JP2007530561A - リアノジンレセプタ(RyR2)の漏れを標的とする、新規な抗−不整脈性及び心不全用薬剤及びその使用 - Google Patents
リアノジンレセプタ(RyR2)の漏れを標的とする、新規な抗−不整脈性及び心不全用薬剤及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本件特許出願は、2004年3月25日付で出願された、米国特許出願第10/809,089号に係る一部継続出願の利益を請求するものであり、該米国特許出願は、2004年1月22日付で出願された、米国特許出願第10/763,498号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2003年10月7日付で出願された、米国特許出願第10/680,988号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2003年6月26日付で出願された、米国特許出願第10/608,723号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2002年11月5日付で出願された、米国特許出願第10/288,606号に係る一部継続出願の利益を請求しており、これは更に、2002年12月3日付で発行された米国特許第6,489,125B1である、2000年5月10日付で出願された、米国特許出願第09/568,474号に係る一部継続出願の利益を請求している。これらの内容を、本発明の参考として、ここに組み入れる。
本件発明は、NIH承認番号PO1HL 67849-01の下で、政府による支援を受けて行われたものであった。従って、米国政府は、本件発明に、幾分かの権利を有する。
心不全の重要な特徴は、低い心筋の収縮性である(Gwathmey等, 末期段階の心不全に罹っている患者由来の、心筋層における、異常な細胞内カルシウム処理, Circ. Res., 1987, 61:70-76)。健常な心筋及び他の横紋筋においては、リアノジンレセプタ(RyRs)を含む筋小胞体(SR)上のカルシウム-放出チャンネルが、活動電位と筋肉細胞の収縮とのカップリング(即ち、励起-収縮(EC)カップリング)を容易にする。収縮は、カルシウム(Ca2+)がSRから周辺の細胞質に放出された際に、開始される。心不全において、収縮異常は、一部には、心臓の活動電位(AP)が収縮を開始することを可能とする、シグナリングカスケードにおける変化によって生じる。特に、衰えた心臓においては、全細胞のCa2+過渡現象の振幅は減少し(Beuckelmann等, 末期の心不全に罹っている患者由来の単離された心室筋細胞における、細胞内カルシウム処理, Circ., 1992, 85:1046-55; Gomez等, 実験的な心肥大及び心不全における欠損性励起-収縮カップリング, Science, 1997, 276:800-06)、またその持続性が延長される(Beuckelmann等, 末期の心不全に罹っている患者由来の単離された心室筋細胞における、細胞内カルシウム処理, Circ., 1992, 85:1046-55)。
心臓疾患に罹っている全患者の約50%が、致死性の心不整脈により死亡している。このような致死性の心不整脈は、しばしば事実上心室性である。幾つかの場合において、心臓における心室性不整脈は、急速に「心臓突然死」(SCD)と呼ばれる現象である、致死性のものとなり得る。致死性の心室性不整脈(及びSCD)は、また若者、又は構造的な心疾患に罹っていることが知られていない、その他は健康な個人においても起こり得る。事実、心室性不整脈は、その他は健康な個人における突然死の最も一般的な原因である。
3つの型のリアノジンレセプタが存在し、これら全てが、Ca2+チャンネルと強い関連性を持つ。RyR1は、骨格筋中に見出され、またRyR2は、心臓に見出され、またRyR3は、脳内に位置している。タイプ2リアノジンレセプタ(RyR2)が、ECカップリング及び心臓の横紋筋における筋肉収縮にとって必要とされる、主なCa2+-放出チャンネルである。
1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、JTV-519又は4-[3-(4-ベンジルピペリジン-1-イル)プロピオニル]-7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン一塩酸塩(k201又はICP-カルスタン(Calstan) 100としても知られている)は、カルシウムイオンチャンネルの新規な調節剤である。心筋細胞内のCa2+レベルの調節に加えて、JTV-519は、またモルモットの心室細胞におけるNa+流及び内向き整流K+流をも調節し、またモルモットの心房細胞における遅延-整流K+流を阻害する。これらの研究は、カテコールアミン-誘発心筋障害、心筋障害-誘発性筋原線維過収縮、及び虚血/再灌流障害に対して、JTV-519が、強力な心臓保護作用を持つことを明らかにしている。実験的な筋原線維過収縮モデルにおいて、JTV-519が、プロプラノロール、ベラパミル、及びジルチアゼムよりも、高い心臓保護作用を持つことが立証されている。実験的なデータは、またJTV-519が、動物モデルにおいて、細胞内Ca2+の過剰放出レベルを減じることにより、心室性虚血/再灌流を効果的に防止することを示唆した。
従って、一局面において、本発明は、心房細動に罹っている又はその候補者である対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限もしくは防止するのに有効な量のJTV-519を、該対象に投与することによって、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限もしくは防止する方法を提供するものであり、ここで該RyR2は、心房RyR2である。また、心房細動に罹っている又はその候補者である対象内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限もしくは防止する方法における、JTV-519の使用法をも提供する。
更に別の態様によれば、対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を該対象に投与することによって、該対象における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止する方法が提供され、ここで該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、以下に列挙する化合物からなる群から選択される:
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。また、対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するための方法における、これら1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法を提供する。
更に別の局面において、本発明は、対象における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する方法を提供するものであり、該方法は、該対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を該対象に投与する工程を含み、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、以下に列挙する化合物からなる群から選択される:
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。
更なる局面において、本発明は、対象における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する方法を提供するものであり、該方法は、該対象における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を該対象に投与する工程を含み、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、以下に列挙する化合物からなる群から選択される:
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。同様に、本発明は、対象における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する方法における、これらの1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法にも関連する。
更に別の局面において、本発明は、心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用する薬剤を同定する方法をも提供するものであり、この方法は、以下の諸工程:(a) RyR2を含む細胞培養物を得、あるいはこれを生成する工程;(b) 該細胞と、候補薬剤とを接触させる工程;(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該細胞を暴露する工程;及び(d) 該薬剤が、該細胞内で、RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。一態様によれば、この方法は、更に、以下の工程:(e) 該薬剤が、該細胞内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む。同様に、本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、及びこの薬剤の、心房細動又は心不全を治療又は予防する方法における使用にも関連する。
本発明の追加の局面は、以下の記載に照らして明らかになるであろう。
構造的に正常な心臓において、同様な現象を検討することができる。具体的には、運動及びストレスが、心臓内のβ-アドレナリンレセプタを活性化する、カテコールアミンの放出を誘発することは公知である。β-アドレナリンレセプタの活性化が、RyR2チャンネルの過ホスホリル化に導く。証拠は、またβ-アドレナリンレセプタの活性化に起因する、このRyR2の過ホスホリル化が、変異されたRyR2チャンネルを、心臓サイクルの弛緩段階において、より一層開放性のものとし、結果的に不整脈の発生頻度を高めることを示唆している。
CPVTに罹っている個体全てが、運動-誘発性心不整脈の可能性を持つ。本発明者等は、前に運動-誘発性心不整脈及び突然死(CPVT患者の)が、RyR2に対するFKBP12.6のアフィニティーの低下に起因することを明らかにした。ここでは、本発明者等は、運動が、アデノシン-3',5'-一燐酸-依存性プロテインキナーゼ(PKA)によるホスホリル化の結果として、RyR2を活性化することを明らかにした。
71%のFKBP12.6+/-マウス(7匹中5匹)において、一回の早期拍動によりVTを誘発できた。JTV-519で前処理を施した7匹のFKBP12.6+/-マウスにおいては、VTは観測されなかった。2回の早期拍動プロトコール(S1-S2-S3)を用いた場合、100%の未処理FKBP12.6+/-マウス(7匹中7匹)において、再現性良く、VTを誘発できた。JTV-519による処理は、FKBP12.6+/-マウス(7匹中7匹)において、誘発可能なVTを完全に排除した。JTV-519処理は、FKBP12.6-/-マウスのけるVTを防止できなかったが、このことは、JTV-519の抗-不整脈作用にとって、FKBP12.6が必要であるという概念を、支持している。
運動させたFKBP12.6+/-マウス由来のRyR2チャンネルの開放確率(Po)は、運動させたFKBP12.6+/+マウス由来のチャンネルと比較して、大幅に増大した(+/-:0.47±0.12、n=11;+/+:0.04±0.01、n=13;P<0.05)。運動させたFKBP12.6+/-マウスのJTV-519(0.5mg/kg/h)による処理は、未処置の運動させたマウスと比較して、該チャンネルのPoを、大幅に減じる(0.02±0.01、n=13)(図2)。この観測は、該RyR2複合体における高い量のFKBP12.6と一致している(図2)。対照的に、FKBP12.6-/-マウスのJTV-519による処理は、低いPoを示すチャンネルを与えなかった。
JTV-519がVTを阻害するメカニズムを更に検討するために、本発明者等は、野生型のRyR2(RyR2-WT)チャンネルのPKAホスホリル化を用いて、運動の条件をシミュレートした。PKAでホスホリル化したRyR2チャンネルを、次に増大する濃度のJTV-519の存在下で、FKBP12.6(250nM)と共にインキュベートした。100nM又は1000nMのJTV-519とのインキュベートは、FKBP12.6とPKAでホスホリル化したRyR2との結合を誘発した(図3)。JTV-519は、また変異体RyR2-S2809Dチャンネルに対するFKBP12.6の結合を誘発したが、該チャンネルは、構成的にPKA-ホスホリル化RyR2チャンネルを真似たものである(図3)。
Ca2+-トランジェントは、RyR2を介するSRからの、Ca2+-誘発性Ca2+-放出を開始させる、筋鞘へのCa2+の流入に起因するから、以前の研究の結果は、細胞内カルシウム処理における変更が、該頻拍-誘発性リモデリング課程を伴うことを示唆している。このような異常に減少するCa2+-トランジェントは、単離された心房筋細胞の抑制された短縮化を関連しており、このことは、カルシウム処理が、AFを伴う心房性収縮機能不全に寄与することを示している(Sun等, 持続的な心房頻拍によって引起される、心房収縮機能不全の細胞的メカニズム; Circulation, 1998, 98:719-27;)。
JTV-519に関する初期の研究は、その抗-虚血性に焦点が当てられていた(個人的情報、アエタス(Aetas))。しかし、ごく最近、JTV-519が、心房細動のイヌ無菌心膜炎モデルにおける、AFの誘発を阻害することが示された(Kumagai等,イヌ無菌心膜炎モデルにおける、心房細動/粗動に及ぼす、新規な心臓保護薬である、JTV-519の抗-不整脈作用; J. Cardiovasc. Electrophysiol., 2003, 14:880-84)。しかし、この研究は、JTV-519が、AFの誘発及び維持に影響を与えるメカニズムを定義しなかった。
心房細動は、複雑な電気生理学的過程であり、その分子的な病因性は、多因性となる傾向がある。異常な心筋Ca2+-処理は、該発病過程に大きく寄与するものと思われる。本発明者等の研究は、RyR2のPKA-過ホスホリル化に起因する、異常な細胞内Ca2+-放出チャンネル機能が、AFにおけるリモデリング過程に寄与する可能性があり、また不整脈の引き金として機能する、潜在的な可能性がある。
上記の記載によれば、本発明は、対象内のRyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少を制限し又は防止する方法を提供する。ここで使用する「FKBP12.6」とは、「FKBP12.6タンパク」及び「FKBP12.6類似体」両者を含む。ここでは、特に述べない限り、「タンパク」とは、タンパク、タンパクドメイン、ポリペプチド、又はペプチド、及びこれらの任意のフラグメントを含むものとする。「FKBP12.6類似体」は、FKBP12.6の生物学的な活性を持つ、該FKBP12.6タンパクの機能性の変異体であり、これは60%又はそれ以上の、該FKBP12.6タンパクとの、アミノ酸配列相同性を持つものである。更に、ここで使用する用語「FKBP12.6の生物学的な活性」とは、ここに記載するアッセイ条件下で、未-ホスホリル化又は非-過ホスホリル化RyR2と、物理的に会合又はこれらと結合する(即ち、負のコントロールのバックグラウンド結合よりも、約2倍又はより好ましくは約5倍結合する)能力を持つことが立証されているが、アフィニティーは、FKBP12.6のものとは異なっていても良い、タンパク又はペプチドの活性を意味する。
本発明の方法によれば、該RyR2-結合FKBP12.6のレベルにおける減少が、対象(例えば、この対象の細胞中)において制限され、又は防止される。本発明における該対象は、両生類、鳥類、魚類、哺乳類及び有袋類を包含する任意の動物であり得るが、好ましくは哺乳動物(例えば、ヒト、家畜(飼育されている)動物、例えばネコ、イヌ、サル、マウス又はラット、あるいは商業動物、例えばウシ又はブタ)である。本発明の幾つかの態様において、該対象は、心臓状態を有するか、あるいはその候補者である。「心臓状態」の例は、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を包含する心室性不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全及び運動-誘発性心臓突然死を含むが、これらに制限されない。
心房細動は、頻脈性不整脈の一例である。より具体的には、心房細動は、異常な及び不規則な心臓の律動に関連する状態であり、そこでは、電気シグナルが、該心臓の上部心室又は心房全体を通して、無秩序に発生する。心房細動の共通する症状は、動悸(心臓の急速な、かつ不規則な拍動の不快な意識)を含むが、これらに限定されない。心房細動は、また心臓から脳に移動して卒中を引起す、血栓を発生する恐れがある。心房細動の従来の治療は、危険因子の調節、心拍数を減らし及び/又は該心臓を正常な律動状態に転化するための薬剤の投与、及び血栓に関連する合併症の予防を含む。
心臓状態(例えば、心不整脈又は心不全)に関する「候補」は、心臓状態を発生する危険性を持つことが知られている、あるいは該危険性があると思われる、あるいは該状態に罹っていると推定される対象である。心臓状態に関する候補の例は、心不整脈(例えば、頻拍;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を包含する心室性不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)及び/又は心不全に罹っているものと考えられる動物/ヒト;及び心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を包含する心室性不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を発症する危険性のあることが知られている、あるいは該危険性があると思われる、あるいは該状態に罹っていると推定される動物/ヒトを含むが、これらに制限されない。
本発明の製薬処方物は、製薬の分野において周知の方法で製造することができる。例えば、JTV-519を、懸濁液又は溶液として、担体又は希釈剤と併合することができる。場合によっては、1又はそれ以上の副成分(例えば、バッファー、矯味剤、界面活性剤、等)を、添加することもできる。担体の選択は、投薬経路に依存するであろう。
経口投与のためには、JTV-519処方物は、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤として、又は懸濁剤として提供することができる。該処方物は、公知の添加剤、例えばラクトース、マニトール、コーンスターチ、又はポテトスターチを含むことができる。該処方物は、またバインダ、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンと共に処方することもできる。更に、該処方物は、コーンスターチ、ポテトスターチ、又はナトリウムカルボキシメチルセルロース等の崩壊剤と共に処方することもできる。同様に、該処方物は、二塩基性無水燐酸カルシウム又はナトリウムデンプングリコレートと共に、処方することもできる。最後に、該処方物は、たる熊ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤と共に処方することもできる。
経皮投与のためには、JTV-519は、皮膚浸透性増強剤、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、N-メチルピロリドン等と組合わせることができ、これらは皮膚のJTV-519に対する浸透性を増し、かつ該JTV-519が、皮膚を透過して、血流内に浸入することを可能とする。このJTV-519/増強剤組成物は、更にポリマー物質、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン/ビニルアセテート、ポリビニルピロリドン等と組合わせて、塩化メチレン等の溶媒に溶解でき、所定の粘度にまで蒸発させ、次いで支持体材料に適用し、貼付剤を製造することもできる。
本発明の一態様によれば、該対象は、未だ心不整脈(例えば、頻拍症;心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死等の心臓疾患状態を発症していない。この場合、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な、JTV-519の量は、該対象内の、心臓疾患状態(例えば、心不整脈、心不全又は運動-誘発性心臓突然死)を予防するのに有効なJTV-519の量であり得る。
ある対象における心臓疾患状態を予防するのに有効な、薬物(例えば、JTV-519)の量は、該心臓疾患状態の種類、該対象の体重、該対象の疾患状態の重篤度、及び該薬物(例えば、JTV-519)の投与モードを含む、各場合における特定の因子に依存して変動するであろう。この量は、既知の手順に基いて、当業者が容易に決定でき、該既知の手順は、臨床的な試み、及びここに記載する方法を含む。本発明の一態様によれば、運動-誘発性心不整脈を防止するのに有効な薬物(例えば、JTV-519)の量は、該対象における、運動-誘発性心臓突然死を予防するのに有効な薬物(例えば、JTV-519)の量である。別の態様では、該薬物(例えば、JTV-519)は、該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房性頻拍不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死等を予防する。
従って、本発明の他の態様では、該対象は、心臓疾患状態を発現している。例えば、該対象は、かつて運動しており、あるいは現在運動しており、しかも運動-誘発性心不整脈を患っている。このような場合、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効なJTV-519の量は、該対象における、心臓疾患状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、又は心不全)を治療するのに有効な、JTV-519の量であり得る。
ある対象における、心臓疾患状態を治療するのに有効な薬物(例えば、JTV-519)の量は、該心臓疾患状態の種類、該対象の体重、該対象の疾患状態の重篤度、及び該薬物(例えば、JTV-519)の投与モードを含む、各場合における特定の因子に依存して変動するであろう。この量は、既知の手順に基いて、当業者が容易に決定することができ、該既知の手順とは、臨床的な試み、及びここに記載する方法を含む。好ましい一態様によれば、該薬物(例えば、JTV-519)は、該対象における、少なくとも1種の心臓疾患状態を治療する。
上記方法の様々な態様において、該運動-誘発性心不整脈は、VTと関連している。好ましい態様において、該VTは、CPVTである。これら方法に関する別の態様では、該対象は、運動-誘発性心臓突然死に関する候補を包含する、運動-誘発性心不整脈に関する候補である。
上で議論し、またここに提示した如く、本発明者等のデータは、セリン2809上の、心臓リアノジンレセプタ、RyR2の、タンパクキナーゼA(PKA)によるホスホリル化が、FK506結合タンパク、FKBP12.6を放出することによって、カルシウム放出チャンネルを活性化することを示している。障害のある心臓(心不全のヒトの心臓及びその動物モデルを含む)においては、RyR2が、PKA-ホスホリル化されており、結果として低下したFKBP12.6の結合量を持つ、不完全なチャンネルをもたらし、またカルシウム-誘発性活性化に対して高い感受性を持つ。これら変化の最終的な結果は、該RyR2チャンネルが、「漏洩性」となることである。これらチャンネルの漏れは、もはや十分なカルシウムが、筋小胞体(SR)中には存在せず、結果的に筋肉収縮の強烈な刺激を与える、カルシウムの細胞内貯蔵量の枯渇をもたらす可能性がある。このことは、心筋の弱い収縮をもたらす。このチャンネル漏洩の第二の結果として、RyR2チャンネルは、「拡張期」として知られる、心臓サイクルの静止段階において、カルシウムを放出する。この拡張期におけるカルシウムの放出は、心臓突然死(SCD)を引起す、該心臓の致死的な不整脈(例えば、心室頻拍症及び心室細動)を誘発する恐れがある。
従って、本発明は、更に少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療し又は予防するのに使用するための薬剤を、同定する方法をも提供する。この方法は、(a) RyR2を含む細胞培養物を得、あるいはこれを生成する工程;(b) 該細胞と、候補薬剤とを接触させる工程;(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該細胞を暴露する工程;及び(d) 該薬剤が、該細胞内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するか否かを決定する工程を含む。
本発明の方法においては、細胞を、ここに記載した、任意の導入並びに投与モードを包含する、薬物/薬剤と細胞との間の接触を行う、標準的な方法の何れかによって、接触させることができる。該細胞内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルは、当業者には公知の、又はここに記載した、任意の方法、分子的な手続き、及びアッセイを含む、公知の手順によって、測定又は検出することができる。本発明の一態様によれば、該薬剤が、該細胞におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限し又は阻害する。
該RyR2-関連状態は、該対象に、そこにおける該RyR2-関連状態を治療し又は予防するのに有効な量の該薬剤を投与することによって、該対象内で、治療し又は予防することができる。当業者は、この量を、容易に決定することができる。一態様において、本発明は、ある対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を、該対象における該少なくとも1種の心臓状態を治療し又は予防するのに有効な量で、該対象に該薬剤を投与することによって、治療し又は予防するための方法を提供する。
心不全の程度と関連する、RyR2のPKA-ホスホリル化のレベルをもアッセイし、次いで該RyR2チャンネルのPKA-ホスホリル化を阻害するように設計された、化合物の有効性を決定するのに利用できる。このようなアッセイは、該RyR2タンパクに特異的な抗体の使用に基くものであり得る。例えば、該RyR2チャンネルタンパクは、免疫沈降させ、次いでPKA及び[γ-32P]-ATPにより、逆-ホスホリル化することができる。次いで、該RyR2タンパクに移行する、放射性[32P]標識の量を、リン光造影装置(phosphoimager)を用いて、測定することができる(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)からFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節;Cell, 2000, 101:365-76)。
新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体及びその合成方法
1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、特に2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、JTV-519を含む生物学的に活性な分子の製造における、重要な結合遮断物質である。本発明者等は、1,4-ベンゾチアゼピン中間体化合物、例えば7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造するための新規な方法を開発した。この本発明者等の方法は、容易に入手でき、かつ高価でない出発物質を使用し、また高収率で主要な1,4-ベンゾチアゼピン中間体を与える。
7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び同様な化合物を製造するための2つの方法が、以前に文献において報告されている。その第一の方法は、Kaneko等(米国特許第5,416,066号)に記載されており、これは2,5-ジヒドロキシ安息香酸から出発する、6段階の合成経路を含んでいた。この方法において、2,5-ジヒドロキシ安息香酸は、ジメチル硫酸によって選択的にメチル化された。次いで、生成する化合物を、20時間に渡り、ジメチルチオカルバモイルクロリドと反応させ、更に9時間に渡り高温(270℃)条件に暴露した。この段階の生成物を、メタノール中で20時間に渡り、ナトリウムメトキシドと共に還流した。次いで、この還流段階の生成物を、塩基性条件下で、かつ高温度下で、2-クロロエチルアミンと反応させた。この環化されたアミドを、LiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1,4-ベンゾチアゼピン中間体の一つ)を製造した。
上記問題点を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき、かつ高価でない出発物質から、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造する新規な方法を開発した。本発明者等の方法は、単離並びに精製段階を単純化し、しかも7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン及び以下の式で示される一般的な構造を持つ他の化合物を含む、様々な1,4-ベンゾチアゼピン中間体を製造するのに利用できる:
R2=アルキル;
R3=アルキル
この方法は、またJTV-519の製造にも利用できる。
従って、上記の観点から、本発明は、以下の式で表される化合物の合成方法を提供する:
(a) 以下の式で表される化合物:
(b) 上記段階(a)において製造した化合物を、ジアゾ化剤及びジスルフィドにより処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程:
(c) 上記段階(b)において製造した化合物を、活性化剤及びクロロエチルアミンで処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程:
(d) 上記段階(c)において製造した化合物を、還元剤と塩基とで処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程:
(e) 上記段階(d)において製造した化合物を、還元剤で処理して、以下の式で表される化合物を製造する工程:
本発明の方法によれば、上記工程(a)における還元剤はH2であり得る。更に、上記工程(b)におけるジアゾ化剤は、NaNO2であり得、また該工程(b)におけるジスルフィドは、Na2S2であり得る。更に、上記工程(c)におけるクロリドは、SOCl2であり得る。上記工程(d)における還元剤はトリメチルホスフィン(PMe3)であり得、一方該工程(d)における塩基は、トリエチルアミンである。もう一つの態様において、上記工程(e)における還元剤はLiAlH4であり得る。
本発明は、更に、以下の式を有する化合物の合成法を提供する:
(a) 以下の式で表される化合物:
一例として、以下の式で表される化合物:
Rは2、3、4、又は5-位に位置することができる。
一例として、また実施例9及び以下の反応式1に示すように、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンは、2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸から、以下のようにして製造できる。2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸のニトロ基を、触媒としてPd/Cを使用して、H2により還元して、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸を得る。2-アミノ-5-メトキシ安息香酸は、NaNO2でジアゾ化することができ、また次にNa2S2で処理して、安定なジスルフィド化合物を製造することができる。更に精製することなしに、該安定なジスルフィド化合物をSOCl2で処理し、次いでEt3Nの存在下で、2-クロロエチルアミンと反応させて、アミドを製造する。次いで、このアミド化合物を、以下のように1-ポット(one-pot)法に従って、環化化合物に転化することができる。還元剤(例えば、トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)及び塩基(例えば、トリエチルアミン)を、該アミド化合物のTHF(テトラヒドロフラン)溶液に添加することができる。次いで、生成した反応混合物を、3時間に渡り還流することができる。該還元剤(例えば、トリメチルホスフィン又はトリフェニルホスフィン)は、該ジスルフィド(S-S)をそのモノスルフィド状態に開裂し、引続き該クロリドと分子内環化を行って、環化されたアミドを生成する。次に、この環化されたアミドを、LiAlH4で還元して、1,4-ベンゾチアゼピン中間体、即ち7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンを製造することができる。次いで、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピンから、これと3-ブロモプロピオン酸クロリドとを反応させ、次いで得られる化合物と、4-ベンジルピペリジンとを反応させることにより、JTV-519を製造することができる。
一例として、また実施例10及び以下の反応式2に示すように、放射性標識したJTV-519は、以下のようにして製造できる。JTV-519は、BBr3を用いて、該フェニルリングにおいて、脱メチル化処理することができる。次いで、生成するフェノール化合物を、塩基(例えば、NaH)の存在下において、放射性標識したメチル化剤(例えば、3H-ジメチル硫酸)で、再度メチル化して、3H-標識JTV-519を得ることができる。
本発明は、更にJTV-519に類似する、2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼペンを包含する、新規な1,4-ベンゾチアゼピン中間体及び誘導体を提供する。例として、本発明は、以下の式で表される化合物を提供する:
本発明者等の新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物の例は、S7、S-20、S-25、S-27及びS36を含むが、これらに制限されない。好ましくは、本発明の化合物は、S36である。S7、S-20、S-25、S-27及びS36に関する構造は、本発明の図15に見出すことができる。本発明のこれら及びその他の任意の新規化合物は、上記した如き製薬上許容される担体と組合わせることができ、かくして薬理組成物を製造することができる。
本発明は、更にここに記載した如き、新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法をも提供する。例えば、本発明は、以下の式で表される化合物の合成方法を提供する:
(a) 以下の式で示される化合物:
本発明の方法は、更に以下の式で表される化合物を、酸化剤によって酸化して:
(ここで、Rは、上記定義通りであり、mは1又は2である)。本発明の一態様においては、該酸化剤は、過酸化水素である。
例として、また実施例11及び反応式3に示すように、本発明者等は、以下の一般式を持つ化合物の合成方法を開発した:
本発明は、また以下の式で示される化合物の合成方法をも提供し:
本発明の方法は、更に以下の式を持つ化合物:
ここで、Rは、上で定義した通りであり、mは1又は2である。一態様において、該酸化剤は、過酸化水素である。
例として、また実施例11及び反応式4に示すように、本発明者等は、以下の式で示される一般的な構造を持つ化合物の合成方法を提供する:
本発明は、更に以下の式で表される化合物の合成方法を提供する:
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である。この方法は、以下の式で表される化合物:
(ここで、Rは上記の定義通りである)を製造する段階を含む。一態様において、該酸化剤は、過酸化水素である。この方法は、またJTV-519を酸化するのに利用することもできる。
本発明は、更に以下の式で表される化合物の合成法をも提供する:
ここで、RはCO(CH2)nXR'2、SO2(CH2)nXR'2、又はSO2NH(CH2)nXR'2であり、XはN又はSであり、及びnは1、2、又は3であり、及びR'はアルキル又はシクロアルキルであり、かつmは1又は2である。この方法は、以下の式で表される化合物:
(ここで、Rは上記の定義通りである)を製造する段階を含む。一態様において、該酸化剤は、過酸化水素である。この方法は、またJTV-519を酸化するのに利用できる。
例として、また実施例11及び反応式5に示すように、本発明者等は、以下の式で示される一般的な構造を持つ化合物の合成方法を開発した:
更に、本発明は、以下の式で表される化合物の合成方法を提供する:
例として、また実施例11及び反応式6に示すように、本発明者等は、以下の式で示される一般的な構造を持つ化合物の合成方法を開発した:
本発明は、更に以下の式で表される、2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン化合物の合成方法を提供する:
(a) 以下の式で表される化合物:
(b) 上記段階(a)において生成した化合物を、ジアゾ化剤及びジスルフィドで処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階:
(c) 上記段階(b)において生成した化合物を、活性化剤及びクロロエチルアミンで処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階:
(d) 上記段階(c)において生成した化合物を、還元剤及び塩基で処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階:
(e) 上記段階(d)において生成した化合物を、還元剤で処理して、以下の式で表される化合物を製造する段階:
新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を用いた、治療並びに予防方法
本発明者等の新規1,4-ベンゾチアゼピン化合物は、JTV-519と、機能特性を共有している。例えば、JTV-519(mwt=423)と同様に、化合物S36(mwt=267)は、カルシウムチャンネルを調節する。事実、S36(カルボン酸)は、カルシウムチャンネルの調節において、JTV-519よりも約10倍も強力である(データは示さない)。しかし、JTV-519とは違って、本発明者等の新規な化合物は、hERGsの活性に対して僅かな遮断性を示すに過ぎない。
迅速遅延整流(I(Kr))チャンネル、即ちカリウムチャンネルは、心臓活動電位の再分極にとって重要である。hERGは、該I(Kr)チャンネルの孔-形成サブユニットである。I(Kr)機能の抑制は、有害薬物作用及び/又はhERGにおける遺伝的な欠陥の結果として、生命を脅かす不整脈の高い危険性をもたらす、長期-QT(LQT)症候群に導く恐れがある。従って、hERGsは、遮断された場合に、心不整脈及び心臓突然死を引起す可能性のある、カリウム-チャンネルサブユニットである。
上記記載に基いて、本発明者等の新規な1,4-ベンゾチアゼピン化合物は、JTV-519よりも一層強力であり、また低い毒性を持つ。従って、本発明者等の新規な化合物は、ある対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するための、上記方法の何れかにおいて特に有用であると思われる。ここで、該対象とは、少なくとも1種の心臓状態を患っており、あるいはその候補者を含むものであり、また該心臓状態とは、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、及び運動-誘発性心臓突然死)を含むが、これらに制限されない。また、本発明者等の化合物は、ある対象におけるこのような心臓状態を治療又は予防する方法において、特に有用であると思われる。
従って、本発明は、更に、ある対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量のある薬剤を、該対象に投与することによって、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するための方法をも提供する。本発明の該薬剤は、以下に列挙するものを含む、任意の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体である:
(h) 上記化合物(a)-(g)の任意の酸化形態にあるもの。また、対象における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限もしくは防止するための方法における、これら薬剤の使用法をも提供する。本発明の一態様においては、該薬剤は、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27及びS36からなる群から選択される。これら薬剤の構造は、図15に見出すことができる。好ましくは、該薬剤はS36である。
本発明の方法において、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、上記のように、該誘導体と、製薬上許容される担体とを含む、治療組成物の一部として、該対象に投与することができる。該誘導体又は薬理組成物は、当分野において公知の及び/又はここに記載する任意の技術によって、該対象に投与することができる。
本発明は、更に該対象における、心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療又は予防する方法をも提供し、この方法は、該対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量で、該対象にある薬剤を投与する工程を含む。本発明の該薬剤は、以下に列挙するものを包含する、任意の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体であり得る:
(h) これら化合物(a)-(g)の任意の酸化形態にあるもの。
本発明は、更に対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療する方法をも提供する。この方法は、該対象に、そこにおける少なくとも1種の心臓状態を治療するのに有効な量で、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体を、該対象に投与する工程を含む。対象における、心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)又は心不全)を治療するのに有効な、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の適当な量は、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内であり得、及び/又は約300ng/ml〜約1000ng/mlなる範囲内の、血漿レベルを達成するのに十分な量であり得る。
上記方法によれば、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の例は、以下に列挙するものを包含するが、これらに限定されない:
(h) これら化合物(a)-(g)の、任意の酸化形態にあるもの。本発明の一態様においては、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体は、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27及びS36からなる群から選択される。好ましくは、該1,4-ベンゾチアゼピン誘導体はS36である。本発明は、また対象における、少なくとも1種の心臓状態(例えば、心不整脈(例えば、頻拍症;心房頻拍性不整脈及び心房細動(持続性及び非-持続性両者)を含む、心房不整脈;心室細動を含む心室不整脈;及び運動-誘発性心不整脈)、心不全、又は運動-誘発性心臓突然死)を治療又は予防するための方法における、これら1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の使用法をも提供する。
本発明の方法において、該RyR2は、固相、例えばプレート又はビーズ等の固相に固定化される。RyR2-FKBP12.6結合の検出を容易にするために、該FKBP12.6を放射線標識(例えば、32Sを用いて)することができる。更に、増強されたRyR2とFKBP12.6との結合は、FKBP12.6-結合剤を用いて検出することができる。一態様において、該FKBP12.6-結合剤は、抗-FKBP12.6抗体である。本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、並びに対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法;対象における心不全、心房細動又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法;及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における、この薬剤の使用法をも提供する。
本発明の方法において、該FKBP12.6は、固相、例えばプレート又はビーズ等の固相に固定化される。RyR2-FKBP12.6結合の検出を容易にするために、該RyR2を放射線標識(例えば、32Pを用いて)することができる。更に、増強されたRyR2とFKBP12.6との結合は、RyR2-結合剤を用いて検出することができる。一態様において、該RyR2-結合剤は、抗-RyR2抗体である。本発明は、またこの方法によって同定された薬剤、並びに対象におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法;対象における心不全、心房細動又は運動-誘発性心不整脈を治療又は予防する方法;及び対象における運動-誘発性心臓突然死を予防する方法における、この薬剤の使用法をも提供する。
あるいはまた、RyR2は、32P-ATPの存在下において、PKA-ホスホリル化することができる。放射性PKA-ホスホリル化RyR2を、様々な濃度(10〜100nM)にて、JTV-519類似体及び他の1,4-ベンゾチアゼピン誘導体の存在下で、該FKBP12.6-被覆96-ウエルプレート上に、30分間適用することができる。該プレートを洗浄して、未結合の放射性RyR2を除去し、次いで自動プレートリーダによって、読み取ることができる。PKA-ホスホリル化RyR2は、また該プレートに塗布し、かつ該類似体及び誘導体の存在下で、32S-標識FKBP12.6と共にインキュベートすることができる。
実施例1:FKBP12.6-枯渇マウス
FKBP12.6-枯渇マウスを、以前に記載されたように(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)して、発生させた。簡単に説明すれば、ヒトFK506結合タンパク12.6(FKBP12.6)の、ネズミオーソロガス遺伝子に関するマウスゲノムλ-ファージクローンを、完全な長さのネズミcDNAプローブを用いて、DBA/1lacJライブラリーから単離した。3.5kbのネズミゲノムDNAと、PGK-ネオ選択性マーカーで置換することにより、ターゲットベクタを、ネズミFKBP12.6に関する全コード配列を含む、エキソン3及び4を欠失するように設計した(Bennett等, ネズミFK506結合タンパク(FKBP) 12.6遺伝子の同定及び特徴付け; Mamm. Genome, 1998, 9:1069-71)。5.0-kbの5'フラグメント及び1.9-kbの3'フラグメントを、PGK-ネオ及びPGK-TKカセットを持つ骨格ベクタにクローニングした。該DBA/lacJ胚性幹(ES)細胞を、確立されたプロトコールを利用して、成長させ、かつトランスフェクションした。ターゲットES細胞を、まずサザン分析によりスクリーニングし、5つの正のES細胞系を、PCRにより解析して、相同的組換えを確認した。雄性キメラを、雌性DBA/1lacJと交配させ、生殖系列の子孫を、褐色コートカラーによって同定した。生殖系列の子孫を、5'サザン分析を利用して、遺伝子型決定(genotyped)を行った。正のFKBP12.6+/-の雄及び雌を、異種交配させたところ、子孫は、約25%の頻度にて、FKBP12.6-/-マウスを生成した。FKBP12.6-/-マウスは、繁殖力を持つものであった。
実施例2:マウスにおけるテレメトリーによる記録及び運動テスト
FKBP12.6+/+マウス及びFKBP12.6-/-マウスを、インスティチューショナルアニマルケア&ユースコミッティーオブコロンビアユニバーシティー(Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University)によって承認されたプロトコールに従って飼育し、かつ研究した。マウスを、2.5%イソフルラン吸入麻酔法により麻酔した。歩行可能動物のECGラジオテレメトリーによる記録は、腹腔内移植後、>7日で得られた(Data Sciences International, MN、セントポール)(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)。ストレステストのために、マウスを、疲労するまで、傾斜のある足踏み車上を運動させ、次いでエピネフリン(0.5〜2.0mg/kg)を腹腔内注射した(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)。歩行可能動物の静止期心拍数を、4時間に渡り追跡して平均値を得た。
RyR2(RyR2-S2809D)上のPKAターゲットサイトの突然変異誘発は、以前に記載されたように(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)行った。HEK293細胞を、20μgのRyR2野生型(WT)又は変異型cDNA及び5μgのFKBP12.6 cDNAにより、Ca2+-燐酸沈殿法を用いて、同時トランスフェクションした。RyR2チャンネルを含む小胞を、以前に記載された(Wehrens等, 運動-誘発性心臓突然死に関連するFKBP12.6-枯渇及び不完全カルシウムチャンネル(リアノジンレセプタ)機能; Cell, 2003, 113:829-40)ようにして調製した。
実施例4:RyR2のPKA-ホスホリル化及びFKBP12.6の結合
心臓SR膜を、以前に記載(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節;Cell, 2000, 101:365-76; Kaftan等, 心筋由来のリアノジンレセプタ/Ca(2+)-放出チャンネルに及ぼす、ラパマイシンの作用, Circ. Res., 1996, 78:990-97)されたようにして製造した。35S-標識したFKBP12.6を、プロメガ(Promega)社(WL、マディソン)から入手した、TNTTMクイックカップルド転写/翻訳装置を用いて発生させた。[3H]リアノジンレセプタを使用して、RyR2レベルを定量した。100μgのミクロソームを、100μlの10-mMイミダゾールバッファーで希釈し、250-nM(最終濃度)の[35S]-FKBP12.6と共に37℃にて60分間インキュベートし、次いで00μlの氷冷したイミダゾールバッファーで急冷した。サンプルを、100,000gにて10分間遠心分離処理し、イミダゾールバッファーで3回洗浄した。結合した[35S]-FKBP12.6の量を、ペレットの液体シンチレーションカウンタで測定した。
ミクロソーム(50μg)の免疫ブロット分析を、抗-FKBP12.6(1:1,000)、抗-RyR5029(1:3,000)(Jayaraman等, カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)と関連した、FK506結合タンパク質; J. Boil. Chem., 1992, 267:9474-77)又は抗-ホスホRyR2-P2809(1:5,000)を用いて、室温にて1時間行った(Reiken等, β-遮断剤は、ヒト心不全症における、カルシウム放出チャンネル機能を回復させ、かつ心筋の性能を改善する; Circulation, 2003, 107:2459-66)。このP2809-ホスホエピトープ-特異的抗-RyR2抗体は、アフィニティー-精製されたポリクローナルウサギ抗体である。これは、Ser2809において、PKA-ホスホリル化されたRyR2に相当する、ペプチドCRTRRI-(pS)-QTSQを用いて、ジムドラボラトリーズ(Zymed Laboratories)(CA、サンフランシスコ)により、オーダーメイドされたものであった。HRP-標識した抗-ウサギIgG(1:5,000希釈;トランスダクションラボラトリーズ(Transduction Laboratories, KY、レキシントン)と共にインキュベートした後、ブロットを、ECL(アマーシャムファルマーシア(Amersham Pharmacia, NJ、ピスカタウエイ)を用いて発現させた。これらの抗体は、また以下の比率:1:4,000(抗-ウサギIgG);及び1:5,000(抗-RyR2-5029及び抗-FKBP12.6)にて使用することもできる。
ゲッシ目(マウス又はラット)の心臓由来の本来のRyR2、及び組換えRyR2の単一チャンネル記録は、以前に記載された(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節;Cell, 2000, 101:365-76)ようにして、0mVにて、電位-固定条件下で得た。チャンネル記録に使用した対称溶液(symmetric solutions)は、以下の通りであった:トランス区画:HEPES, 250mM/L; Ba(OH)2, 53mM/L(幾つかの実験では、Ba(OH)2をCa(OH)2で置換えた);pH 7.35;及びシス区画:HEPES, 250mM/L; Tris-塩基、125mM/L; EGTA, 1.0mM/L;及びCaCl2, 0.5mM/L; pH 7.35。特に述べない限り、単一チャンネル記録は、シス区画において、150-nMの[Ca2+]及び1.0mMの[Mg2+]の存在下で行った。リアノジン(5mM)を、このシス区画に適用して、全チャンネルの同一性を確認した。データは、フェッチャン(Fetchan)ソフトウエア(アキソンインスツルメンツ(Axon Instruments), CA、ユニオンシティー)を用いて、デジタル化した電流の読みから解析した。全てのデータは、平均±SEとして表示する。アンペアードスチューデントt-テストを、実験同士の平均値の統計的な比較のために使用した。p<0.05なる値を、統計的に有意なものとした。
25匹のスプラーク-ダウレイ(300-400g)マウスを、開胸術によって、左冠動脈結サツを行い、以前に記載されたように心筋梗塞を発生させた(Alvarez等, 後期の後-心筋梗塞は、ラットの心筋細胞にテトラドトキシン-耐性Na+流を誘発する; J. Mol. Cell Cardiol., 2000, 32:1169-79)。簡単に説明すると、ラットを、150mg/kgの腹腔内ケタミン及び15mg/kgのクロルプロマジンとの混合物で麻酔した。換気アシストデバイス及び気管内チューブで呼吸を維持(3ml空気/60ストローク/分)した。中央-左部開胸及び心膜開放後、左主冠動脈を、左側心耳下部の最も遠位部分において、7-0シルク縫合糸で閉じた。擬似手術を施したラット(n=5)を、同様に処置したが、冠動脈の結サツはしなかった。
心筋梗塞の6週後に、心エコー法を用いて、心不全が確認された。JTV-519又は賦形剤(DMSO)を、移植可能な浸透圧輸注ポンプ(アルゼ(Alzet)ミニ-浸透圧ポンプ;デュレクト(Durect)社、CA、クパーチノ)によって、連続的に輸注(0.5mg/kg/h)した。連続処置の4週間後に、心エコー法及び血行動態測定を実施した。動物を殺し、その組織サンプルを採取した。
構成性のPKA-ホスホリル化RyR2チャンネルを模倣する、変異RyR2-S2809Dチャンネルを用いて、JTV-519が、該RyR2チャンネルに対するFKBP12.6のアフィニティーを増すことが明らかになった(図5)。より具体的には、JTV-519による処理が、該変異チャンネルに対するFKBP12.6の結合能を高め、結果としてJTV-519が心不全を防止するメカニズムが明らかになった。JTV-519による処理は、また機能不全の心臓のRyR2チャンネルにおける漏れをも防止した(図6)。更に、JTV-519は、PKA-ホスホリル化RyR2及び、用量-依存性様式で、構成性のPKA-ホスホリル化RyR2を模倣する、該変異RyR2-S2809D両者に対する、FKBP12.6の結合性を回復した(図7)。
a) 動物プロトコール
ペースメーカーを、24-26kgの雌の雑種成犬に、以前に記載された技術に従って、移植した(Dun等, 慢性心房細動は、外向きの流れを更に減じることはない。該心房細動は、該流れを増大させる; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2003, 285:H1378-84)。動物を、チオペンタールナトリウム(17mg/kg、i.v.経路)で麻酔し、イソフルラン(1.5-2%)及びO2(2 L/分)で換気した。活性な固定用リードを、皮下にトンネルを設けて、右の心耳及び右心房自由壁に移植し、夫々アイトレル(Itrel)パルス発生装置及びテラ(Thera) 8962ペースメーカー(メドトロニクス(Medtronics), MN, ミネアポリス)と接続した。40%のホルムアルデヒド(0.1-0.3ml)を、ヒス束に注入し、完全なAV遮断を達成した。心室ペースメーカーを、60bpmなる速度にプログラムし、ペーシングプロトコール中ずっとこの速度に維持した。回収した後、心房ペーシングを、600-900bpmなる速度に設定し、46±3日間又は該動物が慢性AF(連続ペーシングのない場合には、AFを>5日として定義した)となるまで維持した。
次いで、これら動物を、ペントバルビタール(30mg/kg)で麻酔し、その心臓を取出した。心房細胞を切取り、即座に液体窒素中でフラッシュ-冷凍し、-80℃にて保存した。
本研究において提示するヒトに関するデータは、インスティチューショナルレビューボードオブザニューヨークプレスバイタリアンホスピタル(Institutional Review Board of the New York Presbyterian Hospital)により承認されたプロトコールの下で、同所性心臓移植に伴う、末期段階の心不全状況下での心房細動に罹っている患者由来の5つのヒトの心臓から得た。更に、データは同様に、移植には適さない3つの正常な心臓から得た。移植の時点において、心臓は、外移植において、低温(4℃)にて、低カルシウム、高カリウム心停止溶液中に保存した。
前に記載されたようにして(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)から、FKBP12.6を解離する:機能不全状態にある心臓の不完全な調節; Cell, 2000, 101:365-376)、左心房(LA)組織から調製した心臓膜(100μg)を、0.5mlのRIPAバッファー(50mMのTris-HCl [pH 7.4]、0.9%のNaCl、0.25%のトライトン(Triton) 100x、5mMのNaF及びプロテアーゼ阻害剤)中に懸濁し、次いでウサギ抗-RyR2抗体と共に4℃にて一夜インキュベートした。プロテインAセファロースビーズを添加し、4℃にて1時間インキュベートした。ビーズを、引続き1xキナーゼバッファー(50mMのTris-HCl、50mMのピペラジン-N,N'-ビス[2-エタンスルホン酸]、8mMのMgCl、及び10mMのEGTA [pH 6.8])で洗浄し、次いで再度1.5xキナーゼバッファー中に懸濁させた。この反応は、PKA(5単位)、100μMのMgATP、及び[γ32P]ATP (NENライフサイエンス(NEN Life Science), ボストン)で開始させ、室温にて8分間インキュベートし、次に5μlの6x重点バッファー(4%のSDS及び0.25MのDTT)で停止させた。サンプルを95℃に加熱し、次いで6%SDS-PAGE上で、サイズ-分画した。RyR2の放射能を、モレキュラーダイナミックホスホイメージャー(Molecular Dynamics Phosphoimager)、及びイメージクワント(Imagequant)ソフトウエア(アマーシャムファルマーシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech), NJ、ピスカタウエイ)を用いて定量化した。これらの値を、免疫沈降したRyR2(免疫ブロット法及びデンシトメトリーによって測定した)の量で割り、[γ32P]ATPシグナルの逆数として表した。
RyR2を心房性SR(100μg)から免疫沈降させ、また上記のように1xキナーゼバッファーで洗浄した。この免疫沈降させたRyR2を、PKA(5単位)及び100μMのMgATPで、室温にてホスホリル化したが、この反応は、8分後に、氷冷したRIPAバッファーで洗浄することによって停止させた。組換えカルスタビン2(FKBP12.6; 200nM)を、引続き室温にて、1,4-ベンゾチアゼピン誘導体、JTV-519(1μM)の存在下又は不在下で、該ホスホリル化したRyR2と共にインキュベートした。この反応系をRIPAバッファーで洗浄した後、タンパクを15%SDS PAGEによりサイズ-分画し、カルスタビン2(FKBP12.6)につき免疫ブロット分析した。
以下にまとめた結果は、実施例8の実験に従って得たものである。
心房RyR2の調節
心房RyR2を、上記の技術に従って、PKA-ホスホリル化した(図8A)。心房RyR2のPKA-ホスホリル化は、同時免疫沈降(図8C)により測定したように、該RyR2巨大分子複合体中の、カルスタビン2(FKBP12.6)の量を減らした。該心房RyR2巨大分子複合体は、以前に心室性RyR2について報告された(Marx等, PKAホスホリル化は、カルシウム放出チャンネル(リアノジンレセプタ)由来のFKBP12.6を解離する: 機能低下した心臓における不完全な調節;Cell, 2000, 101:365-76)ように、カルスタビン2(FKBP12.6)、PKAの触媒サブユニット、PKA調節サブユニット(RII)、PP2A、PP1、及びmAKAP(図8B)を含んでいた。
免疫沈降させたRyR2のPKA-ホスホリル化は、持続性のある心房細動(AF)を患うイヌ由来の心房細胞中で、コントロール(AFについてn=6、コントロールについてn=6、P<0.001;図9A)と比較して、130%増加した。RyR2と結合したカルスタビン2(FKBP12.6)は、持続性AFを患うイヌ由来の心房細胞中で、コントロール(AFについてn=7、コントロールについてn=6、P<0.0005;図9A)に対して、72%減少した。
同様に、免疫沈降させたRyR2のPKA-ホスホリル化は、心不全発症中の慢性的心房細動に罹っているヒト由来の心房細胞において、コントロール(AFについてn=5、コントロールについてn=3、P<0.002;図9B)と比較して、112%増加した。RyR2と結合したカルスタビン2(FKBP12.6)は、70%減少した(AFについてn=5、コントロールについてn=3、P<0.0001;図9B)。
逆-ホスホリル化及び同時免疫沈降実験の全てに対して、適用したRyR2の全量は、免疫沈降させたRyR2の抗-RyR2-5029抗体を用いて、並行して行った免疫ブロット分析により確認した(図9A及び9B)。
AFに罹っているイヌにおいて観測された、RyR2のPKA-過ホスホリル化の生理的な意味を決定するために、RyR2単一チャンネル測定を、電位固定条件下で、即ち0mVにて、対称的イオン条件を用いて、平坦な脂質二重層中で行った。心房RyR2単一チャンネル特性を、5匹のAFに罹っているイヌ由来の17チャンネル及び5匹のコントロールのイヌ由来の11チャンネルにおいて検討した。コントロールのイヌの何れも高い活性を示さなかったが、AFに罹っているイヌ由来の17チャンネル中の15チャンネル(88%)が、有意に高い開放確率(Po; AF: 0.412±0.07;コントロール:0.008±0.002;P<0.001)及びゲート開閉頻度(Fo; AF: 21.9±4.6;コントロール:1.6±0.6s-1; P<0.002(図10A及び10B)示した。
JTV-519(1mM)による処置は、正常なイヌの心筋から単離した、PKA-ホスホリル化RyR2に対する、組換えカルスタビン2(FKBP12.6)の結合を可能とする。JTV-519が存在しない場合には、カルスタビン2(FKBP12.6)は、これら実験において、PKA-ホスホリル化RyR2と結合することはできなかった(図11B)。
JTV-519の存在下での、FKBP12.6の再結合の生理的な意味は、平坦な脂質二重層における、RyR2単一チャンネル測定によって明らかとなった。組換えカルスタビン2(FKBP12.6)単独の存在下で、単離されたチャンネルは、高い開放確率(Po)を持ち、また準導電性状態の存在等のかなり異常な挙動を示すことが明らかになった。チャンネル機能におけるこれらの異常性は、特定のPKA阻害剤(PKI)を添加した場合には観測されず、このことは、該チャンネル機能における観測された異常性が、PKAによるRyR2のホスホリル化に特異的なものであることを示している。PKA-ホスホリル化したチャンネルを、組換えカルスタビン2(FKBP12.6)の存在下で、JTV-519で処置した場合には、単一チャンネル測定は、PKIの存在下で観測される結果と同様であった(図11A)。
インビボ実験のために、本発明者等は、1g量のJTV-519を必要とした。しかし、報告された1,4-ベンゾチアゼピン中間体、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(以下の反応式1における化合物6)を介して、この化合物を製造しようとした最初の試みは、成功しなかった。この中間体のチオ基は、空気で容易に酸化されて、ジスルフィド化合物となり、これは環化生成物(5)の合成を不可能にする。この問題を克服するために、本発明者等は、容易に入手でき、かつ高価でない2-ニトロ-5-メトキシ安息香酸(1)から出発する新規な方法を開発した。この方法を、以下の反応式1に示す。
H2を用い、また触媒としてPd/Cを使用した、この化合物(1)のニトロ基の還元は、2-アミノ-5-メトキシ安息香酸(2)を、定量的な収率で与えた。この化合物(2)を、NaNO2でジアゾ化し、次いでNa2S2で処理して、80%の収率で、安定なジスルフィド化合物(3)を生成した。更に精製することなしに、該安定なジスルフィド(3)を、SOCl2で処理し、次いでEt3Nの存在下で、2-クロロエチルアミンと反応させ、90%の収率でアミド(4)を得た。この化合物(4)を、THF中で、トリメチルホスフィン及びEt3Nと共に還流することにより、1-ポット法によって、環化された化合物(5)に添加した。この環化されたアミド(5)を、次にLiAlH4で還元して、7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(6)を生成した。
反応式1:
実施例10:放射性-標識したJTV-519の合成
本発明者等の放射性-標識したJTV-519の新規な合成法を、以下の反応式2に示す。放射性-標識したJTV-519を合成するために、JTV-519を、BBr3を用いて、そのフェニル環において脱メチル化して、フェノール化合物(21)を得た。このフェノール化合物(21)を、塩基(NaH)の存在下で、放射性標識したメチル化剤(3H-ジメチル硫酸)により、再度メチル化して、3H-標識したJTV-519を製造した(反応式2)。
反応式2:
本発明者等は、また心不整脈を治療し及び予防するのに使用する、新規な1,4-ベンゾチアゼピン誘導体をも開発した。特に、本発明者等は、以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した:
反応式3から明らかなように、2-クロロエタンスルホニルクロリド(180mg; 1.1mM)及びEt3N(140mg; 1.1mM)を、0℃にて、CH2Cl2(20ml)中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1)(194mg; 1mM)に添加した。この混合物を0℃にて2時間攪拌し、H2O及び飽和NaHCO3溶液で洗浄した。該溶媒を除去して、粗生成物(Ia)を得、これをシリカゲル上でのクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=3:1)により精製した。この合成の収量は280mg、又は95%であった。その構造をNMRにより確認した。
反応式3は、更に化合物(Ia)の側鎖が、この化合物(Ia)(28mg; 0.1mM)とCH2Cl2中の4-ベンジルピペリジン(21mg; 0.13mM)と反応させることにより、伸張されることを示した。該反応が完了した(TLCにより確認)後、過剰量のアミンを塩基掃去剤(3-(2-無水琥珀酸)プロピル官能化したシリカゲル、0.5g)で除去した。1H NMR及びHPLC分析は、生成物(Ib)の純度が、>98%であることを示した。
更に、本発明者等は、以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した:
反応式4から明らかなように、スルフリルクロリド(15.0mg; 0.111mM)及びEt3N(28.0mg; 0.22mM)を、CH2Cl2(20ml)中の7-メトキシ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1,4-ベンゾチアゼピン(1) (19.4mg; 0.1mM)に、0℃にて添加した。この混合物を0℃にて2時間攪拌した後、1-ピペロニルピペラジン(27mg; 0.12mM)を、添加した。この混合物を、更に2時間攪拌し、次いでH2O及び飽和NaHCO3溶液で洗浄した。過剰量のアミンを、塩基掃去剤(3-(2-無水琥珀酸)プロピル官能化したシリカゲル、0.2g)の添加により除去した。この合成の収量は36mg、又は77%であった。
本発明者等は、また以下の一般的な構造を持つ化合物をも製造した:
反応式5が示すように、MeOH(5ml)中の化合物(Ib)(21mg; 0.05mM)を、H2O2(0.1ml、過剰量)に添加した。この混合物を2日間攪拌し、得られた生成物IIIを、シリカゲル上でのクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=10:1)によって精製した。この合成の収量は19mg、又は91%であった。
最後に、本発明者等は、また以下の一般的な構造を持つ化合物を製造した:
実施例12:高い処理量でスクリーニングするためのアッセイ
本発明者等は、生物学的に活性な小分子をスクリーニングするためのアッセイを開発した。これらアッセイは、RyRへのFKBP12.6タンパクの再結合に基いている。
小分子を、高い処理量でスクリーニングするための、高効率のアッセイは、グルタチオンで被覆した96-ウエルプレートに、FKBP12.6(GST-融合タンパク)を固定化することにより開発することができる。PKA-ホスホリル化リアノジンレセプタタイプ2(RyR2)を、該FKBP12.6-被覆プレート上に装入し、様々な濃度(10-100nM)にて、JTV-519類似体と共に、30分間インキュベートする。その後、該プレートを洗浄して、未結合のRyR2を除去し、次に抗-RyR2抗体と共に30分間インキュベートする。該プレートを再度洗浄して、未結合の抗-RyR2抗体を除去し、次に蛍光-標識した第二の抗体で処理する。このプレートを、結合活性に関する、自動的蛍光プレートリーダーにより読取る。
もう一つのアッセイにおいて、RyR2は、32P-ATPの存在下で、PKA-ホスホリル化する。放射性PKA-ホスホリル化RyR2を、様々な濃度(10-100nM)にて、JTV-519類似体の存在下で、30分間、FKBP12.6-被覆96-ウエルプレート上に投入する。該プレートを洗浄して、未結合の放射性標識したRyR2を除去し、次いで自動プレートリーダーにより読取る。
心臓筋小胞体(SR)を、室温にて、30分間、PKAでホスホリル化し、RyR2複合体からの、FKBP12.6の完全に解離させた。このSR(50mg)を、次に室温にて30分間、250nMのFKBP12.6及びテスト化合物と共にインキュベートした。サンプルを、100,000gにて10分間遠心分離処理し、得られたペレットを、10mMイミダゾールバッファーで3回洗浄した。洗浄後、タンパクを15%PAGEにより分離した。免疫ブロットを、抗-FKBP抗体を用いて発現させた。この研究の結果を、図12に示す。
実施例14:テレメトリー記録及びマウスにおける運動/EKGテスト
研究は、FKBP12.6+/-マウス(介入群)、年齢及び性別の一致するFKBP12.6-/-マウス(正のコントロール)、及びFKBP12.6+/+マウス(負のコントロール)について行った。FKBP12.6タンパクがないこと(FKBP12.6-/-)又はこれが低いこと(FKBP12.6+/-)は、心臓組織における免疫ブロット法によって明らかにされた。
ストレステストのために、マウスを傾斜した足踏み車上で、段階的に、疲労するまで運動させ、次いで最大交感神経刺激を与えるために、エピネフリン(0.2mg/kg)を腹腔内注射した。次いで、歩行性動物の静止期の心拍数を4時間に渡り追跡して平均した。運動テスト後の回復、及び運動後の事象の追跡を、一夜に渡り行った。洞サイクル長(SCL)、及びPR、QRS、及びQT間隔を、測定し、速度-補正したQT間隔(QTc)をミッチェル(Mitchell)の式を用いて算出した。血漿の薬物レベルは、HPLCにより確認した。結果を図13にまとめた。
ラットを、左冠動脈の結サツにより、心筋梗塞(MI)に罹らせた。移植可能な浸透圧ポンプ(アルゼットデュレクト社、CA、クパーチノ)を用いた、JTV-519(n=x)又は賦形剤(n=x)による処理は、MI語に直接開始した。心筋の収縮期(Ds)及び拡張期(Dd)の径は、心エコー法を用いて、MIの24時間及び6週間後に、中央-乳頭部で測定し、次いで径短縮率を算出した。図14に示したように、JTV-519による処理は、心不全を患うラットにおける心臓機能を有意に改善した。
以上、本発明を、その明確化及び理解のために、幾分詳細に説明してきたが、当業者は、その開示から、形態及び細部における様々な変更が、添付した特許請求の範囲における本発明の真の範囲を逸脱することなしに、なしえることを理解するであろう。
Claims (42)
- 心房細動に罹っている又はその候補者である患者における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法であって、該患者におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するのに有効な量のJTV-519を、該患者に投与する工程を含み、該RyR2が、心房RyR2であることを特徴とする方法。
- 該患者において、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、該患者中のホスホリル化されたRyR2のレベルを減じることにより、制限又は防止する、請求項1記載の方法。
- 該患者が、ヒトである、請求項1記載の方法。
- 該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効なJTV-519の量が、該患者における心房細動を治療又は予防するのに有効なJTV-519の量である、請求項1記載の方法。
- 該JTV-519が、該患者における、心房細動を治療又は予防する、請求項1記載の方法。
- 該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な該JTV-519の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項1記載の方法。
- 心房細動に罹っている又はその候補者である患者内の、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止する方法における、JTV-519の使用。
- 患者における心房細動を治療又は予防する方法であって、該患者における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量のJTV-519を、該患者に投与して、該患者における心房細動を治療もしくは予防する工程を含むことを特徴とする方法。
- 該心房細動が、非-持続性の心房細動である、請求項8記載の方法。
- 該患者における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量のJTV-519が、該患者における心房細動を治療又は予防するのに有効なJTV-519の量である、請求項8記載の方法。
- 該JTV-519が、該患者における、心房細動を治療又は予防する、請求項10記載の方法。
- 該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な該JTV-519の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項8記載の方法。
- 患者におけるRyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止する方法であって、該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量で、薬剤を該患者に投与する工程を含み、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。 - 該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少が、該患者における、ホスホリル化されたRyR2レベルを減じることによって、該患者内で制限又は防止される、請求項13記載の方法。
- 該患者が、ヒトである、請求項13記載の方法。
- 該患者が、カテコールアミン性多形型心室頻拍症(CPVT)に罹っている、請求項13記載の方法。
- 該患者が、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を患っているか、あるいはその候補である、請求項13記載の方法。
- 該患者における該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な該薬剤の量が、該患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防するのに有効な該薬剤の量である、請求項13記載の方法。
- 該心不整脈が、心房性不整脈又は心室性不整脈である、請求項18記載の方法。
- 該心房性不整脈が、心房細動である、請求項19記載の方法。
- 該心房細動が、持続性の心房細動である、請求項21記載の方法。
- 該心室性不整脈が、運動-誘発性心室性不整脈である、請求項19記載の方法。
- 該薬剤が、該患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療もしくは予防する、請求項13記載の方法。
- 該患者における、該RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な、該薬剤の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項13記載の方法。
- 該薬剤が、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27、又はS36である、請求項13記載の方法。
- 該薬剤が、S36である、請求項25記載の方法。
- 患者における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止する方法における、薬剤の使用であって、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする使用。
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。 - 患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防する方法であって、該患者における、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するのに有効な量で、薬剤を該患者に投与する工程を含み、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。 - 患者における心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防する方法であって、該患者における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を治療又は予防するのに有効な量で、薬剤を該患者に投与する工程を含み、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする方法。
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。 - 該心不整脈が、心房性不整脈又は心室性不整脈である、請求項29記載の方法。
- 該心房性不整脈が、心房細動である、請求項30記載の方法。
- 該心室性不整脈が、運動-誘発性心室性不整脈である、請求項30記載の方法。
- 該患者における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を、治療又は予防するのに有効な、該薬剤の量が、約5mg/kg/日〜約20mg/kg/日なる範囲内にある、請求項29記載の方法。
- 該薬剤が、S4、S7、S-20、S-24、S-25、S-26、S-27、又はS36である、請求項29記載の方法。
- 該薬剤が、S36である、請求項34記載の方法。
- 患者における、心不整脈、心不全及び/又は運動-誘発性心臓突然死を、治療又は予防する方法における、薬剤の使用であって、該薬剤が、以下に列挙する化合物からなる群から選択されることを特徴とする使用。
(h) これらの任意の酸化形態にあるもの。 - 心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用する薬剤を同定する方法であって、以下の諸工程、
(a) RyR2を含む細胞培養物を得、あるいはこれを生成する工程、
(b) 該細胞と、候補薬剤とを接触させる工程、
(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該細胞を暴露する工程、及び
(d) 該薬剤が、該細胞内で、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を制限又は防止するか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 更に、以下の工程:(e) 該薬剤が、該細胞内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む、請求項37記載の方法。
- 請求項37記載の方法によって同定された薬剤。
- 心房細動又は心不全を治療又は予防するのに使用する薬剤を同定するための方法であって、以下の諸工程、
(a) RyR2を含む動物を得、又はこれを発生させる工程、
(b) 該動物に、候補薬剤を投与する工程、
(c) 細胞内でのRyR2のホスホリル化を高めることが知られている、1又はそれ以上の条件に、該動物を暴露する工程、及び
(d) 該薬剤が、該動物内で、RyR2-結合FKBP12.6レベルの減少を、制限又は防止するか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 更に、以下の工程、(e) 該薬剤が、該動物内における、RyR2-関連生物学的事象に対して、効果を持つか否かを決定する工程をも含む、請求項40記載の方法。
- 請求項40記載の方法によって同定された薬剤。
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