они по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90% гомологичны по последовательности таким связывающим рецептор или лиганд доменам. Варианты аминокислотной последовательности имеют замены, делеции и/или вставки в конкретных положениях внутри аминокислотной последовательности природной аминокислотной последовательности. Аминокислоты обозначают общепринятыми наименованиями, в однобуквенном и трехбуквенном кодах.
«Идентичность последовательности» определяют как процент остатков в варианте аминокислотной последовательности, являющихся идентичными после выравнивания последовательностей и введения пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области. Одной такой компьютерной программой является «Align 2», авторство которой принадлежит Genentech, Inc. и подано с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Washington, DC 20559, 10 декабря 1991 г.
«Антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность» и «ADCC» относятся к опосредованной клетками реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, клетки естественные киллеры (NK), нейтрофилы, и макрофаги) узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, (1991) «Annu. Rev. Immunol.» 9:457-92. Для оценки активности ADCC интересующей молекулы можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как описан в US 5500362 и US 5821337. Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой, как описана в Clynes et al (1998) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) (USA) 95:652-656.
«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько рецепторов константной области (FcR) и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcyRIII и выполняют эффекторную функцию(функции) ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы; где PBMC и NK клетки являются предпочтительными. Эффекторные клетки можно выделить из их природного источника, например, из крови или PBMC, как описано в настоящем документе.
Термины «Fc рецептор» или «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с константной областью Fc антитела. Предпочтительный FcR представляет собой FcR человека с природной последовательностью. Более того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcyRII, и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), обладающие сходными аминокислотными последовательностями, которые отличаются, в первую очередь, в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный активирующий мотив, основанный на тирозине (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный ингибирующий мотив, основанный на тирозине (ITIM), в его цитоплазматическом домене. (См. обзор M. в Daлron, «Annu. Rev. Immunol.» 15:203-234 (1997)). Обзор FcR приведен в Ravetch and Kinet, «Annu. Rev. Immunol»., 9:457-92 (1991); Capel et al (1994) Immunomethods 4:25-34; и de Haas et al (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41. Другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, включены в термин «FcR» в настоящем документе. Термин включает также неонатальный рецептор, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al (1976) J. Immunol, 117:587 и Kim et al (1994) J. Immunol. 24:249).
«Комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента запускается связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с родственными ей антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).
«Нативные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей меняется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. В каждой тяжелой и легкой цепи также равномерно расположены внутрицепьевые дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь на одном конце имеет вариабельный домен (VH) с последующими несколькими константными доменами. Каждая легкая цепь на одном конце имеет вариабельный домен (VL) и на другом конце - константный домен. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считают, что конкретные аминокислотные остатки формируют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.
Термин «вариабельный» относится к факту, что конкретные части вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности среди антител и используются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность не является равномерно распределенной на всем протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех участках, называемых гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как на легкой цепи, так и на тяжелой цепи. Наиболее высоко консервативные части вариабельных доменов называют каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов природных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, преимущественно принимающие конфигурацию β-листа, соединенные тремя гипервариабельными областями, формирующими петли, соединяющие структуры β-листа, и в некоторых случаях формирующие их часть. Гипервариабельные области на каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR и, вместе с гипервариабельными областями из другой цепи, участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Константные домены не являются непосредственно вовлеченными в связывание антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности (ADCC).
Термин «гипервариабельная область» при использовании в настоящем документе относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24-34 (LI), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al выше) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (HI), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol, 196:901-917). Остатки «каркасной области» или «FR» представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем документе.
Расщеплением антител папаином получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab» фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим участком, и оставшийся «Fc» фрагмент, наименование которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработкой пепсином получают F(ab')2 фрагмент, обладающий двумя антигенсвязывающими участками и еще способный к перекрестному связыванию антигена.
«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный узнающий антиген и антигенсвязывающий участок. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной, нековалентной связи. В этой конфигурации три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антигенсвязывающего участка на поверхности димера VH-VL. Шесть гипервариабельных областей совместно придают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако, даже отдельный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельные области, специфичные для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый связывающий участок.
Fab-фрагмент содержит также константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце CH1 домена тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем документе является обозначением Fab', в котором остаток(остатки) цистеина константных доменов несут по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. F(ab')2 фрагменты антитела первоначально были получены в форме пар Fab'-фрагментов с шарнирными цистеинами между ними. Известны также другие химические соединения фрагментов антител.
«Легкие цепи» антител из любых видов позвоночных можно отнести к одному из двух явно различимых типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.
«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антител содержат VH и VL домены антитела, где эти домены присутствуют на одной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH и VL доменами, позволяющий scFv формировать желательную структуру для связывания антигена. Обзор scFv см. в Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). scFv фрагменты анти-ErbB2 антитела описаны в WO 93/16185; Патентах США №№ 5571894; и 5587458.
Термин «диатела» относится к малым фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). С использованием линкера, слишком короткого, чтобы позволить спаривание двух доменов одной и той же цепи, домены вынуждают спариваться с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антигенсвязывающих участка. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
«Гуманизированные» формы не относящихся к человеку антител» (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Гуманизация является способом переноса информации для связывания антигена от мыши к неиммуногенному акцепторному антителу человека, и приводит к получению множества терапевтически пригодных лекарственных средств. Способ гуманизации, как правило, начинается с переноса всех шести мышиных определяющих комплементарность областей (CDR) в каркас человеческого антитела (Jones et al, (1986) Nature 321:522-525). Эти CDR-привитые антитела, как правило, не сохраняют исходную аффинность для связывания антигена, и фактически, аффинность часто серьезно нарушена. Помимо CDR, избранные каркасные остатки не относящегося к человеку антитела также необходимо включать для поддержания правильной конформации CDR (Chothia et al (1989) Nature 342:877). Показано, что перенос ключевых мышиных остатков в человеческий акцептор для поддержания структурной конформации привитых CDR сохраняет связывание антигена и аффинность (Riechmann et al (1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote and Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta et al (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al (1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; и Presta et al (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389). По большей части, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в котором остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области не относящихся к человеку видов (антитела-донора), таких как мышь, крыса, кролик или не относящийся к человеку примат, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не присутствующими у человека остатками. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не обнаруженные в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации выполняют для дальнейшего усовершенствования характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит в основном все из по меньшей мере одного, и как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все гипервариабельные петли соответствуют петлям не относящегося к человеку иммуноглобулина, и все или в основном все FR являются FR с последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать также по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Более подробно см. US 6407213; Jones et al (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al (1988) Nature 332:323-329; и Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596.
«Свободная аминокислота цистеин» относится к остатку аминокислоты цистеина, который введен при конструировании в исходное антитело, имеет тиоловую функциональную группу (-SH), и не является спаренным в качестве внутримолекулярного или межмолекулярного дисульфидного мостика.
Термин «значение реакционной способности тиола» представляет собой количественную характеристику реакционной способности свободных цистеиновых аминокислот. Значение реакционной способности тиола представляет собой процент свободной аминокислоты цистеина в сконструированном антителе с цистеиновыми заменами, вступающий в реакцию с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, и преобразованный до максимального значения 1. Например, свободная аминокислота цистеин в сконструированном антителе с цистеиновыми заменами, которая вступает в реакцию со 100% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, таким как биотин-малеимидный реагент, с формированием меченного биотином антитела, имеет значение реакционной способности тиола 1,0. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая вступает в реакцию с 80% выходом с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0,8. Другая аминокислота цистеин, введенная при конструировании в такое же или другое исходное антитело, которая совсем не вступает в реакцию с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом, имеет значение реакционной способности тиола 0. Определение значения реакционной способности тиола конкретного цистеина можно проводить анализом ELISA, масс-спектроскопией, жидкостной хроматографией, радиоавтографией или другими количественными аналитическими тестами.
«Исходное антитело» представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков заменяют на один или несколько остатков цистеина. Исходное антитело может содержать природную последовательность или последовательность дикого типа. Исходное антитело может обладать предсуществующими модификациями аминокислотной последовательности (такими как добавления, делеции и/или замены) по сравнению с другими природными формами, формами дикого типа или модифицированными формами антитела. Исходное антитело может быть нацелено против интересующего антигена-мишени, например, биологически важного полипептида. Предусмотрены также антитела, нацеленные против неполипептидных антигенов (таких как опухолеассоциированные гликолипидные антигены; см. US 5091178).
Иллюстративные исходные антитела включают антитела, обладающие аффинностью и избирательностью для рецепторов поверхности клеток и трансмембранных рецепторов, и опухолеассоциированных антигенов (TAA).
Другие иллюстративные исходные антитела включают антитела, выбранные, и без ограничения, из антитела против рецептора эстрогена, антитела против рецептора прогестерона, анти-p53 антитела, анти-HER-2/neu антитела, анти-EGFR антитела, антитела против катепсина D, анти-Bcl-2 антитела, антитела против E-кадгерина, анти-CA125 антитела, анти-CA15-3 антитела, анти-CA19-9 антитела, анти-c-erbB-2 антитела, антитела против P-гликопротеина, анти-CEA антитела, антитела против белка ретинобластомы, антитела против онкобелка ras, антитела против Льюиса X, анти-Ki-67 антитела, анти-PCNA антитела, анти-CD3 антитела, анти-CD4 антитела, анти-CD5 антитела, анти-CD7 антитела, анти-CD8 антитела, анти-CD9/p24 антитела, анти-CD10 антитела, анти-CD11c антитела, анти-CD13 антитела, анти-CD14 антитела, анти-CD15 антитела, анти-CD19 антитела, анти-CD20 антитела, анти-CD22 антитела, анти-CD23 антитела, анти-CD30 антитела, анти-CD31 антитела, анти-CD33 антитела, анти-CD34 антитела, анти-CD35 антитела, анти-CD38 антитела, анти-CD41 антитела, анти-LCA/CD45 антитела, анти-CD45RO антитела, анти-CD45RA антитела, анти-CD39 антитела, анти-CD100 антитела, анти-CD95/Fas антитела, анти-CD99 антитела, анти-CD106 антитела, антитела против убиквитина, анти-CD71 антитела, анти-c-myc антитела, антитела против цитокератинов, антитела против виментинов, антитела против белков HPV, антитела против легких цепей каппа, антитела против легких цепей лямбда, антитела против меланосом, антитела против специфического антигена простаты, анти-S-100 антитела, антитела против антигена tau, антитела против фибрина, антитела против кератинов и антитела против Tn-антигена.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его натурального окружения представляют собой материалы, которые могут мешать исследовательским, диагностическим или терапевтическим применениям антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело является очищенным (1) до более чем 95% по массе антитела, как определено способом Лоури, и наиболее предпочтительно, до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности в SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с использованием окраски Кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, с тех пор, когда перестает присутствовать по меньшей мере один из компонентов природного окружения антитела. Обычно, однако, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.
Антитело, «которое связывает» интересующую молекулярную мишень или антиген, например, антиген ErbB2, представляет собой антитело, способное связывать этот антиген с достаточной аффинностью, так что антитело является пригодным для нацеливания на клетку, экспрессирующую антиген. Когда антитело представляет собой антитело, связывающее ErbB2, оно обычно предпочтительно связывает ErbB2 в отличие от других рецепторов ErbB, и может представлять собой антитело, которое не вступает в значительную перекрестную реакцию с другими белками, такими как EGFR, ErbB3 или ErbB4. В таких вариантах осуществления степень связывания антитела с этими не относящимися к ErbB2 белками (например, связывания поверхности клеток с эндогенным рецептором) составляет менее 10%, как определено анализом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или радиоиммунопреципитацией (RIA). Иногда анти-ErbB2 антитело не вступает в значительную перекрестную реакцию с белком neu крысы, например, как описано в Schecter et al. (1984) Nature 312:513 и Drebin et al (1984) Nature 312:545-548.
Молекулярные мишени для антител, включенные в настоящее изобретение, включают CD белки и их лиганды, такие как, в качестве неограничивающих примеров: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a) и CD79β (CD79b); (ii) члены семейства рецепторов ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; (iii) молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Macl, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и αν/β3 интегрин, включая их альфа- или бета-субъединицы (например, анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD11b антитела); (iv) факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl; CTLA-4; белок C, BR3, c-met, тканевой фактор, β7 и т.д.; и (v) опухолеассоциированный антигены (TAA) поверхности клеток и трансмембранные опухолеассоциированные антигены (TAA).
Если нет иных указаний, термин «моноклональное антитело 4D5» обозначает антитело, обладающее антигенсвязывающими остатками мышиного антитела 4D5 (ATCC CRL 10463), или полученное из него. Например, моноклональное антитело 4D5 может представлять собой мышиное моноклональные антитело 4D5 или его вариант, такой как гуманизированное 4D5. Иллюстративные гуманизированные антитела 4D5 включают huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (трастузумаб, ГЕРЦЕПТИН®), как в Патенте США № 5821337.
«Фаговый дисплей» представляет собой способ, посредством которого варианты полипептидов экспонируют в виде белков, слитых с белком оболочки, на поверхности частиц фага, например, нитевидного фага. Применимость фагового дисплея основана на факте, что большие библиотеки рандомизированных вариантов белка можно быстро и эффективно отсортировать по тем последовательностям, которые связывают антиген-мишень с высокой аффинностью. Экспонирование пептидных и белковых библиотек на фаге использовали для скрининга миллионов полипептидов для отбора полипептидов со специфическими свойствами связывания. Способы поливалентного фагового дисплея использовали для экспонирования малых случайных пептидов и малых белков, как правило, посредством слияния с pIII или pVIII нитевидного фага (Wells and Lowman, (1992) Curr. Opin. Struct. Biol, 3:355-362, и процитированные в этом документе ссылки). В моновалентном фаговом дисплее белковую или пептидную библиотеку сливают с белком оболочки фага или его частью, и экспрессируют на низких уровнях в присутствии белка дикого типа. Эффекты авидности снижены по сравнению с поливалентным фагом, так что отбор проходит на основе собственной аффинности лиганда, и используют фагмидные векторы, упрощающие манипуляции с ДНК. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991). Фаговый дисплей включает способы получения антителоподобных молекул (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, p.627-628; Lee et al ).
«Фагмида» представляет собой плазмидный вектор, обладающий бактериальной точкой начала репликации, например, ColE1, и копией межгенной области бактериофага. Фагмиду можно использовать для любого известного бактериофага, включая нитевидный бактериофаг и лямбдоидный бактериофаг. Плазмида также, как правило, содержит селективный маркер для устойчивости к антибиотику. Фрагменты ДНК, клонированные в эти векторы, можно размножать в форме плазмид. Когда клетки, несущие эти векторы, обеспечивают всеми генами, необходимыми для продукции фаговых частиц, тип репликации плазмиды меняется на репликацию по типу катящегося кольца для получения копий одной цепи плазмидной ДНК и упаковки фаговых частиц. Фагмиды могут формировать инфекционные или неинфекционные фаговые частицы. Этот термин включает фагмиды, содержащие ген белка оболочки фага или его фрагмент, связанный с геном гетерологичного полипептида в форме слитого гена, так что гетерологичный полипептид экспонирован на поверхности фаговых частиц.
«Линкер», «линкерное звено», или «связующее звено» обозначает химическую группу, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которая ковалентно присоединяет антитело к группе лекарственного средства. В различных вариантах осуществления линкер обозначают как L. Линкеры включают двухвалентный радикал, такой как алкилдииловые, ариленовые, гетероариленовые группы, такие как: -(CR2)nO(CR2)n-, повторяющиеся звенья алкилокси (например, полиэтиленокси, PEG, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, Джеффамин™); и сложные эфиры и амиды двухосновной кислоты, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.
Термин «метка» обозначает любую группу, которую можно ковалентно присоединять к антителу и которая функционирует для: (i) обеспечения поддающегося детекции сигнала; (ii) взаимодействия со второй меткой для модификации поддающегося детекции сигнала, обеспечиваемого первой или второй меткой, например, FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции); (iii) стабилизации взаимодействий или увеличения аффинности связывания с антигеном или лигандом; (iv) влияния на подвижность, например, электрофоретическую подвижность, или клеточную проницаемость, посредством заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров, или (v) предоставления связывающей группы, для модуляции аффинности лиганда, связывания антитело/антиген или образования комплексных ионов.
Стереохимические определения и обозначения, используемые в настоящем документе, в основном, следуют S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е., они обладают способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения, префиксы D и L или R и S, используют для обозначения абсолютной конфигурации молекулы вокруг ее хирального центра(центров). Префиксы d и l или (+) и (-) используют для обозначения знака вращения плоскополяризованного света соединением, где (-) или l обозначает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры, эти стереоизомеры являются идентичными, за исключением того, что они являются зеркальными отражениями друг друга. Конкретный стереоизомер можно обозначать также, как энантиомер, и смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 обозначают рацемической смесью или рацематом, которые могут возникать в отсутствие стереоизбирательности или стереоспецифичности химической реакции или процесса. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» относятся к эквимолярной смеси двух видов энантиомеров, лишенной оптической активности.
Фраза «фармацевтически приемлемая соль», как применяют в настоящем документе, относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям AZC. Иллюстративные соли включают соли сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, иодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат (т.е., 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)), но не ограничены ими. Фармацевтически приемлемая соль может предполагать включение другой молекулы, такой как ион ацетата, ион сукцината или другой противоион. Противоион может представлять собой любую органическую или неорганическую группу, стабилизирующую заряд исходного соединения. Более того, фармацевтически приемлемая соль может иметь в структуре более одного заряженного атома. В случаях, когда несколько заряженных атомов составляют часть фармацевтически приемлемой соли, она может иметь несколько противоионов. Таким образом, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.
«Фармацевтически приемлемый сольват» обозначает ассоциацию одной или нескольких молекул растворителя и AZC. Растворители, формирующие фармацевтически приемлемые сольваты, включают в качестве неограничивающих примеров, воду, изопропанол, этанол, метанол, DMSO, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин.
Следующие аббревиатуры использованы в настоящем документе и имеют следующие определения: BME представляет собой бета-меркаптоэтанол, Boc представляет собой N-(трет-бутоксикарбонил), cit представляет собой цитруллин (2-амино-5-уреидопентановая кислота), dap представляет собой долапроин, DCC представляет собой 1,3-дициклогексилкарбодиимид, DCM представляет собой дихлорметан, DEA представляет собой диэтиламин, DEAD представляет собой диэтилазодикарбоксилат, DEPC представляет собой диэтилфосфорилцианидат, DIAD представляет собой диизопропилазодикарбоксилат, DIEA представляет собой N,N-диизопропилэтиламин, dil представляет собой долаизолейцин, DMA представляет собой диметилацетамид, DMAP представляет собой 4-диметиламинопиридин, DME представляет собой диметиловый эфир этиленгликоля (или 1,2-диметоксиэтан), DMF представляет собой N,N-диметилформамид, DMSO представляет собой диметилсульфоксид, doe представляет собой долафенин, dov представляет собой N,N-диметилвалин, DTNB представляет собой 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту), DTPA представляет собой диэтилентриаминпентауксусную кислоту, DTT представляет собой дитиотреитол, EDCI представляет собой гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, EEDQ представляет собой 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, ES-MS представляет собой масс-спектрометрию с электрораспылением, EtOAc представляет собой этилацетат, Fmoc представляет собой N-(9-флуоренилметоксикарбонил), gly представляет собой глицин, HATU представляет собой гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол, HPLC представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию, ile представляет собой изолейцин, lys представляет собой лизин, MeCN (CH3CN) представляет собой ацетонитрил, MeOH представляет собой метанол, Mtr представляет собой 4-анизилдифенилметил (или 4-метокситритил), nor представляет собой (1S,2R)-(+)-норэфедрин, PAB представляет собой п-аминобензилкарбамоил, PBS представляет собой фосфатно-солевой буфер (pH 7), PEG представляет собой полиэтиленгликоль, Ph представляет собой фенил, Pnp представляет собой п-нитрофенил, MC представляет собой 6-малеимидокапроил, phe представляет собой L-фенилаланин, PyBrop представляет собой гексафторфосфат бром-трис-пирролидинофосфония, SEC представляет собой эксклюзионную хроматографию, Su представляет собой сукцинимид, TFA представляет собой трифторуксусную кислоту, TLC представляет собой тонкослойную хроматографию, UV представляет собой ультрафиолет, и val представляет собой валин.
СКОНСТРУИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА С ЦИСТЕИНОВЫМИ ЗАМЕНАМИ
Соединения по изобретению включают сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, в которых одна или несколько аминокислот антитела дикого типа или исходного антитела заменены на аминокислоту цистеин. Любую форму антитела можно модифицировать таким образом, т.е. подвергать мутации. Например, исходный Fab-фрагмент антитела можно модифицировать для получения сконструированного Fab с цистеиновыми заменами, обозначенного в настоящем документе как «ТиоFab». Подобным образом, исходное моноклональное антитело можно модифицировать для получения «ТиоMab». Следует отметить, что мутация в одном участке приводит к одному сконструированному остатку цистеина в ТиоFab, в то время как мутация в одном участке приводит к двум сконструированным остаткам цистеина в ТиоMab, из-за димерной природы антитела IgG. Мутанты с замененными («сконструированными») остатками цистеина (Cys) оценивали по реакционной способности вновь введенных сконструированных тиоловых групп цистеина. Значение реакционной способности тиола является относительным числовым термином в диапазоне от 0 до 1,0, и его можно измерять для любого сконструированного антитела с цистеиновыми заменами. Значения реакционной способности тиола сконструированных антител с цистеиновыми заменами по изобретению лежат в диапазонах 0,6-1,0; 0,7-1,0; или 0,8-1,0.
Способы дизайна, отбора и получения по изобретению предоставляют сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, реакционноспособные по отношению к электрофильной функциональной группе. Эти способы, кроме того, предоставляют соединения конъюгата с антителом, такие как соединения конъюгата антитело-цирконий (AZC) с атомами циркония в обозначенных сконструированных избранных участках. Реакционноспособные остатки цистеина на поверхности антитела позволяют специфическую конъюгацию группы циркония через реакционноспособную по отношению к тиолу группу, такую как малеимид или галоацетил. Реакционная способность нуклеофильной тиоловой функциональной группы остатка Cys по отношению к малеимидной группе приблизительно в 1000 выше по сравнению с любой другой функциональной группой аминокислот в белке, такой как аминогруппа остатков лизина или N-концевая аминогруппа. Специфические для тиола функциональные группы в иодацетиловых и малеимидных реагентах могут вступать в реакцию с аминогруппами, однако, необходимы более высокий pH (>9,0) и более длительные периоды времени реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами по изобретению предпочтительно сохраняют антигенсвязывающую способность эквивалентных им антител дикого типа, исходных антител. Таким образом, сконструированные антитела с цистеиновыми заменами способны связываться, предпочтительно, специфически, с антигенами. Такие антигены включают, например, опухолеассоциированные антигены (TAA), рецепторные белки поверхности клеток и другие молекулы поверхности клеток, трансмембранные белки, белки передачи сигнала, регуляторные факторы выживаемости клеток, регуляторные факторы пролиферации клеток, молекулы, ассоциированные с развитием или дифференцировкой тканей (например, как известно или как предполагают, вносящие в них функциональный вклад), лимфокины, цитокины, молекулы, вовлеченные в регуляцию клеточного цикла, молекулы, вовлеченные в васкулогенез, и молекулы, ассоциированные с ангиогенезом (например, как известно или как предполагают, вносящие в него функциональный вклад). Опухолеассоциированный антиген может представлять собой фактор кластера дифференцировки (т.е., CD белок). Антиген, с которым способно связываться сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, может являться членом подгруппы одной из вышеупомянутых категорий, где другая подгруппа(подгруппы) указанной категории содержит другие молекулы/антигены, обладающие отличной характеристикой (по отношению к интересующему антигену).
Исходное антитело может представлять собой также гуманизированное антитело, выбранное из huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (Трастузумаб, ГЕРЦЕПТИН®), как описано в таблице 3 US 5821337, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; антитела гуманизированное 520C9 (WO 93/21319) и гуманизированное 2C4, как описано в настоящем описании.
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами по изобретению можно сайт-специфически и эффективно присоединять к реакционноспособному по отношению к тиолу реагенту. Реакционноспособный по отношению к тиолу реагент может представлять собой мультифункциональный линкерный реагент, реагент с меткой связывания, т.е. аффинности, (например, биотин-линкерный реагент), метку для детекции (например, реагент с флуорофором), реагент для иммобилизации на твердой фазе (например, SEPHAROSE™, полистироле или стекле), или промежуточное соединение цирконий-линкер. Одним из примеров реакционноспособного по отношению к тиолу реагента является N-этилмалеимид (NEM). В иллюстративном варианте осуществления реакция ТиоFab с реагентом биотин-линкер предоставляет биотинилированное ТиоFab, посредством которого можно детектировать и измерять присутствие и реакционную способность сконструированного остатка цистеина. Реакция ТиоFab с мультифункциональным линкерным реагентом предоставляет ТиоFab с функционализированным линкером, который далее может вступать в реакцию с реагентом с группой циркония или с другой меткой. Реакция ТиоFab с промежуточным соединением цирконий-линкер предоставляет конъюгат ТиоFab с цирконием.
Иллюстративные способы, описанные в настоящем документе, можно широко использовать для идентификации и продукции антител, и более широко, для других белков, посредством использования стадий разработки и скрининга, описанных в настоящем документе.
Такой способ можно использовать для конъюгации других реакционноспособных по отношению к тиолу средств, в которых реакционноспособная группа представляет собой, например, малеимид, иодацетамид, пиридилдисульфид, или другой реакционноспособный по отношению к тиолу партнер для конъюгации (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). Партнер может представлять собой цитотоксическое средство (например, токсин, такой как доксорубицин или токсин коклюша), флуорофор, такой как флуоресцентный краситель, подобный флуоресцеину или родамину, хелатирующий агент для получения изображений или металлсодержащее радиотерапевтическое средство, пептидильную или непептидильную метку или метку для детекции, или модифицирующее выведение средство, такое как различные изомеры полиэтиленгликоля, пептид, связывающий третий компонент, или другой углевод или липофильное средство.
Участки, идентифицированные в иллюстративном фрагменте антитела, hu4D5Fabv8, в настоящей работе, находятся в первую очередь в константном домене антитела, который является достаточно консервативным во всех видах антител. Эти участки можно широко использовать для других антител, без дальнейшей необходимости структурной разработки или знаний о структурах конкретных антител и без влияния на свойства связывания антигена, присущие вариабельным доменам антитела.
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, которые могут являться пригодными для лечения злокачественной опухоли, включают в качестве неограничивающих примеров, антитела против рецепторов поверхности клеток и опухолеассоциированных антигенов (TAA). Такие антитела можно использовать в форме голых антител (не конъюгированных с группой метки) или в форме конъюгатов антитело-цирконий (AZC) формулы I. Опухолеассоциированные антигены известны в данной области и могут быть получены для использования в получении антител с использованием способов и информации, хорошо известных в данной области. В попытках открыть эффективные клеточные мишени для диагностики и терапии злокачественных опухолей, исследователи стремились к идентификации трансмембранных или иным образом ассоциированных с опухолями полипептидов, специфически экспрессирующихся на поверхности одного или нескольких конкретных типа(типов) клеток злокачественных опухолей по сравнению с одной или несколькими нормальными незлокачественными клеткой(клетками). Часто, такие опухолеассоциированные полипептиды более сильно экспрессированы на поверхности клеток злокачественных опухолей по сравнению с поверхностью незлокачественных клеток. Идентификация таких опухолеассоциированных антигенных полипептидов на поверхности клеток привела к возможности специфического нацеливания на клетки злокачественных опухолей для их разрушения способами терапии на основе антител.
TAA включают в качестве неограничивающих примеров TAA (1)-(36), перечисленные ниже. Для удобства, информация относительно этих антигенов, все из которых известны в данной области, перечислена ниже и включает наименования, альтернативные наименования, номера доступа в Genbank и основополагающую ссылку(ссылки), следующие идентификационным обозначениям последовательностей нуклеиновых кислот и белков Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Последовательности нуклеиновых кислот и белков, соответствующие TAA (1)-(36), доступны в публичных базах данных, таких как GenBank. Опухолеассоциированные антигены, являющиеся мишенями для антител, включают все варианты и изоформы аминокислотной последовательности, обладающие по меньшей мере приблизительно 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности по отношению к последовательности, идентифицированной в процитированных ссылках, или обладающие по существу такими же биологическими свойствами или характеристиками, как TAA, обладающие последовательностью, обнаруженной в процитированных ссылках. Например, TAA, обладающие вариантом последовательности, как правило, способны специфически связываться с антителом, специфически связывающимся с TAA с соответствующими перечисленными последовательностями. Последовательности и описание в ссылке, конкретно процитированной в настоящем документе, в явной форме приведены в качестве ссылки.
ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫЕ АНТИГЕНЫ (1)-(36):
(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенного белка типа IB, номер доступа в Genbank NM_001203)
ten Dijke,P., et al Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11): 1377-1382 (1997)); WO2004063362 (пункт формулы изобретения 2); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); US2003134790-A1 (страницы 38-39); WO2002102235 (пункт формулы изобретения 13; страница 296); WO2003055443 (страницы 91-92); WO200299122 (Пример 2; страницы 528-530); WO2003029421 (пункт формулы изобретения 6); WO2003024392 (пункт формулы изобретения 2; Фиг.112); WO200298358 (пункт формулы изобретения 1; страница 183); WO200254940 (страницы 100-101); WO200259377(страницы 349-350); WO200230268 (пункт формулы изобретения 27; страница 376); WO200148204 (Пример; Фиг.4)
NP_001194 bone morphogenetic protein receptor, type IB /pid=NP_001194.1
Перекрестные ссылки: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, номер доступа в Genbank NM_003486)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 11267-11273); WO2004048938 (Пример 2); WO2004032842 (Пример IV); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); WO2003016475 (пункт формулы изобретения 1); WO200278524 (Пример 2); WO200299074 (пункт формулы изобретения 19; страницы 127-129); WO200286443 (пункт формулы изобретения 27; страницы 222, 393); WO2003003906 (пункт формулы изобретения 10; страницы 293); WO200264798 (пункт формулы изобретения 33; страницы 93-95); WO200014228 (пункт формулы изобретения 5; страницы 133-136); US2003224454 (Фиг.3); WO2003025138 (пункт формулы изобретения 12; страница 150);
NP_003477 solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 5 /pid=NP_003477.3 - Homo sapiens
Перекрестные ссылки: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3) STEAP1 (эпителиальный антиген простаты, содержащий шесть трансмембранных доменов, номер доступа в Genbank NM_012449)
Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25): 14523-14528); WO2004065577 (пункт формулы изобретения 6); WO2004027049 (Фиг.1L); EP1394274 (Пример 11); WO2004016225 (пункт формулы изобретения 2); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); US2003157089 (Пример 5); US2003185830 (Пример 5); US2003064397 (Фиг.2); WO200289747 (Пример 5; страницы 618-619); WO2003022995 (Пример 9; Фиг.13A, Пример 53; страница 173, Пример 2; Фиг.2A);
NP_036581 six transmembrane epithelial antigen of the prostate
Перекрестные ссылки: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, номер доступа в Genbank AF361486)
J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); WO2004045553 (пункт формулы изобретения 14); WO200292836 (пункт формулы изобретения 6; Фиг.12); WO200283866 (пункт формулы изобретения 15; страницы 116-121); US2003124140 (Пример 16); Перекрестные ссылки: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, фактор активации мегакариоцитов, мезотелин, номер доступа в Genbank NM_005823) Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20): 11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1): 136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); WO2003101283 (пункт формулы изобретения 14); (WO2002102235 (пункт формулы изобретения 13; страницы 287-288); WO2002101075 (пункт формулы изобретения 4; страницы 308-309); WO200271928 (страницы 320-321); WO9410312 (страницы 52-57); Перекрестные ссылки: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, семейство переносчиков растворенных веществ 34 (фосфат натрия), член 2, натрий-зависимый переносчик фосфата 3b, типа II, номер доступа в Genbank NM 006424)
J. Biol. Chem. 277 (22): 19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); WO2004022778 (пункт формулы изобретения 2); EP1394274 (Пример 11); WO2002102235 (пункт формулы изобретения 13; страница 326); EP875569 (пункт формулы изобретения 1; страницы 17-19); WO200157188 (пункт формулы изобретения 20; страница 329); WO2004032842 (Пример IV); WO200175177 (пункт формулы изобретения 24; страницы 139-140);
Перекрестные ссылки: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Семафорин 5b Hlog, домен sema, семь повторов тромбоспондина (типа 1 и подобный типу 1), трансмембранный домен (TM) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5B, номер доступа в Genbank AB040878)
Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150); WO2004000997 (пункт формулы изобретения 1); WO2003003984 (пункт формулы изобретения 1); WO200206339 (пункт формулы изобретения 1; страницы 50); WO200188133 (пункт формулы изобретения 1; страницы 41-43, 48-58); WO2003054152 (пункт формулы изобретения 20); WO2003101400 (пункт формулы изобретения 11);
Номера доступа: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC: 10737;
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, кДНК RIKEN 2700050C12, кДНК RIKEN гена 2700050C12, номер доступа в Genbank AY358628); Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US2003129192 (пункт формулы изобретения 2); US2004044180 (пункт формулы изобретения 12); US2004044179 (пункт формулы изобретения 11); US2003096961 (пункт формулы изобретения 11); US2003232056 (Пример 5); WO2003105758 (пункт формулы изобретения 12); US2003206918 (Пример 5); EP1347046 (пункт формулы изобретения 1); WO2003025148 (пункт формулы изобретения 20);
Перекрестные ссылки: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9) ETBR (рецептор эндотелина типа B, номер доступа в Genbank AY275463);
Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C, et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206; WO2004045516 (пункт формулы изобретения 1); WO2004048938 (Пример 2); WO2004040000 (пункт формулы изобретения 151); WO2003087768 (пункт формулы изобретения 1); WO2003016475 (пункт формулы изобретения 1); WO2003016475 (пункт формулы изобретения 1); WO200261087 (Фиг.1); WO2003016494 (Фиг.6); WO2003025138 (пункт формулы изобретения 12; страницы 144); WO200198351 (пункт формулы изобретения 1; страницы 124-125); EP522868 (пункт формулы изобретения 8; Фиг.2); WO200177172 (пункт формулы изобретения 1; страницы 297-299); US2003109676; US6518404 (Фиг.3); US5773223 (пункт формулы изобретения 1a; кол. 31-34); WO2004001004;
(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315, номер доступа в Genbank NM_017763);
WO2003104275 (пункт формулы изобретения 1); WO2004046342 (Пример 2); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); WO2003083074 (пункт формулы изобретения 14; страница 61); WO2003018621 (пункт формулы изобретения 1); WO2003024392 (пункт формулы изобретения 2; Фиг.93); WO200166689 (Пример 6);
Перекрестные ссылки: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ассоциированный с раком предстательной железы ген 1, ассоциированный с раком предстательной железы белок 1, эпителиальный антиген простаты 2, содержащий шесть трансмембранных доменов, белок простаты, содержащий шесть трансмембранных доменов, номер доступа в Genbank AF455138)
Lab. Invest. 82 (11): 1573-1582 (2002)); WO2003087306; US2003064397 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.1); WO200272596 (пункт формулы изобретения 13; страницы 54-55); WO200172962 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.4B); WO2003104270 (пункт формулы изобретения 11); WO2003104270 (пункт формулы изобретения 16); US2004005598 (пункт формулы изобретения 22); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); US2003060612 (пункт формулы изобретения 12; Фиг.10); WO200226822 (пункт формулы изобретения 23; Фиг.2); WO200216429 (пункт формулы изобретения 12; Фиг.10);
Перекрестные ссылки: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, катионный канал транзиторного рецепторного потенциала, подсемейство M, член 4, номер доступа в Genbank NM_017636)
Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19): 10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); US2003143557 (пункт формулы изобретения 4); WO200040614 (пункт формулы изобретения 14; страницы 100-103); WO200210382 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.9A); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); WO200230268 (пункт формулы изобретения 27; страница 391); US2003219806 (пункт формулы изобретения 4); WO200162794 (пункт формулы изобретения 14; Фиг.1A-D);
Перекрестные ссылки: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, полученный из тератокарциномы фактор роста, номер доступа в Genbank NP 003203 или NM_003212)
Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); US2003224411 (пункт формулы изобретения 1); WO2003083041 (Пример 1); WO2003034984 (пункт формулы изобретения 12); WO200288170 (пункт формулы изобретения 2; страницы 52-53); WO2003024392 (пункт формулы изобретения 2; Фиг.58); WO200216413 (пункт формулы изобретения 1; страницы 94-95, 105); WO200222808 (пункт формулы изобретения 2; Фиг.1); US5854399 (Пример 2; кол. 17-18); US5792616 (Фиг.2);
Перекрестные ссылки: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (рецептор C3d/вируса Эпштейна-Барр) или Hs.73792 номер доступа в Genbank M26004)
Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; WO2004045520 (Пример 4); US2004005538 (Пример 1); WO2003062401 (пункт формулы изобретения 9); WO2004045520 (Пример 4); WO9102536 (Фиг.9.1-9.9); WO2004020595 (пункт формулы изобретения 1);
Номера доступа: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (иммуноглобулин-ассоциированная молекула бета), B29, номер доступа в Genbank NM_000626 или 11038674)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6): 1621-1625); WO2004016225 (пункт формулы изобретения 2, Фиг.140); WO2003087768, US2004101874 (пункт формулы изобретения 1, страница 102); WO2003062401 (пункт формулы изобретения 9); WO200278524 (Пример 2); US2002150573 (пункт формулы изобретения 5, страница 15); US5644033; WO2003048202 (пункт формулы изобретения 1, страницы 306 и 309); WO 99/558658, US6534482 (пункт формулы изобретения 13, Фиг.17A/B); WO200055351 (пункт формулы изобретения 11, страницы 1145-1146);
Перекрестные ссылки: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (содержащий SH2 домен фосфатазный якорный белок 1a), SPAP1B, SPAP1C, номер доступа в Genbank NM_030764, AY358130)
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO2004016225 (пункт формулы изобретения 2); WO2003077836; WO200138490 (пункт формулы изобретения 5; Фиг.18D-1-18D-2); WO2003097803 (пункт формулы изобретения 12); WO2003089624 (пункт формулы изобретения 25);
Перекрестные ссылки: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, номер доступа в Genbank M11730)
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730): 1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429; WO2004048938 (Пример 2); WO2004027049 (Фиг.1I); WO2004009622; WO2003081210; WO2003089904 (пункт формулы изобретения 9); WO2003016475 (пункт формулы изобретения 1); US2003118592; WO2003008537 (пункт формулы изобретения 1); WO2003055439 (пункт формулы изобретения 29; Фиг.1A-B); WO2003025228 (пункт формулы изобретения 37; Фиг.5C); WO200222636 (Пример 13; страницы 95-107); WO200212341 (пункт формулы изобретения 68; Фиг.7); WO200213847 (страницы 71-74); WO200214503 (страницы 114-117); WO200153463 (пункт формулы изобретения 2; страницы 41-46); WO200141787 (страница 15); WO200044899 (пункт формулы изобретения 52; Фиг.7); WO200020579 (пункт формулы изобретения 3; Фиг.2); US5869445 (пункт формулы изобретения 3; Кол. 31-38); WO9630514 (пункт формулы изобретения 2; страницы 56-61); EP1439393 (пункт формулы изобретения 7); WO2004043361 (пункт формулы изобретения 7); WO2004022709; WO200100244 (Пример 3; Фиг.4);
Номера доступа: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; М11761; AAA35808.1.
(18) NCA (CEACAM6, номер доступа в Genbank M18728);
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16899-16903, 2002; WO2004063709; EP1439393 (пункт формулы изобретения 7); WO2004044178 (Пример 4); WO2004031238; WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); WO200278524 (Пример 2); WO200286443 (пункт формулы изобретения 27; страница 427); WO200260317 (пункт формулы изобретения 2);
Номера доступа: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
(19) MDP (DPEP1, номер доступа в Genbank BC017023)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002)); WO2003016475 (пункт формулы изобретения 1); WO200264798 (пункт формулы изобретения 33; страницы 85-87); JP05003790 (Фиг.6-8); W09946284 (Фиг.9);
Перекрестные ссылки: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, номер доступа в Genbank AF184971); Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42: 12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (Пример 11); US2004005320 (Пример 5); WO2003029262 (страницы 74-75); WO2003002717 (пункт формулы изобретения 2; страница 63); WO200222153 (страницы 45-47); US2002042366 (страницы 20-21); WO200146261 (страницы 57-59); WO200146232 (страницы 63-65); W09837193 (пункт формулы изобретения 1; страницы 55-59);
Номера доступа: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) Бревикан (BCAN, BEHAB, номер доступа в Genbank AF229053)
Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003186372 (пункт формулы изобретения 11); US2003186373 (пункт формулы изобретения 11); US2003119131 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.52); US2003119122 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.52); US2003119126 (пункт формулы изобретения 1); US2003119121 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.52); US2003119129 (пункт формулы изобретения 1); US2003119130 (пункт формулы изобретения 1); US2003119128 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.52); US2003119125 (пункт формулы изобретения 1); WO2003016475 (пункт формулы изобретения 1); WO200202634 (пункт формулы изобретения 1);
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, номер доступа в Genbank NM_004442)
Chan,J. и Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196: 177-244 (2000)); WO2003042661 (пункт формулы изобретения 12); WO200053216 (пункт формулы изобретения 1; страница 41); WO2004065576 (пункт формулы изобретения 1); WO2004020583 (пункт формулы изобретения 9); WO2003004529 (страницы 128-132); WO200053216 (пункт формулы изобретения 1; страница 42);
Перекрестные ссылки: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, номер доступа в Genbank AX092328)
US20040101899 (пункт формулы изобретения 2); WO2003104399 (пункт формулы изобретения 11); WO2004000221 (Фиг.3); US2003165504 (пункт формулы изобретения 1); US2003124140 (Пример 2); US2003065143 (Фиг.60); WO2002102235 (пункт формулы изобретения 13; страница 299); US2003091580 (Пример 2); WO200210187 (пункт формулы изобретения 6; Фиг.10); WO200194641 (пункт формулы изобретения 12; Фиг.7b); WO200202624 (пункт формулы изобретения 13; Фиг.1A-1B); US2002034749 (пункт формулы изобретения 54; страницы 45-46); WO200206317 (Пример 2; страницы 320-321, пункт формулы изобретения 34; страницы 321-322); WO200271928 (страницы 468-469); WO200202587 (Пример 1; Фиг.1); WO200140269 (Пример 3; страницы 190-192); WO200036107 (Пример 2; страницы 205-207); WO2004053079 (пункт формулы изобретения 12); WO2003004989 (пункт формулы изобретения 1); WO200271928 (страницы 233-234, 452-453); WO 0116318;
(24) PSCA (Предшественник антигена стволовых клеток простаты, номер доступа в Genbank AJ297436)
Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO2004022709; EP1394274 (Пример 11); US2004018553 (пункт формулы изобретения 17); WO2003008537 (пункт формулы изобретения 1); WO200281646 (пункт формулы изобретения 1; страница 164); WO2003003906 (пункт формулы изобретения 10; страница 288); WO200140309 (Пример 1; Фиг.17); US2001055751 (Пример 1; Фиг.1b); WO200032752 (пункт формулы изобретения 18; Фиг.1); WO9851805 (пункт формулы изобретения 17; страница 97); W09851824 (пункт формулы изобретения 10; страница 94); WO9840403 (пункт формулы изобретения 2; Фиг.1B);
Номер доступа: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
(25) GEDA (номер доступа в Genbank AY260763);
AAP14954 lipoma HMGIC fusion-partner-like protein /pid=AAP14954.1 - Homo sapiens Species: Homo sapiens (human)
WO2003054152 (пункт формулы изобретения 20); WO2003000842 (пункт формулы изобретения 1); WO2003023013 (Пример 3, пункт формулы изобретения 20); US2003194704 (пункт формулы изобретения 45);
Перекрестные ссылки: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (рецептор фактора активации B-клеток, BLyS рецептор 3, BR3, номер доступа в Genbank AF116456); BAFF receptor /pid=NP_443177.1 - Homo sapiens
Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004058309; WO2004011611; WO2003045422 (Пример; страницы 32-33); WO2003014294 (пункт формулы изобретения 35; Фиг.6B); WO2003035846 (пункт формулы изобретения 70; страницы 615-616); WO200294852 (Кол. 136-137); WO200238766 (пункт формулы изобретения 3; страница 133); WO200224909 (Пример 3; Фиг.3);
Перекрестные ссылки: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (изоформа B-клеточного рецептора CD22-B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, номер доступа в Genbank AK026467);
Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173: 137-146; WO2003072036 (пункт формулы изобретения 1; Фиг.1);
Перекрестные ссылки: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79α, иммуноглобулин-ассоциированная молекула альфа, специфический для B-клеток белок, ковалентно взаимодействующий с Ig бета (CD79B) и формирующий комплекс на поверхности с молекулами IgM, передает сигнал, вовлеченный в дифференцировку B-клеток), pI: 4,84, MW: 25028 TM: 2 [P] Хромосома гена: 19q13.2, номер доступа в Genbank NP_001774.10)
WO2003088808, US20030228319; WO2003062401 (пункт формулы изобретения 9); US2002150573 (пункт формулы изобретения 4, страницы 13-14); W09958658 (пункт формулы изобретения 13, Фиг.16); WO9207574 (Фиг.1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5): 1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1): 141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464;
(29) CXCR5 (Рецептор лимфомы Беркитта 1, связанный с G белком рецептор, активируемый хемокином CXCL13, функционирует в миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет роль в инфекции HIV-2 и, возможно, развитии СПИД, лимфомы, миеломы и лейкоза); 372 ак, pI: 8,54 MW: 41959 TM: 7 [P] Хромосома гена: 11q23.3, номер доступа в Genbank NP_001707.1)
WO2004040000; WO2004015426; US2003105292 (Пример 2); US6555339 (Пример 2); WO200261087 (Фиг.1); WO200157188 (пункт формулы изобретения 20, страница 269); WO200172830 (страницы 12-13); WO200022129 (Пример 1, страницы 152-153, Пример 2, страницы 254-256); W09928468 (пункт формулы изобретения 1, страница 38); US5440021 (Пример 2, кол. 49-52); W09428931 (страницы 56-58); W09217497 (пункт формулы изобретения 7, Фиг.5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779;
(30) HLA-DOB (Бета-субъединица молекулы MHC класса II (Ia антиген), связывающая пептиды и представляющая их CD4+ T-лимфоцитам); 273 ак, pI: 6,56 MW: 30820 TM: 1 [P] Хромосома гена: 6p21.3, номер доступа в Genbank NP_002111.1)
Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255: 1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519; W09958658 (пункт формулы изобретения 13, Фиг.15); US6153408 (Кол. 35-38); US5976551 (кол. 168-170); US6011146 (кол. 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26): 14111-14119;
(31) P2X5 (управляемый лигандом пуринергического рецептора P2X ионный канал 5, ионный канал, управляемый внеклеточным ATP, может быть вовлечен в передачу возбуждения по синапсам и нейрогенез, недостаточность может вносить вклад в патофизиологию идиопатической нестабильности детрузора); 422 ак), pI: 7,63, MW: 47206 TM: 1 [P] Хромосома гена: 17p13.3, номер доступа в Genbank NP_002552.2)
Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2): 195-199; WO2004047749; WO2003072035 (пункт формулы изобретения 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10: 165-173; WO200222660 (пункт формулы изобретения 20); WO2003093444 (пункт формулы изобретения 1); WO2003087768 (пункт формулы изобретения 1); WO2003029277 (страница 82);
(32) CD72 (антиген дифференцировки B-клеток CD72, Lyb-2) БЕЛКОВАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ Полная maeaity...tafrfpd (1..359; 359 ак), pI: 8,66, MW: 40225 TM: 1 [P] Хромосома гена: 9p13.3, номер доступа в Genbank NP_001773.1)
WO2004042346 (пункт формулы изобретения 65); WO2003026493 (страницы 51-52, 57-58); WO200075655 (страницы 105-106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903;
(33) LY64 (Лимфоцитарный антиген 64 (RP105), мембранный белок типа I семейства богатых лейцином повторов (LRR), регулирует активацию и апоптоз B-клеток, потеря функции ассоциирована с увеличенной активностью заболевания у пациентов с системной красной волчанкой); 661 ак, pI: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] Хромосома гена: 5q12, номер доступа в Genbank NP_005573.1)
US2002193567; WO9707198 (пункт формулы изобретения 11, стр. 39-42); Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003083047; W09744452 (пункт формулы изобретения 8, страницы 57-61); WO200012130 (страницы 24-26);
(34) FcRH1 (подобный Fc-рецептору белок 1, предположительный рецептор для Fc-домена иммуноглобулинов, содержащий Ig-подобный домен типа C2 и домен ITAM, может играть роль в дифференцировке B-лимфоцитов); 429 ак, pI: 5,28, MW: 46925 TM: 1 [P] Хромосома гена: 1q21-1q22, номер доступа в Genbank NP_443170.1)
WO2003077836; WO200138490 (пункт формулы изобретения 6, Фиг.18E-1-18-E-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; WO2003089624 (пункт формулы изобретения 8); EP1347046 (пункт формулы изобретения 1); WO2003089624 (пункт формулы изобретения 7);
(35) IRTA2 (ассоциированный с транслокацией рецептор 2 суперсемейства иммуноглобулинов, предположительный иммунорецептор с возможной ролью в развитии B-клеток и лимфомагенезе; нарушение регуляции гена посредством транслокации происходит при некоторых злокачественных новообразованиях B-клеток); 977 ак, pI: 6,88 MW: 106468 TM: 1 [P] Хромосома гена: 1q21, номер доступа в Genbank Человек: AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Мышь: AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1
WO2003024392 (пункт формулы изобретения 2, Фиг.97); Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1): 124-127; WO2003077836; WO200138490 (пункт формулы изобретения 3, Фиг.18B-1-18B-2);
(36) TENB2 (TMEFF2, томорегулин, TPEF, HPP1, TR, предположительный трансмембранный протеогликан, родственный семейству факторов роста EGF/херегулина и фоллистатину); 374 ак, Номера доступа в NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; Ген в NCBI: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; номер доступа в Genbank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436
WO2004074320 (SEQ ID NO 810); JP2004113151 (SEQ ID NO 2, 4, 8); WO2003042661 (SEQ ID NO 580); WO2003009814 (SEQ ID NO 411); EP1295944 (страницы 69-70); WO200230268 (страница 329); WO200190304 (SEQ ID NO 2706); US2004249130; US2004022727; WO2004063355; US2004197325; US2003232350; US2004005563; US2003124579; Horie et al (2000) Genomics 67: 146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2): 178-84;
(37) PMEL17 (гомолог silver; SILV; D12S53E; PMEL17; (SI); (SIL); ME20; gp100) BC001414; BT007202; M32295; M77348; NM_006928; McGlinchey,R.P. et al (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736; Kummer,M.P. et al (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306;
(38) TMEFF1 (трансмембранный белок с EGF-подобным доменом и двумя фоллистатин-подобными доменами 1; Томорегулин-1; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961) NM_080655; NM_003692; Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629; Gery, S. et al (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727;
(39) GDNF-Ra1 (рецептор альфа 1 семейства GDNF; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alpha1; GFR-ALPHA-1; U95847; BC014962; NM_145793)
NM_005264; Kim, M.H. et al (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277; Treanor, J.J. et al (1996) Nature 382 (6586): 80-83;
(40) Ly6E (комплекс лимфоцитарного антигена 6, локус E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)
NP_002337.1; NM_002346.2; de Nooij-van Dalen, A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774; Zammit, D.J. et al (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952;
(41) TMEM46 (гомолог shisa 2 (Xenopus laevis); SHISA2) NP_001007539.1;
NM_001007538,1; Furushima,K. et al (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492; Clark,H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270;
(42) Ly6G6D (комплекс лимфоцитарного антигена 6, локус G6D; Ly6-D, MEGT1) NP_067079.2; NM_021246.2; Mallya, M. et al (2002) Genomics 80 (1): 113-123; Ribas, G. et al (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287;
(43) LGR5 (содержащий богатые лейцином повторы связанный с белком G рецептор 5; GPR49, GPR67) NP_003658.1; NM_003667.2; Salanti,G. et al (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537-545; Yamamoto,Y. et al (2003) Hepatology 37 (3):528-533;
(44) RET (протоонкоген ret; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; (PTC); CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1) NP_066124.1; NM_020975.4; Tsukamoto, H. et al (2009) Cancer Sci. 100 (10): 1895-1901; Narita,N. et al (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068;
(45) LY6K (комплекс лимфоцитарного антигена 6, локус K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226) NP_059997.3; NM_017527.3; Ishikawa,N. et al (2007) Cancer Res. 67 (24): 11601-11611; de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774;
(46) GPR19 (связанный с белком G рецептор 19; Mm.4787) NP_006134.1; NM_006143.2;
Montpetit, A. and Sinnett,D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2): 162-164; O'Dowd, B.F. et al (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329;
(47) GPR54 (рецептор KISS1; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12) NP_115940.2; NM_032551.4; Navenot, J.M. et al (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6): 1300-1306; Hata, K. et al (2009) Anticancer Res. 29 (2):617-623;
(48) ASPHD1 (содержащий домен аспартат-бета-гидроксилазы белок 1; LOC253982) NP_859069.2; NM_181718.3; Gerhard, D.S. et al (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127;
(49) Тирозиназа (TYR; OCAIA; OCA1A; тирозиназа; SHEP3) NP_000363.1; NM_000372.4; Bishop, D.T. et al (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925; Nan, H. et al (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917;
(50) TMEM118 (белок с «безымянным пальцем», трансмембранный белок 2; RNFT2; FLJ14627)
NP_001103373.1; NM_001109903.1; Clark, H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270; Scherer,S.E. et al (2006) Nature 440 (7082):346-351
(51) GPR172A (связанный с белком G рецептор 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e)
NP_078807.1; NM_024531.3; Ericsson, T.A. et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759-6764; Takeda, S. et al (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101.
Исходное антитело может представлять собой также слитый белок, содержащий последовательность альбуминсвязывающего пептида (ABP) (Dennis et al. (2002) «Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins» J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Антитела по изобретению включают слитые белки с последовательностями ABP, объясняемые в: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 в таблицах III и IV, страница 35038; (ii) US 20040001827 в SEQ ID NO: 9-22; и (iii) WO 01/45746 на страницах 12-13, в SEQ ID NO: z1-z14, и содержание всех из них приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
МУТАГЕНЕЗ
ДНК, кодирующую вариант аминокислотной последовательности исходного полипептида, получают множеством способов, известных в данной области. Эти способы включают, без ограничения, получение посредством сайт-специфического (или опосредованного олигонуклеотидом) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной ДНК, кодирующей полипептид. Варианты рекомбинантных антител можно также конструировать посредством манипуляций с рестрикционными фрагментами или посредством ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов с использованием синтетических олигонуклеотидов. Праймеры для мутагенеза кодируют замену(замены) кодонов на кодоны для цистеина. Общепринятые способы мутагенеза можно использовать для получения ДНК, кодирующей такие мутантные сконструированные антитела с цистеиновыми заменами. Общее руководство можно найти в Sambrook et al Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; и Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993.
Сайт-специфический мутагенез является одним из способов получения вариантов с заменами, т.е. мутантных белков. Этот способ хорошо известен в данной области (см., например, Carter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; и Kunkel et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488). Кратко, при проведении сайт-специфического мутагенеза ДНК, исходную ДНК изменяют, сначала проводя гибридизацию олигонуклеотида, кодирующего желательную мутацию, с одной цепью такой исходной ДНК. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй цепи с использованием прогибридизовавшегося олигонуклеотида в качестве праймера, и с использованием одной цепи исходной ДНК в качестве матрицы. Таким образом олигонуклеотид, кодирующий желательную мутацию, включают в полученную двухцепочечную ДНК. Сайт-специфический мутагенез можно проводить в гене, экспрессирующем белок, подлежащий мутагенезу, в экспрессирующей плазмиде, и полученную плазмиду можно секвенировать для подтверждения вставки желательных мутаций замены на цистеин (Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260). Способы и форматы сайт-специфического мутагенеза включают коммерчески доступные способы и форматы, например, набор для множественного сайт-специфического мутагенеза QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA).
ПЦР-мутагенез также пригоден для получения вариантов аминокислотной последовательности исходного полипептида. См. Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; и Vallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733. Кратко, когда малые количества ДНК-матрицы используют в качестве исходного материала для ПЦР, праймеры, которые немного отличаются по последовательности от соответствующей области в ДНК-матрице, можно использовать для получения относительно больших количеств специфического фрагмента ДНК, отличающегося от последовательности матрицы только в положениях, в которых праймеры отличаются от матрицы.
Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на способе, описанном Wells et al (1985) Gene 34:315-323. Исходный материал представляет собой плазмиду (или другой вектор), содержащий ДНК исходного полипептида, подлежащего мутагенезу. Идентифицируют кодон(ы) в исходной ДНК, подлежащие мутагенезу. Должны присутствовать участки для уникальной рестрикционной эндонуклеазы с каждой стороны идентифицированного участка(участков) мутации. Если таких участков рестрикции не существует, их можно получить с использованием вышеописанного способа опосредованного олигонуклеотидами мутагенеза для введения их в подходящие положения ДНК исходного полипептида. Плазмидную ДНК разрезают в этих участках, чтобы линеаризовать ее. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между участками рестрикции, но содержащий желательную мутацию(мутации), синтезируют с использованием общепринятых способов, когда две цепи олигонуклеотида синтезируют по отдельности и затем гибридизуют вместе с использованием общепринятых способов. Этот двухцепочечный олигонуклеотид обозначают кассетой. Эту кассету конструируют с наличием 5'- и 3'-концов, совместимых с концами линеаризованной плазмиды, так что ее можно напрямую лигировать в плазмиду. Эта плазмида теперь содержит последовательность ДНК с мутацией. Мутантную ДНК, содержащую закодированные цистеиновые замены, можно подтверждать секвенированием ДНК.
Отдельные мутации получают также направляемым олигонуклеотидами мутагенезом с использованием двухцепочечной плазмидной ДНК в качестве матрицы, посредством основанного на ПЦР мутагенеза (Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500).
По настоящему изобретению, hu4D5Fabv8, экспонированное на фаге M13 (Gerstner et al (2002) «Sequence Plasticity In The Antigen-Binding Site Of A Therapeutic Anti-HER2 Antibody», J Mol Biol. 321:851-62) использовали во всех экспериментах в качестве модельной системы. Цистеиновые мутации вводили в конструкции hu4D5Fabv8-фаг, hu4D5Fabv8 и ABP-hu4D5Fabv8. Выделения hu4D5-ТиоFab-фага проводили с использованием способа преципитации полиэтиленгликолем (PEG), как описано ранее (Lowman, Henry B. (1998) Methods in Molecular Biology (Totowa, New Jersey) 87 (Combinatorial Peptide Library Protocols) 249-264).
Олигонуклеотиды получают способом фосфорамидитного синтеза (US 4415732; US 4458066; Beaucage, S. and Iyer, R. (1992) «Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach», Tetrahedron 48:2223-2311). Фосфорамидитный способ включает циклическое добавление нуклеотидных мономерных звеньев с реакционноспособной 3'-фосфорамидитной группой к олигонуклеотидной цепи, растущей на твердой подложке, состоящей из стекла с контролируемым размером пор или полистирола с высокой степенью сшивки, и, наиболее часто, в направлении от 3' к 5', где 3'-концевой нуклеозид присоединяют к твердой подложке в начале синтеза (US 5047524; US 5262530). Способ обычно осуществляют на практике с использованием автоматических, коммерчески доступных синтезаторов (Applied Biosystems, Foster City, CA). Олигонуклеотиды можно химически метить с помощью неизотопных групп для детекции, захвата, стабилизации или других целей (Andrus, A. «Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers» (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, pp. 39-54; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671; Keller, G. and Manak, M. in DNA Probes Second Edition (1993), Stockton Press, New York, pp. 121-23).
АНАЛИЗ PHESELECTOR
Анализ PHESELECTOR (фаговый ELISA для отбора реакционноспособных тиолов) позволяет детекцию реакционноспособных групп цистеина в антителах в формате фагового ELISA (US 7521541; Junutula JR et al. «Rapid identification of reactive cysteine residues for site-specific labeling of antibody-Fabs» J Immunol Methods 2008; 332:41-52). Способ покрытия интересующим белком (например, антителом) поверхностей лунок, последующей инкубации с фаговыми частицами и затем с меченным HRP вторичным антителом с детекцией оптической плотности подробно описан в примере 2. Можно проводить скрининг мутантных белков, экспонированных на фагах, быстрым, точным и высоко производительным способом. Библиотеки сконструированных антител с цистеиновыми заменами можно получать и подвергать отбору по связыванию с использованием такого же способа для идентификации подходящих реакционноспособных участков включения свободного Cys из случайных белково-фаговых библиотек антител или других белков. Этот способ включает реакцию мутантных по цистеину белков, экспонированных на фаге, с аффинным реагентом или репортерной группой, которая также является реакционноспособной по отношению к тиолу. Фигура 8 иллюстрирует анализ PHESELECTOR посредством схематического представления, изображающего связывание Fab или ТиоFab с HER2 (вверху) и биотинилированного ТиоFab со стрептавидином (внизу).
ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА БЕЛКА
ДНК, кодирующую сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы служат источником такой ДНК. После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки обезьяны COS, клетки яичников китайского хомяка (CHO) или другие клетки-хозяева млекопитающих, такие как клетки миеломы (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310), которые в ином случае не продуцируют белка антитела, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Выходы сконструированных антител с цистеиновыми заменами hu4D5Fabv8 являлись сходными с выходами hu4D5Fabv8 дикого типа. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 и Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151-188.
После конструирования и отбора сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, например, ТиоFab, с неспаренными остатками Cys с высокой реакционной способностью, можно получать посредством: (i) экспрессии в бактериальной системе, например, E. coli, или в системе культуры клеток млекопитающих (WO 01/00245), например, клеток яичников китайского хомяка (CHO); и (ii) очистки с использованием общепринятых способов очистки белка (Lowman et al (1991) J. Biol. Chem. 266(17): 10982-10988).
ТиоFab экспрессировали при индукции в 34B8, несупрессорном штамме E. coli (Baca et al (1997) Journal Biological Chemistry 272(16): 10678-84). См. Пример 3a. Собранный осадок клеток ресуспендировали в PBS (фосфатно-солевом буфере), общий лизис клеток проводили пропусканием через микрофлюидайзер, и ТиоFab очищали аффинной хроматографией на SEPHAROSE™ с белком G (Amersham). ТиоFab конъюгировали с биотин-PEO-малеимидом, как описано выше, и биотинилированые-ТиоFab дополнительно очищали гель-фильтрационной хроматографией на Superdex-200™ (Amersham), отсекающей свободный биотин-PEO-малеимид и олигомерную фракцию ТиоFab.
АНАЛИЗ МАСС-СПЕКТРОСКОПИИ
Масс-спектрометрический анализ жидкостной хроматографией с ионизацией электрораспылением (LC-ESI-MS) использовали для точного определения молекулярной массы конъюгированных с биотином Fab (Cole, R.B. Electro Spray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation And Applications. (1997) Wiley, New York). Аминокислотную последовательность биотинилированного пептида hu4D5Fabv8 (A121C) определяли расщеплением трипсином с последующим анализом LC-ESI-тандемной MS (таблица 4, пример 3b).
Fab-фрагмент антитела hu4D5Fabv8 содержит приблизительно 445 аминокислотных остатков, включая 10 остатков Cys (пять на легкой и пять на тяжелой цепи). Определена структура с высоким разрешением вариабельного фрагмента гуманизированного 4D5 (Fv4D5), см.: Eigenbrot et al «X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized Anti-P185her2 Antibody 4D5 And Comparison With Molecular Modeling» (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Все остатки Cys присутствуют в форме дисульфидных связей, таким образом, эти остатки не имеют каких-либо реакционноспособных тиоловых групп для конъюгации с цирконий-малеимидом (если только не обработаны восстанавливающим агентом). Таким образом, вновь сконструированный остаток Cys может оставаться неспаренным, и способным вступать в реакцию, т.е., образовывать конъюгат с электрофильным линкерным реагентом или промежуточным соединением цирконий-линкер, таким как цирконий-малеимид. На фигуре 1A показано трехмерное представление фрагмента антитела hu4D5Fabv8 в координатах кристалла, полученных с помощью рентгеновского излучения. Положения в структуре сконструированных остатков Cys тяжелой и легкой цепей пронумерованы в соответствии с последовательной системой нумерации. Эта последовательная система нумерации коррелирует с системой нумерации Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) для варианта 4d5v7fabH трастузумаба в соответствии с фигурой 1B, на которой показана схема последовательной нумерации (верхний ряд), начиная с N-конца, отличающаяся от схемы нумерации по Kabat (нижний ряд) вставками, обозначенными a,b,c. При использовании системы нумерации Kabat, действительная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или может содержать дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению FR или CDR вариабельного домена или вставке в них. Участки сконструированного варианта тяжелой цепи с цистеиновыми заменами идентифицированы по схеме последовательной нумерации и схеме нумерации Kabat в следующей таблице:
Figure 00000014
Для M13 фагмиды-Cys мутантных Fab (фигуры 3A и 3B) можно проводить быстрый скрининг по сравнению с Fab белками. Связывание фагмиды-ТиоFab с антигеном и со стрептавидином можно тестировать покрытием планшетов для ELISA HER2 и стрептавидином, соответственно, с последующим использованием в качестве зонда анти-Fab-HRP (Пероксидаза хрена), как описано в примере 2 и изображено на фигуре 8. Этот способ позволяет одновременное мониторирование эффекта на связывание антигена и на реакционную способность тиоловой группы сконструированного остатка Cys/конъюгированной молекулы биотина. Способ можно использовать также для скрининга реакционноспособных тиоловых групп любого белка, экспонированного на фаге M13. Конъюгированные или неконъюгированные фагмиды-ТиоFab очищают простой преципитацией PEG.
Антигенсвязывающий фрагмент гуманизированного 4D5 (hu4D5Fab) хорошо экспрессируется в E. Coli и был экспонирован на бактериофаге (Garrard et al (1993) Gene 128: 103-109). Fab-фрагмент антитела hu4D5Fabv8 был экспонирован на фаге M13 в качестве модельной системы в анализе на основе ELISA для тестирования реакционной способности тиола. Фигура 8 представляет собой графическое изображение анализа PHESELECTOR, показывающее связывание биотинилированного ТиоFab фага и антитела против фага с HRP с HER2 (вверху) и стрептавидином (внизу). Пять аминокислотных остатков (L-Ala43, H-Ala40, H-Ser119, H-Ala121 и H-Ser122) первоначально выбраны по информации о кристаллической структуре как удаленные от антигенсвязывающей поверхности (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Рентгеновская кристаллическая структура из базы данных белков обозначена 1FVC. Остатки Cys сконструированы в этих положениях посредством сайт-специфического мутагенеза. Препараты ТиоFab-фага выделяли и подвергали реакции с реагентом для биотинилирования.
Конъюгированные и неконъюгированные с биотином варианты тестировали по связыванию с HER2 и стрептавидином с использованием анализа PHESELECTOR на основе ELISA (фигура 8, пример 2) с HRP (пероксидаза хрена)-конъюгированным антителом против фага. Взаимодействие небиотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 (фигура 2A) и биотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 (Фигура 2B) с BSA (незакрашенный прямоугольник), HER2 (серый прямоугольник) или стрептавидином (закрашенный прямоугольник) мониторировали с помощью антитела анти-M13-пероксидаза хрена (HRP) посредством проявления стандартной реакции HRP и измерения оптической плотности при 450 нм. Оптическую плотность, полученную при превращении колориметрического субстрата, измеряли при 450 нм. Реакционная способность ТиоFab по отношению HER2 является показателем связывания антигена. Реакционная способность ТиоFab по отношению к стрептавидину является показателем степени биотинилирования. Реакционная способность ТиоFab по отношению к BSA является отрицательным контролем для неспецифического взаимодействия. Как видно на фигуре 2A, все варианты ТиоFab-фага обладали сходным связыванием с HER2 по сравнению со связыванием hu4D5Fabv8-фага дикого типа. Более того, конъюгация с биотином не влияла на связывание ТиоFab с HER2 (Фигура 2B).
Удивительно и неожиданно, для образцов ТиоFab-фагов показали изменяющиеся уровни активности связывания стрептавидина. Из всех протестированных фаг-ТиоFab, для сконструированного антитела с цистеиновыми заменами A121C показали максимальную реакционную способность тиола. Даже несмотря на то, что hu4D5Fabv8-фаг дикого типа инкубировали с такими же количествами биотин-малеимида, этот фаг обладал небольшим связыванием стрептавидина, что указывает на то, что предсуществующие остатки цистеина (вовлеченные в формирование дисульфидных связей) из hu4D5Fabv8 и белков оболочки фага M13 не мешают сайт-специфической конъюгации биотин-малеимида. Эти результаты показывают, что анализ фагового ELISA можно успешно использовать для скрининга реакционноспособных тиоловых групп на поверхности Fab.
Анализ PHESELECTOR позволяет скрининг реакционноспособных тиоловых групп в антителах. Идентификация варианта A121C этим способом является иллюстративной. Можно проводить эффективный поиск по целой молекуле Fab для идентификации большего числа вариантов ТиоFab с реакционноспособными тиоловыми группами. Параметр относительную доступность поверхности использовали для идентификации и количественной оценки доступности для растворителя аминокислотных остатков в полипептиде. Доступность поверхности можно выражать как площадь поверхности (Е2), которая может вступать в контакт с молекулой растворителя, например, воды. Пространство, занимаемое водой, составляет сферу радиусом приблизительно 1,4 Е. Программное обеспечение является свободно доступным или лицензируемым (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA44 AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, или доступным в интернет: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) как пакет программ для кристаллографии CCP4, использующий алгоритмы для расчета доступности поверхности каждой аминокислоты белка с известными координатами, полученными рентгеновской кристаллографией («The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography» (1994) Acta. Cryst. D50:760-763). Два иллюстративных модуля программного обеспечения, осуществляющие расчеты доступности поверхности «AREAIMOL» и «SURFACE», основаны на алгоритмах B.Lee and F. M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400.
AREAIMOL определяет поверхность белка, доступную для растворителя, как локус в центре сферы зонда (представляющей молекулу растворителя), по мере того, как она катится по Ван-дер-Ваальсовой поверхности белка. AREAIMOL рассчитывает площадь поверхности, доступной для растворителя, посредством получения точек поверхности на расширенной сфере вокруг каждого атома (на расстоянии от центра атома, равном сумме радиусов атома и зонда), и исключения точек, лежащих внутри одних и тех же сфер, ассоциированных с соседними атомами. AREAIMOL находит площадь атомов, доступных для растворителя, в файле координат PDB и суммирует доступную площадь по остатку, по цепи и по целой молекуле. Доступные площади (или разности площадей) для отдельных атомов можно записать в файл выходных данных псевдо-PDB. AREAIMOL присваивает один радиус каждому элементу и распознает только ограниченное количество различных элементов. Неизвестным типам атомов (т.е., не присутствующим во внутренней базе данных AREAIMOL) по умолчанию присваивается радиус 1,8 Å. Список распознаваемых атомов представляет собой:
Figure 00000015
AREAIMOL и SURFACE выдают абсолютные значения доступности, т.е. количество квадратных ангстрем (Å). Относительную доступность поверхности рассчитывают на основе стандартного состояния, соответствующего аминокислоте внутри полипептида. Стандартное состояние представляет собой трипептид Gly-X-Gly, где X представляет собой интересующую аминокислоту, и стандартное состояние должно представлять собой «растянутую» конформацию, т.е. подобную конформации в бета-цепях. Растянутая конформация максимизирует доступность X. Рассчитанную доступную площадь делят на доступную площадь в стандартном состоянии трипептида Gly-X-Gly и регистрируют частное, представляющее собой относительную доступность. Процент доступности представляет собой относительную доступность, умноженную на 100.
Другой иллюстративный алгоритм для расчета доступности поверхности основан на модуле SOLV программы xsae (Broger, C, F. Hoffman-LaRoche, Basel), рассчитывающем относительную доступность аминокислотного остатка для водяной сферы на основании рентгеновских координат полипептида.
Относительную доступность поверхности для каждой аминокислоты в hu4D5Fabv7 рассчитывали с использованием информации о кристаллической структуре (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Значения относительной доступности поверхности для аминокислот легкой цепи и тяжелой цепи hu4D5Fabv7 показаны в нисходящем порядке в таблице 1.
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Следующие два критерия использовали для идентификации остатков hu4D5Fabv8, которые можно конструировать с заменой на остатки Cys:
1. Исключены аминокислотные остатки, которые полностью скрыты, т.е. менее чем с 10% относительной доступностью поверхности. В таблице 1 показано, что существует 134 (легкая цепь) и 151 (тяжелая цепь) остатков в hu4D5Fabv8, доступных более чем на 10% (относительная доступность поверхности). Выбрано десять наиболее доступных остатков Ser, Ala и Val из-за их близкого структурного свойства с Cys по сравнению с другими аминокислотами, так что вновь сконструированный Cys вносит только минимальные структурные ограничения в антитело. Можно также проводить скрининг других участков замены на цистеин, и они могут быть пригодны для конъюгации.
2. Остатки сортируют на основании их роли в функциональных и структурных взаимодействиях Fab. Затем отбирали остатки, не вовлеченные во взаимодействия с антигеном и удаленные от существующих дисульфидных связей. Вновь сконструированные остатки Cys должны быть удалены от участка связывания антигена, и не должны ни мешать связыванию антигена, ни ошибочно спариваться с остатками цистеина, вовлеченными в формирование дисульфидных связей.
Следующие остатки hu4D5Fabv8 удовлетворяли вышеуказанным критериям и были выбраны для замены на Cys: L-V15, L-A43, L-V110, L-A144, L-S168, H-A88, H-A121, H-S122, H-A175 и H-S179 (показаны на фигуре 1).
Реакционную способность тиола можно распространять на любое антитело, в котором можно выполнять замену аминокислот на реакционноспособные цистеиновые аминокислоты в пределах легкой цепи, выбранных из: L-10 - L-20; L-38 - L-48; L-105 - L-115; L-139 - L-149; L-163 - L-173; и в пределах тяжелой цепи, выбранных из: H-35 - H-45; H-83 - H-93; H-114 - H-127; и H-170 - H-184, и в пределах Fc-области, выбранных из H-268 - H-291; H-319 - H-344; H-370 - H-380; и H-395 - H-405.
Реакционную способность тиола можно распространять также на конкретные домены антитела, такие как константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Замены на цистеин, приводящие к значению реакционной способности тиолов 0,6 и выше, можно выполнять в константных доменах тяжелых цепей α, δ, ε, γ и μ интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая подклассы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2.
Из данных кристаллической структуры очевидно, что выбранные 10 мутантов Cys находятся далеко от антигенсвязывающего участка, такого как поверхность контакта с HER2 в этом случае. Эти мутанты можно тестировать экспериментально по непрямым эффектам на функциональные взаимодействия. Реакционную способность тиола всех Cys вариантов Fab измеряли и рассчитывали, как описано в примерах 1 и 2, и представлено в таблице 2. Остатки L-V15C, L-V110C, H-A88C и H-A121C имели реакционноспособные и стабильные тиоловые группы (Фигуры 3A и 3B). Мутанты V15C, V110C, A144C, S168C представляют собой Cys варианты легкой цепи. Мутанты A88C, A121C, A175C, S179C представляют собой Cys варианты тяжелой цепи. Удивительно и неожиданно, что участки с высокой относительной доступностью поверхности не обладают наиболее высокой реакционной способностью тиола, как рассчитано посредством анализа PHESELECTOR (таблица 2). Иными словами, относительная доступность поверхности (таблицы 1, 2) не коррелирует с реакционной способностью тиола (таблица 2). Фактически, остатки Cys, сконструированные в участках с умеренной доступностью поверхности 20%-80% (фигура 4A, таблица 1), или частично экспонированные участки, подобные остаткам Ala или Val, обладают лучшей реакционной способностью тиола, т.е. >0,6, (фигура 3B, таблица 2), чем Cys, введенный вместо остатков Ser, таким образом, необходимость использования анализа PHESELECTOR для скрининга реакционноспособных участков тиола только по информации о кристаллической структуре является недостаточной для отбора этих участков (фигура 3B и 4A).
Данные по реакционной способности тиола показаны на фигурах 3A и 3B для аминокислотных остатков Cys мутантов 4D5 ТиоFab: (3A) небиотинилированный (контроль) и (3B) биотинилированные фаг-ТиоFab. Реакционноспособные тиоловые группы на поверхности антитела/Fab идентифицировали анализами PHESELECTOR по взаимодействию небиотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 (3A) и биотинилированного фаг-hu4D5Fabv8 (3B) с BSA (незакрашенный прямоугольник), HER2 (серый прямоугольник) или стрептавидином (закрашенный прямоугольник). Анализ проводили, как описано в примере 2. Варианты легкой цепи расположены на левой стороне, и варианты тяжелой цепи расположены на правой стороне. Связывание небиотинилированных Cys мутантов 4D5 ТиоFab является низким, как ожидалось, однако, сильное связывание с HER2 сохраняется. Соотношение связывания со стрептавидином и с HER2 биотинилированных Cys мутантов 4D5 ТиоFab дает значение реакционной способности тиолов в таблице 2. Фоновая оптическая плотность при 450 нм или малые количества неспецифического связывания белка Cys мутантов биотинилированного 4D5 ТиоFab с BSA также видны на фигуре 3B. Значения относительной доступности поверхности избранных аминокислотных остатков, замененных на остаток Cys, показаны на фигуре 4A. Относительная доступность поверхности рассчитана по доступной структуре hu4D5Fabv7 и показана в таблице 1 (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Конформационные параметры структур hu4D5Fabv7 и hu4D5Fabv8 хорошо согласуются и позволяют определение любой корреляции между относительной доступностью поверхности hu4D5Fabv7 и реакционной способностью тиола цистеиновых мутантов hu4D5Fabv8. Измеренная реакционная способность тиола остатков Cys на фаге с ТиоFab, введенных в частично экспонированные остатки (Ala или Val), показывает лучшую реакционную способность тиола по сравнению с остатками Cys, введенными в остатки Ser (Таблица 2). В таблице 2 можно видеть, что для Cys мутантов ТиоFab корреляция между значениями реакционной способности тио- и относительной доступностью поверхности мала или отсутствует.
Аминокислоты в положениях L-15, L-43, L-110, L-144, L-168, H-40, H-88, H-119, H-121, H-122, H-175 и H-179 антитела можно, как правило, подвергать мутации (заменять) с помощью свободных цистеиновых аминокислот. Диапазоны в пределах приблизительно 5 аминокислотных остатков с каждой стороны от этих положений также можно заменять на свободные цистеиновые аминокислоты, т.е. L-10 - L-20; L-38 - L-48; L-105 - L-115; L-139 - L-149; L-163 - L-173; H-35 - H-45; H-83 - H-93; H-114 - H-127; и H-170 - H-184, так же как в диапазонах Fc-области, выбранных из H-268 - H-291; H-319 - H-344; H-370 - H-380; и H-395 - H-405, для получения сконструированных антител с цистеиновыми заменами по изобретению.
Figure 00000020
Два Cys варианта для легкой цепи (L-V15C и L-V110C) и два для тяжелой цепи (H-A88C и H-A121C) выбраны для дальнейшего анализа, поскольку для этих вариантов показана наивысшая реакционная способность тиола (таблица 2).
В отличие от очистки фага, получение Fab может требовать 2-3 суток, в зависимости от масштаба продукции. На протяжении этого времени, тиоловые группы могут терять реакционную способность из-за окисления. Для тестирования стабильности тиоловых групп на hu4D5Fabv8-фаге, измеряли реакционную способность тиола фаг-тиоFab (фигура 4B). После выделения ТиоFab-фага, на сутки 1, сутки 2 и сутки 4, все образцы конъюгировали с биотин-PEO-малеимидом и тестировали в анализе фагового ELISA (PHESELECTOR) для тестирования связывания HER2 и стрептавидина. L-V15C, L-V110C, H-A88C и H-A121C сохраняли значительные уровни реакционной способности тиола по сравнению с другими вариантами ТиоFab (фигура 4B).
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ СКОНСТРУИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ С ЦИСТЕИНОВЫМИ ЗАМЕНАМИ
Соединения по изобретению включают сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, в которых одна или несколько аминокислот исходного антитела заменены на свободную аминокислоту цистеин. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами содержит одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, обладающих значением реакционной способности тиола в диапазоне 0,6-1,0. Свободная аминокислота цистеин представляет собой остаток цистеина, введенный при конструировании в исходное антитело и не являющийся частью дисульфидного мостика.
В одном аспекте сконструированное антитело с цистеиновыми заменами получено способом, включающим:
(a) замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела на цистеин; и
(b) определение реакционной способности тиола сконструированного антитела с цистеиновыми заменами посредством реакции сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с реакционноспособным по отношению к тиолу реагентом.
Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами может являться более реакционноспособным, чем исходное антитело, по отношению к реакционноспособному по отношению к тиолу реагенту.
Остатки свободной аминокислоты цистеина могут быть локализованы в тяжелой или легкой цепях, или в константном или вариабельном доменах. Фрагменты антитела, например, Fab, также можно конструировать с заменой аминокислот фрагментов антитела на одну или нескольких цистеиновых аминокислот для получения сконструированных фрагментов антитела с цистеиновыми заменами.
Другой аспект изобретения относится к способу получения (изготовления) сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, включающему:
(a) введение одной или нескольких цистеиновых аминокислот в исходное антитело для получения сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(b) определение реакционной способности тиола сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с помощью реакционноспособного по отношению к тиолу реагента;
где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами является более реакционноспособным, чем исходное антитело, по отношению к реакционноспособному по отношению к тиолу реагенту.
Стадия (a) способа получения сконструированного антитела с цистеиновыми заменами может включать:
(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированное антитело с цистеиновыми заменами;
(ii) экспрессию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(iii) выделение и очистку сконструированного антитела с цистеиновыми заменами.
Стадия (b) способа получения сконструированного антитела с цистеиновыми заменами может включать экспрессию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами на вирусной частице, выбранной из частицы фага или фагмиды.
Стадия (b) способа получения сконструированного антитела с цистеиновыми заменами может включать также:
(i) реакцию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с реакционноспособным по отношению к тиолу аффинным реагентом для получения аффинно меченного сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(ii) измерение связывания аффинно меченного сконструированного антитела с цистеиновыми заменами со связывающей средой.
Другой аспект по изобретению относится к способу скрининга сконструированных антител с цистеиновыми заменами с высоко реакционноспособными, неспаренными цистеиновыми аминокислотами по реакционной способности тиола, включающему:
(a) введение одной или нескольких цистеиновых аминокислот в исходное антитело для получения сконструированного антитела с цистеиновыми заменами;
(b) реакцию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с реакционноспособным по отношению к тиолу аффинным реагентом для получения аффинно меченного сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(c) измерение связывания аффинно меченного сконструированного антитела с цистеиновыми заменами со связывающей средой; и
(d) определение реакционной способности тиола сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с помощью реакционноспособного по отношению к тиолу реагента.
Стадия (a) способа скрининга сконструированных антител с цистеиновыми заменами может включать:
(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированное антитело с цистеиновыми заменами;
(ii) экспрессию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(iii) выделение и очистку сконструированного антитела с цистеиновыми заменами.
Стадия (b) способа скрининга сконструированного антитела с цистеиновыми заменами может включать экспрессию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами на вирусной частице, выбранной из частицы фага или фагмиды.
Стадия (b) способа скрининга сконструированного антитела с цистеиновыми заменами может включать также:
(i) реакцию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с реакционноспособным по отношению к тиолу аффинным реагентом для получения аффинно меченного сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(ii) измерение связывания аффинно меченного сконструированного антитела с цистеиновыми заменами со связывающей средой.
МЕЧЕНЫЕ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА С ЦИСТЕИНОВЫМИ ЗАМЕНАМИ
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами по изобретению можно конъюгировать с любой группой метки, которую можно ковалентно присоединять к антителу посредством тиоловой группы цистеина (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. и Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). Присоединенная метка может функционировать для: (i) обеспечения поддающегося детекции сигнала; (ii) взаимодействия со второй меткой для модификации поддающегося детекции сигнала, обеспечиваемого первой или второй меткой, например, для получения FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции); (iii) стабилизации взаимодействий или увеличения аффинности связывания с антигеном или лигандом; (iv) влияния на подвижность, например, электрофоретическую подвижность, или клеточную проницаемость, посредством заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров, или (v) предоставления связывающей группы, для модуляции аффинности лиганда, связывания антитело/антиген, или образования комплексных ионов.
Меченые сконструированные антитела с цистеиновыми заменами могут являться полезными для диагностических анализов, например, для детекции экспрессии интересующего антигена в специфических клетках, тканях или сыворотке. Для диагностических применений антитело, как правило, метят поддающейся детекции группой.
Доступно множество меток, которые можно в общем сгруппировать по следующим категориям:
(a) Радиоизотопы (радиоактивные изотопы), такие как 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177LU, 211At или 213Bi. Меченные радиоизотопами антитела являются полезными в экспериментах получения изображений, направленных на рецепторы. Антитело можно метить с помощью реагентов с лигандами, которые связывают, образуют хелат или другой комплекс с радиоизотопом металла, где реагент является реакционноспособным по отношению к сконструированному тиолу антитела, с использованием способов, описанных в Current Protocols in Immunology, Volumes 1 и 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Хелатирующие лиганды, которые могут образовывать комплексы с ионом металла, включают DOTA, DOPA, DOTP, DOTMA, DTPA и TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Радиоактивные изотопы можно нацеливать посредством образования комплексов с сконструированными антителами с цистеиновыми заменами в форме конъюгатов антитело-цирконий по изобретению (Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146).
Металл-хелатные комплексы, пригодные в качестве меток для антитела для экспериментов по получению изображений, описаны в: US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al (1983) J. Immunol. Methods 65: 147-157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al (1990) J. Cancerl990, Suppl. 10:21-26; Izard et al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
(b) Флуоресцентные метки, такие как хелаты редкоземельных элементов (хелаты европия), типы флуоресцеина, включая FITC, 5-карбоксифлуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин; типы родамина, включая TAMRA; данзил; лиссамин; цианины; фикоэритрины; Техасский Красный; и их аналоги. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителами с использованием способов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, выше. Реагенты с флуоресцентными красителями и флуоресцентной меткой включают реагенты, коммерчески доступные из Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) и Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).
(c) Различные фермент-субстратные метки доступны или описаны (US 4275149). Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно измерять с использованием различных способов. Например, фермент может катализировать изменение окраски субстрата, которое можно измерять спектрофотометрически. Альтернативно, фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Способы количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат становится электронно-возбужденным посредством химической реакции и может затем испускать свет, который можно измерять (например, с использованием хемилюминометра) или передавать энергию акцептору флуоресценции. Примеры ферментых меток включают люциферазы (например, люциферазу светлячков и бактериальную люциферазу; US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уриназу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP), β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов (например, оксидазу глюкозы, оксидазу галактозы и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Способы конъюгации ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al (1981) «Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay», in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166.
Примеры комбинаций фермент-субстрат включают, например:
(i) пероксидазу хрена (HRP) с перекисью водорода в качестве субстрата, где перекись водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидингидрохлорид (TMB));
(ii) щелочную фосфатазу (AP) с пара-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и
(iii) β-D-галактозидазу (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозидазой) или флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидазой.
Множество других комбинаций фермент-субстрат доступно специалистам в данной области. Общий обзор см. в US 4275149 и US 4318980.
Метку можно опосредованно конъюгировать с сконструированным антителом с цистеиновыми заменами. Например, антитело можно конъюгировать с биотином и любую метку из трех широких категорий, указанных выше, можно конъюгировать с авидином или стрептавидином, или наоборот. Биотин избирательно связывается со стрептавидином, и, таким образом, метку можно конъюгировать с антителом данным опосредованным образом. Альтернативно для достижения опосредованной конъюгации метки с вариантом полипептида, вариант полипептида конъюгируют с небольшим гаптеном (например, дигоксином) и одну из различных типов меток, указанных выше, конъюгируют с полипептидным вариантом против гаптена (например, антителом против дигоксина). Таким образом можно достигать опосредованной конъюгации метки с вариантом полипептида (Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
Вариант полипептида по настоящему изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как ELISA, анализы конкурентного связывания, прямом и непрямом сэндвич-анализах, и анализах иммунопреципитации (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).
Метка для детекции может являться пригодной для локализации, визуализации и количественной оценки события связывания или узнавания. Меченые антитела по изобретению могут детектировать рецепторы поверхности клеток. Другим применением для меченных поддающейся детекции меткой антител является способ иммунного связывания с помощью бусин, включающий конъюгацию бусин с флуоресцентно меченным антителом и детекцию сигнала флуоресценции при связывании лиганда. В сходных способах детекции связывания используют эффект поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для измерения и детекции взаимодействий антитело-антиген.
Такие метки для детекции, как флуоресцентные красители и хемилюминесцентные красители (Briggs et al (1997) «Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids», J. Chem. Soc, Perkin-Trans. 1: 1051-1058), обеспечивают поддающийся детекции сигнал и являются общепринятыми для мечения антитела, предпочтительно, со следующими свойствами: (i) меченое антитело должно производить очень сильный сигнал с низким фоном, так что небольшие количества антител можно с большой чувствительностью детектировать как в бесклеточных, так и в основанных на клетках анализах; и (ii) меченое антитело должно являться фотостабильным, так чтобы флуоресцентный сигнал можно было наблюдать, мониторировать и регистрировать без значительного фотообесцвечивания. Для применений, включающих связывание на поверхности клетки меченого антитела с мембранами или поверхностями клеток, особенно живых клеток, метки предпочтительно (iii) обладают хорошей растворимостью в воде для достижения эффективных концентраций конъюгата и чувствительности детекции и (iv) являются нетоксичными для живых клеток, так чтобы не нарушать нормальных процессов метаболизма клеток или не вызывать преждевременной гибели клеток.
Прямую количественную оценку интенсивности клеточной флуоресценции и подсчет событий флуоресцентного мечения, например, связывания на поверхности клеток конъюгатов пептид-краситель, можно проводить в системе (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.), автоматизирующей нерадиоактивные анализы смешивания и считывания с живыми клетками или бусинами (Miraglia, «Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology», (1999) J. of Biomolecular Screening 4: 193-204). Применения меченых антител включают также анализы связывания с рецептором на поверхности клеток, анализы иммунного связывания, твердофазные иммунофлуоресцентные анализы (FLISA), анализы расщепления каспазой (Zheng, «Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo», (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907), анализы апоптоза (Vermes, «A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V» (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) и анализы цитотоксичности. Способ флуориметрического анализа в микрообъемах можно использовать для идентификации повышающей или понижающей регуляции посредством молекулы, нацеленной на поверхность клеток (Swartzman, «A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology», (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
Меченые сконструированные антитела с цистеиновыми заменами по изобретению являются пригодными в качестве биомаркеров и зондов для получения изображений различными методами и способами получения биомедицинских и молекулярных изображений, такими как: (i) МРТ (магнитно-резонансная томография); (ii) МикроКТ (компьютерная томография); (iii) SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография); (iv) ПЭТ (позитронная эмиссионная томография) Chen et al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) биолюминесценция; (vi) флуоресценция; и (vii) ультразвук. Иммуносцинтиография представляет собой способ получения изображений при котором антитела, меченные радиоактивными веществами, вводят пациенту - животному или человеку, и получают изображение в участках организма, где локализовано антитело (US 6528624). Биомаркеры для получения изображений можно объективно измерять и оценивать в качестве показателя нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут принадлежать к нескольким типам: маркеры типа 0 представляют собой маркеры естественного течения заболевания и по длительности проявления коррелируют с известными клиническими показателями, например, оценкой ЯМР синовиального воспаления при ревматоидном артрите; маркеры типа I фиксируют эффект вмешательства вне зависимости от механизма действия, даже несмотря на то, что механизм может не быть ассоциирован с клиническим исходом; маркеры типа II функционируют как суррогатные конечные точки, где по изменению биомаркера или по сигналу от биомаркера прогнозируют клиническое преимущество для «подтверждения» намеченного ответа, например, измерение эрозии костной ткани при ревматоидном артрите посредством КТ. Биомаркеры для получения изображений таким образом могут предоставлять фармакодинамическую (PD) терапевтическую информацию относительно: (i) экспрессии белка-мишени, (ii) связывания лекарственного средства с белком-мишенью, т.е., избирательности, и (iii) фармакокинетических данных о выведении и времени полужизни. Преимущества биомаркеров для получения изображений in vivo по сравнению с биомаркерами для лабораторных исследований включают: неинвазивную обработку, количественную оценку целого организма, повторяющиеся введение и оценку, т.е. множественные временные точки, и эффекты, потенциально переносимые от доклинических результатов (для мелких животных) к клиническим результатам (для человека). Для некоторых применений получение изображений биологических объектов заменяет эксперименты на животных или минимизирует количество экспериментов на животных в доклинических исследованиях.
Метки для получения изображений с радиоактивными изотопами включают такие радиоактивные изотопы, как 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At или 213Bi. Можно получать комплекс иона радиоактивного изотопа металла с хелатирующим линкером, таким как DOTA. Линкерные реагенты, такие как DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), можно получать реакцией аминобензил-DOTA с 4-малеимидомасляной кислотой (Fluka), активированной изопропилхлорформатом (Aldrich), с последующим использованием способа Axworthy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1802-1807). DOTA-малеимидные реагенты вступают в реакцию со свободными цистеиновыми аминокислотами сконструированных антител с цистеиновыми заменами и обеспечивают наличие на антителе образующего комплексы с металлами лиганда (Lewis et al (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Реагенты для мечения с хелатирующим линкером, такие как DOTA-NHS (сложный моно(N-гидроксисукцинимидный) эфир 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты), являются коммерчески доступными (Macrocyclics, Dallas, TX). Нацеленное на рецепторы получение изображений с помощью меченных радиоактивным изотопом антител может обеспечивать маркер активации пути посредством детекции и количественной оценки возрастающего накопления антител в ткани опухоли (Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210). Конъюгированные радиоактивные металлы могут оставаться внутри клеток после лизосомальной деградации.
Способы мечения пептидов хорошо известны. См. Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work и E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) «Chemical Modification of Proteins», Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; и Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10: 1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Пептиды и белки, меченные двумя группам, флуоресцентным репортером и тушителем в достаточной близости, подвергаются резонансному переносу энергии флуоресценции (FRET). Репортерные группы, как правило, представляют собой флуоресцентные красители, возбуждаемые светом определенной длины волны и переносящие энергию на группу акцептора, или тушителя, с соответствующим сдвигом Стокса для излучения с максимальной яркостью. Флуоресцентные красители включают молекулы с большими ароматическими группами, такие как флуоресцеин и родамин, и их производные. Флуоресцентный репортер может подвергаться частичному или полному тушению группой тушителя в интактном пептиде. При расщеплении пептида пептидазой или протеазой можно измерять поддающееся детекции увеличение флуоресценции (Knight, C. (1995) «Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes», Methods in Enzymology, Academic Press, 248: 18-34).
Меченые антитела по изобретению можно использовать также в качестве средства для аффинной очистки. По этому способу, меченое антитело иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага, с использованием способов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело приводят в контакт с образцом, содержащим антиген, подлежащий очистке, и затем подложку промывают подходящим растворителем, удаляющим в основном весь материал образца, за исключением антигена, подлежащего очистке, который является связанным с иммобилизованным вариантом полипептида. Наконец, подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, pH 5,0, высвобождающим антиген с варианта полипептида.
Реагенты для мечения, как правило, несут реакционноспособную функциональную группу, которая может вступать в реакцию (i) неспосредственно с тиолом цистеина сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с образованием меченого антитела, (ii) с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения линкер-метка, или (iii) с имеющим линкер антителом с образованием меченого антитела. Реакционноспособные функциональные группы реагентов для мечения включают: малеимид, галоацетил, сложный эфир иодацетамида и сукцинимидила (например, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, сложный эфир пентарфторфенила и фосфорамидит, хотя можно использовать также другие функциональные группы.
Иллюстративной реакционноспособной функциональной группой является N-гидроксисукцинимидиловый сложный эфир (NHS) карбоксильной группы заместителя поддающейся детекции метки, например, биотина или флуоресцентного красителя. NHS сложный эфир метки может являться заранее полученным, выделенным, очищенным и/или охарактеризованным, или он может образовываться in situ и вступать в реакцию с нуклеофильной группой антитела. Как правило, карбоксильную форму метки активируют посредством реакции с некоторой комбинацией карбодиимидного реагента, например, дициклогексилкарбодиимида, диизопропилкарбодиимида или урониевого реагента, например, TSTU (тетрафторборат (O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония), HBTU (гексафторфосфат O-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония) или HATU (гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония), активатора, такого как 1-гидроксибензотриазол (HOBt), и N-гидроксисукцинимида для получения NHS сложного эфира метки. В некоторых случаях, метку и антитело можно связывать активацией метки in situ и реакцией с антителом с образованием конъюгата метка-антитело в одну стадию. Другие реагенты для активации и связывания включают TBTU (гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазо-1-ил)-1-1,3,3-тетраметилурония), TFFH (2-фтор-гексафторфосфат N,N',N'',N'''-тетраметилурония), PyBOP (гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинофосфония), EEDQ (2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин), DCC (дициклогексилкарбодиимид); DIPCDI (диизопропилкарбодиимид), MSNT (1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1H-1,2,4-триазол и арилсульфонилгалогениды, например, триизопропилбензолсульфонилхлорид.
КОНЪЮГАЦИЯ БИОТИН-МАЛЕИМИДА С ТИОFAB
Вышеописанные свойства ТиоFab определены в присутствии фага, поскольку слияние Fab с белком оболочки фага потенциально может изменять доступность или реакционную способность тиола Cys. Таким образом, конструкции ТиоFab клонировали в экспрессирующий вектор под промотором щелочной фосфатазы (Chang et al (1987) Gene 55: 189-196), и экспрессию ТиоFab индуцировали посредством выращивания клеток E. coli в бесфосфатной среде. ТиоFab очищали на колонке с SEPHAROSE™ с белком G и анализировали в восстанавливающих и невосстанавливающих гелях для SDS-PAGE. Эти анализы позволяют оценку того, сохранили ли ТиоFab свою реакционноспособную тиоловую группу или сделаны неактивными посредством формирования внутримолекулярных или межмолекулярных дисульфидных связей. ТиоFab L-V15C, L-V110C, H-A88C и H-A121C экспрессировали и очищали хроматографией на колонке с SEPHAROSE™ с белком-G (подробно см. в разделе методы). Очищенные белки анализировали в геле для SDS-PAGE в восстанавливающих (с DTT) и невосстанавливающих (без DTT) условиях. Другие восстанавливающие средства, такие как BME (бета-меркаптоэтанол), можно использовать в геле для расщепления межцепочечных дисульфидных групп. Из анализа SDS-PAGE в геле очевидно, что главная (~90%) фракция ТиоFab присутствует в мономерной форме, в то время как hu4D5Fabv8 дикого типа присутствует в основном в мономерной форме (47 кДа).
ТиоFab (A121C) и hu4D5Fabv8 дикого типа инкубировали со 100-кратным избытком биотин-малеимида в течение 3 часов при комнатной температуре, и биотинилированные Fab наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex-200™. Эта стадия очистки являлась пригодной для отделения мономерных Fab от олигомерных Fab, а также от избыточного свободного биотин-малеимида (или свободного циркониевого реагента).
На фигуре 5 показано подтверждение свойств вариантов ТиоFab в отсутствие фагового окружения. Белки без слияния с фагом, hu4D5Fabv8 и hu4D5Fabv8-A121C (ТиоFab-A121C), экспрессировали и очищали с использованием бусин с агарозой с белком-G с последующей инкубацией со 100-кратным молярным избытком биотин-малеимида. Сравнивали связывание стрептавидина и HER2 с биотинилированным сконструированным ТиоFab с cys заменами и небиотинилированным Fab дикого типа. Степень конъюгации с биотином (взаимодействие со стрептавидином) и способность связывания с HER2 мониторировали посредством анализов ELISA. Каждый Fab тестировали при 2 нг и 20 нг.
Биотинилированный A121C ТиоFab сохранял связывание с HER2, сравнимое со связыванием hu4D5Fabv8 дикого типа (фигура 5). Fab дикого типа и A121C-ТиоFab очищали гель-хроматографией на колонке. Два образца тестировали по связыванию HER2 и стрептавидина посредством ELISA с использованием анти-Fab-HRP козы в качестве вторичного антитела. Как Fab дикого типа (незакрашенный прямоугольник), так и ТиоFab (прямоугольник с точками) обладают сходным связыванием с HER2, но только ТиоFab сохранял связывание со стрептавидином. Только фоновый уровень взаимодействия со стрептавидином наблюдали для небиотинилированного hu4D5Fabv8 дикого типа (фигура 5). Масс-спектральный (LC-ESI-MS) анализ биотинилированного-ТиоFab (A121C) приводил к главному пику 48294,5 дальтон в отличие от hu4D5Fabv8 дикого типа (47737 дальтон). Разница в 537,5 дальтон между двумя молекулами точно соответствует одному биотин-малеимиду, конъюгированному с ТиоFab. Результаты масс-спектрального секвенирования белка (LC-ESI-тандемного масс-спектрального анализа) дополнительно подтвердили, что конъюгированная молекула биотина присутствует на вновь сконструированном остатке Cys (таблица 4, пример 3).
САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ КОНЪЮГАЦИЯ БИОТИН-МАЛЕИМИДА С АЛЬБУМИНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ПЕПТИД (ABP)-ТИОFAB
Связывание с белком плазмы может являться эффективным способом улучшения фармакокинетических свойств короткоживущих молекул. Альбумин является наиболее распространенным белком в плазме. Связывающие сывороточный альбумин пептиды (ABP) могут изменять фармакодинамику слитых с ними активных доменов белков, включая изменение поглощения, проникновения и диффузии в тканях. Эти фармакодинамические параметры можно регулировать специфическим выбором подходящей последовательности связывающего сывороточный альбумин пептида (US 20040001827). Серию альбуминсвязывающих пептидов идентифицировали скринингом фагового дисплея (Dennis et al. (2002) «Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins» J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Соединения по изобретению включают ABP последовательности, объясняемые в: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 в таблицах III и IV, страница 35038; (ii) US 20040001827 в SEQ ID NO: 9-22; и (iii) WO 01/45746 на страницах 12-13, SEQ ID NO: z1-z14, и содержание всех из них приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
Альбуминсвязывающие белки (ABP)-Fab конструировали слиянием альбуминсвязывающего пептида с C-концом тяжелой цепи Fab в стехиометрическом соотношении 1:1 (1 ABP/1 Fab). Показано, что связывание этих ABP-Fab с альбумином увеличивало время их полужизни более чем в 25 раз у кроликов и мышей. Вышеописанные реакционноспособные остатки Cys можно, таким образом, вводить в эти ABP-Fab и использовать для сайт-специфической конъюгации с циркониевыми реагентами с последующими исследованиями на животных in vivo.
Последовательности альбуминсвязывающих пептидов включают в качестве неограничивающих примеров аминокислотные последовательности, перечисленные в SEQ ID NO: 1-5:
Figure 00000021
Последовательности альбуминсвязывающих пептидов (ABP) связывают альбумин множества видов (мыши, крысы, кролика, быка, макака-резуса, бабуина и человека) с Kd (кролик) = 0,3 мкМ. Альбуминсвязывающий пептид не конкурирует с лигандами, как известно, связывающими альбумин и обладает временем полужизни (T½) у кролика 2,3 ч. Белки ABP-ТиоFab очищали на BSA-SEPHAROSE™ с последующей конъюгацией с биотин-малеимидом и очисткой хроматографией на колонке Superdex-S200, как описано в предыдущих разделах. Очищенные биотинилированные белки являлись гомогенными и лишенными каких-либо олигомерных форм (пример 4).
На фигуре 6 показаны свойства вариантов альбуминсвязывающий пептид (ABP)-ТиоFab. Анализы ELISA проводили для тестирования способности ABP-hu4D5Fabv8-wt, ABP-hu4D5Fabv8-V110C и ABP-hu4D5Fabv8-A121C связываться с кроличьим альбумином, стрептавидином и HER2. Биотинилированные ABP-ТиоFab способны связывать альбумин и HER2 с аффинностью, сходной с аффинностью ABP-hu4D5Fabv8 дикого типа, как подтверждено ELISA (фигура 6) и анализом кинетики BIAcore (таблица 3). Планшет для ELISA покрывали альбумином, HER2 и SA, как описано. Для связывания биотинилированного ABP-ТиоFab с альбумином, HER2 и SA в качестве зонда использовали анти-Fab HRP. Биотинилированные ABP-ТиоFab были способны связываться со стрептавидином по сравнению с небиотинилированным контрольным ABP-hu4D5Fabv8-wt, что указывает на то, что ABP-ТиоFab являлись конъюгированными с биотин-малеимидом, подобно ТиоFab, сайт-специфическим образом, поскольку одни и те же мутанты Cys использовали для обоих вариантов (фигура 6).
Figure 00000022
Альтернативно, альбуминсвязывающий пептид можно связывать с антителом посредством ковалентного присоединения через линкерную группу.
КОНСТРУИРОВАНИЕ ABP-ТИОFAB С ДВУМЯ СВОБОДНЫМИ ТИОЛОВЫМИ ГРУППАМИ НА FAB
Вышеуказанные результаты показывают, что все четыре варианта (L-V15C, L-V110C, H-A88C и H-A121C) тиоFab (сконструированных Fab антител с цистеиновыми заменами) обладают реакционноспособными тиоловыми группами, которые можно использовать для сайт-специфической конъюгации с реагентом для мечения, линкерным реагентом или промежуточным соединением цирконий-линкер. L-V15C можно экспрессировать и очищать, но с относительно низкими выходами. Однако, выходы экспрессии и очистки вариантов L-V110C, H-A88C и H-A121C являлись сходными с выходами hu4D5Fabv8. Таким образом, эти мутанты можно использовать для дальнейшего анализа и рекомбинации для получения более одной тиоловой группы на Fab. Для этой цели конструировали одну тиоловую группу на легкой и одну на тяжелой цепи для получения двух тиоловых групп на молекулу Fab (L-V110C/H-A88C и L-V110C/H-A121C). Эти два варианта с двойным Cys экспрессировали в экспрессирующей системе E. coli и очищали. Обнаружено, что гомогенность очищенных биотинилированных ABP-ТиоFab является сходной с гомогенностью вариантов с отдельным Cys.
Исследовали эффекты конструирования двух реакционноспособных остатков Cys на Fab (фигура 7). Присутствие второго биотина тестировали посредством исследования связывания биотинилированного ABP-ТиоFab с SA с использованием стрептавидин-HRP (фигура 7). Для анализа HER2/Fab планшет для ELISA покрывали HER2, и в качестве зонда использовали анти-Fab HRP. Для анализа SA/Fab планшет для ELISA покрывали SA, и в качестве зонда использовали анти-Fab HRP. Для анализа SA/SA планшет для ELISA покрывали SA, и в качестве зонда использовали SA-HRP. Фигура 7. Анализы ELISA взаимодействия cys вариантов биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8 с HER2, стрептавидином (SA). Для HER2/Fab, SA/Fab и SA/SA показали, что их взаимодействия выявлены посредством анти-Fab-HRP, SA-HRP, соответственно. SA/Fab выявляет присутствие одного биотина на Fab, и более одного биотина на Fab выявляют анализом SA/SA. Связывание HER2 с мутантами с двойным cys является сходным со связыванием с вариантами с одним Cys (фигура 7). Однако, степень биотинилирования мутантов с двойным Cys была выше по сравнению с вариантами с одним Cys благодаря более одной свободной тиоловой группе на молекулу Fab (фигура 7).
КОНСТРУИРОВАНИЕ ТИО-IgG ВАРИАНТОВ ТРАСТУЗУМАБА
Цистеин вводили в конкретные остатки полноразмерного моноклонального антитела, трастузумаба (ГЕРЦЕПТИН®, Genentech Inc.). Мутанты трастузумаба с одним cys H-A88C, H-A121C и L-V110C, и мутанты трастузумаба с двойным cys V110C-A121C и V110C-A121C экспрессировали в клетках CHO (яичников китайского хомяка) посредством нестационарной ферментации в среде, содержащей 1 мМ цистеин. Последовательность мутантной тяжелой цепи A88C (450 ак) представляет собой SEQ ID NO:6. Последовательность мутантной тяжелой цепи A121C (450 ак) представляет собой SEQ ID NO:7. Последовательность мутантной легкой цепи V110C (214 ак) представляет собой SEQ ID NO:8.
Figure 00000023
В одном из вариантов осуществления сконструированные антитела с цистеиновыми заменами тио-трастузумаб содержат одну или несколько из следующих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи со свободной аминокислотой цистеином (SEQ ID NO: 9-16).
Figure 00000024
В другом варианте осуществления сконструированные антитела с цистеиновыми заменами тио-трастузумаб содержат одну или несколько из следующих последовательностей вариабельных областей легкой цепи со свободной аминокислотой цистеином (SEQ ID NO: 17-27).
Figure 00000025
Полученные полноразмерные варианты IgG тио-трастузумаба анализировали по реакционной способности тиола и активности связывания HER2. На фигуре 13A показано графическое изображение связывания биотинилированного антитела с иммобилизованным HER2 и меченным HRP вторичным антителом для детекции оптической плотности. На фигуре 13B показаны измерения связывания с иммобилизованным HER2 с детекцией оптической плотности при 450 нм (слева направо): небиотинилированный трастузумаб дикого типа (Wt), конъюгированные с биотином-малеимидом варианты тио-трастузумаба V110C (один cys), A121C (один cys) и V110C-A121C (двойной cys). Каждый вариант тио-IgG и трастузумаб тестировали при 1, 10 и 100 нг. Измерения показывают, что биотинилированные анти-HER2 ТиоMab сохраняют активность связывания HER2.
На фигуре 14A показано графическое изображение связывания биотинилированного антитела с иммобилизованным HER2 со связыванием биотина с анти-IgG-HRP для детекции оптической плотности. На фигуре 14B показаны измерения связывания с детекцией оптической плотности при 450 нм для конъюгированных с биотином-малеимидом вариантов тио-трастузумаба и небиотинилированного трастузумаба дикого типа при связывании со стрептавидином. Слева направо: V110C (один cys), A121C (один cys), V110C/A121C (двойной cys) и трастузумаб. Каждый вариант тио IgG и исходный трастузумаб тестировали при 1, 10 и 100 нг. Измерения показывают, что ТиоMab против HER2 обладают высокой реакционной способностью тиола.
Цистеин вводили в конкретные остатки полноразмерного анти-EphB2R антитела 2H9. Мутант с одним cys H-A121C 2H9 экспрессировали в клетках CHO (яичников китайского хомяка) посредством нестационарной ферментации в среде, содержащей 1 мМ цистеин. Мутантная последовательность тяжелой цепи A121C 2H9 (450 ак) представляет собой SEQ ID NO:28.
Figure 00000026
Сконструированные тио-2H9 антитела с цистеиновыми заменами содержат следующие последовательности константной области тяжелой цепи Fc со свободной аминокислотой цистеином (SEQ ID NO: 29-38).
Figure 00000027
На фигуре 16 показан анализ электрофорезом в невосстанавливающем (вверху) и восстанавливающем (внизу) денатурирующем SDS-PAGE (электрофорезом в полиакриламидном геле) вариантов 2H9 ТиоMab Fc (слева направо, дорожки 1-9): A339C; S337C; S324C; A287C; V284C; V282C; V279C; и V273C, вместе с 2H9 дикого типа, после очистки на иммобилизованном белке A. Дорожка справа представляет собой маркер размера, указывающий на то, что интактные белки составляют приблизительно 150 кДа, фрагменты тяжелой цепи приблизительно 50 кДа и фрагменты легкой цепи приблизительно 25 кДа. На фигуре 17A показан анализ электрофорезом в невосстанавливающем (слева) и восстанавливающем (справа) денатурирующем полиакриламидном геле вариантов 2H9 ТиоMab (слева направо, дорожки 1-4): L-V15C; S179C; S375C; S400C, после очистки на иммобилизованном белке A. На фигуре 17B показан анализ электрофорезом в невосстанавливающем (слева) и восстанавливающем (+DTT) (справа) денатурирующем полиакриламидном геле дополнительных вариантов ТиоMab 2H9 и 3A5 после очистки на иммобилизованном белке A. Варианты ТиоMab 2H9 (в области Fab, так же как в Fc-области) экспрессировали и очищали, как описано. Как показано на фигурах 16, 17A и 17B, все белки являются гомогенными в SDS-PAGE после процедуры восстановления и окисления из примера 11 для получения реакционноспособных ТиоMab для конъюгации (пример 12).
Цистеин вводили в конкретные остатки полноразмерного анти-MUC16 антитела 3A5. Мутант 3A5 с одним cys H-A121C экспрессировали в клетках CHO (яичников китайского хомяка) посредством нестационарной ферментации в среде, содержащей 1 мМ цистеин. Мутантная последовательность тяжелой цепи A121C 3A5 (446 ак) содержит SEQ ID NO:39.
Figure 00000028
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами тио-3A5 анти-MUC16 содержат следующие последовательности вариабельной области тяжелой цепи со свободной аминокислотой цистеином (SEQ ID NO: 40-44).
Figure 00000029
Сконструированные тио-3A5 анти-MUC16 антитела с цистеиновыми заменами содержат следующие последовательности вариабельной области легкой цепи со свободной аминокислотой цистеином (SEQ ID NO: 45-49).
Figure 00000030
РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ТИОЛА ТИОMAB
Реакционную способность тиола полноразмерных сконструированных антител с цистеиновыми заменами IgG (ТиоMab) измеряли по биотинилированию и связыванию стрептавидина. Анализ вестерн-блоттингом разрабатывали для скрининга ТиоMab, специфически конъюгированного с биотин-малеимидом. В этом анализе антитела анализировали восстанавливающим SDS-PAGE, и присутствие биотина специфически тестировали инкубацией со стрептавидином-HRP. Как видно на фигуре 18, наблюдают взаимодействие стрептавидина-HRP с тяжелой цепью или легкой цепью в зависимости от того, какой сконструированный с заменами cys вариант используют, и не наблюдают взаимодействия для дикого типа, что указывает на специфическую конъюгацию вариантов ТиоMab с биотином на сконструированном остатке Cys. На фигуре 18 показан анализ электрофорезом в денатурирующем геле восстановленных биотинилированных вариантов Тио-IgG после связывания с иммобилизованным анти-IgG-HRP (верхний гель) и стрептавидином-HRP (нижний гель). Дорожка 1: 3A5 H-A121C. Дорожка 2: 3A5 L-V110C. Дорожка 3: 2H9 H-A121C. Дорожка 4: 2H9 L-V110C. Дорожка 5: исходное анти-EphB2R 2H9, дикого типа. Каждый мутант (дорожки 1-4) связывался с анти-IgG с детекцией HRP (вверху), что указывает на сохранение избирательности и аффинности. Связывание с иммобилизованным стрептавидином с детекцией HRP (внизу) подтвердило локализацию биотина на тяжелой и легкой цепях. Локализацией цистеиновой мутации на сконструированных антителах с цистеиновыми заменами в дорожках 1 и 3 является тяжелая цепь. Локализацией цистеиновой мутации на сконструированных антителах с цистеиновыми заменами в дорожках 2 и 4 является легкая цепь. Участок цистеиновой мутации подвергается конъюгации с биотин-малеимидным реагентом.
Анализ ТиоMab сконструированных антител с цистеиновыми заменами на фигуре 18 и варианта 2H9 V15C посредством LC/MS дает количественные показатели реакционной способности тиола (Таблица 5).
Figure 00000031
Конструирование цистеиновых замен проводили в константном домене, т.е. Fc-области, IgG антител. Множество аминокислотных участков переводили в цистеиновые участки, и экспрессированные мутанты, т.е. сконструированные антитела с цистеиновыми заменами, оценивали по реакционной способности тиола.
Варианты биотинилированного Fc ТиоMab 2H9 оценивали по реакционной способности тиола посредством количественной оценки с помощью HRP посредством связывания с иммобилизованным стрептавидином в анализе ELISA (фигура 19). Анализ ELISA разрабатывали для быстрого скрининга остатков Cys с реакционноспособными тиоловыми группами. Как показано на схематической диаграмме на фигуре 19, взаимодействие стрептавидин-биотин мониторировали с использованием в качестве зонда анти-IgG-HRP с последующим измерением оптической плотности при 450 нм. Эти результаты подтвердили, что 2H9-ТиоFc варианты V282C, A287C, A339C, S375C и S400C обладали реакционной способностью тиола, от средней до наиболее высокой. Степень конъюгации с биотином вариантов 2H9 ТиоMab Fc количественно оценивали анализом LS/MS, как указано в таблице 6. Анализ LS/MS подтвердил, что варианты A282C, S375C и S400C обладали 100% конъюгацией с биотином, и V284C и A339C обладали 50% конъюгацией, что указывает на присутствие реакционноспособной тиоловой группы цистеина. Другие варианты ТиоFc, и исходное 2H9 дикого типа либо обладали очень малым биотинилированием, либо не были биотинилированы.
Figure 00000032
РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ТИОЛА ВАРИАНТОВ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ТИО-4D5 FAB
Скринингом множества сконструированных вариантов легкой цепи Fab анти-ErbB2 антитела 4D5 с цистеиновыми заменами получили ряд вариантов с значением реакционной способности тиола 0,6 и выше (таблица 7), как измерено анализом PHESELECTOR на фигуре 8. Значения реакционной способности тиола из таблицы 7 нормализованы по варианту тяжелой цепи 4D5 ТиоFab (HC-A121C), который принимали за 100%, принимая полное биотинилирование варианта HC-A121C, и представлены как значения в процентах.
Figure 00000033
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МЕЧЕНИЯ ЦИРКОНИЕМ
Иллюстративные бифункциональные реагенты на основе десферриоксамина B (Df) использовали для образования комплексов 89Zr с антителами, включая моноклональные антитела (mAb). Десферриоксамин B (Ν'-{5-[ацетил(гидрокси)амино]пентил}-N-[5-({4-[(5-аминопентил)(гидрокси)амино]-4-оксобутаноил}амино)пентил]-N-гидроксисукцинамид (CAS Reg. No. 70-51-9); и известный также как дефероксамин, десфероксамин B, DFO-B, DFOA, DFB или десферал), представляет собой бактериальный сидерофор, продуцируемый actinobacter Streptomyces pilosus (фигура 20, вверху). Десферриоксамин B имеет применение в медицине в качестве хелатирующего агента, используемого для удаления избытка железа из организма (Miller, Marvin J. «Syntheses and therapeutic potential of hydroxamic acid based siderophores and analogs» (1989) Chemical Reviews 89 (7): 1563-1579). Соль мезилат DFO-B является коммерчески доступной. Первоначальные эксперименты проводили с N-(S-ацетил)тиоацетил-Df (SATA-Df) и mAb с добавленными малеимидными группами, 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилатом (mAb-SMCC), присоединенными к ε-аминогруппе в боковой цепи лизина (Meijs WE et al. «Zirconium-labeled monoclonal antibodies and their distribution in tumor-bearing nude mice» (1997) J. Nucl. Med. 38: 112-8; Meijs WE et al. «A facile method for the labeling of proteins with zirconium isotopes» (1996) Nucl Med Biol. 23:439-48). Однако, полученные тиоэфирные конъюгаты (mAb-SMCC-SATA-Df) были нестабильными в сыворотке человека при 37°C (Verel I et al «89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies» (2003) J Nucl Med 44: 1271-81). Другие иллюстративные реакционноспособные по отношению к аминогруппам бифункциональные хелаторы на основе Df, модифицированного янтарным ангидридом (Suc), использовали для превращения аминогруппы Df в карбоновую кислоту и последующей активации в форме сложного эфира 2,3,5,6-тетрафторфенила (TFP). TFP-N-Suc-Df (фигура 20, в центре) присоединяли к ε-аминогруппам лизина mAb, и получали хелаты очищенного mAb-N-Suc-Df с 89Zr. Полученный 89Zr-mAb-N-Suc-Df являлся стабильным в физиологических условиях, и его биораспределение сравнивали с mAb-SMCC-SATA-Df у мышей (Verel I et al «89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies» (2003) J Nucl Med. 44: 1271-81). Однако, получение TFP-N-Suc-Df требует защиты гидроксамидных групп в форме комплекса Fe(III). Железо удаляют обработкой ЭДТА до образования хелатов с 89Zr, но многоступенчатый способ является трудоемким и подвержен опасности неполного удаления железа из десферриоксамина и/или неполного удаления ЭДТА из буфера для конъюгации, что может отрицательно влиять на выход образования 89Zr-хелатов. Таким образом, гетеробифункциональный реакционноспособный по отношению к аминогруппам реагент, п-изотиоцианатбензил-десферриоксамин (Df-Bz-NCS), недавно разработан для включения Df в белки посредством связи с тиомочевиной, фигура 20, в центре (Perk LR et al. «Facile radiolabeling of monoclonal antibodies and other proteins with zirconium-89 or gallium-68 for PET Imaging using p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine» (2008) Nature Protocols, published online:DOI: 10.1038/nprot.2008.22; Perk LR et al. «p-Isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine: a new bifunctional chelate for facile radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for immuno-PET imaging» (2009) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging). Для конъюгатов антител, полученных с использованием Df-Bz-NCS, показали стабильность и свойства получения изображений, сравнимые с контрольными конъюгатами, полученными с использованием TFP-N-Suc-Df. Поскольку разработаны надежные способы присоединения 89Zr к антителам через ε-аминогруппы лизина, число опубликованных доклинических и клинических исследований иммуноПЭТ с меченными 89Zr антителами быстро увеличивается (Verel I, et al. «Long-lived positron emitters zirconium-89 and iodine-124 for scouting of therapeutic radioimmunoconjugates with PET» (2003) Cancer Biother Radiopharm. 18:655-61; Nagengast WB et al. «In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft» (2007) J Nucl Med. 48:1313-9; Perk LR, et al. «(89)Zr as a PET surrogate radioisotope for scouting biodistribution of the therapeutic radiometals (90)Y and (177)Lu in tumor-bearing nude mice after coupling to the internalizing antibody cetuximab» (2005) J Nucl Med. 46: 1898-906; Perk LR et al. «Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with (89)Zr-labelled monoclonal antibody DN30» (2008) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging 35:1857-67; Perk LR et al. «Preparation and evaluation of (89)Zr-Zevalin for monitoring of (90)Y-Zevalin biodistribution with positron emission tomography» (2006) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging 33:1337-45; Borjesson PK et al. «Performance of immuno-positron emission tomography with zirconium-89-labeled chimeric monoclonal antibody U36 in the detection of lymph node metastases in head and neck cancer patients» (2006) Clin Cancer Res. 12:2133-40; Aerts HJ et al. «Disparity between in vivo EGFR expression and 89Zr-labeled cetuximab uptake assessed with PET» (2009) J Nucl Med. 50:123-31; Dijkers EC et al. «Development and Characterization of Clinical-Grade 89Zr-Trastuzumab for HER2/neu ImmunoPET Imaging» (2009) J Nucl Med 50(6):974-981).
Варианты осуществления комплексов циркония включают также связывающие цирконий (образующие с ним хелаты) лиганды, такие как DTPA (CAS Reg. No. 67-43-6), DOPA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота) (Liu, Shuang (2008) Advanced Drug Delivery Reviews 60(12):1347-1370), циклопентадиенильные и аллильные группы (Erker, G. (1991) Pure and Applied Chemistry 63(6):797-806; Erker, G. (1990) Jour, of Organometallic Chem. 400(1-2):185-203), содержание каждого из которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
Комплексы циркония (Z) и других радиоактивных изотопов можно конъюгировать с антителами (Ab), включая моноклональные антитела (mAb), через ε-аминогруппу боковой цепи лизина или через тиоловую группу цистеина. Поскольку приблизительно 40 боковых цепей лизина (Wang L et al «Structural characterization of the maytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate, huN901-DM1, by mass spectrometry» (2005) Protein Sci. 14:2436-46) или 8 остатков цистеина (Hamblett KJ et al. «Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate» (2004) Clin Cancer Res. 10:7063-70) доступны для конъюгации в mAb, оба способа обеспечивают гетерогенность по отношению к соотношениям конъюгатов mAb и участкам конъюгации. Модификация остатка лизина внутри участка связывания может уменьшать биологическую активность конъюгата (Cai W et al. «PET imaging of colorectal cancer in xenograft-bearing mice by use of an 18F-labeled T84.66 anti-carcinoembryonic antigen diabody» (2007) J Nucl Med. 48:304-10; Shively JE. «18F labeling for immuno-PET: where speed and contrast meet» (2007) J Nucl Med. 48: 170-2; Tait JF et al «Improved detection of cell death in vivo with annexin V radiolabeled by site-specific methods» (2006) J Nucl Med. 47: 1546-53; Schellenberger EA et al «Optical imaging of apoptosis as a biomarker of tumor response to chemotherapy» (2003) Neoplasia (New York, N.Y) 5: 187-92), в то время как модификация остатков цистеина в шарнирной области обеспечивает уменьшенное время полужизни в плазме (Hamblett KJ et al. «Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate» (2004) Clin Cancer Res. 10:7063-70). Этих ограничений можно избежать с использованием mAb, сконструированных с содержанием цистеина, расположенного избирательно, с целью сайт-специфической конъюгации, с помощью биохимического анализа PHESELECTOR (US 7521541; Junutula JR et al. «Rapid identification of reactive cysteine residues for site-specific labeling of antibody-Fabs» J Immunol Methods 2008;332:41-52) для быстрой идентификации предпочтительных аминокислот в антителе для мутации с заменой на цистеин. Полученное антитело (ТИОMAB) затем химически избирательно и сайт-специфически конъюгируют с цитотоксическими лекарственными средствами без какой-либо потери аффинности связывания или неблагоприятных эффектов на стабильность каркаса антитела (Junutula JR et al. «Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index» (2008) Nat Biotechnol. 26:925-32).
С точки зрения получения изображений, высокая аффинность к мишени и минимальное неспецифическое поглощение необходимы для оптимального качества изображения. Соответственно, сайт-специфически радиоактивно меченные сконструированные антитела с цистеиновыми заменами (ТИОMAB) могут обеспечивать метки с неизмененной аффинностью связывания и стабильностью каркаса, которые могут минимизировать неспецифическое поглощение метаболитов вне ткани-мишени. Один аспект настоящего изобретения относится к способу сайт-специфического радиоактивного мечения ТИОMAB с использованием новых реакционноспособных по отношению к тиолу бифункциональных реагентов на основе Df малеимидоциклогексил-десферриоксамина (Df-Chx-Mal), бромацетил-десферриоксамина (Df-Bac) и иодацетил-десферриоксамина (Df-Iac) (фигура 20). Иллюстративные варианты осуществления включают варианты осуществления, в которых эти реагенты сайт-специфически конъюгируют с ТИОMAB трастузумабом (тио-трастузумаб), получают хелаты с 89Zr и оценивают in vitro и in vivo.
Одним из метастабильных изомеров циркония является 89Zr со временем полужизни 78,4 часов с типами распада бета (испускание электронов), испускания позитронов (бета плюс) и гамма-излучения.
Радиоактивный изотоп или другие метки можно включать в конъюгат известными способами (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy» Chatal, CRC Press 1989). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративный хелатирующий агент для конъюгации радиоактивного изотопа с антителом (WO 94/11026).
ЛИНКЕРЫ
«Линкер» (L) представляет собой бифункциональную или мультифункциональную группу, которую можно использовать для соединения одной или нескольких групп комплекса с цирконием (Z) и молекулы антитела (Ab) с образованием конъюгатов антитело-цирконий (AZC) формулы I. Конъюгаты антитело-цирконий (AZC) можно удобно получать с использованием линкера, обладающего реакционноспособной функциональной группой для связывания с цирконием и с антителом. Тиол цистеина сконструированного антитела с цистеиновыми заменами (Ab) может образовывать связь с функциональной группой линкерного реагента, группой циркониевой метки или промежуточным соединением цирконий-линкер.
В одном аспекте линкер имеет реакционноспособный участок с электрофильной группой, являющейся реакционноспособной по отношению к нуклеофильному цистеину, присутствующему в антителе. Тиол цистеина антитела является реакционноспособным по отношению к электрофильной группе линкера и образует ковалентную связь с линкером. Пригодные электрофильные группы включают в качестве неограничивающих примеров малеимидные и галоацетамидные группы.
Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами могут вступать в реакцию с линкерными реагентами или промежуточными соединениями цирконий-линкер, с электрофильными функциональными группами, такими как малеимид или α-галокарбонил, согласно способу конъюгации на странице 766 в Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, и согласно способам из примеров 17-19.
В другом варианте осуществления группы Z являются одинаковыми.
В другом варианте осуществления группы Z являются различными.
Иллюстративные варианты осуществления соединений конъюгатов антитело-цирконий (AZC) формулы I включают:
Figure 00000034
где X представляет собой:
Figure 00000035
где Y представляет собой:
Figure 00000036
R независимо представляет собой H или C1-C6 алкил; и n представляет собой 1-12.
В другом варианте осуществления линкер обладает реакционноспособной функциональной группой, обладающей нуклеофильной группой, реакционноспособной по отношению к электрофильной группе, присутствующей в антителе. Пригодные электрофильные группы антитела включают в качестве неограничивающих примеров, карбонильные группы альдегидов и кетонов. Гетероатом нуклеофильной группы линкера может вступать в реакцию с электрофильной группой антитела и образовывать ковалентную связь с молекулой антитела. Пригодные нуклеофильные группы линкера включают в качестве неограничивающих примеров, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразид. Электрофильная группа антитела обеспечивает удобный участок для присоединения к линкеру.
В другом варианте осуществления линкер может быть замещен группами, модулирующими растворимость или реакционную способность. Например, заряженный заместитель, такой как сульфонат (-SO3 -) или аммоний, может увеличивать растворимость реагента в воде и облегчать реакцию присоединения линкерного реагента к антителу или группе циркония, или облегчать реакцию присоединения Ab-L (промежуточного соединения антитело-линкер) к Z или Z-L (промежуточного соединения цирконий-линкер) к Ab, в зависимости от способа синтеза, используемого для получения AZC.
Соединения по изобретению конкретно включают, но без ограничения, AZC, полученные с помощью линкерных реагентов: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), и включая бис-малеимидные реагенты: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)2 и BM(PEO)43, коммерчески доступные от Pierce Biotechnology, Inc., Customer Service Department, P.O. Box 117, Rockford, IL. 61105 U.S.A. Бис-малеимидные реагенты позволяют присоединение тиоловой группы сконструированного антитела с цистеиновыми заменами к содержащей тиол циркониевой группе, метке или линкерному промежуточному соединению, последовательным или одновременным образом. Другие функциональные группы помимо малеимида, реакционноспособные по отношению к тиоловой группе сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, циркониевой группе, метке или линкерному промежуточному соединению, включают иодацетамид, бромацетамид, винилпиридин, дисульфид, пиридилдисульфидизоцианат и изотиоцианат.
Figure 00000037
Пригодные линкерные реагенты можно получать также из других коммерческих источников, таких как Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), или синтезировать способами, описанными в Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; и WO 04/032828.
Иллюстративные линкерные реагенты включают:
Figure 00000038
где n представляет собой целое число в диапазоне 1-10, и T представляет собой -H или -SO3Na;
Figure 00000039
где n представляет собой целое число в диапазоне 0-3;
Figure 00000040
В другом варианте осуществления линкер L может представлять собой линкер древовидного типа для ковалентного присоединения более одной группы циркония через разветвленную, мультифункциональную линкерную группу к антителу (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Линкеры древовидного типа могут увеличивать молярное соотношение циркония к антителу, т.е. нагрузку AZC. Таким образом, когда сконструированное антитело с цистеиновыми заменами несет только одну реакционноспособную тиоловую группу цистеина, множество циркониевых групп можно присоединять через линкер древовидного типа.
Следующие иллюстративные варианты осуществления линкерных реагентов древовидного типа позволяют конъюгацию вплоть до девяти содержащих циркониевую группу нуклеофильных реагентов посредством реакции с содержащими хлорэтил и азотистый иприт функциональными группами:
Figure 00000041
Figure 00000042
Другие варианты осуществления разветвленных, древовидных линкеров включают линкеры с самоуничтожающимися дендримерными звеньями 2,6-бис(гидроксиметил)-п-крезола и 2,4,6-трис(гидроксиметил)-фенола (WO 2004/01993; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125: 15688-15689; Shamis et al (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126: 1726-1731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
МЕЧЕННЫЕ ДЕСФЕРРИОКСАМИНОМ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА С ЦИСТЕИНОВЫМИ ЗАМЕНАМИ
В одном аспекте изобретение относится к меченному десферриоксамином сконструированному антителу с цистеиновыми заменами, содержащему сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и группой десферриоксамина (Df), обладающему формулой II:
Figure 00000043
где L-Df выбран из:
Figure 00000044
где волнистая линия обозначает присоединение к антителу (Ab); и
p представляет собой 1-4.
ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛО-ЦИРКОНИЙ
Конъюгаты антитело-цирконий (AZC) формулы I можно получать несколькими способами с использованием реакций, условий и реагентов органической химии, известных специалистам в данной области, включая: (1) реакцию цистеиновой группы сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с линкерным реагентом для образования промежуточного соединения антитело-линкер Ab-L, посредством ковалентной связи, с последующей реакцией с активированной группой циркониевой метки Z; и (2) реакцию нуклеофильной группы циркониевой группы с линкерным реагентом для образования промежуточного соединения циркониевая метка-линкер Z-L, посредством ковалентной связи, с последующей реакцией с цистеиновой группой сконструированного антитела с цистеиновыми заменами. Способы конъюгации (1) и (2) можно использовать со множеством сконструированных антител с цистеиновыми заменами, групп циркониевой метки и линкеров для получения конъюгатов антитело-цирконий формулы I.
Тиоловые группы цистеина антитела являются нуклеофильными и способными вступать в реакцию для формирования ковалентных связей с электрофильными группами линкерных реагентов и промежуточных соединений цирконий-линкер, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил и бензилгалиды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы; и (iv) дисульфиды, включая пиридилдисульфиды, посредством сульфидного обмена. Нуклеофильные группы на группе циркониевой метки включают в качестве неограничивающих примеров: группы амина, тиола, гидроксила, гидразида, оксима, гидразина, тиосемикарбазона, гидразинкарбоксилата и арилгидразида, способные вступать в реакцию для формирования ковалентных связей с электрофильными группами линкерных групп и линкерных реагентов.
В конкретных условиях сконструированные антитела с цистеиновыми заменами можно сделать реакционноспособными для конъюгации с линкерными реагентами посредством обработки восстанавливающим агентом, таким как DTT (реактив Клеланда, дитиотреитол) или TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорид; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Полноразмерные сконструированные моноклональные антитела с цистеиновыми заменами (ТиоMab), экспрессированные в клетках CHO, восстанавливали с помощью приблизительно 50-кратного избытка TCEP в течение 3 часов при 37°C для восстановления дисульфидных связей, которые могут формироваться между вновь введенными остатками цистеина и цистеином, присутствующим в культуральной среде. Восстановленное ТиоMab разводили и наносили на колонку HiTrap S в 10 мМ ацетате натрия, pH 5, и элюировали с помощью PBS, содержащего 0,3 М хлорид натрия. Дисульфидные связи вновь образовывались между остатками цистеина, присутствующими в исходном Mab, с помощью разведенного (200 нМ) водного сульфата меди (CuSO4) при комнатной температуре, в течение ночи. Можно использовать другие окислители, т.е. окисляющие агенты и окисляющие условия, известные в данной области. Окисление атмосферным воздухом также является эффективным. Эта стадия мягкого, частичного повторного окисления формирует внутрицепочечные дисульфиды эффективно с высокой точностью. Приблизительно 10-кратный избыток промежуточного соединения цирконий-линкер добавляют, перемешивают и оставляют приблизительно на один час при комнатной температуре для осуществления конъюгации и образования конъюгата ТиоMab антитело-цирконий. Смесь после конъюгации подвергают гель-фильтрации, наносят на колонку HiTrap S и проводят элюцию для удаления избытка промежуточного соединения цирконий-линкер и других примесей.
На фигуре 15 показан общий способ подготовки сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, экспрессированного из культуры клеток, для конъюгации. Цистеиновые аддукты, предположительно с различными межцепьевыми дисульфидными связями, подвергают восстановительному отщеплению для получения восстановленной формы антитела. Межцепочечные дисульфидные связи между спаренными остатками цистеина вновь формируют в условиях частичного окисления, таких как воздействие атмосферного кислорода. Вновь введенные сконструированные и неспаренные остатки цистеина остаются доступными для реакции с линкерными реагентами или промежуточными соединениями цирконий-линкер для образования конъюгатов антител по изобретению. С ТиоMab, экспрессированных в линиях клеток млекопитающих, получали внешний аддукт Cys, конъюгированный с конструированным Cys посредством формирования -S-S- связи. Таким образом, очищенные ТиоMab необходимо обрабатывать способами восстановления и окисления, как описано в примере 11, для получения реакционноспособных ТиоMab. Эти ТиоMab используют для конъюгации с содержащими малеимид радиоактивными метками, цитотоксическими лекарственными средствами, флуорофорами и другими метками.
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ КОНЪЮГАТОВ 89 Zr-Df-ТРАСТУЗУМАБА
Защищенный активный сложный эфир TFP-N-SucDf-Fe получали согласно описанному ранее способу (Verel I et al «89Zr Immuno-PET: Comprehensive Procedures For The Production Of 89Zr-Labeled Monoclonal Antibodies» (2003) J Nucl Med 44: 1271-81) и конъюгировали с трастузумабом с использованием 5-кратного молярного избытка TFP-N-SucDf-Fe для получения N-SucDf-трастузумаба в среднем с 1,6 молекулами десферриоксамина (Таблица 8). Df-Bz-SCN-трастузумаб получали объединением с 8-кратным молярным избытком Df-Bz-SCN при pH 8,5 (Perk LR, et al. «Facile radiolabeling of monoclonal antibodies and other proteins with zirconium-89 or gallium-68 for PET Imaging using p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine» (2008) Nature Protocols; published online:DOI: 10.1038/nprot.2008.22). Реакция приводит к Df-Bz-SCN-трастузумабу с присоединенными в среднем 2,4 молекулами десферриоксамина (Таблица 1).
Новый реакционноспособный по отношению к тиолу бифункциональный линкер на основе малеимида Df-Chx-Mal получали из эквимолярных количеств мезилата десферриоксамина и SMCC (фигура 21, пример 13). Реакция завершалась через 30 мин при комнатной температуре, и продукт выделяли преципитацией при добавлении воды с 45% выходом и более чем 95% чистотой. Реакцией 8,5-кратного молярного избытка Df-Chx-Mal со свежеприготовленым тио-трастузумабом (фигура 21, пример 17) получали конъюгат Df-Chx-Mal-тио-трастузумаб точно с 2 молекулами десферриоксамина за 1 час (таблица 1, фигура 21). Бромацетилдесферриоксамин (BDf-Bac) получали реакцией с эквимолярными количествами мезилата десферриоксамина и бромацетилбромида при 0°C (пример 14). Продукт получали с 14% выходом после очистки HPLC. Алкилированием свежеполученного тио-трастузумаба (фигура 21, пример 16) с помощью 12-кратного молярного избытка Df-Bac получали конъюгат (Df-Ac-тио-трастузумаб) с 1,8 молекулами Df на антитело через 5 часов (таблица 8, фигура 21, пример 18). Низкая реакционная способность бромида побудила авторов настоящего изобретения исследовать более реакционноспособное производное иодацетила (Df-Iac). Df-Iac получали с 53% выходом реакцией мезилата десферриоксамина с небольшим избытком иодацетата N-гидроксисукцинимидила (фигура 21, пример 15). Продукт получали более чем с 95% чистотой посредством преципитации из реакционной смеси. Последующей реакцией с 11-кратным избытком Df-Iac получали Df-Ac-тио-трастузумаб с 1,8 молекулами Df через 2 часа (таблица 1, фигура 21, пример 19). На основании опыта авторов настоящего изобретения, Df-Chx-Mal является предпочтительным реагентом из трех исследованных соединений. Следует отметить, что реакция Df-Chx-Mal завершалась при среднем pH в пределах 1 часа, в отличие от более высокого pH и более длительного времени реакции, необходимых для алкилирования тиоловых групп с помощью Df-Bac и Df-Iac. Кроме того, более низкая реакционная способность галогенацетамидов может вызывать неполную загрузку обеих доступных остатков цистеина тио-трастузумаба.
Figure 00000045
89Zr образовывал хелаты в форме оксалата 89-циркония со всеми четырьмя вариантами Df-трастузумаба с использованием ранее описанного экспериментального способа (Verel I et al «89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies» (2003) J Nucl Med. 44: 1271-81). Белки с радиоактивной меткой очищали на обессоливающей колонке, и конечный раствор концентрировали до необходимого объема мембранной фильтрацией. Выход, чистота и конечная сецифическая активность конъюгатов 89Zr обобщены в таблице 9. Как правило, выход хелатов превышал 80%, за исключением Df-N-Suc линкера, полученного с низким выходом, предположительно, из-за более низкого количества Df на молекулу антитела и/или неполного удаления Fe(III), используемого для защиты хелатирующего агента в ходе активации и конъюгации. После очистки вариантов Df-трастузумаба с использованием обессоливающей колонки, чистота продукта составляла более 90% с малым количеством (1-6%) высокомолекулярных агрегатов, детектированных в каждом образце. Df-Chx-Mal-тио-трастузумаб обеспечивал комплекс 89Zr с чистотой 99% (Таблица 9), в отличие от конъюгата Df-Ac, загрязненного приблизительно 8% низкомолекулярных загрязнений и 2% высокомолекулярных агрегатов. Загрязнения выдерживали удаление с использованием колонки NAP-10, но удаление являлось возможным с использованием повторяющейся смены буфера на фильтре Amicon.
Таблица 9
Выходы, специфическая активность и чистота меченного радиоактивной меткой 89Zr-Df-линкер-трастузумаба		  
Figure 00000046
  
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КОНЪЮГАТОВ 89 Zr-Df-ТРАСТУЗУМАБА
Биологическую активность вновь полученных сайт-специфических конъюгатов Df-линкер-тио-трастузумаб определяли с использованием анализа Скэтчарда, анализа связывания с линией клеток рака молочной железы BT474. Полученные значения KD сравнивали с немодифицированным трастузумабом (0,91±0,20 нМ). KD для конгъюгата тио-трастузумаба, содержащего Chx-Mal линкер, составляла 0,93±0,15 нМ, и значения для конъюгатов, содержащих Ac линкер, составляли 1,22±0,22 нМ для конъюгата, полученного с использованием Df-Bac, и 0,87±0,15 нМ для конъюгата, полученного с использованием Df-Iac. Результаты анализов биологической активности указывают на то, что модификация тио-трастузумаба не влияет на аффинность связывания антитела с HER2.
СТАБИЛЬНОСТЬ СЫВОРОТКИ IN VITRO
Ранее опубликованные конъюгаты Df-антитела с линкерами N-Suc и Bz-SCN, содержащие связи амида или тиомочевины, являлись стабильными in vitro в течение периода 6 суток в сыворотке при 37°C (Verel I et al «89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies» J Nucl Med 2003;44: 1271-81; Perk LR et al, (2009) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging 35(10): 1857-1867). Стабильность конъюгатов 89Zr-тио-трастузумаба с Chx-Mal и Ac линкерами определяли в сыворотке мыши при 37°C. Значительной потери связанного с антителом 89Zr не наблюдали в течение периода 5 суток. Оба тио-конъюгата являлись стабильными со средней потерей связанного с антителом 89Zr 1,8% в сутки для 89Zr-Df-Chx-Mal-тио-трастузумаба и 1,4% в сутки для 89Zr-Df-Ac-тио-трастузумаба (Фигура 24). Медленное формирование высокомолекулярных молекул, предположительно, агрегатов, наблюдали для обоих линкеров Df-Chx-Mal и Df-Ac.
ПОЛУЧЕНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ МИКРОПЭТ IN VIVO
Двадцати животным (5 животных на группу), несущим подкожные ксенотрансплантаты BT474M1 (размер ~200 мм3), инъецировали внутривенно 89Zr-трастузумаб. Количество антитела, инъецированного на животное, составляло 1,4±0,29 мг/кг. Изображения для проекции максимальной интенсивности для репрезентативных животных (через 96 ч p.i.) показаны на фиг.3. Поглощение 89Zr-трастузумаба избранными тканями обобщено на фиг.4. В изображениях через 1 час (не показаны) преобладало сильное поглощение в кровяных депо, за исключением Df-Bac, где быстрое выделение липофильных загрязнений из печени и желчных путей приводило к увеличенному поглощению в кишечнике. Загрязнения полностью выводились в течение первых 24 часов, и увеличенное поглощение в тонком и толстом кишечнике не детектировали через 24 часа или в более позднее время после инъекции метки. Хотя поглощение тканями конъюгата Df-Ac в результате являлось немного меньшим (~8%), на соотношения опухоли к крови (таблица 10) не влияла потеря инъецированной радиоактивности. В изображениях через 96 часов преобладало сильное поглощение в опухолях с небольшими различиями, обнаруженными среди четырех различных вариантов 89Zr-трастузумаба (фигура 25). Поглощение в опухоли было идентичным для каждой метки, достигая максимальных значений через 24 часа после инъекции и максимальных соотношений для опухоли и крови через 144 часа из-за выведения из крови (таблица 10). Для конъюгата на основе тиола 89Zr-Df-Chx-Mal-тио-трастузумаба показали увеличенное поглощение в костной ткани (P<0,05) по сравнению с конъюгатами на основе амина (Df-Bz-SCN и Df-N-Suc) через 96 и 144 часов p.i. Поглощение в костной ткани Df-Ac-тио-трастузумаба не было значимо повышенным (P=0,20) по сравнению с линкерами Df-Bz-SCN и Df-N-Suc, но может становиться значимым при коррекции на 8% потери радиоактивности в течение первых 24 часов. Поглощение в почках для каждой метки являлось низким (фигура 26), как ожидали для меток на основе антитела, но для 89Zr-Df-Chx-Mal-тио-трастузумаба было немного выше по сравнению с другими линкерами через 24, 96 и 144 часа (P<0,05).
Figure 00000047
Для ксенотрансплантов BT474 (3+ уровень экспрессии HER2) показали более низкое абсолютное поглощение метки (15 %ID/г), чем ранее измерено Dijkers et al для SKOV3 (3+ уровень экспрессии HER2) 33,4±7,7%ID/г (Dijkers EC, et al. «Development and Characterization of Clinical-Grade 89Zr-Trastuzumab for HER2/neu ImmunoPET Imaging» (2009) J Nucl Med 50(6):974-981). Однако, соотношение опухоли к крови 5,7-7,1 (таблица 10) является сравнимым со значением, полученным для SKOV3 (соотношение опухоли к крови 7,6). Различия в поглощении в опухоли можно отнести к модели опухоли и общей дозы трастузумаба. Использовали материал с более высокой специфической активностью, таким образом, инъецировали значительно меньше антитела (35 мкг, 1,4 мг/кг) по сравнению с исследованием Dijkers et al с SKOV3 (100 мкг, 4 мг/кг). Различия в специфической активности также можно отнести к более низкому поглощению в костях свободного 89Zr в эксперименте в настоящем документе 2-3 %ID/г по сравнению с моделью SKOV3 (5-10 %ID/г). К сожалению, Dijkers et al не приводят объяснений относительно повышенного поглощения в костной ткани. Известно, что цирконий связывается с белками плазмы (Mealey J, Jr. «Turn-over of carrier-free zirconium-89 in man» (1957) Nature 179:673-4 и позже депонируется в костных минералах (Fletcher CR. «The radiological hazards of zirconium-95 and niobium-95» (1969) Health Phys. 16:209-20; Shiraishi Y and Ichikawa R. «Absorption and retention of 144 Ce and 95 Zr-95 Nb in newborn, juvenile and adult rats» (1972) Health Phys. 22:373-8). Поскольку инъецированный материал не содержит свободного 89Zr, поглощение в костной ткани может происходить из-за разрушения 89Zr антитела или из-за 89Zr, неспецифически ассоциированного с антителом, который может затем образовывать транс-хелаты с белками плазмы в отличие от 89Zr, связанного с Df.
Три специфичных для тиола реагента приведены в настоящем документе в качестве примера для хемоселективной конъюгации десферриоксамина (Df) с моноклональными антителами через тиоловую группу цистеина сконструированного антитела с цистеиновыми заменами. Тиол-специфические Df-реагенты получали ацилированием аминогруппы десферриоксамина B с выходами 14% (Df-Bac), 53% (Df-Iac) и 45% (Df-Chx-Mal), и конъюгировали с тио-трастузумабом, получая сайт-специфическую модификацию обоих сконструированных остатков цистеина за 1-5 ч. Активность связывания сайт-специфических конъюгатов тио-трастузумаба с HER2 были идентичны активности немодифицированного трастузумаба. Для Df-модифицированного тио-трастузумаба (Df-Ac-тио-трастузумаб и Df-Chx-Mal-тио-трастузумаб) получали хелаты с 89Zr (фигура 22) с выходами, превышающими 80%, в течение 1 часа, что сравнимо с лизиновыми конъюгатами, полученными с использованием ранее описанных линкеров Df-Bz-SCN и Df-N-Suc. Как для 89Zr-Df-Ac-тио-трастузумаба, так и для 89Zr-Df-Chx-Mal-тио-трастузумаба показали сравнимую стабильность в сыворотке мыши. Для обоих соединений показали также возможность получения изображений ПЭТ на модели рака молочной железы BT474M1, что сравнимо с лизиновыми конъюгатами, достигающими поглощения в опухоли 10-15% ID/г с соотношением опухоли к крови в диапазоне 6,1-7,1. В целом, новые реагенты являются легко доступными, обладая хорошей реакционной способностью по отношению к тиоловым группам белка, и обладают очень хорошими хелатирующими свойствами по отношению к 89Zr. 89Zr-меченные антитела являлись стабильными в сыворотке и обладали отличными свойствами получения изображений ПЭТ. Df-Chx-Mal является пригодным реагентом для конъюгации Df с антителами через боковую цепь цистеина и обладает несколькими преимуществами по сравнению с Df-Bac и Df-Iac. Во-первых, умеренный pH 7,5 необходим для полной конъюгации Df-Chx-Mal в течение 1 часа по сравнению с pH 9 и 2 или 5 часами, необходимыми для Df-Bac и Df-Iac. Кроме того, сайт-специфически меченные 89Zr конъюгаты сконструированного ТИОMAB можно использовать сходным образом с 18F меченными конъюгатами ТИОFAB (Gill HS, et al. «A modular platform for the rapid site-specific radiolabeling of proteins with 18F exemplified by quantitative positron emission tomography of human epidermal growth factor receptor 2» (2009) Jour, of Med. Chem. 52:5816-25) в качестве полезных инструментов для применений получения изображений ПЭТ в биомедицинских исследованиях.
ВВЕДЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛО-ЦИРКОНИЙ
Конъюгаты антитело-цирконий (AZC) по изобретению можно вводить любым способом, подходящим для состояния, подлежащего лечению. AZC, как правило, вводят парентерально, т.е. инфузией, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, интратекально и эпидурально.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ
Фармацевтические составы диагностических конъюгатов антитело-цирконий (AZC) по изобретению, как правило, получают для парентерального введения, т.е. болюсной, внутривенной, внутриопухолевой инъекции вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем и в пригодной для инъекции единичной лекарственной форме. Конъюгат антитело-цирконий (AZC), обладающий желательной степенью чистоты, необязательно смешивают с фармацевтически приемлемыми разбавителями, носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.), в форме лиофилизированного состава или водного раствора.
Приемлемые разбавители, носители, наполнители и стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях не токсичны для реципиентов и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и относящиеся к другим органическим кислотам; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметэтония; хлорид бензалкония, хлорид бензэтония; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металла (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН™, ПЛЮРОНИК™ или полиэтиленгликоль (PEG). Например, лиофилизированные составы анти-ErbB2 антитела описаны в WO 97/04801, содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.
Активные фармацевтические ингредиенты можно заключать также в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или межповерхностной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают содержащие AZC полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, где матрицы находятся в виде изделий с заданной формой, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поливиниловый спирт)), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразлагаемый ацетат этиленвинила, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (пригодные для инъекции микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата леупролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
Подлежащие использованию для введения in vivo составы должны быть стерильными, что легко осуществить фильтрацией через стерильные мембраны для фильтрации.
Составы включают составы, пригодные для вышеуказанных способов введения. Составы можно для удобства предоставлять в единичной дозированной форме, и их можно получать любыми способами, хорошо известными в данной области фармацевтики. Способы и составы в основном можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Такие способы включают стадию объединения активного ингредиента с носителем, представляющим собой один или несколько вспомогательных ингредиентов. Как правило, составы получают посредством однородного и тесного объединения активного ингредиента с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или и с теми, и с другими, и затем, при необходимости, формования продукта.
Водные суспензии по изобретению содержат активные вещества в смеси с наполнителями, пригодными для изготовления водных суспензий. Такие наполнители включают суспендирующее вещество, такое как карбоксиметилцеллюлоза натрия, кроскармеллоза, повидон, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и гуммиарабик, и диспергирующие или увлажняющие средства, такие как природный фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, полиоксиэтиленстеарат), продукт конденсации этиленоксида с алифатическим спиртом с длинными цепями (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукт конденсации этиленоксида с неполным сложным эфиром, полученным из жирной кислоты и ангидрид гексита (например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана). Водная суспензия может содержать также один или несколько консервантов, таких как этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, одно или несколько окрашивающих средств, одно или несколько придающих вкус средств и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Фармацевтические композиции AZC могут присутствовать в форме стерильного пригодного для инъекции препарата, такого как стерильная пригодная для инъекции водная или масляная суспензия. Эту суспензию можно составлять, как известно в данной области, с использованием тех пригодных диспергирующих или увлажняющих средств и суспендирующих средств, которые упомянуты выше. Стерильный пригодный для инъекции препарат может представлять собой также стерильные пригодные для инъекции раствор или суспензию в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле, или может представлять собой лиофилизированный порошок. Среди пригодных носителей и растворителей, которые можно использовать, присутствуют вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные жирные масла являются общепринятыми в качестве растворителя или суспендирующего вещества. Для этой цели можно применять любое легкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, можно подобным образом использовать для получения пригодных для инъекции препаратов.
Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы, меняется в зависимости от обрабатываемого хозяина и конкретного способа введения. Например, водный раствор, предназначенный для внутривенной инфузии, может содержать приблизительно от 3 до 500 мкг активного ингредиента на миллилитр раствора, чтобы могла происходить инфузия подходящего объема со скоростью приблизительно 30 мл/ч.
Составы, пригодные для парентерального введения, содержат водные и неводные стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать анти-окислители, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, делающие состав изотоническим с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства и загустители.
Хотя пероральное введение белковых лекарственных средств нежелательно из-за гидролиза или денатурации в пищеварительном тракте, составы AZC, пригодные для перорального введения, можно получать в форме единичных лекарственных форм, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит предопределенное количество AZC.
Составы можно упаковывать в контейнеры для единичных доз или множественных доз, например, герметично закрытые ампулы и флаконы, и можно хранить в высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды, для инъекции, непосредственно перед использованием. Приготовленные для немедленного использования растворы и суспензии для инъекций получают из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного ранее вида. Предпочтительными единичными дозированными составами являются составы, содержащие ежесуточную дозу активного ингредиента или единичную часть ежесуточной дозы, как перечислено в настоящем документе выше, или ее подходящую часть.
Изобретение, кроме того, относится к ветеринарным композициям, содержащим по меньшей мере один активный ингредиент, как определено выше, вместе с ветеринарным носителем, соответственно. Ветеринарные носители представляют собой материалы, пригодные для цели введения композиции, и могут представлять собой твердые, жидкие или газообразные материалы, которые в ином случае являются инертными или приемлемыми в области ветеринарии и являются совместимыми с активным ингредиентом. Эти ветеринарные композиции можно вводить парентерально, перорально или любым другим желательным способом.
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЙ МЕЧЕНОГО АНТИТЕЛА
В другом варианте осуществления изобретения сконструированные антитела с цистеиновыми заменами могут являться меченными через тиол цистеина радиоактивными изотопами, флуоресцентными красителями, превращаемыми под действием биолюминесценции субстратными группами, превращаемыми под действием хемилюминесценции субстратными группами, ферментами и другими детектируемыми метками для экспериментов по получению изображений для диагностических, фармакодинамических и терапевтических применений. Как правило, меченое сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, т.е. «биомаркер» или «зонд», вводят посредством инъекции, перфузии или перорального приема внутрь в живой организм, например, человеку, грызуну или другому мелкому животному, в перфузируемый орган или образец ткани. Распределение зонда детектируют с течением времени и представляют в виде изображения.
ПРИМЕРЫ
Препараты растворителей и химикатов закупали в Aldrich (Milwaukee, WI), если не указано иначе. Следующие системы для обращеннофазовой HPLC использовали для анализа и очистки продуктов. Система A: Phenomenex BioSep-SEC-S 3000 (300×4,60 мм, 5 мкм) 50 мМ PBS 0,5 мл/мин, оборудованная детектором УФ-поглощения и радиоактивности (PMT); Система B Altima C-18 (100×22,0 мм, 5 мкм) 0,05% TFA+10-50% ацетонитрил, 0-30 мин, 24 мл/мин, оборудованная УФ-детектором. Масс-спектрометрический анализ низкомолекулярных продуктов проводили в системе PE Sciex API 150EX LCMS, оборудованной колонкой Onyx Monolithic C18. LCMS анализ белков проводили на тройном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Quantum с расширенным диапазоном массовых чисел (Thermo Electron, Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Образцы белка для анализа LCMS восстанавливали обработкой 20 мМ дитиотреитолом (DTT) при 37°C в течение 1 часа для разделения тяжелых и легких цепей. Образцы подвергали хроматографии на микроколонке PRLP-S 1000 A (50×2,1 мм, Polymer Laboratories, Varian Inc., USA), нагретой до 75°C. Использовали линейный градиент от 30-40% B (растворитель A, 0,05% TFA в воде; растворитель B, 0,04% TFA в ацетонитриле), и элюат напрямую ионизировали с использованием источника электрораспыления. Данные собирали в системе данных Xcalibur и деконволюцию проводили с использованием программного обеспечения ProMass (Novatia, Monmouth Junction, NJ). Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker Avance II 400 при 298K, и регистрировали химические сдвиги относительно TMS. Концентрации белка измеряли при 280 нм с использованием Eppendorf BioPhotometer (Westbury, NY). 89Zr получали из Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (New York, NY) в форме оксалата 89Zr(IV) в 1M растворе щавелевой кислоты с удельной активностью 470-1195 Ки/ммоль (Holland JP, et al (2009) «Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89» Nucl Med Biol. 36:729-39). Гетеробифункциональный линкер сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) закупали в Pierce (Rockford, IL) и иодацетат N-гидроксисукцинимидила получали из Indofine Chemical Company (Hillsborough, NJ). Колонки NAP-10 получали от GE Healthcare, USA и фильтры для ультрацентрифугирования Amicon Ultra-4 (10000 MWCO) от Millipore (Billerica, MA). Df-Bz-SCN закупали в Macrocyclics (Dallas, TX).
Пример 1 Получение биотинилированного ТиоFab-фага
Проводили реакцию ТиоFab-фага (5×1012 фаговых частиц) с 150-кратным избытком биотин-PEO-малеимида ((+)-биотинил-3-малеимидопропионамидил-3,6-диоксаоктандиамин, Oda et al (2001) Nature Biotechnology 19:379-382, Pierce Biotechnology, Inc.) в течение 3 часов при комнатной температуре. Избыток биотин-PEO-малеимида удаляли из биотин-конъюгированного фага повторяющимися преципитациями PEG (3-4 раза). Можно использовать другие коммерчески доступные реагенты для биотинилирования с электрофильными группами, реакционноспособными по отношению к тиоловым группам цистеина, включая биотин-BMCC, PEO-иодацетил-биотин, иодацетил-LC-биотин и биотин-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.), и N α-(3-малеимидилпропионил)биоцитин (MPB, Molecular Probes, Eugene, OR). Другие коммерческие источники биотинилированных, бифункциональных и мультифункциональных линкерных реагентов включают Molecular Probes, Eugene, OR, и Sigma, St. Louis, MO.
Figure 00000048
Пример 2 Анализ PHESELECTOR
Бычьим сывороточным альбумином (BSA), внеклеточным доменом erbB2 (HER2) и стрептавидином (100 мкл при 2 мкг/мл) по отдельности покрывали 96-луночные планшеты Maxisorp. После блокирования с помощью 0,5% Твин-20 (в PBS), биотинилированный и небиотинилированный hu4D5Fabv8-ТиоFab-фаг (2×1010 фаговых частиц) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией с меченным пероксидазой хрена (HRP) вторичным антителом (антитело против белка оболочки фага M13, белка pVIII). Фигура 8 иллюстрирует анализ PHESELECTOR посредством схематического представления, изображающего связывание Fab или ТиоFab с HER2 (вверху) и биотинилированного ТиоFab со стрептавидином (внизу).
Проводили стандартную реакцию с HRP и измеряли оптическую плотность при 450 нм. Реакционную способность тиола измеряли, рассчитывая соотношение OD450 для стрептавидина/OD450 для HER2. Значение реакционной способности тиола 1 указывает на полное биотинилирование тиола цистеина. В случае измерений связывания белка Fab, использовали hu4D5Fabv8 (2-20 нг) с последующей инкубацией с меченными HRP поликлональными анти-Fab антителами козы.
Пример 3a Экспрессия и очистка ТиоFab
ТиоFab экспрессировали при индукции в 34B8, несупрессорном штамме E. coli (Baca et al (1997) Journal Biological Chemistry 272(16): 10678-84). Собранный осадок клеток ресуспендировали в PBS (фосфатно-солевом буфере), общий лизис клеток проводили пропусканием через микрофлюидайзер, и ТиоFab очищали аффинной хроматографией на SEPHAROSE™ с белком G (Amersham).
ТиоFab L-V15C, L-V110C, H-A88C и H-A121C экспрессировали и очищали хроматографией на колонке с SEPHAROSE™ с белком G. Олигомерный-Fab присутствовал в фракциях 26-30, и большая часть мономерной формы находилась в фракциях 31-34. Фракции, состоящие из мономерной формы, объединяли и анализировали посредством SDS-PAGE вместе с hu4D5Fabv8 дикого типа, и анализировали в геле для SDS-PAGE в восстанавливающих (с DTT или BME) и невосстанавливающих (без DTT или BME) условиях. Фракции после гель-фильтрации A121C-ТиоFab анализировали невосстанавливающим SDS-PAGE.
ТиоFab конъюгировали с биотин-PEO-малеимидом, как описано выше, и биотинилированные-ТиоFab дополнительно очищали гель-фильтрационной хроматографией на Superdex-200™ (Amersham), отсекающей свободный биотин-PEO-малеимид и олигомерную фракцию ТиоFab. Каждый из hu4D5Fabv8 дикого типа и hu4D5Fabv8 A121C-ТиоFab (в количестве 0,5 мг) по отдельности инкубировали со 100-кратным молярным избытком биотин-PEO-малеимида в течение 3 часов при комнатной температуре и наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex-200 для отделения свободного биотина, так же как олигомерных Fab, от мономерной формы.
Пример 3b Анализ ТиоFab
Фрагменты после ферментативного расщепления биотинилированного hu4D5Fabv8 (A121C) ТиоFab и hu4D5Fabv8 дикого типа анализировали масс-спектрометрическим анализом жидкостной хроматографией с ионизацией электрораспылением (LS-ESI-MS). Различие между исходной массой 48294,5 биотинилированного hu4D5Fabv8 (A121C) и исходной массой 47737,0 hu4D5Fabv8 дикого типа составляло 557,5 единиц массы. Этот фрагмент указывает на присутствие одной биотин-PEO-малеимидной группы (C23H36N5O7S2). В таблице 4 показано распределение значений фрагментации, подтверждающее последовательность.
Таблица 4
LC-ESI-Масс-спектрометрический анализ биотинилированного hu4D5Fabv8 ТиоFab A121C после расщепления трипсином
Аминокислота Фрагмент b Фрагмент y
A (Аланин) 72  
M (Метионин) 203 2505
D (Аспарагиновая кислота) 318 2374
Y (Тирозин) 481 2259
W (Триптофан) 667 2096
G (Глицин) 724 1910
Q (Глутамин) 852 1853
G (Глицин) 909 1725
T (Треонин) 1010 1668
L (Лейцин) 1123 1567
V (Валин) 1222 1454
T (Треонин) 1323 1355
V (Валин) 1422 1254
S (Серин) 1509 1155
S (Серин) 1596 1068
С (Цистеин)+биотин 2242 981
S (Серин) 2329 335
T (Треонин) 2430 248
К (Лизин)   175
До и после гель-фильтрации на Superdex-200 проводили анализы SDS-PAGE в гелях, с восстановлением и без восстановления посредством DTT или BME, биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8-A121C, биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8-V110C, биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8-(V110C-A88C) с двойным Cys и биотинилированного ABP-hu4D5Fabv8-(V110C-A121C) с двойным Cys.
Масс-спектрометрический анализ (MS/MS) hu4D5Fabv8-(V110C)-BMPEO-DM1 (после очистки гель-фильтрацией на Superdex-200): Fab+1 51607,5, Fab 50515,5. Эти данные показывают 91,2% конъюгацию. Анализ MS/MS hu4D5Fabv8-(V110C)-BMPEO-DM1 (восстановленного): LC 23447,2, LC+1 24537,3, HC (Fab) 27072,5. Эти данные показывают, что вся конъюгация DM1 произошла на легкой цепи Fab.
Пример 11 Восстановление/окисление ТиоMab для конъюгации
Полноразмерные сконструированные моноклональные антитела с цистеиновыми заменами (ТиоMab), экспрессированные в клетках CHO, восстанавливали с помощью приблизительно 50-кратного избытка TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) в течение 3 часов при 37°C. Восстановленный ТиоMab (Фигура 15) разводили и наносили на колонку HiTrap S в 10 мМ ацетате натрия, pH 5, и элюировали с помощью PBS, содержащего 0,3 M хлорид натрия. Элюированный восстановленный ТиоMab обрабатывали 200 нМ водным сульфатом меди (CuSO4) при комнатной температуре, в течение ночи. Окисление окружающим воздухом также являлось эффективным.
Пример 13 N-[4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксил]десферриоксамин (Df-Chx-Mal)
Figure 00000049
4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (SMCC, 40 мг, 0,12 ммоль), мезилат десферриоксамина (78 мг, 0,12 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (22 мкл, 0,13 ммоль) растворяли в смеси DMF (2,0 мл) и 0,2 мл воды (фигура 21). Полученный мутный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли воду (8 мл), и преципитированный продукт выделяли посредством фильтрации, промывали водой и высушивали под пониженным давлением с получением 42 мг (45%) N-[4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксил]десферриоксамина (Df-Chx-Mal) в виде белого твердого вещества (фигура 20, внизу).
1H ЯМР (400 МГц, d6-DMSO) δ 0,87-0,90 (м, 2H), 1,20-1,26 (м, 8Н), 1,35-1,41 (м, 6Н), 1,45-1,55 (м, 8H), 1,60-1,70 (м, 4H), 1,97 (с, 3H, ацетил), 2,26-2,29 (м, 4H), 2,56-2,60 (м, 4H), 2,95-3,05 (м, 6H), 3,24 (д, J=7,0 Гц, 2H), 3,44-3,48 (м, 6H), 7,00 (с, 2H, малеимид), 7,62 (т, J=5,4 Гц, 1H, амид), 7,75 (м, 2H, амид), 9,59 (с, 2H, гидроксил), 9,64 (с, 1H, гидроксил). MS ESI (m/z): [M+H]+ рассчитано для C37H62N7O11 780,44; обнаружено 780.6.
Пример 14 N-бромацетилдесферриоксамин (Df-Bac)
Figure 00000050
Раствор бромацетилбромида (27 мкл, 0,30 ммоль) в DMF (1 мл) добавляли по каплям за 5 минут в охлажденную (0°C) смесь мезилата десферриоксамина (200 мг, 0,30 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (106 мкл, 0,60 ммоль) в DMF (5 мл), после чего реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 4 часов (фигура 21). Добавляли воду (10 мл), и продукт выделяли с использованием HPLC (Система B, время удержания 7,5 мин) с получением 29 мг (14%) N-бромацетилдесферриоксамина (Df-Bac) в виде белого твердого вещества (фигура 20, внизу).
1H ЯМР (400 МГц, d6-DMSO) δ 1,18-1,26 (м, 6H), 1,35-1,42 (м, 6H), 1,45-1,55 (м, 6H), 1,97 (с, 3Н, ацетил), 2,24-2,30 (м, 4H), 2,54-2,59 (м, 4Н), 2,96-3,07 (м, 6Н), 3,44-3,47 (м, 6Н), 3,82 (c, 2Н, бромацетил), 7,74 (м, 2H, амид), 8,21 (т, 1H, амид), 9,59 (с, 2H, гидроксил), 9,63 (с, 1H, гидроксил). MS ESI (m/z): [M+H]+ рассчитано для C27H50BrN6O9 681,27, 683,27; обнаружено 681,1, 683,0.
Пример 15 N-иодацетилдесферриоксамин (Df-Iac)
Figure 00000051
Мезилат десферриоксамина (200 мг, 0,30 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (53 мкл, 0,30 ммоль) смешивали в DMF (4 мл) и воде (0,4 мл). Добавляли иодацетат N-гидроксисукцинимидила (93 мг, 0,33 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа (фигура 21). Добавляли воду (8 мл) и преципитированный продукт отделяли, промывали водой и высушивали под пониженным давлением с получением 115 мг (53%) N-иодацетилдесферриоксамина (Df-Iac) в виде белого твердого вещества (фигура 20, внизу).
1H ЯМР (400 МГц, d6-DMSO) δ 1,20-1,25 (м, 6H), 1,35-1,42 (м, 6H), 1,47-1,54 (м, 6H), 1,97 (с, 3H, ацетил), 2,25-2,29 (м, 4H), 2,56-2,59 (м, 4Н), 2,98-3,03 (м, 6Н), 3,45 (м, 6Н), 3,61 (с, 2Н, иодацетил), 7,75 (м, 2H, амид), 8,17 (т, 1H, амид), 9,57 (с, 2H, гидроксил), 9,61 (с, 1H, гидроксил). MS ESI (m/z): [M+H]+ рассчитано для C27H50IN6O9 729,26; обнаружено 729,1.
Пример 16 Тио-трастузумаб
Конструирование, экспрессия и очистка ТИОMAB с заменой Cys вместо Ala114 (нумерация Kabat) в тяжелой цепи описаны ранее (Junutula JR, et al «Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index» (2008) Nat Biotechnol 26:925-32). Выделенный тио-трастузумаб подготавливали для конъюгации способом восстановления и повторного окисления для удаления дисульфидных аддуктов, связанных с Cys114. Сначала белок восстанавливали в течение 24 часов обработкой 40-кратным молярным избытком DTT и 2 мМ ЭДТА в 88 мМ Трис-буфере pH 7,5. Для удаления DTT перед повторным окислением, pH раствора тио-трастузумаба доводили до 5 добавлением 10 мМ буфера сукцината натрия. Затем раствор наносили на ионообменную колонку (HiTrap SP FF, GE Healthcare), которую стерилизовали и уравновешивали с помощью 10 мМ буфера сукцината натрия pH 5. Колонку промывали 10 мМ буфером сукцинатом натрия (10 мл), и затем тио-трастузумаб элюировали 3 мл буфера 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl с pH 7,5. Повторное окисление тио-трастузумаба осуществляли обработкой 25-кратным молярным избытком дегидроаскорбиновой кислоты (100 мМ в N,N-диметилацетамиде (DMA)) в буфере 75 мМ Трис, 150 мМ NaCl pH 7,5 при 25°C в течение 3,5 часов. После повторного окисления тио-трастузумаб конъюгировали с десферриоксамином без дополнительной очистки. MS ESI (m/z): обнаружено для легкой цепи 23440,0, для тяжелой цепи 50627,3.
Пример 17 Df-Chx-Mal-тио-трастузумаб
Figure 00000052
2 мМ исходный раствор бифункционального хелатирующего средства получали растворением Df-Chx-Mal (1,5 мг, 2 мкмоль) в 1:1 смеси (1 мл) DMF и DMA посредством нагревания при 44°C в течение 30 мин, затем исходный раствор разделяли на аликвоты и хранили при -80°C (фигура 21). Затем аликвоту исходного раствора (220 мкл, 0,440 мкмоль) добавляли к раствору тио-трастузумаба (7,5 мг, 52 нмоль) в буфере 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl pH 7,5 (1,5 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем раствор подвергали замене буфера на фильтре Amicon Ultra-4 на буфер 0,25 M ацетат натрия с получением 1 мл раствора конъюгата Df-Chx-Mal-тио-трастузумаба в концентрации 6 мг/мл. MS ESI (m/z): обнаружено для легкой цепи 23440,2, для тяжелой цепи 51407,3 (фигура 23, D).
Пример 18 Df-Ac-тио-трастузумаб с использованием Df-Bac
Figure 00000053
12 мМ исходный раствор бифункционального хелатирующего средства получали растворением Df-Bac (8 мг, 12 мкмоль) в 1 мл DMA (фигура 21). Затем исходный раствор разделяли на аликвоты и хранили при -80°C. Повторно окисленный тио-трастузумаб подвергали замене буфера на фильтре Amicon Ultra-4 на буфер 0,05 M борат натрия pH 9. Аликвоту исходного раствора Df-Bac (35 мкл, 0,410 мкмоль) добавляли к раствору тио-трастузумаба (4,9 мг, 34 нмоль) в буфере 0,05 M борате натрия pH 9 (1 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 часов. Реакционную смесь наносили на колонку NAP-10, и Df-Ac-тио-трастузумаб элюировали с помощью 1,5 мл буфера 0,25 M ацетата натрия с получением продукта в концентрации 3,2 мг/мл. MS ESI (m/z): обнаружено для легкой цепи 23440,1, для тяжелой цепи 51228,1 (фигура 23, B).
Пример 19 Df-Ac-тио-трастузумаб с использованием Df-Iac
Figure 00000054
11 мМ исходный раствор бифункционального хелатирующего средства получали растворением Df-Iac (8 мг, 11 мкмоль) в DMSO (1 мл), затем исходный раствор разделяли на аликвоты и хранили при -80°C (фигура 21). pH раствора тио-трастузумаба (3,2 мл) доводили до 9 добавлением 0,5 мл 0,1 M карбоната натрия. Затем аликвоту исходного раствора (110 мкл, 1,20 мкмоль) добавляли к раствору тио-трастузумаба (16 мг, 110 нмоль) в буфере 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,0125 M карбонат натрия с pH 9 (4 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем раствор подвергали замене буфера на фильтре Amicon Ultra-4 на буфер 0,25 M ацетат натрия буфер с получением 1 мл раствора конъюгата Df-Ac-тио-трастузумаба в концентрации 8 мг/мл. MS ESI (m/z): обнаружено для легкой цепи 23440,1, для тяжелой цепи 51228,3 (фигура 23, C).
Пример 20 Общий способ получения хелатов 89Zr
Раствор оксалата 89Zr(IV) (2-4 мКи, 100 мкл) в 1 M щавелевой кислоте смешивали с 2 M раствором Na2CО3 (45 мкл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин, после чего добавляли буфер 0,5 M HEPES (0,15 мл) (фигура 22). Конъюгат Df-тио-трастузумаба (1 мг, 7 нмоль) разводили 0,25 M ацетатом натрия/0,5% гентизиновой кислотой до конечного объема 0,356 мл и добавляли к раствору 89Zr. Наконец, добавляли вторую часть буфера HEPES (0,350 мл), получая общий объем 1 мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Для удаления свободного 89Zr белок с радиоактивной меткой очищали с использованием обессоливающей колонки NAP-10. Колонку NAP-10 уравновешивали с помощью 20 мл 0,25 M ацетата натрия/0,5% гентизиновой кислоты. Реакционную смесь наносили на колонку NAP-10, и 89Zr-Df-тио-трастузумаб элюировали с помощью 1,5 мл буфера 0,25 M ацетата натрия/0,5% гентизиновой кислоты (1,5 мл). При необходимости 89Zr-Df-тио-трастузумаб концентрировали с использованием фильтра Amicon Ultra-4 до желательного объема. Продукт анализировали посредством SEC HPLC (Система A).
Пример 21 Стабильность в сыворотке in vitro
Раствор конъюгата 89Zr-Df-тио-трастузумаба 0,5-1,5 мКи (1 мг) в буфере 0,25 M ацетате натрия/0,5% гентизиновой кислоте (0,1 мл) добавляли к свежей сыворотке мыши (0,9 мл) и инкубировали при 37°C в течение 0-96 часов. Образцы (20 мкл) раствора сыворотки анализировали с использованием SEC HPLC (Система A), результаты показаны на фигуре 24.
Пример 22 Модели на животных
Бежевых голых мышей XID в возрасте 6-8 недель получали из Harlan Sprague Dawley (Livermore, CA). За трое суток до инокуляции клеток, мышам имплантировали (s.c, левый бок) 0,36 мг частиц 17β-эстрадиола с замедленным высвобождением в течение 60-суток (Innovative Research of America) для поддержания уровня эстрогена в сыворотке. Мышам инокулировали в жировую прослойку молочной железы 5×106 клеток BT474M1 в 50% матригеле без содержания фенола красного. BT474M1 представляет собой субклон линии клеток опухоли молочной железы человека BT474, полученный из California Pacific Medical Center. При содержании животных и манипуляциях с ними следовали протоколам, одобренным Genentech's Institutioned Animal Care and Use Committee, аккредитованным Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
Пример 23 Получение изображений микроПЭТ
Мышей подвергали анестезии приблизительно 3% севофлураном до получения эффекта и инъецировали мышам i.v. через хвостовую вену приблизительно 0,1 мКи меченного радиоактивным 89Zr трастузумаба в изотоническом растворе (100-130 мкл) и возвращали их в клетку для восстановления. Получение изображений ПЭТ (фигура 25) проводили на сканере Inveon PET/CT через 1, 24, 96 и 144 часа после инъекции метки следующим образом. Животных после подвергания анестезии севофлураном располагали в положении лежа, головой вперед на площадке сканера и проводили статическое сканирование 15 или 30 мин. Температуру тела измеряли ректальным зондом и поддерживали с помощью теплого воздуха. Реконструкцию повторяющихся изображений целого организма получали с использованием алгоритма максимальной апостериорной вероятности (MAP, гиперпараметр бета (β) 0,05) и корректировали на затухание сигнала с использованием плотности тканей, полученной при КТ. Проекции получали с помощью программного обеспечения ASIPro (Siemens Preclinical Solutions) и использовали для получения количественных уровней активности в каждом интересующем органе с использованием анализа интересующих областей.
Статистический анализ: Графики на фигуре 26 получали с помощью программного обеспечения R версии 2.4.1 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Статистическую значимость определяли с использованием двустороннего критерия Стьюдента или ANOVA, и значения P менее 0,05 считали значимыми; данные представлены как среднее ± s.d., если не указано иначе.
Объем настоящего изобретения не является ограниченным конкретными вариантами осуществления, описанными в примерах, которые предназначены в качестве иллюстраций некоторых аспектов изобретения, и любые варианты осуществления, являющиеся функционально эквивалентными, входят в объем этого изобретения. Действительно, различные модификации по изобретению в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе очевидны специалистам в данной области и предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.
Содержание всех патентов, патентных заявок и ссылок, процитированных на протяжении описания, конкретно приведено в качестве ссылки.

Claims (15)

1. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, содержащее сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и комплексом циркония (Z), обладающее формулой I:
Figure 00000055

где p представляет собой 1-4;
где (L-Z) выбран из
Figure 00000056
,
где волнистая линия обозначает присоединение к антителу; и где цирконий образует комплекс с десферриоксаминовой группой; и
где сконструированное антитело содержит последовательность в тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 15:
Figure 00000057

Figure 00000058

где цистеин в SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 15 представляет собой свободную аминокислоту цистеин, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами в легкой цепи содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 45 и 46:
Figure 00000059

где цистеин в SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 45 и 46 представляет собой свободную аминокислоту цистеин.
2. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п. 1, где p равно 2.
3. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п. 1, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами получают способом, включающим:
(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированное антитело с цистеиновыми заменами;
(ii) экспрессию сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; и
(iii) выделение и очистку сконструированного антитела с цистеиновыми заменами.
4. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п. 1, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами выбрано из моноклонального антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела и Fab-фрагмента.
5. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п. 1, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами представляет собой А121С тио-трастузумаб.
6. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п. 1, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами получают способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела на одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, где исходное антитело избирательно связывается с антигеном и сконструированное антитело с цистеиновыми заменами избирательно связывается с тем же антигеном, что и исходное антитело.
7. Меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п. 1, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами или исходное антитело связывается с одним или несколькими из рецепторов (1)-(51):
(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенного белка типа IB);
(2) Е16 (LAT1, SLC7A5);
(3) STEAP1 (эпителиальный антиген простаты, содержащий шесть трансмембранных доменов);
(4) 0772Р (СА125, MUC16);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, фактор активации мегакариоцитов, мезотелин);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, семейство переносчиков растворенных веществ 34 (фосфат натрия), член 2, натрий-зависимый переносчик фосфата 3b, типа II);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, Семафорин 5b Hlog, домен sema, семь повторов тромбоспондина (типа 1 и подобный типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5В);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, кДНК RIKEN 2700050С12, кДНК RIKEN гена 2700050С12);
(9) ETBR (рецептор эндотелина типа В);
(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ассоциированный с раком предстательной железы ген 1, ассоциированный с раком предстательной железы белок 1, эпителиальный антиген простаты 2, содержащий шесть трансмембранных доменов, белок простаты, содержащий шесть трансмембранных доменов);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, катионный канал транзиторного рецепторного потенциала, подсемейство М, член 4);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, полученный из тератокарциномы фактор роста);
(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (рецептор C3d/вируса Эпштейна-Барр) или Hs. 73792);
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (иммуноглобулин-ассоциированная молекула бета), В29);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (содержащий SH2 домен фосфатазный якорный белок 1a), SPAP1B, SPAP1C);
(17) HER2;
(18) NCA;
(19) MDP;
(20) IL20Rα;
(21) Бревикан;
(22) EphB2R;
(23) ASLG659;
(24) PSCA;
(25) GEDA;
(26) BAFF-R (рецептор фактора активации В-клеток, BLyS рецептор 3, BR3;
(27) CD22 (изоформа B-клеточного рецептора CD22-B);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, иммуноглобулин-ассоциированная молекула альфа, специфический для В-клеток белок, ковалентно взаимодействующий с Ig бета (CD79B) и формирующий комплекс на поверхности с молекулами IgM, передает сигнал, вовлеченный в дифференцировку В-клеток);
(29) CXCR5 (рецептор лимфомы Беркитта 1, связанный с G белком рецептор, активируемый хемокином CXCL13, функционирует в миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет роль в инфекции HIV-2 и, возможно, развитии СПИД, лимфомы, миеломы и лейкоза);
(30) HLA-DOB (бета-субъединица молекулы МНС класса II (1а антиген), связывающая пептиды и представляющая их CD4+ Т-лимфоцитам);
(31) Р2Х5 (управляемый лигандом пуринергического рецептора Р2Х ионный канал 5, ионный канал, управляемый внеклеточным АТР, может быть вовлечен в передачу возбуждения по синапсам и нейрогенез, недостаточность может вносить вклад в патофизиологию идиопатической нестабильности детрузора);
(32) CD72 (антиген дифференцировки В-клеток CD72, Lyb-2);
(33) LY64 (лимфоцитарный антиген 64 (RP105), мембранный белок типа I семейства богатых лейцином повторов (LRR), регулирует активацию и апоптоз В-клеток, потеря функции ассоциирована с увеличенной активностью заболевания у пациентов с системной красной волчанкой);
(34) FcRH1 (подобный Fc-рецептору белок 1, предположительный рецептор для Fc-домена иммуноглобулинов, содержащий Ig-подобный домен типа С2 и домен ITAM, может играть роль в дифференцировке В-лимфоцитов);
(35) IRTA2 (ассоциированный с транслокацией рецептор 2 суперсемейства иммуноглобулинов, предположительный иммунорецептор с возможной ролью в развитии В-клеток и лимфомагенезе; нарушение регуляции гена посредством транслокации происходит при некоторых злокачественных новообразованиях В-клеток);
(36) TENB2 (предположительный трансмембранный протеогликан, родственный семейству факторов роста EGF/херегулина и фоллистатину);
(37) PMEL17 (гомолог silver; SILV; D12S53E; PMEL17; (SI); (SIL); МЕ20; gp100);
(38) TMEFF1 (трансмембранный белок с EGF-подобным доменом и двумя фоллистатин-подобными доменами 1; Томорегулин-1; Н7365; C9orf2; C90RF2; U19878; Х83961;
(39) GDNF-Ra1 (рецептор альфа 1 семейства GDNF; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alpha1; GFR-ALPHA-1; U95847; ВС014962);
(40) Ly6E (комплекс лимфоцитарного антигена 6, локус Е; Ly67, RIG-E, SCA-2, TSA-1);
(41) ТМЕМ46 (гомолог shisa 2 (Xenopus laevis); SHISA2);
(42) Ly6G6D (комплекс лимфоцитарного антигена 6, локус G6D; Ly6-D, MEGT1);
(43) LGR5 (содержащий богатые лейцином повторы, связанный с белком G рецептор 5; GPR49, GPR67);
(44) RET (протоонкоген ret; MEN2A; HSCR1; MEN2B; МТС1; (РТС); CDHF12; Hs. 168114; RET51; RET-ELE1);
(45) LY6K (комплекс лимфоцитарного антигена 6, локус K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226);
(46) GPR19 (связанный с белком G рецептор 19; Mm. 4787);
(47) GPR54 (рецептор KISS1; KISS1R; GPR54; НОТ7Т175; AXOR12);
(48) ASPHD1 (содержащий домен аспартат-бета-гидроксилазы белок 1; LOC253982);
(49) Тирозиназа (TYR; OCAIA; OCA1A; тирозиназа; SHEP3);
(50) TMEM118 (белок с «безымянным пальцем», трансмембранный белок 2; RNFT2; FLJ14627); и
(51) GPR172A (связанный с белком G рецептор 172А; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e).
8. Меченное десферриоксамином сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, содержащее сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и группой десферриоксамина (Df), обладающее формулой II:
Figure 00000060

где L-Df выбран из:
Figure 00000061

где волнистая линия обозначает присоединение к антителу (Ab); и
p представляет собой 1-4.
9. Способ получения меченного десферриоксамином сконструированного антитела с цистеиновыми заменами по п. 8,
где способ включает реакцию композиции, выбранной из структур:
Figure 00000062

где R выбран из:
Figure 00000063

со сконструированным антителом с цистеиновыми заменами, имеющим одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, посредством чего получают меченное десферриоксамином сконструированное антитело с цистеиновыми заменами.
10. Способ получения меченного цирконием сконструированного антитела с цистеиновыми заменами, содержащего сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и комплексом циркония (Z), обладающего формулой I:
Figure 00000064

где p представляет собой 1-4;
где способ включает образование комплекса циркониевого реагента с меченным десферриоксамином сконструированным антителом с цистеиновыми заменами, содержащим сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), конъюгированное через свободную аминокислоту цистеин с линкером (L) и группой десферриоксамина (Df), обладающим формулой II:
Figure 00000065

где L-Df выбран из:
Figure 00000066

где волнистая линия обозначает присоединение к антителу (Ab); и
p представляет собой 1-4;
посредством чего получают меченное десферриоксамином сконструированное антитело с цистеиновыми заменами.
11. Способ по п. 10, где циркониевый реагент представляет собой оксалат 89циркония.
12. Способ получения изображений, включающий:
введение меченного цирконием сконструированного антитела с цистеиновыми заменами по п. 1 животному; и
детекцию in vivo присутствия меченного цирконием сконструированного антитела с цистеиновыми заменами посредством получения изображений.
13. Способ по п. 12, где Z содержит цирконий в комплексе с десферриоксамином В.
14. Способ по п. 12, где меченное цирконием сконструированное антитело с цистеиновыми заменами связывается с антигеном.
15. Способ по п. 12, где животное представляет собой модель ксенотрансплантата опухоли на мышах.
RU2012123007/10A 2009-11-05 2010-11-04 Конъюгаты меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами RU2562862C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/612,912 US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2009-11-05 Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US12/612,912 2009-11-05
PCT/US2010/055465 WO2011056983A1 (en) 2009-11-05 2010-11-04 Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012123007A RU2012123007A (ru) 2013-12-10
RU2562862C2 true RU2562862C2 (ru) 2015-09-10

Family

ID=43383591

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012123007/10A RU2562862C2 (ru) 2009-11-05 2010-11-04 Конъюгаты меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20100111856A1 (ru)
EP (1) EP2496270B1 (ru)
JP (1) JP5850843B2 (ru)
KR (2) KR20170136652A (ru)
CN (1) CN102596260B (ru)
BR (1) BR112012007774A2 (ru)
CA (1) CA2780216A1 (ru)
MX (1) MX340674B (ru)
RU (1) RU2562862C2 (ru)
WO (1) WO2011056983A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11779649B2 (en) 2018-12-21 2023-10-10 Novartis Ag Antibodies to PMEL17 and conjugates thereof

Families Citing this family (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
CA2646329C (en) 2006-03-20 2018-07-03 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
CN101802013B (zh) 2007-07-16 2014-07-02 健泰科生物技术公司 人源化抗cd79b抗体和免疫偶联物及使用方法
NZ583367A (en) 2007-07-16 2012-10-26 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
CA2698343C (en) 2007-09-04 2018-06-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
CA2700410C (en) * 2007-10-03 2020-10-06 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to psma
MX2010008437A (es) 2008-01-31 2010-11-25 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados y metodos de uso.
GB0803076D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
US20100009390A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Mutant antibodies with high affinity for egfr
US20100008978A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Nanoparticles effective for internalization into cells
US8999661B2 (en) * 2008-07-30 2015-04-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions for detecting cell death and methods of use thereof
ES2712732T3 (es) 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
ES2547712T3 (es) 2009-02-27 2015-10-08 Genentech, Inc. Métodos y composiciones para el marcado de proteínas
MX354143B (es) 2009-12-02 2018-02-14 Imaginab Inc Minicuerpos j591 y diacuerpos-cys para apuntar con especificidad de objetivo a un antígeno de membrana específico para próstata de humano (psma) y métodos para su uso.
US8877897B2 (en) 2010-02-23 2014-11-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
RU2613886C2 (ru) * 2010-06-03 2017-03-21 Дженентек, Инк. Антитела и иммуноконъюгаты, визуализируемые при помощи иммуно-позитрон-эмиссионной томографии, и способы их применения
SG185428A1 (en) 2010-06-08 2012-12-28 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
JP6253987B2 (ja) 2010-12-20 2017-12-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗メソテリン抗体及びイムノコンジュゲート
MX350807B (es) 2011-11-29 2017-09-20 Genentech Inc Composiciones y metodos para el analisis de cancer de prostata.
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
BR112014027166A2 (pt) 2012-05-01 2017-06-27 Genentech Inc anticorpo, ácido nucleico, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, método de tratamento, método de inibir proliferação e métodos de detecção.
MA37538B1 (fr) 2012-05-21 2017-11-30 Genentech Inc Anticorps et immunoconjugués anti-ly6e et procédés d'utilisation
KR102006997B1 (ko) * 2012-07-03 2019-08-02 한국생명공학연구원 ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자
CN107973856B (zh) 2012-07-04 2021-11-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 共价连接的抗原-抗体缀合物
BR112014030843A2 (pt) 2012-07-04 2019-10-15 Hoffmann La Roche anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo
CA2872192A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-biotin antibodies and methods of use
WO2014011327A1 (en) * 2012-07-12 2014-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Radiolabeled probes for the non-invasive detection and imaging of cell death
CA2879670A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 Genentech, Inc. Anti-etbr antibodies and immunoconjugates
MX2015001399A (es) * 2012-08-02 2015-09-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-etbr e inmunoconjugados.
CN104797599A (zh) * 2012-11-05 2015-07-22 全药工业株式会社 抗体或抗体组合物的制备方法
US20140147381A1 (en) * 2012-11-29 2014-05-29 Gregory David Espenan 89zr compounds, to include somatostatin, apparatus and products comprising such compounds, methods of making same, and methods of using same for radio imaging and/or treatment
EP2934602B1 (en) 2012-12-19 2019-02-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for radiohalogen protein labeling
KR102447350B1 (ko) 2013-02-08 2022-09-23 노파르티스 아게 면역접합체의 제조를 위한 항체의 변형에 사용되는 특정 부위
WO2014164988A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tetrahydroxamate chelators of zirconium89 and niobium90 for use in diagnostic applications
MX2015010777A (es) 2013-03-14 2016-04-25 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-b7-h4.
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
ES2699599T3 (es) * 2013-03-15 2019-02-11 Abbvie Biotherapeutics Inc Variantes de Fc
EP3008212A4 (en) * 2013-06-10 2017-05-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of cancer
CN105518027A (zh) 2013-09-17 2016-04-20 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗lgr5抗体的方法
AR098126A1 (es) 2013-10-21 2016-05-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6e (locus e del complejo del antígeno 6 linfocítico), inmunoconjugados y métodos para usarlos
WO2015089344A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Genentech, Inc. Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
WO2015095124A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
CR20160271A (es) 2013-12-16 2016-12-02 Genentech Inc Compuestos peptidométicos y sus conjugados de anticuerpo-fármaco
MX2016007958A (es) 2013-12-17 2016-08-03 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso.
CN105873616B (zh) 2014-01-03 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的多肽毒素-抗体缀合物
CN105873615B (zh) 2014-01-03 2020-12-25 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途
WO2015101586A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
BR112016015693A2 (pt) 2014-01-24 2017-10-24 Genentech Inc método para tratar um câncer de próstata e anticorpo
EA201691827A1 (ru) * 2014-03-12 2017-01-30 Новартис Аг Конкретные участки для модификации антител с целью получения иммуноконъюгатов
RU2016150370A (ru) 2014-05-22 2018-06-26 Дженентек, Инк. Антитела и иммуноконъюгаты против GPC3
CA2949982A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Genentech, Inc. Anti-lgr5 antibodies and uses thereof
JP7286267B2 (ja) 2014-08-28 2023-06-05 バイオアトラ インコーポレイテッド 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
JP7085837B2 (ja) 2014-09-12 2022-06-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体及び免疫複合体
PE20170670A1 (es) 2014-09-12 2017-06-06 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
SG11201701128YA (en) 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
TW201625689A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｂ７－ｈ４抗體及免疫結合物
LT3262071T (lt) 2014-09-23 2020-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd79b imunokonjugatų naudojimo būdai
EP3207027B1 (en) * 2014-10-16 2019-06-19 The University of Melbourne Novel imaging composition and uses thereof
CN107250358B (zh) * 2014-11-05 2021-03-30 伊卢米纳剑桥有限公司 在样品制备和测序期间使用铁载体螯合剂减少dna损伤
KR20170094216A (ko) 2014-12-17 2017-08-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 소르타제를 사용하는 효소 매개되는 폴리펩티드 접합을 위한 신규한 방법
CN104645364A (zh) * 2015-01-27 2015-05-27 南京江原安迪科正电子研究发展有限公司 89Zr标记地诺单抗的标记产物及其制备方法、应用
EP3277314A4 (en) 2015-04-03 2018-08-29 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
EP3307780A1 (en) 2015-06-15 2018-04-18 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
JP2018526972A (ja) 2015-06-16 2018-09-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ３抗体及び使用方法
EP4137158A1 (en) 2015-08-07 2023-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
JP6861702B2 (ja) 2015-09-25 2021-04-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖およびそのコンジュゲート
EP3353291B1 (en) 2015-09-25 2021-06-09 F. Hoffmann-La Roche AG Novel soluble sortase a
CN108138204B (zh) 2015-09-25 2021-12-31 豪夫迈·罗氏有限公司 使用分选酶a生产硫酯的方法
CN108026560A (zh) 2015-09-25 2018-05-11 豪夫迈·罗氏有限公司 在低共熔溶剂中使用分选酶的转酰胺反应
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
US10758634B2 (en) 2016-03-18 2020-09-01 Wake Forest University Compounds, compositions and associated methods using zirconium-89 in immuno-positron emission tomography
WO2017167712A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved sortase
KR102001821B1 (ko) 2016-04-06 2019-07-19 (주)알테오젠 변형항체를 포함하는 항체-약물 접합체
EP3442999A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11201808994YA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Bioatla Llc Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
KR20190006495A (ko) 2016-04-15 2019-01-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd80 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
ES2930255T3 (es) 2016-05-13 2022-12-09 Bioatla Inc Anticuerpos anti-Ror2, fragmentos de anticuerpos, sus inmunoconjugados y usos de los mismos
JP7133477B2 (ja) 2016-06-24 2022-09-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ポリユビキチン多重特異性抗体
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3491013A1 (en) 2016-07-28 2019-06-05 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US20240018268A1 (en) 2016-07-29 2024-01-18 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies against anti-cd19 antibodies
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
US10517966B2 (en) 2016-11-18 2019-12-31 Astellas Pharma Inc. Anti-human MUC1 antibody Fab fragment
CN110023334B (zh) 2016-11-21 2023-11-14 科雅博有限责任公司 抗gp73抗体和免疫偶联物
AU2017367734A1 (en) 2016-12-01 2019-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-PD-l1 antibodies for immuno-PET imaging
KR20190104528A (ko) 2016-12-03 2019-09-10 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Car-t 세포들 투여를 결정하는 방법
US11274157B2 (en) 2017-01-12 2022-03-15 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone H3 peptide/MHC complexes and uses thereof
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
SG11201907208XA (en) 2017-02-10 2019-09-27 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
WO2018170026A2 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2018235835A1 (en) 2017-03-16 2019-09-05 Alpine Immune Sciences, Inc. PD-L2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
PT3596116T (pt) 2017-03-16 2023-12-04 Alpine Immune Sciences Inc Proteínas imunomoduladoras de pd-l1 variante e suas utilizações
CN110475779A (zh) 2017-04-12 2019-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 标记含醛靶分子的方法
KR20200012860A (ko) 2017-04-26 2020-02-05 유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 글리피칸 3을 특이적으로 인식하는 구축물 및 그의 용도
CA3064597A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods related to toxicity associated with cell therapy
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
KR20200027522A (ko) 2017-07-13 2020-03-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pivka에 대한 신규 결합제 및 어세이
US10730944B2 (en) 2017-07-24 2020-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD8 antibodies and uses thereof
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US20200283500A1 (en) 2017-10-18 2020-09-10 Alpine Immune Sciences, Inc. Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
EP3697813A1 (en) 2017-10-20 2020-08-26 H. Hoffnabb-La Roche Ag Copy protection for antibodies
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
WO2019089848A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
MA51210A (fr) 2017-12-01 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Procédés de dosage et de modulation de cellules génétiquement modifiées
WO2019165143A1 (en) * 2018-02-21 2019-08-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Positron emission tomography imaging of activatable binding polypeptides and related compositions thereof
WO2019175131A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for affinity maturation of antibodies
CN111971300A (zh) 2018-03-14 2020-11-20 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖的抗-肌钙蛋白t抗体
CN111936522A (zh) 2018-04-18 2020-11-13 豪夫迈·罗氏有限公司 新型抗胸苷激酶抗体
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3844503A1 (en) 2018-08-31 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Thymidine kinase (tk-1) in prognostic indices for dlbcl
MX2021004146A (es) 2018-10-10 2021-06-08 Astellas Pharma Inc Composicion farmaceutica que contiene complejo de fragmento fab de anticuerpo antihumano con sitio marcado.
AU2019356573A1 (en) 2018-10-11 2021-05-27 Inhibrx, Inc. PD-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
EP3863721A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020076977A2 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202028246A (zh) 2018-10-11 2020-08-01 美商英伊布里克斯公司 B7h3單域抗體及其治療性組合物
AU2019387497A1 (en) 2018-11-30 2021-06-24 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using adoptive cell therapy
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2020117257A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Genentech, Inc. Combination therapy of diffuse large b-cell lymphoma comprising an anti-cd79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-cd20 antibody
CN113396230A (zh) 2019-02-08 2021-09-14 豪夫迈·罗氏有限公司 癌症的诊断和治疗方法
CN115943306A (zh) 2019-03-29 2023-04-07 乐天医药生技股份有限公司 用于光免疫疗法的方法和相关生物标志物
AU2020275415A1 (en) 2019-05-14 2021-11-25 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79B immunoconjugates to treat follicular lymphoma
WO2020236679A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Methods and compositions for determining the biodistribution of activatable anti-cd166 antibody conjugates
US20200399371A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind muc16 and cd3 in combination with 4-1bb co-stimulation
AU2020296181A1 (en) 2019-06-21 2021-12-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind PSMA and CD3 in combination with 4-1BB co-stimulation
MX2022002886A (es) 2019-09-16 2022-04-06 Regeneron Pharma Proteinas de union met radiomarcadas para la obtencion de imagenes por inmuno-pet.
TW202122114A (zh) 2019-10-18 2021-06-16 美商建南德克公司 使用抗CD79b 免疫偶聯物治療彌漫性大B 細胞淋巴瘤的方法
JP2023504736A (ja) 2019-12-06 2023-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
US20230028050A1 (en) 2019-12-06 2023-01-26 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to bcma-targeted binding domains and related compositions and methods
BR112022014667A2 (pt) 2020-01-29 2022-09-20 Inhibrx Inc Anticorpos de domínio único de cd28 e construtos multivalentes e multiespecíficos dos mesmos
WO2021217051A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
US20230324408A1 (en) 2020-08-05 2023-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
WO2022036146A1 (en) 2020-08-12 2022-02-17 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
JP2023550278A (ja) 2020-10-30 2023-12-01 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 胆管癌のマーカーとしてのｔｉｍｐ１
WO2022147463A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Alamar Biosciences, Inc. Binder molecules with high affinity and/ or specificity and methods of making and use thereof
WO2022241446A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
WO2023019092A1 (en) 2021-08-07 2023-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
WO2023034750A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
WO2023111168A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag A novel antibody for detection of amyloid beta 42 (aβ42)
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2023178357A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
CN117198390B (zh) * 2023-09-08 2024-03-12 中国科学院广州生物医药与健康研究院 通过设计和改造二硫键交联位点的slc膜蛋白复合物的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006034488A2 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates

Family Cites Families (290)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6098584A (ja) 1983-11-02 1985-06-01 Canon Inc カメラ―体形ｖｔｒ
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8720833D0 (en) * 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU6355090A (en) 1989-08-23 1991-04-03 Scripps Clinic And Research Foundation Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
AU9016591A (en) 1990-10-25 1992-05-26 Tanox Biosystems, Inc. Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on B cells
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
US5440021A (en) 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
ATE194385T1 (de) 1991-03-29 2000-07-15 Genentech Inc Menschliche pf4a rezeptoren und ihre verwendung
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US6011146A (en) 1991-11-15 2000-01-04 Institut Pasteur Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US6153408A (en) 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
CA2122732C (en) 1991-11-25 2008-04-08 Marc D. Whitlow Multivalent antigen-binding proteins
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
ES2091684T3 (es) 1992-11-13 1996-11-01 Idec Pharma Corp Aplicacion terapeutica de anticuerpos quimericos y radiomarcados contra el antigeno de diferenciacion restringida de los linfocitos b humanos para el tratamiento del linfoma de las celulas b.
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
US5644033A (en) 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
CZ292061B6 (cs) 1994-03-17 2003-07-16 Merck Patent Gmbh Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
AU716785B2 (en) 1995-07-27 2000-03-09 Genentech Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
DK0853487T3 (da) * 1995-09-18 2000-10-23 Us Health Neutraliserende monoklonale antistoffer mod respiratorisk syncytial virus
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
DK0896586T4 (en) 1996-03-27 2015-08-24 Genentech Inc ErbB3 antibodies.
NZ332598A (en) 1996-05-17 2000-04-28 Schering Corp Human BAS-1 protein, and use as an antagonist for modulating physiology or development of a cell
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US20030185830A1 (en) 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US7033827B2 (en) 1997-02-25 2006-04-25 Corixa Corporation Prostate-specific polynucleotide compositions
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
ES2221982T3 (es) 1997-03-10 2005-01-16 The Regents Of The University Of California Antigeno de celulas madre de la prostata (psca).
US6261791B1 (en) 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
WO1998051824A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
US6890749B2 (en) 1997-05-15 2005-05-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6248564B1 (en) * 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
WO1999019488A1 (en) 1997-10-15 1999-04-22 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
WO1999046284A2 (en) 1998-03-13 1999-09-16 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6534482B1 (en) 1998-05-13 2003-03-18 Epimmune, Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
US20020187472A1 (en) 2001-03-09 2002-12-12 Preeti Lal Steap-related protein
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030091580A1 (en) 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20020119158A1 (en) 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030190669A1 (en) 1998-12-30 2003-10-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU776672B2 (en) 1998-12-30 2004-09-16 Beth Israel Deaconess Medical Center Characterization of a calcium channel family
CZ20012587A3 (cs) 1999-01-29 2002-05-15 Corixa Corporation Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu
GB9905124D0 (en) 1999-03-05 1999-04-28 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US7304126B2 (en) 1999-05-11 2007-12-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6399743B1 (en) 1999-05-14 2002-06-04 Dept. Of Veterans Affairs Isolation and characterization of a rat epidermal growth factor related protein
US7049410B2 (en) 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
WO2000075655A1 (fr) 1999-06-03 2000-12-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de criblage avec cd100
HU226742B1 (en) 1999-06-25 2009-08-28 Genentech Inc Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies
AU784157B2 (en) 1999-06-25 2006-02-16 Genentech Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US7589172B2 (en) 1999-07-20 2009-09-15 Genentech, Inc. PRO256 polypeptides
US7297770B2 (en) 1999-08-10 2007-11-20 Genentech, Inc. PRO6496 polypeptides
US7294696B2 (en) 1999-08-17 2007-11-13 Genentech Inc. PRO7168 polypeptides
CA2380355A1 (en) 1999-09-01 2001-03-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030206918A1 (en) 1999-09-10 2003-11-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030232056A1 (en) 1999-09-10 2003-12-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
ATE400587T1 (de) 1999-10-29 2008-07-15 Genentech Inc Gegen das prostata-stammzellantigen (psca) gerichtete antikörper und deren verwendung
US6372907B1 (en) 1999-11-03 2002-04-16 Apptera Corporation Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates
ES2591102T3 (es) 1999-11-29 2016-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma
WO2001040269A2 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
AU2087401A (en) 1999-12-10 2001-06-18 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
EP2248828A1 (en) 1999-12-23 2010-11-10 ZymoGenetics, Inc. Method for treating inflammation
CA2395539C (en) 1999-12-23 2009-08-25 Zymogenetics, Inc. Soluble interleukin-20 receptor
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
ATE337403T1 (de) 1999-12-24 2006-09-15 Genentech Inc Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US7294695B2 (en) 2000-01-20 2007-11-13 Genentech, Inc. PRO10268 polypeptides
US20030224379A1 (en) 2000-01-21 2003-12-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
AU2001234493A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Corixa Corporation Compounds and methods for prevention and treatment of her-2/neu associated malignancies
AU2001243142A1 (en) 2000-02-03 2001-08-14 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030186372A1 (en) 2000-02-11 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020142377A1 (en) 2000-02-22 2002-10-03 Glucksmann Maria Alexandra 18607, a novel human calcium channel
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP1261743A2 (en) 2000-03-07 2002-12-04 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US7097840B2 (en) * 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
WO2001072962A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Fahri Saatcioglu Novel prostate-specific or testis-specific nucleic acid molecules, polypeptides, and diagnostic and therapeutic methods
US20030186889A1 (en) 2000-03-31 2003-10-02 Wolf-Georg Forssmann Diagnostic and medicament for analysing the cell surface proteome of tumour and inflammatory cells and for treating tumorous and inflammatory diseases, preferably using a specific chemokine receptor analysis and the chemokine receptor-ligand interaction
AU2001253140A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
US6806054B2 (en) 2000-04-07 2004-10-19 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated known G protein-coupled receptors
WO2001088133A2 (en) 2000-05-18 2001-11-22 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
WO2001090304A2 (en) 2000-05-19 2001-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001275437A1 (en) 2000-06-09 2001-12-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
JP2004523203A (ja) 2000-06-16 2004-08-05 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド Ｇタンパク質結合受容体
AU2001271714A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
AU2001273194A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Amgen Inc. B7-Like Molecules and Uses Thereof
JP2004528003A (ja) 2000-06-30 2004-09-16 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 細胞外マトリクスおよび細胞接着分子
AU2002214531A1 (en) 2000-07-03 2002-01-30 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20040044179A1 (en) 2000-07-25 2004-03-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2001283507A1 (en) 2000-07-27 2002-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h3 and b7-h4, novel immunoregulatory molecules
WO2002010382A2 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Ulrich Wissenbach Trp8, trp9 and trp10, markers for cancer
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
WO2002013847A2 (en) 2000-08-14 2002-02-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
BR0113235A (pt) 2000-08-14 2004-06-08 Corixa Corp Composições e métodos para a terapia e a diagnose de malignidades associadas com her-2/neu
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU2001270118A1 (en) 2000-08-24 2002-03-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020119148A1 (en) 2000-09-01 2002-08-29 Gerritsen Mary E. ErbB4 antagonists
AU2001290548A1 (en) 2000-09-11 2002-03-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030119121A1 (en) 2000-09-15 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
DE60141546D1 (de) 2000-09-15 2010-04-22 Zymogenetics Inc Polypeptide enthaltend extrazellulären Domäne von IL-20RA und/oderr IL-20RB
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
AU2001292724B2 (en) 2000-09-18 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. CRIPTO mutant and uses thereof
UA83458C2 (ru) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
WO2002030268A2 (en) 2000-10-13 2002-04-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of prostate cancer, compositions and methods of screening for modulators of prostate cancer
ES2329012T3 (es) 2000-11-07 2009-11-20 Zymogenetics, Inc. Receptor del factor de necrosis tumoral humano.
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
US20020159986A1 (en) 2001-01-12 2002-10-31 John Langenfeld Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US20030119133A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030119119A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2440703A1 (en) 2001-01-24 2002-08-01 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
WO2002060317A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
WO2002064780A1 (en) 2001-02-12 2002-08-22 Bionomics Limited Dna sequences for human tumour suppressor genes
US20030087250A1 (en) 2001-03-14 2003-05-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
AU2002311787A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Zycos Inc. Translational profiling
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
WO2002083866A2 (en) 2001-04-17 2002-10-24 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repeat sequences of the ca125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions
CA2444691A1 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
EA007469B1 (ru) 2001-04-26 2006-10-27 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Антитела, блокирующие cripto, и их применения
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
CA2446788A1 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
WO2002092836A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, ca125, and uses thereof
EP1436003B3 (en) 2001-05-24 2012-03-14 ZymoGenetics, Inc. Taci-immunoglobulin fusion proteins
JP2005518185A (ja) 2001-06-04 2005-06-23 キュラジェン コーポレイション 新規タンパク質およびそれをコード化する核酸
AU2002314901A1 (en) 2001-06-04 2002-12-16 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
US20030087266A1 (en) 2001-06-05 2003-05-08 Lori Friedman IGs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
ATE483976T1 (de) 2001-06-05 2010-10-15 Exelixis Inc Gfats als modifikatoren des p53-wegs und verwendungsverfahren
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7125663B2 (en) 2001-06-13 2006-10-24 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
CA2451465A1 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
WO2003004989A2 (en) 2001-06-21 2003-01-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20030108958A1 (en) 2001-06-28 2003-06-12 Rene De Waal Malefyt Biological activity of AK155
US20030120040A1 (en) 2001-06-29 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and Transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2003004529A2 (en) 2001-07-02 2003-01-16 Licentia Ltd. Ephrin-tie receptor materials and methods
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
WO2003003984A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
WO2003055439A2 (en) 2001-07-18 2003-07-10 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
AU2002337657A1 (en) 2001-07-25 2003-02-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
JP2005510208A (ja) 2001-08-03 2005-04-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＴＡＣＩｓ及びＢＲ３ポリペプチドとその用途
US20070015145A1 (en) 2001-08-14 2007-01-18 Clifford Woolf Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20030092013A1 (en) 2001-08-16 2003-05-15 Vitivity, Inc. Diagnosis and treatment of vascular disease
WO2003018621A2 (en) 2001-08-23 2003-03-06 Oxford Biomedica (Uk) Limited Genes
AU2002357643A1 (en) 2001-08-29 2003-04-14 Vanderbilt University The human mob-5 (il-24) receptors and uses thereof
US20040235068A1 (en) * 2001-09-05 2004-11-25 Levinson Arthur D. Methods for the identification of polypeptide antigens associated with disorders involving aberrant cell proliferation and compositions useful for the treatment of such disorders
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
ES2537074T3 (es) 2001-09-06 2015-06-02 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
JP2005518782A (ja) 2001-09-17 2005-06-30 プロテイン デザイン ラブス， インコーポレイテッド ガンの診断方法、ガンのモジュレータのスクリーニング組成物及び方法
NZ573831A (en) 2001-09-18 2010-07-30 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor, particularly breast tumor - TAT193
IL160933A0 (en) 2001-09-18 2004-08-31 Proteologics Inc Methods and compositions for treating ?cap associated diseases
WO2003025148A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US20030077644A1 (en) 2001-09-28 2003-04-24 Bing Yang Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in CD72
US20050130117A1 (en) 2001-10-03 2005-06-16 Davis Cong L. Modulators of lymphocyte activation and migration
US20040249144A1 (en) 2001-10-03 2004-12-09 Zairen Sun Regulated breast cancer genes
WO2003034984A2 (en) 2001-10-19 2003-05-01 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
US20040241703A1 (en) 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
CN1685055A (zh) 2001-10-31 2005-10-19 爱尔康公司 骨形态发生蛋白(bmp)、bmp受体和bmp结合蛋白及它们在诊断和治疗青光眼中的用途
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20050123536A1 (en) 2001-11-20 2005-06-09 Che-Leung Law Treatment of immunological disorders using anti-dc30 antibodies
WO2003045422A1 (en) 2001-11-29 2003-06-05 Genset S.A. Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders
AU2002349784A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Asahi Kasei Pharma Corporation Nf-kappab activating genes
AU2002366951A1 (en) 2001-12-10 2003-07-09 Nuvelo,Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
DE60334364D1 (de) 2002-02-21 2010-11-11 Univ California Behandlungsverfahren unter verwendung von anti-cd22-antikörpern
EP1575480A4 (en) 2002-02-22 2008-08-06 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASES RELATED TO THE IMMUNE SYSTEM
WO2003073823A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Exelixis, Inc. PDPK1s AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
WO2003104399A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
WO2003097803A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Avalon Pharmaceuticals Cancer-linked gene as target for chemotherapy
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
CA2486490A1 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
JP2005534286A (ja) 2002-03-21 2005-11-17 サネシス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド キナーゼインヒビターの同定
EP1494693B1 (en) 2002-03-22 2010-12-08 Biogen Idec MA Inc. Cripto-specific antibodies
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
AU2003245239A1 (en) 2002-03-25 2003-11-03 Uab Research Foundation FC receptor homolog, reagents, and uses thereof
AU2003222103A1 (en) 2002-03-28 2003-10-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
BR0308953A (pt) 2002-04-05 2006-03-14 Agensys Inc composições, proteìna, polinucleotìdeo, método de geração de uma resposta imune, método de detecção, composição farmacêutica, anticorpo ou seu fragmento, animal transgênico, hibridoma, método de fornecimento de um agente citotóxico ou agente de diagnóstico e método de inibição do crescimento de células cancerosas
US20040101874A1 (en) 2002-04-12 2004-05-27 Mitokor Inc. Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
CA2481507A1 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003089904A2 (en) 2002-04-17 2003-10-30 Baylor College Of Medicine Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy
AU2003228869A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Incyte Corporation Transporters and ion channels
AU2003232453A1 (en) 2002-05-30 2003-12-19 David K. Bol Human solute carrier family 7 member 11 (hslc7a11)
AU2003239969A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
WO2003104270A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Ingenium Pharmaceuticals Ag Dudulin 2 genes, expression products, non-human animal model: uses in human hematological disease
SG145559A1 (en) 2002-06-06 2008-09-29 Oncotherapy Science Inc Genes and polypeptides relating to human colon cancers
AU2003245441A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
EP1552002A4 (en) 2002-06-18 2006-02-08 Archemix Corp APTAMER TOXIN MOLECULES AND METHOD FOR THEIR USE
US20040249130A1 (en) 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
JP4364121B2 (ja) 2002-06-20 2009-11-11 スナップトラック・インコーポレーテッド 結合されたｇｐｓ受信器と通信システムにおける相互干渉の低減
WO2004000221A2 (en) 2002-06-20 2003-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
EP1534331B1 (en) 2002-06-21 2014-10-29 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
WO2004009622A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Cellzome Ag Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases
WO2004011611A2 (en) 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
CA2494104A1 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
AU2003251471A1 (en) 2002-08-06 2004-02-25 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
AU2003278725A1 (en) 2002-08-27 2004-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide predictor set for identifying protein tyrosine kinase modulators
WO2004020595A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
CA2496888A1 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Mannkind Corporation Epitope sequences
AU2003300776A1 (en) 2002-09-09 2004-05-25 Omeros Corporation G protein coupled receptors and uses thereof
JP2004113151A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
CA2500978A1 (en) 2002-10-03 2004-04-15 Mcgill University Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
AU2003288918A1 (en) 2002-10-04 2004-05-04 Van Andel Research Institute Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers
WO2004042017A2 (en) * 2002-10-31 2004-05-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
JP2006516094A (ja) 2002-11-08 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド ナチュラルキラー細胞関連疾患の治療のための組成物と方法
WO2004044178A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosing dysplasia
US8007804B2 (en) 2002-11-15 2011-08-30 Musc Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
AU2003294355A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
AU2003297300A1 (en) 2002-11-20 2004-06-15 Biogen Idec Inc. Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of carcinomas
AU2003294462C1 (en) 2002-11-21 2011-06-30 University Of Utah Research Foundation Purinergic modulation of smell
WO2004048938A2 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
WO2004053079A2 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to ovarian specific genes and proteins
US20040157278A1 (en) 2002-12-13 2004-08-12 Bayer Corporation Detection methods using TIMP 1
ES2388280T3 (es) 2002-12-20 2012-10-11 Abbott Biotherapeutics Corp. Anticuerpos que reaccionan frente a GPR64 y utilización de los mismos
WO2004058309A1 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
CA2512536A1 (en) 2003-01-08 2004-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
US20040171823A1 (en) 2003-01-14 2004-09-02 Nadler Steven G. Polynucleotides and polypeptides associated with the NF-kappaB pathway
WO2004065576A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of urological disorder using differential expressed polypeptides
WO2004065417A2 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
US20060228710A1 (en) 2003-02-14 2006-10-12 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
CA2652945C (en) * 2006-05-30 2015-06-02 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CA2676766A1 (en) * 2007-02-09 2008-08-21 Genentech, Inc. Anti-robo4 antibodies and uses therefor
AU2008251608B2 (en) * 2007-05-08 2014-03-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-MUC16 antibodies and antibody drug conjugates
CN101802013B (zh) * 2007-07-16 2014-07-02 健泰科生物技术公司 人源化抗cd79b抗体和免疫偶联物及使用方法
NZ583367A (en) * 2007-07-16 2012-10-26 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
CA2698541C (en) * 2007-10-19 2018-01-09 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006034488A2 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIJKERS E.C.F. et al, Development and Characterization of Clinical-Grade 89Zr-Trastuzumab for HER2/neu ImmunoPET Imaging, The Journal of Nuclear Medicine, 2009, v. 50, n. 6, p. 974-981. GOVINDAN S.V. et al, Deferoxamine as a chelator for 67Ga in the preparation of antibody conjugates, 2005, v. 32, p. 513-519. РОЙТ А. и др., Иммунология, Москва, "Мир", 2000, стр. 110-111 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11779649B2 (en) 2018-12-21 2023-10-10 Novartis Ag Antibodies to PMEL17 and conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2496270B1 (en) 2018-01-31
RU2012123007A (ru) 2013-12-10
KR20170136652A (ko) 2017-12-11
JP2013510093A (ja) 2013-03-21
US20100111856A1 (en) 2010-05-06
MX340674B (es) 2016-07-20
CA2780216A1 (en) 2011-05-12
WO2011056983A1 (en) 2011-05-12
CN102596260A (zh) 2012-07-18
MX2012005211A (es) 2012-06-13
KR20120102625A (ko) 2012-09-18
JP5850843B2 (ja) 2016-02-03
CN102596260B (zh) 2017-04-05
BR112012007774A2 (pt) 2016-11-22
US20150017094A1 (en) 2015-01-15
EP2496270A1 (en) 2012-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2562862C2 (ru) Конъюгаты меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами
US11873330B2 (en) Cysteine engineered antibodies and conjugates
JP4948413B2 (ja) システイン操作抗体および結合体
MX2007003404A (es) Anticuerpos y conjugados diseñados de cisteina