PT2311878E - Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro - Google Patents

Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro Download PDF

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Ugur Sahin
Dirk Usener
Philippe Thiel
Stefan Fritz
Gunda Brandenburg
Harald-Gerhard Geppert
Anja Kristina Schröder
Christoph Uherek
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Description

DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro"
As terapias baseadas em anticorpos para cancro têm o potencial de maior especificidade e perfil de menores efeitos secundários em comparação com os fármacos convencionais. A razão é a distinção precisa entre células normais e neoplásicas pelos anticorpos e o facto de o seu modo de ação se basear em mecanismos imunológicos antitumorais menos tóxicos, tais como ativação do complemento e recrutamento de células imunitárias citotóxicas.
Os alvos para terapias baseadas em anticorpos necessitam de ter qualidades particulares, que formam a base da discriminação correta entre células normais e neoplásicas. Obviamente, um alvo com restrição exclusiva a células tumorais e inteiramente indetetável em tecidos normais é ideal para o desenvolvimento de produtos terapêuticos de anticorpos eficientes e seguros. Num outro aspeto, uma sobre-expressão de alto nivel podem ser a base para a janela terapêutica e os baixos efeitos secundários exemplificados pelo recetor do fator de crescimento epidérmico humano de tipo 2 (HER-2), que, em resultado da amplificação do gene, é um bom alvo para o anticorpo trastuzumab (Herceptin).
Outros alvos para anticorpos que ou já estão aprovados ou estão em desenvolvimento clinico para terapia de tumores têm qualidades distintas, que não são baseadas numa sobre-expressão numérica de moléculas alvo em células tumorais. No caso dos anticorpos para o proteoglicano MUC-1, um epitopo peptidico de repetição no esqueleto do alvo é subglicosilado em células tumorais e assim alterado para o seu equivalente normal. No caso de anticorpos para CD20 (rituximab) , CD52 (Campath-1H) e CD22 (epratuzumab), os alvos de anticorpos têm níveis comparáveis de expressão em células tumorais e linfócitos normais. Neste caso, a ablação de células normais pelo anticorpo é tolerável uma vez que células estaminais negativas para o alvo restauram o repertório de linfócitos normal. Outros exemplos de acessibilidade diferencial dos alvos de anticorpos são o antigénio carcinoembrionário (CEA) e carboanidrase IX (CA9). Ambos os antigénios são expressos em epitélio normal do cólon e rim, respetivamente. No entanto, anticorpos de imagiologia marcados radioactivamente distinguem bem entre tecido tumoral e normal e anticorpos citotóxicos são bem tolerados. Isto é muito provavelmente devido a uma expressão restrita de CA9 e CEA no lado luminal do tecido epitelial normal, onde os anticorpos IgG não têm acesso. Também o antigénio molécula de adesão de células epiteliais (Ep-CAM) pertence a esta categoria. Como uma molécula de adesão celular homotípica para células epiteliais, localiza-se no espaço intercelular. Curiosamente, embora os anticorpos anti-Ep-CAM de alta afinidade sejam muito tóxicos, anticorpos de afinidade intermédia são bem tolerados. Isto sugere acessibilidade do alvo Ep-CAM em células normais, mas também indica que a cinética da ligação do anticorpo pode abrir uma janela terapêutica.
Uma possibilidade é de que outras proteínas específicas de células epiteliais envolvidas na adesão célula/célula possam também ser atrativas para abordagens de anticorpos, uma vez que podem ser de difícil acesso aos anticorpos em epitélios bem estruturados mas tornarem-se expostas em células tumorais. Analisámos por isso proteínas envolvidas na organização da arquitetura do tecido epitelial quanto à sua adequabilidade como alvos para anticorpos terapêuticos. Uma proteína que chamou particularmente a nossa atenção é a claudina 18. A molécula de claudina 18 (CLD18) (número de acesso Genbank: variante de processamento 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369, e variante de processamento 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026) é uma proteína transmembranar integral com um peso molecular de aproximadamente 27,9/27,72 kDa. As claudinas são proteínas membranares integrais localizadas dentro das junções de oclusão dos epitélios e endotélios. As junções de oclusão organizam uma rede de cadeias interligadas de partículas intramembranosas entre células adjacentes. Em junções de oclusão, a ocludina e as claudinas são os componentes proteicos transmembranares mais proeminentes. Devido às suas fortes propriedades de adesão intercelular, criam uma barreira primária para prevenir e controlar o transporte paracelular de solutos e restringem a difusão lateral de lípidos e proteínas membranares para manter a polaridade celular. As proteínas formadoras de junções de oclusão estão criticamente envolvidas na organização da arquitetura do tecido epitelial. Assumiu-se que tais proteínas podem ser pouco acessíveis aos anticorpos em epitélios bem estruturados, mas que se tornam expostas nas células tumorais. WO 2004/047863 descreve a identificação de variantes de processamento variantes de processamento (splicing) CLD18A1 e CLD18A2 como alvos de diagnóstico e terapêuticos do cancro. CLD18 é uma tetraspanina e tem, como tal, 4 regiões hidrófobas. Geraram-se dados indicando que CLD18 apresenta várias conformações diferentes, que podem ser seletivamente alcançadas por anticorpos. Uma conformação (CLD18-Conformação-1) implica que todas as quatro regiões hidrófobas servem como domínios transmembranares (TM) regulares e formam-se duas voltas extracelulares (voltai englobada pela região hidrófoba e uma região hidrófoba 2; volta2 englobada pelas regiões hidrófobas 3 e 4), tal como descrito para a grande maioria dos membros da família das claudinas. Uma segunda conformação (CLD18-Conformação-2) implica que, tal como descrito para PMP22, outro membro da família das tetraspaninas (Taylor et al. , J. Neurose. Res. 62: 15-27, 2000), o segundo e terceiro domínios hidrófobos não atravessem completamente a membrana plasmática de modo a que essa porção (voltaD3) entre o primeiro e o quarto domínio transmembranar seja extracelular. Uma terceira conformação (CLD18-Conformação-3) implica um grande domínio extracelular com duas regiões hidrófobas internas englobadas pela primeira e quarta região hidrófoba, que servem como domínios transmembranares regulares. Devido à presença do local de N-glicosilação clássico na voltaD3, as variantes de topologia da Claudina-18, CLD18 topologia-2 e CLD18 topologia-3, ancoram um local de N-glicosilação extracelular adicional.
Outro nível de complexidade é adicionado à molécula de CLD18 através da presença de duas variantes de processamento diferentes, que são descritas no ratinho e no ser humano (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001) . As variantes de processamento CLD18A1 e CLD18A2 diferem nos primeiros 21 aminoácidos N-terminais, que constituem o primeiro TM e a voltai, enquanto a sequência proteica primária do terminal C é idêntica. CLD18A1 é seletivamente expressa no pulmão e epitélio do estômago normais, enquanto CLD18A2 é expressa apenas em células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001) . Mais importante ainda, CLD18A2 é restrita às células diferenciadas de vida curta do epitélio do estômago mas está ausente na região das células estaminais gástricas. Utilizando RT-PCR sensível, demonstrámos que ambas as variantes não são de todo detetáveis em qualquer outro órgão humano normal, mas são expressas de forma robusta em vários tipos de cancro incluindo tumores do estômago, esofágico, pancreático e do pulmão, bem como em linhas celulares de cancro humanas. A expressão é mais proeminente nos subtipos de adenocarcinoma destas indicações. O peso molecular da proteína difere em alguns cancros e tecido adjacente normal. A proteína de peso molecular mais elevado observado em tecido saudável pode ser transferida para o mesmo peso molecular que o observado em cancro através de tratamento de Usados de tecido com o composto desglicosilante PNGase F. Isto sugere que CLD18 é menos N-glicosilada em cancro, em comparação com a sua equivalente em tecido normal. Esta diferença estrutural é suscetível de dar origem a um epitopo alterado. Um motivo de N-glicosilação clássico está na posição do aa 116 dentro do domínio voltaD3 da molécula. O termo "CLD18" e a expressão "variante de CLD18" de acordo com o invento devem englobar (i) variantes de processamento de CLD18, (ii) variantes de N-glicosilação de CLD18, (iii) variantes de conformação de CLD18, (iv) variantes de CLD18 livres e associadas homotipicamente/heterotipicamente localizadas em junções de oclusão intercelulares e (v) variantes de CLD18 relacionadas com cancro e de CLD18 não relacionadas com células de cancro.
As características moleculares e funcionais de CLD18 tornam esta molécula um alvo altamente interessante para terapia de cancro baseada em anticorpos. Estas são, em particular, (i) a ausência de CLD18 da grande maioria dos tecidos normais com toxicidade relevante, (ii) a restrição da expressão da variante CLD18A2 a uma população celular dispensável como as células gástricas diferenciadas, que podem ser repostas por células estaminais negativas para o alvo do estômago, (iii) sugestão de potencial glicosilação diferencial entre células normais e neoplásicas, e (iv) a presença de diferentes topologias de conformação. Além disso, o papel de CLD18 como proteína de junção de oclusão pode ainda contribuir para uma boa janela terapêutica. Como as células tumorais expressam claudinas mas muitas vezes não formam junções de oclusão clássicas através de associação homotípica e heterotípica de claudinas tal como verificado no tecido epitelial normal, as células tumorais podem ter um banco considerável de claudinas livres que são passíveis de se ligarem a anticorpos extracelulares e de imunoterapia. É possível que os epitopos de ligação das claudinas no epitélio saudável sejam protegidos dentro de junções de oclusão do acesso de tais anticorpos. 0 objeto do invento consiste em proporcionar anticorpos úteis para terapia de doenças em que é expressa CLD18, tais como doenças tumorais. Os anticorpos aqui descritos têm também utilidade no diagnóstico de tais doenças.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento genericamente proporciona anticorpos úteis como produtos terapêuticos para tratamento e/ou prevenção de doenças associadas a células que expressam CLD18, incluindo doenças relacionadas com tumores tais como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro de cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar.
Num aspeto o invento refere-se a um anticorpo que compreende uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionadas entre as seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129. O anticorpo do presente invento é um anticorpo possuindo a capacidade de se ligar a CLD18 e mediar a morte de células que expressam CLD18. De preferência, o anticorpo liga-se a CLD18A1 e CLD18A2 e com maior preferência liga-se a CLD18A2 mas não a CLD18A1. Os anticorpos do invento ligam-se a, e são específicos para, a voltai de CLD-conformação-1 ou a voltaD3 de CLD-conformação-2. A morte de células pelo anticorpo do invento é de preferência induzida por ligação do anticorpo a CLD18 expressa pelas referidas células, com mais preferência, por ligação do anticorpo a CLD18A2 expressa pelas referidas células. Numa concretização, a ligação do anticorpo do invento a CLD18A1 expressa pelas referidas células não induz morte das referidas células.
As células que expressam CLD18 são de preferência células de cancro e são, em particular, selecionadas a partir do grupo que consiste em células de cancro tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, do pulmão, ovário, cólon, hepáticas, da cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
De preferência o anticorpo do invento medeia a morte de células através de indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
Numa concretização o anticorpo do invento não inclui a lise de células mediada por CDC. A lise de células mediada por ADCC pode ocorrer na presença de células efetoras, que podem ser selecionadas do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMN. 0 anticorpo da divulgação pode ser um anticorpo monoclonal, quimérico, humano, ou humanizado, e pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgGl, um IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgA segregado, um IgD, e um IgE.
De acordo com todos os aspetos do invento, CLD18 é de preferência CLD18 humana, de preferência CLD18A2 humana, e CLD18A2 tem de preferência a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 e CLD18A1 tem de preferência a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 8.
Em concretizações preferidas particulares, o anticorpo do invento liga-se a epitopos nativos de CLD18 presentes na superfície de células vivas. Noutras concretizações preferidas, o anticorpo do invento é específico para células de cancro, de preferência células de cancro do estômago.
Em certas concretizações do invento CLD18 é expressa na superfície das células.
Os anticorpos do invento podem ser obtidos através de um método compreendendo o passo de imunização de um animal com uma proteína ou um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23 e 26-31, ou um seu fragmento imunogénico, ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira que expressam a referida proteína ou péptido, ou seu fragmento imunogénico. De preferência, um anticorpo do invento é específico para as proteínas, os péptidos ou seus fragmentos imunogénicos acima mencionados. O anticorpo do invento pode ser, por exemplo, produzido por um clone possuindo on.2, de acesso DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2808 (182-D1106-279) , DSM ACC2809 (182-D1106-294), ou DSM ACC2810 (182-D1106-3 62) . O presente invento refere-se também a um hibridoma capaz de produzir o anticorpo do presente invento. O anticorpo do invento pode ser ligado (acoplado) a um agente terapêutico tal como uma toxina, um isótopo radioativo, um fármaco ou agente citotóxico.
Deste modo, o presente invento refere-se a um conjugado compreendendo o anticorpo do presente invento ligado (acoplado) a um agente terapêutico, em que o agente terapêutico é preferivelmente uma toxina, um isótopo radioativo, um fármaco ou um agente citotóxico.
Os anticorpos do invento são aqui designados com referência à designação do anticorpo, por exemplo 182-D758-035, e/ou com referência ao clone que produz o anticorpo, por exemplo 26D12. O invento também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo do invento e/ou um conjugado do invento, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspeto o invento refere-se a um anticorpo do presente invento para utilização num método de inibição do crescimento e/ou de morte de uma célula que expressa CLD18A2. O referido método pode, por exemplo, compreender o contacto da célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento e/ou um seu conjugado com um agente terapêutico. CLD18 é de preferência expressa na superfície da referida célula.
Num outro aspeto o invento refere-se a um anticorpo ou conjugado ou uma composição farmacêutica do presente invento para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou um distúrbio envolvendo células que expressam CLD18A2. De preferência a doença ou distúrbio é uma doença relacionada com tumor e em concretizações particulares é selecionada a partir do grupo que consiste em cancro da mama, cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro colorretal, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar e as suas metástases. CLD18 é de preferência expressa na superfície das referidas células.
Preferivelmente, os anticorpos do invento têm a capacidade para discriminar variantes de CLD18 expressas por diferentes tipos celulares incluindo células de cancro e células não malignas. Numa concretização particularmente preferida, os anticorpos do invento têm a capacidade de se ligar a CLD18A2 ao passo que não se ligam a CLD18A1, ou ligam-se a CLD18A1 com uma especificidade menor em comparação com a especificidade de ligação a CLD18A2. 0 termo "ligação" de acordo com o invento refere-se de preferência a uma ligação específica. "Ligação específica" significa que um agente tal como um anticorpo se liga com mais força a um alvo tal como um epitopo para o qual é específico em comparação com a ligação a outro alvo. Um agente liga-se com mais força a um primeiro alvo em comparação com um segundo alvo se se ligar ao primeiro alvo com uma constante de dissociação (Kd) que é inferior à constante de dissociação para o segundo alvo. De preferência a constante de dissociação (Kd) para o alvo ao qual o agente se liga especificamente é mais de 10 vezes, de preferência mais de 20 vezes, com maior preferência mais de 50 vezes, ainda mais de preferência mais de 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes inferior à constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente.
Os anticorpos do invento medeiam a morte de células que expressam CLD18, de preferência CLD18A2, através da ligação a CLD18, de preferência expressa na superfície das referidas células. Numa concretização, os anticorpos do invento induzem citotoxicidade dependente do complemento (CDC), p. ex. pelo menos cerca de 20-40% de lise mediada por CDC, de preferência cerca de 40-50% de lise mediada por CDC, e com maior preferência mais de 50% de lise mediada por CDC de células que expressam CLD18. Tais anticorpos são aqui exemplificados pelos seguintes anticorpos: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12, e ch-175D10. Alternativamente ou adicionalmente à indução de CDC, os anticorpos do invento podem induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células que expressam CLD18 na presença de células efetoras (p. ex., monócitos, células mononucleares, células NK e PMN) . Tais anticorpos são aqui exemplificados pelos seguintes anticorpos: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1, e 125E1. Os anticorpos do invento podem ter a capacidade de induzir apoptose de células que expressam CLD18, induzir adesão homotípica de células que expressam CLD18 e/ou induzir fagocitose de células que expressam CLD18 na presença de macrófagos. Os anticorpos do invento podem ter uma ou mais das propriedades funcionais acima descritas. De preferência, os anticorpos do invento induzem lise mediada por CDC e lise mediada por ADCC de células que expressam CLD18 e com maior preferência induzem lise mediada por ADCC de células que expressam CLD18 ao mesmo tempo que não induzem lise mediada por CDC das referidas células. Células alvo exemplares para os anticorpos do presente invento incluem, mas não se limitam a, células de cancro que expressam CLD18, de preferência CLD18A2, tais como células de cancro tumorigénicas gástricas, pancreáticas, esofágicas e do pulmão. Numa concretização particularmente preferida, a morte de células mediada por anticorpos do invento é específica de CLD18A2, i.e. os anticorpos do invento medeiam a morte das células, de preferência a lise de células mediada por CDC e/ou ADCC, que expressam CLD18A2 mas não medeiam a morte de células que expressam CLD18A1 mas não expressam CLD18A2. Os anticorpos descritos acima podem ser utilizados para mediar morte de células tumorais no tratamento ou na prevenção de cancro tal como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar.
Os anticorpos do invento podem ser classificados em classes distintas de acordo com as suas propriedades de ligação e a sua capacidade para mediar a função efetora em células que expressam CLD18. Os anticorpos do invento podem ser classificados de acordo com as suas: - propriedades de ligação a, e/ou funções efetoras mediadas em, células que expressam CLD18A1 ou CLD18A2 (discriminação das variantes de processamento de CLD18), - propriedades de ligação a, e/ou funções efetoras mediadas em, células que expressam variantes de CLD18 glicosiladas ou não glicosiladas (discriminação entre variantes de CLD18 com e sem N-glicosilação), - propriedades de ligação a, e/ou funções efetoras mediadas em, células de cancro ou tipos celulares normais (discriminação entre variantes de CLD18 expressas por células tumorais ou células normais não malignas), - propriedades de ligação a epitopos de CLD18 mascarados pela formação de junções de oclusão, - capacidades para induzir a formação de agregados de CLD18 em células vivas, e - capacidades para se ligarem a uma variante de CLD18 não humana, particularmente variantes de CLD18 de ratinhos, ratos, coelhos e primatas.
Os anticorpos do invento podem ter uma ou mais das seguintes propriedades pelo que é dada referência aos exemplos específicos de anticorpos do invento aqui descritos (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12, ch-16 6E2, ch-175D10) : a) ligação a CLD18A2 bem como a CLD18A1 (p. ex. 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2, e 41C6) b) ligação a CLD18A2 mas não a CLD18A1 (p. ex. 26B5, 37G11, 38G5, 42E12, e 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2, ch- 175D10) c) ligação a CLD18 expressa naturalmente por células tumorais mas não a CLD18 expressa naturalmente por células ou tecidos sem ser de cancro tais como células de estômago e pulmão (p. ex. 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10) d) mediação de morte induzida por CDC de células que expressam CLD18A2 mas não de células que expressam CLD18A1 (p. ex. 26D12, 28D10, 37H8, e 39F11, 163E12, ch-125El, ch-163E12, ch-175D10) e) mediação de morte induzida por ADCC de células que expressam CLD18 (p. ex. 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12, e 61C2, ch-163E12, ch-175D10) f) mediação de morte induzida por ADCC mas não de morte mediada por CDC de células que expressam CLD18 (p. ex. 37G11, 42E12, e 43A11) g) mediação de morte induzida por ADCC e morte induzida por CDC de células que expressam CLD18A2 (p. ex. 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
Tal como aqui exemplificado, os anticorpos do invento englobam ainda moléculas, que: a) se ligam a células diferenciadas de estômago normal, mas não a células estaminais do estômago (p. ex. 39F11) b) não se ligam a tecido gástrico normal bem como outros órgãos normais mas exclusivamente a células de cancro (p. ex. 26B5) c) se ligam a um epitopo englobando um Asn não glicosilado na posição 116 de CLD18 d) se ligam a CLD18 humana bem como de ratinho permitindo realizar exaustivamente estudos de toxicidade pré-clínicos em ratinhos.
Os anticorpos do invento podem ser derivados de diferentes espécies, incluindo mas não limitadas a ratinho, rato, coelho, cobaia e humano. Os anticorpos do invento incluem também moléculas quiméricas nas quais uma região constante do anticorpo derivada de uma espécie, de preferência humano, é combinada com o local de ligação ao antigénio derivado de outra espécie. Além disso, os anticorpos do invento incluem moléculas humanizadas nas quais os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo derivados de uma espécie não humana são combinados com regiões constantes e estruturais de origem humana.
Os anticorpos do invento incluem anticorpos policlonais e monoclonais e incluem anticorpos IgG2a (p. ex. IgG2a, , ),
IgG2b (p. ex. IgG2b, , ), IgG3 (p. ex. IgG3, , ) e IgM. No entanto, outros isotipos de anticorpo são também englobados pelo invento, incluindo anticorpos IgGl, IgAl, IgA2, IgA segregado, IgD, e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros ou podem ser utilizados para gerar seus fragmentos de ligação ao antigénio incluindo, por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadeia simples ou anticorpos biespecificos.
Além disso, os fragmentos de ligação ao antigénio incluem proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina compreendendo (i) um polipéptido de domínio de ligação (tal como uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve) que é fundido com um polipéptido de região charneira de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região charneira, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. Tais proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina são ainda divulgadas em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
De preferência os anticorpos do presente invento dissociam-se de CLD18 com uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) de aproximadamente 1-100 nM ou menos. De preferência, os anticorpos do invento não reagem de forma cruzada com antigénios da superfície celular relacionados e não inibem assim a sua função.
Em concretizações preferidas, os anticorpos do presente invento podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades: a) especificidade para CLD18, em particular especificidade para CLD18A2; b) uma afinidade de ligação a CLD18, em particular CLD18A2, de cerca de 100 nM ou menos, de preferência cerca de 5-10 nM ou menos e, com maior preferência, cerca de 1-3 nM ou menos, c) a capacidade para mediar um nivel elevado de CDC em células negativas para CD55/59 ou positivas para CD55/59; d) a capacidade para inibir o crescimento de células que expressem CLD18; e) a capacidade para induzir apoptose de células que expressem CLD18; f) a capacidade para induzir adesão homotípica de células que expressem CLD18; g) a capacidade para induzir ADCC de células que expressem CLD18 na presença de células efetoras; h) a capacidade para prolongar a sobrevivência de um sujeito possuindo células tumorais que expressem CLD18; i) a capacidade para eliminar células que expressem CLD18; j) a capacidade para eliminar células que expressem níveis baixos de CLD18 e/ou k) a capacidade para agregar CLD18 na superfície de células vivas.
Os anticorpos anti-CLD18 do presente invento podem ser derivatizados, ligados a, ou co-expressos com outras especificidades de ligação. Numa concretização particular, o invento proporciona uma molécula biespecífica ou multiespecífica compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLD18 (p. ex., um anticorpo anti-CLD18 ou seu mimético) , e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efetora, tal como uma especificidade de ligação para um recetor de Fc (p. ex., um recetor de Fc-gama, tal como Fc-gama RI, ou qualquer outro recetor de Fc) ou um recetor de células T, p. ex., CD3.
Consequentemente, o presente invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que se ligam tanto a CLD18 como a um recetor de Fc ou um recetor de células T, p. ex.
CD3. Exemplos de recetores de Fc são recetores de IgG, recetores de Fc-gama (Fc R) , tais como Fc RI (CD64), Fc RII (CD32), e Fc RIII (CD16). Outros recetores de Fc, tais como recetores de IgA (p. ex., Fc RI), podem também ser alvos. 0 recetor de Fc está de preferência localizado na superfície de uma célula efetora, p. ex., um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear ativada. Numa concretização preferida, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas ligam-se a um recetor de Fc num local que é diferente do local de ligação a Fc de imunoglobulina (p. ex., IgG ou IgA) do recetor. Portanto, a ligação das moléculas biespecíficas e multiespecífica não é bloqueada através de níveis fisiológicos de imunoglobulinas.
Em ainda outro aspeto, os anticorpos anti-CLD18 do invento são derivatizados, ligados a, ou co-expressos com outra molécula funcional, p. ex., outro péptido ou proteína (p. ex., um fragmento Fab') . Por exemplo, um anticorpo do invento podem ser funcionalmente ligado (p. ex., através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (p. ex. para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico), uma citotoxina, um ligando celular ou antigénio (p. ex., para produzir um imunoconjugado, tal como uma imunotoxina) . Um anticorpo do presente invento pode ser ligado a outras porções terapêuticas, p. ex., um isótopo radioativo, um fármaco anticanceroso de molécula pequena, uma citocina recombinante ou quimiocina. Consequentemente, o presente invento abrange uma grande variedade de moléculas de conjugado de anticorpo, biespecíficas e multiespecíficas, e proteínas de fusão, as quais se ligam todas a células que expressam CLD18 e que podem ser utilizadas para direccionar outras moléculas para tais células.
Ainda noutro aspeto, o invento proporciona composições, p. ex., composições/estojos farmacêuticos e de diagnóstico, compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável formulado juntamente com um ou uma combinação de anticorpos do invento. Numa concretização particular, a composição inclui uma combinação de anticorpos que se ligam a epitopos distintos ou que possuem características funcionais distintas, tais como indução de CDC e/ou ADCC e indução de apoptose. Nesta concretização do invento, os anticorpos podem ser utilizados em combinação, p. ex., como uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais anti-CLD18. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 possuindo atividades diferentes mas complementares podem ser combinados numa única terapia para alcançar um efeito terapêutico desejado. Numa concretização preferida, a composição inclui um anticorpo anti-CLD18 que medeia CDC combinado com outro anticorpo anti-CLD18 que induz apoptose. Em outra concretização, a composição inclui um anticorpo anti-CLD18 que medeia uma morte altamente eficaz das células alvo na presença de células efetoras, combinado com um outro anticorpo anti-CLD18 que inibe o crescimento de células que expressem CLD18. A presente invenção inclui também a administração simultânea ou sequencial de dois ou mais anticorpos anti-CLD18 do invento, em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo anti-CLD18 quimérico e pelo menos um outro anticorpo é um anticorpo anti-CLD18 humano, os anticorpos ligando-se ao mesmo epitopo ou a epitopos diferentes de CLD18. De preferência, um anticorpo de CLD18 quimérico do invento é administrado primeiro seguido de administração de um anticorpo anti-CLD18 humano do invento, em que o anticorpo anti-CLD18 humano é de preferência administrado durante um período alargado de tempo, i.e. como terapia de manutenção.
Os anticorpos, os imunoconjugados, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas e as composições do presente invento podem ser utilizados numa variedade de métodos para inibir o crescimento de células que expressam CLD18, em particular CLD18A2 e/ou matar seletivamente células que expressam CLD18, em particular CLD18A2 através do contacto das células com uma quantidade eficaz do anticorpo, do imunoconjugado, da molécula biespecífica/multiespecífica ou da composição, de modo a que o crescimento da célula seja inibido e/ou a célula seja morta. Numa concretização, o método inclui a morte da célula que expressa CLD18, opcionalmente na presença de células efetoras, por exemplo, por CDC, apoptose, ADCC, fagocitose, ou por uma combinação de dois ou mais destes mecanismos. Células que expressam CLD18 que podem ser inibidas ou mortas utilizando os anticorpos do invento incluem células de cancro tais como células tumorigénicas do estômago, pancreáticas, esofágicas, de pulmão, ovário, cólon, hepáticas, da cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
Consequentemente, os anticorpos do presente invento podem ser utilizados para tratar e/ou prevenir uma variedade de doenças envolvendo células que expressam CLD18 através da administração dos anticorpos a pacientes sofrendo de tais doenças. Exemplos de doenças que podem ser tratadas (p. ex., melhoradas) ou prevenidas, incluem, mas não se limitam a, doenças tumoriqénicas. Exemplos de doenças tumorigénicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem cancro gástrico, cancro pancreático, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro colorretal, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço, e cancro da vesícula biliar.
Numa concretização particular do invento, o sujeito ao qual é administrado o anticorpo é adicionalmente ser tratado com um agente quimioterapêutico, radiação ou um agente que module, p. ex., aumente ou iniba a expressão ou atividade de um recetor de Fc, p. ex., um recetor de Fc-gama, tal como uma citocina. Citocinas típicas para administração durante o tratamento incluem fator estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão- (IFN- ), e fator de necrose tumoral (TNF). Agentes terapêuticos típicos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos tais como doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluorouracilo, metotrexato, gemzitabina e ciclofosfamida.
Os anticorpos do presente invento são obteníveis através de uma estratégia de imunização para imunizar animais não humanos, tais como ratinhos, com CLD18 humana ou um seu fragmento peptídico, de preferência CLD18A2 ou um seu fragmento peptídico, para obter anticorpos. Os péptidos preferidos para imunização são os selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31. Consequentemente, em concretizações preferidas, os anticorpos do invento são aqueles obtidos através de imunização utilizando péptidos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31. De modo análogo, anticorpos para CLD18 podem ser gerados num animal transgénico não humano, tal como um ratinho transgénico. O animal transgénico não humano pode ser um ratinho transgénico possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve codificando todo ou uma porção de um anticorpo.
Animais de tipo selvagem bem como transgénicos não humanos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio de CLD18 e/ou ácidos nucleicos e/ou células que expressam CLD18 ou um seu fragmento peptidico. De preferência, o animal não humano é capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 (p. ex. , IgG, IgA e/ou IgM) através da sujeição a recombinação de V-D-J e a mudança de isotipo. A mudança de isotipo pode ocorrer através p. ex., de mudança do isotipo clássica ou não clássica. Células B isoladas obtidas de um animal não humano tal como descrito acima podem depois ser imortalizadas através de fusão com uma célula imortalizada para proporcionar uma fonte (p. ex., um hibridoma) de anticorpos do invento. Tais hibridomas (isto é, que produzem os anticorpos do invento) estão também incluídos dentro do âmbito do invento.
Tal como aqui exemplificado, os anticorpos do invento podem ser obtidos diretamente a partir de hibridomas que expressem o anticorpo, ou podem ser clonados e expressos de forma recombinante numa célula hospedeira (p. ex. , uma célula CHO, ou uma célula linfocítica). Outros exemplos de células hospedeiras são microorganismos, tais como E. coli, e fungos, tais como levedura. Alternativamente, podem ser produzidos de forma recombinante num animal transgénico não humano ou planta. Células de hibridoma para a produção de anticorpos aqui descritos são aquelas sequenciadas ou depositadas em DSMZ (Mascheroder Weg lb, 31824 Braunschweig, Alemanha; novo endereço: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemanha) com as seguintes designações e números de acesso: a. 182-D1106-055, n.2 de acesso DSM ACC2737, depositada a 19 de Outubro de 2005 b. 182-D1106-056, n.2 de acesso DSM ACC2738, depositada a 19 de Outubro de 2005 c. 182-D1106-057, n.2 de acesso DSM ACC2739, depositada a 19 de Outubro de 2005 d. 182-D1106-058, n.2 de acesso DSM ACC2740, depositada a 19 de Outubro de 2005 e. 182-D1106-059, n.2 de acesso DSM ACC2741, depositada a 19 de Outubro de 2005 f. 182-D1106-062, n.2 de acesso DSM ACC2742, depositada a 19 de Outubro de 2005, g. 182-D1106-067, n.2 de acesso DSM ACC2743, depositada a 19 de Outubro de 2005 h. 182-D758-035, n.2 de acesso DSM ACC2745, depositada a 17 de Novembro de 2005 i. 182-D758-036, n.2 de acesso DSM ACC2746, depositada a 17 de Novembro de 2005 j. 182-D758-040, n.2 de acesso DSM ACC2747, depositada a 17 de Novembro de 2005 k. 182-D1106-061, n.2 de acesso DSM ACC2748, depositada a 17 de Novembro de 2005 l. 182-D1106-279, n.2 de acesso DSM ACC2808, depositada a 26 de Outubro de 2006 m. 182-D1106-294, n.2 de acesso DSM ACC2809, depositada a 26 de Outubro de 2006, n. 182-D1106-362, n.2 de acesso DSM ACC2810, depositada a 26 de Outubro de 2006.
Anticorpos do invento preferidos são aqueles produzidos através, e obteníveis a partir dos hibridomas acima descritos; i.e. 37G11 no caso de 182-D1106-055, 37H8 no caso de 182-D1106-056, 38G5 no caso de 182-D1106-057, 38H3 no caso de 182-D1106-058, 39F11 no caso de 182-D1106-059, 43A11 no caso de 182- D1106-062, 61C2 no caso de 182-D1106-067, 26B5 no caso de 182- D758-035, 26D12 no caso de 182-D758-036, 28D10 no caso de 182- D758-040, 42E12 no caso de 182-D1106-061, 125E1 no caso de 182-D1106-279, 163E12 no caso de 182-D1106-294, e 175D10 no caso de 182-D1106-362; e as suas formas tornadas quiméricas e humanizadas.
Em concretizações preferidas, os anticorpos, em particular as formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia pesada humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 ou 150. Noutras concretizações preferidas, os anticorpos, em particular formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia leve (CL) compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia leve humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 ou 148. Numa concretização particularmente preferida, os anticorpos, em particular as formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos que compreendem uma CH compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma CH humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 e que compreende uma CL compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma CL humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 .
Uma CH compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 45. Uma CH compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 150 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 149. Uma CL compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 40. Uma CL compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 148 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 147.
As formas tornadas quiméricas de anticorpos podem incluir anticorpos compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, e um seu fragmento e/ou compreendendo uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, e um seu fragmento.
Os anticorpos do presente invento incluem anticorpos compreendendo uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129. "Fragmento" ou "fragmento de uma sequência de aminoácidos" tal como utilizado acima refere-se a uma parte de uma sequência de anticorpo, i.e. uma sequência que representa a sequência de anticorpo encurtada no terminal N e/ou C, que quando substitui a referida sequência de anticorpo num anticorpo mantém a ligação do referido anticorpo a CLD18 e de preferência as funções do referido anticorpo tal como aqui descrito, p. ex. lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.
De preferência, um fragmento de uma sequência de aminoácidos compreende pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácidos da referida sequência de aminoácidos. Um fragmento de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, e 129 refere-se de preferência à referida sequência em que 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos no terminal N são removidos. Fragmentos das sequências de aminoácidos aqui descritas podem ser codificados pelos respetivos fragmentos das sequências de ácido nucleico codificando as referidas sequências de aminoácidos.
Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 100. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 101. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 102. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 104. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 103. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 105.
Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 107. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 106. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 108. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 111. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 110. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 109. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 112. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 113. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 114.
Um anticorpo do invento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137.
Um anticorpo do invento compreende uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146.
Um anticorpo do invento compreende uma combinação da região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145, (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146.
Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 55. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 56. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 57. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 59. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 58. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 60.
Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 62. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 61. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 63. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 66. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 65. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 64. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 67. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 68. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 69.
Um anticorpo do invento compreende uma VH compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (vi): (i) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115,
(ii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, (iii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, (iv) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições
70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, (v) CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, e (vi) CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120.
Um anticorpo do invento compreende uma VL compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (ix): (i) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76- 78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (ii) CDRl: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições
71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (iii) CDRl: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições
70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (v) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (vii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições
70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Um anticorpo do invento compreende uma combinação de VH e VL compreendendo, cada uma, um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (ix) : (i) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1 : posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2 : posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1 : posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2 : posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições
69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2 : posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Um anticorpo do invento compreende de preferência uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a região variável CDR3, da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18, de preferência de um anticorpo monoclonal contra CLD18 aqui descrito, e compreende de preferência uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a região variável CDR3, das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) aqui descritas. Numa concretização a referida uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) são selecionadas a partir de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 aqui descritas. Numa concretização particularmente preferida, um anticorpo do invento compreende de preferência as regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18, de preferência de um anticorpo monoclonal contra CLD18 aqui descrito, e compreende de preferência as regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) aqui descritas.
Um anticorpo do invento compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDR ou a combinação de conjuntos de CDR tal como aqui descrito compreende as referidas CDR juntamente com as suas regiões estruturais intervenientes. De preferência, a porção incluirá também pelo menos cerca de 50% de uma ou ambas da primeira e quarta regiões estruturais, sendo os 50% os 50% C-terminais da primeira região estrutural e os 50% N-terminais da quarta região estrutural. A construção de anticorpos do presente invento produzidos através de técnicas de ADN recombinante pode resultar na introdução de resíduos N ou C-terminais às regiões variáveis codificadas por ligadores introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação, incluindo a introdução de ligadores para unir regiões variáveis do invento a outras sequências proteicas incluindo cadeia pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou marcadores proteicos .
Um anticorpo do invento compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDR ou a combinação de conjuntos de CDR tal como aqui descrito compreende as referidas CDR numa estrutura de anticorpo humana. A referência aqui a um anticorpo compreendendo em relação à sua cadeia pesada uma determinada cadeia, ou uma determinada região ou sequência refere-se, de preferência, à situação em que todas as cadeias pesadas do referido anticorpo compreendem a referida cadeia, região ou sequência particular. Isto aplica-se correspondentemente à cadeia leve de um anticorpo. O presente fascículo também descreve ácidos nucleicos compreendendo genes ou sequências de ácido nucleico codificando anticorpos ou suas partes, p. ex. uma cadeia de anticorpo, tal como aqui descrito. Os ácidos nucleicos podem estar compreendidos num vetor, p. ex., um plasmideo, cosmideo, virus, bacteriófago ou outro vetor utilizado p. ex. convencionalmente em engenharia genética. 0 vetor pode compreender outros genes tais como genes marcadores que permitam a seleção do vetor numa célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vetor pode compreender elementos de controlo da expressão permitindo a expressão correta das regiões de codificação em hospedeiros adequados. Tais elementos de controlo são conhecidos dos peritos e podem incluir um promotor, uma cassete de processamento, e um codão de iniciação da tradução. 0 ácido nucleico pode estar operativamente ligado às sequências de controlo da expressão de cima que permitem a expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Os elementos de controlo assegurando a expressão em células eucarióticas ou procarióticas são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Os métodos para construção de moléculas de ácido nucleico, para construção de vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico de cima, para introdução dos vetores em células hospedeiras escolhidas de forma apropriada, para causar ou alcançar a expressão são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Outras caracteristicas e vantagens do presente invento tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra uma análise de imunofluorescência de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 ligadas a um fluorocromo verde e feitas reagir com soro de ratinho após imunização com ADN com SEQ ID NO: 15 fundida com um epitopo ajudante. A Fig. 2 mostra uma análise Western blot de células HEK293 transfectadas com CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3) e células HEK293 não transfectadas com o anticorpo monoclonal anti-c-myc de ratinho 9E11 (Serotec, CRL MCA2200). A Fig. 3 mostra uma análise de imunofluorescência utilizando células CHO transfectadas com CLD18A2 e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000).
As Fig. 4A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 24H5 e 85A3 a células HEK293 transfectadas transientemente com CLD18A2 humana e um marcador fluorescente tal como determinado através de citometria de fluxo. A Figura 4C mostra a ligação de sobrenadantes de hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 a células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana e contrastadas com iodeto de propidio. A Fig. 5 mostra a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 2 4H5 (A), 9E8 (B) , 26B5 (C) e 19B9 (D) a células HEK293 transfectadas transientemente com um marcador fluorescente e CLD18A2 humana ou CLD18A2-Myc ou CLD18A2-HA tal como analisado através de citometria de fluxo.
As Fig. 6A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 e 163E12 a células HEK293 transfectadas estavelmente com CLD18A2 ou CLD18A1 humana, tal como determinado através de citometria de fluxo. A Fig. 7 mostra uma análise de imunofluorescência do anticorpo monoclonal especifico da isoforma CLD18A2, 37G11, através da coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D), respetivamente, sob condições nativas (A, B) e de fixação com paraformaldeido (C, D). A Fig. 8 mostra uma análise de imunofluorescência do anticorpo monoclonal de CLD18, 26B5, através de coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D), respetivamente, sob condições nativas (A, B) e de fixação com paraformaldeido (C, D).
Fig. 9. RT-PCR de linhas celulares. A análise de RT-PCR com iniciadores específicos de CLD18A2 mostrou uma expressão clara em 4/5 das linhas celulares testadas. A Fig. 10 mostra uma análise de imunofluorescência de células DAN-G (subclone F2) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 11 mostra uma análise de imunofluorescência de células KATO-III (subclone 3B9 4D5) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 12A mostra uma análise de imunofluorescência de células SNU-16 (subclone G5) com um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 12 B mostra uma análise de imunofluorescência de células KATO-III com anticorpos monoclonais do invento. A Fig. 13 mostra expressão na superfície de CLD18 em células KATO-III e NUGC-4 analisada através da coloração das células com os anticorpos monoclonais 61C2 e 163E12 seguida de análise de citometria de fluxo.
Fig. 14. Alinhamento de proteínas de CLD18A1 humana (NP_057453), CLD18A2 humana (NP_001002026), CLD18A1 de ratinho (NP_062789) e CLD18A2 de ratinho (AAL15636) .
As Fig. 15 A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1, e 163E12, respetivamente, a células HEK293 transfectadas transientemente com um marcador fluorescente e CLD18A1 de murideo ou CLD18A2 de murideo tal como analisado através de citometria de fluxo.
Fig. 16. Análises imuno-histoquímicas com o AB policlonal pl05. As colorações imuno-histoquímicas num subconjunto de tecidos normais (estômago, pulmão, medula óssea e próstata) confirmam a especificidade do tecido gástrico (A) . A expressão foi também detetada em carcinomas de estômago (linha superior) e carcinomas de pulmão (B) . Apenas as células diferenciadas mas não as células estaminais expressam CLD18A2 (C). FIG. 17. Análises imuno-histoquímicas com o AB monoclonal 39F11D7 (A) Expressão proteica específica foi detetada em mucosa normal do estômago, enquanto todos os outros tecidos normais testados foram negativos. (B) Forte expressão de CLD18A2 foi verificada em carcinomas de estômago e pulmão.
Fig. 18. Análises imuno-histoquímicas com os AB monoclonais 26B5 (A), 175D10 (B) , 43A11 (C) , 163E12 (D), e 45C1 (E) . Todos os anticorpos mostram forte coloração de tumores de xenoenxertos HEK293-CLD18A2 e espécimenes de cancros gástricos, mas não tumores transfectados de controlo HEK2 93-Simulado. A Fig. 19 é um gráfico comparando a percentagem de células mortas após indução de CDC por 85A3, 28D10, 24H5, ou 26D12 contra células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana utilizando citometria de fluxo. A Fig. 20 é um gráfico comparando a percentagem de lise celular especifica após indução de CDC por 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, ou 61C2 contra células CHO aderentes estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana ou CLD18A1 humana tal como determinado através de medição de fluorescência. A Fig. 21 mostra indução de CDC dependente da concentração contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana por 75B8 (A), 28D10 (B), ou 37H8 (C) tal como determinado através de medição de fluorescência. A Fig. 22 mostra a lise de células HEK293-CLD18A2 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2, respetivamente, na presença de MNC. A Fig. 23 mostra a lise de células HEK293-CLD18A1 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2, respetivamente, na presença de MNC. A Fig. 24 mostra inibição do crescimento tumoral por anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce com células HEK293-CLD18A2.
As Fig. 25A e B mostram a sobrevivência prolongada através do tratamento com anticorpos do invento em dois modelos de xenoenxerto de tratamento precoce com células HEK293-CLD18A2. A Fig. 26 mostra o prolongamento da sobrevivência através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento avançado com células HEK293-CLD18A2. A Fig. 27A mostra inibição do crescimento tumoral através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce. A Fig. 27B mostra prolongamento da sobrevivência através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce. Foram utilizadas células DAN-G que expressam CLD18A2 endogenamente. A Fig. 28 mostra a expressão de ARNm de CLD18A2 em tecidos de ratinho. Investigações de RT-PCR com iniciadores específicos de CLD18A2 não mostraram expressão significativa em nenhum dos tecidos normais exceto do estômago. Foram analisados os seguintes tecidos normais: 1: intestino delgado, 2: baço, 3: pele, 4: estômago, 5: pulmão, 6: pâncreas, 7: nódulo linfático, 8: timo, 9: controlo negativo A Fig. 29 mostra expressão de CLD18 em estômago normal. Análise imuno-histoquímica com anticorpo específico de CLD18 de estômago de ratinho revela um padrão de expressão conservado. Enquanto o epitélio superficial e as criptas mais internas expressam CLD18 na sua superfície celular, a região central do pescoço é negativa para CLD18. A Fig. 30 mostra coloração de hematoxilina e eosina de tecidos do estômago de ratinhos. É mostrado em perspetiva geral (A) e em detalhe (B) o estômago de um ratinho tratado com 37G11 em comparação com um ratinho de controlo (C e D) , que foi tratado apenas com PBS.
As Fig. 31A e B mostram coloração de citometria de fluxo de células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A1 e A2 humanas, respetivamente, bem como células KATO-III que expressam endogenamente com anticorpos do invento (43A11, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10). A Fig. 32 mostra CDC em células que expressam CLD18A2 mediada por anticorpos quiméricos do invento. A Fig. 33 mostra ADCC em células KATO-III mediada por anticorpos quiméricos do invento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente a um epitopo presente em CLD18. Anticorpos monoclonais isolados englobados pelo presente invento incluem anticorpos IgA, IgGl-4, IgE, IgM, e IgD. Numa concretização, o anticorpo é um anticorpo IgGl, mais particularmente um isotipo IgGl, capa ou IgGl, lambda. Noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgG3, mais particularmente um isotipo IgG3, capa ou IgG3, lambda. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgG4, mais particularmente um isotipo IgG4, capa ou IgG4, lambda. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgAl ou IgA2. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgM.
Numa concretização, o invento refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a células que expressam CLD18 e de preferência (i) ligam-se a células que expressam CLD18A2, e (ii) não se ligam a células que não expressam CLD18A2 mas expressam CLD18A1. Os anticorpos do invento de preferência (i) medeiam a morte de células que expressam CLD18A2, e (ii) não medeiam a morte de células que não expressam CLD18A2 mas que expressam CLD18A1.
Noutra concretização, o invento refere-se a anticorpos que (i) se ligam a células tumorais que expressam CLD18, (ii) não se ligam a células que expressam CLD18 de mucosa de estômago normal, e/ou (iii) não se ligam a células que expressam CLD18 de tecido de pulmão sem ser de cancro. 0 invento inclui também anticorpos que (i) medeiam a morte de células tumorais que expressam CLD18, (ii) não medeiam a morte de células que expressam CLD18 de mucosa de estômago normal, e/ou (iii) não medeiam a morte de células que expressam CLD18 de tecido de pulmão sem ser cancro.
Em concretizações particulares, os anticorpos do invento (i) ligam-se a um epitopo em CLD18A2 que não está presente em CLD18A1, de preferência SEQ ID NO: 21, 22 e 23, (ii) ligam-se a um epitopo localizado na voltai de CLD18A2 (CLD18A2-voltal), de preferência SEQ ID NO: 28, (iii) ligam-se a um epitopo localizado na voltaD3 de CLD18A2 (CLD18A2-voltaD3) , de preferência SEQ ID NO: 31, (iv) ligam-se a um epitopo, que engloba a voltai de CLD18A2 e a voltaD3 de CLD18A2, (v) ligam-se a um epitopo não glicosilado localizado na voltaD3 de CLD18A2, de preferência SEQ ID NO: 29, ou (vi) ligam-se a um epitopo presente em CLD18 humana e de ratinho (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respetivamente).
Em concretizações particularmente preferidas, os anticorpos do invento ligam-se a um epitopo em CLD18A2 que não está presente em CLD18A1.
Os anticorpos do invento incluem anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos num animal transgénico não humano, p. ex., um ratinho transgénico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 através da sujeição a recombinação homóloga de V-D-J e mudança de isotipo. Tal animal transgénico pode também ser um coelho transgénico para produção de anticorpos policlonais tal como divulgado em US 2003/0017534. A ligação de um anticorpo do invento ao antigénio CLD18 pode mediar a morte de células que expressam CLD18 (por exemplo uma célula tumoral), por exemplo, por ativação do sistema do complemento. A morte de células que expressam CLD18 pode ocorrer através de um ou mais dos seguintes mecanismos: citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de células que expressam CLD18; apoptose de células que expressam CLD18; fagocitose por células efetoras de células que expressam CLD18; ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras de células que expressam CLD18.
Para que o presente invento possa ser mais facilmente compreendido, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são expostas ao longo da descrição detalhada.
DEFINIÇÃO DOS TERMOS O termo "CLD18" refere-se a claudina-18 e inclui quaisquer variantes, incluindo CLD18A1 e CLD18A2, conformações, isoformas e homólogos de espécie de CLD18 que sejam naturalmente expressos por células ou sejam expressos por células transfectadas com o gene de CLD18. De preferência, "CLD18" refere-se a CLD18 humana, em particular CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) e/ou CLD18A1 (SEQ ID NO: 7, 8), com maior preferência CLD18A2. 0 termo "CLD18A1" inclui variantes modificadas após a tradução, isoformas e homólogos de espécie de CLD18A1 humana que sejam expressos naturalmente por células ou sejam expressos em células transfectadas com o gene de CLD18A1. 0 termo "CLD18A2" inclui variantes modificadas após a tradução, isoformas e homólogos de espécie de CLD18A2 humana que sejam expressos naturalmente por células ou sejam expressos em células transfectadas com o gene de CLD18A2. A expressão "variante de CLD18" deve englobar (i) variantes de processamento de CLD18, (ii) variantes de CLD18 modificadas após a tradução, particularmente incluindo variantes com diferente estados de N-glicosilação, (i i i) variantes de conformação de CLD18, particularmente incluindo CLD18-conformação-l, CLD18-conformação-2 e CLD18-conformação-3, (iv) variantes de CLD18 livres e homotipicamente/ heterotipicamente associadas localizadas em junções de oclusão intercelulares, (v) variantes de CLD18 relacionadas com cancro e de CLD18 não relacionadas com cancro. 0 termo "jangada" refere-se aos microdominios membranares ricos em esfingolipidos e colesterol localizados na área do folheto externo da membrana plasmática de uma célula. A capacidade de certas proteínas para se associarem dentro de tais domínios e a sua capacidade de formação de "agregados" ou "agregados focais" podem efetuar a função das proteínas. Por exemplo, a translocação de moléculas CLD18 para tais estruturas, após serem ligadas a anticorpos do presente invento, cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo de CLD18 nas membranas plasmáticas. Tal elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo de CLD18 pode permitir a ativação eficiente do sistema do complemento durante a CDC.
Os termos "conformação" e "topologia" descrevem como uma molécula membranar integral se posiciona na membrana da superfície celular, e, em particular, quais das suas regiões são extracelulares e assim elegíveis para anticorpos. CLD18 pode por exemplo existir em três conformações diferentes, que muito provavelmente dependem de se é prevalente como homómeros ou heterómeros e de se está integrada em estruturas supramoleculares de junção de oclusão ou "livre". Estes diferentes estados resultam em diferentes epitopos elegíveis para anticorpos.
De acordo com o invento, o termo "doença" refere-se a qualquer estado patológico, incluindo cancro, em particular as formas de cancro aqui descritas.
Por "tumor" entenda-se um grupo anormal de células ou tecido que cresce através de uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer após cessar o estímulo que iniciou o novo crescimento. Os tumores mostram uma falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e formam geralmente uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna ou maligna.
Por "metástase" entenda-se a propagação de células de cancro a partir do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende do desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade do corpo e vasos e, em seguida, após ser transportada pelo sangue, infiltração dos órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogénese. A metástase tumoral ocorre frequentemente mesmo após a remoção do tumor primário, porque podem permanecer células ou componentes tumorais e desenvolverem potencial metastático. Numa concretização, o termo "metástase" de acordo com o invento refere-se a "metástase distante" que se refere a uma metástase remota do tumor primário e do sistema de nódulos linfáticos regionais. A expressão "tratamento de uma doença" inclui cura, encurtamento da duração, melhoria, prevenção, abrandamento ou inibição da progressão ou agravamento, ou prevenção ou retardamento do aparecimento de uma doença ou dos seus sintomas.
De acordo com o invento, uma amostra pode ser gualguer amostra útil de acordo com o presente invento, em particular uma amostra biológica tal como uma amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e/ou uma amostra celular e pode ser obtida de um modo convencional tal como através de biopsia de tecidos, incluindo biopsia de punção, e tomada de sangue, aspirado brônguico, escarro, urina, fezes e outros fluidos corporais. De acordo com o invento, a expressão "amostra biológica" inclui também frações de amostras biológicas. 0 termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas através de ligações dissulfureto, ou uma sua porção de ligação ao antigénio. 0 termo "anticorpo" inclui também todas as formas recombinantes de anticorpos, em particular dos anticorpos agui descritos, p. ex., anticorpos expressos em procariotas, anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos e derivados de anticorpo de ligação ao antigénio tal como descrito abaixo. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (p. ex., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se a uma molécula possuindo um local de ligação ao antigénio que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula se baseia na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação ao antigénio pode compreender domínios variáveis completos fundidos com domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação ao antigénio podem ser de tipo selvagem ou modificados através de uma ou mais substituições de aminoácidos, p. ex. modificados para se assemelharem mais a imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados conservam todas as sequências CDR (por exemplo um anticorpo de ratinho humanizado que contenha todas as seis CDR do anticorpo de ratinho). Outras formas têm uma ou mais CDR que são alteradas em relação ao anticorpo original. A expressão "anticorpo quimérico" refere-se aqueles anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe, enquanto o restante segmento da cadeia é homólogo às sequências correspondentes noutra. Tipicamente a região variável tanto das cadeias leves como das pesadas imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto as porções constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivados de outra. Uma clara vantagem para tais formas quiméricas é que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes presentemente conhecidas utilizando facilmente células B ou hibridomas disponíveis a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Enquanto a região variável tem a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não é afetada pela fonte, a região constante sendo humana, tem menor probabilidade de induzir uma resposta imunitária de um sujeito humano quando os anticorpos são injetados do que a região constante de uma fonte não humana. No entanto, a definição não está limitada a este exemplo particular. A expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação"), tal como aqui se utiliza, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antigénio. Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação englobados na expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados através de uma ponte dissulfureto na região charneira; (iii) fragmentos Fd consistindo nos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consistem num domínio VH; (vi) regiões determinantes de complementaridade (CDR) isoladas; e (vii) combinações de duas ou mais CDR isoladas que podem ser opcionalmente unidas através de um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, através de um ligador sintético que permite que sejam produzidos como uma única cadeia proteica em que as regiões VL e VH emparelhem para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, p. ex., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia simples estejam englobados na expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Outro exemplo são proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina compreendendo (i) um polipéptido domínio de ligação que é fundido com um polipéptido região charneira de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região charneira, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. 0 polipéptido domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina são ainda divulgadas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são pesquisados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. O termo "epitopo" significa um determinante proteico capaz de se ligar a um anticorpo, em que o termo "ligação" aqui refere-se de preferência a uma ligação específica. Os epitopos consistem habitualmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como os aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e possuem geralmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos por a ligação ao primeiro, mas não ao último se perder na presença de solventes de desnaturação. A expressão "epitopo descontínuo" tal como aqui utilizada, significa um epitopo conformacional num antigénio proteico que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína.
Na expressão "molécula biespecífica" pretende-se incluir qualquer agente, p. ex., uma proteína, um péptido ou complexo proteico ou peptídico, que tenha duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, e (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora. Na expressão "molécula multiespecífica" ou "molécula heteroespecífica" pretende-se incluir qualquer agente, p. ex., uma proteína, um péptido, complexo proteico ou peptídico, que tenha mais de duas especificidade de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora, e (c) pelo menos um outro componente. Consequentemente, o invento inclui, mas não está limitado a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas, e outras multiespecíficas que se dirigem a CLD18, e a outros alvos, tais como recetores de Fc em células efetoras. A expressão "anticorpos biespecíficos" inclui também diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos em que os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptídica, mas utilizando um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver p. ex., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). O invento inclui também derivados dos anticorpos aqui descritos. A expressão "derivados de anticorpo" refere-se a qualquer forma modificada de um anticorpo, p. ex., um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. Tal como aqui utilizado, um anticorpo é "derivado de" uma determinada sequência da linha germinativa se o anticorpo for obtido a partir de um sistema através de imunização de um animal ou através de pesquisa de uma biblioteca de genes de imunoglobulina, e em que o anticorpo selecionado é pelo menos 90%, com maior preferência pelo menos 95%, ainda de preferência pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo derivado de uma determinada sequência da linha germinativa não apresentará mais de 10 diferenças de aminoácidos, de preferência não mais de 5, ou mesmo com maior preferência não mais de 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa.
Tal como aqui utilizado, o termo "heteroanticorpos" refere-se a dois ou mais anticorpos, seus derivados, ou regiões de ligação ao antigénio ligados entre si, pelo menos dois dos quais têm especificidades diferentes. Estas especificidades diferentes incluem a especificidade de ligação a um recetor de Fc numa célula efetora, e a especificidade de ligação a um antigénio ou epitopo numa célula alvo, p. ex., uma célula tumoral.
Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos humanos. Na expressão "anticorpo humano", tal como aqui utilizada, pretende-se incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos do invento podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (p. ex., mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou através de mutação somática in vivo) . A expressão "anticorpo monoclonal", tal como aqui se utiliza, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epitopo. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano, p. ex., ratinho, fundida com uma célula imortalizada. A expressão "anticorpo recombinante", tal como aqui utilizada, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (p. ex., um ratinho) que seja transgénico ou transcromossómico em relação aos genes de imunoglobulina ou a um hibridoma preparado a partir deles, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, p. ex., a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva união de sequências génicas de imunoglobulina com outras sequências de ADN. 0 termo "transfectoma", tal como aqui utilizado, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetais, ou células fúngicas incluindo leveduras.
Tal como aqui se utiliza, um "anticorpo heterólogo" é definido em relação a um organismo transgénico produtor de um tal anticorpo. Esta expressão refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de codificação de ácido nucleico correspondendo à verificada num organismo não consistindo no organismo transgénico, e sendo geralmente derivado de uma espécie diferente da do organismo transgénico.
Tal como aqui utilizado, um "anticorpo hetero-híbrido" refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas com origem em diferentes organismos. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murideo é um anticorpo hetero-híbrido.
Os anticorpos aqui descritos são de preferência isolados. Um "anticorpo isolado" tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigénicas (p. ex., um anticorpo isolado que se liga especificamente a CLD18 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios diferentes de CLD18). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, uma isoforma ou variante de CLD18 humana pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antigénios aparentados, p. ex., de outras espécies (p. ex., homólogos específicos de CLD18). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos. Numa concretização do invento, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" refere-se a anticorpos possuindo diferentes especificidades e sendo combinados numa composição bem definida.
De acordo com o invento, o termo "ligação" refere-se de preferência a "ligação específica". Tal como aqui utilizado, "ligação específica" refere-se à ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade correspondendo a uma KD de cerca de lxlCh7 M ou menos, e liga-se ao antigénio predeterminado com uma afinidade correspondendo a uma KD que é pelo menos duas ordens de grandeza inferior à sua afinidade para ligação a um antigénio não específico (p. ex., BSA, caseína) além do antigénio predeterminado ou um antigénio intimamente aparentado. 0 termo "KD" (Μ) , tal como aqui utilizado, pretende referir a constante de dissociação em equilíbrio de uma determinada interação anticorpo-antigénio .
Tal como aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe do anticorpo (p. ex., IgM ou IgGl) que é codificada por genes da região constante da cadeia pesada.
Tal como aqui utilizado, "mudança de isotipo" refere-se ao fenómeno através do qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig. A expressão "de ocorrência natural" tal como aqui utilizada aplicada a um objeto refere-se ao facto de um objeto poder ser verificado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que esteja presente num organismo (incluindo vírus) que possa ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório, é de ocorrência natural. 0 termo "rearranjado" tal como aqui utilizado refere-se a uma configuração de um locus de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação codificando essencialmente um domínio VH ou VL completo, respetivamente. Um locus de um gene de imunoglobulina (anticorpo) rearranjado pode ser identificado através de comparação com o ADN da linha germinativa; um locus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia heptâmero/nonâmero recombinado.
As expressões "não rearranjado" ou "configuração da linha germinativa" tal como aqui utilizadas em referência a um segmento V referem-se à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
Na expressão "molécula de ácido nucleico", tal como aqui utilizada, pretende-se incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é ADN de cadeia dupla.
Os ácidos nucleicos descritos de acordo com o invento foram, de preferência, isolados. A expressão "ácido nucleico isolado" significa de acordo com o invento que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo através de reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido de forma recombinante através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo através de clivagem e fracionamento por eletroforese em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, através de síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação através de técnicas de ADN recombinante.
Os ácidos nucleicos podem, de acordo com o invento, estar presentes sozinhos ou em combinação com outros ácidos nucleicos, que podem ser homólogos ou heterólogos. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controlo da expressão que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao referido ácido nucleico. 0 termo "homólogo" significa que um ácido nucleico está também funcionalmente ligado naturalmente à sequência de controlo da expressão e o termo "heterólogo" significa que um ácido nucleico não está funcionalmente ligado naturalmente à sequência de controlo expressão.
Um ácido nucleico, tal como um ácido nucleico que expressam ARN e/ou proteína ou péptido, e uma sequência de controlo da expressão estão "funcionalmente" ligados um ao outro, se estiverem covalentemente ligados um ao outro de modo a que a expressão ou transcrição do referido ácido nucleico esteja sob o controlo ou sob a influência da referida sequência de controlo da expressão. Se o ácido nucleico for para se traduzir numa proteína funcional, então, com uma sequência de controlo da expressão funcionalmente ligada a uma sequência de codificação, a indução da referida sequência de controlo da expressão resulta em transcrição do referido ácido nucleico, sem causar uma mudança de enquadramento na sequência de codificação ou que a referida sequência de codificação não seja capaz de ser traduzida na proteína ou no péptido desejado. A expressão "sequência de controlo da expressão" compreende de acordo com o invento, promotores, locais de ligação ao ribossoma, estimuladores e outros elementos de controlo que regulam a transcrição de um gene ou a tradução de um ARNm. Em concretizações particulares do invento, as sequências de controlo da expressão podem ser reguladas. A estrutura exata das sequências de controlo da expressão pode variar em função da espécie ou do tipo celular, mas geralmente compreende sequências não transcritas a 5' e não traduzidas a 5' e a 3' que estão envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, respetivamente, tal como a caixa TATA, sequência de remate (capping) e a sequência CAAT. Mais especificamente, as sequências de controlo da expressão não transcritas a 5' compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controlo da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligado. As sequências de controlo da expressão podem também compreender sequências estimuladoras ou sequências activadoras a montante.
De acordo com o invento, o termo "promotor" ou "região promotora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que está localizada a montante (5') da sequência de ácido nucleico a expressar e controla a expressão da sequência ao proporcionar um local de reconhecimento e local de ligação para ARN-polimerase. A "região promotora" pode incluir mais locais de reconhecimento e ligação para outros fatores que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser "indutível" e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser "constitutivo" se a transcrição não for controlada através de um agente indutor. Um gene que está sob o controlo de um promotor indutível não é expresso ou é apenas expresso numa pequena extensão se estiver ausente um agente indutor. Na presença do agente indutor o gene é ligado ou o nível de transcrição é aumentado. Isto é mediado, em geral, pela ligação de um fator de transcrição específico.
Promotores que são preferidos acordo com o invento incluem promotores para a polimerase SP6, T3 e T7, promotor do ARN U6 humano, promotor de CMV e promotores seus híbridos artificiais (p. ex. CMV) onde uma parte ou partes são fundidas com uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares tais como p. ex. GAPDH humana (gliceraldeído-3- fosfato-desidrogenase), e incluindo ou não incluindo um ou mais intrões adicionais.
De acordo com o invento, o termo "expressão" é utilizado no seu sentido mais geral e compreende a produção de ARN ou de ARN e proteina/péptido. Compreende também a expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser realizada transientemente ou estavelmente.
Numa concretização preferida, uma molécula de ácido nucleico está, de acordo com o invento, presente num vetor, quando apropriado com um promotor, que controla a expressão do ácido nucleico. 0 termo "vetor" é aqui utilizado no seu sentido mais geral e compreende qualquer veiculo intermediário para um ácido nucleico que permite que o referido ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procarióticas e/ou eucarióticas e, quando apropriado, seja integrado num genoma. Vetores deste tipo são de preferência replicados e/ou expressos nas células. Os vetores compreendem plasmideos, fagemideos, bacteriófagos ou genomas virais. 0 termo "plasmídeo" tal como aqui utilizado refere-se geralmente a uma construção de material genético extracromossómico, habitualmente um dúplex de ADN circular, que se pode replicar independentemente do ADN cromossómico.
Como vetor para expressão de um anticorpo, pode ser utilizado um tipo de vetor em que a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo estão presentes em diferentes vetores ou um tipo de vetor em que a cadeia pesada e a cadeia leve estão presentes no mesmo vetor. 0 ensinamento aqui dado em relação a sequências de ácido nucleico e de aminoácidos especificas, p. ex. aquelas mostradas na listagem de sequências, deve ser entendido como se relacionando também a modificações das referidas sequências especificas resultando em sequências que sejam funcionalmente equivalentes às referidas sequências especificas, p. ex. sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou semelhantes às da sequências de aminoácidos especificas e sequências de ácido nucleico codificando as sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou semelhantes às das sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico especificas. Uma propriedade importante é reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo ou manter funções efetoras de um anticorpo. De preferência, uma sequência modificada em relação a uma sequência específica, quando substitui a sequência específica num anticorpo mantém a ligação do referido anticorpo a CLD18 e de preferência as funções do referido anticorpo tal como aqui descritas, p. ex. lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.
Será apreciado pelos peritos na técnica que em particular as sequências da CDR, regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade para se ligarem a CLD18. Por exemplo, as regiões CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões aqui especificadas. Por "altamente homólogo" está contemplado que de 1 a 5, de preferência de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas nas CDR. Além disso, as regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas de modo a que mostrem substancial homologia com as regiões especificamente aqui divulgadas.
Deve entender-se que os ácidos nucleicos específicos aqui descritos incluem também ácidos nucleicos modificados por razões de otimização da utilização de codões numa determinada célula hospedeira ou organismo. Diferenças na utilização de codões entre os organismos podem levar a uma variedade de problemas em relação à expressão de genes heterólogos. A otimização de codões através da mudança de um ou mais nucleótidos da sequência original pode resultar numa otimização da expressão de um ácido nucleico, em particular na otimização da eficácia de tradução, num hospedeiro homólogo ou heterólogo no qual se pretende expressar o referido ácido nucleico. Por exemplo se forem utilizados ácidos nucleicos derivados de humano e codificando regiões constantes e/ou regiões estruturais de anticorpos de acordo com o presente invento, p. ex. para preparação de anticorpos quiméricos ou humanizados, pode ser preferido modificar os referidos ácidos nucleicos por razões de otimização da utilização de codões, em particular se os referidos ácidos nucleicos, opcionalmente fundidos com ácidos nucleicos heterólogos tais como ácidos nucleicos derivados de outros organismos tal como aqui descrito, forem para ser expressos em células de um organismo diferente de um ser humano tal como um ratinho ou hamster. Por exemplo, as sequências de ácido nucleico codificando as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas tais como aquelas de acordo com SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, podem ser modificadas para incluir uma ou mais, de preferência, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e de preferência até 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ou 100 ou mais substituições de nucleótidos resultando numa utilização otimizada de codões mas não resultando numa mudança da sequência de aminoácidos. Tais substituições de aminoácidos referem-se de preferência a substituições de nucleótidos em SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, selecionadas a partir das substituições mostradas no sequinte alinhamento de SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, com os seus equivalentes modificados e não resultando numa mudança na sequência de aminoácidos codificada ou referem-se às substituições correspondentes em posições correspondentes noutras sequências de ácido nucleico codificando as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respetivamente. De preferência, todas as substituições mostradas nos seguintes alinhamentos de SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, com os seus equivalentes modificados a não resultar numa mudança na sequência de aminoácidos codificada, são realizadas em sequências de ácido nucleico codificando regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respetivamente.
Alinhamento de SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 147: CGTACGGTGGCTGCA CCATCTG TCTTCATC TTCC CGC CA TCT GATGAGC AGTTGAAATC T 60
11111111111 li II II imillllll II II MINI Mil II C GT ACG GTGG CCQCT CCC AG CGTGTTCAT C TT C C CC CCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCC 60 GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG 120
II II lit M 11111111II111 i ill 1U IM I llllllll II III GGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAQ 120 TGGAAQ GTGGATAACGCCC TCCAATCGGG TAA C T C C CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC 1B0
Ellllllllll llllllll II Μ III lllllllil Mill 111111111 TGGAAG GTGGACAACGCCCTG C AGAG CGGCAACAGC CAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGA C 180 A G C AAG GACAGCACCTAC AG CC TCAGCAGCAC C C TG ACG CTG AGCAAAGC AGACTACGAG 24 0 E111111 II IIMMMMII 111111 Μ 11 Μ 11 MIIMII II lllllllil AGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAG 240 AAA CA C AAAGTCTACGCCTG CGAAGTCACCCA TC AGGGC C TG AGCTCGCCCGTC ACAAAG 300 II Mil I II 11111111:11 II lllllllil illll I Mill II 111 AAGCA CAAGGTGTACGCCT GCGAGGTGA CCCACCAGGGCCTGTC CAGCCCCGTG ACCAAG 300 AGCTT CAA CAGGGGAGAGT GTTAG 3 2 4
1111111IIIII11 Illll III AGCTT C AACAGGGGCGAGT GCT AG 3 24
Alinhamento de SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 149: GG CCCATCGGTCTTCCCC C TGGCAC C CTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGG GG CACAGCGGCC 60
Mim ii mi iiiiiiii ιι i miiiini n imiiii m GGC CCAAGCGTGT T C CCCCTGGCCC C CAGCAGCAA GAGCACCAGCGGCGG CACAG C CGC C 60 CTGGGCTG CCTGGT C AAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCA G GC 120
I 111 I III IIIII f III Ml III III 11 III II HIM III Him II CTGGGCTGCCTGGTG AAGGACTACTTCC C CGAGCC CGTG ACCGTGAGC TGGAACAGC GG A 12 0 GCCCTGAC CAGCGG C GTGCACACCT TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTC T A C TC C 18 0
lllllllll III 1111111:11 II II 11 III I II I i III I GCCCTGAC CTCCGG C GTGCAC ACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGC C TSTACAGC 18 0 C TC A GCAGCGTGGTG AC CGTG CC C T C CAGC AGCTTGGG C AC C CAG ACCTAC ATCTGC AA C 24 0 ιι 111111 i 111; iihiimii iiiim 1111111,,11111110111,.1 C TG AGC AGCGTGGTG ACCGTG C C CAG CAGC AGC C TGGG C AC C CAG A CCTAC ATCTGCAA C 2 4 0 GTG AATC ACAAG CCC AGCAA C AC C AAGGTGG A CAAG AAAGTTG AGCCC AAATCTTGTGA C 3 00 mu mimimiimiiimHimm π him mi ii hi GTG AAC CA CAAGCCC AGCAA CA CCAAGGTG GA CAAGAGA G TGGAGC CC AAGAGCTGCGAC 3 00 AAAACTC ACA CATGC CCA CCGT GCCCAGC A C C TGAA CT C C TGG GGGGACCGTCAGTCTTC 36 0
II II HIM Mill Μ 1111! If 1 II II II Mill Hill II III AAG ACC C AC ACCTGC CCCCC CTGCCCAG CCC C AGAGCTG C TGGG CG GACCCAGCGTGTTC 360 CTCTTCCCCC CAAAACCCAAGG ACACCC TC AT GATCTCC C GGA CCC CTGAGGTCAC ATGC 4 2 0 ιι 11 ιι mi ιι him i mi ι n1 mm i mi 111 him ii iii CTGTTC CC CCCCAAGCCCAAGG AC ACC CTGATGATCAGCAGGACCC CCG AGGTGAC CTGC 4 2 0 GTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACC C TGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC 4 B 0 11111111111 η 1111111 i 11 mu mu n mmi mm ιι i min gtggtggtggacgtgagccacgagGacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggc 4 a 0 GTGGAGGTGCaTAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT 54 0 11111111111 ιι ι: ι ιι 11 mn i mm mil i mi n n m ι G TGGAGGTGC AC AA CG CCAA G ACC AAGCCCAG AG AGG AGC AGTACAA CAGC ACCT AC AGG 54 0 G TGGTC AGCG T CCTC AC CGT CCTGC ACC AGG ACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG C 600
Mill III II Mill HI III11111! Ill I i IM ΙΙΙΠΙΠ 111 Μ 11 II GTGGTGTCCGTGCTGACCGT GCTG C ACC AGGACTGGCTG AAC GGCAAGGAAT AC AAGTG C 600 AAGGTCTC CAA CAAA GCCC TCC C AGCC CCCATCGAG AAAA CC ATCT C C AAAGCCAAAG GG 660 iiiiii:i:iii mu iiiiimmm n mini mi iiiii ii AAGGTCTCC AA CAAGGCCCTGC C A GCCCCCATCGAAAAGACC ATCAGCAAGGCCAAG GGC 660 CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC 72 0 mi ι ιι ιι ii mm ι mi iiiim ι hi mm hi n iiiii mi CAGCCACGGG AGCC C C AGGTGT AC ACC CTGCCCCCC AGCCGGGAGG AGATGACCAAGAAC 720 C AGG TC AGC CTG AC CTGCCT GGTC AAAGGCTTCT ATCCC AGCGACATCGCCGTGGAG TGG 700 mil 1111111 h iiiii ii mum miimi iiimimi mm C AGGTGTCC CTGACCTGTCTGGTG AAGGGCTTCTACCCC AGCGAC A TCGCCGTGGAG TGG 780 GAGA GC ΑΑΊ CGGC AGC CGG A G AAC AACT ACAAGACC ACGCCTCCCG TGCTGGACTC C G A C 840 11111111 ii iiiii ι m 111 π 11111111111 ιι ii mimii mi GAG AGC AAC GGCC AG C CCG A G AAC AACTACAAG ACC AC CCCCCC AG TGCTGGACAGCG A C 840 GGCTCCTTCTTCCTC TATAGC AAGCTC ACCGTGG AC AAG AGCAGGTGGC AGCAGGGG AAC 900 μι Minim π mimi iiiiiiiiiiii iimmimm m GGCAGCTTCTTCCTG TACAG CAAG CTG ACCGTGG ACAAGTCC AGGTBGC AG CAGGGCAAC 900 GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC 960 ii m mi iiiiiim mn mmmimini mm iii GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG 960 TCCCTGTCT CCGGGTAAATG A 981 mi ιι ιι ιι ι AGCCTG A GC CCCGGCAAGTAG 9 B1
Além disso, pode ser desejado, de acordo com o presente invento, modificar a sequência de aminoácidos aqui descrita, em particular as das reqiões constantes de cadeias pesadas humanas para adaptar a sequência a um alotipo desejado, p. ex. um alotipo verificado na população Caucasiana. Tais modificações são de preferência selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes substituições de aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 46 ou nas posições correspondentes dentro de outras regiões constantes de cadeias pesadas humanas: K93R, D235E, e L237M. De preferência, todas estas modificações estão incluídas nas sequências de aminoácidos das regiões constantes de cadeias pesadas humanas.
De acordo com o invento, a expressão "posições correspondentes" refere-se a nucleótidos ou resíduos de aminoácidos que num alinhamento de sequências de duas sequências de aminoácidos ou proteicas são alinhadas uma com a outra.
De preferência, o grau de identidade entre a sequência de ácido nucleico específica aqui descrita e a sequência de ácido nucleico que é modificada em relação à referida sequência de ácido nucleico específica será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, com maior preferência pelo menos 80%, ainda mais de preferência pelo menos 90% ou ainda com maior preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. De preferência, as duas sequências são capazes de hibridar e formar um dúplex estável uma com a outra, com a hibridação a ser de preferência realizada sob condições que permitam hibridação específica entre polinucleótidos (condições rigorosas). As condições rigorosas são descritas, por exemplo, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", J. Sambrook et al. , Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York e referem-se, por exemplo, à hibridação a 65°C em tampão de hibridação (SSC 3,5*, Ficoll a 0,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina de soro bovino a 0,02%, NaH2P04 2,5 mM (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM). SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridação, a membrana para a qual o ADN foi transferido é lavada, por exemplo, em SSC 2x à temperatura ambiente e depois em SSC 0,1-0,5x/SDS 0,lx a temperaturas de até 68°C.
De preferência, o grau de semelhança, de preferência de identidade entre a sequência de aminoácidos específica aqui descrita e uma sequência de aminoácidos que é modificada em relação à referida sequência de aminoácidos específica tal como entre a sequência de aminoácidos mostrando substancial homologia será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com maior preferência pelo menos 90% ou ainda mais de preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
Todas as sequências modificadas acima descritas estão dentro do âmbito do presente invento. "Semelhança de sequência" indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. "Identidade de sequência" entre duas sequências polipeptídicas ou de ácido nucleico indica a percentagem de aminoácidos ou nucleótidos que são idênticos entre as sequências. A "percentagem de identidade" é obtida após o melhor alinhamento, sendo esta percentagem meramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos são convencionalmente realizadas por comparação destas sequências, depois de serem alinhadas de forma ótima, sendo a referida comparação realizada por segmento ou por "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança das sequências. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman de 1981, Ads App. Math. 2: 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, por meio do método de pesquisa de semelhanças de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444, ou por meio de programas de computador que utilizem estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). A percentagem de identidade é calcula através da determinação do número de posições idênticas entre as duas sequências a comparar, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter-se a percentagem de identidade entre estas duas sequências. "Substituições conservativas" podem ser feitas, por exemplo, com base na semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo: (a) aminoácidos não polares (hidrófobos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina; (b) aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; (c) aminoácidos com carga positiva (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e (d) aminoácidos com carga negativa (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. As substituições podem ser feitas tipicamente dentro dos grupos (a)-(d). Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas uma pela outra com base na sua capacidade para perturbar [alfa]-hélices. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, Lei. Dado o código genético conhecido, e as técnicas de ADN sintético e recombinante, o cientista especializado pode facilmente construir ADN que codifiquem as variantes de aminoácidos conservativas. O presente invento compreende anticorpos em que foram feitas alterações na região Fc para mudar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar numa diminuição ou num aumento da ligação de Clq e CDC ou da ligação de Fc Re ADCC. As substitções podem, por exemplo, ser feitas num ou mais dos resíduos de aminoácidos da região constante de cadeia pesada, causando assim uma alteração numa função efetora enquanto mantém a capacidade de se ligar ao antigénio, em comparação com o anticorpo modificado, cf. US 5624821 e US 5648260. A semivida in vivo dos anticorpos pode ser melhorada através da modificação do epitopo do recetor de salvamento do domínio constante de Ig ou de um domínio constante semelhante a Ig, de modo a que a molécula não compreenda um domínio CH2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6121022 e US 6194551. A semivida in vivo pode além disso ser aumentada através da produção de mutações na região Fc, p. ex., através da substituição de leucina por treonina na posição 252, através da substituição de serina por treonina na posição 254, ou através da substituição de fenilalanina por treonina na posição 256, cf. US 6277375.
Além disso, o padrão de glicosilação dos anticorpos pode ser modificado para mudar a função efetora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos num transfectoma que não adicione a unidade de fucose normalmente ligada a Asn na posição 297 da região Fc para aumentar a afinidade da região Fc para recetores de Fc que, por sua vez, resultará numa maior ADCC dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et ai. (2002) JBC, 211: 26733. Além disso, pode ser feita modificação da galactosilação para modificar a CDC.
Alternativamente, noutra concretização, podem ser introduzidas mutações aleatoriamente ao longo de toda a sequência de codificação do anticorpo anti-CLD18, tal como através de mutagénese de saturação, e os anticorpos anti-CLD18 modificados resultantes podem ser pesquisados quanto à atividade de ligação. A expressão "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como aqui utilizada, pretende referir-se a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Deve ser entendido que tais expressões se destinam a referir não só a célula sujeita em particular como também a descendência dessa célula. Como podem ocorrer certas modificações nas gerações que se sucedem, devido a mutação ou a influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula parental, mas está ainda incluída no âmbito na expressão "célula hospedeira", tal como aqui utilizada. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0 e células linfocíticas.
Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" compreende qualquer animal humano ou não humano. A expressão "animal não humano" inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. A expressão "animal transgénico" refere-se a um animal possuindo um genoma compreendendo um ou mais transgenes e de preferência transgenes de cadeia pesada e/ou leve, ou transcromossomas (integrados ou não integrados no ADN genómico natural do animal) e que é de preferência capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um ratinho transgénico pode ter um transgene da cadeia leve humana e um transgene da cadeia pesada humana ou um transcromossoma da cadeia pesada humana, de modo a que o ratinho produza anticorpos anti-CLD18 humanos quando imunizado com antigénio CLD18 e/ou células que expressam CLD18. 0 transgene da cadeia pesada humana pode ser integrado no ADN cromossómico do ratinho, como é o caso para ratinhos transgénicos, p. ex., ratinhos HuMAb, tais como ratinhos HCo7 ou HCol2, ou o transgene da cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para ratinhos transcromossómicos (p. ex., KM) tal como descrito em WO 02/43478. Tais ratinhos transgénicos e transcromossómicos podem ser capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 (p. ex., IgG, IgA e/ou IgE) sofrendo recombinação de V-D-J e mudança de isotipo.
Mecanismos de ação de mAb
Embora a seguir se proporcionem considerações sobre o mecanismo subjacente à eficácia terapêutica dos anticorpos do invento, não deve ser considerada como de modo algum limitante do invento.
Os anticorpos aqui descritos interagem de preferência com componentes do sistema imunitário, de preferência através de ADCC ou CDC. Os anticorpos do invento podem também ser utilizados para direccionar cargas (p. ex., isótopos radioativos, fármacos ou toxinas) para matar diretamente células tumorais ou podem ser utilizados sinergicamente com agentes quimioterapêuticos tradicionais, atacando os tumores através de mecanismos de ação complementares, que podem incluir respostas imunitárias antitumorais que possam ter sido comprometidas devido a efeitos secundários citotóxicos dos quimioterapêuticos sobre os linfócitos T.
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos. A ADCC descreve a capacidade das células efetoras para matar células, tal como aqui descrito, em particular linfócitos, o que requer, de preferência, que a célula alvo seja marcada por um anticorpo. A ADCC ocorre de preferência quando os anticorpos se liqam a antigénios em células tumorais e os domínios Fc do anticorpo envolvem recetores de Fc (FcR) na superfície de células imunitárias efetoras. Várias famílias de recetores de Fc foram identificadas e populações celulares específicas expressam caracteristicamente recetores de Fc definidos. A ADCC pode ser vista como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruição imediata de tumores que conduz a apresentação do antigénio e à indução de respostas de células T dirigidas a tumores. De preferência, a indução in vivo de ADCC conduzirá a respostas de células T dirigidas a tumores e respostas de anticorpos derivadas do hospedeiro.
Citotoxicidade dependente do complemento. A CDC é outro método de matar células que pode ser dirigido por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para a ativação do complemento. IgGl e IgG3 são também muito eficazes no direcionamento de CDC através da via clássica de ativação do complemento. De preferência, nesta cascata, a formação de complexos antigénio-anticorpo resulta no desvelamento de múltiplos locais de ligação a Clq em estreita proximidade nos domínios Ch2 das moléculas de anticorpo participantes, tais como moléculas de IgG (Clq é um dos três subcomponentes do complemento Cl). De preferência, estes locais de ligação a Clq desvelados convertem a interação Clq-IgG anteriormente de baixa afinidade numa de elevada avidez, que desencadeia uma cascata de eventos envolvendo uma série de outras proteínas do complemento e conduz à libertação proteolítica dos agentes quimiotáticos/de ativação de células efetoras C3a e C5a. De preferência, a cascata do complemento termina na formação de um complexo de ataque da membrana que cria poros na membrana celular que facilitam a passagem livre de água e de solutos para dentro e para fora da célula.
Produção de anticorpos
Os anticorpos do invento podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, p. ex., a técnica padrão de hibridação de células somáticas de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridação de células somáticas, em principio outras técnicas para produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues, p. ex., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B ou técnicas de apresentação fágica utilizando bibliotecas de genes de anticorpos. 0 sistema animal preferido para preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é o sistema de murideo. A produção de hibridomas no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e as técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (p. ex., células de mieloma de murideo) e os procedimentos de fusão são também conhecidos.
Outros sistemas animais preferidos para preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais são o sistema de rato e coelho (p. ex., descrito em Spieker-Polet et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 9348 (1995), ver também Rossi et ai., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Ainda numa outra concretização preferida, anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CLD18 pode ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos possuindo partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos conhecidos como ratinhos HuMAb e ratinhos KM, respetivamente, e são coletivamente aqui referidos como "ratinhos transgénicos". A produção de anticorpos humanos em tais ratinhos transgénicos pode ser realizada tal como descrito em detalhe para CD20 em W02004/035607.
No entanto, uma outra estratégia para a produção de anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes codificando anticorpos a partir de linfócitos que produzam anticorpos de estratégia definida, p. ex. ver Babcock et al., 1996; "A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy". Para detalhes de engenharia de anticorpos recombinantes ver também Welschof e Kraus, "Recombinant antibodies for cancer therapy" ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Lo "Antibody Engineering" ISBN 1-58829-092-1.
Imunizações
Para gerar anticorpos para CLD18, os ratinhos podem ser imunizados com péptidos conjugados com transportador derivados da sequência de CLD18, uma preparação enriquecida em antigénio CLD18 expresso de forma recombinante ou seus fragmentos e/ou células que expressam CLD18, tal como descrito. Alternativamente, os ratinhos podem ser imunizados com ADN codificando CLD18 humana inteira (p. ex. SEQ ID NO: 1) ou seus fragmentos, em particular os de SEQ ID NO: 15, 17, e 19. No caso das imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida em antigénio CLD18 não resultarem em anticorpos, os ratinhos podem também ser imunizados com células que expressam CLD18, p. ex., uma linha celular, para promover respostas imunitárias. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma e soro obtidas através de sangrias da veia caudal ou retro-orbitais. Os ratinhos com títulos de imunoglobulina anti-CLD18 suficientes podem ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados por via intraperitoneal ou intravenosa com células que expressam CLD18 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas segregando anticorpos específicos.
Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais para CLD18, esplenócitos e células dos nódulos linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linha celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem então ser pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos do antiqénio. Poços individuais podem então ser pesquisados através de ELISA quanto a hibridomas secretores de anticorpos. Através de análise de imunofluorescência e FACS utilizando células que expressam CLD18, podem ser identificados anticorpos com especificidade para CLD18. Os hibridomas segregando anticorpos podem ser replaqueados, novamente pesquisados, e se ainda forem positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.
Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos do invento podem também ser produzidos num transfectoma de células hospedeiras utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de genes, como são bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por exemplo, numa concretização, o gene ou os genes de interesse, p. ex., genes de anticorpos, podem ser ligados num vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariótica tal como usado pelo sistema de expressão de genes GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpos clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas como células derivadas de plantas, células fúngicas ou de levedura. O método utilizado para introduzir estes genes pode ser métodos descritos na técnica, tais como electroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução destes genes de anticorpo em células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados pelo seu nível de expressão e aumentados em escala para produzir anticorpos. Anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes e/ou células de cultura. Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressos noutros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, p. ex. E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgénicos não humanos, tais como em leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgénicas; ver p. ex. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147- 157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Utilização de Sequências de Anticorpos Parciais para Expressar Anticorpos Intactos (i.e. humanização e quimerização). a) Quimerização
Os anticorpos monoclonais de murideo podem ser utilizados como anticorpos terapêuticos em seres humanos quando marcados com toxinas ou isótopos radioativos. Os anticorpos de murideo não marcados são altamente imunogénicos no homem quando são aplicados repetitivamente conduzindo à redução do efeito terapêutico. A imunogenicidade principal é mediada pelas regiões constantes das cadeias pesadas. A imunogenicidade de anticorpos de murideo no homem pode ser reduzida ou completamente evitada se os respetivos anticorpos forem tornados quiméricos ou humanizados. Os anticorpos quiméricos são anticorpos cujas diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles possuindo uma região variável derivada de um anticorpo de murideo e uma região constante de uma imunoglobulina humana. A quimerização de anticorpos é alcançada através da união das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpo de murideo com a região constante da cadeia pesada e leve humana (p. ex. tal como descrito por Kraus et al., em "Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy" ISBN-0-89603-918-8) . Numa concretização preferida, os anticorpos quiméricos são gerados através da união da região constante de cadeia leve capa humana à região variável da cadeia leve de murideo. Numa concretização também preferida, os anticorpos quiméricos podem ser gerados através da união da região constante da cadeia leve lambda humana com a região variável da cadeia leve de murideo. As regiões constantes das cadeias pesadas preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgGl, IgG3 e IgG4. Outras regiões constantes das cadeias pesadas preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM. b) Humanização
Os anticorpos interagem com antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que se localizam nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) das cadeias pesadas e leves. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDR são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDR. Como as sequências das CDR são responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades dos anticorpos de ocorrência natural específicos através da construção de vetores de expressão que incluam sequências CDR dos anticorpos de ocorrência natural específicos enxertadas em sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, p. ex., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 86: 10029-10033) . Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de ADN públicas que incluem sequências génicas de anticorpos da linha germinativa. Estas sequências da linha germinativa diferirão das sequências génicas de anticorpos maduros porque não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados pela união de V (D) J durante a maturação das células B. As sequências génicas da linha germinativa diferirão também das sequências de um anticorpo de repertório secundário de elevada afinidade no indivíduo uniformemente em toda a região variável. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente pouco frequentes na porção amino-terminal da região estrutural 1 e na porção carboxi-terminal da região estrutural 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter toda a sequência de ADN de um determinado anticorpo para recrear um anticorpo recombinante intacto possuindo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (ver WO 99/45962). Sequências das cadeias pesadas e leves parciais abrangendo as regiões CDR são tipicamente suficientes para este fim. A sequência parcial é utilizada para determinar que variável da linha germinativa e segmentos génicos de união contribuíram para os genes variáveis do anticorpo recombinado. A sequência da linha germinativa é então utilizada para preencher as porções em falta das regiões variáveis. As sequências de comando das cadeias pesadas e leves são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar sequências em falta, sequências de ADNc clonadas podem ser combinadas com oligonucleótidos sintéticos através de ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleótidos curtos, sobreponíveis, e combinados através de amplificação por PCR para criar um clone da região variável inteiramente sintético. Este processo tem certas vantagens tal como a eliminação ou inclusão de determinados locais de restrição, ou a otimização de determinados codões.
As sequências nucleotídicas de transcritos das cadeias pesadas e leves de hibridomas são utilizadas para desenhar um conjunto sobreponível de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às das sequências naturais. As sequências sintéticas das cadeias pesadas e capa podem diferir das sequências naturais de três formas: cadeias de bases nucleotídicas repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleótidos e a amplificação por PCR; locais de iniciação da tradução ótimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870) e locais HindIII são concebidos a montante dos locais de iniciação da tradução.
Tanto para as regiões variáveis das cadeias pesadas como das leves, as sequências de cadeias de codificação otimizadas e as correspondentes de não codificação são quebradas em aproximadamente 30-50 nucleótidos no ponto médio do correspondente oligonucleótido não codificador. Assim, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser montados em conjuntos de cadeias duplas sobreponíveis que abrangem segmentos de 150-400 nucleótidos. Os bancos são então utilizados como moldes para produzir produtos de amplificação por PCR de 150-400 nucleótidos. Tipicamente, um único conjunto de oligonucleótidos da região variável será quebrado em dois bancos que são amplificados separadamente para gerar dois produtos de PCR sobreponiveis. Estes produtos sobreponiveis são então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Pode também ser desejável incluir um fragmento sobreponivel da região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve na amplificação por PCR para gerar fragmentos que possam ser facilmente clonados nas construções do vetor de expressão.
As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves reconstruídas tornadas quiméricas ou humanizadas são então combinadas com sequências clonadas promotoras, de comando, de iniciação da tradução, da região constante, não traduzidas a 3' , de poliadenilação e de terminação da transcrição, para formar construções de vetores de expressão. As construções de expressão das cadeias pesadas e leves podem ser combinadas num único vetor, co-transfectadas, transfectadas em série, ou transfectadas separadamente em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa ambas as cadeias. Os plasmídeos para utilização na construção de vetores de expressão para IgG humana são descritos abaixo. Os plasmídeos foram construídos de forma a que as sequências de ADNc da cadeia pesada V e leve capa V amplificadas por PCR pudessem ser utilizadas para reconstruir minigenes das cadeias pesadas e leves completas. Estes plasmídeos podem ser utilizados para expressar completamente anticorpos IgGl, Capa ou IgG4, Capa humanos ou quiméricos. Plasmídeos semelhantes podem ser construídos para expressão de outros isotipos da cadeia pesada, ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeias leves lambda.
Assim, noutro aspeto do invento, as características estruturais dos anticorpos anti-CLD18 do invento, são utilizadas para criar anticorpos anti-CLD18 humanizados estruturalmente relacionados que mantenham pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos do invento, tal como a ligação a CLD18. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de anticorpos monoclonais de ratinho podem ser combinadas de forma recombinante com regiões estruturais e CDR humanas conhecidas para criar mais anticorpos anti-CLD18 humanizados concebidos de forma recombinante do invento.
Ligação a células que expressam o antigénio A capacidade do anticorpo para se ligar a CLD18 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, tal como os expostos nos exemplos (p. ex., ELISA, Western blot, análise de Imunofluorescência e citometria de fluxo)
Caracterização da ligação dos anticorpos
Para purificar anticorpos anti-CLD18, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos rotativos de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Alternativamente, os anticorpos anti-CLD18 podem ser produzidos em biorreatores baseados em diálise. Os sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína G-Sepharose ou proteína A-sepharose. A IgG eluída pode ser verificada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta resolução para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80°C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CLD18 selecionados se ligam a epitopos únicos, pode ser utilizada mutagénese dirigida ao local ou a múltiplos locais.
Determinação do isotipo
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, podem ser efetuados ELISA do isotipo com vários estojos comerciais (p. ex. Zymed, Roche Diagnostics). Os poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com Ig anti-ratinho. Após o bloqueio, as placas são feitas reagir com anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo purificados, à temperatura ambiente durante duas horas. Os poços podem em seguida ser feitos reagir com IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3, IgA de ratinho ou sondas conjugadas com peroxidase específicas de IgM de ratinho. Após lavagem, as placas podem ser reveladas com substrato ABTS (1 mg/ml) e analisadas a uma DO de 405-650.
Alternativamente, pode ser utilizado o IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, N.2 Cat. 1493027) tal como descrito pelo fabricante.
Análise de citometria de fluxo
Para demonstrar a presença de anticorpos anti-CLD18 em soros de ratinhos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLD18, pode ser utilizada citometria de fluxo. As linhas celulares que expressam CLD18 naturalmente, ou após transfecção, e controlos negativos sem expressão de CLD18 (criados sob condições de crescimento padrão) podem ser misturados com várias concentrações de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo FBS a 1%, e podem ser incubadas a 4°C durante 30 min. Após lavagem, o anticorpo anti-IgG marcado com APC ou Alexa647 pode ligar-se ao anticorpo monoclonal ligado a CLD18 sob as mesmas condições que a coloração de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas através de citometria de fluxo com um instrumento FACS utilizando propriedades de luz e dispersão lateral para apanhar células vivas individuais. Para distinguir os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 de ligadores não específicos numa única medição, pode ser empregue o método de co-transfecção. As células transfectadas transientemente com plasmídeos codificando CLD18 e um marcador fluorescente podem ser coradas, como descrito acima. As células transfectadas podem ser detetadas num canal de fluorescência diferente do das células coradas por anticorpos. Como a maioria das células transfectadas expressa ambos os transgenes, os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 ligam-se de preferência a células que expressam um marcador fluorescente, enquanto os anticorpos não específicos se ligam numa razão comparável a células não transfectadas. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado para além de, ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.
As proteínas de junções de oclusão tendem a ser internalizadas, se o contacto célula-célula com células vizinhas particularmente aderentes se perder por p. ex. destacamento das células. A expressão na superfície celular de CLD18 pode ser otimizada através de a) ajuste das condições de cultura, p. ex. cultivando numa densidade celular mais elevada de um modo padronizado, utilizando destacamento suave (p. ex. EDTA 2 mM/PBS ou acutase), processamento à temperatura ambiente, e adição de inibidores de endocitose (p. ex. azida de sódio) ou activadores da transcrição ou tradução de CLD18, e através de b) seleção e clonagem de células mantendo CLD18 a níveis elevados na superfície celular, p. ex. através de seleção com antibióticos em termos de células transfectadas, através de separação de células imunomagnética ou por FACS, e através de clonagem por diluição limitada.
Microscopia de imunofluorescência
Para demonstrar a presença de anticorpos anti-CLD18 em soros de ratinhos imunizados ou ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLD18, pode ser utilizada análise de microscopia de imunofluorescência. Por exemplo, as linhas celulares que expressam CLD18, espontaneamente ou após transfecção, e controlos negativos sem expressão de CLD18 são criadas em lâminas de câmaras sob condições de crescimento padrão em meio DMEM/F12, suplementado com soro fetal de vitelo a 10% (FCS) , L-glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina e 100 yg/ml de estreptomicina. Células podem então ser fixadas com metanol ou paraformaldeído ou deixadas sem tratamento. As células podem então ser feitas reagir com anticorpos monoclonais contra CLD18 durante 30 min. a 25°C. Após lavagem, as células podem reagir com um anticorpo secundário anti-IgG de ratinho marcado com Alexa555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem então ser examinadas através de microscopia de fluorescência.
Os níveis totais de CLD18 nas células podem ser observados quando as células são fixadas em metanol ou fixadas em paraformaldeído e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e células fixadas em paraformaldeído não permeabilizadas, a localização na superfície de CLD18 pode ser examinada. Adicionalmente, o direcionamento de CLD18 em junções de oclusão pode ser analisado através de co-coloração com marcadores de junções de oclusão tais como ZO-1. Além disso, os efeitos da ligação de anticorpo e localização de CLD18 dentro da membrana celular podem ser examinados.
Western Blot A IgG anti-CLD18 pode ser ainda testada quanto à reatividade com antigénio CLD18 através de Western Blotting. Resumidamente, extratos celulares de células que expressam CLD18 e controlos negativos adequados podem ser preparados e sujeitos a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS). Após eletroforese, os antigénios separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados, e sondados com os anticorpos monoclonais a testar. A ligação de IgG pode ser detetada utilizando anti-IgG de ratinho-peroxidase e revelada com substrato ECL.
Imuno-histoquímica
Os IgG de ratinho anti-CLD18 podem ainda ser testados quanto à reatividade com antigénio CLD18 através de imuno-histoquímica de um modo bem conhecido do perito, p. ex. utilizando crio-secções fixadas em paraformaldeído ou acetona ou secções de tecido impregnadas em parafina fixadas com paraformaldeído de amostras de tecido não canceroso ou tecido de cancro obtidas de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de ratinhos portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas celulares que expressam CLD18 espontaneamente (p. ex. DAN-G, SNU-16, ou KATO-III) ou após transfecção (p. ex. HEK293) . Para imunocoloração, anticorpos reativos com CLD18 podem ser incubados seguido de anticorpos de cabra anti-ratinho ou cabra anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (DAKO) de acordo com as instruções do vendedor.
Atividades Fagocitica e de Morte Celular dos anticorpos in vitro
Além de se ligarem especificamente a CLD18, os anticorpos anti-CLD18 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar fagocitose e morte de células que expressem CLD18. 0 ensaio de atividade de anticorpos monoclonais in vitro proporcionará uma pesquisa inicial antes do ensaio em modelos in vivo.
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) :
Resumidamente, células polimorfonucleares (PMN), células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras, de dadores saudáveis podem ser purificadas através de centrifugação de densidade em Ficoll Hypaque, seguida de lise dos eritrócitos contaminantes. As células efetoras lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor a 10%, ou, alternativamente, com soro humano inactivado pelo calor a 5% e misturadas com células alvo marcadas com 51Cr que expressam CLD18, a várias razões de células efetoras para células alvo. Alternativamente, as células alvo podem ser marcadas com um ligando de reforço da fluorescência (BATDA). Um quelato altamente fluorescente de Európio com o ligando de reforço que é libertado a partir de células mortas pode ser medido por um fluorómetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfecção de células alvo com luciferase. O amarelo Lúcifer adicionado pode então ser oxidado apenas por células viáveis. Os IgG anti-CLD18 purificados podem então ser adicionados a várias concentrações. Uma IgG humana irrelevante pode ser utilizada como controlo negativo. Os ensaios podem ser realizados durante 4 a 20 horas a 37°C dependendo do tipo de célula efetora utilizado. As amostras podem ser ensaiadas quanto à citólise através da medição da libertação de 51Cr ou da presença do quelato EuTDA no sobrenadante da cultura. Alternativamente, a luminescência resultante da oxidação do amarelo Lúcifer pode ser uma medida das células viáveis.
Os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem também ser testados em várias combinações para determinar se a citólise é reforçada com múltiplos anticorpos monoclonais.
Citotoxicidade dependente do complemento (CDC):
Os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar CDC, utilizando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, o soro para complemento pode ser obtido a partir de sangue de um modo conhecido do perito na técnica. Para determinar a atividade de CDC de mAb, podem ser utilizados diferentes métodos. Por exemplo, pode ser medida a libertação de 51Cr ou pode ser avaliada a elevada permeabilidade da membrana utilizando um ensaio de exclusão de iodeto de propídio (PI). Resumidamente, as células alvo podem ser lavadas e podem ser incubadas 5xl05/ml com várias concentrações de mAb durante 10-30 min. à temperatura ambiente ou a 37 °C. O soro ou plasma pode então ser adicionado a uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37°C durante 20-30 min. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI num tubo FACS. A mistura pode então ser analisada imediatamente através de citometria de fluxo utilizando FACSArray.
Num ensaio alternativo, a indução de CDC pode ser determinada em células aderentes. Numa concretização deste ensaio, as células são semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3xl04/poço em placas de microtitulação de fundo plano de cultura de tecidos. O meio de crescimento do dia seguinte é removido e as células são incubadas em triplicado com os anticorpos. As células de controlo são incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo saponina a 0,2% para a determinação da lise de fundo e da lise máxima, respetivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante é removido e é adicionado às células plasma ou soro humano a 20% (v/v) em DMEM (pré-aquecido a 37°C) e incuba-se durante mais 20 min. a 37°C. Todas as células de cada amostra são adicionadas a solução de iodeto de propídio (10 pg/ml). Em seguida, os sobrenadantes são substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm é medida a 600 nm utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica é calculada da seguinte forma: % de lise específica = (fluorescência da amostra-fluorescência de fundo)/(fluorescência da lise máxima-fluorescência de fundo)x10 0.
Inibição da proliferação celular através de anticorpos monoclonais:
Para testar a capacidade de iniciar apoptose, os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem, por exemplo, ser incubados com células tumorais positivas para CLD18, p. ex., SNU-16, DAN-G, KATO-III ou células tumorais transfectadas com CLD18 a 37°C durante cerca de 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampão de ligação a Anexina V (BD Biosciences), e incubadas com Anexina V conjugada com FITC ou APC (BD Biosciences) durante 15 min. no escuro. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI (10 g/ml em PBS) num tubo de FACS e avaliadas imediatamente através de citometria de fluxo (como acima). Alternativamente, uma inibição geral da proliferação celular através de anticorpos monoclonais, pode ser detetada com estojos comercialmente disponíveis. O DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, N.2 Cat. AD0200) é um imunoensaio não isotípico baseado na medição de incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante a síntese de ADN das células em proliferação em microplacas. O BrdU incorporado é detetado utilizando anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a deteção dos anticorpos, as células são fixadas e o ADN é desnaturado utilizando solução Fix. O anticorpo não ligado é lavado e o indutor DELFIA é adicionado para dissociar os iões de európio do anticorpo marcado para a solução onde formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando fluorometria resolvida no tempo na deteção - é proporcional à síntese de ADN na célula de cada poço.
Estudos pré-clinicos
Os anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18 podem também ser testados num modelo in vivo (p. ex. em ratinhos imunodeficientes portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas celulares que expressam CLD18, p. ex., DAN-G, SNU-16, ou KATO-III, ou após transfecção, p. ex. HEK293) para determinar a sua eficácia no controlo do crescimento de células tumorais que expressam CLD18.
Estudos in vivo após xenoenxerto de células tumorais que expressam CLD18 em ratinhos imunocomprometidos ou em outros animais podem ser realizados utilizando os anticorpos do invento. Os anticorpos podem ser administrados a ratinhos livres de tumor, seguido por injeção de células tumorais para medir os efeitos dos anticorpos para prevenir a formação de tumores ou de sintomas relacionados com tumores. Os anticorpos podem ser administrados a ratinhos portadores de tumores para determinar a eficácia terapêutica dos respetivos anticorpos para reduzir o crescimento, metástase ou sintomas relacionados com tumores. A aplicação dos anticorpos pode ser combinada com aplicação de outras substâncias tais como fármacos citostáticos, inibidores de fatores de crescimento, bloqueadores do ciclo celular, inibidores de angiogénese ou outros anticorpos para determinar a eficácia sinérgica e potencial toxicidade de combinações. Para analisar os efeitos secundários tóxicos mediados pelos anticorpos do invento, animais podem ser inoculados com anticorpos ou reagentes de controlo e cuidadosamente investigados quanto a sintomas possivelmente relacionados com a terapia de anticorpos de CLD18. Possíveis efeitos secundários da aplicação in vivo de anticorpos de CLD18 incluem particularmente toxicidade em tecidos que expressam CLD18 incluindo estômago e pulmão. Os anticorpos que reconhecem CLD18 em humanos e noutras espécies, p. ex., ratinhos, são particularmente úteis para prever potenciais efeitos secundários mediados pela aplicação de anticorpos monoclonais de CLD18 em seres humanos.
Mapeamento de epitopos 0 mapeamento de epitopos reconhecidos pelos anticorpos do invento pode ser realizado como descrito em detalhe em "Epitope Mapping Protocols" (Methods in Molecular Biology) de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em "Epitope Mapping: A Practical
Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay. I. Moléculas Biespecificas/Multiespecificas Que se Ligam a CLD18
Ainda noutra concretização do invento, os anticorpos para CLD18 podem ser derivatizados ou ligados a outras moléculas funcionais, p. ex., outro péptido ou proteína (p. ex., um fragmento Fab') para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a múltiplos locais de ligação ou epitopos alvo. Por exemplo, um anticorpo do invento pode ser funcionalmente ligado (p. ex. através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como um outro anticorpo, péptido ou mimético de ligação.
Consequentemente, o presente invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLD18 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. Numa concretização particular do invento, o segundo epitopo alvo é um recetor de Fc, p. ex. Fc-gamaRI humano (CD64) ou um recetor de Fc-alfa humano (CD89), ou um recetor de células T, p. ex. CD3. Portanto, o invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de se ligar a células efetoras que expressam Fc-gamaR, Fc-alfaR ou Fc-épsilonR (p. ex. monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMN)) , e a células alvo que expressam CLD18. Estas moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem dirigir células que expressam CLD18 a células efetoras e podem desencadear atividades de células efetoras mediadas pelo recetor de Fc, tais como fagocitose de células que expressam CLD18, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), libertação de citocinas, ou geração de anião superóxido.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento podem ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CLD18. Numa concretização, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-fator de melhoria (EF), p. ex. uma molécula que se liga a uma proteína da superfície envolvida em atividade citotóxica e aumenta deste modo a resposta imunitária contra a célula alvo. A "porção anti-fator de melhoria" pode ser um anticorpo, fragmento funcional de anticorpo ou um ligando que se liga a uma dada molécula, p. ex., um antigénio ou um recetor, e resulta deste modo numa melhoria do efeito dos determinantes de ligação para o recetor de Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção anti-fator de melhoria" pode ligar-se a um recetor de Fc ou um antigénio da célula alvo. Alternativamente, a porção anti-fator de melhoria pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade a que a primeira e a segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção anti-fator de melhoria pode ligar-se a uma célula T citotóxica (p. ex., através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imunitária que resulte numa maior resposta imunitária contra a célula alvo).
Numa concretização, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento compreendem como especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, incluindo, p. ex., um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dimero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer seu fragmento minimo tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples tal como descrito em Ladner et al., US 4946778. 0 anticorpo pode também ser uma proteína de fusão domínio de ligação-imunoglobulina tal como divulgado em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
Numa concretização, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento compreendem uma especificidade de ligação para um Fc-gamaR ou um Fc-alfaR presente na superfície de uma célula efetora, e uma segunda especificidade de ligação para um antigénio da célula alvo, p. ex., CLD18.
Numa concretização, a especificidade de ligação para um recetor de Fc é proporcionada por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG) . Tal como aqui utilizada, a expressão "recetor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes da cadeia gama localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas do recetor transmembranares ou solúveis que são agrupadas em três classes de recetores de Fc-gama: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32), e Fc-gamaRIII (CD16). Numa concretização preferida, o recetor de Fc-gama é um Fc-gamaRI humano de elevada afinidade. A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais preferidos são descritas por Fanger et al. em WO 88/00052 e em US 4954617. Estes anticorpos ligam-se a um epitopo de Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ou Fc-gamayRIII num local que é distinto do local de ligação de Fc ao recetor e, assim, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-Fc-gammaRI específicos úteis neste invento são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outras concretizações, o anticorpo anti-recetor de Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e WO 94/10332. A linha celular produtora do anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection a 4 de Novembro de 1992, sob a designação HA022CL1 e tem o N.2 de acesso CRL 11177.
Ainda noutras concretizações preferidas, a especificidade de ligação para um recetor de Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um recetor de IgA humano, p. ex., um recetor de Fc-alfa (Fc-alfaRI (CD89)), a ligação do qual não é, de preferência, bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA). Na expressão "recetor de IgA" pretende-se incluir o produto génico de um gene alfa (Fc-alfaRI) localizado no cromossoma 19. Sabe-se que este gene codifica várias isoformas transmembranares processadas alternativamente de 55 a 110 kDa. Fc-alfaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinófilos e neutrófilos, mas não em populações de células não efetoras. Fc-alfaRI tem afinidade média tanto para IgAl como para IgA2, que aumenta após exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423- 440) . Quatro anticorpos monoclonais específicos de Fc-alfaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a Fc-alfaRI fora do domínio de ligação ao ligando IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).
Fc-alfaRI e Fc-gamaRI são os recetores de desencadeamento preferidos para utilização no invento porque: (1) são expressos principalmente em células imunitárias efetoras, p. ex., monócitos, PMN, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos a níveis elevados (p. ex., 5000-100000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (p. ex., ADCC, fagocitose); (4) medeiam maior apresentação do antigénio, de antigénios incluindo auto-antigénios, dirigidos para eles.
Noutra concretização, a molécula biespecifica é constituída por dois anticorpos monoclonais de acordo com o invento que têm atividades funcionais complementares, tais como um anticorpo funcionando predominantemente através da indução de CDC e o outro anticorpo funcionando predominantemente através da indução de apoptose.
Um "anticorpo especifico de uma célula efetora" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que se liga ao recetor de Fc de células efetoras. Os anticorpos preferidos para utilização no presente invento ligam-se ao recetor de Fc de células efetoras num local ao qual a imunoglobulina endógena não se liga.
Tal como aqui utilizado, a expressão "célula efetora" refere-se a uma célula imunitária que está envolvida na fase efetora de uma resposta imunitária, em oposição às fases cognitiva e de ativação de uma resposta imunitária. Células imunitárias exemplares incluem células de origem mielóide ou linfóide, p. ex., linfócitos (p. ex., células B e células T, incluindo células T citoliticas (CTL) , células assassinas, células assassinas naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efetoras expressam recetores de Fc específicos e realizam funções imunológicas especificas. Em concretizações preferidas, uma célula efetora é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), p. ex., um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR estão envolvidos na morte específica de células alvo e apresentam antigénios a outros componentes do sistema imunitário, ou se ligam a células que apresentam antigénios. Noutras concretizações, uma célula efetora pode fagocitar um antigénio alvo, célula alvo, ou microorganismo. A expressão de um determinado FcR numa célula efetora pode ser regulada por fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, verificou-se que a expressão de Fc-gamaRI é sobre-regulada pelo interferão gama (IFN- ). Esta express aumentada aumenta a atividade citotóxica de células possuindo Fc-gamaRI contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar um antigénio alvo ou uma célula alvo. "Célula alvo" significa qualquer célula indesejável num sujeito (p. ex., um ser humano ou animal) que pode ser atingida por um anticorpo do invento. Em concretizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa ou sobre-expressa CLD18. Células que expressam CLD18 incluem tipicamente células tumorais.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas do presente invento podem ser feitas usando técnicas químicas (ver, p. ex., D.M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (ver US 4474893, para Reading), ou técnicas de ADN recombinante.
Em particular, moléculas biespecíficas e multiespecíficas do presente invento podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação dos constituintes, p. ex., as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CLD18, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, uma variedade de agentes de ligação ou reticulação pode ser utilizada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver p. ex., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648) . Outros métodos incluem os descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) N.2 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), e Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de uma ligação sulfidrilo das regiões charneira C-terminais das duas cadeias pesadas. Numa concretização particularmente preferida, a região charneira é modificada para conter um número impar de resíduos de sulfidrilo, de preferência um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica e multiespecífica é uma proteína de fusão mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligando χ Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica do invento, p. ex., uma molécula biespecífica, pode ser uma molécula de cadeia simples, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia simples, uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem também ser moléculas de cadeia simples ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Os métodos para preparação de moléculas bi- e multiespecíficas são descritos, por exemplo em US 5260203, US 5455030, US 4881175, US 5132405, US 5091513, US 5476786, US 5013653, US 5258498 e US 5482858. A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada através de um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise de FACS, um bioensaio (p. ex. , inibição do crescimento), ou um Ensaio de Western Blot. Cada um destes ensaios deteta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente marcado (p. ex., um anticorpo), específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detetados utilizando, p. ex., um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detetados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., "Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques", The Endocrine Society, Março, 1986). O isótopo radioativo pode ser detetado por meios tais como a utilização de um contador- ou um contador de cintilações ou através de autorradiografia. II. Imunoconjugados
Noutro aspeto, o presente invento apresenta um anticorpo anti-CLD18 conjugado com uma porção ou agente terapêutico, tal como uma citotoxina, um fármaco (p. ex., um imunossupressor), ou um isótopo radioativo. Tais conjugados são aqui referidos como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial e, em particular, mate as células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos.
Agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados do invento incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (p. ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo-descarbazina), agentes alquilantes (p. ex., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina-platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p. ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC), e agentes anti-mitóticos (p. ex., vincristina e vinblastina). Numa concretização preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Noutra concretização, o agente terapêutico é um imunossupressor. Ainda numa outra concretização, o agente terapêutico é GM-CSF. Numa concretização preferida, o agente terapêutico é doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida ou ricina A.
Os anticorpos do presente invento podem também ser conjugados com um isótopo radioativo, p. ex., iodo-131, ítrio-90 ou indio-111, para gerar radiofármacos citotóxicos para tratamento de um distúrbio relacionado com CLD18, tal como um cancro. Os conjugados de anticorpo do invento podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção fármaco não deve ser entendida como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou seu fragmento ativo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou o interferão- ; ou, modificadores da resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos ("GM-CSF"), fator de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.
As técnicas para conjugação de tal fração terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, ver, p. ex., Amon et ai., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agent In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal
Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and
Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation e Cytotoxic Proprieties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982) .
Noutra concretização, os anticorpos de acordo com ο invento são ligados a um ligador-quelante, p. ex., tiuxetano, que permite que o anticorpo seja conjugado com um isótopo radioativo. III. Composições Farmacêuticas
Noutro aspeto, o presente invento proporciona uma composição, p. ex., uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos do presente invento. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com transportadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como as divulgadas em Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Numa concretização, as composições incluem uma combinação de múltiplos (p. ex., dois ou mais) anticorpos isolados do invento que atuam através de mecanismos diferentes, p. ex., um anticorpo que atua predominantemente através da indução de CDC em combinação com outro anticorpo que atua predominantemente através de indução de apoptose.
As composições farmacêuticas do invento podem também ser administradas em terapia de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição do presente invento com pelo menos um agente anti-inflamatório ou, pelo menos, um agente imunossupressor. Numa concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes anti-inflamatórios, tais como um fármaco esteróide ou um ΑΙΝΕ (fármaco anti-inflamatório não esteróide). Agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2 tais como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), ΑΙΝΕ tais como ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis) , diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
Noutra concretização, tais agentes terapêuticos incluem agentes que conduzem ao esgotamento ou inactivação funcional de células T reguladoras como ciclofosfamida em dose baixa, anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-IL2 ou anti-recetor de IL2 .
Ainda noutra concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais quimioterapêuticos, tais como derivados de Taxol, taxotere, gemcitabina, 5-Fluorouracilo, doxorrubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar) . Noutra concretização, os anticorpos do presente invento podem ser administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos, que de preferência mostram eficácia terapêutica em pacientes sofrendo de cancro do estômago, esofágico, pancreático e do pulmão.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em conjunto com radioterapia e/ou transplante autólogo de células estaminais periféricas ou de medula óssea.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados a partir de anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-EPCAM, anti-EGFR, anti-Her2/neu, e anticorpos anti-CD40.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-C3b(i) para aumentar a ativação do complemento.
Tal como aqui utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (p. ex., através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser revestido num material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que mantém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver p. ex., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19).
Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, e fosforoso, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos. Sais de adição básica incluem os derivados de metais de terra alcalina, tais como sódio, potássio, magnésio e cálcio, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, e procaína.
Uma composição do presente invento pode ser administrada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado pelo perito, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p. ex., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Para administrar um composto do invento por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir a sua inactivação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito num transportador apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções tampão aquosas. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água, bem como lipossomas convencionais (Strejan et al. , (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27) .
Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições farmacêuticas do presente invento está contemplada. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma elevada concentração de fármaco. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e suas misturas adequadas. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por microfiltração.
Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e secagem por congelação (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem tal como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem do invento são ditadas por, e diretamente dependentes de, (a) as caracteristicas únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a alcançar, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio e sulfito de sódio; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo e alfa-tocoferol; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico e ácido fosfórico.
Para as composições terapêuticas, formulações do presente invento incluem as adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas através de quaisquer métodos conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do sujeito a tratar e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.
Geralmente, dos cem porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, de preferência de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, com maior preferência de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento.
Formulações do presente invento que são adequadas para administração vaginal incluem também pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo tais transportadores como se sabe serem apropriados na técnica. Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de composições deste invento incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões, ou propulsores que possam ser requeridos.
As frases "administração parentérica" e "administrado por via parentérica" tal como aqui utilizadas, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente através de injeção, e incluem, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, injeção epidural e intrasternal e infusão.
Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e através da utilização de tensioativos.
Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes humidificadores, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, como através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, e ácido fenol-sórbico. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, e cloreto de sódio, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser alcançada através da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Numa concretização, os anticorpos monoclonais do invento são administrados na forma cristalina através de injeção subcutânea, cf. Yang et al., (2003) PNAS, 100(12): 6934-6939. Quando os compostos do presente invento são administrados como produtos farmacêuticos a humanos e animais, podem ser administrados sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,01-99,5% (com maior preferência, 0,1 a 90%) de ingrediente ativo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
Independentemente da via de administração selecionada, os compostos do presente invento, que podem ser utilizados numa forma hidratada adequada, e/ou nas composições farmacêuticas do presente invento, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis através de métodos convencionais conhecidos dos peritos na técnica.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas do presente invento podem ser variados de modo a obter-se uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares do presente invento empregues, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a empregar, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e a história médica prévia do paciente a tratar, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
Um médico ou veterinário com vulgar perícia na técnica pode determinar prontamente e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos do invento empregues na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que o requerido para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado fosse alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição do invento será a quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. E preferível que a administração seja por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, de preferência administrada proximal ao local do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente a intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente em formas de unidade de dosagem. Embora seja possível que um composto do presente invento seja administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação (composição) farmacêutica.
Numa concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados através de infusão, de preferência infusão contínua lenta durante um longo período, tal como mais de 24 horas, para reduzir efeitos secundários tóxicos. A administração pode também ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada através da medição da quantidade de anticorpos monoclonais anti-CLD18 em circulação após a administração numa amostra biológica usando anticorpos anti-idiotipicos que se dirigem aos anticorpos anti-CLD18.
Ainda noutra concretização, os anticorpos são administrados através de terapia de manutenção, tal como, p. ex., uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.
Ainda noutra concretização, os anticorpos de acordo com o invento podem ser administrados através de um regime incluindo uma infusão de um anticorpo contra CLD18 seguida de uma infusão de um anticorpo contra CLD18 conjugado com um isótopo radioativo. 0 regime pode ser repetido, p. ex., 7 a 9 dias depois.
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa concretização preferida, uma composição terapêutica do invento pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados em US 5399163; US 5383851; US 5312335; US 5064413; US 4941880; US 4790824; ou US 4596556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis no presente invento incluem os descritos em: US 4487603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuição de medicação a uma taxa controlada; US 4486194, que divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; US 4447233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; US 4447224, que divulga um aparelho de infusão implantável de caudal variável para distribuição contínua de fármacos; US 4439196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos possuindo compartimentos de múltiplas câmaras; e US 4475196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos.
Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos são bem conhecidos dos peritos na técnica. Em certas concretizações, os anticorpos do invento podem ser formulados para assegurar uma distribuição correta in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para assegurar que os compostos terapêuticos do invento atravessam a BHE (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, p. ex., US 4522811; US 5374548; e US 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para dentro de células ou órgãos específicos, e, portanto, aumentam a distribuição de fármacos direcionada (ver, p. ex., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Porções de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, p. ex., US 5416016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140, M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); e recetor de proteína A tensioativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134) .
Numa concretização do invento, os compostos terapêuticos do invento são formulados em lipossomas. Numa concretização mais preferida, os lipossomas incluem uma porção de direcionamento. Numa concretização mais preferida, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos através de injeção do bolo num local proximal à área desejada, p. ex., o local de um tumor. A composição deve ser fluida até ao ponto de ser fácil a utilização de seringa. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos.
Noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser formulados para prevenir ou reduzir o seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito através de métodos conhecidos na técnica, p. ex., através de PEGuilação dos anticorpos ou através da utilização de fragmentos F (ab)2 ' . Outras referências podem ser feitas a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation". J. Immunol. Methods, 152: 177-190; e a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins", Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 27 9-283.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia tumoral pode ser medida através de respostas tumorais objetivas que podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (RC) é definida como uma prova não clínica, radiológica ou outra, de doença. Uma resposta parcial (RP) resulta de uma redução do tamanho total do tumor superior a 50%. O tempo mediano até à progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta objetiva do tumor.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia tumoral pode também ser medida através da sua capacidade para estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir cancro pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada através do exame da capacidade do composto para inibir o crescimento celular ou a apoptose através de ensaios in vitro conhecidos do perito na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar os sintomas num sujeito. Um vulgar perito na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou a via de administração selecionada. A composição deve ser estéril e fluida até ao ponto de a composição poder ser distribuída através de uma seringa. Além da água, o transportador pode ser uma solução salina tamponada isotónica, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e suas misturas adequadas. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção de longo prazo das composições injetáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto ativo é adequadamente protegido, tal como descrito acima, o composto pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível assimilável. IV. Utilizações e Métodos envolvendo anticorpos do Invento
Os anticorpos (incluindo imunoconjugados, biespecíficos/multiespecíficos, composições e outros derivados aqui descritos) do presente invento têm numerosas utilidades terapêuticas envolvendo o tratamento de distúrbios envolvendo células que expressam CLD18. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados a células em cultura, p. ex., in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p. ex. , in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios tais como aqueles aqui descritos. Tal como aqui utilizado, pretende-se que o termo "sujeito" inclua humanos e animais não humanos que respondem aos anticorpos contra CLD18. Os sujeitos preferidos incluem pacientes humanos possuindo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados matando células doentes, em particular células caracterizadas por um padrão de expressão alterado de CLD18 em comparação com células normais.
Um efeito terapêutico nos tratamentos aqui discutidos é de preferência alcançado através das propriedades funcionais dos anticorpos do invento para mediar a morte de células, por exemplo por indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), apoptose, adesão homotípica e/ou fagocitose, de preferência por indução de lise mediada por CDC e/ou lise mediada por ADCC.
Por exemplo, numa concretização, os anticorpos do presente invento podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigénico, p. ex., um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais que expressam CLD18 incluindo, por exemplo, cancro gástrico. Exemplos de doenças tumorigénicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam todos os cancros que expressam CLD18 e entidades tumorais, incluindo cancro de estômago, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro colorretal, cancro hepático, cancro da vesícula biliar e cancro da cabeça-pescoço. Estes cancros podem estar em estádios iniciais, intermédios ou avançados, p. ex. metástase.
As composições farmacêuticas e os métodos de tratamento descritos de acordo com o invento podem também ser úteis para imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.
Noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser utilizados para detetar níveis de CLD18 ou formas particulares de CLD18, ou níveis de células que contenham CLD18 na superfície da sua membrana, níveis que podem então ser ligados a certas doenças ou sintomas de doença tal como descrito acima. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para esgotar ou interagir com a função de células que expressam CLD18, implicando, assim, estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser conseguido através do contacto de uma amostra e de uma amostra de controlo com o anticorpo anti-CLD18 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CLD18. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CLD18 são detetados e comparados na amostra e numa amostra de controlo, isto é, uma amostra de referência.
Os anticorpos do invento podem ser inicialmente ensaiados quanto à sua atividade de ligação associada a utilizações terapêuticas ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados utilizando ensaios de citometria de fluxo, tal como aqui descrito.
Além disso, pode ser ensaiada a atividade dos anticorpos no desencadeamento de pelo menos uma atividade celular efetora mediada por efetor, incluindo a inibição do crescimento e/ou a morte de células que expressam CLD18. Por exemplo, pode ser ensaiada a capacidade dos anticorpos para desencadear CDC e/ou apoptose. Os protocolos para ensaio de CDC, adesão homotípica, agrupamento molecular ou apoptose são aqui descritos.
Os anticorpos do invento podem ser utilizados para desencadear, in vivo ou in vitro, uma ou mais das seguintes atividades biológicas: para inibir o crescimento de e/ou a diferenciação de uma célula que expressa CLD18; para matar uma célula que expressa CLD18; para mediar fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa CLD18 na presença de células efetoras; para mediar CDC de uma célula que expressa CLD18 na presença de complemento; para mediar a apoptose de uma célula que expressa CLD18; para induzir adesão homotípica; e/ou para induzir translocação em jangadas lipidicas após ligação a CLD18.
Numa concretização particular, os anticorpos são utilizados in vivo ou in vitro, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com CLD18. Exemplos de doenças relacionadas com CLD18 incluem, entre outros, cancros, tais como cancro gástrico, cancro pancreático, cancro esofágico, cancro de pulmão e cancros tais como os listados acima. CLD18A2 é também expresso em células do estômago normais diferenciadas. Os possíveis efeitos secundários clínicos induzidos pelos anticorpos pela morte destas células podem ser reduzidos ou evitados através da administração paralela de fármacos protetores do estômago tais como antacida, ou inibidores da bomba de protões gástrica tal como omeprazol ou fármacos relacionados.
Vias de administração adequadas das composições de anticorpos do invento, in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas pelos vulgares peritos.
Tal como descrito acima, os anticorpos anti-CLD18 do invento podem ser coadministrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, p. ex., um agente citotóxico, um agente radiotóxico, agente antiangiogénico e agente imunossupressor para reduzir a indução de respostas imunitárias contra os anticorpos do invento. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, p. ex., uma terapia anticancerosa, p. ex., radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como os listados acima. A coadministração dos anticorpos anti-CLD18 do presente invento com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anticancerosos que atuam através de diferentes mecanismos produzindo um efeito citotóxico para as células tumorais. Tal coadministração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou a uma mudança na antigenicidade das células tumorais que as tornariam não reativas com o anticorpo.
Numa outra concretização particular do invento, o sujeito a quem se administra o anticorpo é, adicionalmente, tratado com um agente antiangiogénico incluindo anticorpos direcionados para VEGF ou VEGFR e um ou mais compostos químicos inibindo a angiogénese. 0 pré-tratamento com ou a aplicação paralela destes fármacos pode melhorar a penetração dos anticorpos em tumores em bruto.
Noutra concretização particular do invento, o sujeito a quem é administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um composto inibindo a sinalização do recetor do fator de crescimento, incluindo anticorpos monoclonais de ligação ao recetor EGFR, bem como compostos químicos que inibem a sinalização iniciada pelo recetor EGFR, Herl ou Her2/neu.
As células efetoras específicas do alvo, p. ex., células ligadas a composições (p. ex. anticorpos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) do invento podem também ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para direcionamento podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células possuindo recetores de IgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas a partir do sujeito a tratar. As células efetoras específicas do alvo podem ser administradas como uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser na ordem de 108 a 109 mas dependerá da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, p. ex., uma célula tumoral que expressa CLD18, e efetuar morte celular através, p.ex. de fagocitose. As vias de administração podem também variar. A terapia com células efetoras específicas do alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção das células alvo. Por exemplo, terapia antitumoral utilizando as composições do invento e/ou células efetoras armadas com estas composições pode ser utilizada em conjunto com quimioterapia.
Adicionalmente, pode ser utilizada imunoterapia de combinação para dirigir duas populações distintas de efetores citotóxicos para rejeição de células tumorais. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 ligados a anti-Fc-RI ou anti-CD3 podem ser utilizados em conjunto com agentes de ligação específicos do recetor de IgG ou IgA.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento podem também ser utilizadas para modular os níveis de Fc-gamaR ou Fc-alfaR em células efetoras, tais como através da proteção e eliminação de recetores na superfície celular. Misturas de anti-recetores de Fc podem também ser utilizadas para esta finalidade.
As composições (p. ex., anticorpos, moléculas biespecíficas e multiespecíficas e imunoconjugados) do invento que têm locais de ligação ao complemento, tais como porções de IgGl, 2 ou 3 ou IgM que se ligam ao complemento, podem também ser utilizadas na presença de complemento. Numa concretização, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação do invento e células efetoras apropriadas pode ser suplementado através da adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação do invento pode ser melhorada através da ligação de proteínas do complemento. Noutra concretização, as células alvo revestidas com as composições do invento podem também ser lisadas pelo complemento. Ainda noutra concretização, as composições do invento não ativam o complemento.
As composições do invento podem também ser administradas juntamente com complemento. Consequentemente, dentro do âmbito do invento estão composições compreendendo anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas por o complemento estar localizado em estreita proximidade com os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas.
Alternativamente, os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas do invento e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente. A ligação das composições do presente invento a células alvo causa a translocação do complexo antigénio CLD18-anticorpo para jangadas lipídicas da membrana celular. Tal translocação cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo que podem ativar e/ou aumentar eficientemente a CDC.
As composições de anticorpos do invento (p. ex., anticorpos e imunoconjugados) e instruções de utilização podem estar compreendidos num estojo (kit) . 0 estojo pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais do invento (p. ex., um anticorpo possuindo uma atividade complementar).
Consequentemente, aos doentes tratados com as composições de anticorpo do invento pode ser adicionalmente administrado (antes de, em simultâneo com, ou após a administração de um anticorpo do invento) um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhore ou aumente o efeito terapêutico dos anticorpos do invento.
Em outras concretizações, o sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que module, p. ex., aumente ou iniba, a expressão ou atividade de recetores de Fc-gama ou Fc-alfa através de, por exemplo, tratamento do indivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas incluem fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão- (IFN- ), e fator de necrose e tumoral (TNF).
Outros agentes importantes para aumento da eficácia terapêutica dos anticorpos e composições farmacêuticas aqui descritos são -glucanos que são homopolissacáridos de resíduos ramificados de glicose e são produzidos através de uma variedade de plantas e microorganismos, por exemplo, bactérias, algas, fungos, leveduras e grãos. Podem também ser utilizados fragmentos de -glucanos produzidos por organismos.
De preferência, o -glucano é um polímero de (l,3)gliceç em que pelo menos algumas das unidades de glicose do esqueleto, p. ex. 3-6% das unidades de glicose do esqueleto, possuem ramificações tais como ramificações (1,6).
Os métodos para deteção da presença de antigénio CLD18 numa amostra, ou medição da quantidade de antigénio CLD18, podem compreender o contacto da amostra, e de uma amostra de controlo, com um anticorpo que se ligue especificamente a CLD18, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou sua porção e CLD18. É então detetada a formação de um complexo, em que a diferença de formação de um complexo entre a amostra comparada com a amostra de controlo é indicativa da presença de antigénio CLD18 na amostra.
Um método para deteção da presença ou quantificação da quantidade de células que expressam CLD18 in vivo ou in vitro pode compreender (i) a administração a um sujeito de uma composição do invento conjugada com um marcador detetável; (ii) a exposição do sujeito a um meio para deteção do referido marcador detetável para identificar áreas contendo células que expressam CLD18.
Os métodos tal como descritos acima são úteis, em particular, para diagnóstico de doenças relacionadas com CLD18 e/ou a localização de doenças relacionadas com CLD18 tal como doenças cancerígenas. De preferência, uma quantidade de CLD18, de preferência CLD18-A2, numa amostra que seja superior à quantidade de CLD18, de preferência CLD18-A2, numa amostra de controlo é indicativa da presença de uma doença relacionada com CLD18 num sujeito, em particular um ser humano, do qual a amostra é derivada.
Em ainda outra concretização, os imunoconjugados do invento podem ser utilizados para direccionar compostos (p. ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) para células que tenham CLD18 expressa na sua superfície, através da ligação desses compostos ao anticorpo. 0 presente invento é ainda ilustrado através dos seguintes exemplos.
EXEMPLOS 1. Geração de anticorpos de murídeo contra CLD18 a. Imunizações:
Ratinhos Balb/c ou C57/BL6 foram imunizados com vetores de expressão eucarióticos, codificando fragmentos de CLD18 humana (SEQ ID NO: 15, 16; 17, 18) . 50 pg ou 25 pg de ADN plasmídico foram injetados nos quadriceps (intramuscular, i.m.) nos dias 1 e 10 para geração de anticorpos monoclonais de Setl ou alternativamente nos dias 1 e 9, 1 e 11, ou 1, 16 e 36 para geração de anticorpos monoclonais de Set2 na presença de adjuvantes, por exemplo CpG (para detalhes ver Tab. lb) . CpG bem como células transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) sozinhas ou co-transfectadas adicionalmente com CD40L solúvel de murideo codificando ARN foram injetados por via intramuscular, PEI-Man foi injetado por via intramuscular ou intraperitoneal. A presença de anticorpos dirigidos contra CLD18 humana no soro de ratinhos foi monitorizada através de microscopia de imunofluorescência imunitária entre o dia 16 e 43, dependendo do protocolo de imunização especifico utilizado. A imunofluorescência foi determinada utilizando células HEK293 transfectadas transientemente com um ácido nucleico codificando uma construção de fusão compreendendo CLD18A2 humana (SEQ ID NO: 1, 2) e uma proteína repórter fluorescente. Os ratinhos com respostas imunitárias detetáveis (Fig. 1) foram reforçados três dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais de Setl, ou os ratinhos foram reforçados três dias, três e dois dias, ou os ratinhos foram reforçados quatro, três e dois dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais de Set2 através de injeção intraperitoneal de 5*107 ou alternativamente lxlO8 células HEK293 transfectadas transientemente com um ácido nucleico codificando CLD18A2 humana (SEQ ID NO: 1, 2) (para detalhes ver Tab. lb). Na Tab. la os protocolos de imunização utilizados são dedicados aos respetivos anticorpos monoclonais.
b. Geração de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos para CLD18:
Esplenócitos de ratinho foram isolados e fundidos com PEG a uma linha celular de mieloma de ratinho com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então pesquisados quanto à produção de imunoglobulinas com especificidade para CLD18 utilizando células HEK293 transfectadas com um ácido nucleico codificando CLD18 humana através de análise FACS. Suspensões de células individuais de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fundidas com células de mieloma de ratinho não secretoras P3X63Ag8U.l (ATCC, CRL 1597) numa razão de 2:1 utilizando PEG a 50% (Roche Diagnostics, CRL 738641). As células foram plaqueadas a aproximadamente 3*104/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de cerca de duas semanas de incubação em meio seletivo contendo soro fetal bovino a 10%, fusão de hibridoma a 2% e suplemento de clonagem (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1363735) mais HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 pg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma, CRL H0262). Após 10 a 14 dias os poços individuais foram pesquisados através de citometria de fluxo quanto a anticorpos monoclonais anti-CLD18. Os hibridomas secretores de anticorpos foram novamente plaqueados, pesquisados novamente e, se ainda fossem positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18, eram subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis eram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização. Foi escolhido pelo menos um clone de cada hibridoma, que manteve a reatividade das células parentais (por FACS). Foram gerados 9 bancos de células em frascos para cada clone que foram armazenados em azoto liquido. c. Seleção de anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18:
Para determinar o isotipo dos anticorpos, foi realizado um ELISA de isotipo. O monoAB ID Kit de ratinho (Zymed, CRL 90-6550) ou alternativamente o IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, N.2 Cat. 1493027) foi utilizado para determinar as subclasses de Ig dos anticorpos monoclonais reativos com CLD18 identificados. Definido como Setl, foram geradas dezanove linhas celulares de hibridoma, seis de uma fusão de células de um ratinho C57/BL6 imunizado com CLD18A2-VoltaD3 (SEQ ID NO: 17, 18), treze de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18A2-Voltai (SEQ ID NO: 15, 16), que expressam os seguintes anticorpos: 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 24H5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b, 182-D758-034 26B5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D758-035, DSM ACC2745 26D12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D758-036, DSM ACC2746 28D10: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D758-040, DSM ACC2747 37G11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-055, DSM ACC2737 37H8: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-056, DSM ACC2738 38G5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-057, DSM ACC2739 38H3: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-058, DSM ACC2740 39F11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-059, DSM ACC2741 41C6: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-060 42E12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-061, DSM ACC2748 43A11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-062, DSM ACC2742 44E10: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-063 47D12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-064 61C2: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b, 182-D1106-067, DSM ACC2743 75B8: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D756-001 85A3: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D756-002 9E8: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D758-011 19B9: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D758-024
Definido como Set2, foram geradas cinco linhas celulares de hibridoma, uma de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18A2-VoltaD3 (SEQ ID NO: 17, 18) e CLD18A2-
VoltaDl (SEQ ID NO: 15, 16), quatro de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18BA2-VoltaDl (SEQ ID NO: 15, 16), que expressam os seguintes anticorpos: 4 5C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10 45C1: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D758-187 125E1: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-279, DSM ACC2808 163E12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-294, DSM ACC2809 166E2: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-308 175D10: anticorpo monoclonal de ratinho IgGl, 182-D1106-362, DSM ACC2810 2. Produção de Anticorpos Monoclonais
Produção e purificação de anticorpos monoclonais reativos com CLD18:
Para produzir quantidades de mg de anticorpo para caracterização funcional, células de hibridoma foram semeadas em biorreatores baseados em diálise (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) a 2xl06 células/ml. 0 anticorpo contendo sobrenadante foi colhido uma vez por semana. 0 anticorpo monoclonal de ratinho foi purificado utilizando Melon Gel (Pierce, Rockford, USA) e concentrado através de precipitação com sulfato de amónio, ou, alternativamente, purificado através de FPLC utilizando proteína A. A concentração e a pureza do anticorpo foram determinadas através de Ensaio de BCA e a pureza verificada através de eletroforese em gel com dodecilsulfato de sódio e coloração de Coomassie. 3. Características de Ligação dos Anticorpos Monoclonais a. Controlo de qualidade dos transfectantes em WB, IF:
Para gerar células que expressam CLD18A2, células HEK293 ou CHO foram transfectadas com ácidos nucleicos codificando CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) ou CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4).
As células HEK293 foram transfectadas com CLDN18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4) ou deixadas não transfectadas. 24 horas após a transfecção, as células foram colhidas, Usadas e sujeitas a eletroforese em gel com dodecilsulfato de sódio. 0 gel foi transferido e corado com um anticorpo de ratinho anti-myc. Após incubação com um anticorpo anti-ratinho marcado com peroxidase, a membrana foi revelada com reagente ECL e visualizada utilizando um gerador de imagens LAS-3000 (Fuji). Apenas nas células transfectadas mas não no controlo negativo, foi observada uma banda com o peso molecular esperado de CLD18-myc (Fig. 2) .
As células CHO foram transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) e criadas em lâminas de câmaras durante 24 h. As células foram fixadas com metanol e coradas com um anticorpo policlonal de coelho contra CLD18 a 1 yg/ml durante 60 min. a 25°C. Após lavagem, as células foram coradas com uma IgG de cabra anti-coelho marcada com Alexa488 (Molecular Probes) e avaliadas através de microscopia de fluorescência. A Fig. 3 mostra células CHO transfectadas, que expressam CLD18 na membrana celular bem como células não transfectadas. Estas células que expressam heterologamente CLD18 foram utilizadas para os seguintes ensaios para testar a especificidade da ligação do anticorpo. b. Seleção de anticorpos monoclonais que se ligam a CLDlS/Pesquisas primárias através de citometria de fluxo: Células HEK293 foram co-transfectadas com vetores de expressão codificando CLD18A2 humana (SEQ ID NO: 1, 2) e uma proteína repórter fluorescente 40 h antes do ensaio, ou, alternativamente, células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) foram utilizadas e contrastadas com iodeto de propídio (PI). Após desprendimento das células utilizando EDTA 2 mM/PBS, as células foram lavadas com meio de crescimento completo e plaqueadas a aproximadamente 1-5*105 células/poço em placas de microtitulação de fundo em U. As células foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadante do hibridoma seguido por dois passos de lavagem com FBS/PBS inactivado por calor a 1% e finalmente incubação com APC ou anticorpo secundário especifico anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647. Após dois passos de lavagem, as células co-transfectadas foram fixadas com CellFIX (BD Biosciences) . A ligação foi avaliada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A expressão do marcador de fluorescência é traçada no eixo horizontal contra a ligação do anticorpo no eixo vertical. Detetou-se que todos os anticorpos de ratinho 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 se ligavam especificamente na superfície das células que expressam marcador de fluorescência (Fig. 4, células em Q2) tal como exemplificado para sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais 24H5 (Fig. 4A, células em Q2), 85A3 (Fig. 4B), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 e 45C1 (Fig. 4C, células em Ql). c. Comparação da ligação do anticorpo a CLD18A2 marcado com Myc ou HA:
As características de ligação dos anticorpos monoclonais específicos de CLD18 identificados foram ainda melhor especificadas. Portanto, a ligação do anticorpo monoclonal foi analisada para mutantes de CLD18A2, criados através da inserção de marcadores epitópicos. CLD18A2-HA (SEQ ID NO: 6) contém um marcador epitópico HA em CLD18A2-voltal, enquanto CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4) contém um marcador epitópico Myc inserido em CLD18A2-volta2. Como a inserção destes marcadores causa a destruição de epitopos, os anticorpos monoclonais identificados podem ser agrupados de acordo com a perda de ligação a qualquer um dos mutantes. Células HEK293 co-transf ectadas transientemente com um marcador de fluorescência e CLD18A2 humana, ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-HA, ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-Myc, foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais específicos de CLD18 durante 30 min. a 4°C, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647. Antes da análise num BD FACSArray, as células foram fixadas utilizando CellFIX. Tal como exemplificado para 24H5, 9E8, 26B5 e 19B9 na Fig. 5, os anticorpos monoclonais podiam ser separados com base nas suas características de ligação em quatro grupos diferentes: (i) anticorpos que se ligam a CLD18A2 não modificada bem como a CLD18A2-HA e CLD18A2-Myc, p. ex. 24H5, (Fig. 5A) , ou (ii) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-HA, p. ex. 9E8, (Fig. 5B), ou (iii) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-Myc, p. ex. 26B5, (Fig. 5C), ou (iv) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-HA nem a CLD18A2-Myc, p. ex. 19B9, (Fig. 5D). d. Comparação da ligação de anticorpos a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de citometria de fluxo: A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais identificados para isoformas de CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 que expressam CLD18A2 humana de forma estável (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 que expressam CLD18A1 humana de forma estável (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação de células ou alternativamente sem fixação mas com contrastação com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 6 mostra exemplos para os dois grupos de anticorpos monoclonais que foram identificados no painel constituído por 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) os anticorpos monoclonais 43A11, 45C1, e 163E12 ligam-se especificamente a CLD18A2 humana mas não a CLD18A1 humana (Fig. 6A,B), e (ii) o anticorpo monoclonal 37H8 liga-se a ambas as isoformas humanas (Fig. 6A). e. Comparação da ligação do anticorpo a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de microscopia de imunofluorescência: Células HEK293 foram transfectadas transientemente com um vetor de expressão codificando uma proteína de fusão de CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) ou CLD18A2 (SEQ ID NO: 2) com um repórter de fluorescência e criadas em lâminas de câmaras. As células foram coradas sem serem fixadas ou após fixação com paraformaldeído com anticorpo monoclonal contendo sobrenadante da cultura de tecidos durante 30 min. a 37°C. Após lavagem, as células foram coradas com um anticorpo anti-Ig de ratinho marcado com Alexa555 (Molecular Probes). A ligação dos anticorpos foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Tal como mostrado na Fig. 7, o anticorpo 37G11 reagiu especificamente com CLD18A2 (Fig. 7A) mas não com CLD18A1 (Fig. 7B) . Em contraste, o anticorpo 26B5 foi reativo com CLD18A2 e CLD18A1 (Fig. 8).
Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, foi observada uma clara diferença entre a coloração de células vivas e as células fixadas com paraformaldeído. Os anticorpos formaram uma coloração uniforme da membrana quando as células eram fixadas (Fig. 7C, 8C, 8D). Em contraste, a incubação de células vivas com estes anticorpos conduz à geração de aglomerados de proteínas, visíveis como um padrão de coloração semelhante a pintas (Fig. 7A, 8A, 8B). Isto mostra que todos os anticorpos se ligam a epitopos nativos tal como verificado na superfície das células vivas. f. Determinação de linhas celulares endogenamente expressoras:
Um par de iniciadores específicos do gene de CLD18A2 (SEQ ID NO: 11, 12) foi utilizado em análises de RT-PCR para pesquisar linhas celulares para expressão de CLD18A2. Verificou-se que as linhas celulares de carcinoma gástrico humano NCI-SNU-16 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) e KATO-III (ATCC HTB-103) e a linha celular de adenocarcinoma de pâncreas humano DAN-G (DSMZ ACC249) apresentam expressão endógena robusta de CLD18 (Fig. 9). A expressão foi confirmada ao nível proteico através de coloração com um soro policlonal de coelho contra CLD18. g. Coloração de linhas celulares endogenamente expressoras com anticorpos específicos de CLD18 e análise de imunofluorescência: Células DAN-G, SNU-16, NUGC-4 e KATO-III foram criadas em lâminas de câmaras sob condições padrão. As células foram não fixadas ou alternativamente fixadas com metanol e coradas com os respetivos anticorpos. Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 foi observada coloração da superfície celular tal como exemplificado na Fig. 10, 11 e 12A. Para os anticorpos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10 o reconhecimento do epitopo nativo foi ensaiado e foi observada coloração da superfície celular em células não fixadas tal como mostrado na Fig. 12B. Os subgrupos de anticorpos mostraram coloração homogénea da membrana celular preponderantemente nas interfaces célula-célula ou em partes da membrana livres não adjacentes a outras células. Outros anticorpos coraram focos e agregados discretos na membrana celular demonstrando em conjunto que os respetivos anticorpos se ligam a diferentes epitopos, incluindo epitopos que são mascarados através da associação homotípica ou heterotípica de CLD18 bem como epitopos de CLD18 acessíveis nas junções de oclusão preformadas. h. Coloração de linhas celulares endogenamente expressoras através de citometria de fluxo: A expressão na superfície de CLD18A2 expressa constitutivamente em células vivas KATO-III e NUGC-4 foi analisada através de citometria de fluxo. Isto é exemplificado através de células KATO-III e NUGC-4 coradas com anticorpo monoclonal 61C2 ou 163E12, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação das células ou alternativamente sem fixação. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 13 mostra uma forte ligação de 61C2 a pelo menos 70,3% das células KATO-III e de 163E12 a CLD18A2 a células KATO-III e NUGC-4. i. Alinhamento das sequências de CLD18A1 e CLD18A2 humanas e de ratinho: A CLD18A2 humana (NP_ 001002026) e a CLD18A1 humana (NP_057453) numa comparação de sequências diferem no terminal N e as variantes de CLD18 de ratinho (NP_062789 e AAL15636) demonstram elevada homologia e locais de variação da sequência entre as moléculas (ver Fig. 14). j. Reatividade dos anticorpos com CLD18A1 de murideo e CLD18A2 de murideo analisada através de citometria de fluxo: A ligação dos anticorpos monoclonais identificados com CLD18A2 e CLD18A1 de murideo foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 co-transfectadas transientemente com um marcador de fluorescência e CLD18A2 de murideo (SEQ ID NO: 33, 35) ou com um marcador de fluorescência e CLD18A1 de murideo (SEQ ID NO: 36, 37) foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 humana, 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 e 163E12, respetivamente, durante 30 min. a 4°C, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação das células. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 15 mostra três perfis de ligação diferentes: 38G5 e 45C1 não se ligam a nenhuma das isoformas de CLD18 de murideo, 37G11 e 163E12 ligam-se a CLD18A2 de murideo mas não a CLD18A1 de murideo, e 38H3 liga-se a CLD18A1 e CLD18A2 de murideo. Estes anticorpos são ferramentas valiosas para determinar a potencial toxicidade dos anticorpos monoclonais de CLD18 em estudos pré-clínicos.
Em conjunto estes dados mostram que os anticorpos monoclonais do invento 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10 gerados contra CLD18 representam uma diversidade de características de ligação a diferentes epitopos e topologias da CLD18 humana.
Uma combinação de diferentes propriedades descritas nos exemplos 3b, c, d, e, g, h, e j pode ser utilizada para categorizar os anticorpos monoclonais em tais classes diferentes. 4. Imuno-histoquímica (IHC)
Um anticorpo especifico do epitopo de CLD18A2 gerado através de imunização com o péptido de SEQ ID NO: 21 foi utilizado para caracterização imuno-histoquímica da expressão de CLD18A2. Cortes de tecido impregnados em parafina derivados de um amplo painel de tecidos normais e tumorais foram utilizados para expressão proteica e análises de localização. Nenhuma expressão significativa foi detetada em nenhum outro tecido de órgão normal, exceto no estômago (ver Tab. 2, Fig. 16A) . Em contraste, a expressão de CLD18A2 foi verificada através de imuno-histoquímica em diferentes tipos de cancro, incluindo cancro de estômago e cancro de pulmão (Fig. 16B).
Curiosamente, a expressão da proteína CLD18A2 na mucosa gástrica estava restrita a células terminalmente diferenciadas do epitélio gástrico nas regiões da base e do fosso. Em contraste, as células na região do pescoço da mucosa gástrica, em particular as células estaminais gástricas na porção do istmo, que repõem toda a mucosa, não expressam CLD18A2 (Fig. 16C) .
Tab. 2: Expressão de CLD18A2 em tecidos normais e tumorais, tal como analisado através de IHC
Tipo de tecido Resultado
Suprarrenal -
Bexiga Células do sangue
Medula Óssea
Mama Cólon
Endotélio
Esófago
Trompa de Falópio Coração
Rim (glomérulo, túbulo) Fígado
Pulmão Nódulo linfático
Ovário - Pâncreas
Paratiróide
Pituitária -
Placenta
Próstata
Pele
Baço
Estômago + Músculo estriado
Testículo
Timo
Tiroide
Uréter - Útero (colo do útero, endométrio) 0 anticorpo monoclonal 39F11 foi utilizado para estudos imuno-histoquímicos específicos de CLD18A2. Tal como mostrado na Fig. 17A, não foi detetável qualquer reatividade significativa em nenhum dos tecidos normais testados exceto no estômago (Fig. 17A), enquanto os carcinomas do estômago e do pulmão permanecem fortemente positivos (Fig. 17B) .
Outro grupo de anticorpos do invento mostra um padrão de coloração específico de cancro com ligação a cancro do estômago mas sem reatividade com tecido de estômago normal. Um tal padrão de coloração é mostrado na Fig. 18A com o anticorpo monoclonal 26B5.
Foi utilizada imuno-histoquímica para análise da especificidade de 175D10 (Fig. 18B), 43A11 (Fig. 18C), 163E12 (Fig.l8D) e 45C1 (Fig. 18E) em secções derivadas de linhas celulares tumorais HEK293: linhas celulares tumorais HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) ou sendo transfectadas com um plasmídeo de controlo da expressão contendo apenas o gene de resistência a antibiótico para seleção (HEK293-falso) foram xenoenxertadas em ratinhos para formar tumores sólidos. Não foi detetada qualquer expressão em tumores de xenoenxertos de HEK293 falsamente transfectadas. Em contraste, observou-se forte e homogénea coloração da membrana em tumores de xenoenxertos de HEK293-CLD18A2 e em espécimes de carcinoma do estômago. 5. Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC) a. CDC de anticorpos monoclonais de Setl medida através de citometria de fluxo:
Plasma para lise do complemento foi preparado através da retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos S-Monovette-EDTA vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha), que foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. O plasma foi colhido e armazenado a -20°C.
Num primeiro conjunto de experiências, os sobrenadantes de hibridoma foram analisados quanto sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). As células foram incubadas com os sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais 85A3, 28D10, 24H5 ou 26D12, respetivamente durante 20 min. à temperatura ambiente. Após centrifugação (5 min. a 450 g) o sobrenadante foi removido e plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) foi adicionado às células e incubado durante mais 20 min. a 37°C. Depois disso, a lise celular foi determinada em FACS utilizando o método de coloração de iodeto de propidio (PI). PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 g/ml. Para citometria de fluxo, foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Foram colhidos pelo menos 10000 eventos para análise com os restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FCS). A percentagem de células lisadas (células positivas para PI) é mostrada na Figura 19.
Os anticorpos monoclonais 85A3, 28D10 e 26D12 induziram lise de 33,5%, 38,2% e 39,2%, respetivamente, das células HEK293- CLD18A2, enquanto a CDC mediada por 24H5 foi de apenas 19,3%. b. CDC de anticorpos monoclonais de Setl:
Num segundo conjunto de experiências foi analisada a especificidade dos anticorpos monoclonais para induzir CDC em células que expressam CLD18A2. Portanto, um conjunto de anticorpos de ligação tanto específica para CLD18A2 humana como também ligando-se a CLD18A1 humana foi testado quanto à indução de CDC contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana (CH0-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (CHO-CLD18A1). Células CHO-CLD18A2 e CH0-CLD18A1 foram semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3*104/poço em placas de microtitulação de cultura de tecidos de fundo plano. 0 meio de crescimento do dia seguinte foi removido e as células foram incubadas em triplicado com os sobrenadantes de hibridoma ajustados para uma concentração de 10 g/ml, contendo os anticorpos monoclonais 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, e 61C2, respetivamente. As células de controlo foram incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo saponina a 0,2% ara a determinação da lise de fundo e da lise máxima, respetivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e foi adicionado plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) às células e incubou-se mais 20 min. a 37°C. Em seguida, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm foi medida utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica foi calculada como se segue: % de lise específica = (fluorescência da amostra - fluorescência de fundo) /(fluorescência da lise máxima - fluorescência de fundo) x 100. A Fig. 20 mostra que os anticorpos monoclonais 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 e 39F11 medeiam elevada CDC, o anticorpo monoclonal 38G5 medeia média CDC, os anticorpos monoclonais 41C6 e 61C2 medeiam baixa CDC, e os anticorpos monoclonais 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 e 47D12 não medeiam nenhuma CDC contra células CHO-CLD18A2. Em contraste, nenhum dos anticorpos é capaz de induzir CDC contra células CHO-CLDA1, embora 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 e 61C2 também se liguem a CLD18A1, tal como determinado através de citometria de fluxo e imunofluorescência. c. Titulação dos anticorpos monoclonais e CDC utilizando anticorpos monoclonais de Setl:
Para medir a capacidade dos anticorpos anti-CLD18 para induzir CDC a baixas concentrações, foi realizada uma experiência em que foram titulados três anticorpos diferentes.
As células CHO-CLD18A2 criadas em placas de microtitulação foram incubadas com um intervalo de concentrações de 75B8 (100, 30, 10, 3 e 1 pg/ml), 37H8 (10, 3,3 e 1 pg/ml) e 28D10 (10, 1 e 0,1 pg/ml), respetivamente, durante 20 min. à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e foi adicionado às células plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) e incubou-se durante mais 20 min. a 37°C. Antes da análise utilizando um Tecan Safire, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio. As Figuras 21A-C mostram a percentagem de lise específica em função da concentração de anticorpo. O anticorpo monoclonal 75B8 induz lise de 31,0% de células CHO-CLD18A2 a 10 pg/ml, e cai para 6,2% a 1 pg/ml (Fig. 21A) , enquanto os anticorpos monoclonais 28D10 e 37H8 ainda induzem 39% e 26,5% de lise específica a 1 pg/ml (Fig. 21B, C), respetivamente. d. CDC de anticorpos monoclonais de Set2 medida através de citometria de fluxo:
Soro para lise de complemento foi preparado através da retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos Serum-Monovette vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha) que foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. O soro foi colhido e armazenado a -20°C. Soro de controlo foi inactivado por calor a 56°C durante 30 min antes do armazenamento.
Os sobrenadantes de hibridoma foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana. As células foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma brutos ou purificados contendo os anticorpos monoclonais 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10, respetivamente, durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubou-se durante mais 30 min. a 37°C. Em seguida, a lise celular foi determinada em FACS através da utilização do método de coloração de iodeto de propídio (PI). PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 pg/ml. Para citometria de fluxo foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Foram colhidos pelo menos 10000 eventos para análise com restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FSC/SSC). A lise específica foi calculada através da seguinte fórmula: lise específica = (% de células positivas para PI na amostra - % de células positivas para PI na amostra com soro inactivado por calor). Foi observada robusta lise mediada por CDC em particular para 163E12. 6. Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)
Os sobrenadantes dos hibridomas foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (HEK293-CLD18A1). a. Enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico humano: Sangue humano de dadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão fosfato (PBS) e as células sanguíneas foram vertidas sobre Ficoll (Lymphocyte Separation Medium a 1077 g/ml, PAA Laboratories, n.2 de cat. J15-004) . As células mononucleares do sangue periférico (MNC) foram colhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo inactivado por calor a 10%, L-glutamina 2 mM. b. Configuração de ADCC: As células alvo foram marcadas com um ligando estimulador de fluorescência (BADTA, estojo de ensaio de citotoxicidade de Perkin Elmer DELFIA Citotoxicity Reagents EuTDA, n.2 de cat. AD0116) durante 30 minutos. Após lavagem extensiva em RPMI-10 suplementado com probenecida 10 mM (Sigma, n.2 de cat. P8761), HEPES 10-20 mM, e soro fetal de vitelo inactivado por calor a 10%, as células foram ajustadas a lxlO5 células/ml. As células alvo marcadas, as células efetoras (MNC), e os sobrenadantes contendo anticorpos monoclonais ajustados a uma concentração de 10 pg/ml foram adicionados a placas de microtitulação de fundo redondo. Para as células efetoras isoladas, foi utilizada uma razão de efetor para alvo (E:T) de 100:1 (dados não mostrados para 50:1 e 25:1). Após incubação (2 horas, 37°C), os ensaios foram parados através de centrifugação, e a libertação do ligando de fluorescência dos duplicados foi medida em contagens de európio num fluorómetro de resolução temporal. A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % de lise específica = (contagens de libertação experimental - contagens de libertação espontânea)/(contagens de libertação máxima - contagens de libertação espontânea) χ 100, com a libertação de ligando de fluorescência máxima determinada através da adição de Triton X-100 (concentração final de 0,25%), para as células alvo, e a libertação espontânea medida na ausência de anticorpos e células efetoras. A Figura 22 mostra que os anticorpos monoclonais 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2 medeiam ADCC contra células HEK293-CLD18A2. Em contraste, estes anticorpos não induzem citotoxicidade significativa ou induzem apenas um nivel baixo em alvos de CLD18A1 demonstrando uma ADCC especifica de CLD18A2 (Figura 23) . 7. Inibição da proliferação
Os anticorpos monoclonais de murideo purificados foram analisados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento celular de células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana. lxlO4 células alvo que expressam endogenamente CLD18A2 (KATO-III) foram cultivadas na presença de aproximadamente 10 pg de anticorpos monoclonais. O Estojo de Proliferação Celular DELFIA (Perkin-Elmer, N.2 de Cat. AD0200) é um imunoensaio não isotópico baseado na medição da incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante a síntese de ADN de células em proliferação em microplacas. O BrdU incorporado é detetado utilizando anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a deteção do anticorpo, as células são fixadas e o ADN desnaturado utilizando solução Fix. O anticorpo não ligado é lavado e é adicionado indutor DELFIA para dissociar os iões de európio do anticorpo marcado para a solução, onde formam quelatos altamente fluorescentes com os componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando na deteção fluorometria resolvida no tempo - é proporcional à síntese de ADN na célula de cada poço.
Uma forte inibição da proliferação foi observada com os anticorpos 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 e 166E2, respetivamente. Uma inibição moderada da proliferação foi observada com os anticorpos de murideo 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 e 38H3, respetivamente. δ. Desempenho em modelos terapêuticos de xenoenxerto de ratinho 0 potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais identificados ligando-se especificamente a CLD18A2 foi estudado em modelos terapêuticos de xenoenxerto. a. Tratamento precoce de tumores altamente expressores de CLD18A2 em ratinhos
Ratinhos SCID foram inoculados subcutaneamente com lxlO7 células HEK293 que expressam estavelmente niveis elevados de CLD18A2 humana (HEK293-CLDl8A2). Os niveis de expressão de CLD18A2 humana em células HEK293-CLDl8A2 foram comparáveis com os niveis de expressão em cancros gástricos primários dos pacientes. Cada grupo de tratamento experimental foi constituído por 10 ratinhos (número de ratinhos por grupo n=10). A terapia dos ratinhos começou 3 dias após a inoculação do tumor. 200 mg de sobrenadantes de hibridoma representando os anticorpos monoclonais de murídeo 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3, ou 61C2 foram injetados uma vez por semana durante 4 semanas por via intravenosa. Alternativamente, 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murídeo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. O crescimento tumoral dos ratinhos tratados foi monitorizado duas vezes por semana (Volume Tumoral = Comprimento χ Largura χ Altura dividido por 2 em mm3). Os ratinhos foram mortos quando o tumor atingia um volume de 500 mm3 ou em caso de morbidez grave. A Fig. 24 exemplifica uma inibição robusta do crescimento de células tumorais HEK293-CLD18A2 através dos anticorpos do invento. As Fig. 25A e 25B mostram o prolongamento da sobrevivência através do tratamento com anticorpos do invento num modelo de tratamento precoce de xenoenxerto utilizando células HEK293-CLD18A2.
Jb. Tratamento de início tardio de tumores avançados altamente expressores de CLD18A2 em ratinhos O mesmo modelo de xenoenxerto tumoral baseado em células HEK293-CLDl8A2 foi concebido como um protocolo de início tardio de terapia em oposição ao tratamento precoce descrito acima.
No dia 27 após a inoculação das células tumorais, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de teste cada um compreendendo 5-6 ratinhos e a terapia foi iniciada com 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murideo 43A11, 163E12, e 175D10, respetivamente. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. Também neste modelo mostrou-se que os anticorpos do invento inibem o crescimento tumoral. Para vários anticorpos isto resultou no prolongamento da sobrevivência (Fig. 26) . c. Tratamento precoce de tumores que expressam níveis baixos de CLD18A2
Ratinhos SCID foram inoculados subcutaneamente com 2xl05 células da linha celular tumoral DAN-G, uma linha celular de adenocarcinoma pancreático humano infiltrante que expressa constitutivamente a proteína CLD18A2 a um nível baixo. O tratamento de ratinhos (10 por grupo) foi iniciado 3 dias após o enxerto do tumor: 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murideo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. Devido ao crescimento do tumor agressivo e rápido da linha celular tumoral pancreática DAN-G in vivo os ratinhos desenvolveram caquexia tumoral e morreram dentro de alguns dias. Mesmo assim, como consequência, a janela para medição dos efeitos terapêuticos foi estreita, a inibição do crescimento tumoral e a sobrevivência prolongada mediada pelos anticorpos do invento foi também observada neste modelo (Fig. 27A e 27B). d. Os anticorpos do invento não desencadeiam efeitos secundários em ratinhos
Um par de iniciadores específicos de CLD18A2 de murideo (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) foi utilizado em análises de RT-PCR para amplificar o ADNc derivado de um amplo painel de tecidos normais de ratinho (ver Fig. 28). A expressão de CLD18A2 de murídeo não foi detetável em nenhum dos tecidos normais testados, exceto no estômago (ver Fig. 28) . Além disso, um anticorpo especifico de CLD18A2, gue reage de forma cruzada com CLD18A2 humana e de ratinho, foi utilizado para análise imuno-histoguimica da expressão de CLD18A2 num grande painel de tecidos de ratinho normais (ver Tab. 3). Com exceção do tecido gástrico normal nenhum dos tecidos normais testados mostra expressão de CLD18A2. Tal como se observou para a CLD18A2 humana, também verificámos para o eguivalente de ratinho gue embora as células epiteliais da superfície e as mais profundas da cripta expressem CLD18A2 na sua superfície celular, a região central do pescoço é negativa para CLD18A2 (ver Fig. 29A-C) . Em resumo, a distribuição tecidual de CLD18A2 parece ser idêntica no homem e nos ratinhos.
Investigámos ainda os potenciais efeitos secundários mediados pelos anticorpos 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 em ratinhos. Tinha sido previamente demonstrado através de análise FACS gue todos estes anticorpos reagem com a CLD18A2 de murídeo bem como com a proteína humana.
Nem foram observados quaisquer efeitos secundários nos ratinhos durante e após o tratamento com estes anticorpos, nem foram observadas quaisquer correlações histomorfológicas de toxicidade na mucosa gástrica dos ratinhos tratados com os anticorpos em comparação com os não tratados (tratados com PBS) (ver Figura 30). 9. Quimerização de Anticorpos a. Geração de anticorpos monoclonais quiméricos ratinho/humano ARN total e subsequentemente ADNc de cadeia simples foi preparado a partir de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e a partir de tecido do baço humano através de métodos padrão conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo utilizando RNeasy Midi Kit (Qiagen) e a transcriptase inversa Superscript II (Invitrogen). A região constante da cadeia leve capa humana foi amplificada a partir de ADNc de PBMC através de PCR. O oligómero com sentido (SEQ ID NO: 38) adicionou um local de restrição BamHI na extremidade 5' da região constante e mudou a sequência de ácido nucleico original 5'-CGAACT-3' codificando para os dois primeiros aminoácidos (Arg-Thr) da região constante para 5'-CGTACG-3', gerando um local de restrição BsiWI sem mudar a sequência de aminoácidos. O oligómero anti-sentido (SEQ ID NO: 39) incluiu um codão de terminação e adicionou um local de restrição Notl na extremidade 3' da região constante amplificada. O produto de PCR bem como um vetor de expressão padrão (por exemplo pcDNA3.1(+), Invitrogen) foram incubados sequencialmente com as enzimas de restrição BamHI e Notl. O vetor foi
adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo para prevenir recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vetor, de modo a que qualquer futura fusão de uma região variável em frente da região constante fosse agora possível através de um local de restrição HindIII (5' — AAGCTT-3') do local de múltipla clonagem do vetor residual e através do local de restrição BsiWI (5'-CGTACG-3') gerado com o produto de PCR. A sequência da região constante da cadeia leve capa humana inserida no vetor está listada como SEQ ID NO: 40, a sequência de aminoácidos da região constante capa humana está listada como SEQ ID NO: 41. A região constante da cadeia pesada gama-1 humana foi amplificada a partir do ADNc do baço através de PCR. O oligómero com sentido fosforilado a 5' (SEQ ID NO: 42) foi colocado sobre o local de restrição Apal de ocorrência natural, localizado 11 nucleótidos a jusante do inicio da região constante, e adicionou um local de restrição HindIII na extremidade 5' da parte amplificada da região constante. O oligómero anti-sentido fosforilado a 5' (SEQ ID NO: 43) incluiu um codão de terminação e adicionou um local de restrição Notl na extremidade 3' da região constante assim amplificada. O produto de PCR assim gerado foi terminado de forma cega e fosforilado a 5'. A região constante gama amplificada foi verificada ser da subclasse IgGl através de PCR com um oligómero anti-sentido discriminador (SEQ ID NO: 44), e através de sequenciação. Um vetor de expressão padrão (p. ex., pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen) com uma resistência a um antibiótico diferente (por exemplo higromicina) da do vetor utilizado para expressão da cadeia leve (por exemplo neomicina) foi incubado com a enzima de restrição Pmel para remover completamente o local de clonagem múltipla deixando extremidades cegas. O vetor foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo para prevenir a recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vetor, de modo a que qualquer futura fusão de uma região variável em frente da região constante fosse agora possível através do local de restrição HindIII (5'-AAGCTT-3') e através do local de restrição Apal (5'-GGGCCC-3' ), ambos gerados com o produto de PCR. A orientação correta da região constante no vetor, isto é, adequada para o promotor precedente do vetor, foi verificada através de sequenciação. Devido à posição do local de restrição Apal, qualquer amplificação de uma região variável para este fim tem de incluir os primeiros 11 nucleótidos da sequência da região constante gama-1 humana além da sequência do local Apal. A sequência da região constante de cadeia pesada gama-1 humana assim amplificada inserida no vetor está listada como SEQ ID NO: 45, a sequência de aminoácidos da região constante gama-1 humana assim expressa está listada como SEQ ID NO: 46.
Correspondendo aos seus equivalentes de murídeo, os anticorpos monoclonais quiméricos foram nomeados adicionando o prefixo "ch-", p. ex. ch-43All, ch-163E12, ch-125El, ch-166E2, ch-175D10, ch-45Cl. A amplificação das regiões variáveis de murideo das cadeias leves e pesadas foi realizada de acordo com o método "step-out PCR" descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, N° 6) . Para isso, ARN total foi preparado a partir de linhas celulares de hibridomas monoclonais (ver Tab. 4. ) através de métodos padrão conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo com a utilização de RNeasy Mini Kit (Qiagen). 0 ADNc de cadeia simples foi preparado de acordo com o método "template-switch", também descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, No. 6, 1558). Além de um oligómero (dT)30 (SEQ ID NO: 47), incluiu um oligómero híbrido ADN/ARN (SEQ ID NO: 48) servindo como um adaptador 5' para mudança de molde durante a polimerização da cadeia de ADNc. Neste oligómero adaptador os últimos três nucleótidos foram ribo em vez de desoxirribonucleótidos. A subsequente "step-out PCR" utilizou um oligómero anti-sentido direcionado à região constante da cadeia capa de ratinho ou à região constante das subclasses 1, 2a ou 3 das cadeias gama (SEQ ID NO: 49 a 52, respetivamente) . As subclasses de IgG do anticorpo monoclonal de murídeo produzidas pelas linhas celulares de hibridoma foram antes analisadas imunologicamente com IsoStrip (ver Exemplo 1), e o oligómero anti-sentido apropriado foi escolhido em conformidade (ver Tab. 4). Uma mistura de iniciadores serviu como oligómero com sentido no "step-out PCR", compreendendo os dois oligómeros listados em SEQ ID NO: 53 e 54. Algumas linhas celulares de hibridoma expressaram mais do que uma cadeia pesada ou leve (para além das cadeias expressas pela linha celular de mieloma utilizada para a geração de hibridomas) . A Tabela 4 resume as SEQ ID NO das regiões variáveis clonadas e sequenciadas das cadeias de anticorpo de murídeo (SEQ ID NO: 55 a 69 e SEQ ID NO: 132 a 146) e das cadeias de anticorpo quimérico inteiras clonadas e sequenciadas (SEQ ID NO: 100 a 129).
As regiões variáveis de murídeo identificadas foram então amplificadas por PCR omitindo a 5' UTR e a região constante de ratinho a 3', adicionando locais de restrição nas extremidades que permitiram a subclonagem nos vetores de expressão preparados transportando as regiões constantes humanas. Além disso, os oligómeros com sentido proporcionaram uma sequência de Kozak de consenso (5'-GCCGCCACC-3' ou 5'-AGCCACC-3') e os oligómeros anti-sentido para as regiões variáveis das cadeias pesadas incluíram os primeiros 11 nucleótidos da região constante gama-1 humana além do local de restrição Apal (ver Tab. 4, SEQ ID NO: 70 a 99). As regiões variáveis das cadeias leves capa foram clonadas utilizando as enzimas de restrição HindIII e BsiWI, as regiões variáveis das cadeias pesadas gama exigiram as enzimas de restrição HindIII e Apal. A região variável da cadeia pesada gama do anticorpo monoclonal 45C1 continha um local de restrição HindIII interno - aqui, foi utilizada em vez dessa a enzima Bsal compatível (ver SEQ ID NO: 80) . SEQ ID NO: 100 a 114 mostram as sequências de ácido nucleico dos anticorpos tornados quiméricos resultantes (ver Tab. 4) . SEQ ID NO: 115 a 129 mostram as sequências de aminoácidos dos anticorpos tornados quiméricos expressos em conformidade (ver Tab. 4). b. Geração e Produção de Anticorpos Quiméricos Contra CLD18
Foram geradas linhas celulares de mamífero produtoras de anticorpos quiméricos com especificidade para CLD18. As linhas celulares derivadas de células HEK293T (ATCC CRL-11268). Um dia antes da transfecção, 2,5*107 células foram plaqueadas numa caixa de cultura de tecidos de 14,5 cm e cultivadas em 20 ml de meio completo, ou alternativamente foram plaqueadas lxlO7 células numa caixa de cultura de tecidos de 10 cm e cultivadas em 10 ml de meio completo, ou alternativamente foram plaqueadas 0,6xl05 células num poço de uma placa de tecidos de 12 poços e cultivadas em 2-3 ml de meio completo (meio completo: meio DMEM:F12 suplementado com FBS a 10% sem antibióticos). A densidade celular recomendada no momento da transfecção deve ser de 90% de confluência. Imediatamente antes da transfecção, o meio foi substituído por meio fresco. As células HEK293T foram transfectadas com reagentes de transfecção, p. ex. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019), ou, alternativamente, polietilenimina (Sigma-Aldrich, 408727) . Exemplificado para transfecção de células HEK293T foi utilizada uma quantidade de ADN total de 110 pg ou 296 pg para uma caixa de cultura de tecidos de 14,5 cm, e a razão de agente de transfecção para ADN foi de 1:2,5 e 1:12 para Lipofectamine 2000 e PEI, respetivamente. 24 h após a transfecção o meio foi substituído com um meio adequado de GMP, p. ex. X-Vivo 15 (Cambrex) ou um meio químico definido como Pro293a (Cambrex) sem soro. As células HEK293T transfectadas produtoras de anticorpos monoclonais quiméricos contra CLD18 foram cultivadas durante mais 96 h. Os sobrenadantes em bruto foram colhidos, esterilizados por filtração e purificados através de proteína A-Sepharose. A concentração de anticorpo foi determinada através de Ensaio BCA e a pureza verificada por eletroforese em gel com dodecilsulfato de sódio e coloração Coomassie. c. Características de Ligação de Anticorpos Monoclonais Quiméricos A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos clonados e gerados para CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 3. Células HEK293 vivas que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A1 humana (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK2 93-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com os sobrenadantes de cultura de células HEK293T purificados contendo anticorpos monoclonais quiméricos, seguido por incubação com fragmento F(ab')2 de anticorpo secundário de cabra anti-Fcy de IgG humana conjugado com APC e contrastadas com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray.
De modo semelhante, linhas celulares tumorais humanas que expressam endogenamente CLD18A2, por exemplo células KATO-III e NUGC-4, foram analisadas através de citometria de fluxo. A Fig. 31A e B mostram análises de citometria de fluxo dos anticorpos quiméricos ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch- 166E2, e ch-175D10. Todos eles mostram reconhecimento do epitopo nativo e exibem ligação especifica e forte a células que expressam CLD18A2 mas não CLD18A1. d. Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) 0 soro para a lise do complemento foi preparado através de retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos Serum-Monovette vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha) que foram então centrifugados a 600 g durante 20 min. O soro foi colhido e armazenado a -20°C. O soro de controlo foi inactivado por calor a 56°C durante 30 min antes do armazenamento.
Os anticorpos quiméricos purificados por Proteína A-Sepharose deste invento foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana, bem como células CHO-CLD18A2 estavelmente transfectadas. As células foram incubadas com anticorpos monoclonais ch-163E12, ch-166E2, e ch-175D10, respetivamente, numa concentração final de 2,5 yg/ml a 35 yg/ml durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubou-se durante mais 30 min. a 37°C. Posteriormente, as células mortas e vivas foram discriminadas através de coloração de PI numa concentração final de 2,5 g/ml e a percentagem de lise celular mediada por anticorpos foi determinada através de citometria de fluxo. Para a análise por citometria de fluxo foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Pelo menos 10000 eventos foram colhidos para análise com os restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FSC/SSC) . A Use específica foi calculada através da fórmula seguinte: lise específica = (% de células positivas para PI na amostra - % de células positivas para PI na amostra com soro inactivado por calor). A lise específica mediada por CDC foi mostrada para vários anticorpos. Todos os três anticorpos mediaram uma CDC robusta em células CHO-CLD18A2 (Figura 32). Em células KATO-III os anticorpos ch-163E12 e ch-175D10 foram indutores de uma CDC robusta. e. Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)
Os anticorpos quiméricos purificados por FPLC do invento foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana.
Sangue humano de dadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão fosfato (PBS) e as células sanguíneas foram vertidas em Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia). Após centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram colhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura X-Vivo-15 suplementado com soro humano inactivado por calor a 5%. 15 h antes do ensaio, as células KATO-III foram transfectadas com luciferase e plaqueadas a 5*104 células/poço numa microplaca branca.
Para o ensaio, as células efetoras (PBMC, preparadas tal como descrito acima) a uma razão de efetor para alvo (E:T) de 20:1 e os anticorpos quiméricos purificados por FPLC foram adicionados e incubou-se durante 2-3 h a 37°C, CO2 a 5%. A concentração final do anticorpo no poço foi de 50 pg/ml. Após 2-3 h de pré-incubação, foi adicionado amarelo Lúcifer (BD Biosciences, San Jose EUA) a 1 mg/ml. A luminescência resultante da oxidação do Amarelo Lúcifer através da luciferase das células viáveis foi medida continuamente durante até 6 h utilizando um leitor de microplacas (Infinite200, Tecan, Suíça). A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % de lise específica = 100-( (contagens de luminescência da amostra - contagens de luminescência espontânea)/(contagens de luminescência máxima contagens de luminescência espontânea) χ 100), com a luminescência espontânea determinada através da adição de Triton X-100 (concentração final de 0,2%) e o sinal máximo medido na ausência de anticorpos.
Utilizando este ensaio, foi mostrado que os anticorpos monoclonais ch-163E12 e ch-175D10 medeiam uma forte ADCC em células KATO-III (Fig. 33). f. Inibição da Proliferação
Os anticorpos quiméricos purificados por FPLC do invento foram analisados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento celular de células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana.
As células alvo (KATO-III) foram cultivadas na presença dos respetivos anticorpos quiméricos (ver inibição da proliferação de anticorpos de murídeo, Exemplo 7). Mostrou-se que os anticorpos quiméricos purificados por FPLC ch-163E12 e ch-166E2 inibem a proliferação celular. 10. Seleção de anticorpos como candidatos a lideres clínicos
Os líderes clínicos ótimos podem cobrir uma ampla variedade de aplicações terapêuticas e de diagnóstico (ver também secção IV - Utilizações e Métodos do Invento). De acordo com o invento, são proporcionados anticorpos dirigidos para CLD18-A2. É mostrado que os anticorpos proporcionados de acordo com o invento oferecem um largo espectro de propriedades em relação a especificidade, capacidade de induzir CDC e ADCC e inibir a proliferação de células que expressam CLD18, em particular células tumorais. Além disso, demonstrou-se que a quimerização de anticorpos pode conduzir à aquisição de mais funções efetoras dependentes de Fc que não estão presentes na molécula de murídeo parental. Por exemplo, mostra-se aqui que o anticorpo 175D10 com IgGl de murídeo não induz citotoxicidade dependente de complemento (ver Exemplo 5), enquanto ch-175D10 com IgGl humana induz lise específica de células tumorais que expressam constitutivamente CLD18 (ver Tab. 5 e Tab. 6).
Os anticorpos proporcionados de acordo com o presente invento podem ser categorizados em classes distintas de acordo com as suas propriedades de ligação e a sua capacidade para mediar funções efetoras em células que expressam CLD18. A partir dos anticorpos proporcionados de acordo com o presente invento, os candidates a lideres clínicos podem ser selecionados com base nas suas características funcionais. Uma perspetiva geral das propriedades dos anticorpos de murídeo e quiméricos selecionados do invento é dada na Tab. 5 e Tab. 6, respetivamente.
Os candidatos a líderes clínicos do invento podem ter uma ou mais das seguintes propriedades: a) ligação a CLD18A2 humana mas não a CLD18A1 humana (p. ex. 43A11, 4 5C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-43All, ch-45C1, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10). Para exemplos, ver as figuras 6A e 6B. b) ligação a CLD18A2 de ratinho mas não a CLD18A1 de ratinho (p. ex. 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10) . Para exemplos, ver as figuras 15A e 15B. c) ligação a CLD18 expressa naturalmente por células tumorais (p. ex. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-45Cl, ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10) . Para exemplos, ver a figura 13. d) ligação a CLD18 em zonas de contacto intercelular (p. ex. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10) . Para exemplos, ver as figuras 12A e 12B. e) mediação de morte induzida por CDC de células que expressam CLD18 (p. ex. 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-163E12 e ch-175D10). Para exemplos, ver a figura 32. f) mediação de morte induzida por ADCC de células que expressam CLD18 (p. ex. ch-163E12 e ch-175D10) . Para exemplos, ver a figura 33. g) inibição da proliferação de células que expressam CLD18 (p. ex. 4 5C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-163E12 e ch-166E2). h) inibição do crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto com células que expressam CLD18 (p. ex. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10). Para exemplos, ver a figura 24. i) prolongamento da sobrevivência em modelos de xenoenxerto com células que expressam CLD18 (p. ex. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, ver a figura 25B.
Perspetiva exemplificativa das propriedades para seleção de candidatos a lideres
Folha adicional relativa a Material Biológico Identificação de outros depósitos: 1) A Denominação e o Endereço da instituição depositária para os depósitos (DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC-2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748) são: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg lb
38124 Braunschweig DE 2) A Denominação e o Endereço da instituição depositária para os depósitos (DSM ACC2808, DSM ACC2809, DSM ACC2810) são: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH
Inhoffenstr. 7 B 38124 Braunschweig
DE
Indicações Adicionais para todos os depósitos acima mencionados: • Mieloma P3X63Ag8U.l de ratinho (Mus musculus) fundido com esplenócitos de ratinho (Mus musculus) • Hibridoma secretor de anticorpo contra claudina-18A2 humana 3) Depositante:
Todos os depósitos acima mencionados foram efetuados por:
Ganymed Pharmaceuticals AG FreiligrathstraBe 12 55131 Mainz DE
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro <130> 342-31 EPT4 <150> EP 05 025 657.7 <151> 2005-11-24 <160> 150 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 786
<212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 atggccgtga ctgcctgtca gggcctgggg ttcgtggtí-t cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa eaaccccgta 130 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 160 accgagtgcc ggggctactt -caccctgctg gggctgccag ccatgeegca ggcagtgega 24 0 gccctgatga rcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca accgcatCgg cagcatggag gactctgcca aagccaaeat gacactgacc 360 tcegggatca tgtteattgt etcaggtett tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgce 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcçjg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt «tecttecaa gcaegecfcat 730 gtgtaa 7B6 <210> 2 <211> 261
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Ala Vai Thr Ala Cys Gin Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu lie 15 10 IS
Gly He Ala Gly lie lie Ala Ala Thr Cye Met Asp Gin Trp Ser Thr 20 25 30
Gin Αβρ Leu Tyr Αηπ Αβη Pro Val The Ala Val Phe Aan Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Tip Arg Ser Cys Val Arg Glu Sor Ser Gly Fhe Thr Glu Cye Arg 50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg
65 70 75 SO
Ala Leu Met lie Val Gly lie Val Leu Gly Ala He Gly Leu Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lya Cya lie Arg tie Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110
Ala Lye Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Met Phe lie Val Ser 115 120 125
Gly Leu Cys Ala lie Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Αβη Met Leu Val 130 125 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Αβη Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu lie Gly Gly val Met Met IB 0 185 190
Cys lie Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Abd Tyr Lye Ala 195 200 205
Val Ser Tyr Hie Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lya Pro Gly Gly 210 215 220
Phe Lye Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Aen Thr Lye Asn Lya Lye lie 225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu val Gin Ser Tyr Pro Ser 245 250 255
Lya Hia Asp Tyr Val 250 <210> 3 <211> 816
<212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 3 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 ateattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta iza acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg çgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 190 accgagtgcc ggggctactt cacccCgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gceetgatga fcogtaggcat cgtcctgggt gcoattggcc tectggtate eatctttgcc loo ctgaaatgca Cccgcactgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 160 tccgggatca tgtteattgt cteaggtctt tgtgcaattg ctggogtgtc egtgtCtgcc 420
a-acacgctgg egactaactt ceggatgtcc acagctaaca tgtaoaccgg catgggtgaa 4SD caaaaactca tctcagaaga ggatctgggg atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca 540 tttggtgcgg ctccgtccgt gggctgggtc gccggaggcc teacactaat tgggggtgeg 600 atgatgtgca tcgcctgceg gggcctggca ceagaagaaa ccaactacaa agccgtttct 660 tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac aagcctggag getbcaaggc cagcactggc 720 tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag 790 gtaeaatcct atccttccaa gcacgaetae gtgtaa 816 <210> 4 <211> 271
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met Ala val Thr Ala cye Gin Gly Leu Gly Phe Val val Ser Leu lie l S 10 15
Gly lie Ala Gly lie lie Ala Ala The eye net Asp Gin Ίΐρ Ser Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asn Asa Pro val Thr Ala Val Phe Aen Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cye Val Arg Glu Ser ser Gly Phe Thr Glu Cya Arg 50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Wet Leu Gin Ala val Arg 65 70 75 80
Ala Leu Wet lie Val Gly lie Val Leu Gly Ala lie Gly Leu Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lye Cye lie Arg lie Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110
Ala Lye Ala Aon Piet Thr Leu Thr Ser Oly lie Met Phe He Val Ser 115 120 125
Gly Leu Cye Ala lie Ala Gly Val Ser Val phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140
Thr As η Phe Ttp net Set Thr Ala Aen Met Tyr Thr Gly Met Gly Glu 145 150 155 160
Gin LyH Leu lie Ber Glu Glu Asp Leu Gly Met Val Gin Thr Val Gin 165 170 175
Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly 180 185 130
Gly Leu Thr Leu He Gly Oly Val Met Met Cya lie Ala Cys Arg Gly 195 300 205
Leu Ala Pro Glu Glu Thr Ah« Tyr Lyo Ala val Ser Tyr His Ala Ser 210 215 220
Gly Hie 5er val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe lys Ala Ser Thr Gly 225 230 235 240
Phe Gly Sec Asn Thr Lya Asn Lye Lye lie Tyr Asp Gly Oly Ala Arg 245 250 255
Thr Glu Asp Glu Val Gin Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 260 265 270 <210> 5 <211> 813
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gettgcgggc 50 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120
acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tecgagagag ctctggcttc 10D accgagtgcc ggggctactt caccctgtac ccatacgacg tgccagacta cgcactgggg 240 ctgccagcca tgctgcaggc agtgcgagcc ctgatgatcg taggeategt cctgggtgcc 300 attggcetcc tggtatccat ctttgcectg aaatgcatcc gcattggcag catggaggac 360 tctgecaaag eoeacatgac actgacctcc gggateatgt tcattgtcte aggtctttgt 420 geaattgctg gagtgtctgt gtttgccaac atgctggtga ctaacttctg gatgtcca-ca 4Θ0 gctaacacgt aeaecggeat gggtgggatg gtgeagactg ttcagaccag gtacacattt 540 ggtgcggctc tgttcgtggg ctgggtcgct ggaggcotca cactaattgg gggtgtgatg 600 atgtgcatcg cctgcegggg cctggcacca gaagaaacea actacaaagc egtttcttat 660 catgcctcgg gccacagtgt tgcctacaag cccggaggct tcaaggccag cactggctct 720 gggtccaaca ccaaaaacaa gaagatatac gatggaggtg cccgcacaga ggacgaggta 780 caatcttatc cttccaagca cgactatgtg taa 813 <210> 6 <211> 270
<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 6
Met Ala Val Thr Ala CyB Gin Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu lie 15 10 15
Gly lie Ala Gly lie He Ala Ala Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr 2D 25 10
Gin Asp Leu Tyr Αβπ Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Aen Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ear Cye Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 SO
Gly Tyr Phe Thr Leu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Qly 65 70 75 80
Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Leu Hec lie Val Gly lie BS 90 95
Val leu Gly Ala lie Gly Leu Leu Val Ser lie Fhe Ala Leu Lye CyB 19Q 105 110 lie Arg He Gly 5er Met Glu Asp Ser Ala Lye Ala Αβπ Met Thr Leu 115 130 125
Thr ser Gly lie Met phe lie Val Ser Gly Leu eye Ala lie Ala Gly 130 135 140
Val Set Val Phe Ala Aen Met Leu Val Thr αβπ Phe Trp Met Ser Thr
145 150 155 ISO
Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr 1SS 170 175
Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Sly Trp Val Ala Gly Gly 180 105 190
Leu Thr Leu lie Gly Gly Val Met Met Cys lie Ala Cys Arg Gly Leu 195 200 305
Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lya Ala Val Ser Tyr Sis Ala Ser Gly 310 315 320
His Ser Val Ala Tyr Lye Pro Gly Gly Phe Lya Ala Ser Thr Gly Phe 225 230 US 240
Gly Ser Aen Thr Lye Aen Lye Lys lie Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr 345 250 255
Glu Asp Glu Val Gin Ser Tyr Pro Ser Lya His Asp Tyr Val 2 SO 2S5 270 <210> 7 <211> 786
<212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 7 atgtccacca ccacatgcca agtggtggcg ttcctcetgt ccatcctgqg gctggccggc 60 tgcatcgogg ccaccgggat ggaeatgtgg agcacccagg acctgtacga eaaceeegtc 120 acctccgtgt tccagtacga agggctctgg aggagctgcg tgaggcagag ttcaggcttc 160 accgaatgca ggccctattt caccatcctg ggaettecag ccatgctgca ggcagtgcga 260 geeotgatga tcgtaggcat egtectgggt gecactggee tcctggtatc catctttgcc 3 go ctgaaatgca tcegcattgg cageatggag gactetgcca aagccaacat gaeactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcoattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtce acagctaaca tgtacaccgg catgggCggg 460 atggtgoaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 545 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cageaetggc tttgggtcea acaccaaaaa caagaagata 720 taegatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcaegaetat 7 BO gtgtaa 736 <210> 8 <211> 261
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Met Ser Thr Thr Thr Cye Gin Val Val Ala Phe Leu Leu ser lie Leu IS 10 15 □ly Leu Ala Giy Cye lie Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gin Tyr Glu Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cye val Arg Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cye Arg SO 55 60
Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg 65 70 75 Θ0
Ala Leu Met He Val Gly lie Val Leu Gly Ala He Gly Leu Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lye Cye He Arg He Gly Ser Met Glu Aep Ser
1O0 105 HO
Ala Lye Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly He Met Phe lie Val Ser 115 120 125
Gly Leu Cys Ala rle Ala Gly val Ser Val Phe Ala Aen Met Leu val 130 135 14C
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Tie Gly Gly Val Met Met 100 185 ISO
Gy9 lie Ala Cy9 Arg Gly Leu Ala pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lya Ala 195 200 205
Val Ser Tyr Hie Ala Ser Gly Hie Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220
Phe Lya Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Aon Thr Lya Aan Lye Lye He 225 230 235 240
Tyr Aep Gly Gly Ala Arg Thr Glu Aep Glu Val Gin Ser Tyr Pro Ser 24S 250 255
Lye Hia Aep Tyr Val 260 <210> 9 <211> 795
<212> ADN <213> Mus musculus <400> 9 atggccacca ccacgtgcca ggtggtaggg cttctcctgt ccctcctggg tctggccggc 60 tgeatageeg eeastgggat ggacatgtgg agcactcaag acctgtatga caacccagtc 120 accgccgtgt tccagtatga agggctctgg aggagttgcg tgcaacagag ctcggggttc 1Θ0 aeegegtgcc ggccetactt caccatcetg ggccttccag ccntgctgca agctgtaçga 240 gccctgatga tcgtgggcat tgttctgggg gtcatcggta tcctcgtgfcc catcttcgcc 300 ctgaagtgca ttcgcattgg tagcatggat gactctgcca aggceaagat gaetetgact 360 tetgggatct tgttcatcat ctecggcatc tgtgcaatea ttggtgtgtc tgcgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgtcc aoegctaaca tgtacagcgg eatgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacacct ttggtgcagc tctgttcgtg 540 ggccgggttg ctggaggcct caccctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcctgccgt 600 ggcctgaeac cagatgacag caacttcaaa gctgtgtctt accatgccte tggccaaaat 660 gctgcccaca ggcçtggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtcçaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgeeegcaea gaagacgaeg aaeagtctca tcctaccaag 780 tatgactatg tgtag 795 <210> 10 <211> 795
<212> ADN <213> Mus musculus <4 Ο 0> 10 atgtcggtga ccgcccgcca gggcttgggg tttgtggtgt cactgatcgg gtttgcgggc 60 atcattgcag ccacttgtat ggaccagtgg agcacccagg atttatacaa caacccggtg 120
accgctgtat tcaactacca agggctatgg cgtteatgcg tccgagagag ctetggettc ISO accgagtgcc gaggctactt eaccctgttg gggttgccag ccatgctgca agctgtacga 240 gcoctgatga tcgtgggeac tgttctgggg gtcateggta tcetcgtgtc catcttegcc 300 ctgeagtgca ttcgcategg tagcatggat gaceetgcca aggecaagat gaetctgace 360 tctgggatct tgttcatcat ctccggcatc tgtgcaatca ttggtgtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt etggatgtcc aeagctaaea tgtaeagegg catgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacaeet Ctggtgcagc tctgttcgtg 540 ggctgggttg ctggaggcet eaecctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcetgcegt 600 ggcctgacac cagatgacag caactcc&aa getgtgtctt accatgcctc tggccaaaat 660 gttgcctaca ggcctggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgcccgcaca gaagacgatg aacagtctca tectacçaag 790 tatgactatg egcag 795 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4 0 0> 11 tggctctgtg tcgacactgt g 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4 0 0> 12 gtgtacatgt tagctgtgga c 21 <210> 13 <211> 55
<212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 13
Met ABp Met Trp ser Thr Gin Asp Leu Tyr Aap Aan Pro val Thr ser 15 10 15 val Pile Gin Tyr Slu Gly Leu Trp Arg Ser Cya Val Arg Gin Ser Ser 20 25 30
Gly Phe Thr Glu Cye Arg Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45
Met Leu Gin Ala Val Arg Ala 50 55 <210> 14 <211> 153
<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Met Aap Met Trp Ser Thr Gin Aap Leu Tyr Αθρ Αβη Pro Val Thr ser
1 5 10 IS val Phe Gin Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cye Val Arg Gin Ser Ser 20 25 30
Qly Phe Thr Glu Cya Arg Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 4S
Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Leu Met He Val Gly lie Val Leu Gly 50 55 60
Ala lie Gly Leu Leu Val Ser lie Phe Ala Leu Lye Cye lie Arg lie 65 70 75 80
Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lya Ala Aan Met Thr Leu Thr Ser Gly Θ 5 90 95 lie Ket Phe lie Val Ber Gly Leu Cys Ala lie Ala Gly Val Ser Val 100 105 110
Phe Ala Aan Met Leu Val Thr Aan Phe Trp Met Ser Thr Ala Aan Met 115 120 125
Tyr Thr Gly Ret Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr 130 135 140
Phe GLy Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 15D <210> 15 <211> 390
<212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 15 atggagacag acaeactcct gctatgggta ctgctgetct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggecag gcgcgegcgc cgtacgaagc ttggtacoga getcggatcc 130 actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcatggacc agtggagoac ccaagacttg iao tacaacaacc ccgtaacagc tgttttcaac taccaggggc tgtggcgctc ctgtgtccga 240 gagagctctg gcttcaccga gtgccggggc tacttcaccc tgctggggct gccagccatg 300 ctgcaggcag tgcgagcggc catccagcac agtggcggcc gctcgaggag ggcccgaaca 360 aaaactcatc teagaagagg atctgaatag 390 <210> 16 <211> 129
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Wet Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Sly Ser Thr Sly Aap Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
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Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly 85 90 95
Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Ala He Gin His Ser Gly 100 ios no
Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lya Thr His Leu Arg Arg Gly Ser 115 120 125
Glu <210> 17 <211> 411
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atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctet gggttccagg ttccaetggt SO gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgcacgaagc ttggtaccga getcggatcc 120
actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcgccçtga tgatcgtagg catcgtcctg ISO ggtgccaccg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat gcatccgcat tggcagcatg 240 gaggaetctg ccaaagccaa catgacaeLg acateeggga tcatgttcat tgteteaggt 300 ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gecaacgcgg eeaeccagca cagtggcggc 360 cgctcgagga gggcccgaae aaaaacteat ctcagaagag gatctgaata g 413 <210> 18 <211> 136
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Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lya Leu Sly Thr Glu leu Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Aan Ser Ala 25 40 4S ASp Gly Arg Ala Leu Met lie Val Gly lie Val Leu Gly Ala lie Gly 50 55 60
Leu Leo Val ser lie Fhe Ala Leu Lye Cye lie Arg lie Gly Ser Met 65 70 75 00
Glu Aap Ser Ala Lye Ala Aen Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Met Phe as 90 95
He Val Ser Gly Leu Cye Ala He Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 100 105 110
Ala Ala He Gin Hie Ser Gly Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lys 115 120 125
Thr Hie Leu Arg Arg Gly Ser Glu 110 135 <210> 19 <211> 531
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Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Met Asp Gin 20 25 30
Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Ann Pro Val Thr Ala Val Phe Aan 35 40 45
Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cye Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr 50 55 60
Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin
65 70 75 SO
Ala Val Arg Ala Leu Met lie Val Gly He Val Leu Gly Ala lie Gly S5 90 95
Leu Leu Val Ser lie Phe Ala Leu Lys Cye lie Arg lie Gly Sex Met 100 105 110
Glu A Bp ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly He Met Phe 115 120 125 lie Val Ser Gly Leu Cye Ala lie Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 130 135 140
Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 145 150 155 160
Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175 <210> 21 <211> 10
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Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe 15 10 <210> 24 <211> 12
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Aap Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Aan Pro IE 10 <210> 25 <211> 12
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Cya Arg Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala l 5 10 <210> 26 <211> 13
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Met Asp Gin Trp Ser Thr Gin Aep Leu Tyr Aan Asn Pro val Thr Ala IS 13 IS
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Gly Phe Thr Glu Cya Ars Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 4$
Met Leu Gin Ala Val Arg Ala SO 55 <210> 29 <211> 24
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Phe Ala Leu Lye Cys lie Arg lie Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lye IS 10 15
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Met Asp aln Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Abu Aen Pro Val Thr Ala 15 10 15
Val Phe Aan Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser 20 25 30
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Met Leu Gin Ala val Arg Ala Leu Met lie Val Gly He Val Leu Gly 50 55 60
Ala lie Gly Leu Leu Val Ser lie Phe Ala Leu Lys Cya lie Arg He 65 10 75 30
Gly Ser Met Glu Aep Ser Ala Lye Ala Aan Met Tbr Leu Thr ser Gly 35 90 95
He Met Phe lie Val Ser Oly Leu Cys Ala He Ala Gly Val ser Val 100 105 110
Phe Ala Aan Met Leu Val Thr Aan Phe Trp Met Ser Thr Ala Aan Met 115 120 125
Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr 130 135 140
Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 150 <210> 32 <211> 3359 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 cacaccttcg gcageaggag ggeggeaget ectcgcaggc ggcagggcgg gcggccagga 60 tcatgtccae eaeeacetgc caagtggtgg cgttcctcct gtccatcctg gggctggccg 120 gctgcatcgc ggccaccggg atggacatgt ggagcaccca ggacctgtac gacaaccccg 130 tcaccttcgt gttccagtac gaagggctct ggaggagctg cgtgaggcag agttcagget 240 tcaccgaatg qaggccctat ttcaccatcc tgggacttcc agccatgctg caggcagtgc 300 gagccccgat gategtagge atcgtectgg gtgccattgg cctcctggta tccatctttg 360 ccctgaaatg catccgcatt ggcagcatgg aggactctgc caaagccaac atgacactga 420 cctccgggat catgtteatt gtetcaggtc tttgegcaat tgctggagcg tctgtgcttg 490 ccaacatgct ggtgactaae ttctggatgt ccacagctaa catgtacacc ggeatgggtg 540 ggatggtgca gactgtteag accaggtaca catttggtgc ggctctgtte gtgggctggg 6QO tcgctggagg cctcaeacta attgggggtg tgatgatgtg catcgcctge cggggectgg 660 caccagaaga aaccaaetac aaagccgttt cttatcatgc ctcaggccac agtgttgcct 720 acaagcccgg aggctccaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaaa aacaagaaga 790 tatacgatgg aggtgcccgc acagaggacg aggtacaatc ttatccttcc aagcacgact 84 0 atgtgtaatg ctctaagacc tctcagcacg ggcggaagaa actcccggag agctcaccca 900 aaaaacaagg agatcccatc tagatttett ettgcttttg actcacaget ggaagttaga 36 0 aaagcctcga tttcatcttt ggagaggcca aatggtctta gcctcagtct ctgtctctaa 102D atattccacc ataaaacagc tgagttattt atgaactaga ggctatagct cacattttca 1090 atcctetatt tcttttttta aataeaactt tctactctga tgagagaatg tggttttaat 1140 ctctctctca cattttgatg atttagacag actccccetc ttcctcctag tcaataaacc 1200 cattgatgat ctatttccca gcttatcccc aogaaaactt ttgaaaggaa agagtagacc 1260 caaagatgtt attttctgct gtttgaattt tgtctcccca cccccaactt ggctagtaat 132D aaacacttac tgaagaagaa gcaataagag aaagatattt gtaatctctc cagcccaega 13 BO tctcggtttt cttacaetgt gatottaaaa gttaceaaac caaagecatt ttcagteega 1440 ggcaaccaaa cctttctact gctgttgaca tcttettatt acagcaacac cattctagga 1500 gtttcctgag ctctccactg gagtcctctt tetgtcgegg gtcagaaatt gtccctagat 1560 gaatgagaaa attatttttt ttaatttaag tcctaaatat agttaaaata aataatgttt 1620 tageaaaaeg atacactatc fcctgtgaaat agccteaccc ctacatgtgg atagaaggaa 1690 atgaaaaaet aatfcgatttg acattgtcta tatggtactt egtaaagtca tgcttaagta 1740 caaattccat gàaaagctca ctgatcctaa ttctttccct ttgaggtctc tatggctccg 1900 attgtacatg atagtaagtg taagccatgt aaaaagtaaa taatgtctgg gcacagtggc I960 tcscgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggagga aggatcactt gagcccagaa 1920 gttegagact ageetgggea aeatggagaa geeefcgtcte taeaaaatae agagagaaaa 1990 aatcagccag tcatggtggc ctacacctgt agtcceagca ttccgggagg ctgaggtggg 2040 aggatcactt gagcccaggg aggttggggc tgcagtgagc catgatcaca ccacegcact zioc ccagecaggt gacatagcga gatcctgtct aaaaaaataa aaaataaata atggaacaca 2160 gcaagtecta ggaagtaggt taaaactaat tctttaaaaa aaaaaaaaag ttgagcctga 2220 attaaatgta atgtttccaa gtgacaggta tccacatttg catggttaca agccactgcc 2280 agttagcagt ageaetttec tggcactgtg gteggttttg ttttgttttg ctttgtfctag 2340
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cagccacttg tatggaccag tggagcaccc aggatttata caacaacccg gtgaccgctg ISO tattcaacta ccaagggcta tggcgtteac gcgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccgaggcta ctteaccctg ttggggttgc cagccatgct geaagctgta cgagccctga 300 tgatcgtggg cattgttctg ggggtcatcg gtatcctcgt gtccatcttc gccctgaagt 360 gcattcgcae tggtagcatg gatgactctg ceaaggccaa gatgactctg aettctggga 420 tcttgttcat catctccggc atctgtgcaa tcattggfcgt gtctgtgttt gceaacatgc 480 tggtgaceaa cttctggacg tccacagcta acatgtacag cggcatgggc ggcatgggtg 540
gcatggtgca gaccgfcecag accaggtaca ccttcggtgc agctctgttc gtgggctggg GOO ttgctggagg cctcaccctg attgggggag tgatgatgtg catcgcctgc cgtggcctga 660 caccagatga cagcoacttc aaagctgtgt cttaccatgc ctctggccaa aatgttgcct 720 acaggcctgg aggctttaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaga aacaagaaga 390 tctacgatgg gggtgcccgc acagaagacg atgaacagtc tcatcctSCc aagtatgact 840 atgtgtagt B49 <210> 34 <211> 3350 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 34 agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg ¢0 cgactgcctg tcagggcttg gggtecgtgg tttcactgat tgggactgcg ggcatcattg 120 ctgccacctg catggaccag tggageaccc aagacttgta caacaacecc gtaacagctg IB 0 ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtecgaga gagccctggc ctcaccgagt 240 gccggggcta CttCacCctg ctggggctgc cagccatgct goaggcagtg cgagccctga 30 0 tgaccgcagg catcgtcctg ggtgceattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 3so gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaangccna catgacactg acctccggga 420 tcatgttcat cgtctcaggt cttcgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 4BO tggtgactaa ct tctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 54 0 agactgttca gaccaggtac acatttggtg cggctctgtt egtgggetgg gtcgctggag 6DO gcctcaeact nattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 650 aaaccaacta caaagccgtt ccttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcccg *72 0 gaggcttcaa ggccagcact ggccctgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 7Θ0 gaggtgcccg cacagaggae gaggracaat cttatcetcc caagcacgae tatgtgcaat 040 gctctaagac ctctcageae gggcggaaga aactecegga gagctcaccc aaaaaacaag 900 gagatcccat ctagatttct tcttgctntt gactcacagc tggaagttag aaaagectcg 950 atttcatctc cggagaggcc aaatggtctt agccteagte tctgtctcta aatattcoac 1020 cstaaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1060 ttettttttt aaatataact tcctactetg acgagagaat gtggttctaa ceectetete 1140 acattttgat gatttagaca gactccccet cttcctccca gtcaataaac ceattgatga 1200 eetatttccc agcttatccc eaagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1250 tattttctgc tgtttgaatt ttgeetcccc acccccaaet tggctagtaa taaacactta 1320 ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctcç ccagcccatg atctcggttt 13 B 0 ccttacactg tgatcttaaa agteaccaaa ccaaagtcat tttcagtttg aggcaaccaa 1440 acctttctac tgctgttgae atcttcttat tacagcaaea eeattctagg agtttcetga 1500 gctctccact ggagccctct ttctgccgcg ggtcagaaat tgtccetaga tgaatgagas 156 0 aattattttt ttcaatttaa gteetaaata tagttaaaat aaaCaaCgtt ttagtaaaat 1620 gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680 taattgettt gaeattgtet atatggtact ttgtaaagtc atgettaagt acaaattcca Π4 0 tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1BQ0 gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcacagtgg ctcacgcctg i860
taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 192D tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 19S0 gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc atcccgggag gctgaggtgg gaggatcaec 2040 tgegcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ceatgateac accactgcac tceagccagg 2100 tgacatagcg agatcctgtg taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160 aggaagtagg ttaaaactaa ttctctaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgc 2220 aatgtttcea agtgaeaggt atccacatte gcatggttac aagccactgc cagctagcag 2280 tagcactttc ecggcactge ggtcggtttt gtteegtttt gctttgfctta gagacggggt 2340 cUcactttcc aggctggcct caeactcctg cactcaagca attctfcctac cctggcctee 2400 caagtagetg gaattaeagg tgtgcgccat cacaactagc eggtggtcag ttttgttact 2460 ctgagagetg ttcacttctc cgaafcteaec eagagfcggtt ggaecatcag atgcttgggc 2SÍ0 aaaactgaaa gctctttgca accacacacc teccctgagc ttaoacoact gccccettga 25βο gcagaaagtc caaattcctt eeaagacagt agaactccat cccagtacca aagccagata 2640 ggccccctag gaaactgagg eaagagcagt ctctaaaaac Cactcaeage agcattggtg 2700 caggggaact bggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtaeat 2760 atgaaagtga eetccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820 tatgtctggg gaaagaacgg attatgeecc attaaataac aagttgtgee caagagtcag 2880 agcagtgagc tcagaggccc ttcLcactqa gacaqcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940 gtatttgtgg aactcactgc cccagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcasctaaag 3000 aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060 tctggabttg agttgaagag catccatfctg agttgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120 cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180 gtttttaatt agcgcattct ccatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240 gactgcgect tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtacatgea ttgagtatta 3300 acctgaatgt tttgttacbt aaatatbaaa aacacfcgbba tcctacagtt 3350 <210> 35 <211> 264
<212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 35
Met Ser Vai Thr Ala Cys Gin Gly lea Gly Phe Val Val Ser Leu lie IS 10 15
Gly Phe Ala Gly He lie Ala Ala Thr Cya riel Asp Gin Trp Ser Thr 20 25 30
Sin Asp Leu Tyr Αβη Aan pro Val Thr Ala val Phe Abu Tyr Gin Gly 35 90 45
Leu Trp Arg ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu cys Arg SO 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Net Leu Gin Ala Val Arg 65 TO 75 80
Ala Leu Met lie Val Gly lie Val Leu Sly Val lie Gly lie Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lys Cys He Arg lie Gly Ser Met Asp Asp Ser loo 105 no
Ala Lye Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Leu Phe Ile He Ser 115 120 125
Gly Ile Cys Ala lie lie Gly Val Ser Val Phe Ala Abu Met Leu Val 130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asti Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175
Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly ISO 185 190
Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly leu Thr Pro Asp Aap Ser Asn 195 200 205
Phe Lys Ala Val Ser Tyr Kie Ala Ser Gly Gin Asn Val Ala Tyr Arg 210 ' 215 220
Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 225 230 235 240
Lya Lya Ile Tyr Aap Gly Gly Ala Aig Thr Glu Asp Asp Glu Gin Ser 245 250 255
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Gly Leu Ala Gly Cys He Ala Ala Thr Gly Met Aap Met Trp Set Thr 20 25 30
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Leu Trp Arg Ser eye val sin Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu eye Arg 50 55 60
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Ala Leu Wet Ue Val Gly lie val Leu Gly Val lie Gly lie Leu val 85 90 95
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Ala Lya Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Leu Phe lie lie Ser 115 120 125
Gly lie Cys Ala lie lie Gly Val Ser Val Phe Ala Aan Met Leu Val 130 1S5 140
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Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 16S 170 175
Ala leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu lie Gly Gly ISO IBS 190 val Met Met Cys lie Ala Cye Arg Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ann 155 2 DC 205
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Lys Lys lie Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gin Ser 245 250 255
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<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <4Ο0> 40 cgtacggtgg ctgcaccate Cgtcttcate ctcccgccat ctgatgagca gttgaaatet 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat sacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tçgaaggtgg ataacgccct çcaatcgggt aactcccagg agagtgtcaç agegçaggaç ião agcaaggaea gcacctacag cctcageage accctgacgc tgagcaaage agactaegag 240 aaacacaaag tccacgcctg cgaagccacc caccagggcc Cgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcfefceaaea ggggagagtg ttag 324 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <400> 41
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<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4Ο0> 46
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr ser Gly IS 10 15
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lya Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 20 25 30
Val Thr Val Ser Trp Aon ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hia Thr 35 40 45
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Val Thr Val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cya Aan
65 70 75 BO
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lya Pro Lys Asp US 120 125
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Val Glu val Hia Aan Ala Lya Thr Lya Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Ann 165 170 175 ser Thr Tyr Arg Val val ser val Leu Thr Val Leu Hia Gin Aap Trp 100 165 190
Leu Aan Gly Lya Glu Tyr Lys Cyo Lya Val Ser Aan Lya Ala Leu Pro 195 200 205
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Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lya Aan 225 230 235 240
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Ser Val Met His Glu Ala Leu Hie Asn Hie Tyr Thr Gin Lya Ser Leu 305 310 315 320
Set Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 47 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n é a, c, g, ou t <400> 47 tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn 32 <210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 48 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30 <210> 49 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 49 ctgctcactg gatggtggga agatgg 26 <210> 50 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 50 gggacagtca ctgagctgct cagag 25 <210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4Ο0> 51 acaggggcca gtggatagac cgatg 25 <210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 52 agccagggac caagggatag acagatg 27 <210> 53 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 53 gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 54 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 54 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 55 <211> 351 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 55
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata SO tcctgcaagg etactggcta cacattcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 130 cctggaeatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag fcactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgag atccgaggac tctgccgtct attacCgtgc aagatatgat loo tacccctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 56 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 56 eagatccagt tggtgcagte tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc $9 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa egaacegggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaaeatat 190 gctgaagagt tcaagggacg gtttgcctcc tctttggaaa cctctgecag cactgcctat 340 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagactgggt 300 tttggtaatg ctatggacta cfcggggtcaa ggaaectcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 57 <211> 348 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 57 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cctctggcta ceccttcact gactectnta taaactgggt gaagcagagg 12□ actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcsa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgtat 300 ggtgcctttg actactgggg ccaaggcacc actcteaeag cctcctca 348 <210> 58 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 58 caggtctaae tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatceefc ctgatagtta tactaaetac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca geagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatcgtgg 300 aggggtaact cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 59 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 59
caggttcagc tgcageagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg SO tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gatcggagag atttacoccg gaagtggteg tacotactac 190 aatgagaagt teaagggcaa ggccacaceg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgae acctgaggac tctgcggtct acttetgtge aagaggggt* OOO ttactacggg ctatggacta ctggggtcaa ggaaccfccag tcaccgtete ctca 354 <210> 60 <211> 360 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 60 caggttcace tacaacagtc tggttctgaa ctgaggagtc ctgggtettc agfcaaagett 60 tcatgcaagg ettttgattc agaagtcttc ccttttgctt atatgagttg gattaggcag 120 aagcctgggo atggatttga atggattgga gacatactcc caagtattgg tagaacaatc 1Θ0 tatggagaga agtttgagga caaagccaca ctggacgcag acacagtgcc caacacagcc 240 tacttggagc tcaacagtct gacatctgag gactctgcta tctactactg tgcaaggggg 300 gagggctacg gtgcctggtt tgcttaetgg ggccaaggga ctctggtcac tgtcfcctgca 360 <210> 61 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 61 gacettgtga tgecacagte tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc ngaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccetgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cacCctcacc 240 atcagcagtg tgcaggeuga agacccggca gtttattacc gtcagaacga ttacagttat 300 ecgcteacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagetgaaa 339 <210> 62 <211> 318 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 62 caaattgttc tcacccagtc tccagoa-atc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 actcctccca aactctggat ttatagcaea tccaaoctgg cttctggagt cectgctegc 100
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac cctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 2 aD gatgctgcca ctiattactg ccagcaaagg agtagttace cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 310 <210> 63 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 63
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagCaggaga cagggtcagc SO atcscctgca aggccngtca gaatgttcgt actgctgtag çctggtatca acagaaacoa 120 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatecaacc ggcacactgg agtccctgat 1B0 cgcttcacag gcagtggatc tggga-cagat etcactctca ccattagcaa tgtgçaatct 240 gaagacctgg eagatcattt ctgtctgcao cattggaatt atcctctgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 64 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 64
gacattgiga tgtcacagtc tccatcctcc ctagetgtgt cagttggaga gaaggttact SO atgagctgca agtccagtca gagcccttca tatagtagca atcaaaagaa ctacccggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg geagtcteet aaaeegetga tttactgggc atccactegg 190 gaatetgggg cccetgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggccga agacccggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 eegeteacgt teggtgetgg gaecaagctg gagecgaaa 339 <210> 65 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 65 gaeattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact so atgagctgce agtecagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tceetgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggetga agaectggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 330 <210> 66 <211> 336 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 66 gaeattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact ¢0 atgagctgna aatccagtca gagcccgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 cggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 100 gaatctgggg tceetgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agaectggca gtttattact gcaagca-atc ttataatctg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 334 <210> 67 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 67 gacatcgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact ¢0 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacbtggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg eaacagattt cactctgaec 240 atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat 300 ccgtacacgt teggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 68 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 68 gacattgtga tgtcac&gtc tccateetec ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaaccgctga cttaccgggc atccactagg 180 gaacctgggg eeeetgaicg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttacagctac 100 ccgctcaegt tcggtgctgg gaecaagctg gagctgaaa 339 <210> 69 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 69 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggLcsce 60 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt act tatgttt cctggtatca acagaaacca 12 0 gagcagtctc cta&actgct gatatacggg gcatccaaee ggtaeaetgg ggtceecgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 240 gaagacctgg cagtttatca ctgtcagcaa tattatagct atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaage tggagctgaa a 321 <210> 70 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucledtido <400> 70 gagaaagctt gccgccacca tggaatggac ctgggtcttt etc 43 <210> 71 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucledtido <400> 71 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtc 43 <210> 72 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 72 gagaaagctt gccgccacca tggattggct gtggaacttg ctattcc 47 <210> 73 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 73 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 74 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 74 gagaaagctt gccgccacca tggaatggat ctggatcttt ctcttc 46 <210> 75 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 75 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc 44 <210> 76 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 76 gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttc 46 <210> 77 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 77 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43 <210> 78 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 78 gagaaagctt gccgccacca tggaatggag gatctttctc ttcatcc 47 <210> 79 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 79 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 80 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 80 gagaggtctc aagcttagcc accatggact ggatttggat catgctccat c 51 <210> 81 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 81 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtcc 44 <210> 82 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 82 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc etc 43 <210> 83 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 83 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cage 34 <210> 84 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 84 gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46 <210> 85 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido. <400> 85 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 86 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 86 gagaaagctt gccgccacca tggagtttca gacccaggtc tttg 44 <210> 87 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 87 cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc etc 33 <210> 88 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 88 gagaaagett gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt ettatg 46 <210> 89 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 89 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 90 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 90 gagaaagett gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctcatg 46 <210> 91 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 91 cacacgtacg ttttatttcc aactttgtcc 30 <210> 92 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 92 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatattg 49 <210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 93 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 94 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 94 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 95 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 95 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 96 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 96 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggctcaggtt cttatg 46 <210> 97 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 97 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cag 33 <210> 98 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 98 gagaaagctt agccaccatg gaatcacaga ctctggtctt c 41 <210> 99 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 99 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 100 <211> 1401 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 100 atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcceag 60 gttcagctgc agcagtctgg agcCgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120 egcaaggcta ctggctacac attcagtagc tactggatag agtgggtaaa gcagaggcct 180 ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggtagtac taactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacattcact gcagatacaC cctccaacac agcctacatg 300 caaeteagca gccegaeatc tgaggactct gccgtotatt actgtgcaag atatgattac 360 ccctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc ctccaccaag 420
ggcccategg tcttccccct ggcaccctec tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 4 BO ctgggctgee tggtcaagga ctacLtcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca eaccttcccg getgtcctac agtcctcagg actetactcc 600 ctcageagcg tggtgaccgt gccctecage agcttgggca cccagaceca catctgcaac 660 gtgaatcaca agcecagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720
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atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagea atcaaaagaa ctacttggcc ISO
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atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg agctgatggg SO aacattgtaa tgacceaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgacetgca sggcqagtga gaatgtggtt acttatgttt ectggtutea aeagaaacca 180 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcetccaacc ggtacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagcc atccgctcac gttcggtgct 360 gggaccaagc tggagcCgaa acgtacggtg getgcaceac ctgtcetcae nttccegcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 460 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaoggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccaccagggc 66 0 etgagctcge ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 115 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 115
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Val Hie Ser Gin Val Sin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu «et Lye 20 25 30
Pro Giy Ala Ser Val Lys lie Ser Cya Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Trp lie Glu Trp Val Lye Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Glu lie Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Aon 6E 70 75 80
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Lau Aep Ser Aap Gly ser Phe phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430
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Gly Pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Het 260 265 270
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lya Asp Thr 260 265 270
Leu Met He Ser Arg Thr Pro <Jlu Val Thr Cye Val Val Val Asp Val 275 290 285
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Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 350 365
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Val Glu Trp Glu Ser Aon Gly Gin Pro Glu Aon Aen Tyr Lys Thr Thr .405 410 415
Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lye Ala Aap Tyr Glu 65 70 75 00
Lye His Lye Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 65 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 10 5 <210> 149 <211> 981 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: ácido nucleico de codões otimizados <4 0 0> 149 ggcccaagcg tgttccccct ggcccccagc ageaagagca ccagcggcgg cacagccgcc 60 ctgggctgec tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgcgagctg gaacagcgga 120 gecctgacct eeggcgtgca caeetteeec geegtgctgc agagcagegg ectgtaeage 180 ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcccgggca cccagaccta catctgcaac 240 gtgaaecaca agcccagcaa caccauggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 300 aagacccaca cetgcccccc ctgcccagcc ccagagetgc tgggcggacc cagcgtgttc 360 ctgteccccc ccaagcecaa ggacarcctg atgatcagca ggacccccga ggtgatctge 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggaccea gaggtgaagt tcaactggta egcggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtaeaacag eacctacagg 540 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 600 aaggtcteea acaaggcece gccageeeec acegaaaaga ceatcagcaa ggccaagggc 660 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggagut gaccaagaac 120 caggtgteec tgaccfcgtct ggtgaagggc ttetaeecca gegao&ecgc cgtggagtgg lao gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ecccagtgct ggacagcgac 640 ggeagoctct tcctgtaeag caagetgacc gtggacaagt eeaggtggca gcagggcaac SO 0 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggce ctgcacaacc actaeaccca gaagtccctg 960 agcctgagcc ccggcaagta g 9B1 <210> 150 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: proteína de codões otimizados <4 0 0> 150 CLy Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lya Ser Thr Ser Gly 1 5 10 15
Oly Thr Ala Ala Leu Gly Cya Leu Val Lya Asp Tyr phe Pro Glu Pro 20 25 30
Val Thr Val scr Trp Aan Ser Gly Ala Leu Thr Ser Oly val Hie Thr OS 40 45 phe Pro Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 50 55 60
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Aen 65 10 75 50
Val Aan His Lys Pro Ser Asn Thr LyB Val Asp Lye Arg Val Glu Pro 85 90 95
Lys Ser Cyo Asp Lys Thr Hie Thr Cya Pro Pro eye Pro Ala Pro Glu 100 105 110
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lya Pro Lya Aap 115 120 125
Thr Leu net lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Tht Gye Val Val Val Aap 130 135 140
Vai Ser Híb Glu Asp Pro Glu Vai Lye Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 145 150 155 160
Vai Glu Vai Hie Asn Ala Lye Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Aon 165 170 115
Ser Thr Tyr Arg Vai Val Ser Vai Leu Thr Vai Leu HÍB Gin Aep Trp ISO 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lye Cys Lye Vai Ser Asn Lyo Ala Leu Pro 195 200 205
Ala Pro lie Glu lya Thr IIe Ser Lye Ala Lye Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220
Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lya Aan 225 230 215 240
Gin Val Ser Leu Thr Cye Leu Val Lye Gly Phe Tyr Pro Ser Aep Ile 245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lya Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Aep Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lye 275 2 80 285
Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Aan Val Phe Ser Cys 290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Híe Tyr Thr Gin Lyã Ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu Ser pro Gly Lya 325
Lisboa, 2015-12-15

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo que compreende uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionada a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129.
  2. 2. Anticorpo da reivindicação 1 que se liga a CLD18A1 e a CLD18A2 ou se liga a CLD18A2 mas não a CLD18A1.
  3. 3. Anticorpo da reivindicação 2, em que CLD18A2 possui a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:2.
  4. 4. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 2-3 em CLD18A1 possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.
  5. 5. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, que se liga a epitopos nativos de CLD18A2 presentes na superfície de células vivas.
  6. 6. Hibridoma capaz de produzir o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  7. 7. Conjugado compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 acoplado a um agente terapêutico, em que o agente terapêutico é de preferência uma toxina, um isótopo radioativo, um fármaco ou um agente citotóxico.
  8. 8. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e/ou um conjugado da reivindicação 7, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e/ou conjugado da reivindicação 7, para utilização num método para inibir o crescimento e/ou matar uma célula que expressa CLD18A2.
  10. 10. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, conjugado da reivindicação 7 ou composição farmacêutica da reivindicação 8, para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células que expressam CLD18A2.
  11. 11. Anticorpo, conjugado, ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a doença ou distúrbio é uma doença relacionada com tumores, em que a doença relacionada com tumores é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em cancro da mama, cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro colorretal, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço, cancro da vesícula biliar, e suas metástases.
  12. 12. Anticorpo, conjugado ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o método compreende ainda o tratamento com um agente quimioterapêutico, radiação ou uma citoquina.
  13. 13. Anticorpo, conjugado ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o agente quimioterapêutico é selecionado do grupo que consiste em doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina e ciclofosfamida. Lisboa, 2015-12-15
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