ES2642688T3 - Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento de cáncer - Google Patents

Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento de cáncer Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento de cáncer.
Las terapias basadas en anticuerpos para el cáncer tienen el potencial de mayor especificidad y menor perfil de efectos secundarios en comparación con fármacos convencionales. La razón es una distinción precisa entre células normales y neoplásicas por parte de los anticuerpos y el hecho de que su modo de acción se basa en mecanismos 5 antitumorales inmunológicos menos tóxicos, tales como la activación del complemento y el reclutamiento de células inmunitarias citotóxicas.
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Los objetivos de las terapias basadas en anticuerpos deben tener cualidades particulares, que constituyen la base para una adecuada discriminación entre células normales y neoplásicas. Obviamente, un objetivo con restricción exclusiva a células tumorales y totalmente indetectable en tejidos normales es ideal para el desarrollo de terapias 10 con anticuerpos eficientes y seguros. En otro aspecto, una sobreexpresión de alto nivel puede ser la base para la ventana terapéutica y los efectos secundarios bajos ejemplificados por el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 2 (HER-2), que como resultado de la amplificación génica es una buena diana para el trastuzumab (Herceptin).
Otras dianas para anticuerpos que ya están aprobados o en desarrollo clínico para terapia tumoral tienen cualidades 15 distintas, que no están basadas en una sobreexpresión numérica de moléculas diana sobre células tumorales. En el caso de los anticuerpos contra el proteoglicano MUC-1, un epítopo de repetición peptídica en el esqueleto de la diana es subglicosilado en células tumorales y, por lo tanto, alterado a su contraparte normal. En el caso de anticuerpos contra CD20 (rituximab), CD52 (Campath-1H) y CD22 (epratuzumab), las dianas de anticuerpos tienen niveles de expresión comparables en células tumorales y linfocitos normales. En este caso, la ablación de células 20 normales por el anticuerpo es tolerable ya que las células madre negativas a la diana restauran el repertorio de linfocitos normales. Otros ejemplos de accesibilidad diferencial de las dianas de anticuerpos son el antígeno carcinoembrionario (CEA) y la carbohidratosa IX (CA9). Ambos antígenos se expresan en epitelios normales de colon y riñón, respectivamente. Sin embargo, los anticuerpos de imagen marcados radioactivamente distinguen bien entre el tumor y el tejido normal, y los anticuerpos citotóxicos son bien tolerados. Esto es más probable debido a una 25 expresión restringida de CA9 y CEA en el lado luminal del tejido epitelial normal donde los anticuerpos IgG no tienen acceso. También la molécula de adhesión de células epiteliales de antígeno (Ep-CAM) pertenece a esta categoría. Como molécula homotípica de adhesión celular para las células epiteliales, se localiza en el espacio intercelular. Inexplicablemente, mientras que los anticuerpos anti-Ep-CAM de alta afinidad son muy tóxicos, los anticuerpos de afinidad intermedia son bien tolerados. Esto sugiere la accesibilidad del objetivo Ep-CAM en células normales, pero 30 también indica que la cinética de unión al anticuerpo puede abrir una ventana terapéutica.
Una posibilidad es que otras proteínas específicas de células epiteliales implicadas en la adhesión célula/célula pueden ser también atractivas para abordajes de anticuerpos, ya que pueden ser apenas accesibles en epitelios bien estructurados a anticuerpos pero se exponen en células tumorales. Por lo tanto, analizamos las proteínas que participan en la organización de la arquitectura del tejido epitelial para su idoneidad como dianas para los 35 anticuerpos terapéuticos. Una proteína que llamó particularmente nuestra atención es la claudina 18.
La molécula de claudina 18 (CLD18) (Número de registro de Genbank: variante de empalme 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369 y variante de empalme 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026) es una proteína transmembrana integral con un peso molecular de aproximadamente 27.9/27.72 kD. Las claudinas son proteínas integrales de membrana situadas dentro de las uniones estrechas de epitelios y endotelios. Las uniones estrechas 40 organizan una red de hebras interconectadas de partículas intramembranosas entre células adyacentes. En las uniones estrechas, la ocludina y las claudinas son los componentes más prominentes de la proteína transmembrana. Debido a sus fuertes propiedades de adhesión intercelular, crean una barrera primaria para prevenir y controlar el transporte paracelular de solutos y restringir la difusión lateral de los lípidos y proteínas de la membrana para mantener la polaridad celular. Las proteínas que forman la unión estrecha están implicadas críticamente en la 45 organización de la arquitectura del tejido epitelial. Asumimos que tales proteínas pueden ser apenas accesibles a los anticuerpos en epitelios bien estructurados pero se exponen en las células tumorales. El documento WO2004/047863 describe diversos tumores que expresan las variantes de empalme de CLD18 de una manera específica del tumor. Además, el documento WO2004/047863 describe anticuerpos que pueden usarse para diagnosticar estos tumores. 50
La CLD18 es una tetraspanina y tiene como tal 4 regiones hidrófobas. Hemos generado datos que indican que la CLD18 muestra varias conformaciones diferentes, que tal vez pueden ser direccionadas selectivamente por anticuerpos. Una conformación (CLD18-Conformación-1) implica que las cuatro regiones hidrófobas sirven como dominios transmembrana regulares (TM) y se forman dos bucles extracelulares (bucle 1 abarcado por la región hidrófoba 1 y la región hidrófoba 2; bucle 2 abarcado por las regiones hidrófobas 3 y 4), como se describe para la 55 gran mayoría de los miembros de la familia de la claudina. Una segunda conformación (CLD18-Conformación-2) implica que, tal como se ha descrito para PMP22, otro miembro de la familia de la tetraspanina (Taylor et al., J. Neurosc Res. 62: 15-27, 2000), que el segundo y tercer dominios hidrófobos no cruzan completamente la membrana plasmática de modo que la porción (bucle D3) entre el primer y el cuarto dominio transmembrana es extracelular. Una tercera conformación (CLD18-Conformación-3) implica un gran dominio extracelular con dos regiones 60
hidrófobas internas abarcadas por la primera y cuarta regiones hidrófobas, que sirven como dominios transmembrana regulares. Debido a la presencia del sitio clásico de N-glicosilación en bucle D3, las variantes de topología Claudina-18 topología CLD18-2 y topología CLD18-3 albergan un sitio adicional de N-glicosilación extracelular.
Otro nivel de complejidad se añade a la molécula CLD18 por la presencia de dos variantes de empalme diferentes, 5 que están descritas en ratón y en humanos (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). Las variantes de empalme CLD18A1 y CLD18A2 difieren en los primeros 21 aminoácidos N-terminales, que comprenden la primera TM y bucle 1, mientras que la secuencia de proteína primaria de la C-terminal es idéntica.
El CLD18A1 se expresa selectivamente en epitelios pulmonares y de estómago normales, mientras que CLD18A2 se expresa únicamente en células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). Lo más importante, CLD18A2 10 está restringido a las células de vida corta diferenciadas del epitelio del estómago pero está desprovisto de la región de las células madre gástricas. Usando PCR-RT sensible, hemos demostrado que ambas variantes no son detectables en absoluto en cualquier otro órgano humano normal, pero se expresan de forma robusta en varios tipos de cáncer incluyendo tumores de estómago, esofágico, pancreático y de pulmón, así como líneas celulares de cáncer humano. La expresión es más prominente en los subtipos de adenocarcinoma de estas indicaciones. 15
El peso molecular de la proteína difiere en algunos cánceres y tejido adyacente normal. La proteína de mayor peso molecular observada en tejido sano puede transferirse al mismo peso molecular que se observa en cáncer tratando lisados de tejido con el compuesto desglicosilante PNGasa F. Esto sugiere que CLD18 es menos N-glicosilado en cáncer en comparación con su tejido normal contrapartida. Es probable que esta diferencia estructural dé lugar a un epítopo alterado. Un motivo clásico de N-glicosilación está en la posición aa 116 dentro del dominio bucle D3 de la 20 molécula.
Los términos "CLD18" y "variante CLD18" de acuerdo con la divulgación comprenderán (i) variantes de empalme de CLD18, (ii) variantes de CLD18-N-glicosilación, (iii) variantes de conformación CLD18, (iv) CLD18 libre y homotípicamente/heterotípicamente asociado a las variantes localizadas en las uniones estrechas intercelulares y (v) CLD18 relacionados con el cáncer y CLD18 no relacionados con las células de las variantes relacionadas. 25
Las características moleculares y funcionales de CLD18 hacen de esta molécula un objetivo muy interesante para la terapia basada en anticuerpos contra el cáncer. Éstos son en particular (i) la ausencia de CLD18 en la gran mayoría de los tejidos normales relevantes para la toxicidad, (ii) la restricción de la expresión de la variante de CLD18A2 a una población de células dispensables como células gástricas diferenciadas, que pueden ser reabastecidas por las células madre negativas a la diana del estómago, (iii) sugerencias para potenciar la glicosilación diferencial entre 30 células normales y neoplásicas, y (iv) la presencia de diferentes topologías conformacionales. Además, el papel de CLD18 como proteína de unión estrecha puede contribuir además a una buena ventana terapéutica. Debido a que las células tumorales expresan claudinas pero a menudo no forman uniones estrechas clásicas por asociación homotípica y heterotípica de claudinas como las encontradas en el tejido epitelial normal, las células tumorales pueden tener una reserva considerable de claudina libre que es susceptible de unión a anticuerpos extracelulares e 35 inmunoterapia. Es posible que los epítopos de unión de claudinas en el epitelio sano estén protegidos dentro de las uniones estrechas del acceso por tales anticuerpos.
El objeto de la divulgación es proporcionar anticuerpos útiles para la terapia de enfermedades en las que se expresa CLD18, tales como enfermedades tumorales. Los anticuerpos descritos en el presente documento también tienen utilidad para diagnosticar tales enfermedades. 40
Resumen de la invención
La presente divulgación generalmente proporciona anticuerpos útiles como agentes terapéuticos para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas con células que expresan CLD18, incluyendo enfermedades relacionadas con tumores tales como cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cuello - cabeza y cáncer de la vesícula biliar. 45
La presente invención se refiere particularmente a un anticuerpo monoclonal para uso como medicamento, teniendo dicho anticuerpo la capacidad de unión a CLD18A2 y de mediación de la muerte de células que expresan CLD18A2, en el que la muerte se induce por unión del anticuerpo a CLD18A2 expresada por dichas células, en las que el anticuerpo no se une a CLD18A1, en el que dicha muerte es inducida por lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC. 50
En una realización, dichas células que expresan CLD18A2 son células cancerosas, en las que las células cancerosas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en células cancerosas tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas y de pulmón.
En otra realización, dicha lisis mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras seleccionadas del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y PMN. 55
El anticuerpo de la presente invención es preferiblemente un anticuerpo quimérico, humano o humanizado, o un
fragmento de un anticuerpo. El anticuerpo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en IgG1, IgG2, preferiblemente IgG2a e IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD e IgE.
Dicho CLD18A2 tiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2. Dicho CLD18A1 tiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 8.
En una realización, el anticuerpo de la presente invención se une a epítopos nativos de CLD18A2 presentes en la 5 superficie de células vivas.
En otra realización, el anticuerpo de la presente invención es específico para células cancerosas, preferiblemente células de cáncer de estómago.
La presente invención también se refiere a un conjugado para uso como medicamento, conjugando dicho conjugado el anticuerpo de la presente invención acoplado a un agente terapéutico, en el que el agente terapéutico es 10 preferiblemente una toxina, un radioisótopo, un fármaco o un agente citotóxico.
La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención y/o el conjugado de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también al anticuerpo de la presente invención y/o al conjugado de la presente invención para uso en un método para inhibir el crecimiento y/o la muerte de una célula que expresa CLD18A2. 15
La presente invención se refiere también al anticuerpo de la presente invención, al conjugado de la presente invención o a la composición farmacéutica de la presente invención para uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno que implica células que expresan CLD18A2. En una realización, dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad relacionada con el tumor, en la que la enfermedad relacionada con el tumor se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer esofágico, 20 cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de cuello de cabeza, cáncer de la vesícula biliar y sus metástasis.
En una realización, el método al que se hace referencia anteriormente comprende además el tratamiento con un agente quimioterapéutico, una radiación o una citoquina. El agente quimioterapéutico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en doxorrubicina, cisplatino, taxotere, 5-fluoruracilo, metotrexato, gemcitabina y 25 ciclofosfamida.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a CLD18 y mediar la muerte de células que expresan CLD18. Preferiblemente, el anticuerpo se une a CLD18A1 y CLD18A2 y más preferiblemente se une a CLD18A2 pero no a CLD18A1. Preferiblemente, los anticuerpos de la divulgación se unen a y son específicos para bucle1 o bucle2 de CLD conformanción-1. En otras realizaciones preferidas, el anticuerpo 30 de la divulgación se une y es específico para el bucle D3 de CLD conformación-2 y, en particular, se une en o alrededor de un potencial sitio de N-glicosilación en la posición 116 dentro de bucle D3. En realizaciones adicionales, el anticuerpo de la divulgación es específico para la forma no glicosilada del potencial sitio de N-glicosilación en la posición 116 dentro del bucle D3
La muerte de células por el anticuerpo de la divulgación se induce preferiblemente mediante la unión del anticuerpo 35 a CLD18 expresado por dichas células, más preferiblemente por unión del anticuerpo a CLD18A2 expresado por dichas células. En una realización, la unión del anticuerpo de la divulgación a CLD18A1 expresada por dichas células no induce la muerte de dichas células.
Las células que expresan CLD18 son preferiblemente células cancerosas y, en particular, se seleccionan del grupo que consiste en células cancerosas tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, pulmonares, ováricas, de 40 colon, hepáticas, cabeza-cuello y vesícula biliar.
Preferiblemente, el anticuerpo de la divulgación media la muerte de células induciendo la lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis, adhesión homotípica y/o fagocitosis, preferiblemente induciendo lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC. 45
En una realización, el anticuerpo de la divulgación no induce la lisis mediada por CDC de células.
Preferiblemente, la lisis mediada por ADCC de células tiene lugar en presencia de células efectoras, que en particular las realizaciones se seleccionan del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y PMN, y la fagocitosis es por macrófagos.
El anticuerpo de la divulgación puede ser un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o un 50 fragmento de un anticuerpo y puede seleccionarse del grupo que consiste en una IgG1, una IgG2, preferiblemente IgG2a e IgG2b, una IgG3, una IgG4, una IgM, una IgA1, una IgA2, una IgA secretora, una IgD, y un anticuerpo IgE.
De acuerdo con todos los aspectos de la divulgación, CLD18 es preferiblemente CLD18 humano, preferiblemente
CLD18A2 humano, y CLD18A2 tiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y CLD18A1 tiene preferiblemente la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 8.
En realizaciones particularmente preferidas, el anticuerpo de la divulgación se une a epítopos nativos de CLD18 presentes en la superficie de células vivas. En otras realizaciones preferidas, el anticuerpo de la divulgación es específico para células cancerosas, preferiblemente células de cáncer de estómago. 5
En ciertas realizaciones de la divulgación CLD18 se expresa en la superficie de las células.
Los anticuerpos de la divulgación pueden obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23 y 26-31, o un fragmento inmunogénico del mismo, o un ácido nucleico o célula huésped que expresa dicha proteína o péptido, o fragmento inmunogénico del mismo. Preferiblemente, un 10 anticuerpo de la divulgación es específico para las proteínas mencionadas anteriormente, péptidos o fragmentos inmunogénicos de las mismas.
En una realización particularmente preferida, el anticuerpo de la divulgación es producido por un clon que tiene el número de acceso. DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), 15 DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294), o DSM ACC2810 (182-D1106-362).
En una realización, el anticuerpo de la divulgación se acopla a un agente terapéutico tal como una toxina, un radioisótopo, un fármaco o un agente citotóxico. 20
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de la divulgación. Los hibridomas preferidos son aquellos que tienen el número de acceso no. DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM 25 ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294), o DSM ACC2810 (182-D1106-362).
Los anticuerpos de la divulgación se designan aquí haciendo referencia a la designación del anticuerpo, por ejemplo, 182-D758-035, y/o haciendo referencia al clon que produce el anticuerpo, por ejemplo, 26D12.
La divulgación se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la divulgación y/o un conjugado de los mismos con un agente terapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 30
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o la muerte de una célula que expresa CLD18, preferiblemente CLD18A2, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo de la divulgación y/o un conjugado de la misma con un agente terapéutico. CLD18 se expresa preferentemente en la superficie de dicha célula.
En un aspecto adicional la divulgación se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno que 35 implica células que expresan CLD18, preferiblemente CLD18A2, que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo de la divulgación, un conjugado del mismo con un agente terapéutico o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la divulgación o su conjugado con un agente terapéutico. Preferiblemente, la enfermedad o trastorno es una enfermedad relacionada con el tumor y en determinadas realizaciones se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de 40 ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de la vesícula biliar. CLD18 se expresa preferentemente en la superficie de dichas células.
Preferiblemente, los anticuerpos de la divulgación tienen la capacidad de discriminar variantes de CLD18 expresadas por diferentes tipos celulares incluyendo células cancerosas y células no malignas. En una realización particularmente preferida, los anticuerpos de la divulgación tienen la capacidad de unirse a CLD18A2 mientras que 45 no se unen a CLD18A1, o se unen a CLD18A1 con una especificidad inferior en comparación con la especificidad de unión a CLD18A2.
El término "unión" de acuerdo con la divulgación se refiere preferiblemente a una unión específica. "Enlace específico" significa que un agente tal como un anticuerpo se une más fuertemente a un objetivo tal como un epítopo para el cual es específico en comparación con la unión a otro objetivo. Un agente se une más fuerte a un primer 50 objetivo en comparación con un segundo objetivo si se une al primer objetivo con una constante de disociación (KD) que es menor que la constante de disociación para el segundo objetivo. Preferiblemente, la constante de disociación (KD) para el objetivo al que se une específicamente el agente es más de 10 veces, preferiblemente más de 20 veces, más preferiblemente más de 50 veces, incluso más preferiblemente más de 100 veces, 200 veces, 500 veces o 1000 veces menor que la constante de disociación (KD) para el objetivo al que el agente no se une específicamente. 55
Los anticuerpos de la divulgación median la muerte de células que expresan CLD18, preferiblemente CLD18A2, por unión a CLD18, expresadas preferiblemente en la superficie de dichas células. En una realización, los anticuerpos de la divulgación inducen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por al menos aproximadamente 20-40% de lisis mediada por CDC, preferiblemente aproximadamente 40-50% de lisis mediada por CDC, y más preferiblemente más de 50% de lisis mediada por CDC de células que expresan CLD18. Tales anticuerpos se 5 ejemplifican aquí por los siguientes anticuerpos: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12 y ch-175D10. Alternativamente o además de inducir CDC, los anticuerpos de la divulgación pueden inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan CLD18 en presencia de células efectoras (por ejemplo, monocitos, células mononucleares, células NK y PMN). Tales anticuerpos se ejemplifican aquí por los siguientes anticuerpos: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 10 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1 y 125E1. Los anticuerpos de la divulgación pueden tener la capacidad de inducir la apoptosis de células que expresan CLD18, inducir la adhesión homotípica de células que expresan CLD18 y/o inducir fagocitosis de células que expresan CLD18 en presencia de macrófagos. Los anticuerpos de la divulgación pueden tener una o más de las propiedades funcionales descritas anteriormente. Preferiblemente, los anticuerpos de la divulgación inducen la lisis mediada por CDC y la lisis mediada por ADCC de 15 células que expresan CLD18 y más preferiblemente inducen la lisis mediada por ADCC de células que expresan CLD18 mientras que no inducen la lisis mediada por CDC de dichas células. Células diana ejemplares para anticuerpos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de cáncer que expresan CLD18, preferiblemente CLD18A2, tales como células tumorigénicas gástricas, pancreáticas, esofágicas y de cáncer de pulmón. En una realización preferida particular, el sacrificio de células mediadas por anticuerpos de la divulgación es 20 CLD18A2 específico, es decir, anticuerpos de la divulgación de mediación de la muerte de células, preferiblemente CDC y/o ADCC mediada por lisis de células, expresando CLD18A2, pero no median la muerte de células que expresan CLD18A1 pero sin expresar CLD18A2. Los anticuerpos descritos anteriormente pueden usarse para mediar la muerte de células tumorales en el tratamiento o prevención de cáncer tales como cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de 25 cuello - cabeza y cáncer de la vesícula biliar.
Los anticuerpos de la divulgación pueden clasificarse en clases distintas de acuerdo con sus propiedades de unión y su capacidad para mediar la función efectora en las células que expresan CLD18. Los anticuerpos de la divulgación pueden clasificarse según sus
• propiedades de unión y/o funciones efectoras mediadas en células que expresan CLD18A1 o CLD18A2 30 (discriminación de variantes de empalme de CLD18),
• propiedades de unión y/o funciones efectoras mediadas en células que expresan variantes de CLD18 glicosiladas o no glicosiladas (discriminación entre variantes de CLD18 con y sin N-glicosilación),
• propiedades de unión y/o funciones efectoras mediadas en células cancerosas o tipos celulares normales (discriminación entre variantes CLD18 expresadas por células tumorales o células normales no malignas), 35
• propiedades de unión a los epítopos CLD18 enmascarados por la formación de uniones estrechas,
• capacidad para inducir la formación de agregados de CLD 18 en células vivas, y
• capacidad para unirse a una variante de CLD18 no humana, particularmente variantes de CLD18 de ratones, ratas, conejos y primates.
Los anticuerpos de la divulgación pueden tener una o más de las siguientes propiedades, por lo que se da referencia 40 a ejemplos específicos de anticuerpos de la divulgación descrita aquí (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10):
a) unión a CLD18A2 así como a CLD18A1 (por ejemplo, 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2 y 41C6)
b) unión a CLD18A2 pero no a CLD18A1 (por ejemplo 26B5, 37G11, 38G5, 42E12 y 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 45 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10)
c) unión a CLD18 expresado naturalmente por células tumorales pero no a CLD 18 expresado naturalmente por células o tejidos no cancerosos tales como células de estómago y pulmón (por ejemplo 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10).
d) mediar la muerte de células inducida por CDC, que expresan CLD18A2 pero no de células que expresan 50 CLD18A1 (por ejemplo, 26D12, 28D10, 37H8 y 39F11, 163E12, ch-125E1, ch-163E12, ch-175D10)
e) mediar la muerte inducida por ADCC de células que expresan CLD18 (por ejemplo, 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12 y 61C2, ch-163E12, ch-175D10)
f) mediar la muerte inducida por ADCC pero no la muerte mediada por CDC de células que expresan CLD18 (por
ejemplo, 37G11, 42E12 y 43A11)
g) mediar la muerte inducida por ADCC y la muerte inducida por CDC de células que expresan CLD18A2 (por ejemplo, 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
Como se ejemplifica en este documento, los anticuerpos de la divulgación abarcan además moléculas, que
a) se unen a células diferenciadas del estómago normal, pero no a las células madre del estómago (por ejemplo, 5 39F11)
b) no se unen al tejido gástrico normal, así como a otros órganos normales, sino exclusivamente a las células cancerosas (por ejemplo 26B5)
c) se unen a un epítopo que abarca una Asn no glicosilada en la posición 116 de CLD18
d) que se unen a CLD18 humano así como a ratón, permitiendo realizar exhaustivamente estudios de toxicidad 10 preclínica en ratones.
Los anticuerpos de la divulgación pueden derivarse de diferentes especies, incluyendo pero no limitándose a ratón, rata, conejo, cobayas y humanos. Los anticuerpos de la divulgación también incluyen moléculas quiméricas en las que una región constante de anticuerpo derivada de una especie, preferiblemente humana, se combina con el sitio de unión a antígeno derivado de otra especie. Además, los anticuerpos de la divulgación incluyen moléculas 15 humanizadas en las que los sitios de unión a antígenos de un anticuerpo derivado de una especie no humana se combinan con regiones constantes y de armazón de origen humano.
Los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales e incluyen anticuerpos IgG2a (por ejemplo IgG2a, κ, λ), IgG2b (por ejemplo, IgG2b, κ, λ), IgG3 (por ejemplo, IgG3, κ, λ) e IgM. Sin embargo, otros isotipos de anticuerpos también están abarcados por la divulgación, incluyendo IgG1, IgA1, IgA2, anticuerpos IgA, 20 IgD e IgE secretores. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos enteros o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluyendo, por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla o anticuerpos biespecíficos. Además, los fragmentos de unión al antígeno incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión (tal como una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera) que se fusiona a un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una 25 región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región constante CH2. Dichas proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen adicionalmente en los documentos US2003/0118592 y US 2003/0133939.
Los anticuerpos de la presente divulgación disocian preferiblemente de CLD18 con una constante de equilibrio de 30 disociación (KD) de aproximadamente 1-100 nM o menos. Preferiblemente, los anticuerpos de la divulgación no reaccionan de forma cruzada con antígenos de superficie celular relacionados y, por tanto, no inhiben su función.
En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por una o más de las siguientes propiedades:
a) especificidad para CLD18, en particular especificidad para CLD18A2; 35
b) una afinidad de unión a CLD18, en particular CLD18A2, de aproximadamente 100 nM o menos, preferiblemente de aproximadamente 5-10 nM o menos y, más preferiblemente, de aproximadamente 1-3 nM o menos,
c) la capacidad para mediar un alto nivel de CDC en células CD55/59 negativas o CD55/59 positivas;
d) la capacidad para inhibir el crecimiento de células que expresan CLD18;
e) la capacidad para inducir la apoptosis de células que expresan CLD18; 40
f) la capacidad para inducir la adhesión homotípica de células que expresan CLD18;
g) la capacidad para inducir ADCC de células que expresan CLD 18 en presencia de células efectoras;
h) la capacidad de prolongar la supervivencia de un sujeto que tiene células tumorales que expresan CLD18;
i) la capacidad de agotar células que expresan CLD18;
j) la capacidad de agotar células que expresan niveles bajos de CLD18 y/o 45
k) la capacidad de agregar CLD18 sobre la superficie de células vivas
Los anticuerpos anti-CLD 18 de la presente invención pueden derivarse, unirse o coexpresarse a otras especificidades de unión. En una realización particular, la divulgación proporciona una molécula biespecífica o
multiespecífica que comprende al menos una primera especificidad de unión para CLD18 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CLD18 o mimético de la misma) y una segunda especificidad de unión para una célula efectora, tal como una especificidad de unión para un receptor Fc (por ejemplo, un receptor Fc-gamma, tal como Fcgamma RI, o cualquier otro receptor Fc) o un receptor de células T, por ejemplo, CD3.
Por consiguiente, la presente divulgación incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que se unen tanto a 5 CLD18 como a un receptor Fc o un receptor de células T, por ejemplo CD3. Ejemplos de receptores Fc son el receptor IgG, el receptor Fc-gamma (FcR), tal como FcRI (CDC64), FcRII (CD32) y FcRIII (CD16). También pueden dirigirse otros receptores Fc, tales como receptores IgA (por ejemplo, FcαRI). El receptor Fc está situado preferiblemente en la superficie de una célula efectora, por ejemplo, un monocito, un macrófago o una célula mononuclear activada. En una realización preferida, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas se unen a un 10 receptor Fc en un sitio que es distinto del sitio de unión de inmunoglobulina Fc (por ejemplo, IgG o IgA) del receptor. Por lo tanto, la unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas no está bloqueada por los niveles fisiológicos de las inmunoglobulinas.
En otro aspecto más, los anticuerpos anti-CLD18 de la divulgación se derivan, se ligan o se coexpresan con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab'). Por ejemplo, un 15 anticuerpo de la divulgación puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), una citotoxina, ligando celular o antígeno (por ejemplo, para producir un inmunoconjugado, tal como una inmunotoxina). Un anticuerpo de la presente divulgación puede estar enlazado a otros restos terapéuticos, por ejemplo, un radioisótopo, un fármaco 20 anticanceroso de molécula pequeña, una citoquina recombinante o quimioquina. Por consiguiente, la presente divulgación abarca una gran variedad de conjugados de anticuerpo, moléculas biespecíficas y multiespecíficas, y proteínas de fusión, todas las cuales se unen a células que expresan CLD18 y que pueden usarse para dirigir otras moléculas a dichas células.
En aún otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones/kits farmacéuticos y de 25 diagnóstico, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable formulado junto con un o una combinación de anticuerpos de la divulgación. En una realización particular, la composición incluye una combinación de anticuerpos que se unen a epítopos distintos o que poseen características funcionales distintas, tales como inducción de CDC y/o ADCC e inducción de apoptosis. En esta realización de la divulgación, se pueden usar anticuerpos en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más 30 anticuerpos monoclonales anti-CLD18. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CLD18 que tienen actividades diferentes pero complementarias pueden combinarse en una sola terapia para conseguir un efecto terapéutico deseado. En una realización preferida, la composición incluye un anticuerpo anti-CLD18 que media el CDC combinado con otro anticuerpo anti-CLD18 que induce la apoptosis. En otra realización, la composición incluye un anticuerpo anti-CLD18 que media la eliminación altamente eficaz de células diana en presencia de células efectoras, combinadas con otro 35 anticuerpo anti-CLD18 que inhibe el crecimiento de células que expresan CLD18.
La presente divulgación también incluye la administración simultánea o secuencial de dos o más anticuerpos anti-CLD18 de la divulgación, en donde al menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo anti-CLD18 quimérico y al menos un anticuerpo adicional es un anticuerpo anti-CLD18, los anticuerpos se unen a los mismos o diferentes epítopos de CLD18. Preferiblemente, se administra un anticuerpo CLD18 quimérico de la divulgación primero 40 seguido por la administración de un anticuerpo anti-CLD18 humano de la divulgación, en el que el anticuerpo anti-CLD18 humano se administra preferiblemente durante un período prolongado de tiempo, es decir, como tratamiento de mantenimiento.
Los anticuerpos, inmunoconjugados, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y composiciones de la presente invención pueden usarse en una variedad de métodos para inhibir el crecimiento de células que expresan CLD18, en 45 particular CLD18A2 y/o matar selectivamente células que expresan CLD18, en particular CLD18A2 poniendo en contacto las células con una cantidad eficaz del anticuerpo, inmunoconjugado, molécula biespecífica/multiespecífica o composición, de tal manera que se inhiba el crecimiento de la célula y/o se mata la célula. En una realización, el método incluye la muerte de la célula que expresa CLD18, opcionalmente en presencia de células efectoras, por ejemplo, por CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las 50 células que expresan CLD18 que se pueden inhibir o matar utilizando los anticuerpos de la divulgación incluyen células cancerosas tales como células tumorigénicas de estómago, páncreas, esófago, pulmón, ovario, colon, hepático, cabeza - cuello y vesícula biliar.
Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar y/o prevenir una variedad de enfermedades que implican células que expresan CLD18 administrando los anticuerpos a pacientes que sufren de 55 tales enfermedades. Las enfermedades ejemplares que pueden ser tratadas (por ejemplo, mejoradas) o prevenidas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades tumorigénicas. Ejemplos de enfermedades tumorigénicas que pueden tratarse y/o prevenirse incluyen cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer esofágico, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de la vesícula biliar.
En una realización particular de la divulgación, el sujeto a administrar el anticuerpo se trata adicionalmente con un 60
agente quimioterapéutico, radiación, o un agente que modula, por ejemplo, aumenta o inhibe, la expresión o actividad de un receptor Fc, por ejemplo, un receptor Fc-gamma, tal como una citoquina. Las citoquinas típicas para la administración durante el tratamiento incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferón- (IFN-) y factor de necrosis tumoral (TNF). Los agentes terapéuticos típicos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina, 5 cisplatino, taxotere, 5-fluoruracilo, metotrexato, gemzitabina y ciclofosfamida.
En otro aspecto más, la divulgación se refiere a una estrategia de inmunización para inmunizar animales no humanos tales como ratones con CLD18 humano o un fragmento peptídico del mismo, preferiblemente CLD18A2 o un fragmento peptídico del mismo para obtener anticuerpos. Los péptidos preferidos para la inmunización son los seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 y 26-31. Por consiguiente, en las 10 realizaciones preferidas, los anticuerpos de la divulgación son los obtenidos por inmunización usando péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 y 26-31. Análogamente, pueden generarse anticuerpos contra CLD18 en un animal transgénico no humano, tal como un ratón transgénico. El animal no humano transgénico puede ser un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera que codifica la totalidad o una parte de un anticuerpo. 15
Animales de tipo salvaje, así como animales no humanos transgénicos, pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno CLD18 y/o ácidos nucleicos y/o células que expresan CLD18 o un fragmento peptídico del mismo. Preferiblemente, el animal no humano es capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos a CLD18 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) sometiéndose a recombinación V-D-J y conmutación de isotipo. La conmutación de isotipo puede ocurrir por ejemplo, conmutación de isotipo clásica o no 20 clásica.
Por consiguiente, en otro aspecto más, la divulgación proporciona células B aisladas a partir de un animal no humano como se ha descrito anteriormente. Las células B aisladas pueden entonces inmortalizarse por fusión a una célula inmortalizada para proporcionar una fuente (por ejemplo, un hibridoma) de anticuerpos de la divulgación. Tales hibridomas (es decir, que producen anticuerpos de la divulgación) también se incluyen dentro del alcance de la 25 divulgación.
Como se ejemplifica aquí, los anticuerpos de la divulgación pueden obtenerse directamente de hibridomas que expresan el anticuerpo, o pueden ser clonados y expresados de forma recombinante en una célula huésped (por ejemplo, una célula CHO o una célula linfocítica). Otros ejemplos de células huésped son microorganismos, tales como E. coli, y hongos, tales como levadura. Alternativamente, pueden producirse recombinantemente en un animal 30 o planta transgénico no humano.
Las células de hibridoma preferidas para producir anticuerpos de la divulgación son las secuenciadas o depositadas en la DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Alemania, nueva dirección: Inhoffenstr.7B, 31824 Braunschweig, Alemania) que tiene las siguientes designaciones y números de acceso:
a. 182-D1106-055, No. de acceso DSM ACC2737, depositado el 19 de octubre de 2005 35
b. 182-D1106-056, No. de acceso DSM ACC2738, depositado el 19 de octubre de 2005
c. 182-D1106-057, No. de acceso DSM ACC2739, depositado el 19 de octubre de 2005
d. 182-D1106-058, No. de acceso DSM ACC2740, depositado el 19 de octubre de 2005
e. 182-D1106-059, No. de acceso DSM ACC2741, depositado el 19 de octubre de 2005
f. 182-D1106-062, No. de acceso DSM ACC2742, depositado el 19 de octubre de 2005, 40
g. 182-D1106-067, No. de acceso DSM ACC2743, depositado el 19 de octubre de 2005
h. 182-D758-035, No. de acceso DSM ACC2745, depositado el 17 de noviembre de 2005
i. 182-D758-036, No. de acceso DSM ACC2746, depositado el 17 de noviembre de 2005
j. 182-D758-040, No. de acceso DSM ACC2747, depositado el 17 de noviembre de 2005
k. 182-D1106-061, No. de acceso DSM ACC2748, depositado el 17 de noviembre de 2005 45
l. 182-D1106-279, No. de acceso DSM ACC2808, depositado el 26 de octubre de 2006
m. 182-D1106-294, No. de acceso DSM ACC2809, depositado el 26 de octubre de 2006,
n. 182-D1106-362, No. de acceso DSM ACC2810, depositado el 26 de octubre de 2006.
Los anticuerpos preferidos de la divulgación son los producidos por y obtenibles a partir de los hibridomas
anteriormente descritos; es decir 37G11 en el caso de 182-D1106-055, 37H8 en el caso de 182-D1106-056, 38G5 en el caso de 182-D1106-057, 38H3 en el caso de 182-D1106-058, 39F11 en el caso de 182-D1106-059, 43A11 en el caso de 182-D1106-062, 61C2 en el caso de 182-D1106-067, 26B5 en el caso de 182-D758-O35, 26D12 en el caso de 182-D758-28D10 en el caso de 182-D758-040, 42E12 en el caso de 182-D1106-061, 125E1 en el caso de 182-D1106-279, 163E12 en el caso de 182-D1106-294 y 175D10 en el caso de 182-D1106-362; y sus formas 5 quimerizada y humanizada.
En realizaciones preferidas, los anticuerpos, en particular las formas quiméricas de anticuerpos de acuerdo con la divulgación incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada (CH) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena pesada humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 o 150 o un fragmento del mismo. En otras realizaciones preferidas, 10 los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos de acuerdo con la divulgación incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena ligera (CL) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena ligera humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 o 148 o un fragmento del mismo. En una realización particular preferida, los anticuerpos, en particular las formas quiméricas de anticuerpos de acuerdo con la divulgación incluyen anticuerpos 15 que comprenden un CH que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un CH humano tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 o 150 o un fragmento del mismo y que comprenden un CL que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un CL humano tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 o 148 o un fragmento del mismo.
Un CH que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 puede ser codificado por un 20 ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 45. Un CH que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 150 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 149. Una CL que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 40. Un CL que comprende la secuencia de 25 aminoácidos representada por SEQ ID NO: 148 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 147.
En ciertas realizaciones preferidas, las formas quiméricas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120 y un fragmento de los mismos y/o que comprende una cadena ligera que comprende 30 una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 y un fragmento del mismo.
En ciertas realizaciones preferidas, las formas quiméricas de anticuerpos incluyen anticuerpos que comprenden una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras seleccionadas entre las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 o un fragmento 35 de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 o un fragmento de la misma,
(ii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 o un fragmento del mismo y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 o un fragmento de la misma, 40
(iii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 o un fragmento de la misma,
(iv) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 o un 45 fragmento de la misma,
(v) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 o un fragmento del mismo y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 o un fragmento de la misma,
(vi) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento 50 de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 o un fragmento de la misma,
(vii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 o un fragmento de la misma, 55
(viii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento
de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 o un fragmento de la misma y
(ix) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 o un fragmento de la misma. 5
"Fragmento" o "fragmento de una secuencia de aminoácidos" como se ha utilizado anteriormente se refiere a una parte de una secuencia de anticuerpos, es decir, una secuencia que representa la secuencia de anticuerpos acortada en el extremo N- y/o C- terminal, que cuando reemplaza dicha secuencia de anticuerpos en un anticuerpo retiene la unión de dicho anticuerpo a CLD18 y preferiblemente las funciones de dicho anticuerpo como se describe en el presente documento, por ejemplo lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC. Preferiblemente, un 10 fragmento de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de los residuos de aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 y 129 se refiere preferiblemente a dicha secuencia en la que se eliminan 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 aminoácidos en el extremo N-terminal. Los fragmentos de las secuencias de aminoácidos 15 descritas aquí pueden codificarse por fragmentos respectivos de secuencias de ácido nucleico que codifican dichas secuencias de aminoácidos.
Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 100. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 puede ser 20 codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 101. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 102. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 25 104. Una cadena pesada que comprende un aminoácido Secuencia representada por SEQ ID NO: 118 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 103. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 puede ser codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 105. 30
Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 107. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 106. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 puede ser 35 codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 108 Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 111. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 110. 40 Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 109. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 112. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 puede estar 45 codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 113. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 114.
En una realización preferida, un anticuerpo de la divulgación comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 132, 133, 134, 50 135, 136, 137 y un fragmento del mismo.
En una realización preferida, un anticuerpo de la divulgación comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, y un fragmento del mismo.
En ciertas realizaciones preferidas, un anticuerpo de la divulgación comprende una combinación de región variable 55 de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) seleccionada de las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 o un fragmento de la misma,
(ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 o un fragmento de la misma,
(iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 o un fragmento de la misma,
(iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 o un fragmento de la misma 5 y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 o un fragmento de la misma,
(v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 o un fragmento de la misma,
(vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 o un fragmento de la misma, 10
(vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 o un fragmento de la misma,
(viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 o un fragmento de la misma, 15
(ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 o un fragmento de la misma.
Un VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 55. Un VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 puede ser codificada por un ácido 20 nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 56. Un VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 57. Un VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 59. Un VH que comprende una secuencia de 25 aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por (SEQ ID NO: 58). Un VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 60.
Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 puede ser codificada por 30 un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 62. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 61. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 63. Un VL que comprende una secuencia 35 de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 66. Un VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 65. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende la 40 secuencia de ácido nucleico representan Ed. Por SEQ ID NO: 64. Un VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 67. Un VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada Por SEQ ID NO: 145 puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 68. Una VL que comprende una secuencia de 45 aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende el nucleico Secuencia de ácido representada por SEQ ID NO: 69.
En una realización preferida, un anticuerpo de la divulgación comprende un VH que comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 determinantes de complementariedad seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (vi): 50
(i) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posiciones 116-125 de SEQ ID NO: 115,
(ii) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 116,
(iii) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posiciones 55
116-124 de SEQ ID NO: 117,
(iv) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 118,
(v) CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posiciones 115-125 de SEQ ID NO: 119, y 5
(vi) CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120,
En una realización preferida, un anticuerpo de la divulgación comprende un VL que comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 determinantes de complementariedad seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (ix): 10
(i) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 121,
(ii) CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posiciones 110-118 de SEQ ID NO: 122,
(iii) CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posiciones 15 109-117 de SEQ ID NO: 123,
(iv) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 124,
(v) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 125, 20
vi) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posiciones 115-122 de SEQ ID NO: 126,
(vii) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 127,
(viii) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posiciones 25 115-123 de SEQ ID NO: 128,
(ix) CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 129,
En una realización preferida, un anticuerpo de la divulgación comprende una combinación de VH y VL, cada una de las cuales comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que determinan la complementariedad, 30 seleccionadas de las siguientes realizaciones (i) a (ix):
(i) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posiciones 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posiciones 110-118 de SEQ ID NO: 122,
(ii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: 35 posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 121,
(iii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posiciones 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 123, 40
(iv) VH: CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posiciones 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posiciones 115-122 de SEQ ID NO: 126,
(v) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posiciones 76-78 45 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 125,
(vi) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 124,
(vii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 127,
(viii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posiciones 76-78 5 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 128, y
(ix) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 129,
En otras realizaciones preferidas, un anticuerpo de la divulgación comprende preferiblemente una o más de las 10 regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLD18, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal contra CLD18 descrito en el presente documento, y preferiblemente comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferiblemente al menos la región variable CDR3, de las regiones variables de cadena pesada VH) y/o regiones variables de 15 cadena ligera (VL) descritas en el presente documento. En una realización, dicha una o más de las regiones de determinación de complementariedad (CDR) se seleccionan de un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 determinantes de la complementariedad descritas en el presente documento. En una realización particularmente preferida, un anticuerpo de la divulgación comprende preferiblemente las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 determinantes de la complementariedad de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de 20 cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLD18, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal contra CLD18 descrito en el presente documento, y preferiblemente comprende las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 determinantes de la complementariedad de las regiones variables (VH) y/o regiones variables de cadena ligera (VL) de cadena pesada descritas en el presente documento.
En una realización, un anticuerpo de la divulgación que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una 25 combinación de conjuntos de CDR como se describe aquí comprende dichas CDR junto con sus regiones estructurales intermedias. Preferiblemente, la porción también incluirá al menos aproximadamente el 50% de una o ambas regiones de la primera y cuarta estructura, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región estructural y el 50% N-terminal de la cuarta región marco. La construcción de anticuerpos de la presente divulgación realizada mediante técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N- o C- terminales 30 en las regiones variables codificadas por los enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación, incluyendo la introducción de conectores para unir regiones variables de la divulgación a secuencias de proteínas adicionales incluyendo cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o etiquetas de proteínas.
En una realización, un anticuerpo de la divulgación que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una 35 combinación de conjuntos de CDR como se describe aquí comprende dichas CDR en una estructura de anticuerpo humano.
La referencia en este documento a un anticuerpo que comprende con respecto a su cadena pesada una cadena particular o una región o secuencia particular se refiere preferiblemente a la situación en la que todas las cadenas pesadas de dicho anticuerpo comprenden dicha cadena, región o secuencia particular. Esto se aplica 40 correspondientemente a la cadena ligera de un anticuerpo.
La presente divulgación se refiere también a ácidos nucleicos que comprenden genes o secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o partes de los mismos, por ejemplo, una cadena de anticuerpos, como se describe en el presente documento. Los ácidos nucleicos pueden estar comprendidos en un vector, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector utilizado por ejemplo convencionalmente en ingeniería genética. 45 El vector puede comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permitan la selección del vector en una célula huésped adecuada y bajo condiciones adecuadas. Además, el vector puede comprender elementos de control de expresión que permitan la expresión apropiada de las regiones codificantes en huéspedes adecuados. Tales elementos de control son conocidos por el experto en la técnica y pueden incluir un promotor, un casete de empalme y un codón de iniciación de la traducción. 50
Preferiblemente, el ácido nucleico de la divulgación está unido operativamente a las secuencias de control de expresión anteriores que permiten la expresión en células eucariotas o procariotas. Los elementos de control que aseguran la expresión en células eucariotas o procariotas son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación, para la construcción de vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico anteriores, para la introducción de los 55 vectores en células huésped apropiadamente elegidas, para causar o lograr la expresión, son bien conocidos en el arte.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico o
un vector como se describe en el presente documento.
Otras características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un análisis por inmunofluorescencia de células HEK293 transfectadas con CLD18A2 acoplado a 5 un fluorocromo verde y hecho reaccionar con suero de ratón después de la inmunización de ADN con SEQ ID NO: 15 fusionado a un epítopo auxiliar.
La figura. 2 muestra un análisis de inmunotransferencia Western de células HEK293 transfectadas con CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3) y células HEK293 no transfectadas con el anticuerpo monoclonal 9E11 de ratón-anti-c-myc (Serotec, CRL MCA2200). 10
La figura 3 muestra un análisis por inmunofluorescencia utilizando células CHO transfectadas con CLD18A2 y un anticuerpo anti-CLD18 de conejo policlonal (Zymed, CRL 38-8000).
Las figuras 4A y B muestran la unión de los sobrenadantes de hibridoma 24H5 y 85A3 a células HEK293 transfectadas transitoriamente con CLD18A2 humano y un marcador fluorescente según se determina por citometría de flujo. 15
La figura 4C muestra la unión de los sobrenadantes de hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 a células HEK293 transfectadas de forma estable con CLD18A2 humano y contrateñidas con yoduro de propidio.
La figura 5 muestra la unión de sobrenadantes de hibridoma 24H5 (A), 9E8 (B), 26B5 (C) y 19B9 (D) a células HEK293 transfectadas transitoriamente con un marcador fluorescente y CLD18A2 humano o CLD18A2-Myc o CLD18A2-HA analizados por citometría de flujo. 20
Las figuras 6A y B muestran la unión de los sobrenadantes de hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 y 163E12 a células HEK293 transfectadas de forma estable con CLD18A2 o CLD18A1 humano según se determina por citometría de flujo.
La figura 7 muestra un análisis de inmunofluorescencia del anticuerpo monoclonal específico de isoforma CLD18A2 37G11 mediante tinción de células HEK293 transfectadas con CLD18A2 (A, C) y CLD18A1 (B, D), respectivamente, 25 bajo condiciones de fijación nativa (A, B) y paraformaldehído (C, D).
La figura 8 muestra un análisis de inmunofluorescencia del anticuerpo monoclonal CLD18 26B5 mediante tinción de células HEK293 transfectadas con CLD18A2 (A, C) y CLD18A1 (B, D), respectivamente, bajo condiciones de fijación nativa (A, B) y paraformaldehído (C, D).
Fig. 9. Línea celular PCR-RT 30
El análisis por PCR-RT con cebadores específicos para CLD18A2 mostró una expresión clara en 4/5 de las líneas celulares ensayadas.
La figura 10 muestra un análisis por inmunofluorescencia de células DAN-G (subclón F2) y un anticuerpo policlonal de conejo-anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000).
La figura 11 muestra un análisis por inmunofluorescencia de células KATO-III (subclón 3B9 4D5) y un anticuerpo 35 policlonal de conejo-anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000).
La figura 12A muestra un análisis por inmunofluorescencia de células SNU-16 (subclón G5) con un anticuerpo policlonal de conejo-anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000).
La figura 12B muestra un análisis por inmunofluorescencia de células KATO-III con anticuerpos monoclonales de la divulgación. 40
La figura 13 muestra la expresión superficial de CLD18 en células KATO-III y NUGC-4 analizadas por tinción de células con anticuerpos monoclonales 61C2 y 163E12 seguido por análisis citométrico de flujo.
La figura 14. Alineación de proteínas de CLD18A1 humano (NP_057453), CLD18A2 humano (NP_001002026), CLD18A1 de ratón (NP_062789) y CLD18A2 de ratón (AAL15636).
Las Figuras 15A y B muestran la unión de los sobrenadantes de hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 y 163E12, 45 respectivamente, a células HEK293 transfectadas transitoriamente con un marcador fluorescente y CLD18A1 murino o CLD18A2 murino analizada por citometría de flujo.
Fig 16. Análisis inmunohistoquímico con AB policlonal p105. Las tinciones inmunohistoquímicas en un subconjunto de tejidos normales (estómago, pulmón, médula ósea y próstata) confirman la especificidad del tejido gástrico (A). La
expresión también se detectó en carcinomas de estómago (fila superior) y carcinomas de pulmón (B). Sólo las células diferenciadas pero no las células madre expresan CLD18A2 (C).
Fig. 17. Análisis inmunohistoquímicos con monoclonal AB 39F11D7
(A) Se detectó expresión específica de proteína en la mucosa estomacal normal, mientras que todos los otros tejidos normales probados fueron negativos. 5
(B) Se encontró una expresión fuerte de CLD18A2 en carcinomas de estómago y pulmón.
Fig. 18. Análisis inmunohistoquímicos con AB 26B5 (A) monoclonal, 175D10 (B), 43A11 (C), 163E12 (D) y 45C1 (E). Todos los anticuerpos muestran fuerte tinción de tumores de xenoinjerto HEK293-CLD18A2 y muestras de cáncer gástrico, pero no de los tumores transfectados de control HEK293-Mock.
La figura 19 es un gráfico que compara el porcentaje de células muertas tras la inducción de CDC por 85A3, 28D10, 10 24H5 o 26D12 contra células HEK293 transfectadas de forma estable con CLD18A2 humano usando citometría de flujo.
La figura 20 es un gráfico que compara el porcentaje de lisis celular específica después de la inducción de CDC por 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 o 61C2 frente a células CHO adherentes transfectadas de forma estable con CLD18A2 humano o con CLD18A1 humano según se 15 determina por medición de fluorescencia.
La figura 21 muestra la inducción dependiente de la concentración de CDC frente a células CHO transfectadas de forma estable con CLD18A2 humano mediante 75B8 (A), 28D10 (B) o 37H8 (C) según se determina mediante medición de fluorescencia.
La figura 22 muestra la lisis de células HEK293-CLD18A2 mediante 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 y 61C2, 20 respectivamente, en presencia de MNCs.
La figura 23 muestra la lisis de células HEK293-CLD18A1 mediante 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 y 61C2, respectivamente, en presencia de MNCs.
La figura 24 muestra la inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos de la divulgación en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano con células HEK293-CLD18A2. 25
Las figuras 25A y B muestran una supervivencia prolongada por tratamiento con anticuerpos de la divulgación en dos modelos de xenoinjerto de tratamiento temprano con células HEK293-CLD18A2.
La figura 26 muestra la prolongación de la supervivencia por anticuerpos de la divulgación en un modelo de xenoinjerto de tratamiento avanzado con células HEK293-CLD18A2.
La figura 27A muestra la inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos de la divulgación en un modelo de 30 xenoinjerto de tratamiento temprano. La figura 27B muestra la prolongación de la supervivencia por anticuerpos de la divulgación en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano. Se usaron células DAN-G que expresan de forma endógena CLD18A2.
La figura 28 muestra la expresión de ARNm de CLD18A2 en tejidos de ratón. Las investigaciones por PCR-RT con cebadores específicos de CLD18A2 no mostraron ninguna expresión significativa en todos los tejidos normales 35 probados, excepto el estómago. Se analizaron los siguientes tejidos normales: 1: intestino delgado, 2: bazo, 3: piel, 4: estómago, 5: pulmón, 6: páncreas, 7: ganglio linfático, 8: timo, 9: control negativo
La figura 29 muestra la expresión de CLD18 en estómago normal. El análisis inmunohistoquímico con el anticuerpo específico CLD18 del estómago del ratón revela el patrón de expresión conservado. Mientras que el epitelio superficial y las criptas más profundas expresan CLD18 en su superficie celular, la región central del cuello es 40 negativa a CLD18.
La figura 30 muestra la tinción con hematoxilina y eosina de tejidos de estómago de ratones. Se muestra en vista general (A) y en detalle (B) el estómago de un ratón tratado con 37G11 en comparación con un ratón de control (C y D), que se trató sólo con PBS.
Las figuras 31A y B muestran la tinción citométrica de flujo de células HEK293 transfectadas de forma estable con 45 CLD18A1 y A2 humanos, respectivamente, así como células endógenamente que expresan KATO-III con anticuerpos de la divulgación (43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10).
La figura 32 muestra CDC en células que expresan CLD18A2 mediadas por anticuerpos quiméricos de la divulgación.
La figura 33 muestra ADCC sobre células KATO-III mediadas por anticuerpos quiméricos de la divulgación. 50
Descripción detallada de la divulgación
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser anticuerpos monoclonales aislados que se unen específicamente a un epítopo presente en CLD18. Los anticuerpos monoclonales aislados abarcados por la presente divulgación incluyen anticuerpos IgA, IgG1-4, IgE, IgM e IgD. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un isotipo IgG1, kappa o IgG1, lambda. En otra realización, el anticuerpo es 5 un anticuerpo IgG3, más particularmente un isotipo IgG3, kappa o IgG3, lambda. En otra realización más, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4, más particularmente un isotipo lambda IgG4, kappa o IgG4. En aún otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgA1 o IgA2. En aún otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgM.
En una realización la divulgación se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a células que expresan CLD18, y preferiblemente (i) se unen a células que expresan CLD18A2, y (ii) no se unen a células que no expresan 10 CLD18A2 pero que expresan CLD18A1. Los anticuerpos de la divulgación preferiblemente (i) median la muerte de células que expresan CLD18A2, y (ii) no median la muerte de células que no expresan CLD18A2 sino que expresan CLD18A1.
En otra realización, la divulgación se refiere a anticuerpos que (i) se unen a células tumorales que expresan CLD18, (ii) no se unen a células que expresan CLD18 de mucosa estomacal normal, y/o (iii) no se unen a CLD18 que 15 expresa células de tejido pulmonar no cancerígeno.
La divulgación también incluye anticuerpos que (i) median la muerte de células tumorales que expresan CLD18, (ii) no median la muerte de células que expresan CLD18 de la mucosa estomacal normal, y/o (iii) no median la muerte de células que expresan CLD18 de tejido pulmonar no cancerígeno.
En realizaciones particulares, los anticuerpos de la divulgación (i) se unen a un epítopo sobre CLD18A2 que no está 20 presente en CLD18A1, preferiblemente SEQ ID NO: 21, 22, y 23, (ii) se unen a un epítopo localizado en el epítopo CLD18A2-bucle1, preferiblemente SEQ ID NO: 28, (iii) se unen a un epítopo localizado en el bucle CLD18A2, preferiblemente SEQ ID NO: 30, (iv) se unen a un epítopo localizado en el CLD18A2-bucle D3, preferiblemente SEQ ID NO: 31, (v) se unen a un epítopo, que abarca CLD18A2-bucle1 y CLD18A2-bucle D3, (vi) se unen a un epítopo no glicosilado localizado en el CLD18A2-bucle D3, preferiblemente SEQ ID NO: 29, o (vii) se unen a un epítopo 25 presente en CLD18 humano y de ratón (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respectivamente).
En realizaciones particularmente preferidas, los anticuerpos de la divulgación se unen a un epítopo sobre CLD18A2 que no está presente en CLD18A1.
Los anticuerpos de la divulgación incluyen anticuerpos completamente humanos. Dichos anticuerpos pueden 30 producirse en un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos frente a CLD18 sometiéndose a recombinación V-D-J y conmutación de isotipos. Dicho animal transgénico puede ser también un conejo transgénico para producir anticuerpos policlonales tal como se describe en el documento US 2003/0017534.
La unión de un anticuerpo de la divulgación al antígeno CLD18 puede mediar la muerte de células que expresan 35 CLD18 (por ejemplo, una célula tumoral), por ejemplo, por activación del sistema del complemento. La muerte de células que expresan CLD18 puede producirse por uno o más de los siguientes mecanismos: citotoxidad dependiente del complemento (CDC) de células que expresan CLD18; apoptosis de células que expresan CLD18; fagocitosis de células efectoras de células que expresan CLD18; o célula citotóxica dependiente de anticuerpos de células efectoras (ADCC) de células que expresan CLD18. 40
Con el fin de que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, se definen en primer lugar ciertos términos. A lo largo de la descripción detallada se exponen definiciones adicionales.
Definición de términos
El término CLD18 se refiere a claudina-18 e incluye cualquier variante, incluyendo CLD18A1 y CLD18A2, conformaciones, isoformas y homólogos de especies de CLD18 que se expresan naturalmente por células o se 45 expresan por células transfectadas con el gen CLD18. Preferiblemente, "CLD18" se refiere a CLD18 humano, en particular CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) y/o CLD18A1 (SEQ ID NO: 7, 8), más preferiblemente CLD18A2.
El término "CLD18A1" incluye variantes, isoformas y homólogos de especies modificadas postraducción de CLD18A1 humano que se expresan naturalmente por células o se expresan en células transfectadas con el gen CLD18A1. 50
El término "CLD18A2" incluye variantes, isoformas y homólogos de especies de CLD18A2 modificados postraducción que se expresan naturalmente por células o se expresan en células transfectadas con el gen CLD18A2.
El término "variante de CLD18" abarcará (i) variantes de empalme de CLD18, (ii) CLD18 variantes modificadas
postraducción, particularmente incluyendo variantes con diferente estado de N-glicosilación, (iii) variantes de conformación de CLD18, incluyendo particularmente CLD18 conformación-1, CLD18 conformación-2 y CLD18-conformación-3, (iv) variantes CLD18 libres y homotípicamente/heterotípicamente asociadas localizadas en las uniones estrechas intercelulares, (v) CLD18 relacionadas con cáncer y CLD18 variantes no relacionadas con el cáncer. 5
El término "balsa" se refiere a los microdominios de membrana ricos en esfingolípidos y colesterol situados en el área exterior de la membrana plasmática de una célula. La capacidad de ciertas proteínas de asociarse dentro de tales dominios y su capacidad para formar "agregados" o "agregados focales" puede afectar la función de la proteína. Por ejemplo, la translocación de moléculas de CLD18 en tales estructuras, después de estar unidas por anticuerpos de la presente divulgación, crea una alta densidad de complejos antígeno-anticuerpo CLD18 en las 10 membranas plasmáticas. Dicha alta densidad de complejos antígeno-anticuerpo CLD18 puede permitir una activación eficaz del sistema del complemento durante los CDC.
Los términos "conformación" y "topología" describen cómo una molécula de membrana integral está posicionada en la membrana de la superficie celular y, en particular, cuáles de sus regiones son extracelulares y, por tanto, elegibles para anticuerpos. CLD18, por ejemplo, puede existir en tres conformaciones diferentes, lo que muy probablemente 15 dependerá de si es prevalente como homómeros o heterómeros y si está integrado en estructuras de unión estrecha supramoleculares o "libre". Estos diferentes estados dan lugar a diferentes epítopos elegibles para anticuerpos.
De acuerdo con la divulgación, el término “enfermedad” se refiere a cualquier estado patológico, incluyendo el cáncer, en particular las formas de cáncer descritas en el presente documento.
Por "tumor" se entiende un grupo anormal de células o tejido que crece por una proliferación celular rápida y no 20 controlada y continúa creciendo después de que cesen los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran parcial o total falta de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigno o maligno.
Por "metástasis" se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende de la separación de las células malignas del 25 tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para entrar en la cavidad corporal y los vasos y luego, después de ser transportado por la sangre, infiltración de órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio diana depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células tumorales o componentes pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de 30 acuerdo con la divulgación se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.
El término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, ralentizar o inhibir la progresión o empeoramiento, o prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o sus síntomas.
De acuerdo con la divulgación, una muestra puede ser cualquier muestra útil de acuerdo con la presente 35 divulgación, en particular una muestra biológica tal como una muestra de tejido, incluyendo fluidos corporales y/o una muestra celular y se puede obtener de la manera convencional tal como por biopsia de tejido, incluyendo biopsia de punzón, y tomando sangre, aspiración bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. Según la divulgación, el término "muestra biológica" también incluye fracciones de muestras biológicas.
El término anticuerpo se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos 40 cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. El término “anticuerpo” también incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, en particular de los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glicosilados y cualquier fragmento de anticuerpo que se une a antígenos y derivados como se describe a continuación. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en este 45 documento como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones de armazón (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino 50 hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico de complemento. 55
El término anticuerpo humanizado se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al
antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados en dominios constantes o solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones de estructura apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígenos pueden ser de tipo salvaje o modificado por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo modificado para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados preservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado 5 que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.
El término “anticuerpo quimérico” se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase particular, mientras que los restantes segmentos de 10 la cadena son homólogos a secuencias correspondientes en otro. Típicamente, la región variable de cadenas tanto ligera como pesada imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a secuencias de anticuerpos derivadas de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando células B o hibridomas fácilmente disponibles de organismos huéspedes no humanos en 15 combinación con regiones constantes derivadas, por ejemplo, de preparaciones celulares humanas. Aunque la región variable tiene la ventaja de facilidad de preparación y la especificidad no se ve afectada por la fuente, siendo la región constante humana, es menos probable que provoque una respuesta inmune de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular. 20
El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión"), como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos 25 monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones aisladas de determinación de la complementariedad (CDR), y (vii) combinaciones de dos o más CDR 30 aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite fabricarse como una única cadena proteica en la que el VL y las regiones VH se unen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv), véase, por ejemplo, Bird et al (1988) Science 242: 423-426; and Huston y otros (1988) Proc. Natl. Acad. USA 85: 5879-35 5883). Tales anticuerpos de cadena única también están destinados a estar comprendidos dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otro ejemplo son proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona con un polipéptido de región de bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la 40 región constante CH2. El polipéptido de dominio de unión puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. 45
El término “epítopo” significa un determinante de proteína capaz de unirse a un anticuerpo, en el que el término "unión" en la presente invención se refiere preferiblemente a una unión específica. Los epítopos consisten usualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la 50 unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
El término “epítopo discontinuo” tal como se utiliza en el presente documento, significa un epítopo conformacional en un antígeno proteico que se forma a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.
El término “molécula biespecífica” pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, un complejo de proteína, péptido o 55 proteína o péptido, que tiene dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular, y (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. El término “molécula multiespecífica” o “molécula heteroespecífica” pretende incluir cualquier agente, por ejemplo, un complejo de proteína, péptido o proteína o péptido, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular, (b) un receptor Fc en la 60 superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. Por consiguiente, la divulgación incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras multiespecíficas dirigidas a CLD18 y a
otros objetivos, tales como receptores Fc en células efectoras. El término “anticuerpos biespecíficos” también incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígenos (ver, por ejemplo, Holliger, 5 P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al., (1994) Structure 2: 1121-1123).
La divulgación también incluye derivados de los anticuerpos descritos en el presente documento. El término “derivados de anticuerpo” se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo es "derivado de" una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema mediante inmunización de un 10 animal o mediante cribado de una biblioteca de genes de inmunoglobulina, y en el que el anticuerpo seleccionado es al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo derivado de una secuencia de línea germinal particular mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos, más preferiblemente, no más de 5, o incluso más preferiblemente, no más de 15 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de la línea germinal.
Tal como se usa en el presente documento, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, derivados de los mismos o regiones de unión al antígeno unidas entre sí, al menos dos de las cuales tienen especificidades diferentes. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión para un receptor Fc 20 en una célula efectora y una especificidad de unión para un antígeno o epítopo en una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral.
Los anticuerpos descritos en la presente invención pueden ser anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden 25 incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).
El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una única 30 especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular. En una realización, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, fusionado a una célula inmortalizada.
El término “anticuerpo recombinante”, tal como se utiliza aquí, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, 35 un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de ellos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante de anticuerpos combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN. 40
El término "transfectoma", tal como se utiliza en el presente documento, incluye células huésped eucariotas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales u hongos, incluyendo células de levadura.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de 45 aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no está constituido por el organismo transgénico y que generalmente se deriva de una especie distinta del organismo transgénico.
Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de orígenes orgánicos diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena 50 pesada humana asociada con una cadena ligera de ratón es un anticuerpo heterohíbrido.
Los anticuerpos descritos en el presente documento están preferiblemente aislados. Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CLD18 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos 55 distintos de CLD18). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CLD18 humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies CLD18). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente
libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la divulgación, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y que se combinan en una composición bien definida.
De acuerdo con la divulgación, el término "unión" se refiere preferiblemente a "unión específica". Como se usa en el presente documento, "unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. 5 Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad correspondiente a un KD de aproximadamente 1 x 10-7 M o menos y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a un KD que es al menos dos órdenes de magnitud menor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado.
El término "KD" (M), tal como se utiliza aquí, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una 10 interacción anticuerpo-antígeno particular.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por genes de región constante de cadena pesada.
Tal como se usa en el presente documento, "conmutación de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase o isotipo de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a otra de las otras clases de Ig. 15
El término "de origen natural" tal como se utiliza en el presente documento como aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, se produce naturalmente un polipéptido o secuencia polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificado por el hombre en el laboratorio.
El término “reordenado” como se usa en el presente documento se refiere a una configuración de un locus de 20 inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera en el que un segmento V está situado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus del gen de inmunoglobulina (anticuerpo) reordenado puede identificarse por comparación con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado. 25
El término “configuración no reordenada” o "de línea germinal" como se usa en el presente documento en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no se recombina de manera que sea inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
El término "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza aquí, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, pero preferiblemente es 30 ADN de doble hebra.
Los ácidos nucleicos descritos de acuerdo con la divulgación han sido preferiblemente aislados. El término “ácido nucleico aislado” significa que el ácido nucleico fue (i) amplificado in vitro, por ejemplo por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido de forma recombinante por clonación, (iii) purificado, por ejemplo por escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo por síntesis química. Un ácido nucleico aislado 35 es un ácido nucleico que está disponible para la manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.
Los ácidos nucleicos pueden, según la divulgación, estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico está funcionalmente unido a secuencias de control de expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término “homólogo” significa que un ácido nucleico está también funcionalmente unido a la 40 secuencia de control de expresión naturalmente y el término "heterólogo" significa que un ácido nucleico no está funcionalmente enlazado a la secuencia de control de expresión naturalmente.
Un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico que expresa ARN y/o proteína o péptido, y una secuencia de control de expresión están "funcionalmente" unidos entre sí, si están unidos covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o la transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de 45 control de expresión. Si el ácido nucleico ha de traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de expresión ligada funcionalmente a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de expresión da como resultado la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco en la secuencia codificante o dicha secuencia codificadora no es capaz de traducirse a la proteína o péptido deseado.
El término "secuencia de control de expresión" comprende de acuerdo con los promotores de divulgación, sitios de 50 unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En realizaciones particulares de la divulgación, las secuencias de control de expresión pueden ser reguladas. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas que están implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de 55 taponado, secuencia CAAT, por ejemplo. Más específicamente, las secuencias de control de expresión no
transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de expresión también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras corriente arriba.
De acuerdo con la divulgación, el término “promotor” o “región promotora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está situada corriente arriba (5') con respecto a la secuencia de ácido nucleico que se expresa y 5 controla la expresión de la secuencia proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa. La "región promotora" puede incluir sitios de reconocimiento y unión adicionales para otros factores que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Además, un promotor puede ser "inducible" y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen 10 que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o sólo se expresa en una pequeña extensión si un agente inductor está ausente. En presencia del agente inductor, el gen se activa o el nivel de transcripción aumenta. Esto está mediado, en general, por unión de un factor de transcripción específico.
Los promotores que se prefieren de acuerdo con la divulgación incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN de U6 humano, promotor de CMV, y promotores híbridos artificiales de los mismos (por 15 ejemplo CMV) donde una parte o partes están fusionadas a una parte o partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como por ejemplo GAPDH humana (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), e incluyendo o no incluyendo intrones adicionales.
De acuerdo con la divulgación, el término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. 20 Además, la expresión puede llevarse a cabo transitoriamente o de forma estable.
En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico está de acuerdo con la divulgación presente en un vector, cuando sea apropiado con un promotor, que controla la expresión del ácido nucleico. El término "vector" se utiliza aquí en su sentido más general y comprende cualquier vehículo intermedio para un ácido nucleico que permita que dicho ácido nucleico, por ejemplo, sea introducido en células procariotas y/o eucariotas y, cuando sea 25 apropiado, para ser integrado en un genoma. Los vectores de este tipo son preferiblemente replicados y/o expresados en las células. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales. El término "plásmido", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una construcción de material genético extracromosómico, usualmente un dúplex de ADN circular, que puede replicarse independientemente del ADN cromosómico. 30
Como el vector para la expresión de un anticuerpo, puede utilizarse cualquiera de un tipo de vector en el que la cadena pesada del anticuerpo y la cadena ligera están presentes en diferentes vectores o un tipo de vector en el que la cadena pesada y la cadena ligera están presentes en el mismo vector.
Las divulgaciones dadas en el presente documento con respecto a las secuencias específicas de ácido nucleico y aminoácidos, por ejemplo los que se muestran en el listado de secuencias, deben ser interpretados de manera que 35 se refieran también a modificaciones de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicos y secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácido nucleico específicas. Una propiedad importante 40 es retener la unión de un anticuerpo a su objetivo o mantener las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferiblemente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo retiene la unión de dicho anticuerpo a CLD18 y preferiblemente las funciones de dicho anticuerpo como se describe en el presente documento, por ejemplo lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC. 45
Los expertos en la técnica apreciarán que en particular las secuencias de las regiones CDR, hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a CLD18. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o altamente homólogas a las regiones especificadas en el presente documento. Por "altamente homóloga" se contempla que se pueden hacer de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, tales como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones en las CDR. Además, las regiones hipervariables y variables pueden ser modificadas de manera que muestren una 50 homología sustancial con las regiones específicamente descritas en el presente documento.
Debe entenderse que los ácidos nucleicos específicos descritos aquí también incluyen ácidos nucleicos modificados con el fin de optimizar el uso de codones en una célula u organismo huésped particular. Las diferencias en el uso de codones entre organismos pueden conducir a una variedad de problemas relativos a la expresión génica heteróloga. La optimización de los codones mediante el cambio de uno o más nucleótidos de la secuencia original puede 55 resultar en una optimización de la expresión de un ácido nucleico, en particular en la optimización de la eficacia de traducción, en un huésped homólogo o heterólogo en el que dicho ácido nucleico ha de expresarse. Por ejemplo, si se utilizan ácidos nucleicos derivados de humanos y que codifican regiones constantes y/o regiones estructurales de anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación, por ejemplo para preparar anticuerpos quiméricos o
humanizados, puede preferirse modificar dichos ácidos nucleicos con el fin de optimizar el uso de codones, en particular si dichos ácidos nucleicos, opcionalmente fusionados a ácidos nucleicos heterólogos tales como ácidos nucleicos derivados de otros organismos como se describen en el presente documento, se expresan en células de un organismo diferente de humano tal como ratón o hámster. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas tales como las de SEQ ID NO: 40 y 45, 5 respectivamente, pueden modificarse para incluir uno o más, preferiblemente al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 y preferiblemente hasta 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 o 100 o más reemplazos de nucleótidos dando como resultado un uso optimizado del codón pero no dando como resultado un cambio de la secuencia de aminoácidos. Tales sustituciones de nucleótidos se refieren preferiblemente a reemplazos de nucleótidos en SEQ ID Nos: 40 y 45, respectivamente, seleccionados de los reemplazos mostrados en la siguiente alineación de SEQ ID Nos: 40 y 45, 10 respectivamente, con sus homólogos modificados y que no da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada o se refieren a reemplazos correspondientes en posiciones correspondientes en otras secuencias de ácido nucleico que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas, respectivamente. Preferiblemente, se efectúan todas las sustituciones mostradas en las siguientes alineaciones de SEQ ID Nos: 40 y 45, respectivamente, con sus contrapartes modificadas que no dan lugar a un cambio en la 15 secuencia de aminoácidos codificada en secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas, respectivamente.
Alineación de SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 147:
20
Alineación de SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 149:
Además, puede ser deseable, de acuerdo con la presente divulgación, modificar las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, en particular las de las regiones constantes de la cadena pesada humana para adaptar la secuencia a un alotipo deseado, por ejemplo un alotipo encontrado en la población caucásica. Tales modificaciones se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en los siguientes reemplazos de aminoácidos 5 dentro de SEQ ID NO: 46 o en posiciones correspondientes dentro de otras regiones constantes de cadena pesada humana: K93R, D235E y L237M. Preferiblemente, todas estas modificaciones se incluyen en secuencias de aminoácidos de regiones constantes de cadena pesada humana.
Según la divulgación, el término "posiciones correspondientes" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos que en una secuencia de alineación de dos secuencias de ácido nucleico o proteína están alineados entre sí. 10
Preferiblemente, el grado de identidad entre una secuencia de ácido nucleico específica descrita en el presente documento y una secuencia de ácido nucleico que está modificada con respecto a dicha secuencia de ácido nucleico específica será al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80 en peso, incluso más preferiblemente al menos 90% o más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Preferiblemente, las dos secuencias son capaces de hibridarse y formar un dúplex estable entre sí, realizándose la 15 hibridación preferiblemente en condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas). Las condiciones rigurosas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editores, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York y se refieren, por ejemplo, a hibridación a 65ºC en regulador de hibridación (3.5 x SSC, Ficoll 0.02%, polivinilpirrolidona al 20 0.02%, albúmina de suero bovino al 0.02% , 2.5 mM de NaH2PO4 (pH 7), 0.5% de SDS, 2 mM de EDTA). SSC es cloruro sódico 0.15 M/citrato sódico 0.15 M, pH 7. Después de la hibridación, la membrana a la que se ha transferido el ADN se lava, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y luego en 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS a temperaturas de hasta 68°C.
Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente la identidad entre una secuencia de aminoácidos específica 25 descrita en el presente documento y una secuencia de aminoácidos que está modificada con respecto a dicha secuencia de aminoácidos específica, tal como entre secuencias de aminoácidos que muestran homología sustancial, será al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90% o más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
Todas las secuencias modificadas descritas anteriormente están dentro del alcance de la presente divulgación. 30
"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservativas de aminoácidos. La "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos o secuencias de ácido nucleico indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.
El "porcentaje de identidad" se obtiene después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias distribuidas al azar y en toda su longitud. Las comparaciones de 35 secuencias entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se realizan convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineadas óptimamente, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede producirse, además manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local 40 de Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin).
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que 45 se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido
por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Las “sustituciones conservadoras” pueden hacerse, por ejemplo, basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo: (a) aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; (b) aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y 5 glutamina; (c) aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y (d) aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden hacerse dentro de los grupos (a)-(d). Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse entre sí basándose en su capacidad para interrumpir [alfa]-hélices. Algunas sustituciones preferidas se pueden hacer entre los siguientes grupos: (i) S y T; (Ii) P y G; y (iii) A, V, L e I. Dado el código genético conocido y las técnicas de ADN recombinante y 10 sintético, el experto en la materia puede fácilmente construir ADN que codifiquen las variantes conservadoras de aminoácidos.
La presente divulgación comprende anticuerpos en los que se han realizado alteraciones en la región Fc con el fin de cambiar las propiedades funcionales o farmacocinéticas de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden resultar en una disminución o aumento de la unión de C1q y CDC o de la unión de FcR y ADCC. Las sustituciones se pueden 15 hacer, por ejemplo, en uno o más de los restos de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada, causando de este modo una alteración en una función efectora mientras que conservan la capacidad de unirse al antígeno en comparación con el anticuerpo modificado, por ejemplo, US 5,624,821 y US 5,648,260.
La vida media in vivo de anticuerpos se puede mejorar modificando el epítopo del receptor de salvamento del dominio constante de Ig o un dominio constante similar a Ig de modo que la molécula no comprende un dominio CH2 20 intacto o una región Ig Fc intacta, por ejemplo US 6,121,022 y US 6,194,551. La vida media in vivo puede además aumentarse haciendo mutaciones en la región Fc, por ejemplo, sustituyendo la treonina por la leucina en la posición 252, sustituyendo la serina por la treonina en la posición 254 o sustituyendo la fenilalanina por la treonina en la posición 256, por ejemplo US 6,277,375.
Además, el patrón de glicosilación de anticuerpos se puede modificar para cambiar la función efectora de los 25 anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden expresarse en un transfectoma que no añade la unidad de fucosa normalmente unida a Asn en la posición 297 de la región Fc con el fin de aumentar la afinidad de la región Fc por los receptores Fc que, a su vez, dará como resultado un ADCC aumentado de los anticuerpos en presencia de células NK, por ejemplo Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Además, la modificación de la galactosilación puede hacerse con el fin de modificar los CDC. 30
Alternativamente, en otra realización, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante del anticuerpo anti-CLD18, tal como por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-CLD18 modificados resultantes pueden ser seleccionados para determinar la actividad de unión.
El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), tal como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe 35 entenderse que tales términos pretenden referirse no sólo a la célula en cuestión sino a la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones posteriores debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie no puede, de hecho, ser idéntica a la célula madre, pero todavía está incluida dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en el presente documento. Las células huésped recombinantes incluyen, por ejemplo, transfectomas, tales como células CHO, células NS/0 y células linfocíticas. 40
Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
El término "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferiblemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (integrados o no integrados en el ADN 45 genómico natural del animal) y que es preferiblemente capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén humano de cadena ligera y un transgén humano de cadena pesada o transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos anti-CLD18 humanos cuando se inmuniza con antígeno CLD18 y/o células que expresan CLD18. El transgén humano de cadena pesada puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para ratones transgénicos, por ejemplo, 50 ratones HuMAb, tales como ratones HCo7 o HCol2, o el transgén humano de cadena pesada puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso de ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describe en el documento WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos a CLD18 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) sometiéndose a recombinación V-D-J y conmutación de isotipo. 55
Mecanismos de acción del mAb
Aunque lo siguiente proporciona consideraciones con respecto al mecanismo subyacente a la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la divulgación, no debe considerarse como limitante de la divulgación de ninguna manera.
Los anticuerpos descritos en el presente documento interactúan preferiblemente con componentes del sistema inmune, preferiblemente mediante ADCC o CDC. Los anticuerpos de la divulgación también pueden usarse para dirigir cargas útiles (por ejemplo, radioisótopos, fármacos o toxinas) para matar directamente células tumorales o pueden usarse sinérgicamente con agentes quimioterapéuticos tradicionales, atacando tumores a través de mecanismos de acción complementarios que pueden incluir respuestas inmunitarias antitumorales que puede haber 5 sido comprometida debido a los efectos secundarios citotóxicos de un quimioterapéutico sobre linfocitos T.
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. ADCC describe la capacidad de destrucción de células efectoras como se describe aquí, en particular linfocitos, que preferiblemente requiere que la célula diana esté marcada por un anticuerpo.
Preferiblemente, ADCC ocurre cuando los anticuerpos se unen a antígenos en células tumorales y los dominios Fc 10 de anticuerpo se conectan con receptores Fc (Fc) sobre la superficie de células efectoras inmunes. Se han identificado varias familias de receptores Fc, y las poblaciones celulares específicas expresan característicamente receptores Fc definidos. ADCC puede ser visto como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de la destrucción inmediata del tumor que conduce a la presentación de antígenos y la inducción de respuestas de células T inducidas por tumores. Preferiblemente, la inducción in vivo de ADCC conducirá a respuestas de células T 15 dirigidas por tumor y a respuestas de anticuerpos administrados en el huésped.
Citotoxicidad dependiente del complemento. CDC es otro método de muerte celular que puede ser dirigido por anticuerpos. IgM es el isotipo más eficaz para la activación del complemento. IgG1 e IgG3 son también muy eficaces para dirigir CDC a través de la clásica vía de activación del complemento. Preferiblemente, en esta cascada, la formación de complejos antígeno-anticuerpo da lugar a la separación de múltiples sitios de unión C1q en estrecha 20 proximidad en los dominios CH2 de moléculas de anticuerpos participantes, tales como moléculas de IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferiblemente, estos sitios de unión C1q no unidos a la cubierta convierten la interacción C1q-IgG previamente de baja afinidad a una de alta avidez, lo que desencadena una cascada de eventos que implican una serie de otras proteínas del complemento y conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos/activadores de células efectoras C3a y C5a. Preferiblemente, la cascada 25 del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el paso libre de agua y solutos dentro y fuera de la célula.
Producción de anticuerpos
Los anticuerpos de la divulgación pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de 30 Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos-B o técnicas de presentación de fagos utilizando bibliotecas de genes de anticuerpos.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. 35 La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. En la técnica se conocen protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión. También se conocen parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
Otros sistemas animales preferidos para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y el de conejo (por ejemplo, descrito en Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9348 (1995), 40 véase también Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
En aún otra realización preferida, se pueden generar anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CLD18 usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones conocidos como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en el presente documento como "ratones 45 transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en tales ratones transgénicos puede realizarse como se describe en detalle para CD20 en WO2004 035607.
Otra estrategia para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente genes que codifican anticuerpos de linfocitos que producen anticuerpos de estrategia definida, por ejemplo véase Babcock et al., 1996; una nueva estrategia para generar anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos únicos aislados que producen anticuerpos de 50 estrategia definida. Para detalles de la ingeniería de anticuerpos recombinantes véase también Welschof and Kraus, anticuerpos recombinantes para terapia de cáncer ISBN-0-89603-918-8 y Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
Inmunizaciones
Para generar anticuerpos contra CLD18, los ratones pueden inmunizarse con péptidos conjugados con vehículo 55 derivados de la secuencia CLD18, una preparación enriquecida de antígeno CLD18 expresado de forma recombinante o fragmentos de los mismos y/o células que expresan CLD18, como se describe. Alternativamente, los
ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el CLD18 humano de longitud completa (por ejemplo SEQ ID NO: 1) o fragmentos de los mismos, en particular los de las SEQ ID Nos: 15, 17 y 19. En el caso de que las inmunizaciones usando una proteína purificada o enriquecida la preparación del antígeno CLD18 no da lugar a anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan CLD18, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunes. 5
La respuesta inmunitaria puede monitorizarse a lo largo del curso del protocolo de inmunización con plasma y muestras de suero obtenidas por sangría de venas de la cola o retroorbitales. Se pueden utilizar ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-CLD18 para fusiones. Los ratones pueden ser estimulados intraperitonealmente o intravenosamente con células que expresan CLD18 3 días antes del sacrificio y eliminación del bazo para aumentar la tasa de hibridomas específicos que secretan anticuerpos. 10
Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a CLD18, se pueden aislar y fusionar esplenocitos y células de nodos linfáticos de ratones inmunizados a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden entonces ser seleccionados para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Los pozos individuales pueden entonces ser examinados por ELISA para 15 detectar hibridomas que secretan anticuerpos. Por inmunofluorescencia y análisis FACS usando células que expresan CLD18, se pueden identificar anticuerpos con especificidad para CLD18. Los hibridomas secretores de anticuerpos pueden ser replantados, rastreados de nuevo, y si todavía son positivos para los anticuerpos monoclonales anti-CLD18 se pueden subclonar mediante dilución limitante. Los subclones estables pueden luego cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo tisular para caracterización. 20
Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos de la divulgación también se pueden producir en un transfectoma de células huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como son bien conocidos en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por ejemplo, en una realización, el gen o genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, pueden ligarse a un 25 vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariota tal como el utilizado por el sistema de expresión génica GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpo clonado puede introducirse en células huésped eucarióticas tales como células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o, alternativamente, otras células eucariotas como células derivadas de plantas, células de hongos o levaduras. El método utilizado para 30 introducir estos genes puede ser métodos descritos en la técnica tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpo en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden ser identificadas y seleccionadas. Estas células representan los transfectomas que pueden ser amplificados para su nivel de expresión y aumentados para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes de cultivo y/o células. 35
Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, incluyendo células procariotas, tales como microorganismos, por ejemplo E coli. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales no humanos transgénicos, tales como en leche de oveja y conejos o en huevos de gallina, o en plantas transgénicas; véase, por ejemplo Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839. 40
Uso de secuencias de anticuerpos parciales para expresar anticuerpos intactos (es decir, humanización y quimerización).
a) Quimerización
Los anticuerpos monoclonales murinos se pueden utilizar como anticuerpos terapéuticos en seres humanos cuando se marcan con toxinas o isótopos radiactivos. Los anticuerpos murinos no marcados son altamente inmunogénicos 45 en el hombre cuando se aplican repetidamente conduciendo a la reducción del efecto terapéutico. La inmunogenicidad principal está mediada por las regiones constantes de la cadena pesada. La inmunogenicidad de anticuerpos murinos en el hombre puede reducirse o evitarse completamente si los anticuerpos respectivos son quimerizados o humanizados. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, cuyas diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino 50 y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra uniendo las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de la cadena pesada y ligera humana (por ejemplo, como se describe en Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). En una realización preferida, los anticuerpos quiméricos se generan uniendo la región constante kappa-cadena ligera humana a la región variable de la cadena ligera de ratón. 55 En una realización también preferida, pueden generarse anticuerpos quiméricos uniendo la región constante de la cadena ligera lambda humana a la región variable de la cadena ligera de ratón. Las regiones constantes de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes
de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.
b) Humanización
Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que están localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDR). Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre los anticuerpos individuales 5 que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos naturales que ocurren naturalmente construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo natural específico injertado sobre secuencias estructurales de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327, Jones, P. et al. (1986) Nature 10 321: 522-525 y Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033). Dichas secuencias armazón pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal se diferencian de las secuencias de genes de anticuerpos maduros porque no incluirán genes variables ensamblados completamente, los cuales están formados por la unión de V (D) J durante la maduración de células B. Las secuencias de los genes de la línea germinal también diferirán 15 de las secuencias de un anticuerpo del repertorio secundario de alta afinidad en el individuo uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción amino terminal de la región de armazón 1 y en la porción carboxi terminal de la región de armazón 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener toda la secuencia de ADN de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante 20 intacto que tiene propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase el documento WO 99/45962). Las secuencias de cadena ligera y pesada parciales que abarcan las regiones CDR son típicamente suficientes para este propósito. La secuencia parcial se utiliza para determinar qué variables genéticas y segmentos génicos de unión contribuyen a los genes variables del anticuerpo recombinado. La secuencia de la línea germinal se utiliza entonces para rellenar las partes faltantes de las regiones variables. La secuencia líder de cadena pesada y ligera 25 se escinde durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para añadir secuencias faltantes, las secuencias de cADN clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos por ligación o amplificación por PCR. Alternativamente, la región variable entera se puede sintetizar como un conjunto de oligonucleótidos cortos y solapantes y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de región variable totalmente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas tales como eliminación o inclusión o sitios de 30 restricción particulares, u optimización de codones particulares.
Las secuencias de nucleótidos de transcritos de cadena pesada y ligera de hibridomas se usan para diseñar un conjunto superpuesto de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con idénticas capacidades de codificación de aminoácidos como las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: las cadenas de bases de nucleótidos repetidas se 35 interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; se incorporan sitios de iniciación de traducción óptimos de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); y los sitios HindIII se construyen antes de los sitios de iniciación de la traducción.
Tanto para las regiones variables de cadena pesada como ligera, la codificación optimizada y las correspondientes secuencias de hebra no codificantes se descomponen en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del 40 correspondiente oligonucleótido no codificante. Por tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos de doble cadena superpuestos que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. A continuación, las agrupaciones se usan como plantillas para producir productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Típicamente, un único conjunto de oligonucleótidos de región variable se dividirá en dos agrupaciones que se amplifican por separado para generar dos productos de PCR solapantes. Estos productos 45 solapantes se combinan entonces mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento de superposición de la región constante de cadena pesada o ligera en la amplificación de PCR para generar fragmentos que pueden ser clonados fácilmente en las construcciones de vector de expresión.
Las regiones variables de cadenas pesada y ligera quimerizadas o humanizadas reconstruidas se combinan a 50 continuación con secuencias de terminación de transcripción, promotor, iniciador, iniciación de traducción, región constante, 3' no traducida, poliadenilación y transcripción para formar construcciones de vector de expresión. Las construcciones de expresión de cadena pesada y ligera se pueden combinar en un solo vector, cotransfectadas, transfectadas en serie o transfectadas por separado en células huésped que se fusionan a continuación para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas. Los plásmidos para uso en la construcción de vectores de 55 expresión para IgGκ humana se describen a continuación. Los plásmidos se construyeron de manera que se pudieran usar secuencias de cADN de cadena ligera V pesada y V kappa amplificadas por PCR para reconstruir minigenes completos de cadenas pesada y ligera. Estos plásmidos se pueden usar para expresar anticuerpos Kappa completamente humanos, o quiméricos IgG1, Kappa o IgG4. Se pueden construir plásmidos similares para la expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras 60 lambda.
Por lo tanto, en otro aspecto de la divulgación, se utilizan las características estructurales de los anticuerpos anti-CLD18 de la divulgación para crear anticuerpos anti-CLD18 humanizados relacionados estructuralmente que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la divulgación, tales como unión a CLD18. Más específicamente, una o más regiones CDR de anticuerpos monoclonales de ratón pueden combinarse de forma recombinante con regiones de armazón humana conocidas y CDR para crear anticuerpos anti-CLD18 humanizados 5 adicionales, de ingeniería recombinante, de la divulgación.
Unión a las células que expresan el antígeno
La capacidad del anticuerpo para unirse a CLD18 se puede determinar usando ensayos de unión convencionales, tales como los expuestos en los ejemplos (por ejemplo, ELISA, Inmunoprecipitación Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo). 10
Caracterización de la unión de anticuerpos
Para purificar anticuerpos anti-CLD18, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en matraces giratorios de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos anti-CLD18 en biorreactores basados en diálisis. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y, si es necesario, concentrados antes de la cromatografía de afinidad con proteína G-sefarosa o proteína Asefarosa. La IgG eluida se puede verificar 15 mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para asegurar la pureza. La solución reguladora se puede intercambiar por PBS, y la concentración puede determinarse mediante OD280 usando un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden dividirse en alícuotas y almacenarse a -80ºC.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CLD18 seleccionados se unen a epítopos únicos, se puede 20 usar la mutagénesis dirigida al sitio o multisitio.
Determinación del isotipo
Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden realizar isótopos ELISA con diversos kits comerciales (por ejemplo, Zymed, Roche Diagnostics). Los pozos de placas de microvaloración pueden recubrirse con Ig anti-ratón. Después del bloqueo, las placas se hacen reaccionar con anticuerpos monoclonales o controles de 25 isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. Los pozos pueden entonces hacerse reaccionar con cualquiera de las sondas conjugadas con peroxidasa de IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de ratón, IgA o IgM específica de ratón. Después del lavado, las placas se pueden desarrollar con sustrato ABTS (1 mg/ml) y se analizan a una OD de 405-650. Alternativamente, se puede usar el kit de isotipos de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, No. de cat. 1493027) como lo describe el fabricante. 30
Análisis de citometría de flujo
Con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos anti-CLD18 en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CLD 18, puede usarse citometría de flujo. Las líneas celulares que se expresan naturalmente o después de la transfección CLD18 y los controles negativos que carecen de expresión de CLD18 (cultivadas bajo condiciones de crecimiento estándar) pueden mezclarse con diversas 35 concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridomas o en PBS que contienen FBS al 1% y pueden incubarse a 4ºC durante 30 minutos. Después del lavado, el anticuerpo anti-IgG marcado con APC o Alexa647 puede unirse al anticuerpo monoclonal unido a CLD18 en las mismas condiciones que la tinción primaria del anticuerpo. Las muestras se pueden analizar por citometría de flujo con un instrumento FACS utilizando la luz y las propiedades de dispersión lateral a la puerta de las células individuales, vivas. Con el fin de distinguir los 40 anticuerpos monoclonales específicos para CLD18 de los aglutinantes no específicos en una sola medición, se puede emplear el método de cotransfección. Las células transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican CLD18 y un marcador fluorescente pueden teñirse como se ha descrito anteriormente. Las células transfectadas se pueden detectar en un canal de fluorescencia diferente que las células teñidas con el anticuerpo. Como la mayoría de las células transfectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales específicos de CLD18 se 45 unen preferentemente a las células que expresan el marcador de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una proporción comparable a las células no transfectadas. Se puede usar un ensayo alternativo usando microscopía de fluorescencia además o en lugar del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente como se ha descrito anteriormente y examinarse mediante microscopía de fluorescencia. 50
Las proteínas de unión estrecha tienden a ser internalizadas, si el contacto de la células con células vecinas de células particularmente adherentes se pierde, por ejemplo, por desprendimiento de células. La expresión en la superficie celular de CLD18 puede optimizarse mediante a) ajuste de las condiciones de cultivo, (por ejemplo EDTA/PBS 2 mM o acutasa), procesamiento a temperatura ambiente y adición de inhibidores de endocitosis (por ejemplo, azida de sodio) o activadores de transcripción o traducción de CLD18, y por b) selección y clonación de 55 células que mantienen CLD 18 en altos niveles en la superficie celular, por ejemplo por selección con antibióticos en términos de células transfectadas, por clasificación de células inmunomagnéticas o FACS, y por clonación de dilución limitada.
Microscopía de inmunofluorescencia
Con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos anti-CLD18 en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CLD18, se puede utilizar el análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan espontáneamente o después de transfección CLD18 y controles negativos que carecen de expresión de CLD18 se hacen crecer en portaobjetos de cámara en 5 condiciones de crecimiento estándar en medio DMEM/F12, suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células pueden entonces fijarse con metanol o paraformaldehído o no ser tratadas. Las células pueden entonces hacerse reaccionar con anticuerpos monoclonales contra CLD18 durante 30 minutos a 25°C. Después del lavado, las células se pueden hacer reaccionar con un anticuerpo secundario de IgG anti-ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) en las mismas 10 condiciones. Las células pueden ser examinadas entonces por microscopía de fluorescencia.
Los niveles totales de CLD18 en las células se pueden observar cuando las células están fijadas con metanol o fijadas con paraformaldehído y permeabilizadas con Triton X-100. En las células vivas y no permeabilizadas, puede examinarse la localización de CLD18 en la superficie de células fijadas con paraformaldehído. Adicionalmente, la orientación de CLD18 a uniones estrechas puede analizarse mediante la cotinción con marcadores de unión 15 estrechos tales como ZO-1. Además, se pueden examinar los efectos de la unión a anticuerpos y la localización de CLD18 dentro de la membrana celular.
Inmunoprecipitación Western
La IgG anti-CLD18 se puede ensayar adicionalmente con respecto a la reactividad con el antígeno CLD18 por Inmunoprecipitación Western. En resumen se pueden preparar extractos celulares de células que expresan CLD18 y 20 controles negativos apropiados y se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, se bloquearán y se probarán con los anticuerpos monoclonales por ensayar. La unión a IgG se puede detectar usando peroxidasa IgG anti-ratón y se desarrolla con sustrato ECL.
Inmunohistoquímica 25
Las IgG de ratón anti-CLD18 se pueden ensayar adicionalmente con respecto a la reactividad con el antígeno CLD18 por inmunohistoquímica de una manera bien conocida por el experto en la técnica, por ejemplo utilizando criosecciones fijadas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido embebidas en parafina fijadas con paraformaldehído a partir de tejidos no cancerosos o muestras de tejido cancerígeno obtenidas de pacientes durante procedimientos quirúrgicos de rutina o de ratones portadores de tumores xenoinjertos inoculados con líneas 30 celulares que expresan espontáneamente (por ejemplo DAN-G, SNU-16, o KATO-III) o después de la transfección (por ejemplo, HEK293) CLD18. Para la inmunocoloración se pueden incubar anticuerpos reactivos a CLD18 seguidos de anticuerpos de cabra anti-ratón o cabra anti-conejo (DAKO) conjugados con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con las instrucciones de los proveedores.
Actividades fagocíticas y de muerte de células de los anticuerpos in vitro 35
Además de unirse específicamente a CLD18, los anticuerpos anti-CLD18 pueden ensayarse en cuanto a su capacidad para mediar la fagocitosis y la muerte de células que expresan CLD18. El ensayo de la actividad del anticuerpo monoclonal in vitro proporcionará un cribado inicial antes de ensayar modelos in vivo.
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC):
En resumen, las células polimorfonucleares (PMN), células NK, monocitos, células mononucleares u otras células 40 efectoras, de donantes sanos pueden purificarse mediante centrifugación por densidad de Ficoll Hypaque, seguido de lisis de eritrocitos contaminantes. Las células efectoras lavadas pueden suspenderse en RPMI suplementado con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10% o, alternativamente con suero humano inactivado por calor al 5% y mezclado con células diana marcadas con 51Cr que expresan CLD18, a diversas relaciones de células efectoras a células diana. Alternativamente, las células diana se pueden marcar con un ligando potenciador de la fluorescencia 45 (BATDA). Un quelato altamente fluorescente de Europio con el ligando potenciador que se libera de las células muertas se puede medir con un fluorómetro. Otra técnica alternativa puede utilizar la transfección de células diana con luciferasa. El amarillo de lucifer añadido puede ser oxidado sólo por células viables. A continuación, pueden añadirse IgG anti-CLD18 purificadas a diversas concentraciones. Se puede usar IgG humana no relevante como control negativo. Los ensayos se pueden llevar a cabo durante 4 a 20 horas a 37ºC dependiendo del tipo de célula 50 efectora utilizado. Las muestras se pueden ensayar para la citólisis midiendo la liberación de 51Cr o la presencia del quelato de EuTDA en el sobrenadante del cultivo. Alternativamente, la luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo de lucifer puede ser una medida de células viables.
Los anticuerpos monoclonales anti-CLD18 también pueden ensayarse en diversas combinaciones para determinar si la citólisis se mejora con múltiples anticuerpos monoclonales. 55
Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC):
Los anticuerpos anti-CLD18 monoclonales pueden ensayarse en cuanto a su capacidad para mediar CDC usando una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, el suero para el complemento puede obtenerse a partir de la sangre de una manera conocida por el experto en la materia. Para determinar la actividad de CDC de mAbs, se pueden usar diferentes métodos. La liberación de 51Cr se puede medir por ejemplo o se puede evaluar la permeabilidad a la membrana elevada usando un ensayo de exclusión de yoduro de propidio (PI). En pocas 5 palabras, las células diana se pueden lavar y se pueden incubar 5 x 105/ml con diversas concentraciones de mAb durante 10-30 minutos a temperatura ambiente o a 37°C. A continuación se puede añadir suero o plasma a una concentración final de 20% (v/v) y las células se incuban a 37ºC durante 20-30 minutos. Todas las células de cada muestra se pueden añadir a la solución PI en un tubo FACS. La mezcla puede entonces analizarse inmediatamente por análisis de citometría de flujo usando FACSArray. 10
En un ensayo alternativo, la inducción de CDC se puede determinar en células adherentes. En una realización de este ensayo, las células se siembran 24 h antes del ensayo con una densidad de 3 x 104/pozo en placas de microtitulación de fondo plano de cultivo de tejidos. El medio de crecimiento del día siguiente se retira y las células se incuban por triplicado con anticuerpos. Las células de control se incuban con medio de crecimiento o medio de crecimiento que contiene saponina al 0.2% para la determinación de lisis de fondo y lisis máxima, respectivamente. 15 Después de la incubación durante 20 minutos se elimina el sobrenadante a temperatura ambiente y se añade a las células un plasma o suero humano al 20% (v/v) en DMEM (precalentado a 37°C) y se incuba durante otros 20 minutos a 37°C. Todas las células de cada muestra se añaden a solución de yoduro de propidio (10 µg/ml). A continuación, los sobrenadantes se reemplazan por PBS que contiene 2.5 µg/ml de bromuro de etidio y la emisión de fluorescencia por excitación a 520 nm se mide a 600 nm usando un Tecan Safire. El porcentaje de lisis específica 20 se calcula como sigue: % de lisis específica = (fondo de fluorescencia-muestra fluorescencia)/(fluorescencia máxima de lisis - fondo de fluorescencia) x 100.
Inhibición de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales:
Para probar la capacidad para iniciar la apoptosis, los anticuerpos anti-CLD18 monoclonales pueden incubarse, por ejemplo, con células tumorales positivas para CLD18, por ejemplo, células tumorales transfectadas con SNU-16, 25 DAN-G, KATO-III o CLD18 a 37ºC para aproximadamente 20 horas. Las células se pueden cosechar, lavar en regulador de unión Annexin-V (BD biosciences), y se incuban con Annexina V conjugada con FITC o APC (BD biosciences) durante 15 minutos en la oscuridad. Todas las células de cada muestra se pueden añadir a la solución PI (10 µg/ml en PBS) en un tubo FACS y se evalúan inmediatamente mediante citometría de flujo (como anteriormente). Alternativamente, se puede detectar una inhibición general de la proliferación celular por anticuerpos 30 monoclonales con kits comercialmente disponibles. El kit de proliferación de células DELFIA (Perkin-Elmer, No. de cat. AD0200) es un inmunoensayo no isotópico basado en la medición de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante la síntesis de ADN de células proliferantes en microplacas. La BrdU incorporada se detecta utilizando anticuerpo monoclonal marcado con europio. Para permitir la detección de anticuerpos, se fijan las células y se desnaturaliza el ADN utilizando la solución Fix. El anticuerpo no unido se elimina por lavado y se añade 35 inductor DELFIA para disociar los iones de europio del anticuerpo marcado en solución, donde forman quelatos altamente fluorescentes con componentes del inductor DELFIA. La fluorescencia medida -utilizando fluorometría resuelta en el tiempo, en la detección- es proporcional a la síntesis de ADN en la célula de cada pozo.
Estudios preclínicos
Los anticuerpos monoclonales que se unen a CLD18 también se pueden ensayar en un modelo in vivo (por ejemplo, 40 en ratones con deficiencia inmunológica que portan tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan CLD18, por ejemplo DAN-G, SNU-16 o KATO-III o después transfección, por ejemplo, HEK293) para determinar su eficacia en el control del crecimiento de células tumorales que expresan CLD18.
Los estudios in vivo después de la xenotransferencia de células tumorales que expresan CLD18 en ratones inmunocomprometidos u otros animales pueden realizarse usando anticuerpos de la divulgación. Los anticuerpos se 45 pueden administrar a ratones libres de tumor seguidos de la inyección de células tumorales para medir los efectos de los anticuerpos para prevenir la formación de tumores o síntomas relacionados con tumores. Los anticuerpos pueden administrarse a ratones portadores de tumores para determinar la eficacia terapéutica de los respectivos anticuerpos para reducir el crecimiento tumoral, las metástasis o los síntomas relacionados con el tumor. La aplicación de anticuerpos puede combinarse con la aplicación de otras sustancias como fármacos cistostáticos, 50 inhibidores del factor de crecimiento, bloqueadores del ciclo celular, inhibidores de la angiogénesis u otros anticuerpos para determinar la eficacia sinérgica y la toxicidad potencial de las combinaciones. Para analizar efectos secundarios tóxicos mediados por anticuerpos de los animales de divulgación se pueden inocular con anticuerpos o reactivos de control y se investigarán a fondo para detectar posibles síntomas relacionados con la terapia con anticuerpos CLD18. Los posibles efectos secundarios de la aplicación in vivo de anticuerpos CLD18 incluyen 55 particularmente la toxicidad en los tejidos que expresan CLD18 incluyendo el estómago y el pulmón. Anticuerpos que reconocen CLD18 en seres humanos y en otras especies, por ejemplo, ratones, son particularmente útiles para predecir efectos secundarios potenciales mediados por la aplicación de anticuerpos monoclonales CLD18 en seres humanos.
Mapeo de epítopos 60
El mapeo de los epítopos reconocidos por anticuerpos de la divulgación puede realizarse como se describe con detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)" de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 y en el "Mapeo de Epítopos: Un Enfoque práctico" Serie de enfoques prácticos, 248 por Olwyn M.R. Westwood, Frank C. Hay.
I. Moléculas biespecíficas/multiespecíficas que se unen a CLD18 5
En otra realización de la divulgación, los anticuerpos para CLD18 pueden derivarse o ligarse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab') para generar una molécula biespecífica o multiespecífica que se une a múltiples enlaces sitios o epítopos objetivo. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, péptido o 10 mimético de unión.
Por consiguiente, la presente divulgación incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para CLD18 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una realización particular de la divulgación, el segundo epítopo diana es un receptor Fc, por ejemplo Fc-gammaRI humano (CD64) o un receptor Fc-alfa humano (CD89), o un receptor de células T, por ejemplo 15 CD3. Por lo tanto, la divulgación incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas capaces de unirse tanto a células efectoras que expresan Fc-gammaR, Fc-alfaR o Fc-epsilonR (por ejemplo monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)), como a células diana que expresan CLD18. Estas moléculas biespecíficas y multiespecíficas pueden dirigir células que expresan CLD18 a células efectoras y pueden desencadenar actividades de células efectoras mediadas por receptor Fc, tales como fagocitosis de células que expresan CLD18, citotoxicidad 20 celular dependiente de anticuerpos (ADCC), liberación de citoquinas o generación de anión superóxido.
Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la divulgación pueden incluir además una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-CLD18. En una realización, la tercera especificidad de unión es una porción de factor antipotenciación (EF), por ejemplo una molécula que se une a una proteína de superficie implicada en la actividad citotóxica y por lo tanto aumenta la respuesta inmune contra la 25 célula diana. La "porción del factor antipotenciación" puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y da como resultado un aumento del efecto de los determinantes de unión para el Fc receptor o antígeno de célula diana. La "porción de factor antipotenciación" puede unirse a un receptor de Fc o un antígeno de célula diana. Alternativamente, la parte del factor antipotenciación puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen las primeras y 30 segundas especificidades de unión. Por ejemplo, la parte del factor antipotenciación puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmunitaria que da como resultado una respuesta inmune aumentada contra la célula diana).
En una realización, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la divulgación comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv de cadena sencilla. El 35 anticuerpo puede ser también un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de cadena sencilla como se describe en Ladner et al., documento de los Estados Unidos 4,946,778. El anticuerpo también puede ser una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión como se describe en los documentos US2003/0118592 y US 2003/0133939.
En una realización, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la divulgación comprenden una especificidad 40 de unión para una Fc-gammaR o una Fc-alphaR presente en la superficie de una célula efectora, y una segunda especificidad de unión para un antígeno de célula diana, por ejemplo CLD18.
En una realización, la especificidad de unión para un receptor Fc es proporcionada por un anticuerpo monoclonal, cuya unión no está bloqueada por la inmunoglobulina G (IgG) humana. Como se usa en el presente documento, el término “receptor de IgG” se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena gamma situados en el cromosoma 1. 45 Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor transmembrana o soluble que se agrupan en tres clases de receptor Fc-gamma: Fc-GammaRI (CD64), Fc-gammaRII (CD32) y Fc-gammaRIII (CD 16). En una realización preferida, el receptor Fc-gamma es un Fc-gammaRI humano de alta afinidad.
La producción y caracterización de estos anticuerpos monoclonales preferidos se describen por Fanger et al., en WO 88/00052 y en US 4,954,617. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de Fc-gammaRI, Fc-gammaRII o 50 FcgammayRIII en un sitio que es distinto del sitio de unión Fc del receptor y, por lo tanto, su unión no se bloquea sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fc-gammaRI específicos útiles en esta divulgación son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. En otras realizaciones, el anticuerpo antirreceptor Fc es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 y WO 94/10332. La línea celular 55 productora de anticuerpo H22 se depositó en la American Type Culture Collection el 4 de noviembre de 1992 bajo la designación HA022CL1 y tiene el No. de acceso CRL 11177.
En otras formas de realización preferidas, la especificidad de unión para un receptor Fc es proporcionada por un
anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (Fc-alfaRI (CD89)), cuya unión no está preferiblemente bloqueada por inmunoglobulina A humana (IgA). Se pretende que el término "receptor IgA" incluya el producto génico de un alfageno (Fc-alfaRI) situado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas transmembranales acopladas alternativamente de 55 a 110 kDa. Fc-alfa-RI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrófilos, pero no en poblaciones de 5 células no efectoras. Fc-alphaRI tiene una afinidad media tanto para IgA1 como para IgA2, que se incrementa después de la exposición a citoquinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H. C. et al (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos de Fc-alfaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a Fc-alfaRI fuera del dominio de unión al ligando de IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764). 10
Fc-alphaRI y Fc-gammaRI son receptores de activación preferidos para uso en la divulgación porque (1) se expresan principalmente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) se expresan a altos niveles (por ejemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) son mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); (4) mediar la presentación mejorada del antígeno de los antígenos, incluyendo autoantígenos, dirigidos a ellos. 15
En otra realización, la molécula biespecífica está compuesta por dos anticuerpos monoclonales de acuerdo con la divulgación que tienen actividades funcionales complementarias, tal como un anticuerpo que trabaja predominantemente induciendo CDC y el otro anticuerpo que trabaja predominantemente induciendo apoptosis.
Un "anticuerpo específico de célula efectora" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional que se une al receptor Fc de células efectoras. Los anticuerpos preferidos para 20 uso en la divulgación del sujeto se unen al receptor Fc de células efectoras en un sitio que no está unido por inmunoglobulina endógena.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “célula efectora” se refiere a una célula inmune que está implicada en la fase efectora de una respuesta inmune, en oposición a las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmune. Las células inmunitarias ejemplares incluyen células de origen mieloide o linfoide, por ejemplo, 25 linfocitos (por ejemplo, células B y células T que incluyen células T citolíticas (CTL), células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos y basófilos Algunas células efectoras expresan receptores Fc específicos y llevan a cabo funciones inmunitarias específicas. En las realizaciones preferidas, una célula efectora es capaz de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, los 30 macrófagos, que expresan FcR, están implicados en la muerte específica de las células diana y en la presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmune, o la unión a células que presentan antígenos. En otras realizaciones, una célula efectora puede fagocitar un antígeno diana, célula diana o microorganismo. La expresión de un FcR particular sobre una célula efectora puede ser regulada por factores humorales tales como citoquinas. Por ejemplo, se ha descubierto que la expresión de Fc-gammaRI está regulada por interferón gamma (IFN-). Esta 35 expresión aumentada aumenta la actividad citotóxica de las células portadoras de Fc-gammaRI frente a dianas. Una célula efectora puede fagocitar o someter a lisis un antígeno diana o una célula diana.
"Célula diana" significará cualquier célula indeseable en un sujeto (por ejemplo, un ser humano o animal) que pueda ser atacada por un anticuerpo de la divulgación. En realizaciones preferidas, la célula diana es una célula que expresa o sobreexpresa CLD18. Las células que expresan CLD18 típicamente incluyen células tumorales. 40
Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente divulgación se pueden hacer usando técnicas químicas (véase, por ejemplo, D.M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (véase US 4,474,893, a Reading), o técnicas de ADN recombinante.
En particular, se pueden preparar moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente divulgación conjugando las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR y anti-CLD18, 45 utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica y multiespecífica puede ser generada separadamente y luego conjugada entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes reticulantes incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) 50 propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686, Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Otros métodos incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78.118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), y Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). 55
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden conjugarse mediante la unión sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica y multiespecífica es mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica y multiespecífica de la divulgación, por ejemplo, una molécula biespecífica, puede ser una molécula de cadena sencilla, tal como un anticuerpo biespecífico de cadena única, una molécula biespecífica de cadena única 5 que comprende un anticuerpo de cadena única y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden ser moléculas de cadena sencilla o pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas bi y multiespecíficas se describen por ejemplo en los documentos US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; y US 10 5,482,858.
La unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas a sus dianas específicas puede confirmarse mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o un Inmunoprecipitación Western Assay. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos proteína-anticuerpo de particular interés empleando un reactivo marcado 15 (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos FcR anticuerpo se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a enzima que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo FcR. Alternativamente, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente y utilizado en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of 20 Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador  o un contador de centelleo o por autorradiografía.
II. Inmunoconjugados
En otro aspecto, la presente divulgación presenta un anticuerpo anti-CLD18 conjugado con un resto o agente 25 terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o un radioisótopo. Tales conjugados se denominan en el presente documento como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para, y en particular, mata células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, 30 daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y sus análogos u homólogos.
Los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) y 35 lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). En una realización preferida, el agente terapéutico es un agente citotóxico o un agente radiotóxico. En otra realización, el agente terapéutico es un inmunosupresor. En otra 40 realización, el agente terapéutico es GMCSF En una realización preferida, el agente terapéutico es doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida o ricina A.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse con un radioisótopo, por ejemplo, yodo-131, itrio-90 o indio-111, para generar radiofármacos citotóxicos para tratar un trastorno relacionado con CLD18, tal como un cáncer. Los conjugados de anticuerpo de la divulgación pueden usarse para modificar una respuesta biológica 45 dada, y el resto de fármaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo del mismo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleucina-1 (“IL-1”), 50 interleucina 2 (“IL-2”), interleucina 6 (“IL-6”), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar tal resto terapéutico con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., " Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug 55 Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The 60 Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
En una realización adicional, los anticuerpos de acuerdo con la divulgación se unen a un quelante de enlace, por ejemplo, tiuxetano, que permite que el anticuerpo se conjugue a un radioisótopo.
III. Composiciones Farmacéuticas
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos de la presente divulgación. Las composiciones farmacéuticas 5 pueden formularse con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualesquiera otros adyuvantes y excipientes conocidos de acuerdo con técnicas convencionales tales como las descritas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. En una realización, las composiciones incluyen una combinación de múltiples (por ejemplo, dos o más) anticuerpos aislados de la divulgación que actúan por mecanismos diferentes, por ejemplo, un anticuerpo que actúa 10 predominantemente induciendo CDC en combinación con otro anticuerpo que actúa predominantemente por inducción de apoptosis.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente divulgación con al menos un agente antiinflamatorio o al menos un agente inmunosupresor. En una 15 realización, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más agentes antiinflamatorios, tales como un fármaco esteroidal o un NSAID (fármaco antiinflamatorio no esteroideo). Los agentes preferidos incluyen, por ejemplo, aspirina y otros salicilatos, inhibidores de Cox-2, tales como rofecoxib (Vioxx) y celecoxib (Celebrex), NSAID tales como ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenaco (Voltaren), piroxicam (Feldene), ketoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolaco (Lodine), 20 oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
En otra realización, tales agentes terapéuticos incluyen agentes que conducen al agotamiento o a la inactivación funcional de células T reguladoras como anticuerpos de ciclofosfamida de baja dosis, anticuerpos anti-CTLA4, anticuerpos anti-IL2 o antirreceptor de IL2.
En otra realización más, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más agentes quimioterapéuticos, tales como 25 derivados Taxol, taxotere, gemcitabina, 5-Fluoruracilo, doxorrubicina (Adriamicina), cisplatino (Platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar). En otra realización, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse en combinación con agentes quimioterapéuticos, que preferiblemente muestran eficacia terapéutica en pacientes que padecen cáncer de estómago, esófago, páncreas y pulmón.
En otra realización más, los anticuerpos de la divulgación pueden administrarse conjuntamente con radioterapia y/o 30 trasplante autólogo de células madre periféricas o de médula ósea.
En otra realización más, los anticuerpos de la divulgación pueden administrarse en combinación con uno o más anticuerpos seleccionados de anticuerpos anti-CD25, anticuerpos anti-EPCAM, anticuerpos anti-EGFR, anti-Her2/neu y anti-CD40.
Todavía en una realización adicional, los anticuerpos de la divulgación pueden administrarse en combinación con un 35 anticuerpo anti-C3b(i) con el fin de potenciar la activación del complemento.
Tal como se usa en el presente documento, vehículo farmacéuticamente aceptable incluye cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, por ejemplo, que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por 40 ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífica, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 45 66: 1-19).
Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenilo sustituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos 50 sulfónicos alifáticos y aromáticos, por ejemplo. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína, por ejemplo.
Una composición de la presente invención puede ser administrada por una variedad de métodos conocidos en la 55 técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los
resultados deseados. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones son generalmente conocidos por los 5 expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Para administrar un compuesto de la divulgación mediante ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los 10 diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones reguladores acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones de CGF agua-en-aceite-en-agua así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol 7: 27).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y 15 agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la divulgación. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y 20 almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, por ejemplo) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido 25 en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida 30 en un disolvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por microfiltración por esterilización.
Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son 35 secado al vacío y secado en congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril de la misma.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la 40 situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación tal como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación 45 de las formas unitarias de dosificación de la divulgación está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que ha de alcanzarse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como 50 ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico, por ejemplo; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propilgalato, alfa-tocoferol, por ejemplo; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, por ejemplo.
Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente divulgación incluyen aquellas adecuadas para 55 administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del
modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico.
Generalmente, de un ciento por ciento, esta cantidad oscilará entre aproximadamente 0.01 por ciento y aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente entre aproximadamente 0.1 por 5 ciento y aproximadamente 70 por ciento, lo más preferiblemente entre aproximadamente 1 por ciento y aproximadamente 30 por ciento.
Las formulaciones de la presente divulgación que son adecuadas para la administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen tales vehículos que son conocidos en la técnica como apropiada. Las formas de dosificación para la administración tópica o 10 transdérmica de composiciones de esta divulgación incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualesquiera conservantes, tampones o propelentes que puedan ser requeridos.
Las expresiones "administración parenteral" y "administradas parenteralmente" tal como se usan aquí significan 15 modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.
Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones 20 farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, por ejemplo) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, Tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos. 25
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto por procedimientos de esterilización como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenólico sórbico, por ejemplo. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, por ejemplo en las composiciones. Además, la 30 absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retardan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina.
En una realización, los anticuerpos monoclonales de la divulgación se administran en forma cristalina por inyección subcutánea, por ejemplo Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939. Cuando los compuestos de la presente invención se administran como productos farmacéuticos, a seres humanos y animales, pueden administrarse solos o 35 como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.01 a 99.5% (más preferiblemente, 0.1 a 90%) de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por los de 40 habilidad en el arte.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo 45 la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleada, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, edad, sexo, peso, condición, estado general de salud y antecedentes médicos previos del paciente que se va a tratar, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. 50
Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis de los compuestos de la divulgación empleada en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se alcance el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la divulgación será la cantidad del 55 compuesto que es la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva dependerá en general de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferiblemente administrada proximal al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria
efectiva de una composición terapéutica se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas separadamente a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias. Aunque es posible administrar solo un compuesto de la presente divulgación, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición).
En una realización, los anticuerpos de la divulgación pueden administrarse por infusión, preferiblemente infusión 5 continua lenta durante un período prolongado, tal como más de 24 horas, con el fin de reducir los efectos secundarios tóxicos. La administración también se puede realizar por infusión continua durante un periodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal régimen puede repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses. La dosificación se puede determinar o ajustar midiendo la cantidad de anticuerpos anti-CLD18 monoclonales circulantes tras la administración en una muestra biológica usando anticuerpos 10 antiidiotípicos que se dirigen a los anticuerpos anti-CLD18.
En otra realización más, los anticuerpos se administran mediante terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de 6 meses o más.
En otra realización más, los anticuerpos de acuerdo con la divulgación pueden administrarse mediante un régimen que incluye una infusión de un anticuerpo contra CLD18 seguido de una infusión de un anticuerpo contra CLD18 15 conjugado con un radioisótopo. El régimen puede repetirse, por ejemplo, 7 a 9 días más tarde.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, se puede administrar una composición terapéutica de la divulgación con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en los documentos US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; o US 4,596,556. Ejemplos de implantes y 20 módulos bien conocidos útiles en la presente divulgación incluyen los descritos en el documento US 4,487,603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; documento US 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; documento US 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicación para suministrar medicación a una velocidad de infusión precisa; documento US 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo 25 variable para la administración continua de fármaco; documento US 4,439,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y documento US 4,475,196, que describe un sistema osmótico de administración de fármaco.
Muchos otros tales implantes, sistemas de suministro y módulos son conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la divulgación pueden formularse para asegurar una distribución apropiada 30 in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la divulgación atraviesan el BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, documentos US 4,522,811; US 5,374,548; y US 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más unidades estructurales que se transportan selectivamente a células u órganos específicos y, por tanto, mejoran la liberación dirigida de fármacos 35 (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol., 29: 685). Ejemplos de unidades estructurales de direccionamiento incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, US 5,416,016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140, M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); y el receptor de la proteína A del surfactante (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol., 1233: 134). 40
En una realización de la divulgación, los compuestos terapéuticos de la divulgación se formulan en liposomas. En una realización más preferida, los liposomas incluyen un resto de diana. En una realización más preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas se administran mediante inyección en bolo a un sitio próximo al área deseada, por ejemplo, el sitio de un tumor. La composición debe ser fluida en la medida en que exista una facilidad de jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la 45 acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
En una realización adicional, los anticuerpos de la divulgación pueden formularse para prevenir o reducir su transporte a través de la placenta. Esto puede hacerse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante PEGilación de los anticuerpos o mediante el uso de fragmentos F(ab)2'. Se puede hacer referencia adicional a “Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol 50 immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; and to "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" para la terapia tumoral puede medirse por respuestas tumorales objetivas que pueden ser completas o parciales. Una respuesta completa (CR) se define como ausencia de evidencia clínica, radiológica u otra de la enfermedad. Una respuesta parcial (PR) resulta de una reducción en el tamaño del tumor 55 agregado de más del 50%. El tiempo mediano hasta la progresión es una medida que caracteriza la durabilidad de la respuesta objetiva del tumor.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" para la terapia tumoral también se puede medir por su capacidad para
estabilizar la progresión de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir el cáncer puede evaluarse en un sistema modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular o la apoptosis mediante ensayos in vitro conocidos por el experto en la materia. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto. 5 Un experto en la técnica podría determinar tales cantidades basadas en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición o vía de administración particular seleccionada.
La composición debe ser estéril y fluida en la medida en que la composición puede ser suministrada mediante una jeringa. Además del agua, el vehículo puede ser una solución salina regulada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, por ejemplo), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez 10 adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de 15 aluminio o gelatina.
Cuando el compuesto activo está adecuadamente protegido, como se ha descrito anteriormente, el compuesto puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable.
IV. Usos y métodos de la divulgación
Los anticuerpos (incluyendo inmunoconjugados, biespecíficos/multiespecíficos, composiciones y otros derivados 20 descritos en el presente documento) de la presente invención tienen numerosas utilidades terapéuticas que implican el tratamiento de trastornos que implican células que expresan CLD18. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o a seres humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar o prevenir una variedad de trastornos tales como los descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” pretende incluir animales humanos y no humanos que responden a los anticuerpos 25 contra CLD18. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos que pueden ser corregidos o mejorados matando células enfermas, en particular células caracterizadas por un patrón de expresión alterado de CLD18 en comparación con células normales.
Un efecto terapéutico en los tratamientos descritos en el presente documento se consigue preferiblemente a través de las propiedades funcionales de los anticuerpos de la divulgación para mediar la muerte de células, por ejemplo 30 mediante la inducción de lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis, adhesión homotípica, y/o fagocitosis, preferiblemente mediante la inducción de la lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC.
Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan 35 CLD18 incluyendo, por ejemplo, cáncer gástrico. Ejemplos de enfermedades tumorigénicas que pueden tratarse y/o prevenirse abarcan todos los cánceres que expresan CLD18 y entidades tumorales, incluyendo cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de la vesícula biliar y cáncer de cabeza y cuello. Estos cánceres pueden estar en etapas tempranas, intermedias o avanzadas, por ejemplo metástasis. 40
Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos de acuerdo con la divulgación también se pueden usar para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en el presente documento.
En otra realización, los anticuerpos de la divulgación pueden usarse para detectar niveles de CLD18 o formas particulares de CLD18, o niveles de células que contienen CLD18 en su superficie de membrana, niveles que pueden estar entonces vinculados a ciertas enfermedades o síntomas de enfermedad tales como se describió 45 anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos pueden usarse para agotar o interactuar con la función de células que expresan CLD18, implicando de este modo a estas células como mediadores importantes de la enfermedad. Esto puede conseguirse poniendo en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-CLD18 en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y CLD18. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y CLD18 se detecta y compara en la muestra y una muestra de control, es decir, una muestra de 50 referencia.
Los anticuerpos de la divulgación pueden ensayarse inicialmente para determinar su actividad de unión asociada con usos terapéuticos o diagnósticos in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden ensayar usando ensayos de citometría de flujo como se describe en el presente documento.
Además, se puede ensayar la actividad de los anticuerpos en el desencadenamiento de al menos una actividad de 55 células efectoras mediada por un efector, incluyendo la inhibición del crecimiento y/o la muerte de células que expresan CLD18. Por ejemplo, la capacidad de los anticuerpos para desencadenar CDC y/o apoptosis puede ser ensayada. Se describen aquí protocolos para ensayar CDC, adhesión homotípica, agrupación molecular o
apoptosis.
Los anticuerpos de la divulgación pueden utilizarse para inducir in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento y/o la diferenciación de una célula que expresa CLD18; para matar una célula que expresa CLD18; para mediar la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa CLD18 en presencia de células efectoras; para mediar CDC de una célula que expresa CLD18 en presencia de complemento; para mediar la 5 apoptosis de una célula que expresa CLD18; para inducir adhesión homotípica; y/o inducir la translocación en acumulaciones lipídicas tras la unión de CLD18.
En una realización particular, los anticuerpos se usan in vivo o in vitro para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con CLD18. Ejemplos de enfermedades relacionadas con CLD18 incluyen, entre otros, cánceres tales como cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de pulmón y 10 cánceres como los enumerados anteriormente.
CLD18A2 también se expresa en células estomacales normales diferenciadas. Los posibles efectos secundarios clínicos inducidos por el anticuerpo mediante la destrucción de estas células pueden reducirse o evitarse mediante la administración paralela de fármacos protectores del estómago tales como antiácidos o inhibidores de la bomba de protones gástrica tales como omeprazol o fármacos relacionados. 15
Las rutas adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpos de la divulgación in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y pueden seleccionarse por los expertos en la materia.
Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos anti-CLD18 de la divulgación pueden ser coadministrados con uno u otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico, un agente antiangiogénico o un agente inmunosupresor para reducir la inducción de respuestas inmunitarias contra los 20 anticuerpos de la divulgación. El anticuerpo puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o puede ser administrado separadamente del agente. En este último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o simultáneamente con el agente o puede coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancerosa, por ejemplo, una radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos como los enumerados anteriormente. La coadministración de los anticuerpos 25 anti-CLD18 de la presente divulgación con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerígenos que actúan a través de diferentes mecanismos dando lugar a un efecto citotóxico a las células tumorales. Dicha coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las harían no reactivas con el anticuerpo.
En otra realización particular de la divulgación, el sujeto al que se administra el anticuerpo se trata adicionalmente 30 con un agente antiagiónico que incluye anticuerpos dirigidos contra VEGF o VEGFR y uno o más compuestos químicos que inhiben la angiogénesis. El pretratamiento con o aplicación paralela de estos fármacos puede mejorar la penetración de anticuerpos en tumores a granel.
En otra realización particular de la divulgación, el sujeto al que se administra el anticuerpo se trata adicionalmente con un compuesto que inhibe la señalización del receptor del factor de crecimiento incluyendo anticuerpos 35 monoclonales que se unen al receptor EGFR así como compuestos químicos que inhiben la señalización iniciada por el EGFR, Her1 o Her2/receptor neu.
También pueden usarse como agentes terapéuticos células efectoras específicas para el objetivo, por ejemplo, células efectoras unidas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la divulgación. Las células efectoras para el direccionamiento pueden ser leucocitos humanos tales como 40 macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células portadoras del receptor IgG o IgA. Si se desea, se pueden obtener células efectoras del sujeto a tratar. Las células efectoras específicas del objetivo se pueden administrar como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108 a 109, pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener localización en la célula 45 diana, por ejemplo, una célula tumoral que expresa CLD18, y para efectuar la muerte celular, por ejemplo, por fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar.
La terapia con células efectoras específicas de un objetivo puede realizarse conjuntamente con otras técnicas para la eliminación de células diana. Por ejemplo, la terapia antitumoral utilizando las composiciones de las células de divulgación y/o efectoras armadas con estas composiciones puede usarse junto con la quimioterapia. Además, la 50 inmunoterapia combinada puede usarse para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos anti-CLD18 ligados a anti-Fc-RI o anti-CD3 junto con agentes de unión específicos de receptor IgG o IgA.
Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la divulgación pueden usarse también para modular los niveles de Fc-gammaR o Fc-alfaR en células efectoras, tales como la formación de tapones y la eliminación de receptores en la 55 superficie celular. También se pueden usar mezclas de receptores anti-Fc para este fin.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la
divulgación que tienen sitios de unión del complemento, tales como porciones de IgG1, -2, o -3 o IgM que se unen al complemento, también se pueden usar en presencia de complemento . En una realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprenden células diana con un agente aglutinante de la divulgación y las células efectoras apropiadas puede complementarse mediante la adición de complemento o complemento que contiene suero. La fagocitosis de células diana revestidas con un agente aglutinante de la divulgación puede ser mejorada 5 mediante la unión de proteínas del complemento. En otra realización, las células diana recubiertas con las composiciones de la divulgación también pueden someter a lisis mediante complemento. En otra realización más, las composiciones de la divulgación no activan complemento.
Las composiciones de la divulgación también se pueden administrar conjuntamente con complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la divulgación se encuentran composiciones que comprenden anticuerpos, 10 moléculas multiespecíficas o biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas porque el complemento está situado muy cerca de los anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas.
Alternativamente, los anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas de la divulgación y el complemento o suero se pueden administrar por separado. La unión de las composiciones de la presente invención a células diana provoca la translocación del complejo antígeno-anticuerpo CLD18 en acumulaciones lipídicas de la membrana 15 celular. Dicha translocación crea una alta densidad de complejos antígeno-anticuerpo que pueden activar y/o potenciar eficazmente CDC.
También dentro del alcance de la presente divulgación son kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la divulgación (por ejemplo, anticuerpos e inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente 20 radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la divulgación (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria).
Por consiguiente, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la divulgación pueden administrarse adicionalmente (antes, simultáneamente o después de la administración de un anticuerpo de la divulgación) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que realza o aumenta el efecto terapéutico de los 25 anticuerpos de la divulgación.
En otras realizaciones, el sujeto puede tratarse adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, mejora o inhibe, la expresión o actividad de receptores Fc-gamma o Fc-alfa, por ejemplo, tratando al sujeto con una citoquina. Las citoquinas preferidas incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferón- (IFN-) y factor de necrosis tumoral (TNF). Otros 30 agentes importantes para aumentar la eficacia terapéutica de los anticuerpos y composiciones farmacéuticas descritos en el presente documento son β-glucanos que son homopolisacáridos de residuos de glucosa ramificados y son producidos por una variedad de plantas y microorganismos, por ejemplo bacterias, algas, hongos, levaduras y granos. También pueden usarse fragmentos de β-glucanos producidos por organismos. Preferiblemente, el β-glucano es un polímero de β(1,3) glucosa en el que al menos algunas de las unidades de glucosa de cadena 35 principal, por ejemplo 3-6% de las unidades de glucosa de la columna vertebral, poseen ramificaciones tales como ramificaciones β(1,6).
En una realización particular, la divulgación proporciona métodos para detectar la presencia de antígeno CLD18 en una muestra, o medir la cantidad de antígeno CLD18, que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo que se une específicamente a CLD18, bajo condiciones que permitan la formación de 40 un complejo entre el anticuerpo o parte de él y CLD18. Entonces se detecta la formación de un complejo, en el que una diferencia de formación de complejo entre la muestra comparada con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno CLD18 en la muestra.
En otra realización más, la divulgación proporciona un método para detectar la presencia o cuantificar la cantidad de células que expresan CLD18 in vivo o in vitro. El método comprende (i) administrar a un sujeto una composición de 45 la divulgación conjugada a un marcador detectable; (Ii) exponer al sujeto a un medio para detectar dicho marcador detectable para identificar áreas que contienen células que expresan CLD18.
Los métodos descritos anteriormente son útiles, en particular, para diagnosticar enfermedades relacionadas con CLD18 y/o la localización de enfermedades relacionadas con CLD18 tales como enfermedades de cáncer. Preferiblemente, una cantidad de CLD18, preferiblemente CLD18-A2 en una muestra que es superior a la cantidad 50 de CLD18, preferiblemente CLD18-A2, en una muestra de control es indicativa de la presencia de una enfermedad relacionada con CLD18 en un sujeto, en particular un ser humano, de la cual se deriva la muestra.
En otra realización más, los inmunoconjugados de la divulgación pueden usarse para dirigir compuestos (por ejemplo, agentes terapéuticos, marcadores, citotoxinas, inmunodepresores de radiotoxinas, etc.) a células que tienen CLD18 expresado en su superficie mediante la unión de dichos compuestos al anticuerpo. Por lo tanto, la 55 divulgación también proporciona métodos para localizar células ex vivo o in vitro que expresan CLD18, tales como células tumorales circulantes.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
1. Generación de anticuerpos murinos contra CLD18
a. Inmunizaciones:
Se inmunizaron ratones Balb/c o C57/BL6 con vectores de expresión eucarióticos, que codifican fragmentos CLD18 humanos (SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18). Se inyectaron 50 µg o 25 µg de ADN plasmídico en los cuádriceps 5 (intramuscular, i.m.) en los días 1 y 10 para la generación de anticuerpos monoclonales de Conjunto1 o alternativamente en los días 1 y 9, 1 y 11, o 1, 16 y 36 para generación de anticuerpos monoclonales de Conjunto2 en presencia de adyuvantes, por ejemplo CpG (para detalles ver Tab. 1b). CpG, así como las células transfectadas con CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) solas o cotransfectadas adicionalmente con ARN codificante de CD40L soluble en murino se inyectaron intramuscularmente, se inyectó PEI-Man intramuscular o intraperitonealmente. La presencia de 10 anticuerpos dirigidos contra CLD18 humano en sueros de ratones se monitorizó mediante microscopía de fluorescencia inmune entre el día 16 y 43 dependiendo del protocolo de inmunización específico utilizado. La fluorescencia inmune se determinó usando células HEK293 transitoriamente transfectadas con un ácido nucleico que codifica una construcción de fusión que comprende CLD18A2 humano (SEQ ID NO: 1, 2) y una proteína informadora fluorescente. Los ratones con respuestas inmunes detectables (Figura 1) fueron reforzados tres días 15 antes de la esplenectomía para la generación de anticuerpos monoclonales de Conjunto1, o los ratones se estimularon tres días, tres y dos días, o los ratones se estimularon cuatro, tres y dos días antes de la esplenectomía para la generación de anticuerpos monoclonales de Conjunto2 mediante inyección intraperitoneal de 5 x 107 o, alternativamente, 1 x 108 células HEK293 transfectadas transitoriamente con un ácido nucleico que codifica CLD18A2 humano (SEQ ID NOs: 1, 2) (para detalles ver Tab. 1b). En Tab. 1a, los protocolos de inmunización 20 utilizados están dedicados a los respectivos anticuerpos monoclonales.
Tabla 1a. Protocolos de inmunización utilizados para la generación de anticuerpos monoclonales
mAB
Protocolo de inmunización * mAB Protocolo de inmunización *
Conjunto1
24H5
40 42E12 45
26B5
40 43A11 45
26D12
40 44E10 45
28D10
40 47D12 45
37G11
45 61C2 45
37H8
45 75B8 6
38G5
45 85A3 6
38H3
45 9E8 40
39F11
45 19B9 40
41C6
45
Conjunto2
45C1
53 166E2 51
125E1
45 175D10 51
163E12
51
* Para los protocolos de inmunización específicos véase Tab.1b
25
Tabla 1b: Protocolos de inmunización detallados
Protocolos de inmunización
Inmunización (cebado y promotores con ADN) Monitorización del suero Se promueve con células transfectadas
Con vectores de ADN que codifican fragmentos de CLD18 Con adyuvante Un día Un día Las células transfectadas solo con CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) Células cotransfectadas con CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) y con ARN codificante de CD40L soluble en murino Días antes de la esplenectomía
6
SEQ ID NO: 15: 50 µg 50 µg CpG 1 y 10 18 5 x 107 células MC3T3 transfectadas Ninguna 3
40
SEQ ID NO: 17: 50 µg 50 µg CpG 1 y 10 18 5 x 107 células HEK293; 100 µg de CPG como adyuvante 3
45
SEQ ID NO: 15: 50 µg 50 µg CpG 1 y 9 16 1 x 108 células HEK293 3
51
SEQ ID NO: 15: 25 µg 2.5 µl de PEI-Man* (150 mM) en H2O con glucosa al 5% 1, 16 y 36 22, 30 y 43 5 x 107 células HEK293 transfectadas Ninguno 3 y 2
53
Cebado: SEQ ID NO: 15: 25 µg, y SEQ ID NO: 17: 25 µg; Aumento: SEQ ID NO: 17: 50 µg 50 µg de CpG en H2O con glucosa al 5% 1 y 11 20 5 x 107 células HEK293 transfectadas Ninguno 4, 3 y 2
* In vivo-jetPEI™-Man de PolyPlus Transfection
b. Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos a CLD18:
Se aislaron los esplenocitos de ratón y se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón basada en protocolos estándar. Los hibridomas resultantes se examinaron entonces para la producción de inmunoglobulinas 5 con especificidad CLD18 usando células HEK293 transfectadas con un ácido nucleico que codifica CLD18 humano mediante análisis FACS.
Se fusionaron suspensiones de células únicas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados con células de mieloma de ratón no detectables P3X63Ag8U.1 (ATCC, CRL 1597) en una proporción de 2:1 usando 50% de PEG (Roche Diagnostics, CRL 738641). Las células se sembraron en placas a aproximadamente 3 x 104/pozo en placas 10 de microtitulación de fondo plano, seguido de aproximadamente dos semanas de incubación en medio selectivo que contenía suero bovino fetal al 10%, fusión de hibridoma al 2% y suplemento de clonación (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1 363 735) más HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, gentamicina 50 µg/ml y 1x HAT (Sigma, CRL H0262). Después de 10 a 14 días, los pozos individuales se tamizaron mediante citometría de flujo para anticuerpos monoclonales anti-CLD18. Los hibridomas de secreción de anticuerpos se replegaron, se 15 rastrearon de nuevo y, si todavía eran positivos para los anticuerpos monoclonales anti-CLD18, se subclonaron mediante dilución limitante. Los subclones estables se cultivaron entonces in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular para caracterización. Se eligió al menos un clon de cada hibridoma, que retenía la reactividad de las células progenitoras (por FACS). Se generaron 9 bancos de células de vial para cada clon y se almacenaron en nitrógeno líquido. 20
c. Selección de anticuerpos monoclonales que se unen a CLD18:
Para determinar el isotipo de anticuerpos, se realizó un isotipo ELISA. Se utilizó el kit de identificación de monoAB de ratón (Zymed, CRL 90-6550) o, alternativamente, el kit de isotipo de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, No. de cat. 1493027) para determinar las subclases de Ig de los anticuerpos monoclonales reactivos CLD18 identificados.
Definidas como Conjunto1, se generaron diecinueve líneas celulares de hibridoma, seis de una fusión de células de 5 un ratón C57/BL6 inmunizado con CLD18A2-Bucle D3 (SEQ ID NO: 17, 18), trece de una fusión de células de un ratón Balb/c inmunizado con CLD18A2-Bucle1 (SEQ ID NO: 15, 16), expresando los siguientes anticuerpos:
24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 , 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9
24H5: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2b, anticuerpo κ, 182-D758-034 10
26B5: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, anticuerpo κ, 182-D758-035, DSM ACC2745
26D12: IgG3 monoclonal de ratón, 182-D758-036, DSM ACC2746
28D10: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D758-040, DSM ACC2747
37G11: IgG2a monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-055, DSM ACC2737
37H8: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-056, DSM ACC2738 15
38G5: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-057, DSM ACC2739
38H3: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-058, DSM ACC2740
39F11: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-059, DSM ACC2741
41 C6: IgG2a monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-060
42E12: IgG2a monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-061, DSM ACC2748 20
43A11: IgG2a monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-062, DSM ACC2742
44E10: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-063
47D12: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-064
61C2: IgG2b monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-067, DSM ACC2743
75B8: IgM monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D756-001 25
85A3: IgM monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D756-002
9E8: IgM monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D758-011
19B9: IgM monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D758-024
Definidas como Conjunto2, se generaron cinco líneas celulares de hibridoma, una de una fusión de células de un ratón Balb/c inmunizado con CLD18A2-Bucle D3 (SEQ ID NO: 17, 18) y CLD18A2-Bucle D1 (SEQ ID NO: 15, 16), 30 cuatro de una fusión de células de un ratón Balb/c inmunizado con CLD18A2-Bucle D1 (SEQ ID NO: 15, 16), que expresan los siguientes anticuerpos:
45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10
45C1: IgG2a monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D758-187
125E1: IgG2a monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-279, DSM ACC2808 35
163E12: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-294, DSM ACC2809
166E2: IgG3 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-308
175D10: IgG1 monoclonal de ratón, anticuerpo κ, 182-D1106-362, DSM ACC2810
2. Producción de anticuerpos monoclonales
Producción y purificación de anticuerpos monoclonales reactivos a CLD 18: 40
Para producir cantidades de mg de anticuerpo para caracterización funcional, se sembraron células de hibridoma en
biorreactores basados en diálisis (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) a 2 x 106 células/ml. El anticuerpo que contenía el sobrenadante se recogió una vez por semana. El anticuerpo monoclonal de ratón se purificó usando Melon Gel (Pierce, Rockford, Estados Unidos) y se concentró mediante precipitación con sulfato de amonio o, alternativamente, se purificó mediante ProteinA usando FPLC. La concentración de anticuerpos y la pureza se determinó mediante ensayo de BCA y se verificó la pureza mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico y 5 tinción con coomassie.
3. Características de unión de los anticuerpos monoclonales
a. Control de calidad de los transfectantes en WB, IF:
Para generar células que expresan CLD18A2, se transfectaron células HEK293 o CHO con ácidos nucleicos que codifican CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) o CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4). 10
Las células HEK293 se transfectaron con CLDN18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4) o se dejaron sin transfectar. 24 horas después de la transfección, se recolectaron las células, se someter a lisis y se sometieron a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico. El gel se secó y se tiñó con un anticuerpo anti-myc de ratón. Después de la incubación con un anticuerpo anti-ratón marcado con peroxidasa, la mancha se desarrolló con reactivo ECL y se visualizó usando un generador de imágenes LAS-3000 (Fuji). Sólo en las células transfectadas pero no en el control negativo, se observó 15 una banda con el peso molecular esperado de CLD18-myc (Figura 2).
Las células CHO se transfectaron con CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) y se cultivaron en placas de cámara durante 24 h. Las células se fijaron con metanol y se tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo contra CLD18 a 1 µg/ml durante 60 minutos a 25°C. Después del lavado, las células se tiñeron con una IgG de cabra anti-conejo marcada con Alexa488 (Molecular Probes) y se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia. La Figura 3 muestra 20 células CHO transfectadas, que expresan CLD18 en la membrana celular así como células no transfectadas.
Estas células que expresan CLD18 heterólogamente se usaron para los siguientes ensayos para ensayar la especificidad de unión al anticuerpo.
b. Selección de anticuerpos monoclonales que se unen a CLD18/cribas primarias por citometría de flujo:
Se cotransfectaron células HEK293 con vectores de expresión que codificaban CLD18A2 humano (SEQ ID NO: 1, 2) 25 y una proteína informadora fluorescente 40 h antes del ensayo o, alternativamente, células HEK293 que expresaban de forma estable CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) y se contratiñeron con yoduro de propidio (PI). Después del desprendimiento de células usando células EDTA/PBS 2 mM se lavaron con medio de crecimiento completo y se sembraron en placas de microtitulación de fondo en U aproximadamente 1-5 x 105 células/pozo. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con sobrenadante de hibridoma seguido por dos etapas de lavado con 1% de 30 FBS/PBS termoinactivado y finalmente incubación con APC o anticuerpo secundario específico de IgG anti-ratón conjugado con Alexa647. Después de dos etapas de lavado, las células cotransfectadas se fijaron con CellFIX (BD Biosciences). La fijación se evaluó por citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. La expresión del marcador de fluorescencia se representa en el eje horizontal frente a la unión del anticuerpo en el eje vertical. Todos los anticuerpos de ratón 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 35 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 se detectaron para unirse específicamente a la superficie de las células que expresan el marcador de fluorescencia (Figura 4, células en Q2) como se ejemplifica para los sobrenadantes de hibridoma que contienen anticuerpos monoclonales 24H5 (Figura 4A, células en Q2), 85A3 (Figura 4B), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 y 45C1 (Figura 4C, células en Q1).
c. Comparación de la unión del anticuerpo a CLD18A2 marcado con Myc- o HA: 40
Se especificaron adicionalmente las características de unión de los anticuerpos monoclonales específicos para CLD18 identificados. Por lo tanto, se analizó la unión de anticuerpos monoclonales a mutantes de CLD18A2, creados mediante la inserción de marcadores de epítopo. CLD18A2-HA (SEQ ID NO: 6) contiene una etiqueta de epítopo HA en CLD18A2-bucle1, mientras que CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4) contiene una etiqueta de epítopo Myc insertada en CLD18A2-bucle2. Como la inserción de estas etiquetas provoca la destrucción de epítopos, los 45 anticuerpos monoclonales identificados, pueden agruparse de acuerdo con la pérdida de unión a cualquiera de los mutantes. Las células HEK293 cotransfectadas transitoriamente con un marcador de fluorescencia y CLD18A2 humano, o con un marcador de fluorescencia y CLD18A2-HA, o con un marcador de fluorescencia y CLD18A2-Myc se incubaron con sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales específicos de CLD18 durante 30 minutos a 4ºC, seguido de incubación con anticuerpo secundario de IgG anti-ratón conjugado con 50 Alexa647. Antes del análisis en un BD FACSArray, las células se fijaron usando CellFIX. Como se ejemplifica para 24H5, 9E8, 26B5 y 19B9 en la Figura 5, los anticuerpos monoclonales pueden separarse basándose en sus características de unión en cuatro grupos diferentes: (i) anticuerpos que se unen a CLD18A2 no modificado así como a CLD18A2-HA y CLD18A2-Myc, por ejemplo 24H5, (Figura 5A), o (ii) anticuerpos que no se unen a CLD18A2-HA, por ejemplo 9E8, (Figura 5B), o (iii) anticuerpos que no se unen a CLD18A2-Myc, por ejemplo 26B5, 55 (Figura 5C), o (iv) anticuerpos que no se unen a CLD18A2-HA ni a CLD18A2-Myc, por ejemplo 19B9, (Figura 5D).
d. Comparación de la unión del anticuerpo a CLD18A1 humano frente a transfectantes de CLD18A2 por citometría
de flujo:
La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales identificados a las isoformas de CLD18A2 se analizó por citometría de flujo. Se incubaron células HEK293 que expresaban de manera estable células CLD18A2 humanas (HEK293-CLD18A2) y HEK293 que expresaban de forma estable el CLD18A1 humano (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) durante 30 minutos a 4ºC con sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales, 5 seguido de incubación con anticuerpo secundario de IgG anti-ratón conjugado con Alexa647 y fijación de células o, alternativamente, sin fijación pero con contratinción de PI. La fijación se evaluó por citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. La Figura 6 muestra ejemplos para los dos grupos de anticuerpos monoclonales que se identificaron en el panel compuesto por 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) los anticuerpos 10 monoclonales 43A11, 45C1 y 163E12 se unen específicamente al CLD18A2 humano pero no al CLD18A1 humano (Figuras 6A, B), y (ii) el anticuerpo monoclonal 37H8 se une a ambas isoformas humanas (Figura 6A).
e. Comparación de la unión de anticuerpo a CLD18A1 humano frente a transfectantes de CLD18A2 por microscopía de inmunofluorescencia:
Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión que codifica una proteína de 15 fusión de CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) o CLD18A2 (SEQ ID NO: 2) con un reportero de fluorescencia y crecieron en portaobjetos de cámara. Las células se tiñeron sin fijar o después de la fijación de paraformaldehído con anticuerpo monoclonal que contenía sobrenadante de cultivo de tejidos durante 30 minutos a 37°C. Después del lavado, las células se tiñeron con un anticuerpo Ig anti-ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes). La unión de anticuerpos se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 7, el anticuerpo 37G11 20 reaccionó específicamente con CLD18A2 (Figura 7A) pero no con CLD18A1 (Figura 7B). En contraste, el anticuerpo 26B5 era reactivo con ambos, CLD18A2 y CLD18A1 (Figura 8).
Para los anticuerpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, se observó una clara diferencia entre tinción de células vivas y células fijadas con paraformaldehído. Los anticuerpos formaron una membrana uniforme de tinción cuando las células fueron 25 fijadas (Figuras 7C, 8C, 8D). Por el contrario, la incubación de células vivas con estos anticuerpos conduce a la generación de grupos de proteínas, visible como un patrón de tinción como manchas (Figuras 7A, 8A, 8B). Esto muestra que todos los anticuerpos se unen a epítopos nativos como se encuentran en la superficie de células vivas.
f. Determinación de líneas celulares que se expresan endógenamente:
Se utilizó un par de cebadores específicos del gen CLD18A2 (SEQ ID NO: 11, 12) en análisis PCR-RT para cribar 30 líneas celulares para la expresión de CLD18A2. Se encontró que las líneas celulares de carcinoma gástrico humano NAN-SNU-16 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) y KATO-III (ATCC HTB-103) y la línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano DAN-G (DSMZ ACC249) despliegan una expresión endógena robusta de CLD18 (Figura 9). La expresión se confirmó en el nivel de proteína mediante tinción con un suero policlonal de conejo contra CLD18. 35
g. Tinción de líneas celulares que se expresan endógenamente con anticuerpos específicos de CLD18 e inmunofluorescencia:
Se hicieron crecer células DAN-G, SNU-16, NUGC-4 y KATO-III sobre placas de cámara en condiciones estándar. Las células no se fijaron o se fijaron alternativamente con metanol y se tiñeron con los anticuerpos respectivos. Para los anticuerpos se observó la tinción de las superficies de las células 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 40 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 como se ilustra en la Figura 10, 11 y 12A. Para anticuerpos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 reconocimiento de epítopo nativo fue ensayado y tinción de la superficie celular se observó en las células no fijadas, como se muestra en la Figura 12B. Los subgrupos de anticuerpos mostraron tinción homogénea de la membrana celular, ya sea preponderantemente en las interfaces célula-célula o en partes libres de la membrana no adyacentes a otras células. Otros anticuerpos 45 tiñeron focos discretos y agregados en la membrana celular demostrando por completo que los anticuerpos respectivos se unen a epítopos diferentes incluyendo epítopos que están enmascarados por asociación homotípica o heterotípica de CLD18 así como epítopos CLD18 accesibles en uniones estrechas preformadas.
h. Tinción de líneas celulares que se expresan endógenamente, por citometría de flujo:
La expresión superficial de CLD18A2 expresado constitutivamente sobre células vivas KATO-III y NUGC-4 se 50 analizó por citometría de flujo. Esto se ejemplifica por células KATO-III y NUGC-4 teñidas con anticuerpo monoclonal 61C2 o 163E12, seguido de incubación con anticuerpo secundario de IgG anti-ratón conjugado con Alexa647 y fijación de células o, alternativamente, sin fijación. La unión se evaluó por citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. La Figura 13 muestra una unión fuerte de 61C2 a al menos 70.3% de células KATO-III y de 163E12 a CLD18A2 sobre células KATO-III y NUGC-4. 55
i. Alineación de secuencia de ratón y humanas CLD18A1 y CLD18A2:
Los CLD18A2 humanos (NP_001002026) y CLD18A1 humanos (NP_057453) en una comparación de secuencias difieren en el terminal N - las variantes de CLD18 de ratón (NP_062789 y AAL15636) demuestran una elevada homología y sitios de variación de secuencia entre las moléculas (véase la Figura 14).
j. Reactividad de anticuerpos con CLD18A1 murino y CLD18A2 murino analizada por citometría de flujo:
La unión de los anticuerpos monoclonales identificados a CLD18A2 y CLD18A1 murinos se analizó por citometría de 5 flujo. Se incubaron células HEK293 cotransfectadas transitoriamente con un marcador de fluorescencia y CLD18A2 murino (SEQ ID NO: 33, 35) o con un marcador de fluorescencia y CLD18A1 murino (SEQ ID NO: 36, 37) con sobrenadantes de hibridoma que contenían los anticuerpos monoclonales específicos para CLD18 humano 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 y 163E12, respectivamente, durante 30 minutos a 4ºC, seguido por incubación con anticuerpo secundario de IgG anti-ratón conjugado con Alexa647 y fijación de células. La fijación se evaluó por citometría de 10 flujo utilizando un BD FACSArray. La Figura 15 muestra tres perfiles de unión diferentes: 38G5 y 45C1 no se unen a ninguna de las isoformas de CLD18 murino, 37G11 y 163E12 se unen a CLD18A2 murino pero no a CLD18A1 murino, y 38H3 se une a CLD18A1 murino y CLD18A2. Estos anticuerpos son valiosos para determinar una toxicidad potencial de anticuerpos monoclonales CLD18 en estudios preclínicos.
En conjunto, estos datos muestran que los anticuerpos monoclonales de las clases 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 15 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 generados contra CLD18 representan una diversidad de características de unión a diferentes epítopos y topologías de CLD18 humano.
Se puede usar una combinación de diferentes propiedades descritas en los ejemplos 3b, c, d, e, g, h y j para categorizar anticuerpos monoclonales en tales clases diferentes. 20
4. Inmunohistoquímica (IHC)
Se utilizó un anticuerpo específico de epítopo CLD18A2 generado por inmunización con el péptido de SEQ ID NO: 21 para la caracterización inmunohistoquímica de la expresión de CLD18A2. Se utilizaron secciones de tejido embebidas en parafina derivadas de un amplio panel de tejidos normales y tumorales para la expresión de proteínas y análisis de localización. No se detectó expresión significativa en ningún otro tejido normal de órganos, excepto el 25 estómago (ver Tab. 2, Figura 16A). Por el contrario, la expresión de CLD18A2 se verificó por inmunohistoquímica en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de estómago y el cáncer de pulmón (Figura 16B).
Curiosamente, la expresión de la proteína CLD18A2 en la mucosa gástrica se restringió a las células terminalmente diferenciadas del epitelio gástrico en las regiones de base y de pozo. Por el contrario, las células de la región del cuello de la mucosa gástrica, en particular las células madre gástricas en la parte del istmo, que reponen toda la 30 mucosa, no expresan CLD18A2 (Figura 16C).
Tabla 2: Expresión de CLD18A2 en tejidos normales y tumorales según se analizó por IHC
Tipo de tejido Resultado
Suprarrenal -
Vejiga - 35
Células de sangre -
Médula ósea -
Mama -
Colon -
Endotelio - 40
Esófago -
Trompa de Falopio -
Corazón -
Riñón (glomérulos, túbulos) -
Hígado - 45
Pulmón -
Ganglio Linfático -
Ovario -
Páncreas -
Paratiroides -
Pituitaria -
Placenta - 5
Próstata -
Piel -
Bazo -
Estómago +
Músculo estriado - 10
Testículos -
Timo -
Tiroides -
Uréter -
Útero (cuello uterino, endometrio) - 15
El anticuerpo monoclonal 39F11 se usó para estudios específicos inmunohistoquímicos de CLD18A2. Como se muestra en la Figura 17A, no se detectó reactividad significativa en todos los tejidos normales probados excepto el estómago (Figura 17A), mientras que los carcinomas de estómago y los carcinomas pulmonares permanecen fuertemente positivos (Figura 17B).
Otro grupo de anticuerpos de la divulgación muestra un patrón de tinción de cáncer específico con unión a cáncer de 20 estómago pero sin reactividad con tejido de estómago normal. Dicha configuración de tinción se muestra en la Figura 18A con el anticuerpo monoclonal 26B5.
Se utilizó inmunohistoquímica para el análisis de especificidad de 175D10 (Figura 18B), 43A11 (Figura 18C), 163E12 (Figura 18D) y 45C1 (Figura 18E) en secciones derivadas de líneas celulares tumorales HEK293: líneas celulares tumorales HEK293 que expresan de forma estable el CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) o el 25 CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) o transfectadas con un plásmido de control de la expresión que contenía sólo el gen de resistencia a los antibióticos para la selección (HEK293-mock) se sometieron a xenoinjerto en ratones para formar tumores sólidos. No se detectó expresión en los tumores de xenoinjerto HEK293 transfectados de manera simulada. En contraste, se observó tinción de membrana fuerte y homogénea en tumores de xenoinjerto HEK293-CLD18A2 y en muestras de carcinoma de estómago. 30
5. Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
a. CDC de anticuerpos monoclonales de Conjunto1 medido por citometría de flujo:
El plasma para la lisis del complemento se preparó extrayendo sangre de voluntarios sanos en tubos vacutainer de S-Monovette-EDTA (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemania), los cuales fueron luego centrifugados a 600 g durante 20 minutos. Se recogió el plasma y se almacenó a -20ºC. 35
En un primer conjunto de experimentos se analizaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar su capacidad para inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células HEK293 que expresan de forma estable el CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2). Las células se incubaron con sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales 85A3, 28D10, 24H5 o 26D12, respectivamente durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación (5 minutos a 450 g), se retiró el sobrenadante y se añadió 40 plasma humano al 20% en DMEM (precalentado a 37ºC) a las células y se incubó durante otros 20 minutos a 37°C. Posteriormente, se determinó la lisis celular en FACS usando el método de tinción con yoduro de propidio (PI). Se añadió PI a una concentración final de 2.5 µg/ml. Para la citometría de flujo, se utilizó un citómetro de flujo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Se recogieron al menos 10000 eventos para el análisis con residuos celulares excluidos por ajuste del umbral de dispersión lateral hacia delante (FCS). El porcentaje de células 45 lisadas (células PI positivas) se muestra en la Figura 19. Los anticuerpos monoclonales 85A3, 28D10 y 26D12 indujeron lisis de 33.5%, 38.2% y 39.2%, respectivamente, de células HEK293-CLD18A2, mientras que CDC mediada por 24H5 sólo fue 19.3%.
b. CDC de anticuerpos monoclonales de Conjunto1:
En un segundo conjunto de experimentos se analizó la especificidad de anticuerpos monoclonales para inducir CDC en células que expresan CLD18A2. Por lo tanto, se ensayó un conjunto de anticuerpos que se unen o bien específicamente a CLD18A2 humano o también se unen a CLD18A1 humano para la inducción de CDC frente a células CHO transfectadas de forma estable con CLD18A2 humano (CHO-CLD18A2) o CLD18A1 humano (CHO-5 CLD18A1). Se sembraron células CHO-CLD18A2 y CHO-CLD18A1 24 h antes del ensayo con una densidad de 3 x 104/pozo en placas de microtitulación de fondo plano de cultivo de tejidos. El medio de crecimiento del día siguiente se retiró y las células se incubaron por triplicado con sobrenadantes de hibridoma ajustados a una concentración de 10 µg/ml que contenían anticuerpos monoclonales 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 y 61C2, respectivamente. Las células de control se incubaron con medio de 10 crecimiento o medio de crecimiento que contenía saponina al 0.2% para la determinación de lisis de fondo y lisis máxima, respectivamente. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente se eliminó el sobrenadante y se añadió plasma 20% humano en DMEM (precalentado a 37°C) a las células y se incubó durante otros 20 minutos a 37°C. A continuación, los sobrenadantes se reemplazaron por PBS que contenía 2.5 µg/ml de bromuro de etidio y la emisión de fluorescencia después de la excitación a 520 nm se midió usando un Tecan Safire. 15 El porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera: % de lisis específica = (muestra de fluorescencia - fondo de fluorescencia)/(lisis de fluorescencia máxima - fondo de fluorescencia) x 100. La figura 20 muestra que los anticuerpos monoclonales 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 y 39F11 median altos, el anticuerpo monoclonal 38G5 media el medio, los anticuerpos monoclonales 41C6 y 61C2 median bajo, y los anticuerpos monoclonales 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 y 47D12 no median CDC frente a células CHO-CLD18A2. Por el contrario, ninguno de los 20 anticuerpos es capaz de inducir CDC frente a células CHO-CLDA1, aunque 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 y 61C2 también se unen a CLD18A1 determinado por citometría de flujo e inmunofluorescencia.
c. Titulación de anticuerpos monoclonales y CDC usando anticuerpos monoclonales de Conjunto1:
Para medir la capacidad de los anticuerpos anti-CLD18 para inducir CDC a bajas concentraciones, se realizó un experimento en el que se titularon tres anticuerpos diferentes. Se incubaron células CHO-CLD18A2 en placas de 25 microtitulación con un intervalo de concentración de 75B8 (100, 30, 10, 3 y 1 µg/ml), 37H8 (10, 3.3 y 1 µg/ml) y 28D10 (10, 1 y 0.1 µg/ml), respectivamente, durante 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró y se añadió plasma humano al 20% en DMEM (precalentado a 37°C) a las células y se incubó durante otros 20 minutos a 37°C. Antes del análisis utilizando un Tecan Safire, los sobrenadantes se reemplazaron por PBS que contenía 2.5 µg/ml de bromuro de etidio. Las Figuras 21A-C muestran el porcentaje de lisis específica en función de 30 la concentración de anticuerpo. El anticuerpo monoclonal 75B8 induce la lisis de 31.0% de células CHO-CLD18A2 a 10 µg/ml y cae hasta 6.2% a 1 µg/ml (Figura 21A), mientras que los anticuerpos monoclonales 28D10 y 37H8 inducen todavía lisis específica del 39% y 26.5% al 1 µg/ml (Figura 21B, C), respectivamente.
d. CDC de anticuerpos monoclonales de Conjunto2 medido por citometría de flujo:
Se preparó suero para la lisis del complemento extrayendo sangre de voluntarios sanos en tubos vacutainer de 35 Serum-Monovette (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemania), los cuales fueron luego centrifugados a 600 g durante 20 minutos. Se recogió el suero y se almacenó a -20ºC. El suero de control se inactivó por calor a 56ºC durante 30 minutos antes del almacenamiento.
Se analizaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar su capacidad para inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células KATO-III que expresan endógenamente CLD18A2 humano. Las células se 40 incubaron con sobrenadantes de hibridomas crudos o purificados que contenían anticuerpos monoclonales 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, respectivamente, durante 30 minutos a 37°C. Se añadió suero humano al 20% en RPMI a las células y se incubó durante otros 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se determinó la lisis celular en FACS usando el método de tinción con yoduro de propidio (PI). Se añadió PI a una concentración final de 2.5 µg/ml. Para la citometría de flujo se utilizó un citómetro de flujo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Al 45 menos 10000 eventos se recogieron para el análisis con residuos celulares excluidos por el ajuste de la parte delantera hacia el lado del umbral de dispersión (FSC/SSC). La lisis específica se calculó mediante la siguiente fórmula: lisis específica = (% de células PI positivas en muestras - % de células PI positivas en la muestra con suero inactivado por calor). Se observó una fuerte lisis mediada por CDC en particular para 163E12.
6. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) 50
Se analizaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar su capacidad para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) frente a células HEK293 que expresan de forma estable CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) o CLD18A1 humana (HEK293-CLD18A1).
a. Enriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica humana: La sangre humana de donantes sanos se diluyó dos veces en regulador fosfato (PBS) y las células sanguíneas se depositaron en capas sobre Ficoll (Medio 55 de Separación de Linfocitos 1077 g/ml, PAA Laboratories, cat. No. J15-004). Las células mononucleares de sangre periférica (MNCs) se recogieron de la interfase, se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor, L-glutamina2 mM.
b. Configuración de ADCC: Las células diana se marcaron con un ligando potenciador de fluorescencia (BADTA, ensayo de citotoxicidad Perkin Elmer, reactivos de citotoxicidad DELFIA EuTDA, No. de cat. ADO116) durante 30 minutos. Después de un lavado extensivo en RPMI-10 suplementado con probenecid 10 mM (Sigma, No. de cat. P8761), 10-20 mM de HEPES y 10% de suero de ternero fetal inactivado por calor, las células se ajustaron a 1 x 105 células/ml. Se añadieron células diana etiquetadas, células efectoras (MNCs) y sobrenadantes que contenían 5 anticuerpos monoclonales ajustados a una concentración de 10 µg/ml a placas de microtitulación de fondo redondo. Para las células efectoras aisladas, se utilizó una relación efector a objetivo (E:T) de 100:1 (datos no mostrados para 50:1 y 25:1). Después de la incubación (2 horas, 37ºC), los ensayos se detuvieron por centrifugación y la liberación de ligando de fluorescencia de los duplicados se midió en recuentos de europio en un fluorómetro resuelto en el tiempo. El porcentaje de citotoxicidad celular se calculó usando la siguiente fórmula: % de lisis específica = 10 (recuentos de liberación experimental - recuentos de liberación espontánea)/(recuentos máximos de liberación - recuentos de liberación espontánea) x 100, con liberación máxima de ligando de fluorescencia determinada añadiendo Triton X-100 0.25% de concentración final) a las células diana, y liberación espontánea medida en ausencia de anticuerpos y células efectoras. La Figura 22 muestra que los anticuerpos monoclonales 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 y 61C2 median ADCC frente a células HEK293-CLD18A2. Por el contrario, estos anticuerpos no 15 inducen ninguna citotoxicidad significativa o sólo de bajo nivel en los dianas CLD18A1 que demuestran un ADCC específico de CLD18A2 (Figura 23).
7. Inhibición de la proliferación
Los anticuerpos monoclonales murinos purificados se analizaron en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento celular de células KATO-III que expresan endógenamente CLD18A2 humano. 20
Se cultivaron 1x104 células diana que expresan endógenamente CLD18A2 (KATO-III) en presencia de aproximadamente 10 µg de anticuerpos monoclonales.
El kit de proliferación de células DELFIA (Perkin-Elmer, No. de catálogo AD0200) es un inmunoensayo no isotópico basado en la medición de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante la síntesis de ADN de células proliferantes en microplacas. La BrdU incorporada se detecta utilizando anticuerpo monoclonal marcado con 25 europio. Para permitir la detección de anticuerpos las células son fijadas y el ADN es desnaturalizado usando solución Fix. El anticuerpo no unido se elimina por lavado y se añade inductor DELFIA para disociar los iones de europio del anticuerpo marcado en solución, donde forman quelatos altamente fluorescentes con componentes del inductor DELFIA. La fluorescencia medida -utilizando fluorometría resuelta en el tiempo, en la detección- es proporcional a la síntesis de ADN en la célula de cada pozo. 30
Se observó una fuerte inhibición de la proliferación con los anticuerpos 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 y 166E2, respectivamente. Se observó una inhibición moderada de la proliferación con anticuerpos murinos 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 y 38H3, respectivamente.
8. Desempeño en modelos terapéuticos de xenoinjerto en ratón
El potencial terapéutico de los anticuerpos monoclonales identificados que se unen específicamente a CLD18A2 se 35 estudió en modelos terapéuticos de xenoinjerto.
a. Tratamiento temprano de tumores que expresan altamente CLD18A2 en ratones
Los ratones SCID se inocularon subcutáneamente con 1 x 107 células HEK293 que expresaban de forma estable altos niveles de CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2). Los niveles de expresión de CLD18A2 humano en células HEK293-CLD18A2 fueron comparables con los niveles de expresión en cánceres gástricos primarios de pacientes. 40 Cada grupo de tratamiento experimental comprendía 10 ratones (número de ratones por grupo n=10). La terapia de ratones comenzó 3 días después de la inoculación del tumor. Se inyectaron 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificado que representaban anticuerpos monoclonales murinos 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3 o 61C2 una vez por semana durante 4 semanas por vía intravenosa. Alternativamente se administraron 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificado que contenían anticuerpos monoclonales murinos 45 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 o 175D10 dos veces por semana durante 6 semanas alternando inyección intravenosa e intraperitoneal. El crecimiento tumoral de ratones tratados se monitorizó dos veces por semana (volumen tumoral = longitud x ancho x ancho dividido por 2 en mm3). Los ratones fueron sacrificados si el tumor alcanzaba un volumen de 500 mm3 o en caso de morbilidad severa. La Figura 24 ejemplifica la inhibición robusta del crecimiento de células tumorales HEK293-CLD18A2 por anticuerpos de la divulgación. Las Figuras 25A y 25B 50 muestran prolongación de la supervivencia por tratamiento con anticuerpos de la divulgación en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano utilizando células HEK293-CLD18A2.
b. Tratamiento de inicio tardío de tumores altamente expresivos que expresan CLD18A2 en ratones
El mismo modelo de xenoinjerto tumoral basado en células HEK293-CLD18A2 se diseñó como un protocolo de inicio tardío de terapia en oposición al tratamiento temprano descrito anteriormente. El día 27 después de la inoculación de 55 células tumorales, los ratones se asignaron al azar en grupos de ensayo que comprendían cada uno 5-6 ratones y se inició la terapia con 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificados que contenían anticuerpos monoclonales
murinos 43A11, 163E12 y 175D10, respectivamente. Los anticuerpos se administraron dos veces por semana durante 6 semanas alternando inyección intravenosa e intraperitoneal. También en este modelo se demostró que los anticuerpos de la divulgación inhiben el crecimiento tumoral. Para varios anticuerpos esto dio como resultado una prolongación de la supervivencia (Figura 26).
c. Tratamiento temprano de tumores que expresan bajos niveles de CLD18A2 5
Los ratones SCID se inocularon subcutáneamente con 2 x 105 células de la línea celular tumoral DAN-G, una línea celular infiltrante de adenocarcinoma pancreático humano que expresa constitutivamente la proteína CLD18A2 a nivel bajo. El tratamiento de ratones (10 por grupo) se inició 3 días después del injerto tumoral: se administraron 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificado que contenían anticuerpos monoclonales murinos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 o 175D10 dos veces por semana durante 6 semanas alternando inyección intravenosa e 10 intraperitoneal. Debido al crecimiento agresivo y rápido del tumor de la línea celular tumoral pancreática DAN-G, los ratones in vivo desarrollaron caquexia tumoral y murieron en pocos días. A pesar de que, como consecuencia, la ventana para medir los efectos terapéuticos fue estrecha, la inhibición del crecimiento tumoral y la supervivencia prolongada mediada por anticuerpos de la divulgación también se observó en este modelo (Figuras 27A y 27B).
d. Los anticuerpos de la divulgación no provocan efectos secundarios en ratones 15
Se utilizó un par de cebadores específicos de CLD18A2 murino (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, como: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) en análisis de PCR-RT para amplificar ADNc derivado de un panel completo de tejidos de ratón normales (Véase la Figura 28).
La expresión de CLD18A2 murino no fue detectable en ningún tejido normal probado, excepto el estómago (véase la Figura 28). Además, se usó un anticuerpo específico de CLD18A2, que reacciona de forma cruzada con CLD18A2 20 humano y de ratón, para el análisis inmunohistoquímico de la expresión de CLD18A2 en un gran panel de tejidos de ratón normales (véase Tab. 3). Excepto para el tejido gástrico normal, todos los tejidos normales probados no muestran expresión de CLD18A2. Como observamos para el CLD18A2 humano, también encontramos para la contraparte de ratón que mientras que el epitelio superficial y células de cripta más profundas expresan CLD18A2 en su superficie celular, la región central del cuello es CLD18A2 negativa (ver Figura 29 A-C). En resumen, la 25 distribución tisular de CLD18A2 parece ser idéntica en hombres y ratones.
Tabla 3: CLD 18 expresión dentro de los tejidos normales murinos como analizado por inmunohistoquímica
Tejido expresión de CLD 18
Cerebelo -
Cerebro - 30
Colon -
Esófago -
Corazón -
Riñón -
Hígado - 35
Pulmón -
Ganglio Linfático -
Ovario -
Páncreas -
Músculo esquelético - 40
Bazo -
Estómago +
Timo -
Vejiga -
Además, investigamos los posibles efectos secundarios mediados por los anticuerpos 125E1, 163E12, 166E2 y 45 175D10 en ratones. Todos estos anticuerpos habían sido previamente mostrados por análisis FACS para reaccionar
con el CLD18A2 murino, así como con la proteína humana.
Tampoco se observaron efectos secundarios visibles en ratones durante y después del tratamiento con estos anticuerpos, ni correlacionados histomorfológicos de la toxicidad observada en la mucosa gástrica de ratones tratados con anticuerpos en comparación con ratones no tratados (tratados con PBS) (véase la Figura 30).
9. Quimerización de anticuerpos 5
a. Generación de anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón/humano
Se preparó ARN total y posteriormente ADNc de cadena sencilla a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas y de tejido de bazo humano por métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo utilizando RNeasy Midi Kit (Qiagen) y Superscript II Transcriptasa inversa (Invitrogen).
La región constante de la cadena ligera kappa humana se amplificó a partir de ADNc de PBMC mediante PCR. El 10 oligómero en sentido (SEQ ID NO: 38) añadió un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' de la región constante y cambió la secuencia de ácido nucleico original 5'-CGAACT-3' que codifica los dos primeros aminoácidos (Arg-Thr) de la región constante en 5'-CGTACG-3', generando un sitio de restricción BsiWI sin cambiar la secuencia de aminoácidos. El oligómero antisentido (SEQ ID NO: 39) incluía un codón de parada y se añadió un sitio de restricción NotI en el extremo 3' de la región constante amplificada. El producto de PCR así como un vector de 15 expresión estándar (por ejemplo pADNc3.1 (+), Invitrogen) se incubaron secuencialmente con enzimas de restricción BamHI y NotI. El vector se trató adicionalmente con fosfatasa alcalina intestinal de ternera para evitar la recirculación. La región constante se ligó finalmente al vector, de modo que cualquier fusión próxima de una región variable delante de la región constante es ahora posible a través de un sitio de restricción HindIII (5'-AAGCTT-3') del sitio de clonación múltiple del vector residual y vía el sitio de restricción BsiWI (5'-CGTACG-3') generado con el 20 producto de PCR. La secuencia de la región constante de cadena ligera kappa humana insertada en el vector se lista como SEQ ID NO: 40, la secuencia de aminoácidos de la región constante kappa humana se lista como SEQ ID NO: 41.
La región constante de la cadena pesada gamma-1 humana se amplificó a partir de ADNc de bazo por PCR. El oligómero en sentido 5' fosforilado (SEQ ID NO: 42) se colocó sobre el sitio de restricción ApaI natural, situado 11 25 nucleótidos aguas abajo del comienzo de la región constante, y añadió un sitio de restricción HindIII en el extremo 5' de la parte amplificada de la región constante. El oligómero antisentido 5' fosforilado (SEQ ID NO: 43) incluyó un codón de parada y añadió un sitio de restricción NotI en el extremo 3' de la región constante así amplificada. El producto de PCR generado de este modo se terminó romo y se fosforiló en 5'. Se comprobó que la región constante gamma amplificada era de la subclase IgG1 mediante PCR con un oligómero antisentido discriminante (SEQ ID NO: 30 44) y por secuenciación. Se incubó un vector de expresión estándar (por ejemplo pADNc3.1 (+)/Hygro, Invitrogen) con una resistencia antibiótica diferente (por ejemplo higromicina) que la del vector utilizado para la expresión de la cadena ligera (por ejemplo neomicina) con enzima de restricción PmeI para eliminar completamente el sitio de clonación múltiple dejando extremos romos. El vector se trató adicionalmente con fosfatasa alcalina intestinal de ternera para evitar la recirculación. La región constante se ligó finalmente al vector, de manera que cualquier fusión 35 próxima de una región variable delante de la región constante es ahora posible a través del sitio de restricción HindIII (5'-AAGCTT-3') y a través del sitio de restricción ApaI (5'-GGGCCC-3'), ambos generados con el producto de PCR. La orientación correcta de la región constante en el vector, es decir, adecuada para el promotor precedente del vector, se verificó por secuenciación. Debido a la posición del sitio de restricción ApaI, cualquier amplificación de una región variable para este propósito tiene que incluir los primeros 11 nucleótidos de la secuencia de la región 40 constante gamma-1 humana además de la secuencia del sitio ApaI. La secuencia de la región constante de la cadena pesada gamma-1 humana así amplificada insertada en el vector se lista como SEQ ID NO: 45, la secuencia de aminoácidos de la región constante gamma-1 humana así expresada se lista como SEQ ID NO: 46.
Tabla 4: Líneas celulares de hibridoma de ratón usadas para la clonación de anticuerpos
Clon mAb Isotipo Región variable Par oligómero en PCR Anticuerpo quimérico
cadena pesada
43A11 182-D1106-062 IgG2a SEQ ID NO:55,132 SEQ ID NO:70, 71 SEQ ID NO:100, 115
163E12
182-D1106-294 IgG3 SEQ ID NO:56, 133 SEQ ID NO:72, 73 SEQ ID NO:101, 116
125E1
182-D1106-279 IgG2a SEQ ID NO:57, 134 SEQ ID NO:74, 75 SEQ ID NO:102, 117
166E2
182-D1106-308 IgG3 SEQ ID NO:59, 136 SEQ ID NO:78, 79 SEQ ID NO:104, 119
175D10
182-D1106-362 IgG1 SEQ ID NO:58, 135 SEQ ID NO:76, 77 SEQ ID NO:103,118
45C1
182-D758-187 IgG2a SEQ ID NO:60, 13 SEQ ID NO:80,81 SEQ ID NO:105, 120
cadena de luz
43A11 182-D1106-062 IgK SEQ ID NO:62,139 SEQ ID NO:84, 85 SEQ ID NO:107, 122
163E12
182-D1106-294 IgK SEQ ID NO:61, 138 SEQ ID NO:82, 83 SEQ ID NO:106, 121
125E1
182-D1106-279 IgK SEQ ID NO:63, 140 SEQ ID NO:86, 87 SEQ ID NO:108, 123
166E2
182-D1106-308 IgK SEQ ID NO:66, 143 SEQ ID NO:92, 93 SEQ ID NO:111, 126
175D10
182-D1106-362 IgK SEQ ID NO:65, 142 SEQ ID NO:90, 91 SEQ ID NO:110, 125
45C1
182-D758-187 IgK SEQ ID NO:64, 141 SEQ ID NO:88, 89 SEQ ID NO:109, 124
45C1
182-D758-187 IgK SEQ ID NO:67, 144 SEQ ID NO:94, 95 SEQ ID NO:112, 127
45C1
182-D758-187 IgK SEQ ID NO:68, 145 SEQ ID NO:96, 97 SEQ ID NO:113, 128
45C1
182-D758-187 IgK SEQ ID NO:69, 146 SEQ ID NO:98, 99 SEQ ID NO:114, 129
Correspondiendo a sus homólogos murinos, se nombraron los anticuerpos monoclonales quiméricos añadiendo el prefijo "ch-" Por ejemplo ch-43A11, ch-163E12, ch-125E1, ch-166E2, ch-175D10, ch-45C1.
La amplificación de las regiones variables murinas de cadenas ligera y pesada se llevó a cabo de acuerdo con el método de "PCR de paso" descrito en Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6). Para ello, se 5 preparó ARN total a partir de líneas celulares de hibridoma monoclonales (véase Tab. 4) por métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo con el uso de RNeasy Mini Kit (Qiagen). El ADNc de cadena sencilla se preparó de acuerdo con el procedimiento de "conector" descrito también en Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558). Además de un oligómero (dT)30 (SEQ ID NO: 47), incluía un oligómero híbrido de ADN/ARN (SEQ ID NO: 48) que servía de adaptador 5' para la conmutación de plantillas durante la 10 polimerización de la hebra de ADNc. En este oligómero adaptador los últimos tres nucleótidos eran ribo- en lugar de desoxirribonucleótidos. La subsiguiente “PCR de paso a paso" utilizó un oligómero antisentido dirigido a la región constante de la cadena kappa de ratón o a la región constante de las subclases 1, 2a o 3 de las cadenas gamma (SEQ ID NO: 49 a 52, respectivamente). La subclase IgG del anticuerpo monoclonal murino producido por las líneas celulares de hibridoma se analizó inmunológicamente antes con IsoStrip (véase el Ejemplo 1), y el oligómero 15 antisentido apropiado se eligió en consecuencia (véase Tab. 4). Una mezcla de cebadores sirvió como oligómero en sentido en la "PCR de salida", que comprende los dos oligómeros enumerados en SEQ ID NO: 53 y 54. Algunas líneas celulares de hibridoma expresaron más de una cadena pesada o ligera (además de las cadenas expresadas por la línea celular de mieloma utilizada para la generación de hibridomas). La Tabla 4 resume las SEQ ID NOs de las regiones variables clonadas y secuenciadas de las cadenas de anticuerpos murinos (SEQ ID NO: 55 a 69 y SEQ 20 ID NO: 132 a 146) y de las cadenas de anticuerpos quiméricos completos clonados y secuenciados (SEQ ID NO: 100 a 129).
Las regiones variables murinas identificadas se amplificaron entonces mediante PCR omitiendo la región 5' UTR y la región constante 3' del ratón, añadiendo sitios de restricción a los extremos que permitían la subclonación en los vectores de expresión preparados que llevaban las regiones constantes humanas. Además, los oligómeros sensibles 25 proporcionaron una secuencia Kozak de consenso (5'-GCCGCCACC-3' o 5'-AGCCACC-3') y los oligómeros antisentido para regiones variables de cadena pesada incluyeron los primeros 11 nucleótidos de la región constante gamma-1 humana además del sitio de restricción ApaI (ver Tab. 4, SEQ ID NO: 70 a 99). Las regiones variables de la cadena ligera Kappa se clonaron utilizando enzimas de restricción HindIII y BsiWI, las regiones variables de la cadena pesada gamma exigieron las enzimas de restricción HindIII y ApaI. La región variable de la cadena gamma 30 pesada del anticuerpo monoclonal 45C1 contenía un sitio de restricción HindIII interno -en este caso, se utilizó la enzima BsaI compatible (ver SEQ ID NO: 80)-. Las SEQ ID NO: 100 a 114 muestran las secuencias de ácidos nucleicos de los anticuerpos quiméricos resultantes (véase Tab. 4). SEQ ID NO: 115 a 129 muestran las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos quimerizados expresados de forma correspondiente (véase Tab. 4).
b. Generación y producción de anticuerpos quiméricos contra CLD18 35
Se generaron líneas celulares de mamífero que producían anticuerpos quiméricos con especificidad CLD18. Las líneas celulares derivadas de células HEK293T (ATCC CRL-11268). Un día antes de la transfección, se sembraron 2.5 x 107 células en un plato de cultivo de tejidos de 14.5 cm y se cultivaron en 20 ml de medio completo, o alternativamente 1 x 107 células se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y se cultivaron en 10 ml de medio completo, o alternativamente se depositaron 0.6 x 106 células en un pozo de una placa de tejido de 12 40 pozos y se cultivaron en 2-3 ml de medio completo (medio completo: medio DMEM:F12 suplementado con FBS al 10% sin antibióticos). La densidad celular recomendada en el momento de la transfección debe ser de 90% de confluencia. Inmediatamente antes de la transfección, el medio se reemplazó por medio fresco. Se transfectaron células HEK293T con reactivos de transfección, por ejemplo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) o alternativamente polietilenimina (Sigma-Aldrich, 408727). Para la transfección de células HEK293T se utilizó una 45
cantidad total de ADN de 110 µg o 296 µg para un plato de tejido de 14.5 cm, y la relación de agente de transfección a ADN fue de 1:2.5 y 1:12 para Lipofectamine 2000 y PEI, respectivamente. 24 h después de que el medio de transfección se reemplazó con un medio apropiado de GMP, por ejemplo X-Vivo 15 (Cambrex) o un medio definido químicamente como Pro293a (Cambrex) sin suero. Las células HEK293T transfectadas que producen anticuerpos monoclonales quiméricos contra CLD18 se cultivaron durante 96 horas más. Los sobrenadantes en bruto se 5 cosecharon, se filtraron estériles y se purificaron mediante proteína Asepharose. La concentración de anticuerpos se determinó por ensayo de BCA y se verificó la pureza mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico y tinción con coomassie.
c. Características de unión de anticuerpos monoclonales quiméricos
La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales quiméricos clonados y generados a CLD18A2 se analizó 10 por citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 3. Las células vivas HEK293 que expresan de forma estable células CLD18A2 humanas (HEK293-CLD18A2) y HEK293 que expresan de forma estable el CLD18A1 humano (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con sobrenadantes de cultivo celular HEK293T purificados que contienen anticuerpos monoclonales quiméricos, seguido por incubación con anticuerpo secundario de Fc de IgG de cabra anti-IgG humano conjugado con APC F(ab’)2 y contratinción con PI. La fijación se 15 evaluó por citometría de flujo utilizando un BD FACSArray.
De forma similar, las líneas de células tumorales humanas que expresan CLD18A2 endógena, por ejemplo células KATO-III y NUGC-4, se analizaron por citometría de flujo.
Las Figuras 31A y B muestran análisis de citometría de flujo de anticuerpos quiméricos ch-43A11, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10. Todos ellos muestran reconocimiento de epítopos nativos y muestran una unión 20 específica y fuerte a CLD18A2 pero no a células que expresan CLD18A1.
d. Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Se preparó suero para la lisis del complemento extrayendo sangre de voluntarios sanos en tubos vacutainer de Serum-Monovette (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemania), los cuales fueron luego centrifugados a 600 g durante 20 min. Se recogió el suero y se almacenó a -20ºC. El suero de control se inactivó por calor a 56ºC durante 30 minutos antes 25 del almacenamiento.
Se analizaron los anticuerpos quiméricos purificados por proteína Asepharose de esta divulgación para determinar su capacidad para inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células KATO-III que expresan endógenamente CLD18A2 humano, así como células CHO-CLD18A2 transfectadas de forma estable. Las células se incubaron con anticuerpos monoclonales ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10, respectivamente, en una 30 concentración final de 2.5 µg/ml a 35 µg/ml durante 30 minutos a 37°C. Se añadió suero humano al 20% en RPMI a las células y se incubó durante otros 30 minutos a 37°C. Posteriormente, las células muertas y vivas se discriminaron por tinción PI en una concentración final de 2.5 µg/ml y el porcentaje de lisis celular mediada por anticuerpos se determinó mediante citometría de flujo. Para el análisis de citometría de flujo se utilizó un citómetro de flujo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Al menos 10000 eventos se recogieron para el 35 análisis con residuos celulares excluidos por el ajuste de la parte delantera hacia el lado de dispersión (FSC/SSC) umbral. La lisis específica se calculó mediante la siguiente fórmula: lisis específica = (% de células PI positivas en muestras - % de células PI positivas en la muestra con suero inactivado por calor). La lisis específica mediada por CDC se mostró para varios anticuerpos. Los tres anticuerpos mediada por CDC robusto en células CHO-CLD18A2 (Figura 32). En las células KATOIII, los anticuerpos ch-163E12 y ch-175D10 fueron inductores de CDC robustos. 40
e. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)
Se analizaron los anticuerpos quiméricos purificados por FPLC de la divulgación para determinar su capacidad para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra células KATO-III que expresan endógenamente CLD 18A2 humano.
La sangre humana procedente de donantes sanos se diluyó dos veces en regulador fosfato (PBS) y las células 45 sanguíneas se colocaron en capas sobre Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia). Después de la centrifugación, se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la interfase, se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo X-Vivo-15 suplementado con suero humano inactivado por calor al 5%.
15 h antes del ensayo, las células KATO-III se transfectaron con luciferasa y se sembraron a 5 x 104 células/pozo en una microplaca blanca. 50
Para el ensayo, se añadieron células efectoras (PBMC, preparadas como se ha descrito anteriormente) a una relación efector a blanco (E:T) de 20:1 y anticuerpos quiméricos purificados con FPLC y se incubaron durante 2-3 h a 37ºC, 5% de CO2. La concentración final del anticuerpo en el pozo fue de 50 µg/ml. Después de 2-3 horas de preincubación, se añadió amarillo de lucifer (BD Biosciences, San José, Estados Unidos) a 1 mg/ml. La luminescencia resultante de la oxidación del lucifer amarillo por la luciferasa de células viables se midió 55 continuamente hasta 6 h usando un lector de microplacas (Infinite200, Tecan, Suiza). El porcentaje de citotoxicidad
celular se calculó usando la siguiente fórmula: % de lisis específica = 100-((recuentos de luminiscencia de la muestra - conteos luminescentes espontáneos)/(recuentos máximos de luminiscencia - conteos luminescentes espontáneos) x 100), con la luminescencia espontánea determinada añadiendo Triton X-100 (concentración final del 0.2%), y la señal máxima medida en ausencia de anticuerpos.
Usando este ensayo se demostró que los anticuerpos monoclonales ch-163E12 y ch-175D10 median ADCC fuerte 5 en células KATO-III (Figura 33).
f. Inhibición de la proliferación
Los anticuerpos quiméricos purificados por FPLC de la divulgación se analizaron en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento celular de células KATO-III que expresan endógenamente CLD18A2 humano.
Se cultivaron células diana (KATO-III) en presencia de anticuerpos respectivos quiméricos (véase inhibición de la 10 proliferación de anticuerpos murinos, Ejemplo 7). Se demostró que los anticuerpos quiméricos purificados por FPLC ch-163E12 y ch-166E2 inhiben la proliferación celular.
10. Selección de anticuerpos como candidatos clínicos principales
Las derivaciones clínicas ideales pueden abarcar una amplia gama de aplicaciones terapéuticas y diagnósticas (véase también la sección IV - Usos y Métodos de la Divulgación). De acuerdo con la divulgación se proporcionan 15 anticuerpos dirigidos a CLD18-A2. Se muestra que los anticuerpos proporcionados de acuerdo con la divulgación ofrecen un amplio espectro de propiedades en cuanto a especificidad, capacidad para inducir CDC y ADCC e inhibir la proliferación de células que expresan CLD18, en particular células tumorales. Además, se ha demostrado que la quimerización de anticuerpos puede conducir a la adquisición de funciones efectoras dependientes de Fc adicionales que no están presentes en la molécula murina parental. Por ejemplo, se muestra aquí que el anticuerpo 20 175D10 con IgG1 murina no induce citotoxicidad dependiente del complemento (véase el Ejemplo 5), mientras que el ch-175D10 con IgG1 humana induce lisis específica de células tumorales que expresan CLD18 constitutivamente (véase Tab. 5 y Tab. 6).
Los anticuerpos proporcionados de acuerdo con la presente divulgación pueden clasificarse en clases distintas de acuerdo con sus propiedades de unión y su capacidad para mediar funciones efectoras en células que expresan 25 CLD18. A partir de los anticuerpos proporcionados de acuerdo con la presente divulgación, los candidatos clínicos de plomo se pueden seleccionar basándose en sus características funcionales. Un resumen de las propiedades de los anticuerpos murinos y quiméricos seleccionados de la divulgación se da en Tab. 5 y Tab. 6, respectivamente.
Los candidatos clínicos principales de la divulgación pueden tener una o más de las siguientes propiedades:
a) unión a CLD18A2 humano pero no a CLD18A1 humano (por ejemplo 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 30 175D10, y ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10). Por ejemplo, véanse las figuras 6A y 6B.
b) unión a CLD18A2 de ratón pero no a CLD18A1 de ratón (por ejemplo, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Por ejemplo, véanse las figuras 15A y 15B.
c) unión a CLD18 expresado naturalmente por células tumorales (por ejemplo 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 35 y 175D10, y ch-45C1, ch-43A11, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10). Por ejemplo, véase la figura 13
d) unión a CLD18 en zonas de contacto intercelular (por ejemplo, 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Por ejemplo, véanse las figuras 12A y 12B.
e) medición de la muerte de células inducida por CDC, que expresan CLD18 (por ejemplo, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, y ch-163E12 y ch-175D10). Para ejemplos, véase la figura 32. 40
f) mediación la muerte de células inducida por ADCC que expresan CLD18 (por ejemplo, ch-163E12 y ch-175D10). Para ejemplos, véase la figura 33.
g) inhibición de la proliferación de células que expresan CLD18 (por ejemplo, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, y ch-163E12 y ch-166E2).
h) inhibición del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto con células que expresan CLD18 (por ejemplo 45 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Para ejemplos, véase la figura 24.
i) prolongación de la supervivencia en modelos de xenoinjerto con células que expresan CLD18 (por ejemplo 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Por ejemplo, véase la figura 25B.
Vista general de ejemplo de propiedades para selección de candidatos principales
Tabla 5. Anticuerpos murinos 50

Claims (37)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal que tiene la capacidad de unirse a CLD18A2 y mediar la muerte de células que expresan CLD18A2, en el que el anticuerpo se une a un epítopo localizado en el bucle1 CLD18A2 o el bucle D3 de CLD18A2 y en el que se induce la muerte por unión del anticuerpo a CLD18A2 expresado por dichas células, en el que dicho anticuerpo comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que determinan la 5 complementariedad, seleccionadas entre las siguientes (i) a (ix):
    (i) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posiciones 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posiciones 110-118 de SEQ ID NO: 122,
    (ii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: 10 posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 121,
    (iii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posiciones 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 123, 15
    (iv) VH: CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posiciones 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posiciones 115-122 de SEQ ID NO: 126,
    (v) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posiciones 76-78 20 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 125,
    (vi) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 124,
    (vii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: 25 posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 127,
    (viii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 128, y 30
    (ix) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 129,
    y en el que dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) compuesta cada una por tres CDR. 35
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se une a CLD18A1 y CLD18A2 o se une a CLD18A2 pero no a CLD18A1.
  3. 3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dichas células que expresan CLD18A2 son células cancerosas, en el que las células cancerosas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en células cancerosas tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas y pulmonares.
  4. 4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es un anticuerpo quimérico, humano o 40 humanizado, o un fragmento de un anticuerpo.
  5. 5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 seleccionado del grupo que consiste en una IgG1, una IgG2, una preferiblemente IgG2a e IgG2b, una IgG3, una IgG4, una IgM, una IgA1, una IgA2, una IgA secretora, una IgD, y un anticuerpo IgE.
  6. 6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que CLD18A2 tiene la secuencia de 45 aminoácidos según SEQ ID NO: 2.
  7. 7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que CLD18A1 tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 8.
  8. 8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que se une a epítopos nativos de CLD18A2 presentes en la superficie de células vivas. 50
  9. 9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que es específico para células cancerosas, preferiblemente células de cáncer de estómago.
  10. 10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que se puede obtener por un método que comprende la etapa de inmunizar un animal no humano con una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 y 26-31, o un fragmento inmunogénico del 5 mismo, o un ácido nucleico o célula huésped que expresa dicha proteína o péptido, o fragmento inmunogénico del mismo.
  11. 11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende una VH que comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 determinantes de la complementariedad seleccionadas entre los siguientes (i) a (vi): 10
    (i) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posiciones 116-125 de SEQ ID NO: 115,
    (ii) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 116,
    (iii) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posiciones 70-77 of SEQ ID NO: 117, CDR3: posiciones 15 116-124 de SEQ ID NO: 117,
    (iv) CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 118,
    (v) CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posiciones 115-125 de SEQ ID NO: 119, y 20
    (vi) CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120.
  12. 12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que comprende una VL que comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que determinan la complementariedad, seleccionadas entre los siguientes (i) a (ix): 25
    (i) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 121,
    (ii) CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posiciones 110-118 de SEQ ID NO: 122,
    (iii) CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posiciones 30 109-117 de SEQ ID NO: 123,
    (iv) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 124,
    (v) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 125, 35
    (vi) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posiciones 115-122 de SEQ ID NO: 126,
    (vii) CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 127,
    (viii) CDR1: positions 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posiciones 40 115-123 de SEQ ID NO: 128, y
    (ix) CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 129.
  13. 13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende una combinación de VH y VL, cada una de las cuales comprende un conjunto de regiones CDR1, CDR2 y CDR3 que determinan la complementariedad, 45 seleccionadas entre los siguientes (i) a (ix):
    (i) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posiciones 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1: posiciones 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posiciones 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posiciones 110-118 de SEQ ID NO: 122,
    (ii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 121,
    (iii) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posiciones 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posiciones 70-72 5 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 123,
    (iv) VH: CDR1: posiciones 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posiciones 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posiciones 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posiciones 115-122 de SEQ ID NO: 126,
    (v) VH: CDR1: posiciones 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posiciones 70-77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: 10 posiciones 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 125,
    (vi) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 124, 15
    (vii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posiciones 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 127,
    (viii) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posiciones 76-78 20 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posiciones 115-123 de SEQ ID NO: 128, y
    (ix) VH: CDR1: posiciones 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posiciones 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posiciones 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posiciones 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posiciones 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posiciones 109-117 de SEQ ID NO: 129.
  14. 14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que comprende una región variable de cadena 25 pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137 y un fragmento de la misma.
  15. 15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 que comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, y un fragmento de la misma. 30
  16. 16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) seleccionada entre las siguientes posibilidades (i) a (ix):
    (i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 o un fragmento de la misma, 35
    (ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 o un fragmento de la misma,
    (iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 o un fragmento de la misma,
    (iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 o un fragmento de la misma 40 y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 o un fragmento de la misma,
    (v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 o un fragmento de la misma,
    (vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 o un fragmento de la misma, 45
    (vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 o un fragmento de la misma,
    (viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 o un fragmento de la 50 misma,
    (ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 o un fragmento de la misma.
  17. 17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 que comprende
    (i) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120 y un fragmento de la misma 5
    y/o
    (ii) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 y un fragmento del mismo.
  18. 18. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 que comprende una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras seleccionadas de las siguientes posibilidades (i) a (ix): 10
    (i) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 o un fragmento de la misma,
    (ii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 o un fragmento del mismo y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 o un 15 fragmento de la misma,
    (iii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 o un fragmento de la misma,
    (iv) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 o un fragmento 20 de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 o un fragmento de la misma,
    (v) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 o un fragmento del mismo y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 o un fragmento de la misma, 25
    (vi) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 o un fragmento de la misma,
    (vii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 o un 30 fragmento de la misma,
    (viii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 o un fragmento de la misma y
    (ix) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 o un fragmento 35 de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 o un fragmento de la misma.
  19. 19. Un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
  20. 20. Un conjugado que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 acoplado a un agente terapéutico, en el que el agente terapéutico es preferiblemente una toxina, un radioisótopo, un fármaco o un 40 agente citotóxico.
  21. 21. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y/o un conjugado de la reivindicación 20, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  22. 22. Un anticuerpo monoclonal para uso como medicamento, teniendo dicho anticuerpo la capacidad de unión a CLD18A2 y de mediación de la muerte de células que expresan CLD18A2, en el que la muerte se induce por unión 45 del anticuerpo a CLD18A2 expresado por dichas células, en donde el anticuerpo no se une a CLD18A1, en donde dicha muerte es inducida por lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC.
  23. 23. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 22, en el que dichas células que expresan CLD18A2 son células cancerosas, en donde las células cancerosas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en células cancerosas gástricas, esofágicas, pancreáticas y pulmonares tumorigénicas. 50
  24. 24. El anticuerpo para el uso de la reivindicación 23, en el que dicha lisis mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras seleccionadas del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y PMN.
  25. 25. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 22-24 que es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo. 5
  26. 26. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 seleccionado del grupo que consiste en una IgG1, una IgG2, preferiblemente IgG2a e IgG2b, una IgG3, una IgG4, una IgM, una IgA1, una IgA2, una IgA secretora, una IgD, y un anticuerpo IgE.
  27. 27. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 22-26 en el que CLD18A2 tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2. 10
  28. 28. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 22-27, en el que CLD18A1 tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 8.
  29. 29. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 22-28 que se une a epítopos nativos de CLD18A2 presentes en la superficie de células vivas.
  30. 30. El anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 22-29 que es específico para células 15 cancerosas, preferiblemente células de cáncer de estómago.
  31. 31. Un conjugado para uso como medicamento, comprendiendo dicho conjugado un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22-30 acoplado a un agente terapéutico, en el que el agente terapéutico es preferiblemente una toxina, un radioisótopo, un fármaco o un agente citotóxico.
  32. 32. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las 20 reivindicaciones 1-18 o 22-30 y/o un conjugado de la reivindicación 31, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  33. 33. Un anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y/o 22-30 y/o un conjugado para uso de la reivindicación 31, para su uso en un método para inhibir el crecimiento y/o la muerte de una célula que expresa CLD18A2.
  34. 34. Un anticuerpo para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o 22-30, un conjugado para uso de la 25 reivindicación 31 o una composición farmacéutica de la reivindicación 32, para uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno que implica células que expresan CLD18A2.
  35. 35. El anticuerpo para uso, conjugado para uso o composición farmacéutica para uso de la reivindicación 34, en el que la enfermedad o trastorno es una enfermedad relacionada con un tumor, en la que la enfermedad relacionada con un tumor se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de 30 esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la vesícula biliar y sus metástasis.
  36. 36. El anticuerpo para uso, conjugado para uso o composición farmacéutica para uso de la reivindicación 34 o 35, en el que el método comprende además el tratamiento con un agente quimioterapéutico, radiación, o una citoquina.
  37. 37. El anticuerpo para uso, conjugado para uso o composición farmacéutica de la reivindicación 36, en el que el 35 agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, cisplatino, taxotere, 5-fluoruracilo, metotrexato, gemcitabina y ciclofosfamida.
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