PT2311464E - Agentes para a prevenção e tratamento de perturbações envolvendo a modulação de recetores ryr - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "AGENTES PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE PERTURBAÇÕES ENVOLVENDO A MODULAÇÃO DE RECETORES RyR" A presente invenção foi realizada com o apoio do governo sob a concessão NIH n° POI HL 67849-01. Como tal, o governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos sobre a presente invenção. O presente pedido reivindica a prioridade da patente nos EUA número 11/212, 413, depositado em 25 de agosto de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a compostos e à sua utilização para o tratamento e prevenção de perturbações e doenças associadas com os recetores de rianodina (RyR) que regulam o funcionamento do canal de cálcio nas células. Mais particularmente, a invenção divulga compostos que estão relacionados com 1,4-benzotiazepinas e são úteis para o tratamento de perturbações cardíacas e musculares esqueléticas. A invenção também descreve composições farmacêuticas que compreendem os compostos e artigos de manufatura que compreendem as composições farmacêuticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O retículo sarcoplasmático (SR) é uma estrutura nas células que funciona, entre outras coisas, como um armazenamento especializado de cálcio intracelular (Ca2+) . Os canais no SR chamados de recetores de rianodina (RyRs) abrem e fecham para regular a libertação de Ca2+ a partir do SR para o citoplasma intracelular da célula. A libertação de Ca2+ no interior do citoplasma da SR aumenta a concentração de citoplasmática de Ca2+. A probabilidade de abertura (Po) da 2

RyR refere-se à probabilidade de o canal RyR estar aberto em qualquer dado momento e, portanto, ser capaz de libertar o Ca2+ no citoplasma a partir do SR.

Existem três tipos de recetores de rianodina, todos os quais são canais altamente relacionados de Ca2+: RyRl, RyR2 e RyR3. 0 RyRl é encontrado predominantemente no músculo esquelético, bem como noutros tecidos, o RyR2 é encontrado predominantemente no coração, bem como noutros tecidos, e RyR3 é encontrado no cérebro, bem como noutros tecidos. Os canais de RyR são formados por quatro polipéptidos RyR em associação com quatro proteínas de ligação a FK506 (FKBPs), especificamente a FKBP12 (calstabinl) e FKBP12.6 (calstabin2) . A calstabinl liga-se a RyRl, a calstabin2 liga-se a RyR2, e a calstabinl liga-se a RyR3. As proteínas FKBP (calstabinl e calstabin2) ligam-se ao canal RyR (uma molécula por subunidade RyR), estabilizam o funcionamento de canais RyR e facilitam a propagação acoplada entre canais vizinhos RyR, impedindo assim a ativação anormal do canal durante o estado fechado do canal.

Para além das proteínas de ligação a calstabin, a proteína quinase A (PKA) também se liga à superfície citoplasmática de RyR. A fosforilação por PKA do RyR provoca a dissociação parcial de calstabins a partir de RyRs. A dissociação de calstabin de RyR provoca um aumento da probabilidade de abertura de RyR e, portanto, um aumento da libertação de Ca2+ a partir do SR para o interior do citoplasma intracelular. A libertação de Ca2+ a partir do SR em células do músculo esquelético e células do coração é um mecanismo fisiológico chave que controla o desempenho do músculo, porque o 3 aumento da concentração de Ca2+ no citoplasma intracelular provoca a contração do músculo. 0 acoplamento excitação-contração (EC) em músculos esqueléticos envolve a despolarização elétrica da membrana plasmática, no túbulo transversal (túbulo T) , que ativa canais Ca2+ tipo-L dependentes da voltagem (LTCCs). Os LTCCs desencadeiam a libertação de Ca2+ a partir do SR através da interação física com RyRl. 0 aumento resultante na concentração citoplasmática de Ca2+ induz a interação actina-miosina e contração muscular. Para permitir o relaxamento, o Ca2+ intracelular é bombeado de volta para o SR via bombas de SR Ca2+ -ATPase (SERCAs), que são reguladas por fospliolamban (PLB) , dependendo do tipo de fibra muscular.

Demonstrou-se que as formas de doenças que resultam na ativação sustentada do sistema nervoso simpático e no aumento dos níveis plasmáticos de catecolaminas causam a ativação de vias de stress intracelulares desajustadas que resultam na desestabilização do estado fechado do canal RyRl e no vazamento intracelular de Ca2+. 0 vazamento de Ca2+ no SR através de canais RyRl demonstrou esgotar as reservas de cálcio intracelular em SR, para aumentar o consumo de energia de compensação, e provocar a aceleração significativa da fadiga muscular. 0 defeito muscular induzido pelo stress reduz permanentemente o desempenho do músculo isolado e o desempenho in vivo particularmente em situações de maior exigência.

Também foi demonstrado que a desestabilização do estado fechado de RyRl ocorre em condições patológicas de ativação simpática aumentada e envolve a depleção da subunidade do 4 canal de calstabinl (FKBP12) de estabilização. Experiências do tipo prova de conceito têm mostrado que a ativação de PKA como um efetor final dos sistemas nervosos simpáticos aumenta a fosforilação por PKA de RyRl em Ser-2843, o que diminui a afinidade de ligação de calstabinl a RyRl e aumenta a probabilidade de abertura do canal.

No músculo estriado cardíaco, o RyR2 é o principal canal de libertação de Ca2+ necessário para um acoplamento EC e contração muscular. Durante o acoplamento de EC, a despolarização da membrana das células do músculo cardíaco durante a fase zero do potencial de ação ativa canais Ca2+ dependentes da voltagem. 0 influxo de Ca2+ através dos canais dependentes da voltagem abertos, por sua vez, inicia a libertação de Ca2+ a partir da via SR RyR2. Este processo é conhecido como libertação de Ca2+ induzida por Ca2+. A libertação de Ca2+ mediada por RyR2, e induzida por Ca2+ ativa então as proteínas contráteis na célula cardíaca, resultando na contração do músculo cardíaco. A fosforilação do RyR2 cardíaco por PKA é uma parte importante da resposta "luta ou fuga" que aumenta o ganho de acoplamento EC cardíaco, aumentando a quantidade de Ca2+ libertado para um determinado desencadeamento. Esta via de sinalização fornece um mecanismo pelo qual a ativação do sistema nervoso simpático, em resposta ao stress, resulta num aumento do débito cardíaco. A fosforilação por PKA de RyR2 aumenta a probabilidade de abertura do canal ao dissociar a calstabin2 (FKBP12.6) a partir do complexo de canal. Isto, por sua vez, aumenta a sensibilidade do RyR2 à ativação dependente de Ca2+. 5

Apesar dos avanços no tratamento, a insuficiência cardíaca continua a ser uma importante causa de mortalidade nos países ocidentais. Um marco importante na insuficiência cardíaca é a reduzida contratilidade miocárdica. Na insuficiência cardíaca, as alterações contráteis resultam, em parte, de alterações na via de sinalização que permite que a ação cardíaca potencial desencadeie a libertação de Ca2+ através de canais RyR2 e contração muscular. Em particular, em corações com insuficiência, a amplitude do conjunto de células transientes de Ca2+ é diminuída e a duração prolongada. A arritmia cardíaca, uma característica comum de insuficiência cardíaca, resulta em muitas das mortes associadas à doença. A fibrilação atrial (AF) é a arritmia cardíaca mais comum nos seres humanos, e representa uma das principais causas de morbilidade e mortalidade. A remodelação estrutural e elétrica - incluindo o encurtamento da refratariedade atrial, perda de adaptação relacionada com a taxa de refratariedade, e encurtamento do comprimento de onda de ondas re-entrantes - acompanha a taquicardia sustentada. Esta remodelação é provavelmente importante no desenvolvimento, manutenção e progressão da fibrilação atrial. Estudos sugerem que o tratamento de cálcio desempenha um papel na remodelação elétrica na fibrilação atrial.

Aproximadamente 50% de todos os pacientes com insuficiência cardíaca morrem de arritmias cardíacas fatais. Em alguns casos, uma arritmia ventricular no coração é rapidamente fatal - um fenómeno preferido como "morte súbita cardíaca" (SCD) . As arritmias ventriculares fatais e SCD também ocorrem em indivíduos jovens e saudáveis, que se desconhece 6 terem uma doença cardíaca estrutural. Na verdade, a arritmia ventricular é a causa mais comum de morte súbita em indivíduos aparentemente saudáveis. A taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) é uma doença hereditária em indivíduos com coração estruturalmente normal. É caracterizada por taquicardia ventricular induzida pelo stress - uma arritmia fatal que provoca SCD. Em indivíduos com CPVT, o esforço físico e/ou stress induzem taquicardias ventriculares bidirecionais e/ou polimórficas que levam à SCD, mesmo na ausência de doença cardíaca estrutural detetável. A CPVT é predominantemente herdada na forma autossómica dominante. Indivíduos com CPVT têm arritmias ventriculares quando sujeitos ao exercício, mas não desenvolvem arritmias em repouso. Estudos identificaram as mutações no gene RyR2 humano, no cromossoma Iq42-q43, em indivíduos com CPVT.

Corações com insuficiência (por exemplo, em pacientes com insuficiência cardíaca e em modelos animais de insuficiência cardíaca) são caracterizados por uma resposta inadequada, que inclui estimulação hiperadrenérgica crónica. Na insuficiência cardíaca, a estimulação beta-adrenérgica crónica está associada com a ativação de recetores beta-adrenérgicos no coração, os quais, através de acoplamento com proteínas G, ativam a guanilato ciclase e, assim, aumentam a concentração de cAMP intracelular. 0 CAMP ativa PKA dependente de cAMP, o qual tem demonstrado induzir a hiperfosforilação de RyR2. Dessa forma, a insuficiência cardíaca crónica é um estado hiperadrenérgico crónico que resulta em várias consequências patológicas, incluindo a hiperfosforilação por PKA de RyR2. 7 A hiperfosforilação por PKA de RyR2 tem sido proposta como um fator que contribui para a função contrátil deprimida e arritmogénese na insuficiência cardíaca. Consistente com esta hipótese, a hiperf osf orilação por PKA de RyR2 em corações com insuficiência demonstrou, in vivo, tanto em modelos animais como em pacientes com insuficiência cardíaca submetidos a transplante cardíaco.

Em corações com insuficiência, a hiperfosforilação por PKA de RyR2 induz a dissociação do FKBP12.6 (calstabin2) a partir do canal RyR2. Isso provoca mudanças marcantes nas propriedades biofísicas do canal RyR2, incluindo o aumento da probabilidade de abertura (Po), devido a um aumento da sensibilidade à ativação dependente de Ca2+; desestabilização do canal, resultando em estados de subconductância; e dependência de acoplamento prejudicada dos canais, resultando num acoplamento EC defeituoso e numa disfunção cardíaca. Assim, o RyR2 PKA-hiperfosforilado é muito sensível a uma estimulação de Ca2+ de baixo nível, e isto manifesta-se como um vazamento diastólico de Ca2+ de SR através do canal RyR2 PICA hiperfosforilado. A resposta inadequada ao stress na insuficiência cardíaca resulta no esgotamento de FKBP12.6 do complexo macromolecular do canal. Isto leva a um desvio para a esquerda na sensibilidade de RyR2 a uma libertação de Ca2+ induzida por Ca2+, resultando em canais que são mais ativos a concentrações baixas a moderadas de Ca2+. Ao longo do tempo, o aumento do "vazamento" através de RyR2 resulta na reposição do teor de Ca2+ no SR para um nível mais baixo, o que por sua vez reduz o ganho de acoplamento EC e contribui para a contratilidade sistólica diminuída.

Além disso, uma subpopulação de RyR2 que é particularmente "vazante", pode libertar Ca2+ de SR durante a fase de repouso do ciclo cardíaco, a diástole. Isto resulta em despolarizações da membrana cardiomiócita conhecida como pós-despolarizações tardias (DADs), que são conhecidas por provocar arritmias ventriculares cardíacas fatais.

Em pacientes com mutações CPVT no seu RyR2 e corações de outra forma estruturalmente normais, um fenómeno semelhante está em trabalho. Especificamente, sabe-se que o exercício físico e stress induzem a libertação de catecolaminas, que ativam os recetores beta-adrenérgicos no coração. A ativação dos recetores beta-adrenérgicos leva à hiperfosforilação por PKA de canais RyR2. As evidências também sugerem que a hiperfosforilação PICA de RyR2 resultante da ativação do recetor beta-adrenérgico rende canais mutantes de RyR2 mais propensos a abrir na fase de relaxamento do ciclo cardíaco, aumentando a probabilidade de arritmias.

As arritmias cardíacas são conhecidas por estarem associadas com vazamentos de Ca2+ do SR diastólicos em pacientes com mutações CPVT no seu RyR2 e com corações de outra forma estruturalmente normais. Nestes casos, o mecanismo mais comum para a indução e manutenção da taquicardia ventricular é o automatismo anormal. Uma forma de automatismo anormal, conhecida como arritmia desencadeada, está associada com a libertação aberrante de Ca2+ do SR, o que inicia DADs. As DADs são despolarizações anormais em cardiomiócitos que ocorrem após a repolarização do potencial de ação cardíaca. A base molecular para a libertação de anormal de Ca2+ de SR que resulta em DADs não foi totalmente elucidada. No entanto, as DADs são 9 conhecidas por serem bloqueadas por rianodina, fornecendo evidências de que o RyR2 desempenha um papel fundamental na patogénese desta libertação aberrante de Ca2+. A Patente US 6,489,125 descreve monocloridrato de JTV-519 (4-[3-(4-benzilpiperidin-l-il)-propionil]-7-metoxi-2,3,4,5-tetra-hidro-1,4-benzotiazepina; também conhecido como K201 ou ICP-Calstan 100), uma 1,4-benzotiazepina, como um novo modulador dos canais de cálcio e iões de RyR. O pedido co-pendente US 10/763,498 discute RyR2 como um alvo para o tratamento e prevenção da insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas, incluindo a fibrilação atrial e as arritmias cardíacas que podem causar a morte súbita cardíaca induzida pelo exercício (SCD). Os canais de RyR2 com 7 diferentes mutações de CPVT (por exemplo, S2246L, R2474S, N4104K, R4497C, P2328S, Q4201R, V4653F) demonstraram ter defeitos funcionais que resultaram em canais que se tornavam permeáveis (ou seja, um vazamento de cálcio) quando estimulados durante o exercício. O mecanismo para a VT em CPVT demonstrou ser o mesmo que o mecanismo para VT na insuficiência cardíaca.

Demonstrou-se que as arritmias induzidas por exercício e a morte súbita (em pacientes com CPVT) resultam de uma reduzida afinidade de FKBP12.6 (calstabin2) com o RyR2. Além disso, tem sido demonstrado que o exercício ativa o RyR2 como resultado da fosforilação pela proteína quinase (PKA) dependente da adenosina 3', 5'-monofosfato (cAMP). Os canais RyR2 mutantes, que tinham função normal em bicamadas lipídicas planas em condições basais, foram mais sensíveis à ativação de PKA fosforilação - exibindo aumento da atividade (probabilidade de abertura) e estados abertos 10 prolongadas, em comparação com os canais do tipo selvagem. Além disso, a os canais RyR2 PKA-fosforilados mutantes eram resistentes à inibição por Mg2+, um inibidor fisiológico do canal, e mostraram uma ligação reduzida a FKBP12.6 (aka calstabin2, que estabiliza o canal no estado fechado). Estes resultados indicam que, durante o exercício, quando os RyR2 são PKA-fosforilados, os canais CPVT mutantes são mais propensos a abrir na fase de relaxamento do ciclo cardíaco (diástole), aumentando a probabilidade de arritmias desencadeadas por vazamento de Ca de SR.

Além disso, o Pedido de Patente co-pendente nos EUA n° 09/288, 606 descreve um método para a regulação da contração do coração de um indivíduo, por administração de um composto que regula a fosforilação por PKA de um RyR2 e especificamente diminui a fosforilação por PKA. O Pedido de Patente co-pendente nos EUA n° 10/608, 723 também descreve um método para o tratamento e profilaxia de taquiarritmia atrial e arritmias induzidas pelo stress e exercício através da administração de um agente que inibe a fosforilação por PKA de RyR2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Tendo em conta o acima exposto, existe uma necessidade de identificar novos agentes eficazes para o tratamento ou prevenção de perturbações e doenças associadas com os RyRs que regulam o funcionamento do canal de cálcio em células, incluindo perturbações e doenças musculares esqueléticas e especialmente perturbações e doenças cardíacas. Mais em particular, permanece a necessidade de identificar novos compostos que podem ser utilizados para tratar perturbações associadas com RyR por, por exemplo, a reparação do vazamento em canais RyR e melhoramento da ligação de 11 proteínas FKBP (calstabinl e calstabin2) a RyR PKA-fosforilado, e RyR mutante que de outra forma tem afinidade reduzida, ou não se ligam a FKBP12 e FKBP 12.6. Formas de realização da invenção resolvem alguns ou todos estes requisitos.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona a utilização de um composto representado pela estrutura:

para o tratamento ou prevenção de uma perturbação ou doença associada com um RyR que regula o funcionamento do canal de cálcio em células, ou para o fabrico de um medicamento para esse tratamento ou prevenção, em que a perturbação ou doença que está associada com a RyR é selecionada de entre o grupo consistindo de perturbações e doenças musculares esqueléticas, perturbações e doenças cognitivas, hipertermia maligna, diabetes e síndrome da morte súbita do lactente.

Numa forma de realização, as perturbações e doenças musculares esqueléticas associadas ao RyR são selecionadas a partir do grupo constituído por fadiga do músculo esquelético, a fadiga do músculo esquelético induzida pelo exercício, distrofia muscular, perturbações da bexiga e incontinência.

Numa forma de realização, as perturbações e doenças cognitivas associadas com a RyR são selecionadas a partir do grupo consistindo de doença de Alzheimer, as formas de perda de memória, e perda de memória dependente da idade. 12

As benzotiazepinas utilizadas no tratamento da doença de Alzheimer e diabetes são divulgadas no documento US2005/009755.

Outras caracteristicas e vantagens da presente invenção irão tornar-se evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando formas de realização diferentes da invenção, são dados a título de ilustração apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para os peritos na arte a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Na Figura 1, as formas de realização A, B, C e D são, respetivamente, (A) imunomarcações de RyR2 PKA-fosforilado na presença de FKBP12.6 e concentrações crescentes de JTV-519; (B) imunomarcações de RyR2 PKA-fosforilado na presença de 0,5 nM de S36; (C) um gráfico da corrente através da membrana plasmática, canais Ca2+ do tipo L dependentes de voltagem que estão completamente bloqueados pela nifedipina, mas não por S3 6 em cardiomiócitos isolados de ratinho; e (D) um gráfico da corrente de Ca2+ do tipo L dependente da voltagem em canais na presença de JTV-519 e S36. A Figura 2 demonstra a prevenção de arritmias ventriculares induzidas por exercício por JTV-519 em ratinhos com insuficiência em haplo calstabin (FKBP12.6) +/~. A figura fornece gráficos que comparam a dependência da dose de efeitos farmacológicos do JTV-519 e S36 no que diz respeito 13 à morte súbita cardíaca (esquerda), VTs sustentadas (média) e VTs não sustentadas (direita). A Figura 3 é um gráfico que mostra o encurtamento fracionário (FS) do ventrículo esquerdo avaliado por ecocardiografia de modo M, 2 semanas pós-enfarte do miocárdio em ratinhos tratados. A Figura 4 é um gráfico que mostra a razão de peso do coração para o peso corporal (HW/BW) e quantificações de ciclos de pressão e volume (dP/dt), uma semana pós-enfarte do miocárdio de ratinhos tratados com placebo e S36. 0 tratamento com S36 resulta numa redução benéfica da razão HW/BW e aumento da velocidade de desenvolvimento de pressão em S36, em comparação com os ratinhos tratados com placebo. A Figura 5 é um gráfico que resume os valores de EC50 de JTV-519 e uma série de compostos Rycal indicando diversos compostos com uma maior atividade biológica como evidenciado pelos valores significativamente mais baixos de EC50 em comparação com JTV-519.

Na Figura 6, as formas de realização A, B e C são, respetivamente, (A) traçados de corrente de um canal simples de RyR2-P2328S e RyR2-WT; (B) traçados de corrente de canal simples de RyR2-P2328S; e (C) análise de imunomarcação da ligação calstabin-2 de RyR2-P2328S.

Na Figura 7, as formas de realização A, B, C, D, E, e F mostram que a função do canal RyRl é aumentada e normalizada em ratinhos mdx tratados com JTV-519. As formas de realização A e B são, respetivamente, um traçado de corrente de canal simples e um histograma de amplitude de 14

RyRl a partir do músculo sóleo de um ratinho de controlo (de tipo selvagem) sob condições de repouso. As formas de realização C e D são, respetivamente, traçado de corrente de canal simples e um histograma de RyRl a partir do músculo sóleo de um ratinho mdx. As formas de realização E e F são, respetivamente, um traçado de corrente de canal simples e um histograma de amplitude do RyRl a partir do músculo sóleo de um ratinho mdx tratado com JTV-519.

Na Figura 8, as formas de realização A e B são, respetivamente, imunomarcações de RyRl, RyRl-pSer2843 e calstabinl associada a RyRl em ratinhos mdx e ratinhos de tipo selvagem; e os gráficos de barras dos valores relativos de RyRl-pSer2843 e calstabinl em ratinhos mdx e do tipo selvagem.

Na Figura 9, as formas de realização A, B e C, demonstram que um vazamento de Ca2+ de SR é detetável em músculo esquelético de animais com insuficiência cardíaca. As formas de realização A e B são imagens de varrimento em linha por fluorescência de parcelas de Ca2+ em miofibras de, respetivamente, ratinhos sham e com enfarte do miocárdio (PMI). A forma de realização C fornece gráficos de barras que resumem a amplitude, tempo de subida, FDHM e FWHM das parcelas de Ca2+ para os ratinhos sham (símbolos abertos) e PMI (símbolos fechados).

Na Figura 10, as formas de realização A e B demonstram que o tratamento de ratinhos de tipo selvagem com JTV-519 melhora os tempos de fadiga do músculo sóleo. A forma de realização A fornece traçados de tempo de fatiga máxima de força tetânica para ratinhos do tipo selvagem e de calstabin2~/~ tratados com JTV-519 ou placebo, como 15 indicado. A forma de realização B mostra gráficos de barras que resumem o tempo médio para a fadiga para ratinhos do tipo selvagem e de calstabin2~/_, tratados com JTV-519 ou placebo, como indicado.

Na Figura 11, as formas de realização A e B demonstram que os efeitos benéficos do tratamento com JTV-519 na função do músculo esquelético dependem da ligação de calstabinl e não de calstabin2 a RyRl. A forma de realização A apresenta gráficos de barras de fosforilação por PKA de RyRl em ratinhos Ser-2844, o que corresponde a Ser-2843 em seres humanos. A forma de realização B mostra gráficos de barras da quantidade de calstabinl ligada a RyRl a partir de ratinhos de tipo selvagem e calstabin2_/” tratados com JTV-519 ou placebo.

Na Figura 12, as formas de realização A, B, C e D demonstram que o JTV-519 normaliza a função anormal ou permeável do canal RyRl in vivo. As formas de realização A e C são traçados de corrente de canais simples de ratinhos selvagens com insuficiência cardíaca tratados com placebo (A) e JTV-519 (C) . As formas de realização B e D são histogramas de amplitude para ratinhos do tipo selvagem com insuficiência cardíaca tratados com placebo (B) e JTV-519 (D) .

Na Figura 13, as formas de realização A e B demonstram que o JTV-519 aumenta a ligação de calstabin a RyR PKA-fosforilado. A forma de realização A mostra imunomarcações de calstabinl incubada e associada com RyRl, e calstabin2 incubada e associada com RyR2 em concentrações crescentes de JTV-519. A forma de realização B apresenta gráficos que 16 resumem a proporção de calstabinl e calstabin2 ligadas a RyRl e RyR2, tal como indicado.

Na Figura 14, as formas de realização A, B, C e D, demonstram que a fosforilação por PKA de Ser-2843 aumenta a probabilidade de abertura e a cinética de dependência de canais RyRl. A forma de realização A fornece traçados de corrente de canal simples e histograma correspondente de RyRl do tipo selvagem. A forma de realização B proporciona traçados de corrente de canal simples e histograma correspondente de RyRl do tipo selvagem que é PKA-fosforilado. A forma de realização C fornece traçados de corrente de canal simples e histograma correspondente de RyRl-Ser-2843A. A forma de realização D fornece traçados de corrente de canal simples e histograma correspondente de RyRl-Ser-2843D.

Na Figura 15, as formas de realização A e B, demonstram a hiperfosforilação por PKA e deficiência de calstabinl de canais RyRl após o exercício sustentado. A forma de realização A são imunomarcações de RyRl, RyRl-pSer2844 , RyRl-PSer2849 e calstabinl para ratinhos de controlo e ratinhos nadadores na sequência de um regime de exercícios. A forma de realização B é um gráfico de barras que resume as quantidades relativas dos compostos indicados seguindo o regime de exercício.

Na Figura 16, as formas de realização A e B demonstram que a fosforilação por PKA de RyRl aumenta após a exposição a durações crescentes de exercício sustentado. A forma de realização A fornece imunomarcações de RyRl e RyRl-pSer2844 seguindo crescentes períodos de exercício sustentado. A forma de realização B é um gráfico que mostra a 17 fosforilação por PKA de RyRl relativa para diferentes durações de exercício.

Na Figura 17, as formas de realização A, B e C, demonstram que a fosforilação por PKA de RyRl aumenta com a fadiga muscular. As formas de realização A e B são, respetivamente, traçados de tempo de fadiga e um gráfico de barras que mostra o tempo médio de fadiga para o músculo sóleo de ratinhos de insuficiência cardíaca e ratinhos de controlo. A forma de realização C é um gráfico de fosforilação por PKA em função do tempo até à fadiga. A Figura 18 mostra colorações tricrómicas e de hematoxilina-eosina de secções transversais do ratinho M. extensor digitorum longus e demonstra a degeneração de miofibrilas consistente com a remodelação distrófica após o exercício sustentado. A Figura 19 mostra um traçado de corrente de amostra hERG antes (controlo) e após a aplicação do ARM036 a 100 μΜ. Também é mostrado o protocolo de pulsação de voltagem utilizado para evocar as correntes hERG. A Figura 20 mostra um curso de tempo típico do efeito do ARM036 na amplitude da corrente de hERG. A aplicação de 10 μΜ de ARM036 é indicada pela barra horizontal. A Figura 21 é um gráfico de concentração-resposta mostrando a percentagem de inibição da corrente hERG após a aplicação de ARM036 a várias concentrações. 18 A Figura 22 é um gráfico de concentração-resposta mostrando a percentagem de inibição da corrente hERG após a aplicação de ARM036-Na a várias concentrações. A Figura 23 é um gráfico de concentração-resposta mostrando a percentagem de inibição da corrente hERG após a aplicação de JTV-519 ("ARMOXX") a várias concentrações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referências plurais a menos que o conteúdo dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um agente" inclui uma pluralidade de tais agentes e seus equivalentes conhecidos pelos peritos na arte, e a referência a "o polipeptido FKBP12.6" é uma referência a um ou mais polipeptidos FKBP12.6 (também conhecidos como calstabin2) e seus equivalentes conhecidos dos peritos na arte, e assim por diante.

Seguidamente fornecem-se definições de termos utilizados na presente descrição. A definição inicial fornecida para um grupo ou termo aplica-se aqui a esse grupo ou termo ao longo da presente especificação, individualmente ou como parte de outro grupo, a menos que indicado de outra forma. desenhos e 0 composto da invenção é referido com o uso de um sistema de nomenclatura numérica. 0 composto numerado é referido utilizando o prefixo "S" ou o prefixo "ARM". Assim, o composto é conhecido, quer como "S36" ou "ARM036". Os sistemas de nomenclatura "S" e "ARM" são utilizados indiferentemente ao longo da descrição, reivindicações. 19 0 composto da presente invenção é, após a sua preparação, preferivelmente isolado e purificado para obter uma composição contendo uma quantidade em peso igual ou superior a 99% do composto (composto "substancialmente puro"), que é então utilizado ou formulado como aqui descrito. Este composto "substancialmente puro" da presente invenção é também aqui contemplado como parte da presente invenção.

Todos os isómeros configuracionais dos compostos da presente invenção estão contemplados, quer numa mistura ou em forma pura ou substancialmente pura. A definição do composto da presente invenção abrange os isómeros cis (Z) e trans (E) alceno, bem como os isómeros cis e trans de hidrocarboneto cíclico ou anéis heterocíclicos. A presente invenção proporciona o composto 536 que é capaz de tratar e prevenir de doenças e perturbações associadas ao RyR que regula o funcionamento do canal de cálcio nas células. Mais particularmente, a presente invenção proporciona o composto 536 que é capaz de tratamento ou prevenção de um vazamento em canais de RyR. "Perturbações e doenças associadas com o RyR" significa perturbações e doenças que podem ser tratadas e/ou prevenidas por modulação dos recetores de rianodina (RyR) que regulam o funcionamento do canal de cálcio nas células. "Perturbações e doenças associadas com o RyR" incluem, sem limitação, perturbações e doenças cardíacas, perturbações e doenças musculares esqueléticas, perturbações e doenças cognitivas, hipertermia maligna, diabetes e síndrome da morte súbita do lactente. As perturbações e doenças musculares esqueléticas incluem, mas não estão limitadas a, fadiga do músculo 20 esquelético, fadiga do músculo esquelético induzida pelo exercício, distrofia muscular, perturbações da bexiga e incontinência. As perturbações e doenças cognitivas incluem, mas não estão limitadas a, doença de Alzheimer, formas de perda de memória e perda de memória dependente da idade.

Compostos A presente invenção utiliza o composto:

Vias de Atividade O composto da invenção, reduz a probabilidade de abertura do RyR aumentando a afinidade da FKBP12 (calstabinl) e FKBP12.6 (calstabin2) com, respetivamente, a RyRl PKA-fosforilada e RyR2 PKA-fosforilada. Além disso, o composto da invenção normaliza a dependência de canais RyR mutantes, incluindo canais RyR2 mutantes associados a CPVT, através do aumento da afinidade de ligação da FKBP12 (calstabinl) e FKBP12.6 (calstabin2). Portanto, o composto da invenção previne perturbações e doenças envolvendo a modulação do RyR, particularmente o RyRl e RyR2. Exemplos de tais perturbações e condições incluem, sem limitação, perturbações e doenças cardíacas, perturbações e doenças musculares esqueléticas, perturbações e doenças cognitivas, hipertermia maligna, diabetes e síndrome da morte súbita do lactente. Perturbações e doenças da musculatura esquelética 21 incluem, mas não estão limitadas a, fadiga do músculo esquelético, fadiga induzida por exercícios do músculo esquelético, distrofia muscular, perturbações da bexiga e incontinência. Perturbações e doenças cognitivas incluem, mas não estão limitadas a, doença de Alzheimer, formas de perda de memória e, perda de memória dependente da idade. 0 composto da invenção trata destas perturbações e doenças, aumentando a afinidade de ligação FKBP12 (calstabinl)-RyRl e aumentando a afinidade de ligação de FKBP12.6 (calstabin2)-RyR2. 0 composto S36 pode ser utilizado num método para limitar ou prevenir uma queda no nível de FKBP (calstabin) ligada a RyR em células de um indivíduo. Tal como aqui utilizado, "RyR", inclui RyRl, RyR2 e RyR3. Além disso, a FKBP inclui tanto FKBP12 (calstabinl) como a FKBP12.6 (calstabin2). "FKBP ligada a RyR", portanto, refere-se a PKBP12 (calstabinl) ligada a RyRl, FKBP12.6 (calstabin2) ligada a RyR2, e FKBP12 (calstabinl) ligada a RyR3.

Tal como aqui utilizado, "RyR" também inclui uma "proteína RyR" e um "análogo de RyR". Um "análogo de RyR" é uma variante funcional da proteína RyR, possuindo atividade biológica RyR, que tem 60% ou mais de homologia de sequência de aminoácidos com a proteína RyR. Os RyR da presente invenção são não fosforilados, fosforilados (por exemplo, por PKA), ou hiperfosforilados (por exemplo, por PKA). Como ainda utilizado aqui, o termo "atividade biológica de RyR" refere-se à atividade de uma proteína ou péptido que demonstra uma capacidade de se associar fisicamente com, ou se ligar, à FKBP12 (calstabinl) no caso de RyRl e RyR3 e FKBP12.6 (calstabin2) no caso de RyR2 (isto é, a ligação de cerca de duas vezes ou cerca de cinco 22 vezes, acima da ligação de fundo de um controlo negativo), de acordo com as condições dos ensaios aqui descritos.

Tal como aqui utilizado, "FKBP" inclui tanto uma "proteína FKBP" e um "análogo de FKBP", quer se trate de FKBP12 (calstabinl) ou FKBP12.6 (calstabin2). A menos que de outro modo aqui indicado, "proteína" inclui uma proteína, domínio de proteína, polipeptido, ou péptidos, e qualquer seu fragmento. Um "análogo de FKBP" é uma variante funcional da proteína FKBP, possuindo actividade biológica FKBP, que tem 60% ou mais de homologia de sequência de aminoácidos com a proteína FKBP, seja FKBP12 (calstabinl) ou FKBP12.6 (calstabin2). Como ainda utilizado aqui, o termo "atividade biológica de FKBP" refere-se à atividade de uma proteína ou péptido que demonstra uma capacidade de se associar fisicamente com, ou se ligar, a RyR2 não fosforilado ou não hiperfosforilado (isto é, a ligação de cerca de duas vezes, ou cerca de cinco vezes, acima da ligação de um controlo negativo de fundo), sob as condições dos ensaios aqui descritos. A FKBP liga-se ao canal RyR, uma molécula por subunidade RyR. Assim, tal como é aqui utilizado, o termo "PKBP ligado a RyR" inclui uma molécula de uma proteína FKBP12 (calstabinl) que está ligada a uma subunidade de proteína RyRl ou a um tetrâmero de FKBP12 que está em associação com um tetrâmero de RyRl, uma molécula de proteína FKBP12. 6 (calstabin2) que está ligada a uma subunidade de proteína de RyR2 ou um tetrâmero de FIKBP12.6 que está em associação com um tetrâmero de RyR2, e uma molécula de uma proteína FKBP12 (calstabinl) que está ligada a uma subunidade de proteína RyR3 ou um tetrâmero de FKBP12 que está em associação com um tetrâmero de RyR3. Portanto, "FKBP ligada 23 a RyR" refere-se a "FKBP12 ligada a RyRl", "FKBP2.6 ligada a RyR2" e "FKBP12 ligada a RyR3".

Uma "diminuição" ou "doença" ao nível de FKBP ligada a RyR em células de um indivíduo refere-se a uma diminuição detetável, diminuição ou redução do nível de FKBP ligada a RyR em células do indivíduo. Tal diminuição é limitada ou impedida, em células de um indivíduo, quando a redução é de alguma forma interrompida, impedida, evitada, obstruída ou reduzida pela administração de compostos de acordo com a invenção, de tal modo que o nível de FKBP ligada a RyR em células do indivíduo é maior do que seria de outro modo na ausência do composto administrado. 0 nível de FKBP ligada a RyR num indivíduo é detetado através de ensaios e técnicas padronizados, incluindo aqueles prontamente determinados a partir da arte conhecida (por exemplo, técnicas imunológicas, análise por hibridação, imunoprecipitação, análise de Western-blot, técnicas de imagem de fluorescência e/ou deteção por radiação, etc.), bem como quaisquer ensaios e métodos de deteção aqui descritos. Por exemplo, a proteína é isolada e purificada a partir de células de um indivíduo utilizando os métodos padrão conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, a extração a partir das células (por exemplo, com um detergente que solubiliza a proteína) se necessário, seguido por purificação de afinidade numa coluna, cromatografia (por exemplo, FTLC e HPLC), imunoprecipitação (com um anticorpo), e precipitação (por exemplo, com isopropanol e um reagente tal como o reagente Trizol). 0 isolamento e purificação da proteína são seguidos por eletroforese (por exemplo, num gel de SDS-poliacrilamida) . Uma diminuição no nível de FKBP ligada a RyR num indivíduo, 24 ou a sua limitação ou prevenção, é determinada por comparação da quantidade de FKBO ligada a RyR detetada antes da administração de JTV-519 ou de um composto da Fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-d, I-e, I-f, I-g, I-h, I-i, I-j, I-k, I-I ou I-m (em conformidade com os métodos descritos a seguir) com a quantidade detetada num tempo adequado após a administração do composto.

Uma redução do nível de FKBP ligada a RyR em células de um indivíduo é limitada ou impedida, por exemplo, inibindo a dissociação de FKBP e RyR nas células do indivíduo; aumentando a ligação entre a FKBP e RyR nas células do indivíduo; ou estabilizando o complexo RyR-PKBP em células de um indivíduo. Tal como aqui utilizado, o termo "inibir a dissociação" inclui o bloqueio, diminuição, inibição, limitação ou prevenção da dissociação física ou separação de uma subunidade de FKBP de uma molécula RyR nas células do indivíduo, e o bloqueio, diminuição, inibição, limitação ou impedimento da dissociação física ou a separação de uma molécula RyR de uma subunidade de FKBP em células do indivíduo. Como ainda utilizado aqui, o termo "aumentar a ligação" inclui intensificar, aumentar, ou melhorar a capacidade de o RyR fosforilado se associar fisicamente com a FKBP (por exemplo, a ligação de cerca de duas vezes ou cerca de cinco vezes, acima da ligação de fundo de um controlo negativo) em células do indivíduo e intensificar, aumentar, ou melhorar a capacidade da FKBP se associar fisicamente com o RyR fosforilado (por exemplo, a ligação de cerca de duas vezes, ou cerca de cinco vezes, acima da ligação de fundo de um controlo negativo) em células do indivíduo. Além disso, uma diminuição no nível de FKBP ligadas a RyR em células de um indivíduo é limitada ou impedida ao diminuir diretamente o nível de RyR fosforilado 25 nas células do indivíduo ou ao diminuir indiretamente o nível de RyR fosforilado nas células (por exemplo, pela orientação de uma enzima (tal como a PKA) ou outra molécula endógena que regula ou modula os níveis ou funções de RyR fosforilado nas células). Numa forma de realização, o nível de RyR fosforilado nas células é reduzida em pelo menos 10% no método da presente invenção. Numa outra forma de realização, o nível de RyR fosforilado é diminuído em pelo menos 20%.

Os indivíduos que podem ser tratados na presente invenção são sistemas in vitro e in vivo, incluindo, sem limitação, células ou tecidos isolados ou cultivados, sistemas de ensaio in vitro não-celulares e um animal (por exemplo, um anfíbio, uma ave, um peixe, um mamífero, um marsupial, um humano, um animal doméstico (por exemplo, um cão, gato, macaco, ratinho ou rato) um animal comercial (por exemplo, uma vaca ou um porco)).

As células de um indivíduo incluem as células do músculo estriado. Um músculo estriado é um músculo em que as unidades de repetição (sarcómeros) das miofibrilas contráteis estão dispostas em registo por toda a célula, resultando em estrias transversais ou oblíquas que são observadas ao nível do microscópio ótico. Exemplos de células do músculo estriado incluem, sem limitação, células musculares voluntárias (esquelético) e células musculares cardíacas. Numa forma de realização, a célula utilizada no método da presente invenção é uma célula do músculo cardíaco humano. Tal como aqui utilizado, o termo "célula muscular cardíaca" inclui fibras do músculo cardíaco, tais como as encontradas no miocárdio do coração. As fibras musculares cardíacas são compostas de cadeias de células de 26 músculo cardíaco contíguas, ou cardiomiócitos, juntas de ponta a ponta em discos intercalares. Estes discos possuem dois tipos de junções celulares: desmosomas expandidas que se estendem ao longo das suas porções transversais, e junções de espaços, a maior das quais se encontra ao longo das suas porções longitudinais.

Uma redução do nível de FKBP ligada ao RyR é limitada ou impedida, em células de um indivíduo através da administração dos compostos da invenção ao indivíduo; isto também iria permitir o contacto entre as células do indivíduo e os compostos da invenção. Os compostos da invenção são moduladores de canais de iões de cálcio. Além de regular os níveis de Ca2+ nas células do miocárdio, os compostos da invenção modulam a corrente de Na+ e a corrente K+ retificadora nas células, tais como células as células ventriculares de cobaias, e inibe uma corrente K+ retificadora atrasada corrente nas células, tais como as células atriais de cobaias.

Composição Farmacêutica 0 composto da invenção pode ser formulado em composições farmacêuticas para administração a seres humanos numa forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo. De acordo com um outro aspeto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o composto S36 em mistura com um diluente farmaceuticamente aceitável e/ou agente de suporte. 0 agente de suporte farmaceuticamente aceitável deverá ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não prejudicial para o seu recipiente. 0 agente de suporte farmaceuticamente aceitável aqui 27 utilizado é selecionado de entre vários materiais orgânicos ou inorgânicos que são usados como materiais para formulações farmacêuticas, e que são incorporados como agentes analgésicos, manteigas, ligantes, desintegrantes, emulsionantes, diluentes, excipientes, diluentes, agentes deslizantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes suspensores, agentes de tonicidade e agentes de suporte e agentes de aumento da viscosidade. Se necessário, os aditivos farmacêuticos, tais como antioxidantes, aromatizantes, corantes, agentes de melhoramento do sabor, conservantes e adoçantes, são também adicionados. Exemplos de agentes de suporte farmacêuticamente aceitáveis incluem a carboximetilcelulose, celulose cristalina, glicerina, goma arábica, lactose, estearato de magnésio, metilcelulose, pós, solução salina, alginato de sódio, sacarose, amido, talco e água, entre outros.

As formulações farmacêuticas são preparadas por métodos bem conhecidos nas artes farmacêuticas. Por exemplo, os compostos de S36 são colocados em associação com um agente de suporte e/ou diluente, tal como uma suspensão ou solução. Opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios (por exemplo, tampões, agentes aromatizantes, agentes superficialmente ativos, e semelhantes) são também adicionados. A escolha do agente de suporte é determinada pela solubilidade e natureza química dos compostos, via de administração escolhida e da prática farmacêutica padrão. 0 Composto S36 é administrado a um indivíduo por contacto das células alvo (por exemplo, células do músculo cardíaco) in vivo no indivíduo com o composto. 0 composto é contactado com (por exemplo, introduzido em) células do indivíduo usando técnicas conhecidas, utilizadas para a 28 introdução e administração de proteínas, ácidos nucleicos e outros fármacos. Exemplos de métodos para o contacto das células com (isto é, o tratamento das células com) o composto da invenção incluem, sem limitação, a absorção, a eletroporação, injeção, imersão, introdução, distribuição de lipossomas, transfecção, transfusão, vetores e outros agentes de suporte de distribuição de fármacos e métodos. Quando as células alvo estão localizadas a uma porção específica de um indivíduo, é desejável introduzir um composto da invenção diretamente para as células, por injeção ou por outros meios (por exemplo, por introdução do composto no sangue ou outro fluido corporal). As células alvo estão contidas em tecidos de um indivíduo e são detetadas por métodos de deteção padrão prontamente determinados a partir da técnica conhecida, os exemplos dos quais incluem, sem limitação, técnicas imunológicas (por exemplo, coloração imuno-histoquímica), as técnicas de imagiologia de fluorescência e técnicas microscópicas.

Além disso, o composto da presente invenção é administrado a um indivíduo humano ou animal por meio de processos conhecidos incluindo, sem limitação, administração oral, administração sublingual ou bucal, administração parentérica, administração transdérmica, via inalação ou via intranasal, vaginal, retal e por via intramuscular. Os compostos de acordo com a invenção são administrados por via parentérica, por epifascial, intracapsular, intracraniana, intradérmica, intratecal, intramuscular, intra-orbital, intraperitoneal, intra-espinal, intra-esternal, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, a injeção subcutânea ou por via sublingual, ou por meio de cateter. Numa forma de realização, o agente é administrado ao indivíduo por meio de distribuição nos músculos do 29 indivíduo, incluindo, mas não limitado aos músculos cardíacos do indivíduo. Numa forma de realização, o agente é administrado ao indivíduo por via de administração direcionada para as células do músculo cardíaco através de um cateter inserido no coração do indivíduo.

Para a administração oral, uma formulação do composto da invenção pode ser apresentada na forma de cápsulas, comprimidos, pós, grânulos, ou como uma suspensão ou solução. A formulação tem aditivos convencionais, tais como a lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata. A formulação também é apresentada com ligantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas. Além disso, a formulação é apresentada com desintegradores, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose de sódio. A formulação também é apresentada com o fosfato de cálcio dibásico anidro ou glicolato amido de sódio. Finalmente, a formulação é apresentada com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio.

Para a administração parentérica (isto é, a administração por injeção através de uma outra via que o canal alimentar) , o composto da invenção é combinado com uma solução aquosa estéril que seja isotónica com o sangue do indivíduo. Tal formulação é preparada por dissolução de um ingrediente ativo sólido em água contendo substâncias fisiologicamente compatíveis tais como o cloreto de sódio, glicina e semelhantes, e possuindo um pH tamponado compatível com condições fisiológicas, de modo a produzir uma solução aquosa, seguida de entrega da dita solução estéril. A formulação está apresentada em recipientes de dose unitária ou multi-dose, tais como ampolas ou frascos 30 selados. A formulação é libertada por qualquer modo de injeção, incluindo, sem limitação, epifascial, intracapsular, intracraniana, intradérmica, intratecal, intramuscular, intra-orbital, intraperitoneal, intra-espinal, intra-esternal, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, subcutânea, ou por via sublingual ou por via de cateter no coração do indivíduo.

Para a administração transdérmica, o composto da invenção é combinado com potenciadores da penetração na pele, tais como propileno glicol, polietileno glicol, isopropanol, etanol, ácido oleico, N-metilpirrolidona e semelhantes, que aumentam a permeabilidade da pele aos compostos da invenção e permitem que o composto penetre através da pele para a corrente sanguínea. As composições de compostos/estimuladoras podem também ser ainda combinadas com uma substância polimérica, tais como etilcelulose, hidroxipropilcelulose, etileno/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, e semelhantes, para proporcionar a composição na forma de gel, que é dissolvida num solvente, tal como cloreto de metileno, evaporada para a viscosidade desejada e, em seguida, aplicada a material de suporte para proporcionar um remendo.

Em algumas formas de realização, a composição está na forma de dose unitária tal como um comprimido, cápsula ou frasco de dose única. As doses adequadas da unidade, ou seja, quantidades terapeuticamente eficazes, podem ser determinadas durante os ensaios clínicos concebidos de forma adequada para cada uma das condições para as quais a administração de um composto escolhido é indicada, e irá, evidentemente, variar em função do parâmetro clínico desejado. O presente pedido de patente descreve também 31 artigos de fabrico para o tratamento e prevenção de perturbações, tais como perturbações cardíacas, num indivíduo. Os artigos de fabrico compreendem uma composição farmacêutica de S36. Os artigos de fabrico, são embalados com indicações de várias perturbações que as composições farmacêuticas são capazes de tratar e/ou prevenir. Por exemplo, os artigos de fabrico compreendem uma dose unitária de um composto aqui descrito que é capaz de tratamento ou prevenção de uma perturbação muscular, e uma indicação de que a dose unitária é capaz de tratamento ou prevenção de uma determinada doença.

De acordo com um método da presente invenção, o composto S36 é administrado ao indivíduo (ou são postas em contacto com células do indivíduo) numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma queda no nível de FKBP ligada a RyR no indivíduo, em particular em células do indivíduo. Esta quantidade é facilmente determinada pelo perito na arte, com base em técnicas conhecidas, incluindo a análise de curvas de titulação estabelecidos in vivo e os métodos e ensaios aqui revelados. Numa forma de realização, uma quantidade apropriada do composto da invenção eficaz para limitar ou prevenir uma queda no nível de FKBP ligada a RyR nas gamas do indivíduo de cerca de 0,01 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia, e/ou é uma quantidade suficiente para atingir níveis plasmáticos que vão desde cerca de 300 ng/mL a cerca de 1000 ng/mL. Numa forma de realização, a quantidade de composto da invenção varia de cerca de 10 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia. Numa outra forma de realização, é administrada a partir de cerca de 0, 01 mg/kg/dia a cerca de 10 mg/kg/dia. Numa outra forma de realização, é administrada a partir de cerca de 0, 01 mg/kg/dia a cerca de 5 mg/kg/dia. Numa outra forma de 32 realização preferida, é administrada a partir de cerca de 0,05 mg/kg/dia a cerca de 5 mg/kg/dia. Numa outra forma de realização, é administrada a partir de cerca de 0,05 mg/kg/dia a cerca de 1 mg/kg/dia.

Utilizações A presente invenção proporciona uma nova gama de tratamentos terapêuticos para pacientes com várias doenças envolvendo a modulação do RyR, particularmente desordens musculares esqueléticas (RyRl).

Numa forma de realização da presente invenção, o indivíduo ainda não desenvolveu uma perturbação. Numa outra forma de realização da presente invenção, o indivíduo está em necessidade de tratamento para uma perturbação. Várias perturbações que os compostos da invenção tratam ou previnem incluem perturbações e doenças musculares esqueléticas, perturbações e doenças cognitivas, hipertermia maligna, diabetes e síndrome da morte súbita do lactente. As perturbações e doenças musculares esqueléticas incluem, mas não estão limitadas a, fadiga do músculo esquelético, fadiga do músculo esquelético induzida pelo exercício, distrofia muscular, perturbações da bexiga e incontinência. Perturbações e doenças cognitivas incluem, mas não estão limitadas a, doença de Alzheimer, formas de perda de memória e, perda de memória dependente da idade. Um perito na técnica irá reconhecer ainda outras doenças, incluindo, mas não limitado a perturbações musculares e cardíacas, que os compostos da invenção podem ser úteis para tratar, de acordo com a informação aqui fornecida. 33

Devido à sua capacidade para estabilizar a FKBP ligada ao RyR e para manter e restaurar o equilíbrio no contexto da dinâmica da fosforilação e desfosforilação por PKA do RyR, o composto da invenção também é útil no tratamento de um indivíduo que já tenha tido sintomas clínicos destas várias perturbações. Por exemplo, se os sintomas da perturbação forem observados no indivíduo suficientemente cedo, o composto S36 é eficaz para limitar ou impedir uma maior redução no nível de FKBP ligada a RyR no indivíduo.

Além disso, o composto previne doenças de batimento cardíaco irregular em indivíduos com deficiências nos heterozigotos do gene FKBP12.6.

Tendo em conta os métodos anteriores, a presente invenção também proporciona a utilização do composto da invenção num método para limitar ou prevenir uma queda no nível de FKBP ligada a RyR num indivíduo candidato a uma perturbação. A presente invenção também proporciona a utilização do composto da invenção num método para o tratamento ou prevenção de uma perturbação muscular num indivíduo. Além disso, a presente invenção proporciona a utilização do composto da invenção num método para o tratamento de prevenção ou prevenção de perturbações musculares induzidas pelo exercício num indivíduo. 0 RyR, incluindo RyRl; RyR2 e RyR3, tem sido implicado numa série de eventos biológicos em células. Por exemplo, tem sido mostrado que os canais de RyR2 desempenham um importante papel no acoplamento EC e contratilidade nas células do músculo cardíaco. Portanto, é evidente que os fármacos preventivos destinados a limitar ou a evitar uma diminuição no nível de FKBP ligada a RyR em células, 34 particularmente FKPB12.6 ligada a RyR2 em células do músculo cardíaco, são úteis na regulação de uma série de eventos biológicos associados com RyR, incluindo o acoplamento EC e contratilidade. Métodos de Síntese A presente invenção, proporciona, num outro aspeto, processos para a preparação de um composto S36.

Algumas das seguintes sínteses utilizam solventes. Numa forma de realização, o solvente é um solvente orgânico. Numa outra forma de realização, o solvente orgânico é o cloreto de metileno (CH2CI2) , clorofórmio (CCI4) , formaldeído (CH20) ou o metanol (CH3OH) . Algumas das seguintes sínteses também utilizam um catalisador básico. Numa forma de realização, o catalisador básico é um composto de amina. Numa outra forma de realização, o catalisador básico é uma alquilamina, tal como trietilamina (TEA) . Ainda numa outra forma de realização, o catalisador básico é piridina. Algumas das seguintes sínteses também utilizam soluções básicas. Numa forma de realização, a solução básica é bicarbonato de sódio ou carbonato de cálcio. Numa outra forma de realização, a solução básica é bicarbonato de sódio saturado ou carbonato de cálcio saturado. Algumas das seguintes sínteses utilizam soluções ácidas. Numa forma de realização, a solução ácida é uma solução de ácido sulfúrico, uma solução de ácido clorídrico, ou uma solução de ácido nítrico. Numa forma de realização, a solução é IN HC1. Um perito na arte apreciará ainda outros solventes, solventes orgânicos, catalisadores básicos, soluções básicas, e soluções ácidas que são usados nas formas de realização, de acordo com a presente descrição. Os solventes, solventes orgânicos, reagentes, 35 catalisadores, soluções de lavagem, e assim por diante são adicionados a temperaturas adequadas (por exemplo, temperatura ambiente ou cerca de 20 °C - 25 °C, 0 °C, etc.).

As seguintes sínteses utilizam o S26 como material de partida. Métodos para a síntese de S26 estão descritos no Pedido de Patente nos EUA N ° 10/680, 988.

Algumas das seguintes sínteses requerem a purificação da mistura de reação para se obter um produto final. A purificação da mistura de reação envolve um ou mais processos tais como a remoção de qualquer solvente, a cristalização do produto, a separação cromatográfica do produto (incluindo HPLC, cromatografia em gel de sílica, cromatografia em coluna, e assim por diante), lavagem com solução básica, lavagem com solução ácida, re-dissolução do produto em outro solvente, e assim por diante. Um perito na arte apreciará ainda outros processos que são usados nas formas de realização, de acordo com a presente descrição.

As reações são levadas a cabo durante o tempo necessário (por exemplo, uma hora, várias horas, durante a noite, 24 horas, etc.), para se obterem os rendimentos desejados ideais ou os compostos desejados. Muitas vezes, as misturas de reação são agitadas. As reações são realizadas a temperaturas adequadas (por exemplo, temperatura ambiente ou cerca de 20 °C - 25 °C, 0 °C, 100 °C, etc.). O Synthon S26 é preparado de acordo com os métodos descritos no Pedido de Patente nos EUA n° 10/680, 988. 36 S57 é preparado a partir de S26 e cloro-oxoacetato de metilo. Numa forma de realização, a reação ocorre na presença de um solvente, tal como um solvente orgânico, tal como cloreto de metileno. Um catalisador básico tal como a piridina é usado como necessário para facilitar ou acelerar a reação. A mistura de reação formada pela mistura dos reagentes e um solvente é lavada com uma solução básica (por exemplo, solução saturada de bicarbonato de sódio), a solução ácida (por exemplo, ECI) e água. A purificação, tal como cromatografia em gel de silica produz S57. S36 é preparado a partir de S57 por reação com hidróxido de sódio. Numa forma de realização, a reação tem lugar num solvente, tal como um solvente orgânico, tal como metanol. 0 solvente é removido a partir da mistura de reação formada pela mistura dos reagentes e do solvente, formando-se assim um resíduo. 0 resíduo é dissolvido em água e lavado com outro solvente orgânico, tal como éter, para a remoção de compostos hidrofóbicos indesejáveis. A fase aquosa a partir das lavagens básicas é acidificada e o produto é extraído dela utilizando um solvente orgânico, tal como cloreto de metileno. A purificação adicional é utilizada, se necessário. 0 composto S36 da presente invenção pode ser preparado de diferentes formas, tais como sais, hidratos, solvatos ou complexos, e a invenção inclui todas as formas variantes dos compostos.

Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura de S36, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos ou pró-fármacos destes, com outros componentes químicos, tais como agentes de suporte e excipientes fisiologicamente 37 aceitáveis. 0 objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

Um composto da presente invenção também pode ser formulado como um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, o sal de adição de ácido e complexos deste. A preparação desses sais pode facilitar a utilização farmacológica por alteração das caracteristicas físicas do agente, sem impedir o seu efeito fisiológico. Exemplos de alterações úteis nas propriedades físicas incluem, mas não estão limitados a, diminuir o ponto de fusão para facilitar a administração transmucosa e aumentar a solubilidade para facilitar a administração de maiores concentrações do fármaco. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" significa um sal de adição de ácido, que é adequado para a ou compatível com o tratamento de um paciente ou de um indivíduo tal como um paciente humano ou um animal tal como um cão. 0 termo "sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" tal aqui utilizado, significa qualquer sal orgânico ou inorgânico não tóxico de S36. Ácidos inorgânicos ilustrativos que formam sais de adição de ácido apropriados incluem ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico, bem como os sais metálicos, tais como monohidrogeno ortofosfato de sódio e sulfato de hidrogénio e potássio. Os ácidos orgânicos ilustrativos que formam sais de adição de ácido adequados incluem ácidos mono-, di-e tricarboxílicos, tais como o ácido glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, benzoico, fenilacético, cinâmico e salicílico, bem como os ácidos 38 sulfónicos tais como o p-tolueno-sulfónico e o ácido metanossulfónico. Tanto os sais mono como di-ácido podem ser formados e tais sais existem quer numa forma hidratada, solvatada ou substancialmente anidra. Em geral, os sais de adição de ácido são mais solúveis em água e em diversos solventes orgânicos hidrofílicos e apresentam geralmente pontos de fusão mais elevados em comparação com as suas formas de base livres. A seleção de um sal apropriado será conhecida dos peritos na arte. Outros sais não farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, oxalatos, são utilizados, por exemplo, no isolamento dos compostos da invenção para utilização laboratorial ou para subsequente conversão num sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. 0 composto da presente invenção forma hidratos ou solvatos, que estão incluídos no âmbito das reivindicações. 0 termo "solvato" como aqui utilizado significa um composto S36, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que as moléculas de um solvente adequado estão incorporadas na rede cristalina. Um solvente adequado é fisiologicamente tolerável na dosagem administrada. Exemplos de solventes adequados são o etanol, a água e similares. Quando a água é o solvente, a molécula é referida como um "hidrato". 0 termo uma "quantidade eficaz", "quantidade suficiente" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, tal como aqui utilizado é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos e, como tal, uma "quantidade eficaz" depende do contexto no qual ela está a ser aplicada. A resposta é preventiva e/ou terapêutica. 0 termo "quantidade eficaz" 39 também inclui a quantidade de composto S36 que é "terapeuticamente eficaz", e que evita ou atenua substancialmente, os efeitos secundários indesejáveis.

Tal como aqui utilizado e como bem entendido na arte, "tratamento" é uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não estão limitados a, alívio ou melhoramento de um ou mais sintomas ou condições, diminuição da extensão da doença, estabilização (ou seja, sem piorar) do estado de doença, a prevenção de propagação da doença, atraso ou abrandamento de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (quer parcial ou total), quer seja detetável ou indetetável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada sem o recebimento do tratamento.

Os termos "animal", "indivíduo" e "paciente", como aqui usados incluem todos os membros do reino animal, incluindo, mas não limitado a, mamíferos, animais (por exemplo, gatos, cães, cavalos, etc.) e os seres humanos. 0 presente pedido descreve ainda uma composição, compreendendo um composto S36 marcado por rádio. A marcação dos compostos é realizada utilizando um de uma variedade de diferentes marcadores radioativos conhecidos na arte. A marcação radioativa da presente invenção é, por exemplo, um radioisótopo. 0 radioisótopo é qualquer isótopo que emita uma radiação detetável, incluindo, sem limitação, 35S, 125I, 3H, ou 14C. A radioatividade emitida pelo isótopo radioativo pode ser detetada por meio de técnicas bem conhecidas na 40 arte. Por exemplo, a emissão gama de radioisótopos é detetada utilizando técnicas de imagiologia gama, nomeadamente imagiologia cintigráfica. A titulo de exemplo, os compostos marcados com rádio da invenção são preparados como se segue. Um composto da invenção pode ser desmetilado no anel fenilo com BBr3. O composto de fenol resultante é então re-metilado com um agente de metilação de marcação de rádio (por exemplo, 3H-dimetilsulfato) , na presença de uma base (tal como NaH) para proporcionar compostos marcados com 3H. 0 composto S36 da presente invenção pode ser associado com um agente de suporte farmaceuticamente aceitável, tal como descrito acima, de modo a formar uma composição farmacêutica.

Manifestações de Eficácia

Como demonstrado na Figura 1, nas formas de realização A, B, C e D, S36 é mais potente no aumento da ligação de FKBP12.6 e RyR2 do gue JTV-519 e não bloqueia o canal Ca2+ do tipo L (Ica,l) ou canal K+ de HERG (IKr) · Na forma de realização A, o RyR2 PKA-f osf orilado é gerado como se segue: preparações de membrana SR cardíacas (5 μΐ, 50 pg) são adicionados a um total de 100 pL de tampão de quinase (8 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA, 50 mM de Tris-PIPES, a um pH 6,8) contendo 100 pM de MgATP e 40 unidades de PKA, e incubou-se à temperatura ambiente. As amostras são centrifugadas a 95.000 g durante 10 min e os peletes são lavadas três vezes em 0,2 mL de tampão de imidazol. Os peletes finais são reunidos e ressuspensos em tampão de imidazol (concentração final ~10 pg/pL). Para testar a 41 eficiência de religação de FKBP12.6 de JTV-519, SR cardíaco PKA-fosforilado (50 mg) é incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente com os compostos de teste e 250 nM de FKBP12.6 em 10 mM de tampão de imidizol, a um pH 7,0. As amostras são, então, centrifugadas a 100.000 g durante 10 minutos e os peletes foram lavados três vezes com tampão de imidizol. Após lavagem, as proteínas são de tamanho fraccionado em 15% PAGE. As imunomarcações são desenvolvidas utilizando um anticorpo anti-FKBP (dilatação de 1:3000). A quantidade de religação é quantificada por densitometria de Western blots e é comparada com a quantidade de FKBP associada a RyR em SR não f osf orilado. Os EC50 para os compostos são determinados através da geração de dados de ligação de FKBP, utilizando as concentrações de compostos que variam de 0,5-1000 nM. Na forma de realização B, as correntes através dos canais Ca2+ do tipo L em cardiomiócitos isolados de ratinho são gravados com condições de gravação de fixação de adesivos de células inteiras com Be2+ como o agente de suporte de carga. A solução extracelular contém (em mM) : N-metil-D-glucamina, 125; BaCl2, 20; CsCl, 5; MgCl2, 1; HEPES, 10; glicose, 5; pH 7,4 (HC1). A solução intracelular contém (em mM) : CsCl, 60; CaCl2, 1; EGTA, 11; MgCl2, 1; K2ATP, 5; HEPES. 10; ácido aspártico, 50; pH 7,4 (CsOH) . Sob estas condições, espera-se que a corrente medida foi realizada por Ba2+, principalmente por meio de canais de cálcio tipo L, que é referido como o ICa, l· Os fármacos são aplicados por um comutador local de soluções e atingem a membrana de células dentro de 1 s. Os efeitos da nifedipina e S36 são testados com passos de adesão de tensão com 20 ms de comprimento para +10 ou +20 mV (pico da relação corrente-tensão para cada célula individual) a partir de potenciais de -80 mV ou -40 mV. Na forma de realização C, a 42 dependência da voltagem da corrente de Ca2+ do tipo L bloqueada pelo JTV-519 (a 1 μΜ) e S36 (1 μΜ) é medida e apresentada.

Como demonstrado na Figura 2. S36 evita morte súbita cardíaca induzida pelo exercício em níveis plasmáticos mais baixos em comparação com o JTV-519. A dose-dependência dos efeitos farmacológicos de JTV-519. e S36 é mostrada. Os níveis plasmáticos de 1 μΜ de JTV519 previnem arritmias cardíacas e morte súbita cardíaca em ratinhos FKBPI2.6+/ . Os níveis plasmáticos de 1 μΜ e 0,02 μΜ de S36 também previnem arritmias cardíacas e morte súbita cardíaca em ratinhos FKBP12.6+/~.

Tal como demonstrado na Figura 3, rycal impede o desenvolvimento de insuficiência cardíaca aguda pós-enfarte do miocárdio. Ratinhos tratados com placebo ou rycal (100 nM ou 200 nM de concentrações plasmáticas) são submetidos a ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda, resultando em enfarte do miocárdio. Rycal melhora significativamente a fração de encurtamento avaliada pela ecocardiograf ia em modo M, 2 semanas pós-enfarte do miocárdio, em comparação com placebo.

Como demonstrado na Figura 4, S36 melhora a função cardíaca em insuficiência cardíaca crónica pós-enfarte do miocárdio. Os ratinhos de tipo selvagem são submetidos a ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda, resultando em enfarte do miocárdio. Sete dias após o enfarte do miocárdio, os ratinhos são tratados com S36 (concentração de plasma de 200 nM) ou placebo. As proporções de peso do coração para o peso corporal (HW/BW) e as quantificações de ciclos de pressão e volume (dP/dt, a 43 inclinação do derivado máximo de mudança na pressão sistólica ao longo do tempo) mostram remodelação inversa e contratilidade cardíaca melhorada em ratinhos tratados com S36 em comparação com o placebo. A Figura 5 é um gráfico resumido de valores EC50 de JTV-519 e compostos de S1-S67 aqui divulgados. 0 ensaio de religação de FKBP2.6 descrito acima é utilizado para determinar a quantidade de ligação de FKBP12.6 a RyR2 PKA-fosforilado a várias concentrações (0,5 - 1000 nM) dos compostos indicados. Os valores de EC50 são calculados utilizando o ajuste de curva de Michaelis-Menten.

Como demonstrado na Figura 6, nas formas de realização A, B e C, rycal normaliza a função e estrutura do canal RyR2-P2328S associado a CPVT. Na forma de realização A são mostrados os traçados representativos de corrente do canal simples de RyR2-P2328S não fosforilado e RyR2-WT PKA-fosforilado tratado com rycal mostrando nenhuma influência de JTV-519 na função do canal de referência. No entanto, no RyR2-P2328S PKA-fosforilado, tal como mostrado na forma de realização B, rycal normaliza o estado fechado de um canal simples para níveis próximos dos observados na forma de realização A, reduzindo a probabilidade de abertura de 14,4% para 0,3% após a administração de 0,1 pmol/L de rycal. As inserções nas formas de realização A e B mostram aberturas de canal > 1 pA a uma resolução maior. A forma de realização C mostra a análise de imunomarcação da ligação de calstabin-2 de RyR2-P2328S na presença ou ausência de PKA e de 0,1 pmol/L de rycal, como indicado. RyR2-P2328S é imunoprecipitado e PKA in vitro foi fosforilado tal como descrito acima. 44

Como mostrado na Figura 7, nas formas de realização A, B, C, D, e E, o funcionamento do canal RyRl é aumentado e normalizado em ratinhos mdx (com deficiência em distrofina) tratados com JTV-519. Na Figura 7, as aberturas de canal são representadas como deflexões ascendentes; "c" indica o estado fechado; e a amplitude de corrente 4 pA aberta é indicada pelo traço. Os traços superiores representam 5 vistas e os traços inferiores 500 ms; as linhas pontilhadas indicam estados de subconductância. A forma de realização A na Figura 7 mostra um traçado de corrente de canal simples de RyRl a partir do músculo sóleo de ratinhos de controlo (de tipo selvagem) sob condições de repouso (Ca2+ citoplasmático a 150 nM) . Como se vê, RyRl está predominantemente fechado. A forma de realização C da Figura 7 mostra que a função do canal RyRl de ratinhos mdx mostra um aumento da probabilidade de abertura significativo, o aumento médio de abertura, e diminuição média de tempos de permanência fechada, To a Tc, respetivamente. O aumento Po em ratinhos mdx é consistente com o vazamento intracelular de Ca2+. Os histogramas de amplitude nas formas de realização B, D e F mostram vários estados de subconductância consistentes com a depleção de calstabinl (FKBP12) no RyRl do músculo sóleo de mdx. A forma de realização E da Figura mostra um ratinho mdx tratado com 1,0 μΜ de JTV-519. Como pode ser visto, os canais RyRl do ratinho tratado com JTV-519 demonstram uma atividade normal que não é significativamente diferente dos traçados de ratinhos não tratados do tipo selvagem, indicando, assim, que o JTV-519 pode normalizar a função do canal RyRl em ratinhos mdx. 45

Os dados da Figura 7 são consistentes com o vazamento intracelular de Ca2+ no SR através de canais RyRl como a causa do aumento do vazamento citosólico de Ca2+ nos músculos esqueléticos de ratinhos mdx (com deficiência em distrofina).

As formas de realização A e B da Figura 8 demonstram que o

músculo esquelético de mdx tem níveis normais de fosforilação por PKA de RyRl, mas níveis de calstabinl empobrecidos. As imunomarcações na forma de realização A mostram que ratinhos do tipo mdx têm niveis empobrecidos de calstabinl comparado com um ratinho de controlo (tipo selvagem). Os gráficos de barras sumários da forma de realização B mostram que o ratinho mdx, no entanto, tem um nivel equivalente de PKA-fosforilação. Portanto, conclui-se que o empobrecimento de calstabinl é um defeito que é consistente com o vazamento intracelular de Ca2+ observado em células do músculo esquelético de ratinhos mdx e de miofibras de agente de suporte de mutação humana. 0 vazamento intracelular de Ca2+ no SR é suscetível de contribuir para a morte de miofibras e perda de massa muscular por sobrecarga de Ca2+ intracelular tóxica e ativação de proteases. A Figura 9, formas de realização A, B e C, mostra que o vazamento de Ca2+ no SR ao nível subcelular em músculos do esqueleto de animais com insuficiência cardíaca é detetável. A qualidade de vida e prognóstico em pacientes com insuficiência cardíaca (HF) é gravemente diminuída devido a uma disfunção do músculo esquelético (por exemplo, falta de ar, devido à fraqueza do diafragma, e intolerância ao exercício devido à fadiga do músculo esquelético do membro), além de função cardíaca deprimida. A desregulação 46 da libertação do Ca2+ intracelular do SR é um mecanismo patogênico subjacente à disfunção muscular esquelética na HF. A HF em animais provoca uma aceleração intrínseca significativa da fadiga do músculo esquelético.

As formas de realização A e B da Figura 9 são imagens de varrimento em linha por fluorescência Af/F de exemplos representativos de parcelas de Ca2+ em miofibras de ratinhos sham e pós-enfarte do miocárdio (PMI) correspondente curso do tempo de parcela de Ca2+. A forma de realização C mostra a distribuição relativa das propriedades espácio-temporais das parcelas de Ca2+. Gráficos indicam os percentis 25, 50, 75, as linhas horizontais indicam o intervalo de 1-99% da distribuição. Sham, símbolos abertos (n = 137, três animais); pós-enfarte do miocárdio (PMI), símbolos cinza (n = 82, dois animais). *, P <0,05. FDHM, duração total a uma amplitude de pico de 50%; FWHM, largura total de 50% da amplitude de pico. A Figura 10, formas de realização A e B, demonstra que o tratamento de ratinhos selvagens com JTV-519 melhorou os tempos de fadiga do músculo sóleo em comparação com placebo. O músculo sóleo de ratinhos do tipo selvagem tratados com JTV519 ou ratinhos de calstabin2~/~ ratos com insuficiência cardíaca a partir de enfarte do miocárdio são mais resistentes à fadiga (P <0,05) em comparação com ratinhos tratados com placebo. Após conclusão do tratamento, o músculo sóleo foi dissecado e montado num banho de tecidos para avaliar a função do músculo esquelético isolado. 50% representativo de traçados de tempo de fadiga de força tetânica máxima é mostrado para ratinhos do tipo selvagem e calstabin2~7~, tratados com JTV519 ou placebo, na forma de realização A. A forma de 47 realização B mostra um gráfico de barras resumindo o tempo médio até à fadiga.

Em resumo, o tratamento com JTV-519 melhorou o cansaço muscular esquelético em animais com insuficiência cardíaca in vivo. Curiosamente, em ratinhos calstabin2~/~knockout, os tempos de fadiga também foram significativamente melhorados nos ratinhos tratados com JTV519, sugerindo que os efeitos benéficos sobre a função do músculo esquelético isolado dependem da ligação de calstabinl e não da calstabin2 a RyRl. Com efeito, calstabinl parece ser a única isoforma de significado funcional expressa nos músculos esqueléticos. A Figura 11, formas de realização A e B, mostra que num modelo de ratinho com insuficiência cardíaca pós-enfarte do miocárdio, o RyRl no músculo sóleo também é PKA-hiperfosforilado. Tanto nos ratinhos do tipo selvagem como de calstabin2_/_, o JTV-519 aumentou a ligação de calstabinl a RyRl no músculo sóleo, sugerindo que o JTV-519 melhora a fatigabilidade do músculo esquelético através da normalização da religação de calstabinl ao complexo de canal. Quantidades equivalentes de RyRl foram imunoprecipitadas com um anticorpo contra RyRl. A forma de realização A fornece gráficos de barras que mostram a quantidade de fosforilação por PKA de RyRl em ratinhos Ser-2844 (correspondente ao humano Ser-2843). A diminuição significativa de fosforilação por PKA de RyRl em animais do tipo selvagem tratados com JTV519 é provavelmente resultante de efeitos cardíacos benéficos e da redução secundária da atividade do sistema nervoso simpático. A forma de realização B mostra gráficos de barras que mostram a quantidade de calstabinl ligada a RyRl de ratinhos do tipo selvagem ou calstabin2~/~ tratados com JTV519 ou 48 placebo. Os ratinhos foram tratados com JTV519 por minibombas osmóticas implantáveis utilizando uma dose de 0,5 mg/kg/dia. Em resumo, o tratamento de JTV-519 resultou num aumento altamente significativo de calstabinl no complexo RyRl no sóleo in vivo. A Figura 12, formas de realização A, B, C e D demonstra que a religação de calstabinl a RyRl por JTV519 normaliza a função anormal ou vazante do canal RyRl in vivo. Nas formas de realização A e C são mostrados traçados de canal simples RyRl em 150 nM de Ca2+ citoplasmático que representam condições de repouso no músculo esquelético de ratinhos de tipo selvagem tratados com placebo e JTV-519. O tratamento com JTV-519 de ratinhos com insuficiência cardíaca e aumento da fadiga muscular normalizou a dependência do canal RyRl no músculo esquelético in vivo. As aberturas de canal são ascendentes, o traço indica o nível máximo de abertura do canal (4 pA) , as linhas tracejadas indicam niveis de subconductância, e "c" indica o estado fechado dos canais. Para os histogramas de amplitude nas formas de realização B e D, a amplitude é representada no eixo x, e os eventos indicam o número de aberturas de canal. Os valores Po, To e Tc correspondem aos traços representativos. O tratamento, tal como indicado no topo dos traços. A inserção mostra maior resolução de estados abertos.

Em resumo, os dados mostram que o tratamento in vivo com JTV519 normaliza a função do músculo esquelético e a disfunção do canal RyRl consistente com a prevenção de vazamento intracelular de Ca2+ no SR como uma causa do aumento da fadiga muscular esquelética. 49 A Figura 13 demonstra que o JTV-519 também aumenta a afinidade de ligação da calstabinl a RyRl no músculo esquelético in vivo. Isso provavelmente explica porque os ratinhos tratados com JTV519 com insuficiência cardiaca têm níveis aumentados de calstabinl ligada a RyRl no músculo sóleo. Na forma de realização A, as quantidades equivalentes de RyRl esquelético ou RyR2 cardíaco foram imunoprecipitadas, PKA-fosforiladas e incubadas com ou calstabinl ou calstabin2 em concentrações crescentes de JTV519, respetivamente. 0 sedimento representa apenas calstabin ligada a RyR. A imunomarcação mostrou que ^ 50 nM de JTV519 aumentou a afinidade de ligação de calstabin a RyR. Os gráficos da forma de realização B demonstram ainda que a fosforilação por PKA de RyRl reduziu a afinidade de calstabinl a RyRl (círculos abertos), enquanto que o tratamento com JTV519 (círculos preenchidos) restaurou a afinidade de ligação de calstabinl a RyRl para a de RyR 1 não PKA-fosforilado (quadrados vazios). A Figura 14, formas de realização A, B, C e D demonstra que Ser-2843 é o local de fosforilação por PKA único em canais RyRl esqueléticos. (A) traçados representativos de canal simples de RyRl do tipo selvagem, (B) Efeito de fosforilação de PKA exógena de RyRl (wt RyRl-P) , (C) PKA não afeta RyRl-S2843A que contém um local de fosforilação por PKA não funcional. Uma vez que a PKA não aumenta a atividade de RyRl-S2843A, Ser-2843 parece constituir o único local de fosforilação por PKA em canais RyRl no músculo esquelético. Por conseguinte, (D) o RyRl-S2843D constitutivamente fosforilado imita a fosforilação por PKA exógena mostrada em (B), confirmando que Ser-2843 é o único local de fosforilação por PKA em canais esqueléticos RyRl. Os registos de canal único RyRl em bicamadas lipídicas 50 planas apresentam atividade dos canais a 150 nM de [Ca2+]cis (lado citosólico) com 1 mM de ATP. Os registos foram realizados a 0 mV, o estado fechado dos canais, tal como indicado por "c", e as aberturas de canal são deflexões ascendentes. Todos os histogramas de amplitude são mostrados à direita. A probabilidade de abertura (Po) e os tempos médios de permanência em fechado (Tc) e aberto (To) são indicados acima de cada traçado do canal. A Figura 15, formas de realização A e B, mostra a depleção de estabilização de calstabinl e PICA-hiperfosforilação de canais RyRl a partir de exercício sustentado. O exercício aeróbico pode ser definido como uma forma de exercício físico que aumenta a frequência cardíaca e melhora o consumo de oxigénio para melhorar o desempenho. Exemplos de exercícios aeróbicos são a corrida, ciclismo e natação. Durante o estudo da Figura 15, os ratinhos foram desafiados por exercícios aeróbicos (natação forçada) durante 90 minutos duas vezes por dia. Os animais estavam acostumados a nadar em sessões de treinamento preliminares: dia -3 duas vezes de 30 minutos, dia 2 - duas vezes por 45 minutos, dia 1 - duas vezes por 60 minutos, dia 0 e seguintes - duas vezes por 90 minutos. Os ratinhos foram, em seguida, exercitados por 1, 7 ou 21 dias consecutivos adicionais, durante 90 minutos duas vezes por dia. Entre as sessões de natação, separadas por um período de descanso de 4 horas os ratos são mantidos aquecidos e com comida e água. Uma piscina com água de corrente ajustável foi usada para exercitar ratinhos por natação. Utilizou-se uma piscina de acrílico (90 cm de comprimento x 45 cm de largura x 45 cm de profundidade) com água até uma profundidade de 25 cm. Uma corrente na piscina foi gerada com uma bomba. A velocidade da corrente, durante a sessão de natação foi a 51 uma velocidade constante de caudal de 11/min. A temperatura da água foi mantida a 34 °C com um aquecedor elétrico. Foram usados ratinhos com a mesma idade e peso para excluir as diferenças de flutuabilidade devida à gordura corporal.

Utilizando natação forçada como um protocolo eficiente para aumentar a capacidade aeróbica do músculo esquelético nos ratinhos, o estado de composição e fosforilação do complexo do canal RyRl esquelético foi investigado. Inesperadamente, após 3 semanas de 90 minutos de natação duas vezes por dia, os ratinhos do tipo selvagem C57B16 apresentaram um aumento significativo de fosforilação por PKA no RyRl enquanto que a fosforilação de Ca2+-calmodulina cinase II (CaMKII) não foi alterada, indicando que a especificidade da via de expressão de proteína de stress de RyRl era estável, contudo, os canais RyRl foram esgotados da subunidade calstabinl de estabilização (FKBP12). Tem sido demonstrado que a hiperfosforilação de RyRl e depleção de calstabinl são consistentes com canais RyRl vazantes que causam o vazamento intracelular de Ca2+ no SR.

Os canais RyRl são PKA-hiperfosforilados e empobrecidos da subunidade de estabilização de calstabinl após 3 semanas de natação a 90 minutos duas vezes por dia. Como pode ser visto na forma de realização A, o complexo do canal macromolecular de RyRl imunoprecipitado mostra um aumento da fosforilação por PKA em Ser-2844 (correspondente ao RyRl-Ser-2843 humano), enquanto a fosforilação de CaMKII em Ser-2849 (correspondente ao RyRl-Ser-2848 humano) se manteve inalterada. Concomitantemente com o aumento da hiperfosforilação de RyRl-Ser-2844 por PKA, a calstabinl está esgotado a partir do complexo de canal. Como se vê na forma de realização B, a normalização da fosforilação e 52 teor de calstabinl para quatro subunidades do complexo do canal tetramico mostra um significativo aumento na fosforilação por PKA e de esgotamento da subunidade de estabilização de calstabinl. Controlo, ratinhos não exercitados; natação, ratinhos exercitados durante 90 minutos duas vezes por dia durante 3 semanas (dados preliminares). P < 0,05. A Figura 16, formas de realização A e B, demonstra que a fosforilação por PKA aumenta as durações do exercício sustentado. Para investigar a influência da duração do exercício sustentado no defeito da libertação de Ca2+ em RyRl, os ratinhos foram expostos a natação durante 1, 7, ou 21 dias, seguido de sacrifício imediato. A exposição mais longa a exercício sustentados resulta num aumento significativo de hiperf osf orilação por PKA em RyRl com início aos 7 dias e aos 21 dias de saturação.

Na Figura 16, forma de realização A, o complexo do canal RyRl imunoprecipitado mostra fosforilação por PKA em Ser-2844 aumentada e a níveis significativamente acima dos fisiológicos (correspondente ao RyRl-Ser-2843 humano), após 7 dias de exercício de natação. Na Figura 16, forma de realização B, a normalização da fosforilação de RyR2-Ser-2844 no complexo de canal tetramérico documenta um aumento significativo da fosforilação por PKA. *, P <0,05, **, P <0,005.

Em resumo, os dados da Figura 16 mostram que o exercício sustentado resulta nuam fosforilação aumentada de RyRl pela proteína quinase A (PKA), o que contribui para a depleção da subunidade de estabilização de calstabinl do complexo do canal, como a causa de um defeito de ganho-de-função. 53 A Figura 17 proporciona dados que mostram que o aumento crónico da estimulação simpática dos músculos esqueléticos, resulta num vazam de Ca2+ intracelular dependente de RyRl e numa fadiga muscular significativamente aumentada. Qual é a consequência funcional do aumento crónico da hiperfosforilação por PKA de RyRl? Como mostrado na Figura 17 para ratinhos e ratos com insuficiência cardiaca a partir de enfarte do miocárdio, a hiperfosforilação crónica por PKA de RyRl resulta em fadiga muscular aumentada.

Na forma de realização A, pode ver-se o músculo esquelético de insuficiência cardiaca antes do controlo. 0 músculo sóleo de ratinhos (n = 5 controlo, n = 8 HF) foi montado num banho de tecidos para avaliar a função contrátil. 0 traçado do tempo representativo da fadiga é mostrado para os músculos esqueléticos de controlo e HF. 0 gráfico de barras mostra o tempo médio (±DP) até à fadiga a 40%. *, P <0,05. Na forma de realização B, pode ser visto que o músculo esquelético de insuficiência cardíaca atingiu a força tetânica máxima mais lentamente do que os músculos esqueléticos de controlo. A força tetânica foi induzida pela estimulação de campo de alta frequência O gráfico de barras mostra o tempo de concentração tetânica a 50%. **, P <0,01. A forma de realização C demonstra a correlação entre o tempo até à fadiga e a fosforilação por PKA de RyRl (r = 0,88) no músculo esquelético de ratinhos sham e animais de insuficiência cardíaca. A função muscular e a fosforilação por PKA de RyRl foram avaliadas através de músculos sóleo contralaterais de cada animal.

Em resumo, a Figura 17 fornece dados que mostram que o exercício sustentado provoca hiperfosforilação por PKA de 54

RyRl e depleção de calstabinl, e a Figura 17 mostra que o defeito idêntico ocorre nas formas da doença com o aumento da atividade simpática causando o vazamento intracelular de Ca2+ em SR e fadiga muscular esquelética significativamente acelerada.

Um problema adicional durante o exercício sustentado e stress é a degeneração do músculo esquelético contribuindo ainda mais para o desempenho diminuído do músculo esquelético. Para avaliar as mudanças estruturais durante o exercício sustentado, alterações histológicas nos músculos de contração rápida de ratinhos expostos a 3 semanas de exercício por natação foram caracterizados. Os resultados são mostrados na Figura 18. As secções transversais do ratinho M. extensor digitorum longus (EDL) apresentaram alterações histológicas consistentes com a degeneração de células musculares por sobrecarga de Ca2+ intracelular de canais defeituosos RyRl. Portanto, o exercício sustentado por 90 minutos duas vezes ao dia provoca um fenótipo distrófico nos músculos EDL de ratinhos C57B16 normais. A coloração trichrome mostra miofibras embaladas com dimensão transversal semelhante em ratinhos de controlo não exercitados (WT) (à esquerda). Três semanas de natação resultam em degeneração de miofibras e em depósitos de colagénio intersticial com tamanhos de fibra irregulares. A coloração com Hematoxilina-eosina (Η & E) indica alterações nucleares e morte das miofibras. Estas alterações são consistentes com a remodelação distrófica. O canal de potássio retificador tardio rápido (I(Kr)) é importante para a repolarização do potencial de ação cardíaca. HERG é a subunidade formadora de poros do canal 55 I(Kr). A supressão da função de I(Kr), por exemplo, como um efeito secundário de um fármaco ou o resultado de uma mutação no hERG, pode levar a sindrome do QT longo (LQT), que está associado ao aumento do risco de arritmias potencialmente fatais. 0 composto da presente invenção exibe uma atividade mais baixa de bloqueio de hERG do que o JTV-519, como demonstrado nas Figuras 19-23. Assim, o composto da presente invenção está previsto como sendo menos tóxico e/ou como apresentando menos efeitos secundários do que o JTV-519.

As Figuras 19 a 22 ilustram o efeito do composto ARM036 (também referido como S36) e ARM036-Na (um sal de sódio de ARM036) em correntes de hERG. A Figura 19 mostra um registo típico de corrente de adesão de tensão hERG antes (controlo) e após a aplicação de ARM036 a 100 μΜ. O protocolo de pulsação de voltagem usado para ativar as correntes hERG é ilustrado por baixo do traçado de corrente. Pode ser visto que, a seguir à ativação pelo condicionamento do pré-pulso (para +20 mV), a repolarização parcial (teste de pulso de -50 mV) da membrana provocou uma corrente de extremidade exterior com deterioração lenta. A aplicação de ARM036 diminuiu minimamente a corrente de extremidade exterior numa forma dependente da concentração e do tempo. A Figura 20 mostra um curso de tempo típico do efeito do ARMO36 a 100 mM sobre a amplitude da corrente do canal hERG. A Figura 21 é um gráfico que mostra a dependência da concentração do efeito de ARM036 na corrente hERG. A Tabela 56 1 apresenta os dados numéricos que são ilustrados graficamente na Figura 21. Porque a maior concentração de ARM036 testado resultou na inibição de corrente inferior a 50%, não foi possivel determinar um valor de IC50 para ARMO36.

Tabela 1

Concentração (μΜ) Média DP MES N 10 0, 7% 0,3% 0,2% 3 100 0, 9% 0,7% 0,4% 3 A Figura 22 é um gráfico que mostra a dependência da concentração do efeito de ARM036-Na na corrente hERG. A Tabela 2 apresenta os dados numéricos que são ilustrados graficamente na Figura 22. Porque a maior concentração de ARM036-Na testado resultou na inibição de corrente inferior a 50%, não foi possivel determinar um valor de IC50 para ARM036-NA.

Tabela 2 ID Artigo de Teste IC50 (1*4) Cone, (1*4) % Média de Inibição hERG % Desvio Padrão % Erro Padrão n Dados Individuais (% Inibição) ARM036-Na ND 0,01 0,29% 0,2% 02% 2 0,0% 0,3% 0,1 5,0% 7,1% 5,0% 2 10,0% 0,0% 1 5,5% 4,4% 31% 2 2,4% 6,6% 10 67% 22% 1,6% 2 5,1% 8,2% A Figura 23 é um gráfico que mostra a dependência da concentração do efeito de JTV-519 (referido na figura como "ARMOXX") na corrente de hERG, A Tabela 3 fornece os dados numéricos que são ilustrados graficamente na Figura 23, 0 valor de IC50 para JTV-519 foi de 0,463 μΜ, 57

Tabela 3 ID Artigo de Teste IC50 0*1) Cone, (1*D % Média de Inibição hERG % Desvio Padrão % Erro Padrão n Dados Individuais (% Inibição) 001 5, 0% 0,3% 0,2% 2 5,2% 4,8% 0,1 18,1% 11, 4% 81% 2 100% ARMOXX 0463 26,1% 1 68,4% 19 1% 13, 6% 2 81,9% 64,9% 10 92 9% 5,8% 4,1% 2 95,9% 8B 7% 0 fármaco antiarrítmico E-4031, um bloqueador conhecido das correntes hERG, foi utilizado como um controlo positivo. 0 E-4031 bloqueou a corrente hERG com um IC50 de 0,5 μΜ (n = 6) .

Em resumo, o composto S36 exibe reduzida atividade bloqueadora de hERG em comparação com o JTV-519. Assim, o composto da invenção é esperado ser menos tóxico e/ou apresentar menos efeitos secundários do que o JTV-519. A Tabela 4 em baixo apresenta um valor de EC50 para o composto S36. Os dados de EC50 foram obtidos utilizando o ensaio de religação de FKBP12.6 descrito acima, para determinar a quantidade de ligação de FKBP12.6 a RyR2 PKA-fosforilado a várias concentrações (0,5 - 1000 nM) do composto S36. O valor de EC50 foi calculado usando o ajuste de curva de Michaelis-Menten. 58

Tabela 20

Composto n° ECso (nM) 36 15 A presente invenção é descrita nos Exemplos seguintes, os quais são estabelecidos para ajudar na compreensão da invenção e não devem ser interpretados de forma a limitar de qualquer forma o âmbito da invenção, tal como definida nas reivindicações que os seguem.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - FOSFORILAÇAO POR PKA DE RyR2 E LIGAÇAO DE FKBP12.6

Membranas cardíacas SR são preparadas, tal como descrito anteriormente (Marx et al, PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000; Kaftan, et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78:990-97, 1996). A FKBP12.6 marcada com 35S foi gerada usando o sistema de transcrição/tradução TNT ™ Quick Coupled da Promega (Madison, WI). [3H] ligação de rianodina é utilizada para quantificar os níveis de RyR2. 100 pg de microssomas são diluídos em 100 pL de 10-mM de tampão de imidazole (pH 6,8), incubada com 250 nM (concentração final), [95 S]-FKBP12.6 a 37 °C durante 60 minutos, depois extinguida com 500 pL de tampão de imidazole gelado. As amostras são centrifugadas a 100.000 g durante 10 min e lavadas três vezes em tampão de imidazol. A quantidade de ligação [35S]-FKBP12.6 é determinada por contagem de cintilação líquida do pelete. 59

EXEMPLO 2 - IMUNOMARCAÇÕES A imunomarcação de microssomas (50 pg) é realizada como descrito, com anti-FKBP 12/12,6 (1:1000), anti-RyR-5029 (1:3000) (Jayaraman, et ai., F506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267:9474-77,1992), ou anti-fosfoRyR2-P2809 (1:5000) durante 1 hora à temperatura ambiente (Reiken, et al., Beta-blockers restore calcium release channel function and improve cardiac muscle performance in human heart failure. Circulalion, 107:2459-66, 2003). O anticorpo anti-RyR2 especifico do P2809- fosfoepitopo é um anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade, feito por encomenda pela Zymed Laboratories (São Francisco, CA), utilizando o péptido, CRTRRI-(pS)-QTSQ, o que corresponde ao RyR2 PKA-fosforilado em Ser2809 . Após incubação com IgG-HRP anti-coelho com marcação HRP (diluição a 1:5000; transduction Laboratories, Lexington, KY), as marcações são desenvolvidas usando ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

EXEMPLO 3 - REGISTOS DE CANAL SIMPLES

Os registos de canal simples de RyR2 nativo do coração de ratinhos, ou RyR2 recombinante, são adquiridos em condições de adesão de tensão a 0 mV, como descrito anteriormente (Marx, et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in bailing hearts. Cell, 101:365-76, 2000) . As soluções simétricas utilizadas para registos de canais são: o compartimento trans - HEPES, 250 mmol/L; 60

Ba (OH)2, 53 mmol/L (em algumas experiências, Ba(OH)2 é substituída por Ca(OH)2), pH 7,35; e compartimento cis -HEPES, 250 mmol/L; de base Tris, 125 mmol/L; EGTA, 1,0 mmol/L e CaCl2, 0,5 mmol/L, pH 7,35. Salvo indicação em contrário, os registos de canais simples foram feitos na presença de 150-nM de [Ca2+] e 1,0-mM de [Mg2+] no compartimento cis. A Rianodina (5 mM) é aplicada ao compartimento cis para confirmar a identidade de todos os canais. Os dados são analisados a partir de gravações atuais digitalizadas usando software Fetchan (Axon

Instruments, Union City, CA). Todos os dados são expressos como média ±EP. O T-testis de Student não pareado foi usado para comparação estatística dos valores médios entre as Experiências. Um valor de p <0,05 é considerado estatisticamente significativo.

EXEMPLO 4 - COMPOSTOS E MÉTODOS PARA A SUA SÍNTESE O Synthon S26 é preparado de acordo com os métodos descritos no Pedido de Patente nos EUA n° 10/680, 988.

Esquerda j: Síntês© de S36

a Síntese de S36 (Esquema 1): A uma solução agitada de S26 (0,85 g, 4,4 mmol) e piridina (0,70 g, 8,8 mmol) em CH2C12 61 (50 mL) a 0 °C, cloro-oxoacetato de metilo é adicionado gota a gota (0,81 g, 6,6 mmol) . A mistura de reação é agitada a 0 °C durante 2 horas e depois lavada com bicarbonato de sódio saturado, IN HC1, e água. Cromatografia em coluna de gel de sílica fornece S57 como um sólido branco (1,1 g, 90% de rendimento) . S57 (1,1 g, 3,9 mmol) é dissolvido em metanol (10 mL) e depois uma solução de hidróxido de sódio (0,3 g, 7,5 mmol) em água (10 mL) é adicionada. A mistura de reação é agitada à temperatura ambiente durante uma hora. Após o solvente ser removido, o resíduo é dissolvido em água (10 mL) e lavado com éter (2x10 mL) . A fase aquosa é acidificada com IN HC1 a um pH = 2. O produto é extraído com CH2CI2 (2x10 mL) . A remoção do solvente produz o produto S36 como um sólido branco (1,0 g, rendimento de 100%). O produto pode ser ainda purificado por recristalização.

EXEMPLO 5 - MÉTODO DE RASTREIO DE ALTO DÉBITO

Ensaios para o rastreio de moléculas pequenas biologicamente ativas têm sido desenvolvidos. Estes ensaios são baseados na religação da proteína FKBP12 a RyR.

Um método altamente eficiente para o rastreio de alto rendimento para as pequenas moléculas é desenvolvido pela imobilização de FKBP12.6 (proteína de fusão-GST) numa placa de 96 poços revestidas com glutationa. O recetor de rianodina do tipo 2 PKA-fosforilado (RyR2) é carregado na placa revestida com FKBP12.6, e incubado com análogos de JTV-519 a várias concentrações (10-100 nM) durante 30 min. Em seguida, a placa é lavada para remover o RyR2 não ligado e, em seguida, é incubada com anticorpo anti-RyR2 durante 30 min. A placa é lavada para remover o anticorpo anti-RyR2 62 não ligado, e é depois tratada com o anticorpo secundário marcado com fluorescência. A placa foi lida por um leitor de placas fluorescentes automático em termos de atividade de ligação.

Num ensaio alternativo, o RyR2 é PKA-fosforilado na presença de 32P-ATP. 0 RyR2 PKA-fosforilado radioativo é carregado numa placa de 96 poços revestida com FKBP12.6, na presença de análogos de JTV-519 a várias concentrações (10— 100 nM) durante 30 min. A placa é lavada para remover o RyR2 radiomarcado não ligado, e, em seguida, é lida por um leitor de placas automático.

EXEMPLO 6 - EFEITO DE COMPOSTOS DE ARM036 EM CORRENTES hERG

Os efeitos dos compostos da invenção em correntes hERG foram estudados utilizando células cultivadas de rim embrionário humano 293 (HEK 293), que tinham sido estavelmente tranfectadas com ADNc de hERG. As células HEK 293 não expressam hERG endógeno. As células HEK293 foram transfectadas com um plasmídeo contendo o ADNc de hERG e um gene de resistência à neomicina. Os transfectantes estáveis foram selecionadas por cultura das células na presença de G418. A pressão de seleção foi mantida pela cultura continuada na presença de G418. As células foram cultivadas em Meio Modificado Eagle Médium da Dulbecco/Nutreint Mizture F-12 (D-MEM/F-12) suplementado com soro fetal bovino a 10%, 199U/mL de penicilina G de sódio, sulfato de estreptomicina a 10 pg/mL e 500 pg/mL de G4118. As células para utilização em electrofisiologia foram cultivadas em pratos de 35 mm. 63

Os registos electrofisiológicos (usando o método de fixação de membranas de célula inteira) foram realizados à temperatura ambiente (18 °C-24 °C). Cada célula atuou como seu próprio controlo. 0 efeito de ARM0036 foi avaliado em duas concentrações: 10 e 100 μΜ. Cada concentração foi testada em pelo menos três células (n > 3) . 90 nM de Cisapiide (disponível comercialmente a partir de TOCRIS Bioscience), foi utilizado como um controlo positivo para bloqueio de hERG. Para o registo, as células foram transferidas para a câmara de registo e superfundidas com uma solução de controlo do veiculo. A solução na pipeta adesiva para registo de célula inteira continha aspartato de potássio a 130 mM, MgC12 a 5 mM, EGTA a 5 mM, ATP a 4 mM e HEPES a 10 mM. O pH foi ajustado para 7,2 com KOH. A solução da pipeta foi preparada em lotes, aliquotada e armazenada congelada. Uma alíquota fresca foi descongelada e utilizada a cada dia. As pipetas adesivas foram feitas a partir de tubos capilares de vidro utilizando um puxador de micropipeta P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Um amplificador de adesão do adesivo comercial foi usado para registo de células inteiras. Antes da digitalização, os registos atuais foram passados por filtro passa-baixo a um quinto da frequência de amostragem. 0 inicio e estado bloqueado constante da corrente hERG foi medido utilizando um padrão de impulsos com amplitudes fixas (condicionamento de pré-pulso: +20 mV durante 2 segundos; pulso de teste: _50 mV durante 2 segundos) repetidos em intervalos de 10 segundos, a partir de um potencial de manutenção de -80 mV. Corrente de pico de cauda foi medida durante o passo de 2 segundos para _50 mV. Um estado estacionário foi mantido durante pelo menos 30 segundos antes de se aplicar o composto de ensaio ou o 64 controlo positivo. A corrente de pico de cauda foi monitorizada até que um novo estado de equilíbrio fosse alcançado. As concentrações dos compostos de teste foram aplicadas cumulativamente, em ordem ascendente sem lavagem entre aplicações. A aquisição e análise dos dados foi realizada utilizando os programas de aplicativo pCLAMP (Vre. 8.2) (Axon Instruments, Union City, CA) . 0 estado estacionário foi definido pela taxa constante de limitação da mudança com o tempo (dependência de tempo linear). 0 estado estacionário antes e depois da aplicação dos compostos de teste ou controlo foi usado para calcular a percentagem de inibição de corrente para cada concentração. Os dados de concentração-resposta foram ajustados numa equação da forma:

onde [Test] é a concentração do composto de teste, a IC5o (concentração inibidora 50) é a concentração do composto do teste produzindo inibição semi-máxima, N é o coeficiente de Hill, e %Block a percentagem da corrente hERG inibida para cada concentração do composto de teste. Os ajustes quadrados não-lineares foram resolvidos com o Solver add-in para Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA). Para alguns compostos que não foi possível determinar o IC50, porque a maior concentração do composto de teste utilizada não bloqueou o canal hHRG em 50% ou mais. 65

EXEMPLO 7 - EFEITO DE VÁRIOS COMPOSTOS SOBRE CORRENTE hERG O composto da invenção foi testado em termos dos seus efeitos sobre as correntes hERG. O composto testado foi: ARM036-Na. A titulo comparativo, o efeito de JTV-519 (referido nas figuras como ARMOXX) em correntes de hERG também foi testado. Os registos eletrofisiológicos foram feitos usando o sistema de adesão paralela automático PatchXpress 7000A (Molecular Devices). Cada composto foi testado a 0,01, 0,1 e 10 mM, sendo cada concentração testada em 2 células (n> 2) . A duração da exposição a cada concentração de teste foi de 5 minutos. Outros aspetos dos protocolos experimentais foram essencialmente semelhantes aos descritos no Exemplo 6. Para ARM 036 NR não foi possível determinar o IC50, porque a maior concentração do composto de teste utilizada não bloqueou o canal hERG em 50% ou mais.

Lisboa,

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto representado pela estrutura:

para o tratamento ou prevenção de uma perturbação ou doença associada com um RyR que regula o funcionamento do canal de cálcio em células, ou para o fabrico de um medicamento para esse tratamento ou prevenção, em que a perturbação ou doença que está associada com a RyR é selecionada de entre o grupo consistindo de perturbações e doenças musculares esqueléticas, perturbações e doenças cognitivas, hipertermia maligna, diabetes e sindrome da morte súbita do lactente.

2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as perturbações e doenças musculares esqueléticas associadas ao RyR são selecionadas a partir do grupo constituído por fadiga do músculo esquelético, a fadiga do músculo esquelético induzida pelo exercício, distrofia muscular, perturbações da bexiga e incontinência.

3. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as perturbações e doenças cognitivas associadas com a RyR são selecionadas a partir do grupo consistindo de doença de Alzheimer, as formas de perda de memória, e perda de memória dependente da idade. Lisboa,