PT1948693E - Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro - Google Patents

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PT1948693E
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Ugur Sahin
Dirk Usener
Philippe Thiel
Stefan Fritz
Christoph Uherek
Gunda Brandenburg
Harald-Gerhard Geppert
Anja Kristina Schroeder
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Description

ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro"
As terapias baseadas em anticorpos para cancro têm o potencial de maior especificidade e perfil de menores efeitos secundários em comparação com os fármacos convencionais. A razão é a distinção precisa entre células normais e neoplásicas pelos anticorpos e o facto de o seu modo de acção se basear em mecanismos imunológicos anti-tumorais menos tóxicos, tais como activação do complemento e recrutamento de células imunitárias citotóxicas.
Os alvos para terapias baseadas em anticorpos necessitam de ter qualidades particulares, que formam a base da discriminação correcta entre células normais e neoplásicas. Obviamente, um alvo com restrição exclusiva a células tumorais e inteiramente indetectável em tecidos normais é ideal para o desenvolvimento de produtos terapêuticos de anticorpos eficientes e seguros. Num outro aspecto, uma sobre-expressão de alto nivel podem ser a base para a janela terapêutica e os baixos efeitos secundários exemplificados pelo receptor do factor de crescimento epidérmico humano de tipo 2 (HER-2), que, em resultado da amplificação do gene, é um bom alvo para o anticorpo trastuzumab (Herceptin).
Outros alvos para anticorpos que ou já estão aprovados ou estão em desenvolvimento clinico para terapia de tumores têm qualidades distintas, que não são baseadas numa sobre-expressão numérica de moléculas alvo em células tumorais. No caso dos anticorpos para o proteoglicano MUC-1, um epitopo peptídico de repetição no esqueleto do alvo é subglicosilado em células tumorais e assim alterado para o seu equivalente normal. No caso de anticorpos para CD20 (rituximab) , CD52 (Campath-1H) e CD22 (epratuzumab), os alvos de anticorpos têm niveis comparáveis de expressão em células tumorais e linfócitos normais. Neste caso, a ablação de células normais pelo anticorpo é tolerável uma vez que células estaminais negativas para o alvo restauram o repertório de linfócitos normal. Outros exemplos de acessibilidade diferencial dos alvos de anticorpos são o antigénio carcinoembrionário (CEA) 2 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ e carboanidrase IX (CA9). Ambos os antigénios são expressos em epitélio normal do cólon e rim, respectivamente. No entanto, anticorpos de imagiologia marcados radioactivamente distinguem bem entre tecido tumoral e normal e anticorpos citotóxicos são bem tolerados. Isto é muito provavelmente devido a uma expressão restrita de CA9 e CEA no lado luminal do tecido epitelial normal, onde os anticorpos IgG não têm acesso. Também o antigénio molécula de adesão de células epiteliais (Ep-CAM) pertence a esta categoria. Como uma molécula de adesão celular homotípica para células epiteliais, localiza-se no espaço intercelular. Curiosamente, embora os anticorpos anti-Ep-CAM de alta afinidade sejam muito tóxicos, anticorpos de afinidade intermédia são bem tolerados. Isto sugere acessibilidade do alvo Ep-CAM em células normais, mas também indica que a cinética da ligação do anticorpo pode abrir uma janela terapêutica.
Uma possibilidade é de que outras proteínas específicas de células epiteliais envolvidas na adesão célula/célula possam também ser atractivas para abordagens de anticorpos, uma vez que podem ser de difícil acesso aos anticorpos em epitélios bem estruturados mas tornarem-se expostas em células tumorais. Analisámos por isso proteínas envolvidas na organização da arquitectura do tecido epitelial quanto à sua susceptibilidade como alvos para anticorpos terapêuticos. Uma proteína que chamou particularmente a nossa atenção é a claudina 18. WO 2004/047863 e WO 2005/113587 divulgam a identificação das variantes de processamento claudina-18A1 e claudina-18A2 como alvos de diagnóstico e terapêutica de cancro. A molécula de claudina 18 (CLD18) (número de acesso Genbank: variante de processamento 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369, e variante de processamento 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026) é uma proteína transmembranar integral com um peso molecular de aproximadamente 27,9/27,72 kDa. As claudinas são proteínas membranares integrais localizadas dentro das junções de oclusão dos epitélios e endotélios. As junções de oclusão organizam uma rede de cadeias interligadas de partículas intramembranosas entre células adjacentes. Em junções de oclusão, a ocludina e as 3 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ claudinas são os componentes proteicos transmembranares mais proeminentes. Devido às suas fortes propriedades de adesão intercelular, criam uma barreira primária para prevenir e controlar o transporte paracelular de solutos e restringem a difusão lateral de lipidos e proteínas membranares para manter a polaridade celular. As proteínas formadoras de junções de oclusão estão criticamente envolvidas na organização da arquitectura do tecido epitelial. Assumiu-se que tais proteínas podem ser pouco acessíveis aos anticorpos em epitélios bem estruturados, mas que se tornam expostas nas células tumorais. CLD18 é uma tetraspanina e tem, como tal, 4 regiões hidrófobas. Geraram-se dados indicando que CLD18 apresenta várias conformações diferentes, que podem ser selectivamente alcançadas por anticorpos. Uma conformação (CLD18-Conformação-1) implica que todas as quatro regiões hidrófobas servem como domínios transmembranares (TM) regulares e formam-se duas voltas extracelulares (voltai englobada pela região hidrófoba e uma região hidrófoba 2; volta2 englobada pelas regiões hidrófobas 3 e 4), tal como descrito para a grande maioria dos membros da família das claudinas. Uma segunda conformação (CLD18-Conformação-2) implica que, tal como descrito para PMP22, outro membro da família das tetraspaninas (Taylor et al., J. Neurose. Res. 62: 15-27, 2000), o segundo e terceiro domínios hidrófobos não atravessem completamente a membrana plasmática de modo a que essa porção (voltaD3) entre o primeiro e o quarto domínio transmembranar seja extracelular. Uma terceira conformação (CLD18-Conformação-3) implica um grande domínio extracelular com duas regiões hidrófobas internas englobadas pela primeira e quarta região hidrófoba, que servem como domínios transmembranares regulares. Devido à presença do local de N-glicosilação clássico na voltaD3, as variantes de topologia da Claudina-18, CLD18 topologia-2 e CLD18 topologia-3, ancoram um local de N-glicosilação extracelular adicional.
Outro nível de complexidade é adicionado à molécula de CLD18 através da presença de duas variantes de processamento diferentes, que são descritas no ratinho e no ser humano (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). As variantes de processamento CLD18A1 e CLD18A2 diferem nos primeiros 21 4 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ aminoácidos N-terminais, que constituem o primeiro TM e a voltai, enquanto a sequência proteica primária do terminal C é idêntica. CLD18A1 é selectivamente expressa no pulmão e epitélio do estômago normais, enquanto CLD18A2 é expressa apenas em células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). Mais importante ainda, CLD18A2 é restrita às células diferenciadas de vida curta do epitélio do estômago mas está ausente na região das células estaminais gástricas. Utilizando RT-PCR sensível, demonstrámos que ambas as variantes não são de todo detectáveis em qualquer outro órgão humano normal, mas são expressas de forma robusta em vários tipos de cancro incluindo tumores do estômago, esofágico, pancreático e do pulmão, bem como em linhas celulares de cancro humanas. A expressão é mais proeminente nos subtipos de adenocarcinoma destas indicações. O peso molecular da proteína difere em alguns cancros e tecido adjacente normal. A proteína de peso molecular mais elevado observado em tecido saudável pode ser transferida para o mesmo peso molecular que o observado em cancro através de tratamento de lisados de tecido com o composto desglicosilante PNGase F. Isto sugere que CLD18 é menos N-glicosilada em cancro, em comparação com a sua equivalente em tecido normal. Esta diferença estrutural é susceptível de dar origem a um epitopo alterado. Um motivo de N-glicosilação clássico está na posição do aa 116 dentro do domínio voltaD3 da molécula.
Os termos "CLD18" e "variante de CLD18" de acordo com o invento devem englobar (i) variantes de processamento de CLD18, (ii) variantes de N-glicosilação de CLD18, (iii) variantes de conformação de CLD18, (iv) variantes de CLD18 livres e associadas homotipicamente/heterotipicamente localizadas em junções de oclusão intercelulares e (v) variantes de CLD18 relacionadas com cancro e de CLD18 não relacionadas com células de cancro.
As características moleculares e funcionais de CLD18 tornam esta molécula um alvo altamente interessante para terapia de cancro baseada em anticorpos. Estas são, em 5 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ particular, (i) a ausência de CLD18 da grande maioria dos tecidos normais com toxicidade relevante, (ii) a restrição da expressão da variante CLD18A2 a uma população celular dispensável como as células gástricas diferenciadas, que podem ser repostas por células estaminais negativas para o alvo do estômago, (iii) sugestão de potencial glicosilação diferencial entre células normais e neoplásicas, e (iv) a presença de diferentes topologias de conformação. Além disso, o papel de CLD18 como proteína de junção de oclusão pode ainda contribuir para uma boa janela terapêutica. Como as células tumorais expressam claudinas mas muitas vezes não formam junções de oclusão clássicas através de associação homotipica e heterotípica de claudinas tal como verificado no tecido epitelial normal, as células tumorais podem ter um banco considerável de claudinas livres que são passíveis de se ligarem a anticorpos extracelulares e de imunoterapia. É possível que os epitopos de ligação das claudinas no epitélio saudável sejam protegidos dentro de junções de oclusão do acesso de tais anticorpos. 0 objecto do invento consiste em proporcionar anticorpos úteis para terapia de doenças em que é expressa CLD18, tais como doenças tumorais. Os anticorpos aqui descritos têm também utilidade no diagnóstico de tais doenças.
SUMÁRIO DO INVENTO A presente invenção proporciona geralmente anticorpos úteis como produtos terapêuticos para tratamento e/ou prevenção de doenças associadas a células expressando CLD18, incluindo doenças relacionadas com tumores tais como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro de cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar.
Num aspecto o invento refere-se a um anticorpo monoclonal possuindo a capacidade de se ligar a claudina 18A2 (CLD18A2) e sendo obtenível através de um método compreendendo o passo de imunização de um animal com um péptido possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira expressando o referido péptido, em que o anticorpo tem a capacidade de 6 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ mediar a morte de células tumorais expressando CLD18A2 in vivo, sendo a referida morte induzida através da ligação do referido anticorpo a CLD18A2 expressa pelas referidas células, e em que o anticorpo medeia a morte de células expressando CLD18A2 através de indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
De preferência, o anticorpo liga-se a CLD18A1 e CLD18A2 e de maior preferência liga-se a CLD18A2 mas não a CLD18A1. De preferência, os anticorpos do invento ligam-se a, e são específicos para, voltai de CLD-conformação-1.
As células expressando CLD18A2 são de preferência células de cancro e são, em particular, seleccionadas a partir do grupo que consiste em células de cancro tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, do pulmão, ovário, cólon, hepáticas, da cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
De preferência, a lise de células mediada por ADCC ocorre na presença de células efectoras, que em concretizações particulares são seleccionadas a partir do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMN. 0 anticorpo do invento pode ser um anticorpo quimérico, humano, ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo e pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgGl, um IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgA segregado, um IgD, e um IgE.
De acordo com todos os aspectos do invento, CLD18 é de preferência CLD18 humana, de preferência CLD18A2 humana, e CLD18A2 tem de preferência a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 e CLD18A1 tem de preferência a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 8.
Em concretizações preferidas particulares, o anticorpo do invento liga-se a epitopos nativos de CLD18A2 presentes à 7 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ superfície de células vivas. Noutras concretizações preferidas, o anticorpo do invento é específico para células de cancro, de preferência células de cancro do estômago.
Em certas concretizações do invento CLD18A2 é expressa à superfície das células.
Os anticorpos do invento podem ser obtidos através de um método compreendendo o passo de imunização de um animal com uma proteína ou um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 20, 21-23, 28, e 31, ou um fragmento imunogénico destes, ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira expressando a referida proteína ou péptido, ou fragmento imunogénico destes. De preferência, um anticorpo do invento é específico para as proteínas, os péptidos ou fragmentos imunogénicos destes acima mencionados.
Noutro aspecto o invento refere-se a um anticorpo produzido por um clone possuindo o n°. de acesso DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (18 2-D110 6-0 5 7), DSM ACC2740 (182-Dl106-058), DSM ACC2741 (182-01106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-06 7), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279) , DSM ACC2809 (182-D1106-294), ou DSM ACC2810 (182-D1106-362), ou uma forma quimérica ou humanizada destes.
Numa concretização o anticorpo do invento é ligado a um agente terapêutico tal como uma toxina, um isótopo radioactivo, um fármaco ou agente citotóxico.
Noutro aspecto o invento refere-se a um hibridoma capaz de produzir o anticorpo do invento. Hibridomas preferidos são aqueles possuindo o n°. de acesso DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056) , DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM 8 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294), ou DSM ACC2810 (182-D1106-362).
Os anticorpos do invento são aqui designados através da referência à designação do anticorpo, p. ex. 182-D758-035, e/ou através da referência ao clone produtor do anticorpo, p. ex. 26D12. O invento também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo do invento e/ou um conjugado deste com um agente terapêutico, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspecto o invento refere-se a um anticorpo, um conjugado ou uma composição farmacêutica do invento para utilização em tratamento ou prevenção de cancro envolvendo células de cancro expressando CLD18A2, em que o referido anticorpo, referido conjugado, ou a referida composição farmacêutica é para ser administrado a um sujeito.
De preferência o cancro é seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro gástrico, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar. CLD18A2 é de preferência expressa à superfície das referidas células.
De preferência, os anticorpos do invento têm a capacidade para discriminar variantes de CLD18 expressas por diferentes tipos celulares incluindo células de cancro e células não malignas. Numa concretização particularmente preferida, os anticorpos do invento têm a capacidade de se ligar a CLD18A2 enquanto não se ligam a CLD18A1, ou ligar a CLD18A1 com uma especificidade menor em comparação com a especificidade de ligação para CLD18A2. O termo "ligação" de acordo com o invento refere-se de preferência a uma ligação específica. "Ligação específica" significa que um agente tal como um anticorpo se liga com mais força a um alvo tal como um epitopo para o qual é específico em comparação com a ligação a outro alvo. Um agente liga-se com mais força a um primeiro alvo em comparação com um segundo alvo se se ligar ao primeiro alvo 9 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ com uma constante de dissociação (KD) que é inferior à constante de dissociação para o segundo alvo. De preferência a constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente se liga especificamente é mais de 10 vezes, de preferência mais de 20 vezes, de maior preferência mais de 50 vezes, ainda de maior preferência mais de 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes inferior à constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente.
Os anticorpos do invento medeiam a morte de células expressando CLD18A2 através da ligação a CLD18A2, de preferência expressa à superfície das referidas células. Numa concretização, os anticorpos do invento induzem citotoxicidade dependente do complemento (CDC), p. ex. pelo menos cerca de 20-40% de lise mediada por CDC, de preferência cerca de 40-50% de lise mediada por CDC, e de maior preferência mais de 50% de lise mediada por CDC de células expressando CLD18A2. Tais anticorpos são aqui exemplificados pelos seguintes anticorpos: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12, e ch-175DlO. Alternativamente ou adicionalmente à indução de CDC, os anticorpos do invento podem induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células expressando CLD18A2 na presença de células efectoras (p. ex., monócitos, células mononucleares, células NK e PMN) . Tais anticorpos são aqui exemplificados pelos seguintes anticorpos: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1, e 125E1. Os anticorpos do invento podem ter a capacidade de induzir apoptose de células expressando CLD18A2, induzir adesão homotípica de células expressando CLD18A2 e/ou induzir fagocitose de células expressando CLD18A2 na presença de macrófagos. De preferência, os anticorpos do invento induzem lise mediada por CDC e lise mediada por ADCC de células expressando CLD18A2 e de maior preferência induzem lise mediada por ADCC de células expressando CLD18A2 ao mesmo tempo que não induzem lise mediada por CDC das referidas células. Células alvo exemplares para os anticorpos do presente invento incluem, mas não se limitam a, células de cancro expressando CLD18A2, tais como células de cancro tumorigénicas gástricas, pancreáticas, esofágicas e do pulmão. Numa concretização particularmente preferida, a morte 10 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ de células mediada por anticorpos do invento é específica de CLD18A2, i.e. os anticorpos do invento medeiam a morte das células, de preferência a lise de células mediada por CDC e/ou ADCC, expressando CLD18A2 mas não medeiam a morte de células expressando CLD18A1 mas não expressando CLD18A2. Os anticorpos descritos acima podem ser utilizados para mediar morte de células tumorais no tratamento ou na prevenção de cancro tal como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar.
Os anticorpos do invento podem ser classificados em classes distintas de acordo com as suas propriedades de ligação e a sua capacidade para mediar a função efectora em células expressando CLD18. Os anticorpos do invento podem ser classificados de acordo com as suas: - propriedades de ligação a, e/ou funções efectoras mediadas em, células expressando CLD18A1 ou CLD18A2 (discriminação das variantes de processamento de CLD18), - propriedades de ligação a, e/ou funções efectoras mediadas em, células expressando variantes de CLD18 glicosiladas ou não glicosiladas (discriminação entre variantes de CLD18 com e sem N-glicosilação), - propriedades de ligação a, e/ou funções efectoras mediadas em, células de cancro ou tipos celulares normais (discriminação entre variantes de CLD18 expressas por células tumorais ou células normais não malignas), - propriedades de ligação a epitopos de CLD18 mascarados pela formação de junções de oclusão, - capacidades para induzir a formação de agregados de CLD18 em células vivas, e - capacidades para se ligarem a uma variante de CLD18 não humana, particularmente variantes de CLD18 de ratinhos, ratos, coelhos e primatas.
Os anticorpos do invento podem ter uma ou mais das seguintes propriedades pelo que é dada referência aos exemplos específicos de anticorpos do invento aqui descritos (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10) : 11 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ a) ligaçao a CLD18A2 bem como a CLD18A1 (P- ex. 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2, e 41C6 ) b) ligação a CLD18A2 mas não a CLD18A1 (P- ex. 26B5, 37G11, 38G5, 42E12, e 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12 , ch- -166E2, ch- 175D10) c) ligação a CLD18 expressa naturalmente por células tumorais mas não a CLD18 expressa naturalmente por células ou tecidos sem ser de cancro tais como células de estômago e pulmão (p. ex. 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10) d) mediação de morte induzida por CDC de células que expressam CLD18A2 mas não de células que expressam CLD18A1 (p. ex. 26D12, 28D10, 37H8, e 39F11, 163E12, ch-125El, ch-163E12, ch-175D10) e) mediação de morte induzida por ADCC de células expressando CLD18 (p. ex. 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12, e 61C2, ch-163El2, ch-175D10) f) mediação de morte induzida por ADCC mas não de morte mediada por CDC de células expressando CLD18 (p. ex. 37G11, 42E12, e 43A11) g) mediação de morte induzida por ADCC e morte induzida por CDC de células expressando CLD18A2 (p. ex. 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
Tal como aqui exemplificado, os anticorpos do invento englobam ainda moléculas, que: a) se ligam a células diferenciadas de estômago normal, mas não a células estaminais do estômago (p. ex. 39F11) b) não se ligam a tecido gástrico normal bem como outros órgãos normais mas exclusivamente a células de cancro (p. ex. 26B5) c) se ligam a um epitopo englobando um Asn não glicosilado na posição 116 de CLD18 d) se ligam a CLD18 humana bem como de ratinho permitindo realizar exaustivamente estudos de toxicidade pré-clínicos em ratinhos.
Os anticorpos do invento podem ser derivados de diferentes espécies, incluindo mas não limitadas a ratinho, rato, coelho, cobaia e humano. Os anticorpos do invento incluem também moléculas quiméricas nas quais uma região 12 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ constante do anticorpo derivada de uma espécie, de preferência humano, é combinada com o local de ligação ao antigénio derivado de outra espécie. Além disso, os anticorpos do invento incluem moléculas humanizadas nas quais os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo derivados de uma espécie não humana são combinados com regiões constantes e estruturais de origem humana.
Os anticorpos do invento incluem anticorpos policlonais e monoclonais e incluem anticorpos IgG2a (p. ex. IgG2a, k, λ), IgG2b (p. ex. IgG2b, κ, λ), IgG3 (p. ex. IgG3, κ, λ) e IgM. No entanto, outros isotipos de anticorpo são também englobados pelo invento, incluindo anticorpos IgGl, IgAl, IgA2, IgA segregado, IgD, e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros ou fragmentos de ligação ao antigénio destes incluindo, por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadeia simples ou anticorpos biespecificos. Além disso, os fragmentos de ligação ao antigénio incluem proteínas de fusão dominio de ligação-imunoglobulina compreendendo (i) um polipéptido de dominio de ligação (tal como uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve) que é fundido com um polipéptido de região charneira de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região charneira, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. Tais proteinas de fusão dominio de ligação-imunoglobulina são ainda divulgadas em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
De preferência os anticorpos do presente invento dissociam-se de CLD18 com uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) de aproximadamente 1-100 nM ou menos. De preferência, os anticorpos do invento não reagem de forma cruzada com antigénios da superfície celular relacionados e não inibem assim a sua função.
Em concretizações preferidas, os anticorpos do presente invento podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades: a) especificidade para CLD18, em particular especificidade para CLD18A2; 13 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ b) uma afinidade de ligação a CLD18, em particular CLD18A2, de cerca de 100 nM ou menos, de preferência cerca de 5-10 nM ou menos e, de maior preferência, cerca de 1-3 nM ou menos, c) a capacidade para mediar um nível elevado de CDC em células negativas para CD55/59 ou positivas para CD55/59; d) a capacidade para inibir o crescimento de células que expressem CLD18; e) a capacidade para induzir apoptose de células que expressem CLD18; f) a capacidade para induzir adesão homotípica de células que expressem CLD18; g) a capacidade para induzir ADCC de células que expressem CLD18 na presença de células efectoras; h) a capacidade para prolongar a sobrevivência de um sujeito possuindo células tumorais que expressem CLD18; i) CLD18; a capacidade para eliminar células que expressem j) níveis a capacidade baixos de CLD18 para e/ou eliminar células que expressem k) a capacidade para agregar CLD18 à superfície de células vivas.
Os anticorpos anti-CLDl8 do presente invento podem ser derivados, ligados a, ou co-expressos com outras especificidades de ligação. Numa concretização particular, o invento proporciona uma molécula biespecífica ou multiespecífica compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLD18 (p. ex., um anticorpo anti-CLD18 ou mimético deste), e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efectora, tal como uma especificidade de ligação para um receptor de Fc (p. ex., um receptor de Fc-gama, tal como Fc-gama RI, ou qualquer outro receptor de Fc) ou um receptor de células T, p. ex., CD3.
Consequentemente, o presente invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que se ligam tanto a CLD18 como a um receptor de Fc ou um receptor de células T, p. ex. CD3. Exemplos de receptores de Fc são receptores de IgG, receptores de Fc-gama (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD16). Outros receptores de Fc, tais como receptores de IgA (p. ex., FcaRI), podem também ser alvos. O 14 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ receptor de Fc está de preferência localizado à superfície de uma célula efectora, p. ex., um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear activada. Numa concretização preferida, as moléculas biespecificas e multiespecificas ligam-se a um receptor de Fc num local que é diferente do local de ligação a Fc de imunoglobulina (p. ex., IgG ou IgA) do receptor. Portanto, a ligação das moléculas biespecificas e multiespecifica não é bloqueada através de níveis fisiológicos de imunoglobulinas.
Ainda noutro aspecto, os anticorpos anti-CLD18 do invento são derivados, ligados a, ou co-expressos com outra molécula funcional, p. ex., outro péptido ou proteína (p. ex., um fragmento Fab'). Por exemplo, um anticorpo do invento podem ser funcionalmente ligado (p. ex., através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (p. ex. para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecifico) , uma citotoxina, um ligando celular ou antigénio (p. ex., para produzir um imunoconjugado, tal como uma imunotoxina). Um anticorpo do presente invento pode ser ligado a outras porções terapêuticas, p. ex., um radioisótopo, um fármaco anticancro de molécula pequena, uma citocina recombinante ou quimocina. Consequentemente, o presente invento engloba uma grande variedade de moléculas de conjugado de anticorpo, biespecificas e multiespecificas, e proteínas de fusão, as quais se ligam todas a células expressando CLD18 e que podem ser utilizadas para direccionar outras moléculas para tais células.
Ainda noutro aspecto, o invento proporciona composições, p. ex., composições/estojos farmacêuticos e de diagnóstico, compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável formulado juntamente com um ou uma combinação de anticorpos do invento. Numa concretização particular, a composição inclui uma combinação de anticorpos que se ligam a epitopos distintos ou que possuem características funcionais distintas, tais como indução de CDC e/ou ADCC e indução de apoptose. Nesta concretização do invento, os anticorpos podem ser utilizados em combinação, p. ex., como uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos 15 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ monoclonais anti-CLD18. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 possuindo actividades diferentes mas complementares podem ser combinados numa única terapia para alcançar um efeito terapêutico desejado. Numa concretização preferida, a composição inclui um anticorpo anti-CLDl8 que medeia CDC combinado com outro anticorpo anti-CLD18 que induz apoptose. Noutra concretização, a composição inclui um anticorpo anti-CLD18 que medeia uma morte altamente eficaz das células alvo na presença de células efectoras, combinado com um outro anticorpo anti-CLD18 que inibe o crescimento de células que expressem CLD18. 0 presente invento inclui também a administração simultânea ou sequencial de dois ou mais anticorpos anti-CLD18 do invento, em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo anti-CLD18 quimérico e pelo menos um outro anticorpo é um anticorpo anti-CLD18 humano, os anticorpos liqando-se ao mesmo epitopo ou a epitopos diferentes de CLD18. De preferência, um anticorpo de CLD18 quimérico do invento é administrado primeiro seguido de administração de um anticorpo anti-CLD18 humano do invento, em que o anticorpo anti-CLD18 humano é de preferência administrado durante um período alargado de tempo, i.e. como terapia de manutenção.
Os anticorpos, os imunoconjugados, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas e as composições do presente invento podem ser utilizados numa variedade de métodos para inibir o crescimento de células expressando CLD18A2 e/ou matar selectivamente células expressando CLD18A2 através do contacto das células com uma quantidade eficaz do anticorpo, do imunoconjugado, da molécula biespecífica/multiespecífica ou da composição, de modo a que o crescimento da célula seja inibido e/ou a célula seja morta. Células expressando CLD18A2 que podem ser inibidas ou mortas utilizando os anticorpos do invento incluem células de cancro tais como células tumorigénicas do estômago, pancreáticas, esofágicas, de pulmão, ovário, cólon, hepáticas, da cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
Consequentemente, os anticorpos do presente invento podem ser utilizados para tratar e/ou prevenir uma variedade 16 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ de doenças envolvendo células expressando CLD18A2 através da administração dos anticorpos a pacientes sofrendo de tais doenças. Exemplos de doenças que podem ser tratadas (p. ex., melhoradas) ou prevenidas, incluem, mas não se limitam a, doenças tumorigénicas. Exemplos de doenças tumorigénicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem cancro gástrico, cancro pancreático, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro colorrectal, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço, e cancro da vesícula biliar.
Em uma concretização particular do invento, o sujeito ao qual será administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente quimioterapêutico, radiação ou um agente que module, p. ex., aumente ou iniba a expressão ou actividade de um receptor de Fc, p. ex., um receptor de Fc-gama, tal como uma citocina. Citocinas típicas para administração durante o tratamento incluem factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-γ), e factor de necrose tumoral (TNF). Agentes terapêuticos típicos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos tais como doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluoruracilo, metotrexato, gemzitabina e ciclofosfamida.
Animais não humanos tais como ratinhos podem ser imunizados com CLD18A2 humana ou um fragmento peptídico desta, para obter anticorpos. Os péptidos preferidos para imunização são os seleccionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 20-23, 28 e 31. Consequentemente, em concretizações preferidas, os anticorpos do invento são aqueles obtidos através de imunização utilizando péptidos seleccionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 20-23, 28 e 31. De modo análogo, anticorpos para CLD18A2 podem ser gerados num animal transgénico não humano, tal como um ratinho transgénico. O animal transgénico não humano pode ser um ratinho transgénico possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve codificando todo ou uma porção de um anticorpo.
Animais de tipo selvagem bem como transgénicos não humanos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou 17 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ enriquecida de antigénio de CLD18A2 e/ou ácidos nucleicos e/ou células expressando CLD18A2 ou um fragmento peptídico desta. De preferência, o animal não humano é capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18A2 (p. ex., IgG, IgA e/ou IgM) através da sujeição a recombinação de V-D-J e a mudança de isotipo. A mudança de isotipo pode ocorrer através p. ex., de mudança do isotipo clássica ou não clássica. Células B isoladas, obtidas a partir de um animal não humano tal como descrito acima podem então ser imortalizadas através de fusão com uma célula imortalizada para proporcionar uma fonte (p. ex., um hibridoma) de anticorpos do invento. Tais hibridomas (isto é, que produzem os anticorpos do invento) estão também incluídos dentro do âmbito do invento.
Tal como aqui exemplificado, os anticorpos do invento podem ser obtidos directamente a partir de hibridomas que expressem o anticorpo, ou podem ser clonados e expressos de forma recombinante numa célula hospedeira (p. ex., uma célula CHO, ou uma célula linfocítica). Outros exemplos de células hospedeiras são microorganismos, tais como E. coli, e fungos, tais como levedura. Alternativamente, podem ser produzidos de forma recombinante num animal transgénico não humano ou planta. Células de hibridoma preferidas para a produção de anticorpos do invento são aquelas sequenciadas ou depositadas em DSMZ (Mascheroder Weg lb, 31824 Braunschweig, Alemanha; novo endereço: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemanha) com as seguintes designações e números de acesso: 19 a. 182-D1106-055, de Outubro de 2005 n° de acesso DSM ACC2737, 19 b. 182-D1106-056, de Outubro de 2005 n° de acesso DSM ACC2738, 19 c. 182-D1106-057, de Outubro de 2005 n° de acesso DSM ACC2739, 19 d. 182-D1106-058, de Outubro de 2005 n° de acesso DSM ACC2740, 19 e. 182-D1106-059, de Outubro de 2005 n° de acesso DSM ACC2741, depositada a 18 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ f . 182-D1106-062, n° de acesso DSM ACC2742, depositada a 19 de Outubro de 2005, g . 182-D1106-067, n° de acesso DSM ACC2743, depositada a 19 de Outubro de 2005 h . 182-D758-035, n° de acesso DSM ACC2745, depositada a 17 de Novembro de 2005 i . 182-D758-036, n° de acesso DSM ACC2746, depositada a 17 de Novembro de 2005 3 . 182-D758-040, n° de acesso DSM ACC2747, depositada a 17 de Novembro de 2005 k . 182-D1106-061, n° de acesso DSM ACC2748, depositada a 17 de Novembro de 2005 1 . 182-D1106-279, n° de acesso DSM ACC2808, depositada a 26 de Outubro de 2006 m .. 182-D1106-294, n° de acesso DSM ACC2809, depositada a 26 de Outubro de 2006, n . 182-D1106-362, n° de acesso DSM ACC2810, depositada a 26 de Outubro de 2006.
Anticorpos do invento preferidos são aqueles produzidos através, e obteníveis a partir dos hibridomas acima descritos; i.e. 37G11 no caso de 182-D1106-055, 37H8 no caso de 182-D1106-056, 38G5 no caso de 182-D1106-057, 38H3 no caso de 182-D1106-058, 39F11 no caso de 182-D1106-059, 43A11 no caso de 182-D1106-062, 61C2 no caso de 182-D1106-067, 26B5 no caso de 182-D758-035, 26D12 no caso de 182-D758-036, 28D10 no caso de 182-D758-040, 42E12 no caso de 182-D1106-061, 125E1 no caso de 182-D1106-279, 163E12 no caso de 182-D1106-294, e 175D10 no caso de 182-D1106-362; e as formas tornadas quiméricas e humanizadas destes.
Em concretizações preferidas, os anticorpos, em particular as formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia pesada humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 ou um fragmento desta. Noutras concretizações preferidas, os anticorpos, em particular formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia leve (CL) compreendendo uma sequência de 19 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia leve humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 ou um fragmento destas. Numa concretização particularmente preferida, os anticorpos, em particular as formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos que compreendem uma CH compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma CH humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 ou um fragmento destas e que compreende uma CL compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma CL humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 ou um fragmento desta.
Uma CH compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 45. Uma CH compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 150 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 149. Uma CL compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 40. Uma CL compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 148 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 147.
Em certas concretizações preferidas, formas tornadas quiméricas de anticorpos incluem anticorpos compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, e um fragmento destas e/ou compreendendo uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, e um fragmento destas.
Em certas concretizações preferidas, formas tornadas quiméricas dos anticorpos incluem anticorpos compreendendo uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves 20 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ seleccionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix) : (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 ou um fragmento desta, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 ou um fragmento desta, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 ou um fragmento desta, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 ou um fragmento desta, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 ou um fragmento desta, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 ou um fragmento desta, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 ou um fragmento desta, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 ou um fragmento desta, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um fragmento desta e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 ou um fragmento desta. "Fragmento" ou "fragmento de uma sequência de aminoácidos" tal como utilizado acima refere-se a uma parte de uma sequência de anticorpo, i.e. uma sequência que 21 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ representa a sequência de anticorpo encurtada no terminal N e/ou C, que quando substitui a referida sequência de anticorpo num anticorpo mantém a ligação do referido anticorpo a CLD18A2 e de preferência as funções do referido anticorpo tal como aqui descrito, p. ex. lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC. De preferência, um fragmento de uma sequência de aminoácidos compreende pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácidos da referida sequência de aminoácidos. Um fragmento de uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, e 129 refere-se de preferência à referida sequência em que 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos no terminal N são removidos. Fragmentos das sequências de aminoácidos aqui descritas podem ser codificados pelos respectivos fragmentos das sequências de ácido nucleico codificando as referidas sequências de aminoácidos.
Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 100. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 101. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 102. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 104. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 103. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 105. 22 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 107. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 106. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 108. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 111. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 110. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 109. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 7 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 112. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 113. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 114.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137, e um fragmento destas.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma região variável de cadeia leve (VL) 23 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, e um fragmento destas.
Em certas concretizações preferidas, um anticorpo do invento compreende uma combinação da região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) seleccionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix) : (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 ou um fragmento desta, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 ou um fragmento desta, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 ou um fragmento desta, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 ou um fragmento desta, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 ou um fragmento desta, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 ou um fragmento desta, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 ou um fragmento desta, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 ou um fragmento desta, 24 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um fragmento desta e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 ou um fragmento desta.
Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 55. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 56. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 57. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 59. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 58. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 60.
Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 62. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 61. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 63. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 66. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos 25 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ representada por SEQ ID NO: 142 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 65. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 64. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 67. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 68. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 69.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma VH compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 seleccionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (vi) : de SEQ ID NO: 115, CDR2: , CDR3: posições 116-125 de de SEQ ID NO: 116, CDR2: , CDR3: posições 116-126 de de SEQ ID NO: 117, CDR2: , CDR3: posições 116-124 de de SEQ ID NO: 118, CDR2: , CDR3: posições 116-126 de de SEQ ID NO: 119, CDR2: , CDR3: posições 115-125 de de SEQ ID NO: 120, CDR2: , CDR3: posições 117-128 de (i) CDR1: posições 45-52 posições 70-77 de SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 115, (ii) CDR1: posições 45-52 posições 70-77 de SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 116, (iii) CDR1: posições 45-52 posições 70-77 de SEQ ID NO: 117 SEQ ID NO: 117, (iv) CDR1: posições 45-52 posições 70-77 de SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 118, (v) CDR1: posições 44-51 posições 69-76 de SEQ ID NO: 119 SEQ ID NO: 119, e (vi) CDR1: posições 45-53 posições 71-78 de SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 120. 26 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma VL compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 eguintes concretizações (i) a 58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: 121, CDR3: posições 115-123 de -53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: 122, CDR3: posições 110-118 de /-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: 123, CDR3: posições 109-117 de -58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: 124, CDR3: posições 115-123 de 58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: 125, CDR3: posições 115-123 de -58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: 126, CDR3: posições 115-122 de 7-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: 127, CDR3: posições 115-123 de :7-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: 128, CDR3: posições 115-123 de -52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: 129, CDR3: posições 109-117 de seleccionadas a partir das : (ix) : (i) CDR1: posições 47-! posições 76-78 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 121, (ii) CDR1: posições 49-posições 71-73 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 122, (iii) CDR1: posições 47 posições 70-72 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 123, (iv) CDR1: posições 47 posições 76-78 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 124, (v) CDR1: posições 47-posições 76-78 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 125, (vi) CDR1: posições 47 posições 76-78 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 126, (vii) CDR1: posições 4' posições 76-78 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 127, (viii) CDR1: posições 4 posições 76-78 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 128, e (ix) CDR1: posições 47 posições 70-72 de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 129.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma combinação de VH e VL compreendendo, cada uma, um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 seleccionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (ix): (i) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDRl: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, 27 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1 : posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115- 122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115- 123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129. 28 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Noutras concretizações preferidas, um anticorpo do invento compreende de preferência uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a região variável CDR3, da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18A2, de preferência de um anticorpo monoclonal contra CLD18A2 aqui descrito, e compreende de preferência uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a região variável CDR3, das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) aqui descritas. Numa concretização a referida uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) são seleccionadas a partir de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 aqui descritas. Numa concretização particularmente preferida, um anticorpo do invento compreende de preferência as regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18A2, de preferência de um anticorpo monoclonal contra CLD18A2 aqui descrito, e compreende de preferência as regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) aqui descritas.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDR ou a combinação de conjuntos de CDR tal como aqui descrito compreende as referidas CDR juntamente com as suas regiões estruturais intervenientes. De preferência, a porção incluirá também pelo menos cerca de 50% de uma ou ambas da primeira e quarta regiões estruturais, sendo os 50% os 50% C-terminais da primeira região estrutural e os 50% N-terminais da quarta região estrutural. A construção de anticorpos do presente invento produzidos através de técnicas de ADN recombinante pode resultar na introdução de resíduos N ou C-terminais às regiões variáveis codificadas por ligadores introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação, incluindo a introdução de ligadores para unir regiões variáveis do invento a outras sequências proteicas incluindo 29 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ cadeia pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou marcadores proteicos.
Numa concretização, um anticorpo do invento compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDR ou a combinação de conjuntos de CDR tal como aqui descrito compreende as referidas CDR numa estrutura de anticorpo humana. A referência aqui a um anticorpo compreendendo em relação à cadeia pesada deste uma determinada cadeia, ou uma determinada região ou sequência refere-se, de preferência, à situação em que todas as cadeias pesadas do referido anticorpo compreendem a referida cadeia, região ou sequência particular. Isto aplica-se correspondentemente à cadeia leve de um anticorpo. Ácidos nucleicos compreendendo genes ou sequências de ácido nucleico codificando anticorpos ou partes destes, p. ex. uma cadeia de anticorpo, tal como aqui descrito podem estar compreendidos num vector, p. ex., um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou outro vector utilizado p. ex. convencionalmente em engenharia genética. 0 vector pode compreender genes tais como genes marcadores que permitam a selecção do vector numa célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vector pode compreender elementos de controlo da expressão permitindo a expressão correcta das regiões de codificação em hospedeiros adequados. Tais elementos de controlo são conhecidos dos peritos e podem incluir um promotor, uma cassete de processamento, e um codão de iniciação da tradução.
De preferência, o ácido nucleico é operativamente ligado às sequências de controlo da expressão de cima permitindo a expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Os elementos de controlo assegurando a expressão em células eucarióticas ou procarióticas são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Os métodos para construção das moléculas de ácido nucleico de cima, para construção de vectores compreendendo 30 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ as moléculas de ácido nucleico de cima, para introdução dos vectores em células hospedeiras escolhidas de forma apropriada, para causar ou alcançar a expressão são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Um ácido nucleico ou vector tal como aqui divulgado pode estar compreendido numa célula hospedeira.
Outras caracteristicas e vantagens do presente invento tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra uma análise de imunofluorescência de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 ligadas a um fluorocromo verde e feitas reagir com soro de ratinho após imunização com ADN com SEQ ID NO: 15 fundida com um epitopo ajudante. A Fig. 2 mostra uma análise Western blot de células HEK293 transfectadas com CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3) e células HEK293 não transfectadas com o anticorpo monoclonal anti-c-myc de ratinho 9E11 (Serotec, CRL MCA2200). A Fig. 3 mostra uma análise de imunofluorescência utilizando células CHO transfectadas com CLD18A2 e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000).
As Fig. 4A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 24H5 e 85A3 a células HEK293 transfectadas transientemente com CLD18A2 humana e um marcador fluorescente tal como determinado através de citometria de fluxo. A Figura 4C mostra a ligação de sobrenadantes de hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 a células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana e contrastadas com iodeto de propidio. A Fig. 5 mostra a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 2 4H5 (A), 9E8 (B) , 26B5 (C) e 19B9 (D) a células HEK293 transfectadas transientemente com um marcador fluorescente e 31 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ CLD18A2 humana ou CLD18A2-Myc ou CLD18A2-HA tal como analisado através de citometria de fluxo.
As Fig. 6A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 e 163E12 a células HEK293 transfectadas estavelmente com CLD18A2 ou CLD18A1 humana, tal como determinado através de citometria de fluxo. A Fig. 7 mostra uma análise de imunofluorescência do anticorpo monoclonal especifico da isoforma CLD18A2, 37G11, através da coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D), respectivamente, sob condições nativas (A, B) e de fixação com paraformaldeido (C, D) . A Fig. 8 mostra uma análise de imunofluorescência do anticorpo monoclonal de CLD18, 26B5, através de coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D), respectivamente, sob condições nativas (A, B) e de fixação com paraformaldeido (C, D).
Fig. 9. RT-PCR de linhas celulares. A análise de RT-PCR com iniciadores específicos de CLD18A2 mostrou uma expressão clara em 4/5 das linhas celulares testadas. A Fig. 10 mostra uma análise de imunofluorescência de células DAN-G (subclone F2) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 11 mostra uma análise de imunofluorescência de células KATO-III (subclone 3B9 4D5) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 12A mostra uma análise de imunofluorescência de células SNU-16 (subclone G5) com um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 12 B mostra uma análise de imunofluorescência de células KATO-III com anticorpos monoclonais do invento. A Fig. 13 mostra expressão à superfície de CLD18 em células KATO-III e NUGC-4 analisada através da coloração das 32 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ células com os anticorpos monoclonais 61C2 e 163E12 seguida de análise de citometria de fluxo.
Fig. 14. Alinhamento de proteínas de CLD18A1 humana (NP_057 453) , CLD18A2 humana (NP_001002026) , CLD18A1 de ratinho (NP_062789) e CLD18A2 de ratinho (AAL15636).
As Fig. 15 A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1, e 163E12, respectivamente, a células HEK293 transfectadas transientemente com um marcador fluorescente e CLD18A1 de murídeo ou CLD18A2 de murídeo tal como analisado através de citometria de fluxo.
Fig. 16. Análises imuno-histoquímicas com o AB policlonal pl05. As colorações imuno-histoquímicas num subconjunto de tecidos normais (estômago, pulmão, medula óssea e próstata) confirmam a especificidade do tecido gástrico (A). A expressão foi também detectada em carcinomas de estômago (linha superior) e carcinomas de pulmão (B) . Apenas as células diferenciadas mas não as células estaminais expressam CLD18A2 (C).
FIG. 17. Análises imuno-histoquímicas com o AB monoclonal 39F11D7 (A) Expressão proteica especifica foi detectada em mucosa normal do estômago, enquanto todos os outros tecidos normais testados foram negativos. (B) Forte expressão de CLD18A2 foi verificada em carcinomas de estômago e pulmão.
Fig. 18. Análises imuno-histoquímicas com os AB monoclonais 26B5 (A), 175D10 (B) , 43A11 (C) , 163E12 (D), e 45C1 (E) . Todos os anticorpos mostram forte coloração de tumores de xenoenxertos HEK293-CLD18A2 e espécimenes de cancros gástricos, mas não tumores transfectados de controlo HEK2 93-Simulado. A Fig. 19 é um gráfico comparando a percentagem de células mortas após indução de CDC por 85A3, 28D10, 24H5, ou 26D12 contra células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana utilizando citometria de fluxo. 33 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ A Fig. 20 é um gráfico comparando a percentagem de lise celular específica após indução de CDC por 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, ou 61C2 contra células CHO aderentes estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana ou CLD18A1 humana tal como determinado através de medição de fluorescência. A Fig. 21 mostra indução de CDC dependente da concentração contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana por 75B8 (A), 28D10 (B) , ou 37H8 (C) tal como determinado através de medição de fluorescência. A Fig. 22 mostra a lise de células HEK293-CLD18A2 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2, respectivamente, na presença de MNC. A Fig. 23 mostra a lise de células HEK293-CLD18A1 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2, respectivamente, na presença de MNC. A Fig. 24 mostra inibição do crescimento tumoral por anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce com células HEK293-CLD18A2.
As Fig. 25A e B mostram a sobrevivência prolongada através do tratamento com anticorpos do invento em dois modelos de xenoenxerto de tratamento precoce com células HEK2 93-CLD18A2 . A Fig. 26 mostra o prolongamento da sobrevivência através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento avançado com células HEK293-CLD18A2. A Fig. 27A mostra inibição do crescimento tumoral através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce. A Fig. 27B mostra prolongamento da sobrevivência através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce. Foram utilizadas células DAN-G expressando CLD18A2 endogenamente. 34 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ A Fig. 28 mostra a expressão de ARNm de CLD18A2 em tecidos de ratinho. Investigações de RT-PCR com iniciadores específicos de CLD18A2 não mostraram expressão significativa em todos os tecidos normais excepto estômago. Foram analisados os seguintes tecidos normais: 1: intestino delgado, 2: baço, 3: pele, 4: estômago, 5: pulmão, 6: pâncreas, 7: nódulo linfático, 8: timo, 9: controlo negativo A Fig. 29 mostra expressão de CLD18 em estômago normal. Análise imuno-histoquímica com anticorpo específico de CLD18 de estômago de ratinho revela um padrão de expressão conservado. Enquanto o epitélio superficial e as criptas mais internas expressam CLD18 na sua superfície celular, a região central do pescoço é negativa para CLD18. A Fig. 30 mostra coloração de hematoxilina e eosina de tecidos do estômago de ratinhos. É mostrado em perspectiva geral (A) e em detalhe (B) o estômago de um ratinho tratado com 37G11 em comparação com um ratinho de controlo (C e D), que foi tratado apenas com PBS.
As Fig. 31A e B mostram coloração de citometria de fluxo de células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A1 e A2 humanas, respectivamente, bem como células KATO-III expressando endogenamente com anticorpos do invento (43A11, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10). A Fig. 32 mostra CDC em células expressando CLD18A2 mediada por anticorpos quiméricos do invento. A Fig. 33 mostra ADCC em células KATO-III mediada por anticorpos quiméricos do invento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente a um epitopo presente em CLD18A2. Anticorpos monoclonais isolados englobados pelo presente invento incluem anticorpos IgA, IgGl-4, IgE, IgM, e IgD. Numa concretização, o anticorpo é um anticorpo IgGl, mais particularmente um isotipo IgGl, capa ou IgGl, lambda. Noutra concretização, o anticorpo é um 35 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ anticorpo IgG3, mais particularmente um isotipo IgG3, capa ou IgG3, lambda. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgG4, mais particularmente um isotipo IgG4, capa ou IgG4, lambda. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgAl ou IgA2. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgM.
Numa concretização, o invento refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a células expressando CLD18A2 e de preferência (i) ligam-se a células expressando CLD18A2, e (ii) não se ligam a células que não expressam CLD18A2 mas expressam CLD18A1. Os anticorpos do invento de preferência (i) medeiam a morte de células expressando CLD18A2, e (ii) não medeiam a morte de células que não expressam CLD18A2 mas que expressam CLD18A1.
Noutra concretização, o invento refere-se a anticorpos que (i) se ligam a células tumorais expressando CLD18, (ii) não se ligam a células expressando CLD18 de mucosa de estômago normal, e/ou (iii) não se ligam a células expressando CLD18 de tecido de pulmão sem ser de cancro. 0 invento inclui também anticorpos que (i) medeiam a morte de células tumorais expressando CLD18, (ii) não medeiam a morte de células expressando CLD18 de mucosa de estômago normal, e/ou (iii) não medeiam a morte de células expressando CLD18 de tecido de pulmão sem ser cancro.
Em concretizações particulares, os anticorpos do invento (i) ligam-se a um epitopo em CLD18A2 que não está presente em CLD18A1, de preferência SEQ ID NO: 21, 22, e 23, (ii) ligam-se a um epitopo localizado na voltai de CLD18A2, de preferência SEQ ID NO: 28, (iii) ligam-se a um epitopo, que engloba voltai de CLD18A2 e voltaD3 de CLD18A2, ou (iv) ligam-se a um epitopo presente em CLD18 humana e de ratinho (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respectivamente).
Em concretizações particularmente preferidas, os anticorpos do invento ligam-se a um epitopo em CLD18A2 que não está presente em CLD18A1. 36 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Os anticorpos do invento incluem anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos num animal transgénico não humano, p. ex., um ratinho transgénico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 através da sujeição a recombinação homóloga de V-D-J e mudança de isotipo. Tal animal transgénico pode também ser um coelho transgénico para produção de anticorpos policlonais tal como divulgado em US 2003/0017534.
Para que o presente invento possa ser mais facilmente compreendido, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são expostas ao longo da descrição detalhada.
DEFINIÇÃO DOS TERMOS 0 termo "CLD18" refere-se a claudina-18 e inclui quaisquer variantes, incluindo CLD18A1 e CLD18A2, conformações, isoformas e homólogos de espécie de CLD18 que sejam naturalmente expressos por células ou sejam expressos por células transf ectadas com o gene de CLD18. De preferência, "CLD18" refere-se a CLD18 humana, em particular CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) e/ou CLD18A1 (SEQ ID NOs: 7, 8), de maior preferência CLD18A2. O termo "CLD18A1" inclui variantes modificadas após a tradução, isoformas e homólogos de espécie de CLD18A1 humana que sejam expressos naturalmente por células ou sejam expressos em células transfectadas com o gene de CLD18A1. O termo "CLD18A2" inclui variantes modificadas após a tradução, isoformas e homólogos de espécie de CLD18A2 humana que sejam expressos naturalmente por células ou sejam expressos em células transfectadas com o gene de CLD18A2. O termo "variante de CLD18" deve englobar (i) variantes de processamento de CLD18, (ii) variantes de CLD18 modificadas após a tradução, particularmente incluindo variantes com diferente estados de N-glicosilação, (iii) variantes de conformação de CLD18, particularmente incluindo CLD18-conformação-1, CLD18-conformação-2 e CLD18-conformação- 37 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 3, (iv) variantes de CLD18 livres e homotipicamente/heterotipicamente associadas localizadas em junções de oclusão intercelulares, (v) variantes de CLD18 relacionadas com cancro e de CLD18 não relacionadas com cancro. 0 termo "jangada" refere-se aos microdominios membranares ricos em esfingolipidos e colesterol localizados na área do folheto externo da membrana plasmática de uma célula. A capacidade de certas proteínas para se associarem dentro de tais domínios e a sua capacidade de formação de "agregados" ou "agregados focais" podem efectuar a função das proteínas. Por exemplo, a translocação de moléculas CLD18 para tais estruturas, após serem ligadas a anticorpos do presente invento, cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo de CLD18 nas membranas plasmáticas. Tal elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo de CLD18 pode permitir a activação eficiente do sistema do complemento durante a CDC.
Os termos "conformação" e "topologia" descrevem como uma molécula membranar integral se posiciona na membrana da superfície celular, e, em particular, quais das suas regiões são extracelulares e assim elegíveis para anticorpos. CLD18 pode por exemplo existir em três conformações diferentes, que muito provavelmente dependem de se é prevalente como homómeros ou heterómeros e de se está integrada em estruturas supramoleculares de junção de oclusão ou "livre". Estes diferentes estados resultam em diferentes epitopos elegíveis para anticorpos.
De acordo com o invento, o termo "doença" refere-se a qualquer estado patológico, incluindo cancro, em particular as formas de cancro aqui descritas.
Por "tumor" entenda-se um grupo anormal de células ou tecido que cresce através de uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer após cessar o estímulo que iniciou o novo crescimento. Os tumores mostram uma falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e formam geralmente uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna ou maligna. 38 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Por "metástase" entenda-se a propagação de células de cancro a partir do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende do desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade do corpo e vasos e, em seguida, após ser transportada pelo sangue, infiltração dos órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogénese. A metástase tumoral ocorre frequentemente mesmo após a remoção do tumor primário, porque podem permanecer células ou componentes tumorais e desenvolverem potencial metastático. Numa concretização, o termo "metástase" de acordo com o invento refere-se a "metástase distante" que se refere a uma metástase remota do tumor primário e do sistema de nódulos linfáticos regionais. 0 termo "tratamento de uma doença" inclui cura, encurtamento da duração, melhoria, prevenção, abrandamento ou inibição da progressão ou agravamento, ou prevenção ou retardamento do aparecimento de uma doença ou dos sintomas desta.
De acordo com o invento, uma amostra pode ser qualquer amostra útil de acordo com o presente invento, em particular uma amostra biológica tal como uma amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e/ou uma amostra celular e pode ser obtida de um modo convencional tal como através de biopsia de tecidos, incluindo biopsia de punção, e tomada de sangue, aspirado brônquico, escarro, urina, fezes e outros fluidos corporais. De acordo com o invento, o termo "amostra biológica" inclui também fracções de amostras biológicas. 0 termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas através de ligações dissulfureto, ou uma porção de ligação ao antigénio destas. 0 termo "anticorpo" inclui também todas as formas recombinantes de anticorpos, em particular dos anticorpos aqui descritos, p. ex., anticorpos expressos em procariotas, anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos e derivados de anticorpo 39 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ de ligação ao antigénio tal como descrito abaixo. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou factores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (p. ex., células efectoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo "anticorpo humanizado" refere-se a uma molécula possuindo um local de ligação ao antigénio que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula se baseia na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação ao antigénio pode compreender domínios variáveis completos fundidos com domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação ao antigénio podem ser de tipo selvagem ou modificados através de uma ou mais substituições de aminoácidos, p. ex. modificados para se assemelharem mais a imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados conservam todas as sequências CDR (por exemplo um anticorpo de ratinho humanizado que contenha todas as seis CDR do anticorpo de ratinho). Outras formas têm uma ou mais CDR que são alteradas em relação ao anticorpo original. 0 termo "anticorpo quimérico" refere-se aqueles anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves é homóloga às 40 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe, enquanto o restante segmento da cadeia é homólogo às sequências correspondentes noutra. Tipicamente a região variável tanto das cadeias leves como das pesadas imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto as porções constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivados de outra. Uma clara vantagem para tais formas quiméricas é que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes presentemente conhecidas utilizando facilmente células B ou hibridomas disponíveis a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Enquanto a região variável tem a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não é afectada pela fonte, a região constante sendo humana, tem menor probabilidade de induzir uma resposta imunitária de um sujeito humano quando os anticorpos são injectados do que a região constante de uma fonte não humana. No entanto, a definição não está limitada a este exemplo particular. O termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação"), tal como aqui se utiliza, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antigénio. Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH; (11) fragmentos F(ab')2»· fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados através de uma ponte dissulfureto na região charneira; (iii) fragmentos Fd consistindo nos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consistem num domínio VH; (vi) regiões determinantes de complementaridade isoladas (CDR); e (vii) combinações de duas ou mais CDR isoladas que podem ser opcionalmente unidas através de um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, 41 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ sejam codificados por genes separados, eles podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, através de um ligador sintético que permite que sejam produzidos como uma única cadeia proteica em que as regiões VL e VH emparelhem para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, p. ex., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia simples estejam englobados dentro do termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Outro exemplo são proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina compreendendo (i) um polipéptido domínio de ligação que é fundido com um polipéptido região charneira de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região charneira, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. 0 polipéptido domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina são ainda divulgadas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são pesquisados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. O termo "epitopo" significa um determinante proteico capaz de se ligar a um anticorpo, em que o termo "ligação" aqui refere-se de preferência a uma ligação específica. Os epitopos consistem habitualmente em agrupamentos de superfície quimicamente activos de moléculas tais como os aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e possuem geralmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos por a ligação ao primeiro, mas não ao último se perder na presença de solventes de desnaturação. O termo "epitopo descontínuo" tal como aqui utilizado, significa um epitopo conformacional num antigénio proteico que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína. 42 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ Ο termo "molécula biespecífica" pretende incluir qualquer agente, p. ex., uma proteína, um péptido ou complexo proteico ou peptídico, que tenha duas especificidades de liqação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, e (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula efectora. 0 termo "molécula multiespecífica" ou "molécula heteroespecífica" pretende incluir qualquer agente, p. ex., uma proteína, um péptido, complexo proteico ou peptídico, que tenha mais de duas especificidade de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula efectora, e (c) pelo menos um outro componente. Consequentemente, o invento inclui, mas não está limitado a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas, e outras multiespecíficas que se dirigem a CLD18, e a outros alvos, tais como receptores de Fc em células efectoras. 0 termo "anticorpos biespecíficos" inclui também diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíf icos em que os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptídica, mas utilizando um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver p. ex., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). O invento inclui também derivados dos anticorpos aqui descritos. O termo "derivados de anticorpo" refere-se a qualquer forma modificada de um anticorpo, p. ex., um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. Tal como aqui utilizado, um anticorpo é "derivado de" uma determinada sequência da linha germinativa se o anticorpo for obtido a partir de um sistema através de imunização de um animal ou através de pesquisa de uma biblioteca de genes de imunoglobulina, e em que o anticorpo seleccionado é pelo menos 90%, de maior preferência pelo menos 95%, ainda de preferência pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos 43 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo derivado de uma determinada sequência da linha germinativa não apresentará mais de 10 diferenças de aminoácidos, de preferência não mais de 5, ou mesmo de maior preferência não mais de 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa.
Tal como aqui utilizado, o termo "heteroanticorpos" refere-se a dois ou mais anticorpos, derivados destes, ou regiões de ligação ao antigénio ligados entre si, pelo menos dois dos quais têm especificidades diferentes. Estas especificidades diferentes incluem a especificidade de ligação a um receptor de Fc numa célula efectora, e a especificidade de ligação a um antigénio ou epitopo numa célula alvo, p. ex., uma célula tumoral.
Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos humanos. 0 termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos do invento podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (p. ex., mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou através de mutação somática in vivo) . O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui se utiliza, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epitopo. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano, p. ex., ratinho, fundida com uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo recombinante", tal como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal 44 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ (ρ. ex., um ratinho) que seja transgénico ou transcromossómico em relação aos genes de imunoglobulina ou a um hibridoma preparado a partir deles, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, p. ex., a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva união de sequências génicas de imunoglobulina com outras sequências de ADN. 0 termo "transfectoma", tal como aqui utilizado, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes expressando um anticorpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetais, ou células fúngicas incluindo leveduras.
Tal como aqui utilizado, um "anticorpo heterólogo" é definido em relação a um organismo transgénico produtor de um tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de codificação de ácido nucleico correspondendo à verificada num organismo não consistindo no organismo transgénico, e sendo geralmente derivado de uma espécie diferente da do organismo transgénico.
Tal como aqui utilizado, um "anticorpo hetero-híbrido" refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas com origem em diferentes organismos. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murideo é um anticorpo hetero-hibrido.
Os anticorpos aqui descritos são de preferência isolados. Um "anticorpo isolado" tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigénicas (p. ex., um anticorpo isolado que se liga especificamente a CLD18 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios diferentes de CLD18). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, uma isoforma ou variante de CLD18 humana pode, no entanto, ter reactividade cruzada com 45 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ outros antigénios aparentados, p. ex., de outras espécies (p. ex., homólogos específicos de CLD18). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos. Numa concretização do invento, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" refere-se a anticorpos possuindo diferentes especificidades e sendo combinados numa composição bem definida.
De acordo com o invento, o termo "ligação" refere-se de preferência a "ligação específica". Tal como aqui utilizado, "ligação específica" refere-se à ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade correspondendo a uma KD de cerca de lxlO”7 M ou menos, e liga-se ao antigénio predeterminado com uma afinidade correspondendo a uma KD que é pelo menos duas ordens de grandeza inferior à sua afinidade para ligação a um antigénio não específico (p. ex., BSA, caseína) além do antigénio predeterminado ou um antigénio intimamente aparentado. 0 termo "KD" (M) , tal como aqui utilizado, pretende referir a constante de dissociação em equilíbrio de uma determinada interacção anticorpo-antigénio.
Tal como aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe do anticorpo (p. ex., IgM ou IgGl) que é codificada por genes da região constante da cadeia pesada.
Tal como aqui utilizado, "mudança de isotipo" refere-se ao fenómeno através do qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig. 0 termo "de ocorrência natural" tal como aqui utilizado aplicado a um objecto refere-se ao facto de um objecto poder ser verificado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que esteja presente num organismo (incluindo vírus) que possa ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório, é de ocorrência natural. 46 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ Ο termo "rearranjado" tal como aqui utilizado refere-se a uma configuração de um locus de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação codificando essencialmente um domínio VH ou VL completo, respectivamente. Um locus de um gene de imunoglobulina (anticorpo) rearranjado pode ser identificado através de comparação com o ADN da linha germinativa; um locus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia heptâmero/nonâmero recombinado. 0 termo "não rearranjado" ou "configuração da linha germinativa" tal como aqui utilizado em referência a um segmento V refere-se à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J. 0 termo "molécula de ácido nucleico", tal como aqui utilizado, pretende incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é ADN de cadeia dupla.
Os ácidos nucleicos descritos de acordo com o invento foram, de preferência, isolados. 0 termo "ácido nucleico isolado" significa de acordo com o invento que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo através de reacção em cadeia da polimerase (PCR), (i i) produzido de forma recombinante através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo através de clivagem e fraccionamento por electroforese em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, através de síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação através de técnicas de ADN recombinante.
Os ácidos nucleicos podem, de acordo com o invento, estar presentes sozinhos ou em combinação com outros ácidos nucleicos, que podem ser homólogos ou heterólogos. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controlo da expressão que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao referido ácido nucleico. 0 termo "homólogo" significa que um ácido nucleico está também funcionalmente ligado naturalmente à 47 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ sequência de controlo da expressão e o termo "heterólogo" significa que um ácido nucleico não está funcionalmente ligado naturalmente à sequência de controlo expressão.
Um ácido nucleico, tal como um ácido nucleico expressando ARN e/ou proteína ou péptido, e uma sequência de controlo da expressão estão "funcionalmente" ligados um ao outro, se estiverem covalentemente ligados um ao outro de modo a que a expressão ou transcrição do referido ácido nucleico esteja sob o controlo ou sob a influência da referida sequência de controlo da expressão. Se o ácido nucleico for para se traduzir numa proteína funcional, então, com uma sequência de controlo da expressão funcionalmente ligada a uma sequência de codificação, a indução da referida sequência de controlo da expressão resulta em transcrição do referido ácido nucleico, sem causar uma mudança de enquadramento na sequência de codificação ou que a referida sequência de codificação não seja capaz de ser traduzida na proteína ou no péptido desejado. 0 termo "sequência de controlo da expressão" compreende de acordo com o invento, promotores, locais de ligação ao ribossoma, estimuladores e outros elementos de controlo que regulam a transcrição de um gene ou a tradução de um ARNm. Em concretizações particulares do invento, as sequências de controlo da expressão podem ser reguladas. A estrutura exacta das sequências de controlo da expressão pode variar em função da espécie ou do tipo celular, mas geralmente compreende sequências 5'-não transcritas e 5'- e 3'-não traduzidas que estão envolvidas na iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, tal como caixa TATA, sequência de protecção, e sequência CAAT. Mais especificamente, as sequências de controlo da expressão 5'-não transcritas compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controlo da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligado. As sequências de controlo da expressão podem também compreender sequências estimuladoras ou sequências activadoras a montante.
De acordo com o invento, o termo "promotor" ou "região promotora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que está localizada a montante (5') da sequência de ácido 48 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ nucleico a expressar e controla a expressão da sequência ao proporcionar um local de reconhecimento e local de ligação para ARN-polimerase. A "região promotora" pode incluir mais locais de reconhecimento e ligação para outros factores que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser "indutível" e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser "constitutivo" se a transcrição não for controlada através de um agente indutor. Um gene que está sob o controlo de um promotor indutível não é expresso ou é apenas expresso numa pequena extensão se estiver ausente um agente indutor. Na presença do agente indutor o gene é ligado ou o nível de transcrição é aumentado. Isto é mediado, em geral, pela ligação de um factor de transcrição específico.
Promotores que são preferidos acordo com o invento incluem promotores para a polimerase SP6, T3 e T7, promotor do ARN U6 humano, promotor de CMV e promotores híbridos artificiais destes (p. ex. CMV) onde uma parte ou partes são fundidas com uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares tais como p. ex. GAPDH humana (gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase), e incluindo ou não incluindo um ou mais intrões adicionais.
De acordo com o invento, o termo "expressão" é utilizado no seu sentido mais geral e compreende a produção de ARN ou de ARN e proteína/péptido. Compreende também a expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser realizada transientemente ou estavelmente.
Numa concretização preferida, uma molécula de ácido nucleico está, de acordo com o invento, presente num vector, quando apropriado com um promotor, que controla a expressão do ácido nucleico. 0 termo "vector" é aqui utilizado no seu sentido mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucleico que permite que o referido ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procarióticas e/ou eucarióticas e, quando apropriado, seja integrado num genoma. Vectores deste tipo são de preferência replicados e/ou expressos nas células. Os vectores compreendem plasmídeos, fagomídeos, bacteriófagos ou 49 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ genomas virais. 0 termo "plasmideo" tal como aqui utilizado refere-se geralmente a uma construção de material genético extracromossómico, habitualmente um dúplex de ADN circular, que se pode replicar independentemente do ADN cromossómico.
Como vector para expressão de um anticorpo, pode ser utilizado um tipo de vector em que a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo estão presentes em diferentes vectores ou um tipo de vector em que a cadeia pesada e a cadeia leve estão presentes no mesmo vector. 0 ensinamento aqui dado em relação a sequências de ácido nucleico e de aminoácidos especificas, p. ex. aquelas mostradas na listagem de sequências, deve ser entendido como se relacionando também a modificações das referidas sequências especificas resultando em sequências que sejam funcionalmente equivalentes às referidas sequências especificas, p. ex. sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou semelhantes às da sequências de aminoácidos especificas e sequências de ácido nucleico codificando as sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou semelhantes às das sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico especificas. Uma propriedade importante é reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo ou manter funções efectoras de um anticorpo. De preferência, uma sequência modificada em relação a uma sequência especifica, quando substitui a sequência específica num anticorpo mantém a ligação do referido anticorpo a CLD18 e de preferência as funções do referido anticorpo tal como aqui descritas, p. ex. lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.
Será apreciado pelos peritos na técnica que em particular as sequências da CDR, regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade para se ligarem a CLD18. Por exemplo, as regiões CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões aqui especificadas. Por "altamente homólogo" está contemplado que de 1 a 5, de preferência de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas nas CDR. Além disso, as regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas de 50 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ modo a que mostrem substancial homologia com as regiões especificamente aqui divulgadas.
Deve entender-se que os ácidos nucleicos específicos aqui descritos incluem também ácidos nucleicos modificados por razões de optimização da utilização de codões numa determinada célula hospedeira ou organismo. Diferenças na utilização de codões entre os organismos podem levar a uma variedade de problemas em relação à expressão de genes heterólogos. A optimização de codões através da mudança de um ou mais nucleótidos da sequência original pode resultar numa optimização da expressão de um ácido nucleico, em particular na optimização da eficácia de tradução, num hospedeiro homólogo ou heterólogo no qual se pretende expressar o referido ácido nucleico. Por exemplo se forem utilizados ácidos nucleicos derivados de humano e codificando regiões constantes e/ou regiões estruturais de anticorpos de acordo com o presente invento, p. ex. para preparação de anticorpos quiméricos ou humanizados, pode ser preferido modificar os referidos ácidos nucleicos por razões de optimização da utilização de codões, em particular se os referidos ácidos nucleicos, opcionalmente fundidos com ácidos nucleicos heterólogos tais como ácidos nucleicos derivados de outros organismos tal como aqui descrito, forem para ser expressos em células de um organismo diferente de um ser humano tal como um ratinho ou hamster. Por exemplo, as sequências de ácido nucleico codificando as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas tais como aquelas de acordo com SEQ ID NOs: 40 e 45, respectivamente, podem ser modificadas para incluir uma ou mais, de preferência, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e de preferência até 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ou 100 ou mais substituições de nucleótidos resultando numa utilização optimizada de codões mas não resultando numa mudança da sequência de aminoácidos. Tais substituições de aminoácidos referem-se de preferência a substituições de nucleótidos em SEQ ID Nos: 40 e 45, respectivamente, seleccionadas a partir das substituições mostradas no seguinte alinhamento de SEQ ID Nos: 40 e 45, respectivamente, com os seus equivalentes modificados e não resultando numa mudança na sequência de aminoácidos codificada ou referem-se às substituições correspondentes em posições correspondentes noutras sequências de ácido nucleico codificando as regiões 51 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respectivamente. De preferência, todas as substituições mostradas nos seguintes alinhamentos de SEQ ID Nos: 40 e 45, respectivamente, com os seus equivalentes modificados a não resultar numa mudança na sequência de aminoácidos codificada, são realizadas em sequências de ácido nucleico codificando regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respectivamente.
Alinhamento de SEQ ID No:40 e SEQ ID No:147: CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT 6 0
III11111111 II II II lllllllllll II II llllll INI II CGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCC 60 GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG 120
IMI III II llllllllllllll llllllll III I llllllll II III GGCACCGCCAGGGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAG 120 TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC 180 ί 111111111 I llllllll II II III lllllllll MIM lllllllll TGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGC AACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGAC 180 AGC AAGGAC AGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAG 240 I ί ί i ί ί 11 i i i i i I i M i i i i ii i i i i i i i i i iIi i i i i i M i i i i i i 11 i i I i AGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAG 240 AAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG 300
II lllll II lllllllllll II lllll lllllllll I lllll II III AAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG 300 AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 324
llllllllllllll lllll III
AGCTTCAACAGGGGCGAGTGCTAG 324 52 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Alinhamento de SEQ ID No:45 e SEQ ID No:149: GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC
ΝΙΝΙ II llllllfllll III I llllllllll II llllllll III
GGCCCAAGCGTGTTCCCCCTGGCCCGCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCC
CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC
llllllllllllll IIIIIIIIIIMIIIII II MIM III llllll II
CTGGGÇTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGA
GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC IIIII MM IIIIMIIIMMIMM II II II III I II II III I..
GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGC
CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
II 111111111111111111111 1111111 1111111111111II111111111II
CTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC
lllll 1111111II11111111II111111111111 III llllllll II III
GTGÁACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC aaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttc
II II lllll lllll II llllllll II II II lllll lllll II III aagacccacacctgccccccctgcccagccccagagctgctgggcggacccagcgtgttc ctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc
II IIIIIIII II 1111 Μ 11111III llllll I MM III lllll II III ctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgc gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggc
11111111111111111111111 lllll lllll II MM IIII MM lllll IIIII 60 60 120 120 180 180 240 240 300 300 360 360 420 420 480 gtggtggtggacgtgagccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggc 480 53 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 54 0 540 600 600 660 660 720 720 780 780 840 840 900 900 960 960
GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT
ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ II ΙΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ I INI IIΙΜΜΙΙΙΙΙΙΙII III I
GTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGG
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
ΙΙΙΙΙ III II ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙIIII ΙΙΙΙΙΙΙΙ IIIIIIIII
GTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG ΙΜΜΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙ ΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙΙ III ΙΙΙΙΙ .11
AAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGC
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC ΙΙΙΙΙ II Μ II 111111111II1111II111 ΙΙΙΙΙ! III 11111111111
CAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC
CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG ΙΙΙΙΙ IIIIIIIII ΙΙΙΙΙ II ΙΙΙΙΙΙΙΙ IIIIIIIIIIIIIIIIIIIΙΙΙΙΙ
CAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG
GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGÀC
GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC
GGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAAC
GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC GTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 981 AGCCTGAGCCCCGGCAAGTAG 981
Além disso, pode ser desejado, de acordo com o presente invento, modificar a sequência de aminoácidos aqui descrita, em particular as das reqiões constantes de cadeias pesadas humanas para adaptar a sequência a um alotipo desejado, p. ex. um alotipo verificado na população Caucasiana. Tais modificações são de preferência seleccionadas a partir do qrupo que consiste nas sequintes substituições de aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 46 ou nas posições correspondentes dentro de outras reqiões constantes de cadeias pesadas humanas: K93R, D235E, e L237M. De preferência, todas estas modificações estão incluidas nas sequências de aminoácidos das reqiões constantes de cadeias pesadas humanas. 54 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
De acordo com o invento, o termo "posições correspondentes" refere-se a nucleótidos ou residuos de aminoácidos que num alinhamento de sequências de duas sequências de aminoácidos ou proteicas são alinhadas uma com a outra.
De preferência, o grau de identidade entre a sequência de ácido nucleico especifica aqui descrita e a sequência de ácido nucleico que é modificada em relação à referida sequência de ácido nucleico especifica será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, de maior preferência pelo menos 80%, ainda de preferência pelo menos 90% ou ainda de maior preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. De preferência, as duas sequências são capazes de hibridar e formar um duplex estável uma com a outra, com a hibridação a ser de preferência realizada sob condições que permitam hibridação especifica entre polinucleótidos (condições rigorosas). As condições rigorosas são descritas, por exemplo, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", J. Sambrook et ai., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel et ai., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York e referem-se, por exemplo, à hibridação a 65°C em tampão de hibridação (SSC 3,5x, Ficoll a 0,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina de soro bovino a 0,02%, Na^PCq 2,5 mM (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM) . SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridação, a membrana para a qual o ADN foi transferido é lavada, por exemplo, em SSC 2x à temperatura ambiente e depois em SSC 0,l-0,5x/SDS 0,lx a temperaturas de até 68°C.
De preferência, o grau de semelhança, de preferência de identidade entre a sequência de aminoácidos especifica aqui descrita e uma sequência de aminoácidos que é modificada em relação à referida sequência de aminoácidos especifica tal como entre a sequência de aminoácidos mostrando substancial homologia será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, de maior preferência pelo menos 90% ou ainda de preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. 55 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Todas as sequências modificadas acima descritas estão dentro do âmbito do presente invento. "Semelhança de sequência" indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. "Identidade de sequência" entre duas sequências polipeptidicas ou de ácido nucleico indica a percentagem de aminoácidos ou nucleótidos gue são idênticos entre as seguências. A "percentagem de identidade" é obtida após o melhor alinhamento, sendo esta percentagem meramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. As comparações de seguências entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos são convencionalmente realizadas por comparação destas sequências, depois de serem alinhadas de forma óptima, sendo a referida comparação realizada por segmento ou por "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança das sequências. 0 alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman de 1981, Ads App. Math. 2: 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, por meio do método de pesquisa de semelhanças de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444, ou por meio de programas de computador que utilizem estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). A percentagem de identidade é calcula através da determinação do número de posições idênticas entre as duas sequências a comparar, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter-se a percentagem de identidade entre estas duas sequências. "Substituições conservativas" podem ser feitas, por exemplo, com base na semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na 56 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ natureza antipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo: (a) aminoácidos não polares (hidrófobos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina; (b) aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; (c) aminoácidos com carga positiva (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e (d) aminoácidos com carga negativa (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. As substituições podem ser feitas tipicamente dentro dos grupos (a)-(d). Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas uma pela outra com base na sua capacidade para perturbar [alfa]-hélices. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, L e I. Dado o código genético conhecido, e as técnicas de ADN sintético e recombinante, o cientista especializado pode facilmente construir ADN que codifiquem as variantes de aminoácidos conservativas. 0 presente invento compreende anticorpos em que foram feitas alterações na região Fc para mudar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar numa diminuição ou num aumento da ligação de Clq e CDC ou da ligação de FcyR e ADCC. As substituições podem, por exemplo, ser feitas num ou mais dos resíduos de aminoácidos da região constante de cadeia pesada, causando assim uma alteração numa função efectora enquanto mantém a capacidade de se ligar ao antigénio, em comparação com o anticorpo modificado, cf. US 5624821 e US 5648260. A semivida in vivo dos anticorpos pode ser melhorada através da modificação do epitopo do receptor de salvamento do domínio constante de Ig ou de um domínio constante semelhante a Ig, de modo a que a molécula não compreenda um domínio CH2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6121022 e US 6194551. A semivida in vivo pode além disso ser aumentada através da produção de mutações na região Fc, p. ex., através da substituição de leucina por treonina na posição 252, através da substituição de serina por treonina na posição 254, ou através da substituição de fenilalanina por treonina na posição 256, cf. US 6277375. 57 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Além disso, ο padrão de glicosilação dos anticorpos pode ser modificado para mudar a função efectora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos num transfectoma que não adicione a unidade de fucose normalmente ligada a Asn na posição 297 da região Fc para aumentar a afinidade da região Fc para receptores de Fc que, por sua vez, resultará numa maior ADCC dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et ai. (2002) JBC, 277: 26733. Além disso, pode ser feita modificação da galactosilação para modificar a CDC.
Alternativamente, noutra concretização, podem ser introduzidas mutações aleatoriamente ao longo de toda a sequência de codificação do anticorpo anti-CLD18, tal como através de mutagénese de saturação, e os anticorpos anti-CLD18 modificados resultantes podem ser pesquisados quanto à actividade de ligação. O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como aqui utilizado, pretende referir-se a uma célula na qual foi introduzido um vector de expressão recombinante. Deve ser entendido que tais termos se destinam a referir-se não só à célula sujeita em particular como também à descendência de tal célula. Como podem ocorrer certas modificações nas gerações que se sucedem, devido a mutação ou a influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula parental, mas está ainda incluída no âmbito do termo "célula hospedeira", tal como aqui utilizado. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0 e células linfocíticas.
Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" compreende qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
0 termo "animal transgénico" refere-se a um animal possuindo um genoma compreendendo um ou mais transgenes e de preferência transgenes de cadeia pesada e/ou leve, ou transcromossomas (integrados ou não integrados no ADN 58 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ genómico natural do animal) e que é de preferência capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um ratinho transgénico pode ter um transgene da cadeia leve humana e um transgene da cadeia pesada humana ou um transcromossoma da cadeia pesada humana, de modo a que o ratinho produza anticorpos anti-CLD18 humanos quando imunizado com antigénio CLD18 e/ou células expressando CLD18. 0 transgene da cadeia pesada humana pode ser integrado no ADN cromossómico do ratinho, como é o caso para ratinhos transgénicos, p. ex., ratinhos HuMAb, tais como ratinhos HCo7 ou HCol2, ou o transgene da cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para ratinhos transcromossómicos (p. ex., KM) tal como descrito em WO 02/43478. Tais ratinhos transgénicos e transcromossómicos podem ser capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 (p. ex., IgG, IgA e/ou IgE) sofrendo recombinação de V-D-J e mudança de isotipo.
Mecanismos de acção de mAb
Embora a seguir se proporcionem considerações sobre o mecanismo subjacente à eficácia terapêutica dos anticorpos do invento, não deve ser considerada como de modo algum limitante do invento.
Os anticorpos aqui descritos interagem de preferência com componentes do sistema imunitário, de preferência através de ADCC ou CDC. Os anticorpos do invento podem também ser utilizados para direccionar cargas (p. ex., isótopos radioactivos, fármacos ou toxinas) para matar directamente células tumorais ou podem ser utilizados sinergicamente com agentes quimioterapêuticos tradicionais, atacando os tumores através de mecanismos de acção complementares, que podem incluir respostas imunitárias anti-tumorais que possam ter sido comprometidas devido a efeitos secundários citotóxicos dos quimioterapêuticos sobre os linfócitos T.
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos. A ADCC descreve a capacidade das células efectoras para matar células, tal como aqui descrito, em particular linfócitos, o que requer, de preferência, que a célula alvo seja marcada por um anticorpo. 59 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ A ADCC ocorre de preferência quando os anticorpos se ligam a antigénios em células tumorais e os domínios Fc do anticorpo envolvem receptores de Fc (FcR) à superfície de células imunitárias efectoras. Várias famílias de receptores de Fc foram identificadas e populações celulares especificas expressam caracteristicamente receptores de Fc definidos. A ADCC pode ser vista como um mecanismo para induzir directamente um grau variável de destruição imediata de tumores que conduz a apresentação do antigénio e à indução de respostas de células T dirigidas a tumores. De preferência, a indução in vivo de ADCC conduzirá a respostas de células T dirigidas a tumores e respostas de anticorpos derivadas do hospedeiro.
Citotoxicidade dependente do complemento. A CDC é outro método de matar células que pode ser dirigido por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para a activação do complemento. IgGl e IgG3 são também muito eficazes no direccionamento de CDC através da via clássica de activação do complemento. De preferência, nesta cascata, a formação de complexos antigénio-anticorpo resulta no desvelamento de múltiplos locais de ligação a Clq em estreita proximidade nos domínios Ch2 das moléculas de anticorpo participantes, tais como moléculas de IgG (Clq é um dos três subcomponentes do complemento Cl) . De preferência, estes locais de ligação a Clq desvelados convertem a interacção Clq-IgG anteriormente de baixa afinidade numa de elevada avidez, que desencadeia uma cascata de eventos envolvendo uma série de outras proteínas do complemento e conduz à libertação proteolítica dos agentes quimiotácticos/de activação de células efectoras C3a e C5a. De preferência, a cascata do complemento termina na formação de um complexo de ataque da membrana que cria poros na membrana celular que facilitam a passagem livre de água e de solutos para dentro e para fora da célula.
Produção de anticorpos
Os anticorpos do invento podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, p. ex., a técnica padrão de hibridação de células somáticas de Kohler e Milstein, Nature 60 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 256: 495 (1975). Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridação de células somáticas, em principio outras técnicas para produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues, p. ex., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B ou técnicas de apresentação fágica utilizando bibliotecas de genes de anticorpos. 0 sistema animal preferido para preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é o sistema de murideo. A produção de hibridomas no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e as técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (p. ex., células de mieloma de murideo) e os procedimentos de fusão são também conhecidos.
Outros sistemas animais preferidos para preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais são o sistema de rato e coelho (p. ex., descrito em Spieker-Polet et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 9348 (1995), ver também Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Ainda numa outra concretização preferida, anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CLD18 pode ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos possuindo partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos conhecidos como ratinhos HuMAb e ratinhos KM, respectivamente, e são colectivamente aqui referidos como "ratinhos transgénicos". A produção de anticorpos humanos em tais ratinhos transgénicos pode ser realizada tal como descrito em detalhe para CD20 em W02004/035607.
No entanto, uma outra estratégia para a produção de anticorpos monoclonais é isolar directamente genes codificando anticorpos a partir de linfócitos que produzam anticorpos de estratégia definida, p. ex. ver Babcock et al., 1996; "A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy". Para detalhes de engenharia de anticorpos recombinantes ver também Welschof e Kraus, "Recombinant 61 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ antibodies for câncer therapy" ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Lo "Antibody Engineering" ISBN 1-58829-092-1.
Imunizações
Para gerar anticorpos para CLD18, os ratinhos podem ser imunizados com péptidos conjugados com transportador derivados da sequência de CLD18, uma preparação enriquecida em antigénio CLD18 expresso de forma recombinante ou fragmentos deste e/ou células expressando CLD18, tal como descrito. Alternativamente, os ratinhos podem ser imunizados com ADN codificando CLD18 humana inteira (p. ex. SEQ ID NO: 1) ou fragmentos desta, em particular os de SEQ ID Nos: 15, 17, e 19. No caso das imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida em antigénio CLD18 não resultarem em anticorpos, os ratinhos podem também ser imunizados com células expressando CLD18, p. ex., uma linha celular, para promover respostas imunitárias. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma e soro obtidas através de sangrias da veia caudal ou retro-orbitais. Os ratinhos com títulos de imunoglobulina anti-CLD18 suficientes podem ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados por via intraperitoneal ou intravenosa com células expressando CLD18 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas segregando anticorpos específicos.
Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais para CLD18, esplenócitos e células dos nódulos linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linha celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem então ser pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Poços individuais podem então ser pesquisados através de ELISA quanto a hibridomas secretores de anticorpos. Através de análise de imunofluorescência e FACS utilizando células expressando 62 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ CLD18, podem ser identificados anticorpos com especificidade para CLD18. Os hibridomas segregando anticorpos podem ser replaqueados, novamente pesquisados, e se ainda forem positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.
Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos do invento podem também ser produzidos num transfectoma de células hospedeiras utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de genes, como são bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por exemplo, numa concretização, o gene ou os genes de interesse, p. ex., genes de anticorpos, podem ser ligados num vector de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariótica tal como usado pelo sistema de expressão de genes GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpos clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas como células derivadas de plantas, células fúngicas ou de levedura. O método utilizado para introduzir estes genes pode ser métodos descritos na técnica, tais como electroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução destes genes de anticorpo em células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e seleccionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados pelo seu nível de expressão e aumentados em escala para produzir anticorpos. Anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes e/ou células de cultura. Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressos noutros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, p. ex. E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais 63 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ transgénicos não humanos, tais como em leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgénicas; ver p. ex. Verma, R., et ai. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Utilização de Sequências de Anticorpos Parciais para Expressar Anticorpos Intactos (i.e. humanização e quimerização). a) Quimerização
Os anticorpos monoclonais de murideo podem ser utilizados como anticorpos terapêuticos em seres humanos quando marcados com toxinas ou isótopos radioactivos. Os anticorpos de murideo não marcados são altamente imunogénicos no homem quando são aplicados repetitivamente conduzindo à redução do efeito terapêutico. A imunogenicidade principal é mediada pelas regiões constantes das cadeias pesadas. A imunogenicidade de anticorpos de murideo no homem pode ser reduzida ou completamente evitada se os respectivos anticorpos forem tornados quiméricos ou humanizados. Os anticorpos quiméricos são anticorpos cujas diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles possuindo uma região variável derivada de um anticorpo de murideo e uma região constante de uma imunoglobulina humana. A quimerização de anticorpos é alcançada através da união das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpo de murideo com a região constante da cadeia pesada e leve humana (p. ex. tal como descrito por Kraus et al., em "Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for câncer therapy" ISBN-0-89603-918-8). Numa concretização preferida, os anticorpos quiméricos são gerados através da união da região constante de cadeia leve capa humana à região variável da cadeia leve de murideo. Numa concretização também preferida, os anticorpos quiméricos podem ser gerados através da união da região constante da cadeia leve lambda humana com a região variável da cadeia leve de murideo. As regiões constantes das cadeias pesadas preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgGl, IgG3 e IgG4. Outras regiões constantes das cadeias pesadas 64 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ preferidas para geração de anticorpos quiméricos sao IgG2, IgA, IgD e IgM. b) Humanização
Os anticorpos interagem com antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que se localizam nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) das cadeias pesadas e leves. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDR são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDR. Como as sequências das CDR são responsáveis pela maior parte das interacções anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades dos anticorpos de ocorrência natural específicos através da construção de vectores de expressão que incluam sequências CDR dos anticorpos de ocorrência natural específicos enxertadas em sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, p. ex.,
Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; e Queen, C. et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033). Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de ADN públicas que incluem sequências génicas de anticorpos da linha germinativa. Estas sequências da linha germinativa diferirão das sequências génicas de anticorpos maduros porque não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados pela união de V (D) J durante a maturação das células B. As sequências génicas da linha germinativa diferirão também das sequências de um anticorpo de repertório secundário de elevada afinidade no indivíduo uniformemente em toda a região variável. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente pouco frequentes na porção amino-terminal da região estrutural 1 e na porção carboxi-terminal da região estrutural 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter toda a sequência de ADN de um determinado anticorpo para recrear um anticorpo recombinante intacto possuindo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (ver WO 99/45962). Sequências das cadeias pesadas e leves parciais abrangendo as regiões CDR são tipicamente suficientes para 65 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ este fim. A sequência parcial é utilizada para determinar que variável da linha germinativa e segmentos génicos de união contribuíram para os genes variáveis do anticorpo recombinado. A sequência da linha germinativa é então utilizada para preencher as porções em falta das regiões variáveis. As sequências líder das cadeias pesadas e leves são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar sequências em falta, sequências de ADNc clonadas podem ser combinadas com oligonucleótidos sintéticos através de ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleótidos curtos, sobreponiveis, e combinados através de amplificação por PCR para criar um clone da região variável inteiramente sintético. Este processo tem certas vantagens tal como a eliminação ou inclusão de determinados locais de restrição, ou a optimização de determinados codões.
As sequências nucleotídicas de transcritos das cadeias pesadas e leves de hibridomas são utilizadas para desenhar um conjunto sobreponível de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às das sequências naturais. As sequências sintéticas das cadeias pesadas e capa podem diferir das sequências naturais de três formas: cadeias de bases nucleotídicas repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleótidos e a amplificação por PCR; locais de iniciação da tradução óptimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870) e locais HindIII são concebidos a montante dos locais de iniciação da tradução.
Tanto para as regiões variáveis das cadeias pesadas como das leves, as sequências de cadeias de codificação optimizadas e as correspondentes de não codificação são quebradas em aproximadamente 30-50 nucleótidos no ponto médio do correspondente oligonucleótido não codificador. Assim, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser montados em conjuntos de cadeias duplas sobreponiveis que abrangem segmentos de 150-400 nucleótidos. Os bancos são então utilizados como moldes para produzir produtos de amplificação por PCR de 150-400 nucleótidos. Tipicamente, um único 66 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ conjunto de oligonucleótidos da região variável será quebrado em dois bancos que são amplificados separadamente para gerar dois produtos de PCR sobreponiveis. Estes produtos sobreponiveis são então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Pode também ser desejável incluir um fragmento sobreponivel da região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve na amplificação por PCR para gerar fragmentos que possam ser facilmente clonados nas construções do vector de expressão.
As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves reconstruídas tornadas quiméricas ou humanizadas são então combinadas com sequências clonadas de promotor, líder, iniciação da tradução, região constante, 3'-não traduzida, poliadenilação, e terminação da transcrição para formar as construções do vector de expressão. As construções de expressão das cadeias pesadas e leves podem ser combinadas num único vector, co-transfectadas, transfectadas em série, ou transfectadas separadamente em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira expressando ambas as cadeias. Os plasmídeos para utilização na construção de vectores de expressão para IgGx humana são descritos abaixo. Os plasmídeos foram construídos para as sequências de ADNc da cadeia pesada V e leve capa V amplificadas por PCR pudessem ser utilizadas para reconstruir minigenes das cadeias pesadas e leves completas. Estes plasmídeos podem ser utilizados para expressar completamente anticorpos IgGl, Capa ou IgG4, Capa humanos ou quiméricos. Plasmídeos semelhantes podem ser construídos para expressão de outros isotipos da cadeia pesada, ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeias leves lambda.
Assim, noutro aspecto do invento, as características estruturais dos anticorpos anti-CLD18 do invento, são utilizadas para criar anticorpos anti-CLD18 humanizados estruturalmente relacionados que mantenham pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos do invento, tal como a ligação a CLD18. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de anticorpos monoclonais de ratinho podem ser combinadas de forma recombinante com regiões estruturais e CDR humanas conhecidas para criar mais anticorpos anti-CLD18 humanizados concebidos de forma recombinante do invento. 67 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Ligação a células que expressam o antigénio A capacidade do anticorpo para se ligar a CLD18 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, tal como os expostos nos exemplos (p. ex., ELISA, Western blot, análise de Imunofluorescência e citometria de fluxo)
Caracterização da ligação dos anticorpos
Para purificar anticorpos anti-CLD18, hibridomas seleccionados podem ser cultivados em frascos rotativos de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Alternativamente, os anticorpos anti-CLD18 podem ser produzidos em biorreactores baseados em diálise. Os sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteina G-Sepharose ou proteina A-sepharose. A IgG eluida pode ser verificada através de electroforese em gel e cromatografia liquida de alta resolução para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CLD18 seleccionados se ligam a epitopos únicos, pode ser utilizada mutagénese dirigida ao local ou a múltiplos locais.
Determinação do isotipo
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, podem ser efectuados ELISA do isotipo com vários estojos comerciais (p. ex. Zymed, Roche Diagnostics). Os poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com Ig anti-ratinho. Após o bloqueio, as placas são feitas reagir com anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo purificados, à temperatura ambiente durante duas horas. Os poços podem em seguida ser feitos reagir com IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3, IgA de ratinho ou sondas conjugadas com peroxidase especificas de IgM de ratinho. Após lavagem, as placas podem ser reveladas com substrato ABTS (1 mg/ml) e analisadas a uma DO de 405- 68 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 650. Alternativamente, pode ser utilizado o IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No. 1493027) tal como descrito pelo fabricante.
Análise de citometria de fluxo
Para demonstrar a presença de anticorpos anti-CLD18 em soros de ratinhos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas expressando CLD18, pode ser utilizada citometria de fluxo. As linhas celulares expressando naturalmente ou após transfecção CLD18 e controlos negativos sem expressão de CLD18 (criados sob condições de crescimento padrão) podem ser misturados com várias concentrações de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo FBS a 1%, e podem ser incubadas a 4°C durante 30 min. Após lavagem, o anticorpo anti-IgG marcado com APC ou Alexa647 pode ligar-se ao anticorpo monoclonal ligado a CLD18 sob as mesmas condições que a coloração de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas através de citometria de fluxo com um instrumento FACS utilizando propriedades de luz e dispersão lateral para apanhar células vivas individuais. Para distinguir os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 de ligadores não específicos numa única medição, pode ser empregue o método de co-transfecção. As células transfectadas transientemente com plasmídeos codificando CLD18 e um marcador fluorescente podem ser coradas, como descrito acima. As células transfectadas podem ser detectadas num canal de fluorescência diferente do das células coradas por anticorpos. Como a maioria das células transfectadas expressa ambos os transgenes, os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 ligam-se de preferência a células expressando um marcador fluorescente, enquanto os anticorpos não específicos se ligam numa razão comparável a células não transfectadas. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado para além de, ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exactamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.
As proteínas de junções de oclusão tendem a ser internalizadas, se o contacto célula-célula com células 69 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ vizinhas particularmente aderentes se perder por p. ex. destacamento das células. A expressão à superfície celular de CLD18 pode ser optimizada através de a) ajuste das condições de cultura, p. ex. cultivando numa densidade celular mais elevada de um modo padronizado, utilizando destacamento suave (p. ex. EDTA 2 mM/PBS ou acutase), processamento à temperatura ambiente, e adição de inibidores de endocitose (p. ex. azida de sódio) ou activadores da transcrição ou tradução de CLD18, e através de b) selecção e clonagem de células mantendo CLD18 a níveis elevados na superfície celular, p. ex. através de selecção com antibióticos em termos de células transfectadas, através de separação de células imunomagnética ou por FACS, e através de clonagem por diluição limitada.
Microscopia de imunofluorescência
Para demonstrar a presença de anticorpos anti-CLD18 em soros de ratinhos imunizados ou ligação de anticorpos monoclonais a células vivas expressando CLD18, pode ser utilizada análise de microscopia de imunofluorescência. Por exemplo, as linhas celulares expressando, espontaneamente ou após transfecção, CLD18 e controlos negativos sem expressão de CLD18 são criadas em lâminas de câmaras sob condições de crescimento padrão em meio DMEM/F12, suplementado com soro fetal de vitelo a 10% (FCS), L-glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. Células podem então ser fixadas com metanol ou paraformaldeído ou deixadas sem tratamento. As células podem então ser feitas reagir com anticorpos monoclonais contra CLD18 durante 30 min. a 25°C. Após lavagem, as células podem reagir com um anticorpo secundário anti-IgG de ratinho marcado com Alexa555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem então ser examinadas através de microscopia de fluorescência.
Os níveis totais de CLD18 nas células podem ser observados quando as células são fixadas em metanol ou fixadas em paraformaldeído e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e células fixadas em paraformaldeído não permeabilizadas, a localização à superfície de CLD18 pode ser examinada. Adicionalmente, o direccionamento de CLD18 em junções de oclusão pode ser analisado através de co-coloração 70 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ com marcadores de junções de oclusão tais como ZO-1. Além disso, os efeitos da ligação de anticorpo e localização de CLD18 dentro da membrana celular podem ser examinados.
Western Blot A IgG anti-CLD18 pode ser ainda testada quanto à reactividade com antigénio CLD18 através de Western Blotting. Resumidamente, extractos celulares de células expressando CLD18 e controlos negativos adequados podem ser preparados e sujeitos a electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS). Após electroforese, os antigénios separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados, e sondados com os anticorpos monoclonais a testar. A ligação de IgG pode ser detectada utilizando anti-IgG de ratinho-peroxidase e revelada com substrato ECL.
Imuno-histoquímica
Os IgG de ratinho anti-CLD18 podem ainda ser testados quanto à reactividade com antigénio CLD18 através de imuno-histoquímica de um modo bem conhecido do perito, p. ex. utilizando crio-secções fixadas em paraformaldeído ou acetona ou secções de tecido impregnadas em parafina fixadas com paraformaldeído de amostras de tecido não canceroso ou tecido de cancro obtidas de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de ratinhos portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas celulares expressando espontaneamente (p. ex. DAN-G, SNU-16, ou KATO-III) ou após transfecção (p. ex. HEK293), CLD18. Para imunocoloração, anticorpos reactivos com CLD18 podem ser incubados seguido de anticorpos de cabra anti-ratinho ou cabra anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (DAKO) de acordo com as instruções do vendedor.
Actividades Fagocítica e de Morte Celular dos anticorpos In vitro
Além de se ligarem especificamente a CLD18, os anticorpos anti-CLD18 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar fagocitose e morte de células que 71 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ expressem CLD18. Ο ensaio de actividade de anticorpos monoclonais in vitro proporcionará uma pesquisa inicial antes do ensaio em modelos in vivo.
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) :
Resumidamente, células polimorfonucleares (PMN), células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efectoras, de dadores saudáveis podem ser purificadas através de centrifugação de densidade em Ficoll Hypaque, seguida de lise dos eritrócitos contaminantes. As células efectoras lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor a 10%, ou, alternativamente, com soro humano inactivado pelo calor a 5% e misturadas com células alvo marcadas com 51Cr expressando CLD18, a várias razões de células efectoras para células alvo. Alternativamente, as células alvo podem ser marcadas com um ligando de reforço da fluorescência (BATDA). Um quelato altamente fluorescente de Európio com o ligando de reforço que é libertado a partir de células mortas pode ser medido por um fluorómetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfecção de células alvo com luciferase. O amarelo Lúcifer adicionado pode então ser oxidado apenas por células viáveis. Os IgG anti-CLDl8 purificados podem então ser adicionados a várias concentrações. Uma IgG humana irrelevante pode ser utilizada como controlo negativo. Os ensaios podem ser realizados durante 4 a 20 horas a 37°C dependendo do tipo de célula efectora utilizado. As amostras podem ser ensaiadas quanto à citólise através da medição da libertação de 51Cr ou da presença do quelato EuTDA no sobrenadante da cultura. Alternativamente, a luminescência resultante da oxidação do amarelo Lúcifer pode ser uma medida das células viáveis.
Os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem também ser testados em várias combinações para determinar se a citólise é reforçada com múltiplos anticorpos monoclonais. 72 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Citotoxicidade dependente do complemento (CDC):
Os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar CDC, utilizando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, o soro para complemento pode ser obtido a partir de sangue de um modo conhecido do perito na técnica. Para determinar a actividade de CDC de mAbs, podem ser utilizados diferentes métodos. Por exemplo, pode ser medida a libertação de 51Cr ou pode ser avaliada a elevada permeabilidade da membrana utilizando um ensaio de exclusão de iodeto de propídio (PI). Resumidamente, as células alvo podem ser lavadas e podem ser incubadas 5xl05/ml com várias concentrações de mAb durante 10-30 min. à temperatura ambiente ou a 3 7°C. O soro ou plasma pode então ser adicionado a uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37°C durante 20-30 min. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI num tubo FACS. A mistura pode então ser analisada imediatamente através de citometria de fluxo utilizando FACSArray. Num ensaio alternativo, a indução de CDC pode ser determinada em células aderentes. Numa concretização deste ensaio, as células são semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3xl04/poço em placas de microtitulação de fundo plano de cultura de tecidos. O meio de crescimento do dia seguinte é removido e as células são incubadas em triplicado com os anticorpos. As células de controlo são incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo saponina a 0,2% para a determinação da lise de fundo e da lise máxima, respectivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante é removido e é adicionado às células plasma ou soro humano a 20% (v/v) em DMEM (pré-aquecido a 37°C) e incuba-se durante mais 20 min. a 37°C. Todas as células de cada amostra são adicionadas a solução de iodeto de propídio (10 pg/ml) . Em seguida, os sobrenadantes são substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm é medida a 600 nm utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica é calculada da seguinte forma: % de lise especifica = (fluorescência da amostra-fluorescência de fundo)/(fluorescência da lise máxima-fluorescência de fundo)xl00. 73 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Inibição da proliferação celular através de anticorpos monoclonais:
Para testar a capacidade de iniciar apoptose, os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem, por exemplo, ser incubados com células tumorais positivas para CLD18, p. ex., SNU-16, DAN-G, KATO-III ou células tumorais transfectadas com CLD18 a 37°C durante cerca de 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampão de ligação a Anexina V (BD Biosciences), e incubadas com Anexina V conjugada com FITC ou APC (BD Biosciences) durante 15 min. no escuro. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI (10 pg/ml em PBS) num tubo de FACS e avaliadas imediatamente através de citometria de fluxo (como acima). Alternativamente, uma inibição geral da proliferação celular através de anticorpos monoclonais, pode ser detectada com estojos comercialmente disponíveis. O DELFIA Cell
Proliferation Kit (Perkin-Elmer, No. Cat. AD0200) é um imunoensaio não isotípico baseado na medição de incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante a síntese de ADN das células em proliferação em microplacas. O BrdU incorporado é detectado utilizando anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a detecção dos anticorpos, as células são fixadas e o ADN é desnaturado utilizando solução Fix. O anticorpo não ligado é lavado e o indutor DELFIA é adicionado para dissociar os iões de európio do anticorpo marcado para a solução onde formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando fluorometria resolvida no tempo na detecção - é proporcional à síntese de ADN na célula de cada poço.
Estudos pré-clinicos
Os anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18 podem também ser testados num modelo in vivo (p. ex. em ratinhos imunodeficientes portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas celulares expressando CLD18, p. ex., DAN-G, SNU-16, ou KATO-III, ou após transfecção, p. ex. HEK293) para determinar a sua eficácia no controlo do crescimento de células tumorais expressando CLD18. 74 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Estudos in vivo após xenoenxerto de células tumorais expressando CLD18 em ratinhos imunocomprometidos ou em outros animais podem ser realizados utilizando os anticorpos do invento. Os anticorpos podem ser administrados a ratinhos livres de tumor, seguido por injecção de células tumorais para medir os efeitos dos anticorpos para prevenir a formação de tumores ou de sintomas relacionados com tumores. Os anticorpos podem ser administrados a ratinhos portadores de tumores para determinar a eficácia terapêutica dos respectivos anticorpos para reduzir o crescimento, metástase ou sintomas relacionados com tumores. A aplicação dos anticorpos pode ser combinada com aplicação de outras substâncias tais como fármacos citostáticos, inibidores de factores de crescimento, bloqueadores do ciclo celular, inibidores de angiogénese ou outros anticorpos para determinar a eficácia sinérgica e potencial toxicidade de combinações. Para analisar os efeitos secundários tóxicos mediados pelos anticorpos do invento, animais podem ser inoculados com anticorpos ou reagentes de controlo e cuidadosamente investigados quanto a sintomas possivelmente relacionados com a terapia de anticorpos de CLD18. Possíveis efeitos secundários da aplicação in vivo de anticorpos de CLD18 incluem particularmente toxicidade em tecidos expressando CLD18 incluindo estômago e pulmão. Os anticorpos que reconhecem CLD18 em humanos e noutras espécies, p. ex., ratinhos, são particularmente úteis para prever potenciais efeitos secundários mediados pela aplicação de anticorpos monoclonais de CLD18 em seres humanos.
Mapeamento de epitopos 0 mapeamento de epitopos reconhecidos pelos anticorpos do invento pode ser realizado como descrito em detalhe em "Epitope Mapping Protocols" (Methods in Molecular Biology) de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay. 75 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ I. Moléculas Biespecíficas/Multiespecíficas Que se Ligam a CLD18
Ainda noutra concretização do invento, os anticorpos para CLD18 podem ser derivados ou ligados a outras moléculas funcionais, p. ex., outro péptido ou proteína (p. ex., um fragmento Fab') para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a múltiplos locais de ligação ou epitopos alvo. Por exemplo, um anticorpo do invento pode ser funcionalmente ligado (p. ex. através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como um outro anticorpo, péptido ou mimético de ligação.
Consequentemente, o presente invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLD18 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. Numa concretização particular do invento, o segundo epitopo alvo é um receptor de Fc, p. ex. Fc-gamaRI humano (CD64) ou um receptor de Fc-alfa humano (CD89), ou um receptor de células T, p. ex. CD3. Portanto, o invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de se ligar a células efectoras expressando Fc-gamaR, Fc-alfaR ou Fc-épsilonR (p. ex. monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMN)), e a células alvo expressando CLD18. Estas moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem dirigir células expressando CLD18 a células efectoras e podem desencadear actividades de células efectoras mediadas pelo receptor de Fc, tais como fagocitose de células expressando CLD18, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), libertação de citocinas, ou geração de anião superóxido.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento podem ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CLD18. Numa concretização, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-factor de melhoria (EF) , p. ex. uma molécula que se liga a uma proteína da superfície envolvida em actividade citotóxica e aumenta deste modo a resposta imunitária contra a célula 76 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ alvo. A "porção anti-factor de melhoria" pode ser um anticorpo, fragmento funcional de anticorpo ou um ligando que se liga a uma dada molécula, p. ex., um antigénio ou um receptor, e resulta deste modo numa melhoria do efeito dos determinantes de ligação para o receptor de Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção anti-factor de melhoria" pode ligar-se a um receptor de Fc ou um antigénio da célula alvo. Alternativamente, a porção anti-factor de melhoria pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade a que a primeira e a segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção anti-factor de melhoria pode ligar-se a uma célula T citotóxica (p. ex., através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imunitária que resulte numa maior resposta imunitária contra a célula alvo).
Numa concretização, as moléculas biespecificas e multiespecíficas do invento compreendem como especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, incluindo, p. ex., um Fab, Fab', F(ab')2f Fv, ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento minimo destes tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples tal como descrito em Ladner et al., US 4946778. 0 anticorpo pode também ser uma proteina de fusão domínio de ligação-imunoglobulina tal como divulgado em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
Numa concretização, as moléculas biespecificas e multiespecíficas do invento compreendem uma especificidade de ligação para um Fc-gamaR ou um Fc-alfaR presente na superfície de uma célula efectora, e uma segunda especificidade de ligação para um antigénio da célula alvo, p. ex., CLD18.
Numa concretização, a especificidade de ligação para um receptor de Fc é proporcionada por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG) . Tal como aqui utilizado, o termo "receptor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes da cadeia gama localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas do receptor transmembranares ou solúveis que são agrupadas em três classes de receptores de Fc-gama: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32), e Fc-gamaRIII (CD 16). 77 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Numa concretização preferida, o receptor de Fc-gama é um Fc-gamaRI humano de elevada afinidade. A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais preferidos são descritas por Fanger et al. em WO 88/00052 e em US 4954617. Estes anticorpos ligam-se a um epitopo de Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ou Fc-gamayRIII num local que é distinto do local de ligação de Fcy ao receptor e, assim, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por niveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-Fc-gammaRI específicos úteis neste invento são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outras concretizações, o anticorpo anti-receptor de Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e WO 94/10332. A linha celular produtora do anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection a 4 de Novembro de 1992, sob a designação HA022CL1 e tem o No. de acesso CRL 11177.
Ainda noutras concretizações preferidas, a especificidade de ligação para um receptor de Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, p. ex., um receptor de Fc-alfa (Fc-alfaRI (CD89)), a ligação do qual não é, de preferência, bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA). O termo "receptor de IgA" pretende incluir o produto génico de um gene alfa (Fc-alfaRI) localizado no cromossoma 19. Sabe-se que este gene codifica várias isoformas transmembranares processadas alternativamente de 55 a 110 kDa. Fc-alfaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinófilos e neutrófilos, mas não em populações de células não efectoras. Fc-alfaRI tem afinidade média tanto para IgAl como para IgA2, que aumenta após exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16: 423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos de Fc-alfaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a Fc-alfaRI fora do domínio de ligação ao ligando IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764). 78 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Fc-alfaRI e Fc-gamaRI são os receptores de desencadeamento preferidos para utilização no invento porque: (1) são expressos principalmente em células imunitárias efectoras, p. ex., monócitos, PMN, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos a níveis elevados (p. ex., 5000-100000 por célula); (3) são mediadores de actividades citotóxicas (p. ex., ADCC, fagocitose); (4) medeiam maior apresentação do antigénio, de antigénios incluindo auto-antigénios, dirigidos para eles.
Noutra concretização, a molécula biespecífica é constituída por dois anticorpos monoclonais de acordo com o invento que têm actividades funcionais complementares, tais como um anticorpo funcionando predominantemente através da indução de CDC e o outro anticorpo funcionando predominantemente através da indução de apoptose.
Um "anticorpo especifico de uma célula efectora" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que se liga ao receptor de Fc de células efectoras. Os anticorpos preferidos para utilização no presente invento ligam-se ao receptor de Fc de células efectoras num local ao qual a imunoglobulina endógena não se liga.
Tal como aqui utilizado, o termo "célula efectora" refere-se a uma célula imunitária que está envolvida na fase efectora de uma resposta imunitária, em oposição às fases cognitiva e de activação de uma resposta imunitária. Células imunitárias exemplares incluem células de origem mielóide ou linfóide, p. ex., linfócitos (p. ex., células B e células T, incluindo células T citoliticas (CTL), células assassinas, células assassinas naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efectoras expressam receptores de Fc específicos e realizam funções imunológicas específicas. Em concretizações preferidas, uma célula efectora é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), p. ex., um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR estão envolvidos na morte específica de células alvo e apresentam antigénios a 79 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ outros componentes do sistema imunitário, ou se ligam a células que apresentam antigénios. Noutras concretizações, uma célula efectora pode fagocitar um antigénio alvo, célula alvo, ou microorganismo. A expressão de um determinado FcR numa célula efectora pode ser regulada por factores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, verificou-se que a expressão de Fc-gamaRI é sobre-regulada pelo interferão gama (IFN-γ). Esta expressão aumentada aumenta a actividade citotóxica de células possuindo Fc-gamaRI contra alvos. Uma célula efectora pode fagocitar ou lisar um antigénio alvo ou uma célula alvo. "Célula alvo" significa qualquer célula indesejável num sujeito (p. ex., um ser humano ou animal) que pode ser atingida por um anticorpo do invento. Em concretizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa ou sobre-expressa CLD18. Células que expressam CLD18 incluem tipicamente células tumorais.
As moléculas biespecificas e multiespecificas do presente invento podem ser feitas usando técnicas químicas (ver, p. ex., D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (ver US 4474893, para Reading), ou técnicas de ADN recombinante.
Em particular, moléculas biespecificas e multiespecificas do presente invento podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação dos constituintes, p. ex., as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CLD18, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecifica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, uma variedade de agentes de ligação ou reticulação pode ser utilizada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver p. ex., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, 80 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ ΜΑ et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Outros métodos incluem os descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), e Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de uma ligação sulfidrilo das regiões charneira C-terminais das duas cadeias pesadas. Numa concretização particularmente preferida, a região charneira é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrilo, de preferência um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vector e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica e multiespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligando χ Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica do invento, p. ex., uma molécula biespecífica, pode ser uma molécula de cadeia simples, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia simples, uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem também ser moléculas de cadeia simples ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Os métodos para preparação de moléculas bi e multiespecíficas são descritos, por exemplo em US 5260203, US 5455030, US 4881175, US 5132405, US 5091513, US 5476786, US 5013653, US 5258498 e US 5482858. A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada através de um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise de FACS, um bioensaio (p. ex., inibição do crescimento), ou um Ensaio de Western Blot. Cada um destes ensaios detecta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente marcado (p. ex., um anticorpo), 81 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ específico para ο complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detectados utilizando, p. ex., um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., "Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques", The Endocrine Society, Março, 1986) . 0 isótopo radioactivo pode ser detectado por meios tais como a utilização de um contador-γ ou um contador de cintilações ou através de autorradiografia. II. Imunoconjugados
Noutro aspecto, o presente invento apresenta um anticorpo anti-CLD18 conjugado com uma porção ou agente terapêutico, tal como uma citotoxina, um fármaco (p. ex., um imunossupressor) , ou um isótopo radioactivo. Tais conjugados são aqui referidos como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial e, em particular, mate as células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes.
Agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados do invento incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (p. ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo-descarbazina), agentes alquilantes (p. ex., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina-platina 82 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p. ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC), e agentes anti-mitóticos (p. ex., vincristina e vinblastina). Numa concretização preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Noutra concretização, o agente terapêutico é um imunossupressor. Ainda numa outra concretização, o agente terapêutico é GM-CSF. Numa concretização preferida, o agente terapêutico é doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou ricina A.
Os anticorpos do presente invento podem também ser conjugados com um radioisótopo, p. ex., iodo-131, ítrio-90 ou índio-111, para gerar radiofármacos citotóxicos para tratamento de um distúrbio relacionado com CLD18, tal como um cancro. Os conjugados de anticorpo do invento podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção fármaco não deve ser entendida como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídeo possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa, ou fragmento activo desta, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como factor de necrose tumoral ou o interferão-γ; ou, modificadores da resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento.
As técnicas para conjugação de tal fracção terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, ver, p. ex., Amon et ai., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody 83 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Carriers of Cytotoxic Agent In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Applications, Pinchera et ai. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection and Therapy, Baldwin et ai. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation e Cytotoxic Proprieties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Noutra concretização, os anticorpos de acordo com o invento são ligados a um ligador-quelante, p. ex., tiuxetano, que permite que o anticorpo seja conjugado com um isótopo radioactivo. III. Composições Farmacêuticas
Noutro aspecto, o presente invento proporciona uma composição, p. ex., uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos do presente invento. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com transportadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como as divulgadas em Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Numa concretização, as composições incluem uma combinação de múltiplos (p. ex., dois ou mais) anticorpos isolados do invento que actuam através de mecanismos diferentes, p. ex., um anticorpo que actua predominantemente através da indução de CDC em combinação com outro anticorpo que actua predominantemente através de indução de apoptose.
As composições farmacêuticas do invento podem também ser administradas em terapia de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição do presente invento com pelo menos um agente anti-inflamatório ou, pelo menos, um agente imunossupressor. Numa concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes anti-inflamatórios, tais como um fármaco esteróide ou um FAINE (fármaco anti-inflamatório não esteróide). Agentes preferidos incluem, por 84 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2 tais como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), FAINE tais como ibuprofeno (Motrin, Advil) , fenoprofeno (Nalfon) , naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene) , cetoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen) , etodolac (Lodine), oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
Noutra concretização, tais agentes terapêuticos incluem agentes que conduzem ao esgotamento ou inactivação funcional de células T reguladoras como ciclofosfamida em dose baixa, anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-IL2 ou anti-receptor de IL2.
Ainda noutra concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais quimioterapêuticos, tais como derivados de Taxol, taxotere, gemcitabina, 5-Fluoruracilo, doxorrubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar). Noutra concretização, os anticorpos do presente invento podem ser administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos, que de preferência mostram eficácia terapêutica em pacientes sofrendo de cancro do estômago, esofágico, pancreático e do pulmão.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em conjunto com radioterapia e/ou transplante autólogo de células estaminais periféricas ou de medula óssea.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos seleccionados a partir de anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-EPCAM, anti-EGFR, anti-Her2/neu, e anticorpos anti-CD40.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-C3b(i) para aumentar a activação do complemento.
Tal como aqui utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes 85 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (p. ex., através de injecção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto activo, isto é, anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser revestido num material para proteger o composto da acção de ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que mantém a actividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver p. ex., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19).
Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, e fosforoso, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos. Sais de adição básica incluem os derivados de metais de terra alcalina, tais como sódio, potássio, magnésio e cálcio, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, e procaína.
Uma composição do presente invento pode ser administrada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado pelo perito, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Os compostos activos podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de 86 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p. ex., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.
Para administrar um composto do invento por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inactivação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito num transportador apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções tampão aquosas. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água, bem como lipossomas convencionais (Strejan et ai., (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições farmacêuticas do presente invento está contemplada. Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma elevada concentração de fármaco. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido), e misturas adequadas destes. A fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, será 87 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.
Soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto activo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por microfiltração.
Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e secagem por congelação (liofilização) que produzem um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem tal como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem do invento são ditadas por, e directamente dependentes de, (a) as características únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a alcançar, e (b) 88 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ as limitações inerentes na técnica de compor um tal composto activo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, e metabissulfito de sódio e sulfito de sódio; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo e alfa-tocoferol; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico e ácido fosfórico.
Para as composições terapêuticas, formulações do presente invento incluem as adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas através de quaisquer métodos conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do sujeito a tratar e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.
Geralmente, dos cem porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente activo, de preferência de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, de maior preferência de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento. cremes
Formulações do presente invento que são adequadas para administração vaginal incluem também pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo tais transportadores como se sabe serem apropriados na técnica. Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de composições deste invento incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, 89 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ emplastros e inalantes. 0 composto activo pode ser misturado sob condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões, ou propulsores que possam ser requeridos.
As frases "administração parentérica" e "administrado por via parentérica" tal como aqui utilizadas, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente através de injecção, e incluem, sem limitação, injecção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, injecção epidural e intrasternal e infusão.
Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e através da utilização de tensioactivos.
Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes humidificadores, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, como através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, e ácido fenol-sórbico. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, e cloreto de sódio, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser alcançada através da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Numa concretização, os anticorpos monoclonais do invento são administrados na forma cristalina através de injecção 90 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ subcutânea, cf. Yang et al., (2003) PNAS, 100(12): 6934-6939. Quando os compostos do presente invento são administrados como produtos farmacêuticos a humanos e animais, podem ser administrados sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,01-99,5% (de maior preferência, 0,1 a 90%) de ingrediente activo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
Independentemente da via de administração seleccionada, os compostos do presente invento, que podem ser utilizados numa forma hidratada adequada, e/ou nas composições farmacêuticas do presente invento, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis através de métodos convencionais conhecidos dos peritos na técnica.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas do presente invento podem ser variados de modo a obter-se uma quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores farmacocinéticos, incluindo a actividade das composições particulares do presente invento empregues, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a empregar, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e a história médica prévia do paciente a tratar, e factores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
Um médico ou veterinário com vulgar perícia na técnica pode determinar prontamente e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos do invento empregues na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que o requerido para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado fosse alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição do invento será a quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito 91 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos factores descritos acima. É preferível que a administração seja por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, de preferência administrada proximal ao local do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente a intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente em formas de unidade de dosagem. Embora seja possível que um composto do presente invento seja administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação (composição) farmacêutica.
Numa concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados através de infusão, de preferência infusão contínua lenta durante um longo período, tal como mais de 24 horas, para reduzir efeitos secundários tóxicos. A administração pode também ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada através da medição da quantidade de anticorpos monoclonais anti-CLD18 em circulação após a administração numa amostra biológica usando anticorpos anti-idiotípicos que se dirigem aos anticorpos anti-CLD18.
Ainda noutra concretização, os anticorpos são administrados através de terapia de manutenção, tal como, p. ex., uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.
Ainda noutra concretização, os anticorpos de acordo com o invento podem ser administrados através de um regime incluindo uma infusão de um anticorpo contra CLD18 seguida de uma infusão de um anticorpo contra CLD18 conjugado com um isótopo radioactivo. 0 regime pode ser repetido, p. ex., 7 a 9 dias depois.
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa concretização preferida, uma composição terapêutica do 92 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ invento pode ser administrada com um dispositivo de injecçao hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados em US 5399163; US 5383851; US 5312335; US 5064413; US 4941880; US 4790824; ou US 4596556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis no presente invento incluem os descritos em: US 4487603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuição de medicação a uma taxa controlada; US 4486194, que divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; US 4447233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; US 4447224, que divulga um aparelho de infusão implantável de caudal variável para distribuição contínua de fármacos; US 4439196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos possuindo compartimentos de múltiplas câmaras; e US 4475196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos.
Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos são bem conhecidos dos peritos na técnica. Em certas concretizações, os anticorpos do invento podem ser formulados para assegurar uma distribuição correcta in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para assegurar que os compostos terapêuticos do invento atravessam a BHE (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, p. ex., US 4522811; US 5374548; e US 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são selectivamente transportadas para dentro de células ou órgãos específicos, e, portanto, aumentam a distribuição de fármacos direccionada (ver, p. ex., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Porções de direccionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, p. ex., US 5416016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140, M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); e receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134).
Numa concretização do invento, os compostos terapêuticos do invento são formulados em lipossomas. Numa concretização 93 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ mais preferida, os lipossomas incluem uma porção de direccionamento. Numa concretização mais preferida, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos através de injecção do bolo num local proximal à área desejada, p. ex., o local de um tumor. A composição deve ser fluida até ao ponto de ser fácil a utilização de seringa. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a acção contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos.
Noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser formulados para prevenir ou reduzir o seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito através de métodos conhecidos na técnica, p. ex., através de PEGuilação dos anticorpos ou através da utilização de fragmentos F(ab)2'. Outras referências podem ser feitas a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation". J. Immunol. Methods, 152: 177-190; e a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins", Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia tumoral pode ser medida através de respostas tumorais objectivas que podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (RC) é definida como uma prova não clínica, radiológica ou outra, de doença. Uma resposta parcial (RP) resulta de uma redução do tamanho total do tumor superior a 50%. O tempo mediano até à progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta objectiva do tumor.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia tumoral pode também ser medida através da sua capacidade para estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir cancro pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada através do exame da capacidade do composto para inibir o crescimento celular ou a apoptose através de ensaios in vitro conhecidos do perito na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar os 94 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ sintomas num sujeito. Um vulgar perito na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em factores tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou a via de administração seleccionada. A composição deve ser estéril e fluida até ao ponto de a composição poder ser distribuída através de uma seringa. Além da água, o transportador pode ser uma solução salina tamponada isotónica, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e misturas adequadas destes. A fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção de longo prazo das composições injectáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto activo é adequadamente protegido, tal como descrito acima, o composto pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível assimilável. IV. Utilizações e Métodos Envolvendo Anticorpos do Invento
Os anticorpos (incluindo imunoconjugados, biespecíficos/multiespecíficos, composições e outros derivados aqui descritos) do presente invento têm numerosas utilidades terapêuticas envolvendo o tratamento de distúrbios envolvendo células expressando CLD18A2. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados a células em cultura, p. ex., in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p. ex., in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios tais como aqueles aqui descritos. Tal como aqui utilizado, pretende-se que o termo "sujeito" inclua humanos e animais não humanos que respondem aos anticorpos contra CLD18A2. Os 95 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ sujeitos preferidos incluem pacientes humanos possuindo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados matando células doentes, em particular células caracterizadas por um padrão de expressão alterado de CLD18A2 em comparação com células normais.
Um efeito terapêutico nos tratamentos aqui discutidos é de preferência alcançado através das propriedades funcionais dos anticorpos do invento para mediar a morte de células.
Por exemplo, numa concretização, os anticorpos do presente invento podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigénico, p. ex., um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais expressando CLD18A2 incluindo, por exemplo, cancro gástrico. Exemplos de doenças tumorigénicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam todos os cancros que expressam CLD18A2 e entidades tumorais, incluindo cancro de estômago, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro colorrectal, cancro hepático, cancro da vesicula biliar e cancro da cabeça-pescoço. Estes cancros podem estar em estádios iniciais, intermédios ou avançados, p. ex. metástase.
As composições farmacêuticas e os métodos de tratamento descritos de acordo com o invento podem também ser úteis para imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.
Noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser utilizados para detectar niveis de CLD18 ou formas particulares de CLD18, ou niveis de células que contenham CLD18 à superfície da sua membrana, níveis que podem então ser ligados a certas doenças ou sintomas de doença tal como descrito acima. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para esgotar ou interagir com a função de células expressando CLD18, implicando, assim, estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser conseguido através do contacto de uma amostra e de uma amostra de controlo com o anticorpo anti-CLD18 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CLD18. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CLD18 são 96 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ detectados e comparados na amostra e numa amostra de controlo, isto é, uma amostra de referência.
Os anticorpos do invento podem ser inicialmente ensaiados quanto à sua actividade de ligação associada a utilizações terapêuticas ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados utilizando ensaios de citometria de fluxo, tal como aqui descrito.
Além disso, pode ser ensaiada a actividade dos anticorpos no desencadeamento de pelo menos uma actividade celular efectora mediada por efector, incluindo a inibição do crescimento e/ou a morte de células expressando CLD18. Por exemplo, pode ser ensaiada a capacidade dos anticorpos para desencadear CDC e/ou apoptose. Os protocolos para ensaio de CDC, adesão homotípica, agrupamento molecular ou apoptose são aqui descritos.
Os anticorpos do invento podem ser utilizados para desencadear, in vivo ou in vitro, uma ou mais das seguintes actividades biológicas: para inibir o crescimento de e/ou a diferenciação de uma célula expressando CLD18; para matar uma célula expressando CLD18; para mediar fagocitose ou ADCC de uma célula expressando CLD18 na presença de células efectoras; para mediar CDC de uma célula expressando CLD18 na presença de complemento; para mediar a apoptose de uma célula expressando CLD18; para induzir adesão homotípica; e/ou para induzir translocação em jangadas lipídicas após ligação a CLD18.
Numa concretização particular, os anticorpos podem ser utilizados in vivo ou in vitro, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com CLD18. Exemplos de doenças relacionadas com CLD18 incluem, entre outros, cancros, tais como cancro gástrico, cancro pancreático, cancro esofágico, cancro de pulmão e cancros tais como os listados acima. CLD18A2 é também expresso em células do estômago normais diferenciadas. Os possíveis efeitos secundários clínicos induzidos pelos anticorpos pela morte destas células podem ser reduzidos ou evitados através da administração paralela 97 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ de fármacos protectores do estômago tais como antacida, ou inibidores da bomba de protões gástrica tal como omeprazol ou fármacos relacionados.
Vias de administração adequadas das composições de anticorpos do invento, in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser seleccionadas pelos vulgares peritos.
Tal como descrito acima, os anticorpos anti-CLD18 do invento podem ser co-administrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, p. ex., um agente citotóxico, um agente radiotóxico, agente antiangiogénico e agente imunossupressor para reduzir a indução de respostas imunitárias contra os anticorpos do invento. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, p. ex., uma terapia anticancro, p. ex., radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como os listados acima. A co-administração dos anticorpos anti-CLD18 do presente invento com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anticancro que actuam através de diferentes mecanismos produzindo um efeito citotóxico para as células tumorais. Tal co-administração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou a uma mudança na antigenicidade das células tumorais que as tornariam não reactivas com o anticorpo.
Numa outra concretização particular do invento, o sujeito a quem se administra o anticorpo é, adicionalmente, tratado com um agente antiangiogénico incluindo anticorpos direccionados para VEGF ou VEGFR e um ou mais compostos químicos inibindo a angiogénese. 0 pré-tratamento com ou a aplicação paralela destes fármacos pode melhorar a penetração dos anticorpos em tumores em bruto.
Noutra concretização particular do invento, o sujeito a quem é administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um composto inibindo a sinalização do receptor do factor de crescimento, incluindo anticorpos monoclonais de ligação ao 98 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ receptor EGFR, bem como compostos químicos que inibem a sinalização iniciada pelo receptor EGFR, Herl ou Her2/neu.
As células efectoras específicas do alvo, p. ex., células ligadas a composições (p. ex. anticorpos, moléculas multiespecificas e biespecificas) do invento podem também ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efectoras para direccionamento podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células possuindo receptores de IgG ou IgA. Se desejado, as células efectoras podem ser obtidas a partir do sujeito a tratar. As células efectoras específicas do alvo podem ser administradas como uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser na ordem de 108 a 109 mas dependerá da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, p. ex., uma célula tumoral expressando CLD18, e efectuar morte celular através, p.ex. de fagocitose. As vias de administração podem também variar. A terapia com células efectoras específicas do alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção das células alvo. Por exemplo, terapia anti-tumoral utilizando as composições do invento e/ou células efectoras armadas com estas composições pode ser utilizada em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, pode ser utilizada imunoterapia de combinação para dirigir duas populações distintas de efectores citotóxicos para rejeição de células tumorais. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 ligados a anti-Fc-RI ou anti-CD3 podem ser utilizados em conjunto com agentes de ligação específicos do receptor de IgG ou IgA.
As moléculas biespecificas e multiespecificas do invento podem também ser utilizadas para modular os níveis de Fc-gamaR ou Fc-alfaR em células efectoras, tais como através da protecção e eliminação de receptores na superfície celular. Misturas de anti-receptores de Fc podem também ser utilizadas para esta finalidade.
As composições (p. ex., anticorpos, moléculas biespecificas e multiespecificas e imunoconjugados) do 99 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ invento que têm locais de ligação ao complemento, tais como porções de IgGl, 2 ou 3 ou IgM que se ligam ao complemento, podem também ser utilizadas na presença de complemento. Numa concretização, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação do invento e células efectoras apropriadas pode ser suplementado através da adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação do invento pode ser melhorada através da ligação de proteínas do complemento. Noutra concretização, as células alvo revestidas com as composições do invento podem também ser lisadas pelo complemento. Ainda noutra concretização, as composições do invento não activam o complemento.
As composições do invento podem também ser administradas juntamente com complemento. Consequentemente, dentro do âmbito do invento estão composições compreendendo anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas por o complemento estar localizado em estreita proximidade com os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas.
Alternativamente, os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas do invento e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente. A ligação das composições do presente invento a células alvo causa a translocação do complexo antigénio CLD18-anticorpo para jangadas lipídicas da membrana celular. Tal translocação cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo que podem activar e/ou aumentar eficientemente a CDC.
As composições de anticorpos do invento (p. ex., anticorpos e imunoconjugados) e as instruções de utilização podem estar compreendidas num estojo. 0 estojo pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais do invento (p. ex., um anticorpo possuindo uma actividade complementar).
Consequentemente, aos doentes tratados com as composições de anticorpo do invento pode ser adicionalmente 100 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ administrado (antes de, em simultâneo com, ou após a administração de um anticorpo do invento) um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhore ou aumente o efeito terapêutico dos anticorpos do invento.
Noutras concretizações, o sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que module, p. ex., aumente ou iniba, a expressão ou actividade de receptores de Fc-gama ou Fc-alfa através de, por exemplo, tratamento do indivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas incluem factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-γ), e factor de necrose e tumoral (TNF). Outros agentes importantes para aumento da eficácia terapêutica dos anticorpos e composições farmacêuticas aqui descritos são β-glucanos que são homopolissacáridos de resíduos ramificados de glicose e são produzidos através de uma variedade de plantas e microorganismos, por exemplo, bactérias, algas, fungos, leveduras e grãos. Podem também ser utilizados fragmentos de β-glucanos produzidos por organismos. De preferência, o β-glucano é um polímero de β (1,3)glicose, em que pelo menos algumas das unidades de glicose do esqueleto, p. ex. 3-6% das unidades de glicose do esqueleto, possuem ramificações tais como ramificações β (1,6) .
Os métodos para detecção da presença de antigénio CLD18 numa amostra, ou medição da quantidade de antigénio CLD18, podem compreender o contacto da amostra e de uma amostra de controlo com um anticorpo que se ligue especificamente a CLD18, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e CLD18. É então detectada a formação de um complexo, em que a diferença de formação de um complexo entre a amostra comparada com a amostra de controlo é indicativa da presença de antigénio CLD18 na amostra.
Um método para detecção da presença ou quantificação da quantidade de células expressando CLD18 in vivo ou in vitro, pode compreender (i) a administração a um sujeito de uma composição do invento conjugada com um marcador detectável; 101 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ (ii) a exposição do sujeito a um meio para detecção do referido marcador detectável para identificar áreas contendo células expressando CLD18.
Os métodos tal como descritos acima são úteis, em particular, para diagnóstico de doenças relacionadas com CLD18 e/ou a localização de doenças relacionadas com CLD18 tal como doenças cancerígenas. De preferência, uma quantidade de CLD18, de preferência CLD18-A2, numa amostra que seja superior à quantidade de CLD18, de preferência CLD18-A2, numa amostra de controlo é indicativa da presença de uma doença relacionada com CLD18 num sujeito, em particular um ser humano, do qual a amostra é derivada.
Ainda noutra concretização, os imunoconjugados do invento podem ser utilizados para direccionar compostos (p. ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) a células que tenham CLD18 expresso à sua superfície através da ligação de tais compostos ao anticorpo. o presente invento é ainda ilustrado através dos seguintes exemplos que não devem ser entendidos como limitantes do âmbito do invento.
EXEMPLOS
1. Geração de anticorpos de murideo contra CLD1S a. Imunizações:
Ratinhos Balb/c ou C57/BL6 foram imunizados com vectores de expressão eucarióticos, codificando fragmentos de CLD18 humana (SEQ ID NO: 15, 16; 17, 18) . 50 pg ou 25 pg de ADN plasmídico foram injectados nos quadrícepes (intramuscular, i.m.) nos dias 1 e 10 para geração de anticorpos monoclonais de Setl ou alternativamente nos dias 1 e 9, 1 e 11, ou 1, 16 e 36 para geração de anticorpos monoclonais de Set2 na presença de adjuvantes, por exemplo CpG (para detalhes ver Tab. lb). CpG bem como células transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) sozinhas ou co-transfectadas adicionalmente com CD40L solúvel de murideo codificando ARN foram injectados por 102 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ via intramuscular, PEI-Man foi injectado por via intramuscular ou intraperitoneal. A presença de anticorpos dirigidos contra CLD18 humana no soro de ratinhos foi monitorizada através de microscopia de imunofluorescência imunitária entre o dia 16 e 43, dependendo do protocolo de imunização especifico utilizado. A imunofluorescência foi determinada utilizando células HEK293 transfectadas transientemente com um ácido nucleico codificando uma construção de fusão compreendendo CLD18A2 humana (SEQ ID NOs: 1, 2) e uma proteina repórter fluorescente. Os ratinhos com respostas imunitárias detectáveis (Fig. 1) foram reforçados três dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais de Setl, ou os ratinhos foram reforçados três dias, três e dois dias, ou os ratinhos foram reforçados quatro, três e dois dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais de Set2 através de injecção intraperitoneal de 5xl07 ou alternativamente lxlO8 células HEK293 transfectadas transientemente com um ácido nucleico codificando CLD18A2 humana (SEQ ID NOs: 1, 2) (para detalhes ver Tab. lb). Na Tab. la os protocolos de imunização utilizados são dedicados aos respectivos anticorpos monoclonais.
Tab. la: Protocolos de imunização utilizados para geração de anticorpos monoclonais mAB Protocolo de imunização* mAB Protocolo de imunização Setl 2 4H5 40 42E12 45 26B5 40 43A11 45 26D12 40 44E10 45 28D10 40 47D12 45 37G11 45 61C2 45 37H8 45 75B8 6 3 8G5 45 85A3 6 38H3 45 9E8 40 39F11 45 19B9 40 41C6 45 Set2 45C1 53 166E2 51 125E1 45 175D10 51 163E12 51 *Para protocolos de imunização específicos ver Tab. lb 103 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Tab. lb: Protocolos de imunização detalhados
Protocolo de imunização Imunização reforços com (vacinação e ADN) Monitorização do soro Reforços com células transfectadas com vectores de ADN codificando fragmentos de CLD18 com adjuvante no dia no dia Células transfectadas apenas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) Células co— transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) e com ARN codificando CD40L solúvel de murideo dias antes da esple-nectomia 6 SEQ ID NO: 15 : 50 pg 50 pg de CpG 1 e 10 18 5x10' células MC3T3 transfectadas nenhuma 3 40 SEQ ID NO: 17: 50 pg 50 pg de CpG 1 e 10 18 5x10' células HEK293; 100 pg de CpG como adjuvante 3 45 SEQ ID NO: 15 : 50 pg 50 pg de CPG 1 e 9 16 1 x 108 células HEK293 3 51 SEQ ID NO: 15 : 25 pg 2,5 pl de PEI-Man* (150 rrM) em H20 com 5% de Glicose 1, 16 e 36 22, 30 e 43 5x10' células HEK293 transfectadas nenhuma 3 e 2 53 Vacinação: SEQ ID NO: 15 : 25 pg, e SEQ ID NO: 17: 25 pg; Reforço: SEQ ID NO: 17: 50 pg 50 pg de CPG em H20 com 5% de Glicose I e 11 20 5x10' células HEK293 transfectadas nenhuma 4, 3 e 2 *in vivo-jetPEI™-Man de PolyPlus Transfection b. Geração de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos para CLD18:
Esplenócitos de ratinho foram isolados e fundidos com PEG a uma linha celular de mieloma de ratinho com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então pesquisados quanto à produção de imunoglobulinas com especificidade para CLD18 utilizando células HEK293 transfectadas com um ácido nucleico codificando CLD18 humana através de análise FACS.
Suspensões de células individuais de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fundidas com células de mieloma de ratinho não secretoras P3X63Ag8U.l (ATCC, CRL 1597) numa razão de 2:1 utilizando PEG a 50% (Roche 104 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Diagnostics, CRL 738641). As células foram plaqueadas a aproximadamente 3xl04/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de cerca de duas semanas de incubação em meio selectivo contendo soro fetal bovino a 10%, fusão de hibridoma a 2% e suplemento de clonagem (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1363735) mais HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0, 055 mM, 50 pg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma, CRL H0262). Após 10 a 14 dias os poços individuais foram pesquisados através de citometria de fluxo quanto a anticorpos monoclonais anti-CLD18. Os hibridomas secretores de anticorpos foram novamente plaqueados, pesquisados novamente e, se ainda fossem positivos para anticorpos monoclonais anti-CLDl8, eram subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis eram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização. Foi escolhido pelo menos um clone de cada hibridoma, que manteve a reactividade das células parentais (por FACS). Foram gerados 9 bancos de células em frascos para cada clone que foram armazenados em azoto liquido. c. Selecção de anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18:
Para determinar o isotipo dos anticorpos, foi realizado um ELISA de isotipo. O monoAB ID Kit de ratinho (Zymed, CRL 90-6550) ou alternativamente o IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, No. Cat. 1493027) foi utilizado para determinar as subclasses de Ig dos anticorpos monoclonais reactivos com CLD18 identificados. Definido como Setl, foram geradas dezanove linhas celulares de hibridoma, seis de uma fusão de células de um ratinho C57/BL6 imunizado com CLD18A2-VoltaD3 (SEQ ID NOs: 17, 18), treze de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18A2-Voltai (SEQ ID NOs: 15, 16), expressando os seguintes anticorpos: 2 4H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 24H5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b, k, 182-D758-034 26B5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D758-035, DSM ACC2745 105 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 26D12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D758-036, DSM ACC2746 28D10: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D758-040, DSM ACC2747 37G11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D1106-055, DSM ACC2737 37H8: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-056, DSM ACC2738 38G5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-057, DSM ACC2739 38H3: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-058, DSM ACC2740 39F11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-059, DSM ACC2741 41C6: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D1106-060 42E12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D1106- 061, DSM ACC2748 43A11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D1106- 062, DSM ACC2742 44E10: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-063 47D12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D 1106-064 61C2: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b, k, 182-D1106-067, DSM ACC2743 75B8: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, k, 182-D756-001 85A3: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, k, 182-D756-002 9E8: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, k, 182-D758-011 19B9: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, k, 182-D758-024
Definido como Set2, foram geradas cinco linhas celulares de hibridoma, uma de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18A2-VoltaD3 (SEQ ID NOs: 17, 18) e CLD18A2-VoltaDl (SEQ ID NOs: 15, 16), quatro de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18BA2-VoltaDl (SEQ ID NOs: 15, 16), expressando os seguintes anticorpos: 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10. 45C1: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D758-187 125E1: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, k, 182-D1106-279, DSM ACC2808 163E12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-294, DSM ACC2809 106 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 166Ε2: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, k, 182-D1106-308 175D10: anticorpo monoclonal de ratinho IgGl, k, 182-D1106-362, DSM ACC2810 2. Produção de Anticorpos Monoclonais
Produção e purificação de anticorpos monoclonais reactivos com CLD18:
Para produzir quantidades de mg de anticorpo para caracterização funcional, células de hibridoma foram semeadas em biorreactores baseados em diálise (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) a 2xl06 células/ml. 0 anticorpo contendo sobrenadante foi colhido uma vez por semana. O anticorpo monoclonal de ratinho foi purificado utilizando Melon Gel (Pierce, Rockford, USA) e concentrado através de precipitação com sulfato de amónio, ou, alternativamente, purificado através de FPLC utilizando proteína A. A concentração e a pureza do anticorpo foram determinadas através de Ensaio de BCA e a pureza verificada através de electroforese em gel com dodecilsulfato de sódio e coloração de Coomassie. 3. Caracteristicas de Ligação dos Anticorpos Monoclonais a. Controlo de qualidade dos transfectantes em WB, IF:
Para gerar células expressando CLD18A2, células HEK293 ou CHO foram transfectadas com ácidos nucleicos codificando CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) ou CLD18A2-myc (SEQ ID NOs: 3,4).
As células HEK293 foram transfectadas com CLDN18A2-myc (SEQ ID NOs: 3, 4) ou deixadas não transf ectadas. 24 horas após a transfecção, as células foram colhidas, lisadas e sujeitas a electroforese em gel com dodecilsulfato de sódio. 0 gel foi transferido e corado com um anticorpo de ratinho anti-myc. Após incubação com um anticorpo anti-ratinho marcado com peroxidase, a membrana foi revelada com reagente ECL e visualizada utilizando um gerador de imagens LAS-3000 (Fuji). Apenas nas células transfectadas mas não no controlo negativo, foi observada uma banda com o peso molecular esperado de CLD18-myc (Fig. 2). 107 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
As células CHO foram transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) e criadas em lâminas de câmaras durante 24 h. As células foram fixadas com metanol e coradas com um anticorpo policlonal de coelho contra CLD18 a 1 pg/ml durante 60 min. a 25°C. Após lavagem, as células foram coradas com uma IgG de cabra anti-coelho marcada com Alexa488 (Molecular Probes) e avaliadas através de microscopia de fluorescência. A Fig. 3 mostra células CHO transfectadas, expressando CLD18 na membrana celular bem como células não transfectadas. Estas células expressando heterologamente CLD18 foram utilizadas para os seguintes ensaios para testar a especificidade da ligação do anticorpo. b. Selecção de anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18/Pesquisas primárias através de citometria de fluxo: Células HEK293 foram co-transfectadas com vectores de expressão codificando CLD18A2 humana (SEQ ID NOs: 1, 2) e uma proteína repórter fluorescente 40 h antes do ensaio, ou, alternativamente, células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) foram utilizadas e contrastadas com iodeto de propídio (PI). Após desprendimento das células utilizando EDTA 2 mM/PBS, as células foram lavadas com meio de crescimento completo e plaqueadas a aproximadamente 1-5χ105 células/poço em placas de microtitulação de fundo em U. As células foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadante do hibridoma seguido por dois passos de lavagem com FBS/PBS inactivado por calor a 1% e finalmente incubação com APC ou anticorpo secundário específico anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647. Após dois passos de lavagem, as células co-transfectadas foram fixadas com CellFIX (BD Biosciences). A ligação foi avaliada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A expressão do marcador de fluorescência é traçada no eixo horizontal contra a ligação do anticorpo no eixo vertical. Detectou-se que todos os anticorpos de ratinho 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 se ligavam especificamente à superfície das células expressando marcador de fluorescência (Fig. 4, células em Q2) tal como exemplificado para sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais 108 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 24Η5 (Fig. 4Α, células em Q2), 85A3 (Fig. 4B) , 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 e 45C1 (Fig. 4C, células em Ql). c. Comparação da ligação do anticorpo a CLD18A2 marcado com Myc ou HA:
As características de ligação dos anticorpos monoclonais específicos de CLD18 identificados foram ainda melhor especificadas. Portanto, a ligação do anticorpo monoclonal foi analisada para mutantes de CLD18A2, criados através da inserção de etiquetas epitopo. CLD18A2-HA (SEQ ID NO: 6) contém uma etiqueta HA-epitopo em CLD18A2-voltal, enquanto CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4) contém uma etiqueta Myc-epitopo inserida em CLD18A2-volta2. Como a inserção destas etiquetas causa a destruição dos epitopos, os anticorpos monoclonais identificados podem ser agrupados de acordo com a perda de ligação a qualquer um dos mutantes. Células HEK293 co-transfectadas transientemente com um marcador de fluorescência e CLD18A2 humana, ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-HA, ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-Myc, foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais específicos de CLD18 durante 30 min. a 4°C, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647. Antes da análise num BD FACSArray, as células foram fixadas utilizando CellFIX. Tal como exemplificado para 24H5, 9E8, 26B5 e 19B9 na Fig. 5, os anticorpos monoclonais podiam ser separados com base nas suas características de ligação em quatro grupos diferentes: (i) anticorpos que se ligam a CLD18A2 não modificada bem como a CLD18A2-HA e CLD18A2-Myc, p. ex. 24H5, (Fig. 5A) , ou (ii) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-HA, p. ex. 9E8, (Fig. 5B) , ou (iii) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-Myc, p. ex. 26B5, (Fig. 5C) , ou (iv) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-HA nem a CLD18A2-Myc, p. ex. 19B9, (Fig. 5D). d. Comparação da ligação de anticorpos a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de citometria de fluxo: A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais identificados para isoformas de CLD18A2 foi analisada através 109 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ de citometria de fluxo. Células HEK293 expressando CLD18A2 humana de forma estável (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 expressando CLD18A1 humana de forma estável (SEQ ID NOs: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação de células ou alternativamente sem fixação mas com contrastação com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 6 mostra exemplos para os dois grupos de anticorpos monoclonais que foram identificados no painel constituído por 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 3 7H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) os anticorpos monoclonais 43A11, 45C1, e 163E12 ligam-se especificamente a CLD18A2 humana mas não a CLD18A1 humana (Fig. 6A,B), e (ii) o anticorpo monoclonal 37H8 liga-se a ambas as isoformas humanas (Fig. 6A). e. Comparação da ligação do anticorpo a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de microscopia de imunofluorescência: Células HEK293 foram transfectadas transientemente com um vector de expressão codificando uma proteína de fusão de CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) ou CLD18A2 (SEQ ID NO: 2) com um repórter de fluorescência e criadas em lâminas de câmaras. As células foram coradas sem serem fixadas ou após fixação com paraformaldeído com anticorpo monoclonal contendo sobrenadante da cultura de tecidos durante 30 min. a 37°C. Após lavagem, as células foram coradas com um anticorpo anti-Ig de ratinho marcado com Alexa555 (Molecular Probes). A ligação dos anticorpos foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Tal como mostrado na Fig. 7, o anticorpo 37G11 reagiu especificamente com CLD18A2 (Fig. 7A) mas não com CLD18A1 (Fig. 7B). Em contraste, o anticorpo 26B5 foi reactivo com CLD18A2 e CLD18A1 (Fig. 8).
Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, foi observada uma clara diferença entre a coloração de células vivas e as células 110 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ fixadas com paraformaldeído. Os anticorpos formaram uma coloração uniforme da membrana quando as células eram fixadas (Fig. 7C, 8C, 8D). Em contraste, a incubação de células vivas com estes anticorpos conduz à geração de aglomerados de proteínas, visíveis como um padrão de coloração semelhante a pintas (Fig. 7A, 8A, 8B). Isto mostra que todos os anticorpos se ligam a epitopos nativos tal como verificado na superfície das células vivas. f. Determinação de linhas celulares expressando endogenamente:
Um par de iniciadores específicos do gene de CLD18A2 (SEQ ID NO: 11, 12) foi utilizado em análises de RT-PCR para pesquisar linhas celulares para expressão de CLD18A2. Verificou-se que as linhas celulares de carcinoma gástrico humano NCI-SNU-16 (ATCC CRL-5974) , NUGC-4 (JCRB0834) e ΚΑΊΌ-III (ATCC HTB-103) e a linha celular de adenocarcinoma de pâncreas humano DAN-G (DSMZ ACC249) apresentam expressão endógena robusta de CLD18 (Fig. 9) . A expressão foi confirmada ao nível proteico através de coloração com um soro policlonal de coelho contra CLD18. g. Coloração de linhas celulares expressando endogenamente com anticorpos específicos de CLD18 e análise de imunofluorescência: Células DAN-G, SNU-16, NUGC-4 e KATO-III foram criadas em lâminas de câmaras sob condições padrão. As células foram não fixadas ou alternativamente fixadas com metanol e coradas com os respectivos anticorpos. Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 foi observada coloração da superfície celular tal como exemplificado na Fig. 10, 11 e 12A. Para os anticorpos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10 o reconhecimento do epitopo nativo foi ensaiado e foi observada coloração da superfície celular em células não fixadas tal como mostrado na Fig. 12B. Os subgrupos de anticorpos mostraram coloração homogénea da membrana celular preponderantemente nas interfaces célula-célula ou em partes da membrana livres não adjacentes a outras células. Outros anticorpos coraram focos e agregados 111 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ discretos na membrana celular demonstrando em conjunto que os respectivos anticorpos se ligam a diferentes epitopos, incluindo epitopos que são mascarados através da associação homotípica ou heterotípica de CLD18 bem como epitopos de CLD18 acessíveis nas junções de oclusão preformadas. h. Coloração de linhas celulares expressando endogenamente através de citometria de fluxo: A expressão à superfície de CLD18A2 expressa constitutivamente em células vivas KATO-III e NUGC-4 foi analisada através de citometria de fluxo. Isto é exemplificado através de células KATO-III e NUGC-4 coradas com anticorpo monoclonal 61C2 ou 163E12, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação das células ou alternativamente sem fixação. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 13 mostra uma forte ligação de 61C2 a pelo menos 70,3% das células KATO-III e de 163E12 a CLD18A2 a células KATO-III e NUGC-4. i. Alinhamento das sequências de CLD18A1 e CLD18A2 humanas e de ratinho: A CLD18A2 humana (NP_ 001002026) e a CLD18A1 humana (NP_057453) numa comparação de sequências diferem no terminal N e as variantes de CLD18 de ratinho (NP_062789 e AAL15636) demonstram elevada homologia e locais de variação da sequência entre as moléculas (ver Fig. 14). j. Reactividade dos anticorpos com CLD18A1 de murídeo e CLD18A2 de murideo analisada através de citometria de fluxo: A ligação dos anticorpos monoclonais identificados com CLD18A2 e CLD18A1 de murídeo foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 co-transfectadas transientemente com um marcador de fluorescência e CLD18A2 de murídeo (SEQ ID NOs: 33, 35) ou com um marcador de fluorescência e CLD18A1 de murideo (SEQ ID NOs: 36, 37) foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 humana, 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 e 163E12, respectivamente, durante 30 min. 112 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ a 4°C, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação das células. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 15 mostra três perfis de ligação diferentes: 38G5 e 45C1 não se ligam a nenhuma das isoformas de CLD18 de murideo, 37G11 e 163E12 ligam-se a CLD18A2 de murideo mas não a CLD18A1 de murídeo, e 38H3 liga-se a CLD18A1 e CLD18A2 de murídeo. Estes anticorpos são ferramentas valiosas para determinar a potencial toxicidade dos anticorpos monoclonais de CLD18 em estudos pré-clínicos.
Em conjunto estes dados mostram que os anticorpos monoclonais do invento 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10 gerados contra CLD18 representam uma diversidade de características de ligação a diferentes epitopos e topologias da CLD18 humana.
Uma combinação de diferentes propriedades descritas nos exemplos 3b, c, d, e, g, h, e j pode ser utilizada para categorizar os anticorpos monoclonais em tais classes diferentes. 4. Imuno-histoquímica (IHC)
Um anticorpo específico do epitopo de CLD18A2 gerado através de imunização com o péptido de SEQ ID NO: 21 foi utilizado para caracterização imuno-histoquímica da expressão de CLD18A2. Cortes de tecido impregnados em parafina derivados de um amplo painel de tecidos normais e tumorais foram utilizados para expressão proteica e análises de localização. Nenhuma expressão significativa foi detectada em nenhum outro tecido de órgão normal, excepto no estômago (ver Tab. 2, Fig. 16A) . Em contraste, a expressão de CLD18A2 foi verificada através de imuno-histoquímica em diferentes tipos de cancro, incluindo cancro de estômago e cancro de pulmão (Fig. 16B).
Curiosamente, a expressão da proteína CLD18A2 na mucosa gástrica estava restrita a células terminalmente diferenciadas do epitélio gástrico nas regiões da base e do 113 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ fosso. Em contraste, as células na região do pescoço da mucosa gástrica, em particular as células estaminais gástricas na porção do istmo, que repõem toda a mucosa, não expressam CLD18A2 (Fig. 16C).
Tab. 2: Expressão de CLD18A2 em tecidos normais e tumorais, tal como analisado através de IHC
Tipo de tecido Resultado
Supra-renal
Bexiga Células do sangue
Medula Óssea
Mama Cólon
Endotélio
Esófago
Trompa de Falópio Coração
Rim (glomérulo, túbulo)
Figado
Pulmão Nódulo linfático
Ovário - Pâncreas
Paratiróide
Pituitária -
Placenta
Próstata
Pele
Baço
Estômago + Músculo estriado
Testículo
Timo
Tiróide
Uréter Útero (colo do útero, endométrio) 0 anticorpo monoclonal 39F11 foi utilizado para estudos imuno-histoquímicos específicos de CLD18A2. Tal como mostrado 114 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ na Fig. 17Α, não foi detectável qualquer reactividade significativa em nenhum dos tecidos normais testados excepto no estômago (Fig. 17A), enquanto os carcinomas do estômago e do pulmão permanecem fortemente positivos (Fig. 17B).
Outro grupo de anticorpos do invento mostra um padrão de coloração especifico de cancro com ligação a cancro do estômago mas sem reactividade com tecido de estômago normal. Um tal padrão de coloração é mostrado na Fig. 18A com o anticorpo monoclonal 26B5.
Foi utilizada imuno-histoquímica para análise da especificidade de 175D10 (Fig. 18B), 43A11 (Fig. 18C), 163E12 (Fig.l8D) e 45C1 (Fig. 18E) em secções derivadas de linhas celulares tumorais HEK293: linhas celulares tumorais HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) ou sendo transfectadas com um plasmideo de controlo da expressão contendo apenas o gene de resistência a antibiótico para selecção (HEK293-falso) foram xenoenxertadas em ratinhos para formar tumores sólidos. Não foi detectada qualquer expressão em tumores de xenoenxertos de HEK293 falsamente transfectadas. Em contraste, observou-se forte e homogénea coloração da membrana em tumores de xenoenxertos de HEK293-CLD18A2 e em espécimes de carcinoma do estômago. 5. Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC) a. CDC de anticorpos monoclonais de Setl medida através de citometria de fluxo:
Plasma para lise do complemento foi preparado através da retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos S-Monovette-EDTA vacutainer (Sarstedt, Niirmbrecht, Alemanha), que foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. O plasma foi colhido e armazenado a -20°C.
Num primeiro conjunto de experiências, os sobrenadantes de hibridoma foram analisados quanto sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). As células foram incubadas com os 115 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais 85A3, 28D10, 24H5 ou 26D12, respectivamente durante 20 min. à temperatura ambiente. Após centrifugação (5 min. a 450 g) o sobrenadante foi removido e plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) foi adicionado às células e incubado durante mais 20 min. a 37°C. Depois disso, a lise celular foi determinada em FACS utilizando o método de coloração de iodeto de propídio (PI) . PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 pg/ml. Para citometria de fluxo, foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Foram colhidos pelo menos 10000 eventos para análise com os restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FCS). A percentagem de células lisadas (células positivas para PI) é mostrada na Figura 19. Os anticorpos monoclonais 85A3, 28D10 e 26D12 induziram lise de 33,5%, 38,2% e 39,2%, respectivamente, das células HEK293-CLD18A2, enquanto a CDC mediada por 24H5 foi de apenas 19,3%. b. CDC de anticorpos monoclonais de Setl:
Num segundo conjunto de experiências foi analisada a especificidade dos anticorpos monoclonais para induzir CDC em células expressando CLD18A2. Portanto, um conjunto de anticorpos de ligação tanto específica para CLD18A2 humana como também ligando-se a CLD18A1 humana foi testado quanto à indução de CDC contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana (CHO-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (CHO-CLD18A1). Células CHO-CLD18A2 e CHO-CLD18A1 foram semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3xl04/poço em placas de microtitulação de cultura de tecidos de fundo plano. O meio de crescimento do dia seguinte foi removido e as células foram incubadas em triplicado com os sobrenadantes de hibridoma ajustados para uma concentração de 10 pg/ml, contendo os anticorpos monoclonais 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 3 8G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, e 61C2, respectivamente. As células de controlo foram incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo saponina a 0,2% ara a determinação da lise de fundo e da lise máxima, respectivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e foi adicionado plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) 116 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ às células e incubou-se mais 20 min. a 37°C. Em seguida, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etidio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm foi medida utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise especifica foi calculada como se segue: % de lise especifica = (fluorescência da amostra fluorescência de fundo)/(fluorescência da lise máxima fluorescência de fundo) χ 100. A Fig. 20 mostra que os anticorpos monoclonais 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 e 39F11 medeiam elevada CDC, o anticorpo monoclonal 38G5 medeia média CDC, os anticorpos monoclonais 41C6 e 61C2 medeiam baixa CDC, e os anticorpos monoclonais 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 e 47D12 não medeiam nenhuma CDC contra células CHO-CLD18A2. Em contraste, nenhum dos anticorpos é capaz de induzir CDC contra células CHO-CLDA1, embora 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 e 61C2 também se liguem a CLD18A1, tal como determinado através de citometria de fluxo e imunofluorescência. c. Titulação dos anticorpos monoclonais e CDC utilizando anticorpos monoclonais de Setl:
Para medir a capacidade dos anticorpos anti-CLD18 para induzir CDC a baixas concentrações, foi realizada uma experiência em que foram titulados três anticorpos diferentes. As células CHO-CLD18A2 criadas em placas de microtitulação foram incubadas com um intervalo de concentrações de 75B8 (100, 30, 10, 3 e 1 pg/ml), 37H8 (10, 3,3 e 1 pg/ml) e 28D10 (10, 1 e 0,1 pg/ml), respectivamente, durante 20 min. à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e foi adicionado às células plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) e incubou-se durante mais 20 min. a 37°C. Antes da análise utilizando um Tecan Safire, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etidio. As Figuras 21A-C mostram a percentagem de lise especifica em função da concentração de anticorpo. O anticorpo monoclonal 75B8 induz lise de 31,0% de células CHO-CLD18A2 a 10 pg/ml, e cai para 6,2% a 1 pg/ml (Fig. 21A) , enquanto os anticorpos monoclonais 28D10 e 37H8 ainda induzem 39% e 26,5% de lise especifica a 1 pg/ml (Fig. 21B, C) , respectivamente. 117 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ d. CDC de anticorpos monoclonais de Set2 medida através de citometria de fluxo:
Soro para lise de complemento foi preparado através da retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos Serum-Monovette vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha) que foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. O soro foi colhido e armazenado a -20°C. Soro de controlo foi inactivado por calor a 56°C durante 30 min antes do armazenamento.
Os sobrenadantes de hibridoma foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana. As células foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma brutos ou purificados contendo os anticorpos monoclonais 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10, respectivamente, durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubou-se durante mais 30 min. a 3 7°C. Em seguida, a lise celular foi determinada em FACS através da utilização do método de coloração de iodeto de propidio (PI) . PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 pg/ml. Para citometria de fluxo foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Foram colhidos pelo menos 10000 eventos para análise com restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FSC/SSC). A lise específica foi calculada através da seguinte fórmula: lise específica = (% de células positivas para PI na amostra - % de células positivas para PI na amostra com soro inactivado por calor) . Foi observada robusta lise mediada por CDC em particular para 163E12. 6. Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)
Os sobrenadantes dos hibridomas foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células HEK293 expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (HEK293-CLD18A1). 118 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ a. Enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico humano: Sangue humano de dadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão fosfato (PBS) e as células sanguíneas foram vertidas sobre Ficoll (Lymphocyte Separation Médium a 1077 g/ml, PAA Laboratories, no. de cat. J15-004) . As células mononucleares do sangue periférico (MNC) foram colhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo inactivado por calor a 10%, L-glutamina 2 mM. b. Configuração de ADCC: As células alvo foram marcadas com um ligando estimulador de fluorescência (BADTA, estojo de ensaio de citotoxicidade de Perkin Elmer DELFIA Citotoxicity Reagents EuTDA, no. de cat. AD0116) durante 30 minutos. Após lavagem extensiva em RPMI-10 suplementado com probenecida 10 mM (Sigma, no. de cat. P8761), HEPES 10-20 mM, e soro fetal de vitelo inactivado por calor a 10%, as células foram ajustadas a lxlO5 células/ml. As células alvo marcadas, as células efectoras (MNC), e os sobrenadantes contendo anticorpos monoclonais ajustados a uma concentração de 10 yg/ml foram adicionados a placas de microtitulação de fundo redondo. Para as células efectoras isoladas, foi utilizada uma razão de efector para alvo (E:T) de 100:1 (dados não mostrados para 50:1 e 25:1). Após incubação (2 horas, 37°C), os ensaios foram parados através de centrifugação, e a libertação do ligando de fluorescência dos duplicados foi medida em contagens de európio num fluorómetro de resolução temporal. A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % de lise específica = (contagens de libertação experimental - contagens de libertação espontânea)/(contagens de libertação máxima -contagens de libertação espontânea) χ 100, com a libertação de ligando de fluorescência máxima determinada através da adição de Triton X-100 (concentração final de 0,25%), para as células alvo, e a libertação espontânea medida na ausência de anticorpos e células efectoras. A Figura 22 mostra que os anticorpos monoclonais 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2 medeiam ADCC contra células HEK293-CLDl8A2. Em contraste, estes anticorpos não induzem citotoxicidade significativa ou induzem apenas um nível baixo em alvos de CLD18A1 demonstrando uma ADCC específica de CLD18A2 (Figura 23). 119 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 7. Inibição da proliferação
Os anticorpos monoclonais de murídeo purificados foram analisados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento celular de células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana. lxlO4 células alvo expressando endogenamente CLD18A2 (KATO-III) foram cultivadas na presença de aproximadamente 10 pg de anticorpos monoclonais. O Estojo de Proliferação Celular DELFIA (Perkin-Elmer, No. de Cat. AD0200) é um imunoensaio não isotópico baseado na medição da incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante a sintese de ADN de células em proliferação em microplacas. O BrdU incorporado é detectado utilizando anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a detecção do anticorpo, as células são fixadas e o ADN desnaturado utilizando solução Fix. O anticorpo não ligado é lavado e é adicionado indutor DELFIA para dissociar os iões de európio do anticorpo marcado para a solução, onde formam quelatos altamente fluorescentes com os componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando na detecção fluorometria resolvida no tempo - é proporcional à sintese de ADN na célula de cada poço.
Uma forte inibição da proliferação foi observada com os anticorpos 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 e 166E2, respectivamente. Uma inibição moderada da proliferação foi observada com os anticorpos de murideo 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 e 38H3, respectivamente. 8. Desempenho em modelos terapêuticos de xenoenxerto de ratinho O potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais identificados ligando-se especificamente a CLD18A2 foi estudado em modelos terapêuticos de xenoenxerto. a. Tratamento precoce de tumores expressando altamente CLD18A2 em ratinhos 120 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Ratinhos SCID foram inoculados subcutaneamente com lxlO7 células HEK293 expressando estavelmente níveis elevados de CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). Os níveis de expressão de CLD18A2 humana em células HEK293-CLD18A2 foram comparáveis com os níveis de expressão em cancros gástricos primários dos pacientes. Cada grupo de tratamento experimental foi constituído por 10 ratinhos (número de ratinhos por grupo n=10). A terapia dos ratinhos começou 3 dias após a inoculação do tumor. 200 mg de sobrenadantes de hibridoma representando os anticorpos monoclonais de murídeo 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3, ou 61C2 foram injectados uma vez por semana durante 4 semanas por via intravenosa. Alternativamente, 200 yg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murídeo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injecção intravenosa e intraperitoneal. O crescimento tumoral dos ratinhos tratados foi monitorizado duas vezes por semana (Volume Tumoral = Comprimento χ Largura x Altura dividido por 2 em mm3) . Os ratinhos foram mortos quando o tumor atingia um volume de 500 mm3 ou em caso de morbidez grave. A Fig. 24 exemplifica uma inibição robusta do crescimento de células tumorais HEK293-CLD18A2 através dos anticorpos do invento. As Fig. 25A e 25B mostram o prolongamento da sobrevivência através do tratamento com anticorpos do invento num modelo de tratamento precoce de xenoenxerto utilizando células HEK293-CLD18A2. b. Tratamento de início tardio de tumores avançados expressando altamente CLD18A2 em ratinhos O mesmo modelo de xenoenxerto tumoral baseado em células HEK2 93-CLD18A2 foi concebido como um protocolo de início tardio de terapia em oposição ao tratamento precoce descrito acima. No dia 27 após a inoculação das células tumorais, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de teste cada um compreendendo 5-6 ratinhos e a terapia foi iniciada com 200 yg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murídeo 43A11, 163E12, e 175D10, respectivamente. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injecção intravenosa e intraperitoneal. Também neste modelo mostrou-se que os 121 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ anticorpos do invento inibem o crescimento tumoral. Para vários anticorpos isto resultou no prolongamento da sobrevivência (Fig. 26). c. Tratamento precoce de tumores expressando níveis baixos de CLD18A2
Ratinhos SCID foram inoculados subcutaneamente com 2xl05 células da linha celular tumoral DAN-G, uma linha celular de adenocarcinoma pancreático humano infiltrante que expressa constitutivamente a proteína CLD18A2 a um nível baixo. 0 tratamento de ratinhos (10 por grupo) foi iniciado 3 dias após o enxerto do tumor: 200 yg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murídeo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injecção intravenosa e intraperitoneal. Devido ao crescimento do tumor agressivo e rápido da linha celular tumoral pancreática DAN-G in vivo os ratinhos desenvolveram caquexia tumoral e morreram dentro de alguns dias. Mesmo assim, como consequência, a janela para medição dos efeitos terapêuticos foi estreita, a inibição do crescimento tumoral e a sobrevivência prolongada mediada pelos anticorpos do invento foi também observada neste modelo (Fig. 27A e 27B). d. Os anticorpos do invento não desencadeiam efeitos secundários em ratinhos
Um par de iniciadores específicos de CLD18A2 de murídeo (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) foi utilizado em análises de RT-PCR para amplificar o ADNc derivado de um amplo painel de tecidos normais de ratinho (ver Fig. 28). A expressão de CLD18A2 de murídeo não foi detectável em nenhum dos tecidos normais testados, excepto no estômago (ver Fig. 28). Além disso, um anticorpo específico de CLD18A2, que reage de forma cruzada com CLD18A2 humana e de ratinho, foi utilizado para análise imuno-histoquímica da expressão de CLD18A2 num grande painel de tecidos de ratinho normais (ver Tab. 3). Com excepção do tecido gástrico normal nenhum dos tecidos normais testados mostra expressão de CLD18A2. Tal 122 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ como se observou para a CLD18A2 humana, também verificámos para o equivalente de ratinho que embora as células epiteliais da superfície e as mais profundas da cripta expressem CLD18A2 na sua superfície celular, a reqião central do pescoço é negativa para CLD18A2 (ver Fig. 29A-C) . Em resumo, a distribuição tecidual de CLD18A2 parece ser idêntica no homem e nos ratinhos.
Tab. 3: Expressão de CLD18 em tecidos normais de ratinho analisada através de imuno-histoquimica tecido expressão de CLD18 cerebelo cérebro - cólon - esófago coração - rim - fígado pulmão - nódulo linfático ovário - pâncreas músculo esquelético baço estômago + timo - bexiga
Investigámos ainda os potenciais efeitos secundários mediados pelos anticorpos 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 em ratinhos. Tinha sido previamente demonstrado através de análise FACS que todos estes anticorpos reagem com a CLD18A2 de murídeo bem como com a proteína humana.
Nem foram observados quaisquer efeitos secundários nos ratinhos durante e após o tratamento com estes anticorpos, nem foram observadas quaisquer correlações histomorfológicas de toxicidade na mucosa gástrica dos ratinhos tratados com os anticorpos em comparação com os não tratados (tratados com PBS) (ver Figura 30). 123 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 9. Quimerização de Anticorpos a. Geração de anticorpos monoclonais quiméricos ratinho/humano ARN total e subsequentemente ADNc de cadeia simples foi preparado a partir de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e a partir de tecido do baço humano através de métodos padrão conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo utilizando RNeasy Midi Kit (Qiagen) e a transcriptase inversa Superscript II (Invitrogen). A região constante da cadeia leve capa humana foi amplificada a partir de ADNc de PBMC através de PCR. 0 oligómero com sentido (SEQ ID NO: 38) adicionou um local de restrição BamHI na extremidade 5' da região constante e mudou a sequência de ácido nucleico original 5'-CGAACT-3' codificando para os dois primeiros aminoácidos (Arg-Thr) da região constante para 5'-CGTACG-3', gerando um local de restrição BsiWI sem mudar a sequência de aminoácidos. 0 oligómero anti-sentido (SEQ ID NO: 39) incluiu um codão de terminação e adicionou um local de restrição Notl na extremidade 3' da região constante amplificada. 0 produto de PCR bem como um vector de expressão padrão (por exemplo pcDNA3.1(+), Invitrogen) foram incubados sequencialmente com as enzimas de restrição BamHI e Notl. 0 vector foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo para prevenir recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vector, de modo a que qualquer futura fusão de uma região variável em frente da região constante fosse agora possivel através de um local de restrição HindIII (5'-AAGCTT-3') do local de múltipla clonagem do vector residual e através do local de restrição BsiWI (5'-CGTACG-3') gerado com o produto de PCR. A sequência da região constante da cadeia leve capa humana inserida no vector está listada como SEQ ID NO: 40, a sequência de aminoácidos da região constante capa humana está listada como SEQ ID NO: 41. A região constante da cadeia pesada gama-1 humana foi amplificada a partir do ADNc do baço através de PCR. O oligómero com sentido fosforilado a 5' (SEQ ID NO: 42) foi colocado sobre o local de restrição Apal de ocorrência 124 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ natural, localizado 11 nucleótidos a jusante do início da região constante, e adicionou um local de restrição HindIII na extremidade 5' da parte amplificada da região constante. 0 oligómero anti-sentido fosforilado a 5' (SEQ ID NO: 43) incluiu um codão de terminação e adicionou um local de restrição Notl na extremidade 3' da região constante assim amplificada. 0 produto de PCR assim gerado foi terminado de forma cega e fosforilado a 5'. A região constante gama amplificada foi verificada ser da subclasse IgGl através de PCR com um oligómero anti-sentido discriminador (SEQ ID NO: 44), e através de sequenciação. Um vector de expressão padrão (p. ex., pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen) com uma resistência a um antibiótico diferente (por exemplo higromicina) da do vector utilizado para expressão da cadeia leve (por exemplo neomicina) foi incubado com a enzima de restrição Pmel para remover completamente o local de clonagem múltipla deixando extremidades cegas. 0 vector foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo para prevenir a recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vector, de modo a que qualquer futura fusão de uma região variável em frente da região constante fosse agora possível através do local de restrição HindIII (5'-AAGCTT-3') e através do local de restrição Apal (5'-GGGCCC-3'), ambos gerados com o produto de PCR. A orientação correcta da região constante no vector, isto é, adequada para o promotor precedente do vector, foi verificada através de sequenciação. Devido à posição do local de restrição Apal, qualquer amplificação de uma região variável para este fim tem de incluir os primeiros 11 nucleótidos da sequência da região constante gama-1 humana além da sequência do local Apal. A sequência da região constante de cadeia pesada gama-1 humana assim amplificada inserida no vector está listada como SEQ ID NO: 45, a sequência de aminoácidos da região constante gama-1 humana assim expressa está listada como SEQ ID NO: 46. 125 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Tab. 4: Linhas celulares de hibridoma de ratinho utilizadas para clonagem dos anticorpos clone mAb Isotipo região par de anticorpo variável oligómeros em tornado PCR quimérico cadeia 43A11 182- IgG2a SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: pesada D1106- 062 55, 132 70, 71 100, 115 163E12 182- IgG3 SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 294 KO LO 133 72, 73 101, 116 125E1 182- IgG2a SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 279 57, 134 74, 75 102, 117 166E2 182- IgG3 SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 308 59, 136 78, 79 104, 119 175D10 182- IgGl SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 362 58, 135 76, 77 103, 118 45C1 182- IgG2a SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D758- 187 60, 137 80, 81 105, 120 cadeia 43A11 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: leve D1106- 062 62, 139 84, 85 107, 122 163E12 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 61, 138 82, 83 106, 121 294 125E1 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 279 63, 140 86, 87 108, 123 166E2 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 308 66, 143 92, 93 111, 126 175D 10 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D1106- 362 65, 142 90, 91 110, 125 45C1 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D758- 187 64, 141 co co 89 109, 124 45C1 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D758- 187 67, 144 94, 95 112, 127 45C1 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D758- 68, 145 96, 97 113, 128 187 45C1 182- IgK SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: D758- 187 69, 146 co 99 114, 129 126 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Correspondendo aos seus equivalentes de murídeo, os anticorpos monoclonais quiméricos foram nomeados adicionando o prefixo "ch-", p. ex. ch-43All, ch-163E12, ch-125El, ch- 166E2, ch-175D10, ch-45Cl. A amplificação das regiões variáveis de murídeo das cadeias leves e pesadas foi realizada de acordo com o método "step-out PCR" descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, N° 6) . Para isso, ARN total foi preparado a partir de linhas celulares de hibridomas monoclonais (ver Tab. 4.) através de métodos padrão conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo com a utilização de RNeasy Mini Kit (Qiagen) . 0 ADNc de cadeia simples foi preparado de acordo com o método "template-switch", também descrito em Matz et al. (Nucleic Acids
Research, 1999, vol. 27, No. 6, 1558) . Além de um oligómero (dT)30 (SEQ ID NO: 47), incluiu um oligómero híbrido ADN/ARN (SEQ ID NO: 48) servindo como um adaptador 5' para mudança de molde durante a polimerização da cadeia de ADNc. Neste oligómero adaptador os últimos três nucleótidos foram ribo em vez de desoxirribonucleótidos. A subsequente "step-out PCR" utilizou um oligómero anti-sentido direccionado à região constante da cadeia capa de ratinho ou à região constante das subclasses 1, 2a ou 3 das cadeias gama (SEQ ID NO: 49 a 52, respectivamente). As subclasses de IgG do anticorpo monoclonal de murídeo produzidas pelas linhas celulares de hibridoma foram antes analisadas imunologicamente com IsoStrip (ver Exemplo 1), e o oligómero anti-sentido apropriado foi escolhido em conformidade (ver Tab. 4) . Uma mistura de iniciadores serviu como oligómero com sentido no "step-out PCR", compreendendo os dois oligómeros listados em SEQ ID NO: 53 e 54. Algumas linhas celulares de hibridoma expressaram mais do que uma cadeia pesada ou leve (para além das cadeias expressas pela linha celular de mieloma utilizada para a geração de hibridomas). A Tabela 4 resume as SEQ ID NO das regiões variáveis clonadas e sequenciadas das cadeias de anticorpo de murídeo (SEQ ID NO: 55 a 69 e SEQ ID NO: 132 a 146) e das cadeias de anticorpo quimérico inteiras clonadas e sequenciadas (SEQ ID NO: 100 a 129).
As regiões variáveis de murídeo identificadas foram então amplificadas por PCR omitindo a 5' UTR e a região 127 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ constante de ratinho a 3' , adicionando locais de restrição nas extremidades que permitiram a subclonagem nos vectores de expressão preparados transportando as regiões constantes humanas. Além disso, os oligómeros com sentido proporcionaram uma sequência de Kozak de consenso (5'-GCCGCCACC-3' ou 5'-AGCCACC-3') e os oligómeros anti-sentido para as regiões variáveis das cadeias pesadas incluíram os primeiros 11 nucleótidos da região constante gama-1 humana além do local de restrição Apal (ver Tab. 4, SEQ ID NO: 70 a 99) . As regiões variáveis das cadeias leves capa foram clonadas utilizando as enzimas de restrição HindIII e BsiWI, as regiões variáveis das cadeias pesadas gama exigiram as enzimas de restrição HindIII e Apal. A região variável da cadeia pesada gama do anticorpo monoclonal 45C1 continha um local de restrição HindIII interno - aqui, foi utilizada em vez dessa a enzima Bsal compatível (ver SEQ ID NO: 80) . SEQ ID NO: 100 a 114 mostram as sequências de ácido nucleico dos anticorpos tornados quiméricos resultantes (ver Tab. 4). SEQ ID NO: 115 a 129 mostram as sequências de aminoácidos dos anticorpos tornados quiméricos expressos em conformidade (ver Tab. 4). b. Geração e Produção de Anticorpos Quiméricos Contra CLD18
Foram geradas linhas celulares de mamífero produtoras de anticorpos quiméricos com especificidade para CLD18. As linhas celulares derivadas de células HEK293T (ATCC CRL-11268). Um dia antes da transfecção, 2,5xl07 células foram plaqueadas numa caixa de cultura de tecidos de 14,5 cm e cultivadas em 20 ml de meio completo, ou alternativamente foram plaqueadas lxlO7 células numa caixa de cultura de tecidos de 10 cm e cultivadas em 10 ml de meio completo, ou alternativamente foram plaqueadas Ο,βχΙΟ6 células num poço de uma placa de tecidos de 12 poços e cultivadas em 2-3 ml de meio completo (meio completo: meio DMEM:F12 suplementado com FBS a 10% sem antibióticos). A densidade celular recomendada no momento da transfecção deve ser de 90% de confluência. Imediatamente antes da transfecção, o meio foi substituído por meio fresco. As células HEK293T foram transfectadas com reagentes de transfecção, p. ex. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019), ou, alternativamente, 128 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ polietilenimina (Sigma-Aldrich, 408727). Exemplificado para transfecção de células HEK293T foi utilizada uma quantidade de ADN total de 110 pg ou 296 pg para uma caixa de cultura de tecidos de 14,5 cm, e a razão de agente de transfecção para ADN foi de 1:2,5 e 1:12 para Lipof ectamine 2000 e PEI, respect ivamente. 24 h após a transfecção o meio foi substituído com um meio adequado de GMP, p. ex. X-Vivo 15 (Cambrex) ou um meio químico definido como Pro293a (Cambrex) sem soro. As células HEK293T transfectadas produtoras de anticorpos monoclonais quiméricos contra CLD18 foram cultivadas durante mais 96 h. Os sobrenadantes em bruto foram colhidos, esterilizados por filtração e purificados através de proteína A-Sepharose. A concentração de anticorpo foi determinada através de Ensaio BCA e a pureza verificada por electroforese em gel com dodecilsulfato de sódio e coloração Coomassie. c. Caracteristicas de Ligação de Anticorpos Monoclonais Quiméricos A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos clonados e gerados para CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 3. Células HEK293 vivas expressando estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 expressando estavelmente CLD18A1 humana (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com os sobrenadantes de cultura de células HEK293T purificados contendo anticorpos monoclonais quiméricos, seguido por incubação com fragmento F(ab')2 de anticorpo secundário de cabra anti-Fcy de IgG humana conjugado com APC e contrastadas com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray.
De modo semelhante, linhas celulares tumorais humanas expressando endogenamente CLD18A2, por exemplo células KATO-III e NUGC-4, foram analisadas através de citometria de fluxo. A Fig. 31A e B mostram análises de citometria de fluxo dos anticorpos quiméricos ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2, e ch-175D10. Todos eles mostram reconhecimento do 129 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ epitopo nativo e exibem ligação especifica e forte a células expressando CLD18A2 mas não CLD18A1. d. Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) 0 soro para a lise do complemento foi preparado através de retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos Serum-Monovette vacutainer (Sarstedt, Niirmbrecht, Alemanha) que foram então centrifugados a 600 g durante 20 min. O soro foi colhido e armazenado a -20°C. O soro de controlo foi inactivado por calor a 56°C durante 30 min antes do armazenamento.
Os anticorpos quiméricos purificados por Proteína A-Sepharose deste invento foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana, bem como células CHO-CLD18A2 estavelmente transfectadas. As células foram incubadas com anticorpos monoclonais ch-163E12, ch-166E2, e ch-175D10, respectivamente, numa concentração final de 2,5 yg/ml a 35 pg/ml durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubou-se durante mais 30 min. a 37°C. Posteriormente, as células mortas e vivas foram discriminadas através de coloração de PI numa concentração final de 2,5 pg/ml e a percentagem de lise celular mediada por anticorpos foi determinada através de citometria de fluxo. Para a análise por citometria de fluxo foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Pelo menos 10000 eventos foram colhidos para análise com os restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FSC/SSC). A lise específica foi calculada através da fórmula seguinte: lise específica = (% de células positivas para PI na amostra - % de células positivas para PI na amostra com soro inactivado por calor) . A lise específica mediada por CDC foi mostrada para vários anticorpos. Todos os três anticorpos mediaram uma CDC robusta em células CHO-CLD18A2 (Figura 32). Em células KATO-III os anticorpos ch-163E12 e ch-175D10 foram indutores de uma CDC robusta. 130 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ e. Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)
Os anticorpos quiméricos purificados por FPLC do invento foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana.
Sangue humano de dadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão fosfato (PBS) e as células sanguíneas foram vertidas em Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia). Após centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram colhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura X-Vivo-15 suplementado com soro humano inactivado por calor a 5%. 15 h antes do ensaio, as células KATO-III foram transfectadas com luciferase e plaqueadas a 5xl04 células/poço numa microplaca branca.
Para o ensaio, as células efectoras (PBMC, preparadas tal como descrito acima) a uma razão de efector para alvo (E:T) de 20:1 e os anticorpos quiméricos purificados por FPLC foram adicionados e incubou-se durante 2-3 h a 37°C, CO2 a 5%. A concentração final do anticorpo no poço foi de 50 pg/ml. Após 2-3 h de pré-incubação, foi adicionado amarelo Lúcifer (BD Biosciences, San Jose EUA) a 1 mg/ml. A luminescência resultante da oxidação do Amarelo Lúcifer através da luciferase das células viáveis foi medida continuamente durante até 6 h utilizando um leitor de microplacas (Infinite200, Tecan, Suíça). A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % de lise específica = 100-((contagens de luminescência da amostra - contagens de luminescência espontânea)/(contagens de luminescência máxima - contagens de luminescência espontânea) χ 100), com a luminescência espontânea determinada através da adição de Triton X-100 (concentração final de 0,2%) e o sinal máximo medido na ausência de anticorpos. 131 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Utilizando este ensaio, foi mostrado que os anticorpos monoclonais ch-163E12 e ch-175D10 medeiam uma forte ADCC em células KATO-III (Fig. 33). f. Inibição da Proliferação
Os anticorpos quiméricos purificados por FPLC do invento foram analisados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento celular de células KATO-III expressando endogenamente CLD18A2 humana.
As células alvo (KATO-III) foram cultivadas na presença dos respectivos anticorpos quiméricos (ver inibição da proliferação de anticorpos de murideo, Exemplo 7). Mostrou-se que os anticorpos quiméricos purificados por FPLC ch-163E12 e ch-166E2 inibem a proliferação celular. 10. Selecção de anticorpos como candidatos a lideres clinicos
Os lideres clínicos óptimos podem cobrir uma ampla variedade de aplicações terapêuticas e de diagnóstico (ver também secção IV - Utilizações e Métodos do Invento). De acordo com o invento, são proporcionados anticorpos dirigidos para CLD18-A2. É mostrado que os anticorpos proporcionados de acordo com o invento oferecem um largo espectro de propriedades em relação a especificidade, capacidade de induzir CDC e ADCC e inibir a proliferação de células que expressam CLD18, em particular células tumorais. Além disso, demonstrou-se que a quimerização de anticorpos pode conduzir à aquisição de mais funções efectoras dependentes de Fc que não estão presentes na molécula de murideo parental. Por exemplo, mostra-se aqui que o anticorpo 175D10 com IgGl de murideo não induz citotoxicidade dependente de complemento (ver Exemplo 5), enquanto ch-175D10 com IgGl humana induz lise específica de células tumorais expressando constitutivamente CLD18 (ver Tab. 5 e Tab. 6).
Os anticorpos proporcionados de acordo com o presente invento podem ser categorizados em classes distintas de acordo com as suas propriedades de ligação e a sua capacidade para mediar funções efectoras em células expressando CLD18. A 132 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ partir dos anticorpos proporcionados de acordo com o presente invento, os candidates a lideres clínicos podem ser seleccionados com base nas suas características funcionais. Uma perspectiva geral das propriedades dos anticorpos de murideo e quiméricos seleccionados do invento é dada na Tab. 5 e Tab. 6, respectivamente.
Os candidatos a lideres clínicos do invento podem ter uma ou mais das seguintes propriedades: a) ligação a CLD18A2 humana mas não a CLD18A1 humana (p. ex. 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10). Para exemplos, ver as figuras 6A e 6B. b) ligação a CLD18A2 de ratinho mas não a CLD18A1 de ratinho (p. ex. 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, ver as figuras 15A e 15B. c) ligação a CLD18 expressa naturalmente por células tumorais (p. ex. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-45Cl, ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10). Para exemplos, ver a figura 13. d) ligação a CLD18 em zonas de contacto intercelular (p. ex. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, ver as figuras 12A e 12B. e) mediação de morte induzida por CDC de células expressando CLD18 (p. ex. 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-163E12 e ch-175D10). Para exemplos, ver a figura 32. f) mediação de morte induzida por ADCC de células expressando CLD18 (p. ex. ch-163E12 e ch-175D10). Para exemplos, ver a figura 33. g) inibição da proliferação de células expressando CLD18 (p. ex. 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-163E12 e ch-166E2). h) inibição do crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto com células expressando CLD18 (p. ex. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10). Para exemplos, ver a figura 24. i) prolongamento da sobrevivência em modelos de xenoenxerto com células expressando CLD18 (p. ex. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, ver a figura 25B. 133 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Perspectiva exemplar das propriedades para selecção de candidatos a lideres
Tabela 5: Anticorpos de murídeo anticor po ligação a CLD18A2 humana mas não a AI ligaçao a CLD18A2 de ratinho mas não a AI ligação a CLD18 em células tumorais que a expressam natural mente ligação a CLD18 em zonas de conta cto mediação de CDC em células que expres sam CLD18 inibição da proliferação de células expressando CLD18 inibição do cresci mento tumoral em xenoen- xerto expres sando CLD18 prolongamento da sobrevivência em xenoen-xerto expressando CLD18 45C1 + - + + (+) + ( + ) ( + ) 125E1 + + + + (+) + + + 163E1 2 + + + + + + + + 175D1 0 + + + + (+) ( + ) + + Legenda: + excelente desempenho, (+) desempenho em diferentes cenários
Tabela 6: Anticorpos quiméricos anticorpo ligação a CLD18A2 humana mas não a AI ligação a CLD18 em células tumorais que a expressam naturalmente mediação de CDC em células expressando CLD18 mediação de ADCC em células expres sando CLD18 inibição da proliferação de células expressando CLD18 ch-45Cl + + n.r. n.r. n.r. ch-125El + + n.r. n.r. n.r. ch-163E12 + + + + + ch-175D10 + + + + n.r. Legenda: diferentes + excelente desempenho, cenários, n.r. não realizado. (+) desempenho em 134 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro
<130> 342-31PCT <150> EP 05 025 657.7 <151> 2005-11-24 <160> 150 <170> Patentln versão 3.3
<210> 1 <211> 786 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780 gtgtaa 786
<210> 2 <211> 261 <212> PRT 135 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 2
Met Ala Vai Thr Ala Cys Gin Gly Leu Gly Phe Vai Vai Ser Leu Ile 15 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr 20 25 30 136 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Vai Thr Ala Vai Phe Aan Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Vai Arg 65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Vai 85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Vai Ser 115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Vai Ser Vai Phe Ala Asn Met Leu Vai 130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175
Vai Gly Trp Vai Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Vai Met Met 180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205
Vai Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Vai Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Vai Gin Ser Tyr Pro Ser 245 250 255
Lys His Asp Tyr Vai 260 <210> 3 <211> 816 137
ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaããtyi-ci tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtgaa 480 caaaaactca tctcagaaga ggatctgggg atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca 540 tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg 600 atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct 660 tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc 720 tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag 780 gtacaatctt atccttccaa gcacgactat gtgtaa 816
<210> 4 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 138 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Met Ala Val Thr Ala Cys Gin Gly 1 5
Gly Ile Ala Gly He Ile Ala Ala 20
Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val 35 40
Leu Trp Arg ser cys val Arg Glu 50 55
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu 65 70
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val 85
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile
Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 10 15 Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr 25 30 Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gin Gly 45 Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys irg 60 Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg 75 80 Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 90 95 Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 139 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Vai Ser 115 120 125
Gly Leu Cys Ala lie Ala Gly Vai Ser Vai Phe Ala Asn Met Leu Vai 130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Glu 145 150 155 160
Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Met Vai Gin Thr Vai Gin 165 170 175
Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Vai Gly Trp Vai Ala Gly 180 185 190
Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Vai Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly 195 200 205
Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala Vai Ser Tyr His Ala Ser 210 215 220
Gly His Ser Vai Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly 225 230 235 240
Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg 245 250 255
Thr Glu Asp Glu Vai Gin Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Vai 260 265 270
<210> 5 <211> 813 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 140
ΕΡ 1 948 6 9 3/PT atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg egctcctgtg tccgagagag ctctggctte 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgtac ccatacgacg tgccagacta cgcactgggg 240 ctgccagcca tgctgcaggc agtgcgagcc ctgatgatcg taggcatcgt cctgggtgcc 300 attggcctcc tggtatccat cttcgccctg aaatgcatcc gcattggcag catggaggac 360 tctgccaaag ccaacatgac actgacctcc gggatcatgt tcattgtctc aggtctttgt 420 gcaattgctg gagtgtctgt gtttgccaac atgctggtga ctaacttctg gatgtccaca 480 gctaacatgt acaccggcat gggtgggatg gtgcagactg ttcagaccag gtacacattt 540 ggtgcggctc tgttcgtggg ctgggtcgct ggaggcctca cactaattgg gggtgtgatg 600 atgtgcatcg cctgccgggg cctggcacca gaagaaacca actacaaagc cgtttcttat 660 catgcctcgg gccacagtgt tgcctacaag cctggaggct tcaaggccag cactggcttt 720 gggtccaaca ccaaaaacaa gaagatatac gatggaggtg cccgcacaga ggacgaggta 780 caatcttatc cttccaagca cgactatgtg taa 813
<210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 141 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Met Ala Val Thr Ala Cys Gin Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr 20 25 30 Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gin Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile 85 90 95 Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys 100 105 110 Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu 115 120 125 Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly 130 135 140 Val Ser val Phe Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr 145 150 155 160
Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr 165 170 175 142 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Vai Gly Trp Vai Ala Gly Gly 180 185 190
Leu Thr Leu Ile Gly Gly Vai Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu 195 200 205
Ala Pro Glu Glu Thr Asn. Tyr Lys Ala Vai Ser Tyr His Ala Ser Gly 210 215 220 His Car Ua Ί ψ «A ^ M-, nxa Tyr Lys Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe 225 230 235 240 Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr 245 250 255 Glu Asp Glu Vai Gin Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 260 265 270
<210> 7 <211> 786 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 atgtccacca ccacatgcca agtggtggcg ttcctcctgt ccatcctggg gctggccggc 60 tgcatcgcgg ccaccgggat ggacatgtgg agcacccagg acctgtacga caaccccgtc 120 acctccgtgt tccagtacga agggctctgg aggagctgcg tgaggcagag ttcaggcttc 180 accgaatgca ggccctattt caccatcctg ggacttccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 430 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780 gtgtaa 786
<210> 8 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens 143 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 8
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gin Vai Vai Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Vai Thr Ser Vai Phe Gin Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Vai Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Vai 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Vai Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Vai Ser Vai Phe Ala Asn Met Leu Vai 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Vai Gly Trp Vai Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Vai Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn TS/r *; - Τ.Λ/α ~1 ~ Ala 195 200 205 Vai Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Vai Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Vai Gin Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 144 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Lys His Asp Tyr Vai 260
<210> 9 <211> 795 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 9 atggccacca ccacgtgcca ggtggtaggg cttctcctgt ccctcctggg tctggccggc 60 tgcatagccg ccactgggat ggacatgtgg agcactcaag acctgtatga caacccagtc 120 accgccgtgt tccagtatga agggctctgg aggagttgcg tgcaacagag ctcggggttc 180 accgagtgcc ggccatactt caccatcctg ggccttccag ccatgctgca agctgtacga 240 gccctgatga tcgtgggcat tgttctgggg gtcatcggta tcctcgtgtc catcttcgcc 300 ctgaagtgca ttcgcattgg tagcatggat gactctgcca aggccaagat gactctgact 360 tctgggatct tgttcatcat ctccggcatc tgtgcaatca ttggtgtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacagcgg catgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacacct ttggtgcagc tctgttcgtg 540 ggctgggttg ctggaggcct caccctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcctgccgt 600 ggcctgacac cagatgacag caacttcaaa gctgtgtctt accatgcctc tggccaaaat 660 gttgcctaca ggcctggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgcccgcaca gaagacgatg aacagtctca tcctaccaag 780 tatgactatg tgtag 795
<210> 10 <211> 795 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 10 atgtcggtga ccgcctgcca atcattgcag ccacttgtat accgctgtat tcaactacca accgagtgcc gaggctactt gccctgatga tcgtgggcat ctgaagtgca ttcgcattgg tctgggatct tgttcatcat aacatgctgg tgaccaactt gggcttgggg tttgtggtgt ggaccagtgg agcacccagg agggctatgg cgttcatgcg caccctgttg gggttgccag tgttctgggg gtcatcggta tagcatggat gactctgcca ctccggcatc tgtgcaatca ctggatgtcc acagctaaca cactgatcgg gtttgcgggc atttatacaa caacccggtg tccgagagag ctctggcttc ccatgctgca agctgtacga tcctcgtgtc catcttcgcc aggccaagat gactctgact ttggtgtgtc tgtgtttgcc tgtacagcgg catgggcggc 60 120 180 240 300 360 420 480 145 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ atgggtggca ggctgggttg ggcctgacac gttgcctaca aagaagatct tatgactatg tggtgcagac etggaggect cagatgacag ggcctggagg acgatggggg tgtag cgttcagacc caccctgatt caacttcaaa ctttaaggcc tgcccgcaca aggtacacct gggggagtga gctgtgtctt agcactggct gaagacgatg ttggtgcagc tgatgtgcat accatgcctc ttgggtccaa aacagtctca tctgttcgtg cgcctgccgt tggccaaaat caccagaaac tcctaccaag 540 600 660 720 780 795 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 11 tggctctgtg tcgacactgt g <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 12 gtgtacatgt tagctgtgga c 21
<210> 13 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 146 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ Met Asp Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Vai Thr Ser 15 10 15
Vai Phe Gin Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Gin Ser Ser 20 25 30
Gly Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Met Leu Gin Ala Vai Arg Ala 50 55 <210> 14 <211> 153 <212> PRT <213> Homo <400> 14 Met Asp Met sapiens 1
Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Vai Thr Ser 5 10 15
Vai Phe Gin
Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Gin Ser Ser 20 25 30
Gly Phe Thr 35
Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 40 45
Met Leu Gin 50
Ala Vai Arg Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai Leu Gly 55 60
Ala Ile Gly 65
Leu Leu Vai Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile 70 75 80
Gly Ser Met
Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 85 90 95
Ile Met Phe
Ile Vai Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Vai Ser Vai 100 105 110
Phe Ala Asn Met 115
Leu Vai Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met 120 125
Tyr Thr Gly Met 130
Gly Gly Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr 135 140
Phe Gly Ala Ala Leu Phe Vai Gly Trp 145 150 147 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 15 <211> 390 <212> ADN<213> Homo sapiens <400> 15 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttggtaccga gctcggatcc 120 actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcatggacc agtggagcac ccaagacttg 180 tacaacaacc ccgtaacagc tgttttcaac taccaggggc tgtggcgctc ctgtgtccga 240 gagagctctg gcttcaccga gtgccggggc tacttcaccc tgctggggct gccagccatg 300 ctgcaggcag tgcgagcggc catccagcac agtggcggcc gctcgaggag ggcccgaaca 360 aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag 390 <210> 16 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 16
Met Glu Thr Asp Thr 1 5
Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp 20
Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 25 30
Lys Leu Gly Thr Glu 35
Leu Gly Ser Thr Pro Vai Trp Trp Asn Ser Ala 40 45
Asp Gly Arg Met Asp 50
Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro 55 60
Vai Thr Ala Vai Phe 65
Asn Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg 70 75 80
Glu Ser Ser Gly Phe 85
Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly 90 95
Leu Pro Ala Met Leu 100
Gin Ala Vai Arg Ala Ala Ile Gin His Ser Gly 105 110
Gly Arg Ser Arg Arg 115
Ala Arg Thr Lys Thr His Leu Arg Arg Gly Ser 120 125
Glu 148 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
<210> 17 <211> 411 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc catacgaagc ttggtaccga gctcggatcc 120 actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcgccctga tgatcgtagg catcgtcctg 180 ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat gcatccgcat tggcagcatg 240 gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acatccggga tcatgttcat tgtctcaggt 300 ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacgcgg ccatccagca cagtggcggc 360 cgctcgagga gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata g 411
<210> 18 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens 149 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 18
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 15 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lye Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Pro Vai Trp Trp Asn Ser Ala 35 40 45
Asp Gly Arg Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai Leu Gly Ala Ile Gly 50 55 60
Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg ile Gly Ser Met 65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe 85 90 95
Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 100 105 110
Ala Ala Ile Gin His Ser Gly Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lys 115 120 125
Thr His Leu Arg Arg Gly Ser Glu 130 135
<210> 19 <211> 531 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgccatg gaccagtgga gcacccaaga cttgtacaac 120 aaccccgtaa cagctgtttt caactaccag gggctgtggc gctcctgtgt ccgagagagc 180 tctggcttca ccgagtgccg gggctacttc accctgctgg ggctgccagc catgctgcag 240 gcagtgcgag ccctgatgat cgtaggcatc gtcctgggtg ccattggcct cctggtatcc 300 atctttgccc tgaaatgcat ccgcattggc agcatggagg actctgccaa agccaacatg 360 acactgacct cogggatcat gttcattgtc tcaggtcttt gtgcaattgc tggagtgtct 420 gtgtttgcca acatgctggt gactaacttc tggatgtcca cagctaacat gtacaccggc 480 531 atgggtggga tggtgcagac tgttcagacc aggtacacat ttggtgcgta g 150 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
<210> 20 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Met Asp Gin 20 25 30 Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Vai Thr Ala Vai Phe Asn 35 40 45 Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr 50 55 60 Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin 65 70 75 80 Ala Vai Arg Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai Leu Gly Ala Ile Gly 85 90 95 Leu Leu Vai Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met 100 105 110 Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe 115 120 125 Ile Vai Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Vai Ser Vai Phe Ala Asn 130 135 140 Met Leu Vai Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 145 150 155 160 Met Gly Gly Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175
<210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens 151 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 21
Asp Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Aan 15 10
<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Asn Asn Pro Vai Thr Ala Vai Phe Asn Tyr Gin 15 10
<210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Vai Thr Ala Vai Phe 15 10
<210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Asp Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro 15 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 15 10
<210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 15 10 152 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
<210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly He 15 10
<210> 28 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Met Asp Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Vai Thr Ala 15 10 15
Vai Phe Asn Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Glu Ser Ser 20 25 30
Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45
Met Leu Gin Ala Vai Arg Ala 50 55
<210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys 15 10 15
Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 20
<210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens 153 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 30
Ala Asn Met Leu Vai Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Met Gly Gly Met Vai Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe 20 25 30 Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 35 40 <210> 31 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Asp Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala 1 5 10 15 Vai Phe Asn Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Met Leu Gin Ala val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly 50 55 60 Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 85 90 95 Ile Met Phe Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val 100 105 110 Phe Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met 115 120 125 Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr 130 135 140 Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 150 154 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
<210> 32 <211> 3359 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 cacaccttcg gcagcaggag ggcggcagct tctcgcaggc ggcagggcgg gcggccagga 60 tcatgtccac caccacatgc caagtggtgg cgttcctcct gtccatcctg gggctggccg 120 gctgcatcgc ggccaccggg atggacatgt ggagcaccca ggacctgtac gacaaccccg 180 tcacctccgt gttccagtac gaagggctct ggaggagctg cgtgaggcag agttcaggct 240 tcaccgaatg caggccctat ttcaccatcc tgggacttcc agccatgctg caggcagtgc 300 gagccctgat gatcgtaggc atcgtcctgg gtgccattgg cctcctggta tccatctttg 360 ccctgaaatg catccgcatt ggcagcatgg aggactctgc caaagccaac atgacactga 420 155 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ cctccgggat catgttcatt gtctcaggtc tttgtgcaat tgctggagtg tctgtgtttg 480 ccaacatgct ggtgactaac ttctggatgt ccacagctaa catgtacacc ggcatgggtg 540 ggatggtgca gactgttcag accaggtaca catttggtgc ggctctgttc gtgggctggg 600 tcgctggagg cctcacacta attgggggtg tgatgatgtg catcgcctgc cggggcctgg 660 caccagaaga aaccaactac aaagccgttt cttatcatgc ctcaggccac agtgttgcct 720 acaagcctgg aggcttcaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaaa aacaagaaga 780 tatacgatgg aggtgcccgc acagaggacg aggtacaatc ttatccttcc aagcacgact 840 atgtgtaatg ctctaagacc tctcagcacg ggcggaagaa actcccggag agctcaccca 900 aaaaacaagg agatcccatc tagatttctt cttgcttttg actcacagct ggaagttaga 960 aaagcctcga tttcatcttt ggagaggcca aatggtctta gcctcagtct ctgtctctaa 1020 atattccacc ataaaacagc tgagttattt atgaattaga ggctatagct cacattttca 1080 atcctctatt tcttttttta aatataactt tctactctga tgagagaatg tggttttaat 1140 ctctctctca cattttgatg atttagacag actccccctc ttcctcctag tcaataaacc 1200 cattgatgat ctatttccca gcttatccce aagaaaactt ttgaaaggaa agagtagacc 1260 caaagatgtt attttctgct gtttgaattt tgtctcccca cccccaactt ggctagtaat 1320 aaacacttac tgaagaagaa gcaataagag aaagatattt gtaatctctc cagcccatga 1380 tctcggtttt cttacactgt gatcttaaaa gttaccaaac caaagtcatt ttcagtttga 1440 ggcaaccaaa cctttctact gctgttgaca tcttcttatt acagcaacac cattctagga 1500 gtttcctgag ctctccactg gagtcctctt tctgtcgcgg gtcagaaatt gtccctagat 1560 gaatgagaaa attatttttt ttaatttaag tcctaaatat agttaaaata aataatgttt 1620 tagtaaaatg atacactatc tctgtgaaat agcctcaccc ctacatgtgg atagaaggaa 1680 atgaaaaaat aattgctttg acattgtcta tatggtactt tgtaaagtca tgcttaagta 1740 caaattccat gaaaagctca ctgatcctaa ttctttccct ttgaggtctc tatggctctg 1800 attgtacatg atagtaagtg taagccatgt aaaaagtaaa taatgtctgg gcacagtggc 1860 tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggagga aggatcactt gagcccagaa 1920 gttcgagact agcctgggca acatggagaa gccctgtctc tacaaaatac agagagaaaa 1980 aatcagccag tcatggtggc ctacacctgt agtcccagca ttccgggagg ctgaggtggg 2040 aggatcactt gagcccaggg aggttggggc tgcagtgagc catgatcaca ccactgcact 2100 ccagccaggt gacatagcga gatcctgtct aaaaaaataa aaaataaata atggaacaca 2160 gcaagtccta ggaagtaggt taaaactaat tctttaaaaa aaaaaaaaag ttgagcctga 2220 attaaatgta atgtttccaa gtgacaggta tccacatttg catggttaca agccactgcc 2280 agttagcagt agcactttcc tggcactgtg gtcggttttg ttttgttttg ctttgtttag 2340 156 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ agacggggtc tcactttcca ggctggcctc aaactcccgc acccaagcaa ctcttctacc 2400 ctggcctccc aagtagctgg aattacaggt gtgcgceatc acaactagct ggtggtcagt 2460 tttgttactc tgagagctgt tcacttctct gaattcacct agagtggttg gaccatcaga 2520 tgtttgggca aaactgaaag ctctttgcaa ccacacacct tccctgagct tacatcactg 2580 cccttttgag cagaaagtct aaattccttc caagacagta gaattccatc ccagtaccaa 2640 agccagatag gccccctagg aaactgaggt aagagcagtc tctaaaaact acccacagca 2700 gcattggtgc aggggaactt ggccattaqg ttattatttg agaggaaagt cctcacatca 2760 atagtacata tgaaagtgac ctccaagggg attggtgaat actcataagg atcttcaggc 2820 tgaacagact atgtctgggg aaagaacgga ttatgcccca ttaaataaca agttgtgttc 2880 aagagtcaga gcagtgagct cagaggccct tctcactgag acagcaacat ttaaaccaaa 2940 ccagaggaag tatttgtgga actcactgcc tcagtttggg taaaggatga gcagacaagt 3000 caactaaaga aaaaagaaaa gcaaggagga gggttgagca atctagagca tggagtttgt 3060 taagtgctct ctggatttga gttgaagagc atccatttga gttgaaggcc acagggcaca 3120 atgagctctc ccttctacca ccagaaagtc cctggtcagg tctcaggtag tgcggtgtgg 3180 ctcagctggg tttttaatta gcgcattctc tatccaacat ttaattgttt gaaagcctcc 3240 atatagttag attgtgcttc gtaattttgt tgttgttgct ctatcttatt gtatatgcat 3300 tgagtattaa cctgaatgtt ttgttactta aatattaaaa acactgttat cctacagtt 3359 <210> 33 <211> 849 <212> ADN <213> Mus muscul us <400> 33 gagaacctgc ctgtctcttg tcctctccat ttgtgtggac tctgtgctcc atcatgtcgg 60 tgaccgcctg ccagggcttg gggtttgtgg tgtcactgat cgggtttgcg ggcatcattg 120 cagccacttg tatggaccag tggagcaccc aggatttata caacaacccg gtgaccgctg 180 tattcaacta ccaagggcta tggcgttcat gcgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccgaggcta cttcaccctg ttggggttgc cagccatgct gcaagctgta cgagccctga 300 tgatcgtggg cattgttctg ggggtcatcg gtatcctcgt Mt· nntf-«—♦- +- m ^ L,v«w>at>v* i· gccctgaagt 360 gcattcgcat tggtagcatg gatgactctg ccaaggccaa gatgactctg acttctggga 420 tcttgttcat catctccggc atctgtgcaa tcattggtgt gtctgtgttt gccaacatgc 480 tggtgaccaa cttctggatg tccacagcta acatgtacag cggcatgggc ggcatgggtg 540 gcatggtgca gaccgttcag accaggtaca ccttcggtgc agctctgttc gtgggctggg 600 ttgctggagg cctcaccctg attgggggag tgatgatgtg catcgcctgc cgtggcctga 660 caccagatga cagcaacttc aaagctgtgt cttaccatgc ctctggccaa aatgttgcct 720 157 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ acaggcetgg aggctttaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaga aacaagaaga 780 tctacgatgg gggtgcccgc acagaagacg atgaacagtc tcatcctacc aagtatgact 840 atgtgtagt B49
<210> 34 <211> 3350 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 34 agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg 50 tgactgcctg tcagggcttg gggttcgtgg tttcactgat tgggattgcg ggcatcattg 120 ctgccacctg catggaccag tggagcaccc aagacttgta caacaacccc gtaacagctg 180 ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccggggcta cttcaccctg ctggggctgc cagccatgct gcaggcagtg cgagccctga 300 tgatcgtagg catcgtcctg ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 360 gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acctccggga 420 tcatgttcat tgtctcaggt ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 480 tggtgactaa cttctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 540 agaetgttca gaccaggtac acatttggtg eggctctgtt cgtgggctgg gtcgctggag 600 gcctcacact aattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 660 aaaccaacta caaagccgtt tcttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcctg 720 gaggcttcaa ggccagcact ggctttgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 780 gaggtgcccg cacagaggac gaggtacaat cttatccttc caagcacgac tatgtgtaat 840 gctctaagac ctctcagcac gggcggaaga aactcccgga gagctcaccc aaaaaacaag 900 gagatcccat ctagatttct tcttgctttt gactcacagc tggaagttag aaaagcctcg 960 atttcatctt tggagaggcc aaatggtctt agcctcagtc tctgtctcta aatattccac 1020 cataaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1080 ttcttttttt aaatataact ttctactctg atgagagaat gtggttttaa tctctctctc 1140 acattttgat gatttagaca gactccccct cttcctccta gtcaataaac ccattgatga 1200 tctatttccc agcttatccc caagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1260 tattttctgc tgtttgaatt ttgtctcccc acccccaact tggctagtaa taaacactta 1320 ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctct ccagcccatg atctcggttt 1380 tcttacactg tgatcttaaa agttaccaaa ccaaagtcat tttcagtttg aggcaaccaa 1440 acctttctac tgctgttgac atcttcttat tacagcaaca ccattctagg agtttcctga 1500 158 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ gctctccact ggagtcctct ttctgtcgcg ggtcagaaat tgtccctaga tgaatgagaa 1560 aattattttt tttaatttaa gtcctaaata tagttaaaat aaataatgtt ttagtaaaat 1620 gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680 taattgcttt gacattgtct atatggtact ttgtaaagtc atgcttaagt acaaattcca 1740 tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1800 gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcaeagtgg ctcacgcctg 1860 taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 1920 tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 1980 gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc attccgggag gctgaggtgg gaggatcact 2040 tgagcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ccatgatcac accactgcac tccagccagg 2100 tgacatagcg agatcctgtc taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160 aggaagtagg ttaaaactaa ttctttaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgt 2220 aatgtttcca agtgacaggt atccacattt gcatggttac aagccactgc cagttagcag 2280 tagcactttc ctggcactgt ggtcggtttt gttttgtttt gctttgttta gagacggggt 2340 ctcactttcc aggctggcct caaactcctg cactcaagca attcttctac cctggcctcc 24 00 caagtagctg gaattacagg tgtgcgccat cacaactagc tggtggtcag ttttgttact 2460 ctgagagctg ttcacttctc tgaattcacc tagagtggtt ggaccatcag atgtttgggc 2520 aaaactgaaa gctctCtgca accacacacc ttccctgagc ttacatcact gcccttttga 2580 gcagaaagtc taaattcctt ccaagacagt agaattccat cccagtacca aagccagata 2640 ggccccctag gaaactgagg taagagcagt ctctaaaaac tacccacagc agcattggtg 2700 caggggaact tggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtacat 2760 atgaaagtga cctccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820 tatgtctggg gaaagaacgg attatgcccc attaaataac aagttgtgtt caagagtcag 2880 agcagtgagc tcagaggccc ttctcactga gacagcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940 gtatttgtgg aactcactgc ctcagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcaactaaag 3000 aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060 tctggatttg agttgaagag cacccatttg agtcgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120 cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180 gtttttaatt agcgcattct ctatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240 gattgtgctt tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtatatgca ttgagtatta 3300 acctgaatgt tttgttactt aaatattaaa aacactgtta tcctacagtt 3350
<210> 35 <211> 264 <212> PRT <213> Mus musculus 159 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 35
Met Ser Vai Thr Ala Cys Gin Gly 1 5
Leu Gly Phe Vai Vai Ser Leu Ile 10 15
Gly Phe Ala Gly Ile Ile Ala Ala 20
Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro vai 35 40
Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gin Gly 45
Leu Trp Arg Ser Cys Vai Arg Glu 50 55
Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu 65 70
Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg 75 80
Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai 85
Leu Gly Val Ile Gly Ile Leu Val 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile 100
Arg Ile Gly Ser Met Asp Asp Ser 105 110
Ala Lys Ala Lys Met Thr Leu Thr 115 120
Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile Ser 125
Gly Ile Cys Ala Ile Ile Gly Vai 130 135
Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala 145 150
Asn Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 155 160
Met Gly Gly Met Vai Gin Thr Vai 165
Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 170 175
Ala Leu Phe Vai Gly Trp Vai Ala 180
Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly 185 190
Vai Met Met Cys Ile Ala Cys Arg 195 200
Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ser Asn 205
Phe Lys Ala Vai Ser Tyr His Ala 210 215
Ser Gly Gin Asn Val Ala Tyr Arg 220
Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr 225 230
Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 235 240 160 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gin Ser 245 250 255
His Pro Thr Lys Tyr Asp Tyr Vai 260
<210> 36 <211> 2786 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 36 ggccgggaac cttcccagca agagggtggt ggttgctcct ggaagcctgc gcccagcagc 60 tgaagccatg gccaccacca cgtgccaggt ggtagggctt ctcctgtccc tcctgggtct 120 ggccggctgc atagccgcca ctgggatgga catgtggagc actcaagacc tgtatgacaa 180 cccagtcacc gccgtgttcc agCatgaagg gctctggagg agttgcgtgc aacagagctc 240 ggggttcacc gagtgccggc catacttcac catcctgggc cttccagcca tgctgcaagc 300 tgtacgagcc ctgatgatcg tgggcattgt tetgggggtc atcggtatcc tcgtgtccat 360 cttcgccctg aagtgcattc gcattggtag catggatgac tctgccaagg ccaagatgac 420 tctgacttct gggatcttgt tcatcatctc cggcatctgt gcaatcatcg gtgtgtctgt 480 gtttgccaac atgctggtga ccaacttctg gatgtccaca gctaacatgt acagcggcat 540 gggcggcatg ggtggoatgg tgcagaccgt tcagaccagg tacaccttcg gtgcagctct 600 gttcgtgggc tgggttgctg gaggcctcac cctgattggg ggagtgatga tgtgcatcgc 660 ctgccgtggc ctgacaccag atgacagcaa cttcaaagct gtgtcttacc atgcctctgg 720 ccaaaatgtt gcctacaggc ctggaggctt taaggccagc actggctttg ggtccaacac 780 cagaaacaag aagatctacg atgggggtgc ccgcacagaa gacgatgaac agtctcatcc 840 taccaagtat gactatgtgt agtgctctaa gacccgccaa cctgtgtgca ggaggaaccc 900 ttccccaaga agagctcacc ccaaagcaac gggagtctac cttgttccct tgttgatttc 960 aactgacatc tgaaagttgg taaagcctga ttttcatcca tagggaggct agacagtctt 1020 ggccacatgt gtctgcctct aaatatccca tcacaaaaca gctgagttat cgtttatgag 1080 ttagaggcca taacactcac tttagcccaa ccctctgctt tttaccgtag actttctttt 1140 catctggtga tggaatggaa tttgactcac agactaatac tttaatggtt tagagaaact 1200 ttccttcctc gtacttaata agcctgctga tggtcgattt tccagcttga ccaccaaggg 1260 aaattttaaa aggaaaaaaa aatacattaa aaggcattat ttcctactca attgtgcctt 1320 acccaccccc aacttgactg ataataataa tgaacaccac ttaaagaaag aatgccagag 1380 gaaagatagt tgtgtttccc cccagccagt catetgagtc cccctatgtg gtgatctaga 1440 161 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ acattactcg ccacagtgat tttcaaagaa ggcaagcgag cctgttcgct ctgctcagca 1500 tctgctgatt ccagcaaggc ccttccagag ctttccacta gaagtcctcc ttctctcgga 1560 agtcagaaat tccccctaga agagtaagaa atagattctt ttgggtaacc tgagtcctag 1620 gtatagttat aataaatagt atattagcaa aacggtttgg tatctcagtg aattagtttc 1680 agccttacat atagaaaaag ctggggaaaa aaaaagcatc ccttgacatt gtctatagcg 1740 taagatccta tataaatcca agcttcaaca aaagctcact gagtctaata gttttctttt 1800 gaggtctcca cggccttagt actcatagat gcagcccctg tttaaaagta aaaaaattaa 1860 agtagcttaa aacgggttct: tttttttttt ttttttttca aaaaatccaa tagagacctg 1920 tgtgtctggc atagctacag ttactgccaa tcgacagggc cacttctttg gtcctgtagg 1980 cagttttgca gttctgacag ctgcgccggg catcaatatg cagaccacac ccttctctgt 2040 gcttgtagga cgacccgttc aaggagaaag catgaactcc atctccatgt gagcctgaat 2100 gctcccagga aatggagata gggtgctctc caaaacccac ctgaacctga aacagctgta 2160 gcgctatgct gtaagagcct ggccatcaag ttcctatgga gaaaaagggc agtccttgca 2220 ttaatagtgc atatataagt ggcctctggg gggeagggat gaatattcag tggtggctcc 2280 gagtatgtac agaccgtcta aggagctgtg ttgaccaaga gccaggctaa tacgcagagt 2340 ttttcccact gggactacag tgattttaga ctatactgaa gaaggccctc tggaaaatca 2400 ttatctgaaa tggcataaag aatgaacaga ccaaacaatt taaggggagg gggcaggtgg 2460 aaggaggggg aaggaggtag aaataagaat ctagggcatg aagattgtta aggttcttgg 2520 ggtccaaatg gaaggtcacc cctttgaggc catggacaca atgcacccca cccctacccc 2580 cacctgccca cccaccagaa agtccctggt cggactggag gcagtgagaa tcagctgttt 2640 tcagttagtg ggtctcggtg tagcacctgg ctgtttcaaa gcttcccctt gctttgccgt 2700 tttttccgcc attgctgtct tgttttctgt gttattaacc tccatgtttt gtacgttaaa 2760 tattaaaaca ctgttaacat ccattc 2786
<210> 37 <211> 264 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37
Met Ala Thr Thr Thr Cys Gin Vai Vai Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu 15 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Vai Thr Ala Vai Phe Gin Tyr Glu Gly 35 40 45 162 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Leu Trp Arg Ser Cys vai Gin Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Vai Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Vai Gly Ile Vai Leu Gly Vai Ile Gly Ile Leu Vai 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Asp Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile Ser 115 120 125 Gly Ile Cys Ala Ile Ile Gly Vai Ser Vai Phe Ala Asn Met Leu Vai 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Gly Gly Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175 Ala Leu Phe Vai Gly Trp Vai Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly 180 185 190 Vai Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ser Asn 195 200 205 Phe Lys Ala Vai Ser Tyr His Ala Ser Gly Gin Asn Vai Ala Tyr Arg 210 215 220 Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 225 230 235 240 Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gin Ser 245 250 255 His Pro Thr Lys Tyr Asp Tyr Vai 260 <210> 38 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial 163 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 38 gagaggatcc cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 40 <210> 39 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 39 gagagcggcc gcctaacact ctcccctgtt gaagctc 37 <210> 40 <211> 324 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 40 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcccgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> 164 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR <400> 41
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 42 gagaaagctt tccaccaagg gcccatcggt cttc 34 <210> 43 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido 165 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 43 gagagcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag 36 <210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 44 taccagttga acttgacctc a 21 <210> 45 <211> 981 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 45 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 60 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 120 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 180 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 240 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 300 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaatg a 981 166 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 4 6 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição < de PCR <400> 46 Gly Pro Ser Vai Phe 10 15
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 20 25 30
Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr 35 40 45
Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser vai 50 55 60
Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 65 70 75 80
Vai Asn Kis Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lvs Vai Glu Pro 85 90 * 95 167 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 100 105 110 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Vai Ser His Glu Asn • —JT Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Vai Vai ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 47 <211> 32 168 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <220> <221> misc_característica <222> (31) .. (32) <223> n é a, c, g, ou t <400> 47 32 tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn <210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 48 30 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg <210> 49 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 49 ctgctcactg gatggtggga agatgg <210> 50 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial 26 <220> 169 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <223> Descrição da seguência artificial: Oligonucleótido <400> 50 gggacagtca ctgagctgct cagag 25 <210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da seguência artificial: Oligonucleótido <400> 51 acaggggcca gtggatagac cgatg 25 <210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da seguência artificial: Oligonucleótido <400> 52 agccagggac caagggatag acagatg 27 <210> 53 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da seguência artificial: Oligonucleótido <400> 53 gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 54 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial 22 170 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 54 gtaatacgac tcactatagg gc <210> 55 <211> 351 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 55 caggttcagc tcctgcaagg ootggacatg aatgagaagt atgcaactca tacccctggt tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180 tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagatatgat 300 ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 56 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR agtcaagatc 60 gaagcaggct 120 gccaacatat 180 cactgcctat 240 aagactgggt 300 ctca 354 <400> 56 cagacccagc tcctgcaagg ccaggaaagg gctgaagagt ttgcagatca tttggtaatg tggtgcagtc cttctgggta gtttaaagtg tcaagggacg acaacctcaa ctatggacta tggacctgag taccttcaca gatgggctgg gtttgccttc aaatgaggac ctggggtcaa ctgaagaagc aactatggaa ataaacacca tctttggaaa acggctacat ggaacctcag <210> 57 <211> 348 171
ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 57 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgtat 300 ggtgcctttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 58 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 58 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaea aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatcgtgg 300 aggggtaact cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 59 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR 172 ΕΡ 1 948 693/PT <400> 59 agtgaagatg 60 gaagcagaga 120 tacttactac 180 cacagcctac 240 aagaggggta 300 ctca 354 caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta taagctgggt actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag aatgagaagt tcaagggcaa ggecacactg actgcagaca aatcctccaa atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc ttactacggg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc <210> 60 <211> 360 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR < 4 0 0 > 6 0 caggttcacc tacaacagtc tggttctgaa ctgaggagtc ctgggtcttc agtaaagctt 60 tcatgcaagg attttgattc agaagtcttc ccttttgctt atatgagttg gattaggcag 120 aagcctgggc atggatttga atggattgga gacatactcc caagtattgg tagaacaatc 180 tatggagaga agtttgagga caaagccaca ctggatgcag acacagtgtc caacacagcc 240 tacttggagc tcaacagtct gacatctgag gactctgcta tctactactg tgcaaggggg 300 gagggctacg gtgcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 61 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 61 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tccactgggc atccactagg 230 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 339 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 173 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 62 <211> 318 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 62 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 318 <210> 63 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 63 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg.gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 240 gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atcctctgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 64 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR 174 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 64 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 65 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 65 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 66 <211> 336 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR < 4 0 0 > 66 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 336 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 175 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 67 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <2 2 0> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 67 gacatcgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat 300 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 68 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR <400> 68 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 69 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: produto de PCR 176 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 69 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt acttatgttt cctggtatca acagaaacca 120 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180 cgcttcacag gcagtggatc cgcaacagat cccactctca ccaccagcag tgcgaaggcc 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagct atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 70 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 70 gagaaagctt gccgccacca tggaatggac ctgggtcttt ctc 43 <210> 71 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 71 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtc 43 <210> 72 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 72 gagaaagctt gccgccacca tggattggct gtggaacttg ctattcc 47 177 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 73 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 73 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 74 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 74 gagaaagctt gccgccacca tggaatggat ctggatcttt ctcttc 46 <210> 75 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 75 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc 44 <210> 76 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 76 178 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttc 46 <210> 77 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 77 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43 <210> 78 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 78 gagaaagctt gccgccacca tggaatggag gatctttctc ttcatcc 47 <210> 79 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 79 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 80 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido 179 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 80 gagaggtctc aagcttagcc accatggact ggatttggat catgctccat c 51 <210> 81 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 81 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtcc 44 <210> 82 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 82 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctc 43 <210> 83 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 83 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cagc 34 <210> 84 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial 180 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 84 gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46 <210> 85 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 85 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 86 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 86 gagaaagctt gccgccacca tggagtttca gacccaggtc tttg 44 <210> 87 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 87 cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc
<210> 88 <211> 46 <212> ADN 33 181 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 88 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 89 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 89 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 90 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 90 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctcatg 46 <210> 91 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 91 cacacgtacg ttttatttcc aactttgtcc 30 <210> 92 182 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <211> 49
<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 92 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatattg 49 <210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 93 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 94 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 94 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 95 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 95 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 183 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 96 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 96 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggctcaggtt cttatg 46 <210> 97 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 97 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cag 33 <210> 98 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido <400> 98 gagaaagctt agccaccatg gaatcacaga ctctggtctt c <210> 99 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótido 184 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 99 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 100 <211> 1401 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 100 atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120 tgcaaggcta ctggctacac attcagtagc tactggatag agtgggtaaa gcagaggcct 180 ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggtagtac taactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag atatgattac 360 ccctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc ctccaccaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cccgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 101 185 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 101 atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aacatatgct 240 gaagagttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag actgggtttt 360 ggtaatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg 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sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 102 atggaatgga tctggatctt tctcttcatc ctctcaggaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg gcgaggcccg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcactgac tactatataa actgggtgaa gcagaggact 160 ggacagggcc ttgagtggat tggagagatt tatcctggaa gtggtaatac ttactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgtatggt 360 gcctttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagcctc caccaagggc 420 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga 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tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 <210> 112 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 194 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 112 atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacatcgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagctgca agtecagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat 360 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 113 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 113 atggattcac aggctcaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagctgca agtecagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 360 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 540 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 195 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 114 <211> 705 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 114 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg agctgatggg 60 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt acttatgttt cctggtatca acagaaacca 1Θ0 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagct atccgctcac gttcggtgct 360 gggaccaagc tggagctgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg Caactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 115 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 196 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 115 Met 1 Glu Trp Thr Trp 5 Vai Phe Leu Phe Leu 10 Leu Ser Vai Thr Ala Gly 15 Vai His Ser Gin 20 Vai Gin Leu Gin Gin 25 Ser Gly Ala Glu Leu 30 Met Lys Pro Gly Ala 35 Ser Vai Lys Ile Ser 40 Cys Lys Ala Thr Gly 45 Tyr Thr Phe 197 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 115 120 125 Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 198 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Asn Ala Lya Thr Lvs Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Aen Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320
Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Aap Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 370 375 380
Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai 405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp 420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His 435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460
Gly Lys 465 <210> 116 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 199 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 116
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser 15 10 15
Ile Gin Ala Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 200 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Αβπ Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr Hls Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 201 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 290 295
Asn Trp Tyr Vai
Asp Gly Vai Glu Vai 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310
Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 315 320
Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 325
Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cvs Lys Vai Ser 340
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 345 350
Glu Lye Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375
Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 425 430 Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 445 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 460
Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 385 390
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 405
Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 435 440
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455
Pro Gly Lys 465 <210> 117 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição quimérico sequência artificial: anticorpo monoclonal 202 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 117 Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe 1 5 Vai His Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin 20 25
Ile Leu Ser Gly 10 Ser Gly Ala Glu
Thr Ala 15
Leu Ala 30
Gly Arg 203 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Pro Gly Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125 Thr Thr Leu Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225 230 235 240 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 204 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn 290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai 305 310 315 320
Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys 340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr 370 375 380
Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu 405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 420 425 430
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460
Lys 465 <210> 118 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 205 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 118
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai Hls Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp 11e Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala ISO 185 190 Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 206 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 275 280
Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 290 295
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310
Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 325
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 340
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375
Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 385 390
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 405
Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 435 440
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455
Cys Vai Val Val Asp Val Ser His 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 300 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 315 320 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 330 335 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 345 350 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 365 Glu Leu Thr Lys Asn Gin val Ser 380 Tyr Pro Ser Αβρ ile Ala Val Glu 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 445 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 460
Pro Gly Lys 465 <210> 119 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da quimérico sequência artificial: anticorpo monoclonal 207 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 119
Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Vai 1 5 10 15 His Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Asp Tyr Vai Ile Ser Trp Vai Lys Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Gly Vai Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125 Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 180 185 190 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255
Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 208 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 275 280
Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 290 295
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310
Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 325
Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 340
Lys Thr Xle Ser Lys Ala Lys Gly 355 360
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 370 375
Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 385 390
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 405
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 435 440
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455
Val Asp Val 285 Ser His Glu Asp Gly Val 300 Glu Val His Tyr 315 Asn Ser Thr Tyr Arg 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys 335 Leu Pro Ala Pro 350 Xle Glu Arg Glu Pro 365 Gin Val Tyr Lys Asn 380 Gin Val Ser Leu Asp 395 He Ala Val Glu Trp 400 Lys Thr Thr Pro Pro 415 Val Ser Lys Leu Thr 430 Val Asp Ser Cys Ser 445 Val Met His Ser Leu 460 Ser Leu Ser Pro
Gly Lys 103 <210> 120 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequênci quimérico icial: anticorpo monoclonal 209 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 120
Met Asp Trp Ile Trp Ile Met Leu His Leu Leu Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ile Gin Ser Gin Val His Leu Gin Gin Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val 35 40 45 Pxl€ DVl A a AAW Ala Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Lys Pro Gly His Gly 50 55 60 Phe Glu Trp Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Glu Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser 85 90 95 Asn Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240
Ser Cys Aap Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 210 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val 290 295 300 Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg val val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 370 375 380 Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ile Ala 385 390 395 400 Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 121 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial 211 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 121
Met Glu Ser Gin Thr Gin Vai Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Vai Ser 15 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr 20 25 30
Vai Thr Ala Gly Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80
Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr 100 105 110
Tyr Cys Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125
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Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai Vai Cys 145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp Lys Vai 165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin 180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 210 215 220
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 212 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 122 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> monoclonal <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo quimérico <400> 122
Met His Phe Gin Vai Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Vai lie Met Ser r* 1 «r WJ.JT Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Vai Ser Tyr Met His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser 50 55 60 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 100 105 110 Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220 213 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 123 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 214 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 123 Met Glu Phe Gin 1 Gly Vai Asp Gly 20
Thr Gin Vai Phe Vai Phe 5 10
Val Leu Leu Trp Leu Ser 15
Asp Ile Vai Met Thr Gin 25
Ser Gin Lys Phe Met Ser 30
Thr Ser Vai Gly 35
Asp Arg Vai Ser lie Thr 40
Cys Lys Ala Ser Gin Asn 45
Vai Arg Thr Ala 50
Vai Ala Trp Tyr Gin Gin 55
Lys Pro Gly Gin Ser Pro 60
Lys Ala Leu Ile 65
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg 70
His Thr Gly Val Pro Asp 75 80
Arg Phe Thr Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90
Phe Thr Leu Thr Ile Ser 95
Asn Vai Gin Ser 100
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 105
Phe Cys Leu Gin His Trp 110
Asn Tyr Pro Leu 115
Thr Phe Gly Gly Gly Thr 120
Lys Leu Glu Ile Lys Arg 125
Thr Vai Ala Ala 130
Pro Ser Vai Phe Ile Phe 135
Pro Pro Ser Asp Glu Gin 140
Leu Lys Ser Gly 145
Thr Ala Ser Vai Vai Cys 150
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 155 160
Pro Arg Glu Ala
Lys Vai Gin Trp Lys Vai 165 170
Asp Asn Ala Leu Gin Ser 175
Gly Asn Ser Gin 180
Glu Ser val Thr Glu Gin 185
Asp Ser Lys Asp Ser Thr 190
Tyr Ser Leu Ser 195 His Lys Vai Tyr 210
Ser Thr Leu Thr Leu Ser 200
Ala Cys Glu Val Thr His 215
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 205
Gin Gly Leu Ser Ser Pro 220
Vai Thr Lys ser 225
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 <210> 124 <211> 240 215 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 124
Met Asp Ser Gin Ala Gin Vai Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Vai Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Vai Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Vai Ser vai Gly Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60 Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai Lys Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai 165 170 175 216 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin 180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His 210 215 220
Gin Gly Leu ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 125 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 217 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 125
Met Ser Leu Leu Phe Trp Vai Ser 10 15
Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr 25 30
Met Glu Ser Gin Thr Gin Vai Leu 1 5
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Vai Met 20
Vai Thr Ala Gly Glu Lys Vai Thr 35 40
Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 45
Leu Leu Agn Ser Gly Asn Gin Lys 50 55
Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin 60
Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu 65 70
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 75 80
Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe 85
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai 100
Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr 105 110
Tyr Cys Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys 145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai 165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin 180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 210 215 220
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 218 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 126 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 126 Met Asp Ser Gin Ala Gin Vai Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Vai Ser 15 10 15
Gly Thr Cys Gly Aap Ile Vai Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30
Vai Ser Ala Gly Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80
Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr 100 105 110
Tyr Cys Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 219 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Leu Glu Ile Lys Arg Thr vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro 130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu 145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp 165 170 175
Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp 180 * 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin 210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 127 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 220 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 127
Met Asp Ser Gin Ala Gin Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Glv Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Vai Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60 Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 Hls Cys Gly Gin Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 221 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 128 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 128
Met Asp Ser Gin Ala Gin Vai Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Vai Ser 15 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Vai Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30
Vai Ser Vai Gly Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 222 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Glu Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai Lys Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr 100 105 110
Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125
Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys 145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai 165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin 180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hls Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 210 215 220
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 129 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico 223 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 129
Met Glu Ser Gin Thr Leu Vai Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15
Gly Ala Asp Gly Asn Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30
Met Ser Vai Gly Glu Arg Vai Thr Leu Thr Cys Lye Ala Ser Glu Asn 35 40 45
Vai Vai Thr Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lya Pro Glu Gin Ser Pro 50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp 65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95
Ser Vai Lys Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr 100 105 110
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125
Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr ISO 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Glu Cys
Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 225 230 224 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <210> 130 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artific <400> 130 ccaagggcta tggcgttc <210> 131 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artific <400> 131 ccgaaggtgt acctggtc <210> 132 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artific de PCR ial: Oligonucleótido 18 ial: Oligonucleótido 18 ial: Traduçao de produto 225 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 132 Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys 15 10 Ser Vai Lya Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 20 25
Pro Gly Ala 15
Ser Ser Tyr 30
Trp Ile Glu Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Ile
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 50 55 60
Glu Lys Phe
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 65 70 75
Thr Ala Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 85 90
Tyr Tyr Cys 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin
Gly Thr Leu 100 105 110 Vai Thr Vai Ser Ala 115 <210> 133 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Tradução de de PCR <400> 133 Gin Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr produto 20 25 30 226 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Ala Pro 40
Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin 35
Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 45
Gly Trp Ile 50
Asn Thr Asn Thr 55
Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 60
Lys Gly Arg 65
Phe Ala Phe Ser 70
Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala 75
Tyr 80 85
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys
Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 90
Phe Cys 95
Ala Met 105
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn 100
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110
Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 134 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR 227 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 134
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Tyr He Asn Trp vai Lys Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Vai Ser Ser 115 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artifici .al: Tradução de produto de PCR 228 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 135
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 <210> 136 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR <400> 136
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Vai Lys Met 20
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 25 10 229 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Vai Ile Ser Trp Vai Lys Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp ile 35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Scr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Vai Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 137 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR 230 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 137
Gin Vai His Leu Gin Gin Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Vai Phe Pro Phe 20 25 30
Ala Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp 35 40 45
Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Lys 50 55 60
Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Vai Ser Asn Thr Ala
65 70 75 BO
Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120 <210> 138 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR 231 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 138
Asp lie Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Vai Thr Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110
Lys <210> 139 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR <400> 139
Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met 20 25 30
His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp He Tyr 35 40 45 232 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto
de PCR <400> 140
Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala ser Gin Asn vai Arg Thr Ala 20 25 30
Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile 45 35 40
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr 50 55
Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Leu Thr Ile Ser Asn Vai Gin Ser 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 85
Leu Gin His Trp Asn Tyr Pro Leu 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
Glu Ile Lys 100 105
<210> 141 <211> 113 <212> PRT 233 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR <400> 141
Asp Ile Vai Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Vai Gly 15 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Vai Lys Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110
Lys <210> 142 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR 234 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 142
Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Vai Thr Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Lys <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produt de PCR 235 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 143
Asp Ile Vai Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 144 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR 236 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 144
Asp ile Val Met ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Drn t.qn • — ---c Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin 85 90 95 Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Lys <210> 145 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produto de PCR 237 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 145
Ser Ser Leu Ala Vai Ser Vai Gly 10 15
Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 25 30
Asp Ile Vai Met Ser Gin Ser Pro 1 5
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys 20
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala 35 40
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 50 55
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 65 70
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 75 80
Ile Ser Ser Vai Lys Ala Glu Asp 85
Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 100
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 105 110
Lye <210> 146 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição da sequência artificial: Tradução de produt de PCR 238 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 146
Asn Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Vai Gly 15 10 15
Glu Arg Vai Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Vai Vai Thr Tyr 20 25 30
Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai Lys Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 147 <211> 324 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: ácido nucleico de codões optimizados <400> 147 cgtacggtgg ccgctcccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagtcc 60 ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 120 tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtcac cgagcaggac 180 agcaaggact ccacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240 aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300 agcttcaaca ggggcgagtg ctag 324 <210> 148 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial 239 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <220> <223> Descrição da sequência artificial: proteína de codões optimizados <400> 148
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Fhe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lya Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 149 <211> 981 <212> ADN <213> Artificial <220> nucleico de <223> Descrição da sequência artificial: ácido codões optimizados 240 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <40 0> 149 ggcccaagcg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgcc 60 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcgga 120 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 180 ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 240 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 300 aagacccaca cctgcccccc ctgcccagcc ccagagctgc tgggcggacc cagcgtgttc 360 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggaccca gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 540 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 600 aaggtctcca acaaggccct gccagccccc atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc 660 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 840 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaagt ccaggtggca gcagggcaac 900 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 960 agcctgagcc ccggcaagta g 981 <210> 150 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: proteína de codões optimizados 241 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ <400> 150
Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 20 25 30 Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr 35 40 45 Phe Pro Ala vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai 50 55 60 Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 65 70 75 80 Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Pro 85 90 35 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 100 105 110 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 130 135 140 242 ΕΡ 1 948 693/ΡΤ
Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp 190 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
Lisboa, 2013-05-30

Claims (23)

  1. ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal possuindo a capacidade de ligação a claudina 18A2 (CLD18A2) e sendo obtenível através de um método compreendendo o passo de imunização de um animal com um péptido possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira expressando o referido péptido, em que o anticorpo tem a capacidade de mediar a morte de células tumorais expressando CLD18A2 in vivo, e em que o anticorpo medeia a morte de células expressando CLD18A2 através da indução de lise mediada por citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
  2. 2. Anticorpo da reivindicação 1 que se liga a CLD18A1 e CLD18A2.
  3. 3. Anticorpo da reivindicação 1 que se liga a CLD18A2 mas não a CLD18A1.
  4. 4. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que as referidas células expressando CLD18A2 são células de cancro.
  5. 5. Anticorpo da reivindicação 4, em que as células de cancro são seleccionadas a partir do grupo que consiste em células tumorigénicas de cancro gástrico, esofágico, pancreático e do pulmão.
  6. 6. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a referida lise mediada por ADCC ocorre na presença de células efectoras seleccionadas a partir do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMN.
  7. 7. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-6, o qual é um anticorpo quimérico ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo.
  8. 8. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-7 seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 2/3 IgGl, um IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgA secretor, um IgD e um IgE.
  9. 9. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-8, em que CLD18A2 tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2.
  10. 10. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-9, em que CLD18A1 tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 8.
  11. 11. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-10, que se liga a epitopos nativos de CLD18A2 presentes na superfície de células vivas.
  12. 12. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-11, que é específico para células de cancro, de preferência células de cancro de estômago.
  13. 13. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-12, em que CLD18A2 é expressa na superfície das referidas células.
  14. 14. Anticorpo produzido por um clone depositado sob o no. de acesso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, ou DSM ACC2810.
  15. 15. Anticorpo que é uma forma quimerizada ou humanizada do anticorpo da reivindicação 14.
  16. 16. Hibridoma capaz de produzir o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
  17. 17. Hibridoma depositado sob o no. de acesso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, ou DSM ACC2810. ΕΡ 1 948 693/ΡΤ 3/3
  18. 18. Conjugado compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 15 acoplado a um agente terapêutico.
  19. 19. Conjugado da reivindicação 18, em que o agente terapêutico é uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
  20. 20. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e/ou um conjugado da reivindicação 18 ou 19, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  21. 21. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 15, um conjugado da reivindicação 18 ou 19 ou uma composição farmacêutica da reivindicação 20 para utilização no tratamento ou na prevenção de cancro envolvendo células de cancro que expressam CLD18A2, em que o referido anticorpo, o referido conjugado, ou a referida composição farmacêutica é para administrar a um sujeito.
  22. 22. Anticorpo, o conjugado, ou a composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o cancro é seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço, e cancro da vesícula biliar.
  23. 23. Anticorpo, o conjugado, ou a composição farmacêutica das reivindicações 21 ou 22, em que a referida CLD18A2 é expressa à superfície das referidas células. Lisboa, 2013-05-30
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