EA015010B1 - Лекарственные средства, применяемые при аритмии и сердечной недостаточности - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензодиазепина, способу их получения и фармацевтической композиции на их основе. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ограничения или предотвращения снижения уровня RyR2-связанного FKBP 12.6 у пациента, к способу лечения и предотвращения заболевания сердца у субъекта, способу предупреждения сердечной аритмии у субъекта. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению производных 1,4-бензодиазепина для ограничения или предотвращения снижения уровня RyR2-связанного FKBP 12.6 у пациента, для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта и для приготовления соответствующего лекарственного средства. Соединения согласно настоящему изобретению представляют собойа также другие соединения, охарактеризованные в формуле избретения.

Description

Перекрестные ссылки на связанные заявки

Притязания согласно настоящей заявке являются частичным продолжением патентной заявки США Серийный № 10/809089, поданной 25 марта 2004; которая является частичным продолжением патентной заявки серийный № 10/763498 поданной 22 января 2004; которая является частичным продолжением патентной заявки серийный № 10/680988, поданной 7 октября 2003; которая является частичным продолжением патентной заявки серийный № 10/608723, поданной 26 июня 2003; которая является частичным продолжением патентной заявки серийный № 10/288606, поданной 5 ноября 2002; которая является частичным продолжением патентной заявки серийный № 09/568474, поданной 10 мая 2000, по которой выдан Патент США 648 9125 В1 3 декабря 2002; содержание которых таким образом включено в настоящее описание в виде ссылки.

Установление государственного интереса

Настоящее исследование проводили с государственной поддержкой ΝΙΗ грантом № РО1 НЬ 6784901. Следовательно, правительство Соединенных Штатов имеет определенные права в этом изобретении.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Несмотря на успехи в лечении, застойная сердечная недостаточность остается важной причиной смертности в Западных странах. Сердечная недостаточность поражает 5 миллионов людей только в Соединенных Штатах, и характеризуется уровнем смертности в течение 5 лет ~50% (Ьеуу е! а1., Ьопд-1егш !гепбк ίη Изе шабепсе о! апб киту1уа1 χνίΐΐι Исай Габиге. Ν. Епд1. 1. Меб., 347:1397-402, 2002).

Важным признаком сердечной недостаточности является сниженная сократимость миокарда (С\\'аб1теу е! а1., АЬпотта1 т1тасе11и1аг са1сшт йапбйпд ш туосагбшт Ггот райеп!к \ν61ι епб-к!аде беай Габиге. С1гс. Век., 61:70-76, 1987). В здоровой сердечной мышце и в других поперечно-полосатых мышцах каналы, высвобождающие кальций на саркоплазматической сети (8В), включая рецепторы рианодина (ВуВк), облегчают связь потенциала действия с сокращением мышечных клеток (т.е. связь возбуждение-сокращение (ЕС)). Сокращение начинается, когда кальций (Са²⁺) высвобождается из 8В в окружающую цитоплазму. При сердечной недостаточности нарушения сократимости приводят, отчасти, к нарушениям сигнального каскада, который позволяет сердечному потенциалу действия (ПД (АР)) запускать сокращение. В частности, при сердечной недостаточности, амплитуда общеклеточного перехода Са²⁺ снижена (Веиске1тапп е! а1., 1п1гасе11и1аг са1сшт бапббпд ш 1ко1а!еб уеп!г1си1аг туосу!ек Ггот ра!1еп!к χνίΐΐι !егтша1 беай Габиге. С1гс., 85:1046-55, 1992; Соте/ е! а1., ОеГесбуе ехсйаНоп-соШгасИоп соирйпд ш ехрептеп1а1 сагб1ас йурейгорйу апб беай Габиге. 8с1епсе, 276:800-06, 1997), и длительность увеличена (Веиске1тапп е! а1., 1п!гасе11и1аг са1сшт бапббпд ш 1ко1а!еб уеп1пси1аг туосу!ек Ггот рабеп!к χνίΐΐι !еттша1 беай Габиге. С1гс, 85:1046-55, 1992).

Известно, что сердечная аритмия, обычная характеристика сердечной недостаточности, ассоциирована с утечкой Са²⁺ 8В в структурно нормальных сердцах. В таких случаях, наиболее обычным механизмом индукции и поддержания желудочковой тахикардии является нарушенный автоматизм. Одна форма нарушенного автоматизма, известная как вызванная аритмия, ассоциирована с нарушенным высвобождением Са2⁺ 8В, который запускает отложенные пост-деполяризации, или ΌΑΌ (Еоххагб. Н.А., Айетберо1апхабопк апб 1г1дцегеб асбубу. Вакю Век. Сатбю1., 87:105-13, 1992; XVб апб Вокеп, Рабюр11укю1одю тесйашктк оГ сагб1ас аггбубишак. Ат. Неай 1., 106:798-811, 1983). ИАЭ представляют собой нарушенные деполяризации в кардиомиоцитах, которые возникают после реполяризации потенциала действия сердца. Молекулярная основа нарушенного высвобождения Са²⁺ 8В, которое приводит к ИАЭ, полностью не ясна. Однако, известно, что ИАЭ блокируются рианодином, обеспечивая доказательство того, что ВуВ2 может играть ключевую роль в патогенезе такого нарушенного высвобождения Са²⁺ (МагЬап е! а1., Месбашктк оГ аггбубштодешс бе1ауеб апб еаг1у аПегберо1апхабопк ш Гепе! уеп1пси1аг тикс1е. 1. С1ш. 1пуек!., 78:1185-92, 1986; 8опд апб Ве1агбшеШ, АТР ргото!ек беуе1ортеп1 оГ аПегберо1апхабопк апб 1пддегеб асбгбу ш сагб1ас туосу!ек. Ат. 1. РЬукюк, 267:Н2005-114, 1994).

Наиболее частой сердечной аритмией у людей является фибрилляция предсердий (ФП (АЕ)). Она представляет собой главную причину заболеваемости и смертности (Сйидй е! а1., Ер1бешю1оду апб па!ига1 Ык!оту оГ а!па1 йЬтШабоп: с11шса1 бпрбсабопк. 1. Ат. Со11. Сатбю1., 37:371-78, 2001; Еа1к, В.Н., А!па1 Г1ЬЙ11а1юп. Ν. Епд1. 1. Меб., 344:1067-78, 2001). Несмотря на ее клиническую значимость, однако возможности лечения ФП ограничены отчасти из-за факта, что лежащие в ее основе молекулярные механизмы плохо известны.

Приблизительно 50% всех пациентов с заболеваниями сердца умирают из-за смертельных сердечных аритмий. Такие смертельные сердечные аритмии часто являются желудочковыми по природе. В некоторых случаях, желудочковая аритмия в сердце может быстро стать смертельной, феномен, называемый как внезапная кардиальная смерть (ВКС (8СИ)). Смертельные желудочковые аритмии (и ВКС) также могут возникать в молодом возрасте, у в остальном здоровых людей, про которых известно, что они не имеют структурных заболеваний сердца. Действительно, желудочковая аритмия является наиболее частой причиной внезапной смерти у здоровых в остальном людей.

Катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПЖТ (СРУТ)) является наследственным расстройством у пациентов со структурно нормальным сердцем. Она характеризуется стрессиндуцированной желудочковой тахикардией - смертельной аритмией, которая может вызвать ВКС. У

- 1 015010 пациентов с КПЖТ, физическая нагрузка и/или стресс индуцируют двунаправленные и/или полиморфные желудочковые тахикардии, которые приводят к ВКС в отсутствие определяемых структурных заболеваний сердца (Ьайтеп е! а1., Ми!айопк οί Не сагб1ас туапобте гсссрЮг (ВуВ2) депе ίη ГатП1а1 ро1утогрЫс уеп1пси1аг !асЬусагб1а. Спси1а1юп, 103:485-90, 2001; ЬеепЛагб! е! а1., Са!есЬо1аттегд1с ро1утогрЫс уеп1пси1аг 1асЬусатб1а ш сЬббтеп: а 7-уеаг Го11от-ир оГ 21 рабеШк. Сиси1а1юп, 91:1512-19, 1995; Рпоп е! а1., Сйшса1 апб то1еси1аг сНагасЮпхаРоп оГ райеп!к \\Й11 са!еско1аттегд1с ро1утотрЫс уеп1пси1аг !асЬусагб1а. Сйси1а!юп, 106:69-74, 2002; Рпоп е! а1., Ми1а1юпк ш !Ье сагб1ас туапобте тесер1ог депе (11Ву В2) ипбегНе са1ес1ю1аттегд1с ро1утотрЫс уеп1пси1аг 1асЬусатб1а. Сйси1а!юп, 103:196-200, 2001; 8тап е! а1., АггНубишс бщотбет тарреб !о сЬготокоте 1с|42-с|43 саикек таНдпап! ро1утогрЫс уеп1пси1аг 1асЬусатб1а ш к1гис!ига11у погта1 Ьеайк. 1. Ат. Со11. Сагбю1, 34:2035-42,1999).

КПЖТ является преимущественно наследуемой по аутосомно-доминантному типу. Пациенты с КПЖТ имеют желудочковые аритмии при воздействии физической нагрузки, но не имеют аритмий в покое. Анализ групп сцепления и прямое секвенирование определили мутации в человеческом гене ВуВ2, на хромосоме 1ц42-ц43. у пациентов с КПЖТ (Ьайтеп е! а1., Ми1а1юпк оГ !Ье сагб1ас туапобте гесер!ог (ВуВ2) депе ш Гатб1а1 ро1утогрЫс уеШпсЫаг 1асЬусатб1а. Спси1а1юп, 103:485-90, 2001; Рпоп е! а1., Ми!а1юпк ш !Ье сагб1ас туапобте гесер!ог депе (НВуВ2) ипбегНе са!есЬо1аттегд1с ро1утогрЫс уеШпсикп 1аскусатб1а. Сйси1а!юп, 103:196-200, 2001; 8тап е! а1., АггНубишс б1котбет тарреб !о скготокоте 1с|42-с|43 саикек таНдпап! ро1утогрЫс геЩпси1аг !асЬусагб1а ш к1тис!ита11у погта1 Ьеайк. 1. Ат. Со11. Сагбю1., 34:2035-42,1999).

Существует три типа рецепторов рианодина, все из которых являются высоко связанными с Са²⁺ каналами. ВуВ1 обнаруживают в скелетных мышцах, ВуВ2 обнаруживают в сердце и ВуВ3 располагается в головном мозге. Рецептор рианодина 2 типа (ВуВ2) является главным каналом, высвобождающим Са²⁺, необходимый для ЕС связывания и мышечного сокращения в поперечно-полосатой мышце сердца.

Каналы ВуВ2 упакованы в плотные массивы в специализированных участках 8В, которые высвобождают внутриклеточные запасы Са²⁺, и таким образом запускают мышечное сокращение (Магх е! а1., Соир1еб дайпд Ье!тееп шбМбиа1 кке1е!а1 тикс1е Са²⁺ ге1еаке сЬаппе1к (туапобте гесер!огк). Есюпсе, 281:818-21, 1998). Во время ЕС соединения, деполяризация мембран клеток сердечной мускулатуры, в нулевой фазе ПД, активирует потенциалзависимые Са²⁺ каналы. Напротив, приток Са²⁺ через эти каналы вызывает высвобождение Са²⁺ из 8В посредством ВуВ2, в процессе, известном как Са²⁺-индуцированное высвобождение Са²⁺ (РаЬ1а!о, А., Са1сшт-тбисеб ге1еаке оГ са1стт Ггот !Ье сагб1ас кагсор1актю ге!1си1ит. Ат. 1. РЬу8ю1, 245.-С1-С14, 1983; ЫаЬаиег е! а1., Веди1аНоп оГ са1сшт ге1еаке ίκ да!еб Ьу са1стт сштеп!, по! дайпд сЬагде, ш сагб1ас туосу!ек. Есюпсе, 244:800-03, 1989). Опосредованное ВуВ2, Са²⁺индуцированное высвобождение Са²⁺ затем активирует сократительные белки, которые ответственны за сокращение сердечной мышцы.

ВуВ2 является комплексом белков, включающим четыре полипептида ВуВ2 по 565000-дальтон в связи с четырьмя белками, связывающими ЕК506, из 12000-дальтон (ЕКВР), особенно ЕКВР12.6 (кальстабин). ЕКВР являются цис-транс пептидилпролилизомеразами, которые широко экспрессируются, и обеспечивают множество клеточных функций (Магкк, А.В., Се11и1аг ГипсНопк оГ 1ттипорЫ1тк. РЬукю1. Вег., 76:631-49, 1996). Белки ЕКВР12 тесно связаны и регулируют функцию скелетного рецептора рианодина, ВуВ1 (Вг111ап!ек е! а1., ЕНаЬШхаиоп оГ са1сшт ге1еаке сЬаппе1 (туапобте гесер!ог) Гипсйоп Ьу РК506-Ьтбтд рго!ет Се11, 77:513-23, 1994; 1ауагатап е! а1., ЕК506 Ьтбтд рго!ет аккоаа!еб \уП11 !Ье са1стт ге1еаке сЬаппе1 (туапобте гесер!ог). 1. Вю1. СЬет., 267:9474-77, 1992); сердечного рецептора рианодина ВуВ2 (Кайап е! а1., ЕГГес!к оГ таратуст оп туапобте гесер!ог/(Са2+)-ге1еаке сЬаппе1к Ггот сагб1ас тикс1е. Сйс. Век., 78:990-97, 1996); связанного внутриклеточного высвобождающего Са²⁺ канала, известного как рецептор инозитол 1,4,5-трифосфата 1 типа (1Р3В1) (Сатегоп е! а1., ЕКВР12 Ьтбк !Ье токйо1 1,4,5-1пкрЬокрЬа!е гесер!ог а! 1еисте-рго1те (1400-1401) апб апсЬогк са1стешгп !о 1Ык РК506-11ке ботат. 1. Вю1 СЬет., 272:27582-88, 1997); и рецептора трансформирующего фактора роста β (ΤΟΡβ) I типа (ТвВ1) (СЬеп е! а1., МесЬашкт оГ ΤΟΡβ гесер!ог тЫЬйюп Ьу РКВР12. ЕМВО 1., 16:3866-76, 1997). РКВР12.6 связывается с каналом ВуВ2 (одна молекула на субъединицу ВуВ2), стабилизирует функцию канала ВуВ2 (Вп11ап!ек е! а1., ЕНаЬШхаиоп оГ са1сшт ге1еаке сЬаппе1 (туапобте гесер!ог) Гипсйоп Ьу РК506Ьтбтд рго!ет Се11, 77:513-23, 1994), и облегчает сочетанное открытие между соседними каналами ВуВ2 (Магх е! а1., Соир1еб дабпд Ье1\уееп шбМбиа1 кке1е!а1 тикс1е Са²⁺ ге1еаке сЬаппе1к (туапобте гесер!огк). 8с1епсе, 281:818-21, 1998), таким образом предотвращая нарушенную активацию канала в течение фазы покоя сердечного цикла.

Очевидно, что утечка в каналах ВуВ2 ассоциирована с рядом патологических состояний как в больных, так и в структурно-нормальных сердцах. Соответственно, способы для восстановления утечки в ВуВ2 могут лечить или предотвращать сердечную недостаточность, сердечные аритмии и внезапную кардиальную смерть у миллионов пациентов.

Производное 1,4-бензотиазепина 1ТУ-519, или моногидрохлорид 4-[3-(4-бензилпиперидин-1ил)пропионил]-7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина (также известный как к201 или 1СРСа1к!ап 100), является новым модулятором кальциевых каналов. Кроме того, для регуляции уровня Са²⁺ в

- 2 015010 клетках миокарда, 1ТУ-519 также модулирует ток Να' и внутринаправленный вентильный ток К⁺ в желудочковых клетках морских свинок, и ингибирует отложенный вентильный ток К⁺ в клетках предсердий морских свинок. Исследования показали, что 1ТУ-519 обладает сильным кардиопротективным эффектом в отношении катехоламин-индуцированного повреждения миокарда, чрезмерного сокращения миофибрилл, индуцированного повреждением миокарда, и ишемически/реперфузионного повреждения. В экспериментальной модели чрезмерного сокращения миофибрилл 1ТУ-519 продемонстрировал большие кардиопротективные эффекты, чем пропранолол, верапамил и дилтиазем. Экспериментальные данные также предполагают, что 1ТУ-519 эффективно предотвращает ишемию/реперфузию желудочков посредством снижения уровня нагрузки внутриклеточным Са²⁺ в моделях на животных.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на удивительном открытии, что РуР2 является мишенью для разработки способов лечения и предотвращения сердечной недостаточности и сердечных аритмий, включая фибрилляцию предсердий, желудочковые аритмии и сердечные аритмии, индуцированные физической нагрузкой. Как описано в настоящем описании, авторы изобретения создали мутантные каналы ВуВ2 с 7 различными мутациями КПЖТ, и изучали их функции. Все 7 мутантов имели функциональные дефекты, которые приводили к тому, что каналы становились протекающими (утечка кальция) при стимуляции во время физической нагрузки. Исследование авторов является первым для определения механизма, посредством которого утечка кальция 8В вызывает ΌΆΌ. Замечательно, что дефект в мутантных каналах КПЖТ приводит к тому, что каналы выглядят как протекающие каналы в сердцах у пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности расстройством, характеризующимся высокой частотой фатальных сердечных аритмий. Следовательно, авторы изобретения показали, что механизм для ЖТ при КПЖТ является таким же, как механизм для ЖТ при сердечной недостаточности.

Авторы также показывают в настоящем описании, что ТГУ-519 (к201 или 1СР-Са151аи 100), и другие новые производные 1,4-бензотиазепина восстанавливают утечку в каналах РуР2. Как показали авторы изобретения, ТГУ-519 и связанные производные усиливают связывание ГКВР12.6 с РКАфосфорилированным ВуВ2. и с мутантным ВуВ2§, который иным образом имеет сниженное сродство к или не связывается с ГКВР12.6. Такое действие определяет утечку в ВуВ2, что в свою очередь запускает смертельные сердечные аритмии (внезапную кардиальную смерть (ВКС)) и вносит вклад в фибрилляцию предсердий/желудочков и дисфункцию сердечной мышцы при сердечной недостаточности.

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к новым производным 1,4бензотиазепина общей формулы (а)

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН2)_пИВ'₂, или -(СН₂)_П8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В¹ = алкил или циклоалкил; или их окисленным производным.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина общей формулы (Ь)

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН₂)_пИВ'₂ или -(СН₂)_П8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или цикло алкил; или их окисленным производным.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина общей формулы (с)

где В = СО(СН₂)_пНВ'₂, 80^¾)^^ 8О₂КН(СН₂)_пК1В'₂, СО(СН₂)_п8В', 8О₂(СН₂)_п8В', или 8О₂НН(СН₂)_п8В', и η = 1, 2 или 3, и В'= алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2; или их окисленным производным.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина общей формулы (б)

- 3 015010

где Я = арил, алкил, -(ΟΗ^,ΝΚ,Υ -(СН₂)_М8Р'. и η = 0, 1, 2, или 3, и Я' = алкил или циклоалкил; и где X = ΝΗ или 0; или их окисленным производным.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина общей формулы (е)

где Я₁ = ОЯ', 8Я', ^Я')₂, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и Я' = алкил, арил, или Η; где Я₂ = алкил, или арил; и где Я₃ = Η или арил; или их окисленным производным.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина общей формулы (ί)

где Я₁ = Η, ОЯ', 8Я', ΝΚ')₂, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и Я' = алкил, арил, или ацил; где Я₂ = алкенил, или арил; где Я₃ = алкил, алкенил, или арил; где т = 0, 1, или 2; и где η = 0 или 1; или их окисленным производным.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина общей формулы (д)

где Я1 = Η, ОЯ', 8Я', ΝΚ')₂, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и Я' = алкил, арил, или ацил; где Я2 = Η, алкил, алкенил, или арил;

где Я3 = Η, алкил, алкенил, или арил; где Я4 = галоид, карбоновая кислота, или алкил, содержащий О, 8, или I; и где т =0, 1, или 2; или их окисленным производным.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к производным 1,4-бензотиазепина, выбранным из группы:

- 4 015010

и их окисленным производным.

В предпочтительном варианте предложенное изобретение относится к соединению формулы

- 5 015010

где В₁ = ОВ', 8В', Ν(Β')₂, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца; В' = алкил, арил, или ацил; В₂ = Н, алкил, алкенил, или арил; В₃ = Н, алкил, алкенил, или арил;

В₄ = галоид, карбоновая кислота, или алкил, содержащий О, 8, или I; и т = 0, 1, или 2; или его окисленному производному.

В предпочтительном варианте предложенное изобретение относится к соединению формулы (д), где В₁ = ОВ' в положении 7 бензотиазепинового кольца, т = 0 или 1, и В' = алкил.

Наиболее предпочтительны соединения формулы (д), в которых В₂ = Н, и В₃ = Н. Еще более предпочительны соединения формулы (д), в которых В₄ = карбоновая кислота, или алкил, содержащий I, и В' = метил.

В предпочтительном варианте предложенное изобретение относится к соединению формулы 836 или его окисленному производному.

В другом аспекте предложенное изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей одно из соединений настоящего изобретения, перечисленных выше, и фармацевтически приемлемый носитель, добавку или разбавитель.

В предпочтительном варианте фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или более компонентов, представляющих собой антиоксидант, краситель, ароматизатор, консервант, подсластитель, связывающий агент или смазывающий агент, при этом носитель представляет собой карбоксиметилцеллюлозу, кристаллическую целлюлозу, глицерин, гуммиарабик, лактозу, стеарат магния, метилцеллюлозу, солевой раствор, альгинат натрия, сахарозу, крахмал, тальк или воду, и фармацевтическая композиция находится в форме капсулы, таблетки, порошка, гранулы или суспензии.

В другом аспекте предложенное изобретение относится к способу ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКБР 12.6 у субъекта, который страдает заболеванием сердца, где указанный способ включает введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобетения или его окисленного производного.

В другом аспекте предложенное изобретение относится к способу лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта, включающему введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения или его окисленного производного.

В предпочтительном варианте заболевание сердца представляет собой сердечную аритмию, тахикардию, предсердную аритмию, предсердную тахиаритмию, фибрилляцию предсердий, постоянную фибрилляцию предсердий, непостоянную фибрилляцию предсердий, желудочковую аритмию, фибрилляцию желудочков, вентрикулярную тахикардию, постоянную вентрикулярную тахикардию, непостоянную вентрикулярную тахикардию, катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию (СРУТ), сердечную недостаточность, внезапную кардиальную смерть или кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.

Предпочтительно соединение выбирают из группы, состоящей из соединений 21, 1а, II, III, 81, 84, 86, 87, 820, 836 или его окисленного производного.

В другом аспекте предложенное изобретение относится к способу предупреждения сердечной аритмии у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества средства, представляющего собой соединение формулы:

где В₁ = Н, ОВ', 8В', №В')₂, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и В' = алкил, арил, или ацил; где В2 = Н, алкил, алкенил, или арил; В3 = Н, алкил, алкенил, или арил; В₄ = галоид, карбоновая кислота, или алкил, содержащий О, 8, или I; и т = 0, 1, или 2; или соединение, выбранное из группы, содержащей соединения: 21, й, II, III, 8Σ, 84, 86, 87, 820, 824, 825, 826, 827, 836 или его окисленные производные.

Предпочтительно, когда в перечисленных выше способах лечения субъект является человеком и эффективное количество соединения определяется как одно или более нижеследующих условий:

(a) от примерно 5 до примерно 20 мг/кг/день, (b) количество, обеспечивающее концентрацию в плазме субъекта от примерно 0,02 до примерно

- 6 015010

1,0 мкМ, (с) количество, обеспечивающее концентрацию в плазме субъекта от примерно 300 нг/мл до примерно 1000 нг/мл у субъекта, (й) количество, достаточное для повышения связывания РКВР 12.6 с КуК2 у субъекта, или (е) количество, эффективное для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта.

Предпочтительно соединение выбирают из группы, содержащей соединения 21, 1а, II, III, 81, 84, 86, 87, 820 и 836 или их окисленного производного. При этом наиболее предпочтительно соединение представляет собой соединение 836.

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к соединению, выбранному из группы, содержащей соединения 824, 825, 826, 827, и их окисленному производному, предназначенному для ограничения или предотвращения снижения уровня КуК2-связанного РКВР12.6 у пациента, страдающего заболеванием сердца.

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к применению соединений согласно настоящему избретению и их окисленных производных для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта.

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к применению соединений согласно настоящему избретению и их окисленных производных для приготовления лекарственного средства для ограничения или предотвращения снижения уровня КуК2-связанного РКБР12.6 у пациента, страдающего заболеванием сердца, или для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта.

Предпочтительно заболевание сердца представляет собой сердечную аритмию, тахикардию, предсердную аритмию, предсердную тахикардию, фибрилляцию предсердий, постоянную фибрилляцию предсердий, непостоянную фибрилляцию предсердий, вентрикулярную фибрилляцию, вентрикулярную тахикардию, постоянную вентрикулярную тахикардию, непостоянную вентрикулярную тахикардию, катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию (СРУТ), сердечную недостаточность, внезапную кардиальную смерть или кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.

Предпочтительно субъектом является человек и соединение выбирают из группы, содержащей соединения 21, й, II, III, 81, 84, 86, 87, 820 и 836, или их окисленного производного.

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к применению соединений формулы (д)

где Р| = Η, ОК', 8К', Ν(Κ')₂, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и К' = алкил, арил, или ацил; где К₂ = Η, алкил, алкенил, или арил; К₃ = Η, алкил, алкенил, или арил; К₄ = галоид, карбоновая кислота, или алкил, содержащий О, 8, или I; и т = 0, 1, или 2;

или соединений, выбранных из группы, состоящей из соединений: 21, й, II, III, 8ф 84, 86, 87, 820,824, 825, 826, 827, 836, или их окисленных производных, для предотвращения сердечной аритмии у субъекта.

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к применению формулы (д),

где Κι = Η, ОК¹, 8К¹, Ν(Κ')2, алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и К' = алкил, арил, или ацил; где К₂ = Η, алкил, алкенил, или арил; К₃ = Η, алкил, алкенил, или арил; К₄ = Η, галоид, карбоновая кислота, или алкил, содержащий О, 8, или I; и т = 0, 1, или 2; или соединений, выбранных из группы, состоящей из соединений: 21, р! II, III, 8ф 84, 86, 87, 820,824, 825, 826, 827, 836, или их окисленных производных, для приготовления лекарственного средства для предотвращения сердечной аритмии у субъекта.

Предпочтительно субъектом является человек и соединение выбирают из группы, содержащей соединения 21, Рт II, III, 81, 84, 86, 87, 820 и 836, или их окисленного производного. Наиболее предпочтительно соединение представляет собой соединение 836.

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к способу получения соединения формулы

- 7 015010

где Я = арил, алкенил, алкил, - (ΟΗ₂) _ηΝΚ'₂, или -(ΟΗ₂)_η8Κ, и η = 0, 1, 2, или 3, т = 0, 1 или 2, и Я' = алкил или циклоалкил, где указанный способ включает стадии:

(а) обработки соединения формулы

производным сульфонилхлорида и основанием для получения соединения формулы

(Ь) в случае необходимости, окисления соединения, полученного на стадии (а) для получения соединения формулы

где т = 1 или 2.

Предпочтительно соединение, полученное на стадии (а), представляет собой

при этом способ дополнительно включает стадию (а-1) между стадией (а) и стадией (Ь), которая представляет собой обработку соединения, полученного на стадии (а) первичным или вторичным амином с образованием соединения формулы

где Я = -(ΟΗ₂)_ηΝ (Я')₂; η = 2; и Я' определен в п.1. В следующем аспекте предложенное изобретение относится к способу получения соединения формулы

где Я = арил, алкил, -(СΗ₂)_ηNΚ'₂,или -(ΟΗ^),,^', и η = 0, 1, 2, или 3, и Я' = алкил или циклоалкил X = ΝΗ или О, где указанный способ включает стадии обработки соединения формулы

карбонилхлоридом в присутствии основания, и первичным или вторичным амином или спиртом, для получения соединения формулы

В следующем аспекте предложенное изобретение относится к способу получения производного 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина, имеющего формулу

где Я1 =ОЯ', 8Я', ΝΚ₂', алкил, или галоид, в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового цикла, и Я¹ = алкил, арил, или Η; где Я2 = Η, алкил, или арил; и где Я3 =Η, алкил, или арил, где указанный способ включает стадии:

(а) обработки соединения формулы

- 8 015010

восстанавливающим агентом, необязательно в присутствии катализатора, для получения соединения формулы

(Ь) обработки соединения, полученного на стадии (а) диазотирующим агентом и дисульфидом для получения соединения формулы

(с) обработки соединения, полученного на стадии (Ь) активирующим агентом и хлорэтиламином для получения соединения формулы

О (б) обработки соединения, полученного на стадии (с) восстанавливающим агентом и основанием для получения соединения формулы

О

и (е) обработки соединения, полученного на стадии (б) восстанавливающим агентом для получения соединения формулы

Дополнительные аспекты настоящего изобретения будут очевидны в свете следующего описания.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует, что 1ТУ-519 предотвращает желудочковые аритмии, индуцированные физической нагрузкой, у мышей РКВР12.6^+/-. (А) Характерные амбулаторные электрокардиограммы нелеченной мыши РКВР12.6^+/-, мыши РКВР12. 6^+/-, леченной 1ТУ-519, и мыши РКВР12.6^-/-, леченной 1ТУ-519. Не было значительных различий в частоте сердечных сокращений или в любом из измеряемых параметров ЭКГ. (В) верхняя метка: пример постоянной полиморфной желудочковой тахикардии, записанной у нелеченной мыши РКВР12.6^+/-, подвергнутой физической нагрузке и введению 1,0 мг/кг эпинефрина. Средняя метка: Электрокардиограмма мыши РКВР12.6^+/-, леченной .ТГУ-519, после такого же протокола; не определяли аритмий. Нижняя метка: Желудочковая тахикардия (ЖТ), индуцированная физической нагрузкой, у мыши РКВР12.6^-/-, леченной 1ТУ-519. Пунктирная линия представляет собой 16,31 с ЖТ, которые не показаны на чертеже. 'Р' показывает Р-волну, которая является показателем синусового ритма после желудочковой тахикардии. (С) Столбчатая диаграмма показывает количественное определение внезапной кардиальной смерти (слева), постоянных желудочковых тахикардии (>10 ударов, середина), и непостоянных желудочковых тахикардии (3-10 неправильных ударов, справа) у мышей РКВР12.6^+/- и РКВР12. 6^-/-, или леченных или нелеченных 1ТУ-519, соответственно. Должно быть отмечено, что лечение 1ТУ-519 полностью предотвращает аритмии, индуцированные физической нагрузкой и эпинефрином, у мышей РКВР12. 6^+/-, леченных 1ТУ-519 (п = 9), по сравнению с нелеченными мышами РКВР12.6^+/(п = 10) или 1ТУ-519-леченными мышами РКВР12.6^-/- (п = 5), предполагая, что 1ТУ-519 предотвращает аритмии и внезапную смерть у мышей РКВР12.6^+/- посредством повторного связывания РКВР12.6 с ВуК.2.

Фиг. 2 показывает, что 1ТУ-519 предотвращает внезапную кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой (ВКС), увеличением сродства РКВР12.6 к РуР2 у мышей РКВР12. 6^+/-. (А-В) Сердечные рецепторы рианодина (ВуК2) метили иммунопреципитацией с использованием антитела РуР2

- 9 015010

5029. Показаны иммуноблоты (А) и столбчатые диаграммы (В) , представляющие собой выраженные количества ВуВ2. РКА-фосфорилированный ВуР2 (антитело ΒνΡ2-ρ8θΓ^2Χ09) , и РКВР12.6 у мышей дикого типа (РКВР12.6^+/+). мышей РКВР12.6^+/-. и ЕКВР12.6^-/- в условиях отдыха. и после физической нагрузки. и в отсутствии и в присутствии 1ТУ-519. соответственно. В условиях отдыха. ~70% РКВР12.6 ассоциировано с ВуВ2 у мышей РКВР12. 6^+/-. После тестирования физической нагрузки. количество РКВР12.6. ассоциированное с комплексом ВуВ2. было значительно снижено у мышей РКВР12.6^+/-. но это можно предотвратить лечением 1ТУ-519. (С) Одиночные каналы ВуВ2 выделяли из сердец. полученных после физической нагрузки и инъекции эпинефрина. Показаны каналы от мышей РКВР12.6^+/-. с и без предварительного лечения 1ТУ-519. и каналы от мышей РКВР12.6^-/- после предварительного лечения 1ТУ-519. Необходимо отметить. что функция РуР2-канала нормализовывалась у мышей РКВР12.6^+/- после физической нагрузки. леченных 1ТУ-519. Характерный одиночный канал от мышей РКВР12.6^-/- с физической нагрузкой после лечения ТГУ-519 показал. что РКВР12.6 в сердце требуется для действия 1ТУ-519. Пунктирные линии представляют собой неполные отверстия канала или 'расщепленные' отверстия и являются показательными для каналов ВуВ2. лишенных РКВР12.6. Метки слева представляют собой 5.0 с. тогда как метки справа представляют собой 500 мс. На чертеже. Ро = вероятность открытия; То = среднее время открытия; Тс = среднее время закрытия; и с = закрытое состояние канала. (И) Суммарная столбчатая диаграмма. показывающая вероятности открытия отдельных ВуВ2 каналов (см. выше). 1ТУ-519 значительно снижает вероятность открытия ВуВ2 от мышей РКВР12.6^+/- после тестов с физической нагрузкой при диастолических концентрациях кальция (150 нМ).

Фиг. 3 иллюстрирует. что 1ТУ-519 нормализует открытие ВуВ2-канала путем увеличения связывающей аффинности РКВР12.6 к РКА-фосфорилированным ВуВ2 каналам. (А. В) Мембраны 8В сердца собак (А) и рекомбинантно-экспрессируемые ВуВ2 каналы (В) получали. как описано ранее (Кайаи с( а1.. ЕГГес1к оГ гарашуст оп гуаиоБше гесер1ог/Са⁽²⁺⁾-ге1еа5е сйаппеП Ггот сагФас тикс1е. С1гс. Век.. 78:990-97. 1996). (А) Рецепторы рианодина (ВуВ2) фосфорилировали с помощью каталитической субъединицы РКА (40 ед; 8щта Сйет1са1 Со.. 81. Ьошк. МО). в присутствии или отсутствии ингибитора РКА. РК15-24. в фосфорилирующем буфере (8 мМ МдС1₂. 10 мМ ЕСТА. и 50 мМ Тг1к/Р1РЕ8; рН 6.8). Образцы центрифугировали при 100000/д в течение 10 мин и промывали три раза в имидазольном буфере (10 мМ имидазола; рН 7). Рекомбинантно-экспрессируемый ЕКВР12.6 (конечная концентрация = 250 нМ) добавляли к образцам в отсутствии или присутствии различных концентраций 1ТУ-519. После 60 мин инкубации образцы центрифугировали при 100000/д в течение 10 мин и промывали дважды в имидазольном буфере. Образцы нагревали до 95°С и фракционировали по размеру с использованием 8П8-РАСЕ. Проводили иммуноблоттинг микросом 8В. как описано ранее (1ауагатап е1 а1.. ЕК506 ЬтБшд рго1ет аккоааВБ \νί(1ι 1йе са1сшт ге1еаке сйапие1 (гуапоБте гесер1ог). 1. Вю1. Сйет.. 267:9474-77. 1992). с анти-ЕКВР12.6 антителом (1:1000) и анти-ВуВ2-5029 антителом (1:3000). Чертеж демонстрирует. что 1ТУ-519 позволяет ЕКВР12.6 связываться с: (А) РКА-фосфорилированным ВуВ2 (частичное связывание при 100 нМ; полное связывание при 1000 нМ) или (В) ВуВ2-82809И мутантными каналами. которые являются по существу РКА-фосфорилированными ВуВ2 каналами. (С-Е) Исследования отдельных каналов показали повышенную вероятность открытия ВуВ2 после фосфорилирования РКА (И). при сравнении с РКАфосфорилированием в присутствие специфического ингибитора РКА. РК15-24 (С) . Функцию отдельного канала нормализовали в РКА-фосфорилированных ВуВ2. инкубированных с ЕКВР12.6 в присутствии 1ТУ-519 (Е). Отверстия каналов направлены вверх. штрих указывает на уровень полного открытия (4 рА). и буква 'с' показывает закрытое состояние. Каналы показаны в сжатой (5 с. верхняя метка) и расширенной (500 мс. нижняя метка) временных шкалах. и записи проводили при 0 мВ. Гистограммы амплитуды (справа) выявили повышенную активность и расщепленные отверстия в РКА-фосфорилированных ВуВ2. но не после лечения 1ТУ-519 и ЕКВР12.6. (Е) нормализованный график вероятности открытия. как функции цитозольного [Са²⁺]. Инкубация РКА-фосфорилированного ВуВ2 с ЕКВР12.6 в присутствии 1ТУ-519 сдвигала Са²⁺-зависимую активацию ВуВ2 направо. делая ее подобной Са²⁺-зависимости нефосфорилированных каналов.

Фиг. 4 показывает. что 1ТУ-519 улучшает сократимость сердца в модели сердечной недостаточности у крыс. (А) Площадь поперечного сечения миокарда в диастоле определяли на срединнопапиллярном уровне с использованием эхокардиографии до и после 4 недель лечения 1ТУ-519 или растворителем (контроль). Относительное увеличение диастолической дисфункции ингибировали 1ТУ-519. (В) Хотя систолическая функция ухудшена у нелеченных животных. 1ТУ-519 существенно увеличивал систолическую функцию у крыс с постинфарктной (пост-ИМ) сердечной недостаточностью.

Фиг. 5 демонстрирует. что 1ТУ-519 увеличивает сродство кальстабина2 (ЕКВР 12.6) к ВуВ2 у крыс с сердечной недостаточностью. Эквивалентные количества ВуВ2 подвергали иммунопреципитации с использованием анти-ВуВ2 антитела (А). Характерные иммуноблоты (А) и столбчатые диаграммы (В) показывают количество РКА фосфорилирование ВуВ2 в 8ег2809 (В. слева) и количество кальстабина2 (ЕКВР12.6) (В. справа). связанного с ВуВ2 в различных экспериментальных группах. При сердечной недостаточности. ВуВ2 является существенно гиперфосфорилированным РКА (В. слева). что приводит к диссоциации кальстабина2 (ЕКВР12.6) из комплекса канала (В. справа). Лечение 1ТУ-519 приводило к

- 10 015010 нормализации и состоянию РКА-фосфорилирования КуКЗ, а также связыванию РКВР12.6 с КуК2. Количество экспериментов указано в столбиках. *Р < 0,05, СН νδ. ложные; #Р < 0,05, СН+1ТУ-519 νδ. СН.

Фиг. 6 иллюстрирует, что РТУ-519 нормализует открытие КуК2-канала при сердечной недостаточности. КуК2 каналы выделяли у крыс с симуляцией операции (ложные) или сердечной недостаточностью (СН). Характерные метки отдельных каналов показывают, что вероятность открытия КуК2-канала (Ро) была существенно увеличена при сердечной недостаточности (среднее), по сравнению с ложнооперированными крысами (вверху). Лечение крыс с сердечной недостаточностью с помощью 1ТУ-519 в течение 4 недель нормализовало вероятность открытия до уровня, подобного таковому у ложнооперированных животных. Для каждого состояния верхняя метка представляет собой 5000 мс и нижняя метка представляет собой 200 мс. Отверстия каналов направлены кверху, штрих показывает полный уровень открытия канала (4 рА), и 'с' указывает закрытое состояние каналов. Гистограммы амплитуды (справа) выявляют повышенную Ро и расщепленные отверстия в КуК2 каналах при сердечной недостаточности.

Фиг. 7 демонстрирует, что 1ТУ-519 нормализует открытие КуК2 канала посредством увеличения связывания РКБР12.6 (кальстабина2) с КуК2 каналами. (А) Каналы КуК2 дикого типа (КуК2-^Т) были РКА фосфорилированы в отсутствии или присутствии специфического ингибитора РКА РК1_5-24, затем инкубированы с кальстабином2 (РКБР12.6) в присутствии РТУ-519 в указанных концентрациях. Иммуноблот КуК2 показывает равные количества КуК2 в образцах; иммуноблот кальстабина2 показывает, что РТУ-519 облегчает частичное (100 нМ) или полное (1000 нМ) повторное связывание кальстабина2 с РКА-фосфорилированным КуК2. (В) КуК2-82809П, который имитирует по существу РКАфосфорилированный КуК2, инкубировали с кальстабином2 в присутствии указанных концентраций 1ТУ519. Иммуноблот РуР2 показывает равные количества КуК.2 в образцах; иммуноблоты кальстабина2 показали, что РТУ-519 облегчает частичное (100 нМ) или полное (1000 нМ) повторное связывание кальстабина2 с КуК2-82809П. (С) Кривые связывания [³⁵8]-меченого кальстабина2 показали, что РТУ-519 увеличивает связывающее сродство кальстабина2 с РКА-фосфорилированным КуК2 и мутантным КуК282809Ό каналами, до уровня, сравнимого с нефосфорилированным РуР2-\УТ. (Э-Р) исследования отдельных каналов показали, что РТУ-519 (1 мкМ) снижает вероятность открытия (Ро) РКА-фосфорилированного РуР2\УТ посредством повторного связывания кальстабина2 при 150 нМ [Са²⁺] (п = 11 для Ό; η = 12 для Е; η = 13 для Р). Отверстия каналов направлены вверх, штрих указывает уровень полного открытия канала (4 рА), и 'с' показывает закрытое состояние каналов. Гистограммы амплитуды (справа) выявили повышенную Ро и расщепленные отверстия в РКА-фосфорилированных РуР2; это не наблюдали после лечения РТУ-519(1 мкМ) и кальстабином2 (РКВР 12.6).

Фиг. 8 иллюстрирует макромолекулярный комплекс РуР2 в ткани предсердия. (А) КуК.2 получали иммунопреципитацией из саркоплазматической сети (8Р) предсердия и фосфорилировали РКА или циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). Добавление ингибитора РКА (РК1) полностью блокировало реакцию фосфорилирования. (В) Компоненты макромолекулярного комплекса РуР2 совместно иммунопреципитировали с КуК.2 из 8Я предсердий. Положительным контролем был 8Р предсердий (с 50% мощностью иммунопреципитации (1Р)). Отрицательный контроль представляет собой образцы, иммунопреципитированные с антителами, блокированными антигенным пептидом. (С) Кальстабин2 (РКВР12.6) совместно иммунопреципитировали с РуР2 из 8Р предсердий. Перед фракционированием по размеру посредством 8Ό8 РАСЕ, образцы фосфорилировали РКА в присутствии и отсутствии РК1. Фосфорилирование РКА вызывало диссоциацию кальстабина2 (РКВР12.6) из комплекса канала, таким образом, ингибируемым РК1. +Конт. (С8К.) = 8Р предсердий; +Конт. (РКВР) рекомбинантный РКВР; -Конт. = 1Р, проводимая с антителом, с предварительным поглощением антигенного пептида.

Фиг. 9 показывает РКА-гиперфосфорилирование КуК.2 при фибрилляции предсердий (ФП) . (А) иммунопреципитированные (1Р) КуК.2 от контрольных животных (Контроль; η = 6) и собак с фибрилляцией предсердий (А Р1Ь; η = 6) фосфорилировали РКА. Для экспериментов обратного фосфорилирования, параллельно проводили иммуноблоттинг КуК2, с целью определения количества белка КуК2, которое было иммунопреципитировано в каждом образце. Столбчатая диаграмма слева представляет собой количественное определение исследований обратного фосфорилирования. Значения представляют собой относительную степень РКА-фосфорилирования КуК2, приведенную для количества иммунопреципитированного белка. У собак с ФП было показано увеличение на 130% РКА фосфорилирования, по сравнению с контролем (п = 6 для ФП; η = 6 для контроля; Р = 0,001). Кальстабин2 (РКВР12.6) совместно иммунопреципитировали с РуР2. Для экспериментов совместной иммунопреципитации иммуноблот для РуР2 проводили параллельно с целью определить количество белка КуК2, которое было иммунопреципитировано из каждого образца. Столбчатая диаграмма справа представляет собой количественное определение экспериментов совместной иммунопреципитации. Значения представляют собой количество кальстабина2 (РКВР12.6), совместно иммунопреципитированное с КуК2, скорректированное с количеством иммунопреципитированного белка. Связывание кальстабина2 (РКВР12.6) с КуК.2 показало снижение ФП у собак на 72%, по сравнению с контролем (η = 6 для контрольной группы; η = 7 для ФП; Р<0,0005). (В) Такую же серию экспериментов проводили с использованием человеческой ткани предсердий от па

- 11 015010 циентов с фибрилляцией предсердий в условиях сердечной недостаточности (А Р1Ь; η = 5) и ткани предсердий от пациентов со здоровыми сердцами (Контроль; η = 3). Столбчатая диаграмма слева представляет собой количественное определение исследования обратного фосфорилирования. У людей с ФП показано увеличение на 112% РКА фосфорилирования, по сравнению с контролем (η = 5 для А Р1Ь; η = 3 для контроля; Р = 0,002). Столбчатая диаграмма справа представляет собой результаты экспериментов совместной иммунопреципитации кальстабина2 (РКВР12.6). У людей с ФП показано снижение на 70% количества кальстабина2 (РКВР12.6), связанного с ВуВ2 (η = 5 для А Р1Ь; η = 3 для контроля; Р < 0,0001).

Фиг. 10 иллюстрирует нарушенную функцию ВуВ2-канала при ФП. (А) Верхние метки показывают характерные ВуВ2 каналы из левого предсердия контрольной группы; нижние метки являются каналами ФП. Справа от меток находятся соответствующие гистограммы существующей амплитуды. (В) Столбчатые диаграммы показывают количественное определение вероятности открытия (Ро) и частоты открытия (Ро) для контрольных собак (Конт.) и собак с хронической фибрилляцией предсердий (А Р1Ь) . Исследовали 17 каналов от 5 собак А Р1Ь, и 11 каналов от 5 контрольных собак. Каналы от контрольных собак не продемонстрировали повышенной активности. Наоборот, 15 из 17 каналов (88%) от собак А Р1Ь показали значительно увеличенную вероятность открытия (ФП: 0,3 9 ± 0,07; контроль: 0,009 ± 0,002; Р < 0,001) и частоту пропускания (ФП: 21,9 ± 4,6 с^-1; контроль: 1,6 + 0,6 с^-1; Р < 0,002).

Фиг. 11 демонстрирует, что лечение РТУ-519 восстанавливает нормальную функцию ВуВ2 при ФП. (А) Характерные метки отдельных ВуВ2 каналов из сердец собак, при концентрации цитозольного Са²⁺ 150 нМ (что имеется во время диастолы) и в присутствии 0,25 мМ кальстабина2 (РКВР12.6), демонстрируют значительно повышенную вероятность открытия (Ро) и частоту пропускания после РКА фосфорилирования (контроль: Ро = 0,3 ± 0,2%, η = 6; РКА: Ро = 14,8 ± 3,2%, η = 7; Р < 0,001). Как видно при более высоком разрешении во времени в нижней метке и во всеточечных гистограммах РКА фосфорилирование ВуВ2 приводит к частичным открытиям (расщепленные состояния), которые наблюдаются, когда кальстабин2 (РКВР12.6) диссоциирует из ВуВ2. РТУ-519 (1,0 мМ) восстанавливает активность канала РКА-фосфорилированного ВуВ2 (Ро = 0,8 ± 0,3%; η = 6; Р < 0,001), по сравнению с РКА-обработанными ВуВ2; РТУ-519 также приводил к прерывистому распределению существующих амплитуд в гистограмме, как видно в нефосфорилированных контрольных каналах. Верхние и нижние метки представляют собой 5000 и 200 мс, соответственно; закрытое состояние указано как 'с'; полное открытие каналов показано как направленные вверх изгибы до уровня 4 рА, что указано столбиками; пунктирные линии в нижних метках указывают 1 рА стадии частичных открытий. (В) Рекомбинантный кальстабин2 (РКВР12.6) инкубировали с РКА-фосфорилированными ВуВ2, в присутствии или отсутствии производного 1,4бензотиазепина, РТУ-519. Иммуноблоттинг с антикальстабин2 антителом выявил, что РТУ-519 позволяет рекомбинантному кальстабину2 (РКВР12.6) связываться с РКА-фосфорилированным ВуВ2. В отсутствие 1ТУ-519, связывание кальстабина2 не возникало.

Фиг. 12 показывает, что новые производные 1,4-бензотиазепина индуцируют связывание кальстабина2 (РКВР12.6) с РКА-фосфорилированным рецептором рианодина в сердце (ВуВ2) при 0,5 нМ. Верхняя панель = 2,0 нМ каждого соединения; нижняя панель = 0,5 нМ каждого соединения.

Фиг. 13 показывает, что производное 1,4-бензотиазепина, 836 (изображенное на фиг. 15) предотвращает сердечные аритмии у мышей при 200 нМ. Столбчатые диаграммы иллюстрируют аритмические эпизоды или внезапную кардиальную смерть в течение исследования физической нагрузки у мышей РКВР12.6^+/- - с или без лечения лекарственным средством, как указано. Левый график иллюстрирует внезапную кардиальную смерть; средний график иллюстрирует постоянную ЖТ; и правый график иллюстрирует непостоянную ЖТ. Числа относятся к общему количеству животных, используемых в каждой группе.

Фиг. 14 демонстрирует, что РТУ-519 улучшает сократимость сердца в модели сердечной недостаточности у крыс.

Фиг. 15 показывает структуры производных.

Подробное описание изобретения

Фосфорилирование сердечного ВуВ2 протеинкиназой (РКА) является важной частью ответа борьбы или полета; оно увеличивает прирост ЕС-связывания в сердце, облегчая высвобождение количества Са²⁺ для данного запуска (Магкк, А.В., СагФас т1гасе11ц1аг са1сшт ге1еаке скатек: го1е ίη Исаи ГаПигс. С1гс. Век., 87:8-11, 2000). Такой сигнальный путь обеспечивает механизм, посредством которого активация симпатической нервной системы в ответ на стресс приводит к повышенному сердечному выбросу, требуемому для соответствия метаболическим потребностям ответа на стресс. При связывании катехоламинов, β1- и в2-адренергические рецепторы активируют аденилилциклазу посредством стимулирующего С-белка, Са_к. Аденилилциклаза увеличивает уровень внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), который активирует цАМФ-зависимую РКА. РКА-фосфорилирование ВуВ2 увеличивает вероятность открытия канала посредством диссоциации кальстабина2 (РКВР12.6) из комплекса канала. Это, в свою очередь, увеличивает чувствительность ВуВ2 к Са²⁺-зависимой активации (Наш е1 а1., РЬокрЬогуИЕоп тойикИек Фе Гцпсйоп оГ Фе са1сшт ге1еаке скаги^ оГ кагсор1актю гексикцп Ггот сагФас тикс1е. ί. Вю1. Скет., 270:2074-81, 1995; УаШМа е1 а1., ВарФ аάарίаΐ^оη оГ сагФас мпоФис гесерЮгк:

- 12 015010 ιηοάιιΐηΐίοη Ьу Мд²⁺ и ρΙιοδρΙιΟΓνΕ-ιΙίοη. 8с1епсе, 267:1997-2000, 1995; Магх е( а1., РКА ρΙιοδρΙιΟΓνΕ-ιΙίοη άίδδοС1а1ез РКБР12.6 Ггот (Не са1сшт ге1еа8е сНаппе1 (гуа1юбп'1е гесерЮг): беГесбуе ^еди1аΐ^οη ίη ГаЛпд НеаП8. Се11, 101:365-76, 2000).

Сердечная недостаточность (например, у пациентов с сердечной недостаточностью и в моделях сердечной недостаточности у животных) характеризуется неадекватным ответом, который включает хроническую гиперадренергическую стимуляцию (Вп8Ю\у е( а1., Эесгеа8еб са1ес1ю1атте 8еп8111У11у апб Ьеΐа-аб^еηе^д^с-^есеρΐο^ беп811у ίη ГаЛпд Нитам НеаП8. Ν. Епд1. ί. Меб., 307:205-11, 1982). Патогенетическая значимость такой стимуляции при сердечной недостаточности поддерживается терапевтическими стратегиями, которые снижают бета-адренергическую стимуляцию и сокращение стенки левого желудочка, и эффективно обращает ремоделирование желудочка (Βа^Ьοηе е( а1., Οοιηρηπδοη οί г1дН1 апб 1ей уеп1пси1аг ΐΌδροη^δ ίο 1ей уеп1пси1аг 388181 беуке δΐιρροΠ ίη райепГъ \\ЙН кеуеге йеай Габше: а рйтагу га1е οί тесНашса1 ипЮабшд ипбейушд геуегке ^етοбе1^ηд. ΟκΛαίίοη, 104:670-75, 2001; ЕКИют апб Вимт, Меб1са1 Легару саη биргоуе Ле ЬюЛдюЛ ргорегбех οί Ле сНгошсайу ГаЛпд йеай. А пе\у ега ίη Ле 1геа1теп1 οί НеаП Гайцге. Сйси1а1юп, 94:2285-96, 1996). При сердечной недостаточности хроническая бетаадренергическая стимуляция ассоциирована с активацией бета-адренергических рецепторов в сердце, которая, посредством связывания с С-белками, активирует аденилилциклазу и таким образом увеличивает внутриклеточную концентрацию цАМФ. ЦАМФ активирует цАМФ-зависимую РКА, про которую показано, что она индуцирует гиперфосфорилирование ЯуЯ2. Следовательно, хроническая сердечная недостаточность является хроническим гиперадренергическим состоянием (СЫбкеу е( а1., Аидшеηΐаΐ^οη οί р1а§та гюгертерНгте ге8|юп8е ίο ехегсЕе ίη раПеШз νίΛ ^ι^8ΐί\Ό НеаП Гайиге. Ν. Епд1 ί. Меб., 267:650, 1962), что приводит к нескольким патологическим последствиям, включая РКАгиперфосфорилирование ЯуЯ2 (Магх е( а1., РКА ρйο8ρйο^у1аΐ^οη б^88οс^аΐе8 ЕКВР12.6 Ггот Ле са1сшт ге1еа8е сЬэпие1 (1уа1юбте гесерЮг): беГес11'е ^еди1аί^οη ίη ГаЛид НеагК Се11, 101:365-76, 2000).

РКА-гиперфосфорилирование ЯуЯ2 было предложено как фактор, участвующий в снижении сократигельной функции и развитии аритмий при сердечной недостаточности (Магк8 е( а1., Ргодге88Юп οί НеаП Габпге: 18 ргоЮш кшазе а йуρе^ρйο8ρйο^у1аί^οη οί Ле гуа1юбб'1е гесерЮг а ^ηΙπΗιιΙη'ΐβ ГасЮг? Сйси1а1юп, 105:272-75, 2002; Магх е( а1., РКА ρйο8ρйο^у1аί^οη б^88οс^аΐе8 ЕКВР12.6 Ггот Ле са1сшт ге1еа8е сНаппе1 (гуа1юбб'1е гесерЮг): беГесЙуе ^еди1аί^οη ίη ГаЛпд НеаП8. Се11, 101:365-76, 2000). Согласуясь с этой гипотезой, РКА-гиперфосфорилирование ЯуК2 при сердечной недостаточности было продемонстрировано ίη νίνο, и в моделях на животных и у пациентов с сердечной недостаточностью, подвергнувшихся трансплантации сердца (ЛпЮ8 е( а1., Эба1еб са^б^οшуορаΛу аиб 8иббеп беаЛ ге8иШпд Ггот ^ιΜΗιιΙίΐΌ асбуа1юп οί ргоЮш кша8е А. Сйс. Яе8., 89:997-1004, 2001; Магх е( а1., РКА ρйο8ρйο^у1аί^οη б^88οс^аΐе8 ЕКВР12.6 Ггот Ле са1сшт ге1еа8е сНаппе1 (гуа1юбб'1е гесерЮг): беГесбуе ^еди1аΐ^οη ίη ГаЛпд НеаП8. Се11, 101:36576,2000; О1Ю е( а1., АЙегеб шЮгас1юп οί ЕКВР12.6 \\ЙН гуа1юбп'1е гесерЮг а8 а саи8е οί аЬ1югта1 Са2+ ге1еа8е ίη НеаП Габпге. Сагбюуа8с. Яе8., 48:323-31, 2000; Яе1кеп е( а1., Ве1а-абгепегд1с гесерЮг ЬЮскеш ге8Юге сагб1ас са1сшт ге1еа8е сНаппе1 (гуа1юбп'1е гесерЮг) 81гисЛге аиб Λη^οη ίη НеаП Габпге. ΟκΛαίίοη, 104:2843-48, 2001; §ет8апап е( а1., ТНе Ыуре са1сшт сНаппе1 ^ηН^Ь^(ο^ бЛ|ахет ргеуепЮ са^б^οшуορаΛу ίη а тοи8е тοбе1. ί. С1ш. 1п'е8к, 109:1013-20, 2002; Υαηο е( а1., АЙегеб 8ΐο^сЬ^οтеί^у οί ЕКВР12.6 уег8П8 гуагюбше гесерЮг а8 а саи8е οί аЬ1югта1 Са2+ 1еак Лгоидй гуа1юбб'1е гесерЮг ίη НеаП Габиге. Сйси1а1юп, 102:2131-36, 2000).

При сердечной недостаточности гиперфосфорилирование ЯуЯ2 РКА индуцирует диссоциацию регуляторной субъединицы ЕКВР12.6 из канала ЯуЯ2 (Магх е( а1., РКА ρйο8ρйο^у1аί^οη б^88οс^аΐе8 ЕКВР12.6 Ггот Ле са1сшт ге1еа8е сНаппе1 (^уаиοб^ηе гесерЮг): беГесбуе ^еди1аΐ^οη ίη ГаЛпд НеаП8. Се11, 101:365-76, 2000). Это вызывает заметные изменения в биофизических свойствах ЯуК2 канала. Такие изменения подтверждаются увеличенной вероятностью открытия (Ρο) из-за повышенной чувствительности к Са²⁺-зависимой активации (Вп11апЮ8 е( а1., 8(3Η6ίζ3ΐίοη οί са1сшш ге1еа8е сНэпие1 (^уаиοб^ηе гесерЮг) Гиис1юи Ьу ЕК506-Ьшбшд ргоЮш. Се11, 77:513-23, 1994; Кайэп е( а1., ЕГГес(8 οί гаратусб'1 οη ^уаиοб^ηе гесерЮг/Са^:'-ге1еа8е сНэпие18 Ггош сагб1ас ти8с1е. Сйс. Яе8, 78:990-97, 1996); дестабилизации канала, приводящей к расщепленному состоянию; и нарушенного связанного пропускания каналов, приводящего к нарушенному ЕС связыванию и кардиальной дисфункции (Магх е( а1., ^ирЫ дайпд Ьеруееп шбМбиа1 8ке1е(а1 тшск Са²⁺ ге1еа8е сНаппе18 (^уаηοб^ηе гесерЮг8). 8аепсе, 281:818-21, 1998). Следовательно, РКАгиперфосфорилированные ЯуЯ2 являются очень чувствительными к стимуляции низким уровнем Са²⁺, и это проявляется само по себе как утечка Са²⁺ 8Я через гиперфосфорилированный канал.

Неадекватный ответ на стресс при сердечной недостаточности приводит к истощению ЕКВР12.6 из макромолекулярного комплекса канала. Это приводит к сдвигу влево в чувствительности ЯуЯ2 к Са²⁺индуцированному высвобождению Са²⁺, приводя к каналам, которые являются более активными при низком-среднем [Са²⁺] (Магх е( а1., РКА ρйο8ρйο^у1аΐ^οη б^88οс^аΐе8 ЕКВР12.6 Ггош Ле са1сшт ге1еа8е сНаппе1 (^уаηοб^ηе гесерЮг): беГесЛ'е ^еди1аί^οη ίη ГаЛпд НеаП8. Се11, 101:365-76, 2000; Υашашοΐο е( а1., АЬηο^ша1 Са²⁺ ге1еа8е Ггош сагб1ас 83ΐΌο]ΐ138ΐι·ιΚ гебсиПпп ίη 1асНусагб1а-шбисеб НеаП Габпге. Сагбюуа8с. Яе8., 44:146-55, 1999; Υαηο е( а1., АЙегеб 8ΐο^сЬ^οшеί^у οί ЕКВР12.6 уег8П8 гуа1юбте гесерЮг а8 а саи8е οί аЬ1югта1 Са²⁺ 1еак Лгоидй ^уаηοб^ηе гесерЮг ίη НеаП Габпге. Сйси1а1юп, 102:2131-36, 2000). В течение времени повышенная утечка через ЯуЯ2 приводит к переустановке содержания Са²⁺ 8Я на более низ

- 13 015010 ком уровне, который в свою очередь снижает прирост ЕС связывания и участвует в нарушенной систолической сократимости (Магх е( а1., РКА ρΙιοφΙιοίΎΐηΙίοη άίδδοαηΐοδ БКВР12.6 Ггот (Нс са1сшт ге1еа§е сНашШ (гуагюбте гесерЮг): беГесШе гедик-ιΐίοη ίη ГаПтд НеагК Се11, 101:365-76, 2000).

Субпопуляция каналов ВуВ2, которая является особенно протекающей, может высвобождать Са²⁺ 8В в течение фазы отдыха сердечного цикла, диастолы. Это приводит к деполяризации мембран кардиомиоцитов, известной как отложенные постдеполяризации (ΌΑΌ), о которых известно, что они запускают смертельные сердечные аритмии (ХУеНгещ е( а1., БКВР12.6 беЛае^у амб беГесйуе са1сшт ге1еа§е сНашШ (гуагюбте гесерЮг) ΓιιικΙίοη Нпкеб ΐο ехегаке-тбисеб 5иббеη сагб1ас беа(Н. Се11, 113:829-40, 2003).

В нормальных по структуре сердцах, подобный феномен может быть в действии. В особенности известно, что физическая нагрузка и стресс индуцируют высвобождение катехоламинов, которые активируют бета-адренергические рецепторы в сердце. Активация бета-адренергических рецепторов приводит к гиперфосфорилированию ВуВ2 каналов. Доказательства также предполагают, что гиперфосфорилирование ВуВ2, возникающее в результате активации бета-адренергических рецепторов, делает мутированные ВуВ2 каналы более способными к открытию в фазе расслабления сердечного цикла, увеличивая вероятность аритмий.

Авторы изобретения показали в данном описании, что 1ТУ-519 предотвращает сердечную недостаточность в модели пост-ИМ сердечной недостаточности у крыс. В такой модели на животных 1ТУ-519 улучшает функцию сердца в отношении сниженной диастолической дисфункции и улучшенной систолической функции. Более того, авторы изобретения продемонстрировали, что скелетно-мышечная форма ВуВ канала, ВуВ1, также является неисправной (или протекающей) в скелетных мышцах при сердечной недостаточности, из-за РКА-гиперфосфорилирования (Βе^кеη е( а1., РКА ρ1ιο5ρ1ιοΓν1;·ιΙίοη б^55οс^аΐе5 БКВР12 Гют (Не са1сшт ге1еа§е сНашШ (гуагюбте гесерЮг) ίη 5ке1е1а1 ти5с1е: беГесбуе гедик-Июн ίη йеай Гайиге. ί. Се11 Вю1, 160:919-28, 2003). Следовательно, ожидают, что 1ТУ-519 также будет улучшать скелетно-мышечную функцию у пациентов с сердечной недостаточностью. Как таковой, 1ТУ-519 обеспечивает новый терапевтический подход к лечению двух основных симптомов сердечной недостаточности ранней утомляемости и одышки, которые вызваны скелетно-мышечной слабостью в конечностях и диафрагме, соответственно.

Как обсуждалось выше, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПЖТ) представляет собой наследственное заболевание у людей со структурно нормальными сердцами. Она характеризуется желудочковой тахикардией, индуцированной стрессом, смертельной аритмией, которая может вызвать внезапную кардиальную смерть (ВКС). Мутации в ВуВ2 каналах, расположенных на саркоплазматической сети (8В), были связаны с КПЖТ.

Все пациенты с КПЖТ имеют сердечные аритмии, индуцированные физической нагрузкой. Авторы изобретения ранее показали, что аритмии, индуцированные физической нагрузкой, и внезапная смерть (у пациентов с КПЖТ) возникает в результате сниженной афинности БКВР12.6 к ВуВ2. Далее авторы изобретения продемонстрировали, что физическая нагрузка активирует ВуВ2 в результате фосфорилирования аденозин-3',5'-монофосфатзависимой протеинкиназы (РКА).

Для определения молекулярных механизмов, лежащих в основе смертельных сердечных аритмий при КПЖТ, авторы изобретения изучали КПЖТ-ассоциированные мутантные ВуВ2 каналы (например, 82246Б, В24748, N41 (ЦК, В4497С). Мутантные ВуВ2 каналы, которые имели нормальную функцию в плоских липидных слоях в основных условиях, были более чувствительными к активации посредством РКА фосфорилирования, проявляя повышенную активность (вероятность открытия) и удлиненное состояние открытия, по сравнению с каналами дикого типа. Кроме того, РКА-фосфорилированные мутантные ВуВ2 каналы были устойчивыми к ингибированию Мд²⁺, физиологическим ингибитором ВуВ2 каналов и проявляли сниженное связывание с БКВР12.6 (который стабилизирует канал в закрытом состоянии). Такие открытия указывают, что во время физической нагрузки, когда ВуВ2 каналы являются РКАфосфорилированными, мутантные КПЖТ каналы более вероятно открываются в фазе расслабления сердечного цикла (диастоле), увеличивая вероятность возникновения аритмий, запускаемых утечкой Са²⁺ 8В. Так как сердечная недостаточность является основной причиной смерти во всем мире, способы для борьбы с утечкой ВуВ2 смогут предотвратить смертельные аритмии у миллионов пациентов.

Авторы изобретения, кроме того, продемонстрировали, что экспериментальное лекарственное средство, 1ТУ-519, производное 1,4-бензотиазепина, предотвращает смертельные желудочковые аритмии у мышей, гетерозиготных по гену БКВР12.6. Недавно было показано, что 1ТУ-519 снижает диастолическую утечку Са²⁺ 8В в модели сердечной недостаточности у животных (Ύ;·ιηο е( а1., БКВР12.6-теб1а1:еб 5ίаЬ^1^ζаΐ^οη οί са1сшт-те1еа5е сНашШ (гуагюбте гесерЮг) а§ а гюуе1 (Негареибс 51га1еду адаиъ! Неаг( Гайите. СйсиШюи, 107:477-84, 2003; 1<ο1ιηο е( а1., А гю\\· сагбюргсИесЩ'е адегИ 1ТУ519, ипргсле беГесбуе сНашШ да1шд οΤ гуагюбте гесерЮг ίη йеай Гайите. Ат. ί. Рйу5ю1. Неай Сйс. Рйу5ю1, 14:14, 2002). В настоящем исследовании, авторы изучали эффективность и механизм действия 1ТУ-519 в модели сердечной аритмии. Для своих экспериментов ίη νίνο авторам исследования требовались граммовые количества 1ТУ-519 (4-[3-(4-бензилпиперидин-1 -ил)пропионил]-7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепинмоногидрохлорида).

Для изучения сердечных аритмий мышей БКВР12.6^+/- и БКВР12.6^-/- подвергали ранее описанному

- 14 015010 протоколу физической нагрузки (\ейгепк с1 а1., РКВР12.6 беПаепсу апб беГесбхе са1сшт ге1еаке сйапие1 (гуапобте гесерЮг) Гипсбоп бикеб 1о ехегаке-тбисеб киббеп сагб1ас бса1б. Се11, 113:829-40, 2003; МоЫег с1 а1., Апкугш-В тШабоп саикек 1уре 4 1опд-ОТ сагб1ас аггбубшба апб киббеп сагб1ас бса1б. Ыа1иге, 421:63439, 2003). Тогда как у 88% мышей РКВР12. 6^+/- (7 из 8) проявились желудочковые тахиаритмии (ЖТ) или синкопальные события во время протокола, ни у одной из мышей РКВР12.6^+/- (0 из 6), предварительно пролеченных 1ТУ-519 не развились аритмии или синкопальные события (фиг. 1). Более того, 90% мышей РКВР12.6^+/-(9 из 10) умерли во время или после физической нагрузки, тогда как ни одна из мышей РКВР12.6^+/-, леченных 1ТУ-519 (0 из 9) не умерла (фиг. 1С) . В противоположность предварительно леченным мышам РКВР12.6^+/- у 100% мышей РКВР12.6^-/- (5 из 5), леченных 1ТУ-519, развились ЖТ во время протокола стресса и они умерли, несмотря на лечение 1ТУ-519 (фиг. 1С). Вместе эти данные предполагают, что РКВР12.6 требуется для антиаритмического действия ТГУ-519.

С целью дальнейших характеристик антиаритмических свойств 1ТУ-519 авторы изобретения подвергали мышей РКВР12.6^+/+, РКВР12.6^+/- и РКВР12.6^-/- протоколам программируемой электрической стимуляции. ЖТ индуцировали быстрым искусственным ускорением сердечного ритма у 71% мышей РКВР12.6^+/- (5 из 7), но не у мышей дикого типа РКВР12.6^+/+ (Р < 0,05, п = 5), после инъекции 0,5 мг/кг изопротеренола. Мыши РКВР12.6^+/-, предварительно леченные 1ТУ-519 (0,5 мг/кг/ч), были достоверно менее подвержены ЖТ, индуцированным искусственным ускорением сердечного ритма, по сравнению с нелеченными мышами РКВР12.6^+/- (1 из 7 νκ. 5 из 7; Р < 0,05). Наоборот, у 67% мышей РКВР12.6^-/- (4 из

6) , предварительно леченных 1ТУ-519, развились ЖТ во время искусственного ускорения сердечного ритма.

ЖТ могли быть индуцированы одиночной ранней экстрасистолой у 71% мышей РКВР12.6^+/- (5 из

7) . ЖТ не наблюдали у 7 мышей РКВР12.6^+/-, предварительно леченных 1ТУ-519. С использованием протокола двойной ранней экстрасистолы (§1-82-83), ЖТ воспроизводимо индуцировали у 100% нелеченных мышей РКВР12.6^+/- (7 из 7). Лечение 1ТУ-519 полностью устраняло индуцируемые ЖТ у мышей РКВР12.6^+/- (7 из 7). Лечение 1ТУ-519 не предотвращало ЖТ у мышей РКВР12.6^-/-, поддерживая концепцию, что РКВР12.6 требуется для антиаритмического действия 1ТУ-519.

Ранее авторы изобретения продемонстрировали, что РКА фосфорилирование КуК2 на 8ег2809 вызывает диссоциацию РКВР12.6 из КуК2 канала (Магх с1 а!, РКА рбокрбогу1абоп б1ккос1а1ск РКВР12.6 Ггот Не са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесерЮг): беГесбуе геди1абоп ш Габбщ НеаПк. Се11, 101:365-76, 2000). В настоящем исследовании предварительное лечение 1ТУ-519 (0,5 мг/кг/ч) не влияло на степень РКА фосфорилирования КуК2 у мышей РКВР12.6^+/- и РКВР12.6^-/-. (фиг. 2). По сравнению с мышами РКВР12.6^+/+, комплексы КуК2 от мышей РКВР12.6^+/- были достоверно более обеднены РКВР12.6 после физической нагрузки (*Р < 0,05). Предварительное лечение 1ТУ-519 однако предотвращало потерю РКВР12.6 из макромолекулярного комплекса КуК2 у мышей РКВР12.6^+/- во время физической нагрузки (фиг. 2; *Р < 0,05).

Вероятность открытия (Ро) КуК2 каналов мышей РКВР12.6^+/-подвергнутых физической нагрузке, была достоверно увеличена, по сравнению с каналами мышей РКВР12.6^+/+ после физической нагрузки ( + /-: 0,47 ± 0,12, п= 11; +/+: 0,04 ± 0,01, п= 13; Р < 0,05).

Лечение мышей РКВР12.6^+/- с физической нагрузкой 1ТУ-519 (0,5 мг/кг/ч) достоверно снижало Ро каналов (0,02 ± 0,01, п = 13) по сравнению с нелеченными мышами с физической нагрузкой (фиг. 2). Такое наблюдение согласуется с повышенным количеством РКВР12.6 в комплексе КуК2 (фиг. 2). Наоборот, лечение 1ТУ-519 мышей РКВР12.6^-/- с физической нагрузкой не приводило к каналам с низкой Ро.

Одиночные КуК2 каналы исследовали с низким цис (цитозольным) [Са²⁺] 150 нМ, с использованием Са²⁺ в качестве носителя заряда. Такие условия симулируют таковые в сердце во время диастолы, когда КуК2 каналы должны иметь низкую вероятность открытия с целью предотвращения диастолического протекания Са²⁺ 8К, которое может запускать сердечные аритмии. Следовательно, значительное снижение КуК2 Ро, что наблюдается у мышей РКВР12.6^+/- с физической нагрузкой, леченных 1ТУ-519, предполагает, что КуК2 каналы не будут протекающими во время диастолы б, что согласуется с отсутствием наблюдаемых аритмий.

Для дальнейшего изучения механизма, посредством которого 1ТУ-519 предотвращает ЖТ, авторы изобретения симулировали условия физической нагрузки с использованием РКА-фосфорилирования дикого типа КуК2 (КуК2-\Т) каналов. РКА-фосфорилированные КуК2 каналы затем инкубировали с РКВР12.6 (250 нМ), в присутствии увеличивающихся концентраций 1ТУ-519. Инкубация с 100 нМ или 1000 нМ 1ТУ-519 индуцировала связывание РКВР12.6 с РКА-фосфорилированными КуК2 (фиг. 3). 1ТУ519 также индуцировал связывание РКВР12.6 с мутантными КуК2-82809О каналами, которые имитируют постоянно-РКА-фосфорилированные КуК2 каналы (фиг. 3).

Афинность РКВР12.6 к РКА-фосфорилированным КуК2 каналам достоверно увеличивалась добавлением 1ТУ-519. Константы диссоциации (К_бк) для связывания РКВР12.6 с каналами были: 148 ± 59,0 нМ для КуК2-\Т + РКА + РК_5-24 (ингибитор РКА); 1972 ± 39,9 нМ для КуК2-\Т + РКА; 158 ± 56,4 нМ для КуК2 + РКА + 1ТУ-519 (Р < 0,05, п = 2 для РКА-фосфорилированных каналов ν8. РКАфосфорилированными каналами с 1ТУ-519) (фиг. 3). Подобные результаты были получены с использова

- 15 015010 нием мутантных КуК2-82809О каналов (которые имитируют постоянно-РКА-фосфорилированные каналы). К_й8 для связывания РКВР12.6 были: 2123 ± 104 нМ для КуК2-82809О; и 428 ± 39 нМ для КуК282809Ό + ТТУ-519. РКА фосфорилирование КуК2 активировало каналы (Ро = 0,01 ± 0,002 (РКА + РКП η = 11) νδ. Ро = 0,4 0 ± 0,02 (РКА; η = 12; Р < 0,05). Добавление РКВР12.6 (250 нМ) к РКАфосфорилированным КуК2-УТ каналам не снижало Ро. Однако добавление 1 мкМ ТТУ-519 плюс РКВР12.6 снижало Ро до уровня, сравнимого с не-РКА-фосфорилированными каналами (Ро = 0,002 ± 0,001; η = 13; Р < 0,05).

В целом, результаты, полученные авторами изобретения, показали, что обеднение РКВР12.6 из макромолекулярного комплекса КуК2, которое ассоциировано с повышенной вероятностью открытия КуК2, желудочковыми тахикардиями, и внезапной кардиальной смертью у мышей РКВР12.6^+/-, обращалось лечением производным 1,4-бензодиазепина, ТТУ-519.

Следовательно, авторы изобретения идентифицировали новый молекулярный механизм для лечения желудочковых аритмий: увеличение афинности КуК2 к РКВР12.6 предотвращает диастолическую утечку кальция 8К, которая запускает аритмии. Так как дефицит РКВР12.6 в макромолекулярном комплексе КуК2 является обычным свойством при сердечной недостаточности (Магх е( а1., РКА рйокрйогу1аΐίοη й1ккос1а(ек РКВР12.6 Ггот 1Не са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапойте гесерЮг): йеГес1Ае геди1айоп ίη ЕаШпд Неайк. Се11, 101:365-76, 2000) и наследственных желудочковых аритмиях, индуцированных физической нагрузкой (УеНгепк е( а1., РКВР12.6 йейаепсу апй йеГес1Ае са1сшш ге1еаке сНаппе1 (гуапойте гесер(ог) Гипсйоп Нпкей (о ехегаке-тйисей киййеп сагй1ас йеа(Н. Се11, 113:829-40, 2003), ожидают, что ТТУ-519 обеспечит новый и специфический путь для лечения молекулярного дефекта КуК2, который запускает внезапную кардиальную смерть.

Как обсуждается выше, фибрилляция предсердий является наиболее частой формой сердечной аритмии у людей. На сегодняшний день было установлено, что структурное ремоделирование и электрическое ремоделирование - включая укорочение рефрактерности предсердий, потерю связанной с частотой адаптации рефрактерности (Ууйе1к е( а1., А(г1а1 Г^Ь^^11а(^οп Ъедей а(г1а1 Г^Ь^^11а(^οп: а кШйу ίη апаке сНгошса11у ткйитеШей доа!к. Спси1айоп, 92:1954-68, 1995; МогШо е( а1., СНгошс гар1й а!г1а1 расшд: к1гпс1ига1, 1ипс11опа1, апй е1ес1горНу81о1од1са1 сНагас1ег1511с8 оГ а пе\у тойе1 оГ кийатей а!г1а1 Г^Ь^^11а(^οπ. Спси1айоп, 91:1588-95, 1995; Ейап е( а1., Расшд-тйисей сНгошс а!г1а1 ПЬШЬ-Шоп ί трайк кНшк пойе Еипсйоп ίη йодк: е1ес(горНу51о1од1са1 гетойейпд. Спси1айоп, 94:2953-60, 1996; Сакро е( а1., Рипс11опа1 тесНашктк ипйейутд 1асйусагй1а-тйисей кийашей а(г1а1 ПЬШЬ-Шоп ίη а сНгошс йод тойе1. Сиси1айоп, 96:4027-35, 1997), и укорочение длины волны входящих импульсов - сопровождающих постоянную тахикардию (Кепкта е( а1., ЬепдЩ о£ ехсйайоп \\т^ге апй киксерйЪййу (о геепйаШ а(г1а1 аггНуЙшиак ίη иогта1 сопксюик йодк. Спс. Кек., 62:395-410, 1988). Такое ремоделирование является, вероятно, важным в развитии, поддержании и прогрессировании фибрилляции предсердий. Также предполагают, что манипулирование кальцием может играть роль в электрическом ремоделировании при фибрилляции предсердий (8ии е( а1., Се11и1аг тесНашктк о£ а!г1а1 сопйасШе йукйтсЕоп саикей Ьу кийатей а!г1а1 1асйусагй1а. Спси1айоп, 98:719-27, 1998; Соейе е( а1., Е1ес1г1са1 гетойейпд ίη а(г1а1 йЪгШайоп: йте соигке и тесНашктк. Сисик-Шоп 94:296874, 1996; Эаопй е( а1., ЕГГес! о£ νе^арат^1 апй ргосашат1йе оп а!г1а1 йЪгШайоп-тйисей е1ес1пса1 гетойейпд ίη Нитапк. Спси1айоп, 96:1542-50, 1997; Уи е( а1., Тасйусагй1а-шйисей сНапде о£ а!г1а1 гейайогу репой ίη Нитапк: га1е йерепйепсу апй еГГес(к о£ апПаггНуЙишс йгадк. Спси1айоп, 97:2331-37, 1998; Ье1йай е( а1., А1г1а1 сопйасШе йук&псйоп айег ЧюгНегт а!г1а1 йЪгШайоп 1к гейисей Ьу νе^арат^1 Ъп1 шсгеакей Ьу ВАУ К8644. Спси1айоп, 93:1747-54, 1996; Т1е1етап е( а1., Уегаратй гейисек 1асНусагй1а-тйисей е1ес!г1са1 гетойейпд о£ (Не айга. Спси1айоп, 95:1945-53, 1997).

Множество механизмов, на основании нарушенной функции ионных каналов, было предложено для ФП. Например, исследования показали снижение тока Са²⁺ Ь-типа Рсгщ) и переходного наружного тока (ГДЕ в условиях длительной предсердной тахикардии (Уие е( а1., йшс гетойейпд ипйейущд асйоп ро(епЙа1 сНапдек ίη а сашпе тойе1 оГ а(г1а1 ЙЪгШайоп. Спс. Кек., 81:512-25, 1997). Наблюдаемое подавление Ц^ь, вероятно, объясняет, по меньшей мере, частично, укорочение АЕКР и потерю связанной с частотой адаптации рефрактерности, оба из которых являются признаками процесса электрического ремоделирования, которое сопровождает ФП (Уие е( а1., Шшс гетойейпд ипйейущд асйоп ро1епЕа1 сйапдек ίη а сашпе тойе1 оГ а1па1 ЙЪгШайоп. Спс. Кек., 81:512-25, 1997). В экспериментальных моделях быстрой стимуляции предсердий на животных и в клинических исследованиях людей с ФП было показано, что верапамил ингибирует электрическое ремоделирование, таким образом предполагая, что вовлечена перегрузка Са²⁺ (Эаопй е( а1., ЕГГес! оГ νе^арат^1 апй ргосататШе оп а(г1а1 йЪгШайоп-тйисей е1ес1пса1 гетойейпд ίη Нитапк. С1гси1айоп, 96:1542-50, 1997; Ье1йай е( а1., А(г1а1 сопйасШе йукЕипсйоп айег кНогЫегт а(г1а1 ЙЪгШайоп 1к гейисей Ъу νе^арат^1 Ъп1 шсгеакей Ъу ВАУК8644. СпсШайоп 93:1747-54, 1996).

Тогда как ионные каналы сарколеммы несомненно играют важную роль в ремоделировании, которое сопровождает предсердную тахикардию и ФП, вклад внутриклеточной поставки Са²⁺ тщательно не изучен. Существуют доказательства, однако, предполагающие, что нарушенная поставка внутриклеточного Са²⁺ играет роль в процессе ремоделирования. В предшествующих исследованиях было продемонстрировано, например, что потеря адаптации к частоте не может быть полностью объяснена нарушенны

- 16 015010 ми токами ионов в сарколемме, таких как 1_Са,_ъ и 1_То (Катбех е( а1., Ма1НетаНса1 апа1ук1к оГ сапше а1г1а1 асбоп ро1еп(1а1з: гаТе, гедюпа1 ГасТогк, апб е1ес1г1са1 гетобе1тд. Ат. 1. РНукю1 Неаб Сбс. РНукюН 279:Н1767-85, 2000; Кпе11ег е( а1., КетобеНпд оГ Са²⁺-Напб1шд Ьу а(г1а1 ТасНусагб1а: еу1бепсе Гог а го1е ш 1окк оГ гаТе-абарГабоп. Сагбюуакс. Кек., 54:416-26, 2002).

Исследования также показали, что изменения, индуцированные тахикардией в внутриклеточном потоке кальция, также вносят значительный вклад в потерю адаптации к скорости, что считается критическим в патогенезе ФП (8ип е( а1., Се11и1аг тесНашктк оГ а1г1а1 сопТгасб1е букГипсбоп саикеб Ьу кикГашеб а(г1а1 ТасНусагб1а. Сбси1абоп, 98:719-27, 1998; Кпе11ег е( а1., Кетобебпд оГ Са²⁺Лапб1тд Ьу а(г1а1 ТасНусагб1а: еу1бепсе Гог а го1е ίπ 1окк оГ гаТе-абарТабоп. Сагбюуакс. Кек., 54:416-26, 2002; Нага е( а1., 81еабу-к1а1е апб попкТеабу-кГаТе асбоп роТепба1к ш йЬпбабпд сапше абшт: аЬпогта1 гаТе абарТабоп апб 1Тк рокк1Ь1е тесНашктк. Сагбюуакс. Кек., 42:455-69, 1999).

В предыдущих исследованиях предсердия из модели стимулированного ФП на собаках продемонстрировали потерю адаптации ПД-длительности-скорости и изменения характеристики ПД, что может быть обращено присутствием рианодина. Такие наблюдения предполагают, что изменения возникают в результате, по меньшей мере, частично, процесса, зависимого от внутриклеточного Са²⁺ (Нага еТ а1., 8Теабу-кГаТе апб попкТеабу-кТаТе асбоп роТепба1к ш йЬгШабпд сашпе абшт: аЬпогта1 гаТе абарТабоп апб 1Тк рокк1Ь1е тесНашктк. Сагбюуакс. Кек., 42:455-69, 1999). Более того, в предсердиях собак с постоянной индуцированной импульсами предсердной тахикардией существует значительное снижение переходного состояния Са²⁺ (8ип еТ а1., Се11и1аг тесНашктк оГ аТба1 сопбасб1е букГипсбоп саикеб Ьу кикГашеб а1г1а1 1асбусагб1а. Сбси1абоп, 98:719-27, 1998).

Так как переходное состояние Са²⁺ возникает в результате входа Са²⁺ сарколеммы, который запускает Са2+-индуцированное высвобождение Са²⁺ из 8К посредством КуК2, результаты предшествующих исследований предполагают, что изменения обмена внутриклеточного кальция сопровождают процесс ремоделирования, индуцированный тахикардией. Такие ненормально сниженные переходные состояния Са²⁺ были ассоциированы с подавленным укорочением выделенных миоцитов предсердий, показывая, что обмен кальция вносит вклад в сократительную дисфункцию предсердий, сопровождающую ФП (8ип еТ а1., Се11и1аг тесНашктк оГ аТба1 сопбасб1е букГипсбоп саикеб Ьу кикТашеб аб1а1 ТасНусагб1а. Сбси1абоп, 98:719-27, 1998).

Как показано в настоящем описании, исследования авторов обеспечивают убедительные доказательства, что гомеостаз кальция играет важную роль в электрическом и сократительном ремоделировании, которое сопровождает постоянную предсердную тахикардию и ФП. Высвобождение запасов Са²⁺ 8К КуК2 стоит как интегральный компонент гомеостаза миокардиального Са²⁺. Регуляция КуК2 хорошо характеризована в ткани желудочков собак и людей, и КуК2 вовлечены в заболевания миокарда желудочков, включая сердечную недостаточность и внезапную коронарную смерть (Магх еТ а1., РКА рНокрбогу1абоп б1ккос1аТек РКВР12.6 Ггош (Не са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобше гесерТог): беГесбуе гедц1абоп ш ГаШпд НеаПк. Се11, 101:365-76, 2000; АеНгепк еТ а1., РКВР12.6 бебаепсу апб беГесбуе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобше гесерТог) Гцпсбоп 1шкеб То ехегшке-шбисеб киббеп сагб1ас беаШ. Се11, 113:829-40, 2003; Ке1кеп еТ а1., ВеТа-Ь1оскегк гекТоге са1сшт ге1еаке сНаппе1 Гцпсбоп апб ппргоге сагб1ас тикс1е регГогтапсе ш Нитап НеаП Габиге. Сбси1абоп, 107:2459-66, 2003). Несмотря на свидетельства того, что обмен Са²⁺ играет роль в предсердных аритмиях, регуляция и функция предсердного рецептора рианодина плохо охарактеризована в этих условиях. В частности, перед настоящим изобретением, роль такого канала в ФП не была известна.

Авторы изобретения подтвердили в настоящем описании, что в миокарде желудочков предсердные каналы, высвобождающие внутриклеточный кальций, существуют в виде макромолекулярных комплексов. Результаты экспериментов авторов по совместной иммунопреципитации показывают, что предсердный КуК2 является физически ассоциированным с главной регуляторной субъединицей, кальстабином2 (РКВР12.6); с фосфатазами, РР1 и РР2А; и с регуляторной и каталитической субъединицами РКА. Более того, авторы изобретения продемонстрировали, что эндогенная РКА специфически фосфорилирует КуК2 в предсердной саркоплазматической сети, приводя к обеднению кальстабином2 (РКВР12.6) комплекса каналов. Такие открытия предполагают, что регуляция в предсердии может моделироваться РКА фосфорилированием предсердных КуК2, образом, подобным, наблюдаемому в миокарде желудочков (ВгШаиТек, еТ а1. , 81аЫНхаНоп оГ са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобше гесерТог) Гипсбоп Ьу РК-506 Ьшбшд ргоТеш, Се11, 77:513-523, 1994).

В настоящем исследовании авторы изобретения наблюдали, что РКА-гиперфосфорилирование КуК2 было ассоциировано с обеднением кальстабином2 (РКВР12.6) в предсердиях собак с ФП. Подобным образом, авторы изобретения наблюдали РКА-гиперфосфорилирование с ассоциированным обеднением кальстабина (РКВР12.6), в ткани предсердий у людей с ФП в условиях сердечной недостаточности. Функциональными последствиями такого нарушенного РКА гиперфосфорилирования КуК2 была увеличенная вероятность открытия в условиях, которые симулируют диастолу в сердце (низкий цитозольный Са²⁺) . Такие функциональные нарушения являются характерными для каналов, которые обеднены кальстабином2 (РКВР12.6) (ВгШаиТек, еТ а1., 81аЬШхабоп оГ са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобше гесерТог) Гипсбоп Ьу РК-506 Ьшбшд ргоТеш, Се11, 77:513-523, 1994). Такая нарушенная функция каналов при ФП согласует

- 17 015010 ся с предшествующими исследованиями, демонстрируя, что потеря кальстабина2 (ЕКВР12.6) из ВуВ2, в условиях РКА гиперфосфорилирования, приводит к протекающим каналам, которые предрасположены к диастолическому протеканию Са²⁺, которое является вторичным к повышенной чувствительности к индуцированному Са²⁺ высвобождению Са²⁺ (Вй11ап!ек е! а1., δίαόίΐίζαΐίοη оГ еа1ешш ге1еаке сЬаппе1 (гуапойше гесерЮг) ГипсОоп Ьу ЕК506-Ьшйшд рго!еш. Се11, 77:513-23, 1994; Кайап е! а1., ЕГГес!к оГ гарашусш оп гуапойше гесер!ог/Са²⁺-ге1еаке сЬаппе1к Ггот сагШас тикс1е. Оге. Век., 78:990-97, 1996). В отсутствие кальстабина2 (РКВР12.6), также известно, что каналы открываются и закрываются (пропускают) случайно, скорее чем одновременно (связанное открытие) (Магх е! а1., Соир1ей да!шд ЬеЕгееп шй1У1йиа1 кке1е!а1 тикс1е Са²⁺ ге1еаке сйаппе1к (гуапойше гесер!огк). 8с1епсе, 281:818-21, 1998).

Свидетельства предполагают, что ФП обычно индуцируется преждевременными предсердными экстрасистолами (Веппей апй Реп!есок!, ТЬе райет оГ опке! апй кроп!апеоик секкайоп оГ а(г1а1 йЬгШайоп ш тап. С1гси1айоп, 41:981-88, 1970), которые известно, что возникают в результате пост-деполяризаций (Сгапейе1й, Р.Р., Асйоп ро!епйа1к, айегро!епйа1к, апй аггЬу!Ьт1ак. Сйс. Век., 41:415-23, 1977). Наблюдали повторное инициирование ФП предсердными экстрасистолами, непосредственно после завершения аритмий (Т1ттегтапк е! а1., 1ттей1а!е гешШайоп оГ а1г1а1 йЬгШайоп Го11о\ушд ш!ета1 а(г1а1 йейЬгШайоп. 1. Сагйюуакс. Е1ес!горЬукю1, 9:122-28, 1998; \Уе11епк е! а1., Айюуейег: ап 1тр1ап!аЬ1е йесюе Гог Ше 1геа1теп! оГ а!па1 ЙЬгШайоп. Сйси1а!юп, 98:1651-56, 1998), и специфически связано с ранними постдеполяризациями (Вигакйпкоу апй Апйе1еуйсЬ, Вешйисйоп оГ а!па1 Г1ЬгШа!юп 1ттей1а!е1у айег !егтша!юп оГ Ше аггЬу!Ьт1а ίκ тей1а!ей Ьу 1а!е рЬаке 3 еаг1у айе^йеро1а^^ζа!^оп-^пйисей 1г1ддегей асйуйу. Сиси1а!юп, 107:2355-60, 2003).

Экстрасистолы, особенно вероятно повышают ФП в условиях укороченного эффективного рефрактерного периода предсердий (\Уапд е! а1., Ведюпа1 апй Гипсйопа1 Гас!огк йе!егш1шпд шйис!юп апй таш!епапсе оГ а!па1 ЙЬгШайоп ш йодк. Ат. 1. Рйукю1., 271 :Н 148-58, 1996), подобно тому, что сопровождает электрическое ремоделирование предсердий.

Как обсуждается выше, существуют доказательства, что нарушенное диастолическое высвобождение Са²⁺ из протекающих РКА-гиперфосфорилированных ВуВ2 приводит к отложенным постдеполяризациям (ΌΛΟ), достаточным, чтобы запустить смертельные желудочковые аритмии (^еЬгепк е! а1., ЕКВР12.6 йейшепсу апй йеГесйуе са1сшт ге1еаке сЬаппе1 (гуапойше гесерЮг) Гипсйоп 1шкей !о ехегакешйисей киййеп сагШас йеа!Ь. Се11, 113:829-40, 2003). Считают, что дисфункциональный обмен кальция ВуВ2 также может служить инициатором ФП подобным образом. Нарушенная функция каналов, наблюдаемая авторами изобретения, может вносить вклад в патогенез ФП, обеспечивая источник ОАЭ, необходимых для запуска ФП, в добавление ко вкладу в дисфункциональный обмен кальция, она является составной частью процесса ремоделирования, ассоциированного с аритмией. Данное свидетельство, представленное в настоящем описании, что миокард предсердия от людей с ФП, в условиях сердечной недостаточности, является РКА-гиперфосфорилированным и обедненным кальстабином2 (ЕКВР12.6), нарушенная функция ВуВ2 может объяснить, частично, частоту предсердных аритмий у пациентов с ФП.

Способность 1ТУ-519 восстанавливать специфический дефект на молекулярном уровне в обмене кальция ВуВ2 делает его интересным кандидатом для нового терапевтического агента. Эффективность 1ТУ-519 подчеркивается увеличивающимся количеством серьезных заболеваний сердца, включая сердечную недостаточность и смертельные желудочковые аритмии, которые включают дисфункциональную регуляцию ВуВ2 (т.е. РКА-гиперфосфорилирование и потеря кальстабина2 (ЕКВР12.6) из комплекса каналов могут быть важными участниками их патогенеза).

Начальные исследования ТГУ-519 фокусировались на его антиишемических свойствах (Регкопа1 Соттишса!юп, Ае!ак). Позднее, однако, было показано, что 1ТУ-519 ингибирует индукцию ФП в модели фибрилляции предсердий при стерильном перикардите у собак (Китада е! а1., АпйаггЬуШтю еГГес!к оГ 1ТУ-519, а поуе1 сагйюрго!ес!1уе йгид, оп а1г1а1 йЬгШайоп/йийег ш а сашпе к!еп1е рейсагйШк тойе1. 1. Сагйюуакс. Е1ес!горЬукю1., 14:880-84, 2003). Это исследование, однако, не определяет механизм, посредством которого 1ТУ-519 влияет на индукцию и поддержание ФП.

Как продемонстрировано в настоящем описании, авторы определили, что лечение 1ТУ-519 (1 мкМ) позволяет рекомбинантному кальстабину2 (ЕКВР12.6) связываться с РКА-фосфорилированным ВуВ2, который выделяли из нормального миокарда собак ш уйго. Ассоциация кальстабина2 (ЕКВР12.6) с РКАфосфорилированным ВуВ2 не возникает в нелеченных каналах. Ре-ассоциация кальстабина2 (ЕКВР12.6) с комплексом каналов восстанавливает нормальную функцию РКА-гиперфосфорилированных каналов. Следовательно, восстановление функции каналов ВуВ2 может играть роль в способности 1ТУ-519 ингибировать индукцию и поддержание ФП, что наблюдали Китада1 е! а1. (АпйаггЬуШтю еГГес!к оГ 1ТУ-519, а поуе1 сагйюрго!есйуе йгид, оп а!па1 йЬгШайоп/йийег ш а сашпе к!еп1е рейсагйШк тойе1. 1. Сагйюуакс. Е1ес!горЬукю1, 14:880-84, 2003).

Фибрилляция предсердий является комплексным электрофизиологическим процессом; его молекулярный патогенез, вероятно является многофакторным. Нарушенный обмен Са²⁺ в миокарде, вероятно вносит существенный вклад в процесс заболевания. Исследования авторов изобретения предполагают, что нарушенная функция каналов высвобождения внутриклеточного Са²⁺, что возникает в результате РКА гиперфосфорилирования ВуВ2, может вносить вклад в процесс ремоделирования при ФП и может

- 18 015010 потенциально служить как пусковой фактор для аритмии.

Новые способы лечения и профилактики с использованием ЛТУ-519

В соответствии с вышеуказанным, настоящее изобретение обеспечивает способ ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента. Как используется в настоящем описании, ЕКВР12.6 включает белок ЕКВР12.6 и аналог ЕКВР12.6. Если не указано иначе в описании, белок должен включать белок, белковый домен, полипептид или пептид и их любой фрагмент. Аналог ЕКВР12.6 является функциональным вариантом белка ЕКВР12.6, имеющим биологическую активность ЕКВР12.6, который имеет 60% или больше гомологии аминокислотной последовательности с белком ЕКВР12.6. Как используется дальше в настоящем описании, термин биологическая активность ЕКВР12.6 относится к активности белка или пептида, который демонстрирует способность ассоциироваться физически или связываться с нефосфорилированным или негиперфосфорилированным ВуВ2 (т. е., связывание приблизительно в два раза, или более предпочтительно, приблизительно в пять раз, выше базового связывания отрицательного контроля), в условиях анализа, описанных в настоящем описании, хотя афинность может отличаться от таковой ЕКВР12.6.

Кроме того, как используется в настоящем описании, ВуВ2 включает и белок ВуВ2 (например, предсердный белок ВуВ2 или желудочковый белок ВуВ2) и аналог ВуВ2. Аналог ВуВ2 является функциональным вариантом белка ВуВ2, имеющего биологическую активность ВуВ2, который имеет 60% или больше гомологию аминокислотной последовательности с белком ВуВ2. Как используется в настоящем описании, термин аналог ВуВ2 включает ВуВ1 - скелетно-мышечную изоформу ВуВ2 - и ВуВ3. ВуВ2 по настоящему изобретению может быть нефосфорилированным, фосфорилированным (например, РКА), или гиперфосфорилированным (например, РКА); предпочтительно, ВуВ2 является фосфорилированным или гиперфосфорилированным. Как используется далее в настоящем описании, термин биологическая активность ВуВ2 относится к активности белка или пептида, который демонстрирует способность физически ассоциироваться с или связываться с, ЕКВР12.6 (т.е. связывание приблизительно в два раза или, более предпочтительно, в пять раз, выше основного связывания отрицательного контроля), в условиях анализов, описанных в настоящем описании, хотя афинность может отличаться от таковой ВуВ2.

Как описано выше, рецептор рианодина в сердце, ВуВ2, является комплексом белков, включающим четыре белка ВуВ2 по 565000-дальтон в ассоциации с четырьмя белками ЕКВР12.6 по 12000-дальтон. Белки, связывающие ЕК506, (ЕКВР) являются цис-транс пептидилпролилизомеразами, которые широко экспрессируются и участвуют во множестве клеточных функций. Белок ЕКВР12.6 тесно связывается с и регулирует функцию ВуВ2. ЕКВР12.6 связывается с ВуВ2 каналом, одна молекула на субъединицу ВуВ2 стабилизирует функцию ВуВ2-канала и облегчает связанное открытие между соседними ВуВ2 каналами, таким образом, предотвращая нарушенную активацию канала во время фазы отдыха сердечного цикла. Соответственно, как используется в настоящем описании, термин ВуВ2-связанный ЕКВР12.6 включает молекулу белка ЕКВР12.6, которая связана с субъединицей белка ВуВ2 или тетрамером ЕКВР12.6, который ассоциирован с тетрамером ВуВ2. Термин ВуВ2-связанный ЕКВР12.6 также включает субъединицу белка ВуВ2, которая связана с молекулой белка ЕКВР12.6, или тетрамер ВуВ2, который находится в ассоциации с тетрамером ЕКВР12.6. Следовательно, снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента включает снижение уровня ЕКВР12.6-связанного ВуВ2 у пациента и снижение уровня комплекса ЕКВР12.6-ВуВ2 у пациента.

В соответствии со способом по настоящему изобретению снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента относится к определяемому снижению, уменьшению или подавлению уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента. Такое снижение ограничивается или предотвращается у пациента, когда снижение является каким-либо образом остановленным, замедленным, воспрепятствованным, блокированным или сниженным введением 1ТУ-519 (как описано ниже), так что уровень ВуВ2связанного ЕКВР12.6 у пациента выше, чем должен иным образом быть в отсутствии 1ТУ-519. Уровень ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента относится к общему уровню у пациента, включая уровни ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 в крови (циркуляции), тканях, и клетках (например, цитоплазме или ядре) пациента. В качестве примера, затем снижение общего уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента может быть достигнуто снижением уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 в крови, в ткани, и/или в клетках пациентов.

Уровень ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента может быть определен стандартными анализами и методиками, включая таковые, легко определяемые в известной области техники (например, иммунологические методики, анализ гибридизации, иммунопреципитация, вестерн-блоттинг анализ, методики флуоресцентной визуализации, и/или рентгенологическое определение и др.), а также любыми анализами и методами определения, описанными в настоящем описании. Например, белок может быть выделен и очищен из клеток пациента с использованием стандартных методов, известных в области техники, включая, без ограничения, экстракцию из клеток (например, детергентом, который растворяет белок), когда необходимо, с последующей афинной очисткой на колонке, хроматографией (например, ЖТЖХ и ВЭЖХ), иммунопреципитацией (с антителом) и осаждением (например, изопропанолом и реагентом, таким как Тризол).

- 19 015010

Выделение и очистка белка может продолжаться электрофорезом (например, на 8Ό8полиакриламидном геле). Снижение уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента, или его ограничение или предотвращение, может быть определено сравнением количества ВуВ2-связанного РКВР12.6, определяемого перед введением терапевтического/профилактического агента (например, ТТУ-519 или другого производного 1,4-бензотиазепина в соответствии со способами, описанными ниже) с количеством, определяемым через подходящее время после введения терапевтического/профилактического агента.

В способе по настоящему изобретению снижение уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента (например, в клетках пациента) может быть ограничено или предотвращено, например, ингибированием диссоциации РКВР12.6 и ВуВ2 у пациента; увеличением связывания между РКВР12.6 и ВуВ2 у пациента; или стабилизацией комплекса ВуВ2-РКВР12.6 у пациента. Как используется в настоящем описании, термин ингибирование диссоциации включает блокирование, снижение, ингибирование, ограничение или предотвращение физической диссоциации или разделения субъединицы РКВР12.6 из молекулы ВуВ2 у пациента, и блокирование, снижение, ингибирование, ограничение, или предотвращение физической диссоциации или отделение молекулы ВуВ2 из от субъединицы РКВР12.6 у пациента. Как дальше используется в настоящем описании, термин увеличенное связывание включает усиление, увеличение, или улучшение способности фосфорилированного ВуВ2 ассоциироваться физически с РКВР12.6 (например, связывание приблизительно в два раза или более предпочтительно, приблизительно в пять раз, выше базального связывания отрицательного контроля) у пациента, и усиление, увеличение или улучшение способности РКВР12.6 связываться физически с фосфорилированным ВуВ2 (например, связывание приблизительно в два раза или более предпочтительно приблизительно в пять раз выше базального связывания отрицательного контроля) у пациента.

Кроме того, в способе по настоящему изобретению, снижение уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента (например, в клетках пациентов) может быть ограничено или предотвращено непосредственным снижением уровня фосфорилирования ВуВ2 у пациента, или непрямым снижением уровня фосфорилированного ВуВ2 у пациента (например, нацеливанием на фермент (такой как РКА) или другую эндогенную молекулу, которая регулирует или модулирует функции или уровни фосфорилированного ВуВ2 в клетках). Предпочтительно, уровень фосфорилированного ВуВ2 у пациента снижен по меньшей мере на 10% в способе по настоящему изобретению. Более предпочтительно, уровень фосфорилированного ВуВ2 снижен на по меньшей мере 20%.

В соответствии со способом по настоящему изобретению снижение уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 ограничивается или предотвращается у пациента (например, в клетках пациента). Пациентом по настоящему изобретению может быть любое животное, включая амфибий, птиц, рыб, млекопитающих и сумчатых, но предпочтительно является млекопитающее (например, человек; домашнее животное, такое как кошка, собака, обезьяна, мышь или крыса; или сельскохозяйственное животное, такое как корова или свинья). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения пациент имеет или является кандидатом для развития заболевания сердца. Примеры заболеваний сердца включают, без ограничения, сердечные аритмии (например, тахикардию; предсердную аритмию, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковую аритмию, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой), сердечную недостаточность, и внезапную кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.

Сердечная аритмия является расстройством электрической активности сердца, которая проявляется как нарушение частоты сердечных сокращений или сердечного ритма. Тахикардия (например, предсердная, атриовентрикулярная (узловая), вентрикулярная и пароксизмальная тахикардия) является состоянием, ассоциированным с избыточной скоростью действия в сердце, особенно, когда частота сердечных сокращений составляет выше 100 в мин. Тахиаритмия является тахикардией, ассоциированной с нерегулярностью нормального ритма сердца. Сердечная аритмия, индицированная физической нагрузкой, является состоянием сердца (например, фибрилляция желудочков или желудочковая тахикардия, включая таковые, приводящие к внезапной кардиальной смерти), которое развивается в течение/после физической нагрузки пациента.

Фибрилляция предсердий является примером тахиаритмии. В частности, фибрилляция предсердий является состоянием, ассоциированным с нарушенным и нерегулярным ритмом сердца, где электрические сигналы образуются хаотично на всем протяжении верхних камер, или предсердий, сердца. Обычные симптомы фибрилляции предсердий включают, без ограничения, сердцебиения (неприятное ощущение быстрых и нерегулярных ударов сердца). Фибрилляция предсердий также может приводить к образованию сгустков крови, которые попадают из сердца в головной мозг, вызывая инсульт. Существующее лечение фибрилляции предсердий включает контроль факторов риска, введение лекарственных препаратов для замедления сердечного ритма и/или преобразования сердца к нормальному ритму, и предотвращение осложнений, ассоциированных с тромбообразованием.

Сердечная недостаточность является состоянием, проявляющимся сниженной сократительной функцией (сократимостью) сердца. Симптомы сердечной недостаточности включают одышку, сниженную толерантность к физической нагрузке и раннюю мышечную слабость.

Кандидатом в заболевания сердца (например, сердечные аритмии или сердечную недостаточ

- 20 015010 ность) является пациент. о котором известно. что он является. или считают. что является или ожидается. что имеет риск развития заболевания сердца. Примеры кандидатов на заболевания сердца включают. без ограничения. животное/человека. у которого ожидается развитие сердечной аритмии (например. тахикардии; предсердной аритмии. включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии. включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии. индуцированной физической нагрузкой; и животное/человека. о котором известно. или о котором считается. или которое ожидается. что будет иметь риск развития сердечной аритмии (например. тахикардии; предсердной аритмии. включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии. включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии. индуцированной физической нагрузкой). сердечной недостаточности. и/или внезапной кардиальной смерти. индуцированной физической нагрузкой.

Кандидатом для сердечной аритмии. индуцированной физической нагрузкой является пациент. о котором известно. или считается или ожидается. что он имеет риск развития сердечной аритмии во время/после физических упражнений. Примеры кандидатов для сердечной аритмии. индуцированной физической нагрузкой. включают. без ограничения. животное/человека. известного как имеющее катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию (КПЖТ); животное/человека. ожидаемого как имеющее КПЖТ; и животное/человека. о котором известно. или считается. или ожидается. что он имеет риск развития сердечной аритмии во время/после физических упражнений. и который собирается заниматься физической нагрузкой. в настоящее время занимается физической нагрузкой или только что завершил физическую нагрузку. Как обсуждается выше. КПЖТ является наследственным расстройством у пациентов со структурно нормальными сердцами. Она характеризуется желудочковой тахикардией. индуцированной стрессом - смертельной аритмией. которая может вызывать внезапную кардиальную смерть. У пациентов с КПЖТ физическое усилие и/или стресс индуцируют двунаправленные и/или полиморфные желудочковые тахикардии. которые приводят к внезапной кардиальной смерти (ВКС) в отсутствие определяемых структурных заболеваний сердца. Пациенты с КПЖТ имеют желудочковые аритмии при воздействии физической нагрузки. но у них не развиваются аритмии в покое.

В способе по настоящему изобретению интересующими клетками являются предпочтительно поперечно-полосатые мышечные клетки. Поперечно-полосатые мышцы являются мышцами. в которых повторяющиеся части (саркомеры) сократительных миофибрилл расположены регулярно на всем протяжении клетки. приводя к поперечным и наклонным полосам. которые можно увидеть на уровне светового микроскопа. Примеры клеток поперечно-полосатых мышц включают. без ограничения. клетки произвольных (скелетных) мышц и клетки сердечной мышцы. В предпочтительном варианте воплощения изобретения. клетки. используемые в способе по настоящему изобретению. являются клетки сердечной мышцы человека. Как используется. клетки сердечной мышцы включают волокна сердечной мышцы. такие как обнаруживаемые в миокарде сердца. Волокна сердечной мышцы состоят из цепей непрерывных клеток сердечной мышцы или кардиомиоцитов. объединенных конец в конец на вставочных дисках. Такие диски обладают двумя видами соединений клеток: расширенные десмосомы. простирающиеся вдоль их поперечных частей. и слияние отверстий. наибольшие из которых лежат вдоль продольных частей.

В способе по настоящему изобретению снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 ограничивается или предотвращается у пациента (например. в клетках пациента) введением 1ТУ-519 пациенту; затем это разрешает контакт между клетками пациента и .ПУ-519. 1ТУ-519 (моногидрохлорид 4- [3-(4бензилпиперидин-1-ил)пропионил]-7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепина). также известный как к201. является производным 1.4-бензотиазепина. и модулятором кальциевых ионных каналов. В добавление к регуляции уровня Са⁺ в клетках миокарда 1ТУ-519 модулирует ток Ν;·ι' и направленный внутрь ток К⁺ в клетках желудочков морских свинок. и ингибирует поздний направленный ток К⁺ в клетках предсердий морских свинок. ЕК506 и рапамицин являются лекарственными средствами. которые могут быть использованы для создания других соединений. которые стабилизируют комплекс ВуВ2ЕКВР12.6 у пациента по настоящему изобретению. ЕК506 и рапамицин оба диссоциируют ЕКВР12.6 из ВуВ2. Возможно создавать и/или искать соединения. которые являются структурно связанными с такими лекарственными средствами. но имеют противоположные эффекты.

В способе по настоящему изобретению. 1ТУ-519 можно вводить пациенту посредством терапевтической композиции. включающей 1ТУ-519 и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель должен быть приемлемым в смысле быть совместимым с другими ингредиентами композиции и не вредным для их потребителя. Фармацевтически приемлемый носитель. используемый в настоящем описании. выбирают из различных органических или неорганических веществ. которые используют как материалы для фармацевтических композиций и которые могут быть включены в качестве обезболивающих агентов. буферов. вяжущих веществ. дезинтегрирующих агентов. разбавителей. эмульгаторов. вспомогательных веществ. наполнителей. глидантов. растворителей. стабилизаторов. суспендирующих агентов. агентов. регулирующих тонус. основ и агентов. увеличивающих вязкость. Если необходимо. также могут быть добавлены фармацевтические добавки. такие как антиоксиданты. ароматизаторы. красители. агенты. улучшающие вкус. консерванты и подсластители. Примеры приемлемых

- 21 015010 фармацевтических носителей включают карбоксиметилцеллюлозу, кристаллическую целлюлозу, глицерин, гуммиарабик, лактозу, стеарат магния, метилцеллюлозу, порошки, солевой раствор, альгинат натрия, сахарозу, крахмал, тальк и воду, среди остальных.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены способами, хорошо известными в фармацевтической области техники. Например, ТГУ-519 можно совместить с носителем или разбавителем, в виде суспензии или раствора. Необязательно также может быть добавлен один или более дополнительных ингредиентов (например, буферы, ароматизирующие агенты, поверхностноактивные вещества и подобные). Выбор носителя будет зависеть от пути введения.

ТГУ-519 может вводиться пациенту посредством контакта с целевыми клетками (например, клетками мышцы сердца) ίη νίνο у пациента с 1ТУ-519. 1ТУ-519 может контактировать с (например, вводиться в) клетками пациента с использованием методик, используемых для внесения и введения белков, нуклеиновых кислот и других лекарственных средств. Примеры способов для контакта клеток с (т. е. лечения клеток) 1ТУ-519 включают, без ограничения, всасывание, электропорирование, иммерсию, инъекцию, введение, доставку липосомами, трансфекцию, трансфузию, векторы, и другие носители и способы доставки лекарственных средств. Когда целевые клетки расположены в определенной части пациента, может быть желательно вносить 1ТУ-519 непосредственно в клетки, инъекцией или каким-либо другими средствами (например, введением 1ТУ-519 в кровь или другую жидкость тела). Целевые клетки могут, например, содержаться в ткани сердца пациента и могут определяться в ткани сердца пациента стандартными методами определения, легко доступными в известной области техники, примеры которых включают, без ограничения, иммунологические методики (например, иммуногистохимическое окрашивание), методики флуоресцентной визуализации и микроскопические методики.

Кроме того, 1ТУ-519 по настоящему изобретению можно вводить пациенту человеку или животному известными методиками, включая, без ограничения, пероральное введение, парентеральное введение и трансдермальное введение. Предпочтительно 1ТУ-519 вводят парентерально, посредством эпифасциальной, интракапсулярной, интракраниальной, внутрикожной, интратекальной, внутримышечной, интраорбитальной, интраперитонеальной, интраспинальной, интрастернальной, внутрисосудистой, внутривенной, паренхиматозной, подкожной или сублингвальной инъекции, или посредством катетера. В одном варианте осуществления изобретения агент вводят пациенту посредством нацеленной доставки в клетки сердечной мышцы посредством катетера, вставленного с сердце пациента.

Для перорального введения композиция 1ТУ-519 может быть представлена в виде капсул, таблеток, порошков, гранул или в виде суспензии. Композиция может иметь обычные добавки, такие как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал. Композиция также может быть представлена с вяжущими веществами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, акация, кукурузный крахмал или желатин. Кроме того, композиция может быть представлена с дезинтегрирующими агентами, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или карбоксиметилцеллюлоза натрия. Композиция также может быть представлена с безводным двухосновным фосфатом кальция или гликолатом крахмала натрия. Наконец, композиция может быть представлена со смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния.

Для парентерального введения (т.е. введения посредством инъекции путем, иным чем пищеварительный канал) 1ТУ-519 может быть смешан со стерильным водным раствором, который является предпочтительно изотоническим с кровью пациента. Такая композиция может быть получена растворением твердого активного ингредиента в воде, содержащей физиологически совместимые вещества, такие как хлорид натрия, глицин и подобные, и имеющая буферизованный рН, совместимый с физиологическими условиями так, чтобы получился водный раствор, затем переводя указанный раствор в стерильный. Композиция может быть представлена в одно- или многодозовых контейнерах, таких как герметичные ампулы или флаконы. Композиция может быть доставлена любым типом инъекции, включая, без ограничения, эпифасциальную внутрикапсулярную, интракраниальную, внутрикожную, интратекальную, внутримышечную, интраорбитальную, интраперитонеальную, интраспинальную, интрастернальную, внутрисосудистую, внутривенную, паренхиматозную, подкожную или сублингвальную, или посредством катетера в сердце пациента.

Для трансдермального введения 1ТУ-519 может быть смешан с усилителями проницаемости кожи, такими как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, изопропанол, этанол, олеиновая кислота, Νметилпирролидон и подобные, которые увеличивают проницаемость кожи для 1ТУ-519, и позволяют 1ТУ-519 проходить через кожу и в кровоток. Композиция 1ТУ-519/усилителя также может далее быть комбинирована с полимерным веществом, таким как этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, этилен/винилацетат, поливинилпирролидон, и подобные, для получения композиции в форме геля, которая может быть растворена в растворителе, таком как метиленхлорид, выпарена до желаемой вязкости и затем нанесена на материал основы для получения пластыря.

В соответствии со способом по настоящему изобретению 1ТУ-519 может быть введен пациенту (и 1ТУ-519 может прийти в контакт с клетками пациента) в количестве, эффективном для ограничения или предотвращения снижения уровня КуК2-связанного РКВР12.6 у пациента, особенно в клетках пациента. Такое количество может быть легко определено опытным специалистом в области техники, на основании

- 22 015010 известных методик, включая анализ кривых титрования, полученных ίη у1уо, и способов и анализов, описанных в настоящем описании. Подходящее количество ТТУ-519, эффективное для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациентов может варьироваться от около 5 до около 20 мг/кг/день, и/или может быть количеством, достаточным для достижения уровней в плазме, варьирующихся от около 300 до около 1000 нг/мл. Предпочтительно количество .ТТУ-519 варьируется от около 10 до около 20 мг/кг/день.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, у пациента еще не развилось заболевание сердца, такое как сердечные аритмии (например, тахикардия; предсердная аритмия, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковая тахикардия, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой), сердечная недостаточность или внезапная кардиальная смерть, индуцированная физической нагрузкой. В таком случае количество ТТУ-519, эффективное для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента, может быть количеством .ТТУ-519, эффективным для предотвращения заболевания сердца (например, сердечной аритмии, сердечной недостаточности или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента.

Как используется в настоящем описании количество лекарственного средства (например, ТТУ-519) эффективное для предотвращения заболевания сердца включает количество лекарственного средства (например, .ТТУ-519), эффективное для предотвращения развития клинических нарушений или симптомов заболевания сердца. Например, когда заболеванием сердца является фибрилляция предсердий, количеством ТТУ-519, эффективным для предотвращения фибрилляции предсердий, может быть количество .ТТУ-519, эффективное для предотвращения сердцебиений и/или образования сгустков крови у пациента. Подобным образом, когда заболеванием сердца является сердечная аритмия, индуцированная физической нагрузкой, количеством ТТУ-519, эффективным для предотвращения сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой, может быть количество ТТУ-519, эффективное для предотвращения индуцированных физической нагрузкой сердцебиений, обмороков, фибрилляции желудочков, желудочковой тахикардии и внезапной кардиальной смерти у пациента. Кроме того, когда заболеванием сердца является сердечная недостаточность, количеством ТТУ-519, эффективным для предотвращения сердечной недостаточности, может быть количество .ТТУ-519, эффективное для предотвращения одышки, сниженной толерантности к физической нагрузке и ранней мышечной слабости у пациента.

Количество лекарственного средства (например, ТТУ-519), эффективное для предотвращения заболеваний сердца у пациента, может варьироваться в зависимости от определенных факторов каждого случая, включая тип заболевания сердца, массу тела пациента, тяжесть состояния пациента и тип введения лекарственного средства (например, .ТТУ-519). Такое количество может быть легко определено опытным специалистом в области техники на основании известных методик, включая клинические исследования и способы, описанные в настоящем описании. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, количество лекарственного средства (например, ТТУ-519), эффективное для предотвращения сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой, является количество лекарственного средства (например, .ТТУ-519), эффективное для предотвращения внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой у пациента. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство (например, .ТТУ-519) предотвращает по меньшей мере одно заболевание сердца (например, сердечную аритмию (например, тахикардию; предсердную аритмию, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковую аритмию, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой), сердечную недостаточность, или внезапную кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой) у пациента.

Из-за его способности стабилизировать ВуВ2-связанный РКВР12.6, поддерживать и восстанавливать баланс в контексте динамического РКА фосфорилирования и дефосфорилирования ВуВ2, ТТУ-519 также может быть применимым в лечении пациента, у которого уже начались клинические симптомы заболевания сердца. Если симптомы заболевания сердца наблюдаются у пациента достаточно рано, 1ТУ519 может быть эффективным в ограничении или предотвращении дальнейшего снижения ВуВ2связанного РКВР12.6 у пациента.

Соответственно, в другом варианте осуществления настоящего изобретения у пациента развилось заболевание сердца. Например, пациент занимался физической нагрузкой или в настоящее время занимается физической нагрузкой, и уже развилась сердечная аритмия, индуцированная физической нагрузкой. В таком случае, количеством ТТУ-519, эффективным для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента, может быть количество ТТУ-519, эффективное для лечения заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой или сердечную недостаточность у пациента.

Как используется в настоящем описании, количество лекарственного средства (например, ТТУ-519) эффективное для лечения заболевания сердца включает количество лекарственного средства (например, ТТУ-519), эффективное для облегчения или улучшения клинических нарушений или симптомов за- 23 015010 болевания сердца. Например, когда заболеванием сердца является фибрилляция предсердий, количеством 1ТУ-519, эффективным для лечения фибрилляции предсердий, может быть количество 1ТУ-519, эффективное для облегчения или улучшения сердцебиений и/или образования сгустков крови у пациента. Подобным образом, когда заболеванием сердца является сердечная аритмия, индуцированная физической нагрузкой, количеством 1ТУ-519, эффективным для лечения сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой, может быть количество 1ТУ-519, эффективное для облегчения или улучшения сердцебиений, индуцированных физической нагрузкой, слабости, фибрилляции желудочков и желудочковой тахикардии у пациента. Кроме того, когда заболеванием сердца является сердечная недостаточность, количеством 1ТУ-519, эффективным для лечения сердечной недостаточности, может быть количество 1ТУ-519, эффективное для облегчения или улучшения одышки, сниженной толерантности к физической нагрузке и ранней мышечной слабости у пациента.

Количество лекарственного средства (например, 1ТУ-519), эффективное для лечения заболевания сердца у пациента, будет варьироваться в зависимости от определенных факторов каждого случая, включая тип заболевания сердца, массу тела пациента, тяжесть состояния пациента, и тип введения лекарственного средства (например, 1ТУ-519). Такое количество может быть легко определено специалистом в области техники на основании известных методик, включая клинические исследования и способы, описанные в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, лекарственное средство (например, 1ТУ-519) лечит по меньшей мере одно заболевание сердца у пациента.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ для лечения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность) у пациента. Способ включает введение 1ТУ-519 пациенту в количестве, эффективном для лечения по меньшей мере одного заболевания сердца у пациента. Подходящее количество 1ТУ-519, эффективное для лечения заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков/ и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность) у пациента может варьироваться от около 5 до около 20 мг/кг/день, и/или может быть количеством, эффективным для достижения уровня в плазме, варьирующегося от около 300 до около 1000 нг/мл.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ для предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии/предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков/ и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность), или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента. Способ включает введение 1ТУ-519 пациенту в количестве, эффективном для предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца у пациента. Подходящее количество 1ТУ-519, эффективное для предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии/предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность), или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента может варьироваться от около 5 до около 20 мг/кг/день, и/или может быть количеством, достаточным для достижения уровня в плазме, варьирующегося от около 300 до около 1000 нг/мл.

В различных вариантах осуществления вышеописанных способов сердечная аритмия, индуцированная физической нагрузкой, у пациента ассоциирована с ЖТ. В предпочтительных вариантах осуществления ЖТ является КПЖТ. В других вариантах осуществления таких способов, пациент является кандидатом к развитию сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой, включая кандидата для развития внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой.

Кроме того, в свете вышеуказанных способов, настоящее изобретение также обеспечивает применение 1ТУ-519 в способе для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента, который имеет или является кандидатом к развитию по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность). Настоящее изобретение также обеспечивает применение 1ТУ519 в способе для лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность) у пациента.

- 24 015010

Новые способы скрининга

Как обсуждается выше и представлено в настоящем описании, данные, полученные авторами изобретения, показывают, что фосфорилирование протеинкиназой А (РКА) рецептора рианодина сердца, ВуВ2, по серину 2809 активирует канал высвобождением белка, связывающего ЕК506, ЕКВР12.6. При сердечной недостаточности (включая сердца людей и модели сердечной недостаточности на животных), ВуВ2 является РКА-гиперфосфорилированным, приводя к дефектным каналам, которые имеют сниженное количество связанного ЕКВР12.6, и имеют повышенную чувствительность к активации, индуцированной кальцием. Конечным результатом таких изменений является то, что ВуВ2 каналы являются протекающими. Такие утечки в каналах могут приводить к обеднению внутриклеточных запасов кальция настолько, что больше не существует достаточно кальция в саркоплазматической сети (8В) для обеспечения сильного стимула для сокращения мышц. Это приводит к слабому сокращению сердечной мышцы. Как второе последствие протекания каналов, ВуВ2 каналы высвобождают кальций во время фазы отдыха сердечного цикла, известной как диастола. Такое высвобождение кальция во время диастолы может запустить смертельные аритмии сердца (например, желудочковую тахикардию и фибрилляцию желудочков), которые вызывают внезапную кардиальную смерть (ВКС).

Авторы изобретения также показали, что лечение сердечной недостаточности механическими насосными устройствами, называемыми левожелудочковыми аппаратами вспомогательного кровообращения (ЬУАО), которые приводят сердце в состояние отдыха и восстанавливают нормализованную функцию, ассоциировано с снижением РКА гиперфосфорилирования ВуВ2, и нормализованной функцией канала. Более того, авторы изобретения показали, что лечение собак (у которых была сердечная недостаточность, индуцированная импульсами) β-адреноблокаторами (β-блокаторами) обращает РКА гиперфосфорилирование ВуВ2. Бета-блокаторы ингибируют путь, который активирует РКА. Выводы, которые могут быть получены на основании результатов работы авторов изобретения, состоят в том, что РКА гиперфосфорилирование ВуВ2 увеличивает активность канала, приводя к большему высвобождению кальция в клетку для заданного сигнала запуска (активатора) канала.

Как описано далее в настоящем описании, авторы изобретения установили, что заболевания сердца (например, сердечная аритмия (например, тахикардия; предсердная аритмия, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковая аритмия, включая фибрилляцию желудочков; и сердечная аритмия, индуцированная физической нагрузкой) или сердечная недостаточность) ассоциированы с увеличением фосфорилирования белков ВуВ2 (особенно КПЖТ-ассоциированных ВуВ2 мутантных белков) и снижением уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6. Такой механизм можно использовать для создания эффективных лекарственных средств для лечения и предотвращения таких заболеваний сердца. Агент-кандидат, имеющий способность ограничивать или предотвращать заболевание на уровне ВуВ2-связанного ЕКВР12.6, может, как последствие такой ограничивающей или предотвращающей активности, оказывать влияние на биологические события, ассоциированные с ВуВ2, таким образом лечить или предотвращать такие заболевания сердца.

Соответственно, настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ для идентификации агента, предназначенного для лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность), или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой). Способ включает стадии: (а) получения или создания культуры клеток, содержащих ВуВ2; (Ь) контакта клеток с агентом-кандидатом; (с) воздействия на клетки одного или более условий, известных как увеличивающие фосфорилирование ВуВ2 в клетках; и (б) определения, ограничивает или предотвращает агент снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 в клетках.

Как используется в настоящем описании, агент будет включать белок, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (включая ДНК или РНК), антитело, ЕаЬ фрагмент, Е(аЬ')₂ фрагмент, молекулу, соединение, антибиотик, лекарственное средство и их любую комбинацию(и). Агент, который ограничивает или предотвращает снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6, может быть естественным или синтетическим и может быть агентом, реакционно-способным с (т.е., агентом, который имеет афинность к, связывается с или направлен против) ВуВ2 и/или ЕКВР12.6. Как дальше используется в настоящем описании клетка содержащая ВуВ2 является клеткой (предпочтительно клеткой мышцы сердца), в которой ВуВ2, или его производное или гомолог, естественно экспрессируется или естественно возникает. Состояния, известные как увеличивающие фосфорилирование ВуВ2 в клетках, включают, без ограничения, РКА.

В способе по настоящему изобретению клетки могут контактировать с агентом-кандидатом любым из стандартных способов возможности контакта между лекарственными средствами/агентами и клетками, включая любые типы введения и внесения, описанные в настоящем описании. Уровень ВуВ2связанного ЕКВР12.6 в клетке может быть измерен или определен известными методиками, включая любые способы, молекулярные методики и анализы, известные специалисту в области техники или описанные в настоящем описании. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, агент ограни

- 25 015010 чивает или предотвращает снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 в клетках.

Как описано в настоящем описании, ВуВ2 вовлечен в ряд биологических событий в поперечнополосатых мышечных клетках. Например, было показано, что ВуВ2 каналы играют важную роль в ЕС связывании и сокращении клеток мышцы сердца. Следовательно, очевидно, что терапевтические или профилактические лекарственные средства, созданные для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКБР12.6 в клетках, особенно клетках мышцы сердца, могут быть применимы в регуляции ряда биологических событий, ассоциированных с ЕуЕ2. включая ЕС связывание и сократимость. Следовательно, так как агент-кандидат по настоящему изобретению был скринирован и было определено, что он имеет подходящий ограничивающий или предотвращающий эффект на снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6, его можно оценивать в отношении его эффекта на ЕС связывание и сократимость в клетках, особенно клетках сердечной мышцы. Ожидают, что терапевтический/профилактический агент по настоящему изобретению будет применимым для лечения или предотвращения заболеваний сердца, включая сердечную аритмию (например, тахикардию; предсердную аритмию, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковую аритмию, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой) или сердечную недостаточность), или внезапную кардиальную смерти, индуцированную физической нагрузкой).

Соответственно способ по настоящему изобретению может кроме того включать стадии: (е) контакта агента-кандидата с культурой клеток, содержащих ВуВ2; и (Г) определения, обладает ли агент эффектом на биологические события, ассоциированные с ВуВ2 в клетках. Как используется в настоящем описании, ВуВ2-ассоциированное биологическое событие включает биохимический или физиологический процесс, в который вовлечены уровень или активность ВуВ2. Как описано в настоящем описании, примеры ВуВ2-ассоциированных биологических событий включают, без ограничения, ЕС связывание и сократимость в клетках мышцы сердца. В соответствии с таким способом по настоящему изобретению, агент-кандидат может контактировать с одной или более клетками (предпочтительно клетками сердечной мышцы) ίη νίΐΓΟ. Например, культуру клеток можно инкубировать с препаратом, содержащим агенткандидат. Затем эффект агента-кандидата на ВуВ2-ассоциированное биологическое событие может быть оценен любыми биологическими анализами или способами, известными в области техники, включая иммуноблоттинг, одноканальные записи и любые другие, описанные в настоящем описании.

Настоящее изобретение далее направлено на агент, идентифицированный вышеописанным способом идентификации, а также фармацевтическую композицию, включающую агент и фармацевтически приемлемый носитель. Агент может быть применимым для предотвращения внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой у пациента, и для лечения или предотвращения других ВуВ2-ассоциированных заболеваний. Как используется в настоящем описании ВуВ2-ассоциированное состояние является состоянием, заболеванием или расстройством, при котором вовлечены уровень или активность ВуВ2, и включает ВуВ2-ассоциированное биологическое событие и заболевание сердца (например, сердечную аритмию (например, тахикардию; предсердную аритмию, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковую аритмию, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой или сердечную недостаточность), или внезапную кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.

ВуВ2-ассоциированное состояние можно лечить или предотвращать у пациента введением пациенту количества агента, эффективного для лечения или предотвращения ВуВ2-ассоциированного состояния у пациента. Такое количество может быть легко определено специалистом в области техники. В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ для лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой) или сердечной недостаточности, или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента, введением агента пациенту в количестве, эффективном для лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца у пациента.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ ίη νίνο для идентификации агента для применения в лечении или предотвращении заболевания (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой) или сердечной недостаточности, или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой). Способ включает стадии: (а) обеспечения или создания животного, содержащего ВуВ2; (Ь) введение агента-кандидата животному; (с) воздействия на животное одного или более состояний, известных как увеличивающие фосфорилирование ВуВ2 в клетках; и (й) определения, ограничивает или предотвращает агент снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у животного. Способ может кроме того включать стадии: (е) введения агента животному, содержащему ВуВ2; и (Г) определения, имеет ли агент воздействие на ВуВ2-ассоциированные биологические события у жи

- 26 015010 вотного. Также настоящее изобретение обеспечивает агент, идентифицируемый таким способом; фармацевтическую композицию, включающую такой агент; и способ для лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой) или сердечной недостаточности, или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента, введением такого агента пациенту в количестве, эффективном для лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца у пациента.

Проведенные авторами изобретения исследования продемонстрировали, что соединения, которые блокируют активацию РКА, ожидаемо будут снижать активацию ВуВ2 канала, приводя к меньшему высвобождению кальция в клетку. Соединения, которые связываются с ВуВ2 каналом в месте связывания ЕКВР12.6, но не проходят через канал, когда канал фосфорилирован РКА, также будут ожидаемо, снижать активность канала в ответ на активацию РКА или другие запускающие импульсы, которые активируют ВуВ2 канал. Такие соединения также будут приводить к меньшему высвобождению кальция в клетку. В свете таких открытий, настоящее изобретение кроме того обеспечивает дополнительные анализы для идентификации агентов, которые могут быть применимыми в лечении или предотвращении заболеваний сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой) или сердечной недостаточности), или внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой), при которых они блокируют или ингибируют активацию ВуВ2.

В качестве примера, диагностические анализы по настоящему изобретению могут скринировать в отношении высвобождения кальция в клетки посредством ВуВ2 канала, с использованием кальцийчувствительных флуоресцентных красителей (например, Е1ио-3, Еига-2, и подобных). Клетки могут быть нагружены выбранным флуоресцентным красителем, затем стимулированы активаторами ВуВ2 для определения уменьшают ли или нет соединения, добавленные к клетке, кальций-зависимый флуоресцентный сигнал (ВгШаЛек с1 а1., 81аЬЛха1юп оГ са1сшт ге1еаке с11аппе1 (гуапоб1пе гесерЮг) Гипсбоп Ьу ЕК506Ьтбтд рго1ет. Се11, 77:513-23, 1994; СШо с1 а1., Са1стт сп1гу биппд тбисеб бШегепЬабоп ш тигте егуЛго1еикеш1а се11к. В1ооб, 81:783-92, 1993; 1ауагатап с1 а1., Веди1абоп оГ Ле токбо1 1.4.5-1г1крНокрНа1с гесерЮг Ьу 1угокте р1юкр1югу1а1юп. 8с1епсе, 272:1492-94, 1996). Кальций-зависимые флуоресцентные сигналы могут отслеживаться с помощью фотоэлектронного умножителя и анализироваться с помощью соответствующего программного обеспечения, как описано ранее (ВгШаЛек с1 а1., 81аЬЛ/аПоп оГ са1сшт ге1еаке с11аппе1 (гуапобте гесерЮг) Гипсбоп Ьу ЕК506-Ьшбтд рго1ет. Се11, 77:513-23, 1994; СШо с1 а1., Са1стт сп1гу биппд тбисеб бгйегепЬабоп т тигте егуЛго1еикеш1а се11к. В1ооб, 81:783-92, 1993; 1ауагатап с1 а1., ВедЛабоп оГ Ле шоЛо1 1,4,5-бгкрЬокрба1е гесерЮг Ьу 1угокте рНокрНогукШоп. 8с1епсе, 272:1492-94, 1996). Этот анализ может легко быть автоматизирован для скрининга большого количества соединений с использованием многолуночных чашек.

Для определения соединений, которые ингибируют РКА-зависимую активацию ВуВ2опосредованного внутриклеточного высвобождения кальция, анализ может включать экспрессию рекомбинантных ВуВ2 каналов в гетерологичной системе экспрессии, такой как клетки 8Г9, НЕК293, или СНО (ВгШаЛек с1 а1., 81аЬЛхабоп оГ са1сшт ге1еаке с11аппе1 (гуапоб1пе гесерЮг) Гипсбоп Ьу ЕК506-Ьтбшд рго1ет. Се11, 77:513-23, 1994). ВуВ2 также могут совместно экспрессироваться с β-адренергическими рецепторами. Это позволит оценить эффект соединений на активацию ВуВ2 в ответ на добавление агонистов β-адренергических рецепторов.

Уровень РКА фосфорилирования ВуВ2, который коррелирует со степенью сердечной недостаточности, также может быть оценен и затем использован для определения эффективности соединений, созданных для блокады РКА фосфорилирования ВуВ2 канала. Такой анализ может быть основан на применении антител, которые являются специфичными для белка ВуВ2. Например, белок ВуВ2-канала может быть иммунопреципитирован и затем обратно фосфорилирован РКА и [гамма³²Р]-АТФ. Количество радиоактивной метки [³²Р], которая переносится на белок ВуВ2, затем может быть измерено с использованием фосфор-визуализатора (Магх с1 а1., РКА рНокрНогукШоп б1ккос1а1ск ЕКВР12.6 Ггот Ле са1стт ге1еаке с1ишпе1 (гуапобте гесерЮг): бсГссЛ'с геди1абоп шГаЛпд НеаПк. Се11, 101:365-76, 2000).

Другой анализ по настоящему изобретению включает применение фосфоэпитоп-специфического антитела, которое определяет ВуВ2, которые являются РКА-фосфорилированными по 8ег 2809. Иммуноблоттинг с таким антителом может быть использован для оценки эффективности терапии сердечной недостаточности и сердечных аритмий. Кроме того, мыши, нокированные ВуВ2 82809А и ВуВ2 82809Ό, могут быть использованы для оценки эффективности терапии сердечной недостаточности и сердечных аритмий. Такие мыши, кроме того, обеспечивают доказательства, что РКА гиперфосфорилирование ВуВ2 является способствующим фактором в сердечной недостаточности и сердечных аритмиях, показывая, что 82809А мутация ВуВ2 ингибирует сердечную недостаточность и аритмии и что 82809Ό мутация ВуВ2 ухудшает сердечную недостаточность и аритмии.

- 27 015010

Новые производные 1,4-Бензотиазепина и способы синтеза таковых

Производные 1.4-бензотиазепина. особенно производные 2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепина. являются важными строительными блоками в получении биологически-активных молекул. включая .ПУ519. Авторы изобретения разработали новый способ для получения промежуточных соединений 1.4бензотиазепина. таких как 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепин. Предложенный способ использует легко доступные и недорогие исходные вещества. и обеспечивает высокие выходы ключевых промежуточных продуктов 1.4-бензотиазепина.

В ранние 1990-е. Капеко е( а1. (Патент США 5416066; XVО 92/12148; ТР4230681) описывает. что ПУ-519 может быть получен реакцией 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепина (промежуточного продукта 1.4-бензотиазепина) с акрилоилхлоридом и затем реакцией полученного продукта с 4бензилпиперидином.

Ранее в литературе сообщали о двух способах получения 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4бензотиазепина и сходных соединений. Первый способ. описанный Капеко е( а1. (патент США №. 5416066). вовлеченный в путь синтеза из шести стадий. который начинается с 2.5-дигидроксибензойной кислоты. В этом способе 2.5-дигидроксибензойную кислоту селективно метилировали диметилсульфатом. Затем полученное соединение реагировало с диметилтиокарбамоилхлоридом в течение 20 ч. и затем его подвергали воздействию высокой температуры (270°С) в течение 9 ч. Продукт этой стадии нагревали в колбе с обратным холодильником с метоксидом натрия в метаноле в течение 20 ч. Продукт стадии рефлюкса затем реагировал с 2-хлорэтиламином. в основных условиях и при высокой температуре. для получения циклизованного амида. Циклизованный амид восстанавливали Ь1А1Н₄ для получения 7-метокси-

2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепин (промежуточный продукт 1.4-бензотиазепина).

Второй способ для получения 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепина описан НйокЫ в Японском патенте (ТР 10045706). Этот способ начинается с 2-бром-5-метоксибензальдегида. Бромид замещали №18Ме. и полученный продукт окисляли хлором с последующим нагреванием в колбе с обратным холодильником в воде для получения диальдегида дисульфида. Диальдегид обрабатывали 2хлорэтиламином. и полученный продукт восстанавливали восстанавливающим агентом. таким как №ВН.-|. Полученное соединение циклизовали для получения 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4бензотиазепина.

Вначале авторы изобретения попробовали получить промежуточный продукт 1.4-бензотиазепина. 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепин. с использованием способов. описанных выше. Однако они обнаружили. что первый способ. описанный Капеко е( а1. (патент США № 5416066). включает высокотемпературные синтетические стадии и продолжительные реакции. Кроме того. авторы изобретения обнаружили. что тиогруппу в третьем тиолированном промежуточном продукте легко окислялась воздухом до дисульфидного соединения. делая возможным синтез последующего циклизованного продукта. Авторы изобретения также определили. что способ. описанный НйокЫ (ТР 10045706). включает С1₂ и что другой запатентованный способ для получения первого промежуточного продукта. кроме замещения бромида №18Ме. должен использоваться.

Для решения вышеуказанных проблем авторы изобретения разработали новый способ для получения 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро-1.4-бензотиазепина из легкодоступных и недорогих исходных веществ. Способ авторов изобретения упрощает стадии выделения и очистки и может быть использован для получения различных промежуточных продуктов 1.4-бензотиазепина. включая 7-метокси-2.3.4.5-тетрагидро1.4-бензотиазепин и другие соединения. имеющие общую структуру. показанную в формуле

Й2и алмл

Я>алшл

Этот процесс также может быть использован для получения ПУ-519.

Соответственно. в свете вышеуказанного. настоящее изобретение обеспечивает способ для синтеза соединения. имеющего формулу

1X7 где В = ОВ'. 8В'. ΝΚ'. алкил. или галоид и В' = алкил. арил или Н и где В может быть в положении 2. 3. 4 или 5. указанный способ включает стадии:

(а) обработки соединения. имеющего формулу:

где В является. как определено выше. восстанавливающим агентом. необязательно в присутствии

- 28 015010 катализатора, для получения соединения, имеющего формулу:

где В является, как определено выше;

(Ь) обработки соединения, полученного на стадии (а) диазотирующим агентом и дисульфидом для получения соединения, имеющего формулу:

где В является, как определено выше;

(с) обработки соединения, полученного на стадии (Ь) активирующим агентом и хлорэтиламином, для получения соединения, имеющего формулу:

где В является, как определено выше;

(ά) обработки соединения, полученного на стадии (с) восстанавливающим агентом и основанием, для получения соединения, имеющего формулу:

где В является, как определено выше; и (е) обработки соединения, полученного на стадии (ά) восстанавливающим агентом для получения соединения, имеющего формулу:

где В является, как определено выше.

В соответствии со способом по настоящему изобретению восстанавливающим агентом на стадии (а) может быть Н₂. Кроме того, диазотирующим агентом на стадии (Ь) может быть Ν;·ιΝΘ₂. и дисульфидом на стадии (Ь) может быть Να₂8₂. Более того, хлоридом на стадии (с) может быть 8ОС1₂. Восстанавливающим агентом на стадии (ά) может быть триметилфосфин (РМе₃), тогда как основанием на стадии (ά) является триэтиламин. В другом варианте осуществления изобретения восстанавливающим агентом на стадии (е) является ЫЛ1Н₄.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ синтеза соединения, имеющего формулу:

где В = ОВ', 8В' , ΝΒ', алкил, или галоид и В' = алкил, арил, или Н и где В может быть в положении 2, 3, 4 или 5, указанный способ включает стадию:

(а) обработки соединения, имеющего формулу:

где В является, как определено выше, с 3-бромпропионхлоридом и соединением, имеющим форму^лу

для получения соединения, имеющего формулу

- 29 015010

где К является, как определено выше.

В качестве примера, соединение, имеющее формулу

где К = ОК', 8К', N62 алкил, или галоид и К' = алкил, арил, или Н и где К может быть в положении 2, 3, 4 или 5, может быть синтезировано, как указано далее:

Λν-βι»μι·<»5)

ЗЯ*, НА', алкил галоиды ; Я*» амил арют Н Я может бы!ь в полсжимяк 2 3 4 мт 5

В качестве примеров и как показано в примере 9 и схеме 1 ниже, 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4бензотиазепин может быть получен из 2-нитро-5-метоксибензойной кислоты, как указано далее. Нитрогруппу 2-нитро-5-метоксибензойной кислоты восстанавливают с использованием Н₂ с Рб/С в качестве катализатора, для получения 2-амино-5-метоксибензойной кислоты. 2-амино-5-метоксибензойная кислота может быть диазотирована №№₂ и затем обработана №1₂8₂ для получения стабильного дисульфидного соединения. Без последующей очистки стабильное дисульфидное соединение может быть обработано 8ОС1₂ и затем подвергнуто реакции с 2-хлорэтиламином в присутствии ΕТзN для получения амида. Затем амидное соединение может быть преобразовано в циклизованное соединение посредством однотигельного способа, как указано далее. Восстанавливающий реагент (такой как триметилфосфин или трифенилфосфин) и основание (такое как триэтиламин) могут быть добавлены к раствору амидного соединения в ТГФ (тетрагидрофуране). Затем полученную реакционную смесь могут нагревать в колбе с обратным холодильником в течение 3 ч. Восстанавливающий агент (триметилфосфин или трифенилфин) расщепляет дисульфид (8-8) до его моносульфида (-8), который на месте подвергается интрамолекулярной циклизации с хлоридом для получения циклизованного амида. Затем циклизованный амид может быть восстановлен Ь1А1Н₄ для получения промежуточного соединения 1,4-бензотиазепина, 7-метокси-

2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина. ПУ-519 затем может быть получен из 7-метокси-2,3,4,5тетрагидро-1,4-бензотиазепина реакцией 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина с 3бромпропионовым хлоридом и затем реакцией полученного соединения с 4-бензилпиперидином.

Настоящее соединение кроме того обеспечивает композицию, включающую меченный радиоактивной меткой ПУ-519. Метка ПУ-519 может быть получена с использованием одного из множества различных радиоактивных меток, известных в области техники. Радиоактивной меткой по настоящему изобретению может быть, например, радиоизотоп. Радиоизотоп может быть любым изотопом, который излучает определяемое излучение, включая, без ограничения, ³⁵8, ¹²⁵1, ³Н, или ¹⁴С. Радиоактивность, излучаемая радиоизотопом, может быть определена методиками, хорошо известными в области техники. Например, гамма-излучение радиоизотопа может быть определено с использованием гаммавизуализационных методик, особенно сцинтиграфической визуализации.

В качестве примера и как показано в примере 10 и схеме 2 ниже, меченный радиоактивной меткой ПУ-519 может быть получен, как указано далее. ПУ-519 может быть диметилирован в фенильном цикле с использованием ВВг₃. Полученное фенольное соединение может затем быть реметилировано меченным радиоактивной меткой метилирующим агентом (таким как ³Н-диметилсульфат) в присутствии основания

- 30 015010 (такого как №1Н) для получения ³Н-меченного 1ТУ-519.

Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает новые промежуточные продукты и производные 1,4-бензотиазепина, включая 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепены, которые подобны 1ТУ-519. В качестве примера, настоящее изобретение обеспечивает соединения, имеющие следующие формулы:

где Я = арил, алкенил, алкил, -(СН2)_ηNЯ'₂, или -(СН2)_п8Я', и η = 0, 1, 2 или 3, и Я' = алкил или циклоалкил

где Я = арил, алкил, -(СН₂)^Я'₂, или -(СН₂)_п8Я', и η = 0, 1, 2 или 3, и Я' = алкил или циклоалкил;

Н

где Я = СО(СН2)пХЯ'2, 8О2 (СН) пХЯ' 2, или 8Ο2NН(СН2)ηXЯ'2, и X = N или 8, и η = 1, 2 или 3, и Я' = алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2; и

где Я = арил, алкил, -(СН₂)_п1МЯ'₂, -(СН₂)_п8Я', и η = 0, 1, 2 или 3, и Я' = алкил или циклоалкил и где X = N4 или О. Также обеспечивают дополнительные соединения 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина, имеющие следующие формулы:

Н₂ где Я1 = ОЯ', 8Я', ΝΚ', алкил, или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и Я' = алкил, арил или Н; где Я₂ = Н, алкил или арил; и где Я₃ = Н, алкил или арил;

где Я1 = Н, ОЯ', 8Я', ΝΚ', алкил, или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и Я' = алкил, арил, или ацил; где Я2 = Н, алкил, алкенил, или арил; где Я3 = Н, алкил, алкенил или арил; где т = 0, 1 или 2; и где η = 0 или 1; и

где Я1 = Н, ОЯ', 8Я', ΝΚ', алкил, или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и Я' = алкил, арил, или ацил; где Я₂ = Н, алкил, алкенил, или арил; где Я₃ = Н, алкил, алкенил, или арил; где Я₄ = Н, галоид, алкенил, карбоновая кислота, или алкил, содержащий О, 8, или Ν; и где т = 0, 1 или 2.

Примеры новых соединений 1,4-бензотиазепина, полученных авторами, включают без ограничения 87, 8-20, 8-25, 8-27 и 836. Предпочтительно соединением является 836. Структуры для 87, 8-20, 8-25, 827, и 836 могут быть обнаружены на фиг. 15 настоящей заявки. Такие и любые другие новые соединения по настоящему изобретению могут быть ассоциированы с фармацевтически приемлемым носителем, как описано выше, так, чтобы получить фармацевтическую композицию.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способы синтеза новых соединений 1,4бензотиазепина, описанных в настоящем описании. Например, настоящее изобретение обеспечивает способ для синтеза соединения, имеющего формулу

- 31 015010

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН₂)_п№'₂, или -(СН₂)_пЕВ', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или цикло алкил, включающего стадии:

(а) обработки соединения, имеющего формулу

сульфонилхлоридом (включая любое производное сульфонилхлорида) и основанием для получения соединения, имеющего формулу

(Ь) необязательно, обработки соединения, полученного на стадии (а), первичным или вторичным амином, для получения соединения, имеющего формулу

где В является, как определено выше. В одном варианте осуществления изобретения, соединение сульфонилхлорида на стадии (а) выбирают из группы, состоящей из алкилсульфонилхлорида и арилсульфонилхлорида. В другом варианте осуществления изобретения основанием на стадии (а) является Ε!₃Ν. В еще одном варианте осуществления изобретения первичным или вторичным амином на стадии (Ь) является 4-бензилпиперидин.

Способ по изобретению может кроме того включать стадию окисления соединения, имеющего формулу

где В = арил, алкенил, алкил, - (СН₂) ₁^В'₂, или -(СН2)_пЕВ', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил, окисляющим агентом для получения соединения, имеющего формулу:

Ц гп * 1 или 2 (ОХп где В является, как определено выше, и где т = 1 или 2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения окисляющим агентом является перекись водорода.

В качестве примера и как показано в примере 11 и схеме 3, авторы изобретения разработали способ синтеза соединения, имеющего общую структуру:

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН₂)_ηNВ'₂, или -(СН₂)_пЕВ', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил. Новые соединения такой общей структуры могут быть получены реакцией 7-метокси-2,3,4,5тетрагидро-1,4-бензотиазепина с алкилсульфонилхлоридом или арилсульфонилхлоридом, в присутствии основания, такого как Ε!₃Ν. Дополнительные реакции (например, добавление 4-бензилпиперидина) могут быть проведены для удлинения боковой цепи, при желании. Как демонстрирует схема 3, 2хлорэтансульфонилхлорид (например, 180 мг; 1,1 мМ) и Ε!₃Ν (например, 140 мг; 1,1 мМ) может быть добавлен к 7-метокси-2,3, 4, 5-тетрагидро-1,4-бензотиазепину (1) (например, 194 мг; 1 мМ) в СН₂С1₂ (например, 20 мл), при 0°С. Затем смесь может быть перемешана (например, при 0°С в течение 2 ч) и промыта (например, Н₂О и насыщенным раствором NаНСО₃). Удаление растворителя даст сырой продукт, который может быть очищен хроматографией на силикагеле. Структура может быть подверждена ЯМР. Схема 3 показывает, что полученная боковая цепь соединения может быть удлинена реакцией соединения (например, 28 мг; 0,1 мМ) с 4-бензилпиперидином (например, 21 мг; 0,13 мМ) в СН₂С1₂. После завершения реакции, избыток амина может быть удален поглотителем оснований (например, 3-(2

- 32 015010 янтарный ангидрид)пропилфункционализированный силикагель, 0,5 г).

Настоящее изобретение также обеспечивает способ синтеза соединения, имеющего формулу

где В = арил, алкил, -(СН₂)_пNΒ'₂, или -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил, включающий стадию обработки соединения, имеющего формулу

сульфурилхлоридом и первичным или вторичным амином, в присутствии основания, для получения соединения, имеющего формулу

где В является, как определено выше. В одном варианте осуществления настоящего изобретения основанием является Εΐ₃Ν. В другом варианте осуществления изобретения первичным или вторичным амином является 1-пиперонилпиперазин.

Способ по настоящему изобретению может кроме того включать стадию окисления соединения, имеющего формулу

где В = арил, алкил, - (СН₂) ^В'₂, или -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил, для получения соединения, имеющего формулу

где В является, как определено выше, и где т = 1 или 2. В одном варианте осуществления изобретения, окисляющим агентом является перекись водорода.

В качестве примера и как показано в примере 11 и схеме 4, авторы изобретения разработали способ синтеза соединений, имеющих общую структуру

где В = арил, алкил, -(СН₂) ^В'₂, или -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2, или 3, и В' = алкил или циклоалкил. Новые соединения такой общей структуры могут быть получены однотигельной реакцией 7-метокси-

2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина с сульфурилхлоридом, в присутствии основания (например, Εΐ₃Ν), с последующим первичным или вторичным амином. Как демонстрирует схема 4, сульфурилхлорид (например, 15,0 мг; 0,111 мМ) и Εΐ₃Ν (например, 28,0 мг; 0,22 мМ) может быть добавлен к 7-метокси-2,3,4,5тетрагидро-1,4-бензотиазепину (например, 19,4 мг; 0,1 мМ) в СН₂С1₂ (например, 20 мл), при 0°С. После перемешивания смеси (например, в течение 2 ч при 0°С) может быть добавлен 1-пиперонилпиперазин (например, 27 мг; 0,12 мМ). Смесь можно перемешивать в течение еще 2 ч и затем промывать (например, Н₂О и насыщенным раствором NаНСО₃). Избыток амина может быть удален добавлением поглотителя оснований (например, 3-(2-янтарный ангидрид)пропилфункционализированного силикагеля, 0,2 г) .

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ для синтеза соединения, имеющего формулу

где В = СО(СН₂)_пХВ'₂, 8О₂ (СН₂)_пХВ'₂, или 8О^ (СН₂)_пХВ'₂ и X = N или 8, и η = 1, 2, или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2, включающий стадию обработки соединения, имеющего формулу

где В является как определено выше, окисляющим агентом для получения соединения, имеющего формулу

- 33 015010

где В и т являются, как определено выше. В одном варианте осуществления изобретения окисляющим агентом является перекись водорода. Такой способ также может быть использован для окисления ТТУ-519.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ для синтеза соединения, имеющего формулу

где В = СО(СН₂)_ПХВ'₂, 8О₂(СН₂)_пХВ'₂, или 8О₂Ж(СН₂)_пХВ'₂, и X = N или 8, и η = 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2, включающий стадию обработки соединения, имеющего формулу

окисляющим агентом для получения соединения, имеющего формулу:

<0И>

где В и т являются, как определено выше. В одном варианте осуществления изобретения окисляющим агентом является перекись водорода. Такой способ также может быть использован для окисления ТТУ-519.

В качестве примера и как показано в примере 11 и схеме 5, авторы изобретения разработали способ синтеза соединений, имеющих общую структуру

(о')т где В = СО(СН₂)_ПХВ'₂, 8О₂(СН₂)_ПХВ'₂ или 8О₂1МН(СН₂)_ПХВ'₂, и X = N или 8, и η = 1, 2 или 3, и В'= алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2.

Новые соединения такой общей структуры могут быть получены окислением ТТУ-519, или одного из новых производных 1,4-бензотиазепина, описанных в настоящем описании, перекисью водорода. Как показывает схема 5, интересующее соединение 1,4-бензотиазепина (например, 21 мг; 0,05 мМ) в МеОН (например, 5 мл) может быть добавлено к Н₂О₂ (например, 0,1 мл, избыток). Смесь может перемешиваться (например, в течение 2 дней), и полученный продукт может быть очищен хроматографией на силикагеле (например, СН₂С1₂:МеОН=10:1) .

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ для синтеза соединения, имеющего формулу

где В = арил, алкил, -(Ο4₂)_ηΝΚ'₂, или -(СН₂)_П8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где Х= ΝΉ или О, включающий стадию обработки соединения, имеющего формулу

карбонилхлоридом, в присутствии основания и первичным или вторичным амином или спиртом, для получения соединения, имеющего формулу

где В и Х являются, как определено выше. В одном варианте осуществления изобретения соединением карбонилхлорида является трифосген. В другом варианте осуществления изобретения основанием является Εΐ₃Ν. В еще одном варианте осуществления изобретения первичным или вторичным амином является 4-бензилпиперидин.

В качестве примера и как показано в примере 11 и схеме 6, авторы изобретения разработали способ

- 34 015010 синтеза соединений, имеющих общую структуру

где В = арил, алкил, -(СНД^В? -(СН₂)_и8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где X = №Н или О. Новые соединения такой общей структуры могут быть получены реакцией 7-метокси-

2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина с трифосгеном, в присутствии основания (например, Εΐ₃Ν), с последующим добавлением первичного или вторичного амина или спирта.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ для синтеза соединений 2,3,4,5тетрагидро-1,4-бензотиазепина, имеющих формулу

где В1 = ОВ', 8В', ΝΚΛ алкил или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил или Н; где В2 = Н, алкил или арил; и где В3 = Н, алкил или арил, включающий стадии:

(а) обработки соединения, имеющего формулу:

где В1 является, как определено выше, восстанавливающим агентом, необазательно в присутствии катализатора, для получения соединения, имеющего формулу:

где В1 является, как определено выше;

(Ь) обработки соединения, полученного на стадии (а) диазотирующим агентом и дисульфидом для получения соединения, имеющего формулу

(с) обработки соединения, полученного на стадии (Ь) активирующим агентом и хлорэтиламином, для получения соединения, имеющего формулу

где В1, В₂ и В₃ являются, как определено выше;

(б) обработки соединения, полученного на стадии (с) восстанавливающим агентом и основанием для получения соединения, имеющего формулу

где В1, В₂ и В₃ являются, как определено выше; и (е) обработки соединения, полученного на стадии (б) восстанавливающим агентом для получения соединения, имеющего формулу

где В₁, В₂ и В₃ являются, как определено выше.

- 35 015010

Способы лечения и предотвращения с использованием новых производных 1,4-бензотиазепина

Полученные авторами новые соединения 1,4-бензотиазепина имеют общие функциональные характеристики с 1ТУ-519. Например, как 1ТУ-519 (мм = 423), соединение 836 (мм = 267) регулирует кальциевые каналы. Действительно, 836 (карбоновая кислота) является приблизительно в 10 раз более сильной, чем 1ТУ-519 в регуляции кальциевых каналов (данные не показаны). В отличие от 1ТУ-519, например, новые соединения авторов показывают слабую блокирующую активность в отношении ИЕВС.

Быстрый отложенный выпрямляющий канал (1(Кг)) - калиевый канал - является важным для реполяризации потенциала действия сердца. ИЕВС является порообразующей субъединицей 1(Кг) канала. Подавление функции 1(Кг) - как результат побочных эффектов лекарственного средства и/или генетических дефектов ИЕВС - может вести к синдрому длинного-ОТ (ЬрТ), что влечет повышенный риск аритмий, угрожающих жизни. Затем ИЕВС являются субъединицами калиевых каналов, которые при блокировании могут вызывать сердечные аритмии и внезапную кардиальную смерть.

Соединения по изобретению обладают значительно сниженным блокированием ИЕВС (1(Кг)) каналов, при сравнении с 1ТУ-519. Как показано на фиг. 4-7, например, одно из соединений авторов изобретения, 836, обладает блокирующей активностью в отношении ИЕВС, которая является приблизительно в 5-10 раз более низкой, чем ИЕВС-блокирующая активность 1ТУ-519. Так как соединения авторов обладают слабой активностью блокирования ИЕВС, ожидают, что они будут менее токсичными чем 1ТУ-519.

На основании вышеуказанного новые соединения 1,4-бензотиазепина по изобретению являются более сильными, чем ТГУ-519 и обладают сниженной токсичностью. Следовательно, считают, что новые соединения по изобретению будут особенно применимыми в любом из вышеуказанных способов для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента, включая пациента, который имеет или является кандидатом для развития по меньшей мере одного заболевания сердца, включая, без ограничения, сердечную аритмию (например, тахикардию; предсердную аритмию, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковую аритмию, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой, сердечную недостаточность и внезапную кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой. Также считают, что соединения по изобретению будут особенно применимыми в способах для лечения или предотвращения таких заболеваний сердца у пациента.

Соответственно, настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента, введением агента пациенту, в количестве, эффективном для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента. Агентом по настоящему изобретению может быть любое производное 1,4бензотиазепина, включая следующее:

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН₂)_пМК'₂ или -(СН₂)_п8В', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил

где В = арил, алкил, -(СН₂)^В'₂ или -(СН₂)_п8В', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил;

где В = СО(СН₂)_пХВ'₂, 8О₂(СН₂)_пХВ'₂ или 8О₂К1Н(СН₂)_пХВ'₂, и X = N или 8, и п = 1, 2, или 3, и В' = алкил или циклоалкил и где т = 1 или 2;

(а) где В = арил, алкил, -(СН₂)_пМК'₂, -(СН₂)_п8В', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где X = К1Н или О;

- 36 015010

где В1 = ОВ', 8В', ΝΚΛ алкил или галоид в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или Н; где В₂ = Н, алкил, или арил и где В₃ = Н, алкил, или арил;

где В1 = Н, ОВ', 8В', ΝΚΛ алкил или галоид в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или ацил; где В2 = Н, алкил, алкенил, или арил; где В3 = Н, алкил, алкенил, или арил; где т = 0, 1, или 2; и где η = 0 или 1;

(8) где В1 = Н, ОВ', 8В', ΝΚΛ алкил или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил или ацил; где В2 = Н, алкил, алкенил или арил; где В3 = Н, алкил, алкенил или арил; где В4 = Н, галоид, алкенил, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8, или Ν; и где т = 0, 1 или 2; и (Н) любая окисленная форма соединений (а)-(д) выше.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение таких агентов в способах для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента. В одном варианте осуществления настоящего изобретения агент выбирают из группы, состоящей из 84, 87, 8-20, 8-24, 8-25, 8-26, 8-27 и 836. Структуры таких агентов могут быть обнаружены на фиг. 15. Предпочтительно агентом является 836.

Как описано выше, пациентом может быть животное, но предпочтительно является человек. В одном варианте осуществления изобретения пациент имеет катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию (КПЖТ). В другом варианте осуществления изобретения пациент имеет или является кандидатом для развития, по меньшей мере одного заболевания сердца, включая, без ограничения, сердечную аритмию (например, тахикардию; предсердную аритмию, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковую аритмию, включая фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой), сердечную недостаточность, и внезапную кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.

В способе по настоящему изобретению производное 1,4-бензотиазепина может вводиться пациенту как часть терапевтической композиции, которая включает производное и фармацевтически приемлемый носитель , как описано выше. Производное или фармацевтическую композицию можно вводить пациенту посредством методик, известных в области техники и/или описанных в настоящем описании.

В соответствии со способом по настоящему изобретению производное 1,4-бензотиазепина может вводиться пациенту (и производное 1,4-бензотиазепина может контактировать с клетками пациента) в количестве, эффективном для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 у пациента, особенно в клетках пациента. Такое количество может быть легко определено специалистом в области техники на основании известных методик, включая анализ кривых титрования, установленных ίη νίνο, и способы и анализы, описанные в настоящем описании. Подходящее количество производного 1,4-бензотиазепина, эффективное для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-сязанного ЕКВР12.6 у пациента, может варьироваться от около 5 до около 20 мг/кг/день, и/или может быть количеством, достаточным для достижения уровня в плазме, варьирующегося от около 300 до около 1000 нг/мл. Предпочтительно количество производного 1,4-бензотиазепина варьируется от около 10 до около 20 мг/кг/день.

В соответствии со способом по настоящему изобретению снижение уровня ВуВ2-связанного ЕКВР12.6 может быть ограничено у пациента снижением уровня фосфорилированного ВуВ2 у пациента. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, у пациента еще не развилось заболевание сердца, такое как сердечная аритмия (например, тахикардия; предсердная аритмия, включая предсердная тахиаритмия и фибрилляция предсердий (и постоянная и непостоянная); желудочковая аритмия, включая

- 37 015010 фибрилляцию желудочков; и сердечную аритмию, индуцированную физической нагрузкой), сердечная недостаточность, и внезапная кардиальная смерть, индуцированная физической нагрузкой. В таком случае количество производного 1,4-бензотиазепина, эффективное для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента, может соответствовать количеству производного 1,4-бензотиазепина, эффективному для предотвращения заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения у пациента уже развилось заболевание сердца. В таком случае, количество производного 1,4-бензотиазепина, эффективное для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента может соответствовать количеству производного 1,4-бензотиазепина, эффективному для лечения заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента. В предпочтигельном варианте осуществления изобретения ТТУ-519 лечит по меньшей мере одно заболевание сердца у пациента.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ лечения или предотвращения заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности, и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента, включающий введение агента пациенту, в количестве, эффективном для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента. Агентом по настоящему изобретению может быть любое производное 1,4-бензотиазепина, включая следующие:

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН₂)_пNΒ'₂ или -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил;

где В = арил, алкил, -(СН₂)^В'₂ или -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2, или 3, и В' = алкил или циклоалкил;

где В = СО(СН₂)_пХВ'₂, 8О₂(СН₂)_пХВ'₂ или 8О₂МН(СН₂)_пХВ'₂, и X = N или 8, и η = 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2;

(<*) где В = арил, алкил, -(СН₂)_пКВ'2, -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где X = N4 или О;

где В1 = ОВ', 8В', NΒ', алкил или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или Н; где В2 = Н, алкил или арил; и где В3 = Н, алкил или арил;

- 38 015010

где В1 = Н, ОВ', 8В', ΝΒ', алкил или галоид в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или ацил; где В₂ = Н, алкил, алкенил, или арил; где В₃ = Н, алкил, алкенил, или арил; где т = 0, 1, или 2; и где η = 0 или 1

где В1 = Н, ОВ', 8В', ΝΒ', алкил или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или ацил; где В2 = Н, алкил, алкенил или арил; где В3 = Н, алкил, алкенил или арил; где В4 = Н, галоид, алкенил, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8 или Ν; и где т = 0, 1, или 2; и (11) любая окисленная форма соединений (а)-(д), указанных выше.

Настоящее изобретение кроме того обеспечивает способ лечения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности, и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента. Способ включает введение производного 1,4-бензотиазепина пациенту в количестве, эффективном для лечения по меньшей мере одного заболевания сердца у пациента. Подходящее количество производного 1,4-бензотиазепина, эффективное для лечения заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности) у пациента может варьироваться от около 5 до около 20 мг/кг/день, и/или может быть количеством, достаточным для достижения уровня в плазме, варьирующимся от около 300 до около 1000 нг/мл. Настоящее изобретение также обеспечивает способ предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности, и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента. Способ включает введение производного 1,4-бензотиазепина пациенту, в количестве, эффективном для предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца у пациента. Подходящее количество производного 1,4-бензотиазепина, эффективное для предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности, и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента может варьироваться от около 5 до около 20 мг/кг/день, и/или может быть количеством, достаточным для достижения уровня в плазме, варьирующегося от около 300 до около 1000 нг/мл.

В соответствии с вышеописанными способами примеры производных 1,4-бензотиазепина включают без ограничения

где В = арил, алкенил, алкил, -(^^ΝΗ^ или -(СН₂)_П8В', и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил;

- 39 015010

где В = арил, алкил, -(СН₂)^В'₂ или -(СН₂)_п8В', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил;

где В = СО(СН₂)_пХВ'₂, 8О₂(СН₂)_пХВ'₂ или §О₂1ЧН(СН₂)_пХВ'₂, и X = N или 8, и п = 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2;

(Ф где В = арил, алкил, -(Ό^υΝ^, -(СН₂)_п8В', и п = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где X = N4 или О;

где В1 = ОВ', 8В', NВ', алкил или галоид в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или Н; где В₂ = Н, алкил, или арил; и где В₃=Н, алкил, или арил;

где В1 = Н, ОВ', 8В', NВ', алкил, или галоид, в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил или ацил; где В₂ = Н, алкил, алкенил или арил; где В₃ = Н, алкил, алкенил или арил; где т = 0, 1 или 2; и где п = 0 или 1;

(к) где В1 = Н, ОВ', 8В', NВ', алкил или галоид в положении 2, 3, 4 или 5 фенильного цикла, и В' = алкил, арил, или ацил; где В2 = Н, алкил, алкенил или арил; где В3 = Н, алкил, алкенил или арил; где В4 = Н, галоид, алкенил, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8, или Ν; и где т = 0, 1, или 2; и (1) любая окисленная форма соединений (а)-(д), указанных выше. В одном варианте осуществления настоящего изобретения производное 1,4-бензотиазепина выбирают из группы, состоящей из 84, 87, 820, 8-24, 8-25, 8-26, 8-27, и 836. Предпочтительно производным 1,4-бензотиазепина является 836. Настоящее изобретение также обеспечивает применение таких производных 1,4-бензотиазепина в способах лечения или предотвращения по меньшей мере одного заболевания сердца (например, сердечной аритмии (например, тахикардии; предсердной аритмии, включая предсердную тахиаритмию и фибрилляцию предсердий (и постоянную и непостоянную); желудочковой аритмии, включая фибрилляцию желудочков; и сердечной аритмии, индуцированной физической нагрузкой), сердечной недостаточности, и внезапной кардиальной смерти, индуцированной физической нагрузкой) у пациента.

Настоящее изобретение также обеспечивает новые анализы для регулярного или высокопроизводительного скрининга других биологически активных небольших молекул, которые усиливают связывание РКВР12.6 и ВуВ2. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ для идентификации агента, который усиливает связывание ВуВ2 и РКВР12.6, включающий стадии: (а) обеспечения или создания

- 40 015010 источника ВуВ2; (Ь) воздействия на ВуВ2 РКВР12.6. в присутствии агента-кандидата; и (с) определения. усиливает ли агент связывание ВуВ2 и РКВР12.6. В одном варианте осуществления изобретения ВуВ2 является РКА-фосфорилированным. В другом варианте осуществления изобретения ВуВ2 является РКАгилерфосфорилированным. В еще одном варианте осуществления изобретения ВуВ2 является нефосфорилированным.

В способе по настоящему изобретению ВуВ2 иммобилизован на твердой фазе. такой как планшет или шарики. Для облегчения связывания ВуВ2-ЕКВР12.6 РКВР12.6 может быть меченным радиоактивной меткой (например. ³²8). Более того. усиленное связывание ВуВ2 и РКВР12.6 может быть определено с использованием агента. связывающего РКВР12.6. В одном варианте осуществления изобретения агентом. связывающим РКВР12.6. является анти-ЕКВР12.6 антитело. Настоящее изобретение также обеспечивает агент. идентифицируемый таким способом. а также применение таких агентов в способах для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента; в способах лечения или предотвращения сердечной недостаточности. фибрилляции предсердий или сердечной недостаточности. индуцированной физической нагрузкой или сердечной аритмии. индуцированной физической нагрузкой у пациента; и в способах предотвращения внезапной кардиальной смерти. индуцированной физической нагрузкой у пациента.

Кроме того. настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации агента для усиления связывания ВуВ2 и РКВР12.6. включающий стадии: (а) обеспечения или создания источника РКВР12.6; (Ь) воздействия РКВР12.6 на ВуВ2 в присутствии агента-кандидата и (с) определения. усиливает ли агент связывание ВуВ2 и РКВР12.6. В одном варианте осуществления изобретения ВуВ2 является РКАфосфорилированным. В другом варианте осуществления изобретения ВуВ2 является РКАгиперфосфорилированным. В еще одном варианте осуществления изобретения ВуВ2 является нефосфорилированным.

В способе по настоящему изобретению РКВР12.6 является иммобилизированным на твердой фазе. такой как планшет или шарики. Для облегчения определения связывания ВуВ2-ЕКВР12.6. ВуВ2 может быть меченным радиоактивным лигандом (например. ³²Р). Более того. усиленное связывание ВуВ2 и РКВР12.6 может быть определено с использованием ВуВ2-связывающего агента. В одном варианте осуществления изобретения ВуВ2-связывающим агентом является анти-ВуВ2 антитело. Настоящее изобретение также обеспечивает агент. идентифицированный таким способом. а также использование такого агента в способах ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР12.6 у пациента; в способах лечения или предотвращения сердечной недостаточности. фибрилляции предсердий или сердечной аритмии. индуцированной физической нагрузкой у пациента; и в способах для предотвращения внезапной кардиальной смерти. индуцированной физической нагрузкой у пациента.

В качестве примера. и как показано в примере 12 ниже. высокоэффективный анализ для высокопроизводительного скрининга для небольших молекул может быть разработан для иммобилизации РКВР12.6 (например. дикого типа РКВР12.6 или сшитого белка. такого как С8Т-ЕКВР12.6) на 96луночные планшеты. покрытые глютатионом. с использованием стандартных методик. РКАфосфорилированный рецептор рианодина типа 2 (ВуВ2) может быть нагружен на планшет. покрытый РКВР12.6. и инкубироваться с аналогами 1ТУ-519 и другими производными 1.4-бензотиазепена в различных концентрациях (10-100 нМ) в течение 30 мин. После этого планшет может быть промыт для удаления несвязавшегося ВуВ2 и затем инкубироваться с анти-ВуВ2 антителом (например. в течение 30 мин). Планшет может быть снова промыт для удаления несвязавшегося анти-ВуВ2 антитела и затем обработан меченным флуоресцентной меткой вторичным антителом. Планшет может быть прочитан автоматическим флуоресцентным счетчиком планшетов для связанной активности.

Альтернативно. ВуВ2 может быть РКА-фосфорилированным в присутствии ³²Р-АТР. Радиоактивный РКА-фосфорилированный ВуВ2 может быть нагружен на покрытый РКВР12.6 96-луночный планшет. в присутствии аналогов 1ТУ-519 и других производных 1.4-бензотиазепена в различных концентрациях (10-100 нМ) в течение 30 мин. Планшет может быть промыт для удаления несвязавшегося меченного радиоактивной меткой ВуВ2 и затем прочтен автоматическим счетчиком планшетов. РКАфосфорилированный ВуВ2 также может быть покрыт на планшет и инкубироваться с ³²8-меченным РКВР12.6 в присутствии аналогов и производных.

Настоящее изобретение описано в следующих примерах. которые представлены для понимания изобретения и не должны рассмариваться как ограничивающие каким-либо образом рамки изобретения. как определено в формуле изобретения. которые указаны в описании далее.

Примеры

Пример 1. ЕКВР12.6-дефицитные мыши

Создавали ЕКВР12.6-дефицитных мышей. как описано ранее ^ейгепк е( а1.. ЕКВР12.6 Бейшепсу апБ БеГесйуе са1сшт ге1еаке скаппе1 (гуапоБте гесер(ог) Гцпсйоп НпкеБ !о ехегсйе-тБисеБ киББеп сагБ1ас Беа111. Се11. 113:829-40. 2003). Коротко. клоны мышиного геномного λ-фага для мышиного ортолога человеческого ЕК506 связывающего белка 12.6 (ЕКВР12.6) выделяли из библиотеки ЭВА/11ас1 с использованием полноразмерного мышиного зонда кДНК. Создавали нацеливающий вектор для удаления экзонов 3 и 4. которые содержат исходные кодирующие последовательности для мышиного ЕКВР12.6 (Веппей е!

- 41 015010 а1., ГбепГгйсаГюп апб сНагасГетайоп οί (Не пшипе РК506 Ьтбтд ргоГеш (РКВР) 12.6 депе. Матт. Сеноте, 9:1069-71,1998), замещением 3,5 н.п. мышиной геномной ДНК РСК-нео выбираемым маркером. 5' фрагмент 5,0-н.п. и 3' фрагмент 1,9-н.п. клонировали в ρίΝ82, основном векторе с вставками РСК-нео и РСКТК. Эмбриональные стволовые (Е8) клетки ЭВА/1ас1 растили и трансфицировали с использованием установленных протоколов. Целевые клетки Е8 сначала скринировали Саузерн-анализом и положительные клеточные линии Е8 анализировали ПЦР для подтверждения гомологичной рекомбинации. Самцов химер скармливали самкам ЭВА/11ас1, и потомство микроорганизмов идентифицировали по коричневому цвету оболочки. Потомство микроорганизмов генотипировали с использованием 5' Саузерн анализа. Положительных самцов и самок РКВР12.6^+/- скрещивали и потомство, возникало у мышей РКВР12.6^-/- с частотой приблизительно 25% частотой. Мыши РКВР12.6^-/- были фертильны.

Во всех исследованиях, проводимых с мышами РКВР12.6^-/-, использовали подобранных по возрасту и полу мышей РКВР12.6^+/+ в качестве контроля. Не наблюдали различий между мышами РКВР12.6^-/-, выращенными в следующих условиях: ЭВЛ/С57ВЬ6 смешанные, чистые ЭВА и чистые С57ВБ6.

Пример 2. Телеметрическая запись и исследование физической нагрузки у мышей

Мышей РКВР12.6^+/+ и РКВР12.6^-/- сохраняли и исследовали в соответствии с протоколами, утвержденными Местным Комитетом Ухода и применения животных Университета Колумбии. Мышей анестезировали с использованием ингаляции анестезии 2,5% изофлурана. Записи ЭКГ радиотелеметрии амбулаторных животных получали через >7 дней после интраперитонеальной имплантации (ЭаГа 8с1епсек ГпГегпаГюпа1, 8г. Раи1, ΜΝ) (ХУейгещ еГ а1., РКВР12.6 бейшепсу апб беГесРхе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесер1ог) Гипсйоп 1ткеб 1о ехегаке-тбисеб киббеп сагШас беаГН. Се11, 113:829-40, 2003). Для стресс-тестов мышей подвергали физической нагрузке на наклонном стенде до полной усталости и затем интраперитонеально вводили эпинефрин (0,5-2,0 мг/кг) (ХУеНгещ е1 а1., РКВР12.6 бейшепсу апб беГесГше са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесер1ог) Гипсйоп Никеб 1о ехегаке-тбнсеб киббеп сагб1ас беаГН. Се11, 113:829-40, 2003). Усредняли частоту сердцебиений в покое амбулаторных животных в течение 4 ч.

Пример 3. Экспрессия дикого типа и мутантов ЯуЯ2-82809Э

Проводили мутагенез целевого сайта РКА на ЯуЯ2 (ЯуЯ2-82809П), как описано ранее (ХУекгещ е1 а1., РКВР12.6 бейшепсу апб беГесРхе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесер1ог) Гипсйоп Нпкеб 1о ехегсщетбисеб кнббеп сагб1ас беаГН. Се11, 113:829-40, 2003). Клетки НЕК293 совместно трансфицировали 20 мкг кДНК ЯуЯ2 дикого типа (^Т) или мутантной, и 5 мкг РКВР12.6 кДНК, с использованием осаждения фосфата Са²⁺. Получали шарики, содержащие ЯуЯ2 каналы, как описано ранее (ХУекгещ е1 а1., РКВР12.6 бейшепсу апб беГесРхе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесер1ог) Гипсйоп 1ткеб 1о ехегаке-тбнсеб кнббеη сагб1ас беаГН. Се11, 113:829-40, 2003).

Пример 4. ЯуЯ2 РКА фосфорирование и связывание РКВР12.6

Получали мембраны кардиальной 8Я, как описано ранее (Магх е1 а1., РКА рНокрНогукИюп б188ос1а1е8 РКВР12.6 Ггот ГНе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесерГог): беГесРхе геди1айоп ίη Гайшд НеагГк. Се11, 101:365-76, 2000; КаГГап е1 а1., ЕГГесГк оГ гаратуст оп гуапобте гесерГог/Са2+-ге1еаке сНаппеЬ Ггот сагб1ас тнкс1е. С1гс. Яек., 78:990-97, 1996). ³⁵8-меченный РКВР12.6 создавали с использованием системы ТЭТ™ Быстрой связанной транскрипции/трансляции от Рготеда (Мабйоп XVI). Связывание [³Н] рианодина использовали для количественного определения уровня ЯуЯ2. 100 мкг микросом разводили в 100 мкл 10мМ имидазольного буфера (рН 6,8), инкубировали с 250-нМ (окончательная концентрация) [³⁵8]РКВР12.6 при 37°С в течение 60 мин, затем гасили 500 мкл ледяного имидазольного буфера. Образцы центрифугировали при 100000 д в течение 10 мин и промывали три раза в имидазольном буфере. Количество связанного [³⁵8]-РКВР12.6 определяли жидкостным счетом сцинтилляций осадка.

Пример 5. Иммуноблоты

Иммуноблоттинг микросом (50 мкг) проводили как описано с анти-РКВР12/12.6 (1:1000), антиЯуЯ-5029 (1:3000) (1ауагатап е1 а1., РК506 Ьтбтд ргоГеш аккошаГеб \\'ЦН ГНе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесерГог). I. Вю1. СНет., 267:9474-77,1992), или антифосфо ЯуЯ2-Р2809 (1:5000) в течение 1 ч при комнатной температуре (Яе1кеп еГ а1., ВеГа-Ь1оскега гекГоге са1сшт ге1еа§е сНаппе1 Гипсйоп апб нпргохе сагб1ас ти§с1е регГогтапсе ίη Нитап НеагГ ГаНиге. С1гси1аГюп, 107:2459-66, 2003). Р2809-фосфоэпитопспецифической анти-ЯуЯ2 антитело является афинно-очищенным поликлональным кроличьим антителом, заказанным 2утеб ЬаЬогаГопек (8ап Ргапшксо, СА) с использованием пептида, СЯТЯК1-(р8)-РТ8О, который соответствует ЯуЯ2 РКА-фосфорилилированным на 8ег²⁸⁰⁹ . После инкубации с НЯР-меченным анти-кроличьим ГдС (разведение 1:5000; ТгаикбисГюп ЬаЬогаГопек, ЬехшдГоп, КУ), блоты получали с использованием ЕСЬ (АтегаНат РНагташа, РтсаГатау, Νί). Антитела также могут быть использованы в следующих соотношениях: 1:4000 (антикроличьи ГдС) и 1:5000 (анти-ЯуЯ2-5029 и анти-РКВР12.6).

Пример 6. Записи отдельных каналов

Получали записи отдельных каналов природных ЯуЯ2 из сердец грызунов (мыши или крысы), или рекомбинантных ЯуЯ2, в условиях фиксации потенциала при 0 мВ, как описано ранее (Магх еГ а1., РКА рНокрНогукИюп б^коСтек РКВР12.6 Ггот ГНе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесерГог): беГесГше геди1аГ1оп ίη ГаШпд НеагГк. Се11, 101:365-76, 2000). Симметричными растворами, используемыми для записей каналов, были: транс камера - НЕРЕ8, 250 ммоль/л; Ва(ОН)₂, 53 ммоль/л (в некоторых экспериментах, Ва(ОН)₂ заменяли Са(ОН₂); рН 7,35; и цис камера - НЕРЕ8, 250 ммоль/л; Тик-основание, 125 ммоль/л;

- 42 015010

ЕСТА, 1,0 ммоль/л; и СаС1₂, 0,5 ммоль/л; рН 7,35. Если не указано иначе, записи отдельных каналов получали в присутствии 150-нМ [Са²⁺] и 1,0-мМ [Мд²⁺] в цис-камере. Рианодин (5 мМ) наносили в цис камеру для подтверждения идентичности всех каналов. Данные анализировали по оцифрованным записям в настоящем времени с использованием программного обеспечения РеШИаи (Αχοη Iη8!^итеη!8, υηίοη СБу, СА). Все данные выражали как среднее ± 8Е. Непарный критерий Стьюдента использовали для статистического сравнения средних значений между экспериментами. Значение Р<0,05 расценивали как статистически значимое.

Эффекты .ТТУ-519 на ВуВ2 каналы указаны на фиг. 1-3 и табл. 1 (ниже). Как продемонстрировано на фиг. 3, исследования отдельных каналов показали увеличенную вероятность открытия ВуВ2 после РКА фосфорилирования (Ό), по сравнению с РКА фосфорилированием в присутствии специфического ингибитора РКА, РК5-24 (С). Функцию отдельных каналов нормализовали в РКА-фосфорилированных ВуВ2, инкубированных с РКВР12.6 в присутствии .ТТУ-519 (Е). Гистограммы амплитуды (справа) выявили увеличенную активность и расщепленное открытие РКА-фосфорилированных ВуВ2, но не после обработки 1ТУ-519 и РКВР12.6. Фиг. 3Р показывает, что инкубация РКА-фосфорилированных ВуВ2 с РКВР12.6, в присутствии 1ТУ-519, сдвигала Са²⁺-зависимость ВуВ2 активации в сторону направо, делая ее подобной Са²⁺-зависимости нефосфорилированных каналов.

Таблица 1. Амбулаторные данные ЭКГ до, во время физической нагрузки и после физической нагрузки и инъекции эпинефрина

	ЗСЪ [мс)	НК 1 РК (мс) (уд/мин)	(2КЗ (мс)	ОТ (мс)	СТс (мс)
Исходно
ГКВР12, 6+/	104 + 6	586+36	32±1,5	9, 9±0, 4	30+1,0	29+0,6
7КВР12,5+/~ + στν-519	99±5	608+32	33+0,6	9,310,3	32±2,7	32+1,9
Ε’ΚΒΡΠ,β·'· + 0ТУ-519	116+9	527143	33+0,4	10,0+0,3	зз±1,з	30+1,1
Максимальная физическая нагрузка
Е’КВР12,б*/·	8012	752118	28+0,7	8,7+0,4	30+1,7	3311,6
ККВР12, У1 + στν-519	90+7	676+49	29±1,8	9,6+0,4	34+2,0	36±0,9
ЕКВР12, 6 ' + στν-519	83±3	729122	29+2	9,3±0,3	30+1,2	33+0,9
Эпинефрин после физической нагрузки
ГКВР12, 6+/-	94+4	645128	35±2,6	9,310,4	33 + 1,8	3411,9
ГКВР12, 6+/ + ЦТУ-519	102±4	592121	37±2,6	9,910,6	32+2,3	32+1,7
7КВР12, б-''- + ЛТУ-519	103±4	585+20	35+3,8	11,1+0,5	36+1,2	36+1,3

Резюме данных амбулаторной ЭКГ у мышей РКВР12,6^+/-, леченных ТГУ-519 (η = 8) или контрольной группы (η = 6), и мышей РКВР12,6^-/-, леченных ТГУ-519 (η = 5). 8СЬ = длина синусового цикла; НВ = частота сердечных сокращений; мс = миллисекунда; уд/мин = ударов в минуту; РКВР12.6 ^- = гетерозиготные мыши РКВР12.6; РКВР12,6^-/- = РКВР12.6 дефицитные мыши.

Пример 7. Модель сердечной недостаточности на крысах крыс 8ргадие-Оа^1еу (300-400 г) подвергались перевязки левой коронарной артерии посредством левосторонней торакотомии, для получения инфаркта миокарда, как описано ранее (А1уагех е! а1., Ьа1е ро81-туосаШ1а1 тГагсПон пШисез а !е!^οάο!οx^η-^е8^8!аη! №1' сштеШ ίη га! сайютуосуТез. 1. Мо1. Се11 Сагάίο1., 32:1169-79, 2000). Коротко, крыс анестезировали смесью 150 мг/кг интраперитонеального кетамина и 15 мг/кг хлорпромазина. Дыхание поддерживали вспомогательным устройством вентиляции и эндотрахеальной трубки (3 мл воздуха/60 ударов в минуту). После срединно-левосторонней торакотомии и

- 43 015010 вскрытия перикарда, левую главную коронарную артерию закрывали 7-0 шелковой нитью в наиболее проксимальной точке ниже отростка левого предсердия. Ложнопрооперированные крысы (п = 5) получали лечение таким же образом, но без перевязки коронарной артерии.

Через шесть недель после инфаркта миокарда подтверждали сердечную недостаточность с использованием эхокардиографии. ПУ-519 или растворитель (ДМСО) непрерывно вводили (0,5 мг/кг/ч) посредством имплантируемой осмотической насосной помпы (миниосмотическая помпа А1хе1; Энгес! Согрогабоп, Сирегбпо, СА). Через 4 недели непрерывного лечения проводили эхокардиографию и гемодинамические оценки. Животных умерщвляли и собирали образцы тканей.

В соответствии с вышеописанными методиками сердечную недостаточность индуцировали у крыс перевязкой левой передней нисходящей коронарной артерии. Это приводило к инфаркту миокарда, который прогрессировал в дилатационную кардиомиопатию, со сниженной сердечной функцией, в течение 4 недель. Исследовали три группы животных, 25 в каждой группе: ложнооперированные (контроль), с сердечной недостаточностью + лечение (ЛУ-519), и с сердечной недостаточностью без лечения (растворитель). Лечение в течение четырех недель ПУ-519 значительно снижало диастолическую и систолическую дисфункцию, что определяли эхокардиографией (фиг. 4). Следовательно, терапия ПУ-519 значительно улучшала функцию сердца и снижала прогрессирование сердечной недостаточности в модели сердечной недостаточности, индуцированной ишемией, на крысах.

С использованием мутантного КуК2-82809Э канала, который имитирует постоянно-РКАфосфорилированные КуК2 каналы, определяли, что ПУ-519 увеличивает афинность РКВР12.6 к КуК2 каналу (фиг. 5). Особенно лечение ПУ-519 позволяло РКВР12.6 связываться с мутантным каналом, таким образом выявляя механизм, посредством которого ПУ-519 предотвращает сердечную недостаточность. Лечение ПУ-519 также предотвращало протекание КуК2 каналов при сердечной недостаточности (фиг. 6). Более того, ПУ-519 восстанавливает связывание РКВР12.6 и с РКА-фосфорилированными КуК2 и с мутантными КуК2-82809Э, которые имитируют постоянно-РКА-фосфорилированные КуК2 дозо-зависимым образом (фиг. 7).

Пример 8. Модель фибрилляции предсердий собак

a) Протоколы животных

Водители ритма имплантировали взрослым самкам непородистых собак, весящим 24-26 кг, с использованием ранее описанных методик (Эип еТ а1., Сбгошс аТпа1 йЬгШабоп боек поТ ГиПНег бесгеаке оиТтеагб сиггепТк. 1Т тсгеакек 1Нет. Ат. I. РНубо1. НеагГ Сбс. РНукюС 285:Н1378-84, 2003). Животных анестезировали тиопенталом натрия (17 мг/кг, в/в) и вентилировали изофлураном (1,5-2%) и О₂ (2 л/мин). Активные фиксирующие швы имплантировали в отросток правого предсердия и свободную стенку правого предсердия, проводили под кожей и соединяли с пульс-генератором Йге1 и водителем ритма ТНега 8962, соответственно (Меббошск, М^ηиеаро1^к, ΜΝ). 40% формальдегид (0,1-0,3 мл) вводили в пучок Гиса для достижения полной АУ блокады. Желудочковый водитель ритма программировали со скоростью 60 уд./мин и держали с такой скоростью на всем протяжении протокола стимуляции. После восстановления устанавливали стимуляцию предсердия со скоростью 600-900 уд./мин и поддерживали в течение 46±3 дней или до того, как у животного развивалась ФП (определяемая как > 5 дней ФП в отсутствие непрерывной стимуляции).

Затем животных анестезировали пентобарбиталом (30 мг/кг) и удаляли их сердца. Ткань предсердия иссекали, непосредственно быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

b) Получение сердец

Человеческие данные, представленные в настоящем исследовании, были получены от 5 человеческих сердец, полученных от пациентов с фибрилляцией предсердий в условиях терминальной стадии сердечной недостаточности после ортотопической трансплантации сердца по протоколу, одобренному Комиссией по биомедицинской этике Пресвитерианского госпиталя Нью-Йорка. Кроме того, данные также получали из образцов, взятых от 3 здоровых сердец, не подходящих для трансплантации. В момент трансплантации сердца консервировали холодным (4°С), гипокальцемическим, гиперкалиемическим кардиоплегическим раствором при выделении.

c) Иммунопреципитация и обратное фосфорилирование КуК2

Мембраны сердца (100 мкг), полученные из ткани левого предсердия (ЛП), как описано ранее (Магх, еТ а1., РКА РНокрНогу1аНоп Э1ккос1аТек РКВР12.6 Ггот 1Не Са1сшт Ке1еаке СНаппе1 (Куапобше КесерТог): ЭеГесбуе Кеди1абоп т РаШпд Неабк, Се11, 101:365-376, 2000) суспендировали в 0,5 мл буфера К1РА (50 мМ Тпк-НС1 [рН 7,4], 0,9% №С1, 0,25% Тритон 100х, 5 мМ NаΕ, и ингибиторы протеаз), и затем инкубировали с кроличьими анти-КуК2 антителами в течение ночи при 4°С. Добавляли шарики белка А сефарозы и позволяли инкубировать при 4°С в течение 1 ч. Горошины протеина А последовательно промывали 1х киназным буфером (50 мМ Тпк-НС1, 50 мМ пиперазин-уП-бис[2-этансульфоновой кислоты], 8 мМ МдС1, и 10 мМ ЕСТА [рН 6,8]) и затем ресуспендировали в 1,5х киназном буфере. Реакцию начинали с РКА (5 единиц), 100 мкМ МдАТФ, и [у³²Р]АТФ (ΝΕΝ Ь1£е 8с1епсек, ВокТоп); позволяли инкубироваться в течение 8 мин при комнатной температуре, и затем останавливали 5 мкл 6х нагрузочного буфера (4% 8Ό8 и 0,25 М ЭТТ). Образцы нагревали до 95°С и затем фракционировали по размеру на 6%

- 44 015010

8Э8-РАСЕ. Радиоактивность ВуВ2 определяли количественно с использованием молекулярного динамического фосфовизуализатора, и программой 1тадедиап! (АтегкИат РИагтааа В1о!есИ, Рекса!а^ау, N1). Значения делили на количество иммунопреципитированного ВуВ2 (определенное иммуноблоттингом и денситометрией), и выражали как обратное значение сигнала [у³²Р]АТФ.

б) Повторное связывание кальстабина2 (ЕКВР12.6) с 1ТУ-519

ВуВ2 иммунопрециптировали из 8В предсердий (100 мкг) и промывали 1х киназным буфером, как описано выше. Иммунопреципитированный ВуВ2 фосфорилировали РКА (5 единиц) и 100 мкМ МдАТФ при комнатной температуре и реакцию терминировали после 8 мин промыванием ледяным буфером В1РА. Рекомбинантный кальстабин2 (ЕКВР12.6; 200 нМ) последовательно инкубировали с фосфорилированным ВуВ2 при комнатной температуре в присутствии или отсутствие производного 1,4бензотиазепина, ЛУ-519 (1 мкМ). После промывки реакционной смеси буфером В1РА, белки фракционировали по размеру посредством 15% 8Ό8 РАСЕ и иммуноблоттировали в отношении кальстабина2 (ЕКВР12.6).

Ниже суммированы результаты, полученные авторами изобретения в связи с экспериментами примера 8.

Регуляция предсердного КуК2

Предсердный ВуВ2 РКА фосфорилировали (фиг. 8А) в соответствии с вышеуказанными методиками. РКА фосфорилирование предсердного ВуВ2 снижало количество кальстабина2 (ЕКВР12.6) в макромолекулярном комплексе ВуВ2, что определяли совместной иммунопреципитацией (фиг. 8С). Предсердный макромолекулярный комплекс ВуВ2 включал кальстабин2 (ЕКВР12.6), каталитическую субъединицу РКА, РКА регуляторную субъединицу (В11), РР2А, РР1, и шАКАР (фиг. 8В), о чем ранее сообщали для желудочковых ВуВ2 (Магх е! а1., РКА р1юкр1югу1а1юп б1ккоаа!ек ЕКВР12.6 Ггот Фе са1сшт ге1еаке сНаппе1 (гуапобте гесер!ог): беГесбуе гедЫайоп ш ГаШпд Ееайк. Се11, 101:365-76, 2000).

РКА гиперфосфорилирование рецептора рианодина при фибрилляции предсердий

РКА фосфорилирование иммунопреципитированного ВуВ2 увеличивалось на 130% в предсердной ткани собак с постоянной фибрилляцией предсердий (ФП) по сравнению с контролем (п = 6 для ФП, п = 6 для контроля, Р < 0,001; фиг. 9А). Связывание кальстабина2 (ЕКВР12.6) с ВуВ2 снижалось на 72% в ткани предсердий от собак с постоянной ФП, относительно контроля (п = 7 для ФП, п = 6 для контроля, Р < 0,0005; фиг. 9А).

Подобным образом РКА фосфорилирование иммунопреципитированного ВуВ2 было увеличено на 112% в ткани предсердий от людей с хронической фибрилляцией предсердий, в условиях сердечной недостаточности, по сравнению с контролем (п = 5 для ФП, п = 3 для контроля, Р = 0,002; фиг. 9В). Связывание кальстабина2 (ЕКВР12.6) с ВуВ2 было снижено на 70% (п = 5 для ФП, п = 3 для контроля, Р < 0,0001; фиг. 9В).

Для всех экспериментов обратного фосфорилирования и совместной иммунопреципитации общее количество нагруженного ВуВ2 подтверждали параллельным иммуноблотом иммунопреципитированного ВуВ2 с анти-ВуВ2-5029 антителом (фиг. 9А и 9В).

Функция канала рианодинового рецептора в сердце

Для определения физиологической значимости ВуВ2 РКА гиперфосфорилирования, которое наблюдали у собак с ФП, получали оценку отдельных каналов ВуВ2 в условиях фиксации потенциала, на 0 мВ в плоских бислоях липидов, с использованием симметричных ионных условий. Свойства отдельных каналов ВуВ2 предсердий исследовали в 17 каналах от 5 собак с ФП, и в 11 каналах от 5 контрольных собак. Каналы от контрольных собак не продемонстрировали повышенной активности, тогда как 15 из 17 каналов (88%) от собак с ФП показали существенно повышенную вероятность открытия (Р_о; ФП: 0,412 ± 0,07; контроль: 0,008 ± 0,002; Р < 0,001) и частота раскрытия (Е_о; ФП: 21,9 ± 4,6; контроль: 1,6 ± 0,6 к^-1; Р < 0,002 (фиг. 10А и 10В).

Кальстабин2 повторное связывание РКБР12.6 в присутствии 6ТУ-519

Обработка ЛУ-519 (1 мМ), позволяла рекомбинантному кальстабину2 (ЕКВР12.6) связываться с РКА-фосфорилированными ВуВ2, которые были выделены из нормального миокарда собак. В отсутствие ЛУ-519, кальстабин2 (ЕКВР12.6) был неспособен ассоциироваться с РКА-фосфорилированным ВуВ2 в таких экспериментах (фиг. 11В).

Физиологическая значимость повторного связывания ЕКВР-12.6 в присутствии ЛУ-519 была продемонстрирована оценками отдельных каналов ВуВ2 в плоских липидных бислоях. В присутствии только рекомбинантного кальстабина2 (ЕКВР12.6), выделенные каналы продемонстрировали заметнонарушенное поведение с повышенной вероятностью открытия (Ро) и присутствием состояний расщепления. Такие нарушения функции каналов не наблюдали, когда добавляли специфический ингибитор РКА (РК1), указывая, что наблюдаемые нарушений функции каналов были специфичными для фосфорилирования ВуВ2 РКА. Когда РКА-фосфорилированные каналы обрабатывали ЛУ-519, в присутствии рекомбинантного кальстабина2 (ЕКВР12.6), оценки отдельных каналов были подобными таковым, наблюдаемым в присутствии РК1 (фиг. 11А) .

Пример 9. Синтез промежуточного продукта 1,4-Бензотиазепина и ЛУ-519

- 45 015010

Для экспериментов ίη νίνο авторам потребовалось количество грамм 1ТУ-519. Однако исходные попытки получить такое соединение посредством сообщаемого промежуточного соединения 1,4бензотиазепина, 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1, 4-бензотиазепина (соединение 6 в схеме 1, ниже), были безуспешными. Тиогруппы такого промежуточного продукта легко окисляются воздухом до дисульфидного соединения, что делает синтез циклизованного продукта (5) невозможным. Чтобы преодолеть такую проблему, авторы изобретения разработали новый способ, который начинается с легкодоступной и недорогой 2-нитро-5-метоксибензойной кислоты (1). Этот способ изображен на схеме 1 ниже.

Восстановление нитрогруппы соединения (1), с использованием Н2 с Рб/С в качестве катализатора, давало 2-амино-5-метоксибензойную кислоту (2) в количественном выходе. Соединение (2) диазотировали NаNο₂ и затем обрабатывали №₂8₂ для получения стабильного дисульфидного соединения (3) с выходом 80%. Без последующей очистки, стабильный дисульфид (3) обрабатывали 8ОС1₂ и затем подвергали реакции с 2-хлорэтиламином, в присутствии Εΐ₃Ν, для получения амида (4) с выходом 90%. Соединение (4) преобразовывали в циклизованное соединение (5) посредством однотигельного способа нагревания в колбе с обратным холодильником с триметилфосфином и Εΐ₃Ν в ТГФ. Затем циклизованный амид (5) восстанавливали ЫА1Н₄ для получения 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина (6).

Схема 1

1ТУ-519 получали реакцией соединения (6) с 3-бромпропионовым хлоридом и затем реакцией полученного продукта с 4-бензилпиперидином. Структуру 1ТУ-519 устанавливали ¹Н ЯМР.

Пример 10. Синтез меченного радиоактивной меткой 1ТУ-519

Новый процесс по изобретению для синтеза меченного радиоактивной меткой 1ТУ-519 изображен на схеме 2 ниже. Для получения меченного радиоактивной меткой 1ТУ-519, 1ТУ-519 диметилировали в фенильном цикле с использованием ВВг₃ для получения фенольного соединения (21). Фенольное соединение (21) реметилировали меченным радиоактивной меткой метилирующим агентом (³Ндиметилсульфат) в присутствии основания (№1Н) для получения ³Н-меченного 1ТУ-519 (схема 2).

Схема 2

Пример 11. Новые производные 1,4-бензотиазепина и способы для их синтеза

Авторы изобретения также разработали новые производные 1,4-бензотиазепина для применения в лечении и предотвращении сердечных аритмий. В частности, авторы изобретения получили соединения, имеющие следующую общую структуру:

где В = арил, алкенил, алкил, -(СН₂)_иНВ'₂, или -(СН₂)_и8В', и η = 0, 1, 2, или 3; и где В' = алкил или циклоалкил. Новые соединения такой общей структуры получали реакцией 7-метокси-2,3,4,5тетрагидро-1,4-бензотиазепина с алкилсульфонилхлоридом или арилсульфонилхлоридом, в присутствии основания, такого как Εΐ₃Ν. Дополнительные реакции (например, добавление 4-бензилпиперидина) могут быть проведены для удлинения боковой цепи при желании. Характерный синтез такого общего способа изображен на схеме 3 ниже.

- 46 015010

Как демонстрирует схема 3, 2-хлорэтансульфонилхлорид (180 мг; 1,1 мМ) и Е1^ (140 мг; 1,1 мМ) добавляли к 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепину (1) (194 мг; 1 мМ) в СН₂С1₂ (20 мл), при 0°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение 2 ч и промывали Н₂О и насыщенным раствором №1НС.'О₃. Удаление растворителя давало сырой продукт (1а), который очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир: этилацетат = 3:1). Выход из этого синтеза был 280 мг или 95%. Структуру подтверждали ЯМР.

Схема 3 далее показывает, что боковую цепь соединения (1а) удлиняли реакционным соединением (la) (28 мг; 0,1 мМ) с 4-бензилпиперидином (21 мг; 0,13 мМ) в СН₂С1₂. После того как реакция подходила к завершению (по ТЖХ), избыток амина удаляли поглотителем оснований (3-(2-янтарный ангидрид)пропилфункционализированный силикагель, 0,5 г). ¹Н ЯМР и ВЭЖХ показали, что чистота продукта (lb) составила >98%.

Схема 3

Кроме того, авторы изобретения получили соединения, имеющие следующую общую структуру:

где В = арил, алкил, -(СН₂)_пХВ'₂, или -(СН₂)_п8В', и η = 0, 1, 2 или 3; и где В' = алкил или циклоалкил. Новые соединения такой общей структуры получали однотигельной реакцией 7-метокси-2,3,4,5тетрагидро-1,4-бензотиазелина (1) с сульфурилхлоридом, в присутствии основания (Βί₃Ν), с последующим первичным или вторичным амином. Характерный синтез такого общего способа изображен на схеме 4 ниже.

Как демонстрирует схема 4, сульфурилхлорид (15,0 мг; 0,111 мМ) и Е1^ (28,0 мг; 0,22 мМ) добавляли к 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепину (1) (19,4 мг; 0,1 мМ) в СН₂С1₂ (20 мл), при 0°С. После перемешивания смеси в течение 2 ч при 0°С, добавляли 1-пиперонилпиперазин (27 мг; 0,12 мМ). Смесь перемешивали в течение еще 2 ч, затем промывали Н₂О и насыщенным раствором NаНСО₃. Избыток амина удаляли добавлением поглотителя оснований (3-(2-янтарный ангидрид)пропилфункционализированный силикагель, 0,2 г). Выход такого синтеза был 36 мг или 77%.

Схема 4

Авторы изобретения также получили соединения, имеющие следующую общую структуру:

где В = СО(СН₂)_пХВ' ''₂, 8О₂(СН₂)_пХВ' ₂ или 8ΟΧΉ (СН₂)_пХВ'₂, и X = N или 8, и η = 1, 2, или 3. Новые соединения такой общей структуры получали окислением 1ТУ-519 или одного из новых производных 1,4-бензотиазепина, описанных выше, перекисью водорода. Характерный синтез такого общего способа изображен на схеме 5 ниже.

Как показывает схема 5 соединение (1Ь) (21 мг; 0,05 мМ) в МеОН (5 мл) добавляли к Н₂О₂ (0,1 мл, избыток). Смесь перемешивали в течение 2 дней, и продукт III очищали хроматографией на силикагеле (СН₂С1₂:МеОН = 10:1). Выход из этого синтеза был 19 мг или 91%.

Схема 5

Наконец, авторы изобретения получали соединения, имеющие следующие общие структуры:

- 47 015010

где В = арил, алкил, -(СН₂)_пИК'₂, -(СН₂)_п8В', и п = 0, 1, 2, или 3, и В' = алкил, циклоалкил; и где X = ΝΗ или О. Новые соединения такой общей структуры получали реакцией 7-метокси-2,3,4,5-тетрагидро1,4-бензотиазепина (1) с трифосгеном в присутствием основания (Ε!₃Ν), с последующим добавлением первичного или вторичного амина или спирта. Характерный синтез такого общего способа изображен на схеме 6 ниже.

Схема 6

Пример 12. Анализ для высокопроизводительного скрининга

Авторы изобретения разработали анализы для скрининга биологически активных небольших молекул. Такие анализы основаны на повторном связывании белка ЕКВР12 с ВуВ.

Высокоэффективный анализ для высокопроизводительного скрининга небольших молекул может быть разработан иммобилизацией ЕКВР12.6 (С8Т-сшитый белок) на 96-луночном планшете, покрытом глютатионом. РКА-фосфорилированный рецептор рианодина типа 2 (ВуВ2) нагружали на планшеты, покрытые ЕКВР12.6, и инкубировали с аналогами 1ТУ-519 в различных концентрациях (10-100 нМ) в течение 30 мин. Затем планшет промывали для удаления несвязавшегося ВуВ2 и затем инкубировали с анти-ВуВ2 антителом в течение 30 мин. Планшет снова промывали для удаления несвязавшегося антиВуВ2 антитела и затем обрабатывали флуоресцентно-меченным вторичным антителом. Планшет считывали автоматическим флуореметрическим счетчиком планшетов в отношении связывающей активности.

В альтернативном анализе, ВуВ2 является РКА-фосфорилированным в присутствии ³²Р-АТФ. Радиоактивные РКА-меченные ВуВ2 нагружали на покрытые ЕКВР12.6, 96-луночные планшеты, в присутствии аналогов 1ТУ-519 в различных концентрациях (10-100 нМ) в течение 30 мин. Планшеты промывали для удаления несвязавшегося меченного радиоактивной меткой ВуВ2 и затем считывали автоматическим счетчиком планшетов.

Пример 13. Новые производные 1,4-бензотиазепина обеспечивают повторное связывание ЕКВР12.6 с ВУК2

Саркоплазматическую сеть сердца (8В) фосфорилировали РКА в течение 30 мин при комнатной температуре, приводя к полной диссоциации ЕКВР12.6 из комплекса ВуВ2. 8В (50 мг) затем инкубировали в течение 30 мин, при комнатной температуре с 250 нМ ЕКВР12.6 и тестируемым соединением. Образцы центрифугировали при 100000 д в течение 10 мин, и осадок промывали 3 раза 10 мМ имидазольным буфером. После промывки белки разделяли 15% РАСЕ. Получали иммуноблоты с использованием анти-ЕКВР антитела. Результаты этого исследования указаны на фиг. 12.

Пример 14. Запись телеметрии и исследование физической нагрузки/ЭКГ у мышей

Исследования проводили с мышами ЕКВР12,6^+/- (группа вмешательства), подобранными по возрасту и полу мышами ЕКВР12,6^-/- (положительный контроль), и мышами дикого типа ЕКВР12.6^+/+ (отрицательный контроль). Отсутствие (ТКВР12,6^-/-) или снижение (ЕКВР12, 6^+/-) белка ЕКВР12.6 было продемонстрировано иммуноблоттингом ткани сердца. Непрерывная подкожная инфузия лекарственного средства 1ТУ-519 (с целевой концентрацией в плазме 1,0 мкМ) или производного, 836 (с целевой концентрацией в плазме 1,0 или 0,02 мкМ) , мышам ЕКВР12,6^+/- или мышам ЕКВР12.6^-/- проводили посредством мини-осмотической помпы, со скоростью 1,0 мкл в час, в течение 7 дней перед исследованием физической нагрузки (Аке! Энгес! Со., Сирейто, СА). Мышей анестезировали с использованием интраперитонеальной инъекции кетамина (50 мкг/кг) и ксилазина (10 мкг/кг), и имплантировали радио-ЭКГ передатчики. Записи радиотелеметрии ЭКГ амбулаторных животных получали через 1 неделю после интраперитонеальной имплантации (Эа!а 8с1епсек 1п!ета!юпа1, 8!. Раи1, ΜΝ). Стандартные критерии использовали для измерения ЭКГ параметров.

Для исследования стресса мышей подвергали физической нагрузке на наклонном стенде, пошагово, до усталости, и затем интраперитонеально вводили эпинефрин (0,2 мг/кг) для максимальной симпатической стимуляции. Затем частоту сердечных сокращений в покое амбулаторных животных усредняли в течение 4 ч. Восстановление после исследования физической нагрузки и мониторинг события после физической нагрузки проводили в течение ночи. Длина синусового цикла (8СЬ) и интервалы РВ, ОР8, и ОТ измеряли и скорректированный на частоту интервал ОТ (ОТс) рассчитывали с использованием формулы Митчелла. Уровень лекарственного средства в плазме подтверждали ВЭЖХ. Результаты суммированы на фиг. 13.

Пример 15. 1ТУ-519 улучшает сократимость сердца в модели сердечной недостаточности у крыс

Крыс подвергали инфаркту миокарда (ИМ) посредством перевязки левой коронарной артерии. Лечение 1ТУ-519 (п = х) или растворителем (п = х) с использованием имплантируемых осмотических помп

- 48 015010 (А1хе1. Энгес! Согрощйоп, Сирейто, СА) начинали непосредственно после ИМ. Диаметры миокарда во время систолы (Эк) и диастолы (Όά) определяли на средне-сосочковом уровне с использованием эхокардиографии через 24 ч и 6 недель после ИМ; затем рассчитывали парциальное укорочение. Как показано на фиг. 14, лечение ТТУ-519 значительно улучшало функцию сердца у крыс с сердечной недостаточностью.

Тогда как вышеуказанное изобретение было описано в некоторых деталях для целей ясности и понимания, необходимо понимать специалисту в области техники из прочитывания описания, что различные изменения в форме и деталях могут быть сделаны без отклонения от истинных рамок изобретения в приложенной формуле изобретения.

Claims (36)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (а) где В = арил, алкенил, алкил, -(СНД^кВг или -(СН₂)_п8В' и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; или их окисленные производные.
2. 2. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (Ь) где В = арил, алкенил, алкил, -(СНД^кВг или -(СН₂)_п8В' и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; или их окисленные производные.
3. 3. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (с) где В = СО(СН2)пМВ'2, 8О2(СН2)пМВ'2, 8О2МН(СН2)п1ЧВ'2, СО(СЩ)п8В', 8О2(СЩ)п8В' или 8О₂ИН(СН₂)_п8В' и η = 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где т = 1 или 2; или их окисленные производные.
4. 4. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (ά) где В = арил, алкил, -(СНЭ^кВг, -(СН₂)_п8В' и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил; и где X = ΝΉ или О; или их окисленные производные.
5. 5. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (е) (е) где В1 = ОВ', 8В', ^В')₂, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и В' = алкил, арил или Н; где В2 = алкил или арил; и где В3 = Н или арил; или их окисленные производные.
6. 6. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (Г) где В1 = Н, ОВ', 8В', ^В')₂, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и В' = алкил, арил или ацил; где В2 = алкенил или арил; где В3 = алкил, алкенил или арил; где т = 0, 1 или 2; и где η = 0 или 1; или их окисленныепроизводные.

   - 49 015010
7. 7. Производные 1,4-бензотиазепина общей формулы (д) где В1 = Н, ОВ', 8В', Ν(Β')2, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и В' = алкил, арил или ацил; где В₂ = Н, алкил, алкенил или арил; где В₃ = Н, алкил, алкенил или арил; где В₄ = галоид, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8 или I; и где т = 0, 1 или 2; или их окис ленные производные.
8. 8. Производные 1,4-бензотиазепина, выбранные из группы О

   - 50 015010 и их окисленные производные.
9. 9. Соединение по п.7, представляющее собой соединение формулы где В1 = ОВ', 8В', Ν(Β')₂, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца;

   В' = алкил, арил или ацил;

   В2 = Н, алкил, алкенил или арил;

   В3 = Н, алкил, алкенил или арил;

   В₄ = галоид, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8 или I, и т = 0, 1 или 2;

   или его окисленное производное.
10. 10. Соединение по п.2, где В! = ОВ' в положении 7 бензотиазепинового кольца, т = 0 или 1, и В' = алкил.
11. 11. Соединение по п.9 или 10, где В₂ = Н и В₃ = Н.
12. 12. Соединение по любому из пп.9, 10 или 11, где В₄ = карбоновая кислота или алкил, содержащий I, и В' = метил.
13. 13. Соединение по п.8, представляющее собой 836 или его окисленное производное.
14. 14. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый носитель, добавку или разбавитель.
15. 15. Фармацевтическая композиция по п.14, дополнительно содержащая один или более компонентов, представляющих собой антиоксидант, краситель, ароматизатор, консервант, подсластитель, связывающий агент или смазывающий агент, и где носитель представляет собой карбоксиметилцеллюлозу, кристаллическую целлюлозу, глицерин, гуммиарабик, лактозу, стеарат магния, метилцеллюлозу, солевой раствор, альгинат натрия, сахарозу, крахмал, тальк или воду, и фармацевтическая композиция находится в форме капсулы, таблетки, порошка, гранулы или суспензии.
16. 16. Способ ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР 12.6 у субъекта, который страдает заболеванием сердца, включающий введение субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-13 или соединения, выбранного из группы, состоящей из 824, 825, 826, 827, или его окисленного производного.

    - 51 015010
17. 17. Способ лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-13 или соединения, выбранного из группы, состоящей из 824, 825, 826, 827, или его окисленного производного.
18. 18. Способ по п.16 или 17, где заболевание сердца представляет собой сердечную аритмию, тахикардию, предсердную аритмию, предсердную тахиаритмию, фибрилляцию предсердий, постоянную фибрилляцию предсердий, непостоянную фибрилляцию предсердий, желудочковую аритмию, фибрилляцию желудочков, вентрикулярную тахикардию, постоянную вентрикулярную тахикардию, непостоянную вентрикулярную тахикардию, катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию (СРУТ), сердечную недостаточность, внезапную кардиальную смерть или кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.
19. 19. Способ по любому из пп.16-19, где соединение выбирают из группы, состоящей из соединений 21, Ы, II, III, 81, 84, 86, 87, 820, 836, или его окисленного производного.
20. 20. Способ предупреждения сердечной аритмии у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества средства, представляющего собой соединение формулы <О)гп (8) где В1 = Н, ОВ', 8В', Ν(Β')2, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и В' = алкил, арил или ацил; где В₂ = Н, алкил, алкенил или арил; В₃ = Н, алкил, алкенил или арил; В₄ =

    H, галоид, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8, или I; и т = 0, 1 или 2; или соединение, выбранное из группы, содержащей соединения 21, Ы, II, III, 81, 84, 86, 87, 820, 824, 825, 826, 827, 836, или его окисленные производные.
21. 21. Способ по любому из пп.16-20, где субъект является человеком и эффективное количество соединения определяется как одно или более нижеследующих условий:

    (a) от примерно 5 до примерно 20 мг/кг/день, (b) количество, обеспечивающее концентрацию в плазме субъекта от примерно 0,02 до примерно

    I, 0 мкМ, (c) количество, обеспечивающее концентрацию в плазме субъекта от примерно 300 до примерно 1000 нг/мл, (б) количество, достаточное для повышения связывания РКВР 12.6 с ВуВ2 у субъекта, или (е) количество, эффективное для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта.
22. 22. Способ по п.20 или 21, где соединение выбирают из группы, содержащей соединения 21, Ы, II, III, 81, 84, 86, 87, 820 и 836, или их окисленного производного.
23. 23. Способ по любому из пп.20-22, где соединение представляет собой соединение 836.
24. 24. Применение соединения по любому из пп.1-13 или соединения, выбранного из группы, содержащей соединения 824, 825, 826, 827, и их окисленного производного для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР 12.6 у пациента, страдающего заболеванием сердца.
25. 25. Применение соединения по любому из пп.1-13 или соединения, выбранного из группы, содержащей соединения 824, 825, 826, 827, и их окисленного производного для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта.
26. 26. Применение соединения по любому из пп.1-13 или соединения, выбранного из группы, содержащей соединения 824, 825, 826, 827 и их окисленного производного для приготовления лекарственного средства для ограничения или предотвращения снижения уровня ВуВ2-связанного РКВР 12.6 у пациента, страдающего заболеванием сердца, или для лечения или предотвращения заболевания сердца у субъекта.
27. 27. Применение по любому из пп.24-26, где заболевание сердца представляет собой сердечную аритмию, тахикардию, предсердную аритмию, предсердную тахикардию, фибрилляцию предсердий, постоянную фибрилляцию предсердий, непостоянную фибрилляцию предсердий, вентрикулярную фибрилляцию, вентрикулярную тахикардию, постоянную вентрикулярную тахикардию, непостоянную вентрикулярную тахикардию, катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию (СРУТ), сердечную недостаточность, внезапную кардиальную смерть или кардиальную смерть, индуцированную физической нагрузкой.
28. 28. Применение по любому из пп.24-27, где субъектом является человек и соединение выбирают из группы, содержащей соединения 21, Ы, II, III, 81, 84, 86, 87, 820 и 836, или их окисленного производного.
29. 29. Применение соединения формулы (д) или соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений 21, Ы, II, III, 81, 84, 86, 87, 820, 824, 825, 826, 827, 836, или их окисленных производных для предотвращения сердечной аритмии у субъекта

    - 52 015010 где К1 = Η, ОК', 8К', Ν(Ε.')2, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и К' = алкил, арил или ацил; где К2 = Η, алкил, алкенил или арил; К3 = Η, алкил, алкенил или арил; К4 = Η, галоид, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8 или I; и т = 0, 1 или 2.
30. 30. Применение соединения формулы (д) или соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений 21, й, II, III, 81, 84, 86, 87, 820, 824, 825, 826, 827, 836, или их окисленных производных для приготовления лекарственного средства для предотвращения сердечной аритмии у субъекта где К1 = Η, ОК', 8К', Ν(Ε.')2, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового кольца, и К' = алкил, арил или ацил; где К2 = Η, алкил, алкенил или арил; К3 = Η, алкил, алкенил или арил; К4 = Η, галоид, карбоновая кислота или алкил, содержащий О, 8 или I; и т = 0, 1 или 2.
31. 31. Применение по п.29 или 30, где субъектом является человек и соединение выбирают из группы, содержащей соединения 21, й, II, III, 81, 84, 86, 87, 820 и 836, или их окисленного производного.
32. 32. Применение по любому из пп.24-31, где соединение представляет собой соединение 836.
33. 33. Способ получения соединения формулы где К = арил, алкенил, алкил, -(ΘΗ^ΝΕ^ или -(СИг^ВК' и η = 0, 1, 2 или 3, т = 0, 1 или 2, и К' = алкил или циклоалкил, включающий стадии:

    (а) обработки соединения формулы производным сульфонилхлорида и основанием для получения соединения формулы (Ъ) в случае необходимости, окисления соединения, полученного на стадии (а), для получения соединения формулы где т = 1 или 2.
34. 34. Способ по п.33, где соединение, полученное на стадии (а), представляет собой дополнительно включающий стадию (а-1) между стадией (а) и стадией (Ъ), которая представляет собой обработку соединения, полученного на стадии (а), первичным или вторичным амином с образова- 53 015010 нием соединения формулы где В = -(СН₂)^(В')₂; η = 2 и В' определен в п.1.
35. 35. Способ получения соединения формулы где В = арил, алкил, -(СН₂)_иНВ'₂ или -(СН₂)_и8В' и η = 0, 1, 2 или 3, и В' = алкил или циклоалкил, X = №Н или О, включающий стадию обработки соединения формулы карбонилхлоридом в присутствии основания и первичным или вторичным амином или спиртом, для получения соединения формулы
36. 36. Способ получения производного 2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепина, имеющего формулу где В1 = ОВ', 8В', NΒ'₂, алкил или галоид в положении 6, 7, 8 или 9 бензотиазепинового цикла, и В' = алкил, арил или Н; где В2 = Н, алкил или арил; и где В3 = Н, алкил или арил, включающий стадии:

    (а) обработки соединения формулы восстанавливающим агентом, необязательно в присутствии катализатора, для получения соединения формулы (Ь) обработки соединения, полученного на стадии (а) диазотирующим агентом и дисульфидом для получения соединения формулы (с) обработки соединения, полученного на стадии (Ь), активирующим агентом и хлорэтиламином для получения соединения формулы

    О К₃ (б) обработки соединения, полученного на стадии (с), восстанавливающим агентом и основанием для получения соединения формулы

    - 54 015010

    О и

    (е) обработки соединения, полученного на стадии (ά), восстанавливающим агентом для получения соединения формулы <Г в покое

    РКВР12Л**

    ЧСС=546 уд/мин

    РКВР 12.6 + ДО519

    ЧСО570 уд/мИН

    С. Внезапная кардиальная смерть Постоянная ЖТ Непостоянная ЖТ лу>м» □τν-βτβ лулв ату-513 лу-яв № мышей ало «в кв ββ до от и

    Фиг. 1

    - 55 015010 генотал * физическая нагрузка + ЛУ4И9 ясвр12.в«л

    Ро 0.005, Т017.2 “> , Тс 3854·*

    ΕΚΒΡ1Ζ6Α ЛУ-$19

    ТЯк *Р»ч ί

    ΡοΟ,Μί,ΤοΚ.Ί мс Тс З У ™ ··*» — ............

    '»>' С* Ι»^»»τ«·4»* I · ОЧ.тЫ»· ПК.»»·-·'

    Фиг. 2

    - 56 015010

    4ГУ-519 (ИМ) 0 0 10 100 1000 РКА ♦ ♦ ♦ + ΡΚΙ + - - - • ЕКВР 12.6 - ♦ + ♦ +

    в ЛУ-519 (НМ) в 0 10 100 1000 ЯуЯ2-528090 - * ♦ ♦ + НуВ2-УГГ + • - - - РКВР12.6 + + ♦ + РКВР12.6 | 4ΐί 7Г ι<- · .<

    . 1,:

    ί'.,χ-Αί :

    Фиг. 3

    Фиг. 4

    Фиг. 5

    - 57 015010

    Ложно-оперированные

    Ро 0,003, То 5.1 мс , Тс 1426 мс _с:ли______ ₀:_лл__,

    Сердечная недостаточность

    Ро 0.112, То 10.8 мс, Тс 25.3 мс

    Сердечная недостаточность+ 4Τν519

    Ро 0.005, То 4.9мс , Тс 1150мс _с:иг„ти.

    Фиг. 6

    А 477-619 (нМ) 0 0 10 100 1000 ДОЗДГТ + РКА * 4 + ♦ ΡΚΙ * - * • > Капьста6ин2 (РКВР19.6) • ♦ * ♦ +

    Р РКА+КтипМ (№№12.6) р» мет, тп 1г.· « , тс и.» ш

    С 1 4 рА вдикыъыаеинг (ΡΚΒΡ12.Β}+υτν5ΐ®

    РО 0.004, То 6.1 * , Тс 1150^

    С > 4 рА

    С с

    Фиг. 7

    - 58 015010

    Ингибитор РКА

    Яу№2

    ПуН2: иммуноблат ΙΡ

    Фиг. 8

    4 -ЯуЙЬ иммуноЗпот ΙΡ > кДа ^и а» «Да

    Фиг. 9

    - 59 015010

    Фиг. 10

    Фиг. 11

    Фиг. 12

    - 60 015010

    Фиг. 13

    Фиг. 14

    - 61 015010

    8-24

    Фиг. 15