PT2311877E - Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro - Google Patents

Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro Download PDF

Info

Publication number
PT2311877E
PT2311877E PT100117738T PT06011773T PT2311877E PT 2311877 E PT2311877 E PT 2311877E PT 100117738 T PT100117738 T PT 100117738T PT 06011773 T PT06011773 T PT 06011773T PT 2311877 E PT2311877 E PT 2311877E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
seq
positions
antibody
cdr3
cdr2
Prior art date
Application number
PT100117738T
Other languages
English (en)
Inventor
Özlem Türeci
Ugur Sahin
Dirk Usener
Philippe Thiel
Stefan Fritz
Gunda Brandenburg
Harald-Gerhard Geppert
Anja Kristina Schröder
Christoph Uherek
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universität Mainz Vertreten Durch Den Präsidenten
Ganymed Pharmaceuticals Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johannes Gutenberg Universität Mainz Vertreten Durch Den Präsidenten, Ganymed Pharmaceuticals Ag filed Critical Johannes Gutenberg Universität Mainz Vertreten Durch Den Präsidenten
Publication of PT2311877E publication Critical patent/PT2311877E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A61K47/6823—Double chain ricin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1063—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from stomach or intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro"
As terapias baseadas em anticorpos para cancro têm o potencial de maior especificidade e perfil de menores efeitos secundários em comparação com os fármacos convencionais. A razão é a distinção precisa entre células normais e neoplásicas pelos anticorpos e o facto de o seu modo de ação se basear em mecanismos imunológicos antitumorais menos tóxicos, tais como ativação do complemento e recrutamento de células imunitárias citotóxicas.
Os alvos para terapias baseadas em anticorpos necessitam de ter qualidades particulares, que formam a base da discriminação correta entre células normais e neoplásicas. Obviamente, um alvo com restrição exclusiva a células tumorais e inteiramente indetetável em tecidos normais é ideal para o desenvolvimento de produtos terapêuticos de anticorpos eficientes e seguros. Num outro aspeto, uma sobre-expressão de alto nivel podem ser a base para a janela terapêutica e os baixos efeitos secundários exemplificados pelo recetor do fator de crescimento epidérmico humano de tipo 2 (HER-2), que, em resultado da amplificação do gene, é um bom alvo para o anticorpo trastuzumab (Herceptin).
Outros alvos para anticorpos que ou já estão aprovados ou estão em desenvolvimento clinico para terapia de tumores têm qualidades distintas, que não são baseadas numa sobre-expressão numérica de moléculas alvo em células tumorais. No caso dos anticorpos para o proteoglicano MUC-1, um epitopo peptidico de repetição no esqueleto do alvo é subglicosilado em células tumorais e assim alterado para o seu equivalente normal. No caso de anticorpos para CD20 (rituximab) , CD52 (Campath-1H) e CD22 (epratuzumab), os alvos de anticorpos têm níveis comparáveis de expressão em células tumorais e linfócitos normais. Neste caso, a ablação de células normais pelo anticorpo é tolerável uma vez que células estaminais negativas para o alvo restauram o repertório de linfócitos normal. Outros exemplos de acessibilidade diferencial dos alvos de anticorpos são o antigénio carcinoembrionário (CEA) e carboanidrase IX (CA9). Ambos os antigénios são expressos em epitélio normal do cólon e rim, respetivamente. No entanto, anticorpos de imagiologia marcados radioactivamente distinguem bem entre tecido tumoral e normal e anticorpos citotóxicos são bem tolerados. Isto é muito provavelmente devido a uma expressão restrita de CA9 e CEA no lado luminal do tecido epitelial normal, onde os anticorpos IgG não têm acesso. Também o antigénio molécula de adesão de células epiteliais (Ep-CAM) pertence a esta categoria. Como uma molécula de adesão celular homotípica para células epiteliais, localiza-se no espaço intercelular. Curiosamente, embora os anticorpos anti-Ep-CAM de alta afinidade sejam muito tóxicos, anticorpos de afinidade intermédia são bem tolerados. Isto sugere acessibilidade do alvo Ep-CAM em células normais, mas também indica que a cinética da ligação do anticorpo pode abrir uma janela terapêutica.
Uma possibilidade é de que outras proteínas específicas de células epiteliais envolvidas na adesão célula/célula possam também ser atrativas para abordagens de anticorpos, uma vez que podem ser de difícil acesso aos anticorpos em epitélios bem estruturados mas tornarem-se expostas em células tumorais. Analisámos por isso proteínas envolvidas na organização da arquitetura do tecido epitelial quanto à sua adequabilidade como alvos para anticorpos terapêuticos. Uma proteína que chamou particularmente a nossa atenção é a claudina 18. A molécula de claudina 18 (CLD18) (número de acesso Genbank: variante de processamento 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369, e variante de processamento 2 (CLD18A2) : NM_001002026, NP_001002026) é uma proteína transmembranar integral com um peso molecular de aproximadamente 27,9/27,72 kDa. As claudinas são proteínas membranares integrais localizadas dentro das junções de oclusão dos epitélios e endotélios. As junções de oclusão organizam uma rede de cadeias interligadas de partículas intramembranosas entre células adjacentes. Em junções de oclusão, a ocludina e as claudinas são os componentes proteicos transmembranares mais proeminentes. Devido às suas fortes propriedades de adesão intercelular, criam uma barreira primária para prevenir e controlar o transporte paracelular de solutos e restringem a difusão lateral de lípidos e proteínas membranares para manter a polaridade celular. As proteínas formadoras de junções de oclusão estão criticamente envolvidas na organização da arquitetura do tecido epitelial. Assumiu-se que tais proteínas podem ser pouco acessíveis aos anticorpos em epitélios bem estruturados, mas que se tornam expostas nas células tumorais. WO 2004/047863 descreve vários tumores que expressam as variantes de processamento de CLD18 de uma maneira específica do tumor. Adicionalmente, WO 2004/047863 descreve anticorpos que podem ser utilizados para o diagnóstico desses tumores. CLD18 é uma tetraspanina e tem, como tal, 4 regiões hidrófobas. Geraram-se dados indicando que CLD18 apresenta várias conformações diferentes, que podem ser seletivamente alcançadas por anticorpos. Uma conformação (CLD18-Conformação-1) implica que todas as quatro regiões hidrófobas servem como domínios transmembranares (TM) regulares e formam-se duas voltas extracelulares (voltai englobada pela região hidrófoba e uma região hidrófoba 2; volta2 englobada pelas regiões hidrófobas 3 e 4), tal como descrito para a grande maioria dos membros da família das claudinas. Uma segunda conformação (CLD18-Conformação-2) implica que, tal como descrito para PMP22, outro membro da família das tetraspaninas (Taylor et al. , J. Neurose. Res. 62: 15-27, 2000), o segundo e terceiro domínios hidrófobos não atravessem completamente a membrana plasmática de modo a que essa porção (voltaD3) entre o primeiro e o quarto domínio transmembranar seja extracelular. Uma terceira conformação (CLD18-Conformação-3) implica um grande domínio extracelular com duas regiões hidrófobas internas englobadas pela primeira e quarta região hidrófoba, que servem como domínios transmembranares regulares. Devido à presença do local de N-glicosilação clássico na voltaD3, as variantes de topologia da Claudina-18, CLD18 topologia-2 e CLD18 topologia-3, ancoram um local de N-glicosilação extracelular adicional.
Outro nível de complexidade é adicionado à molécula de CLD18 através da presença de duas variantes de processamento diferentes, que são descritas no ratinho e no ser humano (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001) . As variantes de processamento CLD18A1 e CLD18A2 diferem nos primeiros 21 aminoácidos N-terminais, que constituem o primeiro TM e a voltai, enquanto a sequência proteica primária do terminal C é idêntica. CLD18A1 é seletivamente expressa no pulmão e epitélio do estômago normais, enquanto CLD18A2 é expressa apenas em células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001) . Mais importante ainda, CLD18A2 é restrita às células diferenciadas de vida curta do epitélio do estômago mas está ausente na região das células estaminais gástricas. Utilizando RT-PCR sensível, demonstrámos que ambas as variantes não são de todo detetáveis em qualquer outro órgão humano normal, mas são expressas de forma robusta em vários tipos de cancro incluindo tumores do estômago, esofágico, pancreático e do pulmão, bem como em linhas celulares de cancro humanas. A expressão é mais proeminente nos subtipos de adenocarcinoma destas indicações. O peso molecular da proteína difere em alguns cancros e tecido adjacente normal. A proteína de peso molecular mais elevado observado em tecido saudável pode ser transferida para o mesmo peso molecular que o observado em cancro através de tratamento de Usados de tecido com o composto desglicosilante PNGase F. Isto sugere que CLD18 é menos N-glicosilada em cancro, em comparação com a sua equivalente em tecido normal. Esta diferença estrutural é suscetível de dar origem a um epitopo alterado. Um motivo de N-glicosilação clássico está na posição do aa 116 dentro do domínio voltaD3 da molécula. O termo "CLD18" e a expressão "variante de CLD18" de acordo com o invento devem englobar (i) variantes de processamento de CLD18, (ii) variantes de N-glicosilação de CLD18, (iii) variantes de conformação de CLD18, (iv) variantes de CLD18 livres e associadas homotipicamente/heterotipicamente localizadas em junções de oclusão intercelulares e (v) variantes de CLD18 relacionadas com cancro e de CLD18 não relacionadas com células de cancro.
As características moleculares e funcionais de CLD18 tornam esta molécula um alvo altamente interessante para terapia de cancro baseada em anticorpos. Estas são, em particular, (i) a ausência de CLD18 da grande maioria dos tecidos normais com toxicidade relevante, (ii) a restrição da expressão da variante CLD18A2 a uma população celular dispensável como as células gástricas diferenciadas, que podem ser repostas por células estaminais negativas para o alvo do estômago, (iii) sugestão de potencial glicosilação diferencial entre células normais e neoplásicas, e (iv) a presença de diferentes topologias de conformação. Além disso, o papel de CLD18 como proteína de junção de oclusão pode ainda contribuir para uma boa janela terapêutica. Como as células tumorais expressam claudinas mas muitas vezes não formam junções de oclusão clássicas através de associação homotípica e heterotípica de claudinas tal como verificado no tecido epitelial normal, as células tumorais podem ter um banco considerável de claudinas livres que são passíveis de se ligarem a anticorpos extracelulares e de imunoterapia. É possível que os epitopos de ligação das claudinas no epitélio saudável sejam protegidos dentro de junções de oclusão do acesso de tais anticorpos. 0 objeto do invento consiste em proporcionar anticorpos úteis para terapia de doenças em que é expressa CLD18, tais como doenças tumorais. Os anticorpos aqui descritos têm também utilidade no diagnóstico de tais doenças.
SUMÁRIO DO INVENTO A presente invenção genericamente proporciona anticorpos úteis como produtos terapêuticos para tratamento e/ou prevenção de doenças associadas a células que expressam CLD18, incluindo doenças relacionadas com tumores tais como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro de cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar.
Num aspeto o invento refere-se a um anticorpo monoclonal possuindo a capacidade de se ligar CLD18A2 e de mediar a morte de células que expressam CLD18A2, em que o anticorpo se liga a um epitopo localizado na voltai de CLD18A2 (CLD18A2-voltal) ou na voltaD3 de CLD18A2 (CLD18A2-voltaD3) e em que a morte é induzida pela ligação do anticorpo a CLD18A2 expressa pelas referidas células, em que o anticorpo medeia a morte de células através de indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
Num aspeto o invento refere-se a um anticorpo possuindo a capacidade de se ligar a CLD18 e mediar a morte de células que expressam CLD18. De preferência, o anticorpo liga-se a CLD18A1 e CLD18A2 e com maior preferência liga-se a CLD18A2 mas não a CLD18A1. De preferência, os anticorpos do invento ligam-se a, e são específicos para, a voltal. Em outras concretizações preferidas, o anticorpo do invento liga-se a, e é específico para, a voltaD3 de CLD-conformação-2. 0 anticorpo pode ligar-se, por exemplo, em um, ou próximo de um local de N-glicosilação potencial na posição 116 dentro da voltaD3. 0 anticorpo pode ser específico para a forma não glicosilada do local de N-glicosilação potencial na posição 116 dentro da voltaD3. A morte de células pelo anticorpo do invento é de preferência induzida por ligação do anticorpo a CLD18 expressa pelas referidas células, com mais preferência, por ligação do anticorpo a CLD18A2 expressa pelas referidas células. Numa concretização, a ligação do anticorpo do invento a CLD18A1 expressa pelas referidas células não induz morte das referidas células.
As células que expressam CLD18 são de preferência células de cancro e são, em particular, selecionadas a partir do grupo que consiste em células de cancro tumorigénicas gástricas, esofágicas, pancreáticas, do pulmão, ovário, cólon, hepáticas, da cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
De preferência o anticorpo do invento medeia a morte de células através de indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
Numa concretização o anticorpo do invento não inclui a lise de células mediada por CDC.
De preferência, a lise de células mediada por ADCC ocorre na presença de células efetoras, que em concretizações particulares são selecionadas a partir do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMN, e a fagocitose é efetuada por macrófagos. 0 anticorpo do invento pode ser um anticorpo monoclonal, quimérico, humano, ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo e pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgGl, um IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgA segregado, um IgD, e um IgE.
De acordo com todos os aspetos do invento, CLD18 é de preferência CLD18 humana, de preferência CLD18A2 humana, e CLD18A2 tem de preferência a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 e CLD18A1 tem de preferência a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 8.
Em concretizações preferidas particulares, o anticorpo do invento liga-se a epitopos nativos de CLD18 presentes na superfície de células vivas. Noutras concretizações preferidas, o anticorpo do invento é específico para células de cancro, de preferência células de cancro do estômago.
Em certas concretizações do invento CLD18 é expressa na superfície das células.
Os anticorpos do invento podem ser obtidos através de um método compreendendo o passo de imunização de um animal com uma proteína ou um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23 e 26-31, ou um seu fragmento imunogénico, ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira que expressam a referida proteína ou péptido, ou seu fragmento imunogénico. De preferência, um anticorpo do invento é específico para as proteínas, os péptidos ou seus fragmentos imunogénicos acima mencionados. O anticorpo do invento é por exemplo produzido por um clone possuindo o n.2. de acesso DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056) , DSM ACC2739 (182-D1106-057) , DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-01106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-0 62) , DSM ACC2743 (182-D1106-067) , DSM ACC2745 (182-D7 5 8-035) , DSM ACC2746 (182-D758-036) , DSM ACC2747 (182-D7 5 8-04 0) , DSM ACC2748 (182-D1106-061) , DSM ACC2808 (182-D1106-279) , DSM ACC2809 (182-D110 6-294) , ou DSM ACC2810 (182-D110 6-3 62) .
Num aspeto, o anticorpo do invento compreende uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a CDR3, da região variável da cadeia pesada (VH) e/ou da região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo que compreende uma combinação de VH e VL, cada uma compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (ix): (i) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69- 76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDRl: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2 : posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Num outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma VH compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (vi): (i) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, (ii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, (iii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, (iv) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições
70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, (v) CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições
69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, e (vi) CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120.
Num outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma VL compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (ix): (i) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (ii) CDR1: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (iii) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (v) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (vii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Num outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma combinação de VH e VL, cada uma compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) (ix): (i) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1 : posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2 : posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1 : posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2 : posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições
69- 76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições
70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2 : posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Em outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137, e um seu fragmento.
Em outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141,142, 143, 144, 145, 146, e um seu fragmento.
Em outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma combinação de região variável da cadeia pesada (VH) e região variável da cadeia leve (VL) selecionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 ou um seu fragmento, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 ou um seu fragmento, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 ou um seu fragmento, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 ou um seu fragmento, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 ou um seu fragmento, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 ou um seu fragmento, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 ou um seu fragmento, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 ou um seu fragmento, (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 ou um seu fragmento.
Em outro aspeto, o anticorpo do invento compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, e um seu fragmento, e/ou (ii) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, e um seu fragmento.
Em outro aspeto, o anticorpo do invento compreende uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix) : (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 ou um seu fragmento, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 ou um seu fragmento, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 ou um seu fragmento, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 ou um seu fragmento, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 ou um seu fragmento, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 ou um seu fragmento, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 ou um seu fragmento, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 ou um seu fragmento, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 ou um seu fragmento.
Numa concretização o anticorpo do invento é ligado a um agente terapêutico tal como uma toxina, um isótopo radioativo, um fármaco ou agente citotóxico.
Noutro aspeto o invento refere-se a um hibridoma capaz de produzir o anticorpo do invento. Os anticorpos do invento são aqui designados com referência à designação do anticorpo, por exemplo 182-D758-035, e/ou com referência ao clone que produz o anticorpo, por exemplo 26D12. O invento também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo do invento e/ou um seu conjugado com um agente terapêutico, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspeto o invento refere-se a um método de inibição do crescimento e/ou de morte de uma célula que expressa CLD18, de preferência CLD18A2, compreendendo o contacto da célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo do invento e/ou um seu conjugado com um agente terapêutico. CLD18 é de preferência expressa na superfície da referida célula.
Num outro aspeto o invento refere-se a um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou um distúrbio envolvendo células que expressam CLD18A2, compreendendo a administração a um sujeito de um anticorpo do invento, um seu conjugado com um agente terapêutico ou de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo do invento ou o seu conjugado com um agente terapêutico. De preferência a doença ou distúrbio é uma doença relacionada com tumor e em concretizações particulares é selecionada a partir do grupo que consiste em cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar. CLD18A2 é de preferência expressa na superfície das referidas células. Os anticorpos podem ter a capacidade para discriminar variantes de CLD18 expressas por diferentes tipos celulares incluindo células de cancro e células não malignas. Numa concretização particularmente preferida, os anticorpos do invento têm a capacidade de se ligar a CLD18A2 enquanto não se ligam a CLD18A1. Os anticorpos podem ligar-se a CLD18A1 com uma especificidade menor em comparação com a especificidade de ligação para CLD18A2. 0 termo "ligação" de acordo com o invento refere-se de preferência a uma ligação específica. "Ligação específica" significa que um agente tal como um anticorpo se liga com mais força a um alvo tal como um epitopo para o qual é específico em comparação com a ligação a outro alvo. Um agente liga-se com mais força a um primeiro alvo em comparação com um segundo alvo se se ligar ao primeiro alvo com uma constante de dissociação (Kd) que é inferior à constante de dissociação para o segundo alvo. De preferência a constante de dissociação (Kd) para o alvo ao qual o agente se liga especificamente é mais de 10 vezes, de preferência mais de 20 vezes, com maior preferência mais de 50 vezes, ainda mais de preferência mais de 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes inferior à constante de dissociação (Kd) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente.
Os anticorpos do invento medeiam a morte de células que expressam CLD18, de preferência CLD18A2, através da ligação a CLD18, de preferência expressa na superfície das referidas células. Numa concretização, os anticorpos do invento induzem citotoxicidade dependente do complemento (CDC), p. ex. pelo menos cerca de 20-40% de lise mediada por CDC, de preferência cerca de 40-50% de lise mediada por CDC, e com maior preferência mais de 50% de lise mediada por CDC de células que expressam CLD18. Tais anticorpos são aqui exemplificados pelos seguintes anticorpos: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12, e ch-175D10. Alternativamente ou adicionalmente à indução de CDC, os anticorpos do invento podem induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células que expressam CLD18 na presença de células efetoras (p. ex., monócitos, células mononucleares, células NK e PMN) . Tais anticorpos são aqui exemplificados pelos seguintes anticorpos: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1, e 125E1. Os anticorpos do invento podem ter a capacidade de induzir apoptose de células que expressam CLD18, induzir adesão homotípica de células que expressam CLD18 e/ou induzir fagocitose de células que expressam CLD18 na presença de macrófagos. Os anticorpos do invento podem ter uma ou mais das propriedades funcionais acima descritas. De preferência, os anticorpos do invento induzem lise mediada por CDC e lise mediada por ADCC de células que expressam CLD18 e com maior preferência induzem lise mediada por ADCC de células que expressam CLD18 ao mesmo tempo que não induzem lise mediada por CDC das referidas células. Células alvo exemplares para os anticorpos do presente invento incluem, mas não se limitam a, células de cancro que expressam CLD18, de preferência CLD18A2, tais como células de cancro tumorigénicas gástricas, pancreáticas, esofágicas e do pulmão. Numa concretização particularmente preferida, a morte de células mediada por anticorpos do invento é específica de CLD18A2, i.e. os anticorpos do invento medeiam a morte das células, de preferência a lise de células mediada por CDC e/ou ADCC, que expressam CLD18A2 mas não medeiam a morte de células que expressam CLD18A1 mas não expressam CLD18A2. Os anticorpos descritos acima podem ser utilizados para mediar morte de células tumorais no tratamento ou na prevenção de cancro tal como cancro gástrico, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço e cancro da vesícula biliar.
Os anticorpos do invento podem ser classificados em classes distintas de acordo com as suas propriedades de ligação e a sua capacidade para mediar a função efetora em células que expressam CLD18. Os anticorpos do invento podem ser classificados de acordo com as suas: - propriedades de ligação a, e/ou funções efetoras mediadas em, células que expressam CLD18A1 ou CLD18A2 (discriminação das variantes de processamento de CLD18), - propriedades de ligação a, e/ou funções efetoras mediadas em, células que expressam variantes de CLD18 glicosiladas ou não glicosiladas (discriminação entre variantes de CLD18 com e sem N-glicosilação), - propriedades de ligação a, e/ou funções efetoras mediadas em, células de cancro ou tipos celulares normais (discriminação entre variantes de CLD18 expressas por células tumorais ou células normais não malignas), - propriedades de ligação a epitopos de CLD18 mascarados pela formação de junções de oclusão, - capacidades para induzir a formação de agregados de CLD18 em células vivas, e - capacidades para se ligarem a uma variante de CLD18 não humana, particularmente variantes de CLD18 de ratinhos, ratos, coelhos e primatas.
Os anticorpos do invento podem ter uma ou mais das seguintes propriedades pelo que é dada referência aos exemplos específicos de anticorpos do invento aqui descritos (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch- 163E12, ch-16 6E2, ch-175D10) : a) ligação a CLD18A2 bem como a CLD18A1 (p. ex. 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2, e 41C6) b) ligação a CLD18A2 mas não a CLD18A1 (p. ex. 26B5, 37G11, 38G5, 42E12, e 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43All, ch-45Cl, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2, ch- 175D10) c) ligação a CLD18 expressa naturalmente por células tumorais mas não a CLD18 expressa naturalmente por células ou tecidos sem ser de cancro tais como células de estômago e pulmão (p. ex. 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10) d) mediação de morte induzida por CDC de células que expressam CLD18A2 mas não de células que expressam CLD18A1 (p. ex. 26D12, 28D10, 37H8, e 39F11, 163E12, ch-125El, ch-163E12, ch-17 5D10) e) mediação de morte induzida por ADCC de células que expressam CLD18 (p. ex. 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12, e 61C2, ch-163E12, ch-175D10) f) mediação de morte induzida por ADCC mas não de morte mediada por CDC de células que expressam CLD18 (p. ex. 37G11, 42E12, e 43A11) g) mediação de morte induzida por ADCC e morte induzida por CDC de células que expressam CLD18A2 (p. ex. 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
Tal como aqui exemplificado, os anticorpos do invento englobam ainda moléculas, que: a) se ligam a células diferenciadas de estômago normal, mas não a células estaminais do estômago (p. ex. 39F11) b) não se ligam a tecido gástrico normal bem como outros órgãos normais mas exclusivamente a células de cancro (p. ex. 26B5) c) se ligam a um epitopo englobando um Asn não glicosilado na posição 116 de CLD18 d) se ligam a CLD18 humana bem como de ratinho permitindo realizar exaustivamente estudos de toxicidade pré-clínicos em ratinhos.
Os anticorpos do invento podem ser derivados de diferentes espécies, incluindo mas não limitadas a ratinho, rato, coelho, cobaia e humano. Os anticorpos do invento incluem também moléculas quiméricas nas quais uma região constante do anticorpo derivada de uma espécie, de preferência humano, é combinada com o local de ligação ao antigénio derivado de outra espécie. Além disso, os anticorpos do invento incluem moléculas humanizadas nas quais os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo derivados de uma espécie não humana são combinados com regiões constantes e estruturais de origem humana.
Os anticorpos do invento incluem anticorpos policlonais e monoclonais e incluem anticorpos IgG2a (p. ex. IgG2a, , ),
IgG2b (p. ex. IgG2b, , ), IgG3 (p. ex. IgG3, , ) e IgM. No entanto, outros isotipos de anticorpo são também englobados pelo invento, incluindo anticorpos IgGl, IgAl, IgA2, IgA segregado, IgD, e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros ou seus fragmentos de ligação ao antigénio incluindo, por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadeia simples ou anticorpos biespecificos. Além disso, os fragmentos de ligação ao antigénio incluem proteínas de fusão dominio de ligação-imunoglobulina compreendendo (i) um polipéptido de dominio de ligação (tal como uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve) que é fundido com um polipéptido de região charneira de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região charneira, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. Tais proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina são ainda divulgadas em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
De preferência os anticorpos do presente invento dissociam-se de CLD18 com uma constante de dissociação em equilíbrio (KD) de aproximadamente 1-100 nM ou menos. De preferência, os anticorpos do invento não reagem de forma cruzada com antigénios da superfície celular relacionados e não inibem assim a sua função.
Em concretizações preferidas, os anticorpos do presente invento podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades: a) especificidade para CLD18, em particular especificidade para CLD18A2; b) uma afinidade de ligação a CLD18, em particular CLD18A2, de cerca de 100 nM ou menos, de preferência cerca de 5-10 nM ou menos e, com maior preferência, cerca de 1-3 nM ou menos, c) a capacidade para mediar um nivel elevado de CDC em células negativas para CD55/59 ou positivas para CD55/59; d) a capacidade para inibir o crescimento de células que expressem CLD18; e) a capacidade para induzir apoptose de células que expressem CLD18; f) a capacidade para induzir adesão homotípica de células que expressem CLD18; g) a capacidade para induzir ADCC de células que expressem CLD18 na presença de células efetoras; h) a capacidade para prolongar a sobrevivência de um sujeito possuindo células tumorais que expressem CLD18; i) a capacidade para eliminar células que expressem CLD18; j) a capacidade para eliminar células que expressem niveis baixos de CLD18 e/ou k) a capacidade para agregar CLD18 na superfície de células vivas.
Os anticorpos anti-CLD18 do presente invento podem ser derivatizados, ligados a, ou co-expressos com outras especificidades de ligação. Numa concretização particular, o invento divulga uma molécula biespecífica ou multiespecífica compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLD18 (p. ex., um anticorpo anti-CLD18 ou seu mimético), e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efetora, tal como uma especificidade de ligação para um recetor de Fc (p. ex., um recetor de Fc-gama, tal como Fc-gama RI, ou qualquer outro recetor de Fc) ou um recetor de células T, p. ex ., CD3.
Consequentemente, o presente invento divulga moléculas biespecificas e multiespecificas que se ligam tanto a CLD18 como a um recetor de Fc ou um recetor de células T, p. ex.
CD3. Exemplos de recetores de Fc são recetores de IgG, recetores de Fc-gama (Fc R) , tais como Fc RI (CD64), Fc RII (CD32), e Fc RIII (CD16). Outros recetores de Fc, tais como recetores de IgA (p. ex., Fc RI), podem também ser alvos. 0 recetor de Fc está de preferência localizado na superfície de uma célula efetora, p. ex., um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear ativada. Numa concretização preferida, as moléculas biespecificas e multiespecificas ligam-se a um recetor de Fc num local que é diferente do local de ligação a Fc de imunoglobulina (p. ex., IgG ou IgA) do recetor. Portanto, a ligação das moléculas biespecificas e multiespecifica não é bloqueada através de níveis fisiológicos de imunoglobulinas.
Os anticorpos anti-CLD18 do invento podem ser derivatizados, ligados a, ou co-expressos com outra molécula funcional, p. ex., outro péptido ou proteína (p. ex., um fragmento Fab') . Por exemplo, um anticorpo do invento podem ser funcionalmente ligado (p. ex., através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (p. ex. para produzir um anticorpo biespecifico ou multiespecifico), uma citotoxina, um ligando celular ou antigénio (p. ex., para produzir um imunoconjugado, tal como uma imunotoxina) . Um anticorpo do presente invento pode ser ligado a outras porções terapêuticas, p. ex., um radioisótopo, um fármaco anticanceroso de molécula pequena, uma citocina recombinante ou quimiocina. Consequentemente, o presente invento divulga uma grande variedade de moléculas de conjugado de anticorpo, biespecificas e multiespecificas, e proteínas de fusão, as quais se ligam todas a células que expressam CLD18 e que podem ser utilizadas para direccionar outras moléculas para tais células.
Ainda noutro aspeto, o invento proporciona composições, p. ex., farmacêuticas e divulga composições/estojos de diagnóstico, compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável formulado juntamente com um ou uma combinação de anticorpos do invento. Numa concretização particular, a composição inclui uma combinação de anticorpos que se ligam a epitopos distintos ou que possuem caracteristicas funcionais distintas, tais como indução de CDC e/ou ADCC e indução de apoptose. Nesta concretização do invento, os anticorpos podem ser utilizados em combinação, p. ex., como uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais anti-CLD18. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 possuindo atividades diferentes mas complementares podem ser combinados numa única terapia para alcançar um efeito terapêutico desejado. A composição pode incluir um anticorpo anti-CLD18 que medeia CDC combinado com outro anticorpo anti-CLD18 que induz apoptose. Alternativamente, a composição pode incluir um anticorpo anti-CLD18 que medeia uma morte altamente eficaz das células alvo na presença de células efetoras, combinado com um outro anticorpo anti-CLD18 que inibe o crescimento de células que expressem CLD18. A presente divulgação inclui também a administração simultânea ou sequencial de dois ou mais anticorpos anti-CLD18 do invento, em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo anti-CLD18 quimérico e pelo menos um outro anticorpo é um anticorpo anti-CLD18 humano, os anticorpos ligando-se ao mesmo epitopo ou a epitopos diferentes de CLD18. De preferência, um anticorpo de CLD18 quimérico do invento é administrado primeiro seguido de administração de um anticorpo anti-CLD18 humano do invento, em que o anticorpo anti-CLD18 humano é de preferência administrado durante um período alargado de tempo, i.e. como terapia de manutenção.
Os anticorpos, os imunoconjugados, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas e as composições do presente invento podem ser utilizados numa variedade de métodos para inibir o crescimento de células que expressam CLD18, em particular CLD18A2 e/ou matar seletivamente células que expressam CLD18, em particular CLD18A2 através do contacto das células com uma quantidade eficaz do anticorpo, do imunoconjugado, da molécula biespecífica/multiespecífica ou da composição, de modo a que o crescimento da célula seja inibido e/ou a célula seja morta. Numa concretização, o método inclui a morte da célula que expressa CLD18, opcionalmente na presença de células efetoras, por exemplo, por CDC, apoptose, ADCC, fagocitose, ou por uma combinação de dois ou mais destes mecanismos. Células que expressam CLD18 que podem ser inibidas ou mortas utilizando os anticorpos do invento incluem células de cancro tais como células tumorigénicas do estômago, pancreáticas, esofágicas, de pulmão, ovário, cólon, hepáticas, da cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
Consequentemente, os anticorpos do presente invento podem ser utilizados para tratar e/ou prevenir uma variedade de doenças envolvendo células que expressam CLD18 através da administração dos anticorpos a pacientes sofrendo de tais doenças. Exemplos de doenças que podem ser tratadas (p. ex., melhoradas) ou prevenidas, incluem, mas não se limitam a, doenças tumorigénicas. Exemplos de doenças tumorigénicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem cancro gástrico, cancro pancreático, cancro esofágico, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro colorrectal, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço, e cancro da vesícula biliar. 0 sujeito ao qual é administrado o anticorpo do invento pode adicionalmente ser tratado com um agente quimioterapêutico, radiação ou um agente que module, p. ex., aumente ou iniba a expressão ou atividade de um recetor de Fc, p. ex., um recetor de Fc-gama, tal como uma citocina. Citocinas típicas para administração durante o tratamento incluem fator estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão- (IFN- ), e fator de necrose tumoral (TNF). Agentes terapêuticos típicos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos tais como doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluorouracilo, metotrexato, gemzitabina e ciclofosfamida. É aqui também divulgada uma estratégia de imunização para imunizar animais não humanos, tais como ratinhos, com CLD18 humana ou um seu fragmento peptídico, de preferência CLD18A2 ou um seu fragmento peptídico, para obter anticorpos. Os péptidos preferidos para imunização são os selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31. Consequentemente, em concretizações preferidas, os anticorpos do invento são aqueles obtidos através de imunização utilizando péptidos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31. De modo análogo, anticorpos para CLD18 podem ser gerados num animal transgénico não humano, tal como um ratinho transgénico. 0 animal transgénico não humano pode ser um ratinho transgénico possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve codificando todo ou uma porção de um anticorpo.
Animais de tipo selvagem bem como transgénicos não humanos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio de CLD18 e/ou ácidos nucleicos e/ou células que expressam CLD18 ou um seu fragmento peptidico. De preferência, o animal não humano é capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 (p. ex., IgG, IgA e/ou IgM) através da sujeição a recombinação de V-D-J e a mudança de isotipo. A mudança de isotipo pode ocorrer através p. ex., de mudança do isotipo clássica ou não clássica. Células B isoladas de um animal não humano tal como descrito acima podem ser imortalizadas através de fusão com uma célula imortalizada para proporcionar uma fonte (p. ex., um hibridoma) de anticorpos do invento. Tais hibridomas (isto é, que produzem os anticorpos do invento) estão também incluídos dentro do âmbito do invento.
Tal como aqui exemplificado, os anticorpos do invento podem ser obtidos diretamente a partir de hibridomas que expressem o anticorpo, ou podem ser clonados e expressos de forma recombinante numa célula hospedeira (p. ex., uma célula CHO, ou uma célula linfocítica). Outros exemplos de células hospedeiras são microorganismos, tais como E. coli, e fungos, tais como levedura. Alternativamente, podem ser produzidos de forma recombinante num animal transgénico não humano ou planta. Células de hibridoma para a produção de anticorpos do invento são por exemplo aquelas sequenciadas ou depositadas em DSMZ (Mascheroder Weg lb, 31824 Braunschweig, Alemanha; novo endereço: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemanha) com as seguintes designações e números de acesso: a. 182-D1106-055, n.2 de acesso DSM ACC2737, depositada a 19 de Outubro de 2005 b. 182-D1106-056, n.2 de acesso DSM ACC2738, depositada a 19 de Outubro de 2005 c. 182-D1106-057, n.2 de acesso DSM ACC2739, depositada a 19 de Outubro de 2005 d. 182-D1106-058, n.2 de acesso DSM ACC2740, depositada a 19 de Outubro de 2005 e. 182-D1106-059, n.2 de acesso DSM ACC2741, depositada a 19 de Outubro de 2005 f. 182-D1106-062, n.2 de acesso DSM ACC2742, depositada a 19 de Outubro de 2005, g. 182-D1106-067, n.2 de acesso DSM ACC2743, depositada a 19 de Outubro de 2005 h. 182-D758-035, n.2 de acesso DSM ACC2745, depositada a 17 de Novembro de 2005 i. 182-D758-036, n.2 de acesso DSM ACC2746, depositada a 17 de Novembro de 2005 j. 182-D758-040, n.2 de acesso DSM ACC2747, depositada a 17 de Novembro de 2005 k. 182-D1106-061, n.2 de acesso DSM ACC2748, depositada a 17 de Novembro de 2005 l. 182-D1106-279, n.2 de acesso DSM ACC2808, depositada a 26 de Outubro de 2006 m. 182-D1106-294, n.2 de acesso DSM ACC2809, depositada a 26 de Outubro de 2006, n. 182-D1106-362, n.2 de acesso DSM ACC2810, depositada a 26 de Outubro de 2006.
Anticorpos do invento preferidos são aqueles produzidos através, e obteníveis a partir dos hibridomas acima descritos; i.e. 37G11 no caso de 182-D1106-055, 37H8 no caso de 182-D1106-056, 38G5 no caso de 182-D1106-0 57, 38H3 no caso de 182-D1106-058, 39F11 no caso de 182-D1106-059, 43A11 no caso de 182- D1106-062, 61C2 no caso de 182-D1106-067, 26B5 no caso de 182-D758-035, 26D12 no caso de 182-D758-036, 28D10 no caso de 182-D758-040, 42E12 no caso de 182-D1106-061, 125E1 no caso de 182-D1106-279, 163E12 no caso de 182-D1106-294, e 175D10 no caso de 182-D1106-362; e as suas formas tornadas quiméricas e humanizadas.
Em concretizações preferidas, os anticorpos, em particular as formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia pesada humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 ou um seu fragmento. Noutras concretizações preferidas, os anticorpos, em particular formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia leve (CL) compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia leve humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 ou um seu fragmento. Numa concretização particularmente preferida, os anticorpos, em particular as formas tornadas quiméricas de anticorpos de acordo com o invento, incluem anticorpos que compreendem uma CH compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma CH humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 ou 150 ou um seu fragmento e que compreende uma CL compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada de uma CL humana tal como a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 ou 148 ou um seu fragmento.
Uma CH compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 45. Uma CH compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 150 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 149. Uma CL compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 40. Uma CL compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 148 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 147.
Em certas concretizações preferidas, formas tornadas quiméricas de anticorpos incluem anticorpos compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, e um seu fragmento e/ou compreendendo uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, e um seu fragmento.
Em certas concretizações preferidas, formas tornadas quiméricas dos anticorpos incluem anticorpos compreendendo uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix) : (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 ou um seu fragmento, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 ou um seu fragmento, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 ou um seu fragmento, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 ou um seu fragmento, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 ou um seu fragmento, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 ou um seu fragmento, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 ou um seu fragmento, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 ou um seu fragmento, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 ou um seu fragmento. "Fragmento" ou "fragmento de uma sequência de aminoácidos" tal como utilizado acima refere-se a uma parte de uma sequência de anticorpo, i.e. uma sequência que representa a sequência de anticorpo encurtada no terminal N e/ou C, que quando substitui a referida sequência de anticorpo num anticorpo mantém a ligação do referido anticorpo a CLD18 e de preferência as funções do referido anticorpo tal como aqui descrito, p. ex. lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC. De preferência, um fragmento de uma sequência de aminoácidos compreende pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% dos resíduos de aminoácidos da referida sequência de aminoácidos. Um fragmento de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, e 129 refere-se de preferência à referida sequência em que 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos no terminal N são removidos. Fragmentos das sequências de aminoácidos aqui descritas podem ser codificados pelos respetivos fragmentos das sequências de ácido nucleico codificando as referidas sequências de aminoácidos.
Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 100. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 101. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 102. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 104. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 103. Uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 105.
Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 107. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 106. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 108. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 111. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 110. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 109. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 112. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 113. Uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 114.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137, e um seu fragmento.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, e um seu fragmento.
Em certas concretizações preferidas, um anticorpo do invento compreende uma combinação da região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionadas a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 ou um seu fragmento, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 ou seu um fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 ou um seu fragmento, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 ou um seu fragmento, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 ou um seu fragmento, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 ou um seu fragmento, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 ou um seu fragmento, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 ou um seu fragmento, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 ou um seu fragmento, (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 ou um seu fragmento.
Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 55. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 56. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 57. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 59. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 58. Uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 60.
Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 62. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 61. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 63. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 66. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 65. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 64. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 67. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 68. Uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 pode ser codificada por um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 69.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma VH compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (vi) : (i) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, (ii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, (iii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, (iv) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições
70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, (v) CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, e (vi) CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma VL compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (ix) : (i) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76- 78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (ii) CDR1: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições
71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (iii) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições
70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (v) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76- 78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (vii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições
76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições
70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Numa concretização preferida, um anticorpo do invento compreende uma combinação de VH e VL compreendendo, cada uma, um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes concretizações (i) a (ix): (i) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1 : posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2 : posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições
70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1 : posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2 : posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições
69- 76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições
70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições
71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2 : posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
Um anticorpo do invento compreende de preferência uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a região variável CDR3, da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18, de preferência de um anticorpo monoclonal contra CLD18 aqui descrito, e compreende de preferência uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a região variável CDR3, das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) aqui descritas. Numa concretização a referida uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) são selecionadas a partir de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 aqui descritas. Numa concretização particularmente preferida, um anticorpo do invento compreende de preferência as regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo monoclonal contra CLD18, de preferência de um anticorpo monoclonal contra CLD18 aqui descrito, e compreende de preferência as regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou regiões variáveis de cadeia leve (VL) aqui descritas.
Um anticorpo do invento compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDR ou a combinação de conjuntos de CDR tal como aqui descrito compreende as referidas CDR juntamente com as suas regiões estruturais intervenientes. De preferência, a porção incluirá também pelo menos cerca de 50% de uma ou ambas da primeira e quarta regiões estruturais, sendo os 50% os 50% C-terminais da primeira região estrutural e os 50% N-terminais da quarta região estrutural. A construção de anticorpos do presente invento produzidos através de técnicas de ADN recombinante pode resultar na introdução de resíduos N ou C-terminais às regiões variáveis codificadas por ligadores introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação, incluindo a introdução de ligadores para unir regiões variáveis do invento a outras sequências proteicas incluindo cadeia pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou marcadores proteicos.
Um anticorpo do invento compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDR ou a combinação de conjuntos de CDR tal como aqui descrito compreende as referidas CDR numa estrutura de anticorpo humana. A referência aqui a um anticorpo compreendendo em relação à sua cadeia pesada uma determinada cadeia, ou uma determinada região ou sequência refere-se, de preferência, à situação em que todas as cadeias pesadas do referido anticorpo compreendem a referida cadeia, região ou sequência particular. Isto aplica-se correspondentemente à cadeia leve de um anticorpo. A presente divulgação refere-se também a ácidos nucleicos compreendendo genes ou sequências de ácido nucleico codificando anticorpos ou suas partes, p. ex. uma cadeia de anticorpo, tal como aqui descrito. Os ácidos nucleicos podem estar compreendidos num vetor, p. ex., um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou outro vetor utilizado p. ex. convencionalmente em engenharia genética. O vetor pode compreender outros genes tais como genes marcadores que permitam a seleção do vetor numa célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vetor pode compreender elementos de controlo da expressão permitindo a expressão correta das regiões de codificação em hospedeiros adequados. Tais elementos de controlo são conhecidos dos peritos e podem incluir um promotor, uma cassete de processamento, e um codão de iniciação da tradução. 0 ácido nucleico pode estar operativamente ligado às sequências de controlo da expressão de cima que permitem a expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Os elementos de controlo assegurando a expressão em células eucarióticas ou procarióticas são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Os métodos para construção de moléculas de ácido nucleico aqui descritos, para construção de vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico de cima, para introdução dos vetores em células hospedeiras escolhidas de forma apropriada, para causar ou alcançar a expressão são bem conhecidos dos peritos na técnica. A presente divulgação refere-se também a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vetor tal como aqui divulgado.
Outras caracteristicas e vantagens do presente invento tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 mostra uma análise de imunofluorescência de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 ligadas a um fluorocromo verde e feitas reagir com soro de ratinho após imunização com ADN com SEQ ID NO: 15 fundida com um epitopo ajudante. A Fig. 2 mostra uma análise Western blot de células HEK293 transfectadas com CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3) e células HEK293 não transfectadas com o anticorpo monoclonal anti-c-myc de ratinho 9E11 (Serotec, CRL MCA2200). A Fig. 3 mostra uma análise de imunofluorescência utilizando células CHO transfectadas com CLD18A2 e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000).
As Fig. 4A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 24H5 e 85A3 a células HEK293 transfectadas transientemente com CLD18A2 humana e um marcador fluorescente tal como determinado através de citometria de fluxo. A Figura 4C mostra a ligação de sobrenadantes de hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 a células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana e contrastadas com iodeto de propidio. A Fig. 5 mostra a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 2 4H5 (A), 9E8 (B) , 26B5 (C) e 19B9 (D) a células HEK293 transfectadas transientemente com um marcador fluorescente e CLD18A2 humana ou CLD18A2-Myc ou CLD18A2-HA tal como analisado através de citometria de fluxo.
As Fig. 6A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 e 163E12 a células HEK293 transfectadas estavelmente com CLD18A2 ou CLD18A1 humana, tal como determinado através de citometria de fluxo. A Fig. 7 mostra uma análise de imunofluorescência do anticorpo monoclonal especifico da isoforma CLD18A2, 37G11, através da coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D), respetivamente, sob condições nativas (A, B) e de fixação com paraformaldeido (C, D). A Fig. 8 mostra uma análise de imunofluorescência do anticorpo monoclonal de CLD18, 26B5, através de coloração de células HEK293 transfectadas com CLD18A2 (A, C) e CLD18A1 (B, D), respetivamente, sob condições nativas (A, B) e de fixação com paraformaldeido (C, D).
Fig. 9. RT-PCR de linhas celulares. A análise de RT-PCR com iniciadores específicos de CLD18A2 mostrou uma expressão clara em 4/5 das linhas celulares testadas. A Fig. 10 mostra uma análise de imunofluorescência de células DAN-G (subclone F2) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 11 mostra uma análise de imunofluorescência de células KATO-III (subclone 3B9 4D5) e um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 12A mostra uma análise de imunofluorescência de células SNU-16 (subclone G5) com um anticorpo policlonal anti-CLD18 de coelho (Zymed, CRL 38-8000). A Fig. 12 B mostra uma análise de imunofluorescência de células KATO-III com anticorpos monoclonais do invento. A Fig. 13 mostra expressão na superfície de CLD18 em células KATO-III e NUGC-4 analisada através da coloração das células com os anticorpos monoclonais 61C2 e 163E12 seguida de análise de citometria de fluxo.
Fig. 14. Alinhamento de proteínas de CLD18A1 humana (NP_057453), CLD18A2 humana (NP_001002026), CLD18A1 de ratinho (NP_062789) e CLD18A2 de ratinho (AAL15636) .
As Fig. 15 A e B mostram a ligação dos sobrenadantes de hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1, e 163E12, respetivamente, a células HEK293 transfectadas transientemente com um marcador fluorescente e CLD18A1 de murideo ou CLD18A2 de murideo tal como analisado através de citometria de fluxo.
Fig. 16. Análises imuno-histoquímicas com o AB policlonal pl05. As colorações imuno-histoquímicas num subconjunto de tecidos normais (estômago, pulmão, medula óssea e próstata) confirmam a especificidade do tecido gástrico (A). A expressão foi também detetada em carcinomas de estômago (linha superior) e carcinomas de pulmão (B) . Apenas as células diferenciadas mas não as células estaminais expressam CLD18A2 (C). FIG. 17. Análises imuno-histoquímicas com o AB monoclonal 39F11D7 (A) Expressão proteica específica foi detetada em mucosa normal do estômago, enquanto todos os outros tecidos normais testados foram negativos. (B) Forte expressão de CLD18A2 foi verificada em carcinomas de estômago e pulmão.
Fig. 18. Análises imuno-histoquímicas com os AB monoclonais 26B5 (A), 175D10 (B) , 43A11 (C) , 163E12 (D), e 45C1 (E) . Todos os anticorpos mostram forte coloração de tumores de xenoenxertos HEK293-CLD18A2 e espécimenes de cancros gástricos, mas não tumores transfectados de controlo HEK2 93-Simulado. A Fig. 19 é um gráfico comparando a percentagem de células mortas após indução de CDC por 85A3, 28D10, 24H5, ou 26D12 contra células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana utilizando citometria de fluxo. A Fig. 20 é um gráfico comparando a percentagem de lise celular especifica após indução de CDC por 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, ou 61C2 contra células CHO aderentes estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana ou CLD18A1 humana tal como determinado através de medição de fluorescência. A Fig. 21 mostra indução de CDC dependente da concentração contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana por 75B8 (A), 28D10 (B), ou 37H8 (C) tal como determinado através de medição de fluorescência. A Fig. 22 mostra a lise de células HEK293-CLD18A2 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2, respetivamente, na presença de MNC. A Fig. 23 mostra a lise de células HEK293-CLD18A1 por 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2, respetivamente, na presença de MNC. A Fig. 24 mostra inibição do crescimento tumoral por anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce com células HEK293-CLD18A2.
As Fig. 25A e B mostram a sobrevivência prolongada através do tratamento com anticorpos do invento em dois modelos de xenoenxerto de tratamento precoce com células HEK293-CLD18A2. A Fig. 26 mostra o prolongamento da sobrevivência através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento avançado com células HEK293-CLD18A2. A Fig. 27A mostra inibição do crescimento tumoral através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce. A Fig. 27B mostra prolongamento da sobrevivência através dos anticorpos do invento num modelo de xenoenxerto de tratamento precoce. Foram utilizadas células DAN-G que expressam CLD18A2 endogenamente. A Fig. 28 mostra a expressão de ARNm de CLD18A2 em tecidos de ratinho. Investigações de RT-PCR com iniciadores específicos de CLD18A2 não mostraram expressão significativa em nenhum dos tecidos normais exceto do estômago. Foram analisados os seguintes tecidos normais: 1: intestino delgado, 2: baço, 3: pele, 4: estômago, 5: pulmão, 6: pâncreas, 7: nódulo linfático, 8: timo, 9: controlo negativo A Fig. 29 mostra expressão de CLD18 em estômago normal. Análise imuno-histoquímica com anticorpo específico de CLD18 de estômago de ratinho revela um padrão de expressão conservado. Enquanto o epitélio superficial e as criptas mais internas expressam CLD18 na sua superfície celular, a região central do pescoço é negativa para CLD18. A Fig. 30 mostra coloração de hematoxilina e eosina de tecidos do estômago de ratinhos. É mostrado em perspetiva geral (A) e em detalhe (B) o estômago de um ratinho tratado com 37G11 em comparação com um ratinho de controlo (C e D) , que foi tratado apenas com PBS.
As Fig. 31A e B mostram coloração de citometria de fluxo de células HEK293 estavelmente transfectadas com CLD18A1 e A2 humanas, respetivamente, bem como células KATO-III que expressam endogenamente com anticorpos do invento (43A11, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10). A Fig. 32 mostra CDC em células que expressam CLD18A2 mediada por anticorpos quiméricos do invento. A Fig. 33 mostra ADCC em células KATO-III mediada por anticorpos quiméricos do invento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente a um epitopo presente em CLD18. Anticorpos monoclonais isolados englobados pelo presente invento incluem anticorpos IgA, IgGl-4, IgE, IgM, e IgD. Numa concretização, o anticorpo é um anticorpo IgGl, mais particularmente um isotipo IgGl, capa ou IgGl, lambda. Noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgG3, mais particularmente um isotipo IgG3, capa ou IgG3, lambda. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgG4, mais particularmente um isotipo IgG4, capa ou IgG4, lambda. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgAl ou IgA2. Ainda noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo IgM.
Numa concretização, o invento refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a células que expressam CLD18 e de preferência (i) ligam-se a células que expressam CLD18A2, e (ii) não se ligam a células que não expressam CLD18A2 mas expressam CLD18A1. Os anticorpos do invento de preferência (i) medeiam a morte de células que expressam CLD18A2, e (ii) não medeiam a morte de células que não expressam CLD18A2 mas que expressam CLD18A1.
Noutra concretização, o invento refere-se a anticorpos que (i) se ligam a células tumorais que expressam CLD18, (ii) não se ligam a células que expressam CLD18 de mucosa de estômago normal, e/ou (iii) não se ligam a células que expressam CLD18 de tecido de pulmão sem ser de cancro. 0 invento inclui também anticorpos que (i) medeiam a morte de células tumorais que expressam CLD18, (ii) não medeiam a morte de células que expressam CLD18 de mucosa de estômago normal, e/ou (iii) não medeiam a morte de células que expressam CLD18 de tecido de pulmão sem ser cancro.
Em concretizações particulares, os anticorpos do invento (i) ligam-se a um epitopo em CLD18A2 que não está presente em CLD18A1, de preferência SEQ ID NO: 21, 22 e 23, (ii) ligam-se a um epitopo localizado na voltai de CLD18A2 (CLD18A2-voltal), de preferência SEQ ID NO: 28, (iii) ligam-se a um epitopo localizado na volta2 de CLD18A2 (CLD18A2-volta2), de preferência SEQ ID NO: 30, (iv) ligam-se a um epitopo localizado na voltaD3 de CLD18A2 (CLD18A2-voltaD3), de preferência SEQ ID NO: 31, (v) ligam-se a um epitopo, que engloba a voltai de CLD18A2 e a voltaD3 de CLD18A2, (vi) ligam-se a um epitopo não glicosilado localizado na voltaD3 de CLD18A2, de preferência SEQ ID NO: 29, ou (vii) ligam-se a um epitopo presente em CLD18 humana e de ratinho (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respetivamente).
Em concretizações particularmente preferidas, os anticorpos do invento ligam-se a um epitopo em CLD18A2 que não está presente em CLD18A1.
Os anticorpos do invento incluem anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos num animal transgénico não humano, p. ex., um ratinho transgénico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 através da sujeição a recombinação homóloga de V-D-J e mudança de isotipo. Tal animal transgénico pode também ser um coelho transgénico para produção de anticorpos policlonais tal como divulgado em US 2003/0017534. A ligação de um anticorpo do invento ao antigénio CLD18 pode mediar a morte de células que expressam CLD18 (por exemplo uma célula tumoral), por exemplo, por ativação do sistema do complemento. A morte de células que expressam CLD18 pode ocorrer através de um ou mais dos seguintes mecanismos: citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de células que expressam CLD18; apoptose de células que expressam CLD18; fagocitose por células efetoras de células que expressam CLD18; ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de células efetoras de células que expressam CLD18.
Para que o presente invento possa ser mais facilmente compreendido, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são expostas ao longo da descrição detalhada.
DEFINIÇÃO DOS TERMOS O termo "CLD18" refere-se a claudina-18 e inclui quaisquer variantes, incluindo CLD18A1 e CLD18A2, conformações, isoformas e homólogos de espécie de CLD18 que sejam naturalmente expressos por células ou sejam expressos por células transfectadas com o gene de CLD18. De preferência, "CLD18" refere-se a CLD18 humana, em particular CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) e/ou CLD18A1 (SEQ ID NO: 7, 8), com maior preferência CLD18A2. 0 termo "CLD18A1" inclui variantes modificadas após a tradução, isoformas e homólogos de espécie de CLD18A1 humana que sejam expressos naturalmente por células ou sejam expressos em células transfectadas com o gene de CLD18A1. 0 termo "CLD18A2" inclui variantes modificadas após a tradução, isoformas e homólogos de espécie de CLD18A2 humana que sejam expressos naturalmente por células ou sejam expressos em células transfectadas com o gene de CLD18A2. A expressão "variante de CLD18" deve englobar (i) variantes de processamento de CLD18, (ii) variantes de CLD18 modificadas após a tradução, particularmente incluindo variantes com diferente estados de N-glicosilação, (i i i) variantes de conformação de CLD18, particularmente incluindo CLD18-conformação-l, CLD18-conformação-2 e CLD18-conformação-3, (iv) variantes de CLD18 livres e homotipicamente/ heterotipicamente associadas localizadas em junções de oclusão intercelulares, (v) variantes de CLD18 relacionadas com cancro e de CLD18 não relacionadas com cancro. 0 termo "jangada" refere-se aos microdominios membranares ricos em esfingolipidos e colesterol localizados na área do folheto externo da membrana plasmática de uma célula. A capacidade de certas proteínas para se associarem dentro de tais domínios e a sua capacidade de formação de "agregados" ou "agregados focais" podem efetuar a função das proteínas. Por exemplo, a translocação de moléculas CLD18 para tais estruturas, após serem ligadas a anticorpos do presente invento, cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo de CLD18 nas membranas plasmáticas. Tal elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo de CLD18 pode permitir a ativação eficiente do sistema do complemento durante a CDC.
Os termos "conformação" e "topologia" descrevem como uma molécula membranar integral se posiciona na membrana da superfície celular, e, em particular, quais das suas regiões são extracelulares e assim elegíveis para anticorpos. CLD18 pode por exemplo existir em três conformações diferentes, que muito provavelmente dependem de se é prevalente como homómeros ou heterómeros e de se está integrada em estruturas supramoleculares de junção de oclusão ou "livre". Estes diferentes estados resultam em diferentes epitopos elegíveis para anticorpos.
De acordo com o invento, o termo "doença" refere-se a qualquer estado patológico, incluindo cancro, em particular as formas de cancro aqui descritas.
Por "tumor" entenda-se um grupo anormal de células ou tecido que cresce através de uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer após cessar o estímulo que iniciou o novo crescimento. Os tumores mostram uma falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e formam geralmente uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna ou maligna.
Por "metástase" entenda-se a propagação de células de cancro a partir do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende do desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade do corpo e vasos e, em seguida, após ser transportada pelo sangue, infiltração dos órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogénese. A metástase tumoral ocorre frequentemente mesmo após a remoção do tumor primário, porque podem permanecer células ou componentes tumorais e desenvolverem potencial metastático. Numa concretização, o termo "metástase" de acordo com o invento refere-se a "metástase distante" que se refere a uma metástase remota do tumor primário e do sistema de nódulos linfáticos regionais. A expressão "tratamento de uma doença" inclui cura, encurtamento da duração, melhoria, prevenção, abrandamento ou inibição da progressão ou agravamento, ou prevenção ou retardamento do aparecimento de uma doença ou dos seus sintomas.
De acordo com o invento, uma amostra pode ser gualguer amostra útil de acordo com o presente invento, em particular uma amostra biológica tal como uma amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e/ou uma amostra celular e pode ser obtida de um modo convencional tal como através de biopsia de tecidos, incluindo biopsia de punção, e tomada de sangue, aspirado brônguico, escarro, urina, fezes e outros fluidos corporais. De acordo com o invento, a expressão "amostra biológica" inclui também frações de amostras biológicas. 0 termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas através de ligações dissulfureto, ou uma sua porção de ligação ao antigénio. 0 termo "anticorpo" inclui também todas as formas recombinantes de anticorpos, em particular dos anticorpos agui descritos, p. ex., anticorpos expressos em procariotas, anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos e derivados de anticorpo de ligação ao antigénio tal como descrito abaixo. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (p. ex., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se a uma molécula possuindo um local de ligação ao antigénio que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula se baseia na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação ao antigénio pode compreender domínios variáveis completos fundidos com domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação ao antigénio podem ser de tipo selvagem ou modificados através de uma ou mais substituições de aminoácidos, p. ex. modificados para se assemelharem mais a imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados conservam todas as sequências CDR (por exemplo um anticorpo de ratinho humanizado que contenha todas as seis CDR do anticorpo de ratinho). Outras formas têm uma ou mais CDR que são alteradas em relação ao anticorpo original. A expressão "anticorpo quimérico" refere-se aqueles anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe, enquanto o restante segmento da cadeia é homólogo às sequências correspondentes noutra. Tipicamente a região variável tanto das cadeias leves como das pesadas imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto as porções constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivados de outra. Uma clara vantagem para tais formas quiméricas é que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes presentemente conhecidas utilizando facilmente células B ou hibridomas disponíveis a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Enquanto a região variável tem a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não é afetada pela fonte, a região constante sendo humana, tem menor probabilidade de induzir uma resposta imunitária de um sujeito humano quando os anticorpos são injetados do que a região constante de uma fonte não humana. No entanto, a definição não está limitada a este exemplo particular. A expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação"), tal como aqui se utiliza, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antigénio. Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação englobados na expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados através de uma ponte dissulfureto na região charneira; (iii) fragmentos Fd consistindo nos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consistem num domínio VH; (vi) regiões determinantes de complementaridade isoladas (CDR) ; e (vii) combinações de duas ou mais CDR isoladas que podem ser opcionalmente unidas através de um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, através de um ligador sintético que permite que sejam produzidos como uma única cadeia proteica em que as regiões VL e VH emparelhem para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, p. ex., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia simples estejam englobados na expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Outro exemplo são proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina compreendendo (i) um polipéptido domínio de ligação que é fundido com um polipéptido região charneira de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região charneira, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região constante CH2. 0 polipéptido domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão domínio de ligação-imunoglobulina são ainda divulgadas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são pesquisados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. O termo "epitopo" significa um determinante proteico capaz de se ligar a um anticorpo, em que o termo "ligação" aqui refere-se de preferência a uma ligação específica. Os epitopos consistem habitualmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como os aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e possuem geralmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos por a ligação ao primeiro, mas não ao último se perder na presença de solventes de desnaturação. A expressão "epitopo descontínuo" tal como aqui utilizada, significa um epitopo conformacional num antigénio proteico que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína.
Na expressão "molécula biespecífica" pretende-se incluir qualquer agente, p. ex., uma proteína, um péptido ou complexo proteico ou peptídico, que tenha duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, e (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora. Na expressão "molécula multiespecífica" ou "molécula heteroespecífica" pretende-se incluir qualquer agente, p. ex., uma proteína, um péptido, complexo proteico ou peptídico, que tenha mais de duas especificidade de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora, e (c) pelo menos um outro componente. Consequentemente, o invento inclui, mas não está limitado a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas, e outras multiespecíficas que se dirigem a CLD18, e a outros alvos, tais como recetores de Fc em células efetoras. A expressão "anticorpos biespecíficos" inclui também diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos em que os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptídica, mas utilizando um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver p. ex., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). O invento inclui também derivados dos anticorpos aqui descritos. A expressão "derivados de anticorpo" refere-se a qualquer forma modificada de um anticorpo, p. ex., um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. Tal como aqui utilizado, um anticorpo é "derivado de" uma determinada sequência da linha germinativa se o anticorpo for obtido a partir de um sistema através de imunização de um animal ou através de pesquisa de uma biblioteca de genes de imunoglobulina, e em que o anticorpo selecionado é pelo menos 90%, com maior preferência pelo menos 95%, ainda de preferência pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo derivado de uma determinada sequência da linha germinativa não apresentará mais de 10 diferenças de aminoácidos, de preferência não mais de 5, ou mesmo com maior preferência não mais de 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinativa.
Tal como aqui utilizado, o termo "heteroanticorpos" refere-se a dois ou mais anticorpos, seus derivados, ou regiões de ligação ao antigénio ligados entre si, pelo menos dois dos quais têm especificidades diferentes. Estas especificidades diferentes incluem a especificidade de ligação a um recetor de Fc numa célula efetora, e a especificidade de ligação a um antigénio ou epitopo numa célula alvo, p. ex., uma célula tumoral.
Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos humanos. Na expressão "anticorpo humano", tal como aqui utilizada, pretende-se incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos do invento podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (p. ex., mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou através de mutação somática in vivo) . A expressão "anticorpo monoclonal", tal como aqui se utiliza, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epitopo. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano, p. ex., ratinho, fundida com uma célula imortalizada. A expressão "anticorpo recombinante", tal como aqui utilizada, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (p. ex., um ratinho) que seja transgénico ou transcromossómico em relação aos genes de imunoglobulina ou a um hibridoma preparado a partir deles, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, p. ex., a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva união de sequências génicas de imunoglobulina com outras sequências de ADN. 0 termo "transfectoma", tal como aqui utilizado, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetais, ou células fúngicas incluindo leveduras.
Tal como aqui se utiliza, um "anticorpo heterólogo" é definido em relação a um organismo transgénico produtor de um tal anticorpo. Esta expressão refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de codificação de ácido nucleico correspondendo à verificada num organismo não consistindo no organismo transgénico, e sendo geralmente derivado de uma espécie diferente da do organismo transgénico.
Tal como aqui utilizado, um "anticorpo hetero-híbrido" refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas com origem em diferentes organismos. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murideo é um anticorpo hetero-híbrido.
Os anticorpos aqui descritos são de preferência isolados. Um "anticorpo isolado" tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigénicas (p. ex., um anticorpo isolado que se liga especificamente a CLD18 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios diferentes de CLD18). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, uma isoforma ou variante de CLD18 humana pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antigénios aparentados, p. ex., de outras espécies (p. ex., homólogos específicos de CLD18). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos. Numa concretização do invento, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" refere-se a anticorpos possuindo diferentes especificidades e sendo combinados numa composição bem definida.
De acordo com o invento, o termo "ligação" refere-se de preferência a "ligação específica". Tal como aqui utilizado, "ligação específica" refere-se à ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade correspondendo a uma KD de cerca de lxlCh7 M ou menos, e liga-se ao antigénio predeterminado com uma afinidade correspondendo a uma KD que é pelo menos duas ordens de grandeza inferior à sua afinidade para ligação a um antigénio não específico (p. ex., BSA, caseína) além do antigénio predeterminado ou um antigénio intimamente aparentado. 0 termo "KD" (Μ) , tal como aqui utilizado, pretende referir a constante de dissociação em equilíbrio de uma determinada interação anticorpo-antigénio .
Tal como aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe do anticorpo (p. ex., IgM ou IgGl) que é codificada por genes da região constante da cadeia pesada.
Tal como aqui utilizado, "mudança de isotipo" refere-se ao fenómeno através do qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig. A expressão "de ocorrência natural" tal como aqui utilizada aplicada a um objeto refere-se ao facto de um objeto poder ser verificado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que esteja presente num organismo (incluindo vírus) que possa ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório, é de ocorrência natural. 0 termo "rearranjado" tal como aqui utilizado refere-se a uma configuração de um locus de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação codificando essencialmente um domínio VH ou VL completo, respetivamente. Um locus de um gene de imunoglobulina (anticorpo) rearranjado pode ser identificado através de comparação com o ADN da linha germinativa; um locus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia heptâmero/nonâmero recombinado.
As expressões "não rearranjado" ou "configuração da linha germinativa" tal como aqui utilizadas em referência a um segmento V referem-se à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
Na expressão "molécula de ácido nucleico", tal como aqui utilizada, pretende-se incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. A molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é ADN de cadeia dupla.
Os ácidos nucleicos descritos de acordo com o invento foram, de preferência, isolados. A expressão "ácido nucleico isolado" significa de acordo com o invento que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo através de reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido de forma recombinante através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo através de clivagem e fracionamento por eletroforese em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, através de síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação através de técnicas de ADN recombinante.
Os ácidos nucleicos podem, de acordo com o invento, estar presentes sozinhos ou em combinação com outros ácidos nucleicos, que podem ser homólogos ou heterólogos. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controlo da expressão que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao referido ácido nucleico. 0 termo "homólogo" significa que um ácido nucleico está também funcionalmente ligado naturalmente à sequência de controlo da expressão e o termo "heterólogo" significa que um ácido nucleico não está funcionalmente ligado naturalmente à sequência de controlo expressão.
Um ácido nucleico, tal como um ácido nucleico que expressam ARN e/ou proteína ou péptido, e uma sequência de controlo da expressão estão "funcionalmente" ligados um ao outro, se estiverem covalentemente ligados um ao outro de modo a que a expressão ou transcrição do referido ácido nucleico esteja sob o controlo ou sob a influência da referida sequência de controlo da expressão. Se o ácido nucleico for para se traduzir numa proteína funcional, então, com uma sequência de controlo da expressão funcionalmente ligada a uma sequência de codificação, a indução da referida sequência de controlo da expressão resulta em transcrição do referido ácido nucleico, sem causar uma mudança de enquadramento na sequência de codificação ou que a referida sequência de codificação não seja capaz de ser traduzida na proteína ou no péptido desejado. A expressão "sequência de controlo da expressão" compreende de acordo com o invento, promotores, locais de ligação ao ribossoma, estimuladores e outros elementos de controlo que regulam a transcrição de um gene ou a tradução de um ARNm. Em concretizações particulares do invento, as sequências de controlo da expressão podem ser reguladas. A estrutura exata das sequências de controlo da expressão pode variar em função da espécie ou do tipo celular, mas geralmente compreende sequências não transcritas a 5' e não traduzidas a 5' e a 3' que estão envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, respetivamente, tal como a caixa TATA, sequência de remate (capping) e a sequência CAAT. Mais especificamente, as sequências de controlo da expressão não transcritas a 5' compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controlo da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligado. As sequências de controlo da expressão podem também compreender sequências estimuladoras ou sequências activadoras a montante.
De acordo com o invento, o termo "promotor" ou "região promotora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que está localizada a montante (5') da sequência de ácido nucleico a expressar e controla a expressão da sequência ao proporcionar um local de reconhecimento e local de ligação para ARN-polimerase. A "região promotora" pode incluir mais locais de reconhecimento e ligação para outros fatores que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser "indutível" e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser "constitutivo" se a transcrição não for controlada através de um agente indutor. Um gene que está sob o controlo de um promotor indutível não é expresso ou é apenas expresso numa pequena extensão se estiver ausente um agente indutor. Na presença do agente indutor o gene é ligado ou o nível de transcrição é aumentado. Isto é mediado, em geral, pela ligação de um fator de transcrição específico.
Promotores que são preferidos acordo com o invento incluem promotores para a polimerase SP6, T3 e T7, promotor do ARN U6 humano, promotor de CMV e promotores seus híbridos artificiais (p. ex. CMV) onde uma parte ou partes são fundidas com uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares tais como p. ex. GAPDH humana (gliceraldeído-3- fosfato-desidrogenase), e incluindo ou não incluindo um ou mais intrões adicionais.
De acordo com o invento, o termo "expressão" é utilizado no seu sentido mais geral e compreende a produção de ARN ou de ARN e proteina/péptido. Compreende também a expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser realizada transientemente ou estavelmente.
Numa concretização preferida, uma molécula de ácido nucleico está, de acordo com o invento, presente num vetor, quando apropriado com um promotor, que controla a expressão do ácido nucleico. 0 termo "vetor" é aqui utilizado no seu sentido mais geral e compreende qualquer veiculo intermediário para um ácido nucleico que permite que o referido ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procarióticas e/ou eucarióticas e, quando apropriado, seja integrado num genoma. Vetores deste tipo são de preferência replicados e/ou expressos nas células. Os vetores compreendem plasmideos, fagemideos, bacteriófagos ou genomas virais. 0 termo "plasmídeo" tal como aqui utilizado refere-se geralmente a uma construção de material genético extracromossómico, habitualmente um dúplex de ADN circular, que se pode replicar independentemente do ADN cromossómico.
Como vetor para expressão de um anticorpo, pode ser utilizado um tipo de vetor em que a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo estão presentes em diferentes vetores ou um tipo de vetor em que a cadeia pesada e a cadeia leve estão presentes no mesmo vetor. 0 ensinamento aqui dado em relação a sequências de ácido nucleico e de aminoácidos especificas, p. ex. aquelas mostradas na listagem de sequências, deve ser entendido como se relacionando também a modificações das referidas sequências especificas resultando em sequências que sejam funcionalmente equivalentes às referidas sequências especificas, p. ex. sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou semelhantes às da sequências de aminoácidos especificas e sequências de ácido nucleico codificando as sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou semelhantes às das sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico especificas. Uma propriedade importante é reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo ou manter funções efetoras de um anticorpo. De preferência, uma sequência modificada em relação a uma sequência específica, quando substitui a sequência específica num anticorpo mantém a ligação do referido anticorpo a CLD18 e de preferência as funções do referido anticorpo tal como aqui descritas, p. ex. lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.
Será apreciado pelos peritos na técnica que em particular as sequências da CDR, regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade para se ligarem a CLD18. Por exemplo, as regiões CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões aqui especificadas. Por "altamente homólogo" está contemplado que de 1 a 5, de preferência de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas nas CDR. Além disso, as regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas de modo a que mostrem substancial homologia com as regiões especificamente aqui divulgadas.
Deve entender-se que os ácidos nucleicos específicos aqui descritos incluem também ácidos nucleicos modificados por razões de otimização da utilização de codões numa determinada célula hospedeira ou organismo. Diferenças na utilização de codões entre os organismos podem levar a uma variedade de problemas em relação à expressão de genes heterólogos. A otimização de codões através da mudança de um ou mais nucleótidos da sequência original pode resultar numa otimização da expressão de um ácido nucleico, em particular na otimização da eficácia de tradução, num hospedeiro homólogo ou heterólogo no qual se pretende expressar o referido ácido nucleico. Por exemplo se forem utilizados ácidos nucleicos derivados de humano e codificando regiões constantes e/ou regiões estruturais de anticorpos de acordo com o presente invento, p. ex. para preparação de anticorpos quiméricos ou humanizados, pode ser preferido modificar os referidos ácidos nucleicos por razões de otimização da utilização de codões, em particular se os referidos ácidos nucleicos, opcionalmente fundidos com ácidos nucleicos heterólogos tais como ácidos nucleicos derivados de outros organismos tal como aqui descrito, forem para ser expressos em células de um organismo diferente de um ser humano tal como um ratinho ou hamster. Por exemplo, as sequências de ácido nucleico codificando as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas tais como aquelas de acordo com SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, podem ser modificadas para incluir uma ou mais, de preferência, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e de preferência até 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ou 100 ou mais substituições de nucleótidos resultando numa utilização otimizada de codões mas não resultando numa mudança da sequência de aminoácidos. Tais substituições de aminoácidos referem-se de preferência a substituições de nucleótidos em SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, selecionadas a partir das substituições mostradas no sequinte alinhamento de SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, com os seus equivalentes modificados e não resultando numa mudança na sequência de aminoácidos codificada ou referem-se às substituições correspondentes em posições correspondentes noutras sequências de ácido nucleico codificando as regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respetivamente. De preferência, todas as substituições mostradas nos seguintes alinhamentos de SEQ ID NO: 40 e 45, respetivamente, com os seus equivalentes modificados a não resultar numa mudança na sequência de aminoácidos codificada, são realizadas em sequências de ácido nucleico codificando regiões constantes de cadeias leves e pesadas humanas, respetivamente.
Alinhamento de SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 147: CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT 60
IlililllMI I! II II lllllllllll II II llllll INI II C GTACGGTG gccgctc c cagcgtgttcatctt cccccccag c gac gagcagctgaagtcc g o GGAACTGCCTCTG TTGT GTGCCTGCTGAATAACTTCTAT C CCAGAGAGG CCAAAGTACAG 120
II II III II llllllllllllll III Ml III I II mill II III GGCACCG CCAG CG TGGTGTGC CT GC Ί GAACAAC 3TCTACC CCCGGGAGG CCAAGGTGCAG 12 0 TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAXCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC 18 0 t ί μ I I I ί i i i | | | Μ i M ii μ mi ! ! i ί ί μ ! ί ί ! I ! ; : ι ι I ι t ·. ·. \
ί ί I 1 ! I I ! : : i ι \ ι ι ι : ι ι II II 1 ί I ι ι ι I ι ι ι ι ι I I I I I I I I I 1 I li I tggaaggtggacaacgccctgcagagc&gcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggac 1B0 AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAOGCTOAGCAAAGCAGACTACGAG 240 lllllllll 1111II1111II 11 ί 111111111II MIIIEII II lllllllll AGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCrAAGGCCGACTACGAG 240 AAAC ACAAAGT CT ACGCCTGCGAAG TCAC CCAT CAGGG CC TGAGCTCGCCCGTCACAAAG 300
II Mill II 111 ί 1111111 II Mill lllllllll I Mill II III aagcacaaggtgtacgcctgggaggtgacccaccagggcctgtccãgccccgtgaccaag 3 q ο AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 324
11111111111111 Mill III AGCTTCAACAGGGGCGAGTGCTAG 324
Alinhamento de SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 149: ggcocatcggtcttccccctggcacCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC 6 0
111 III II 11 111 i 11 : IE 111 I I Mil III II II Mill II I III GGCCCAAGCGTGTT CCCCCTGGCCC CCRQCAGCAAGAGCACCAGCGQCGGCACAGCCGCC 61> CTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC 12 0
llllllllilllll Μ 11111 1111; 111 II 111! 1 Ml IIIMI II CTGGGC TGCC TGGTGAAGGACIACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGA 12D GC CCTGACCAG CGGCGTGCACACCT2C CCGGCTGTC C TACAGTCCT GAG GACTC TACTCC 180
111 111 M I I i 111 I I M 11! 111111 II 11 II III I II II III I GCCCTGACCTCCGGCGTGCACAC CTTCCC CGCCGTGC TGCAGAGCAG CGGCC TGTACAG C 180 CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC 240
Μ 111 Μ 1111111111111111 Mlllll 1111II1111111II11 M111IIII CTGAGCAGCGTGGTGAC CGTGCC CAGCAG CAGC CTGGG CACCCAGACC TACATCTGCAAC 240 GTGAAICACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC 300
Mill IIII111111 Μ II1111 Μ 111 Μ 11 Μ 11 III llllllll II III GTGAACC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTG GAGCCCAAGAGCTG C GAC 3C0 AAAACTCACACATGCCCAC C GTGC C CAGCACCTGAAC TCC TGGGGGGACCG TCAGT CTTC 360
II II Mill MIM II llllllll II II II HIM Mill II III AAGAC CCACACCT GCCC CC CCTGC C CAG CCCCAGAGCTGC TGGGCGGAC C CAGCGTGTTC 360 CTCTTC CCCCCAAAAC C CAAGGACACCC 1CATGATCTC C C GGACC CCTGAGGT CACATG C 420 II llllllll II 1111111111II11 IIIMI I 1111111 HIM II ill CTGTT CCCCCC CAAGC CCAAGGACAC CC IGATGATCAG CAGGACC CC CGAGGTGACCTGC 420 GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAjSTTCAACTGGTACGTGGACGGC 480
IMM MM Mil Mill Mill Mill 111 Μ IIIII1111II1111 Μ II GTGGTGGTGGACGIGAGCCACGAGOACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC 4 B0 GTGGAGGTGC ATAAT GC CAACACAAAGCCG CGGGAGGAG C AGTACAACAG CACGTACCGT 540
II MM II llllllll MIM I 11IIII III 1111 i 11! Μ I III I GTGGAGGTGCACAACGCCAAGACC AAGCC CAGAGAGGAG C AGTACAACAGCAC C TACAGG 540 GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC 600
Mill III II MIM I ! 111 Ml 111 I 111 i 1111 I II Μ I II llillllli GTGGTGTCC GTGCTGACCGT SCTGCAC CAGGAC TGG CTGAACGGCAAGGAATACAAGTGC 6 0 Q AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAjGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG €60
11111111111111 Mill 111! 1111111 111 II mill Ml mil II AAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGC 660 CAGC CCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCC CCATCCCGGGAT GAGC TGACCAAGAAC 720
Mill Μ II II II III II III 11 11111 Μ I 111111 III I Μ I 1111111 C AGCCACGGGAGC C C CAGGTGTACACCCTGCCCCC CAGCC GG-GAGGAG ATGACCAAG AAC 720 CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGaCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG 780 mu iiimm mu m mimi μιιιιμμμμμμμιμι CAGGTGT CC C TGACCTGTCT G GTGAAGGGCTTC TACC CCAGCGACAT CG CCGTGGAGTGG 780 GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTOCTGGACTCCGAC 840
llllllll II MIM 111111111111 Μ IJ1111 II II III Ml III MM GAGAGCAACGG C C AG CCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCC GAGTGC TGGACAGCGAC 840 GGC TCCTTCTTCCTCTATAGCAAQCT CACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAG CAGGGGAAC 900 II! IIIII Ml! I! II Mill! Hill MIJ III 11111111 III 1111 11! GGCftG CTTCTTCCTGTACAG CAAGCTGAC CGTGGACAAGTCCAGGTGGCAG CAS GGCAAC 900 GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGASGCTCTaCACAACCACTACACGCAGAftGAGCCTC 960 II ill IN llillllll Mill 111111ÍI111 ill 111 mill ill GTGTTCAGC TG CASCGTGATGCACGAGGC CCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG 960 T CCCTGTC TC CG GGTAAATGA 981
III! II II II I AGCCTGAGCCCCGGCflAGTAG 981
Além disso, pode ser desejado, de acordo com o presente invento, modificar a sequência de aminoácidos aqui descrita, em particular as das regiões constantes de cadeias pesadas humanas para adaptar a sequência a um alotipo desejado, p. ex. um alotipo verificado na população Caucasiana. Tais modificações são de preferência selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes substituições de aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 46 ou nas posições correspondentes dentro de outras regiões constantes de cadeias pesadas humanas: K93R, D235E, e L237M. De preferência, todas estas modificações estão incluídas nas sequências de aminoácidos das regiões constantes de cadeias pesadas humanas.
De acordo com o invento, a expressão "posições correspondentes" refere-se a nucleótidos ou resíduos de aminoácidos que num alinhamento de sequências de duas sequências de aminoácidos ou proteicas são alinhadas uma com a outra.
De preferência, o grau de identidade entre a sequência de ácido nucleico específica aqui descrita e a sequência de ácido nucleico que é modificada em relação à referida sequência de ácido nucleico específica será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, com maior preferência pelo menos 80%, ainda mais de preferência pelo menos 90% ou ainda com maior preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. De preferência, as duas sequências são capazes de hibridar e formar um dúplex estável uma com a outra, com a hibridação a ser de preferência realizada sob condições que permitam hibridação específica entre polinucleótidos (condições rigorosas). As condições rigorosas são descritas, por exemplo, in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", J. Sambrook et al. , Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou "Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York e referem-se, por exemplo, à hibridação a 65°C em tampão de hibridação (SSC 3,5x, Ficoll a 0,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina de soro bovino a 0,02%, NaH2P04 2,5 mM (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM). SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridação, a membrana para a qual o ADN foi transferido é lavada, por exemplo, em SSC 2x à temperatura ambiente e depois em SSC 0,1-0,5x/SDS 0,1χ a temperaturas de até 68°C.
De preferência, o grau de semelhança, de preferência de identidade entre a sequência de aminoácidos especifica aqui descrita e uma sequência de aminoácidos que é modificada em relação à referida sequência de aminoácidos especifica tal como entre a sequência de aminoácidos mostrando substancial homologia será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com maior preferência pelo menos 90% ou ainda mais de preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
Todas as sequências modificadas acima descritas estão dentro do âmbito do presente invento. "Semelhança de sequência" indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. "Identidade de sequência" entre duas sequências polipeptidicas ou de ácido nucleico indica a percentagem de aminoácidos ou nucleótidos que são idênticos entre as sequências. A "percentagem de identidade" é obtida após o melhor alinhamento, sendo esta percentagem meramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos são convencionalmente realizadas por comparação destas sequências, depois de serem alinhadas de forma ótima, sendo a referida comparação realizada por segmento ou por "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança das sequências. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman de 1981, Ads App. Math. 2: 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, por meio do método de pesquisa de semelhanças de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444, ou por meio de programas de computador que utilizem estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). A percentagem de identidade é calcula através da determinação do número de posições idênticas entre as duas sequências a comparar, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter-se a percentagem de identidade entre estas duas sequências. "Substituições conservativas" podem ser feitas, por exemplo, com base na semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo: (a) aminoácidos não polares (hidrófobos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina; (b) aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; (c) aminoácidos com carga positiva (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e (d) aminoácidos com carga negativa (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. As substituições podem ser feitas tipicamente dentro dos grupos (a)- (d) . Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas uma pela outra com base na sua capacidade para perturbar [alfa]-hélices. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, Lei. Dado o código genético conhecido, e as técnicas de ADN sintético e recombinante, o cientista especializado pode facilmente construir ADN que codifiquem as variantes de aminoácidos conservativas. O presente invento compreende anticorpos em que foram feitas alterações na região Fc para mudar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar numa diminuição ou num aumento da ligação de
Clq e CDC ou da ligação de Fc Re ADCC. As substitções podem, por exemplo, ser feitas num ou mais dos resíduos de aminoácidos da região constante de cadeia pesada, causando assim uma alteração numa função efetora enguanto mantém a capacidade de se ligar ao antigénio, em comparação com o anticorpo modificado, cf. US 5624821 e US 5648260. A semivida in vivo dos anticorpos pode ser melhorada através da modificação do epitopo do recetor de salvamento do domínio constante de Ig ou de um domínio constante semelhante a Ig, de modo a gue a molécula não compreenda um domínio CH2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6121022 e US 6194551. A semivida in vivo pode além disso ser aumentada através da produção de mutações na região Fc, p. ex., através da substituição de leucina por treonina na posição 252, através da substituição de serina por treonina na posição 254, ou através da substituição de fenilalanina por treonina na posição 256, cf. US 6277375.
Além disso, o padrão de glicosilação dos anticorpos pode ser modificado para mudar a função efetora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos num transfectoma que não adicione a unidade de fucose normalmente ligada a Asn na posição 297 da região Fc para aumentar a afinidade da região Fc para recetores de Fc que, por sua vez, resultará numa maior ADCC dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et ai. (2002) JBC, 277: 26733. Além disso, pode ser feita modificação da galactosilação para modificar a CDC.
Alternativamente, noutra concretização, podem ser introduzidas mutações aleatoriamente ao longo de toda a sequência de codificação do anticorpo anti-CLD18, tal como através de mutagénese de saturação, e os anticorpos anti-CLD18 modificados resultantes podem ser pesquisados quanto à atividade de ligação. A expressão "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como aqui utilizada, pretende referir-se a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Deve ser entendido que tais expressões se destinam a referir não só a célula sujeita em particular como também a descendência dessa célula. Como podem ocorrer certas modificações nas gerações que se sucedem, devido a mutação ou a influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula parental, mas está ainda incluída no âmbito na expressão "célula hospedeira", tal como aqui utilizada. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0 e células linfocíticas.
Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" compreende qualquer animal humano ou não humano. A expressão "animal não humano" inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. A expressão "animal transgénico" refere-se a um animal possuindo um genoma compreendendo um ou mais transgenes e de preferência transgenes de cadeia pesada e/ou leve, ou transcromossomas (integrados ou não integrados no ADN genómico natural do animal) e que é de preferência capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um ratinho transgénico pode ter um transgene da cadeia leve humana e um transgene da cadeia pesada humana ou um transcromossoma da cadeia pesada humana, de modo a que o ratinho produza anticorpos anti-CLD18 humanos quando imunizado com antigénio CLD18 e/ou células que expressam CLD18. 0 transgene da cadeia pesada humana pode ser integrado no ADN cromossómico do ratinho, como é o caso para ratinhos transgénicos, p. ex., ratinhos HuMAb, tais como ratinhos HCo7 ou HCol2, ou o transgene da cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para ratinhos transcromossómicos (p. ex., KM) tal como descrito em WO 02/43478. Tais ratinhos transgénicos e transcromossómicos podem ser capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLD18 (p. ex., IgG, IgA e/ou IgE) sofrendo recombinação de V-D-J e mudança de isotipo.
Mecanismos de ação de mAb
Embora a seguir se proporcionem considerações sobre o mecanismo subjacente à eficácia terapêutica dos anticorpos do invento, não deve ser considerada como de modo algum limitante do invento.
Os anticorpos aqui descritos interagem de preferência com componentes do sistema imunitário, de preferência através de ADCC ou CDC. Os anticorpos do invento podem também ser utilizados para direccionar cargas (p. ex. , isótopos radioativos, fármacos ou toxinas) para matar diretamente células tumorais ou podem ser utilizados sinergicamente com agentes quimioterapêuticos tradicionais, atacando os tumores através de mecanismos de ação complementares, que podem incluir respostas imunitárias antitumorais que possam ter sido comprometidas devido a efeitos secundários citotóxicos dos quimioterapêuticos sobre os linfócitos T.
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos. A ADCC descreve a capacidade das células efetoras para matar células, tal como aqui descrito, em particular linfócitos, o que requer, de preferência, que a célula alvo seja marcada por um anticorpo. A ADCC ocorre de preferência quando os anticorpos se ligam a antigénios em células tumorais e os domínios Fc do anticorpo envolvem recetores de Fc (FcR) na superfície de células imunitárias efetoras. Várias famílias de recetores de Fc foram identificadas e populações celulares específicas expressam caracteristicamente recetores de Fc definidos. A ADCC pode ser vista como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruição imediata de tumores que conduz a apresentação do antigénio e à indução de respostas de células T dirigidas a tumores. De preferência, a indução in vivo de ADCC conduzirá a respostas de células T dirigidas a tumores e respostas de anticorpos derivadas do hospedeiro.
Citotoxicidade dependente do complemento. A CDC é outro método de matar células que pode ser dirigido por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para a ativação do complemento. IgGl e IgG3 são também muito eficazes no direcionamento de CDC através da via clássica de ativação do complemento. De preferência, nesta cascata, a formação de complexos antigénio-anticorpo resulta no desvelamento de múltiplos locais de ligação a Clq em estreita proximidade nos domínios Ch2 das moléculas de anticorpo participantes, tais como moléculas de IgG (Clq é um dos três subcomponentes do complemento Cl). De preferência, estes locais de ligação a Clq desvelados convertem a interação Clq-IgG anteriormente de baixa afinidade numa de elevada avidez, que desencadeia uma cascata de eventos envolvendo uma série de outras proteínas do complemento e conduz à libertação proteolítica dos agentes quimiotáticos/de ativação de células efetoras C3a e C5a. De preferência, a cascata do complemento termina na formação de um complexo de ataque da membrana que cria poros na membrana celular que facilitam a passagem livre de água e de solutos para dentro e para fora da célula.
Produção de anticorpos
Os anticorpos do invento podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, p. ex., a técnica padrão de hibridação de células somáticas de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridação de células somáticas, em princípio outras técnicas para produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues, p. ex., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B ou técnicas de apresentação fágica utilizando bibliotecas de genes de anticorpos. 0 sistema animal preferido para preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é o sistema de murídeo. A produção de hibridomas no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e as técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (p. ex., células de mieloma de murídeo) e os procedimentos de fusão são também conhecidos.
Outros sistemas animais preferidos para preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais são o sistema de rato e coelho (p. ex., descrito em Spieker-Polet et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 9348 (1995), ver também Rossi et ai., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Ainda numa outra concretização preferida, anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CLD18 pode ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos possuindo partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos conhecidos como ratinhos HuMAb e ratinhos KM, respetivamente, e são coletivamente aqui referidos como "ratinhos transgénicos". A produção de anticorpos humanos em tais ratinhos transgénicos pode ser realizada tal como descrito em detalhe para CD20 em W02004/035607.
No entanto, uma outra estratégia para a produção de anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes codificando anticorpos a partir de linfócitos que produzam anticorpos de estratégia definida, p. ex. ver Babcock et al., 1996; "A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy". Para detalhes de engenharia de anticorpos recombinantes ver também Welschof e Kraus, "Recombinant antibodies for cancer therapy" ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Lo "Antibody Engineering" ISBN 1-58829-092-1.
Imunizações
Para gerar anticorpos para CLD18, os ratinhos podem ser imunizados com péptidos conjugados com transportador derivados da sequência de CLD18, uma preparação enriquecida em antigénio CLD18 expresso de forma recombinante ou seus fragmentos e/ou células que expressam CLD18, tal como descrito. Alternativamente, os ratinhos podem ser imunizados com ADN codificando CLD18 humana inteira (p. ex. SEQ ID NO: 1) ou seus fragmentos, em particular os de SEQ ID NO: 15, 17, e 19. No caso das imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida em antigénio CLD18 não resultarem em anticorpos, os ratinhos podem também ser imunizados com células que expressam CLD18, p. ex., uma linha celular, para promover respostas imunitárias. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma e soro obtidas através de sangrias da veia caudal ou retro-orbitais. Os ratinhos com títulos de imunoglobulina anti-CLD18 suficientes podem ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados por via intraperitoneal ou intravenosa com células que expressam CLD18 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas segregando anticorpos específicos.
Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais para CLD18, esplenócitos e células dos nódulos linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linha celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem então ser pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Poços individuais podem então ser pesquisados através de ELISA quanto a hibridomas secretores de anticorpos. Através de análise de imunofluorescência e FACS utilizando células que expressam CLD18, podem ser identificados anticorpos com especificidade para CLD18. Os hibridomas segregando anticorpos podem ser replaqueados, novamente pesquisados, e se ainda forem positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.
Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos do invento podem também ser produzidos num transfectoma de células hospedeiras utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de genes, como são bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) .
Por exemplo, numa concretização, o gene ou os genes de interesse, p. ex., genes de anticorpos, podem ser ligados num vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariótica tal como usado pelo sistema de expressão de genes GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpos clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas como células derivadas de plantas, células fúngicas ou de levedura. O método utilizado para introduzir estes genes pode ser métodos descritos na técnica, tais como electroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução destes genes de anticorpo em células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados pelo seu nivel de expressão e aumentados em escala para produzir anticorpos. Anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes e/ou células de cultura. Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressos noutros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, p. ex. E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgénicos não humanos, tais como em leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgénicas; ver p. ex. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147- 157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Utilização de Sequências de Anticorpos Parciais para Expressar Anticorpos Intactos (i.e. humanização e quimerização). a) Quimerização
Os anticorpos monoclonais de murideo podem ser utilizados como anticorpos terapêuticos em seres humanos quando marcados com toxinas ou isótopos radioativos. Os anticorpos de murideo não marcados são altamente imunogénicos no homem quando são aplicados repetitivamente conduzindo à redução do efeito terapêutico. A imunogenicidade principal é mediada pelas regiões constantes das cadeias pesadas. A imunogenicidade de anticorpos de murideo no homem pode ser reduzida ou completamente evitada se os respetivos anticorpos forem tornados quiméricos ou humanizados. Os anticorpos quiméricos são anticorpos cujas diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles possuindo uma região variável derivada de um anticorpo de murideo e uma região constante de uma imunoglobulina humana. A quimerização de anticorpos é alcançada através da união das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpo de murideo com a região constante da cadeia pesada e leve humana (p. ex. tal como descrito por Kraus et al., em "Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy" ISBN-0-89603-918-8). Numa concretização preferida, os anticorpos quiméricos são gerados através da união da região constante de cadeia leve capa humana à região variável da cadeia leve de murideo. Numa concretização também preferida, os anticorpos quiméricos podem ser gerados através da união da região constante da cadeia leve lambda humana com a região variável da cadeia leve de murideo. As regiões constantes das cadeias pesadas preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgGl, IgG3 e IgG4. Outras regiões constantes das cadeias pesadas preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM. b) Humanização
Os anticorpos interagem com antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que se localizam nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) das cadeias pesadas e leves. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDR são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDR. Como as sequências das CDR são responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades dos anticorpos de ocorrência natural específicos através da construção de vetores de expressão que incluam sequências CDR dos anticorpos de ocorrência natural específicos enxertadas em sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, p. ex., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033) . Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de ADN públicas que incluem sequências génicas de anticorpos da linha germinativa. Estas sequências da linha germinativa diferirão das sequências génicas de anticorpos maduros porque não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados pela união de V (D) J durante a maturação das células B. As sequências génicas da linha germinativa diferirão também das sequências de um anticorpo de repertório secundário de elevada afinidade no indivíduo uniformemente em toda a região variável. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente pouco frequentes na porção amino-terminal da região estrutural 1 e na porção carboxi-terminal da região estrutural 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter toda a sequência de ADN de um determinado anticorpo para recrear um anticorpo recombinante intacto possuindo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (ver WO 99/45962). Sequências das cadeias pesadas e leves parciais abrangendo as regiões CDR são tipicamente suficientes para este fim. A sequência parcial é utilizada para determinar que variável da linha germinativa e segmentos génicos de união contribuíram para os genes variáveis do anticorpo recombinado. A sequência da linha germinativa é então utilizada para preencher as porções em falta das regiões variáveis. As sequências de comando das cadeias pesadas e leves são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar sequências em falta, sequências de ADNc clonadas podem ser combinadas com oligonucleótidos sintéticos através de ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleótidos curtos, sobreponíveis, e combinados através de amplificação por PCR para criar um clone da região variável inteiramente sintético. Este processo tem certas vantagens tal como a eliminação ou inclusão de determinados locais de restrição, ou a otimização de determinados codões.
As sequências nucleotídicas de transcritos das cadeias pesadas e leves de hibridomas são utilizadas para desenhar um conjunto sobreponível de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às das sequências naturais. As sequências sintéticas das cadeias pesadas e capa podem diferir das sequências naturais de três formas: cadeias de bases nucleotídicas repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleótidos e a amplificação por PCR; locais de iniciação da tradução ótimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870) e locais HindIII são concebidos a montante dos locais de iniciação da tradução.
Tanto para as regiões variáveis das cadeias pesadas como das leves, as sequências de cadeias de codificação otimizadas e as correspondentes de não codificação são quebradas em aproximadamente 30-50 nucleótidos no ponto médio do correspondente oligonucleótido não codificador. Assim, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser montados em conjuntos de cadeias duplas sobreponíveis que abrangem segmentos de 150-400 nucleótidos. Os bancos são então utilizados como moldes para produzir produtos de amplificação por PCR de 150-400 nucleótidos. Tipicamente, um único conjunto de oligonucleótidos da região variável será quebrado em dois bancos que são amplificados separadamente para gerar dois produtos de PCR sobreponíveis. Estes produtos sobreponíveis são então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Pode também ser desejável incluir um fragmento sobreponível da região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve na amplificação por PCR para gerar fragmentos que possam ser facilmente clonados nas construções do vetor de expressão.
As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves reconstruídas tornadas quiméricas ou humanizadas são então combinadas com sequências clonadas promotoras, de comando, de iniciação da tradução, da região constante, não traduzidas a 3' , de poliadenilação e de terminação da transcrição, para formar construções de vetores de expressão. As construções de expressão das cadeias pesadas e leves podem ser combinadas num único vetor, co-transfectadas, transfectadas em série, ou transfectadas separadamente em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa ambas as cadeias. Os plasmídeos para utilização na construção de vetores de expressão para IgG humana são descritos abaixo. Os plasmídeos foram construídos de forma a que as sequências de ADNc da cadeia pesada V e leve capa V amplificadas por PCR pudessem ser utilizadas para reconstruir minigenes das cadeias pesadas e leves completas. Estes plasmídeos podem ser utilizados para expressar completamente anticorpos IgGl, Capa ou IgG4, Capa humanos ou quiméricos. Plasmídeos semelhantes podem ser construídos para expressão de outros isotipos da cadeia pesada, ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeias leves lambda.
Assim, noutro aspeto do invento, as características estruturais dos anticorpos anti-CLD18 do invento, são utilizadas para criar anticorpos anti-CLD18 humanizados estruturalmente relacionados que mantenham pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos do invento, tal como a ligação a CLD18. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de anticorpos monoclonais de ratinho podem ser combinadas de forma recombinante com regiões estruturais e CDR humanas conhecidas para criar mais anticorpos anti-CLD18 humanizados concebidos de forma recombinante do invento.
Ligação a células que expressam o antigénio A capacidade do anticorpo para se ligar a CLD18 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, tal como os expostos nos exemplos (p. ex., ELISA, Western blot, análise de Imunofluorescência e citometria de fluxo)
Caracterização da ligação dos anticorpos
Para purificar anticorpos anti-CLD18, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos rotativos de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Alternativamente, os anticorpos anti-CLD18 podem ser produzidos em biorreatores baseados em diálise. Os sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína G-Sepharose ou proteína A-sepharose. A IgG eluída pode ser verificada através de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta resolução para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80°C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CLD18 selecionados se ligam a epitopos únicos, pode ser utilizada mutagénese dirigida ao local ou a múltiplos locais.
Determinação do isotipo
Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, podem ser efetuados ELISA do isotipo com vários estojos comerciais (p. ex. Zymed, Roche Diagnostics). Os poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com Ig anti-ratinho. Após o bloqueio, as placas são feitas reagir com anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo purificados, à temperatura ambiente durante duas horas. Os poços podem em seguida ser feitos reagir com IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3, IgA de ratinho ou sondas conjugadas com peroxidase específicas de IgM de ratinho. Após lavagem, as placas podem ser reveladas com substrato ABTS (1 mg/ml) e analisadas a uma DO de 405-650. Alternativamente, pode ser utilizado o IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, N.2 Cat. 1493027) tal como descrito pelo fabricante.
Análise de citometria de fluxo
Para demonstrar a presença de anticorpos anti-CLD18 em soros de ratinhos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLD18, pode ser utilizada citometria de fluxo. As linhas celulares que expressam CLD18 naturalmente, ou após transfecção, e controlos negativos sem expressão de CLD18 (criados sob condições de crescimento padrão) podem ser misturados com várias concentrações de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo FBS a 1%, e podem ser incubadas a 4°C durante 30 min. Após lavagem, o anticorpo anti-IgG marcado com APC ou Alexa647 pode ligar-se ao anticorpo monoclonal ligado a CLD18 sob as mesmas condições que a coloração de anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas através de citometria de fluxo com um instrumento FACS utilizando propriedades de luz e dispersão lateral para apanhar células vivas individuais. Para distinguir os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 de ligadores não específicos numa única medição, pode ser empregue o método de co-transfecção. As células transfectadas transientemente com plasmídeos codificando CLD18 e um marcador fluorescente podem ser coradas, como descrito acima. As células transfectadas podem ser detetadas num canal de fluorescência diferente do das células coradas por anticorpos. Como a maioria das células transfectadas expressa ambos os transgenes, os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 ligam-se de preferência a células que expressam um marcador fluorescente, enquanto os anticorpos não específicos se ligam numa razão comparável a células não transfectadas. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado para além de, ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.
As proteínas de junções de oclusão tendem a ser internalizadas, se o contacto célula-célula com células vizinhas particularmente aderentes se perder por p. ex. destacamento das células. A expressão na superfície celular de CLD18 pode ser otimizada através de a) ajuste das condições de cultura, p. ex. cultivando numa densidade celular mais elevada de um modo padronizado, utilizando destacamento suave (p. ex. EDTA 2 mM/PBS ou acutase), processamento à temperatura ambiente, e adição de inibidores de endocitose (p. ex. azida de sódio) ou activadores da transcrição ou tradução de CLD18, e através de b) seleção e clonagem de células mantendo CLD18 a níveis elevados na superfície celular, p. ex. através de seleção com antibióticos em termos de células transfectadas, através de separação de células imunomagnética ou por FACS, e através de clonagem por diluição limitada.
Microscopia de imunofluorescência
Para demonstrar a presença de anticorpos anti-CLD18 em soros de ratinhos imunizados ou ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLD18, pode ser utilizada análise de microscopia de imunofluorescência. Por exemplo, as linhas celulares que expressam CLD18, espontaneamente ou após transfecção, e controlos negativos sem expressão de CLD18 são criadas em lâminas de câmaras sob condições de crescimento padrão em meio DMEM/F12, suplementado com soro fetal de vitelo a 10% (FCS) , L-glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. Células podem então ser fixadas com metanol ou paraformaldeído ou deixadas sem tratamento. As células podem então ser feitas reagir com anticorpos monoclonais contra CLD18 durante 30 min. a 25°C. Após lavagem, as células podem reagir com um anticorpo secundário anti-IgG de ratinho marcado com Alexa555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem então ser examinadas através de microscopia de fluorescência.
Os níveis totais de CLD18 nas células podem ser observados quando as células são fixadas em metanol ou fixadas em paraformaldeído e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e células fixadas em paraformaldeído não permeabilizadas, a localização na superfície de CLD18 pode ser examinada. Adicionalmente, o direcionamento de CLD18 em junções de oclusão pode ser analisado através de co-coloração com marcadores de junções de oclusão tais como ZO-1. Além disso, os efeitos da ligação de anticorpo e localização de CLD18 dentro da membrana celular podem ser examinados.
Western Blot A IgG anti-CLD18 pode ser ainda testada quanto à reatividade com antigénio CLD18 através de Western Blotting. Resumidamente, extratos celulares de células que expressam CLD18 e controlos negativos adequados podem ser preparados e sujeitos a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS) . Após eletroforese, os antigénios separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados, e sondados com os anticorpos monoclonais a testar. A ligação de IgG pode ser detetada utilizando anti-IgG de ratinho-peroxidase e revelada com substrato ECL.
Imuno-histoquímica
Os IgG de ratinho anti-CLD18 podem ainda ser testados quanto à reatividade com antigénio CLD18 através de imuno-histoquímica de um modo bem conhecido do perito, p. ex. utilizando crio-secções fixadas em paraformaldeído ou acetona ou secções de tecido impregnadas em parafina fixadas com paraformaldeído de amostras de tecido não canceroso ou tecido de cancro obtidas de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de ratinhos portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas celulares que expressam CLD18 espontaneamente (p. ex. DAN-G, SNU-16, ou KATO-III) ou após transfecção (p. ex. HEK293). Para imunocoloração, anticorpos reativos com CLD18 podem ser incubados seguido de anticorpos de cabra anti-ratinho ou cabra anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (DAKO) de acordo com as instruções do vendedor.
Atividades Fagocitica e de Morte Celular dos anticorpos in vitro
Além de se ligarem especificamente a CLD18, os anticorpos anti-CLD18 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar fagocitose e morte de células que expressem CLD18. 0 ensaio de atividade de anticorpos monoclonais in vitro proporcionará uma pesquisa inicial antes do ensaio em modelos in vivo.
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) :
Resumidamente, células polimorfonucleares (PMN), células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras, de dadores saudáveis podem ser purificadas através de centrifugação de densidade em Ficoll Hypaque, seguida de lise dos eritrócitos contaminantes. As células efetoras lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor a 10%, ou, alternativamente, com soro humano inactivado pelo calor a 5% e misturadas com células alvo marcadas com 51Cr que expressam CLD18, a várias razões de células efetoras para células alvo. Alternativamente, as células alvo podem ser marcadas com um ligando de reforço da fluorescência (BATDA). Um quelato altamente fluorescente de Európio com o ligando de reforço que é libertado a partir de células mortas pode ser medido por um fluorómetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfecção de células alvo com luciferase. O amarelo Lúcifer adicionado pode então ser oxidado apenas por células viáveis. Os IgG anti-CLD18 purificados podem então ser adicionados a várias concentrações. Uma IgG humana irrelevante pode ser utilizada como controlo negativo. Os ensaios podem ser realizados durante 4 a 20 horas a 37°C dependendo do tipo de célula efetora utilizado. As amostras podem ser ensaiadas quanto à citólise através da medição da libertação de 51Cr ou da presença do quelato EuTDA no sobrenadante da cultura. Alternativamente, a luminescência resultante da oxidação do amarelo Lúcifer pode ser uma medida das células viáveis.
Os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem também ser testados em várias combinações para determinar se a citólise é reforçada com múltiplos anticorpos monoclonais.
Citotoxicidade dependente do complemento (CDC):
Os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar CDC, utilizando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, o soro para complemento pode ser obtido a partir de sangue de um modo conhecido do perito na técnica. Para determinar a atividade de CDC de mAb, podem ser utilizados diferentes métodos. Por exemplo, pode ser medida a libertação de 51Cr ou pode ser avaliada a elevada permeabilidade da membrana utilizando um ensaio de exclusão de iodeto de propídio (PI). Resumidamente, as células alvo podem ser lavadas e podem ser incubadas 5xl05/ml com várias concentrações de mAb durante 10-30 min. à temperatura ambiente ou a 37 °C. O soro ou plasma pode então ser adicionado a uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37°C durante 20-30 min. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI num tubo FACS. A mistura pode então ser analisada imediatamente através de citometria de fluxo utilizando FACSArray.
Num ensaio alternativo, a indução de CDC pode ser determinada em células aderentes. Numa concretização deste ensaio, as células são semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3xl04/poço em placas de microtitulação de fundo plano de cultura de tecidos. O meio de crescimento do dia seguinte é removido e as células são incubadas em triplicado com os anticorpos. As células de controlo são incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo saponina a 0,2% para a determinação da lise de fundo e da lise máxima, respetivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante é removido e é adicionado às células plasma ou soro humano a 20% (v/v) em DMEM (pré-aquecido a 37°C) e incuba-se durante mais 20 min. a 37°C. Todas as células de cada amostra são adicionadas a solução de iodeto de propídio (10 yg/ml). Em seguida, os sobrenadantes são substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm é medida a 600 nm utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica é calculada da seguinte forma: % de lise específica = (fluorescência da amostra-fluorescência de fundo)/(fluorescência da lise máxima-fluorescência de fundo)x10 0.
Inibição da proliferação celular através de anticorpos monoclonais:
Para testar a capacidade de iniciar apoptose, os anticorpos monoclonais anti-CLD18 podem, por exemplo, ser incubados com células tumorais positivas para CLD18, p. ex., SNU-16, DAN-G, KATO-III ou células tumorais transfectadas com CLD18 a 37°C durante cerca de 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampão de ligação a Anexina V (BD Biosciences), e incubadas com Anexina V conjugada com FITC ou APC (BD Biosciences) durante 15 min. no escuro. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI (10 g/ml em PBS) num tubo de FACS e avaliadas imediatamente através de citometria de fluxo (como acima). Alternativamente, uma inibição geral da proliferação celular através de anticorpos monoclonais, pode ser detetada com estojos comercialmente disponíveis. O DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, N.2 Cat. AD0200) é um imunoensaio não isotípico baseado na medição de incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante a síntese de ADN das células em proliferação em microplacas. O BrdU incorporado é detetado utilizando anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a deteção dos anticorpos, as células são fixadas e o ADN é desnaturado utilizando solução Fix. O anticorpo não ligado é lavado e o indutor DELFIA é adicionado para dissociar os iões de európio do anticorpo marcado para a solução onde formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando fluorometria resolvida no tempo na deteção - é proporcional à síntese de ADN na célula de cada poço.
Estudos pré-clinicos
Os anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18 podem também ser testados num modelo in vivo (p. ex. em ratinhos imunodeficientes portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas celulares que expressam CLD18, p. ex., DAN-G, SNU-16, ou KATO-III, ou após transfecção, p. ex. HEK293) para determinar a sua eficácia no controlo do crescimento de células tumorais que expressam CLD18.
Estudos in vivo após xenoenxerto de células tumorais que expressam CLD18 em ratinhos imunocomprometidos ou em outros animais podem ser realizados utilizando os anticorpos do invento. Os anticorpos podem ser administrados a ratinhos livres de tumor, seguido por injeção de células tumorais para medir os efeitos dos anticorpos para prevenir a formação de tumores ou de sintomas relacionados com tumores. Os anticorpos podem ser administrados a ratinhos portadores de tumores para determinar a eficácia terapêutica dos respetivos anticorpos para reduzir o crescimento, metástase ou sintomas relacionados com tumores. A aplicação dos anticorpos pode ser combinada com aplicação de outras substâncias tais como fármacos citostáticos, inibidores de fatores de crescimento, bloqueadores do ciclo celular, inibidores de angiogénese ou outros anticorpos para determinar a eficácia sinérgica e potencial toxicidade de combinações. Para analisar os efeitos secundários tóxicos mediados pelos anticorpos do invento, animais podem ser inoculados com anticorpos ou reagentes de controlo e cuidadosamente investigados quanto a sintomas possivelmente relacionados com a terapia de anticorpos de CLD18. Possíveis efeitos secundários da aplicação in vivo de anticorpos de CLD18 incluem particularmente toxicidade em tecidos que expressam CLD18 incluindo estômago e pulmão. Os anticorpos que reconhecem CLD18 em humanos e noutras espécies, p. ex., ratinhos, são particularmente úteis para prever potenciais efeitos secundários mediados pela aplicação de anticorpos monoclonais de CLD18 em seres humanos.
Mapeamento de epitopos 0 mapeamento de epitopos reconhecidos pelos anticorpos do invento pode ser realizado como descrito em detalhe em "Epitope Mapping Protocols" (Methods in Molecular Biology) de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay. I. Moléculas Biespecíficas/Multiespecíficas Que se Ligam a CLD18
Ainda noutra concretização do invento, os anticorpos para CLD18 podem ser derivatizados ou ligados a outras moléculas funcionais, p. ex., outro péptido ou proteína (p. ex., um fragmento Fab') para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a múltiplos locais de ligação ou epitopos alvo. Por exemplo, um anticorpo do invento pode ser funcionalmente ligado (p. ex. através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como um outro anticorpo, péptido ou mimético de ligação.
Consequentemente, o presente invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLD18 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. Numa concretização particular do invento, o segundo epitopo alvo é um recetor de Fc, p. ex. Fc-gamaRI humano (CD64) ou um recetor de Fc-alfa humano (CD89), ou um recetor de células T, p. ex. CD3. Portanto, o invento inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de se ligar a células efetoras que expressam Fc-gamaR, Fc-alfaR ou Fc-épsilonR (p. ex. monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMN)), e a células alvo que expressam CLD18. Estas moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem dirigir células que expressam CLD18 a células efetoras e podem desencadear atividades de células efetoras mediadas pelo recetor de Fc, tais como fagocitose de células que expressam CLD18, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), libertação de citocinas, ou geração de anião superóxido.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento podem ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CLD18. Numa concretização, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-fator de melhoria (EF), p. ex. uma molécula que se liga a uma proteína da superfície envolvida em atividade citotóxica e aumenta deste modo a resposta imunitária contra a célula alvo. A "porção anti-fator de melhoria" pode ser um anticorpo, fragmento funcional de anticorpo ou um ligando que se liga a uma dada molécula, p. ex., um antigénio ou um recetor, e resulta deste modo numa melhoria do efeito dos determinantes de ligação para o recetor de Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção anti-fator de melhoria" pode ligar-se a um recetor de Fc ou um antigénio da célula alvo. Alternativamente, a porção anti-fator de melhoria pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade a que a primeira e a segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção anti-fator de melhoria pode ligar-se a uma célula T citotóxica (p. ex., através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imunitária que resulte numa maior resposta imunitária contra a célula alvo).
Numa concretização, as moléculas biespecificas e multiespecificas do invento compreendem como especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, incluindo, p. ex., um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dimero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer seu fragmento mínimo tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples tal como descrito em Ladner et al., US 4946778. 0 anticorpo pode também ser uma proteína de fusão domínio de ligação-imunoglobulina tal como divulgado em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
Numa concretização, as moléculas biespecificas e multiespecificas do invento compreendem uma especificidade de ligação para um Fc-gamaR ou um Fc-alfaR presente na superfície de uma célula efetora, e uma segunda especificidade de ligação para um antigénio da célula alvo, p. ex., CLD18.
Numa concretização, a especificidade de ligação para um recetor de Fc é proporcionada por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG) . Tal como aqui utilizada, a expressão "recetor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes da cadeia gama localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas do recetor transmembranares ou solúveis que são agrupadas em três classes de recetores de Fc-gama: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32), e Fc-gamaRIII (CD16). Numa concretização preferida, o recetor de Fc-gama é um Fc-gamaRI humano de elevada afinidade. A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais preferidos são descritas por Fanger et al. em WO 88/00052 e em US 4954617. Estes anticorpos ligam-se a um epitopo de Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ou Fc-gamayRIII num local que é distinto do local de ligação de Fc ao recetor e, assim, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por niveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-Fc-gammaRI específicos úteis neste invento são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outras concretizações, o anticorpo anti-recetor de Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e WO 94/10332. A linha celular produtora do anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection a 4 de Novembro de 1992, sob a designação HA022CL1 e tem o N.2 de acesso CRL 11177.
Ainda noutras concretizações preferidas, a especificidade de ligação para um recetor de Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um recetor de IgA humano, p. ex., um recetor de Fc-alfa (Fc-alfaRI (CD89)), a ligação do qual não é, de preferência, bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA) . Na expressão "recetor de IgA" pretende-se incluir o produto génico de um gene alfa (Fc-alfaRI) localizado no cromossoma 19. Sabe-se que este gene codifica várias isoformas transmembranares processadas alternativamente de 55 a 110 kDa. Fc-alfaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinófilos e neutrófilos, mas não em populações de células não efetoras. Fc-alfaRI tem afinidade média tanto para IgAl como para IgA2, que aumenta após exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et ai. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423- 440) . Quatro anticorpos monoclonais específicos de Fc-alfaRI, identificados como A3, A59, A62 e All, que se ligam a Fc-alfaRI fora do domínio de ligação ao ligando IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).
Fc-alfaRI e Fc-gamaRI são os recetores de desencadeamento preferidos para utilização no invento porque: (1) são expressos principalmente em células imunitárias efetoras, p. ex., monócitos, PMN, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos a níveis elevados (p. ex., 5000-100000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (p. ex., ADCC, fagocitose); (4) medeiam maior apresentação do antigénio, de antigénios incluindo auto-antigénios, dirigidos para eles.
Noutra concretização, a molécula biespecifica é constituída por dois anticorpos monoclonais de acordo com o invento que têm atividades funcionais complementares, tais como um anticorpo funcionando predominantemente através da indução de CDC e o outro anticorpo funcionando predominantemente através da indução de apoptose.
Um "anticorpo específico de uma célula efetora" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que se liga ao recetor de Fc de células efetoras. Os anticorpos preferidos para utilização no presente invento ligam-se ao recetor de Fc de células efetoras num local ao qual a imunoglobulina endógena não se liga.
Tal como aqui utilizado, a expressão "célula efetora" refere-se a uma célula imunitária que está envolvida na fase efetora de uma resposta imunitária, em oposição às fases cognitiva e de ativação de uma resposta imunitária. Células imunitárias exemplares incluem células de origem mielóide ou linfóide, p. ex., linfócitos (p. ex., células B e células T, incluindo células T citolíticas (CTL) , células assassinas, células assassinas naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efetoras expressam recetores de Fc específicos e realizam funções imunológicas específicas. Em concretizações preferidas, uma célula efetora é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), p. ex., um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR estão envolvidos na morte específica de células alvo e apresentam antigénios a outros componentes do sistema imunitário, ou se ligam a células que apresentam antigénios. Noutras concretizações, uma célula efetora pode fagocitar um antigénio alvo, célula alvo, ou microorganismo. A expressão de um determinado FcR numa célula efetora pode ser regulada por fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, verificou-se que a expressão de Fc-gamaRI é sobre-regulada pelo interferão gama (IFN- ). Esta expressão aumentada aumenta a atividade citotóxica de células possuindo Fc-gamaRI contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar um antigénio alvo ou uma célula alvo. "Célula alvo" significa qualquer célula indesejável num sujeito (p. ex., um ser humano ou animal) que pode ser atingida por um anticorpo do invento. Em concretizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa ou sobre-expressa CLD18. Células que expressam CLD18 incluem tipicamente células tumorais.
As moléculas biespecificas e multiespecificas do presente invento podem ser feitas usando técnicas químicas (ver, p. ex., D.M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (ver US 4474893, para Reading), ou técnicas de ADN recombinante.
Em particular, moléculas biespecificas e multiespecificas do presente invento podem ser preparadas através de conjugação das especificidades de ligação dos constituintes, p. ex., as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CLD18, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecifica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, uma variedade de agentes de ligação ou reticulação pode ser utilizada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver p. ex., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648) . Outros métodos incluem os descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) N.2 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), e Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de uma ligação sulfidrilo das regiões charneira C-terminais das duas cadeias pesadas. Numa concretização particularmente preferida, a região charneira é modificada para conter um número impar de resíduos de sulfidrilo, de preferência um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica e multiespecífica é uma proteína de fusão mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou ligando χ Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica do invento, p. ex., uma molécula biespecífica, pode ser uma molécula de cadeia simples, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia simples, uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem também ser moléculas de cadeia simples ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Os métodos para preparação de moléculas bi- e multiespecíficas são descritos, por exemplo em US 5260203, US 5455030, US 4881175, US 5132405, US 5091513, US 5476786, US 5013653, US 5258498 e US 5482858. A ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada através de um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise de FACS, um bioensaio (p. ex., inibição do crescimento), ou um Ensaio de Western Blot. Cada um destes ensaios deteta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente marcado (p. ex., um anticorpo), específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detetados utilizando, p. ex., um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detetados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., "Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques", The Endocrine Society, Março, 1986). 0 isótopo radioativo pode ser detetado por meios tais como a utilização de um contador- ou um contador de cintilações ou através de autorradiografia. II. Imunoconjugados
Noutro aspeto, o presente invento apresenta um anticorpo anti-CLD18 conjugado com uma porção ou agente terapêutico, tal como uma citotoxina, um fármaco (p. ex., um imunossupressor), ou um isótopo radioativo. Tais conjugados são aqui referidos como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial e, em particular, mate as células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos.
Agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados do invento incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (p. ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo-descarbazina), agentes alquilantes (p. ex., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina-platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p. ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC), e agentes anti-mitóticos (p. ex., vincristina e vinblastina). Numa concretização preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Noutra concretização, o agente terapêutico é um imunossupressor. Ainda numa outra concretização, o agente terapêutico é GM-CSF. Numa concretização preferida, o agente terapêutico é doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida ou ricina A.
Os anticorpos do presente invento podem também ser conjugados com um radioisótopo, p. ex., iodo-131, ítrio-90 ou índio-111, para gerar radiofármacos citotóxicos para tratamento de um distúrbio relacionado com CLD18, tal como um cancro. Os conjugados de anticorpo do invento podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção fármaco não deve ser entendida como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou um polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou seu fragmento ativo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou o interferão- ; ou, modificadores da resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos ("GM-CSF"), fator de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.
As técnicas para conjugação de tal fração terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, ver, p. ex., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agent In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and
Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation e Cytotoxic Proprieties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982) .
Noutra concretização, os anticorpos de acordo com o invento são ligados a um ligador-quelante, p. ex., tiuxetano, que permite que o anticorpo seja conjugado com um isótopo radioativo. III. Composições Farmacêuticas
Noutro aspeto, o presente invento proporciona uma composição, p. ex., uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos do presente invento. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com transportadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como as divulgadas em Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Numa concretização, as composições incluem uma combinação de múltiplos (p. ex., dois ou mais) anticorpos isolados do invento que atuam através de mecanismos diferentes, p. ex., um anticorpo que atua predominantemente através da indução de CDC em combinação com outro anticorpo que atua predominantemente através de indução de apoptose.
As composições farmacêuticas do invento podem também ser administradas em terapia de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição do presente invento com pelo menos um agente anti-inflamatório ou, pelo menos, um agente imunossupressor. Numa concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes anti-inflamatórios, tais como um fármaco esteróide ou um FAINE (fármaco anti-inflamatório não esteróide). Agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2 tais como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), FAINE tais como ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis) , diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
Noutra concretização, tais agentes terapêuticos incluem agentes que conduzem ao esgotamento ou inactivação funcional de células T reguladoras como ciclofosfamida em dose baixa, anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-IL2 ou anti-recetor de IL2 .
Ainda noutra concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais quimioterapêuticos, tais como derivados de Taxol, taxotere, gemcitabina, 5-Fluorouracilo, doxorrubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar) . Noutra concretização, os anticorpos do presente invento podem ser administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos, que de preferência mostram eficácia terapêutica em pacientes sofrendo de cancro do estômago, esofágico, pancreático e do pulmão.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em conjunto com radioterapia e/ou transplante autólogo de células estaminais periféricas ou de medula óssea.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados a partir de anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-EPCAM, anti-EGFR, anti-Her2/neu, e anticorpos anti-CD40.
Ainda noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-C3b(i) para aumentar a ativação do complemento.
Tal como aqui utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (p. ex., através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser revestido num material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que mantém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver p. ex., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19).
Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, e fosforoso, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos. Sais de adição básica incluem os derivados de metais de terra alcalina, tais como sódio, potássio, magnésio e cálcio, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, e procaína.
Uma composição do presente invento pode ser administrada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado pelo perito, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p. ex., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Para administrar um composto do invento por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inactivação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito num transportador apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções tampão aquosas. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água, bem como lipossomas convencionais (Strejan et al. , (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27) .
Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições farmacêuticas do presente invento está contemplada. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma elevada concentração de fármaco. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e suas misturas adequadas. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por microfiltração.
Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e secagem por congelação (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem tal como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem do invento são ditadas por, e diretamente dependentes de, (a) as características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a alcançar, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio e sulfito de sódio; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo e alfa-tocoferol; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico e ácido fosfórico.
Para as composições terapêuticas, formulações do presente invento incluem as adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas através de quaisquer métodos conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do sujeito a tratar e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.
Geralmente, dos cem porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, de preferência de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, com maior preferência de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento.
Formulações do presente invento que são adequadas para administração vaginal incluem também pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo tais transportadores como se sabe serem apropriados na técnica. Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de composições deste invento incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões, ou propulsores que possam ser requeridos.
As frases "administração parentérica" e "administrado por via parentérica" tal como aqui utilizadas, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente através de injeção, e incluem, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, injeção epidural e intrasternal e infusão.
Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e através da utilização de tensioativos.
Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes humidificadores, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, como através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, e ácido fenol-sórbico. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, e cloreto de sódio, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser alcançada através da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Numa concretização, os anticorpos monoclonais do invento são administrados na forma cristalina através de injeção subcutânea, cf. Yang et al., (2003) PNAS, 100(12): 6934-6939. Quando os compostos do presente invento são administrados como produtos farmacêuticos a humanos e animais, podem ser administrados sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,01-99,5% (com maior preferência, 0,1 a 90%) de ingrediente ativo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
Independentemente da via de administração selecionada, os compostos do presente invento, que podem ser utilizados numa forma hidratada adequada, e/ou nas composições farmacêuticas do presente invento, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis através de métodos convencionais conhecidos dos peritos na técnica.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas do presente invento podem ser variados de modo a obter-se uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares do presente invento empregues, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a empregar, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e a história médica prévia do paciente a tratar, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
Um médico ou veterinário com vulgar perícia na técnica pode determinar prontamente e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos do invento empregues na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que o requerido para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado fosse alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição do invento será a quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. É preferível que a administração seja por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, de preferência administrada proximal ao local do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente a intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente em formas de unidade de dosagem. Embora seja possível que um composto do presente invento seja administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação (composição) farmacêutica.
Numa concretização, os anticorpos do invento podem ser administrados através de infusão, de preferência infusão contínua lenta durante um longo período, tal como mais de 24 horas, para reduzir efeitos secundários tóxicos. A administração pode também ser realizada por infusão continua ao longo de um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada através da medição da quantidade de anticorpos monoclonais anti-CLD18 em circulação após a administração numa amostra biológica usando anticorpos anti-idiotípicos que se dirigem aos anticorpos anti-CLD18.
Ainda noutra concretização, os anticorpos são administrados através de terapia de manutenção, tal como, p. ex., uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.
Ainda noutra concretização, os anticorpos de acordo com o invento podem ser administrados através de um regime incluindo uma infusão de um anticorpo contra CLD18 seguida de uma infusão de um anticorpo contra CLD18 conjugado com um isótopo radioativo. 0 regime pode ser repetido, p. ex., 7 a 9 dias depois.
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa concretização preferida, uma composição terapêutica do invento pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados em US 5399163; US 5383851; US 5312335; US 5064413; US 4941880; US 4790824; ou US 4596556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis no presente invento incluem os descritos em: US 4487603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuição de medicação a uma taxa controlada; US 4486194, que divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; US 4447233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; US 4447224, que divulga um aparelho de infusão implantável de caudal variável para distribuição contínua de fármacos; US 4439196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos possuindo compartimentos de múltiplas câmaras; e US 4475196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos.
Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos são bem conhecidos dos peritos na técnica. Em certas concretizações, os anticorpos do invento podem ser formulados para assegurar uma distribuição correta in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para assegurar que os compostos terapêuticos do invento atravessam a BHE (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, p. ex., US 4522811; US 5374548; e US 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para dentro de células ou órgãos específicos, e, portanto, aumentam a distribuição de fármacos direcionada (ver, p. ex., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685) . Porções de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, p. ex., US 5416016 para Low et ai.); manósidos (Umezawa et ai., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman et ai. (1995) FEBS Lett. 357: 140, M. Owais et ai. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); e recetor de proteína A tensioativo (Briscoe et ai. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134) .
Numa concretização do invento, os compostos terapêuticos do invento são formulados em lipossomas. Numa concretização mais preferida, os lipossomas incluem uma porção de direcionamento. Numa concretização mais preferida, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos através de injeção do bolo num local proximal à área desejada, p. ex., o local de um tumor. A composição deve ser fluida até ao ponto de ser fácil a utilização de seringa. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos.
Noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser formulados para prevenir ou reduzir o seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito através de métodos conhecidos na técnica, p. ex., através de PEGuilação dos anticorpos ou através da utilização de fragmentos F(ab)2'. Outras referências podem ser feitas a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation". J. Immunol. Methods, 152: 177-190; e a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins", Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 27 9-283.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia tumoral pode ser medida através de respostas tumorais objetivas que podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (RC) é definida como uma prova não clinica, radiológica ou outra, de doença. Uma resposta parcial (RP) resulta de uma redução do tamanho total do tumor superior a 50%. O tempo mediano até à progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta objetiva do tumor.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia tumoral pode também ser medida através da sua capacidade para estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir cancro pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada através do exame da capacidade do composto para inibir o crescimento celular ou a apoptose através de ensaios in vitro conhecidos do perito na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar os sintomas num sujeito. Um vulgar perito na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou a via de administração selecionada. A composição deve ser estéril e fluida até ao ponto de a composição poder ser distribuída através de uma seringa. Além da água, o transportador pode ser uma solução salina tamponada isotónica, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e suas misturas adequadas. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção de longo prazo das composições injetáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto ativo é adequadamente protegido, tal como descrito acima, o composto pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível assimilável. IV. Utilizações e Métodos do Invento
Os anticorpos (incluindo imunoconjugados, biespecíficos/multiespecíficos, composições e outros derivados aqui descritos) do presente invento têm numerosas utilidades terapêuticas envolvendo o tratamento de distúrbios envolvendo células que expressam CLD18. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados a células em cultura, p. ex. , in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p. ex. , in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios tais como aqueles aqui descritos. Tal como aqui utilizado, pretende-se que o termo "sujeito" inclua humanos e animais não humanos que respondem aos anticorpos contra CLD18. Os sujeitos preferidos incluem pacientes humanos possuindo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados matando células doentes, em particular células caracterizadas por um padrão de expressão alterado de CLD18 em comparação com células normais.
Um efeito terapêutico nos tratamentos aqui discutidos é de preferência alcançado através das propriedades funcionais dos anticorpos do invento para mediar a morte de células, por exemplo por indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), apoptose, adesão homotípica e/ou fagocitose, de preferência por indução de lise mediada por CDC e/ou lise mediada por ADCC.
Por exemplo, numa concretização, os anticorpos do presente invento podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigénico, p. ex. , um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais que expressam CLD18 incluindo, por exemplo, cancro gástrico. Exemplos de doenças tumorigénicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam todos os cancros que expressam CLD18 e entidades tumorais, incluindo cancro de estômago, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro colorrectal, cancro hepático, cancro da vesícula biliar e cancro da cabeça-pescoço. Estes cancros podem estar em estádios iniciais, intermédios ou avançados, p. ex. metástase.
As composições farmacêuticas e os métodos de tratamento descritos de acordo com o invento podem também ser úteis para imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.
Noutra concretização, os anticorpos do invento podem ser utilizados para detetar níveis de CLD18 ou formas particulares de CLD18, ou níveis de células que contenham CLD18 na superfície da sua membrana, níveis que podem então ser ligados a certas doenças ou sintomas de doença tal como descrito acima. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para esgotar ou interagir com a função de células que expressam CLD18, implicando, assim, estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser conseguido através do contacto de uma amostra e de uma amostra de controlo com o anticorpo anti-CLD18 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CLD18. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CLD18 são detetados e comparados na amostra e numa amostra de controlo, isto é, uma amostra de referência.
Os anticorpos do invento podem ser inicialmente ensaiados quanto à sua atividade de ligação associada a utilizações terapêuticas ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados utilizando ensaios de citometria de fluxo, tal como aqui descrito.
Além disso, pode ser ensaiada a atividade dos anticorpos no desencadeamento de pelo menos uma atividade celular efetora mediada por efetor, incluindo a inibição do crescimento e/ou a morte de células que expressam CLD18. Por exemplo, pode ser ensaiada a capacidade dos anticorpos para desencadear CDC e/ou apoptose. Os protocolos para ensaio de CDC, adesão homotípica, agrupamento molecular ou apoptose são aqui descritos.
Os anticorpos do invento podem ser utilizados para desencadear, in vivo ou in vitro, uma ou mais das seguintes atividades biológicas: para inibir o crescimento de e/ou a diferenciação de uma célula que expressa CLD18; para matar uma célula que expressa CLD18; para mediar fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa CLD18 na presença de células efetoras; para mediar CDC de uma célula que expressa CLD18 na presença de complemento; para mediar a apoptose de uma célula que expressa CLD18; para induzir adesão homotípica; e/ou para induzir translocação em jangadas lipidicas após ligação a CLD18.
Numa concretização particular, os anticorpos são utilizados in vivo ou in vitro, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com CLD18. Exemplos de doenças relacionadas com CLD18 incluem, entre outros, cancros, tais como cancro gástrico, cancro pancreático, cancro esofágico, cancro de pulmão e cancros tais como os listados acima. CLD18A2 é também expresso em células do estômago normais diferenciadas. Os possíveis efeitos secundários clínicos induzidos pelos anticorpos pela morte destas células podem ser reduzidos ou evitados através da administração paralela de fármacos protetores do estômago tais como antacida, ou inibidores da bomba de protões gástrica tal como omeprazol ou fármacos relacionados.
Vias de administração adequadas das composições de anticorpos do invento, in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas pelos vulgares peritos.
Tal como descrito acima, os anticorpos anti-CLD18 do invento podem ser coadministrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, p. ex., um agente citotóxico, um agente radiotóxico, agente antiangiogénico e agente imunossupressor para reduzir a indução de respostas imunitárias contra os anticorpos do invento. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, p. ex., uma terapia anticancerosa, p. ex., radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como os listados acima. A coadministração dos anticorpos anti-CLD18 do presente invento com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anticancerosos que atuam através de diferentes mecanismos produzindo um efeito citotóxico para as células tumorais. Tal coadministração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou a uma mudança na antigenicidade das células tumorais que as tornariam não reativas com o anticorpo.
Numa outra concretização particular do invento, o sujeito a quem se administra o anticorpo é, adicionalmente, tratado com um agente antiangiogénico incluindo anticorpos direcionados para VEGF ou VEGFR e um ou mais compostos químicos inibindo a angiogénese. 0 pré-tratamento com ou a aplicação paralela destes fármacos pode melhorar a penetração dos anticorpos em tumores em bruto.
Noutra concretização particular do invento, o sujeito a quem é administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um composto inibindo a sinalização do recetor do fator de crescimento, incluindo anticorpos monoclonais de ligação ao recetor EGFR, bem como compostos químicos que inibem a sinalização iniciada pelo recetor EGFR, Herl ou Her2/neu.
As células efetoras específicas do alvo, p. ex., células ligadas a composições (p. ex. anticorpos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) do invento podem também ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para direcionamento podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células possuindo recetores de IgG ou IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas a partir do sujeito a tratar. As células efetoras específicas do alvo podem ser administradas como uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser na ordem de 108 a 109 mas dependerá da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, p. ex., uma célula tumoral que expressa CLD18, e efetuar morte celular através, p.ex. de fagocitose. As vias de administração podem também variar. A terapia com células efetoras específicas do alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção das células alvo. Por exemplo, terapia antitumoral utilizando as composições do invento e/ou células efetoras armadas com estas composições pode ser utilizada em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, pode ser utilizada imunoterapia de combinação para dirigir duas populações distintas de efetores citotóxicos para rejeição de células tumorais. Por exemplo, anticorpos anti-CLD18 ligados a anti-Fc-RI ou anti-CD3 podem ser utilizados em conjunto com agentes de ligação específicos do recetor de IgG ou IgA.
As moléculas biespecíficas e multiespecíficas do invento podem também ser utilizadas para modular os níveis de Fc-gamaR ou Fc-alfaR em células efetoras, tais como através da proteção e eliminação de recetores na superfície celular. Misturas de anti-recetores de Fc podem também ser utilizadas para esta finalidade.
As composições (p. ex., anticorpos, moléculas biespecíficas e multiespecíficas e imunoconjugados) do invento que têm locais de ligação ao complemento, tais como porções de IgGl, 2 ou 3 ou IgM que se ligam ao complemento, podem também ser utilizadas na presença de complemento. Numa concretização, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação do invento e células efetoras apropriadas pode ser suplementado através da adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação do invento pode ser melhorada através da ligação de proteínas do complemento. Noutra concretização, as células alvo revestidas com as composições do invento podem também ser lisadas pelo complemento. Ainda noutra concretização, as composições do invento não ativam o complemento.
As composições do invento podem também ser administradas juntamente com complemento. Consequentemente, dentro do âmbito do invento estão composições compreendendo anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas por o complemento estar localizado em estreita proximidade com os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas.
Alternativamente, os anticorpos, moléculas multiespecificas ou biespecificas do invento e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente. A ligação das composições do presente invento a células alvo causa a translocação do complexo antigénio CLD18-anticorpo para jangadas lipídicas da membrana celular. Tal translocação cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo que podem ativar e/ou aumentar eficientemente a CDC. São aqui também descritos estojos (kits) compreendendo as composições de anticorpos do invento (p. ex. , anticorpos e imunoconjugados) e instruções de utilização. 0 estojo pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais do invento (p. ex., um anticorpo possuindo uma atividade complementar).
Consequentemente, aos doentes tratados com as composições de anticorpo do invento pode ser adicionalmente administrado (antes de, em simultâneo com, ou após a administração de um anticorpo do invento) um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhore ou aumente o efeito terapêutico dos anticorpos do invento. 0 sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que module, p. ex., aumente ou iniba, a expressão ou atividade de recetores de Fc-gama ou Fc-alfa através de, por exemplo, tratamento do indivíduo com uma citocina. Citocinas preferidas incluem fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) , fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão- (IFN- ), e fator de necrose e tumoral (TNF). Outros agentes importantes para aumento da eficácia terapêutica dos anticorpos e composições farmacêuticas aqui descritos são -glucanos que são homopolissacáridos de resíduos ramificados de glicose e são produzidos através de uma variedade de plantas e microorganismos, por exemplo, bactérias, algas, fungos, leveduras e grãos. Podem também ser utilizados fragmentos de -glucanos produzidos por organismos. De preferência, o-glucano é um polímero de (1,3) glicose, em que pelo menos algumas das unidades de glicose do esqueleto, p. ex. 3-6% das unidades de glicose do esqueleto, possuem ramificações tais como ramificações (1,6) . 0 fascículo também divulga métodos para deteção da presença de antigénio CLD18 numa amostra, ou medição da quantidade de antigénio CLD18, compreendendo o contacto da amostra, e de uma amostra de controlo, com um anticorpo que se ligue especificamente a CLD18, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou sua porção e CLD18. É então detetada a formação de um complexo, em que a diferença de formação de um complexo entre a amostra comparada com a amostra de controlo é indicativa da presença de antigénio CLD18 na amostra. 0 fascículo também divulga um método para deteção da presença ou quantificação da quantidade de células que expressam CLD18 in vivo ou in vitro. 0 método compreende (i) a administração a um sujeito de uma composição do invento conjugada com um marcador detetável; (ii) a exposição do sujeito a um meio para deteção do referido marcador detetável para identificar áreas contendo células que expressam CLD18.
Os métodos tal como descritos acima são úteis, em particular, para diagnóstico de doenças relacionadas com CLD18 e/ou a localização de doenças relacionadas com CLD18 tal como doenças cancerígenas. De preferência, uma quantidade de CLD18, de preferência CLD18-A2, numa amostra que seja superior à quantidade de CLD18, de preferência CLD18-A2, numa amostra de controlo é indicativa da presença de uma doença relacionada com CLD18 num sujeito, em particular um ser humano, do qual a amostra é derivada.
Os imunoconjugados do invento podem ser utilizados para direccionar compostos (p. ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) a células que tenham CLD18 expressa na sua superfície através da ligação de tais compostos ao anticorpo. Assim, o fascículo também divulga métodos para a localização ex vivo ou in vitro de células que expressam CLD18, tais como células tumorais circulantes. 0 presente invento é ainda ilustrado através dos seguintes exemplos.
EXEMPLOS 1. Geração de anticorpos de murídeo contra CLD18 a. Imunizações:
Ratinhos Balb/c ou C57/BL6 foram imunizados com vetores de expressão eucarióticos, codificando fragmentos de CLD18 humana (SEQ ID NO: 15, 16; 17, 18) . 50 pg ou 25 pg de ADN plasmídico foram injetados nos quadriceps (intramuscular, i.m.) nos dias 1 e 10 para geração de anticorpos monoclonais de Setl ou alternativamente nos dias 1 e 9, 1 e 11, ou 1, 16 e 36 para geração de anticorpos monoclonais de Set2 na presença de adjuvantes, por exemplo CpG (para detalhes ver Tab. lb) . CpG bem como células transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1) sozinhas ou co-transfectadas adicionalmente com CD40L solúvel de murideo codificando ARN foram injetados por via intramuscular, PEI-Man foi injetado por via intramuscular ou intraperitoneal. A presença de anticorpos dirigidos contra CLD18 humana no soro de ratinhos foi monitorizada através de microscopia de imunofluorescência imunitária entre o dia 16 e 43, dependendo do protocolo de imunização especifico utilizado. A imunofluorescência foi determinada utilizando células HEK293 transfectadas transientemente com um ácido nucleico codificando uma construção de fusão compreendendo CLD18A2 humana (SEQ ID NO: 1, 2) e uma proteína repórter fluorescente. Os ratinhos com respostas imunitárias detetáveis (Fig. 1) foram reforçados três dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais de Setl, ou os ratinhos foram reforçados três dias, três e dois dias, ou os ratinhos foram reforçados quatro, três e dois dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais de Set2 através de injeção intraperitoneal de 5*107 ou alternativamente lxlO8 células HEK293 transfectadas transientemente com um ácido nucleico codificando CLD18A2 humana (SEQ ID NO: 1, 2) (para detalhes ver Tab. lb). Na Tab. la os protocolos de imunização utilizados sao dedicados aos respetivos anticorpos monoclonais.
b. Geração de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos para CLD18:
Esplenócitos de ratinho foram isolados e fundidos com PEG a uma linha celular de mieloma de ratinho com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então pesquisados quanto à produção de imunoglobulinas com especificidade para CLD18 utilizando células HEK293 transfectadas com um ácido nucleico codificando CLD18 humana através de análise FACS. Suspensões de células individuais de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fundidas com células de mieloma de ratinho não secretoras P3X63Ag8U.l (ATCC, CRL 1597) numa razão de 2:1 utilizando PEG a 50% (Roche Diagnostics, CRL 738641). As células foram plaqueadas a aproximadamente 3*104/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de cerca de duas semanas de incubação em meio seletivo contendo soro fetal bovino a 10%, fusão de hibridoma a 2% e suplemento de clonagem (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1363735) mais HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 pg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma, CRL H0262). Após 10 a 14 dias os poços individuais foram pesquisados através de citometria de fluxo quanto a anticorpos monoclonais anti-CLD18. Os hibridomas secretores de anticorpos foram novamente plaqueados, pesquisados novamente e, se ainda fossem positivos para anticorpos monoclonais anti-CLD18, eram subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis eram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização. Foi escolhido pelo menos um clone de cada hibridoma, que manteve a reatividade das células parentais (por FACS). Foram gerados 9 bancos de células em frascos para cada clone que foram armazenados em azoto liquido. c. Seleção de anticorpos monoclonais que se ligam a CLD18:
Para determinar o isotipo dos anticorpos, foi realizado um ELISA de isotipo. 0 monoAB ID Kit de ratinho (Zymed, CRL 90-6550) ou alternativamente o IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, N.2 Cat. 1493027) foi utilizado para determinar as subclasses de Ig dos anticorpos monoclonais reativos com CLD18 identificados. Definido como Setl, foram geradas dezanove linhas celulares de hibridoma, seis de uma fusão de células de um ratinho C57/BL6 imunizado com CLD18A2-VoltaD3 (SEQ ID NO: 17, 18), treze de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18A2-Voltai (SEQ ID NO: 15, 16), que expressam os seguintes anticorpos: 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 24H5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b, 182-D758-034 26B5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D758-035, DSM ACC2745 26D12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D758-036, DSM ACC2746 28D10: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D758-040, DSM ACC2747 37G11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-055, DSM ACC2737 37H8: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-056, DSM ACC2738 38G5: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-057, DSM ACC2739 38H3: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-058, DSM ACC2740 39F11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-059, DSM ACC2741 41C6: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-060 42E12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-061, DSM ACC2748 43A11: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-062, DSM ACC2742 44E10: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-063 47D12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-064 61C2: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2b, 182-D1106-067, DSM ACC2743 75B8: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D756-001 85A3: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D756-002 9E8: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D758-011 19B9: anticorpo monoclonal de ratinho IgM, 182-D758-024
Definido como Set2, foram geradas cinco linhas celulares de hibridoma, uma de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18A2-VoltaD3 (SEQ ID NO: 17, 18) e CLD18A2-
VoltaDl (SEQ ID NO: 15, 16), quatro de uma fusão de células de um ratinho Balb/c imunizado com CLD18BA2-VoltaDl (SEQ ID NO: 15, 16), que expressam os seguintes anticorpos: 4 5C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10 45C1: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D758-187 125E1: anticorpo monoclonal de ratinho IgG2a, 182-D1106-279, DSM ACC2808 163E12: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-294, DSM ACC2809 166E2: anticorpo monoclonal de ratinho IgG3, 182-D1106-308 175D10: anticorpo monoclonal de ratinho IgGl, 182-D1106-362, DSM ACC2810 2. Produção de Anticorpos Monoclonais
Produção e purificação de anticorpos monoclonais reativos com CLD18:
Para produzir quantidades de mg de anticorpo para caracterização funcional, células de hibridoma foram semeadas em biorreatores baseados em diálise (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) a 2xl06 células/ml. O anticorpo contendo sobrenadante foi colhido uma vez por semana. O anticorpo monoclonal de ratinho foi purificado utilizando Melon Gel (Pierce, Rockford, USA) e concentrado através de precipitação com sulfato de amónio, ou, alternativamente, purificado através de FPLC utilizando proteína A. A concentração e a pureza do anticorpo foram determinadas através de Ensaio de BCA e a pureza verificada através de eletroforese em gel com dodecilsulfato de sódio e coloração de Coomassie. 3. Características de Ligação dos Anticorpos Monoclonais a. Controlo de qualidade dos transfectantes em WB, IF:
Para gerar células que expressam CLD18A2, células HEK293 ou CHO foram transfectadas com ácidos nucleicos codificando CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) ou CLD18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4).
As células HEK293 foram transfectadas com CLDN18A2-myc (SEQ ID NO: 3, 4) ou deixadas não transfectadas. 24 horas após a transfecção, as células foram colhidas, lisadas e sujeitas a eletroforese em gel com dodecilsulfato de sódio. 0 gel foi transferido e corado com um anticorpo de ratinho anti-myc. Após incubação com um anticorpo anti-ratinho marcado com peroxidase, a membrana foi revelada com reagente ECL e visualizada utilizando um gerador de imagens LAS-3000 (Fuji). Apenas nas células transfectadas mas não no controlo negativo, foi observada uma banda com o peso molecular esperado de CLD18-myc (Fig . 2 ) .
As células CHO foram transfectadas com CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) e criadas em lâminas de câmaras durante 24 h. As células foram fixadas com metanol e coradas com um anticorpo policlonal de coelho contra CLD18 a 1 pg/ml durante 60 min. a 25°C. Após lavagem, as células foram coradas com uma IgG de cabra anti-coelho marcada com Alexa488 (Molecular Probes) e avaliadas através de microscopia de fluorescência. A Fig. 3 mostra células CHO transfectadas, que expressam CLD18 na membrana celular bem como células não transfectadas. Estas células que expressam heterologamente CLD18 foram utilizadas para os seguintes ensaios para testar a especificidade da ligação do anticorpo. b. Seleção de anticorpos monoclonais que se ligam a CLDlS/Pesquisas primárias através de citometria de fluxo: Células HEK293 foram co-transfectadas com vetores de expressão codificando CLD18A2 humana (SEQ ID NO: 1, 2) e uma proteína repórter fluorescente 40 h antes do ensaio, ou, alternativamente, células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) foram utilizadas e contrastadas com iodeto de propídio (PI). Após desprendimento das células utilizando EDTA 2 mM/PBS, as células foram lavadas com meio de crescimento completo e plaqueadas a aproximadamente 1-5*105 células/poço em placas de microtitulação de fundo em U. As células foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadante do hibridoma seguido por dois passos de lavagem com FBS/PBS inactivado por calor a 1% e finalmente incubação com APC ou anticorpo secundário específico anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647. Após dois passos de lavagem, as células co-transfectadas foram fixadas com CellFIX (BD Biosciences). A ligação foi avaliada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A expressão do marcador de fluorescência é traçada no eixo horizontal contra a ligação do anticorpo no eixo vertical. Detetou-se que todos os anticorpos de ratinho 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 se ligavam especificamente na superfície das células que expressam marcador de fluorescência (Fig. 4, células em Q2) tal como exemplificado para sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais 24H5 (Fig. 4A, células em Q2), 85A3 (Fig. 4B), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 e 45C1 (Fig. 4C, células em Ql). c. Comparação da ligação do anticorpo a CLD18A2 marcado com Myc ou HA:
As características de ligação dos anticorpos monoclonais específicos de CLD18 identificados foram ainda melhor especificadas. Portanto, a ligação do anticorpo monoclonal foi analisada para mutantes de CLD18A2, criados através da inserção de marcadores epitópicos. CLD18A2-HA (SEQ ID NO: 6) contém um marcador epitópico HA em CLD18A2-voltal, enquanto CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4) contém um marcador epitópico Myc inserido em CLD18A2-volta2. Como a inserção destes marcadores causa a destruição de epitopos, os anticorpos monoclonais identificados podem ser agrupados de acordo com a perda de ligação a qualquer um dos mutantes. Células HEK293 co-transfectadas transientemente com um marcador de fluorescência e CLD18A2 humana, ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-HA, ou com um marcador de fluorescência e CLD18A2-Myc, foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais específicos de CLD18 durante 30 min. a 4°C, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647. Antes da análise num BD FACSArray, as células foram fixadas utilizando CellFIX. Tal como exemplificado para 24H5, 9E8, 26B5 e 19B9 na Fig. 5, os anticorpos monoclonais podiam ser separados com base nas suas características de ligação em quatro grupos diferentes: (i) anticorpos que se ligam a CLD18A2 não modificada bem como a CLD18A2-HA e CLD18A2-Myc, p. ex. 24H5, (Fig. 5A) , ou (ii) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-HA, p. ex. 9E8, (Fig. 5B) , ou (iii) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-Myc, p. ex. 26B5, (Fig. 5C) , ou (iv) anticorpos que não se ligam a CLD18A2-HA nem a CLD18A2-Myc, p. ex. 19B9, (Fig. 5D). d. Comparação da ligação de anticorpos a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de citometria de fluxo: A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais identificados para isoformas de CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 que expressam CLD18A2 humana de forma estável (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 que expressam CLD18A1 humana de forma estável (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação de células ou alternativamente sem fixação mas com contrastação com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 6 mostra exemplos para os dois grupos de anticorpos monoclonais que foram identificados no painel constituído por 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) os anticorpos monoclonais 43A11, 45C1, e 163E12 ligam-se especificamente a CLD18A2 humana mas não a CLD18A1 humana (Fig. 6A,B), e (ii) o anticorpo monoclonal 37H8 liga-se a ambas as isoformas humanas (Fig. 6A). e. Comparação da ligação do anticorpo a transfectantes de CLD18A1 versus CLD18A2 humana através de microscopia de imunofluorescência: Células HEK293 foram transfectadas transientemente com um vetor de expressão codificando uma proteína de fusão de CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) ou CLD18A2 (SEQ ID NO: 2) com um repórter de fluorescência e criadas em lâminas de câmaras. As células foram coradas sem serem fixadas ou após fixação com paraformaldeído com anticorpo monoclonal contendo sobrenadante da cultura de tecidos durante 30 min. a 37°C. Após lavagem, as células foram coradas com um anticorpo anti-Ig de ratinho marcado com Alexa555 (Molecular Probes). A ligação dos anticorpos foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Tal como mostrado na Fig. 7, o anticorpo 37G11 reagiu especificamente com CLD18A2 (Fig. 7A) mas não com CLD18A1 (Fig. 7B) . Em contraste, o anticorpo 26B5 foi reativo com CLD18A2 e CLD18A1 (Fig. 8) .
Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, foi observada uma clara diferença entre a coloração de células vivas e as células fixadas com paraformaldeído. Os anticorpos formaram uma coloração uniforme da membrana quando as células eram fixadas (Fig. 7C, 8C, 8D). Em contraste, a incubação de células vivas com estes anticorpos conduz à geração de aglomerados de proteínas, visíveis como um padrão de coloração semelhante a pintas (Fig. 7A, 8A, 8B). Isto mostra que todos os anticorpos se ligam a epitopos nativos tal como verificado na superfície das células vivas. f. Determinação de linhas celulares endogenamente expressoras:
Um par de iniciadores específicos do gene de CLD18A2 (SEQ ID NO: 11, 12) foi utilizado em análises de RT-PCR para pesquisar linhas celulares para expressão de CLD18A2. Verificou-se que as linhas celulares de carcinoma gástrico humano NCI-SNU-16 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) e KATO-III (ATCC HTB-103) e a linha celular de adenocarcinoma de pâncreas humano DAN-G (DSMZ ACC249) apresentam expressão endógena robusta de CLD18 (Fig. 9). A expressão foi confirmada ao nível proteico através de coloração com um soro policlonal de coelho contra CLD18. g. Coloração de linhas celulares endogenamente expressoras com anticorpos específicos de CLD18 e análise de imunofluorescência: Células DAN-G, SNU-16, NUGC-4 e KATO-III foram criadas em lâminas de câmaras sob condições padrão. As células foram não fixadas ou alternativamente fixadas com metanol e coradas com os respetivos anticorpos. Para os anticorpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9 foi observada coloração da superfície celular tal como exemplificado na Fig. 10, 11 e 12A. Para os anticorpos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10 o reconhecimento do epitopo nativo foi ensaiado e foi observada coloração da superfície celular em células não fixadas tal como mostrado na Fig. 12B. Os subgrupos de anticorpos mostraram coloração homogénea da membrana celular preponderantemente nas interfaces célula-célula ou em partes da membrana livres não adjacentes a outras células. Outros anticorpos coraram focos e agregados discretos na membrana celular demonstrando em conjunto que os respetivos anticorpos se ligam a diferentes epitopos, incluindo epitopos que são mascarados através da associação homotípica ou heterotípica de CLD18 bem como epitopos de CLD18 acessíveis nas junções de oclusão preformadas. h. Coloração de linhas celulares endogenamente expressoras através de citometria de fluxo: A expressão na superfície de CLD18A2 expressa constitutivamente em células vivas KATO-III e NUGC-4 foi analisada através de citometria de fluxo. Isto é exemplificado através de células KATO-III e NUGC-4 coradas com anticorpo monoclonal 61C2 ou 163E12, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação das células ou alternativamente sem fixação. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 13 mostra uma forte ligação de 61C2 a pelo menos 70,3% das células KATO-III e de 163E12 a CLD18A2 a células KATO-III e NUGC-4. i. Alinhamento das sequências de CLD18A1 e CLD18A2 humanas e de ratinho: A CLD18A2 humana (NP_ 001002026) e a CLD18A1 humana (NP_057453) numa comparação de sequências diferem no terminal N e as variantes de CLD18 de ratinho (NP_062789 e AAL15636) demonstram elevada homologia e locais de variação da sequência entre as moléculas (ver Fig. 14). j. Reatividade dos anticorpos com CLD18A1 de murideo e CLD18A2 de murideo analisada através de citometria de fluxo: A ligação dos anticorpos monoclonais identificados com CLD18A2 e CLD18A1 de murideo foi analisada através de citometria de fluxo. Células HEK293 co-transfectadas transientemente com um marcador de fluorescência e CLD18A2 de murideo (SEQ ID NO: 33, 35) ou com um marcador de fluorescência e CLD18A1 de murideo (SEQ ID NO: 36, 37) foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais específicos de CLD18 humana, 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 e 163E12, respetivamente, durante 30 min. a 4°C, seguido de incubação com anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com Alexa647 e fixação das células. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A Fig. 15 mostra três perfis de ligação diferentes: 38G5 e 45C1 não se ligam a nenhuma das isoformas de CLD18 de murideo, 37G11 e 163E12 ligam-se a CLD18A2 de murideo mas não a CLD18A1 de murideo, e 38H3 liga-se a CLD18A1 e CLD18A2 de murideo. Estes anticorpos são ferramentas valiosas para determinar a potencial toxicidade dos anticorpos monoclonais de CLD18 em estudos pré-clínicos.
Em conjunto estes dados mostram que os anticorpos monoclonais do invento 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10 gerados contra CLD18 representam uma diversidade de características de ligação a diferentes epitopos e topologias da CLD18 humana.
Uma combinação de diferentes propriedades descritas nos exemplos 3b, c, d, e, g, h, e j pode ser utilizada para categorizar os anticorpos monoclonais em tais classes diferentes. 4. Imuno-histoquímica (IHC)
Um anticorpo especifico do epitopo de CLD18A2 gerado através de imunização com o péptido de SEQ ID NO: 21 foi utilizado para caracterização imuno-histoquímica da expressão de CLD18A2. Cortes de tecido impregnados em parafina derivados de um amplo painel de tecidos normais e tumorais foram utilizados para expressão proteica e análises de localização. Nenhuma expressão significativa foi detetada em nenhum outro tecido de órgão normal, exceto no estômago (ver Tab. 2, Fig. 16A). Em contraste, a expressão de CLD18A2 foi verificada através de imuno-histoquímica em diferentes tipos de cancro, incluindo cancro de estômago e cancro de pulmão (Fig. 16B).
Curiosamente, a expressão da proteína CLD18A2 na mucosa gástrica estava restrita a células terminalmente diferenciadas do epitélio gástrico nas regiões da base e do fosso. Em contraste, as células na região do pescoço da mucosa gástrica, em particular as células estaminais gástricas na porção do istmo, que repõem toda a mucosa, não expressam CLD18A2 (Fig. 16C) .
Tab. 2: Expressão de CLD18A2 em tecidos normais e tumorais, tal como analisado através de IHC
Tipo de tecido Resultado
Suprarrenal -
Bexiga Células do sangue
Medula Óssea
Mama Cólon
Endotélio
Esófago
Trompa de Falópio Coração
Rim (glomérulo, túbulo) Fígado
Pulmão Nódulo linfático
Ovário - Pâncreas
Paratiróide
Pituitária -
Placenta
Próstata
Pele
Baço
Estômago + Músculo estriado
Testículo
Timo
Tiroide
Uréter - Útero (colo do útero, endométrio) 0 anticorpo monoclonal 39F11 foi utilizado para estudos imuno-histoquímicos específicos de CLD18A2. Tal como mostrado na Fig. 17A, não foi detetável qualquer reatividade significativa em nenhum dos tecidos normais testados exceto no estômago (Fig. 17A), enquanto os carcinomas do estômago e do pulmão permanecem fortemente positivos (Fig. 17B) .
Outro grupo de anticorpos do invento mostra um padrão de coloração específico de cancro com ligação a cancro do estômago mas sem reatividade com tecido de estômago normal. Um tal padrão de coloração é mostrado na Fig. 18A com o anticorpo monoclonal 26B5.
Foi utilizada imuno-histoquímica para análise da especificidade de 175D10 (Fig. 18B), 43A11 (Fig. 18C), 163E12 (Fig.l8D) e 45C1 (Fig. 18E) em secções derivadas de linhas celulares tumorais HEK293: linhas celulares tumorais HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) ou sendo transfectadas com um plasmídeo de controlo da expressão contendo apenas o gene de resistência a antibiótico para seleção (HEK293-falso) foram xenoenxertadas em ratinhos para formar tumores sólidos. Não foi detetada qualquer expressão em tumores de xenoenxertos de HEK293 falsamente transfectadas. Em contraste, observou-se forte e homogénea coloração da membrana em tumores de xenoenxertos de HEK293-CLD18A2 e em espécimes de carcinoma do estômago. 5. Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC) a. CDC de anticorpos monoclonais de Setl medida através de citometria de fluxo:
Plasma para lise do complemento foi preparado através da retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos S-Monovette-EDTA vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha), que foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. O plasma foi colhido e armazenado a -20°C.
Num primeiro conjunto de experiências, os sobrenadantes de hibridoma foram analisados quanto sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). As células foram incubadas com os sobrenadantes de hibridoma contendo os anticorpos monoclonais 85A3, 28D10, 24H5 ou 26D12, respetivamente durante 20 min. à temperatura ambiente. Após centrifugação (5 min. a 450 g) o sobrenadante foi removido e plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) foi adicionado às células e incubado durante mais 20 min. a 37°C. Depois disso, a lise celular foi determinada em FACS utilizando o método de coloração de iodeto de propidio (PI). PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 g/ml. Para citometria de fluxo, foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Foram colhidos pelo menos 10000 eventos para análise com os restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FCS). A percentagem de células lisadas (células positivas para PI) é mostrada na Figura 19.
Os anticorpos monoclonais 85A3, 28D10 e 26D12 induziram lise de 33,5%, 38,2% e 39,2%, respetivamente, das células HEK293-CLD18A2, enquanto a CDC mediada por 24H5 foi de apenas 19,3%. b. CDC de anticorpos monoclonais de Setl:
Num segundo conjunto de experiências foi analisada a especificidade dos anticorpos monoclonais para induzir CDC em células que expressam CLD18A2. Portanto, um conjunto de anticorpos de ligação tanto especifica para CLD18A2 humana como também ligando-se a CLD18A1 humana foi testado quanto à indução de CDC contra células CHO estavelmente transfectadas com CLD18A2 humana (CH0-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (CHO-CLD18A1). Células CHO-CLD18A2 e CH0-CLD18A1 foram semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3*104/poço em placas de microtitulação de cultura de tecidos de fundo plano. 0 meio de crescimento do dia seguinte foi removido e as células foram incubadas em triplicado com os sobrenadantes de hibridoma ajustados para uma concentração de 10 g/ml, contendo os anticorpos monoclonais 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, e 61C2, respetivamente. As células de controlo foram incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo saponina a 0,2% ara a determinação da lise de fundo e da lise máxima, respetivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e foi adicionado plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) às células e incubou-se mais 20 min. a 37°C. Em seguida, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio e a emissão de fluorescência após excitação a 520 nm foi medida utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica foi calculada como se segue: % de lise específica = (fluorescência da amostra - fluorescência de fundo) /(fluorescência da lise máxima - fluorescência de fundo) x 100. A Fig. 20 mostra que os anticorpos monoclonais 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 e 39F11 medeiam elevada CDC, o anticorpo monoclonal 38G5 medeia média CDC, os anticorpos monoclonais 41C6 e 61C2 medeiam baixa CDC, e os anticorpos monoclonais 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 e 47D12 não medeiam nenhuma CDC contra células CHO-CLD18A2. Em contraste, nenhum dos anticorpos é capaz de induzir CDC contra células CHO-CLDA1, embora 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 e 61C2 também se liguem a CLD18A1, tal como determinado através de citometria de fluxo e imunofluorescência. c. Titulação dos anticorpos monoclonais e CDC utilizando anticorpos monoclonais de Setl:
Para medir a capacidade dos anticorpos anti-CLD18 para induzir CDC a baixas concentrações, foi realizada uma experiência em que foram titulados três anticorpos diferentes. As células CHO-CLD18A2 criadas em placas de microtitulação foram incubadas com um intervalo de concentrações de 75B8 (100, 30, 10, 3 e 1 pg/ml), 37H8 (10, 3,3 e 1 pg/ml) e 28D10 (10, 1 e 0,1 pg/ml), respetivamente, durante 20 min. à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e foi adicionado às células plasma humano a 20% em DMEM (pré-aquecido a 37°C) e incubou-se durante mais 20 min. a 37°C. Antes da análise utilizando um Tecan Safire, os sobrenadantes foram substituídos por PBS contendo 2,5 pg/ml de brometo de etídio. As Figuras 21A-C mostram a percentagem de lise específica em função da concentração de anticorpo. O anticorpo monoclonal 75B8 induz lise de 31,0% de células CHO-CLD18A2 a 10 pg/ml, e cai para 6,2% a 1 pg/ml (Fig. 21A) , enquanto os anticorpos monoclonais 28D10 e 37H8 ainda induzem 39% e 26,5% de lise específica a 1 pg/ml (Fig. 21B, C), respetivamente. d. CDC de anticorpos monoclonais de Set2 medida através de citometria de fluxo:
Soro para lise de complemento foi preparado através da retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos Serum-Monovette vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha) que foram, então, centrifugados a 600 g durante 20 min. O soro foi colhido e armazenado a -20°C. Soro de controlo foi inactivado por calor a 56°C durante 30 min antes do armazenamento.
Os sobrenadantes de hibridoma foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana. As células foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma brutos ou purificados contendo os anticorpos monoclonais 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10, respetivamente, durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubou-se durante mais 30 min. a 37°C. Em seguida, a lise celular foi determinada em FACS através da utilização do método de coloração de iodeto de propídio (PI). PI foi adicionado até uma concentração final de 2,5 pg/ml. Para citometria de fluxo foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA) . Foram colhidos pelo menos 10000 eventos para análise com restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FSC/SSC). A lise específica foi calculada através da seguinte fórmula: lise específica = (% de células positivas para PI na amostra - % de células positivas para PI na amostra com soro inactivado por calor). Foi observada robusta lise mediada por CDC em particular para 163E12. 6. Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)
Os sobrenadantes dos hibridomas foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) ou CLD18A1 humana (HEK293-CLD18A1). a. Enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico humano: Sangue humano de dadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão fosfato (PBS) e as células sanguíneas foram vertidas sobre Ficoll (Lymphocyte Separation Medium a 1077 g/ml, PAA Laboratories, n.2 de cat. J15-004) . As células mononucleares do sangue periférico (MNC) foram colhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo inactivado por calor a 10%, L-glutamina 2 mM. b. Configuração de ADCC: As células alvo foram marcadas com um ligando estimulador de fluorescência (BADTA, estojo de ensaio de citotoxicidade de Perkin Elmer DELFIA Citotoxicity Reagents EuTDA, n.2 de cat. AD0116) durante 30 minutos. Após lavagem extensiva em RPMI-10 suplementado com probenecida 10 mM (Sigma, n.2 de cat. P8761), HEPES 10-20 mM, e soro fetal de vitelo inactivado por calor a 10%, as células foram ajustadas a lxlO5 células/ml. As células alvo marcadas, as células efetoras (MNC), e os sobrenadantes contendo anticorpos monoclonais ajustados a uma concentração de 10 pg/ml foram adicionados a placas de microtitulação de fundo redondo. Para as células efetoras isoladas, foi utilizada uma razão de efetor para alvo (E:T) de 100:1 (dados não mostrados para 50:1 e 25:1). Após incubação (2 horas, 37°C), os ensaios foram parados através de centrifugação, e a libertação do ligando de fluorescência dos duplicados foi medida em contagens de európio num fluorómetro de resolução temporal. A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % de lise específica = (contagens de libertação experimental - contagens de libertação espontânea)/(contagens de libertação máxima - contagens de libertação espontânea) χ 100, com a libertação de ligando de fluorescência máxima determinada através da adição de Triton X-100 (concentração final de 0,25%), para as células alvo, e a libertação espontânea medida na ausência de anticorpos e células efetoras. A Figura 22 mostra que os anticorpos monoclonais 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, e 61C2 medeiam ADCC contra células HEK293-CLD18A2 . Em contraste, estes anticorpos não induzem citotoxicidade significativa ou induzem apenas um nível baixo em alvos de CLD18A1 demonstrando uma ADCC específica de CLD18A2 (Figura 23) . 7. Inibição da proliferação
Os anticorpos monoclonais de murídeo purificados foram analisados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento celular de células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana. lxlO4 células alvo que expressam endogenamente CLD18A2 (KATO-III) foram cultivadas na presença de aproximadamente 10 pg de anticorpos monoclonais. O Estojo de Proliferação Celular DELFIA (Perkin-Elmer, N.2 de Cat. AD0200) é um imunoensaio não isotópico baseado na medição da incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante a síntese de ADN de células em proliferação em microplacas. O BrdU incorporado é detetado utilizando anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a deteção do anticorpo, as células são fixadas e o ADN desnaturado utilizando solução Fix. O anticorpo não ligado é lavado e é adicionado indutor DELFIA para dissociar os iões de európio do anticorpo marcado para a solução, onde formam quelatos altamente fluorescentes com os componentes do Indutor DELFIA. A fluorescência medida - utilizando na deteção fluorometria resolvida no tempo - é proporcional à síntese de ADN na célula de cada poço.
Uma forte inibição da proliferação foi observada com os anticorpos 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 e 166E2, respetivamente. Uma inibição moderada da proliferação foi observada com os anticorpos de murideo 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 e 38H3, respetivamente. 8. Desempenho em modelos terapêuticos de xenoenxerto de ratinho 0 potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais identificados ligando-se especificamente a CLD18A2 foi estudado em modelos terapêuticos de xenoenxerto. a. Tratamento precoce de tumores altamente expressores de CLD18A2 em ratinhos
Ratinhos SCID foram inoculados subcutaneamente com lxlO7 células HEK293 que expressam estavelmente niveis elevados de CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2). Os niveis de expressão de CLD18A2 humana em células HEK293-CLD18A2 foram comparáveis com os niveis de expressão em cancros gástricos primários dos pacientes. Cada grupo de tratamento experimental foi constituído por 10 ratinhos (número de ratinhos por grupo n=10). A terapia dos ratinhos começou 3 dias após a inoculação do tumor. 200 mg de sobrenadantes de hibridoma representando os anticorpos monoclonais de murideo 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3, ou 61C2 foram injetados uma vez por semana durante 4 semanas por via intravenosa. Alternativamente, 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murideo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. O crescimento tumoral dos ratinhos tratados foi monitorizado duas vezes por semana (Volume Tumoral = Comprimento χ Largura χ Altura dividido por 2 em mm3) . Os ratinhos foram mortos quando o tumor atingia um volume de 500 mm3 ou em caso de morbidez grave. A Fig. 24 exemplifica uma inibição robusta do crescimento de células tumorais HEK293-CLD18A2 através dos anticorpos do invento. As Fig. 25A e 25B mostram o prolongamento da sobrevivência através do tratamento com anticorpos do invento num modelo de tratamento precoce de xenoenxerto utilizando células HEK293-CLD18A2. b. Tratamento de início tardio de tumores avançados altamente expressores de CLD18A2 em ratinhos 0 mesmo modelo de xenoenxerto tumoral baseado em células HEK293-CLD18A2 foi concebido como um protocolo de início tardio de terapia em oposição ao tratamento precoce descrito acima. No dia 27 após a inoculação das células tumorais, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de teste cada um compreendendo 5-6 ratinhos e a terapia foi iniciada com 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murídeo 43A11, 163E12, e 175D10, respetivamente. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. Também neste modelo mostrou-se que os anticorpos do invento inibem o crescimento tumoral. Para vários anticorpos isto resultou no prolongamento da sobrevivência (Fig. 2 6). c. Tratamento precoce de tumores que expressam níveis baixos de CLD18A2
Ratinhos SCID foram inoculados subcutaneamente com 2*105 células da linha celular tumoral DAN-G, uma linha celular de adenocarcinoma pancreático humano infiltrante que expressa constitutivamente a proteína CLD18A2 a um nível baixo. O tratamento de ratinhos (10 por grupo) foi iniciado 3 dias após o enxerto do tumor: 200 pg de sobrenadantes de hibridoma purificados contendo os anticorpos monoclonais de murídeo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, ou 175D10 foram administrados duas vezes por semana durante 6 semanas alternando injeção intravenosa e intraperitoneal. Devido ao crescimento do tumor agressivo e rápido da linha celular tumoral pancreática DAN-G in vivo os ratinhos desenvolveram caquexia tumoral e morreram dentro de alguns dias. Mesmo assim, como consequência, a janela para medição dos efeitos terapêuticos foi estreita, a inibição do crescimento tumoral e a sobrevivência prolongada mediada pelos anticorpos do invento foi também observada neste modelo (Fig. 27A e 27B). d. Os anticorpos do invento não desencadeiam efeitos secundários em ratinhos
Um par de iniciadores específicos de CLD18A2 de murídeo (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) foi utilizado em análises de RT-PCR para amplificar o ADNc derivado de um amplo painel de tecidos normais de ratinho (ver Fig. 28). A expressão de CLD18A2 de murídeo não foi detetável em nenhum dos tecidos normais testados, exceto no estômago (ver Fig. 28). Além disso, um anticorpo específico de CLD18A2, que reage de forma cruzada com CLD18A2 humana e de ratinho, foi utilizado para análise imuno-histoquímica da expressão de CLD18A2 num grande painel de tecidos de ratinho normais (ver Tab. 3). Com exceção do tecido gástrico normal nenhum dos tecidos normais testados mostra expressão de CLD18A2. Tal como se observou para a CLD18A2 humana, também verificámos para o equivalente de ratinho que embora as células epiteliais da superfície e as mais profundas da cripta expressem CLD18A2 na sua superfície celular, a região central do pescoço é negativa para CLD18A2 (ver Fig. 29A-C) . Em resumo, a distribuição tecidual de CLD18A2 parece ser idêntica no homem e nos ratinhos.
Investigámos ainda os potenciais efeitos secundários mediados pelos anticorpos 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10 em ratinhos. Tinha sido previamente demonstrado através de análise FACS que todos estes anticorpos reagem com a CLD18A2 de murideo bem como com a proteína humana.
Nem foram observados quaisquer efeitos secundários nos ratinhos durante e após o tratamento com estes anticorpos, nem foram observadas quaisquer correlações histomorfológicas de toxicidade na mucosa gástrica dos ratinhos tratados com os anticorpos em comparação com os não tratados (tratados com PBS) (ver Figura 30). 9. Quimerização de Anticorpos a. Geração de anticorpos monoclonais quiméricos ratinho/humano ARN total e subsequentemente ADNc de cadeia simples foi preparado a partir de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e a partir de tecido do baço humano através de métodos padrão conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo utilizando RNeasy Midi Kit (Qiagen) e a transcriptase inversa Superscript II (Invitrogen). A região constante da cadeia leve capa humana foi amplificada a partir de ADNc de PBMC através de PCR. O oligómero com sentido (SEQ ID NO: 38) adicionou um local de restrição BamHI na extremidade 5' da região constante e mudou a sequência de ácido nucleico original 5'-CGAACT-3' codificando para os dois primeiros aminoácidos (Arg-Thr) da região constante para 5'-CGTACG-3', gerando um local de restrição BsiWI sem mudar a sequência de aminoácidos. O oligómero anti-sentido (SEQ ID NO: 39) incluiu um codão de terminação e adicionou um local de restrição Notl na extremidade 3' da região constante amplificada. O produto de PCR bem como um vetor de expressão padrão (por exemplo pcDNA3.1(+), Invitrogen) foram incubados sequencialmente com as enzimas de restrição BamHI e Notl. O vetor foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo para prevenir recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vetor, de modo a que qualquer futura fusão de uma região variável em frente da região constante fosse agora possível através de um local de restrição HindIII (5'— AAGCTT-3') do local de múltipla clonagem do vetor residual e através do local de restrição BsiWI (5'-CGTACG-3') gerado com o produto de PCR. A sequência da região constante da cadeia leve capa humana inserida no vetor está listada como SEQ ID NO: 40, a sequência de aminoácidos da região constante capa humana está listada como SEQ ID NO: 41. A região constante da cadeia pesada gama-1 humana foi amplificada a partir do ADNc do baço através de PCR. O oligómero com sentido fosforilado a 5' (SEQ ID NO: 42) foi colocado sobre o local de restrição Apal de ocorrência natural, localizado 11 nucleótidos a jusante do início da região constante, e adicionou um local de restrição HindIII na extremidade 5' da parte amplificada da região constante. O oligómero anti-sentido fosforilado a 5' (SEQ ID NO: 43) incluiu um codão de terminação e adicionou um local de restrição Notl na extremidade 3' da região constante assim amplificada. O produto de PCR assim gerado foi terminado de forma cega e fosforilado a 5'. A região constante gama amplificada foi verificada ser da subclasse IgGl através de PCR com um oligómero anti-sentido discriminador (SEQ ID NO: 44), e através de sequenciação. Um vetor de expressão padrão (p. ex., pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen) com uma resistência a um antibiótico diferente (por exemplo higromicina) da do vetor utilizado para expressão da cadeia leve (por exemplo neomicina) foi incubado com a enzima de restrição Pmel para remover completamente o local de clonagem múltipla deixando extremidades cegas. O vetor foi adicionalmente tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo para prevenir a recirculação. A região constante foi finalmente ligada no vetor, de modo a que qualquer futura fusão de uma região variável em frente da região constante fosse agora possível através do local de restrição HindIII (5'-AAGCTT-3') e através do local de restrição Apal (5'-GGGCCC-3'), ambos gerados com o produto de PCR. A orientação correta da região constante no vetor, isto é, adequada para o promotor precedente do vetor, foi verificada através de sequenciação. Devido à posição do local de restrição Apal, qualquer amplificação de uma região variável para este fim tem de incluir os primeiros 11 nucleótidos da sequência da região constante gama-1 humana além da sequência do local Apal. A sequência da região constante de cadeia pesada gama-1 humana assim amplificada inserida no vetor está listada como SEQ ID NO: 45, a sequência de aminoácidos da região constante gama-1 humana assim expressa está listada como SEQ ID NO: 46.
Correspondendo aos seus equivalentes de murideo, os anticorpos monoclonais quiméricos foram nomeados adicionando o prefixo "ch-", p. ex. ch-43All, ch-163E12, ch-125El, ch-166E2, ch-175D10, ch-45Cl. A amplificação das regiões variáveis de murideo das cadeias leves e pesadas foi realizada de acordo com o método "step-out PCR" descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, N° 6) . Para isso, ARN total foi preparado a partir de linhas celulares de hibridomas monoclonais (ver Tab. 4. ) através de métodos padrão conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo com a utilização de RNeasy Mini Kit (Qiagen). 0 ADNc de cadeia simples foi preparado de acordo com o método "template-switch", também descrito em Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, No. 6, 1558). Além de um oligómero (dT)30 (SEQ ID NO: 47), incluiu um oligómero híbrido ADN/ARN (SEQ ID NO: 48) servindo como um adaptador 5' para mudança de molde durante a polimerização da cadeia de ADNc. Neste oligómero adaptador os últimos três nucleótidos foram ribo em vez de desoxirribonucleótidos. A subsequente "step-out PCR" utilizou um oligómero anti-sentido direcionado à região constante da cadeia capa de ratinho ou à região constante das subclasses 1, 2a ou 3 das cadeias gama (SEQ ID NO: 49 a 52, respetivamente) . As subclasses de IgG do anticorpo monoclonal de murideo produzidas pelas linhas celulares de hibridoma foram antes analisadas imunologicamente com IsoStrip (ver Exemplo 1), e o oligómero anti-sentido apropriado foi escolhido em conformidade (ver Tab. 4). Uma mistura de iniciadores serviu como oligómero com sentido no "step-out PCR", compreendendo os dois oligómeros listados em SEQ ID NO: 53 e 54. Algumas linhas celulares de hibridoma expressaram mais do que uma cadeia pesada ou leve (para além das cadeias expressas pela linha celular de mieloma utilizada para a geração de hibridomas) . A Tabela 4 resume as SEQ ID NO das regiões variáveis clonadas e sequenciadas das cadeias de anticorpo de murideo (SEQ ID NO: 55 a 69 e SEQ ID NO: 132 a 146) e das cadeias de anticorpo quimérico inteiras clonadas e sequenciadas (SEQ ID NO: 100 a 129).
As regiões variáveis de murideo identificadas foram então amplificadas por PCR omitindo a 5' UTR e a região constante de ratinho a 3', adicionando locais de restrição nas extremidades que permitiram a subclonagem nos vetores de expressão preparados transportando as regiões constantes humanas. Além disso, os oligómeros com sentido proporcionaram uma sequência de Kozak de consenso (5'-GCCGCCACC-3' ou 5'-AGCCACC-3') e os oligómeros anti-sentido para as regiões variáveis das cadeias pesadas incluíram os primeiros 11 nucleótidos da região constante gama-1 humana além do local de restrição Apal (ver Tab. 4, SEQ ID NO: 70 a 99). As regiões variáveis das cadeias leves capa foram clonadas utilizando as enzimas de restrição HindIII e BsiWI, as regiões variáveis das cadeias pesadas gama exigiram as enzimas de restrição HindIII e Apal. A região variável da cadeia pesada gama do anticorpo monoclonal 45C1 continha um local de restrição HindIII interno - aqui, foi utilizada em vez dessa a enzima Bsal compatível (ver SEQ ID NO: 80). SEQ ID NO: 100 a 114 mostram as sequências de ácido nucleico dos anticorpos tornados quiméricos resultantes (ver Tab. 4) . SEQ ID NO: 115 a 129 mostram as sequências de aminoácidos dos anticorpos tornados quiméricos expressos em conformidade (ver Tab. 4). b. Geração e Produção de Anticorpos Quiméricos Contra CLD18
Foram geradas linhas celulares de mamífero produtoras de anticorpos quiméricos com especificidade para CLD18. As linhas celulares derivadas de células HEK293T (ATCC CRL-11268). Um dia antes da transfecção, 2,5*107 células foram plaqueadas numa caixa de cultura de tecidos de 14,5 cm e cultivadas em 20 ml de meio completo, ou alternativamente foram plaqueadas lxlO7 células numa caixa de cultura de tecidos de 10 cm e cultivadas em 10 ml de meio completo, ou alternativamente foram plaqueadas Ο,βχΙΟ6 células num poço de uma placa de tecidos de 12 poços e cultivadas em 2-3 ml de meio completo (meio completo: meio DMEM:F12 suplementado com FBS a 10% sem antibióticos). A densidade celular recomendada no momento da transfecção deve ser de 90% de confluência. Imediatamente antes da transfecção, o meio foi substituído por meio fresco. As células HEK293T foram transfectadas com reagentes de transfecção, p. ex. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019), ou, alternativamente, polietilenimina (Sigma-Aldrich, 408727) . Exemplificado para transfecção de células HEK293T foi utilizada uma quantidade de ADN total de 110 pg ou 296 pg para uma caixa de cultura de tecidos de 14,5 cm, e a razão de agente de transfecção para ADN foi de 1:2,5 e 1:12 para Lipofectamine 2000 e PEI, respetivamente. 24 h após a transfecção o meio foi substituído com um meio adequado de GMP, p. ex. X-Vivo 15 (Cambrex) ou um meio químico definido como Pro293a (Cambrex) sem soro. As células HEK293T transfectadas produtoras de anticorpos monoclonais quiméricos contra CLD18 foram cultivadas durante mais 96 h. Os sobrenadantes em bruto foram colhidos, esterilizados por filtração e purificados através de proteína A-Sepharose. A concentração de anticorpo foi determinada através de Ensaio BCA e a pureza verificada por eletroforese em gel com dodecilsulfato de sódio e coloração Coomassie. c. Características de Ligação de Anticorpos Monoclonais Quiméricos A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos clonados e gerados para CLD18A2 foi analisada através de citometria de fluxo, tal como descrito no Exemplo 3. Células HEK293 vivas que expressam estavelmente CLD18A2 humana (HEK293-CLD18A2) e células HEK293 que expressam estavelmente CLD18A1 humana (SEQ ID NO: 7, 8) (HEK293-CLD18A1) foram incubadas durante 30 min. a 4°C com os sobrenadantes de cultura de células HEK293T purificados contendo anticorpos monoclonais quiméricos, sequido por incubação com fragmento F(ab')2 de anticorpo secundário de cabra anti-Fcy de IgG humana conjugado com APC e contrastadas com PI. A ligação foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray.
De modo semelhante, linhas celulares tumorais humanas que expressam endogenamente CLD18A2, por exemplo células KATO-III e NUGC-4, foram analisadas através de citometria de fluxo. A Fig. 31A e B mostram análises de citometria de fluxo dos anticorpos quiméricos ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch- 166E2, e ch-175D10. Todos eles mostram reconhecimento do epitopo nativo e exibem ligação específica e forte a células que expressam CLD18A2 mas não CLD18A1. d. Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) O soro para a lise do complemento foi preparado através de retirada de sangue de voluntários saudáveis para tubos Serum-Monovette vacutainer (Sarstedt, Nurmbrecht, Alemanha) que foram então centrifugados a 600 g durante 20 min. O soro foi colhido e armazenado a -20°C. O soro de controlo foi inactivado por calor a 56°C durante 30 min antes do armazenamento.
Os anticorpos quiméricos purificados por Proteína A-Sepharose deste invento foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana, bem como células CHO-CLD18A2 estavelmente transfectadas. As células foram incubadas com anticorpos monoclonais ch-163E12, ch-166E2, e ch-175D10, respetivamente, numa concentração final de 2,5 pg/ml a 35 pg/ml durante 30 min. a 37°C. Soro humano a 20% em RPMI foi adicionado às células e incubou-se durante mais 30 min. a 37°C. Posteriormente, as células mortas e vivas foram discriminadas através de coloração de PI numa concentração final de 2,5 g/ml e a percentagem de lise celular mediada por anticorpos foi determinada através de citometria de fluxo. Para a análise por citometria de fluxo foi utilizado um citómetro de fluxo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Pelo menos 10000 eventos foram colhidos para análise com os restos celulares excluídos através do ajuste do limiar de dispersão frontal e lateral (FSC/SSC) . A lise especifica foi calculada através da fórmula seguinte: lise especifica = (% de células positivas para PI na amostra - % de células positivas para PI na amostra com soro inactivado por calor). A lise especifica mediada por CDC foi mostrada para vários anticorpos. Todos os três anticorpos mediaram uma CDC robusta em células CHO-CLD18A2 (Figura 32). Em células KATO-III os anticorpos ch-163E12 e ch-175D10 foram indutores de uma CDC robusta. e. Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)
Os anticorpos quiméricos purificados por FPLC do invento foram analisados quanto à sua capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) contra células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana.
Sangue humano de dadores saudáveis foi diluído duas vezes em tampão fosfato (PBS) e as células sanguíneas foram vertidas em Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia). Após centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram colhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura X-Vivo-15 suplementado com soro humano inactivado por calor a 5%. 15 h antes do ensaio, as células KATO-III foram transfectadas com luciferase e plaqueadas a 5*104 células/poço numa microplaca branca.
Para o ensaio, as células efetoras (PBMC, preparadas tal como descrito acima) a uma razão de efetor para alvo (E:T) de 20:1 e os anticorpos quiméricos purificados por FPLC foram adicionados e incubou-se durante 2-3 h a 37°C, CO2 a 5%. A concentração final do anticorpo no poço foi de 50 pg/ml. Após 2-3 h de pré-incubação, foi adicionado amarelo Lúcifer (BD Biosciences, San Jose EUA) a 1 mg/ml. A luminescência resultante da oxidação do Amarelo Lúcifer através da luciferase das células viáveis foi medida continuamente durante até 6 h utilizando um leitor de microplacas (Infinite200, Tecan, Suiça). A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: % de lise especifica = 100-( (contagens de luminescência da amostra - contagens de luminescência espontânea)/(contagens de luminescência máxima contagens de luminescência espontânea) χ 100), com a luminescência espontânea determinada através da adição de Triton X-100 (concentração final de 0,2%) e o sinal máximo medido na ausência de anticorpos.
Utilizando este ensaio, foi mostrado que os anticorpos monoclonais ch-163E12 e ch-175D10 medeiam uma forte ADCC em células KATO-III (Fig. 33). f. Inibição da Proliferação
Os anticorpos quiméricos purificados por FPLC do invento foram analisados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento celular de células KATO-III que expressam endogenamente CLD18A2 humana.
As células alvo (KATO-III) foram cultivadas na presença dos respetivos anticorpos quiméricos (ver inibição da proliferação de anticorpos de murideo, Exemplo 7). Mostrou-se que os anticorpos quiméricos purificados por FPLC ch-163E12 e ch-166E2 inibem a proliferação celular. 10. Seleção de anticorpos como candidatos a lideres clínicos
Os líderes clínicos ótimos podem cobrir uma ampla variedade de aplicações terapêuticas e de diagnóstico (ver também secção IV - Utilizações e Métodos do Invento). De acordo com o invento, são proporcionados anticorpos dirigidos para CLD18-A2. É mostrado que os anticorpos proporcionados de acordo com o invento oferecem um largo espectro de propriedades em relação a especificidade, capacidade de induzir CDC e ADCC e inibir a proliferação de células que expressam CLD18, em particular células tumorais. Além disso, demonstrou-se que a quimerização de anticorpos pode conduzir à aquisição de mais funções efetoras dependentes de Fc que não estão presentes na molécula de murideo parental. Por exemplo, mostra-se aqui que o anticorpo 175D10 com IgGl de murideo não induz citotoxicidade dependente de complemento (ver Exemplo 5), enquanto ch-175D10 com IgGl humana induz lise específica de células tumorais que expressam constitutivamente CLD18 (ver Tab. 5 e Tab. 6).
Os anticorpos proporcionados de acordo com o presente invento podem ser categorizados em classes distintas de acordo com as suas propriedades de ligação e a sua capacidade para mediar funções efetoras em células que expressam CLD18. A partir dos anticorpos proporcionados de acordo com o presente invento, os candidates a líderes clínicos podem ser selecionados com base nas suas características funcionais. Uma perspetiva geral das propriedades dos anticorpos de murídeo e quiméricos selecionados do invento é dada na Tab. 5 e Tab. 6, respetivamente.
Os candidatos a líderes clínicos do invento podem ter uma ou mais das seguintes propriedades: a) ligação a CLD18A2 humana mas não a CLD18A1 humana (p. ex. 43A11, 4 5C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-43All, ch-45C1, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10). Para exemplos, ver as figuras 6A e 6B. b) ligação a CLD18A2 de ratinho mas não a CLD18A1 de ratinho (p. ex. 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10) . Para exemplos, ver as figuras 15A e 15B. c) ligação a CLD18 expressa naturalmente por células tumorais (p. ex. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-45Cl, ch-43All, ch-125El, ch-163E12, ch-166E2 e ch-175D10) . Para exemplos, ver a figura 13. d) ligação a CLD18 em zonas de contacto intercelular (p. ex. 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10) . Para exemplos, ver as figuras 12A e 12B. e) mediação de morte induzida por CDC de células que expressam CLD18 (p. ex. 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-163E12 e ch-175D10). Para exemplos, ver a figura 32. f) mediação de morte induzida por ADCC de células que expressam CLD18 (p. ex. ch-163E12 e ch-175D10) . Para exemplos, ver a figura 33. g) inibição da proliferação de células que expressam CLD18 (p. ex. 4 5C1, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10, e ch-163E12 e ch-166E2). h) inibição do crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto com células que expressam CLD18 (p. ex. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2, e 175D10). Para exemplos, ver a figura 24. i) prolongamento da sobrevivência em modelos de xenoenxerto com células que expressam CLD18 (p. ex. 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 e 175D10). Para exemplos, ver a figura 25B.
Perspetiva exemplificativa das propriedades para seleção de candidatos a lideres
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG <120> Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro <130> 342-31 EPT2 <150> EP 05 025 657.7 <151> 2005-11-24 <160> 150 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 786
<212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 atggccgtga ctgcctgtca gggcctgggg ttcgtggtí-t cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa eaaccccgta 130 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 160 accgagtgcc ggggctactt -caccctgctg gggctgccag ccatgeegca ggcagtgega 24 0 gccctgatga rcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca accgcatCgg cagcatggag gactctgcca aagccaaeat gacactgacc 360 tcegggatca tgtteattgt etcaggtett tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgee 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcçjg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt «tecttecaa gcaegecfcat 730 gtgtaa 7B6 <210> 2 <211> 261
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Ala Vai Thr Ala Cys Gin Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu lie 15 10 IS
Gly He Ala Gly lie lie Ala Ala Thr Cye Met Asp Gin Trp Ser Thr 20 25 30
Gin Αβρ Leu Tyr Αηπ Αβη Pro Val The Ala Val Phe Aan Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Tip Arg Ser Cys Val Arg Glu Sor Ser Gly Fhe Thr Glu Cye Arg 50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg
65 70 75 SO
Ala Leu Met lie Val Gly lie Val Leu Gly Ala He Gly Leu Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lya Cya lie Arg tie Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110
Ala Lye Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Met Phe lie Val Ser 115 120 125
Gly Leu Cys Ala lie Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Αβη Met Leu Val 130 125 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Αβη Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu lie Gly Gly val Met Met IB 0 185 190
Cys lie Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Abd Tyr Lye Ala 195 200 205
Val Ser Tyr Hie Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lya Pro Gly Gly 210 215 220
Phe Lye Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Aen Thr Lye Asn Lya Lye lie 225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu val Gin Ser Tyr Pro Ser 245 250 255
Lya Hia Asp Tyr Val 250 <210> 3 <211> 816
<212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 3 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 ateattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta iza acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg çgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 190 accgagtgcc ggggctactt cacccCgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gceetgatga fcogtaggcat cgtcctgggt gcoattggcc tectggtate eatctttgcc loo ctgaaatgca Cccgcactgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 160 tccgggatca tgtteattgt cteaggtctt tgtgcaattg ctggogtgtc egtgtCtgcc 420
a-acacgctgg egactaactt ceggatgtcc acagctaaca tgtaoaccgg catgggtgaa 4SD caaaaactca tctcagaaga ggatctgggg atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca 540 tttggtgcgg ctccgtccgt gggctgggtc gccggaggcc teacactaat tgggggtgeg 600 atgatgtgca tcgcctgceg gggcctggca ceagaagaaa ccaactacaa agccgtttct 660 tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac aagcctggag getbcaaggc cagcactggc 720 tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag 790 gtaeaatcct atccttccaa gcacgaetae gtgtaa 816 <210> 4 <211> 271
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met Ala val Thr Ala cye Gin Gly Leu Gly Phe Val val Ser Leu lie l S 10 15
Gly lie Ala Gly lie lie Ala Ala The eye net Asp Gin Ίΐρ Ser Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asn Asa Pro val Thr Ala Val Phe Aen Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cye Val Arg Glu Ser ser Gly Phe Thr Glu Cya Arg 50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Wet Leu Gin Ala val Arg 65 70 75 80
Ala Leu Wet lie Val Gly lie Val Leu Gly Ala lie Gly Leu Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lye Cye lie Arg lie Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110
Ala Lye Ala Aon Piet Thr Leu Thr Ser Oly lie Met Phe He Val Ser 115 120 125
Gly Leu Cye Ala lie Ala Gly Val Ser Val phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140
Thr As η Phe Ttp net Set Thr Ala Aen Met Tyr Thr Gly Met Gly Glu 145 150 155 160
Gin LyH Leu lie Ber Glu Glu Asp Leu Gly Met Val Gin Thr Val Gin 165 170 175
Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly 180 185 130
Gly Leu Thr Leu He Gly Oly Val Met Met Cya lie Ala Cys Arg Gly 195 300 205
Leu Ala Pro Glu Glu Thr Ah« Tyr Lyo Ala val Ser Tyr His Ala Ser 210 215 220
Gly Hie 5er val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe lys Ala Ser Thr Gly 225 230 235 240
Phe Gly Sec Asn Thr Lya Asn Lye Lye lie Tyr Asp Gly Oly Ala Arg 245 250 255
Thr Glu Asp Glu Val Gin Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 260 265 270 <210> 5 <211> 813
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gettgcgggc 50 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120
acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tecgagagag ctctggcttc 10D accgagtgcc ggggctactt caccctgtac ccatacgacg tgccagacta cgcactgggg 240 ctgccagcca tgctgcaggc agtgcgagcc ctgatgatcg taggeategt cctgggtgcc 300 attggcetcc tggtatccat ctttgcectg aaatgcatcc gcattggcag catggaggac 360 tctgecaaag eoeacatgac actgacctcc gggateatgt tcattgtcte aggtctttgt 420 geaattgctg gagtgtctgt gtttgccaac atgctggtga ctaacttctg gatgtcca-ca 4Θ0 gctaacaogt acaccggcat gggtgggatg gtgeagactg ttcagaccag gtacacattt 540 ggtgcggctc tgttcgtggg ctgggtcgct ggaggcotca cactaattgg gggtgtgatg 600 atgtgcatcg cctgcegggg cctggcacca gaagaaacea actacaaagc egtttcttat 660 catgcctcgg gccacagtgt cgcctacaag cctggaggce tcaaggccag cactggcttt 720 gggtccaaca ccaaaa&caa gaagatatac gatggaggtg cccgcacaga ggacgaggta 780 caatcttatc cttccaagca cgactatgtg taa 813 <210> 6 <211> 270
<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 6
Met Ala Val Thr Ala CyB Gin Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu lie 15 10 15
Gly lie Ala Gly lie He Ala Ala Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr 2D 25 10
Gin Asp Leu Tyr Αβπ Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Aen Tyr Gin Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ear Cye Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 SO
Gly Tyr Phe Thr Leu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Qly 65 70 75 80
Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Leu Hec lie Val Gly lie BS 90 95
Val leu Gly Ala lie Gly Leu Leu Val Ser lie Fhe Ala Leu Lye CyB 19Q 105 110 lie Arg He Gly 5er Met Glu Asp Ser Ala Lye Ala Αβπ Met Thr Leu 115 130 125
Thr ser Gly lie Met phe lie Val Ser Gly Leu eye Ala lie Ala Gly 130 135 140
Val Set Val Phe Ala Aen Met Leu Val Thr αβπ Phe Trp Met Ser Thr
145 150 155 ISO
Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr 1SS 170 175
Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Sly Trp Val Ala Gly Gly 180 105 190
Leu Thr Leu lie Gly Gly Val Met Met Cys lie Ala Cys Arg Gly Leu 195 200 305
Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lya Ala Val Ser Tyr Sis Ala Ser Gly 310 315 320
His Ser Val Ala Tyr Lye Pro Gly Gly Phe Lya Ala Ser Thr Gly Phe 225 230 US 240
Gly Ser Aen Thr Lye Aen Lye Lys lie Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr 345 250 255
Glu Asp Glu Val Gin Ser Tyr Pro Ser Lya His Asp Tyr Val 2 SO 2S5 270 <210> 7 <211> 786
<212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 7 atgtccacca ccacatgcca agtggtggcg ttcctcetgt ccatcctgqg gctggccggc 60 tgcatcgogg ccaccgggat ggaeatgtgg agcacccagg acctgtacga eaaceeegtc 120 acctccgtgt tccagtacga agggctctgg aggagctgcg tgaggcagag ttcaggcttc 160 accgaatgca ggccctattt caccatcctg ggaettecag ccatgctgca ggcagtgcga 260 geeotgatga tcgtaggcat egtectgggt gecactggee tcctggtatc catctttgcc 3 go ctgaaatgca tcegcattgg cageatggag gactetgcca aagccaacat gaeactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcoattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtce acagctaaca tgtacaccgg catgggCggg 460 atggtgoaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 545 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cageaetggc tttgggtcea acaccaaaaa caagaagata 720 taegatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcaegaetat 7 BO gtgtaa 736 <210> 8 <211> 261
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Met Ser Thr Thr Thr Cye Gin Val Val Ala Phe Leu Leu ser lie Leu IS 10 15 □ly Leu Ala Giy Cye lie Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gin Tyr Glu Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cye val Arg Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cye Arg SO 55 60
Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg 65 70 75 Θ0
Ala Leu Met He Val Gly lie Val Leu Gly Ala He Gly Leu Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lye Cye He Arg He Gly Ser Met Glu Aep Ser
1O0 105 HO
Ala Lye Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly He Met Phe lie Val Ser 115 120 125
Gly Leu Cys Ala rle Ala Gly val Ser Val Phe Ala Aen Met Leu val 130 135 14C
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Vai Gin Thr Vai Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Tie Gly Gly Val Met Met 100 185 ISO
Gy9 lie Ala Cy9 Arg Gly Leu Ala pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lya Ala 195 200 205
Val Ser Tyr Hie Ala Ser Gly Hie Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220
Phe Lya Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Aon Thr Lya Aan Lye Lye He 225 230 235 240
Tyr Aep Gly Gly Ala Arg Thr Glu Aep Glu Val Gin Ser Tyr Pro Ser 24S 250 255
Lye Hia Aep Tyr Val 260 <210> 9 <211> 795
<212> ADN <213> Mus musculus <400> 9 atggccacca ccacgtgcca ggtggtaggg cttctcctgt ccctcctggg tctggccggc 60 tgeatageeg eeastgggat ggacatgtgg agcactcaag acctgtatga caacccagtc 120 accgccgtgt tccagtatga agggctctgg aggagttgcg tgcaacagag ctcggggttc 1Θ0 aeegegtgcc ggccetactt caccatcetg ggccttccag ccntgctgca agctgtaçga 240 gccctgatga tcgtgggcat tgttctgggg gtcatcggta tcctcgtgfcc catcttcgcc 300 ctgaagtgca ttcgcattgg tagcatggat gactctgcca aggceaagat gaetetgact 360 tetgggatct tgttcatcat ctecggcatc tgtgcaatea ttggtgtgtc tgcgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgtcc aoegctaaca tgtacagcgg eatgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacacct ttggtgcagc tctgttcgtg 540 ggccgggttg ctggaggcct caccctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcctgccgt 600 ggcctgaeac cagatgacag caacttcaaa gctgtgtctt accatgccte tggccaaaat 660 gctgcccaca ggcçtggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtcçaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgeeegcaea gaagacgaeg aaeagtctca tcctaccaag 780 tatgactatg tgtag 795 <210> 10 <211> 795
<212> ADN <213> Mus musculus <4 Ο 0> 10 atgtcggtga ccgcccgcca gggcttgggg tttgtggtgt cactgatcgg gtttgcgggc 60 atcattgcag ccacttgtat ggaccagtgg agcacccagg atttatacaa caacccggtg 120
accgctgtat tcaactacca agggctatgg cgtteatgcg tccgagagag ctetggettc ISO accgagtgcc gaggctactt eaccctgttg gggttgccag ccatgctgca agctgtacga 240 gcoctgatga tcgtgggeac tgttctgggg gtcateggta tcetcgtgtc catcttegcc 300 ctgeagtgca ttcgcategg tagcatggat gaceetgcca aggecaagat gaetctgace 360 tctgggatct tgttcatcat ctccggcatc tgtgcaatca ttggtgtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt etggatgtcc aeagctaaea tgtaeagegg catgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacaeet Ctggtgcagc tctgttcgtg 540 ggctgggttg ctggaggcet eaecctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcetgcegt 600 ggcctgacac cagatgacag caactcc&aa getgtgtctt accatgcctc tggccaaaat 660 gttgcctaca ggcctggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgcccgcaca gaagacgatg aacagtctca tectacçaag 790 tatgactatg egcag 795 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4 0 0> 11 tggctctgtg tcgacactgt g 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4 0 0> 12 gtgtacatgt tagctgtgga c 21 <210> 13 <211> 55
<212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 13
Met ABp Met Trp ser Thr Gin Asp Leu Tyr Aap Aan Pro val Thr ser 15 10 15 val Pile Gin Tyr Slu Gly Leu Trp Arg Ser Cya Val Arg Gin Ser Ser 20 25 30
Gly Phe Thr Glu Cye Arg Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45
Met Leu Gin Ala Val Arg Ala 50 55 <210> 14 <211> 153
<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Met Aap Met Trp Ser Thr Gin Aap Leu Tyr Αθρ Αβη Pro Val Thr ser
1 5 10 IS val Phe Gin Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cye Val Arg Gin Ser Ser 20 25 30
Qly Phe Thr Glu Cya Arg Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 4S
Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Leu Met He Val Gly lie Val Leu Gly 50 55 60
Ala lie Gly Leu Leu Val Ser lie Phe Ala Leu Lye Cye lie Arg lie 65 70 75 80
Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lya Ala Aan Met Thr Leu Thr Ser Gly Θ 5 90 95 lie Ket Phe lie Val Ber Gly Leu Cys Ala lie Ala Gly Val Ser Val 100 105 110
Phe Ala Aan Met Leu Val Thr Aan Phe Trp Met Ser Thr Ala Aan Met 115 120 125
Tyr Thr Gly Ret Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr 130 135 140
Phe GLy Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 15D <210> 15 <211> 390
<212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 15 atggagacag acaeactcct gctatgggta ctgctgetct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggecag gcgcgegcgc cgtacgaagc ttggtacoga getcggatcc 130 actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcatggacc agtggagoac ccaagacttg iao tacaacaacc ccgtaacagc tgttttcaac taccaggggc tgtggcgctc ctgtgtccga 240 gagagctctg gcttcaccga gtgccggggc tacttcaccc tgctggggct gccagccatg 300 ctgcaggcag tgcgagcggc catccagcac agtggcggcc gctcgaggag ggcccgaaca 360 aaaactcatc teagaagagg atctgaatag 390 <210> 16 <211> 129
<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16
Wet Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Sly Ser Thr Sly Aap Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lye Leu Gly Thr Glu Leu Sly fier Thr Pro val Trp Trp Asa Ser Ala 35 40 45
Asp Sly Arg Met Αερ Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Aon Aan Pro 50 55 GO
Val Thr Ala Val Phe Aao Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser eye veL Arg 65 70 75 ao
Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly 85 90 95
Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg Ala Ala He Gin His Ser Gly 100 ios no
Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lya Thr His Leu Arg Arg Gly Ser 115 120 125
Glu <210> 17 <211> 411
<212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 17
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctet gggttccagg ttccaetggt SO gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgcacgaagc ttggtaccga getcggatcc 120
actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcgccçtga tgatcgtagg catcgtcctg ISO ggtgccaccg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat gcatccgcat tggcagcatg 240 gaggaetctg ccaaagccaa catgacaeLg acateeggga tcatgttcat tgteteaggt 300 ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gecaacgcgg eeaeccagca cagtggcggc 360 cgctcgagga gggcccgaae aaaaacteat ctcagaagag gatctgaata g 413 <210> 18 <211> 136
<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18 net Glu Thr Asp Thr leu Leu leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro l s 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lya Leu Sly Thr Glu leu Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Aan Ser Ala 25 40 4S ASp Gly Arg Ala Leu Met lie Val Gly lie Val Leu Gly Ala lie Gly 50 55 60
Leu Leo Val ser lie Fhe Ala Leu Lye Cye lie Arg lie Gly Ser Met 65 70 75 00
Glu Aap Ser Ala Lye Ala Aen Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Met Phe as 90 95
He Val Ser Gly Leu Cye Ala He Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 100 105 110
Ala Ala He Gin Hie Ser Gly Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lys 115 120 125
Thr Hie Leu Arg Arg Gly Ser Glu 110 135 <210> 19 <211> 531
<212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 19 atggagacag acacaeteet gctatgggfca ctgctgetet gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgccaeg gaccagtgga gcacccaaga cttgtacaac 120
aaccccgtaa cagctgtttt caascaceag gggctgtggc gctcctgegt ccgagagagc ISO tctggcctca ccgagtgccg gggctacccc acccCgctgg ggctgccagc catgctgcag 2 40 gcagtgcgag tcetgatgac cgtaggeatc gtcctgggtg ccaetggect ectggtatcc 300 atctttgecc tgaastgcat ccgcattggc agcatggagg aetctgceaa agccaacatg 340 acactgacct ccgggatcat gttcattgtc teaggtcttt gtgcaattgc tggagtgtct 420 gtgtttgcca acatgctggt gactaacttc tggatgtcca cagetaaeat gtacaccggc 490 atgggtggga cggtgeagac tgttcagacc aggtaeacat ttggtgcgta g S31 <210> 20 <211> 176
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu leu Leu Trp val Leu Leu Leu Trp Val Pro IS 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Met Asp Gin 20 25 30
Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Ann Pro Val Thr Ala Val Phe Aan 35 40 45
Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cye Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr 50 55 60
Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Oln
65 70 75 SO
Ala Val Arg Ala Leu Met lie Val Oly lie Val Leu Gly Ala He Gly S5 90 95
Leu Leu Val Ser lie Phe Ala Leu Lys Cye lie Arg lie Gly Ser Keh 100 105 110
Glu A Bp ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly He Met Phe 115 120 125 lie Val Ser Gly Leu Cye Ala lie Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 130 135 140
Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 145 150 155 160
Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala
165 170 17S <210> 21 <211> 10
<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 21
Asp Cln Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Aan L 5 16 <210> 22 <211> 11
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Asn Abr Pro Val Thr Ala Val Phe Aan Tyr Gin 15 10 <210> 23 <211> 14
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe 15 10 <210> 24 <211> 12
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Aap Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Aan Pro IE 10 <210> 25 <211> 12
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Cya Arg Pro Tyr Phe Thr lie Leu Gly Leu Pro Ala l 5 10 <210> 26 <211> 13
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Thr Aan Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 15 10 <210> 27 <211> 13
<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 27
Asp Ser Ala Lye Ala Asn Met The Leu Thr Ser 01 y He IS 10 <210> 28 <211> 55
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Met Asp Gin Trp Ser Thr Gin Aep Leu Tyr Aan Asn Pro val Thr Ala IS 13 IS
Val Phe Asn Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cya Val Arg Glu Ser Ser 30 25 30
Gly Phe Thr Glu Cya Ars Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 4$
Met Leu Gin Ala Val Arg Ala SO 55 <210> 29 <211> 24
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Phe Ala Leu Lye Cys lie Arg lie Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lye IS 10 15
Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 20 <210> 30 <211> 40
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Ala Asn Met Leu Val Thr Asn phe Trp Met ser Thr Ala Asn Met Tyr IS 10 15
Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe 30 25 10
Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 35 40 <210> 31 <211> 153
<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 31
Met Asp aln Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Abu Aen Pro Val Thr Ala 15 10 15
Val Phe Aan Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser 20 25 30
Gly Phe Thr Glu eye Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45
Met Leu Gin Ala val Arg Ala Leu Met lie Val Gly He Val Leu Gly 50 55 60
Ala lie Gly Leu Leu Val Ser lie Phe Ala Leu Lys Cya lie Arg He 65 10 75 30
Gly Ser Met Glu Aep Ser Ala Lye Ala Aan Met Tbr Leu Thr ser Gly 35 90 95
He Met Phe lie Val Ser Oly Leu Cys Ala He Ala Gly Val ser Val 100 105 110
Phe Ala Aan Met Leu Val Thr Aan Phe Trp Met Ser Thr Ala Aan Met 115 120 125
Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr 130 135 140
Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 150 <210> 32 <211> 3359 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 cacaccttcg gcageaggag ggeggeaget ectcgcaggc ggcagggcgg gcggccagga 60 tcatgtccae eaeeacetgc caagtggtgg cgttcctcct gtccatcctg gggctggccg 120 gctgcatcgc ggccaccggg atggacatgt ggagcaccca ggacctgtac gacaaccccg 130 tcaccttcgt gttccagtac gaagggctct ggaggagctg cgtgaggcag agttcagget 240 tcaccgaatg qaggccctat ttcaccatcc tgggacttcc agccatgctg caggcagtgc 300 gagccccgat gategtagge atcgtectgg gtgccattgg cctcctggta tccatctttg 360 ccctgaaatg catccgcatt ggcagcatgg aggactctgc caaagccaac atgacactga 420 cctccgggat catgtteatc gtetcaggtc tttgegcaat tgctggagtg cctgtgcctg 490 ccaacatgct ggtgactaae ttctggatgt ceacagctaa catgtacacc ggeatgggtg 540 ggatggtgca gactgttcag accaggtaca catttggtgc ggctctgtte gtgggctggg 600 tcgctggagg cctcaeacta attgggggtg tgatgatgtg catcgcctgc cggggectgg 660 caccagaaga aaccaaetac aaagccgttt cttatcacgc ctcaggccac agtgttgect 720 acaagcetgg aggctccaag gccagcaetg gctttgggtc caacaccaaa aacaagaag* 790 tatacgatgg aggtggccgc acagaggacg aggtacaatc ttatccttcc aagcacgact 840 atgtgtaatg ctctaagacc tctcagcacg ggcggaagaa actcccggag agctcaccca 900 aaaaacaagg agatcccatc tagatttcrtt ettgettttg actcaeaget ggaagttaga 36 0 aaagcctcga tttcatcttt ggagaggcca aatggtctta gcctcagtct ctgtctctaa 102D atattccacc ataaaacagc tgagttattt atgaactaga ggctatagct cacattttca 1090 atcctetatt tcttttttta aatataactt tctactctga tgagagaatg tggttttaat 1140 ctctctctca cattttgatg atttagacag actccccctc ttcctcctag tcaataaacc 1200 cattgabgat ctatttccca gcttatcccc aogaaaactt ttgaaaggaa agagtagacc 1260 caaagatgtt attttctgct gtttgaattt tgtctcccca cccccaactt ggctagtaat 132D aaacacttac tgaagaagaa gcaataagag aaagatattt gtaatctctc cagcccatga 13 BO tcecggtttt cttacaetgt gatottaaaa gttaceaaac caaagecatt ttcagtetga 1440 ggcaaccaaa cctttctact gctgttgaca tettettatt acagcaacac cattctagga 1500 gtttcctgag ctctccactg gagtcctctt tetgtcgegg gtcagaaatt gtccctagat 15SO gaatgagaaa attatttttt ttaatttaag tcctaaatat agttaaaata aataatgttt 1620 tageaaaaeg atacactatc fcctgtgaaat agccteaccc ctacatgtgg atagaaggaa 1690 atgaaaaaat aatfcgatttg acattgtcta tatggtactt egtaaagtca tgcttaagta 1740 caaattccat gàaaagctca ctgatcctaa ttctttccct tcgaggtctc tatggctccg 1900 attgtacatg atagtaagtg taagccatgt aaaaagtaaa taatgtctgg gcacagtggc I960 tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggagga aggatcactt gagcccagaa 1920 gttegagact ageetgggea acatggagaa geeefcgtcte taeaaaatae agagagaaaa 1990 aatcagccag tcatggtggc ctacacctgt agtcceagca ttccgggagg ctgaggtggg 2040 aggatcactt gagcccaggg aggttggggc tgcagtgagc catgatcaca ccacegcact 2100 ccagccaggt gacatagcga gatcctgtct aaaaaaataa aaaataaata atggaacaca 2160 gcaagtccta ggaagtaggt taaaactaat tctttaaaaa aaaaaaaaag ttgsgcctga 2220 attaaatgta atgtttccaa gtgacaggta tccacatttg catggttaca agccactgcc 2280 agttagcagt ageaetfcfccc tggcactgtg gtcggttttg ttttgttttg ctttgtfctag 2340
agacggggtc tcactttcca ggetggcctc aaactcctgc actcaagcaa ttctteta.cc 24DO ctggcctccc aagtagctgg sattacaggt gtgcgecate acaactagct ggtggtcagt 2460 tttgttactc tgagagctgt tcacttctct gaattcacet agagtggttg gaccatcaga 2520 tgtttgggca aaactgaaag ctctctgcaa ccacacacet tccctgagct tacatcactg 25 00 cccttttgag cagaaagtct aaattccttc eaagacagta gaaetccatc ccagtaccaa 2640 agccagatag gccccctagg aaactgaggt aagagcagtc tctaaaaact acccacagca 2200 gcattggtgc aggggaacct ggccattagg ttattatttg agaggaaagt cctcacatca 2760 atagtacata tgaaagtgac ctccaagggg attggtgaat actcataagg atcttcaggc 2620
egaacagact atgtctgggg aaagaacgga ttatgcccca ttaaatasca agttgtgttc 28BQ aagagtcaga gcagegagct eagaggccct tctcactgag acagcaacat ttaaaccaaa 2940 ccagaggaag tatttgtgga actcactgcc tcagtttggg taaaggatga geagacaagt 3000 caactaaaga aaaaagaaaa gcaaggagga gggttgagca atctagagca tggagtttgt 3060 taagtgctct ctggatttga gttgaagagc atecatttga gttgaaggcc acagggcaca 3120 acgagctctc ccttctacca ccngaaagtc cctggtcagg tctcaggtag tgcggtgtgg 3180 ctcagctggg tttttaatta gcgcattctc tatccaaeat ttaattgttt gaaagcctcc 3240 atatagttag attgtgcttt gtaattttgt tgttgttgct ctatcttatt gtstatgcat 3300 tgagtattaa cctgaatgtt ttgttactta aatattaaaa aeaetgttat ectaeagtt 3369 <210> 33 <211> 849
<212> ADN <213> Mus musculus <400> 33 gagaacctgc ctgtetcttg tcctctccat ttgtgtggac tctgtgctcc ateatgtcgg 60 tgaccgcctg ceagggcttg gggtttgtgg tgtcactgat cgggtttgcg ggcatcattg 120
cagccacttg tatggaccag tggagcaccc aggatttata caacaacccg gtgaccgctg ISO tattcaacta ccaagggcta tggcgtteac gcgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccgaggcta ctteaccctg ttggggttgc cagccatgct geaagctgta cgagccctga 300 tgatcgtggg cattgttctg ggggtcatcg gtatcctcgt gtccatcttc gccctgaagt 360 gcattcgcae tggtagcatg gatgactctg ceaaggccaa gatgactctg aettctggga 420 tcttgttcat catctccggc atctgtgcaa tcattggfcgt gtctgtgttt gceaacatgc 480 tggtgaceaa cttctggacg tccacagcta acatgtacag cggcatgggc ggcatgggtg 540
gcatggtgca gaccgfcecag accaggtaca ccttcggtgc agctctgttc gtgggctggg GOO ttgctggagg cctcaccctg attgggggag tgatgatgtg catcgcctgc cgtggcctga 660 caccagatga cagcoacttc aaagctgtgt cttaccatgc ctctggccaa aatgttgcct 720 acaggcctgg aggctttaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaga aacaagaaga 390 tctacgatgg gggtgcccgc acagaagacg atgaacagtc tcatcctSCc aagtatgact 840 atgtgtagt B49 <210> 34 <211> 3350 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 34 agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg ¢0 tgactgcctg tcaggggttg gggtecgtgg tttcactgat tgggactgcg ggcatcattg 120 ctgccacctg catggaccag tggageaccc aagacttgta caacaacecc gtaacagctg 13 0 ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtecgaga gagctctgge ctcaccgagt 240 gccggggcta CttCacCctg ctggggctgc cagccatgct goaggcagtg cgagccctga 30 0 tgaccgcagg catcgtcctg ggtgceattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 3so gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaaagccna catgacactg acctccggga 420
tcatgttcat cgtctcaggt ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 4BO tggtgactaa ct tctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 54 0
agactgttca gaccaggtac acatttggtg cggctctgtt egtgggetgg gtegctggag 6DO gcctcaeact nattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 650 aaaccaacta caaagccgtt tcttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcccg 720 gaggcttcaa ggccagcact ggccctgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 7Θ0 gaggtgcccg cacagaggae gaggtacaat cttatcetcc caagcacgae tatgtgcaat 040 gctctaagac ctctcageae gggcggaaga aactecegga gagctcaccc aaaaaacaag 900 gagatcccat ctagatttct tcttgctntt gactcacagc tggaagttag aaaagectcg 950 atttcatctc cggagaggcc aaatggtctt agccteagtc tctgtctcta aatattccac 1020 cstaaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1060 ttcttttttt aaatataacc tcctactetjg acgagagaat gtggttttaa cccctctetc 1140 acattttgat gatttagaca gactccccet cttcctceca gtcaataaac ceattgatga 1200 eetatttccc agcttatccc eaagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1250 tattttctgc tgtttgaatt ttgtctcccc accoccaaet tggctagtaa taaacactta 1320 ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctct ccagcccatg atctcggttt 13 B 0 ccttacactg tgatcttaaa agttaccaaa ccaaagtcat ttfccagtttg aggcaaccaa 1440 acctttctac tgctgttgae atcttcttat tacagcaaea eeattctagg agtttcetga 1500 gctctccact ggagccctct ttctgccgcg ggtcagaaat tgtccetaga tgaatgagas 156 0 aattattttt ttcaatttaa gteetaaata tagttaaaat aaaCaaCgtt ttagtaaaat 1620 gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680 taattgettt gaeattgtet atatggtact ttgtaaagtc atgettaagt acaaattcca Π4 0 tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1BQ0 gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcacagtgg ctcacgcctg i860
taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 192D tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 19S0 gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc atcccgggag gctgaggtgg gaggatcaec 2040 tgegcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ceatgateac accactgcac tceagccagg 2100 tgacatagcg agatcctgtg taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160 aggaagtagg ttaaaactaa ttctctaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgc 2220 aatgtttcea agtgaeaggt atccacatte gcatggttac aagccactgc cagctagcag 2280 tagcactttc ecggcactge ggtcggtttt gtteegtttt gctttgfctta gagacggggt 2340 cUcactttcc aggctggcct caeactcctg cactcaagca attctfcctac cctggcctee 2400 caagtagetg gaattaeagg tgtgcgccat cacaactagc eggtggtcag ttttgttact 2460 ctgagagetg ttcacttctc cgaafcteaec eagagfcggtt ggaecatcag atgcttgggc 2SÍ0 aaaactgaaa gctctttgca accacacacc teccctgagc ttaoacoact gccccettga 25βο gcagaaagtc caaattcctt eeaagacagt agaactccat cccagtacca aagccagata 2640 ggccccctag gaaactgagg eaagagcagt ctctaaaaac Cactcaeage agcattggtg 2700 caggggaact bggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtaeat 2760 atgaaagtga eetccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820 tatgtctggg gaaagaacgg attatgeecc attaaataac aagttgtgee caagagtcag 2880 agcagtgagc tcagaggccc ttcLcactqa gacaqcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940 gtatttgtgg aactcactgc cccagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcasctaaag 3000 aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060 tctggabttg agttgaagag catccatfctg agttgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120 cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180 gtttttaatt agcgcattct ccatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240 gactgcgect tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtacatgea ttgagtatta 3300 acctgaatgt tttgttacbt aaatatbaaa aacacfcgbba tcctacagtt 3350 <210> 35 <211> 264
<212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 35
Met Ser Vai Thr Ala Cys Gin Gly lea Gly Phe Val Val Ser Leu lie IS 10 15
Gly Phe Ala Gly He lie Ala Ala Thr Cya riel Asp Gin Trp Ser Thr 20 25 30
Sin Asp Leu Tyr Αβη Aan pro Val Thr Ala val Phe Abu Tyr Gin Gly 35 90 45
Leu Trp Arg ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu cys Arg SO 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Net Leu Gin Ala Val Arg 65 TO 75 80
Ala Leu Met lie Val Gly lie Val Leu Sly Val lie Gly lie Leu Val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lys Cys He Arg lie Gly Ser Met Asp Asp Ser loo 105 no
Ala Lye Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Leu Phe Ile He Ser 115 120 125
Gly Ile Cys Ala lie lie Gly Val Ser Val Phe Ala Abu Met Leu Val 130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asti Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175
Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly ISO 185 190
Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly leu Thr Pro Asp Aap Ser Asn 195 200 205
Phe Lys Ala Val Ser Tyr Kie Ala Ser Gly Gin Asn Val Ala Tyr Arg 210 ' 215 220
Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 225 230 235 240
Lys Lya Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gin Ser 245 250 255
His Pro Thr Lye Tyr Asp Tyr Val 260 <210> 36 <211> 2786 <212> ADN <213> Mus musculus <4Ο0> 36 ggccgggaac cttcccagca agagggtggt ggttgcecct cgaagcetgc gcccageage 60 tgaagccatg gccaccacca cgtgccaggt ggtagggctt ctcctgtccc tcctgggtct 120 ggccggctgc atagccgcca ctgggatgga catgtggagc actcaagacc tgtatgacaa 1Θ0 cccagtcacc gccgcgttcc agtatgaagg gctctggagg agttgcgtgc aacagagctc 240 ggggttcacc gagtgceggc catacttcac catcctgggc cttccageca tgetgcaagc 300 tgtacgagcc ctgatgatcg tgggcattgt tctgggggtc atcggtatcc tcgtgtccae 360 cttcgccctg aagtgcatec gcattggtag catggatgac tctgccaagg ccaagatgac 420 tccgaettct gggatcctgt tcatcatctc cggcatoegc gcaatcattg gtgtgtctge 4BO gtttgccaac atgctggtga ccaacttctg gatgtccaca gctaacatgt acagcggcat 540 gggcggcatg ggtggcatgg tgcagaccgt tcagaccagg tacaccttcg gtgcagcccc 600 gtecgtgggc tgggttgctg gaggcctcac cctgattggg ggogtgatga tgtgcatcgc 660 ctgecgtggc ccgacaccag atgacagcaa cttcaaagct gtgtcttacc atgcctctgg 720 ccaaaacgtt gcctacaggc ctggaggctt fcaaggccagc actggctttg ggtccaacac 780 cagaaacaag aagatctacg atgggggtgc ccgcacagaa gacgatgaac agtctcatcc B40 taccaagtat gactatgtgt agtgctctaa gacccgccaa cctgtgtgca ggaggaaccc 900 ttccccaaga agagctcacc ccaaagcaac gggagtctac ettgttccct tgttgetttc 960 aactgacatc tgaaagttgg taaagcctga ttttcatcca eagggaggct agacagtctt 1020 ggccacatgt gcctgcctct aaatatccca tcaqaaaaca gctgagttat cgtttatgag 1080 ttagaggcca taacactcac tttageceaa ccctctgctt tttaccgtag ectbtctttfc 1140 cabctggbga tggaatggaa tttgactcac agactaatac tttaatggtt bagagaaacc 1200 ttccttcetc gbacttaata agcctgctga tggtcgactt bccagcttga ccaccaaggg 1260 aaabbbbaaa aggaaaaaaa aataeabtaa aaggcattat ttcctacbca attgtgcctt 1320 acccaccccc aacttgacbg ataataataa tgaacaccac ttaaagaaag aabgccsgag 13SO gaaagatagt tgtgtttccc cccagccagt eabctgagbc cccctatgtg gtgatcbaga 1440 acabbactcg ccacagtgat tttcaaagaa ggceagcgag cctgttcgct cbgeteagca 1500 tctgctgatt ccagcaaggc ccttccagag ctbtccacta gaagtcctcc btctctcgga 1560 agecagaaab tccccctaga agagtaagaa atagattctL ttgggtaacc tgagtcctag 1620 gtatagttat aabaaatagt atattagcaa aacggtttgg tatctcagtg aattagticc 16B0 agcctcacat atagaaaaag ctggggaaaa aaaaagcabc cctbgaeatt gtcbacagcg 1740 baagatccta tataaatcca agettcaaca aaagcteact gagtetaata gtcttctttt 1600 gaggtctcea oggccttagt actcacagat g-cagcccctg tttaaaagta aaaaaattaa 1660 agbagcttaa aacgggbtct tttbtttttb ttttttttca aaaaatccaa bagagaccbg 1920 tgtgtctggc atagctacag bbacbgccaa tcgacagggc cacttctttg gccctgtagg 19ao cagtttbgca gbbcbgacag cbgcgecggg eabcaabatg eagaecacac ccbbcbetgt 2040 gcttgtagga cgacccgttc aaggagaaag cabgaactcc atctccatgt gagcctgaae 2100 gcteecagga aatggagata gggtgetctc çâaaaeecac ctgaaectga aacagctgta 2160 gcgetatgct gtaagagccc ggcgatcaag ttcctatgga gaaaaagggc agtccttgea 2220 ttaaeagtgc atstataagt ggcctvtggg gggcagggat gaatattcag tggtggctcc 2280 gagtatgtac agaecgtcta aggagctgtg ttgaccaaga gccaggttaa tacgcagagt 2360 ttttcccact gggactacag tgattttag* ctataetgaa gaaggccctc tggaaaatca 2400 ttatctgaaa tggeataaag aatgaaeaga ceaaacaatt taaggggagg gggcaggtgg 2460 aaggaggggg aaggaggtag aaataagaat ctagggcatg aagatfcgtta aggttcttgg 2520 ggtccaaatg gaaggtcacc cctttgaggc catggacaca atgcacccca cccctacccc 2580 cacctgccca cccaccagaa agtccctggt cggactggag gcagtgagaa tcagctgttt 2640 tcagttagtg ggtctcggtg tagcacctgg ctgtttcaaa gcttcccctt gctttgccgt 27qq ttfcttccgcc aetgeegtct tgttttcegt gttattaaee tceatgtttt gtacgttaaa 2760 tattaaaaca ctgttaacat ccattc 2786 <210> 37 <211> 264
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 37
Met Ala Thr Thr Thr eye Gin Val Val Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu 15 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys He Ala Ala Thr Gly Met Aap Met Trp Set Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asp Aen Pro Val Thr Ala Val Phe Gin Tyr Glu Gly 35 40 45
Leu Trp Arg Ser eye val sin Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu eye Arg 50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Tie Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg 65 70 75 80
Ala Leu Wet Ue Val Gly lie val Leu Gly Val lie Gly lie Leu val 85 90 95
Ser lie Phe Ala Leu Lya Cys lie Arg lie Gly Ser Wet Aap Asp Ser 100 105 110
Ala Lya Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly lie Leu Phe lie lie Ser 115 120 125
Gly lie Cys Ala lie lie Gly Val Ser Val Phe Ala Aan Met Leu Val 130 1S5 140
Thr Aan Phe Trp Met Ser Thr Ala Aan Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 145 150 155 160
Met Gly Gly Met Val Gin Thr Val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 16S 170 175
Ala leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu lie Gly Gly ISO IBS 190 val Met Met Cys lie Ala Cye Arg Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ann 155 2 DC 205
Fhe Lys Ala Val Ser Tyr KÍS Ala Ser Gly Gin Asn Val Ala Tyr Arg 210 215 220
Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 225 230 235 340
Lys Lys lie Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gin Ser 245 250 255
Hie Pro Thr Lya Tyr Asp Tyr Val 2 50 <210> 38 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 38 gagaggatcc cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 40 <210> 39 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 39 gagagcggcc gcctaacact ctcccctgtt gaagctc 37 <210> 40 <211> 324 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <4Ο0> 40 cgtacggtgg ctgcaccate Cgtcttcate ctcccgccat ctgatgagca gttgaaatet 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat sacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tçgaaggtgg ataacgccct çcaatcgggt aactcccagg agagtgtcaç agegçaggaç ião agcaaggaea gcacctacag cctcageage accctgacgc tgagcaaage agactaegag 240 aaacacaaag tccacgcctg cgaagccacc caccagggcc Cgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcfefceaaea ggggagagtg ttag 324 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <400> 41
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Aap Glu 15 10 15
Oln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai vpi Cye Leu Leu Asn Aan Phe 20 25 10
Tyr Pro Arg Glu Ala Lye Vai Gin Trp Lye Vai Aep Aan Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Aon Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Aap Ser Lya Aap Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lya Ala Aap Tyr Glu 65 70 75 80
Lya Hia Lye Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr Hi a Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Vai Thr Lya Ser Phe Aan Arg Gly Glu Cye 100 105 <210> 42 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 42 gagaaagctt tccaccaagg gcccatcggt ette 34 <210> 43 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4Ο0> 43 gagagcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag 36 <210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 44 taccagttga acttgacctc a 21 <210> 45 <211> 981 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 45 ggcccategg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 60 ctgggctgcc tggtcaagga ctacCtcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 120 gccctgacca gcggcgtgca caccctcccg gctgwccac agtcctcagg accctactcc 100 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 240 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgageeeaa atcttgtgac 300 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactCC cggggggacc gccagtcctc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggaccccega ggtcacatgc 420 geggtggtgg acgtgagcca cgaagaccet gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 480 stggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agfcacaacag eacgtaccgt 540 gtggtcageg tcefeeaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 600 aoggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatccccaa agccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctatag caagctcace geggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ccgcaeaacc aetaeacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaatg a 901 <210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4Ο0> 46
Gly Pro Ser Val Pbe Pro Leu Ala Fro Ser Ser Lys Ser Thr ser Gly 15 19 15
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Lev Val Lya Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 20 25 30
Val Thr Val Ser Trp Aan Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hia Thr 35 40 45
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 50 55 60
Val Thr Val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cya Aan
65 70 75 BO
Val Aan HI a Lya Pro Ser Aan Thr Lya Val Aap Lys Lys Val Glu Pro
as 90 PS
Lys Ser Cys Asp Lye Thr Híh Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1O0 105 110
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lye Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 110 val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Abu Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160
Val Glu val His Aon Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp ISO 165 ISO
Leu Aon Gly Lys Glu Tyr Lys Cyo Lys Val ser ash Lys Ala leu Pro 195 200 205
Ala Pro He Glu Lys Thr lie ser Lys Ala Lye Gly Gin pro Arg Glu 210 215 220
Pro Cln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys As it 225 230 235 240
Gin val Ser Leu Thr Cye Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 200 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 260 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 47 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n é a, c, g, ou t <400> 47 tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn 32 <210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 48 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30 <210> 49 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 49 ctgctcactg gatggtggga agatgg 26 <210> 50 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 50 gggacagtca ctgagctgct cagag 25 <210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 51 acaggggcca gtggatagac cgatg 25 <210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 52 agccagggac caagggatag acagatg 27 <210> 53 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 53 gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 54 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 54 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 55 <211> 351 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 55
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata SO tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 130 cctggacacg gccttgagtg gatcggagag attttacetg gaagtggtag tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 24Ú atgcaactca gcagcctgac atccgaggac tctgccgtct attactgtgc aagacatgat 3oo tacccctggc tegcttactg gggccaaggg actctggtea ctgtccctgc a 351 <210> 56 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 56 cagatccagt tggtgcagt:c tggacccgag ctgaogaagc ctggagagac agtcaagatc $0 fccctgcaagg cttetgggta taccttcaca aactatggaa cgaactgggt gaagoaggct 120 ccaggaaagg gcttaaogtg gatgggctgg oteaacocca acectggaga gccaacataC 130 gctgaagagt tcaagggacg gtttgcctec tctttggaaa cctetgccag eaetgectat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagactgggt 300 tttggtaatg ctatggacta cfcggggtcaa ggaaectcag tcaccgtcfcc ctca 354 <210> 57 <211> 348 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 57 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cctctggcta caccttcact gactectata taaactgggt gaagcagagg 12□ actggacagg gccttgegtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 18 0 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgtat 300
ggtgcctttg actactgggg ccaaggcacc actctcaeag cctcctca 34S <210> 58 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 58 caggtceaae tgcagcagce tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctaccgga taaactgggt gaagcegagg 120
cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt ctgatagtta tactaactac ISO aatcaaaagt teaaggacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca geagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtae aagatcgtgg 300 aggggtaact cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 59 <211> 354 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 59 caggttcagc tgcageagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc sgtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag Atttatcctg gaagtggtag tacttactac 1Θ0 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagaggggta 300 ttactacggg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtete ctca 354 <210> 60 <211> 360 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 60 caggttcace tacaacagtc tggttctgaa ctgaggagtc ctgggtettc agfcaaagett 60 teatgcaagg sttttgattc agaagtctte ccttttgctt atatgagttg gafctaggcag 120 aagcctgggc atggatctga atggattgga gacatectcc caagtattgg tagaacaatc 19 0 tatggagaga agtttgagga caaagccaca ctggacgcag acacagtgcc caacacagcc 200 tacttggagc tcaacagtct gacatctgag gactctgcta tctactactg tgcaaggggg 300 gagggctacg gtgcctggtt tgcttaetgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 61 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 61 g&cattgega tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cageaggaga gaaggtcact 60 stgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctactcgacc 120 tggtaceagc agaaaccegg gcagcctcct aaactgetga tctactgggc atccactagg 1Θ0 gaatctgggg cccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
ateagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 3□D ecgctcacgt ccggtgctgg gaccaagctg gagetgaaa 339 <210> 62 <211> 318 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 62 caaatçgctc tcacccagtc tccagoaate atgtctgcat etccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt taeatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 190 tteagtggea gtggacctgg gaceecttac ectctcwaa tcagecgaat ggaggstgaa 240 gacgctgcca ctcattactg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 310 <210> 63 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 63
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc SO atcacctgca oggccngtca gaatgttcgt actgetgtag cctggtatea acagaaacca 120 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 1B0 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtggaatct 240 gaagacctgg eagattattt ctgtctgcao cattggaatt atcctctgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 64 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 64
gacattgega tgtcacagtc tccatcetce ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact SO atgagctgca agtccagtca gageettcta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 330 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgccga tttactgggc atccactagg 1B0 gaatctgggg tccctgateg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 340 atcagcagtg tgaaggctga agateeggea gtttattact gtcagcaata ttatagetat 300 ecgctcacgt teggtgeegg gaecaagctg gagetgaaa 339 <210> 65 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 65 gaeattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cageaggaga gaaggccact 60 atgagctgca agtccagtca gagccegtta aacagtggaa ateaasaga* ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 130 gaatcegggg tccctgateg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccattcacgt teggeteggg gacaaagttg gaaataaaa 330 <210> 66 <211> 336 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 66 gacattgfcga tgtcacagtc tccatcctce ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact ¢0 atgagctgca aatccagtca gagtccgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 10 Q gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatetg ggacagattt cactctcaec 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 tacscgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 334 <210> 67 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 67 gacatcgtga tgtcacagtc tecetcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact ¢0 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tat-agtagca atcaaasgaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaeeagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg laO gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatetg caacagattt cactctgacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agaecttgca gattatcact gtggaeaggg ttacagctat 300 ccgtaeacgt teggaggggg gaccaagetg gaaataaaa 339 <210> 68 <211> 339 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 68 gacettgtga tgtcacagtc tccatcctce ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact ¢0 atgagctgca agtccagtca gageetttta tatagtagea atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaeeagg gcagtctcct ooectgctga tttactgggc atccactagg ISO gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tg&aggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagetat 300 ccgctcaegt tcggtgctgg gaccaagetg gagctgaaa 339 <210> 69 <211> 321 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: produto de PCR <400> 69 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcace £0 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt act tatgttt cctggtatca acagaaacca 120 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatecaaec ggtaeactgg ggtccccgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccaccagcag tgtgaaggct 240 gaagacctgg cagtttatca ctgtcagcaa tattatagct atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 70 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 70 gagaaagctt gccgccacca tggaatggac ctgggtcttt etc 43 <210> 71 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 71 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtc 43 <210> 72 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 72 gagaaagctt gccgccacca tggattggct gtggaacttg ctattcc 47 <210> 73 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 73 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 74 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 74 gagaaagctt gccgccacca tggaatggat ctggatcttt ctcttc 46 <210> 75 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 75 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc 44 <210> 76 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 76 gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttc 46 <210> 77 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 77 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43 <210> 78 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4Ο0> 78 gagaaagctt gccgccacca tggaatggag gatctttctc ttcatcc 47 <210> 79 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 79 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 80 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 80 gagaggtctc aagcttagcc accatggact ggatttggat catgctccat c 51 <210> 81 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 81 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtcc 44 <210> 82 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 82 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc etc 43 <210> 83 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4Ο0> 83 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cage 34 <210> 84 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 84 gagaaagett gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46 <210> 85 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido. <400> 85 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 86 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 86 gagaaagett gccgccacca tggagtttca gacccaggtc tttg 44 <210> 87 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 87 cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc etc 33 <210> 88 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4Ο0> 88 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 89 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 89 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 90 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 90 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctcatg 46 <210> 91 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 91 cacacgtacg ttttatttcc aactttgtcc 30 <210> 92 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 92 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatattg 49 <210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <4Ο0> 93 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 94 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 94 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 95 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 95 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 96 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 96 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggctcaggtt cttatg 46 <210> 97 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 97 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cag 33 <210> 98 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4Ο0> 98 gagaaagctt agccaccatg gaatcacaga ctctggtctt c 41 <210> 99 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: oligonucleótido <400> 99 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 100 <211> 1401 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 100 atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccacteccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agcCgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120 egcaaggcta ctggctacac attcagtagc tactggatag agtgggtaaa gcagaggcct 180 ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggtagtac taactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacattcact gcagataeat cctccaacac agcctacatg 300 caaeteagca gccegaeatc tgag-gactct gccgtotatt actgtgcaag atatgaetac 3 60 ccctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc ctccaccaag 420
ggcccategg tcttccccct ggcaccctec tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 4 BO ctgggctgee tggtcaagga ctacLtcccc qaaccggtga cggtgtcgtg qaactcaggc 540 gcectgacca gcggcgtgca eaccttcccg gctgccctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcageagcg tggtgaccgt gccctccagc agctcgggca cccagaccca catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaacccaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 7B0 ctctcccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacafcge 840 gtggcggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt ccaactggta cgtggacgge 900 gtggaggtgc ataatgccoa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtac^gt 9so gtggecagcg eccfccaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaao ccatctccaa agccaaaggg 1090 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatcec gggatgaget gaccaagaac 1140
caggteagcc tgacctgocC ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 120D gagagcaatg ggcagccgga gaacaactae aagaccacqc ctcccgtgct ggadtccgac 1260 ggctccctct ccctctatag caagcccacc gtggacaaga gcaggtygca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcaeaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 101 <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 101
atggati-ggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag SO atceagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacage caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gdaggcfccea 180 ggaaagggtt caaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aacaCacgct 240 gaagagtcca agggacggct tgccttctct tiggaaacci ctgccagcac egcctattcg 300
cagateaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag actgggtttt ISO ggtaatgcta tggactactg gggtcaagga occtcagtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcceac cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcaccectgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggaetacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca S40 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgfccc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgcccCcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc aeaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagtegagee caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tectgggggg accgtcagtc 7B0 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcaegatct cccggaecce tgaggCcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 800 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggo tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cçcatcgaga aaaccatcte caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaea ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtea gcctgacctg cctggtcaaa ggctbctatc ccagcgacat cgcegtggag 1200 tgggagagcra atgggcagcc ggagaacaac cacaagacca egcctcccgt gctggacccc 1260 gacggctcct tcttcctcta eagcaagcte accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 13 2 p aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctetgcaca accaetacae gcagaagagc 1380 ctetccctgt ctccgggtaa atga 14 04 <210> 102 <211> 1398 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 102
atggaatgga tctggacctt tctcttcatc ctctcaggaa ccgcaggtgc ccectcceag SO gtecagcegc agcagtctgg agctgagctg gcgaggcccg gggctecage gaagctgtce 110 sgeaaggctt ctggccacac cttcaccgae tactaeataa actgggtgaa gçagaggact 100 ggaeagggcc ttgagtggat tggagagatc tatcctggaa gtggtaatac ttactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc eaeactgact geagacaaae cctccagcac agcceacatg loo
cagctcagca gcctgacate tgaggactct gcs.gtct.att tctgtgcaag atcgtatggt 3CC gccettgact actggggcca aggcaccact cccacagtct cctcagcctc caccaagggc 420 ccatcggtct tccccctgcc aecctcctcc aagagesect cegggggcac agcggcccLg 480 ggctgcctgg tcaaggacta ettccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa etcaggcgce 840 etgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagb cctcaggact ccactccctc 60 0 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aaccacaagc ccagcaacac caaggeggac aagaaagCtg agcccaaatc ctgtgacaaa 72 0 acteaoacat gcecaccgtg cccageacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 7Θ0 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atetcccgga cccetgaggt cacatgegtg 840 gtggtggacg tgagccacga agacectgag gbcaagCCca actggtacgt ggacggcgtg 000 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 9S0 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctecaaagc caaagggeag 10BO ccccgagaac cacaggcgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag aceacgcctc ccgtgctgga ctecgacggc 1260 tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1300 etgtetccgg gtaaatga 1398 <210> 103 <211> 1404 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 103 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccacteceag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gcgaggcccg gggcttcagt gaagctgcce 120
tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggataa actgggtgaa gcagaggcct lBO ggacaaggcc ttgagtggat cggaaatatt catccttctg atagccatac Caactacaat 240 caaaagttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcccgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag accgtggagg 360 ggtaactcct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtettcce cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggeacagcg 400 gccctgggct gcctggtcaa ggaccactcc cccgaaccgg tgaeggtgtc gtggaactca S40 ggcgcectga ccagcggcgc gcaeaccttc ccggetgtee taeagtccte aggaetetac 600 tcccccagca gcgtggtgae cgtgccetcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaacc acaageccag caacaccaag gcggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac toctgggggg accgtcagtc 700 fctectcttce ccccaaaace caaggacacc etcatgatct cccggacccc tgaggtcaca B40 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agCtcaactg gcacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtoa gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagee cccatcgaga aaaecatctc caaagccaaa 1080 gggcagcCCC gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggacga gctgaccaag 1140 aaecaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggettctatc ccagcgacat egcegtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gaeggctcct tcttcctcta tagcaagctc ascgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1330 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gçtctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt etcegggtaa atg& 1404 <210> 104 <211> 1401 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 104 atggaatgga ggatctctct cttcatcctg tcaggaactg caggtgtcca ctcccaggtt 60 cagctgcagc agtctggacc tgagctggtg aagcctgggg cttcagtgaa gatgtcctgc 120
aaggcttotg gataeaeatt cactgaetat gttataagct gggtgaagca gagaactgga ISO cagggccttg agtggaecgg agagatttat cctggaagtg gtagtactta ccacaatgag 240 aagttcaagg gcaaggccac actgaccgca gacaaatcct ccaacacagc ctecatgeag 300 cteagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttcfc gtgeaagagg ggtattacta 360 cgggctaegg actactgggg tcaagga&cc tcagtcaccg cctcctcagc ccccaccaag 420 ggcccatcgg tcttcccccfc ggcaccctcc tccaagagca qctctggggg cacagqggcc 400 etgggctgcc tggtceagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgcg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggegtgca cacctCcecg gctgtcctae agtectcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggegaccgt gccctceagc agcctgggc* cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcccgtgac 720 aaaactcaca catgcccace gtgcccagca ccegaactcc tggggggacc gtcagtcttc 700 qtcttccccc caaaacccaa ggacaCCCtc atgateCcce ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggccaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtge ataatgeeaa gaeaaagccg cgggaggage agtaeaacag caegtaccgt 060 gtggccagcg tcctcaccgt cccgcaccag gaccggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtetcea acaaagceet acaagceoco atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1090 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactae aagaeeacge ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtgg-acaaga gcajgtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgeacaaee aetaeacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc egggtaaatg a 1401 <210> 105 <211> 1410 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 105 atggactgga tttggatcat gctccatctg ctggcagcag ctacaggtat ccaatcccag 60 gttcacctac aacagtctgg ttctgaactg aggagtcctg ggfcettcagfc aaagetttca 120
tgcaaggatt etgattcaga agtcttccct tttgctCaca tgagtcggat Caggcagaag 1BO cctgggcaug gatttgaatg gattggagac atactcccaa gtactggtag aacaatctat 2*0 ggagagaagt ttgaggacaa agccacactg gatgcagaca cagtgtccaa cacagcctac 300 ccggagctca acagtctgac atccgaggac tccgctatct actaccgtgc aaggggggag 3so ggctacggtg eetggtttgc ttaetgggge caagggacte EggEcactgt ctctgcagec ' 423 tceaccaagg gcccatcggc cteccccctg gcacccccct ccaagagcac ctccgggggc *80 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 54 0 aactcaggcg ccctgaqcag cggcgtgcac accttecegg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ccceactccc tcagcagcgc ggtgaccgtg ccctccagca gcccgggcac ccagacctac 650 atctgcaacg tgaatcacaa gqccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720
tctegtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 7BO ecagtcttcc tetteecccc aaaacccaag gacaccctea tgatcteecg gacccctgag 6*0 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggnggtgca taatgccaag ecaaagccgc gggaggagca gtacnacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgeaeeagg actggctgaa tggcaaggag 1020 taeaagtgea aggtctccaa caaagccoco ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa iobq gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1110 accaagaacc aggtcagcct gaectgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1300 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactace agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gotccCucCt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg ccttcCcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtotce gggtaaatga 1410 <210> 106 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 106 atggaatcac agactcaggt cctcatgtcc ctgctgttct gggcatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgacacagtc tccafccctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca agtecagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 1B0 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga cccactgggc atccactagg 2*0 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaeagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agatetggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 360 cegctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatet tcccgccatc tgatgagtag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 400 ctgctgaata acttccatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgteaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagetcgecc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 733 <210> 107 <211> 708 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 107 atgcactttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatotcc aggggagaag 120
gtcaccataa cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggtt ccagcagaag ISO
ccaggcactt cUcccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 2 4 D gctcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caaaggagta gttacccace cacgttcgga 3 60 ggggggacca agctggaaat aaaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa aectggaact gcctctgttg egtgcctgct gaataaettc 400 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggegagtg tcacagagca ggacageaag gaeageacct aeagecteag eagcaceecg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcetgaget egcccgtcae aaagagctts aacaggggag agtgttag 70S <210> 108 <211> 705 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 108 atggagtttc agatceaggt ctttgtattc gtgttgctct ggttgeetgg egttgatgga so gac&ttgtga tgacccagtc teaaaaattc atgtccacat eagtaggaga cegggtcagc 120
atcaeetgea aggecagtea gaatgttegt actgetgtag ootggcatca acagesacca ISO gggcagtctc ctaaagcact gateCacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgggaeagat ttcactctca eeattagcaa tgtgcaatct 300 gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atcctctgac getcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcet cttcccgcca 420 fcetgatgagc agttgaaate tggaacfcgee tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gectacgcct gegaagteae ccatcagggc 660
ctgagçtcgc ccgtcacaaa gagcctcaac aggggagagt gttag 70S <210> 109 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 109 atggattcac aggcccaggt tctcacgtta ctgcCgcCat gggtatctgg cacccgcggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgcgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagoegea agtccagtca gagcccttea tatagtagea atcaaaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaaetgctga tttactgggc atceactagg 240 gaacctgggg tccetgatcg ctccacaggc agtggatceg ggacagacet cactcccacc 300 ateageagtg tgaaggctga agaectggea gtttatcact gtcagcaata ttatagetat 360 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagccgaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgat-gagcag Utgaaatctg gaactgcctn cgtcgcglgc 480 eegetgaata aettctatcc cagagaggcc aaagtaeagt ggaaggtgga taacgcectc S40 caatcgggta actcceagga gagtgtcaca gageaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactaegaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 110 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 110 atggaatcac agacteaggt ceteatgtcc ctgetgttet gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cageaggaga gaaggtcact 120
atgagetgea agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaoagaa ctacttgacc ISO tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctaccgggc atccactagg 240 gaafcetgggg tecctgateg ette&caggc agtggatctg gaaeagattt eactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agaectggca gtttafctact gteagaaega ttatagttat 36a ccattcacgt Lcggcccggg gacaaagttg gaaataaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcattt tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggee aaagtacagt ggeaggtgga taacgccctc 540 esatcgggta acteeeagga gagtgtcaea gagcaggaca geaaggaeag caeetaaage 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcet gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 72o tag 723 <210> 111 <211> 720 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <400> 111 aeggattcae aggcccsggt tettatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctce ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagetgea aatceagtca gagtctgctc aacagtagaa ceegaaagaa etaettgget 100 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tecctgateg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaageaatc ttataatctg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgecatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 400 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccsggagag tgfceacogag caggacagca aggacagcac ct&cagectc 600 ageageactc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagaget tcaacagggg agagtgttag 720 <210> 112 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 112
atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg SO gacatcgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagccgtgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa etacttggcc ibo tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttaccgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg caaeagattt eactctgaee 300
arcagcagtg tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg tt. a cage tat ISO ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagetg gaaataaaac gtacggtggc tgeaccatet 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 4Θ0 ctgctgaata acttetatec cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccetc 540 caatcgggta aetcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 113 <211> 723 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 113 atggatccac aggctcaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagea atcaaaagaa ctacttggcc ISO
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 24Q gaatctgggg tccctgatcg cttcacagge agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gccagcaata ttatagetat 360 eegctcacgt tcggtgctgg gaccaagetg gagctgaeec gtacggtggc tgeaccatet 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 460 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccetc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 114 <211> 705 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 114
atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg agctgatggg SO aacattgtaa tgacceaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgacetgca sggcqagtga gaatgtggtt acttatgttt ectggtutea aeagaaacca 180 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcetccaacc ggtacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagcc atccgctcac gttcggtgct 360 gggaccaagc tggagcCgaa acgtacggtg getgcaceac ctgtcetcae nttccegcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 460 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaoggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccaccagggc 66 0 etgagctcge ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 115 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 115
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu 3er Val Thr Ala Gly 15 10 15
Val Hie Ser Gin Val Sin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu «et Lye 20 25 30
Pro Giy Ala Ser Val Lys lie Ser Cya Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Trp lie Glu Trp Val Lye Gin Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Glu lie Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Aon 6E 70 75 80
Glu Lys Pile Lye Gly Lya Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Aan 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gin Leu Sec Sec Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cye Ala Arg Tyr Aap Tyr Fro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 115 120 125
Gly Thr Leu val Thr val Set Ala Ala ser Thr LyB Gly Pro ser val 130 135 140
Phe pro Leu Ala Pro Ser Ser Lye Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 150
Leu Gly Cys Leu Val Lya Asp Tyr Phe pro Glu Pro Val Thr val Ser 165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val Hie Thr Phe Pro Ala Val 1B0 1S5 190
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 230 205 3er Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cya Aen Val Asn Hie Lye 210 215 220 pro ser Asn Thr Lye val Asp Lye Lye val Glu Pro Lye Ser Cys Asp 225 230 235 240
Lya Thr Hia Thr Cys Pro Pro Cya Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lya Pro Lye Asp Thr Leu Met tie 260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 2Θ5
Asp Pro Glu Val Lys Phe Aan Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300
Aan Ala Lye Thr Lya Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Aan Ser Thr Tyr Arg 3 05 310 31.5 320
Val Val Ser Val Leu Thr val Leu His Glu Aap Trp Leu Aan Gly Lys 325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lya val ser Aan Lya Ala Leu Pro Ala Fro lie Olu 340 345 350
Lys Thr lie Ser Lya Ala Lya Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lye Aan Gin Val Ser Leu 370 375 380
Thr Cys Leu Val Lya Gly Fhe Tyr Pro Ser Aap lie Ala Val Glu Trp 385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 4 IS
Leu Asp ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp 420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gin Gift Gly Asn Val Phe Ser Cye Ser Val Met His 435 440 445
Glu Ala Leu Hie Asn His Tyr Thr Gin Lya Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460
Gly Lys 465 <210> 116 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 116
Met Aap Trp Leu Trp Ann Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser 15 10 15
He Gin Ala Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lye 20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lya lie Ser Cys Lyi Ala Ser Gly Tyx Thr Phe 35 40 45
Thr Αβπ Tyr Gly Met Aan Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu 50 55 SO
Lya Trp Met Gly Trp lie Aan Thr Aan Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80
Glu Qlu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 50 95
Thr Ala Tyr Leu Gin lie Aan Aan Leu Lys Aan Glu Aap Thr Ala Thr 100 105 110
Tyr Phe Cyfl Ala Arg Leu Gly Phe Gly Aan Ala Met Aap Tyr Trp Gly 115 120 135
Gin Gly Thr ser val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lye Gly Pro ser 130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160
Ala Leu Gly Cya Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr Val 165 170 175
Ser Trp Aan Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi a Thr Phe Pro Ala ISO 185 190
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 300 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Ola Thr Tyx lie Cya Aan Val Ann Hie 210 215 220
Lye Pro Ser Aan Thr Lya Val Aap Lye Lya Val Glu Pro Lye Ser Cya 225 230 235 240
Asp Lys Thr Sis Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255
Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro pro Lye Pro Lys Aap Thr Leu Met 260 265 270 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cya Val Val Val Aap Val Ser His 275 280 285
Glu Asp Pro Glu Vai Lya Phe Aan Trp Tyr Val Aap Gly Val Glu Val 290 295 300
His Ren Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asti Ser Thr Tyr 305 310 315 120
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Aan Gly 325 330 335
Lye Glu Tyr Lye Cye Lys Val Ser Aan Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 340 345 iso
Glu Lye Thr He Ser Lye Ala Lye Gly Cl Λ Pro Arg Glu Pro Gin val 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 370 375 390
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 3B5 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Aon Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430
Asp Lya Ser Arg Trp Gin Gin Gly Afln val Phe Ser Cye Ser val Met 435 440 445
His Glu Ala Leu Hia Aan Hie Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Pro Gly Lye 465 <210> 117 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 117
Met Glu Trp lie Trp lie Phe Leu Phe lie Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu Oln Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lye Leu Ser Cya Lya Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Tie Aen Trp Val Lya Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu 50 55 60
Glu Trp He Gly Glu Tie Tyr Pro Oly ser Gly Aon Thr Tyr tyr Aen 65 TO 75 Θ0
Glu Lys Phe Lya Oly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Αβρ Lya Ser Ser Ser BS 90 95
Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Αβρ Ser Ala Val 100 10S 110
Tyr Phe Cye Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Αβρ Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125
Thr Thr Leu Thr val ser Ser Ala ser Thr Lya Gly pro ser val Phe 130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 ISO 155 160
Gly Cys Leu Val Lya Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 no 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi a Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 ISO
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 1SS 200 205
Ser ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Aen Val Asn Hie Lya Pro 210 215 220
Ser Asn Thr Lya Val Aap Lya Lya Val Glu Pro Lya Ser Cya Asp Lya 225 230 235 240
Thr His Thr Cya Pro Pro Cya Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lye Pro Lya Asp Thr Leu Met lie Ser 260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cya Val Val Val Aap Val Ser His Glu Aap 275 260 285
Pro Glu Val Lys She Asn Trp Tyr Val Aap Gly Val Glu Val Hio Asn 290 295 300
Ala Lys Thr Lye Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Aap Trp Leu Asn Gly Lye Glu 325 330 335
Tyr Lyfl Cys Lya Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lye 340 345 350
Thr He ser Lya Ala Lya Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr ThT 355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Aap Glu Leu Thr Lyfl Aan Gin Val Ser Leu Thr
370 375 3 SO
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Aap lie Ala Val Glu Trp Glu 3B5 390 395 400
Ser Aan Gly Gin Pro Glu Aan Ann Tyr Lye Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415
Aap Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lye Leu Thr Val Aap Lye 420 425 430
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Aan Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445
Ala Leu Hia Aan His Tyr Thr Gin Lya Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 450
Lya 455 <210> 118 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 118
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Vai tila Ser Gin Vai Gin Lev Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30
Pro Gly Ala Ser val Lye Leu Set Cya Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 3 E 4a 4 5
Thr Ser Tyr Trp lie Aan Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 ¢0
Glu Trp He Gly Asn lie Tyr Pro Ser Aep Ser Tyr Thr Ann Tyr Asn 65 70 75 80
Gin Lya Phe Lya Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Aap Lys Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Wet Gin Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Aop Ser Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Abu Ser Phe Aep Tyr Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Thr Leu Thr val Sar Ser Ala ser Thr Lya Gly Pro ser 130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lya Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160
Ala Leu Gly eye Leu val Lys Aep Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala lcu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190
Val Leu. Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Ann Val Asn Hie 210 215 220
Lya Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lye Lya Val Glu Pro Lya Ser Cya 225 230 235 240
Aep Lys Thr Hia Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255
Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Het 260 265 270
Ilâ Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cya Val Val Val Asp Val Ser Hie 275 200 205
Glu Aap Pro Glu Val Lya Phe Aan Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300
His Asn Ala Lye Thr Lye Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr 305 310 315 320
Arg val Val Ser Vsl Leu Thr Val Leu Hie Gin Asp Trp Leu Aon Gly 325 330 335
Lys Glu Tyr Lye Cys Lye Val Ser Aan Lye Ala Leu Pro Ala Pro He 340 345 350
Glu Lya Thr lie Ser Lye Ala Lya Gly Gin pro Arg Glu Pro Gin val 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro pro ser Arg Aep Glu Leu Thr Lye Aan Gin val Ser 370 3T5 360
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Aap lie Ala Val Glu 305 390 395 400
Trp Glu Ser Aan Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 41S
Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lya Leu Thr Val 420 125 430
Aap Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser Cye Ser Val Met 435 440 445
His Glu Ala Leu Hie Aan Hi a Tyr Thr Gin Lya Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Pro Gly Lye 465 <210> 119 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 0 0> 119
Met Glu Trp Arg lie Phe Leu Phe lie Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val 15 10 15
His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Blu Leu Val Lye Pro 20 25 30
Gly Ala. Ser Val Lye Met Ser Cys Lye Ala Ser Gly Tyr Thr Phe The 35 40 46
Aop Tyr val lie scr Trp Val Lye Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu SO SS ¢0
Trp lie Gly Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Abu Glu 65 70 75 80
Lys Phe Lys Gly Lye Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lye Ser Ser Aen Thr 85 SO 95
Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110
Phe Cys Ala Arg Gly Val Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 11S 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lye Gly Pro Ser Val 130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys see Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160
Leu Gly Cya Leu Val Lya Aap Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175
Trp Aan Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hia Thr Phe Pro Ala val ISO 195 190
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr val Pro 195 200 205
Ser Ser ser Leu Gly Thr Oln Thr Tyr lie cys Asn val Aen Hia Lys 210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lye Val Asp Lye Lys val Glu Pro Lye ser Cya Asp 225 230 235 240
Lye Thr His Thr Cya Pro pro Cya Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Aap Thr Leu Met lie 260 265 270
Ser Arg Thr Pro. Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285
Aep Pro Olu Val Lya Phe Aaa Trp Tyr Val Asp Qly Val Olu Val Hie 290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lye Pro Arg Glu Glu Sin Tyr ASH Ser Thr Tyr Arg 305 UO 315 320
Val val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Sly Lys 325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 340 345 350
Lys Thr lie ser Lya Ala Lya Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Aap Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 5er Leu 370 375 380
Thr Cys Leu Val Lya Gly The Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp
385 390 395 40D
Glu Ser Aen Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 4 05 410 415
Leu Asp Ser Aep Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val Aap 420 425 430
Lya Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe ser cys ser Val Met His 435 440 445
Glu Ala Leu Hia Aan His Tyr Thr Gin Lya Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460
Gly Lys 465 <210> 120 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 120
Met Asp Trp lie Trp He Met Leu His Leu Leu Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15 lie Gin Ser Gin Val His Leu Gin Gin Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser 20 25 30
Pro Gly Ser Set Val Lye Leu Ser Cys Lys Asp Phe ASp Ser Glu Val 35 40 45
PJie Pro Phe Ala Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Lye Pro Gly Hie Gly 50 55 fiO
Phe Glu Trp Tie Gly Aep lie Leu Pro Ser lie Gly Arg Thr lie Tyr 65 70 75 80
Gly Glu Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Aap Ala Asp Thr Val Ser 85 90 95
Aon Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Aan Ser Leu rhr Ser Glu Aop Ser Ala LOO 105 110 lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125
Trp Qiy din Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 130 1 IS 140
Pro ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lye ser rhr Ser Gly Gly 145 150 155 100
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175
Thr val Ser Trp Aan Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hie Thr Phe 1B0 185 190
Pro Ala Val Leu Gin. Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Aan Val 210 215 220
Asa His Lye Pro Ser Asn Thr Lye val Asp Lye Lye val Glu Pro Lys 225 230 235 240
Ser Cys Aop Lya Thr Hia Thr Gya Pro Pro Gy a Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lya Asp Thr 260 265 270
Leu Met He Ser Arg Thr Pro <Jlu Val Thr Cye Val Val Val Asp Val 275 290 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lye Phe Asn Trp Tyr Val Aep Gly Val 290 295 300
Glu Val Hie Asn Ala Lya Thr Lye Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 3OS 310 115 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hie Gin Asp Trp Leu 325 330 335
Aen Gly Lye Glu Tyr Lya Cye Lye Val Ser Asn Lye Ala Leu Pro Ala 340 345 350
Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 350 365
Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lya Aon Gin 370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lye Gly Phe Tyr Pro Ser Aep lie Ala 385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Aon Gly Gin Pro Glu Aon Aen Tyr Lys Thr Thr .405 410 415
Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430
Thr val Aep Lye Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe ser Cye ser 435 440 445 val Met His Glu Ala Leu His Aaη Hie Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lye 465 <210> 121 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 121
net Glu Sec Gin Thr Gin Val Leu Met Scr Leu Leu Pbe Trp Val Ser 15 10 IS
Gly Thr Cya Gly Asp He Val Met Thr Gin See Pro Ser Ser Leu Thr 30 25 30
Val Thr Ala Gly Glu Lye Val Thr Met Ser Cye Lye ser Ser Gin Ser 15 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Aon Gin Lya Aan Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin 50 55 50
Lya Pro Gly Gin Pro Pro Lya leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 □lu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp S5 90 95
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Aap Leu Ala Val Tyr 100 103 110
Tyr Cye Gin Aan Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 . 120 123
Lya Leu Glu Leu Lye Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe lie Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lya Ser Gly Thr Ala ser val val Cys 145 150 155 iso
Leu Leu Asn Aan Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lya Val Gin Trp Lya Val 165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Aan Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 1BO 185 19D
Asp Ser Lys Aap ser Thr Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lya Val Tyr Ala Cys Glu val Thr Kls 210 215 220
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lya Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 122 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 122
Met Hia Phe Gin Val Gin lie Phe Ser Phe Leu Leu He 9er Ala Sec IS 10 15
Val He Mec Ser Arg Gly Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie 30 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val The lie Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45
Ser Ser val Ser Tyr Met Kie Trp Phe Gin Gin Lye Pro Gly Thr Ser SO 55 60
Fro Lye Leu Trp lie Tyr ser Thr Ser Aen Leu Ala Ser Gly Val Pro ¢5 70 75 60 >1» Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie 05 90 95
Eer Arg Met Olu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cya Gin Gin Arg 100 105 110
Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Leu Glu He Lye 115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro ser Asp Glu 130 135 14 0
Gin Leu Lye Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cya Leu Leu Aen Aen Phe 145 150 155 160
Tyr Pm Arg Glu Ala Lya Val Gin Trp Lys Val Asp Aen Ala Leu Gin 165 170 175
Ser Gly Aen Ser Gin Glu ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lye Asp Ser 180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Gya Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220
Pro val Thr Lya Ser Phe Asn Arg" Gly Glu Cya
325 230 Í3S <210> 123 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 123
Met Glu Phe Gin Thr Gin Val Phe Val Phe Val Leu Lett Trp Leu Ser 1 5 10 15
Gly Val Asp Gly Asp lie Val Met The Gin Ser Gin Lye Phe Met Ser 20 25 30
Thr Ser Val Gly Aep Arg Val Ser lie thr Cys Lye Ala Ser Gin Aan 15 40 45
Val Arg Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Gin Ser Pro SO 55 60
Lys Ala Leu lie Tyr Leu Ala Ser Aen Arg Hie Thr Gly val Pro Asp 65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser S5 90 95
Aen Val Gin Ser Glu Aep Leu Ala Αβρ Tyr Phe Cya Leu Gin His Trp 100 105 110
Aen Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lye Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 13 0 13 5 140
Leu Lye Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cye Leu Leu Aen Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Qly Asn Ser Gin Glu Sec Val Thr Glu Gin Asp Ser Lye Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lye Ala Asp Tyr Glu Lya 195 200 205
Hia Lys Val Tyr Ala Cya Glu Val Thr Hie Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lya Ser Phe Asn Arg Gly Glu eye 225 230 <210> 124 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 124
Met Asp Sec Gin Ala Gin Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 15 10 15
Gly Thr Cya Gly Asp He Val, Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30
Val Ser val Gly Glu Lya Val Thr Met Ser Cye Lye Ser Ser Qln Ser 35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Ser Aon Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lya Pro Gly Gin Ser Pro Lya Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 6 5 70 75 3 0
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap 05 90 95
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Lya Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cye Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125
Lye Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe lie Phe 130 135 140
Pro Pro ser Aep Glu oln Leu Lya Ser Gly Thr Ala ser Val Val cya 145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lye Val Gin Trp Lye Val
165 170 17S
Asp Aen Ala Leu Gin Ser Gly Aen Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin ISO 135 190
Asp Ser Lys Aep Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 20D 205
Lye Ala Asp Tyr Glu Lye Hie Lys Val Tyr Ala Cye Glu Val Thr Hie 210 215 230
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lye Ser Phe Aen Arg Gly Glu Cye 225 230 235 240 <210> 125 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 125
Met Glu Her Gin Thr Gin Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser 15 10 IS
Gly Thr Cys Gly Asp lie val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr 20 25 30
VaL Thr Ala Gly Glu Lye Val Thr Met Ger Cye Lye Ser Ser Gin Set 35 40 45
Leu Lev· Aen Her Gly Ann Gin Lye Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lys pro Gly Gin Pro Pro Lye Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80
Glu ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Thr Leu Thr lie ser Ser val Gin Ala Glu Aep Leu Ala val Tyr 1O0 105 110
Tyr Cys Gin Asm Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Oly Ser Gly Thr 115 120 125
Lye Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe He Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lya Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cya 145 150 1SS 160
Leu Leu As π Aan Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lye Val Gin Trp Lys Val 165 170 175
Asp Aan Ala Leu Gin Ser Gly Aan Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 1B0 185 190
Asp Ser Lye Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lya Ala Asp Tyr Glu Lye Hie Lys Val Tyr Ala Cya Glu Val Thr Hie 210 215 220
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lya Ser Phe Aen Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 126 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 126
Met Asp ser Gin Ala Gin val Leu lie Leu Leu Leu Leu Trp Val ser IS 10 15
Gly Ttlr Cys Gly Aop lie Val Met Set Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 20
Val Ser Ala Gly Glu Lys val Thr Met Ser Cys Lya Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lye Aan Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin SO 55 60
Lya Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg £5 70 75 60
Glu Ser Gly Val Pro Aap Arg Phe The Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 9S
Phe Thr Leu Thr lie Ser Set- Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cya Lye Gin Ser Tyr Aan Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lya 115 120 125
Leu Glu lie Lye Arg Thr Val Ala Ala Pro ser Val Phe He pfce pro 130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lya Sec Gly Thr Ala Ser VaL Val Cya Leu 145 150 155 160
Leu Aan Aen Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lya Val Gin Trp Lya Val Aap 165 170 175
Aan Ala Leu Gin ser Gly Aen Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Aap ISO 195 190
Ser Lye Aap Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lya 195 200 205
Ala Aap Tyr Glu Lye His Lya val Tyr Ala Cya Glu Val Thr Kia Gin 210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lya Ser Phe Aan Arg Gly Glu Cya 225 230 235 <210> 127 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 127
Met Asp Ser Gin Ala Gin Val Leu net Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 15 10 15
Gly Thr Cya Gly Asp lie Val Met Ser Gin Ser Fro Ser Ser Leu Ala 20 25 30
VaL Ser Val Gly Glu Lye Val Thr Met Ser Cys Lya Ser Ser Gin Ser 35 40 4S
Leu Leu Tyr Ser ser Aon Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 5S 60
Lye Pro Gly Gin Ser Pro Lye Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 eo
Olu Ser Gly Val Pro Aep Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp 85 90 95
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110
Hia Cys Gly Gin Gly Tyr Ser Tyr Pro tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125
Lye Leu Glu lie Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 ISO 155 150
Leu teu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lya Val Gin Trp Lys Val 165 170 175
Asp Aan Ala Leu Gin Ser Gly Aon Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 180 185 190
Asp Ser Lya Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 19S 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hie Lys Val Tyr Ala Cye Glu Val Thr File 210 21S 220
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 128 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 128
Met Asp Ser Gin Ala Gin Val Leo net Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 15 10 15
Gly Tlir Cys Gly Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Lye Val Thr Met Ser Cys Lye Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lye Aen Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Lye Pro Gly Gin Ser Pro Lye Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp 8 5 90 95
Phe Thr Leu Thr Tie Ser Ser Val Lya Ala Glu Asp Levi Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 12 D 125
Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser val Phe He Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lya Val 165 170 175
Asp Aan Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205
Lya Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr Hi a 210 215 220
Gin Gly Leu Ser set pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 129 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: anticorpo monoclonal quimérico <4 Ο 0> 129
Met Glu Ser Gin Thr leu Val Phe He Ser He Leu Leu Trp Leu Tyr
15 10 IS
Gly Ala Aep Gly Aen He Val Net Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30
Met Sot- Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr eye Lya Ala Ser Glu Asn 35 40 45
Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lya Pro Glu flln Ser Pro 50 55 60
Lye Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Aon Arg Tyr Thr Gly Val Pro Aap 65 70 75 60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Aop Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 90 35
Ser Val Lya Ala Glu Aep Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr 100 105 110
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lye Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125
Thr val JUa Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser Val val Cys Leu Leu Asn Aen Phé Tyr 145 150 155 160 pro Arg Glu Ala Lye val Gin Trp Lys val Asp Aen Ala Leu Gin ser
--------— -165 170 17S
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp ser Lya Asp ser Thr ISO 1S5 190
Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Aep Tyr Glu Lys 195 200 205
Hie Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 130 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4 0 0> 130 ccaagggcta tggcgttc 18 <210> 131 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <4 0 0> 131 ccgaaggtgt acctggtc 18 <210> 132 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 132
Gin Val Gin Leu Bln Bln Ser oiy Ala Glu Leu Net lye Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val LyH lie Ser Cye Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 30 25 30
Tip lie Glu Trp val Lye Gin Arg Pro Gly Hia Gly Leu Glu Trp lie 15 40 45
Gly Glu lie Ley Pro Gly Ser Gly Ser Thr Aeo Tyr Aan Gly Lye Phe 50 55 ¢0
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Aan Thr Ala Tyr 65 7 0 75 0 0
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp aly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 133 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 133
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cya Lys Ala Ser Oly Tyr Thr Phe Thr Aan Tyr 20 25 30
Gly net Αβπ Trp val Lye Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu Lya Trp Met 35 10 45
Sly Trp lie Asn Thr Aan Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala Qlu Glu Phe 50 55 ¢0
Lya Gly Arg Fhe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 00 75 80
Leu Gin lie Aon Aon Leu Lye Aan Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cya 85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Aan Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 134 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 134
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Fro Gly Ala 15 10 IS
Ser val Lya Leu Ser Cye Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Tyr lie Asn Trp val Lys Gin Arg Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Αβπ Thr Tyr Tyr Aan Glu Lys Phe 50 5 5 60
Lys Gly Lye Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lye 3er 3er Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 60
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cye 65 90 95
Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 Ο 0> 135
Oln Vai Oln leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Ala 15 10 15 3er Vai Lye Leu Ser Çys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr S6r Tyr 20 2S 30
Trp lie Aon Trp Vai Lye Gin Arg Pro Gly 3ln Gly leu Glu Trp Ile 15 40 45
Gly Asn lie Tyr Pro Ser ABp Ser Tyr Thr Aan Tyr Asn Gin Lya Phe 50 55 ¢0
Lys Aap Lye Ala Thr leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
G5 70 75 SO
Met Gin Leu Ser Ser Pro Thr ser Glu Aep ser Ala Vai Tyr Tyr cye Θ 5 90 95
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Aep Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 <210> 136 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 136
Gin Vai Oln Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lye Pro Gly Ala 15 10 15
Ser val Lye Met Ser cye Lye Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Aap Tyr 20 25 20 val Ile Ser Trp Val Lya Gin Arg"Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp ile 35 40 45
Gly Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Aen Glu Lys Phe SO 55 60
Lya Gly Lye Ala Thr Leu Thr Ala Aep Lye Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 SO
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Aep Ser Ale Val Tyr Phe Cye 85 90 95
Ala Arg Gly Val Leu Leu Arg Ala Met Aap Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 137 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 137
Gin Val Hie Leu Gin Gin Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lye Lev Ser eye Lye Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe pro Phe 20 25 30
Ala Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Lye Pro Gly Hie Gly Phe Glu Trp 35 40 45 lie Cly Asp lie Leu Pro Ser lie Qly Arg Thr lie Tyr Gly Glu Lya 50 55 60
Phe Gill Asp Lye Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala
65 70 75 SO
Tyr Leu Glu Leu Aen Ser Leu Thr Ser Glu Aap Ser Ala lie Tyr Tyr 65 90 95
Cys Ala Arg Cly Clu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Cly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 138 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 Ο 0> 138 Αβρ lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 IS
Glu Lye Val Thr Met Ser Cye Lye Ser Ser Gin Ser Leu Leu Aon Ser 20 25 10 01 y Aan Gin Lys Aen Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val SO 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 00 lie Ser Ser val Gin Ala Glu Asp Leu Ala val Tyr Tyr eye Gin Aen 65 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phs Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 10S 110
Lya <210> 139 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 139
Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Lye Val Thr lie Thr Cye Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30
Hie Trp Phe Qln Gin Lye Pro Gly Thr Ser Pro Lya Leu Trp lie Tyr 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu 6S 70 75 eo
Aap Ala Ala Thr Tyr Tyr Cye Gin Gin Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 05 »0 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lye Leu Glu lie Lye 100 105 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto
de PCR <4 0 0> 140
Aep He Val Met Thr Gin ser Gin Lya Phe Met ser Thr Ser val Gly 15 10 IS
Asp Arg Val Ser He Thr eye Lys Ala ser Gin Asn val Arg Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Gin Ser Pro Lye Ala Leu lie 35 40 45
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Hie Thr Gly Val Pro Αθρ Arg phe Thr Gly
SO 5S SO
Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Thr Leu Thr lie Ser Aen val Gin ser
65 70 75 BO
Clu Asp Leu Ala Aap Tyr Phe Cya Leu Gin Hie Trp Asn Tyr Pro Leu SS 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 141 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto
de PCR <4 Ο 0> 141
Aep tie Val Met Set Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly IS 10 15
Glu Lya Val Thr Met Ser Cye Lye Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Gin Lye Αβπ Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lya pro Gly Gin IS 40 45 ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 SO lie Ser Ser Val Lya Ala Glu Aep Leu Ala Val Tyr Tyr Cye Oln Gin S3 SO 55
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lya Leu Glu Leu 100 105 110
Lys <210> 142 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 142
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr val Thr Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser cys Lya Ser Ser Gin Ser Leu. Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Aen Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lya pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 SO lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Aep Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly ser Gly Thr Lys Leu Glu lie 1O0 105 110
Lys <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto
de PCR <4 0 0> 143
Asp He val net Set Gin ser Pro ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 15 10 15
Glu Lya Val Thr Met Ser Cya Lya Ser Ser Gin Ser Leu-Leu Aan Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lya Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lye Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Aop Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Thr Levi THr
65 70 75 SO lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Aap Leu Ala Val Tyr Tyr Cya Lys Gin
es 90 9S ser Tyr Aan Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 144 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto
de PCR <4 0 0> 144
Asp He Val net Ser Gin ser Pro Ser ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cya Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Aan Gin Lya Asa Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Sin Lya Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lya Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val SO 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 SO
He Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin 85 80 95
Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys <210> 145 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 145
Asp lie Val Met ser Gin ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly IS 10 15
Glu Lya val Thr Met Ser eye Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 30 35 30
Set Aan Gin Lya Aan Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lya Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lya Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Thr Leu Thr
65 70 75 SO lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Aep Leu Ala Val Tyr Tyr Cya Gin Gin B5 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe GLy Ala Gly Thr Lya Leu Glu Leu 100 105 110
Lys <210> 146 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Descrição de sequência artificial: Tradução de produto de PCR <4 0 0> 146
Asn lie Vai Met Thr Gin Ser Pro Ιγβ Ser Met Ser Met Ser Vai Gly 15 10 15
Glu Arg Vai Thr Leu Thr Cye Lyn Ala Ser Glu Aon Vai Vai Thr Tyr 20 25 30
Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Olu Gin Ser Pro Lyo Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Oly SO S5 60
Ser Gly Ser Ala Thr Aep Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Vai Lya Ala 65 70 75 90
Glu Aep Leu Ala Vai Tyr Tyr Cya Oln Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu 95 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 147 <211> 324 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: ácido nucleico de codões otimizados <4 0 0> 147 cgtacggtgg ccgctcocag egtgttcate ctccccccca gcgacgagca gctgaagtcc 60 ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaae aacttctace ccegggaggc caaggtgcag 120 tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtcac cgagcaggac 1β o agcaaggact ccagctacag cctgageagc accetgacec tgagcaagge cgaetacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc cacçagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 1QQ agcttcaaca ggggcgagtg ctag 324 <210> 148 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: proteína de codões otimizados <4 Ο 0> 148
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lye Ser Gly Thr Ale Ser Val Val Cye Leu Leu Aon Aen Phe
20 25 3D
Tyr Pro Arg Glu Ala Lya Val Gin Trp Lye Val Aep Aan Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Aan Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Aep Ser Lya Aep See 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lya Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 00
Lya Hie Lye Val Tyr Ala Cya Glu Val Thr Hla Gin Gly Leu Ser Ser 65 90 95
Pro Val Thr Lya Ser Phe Aen Arg Gly Glu Cys 100 10 5 <210> 149 <211> 981 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: ácido nucleico de codões otimizados <4 0 0> 149 ggcccaagcg tgttccccct ggcccccagc ageaagagea ccegcggcgg cacagccgcc 60 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgcgagctg gaacagcgga 120 gccctgacct ccggcgtgca cacettcccc gecgtgctgc agageagegg cctgtaeagc 180 ctgagcagcg tggtgaccgt gcccageagc agcecgggca cccagaecta catctgcaac 240 gtgaaccaca agcccagcaa caccauggtg gacaagagag tggagcccaa gagetgegae 300 aagacccaca cccgcccccc ctgcccagcc ccagagctge tgggcggacc cagcgtgtte 360 ctgttccccc ccaagcceaa ggecaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgaectgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggaccea gaggtgaagt tcaactggta egtggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccç agageggegc agtacaacaq eacctacagg 540 gtggtgtccg tgctgaecgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 600 aaggtcteea acaaggcect gceagceeoc ar.f-gaaaagn eeatcagcaa ggceaagggc 6 60 cagccacggg agccccaggc gtacaccctg ccccccagcc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtgteec tgacctgtee ggtgaagggc ttetaeecca gegac&tcgc cgtggagtgg 780 gagagcaacg gccagcccga gaacaaetac aagaceaecc ccccagtget ggacagcgae 640 ggeagettet tcetgtaeag eaagetgace gtggacaagt eeaggtggca gcagggcaac 90 0 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgeacaacc actacaccca gaagtccctg 960 agcctgagec ccggcaagta g 901 <210> 150 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: proteína de codões otimizados <4 0 0> 150 CLy Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lya Ser Thr Ser Gly 1 5 10 15
Oly Thr Ala Ala Leu Gly Cyo Leu Val Lya Asp Tyr phe Pro Glu Pro 20 25 30
Val Thr Val Ser Trp Aan Ser Gly Ala Leu Thr Ser Oly val His Thr 35 40 45 phe Pro Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
50 55 SO
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Aen
65 10 75 SO
Val Aan HIb Lya Pro Ser Abu Thr LyB Val Aap Lye Arg Val Glu Pro 85 90 95
Lys Ser Cys Aap Lys Thr Hie Thr Cys Pro Pro eye Pro Ala Pro Glu 100 105 110
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lya Pro Lya Aap 115 120 125
Thr Leu wet lie Ser Arg Thr Pro Glu Val The Cys Val Val Val Aap 130 135 140
Val Ser Híb Glu Asp Pro Glu Val Lye Phe Aan Trp Tyr Val Aap Gly 145 150 155 160
Val Glu Val HI a Asπ Ala Lya Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Aen 165 170 175
Ser Thr Tyr Arg val val ser Val Leu Thr val Leu His Gin ABp Trp 180 185 190
Leu Asa Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lye Val Ser Aen Lyo Ala Leu Pro 195 200 205
Ala Pro lie Glu lya Thr He Ser Lya Ala Lye Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220
Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lya Aan 225 230 235 240
Gin Val Sec Leu Thr Cys Leu Val Lye Oly Pile Tyr Pra Sec Asp lie 245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser ASn Gly Gin Pro Glu Aon Asn Tyr Lya Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lye 275 2 30 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 Í0O
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin LyS Set Leu 105 110 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lyo 325
Lisboa, 2015-10-29

Claims (29)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal possuindo a capacidade de se ligar a CLD18A2 e de mediar a morte de células que expressam CLD18A2 em que o anticorpo se liga a um epitopo localizado na voltai de CLD18A2 (CLD18A2-voltal) ou na voltaD3 de CLD18A2 (CLD18A2-voltaD3) e em que a morte é induzida pela ligação do anticorpo a CLD18A2 expressa pelas referidas células, em que o anticorpo medeia a morte de células através da indução de lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e/ou lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
  2. 2. Anticorpo da reivindicação 1 que se liga a CLD18A1 e a CLD18A2 ou se liga a CLD18A2 mas não a CLD18A1.
  3. 3. Anticorpo das reivindicações 1 ou 2, em que as referidas células que expressam CLD18A2 são células de cancro, em que as células de cancro são de preferência selecionadas a partir do grupo que consiste em células tumorigénicas de cancro gástrico, esofágico, pancreático e do pulmão.
  4. 4. Anticorpo da reivindicação 3 em que a referida lise mediada por ADCC ocorre na presença de células efetoras selecionadas a partir do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMN ou a referida fagocitose é por macrófagos.
  5. 5. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, o qual é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo.
  6. 6. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-5 selecionado a partir do grupo que consiste num anticorpo IgGl, um IgG2, de preferência IgG2a e IgG2b, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgA secretor, um IgD e um IgE.
  7. 7. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 2-6, em que CLD18A2 tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2.
  8. 8. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 2-7, em que CLD18A1 tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 8.
  9. 9. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-8, que se liga a epitopos nativos de CLD18A2 presentes na superfície de células vivas.
  10. 10. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-9, que é específico para células de cancro, de preferência células de cancro do estômago.
  11. 11. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-10 que é obtenível através de um método compreendendo o passo de imunização de um animal não humano com uma proteína ou um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23 e 26-31, ou um seu fragmento imunogénico, ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira que expressa a referida proteína ou péptido, ou seu fragmento imunogénico.
  12. 12. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de preferência pelo menos a CDR3, da região variável da cadeia pesada (VH) e/ou da região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo que compreende uma combinação de VH e VL, cada uma compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (ix): (i) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1 : posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2 : posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1 : posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2 : posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69- 76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
  13. 13. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma VH compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (vi): (i) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, (ii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, (iii) CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, (iv) CDR1 posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, (v) CDR1: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69-76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, e (vi) CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71- 78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120.
  14. 14. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma VL compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (ix): (i) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76- 78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (ii) CDR1: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (iii) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (v) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (vii) CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) CDR1: posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
  15. 15. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma combinação de VH e VL, cada uma compreendendo um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das seguintes (i) a (ix): (i) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 115, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 115, CDR3: posições 116-125 de SEQ ID NO: 115, VL: CDR1: posições 49-53 de SEQ ID NO: 122, CDR2: posições 71-73 de SEQ ID NO: 122, CDR3: posições 110-118 de SEQ ID NO: 122, (ii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 116, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 116, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 116, VL: CDR1: posições 47-58 de SEQ ID NO: 121, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 121, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 121, (iii) VH: CDR1: posições 45-52 de SEQ ID NO: 117, CDR2: posições 70-77 de SEQ ID NO: 117, CDR3: posições 116-124 de SEQ ID NO: 117, VL: CDRl : posições 47-52 de SEQ ID NO: 123, CDR2: posições 70-72 de SEQ ID NO: 123, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 123, (iv) VH: CDRl: posições 44-51 de SEQ ID NO: 119, CDR2: posições 69- 76 de SEQ ID NO: 119, CDR3: posições 115-125 de SEQ ID NO: 119, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 126, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 126, CDR3: posições 115-122 de SEQ ID NO: 126, (v) VH: CDRl: posições 45-52 de SEQ ID NO: 118, CDR2: posições 70- 77 de SEQ ID NO: 118, CDR3: posições 116-126 de SEQ ID NO: 118, VL: CDRl: posições 47-58 de SEQ ID NO: 125, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 125, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 125, (vi) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 124, CDR2 : posições 76-78 de SEQ ID NO: 124, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 124, (vii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 127, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 127, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 127, (viii) VH: CDR1 : posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2 : posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-58 de SEQ ID NO: 128, CDR2: posições 76-78 de SEQ ID NO: 128, CDR3: posições 115-123 de SEQ ID NO: 128, e (ix) VH: CDR1: posições 45-53 de SEQ ID NO: 120, CDR2: posições 71-78 de SEQ ID NO: 120, CDR3: posições 117-128 de SEQ ID NO: 120, VL: CDR1 : posições 47-52 de SEQ ID NO: 129, CDR2 : posições 70-72 de SEQ ID NO: 129, CDR3: posições 109-117 de SEQ ID NO: 129.
  16. 16. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137 e um seu fragmento.
  17. 17. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, e um seu fragmento.
  18. 18. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma combinação de região variável da cadeia pesada (VH) e região variável da cadeia leve (VL) selecionada a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix): (i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 132 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 139 ou um seu fragmento, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 138 ou um seu fragmento, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 134 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 140 ou um seu fragmento, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 136 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 143 ou um seu fragmento, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 135 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 142 ou um seu fragmento, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 141 ou um seu fragmento, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 144 ou um seu fragmento, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 145 ou um seu fragmento, (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 137 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 146 ou um seu fragmento.
  19. 19. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, e um seu fragmento e/ou (ii) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, e um seu fragmento.
  20. 20. Anticorpo da reivindicação 1 que compreende uma combinação de cadeias pesadas e cadeias leves selecionada a partir das seguintes possibilidades (i) a (ix) : (i) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 115 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 122 ou um seu fragmento, (ii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 116 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 121 ou um seu fragmento, (iii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 117 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 123 ou um seu fragmento, (iv) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 119 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 126 ou um seu fragmento, (v) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 118 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 125 ou um seu fragmento, (vi) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 124 ou um seu fragmento, (vii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 127 ou um seu fragmento, (viii) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 128 ou um seu fragmento, e (ix) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 120 ou um seu fragmento e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 129 ou um seu fragmento.
  21. 21. Hibridoma capaz de produzir o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
  22. 22. Conjugado compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 20 acoplado a um agente terapêutico, em que o agente terapêutico é de preferência uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
  23. 23. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 20 e/ou um conjugado da reivindicação 22, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  24. 24. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 20 e/ou conjugado da reivindicação 22, para utilização num método para inibir o crescimento e/ou matar uma célula que expressa CLD18A2.
  25. 25. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 20, conjugado da reivindicação 22 ou composição farmacêutica da reivindicação 23, para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células que expressam CLD18A2.
  26. 26. Anticorpo, conjugado, ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 25, em que a doença ou distúrbio é uma doença relacionada com tumores, em que a doença relacionada com tumores é, de preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em cancro da mama, cancro gástrico, cancro esofágico, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro do cólon, cancro colorrectal, cancro hepático, cancro da cabeça-pescoço, cancro da vesícula biliar, e suas metástases.
  27. 27. Anticorpo, conjugado ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 25 ou 26, em que o método compreende ainda o tratamento com um agente quimioterapêutico, radiação ou uma citoquina.
  28. 28. Anticorpo, conjugado ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 27, em que o agente quimioterapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina e ciclofosfamida.
  29. 29. Anticorpo, hibridoma, conjugado ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1-23, e anticorpo, conjugado ou composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, em que a referida CLD18A2 é expressa na superfície das referidas células. Lisboa, 2015-10-29
PT100117738T 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro PT2311877E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05025657A EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2005-11-24 Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2311877E true PT2311877E (pt) 2015-11-18

Family

ID=36090797

Family Applications (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT100117738T PT2311877E (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro
PT181852377T PT3421498T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT100117753T PT2311878E (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro
PT68188176T PT1948693E (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro
PT100117761T PT2311879T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT192028488T PT3656793T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT171924665T PT3312197T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT10011772T PT2325210T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro

Family Applications After (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT181852377T PT3421498T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT100117753T PT2311878E (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro
PT68188176T PT1948693E (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para tratamento de cancro
PT100117761T PT2311879T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT192028488T PT3656793T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT171924665T PT3312197T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro
PT10011772T PT2325210T (pt) 2005-11-24 2006-11-24 Anticorpos monoclonais contra claudina-18 para o tratamento de cancro

Country Status (24)

Country Link
US (9) US8168427B2 (pt)
EP (11) EP1790664A1 (pt)
JP (4) JP5933157B2 (pt)
KR (7) KR102099875B1 (pt)
CN (3) CN103509110B (pt)
AU (1) AU2006316767B9 (pt)
BR (1) BRPI0618920B8 (pt)
CA (3) CA2886580C (pt)
CY (8) CY1114050T1 (pt)
DK (8) DK2311879T3 (pt)
ES (8) ES2642688T3 (pt)
HK (5) HK1246320A1 (pt)
HR (8) HRP20220155T3 (pt)
HU (7) HUE048404T2 (pt)
LT (5) LT3312197T (pt)
ME (1) ME03608B (pt)
MX (3) MX339682B (pt)
PL (8) PL1948693T3 (pt)
PT (8) PT2311877E (pt)
RS (8) RS52790B (pt)
RU (1) RU2445319C2 (pt)
SG (2) SG10201405134WA (pt)
SI (8) SI3421498T1 (pt)
WO (1) WO2007059997A1 (pt)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1767627A4 (en) * 2004-06-07 2007-07-25 Kyowa Hakko Kogyo Kk ANTI-PERP ANTIBODY
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
JP5095416B2 (ja) * 2005-12-06 2012-12-12 協和発酵キリン株式会社 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
US20090124022A1 (en) * 2007-10-19 2009-05-14 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian ngal and uses thereof
US20090123946A1 (en) * 2007-10-19 2009-05-14 Abbott Laboratories Immunoassays and kits for the detection of ngal
US8846036B2 (en) * 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
KR20110128316A (ko) 2009-02-20 2011-11-29 가니메드 파마슈티칼스 아게 암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물
US9487584B2 (en) 2009-11-11 2016-11-08 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
CN102666585B (zh) 2009-11-24 2015-02-18 阿莱斯亚生物疗法股份有限公司 抗簇蛋白抗体和抗原结合片段及其减小肿瘤体积的用途
KR20220017432A (ko) 2010-02-24 2022-02-11 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
EP2404936A1 (en) * 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
AU2011317743B2 (en) * 2010-10-18 2015-05-21 Mediapharma S.R.L. ErbB3 binding antibody
US9217040B2 (en) 2011-01-14 2015-12-22 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ROR-1 protein and methods for use of same
EP2668210B1 (en) * 2011-01-26 2020-06-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
WO2012109282A2 (en) * 2011-02-07 2012-08-16 Agamin Pharmaceuticals, Llc Methods and systems for treating or preventing pregnancy-related hypertensive disorders
US8722044B2 (en) * 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
MX346555B (es) 2011-04-01 2017-03-24 Immunogen Inc Metodos para aumentar la eficacia de la terapia contra el cancer con receptor 1 de folato (folr1).
EP3421496A1 (en) 2011-05-13 2019-01-02 Ganymed Pharmaceuticals GmbH Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
AU2012359039B2 (en) * 2011-12-20 2017-08-24 Janssen Biotech, Inc. Anti-PHF-tau antibodies and their uses
WO2013123588A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Alethia Biotherapeutics Inc. Co-use of a clusterin inhibitor with an egfr inhibitor to treat cancer
WO2013167153A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174403A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP3725810B1 (en) 2012-05-23 2022-07-06 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
AU2013295848B2 (en) 2012-07-25 2018-05-24 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-KIT antibodies and uses thereof
PL2890717T3 (pl) 2012-08-31 2020-08-10 Immunogen, Inc. Testy i zestawy diagnostyczne do wykrywania receptora folianu
RU2678127C2 (ru) 2012-11-13 2019-01-23 Бионтех Аг Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний
EP3766903A3 (en) * 2012-11-13 2021-02-17 BioNTech SE Bispecific anti claudin xcd3 antibodies for treatment of claudin expressing cancer diseases
AU2013362935B2 (en) 2012-12-18 2018-10-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
EP2958945B1 (en) * 2013-02-20 2022-10-19 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014159531A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Monoclonal antibodies targeting epcam for detection of prostate cancer lymph node metastases
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
WO2014146672A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
SI2976360T1 (sl) * 2013-03-18 2020-04-30 Astellas Pharma Inc. Terapija, ki vključuje protitelesa proti Klavdinu 18.2 za zdravljenje raka
WO2015014376A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
WO2015031815A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
JP6515111B2 (ja) 2013-11-06 2019-05-22 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー 新規の抗クローディン抗体および使用方法
CN106659782B (zh) 2014-05-23 2021-11-09 塞尔德克斯医疗公司 一种用于嗜酸性粒细胞或肥大细胞相关病症治疗的抗体
JP6893594B2 (ja) * 2014-07-10 2021-06-23 ハイバーセル，インク． 腫瘍微小環境に影響する抗癌剤と組み合わせたβ−グルカン
CN105315375B (zh) * 2014-07-17 2021-04-23 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
CA2990398A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-cd123-antibodies
WO2017035375A1 (en) * 2015-08-25 2017-03-02 The Uab Research Foundation Methods for stem cell transplantation
WO2017049149A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Immunogen, Inc. Therapeutic combinations comprising anti-folr1 immunoconjugates
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
EP3471762A4 (en) * 2016-06-16 2020-03-11 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University HUMANIZED AND CHIMERIC MONOCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST CD81
SG11201900171QA (en) * 2016-07-08 2019-02-27 Carsgen Therapeutics Co Ltd Antibody for anti-claudin 18a2 and use thereof
EP3558388A1 (de) 2016-12-21 2019-10-30 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
JP7030811B2 (ja) 2016-12-21 2022-03-07 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤を有する特異的抗体－薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
JOP20180021A1 (ar) 2017-03-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتلات خيوط بروتين تاو (tau) الحلزونية المزدوجة واستخداماتها
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
WO2019173420A1 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
WO2019173417A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-tip-1 antibodies and uses thereof
KR102340989B1 (ko) * 2018-03-28 2021-12-20 에이비온 주식회사 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도
CN108517315B (zh) * 2018-03-30 2019-06-04 四川迈克生物新材料技术有限公司 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
EP3794037A4 (en) 2018-05-18 2022-03-02 Lanova Medicines Limited Company ANTI-CLAUDIN 18.2 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2020018852A2 (en) * 2018-07-18 2020-01-23 Askgene Pharma Inc. Novel antibodies and methods for making and using the same
EP3827021A4 (en) * 2018-07-23 2022-08-03 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. ANTIBODIES TARGETING A COMPLEX INCLUDING UNCLASSICAL HLA-I AND NEOANTIGEN AND METHODS OF USE THEREOF
CN110862454B (zh) 2018-08-27 2022-12-30 南京圣和药业股份有限公司 一种抗Claudin18_2抗体及其应用
KR20210093879A (ko) 2018-10-22 2021-07-28 상하이 젠베이스 바이오테크놀로지 씨오., 엘티디. 항-cldn18.2 항체 및 이의 용도
CN113423735B (zh) * 2018-12-07 2024-02-13 再鼎医药(上海)有限公司 抗-紧密连接蛋白抗体及其用途
CN113166246A (zh) * 2018-12-28 2021-07-23 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种抗体及其用途
JP2022516505A (ja) * 2018-12-28 2022-02-28 スパークス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 癌および他の疾患の治療のための、クローディン１８．２に特異的な結合分子、その組成物および方法
JP2022515487A (ja) * 2018-12-28 2022-02-18 ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド クローディン１８．２結合部分およびその利用
CN116333141A (zh) * 2019-01-15 2023-06-27 浙江道尔生物科技有限公司 抗cld18a2纳米抗体及其应用
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
CN113645996B (zh) * 2019-02-01 2024-04-02 新石生物制药有限公司 抗claudin 18抗体及其使用方法
CA3137160A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
PE20220763A1 (es) 2019-05-08 2022-05-16 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para modular la inmunidad mediada por celulas t
KR20220024010A (ko) 2019-05-16 2022-03-03 치루 파머수티컬 컴퍼니 리미티드 클라우딘 18a2에 대한 항체 및 그의 용도
CN117264059A (zh) * 2019-05-16 2023-12-22 启愈生物技术(上海)有限公司 抗cldn抗体及其药物组合物和检测方法
KR20220012262A (ko) * 2019-05-24 2022-02-03 산유 바이오파마슈티컬스 씨오., 엘티디. 신형 cldn18.2 결합분자
WO2021032157A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Limited Novel anti-cldn18.2 antibodies
CN112409483A (zh) 2019-08-22 2021-02-26 浙江道尔生物科技有限公司 抗pd-l1纳米抗体
CN112574307B (zh) * 2019-09-29 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Claudin18.2抗体及其应用
CN112707965A (zh) * 2019-09-30 2021-04-27 和铂医药(苏州)有限公司 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
CN114269389B (zh) * 2019-11-05 2022-12-27 礼新医药科技(上海)有限公司 靶向紧密连接蛋白18.2的抗体药物偶联物
AU2020398045A1 (en) * 2019-12-06 2022-06-09 Sotio Biotech A.S. Humanized CLDN18.2 antibodies
IL293827A (en) * 2019-12-13 2022-08-01 Alector Llc Anti-mertko antibodies and methods of using them
JP2023507664A (ja) 2019-12-23 2023-02-24 ソティオ バイオテック エイ．エス． 腫瘍特異的クローディン１８．２抗体
IL294218A (en) * 2019-12-27 2022-08-01 Chiome Bioscience Inc Antibody against cdcp1
US20210269551A1 (en) * 2020-02-25 2021-09-02 Gensun Biopharma Inc. Trispecific T cell Engagers
WO2021173896A1 (en) * 2020-02-27 2021-09-02 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for modulating an immune response
US20240043527A1 (en) 2020-03-30 2024-02-08 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
CN113493515B (zh) * 2020-04-02 2023-03-28 广东菲鹏制药股份有限公司 抗cldn18a2的抗体以及治疗肿瘤的药物
WO2021228141A1 (zh) * 2020-05-15 2021-11-18 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗体药物缀合物及其制备方法和用途
US20230331836A1 (en) * 2020-05-25 2023-10-19 Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. Anti-cldn18.2 antibodies and diagnostic uses thereof
CN113735974B (zh) * 2020-05-29 2023-10-27 杭州邦顺制药有限公司 针对Claudin18.2的抗体及其用途
US11976120B2 (en) 2020-06-01 2024-05-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
US10981997B1 (en) 2020-06-01 2021-04-20 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
US10981996B1 (en) 2020-06-01 2021-04-20 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
CN113754778A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 上海交通大学 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途
CN111777681B (zh) * 2020-07-06 2022-10-11 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种结合紧密连接蛋白-18.2的抗体及其用途
AU2021307516A1 (en) 2020-07-13 2023-03-02 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-CLDN-18.2 antibody and use thereof
CN113929780A (zh) * 2020-07-13 2022-01-14 北京凯因科技股份有限公司 一种结合密蛋白的用于治疗癌症的人源化抗体
WO2022011531A1 (zh) * 2020-07-14 2022-01-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
AU2021345124A1 (en) 2020-09-16 2023-03-30 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific T-cell engaging molecules for the treatment of cancer
CN114316046A (zh) * 2020-09-29 2022-04-12 北京凯因科技股份有限公司 一种稳定的抗体组合物
JP2023548538A (ja) 2020-11-08 2023-11-17 シージェン インコーポレイテッド 併用療法
CN112480248B (zh) 2020-11-24 2023-05-05 三优生物医药(上海)有限公司 与cld18a2特异性结合的分子
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
JP2024500242A (ja) 2020-12-23 2024-01-05 ソティオ バイオテック エイ．エス． 腫瘍特異的クローディン１８．２抗体と薬物との複合体
EP4273167A1 (en) 2020-12-30 2023-11-08 Bio-Thera Solutions, Ltd. Anti-cldn18.2 antibody, and preparation method therefor and use thereof
WO2022174809A1 (en) * 2021-02-19 2022-08-25 Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. Anti-cldn18.2 antibody conjugates
US20240182562A1 (en) 2021-04-02 2024-06-06 Oricell Therapeutics Co., Ltd Cldn18.2 antigen-binding protein and use thereof
WO2022226079A1 (en) * 2021-04-20 2022-10-27 Inbios International, Inc. Neutralizing antibodies against sars-cov-2
CN117295524A (zh) 2021-06-02 2023-12-26 百奥泰生物制药股份有限公司 药物偶联物及其用途
WO2022262959A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Astellas Pharma Europe Bv Bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3
WO2022266219A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind claudin18.2 and cd3
AU2022325498A1 (en) 2021-08-13 2024-02-01 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
CA3233254A1 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Evopoint Biosciences Co., Ltd. Antibody, antibody-drug conjugate thereof and use thereof
WO2023161457A1 (en) 2022-02-27 2023-08-31 Evobright Gmbh Bispecific antibodies against cd277 and a tumor-antigen
WO2024074211A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074634A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
CN115819586B (zh) * 2022-10-13 2023-10-31 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

Family Cites Families (202)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3044382A (en) 1957-12-14 1962-07-17 Compur Werk Friedrich Deckel Photographic shutter
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
WO1991009974A1 (en) 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5589579A (en) 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
KR19990077146A (ko) 1996-01-11 1999-10-25 길리스 스티브 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US7411051B2 (en) 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
US20070224663A1 (en) 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2000012708A2 (en) 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
US20030073129A1 (en) 1998-09-01 2003-04-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020127584A1 (en) 1997-09-18 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030022298A1 (en) 1997-09-15 2003-01-30 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050196832A1 (en) 1997-09-18 2005-09-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030027272A1 (en) 1997-09-18 2003-02-06 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030166104A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030008352A1 (en) 1997-09-18 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030170794A1 (en) 1997-09-18 2003-09-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7160985B2 (en) 1997-10-29 2007-01-09 Genentech, Inc. Pro180 polypeptide
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20030022835A1 (en) 1998-04-29 2003-01-30 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US20030040471A1 (en) 1998-04-29 2003-02-27 Watson James D. Compositions isolated from skin cells and methods for their use
JP3428441B2 (ja) 1998-05-15 2003-07-22 エーザイ株式会社 タイトジャンクション構成膜蛋白質クローディンファミリー
US7351543B2 (en) 1998-06-02 2008-04-01 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in melanoma
US7319008B2 (en) 1998-06-02 2008-01-15 Genentech, Inc. Nucleic acid underexpressed in melanoma
EP1084142A4 (en) 1998-06-11 2005-01-19 Smithkline Beecham Corp GPR35A RECEIVER
CA2347656A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Diadexus, Inc. A novel method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating lung cancer
US20030166132A1 (en) 1998-08-26 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030082626A1 (en) 1998-09-01 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050181478A1 (en) 1998-09-01 2005-08-18 Baker Kevin P. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7026455B2 (en) 1998-09-01 2006-04-11 Genentech, Inc. Anti-pro 1343 antibodies
US7098312B2 (en) 1998-09-01 2006-08-29 Genetech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2004507201A (ja) 1998-09-16 2004-03-11 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
WO2000015659A2 (en) 1998-09-16 2000-03-23 Zymogenetics, Inc. Stomach polypeptide zsig28
AU766279B2 (en) 1998-10-06 2003-10-16 Curagen Corporation Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
US7399834B2 (en) 1998-10-07 2008-07-15 Genentech, Inc. Anti-PRO1558 antibodies
US6235481B1 (en) 1998-10-21 2001-05-22 Arch Development Corporation & Board Of Regents Polynucleotides encoding calpain 10
US7026449B2 (en) 1999-01-05 2006-04-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2883600A (en) 1999-03-08 2000-09-28 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7465785B2 (en) 1999-03-08 2008-12-16 Genentech, Inc. Polypeptide encoded by a nucleic acid over-expressed in melanoma
AU768694B2 (en) 1999-03-08 2004-01-08 Genentech Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
US7507404B2 (en) 1999-03-08 2009-03-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
NZ527292A (en) 1999-03-23 2005-03-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides PRO1484 and nucleic acids encoding the same, with homology to an adipocyte complement-related protein
AU3774500A (en) 1999-03-31 2000-10-16 Curagen Corporation Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; "orfx"
US20080286821A1 (en) 1999-05-14 2008-11-20 Eaton Dan L Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU3246100A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Genentech Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
EP1185648B1 (en) 1999-06-02 2007-03-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
AU3774300A (en) 1999-06-02 2000-12-18 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2215300A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Genentech Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
CA2372511C (en) 1999-06-15 2011-11-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2883900A (en) 1999-07-07 2001-01-30 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001027257A1 (en) 1999-10-14 2001-04-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Tumor antigen derived gene-16 (tadg-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof
CA2492070A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Kevin P. Baker Lung tumor marker pro4329 polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
EP1244784A2 (en) 2000-01-06 2002-10-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
CA2396719A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. 22 human secreted proteins
US20030077808A1 (en) 2000-01-31 2003-04-24 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055321A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
NZ521430A (en) 2000-02-22 2004-04-30 Corixa Corp Compositions comprising 1-4 antigenic peptide fragments of the Wilms' tumour gene product for treatment or prevention of malignant mesothelioma
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU4592601A (en) 2000-03-21 2001-10-03 Millennium Predictive Medicine Novel genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
EP2267026A1 (en) 2000-04-12 2010-12-29 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001260847A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US6822082B2 (en) 2000-06-30 2004-11-23 Zymogenetics, Inc. Polynucleotides for mammalian secreted protein, Z1055G2P
NZ524523A (en) 2000-08-03 2006-02-24 Therapeutic Human Polyclonals Production of humanized antibodies in transgenic animals
JP2004519215A (ja) 2000-08-15 2004-07-02 イミュネックス・コーポレーション クローディンポリペプチド
JP2004512029A (ja) 2000-08-16 2004-04-22 カイロン　コーポレイション ヒト遺伝子および遺伝子発現産物
US7442765B2 (en) 2000-08-24 2008-10-28 Genentech, Inc. Secreted transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2004520814A (ja) 2000-08-28 2004-07-15 ディアデクサス インコーポレーテッド 肺特異的遺伝子に関する組成物および方法
MXPA03002049A (es) 2000-09-08 2003-07-24 Schering Corp Genes de mamiferos: reactivos y metodos relacionados.
US7829276B2 (en) 2000-09-18 2010-11-09 Thomas Jefferson University Methods of using CRCA-1 as a stomach and esophageal cancer marker
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
AU2002255478A1 (en) 2001-01-10 2002-09-12 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2440008A1 (en) 2001-01-29 2002-08-29 Phase-1 Molecular Toxicology, Inc. Rat toxicologically relevant genes and uses thereof
WO2002068600A2 (en) 2001-02-26 2002-09-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
US20030152939A1 (en) 2001-04-09 2003-08-14 Glennda Smithson Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2003000249A (ja) 2001-05-10 2003-01-07 Daiichi Fine Chemical Co Ltd クローディンによるＭＴ−ＭＭＰｓを介したｐｒｏＭＭＰ−２活性化
AU2002330714A1 (en) 2001-05-30 2003-01-02 Biomedical Center In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
US20030148264A1 (en) * 2001-07-06 2003-08-07 Genentech, Inc. Phage displayed PDZ domain ligands
AU2002321903A1 (en) 2001-08-03 2003-02-24 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
WO2004045535A2 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in neurons
US6551893B1 (en) 2001-11-27 2003-04-22 Micron Technology, Inc. Atomic layer deposition of capacitor dielectric
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
CA2379661A1 (en) 2002-03-28 2003-09-28 Kursad Turksen Paracellular drug delivery system
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
US7238786B2 (en) * 2002-06-14 2007-07-03 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody cPAM4
DK2345671T3 (en) * 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
WO2004035607A2 (en) 2002-10-17 2004-04-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
DE10254601A1 (de) * 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1430902A1 (en) 2002-12-20 2004-06-23 Mondobiotech Laboratories Anstalt Pharmaceutical composition of interferon gamma with molecular diagnostics for the improved treatment of asthma bronchiale
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
AU2004256425A1 (en) 2003-06-09 2005-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
WO2005032495A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Bayer Pharmaceuticals Corporation Gene expression profiles and methods of use
DE10354601B3 (de) 2003-11-21 2005-06-23 Chiropro Gmbh Gelenkprothese für Fingerglieder
WO2005052182A2 (en) 2003-11-26 2005-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A method of analyzing plasma membrane protein content of cells
US7858322B2 (en) 2003-12-23 2010-12-28 Nono, Inc. Method of determining inhibition of binding to TRPM7 protein
WO2005076939A2 (en) 2004-02-09 2005-08-25 University Of Kentucky Research Foundation Assay and method for diagnosing and treating alzheimer’s disease
WO2005082398A2 (en) 2004-02-26 2005-09-09 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in muscle cells
US20050255041A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP2302393A1 (en) 2004-05-21 2011-03-30 The Institute for Systems Biology Compositions and methods for quantification of serum glycoproteins
WO2006023121A1 (en) 2004-07-27 2006-03-02 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in white adipose tissue (13)
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
FR2876705B1 (fr) 2004-10-19 2008-12-12 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic d'une intolerance a l'aspirine
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
ATE549624T1 (de) 2005-07-01 2012-03-15 Arbor Vita Corp Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose und behandlung von grippe
ZA200800970B (en) 2005-08-15 2009-10-28 Genentech Inc Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
WO2007027867A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways
DK1934615T3 (da) 2005-09-19 2014-07-14 Janssen Diagnostics Llc Fremgangsmåder og materialer til identificering af oprindelsen af et karcinom med ukendt primær oprindelse
US20070099251A1 (en) 2005-10-17 2007-05-03 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2007233237A1 (en) 2006-03-29 2007-10-11 Genentech, Inc. Diagnostics and treatments for tumors
US20100129929A1 (en) 2006-07-27 2010-05-27 Roberto Polakewicz Tyrosine Phosphorylation Sites
EP2057465A4 (en) 2006-08-09 2010-04-21 Homestead Clinical Corp SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE
WO2008021115A2 (en) 2006-08-14 2008-02-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic tests using gene expression ratios
KR20090071603A (ko) 2006-09-19 2009-07-01 노파르티스 아게 Ｒａｆ 억제제에 대한 표적 조절, 효능, 진단 및/또는 예후의 바이오마커
EP2087110A2 (en) 2006-10-11 2009-08-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Influenza targets
EP2097538A4 (en) 2006-12-07 2011-11-30 Switchgear Genomics TRANSCRIPTION REAGULATION ELEMENTS OF BIOLOGICAL PATHS, TOOLS AND METHODS
AU2007333106A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CN101687050A (zh) 2007-02-01 2010-03-31 维里德克斯有限责任公司 用于鉴别原发起源不明的癌的起源的方法和材料
EP2145902A3 (en) 2007-04-19 2010-09-29 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
JP2010529966A (ja) 2007-06-08 2010-09-02 アシュラジェン インコーポレイテッド 治療的介入の標的としてｍｉＲ−３４によって調節される遺伝子および経路
WO2008152822A1 (ja) 2007-06-15 2008-12-18 Medinet Co., Ltd. 医薬
US20100292303A1 (en) 2007-07-20 2010-11-18 Birrer Michael J Gene expression profile for predicting ovarian cancer patient survival
WO2009035497A2 (en) 2007-08-08 2009-03-19 Savidge Tor C Disease related cysteine modifications and uses thereof
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
US8653130B2 (en) 2007-09-19 2014-02-18 Suntory Holdings Limited Compositions containing sesamin-class compound(s) and arachidonic acid class compound(s)
EP2209894B1 (en) 2007-10-12 2015-06-03 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of the Holy & Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin Method for opening tight junctions
US8563515B2 (en) 2007-11-19 2013-10-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Tight junction protein modulators and uses thereof
US20090304697A1 (en) 2008-06-02 2009-12-10 Nsabp Foundation, Inc. Identification and use of prognostic and predictive markers in cancer treatment
WO2010046889A1 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof
CN101381524A (zh) 2008-10-24 2009-03-11 南开大学 单层氧化石墨与水溶性高分子增强复合材料
GB0904957D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Tumour gene profile
US20120028816A1 (en) 2009-03-31 2012-02-02 Warren Stephen T Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated with autism spectrum disorders
CN101584860A (zh) 2009-04-27 2009-11-25 西安杰诺瓦生物科技有限公司 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
WO2010141093A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
EP2483813A1 (en) 2009-10-01 2012-08-08 Chipdx LLC System and method for classification of patients
CA2782620A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Compendia Bioscience, Inc. Classification of cancers
EP2366709A1 (en) 2010-03-16 2011-09-21 BioNTech AG Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
EP2547695B1 (en) 2010-03-16 2018-05-09 Biontech Protein Therapeutics GmbH Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2
US8945847B2 (en) 2010-05-24 2015-02-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
EP2576824A2 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Roche Diagnostics GmbH Gene expression markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
US8454385B2 (en) 2010-06-22 2013-06-04 John Mezzalingua Associates, LLC Coaxial cable connector with strain relief clamp
WO2011163627A2 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Integrated Diagnostics, Inc. Organ specific diagnostic panels and methods for identification of organ specific panel proteins
WO2012070014A2 (en) 2010-11-26 2012-05-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Identification of novel cell surface markers for pancreatic progenitor cells and definite endodermal cells
US20130280368A1 (en) 2011-01-12 2013-10-24 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Method for screening for diet providing production of milk having immunoregulatory action
DE102011005235B4 (de) 2011-03-08 2017-05-24 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten
EP2833892A4 (en) 2012-04-02 2016-07-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014025199A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
WO2014025198A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 Lfa3 변이체 및 상기 변이체 또는 lfa3 cd2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
EP2888391A4 (en) 2012-08-24 2016-09-14 Univ Utah Res Found COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO BLOOD BIOMARKERS OF BREAST CANCER
US20140073524A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (ptsd)
US9856532B2 (en) 2012-09-07 2018-01-02 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (PTSD)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200039015A (ko) 2020-04-14
LT3421498T (lt) 2022-03-10
MX2020011789A (es) 2020-11-24
CY1119290T1 (el) 2018-02-14
EP2325210B1 (en) 2018-09-05
AU2006316767A1 (en) 2007-05-31
HUE048404T2 (hu) 2020-07-28
EP2311877B1 (en) 2015-08-26
EP4112645A1 (en) 2023-01-04
PT3421498T (pt) 2022-01-19
CN103509114A (zh) 2014-01-15
US10017564B2 (en) 2018-07-10
HRP20130451T1 (en) 2013-06-30
HUE025900T2 (en) 2016-05-30
JP5933157B2 (ja) 2016-06-08
BRPI0618920A2 (pt) 2011-09-27
CY1116964T1 (el) 2017-04-05
PL1948693T3 (pl) 2013-08-30
JP6086894B2 (ja) 2017-03-01
PT3312197T (pt) 2019-11-26
ES2757498T3 (es) 2020-04-29
ES2907716T3 (es) 2022-04-26
KR101535292B1 (ko) 2015-07-09
PT3656793T (pt) 2022-03-08
PL3421498T3 (pl) 2022-02-28
EP1948693B1 (en) 2013-03-20
KR20140018386A (ko) 2014-02-12
PL3312197T3 (pl) 2020-03-31
DK2325210T3 (en) 2018-10-29
KR20160081988A (ko) 2016-07-08
DK2311878T3 (en) 2016-01-04
EP2311879B1 (en) 2017-06-21
PL2325210T3 (pl) 2018-12-31
EP2311879A3 (en) 2011-05-18
RS54468B1 (en) 2016-06-30
CN103509110B (zh) 2015-12-09
EP3312197B1 (en) 2019-10-16
US20240117022A1 (en) 2024-04-11
JP2009517354A (ja) 2009-04-30
RS56327B1 (sr) 2017-12-29
CA2628126C (en) 2015-06-16
US10738108B2 (en) 2020-08-11
BRPI0618920A8 (pt) 2022-11-22
SI3656793T1 (sl) 2022-04-29
US9751934B2 (en) 2017-09-05
KR101669631B1 (ko) 2016-10-26
DK3312197T3 (da) 2019-11-11
HRP20151136T1 (hr) 2016-01-01
US10174104B2 (en) 2019-01-08
CY1124965T1 (el) 2023-01-05
AU2006316767B9 (en) 2014-02-13
CA2886580C (en) 2019-12-10
AU2006316767B2 (en) 2012-02-02
HK1119721A1 (en) 2009-03-13
HRP20171337T1 (hr) 2017-11-03
BRPI0618920B8 (pt) 2023-02-28
SI3312197T1 (sl) 2019-12-31
PL2311877T3 (pl) 2016-01-29
EP2295469A3 (en) 2011-05-18
RS52790B (en) 2013-10-31
DK3656793T3 (da) 2022-03-07
CN101312989A (zh) 2008-11-26
EP1948693A1 (en) 2008-07-30
US8168427B2 (en) 2012-05-01
CY1114050T1 (el) 2016-07-27
RU2445319C2 (ru) 2012-03-20
EP1790664A1 (en) 2007-05-30
KR20080090403A (ko) 2008-10-08
CN101312989B (zh) 2013-08-07
HUE058777T2 (hu) 2022-09-28
ES2689746T3 (es) 2018-11-15
EP3312197A1 (en) 2018-04-25
RS54376B1 (en) 2016-04-28
HRP20220155T3 (hr) 2022-04-15
CN103509110A (zh) 2014-01-15
DK2311879T3 (en) 2017-09-11
LT2325210T (lt) 2018-11-12
EP2325210A1 (en) 2011-05-25
EP2311878A2 (en) 2011-04-20
EP2311879A2 (en) 2011-04-20
US20200385448A1 (en) 2020-12-10
SI2325210T1 (sl) 2018-11-30
KR101921287B1 (ko) 2018-11-22
US20160185860A1 (en) 2016-06-30
HK1151535A1 (en) 2012-02-03
PT2311878E (pt) 2016-01-26
ES2555979T3 (es) 2016-01-12
US9499609B2 (en) 2016-11-22
EP2311877A3 (en) 2011-05-18
HUE041538T2 (hu) 2019-05-28
KR102099875B1 (ko) 2020-04-10
MX2020011792A (es) 2020-12-07
KR20170125131A (ko) 2017-11-13
BRPI0618920B1 (pt) 2022-12-13
CY1117031T1 (el) 2017-04-05
EP3421498A1 (en) 2019-01-02
RS62947B1 (sr) 2022-03-31
JP2016196467A (ja) 2016-11-24
CA3058722C (en) 2023-05-09
DK1948693T3 (da) 2013-06-10
KR20140106732A (ko) 2014-09-03
RS59563B1 (sr) 2019-12-31
HUE034777T2 (en) 2018-02-28
CA2628126A1 (en) 2007-05-31
PT2325210T (pt) 2018-11-07
US9212228B2 (en) 2015-12-15
US20150252103A1 (en) 2015-09-10
LT3656793T (lt) 2022-03-10
DK2311877T3 (en) 2015-11-16
SI2311879T1 (sl) 2017-10-30
JP6261650B2 (ja) 2018-01-17
KR101797188B1 (ko) 2017-11-13
EP2295469A2 (en) 2011-03-16
ES2642688T3 (es) 2017-11-17
KR101463585B1 (ko) 2014-11-21
US20180127489A1 (en) 2018-05-10
MX339682B (es) 2016-06-06
CA2886580A1 (en) 2007-05-31
EP2311877A2 (en) 2011-04-20
EP3421498B1 (en) 2022-01-05
SI1948693T1 (sl) 2013-07-31
RU2008125324A (ru) 2009-12-27
EP3656793B1 (en) 2022-02-02
ES2550027T3 (es) 2015-11-04
SI3421498T1 (sl) 2022-04-29
DK3421498T3 (da) 2022-02-14
CY1122346T1 (el) 2021-01-27
PL2311879T3 (pl) 2018-03-30
JP2015083579A (ja) 2015-04-30
RS62886B1 (sr) 2022-03-31
HRP20191968T1 (hr) 2020-01-24
EP3656793A1 (en) 2020-05-27
SI2311877T1 (sl) 2015-12-31
EP2311878B1 (en) 2015-10-07
HK1151305A1 (zh) 2012-01-27
US11739139B2 (en) 2023-08-29
ES2905951T3 (es) 2022-04-12
AU2006316767B8 (en) 2012-05-24
HUE025578T2 (en) 2016-04-28
HRP20181565T1 (hr) 2018-12-14
CY1121002T1 (el) 2019-12-11
LT3312197T (lt) 2019-11-11
CN103509114B (zh) 2018-06-29
PT2311879T (pt) 2017-09-11
ME03608B (me) 2020-07-20
PL2311878T3 (pl) 2016-02-29
JP6085148B2 (ja) 2017-02-22
RS57781B1 (sr) 2018-12-31
HK1246320A1 (zh) 2018-09-07
US20150252104A1 (en) 2015-09-10
ES2407819T3 (es) 2013-06-14
PT1948693E (pt) 2013-06-05
CA3058722A1 (en) 2007-05-31
KR20180126091A (ko) 2018-11-26
US20120195830A1 (en) 2012-08-02
JP2013079241A (ja) 2013-05-02
CY1125027T1 (el) 2023-06-09
US20120164160A1 (en) 2012-06-28
HRP20220246T3 (hr) 2022-04-29
SG10201903351SA (en) 2019-05-30
US20090169547A1 (en) 2009-07-02
HRP20151257T1 (hr) 2016-01-15
WO2007059997A1 (en) 2007-05-31
LT2311879T (lt) 2017-09-25
SI2311878T1 (sl) 2016-01-29
EP2311878A3 (en) 2011-05-18
HK1257914A1 (zh) 2019-11-01
HUE058814T2 (hu) 2022-09-28
SG10201405134WA (en) 2014-10-30
PL3656793T3 (pl) 2022-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2311877T3 (en) Monoclonal antibodies to claudin-18 for treating cancer
KR101585990B1 (ko) 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체
KR101960509B1 (ko) 클라우딘 6 특이적 항체
HUE028603T2 (en) Antibody for treating cancers expressing claudin-6
AU2023208150A1 (en) Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2016202322B2 (en) Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
RU2816850C2 (ru) Антитела для лечения раковых заболеваний, при которых экспрессируется клаудин 6