PT2163248E - Derivados da benzotiazepina enquanto inibidores de receptores de rianodina (ryr2) e respectiva utilização no tratamento de cardiopatias - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO «DERIVADOS DA BENZOTIAZEPINA ENQUANTO INIBIDORES DE RECEPTORES DE RIANODINA (RYR2) E RESPECTIVA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE CARDIOPATIAS»

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[0001] O presente pedido de patente reivindica beneficios sobre o pedido de patente U.S. de continuação em parte com o n.° de série 10/809,089, depositado a 25 de Março de 2004; que reivindica beneficios sobre o pedido de patente U.S. de continuação em parte com o n.° de série 10/763,498, depositado a 22 de Janeiro de 2004; que reivindica beneficios sobre o pedido de patente U.S. de continuação em parte com o n.° de série 10/680, 988, depositado a 7 de Outubro de 2003; que reivindica beneficios sobre o pedido de patente U.S. de continuação em parte com o n.° de série 10/608,723, depositado a 26 de Junho de 2003; que reivindica beneficios sobre o pedido de patente U.S. de continuação em parte com o n.° de série 10/288,606, depositado a 5 de Novembro de 2002; que reivindica beneficios sobre o pedido de patente U.S. de continuação em parte com o n.° de série 09/568,474, depositado a 10 de Maio de 2000, que corresponde aqora à Patente U.S. 6,489,125 Bl, emitida a 3 de Dezembro de 2002.

DECLARAÇÃO DE INTERESSE GOVERNAMENTAL

[0002] Esta invenção foi concretizada com apoio do Governo nos termos da subvenção NIH n.° POl HL 67849-01. Como tal, o Governo dos Estados Unidos detém alguns direitos sobre esta invenção. 1

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Apesar dos avanços terapêuticos, a insuficiência cardíaca congestiva permanece como uma importante causa de mortalidade nos países ocidentais. A insuficiência cardíaca afecta 5 milhões de indivíduos apenas nos Estados Unidos e é caracterizada por uma taxa de mortalidade a 5 anos > 50% (Levy et al., Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. N. Engl. J. Med., 347:1397-402, 2002) .

[0004] Uma importante característica da insuficiência cardíaca é a redução da contractilidade miocárdica (Gwathmey et al., Abnormal intracellular calcium handling in myocardium from patients with end-stage heart failure. Circ. Res., 61:70-76, 1987). No músculo cardíaco saudável e outros músculos estriados, os canais de libertação de cálcio situados no retículo sarcoplasmático (RS), incluindo os receptores de rianodina (RyRs), facilita o acoplamento de um potencial de acção à contracção de uma célula muscular (i.e., acoplamento excitação-contracção (EC)) . A contracção inicia-se quando é libertado cálcio (Ca2+) pelo RS para o citoplasma circundante. Na insuficiência cardíaca, as anomalias contrácteis derivam, em parte, de alterações na cascata de sinalização que permite ao potencial de acção cardíaco (PA) iniciar a contracção. Em particular, em corações com insuficiência, a amplitude do transiente de Ca2+ da célula inteira é reduzida (Beuckelmann et al., Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circ., 85:1046-55, 1992; Gomez et al. , Defective excitation-contraction coupling in experimental cardiac hypertrophy and heart failure. Science, 276:800-06, 1997) e a duração é prolongada (Beuckelmann et al., 2

Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circ., 85:1046-55, 1992).

[0005] A arritmia cardiaca, uma caracteristica comum da insuficiência cardiaca, é reconhecida como estando associada a fugas de Ca2+ RS em corações estruturalmente normais. Nestes casos, o mecanismo mais corrente para a indução e manutenção da taquicardia ventricular corresponde à automaticidade anómala. Uma forma de automaticidade anómala, conhecida como arritmia induzida, está associada a uma libertação anómala de Ca2+ RS, dando origem a eventos de pós-despolarização ou DAD (Fozzard, H.A., After depolarizations and triggered activity. Basic Res. Cardiol., 87:105-13, 1992; Wit and Rosen, Pathophysiologic mechanisms of cardiac arrhythmias. Am. Heart J., 106:798-811, 1983) . As DAD correspondem a despolarizações anormais em cardiomiócitos que ocorrem após a repolarização de um potencial de acção cardíaco. A base molecular para a libertação anómala de Ca2+ RS obtida nos DAD não foi ainda totalmente esclarecida. Sabe-se, contudo, que os DAD são bloqueados pela rianodina, o que evidencia que o RyR2 pode desempenhar um importante papel na patogénese desta libertação anómala de Ca2+ (Marban et al., Mechanisms of arrhythmogenic delayed and early afterdepolarizations in ferret ventricular muscle. J. Clin. Invest., 78:1185-92, 1986; Song and Belardinelli, ATP promotes development of after depolarizations and triggered activity in cardiac myocytes. Am. J. Physiol., 267:H2005-11, 1994).

[0006] A forma mais comum de arritmia cardíaca em humanos é a fibrilação auricular (FA). Esta representa uma das principais causas de morbilidade e mortalidade (Chugh et ai., Epidemiology and natural history of atrial 3 fibrillation: clinicai implications. J. Am. Coll. Cardiol., 37:371-78, 2001; Falk, R.H., Atrial fibrillation. N. Engl. J. Med., 344:1067-78, 2001). Contudo, apesar da sua relevância clínica, as opções de tratamento para a FA têm sido limitadas - devido, em parte, ao facto de os seus mecanismos moleculares subjacentes serem fracamente compreendidos.

[0007] Apr oximadamente 50% de todos os doentes com cardiopatias morrem de arritmias cardíacas fatais. Tais arritmias cardíacas fatais são, regularmente, de natureza ventricular. Em alguns casos, uma arritmia ventricular cardíaca pode ser rapidamente fatal - um fenómeno designado por "morte súbita cardíaca" (MSC). As arritmias ventriculares fatais (e MSC) podem também ocorrer em indivíduos jovens, de outro modo saudáveis, que não se sabem sofrer de cardiopatia estrutural. Na verdade, a arritmia ventricular é a causa mais comum de morte súbita em indivíduos de outro modo saudáveis.

[0008] A taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) é uma perturbação hereditária que ocorre em indivíduos com corações estruturalmente normais. Caracteriza-se pela taquicardia ventricular induzida pelo stress - uma arritmia letal que pode causar MSC. Em sujeitos com TVPC, são as taquicardias ventriculares polimórficas e/ou induzidas pelo esforço físico e/ou stress que conduzem à MSC na ausência de cardiopatia estrutural detectável (Laitinen et al., Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:485-90, 2001; Leenhardt et al., Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children: a 7-year follow-up of 21 patients. Circulation, 91:1512-19, 1995; Priori et al., Clinicai and 4 molecular characterization of patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 106:69-74, 2002; Priori et al., Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:196-200, 2001; Swan et al., Arrhythmic disorder mapped to chromosome Iq42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts. J. Am. Coll. Cardiol., 34:2035-42, 1999).

[0009] A TVPC é predominantemente herdada de forma autossómica dominante. Os indivíduos com TVPC têm arritmias ventriculares quando sujeitos a esforço físico, não as desenvolvendo quando se encontram em repouso. Foram identificadas mutações em estudos de ligação e sequenciação directa a nível do gene humano RyR2, no cromossoma lq42-q43, em indivíduos com TVPC (Laitinen et ai., Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:485-90, 2001; Priori et al., Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103:196-200, 2001; Swan et ai., Arrhythmic disorder mapped to chromosome Iq42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts. J. Am. Coll. Cardiol., 34:2035-42, 1999).

[0010] Existem três tipos de receptores de rianodina, correspondendo todos eles a canais de Ca2+ altamente relacionados. O RyRl é encontrado no músculo-esquelético, o RyR2 é encontrado no coração e o RyR3 encontra-se localizado no cérebro. 0 receptor de rianodina de tipo 2 (RyR2) é o principal canal de libertação de Ca2+ necessário 5 ao acoplamento EC e à contracção muscular a nível do músculo cardíaco estriado.

[0011] Os canais de RyR2 encontram-se compactados em densas matrizes localizadas em regiões especializadas do RS que libertam reservas intracelulares de Ca2+ e, desse modo, desencadeiam a contracção muscular (Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281:818-21, 1998). Durante o acoplamento EC, a despolarização da membrana celular do músculo cardíaco, na fase zero da PA, activa canais de Ca2+ voltaico-dependentes. O influxo de Ca2+ através destes canais inicia, por sua vez, a libertação de Ca2+ do RS através do RyR2 num processo conhecido como libertação de Ca2+ induzida pelo Ca2+ (Fabiato, A., Calcium-induced release of calcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum. Am. J. Physiol., 245:C1-C14, 1983; Nabauer et al., Regulation of calcium release is gated by calcium current, not gating charge, in cardiac myocytes. Science, 244:800-03, 1989) . A libertação de Ca2+ induzida pelo Ca2+ mediada pelo RyR2 activa, então, as proteínas contrácteis responsáveis pela contracção do músculo cardíaco.

[0012] 0 RyR2 é um complexo proteico composto por quarto polipéptidos RyR2 com 565.000 daltons associados a quatro proteínas de ligação FK506 com 12.000 daltons (FKBP), especificamente, FKBP12.6 (calestabina). As FKBP são peptidilprolil isomerases cis-trans amplamente expressas e servem uma diversidade de funções celulares (Marks, A.R., Cellular functions of immunophilins. Physiol. Rev., 76:631-49, 1996). As proteínas FKBP12 encontram-se estreitamente associadas ao receptor esquelético de rianodina RyRl, controlando o seu funcionamento (Brillantes et al., Stabilization of calcium release 6 channel (ryanodine receptor), function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994; Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992); ao receptor cardíaco de rianodina, RyR2 (Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78:990-97, 1996); a um canal de libertação intracelular de Ca2+ relacionado, conhecido como o receptor 1,4,5-trifosfato de inositol de tipo 1 (IP3R1) (Cameron et al., FKBP12 binds the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor at leucine-proline (1400-1401) and anchors calcineurin to this FK506-like domain. J. Biol. Chem., 272:27582-88, 1997) e ao

receptor do factor de crescimento transformador β de tipo 1 (ΊΌΓβ) (Chen et al., Mechanism of TGFbeta receptor inhibition by FKBP12. EMBO J., 16:3866-76, 1997). A FKBP12.6 vincula-se ao canal de RyR2 (uma molécula por subunidade de RyR2), estabiliza o funcionamento do canal de RyR2 (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994) e facilita a modulação do acoplamento entre canais adjacentes de RyR2 (Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281:818-21, 1998), prevenindo, desse modo, a activação anormal do canal durante a fase de repouso do ciclo cardíaco.

[0013] É evidente que a existência de fugas em canais de RyR2 se encontra associada a uma série de estados patológicos - tanto em corações doentes como em corações estruturalmente normais. Como tal, os métodos de reparação de fugas a nível do RyR2 podem tratar ou prevenir a 7 insuficiência cardíaca, arritmias cardíacas e a morte súbita cardíaca em milhões de doentes.

[0014] 0 derivado da 1,4-benzotiazepina, JTV-519 ou monocloridrato de 4-[3-(4-benzilpiperidin-l-il)propionil]-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina (também conhecido como k201 ou ICP-Calstan 100) é um modulador de canais iónicos de cálcio. Para além de regular os níveis de Ca2+ em células miocárdicas, o JTV-519 também modula as correntes de Na+ e rect if icadores de influxo de K+ em células ventriculares e inibe a corrente de rectificadores tardios de K+ em células auriculares de cobaias. Os estudos têm demonstrado que o JTV-519 tem um forte efeito cardioprotector contra a lesão miocárdica induzida por catecolaminas, a sobre-contracção miofibrilar induzida pela lesão miocárdica e a lesão por reperfusão/isquémica. Em modelos experimentais de sobre-contracção miofibrilar, o JTV-519 demonstrou um maior efeito cardioprotector que o propranolol, o verapamil e o diltiazem. Os dados experimentais sugerem também que o JTV-519 previne eficazmente a isquemia/reperfusão ventricular através da redução da sobrecarga intracelular de Ca2+ em modelos animais.

[0015] A patente US 2004/0048780 e Ann. N. Y. Acad. Sei 1015: 144-159 (2004) divulgam já descrições sobre a actividade do JTV-519 sobre o RyR2 e, desse modo, a sua utilização no tratamento da insuficiência cardíaca e arritmias ventriculares.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0016] A presente invenção baseia-se na descoberta surpreendente de que o RyR2 é um alvo para tratar ou 8 prevenir a insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas, incluindo fibrilação auricular, arritmias ventriculares e arritmias cardíacas induzidas por exercício físico. Conforme aqui descrito, os inventores produziram canais de RyR2 mutantes com 7 mutações CPVT diferentes e estudaram as suas funções. Todos os 7 mutantes apresentaram defeitos que resultaram em canais não estanques (fuga de cálcio) quando estimulados durante o exercício. 0 estudo dos inventores é o primeiro a identificar um mecanismo pelo qual a fuga de cálcio RS causa DAD. Significativamente, o defeito nos canais TVPC mutantes fizeram os canais assemelharem-se a canais com fuga nos corações de doentes com insuficiência cardíaca terminal - um distúrbio caracterizado por uma elevada incidência de arritmias cardíacas fatais. Deste modo, os inventores demonstraram que o mecanismo da TV na TVPC é o mesmo mecanismo da TV na insuficiência cardíaca.

[0017] Os inventores também revelam aqui que o JTV-519 (k201 ou ICP-Calstan 100) e outros derivados inovadores da 1,4-benzotiazepina reparam a fuga nos canais RyR2. Tal como os inventores demonstraram, o JTV-519 e derivados associados melhoram a capacidade de ligação do FKBP12.6 ao RyR2 fosforilado pela PKA e ao RyR2s mutante que de outro modo têm uma afinidade reduzida ou não se ligam à FKBP 12.6. Esta acção resolve a fuga a nível do RyR2 que desencadeia arritmias ventriculares cardíacas fatais (morte súbita cardíaca (MSC)) e contribui para a fibrilação auricular/ventricular e disfunção do músculo cardíaco na insuficiência cardíaca.

[0018] Assim, num aspecto da presente invenção, esta fornece o composto de acordo com a reivindicação 1. 9 [0019] Noutro aspecto da presente invenção, esta fornece uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6.

[0020] Ainda noutro aspecto da presente invenção, esta fornece a composição ou utilização de qualquer uma das reivindicações 7 a 11.

[0021] Aspectos adicionais da presente invenção serão evidentes a partir da descrição que se segue.

[0022] Observação: o JTV-519 deve ser considerado como um exemplo de referência na divulgação que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] A FIG. 1 demonstra que o JTV-519 previne arritmias ventriculares induzidas pelo exercício físico em ratos FKBP 12.6+/-. (A) Electrocardiogramas em ambulatório representativos de um rato FKBP12.6+/- não tratado, um rato FKBP12.6+/- tratado com JTV-519 e um rato FKBP12.6-/- tratado com JTV-519. Não existem diferenças significativas a nível da frequência cardíaca ou em qualquer outro dos parâmetros ECG avaliados. (B) traçado superior: Exemplo de taquicardia ventricular polimórfica permanente registado num rato FKBP12.6+/- não tratado submetido a testes de exercício físico e à injecção de 1,0 mg/kg de epinefrina; traçado central: Electrocardiograma de um rato FKBP12.6+/-tratado com JTV-519 após o mesmo protocolo; não foram detectadas arritmias; traçado inferior: Taquicardia ventricular (TV) induzida pelo exercício físico num rato FKBP12.6-/- tratado com JTV-519. As linhas a tracejado ilustram 16,31 segundos de TV que não se encontram apresentados na figura. 'P' representa uma onda P, sendo 10 esta indicativa de ritmo sinusal após a taquicardia ventricular. (C) Gráfico de barras que apresenta a quantificação de mortes súbitas cardíacas (esquerda), taquicardias ventriculares permanentes (>10 batimentos, centro) e não permanentes (3-10 batimentos anormais, direita) em ratos FKBP12.6+/- e FKBP12.6-/- com e sem tratamento com JTV-519, respectivamente. Deve notar-se que o tratamento com JTV-519 preveniu completamente a ocorrência de arritmias induzidas pelo exercício físico e pela epinefrina em ratos FKBP12.6+/- tratados com JTV-519 (n = 9), quando comparados com ratos FKBP12.6+/- (n = 10) não tratados ou FKBP12.6-/- (n = 5) tratados com JTV-519, sugerindo que o JTV-519 previne arritmias e a morte súbita em ratos FKBP12.6+/- através da recuperação da ligação da FKBP12.6 ao RyR2.

[0024] A FIG. 2 demonstra que o JTV-519 previne a morte súbita cardíaca (MSC) induzida pelo exercício físico através do incremento da afinidade da FKBP12.6 para o RyR2 em ratos FKBP12.6+/-. (A-B) Receptores cardíacos de rianodina (RyR2) imunoprecipitados com o anticorpo RyR2-5029. São apresentados ensaios imunoenzimáticos (A) e gráficos de barras (B) representativos das quantidades calculadas de RyR2, RyR2 fosforilado pela PKA (anticorpo RyR2-pSer2809) e FKBP12.6 em ratos de tipo selvagem (FKBP12.6 + / + ) , FKBP12.6 + /- e FKBP12.6-/- em condições de repouso e após exercício físico, quer na ausência como na presença de JTV-519, respectivamente. Em condições de repouso, D70% da FKBP12.6 está associada ao RyR2 nos ratos FKBP12.6+/-. Após os testes de exercício físico, a quantidade de FKBP12.6 associada ao complexo RyR2 foi drasticamente reduzida nos ratos FKBP12.6+/-, contudo, estes puderam ainda ser salvos através de tratamento com JTV-519. (C) Canais individuais de RyR2 isolados de 11 corações obtidos após a execução de testes de exercício físico e injecção de epinefrina. São apresentados canais de ratos FKBP12.6+/- com e sem pré-tratamento com JTV-519 e canais de ratos FKBP12.6-/- após pré-tratamento com JTV-519. Deve notar-se que a função do canal de RyR2 foi normalizada nos ratos FKBP12.6+/- submetidos a exercício físico tratados com JTV-519. 0 canal individual representativo de um rato FKBP12.6-/- após tratamento com JTV-519 demonstra que a FKBP12.6 cardíaca é necessária à acção do JTV-519. As linhas a tracejado representam aberturas incompletas de canais, ou de "sub-condutância" e são indicativas de canais de RyR2 esgotados de FKBP12.6. Os traçados à esquerda representam 5,0 Seg., enquanto que os traçados à direita representam 500 mseg. Na figura, Po = probabilidade de abertura; To = período médio de abertura; Tc = período médio de encerramento e c = estado de encerramento do canal. (D) Gráfico de barras com a síntese da probabilidade média de abertura dos canais individuais de RyR2 (ver acima). O JTV-519 reduz drasticamente a probabilidade de abertura do RyR2 dos ratos FKBP12.6+/-após submissão a testes de exercício físico em concentrações de cálcio diastólicas (150 nM).

[0025] A FIG. 3 demonstra que o JTV-519 normaliza o bloqueio do canal de RyR2 através do incremento da afinidade de ligação da FKBP12.6 aos canais de RyR2 fosforilados pela PKA. (A, B) Foram preparadas membranas RS cardíacas caninas (A) e canais de RyR2 de expressão recombinante (B) de acordo com a descrição precedente (Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca (2+)-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78:990-97, 1996). (A) Receptores de rianodina (RyR2) fosforilados pela subunidade catalítica de PKA (40 U; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), na presença ou 12 ausência do inibidor de PKA, PKI5-24, em tampão de fosforilação (MgC12 8 mM, EGTA 10 mM e Tris/PIPES 50 mM; pH 6,8) .

As amostras foram centrifugadas a lOO.OOOx g durante 10 min e lavadas três vezes em tampão de imidazol (imidazol 10 mM; pH 7). Foi adicionada FKBP12.6 de expressão recombinante (concentração final = 250 nM) às amostras, na ausência ou presença de diferentes concentrações de JTV-519. Após uma incubação de 60 min, as amostras foram centrifugadas a lOO.OOOx g durante 10 min e lavadas duas vezes em tampão de imidazol. As amostras foram aquecidas a 95°C e fraccionadas por tamanho através de SDS-PAGE. Foram realizados ensaios imunoenzimáticos para os microssomas RS, de acordo com a descrição precedente (Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992), com anticorpos anti-FKBPl2.6 (1:1.000) e anti-RyR2-5029 (1:3.000). A figura demonstra que o JTV-519 possibilita que a FKBP12.6 estabeleça ligação com: (A) RyR2 fosforilado pela PKA (ligação parcial a 100 nM; ligação completa a 1000 nM) ou (B) canais mutantes de RyR2-S2809D, que correspondem, constitutivamente, a canais de RyR2 fosforilados pela PKA. (C-E) Estudos de canal individual que apresentam uma probabilidade de abertura acrescida do RyR2 após fosforilação pela PKA (D) face à fosforilação pela PKA na presença do inibidor especifico de PKA, PKI5-24 (C). A função de canal único foi normalizada no RyR2 fosforilado pela PKA incubado com FKBP12.6 na presença do JTV-519 (E). As aberturas de canal encontram-se no topo, o traço indica o nível de aberturas completas (4 pA) e a letra ' c' ilustra o estado de encerramento. Os canais são apresentados em escalas temporais compactadas (5 Seg., traçado superior) e expandidas (500 mseg, traçado inferior), encontrando-se os registos a 0 mV. Os 13 histogramas de amplitude (direita) revelam um incremento da actividade e das aberturas de sub-condutância no RyR2 fosforilado pela PKA, contudo, tal não ocorreu após tratamento com JTV-519 e FKBP12.6. (F) Gráfico normalizado da probabilidade de abertura enquanto função do [Ca2+] citosólico. A incubação do RyR2 fosforilado pela PKA com FKBP12.6 na presença de JTV-519 deslocou a activação do RyR2 dependente do Ca2+ para a direita, tornando-a semelhante à dependência de Ca2+ dos canais não fosforilados.

[0026] A FIG. 4 demonstra que o JTV-519 aumenta a contractilidade cardíaca num modelo murino de insuficiência cardíaca. (A) A secção transversal diastólica do miocárdio foi determinada a níveis papilares médios através de ecocardiografia, antes e depois de um tratamento de 4 semanas com JTV-519 ou veículo (controlo). 0 aumento relativo da disfunção diastólica foi inibido pelo JTV-519. (B) Apesar da função sistólica se ter deteriorado em animais não tratados, o JTV-519 aumentou significativamente a função diastólica em ratos com insuficiência cardíaca após enfarte do miocárdio (EM).

[0027] A FIG. 5 demonstra que o JTV-519 aumenta a afinidade da calestabina2 (FKBP12.6) para o RyR2 em ratos com insuficiência cardíaca. Foram imunoprecipitadas quantidades equivalentes do RyR2 com o anticorpo anti-RyR2 (A) . Os ensaios imunoenzimáticos (A) e gráficos de barras (B) representados apresentam a quantidade de RyR2 fosforilada pela PKA em Ser2809 (B, esquerda) e a quantidade de calestabina2 (FKBP12.6) (B, direita) ligada ao RyR2 nos diferentes grupos experimentais. Na insuficiência cardíaca, o RyR2 encontra-se significativamente hiperfosforilado pela PKA (B, esquerda), conduzindo à dissociação da calestabina2 14

(FKBP12.6) do complexo de canais (B, direita). 0 tratamento com JTV-519 resultou na normalização de ambos os estados de fosforilação pela PKA do RyR2, assim como a ligação de FKBP12.6 ao RyR2. 0 número de experiências é indicado nas barras. *P<0,05, FC vs. simulação; #P<0,05, FC+JTV-519 vs. FC

[0028] A FIG. 6 ilustra que o JTV-519 normaliza o bloqueio de canais de RyR2 em corações com insuficiência. Os canais de RyR2 foram isolados de ratos de operacionalização simulada (simulação) ou com insuficiência cardíaca (IC). Os traçados representativos de canais individuais demonstram que a probabilidade de abertura do canal de RyR2 (Po) foi significativamente elevada em corações com insuficiência (centro) face à dos ratos de operacionalização simulada (topo). 0 tratamento de ratos com insuficiência cardíaca com JTV-519 durante 4 semanas normalizou a probabilidade de abertura dos canais a níveis semelhantes aos correspondentes a animais de operacionalização simulada. O traçado superior representa, para cada condição, 5000 ms e o inferior 200 ms. As aberturas de canal encontram-se no topo, o traço indica o nível completo de abertura (4 pA) e ' c' indica o estado de encerramento dos canais. Os histogramas de amplitude (direita) revelam um incremento da Po e das aberturas de sub-condutância em canais de RyR2 de corações com insuficiência.

[0029] A FIG. 7 demonstra que o JTV-519 normaliza o bloqueio do canal de RyR2 através do aumento das ligações entre a FKBP12.6 (calestabina2) aos canais de RyR2. (A) Os canais de RyR2 de tipo selvagem (RyR2-TS) foram fosforilados pela PKA na ausência ou presença do inibidor de PKA específico PKA15-24 e incubados com calestabina2 (FKBP12.6) na presença de JTV-519 às concentrações 15 indicadas. 0 ensaio imunoenzimático do RyR2 apresenta quantidades idênticas de RyR2 nas amostras; o ensaio imunoenzimático da calestabina2 mostra que o JTV-519 permite a recuperação parcial (100 nM) ou completa (1000 nM) da ligação entre a calestabina2 e o RyR2 fosforilado pela PKA. (B) O RyR2-S2809D, que mimetiza constitutivamente o RyR2 fosforilado pela PKA, foi incubado com calestabina2 na presença de JTV-519 às concentrações indicadas. O ensaio imunoenzimático do RyR2 apresenta quantidades idênticas de RyR2 nas amostras; o ensaio imunoenzimático da calestabina2 mostra que o JTV-519 permite a recuperação parcial (100 nM) ou completa (1000 nM) da ligação entre a calestabina2 e o RyR2-S2809D. (C) As curvas de ligação da calestabina2 marcada com [35S] mostram que o JTV-519 aumenta a afinidade de ligação da calestabina2 ao RyR2 fosforilado pela PKA e a canais mutantes de RyR2-S2809D a um nível comparável ao do RyR2-TS não fosforilado. (D-F) Os estudos de canal individual mostram que o JTV-519 (1 PM) reduz a probabilidade de abertura (Po) do RyR2-TS fosforilado pela PKA através do restabelecimento da ligação da calestabian2 a 150 nM [Ca2+] (n=ll para D; n=12 para E; n=13 para F) . As aberturas de canal encontram-se no topo, o traço indica o nível completo de abertura (4 pA) e 'c' indica o estado de encerramento dos canais. Os histogramas de amplitude (direita) revelam um incremento da Po e das aberturas de sub-condutância no RyR2 fosforilado pela PKA; tal não foi observado após o tratamento com JTV-519 (1 PM) e calestabina2 (FKBP12.6).

[0030] A FIG. 8 ilustra o complexo macromolecular de RyR2 em tecido auricular. (A) O RyR2 foi imunoprecipitado a partir do retículo sarcoplasmático (RS) auricular e fosforilado com PKA ou monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) . A adição do inibidor de PKA (PKI) bloqueou 16 completamente a reacção de fosforilação. (B) Os componentes do complexo macromolecular de RyR2 foram co-imunoprecipitados com RyR2 do RS auricular. 0 controlo positivo correspondeu ao RS auricular (com um input de imunoprecipitação de 50% (IP)). O controlo negativo representa amostras imunoprecipitadas com o anticorpo bloqueado com o péptido antigénico. (C) A calestabina2 (FKBP12.6) foi co-imunoprecipitada com RyR2 do RS auricular. Antes do fraccionamento por tamanho através de SDS-PAGE, as amostras foram fosforiladas pela PKA, com e sem a presença de PKI. A fosforilação pela PKA causou a dissociação da calestabina2 (FKBP12.6) do complexo de canais, de uma forma inibida pelo PKI. +Cont. (CRS) = RS auricular; + Cont. (FKBP) = FKBP recombinante; -Cont. = IP realizada com um anticorpo pré-absorvido com péptido antigénico.

[0031] A FIG. 9 ilustra a hiperfosforilação pela PKA do RyR2 na fibrilação auricular (FA). (A) O RyR2 imunoprecipitado (IP) de animais de controlo (Controlo; n=6) e cães com fibrilação auricular (Fib A; n=6) foi fosforilado com PKA. Para as experiências de retro-fosforilação, foi realizado um ensaio imunoenzimático para o RyR2 em paralelo, de modo a determinar a quantidade de proteína RyR2 imunoprecipitada em cada amostra. O gráfico de barras à esquerda representa uma quantificação dos estudos de retro-fosforilação. Os valores representam os níveis relativos de fosforilação pela PKA do RyR2, ajustados de acordo com a quantidade de proteína imunoprecipitada. Os humanos com FA apresentaram um incremento de 130% na fosforilação pela PKA em relação aos controlos (n=6 para a Fib A; n=6 para o Controlo; P=0,001). A calestabina2 (FKBP12.6) foi co-imunoprecipitada com RyR2. Para a experiências de co-imunoprecipitação, foi realizado 17 um ensaio imunoenzimático em paralelo, de modo a determinar a quantidade de proteína RyR2 imunoprecipitada em cada amostra. 0 gráfico de barras à direita representa uma quantificação das experiências de co-imunoprecipitação. Os valores representam a quantidade de calestabina2 (FKBP12.6) co-imunoprecipitada com o R.yR.2, ajustada à quantidade de proteína imunoprecipitada. A ligação da calestabina2 (FKBP12.6) ao RyR.2 apresentou uma redução de 72% em cães com FA em relação aos controlos (n = 6 para os controlos; n = 7 para a FA; P<0,0005) . (B) Foi realizada uma série experimental idêntica com utilização de tecido auricular humano de doentes com fibrilação auricular durante o estabelecimento da insuficiência cardíaca (Fib A; n=5) e tecido auricular de doentes com corações normais (Controlo; n=3). 0 gráfico de barras à esquerda representa uma quantificação dos estudos de retro-fosforilação. Os humanos com FA apresentaram um incremento de 112% na fosforilação pela PKA em relação aos controlos (n=5 para a Fib A; n=3 para o Controlo; P=0,002). 0 gráfico de barras à direita representa os resultados das experiências de co-imunoprecipitação para a calestabina2 (FKBP12.6). Os humanos com FA apresentaram uma redução de 7 0% da quantidade de calestabina2 (FKBP12.6) ligada ao R.yR.2 (n=5 para a Fib A; n=3 para os Controlos; P<0,0001).

[0032] A FIG. 10 ilustra o funcionamento anómalo do canal de RyR2 na FA. (A) Os traçados superiores mostram canais de RyR2 representativos do aurículo esquerdo dos controlos; os traçados inferiores correspondem a canais de FA. À direita dos traçados encontram-se os histogramas de amplitude de corrente correspondentes. (B) Os gráficos de barras mostram a quantificação da probabilidade (Po) e frequência (Fo) de abertura para cães de controlo (Cont.) e cães com fibrilação auricular crónica (Fib A). Foram estudados 17 18 canais de 5 cães com Fib A e 11 canais de cães de controlo. Os canais dos cães de controlo não demonstraram um incremento de actividade. Em contraste, 15 dos 17 canais (88%) dos cães com Fib A apresentaram uma elevação significativa da probabilidade de abertura (FA: 0,39 _ 0,07; controlo: 0,009 _ 0,002; P<0,001) e da frequência de bloqueio (FA: 21,9 _ 4,6 s-1; controlo: 1,6 _ 0,6 s-1; P<0,002) .

[0033] A FIG. 11 demonstra que o tratamento com JTV-519 restaura o funcionamento normal do RyR2 na FA. (A) Os traçados representativos de canais individuais de RyR2 de corações caninos, a uma concentração de Ca2+ citosólico de 150 nM (tal como ocorre durante a diástole) e na presença de calestabina2 a 0,25 mM (FKBP12.6), demonstram um incremento significativo da probabilidade (Po) de abertura e frequência de bloqueio após fosforilação pela PKA (controlo: Po = 0,3 _ 0,2 %, n=6; PKA: Po=14,8 _ 3,2 %, n = 7; P<0,001) . Tal como observado a uma resolução temporal superior a nível do traçado inferior, assim como no histograma global, a fosforilação pela PKA do RyR2 resulta em aberturas parciais (estados de sub-condutância) que se tornam observáveis quando a calestabina2 (FKBP12.6) é dissociada do RyR2. O JTV-519 (1,0 mM) restabeleceu a actividade dos canais de RyR2 fosforilado pela PKA (Po=0,8 _ 0,3%; n=6; P<0,001) quando comparado com o RyR2 tratado com PKA; o JTV-519 também se traduziu numa distribuição discreta da amplitude de corrente a nível do histograma, tal como observado para os canais de controlo não fosforilados. Os traçados superior e inferior representam, respectivamente, 5000 mseg e 200 mseg; o estado de encerramento é indicado por 'c'; as aberturas completas de canal são apresentadas como deflexões ascendentes para o nível 4 pA, tal como indicado pelas barras; as linhas a 19 tracejado indicam etapas de 1 pA para aberturas parciais. (B) A calestabina2 recombinante (FKBP12.6) foi incubada com RyR2 fosforilado pela PKA, com ou sem a presença do derivado 1,4-benzotiazepina, JTV-519. 0 ensaio imunoenzimático com o anticorpo anti-calestabina2 revelou que o JTV-519 permitiu a ligação entre a calestabina2 recombinante (FKBP12.6) e o RyR2 fosforilado pela PKA. Na ausência do JTV-519, não ocorreu qualquer ligação de calestabina2.

[0034] A FIG. 12 demonstra que os derivados inovadores da 1,4-benzotiazepina induzem a ligação da calestabina2 (FKBP12.6) ao receptor cardíaco de rianodina fosforilado pela PKA (RyR2) a 0,5 nM; painel superior = 2,0 nM de cada composto; painel inferior = 0,5 nM de cada composto.

[0035] A FIG. 13 mostra que o derivado da 1,4-benzotiazepina, S36 (descrito na FIG. 15), previne a ocorrência de arritmias cardíacas em ratos a 200 nM. Os gráficos de barras ilustram eventos arrítmicos ou morte súbita cardíaca durante a execução de testes de exercício em ratos FKBP12.6+/- - com ou sem tratamento farmacológico, conforme indicado. O gráfico à esquerda ilustra a morte súbita cardíaca; o gráfico central ilustra a TV permanente e o gráfico à direita ilustra a TV não permanente. Os dígitos referem-se ao número total de animais utilizados em cada grupo.

[0036] A FIG. 14 demonstra que o JTV-519 aumenta a contractilidade num modelo murino de insuficiência cardíaca. 20 [0037] A FIG. 15 apresenta as estruturas dos derivados. S4, S7, S20, S24, S25, S26 e S27 devem ser considerados como exemplos de referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038] A fosforilação do RyR2 cardíaco pela proteína cinase (PKA) é uma importante parte da resposta de "luta ou fuga"; esta aumenta o benefício de acoplamento cardíaco EC através do aumento da quantidade de Ca2+ libertada por um determinado desencadeador (Marks, A.R., Cardiac intracellular calcium release channels: role in heart failure. Circ. Res., 87:8-11, 2000). Esta via de sinalização faculta um mecanismo através do qual a activação do sistema nervoso simpático, como resposta ao stress, resulta na elevação do débito cardíaco necessária à satisfação dos requerimentos deste tipo de respostas. Após ligação às catecolaminas, os receptores adrenérgicos βΐ e β2 activam a adenilato ciclase através de uma proteína G estimulante, Gas. A adenilato ciclase aumenta os níveis intracelulares de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) responsáveis pela activação da PKA dependente do cAMP. A fosforilação pela PKA do RyR2 aumenta a probabilidade de abertura do canal através da dissociação da calestabina2 (FKBP12.6) do complexo de canais. Tal, por sua vez, aumenta a sensibilidade do RyR2 para a activação dependente do Ca2+ (Hain et al., Phosphorylation modulates the function of the calcium release channel of sarcoplasmic reticulum from cardiac muscle. J. Biol. Chem., 270:2074-81, 1995; Valdivia et al. , Rapid adaptation of cardiac ryanodine receptors: modulation by Mg2+ and phosphorylation. Science, 267:1997-2000, 1995; Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine 21 receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000).

[0039] Os coraçoes com insuficiência {e.g., em doentes com insuficiência cardiaca e modelos animais de insuficiência cardíaca) são caracterizados por uma resposta inadequada que inclui a estimulação hiperadrenérgica crónica (Bristow et al., Decreased catecholamine sensitivity and beta-adrenergic-receptor density in failing human hearts. N. Engl. J. Med., 307:205-11, 1982). O significado patogénico desta estimulação sobre a insuficiência cardíaca é suportado por estratégias terapêuticas que reduzem a estimulação β-adrenérgica e a tensão da parede miocárdica ventricular esquerda, invertendo poderosamente a remodelação ventricular inversa (Barbone et al., Comparison of right and left ventricular responses to left ventricular assist device support in patients with severe heart failure: a primary role of mechanical unloading underlying reverse remodeling. Circulation, 104:670-75,2001; Eichhorn and Bristow, Medicai therapy can improve the biological properties of the chronically failing heart. A new era in the treatment of heart failure. Circulation, 94:2285-96, 1996). Na insuficiência cardíaca, a estimulação β-adrenérgica crónica encontra-se associada à activação dos receptores β-adrenérgicos cardíacos, o que, apesar a ligação a proteínas G, activa a adenilato ciclase e, dessa forma, eleva a concentração intracelular de cAMP. O cAMP activa a PKA dependente do cAMP, que se sabe induzir a hiperfosforilação do RyR2. Por conseguinte, a insuficiência cardíaca crónica é um estado hiperadrenérgico (Chidsey et al., Augmentation of plasma norepinephrine response to exercise in patients with congestive heart failure. N. Engl. J. Med., 267:650, 1962) que se traduz em várias consequências patológicas, que incluem a hiperfosforilação 22 pela PKA do RyR2 (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000).

[0040] A hiperfosforilação pela PKA do RyR2 foi proposta como um factor que contribui para a redução da função contráctil e arritmogénese no coração com insuficiência (Marks et al., Progression of heart failure: is protein kinase a hyperphosphorylation of the ryanodine receptor a contributing factor? Circulation, 105:272-75, 2002; Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000).

Em consonância com esta hipótese, foi demonstrada, in vivo, a hiperf osf orilação do RyR2 pela PKA em corações com insuficiência, tanto em modelos animais como em doentes com insuficiência submetidos a transplante cardíaco (Antos et al., Dilated cardiomyopathy and sudden death resulting from constitutive activation of protein kinase A. Circ. Res., 89:997-1004, 2001; Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000; Ono et al., Altered interaction of FKBP12.6 with ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+ release in heart failure. Cardiovasc. Res., 48:323-31, 2000; Reiken et al., Beta-adrenergic receptor blockers restore cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) structure and function in heart failure. Circulation, 104:2843-48, 2001; Semsarian et al., The L-type calcium channel inhibitor diltiazem prevents cardiomyopathy in a mouse model. J. Clin. Invest., 109:1013-20, 2002; Yano et al., Altered stoichiometry of 23 FKBP12.6 versus ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+ leak through ryanodine receptor in heart failure. Circulation, 102:2131-36, 2000).

[0041] Nos corações com insuficiência, a hiperfosforilação do RyR2 pela PKA induz a dissociação da subunidade reguladora de FKBP12.6 do canal de RyR2 (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000). Esta provoca alterações significativas a nível das propriedades biofísicas do canal de RyR2. Tais alterações são evidenciadas pelo incremento da probabilidade de abertura (Po) , devido a uma maior sensibilidade da activação dependente do Ca2+ (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994; Kaftan et al. , Effects of rapamycin on ryanodine receptor / Ca2+- release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78:990-97, 1996); pela desestabilização do canal que se traduz em estados de sub-condutância e pelo comprometimento da modulação do acoplamento de canais, que origina um acoplamento EC defeituoso e disfunção cardíaca (Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281:818-21, 1998). Por conseguinte, o RyR2 hiperfosforilado pela PKA é extremamente sensível à estimulação de baixo nível pelo Ca2+, manifestando-se a última como uma fuga de Ca2+ do RS através do canal hiperfosforilado.

[0042] A resposta inadequada ao stress na insuficiência cardíaca resulta na depleção de FKBP12.6 do complexo macromolecular de canais. Tal conduz a um desvio à esquerda da sensibilidade do RyR2 para a libertação de Ca2+ por 24 indução de Ca2+, dando origem a canais que são mais susceptiveis à activação por concentrações baixas a moderadas de [Ca2+] (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000; Yamamoto et al. , Abnormal Ca2+ release from cardiac sarcoplasmic reticulum in tachycardia-induced heart failure. Cardiovasc. Res., 44:146-55, 1999; Yano et al. , Altered stoichiometry of FKBP12.6 versus ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+ leak through ryanodine receptor in heart failure. Circulation, 102:2131-36, 2000). Com o decorrer do tempo, o aumento da "fuga" através do RyR2 resulta numa reconfiguração do teor de Ca2+ RS para um nivel inferior o que, por sua vez, reduz o retorno do acoplamento EC e contribui para uma contractilidade sistólica diminuída (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000).

[0043] Uma subpopulação de canais de RyR2 particularmente propensa a "fugas" pode libertar Ca2+ RS durante a fase de repouso do ciclo cardíaco, diástole. Tal dá origem a despolarizações membranares em cardiomiócitos conhecidas como eventos tardios de pós-despolarização (DAD), que se sabem estar associados ao desencadeamento de arritmias ventriculares cardíacas fatais (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003).

[0044] Poderá ocorrer um fenómeno similar em corações estruturalmente normais. Especificamente, sabe-se que o exercício e o stress induzem a libertação de catecolaminas 25 que activam os receptores β-adrenérgicos cardíacos. A activação dos receptores β-adrenérgicos conduz à hiperfosforilação dos canais de RyR2 As evidências sugerem ainda que a hiperfosforilação do RyR2 decorrente da activação de receptores β-adrenérgicos aumenta a probabilidade de abertura dos canais mutantes de RyR2 na fase de relaxamento do ciclo cardíaco, elevando a possibilidade de ocorrência de arritmias.

[0045] A presente descrição revela que o JTV-519 previne a insuficiência cardíaca num modelo murino de insuficiência pós-EM. Neste modelo animal, o JTV-519 beneficiou o funcionamento cardíaco em termos da disfunção diastólica e melhoria da função sistólica. Além disso, a presente divulgação demonstra que a forma muscular esquelética do canal de RyR, RyRl, é igualmente defeituosa (ou propensa a fugas) a nível do músculo-esquelético na insuficiência cardíaca, devido à hiperfosforilação pela PKA (Reiken et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12 from the calcium release channel (ryanodine receptor) in skeletal muscle: defective regulation in heart failure. J. Cell Biol, 160:919-28, 2003). Por conseguinte, é expectável que o JTV-519 também beneficie a função muscular esquelética em doentes com insuficiência cardíaca. Como tal, o JTV-519 constitui uma abordagem terapêutica inovadora para o tratamento dos dois principais sintomas de insuficiência cardíaca - fadiga precoce e dificuldade respiratória decorrentes da fragilização do músculo-esquelético nas extremidades e diafragma, respectivamente.

[0046] Tal como discutido anteriormente, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) é uma perturbação hereditária que ocorre em indivíduos com corações estruturalmente normais. É caracterizada pela 26 taquicardia ventricular induzida pelo stress, uma arritmia fatal que pode traduzir-se em morte súbita cardíaca (MSC). Foi já realizada a associação entre as mutações em canais de RyR2 situadas no retículo sarcoplasmático (RS) e a TVPC.

[0047] Todos os indivíduos com TVPC têm arritmias cardíacas induzidas pelo exercício físico. Os inventores demonstraram anteriormente que as arritmias induzidas pelo exercício físico e a morte súbita (em doentes com TVPC) resultam de uma redução da afinidade da FKBP12.6 para o RyR2. Os inventores já aqui demonstraram que o exercício físico activa o RyR2 como resultado da fosforilação pela proteína cinase dependente do 3',5'-monofosfato de adenosina (PKA).

[0048] Para determinar os mecanismos moleculares subjacentes às arritmias cardíacas fatais na TVPC, os inventores estudaram canais mutantes de RyR2 a ela associados (e.g., S2246L, R2474S, N4104K e R4497C). Os canais mutantes de RyR2, que apresentavam um funcionamento regular nas bicamadas lipídicas planares sob condições basais, eram mais susceptíveis à activação pela fosforilação pela PKA - apresentando uma actividade de abertura superior (Po) e estados de abertura mais prolongados face aos apresentados pelos canais de tipo selvagem. Adicionalmente, os canais mutantes de RyR2 fosforilados pela PKA demonstraram ser resistentes à inibição pelo Mg2+, um inibidor fisiológico dos canais de RyR2, e apresentaram uma redução da ligação à FKBP12.6 (que estabiliza o canal no seu estado de encerramento). Estas constatações indicam que, durante o exercício físico, quando os canais de RyR2 se encontram fosforilados pela PKA os canais mutantes da TVPC estão mais propensos a abrir durante a fase de relaxamento do ciclo cardíaco (diástole), aumentando a probabilidade de ocorrência de arritmias 27 cardíacas desencadeadas por fugas de Ca2+ RS. Tendo em conta que a insuficiência cardíaca é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo, os métodos de reparação da fuga de RyR2 poderão prevenir a ocorrência de arritmias fatais em milhões de doentes.

[0049] A presente divulgação demonstrou ainda que o fármaco JTV-519, um derivado da 1,4-benzotiazepina, previne a ocorrência de arritmias ventriculares fatais em ratos heterozigóticos para o gene da FKBP12.6. Foi recentemente demonstrado que o JTV-519 reduz a fuga diastólica de Ca2+ RS num modelo animal de insuficiência cardíaca (Yano et al., FKBP12.6-mediated stabilization of calcium-release channel (ryanodine receptor) as a novel therapeutic strategy against heart failure. Circulation, 107:477-84, 2003; Kohno et al. , A new cardioprotective agent, JTV519, improves defective channel gating of ryanodine receptor in heart failure. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 14:14, 2002) . A presente divulgação examinou a eficácia e o modelo de acção do JTV-519 num modelo de arritmia cardíaca. Nas experiências in vivo, foram utilizadas quantidades de um grama de JTV-519 (monocloridrato de 4—[3—(4— benzilpiperidin-l-il) propionil]-7-metoxi-2,3,4,5- tetrahidro-1,4-benzotiazepina).

[0050] Para testar as arritmias cardíacas, os ratos FKBP12.6+/- e FKBP12.6-/- foram submetidos ao protocolo de exercício físico anteriormente descrito (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003; Mohler et al., Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature, 421:634-39, 2003) . Embora 88% dos ratos FKBP12.6+/- (7 de 8) tenham 28 apresentado taquicardias ventriculares (TV) ou síncopes durante a execução do protocolo, nenhum dos ratos FKBP12.6+/- (0 de 6) pré-tratados com JTV-519 desenvolveu arritmias ou síncopes (FIG. 1) . Além disso, 90% dos ratos FKBP12.6+/- (9 de 10) morreram durante ou após a submissão a exercício físico, enquanto que nenhum dos ratos FKBP12.6+/- pré-tratados com JTV-519 (0 de 9) faleceu (Fig. 1C). Ao contrário dos ratos FKBP12.6+/- pré-tratados, todos os ratos FKBP12.6-/- (5 de 5) tratados com JTV-519 desenvolveram TV durante o protocolo de submissão a stress e faleceram apesar do tratamento com JTV-519 (FIG. 1C) . Quando considerados em conjunto, estes dados sugerem que a FKBP12.6 é necessária à acção anti-arrítmica do JTV-519.

[0051] De modo a caracterizar adicionalmente as propriedades anti-arrítmicas do JTV-519, os inventores submeteram ratos FKBP12.6+/+, FKBP12.6+/- e FKBP12.6-/- a protocolos de electroestimulação programada. As TV foram induzidas pela sobremultiplicação rítmica em 71% dos ratos FKBP12.6 + /- (5 de 7), mas não nos FKBP12.6 + /+ de tipo selvagem (P<0,05, n = 5) , após injecção de 0,5 mg/kg de isoproterenol. Os ratos FKBP12.6+/- pré-tratados com JTV-519 (0,5 mg/kg/h) eram significativamente menos susceptíveis à TV por sobremultiplicação rítmica quando comparados com os FKBP12.6+/- não tratados (1 de 7 vs. 5 de 7; P<0,05). Em contraste, 67% dos ratos FKBP12.6-/- (4 de 6) pré-tratados com JTV-519 desenvolveram TV durante a sobremultiplicação rítmica.

[0052] As TV foram induzidas com um único batimento prematuro em 71 % dos ratos FKBP12.6 + /- (5 de 7) . Não foi observada a ocorrência de TV em nenhum dos 7 ratos FKBP 12.6 + /- pré-tratados com JTV-519. As TV foram reprodutivamente induzidas, através da utilização de um 29 protocolo de duplo batimento prematuro (S1-S2-S3), em 100% dos ratos FKBP 12.6+/- não tratados (7 de 7). O tratamento com JTV-519 erradicou totalmente as TV indutíveis nos ratos FKBP12.6+/- (7 de 7). O tratamento com JTV-519 não evitou a ocorrência de TV nos ratos FKBP12.6-/-, suportando o conceito de que a FKBP12.6 é necessária às acções anti-arritmicas do JTV-519.

[0053] Os inventores demonstraram previamente que a fosforilação pela PKA do RyR2 em Ser2809 causa a dissociação da FKBP12.6 do canal de RyR2 (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000). No presente estudo, o pré-tratamento com JTV-519 (0,5 mg/kg/h) não teve impacto sobre o grau de fosforilação do RyR2 pela PKA nos ratos FKBP12.6+/- e FKBP12.6-/- (FIG. 2). Quando comparados com ratos FKBP12.6 + / + , os complexos de RyR2 dos ratos FKBP12.6+/- encontravam-se consideravelmente mais empobrecidos em FKBP12.6 após a submissão à prática de exercício físico (*P<0,05). 0 pré-tratamento com JTV-519 preveniu, contudo, a perda de FKBP12.6 do complexo macromolecular de RyR2 nos ratos FKBP12.6+/- durante a submissão a exercício físico (FIG. 2; *P<0,05).

[0054] A probabilidade de abertura (Po) dos canais de RyR2 dos ratos FKBP12.6+/- submetidos a exercício físico aumentou significativamente face à respectiva aos canais de ratos FKBP12.6+/+ nas mesmas condições (+/-: 0,47 _ 0,12, n = 11; +/+: 0,04 _ 0,01, n=13; P<0,05). O tratamento dos ratos submetidos a exercício físico com JTV-519 (0,5 mg/kg/h) reduziu significativamente a Po dos canais (0,02 _ 0,01, n = 13) relativamente aos ratos que não foram sujeitos ao mesmo protocolo (FIG. 2). Esta observação 30 coaduna-se com o incremento das quantidades de FKBP12.6 no complexo de RyR2 (FIG. 2). Em contraste, o tratamento com JTV-519 dos ratos FKBP12.6-/- submetidos a exercício físico não se traduziu em canais com uma Po reduzida.

[0055] Os canais individuais de RyR2 foram examinados com uma concentração reduzida de [Ca2+] (citosólico), 150 nM, utilizando Ca2+ como portador de carga. Estas condições simulam aquelas que ocorrem durante a diástole, quando os canais de RyR2 devem apresentar uma probabilidade de abertura reduzida de modo a evitar a fuga diastólica de Ca2+ RS que pode dar origem à ocorrência de arritmias cardíacas. Assim, a redução significativa da Po de RyR2, tal como observada em ratos FKBP12.6+/- tratados com JTV-519 submetidos a exercício físico, sugere que os canais de RyR2 não estarão propensos à ocorrência de "fugas" durante a diástole d, o que é coerente com a ausência de arritmias observáveis.

[0056] Para avaliar adicionalmente o mecanismo através do qual o JTV-519 previne a ocorrência da TV, os inventores simularam condições de exercício através da fosforilação pela PKA dos canais de RyR2 de tipo selvagem (RyR2-TS). Os canais de RyR2 fosforilados pela PKA foram, em seguida, incubados com FKBP12.6 (250 nM) na presença de concentrações crescentes de JTV-519. A incubação com JTV-519 a 100 nM ou 1000 nM induziu a ligação da FKBP12.6 ao RyR2 fosforilado pela PKA (FIG. 3). 0 JTV-519 induziu ainda a ligação da FKBP12.6 aos canais mutantes de RyR2-S2809D que mimetizam constitutivamente os canais de RyR2 fosforilados pela PKA (FIG. 3).

[0057] A afinidade da FKBP12.6 para os canais RyR2 fosforilado pela PKA subiu significativamente com a adição 31 do JTV-519. As constantes de dissociação (KD) para a ligação da FKBP12.6 aos canais foram: 148 _ 59,0 nM para RyR2-TS + PKA + PKI5-24 (inibidor da PKA ); 1972 _ 39,9 nM para RyR2-TS + PKA; 158 _ 56,4 nM para RyR2 + PKA + JTV-519 (P <0,05, n = 2 para os canais fosforilados pela PKA vs. canais fosforilados pela PKA com JTV-519) (FIG. 3) . Foram obtidos resultados semelhantes com os canais mutantes de RyR2-S2809D (que mimetizam constitutivamente os canais fosforilados pela PKA) . As KD para a ligação da FKBP12.6 foram: 2123 _ 104 nM para RyR2-S2809D e 428 _ 39 nM para RyR2-S2809D + JTV-519. A fosforilação pela PKA do RyR2 deu origem à activação do canal (Po = 0,01 _ 0,002 (PKA + PKI; n = 11) vs. Po = 0,40 _ 0,02 (PKA; n = 12; P < 0,05). A adição da FKBP12.6 (250 nM) aos canais de RyR2-TS fosforilados pela PKA não resultou na redução da Po. Contudo, a adição de JTV-519 1 PM e FKBP12.6 reduziu a Po a níveis comparáveis aos que correspondem aos canais não fosforilados pela PKA (Po = 0, 002 _ 0,001; n = 13; P < 0,05) .

[0058] Quando considerados em conjunto, os resultados obtidos pelos inventores demonstram que a depleção de FKBP12.6 do complexo macromolecular de RyR2 - que se encontra associada ao aumento da probabilidade de abertura do RyR2, taquicardias ventriculares e morte súbita cardíaca em ratos FKBP12.6+/- - é revertida pelo tratamento com o derivado da 1,4-benzotiazepina, JTV-519. Por conseguinte, os inventores identificaram um mecanismo molecular inovador para o tratamento de arritmias ventriculares: o aumento da afinidade do RyR2 para a FKBP12.6 evita a ocorrência das fugas diastólicas de cálcio RS que podem dar origem a arritmias. Tendo em conta que a deficiência de FKBP12.6 no complexo macromolecular de RyR2 é uma característica comum da insuficiência cardíaca (Marx et al., PKA phosphorylation 32 dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000) e das arritmias ventriculares hereditárias induzidas pelo exercício físico (Wehrens et ai., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003), é expectável que o JTV-519 venha a constituir um método inovador e concreto para o tratamento da anomalia molecular a nível do RyR2 que desencadeia a morte súbita cardíaca.

[0059] Tal como anteriormente descrito, a fibrilaçao auricular é a forma mais comum de arritmia cardíaca em humanos. Até à data, foi estabelecido que a remodelação estrutural e eléctrica - incluindo a redução da refractariedade auricular, perda da adaptação da refractariedade de associação rítmica (Wijffels et al., Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake chronically instrumented goats. Circulation, 92:1954-68, 1995; Morillo et ai., Chronic rapid atrial pacing: structural, functional, and electrophysiological characteristics of a new model of sustained atrial fibrillation. Circulation, 91:1588-95, 1995; Elvan et ai., Pacing-induced chronic atrial fibrillation impairs sinus node function in dogs: electrophysiological remodeling. Circulation, 94:2953-60, 1996; Gaspo et ai., Functional mechanisms underlying tachycardia-induced sustained atrial fibrillation in a chronic dog model. Circulation, 96:4027-35, 1997) e a redução do comprimento de pequenas ondas de reentrada - acompanha a taquicardia permanente (Rensma et ai., Length of excitation wave and susceptibility to reentrant atrial arrhythmias in normal conscious dogs. Circ. Res., 62:395-410, 1988). Esta reconfiguração é 33 provavelmente importante para o desenvolvimento, manutenção e progressão da fibrilação auricular. Foi também sugerido que a manipulação do cálcio possa estar envolvida na remodelação eléctrica na fibrilação auricular (Sun et al., Cellular mechanisms of atrial contractile dysfunction caused by sustained atrial tachycardia. Circulation, 98:719-27, 1998; Goette et al., Electrical remodeling in atrial fibrillation: time course and mechanisms. Circulation, 94:2968-74, 1996; Daoud et al., Effect of verapamil and procainamide on atrial fibrillation-induced electrical remodeling in humans. Circulation, 96:1542-50, 1997; Yu et al., Tachycardiainduced change of atrial refractory period in humans: rate dependency and effects of antiarrhythmic drugs. Circulation, 97:2331-37, 1998; Leistad et al., Atrial contractile dysfunction after short-term atrial fibrillation is reduced by verapamil but increased by ΒΑΥ K8644. Circulation, 93:1747-54, 1996; Tieleman et al., Verapamil reduces tachycardia-induced electrical remodeling of the atria. Circulation, 95:1945-53, 1997).

[0060] Com base na alteração funcional do canal iónico, foram propostos diversos mecanismos para a FA. Por exemplo, os estudos demonstraram uma redução das correntes de Ca2+ de tipo L (ICa,L) e transiente externa (Ito) durante o estabelecimento da taquicardia auricular prolongada (Yue et al., Ionic remodeling underlying action potential changes in a canine model of atrial fibrillation. Circ. Res., 81:512-25, 1997). A regulação negativa observada para ICa,L provavelmente constitui uma explicação, pelo menos parcial, para a contracção do período refractário efectivo auricular (PRTA) e para a perda de refractariedade de associação rítmica - correspondendo ambas a importantes características do processo de remodelação eléctrica que 34 acompanha a FA (Yue et al., Ionic remodeling underlying action potential changes in a canine model of atrial fibrillation. Circ. Res., 81:512-25, 1997). Em modelos animais experimentais de rápida estimulação auricular e em estudos clínicos de humanos com FA, o verapamil demonstrou inibir a remodelação eléctrica, sugerindo, desse modo, o envolvimento de uma sobrecarga de Ca2+ (Daoud et al., Effect of verapamil and procainamide on atrial fibrillation- induced electrical remodeling in humans. Circulation, 96:1542-50, 1997; Leistad et al., Atrial contractile dysfunction after short-term atrial fibrillation is reduced by verapamil but increased by BAY K8644. Circulation, 93:1747-54, 1996).

[0061] Embora seja claro que os canais iónicos sarcolemais desempenham um papel importante sobre a remodelação que acompanha a taquicardia auricular e a FA, a contribuição da manipulação intracelular do Ca2+ não foi ainda meticulosamente explorada. Existem, contudo, evidências que sugerem que a manipulação intracelular anómala do Ca2+ está associada ao processo de remodelação. Estudos anteriores demonstraram, por exemplo, que a perda de adaptação da frequência não pode ser inteiramente explicada por correntes iónicas sarcolemais alteradas, tais como ICa,L e Ito (Ramirez et al., Mathematical analysis of canine atrial action potentials: rate, regional factors, and electrical remodeling. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 279:H17 67-85, 2000; Kneller et al., Remodeling of Ca2+-handling by atrial tachycardia: evidence for a role in loss of rate-adaptation. Cardiovasc. Res., 54:416-26, 2002). Os estudos demonstraram ainda que as alterações na manipulação intracelular do cálcio decorrentes da taquicardia também contribuem de forma significativa para a perda de adaptação da frequência, que se acredita ser crítica para a 35 patogénese da FA (Sun et al., Cellular mechanisms of atrial contractile dysfunction caused by sustained atrial tachycardia. Circulation, 98:719-27, 1998; Kneller et al., Remodeling of Ca2+-handling by atrial tachycardia: evidence for a role in loss of rate-adaptation. Cardiovasc. Res., 54:416-26, 2002; Hara et al., Steady-state and nonsteady- state action potentials in fibrillating canine atrium: abnormal rate adaptation and its possible mechanisms. Cardiovasc. Res., 42:455-69, 1999).

[0062] Em estudos anteriores, os auriculos de um modelo canino da FA de indução rítmica demonstraram uma perda de adaptação do período de duração do PA e uma alteração a nível das suas características, passíveis de reversão na presença de rianodina. Estas observações sugerem que as alterações decorrem, pelo menos parcialmente, de um processo intracelular dependente do Ca2+ (Hara et al., Steady-state and nonsteady-state action potentials in fibrillating canine atrium: abnormal rate adaptation and its possible mechanisms. Cardiovasc. Res., 42:455-69, 1999). Além disso, existe uma redução significativa dos transientes de Ca2+ nos auriculos de cães com taquicardia auricular permanente de indução rítmica (Sun et al., Cellular mechanisms of atrial contractile dysfunction caused by sustained atrial tachycardia. Circulation, 98:719-27, 1998) .

[0063] Uma vez que os transientes de Ca2+ resultam de uma entrada sarcolemal de Ca2+ que desencadeia a libertação de Ca2+ induzida pelo Ca2+ a partir do RS através do RyR2, os resultados de estudos anteriores sugerem que a ocorrência de alterações na manipulação intracelular do cálcio acompanha o processo de remodelação induzido pela taquicardia. Tais transientes de Ca2+ anormalmente 36 reduzidos foram já associados à contracção de miócitos auriculares isolados, indiciando que a manipulação do cálcio contribui para a disfunção contráctil auricular que acompanha a FA (Sun et al., Cellular mechanisms of atrial contractile dysfunction caused by sustained atrial tachycardia. Circulation, 98:719-27, 1998).

[0064] Tal como aqui descrito, os estudos dos inventores fornecem evidências convincentes de que a homeostase do cálcio desempenha um importante papel a nivel da remodelação eléctrica e contráctil que acompanha a taquicardia auricular permanente e a FA. A libertação de reservas de Ca2+ pelo RyR2 destaca-se como um componente integrante da homeostase miocárdica do Ca2+. A regulação do RyR2 foi bem caracterizada a nível do tecido ventricular canino e humano, tendo o mesmo sido implicado em doenças do miocárdio ventricular, incluindo a insuficiência cardíaca e a morte súbita cardíaca (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000; Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003; Reiken et al., Beta-blockers restore calcium release channel function and improve cardiac muscle performance in human heart failure. Circulation, 107:2459-66, 2003). Apesar de ter sido evidenciado o papel da manipulação do Ca2+ a nível das arritmias cardíacas, a regulação e função do receptor auricular de rianodina não foi suficientemente caracterizado neste contexto. Nomeadamente, até à presente invenção, o papel deste canal na FA não era conhecido. 37 [0065] Os inventores confirmam aqui que, tal como no miocárdio ventricular, os canais auriculares de libertação de cálcio existem na forma de complexos macromoleculares. Os resultados das experiências de co-imunoprecipitação executadas pelos inventores indicam que o RyR2 auricular se encontra fisicamente associado à principal subunidade de requlação, calestabina2 (FKBP12.6); às fosfatases PP1 e PP2A e às subunidades de requlação e catalítica da PKA. Além disso, os inventores demonstraram que a PKA endóqena fosforila de modo específico o RyR2 no retículo sarcoplasmático auricular, dando oriqem a uma depleção de calestabina2 (FKBP12.6) a nível do complexo de canais. Estas conclusões sugerem que a requlação da função contráctil no aurículo é susceptível à modulação pela fosforilação pela PKA do RyR2 auricular, de um modo similar ao observado no miocárdio ventricular (Brillantes, et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK-506 bindinq protein, Cell, 77:513-523, 1994) .

[0066] No presente estudo, os inventores observaram que a hiperfosforilação do RyR2 pela PKA encontrava-se associada à depleção de calestabina2 (FKBP12.6) em aurículos caninos afectados pela FA. Os inventores observaram, de modo semelhante, a fosforilação pela PKA com a respectiva depleção de calestabina (FKBP12.6), em tecido auricular de humanos com FA durante o estabelecimento da insuficiência cardíaca. A consequência funcional desta hiperfosforilação anómala do RyR2 pela PKA correspondeu ao incremento da probabilidade de aberturas sob condições que simulam a diástole cardíaca (baixa concentração de Ca2+ citosólico) . Tais anomalias funcionais são características dos canais onde tenha ocorrido depleção da calestabina2 (FKBP12.6) (Brillantes, et al., Stabilization of calcium release 38 channel (ryanodine receptor) function by FK-506 binding protein, Cell, 77:513-523, 1994). Este funcionamento anormal dos canais na FA coaduna-se com os estudos anteriores que demonstram que a perda de calestabina2 (FKBP12.6) através do RyR2, durante o estabelecimento da hiperfosforilação pela PKA, resulta em canais susceptiveis à ocorrência de fugas predispostos a uma libertação diastólica de Ca2+ decorrente de uma maior sensibilidade à libertação de Ca2+ induzida pelo Ca2+ (Brillantes et ai., Stabilization of calcium release e channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994; Kaftan et ai., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/ Ca2+- release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78:990-97, 1996). Sabe-se também que na ausência de calestabina2 (FKBP12.6), os canais abrem e fecham (bloqueio) de forma estocástica, em vez de o fazerem em unissono (acoplamento modulado) (Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels (ryanodine receptors). Science, 281:818-21, 1998).

[0067] As evidências sugerem que a FA é habitualmente iniciada por extrassistoles auriculares prematuras (Bennett & Pentecost, The pattern of onset and spontaneous cessation of atrial fibrillation in man. Circulation, 41:981-88, 1970), que se sabem resultar de pós-despolarizações (Cranefield, P.F., Action potentials, afterpotentials, and arrhythmias. Circ. Res., 41:415-23, 1977). Foi observado o reinicio da FA através de extrassistoles auriculares, imediatamente após o término da arritmia (Timmermans et al. , Immediate reinitiation of atrial fibrillation following internai atrial defibrillation. J. Cardiovasc. Electrophysiol., 9:122-28, 1998; Wellens et al., Atrioverter: an implantable device for the treatment of atrial fibrillation. Circulation, 98:1651-56, 1998), tendo 39 esta sido especificamente associada a eventos precoces de pós-despolarização (Burashnikov & Antzelevitch, Reinduction of atrial fibrillation immediately after termination of the arrhythmia is mediated by late phase 3 early afterdepolarization-induced triggered activity. Circulation, 107:2355-60, 2003). As extrassistoles são particularmente susceptiveis ao desencadeamento da FA durante o estabelecimento de um período refractário efectivo auricular reduzido (Wang et al., Regional and functional factors determining induction and maintenance of atrial fibrillation in dogs. Am. J. Physiol., 271:H148-58, 1996), semelhante ao que acompanha a remodelação eléctrica auricular.

[0068] Tal como discutido anteriormente, existem evidências de que a libertação anómala de Ca2+ a partir de RyR2 fosforilado pela PKA "susceptível a fugas" dá origem a eventos tardios de pós-despolarização (DAD) capazes de desencadear a ocorrência de arritmias ventriculares letais (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003). Acredita-se que a manipulação disfuncional do cálcio pelo RyR2 pode também servir como iniciador da FA de um modo semelhante. A função anómala dos canais observada pelos inventores pode contribuir para a patogénese da FA através do fornecimento de uma fonte de DAD necessária ao desencadeamento da FA, para além de contribuir para a disfunção da manipulação do cálcio que integra o processo de remodelação associado à arritmia. Tendo em consideração as evidências aqui apresentadas de que o miocárdio auricular em humanos afectados pela FA, durante o estabelecimento da insuficiência cardíaca, é hiperfosforilado pela PKA e totalmente desprovido de 40 calestabina2 (FKBP12.6), é possível aferir que a disfunção do RyR2 pode explicar, parcialmente, a frequência da ocorrência de arritmias auriculares nesses mesmos doentes.

[0069] A capacidade do JTV-519 para reparar defeitos específicos a nível molecular na manipulação do cálcio por parte do RyR2 torna-o um candidato intrigante ao desempenho de funções enquanto agente terapêutico inovador. O potencial do JTV-519 é realçado pelo número crescente de cardiopatias graves, que incluem a insuficiência cardíaca e arritmias ventriculares fatais, com envolvimento de uma regulação disfuncional pelo RyR2 (i.e., a fosforilação pela PKA e a perda de calestabina2 (FKBP12.6) a partir do complexo de canais podem constituir importantes contribuições para a sua patogénese).

[0070] 0 foco dos estudos iniciais acerca do JTV-519 centrou-se sobre as suas propriedades anti-isquémicas (Comunicação Pessoal, Aetas). 0 JTV-519 foi, contudo, recentemente demonstrado como capaz de inibir a indução da FA num modelo estéril de pericardite canino da fibrilação auricular (Kumagai et al., Antiarrhythmic effects of JTV-519, a novel cardioprotective drug, on atrial fibrillation / flutter in a canine sterile pericarditis model. J. Cardiovasc. Electrophysiol., 14:880-84, 2003). Todavia, este estudo não definiu o mecanismo através do qual o JTV-519 teve impacto sobre a inductilidade e manutenção da FA.

[0071] Tal como aqui demonstrado, os inventores determinaram que o tratamento com JTV-519 (1 PM) possibilita que a calestabina2 recombinante (FKBP12.6) se ligue ao RyR2 fosforilado pela PKA isolado, in vitro, a partir do miocárdio canino. A associação da calestabina2 (FKBP12.6) ao RyR2 fosforilado pela PKA não ocorreu em 41 canais não tratados. 0 restabelecimento da associação da calestabina2 (FKBP12.6) ao complexo de canais recupera o funcionamento normal dos canais hiperfosforilados pela PKA. Assim, a recuperação do funcionamento do canal de RyR2 pode estar envolvida na capacidade do JTV-519 para inibir a inductilidade e manutenção da FA, tal como foi observado por Kumagai et al. (Antiarrhythmic effects of JTV-519, a novel cardioprotective drug, on atrial fibrillation / flutter in a canine sterile pericarditis model. J. Cardiovasc. Electrophysiol., 14:880-84, 2003).

[0072] A fibrilaçao auricular é um processo electrofisiológico complexo; a sua patogénese molecular será, provavelmente, multifactorial. A anormalidade da manipulação miocárdica do Ca2+ parece contribuir de forma significativa para a evolução da doença. Os estudos dos inventores sugerem gue a existência de anomalias no funcionamento dos canais a nível da libertação intracelular de Ca2+, que resulta na hiperfosforilação do RyR2 pela PKA, pode contribuir para o processo de remodelação na FA e, potencialmente, encontrar-se na base do desencadeamento da arritmia.

Novos métodos de tratamento e prevenção com utilização do JTV-519 [0073] De acordo com a descrição precedente, o presente documento divulga um método de limitação ou prevenção de um decréscimo no nível de RyR2 ligado à FKBP 12.6 num sujeito. Tal como aqui empregue, o termo "FKBP12.6" inclui quer uma "proteína de FKBP12.6" como um "análogo de FKBP12.6". Salvo indicação em contrário, o termo "proteína" deve incluir uma proteína, domínio proteico, polipéptido ou péptido, assim como qualquer fragmento dos mesmos. Um "análogo de 42 FKBP12.6" é uma variante funcional da proteína FKBP12.6, que apresenta uma actividade biológica equivalente e possui uma homologia igual ou superior a 60% em relação à sequência de aminoácidos da proteína FKBP12.6. Tal como empregue daqui em diante, o termo "actividade biológica de FKBP12.6" refere-se à actividade de uma proteína ou péptido que demonstra capacidade de associação física ou ligação ao RyR2 não fosforilado ou não hiperfosforilado (i.e., uma ligação aproximadamente duas ou, preferencialmente, cinco vezes superior à ligação de fundo de um controlo negativo), sob as condições dos ensaios aqui descritos, apesar de a sua afinidade poder ser diferente da que corresponde à FKBP12.6.

[0074] Adicionalmente, como aqui empregue, o termo "RyR2" inclui quer uma "proteína de RyR2" (e.g., proteína de RyR2 auricular ou ventricular), quer um "análogo de RyR2". Um "análogo de RyR2" é uma variante funcional da proteína RyR2, que apresenta uma actividade biológica equivalente e possui uma homologia igual ou superior a 60% em relação à sequência de aminoácidos da proteína de RyR2. Tal como aqui empregue, o termo "análogo de RyR2" inclui RyRl - a isoforma muscular esquelética do RyR2 - e RyR3. O RyR2 da presente invenção pode ser não fosforilado, fosforilado (e.g., pela PKA) ou hiperf osf orilado (e.g., pela PKA) ; preferencialmente, o RyR2 irá encontrar-se fosforilado ou hiperfosforilado. Tal como empregue daqui em diante, o termo "actividade biológica de RyR2" refere-se à actividade de uma proteína ou péptido que demonstra capacidade de associação física ou ligação à FKBP12.6 (i.e., uma ligação aproximadamente duas ou, preferencialmente, cinco vezes superior à ligação de fundo de um controlo negativo), sob as condições dos ensaios aqui descritos, apesar de a sua afinidade poder ser diferente da que corresponde ao RyR2. 43 [0075] Tal como acima descrito, o receptor cardíaco de rianodina, RyR2, é um complexo proteico composto por quatro proteínas com 565.000 daltons associadas a quatro proteínas de FKBP12.6 com 12.000 daltons. As proteínas de liqação FK506 (FKBP) são peptidilprolil isomerases eis-trans amplamente expressas e servem uma diversidade de funções celulares. A proteína de FKBP12.6 encontra-se estreitamente associada ao RyR2, regulando o seu funcionamento. A FKBP12.6 liga-se ao canal de RyR2, uma molécula por cada subunidade de RyR2, estabiliza o seu funcionamento e facilita a modulação do bloqueio entre canais adjacentes de RyR2, prevenindo, desse modo, a activação anormal do canal durante a fase de repouso do ciclo cardíaco. Portanto, como aqui empregue, o termo "FKBP12.6 ligada ao RyR2" inclui uma molécula de uma proteína de FKBP12.6 que se encontra vinculada a uma subunidade de uma proteína de RyR2 ou um tetrâmero de FKBP12.6 associado a um tetrâmero de RyR2. O termo "FKBP12.6 ligada ao RyR2" também inclui uma subunidade de uma proteína de RyR2 que se encontra vinculada a uma molécula de uma proteína de FKBP12.6 ou a um tetrâmero de RyR2 associado a um tetrâmero de FKBP12.6. Por conseguinte, "um decréscimo no nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito" inclui um decréscimo no nível de RyR2 ligado à FKBP12.6 num sujeito e um decréscimo no nível de um complexo FKBP12.6-RyR2 num sujeito.

[0076] De acordo com o método aqui descrito, um "decréscimo" no nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito refere-se a um decréscimo, diminuição ou redução detectável do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito. Tal decréscimo é limitado ou evitado no sujeito quando é, de alguma forma, interrompido, impedido, dificultado, obstruído ou reduzido pela administração do JTV-519 (tal 44 como abaixo descrita), de tal modo que o nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 no sujeito seja superior ao que seria de outro modo, na ausência do JTV-519. 0 "nível" de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito refere-se ao nível global que se encontra presente no sujeito, incluindo o nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 no sangue (em circulação), tecidos e células (e.g., citoplasma ou núcleo) do mesmo. A título de exemplo, um decréscimo no nível global de FKBP12.6 ligada ao RyR2 no sujeito pode, então, ser obtido através de um decréscimo no nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 no seu sangue, tecidos e/ou células.

[0077] 0 nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito pode ser detectado através de ensaios ou técnicas padronizadas, com inclusão das que são facilmente determinadas a partir do conhecimento da área (e.g., técnicas imunológicas, análise de hibridação, imunoprecipitação e/ou a detecção de radiação, etc.), assim como por quaisquer ensaios ou métodos de detecção aqui descritos. Por exemplo, uma proteína pode ser isolada e purificada a partir das células de um sujeito através de métodos padronizados conhecidos na área, incluindo, sem limitação, a colheita de células (e.g., com um detergente que solubiliza a proteína), onde necessário, seguida de purificação por afinidade numa coluna, cromatografia (FTLC e HPLC), imunoprecipitação (com um anticorpo) e precipitação (e.g., com isopropanol e um reagente como o trizol) . O isolamento e purificação da proteína podem ser seguidos de electroforese (e.g., num gel de poliacrilamida SDS-PAGE). A determinação de um decréscimo do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito, assim como da limitação ou prevenção do mesmo, pode ser realizada através da comparação da quantidade de FKBP12.6 ligada ao RyR2 detectada antes da administração de um agente terapêutico/preventivo (e.g., JTV-519 ou outro 45 derivado da 1,4-benzotiazepina, em consonância com os métodos descritos abaixo) com a quantidade detectada, após ter decorrido um período adequado a partir dessa mesma administração.

[0078] No método actualmente descrito, um decréscimo do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito (e.g., nas suas células) pode ser limitado ou prevenido, por exemplo, pela inibição da dissociação da FKBP12.6 do RyR2 e através do aumento das ligações entre FKBP12.6 e RyR2 ou da estabilização do complexo RyR2-FKBP12.6 nesse mesmo sujeito. Tal como aqui empregue, o termo "inibição da dissociação" inclui o bloqueio, diminuição, inibição, limitação ou impedimento da dissociação ou separação física de uma subunidade de FKBP12.6 de uma molécula de RyR2 no sujeito e o bloqueio, diminuição, inibição, limitação ou impedimento da dissociação ou separação física de uma molécula de RyR2 de uma subunidade de FKBP 12.6 nesse mesmo sujeito. Tal como empregue daqui em diante, o termo "aumento das ligações" inclui o reforço, aumento ou melhoria da capacidade de associação física do RyR2 fosforilado à FKBP12.6 (e.g., uma ligação aproximadamente duas ou, preferencialmente, cinco vezes superior à ligação de fundo de um controlo negativo) num sujeito e o reforço, aumento ou melhoria da capacidade de associação física da FKBP12.6 ao RyR2 fosforilado (e.g., uma ligação aproximadamente duas ou, preferencialmente, cinco vezes superior à ligação de fundo de um controlo negativo) nesse mesmo sujeito.

[0079] Adicionalmente, no método actualmente descrito, um decréscimo no nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito (e.g., nas suas células) pode ser limitado ou prevenido através de uma redução directa do nível de RyR2 fosforilado 46 no sujeito ou através de uma redução indirecta do nível de RyR2 fosforilado nesse mesmo sujeito (e.g., através do accionamento de uma enzima (como a PKA) ou outra molécula endógena que regule ou module as funções ou níveis celulares de RyR2). 0 nível de RyR2 fosforilado no sujeito será, preferencialmente, reduzido em, pelo menos, 10% através do método da presente invenção. Ainda com maior preferência, o nível de RyR2 fosforilado será reduzido em, pelo menos, 20%.

[0080] De acordo com o método actualmente descrito, uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 será limitado ou prevenido num sujeito (e.g., nas suas células). O sujeito da presente invenção pode ser qualquer animal, com inclusão dos anfíbios, pássaros, mamíferos e marsupiais, sendo, contudo, preferível que seja um mamífero (e.g., um humano; um animal doméstico, tal como um gato, cão, macaco, ratinho ou rato ou ainda um animal comercial, tal como uma vaca ou porco). Em determinadas modalidades da presente invenção, o sujeito tem ou é candidato ao desenvolvimento de uma condição cardíaca. Os exemplos de uma "condição cardíaca" incluem, sem limitação, arritmias cardíacas (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente) ; arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência cardíaca e a morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico.

[0081] A arritmia cardíaca é um distúrbio da actividade eléctrica do coração que se manifesta como uma anomalia na frequência ou ritmo cardíaco. A taquicardia (e.g., a taquicardia auricular, juncional (nodal), ventricular e paroxística) é uma condição associada à rapidez excessiva 47 na acção cardíaca, particularmente quando a frequência cardíaca se encontra acima dos 100 batimentos por minuto. Uma taquiarritmia corresponde a uma taquicardia associada a uma irregularidade a nível do ritmo cardíaco normal. A arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico é uma condição cardíaca (e.g., uma fibrilação ou taquicardia ventricular, com inclusão de qualquer evento que conduza à morte súbita cardíaca) que se desenvolve durante/após a submissão de um sujeito à prática de exercício físico.

[0082] A fibrilação auricular é um exemplo de taquiarritmia. Mais especificamente, a fibrilação auricular é uma condição associada a um ritmo cardíaco anormal e irregular, onde são gerados impulsos eléctricos de forma caótica ao longo das câmaras superiores, ou aurículos, do coração. Os sintomas mais comuns da fibrilação auricular incluem, sem limitação, a ocorrência de palpitações (uma percepção desconfortável do batimento rápido e irregular do coração). A fibrilação auricular pode ainda resultar na formação de coágulos sanguíneos que se movem entre o coração e o cérebro e levam à ocorrência de acidentes vasculares cerebrais (AVC). O tratamento actualmente disponível para a fibrilação auricular envolve a gestão de factores de risco, a administração de fármacos que reduzem a frequência cardíaca e/ou normalizam o ritmo cardíaco e a prevenção de complicações associadas à coagulação sanguínea.

[0083] A insuficiência cardíaca é uma condição que se manifesta através da redução da função contráctil (contractilidade) do coração. Os sintomas da insuficiência cardíaca incluem a dificuldade respiratória, uma redução da tolerância ao exercício físico e a fadiga muscular precoce. 48 [0084] Um "candidato" ao desenvolvimento de uma condição cardíaca (e.g., arritmia ou insuficiência cardíaca) é um sujeito que se sabe, acredita ou suspeita estar em risco de desenvolvimento de uma condição cardíaca. Os exemplos de candidatos ao desenvolvimento de uma condição cardíaca incluem, sem limitação, uma pessoa/animal com suspeita de arritmia cardíaca (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente): arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico) e/ou insuficiência cardíaca; uma pessoa/animal que se sabe, acredita ou suspeita estar em risco de desenvolvimento de arritmia cardíaca (e.g.,taquicardia, arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico.

[0085] Um "candidato" ao desenvolvimento da arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico é uma pessoa que se sabe, acredita ou suspeita ser susceptível ao desenvolvimento de uma arritmia cardíaca durante/após a submissão à prática de exercício físico. Os exemplos de candidatos ao desenvolvimento de uma arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico incluem, sem limitação, uma pessoa/animal que se sabe estar afectada pela taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC); uma pessoa/animal com suspeita de TVPC e/ou uma pessoa/animal que se sabe, acredita ou suspeita estar em risco de desenvolvimento de arritmia cardíaca durante/após a submissão à prática de exercício físico e quem está prestes a iniciar, a praticar ou tenha acabado de terminar uma 49 actividade de exercício físico. Tal como discutido anteriormente, a TVPC é uma perturbação hereditária que ocorre em indivíduos com corações estruturalmente normais. É caracterizada pela taquicardia ventricular induzida pelo stress - uma arritmia fatal que pode conduzir à morte súbita cardíaca. Nos sujeitos com TVPC, são as taquicardias ventriculares polimórficas e/ou bidireccionais induzidas pelo esforço físico/stress que conduzem à morte súbita cardíaca (MSC) na ausência de cardiopatia estrutural detectável. Os indivíduos com TVPC têm arritmias ventriculares quando sujeitos a esforço físico, não as desenvolvendo quando se encontram em repouso.

[0086] No método actualmente descrito, as células de um sujeito correspondem, preferencialmente, a células musculares estriadas. Um músculo estriado é um músculo onde as unidades de repetição (sarcómeros) das microfibrilas contrácteis se encontram alinhadas ao longo da célula, dando origem a estrias transversais e oblíquas que podem ser observadas através de microscopia óptica. Os exemplos de células da musculatura estriada incluem, sem limitação, as células musculares voluntárias (esqueléticas) e cardíacas. Numa modalidade preferida, a célula utilizada no método da presente invenção é uma célula muscular cardíaca humana. Tal como aqui empregue, o termo "célula muscular cardíaca" inclui fibras musculares cardíacas, tais como as encontradas do miocárdio. As fibras musculares cardíacas são compostas por cadeias contíguas de células musculares ou cardiomiócitos unidos de extremidade em extremidade em discos intercalados. Estes discos apresentam dois tipos de junção celular: desmossomas expandidos que se estendem ao longo das suas secções transversais e junções comunicantes que se estendem ao longo das suas secções longitudinais. 50 [0087] No método actualmente descrito, um decréscimo no nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 é limitado ou prevenido num sujeito (e.g., nas suas células) através da administração de JTV-519 que possibilitaria, então, o contacto entre as células desse mesmo sujeito e o JTV-519. 0 JTV-519 (monocloridrato de 4-[3-(4-benzilpiperidin-l-il)propionil]-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l, 4- benzotiazepina), também conhecido como k201, um derivado da 1,4-benzotiazepina, é um modulador dos canais iónicos de cálcio. Para além de regular os níveis de Ca2+ em células miocárdicas, o JTV-519 modula as correntes de Na+ e rectificadores de influxo de K+ em células ventriculares e inibe a corrente de rectificadores tardios de K+ em células auriculares de cobaias. A FK506 e a rapamicina são fármacos que podem ser utilizados na concepção de outros compostos que estabilizem o complexo RyR2-FKBP12.6 no sujeito da presente invenção. Tanto a FK506 como a rapamicina dissociam a FKBP12.6 do RyR2. É possível conceber e/ou proceder ao rastreio de compostos estruturalmente associados a estes fármacos que tenham, contudo, efeitos opostos.

[0088] No método actualmente descrito, o JTV-519 pode ser administrado a um sujeito através de uma composição terapêutica, que contém JTV-519 e um veículo farmacologicamente aceitável. 0 veículo deve ser farmacologicamente "aceitável" em termos da sua compatibilidade com os restantes ingredientes da composição, não devendo ser prejudicial ao seu destinatário. 0 veículo farmacologicamente aceitável aqui empregue é seleccionado entre vários materiais orgânicos e inorgânicos utilizados como componentes para formulações farmacêuticas que podem ser incorporados enquanto agentes analgésicos, tampões, aglutinantes, desintegrantes, 51 diluentes, emulsionantes, excipientes, extensores, lubrificantes, solubilizantes, estabilizadores, agentes de suspensão e de tonicidade, veículos e agentes de aumento da viscosidade. Se necessário, podem também ser adicionados aditivos farmacêuticos como antioxidantes, aromatizantes, corantes, agentes de melhoria da sensação gustativa, conservantes e adoçantes. Os exemplos de veículos farmacologicamente aceitáveis incluem, entre outros, carboximetilcelulose, celulose cristalina, glicerina, goma-arábica, lactose, estearato de magnésio, metilcelulose, pós, soro fisiológico, alginato de sódio, sacarose, amido e água.

[0089] As formulações da presente invenção podem ser preparadas através de métodos bem conhecidos na área farmacêutica. Por exemplo, o JTV-519 pode ser associado a um veículo ou diluente, tal como uma suspensão ou solução. Em alternativa, podem também ser adicionados um ou mais ingredientes acessório (e.g., tampões, aromatizantes, agentes tensioactivos e similares). A selecção do veículo irá depender da via de administração.

[0090] O JTV-519 pode ser administrado a um sujeito através da promoção do contacto, in vivo, entre as células-alvo (e.g., células musculares cardíacas) do sujeito e o JTV-519. O JTV-519 pode ser colocado em contacto (e.g., introduzido) com as células de um sujeito através da aplicação de técnicas conhecidas de introdução e administração de proteínas, ácidos nucleicos e outros fármacos. Os exemplos de métodos para a promoção do contacto entre as células (i.e., tratamento das mesmas com JTV-519) e o JTV-519 incluem, sem limitação, a absorção, electroporação, imersão, injecção, introdução, entrega de lipossomas, transfecção, transfusão, vectores e outros 52 veículos e métodos de administração de fármacos. Quando as células-alvo são localizadas numa secção específica de um sujeito, pode ser desejável proceder à inserção directa do JTV-519 nas mesmas, por injecção ou quaisquer outros meios (e.g., através da introdução do JTV-519 na corrente sanguínea ou outro fluido corporal) . As células-alvo podem, por exemplo, estar contidas no tecido cardíaco de um sujeito podendo a sua presença nesse tecido do sujeito ser aferida através de métodos de detecção convencionais facilmente determinados a partir do conhecimento da área, incluindo os seus exemplos, sem limitação, técnicas imunológicas (e.g., coloração imunohistoquímica), técnicas de imagiologia por fluorescência e de microscopia.

[0091] 0 JTV-519 actualmente descrito pode, adicionalmente, ser administrado a um sujeito humano ou animal através de procedimentos conhecidos que incluem, sem limitação, a administração oral, parentérica e transdérmica. A administração do JTV-519 é, preferencialmente, concretizada através de injecção epifascial, intracapsular, intracraniana, intradérmica, intratecal, intramuscular, intra-orbital, intraperitoneal, intra-espinal, intra-esternal, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, subcutânea, subcutânea ou por meio de um cateter. Numa modalidade, o agente é administrado ao sujeito através de uma aplicação direccionada às células musculares cardíacas através de um cateter inserido no seu coração.

[0092] Para administraçao oral, uma formulação de JTV-519 pode ser apresentada em cápsulas, comprimidos, pós, grânulos ou encontrar-se na forma de suspensão. A formulação pode conter aditivos convencionais, tais como a lactose, manitol, amido de milho ou fécula de batata. A formulação pode ainda ser apresentada com aglutinantes, 53 tais como a celulose cristalina, derivados da celulose, goma-arábica, amido de milho ou gelatinas. Adicionalmente, a formulação pode ser apresentada com desintegradores, tais como o amido de milho, fécula de batata ou carboximetilcelulose de sódio. A formulação pode também ser apresentada com fosfato de cálcio anidro dibásico ou amidoglicolato de sódio. Finalmente, a formulação pode ser apresentada com lubrificantes, tais como o talco ou estearato de magnésio.

[0093] Para a administraçao parentérica (i.e., administração por injecção através de uma via não digestiva) o JTV-519 pode ser combinado com uma solução aquosa estéril preferencialmente isotónica relativamente ao sangue do sujeito. Tal formulação pode ser preparada através da dissolução de um ingrediente activo sólido em água com substâncias fisiologicamente compatíveis, tais como o cloreto de sódio, glicina e similares, e um pH tamponado compatível com as condições fisiológicas, de modo a produzir uma solução aquosa e a torná-la estéril. A formulação pode ser apresentada em recipientes de dose unitária ou múltipla, tais como ampolas ou frascos selados. A formulação pode ser administrada através de qualquer forma injectável incluindo, sem limitação, a injecção epifascial, intracapsular, intracraniana, intradérmica, intratecal, intramuscular, intra-orbital, intraperitoneal, intra-espinal, intra-esternal, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, subcutânea, subcutânea ou por meio de um cateter inserido no coração do sujeito.

[0094] Para a administração transdérmica, o JTV-519 pode ser combinado com intensificadores de penetração cutânea, tais como o propilenoglicol, polietilenoglicol, isopropanol, etanol, ácido oleico, N-metilpirrolidona e 54 similares, que aumentam a permeabilidade cutânea para o JTV-519 possibilitam que este atravesse a pele em direcção à corrente sanguínea. A composição de JTV-519/intensificador pode ainda ser combinada com uma substância polimérica, tal como a etilcelulose, hidroxipropilcelulose, co-polímero de etileno/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona e similares, de modo esta possa ser apresentada na forma de um gel solúvel em cloreto de metileno, evaporado até a viscosidade pretendida e, em seguida, aplicado a um material de suporte que lhe confira o formato de penso.

[0095] De acordo com o que foi aqui descrito, o JTV-519 pode ser administrado ao sujeito (e o JTV-519 pode ser posto em contacto com as células do sujeito) numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito, particularmente nas células do sujeito. Esta quantidade pode ser prontamente determinada pelo especialista na área, com base em procedimentos conhecidos, incluindo a análise de curvas de titulação determinadas in vivo e métodos e ensaios aqui apresentados. Uma quantidade adequada de JTV-519, eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito, pode variar de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia, e/ou pode ser uma quantidade suficiente para atingir níveis plasmáticos que variaram entre cerca de 300 ng/ml a cerca de 1000 ng/ml. De preferência, a quantidade de JTV-519 varia de cerca de 10 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia.

[0096] Numa modalidade do método, o sujeito ainda não desenvolveu uma condição cardíaca, como por exemplo uma arritmia cardíaca (e.g., taquicardia, arritmia auricular, incluindo taquicardia auricular e fibrilação auricular 55 (tanto permanente como não permanente) ; arritmia ventricular, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico. Neste caso, a quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito pode ser uma quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) no sujeito.

[0097] Tal como aqui empregue, uma quantidade de uma substância (e.g., JTV-519) "eficaz para prevenir uma condição cardíaca" inclui uma quantidade da substância (e.g., JTV-519) eficaz para prevenir o desenvolvimento da disfunção clínica ou sintomas da condição cardíaca. Por exemplo, quando a condição cardíaca é fibrilação auricular, a quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir a fibrilação auricular pode ser uma quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir palpitações e/ou coágulos sanguíneos no sujeito. Similarmente, quando a condição cardíaca é a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico, a quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico pode ser uma quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir as palpitações induzidas pelo exercício, desmaios, fibrilação ventricular, taquicardia ventricular e morte súbita cardíaca no sujeito. Adicionalmente, quando a condição cardíaca é insuficiência cardíaca, a quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir a insuficiência cardíaca pode ser uma quantidade de JTV-519 eficaz para prevenir a dificuldade respiratória, a tolerância reduzida ao exercício e a fadiga muscular precoce no sujeito. 56 [0098] A quantidade eficaz de um fármaco (e.g., JTV-519) para a prevenção de uma condição cardíaca irá variar de acordo com factores específicos a cada caso, que incluem o tipo e gravidade da condição, o peso do sujeito e a via de administração do fármaco (e.g., JTV-519). Esta quantidade pode ser facilmente determinada por especialistas na área, com base em procedimentos conhecidos que incluem ensaios clínicos e os métodos aqui descritos. Numa modalidade da presente invenção, a quantidade eficaz de um fármaco (e.g., JTV-519) para o tratamento da arritmia cardíaca induzida pelo esforço físico corresponde à quantidade eficaz de um fármaco (e.g., JTV-519) para a prevenção da morte súbita cardíaca induzida pelo esforço físico num determinado sujeito. Noutra modalidade, o fármaco (e.g., JTV-519) previne a ocorrência de, pelo menos, uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência cardíaca e a morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) num determinado sujeito.

[0099] Devido às suas capacidades de estabilização da FKBP12.6 ligada ao RyR2, manutenção e restabelecimento do equilíbrio num contexto dinâmico de fosforilação e desfosforilação do RyR2, o JTV-519 pode também ser útil no tratamento de um sujeito que tenha já começado a ser afectado pelos sintomas iniciais de uma determinada condição cardíaca. Caso os sintomas da condição cardíaca sejam observados suficientemente cedo nesse sujeito, o JTV-519 pode ser eficaz na limitação ou prevenção de uma redução adicional do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2. 57 [0100] Por conseguinte, noutra modalidade o sujeito já foi afectado pelo desenvolvimento de uma condição cardíaca. Por exemplo, o sujeito esteve ou encontra-se actualmente a exercer uma actividade física e desenvolveu uma arritmia cardíaca induzida pelo esforço físico. Nesse caso, a quantidade eficaz de JTV-519 para limitação ou prevenção do decréscimo do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito pode corresponder a uma quantidade de JTV-519 eficaz para o tratamento de uma condição cardíaca (e.g., uma arritmia cardíaca (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia, fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente) ; arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico) ou insuficiência cardíaca) num determinado sujeito.

[0101] Tal como aqui empregue, uma quantidade de um fármaco (e.g., JTV-519) "eficaz para o tratamento de uma condição cardíaca" inclui uma quantidade de um fármaco (e.g., JTV-519) eficaz no alívio ou melhoria da disfunção ou sintomas clínicos associados à condição cardíaca. Por exemplo, quando a condição cardíaca é a fibrilação auricular, a quantidade de JTV-519 eficaz para o seu tratamento pode corresponder à quantidade de JTV—519 necessária ao alívio ou melhoria de palpitações e/ou coagulação sanguínea num determinado sujeito. De modo semelhante, quando a condição cardíaca é a arritmia induzida pelo exercício físico, a quantidade de JTV-519 eficaz para o seu tratamento pode corresponder a uma quantidade de JTV-519 necessária ao alívio ou melhoria de palpitações induzidas pelo esforço, desmaio, fibrilação e taquicardia ventricular num determinado sujeito. Adicionalmente, quando a condição cardíaca é a insuficiência cardíaca, a quantidade eficaz de 58 JTV-519 para o seu tratamento pode corresponder à quantidade de JTV-519 necessária ao alívio ou melhoria da dificuldade respiratória, tolerância reduzida à prática de exercício e fadiga muscular precoce num determinado sujeito.

[0102] A quantidade eficaz de um fármaco (e.g., JTV-519) para o tratamento de uma condição cardíaca num sujeito irá variar de acordo com factores específicos a cada caso, que incluem o tipo e gravidade da condição, o peso do sujeito e a via de administração do fármaco (e.g., JTV-519). Esta quantidade pode ser facilmente determinada por especialistas na área, com base em procedimentos conhecidos que incluem ensaios clínicos e os métodos aqui descritos. Numa modalidade preferida, o fármaco (e.g., JTV-519) trata, pelo menos, uma condição cardíaca num determinado sujeito.

[0103] A presente invenção fornece ainda um método de tratamento para, pelo menos, uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência cardíaca e a morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) num determinado sujeito. 0 método pode compreender a administração de JTV-519 ao sujeito numa quantidade eficaz para o tratamento de, pelo menos, uma condição cardíaca. Uma quantidade eficaz de JTV-519 para o tratamento de uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia, arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo 59 exercício físico) ou insuficiência cardíaca) num determinado sujeito pode variar entre cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia e/ou corresponder a uma quantidade suficiente para obter uma concentração plasmática entre cerca de 300 ng/ml e cerca de 1000 ng/ml.

[0104] A presente invenção fornece ainda um método de prevenção da ocorrência de, pelo menos, uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente) ; arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência cardíaca e a morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) num determinado sujeito. O método pode compreender a administração de JTV-519 ao sujeito numa quantidade eficaz para a prevenção da ocorrência de, pelo menos, uma condição cardíaca. Uma quantidade eficaz de JTV-519 para a prevenção da ocorrência de uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia, arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência e morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) num determinado sujeito pode variar entre cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia e/ou corresponder a uma quantidade suficiente para obter uma concentração plasmática entre cerca de 300 ng/ml e cerca de 1000 ng/ml.

[0105] Em várias modalidades dos métodos anteriormente descritos, a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico num determinado sujeito encontra-se associada à TV. 60

Em modalidades preferidas, a TV é TVPC. Noutras modalidades destes métodos, o sujeito é um candidato ao desenvolvimento de arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico, sendo-o também para a ocorrência de morte súbita cardíaca de indução física.

[0106] Adicionalmente, atendendo aos métodos precedentes, a presente divulgação ensina ainda a utilizar o JTV-519 num método de limitação ou prevenção do decréscimo do nível de FKBP12.6 ligada ao RyR2 num sujeito que tenha ou seja candidato ao desenvolvimento de, pelo menos, uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia, arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) . A presente invenção possibilita ainda a utilização do JTV-519 num método de tratamento ou prevenção da ocorrência de, pelo menos, uma condição cardíaca (e.g., arritmia cardíaca (e.g., taquicardia; arritmia auricular, com inclusão da taquiarritmia e fibrilação auricular (tanto permanente como não permanente); arritmia ventricular, com inclusão da fibrilação ventricular e a arritmia cardíaca induzida pelo exercício físico), insuficiência cardíaca e a morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico) num determinado sujeito.

Novos métodos de triagem [0107] Como discutido acima e apresentado neste documento, os dados dos inventores mostram que a fosforilação pela quinase A da proteína (PKA) do receptor cardíaco da 61 rianodina, RyR2, na serina 2809 activa o canal por libertação da proteína de ligação de FK506, a FKBP12.6. Em corações com insuficiência, (incluindo corações humanos e modelos animais de insuficiência cardíaca), RyR2 é hiperfosforilada por PKA, resultando em canais defeituosos que têm menores quantidades de FKBP12.6 ligado e que têm uma maior sensibilidade à activação induzida por cálcio. O resultado destas mudanças é que os canais de RyR2 são "furados". Estas fugas do canal podem resultar num empobrecimento do armazenamento intracelular de cálcio a tal ponto que já não existe cálcio suficiente no reticulo sarcoplasmático (RS) para fornecer um forte estímulo para a contracção muscular. Isso resulta numa fraca contracção do músculo cardíaco. Como uma segunda consequência das fugas do canal, os canais RyR2 libertam cálcio durante a fase de repouso do ciclo do coração conhecida como "diástole". Esta libertação de cálcio durante a diástole pode desencadear as arritmias fatais dos corações (por exemplo, taquicardia ventricular e fibrilação ventricular) que causam morte súbita cardíaca (MSC).

[0108] Os inventores também têm demonstrado que o tratamento da insuficiência cardíaca com um dispositivo de bombeamento mecânico, conhecido como dispositivo auxiliar ventricular esquerdo (DAVE), que coloca o coração em repouso e restaura a função normalizada, é associado a uma redução na hiperf osf orilação pela PKA de RyR2 e a uma função do canal normalizada. Além disso, os inventores têm mostrado que o tratamento de cães (que têm insuficiência cardíaca induzida por estimulação) com bloqueadores de actividade (betabloqueadores) inverte a hiperfosforilação pela PKA do RyR2. Os betabloqueadores inibem a via que activa a PKA. A conclusão que se pode retirar dos resultados do trabalho dos inventores é que a fosforilação 62 pela PKA de RyR2 aumenta a actividade do canal, resultando na libertação de mais cálcio para a célula para um determinado gatilho (activador) do canal.

[0109] Como divulgado ainda subsequentemente aqui, inventores estabeleceram que condições cardíacas (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) estão associadas com um aumento na fosforilação de proteínas RyR2 (particularmente proteínas RyR2 mutantes associadas a TVPC) e a uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2. É possível utilizar este mecanismo para projectar fármacos eficazes no tratamento e prevenção dessas condições cardíacas. Um agente candidato com a capacidade para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 pode, em consequência desta actividade limitativa ou preventiva, ter efeito num evento biológico associado a RyR2, tratando ou prevenindo desta forma, tais condições cardíacas.

[0110] Nesse sentido, a presente divulgação fornece adicionalmente um método para a identificação de um agente para uso no tratamento ou prevenção de pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício). O método compreende as etapas de: (a) obter 63 ou gerar uma cultura de células contendo RyR2; (b) pôr as células em contacto com um agente candidato; (c) expor as células a uma ou mais condições, conhecidas por aumentarem a fosforilação de RyR2 nas células; e (d) determinar se o agente limita ou impede uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 nas células.

[0111] Tal como usado agui, um "agente" deve incluir uma proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico (incluindo DNA ou RNA), anticorpo, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, molécula, composto, antibiótico, fármaco e qualguer combinação destes. Um agente que limita ou impede uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 tanto pode ser natural como sintético e pode ser um agente que reaja com RyR2 e/ou FKBP12.6 (ou seja, um agente que tem afinidade, que se liga ou é dirigido contra RyR2 e/ou FKBP12.6) . Também tal como utilizado aqui, uma célula "contendo RyR2" é uma célula (de preferência, uma célula do músculo cardíaco) na qual o RyR2, ou um seu derivado ou homólogo, é naturalmente expresso ou ocorre naturalmente. As condições conhecidas por aumentarem a fosforilação do RyR2 nas células incluem, sem limitação, PKA.

[0112] No método da presente divulgação, as células podem ser postas em contacto com um agente candidato por qualquer dos métodos padrão para efectuar o contacto entre fármacos/agentes e células, incluindo quaisquer modos de introdução e administração aqui descritos. 0 nível do FKBP12.6 ligado a RyR2 na célula pode ser medido ou detectado por procedimentos conhecidos, incluindo qualquer um dos métodos, procedimentos moleculares e ensaios, conhecidos por um especialista na arte ou descritos neste documento. Numa modalidade da presente invenção, o agente 64 limita ou impede uma diminuição do nivel de FKBP12.6 ligado a RyR2 nas células.

[0113] Conforme divulgado aqui, RyR2 tem sido implicado numa série de eventos biológicos nas células do músculo estriado. Por exemplo, mostrou-se que os canais de RyR2 desempenham um papel importante no acoplamento e na contractilidade de CE em células musculares cardíacas. Portanto, é evidente que as drogas terapêuticas ou preventivas, projectadas para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligados a RyR2 nas células, especialmente células musculares cardíacas, podem ser úteis na regulação de uma série de eventos biológicos RyR2-associado, incluindo a contractilidade e acoplamento de EC. Assim, uma vez seleccionado o agente candidato da presente invenção, depois de determinado que tem um efeito limitativo ou preventivo adequado na diminuição dos níveis de FKBP12.6 ligados a RyR2, pode ser avaliado o seu efeito no acoplamento e contractilidade de CE em células, particularmente nas células musculares cardíacas. Espera-se que o agente terapêutico/preventivo da presente invenção venha a ser útil no tratamento ou prevenção de condições cardíacas, incluindo arritmias cardíacas (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente) ; arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício) , insuficiência cardíaca e morte súbita cardíaca induzida pelo exercício.

[0114] Nesse sentido, o método da divulgação presente ainda pode incluir as etapas de: (e) pôr uma cultura de células contendo RyR2 em contacto com o agente candidato; e (f) determinar se o agente tem um efeito sobre um evento biológico associado a RyR2 nas células. Tal como usado 65 inclui um aqui, um "evento biológico associado a RyR2" processo bioquímico ou fisiológico no qual os níveis ou a actividade RyR2 têm sido implicados. Conforme divulgado aqui, exemplos de eventos biológicos associados a RyR2 incluem, sem limitação, acoplamento e contractilidade de EC em células musculares cardíacas. De acordo com este método da presente invenção, um agente candidato pode ser posto em contacto com uma ou mais células (de preferência, células do músculo cardíaco) in vitro. Por exemplo, uma cultura de células pode ser incubada com uma preparação contendo o agente candidato. 0 efeito do agente candidato num biológico evento associado a RyR2 pode então ser avaliado por ensaios biológicos ou por métodos conhecidos na arte, incluindo ensaio imunoenzimático, gravações de canal único e quaisquer outros divulgados neste documento.

[0115] A presente divulgação descreve adicionalmente um agente identificado pelo método de identificação acima descrito, bem como uma composição farmacêutica que compreende o agente e um portador farmaceuticamente aceitável. 0 agente pode ser útil para a prevenção de morte súbita cardíaca induzida por exercício num doente e para tratar ou prevenir outras condições associadas a RyR2. Como usado aqui, uma "condição associada a RyR2" é uma condição, doença ou transtorno no qual têm sido implicados os níveis ou a actividade do RyR2 e inclui um evento biológico associado a RyR2 e uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício). 66 [0116] A condição associada a RyR2 pode ser tratada ou impedida no doente pela administração ao doente de uma quantidade do agente eficaz para tratar ou prevenir a condição associada a RyR2 no doente. Esta quantidade pode ser determinada facilmente por um perito na arte. Numa modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) num doente, por administração do agente ao doente numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir pelo menos uma condição cardíaca no doente.

[0117] A presente divulgação também fornece um método in vivo para a identificação de um agente para uso no tratamento ou prevenção de uma doença cardíaca (p. ex., uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) . 0 método compreende as etapas de: (a) obter ou gerar um animal que contém RyR2; (b) administrar um agente candidato ao animal; (c) expor o animal a uma ou mais condições conhecidas por aumentarem a fosforilação de RyR2 nas células; e (d) determinar se o agente limita ou impede uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligada a RyR2 no animal. 0 método ainda pode incluir as etapas de (e) , administrar o agente a um animal que contém RyR2; e (f) determinar se o agente tem um 67 efeito sobre um evento biológico associado a RyR2 no animal. Também é um agente identificado por esse método; uma composição farmacêutica que compreende este agente; e um método para tratar ou prevenir pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente), arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e insuficiência cardíaca induzida por exercício ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício) num doente, pela administração deste agente ao doente numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir pelo menos uma condição cardíaca no doente.

[0118] 0 trabalho dos inventores, demonstrou esperar que os compostos que bloqueiam a activação pela PKA reduzam a activação do canal de RyR2, resultando numa menor libertação de cálcio para a célula. Também se espera que os compostos que se ligam ao canal de RyR2 no local de ligação de FKBP12.6, mas que não saem do canal quando o canal é fosforilado pela PKA, diminuam a actividade do canal em resposta à activação pela PKA ou por outros gatilhos que activam o canal de RyR2. Tais compostos também deveriam provocar uma menor libertação de cálcio para a célula. Tendo em conta estes resultados, a presente divulgação fornece ainda para além disso, ensaios adicionais para a identificação de agentes que podem ser úteis para tratar ou prevenir condições cardíacas (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia auricular, arritmia, incluindo taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca do exercício induzida), insuficiência cardíaca ou morte súbita 68 cardíaca induzida por exercício), por bloquearem ou inibirem a activação de RyR2.

[0119] A título de exemplo, os ensaios de diagnóstico da divulgação presente podem rastrear a liberação de cálcio em células através do canal de RyR2, usando corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio (por exemplo, Fluo-3, Fura-2 e similares). As células podem ser carregadas com o corante fluorescente escolhido, e, em seguida, estimuladas com activadores de RyR2 para determinar se os compostos adicionados à célula reduzem ou não o sinal fluorescente dependente de cálcio (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994; Gillo et al., Calcium entry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Blood, 81:783-92, 1993; Jayaraman et al. , Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation. Science, 272:1492-94, 1996). Sinais fluorescentes dependentes de cálcio podem ser monitorizados com um tubo fotomultiplicador e analisados com o software adequado, como descrito anteriormente (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994; Gillo et al., Calcium entry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Blood, 81:783-92, 1993; Jayaraman et ai., Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation. Science, 272:1492-94, 1996). Este ensaio pode ser facilmente automatizado para um grande número de compostos usando rastreio com placas multipoços.

[0120] Para identificar os compostos que inibem a activaçao pela PKA dependente da libertação de cálcio intracelular mediada por RyR2, um ensaio pode envolver a expressão 69 recombinante de canais de RyR2 num sistema de expressão heteróloga, como células Sf9, HEK293 ou CHO (Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK50β-binding protein. Cell, 77:513-23, 1994). 0 RyR2 também poderia ser co-expresso com receptores beta-adrenérgicos. Isto permitiria a avaliação do efeito dos compostos na activação de RyR2, em resposta à adição de agonistas dos receptores beta-adrenérgicos.

[0121] 0 nivel de fosforilação pela PKA do RyR2 gue se correlaciona com o grau de insuficiência cardíaca também pode ser analisado e, em seguida, usado para determinar a eficácia dos compostos projectados para bloguear a fosforilação do canal de RyR2 pela PKA. Um tal ensaio pode basear-se na utilização de anticorpos gue são específicos para a proteína RyR2. Por exemplo, a proteína de canais de RyR2 pode ser imunoprecipitada e, em seguida, retro-fosforilada pela PKA e [gamma32P] -ATP. A quantidade de marcador radioactivo do [32P] que é transferido para a proteína RyR2 pode ser medida, em seguida, usando um Phosphorimager (Marx et al., PKA phosphoryla ion dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000).

[0122] Outro ensaio da presente divulgação envolve o uso de um anticorpo específico do fosfoepítopo que detecta RyR2 que é fosforilado pela PKA na Ser 2809. Pode utilizar-se o ensaio imunoenzimático neste anticorpo para avaliar a eficácia da terapia para insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas. Além disso, podem ser usados ratos knock-in RyR2 S2809A e RyR2 S2809D para avaliar a eficácia da terapia para insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas. Estes ratos fornecem provas adicionais de que a hiperfosforilação 70 pela PKA de RyR2 é um factor que contribui para a insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas, mostrando que a mutação S2809A de RyR2 inibe arritmias e insuficiência cardíaca, e que a mutação S2809D de RyR2 agrava a insuficiência cardíaca e arritmias.

Novos derivados de 1.4-Benzotiazepina e métodos de síntese dos mesmos [0123] Os derivados de 1,4-benzotiazepina, particularmente os derivados de 2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina, são pedras de base importantes na preparação de moléculas biologicamente activas, incluindo JTV-519. Os inventores desenvolveram um processo novo para a preparação de compostos intermediários de 1,4-benzotiazepina, tal como 7-metoxy-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina. 0 processo dos inventores utiliza matérias-primas baratas e prontamente disponíveis e proporciona altos rendimentos de intermediários chave de 1,4-benzotiazepina.

[0124] No início dos anos 1990, Kaneko et al. (Patente US 5,416,066; WO 92/12148; JP4230681) divulgaram que o JTV-519 poderia ser preparado pela reacção de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina (um intermediário de 1,4-benzotiazepina) com cloreto de acriloilo e, em seguida, fazendo reagir o produto resultante com 4-benzil piperidina.

[0125] Foram anteriormente relatados dois processos para a preparação de compostos de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina na literatura. O primeiro processo, divulgado por Kaneko et al. (Patente US n.° 5,416,066), envolveu um mecanismo sintético de seis etapas que começou com ácido benzoico-2,5. Neste processo, o ácido benzoico- 71 2,5 foi metilado selectivamente com sulfato de dimetilo. 0 composto resultante reagiu então com cloreto de dimetiltiocarbamoilo durante 20 h, sendo então submetido a alta temperatura (270° C) durante 9 h. O produto desta etapa foi a refluxo com metóxido de sódio em metanol durante 20h. O produto da etapa de refluxo foi então reagir com 2-cloroetilamina, sob condições básicas e a uma temperatura elevada, para produzir uma amida ciclizada. A amida ciclizada foi reduzida com LÍA1H4 para produzir 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina (um intermediário de 1,4-benzotiazepina).

[0126] O segundo processo para a preparação de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina foi divulgado por Hitoshi numa patente japonesa (10045706 JP). Este processo começou com 2-bromo-5-metoxi benzaldeido. O brometo foi substituído com NaSMe, e o produto resultante foi oxidado com cloro, seguido por refluxo em água, para produzir dissulfureto de dialdeído. O dialdeído foi tratado com 2-cloroetilamina, e o produto resultante foi reduzido com um agente redutor, como NaBH4. O composto resultante foi ciclizado a 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina.

[0127] Inicialmente, os inventores tentaram preparar o intermediário de 1,4-benzothiazepine, 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina, usando os métodos descritos acima. No entanto, eles descobriram que o primeiro processo, descrito por Kaneko et al. (Patente US n.° 5,416,066), envolveu etapas sintéticas de alta temperatura e longo tempo de reacção. Além disso, os inventores descobriram que o grupo tio no terceiro intermediário tiolado foi oxidado facilmente pelo ar para dar um composto de dissulfeto, tornando impossível sintetizar o produto ciclizado subsequente. Os inventores também determinaram 72 que o processo descrito por Hitoshi (JP 10045706) envolveu CI2, e que outro método patenteado para a preparação do primeiro intermediário, além da substituição do brometo com NaSMe, teve de ser usado.

[0128] Para superar os problemas anteriores, os inventores desenvolveram um novo processo para fazer 7-metoxi-2,3, 4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina a partir de matérias-primas baratas e prontamente disponíveis. O processo dos inventores simplifica os passos de isolamento e purificação e pode ser usado para preparar vários intermediários de 1.4- benzotiazepina, incluindo 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro- 1.4- benzotiazepina e outros compostos com a estrutura geral mostrada na fórmula:

'3

Ri=n-MeO, n-MeS, n-alquilo, n=6, 7, 8, 9 R2=alquilo R3=alquilo

Este processo também pode ser usado para preparar JTV-519.

[0129] Nesse sentido, em vista do exposto, a presente divulgação fornece um método para a síntese de um composto com a fórmula:

73

Onde, R = OR', SR', NR', alquilo, ou haleto e R' = alquilo, arilo, ou H, e onde R pode estar na posição 2, 3, 4 ou 5, dito método que inclui as etapas de: (a) tratar um composto com a fórmula:

em que R é como definido acima, com um agente redutor, na presença de um catalisador opcional, para formar um composto de fórmula:

em que R é como definido acima; (b) tratar o composto formado na etapa (a) com um agente de diazotização e um dissulfureto, para formar um composto de fórmula:

em que R é como definido acima; (c) tratar o composto formado na etapa (b) com um agente de activação e cloroetilamina, para formar um composto de fórmula: 74

em que R é como definido acima; (d) tratar o composto formado na fase c com um agente redutor e uma base, para formar um composto de fórmula: em que R é como definido acima; e (e) tratar o composto formado no passo (d) com um agente redutor, para formar um composto de fórmula:

R onde R é como definido acima.

[0130] Segundo o método da presente divulgação, o agente redutor na etapa (a) pode ser H2. Além disso, o agente de diazotização na etapa (b) pode ser NaN02 e o dissulfureto 75 na etapa (b) pode ser Na2S2. Além disso, o cloreto na etapa (c) pode ser S0C12. 0 agente redutor no passo (d) pode ser trimetilfosfina (PMe3) , enquanto que a base no passo (d) é trietilamina. Numa outra modalidade, o agente redutor na etapa (e) é LiAlH4.

[0131] A presente divulgação fornece ainda um método para a síntese de um composto de fórmula:

O

onde R = OR', SR', NR', alquilo, ou haleto e R' = alquilo, arilo ou H, e onde R pode estar na posição 2, 3, 4 ou 5, dito método compreendendo os passos de: (a) tratar um composto com a fórmula:

em que R é como definido acima, com cloreto de 3-bromopropiónico e um composto tendo a fórmula:

para formar um composto com fórmula: 76

onde R é como definido acima.

[0132] A titulo de exemplo, um composto com a fórmula:

onde R = OR' , SR', NR', alquilo, ou haleto e R' = alquilo, arilo, ou H, e onde R pode estar na posição 2, 3, 4 ou 5, pode ser sintetizado da seguinte forma: 77

1 » JTV-ôtS (fteOCN^ onde R = OR', SR' λ-m i Ί , , , ΰΚ ' NR', alquilo ou haleto; R' = alquilo, arilo ou H e onde r . . ~ ^ _ . _ K pode estar na posição 2, 3, 4 ou 5.

[0133] A título de exemplo, e como mostrado no exemplo 9 e esquema 1 abaixo, 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina pode ser preparada a partir de ácido 2-nitro-5-metoxibenzóico da seguinte maneira. 0 grupo nitro do ácido 2-nitro-5-metoxibenzóico é reduzido, usando H2 com Pd/C como catalisador, para dar ácido 2-amino-5-metoxibenzóico. 0 ácido 2-amino-5-metoxibenzóico pode ser diazotado com NaN02 e então tratado com Na2S2, para fornecer um composto estável de bissulfureto. Sem mais purificação, o composto estável de bissulfureto pode ser tratado com S0C12 e então reagir com 2-cloroetilamina, na presença de Et3N, para dar uma amida. O composto de amido pode ser 78 convertido para um composto cíclico através de um procedimento "one-pot", como segue. Um reagente redutor (como trimetilfosfina ou trifenilfosfina) e uma base (tal como a trietilamina) podem ser adicionadas a uma solução de amida composta em THF (tetrahidrofurano). A mistura resultante da reacção pode então sofrer refluxo durante 3h. 0 agente redutor (trimetilfosfina ou trifenilfosfina) cliva o dissulfureto (S-S) para a sua forma monossulfureto (-S), que, in situ, sofre ciclização intramolecular com o cloreto para produzir uma amida cíclica. A amida cíclica, em seguida, pode ser reduzida com LiAlH4 para produzir o intermediário de 1,4-benzothiazepine, o 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina. 0 JTV-519 pode então ser preparado a partir de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina, por reacção de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina com cloreto de 3-bromopropiónico e reagindo, em seguida, o composto resultante com 4-benzil piperidina.

[0134] A presente divulgação fornece ainda uma composição, que inclui JTV-519 com marcação radioactiva. A marcação do JTV-519 pode ser realizada usando um entre uma variedade de diferentes marcadores radioactivos conhecidos na arte. O marcador radioactivo da presente invenção pode ser, por exemplo, um radioisótopo. Os radioisótopos podem ser qualquer isótopo que emita radiação detectável, incluindo, sem limitação, 35S, 125I, 3H ou 14C. A radioactividade emitida pelo radioisótopo pode ser detectada por técnicas bem conhecidas na arte. Por exemplo, a emissão gama do radioisótopo pode ser detectada usando a gama de técnicas de imagiologia, particularmente cintilografia.

[0135] A título de exemplo e como mostrado no exemplo 10 e figura 2 do esquema abaixo, JTV-519 com marcação 79 radioactiva pode ser preparado da seguinte maneira. 0 JTV-519 pode ser desmetilado no anel fenilo usando BBr3. 0 composto de fenol resultante pode então ser re-metilado com um agente de metilação marcado radioactivamente (como o sulfato de 3H-dimetilo) na presença de uma base (por exemplo, NaH) para fornecer JTV-519 marcado com 3H.

[0136] A presente divulgação fornece adicionalmente novos intermediários e derivados de 1,4-benzotiazepina e, incluindo 2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepenos que são semelhantes ao JTV-519. A titulo de exemplo, a divulgação presente fornece compostos com as seguintes fórmulas:

«-R

onde R = arilo, alceno, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo;

Q

onde R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo;

(o) m 80 onde R = CO (CH2)nXR2, S02 nXR (CH2)2, ou S02NH (CH2) nXR2 e X = N ou S e n = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2; e

e em que R = arilo, alquilo, -(CH)2nNR'2, -(CH2)nSR', e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou O. Também são fornecidos adicionalmente compostos de 2, 3, 4, 5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina com as seguintes fórmulas:

onde RI = OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; onde R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo;

«>)m onde Ri = H, OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo; onde m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1; e 81 ο Λ

Ra r2 // Ra em que Ri = H, OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R3 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R4 = H, haleto, alceno, carboxilo ou um alquilo que contém 0, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2.

[0137] Exemplos de novos compostos de 1,4-benzotiazepina dos inventores incluem, sem limitação, S7, S-20, S-25, 27-S e S36. De preferência, o composto é S36. Estruturas para S7, S-20, S-25, S-27, e S36 podem ser encontradas na Fig. 15 do presente requerimento. Estes e outros quaisquer novos compostos da presente invenção podem ser associados com um transportador farmaceuticamente aceitável, como descrito acima, de modo a formar uma composição farmacêutica.

[0138] A presente divulgação mais fornece métodos para sintetizar os novos compostos de 1,4-benzotiazepina divulgados neste documento. Por exemplo, a divulgação presente fornece um método para a síntese de um composto tendo a fórmula:

«-R 82

onde R = arilo, alceno, alquilo, (CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo, compreendendo as etapas de: (a) tratar um composto com a fórmula:

com um composto de cloreto de sulfonilo (incluindo qualquer derivado do cloreto de sulfonilo) e uma base, para formar um composto com a fórmula:

O M

(b) opcionalmente, tratar o composto formado na etapa (a) com uma amina primária ou secundária, para formar um composto com a fórmula:

MeO

onde R é como definido acima. Numa modalidade, o composto de cloreto de sulfonilo na etapa (a) é seleccionado do grupo constituído por cloreto de alquilsulfonilo e cloreto de arilsulfonilo. Noutra modalidade, a base na etapa (a) é Et3N. Noutra modalidade, a amina primária ou secundária no passo (b) é 4-benzilpiperidina. 83 [0139] O método da divulgação pode ainda incluir a etapa de oxidação do composto com a fórmula:

MeO

onde R = arilo, alceno, alquilo, -(CH2)nNR '2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo, com um agente oxidante, para formar um composto tendo fórmula:

MeO

em que R é definido como acima e em que m = 1 ou 2. Numa modalidade da presente invenção, o agente oxidante é o peróxido de hidrogénio.

[0140] A titulo de exemplo e como mostrado no exemplo 11 e esquema 3, os inventores desenvolveram um método de síntese de compostos com a estrutura geral:

onde R = arilo, alceno, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo. Novos compostos dessa estrutura geral podem ser preparados por reacção do 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina com cloreto de alquilsulfonilo ou cloreto de arilsulfonilo, na presença de uma base tal como Et3N. Reacções adicionais 84 (por exemplo, a adição de 4-benzil piperidina) podem seguir-se, para estender a cadeia lateral conforme desejado. Como demonstra o esquema 3, pode ser adicionado cloreto de 2-cloroetanosulfonilo (p. ex., 180 mg; 1,1 mM) e Et3N (p. ex., 140 mg; 1,1 mM) ao 7-metoxi-2,3, 4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina (1) (p. ex., 194 mg; 1 mM) em CH2C12 (por exemplo, 20 ml), a 0 0 C. A mistura pode ser agitada (por exemplo, a 0 0 C durante 2 h) e lavada (por exemplo, com H20 e solução saturada de NaHC03) . Remoção do solvente irá produzir um produto bruto, que pode ser purificado por cromatografia em gel de sílica. A estrutura pode ser confirmada por NMR. Para além disso, o esquema 3 mostra que a cadeia lateral do composto resultante pode ser prolongada por reacção do composto (por exemplo, 28 mg; 0,1 mM) com 4-benzil piperidina (por exemplo, 21 mg; 0,13 mM) em CH2C12. Depois de a reacção terminar, a amina em excesso pode ser removida por um limpador de base (por exemplo, 3 -gel de silicone de propilo funcionalizado (anidrido succínico-2), 0,5 g).

[0141] A presente divulgação também fornece um método para a síntese de um composto de fórmula:

onde R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou - (CH2) nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo, compreendendo a etapa de tratamento de um composto tendo a fórmula: 85

MeO com um cloreto de sulfurilo e uma amina primária ou secundária, na presença de uma base, para formar um composto com a fórmula:

MeO

onde R é definido como acima. Numa modalidade da presente invenção, a base é Et3N. Noutra modalidade, a amina primária ou secundária é 1-piperonilpiperazina.

[0142] 0 método da presente divulgação pode ainda incluir a etapa de oxidação do composto tendo fórmula:

MeO. ^ v~n'5'n-r tG”

Onde R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo, para formar um composto tendo fórmula:

MeO. %-N-* XXL) S mel or 2 (Ojm em que R é definido como acima e em que m = 1 ou 2. Numa modalidade, o agente oxidante é o peróxido de hidrogénio. 86 [0143] A título de exemplo e como mostrado no exemplo 11 e 4 do esquema, os inventores desenvolveram um método de síntese de compostos com a estrutura geral:

onde R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo. Novos compostos dessa estrutura geral podem ser preparados por uma reacção "one-pot" de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina com cloreto de sulfurilo, na presença de uma base (por exemplo, Et3N) , seguida de uma amina primária ou secundária. Como demonstra o esquema 4, cloreto de sulfurilo (por exemplo, 15,0 mg; 0.111 mM) e Et3N (por exemplo, mg 28,0; 0,22 mM) podem ser adicionados ao 7- metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina (por exemplo, 19,4 mg; 0,1 mM) em CH2C12 (por exemplo, 20 ml), a 0o C. Após a agitação da mistura (por exemplo, 2h a 0°C), pode ser adicionada 1-piperonilpiperazina (p. ex., 27 mg; 0,12 mM) . A mistura pode ser agitada outros 2h e então lavada (por exemplo, com H20 e uma solução saturada de NaHC03) . A amina em excesso pode ser removida pela adição de uma armadilha de bases (por exemplo, sílica gel 3- (2-anidrido-succínica) funcionalizada com propilo, 0,2 g).

[0144] A presente divulgação ainda fornece um método para a síntese de um composto de fórmula:

(O)m onde R = CO (CH2)nXR2, S02nXR (CH2)2, ou S02NH (CH2)nXR2 e X = N ou S e n = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e 87 em que m = 1 ou 2, que compreende a etapa do tratamento de um composto tendo fórmula:

em que R é como definido acima, com um agente oxidante, para formar um composto tendo fórmula:

m= 1 ou 2 em que R e m são como definidos acima. Numa modalidade, o agente oxidante é o peróxido de hidrogénio. Esse método também pode ser usado para oxidar JTV-519.

[0145] A presente divulgação fornece ainda um método para a síntese de um composto de fórmula:

R

m* 1 ou 2 (0)m onde R = CO (CH2)nXR2, S02nXR (CH2)2, ou S02NH (CH2)nXR2 e X = N ou S e n = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2, que compreende a etapa do tratamento de um composto com fórmula: O u

com um agente oxidante, para formar um composto tendo fórmula: 88

R

MeON^?sN/-*N'

(0)m m= 1 ou 2 em que R e m são como definido acima. Numa modalidade, o agente oxidante é o peróxido de hidrogénio. Esse método também pode ser usado para oxidar JTV-519.

[0146] A titulo de exemplo e como mostrado no exemplo de 11 e no esquema 5, a presente divulgação fornece um método de síntese de compostos com a estrutura geral:

onde R = CO (CH2)nXR2, S02nXR (CH2)2, OU S02NH (CH2)nXR2 e X = N ou S e n = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2. Novos compostos dessa estrutura geral podem ser preparados pela oxidação do JTV-519, ou dentre os novos derivados de 1,4-benzotiazepina divulgados aqui, com peróxido de hidrogénio. Como mostra o esquema de 5, o composto 1,4-benzotiazepina de interesse (por exemplo, 21 mg; 0,05 mM) em MeOH (por exemplo, 5 ml) pode ser adicionado a H202 (por exemplo, 0,1 ml, excesso) . A mistura pode ser agitada (por exemplo, 2 dias), e o produto resultante pode ser purificado por cromatografia em gel de silicone (por exemplo, CH2Cl2:MeOH = 10:1) [0147] Além disso, a presente divulgação fornece um método para a síntese de um composto tendo fórmula: 89

onde R 0 = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou 0, compreendendo a etapa de tratamento de um composto tendo fórmula:

com um composto de cloreto de carbonilo, na presença de uma base e com uma amina primária ou secundária ou um álcool, para formar um composto com a fórmula:

em que R e X são como definidos acima. Numa modalidade, o composto cloreto de carbonilo é trifosgeno. Noutra modalidade, a base é Et3N. Noutra modalidade, a amina primária ou secundária é 4-benzilpiperidina.

[0148] A titulo de exemplo e como mostrado no exemplo de 11 e no esquema 6, os inventores desenvolveram um método de síntese de compostos com a estrutura geral:

90 onde R = alquilo, arilo, -nNR (CH2) 2, ~ (CH2) nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou O. Novos compostos desta estrutura geral podem ser preparados pela reacção de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina com trifosgeno, na presença de uma base (por exemplo, Et3N) , seguido pela adição de uma amina primária ou secundária ou um álcool.

[0149] A presente divulgação fornece ainda um método para a síntese de compostos de 2, 3, 4, 5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina tendo fórmula:

R2 onde Ri = OR', SR', NR', alquilo ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; onde R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo, compreendendo as etapas de: (a) tratar um composto com a fórmula:

CO*H N02 em que Ri é como definido acima, com um agente redutor, na presença de um catalisador opcional, para formar um composto tendo fórmula:

em que R2 é como definido acima; (b) tratar o composto formado na etapa (a) com um agente de diazotização e um dissulfureto um composto com fórmula: , para formar 91

em que RI é como definido acima; (c) tratar o composto formado na etapa (b) com um agente de activação e cloroetilamina, para formar um composto com fórmula:

Ri, R2 e R3 são conforme definido acima; (d) tratar o composto formado na fase c com um agente redutor e uma base para formar um composto com fórmula:

onde Ri, R2 e R3 sao definidos como acima; e (e) tratar o composto formado no passo (d) com um agente redutor, para formar um composto tendo fórmula:

92

Ri, R2 e R3 conforme definido acima.

[0150] Os novos compostos de 1,4-benzotiazepina dos inventores partilham as caracteristicas funcionais de JTV-519. Por exemplo, tal como o JTV-519 (mwt = 423), o composto S36 (mwt = 267) regula os canais de cálcio. Na verdade, S36 (um ácido carboxilico) é aproximadamente 10 vezes mais potente que JTV-519 na regulação de canais de cálcio (dados não mostrados). Ao contrário do JTV-519, no entanto, os novos compostos dos inventores mostram fraca actividade de bloqueio de hERGs.

[0151] 0 canal (I(Kr)) rectificador retardado rápido - um canal de potássio - é importante para a repolarização do potencial de acção cardíaco. hERG é a subunidade que forma o poro do canal I (Kr) . Supressão da função de I (Kr) - como resultado de efeitos adversos de fármacos e/ou defeitos genéticos em hERG - pode levar à síndrome de (LQT) long-QT, que leva a aumento do risco de arritmias potencialmente fatais. hERGs, então, são subunidades do canal de potássio que, quando bloqueadas, podem causar arritmias cardíacas e morte súbita cardíaca.

[0152] Os compostos dos inventores reduziram significativamente o bloqueio de hERG (canais de I(Kr)), quando comparados com JTV-519. Como mostrado na Fig. 4-7, por exemplo, um dos compostos dos inventores, S36, tem actividade de bloqueio de hERG que é aproximadamente 5 - a 10 vezes menor do que a actividade de bloqueio de hERG do JTV-519. Porque os compostos dos inventores têm fraca actividade de bloqueio de hERG deverão ser menos tóxicos do que JTV-519. 93 [0153] Baseado no acima exposto, os novos compostos de 1,4-benzotiazepina dos inventores são mais potentes do que JTV-519 e reduziram a toxicidade. Assim, acredita-se que os compostos inovadores dos inventores serão particularmente úteis para qualquer um dos métodos acima descritos para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 num paciente, incluindo um paciente que tem, ou é um candidato a, pelo menos uma condição cardíaca, incluindo, sem limitação, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente), arritmia ventricular, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca e morte súbita cardíaca induzida pelo exercício.

[0154] Concordantemente, a presente divulgação fornece ainda adicionalmente um método para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligada a RyR2 num paciente, através da administração de um agente para o paciente, numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 no paciente. 0 agente da presente divulgação pode ser qualquer derivado de 1,4-benzotiazepina, incluindo o seguinte:

onde R = arilo, alceno, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou - (CH2) nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; 94

onde R = 1, 2, ou arilo, alquilo - nNR (CH2)2, ou -(CH2)nSR e n = 0, 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo;

(O)m onde R = N ou S e em que m CO (CH2)nXR2, S02nXR (CH2)2, ou S02NH (CH2)nXR2 e X = η = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e = 1 ou 2;

onde R = 2, ou 3 0; alquilo, arilo, - nNR (CH2) 2, - (CH2) nSR' e n = 0, 1, e R'= alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou

Ri-r

onde Ri 3, 4 ou R2 = H, arilo; = OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo alquilo ou arilo; e em que R3 = H, posição 2, ou H; onde alquilo ou 95 // R3 «>Vn onde Ri = H, OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R3 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1; [0155] Conforme descrito acima, o sujeito pode ser qualquer animal, mas é de preferência um ser humano. Numa modalidade, o sujeito tem taquicardia ventricular catecolaminérgica, polimórfica (CPVT). Noutra modalidade, o sujeito tem, ou é um candidato para, pelo menos uma condição cardiaca, incluindo, sem limitação, uma arritmia cardiaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardiaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca e morte súbita cardíaca induzida pelo exercício.

[0156] No método da presente divulgação, pode ser administrado um derivado de 1,4-benzotiazepina a um sujeito como parte de uma composição terapêutica que compreende o derivado e um transportador farmaceuticamente aceitável, tal como descrito acima. 0 derivado ou a composição farmacêutica podem ser administrados ao sujeito por meio de quaisquer das técnicas conhecidas na arte e/ou divulgadas aqui. 96 [0157] Segundo o método da presente divulgação, um derivado de 1,4-benzotiazepina pode ser administrado a um sujeito (e o derivado de 1,4-benzotiazepina pode ser posto em contacto com células do sujeito) num valor eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 no sujeito, particularmente nas células do sujeito. Esta quantidade pode ser facilmente determinada por um perito na arte, com base em procedimentos conhecidos, incluindo análise de curvas de titulação estabelecidas in vivo, e métodos e ensaios divulgados neste documento. Uma quantidade adequada do derivado de 1,4-benzotiazepina eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 no sujeito pode variar de cerca de 5 mg/kg/dia até aproximadamente 20 mg/kg/dia, e/ou pode ser uma quantidade suficiente para atingir níveis plasmáticos que variam de cerca de 300 ng/ml até cerca de 1000 ng / ml. Preferencialmente, a quantidade de derivados de 1,4-benzotiazepina varia de cerca de 10 mg/kg/dia até aproximadamente 20 mg/kg/dia.

[0158] Segundo o método da presente divulgação, uma diminuição do nivel de FKBP12.6 ligado a RyR2 pode ser limitada ou impedida no sujeito, diminuindo o nível de RyR2 fosforilada no sujeito. Numa modalidade da presente invenção, o sujeito não desenvolveu ainda uma condição cardíaca, como arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício. Neste caso, a quantidade do derivado de 1,4-benzotiazepina eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 no sujeito pode ser uma quantidade de 97 derivado de 1,4-benzotiazepina eficaz para evitar uma condição cardíaca (por exemplo, arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) no sujeito. Numa modalidade, o derivado de 1.4- benzotiazepina impede pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia auricular arritmia, incluindo taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca do exercício induzida), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) no sujeito.

[0159] Noutra modalidade, o sujeito já desenvolveu uma condição cardíaca. Neste caso, a quantidade do derivado de 1.4- benzotiazepina eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 no sujeito pode ser uma quantidade de derivado de 1,4-benzotiazepina eficaz para tratar uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente), arritmia ventricular, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício) ou insuficiência cardíaca) no sujeito. Numa modalidade preferencial, o JTV-519 trata pelo menos uma condição cardíaca no sujeito.

[0160] A presente divulgação fornece ainda um método para tratar ou impedir uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente) ; arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte 98 súbita cardíaca induzida por exercício) num sujeito, compreendendo a administração de um agente ao sujeito, numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 no sujeito. 0 agente da presente divulgação pode ser qualquer derivado de 1,4-benzotiazepina, incluindo o seguinte:

onde R = arilo, alceno, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo;

onde R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo;

onde R - CO (CH2)nXR2, S02 (CH2)nXR2, ou S02NH(CH2)nXR2 e X = N ou S e η - 1, 2, ou 3 e R' = alquila ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2;

(d) 99 onde R = alquilo, arilo, -(CH2)nNR' 2, -(CH2)nSR' e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou O;

onde RI = OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 do anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; onde R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo;

(0 onde RI = H, OR' , SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R3 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1;

(°Vn (g) onde RI = H, OR' , SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R3 = H, 100 alquilo, alceno ou arilo; onde R4 = H, haleto, alceno, carboxilo ou um alquilo que contém 0, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada dos compostos acima de (a)-(g) [0161] A presente divulgação fornece ainda um método para tratamento de pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente) ; arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício) ou insuficiência cardíaca) num sujeito. 0 método compreende a administração de um derivado de 1,4-benzotiazepina ao sujeito numa quantidade eficaz para tratar pelo menos uma condição cardíaca no sujeito. Uma quantidade adequada do derivado de 1,4-benzotiazepina eficaz para tratar uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente) ; arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício) ou insuficiência cardíaca) num sujeito pode variar de cerca de 5 mg/kg/dia até aproximadamente 20 mg/kg/dia, e/ou pode ser uma quantidade suficiente para atingir niveis de plasma variando de cerca de 300 ng/ml a cerca de 1000 ng/ml.

[0162] A presente divulgação também fornece um método para a prevenção de pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou 101 morte súbita cardíaca induzida por exercício) num sujeito. 0 método compreende a administração de um derivado de 1,4-benzotiazepina ao sujeito numa quantidade eficaz para evitar que pelo menos uma condição cardíaca no sujeito. Uma quantidade adequada do derivado de 1,4-benzotiazepina eficaz para evitar que pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente) ; arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), falha de coração, ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) num sujeito que pode variar de cerca de 5 mg/kg/dia até aproximadamente 2 0 mg/kg/dia, e/ou pode ser uma quantidade suficiente para atingir níveis de plasma variando de cerca de 300 ng/ml a cerca de 1000 ng/ml.

[0163] Em conformidade com os métodos acima descritos, exemplos de derivados de 1,4-benzotiazepina, incluem, sem limitação:

onde R = arilo, alceno, alquilo, -(CH2)nNR'2, ou (CH2)nSR' , e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo;

onde R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2, ou -(CH2)nSR', e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; 102 onde R = CO(CH2)nXR'2, S02(CH2)nXR'2, ou S02NH(CH2)nXR'2, e X = N ou S, e n = 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2;

(d) onde R = alquilo, arilo, -(CH2)nNR' 2, - (CH2)nSR',e n = 0, 1, 2, ou 3 e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou O;

Ra r2 (C) onde RI = OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; onde R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo;

(0 onde RI = H, OR' , SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R3 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1;

(g) onde Rl = H, OR', SR', NR', alquilo, ou haleto, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; onde R2 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R3 = H, alquilo, alceno ou arilo; onde R4 = H, haleto, alceno, carboxilo ou um alquilo que contém O, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada dos compostos acima de (a)-(g). Numa modalidade da presente invenção, o derivado de 1,4-benzotiazepina é seleccionado do grupo constituído por S4, S7, S-20, S-24, S-25, 26-S, S-27 e S36. De preferência, o derivado de 1,4-benzotiazepina é S36. A presente divulgação também fornece usos desses derivados de 1,4-benzotiazepina em métodos para tratar ou prevenir pelo menos uma condição cardíaca (por exemplo, uma arritmia cardíaca (por exemplo, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular e fibrilação auricular (permanente e não permanente); arritmias ventriculares, incluindo fibrilação ventricular; e arritmia cardíaca induzida por exercício), insuficiência cardíaca ou morte súbita cardíaca induzida por exercício) num sujeito.

[0164] A presente divulgação também fornece novos ensaios para rastreio regular ou de alto rendimento de outras biologicamente activas que melhoram a ligação de FKBP12.6 e RyR2. Em particular, a presente divulgação fornece um método para a identificação de um agente que aumente a ligação de RyR2 e FKBP12.6, compreendendo as etapas de: (a) 104 obter ou gerar uma fonte de RyR2; (b) expor o RyR2 ao FKBP12.6, na presença de um agente candidato; e (c) determinar se o agente reforça a ligação de RyR2 e FKBP12.6. Numa modalidade, RyR2 é fosforilada pela PKA. Noutra modalidade, RyR2 é hiperfosforilada pela PKA. Ainda noutra modalidade, o RyR2 não é fosforilado.

[0165] No método da presente divulgação, o RyR2 é imobilizado numa fase sólida, como uma placa ou grânulos. Para facilitar a detecção da ligação RyR2-FKBPl2.6, o FKBP12.6 pode ser marcado radioactivamente (por exemplo, com 32S) . Além disso, a maior ligação do RyR2 e FKBP12.6 pode ser detectada usando um agente de ligação de FKBP12.6. Numa modalidade, o agente de ligação de FKBP12.6 é um anticorpo anti-FKBP12.6. A presente divulgação também fornece um agente identificado por este método, assim como também usa este agente em métodos para limitar ou prevenir uma diminuição do nível de FKBP12.6 ligado a RyR2 num sujeito; em métodos para tratar ou prevenir a insuficiência cardíaca, fibrilação auricular ou arritmia cardíaca induzida pelo exercício em um sujeito; e em métodos para impedir a morte súbita cardíaca induzida por exercício em um sujeito.

[0166] Além disso, a presente divulgação fornece um método para identificar um agente para reforçar a ligação de RyR2 e FKBP12.6, compreendendo as etapas de: (a) obter ou gerar uma fonte de FKBP12.6; (b) expor o FKBP12.6 a RyR2, na presença de um agente candidato; e (c) determinar se o agente reforça a ligação de RyR2 e FKBP12.6. Numa modalidade, RyR2 é fosforilada pela PKA. Noutra modalidade, RyR2 é hiperfosforilada pela PKA. Ainda noutra modalidade, RyR2 não é fosforilada. 105 [0167] No método da presente divulgação, FKBP12.6 é imobilizado numa fase sólida, como uma placa ou grânulos. Para facilitar a detecção de da ligação RyR2-FKBP12.6, RyR2 pode ser marcado radioactivamente (por exemplo, com 32P) . Além disso, a maior ligação de RyR2 e FKBP12.6 pode ser detectada usando um agente de ligação de RyR2. Numa modalidade, o agente de ligação RyR2 é um anticorpo anti-RyR2. A presente divulgação também fornece um agente identificado por este método, assim como também usa este agente em métodos para limitar ou prevenir uma diminuição do nivel de FKBP12.6 ligado a RyR2 num sujeito; [0168] A titulo de exemplo e como mostrado no exemplo 12 abaixo, um ensaio altamente eficiente para rastreio de alto rendimento de pequenas moléculas pode ser desenvolvido por imobilização de FKBP12.6 (por exemplo, FKBP12.6 de tipo selvagem ou uma proteína de fusão, como GST-FKBP12.6) numa placa de 96 poços revestida com glutationa, usando procedimentos padrão. O receptor de rianodina do tipo 2 fosforilado pela PKA (RyR2) pode ser carregado para a placa revestida com FKBP12.6 e incubado com análogos de JTV-519 e com outros derivados de 1,4-benzotiazepina em várias concentrações (10-100 nM) durante 30 minutos. Posteriormente, a placa pode ser lavada para remover o RyR2 não ligado e depois incubada com anticorpo anti-RyR2 (por exemplo, durante 30 min). A placa pode ser lavada novamente para retirar o anticorpo anti-RyR2 desacoplado e então tratada com anticorpo secundário com um marcador fluorescente. A placa pode ser verificada por um leitor automático de placa fluorescente para a actividade de ligação.

[0169] Como alternativa, RyR2 pode ser fosforilado pela PKA na presença de 32Ρ-ΆΤΡ. RyR2 radioactivo fosforilado pela 106 PKA pode ser carregado numa placa revestida com FKBP12.6, 96 poços, na presença de análogos de JTV-519 e de outros derivados de 1,4-benzotiazepina em várias concentrações (10-100 nM) por 30 min. A placa pode ser lavada para remover o RyR2 marcado não ligado e, em seguida, lido por um leitor automático. RyR2 fosforilado pela PKA também pode revestir a placa e ser incubado com FKBP 12,6 marcado com 32S na presença de análogos e derivados.

[0170] Os exemplos que se seguem, situam-se adiante para ajudar na compreensão da invenção e não devem ser interpretados no sentido de limitar de alguma forma o âmbito da invenção, conforme definido nas reivindicações posteriores.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - RATOS FKBP 12.6 DEFICIENTES

[0171] Os ratos FKBP12.6 deficientes foram produzidos, como descrito anteriormente (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003). Resumidamente, os clones de λ- fagos do genoma de ratinho para o ortólogo murino da proteína de ligação humana FK506 12.6 (FKBP12.6) foram isolados a partir duma biblioteca DBA/llacJ, usando uma sonda de cDNA murino de comprimento total. 0 vector alvo foi concebido para deletar os exões 3 e 4, que contém as sequências de codificação completas para a FKBP12.6 murina (Bennett et al., Identification and characterization of the murine FK506 binding protein (FKBP) 12.6 gene. Mamm. Genome, 9:1069-71, 1998), pela substituição de 3,5 kb do ADN genómico murino com um marcador seleccionável PGK-neo. 107

Um fragmento 5' de 5,0 kb e um fragmento 3' de 1,9 kb foram clonados em pJNS2, um vector esgueleto com cassetes PGK-neo e PGK-TK. As células estaminais embrionárias DBA/lacJ (ES) foram colocadas a crescer e transfectadas, usando protocolos estabelecidos. As células-alvo ES foram primeiro pesquisadas por análise Southern, e depois foram analisadas 5 linhas celulares ES positivas por PCR para confirmar a recombinação homóloga. Quimeras macho foram procriadas com fêmeas DBA/llacJ, e a linha germinal da descendência identificada por uma pelagem de cor castanha. A linha germinal da descendência foi genotipada usando a análise Southern 5'. Os machos e fêmeas FKBP12.6+/- positivos foram entrecruzados, e a descendência resultou em ratos FKBP12.6 -/- com uma frequência de aproximadamente 25%. Os ratos FKBP12.6-/- eram férteis.

[0172] Todos os estudos realizados com ratos FKBP12.6-/-usaram ratos FKBP12.6+/+ com idades e sexo correspondentes como controlos. Não foram observadas diferenças entre os ratos FKBP12.6-/- crescidos com os seguintes antecedentes: DBA/C57BL6 misturados, DBA puro e C57BL6 puro.

EXEMPLO 2 - REGISTO DE TELEMETRIA E EXERCÍCIO DE TESTE EM RATOS

[0173] Os ratos FKBP12.6+/+ e FKBP12.6-/- foram conservados e estudados de acordo com os protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee d\a Columbia University. Os ratos foram anestesiados por inalação de isoflurano a 2,5%. Os registos de radiotelemetria de ECG dos animais em ambulatório foram obtidos >7 dias após a implantação intraperitoneal (Data Sciences International, St. Paul, MN) (Wehrens et ai., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) 108 function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003). Para os testes de stress, os ratos foram postos a fazer exercício numa passadeira inclinada até à exaustão, e então foram injectados com epinefrina intraperitonealmente (0,5-2,0 mg/kg) (Wehrens et al. , FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003). Foram calculadas as médias das taxas cardíacas em repouso dos animais em ambulatório durante 4 h.

EXEMPLO 3 - EXPRESSÃO DO TIPO SELVAGEM E MUTANTES RyR2— S2809D

[0174] Foi realizada a mutagénese do sítio alvo PKA no RyR2 (RyR2-S2809D), como descrito anteriormente (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise induced sudden cardiac death. Cell, 113:829-40, 2003). As células HEK293 foram co-transf ectadas com 20 pg de cDNA do tipo selvagem (TS) ou mutante do RyR2, e com 5 pg de cDNA de FKBP12.6, usando precipitação com fosfato de Ca2+. Foram preparadas vesículas com canais de RyR2, como descrito anteriormente (Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113 : 829-40, 2003) .

EXEMPLO 4 - FOSFORILAÇÃO PELA PKA DE RyR2 E LIGAÇÃO FKBP12.6 [0175] Foram preparadas membranas RS cardíacas, como descrito anteriormente (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel 109 (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000; Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/ Ca2+-release channels from cardiac muscle. Cire. Res., 78:990-97, 1996). Foram produzidos FKBP12.6 35S marcados usando o sistema TNT™ Quick Coupled Transcription/Translation da Promega (Madison, WI) . Foi usada ligação com [3H] rianodina para guantificar os níveis de RyR2. Foram diluídos 100 pg de microssomas em 100 μΐ de tampão de imidazol 10 mM (pH 6,8), incubados com [35S]-FKBP12.6 250 nM (concentração final) a 37 °C durante 60 min, depois temperados com 500 μΐ de tampão de imidazol arrefecido em gelo. As amostras foram centrifugadas a 100 000 g durante 10 min, e lavadas três vezes em tampão de imidazol. A quantidade de [35S]-FKBP12.6 ligado foi determinada por contagem de cintilação líquida do pellet. EXEMPLO 5 -ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS (IMMUNOBLOTS) [0176] Os ensaios imunoenzimáticos de microssomas (50 pg) foram realizadas como descrito, com anti-FKBP12/12.6 (1:1000), anti-RyR-5029 (1:3000) (Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267:9474-77, 1992), ou anti-fosfoRyR2-P2809 (1:5000) durante 1 h à temperatura ambiente (Reiken et al., Beta-blockers restore calcium release channel function and improve cardiac muscle performance in human heart failure. Circulation, 107:2459-66, 2003) . O anticorpo anti-RyR2 P2809 fosfoepítopo específico é um anticorpo de coelho policlonal de afinidade purificado, feito por encomenda aos Zymed Laboratories (San Francisco, CA) usando o péptido, CRTRRI-(pS)-QTSQ, que corresponde ao RyR2 fosforilado pela PKA em Ser2809 . Após a incubação com IgG anti-coelho marcada HRP (diluição 1:5000; 110

Transduction Laboratories, Lexington, KY), as transferências foram desenvolvidas usando ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) . Os anticorpos também podem ser usados nas seguintes razões: 1:4000 (IgG anti-coelho); e 1:5000 (anti-RyR2-502 9 e anti-FKBP 12.6).

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6 - REGISTOS DE CANAIS INDIVIDUAIS

[0177] Os registos de canais únicos de RyR2 nativa de corações de roedores (rato ou ratazanas), ou RyR2 recombinante, foram adquiridos sob condições de voltagem com grampo a 0 mV, como descrito anteriormente (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76,2000) . As soluções simétricas usadas para os registos do canal foram: compartimento trans - HEPES, 250 mmol/L; Ba(OH)2, 53 mmol/L (nalgumas experiências, o Ba(OH)2 foi substituído por Ca (OH)2); pH 7,35; e compartimento eis - HEPES, 250 mmol/L; Tris-base, 125 mmol/L; EGTA, 1,0 mmol/L; e CaCl2, 0,5 mmol/L; pH 7,5. A menos que indicado em contrário, os registos dos canais únicos foram feitos na presença de [Ca2+] 150 nM e [Mg2+] 1,0 mM no compartimento cis. Foi aplicada a rianodina (5 mM) ao compartimento cis para confirmar a identidade de todos os canais. Os dados foram analisados a partir de registos actualizados digitalizados usando o Fetchan software (Axon Instruments, Union City, CA). Todos os dados são expressos como a média ± SE. Foi usado o teste t-Student para a comparação estatística dos valores médios entre experiências. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[0178] O efeito de JTV-519 sobre os canais de RyR2 está apresentado nas FIGs. 1-3 e Tabela 1 (abaixo). Como 111 demonstrado na FIG. 3, os estudos de canal individual mostraram um aumento da probabilidade de abertura de RyR2 a seguir à fosforilação pela PKA (D), quando comparada com a fosforilação pela PKA na presença do inibidor de PKA especifico, PKI5-24 (C). A função de canal único foi normalizada em RyR2 fosforilada pela PKA, incubada com FKBP12.6 na presença de JTV-519 (E) . Os histogramas de amplitude (direita) revelaram uma actividade aumentada e aberturas de subconductância em RyR2 fosforilada pela PKA, mas não a seguir ao tratamento com JTV-519 e FKBP 12.6. A FIG. 3F mostra que a incubação de RyR2 fosforilada pela PKA com FKBP12.6, na presença de JTV-519, deslocou a dependência de Ca2+ da activação de RyR2 para a direita, tornando-a semelhante à dependência de Ca2+ dos canais não fosforilados.

Tabela 1. Dados de ECG em ambulatório antes, durante e após o exercício, injecção com epinefrina. SCL FC PR QRS QT(ms) QTc (ms) (bpm) (ms; ) (ms) (ms) Linha de base FKBP12.6+/- 104 + 586 ± 32 + 9,9 ± 30 + 29 + 6 36 1,5 0,4 1,0 0, 6 FKBP12.6+/- 99 + 608 ± 33 + 9,3 ± 32 + 32 + + JTV-519 5 32 0, 6 0,3 2,7 1, 9 FKBP12.6-/- 116 + 527 ± 33 + 10,0 33 + 30 + + JTV-519 9 43 0,4 ± 0,3 1,3 1,1 (continuação) exercício máximo FKBP12.6+/- co o 1+ 752 28 ± 8,7 ± 30 ± 33 2 ±18 0,7 0,4 1,7 1, 6 FKBP 12.6 + +1 o σι 676 29 ± 9, 6 ± 34 ± 36 112 JTV-519 7 CTi +1 00 1—1 0, 4 2,0 0, 9 FKBP 12.6-/- 83 ± 729 29 ± 9, 3 ± 30 ± 33 ± + JTV-519 3 ± 22 2 0, 3 1,2 0, 9 epinefrina pós-exercicio FKBP12.6+/- 94 ± 645 35 ± 9,3 ± 33 ± 34 ± 4 ± 28 2, 6 0,4 1,8 1,9 FKBP 2.6+/-+ 102 592 37 ± 9, 9 ± 32 ± 32 ± JTV-519 ± 4 ± 21 2, 6 0, 6 2,3 1,7 FKBP 12.6-/- 103 585 35 ± 11,1 36 ± 36 ± + JTV-519 ± 4 ± 20 3, 8 ± 0,5 1,2 1,3 Resumo dos dados de ECG em ambulatório de ratos FKBP12.6+/- tratados com JTV- 519 (n = 8) ou controlo (n = 6), e ratos FKBP12.6-/- tratados com JTV-519 (n = 5) SCL = = comprimento do ciclo sinusoidal (sinus cycle length) ; FC = frequência cardíaca; ms = milissegundo; bpm = batimentos por minuto; FKBP12.6+/- = ratos heterozigóticos FKBP12.6; FKBP12.6-/- = ratos deficientes FKBP12.6

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7 - MODELO DE RATO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA

[0179] 25 Sprague-Dawley (300-400 g) foram submetidos a ligação da coronária esquerda, através de toracotomia esquerda, para provocar um enfarte do miocárdio, como descrito anteriormente (Alvarez et al., Late post-myocardial infarction induces a tetrodotoxin-resistant Na+ current in rat cardiomyocytes. J Mol. Cell Cardiol., 32:1169-79, 2000). Resumidamente, os ratos foram anestesiados com uma mistura de 150 mg/kg de cetamina intraperitoneal e 15 mg/kg de clorpromazina. Foi mantida a respiração com um dispositivo de auxílio de ventilação e um 113 tubo endotraqueal (3 ml de ar / 60 pulsações por min). Após toracotomia mediana esquerda e abertura do pericárdio, a artéria coronária principal esquerda foi ocludida com uma sutura de seda 7-0 no ponto mais próximo abaixo do apêndice da auricula esquerda. Os ratos simuladamente operados (n = 5) foram tratados do mesmo modo, mas sem a ligação da artéria coronária.

[0180] 6 semanas após o enfarte do miocárdio, a insuficiência cardíaca foi confirmada usando uma ecocardiografia. JTV-519 ou veículo (DMSO) foi continuamente posto em infusão (0,5 mg/kg/h) através de uma bomba de infusão osmótica implantável (Alzet mini-osmotic pump; Durect Corporation, Cupertino, CA). Após 4 semanas de tratamento contínuo, foram realizadas medições de ecocardiografia e hemodinâmica. Os animais foram sacrificados, e foram recolhidas amostras de tecido.

[0181] De acordo com as técnicas acima mencionadas, a insuficiência cardíaca foi induzida em ratos por ligação da artéria coronária descendente anterior esquerda. Deste modo, resultou em enfarte do miocárdio que se desenvolveu em cardiomiopatia dilatada, com a função cardíaca reduzida, em 4 semanas. Foram estudados 3 grupos de animais, com 25 em cada grupo: simulação de operação (controlo), insuficiência cardíaca + terapia (JTV-519), e insuficiência cardíaca sem terapia (veículo). Um tratamento de 4 semanas com JTV-519 reduziu significativamente a disfunção diastólica e sistólica, como determinado por ecocardiografia (FIG. 4). Assim, a terapia com JTV-519 melhorou significativamente a função cardíaca e reduziu a progressão da insuficiência cardíaca no modelo de rato da insuficiência cardíaca isquémica induzida. 114 [0182] Usando um canal RyR2-S2809D mutante que simula os canais de RyR2 constitutivamente fosforilado pela PKAs, foi determinado que JTV-519 aumenta a afinidade de FKBP12.6 para o canal RyR2 (FIG. 5) . Especificamente, o tratamento com JTV-519 permitiu que a FKBP 12.6 se ligue ao canal mutante, revelando, desse modo, um mecanismo pelo qual JTV-519 previne a insuficiência cardíaca. 0 tratamento com JTV-519 também preveniu a fuga nos canais de RyR2 das insuficiências cardíacas (FIG. 6). Além disso, JTV-519 restaurou a ligação de FKBP12.6 quer ao RyR2 fosforilado pela PKA quer ao RyR2-S2 8 0 9D mutante o que simula RyR2 constitutivamente fosforilado pela PKA dum modo dependente da dose (FIG. 7).

EXEMPLO DE REFERENCIA 8 - MODELO CANINO DE FIBRILAÇÃO

AURICULAR a) Protocolos Animais [0183] Foram implantados pacemakers em fêmeas caninas adultas rafeiras com um peso de 24-26 kg, usando técnicas previamente descritas (Dun et al. , Chronic atrial fibrillation does not further decrease outward currents. It increases them. Am. J Physiol. Heart Circ. Physiol., 285:H1378-84, 2003). Os animais foram anestesiados com tiopental sódico (17 mg/kg, i.v.), e ventilados com isoflurano (1,5-2%) e 02 (21/min). Os chumbos de fixação activa foram implantados no apêndice auricular direito e na parede livre da aurícula direita, introduzidos subcutaneamente, e conectados a um gerador de pulsos Itrel e um pacemaker Thera 8962, respectivamente (Medtronics, Minneapolis, MN). Foi injectado formaldeído a 40% (0,1-0,3 ml) no feixe de His, para se conseguir um bloqueio AV completo. 0 pacemaker ventricular foi programado para uma 115 taxa de 60 bpm, e mantido nesta taxa durante todo o protocolo de batimentos. A seguir à recuperação, os batimentos auriculares foram estabelecidos numa taxa de 600-900 bpm, e mantido durante 46 ± 3 dias, ou até o animal ficar em AF crónico (definido como >5 dias de AF na ausência de batimentos continuados).

[0184] Os animais foram então anestesiados com pentobarbital (30 mg/kg), e os seus corações removidos. O tecido auricular foi dissecado, imediatamente congelado rapidamente em nitrogénio liquido e armazenado a -80 °C. b) Colheita do Coração [0185] Os dados humanos apresentados neste estudo foram derivados de 5 corações humanos de doentes com fibrilação auricular em contexto de fase final da insuficiência cardíaca após transplante cardíaco ortotópico sob um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board do New York Presbyterian Hospital. Adicionalmente, os dados também foram obtidos a partir de amostras tomadas a partir de 3 corações normais não adequados para transplante. Na altura da transplantação, os corações foram conservados com solução de cardioplegia hipocalcémica, hipercalémica, no frio (4 °C), no explante. c) Imunoprecipitação e retro-fosforilação de RyR2.

[0186] As membranas cardíacas (100 pg) , preparadas a partir do tecido auricular esquerdo (LA) como descrito anteriormente (Marx, et al. , PKA Phosphorylation Dissociates FKBP12.6 from the Calcium Release Channel (Ryanodine Receptor): Defective Regulation in Failing Hearts, Cell, 101:365-376, 2000) foram suspendidas em 0,5 116

ml de tampão RIPA (Tris-HCL 50 mM [pH 7,4], NaCl a 0,9%, Triton a 0,25% lOOx, NaF 5 mM, e inibidores da protease), e depois incubadas com anticorpo de coelho anti-RyR2 durante a noite a 4 °C. Foram adicionadas esferas de sefarose com Proteína A, e deixadas a incubar a 4°C durante 1 h. As esferas com Proteína A foram subsequentemente lavadas com tampão cinase lx (Tris-HCL 50 mM, ácido piperazina-N,N'-bis [2-etanossulfónico] 50 mM, MgCl 8 mM e EGTA 10 mM [pH 6,8]), e depois ressuspendidas em tampão cinase l,5x. A reacção foi iniciada com PKA (5 unidades), MgATP 100 μΜ, e [□32P]ATP (NEN Life Sciences, Boston); foi deixada a incubar durante 8 min. à temperatura ambiente, e depois foi parada com 5 μΐ de tampão de carregamento 6x (SDS a 4% e DTT 0,25 M). As amostras foram aquecidas a 95 °C, e depois fraccionadas por tamanho em SDS-PAGE a 6%. A radioactividade de RyR2 foi quantificada usando um

Molecular Dynamics Phosphoimager, e software Imagequant (Amersham Pharmacia Biotech, Pescataway, NJ) . Os valores foram divididos por quantidade de RyR2 imunoprecipitado (determinado por imunotransferência e densitometria), e expressos como o inverso do sinal de [γ32Ρ]ΑΤΡ. d) Religação de Calestabina2 (FKBP12.6) com JTV-519 [0187] RyR2 foi imunoprecipitado a partir da SR auricular (100 pg) , e lavado com lx tampão cinase, como descrito acima. O RyR2 imunoprecipitado foi fosforilado com PKA (5 unidades) e MgATP 100 μΜ à temperatura ambiente, e a reacção foi terminada após 8 min por lavagem com tampão RIPA arrefecido em gelo. A calestabina2 recombinante (FKBP12.6; 200 nM) foi subsequentemente incubada com o RyR2 fosforilado à temperatura ambiente, na presença ou ausência do derivado de 1,4-benzotiazepina, JTV-519 (1 μΜ) . Após a lavagem a reacção com o tampão RIPA, as proteínas foram 117 fraccionadas por tamanhos com SDS PAGE a 15%, e imunotransferidas para calestabina2 (FKBP12.6).

[0188] Resumidamente abaixo estão os resultados obtidos em relação com as experiências do Exemplo 8:

Regulação do RyR2 auricular [0189] 0 RyR2 auricular foi fosforilado pela PKA (FIG. 8A), de acordo com as técnicas acima. A fosforilação pela PKA do RyR2 auricular reduziu a quantidade de calestabina2 (FKBP12.6) no complexo macromolecular RyR2, como determinado por co-imunoprecipitação (FIG. 8C). 0 complexo macromolecular RyR2 auricular compreende a calestabina2 (FKBP12.6), a subunidade catalítica de PKA, a subunidade reguladora de PKA (RII), PP2A, PPl, e mAKAP (FIG. 8B), como relatado anteriormente para o RyR2 ventricular (Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101:365-76, 2000).

Hiperfosforilação pela PKA do receptor de rianodina na fibrilação auricular [0190] A fosforilação pela PKA do RyR2 imunoprecipitado foi aumentada em 130% no tecido auricular a partir de cães com fibrilação auricular prolongada (AF), quando comparado com os controlos (n = 6 para AF, n = 6 para controlo, P < 0,001; FIG. 9A) . A calestabina2 (FKBP12.6) ligada ao RyR2 foi diminuída em 72% no tecido auricular a partir de cães com AF prolongada, em relação aos controlos (n = 7 para AF, n = 6 para controlo, P < 0,0005; FIG. 9A). 118 [0191] Do mesmo modo, a fosforilação pela PKA do RyR2 imunoprecipitado foi aumentada em 112% no tecido auricular a partir de seres humanos com fibrilação auricular crónica, no cenário da insuficiência cardíaca, quando comparado com os controlos (n = 5 para AF, n = 3 para controlo, P = 0,002; FIG. 9B) . A calestabina2 (FKBP12.6) ligada ao RyR2 foi diminuída em 70% (n = 5 para AF, n = 3 para controlo, P <0,0001; FIG. 9B).

[0192] Para todas as experiências de retro-fosforilação e co-imunoprecipitação, a quantidade total de RyR2 carregado foi confirmada por uma imunotransferência paralela do RyR2 imunoprecipitado com um anticorpo anti-RyR2-5029 (FIGs. 9A e 9B) .

Função do canal do receptor cardíaco de rianodina [0193] Para determinar a significância fisiológica da hiperf osf orilação pela PKA de RyR2 que foi observada em cães AF, as medições do canal único de RyR2 foram feitas sob condições de voltagem com grampo, a 0 mV em bicamadas lipídicas planares, usando condições iónicas simétricas. As propriedades do canal único de RyR2 foram estudadas em 17 canais a partir de 5 cães AF, e em 11 canais a partir de 5 cães de controlo. Os canais dos cães de controlo não demonstraram actividade aumentada, enquanto que 15 dos 17 canais (88%) a partir dos cães AF apresentaram uma probabilidade de abertura significativamente aumentada (P0; AF: 0,412 ± 0,07; controlo: 0,008 ± 0,002; P<0,001) e frequência de fecho (F0; AF: 21,9 ± 4,6; controlo: 1,6 ± 0,6 s_1; P < 0,002 (FIGs. 10A e 10B) .

Religação de Calestabina2 (FKBP12.6) na Presença de JTV-519 119 [0194] O tratamento com JTV-519 (1 mM) , permitiu que a calestabina2 (FKBP12.6) recombinante se ligasse ao RyR2 fosforilado pela PKA que foi isolado a partir do miocárdio canino normal. Na ausência de JTV-519, a calestabina2 (FKBP12.6) foi incapaz de se associar com o RyR2 fosforilado pela PKA nestas experiências (FIG. 11B).

[0195] A significância fisiológica da religação de FKBP-12.6 na presença de JTV-519 foi demonstrada por medições de canal único de RyR2 em bicamadas lipidicas planares. Na presença de calestabina2 (FKBP12.6) recombinante sozinha, os canais isolados demonstraram um comportamento marcadamente anormal, com probabilidade de abertura aumentada (Po) e a presença de estados de subconductância. Estas anormalidades na função do canal não foram vistas quando um inibidor de PKA especifico (foi adicionado PKI, que indica que as anormalidades observadas na função do canal foram especificas para a fosforilação de RyR2 pela PKA. Quando os canais fosforilado pela PKA foram tratados com JTV-519, na presença de calestabina2 (FKBP12.6) recombinante, as medições de canal único foram semelhantes àquelas observadas na presença de PKI (FIG. 11A) . EXEMPLO DE REFERÊNCIA 9 - SÍNTESE DO INTERMEDIÁRIO DE 1.4-BENZOTIAZEPINA E JTV-519 [0196] Para as experiências in vivo, os inventores precisaram de uma grande quantidade de JTV-519. No entanto, as tentativas iniciais para preparar este composto através do intermediário da 1,4-benzotiazepina relatado, 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina (composto 6 no Esquema 1, abaixo), não teve sucesso. Os grupos tio deste intermediário são facilmente oxidados pelo ar para dar um composto de dissulfureto, o que torna a síntese do produto 120 cíclico (5) impossível. Para contornar este problema, os inventores desenvolveram um processo novo que começa com o, prontamente disponível e pouco dispendioso, ácido 2-nitro-5-metoxibenzóico (1) . Este processo está representado no Esquema 1 abaixo.

[0197] A redução do grupo nitro do composto (1), usando H2 com Pd/C como um catalisador, deu o ácido 2-amino-5-metoxibenzóico (2) num rendimento quantitativo. O composto (2) foi diazotizado com NaN02, e depois tratado com Na2S2 para fornecer o composto de dissulfureto estável (3) com um rendimento 80%. Sem outras purificações, o dissulfureto estável (3) foi tratado com S0C12, e depois posto a reagir com 2-cloroet ilamina, na presença de Et2N, para dar uma amida (4) com 90% de rendimento. O composto (4) foi convertido no composto cíclico (5) através dum procedimento "one-pot11 por refluxo com trimetilfosfina e Et2N em THF. A amida cíclica (5) foi então reduzida com L±Aiííí para se obter 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina (6). ESQUEMA 1 MC. tn ^ rCtf "‘A***-

_-v-rr * é

•QOQ nor reacção do composto (6) [0198] JTV-519 foi preparado Pu vnniónico e depois por reacção do com cloreto de 3-bromopropioniu . Hon7il piperidina. A estrutura de produto resultante com 4 oe . . nnr NMR. JTV-519 foi estabelecida p° 121

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 10 - SÍNTESE DE JTV-519 RADIO—MARCADO

[0199] O novo processo dos inventores para a síntese de JTV-519 radio-marcado está retratado no Esquema 2 abaixo. Para preparar JTV-519 radio-marcado, JTV-519 foi desmetilado no anel de fenilo usando BBr3, para dar o composto de fenol (21) . O composto de fenol (21) foi re-metilado com um agente de metilação radio-marcado (3H-dimetil sulfato) na presença duma base (NaH) para fornecer JTV-519 3H-marcado (Esquema 2).

EXEMPLO DE REFERENCIA 11 -NOVOS DERIVADOS DA 1,4-BENZOTIAZEPINA E MÉTODOS PARA A SUA SÍNTESE

[0200] Os novos derivados de 1,4-benzotiazepina para uso no tratamento e prevenção de arritmias cardíacas são revelados a seguir. Em particular, os inventores produziram compostos com a seguinte estrutura geral:

em que R = arilo, alcenilo, alquilo, -(CH2)nNR,2, ou -(CH2) nSR' , e n = 0, 1, 2, ou 3; e em que R' = alquilo ou cicloalquilo. Os novos compostos desta estrutura geral foram preparados por reacção de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-1,4-benzotiazepina com cloreto de alquilsulfonilo ou cloreto de arilsulfonilo, na presença duma base tal como Et3N. Podem seguir-se reacções adicionais (por exemplo, adição de 4-benzil piperidina), para prolongar a cadeia lateral se desejado. Uma síntese representativa deste processo geral está representada no Esquema 3 abaixo. 122 [0201] Como o Esquema 3 demonstra, o cloreto de 2- cloroetanosulfonil (180 mg; 1,1 mM) e Et3N (140 mg; 1,1 mM) foram adicionados a 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l, 4-benzotiazepina (1) (194 mg; 1 mM) em CH2C12 (20 ml) , a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 °C durante 2 h, e lavada com H20 e saturada com solução de NaHCC>3. A remoção do solvente deu o produto em bruto (Ia), que foi purificado por cromatografia em gel sílica (éter de petróleo: acetato de etilo = 3:1). O rendimento desta síntese foi 280 mg, ou 95%. A estrutura foi confirmada por NMR.

[0202] 0 Esquema 3 mostra ainda que a cadeia lateral do composto (Ia) foi estendida por reacção do composto (Ia) (28 mg; 0,1 mM) com 4-benzil piperidina (21 mg; 0,13 mM) em CH2C12. Após a reacção ter sido completada (por TLC) , a amina em excesso foi removida por uma armadilha alcalina (sílica gel funcionalizada de 3-(2-succínico anidro)propil, 0,5 g) . 1HNMR e HPLC mostraram que a pureza do produto (Ib) foi >98%. o

[0203] Adicionalmente, foram produzidos os compostos com a seguinte estrutura geral:

123 em que R = arilo, alquilo, - (CH2) nNR' 2, ou -(CH2)nSR', e n = 0, 1, 2, ou 3; e em que R' = alquilo ou cicloalquilo. Os novos compostos desta estrutura geral foram preparados por uma reacção "one-pot" de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l, 4-benzotiazepina (1) com cloreto de sulfurilo, na presença duma base (Et3N) , seguida por uma amina primária ou secundária. Uma síntese representativa deste processo geral está representada no Esquema 4 abaixo.

[0204] Como o Esquema 4 demonstra, foram adicionados cloreto de sulfurilo (15,0 mg; 0,111 mM) e Et3N (28,0 mg; 0,22 mM) a 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l,4-benzotiazepina (1) (19,4 mg; 0,1 mM) em CH2C12 (20 ml), a 0 °C. Após agitação da mistura durante 2 h a 0 °C, foi adicionada 1-piperonilpiperazina (27 mg; 0,12 mM). A mistura foi agitada durante mais 2 h, e depois lavada com H20 e uma solução de NaHC03 saturada. 0 excesso de amina foi removido por adição duma armadilha alcalina (sílica gel funcionalizada de 3-(2-succínico anidro)propil, 0,2 g). O rendimento desta síntese foi de 36 mg, ou 77%.

[0205] Foram sintetizados os compostos com a seguinte estrutura geral:

em que R" = CO (CH2) nXR' ' ' 2, S02 (CH2) nXR' ' ' 2, ou S02NH (CH2) nXR' ' ' 2r e X = N ou S, e n = 1, 2, ou 3. Os novos compostos desta estrutura geral foram preparados por oxidação de JTV-519, ou um dos novos derivados de 1,4-benzotiazepina descritos acima, com peróxido de hidrogénio. Uma síntese representativa deste processo geral está representado no Esquema 5 abaixo. 124 [0206] Como o Esquema 5 mostra, o composto (Ib) (21 mg; 0,05 mM) em MeOH (5 ml) foi adicionado a H202 (0, 1 ml, excesso). A mistura foi agitada durante 2 dias e o produto III foi purificado por cromatografia em sílica gel (CH2C12 :MeOH = 10:1). O rendimento desta síntese foi 19 mg, ou 91%.

[0207] Finalmente, os compostos que têm a seguinte estrutura geral foram produzidos:

em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR' 2, -(CH2)nSR', e n = 0, 1, 2, ou 3, e R' = alquilo, cicloalquilo; e em que X = NH ou 0. Foram preparados os novos compostos desta estrutura geral por reacção de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidro-l, 4-benzotiazepina (1) com trifosgeno, na presença duma base (EtsN) , seguida pela adição de uma amina primária ou secundária ou um álcool. Uma síntese representativa deste processo geral está representada no Esquema 6 abaixo.

EXEMPLO 12 - ENSAIO PARA PESQUISA DE ALTA PRODUTIVIDADE

[0208] Os inventores desenvolveram ensaios para pesquisar moléculas pequenas biologicamente activas. Estes ensaios estão baseados na religação da proteína FKBP 12 a RyR.

[0209] Pode ser desenvolvido um ensaio de elevada eficiência para pesquisa de alta produtividade para moléculas pequenas por imobilização de FKBP12.6 (GST-proteína de fusão) numa placa de 96 poços revestida com glutationa. 0 receptor de rianodina fosforilada pela PKA tipo 2 (RyR2) é carregado na placa revestida de FKBP12.6, e incubado com análogos de JTV-519 em várias concentrações 125 (10-100 nM) durante 30 min. Depois disso, a placa é lavada para remover o RyR2 não ligado, e depois incubada com o anticorpo anti-RyR2 durante 30 min. A placa é novamente lavada para remover o anticorpo anti-RyR2 não ligado, e depois tratada com anticorpo secundário florescente marcado. A placa é lida por um leitor de placas fluorescente automático para a actividade de ligação.

[0210] Num ensaio alternativo, o RyR2 é fosforilado pela PKA na presença de 32P-ATP. 0 RyR2 fosforilado pela PKA radioactivo é carregado numa placa de 96 poços FKBP12.6 revestida, na presença de análogos JTV-519 em várias concentrações (10-100 nM) durante 30 min. A placa é lavada para remover o RyR2 radiomarcado não ligado, e depois lido por um leitor de placas fluorescente automático. EXEMPLO 13 - NOVOS DERIVADOS DA 1,4-BENZOTIAZEPINA PERMITEM A RELIGAÇÃO DE FKBP12.6 A RYR2 [0211] A membrana do retículo sarcoplásmico cardíaco (SR) foi fosforilada com PKA durante 30 min, à temperatura ambiente, resultando na dissociação completa de FKBP12.6 a partir do complexo RyR2. O SR (50 mg) foi então incubado durante 30 min, à temperatura ambiente, com FKBP12.6 250 nM e os compostos de teste. As amostras foram centrifugadas a 100000 g durante 10 min, e os pellets foram lavados 3 vezes com tampão de imidazol 10 mM. Após a lavagem, as proteínas foram separadas por PAGE a 15%. Foram desenvolvidas as imunotransferências usando um anticorpo anti-FKBP. Os resultados deste estudo estão apresentados na FIG. 12. Os compostos S4, S7, S20, S24, S25, S26 e S27 são para serem considerados como exemplos de referência. 126

EXEMPLO 14 - REGISTO DE TELEMETRIA E TESTE DE EXERCÍCIO/EKG EM RATOS

[0212] Foram realizados estudos com ratos FKBP12.6+/-(grupo de intervenção), idade e sexo coincidentes com ratos FKBP12.6-/- (controlo positivo) e ratos do tipo selvagem FKBP 12.6+/+ (controlo negativo). A ausência de (FKBP12.6-/-) , ou a diminuição em (FKBP12.6 + /-), a proteína FKBP12.6 foi demonstrada por imunotransferência no tecido cardíaco.

[0213] A infusão do fármaco subcutaneamente e de modo contínuo de JTV-519 (numa concentração alvo no plasma de 1.0 μΜ) ou o derivado, S36 (em concentrações alvo no plasma de 1,0 μΜ ou 0,02 μΜ) , em ratos FKBP12.6 + /- ou FKBP12.6-/-ocorreu através de uma bomba mini-osmótica, numa taxa de 1.0 μΐ por hora, durante 7 dias antes do teste de exercício (Alzet Durect Co., Cupertino, CA) . Os ratos foram anestesiados através duma injecção intraperitoneal de cetamina (50 pg/kg) e xilazina (10 pg/kg), e foram implantados transmissores-rádio EKG. Os registos de telemetria rádio de ECG dos animais em ambulatório foram obtidos 1 semana a seguir ao implante intraperitoneal (Data Sciences International, St. Paul, MN). Foram usados critérios-padrão para medir os parâmetros de ECG.

[0214] Para os testes de stress, os ratos foram postos a fazer exercício numa passadeira inclinada, de modo progressivo, até à exaustão, e depois injectados intraperitonealmente com epinefrina (0,2 mg/kg) para estimulação simpática máxima. Foram feitas as médias das taxas cardíacas em repouso dos animais em ambulatório durante 4 h. A recuperação após o teste de exercício e monitorização dos eventos pós-exercício, foram realizados durante a noite. O comprimento do ciclo sinusoidal (SCL), e 127 os intervalos PR, QRS, e QT, foram medidos, e a taxa do intervalo QT corrigida (QTc) foi calculada usando a fórmula de Mitchell. Os níveis de fármaco no plasma foram confirmados por HPLC. Os resultados estão resumidos na FIG. 13.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 15 - JTV-519 MELHORA A CONTRACTILIDADE CARDÍACA NUM MODELO DE RATO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA

[0215] Os ratos foram sujeitos a enfarte do miocárdio (MI) por ligação da artéria coronária esquerda. 0 tratamento com JTV-519 (n = x) ou veículo (n = x), usando bombas osmóticas implantáveis (Alzet, Durect Corporation, Cupertino, CA), foi iniciado logo a seguir ao MI. Foram determinados os diâmetros sistólicos (Ds) e diastólicos (Dd) miocardíacos nos níveis papilares médios, usando ecocardiografia 24 h e 6 semanas após o MI; o decaimento fraccional foi calculado. Como mostrado na FIG. 14, o tratamento com JTV-519 melhorou significativamente a função cardíaca em ratos com insuficiência cardíaca.

[0216] Enquanto a invenção anterior foi descrita com algum detalhe com o propósito de clarificação e de compreensão, será apreciado por um especialista na área, a partir da leitura desta divulgação, que várias modificações na forma e detalhe podem ser feitas sem afastamento do verdadeiro âmbito da invenção nas reivindicações anexas. 0 apêndice que se segue às reivindicações deste pedido corresponde às reivindicações do pedido "original", tal como apresentadas, a partir das quais o presente requerimento se divide. 0 apêndice é parte integrante deste pedido, sendo incluído com o intuito de fornecer uma descrição 128 acerca das reivindicações do pedido divisional originalmente depositado. SEGUNDO AS REIVINDICAÇÕES DO PEDIDO DE PATENTE ORIGINAL [0217] 1. Um método para limitação ou prevenção de um decréscimo do nivel de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 num sujeito que tem, ou é candidato a ter, fibrilação auricular, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou evitar a redução do nivel de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito, no qual o RyR2 é RyR2 auricular. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a redução no nivel de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 é limitada ou impedida no sujeito através da redução do nível de RyR2 fosforilado no sujeito. 3. 0 método da reivindicação 1, no qual o sujeito é um humano. 4. O método da reivindicação 1, em que a quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou impedir a redução do nivel de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito é uma quantidade de JTV-519 eficaz para tratar ou impedir a fibrilação auricular no sujeito. 5. 0 método da reivindicação 1, em que o JTV-519 trata ou previne a fibrilação auricular no sujeito. 6. 0 método da reivindicação 1, em que a quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nivel de 129 FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito vai de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia. 7. Utilização do JTV-519 num método para limitação ou prevenção de uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 num sujeito que tem, ou é candidato a ter, fibrilação auricular. 8. Um método para tratamento ou prevenção da fibrilação auricular num sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 num sujeito, tratando ou prevenindo, assim, a fibrilação auricular no sujeito. 9. 0 método da reivindicação 8, em que a fibrilação auricular é fibrilação auricular não permanente. 10. O método da reivindicação 8, em que a quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou impedir a redução do nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito é uma quantidade de JTV-519 eficaz para tratar ou impedir a fibrilação auricular no sujeito. 11. 0 método da reivindicação 10, em que o JTV-519 trata ou previne a fibrilação auricular no sujeito. 12. 0 método da reivindicação 8, em que a quantidade de JTV-519 eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito vai de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia. 13. Um método para limitação ou prevenção de uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 num sujeito, 130 compreendendo a administração de agente ao sujeito, numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 num sujeito, em que o agente é seleccionado do grupo composto por:

_ (CH2) nNR' 2 ou -R'= alquilo ou em que R (CH2)nSR', cicloalqui = arilo, e n = o; alcenilo,0, 1, 2 alquilo, ou 3, e

(b) em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R'= alquilo ou cicloalquilo;

em que R = CO (CH2) n) CR2, S02 (CH2) nXR' 2 ou S02NH (CH2) nXR' 2 e X = N ou S e n = 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2;

(d) em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR,2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou O; 131 (e) R2 em que Ri = OR posição 2, 3, 4 ou H; em que ISO II a ou arilo;

(f)

O

em que Ri = H, OR' , SR' , NR' , alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3 , 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que r2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que r3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que m = 0, 1 ou 2; e em que 0 11 c ou i; (g) em que Ri = H, OR', SR', NR', alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R4 = H, 132 halogenetos, alcenilo, ácido carboxílico, ou um alquilo contendo 0, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada destes. 14. 0 método da reivindicação 13, em que a redução no nivel de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 é limitada ou impedida no sujeito através da redução do nivel de RyR2 fosforilado no sujeito. 15. 0 método da reivindicação 13, no qual o sujeito é um humano. 16. 0 método da reivindicação 13, em que o sujeito tem taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) . 17. 0 método da reivindicação 13, em que o sujeito tem, ou é candidato a ter, arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico. 18. 0 método da reivindicação 13, em que a quantidade de agente eficaz para limitar ou prevenir a redução do nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito é uma quantidade de agente eficaz para tratar ou impedir a arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito. arritmia arritmia 19. 0 método da reivindicação 18, em que a cardíaca é uma arritmia auricular ou uma ventricular. 20. 0 método da reivindicação 19, em que a arritmia auricular é fibrilação auricular. 133 21. 0 método da reivindicação 21, em que a fibrilaçao auricular é fibrilação auricular permanente. 22. 0 método da reivindicação 19, em que a arritmia ventricular é arritmia ventricular induzida pelo exercício f ís ico. 23. 0 método da reivindicação 13, em que o agente trata ou previne uma arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito. 24. 0 método da reivindicação 13, em que a quantidade de agente eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito vai de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia. 25. 0 método da reivindicação 13, em que o agente é S4, S7, S-20, S-24, S-25, S-26, S-27 ou S36. 26. 0 método da reivindicação 25, no qual o agente é S36. 27. Uso de um agente num método para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito, em que o agente é seleccionado do grupo composto por:

(a) - (CH2) nNR' 2 ou -R'= alquilo ou em que R = arilo, alcenilo, alquilo, (CH2)nSR' , e n = 0, 1, 2 ou 3, e cicloalquilo; 134 (b)

MeQv^r % ,S-N-R N -ò em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R'= alquilo ou cicloalquilo;

(c) <°)m em que R = = N ou S e em que m =

CO (CH2) nXR' 2, S02 (CH2)nXR'2 ou S02NH (CH2) nXR' 2 e X n = 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e 1 ou 2;

(d) em que R = 1, 2 ou 3,

arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou 0;

3 R2 (e) em que R2 = 0R' , SR' , NR' , alquilo ou halogenetos na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; em que R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo; 135

(Ο em que Ri = H, OR' , SR' , NR' , alquilo ou haloqenetos na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1;

O

(g) em que Ri = H, OR', SR', NR', alquilo ou haloqenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R4 = H, halogenetos, alcenilo, ácido carboxilico, ou um alquilo contendo 0, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada destes. 28. Um método para tratamento ou prevenção da arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito, compreendendo a administração de um agente ao sujeito, numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no sujeito, em que o agente é seleccionado do grupo composto por: 136 (C)

em que R (CH2)nSR', cicloalqui = arilo, e n = o; alcenilo, 0, 1, 2 alquilo, ou 3, e - (CH2) nNR' 2 ou -R'= alquilo ou

(b) em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R'= alquilo ou cicloalquilo;

(c) (Ó5m em que R = = N ou S e em que m =

CO (CH2) nXR' 2, S02(CH2)nXR'2 ou S02NH (CH2) nXR'2 e X n = 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e 1 ou 2;

(d) em que R = arilo, 1, 2 ou 3, e R' =

alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou O; 137

em que Ri = OR' , SR' , NR' , alquilo ou halogenetos na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; em que R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo;

em que Ri = H, OR' , SR' , NR' , alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3 , 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que r2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que r3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que m = 0, 1 ou 2; e em que 0 11 c ou i;

em que Ri = H, OR', SR', NR' , alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que 138 R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R4 = H, halogenetos, alcenilo, ácido carboxílico ou um alquilo contendo 0, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada destes. 29. Um método para tratamento ou prevenção da arritmia cardiaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito, compreendendo a administração de um agente ao sujeito, numa quantidade eficaz para limitar ou prevenir a arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito, em que o agente é seleccionado do grupo composto por:

-(CH2)nNR'2 ou -R'= alquilo ou em que R (CH2)nSR', cicloalqui = arilo, e n = o; alcenilo,0, 1, 2 alquilo, ou 3, e

(b) em que R = arilo, alquilo, - (CH2) nNR' 2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R'= alquilo ou cicloalquilo;

(c) 139 em que R = CO(CH2)nXR2, S02 (CH2) nXR' 2 ou S02NH (CH2) nXR'2 e X = N ou S e n = 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2;

(d) em que R = arilo, alquilo, - (CH2) nNR' 2 ou - (CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou 0;

r3 r2 (e) em que R2 = OR' , SR' , NR' , alquilo ou halogenetos na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; em que R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo;

(0 em que R2 = H, OR', SR', NR', alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que 140 R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1;

(g) em que Ri = H, OR', SR', NR', alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R4 = H, halogenetos, alcenilo, ácido carboxilico, ou um alquilo contendo O, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada destes. arritmia arritmia 30. O método da reivindicação 29, em que a cardíaca é uma arritmia auricular ou uma ventricular. 31. O método da reivindicação 30, em que a arritmia auricular é fibrilação auricular. 32. 0 método da reivindicação 30, em que a arritmia ventricular é arritmia ventricular induzida pelo exercício físico. 33. 0 método da reivindicação 29, em que a quantidade de agente eficaz para tratar ou prevenir uma arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito vai de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia. 34. O método da reivindicação 29, em que o agente é S4, S7, S-20, S-24, S-25, S-26, S-27 ou S36. 141 35. 0 método da reivindicação 34, no qual o agente é S36. 36. Uso de um agente num método para tratamento ou prevenção de uma arritmia cardíaca, insuficiência cardíaca e/ou morte súbita cardíaca induzida pelo exercício físico no sujeito, em que o agente é seleccionado do grupo composto por:

" (CH2) nNR' 2 ou -R'= alquilo ou em que R = arilo, alcenilo, alquilo, (CH2)nSR', e n = 0, 1, 2 ou 3, e cicloalquilo;

(b) em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo;

(c) (0)m em que R = CO (CH2) nXR'2, S02 (CH2) nXR'2 ou S02NH (CH2) nXR'2 e X = N ou S e n = 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que m = 1 ou 2; 142

(d) em que R = arilo, alquilo, -(CH2)nNR'2 ou -(CH2)nSR', e n=0, 1, 2 ou 3, e R' = alquilo ou cicloalquilo; e em que X = NH ou 0;

R3 r2 (e) em que R2 = OR' , SR' , NR' , alquilo ou halogenetos na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou H; em que R2 = H, alquilo ou arilo; e em que R3 = H, alquilo ou arilo;

(0 em que R2 = H, OR', SR', NR', alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que m = 0, 1 ou 2; e em que n = 0 ou 1; 143

em que Ri = H, OR' , SR', NR', alquilo ou halogenetos, na posição 2, 3, 4 ou 5 no anel fenilo e R' = alquilo, arilo ou acilo; em que R2 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R3 = H, alquilo, alcenilo ou arilo; em que R4 = H, halogenetos, alcenilo, ácido carboxilico, ou um alquilo contendo 0, S ou N; e em que m = 0, 1 ou 2; e (h) qualquer forma oxidada destes. 37. Um método para identificar um agente para uso no tratamento ou prevenção da fibrilação auricular ou insuficiência cardiaca, compreendendo os passos de: (a) obter ou gerar uma cultura de células que contêm o RyR2; (b) colocar as células em contacto com o agente candidato; (c) expor as células a uma ou mais condições conhecidas para incrementar a fosforilação de RyR2 nas células; e (d) determinar se o agente limita ou previne uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 nas células. 38. O método da reivindicação 37, que compreende ainda o passo de: (e) determinar se o agente tem efeito sobre um evento biológico associado ao RyR2 nas células. 39. Um agente identificado pelo método da reivindicação 37. 144 40. Um método para identificar um agente para uso no tratamento ou prevenção da fibrilação auricular ou insuficiência cardíaca, compreendendo os passos de: (a) obter ou gerar um animal que contenha o RyR2; (b) administrar um agente candidato ao animal; (c) expor o animal a uma ou mais condições conhecidas para incrementar a fosforilação de RyR2 nas células; e (d) determinar se o agente limita ou previne uma redução no nível de FKBP12.6 vinculada ao RyR2 no animal. 41. O método da reivindicação 40, que compreende ainda o passo de: (e) determinar se o agente tem efeito sobre um evento biológico associado ao RyR2 no animal. 42. Um agente identificado pelo método da reivindicação 40. 145

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto caracterizado por ser representado pela estrutura:

2. Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender o composto da reivindicação 1 e um diluente ou veículo farmacologicamente aceitável.

3. A composição farmacêutica da reivindicação 2, caracterizada por o veículo compreender carboximetilcelulose, celulose cristalina, glicerina, goma-arábica, lactose, estearato de magnésio, metilcelulose, solução salina, alginato de sódio, sacarose, amido, talco ou água.

4. A composição farmacêutica da reivindicação 2 caracterizada por estar sob a forma de uma cápsula, comprimido, pó, grânulo ou suspensão.

5. A composição farmacêutica da reivindicação 2 caracterizada por compreender ainda um aditivo.

6. A composição farmacêutica da reivindicação 5, caracterizada por o aditivo ser um ou mais dos seguintes: antioxidantes, corantes, aromatizantes, conservantes, edulcorantes, ligantes ou lubrificantes. 2

7. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma reivindicações 2 a 6, caracterizada por ser usada no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição cardíaca num sujeito.

8. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a condição cardíaca ser arritmia cardíaca, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular, fibrilação auricular, fibrilação auricular permanente, fibrilação auricular não permanente, arritmia ventricular, fibrilação ventricular, taquicardia ventricular, taquicardia ventricular permanente, taquicardia ventricular não permanente, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC), insuficiência cardíaca, morte súbita cardíaca ou morte súbita cardíaca (MSC) induzida pelo exercício físico.

9. Um composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser para uso no tratamento ou prevenção de uma condição cardíaca num sujeito.

10. Uso de um composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser para o fabrico de um medicamento para uso no tratamento ou prevenção de uma condição cardíaca num sujeito.

11. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizada por a condição cardíaca ser seleccionada de entre o grupo composto por arritmia cardíaca, taquicardia, arritmia auricular, taquicardia auricular, fibrilação auricular, fibrilação auricular permanente, fibrilação auricular não permanente, arritmia ventricular, fibrilação ventricular, taquicardia ventricular, taquicardia ventricular permanente, 3 taquicardia ventricular não permanente, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC), insuficiência cardíaca, morte súbita cardíaca e morte súbita cardíaca (MSC) induzida pelo exercício físico.