PL206833B1 - Przeciwciało, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, rekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompozycja, przeciwciało i kompozycja do zastosowania w diagnostyce lub terapii - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 206833 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 360438 (22) Data zgłoszenia: 07.08.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

07.08.2001, PCT/US01/024785 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

14.02.2002,WO02/12502 (51) Int.Cl.

A61K 39/395 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01) C07K 16/24 (2006.01) C07K 16/42 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01)

Przeciwciało, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, rekombinowany wektor, (54) komórka gospodarza, kompozycja, przeciwciało i kompozycja do zastosowania w diagnostyce lub terapii (30) Pierwszeństwo:

07.08.2000, US, 60/223,360 29.09.2000, US, 60/236,826 01.08.2001, US, 09/920,137 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

06.09.2004 BUP 18/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.09.2010 WUP 09/10 (73) Uprawniony z patentu:

CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC., Horsham, US (72) Twórca(y) wynalazku:

JILL GILES-KOMAR, Downingtown, US DAVID M. KNIGHT, Berwyn, US GEORGE HEAVNER, Malavern, US BERNARD SCALLON, Collegeville, US DAVID SHEALY, Downingtown, US (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Marta Kawczyńska

PL 206 833 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca polinukleotydy kodujący takie przeciwciało, rekombinowany wektor zawierający taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórka gospodarza zawierająca taką cząsteczkę kwasu nukleinowego albo taki wektor, kompozycja zawierająca takie przeciwciało oraz przeciwciało i kompozycja do zastosowania w diagnostyce lub terapii.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał, specyficznych dla białka czynnika martwicy nowotworu (TNF) alfa.

Stan techniki

TNF alfa jest rozpuszczalnym homotrimerem składającym się z białkowych podjednostek o masie 17 kD (Smith i wsp., J. Biol. Chem. 262:6951-6954 (1987)). Istnieje także związana z błoną prekursorowa forma TNF o masie 26 kD (Kriegler i wsp. Cell 53:45-53 (1988)). W celu zapoznania się z artykuł ami przeglą dowymi na temat TNF zobacz Beutler i wsp., Nature 320:584 (1986); Old, Science 230:630 (1986) i Le i wsp., Lab. Invest. 56:234 (1987).

Komórki inne niż monocyty lub makrofagi także wytwarzają TNF alfa. Na przykład, TNF alfa jest produkowany przez ludzkie niemonocytarne nowotworowe linie komórkowe (Rubin i wsp., J. Exp. Med. 164:1350 (1986); Spriggs i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6563 (1987)). TNF alfa wytwarzają także limfocyty T z krwi obwodowej CD4+ i CD8+ i niektóre hodowane linie komórkowe limfocytów T i B (Cuturi i wsp., J. Exp. Med. 165:1581 (1987); Sung i wsp., J. Exp. Med. 168:1539 (1988); Turner i wsp., Eur. J. Immunol. 17:1807-1814 (1987)).

TNF alfa powoduje zmiany prozapalne, których skutkiem jest uszkodzenie tkanek, takie jak degradacja chrząstki i kości (Saklatvala, Nature 322:547-549 (1986); Bertolini, Nature 319:516-518 (1986)), indukcja cząsteczek adhezyjnych, w tym prokoagulacyjny wpływ na komórki śródbłonka naczyniowego (Pober i wsp., J. Immunol. 136:1680 (1986)), zwiększenie przylegania neutrofili i limfocytów (Pober i wsp., J. Immunol. 138:3319 (1987)) oraz stymulacja uwalniania z makrofagów, neutrofili i komórek ś ródbłonka naczyniowego czynnika aktywującego płytki krwi (Camussi i wsp., J. Exp. Med. 166:1390 (1987)).

Obecnie są dowody na powiązanie TNF alfa z infekcjami (Cerami i wsp., Immunol. Today 9:28 (1988)), chorobami immunologicznymi, patologiami nowotworowymi (Oliff i wsp., Cell 50:555 (1987)), patologiami autoimmunologicznymi i patologiami „przeszczep przeciwko gospodarzowi (Piguet i wsp., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). Udział TNF alfa w chorobach nowotworowych i patologiach infekcyjnych często jest związany ze stanem katabolizmu gospodarza. U pacjentów z chorobą nowotworową często dochodzi do znacznego zmniejszenia masy ciała, zazwyczaj związanego z anoreksją (brakiem apetytu).

Rozległe wyniszczenie, związane z nowotworem i innymi chorobami, zwane jest kacheksją (Kern i wsp., J. Parent. Enter. Nutr. 12:286-298 (1988)). Kacheksja obejmuje postępujące zmniejszanie masy ciała, anoreksję i ciągłą erozję beztłuszczowej masy ciała w odpowiedzi na wzrost nowotworu złośliwego. Stan kacheksji powoduje pogorszenie stanu chorobowego i zwiększenie śmiertelności związanej z nowotworem. Udowodniono, że TNF alfa jest zaangażowany w kacheksję w chorobach nowotworowych, patologiach infekcyjnych i innych stanach katabolicznych (zobacz na przykład Beutler i Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7:625-655 (1989)).

Przypuszcza się, że TNF alfa odgrywa główną rolę w posocznicy wywołanej bakteriami Gram-ujemnymi i wstrząsie endotoksycznym (Michie i wsp., Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debets i wsp., Second Vienna Shock Forum, str. 463-466 (1989); Simpson i wsp., Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989)), w tym w gorą czce, zł ym samopoczuciu, anoreksji i kacheksji. Endotoksyna silnie aktywuje produkcję i sekrecję TNF alfa oraz innych cytokin przez monocyty/makrofagi (Kornbluth i wsp., J. Immunol. 137:2585-2591 (1986)). TNF alfa i inne cytokiny produkowane przez monocyty pośredniczą w odpowiedzi metabolicznej i neurohormonalnej na endotoksyny (Michie i wsp., New Engl. J. Med. 318: 1481-1486 (1988)). Podawanie endotoksyny ochotnikom (ludziom) powoduje ostre zachorowanie z objawami podobnymi do grypy, takimi jak gorą czka, czę stoskurcz, zwię kszenie tempa przemian metabolicznych i uwalnianie hormonu stresu (Revhaug i wsp., Arch. Surg. 123:162-170 (1988)). U pacjentów z posocznicą wywołaną bakteriami Gram-ujemnymi dochodzi do zwiększenia stężenia krążącego TNF alfa (Waage i wsp., Lancet 1:355-357 (1987); Hammerle i wsp., Second Vienna Shock

PL 206 833 B1

Forum, str. 715-718 (1989); Debets i wsp., Crit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra i wsp., J. Infect. Dis. 161:982-987 (1990)).

TNF alfa jest zatem zaangażowany w choroby zapalne, choroby autoimmunologiczne, infekcje wirusowe, bakteryjne i pasożytnicze, nowotwory złośliwe i(lub) choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego i jest użytecznym celem specyficznej terapii biologicznej w chorobach takich, jak reumatoidalne zapalenie stawów i choroba Crohna. Stwierdzono pożądane skutki w otwartych próbach klinicznych z chimerowym przeciwciałem monoklonalnym rozpoznającym TNF alfa (cA2) objawiające się zahamowaniem stanu zapalnego i skutecznym leczeniem po nawrocie reumatoidalnego zapalenia stawów (Elliott i wsp., Arthritis Rheum. 36:1681-1690 (1993) i Elliott i wsp., Lancet 344:1125-1127 (1994)) i choroby Crohna (Van Dullemen i wsp., Gastroenterology 109:129-135 (1995)). Pożądane wyniki, obejmujące zahamowanie stanu zapalnego, uzyskano także w badaniu klinicznym z użyciem cA2, prowadzonym metodą randomizowanej, podwójnie ślepej próby z kontrolą placebo, w reumatoidalnym zapaleniu stawów (Elliott i wsp., Lancet 344:1105-1110 (1994)). Przeciwciała przeciwko czynnikowi „modulującemu, który scharakteryzowano jako kachektynę (która później okazała się identyczna z TNF) ujawnili Cerami i wsp. (publikacja patentowa EPO 0212489, 4 marca 1987).

Stwierdzono, że takie przeciwciała są użyteczne w diagnostycznych testach immunologicznych i terapii wstrząsu w infekcjach bakteryjnych. Rubin i wsp. (publikacja patentowa EPO 0218868, 22 kwietnia 1987) ujawnił przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiemu TNF, hybrydomy wydzielające takie przeciwciała, sposoby otrzymywania takich przeciwciał i zastosowanie takich przeciwciał w testach immunologicznych do oznaczania TNF. Yone i wsp. (publikacja patentowa EPO 0288088, 26 października 1988) ujawnił przeciwciała anty-TNF, w tym przeciwciała monoklonalne (mAb) i ich zastosowanie w immunodiagnostyce chorób, w szczególności patologii Kawasaki i infekcji bakteryjnych. W płynach ustrojowych pacjentów z chorobą Kawasaki (zespół ostrego zapalenia śluzówkowoskórno-węzłowego z gorączką u dzieci; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1985)) poziom TNF jest podwyższony, i to podwyższenie wykazuje związek z postę pem procesu patologicznego (Yone i wsp., jak wy ż ej).

Inni badacze opisali mAb specyficzne dla rekombinowanego ludzkiego TNF, wykazujące in vitro aktywność neutralizującą (Liang, C-M. i wsp. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, A. i wsp., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly i wsp., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, T. S. i wsp., Hybridoma 6:489-507 (1987); Hirai, M. i wsp., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987); Molier, A. i wsp. (Cytokine 2:162-169 (1990)). Niektórych z tych mAb użyto do mapowania epitopów ludzkiego TNF i opracowania immunologicznych testów enzymatycznych (Fendly i wsp., jak wyżej; Hirai i wsp., jak wyżej; Molier i wsp., jak wyżej) i do ułatwienia oczyszczania rekombinowanego TNF (Bringman i wsp., jak wyżej). Jednakże te badania nie dostarczają podstawy do produkcji przeciwciał neutralizujących TNF, które można byłoby wykorzystać w diagnostyce in vivo u człowieka z powodu immunogenności, braku specyficzności i(lub) odpowiedniego charakteru farmaceutycznego.

U ssaków innych niż człowiek wykazano, że neutralizujące surowice odpornościowe lub mAb przeciwko TNF znoszą niepomyślne zmiany fizjologiczne i chronią przed śmiercią po podaniu dawki śmiertelnej w eksperymentalnej endotoksemii i bakteriemii. Ten efekt wykazano np. w oznaczeniach śmiertelności na gryzoniach i w modelowych systemach patologii u naczelnych (Mathison, J. C. i wsp., J. Clin. Invest. 81:1925-1937 (1988); Beutler, B. i wsp., Science 229:869-871 (1985); Tracey, K. J. i wsp., Nature 330:662-664 (1987); Shimamoto, Y. i wsp., Immunol. Lett. 17:311-318 (1988); Silva, A. T. i wsp., J. Infect. Dis. 162:421-427 (1990); Opal, S. M. i wsp., J. Infect. Dis. 161:1148-1152 (1990); Hinshaw, L. B. i wsp., Circ. Shock 30:279-292 (1990)).

Przypuszczalne miejsce wiązania receptora przez hTNF zostało ujawnione przez Eck i Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), 17595-17605 (1989), którzy zidentyfikowali miejsca wiązania receptora przez TNF -α jako składające się z aminokwasów 11-13, 37-42, 49-57 i 155-157. Zgłoszenie PCT W091/02078 (data pierwszeństwa 7 sierpnia 1989) ujawnia ligandy TNF, które mogą wiązać się z przeciwciałami mającymi następujące epitopy: przynajmniej jeden z 1-20, 56-77 i 108-127; przynajmniej dwa z 1-20, 56-77, 108-127 i 138-149; wszystkie z 1-18, 58-65, 115-125 i 138-149; wszystkie z 1-18 i 108-128; wszystkie z 56-79, 110-127 i 135- lub 136-155; wszystkie z 1-30, 117-128 i 141-153; wszystkie z 1-26, 117-128 i 141-153; wszystkie z 22-40, 49-96 lub -97, 110-127 i 136-153; wszystkie z 12-22, 36-45, 96-105 i 132-157; zarówno 1-20 jak i 76-90; wszystkie z 22-40, 69-97, 105-128 i 135-155; wszystkie z 22-31 i 146-157; wszystkie z 22-40 i 49-98; przynajmniej jeden z 22-40, 49-98 i 69-97, zarówno 22-40 jak i 70-87. W WO 97/29131 ujawniono przeciwciała ludzkie, wiążące się z ludzkim

TNFa. Przeciwciała określa się jako przeciwciała o dużym powinowactwie do ludzkiego TNFa (war4

PL 206 833 B1 tość K_d 10^-8 M lub mniej), niewielkiej prędkości oddysocjowania od ludzkiego TNFa (wartość K_off 10^-3 s^-1 lub mniej) i zdolne do neutralizowania aktywności ludzkiego TNFa in vitro i in vivo.

Przeciwciała ssacze inne niż ludzkie, chimerowe, poliklonalne (np. surowice odpornościowe) i(lub) przeciwciała monoklonalne (MAb) i fragmenty (np. produkty trawienia proteolitycznego lub produkty ich fuzji białkowych) są potencjalnymi czynnikami terapeutycznymi, które bada się w niektórych przypadkach prób leczenia pewnych chorób. Jednakże takie przeciwciała lub fragmenty mogą wywoływać odpowiedź immunologiczną po podaniu ludziom. Skutkiem takiej odpowiedzi immunologicznej może być usuwanie przeciwciał lub fragmentów z krążenia poprzez kompleksowanie przez układ immunologiczny, co czyni powtórne podanie nieprzydatnym w terapii, zmniejszając przez to terapeutyczną korzyść dla pacjenta i ograniczając możliwość powtórnego podania przeciwciała lub fragmentu. Na przykład powtórne podanie przeciwciał lub fragmentów obejmujących fragmenty pochodzenia innego niż ludzkie może prowadzić do choroby posurowiczej i(lub) anafilaksji. W celu uniknięcia tych i innych problemów stosowano wiele metod, aby zmniejszyć immunogenność takich przeciwciał i ich fragmentów, w tym wytwarzanie chimer i humanizację, dobrze znane ze stanu techniki. Jednakże te i inne metody mogą nadal powodować pewną immunogenność przeciwciał i fragmentów, ich niskie powinowactwo, niską zachłanność wiązania lub problemy z hodowlą komórkową, zwiększeniem skali produkcji, produkcją i(lub) niską wydajnością. Takie przeciwciała lub fragmenty mogą być zatem niewystarczająco przystosowane do masowej produkcji lub zastosowania jako białka terapeutyczne.

Skutkiem tego istnieje potrzeba dostarczenia przeciwciał anty-TNF lub ich fragmentów, które pozwalałyby uniknąć przynajmniej jednego z tych problemów, jak również udoskonaleń w stosunku do znanych przeciwciał lub ich fragmentów.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało zawierające:

- regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego i zmienne regiony zrębowe (FR) przeciwciała mAb TNV148 jak opisano na Fig. 4; oraz

- regiony CDR łańcucha lekkiego i zmienne regiony FR przeciwciała mAb TNV148 jako opisano na Fig. 5;

- ewentualnie zawierające ponadto specyficzną substytucję proliny seryną w regionie FR3 przeciwciała mAb TNV148B jak opisano na Fig. 4.

Korzystnie przeciwciało zawiera regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego jednego z przeciwciał mAb TNV148 i mAb TNV148B jak opisano na Fig. 4 i 5.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że zawiera polinukleotyd kodujący przeciwciało jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowany wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono powyżej albo wektor jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało jak określono powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto przeciwciało jak określono powyżej albo kompozycja jak określono powyżej do zastosowania w diagnostyce lub terapii, korzystnie do zastosowania w leczeniu choroby związanej z układem immunologicznym.

Wynalazek dotyczy wyizolowanych, ludzkich, naczelnych, gryzoni, ssaczych i(lub) chimerowych przeciwciał anty-TNF, kompozycji zawierających przeciwciała anty-TNF, kodujących je kwasów nukleinowych, wektorów, komórek gospodarza, kompozycji, i ich zastosowania, jak opisano i przedstawiono tutaj w połączeniu z tym, co jest znane ze stanu techniki.

Przeciwciało według wynalazku może pochodzić od dowolnego ssaka bez ograniczenia do człowieka, myszy, królika, szczura, gryzonia, naczelnego lub ich kombinacji i tym podobne. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, zawierająca polinukleotyd kodujący przeciwciało według niniejszego wynalazku, rekombinowany wektor zawierający tę cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórka gospodarza zawierająca tę cząsteczkę kwasu nukleinowego lub wektor, kompozycja zawierająca przeciwciało i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik i przeciwciało lub kompozycja do zastosowania w diagnostyce i terapii, korzystnie, do stosowania w leczeniu chorób immunologicznych.

Niniejszy opis ujawnia izolowane cząsteczki kwasów nukleinowych, obejmujące komplementarny lub hybrydyzujący do niego polinukleotyd, kodujący specyficzne przeciwciała anty-TNF, obejmujący

PL 206 833 B1 przynajmniej jedną wyszczególnioną sekwencję, domenę, jej fragment lub wariant. Niniejszy opis ponadto ujawnia rekombinowane wektory zawierające te cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-TNF, komórki gospodarza, zawierające takie kwasy nukleinowe i(lub) rekombinowane wektory, jak również sposoby wytwarzania i(lub) stosowania takich kwasów nukleinowych kodujących przeciwciało, wektorów i(lub) komórek gospodarza.

Przynajmniej jedno przeciwciało według wynalazku wiąże przynajmniej jeden wyszczególniony epitop specyficzny dla przynajmniej jednego białka TNF, jego podjednostki, fragmentu, części lub ich dowolnej kombinacji. Przynajmniej jeden epitop może zawierać przynajmniej jeden region wiążący przeciwciało, który zawiera przynajmniej jeden fragment tego białka, przy czym epitop ten dogodnie składa się z przynajmniej 1-5 aminokwasów przynajmniej jednej jego części, takiej jak niebędąca ograniczeniem przynajmniej jedna funkcjonalna, zewnątrzkomórkowa, rozpuszczalna, hydrofilowa, zewnętrzna lub cytoplazmatyczna domena tego białka lub dowolna jego część.

Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedno izolowane przeciwciało anty-TNF, jak opisano tutaj, które wykazuje przynajmniej jedną aktywność taką, jak niebędące ograniczeniem hamowanie cząsteczek adhezyjnych produkowanych przez komórki indukowane przez TNF, hamowanie wiązania TNF z receptorem, poprawienie wskaźnika zapalenia stawów w modelu mysim, (zobacz np. Przykłady 3-7). Przeciwciało anty-TNF można więc zbadać według znanych sposobów pod względem odpowiednich aktywności takich, jak niebędąca ograniczeniem przynajmniej jedna aktywność biologiczna dla białka TNF.

Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jeden sposób ekspresji przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF w komórce gospodarza, obejmujący hodowanie komórki gospodarza, jak opisano tutaj, w warunkach, w których przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF ulega ekspresji w wykrywalnych i(lub) możliwych do oczyszczenia ilościach.

Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję zawierającą (a) wyizolowany kwas nukleinowy kodujący przeciwciało anty-TNF i(lub) przeciwciało, jak opisano tutaj; i (b) odpowiedni nośnik lub rozcieńczalnik. Nośnik lub rozcieńczalnik opcjonalnie może być dopuszczalny farmaceutycznie, stosownie do znanych nośników i rozcieńczalników. Kompozycja może opcjonalnie zawierać przynajmniej jeden dalszy związek, białko lub kompozycję.

Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję z przeciwciałem anty-TNF do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce w celu modulowania lub leczenia przynajmniej jednej związanej z TNF choroby w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta i(lub) przed wystąpieniem tej choroby, po jej wystąpieniu lub w trakcie jej występowania, jak jest to znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj.

Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i(lub) sposób dostarczania terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF według niniejszego wynalazku.

Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję z przeciwciałem anty-TNF do diagnostyki przynajmniej jednej związanej z TNF choroby w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta i(lub) przed wystąpieniem tej choroby, po jej wystąpieniu lub w trakcie jej występowania, jak jest to znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj.

Niniejszy opis ujawnia także przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i(lub) sposób dostarczenia do diagnostyki przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF według niniejszego wynalazku.

Opis rysunków

Fig. 1 jest graficzną reprezentacją przedstawiającą oznaczanie zdolności mAb TNV obecnych w supernatantach komórek hybrydomy do hamowania wiązania się TNFa z rekombinowanym receptorem TNF. Różne ilości supernatantów z komórek hybrydomy zawierających znane ilości mAb TNV inkubowano wstępnie z ustalonym stężeniem (5 ng/ml) TNFa wyznakowanego I¹²⁵. Mieszaninę przeniesiono do 96-studzienkowych płytek Optiplate, które wcześniej pokryto p55-sf2, białkiem fuzyjnym rekombinowany receptor TNF/IgG. Po odpłukaniu niezwiązanego materiału oznaczano ilość TNFa, która wiązała się z receptorem p55 w obecności mAb i zliczono ją przy użyciu licznika gamma. Pomimo, że w tych eksperymentach przetestowano osiem próbek mAb TNV, dla uproszczenia nie pokazano tutaj trzech mAb, dla których wykazano poprzez analizy sekwencji DNA, że są identyczne z jednym z innych mAb TNV (zobacz Rozdział 5.2.2). Każdą próbkę testowano dwukrotnie. Pokazane wyniki przedstawiają dwa niezależne eksperymenty.

Fig. 2 przedstawia sekwencje DNA regionów zmiennych łańcucha ciężkiego mAb TNV. Pokazany gen wyjściowy to gen DP-46. Symbol „TNV wskazuje, że pokazana sekwencja jest sekwencją

PL 206 833 B1

TNV14, TNV15, TNV148 i TNV196. Pierwsze trzy nukleotydy w sekwencji TNV definiują kodon inicjacji translacji Met. Kropki w sekwencji genu mAb TNV wskazują, że ten sam nukleotyd występuje w sekwencji wyjściowej. 19 pierwszych nukleotydów sekwencji TNV (podkreś lone) odpowiada oligonukleotydowi użytemu do amplifikacji regionu zmiennego w reakcji PCR. Translację aminokwasów (skróty jednoliterowe) zaczynającą się po ukończeniu dojrzewania mAb pokazano tylko dla genu wyjściowego. Trzy domeny CDR w sekwencji aminokwasowej dla genu wyjściowego zaznaczono pogrubieniem i podkreśleniem. Linie oznaczone jako TNV148(B) wskazują, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Przerwy w sekwencji wyjściowego DNA (CDR3) występują z tego powodu, że ten fragment nie jest znany lub nie występuje w genie wyjściowym. W łań cuchach ciężkich mAb TNV użyty jest region łączący J6.

Fig. 3 przedstawia sekwencje DNA regionów zmiennych łańcucha lekkiego mAb TNV. Pokazany gen wyjściowy jest przedstawicielem rodziny Vg/38K ludzkich genów wyjściowych kodujących regiony zmienne kappa. Kropki w sekwencjach genu mAb TNV wskazują, że jest to ten sam nukleotyd, który występuje w sekwencji wyjściowej. 16 pierwszych nukleotydów sekwencji TNV (podkreślone) odpowiada oligonukleotydowi użytemu do amplifikacji regionu zmiennego w reakcji PCR. Translację aminokwasową dojrzałego mAb (skróty jednoliterowe) pokazano tylko dla genu wyjściowego. Trzy domeny CDR w translacji aminokwasowej dla genu wyjściowego zaznaczono pogrubieniem i podkreśleniem. Linie oznaczone jako TNV148 (B) wskazują, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Przerwy w wyjściowej sekwencji DNA (CDR3) występują z tego powodu, że ten fragment nie jest znany lub nie występuje w genie wyjściowym. W łańcuchach ciężkich mAb TNV użyty jest region łączący J3.

Fig. 4 przedstawia wywnioskowane sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego mAb TNV. Pokazane sekwencje aminokwasowe (skróty jednoliterowe) zostały wywnioskowane na podstawie oznaczonej sekwencji DNA, zarówno z niesklonowanych produktów PCR, jak i ze sklonowanych produktów PCR. Pokazane sekwencje aminokwasowe są podzielone na wydzielniczą sekwencję sygnałową (sygnał), sekwencję zrębową (FW) i domeny regionu determinującego komplementarność (CDR). Sekwencję aminokwasową dla genu wyjściowego DP-46 przedstawiono w górnym wierszu dla każdej domeny. Kropki wskazują, że aminokwas w mAb TNV jest identyczny, jak w genie wyjściowym. TNV148(B) wskazuje, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. Symbol „TNV wskazuje, ż e pokazana sekwencja wystę puje we wszystkich mAb TNV, o ile nie jest przedstawiona inna sekwencja. Kreski w sekwencji wyjś ciowej (CDR3) wskazują , ż e sekwencje nie są znane lub nie występują w genie wyjściowym.

Fig. 5 przedstawia wywnioskowane sekwencje aminokasowe regionów zmiennych łańcucha lekkiego mAb TNV. Pokazane sekwencje aminokwasowe (skróty jednoliterowe) zostały wywnioskowane na podstawie oznaczonej sekwencji DNA zarówno z niesklonowanych produktów PCR, jak i ze sklonowanych produktów PCR. Pokazane sekwencje aminokwasowe są podzielone na wydzielniczą sekwencję sygnałową (sygnał), sekwencję zrębową (FW) i domeny regionu determinującego komplementarność (CDR). Sekwencję aminokwasową dla genu wyjściowego kodującego łańcuch lekki typu Vg/38K pokazano w górnym wierszu dla każdej domeny. Kropki wskazują, że aminokwas w mAb TNV jest identyczny jak w genie wyjściowym. TNV148(B) wskazuje, że pokazana sekwencja występuje zarówno w TNV148, jak i w TNV148B. „Wszystkie wskazuje, że pokazana sekwencja występuje w TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B i TNV186.

Fig. 6 przedstawia schematyczne rysunki plazmidów ekspresyjnych, zawierających łańcuch ciężki i lekki użytych do wytworzenia komórek C466 z ekspresją rTNV148B. P1783 oznacza plazmid zawierający łańcuch ciężki, a p1776 oznacza plazmid zawierający łańcuch lekki. Domeny kodujące region zmienny i stały rTNV148B są pokazane jako czarne prostokąty. Wzmacniacze immunoglobulinowe w intronach J-C są pokazane jako szare prostokąty. Pokazane są istotne miejsca restrykcyjne. Pokazane plazmidy są zorientowane tak, że transkrypcja genów Ab przebiega w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Dł ugość plazmidu p1783 wynosi 19,53 kb, a plazmidu p1776 - 15,06 kb. Znane są kompletne sekwencje nukleotydowe obydwu plazmidów. Sekwencja kodująca region zmienny w p1783 może być łatwo zastąpiona przez inną sekwencję regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego BsiWI/BstBI. Sekwencja kodująca region zmienny w p1776 może być łatwo zastąpiona przez inną sekwencję regionu zmiennego przez zastąpienie fragmentu restrykcyjnego SalI/AflII.

Fig. 7 stanowi graficzną reprezentację analiz krzywych wzrostowych pięciu linii komórkowych produkujących rTNV148B. Hodowle zainicjowano dnia 0 przez rozsianie komórek do butelek T75

PL 206 833 B1 w pożywce I5Q+MHX tak, aby otrzymać gęstość żywotnych komórek 1,0 x 10⁵ komórek/ml w objętości 30 ml. Hodowle komórkowe użyte w tych badaniach były hodowlami ciągłymi dopóki nie wykonano transfekcji lub subklonowań. W ciągu następnych dni komórki w butelkach T ponownie zawieszano i pobierano porcję 0,3 ml hodowli. Badania krzywej wzrostowej koń czono, gdy liczebność komórek spadła poniżej 1,5 x 10⁵ komórek/ml. Liczbę żywych komórek w pobranej porcji oznaczano przez barwienie barwnikiem typu błękitu trypanu, a resztę porcji zachowywano w celu późniejszego oznaczania stężenia mAb. Ze wszystkich pobranych próbek w tym samym czasie wykonano test ELISA w kierunku ludzkich IgG.

Fig. 8 stanowi graficzną reprezentację porównania szybkości wzrostu komórek w obecności zmieniającego się stężenia czynnika selekcyjnego MHX. Subklony komórkowe C466A i C466B rozmrożono do pożywek bez MHX (IMDM. 5% FBS, 2 mM glutaminy) i hodowano przez dwa dodatkowe dni. Obydwie hodowle komórkowe zostały następnie podzielone na trzy hodowle, które nie zawierały MHX albo zawierały 0,2X MHX lub 1X MHX. Dzień później hodowle rozsiano do świeżych butelek T75 do początkowej gęstości 1 x 10⁵ komórek/ml i liczono komórki w odstępach co 24 godziny przez jeden tydzień. Policzono czas podwojenia liczby komórek podczas pierwszych 5 dni przy użyciu wzoru z SOP PD32.025; czas ten przedstawiono nad sł upkami.

Fig. 9 stanowi graficzną reprezentację stabilności produkcji mAb w czasie dla dwóch linii komórkowych produkujących rTNV148B. Subklony komórkowe pozostające w hodowli ciągłej od chwili transfekcji i subklonowań zastosowano do zapoczątkowania długookresowych seryjnych hodowli na 24-studzienkowych płytkach hodowlanych. Komórki były hodowane w pożywce I5Q z selekcją i bez selekcji czynnikiem MHX. Komórki pasażowano w sposób ciągły przez rozsiewanie hodowli co każde 4-6 dni w celu utrzymywania nowych żywotnych hodowli, poprzednie hodowle pozostawiano zaś do wyczerpania zapasów pokarmowych. Krótko po ukończeniu hodowli zbierano porcje supernatantów z pozostawionych komórek i przechowywane je do chwili oznaczenia stężenia mAb. Ze wszystkich zebranych próbek w tym samym czasie wykonano test ELISA w kierunku ludzkiej IgG.

Fig. 10 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciał a anty-TNF wedł ug niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami z Przykładu 4. Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano, na podstawie płci i masy ciała, do jednej z 9 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę PBS Dulbecco (DPBS) lub przeciwciała anty-TNF według niniejszego wynalazku (TNV14, TNV148 lub TNV196) w ilości 1 mg/kg lub 10 mg/kg. Gdy masę ciał a analizowano jako zmianę w stosunku do masy przed podaniem dawki, wszystkie zwierzęta podczas badania leczone 10 mg/kg cA2 wykazywały zawsze większy przyrost masy ciała niż myszy otrzymujące D-PBS. Ten wzrost masy ciała był znaczący w tygodniach 3-7. Zwierzęta otrzymujące 10 mg/kg TNV148 także osiągnęły znacząco większy wzrost masy ciała w 7 tygodniu badań .

Fig. 11A-C przedstawiają progresję nasilenia objawów chorobowych mierzonych na podstawie wskaźnika zapalenia stawów (Al), jak przedstawiono w Przykładzie 4. Wskaźnik zapalenia stawów w grupach otrzymujących 10 mg/kg cA2 był niższy w porównaniu z grupą kontrolną D-PBS, od 3 tygodnia aż do końca badań (tydzień 7). U zwierząt leczonych 1 mg/kg TNV14 i zwierząt leczonych 1 mg/kg cA2 nie zaobserwowano znaczą cego zmniejszenia AI po trzech tygodniach w porównaniu z grupą otrzymując ą D-PBS. Porównując pomiędzy sobą grupy otrzymujące podobną dawkę (10 mg/kg cA2 w porównaniu z 10 mg/kg TNV14, 148 i 196) nie stwierdzono żadnych istotnych różnic pomiędzy grupami otrzymującymi dawkę 10 mg/kg. Przy porównaniu grup otrzymujących 1 mg/kg stwierdzono, że grupa otrzymująca 1 mg/kg TNV148 wykazywała znacząco niższy Al w tygodniu 3, 4 i 7 niż grupa otrzymująca 1 mg/kg cA2. Al w grupie otrzymującej 1 mg/kg TNV148 był także znacząco niższy w tygodniu 3 i 4 niż w grupie otrzymującej 1 mg/kg TNV14. Pomimo, że podawanie TNV196 powodowało istotne zmniejszenie Al do 6 tygodnia badań (w porównaniu z grupą otrzymującą D-PBS), grupa otrzymująca TNV148 była jedyną grupą spośród grup otrzymujących 1 mg/kg, w której zmniejszenie Al było istotne na końcu badania.

Fig. 12 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciał a anty-TNF wedł ug niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami z Przykł adu 5. Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano na podstawie masy ciał a do jednej z 8 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę środka kontrolnego (D-PBS) lub przeciwciała (TNV14, TNV148) w ilości 3 mg/kg (tydzień 0). Iniekcje powtórzono u wszystkich zwierząt w tygodniach 1, 2, 3 i 4. W grupach 1-6 oznaczano skuteczność podanego środka. W prób8

PL 206 833 B1 kach surowicy uzyskanych od zwierząt z grup 7 i 8 oznaczano indukcję odpowiedzi immunologicznej i farmakokinetykę usuwania TNV14 lub TNV148 w tygodniach 2, 3 i 4.

Fig. 13A-C są wykresami przedstawiającymi progresję nasilenia choroby w Przykładzie 5 na podstawie wskaźnika zapalenia stawów. Wskaźnik zapalenia stawów w grupie otrzymującej 10 mg/kg cA2 był istotnie niższy niż w grupie kontrolnej, od 2 tygodnia do końca badań (tydzień 5). U zwierząt otrzymujących 1 mg/kg lub 3 mg/kg cA2 i zwierząt otrzymujących 3 mg/kg TNV14 nie zaobserwowano żadnego istotnego zmniejszenia Al przez cały czas trwania badań w porównaniu z grupą kontrolną traktowaną D-PBS. Zwierzęta otrzymujące 3 mg/kg TNV148 wykazywały istotne zmniejszenie Al od tygodnia 3 do tygodnia 5 w porównaniu z grupą otrzymującą D-PBS. Zwierzęta otrzymujące 10 mg/kg cA2 wykazywały istotne zmniejszenie Al w 4 i 5 tygodniu badań w porównaniu z niższymi dawkami (1 mg/kg i 3 mg/kg) cA2, jak również Al w tygodniach 3-5 był istotnie niższy niż u zwierząt traktowanych TNV14. Pomimo, że nie stwierdzono żadnych istotnych różnic pomiędzy dowolną z grup leczonych dawką 3 mg/kg, wartości Al u zwierząt otrzymujących 3 mg/kg TNV14 były istotnie wyższe w pewnych punktach czasowych w porównaniu z dawką 10 mg/kg, natomiast zwierzę ta otrzymują ce TNV148 nie wykazywały istotnych różnic w porównaniu ze zwierzętami otrzymującymi 10 mg/kg cA2.

Fig. 14 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciał a anty-TNF wedł ug niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami z Przykł adu 6. Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano na podstawie masy ciał a do jednej z 6 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę przeciwciała (cA2 lub TNV148) w ilości 3 mg/kg lub 5 mg/kg. W tym badaniu wykorzystano grupy kontrolne, którym podano D-PBS i 10 mg/kg cA2.

Fig. 15 przedstawia progresję nasilenia objawów chorobowych na podstawie wskaźnika zapalenia stawów, jak przedstawiono w Przykładzie 6. We wszystkich grupach stwierdzono pewien stopień ochrony we wczesnych punktach czasowych: w grupach otrzymujących 5 mg/kg cA2 i 5 mg/kg TNV148 wykazano istotne zmniejszenie Al w tygodniach 1-3, a we wszystkich grupach wykazano istotne zmniejszenie Al w tygodniu 2. Ponadto podczas badań u zwierząt otrzymujących 5 mg/kg cA2 stwierdzono pewien stopień ochrony z istotnym zmniejszeniem Al w tygodniach 4, 6 i 7. Niska dawka (3 mg/kg) zarówno cA2, jak i TNV148 powodowała istotne zmniejszenie Al w tygodniu 6, a we wszystkich grupach obserwowano istotnie zmniejszenie Al w tygodniu 7. Żadna z grup nie była zdolna do utrzymania istotnej redukcji do końca badań (tydzień 8). Nie stwierdzono żadnych istotnych różnic pomiędzy badanymi grupami (wyłączając grupę kontrolną traktowaną solą fizjologiczną) w dowolnym punkcie czasowym.

Fig. 16 przedstawia zmiany masy ciała w mysim modelu zapalenia stawów u myszy Tg 197 w odpowiedzi na przeciwciał a anty-TNF wedł ug niniejszego wynalazku w porównaniu z kontrolami w Przykł adzie 7. W celu porównania skutecznoś ci pojedynczej dootrzewnowej dawki TNV148 (otrzymanego z komórek hybrydomy) i rTNV148B (otrzymanego z komórek transfekowanych). Badane myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni przydzielano na podstawie płci i masy ciała do jednej z 9 grup i podawano im dootrzewnowo pojedynczą dużą dawkę Dulbecco PBS (D-PBS) lub przeciwciała (TNV148, rTNV148B) w ilości 1 mg/kg.

Fig. 17 przedstawia progresję nasilenia objawów chorobowych mierzonych na podstawie wskaźnika zapalenia stawów, jak przedstawiono w Przykładzie 7. Wskaźnik zapalenia stawów w grupach otrzymujących 10 mg/kg cA2 był niższy w porównaniu z grupą kontrolną D-PBS, od 4 tygodnia aż do końca badań (tydzień 8). Zarówno w grupach otrzymujących TNV148, jak i w grupie otrzymującej 1 mg/kg cA2 stwierdzono istotne zmniejszenie Al w tygodniu 4. Pomimo, że wcześniejsze badanie (P-099-017) wykazało, że TNV148 był nieco bardziej skuteczny w zmniejszaniu wskaźnika zapalenia stawów po podaniu dootrzewnowe pojedynczej dużej dawki w ilości 1 mg/kg, te badanie wykazało, że Al w grupach otrzymujących obydwie wersje przeciwciała TNV był nieco wyższy. Pomimo, że (z wyjątkiem tygodnia 6) w grupie otrzymującej 1 mg/kg cA2 Al nie był istotnie wyższy w porównaniu z grupą otrzymującą 10 mg/kg cA2, a w grupach otrzymujących TNV148 Al był istotnie wyższy w tygodniach 7 i 8, nie zaobserwowano ż adnych różnic w Al pomiędzy grupami otrzymującymi 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148 i 1 mg/kg TNV 148B w dowolnym punkcie czasowym badania.

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanych, rekombinowanych i(lub) syntetycznych, ludzkich, naczelnych, gryzoni, ssaczych, chimerowych przeciwciał anty-TNF, jak również kompozycji i kodujących cząsteczek kwasu nukleinowego zawierających przynajmniej jeden polinukleotyd kodujący przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF według wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje także zastoPL 206 833 B1 sowanie takich przeciwciał, na przykład w diagnostycznych i terapeutycznych kompozycjach, sposobach i urządzeniach.

Stosowane tutaj terminy „przeciwciało przeciwko czynnikowi martwicy nowotworu alfa, „przeciwciało anty-TNF, „część przeciwciała anty-TNF lub „fragment przeciwciała anty-TNF i(lub) „wariant przeciwciała anty-TNF i tym podobne dotyczą dowolnego białka lub peptydu zawierającego cząsteczkę, która obejmuje przynajmniej część cząsteczki immunoglobulinowej takiej, jak niestanowiący ograniczenia region determinujący komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego lub lekkiego lub ligand wiążący jego fragment, region zmienny łańcucha ciężkiego lub lekkiego, region stały łańcucha ciężkiego lub lekkiego, region zrębowy lub dowolny jego fragment lub przynajmniej jeden fragment receptora TNF lub białka wiążącego, które można włączać do przeciwciała według niniejszego wynalazku. Takie przeciwciało może ponadto opcjonalnie oddziaływać ze specyficznym ligandem, w taki sposób niebędący ograniczeniem, że przeciwciało moduluje, zmniejsza, zwiększa, działa w sposób antagonistyczny, agonistyczny, minimalizuje, blokuje, hamuje, znosi i(lub) interferuje z przynajmniej jedną aktywnością lub wiązaniem TNF lub z aktywnością lub wiązaniem receptora TNF, in vitro, in situ i(lub) in vivo. Jako nieograniczający przykład można podać, że odpowiednie przeciwciało anty-TNF, wyszczególniony fragment lub wariant może wiązać przynajmniej jeden TNF lub jego wyszczególnione fragmenty, warianty lub domeny. Odpowiednie przeciwciało anty-TNF, jego wyszczególniony fragment lub wariant może także opcjonalnie wpływać na przynajmniej jedną aktywność lub funkcję TNF, jak niebędąca ograniczeniem synteza RNA, DNA lub białka, uwalnianie TNF, przekazywanie sygnałów do receptora TNF, błonowe cięcie TNF, aktywność TNF, produkcja i(lub) synteza TNF. Ponadto sugeruje się, aby termin „przeciwciało obejmował przeciwciała, fragmenty po trawieniu, ich wyszczególnione fragmenty i warianty, w tym mimetyki przeciwciał lub fragmenty przeciwciał, które naśladują strukturę i(lub) funkcję przeciwciała lub jego wyszczególnionego fragmentu lub części. Funkcjonalne fragmenty obejmują fragmenty wiążące antygen, które wiążą się ze ssaczym TNF. Na przykład niniejszy wynalazek obejmuje fragmenty zdolne do wiązania TNF lub ich części, w tym, ale bez ograniczenia do fragmentów Fab (wytworzonych np. przez trawienie papainą), Fab' (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną i częściową redukcję) i F(ab')2 (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną), facb (wytworzonych np. przez trawienie plazminą), pFc' (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną lub trawienie plazminą), Fd (wytworzonych np. przez trawienie pepsyną, częściową redukcję i ponowną agregację), Fv lub scFv (wytworzonych np. przez techniki biologii molekularnej) (zobacz np. Colligan, Immunology, jak wyżej).

Takie fragmenty można otrzymywać przez cięcie enzymatyczne, przy użyciu technik syntezy lub rekombinacji genetycznej, które są znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj. Przeciwciała można wytwarzać w postaci różnych form skróconych przy użyciu genów przeciwciał, w których na lewo od naturalnego miejsca końca translacji wprowadzono jeden lub większą liczbę kodonów stop. Na przykład kombinacja genu kodująca fragment F(ab')2 łańcucha ciężkiego może być tak zaprojektowana, żeby zawierała sekwencje DNA kodujące domenę CH1 i(lub) region łączący łańcucha ciężkiego. Różne fragmenty przeciwciał można ze sobą łączyć chemicznie przy użyciu klasycznych technik lub wytwarzać jako jeden fragment białkowy przy użyciu technik inżynierii genetycznej.

Stosowany tutaj termin „przeciwciało ludzkie dotyczy przeciwciała, w którym zasadniczo każda część białka (np. CDR, region zrębowy, CL, domeny CH (np. CH¹, CH², CH³), region łączący (VL, VH)) jest zasadniczo nieimmunogenny dla ludzi, z niewielkimi tylko zmianami sekwencji lub odstępstwami. Podobnie przeciwciała oznaczone jako przeciwciała naczelnych (małpa, pawian, szympans itp.) gryzoni (mysz, szczur, królik, świnka morska, chomik i tym podobne) i innych ssaków wskazują dany gatunek, podrodzaj, rodzaj, podrodzinę i rodzinę. Ponadto, przeciwciała chimerowe zawierają kombinacje powyższych. Takie zmiany lub odstępstwa opcjonalnie i dogodnie utrzymują lub eliminują immunogenność u ludzi lub innych gatunków w porównaniu z przeciwciałami niemodyfikowanymi. Ludzkie przeciwciało jest więc różne od przeciwciała chimerowego lub humanizowanego. Należy podkreślić, że przeciwciało ludzkie może być wytwarzane przez zwierzę inne niż człowiek lub przez komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną, zdolną do ekspresji funkcjonalnie zmienionych genów ludzkich immunoglobulin (np. łańcucha ciężkiego i(lub) łańcucha lekkiego). Ponadto, jeżeli ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem o pojedynczym łańcuchu, może ono zawierać peptyd łączący, który nie występuje w natywnych ludzkich przeciwciałach. Na przykład Fv może zawierać peptyd łączący, taki jak dwie do ośmiu glicyn lub innych reszt aminokwasowych, które łączą region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego. Takie peptydy łączące uznaje się za peptydy pochodzenia ludzkiego.

PL 206 833 B1

Można także zastosować przeciwciała bispecyficzne, heterospecyficzne, heterokoniugaty lub podobne, które są monoklonalne, jeżeli są to przeciwciała ludzkie lub humanizowane i wykazują specyficzność wiązania z przynajmniej dwoma różnymi antygenami. W tym przypadku, jedna ze specyficzności wiązania dotyczy przynajmniej jednego białka TNF, inna zaś dowolnego innego antygenu. Sposoby wytwarzania specyficznych przeciwciał są znane ze stanu techniki. Tradycyjnie, rekombinowana produkcja bispecyficznych przeciwciał opiera się na koekspresji dwóch par: łańcuch ciężki-łańcuch lekki immunoglobuliny, gdzie dwa łańcuchy ciężkie mają różną specyficzność (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Z powodu losowego łączenia się łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobuliny te hybrydomy (kwadromy) produkują potencjalną mieszankę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedna ma właściwą strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie właściwej cząsteczki, które zazwyczaj wykonuje się metodą użyciu chromatografii powinowactwa, jest dość trudne, a wydajność jest mała. Podobne procedury ujawniono np. w WO 93/08829, patentach USA nr 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker i wsp., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh i wsp., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Przeciwciała anty-TNF (określane także jako przeciwciała TNF) według niniejszego wynalazku można opcjonalnie scharakteryzować pod względem wysokiego powinowactwa w wiązaniu się z TNF i mogą one opcjonalnie wykazywać niską toksyczność. W szczególności przeciwciało według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczne w niniejszym wynalazku, jeżeli jego poszczególne składniki, takie jak region zmienny, region stały, region zrębowy, każdy z osobna lub wszystkie razem opcjonalnie i dogodnie wykazują niską immunogenność. Przeciwciała, które można zastosować w niniejszym wynalazku, są opcjonalnie scharakteryzowane pod względem możliwości ich stosowania u pacjentów przez dł uż szy czas przy mierzalnej poprawie objawów chorobowych oraz niskiej i(lub) akceptowalnej toksyczności. Na osiągnięte rezultaty terapeutyczne mogą składać się niska lub akceptowalna immunogenność i(lub) wysokie powinowactwo, jak również inne pożądane właściwości. „Niską immunogenność definiuje się tutaj jako wywoływanie istotnej odpowiedzi HAHA, HACA lub HAMA u mniej niż około 75% lub zwłaszcza mniej niż około 50% leczonych pacjentów i(lub) uzyskiwanie niskiego miana u leczonych pacjentów (mniejszego niż około 300, zwłaszcza mniejszego niż około 100 w enzymatycznym teście immunologicznym z podwójnym antygenem) (Elliott i wsp., Lancet 344:1125-1127 (1994).

Zastosowanie

Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku można zastosować do otrzymania przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF lub jego wyszczególnionego wariantu, którego można użyć do pomiaru lub wpływu na komórkę, tkankę, narząd lub zwierzę (w tym na ssaki i ludzi), do diagnostyki, monitorowania, modulowania, leczenia, ulż enia cierpieniu, uł atwienia zapobiegania skutkom lub zmniejszenia objawów chorobowych przynajmniej jednego stanu chorobowego związanego z TNF, wybranego spośród, ale nieograniczającego się do zaburzenia lub choroby immunologicznej, zaburzenia lub choroby sercowo-naczyniowej, zaburzenia lub choroby infekcyjnej, związanej z nowotworem złośliwym lub choroby układu nerwowego.

Taki sposób może obejmować podawanie skutecznej dawki kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF komórce, tkance, narządowi, zwierzęciu lub pacjentowi potrzebującemu takiej modulacji, leczenia, ulżenia w cierpieniu, profilaktyki lub zmniejszenia objawów, skutków lub mechanizmów. Skuteczna dawka może obejmować ilość od około 0,001 do 500 mg/kg przy podawaniu pojedynczej dawki (np. pojedynczej dawki w dużej ilości), podawaniu wielokrotnym lub ciągłym lub ilość pozwalającą osiągnąć, przy podawaniu dawki pojedynczej, podawaniu wielokrotnym lub ciągłym, stężenie w surowicy 0,01-5000 μg/ml lub dowolnego innego zakresu lub wartości w nim zawartej, co przeprowadza się i oznacza przy użyciu znanych sposobów, jak opisano tutaj lub jest to znane ze stanu techniki.

Cytowania

Wszystkie publikacje lub patenty cytowane tutaj przedstawiają stan techniki w chwili opracowywania niniejszego wynalazku i(lub) dostarczają opisu i wykonania niniejszego wynalazku. Publikacje są dowolnymi publikacjami naukowymi lub patentowymi lub informacjami dostępnymi na dowolnym nośniku, na przykład nagraniami, dokumentami elektronicznymi lub drukowanymi. Specyficznie wymienione są poniższe pozycje piśmiennictwa: Ausubel i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A LaboPL 206 833 B1 ratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John

Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Przeciwciała według niniejszego wynalazku

Przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF według niniejszego wynalazku może być opcjonalnie wytwarzane przez linię komórkową, mieszaną linię komórkową, komórkę unieśmiertelnioną lub klonalną populację komórek unieśmiertelnionych, jak jest to dobrze znane ze stanu techniki. Zobacz np. Ausubel, i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (19872001); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Można wytwarzać ludzkie przeciwciała, skierowane specyficznie przeciwko ludzkim białkom TNF lub ich fragmentom, przeciwko odpowiedniemu immunogennemu antygenowi, takiemu jak wyizolowany antygen i(lub) białko TNF lub jego fragment (w tym cząsteczki syntetyczne, takie jak syntetyczne peptydy). Podobnie można wytwarzać inne specyficzne lub ogólne ssacze przeciwciała. Antygeny immunogenne i przeciwciała monoklonalne można wytwarzać przy użyciu dowolnej dogodnej techniki.

W jednej z metod hybrydomę wytwarza się przez fuzję odpowiedniej unieśmiertelnionej linii komórkowej (np. linia komórkowa szpiczaka, taka jak między innymi Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO

2A lub podobna, lub heteroszpiczaków, ich produktów fuzyjnych lub dowolnych pochodzących z nich komórek lub fuzji komórkowych, lub dowolnej odpowiedniej linii komórkowej, znanej ze stanu techniki. Zobacz np.www.atcc.org, www.lifetech.com i podobne z komórkami wytwarzającymi przeciwciała, takimi jak, lecz bez ograniczenia, wyizolowane lub sklonowane komórki śledziony, krwi obwodowej, chłonki, migdałka lub z innych komórek, limfocyty B lub dowolne inne komórki z ekspresją sekwencji stałych, zmiennych, zrębowych lub CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego zarówno w postaci endogennego, jak i heterologicznego kwasu nukleinowego, rekombinowane lub endogenne, wirusowe, bakteryjne, pochodzące z glonów, prokariotyczne, pochodzące ze zwierząt ziemnowodnych, owadzie, gadzie, rybie, ssacze, pochodzące z gryzoni, zwierząt jednokopytnych, dwukopytnych, kozie, owcze, pochodzące z naczelnych, eukariotyczne, genomowe DNA, cDNA, rDNA, mitochondrialne DNA lub RNA, chloroplastowe DNA lub RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, jednoniciowe, dwuniciowe, trójniciowe, hybrydyzowane i tym podobne lub jako dowolna ich kombinacja. Zobacz np. Ausubel, jak wyżej, i Colligan, Immunology, jak wyżej, rozdział 2.

Komórki produkujące przeciwciała można także uzyskać z krwi obwodowej lub, dogodniej, ze śledziony lub węzłów chłonnych ludzi lub innych odpowiednich zwierząt, które immunizowano antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Do ekspresji heterologicznego lub endogennego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, jego wyszczególnionego fragmentu lub wariantu, zgodnie z niniejszym wynalazkiem można użyć dowolnej innej odpowiedniej komórki gospodarza. Fuzje komórkowe (hybrydomy) lub komórki rekombinowane można wyizolować przy użyciu selektywnych warunków hodowli lub innych znanych odpowiednich sposobów i klonować przez rozcieńczenie do pojedynczych komórek lub przez sortowanie komórek lub innymi znanymi sposobami. Komórki produkujące przeciwciała z pożądaną specyficznością można wyselekcjonować przez zastosowanie odpowiedniego oznaczenia (np. testu ELISA).

Można zastosować inne odpowiednie sposoby wytwarzania lub izolacji przeciwciał o wymaganej specyficzności, w tym, lecz bez ograniczenia, sposoby służące do selekcji rekombinowanego przeciwciała z biblioteki peptydowej lub biblioteki białek (np. niebędąca ograniczeniem biblioteka bakteriofagów, rybozymów, oligonukleotydów, RNA, cDNA lub podobna, biblioteka bazująca na prezentacji, np. dostępna w Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, Wielka Brytania; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, Niemcy; Biovation, Aberdeen, Szkocja, Wielka Brytania; BioInvent, Lund, Szwecja; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA, USA; Ixsys. Zobacz np. EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps);

PL 206 833 B1

EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); USA 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046;

PCT/US91/07149 (Ixsys) lub stochastycznie wygenerowanych peptydów lub białek - USA 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, obecnie Applied Molecular Evolution (AME)) lub sposoby polegające na immunizacji transgenicznych zwierząt (np. myszy SCID, Nguyen i wsp., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu i wsp., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren i wsp., Immunol. 93:154-161 (1998), w wyniku których można otrzymać różne ludzkie przeciwciała, jak jest to znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj. Takie techniki obejmują, ale nie są do nich ograniczone, prezentację na rybosomie (Hanes i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); technologie otrzymywania przeciwciała z pojedynczej komórki (np. sposób selekcji przeciwciała z wybranego limfocytu („SLAM) (patent USA nr 5627052, Wen i wsp., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); mikrokropelki żelowe i cytometrię przepływową (Powell i wsp., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA, USA; Gray i wsp., J. Imm. Meth. 182: 155-163 (1995); Kenny i wsp., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); selekcję limfocytów B (Steenbakkers i wsp., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak i wsp., Progress Biotech, Tom 5, In vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, red., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Holandia (1988)).

Można także zastosować sposoby obróbki lub humanizowania innych niż ludzkie lub ludzkich przeciwciał; są one dobrze znane ze stanu techniki. Ogólnie przeciwciało humanizowane lub wytworzone technikami inżynierii genetycznej zawiera jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych ze źródła, które jest inne niż ludzkie, np. bez ograniczenia, od myszy, szczura, królika, naczelnych innych niż człowiek lub innych ssaków. Te ludzkie reszty aminokwasowe często są określane jako reszty „importowane i typowo pochodzą z „importowanej zmiennej, stałej lub innej domeny znanej ludzkiej sekwencji.

Znane ludzkie sekwencje Ig ujawniono np. w www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/;

www.abcam.com/;

www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;

www.public.iastate.edu/~pedro/researchtools.html;

www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html;

www.whfreeman.com/immunology/CH05/kubyO5.htm;

www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;

www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;

www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html;

www.antibodyresource.com/;

mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.

www.immunologylink.com/;

pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;

www.biotech.ufl.edu/~hcl/;

www.pebio.com/pa/340913/340913.html;

www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;

www.m.ehimeu.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html;

www.biodesign.com/table.asp;

www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html;

www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html;

www.isacnet.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/~rek/AEPStart.html;

baserv.uci.kun.nl/~jraats/linksl.html;

www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/;

www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imtdoc/public/INTRO.html;

www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/;

www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;

antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;

www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html;

PL 206 833 B1 www.cryst.bbk.ac.uk~ubcgO7s/;

www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;

www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html;

www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;

www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;

www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolinaAVebpages/Pept/spottech.html;

www.jerini.de/frproducts.htm;

www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. Health (1983).

Takie importowane sekwencje można zastosować do zmniejszenia immunogenności lub zmniejszenia, wzmocnienia lub modyfikacji wiązania, powinowactwa, szybkości wiązania, szybkości oddysocjowania, zachłanności wiązania, okresu półtrwania lub innej odpowiedniej cechy, jak to jest znane ze stanu techniki. Ogólnie, część lub całość ludzkich lub innych niż ludzkie sekwencji CDR jest zachowywana, podczas gdy sekwencje inne niż ludzkie regionów zmiennych lub stałych zastępuje się aminokwasami występującymi w sekwencji ludzkiej lub innej. Przeciwciała można również opcjonalnie humanizować z pozostawieniem silnego powinowactwa do antygenu i innych pożądanych właściwości biologicznych. Aby to osiągnąć, można opcjonalnie wytwarzać humanizowane przeciwciała przez proces analizy sekwencji wyjściowych i różnych opracowanych produktów humanizowanych przy użyciu przestrzennych modeli sekwencji wyjściowych i humanizowanych. Modele przestrzenne immunoglobulin są powszechnie dostępne i są znane specjalistom w tej dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe, obrazujące i przedstawiające prawdopodobne przestrzenne struktury konformacyjne wybranych sekwencji immunoglobulin. Przegląd tych przedstawień pozwala na analizę przypuszczalnej roli reszt aminokwasowych w funkcjonowaniu wybranej sekwencji immunoglobulinowej, tj. analizę reszt aminokwasowych, wpływających na zdolność wybranej sekwencji immunoglobulinowej do wiązania swojego antygenu. W ten sposób można wybrać reszty aminokwasowe FR i połączyć FR z sekwencji najwyższej zgodności i importowanych tak, żeby uzyskać odpowiednią cechę przeciwciała, taką jak zwiększone powinowactwo do antygenu(antygenów). Ogólnie we wpływ na wiązanie antygenu w sposób bezpośredni i najbardziej znaczący zaangażowane są reszty aminokwasowe CDR. Humanizowanie lub wytwarzanie technikami inżynierii genetycznej przeciwciała według niniejszego wynalazku można przeprowadzić dowolnym znanym sposobem, takim jak niestanowiący ograniczenia sposób opisany w Winter (Jones i wsp.. Nature 321:522 (1986); Riechmann i wsp. Nature 332:323 (1988); Verhoeyen i wsp.. Science 239:1534 (1988)), Sims i wsp., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:4285 (1992); Presta i wsp., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentach USA nr: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP 229246.

Przeciwciało anty-TNF można ewentualnie wytwarzać przez immunizację zwierzęcia transgenicznego (np. myszy, szczura, chomika, naczelnych innych niż człowiek i tym podobnych) zdolnego do produkcji repertuaru przeciwciał ludzkich, jak opisano tutaj i(lub) jak jest to znane ze stanu techniki. Z takich zwierząt można izolować komórki, wytwarzające ludzkie przeciwciało anty-TNF i unieśmiertelniać je odpowiednimi sposobami, takimi jak sposoby opisane tutaj.

Myszy transgeniczne, które mogą wytwarzać repertuar ludzkich przeciwciał, wiążących się z ludzkimi antygenami, można otrzymywać znanymi sposobami (np. niestanowiące ograniczenia patenty USA nr: 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 i 5789650 przyznane dla Lonberg i wsp.; Jakobovits i wsp. WO 98/50433, Jakobovits i wsp. WO 98/24893, Lonberg i wsp. WO 98/24884, Lonberg i wsp. WO 97/13852, Lonberg i wsp. WO 94/25585, Kucherlapate i wsp. WO 96/34096, Kucherlapate i wsp. EP 0463 151 B1, Kucherlapate i wsp. EP 0710 719 A1, Surani i wsp. Patent USA Nr 5545807, Bruggemann i wsp. WO 90/04036, Bruggemann i wsp. EP 0438 474 BI, Lonberg i wsp. EP 0814 259 A2, Lonberg i wsp. GB 2 272 440 A, Lonberg i wsp. Nature 368:856859 (1994), Taylor i wsp., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green i wsp. Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez i wsp., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor i wsp., Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon i wsp.. Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg i wsp., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) i Fishwald i wsp., Nat Biotechnol 14 (7):845-851 (1996). Ogólnie myszy te zawierają przynajmniej jeden transgen zawierający DNA z przynajmniej jednego

PL 206 833 B1 locus ludzkiej immunoglobuliny, która uległa funkcjonalnej rearanżacji lub która może przejść funkcjonalną rearanżację. Endogenne loci immunoglobulinowe u takiej myszy mogą być uszkodzone lub usunięte w celu wyeliminowania zdolności zwierzęcia do produkcji przeciwciał przez endogenne geny.

Przeszukiwanie przeciwciał w celu znalezienia specyficznego wiązania się z podobnymi białkami lub fragmentami można przeprowadzić przy użyciu bibliotek peptydowych. Sposób ten polega na przeszukiwaniu dużych zbiorów peptydów w celu znalezienia pojedynczych jej członków posiadających pożądaną funkcję lub strukturę. Przeszukiwanie przeciwciałami takich bibliotek peptydowych jest dobrze znane ze stanu techniki. Prezentowane sekwencje peptydowe mogą posiadać długość od 3 do 5000 lub więcej aminokwasów, często długość od 5 do 100 aminokwasów i najczęściej długość od około 8 do 25 aminokwasów. Ponadto oprócz sposobów generowania bibliotek peptydowych bezpośrednimi sposobami syntezy chemicznej, opisano kilka sposobów z użyciem rekombinowanego DNA. Jeden typ polega na prezentacji sekwencji peptydowej na powierzchni bakteriofaga lub komórki. Każdy bakteriofag lub komórka zawiera sekwencję nukleotydową kodującą poszczególne prezentowane sekwencje peptydowe. Takie sposoby są opisane w publikacjach patentowych PCT nr 91/17271, 91/18980, 91/19818, i 93/08278. Inne systemy wytwarzania bibliotek peptydowych mają aspekty zarówno syntezy chemicznej, jak i sposobów rekombinacji DNA. Zobacz publikacje patentowe nr 92/05258, 92/14843 i 96/19256. Zobacz także patenty USA Nr 5658754 i 5643768. Bibioteki peptydowe, wektory i zestawy do przeszukiwania są komercyjnie dostępne u takich dostawców jak Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) i Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Wielka Brytania). Zobacz np. patenty USA nr 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456 przyznane dla Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500 przyznane dla Dyax, 5427908, 5580717, przyznane dla Affymax; 5885793 przyznany dla Cambridge Antibody Technologies; 5750373 przyznany dla Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417 przyznane dla Xoma, Colligan, jak wyżej; Ausubel, jak wyżej; lub Sambrook, jak wyżej.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można otrzymywać przy użyciu przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-TNF, w celu dostarczenia transgenicznym zwierzętom lub ssakom, takim jak kozy, krowy, konie, owca i tym podobne, które produkują takie przeciwciała w swoim mleku. Takie zwierzęta można otrzymywać przy zastosowaniu znanych sposobów. Zobacz np. nie stanowiące ograniczenia patenty USA nr 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489 i tym podobne.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku można dodatkowo otrzymywać przy użyciu przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-TNF, w celu dostarczenia go transgenicznym roślinom i hodowanym komórkom roślinnym (na przykład, lecz bez ograniczenia do tytoniu i kukurydzy), które wytwarzają takie przeciwciała, wyszczególnione fragmenty lub warianty w komórkach lub częściach roślinnych z nich wyhodowanych. Jako nieograniczający przykład moż na podać skuteczne zastosowanie liści transgenicznego tytoniu z ekspresją rekombinowanych białek do otrzymania dużych iłości rekombinowanych białek, np. przy użyciu promotora indukowanego. Zobacz np. Cramer i wsp., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) i cytowane tam piśmiennictwo. Także transgeniczną kukurydzę wykorzystano do ekspresji na skalę przemysłową ssaczych białek, których aktywność biologiczna jest równoważna z białkami otrzymywanymi w innych systemach rekombinowanych lub oczyszczanymi ze źródeł naturalnych. Zobacz np. Hood i wsp., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) i cytowane tam piśmiennictwo. Przeciwciała otrzymywano również w dużych ilościach z nasion roślin transgenicznych, w tym fragmenty przeciwciał, takie jak przeciwciała jednołańcuchowe (scFv), w tym z nasion tytoniu i bulw ziemniaczanych. Zobacz np. Conrad i wsp., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) i odnośniki tam cytowane. Przeciwciała według niniejszego wynalazku można więc także otrzymywać przy użyciu transgenicznych roślin, według znanych sposobów. Zobacz także np. Fischer i wsp., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999), Ma i wsp., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma i wsp., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam i wsp., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994) i cytowane tam piśmiennictwo.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą wiązać ludzki TNF w dużym zakresie powinowactwa (KD). W zalecanym wykonaniu przynajmniej jedno ludzkie mAb według niniejszego wynalazku może opcjonalnie wiązać się z ludzkim TNF z dużym powinowactwem. Na przykład, ludzkie mAb może wiązać ludzki TNF z KD równą lub mniejszą niż 10^-7 M, taką jak, ale bez ograniczenia do 0,1-9,9 (lub dowolny zakres lub wartość spośród wymienionych) X 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 lub dowolny zakres lub wartość spośród wymienionych.

PL 206 833 B1

Powinowactwo lub zachłanność wiązania przeciwciała względem antygenu można oznaczać doświadczalnie przy użyciu stosownego sposobu. (Zobacz na przykład Berzofsky i wsp., „Antibody-Antigen Interactions w Fundamental Immunology, Paul, W. E., red., Raven Press: New York, NY, USA (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY, USA (1992) i sposoby opisane tutaj). Mierzone powinowactwo poszczególnych interakcji przeciwciało-antygen może zmieniać się przy pomiarze w różnych warunkach (np. stężenie soli, pH). Pomiary powinowactwa i innych parametrów wiązania antygenu (np. KD, Ka, Kd) dogodnie wykonuje się zatem w standaryzowanych roztworach przeciwciała, antygenu i standaryzowanego buforu, takiego jak bufor opisany tutaj.

Cząsteczki kwasu nukleinowego

Przy zastosowaniu informacji dostarczonych tutaj, można wytworzyć izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku kodującą przynajmniej jedno przeciwciało antyTNF przy zastosowaniu sposobów opisanych tutaj lub znanych ze stanu techniki.

Cząsteczki kwasów nukleinowych tu ujawniane mogą mieć postać RNA, takiego jak mRNA, hnRNA, tRNA lub dowolnej innej jego postaci lub postać DNA, w tym między innymi cDNA, DNA genomowy uzyskany przez klonowanie lub otrzymany na drodze syntezy albo dowolną ich kombinację. DNA może być trójniciowe, dwuniciowe lub jednoniciowe, lub być dowolną ich kombinacją. Dowolny fragment przynajmniej jednej nici DNA lub RNA może być nicią kodującą, znaną także jako nić sensowna lub może być nicią niekodującą, nazywaną także nicią antysensowną.

Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego tu opisane mogą obejmować cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające otwartą ramkę odczytu (ORF), opcjonalnie z jednym lub kilkoma intronami, np. niestanowiący ograniczenia przynajmniej jeden wyszczególniony fragment przynajmniej jednego regionu CDR takiego, jak CDR1, CDR2 i(lub) CDR3 przynajmniej jednego łańcucha ciężkiego (np. SEK ID NR:1-3) lub łańcucha lekkiego (np. SEK ID NR: 4-6); cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję kodującą przeciwciało anty-TNF lub region zmienny (np. SEK ID NR: 7, 8) oraz cząsteczki kwasu nukleinowego, obejmujące sekwencję nukleotydową zasadniczo inną od tych opisanych powyżej, ale która dzięki zdegenerowaniu kodu genetycznego nadal koduje przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF, jak opisano tutaj i(lub) jest to znane ze stanu techniki. Oczywiście, kod genetyczny jest dobrze znany ze stanu techniki. Wytworzenie takich zdegenerowanych wariantów kwasu nukleinowego, kodujących specyficzne przeciwciała anty-TNF według niniejszego wynalazku, byłoby więc rutynową czynnością dla specjalisty w tej dziedzinie. Zobacz np. Ausubel, i wsp., jak wyżej. Niestanowiące ograniczenia przykłady izolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego obejmują sekwencje SEK ID NR: 10, 11, 12, 13, 14, 15 odpowiadające niestanowiącym ograniczenia przykładom kwasu nukleinowego kodującego odpowiednio HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 i LC CDR3.

Jak wskazano tutaj, cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, zawierające kwas nukleinowy kodujący przeciwciało anty-TNF, mogą obejmować, ale nie są ograniczone do cząsteczek samodzielnie kodujących sekwencję aminokwasową fragmentu przeciwciała; sekwencji kodującej całe przeciwciało lub jego część; sekwencji kodującej przeciwciało, jego fragment lub część, jak również sekwencji dodatkowych, takich jak sekwencja kodująca przynajmniej jeden sygnał liderowy lub peptyd fuzyjny ze wspomnianymi powyżej dodatkowymi sekwencjami kodującymi lub bez nich; są to sekwencje takie, jak przynajmniej jeden intron, razem z dodatkowymi sekwencjami niekodującymi, w tym, ale bez ograniczenia do niekodujących sekwencji 5' i 3', takich jak ulegające transkrypcji, ale nieulegające translacji sekwencje, które odgrywają rolę w transkrypcji, obróbce mRNA, w tym w wycinaniu intronów i sygnałach poliadenylacji (na przykład wiązanie rybosomów i stabilność mRNA); dodatkowa sekwencja kodująca, która koduje dodatkowe aminokwasy, takie jak te, które dostarczają dodatkowych funkcji. Sekwencję kodującą przeciwciało można więc poddać fuzji z sekwencją znacznikową, taką jak sekwencja kodująca peptyd, ułatwiający oczyszczanie przeciwciała poddanego fuzji zawierającego fragment lub część przeciwciała.

Konstruowanie kwasów nukleinowych

Izolowane cząsteczki kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku można wytwarzać przy użyciu (a) sposobów rekombinacji genetycznej, (b) technik syntezy, (c) technik oczyszczania lub ich kombinacji, jak jest to dobrze znane ze stanu techniki.

Kwasy nukleinowe mogą dogodnie obejmować oprócz polinukleotydu tu opisanego także sekwencje dodatkowe. Na przykład, do kwasu nukleinowego można dodać polilinker zawierający jedno lub kilka miejsc cięcia dla endonukleaz w celu ułatwienia izolacji polinukleotydu. Można także dodać sekwencje ulegające translacji w celu ułatwienia izolowania ulegającego translacji polinukleotydu tu opisanego. Dogodnego sposobu oczyszczania białek tu opisanych dostarcza na przykład znacznik

PL 206 833 B1 o sekwencji sześciu histydyn. Kwas nukleinowy tu opisany, z wyłączeniem sekwencji kodują cych opcjonalnie jest wektorem, adapterem lub linkerem do klonowania i(lub) ekspresji polinukleotydu tu opisanego.

Do takich sekwencji kodujących i(lub) ekspresyjnych można dodawać dodatkowe sekwencje w celu optymalizacji ich funkcji w klonowaniu i(lub) ekspresji, uł atwienia izolowania polinukleotydu lub w celu poprawy wprowadzania polinukleotydu do komórki. Używanie wektorów do klonowania, wektorów ekspresyjnych, adapterów i linkerów jest dobrze znane ze stanu techniki (zobacz np. Ausubel, jak wyżej, lub Sambrook, jak wyżej).

Sposoby rekombinacji stosowane do konstrukcji kwasów nukleinowych

Kompozycje izolowanego kwasu nukleinowego tu opisanego, takiego jak RNA, cDNA, genomowy DNA lub dowolna ich kombinacja, można wytwarzać ze źródeł biologicznych przy użyciu szeregu metod klonowania znanych specjalistom w tej dziedzinie. W pewnych wykonaniach do identyfikacji pożądanej sekwencji w bibliotece cDNA lub genomowego DNA wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe, które hybrydyzują selektywnie w surowych warunkach hybrydyzacji do polinukleotydów tu opisanych. Izolowanie RNA i konstruowanie cDNA i bibliotek genomowych są dobrze znana specjalistom w tej dziedziniec (Zobacz np. Ausubel, jak wyżej, lub Sambrook, jak wyż ej). Sposoby izolowania i przeszukiwania kwasów nukleinowych

Bibiotekę cDNA lub genomową można przeszukiwać przy użyciu sondy sporządzonej na podstawie sekwencji polinukleotydu tu opisanego. Sondy można zastosować do hybrydyzacji z sekwencjami genomowego DNA lub cDNA w celu izolacji genów homologicznych w tych samych lub różnych organizmach. Specjaliści w tej dziedzinie docenią, że w tej metodzie mogą być zastosowane różne poziomy restrykcyjności warunków hybrydyzacji; zarówno roztwór do hybrydyzacji, jak i roztwór do płukania mogą być odpowiednio silne. Wraz ze wzrostem restrykcyjności warunków hybrydyzacji musi zwiększać się stopień komplementarności pomiędzy sondą i jej celem, aby doszło do formowania dupleksów. Stopień restrykcyjności warunków hybrydyzacji można regulować przez jeden lub więcej parametrów takich, jak temperatura, siła jonowa, pH i obecność częściowo denaturującego rozpuszczalnika takiego, jak formamid. Na przykład retrykcyjność hybrydyzacji można dogodnie zmieniać przez zmianę polarności roztworu reakcyjnego poprzez manipulację stężeniem formamidu w zakresie od 0 do 50%. Stopień komplementarności (identyczności sekwencji) wymagany do wykrywalnego wiązania będzie się zmieniać wraz ze zmianami restrykcyjności roztworu hybrydyzacyjnego i(lub) roztworu płuczącego. Stopień komplementarności będzie wynosił optymalnie 100%, 70-100% lub dowolny zakres lub wartość spośród wymienionego. Jednakże powinno być zrozumiałe, że niewielkie zmiany sekwencji w sondach i starterach można skompensować przez zmniejszenie restrykcyjności roztworu do hybrydyzacji i(lub) płukania.

Sposoby amplifikacji RNA lub DNA są dobrze znane ze stanu techniki i można je zastosować według zgodnie z niniejszym wynalazkiem bez zbytniego eksperymentowania, na podstawie pouczeń i wskazówek przedstawionych tutaj.

Znane sposoby amplifikacji DNA lub RNA, obejmują, ale nie są do nich ograniczone, łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i pokrewne procesy amplifikacji (zobacz np. patenty USA nr 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 dla Mullis i wsp.; 4795699 i 4921794 dla Tabor i wsp; 5142033 dla Innis; 5122464 dla Wilson i wsp.; 5091310 dla Innis; 5066584 dla Gyllensten i wsp; 4889818 dla Gelfand i wsp; 4994370 dla Silver, i wsp; 4766067 dla Biswas; 4656134 dla Ringold) i amplifikację za pośrednictwem RNA, która wykorzystuje antysensowny RNA do sekwencji docelowej jako matrycę do syntezy dwuniciowego DNA (patent USA nr 5130238 dla Malek, i wsp, z handlową nazwą NASBA) (Zobacz np. Ausubel, jak wyżej, lub Sambrook, jak wyżej).

Do amplifikacji sekwencji polinukleotydów tu opisanych i genów pokrewnych bezpośrednio z bibliotek genomowego DNA lub cDNA można zastosować na przykład technologię łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). PCR i inne sposoby amplifikacji in vitro można zastosować na przykład do sklonowania sekwencji kwasu nukleinowego, kodujących białka ulegające ekspresji, do zastosowania kwasów nukleinowych jako sondy do detekcji obecności pożądanego mRNA w próbkach, do sekwencjonowania kwasów nukleinowych lub w innych celach. Przykłady technik wystarczających do wprowadzenia specjalistów do metodyki amplifikacji in vitro można znaleźć w Berger, jak wyżej, Sambrook, jak wyżej, i Ausubel, jak wyżej, jak również w Mullis, i wsp., patent USA nr 4683202 (1987); i Innis i wsp., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, red., Academic Press Inc., San Diego, CA, USA (1990). Znane są ze stanu techniki dostępne zestawy handlowe do namnażania genomowePL 206 833 B1 go DNA techniką PCR. Zobacz np. Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Do poprawy wydajności dla długich produktów PCR można ponadto użyć białka 32 genu T4 (Boehringer Mannheim).

Syntetyczne sposoby konstruowania kwasów nukleinowych

Izolowane cząsteczki kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku można także wytwarzać znanymi sposobami przez bezpośrednią syntezę chemiczną (zobacz np. Ausubel, i wsp., jak wyżej). Synteza chemiczna ogólnie prowadzi do powstania jednoniciowego oligonukleotydu, który można przekształcać do dwuniciowego DNA przez hybrydyzację z sekwencją komplementarną lub przez polimeryzację przy użyciu polimerazy DNA, stosując jako matrycę pojedynczą nić. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że podczas gdy chemiczna synteza DNA może być ograniczona do około stu lub więcej nukleotydów, można uzyskać sekwencje dłuższe przez ligację krótszych sekwencji.

Rekombinowane kasety ekspresyjne

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto rekombinowane kasety ekspresyjne, zawierające cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku. Sekwencji kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, na przykład sekwencja cDNA lub genomowej kodującej przeciwciało według niniejszego wynalazku można użyć do skonstruowania rekombinowanej kasety ekspresyjnej, którą można wprowadzić do przynajmniej jednej pożądanej komórki gospodarza. Rekombinowana kaseta ekspresyjna będzie typowo zawierać polinukleotyd tu opisany w funkcjonalny sposób dołączony do sekwencji regulujących inicjację transkrypcji, które będą sterować transkrypcją polinukleotydu w użytej komórce gospodarza. Do sterowania ekspresją cząsteczek kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku można zastosować zarówno promotory heterologiczne, jak i nieheterologiczne (np. endogenne).

W pewnych wykonaniach izolowane kwasy nukleinowe, które służą jako promotor, wzmacniacz transkrypcji lub inne elementy, mogą być włączone w odpowiedniej pozycji (na prawo, na lewo lub w intronie) w nieheterologicznej postaci polinukleotydu tu opisanego tak, aby zwiększać lub zmniejszać ekspresję polinukleotydu tu opisanego. Na przykład endogenne promotory mogą być zmienione in vivo lub in vitro przez mutację, delecję i(lub) substytucję.

Wektory i komórki gospodarza

Zgodnie z wynalazkiem opisano także wektory, zawierające izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, komórki gospodarza, do których są wprowadzane rekombinowane wektory i wytwarzanie przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF technikami rekombinacji genetycznej, jak jest to dobrze znane ze stanu techniki. Zobacz np. Sambrook, i wsp., jak wyżej; Ausubel, i wsp., jak wyżej.

Polinukleotydy mogą opcjonalnie być połączone z wektorem zawierającym znacznik selekcyjny, ulegający ekspresji w gospodarzu. Ogólnie wektor plazmidowy jest umieszczany w precypitacje, takim jak precypitat fosforanu wapnia, lub w kompleksie z naładowanym lipidem. Jeżeli wektorem jest wirus, może on być zapakowany in vitro przy użyciu odpowiedniej pakującej linii komórkowej i następnie wprowadzony do komórek gospodarza.

Wstawka DNA powinna być przyłączona w sposób funkcjonalny do odpowiedniego promotora. Konstrukty ekspresyjne będą ponadto zawierać miejsca inicjacji i terminacji transkrypcji oraz w regionie ulegającym transkrypcji miejsce wiązania rybosomu potrzebne do translacji. Kodująca część dojrzałych transkryptów ulegających ekspresji z konstruktów będzie dogodnie zawierać kodon inicjacji translacji na początku i kodon stop (np. UAA, UGA lub UAG) odpowiednio umieszczony na końcu mRNA ulegającego translacji, przy czym w przypadku ssaczej lub eukariotycznej ekspresji w komórce zalecane są kodony UAA i UAG.

Wektory ekspresyjne będą dogodnie, ale opcjonalnie zawierać przynajmniej jeden znacznik selekcyjny. Takie znaczniki obejmują np. ale nie są ograniczone do genów oporności hodowli komórek eukariotycznych na metotreksat (MTX), reduktazę dihydrofolianu (DHFR, patenty USA nr 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ampicylinę, neomycynę (G418), kwas mikofenolowy, lub syntetazę glutaminy (GS, patenty USA nr 5122464; 5770359; 5827739) i genów oporności na tetracyklinę lub ampicylinę do hodowli E. coli i innych bakterii lub komórek prokariotycznych. Odpowiednie pożywki i warunki hodowli wszystkich opisanych powyżej komórek gospodarza są znane ze stanu techniki. Odpowiednie wektory będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie. Wprowadzenie konstruktu wektora do komórki gospodarza może odbywać się przez transfekcję z fosforanem wapnia, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transfekcję za pośrednictwem lipidów kationowych, elektroporację, transdukcję, infekcję lub innymi znanymi sposobami. Takie sposoby są opisane w tej

PL 206 833 B1 dziedzinie, jak np. Sambrook, jak wyżej, rozdziały 1-4 i 16-18; Ausubel, jak wyżej, rozdziały 1, 9, 13, 15, 16.

Przynajmniej jedno przeciwciało według niniejszego wynalazku może ulegać ekspresji w zmienionej formie, takiej jak białko fuzyjne, i może zawierać nie tylko sygnały sekrecji, ale dodatkowo heterologiczne regiony funkcjonalne. Na przykład, do końca N przeciwciała można dodawać region dodatkowych aminokwasów, szczególnie naładowanych aminokwasów, w celu poprawienia stabilności i trwałości w komórce gospodarza, podczas oczyszczania lub podczas póź niejszej obróbki i przechowywania. Do przeciwciała można także dodawać fragmenty peptydowe ułatwiające oczyszczanie. Takie regiony mogą być usunięte przed ostatecznym wytworzeniem przeciwciała lub przynajmniej jednego jego fragmentu. Takie sposoby są opisane w wielu standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Sambrook, jak wyżej, rozdziały 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, jak wyżej, rozdziały 16, 17 i 18.

Specjaliści w tej dziedzinie posiadają odpowiednią wiedzę na temat licznych systemów ekspresyjnych zdolnych do ekspresji kwasu nukleinowego kodującego białko tu opisane.

Alternatywnie, kwasy nukleinowe tu opisane mogą ulegać ekspresji w komórkach gospodarza przez włączenie (przez manipulację) w komórkę gospodarza, która zawiera endogenne DNA kodujące przeciwciało według niniejszego wynalazku. Takie sposoby są dobrze znane ze stanu techniki, jak np. opisano w patentach USA nr 5580734, 5641670, 5733746 i 5733761.

Przykładowymi hodowlami komórkowymi użytecznymi do wytwarzania przeciwciał, ich wyszczególnionych fragmentów lub wariantów są komórki ssacze. Ssacze systemy komórkowe często będą miały postać pojedynczych warstw komórek, chociaż używa się także zawiesin lub bioreaktorów komórek ssaczych. W tej dziedzinie opracowano szereg odpowiednich linii komórkowych gospodarza zdolnych do ekspresji nienaruszonych glikozylowanych białek obejmujących linie komórkowe COS-1 (np. CRL 1650 ATCC), COS-7 (np. CRL 1651 ATCC), HEK293, BHK21 (np. CRL-10 ATCC), CHO (np. CRL 1610 ATCC) i BSC-1 (np. CRL-26 ATCC), komórki Cos-7, komórki CHO, komórki hep G2, komórki P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293, komórki HeLa i tym podobne, które są łatwo dostępne, na przykład z American Type Culture Collection, Manassas, Va, USA (www.atcc.org). Preferowane komórki gospodarza obejmują komórki pochodzenia limfoidalnego, takie jak komórki szpiczaka i chłoniaka. Szczególnie preferowanymi komórkami gospodarza są komórki P3X63Ag8.653 (numer dostępu ATCC CRL-1580) i komórki SP2/0Ag14 (numer dostępu ATCC CRL-1851). W szczególnie zalecanym wykonaniu, rekombinowana komórką jest komórka P3X63Ab8.653 lub SP2/0-Ag14.

Wektory ekspresyjne dla tych komórek mogą zawierać jeden lub większą liczbę następujących sekwencji regulujących ekspresję, takich jak, między innymi miejsce inicjacji replikacji, promotor (np. późne lub wczesne promotory SV40, promotor CMV (patenty USA nr 5168062; 5385839), promotor HSV tk, promotor pgk (kinazy fosfoglicerynianowej), promotor EF-1 alfa (patent USA nr 5266491), przynajmniej jeden promotor ludzkiej immunoglobuliny, wzmacniacz transkrypcji i(lub) miejsca zawierające informację o obróbce mRNA, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca wycinania intronów z RNA, miejsca poliadenylacji (np. miejsce dodawania poli(A) z duż ego T Ag z SV40) i sekwencje terminacji transkrypcji. Zobacz np. Ausubel i wsp., jak wyżej, Sambrook, i wsp., jak wyżej. Inne komórki użyteczne w produkcji kwasów nukleinowych lub białek tu opisanych są znane i(lub) dostępne, na przykład z Katalogu Linii Komórkowych i Hybrydom American Type Culture Collection (www.atcc.org) lub innych znanych lub komercyjnych źródeł.

W przypadku eukariotycznych komórek gospodarza, sekwencje poliadenylacji lub terminacji transkrypcji są typowo włączone do wektora. Przykładem sekwencji terminatora jest sekwencja poliadenylacji z genu bydlęcego hormonu wzrostu. Można włączać także sekwencje do dokładnego wycinania intronów z transkryptu. Przykładem sekwencji wycinania intronu jest intron VP1 z SV40 (Sprague i wsp., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Dodatkowo, do wektora mogą być włączone sekwencje genowe regulujące replikację w komórce gospodarza, jak jest to znane ze stanu techniki.

Oczyszczanie przeciwciała

Przeciwciało anty-TNF można odzyskiwać i oczyszczać z hodowli rekombinowaych komórek dobrze znanymi sposobami, takimi jak oczyszczanie przy użyciu białka A, wytrącanie siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcja kwasem, chromatografia aniono- lub kationowymienna, chromatografia na fosfocelulozie, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia na hydroksyapatycie i chromatografia z użyciem lektyn. Do oczyszczania można także zastosować wysokosprawną chromatografię cieczową („HPLC). Zobacz np. Colligan, Current

PL 206 833 B1

Protocols in Immunology lub Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, USA (1997-2001), np. rozdziały 1, 4, 6, 8, 9, 10.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmują naturalnie oczyszczone produkty, produkty procedur syntezy chemicznej i produkty otrzymane przy użyciu technik rekombinacji genetycznej z eukariotycznego gospodarza, w tym na przykład komórki drożdży, roślin wyższych, owadów i ssaków. W zależności od gospodarza użytego w procedurze wytwarzania przy użyciu technik rekombinacji genetycznej, przeciwciało według niniejszego wynalazku może być lub nie być glikozylowane, przy czym zalecane jest glikozylowane. Takie sposoby są opisane w wielu standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Sambrook, jak wyżej, rozdziały 17.37-17.42; Ausubel, jak wyżej, rozdziały 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, jak wyżej, rozdziały 12-14.

Przeciwciała anty-TNF

Izolowane przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmują specyficzną sekwencję aminokwasową określoną w zastrzeżeniach, kodowaną przez odpowiedni polinukleotyd, lub dowolne wyizolowane lub otrzymane przeciwciało. Zalecane jest, jeżeli ludzkie przeciwciało wiąże się z ludzkim TNF i przez to częściowo lub zasadniczo neutralizuje przynajmniej jedną aktywność biologiczną białka. Przeciwciało lub jego wyszczególniony fragment lub wariant, który częściowo lub dogodnie zasadniczo neutralizuje przynajmniej jedną aktywność biologiczną przynajmniej jednego białka TNF lub jego fragmentu, może wiązać białko lub jego fragment i przez to hamować aktywności, w których TNF pośredniczy przez wiązanie się z receptorem TNF lub poprzez inne mechanizmy zależne od TNF lub za pośrednictwem TNF. Stosowany tutaj termin „przeciwciało neutralizujące dotyczy przeciwciała, które może hamować aktywność zależną od TNF o około 20-120%, zwłaszcza o przynajmniej około 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% lub więcej w zależności od oznaczenia. Zdolność przeciwciała anty-TNF do hamowania aktywności zależnej od TNF ocenia się dogodnie na podstawie przynajmniej jednego odpowiedniego oznaczenia białka lub receptora TNF, jak opisano tutaj i(lub) jak jest to znane ze stanu techniki. Ludzkie przeciwciało według niniejszego wynalazku może być dowolnej klasy (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD itp.) lub izotypu i może zawierać łańcuch lekki kappa lub lambda. W jednym z wykonań ludzkie przeciwciało zawiera łańcuch ciężki IgG lub zdefiniowany fragment, na przykład przynajmniej jednego z izotypów IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Przeciwciała tego typu można otrzymywać przez użycie transgenicznej myszy lub innego transgenicznego ssaka innego niż człowiek, zawierającego przynajmniej jeden transgen kodujący ludzki łańcuch lekki (np. IgG, IgA i IgM (np. γ1, γ2, γ3, γ4), jak opisano to tutaj i(lub) jest znane ze stanu techniki. W innym wykonaniu ludzkie przeciwciało przeciwko ludzkiemu TNF zawiera łańcuch ciężki IgG1 i łańcuch lekki IgG1.

Przynajmniej jedno przeciwciało według niniejszego wynalazku wiąże przynajmniej jeden wyszczególniony epitop specyficzny dla przynajmniej jednego białka TNF, jego podjednostki, fragmentu, części lub dowolnej ich kombinacji. Przynajmniej jeden epitop może zawierać przynajmniej jeden region wiążący przeciwciało, który zawiera przynajmniej jeden fragment tego białka, którego epitop jest dogodnie złożony z przynajmniej jednego zewnątrzkomórkowego, rozpuszczalnego, hydrofilowego, zewnętrznego lub cytoplazmatycznego fragmentu tego białka. Przynajmniej jeden wyszczególniony epitop może zawierać dowolną kombinację przynajmniej jednej sekwencji aminokwasowej przynajmniej 1-3 aminokwasów dołączoną do całego wyszczególnionego fragmentu ciągłej sekwencji aminokwasowej SEK ID NR:9.

Przeciwciało według wynalazku zawiera regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego i zmienne regiony zrębowe (FR) mAb TNV148, opisane na Fig. 4, oraz CDR łańcucha lekkiego i zmienne regiony zrębowe (FR) mAb TNV148, opisane na Fig. 5.

Takie przeciwciała można otrzymywać przez chemiczne połączenie razem różnych fragmentów przeciwciała (np. regionów CDR, zrębowego) przy użyciu konwencjonalnych technik, przez wytworzenie i ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego (tj. jednej lub więcej), która koduje przeciwciało, przy użyciu technik konwencjonalnych technologii rekombinowanego DNA lub przez zastosowanie innej odpowiedniej techniki.

Przeciwciało anty-TNF może zawierać regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego jednego z mAb TNV148 i 148B, jak opisano na Fig. 4 i 5. Przeciwciała, które wiążą się z ludzkim TNF i zawierają zdefiniowany region zmienny łańcucha ciężkiego lub lekkiego można otrzymywać przy użyciu odpowiednich sposobów, takich jak prezentacja na fagach (Katsube, Y., i wsp., Int J Mol Med, 1(5): 863-868 (1998)) lub sposoby z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych, jak jest to znane ze stanu techniki i(lub) opisane tutaj. Na przykład mysz transgeniczną zawierającą transgen funkcjonal20

PL 206 833 B1 nie przearanżowanego łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny i transgen zawierający DNA z locus łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, który może zostać funkcjonalnie przearanżowany, można poddać immunizacji ludzkim TNF lub jego fragmentem w celu wywołania produkcji przeciwciał. Jeżeli jest to pożądane, można wyizolować komórki produkujące przeciwciało i wytworzyć hybrydy lub inne unieśmiertelnione komórki produkujące przeciwciało, jak opisano to tutaj i(lub) jest to znane ze stanu techniki. Alternatywnie, przeciwciało, wyszczególniony fragment lub wariant może ulegać ekspresji przy użyciu kodującego kwasu nukleinowego lub jego fragmentu w odpowiednich komórkach gospodarza.

Pojęcie „substytucje konserwatywne aminokwasów oznacza zastąpienie jednego aminokwasu przez drugi aminokwas, posiadający właściwości chemiczne i(lub) fizyczne (np. ładunek, struktura, polarność, hydrofobowość/hydrofilowość) podobne do właściwości pierwszego aminokwasu. Substytucje konserwatywne obejmują zastąpienie jednego aminokwasu przez inny pochodzący z poniższych grup: lizyna (K), arginina (R) i histydyna (H); kwas asparaginowy (D) i glutaminowy (E); asparagina (N), glutamina (Q), seryna (S), treonina (T), tyrozyna (Y), K, R, H, D i E; alanina (A), walina (V), leucyna (L), izoleucyna (I), prolina (P), fenyloalanina (F), tryptofan (W), metionina (M), cysteina (C) i glicyna (G); F, W i Y; C, S i T.

Kody aminokwasów

Nazwy aminokwasów, z których zbudowane są przeciwciała anty-TNF według niniejszego wynalazku, są często podane skrótowo. Aminokwasy można oznaczeć kodem jednoliterowym, kodem trójliterowym, pełną nazwą lub kodonem(kodonami) w postaci trzech nukleotydów, jak jest to dobrze zrozumiałe w tej dziedzinie (zobacz Alberts, B. i wsp., Molecular Biology of The Cell, Wyd. trzecie, Garland Publishing, Inc., New York, 1994):

Kod jednoliterowy	Kod trzyliterowy	Nazwa	Trzy nukleotydowe kodony
1	2	3	4
A	Ala	Alanina	GCA, GCC, GCG, GCU
C	Cys	Cysteina	UGC, UGU
D	Asp	Kwas asparaginowy	GAC, GAU
E	Glu	Kwas glutaminowy	GAA, GAG
F	Phe	Fenyloalanina	UUC, UUU
G	Gly	Glicyna	GGA, GGC, GGG, GGU
H	His	Histydyna	CAC, CAU
I	Ile	Izoleucyna	AUA, AUC, AW
K	Lys	Lizyna	AAA, AAG
L	Leu	Leucyna	UUA, WG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	Met	Metionina	AUG
N	Asn	Asparagina	AAC, AAU
P	Pro	Prolina	CCA, CCC, CCG, CCU
Q	Gln	Glutamina	CAA, CAG
R	Arg	Arginina	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S	Ser	Seryna	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	Thr	Treonina	ACA, ACC, ACG, ACU

PL 206 833 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
V	Val	Walina	GUA, GUC, GUG, GUU
W	Trp	Tryptofan	UGG
Y	Tyr	Tyrozyna	UAC, UAU

Przeciwciało anty-TNF według niniejszego wynalazku może zawierać jedną lub większą liczbę substytucji, delecji lub addycji aminokwasów pochodzących zarówno z mutacji naturalnych, jak i manipulacji przez człowieka, jak wyszczególniono tutaj.

Oczywiście specjalista w tej dziedzinie dobrałby liczbę substytucji aminokwasów w zależności od wielu czynników, w tym czynników opisanych powyżej. Ogólnie, liczba substytucji aminokwasów, insercji lub delecji dla dowolnego podanego przeciwciała anty-TNF, jego fragmentu lub wariantu nie będzie większa niż 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, czyli 1-30 lub dowolny zakres lub wartość spośród wymienionych, jak wyszczególniono tutaj.

Aminokwasy w przeciwciele anty-TNF według niniejszego wynalazku, które są istotne do funkcjonowania, można zidentyfikować sposobami znanymi ze stanu techniki, takimi jak ukierunkowana mutageneza lub mutageneza ze skanowaniem alanin (np. Ausubel, jak wyżej, rozdziały 8, 15; Cunningham i Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). Ta druga procedura polega na dokonywaniu pojedynczych mutacji, wprowadzających alaninę w każdej pozycji w cząsteczce. Powstałe zmutowane cząsteczki są następnie testowane na obecność aktywności biologicznej, takiej jak, ale bez ograniczenia do przynajmniej jednej aktywności neutralizującej TNF. Miejsca krytyczne do wiązania się przeciwciała można także zidentyfikować przez analizę strukturalną, taką jak krystalizacja, magnetyczny rezonans jądrowy lub znakowanie przy użyciu fotopowinowactwa (Smith i wsp., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) i de Vos, i wsp.. Science 255: 306-312 (1992)).

Specjalista w tej dziedzinie doceni, że niniejszy wynalazek obejmuje przynajmniej jedno biologicznie aktywne przeciwciało według niniejszego wynalazku. Biologicznie aktywne przeciwciała posiadają aktywność specyficzną na poziomie przynajmniej 20%, 30% lub 40% i zwłaszcza, na poziomie przynajmniej 50%, 60% lub 70% a w szczególności na poziomie przynajmniej 80%, 90% lub 95%-1000% aktywności natywnego (niesyntetycznego), endogennego lub pokrewnego i znanego przeciwciała. Sposoby badania i ilościowego oznaczania aktywności enzymatyczej i specyficzności substratowej są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

W innym aspekcie zgodnie z wynalazkiem opisano ludzkie przeciwciała, które są zmodyfikowane przez kowalencyjne dołączenie części organicznej. Taka modyfikacja może prowadzić do powstania przeciwciała o ulepszonych właściwościach farmakokinetycznych (np. o zwiększonym półokresie rozpadu in vlvo, w surowicy). Część organiczna może być liniową lub rozgałęzioną hydrofilową grupą polimeru, grupą kwasu tłuszczowego lub grupą estru kwasu tłuszczowego. W poszczególnych wykonaniach masa cząsteczkowa hydrofilowej grupy polimerowej może wynosić od około 800 do około 120000 daltonów, grupa może być glikolem polialkanowym (takim jak np. glikol polietylenowy (PEG), glikol polipropylenowy (PPG)), polimerem węglowodanowym, polimerem aminokwasowym lub pirolidonem poliwinylu, a grupa kwasu tłuszczowego lub estru kwasu tłuszczowego może zawierać od około ośmiu do około czterdziestu atomów węgla.

Zmodyfikowane przeciwciała tu opisane mogą obejmować jedną lub większą liczbę części organicznych, które są przyłączone kowalencyjnie bezpośrednio lub pośrednio do przeciwciała. Każda część organiczna, która jest przyłączona do przeciwciała tu opisanego może niezależnie być hydrofilową grupą polimerową, grupą kwasu tłuszczowego lub grupą estru kwasu tłuszczowego. Stosowany tutaj termin „kwas tłuszczowy obejmuje kwasy jednokarboksylowe i kwasy dwukarboksylowe. Stosowany tutaj termin „hydrofilowa grupa polimerowa dotyczy polimeru organicznego, który jest bardziej rozpuszczalny w wodzie niż w oktanie. Bardziej rozpuszczalna w wodzie niż w oktanie jest na przykład polilizyna. Przeciwciało zmienione przez kowalencyjne dołączenie polilizyny jest więc objęte zakresem niniejszego wynalazku. Polimery hydrofilowe odpowiednie do modyfikowania przeciwciał według niniejszego wynalazku mogą być liniowe lub rozgałęzione i obejmują na przykład glikole polialakanowe (np. glikol monometoksypolietylenowy (mPEG), PPG i tym podobne), węglowodany (np. dekstran, celuloza, oligosacharydy, polisacharydy i tym podobne), polimery hydrofilowych aminokwasów (np. polilizyny, poliargininy, poliasparaginianu i tym podobnych), tlenki polialkanu (np. tlenek polietylenu,

PL 206 833 B1 tlenek polipropylenu i tym podobne), pirolidon poliwinylu. Masa cząsteczkowa polimeru hydrofilowego (jako osobnej cząsteczki), który modyfikuje przeciwciało według niniejszego wynalazku, wynosi dogodnie od około 800 do około 150000 daltonów. Na przykład można zastosować PEG5000 i PEG20000; indeks dolny określa średnią masę cząsteczkową polimeru w daltonach. Hydrofilowe grupy polimerowe mogą być podstawione grupami alkilowymi (od jednej do około sześciu), kwasów tłuszczowych lub estrów kwasów tłuszczowych. Polimery hydrofilowe podstawione grupą kwasu tłuszczowego lub estru kwasu tłuszczowego można otrzymywać przez zastosowanie odpowiednich sposobów. Na przykład polimer zawierający grupę aminową może być połączony z grupą karboksylową kwasu tłuszczowego lub estru kwasu tłuszczowego, a zaktywowana grupa karboksylowa (np. zaktywowana przez

N,N-karbonylo-diimidazol) na kwasie tłuszczowym lub estrze kwasu tłuszczowego może być połączona z grupą hydroksylową polimeru.

Kwasy tłuszczowe lub estry kwasów tłuszczowych odpowiednie do modyfikacji przeciwciał według niniejszego wynalazku mogą być nasycone lub mogą zawierać jedno lub większą liczbę wiązań nienasyconych. Kwasy tłuszczowe, które są odpowiednie do modyfikacji przeciwciał według niniejszego wynalazku obejmują, na przykład, kwas n-dodekanowy (C12, kwas laurowy), n-tetradekanowy (C14, kwas mirystynowy), n-oktadekanowy (C20, kwas stearynowy), n-eikozanowy (C20, kwas arachidowy), n-dokozanowy (C₂₂, kwas behenowy), n-triakontanowy (C₃₀), n-tetrakontanowy (C₄₀), cis^9-oktadekanowy (C₁₈, kwas oleinowy), wszystkie kwasy cis^5,8,11,14-eikozatetraenowe (C₂₀ kwas arachidonowy), kwas oktanodiowy, kwas tetradekanodiowy, kwas oktadekanodiowy, kwas dokozanodiowy i tym podobne. Odpowiednie estry kwasów tłuszczowych obejmują monoestry kwasów dwukarboksylowych, które zawierają liniową lub rozgałęzioną niższą grupę alkilową. Niższa grupa alkilowa może zawierać od jednego do około dwunastu, zwłaszcza od jednego do około sześciu atomów węgla.

Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała można otrzymywać przy użyciu odpowiednich sposobów, takich jak reakcja z jednym lub większą liczbą czynników modyfikujących. Stosowany tutaj termin „czynnik modyfikujący dotyczy odpowiedniej grupy organicznej (np. polimeru hydrofilowego, kwasu tłuszczowego, estru kwasu tłuszczowego), która zawiera grupę aktywującą. „Grupa aktywująca jest cząstką chemiczną lub grupą funkcyjną, która w odpowiednich warunkach reaguje z drugą grupą chemiczną, tworząc przez to wiązanie kowalencyjne pomiędzy czynnikiem modyfikującym a drugą grupą chemiczną. Na przykład aktywujące reaktywne grupy aminowe obejmują grupy elektrofilowe takie, jak tosylan, mesylan, fluorowcopochodne (chlor, brom, fluor, jod), estry N-hydroksysukcynimidu (NHS) i tym podobne. Grupy aktywujące, które mogą reagować z tiolami, obejmują na przykład imid kwasu maleinowego, dwusiarczek jodoacetylu, akrylolilu, pirydylu, tiol kwasu 5-tiolo-2-nitrobenzoesowego (TNB-tiol) i tym podobne. Funkcyjna grupa aldehydowa może być połączona z cząsteczkami zawierającymi grupę aminową lub hydrazydową, a grupa azydkowa może reagować z trójwartościową grupą fosforową, tworząc połączenia fosforoamidowe lub fosforoimidowe. Odpowiednie sposoby wprowadzania grup aktywujących do cząsteczek są znane ze stanu techniki (zobacz na przykład Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques. Academic Press: San Diego, CA, USA (1996)). Grupa aktywująca może być związana z grupą organiczną (np. polimerem hydrofilowym, kwasem tłuszczowym lub estrem kwasu tłuszczowego), bezpośrednio lub przez część łączącą, na przykład dwuwartościową grupę C1-C12, w której jeden lub większa liczba atomów węgla może być zastąpiona przez heteroatomy takie, jak tlen, azot lub siarka. Odpowiednie części wiążące obejmują, na przykład, glikol tetraetylenowy, -(CH2)3-,-NH-(CH2)6-NH-,-(CH2)2-NH- i -CH2-O-CH2-CH2-O-CH-CH2-O-CH-NH-. Czynniki modyfikujące, zawierające część łączącą można otrzymywać na przykład przez reakcję monoBoc-alkilodiaminy (np. mono-Boc-etylenodiaminy, mono-Boc-diaminoheksanu) z kwasem tłuszczowym w obecności 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) w celu otrzymania wiązania amidowego pomiędzy wolną aminą a grupą karboksylową kwasu tłuszczowego. Grupę zabezpieczającą Boc można usuwać z produktu przez traktowanie kwasem trifluorooctowym (TFA) w celu uwolnienia pierwszorzędowej aminy, która może być połączona z inną grupą karboksylową, jak opisano, lub może ulec reakcji z bezwodnikiem maleinowym, a powstały produkt może ulec cyklizacji tworząc zaktywowaną pochodną maleimidową kwasu tłuszczowego. Zobacz na przykład Thompson i wsp., WO 92/16221.

Zmodyfikowane przeciwciała według niniejszego wynalazku można otrzymywać przez reakcję ludzkiego przeciwciała z czynnikiem modyfikującym. Na przykład, części organiczne można dołączać do przeciwciała w sposób niespecyficzny do miejsca przez użycie reagującego z aminami czynnika modyfikującego, na przykład, estru PEG NHS. Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała można także otrzymywać przez redukcję wiązań dwusiarczkowych (np. wewnątrzłańcuchowych wiązań dwusiarczPL 206 833 B1 kowych) przeciwciała lub fragmentu wiążącego antygen. Zredukowane przeciwciało może następnie ulec reakcji ze środkiem modyfikującym reagującym z grupami tiolowymi w celu otrzymania zmodyfikowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała zawierające część organiczną, która jest przyłączona do specyficznych miejsc przeciwciała według niniejszego wynalazku, można otrzymywać przy zastosowaniu odpowiednich sposobów, takich jak odwrotna proteoliza (Fisch i wsp., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen i wsp., Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran i wsp., Protein Sci. 6 (10): 2233-2241 (1997); Itoh i wsp., Bioorg. Chem., 24 (1): 59-68 (1996); Capellas i wsp., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): 456-463 (1997)) i sposobów opisanych w Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Kompozycje przeciwciała anty-TNF

Zgodnie z wynalazkiem opisano także przynajmniej jedną kompozycję przeciwciała anty-TNF, obejmującą przynajmniej jedno, przynajmniej dwa, przynajmniej trzy, przynajmniej cztery, przynajmniej pięć, przynajmniej sześć lub więcej przeciwciał anty-TNF według tego wynalazku, zgodnych z opisem tu zawartym i(lub) znanych w dziedzinie, które dostarcza się w kompozycji, mieszaninie lub formie, niewystępującej w przyrodzie.

Kompozycje przeciwciała anty-TNF tu opisane mogą ponadto zawierać odpowiednią i skuteczną ilość przynajmniej jednej kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej, zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF dla komórki, tkanki, narządu, zwierzęcia lub pacjenta, potrzebującego takiej modulacji, leczenia lub terapii, ewentualnie zawierając ponadto przynajmniej jedną substancję wybraną spośród przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. lecz bez ograniczenia do przeciwciała TNF lub fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub fragmentu, ich białek fuzyjnych lub drobnocząsteczkowego antagonisty TNF), leku przeciwreumatycznego (np. metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, tiojabłczan złotowo-sodowy, siarczan hydroksychlorochiny, leflunomid, sulfasalazyna), leku zwiotczającego mięśnie, narkotyku, niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NLPZ), leku przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka znieczulającego miejscowo, blokera złącza nerwowo-mięśniowego, leku przeciwko drobnoustrojom (np. aminoglikozydu, leku przeciwgrzybiczego, leku przeciwpasożytniczego, leku przeciwwirusowego, karbapenemu, cefalosporyny, fluorochinolonu, makrolidu, penicyliny, sulfonamidu, tetracykliny, innego leku przeciwko drobnoustrojom), leku przeciwłuszczycowego, kortykosteroidu, steroidu anabolicznego, środka związanego z cukrzycą, substancji mineralnej, substancji odżywczej, środka działającego na tarczycę, witaminy, hormonu związanego z wapniem, leku przeciwbiegunkowego, środka przeciwkaszlowego, środka przeciwwymiotnego, leku przeciwwrzodowego, środka przeczyszczającego, środka przeciwkrzepliwego, erytropoetyny (np. epoetyny alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen),) sargramostimu (GM-CSF, Leukine), szczepionki, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego (np. basiliksymab, cyklosporyna, daklizumab), hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, modulatora receptora estrogenu, środka rozszerzającego źrenice, środka cykloplegicznego, czynnika alkilującego, antymetabolitu, inhibitora mitozy, środka radiofarmaceutycznego, leku przeciwdepresyjnego, środka przeciw manii, środka przeciwpsychotycznego, środka przeciwlękowego, leku nasennego, środka sympatykomimetycznego, środka pobudzającego, donepezilu, takryny, leku na astmę, agonisty receptora beta, steroidu wziewnego, inhibitora leukotrienu, metyloksantyny, kromoglikanu disodowego, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (Pulmozyme), cytokiny lub antagonisty cytokiny. Nieograniczające przykłady takich cytokin obejmują, ale nie ograniczają się do każdej z IL-1 do IL-23. Stosowne dawkowanie jest dobrze znane ze stanu techniki. Zobacz np. Wells i wsp., red., Pharmacotherapy Handbook, wydanie drugie, Appleton i Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Takie środki przeciwnowotworowe lub przeciwzakażne mogą również zawierać cząsteczki toksyn, które towarzyszą, są związane, wchodzą w skład tej samej kompozycji lub są jednocześnie podawane z przynajmniej jednym przeciwciałem według niniejszego wynalazku. Toksyna może ewentualnie służyć do zabijania patologicznych komórek lub tkanek. Komórką patologiczną może być komórka rakowa lub inna komórka. Takie toksyny mogą obejmować, ale nie są ograniczone do oczyszczonych lub rekombinowanych toksyn lub fragmentów toksyn, zawierających przynajmniej jedną funkcjonalną domenę cytotoksyczną toksyny, np. wybieraną spośród przynajmniej jednej z rycyny, toksyny błonicy, toksyny jadowej lub toksyny bakteryjnej. Termin „toksyna obejmuje również endotoksyny oraz egzotoksyny, wytwarzane przez wszelkie występujące w przyrodzie, zmutowane lub zrekombinowane bakterie bądź wirusy, które mogą wywoływać u człowieka i innych ssaków dowolny stan patologiczny, w tym wstrząs toksyczny, który może zakończyć się śmiercią. Takie toksyny mogą obejmo24

PL 206 833 B1 wać, ale nie są ograniczone do wrażliwej na ciepło enterotoksyny z wytwarzających enterotoksynę E. coli (LT), niewrażliwą na ciepło enterotoksynę (ST), cytotoksynę Shigella, enterotoksyny Aeromonas, toksyny-1 zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1), enterotoksyny A (SEA), B (SEB) lub C (SEC) gronkowców, enterotoksyny paciorkowców i tym podobne. Takie bakterie obejmują, ale nie są ograniczone do szczepów wytwarzających enterotoksynę E. coli (ETEC), jelitowo-krwotoczne E. coli (np. szczepy serotypu 0157:H7), gatunki gronkowców (np. Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), gatunki Shigella (np. Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei), gatunki Salmonella (np. Salmonella typhi. Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis), gatunki Clostridium (np. Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum), gatunki Campylobacter (np. Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus), gatunki Helicobacter (np. Helicobacter pylori), gatunki Aeromonas (np. Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Plesiomonas shigelloides, Yersinia enterocolitica, gatunki Vibrio (np. Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus), gatunki Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa oraz paciorkowce. Zobacz np. Stein, red., INTERNAL MEDICINE, wyd. 3, str. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans i wsp., red., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, wyd. 2, str. 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell i wsp., Principles and Practice of Infectious Diseases, wyd. 3., Churchill Livingstone, New York (1990); Berków i wsp., red., The Merck Manual, wydanie 16, Merck and Co., Rahway, N. J., 1992; Wood i wsp., FEMS Microbiology Immnunology, 76: 121-134 (1991); Marrack i wsp., Science, 248: 705-711 (1990).

Związki, kompozycje i kombinacje przeciwciał anty-TNF według niniejszego wynalazku mogą ponadto zawierać przynajmniej jedną spośród wszelkich odpowiednich substancji pomocniczych, takich jak, ale nie ograniczonych do rozcieńczalników, substancji wiążących, stabilizatorów, buforów, soli, rozpuszczalników lipofilowych, konserwantów, adiuwantów i tym podobnych. Zalecane są substancje pomocnicze dopuszczalne farmaceutycznie. Nieograniczające przykłady i sposoby przygotowania takich jałowych roztworów są dobrze znane ze stanu techniki, takie jak, ale bez ograniczenia do Gennaro, red.. Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, Mack Publishing Co. (Easton, PA, USA) 1990. Można rutynowo dobrać akceptowalne farmaceutycznie nośniki, które są stosowne do sposobu podawania, rozpuszczalności i(lub) trwałości kompozycji przeciwciała anty-TNF, które są dobrze znane ze stanu techniki lub jak tu opisano.

Farmaceutyczne zaróbki i dodatki przydatne w niniejszej kompozycji obejmują, ale nie są ograniczone do białek, peptydów, aminokwasów, lipidów i węglowodanów (np. cukrów, w tym monosacharydów, di-, tri-, tetra- i oligosacharydów, pochodnych cukrów takich jak alditole, kwasy aldonowe, cukry zestryfikowane i tym podobne oraz polisacharydy lub polimery cukrów), które mogą być obecne pojedynczo lub w kombinacji, stanowiąc samodzielnie lub w kombinacji 1-99,99% wagowo lub objętościowo. Do przykładowych zaróbek białkowych należą albumina surowicy, taka jak albumina surowicy ludzkiej (HSA), rekombinowana albumina ludzka (rHA), żelatyna, kazeina i tym podobne. Reprezentatywne aminokwasy/składniki przeciwciał, które mogą również działać jako bufory, obejmują alaninę, glicynę, argininę, betainę, histydynę, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, cysteinę, lizynę, leucynę, izoleucynę, walinę, metioninę, fenyloalaninę, aspartam i tym podobne. Jednym z zalecanych aminokwasów jest glicyna.

Zaróbki węglowodanowe, odpowiednie do zastosowania w tym wynalazku obejmują na przykład monosacharydy, takie jak fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-mannoza, sorboza i tym podobne; disacharydy, takie jak laktoza, sacharoza, trehaloza, celobioza i tym podobne, polisacharydy, takie jak rafinoza, melezytoza, maltodekstryny, dekstrany, skrobie i tym podobne oraz alditole, takie jak mannitol, ksylitol, maltytol, laktytol, ksylitol, sorbitol (glucytol), mioinozytol i tym podobne. Zaróbkami węglowodanowymi, których zastosowanie w niniejszym wynalazku jest zalecane, są mannitol, trehaloza i rafinoza.

Kompozycje przeciwciała anty-TNF mogą również zawierać bufor lub czynnik ustalający pH, typowo bufor jest solą utworzoną z kwasu lub zasady organicznej. Do reprezentatywnych buforów należą sole kwasów organicznych, takie jak sole kwasu cytrynowego, kwasu askorbinowego, kwasu glukonowego, kwasu węglowego, kwasu winowego, kwasu bursztynowego, kwasu octowego lub kwasu ftalowego; Tris, chlorowodorek trometaminy lub bufory fosforanowe. Buforami, których zastosowanie jest zalecane w niniejszym wynalazku, są sole kwasów organicznych, takie jak cytrynian.

Dodatkowo kompozycje przeciwciała anty-TNF według wynalazku mogą zawierać zaróbki/dodatki polimeryczne, takie jak poliwinylopirolidony, fikole (cukier polimeryczny), dekstrany (np.

cyklodekstryny, takie jak 2-hydroksypropylo-(e-cyklodekstryna), glikole polietylenowe, czynniki smaPL 206 833 B1 kowe, środki przeciwko drobnoustrojom, substancje słodzące, przeciwutleniacze, czynniki antystatyczne, czynniki powierzchniowo czynne (np. polisorbiniany, takie jak „TWEEN 20 i „TWEEN 80), lipidy (np. fosfolipidy, kwasy tłuszczowe), steroidy (np. cholesterol), i czynniki chelatujące (np. EDTA).

Te i dodatkowe znane zaróbki i(lub) dodatki farmaceutyczne, odpowiednie do zastosowania w kompozycjach przeciwciał anty-TNF, zgodnie z wynalazkiem, są znane ze stanu techniki, np. wymieniane w „Remington: The Science & Practice of Pharmacy, wyd. 19, Williams & Williams, (1995), i w „Physician's Desk Reference, wyd. 52, Medical Economics, Montvale, NJ (1998), USA. Zalecanymi materiałami nośników lub zaróbek są węglowodany (np. sacharydy i alditole) i bufory (np. cytrynian) lub czynniki polimerowe.

Preparaty

Zgodnie z wynalazkiem opisano trwałe preparaty, które dogodnie zawierają bufor fosforanowy z solą fizjologiczną lub wybraną solą, a także roztwory i preparaty, zawierające konserwanty oraz preparaty konserwowane do różnego użytku, odpowiedniego do zastosowania farmaceutycznego lub weterynaryjnego, zawierające przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF w preparacie akceptowalnym farmaceutycznie. Praparaty konserwowane zawierają przynajmniej jeden konserwant znany lub ewentualnie wybrany z grupy, zawierającej przynajmniej jeden spośród fenolu, m-krezolu, p-krezolu, o-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, azotynu fenylortęciowego, fenoksyetanolu, formaldehydu, chlorobutanolu, chlorku magnezu (np. heksahydratu), alkiloparabenu (metylo-, etylo-, propyle-, butyloparaben i podobne), chlorku benzalkoniowego, chlorku benzetoniowego, dehydrooctanu sodowego i timerosalu, lub ich mieszanin w rozcień czalniku wodnym. Moż na uż y ć dowolnego odpowiedniego stężenia lub mieszaniny znanych ze stanu techniki, na przykład 0,001-5%, lub wszelki zakres lub wartość z tego zakresu, takie jak, między innymi 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 lub wszelkich zakresów lub wartości z tego zakresu. Nieograniczające przykłady obejmują brak konserwantu, 0,1-2% m-krezolu (np. 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% alkoholu benzylowego (np. 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% timerosalu (np. 0,005, 0,01), 0,001-2,0% fenolu (np. 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% alkiloparabenu(ów) (np. 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) i tym podobnie.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opisano także produkt przemysłowy, obejmujący opakowanie i przynajmniej jedną fiolkę, zawierającą roztwór przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF z przepisanymi buforami i(lub) konserwantami, ewentualnie w rozcień czalniku wodnym, gdzie to opakowanie zawiera etykietę, która wskazuje, że ten roztwór może być przechowywany przez okres 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 godzin lub dłużej. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem opisano ponadto produkt przemysłowy, obejmujący opakowanie, pierwszą fiolkę, zawierającą liofilizowane przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF i drugą fiolkę, zawierającą rozcieńczenie wodne przepisanego buforu lub konserwantu, przy czym to opakowanie zawiera etykietę, która instruuje pacjenta, żeby dokonał rozpuszczenia przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF w rozcieńczalniku wodnym, by utworzyć roztwór, który może być przechowywany przez okres dwudziestu czterech godzin lub dłużej.

To przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF, stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, można wyprodukować środkami rekombinacji, w tym z zastosowaniem komórek ssaków lub preparatów transgenicznych, lub można je oczyszczać z innych źródeł biologicznych, jak opisano tutaj lub w sposób znany ze stanu techniki.

Zakres przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF w produkcie tu opisanym obejmuje ilości, dające po rozpuszczeniu, jeśli jest to układ substancja sucha/roztwór, stężenie od około 1,0 μg/ml do około 1000 mg/ml, choć można zastosować niższe i wyższe stężenie, zależnie od zamierzonego nośnika podawania, np. kompozycje roztworów będą się różnić od plastra przezskórnego i sposobów płucnych, przezśluzówkowych, osmotycznych lub z użyciem mikropomp.

Zalecane jest, gdy rozcieńczalnik wodny zawiera ponadto ewentualnie dopuszczalny farmaceutycznie konserwant. Do zalecanych konserwantów należą takie, które wybiera się z grupy, składającej się z fenolu, m-krezolu, p-krezolu, o-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, alkiloparabenu (metylo-, etylo-, propylo-, butyloparaben i podobne), chlorku benzalkoniowego, chlorku benzetoniowego, dehydrooctanu sodowego i timerosalu lub ich mieszanin. Stężenie konserwantu zastosowanego w kompozycji jest stężeniem wystarczającym do uzyskania efektu przeciwko drobnoustrojom. Takie stężenie zależy od wybranego konserwantu i może je łatwo ustalić wyszkolony wykonawca.

PL 206 833 B1

Do rozcieńczalnika ewentualnie i dogodnie można dodać inne zaróbki, np. czynniki izotoniczne, bufory, przeciwutleniacze, wzmacniacze konserwantów. Powszechnie stosuje się znane stężenie czynnika izotonicznego, takiego jak gliceryna. W celu poprawy regulacji pH zalecane jest dodanie tolerowanego fizjologicznie buforu. Preparaty mogą pokrywać szeroki zakres pH, taki jak od około 4 do około 10, zwłaszcza zakres od około 5 do około 9, a w szczególności zakres od około 6,0 do około 8,0. Zalecane pH preparatu tu opianego wynosi od około 6,8 do około 7,8. Do zalecanych buforów należą bufory fosforanowe, najbardziej zalecany jest fosforan sodu, a w szczególności buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS).

Ewentualnie, w celu obniżenia agregacji, można dodać do kompozycji lub preparatu inne substancje dodatkowe, takie jak akceptowalne farmaceutycznie susbtancje ułatwiające rozpuszczanie, w rodzaju Tween 20 (monolaurynian polioksyetyleno-(20)sorbitanu), Tween 40 (monopalmitynian polioksyetyleno(20)sorbitanu), Tween 80 (monooleinian polioksyetyleno(20)sorbitanu), Pluronic F68 (kopolimery blokowe polioksyetylenu i polioksypropylenu) i PEG (glikol polietylenowy) lub niejonowe substancje powierzchniowo czynne, takie jak polisorbinian 20 lub 80 lub poloksamer 184 lub 188, polile Pluronic®, inne kopolimery blokowe i chelatory, takie jak EDTA i EGTA. Te substancje dodatkowe są szczególnie przydatne, gdy do podawania kompozycji jest stosowana pompa lub pojemnik plastikowy. Obecność substancji powierzchniowo czynnej akceptowalnej farmaceutycznie osłabia skłonność białka do agregacji.

Preparaty tu opisane można wytworzyć w procesie, który obejmuje mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF i konserwantu, wybranego z grupy, składającej się z fenolu, m-krezolu, p-krezolu, o-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, alkiloparabenu (metylo-, etylo-, propylo-, butyloparaben i podobne), chlorku benzalkoniowego, chlorku benzetoniowego, dehydrooctanu sodowego i timerosalu, lub ich mieszanin w rozcieńczalniku wodnym. Mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF i konserwantu w rozcieńczalniku wodnym przeprowadza się stosując konwencjonalne procedury rozpuszczania i mieszania. Aby otrzymać odpowiednią kompozycję, na przykład łączy się odmierzoną ilość przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF w zbuforowanym roztworze z pożądanym konserwantem w zbuforowanym roztworze w ilościach wystarczających dla dostarczenia białka i konserwantu w pożądanym stężeniu. Modyfikacje tego procesu będą jasne dla osób o zwykłej znajomości dziedziny. Na przykład kolejność, w jakiej dodawane są składniki, to, czy stosuje się dalsze substancje dodatkowe, temperatura i pH, w jakich wykonuje się kompozycję, są czynnikami, które można zoptymalizować dla stosowanego stężenia i środków podawania.

Opisane tu preparaty można dostarczać pacjentom jako czyste roztwory lub jako pary fiolek, w skład których wchodzi fiolka zawierająca liofilizowane przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF, które rozpuszcza się za pomocą drugiej fiolki, zawierającej wodę, konserwant i(lub) zaróbki, dogodnie jest to bufor fosforanowy i(lub) sól fizjologiczna oraz wybrana sól, w rozcieńczalniku wodnym. Zarówno fiolka z pojedynczym roztworem, jak i para fiolek, wymagająca rozpuszczania, może być używana wielokrotnie i może wystarczyć na pojedynczy lub wiele cykli leczenia pacjenta, zapewniając tym samym schemat leczniczy dogodniejszy od dostępnego obecnie.

Opisane tu produkty przemysłowe nadają się do podawania w okresie od zaraz do dwudziestu czterech godzin lub dłużej. Zgodnie z tym, opisane tu produkty przemysłowe dają pacjentowi znaczące korzyści. Opisane tu preparaty można ewentualnie bezpiecznie przechowywać w temperaturze od około 2 do około 40°C, zachowując aktywność biologiczną białka przez dłuższy czas, co pozwala na podanie na etykiecie opakowania, że roztwór można stosować i(lub) przechowywać przez okres 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 lub 96 godzin albo dłużej. Jeśli stosuje się rozcieńczalnik z konserwantem, to taka etykieta może zalecać stosowanie do 1-12 miesięcy, pół roku, półtora roku i(lub) dwóch lat.

Roztwory przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF w tym wynalazku można sporządzić w procesie, obejmującym mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała z rozcieńczalnikiem wodnym. Mieszanie przeprowadza się stosując konwencjonalne procedury rozpuszczania i mieszania. Aby otrzymać odpowiedni rozcieńczalnik, łączy się na przykład odmierzoną ilość przynajmniej jednego przeciwciała w wodzie lub buforze w ilościach wystarczających dla dostarczenia białka i ewentualnie konserwantu lub buforu w pożądanym stężeniu. Modyfikacje tego procesu będą jasne dla osób o zwykłej znajomości dziedziny. Na przykład kolejność, w jakiej dodawane są składniki, to, czy stosuje się dalsze substancje dodatkowe, temperatura i pH, w jakich wykonuje się preparat, są czynnikami, które można zoptymalizować dla stosowanego stężenia i środków podawania.

Opisane tu produkty można dostarczać pacjentom jako czyste roztwory lub jako pary fiolek, w skład których wchodzi fiolka z liofilizowanym przynajmniej jednym przeciwciałem anty-TNF, które

PL 206 833 B1 rozpuszcza się za pomocą drugiej fiolki, zawierającej rozcieńczalnik wodny. Zarówno fiolka z pojedynczym roztworem, jak i para fiolek, wymagająca rozpuszczania, mogą być używane wielokrotnie i mogą wystarczyć na pojedynczy lub wiele cykli leczenia pacjenta, zapewniając tym samym schemat leczniczy dogodniejszy od dostępnego obecnie.

Opisane tu produkty można dostarczać pacjentom pośrednio, przez dostarczenie do aptek, klinik lub innych instytucji i zakładów czystych roztworów lub par fiolek, w skład których wchodzi fiolka z liofilizowanym przynajmniej jednym przeciwciałem anty-TNF, które rozpuszcza się za pomocą drugiej fiolki, zawierającej rozcieńczalnik wodny. Czysty roztwór w tym przypadku może mieć objętość jednego litra lub nawet większą, w postaci dużego zbiornika, z którego można jednokrotnie lub wielokrotnie pobierać mniejsze porcje roztworu przynajmniej jednego przeciwciała, celem przeniesienia do mniejszych fiolek i dostarczenia przez aptekę bądź klinikę klientom i(lub) pacjentom.

Do uznanych urządzeń, zawierających te systemy z jedną fiolką, należą urządzenia do wstrzyknięć do podawania roztworów, takie jak BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, np. takie jak wykonane lub udoskonalone przez Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA, www.bectondickinson.com), Disetronic (Burgdorf, Szwajcaria, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon, USA (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Wielka Brytania, www.westonmedical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, USA www.mediject.com). Do uznanych urządzeń, zawierających systemy z parą fiolek, należą te urządzenia do wstrzyknięć, które rozpuszczają liofilizowany lek w kasecie i podają zawarty w nich roztwór, takie jak HumatroPen®.

Opisane tu produkty zawierają opakowanie. Opakowanie dostarcza, oprócz informacji wymaganych przez władze administracyjne, informacje o chorobach, w jakich można zastosować produkt. Opakowanie tu opisane dostarcza instrukcji dla pacjenta, że należy rozpuścić przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF w rozcieńczalniku wodnym, by uzyskać roztwór, i zastosować roztwór w okresie 2-24 godzin lub dłuższym dla produktu z dwiema fiolkami, w układzie substancja sucha/roztwór. Dla produktu z jedną fiolką i roztworem etykieta wskazuje, że taki roztwór można zastosować w okresie 2-24 godzin lub dłuższym. Opisane tu produkty można zastosować zgodnie z zastosowaniami dla produktów farmaceutycznych dla ludzi.

Opisane tu preparaty można wytworzyć w procesie, który obejmuje mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF i wybranego buforu, dogodnie buforu fosforanowego, zawierającego sól fizjologiczną lub wybraną sól. Mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała i buforu przeprowadza się, stosując konwencjonalne procedury rozpuszczania i mieszania. Aby otrzymać odpowiedni preparat, łączy się na przykład odmierzoną ilość przynajmniej jednego przeciwciała w wodzie lub buforze z pożądanym czynnikiem buforującym w wodzie w ilościach wystarczających dla dostarczenia białka i buforu w pożądanym stężeniu. Modyfikacje tego procesu będą jasne dla specjalistów w tej dziedzinie. Na przykład kolejność, w jakiej dodawane są składniki, to, czy stosuje się dalsze substancje dodatkowe, temperatura i pH, w jakich wykonuje się preparat, są czynnikami, które można zoptymalizować dla stosowanego stężenia i sposobu podawania.

Opisane tu trwałe lub konserwowane preparaty można dostarczać pacjentom jako czyste roztwory lub jako pary fiolek, w skład których wchodzi fiolka z liofilizowanym przynajmniej jednym przeciwciałem anty-TNF, które rozpuszcza się za pomocą drugiej fiolki, zawierającej konserwant lub bufor i zaróbki w rozcieńczalniku wodnym. Zarówno fiolka z pojedynczym roztworem, jaki i para fiolek, wymagająca rozpuszczania, mogą być używane wielokrotnie i mogą wystarczyć na pojedynczy lub wiele cykli leczenia pacjenta, zapewniając tym samym schemat leczniczy dogodniejszy od dostępnego obecnie.

Przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF, zarówno w opisanych tu preparatach trwałych, jak i konserwowanych, można podawać pacjentowi w zgodzie z niniejszym wynalazkiem za pomocą szeregu sposobów podawnaia, w tym przez wstrzyknięcia podskórne lub domięśniowe, podawanie przezskórne, płucne, przezśluzówkowe, za pomocą implantu, pompy osmotycznej, kasety, mikropompy i innych środków, znanych wykształconemu wykonawcy, co jest dobrze znane ze stanu techniki.

Zastosowanie terapeutyczne

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku może być przeznaczona do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby, związanej z TNF, w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, wedle wiedzy ze stanu techniki lub jak opisano tutaj.

PL 206 833 B1

W szczególnoś ci mogą być one przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby, związanej z TNF, w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, włączając w to, między innymi przynajmniej jedną spośród otyłości, choroby immunologicznej, choroby sercowo-naczyniowej, choroby zakaźnej, choroby nowotworowej lub choroby układu nerwowego.

Dokładniej, mogą być one przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby, związanej z immunologią, w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, w tym, lecz bez ograniczenia do przynajmniej jednej spośród reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku ogólnoustrojowym, łuszczycowego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, wrzodu żołądka, artropatii surowiczo-ujemnych, choroby zwyrodnieniowej stawów, choroby zapalnej jelit, zapalenia okrężnicy wrzodziejącego, liszaja rumieniowatego uogólnionego, zespołu antyfosfolipidowego, zapalenia tęczówki i ciała rzęskowego/zapalenia błony naczyniowej oka/zapalenia nerwu wzrokowego, samoistnego zwłóknienia płuc, ogólnoustrojowego zapalenia naczyń/ziarniniaka Wegenera, sarkoidozy, zapalenia jąder, zabiegów odwracających skutki wazektomii, chorób alergicznych/atopowych, astmy, alergicznego nieżytu nosa, wyprysku, alergicznego kontaktowego zapalenia skóry, alergicznego zapalenia spojówek, zapalenia płuc z nadwrażliwości, przeszczepów, odrzucenia przeszczepu narządu, choroby „przeszczep przeciw gospodarzowi, zespołu ogólnoustrojowej reakcji zapalnej, zespołu posocznicy, posocznicy Gram-dodatniej, posocznicy Gram-ujemnej, posocznicy z ujemnymi wynikami hodowli, posocznicy grzybiczej, gorą czki neutropenicznej, posocznicy moczopochodnej, posocznicy meningokokowej, urazu/krwotoku, oparzeń, ekspozycji na promieniowanie jonizujące, ostrego zapalenia trzustki, zespołu zaburzeń oddechowych dorosłych, reumatoidalnego zapalenia stawów, alkoholowego zapalenia wątroby, przewlekłych stanów zapalnych, sarkoidozy, choroby Crohna, anemii sierpowatej, cukrzycy, nerczycy, chorób atopowych, reakcji nadwrażliwości, alergicznego nieżytu nosa, kataru siennego, całorocznego nieżytu nosa, zapalenia spojówek, endometriozy, astmy, pokrzywki, anafilaksji ogólnoustrojowej, zapalenia skóry, niedokrwistości złośliwej, choroby hemolitycznej, małopłytkowości, odrzucenia przeszczepu dowolnego narządu lub tkanki, odrzucenia przeszczepu nerki, odrzucenia przeszczepu serca, odrzucenia przeszczepu wątroby, odrzucenia przeszczepu trzustki, odrzucenia przeszczepu płuca, odrzucenia przeszczepu szpiku kostnego, odrzucenia aloprzeszczepu skóry, odrzucenia przeszczepu tkanki chrzestnej, odrzucenia przeszczepu kości, odrzucenia przeszczepu jelita cienkiego, odrzucenia implantu grasicy płodowej, odrzucenia przeszczepu przytarczyc, odrzucenia przeszczepu międzygatunkowego dowolnego narządu lub tkanki, odrzucenia aloprzeszczepu, reakcji nadwrażliwości skierowanych przeciwko receptorom, choroby Gravesa, choroby Raynauda, cukrzycy insulinoopornej typu B, astmy, miastenii, cytotoksyczności zależnej od przeciwciał, reakcji nadwrażliwości typu III, liszaja rumieniowatego uogólnionego, zespołu POEMS (zespołu polineuropatia, organomegalia, endokrynopatia, gammapatia monoklonalna i zmiany skórne) polineuropatii, organomegalii, endokrynopatii, gammapatii monoklonalnej, zespołu zmian skórnych, zespołu antyfosfolipidowego, pęcherzycy, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki łącznej, idiopatycznej choroby Addisona, cukrzycy, zapalenia wątroby przewlekłego aktywnego, marskości wątroby żółciowej pierwotnej, bielactwa nabytego, zapalenia naczyń, zespołu otwarcia serca pozawałowego, reakcji nadwrażliwości typu IV, kontaktowego zapalenia skóry, zapalenia płuc z nadwrażliwości, odrzucenia aloprzeszczepu, ziarniniaków wywołanych przez drobnoustroje wewnątrzkomórkowe, nadwrażliwości na leki, metabolicznej/idiopatycznej, choroby Wilsona, hemochromatozy, niedoboru alfa-1-antytrypsyny, retynopatii cukrzycowej, zapalenia tarczycy Hashimoto, osteoporozy, oceny osi podwzgórze-przysadka-nadnercza, marskości wątroby żółciowej pierwotnej, zapalenia tarczycy, zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego, kacheksji, mukowiscydozy, przewlekłej choroby płuc noworodków, przewlekłej choroby obturacyjnej płuc (POChP), rodzinnej limfohistiocytozy hematofagocytarnej, chorób skóry, łuszczycy, łysienia, zespołu nerczycowego, zapalenia nerek, kłębuszkowego zapalenia nerek, ostrej niewydolności nerek, hemodializy, mocznicy, zatrucia, stanu przedrzucawkowego, terapii okt3, terapii anty-cd3, terapii cytokinowej, chemioterapii, radioterapii (w tym np. lecz bez ograniczenia do astenii, niedokrwistości, kacheksji i tym podobnych), przewlekłego zatrucia salicylanami i tym podobnych. Zobacz np. Merck Manul, wydania 12-17, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells i wsp., red., wydanie drugie, Appleton i Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).

Przeciwciało według niniejszego wynalazku może być przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby sercowo-naczyniowej w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, w tym, lecz bez ograniczenia do przynajmniej jednej spośród zespołu ogłuszenia mięPL 206 833 B1 śnia sercowego, zawału serca, zastoinowej niewydolności serca, udaru mózgu, udaru niedokrwiennego, krwotoku, stwardnienia tętnic, miażdżycy tętnic, nawrotu zwężenia, miażdżycy o podłożu cukrzycowym, nadciśnienia, nadciśnienia tętniczego, nadciśnienia nerkowo-naczyniowego, omdlenia, wstrząsu, kiły układu sercowo-naczyniowego, niewydolności serca, serca płucnego, pierwotnego nadciśnienia płucnego, arytmii serca, przedsionkowych skurczów dodatkowych pozazatokowych, trzepotania przedsionków, migotania przedsionków (utrwalonego lub napadowego), zespołu poperfuzyjnego, odpowiedzi zapalnej na przepływ omijający sercowo-płucny, częstoskurczu przedsionkowego chaotycznego lub wieloogniskowego, typowego częstoskurczu z wąskim QRS, niemiarowości swoistych, migotania komór, niemiarowości z pęczka Hisa, bloku przedsionkowo-komorowego, bloku odnogi pęczka Hisa, zaburzeń niedokrwiennych mięśnia sercowego, choroby wieńcowej, dusznicy bolesnej, zawału serca, kardiomiopatii, kardiomiopatii rozstrzeniowej i zastoinowej, kardiomiopatii restrykcyjnej, chorób serca związanych z zastawkami, zapalenia wsierdzia, chorób osierdzia, guzów serca, tętniaków aorty i naczyń obwodowych, rozwarstwienia aorty, zapalenia aorty, zwężenia aorty brzusznej i jej gałęzi, obwodowych zaburzeń naczyniowych, zaburzeń związanych ze zwężeniem tętnic, miażdżycy naczyń obwodowych, zakrzepowo-zarostowego zapalenia naczyń, zaburzeń czynnościowych tętnic obwodowych, choroby i zjawiska Raynauda, akrocyjanozy, erytromelalgii, chorób żył, zakrzepicy żylnej, żylaków, przetoki tętniczo-żylnej, obrzęku wskutek niedrożności naczyń chłonnych, bolesnego obrzęku tkanki tłuszczowej, dusznicy niestabilnej, uszkodzenia w wyniku reperfuzji, zespołu po zastosowaniu pompy, uszkodzenia w wyniku niedokrwienia i reperfuzji i tym podobnych.

Przeciwciało lub kompozycja według niniejszego wynalazku może być przeznaczona do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby zakaźnej w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, w tym, lecz bez ograniczenia do przynajmniej jednej spośród: ostrego lub przewlekłego zakażenia bakteryjnego, ostrego lub przewlekłego procesu zakaźnego, z uwzględnieniem chorób takich, jak zakażenia bakteryjne, wirusowe i grzybicze, zakażenia HIV/neuropatia HIV, zapalenie opon mózgowych, zapalenie wątroby (A, B lub C albo podobne), zakaźne zapalenie stawów, zapalenie otrzewnej, zapalenie płuc, zapalenie nagłośni, zakażenie E. coli 0157: h7, zespół hemolityczno-mocznicowy/zakrzepowa plamica małopłytkowa, malaria, gorączka krwotoczna denga, leiszmanioza, trąd, zespół wstrząsu toksycznego, paciorkowcowe zapalenie mięśni, zgorzel gazowa, gruźlica wywoływana przez Mycobacterium, gruźlica wywoływana przez Mycohacterium avium - podgatunek intracellulare, zapalenie płuc wywołane przez Pneumocystis carinii, choroba zapalna miednicy, zapalenie jąder/zapalenie najądrzy, legionelloza, borelioza, grypa a, zakażenie wirusem Epsteina-Barra, zagrażający życiu zespół hemofagocytarnego, zagrażające życiu zapalenie mózgu/aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i tym podobnych.

Przeciwciało lub kompozycja według niniejszego wynalazku może być przeznaczona do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby nowotworowej w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, włączając w to, lecz bez ograniczenia do przynajmniej jednej spośród: białaczki, białaczki ostrej, ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), ALL z komórek B, komórek T lub FAB, ostrej białaczki szpikowej (AML), przewlekłej białaczki szpikowej (CML), przewlekłej białaczki limfocytarnej (CLL), białaczki kosmatokomórkowej, zespołu mielodysplastycznego (MDS), chłoniaka, ziarnicy złośliwej, chłoniaka złośliwego, chłoniaka nieziarniczego, chłoniaka Burkitta, szpiczaka mnogiego, mięsaka Kaposiego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka jamy nosowo-gardłowej, histiocytozy złośliwej, zespołu paranowotworowego/hiperkalcemii w chorobach nowotworowych, guzów litych, gruczolakoraków, mięsaków, czerniaka złośliwego, naczyniaka krwionośnego, choroby przerzutowej, związanej z rakiem resorpcji kości, związanego z rakiem bólu kości i tym podobnych.

Przeciwciało lub kompozycja według niniejszego wynalazku może być przeznaczona do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby układu nerwowego w komórce, tkance, narządzie, zwierzęciu lub u pacjenta, włączając w to, lecz bez ograniczenia do przynajmniej jednej spośród: chorób zwyrodnieniowych układu nerwowego, stwardnienia rozsianego, migrenowego bólu głowy, zespołu otępienia związanego z AIDS, chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i ostre poprzeczne zapalenie rdzenia; zaburzeń pozapiramidowych i móżdżkowych, takich jak uszkodzenia układu korowo-rdzeniowego; zaburzenia zwojów podstawy mózgu lub zaburzenia móżdżku; hiperkinetycznych zaburzeń ruchowych, takich jak pląsawica Huntingtona i pląsawica starcza; zaburzeń ruchowych wywołanych przez leki, takich jak zaburzenia wywołane przez leki blokujące receptory dopaminowe ośrodkowego układu nerwowego; hipokinetycznych zaburzeń ruchowych, takich jak choroba Parkinsona; postępującego porażenia nadjądrowego; uszkodzeń strukturalnych móżdżku; zwyrodnień rdzeniowo-móżdżkowych, takich jak ataksja rdzeniowa, ataksja Friedreicha, zwyrodnień korowych

PL 206 833 B1 móżdżku, zwyrodnień wieloukładowych (Mencela, Dejerine-Thomasa, Shy-Dragera i MachadoJosepha); zaburzeń ogólnoustrojowych (choroba Refsuma, abetalipoproteinemia, ataksja, telangiektazja, i wieloukładowe zaburzenia mitochondrialne); demielinizacyjnych zaburzeń rdzeniowych, takich jak stwardnienie rozsiane i ostre poprzeczne zapalenie rdzenia oraz zaburzeń jednostki ruchowej, takich jak neurogenne zaniki mięśni (zwyrodnienia komórek rogu przedniego rdzenia kręgowego, takie jak stwardnienie zanikowe boczne, rdzeniowy zanik mięśni wieku dziecięcego i młodzieńczy rdzeniowy zanik mięśni); choroby Alzheimera; zespołu Downa w wieku średnim; choroby rozsianych ciałek Lewy'ego; otępienia starczego typu ciałka Lewy'ego; zespołu Wernicke-Korsakoffa; alkoholizmu przewlekłego; choroby Creutzfeldta-Jakoba; podostrego twardniejącego uogólnionego zapalenia mózgu, choroby Hallervordena-Spatza oraz otępienia bokserów i tym podobnych. Zobacz np. The Merck Manul, wyd. 16, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

Kompozycję według niniejszego wynalazku można stosować w sposobie obejmującym podawanie skutecznej ilości komórce, tkance, narządowi, zwierzęciu lub pacjentowi tego potrzebującemu. Taki sposób może również ewentualnie obejmować współpodawanie lub terapię skojarzoną w leczeniu takich chorób układu immunologicznego, gdzie podawanie rzeczonej kompozycji obejmuje ponadto podawanie uprzednio, jednocześnie lub następnie przynajmniej jednego, wybranego spośród przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. lecz bez ograniczenia do przeciwciała TNF lub fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub fragmentu, ich białek fuzyjnych lub drobnocząsteczkowego antagonisty TNF), leku przeciwreumatycznego (takiego jak metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, tiomaleinian złotowo-sodowy, siarczan hydroksychlorochiny, leflunomid, sulfasalazyna), leku zwiotczającego mięśnie, narkotyku, niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NLPZ), leku przeciwbólowego, środka i znieczulającego, środka uspokajającego, środka znieczulającego miejscowo, blokera złącza nerwowo-mięśniowego, leku przeciwko drobnoustrojom (np. aminoglikozydu, leku przeciwgrzybiczego, leku przeciwpasożytniczego, leku przeciwwirusowego, karbapenemu, cefalosporyny, fluorochinolonu, makrolidu, penicyliny, sulfonamidu, tetracykliny, innego leku przeciwko drobnoustrojom), leku przeciwłuszczycowego, kortykosteroidu, steroidu anabolicznego, środka związanego z cukrzycą, substancji mineralnej, substancji odżywczej, środka działającego na tarczycę, witaminy, hormonu związanego z wapniem, leku przeciwbiegunkowego, środka przeciwkaszlowego, środka przeciwwymiotnego, leku przeciwwrzodowego, środka przeczyszczającego, środka przeciwkrzepliwego, erytropoetyny (np. epoetyny alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukine), szczepionki, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego (np. basiliksymab, cyklosporyna, daklizumab), hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, modulatora receptora estrogenu, środka rozszerzającego źrenice, środka cykloplegicznego, czynnika alkilującego, antymetabolitu, inhibitora mitozy, środka radiofarmaceutycznego, leku przeciwdepresyjnego, środka przeciw manii, środka przeciwpsychotycznego, środka przeciwlękowego, leku nasennego, środka sympatykomimetycznego, środka pobudzającego, donepezilu, takryny, leku na astmę, agonisty receptora beta, steroidu wziewnego, inhibitora leukotrienu, metyloksantyny, kromoglikanu disodowego, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (Pulmozyme), cytokiny lub antagonisty cytokiny. Stosowne dawkowanie jest dobrze znane ze stanu techniki. Zobacz np. Wells i wsp., red., Pharmacotherapy Handbook, wydanie drugie, Appleton i Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Antagoniści TNF, odpowiedni do kompozycji, terapii skojarzonej, współpodawania, urządzeń i(lub) sposobów tu opisanych (zawierający ponadto przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF według niniejszego wynalazku, jego określoną część lub wariant), obejmują między innymi przeciwciała antyTNF, ich fragmenty wiążące antygen i cząsteczki receptorów, które wiążą się swoiście z TNF; związki, które zapobiegają syntezie TNF i(lub) hamują syntezę TNF, wydzielanie TNF lub jego działanie na komórki docelowe, takie jak talidomid, tenidap, inhibitory fosfodiesterazy (np. pentoksyfilina i rolipram), agoniści receptorów adenozynowych A2b i związki pobudzające receptory adenozynowe A2b, związki blokujące i(lub) hamujące przekazywanie sygnału przez receptor TNF, takie jak inhibitory kinazy białkowej, aktywowanej przez mitogeny (MAP); związki blokujące i(lub) hamujące cięcie TNF w błonie, takie jak inhibitory metaloproteaz, związki blokujące i(lub) hamujące aktywność TNF, takie jak inhibitory enzymu konwertującego angiotensynę (ACE) (np. kaptopryl) oraz związki blokujące i(lub) hamujące wytwarzanie i(lub) syntezę TNF, takie jak inhibitory kinazy MAP.

Zgodnie z zastosowaniem tutaj, „przeciwciało przeciwko czynnikowi martwicy nowotworów, „przeciwciało TNF, „przeciwciało TNFa lub fragment i tym podobne, obniża, blokuje, hamuje, znosi lub zakłóca aktywność TNFa in vitro, in situ i(lub), w szczególności, in vivo. Na przykład odpowiednie

PL 206 833 B1 ludzkie przeciwciało TNF według niniejszego wynalazku może wiązać TNFa, i obejmuje przeciwciała anty-TNF, ich fragmenty wiążące antygen i ich określone mutanty lub domeny, które wiążą się swoiście z TNFa. Odpowiednie przeciwciało TNFa lub fragment może również obniżać, blokować, hamować, znosić lub zakłócać syntezę RNA, DNA lub białka TNF, wydzielanie TNF, przekazywanie sygnału TNF, cięcie TNF w błonie, aktywność TNF, wytwarzanie i(lub) syntezę TNF.

Przeciwciało chimerowe cA2 składa się z wiążącego antygen regionu zmiennego neutralizującego mysiego przeciwciała IgG1 anty-TNFa człowieka o wysokim powinowactwie, oznaczonego A2, oraz regionów stałych immunoglobuliny człowieka IgG1, kappa. Region Fc IgG1 człowieka poprawia alogeniczną funkcję efektorową przeciwciała, wydłuża okres półtrwania w osoczu krążącej krwi i zmniejsza immunogenność przeciwciała. Zachłanność wiązania i swoistość epitopu przeciwciała chimerowego cA2 zależą od regionu zmiennego przeciwciała A2 myszy. W szczególnym wykonaniu, zalecanym źródłem kwasów nukleinowych, kodujących region zmienny przeciwciała A2 myszy jest linia komórek hybrydomy A2.

Chimerowe A2 (cA2) neutralizuje efekt cytotoksyczny TNFa człowieka, zarówno naturalnego, jak i rekombinowanego, w sposób zależny od dawki. Na podstawie testów wiązania przeciwciała chimerowego cA2 i rekombinowanego TNFa człowieka obliczono stałą powinowactwa przeciwciała chimerowego cA2 jako 1,04 x 10¹⁰ M^-1. Zalecanne sposoby wyznaczania swoistości i powinowactwa przeciwciał monoklonalnych za pomocą hamowania kompetycyjnego można znaleźć w Harlow i wsp., Antibodies: A Laboratory Manul, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan i wsp., red., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozbor i wsp., Immunol. Today, 4: 72-79 (1983); Ausubel i wsp., red., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000) oraz Muller, Meth. Enzymol., 92: 589-601 (1983).

W konkretnym wykonaniu mysie przeciwciało monoklonalne A2 jest wytwarzane przez linię komórkową, oznaczoną symbolem c134A. Przeciwciało chimerowe cA2 jest wytwarzane przez linię komórkową, oznaczoną c168A.

Dodatkowe przykłady przeciwciał monoklonalnych anty-TNF, które można zastosować w niniejszym wynalazku, opisano w dziedzinie (zobacz np. patent USA nr 5231024; Molier, A. i wsp., Cytokine 2(3): 162-169 (1990); zgłoszenie USA nr 07/943852 (złożone 11 września 1992); Rathjen i wsp., publikacja międzynarodowa nr WO 91/02078 (opublikowane 21 lutego 1991); Rubin i wsp., publikacja patentowa EPO nr 0218868 (opublikowana 22 kwietnia 1987); Yone i wsp. publikacja patentowa EPO nr 0288088 (26 października 1988); Liang i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager i wsp., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly i wsp. Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman i wsp., Hybridoma 6: 489-507 (1987) oraz Hirai i wsp., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987).

Cząsteczki receptorów TNF

Zalecanymi cząsteczkami receptora TNF, przydatnymi w niniejszym wynalazku, są takie, które wiążą TNFa z wysokim powinowactwem (zobacz np. Feldmann i wsp., międzynarodowa publikacja nr WO 92/07076 (opublikowana 30 kwietnia 1992); Schall i wsp., Cell 61: 361-370 (1990) oraz Loetscher i wsp., Cell 61: 351-359 (1990)) i ewentualnie wykazują niską immunogenność. W niniejszym wynalazku użyteczne są w szczególności receptory TNF z powierzchni komórki o masie 55 kDa (p55 TNF-R) i 75 kDa (p75-TNF-R). W niniejszym wynalazku użyteczne są również skrócone formy tych receptorów, zawierające domeny pozakomórkowe (ECD) lub ich funkcjonalne części (zobacz np. Corcoran i wsp., Eur. J. Biochem. 223: 831-840 (1994)). Skrócone formy receptorów TNF, zawierające ECD, wykrywa się w moczu i osoczu jako hamujące białka wiążące TNFa o masie 30 kDa i 40 kDa (Engelmann, H. i wsp., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990)). Dodatkowymi przykładami cząsteczek receptorowych TNF, przydatnych w sposobach i kompozycjach według niniejszego wynalazku, są multimerowe białka receptorowe i cząsteczki fuzyjne immunoreceptorów TNF, ich pochodne i fragmenty lub części. Cząsteczki receptorowe TNF, które można zastosować w tym wynalazku, cechują się tym, że nadają się do leczenia pacjentów przez dłuższy czas, z dobrym lub doskonałym złagodzeniem objawów i niską toksycznością. W osiąganych wynikach terapeutycznych może mieć udział niska immunogenność i(lub) wysokie powinowactwo, a także inne, niezdefiniowane właściwości.

Multimerowe cząsteczki receptorów TNF, przydatne w niniejszym wynalazku, zawierają całość lub część funkcjonalnej ECD dwóch lub większej liczby receptorów TNF, połączonych za pomocą jednego lub większej liczby łączników polipeptydowych lub innych łączników niepeptydowych, takich jak glikol polietylenowy (PEG). Cząsteczki multimerowe mogą ponadto zawierać peptyd sygnałowy

PL 206 833 B1 wydzielanego białka, aby ukierunkować ekspresję cząsteczki multimerowej. Te cząsteczki multimerowe i sposoby ich wytwarzania opisano w zgłoszeniu USA nr 08/437533 (złożonym 9 maja 1995).

Cząsteczki fuzyjne immunoreceptorów TNF, przydatne w sposobach i kompozycjach według niniejszego wynalazku, zawierają przynajmniej jedną część jednego lub większej liczby cząsteczek immunoglobulin oraz całość lub część funkcjonalną jednego lub większej liczby receptorów TNF. Te cząsteczki fuzyjne immunoreceptorów mogą łączyć się jako monomery lub hetero- lub homomultimery. Cząsteczki fuzyjne mmunoreceptorów TNF mogą być również monowalentne lub multiwalentne. Przykładem takiej cząsteczki fuzyjnej immunoreceptora TNF jest białko fuzyjne receptor TNF/IgG. Cząsteczki fuzyjne immunoreceptorów TNF i sposoby ich wytwarzania są znane ze stanu techniki (Lesslauer i wsp., Eur. J. Immunol. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel i wsp., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991); Kolls i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219 (1994); Butler i wsp., Cytokine 6 (6): 616-623 (1994); Baker i wsp., Eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler i wsp., patent USA nr 5447851 i zgłoszenie USA nr 08/442133 (złożone 16 maja 1995). Sposoby wytwarzania cząsteczek fuzyjnych immunoreceptorów można również znaleźć w Capon i wsp., patent USA nr 5116964; Capon i wsp., patent USA nr 5225538 oraz Capon i wsp., Nature 337: 525-531 (1989).

Określenia „ekwiwalent funkcjonalny, „pochodna, „fragment lub „region cząsteczki receptora TNF odnoszą się do części cząsteczki receptora TNF lub części sekwencji cząsteczki receptora TNF, kodującej cząsteczkę receptora TNF, której wielkość i sekwencja są wystarczające, by przypominać funkcjonalnie cząsteczki receptora TNF, które można zastosować w niniejszym wynalazku (np. wiążą TNF z dużym powinowactwem i wykazują niską immunogenność). Ekwiwalent funkcjonalny cząsteczki receptora TNF obejmuje również zmodyfikowane cząsteczki receptora TNF, przypominające funkcjonalnie cząsteczki receptora TNF, które można zastosować w niniejszym wynalazku (np. wiążą TNF z dużym powinowactwem i wykazują niską immunogenność). Na przykład ekwiwalent funkcjonalny cząsteczki receptora TNF może zawierać kodon „NIEMY lub jedną lub większą liczbę podstawień aminokwasowych, delecji lub addycji (np. podstawienie jednego aminokwasu kwasowego innym aminokwasem kwasowym lub podstawienie kodonu kodującego taki sam lub inny aminokwas hydrofobowy innym kodonem, kodującym aminokwas hydrofobowy. Zobacz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000).

Do cytokin należą wszelkie znane cytokiny. Zobacz np. CopewithCytokines.com. Antagoniści cytokin obejmują między innymi dowolne przeciwciała, fragmenty lub mimetyki, dowolne rozpuszczalne receptory, fragmenty lub mimetyki, dowolnych antagonistów drobnocząsteczkowych lub dowolną ich kombinację.

Leczenie

Kompozycję według niniejszego wynalazku można stosować w leczeniu zaburzenia, w którym pośredniczy TNF, a które obejmuje podawanie jej skutecznej ilości komórce, tkance, narządowi, zwierzęciu lub pacjentowi tego potrzebującemu. Taki sposób może również ewentualnie obejmować współpodawanie lub terapię skojarzoną w leczeniu takich chorób immunologicznych, gdzie podawanie rzeczonej kompozycji obejmuje również podawanie uprzednio, jednocześnie lub następnie przynajmniej jednego, wybranego spośród przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. lecz bez ograniczenia do przeciwciała TNF lub fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub fragmentu, ich białek fuzyjnych lub drobnocząsteczkowego antagonisty TNF), leku przeciwreumatycznego (np. metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, tiomaleinian złotowo-sodowy, siarczan hydroksychlorochiny, leflunomid, sulfasalazyna), leku zwiotczającego mięśnie, narkotyku, niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NLPZ), leku przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka znieczulającego miejscowo, blokera złącza nerwowo-mięśniowego, leku przeciwko drobnoustrojom (np. aminoglikozydu, leku przeciwgrzybiczego, leku przeciwpasożytniczego, leku przeciwwirusowego, karbapenemu, cefalosporyny, fluorochinolonu, makrolidu, penicyliny, sulfonamidu, tetracykliny, innego leku przeciwko drobnoustrojom), leku przeciwłuszczycowego, kortykosteroidu, steroidu anabolicznego, środka związanego z cukrzycą, substancji mineralnej, substancji odżywczej, środka działającego na tarczycę, witaminy, hormonu związanego z wapniem, leku przeciwbiegunkowego, środka przeciwkaszlowego, środka przeciwwymiotnego, leku przeciwwrzodowego, środka przeczyszczającego, środka przeciwkrzepliwego, erytropoetyny (np. epoetyny alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukine), szczepionki, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego (np. basiliksymab, cyklosporyna, daklizumab), hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, modulatora receptora estrogenu, środka rozszerzającego źrenice, środka cykloplegicznego, czynnika

PL 206 833 B1 alkilującego, antymetabolitu, inhibitora mitozy, środka radiofarmaceutycznego, leku przeciwdepresyjnego, środka przeciw manii, środka przeciwpsychotycznego, środka przeciwlękowego, leku nasennego, środka sympatykomimetycznego, środka pobudzającego, donepezilu, takryny, leku na astmę, agonisty receptora beta, steroidu wziewnego, inhibitora leukotrienu, metyloksantyny, kromoglikanu disodowego, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (Pulmozyme), cytokiny lub antagonisty cytokiny.

W sytuacji typowej leczenie stanu patologicznego prowadzi się, podając skuteczną ilość lub dawkę przynajmniej jednej kompozycji anty-TNF, która zawiera średnio ilość z zakresu od przynajmniej około 0,01 do 500 miligramów przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF na kilogram ciała pacjenta na dawkę, dogodnie od około 0,1 do 100 miligramów na kilogram ciała pacjenta na dawkę podawaną jednorazowo lub wielokrotnie, w zależności od aktywności swoistej przeciwciała zawartego w kompozycji. Alternatywnie, efektywne stężenie w osoczu może wynosić 0,1-5000 μg/ml na podanie jednokrotne lub wielokrotne. Odpowiednie dawkowanie znane jest praktykującym lekarzom i zależy oczywiście od konkretnego stanu chorobowego, aktywności swoistej podawanej kompozycji i danego pacjenta poddanego leczeniu. W pewnych przypadkach, aby osiągnąć pożądaną ilość terapeutyczną, może okazać się konieczne powtarzanie podawania, tj. wielokrotne indywidualne podawanie konkretnej dawki monitorowanej lub odmierzonej dawki, a poszczególne podania powtarza się aż do osiągnięcia pożądanej dawki dziennej lub efektu.

Do zalecanych dawek należą ewentualnie 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,

89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i(lub) 100-500 mg/kg/podanie, lub wszelki ich zakres, wartość lub jej część, aby osiągnąć stężenie w osoczu 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0,

3.5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15,

15.5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, i(lub) 5000 μg/ml osocza na jednorazowe lub wielokrotne podanie dawki lub jego zakresu, wartości lub ułamka.

Alternatywnie, dawka podawana może się zmieniać w zależności od znanych czynników, takich jak charakterystyka farmakodynamiczna danego środka, sposób i droga jego podania, wiek, stan zdrowia i masa ciała pacjenta, charakter i nasilenie objawów, rodzaj leczenia równoległego, częstotliwość leczenia i pożądany efekt. Zazwyczaj dawka składnika aktywnego może wynosić około 0,1 do 100 miligramów na kilogram masy ciała. Zwykle do uzyskania pożądanych wyników wystarczy od 0,1 do 50, dogodnie od 0,1 do 10 miligramów na kilogram jednorazowo lub w przypadku formy o przedłużonym uwalnianiu.

Jako nieograniczajacy przykład można przedstawić leczenie ludzi lub zwierząt jako jednorazowe lub periodyczne podawanie przynajmniej jednego przeciwciała według niniejszego wynalazku w dawce od 0,1 do 100 mg/kg, na przykład 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 lub 100 mg/kg na dzień, przynajmniej raz na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 lub 40 dni lub alternatywnie albo dodatkowo przynajmniej raz na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 lub 52 tygodni lub alternatywnie albo dodatkowo przynajmniej raz na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 lat, lub ich wszelką kombinację, z zastosowaniem dawki pojedynczej, wlewu lub dawek powtarzanych.

Formy dawkowania (kompozycje), odpowiednie do podawania wewnętrznego, zawierają zasadniczo od około 0,1 miligrama do około 500 miligramów składnika aktywnego na jednostkę lub pojemnik. W tych kompozycjach farmaceutycznych składnik aktywny jest zazwyczaj obecny w ilości około 0,5-99,999% wagowo, w stosunku do masy całkowitej kompozycji.

Przy podawaniu pozajelitowym z przeciwciała można wytworzyć roztwór, zawiesinę, emulsję lub liofilizowany proszek, dostarczany osobno lub wraz z akceptowalnym farmaceutycznie nośnikiem pozajelitowym. Przykładami takich nośników są woda, sól fizjologiczna, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i 1-10% albumina osocza człowieka. Można również zastosować liposomy lub nośniki niewod34

PL 206 833 B1 ne, takie jak oleje zestalone. Nośnik lub liofilizowany proszek mogą zawierać dodatki, zapewniające izotoniczność (np. chlorek sodu, mannitol) i stabilność chemiczną (np. bufory i konserwanty). Kompozycję poddaje się sterylizacji za pomocą znanych lub odpowiednich technik.

Odpowiednie nośniki farmaceutyczne opisano w najnowszym wydaniu Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, standardowym podręczniku w tej dziedzinie.

Podawanie alternatywne

Do podawania skutecznych farmaceutycznie ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF według niniejszego wynalazku można zastosować wiele znanych i udoskonalonych sposobów. W następującym opisie stosuje się podawanie dopłucne, ale według niniejszego wynalazku można zastosować inne sposoby podawania ze stosownymi wynikami.

Przeciwciała TNF według niniejszego wynalazku można podawać w nośniku, jako roztwór, emulsję, koloid, zawiesinę, lub jako suchy proszek, stosując dowolny spośród wielu sposobów i urządzeń odpowiednich do podawania wziewnego lub innych sposobów, opisanych tutaj lub znanych ze stanu techniki.

Preparaty i podawanie pozajelitowe

Preparaty do podawania pozajelitowego mogą zawierać jako typowe zaróbki jałową wodę lub sól fizjologiczną, glikole polialkilenowe, takie jak glikol polietylenowy, oleje pochodzenia roślinnego, uwodornione naftaleny i tym podobne. Zawiesiny wodne lub olejowe do wstrzyknięć można wytworzyć z użyciem odpowiedniego emulgatora lub środka zwilżającego oraz środka ułatwiającego powstanie zawiesiny, według znanych sposobów. Środkami do sporządzania preparatów do wstrzyknięć mogą być nietoksyczne środki rozcieńczające, nienadające się do podawania doustnego, takie jak roztwór wodny lub jałowy roztwór do wstrzyknięć lub zawiesina w rozpuszczalniku. Dopuszczalne jako stosowalne nośniki lub rozpuszczalniki są woda, roztwór Ringera, izotoniczna sól fizjologiczna itp.; jako zwykły rozpuszczalnik lub rozpuszczalnik do tworzenia zawiesin można zastosować jałowy nielotny olej. Do tych celów można zastosować nielotny olej lub kwas tłuszczowy każdego rodzaju, w tym naturalne, syntetyczne lub półsyntetyczne oleje tłuszczowe lub kwasy tłuszczowe, naturalne, syntetyczne lub półsyntetyczne mono- lub di- lub triglicerydy. Podawanie pozajelitowe jest znane ze stanu techniki i obejmuje, lecz nie jest ograniczone do konwencjonalnych sposobów wstrzykiwania, bezigłowego urządzenia do wstrzyknięć, z zastosowaniem gazu pod ciśnieniem, jak opisano w patencie USA nr 5851198 oraz laserowego urządzenia do perforacji, jak opisano w patencie USA nr 5839446, włączonych tutaj w całości jako odniesienie.

Podawanie alternatywne

Wynalazek odnosi się ponadto do podawania przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF drogą pozajelitową, podskórną, domięśniową, dożylną, dostawową, dooskrzelową, dobrzuszną, dotorebkową, dochrzęstną, dojamową, do jamy ciała, domóżdżkową, do komory mózgu, dookrężniczą, doszyjkową, dożołądkową, dowątrobową, do mięśnia sercowego, dokostną, domiedniczą, doosierdziową, dootrzewnową, doopłucnową, doprostatową, wziewną, doodbytniczą, donerkową, dosiatkówkową, do rdzenia, domaziówkową, do klatki piersiowej, domaciczną, dopęcherzową, w pojedynczej dużej dawce, dopochwową, doodbytniczą, policzkową, podjęzykową, donosową lub przezskórną. Kompozycję przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF można wytwarzać w postaci do podawania pozajelitowego (podskórnego, domięśniowego lub dożylnego) lub jakiegokolwiek innego, szczególnie w postaci roztworu lub zawiesiny płynnej; do zastosowania do podania dopochwowego lub doodbytniczego, szczególnie w postaciach półstałych, takich jak, lecz nie ograniczonych do kremów i czopków; do podania policzkowego lub podjęzykowego takich jak, lecz nie ograniczonych do postaci tabletek lub kapsułek; lub donosowego, takich jak, lecz nie ograniczonych do postaci proszków, kropli do nosa lub aerozoli lub pewnych środków; lub przezskórnego, takich jak, lecz nie ograniczonych do żeli, maści, balsamów, zawiesin lub plastrowych układów podawania, z chemicznymi substancjami wspomagającymi, takimi jak dimetylosulfotlenek, w celu albo modyfikacji struktury skóry, albo zwiększenia stężenia leku w plastrze przezskórnym (Junginger i wsp. w „Drug Permeation Enhancement; Hsieh, D. S., red., str. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), albo za pomocą środków utleniających, które umożliwiają podawanie kompozycji zawierających białka i peptydy na skórę (WO 98/53847), albo zastosowania pól elektrycznych do wytworzenia przejściowych szlaków transportu, takich jak elektroporacja, lub by zwiększyć przenikanie naładowanych leków przez skórę, takich jak jonoforeza, lub zastosowanie ultradźwięków, takie jak sonoforeza (patenty USA nr 4309989 i 4767402).

PL 206 833 B1

Podawanie dopłucne/donosowe

Zalecane jest, gdy do podawania dopłucnego kompozycję przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF wytwarza się w postaci cząstek o wielkości pozwalającej skutecznie osiągnąć dolne drogi oddechowe (płuca) lub zatoki przynosowe.

Według wynalazku przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF można podawać za pomocą szeregu urządzeń wziewnych lub donosowych, znanych w dziedzinie, służących do podawania wziewnego czynników terapeutycznych. Do tych urządzeń, zdolnych do wprowadzania kompozycji w postaci aerozolu do jamy zatok przynosowych lub do pęcherzyków płucnych, zalicza się inhalatory z odmierzonymi dawkami, nebulizery, generatory suchych proszków, rozpylacze i tym podobne. Ze stanu techniki są również znane inne urządzenia, odpowiednie do dopłucnego lub donosowego podania przeciwciał. We wszystkich tych urządzeniach można wykorzystywać kompozycje odpowiednie do podawania przeciwciała w aerozolu. Takie aerozole mogą zawierać albo roztwory (zarówno wodne, jak i niewodne) albo cząstki stałe. W inhalatorach z odmierzonymi dawkami, takich jak inhalator z odmierzonymi dawkami Ventolin®, zazwyczaj wykorzystuje się gaz napędowy i wymagają one aktywacji wdechem (zobacz np. WO 94/16970, WO 98/35888). W inhalatorach suchych proszków, takich jak Turbuhaler™ (Astra), Rotahalere® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalator Spiros™ (Dura), urządzeniach sprzedawanych przez Inhale Therapeutics oraz inhalatorze proszkowym Spinhaler® (Fisons) wykorzystuje się aktywację mieszanego proszku oddechem (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Nebulizery, jak AERx™ Aradigm, nebulizer Ultravent® (Mallinckrodt) i nebulizer Acorn II® (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), wytwarzają aerozole z roztworów, podczas gdy inhalatory z odmierzonymi dawkami, inhalatory suchych proszków itp. wytwarzają aerozole drobnych cząstek. Te szczególne przykłady dostępnych w handlu urządzeń do inhalacji mają być reprezentatywnymi przykładami konkretnych urządzeń, odpowiednich dla wykonywania tego wynalazku, a nie mają ograniczać zakresu tego wynalazku. W zalecanym przypadku kompozycja, zawierająca przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF, dostarczana jest przez inhalator suchego proszku lub rozpylacz. Istnieje kilka pożądanych cech urządzenia do inhalacji, do podawania przynajmniej jednego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Na przykład w zaleanej sytuacji dostarczanie przez urządzenie do inhalacji jest pewne, powtarzalne i dokładne. Urządzenie do inhalacji może ewentualnie dostarczać drobnych, suchych cząstek, np. mniejszych niż około 10 μm, zwłaszcza około 1-5 μm, celem ułatwienia wdychania.

Podawanie kompozycji przeciwciała TNF w postaci rozpylonej

Rozpylony płyn (sprej), zawierający białko kompozycji przeciwciała TNF, można wytworzyć przez przepchnięcie zawiesiny lub roztworu przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF przez dyszę pod ciśnieniem. Wielkość i układ dyszy, przyłożone ciśnienie i prędkość podawania płynu można dobrać tak, by uzyskać pożądany wypływ i wielkość cząstek. Można na przykład wytworzyć elektrosprej za pomocą pola elektrycznego, w połączeniu z kapilarą lub doprowadzeniem do dyszy. Zalecana wielkość cząstek białka kompozycji przeciwciała TNF, podawanego przez rozpylacz, jest mniejsza niż około 10 μm, zwłaszcza wynosi od około 1 μm do około 5 μm, w szczególności od około 2 μm do około 3 μm.

Preparaty białka kompozycji przeciwciała anty-TNF, odpowiednie do użycia w rozpylaczu, na ogół zawierają białko kompozycji przeciwciała w roztworze wodnym o stężeniu około 0,1 mg do około 100 mg przynajmniej jednego białka kompozycji przeciwciała anty-TNF na ml roztworu lub mg/gm lub dowolny zakres lub wartość z niego, np. lecz bez ograniczenia do 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 lub 100 mg/ml lub mg/gm. Preparat może zawierać czynniki, takie jak zaróbka, bufor, czynnik izotoniczny, konserwant, środek powierzchniowo czynny i w szczególności, cynk. Preparat może również zawierać zaróbkę lub czynnik do stabilizowania białkowych kompozycji przeciwciała, taki jak bufor, czynnik redukujący, białko wypełniające lub węglowodan. Do białek wypełniających, przydatnych do wytwarzania białkowych kompozycji przeciwciał, należą albumina, protamina i tym podobne. Do typowych węglowodanów, przydatnych do wytwarzania białek kompozycji przeciwciał, należą sacharoza, mannitol, laktoza, trehaloza, glukoza i tym podobne. W skład preparat białkowej kompozycji przeciwciała może również wchodzić środek powierzchniowo czynny, który może ograniczyć lub zapobiec indukowanej przez kontakt z powierzchnią agregacji białkowej kompozycji przeciwciała, spowodowanej przez atomizację roztworu podczas tworzenia aerozolu. Można wykorzystać różne konwencjonalne środki powierzchniowo czynne, takie jak estry kwasów tłuszczowych

PL 206 833 B1 i polioksoetyleno-alkoholi i estry kwasów tłuszczowych i polioksoetyleno-sorbitolu. Ilości z reguły mieszczą się w zakresie od 0,001 do 14% masy kompozycji. Środkami powierzchniowo czynnymi, szczególnie zalecanymi dla potrzeb tego wynalazku, są monooleinian polioksoetyleno-sorbitanu, polisorbat 80, polisorbat 20 lub podobne. Do preparatu można również włączyć dodatkowe czynniki znane ze stanu techniki tworzenia kompozycji białek takich, jak przeciwciała TNF lub określone części lub warianty.

Podawanie kompozycji przeciwciała TNF za pomocą nebulizera

Białko kompozycji przeciwciała można podawać za pomocą nebulizera, takiego jak nebulizer strumieniowy lub nebulizer ultradźwiękowy. Z reguły w nebulizerze strumieniowym do wytworzenia strumienia powietrza o dużej prędkości, wypływającego przez otwór wykorzystuje się źródło sprężonego powietrza. Podczas rozprężania gazu poza dyszą powstaje obszar niskiego ciśnienia, który wciąga roztwór białka kompozycji przeciwciała przez rurkę kapilarną, połączoną ze zbiornikiem cieczy. Strumień cieczy z rurki kapilarnej podczas opuszczania rurki ulega rozpadowi na niestabilne filamenty kropelki, wytwarzając aerozol. W celu osiągnięcia pożądanej charakterystyki działania danego nebulizera strumieniowego można wykorzystać szereg konfiguracji, prędkości przepływu i rodzajów deflektora. W nebulizerze ultradźwiękowym do wytworzenia wibracyjnej energii mechanicznej stosuje się energię elektryczną o wysokiej częstotliwości, na ogół z użyciem przetwornika piezoelektrycznego. Ta energia jest przekazywana kompozycji białkowej kompozycji przeciwciała albo bezpośrednio, albo poprzez płyn sprzęgający, z wytworzeniem aerozolu, zawierającego białkową kompozycję przeciwciała. Wielkość cząstek białka kompozycji przeciwciała, podawanych przez nebulizer, wynosi dogodnie poniżej około 10 μm, zwłaszcza w zakresie od około 1 μm do około 5 μm, w szczególności od około μm do około 3 nm.

Preparaty przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF, odpowiednie do zastosowania wraz z nebulizerem, albo strumieniowym, albo ultradźwiękowym, zazwyczaj zawierają przynajmniej jedno białko przeciwciała anty-TNF w stężeniu około 0,1 mg do około 100 mg na ml roztworu. Preparat może zawierać środki takie, jak zaróbka, bufor, czynnik izotoniczny, konserwant, środek powierzchniowo czynny i, w szczególności, cynk. Preparat może również zawierać zaróbkę lub środek do stabilizowania białka kompozycji przeciwciała, taki jak bufor, środek redukujący, białko wypełniające lub węglowodan. Do białek wypełniających, przydatnych do wytwarzania białek kompozycji przeciwciał, należą albumina, protamina i tym podobne. Do typowych węglowodanów, przydatnych do wytwarzania białek kompozycji przeciwciał, należą sacharoza, mannitol, laktoza, trehaloza, glukoza i tym podobne. Preparat przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF może również zawierać środek powierzchniowo czynny, który może ograniczyć lub zapobiec indukowanej przez kontakt z powierzchnią agregacji białka kompozycji przeciwciała, spowodowanej przez atomizację roztworu podczas tworzenia aerozolu. Można wykorzystać różne konwencjonalne środki powierzchniowo czynne, takie jak estry kwasów tłuszczowych i polioksoetyleno-alkoholi oraz estry kwasów tłuszczowych i polioksoetyleno-sorbitolu. Ilości z reguły mieszczą się w zakresie od 0,001 do 4% wagowych kompozycji. Środkami powierzchniowo czynnymi, szczególnie zalecanymi dla potrzeb tego wynalazku są monooleinian polioksoetyleno-sorbitanu, polisorbat 80, polisorbat 20 lub podobne. Do preparatu można również włączyć dodatkowe czynniki znane ze stanu techniki tworzenia kompozycji białek takich jak białka przeciwciał.

Podawanie kompozycji przeciwciała TNF za pomocą inhalatora z odmierzonymi dawkami

W inhalatorze z odmierzonymi dawkami (MDI), gaz napędowy, przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF i dowolne zaróbki lub inne substancje dodatkowe znajdują się w zbiorniku jako mieszanina, zawierająca sprężony gaz ciekły. Aktywacja zaworu odmierzającego uwalnia mieszaninę jako aerozol, dogodnie zawierający cząstki o wielkości z zakresu poniżej około 10 nm, zwłaszcza od około 1 nm do około 5 nm, w szczególności od około 2 μm do około 3 μm. Pożądany rozmiar cząstek aerozolu można uzyskać, wykorzystując preparat białkowej kompozycji przeciwciała, otrzymaną za pomocą różnych sposobów znanych specjalistom w dziedzinie, w tym pulweryzacji, suszenia rozpryskowego, kondensacji w punkcie krytycznym lub podobnych. Do zalecanych inhalatorów z odmierzonymi dawkami należą te, które wytwarza 3M lub Glaxo, z wykorzystaniem fluorowęglowodorowego gazu napędowego.

Preparaty przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF do zastosowania z inhalatorem z odmierzonymi dawkami zawierają ogólnie bardzo drobny proszek, zawierający przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF jako zawiesinę w ośrodku niewodnym, na przykład zawieszone w gazie napędowym za pomocą środka powierzchniowo czynnego. Gazem napędowym może być każdy konwencjonalny materiał stosowany dla tego celu, taki jak związek chlorofluorowęglowy, związek chlorofluorowęglowodorowy, związek fluorowęglowodorowy, lub węglowodór, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluPL 206 833 B1 orometan, dichlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, HFA-134a (wodorofluoroalkan-134a), HFA-227 (wodorofluoroalkan-227) lub podobne. Zalecanym gazem napędowym jest związek fluorowęglowodorowy. Celem zabezpieczenia tego przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF przed rozkładem chemicznym i tym podobnymi można dobrać środek powierzchniowo czynny. Do odpowiednich środków powierzchniowo czynnych należą trioleinian sorbitanu, lecytyna sojowa, kwas oleinowy i tym podobne. W pewnych przypadkach zalecane są aerozole zawierają ce roztwory z rozpuszczalnikami takimi, jak etanol.

Preparat może również zawierać dodatkowe środki, znane ze stanu techniki wytwarzania kompozycji białek, na przykład takie jak białko.

Osoba o zwykłej znajomości dziedziny stwierdzi, że sposoby tu opisane można zrealizować za pomocą podawania wziewnego kompozycji przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF urządzeniami tutaj nieopisanymi.

Preparaty i podawanie doustne

Preparaty do podawania doustnego opierają się na współpodawaniu adiuwantów (np. rezorcynoli i niejonowych środków powierzchniowo czynnych, takich jak eter polioksoetylenowo-oleinowy i eter n-heksadecylopoli-etylenowy), aby sztucznie zwię kszyć przepuszczalność ś cian jelita, a także współpodawaniu inhibitorów enzymów (np. inhibitorów trypsyny trzustkowej, fluorofosforanu diizopropylowego (DFF) i trasylolu), aby zahamować rozkład enzymatyczny. Związek, będący składnikiem aktywnym formy stałej dawkowania do podawania doustnego, można zmieszać z przynajmniej jedną substancją dodatkową, w tym sacharozą, laktozą, celulozą, mannitolem, trehalozą, rafinozą, maltytolem, dekstranem, skrobiami, agarem, alginianami, chitynami, chitozanami, pektynami, gumą tragakantową, gumą arabską, żelatyną, kolagenem, kazeiną, albuminą, polimerem syntetycznym lub półsyntetycznym i glicerydem. Te formy dawkowania mogą również zawierać inny rodzaj(rodzaje) substancji dodatkowych, np. nieaktywne środki rozcieńczające, środek poślizgowy, taki jak stearynian magnezu, paraben, czynnik konserwujący, taki jak kwas sorbowy, kwas askorbinowy, tokoferol alfa, przeciwutleniacz, taki jak cysteina, substancję rozpraszającą, substancję wiążącą, substancję zagęszczającą, środek buforujący, środek słodzący, środek poprawiający smak, środek zapachowy itp.

Tabletki i pigułki można przekształcić dalej w preparaty powleczone warstwą zabezpieczającą przed działaniem soku żołądkowego. Do preparatów ciekłych do podawania doustnego należą emulsja, syrop, eliksir, zawiesina i roztwór, dopuszczalny do zastosowania medycznego. Te preparaty mogą zawierać nieaktywne czynniki rozcieńczające, stosowane zazwyczaj w tej dziedzinie, takie jak np. woda. Opisano również liposomy, jako układy dostarczania leków dla insuliny i heparyny (pat. USA nr 4239754). Ostatnio do dostarczania substancji farmaceutycznych zastosowano mikrokulki sztucznych polimerów mieszanin aminokwasów (proteinoidów) (pat. USA nr 4925673). Ponadto do podawania doustnego czynników aktywnych biologicznie stosuje się związki nośnikowe, opisane w pat. USA nr 5879681 i pat. USA nr 55871753.

Preparaty i podawanie dośluzówkowe

Preparaty i sposoby do podawania przynajmniej jednego przeciwciała anty-TNF, w których związek ma się wchłaniać przez błonę śluzową, obejmują emulsję zawierającą wiele cząstek submikronowych, makrocząsteczkę mukoadhezyjną, peptyd bioaktywny oraz ciągłą fazę wodną, która ułatwia absorpcję przez powierzchnię błon śluzowych dzięki uzyskaniu mukoadhezji cząstek emulsji (pat. USA nr 5514670). Do błon śluzowych odpowiednich do nakładania emulsji tu opisanej mogą należeć rogówka, spojówka, śluzówka policzka, podjęzykowa, nosowa, pochwy, płucna, żołądkowa, jelitowa i odbytnicy. Preparaty do podawania pochwowego lub odbytniczego, np. czopki, mogą zawierać zaróbki, na przykład glikole polialkilenowe, wazelinę, masło kakaowe i tym podobne. Preparaty do podawania donosowego mogą być ciałem stałym i zawierać jako zaróbki na przykład laktozę lub mogą być roztworami wodnymi bądź olejowymi kropli do nosa. Zaróbki do podawania policzkowego obejmują cukry, stearynian wapnia, stearynian magnezu, skrobię zżelowaną i tym podobne (pat. USA nr 5849695).

Preparaty i podawanie przezskórne

Do podawania przezskórnego takie przynajmniej jedno przeciwciało anty-TNF zamyka się (inkapsuluje) w takim środku do podawania, jak liposom lub nanocząstki polimerowe, mikrocząstki, mikrokapsułki lub mikrokulki (zbiorczo nazywane mikrocząstkami, o ile nie stwierdza się inaczej). Znany jest szereg odpowiednich środków, w tym mikrocząstki wykonane z polimerów syntetycznych, takich jak polihydroksykwasy, takie jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy i ich kopolimery, ortopoliestry,

PL 206 833 B1 polibezwodniki i polifosfazeny oraz polimerów naturalnych, takich jak kolagen, poliaminokwasy, albumina i inne białka, alginian i inne polisacharydy i ich kombinacje (pat. USA nr 5814599).

Preparaty i podawanie przedłużone

Czasem pożądane może być uwalnianie związku tu opisanego pacjentowi przez dłuższy czas, na przykład przez okres od jednego tygodnia do jednego roku, po jednorazowym podaniu. Można wykorzystać różne formy dawkowania o powolnym uwalnianiu, typu depot lub implanty. Na przykład forma dawkowania może zawierać akceptowalną farmaceutycznie nietoksyczną sól związku, który rozpuszcza się w płynach ustrojowych w niskim stopniu, taką jak na przykład (a) kwasowa sól addycyjna z kwasem wielozasadowym, takim jak kwas fosforowy, kwas siarkowy, kwas cytrynowy, kwas winowy, tanina, kwas paminowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy naftalenomono- lub disulfonowe, kwas poligalakturonowy i tym podobne; (b) sól z wielowartościowym jonem metalu, takim jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm i tym podobne, albo z kationem organicznym, powstałym z np. N,N'-dibenzyloetylenodiaminy lub etylenodiaminy; albo (c) kombinacji (a) i (b), np. sól cynkowo-taninową. Dodatkowo ze związków tu opisanych lub, dogodnie, ich względnie nierozpuszczalnej soli, takich jak te właśnie opisane, można wytwarzać żel, np. żel monostearynianu glinu z np. olejem sezamowym, odpowiednim do wstrzyknięć. Szczególnie zalecane są sole cynku, sole taninowe cynku, sole kwasu paminowego i tym podobne. Inny rodzaj kompozycji depot o powolnym uwalnianiu, do wstrzyknięć, może zawierać związek lub sól rozproszoną dla celu zamknięcia w rozkładającym się powoli, nietoksycznym, nieantygenowym polimerze, takim jak polimer kwasu polimlekowego/kwasu poliglikolowego, na przykład tak, jak opisano w pat. USA nr 3773919. Ze związków, lub dogodnie ich względnie nierozpuszczalnych soli, takich jak opisane powyżej, można również wytwarzać preparaty w granulkach Silastic z macierzy cholesterolowej, szczególnie do zastosowania u zwierząt. W literaturze znane są inne kompozycje o powolnym uwalnianiu, depot lub implantów, np. liposomy gazowe lub ciekłe (pat. USA nr 5770222 i „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., N. Y., 1978).

Po ogólnym opisie wynalazku, będzie można łatwiej go zrozumieć, z odwołaniem się do następujących przykładów, które podaje się dla ilustracji i które nie mają na celu ograniczania.

P r z y k ł a d 1: Klonowanie i ekspresja przeciwciała anty-TNF w komórkach ssaczych

Typowy ssaczy wektor ekspresyjny zawiera przynajmniej jeden element promotorowy, pośredniczący w inicjacji transkrypcji mRNA, sekwencję kodującą przeciwciało i sygnały niezbędne do terminacji transkrypcji i poliadenylacji transkryptu. Wśród dodatkowych elementów są wzmacniacze, sekwencje Kozak i sekwencje intronowe otoczone przez miejsca donorowo i akceptorowe do składania RNA. Wysokowydajną transkrypcję można osiągnąć z wczesnych i późnych promotorów SV40, długich końcowych powtórzeń (LTR) z retrowirusów np. RSV, HTLVI, HIVI i z wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV). Niemniej można użyć także elementów komórkowych (np. promotora genu aktyny człowieka). Do wektorów ekspresyjnych odpowiednich do wykorzystania w wynalazku należą np. wektory takie jak pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN lub pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA, USA), pcDNA3.1 (+/), pcDNA/Zeo (+/-) lub pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL i PMSG (Pharmacia, Uppsala, Szwecja), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) i pBC12MI (ATCC 67109). Do ssaczych komórek gospodarza, które można wykorzystać, należą ludzkie komórki HeLa 293, H9 i Jurkat, mysie komórki NIH3T3 i C127, Cos 1, Cos 7 i CV 1, przepiórcze komórki QC1-3, mysie komórki L i komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO).

Alternatywnie, gen może ulegać ekspresji w stabilnych liniach komórkowych zawierających gen wbudowany do chromosomu. Kotransfekcja markerem selekcyjnym, takim jak oporność na dhfr, gpt, neomycynę lub higromycynę, pozwala na identyfikowanie i izolowanie transfekowanych komórek.

Gen, którym się transfekuje może być również powielany, tak, aby doszło do ekspresji dużych ilości kodowanego przeciwciała. Marker DHFR (reduktazy dihydrofolianowej) jest użyteczny w otrzymywaniu linii komórkowych zawierających nawet kilka tysięcy kopii odpowiedniego genu. Innym użytecznym markerem selekcyjnym jest enzym syntaza glutaminy (GS) (Murphy i wsp., Biochem. J. 227: 277279 (1991); Bebbington i wsp., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Komórki ssacze hoduje się na podłożu selekcyjnym i za pomocą tych markerów selekcjonuje się komórki o najwyższej oporności. Takie linie komórkowe zawierają powielony gen(geny) zintegrowane na chromosomie. Do produkcji przeciwciał często wykorzystuje się komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO) i komórki NSO.

Wektory ekspresyjne pCl i pC4 zawierają silny promotor (LTR) wirusa mięsaka Rousa (Cullen i wsp., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)), dodatkowo zawierają fragment wzmacniacza CMV (Boshart i wsp., Cell 41: 521-530 (1985)). Miejsca wielokrotnego klonowania np. miejsca cięcia dla enzyPL 206 833 B1 mów restrykcyjnych BamRl, Xhal i Asp718 umożliwiają klonowanie odpowiedniego genu. Wektory zawierają dodatkowo 3'intron, sygnał poliadenylacji i terminacji szczurzego genu preproinsuliny.

Klonowanie i ekspresja w komórkach CHO

Do ekspresji przeciwciała anty-TNF użyto wektora pC4. Plazmid pC4 jest pochodną plazmidu pSV2-dhfr (nr dostępu ATCC 37146). Plazmid zawiera mysi gen DHFR pod kontrolą wczesnego promotora SV40. Komórki jajnikowe chomika chińskiego lub inne komórki niewykazujące aktywności reduktazy dihydrofolianowej, transfekowane tymi plazmidami można selekcjonować przez wzrost na pożywce selekcyjnej (np. alpha minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) uzupełnionej metotreksatem, czynnikiem chemioterapeutycznym. Powielanie genów DHFR w komórkach opornych na metotreksat (MTX) zostało dobrze udokumentowane (patrz np. F. W. Alt i wsp., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); J.L. Hamlin i C. Ma, Biochem, et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); i M. J. Page i M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). Komórki hodowane we wzrastającym stężeniu MTX rozwijają oporność na lek przez nadprodukcję docelowego enzymu DHFR, osiąganą przez powielenie genu DHFR. Jeżeli z genem DHFR sprzężony jest inny gen, jest on zwykle razem z nim powielany i ulega nadmiernej ekspresji. Wiadomo, że tej metody można użyć do wytworzenia linii komórkowych zawierających ponad 1000 kopii powielanego genu(genów). Następnie, gdy wycofany zostanie metotreksat, otrzymuje się linie komórkowe zawierające powielony gen zintegrowany do jednego lub więcej chromosomów komórek gospodarza.

Plazmid pC4 do ekspresji danego genu zawiera silny promotor długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa mięsaka Rousa (Cullen i wsp., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)) i zawiera dodatkowo fragment wyizolowany ze wzmacniacza najwcześniejszych genów ludzkiego cytomegalowirusa (CMV) (Boshart i wsp., Cell 41: 521-530 (1985)). Poniżej promotora znajdują się miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych BamHl, Xbal i Asp718, umożliwiające podłączanie genów. Za tymi miejscami klonowania plazmid zawiera 3'intron i miejsce poliadenylacji szczurzego genu preproinsuliny. Do ekspresji można zastosować inne, wysokowydajne promotory, np. promotor ludzkiej β-aktyny, wczesne lub późne promotory SV40 lub długie końcowe powtórzenia (LTR) z retrowirusów, np. HIV i HTLVI. Do ekspresji TNF w sposób regulowany w komórkach ssaczych można użyć systemów ekspresji genów Tet-Off i Tet-On firmy Clontech lub systemów podobnych (M. Gossen i H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Do poliadenylacji mRNA można również użyć innych sekwencji sygnałowych, np. z genów ludzkiego hormonu wzrostu lub globiny. Stabilne linie komórkowe zawierające odpowiedni gen zintegrowany do chromosomów można również selekcjonować przez kotransfekcję markerem selekcyjnym, takim jak gpt, G418 i higromycyna. Zalecane jest stosowanie na początku więcej niż jednego markera selekcyjnego, na przykład G418 i metotreksatu.

Plazmid pC4 trawi się enzymami restrykcyjnymi, a następnie defosforyluje przy pomocy cielęcej fosfatazy jelitowej w standardowy sposób. Wektor następnie izoluje się z 1% żelu agarozowego.

Izolowany DNA kodujący region zmienny i stały oraz defosforylowany wektor poddaje się następnie ligacji ligazą DNA faga T4. Transformuje się komórki E. coli HB101 lub XL-1 Blue i identyfikuje się bakterie zawierające plazmid pC4 ze wstawką, np. poprzez analizę enzymami restrykcyjnymi.

Do transfekcji wykorzystuje się komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO), nieposiadające aktywnego genu DHFR. Kotransfekcję przeprowadza się 5 μg plazmidu ekspresyjnego pC4 oraz 0,5 μg plazmidu pSV2-neo z użyciem lipofektyny. Plazmid pSV2neo zawiera jako dominujący znacznik selekcyjny gen neo z transpozonu Tn5, kodujący enzym odpowiedzialny za oporność na grupę antybiotyków, do której należy G418. Komórki rozsiewa się na podłożu alpha minus MEM uzupełnionym G418 w stężeniu 1 μq/ml. Po dwóch dniach komórki poddaje się trypsynizacji i rozsiewa na szalkach do klonowania hybrydom (Greiner, Niemcy) na podłożu alpha minus MEM uzupełnionym metotreksatem w stężeniu 10, 25 lub 50 ng/ml i G418 w stężeniu 1 μg/ml. Po około 10-14 dniach pojedyncze klony poddaje się trypsynizacji, a następnie przesiewa na 6-studzienkowe szalki Petriego lub do 10-ml butelek przy różnym stężeniu metotreksatu (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klony hodowane na wyższym stężeniu metotreksatu przenosi się na nowe 6-studzienkowe szalki Petriego z jeszcze wyższym stężeniem metotreksatu (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Procedurę tę powtarza się do otrzymania klonów rosnących przy stężeniu 100-200 mM. Ekspresję produktów odpowiednich genów sprawdza się np. przez SDS-PAGE i Western-blot albo chromatografię HPLC w odwróconej fazie.

PL 206 833 B1

P r z y k ł a d 2: Otrzymywanie, z użyciem transgenicznych myszy, ludzkich, monoklonalnych przeciwciał IgG o wysokim powinowactwie, reagujących z ludzkim TNF

Streszczenie

Do wytwarzania w pełni ludzkich, o wysokim powinowactwie, monoklonalnych przeciwciał, które można wykorzystywać do zahamowania działania TNF w terapii jednej lub więcej chorób związanych z TNF, użyto transgenicznych myszy zawierających ludzkie geny łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Myszy hybrydowe pokolenia F2 (CBA/J x C57/BL6/J), zawierające ludzkie transgeny regionów zmiennych i stałych zarówno dla łańcuchów ciężkich, jak i lekkich przeciwciał immunizuje się ludzkim, rekombinowanym TNF (Taylor i wsp., Intl. Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg i wsp., Nature 368: 856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14: 826 (1996); Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)). Z szeregu fuzji otrzymano jeden lub więcej zestawów w pełni ludzkich, monoklonalnych przeciwciał IgG reagujących z TNF. Prowadzono dalsze badania charakterystyki w pełni ludzkich przeciwciał anty-TNF. Wszystkie należą do klasy IgG1. Wykazano, że stała powinowactwa tych przeciwciał mieści się w zakresie od około 1x10⁹ do 9x10¹². Nieoczekiwanie wysokie powinowactwo tych w pełni ludzkich, monoklonalnych przeciwciał czyni je odpowiednimi do zastosowań terapeutycznych w chorobach, patologiach lub zaburzeniach związanych z TNF.

Skróty

BSA - bydlęca albumina surowicy

CO2 - dwutlenek węgla

DMSO - dimetylosulfotlenek

EIA - test immunoenzymatyczny

FBS - bydlęca surowica płodowa

H2O2 - nadtlenek wodoru

HRP - peroksydaza chrzanowa

ID - śródskórnie

Ig - immunoglobulina

TNF - czynnik martwicy nowotworu alfa

IP - dootrzewnowe,

IV - dożylnie

Mab - przeciwciało monoklonalne

OD - gęstość optyczna

OPD - dihydroksychlorek o-fenylenodiaminy

PEG - glikol polietylenowy

PSA - penicylina, streptomycyna, amfoterycyna

RT - temperatura pokojowa

SQ - podskórnie obj./obj. - objętość/objętość wag./obj. - masa/objętość Materiały i Metody Zwierzęta

Znane ze stanu techniki i dostępne komercyjnie transgeniczne myszy zdolne do ekspresji ludzkich przeciwciał (np. z GenPharm International, San Jose, CA, USA; Abgenix, Freemont, CA, USA, i z innych firm), zachodzi w nich ekspresja ludzkich immunoglobulin, ale nie mysich IgM lub Ig. Na przykład, takie transgeniczne myszy posiadają sekwencje ludzkich transgenów podlegających łączeniu na zrębach V(D)J, zmianom klasy ciężkich łańcuchów i mutacjom somatycznym, co pozwala na wytworzenie szerokiego repertuaru sekwencji ludzkich immunoglobulin (Lonberg i wsp., Nature 368: 856-859 (1994)). Transgen łańcucha lekkiego może pochodzić np. częściowo z klonów drożdżowych posiadających sztuczny drożdżowy chromosom zawierający blisko połowę ludzkiego regionu V kodowanego w linii komórek płciowych. Dodatkowo, transgen łańcucha ciężkiego może kodować zarówno ludzkie regiony μ, jak i 1 (Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)) i(lub) 3 regiony stałe. Do otrzymania w pełni ludzkich, monoklonalnych przeciwciał anty-TNF do procesu immunizacji i fuzji można wykorzystać myszy pochodzące z odpowiednich genotypowo linii.

Immunizacja

Do otrzymania ludzkich hybrydom anty-TNF można wykorzystać jeden lub więcej sposobów immunizacji. Kilka pierwszych fuzji można wykonać według następującego, przykładowego protokołu immunizacyjnego, przy czym można wykorzystywać także inne, znane, podobne protokoły. Kilka saPL 206 833 B1 mic w wieku 14-20 tygodni i(lub) chirurgicznie wykastrowanych transgenicznych samców myszy immunizuje się IP i(lub) ID 1-10000 μq rekombinowanego ludzkiego TNF, zemulgowanego w równej objętości TITERMAK lub pełnego adiuwanta Freunda w końcowej objętości 100-400 μl (np. 200). Każdej z myszy można opcjonalnie podać SQ 1-10 μg soli fizjologicznej na każde z 2 miejsc wstrzyknięcia. Myszy można następnie immunizować 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 i(lub) 21-34 dni później przez podanie IP (1-400 μq) i SQ (1-400 μq x 2) TNF zemulgowanego w równej objętości TITERMAK lub niepełnego adiuwanta Freunda. Myszy można skrwawiać w 12-25 i 25-45 dni później przez punkcję oczodołową bez zastosowania antykoagulantów. Krew krzepnie przez godzinę w RT, następnie zbiera się surowicę i oznacza się miano przeciwciał w teście EIA TNF, według znanych metod. Gdy ponawiane wstrzyknięcia nie wywołują wzrostu mian, wykonuje się fuzje. Wtedy można podać myszom ostateczne IV wstrzyknięcie wzmagające w postaci 1-400 μg TNF rozpuszczonego w 100 μl soli fizjologicznej. Trzy dni później myszy usypia się przez przerwanie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, pobiera się w warunkach jałowych śledziony i zanurza się je w 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), zawierającym 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B (PSA). Pobiera się splenocyty przez jałowe płukanie śledziony PSA-PBS. Komórki następnie płucze się jeden raz zimnym PSA-PBS, zlicza przez eliminację komórek martwych w teście błękitu trypanowego i zawiesza w pożywce RPMI 1640 zawierającej 25 mM HEPES.

Fuzje komórkowe

Fuzje można przeprowadzać powszechnie znanymi sposobami, przy stosunku od 1:1 do 1:10 mysich komórek szpiczaka do żywych komórek śledziony. W nie ograniczającym przykładzie, komórki śledziony osadza się razem z komórkami szpiczaka. Osad jest następnie wolno zawieszany, przez ponad 30 sekund, w 1 ml 50% (wag/obj.) roztworu PEG/PBS (PEG o masie cząsteczkowej 1450, Sigma) w 37°C. Fuzję można następnie zatrzymać przez powolne dodawanie 10,5 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 25 mM Hepes (37°C) przez ponad 1 minutę. Połączone komórki następnie odwirowuje się przez 5 minut przy 500-1500 obr./min. Następnie komórki zawiesza się w pożywce HAT (pożywce RPMI 1640 zawierającej 25 mM Hepes, 10% surowicę Fetal Clone I (Hyclone), 1 mM pirogronianu sodu, 4 mM L-glutaminy, 10 μg/ml gentamycyny, 2,5% suplementu hodowlanego

Origen (Fisher), 10% kondycjonowanej pożywki RPMI 1640/Hepes z komórek 653, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 100 μM hipoksantyny, 0,4 μM aminopteryny i 16 μM tymidyny) i wysiewa się po 200 μl/studzienkę na piętnaście 96-studzienkowych, płaskodennych płytek do hodowli komórkowych. Płytki są umieszczane na 7-10 dni w nawilżanym inkubatorze w 37°C, w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrzu.

Wykrywanie ludzkich przeciwciał IgG anty-TNF w mysiej surowicy

Do sprawdzania obecności w mysiej surowicy ludzkich przeciwciał IgG specyficznych dla ludzkiego TNF wykorzystuje się testy EIA na fazie stałej. Pokrótce, płytki są pokrywane TNF przez inkubację przez noc w roztworze PBS z TNF w stężeniu 2 μg/ml. Po płukaniu w 0,15 M roztworze chlorku sodu zawierającym 0,02% (obj./obj.) Tween 20 płytki można blokować 1% (wag/obj.) BSA w PBS, 200 μl/studzienkę przez 1 godzinę w RT. Płytki wykorzystuje się natychmiast lub zamraża w -20°C do późniejszego użytku. Na płytkach pokrytych TNF inkubuje się po 50 μl/studzienkę rozcieńczeń mysiej surowicy przez 1 godzinę w RT. Płytki płucze się, a następnie inkubuje ze znakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG, specyficznym dla Fc, rozcieńczonym 1:30000 w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę w RT. Płytki ponownie się płucze i dodaje się przez 15 minut w RT po 100 μl/studzienkę cytrynianowo-fosforanowego roztworu substratu (0,1M kwas cytrynowy, 0,2M fosforan sodu, 0,01% H₂O₂ i Img/ml OPD). Dodaje się po 25 μl/studzienkę roztworu stop (4N kwas siarkowy) i odczytuje się OD przy 490 nm przez automatyczny spektrofotometr szalkowy.

Wykrywanie w pełni ludzkich immunoglobulin w supernatantach hybrydom

Wzrastające hybrydomy, wydzielające w pełni ludzkie immunoglobuliny wykrywa się w odpowiednim teście EIA. W skrócie, 96-studzienkowe płytki typu pop-out (VWR, 610744) pokrywa się kozią IgG przeciw ludzkiemu Fc, inkubując w roztworze 10 μg/ml tego przeciwciała w buforze węglanu sodu przez noc w 4°C. Płytki płucze się i blokuje się 1% BSA-PBS przez 1 godzinę w 37°C, po czym natychmiast wykorzystuje się lub zamraża w -20°C. Na płytkach inkubuje się nierozcieńczane supernatanty hybrydom przez 1 godzinę w 37°C. Płytki płucze się, a następnie inkubuje ze znakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciw ludzkiemu kappa, rozcieńczonym 1:10000 w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę w 37°C. Płytki następnie inkubuje się z roztworem substratu, jak opisano powyżej.

PL 206 833 B1

Oznaczenie reaktywności względem w pełni ludzkiego TNF

Z wykorzystaniem odpowiedniego RIA lub innego testu, tak jak powyżej, można jednocześnie sprawdzać reaktywność hybrydom z TNF. Na przykład, supernatanty inkubuje się na płytkach pokrytych kozim przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG Fc, tak jak opisano powyżej, płytki płucze się i inkubuje z wyznakowanym radioaktywnie TNF przy odpowiedniej ilości zliczeń na studzienkę przez 1 godzinę w RT. Studzienki płucze się dwukrotnie PBS i związany radioaktywny TNF zlicza się z użyciem odpowiedniego licznika.

Hybrydomy wydzielające ludzkie IgG1 anty-TNF namnaża się w hodowli komórkowej i seryjnie subklonuje przez limitujące rozcieńczenia. Otrzymane populacje klonalne namnaża się i konserwuje przez zamrożenie w ciekłym azocie w pożywce do zamrażania (95% FBS, 5% DMSO).

Izotypowanie

Oznaczanie izotypu przeciwciał można wykonać, wykorzystując EIA w sposób podobny do użytego do przeszukiwania immunizowanych mysich surowic pod względem specyficznych mian. Jak opisano powyżej, 96-studzienkowe płytki pokrywa się TNF i inkubuje z oczyszczonym przeciwciałem w stężeniu 2 μg/ml przez jedną godzinę w RT. Płytkę płucze się i inkubuje ze znakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciw ludzkim IgG1 lub ze znakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciw ludzkim IgG3, rozcieńczonymi 1:4000 w 1% BSA-PBS przez jedną godzinę w RT. Płytki następnie płucze się i inkubuje z roztworem substratu tak, jak opisano powyżej.

Kinetyka wiązania ludzkich przeciwciał przeciw ludzkiemu TNF z ludzkim TNF

Charakterystykę wiązania przeciwciał można odpowiednio wyznaczyć, wykorzystując np. zatrzymywanie TNF w EIA i technologię BIAcore. Oznacza się wiązanie z płytkami EIA, pokrytymi 2 μg/ml TNF, oczyszczonych, ludzkich przeciwciał anty-TNF w różnym stężeniu, tak jak w testach opisanych powyżej. OD są prezentowane jako półlogarytmiczne wykresy ukazujące relatywną wydajność wiązania.

Stałe ilościowe wiązania można wyznaczyć np. tak jak przedstawiono poniżej lub inną odpowiednią, znaną metodą. Mikromacierz BIAcore CM-5 (karboksymetylowaną) umieszcza się w urządzeniu BIAcore 2000. Komorę przepływową macierzy przepłukuje się buforem HBS (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% obj./obj. substancji powierzchniowo czynnej P20, pH 7,4) w tempie 5 μl/minutę aż do osiągnięcia stabilnego odczytu linii podstawowej. Do 100 μl roztworu 2,3 mg NHS (N-hydroksysukcynoimidu) w 200 pl wody dodaje się roztwór (100 μθ 15 mg EDC (chlorowodorek N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimidu) w 200 μl wody. Na macierz nastrzykuje się czterdzieści (40) gl otrzymanego roztworu. Na macierz nastrzykuje się 6 μl roztworu ludzkiego TNF (15 μg/ml w 10 mM octanu sodu, pH 4,8) co powoduje wzrost o ok. 500 RU. Bufor zmienia się na bufor roboczy TBS/Ca/Mg/BSA (20 mM Tris, 0,15 M chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, 2 mM octanu magnezu, 0,5% Triton X-100, 25 μg/ml BSA, pH 7,4) i płukanie prowadzi się przez noc, aby zrównoważyć macierz i osiągnąć hydrolizę lub zabezpieczenie wszystkich nieprzereagowanych estrów sukcynoimidowych.

Przeciwciała rozpuszcza się w buforze roboczym, w stężeniu 33,33, 16,67, 8,33 i 4,17 nM. Tempo przepływu ustalone jest na 30 gl/min, a temperatura pracy urządzenia na 25°C. Do prób kinetyki wykorzystywane są dwie komory przepływowe, na jednej z nich został związany TNF (próba badana) a druga to niezmodyfikowana komora przepływowa (próba ślepa). Do komory przepływowej wstrzykuje się po 120 gl każdego ze stężeń przeciwciał w tempie 30 gl/min (faza asocjacji), następnie płucze się nieprzerwanym przepływem buforu przez 360 sekund (faza dysocjacji). Powierzchnię macierzy regeneruje się (rozdysocjowuje kompleks czynnik martwicy nowotworu/przeciwciało) przez dwukrotne wstrzyknięcie 30 gl 2 M rodanku guanidyny.

Analizę danych przeprowadza się standardowo z użyciem BIA wersja 3.0 lub CLAMP 2.0, znanych ze stanu techniki. Dla każdego stężenia przeciwciał od sensogramu próby odejmuje się sensogram ślepy. Wykonuje się globalne dopasowanie zarówno dla dysocjacji (Kd, sec^-1), jak i asocjacji (ka, mol^-1, sec^-1) i wylicza się (Kd/Ka) stałą dysocjacji (KD, mol). Jeżeli powinowactwo przeciwciał jest wysokie tak, że liczba RU zatrzymanego przeciwciała wynosi >100, wykonuje się próbę z dodatkowymi rozcieńczeniami przeciwciała.

Wyniki i dyskusja

Otrzymywanie monoklonalnych przeciwciał przeciw ludzkiemu TNF

Wykonano kilka fuzji i każdą fuzję rozsiano na 14 płytkach (1440 studzienek/fuzję), co dało kilkadziesiąt rodzajów przeciwciał specyficznych dla ludzkiego TNF. Stwierdzono, że część z nich złożona jest z kombinacji łańcuchów ludzkich i mysich Ig. Pozostałe hybrydomy wydzielają przeciwciała

PL 206 833 B1 anty-TNF składające się wyłącznie z ludzkich łańcuchów ciężkich i lekkich. Zakłada się, że wszystkie ludzkie hybrydomy należą do klasy IgG1.

Kinetyka wiązania ludzkich przeciwciał przeciw ludzkiemu TNF

Analizy ELISA potwierdzają, że oczyszczone przeciwciała z większości hybrydom wiążą TNF w sposób zależny od stężenia. Fig. 1-2 pokazują względną wydajność wiązania tych przeciwciał. W tym przypadku zmierzono zachłanność wiązania przeciwciał w stosunku do swojego antygenu (epitopu). Trzeba zauważyć, że wiązanie TNF bezpośrednio na płytkę EIA może wywołać denaturację białka i objawiającego się powinowactwa wiązania nie można odnosić z niezdenaturowanym białkiem. Przy różnym stężeniu obserwuje się pięćdziesięcioprocentową wydajność wiązania.

Przez analizę metodą BIAcore wyznaczono stałe ilościowe wiązania ludzkich przeciwciał i wykazano, że kilka ludzkich przeciwciał monoklonalnych wykazuje bardzo wysokie powinowactwo z KD w zakresie od 1x10^-9 do 7x10^-12.

Wnioski

Przeprowadzono kilka fuzji z wykorzystaniem splenocytów z myszy hybrydowych posiadających transgeny ludzkich zmiennych i stałych regionów przeciwciał, immunizowanych ludzkim TNF. Wytworzono zestaw kilku w pełni ludzkich, reagujących z TNF monoklonalnych przeciwciał IgG izotypu IgG1. Następnie przeprowadzono badania charakterystyki w pełni ludzkich przeciwciał anty-TNF. Stała powinowactwa kilku wytworzonych przeciwciał wynosi od 1x10^-9 do 7x10^-12. Nieoczekiwanie wysokie powinowactwo tych w pełni ludzkich, monoklonalnych przeciwciał czyni je odpowiednimi do zastosowań terapeutycznych w chorobach, patologiach lub zaburzeniach związanych z TNF.

P r z y k ł a d 2: Otrzymywanie ludzkich, monoklonalnych przeciwciał IgG reagujących z ludzkim TNFa:

Streszczenie

Myszy hybrydowe pokolenie F2 (CBA/J x C57/BL6/J) (1-4) zawierające ludzkie transgeny regionów zmiennych i stałych zarówno dla ciężkich, jak i lekkich łańcuchów przeciwciał immunizowano ludzkim, rekombinowanym TNFa. Z jednej fuzji nazwanej GenTNV otrzymano osiem w pełni ludzkich, monoklonalnych przeciwciał IgG1K wiążących się z unieruchomionym rekombinowanym, ludzkim TNFa. Wkrótce po identyfikacji osiem linii komórkowych przekazano do dalszych badań do grupy Molecular Biology. Jako że te Mab mają w pełni ludzką sekwencję, oczekuje się, że będą mniej immunogenne dla człowieka niż cA2 (Remicade).

Skróty

BSA - bydlęca albumina surowicy

CO2 - dwutlenek węgla

DMSO - dimetylosulfoltenek

EIA - test immunoenzymatyczny

FBS - bydlęca surowica płodowa

H2O2 - nadtlenek wodoru

HC - łańcuch ciężki

HRP - peroksydaza chrzanowa

Ig - immunoglobulina

IP- dootrzewnowo

IV- dożylnie

Mab - przeciwciało monoklonalne

OD - gęstość optyczna

OPD - dihydroksychlorek o-fenylenodiaminy

PEG - glikol polietylenowy

PSA - penicylina, streptomycyna, amfoterycyna

RT - temperatura pokojowa

SQ - podskórnie

TNFa - czynnik martwicy nowotworu alfa obj./obj. - objętość/objętość wag./obj. - masa/objętość Wstęp

Do wytwarzania w pełni ludzkich, monoklonalnych przeciwciał, skierowanych specyficznie przeciwko rekombinowanemu, ludzkiemu TNFa wykorzystano transgeniczne myszy zawierające ludzkie geny łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Liczy się na to, że możliwe będzie zastosowanie

PL 206 833 B1 tych unikalnych przeciwciał tak, jak używany jest cA2 (Remicade), do leczniczego hamowania procesów zapalnych zachodzących w chorobach związanych z TNFa z równoczesną korzyścią w postaci wydłużenia czasu półtrwania surowicy i zmniejszenia efektów ubocznych związanych z immunogennością.

Materiały i Metody:

Zwierzęta

W GenPharm International otrzymano transgeniczne myszy, wykazujące ekspresję ludzkich przeciwciał, ale nie mysich IgM lub IgK. Myszy te posiadają funkcjonalne ludzkie transgeny podlegające łączeniu na zrębach V(D)J, zmianom klas ciężkich łańcuchów i mutacjom somatycznym, co pozwala na wytworzenie szerokiego repertuaru sekwencji ludzkich antygenowe specyficznych immunoglobulin (1). Transgen łańcucha lekkiego pochodzi częściowo z klonów drożdżowych posiadających sztuczny drożdżowy chromosom zawierający blisko połowę locus ludzkiego regionu Vk kodowanego w linii komórek płciowych. Oprócz kilku genów VH, transgen łańcucha ciężkiego (HC) koduje zarówno ludzkie regiony stałe μ, jak i γ1 (2) i(lub) γ3. W celu otrzymania opisywanych tutaj przeciwciał, do procesu immunizacji i fuzji wykorzystano myszy pochodzące z linii genotypowej HCo12/KCo5.

Oczyszczanie ludzkiego TNFa

Ludzki TNFa oczyszczono z supernatantów hodowli tkankowych komórek C237A przez chromatografię powinowactwa z użyciem kolumny z ułożonym złożem Sepharose 4B (Pharmacia) powiązanym z białkiem fuzyjnym receptor TNFa-Fc (p55-sf2) (5). Supernatant komórkowy zmieszano z jedną dziewiątą jego objętości 10x PBS Dulbecco (D-PBS) i przepuszczono przez kolumnę w temperaturze 4°C przy przepływie 4 ml/min. Kolumnę przepłukano następnie PBS, a TNFa eluowano 0,1 M cytrynianem sodu, pH 3,5 i zobojętniano 2 M Tris-HCl, pH 8,5. W oczyszczonym TNFa zmieniono bufor na 10 mM Tris, 0,12 M chlorek sodu pH 7,5 i przefiltrowano go przez filtr strzykawkowy 0,2 um.

Immunizacja

Samicę myszy z GenPharm, w wieku około 16 tygodni, immunizowano IP (200 ul) i ID (100 ul u podstawy ogona) łącznie 100 ug TNFa (seria JG102298 lub JG102098), zemulgowanego w równej objętości adiuwantu TITERMAX w dniach 0, 12 i 28 dniu. Myszy skrwawiono w 21 i 35 dni później przez punkcję oczodołową bez zastosowania antykoagulantów. Krew krzepła przez godzinę w RT, następnie zebrano surowicę i oznaczono miano przeciwciał w teście EIA z TNFa w fazie stałej. Fuzję oznaczoną GenTNV wykonano po tym jak pozwolono odpocząć myszy przez 7 tygodni po wstrzyknięciu w 28 dnia. Następnie podawano myszy z mianem 1:160 specyficznych, ludzkich IgG anty-TNFa, ostateczne wstrzyknięcie lV wzmagające odpowiedź w postaci 50 uq TNFa rozpuszczonego w 100 ul soli fizjologicznej. Trzy dni później mysz uśpiono przez przerwanie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, pobrano sterylnie śledzionę, zanurzono ją następnie w 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), zawierającym 100 U/ml penicyliny, 100 ug/ml streptomycyny i 0,25 ug/ml amfoterycyny B (PSA). Pobrano splenocyty przez jałową perfuzję śledziony PSA-PBS. Komórki następnie płukano jeden raz zimnym PSA-PBS, zliczano w liczniku Coultera i zawieszano w pożywce RPMI 1640 zawierającej 25 mM HEPES.

Linie komórkowe

Uczestniczące w fuzji, niewydzielające mysie komórki 653 szpiczaka grupa Product Development firmy Centocor dostarczyła do grupy Cell Biology Services (CBS) 14.05.97. Linię komórkową namnażano w pożywce RPMI (JRH Biosciences) uzupełnionej 10% (obj./obj.) FBS (Cell Culture Labs), 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutaminy (wszystko z JRH Biosciences), konserwowano w niskiej temperaturze w 95% FBS i 5% DMSO (Sigma) i przechowywano w fazie gazowej zamrażarki z ciekłym azotem w CBS. Bank komórkowy był sterylny (Quality Control Centocor, Malvern) i wolny od mikoplazmy (Bionique Laboratories). Komórki utrzymywano w fazie logarytmicznej hodowli do czasu fuzji. Przed fuzją w teście wykluczenia błękitem trypanowym komórki płukano PBS, zliczano i określano ich żywotność.

Ludzki TNFa był produkowany przez rekombinowana linię komórkową oznaczoną C237A, otrzymaną w grupie Molecular Biology w Centocor. Linię komórkową namnażano w pożywce IMDM (JRH Biosciences) uzupełnionej 5% (obj./obj.) FBS (Cell Culture Labs), 2 mM L-glutaminy (wszystko z JRH Biosciences) i 0,5 ug/ml kwasu mikofenolowego, konserwowano w niskiej temperaturze w 95% FBS i 5% DMSO (Sigma) i przechowywana w fazie gazowej zamrażarki z ciekłym azotem w CBS. Bank komórkowy był sterylny (Quality Control Centocor, Malvern) i wolny od mikoplazmy (Bionique Laboratories).

PL 206 833 B1

Fuzje komórkowe

Fuzje przeprowadzono przy stosunku 1:1 mysich komórek szpiczaka 653 do żywych, mysich komórek śledziony. Komórki śledziony osadzano razem z komórkami szpiczaka. Osad następnie wolno zawieszano przez ponad 30 sekund w 1 ml 50% (wag/obj.) roztworu PEG/PBS (PEG o masie cząsteczkowej 1450, Sigma) w 37°C. Fuzja została następnie zatrzymana przez powolne dodawanie 10,5 ml pożywki RPMI 1640 (bez uzupełnień) (JRH) (37°C) przez ponad 1 minutę. Połączone komórki odwirowano przez 5 minut przy 750 obr./min. Następnie komórki zawieszono w pożywce HAT (pożywka RPMI/HEPES zawierająca 10% bydlęcą surowicę płodową (JHR), 1 mM pirogronianu sodu, 2 μΜ L-glutaminy, 10 μg/ml gentamycyny, 2,5% suplementu hodowlanego Origen (Fisher), 50 μM 2-merkaptoetanolu, 1% kondycjonowanej pożywki RPMI z komórek 653, 100 μM hipoksantyny, 0,4 μM aminopteryny i 16 μM tymidyny) i wysiano po 200 μl/studzienkę na piętnaście 96-studzienkowych, płaskodennych płytek do hodowli komórkowych. Płytki umieszczono na 7-10 dni w nawilżanym inkubatorze w 37°C, w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza.

Wykrywanie ludzkich przeciwciał IgG anty-TNFa w mysiej surowicy

Do sprawdzania obecności w mysiej surowicy ludzkich przeciwciał IgG specyficznych dla ludzkiego TNFa wykorzystywano test EIA na fazie stałej. W skrócie, płytki pokryto TNFa przez inkubację przez noc w roztworze PBS z TNFa w stężeniu 1 μg/ml. Po płukaniu w roztworze 0,15 M chlorku sodu zawierającym 0,02% (obj./obj.) Tween 20 płytki blokowano 1% (wag/obj.) BSA w PBS, 200 pl/studzienkę przez 1 godzinę w RT. Płytek używano natychmiast lub zamrażano w -20°C przed dalszym użyciem. Na płytkach pokrytych ludzkim TNFa inkubowano po 50 pl/studzienkę seryjnych, dwukrotnych rozcieńczeń mysiej surowicy przez 1 godzinę w RT. Płytki płukano, a następnie inkubowano ze znakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG, specyficznym dla Fc (Accurate), rozcieńczonym 1:30000 w 1% BSA-PBS przez 1 godzinę w RT. Szalki ponownie płukano i dodawano po 100 pl/studzienkę cytrynianowo-fosforanowego roztworu substratu (0,1 M kwasu cytrynowego, 0,2 M fosforanu sodu, 0,01% H₂O₂ i 1 mg/ml OPD) na 15 minut w RT. Dodawano po 25 pl/studzienkę roztworu stop (4 N kwas siarkowy) i odczytywano OD przy 490 nm w automatycznym spektrofotometrze szalkowym.

Wykrywanie w pełni ludzkich immunoglobulin w supernatantach hybrydom

Ponieważ myszy GenPharm są zdolne do wytwarzania zarówno mysich, jak i ludzkich łańcuchów immunoglobulin, użyto dwóch oddzielnych testów EIA celem sprawdzenia obecności zarówno ludzkich łańcuchów lekkich, jak i ciężkich w klonach hybrydom pozytywnych pod względem wzrostu. Płytki pokrywano tak, jak opisano powyżej i inkubowano z nierozcieńczonymi supernatantami hybrydom przez 1 godzinę w 37°C. Szalki płukano, a następnie inkubowano ze znakowanym HRP kozi przeciwciałem przeciw ludzkiemu kappa (Southern Biotech) rozcieńczonym 1:10000 lub ze znakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciwko Fc Ig ludzkiej, rozcieńczonym w stosunku 1:30000 w 1% BSA-HBSS przez 1 godzinę w 37°C. Szalki następnie inkubowano z roztworem substratu tak, jak opisano powyżej. Odrzucono klony hybrydom niedające pozytywnego sygnału ani w testach EIA przeciw ludzkim kappa, ani w testach przeciw ludzkim Fc IgG.

Izotypowanie

Oznaczanie izotypu przeciwciał wykonano, wykorzystując EIA w sposób podobny do wykorzystanego do przeszukiwania immunizowanych mysich surowic pod względem specyficznych mian. Płytki EIA pokryto kozim przeciwciałem przeciw ludzkim IgG (H+L) w buforze węglanu sodu w stężeniu 10 pg/ml inkubowano przez noc w 4°C i blokowano jak opisano powyżej. Supernatanty netto z 24-studzienkowych hodowli inkubowano na płytce przez 1 godzinę w RT. Płytkę płukano i inkubowano ze znakowanymi HRP kozimi przeciwciałami przeciw ludzkim IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4 (Binding Site), rozcieńczonymi 1:4000 w 1% BSA-PBS przez jedną godzinę w RT. Płytki następnie płukano i inkubowano z roztworem substratu tak, jak opisano powyżej.

Wyniki i omówienie

Otrzymywanie w pełni ludzkich, monoklonalych przeciwciał przeciw ludzkiemu TNFa

Wykonano jedną fuzję, oznaczoną jako GenTNV, z wykorzystaniem myszy GenPharm immunizowano rekombinowanym białkiem ludzkiego TNFa. Z fuzji tej przeszukano 196 hybryd pozytywnych wzrostowe. Zidentyfikowano osiem linii komórkowych hybrydom wydzielających w pełni ludzkie przeciwciała IgG reagujące z ludzkim TNFa. Każda z tych ośmiu linii komórkowych wydzielała ludzkie przeciwciała izotypu IgGK i wszystkie dwukrotnie subklonowano przez limitujące rozcieńczenia, aby otrzymać stabilne linie komórkowe (>90% homogenności). Linie komórkowe i odpowiednie oznaczenia

PL 206 833 B1 wg kodu C pokazano w Tabeli 1. Każdą z linii zamrożono w 12-fiolkowym, badawczym banku komórkowym przechowywanym w ciekłym azocie.

Komórki rodzicielskie zebrane ze studzienek 24-studzienkowej płytki hodowlanej dla każdej z ośmiu linii komórkowych 18.02.99 przekazano do grupy Molecular Biology do wykonania transfekcji i dalszych badań.

T a b e l a 1: Oznaczenia lini komórkowej GenTNV

Nazwa	Oznaczenie kodem C
GenTNV14.17.12	C414A
GenTNV15.28.11	C415A
GenTNV32.2.16	C416A
GenTNV86.14.34	C417A
GenTNV118.3.36	C418A
GenTNV122.23.2	C419A
GenTNV148.26.12	C420A
GenTNV196.9.1	C421A

Wnioski

Fuzję GenTNV wykonano z wykorzystaniem splenocytów z myszy hybrydowych zawierających transgeny zmiennych i stałych regionów ludzkich przeciwciał, immunizowanych rekombinowanym ludzkim TNFa wytworzonym w firmie Centocor. Otrzymano osiem w pełni ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG, reagujących anty-TNFa, izotypu IgGK. Rodzicielskie linie komórkowe przekazano do grupy Molecular Biology celem dalszych badań i rozwoju. Być może uda się potwierdzić przydatność niektórych z tych nowych przeciwciał w przeciwzapalnym działaniu z potencjalną korzyścią w postaci zmniejszenia immunogenności i powikłań typu alergicznego w porównaniu do Remicade.

Literatura

1. Taylor i wsp., International Immunology 6: 579-591 (1993).

2. Lonberg i wsp., Nature 368: 856-859 (1994).

3. Neuberger, M. Nature Biotechnology 14: 826 (1996).

4. Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996).

5. Scallon i wsp., Cytokine 7: 759-770 (1995).

P r z y k ł a d 3: Klonowanie i przygotowanie linii komórkowych eksprymujących ludzkie przeciwciało anty-TNFa

Streszczenie

Wykazano, że zestaw ośmiu ludzkich, monoklonalnych przeciwciał (mAb), oznaczonych symbolem TNV, wiąże związany ludzki TNFa z wyraźnie wysoką zachłannością. Siedem z ośmiu mAb efektywnie blokuje wiązanie huTNFa z rekombinowanym receptorem TNF. Analiza sekwencji DNA kodującego siedem mAb potwierdziła, że wszystkie te mAb zawierają ludzkie regiony V. Sekwencja DNA wykazała także, że trzy pary mAb były identyczne względem siebie, więc początkowy zestaw ośmiu przeciwciał zawierał tylko cztery różne mAb, reprezentowane przez TNV14, TNV15, TNV148 i TNV196. Na podstawie analizy przewidywanych sekwencji aminokwasowych mAb i wyników neutralizacji TNFa in vitro do dalszych badań wybrano mAb TNV148 i TNV14.

Ponieważ w trakcie przeszukiwania baz danych podstawnika prolinowego z pozycji 75 (zrąb 3) ciężkiego łańcucha TNV148 nie znaleziono w tej pozycji w innych przeciwciałach tej samej grupy, wykonano ukierunkowaną mutagenezę DNA zmieniającą w tej pozycji podstawnik na serynowy w celu otrzymania sekwencji zgodnej ze znanymi sekwencjami zrębowymi z linii komórek płciowych. mAb zmodyfikowane podstawnikiem serynowym oznaczono symbolem TNV148B. DNA powielony w reakcji PCR kodujący regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich TNV148B i TNV14 sklonowano do nowo wytworzonych wektorów ekspresyjnych bazujących na ostatnio sklonowanych genach łańcuchów

PL 206 833 B1 lekkich i ciężkich innego, ludzkiego mAb (12B75), opisanego w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych złożonym 7 października 2000, zatytułowanym „Przeciwciała IL-12, kompozycje, sposoby i zastosowanie.

Komórki P3X63Ag8.653 (653) lub mysie komórki szpiczaka Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) transfekowano odpowiednimi plazmidami ekspresyjnymi łańcuchów lekkich i ciężkich i przeszukano w dwóch rundach subklonowania pod kątem obecności linii komórkowych produkujących duże ilości mAb rekombinowanego TNV148B i TNV14 (rTNV148B i rTNV14). Otrzymane krzywe wzrostowe i stabilność produkcji mAb w czasie wskazują, że klony C466D i C466C transfektantów 653 stabilnie produkują około 125 μg/ml mAb rTNV148B w hodowlach prowadzonych do wyczerpania, natomiast transfektanty Sp2/0 1.73-12-122 (C467A) stabilnie produkują około 25 μg/ml mAb rTNV148B w hodowlach prowadzonych do wyczerpania. Podobna analiza wykazała że klon C476A transfektantów Sp2/0 produkuje 18 μg/ml mAb rTNV14 w hodowlach prowadzonych do wyczerpania.

Wprowadzenie

Poprzednio wykazano, że zestaw ośmiu mAb pochodzących od myszy GenPharm/Medarex (genotyp HCo12/KCo5) immunizowanych ludzkim TNFa wiąże ludzki TNFa i posiada w pełni ludzki izotyp IgG1 kappa. Do wyznaczenia, czy przykładowe mAb według wynalazku wykazują aktywność neutralizującą TNFa wykorzystano prosty test wiązania przez zbadanie ich zdolności do blokowania wiązania TNFa z rekombinowanym receptorem TNF. Na podstawie tych wyników, sekwencji DNA i badania charakterystyki in vitro kilku z mAb wybrano TNV148 jako mAb do dalszych badań.

Sekwencje DNA kodujące TNV148 sklonowano, zmodyfikowano do wprowadzenia do wektorów ekspresyjnych kodujących odpowiednie regiony stałe, wprowadzono do dobrze scharakteryzowanej linii komórkowej 653 i mysich komórek szpiczaka Sp2/0 oraz przeszukano otrzymane transfekowane linie komórkowe w celu identyfikacji subklonów produkujących 40 razy więcej mAb niż wyjściowa linia komórek hybrydoma.

Materiały i Metody

Odczynniki i komórki

Odczynnik TRIZOL zakupiono w Gibco BRL. Proteinazę K otrzymano z Sigma Chemical Company. Z Life Sciences, Inc otrzymano odwrotną transkryptazę, polimerazę DNA Taq otrzymano z Perkin Elmer Cetus lub Gibco BRL. Enzymy restrykcyjne zakupiono w New England Biolabs. QIAquick PCR Purification Kit pochodził z Qiagen. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit zakupiono w Stratagene. Wizard plasmid miniprep kits i RNazyna pochodziły z Promega. Płytki Optiplate nabyto w firmie Packard. ¹²⁵jod zakupiono w Amersham. Oligonukleotydy o własnej sekwencji zakupiono w Keystone/Biosource International. Nazwy, numery identyfikacyjne i sekwencje oligonukleotydów użytych w tej pracy przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1. Oligonukleotydy użyte do klonowania, konstruowania lub sekwencjonowania genów mAb TNV. Aminokwasy kodowane przez oligonukleotydy 5'14 i HuH-J6 pokazano nad sekwencją. Podstawnik aminokwasowy „M określa kodon startu translacji. Podkreślone sekwencje w oligonukleotydach 5'14 i HuH-J6 oznaczają miejsca restrykcyjne, odpowiednio, BsiWI i BstBI. Symbol „/ w HuH-J6 odpowiada stykowi intron/ekson. Uwaga: oligonukleotydy, których sekwencja odpowiada nici minus, zapisano w orientacji 3'-5'.

Nazwa	ID	Sekwencja
1	2	3
HGl-4b	119	3'-TTGGTCCAGTCGGACTGG-5'
HGl-5	354	3'-CACCTGCACTCGGTGCTT-5'
HGlhg	360	3'-CAC 1 G 1 1 1 1 GAGlGlGlACGGGGC IIAAgII -5'
HGl-6	35	3'-GCCGCACGTGTGGAAGGG-5'
HCK1-3E	117	3'-AGTCAAGGTCGGACTGGCTTAAGTT-5'
HuK-3'Hd	208	3'-GTTGTCCCCTCTCACAATCTTCGAATTT-5'
HVKRNAseq	34	3'-GGCGGTAGACTACTCGTC-5'

PL 206 833 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
	BsiWI	| M D W T W S I
5'143	366	5-TTTCGTACGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATC-3'
5'46s	367	5'-TTTCGTACGCCACCATGGGGTTTGGGCTGAGCTG-3'
5'47s	368	5'-TTTCGTACGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCATG-3'
5'63s	369	5'-TTTCGTACGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTC-3'
5'73s	370	5'-TTTCGTACGCCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTC-3'
	T V T V	S S | BstBI
HuH-J6	388	3'-GTGCCAGTGGCAGAGGAGTC/CATTCAAGCTTAAGTT-5'
SalI	M D M R V
LK7s	362	5'-TTTGTCGACACCATGGACATGAGGGTCC(TC)C-3'
LVgs	363	5'-TTTGTCGACACCATGGAAGCCCCAGCTC-3'
	T K V D	I K | Afl2
HuL-J3	380	3'CTGGTTTCACCTATAGTTTG/CATTCAGAATTCGGCGCCTTT
V148-QC1	399	5'-CATCTCCAGAGACAATtCCAAGAACACGCTGTATC-3'
V148-QC2	400	3'-GTAGAGGTCTCTGTTAaGGTTCTTGTGCGACATAG-5'

Otrzymano pojedynczą zamrożoną fiolkę mysich komórek szpiczaka. Tego samego dnia fiolkę rozmrożono i rozsiano w butelkach T w IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminy (pożywka). Komórki utrzymywano w ciągłej hodowli do czasu transfekowania opisanym tutaj DNA anty-TNF, 2-3 tygodnie później. Niektóre z hodowli zebrano 5 dni po dacie rozmrożenia, osadzono przez wirowanie i zawieszono w 95% FBS, 5% DMSO, równo podzielono na 30 fiolek, zamrożono i zachowano do dalszego użytku. Podobnie, otrzymano pojedynczą zamrożoną fiolkę mysich komórek szpiczaka Sp2/0. Fiolkę rozmrożono i przygotowano nową porcję do zamrożenia, tak jak opisano powyżej, a zamrożone fiolki zachowano w zamrażarkach AA i AB w CBC. Komórki te rozmrożono i użyto ich do wszystkich opisanych tutaj transfekcji Sp2/0.

Test hamowania wiązania TNF z receptorem

125

Do testowania zdolności mAb do blokowania wiązania TNFa znakowanego ¹²⁵jodem z rekombinowanym białkiem fuzyjnym receptora TNF p55-sf2 (Scallon i wsp., (1995) Cytokine 7:759-770) wykorzystano supernatanty komórek hybrydom, zawierające mAb TNV. Na Optiplates nałożono 50 μl roztworu 0,5 μg/ml p55-sf2 w PBS, żeby pokryć studzienki w trakcie 1-godzinnej inkubacji w 37°C. Na 96-studzienkowych okrągłodennych płytkach sporządzono seryjne rozcieńczenia ośmiu supernatantów komórkowych TNV z użyciem PBS/0,1% BSA jako rozcieńczalnika. Jako kontroli negatywnej użyto supernatantu komórkowego zawierającego mAb przeciw IL-18, i tego samego supernatantu przeciw IL-18, nasycanego cA2 (chimerowe przeciwciało anty-TNF, Remicade, patent Stanów Zjednoczonych nr 5,770,198) użyto jako kontroli pozytywnej. Do 100 μl supernatantów komórkowych dodano TNFa znakowany jodem (58 pCi/pg, D. Shealy), tak aby otrzymać końcowe stężenie TNFa 5 ng/ml. Mieszaninę poddano wstępnej inkubacji przez 1 godzinę w RT. Pokryte Optiplates przepłukano, żeby usunąć

125 niezwiązane p55-sf2 i nanoszono na Optiplates 50 μl roztworu jod-TNFa/supernatant komórkowy. Po 2 godz. w RT, Optiplates trzykrotnie przemywano PBS-Tween. Dodano 100 μl Microscint-20 i oznaczano związane cpm z użyciem licznika TopCount gamma.

Powielanie genów V i analiza sekwencji DNA

Komórki hybrydom płukano jeden raz PBS, po czym dodawano odczynnik TRIZOL do izolowania RNA. W 1 ml TRIZOL zawieszano od 7x10⁶ do 1,7x10⁷ komórek. Po dodaniu 200 μl chloroformu probówki energicznie wytrząsano. Próbki odwirowywano w 4°C przez 10 minut. Fazę wodną przenoszono do świeżych probówek i dodawano równą objętość izopropanolu. Probówki energicznie wytrząPL 206 833 B1 sano i inkubowano przez 10 minut w RT. Próbki następnie odwirowywano w 4°C przez 10 minut. Próbki płukano jeden raz 70% etanolem i suszono krótko w suszarce próżniowej. Osady RNA zawieszano w 40 pl wody traktowanej DEPC. Jakość preparatów RNA oceniano przez rozdział 0,5 pl w 1% żelu agarozowym. Przed użyciem RNA przechowywano w temperaturze - 80°C.

Do otrzymania cDNA łańcuchów lekkich i ciężkich przygotowano mieszaniny zawierające 3 pl RNA i 1 pg oligonukleotydu 119 (łańcuch ciężki) lub oligonukleotydu 117 (łańcuch lekki) (patrz Tabela 1) w objętości 11,5 pl. Mieszaninę inkubowano przez 10 minut w 70°C w łaźni wodnej i schładzano na lodzie przez 10 minut. Przygotowano oddzielną mieszaninę, zawierającą 2,5 pl 10x buforu dla odwrotnej transkryptazy, 10 pl 2,5 mM dNTP, 1 pl odwrotnej transkryptazy (20 jednostek) i 0,4 pl inhibitora rybonukleaz RNazyny (1 jednostka). 13,5 pl tej mieszaniny dodawano do 11,5 pl schłodzonej mieszaniny RNA/oligonukleotydy i reakcję inkubowano przez 40 minut w 42°C. Reakcję syntezy cDNA przechowywano przed użyciem w zamrażarce w temperaturze -20°C.

Nieoczyszczane cDNA łańcuchów ciężkich i lekkich służyły jako matryce do powielania w reakcji PCR sekwencji kodujących regiony zmienne. Zastosowano jednocześnie pięć par oligonukleotydów (366/354, 367/354, 368/354, 369/354, i 370/354, Tabela 1) do sprawdzenia ich zdolności do zapoczątkowywania reakcji powielania DNA łańcuchów ciężkich. Zastosowano jednocześnie dwie pary oligonukleotydów (362/208 i 363/208) do sprawdzenia ich zdolności do zapoczątkowywania reakcji powielania DNA łańcuchów lekkich. Reakcje PCR przeprowadzono z użyciem 2 jednostek polimerazy Taq PLATINUM^TM o wysokiej wierności (HIFI) w końcowej objętości 50 pl. Każda z reakcji zawierała 2 pl reakcji cDNA, 10 pmoli każdego z oligonukleotydów, 0,2 mM dNTP, 5 pl 10 X buforu HIFI i 2 mM siarczanu magnezu. Program termocyklera wyglądał następująco: 95°C przez 5 minut, następnie 30 cykli (94°C przez 30 sekund, 62°C przez 30 sekund, 68°C przez 1,5 minuty). Kończono inkubacją w temperaturze 68°C przez 10 minut.

Aby przygotować produkty PCR do bezpośredniego sekwencjonowania DNA, oczyszczano je z użyciem QIAquick PCR Purification Kit, zgodnie z przepisem producenta. DNA eluowano z kolumny wirowniczej z użyciem 50 pl sterylnej wody, a następnie zagęszczano do objętości 10 pl w suszarce próżniowej. Na reakcję sekwencjonowania wchodził 1 pl oczyszczonego produktu PCR, 10 pM startera oligonukleotydowego, 4 pl gotowej mieszaniny reakcyjnej BigDye Terminator^TM i 14 pl sterylnej wody w całkowitej objętości 20 pl. Produkty PCR łańcuchów ciężkich otrzymane przy użyciu pary oligonukleotydów 367/354 sekwencjonowano z oligonukleotydowych starterów 159 i 360. Produkty PCR lekkich łańcuchów otrzymane przy użyciu pary oligonukleotydów 363/208 sekwencjonowano z oligonukleotydowych starterów 34 i 163. Program termocyklera do sekwencjonowania to 25 cykli (96°C przez 30 sekund, 50°C przez 15 sekund, 60°C przez 4 minuty) następnie inkubacja w 4°C przez noc. Produkty reakcji rozdzielano w żelu poliakrylamidowym i wykrywano z użyciem sekwenatora ABI 377 DNA Sequencer.

Ukierunkowana mutageneza w celu zamiany aminokwasu

Pojedynczy nukleotyd w sekwencji DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego TNV148 zmieniono tak, aby zmienić Pro⁷⁵ na podstawnik serynowy w mAb TNV148. Zaprojektowano i zamówiono oligonukleotydy komplementarne, 399 i 400 (Tabela 1), żeby wykonać tę zamianę z użyciem unikalnego miejsca klonowania BsiWI tuż powyżej miejsca inicjacji translacji, zgodnie z przepisem producenta. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem p1747. Aby wprowadzić miejsce BstBI na końcu 3' regionu zmiennego, zaprojektowano 5'-końcowy starter oligonukleotydowy z miejscami SalI i BstBI. Startera użyto razem ze starterem odwrotnym pUC, aby powielić fragment 2,75 kb z p1747. Fragment ten z powrotem przeklonowano do występującego naturalnie miejsca SalI w regionie zmiennym 12B75 i do miejsca HindIII, co wprowadziło unikalne miejsce BstBI. Otrzymany wektor przejściowy oznaczony symbolem p1750 może przyjmować fragmenty zmiennych regionów z końcami BsiWI i BstBI. Aby wytworzyć wersję wektora łańcucha ciężkiego, w którym region stały także pochodzi z genu 12B75, wstawkę BamHl-HindIII z p1750 przeniesiono do pBR322, tak aby otrzymać miejsce EcoRl poniżej miejsca HindIII. Otrzymany plazmid p1768 poddano następnie trawieniu HindIII i BcoRI i ligacji do 5,7-kb fragmentu HindIII-BcoRI z p1744, subklonu otrzymanego przez sklonowanie dużego fragmentu SamRl-SamHl z p1560 do pBC. Otrzymany plazmid - p1784 - wykorzystano następnie jako wektor dla fragmentów cDNA mAb TNV z końcami BsiWI i BstBI. Wykonano dodatkową pracę, aby otrzymać wektory ekspresyjne p1788 i p1798 zawierające regiony stałe IgG1 z genu 12B75 i różniące się od siebie tym, jak dużo zawierają z intronu J-C łańcucha ciężkiego 12B75.

Aby zmodyfikować gen łańcucha lekkiego 12B75 na plazmidzie p1558, 5,7-kb fragment Sa//AflII, zawierający promotor i region zmienny 12B75, przeniesiono z p1558 do miejsc XhoI/AflIII plazmidu L28. Ten nowy plazmid p1745 dostarczył mniejszej matrycy dla etapu mutagenezy. Do wpro50

PL 206 833 B1 wadzenia przez mutagenezę QuickChange^TM unikalnego miejsca restrykcyjnego SalI na końcu 5' regionu zmiennego wykorzystano oligonukleotydy (C340sall i C340sal2). Otrzymany wektor pośredni p1746 zawierał unikalne miejsca restrykcyjne SalI i Aflll, do których mogły być wklonowywane fragmenty regionów zmiennych. Dowolny fragment regionów zmiennych wklonowany do p1745 preferencyjnie łączyłby się z połową 3' genu łańcucha lekkiego. Aby wytworzyć fragment restrykcyjny połowy 3' genu 12B75 łańcucha lekkiego, który mógł być do tego użyty, hybrydyzowano ze sobą oligonukleotydy BAHN-1 i BAHN-2 z wytworzeniem dwu niciowego łącznika zawierającego miejsca restrykcyjne BsiWI, Aflll, HindII i Notl, i końce poddano ligacji do miejsc Kpnl i SacI. Łącznik ten sklonowane do wektora pBC z wykorzystaniem miejsc Kpnl i SacI i otrzymano plazmid p1757. Fragment 7,1 kb zawierający region stały łańcucha lekkiego 12B75, uzyskany po strawieniu p1448 Aflll i późniejszym częściowym trawieniu HindIII, wklonowano pomiędzy miejsca Aflll i HindIII p1757 i otrzymano p1762. Ten nowy plazmid zawierał unikalne miejsca BsiWI i Aflll, w które można było przenieść fragment BsiWI/Aflll zawierający promotor i regiony zmienne, łącząc dwie połowy genu.

Klonowanie cDNA i składanie plazmidów ekspresyjnych

Wszystkie reakcje RT-PCR (patrz wyżej) potraktowano enzymem Klenowa, aby wypełnić końce DNA. Fragmenty PCR łańcuchów ciężkich strawiono enzymami restrykcyjnymi BsiWI i BstBI a następnie wklonowano pomiędzy miejsca BsiWI i BstBI plazmidu L28 (L28 użyto, ponieważ jeszcze nie wytworzono opartego na 12B75 wektora przejściowego p1750). Analiza sekwencji DNA sklonowanych wstawek wykazała, że otrzymane konstrukty były poprawne i że w trakcie powielania PCR nie doszło do żadnych błędów. Numery identyfikacyjne przypisane tym konstruktom plazmidu L28 (dla TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B i TNV196) pokazano w Tabeli 2.

Wstawki BsiWI/BstBI dla łańcuchów ciężkich TNV14, TNV148 i TNV148B przeniesiono z wektora L28 do nowo wytworzonego wektora przejściowego p1750. Numery identyfikacyjne przypisane tym przejściowym plazmidom pokazano w Tabeli 2. Ten etap klonowania i następujące po nim etapy nie zostały wykonane dla TNV15 i TNV196. Regiony zmienne przeniesiono następnie do dwóch różnych wektorów ekspresyjnych dla ludzkich IgG1. Do przeniesienia regionów zmiennych do p104, poprzednio używanego przez Centocor wektora IgG1 wykorzystano enzymy restrykcyjne BcoRI i HindIII. Otrzymane plazmidy ekspresyjne, kodujące IgG1 allotypu Gm(f+), oznaczono jako p1781 (TNV14), p1782 (TNV148) i p1783 (TNV148B) (patrz Tabela 2). Regiony zmienne klonowano także powyżej regionu stałego IgG1 pochodzącego z genu 12B75 (GenPharm). Te plazmidy ekspresyjne, kodujące IgG1 allotypu Glm(z), wymieniono także w Tabeli 2.

T a b e l a 2. Numery identyfikacyjne dla szeregu plazmidów zawierających łańcuchy ciężkie i lekkie. Wektor L28 lub wektor pBC odpowiadają początkowemu klonowi cDNA Ab. Wstawki z tych plazmidów przeniesiono do wektora opartego na niepełnym 12B75, aby wytworzyć plazmidy przejściowe. Jeden dodatkowy etap przenoszenia dawał ostateczne plazmidy ekspresyjne, które wprowadzano do komórek po linearyzacji lub stosowano do izolowania wstawek genów mAb przed transfekcją komórek. (ND) = nie wykonano.

mAb	Nr plazmidu pochodnego wektora	Nr plazmidu przejścio-	Nr plazmidu ekspresyj-	Nr plazmidu ekspre-
L28	wego	nego Gm(f+)	syjnego G1m(z)
1	2	3	4	5
Łańcuchy ciężkie
TNV14	p1751	p1777	p1781	p1786
TNV15	p1752	(ND)	(ND)	(ND)
TNV148	p1778	p1782	p1787
p1753
TNV148B	p1779	p1783	p1788
p1760
TNV196	(ND)	(ND)	(ND)
p1754

PL 206 833 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5
Łańcuchy lekkie
TNV14	p1748	p1755	p1775
TNV15	p1748	p1755	p1775
TNV148	p1749	p1756	p1776
TNV196	p1749	p1756	p1776

Produkty PCR łańcuchów lekkich strawiono enzymami restrykcyjnymi SalI i SacII, a następnie wklonowano pomiędzy miejsca SalI i SacII plazmidu pBC. Dwie różne wersje łańcuchów lekkich, różniące się jednym aminokwasem, oznaczono jako p1748 i p1749 (Tabela 2). Analiza sekwencji DNA wykazała, że konstrukty te miały odpowiednią sekwencję. Fragmenty SalI/Aflll z p1748 i p1749 wklonowano pomiędzy miejsca SalI i Aflll wektora przejściowego p1746 i otrzymano odpowiednio p1755 i p1756. Te 5'-połowy genów łańcuchów lekkich połączono z 3'-połowami genu przez przeniesienie fragmentów BsiWI/Aflll odpowiednio z p1755 i p1756 do nowo wytworzonego konstruktu p1762, aby otrzymać końcowe plazmidy ekspresyjne, odpowiednio p1775 i p1776 (Tabela 2).

Transfekcja, przeszukiwanie i subklonowanie komórek

Łącznie wykonano 15 transfekcji mysich komórek szpiczaka różnymi plazmidami ekspresyjnymi TNV (patrz Tabela 3 w części „Wyniki i omówienie). Transfekcje różniły się tym, że (1) komórkami gospodarza były Sp2/0 lub 653; (2) region stały łańcucha ciężkiego kodowany był przez poprzedni wektor IgG1 firmy Centocor lub przez region stały łańcucha ciężkiego 12B75; (3) mAb stanowiły TNV148B, TNV148 i TNV14 lub nowe połączenie HC/LC; (4) DNA było linearyzowanym plazmidem lub izolowanymi wstawkami genów mAb; i (5) obecnością lub brakiem pełnej sekwencji intronu J-C w genie łańcucha ciężkiego. Dodatkowo część transfekcji powtarzano kilkakrotnie, aby zwiększyć prawdopodobieństwo przeszukania dużej liczby klonów.

Komórki Sp2/0 i komórki 653 transfekowano mieszaniną DNA łańcuchów ciężkich i lekkich (8-12 gg każdy) przez elektroporację w warunkach standardowych, jak opisano wcześniej (Knight DM wsp., (1993) Molecular Immunology 30: 1443-1453). Przy transfekcjach o numerach 1, 2, 3 i 16 odpowiednie plazmidy ekspresyjne przed transfekcją linearyzowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Na przykład do linearyzacji plazmidu p1783 łańcucha ciężkiego TNV148B i plazmidu p1776 łańcucha lekkiego użyto, odpowiednio, enzymów restrykcyjnych SalI i Notl. Przy pozostałych transfekcjach oczyszczano z wektora plazmidowego wstawki DNA zawierające jedynie geny mAb, przez trawienie BamHl plazmidów łańcuchów ciężkich i BsiWI i Notl plazmidów łańcuchów lekkich. Wstawki genów mAb oczyszczano następnie przez elektroforezę w żelu agarozowym i żywicą do oczyszczania Qiex. Komórki transfekowane oczyszczonymi wstawkami genów transfekowano jednocześnie 3-5 gg plazmidu pSV2gpt linearyzowanego Pstl (p13), dostarczającego markera selekcyjnego. Po elektroporacji komórki rozsiewano na 96-studzienkowe szalki do hodowli komórkowych w IMDM, 15% FBS, mM glutaminy i inkubowano w 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Dwa dni później dodano równą objętość IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminy, 2 X MHX czynniki selekcyjne (1 X MHX =0,5 gg/ml kwasy mikofenolowego, 2,5 gg/ml hipoksantyna, 50 gg/ml ksantyna) i inkubowano dalej szalki przez dodatkowe 2-3 tygodnie do czasu powstania kolonii.

Supernatanty komórkowe zebrane ze studzienek z koloniami testowano teraz na ludzkie IgG w teście ELISA, tak jak opisano. W skrócie, na 96-studzienkowej płytce EIA pokrytej poliklonalnym, kozim, przeciwciałem przeciwko fragmentowi Fc ludzkiej IgG inkubowano różne rozcieńczenia supernatantów komórkowych, po czym wykrywano związane ludzkie IgG z użyciem skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG(H+L) i odpowiedniego substratu barwnego. Aby umożliwić oznaczenie ilości ludzkiej IgG w supernatantach, dołączono na każdej płytce EIA krzywe standardowe, wykorzystane do standaryzacji oczyszczonego, tego samego mAb, które było oznaczane w supernatantach komórkowych. Komórki z kolonii, produkujących najwięcej ludzkich IgG, przeniesiono na 24-studzienkowe płytki do dalszego określenia produkcji w hodowlach prowadzonych do wyczerpania i następnie zidentyfikowano najbardziej produktywne klony rodzicielskie.

Najbardziej produktywne klony rodzicielskie subklonowano, żeby zidentyfikować jeszcze bardziej produktywne subklony i uzyskać bardziej jednorodną linię komórkową. 96-studzienkowe szalki

PL 206 833 B1 do hodowli tkankowych szczepiono jedną komórką na studzienkę lub czteroma komórkami na studzienkę w IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminy, 1X MHX i inkubowano w 37°C w inkubatorze z 5% przez 12-20 dni do czasu utworzenia kolonii. Ze studzienek zawierających tylko pojedyncze kolonie na studzienkę zebrano supernatanty komórkowe i testowano je w ELISA, tak jak opisano powyżej. Wybrane kolonie przeniesiono na 24-studzienkowe płytki, hodowle prowadzono do wyczerpania, przed identyfikacją najbardziej produktywnych subklonów przez określanie poziomu ludzkich IgG w ich supernatantach. Proces powtórzono, gdy wyselekcjonowane subklony pierwszej rundy poddano drugiej rundzie subklonowania. Do dalszego rozwoju wybrano najlepsze subklony drugiej rundy.

Charakterystyka subklonów komórkowych

Wybrano najlepsze subklony drugiej rundy i wykonano krzywe wzrostowe, aby określić poziom produkcji mAb i charakterystykę wzrostu komórki. Butelki T75 zaszczepiono 1 X 10⁵ komórek/ml w 30 ml IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminy i 1X MHX (lub pożywką bez surowicy). Pobierano porcje po 300 ul co 24 godziny i wyznaczano gęstość żywych komórek. Analizę kontynuowano, aż liczba żywych komórek była niższa niż 1 X 10⁵ komórek/ml. W zebranych porcjach supernatantów komórkowych określano stężenie obecnych w nich przeciwciał. Wykonano testy ELISA z użyciem jako wzorców rTNV148B lub rTNV14 JG92399. Próbki inkubowano przez 1 godzinę na płytkach ELISA pokrytych poliklonalnym, kozim przeciwciałem przeciwko fragmentowi Fc ludzkiej IgG, a następnie związane mAb wykrywano z użyciem skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG(H+L) w rozcieńczeniu 1:1000.

Dla porównania tempa wzrostu w obecności różnej ilości czynników selekcji MHX dla dwóch linii komórkowych przeprowadzono inną analizę krzywych wzrostowych. Linie komórkowe C466A i C466B rozmrożono w pożywce bez MHX (IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminy) i hodowano przez dwa dni. Obie hodowle komórkowe podzielono na trzy hodowle, bez MHX i zawierające 0,2X MHX lub 1X MHX (1 X MHX = 0,5 ug/ml kwasu mikofenolowego, 2,5 ug/ml hipoksantyna, 50 ug/ml ksantyna). Jeden dzień później, świeże butelki T75 szczepiono hodowlami przy początkowej gęstości 1 X 10⁵ komórek/ml i liczono komórki co 24 godziny przez tydzień. Nie pobierano supernatantu do określenia produkcji mAb. Dla tych próbek wyliczono czasy podwojenia z wykorzystaniem wzoru zawartego w SOP PD32.025.

Przeprowadzono dodatkowe badania, żeby określić stabilność produkcji mAb w czasie. Hodowle prowadzono na 24-studzienkowych płytkach w IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminy zarówno z selekcją MHX, jak i bez niej. Gdy tylko hodowle osiągały konfluencję dzielono je i zakładano świeże hodowle, a starsze hodowle prowadzono do wyczerpania, kiedy to pobierano z nich równe objętości supernatantów, które przechowywano w temperaturze 4°C. Pobierano porcje w okresie 55-78 dni. Na koniec tego okresu, w supernatantach sprawdzono ilość obecnych przeciwciał w teście ELISA przeciw Fc ludzkiej IgG, tak jak określono powyżej.

Wyniki i omówienie

Hamowania wiązania TNF z rekombinowanym receptorem

Wykonano prosty test wiązania celem określenia, czy któreś z ośmiu mAb TNV zawartych w supernatantach komórek hybrydom jest zdolne blokować wiązanie TNFa z receptorem.

Najpierw wyznaczono stężenie mAb TNV w odpowiednich supernatantach komórkowych w standardowej analizie ELISA dla ludzkich IgG. Płytki EIA pokryto rekombinowanym białkiem fuzyjnym p55-sf2 receptora TNF i dopuszczano do wiązania TNFa znakowanego ¹²⁵jodem z receptorem p55 w obecności różnych ilości mAb. Jak przedstawiono na Fig. 1, wszystkie poza jednym (TNV122) z ośmiu mAb TNV efektywnie blokowały wiązanie TNFa z receptorem p55. Faktycznie okazało się, że mAb TNV są bardziej efektywne w hamowaniu wiązania TNFa, niż kontrola pozytywna cA2 mAb, którą podano w supernatantach hybrydom, użytych także samych jako kontrola negatywna. Interpretacja wyników wskazywała, że jest wysoce możliwe że mAb TNV będą blokować biologiczną aktywność TNFa w testach komórkowych in vivo i dlatego podjęto dodatkowe analizy.

Analiza sekwencji DNA

Potwierdzenie, że RNA kodują ludzkie mAb

Jako pierwszy krok w poznaniu charakterystyki siedmiu mAb TNV (TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNV 118, TNV148 i TNV196), które wykazały aktywność blokowania TNFa w teście wiązania receptora, wyizolowano RNA całkowite z siedmiu linii komórkowych hybrydom produkujących te mAb. Każda z próbek RNA posłużyła do otrzymania cDNA łańcuchów ciężkich i lekkich ludzkich przeciwciał, zawierających pełną sekwencję sygnałową, kompletną sekwencję regionów zmiennych i część sekwencji regionów stałych dla każdego z mAb. Te produkty cDNA powielono w reakcji PCR i powielone

PL 206 833 B1 przez PCR DNA sekwencjonowano bezpośrednio bez wcześniejszego klonowania fragmentów. Zsekwencjonowane cDNA łańcucha ciężkiego były w >90% identyczne z DP-46, jednym z pięciu ludzkich genów linii płciowej, obecnych w myszach (Fig. 2). Podobnie, zsekwencjonowane cDNA lekkich łańcuchów były w 100% lub 98% identyczne z jednym z ludzkich genów linii płciowej, obecnych w myszach (Fig. 3). Wyniki sekwencjonowania potwierdziły, że cząsteczki RNA transkrybowane na cDNA i zsekwencjonowane kodują łańcuchy ciężkie ludzkiego przeciwciała i łańcuchy lekkie ludzkiego przeciwciała. Trzeba zauważyć, że ponieważ regiony zmienne powielono w PCR z użyciem oligonukleotydów mapujących się w końcu 5' sekwencji sygnałowej sekwencji kodującej, kilka pierwszych aminokwasów sekwencji sygnałowej może nie być w istocie sekwencją pierwotnego produktu translacji TNV ale odpowiada rzeczywistej sekwencji rekombinowanego mAb TNV.

Unikalne, neutralizujące mAb.

Analiza sekwencji cDNA dla całych regionów zmiennych łańcuchów zarówno ciężkich, jak i lekkich wykazała, że TNV32 jest identyczne z TNV15, TNV118 jest identyczne z TNV14, a TNV86 jest identyczne z TNV148. Wyniki testu wiązania receptora pokrywały się z analizą sekwencji DNA, tzn. zarówno TNV86, jak i TNV148 około 4 razy lepiej blokują wiązanie TNF niż TNV118 i TNV14. Następne prace skupiły się jedynie na czterech unikalnych mAb: TNV14, TNV15, TNV148 i TNV196.

Powiązanie czterech mAb

Wyniki sekwencjonowania DNA wykazały, że geny kodujące ciężkie łańcuchy czterech mAb TNV cechowały się wysoką homologią względem siebie i wykazywały, że wszystkie pochodzą od DP46, tego samego genu linii płciowej (Fig. 2). W dodatku, ponieważ sekwencje każdego z ciężkich łańcuchów są tak podobne i tej samej długości i ponieważ wszystkie wykorzystują ekson J6, ewidentnie wywodzą się z pojedynczego zdarzenia rekombinacji genu VDJ, po którym nastąpiły zmiany somatyczne czyniące każde z mAb unikalnym. Analiza sekwencji DNA wykazała, że wśród czterech mAb były tylko dwa różne geny lekkich łańcuchów (Fig. 3). Sekwencje kodujące regiony zmienne lekkich łańcuchów w TNV14 i TNV15 są identyczne względem siebie i odpowiedniej sekwencji linii płciowej rodziny Vg/38K ludzkich łańcuchów kappa. Sekwencje kodujące lekkie łańcuchy TNV148 i TNV196 są identyczne względem siebie a od odpowiedniej sekwencji linii płciowej różnią się w dwóch pozycjach nukleotydowych (Fig. 3).

Przewidywane sekwencje aminokwasowe czterech mAb wykazują powiązania rzeczywistych mAb. Cztery mAb zawierają cztery różne ciężkie łańcuchy (Fig. 4), ale jedynie dwa różne łańcuchy lekkie (Fig. 5). Różnice pomiędzy sekwencjami mAb TNV a sekwencjami linii płciowej znaleziono głównie w domenach CDR, ale trzy z ciężkich łańcuchów mAb także różnią się od sekwencji linii płciowej w regionach zrębowych (Fig. 4). W porównaniu z regionami zrębowymi DP-4 6 Ab kodowanego w linii płciowej, TNV14 było identyczne, TNV15 różniło się jednym aminokwasem, TNV148 różniło się dwoma aminokwasami, a TNV196 różniło się trzema aminokwasami. Klonowanie cDNA, ukierunkowana mutageneza, składanie ostatecznych plazmidów ekspresyjnych

Klonowanie cDNA

Dla potrzeb przystosowania sekwencji kodującej do wklonowania do wektora ekspresyjnego, na podstawie sekwencji DNA powielonych w PCR regionów zmiennych, zamówiono nowe oligonukleotydy, aby przeprowadzić następną rundę powielania w PCR. W przypadku łańcuchów ciężkich produkty tej nowej rundy PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi BsiWI i BstBI i wklonowano do wektora plazmidowego L28 (numery identyfikacyjne plazmidów pokazano w Tabeli 2). W przypadku łańcuchów lekkich produkty drugiej rundy PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi SalI i Aflll i wklonowano do wektora plazmidowego pBC. Następnie zsekwencjonowano pojedyncze klony, aby potwierdzić, że ich sekwencja jest tożsama z sekwencją wcześniej otrzymaną w bezpośrednim sekwencjonowaniu produktów PCR, co pozwoliło ustalić najczęściej występujące nukleotydy w każdej z pozycji w potencjalnie heterogenicznej populacji cząsteczek.

Ukierunkowana mutageneza zmieniająca TNV148

Zauważono, że zarówno mAb TNV148, jak i TNV196 są czterokrotnie bardziej zdolne niż najlepsze z pozostałych mAb (TNV14) do znoszenia aktywności biologicznej TNFa. Jednak, jak opisano powyżej, sekwencje zrębowe łańcuchów ciężkich TNV148 i TNV196 różnią się od sekwencji zrębowej linii komórek płciowych. Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego TNV148 do innych ludzkich przeciwciał wskazuje, że szereg innych ludzkich przeciwciał zawiera podstawnik Ile w pozycji 28 regionu zrębowego 1 (licząc jedynie sekwencje dojrzałe), podczas gdy podstawnik Pro w pozycji 75 regionu zrębowego 3 był dla tej pozycji aminokwasem nietypowym.

PL 206 833 B1

Podobne porównanie łańcucha ciężkiego TNV196 sugerowało, że trzy aminokwasy, które go różnią od sekwencji linii płciowej w zrębie 3, mogą rzadko występować w ludzkich mAb. Możliwe, że te różnice mogą wywoływać immunogenność TNV148 i TNV196 po podaniu człowiekowi. Ponieważ TNV148 ma tylko jeden rozważany podstawnik aminokwasowy i uznano, że ten podstawnik nie ma znaczenia w wiązaniu TNFa, wykorzystano technikę ukierunkowanej mutagenezy, aby zamienić pojedynczy nukleotyd w sekwencji kodującej łańcucha ciężkiego TNV148 (na plazmidzie p1753) tak, że zamiast podstawnika Pro w pozycji 75 kodowany będzie podstawnik Ser z linii płciowej. Otrzymany plazmid określono jako p1760 (patrz Tabela 1). Otrzymany gen i mAb oznaczono TNV148B, aby odróżnić je od pierwotnego genu i mAb TNV148 (patrz Fig. 5).

Składanie ostatecznych plazmidów ekspresyjnych

Wytworzono nowe wektory ekspresyjne przeciwciał oparte na genach łańcuchów ciężkich i lekkich 12B75, poprzednio sklonowanych jako fragmenty genomowe. Pomimo, że wytworzono różne plazmidy ekspresyjne TNV (patrz Tabela 2), w każdym przypadku sekwencje flankujące 5', promotor i wzmacniacz intronowy pochodziły z odpowiednich genów 12B75. W plazmidach ekspresyjnych łańcuchów lekkich, cały intron J-C, sekwencja kodująca region stały i sekwencja flankująca 3' także pochodziły z genu łańcucha lekkiego 12B75. W plazmidach ekspresyjnych łańcuchów ciężkich, ostatecznie użytych w produkcyjnych liniach komórkowych (p1781 i p1783, patrz niżej), sekwencja kodująca region stały ludzkiej IgG1 pochodziła z poprzednio wykorzystanego przez Centocor wektora ekspresyjnego (p104). Co istotne, opisywane tutaj ostateczne, produkcyjne linie komórkowe wykazują ekspresję mAb TNV innego allotypu (Gm(f+)) niż pochodzące pierwotnie z hybrydom mAb TNV (G1m(z)). Jest to spowodowane tym, że gen łańcucha ciężkiego 12B75 pochodzący z myszy GenPharm koduje podstawnik Arg w końcu C domeny CH1, podczas gdy wektor ekspresyjny IgG1 firmy Centocor p104 koduje w tej pozycji podstawnik Lys. Wytworzono inne plazmidy ekspresyjne łańcuchów ciężkich, np. p1786 i p1788, w których intron J-C, sekwencja kodująca cały region stały i sekwencja flankująca 3' pochodzą z genu łańcucha ciężkiego 12B75, przy czym linie komórkowe transfekowane tymi genami nie były wyselekcjonowane jako komórkowe linie produkcyjne. Wektory zostały uważnie zaprojektowane tak, aby umożliwić jednoetapowe klonowanie przyszłych powielanych w PCR regionów V z wytworzeniem ostatecznego plazmidu ekspresyjnego.

Powielone w PCR cDNA regionów zmiennych przeniesiono z wektorów L28 lub pBC na oparte o 12B75 wektory etapu przejściowego, dostarczające regionu promotorowego i część intronu J-C (numery identyfikacyjne plazmidów patrz Tabela 2). Aby wytworzyć ostateczne plazmidy ekspresyjne, fragmenty restrykcyjne zawierające końce 5' genów przeciwciał przenoszono następnie z wektorów etapu przejściowego na ostateczne wektory ekspresyjne dostarczające końców 3' odpowiednich genów (numery identyfikacyjne plazmidów - patrz Tabela 2).

Transfekcja i subklonowanie komórek

Plazmidy ekspresyjne linearyzowano przez trawienie restrykcyjne lub oczyszczano wstawki genów przeciwciał od reszty plazmidu. Mysie komórki szpiczaka 653 i Sp2/0 transfekowano DNA łańcucha ciężkiego i lekkiego przez elektroporację. Wykonano piętnaście różnych transfekcji, większość z nich była niepowtarzalna pod względem Ab, specyficznej charakterystyki genów Ab, pod względem tego, czy geny znajdowały się na całych linearyzowanych plazmidach, czy na oczyszczanych wstawkach, i rodzaju komórek gospodarza (podsumowanie w Tabeli 3). Supernatanty komórkowe z klonów opornych na kwas mikofenolowy testowano na obecność ludzkich IgG w ELISA i oznaczano z użyciem oczyszczonego rTNV148B jako standardowej krzywej odniesienia.

Linie komórkowe produkujące najwięcej rTNV148B

Dziesięć z najbardziej produktywnych linii rodzicielskich 653 transfekcji 2 rTNV148B (produkujących 5-10 pg/ml w 24-studzienkowych hodowlach prowadzonych do wyczerpania) poddano subklonowaniu, aby uzyskać jeszcze bardziej produktywne linie komórkowe i aby wytworzyć jednorodną populację komórek. Dwa subklony linii rodzicielskiej, 2.320, 2.320-17 i 2.320-20, produkowały około 50 pg/ml w 24-studzienkowych hodowlach prowadzonych do wyczerpania, co oznaczało 5-krotny wzrost wobec ich linii rodzicielskiej. Druga runda subklonowania linii subklonów 2.320-17 i 2.320-20 doprowadziła do następujących wyników:

PL 206 833 B1

T a b e l a 3. Podsumowanie transfekcji komórek. Pokazano numery identyfikacyjne plazmidów ciężkich i lekkich łańcuchów kodujących poszczególne mAb. W przypadku transfekcji wykonanej oczyszczoną wstawką z genem mAb, jako źródło markera selekcyjnego gpt wykorzystano plazmid p13 (pSV2gpt). Regiony stałe łańcuchów ciężkich kodowane były przez ten sam wektor ekspresyjny IgG1 kodujący Remicade („stary) lub przez regiony stałe zawarte w genie łańcucha ciężkiego 12B75 (GenPharm/Medarex) („nowy). H1/L2 odnosi się do nowego mAb składającego się z łańcucha ciężkiego TNV14 i łańcucha lekkiego TNV148. Plazmid p1783 i p1801 różnią się jedynie tym, jak dużą część intonu J-C zawierają zawarte na nich geny łańcuchów ciężkich. Numery transfekcji definiują pierwszy numer nazw rodzajowych klonów komórkowych i są pokazane na prawo. Linie komórkowe C466 (A, B, C, D) i C467A produkujące tutaj opisane rTNV148B, wywodzą się odpowiednio z transfekcji o numerze 2 i 1. Linie komórkowe C476A produkujące rTNV14 wywodzą się z transfekcji o numerze 3.

	Plazmidy	Wektor	Postać	Nr transfekcji
mAb	HC/LC/gpt	HC	DNA	Sp2/0		653
rTNV148B	1783/1776	stary	liniowy	1		2
rTNV14	1781/1775	stary	liniowy	3		-
rTNV14	3.27-1	C476A	Sp2/0	19 pg/ml

Charakterystyka subklonowanych linii komórkowych

Aby dokładniej scharakteryzować wzrost linii komórkowych i oznaczyć poziom produkcji mAb na większą skalę, przeprowadzono analizy krzywych wzrostowych dla hodowli prowadzonych w butelkach T75. Wyniki wykazały, że każda z czterech serii C466 linii komórkowych osiągała szczytową gęstość komórek pomiędzy 1,0 X 10⁶ a 1,25 X 10⁶ komórek/ml i maksymalny poziom akumulacji mAb pomiędzy 110 a 140 μg/ml (Fig. 7). Dla odmiany, najbardziej produktywny subklon Sp2/0 C467A osiągał szczytową gęstość komórek 2 X 10⁶ komórek/ml i maksymalny poziom akumulacji mAb 25 μg/ml (Fig. 7). Analizy krzywych wzrostowych nie przeprowadzono dla linii komórkowej wytwarzającej rTNV14 C476A.

Przeprowadzono dodatkową analizę krzywych wzrostowych, aby porównać tempo wzrostu przy różnym stężeniu selekcji MHX. Porównanie to poprzedzone zostało wcześniejszą obserwacją komórek C466 hodowanych przy braku MHX, których wzrost wydawał się szybszy niż tych samych komórek hodowanych przy normalnym stężeniu MHX (1X).

Aby dokonywać pomiarów w zakresie rzędów wielkości rozważono, czy możliwe jest, że zastosowanie niższego stężenia MHX mogłoby powodować znaczące skrócenie czasu podwajania komórek bez istotnego zachwiania stabilności produkcji mAb. Linie komórkowe C466A i C466B hodowano zarówno bez MHX jak i z 0,2X MHX lub 1X MHX. Żywe komórki zliczano co 24 godzimy przez 7 dni. Wyniki wykazały zależność tempa wzrostu komórek od stężenia MHX (Fig. 8). Linia komórkowa C466A wykazała czas podwajania 25 godzin przy 1X MHX, przy czym tylko 20,7 godziny bez MHX. Podobnie, linia komórkowa C466B, wykazała czas podwajania 32,4 godziny przy 1X MHX, przy czym tylko 22,9 godziny bez MHX. Co ważne, czasy podwajania obu linii komórkowych były bardziej zbliżone przy 0,2X MHX do tego, co obserwowano bez MHX niż przy 1X MHX (Fig. 8). Obserwacje umożliwiają osiągnięcie zwiększonej wydajności bioreaktorów przy niższym stężeniu MHX, dla których czas podwajania jest ważnym parametrem. Pomimo że wyniki testów stabilności (patrz niżej) sugerują, że linia komórkowa C466D jest zdolna stabilnie produkować rTNV148B przez przynajmniej 60 dni nawet przy braku MHX, wyniki testów stabilności wykazały wyższy poziom produkcji mAb, gdy komórki hodowano w obecności MHX niż przy braku MHX.

Aby oszacować produkcję mAb w różnych liniach komórkowych przez okres około 60 dni, wykonano testy stabilności dla hodowli, które zawierały selekcję MHX lub jej nie zawierały. Nie wszystkie z linii komórkowych utrzymywały wysoką produkcję mAb. Po zaledwie 2 tygodniach hodowli, klon C466A produkował około 45% mniej niż na początku badania. Klon C466B także wykazywał znaczący spadek produkcji. Klony C466C i C466D utrzymywały jednak dość stabilną produkcję, przy czym C466D wykazywał najwyższy absolutny poziom produkcji (Fig. 9).

PL 206 833 B1

Wnioski

Z początkowego zestawu ośmiu ludzkich mAb przeciw ludzkiemu TNFa wybrano jako najlepsze zarówno TNV148B, jak i TNV14, na podstawie szeregu kryteriów, m.in. na podstawie sekwencji białka i możliwości neutralizujących TNF. Otrzymano linie komórkowe produkujące ponad 100 pg/ml rTNV148B i ponad 19 pg/ml rTNV14.

P r z y k ł a d 4: Badania myszy z zapaleniem stawów z wykorzystaniem przeciwciał anty-TNF i kontroli, z podawaniem pojedynczych wstrzyknięć dużej dawki

Myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni zakwalifikowano, na podstawie płci i masy ciała, do jednej z 9 grup leczenia i leczono pojedynczymi, dootrzewnowymi wstrzyknięciami dużej dawki Dulbecco PBS (D-PBS) lub przeciwciał anty-TNF według wynalazku (TNV14, TNV148 lub TNV196) w dawce 1 mg/kg lub 10 mg/kg.

Wyniki: Analizowano masę ciała jako zmianę od czasu sprzed podania dawki; zwierzęta otrzymujące 10 mg/kg cA2 wykazywały konsekwentnie wyższy przyrost masy niż zwierzęta otrzymujące w trakcie badań D-PBS. Ten przyrost masy ciała był znaczący w tygodniach 3-7. Zwierzęta leczone 10 mg/kg TNV148 także osiągnęły znaczący przyrost masy ciała w 7 tygodniu badań (patrz Fig. 10).

Fig. 11A-C przedstawiają postęp zaawansowania choroby na podstawie wskaźnika zapalenia stawów. Wskaźnik zapalenia stawów grupy otrzymującej 10 mg/kg cA2 był niższy niż grupy kontrolnej D-PBS, od 3 tygodnia z kontynuacją przez pozostały czas badania (tydzień 7). Zwierzęta leczone 1 mg/kg TNV14 i zwierzęta leczone 1 mg/kg cA2 nie wykazywały znaczącego zmniejszenia Al po 3 tygodniach w porównaniu do grupy kontrolnej otrzymującej D-PBS. Nie było znaczących różnic pomiędzy grupami otrzymującymi 10 mg/kg, gdy porównywano je do innych o podobnej dawce (10 mg/kg cA2 w porównaniu z 10 mg/kg TNV14, 148 i 196). Gdy porównano grupy leczone dawkami 1 mg/kg, grupa leczona 1 mg/kg TNV148 wykazała znacząco niższy Al niż grupa leczona 1 mg/kg cA2 w tygodniu 3, 4 i 7. Grupa leczona 1 mg/kg TNV148 wykazała także znacząco niższy Al niż grupa leczona 1 mg/kg TNV14 w tygodniu 3 i 4. Ponieważ grupa leczona TNV196 wykazywała znaczące obniżenie Al do tygodnia 6 badań (w porównaniu do grupy otrzymującej D-PBS), leczenie TNV148 było jedynym leczeniem dawką 1 mg/kg, które dawało znaczące wyniki na koniec badań.

P r z y k ł a d 5: Badania myszy z zapaleniem stawów z wykorzystaniem przeciwciał anty-TNF i kontroli, z wielokrotnym podawaniem wstrzyknięć

Myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni zakwalifikowano, na podstawie masy ciała, do jednej z 8 grup leczenia i leczono dootrzewnowymi wstrzyknięciami pojedynczej dużej dawki preparatu kontrolnego (D-PBS) lub przeciwciał (TNV14, TNV148) po 3 mg/kg (tydzień 0). Wstrzyknięcia powtórzono wszystkim zwierzętom w tygodniach 1, 2, 3 i 4. W grupach 1-6 oceniano skuteczność testowanego preparatu. W próbkach surowicy uzyskanych ze zwierząt grup 7 i 8 oceniano indukcję odpowiedzi immunologicznej i eliminację farmakokinetyczną TNV14 lub TNV148 w tygodniach 2, 3 i 4.

Wyniki: Nie zauważono znaczących różnic w masie określanej jako zmiana od czasu sprzed podania dawki. Zwierzęta leczone 10 mg/kg cA2 wykazywały konsekwentnie większy przyrost masy niż zwierzęta otrzymujące w trakcie badań D-PBS (patrz Fig. 12).

Fig. 13A-C przedstawiają postęp zaawansowania choroby na podstawie wskaźnika zapalenia stawów. Wskaźnik zapalenia stawów grupy leczonej 10 mg/kg cA2 był znacząco niższy niż grupy kontrolnej d-PBS, od 2 tygodnia z kontynuacją przez pozostały czas badania (tydzień 5). Zwierzęta leczone 1 mg/kg lub 3 mg/kg cA2 i zwierzęta leczone 3 mg/kg TNV14 nie wykazywały w żadnym momencie badania znaczącego obniżenia Al w porównaniu do grupy kontrolnej otrzymującej d-PBS. Zwierzęta leczone 3 mg/kg TNV148 wykazywały znaczące obniżenie Al w porównaniu do grupy otrzymującej D-PBS, od tygodnia 2 do tygodnia 5. Zwierzęta leczone 10 mg/kg cA2 wykazywały znaczące obniżenie Al w porównaniu do leczonych obydwoma niższymi dawkami (1 mg/kg i 3 mg/kg) cA2 w tygodniu 4 i 5 badań, a także wykazywały znaczące obniżenie Al w porównaniu do zwierząt leczonych TNV14 w tygodniach 3-5. Pomimo że nie wykazano znaczących różnic pomiędzy grupami leczonymi dawką 3 mg/kg, Al dla zwierząt leczonych 3 mg/kg TNV14 był znacząco wyższy w niektórych punktach czasowych niż grupy leczonej 10 mg/kg, podczas gdy u zwierząt leczonych TNV148 nie było znaczących różnic w stosunku do zwierząt leczonych 10 mg/kg cA2.

P r z y k ł a d 6: Badania myszy z zapaleniem stawów z wykorzystaniem przeciwciał anty-TNF i kontroli, z podawaniem pojedynczych dawek przez wstrzyknięcie dootrzewnowe

Myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni zakwalifikowano, na podstawie płci i masy ciała, do jednej z 6 grup leczenia i leczono pojedynczymi, dootrzewnowymi wstrzyknięciami przeciwciał (cA2 lub

PL 206 833 B1

TNV148) w dawce 3 mg/kg lub 5 mg/kg. W badaniu wykorzystano grupy kontrolne, którym podawano D-PBS lub 10 mg/kg cA2.

Analizowano masę jako zmianę od czasu sprzed podania dawki, we wszystkich grupach terapeutycznych osiągnięto zbliżony przyrost masy. Zwierzęta leczone 3 mg/kg lub 5 mg/kg cA2 osiągnęły znaczącą masę wcześnie w trakcie badania (tydzień 2 i 3). Jedynie zwierzęta leczone TNV148 utrzymywały znaczący przyrost masy ciała w późniejszych punktach czasowych. Zarówno zwierzęta leczone dawką 3 mg/kg, jak i 5 mg/kg TNV148 wykazały znaczące wyniki w tygodniu 7, a u zwierząt leczonych 3 mg/kg TNV148 stwierdzano przez cały czas po wstrzyknięciu znaczące zwiększenie masy ciała (patrz Fig. 14).

Fig. 15 przedstawia postęp nasilenia choroby na podstawie wskaźnika zapalenia stawów. Wszystkie grupy terapeutyczne wykazują pewną ochronę we wcześniejszych punktach czasowych, przy czym grupy leczone 5 mg/kg cA2 i 5 mg/kg TNV148 wykazują znaczące obniżenie Al w tygodniach 1-3 i wszystkie grupy terapeutyczne wykazują znaczącą redukcję Al w tygodniu 2. W późniejszym okresie badania, zwierzęta leczone 5 mg/kg cA2 wykazały pewną ochronę przy znaczącej redukcji Al w tygodniach 4, 6 i 7. Grupy leczone niską dawką (3 mg/kg), zarówno cA2 jak i TNV148, wykazują znaczące obniżenie Al w tygodniu 6, a wszystkie grupy terapeutyczne wykazują znaczące obniżenie Al w tygodniu 7. Żadna z badanych grup nie była zdolna utrzymać znaczącego obniżenia Al na koniec badania (tydzień 8). Nie zauważono żadnych znaczących różnic pomiędzy poszczególnymi grupami terapeutycznymi (z wyłączeniem grupy kontrolnej, której podawano sól fizjologiczną) w każdym z punktów czasowych.

P r z y k ł a d 7: Badania myszy z zapaleniem stawów z wykorzystaniem przeciwciał anty-TNF i kontroli z podawaniem pojedynczych dawek przez wstrzyknięcie dootrzewnowe, różnice w leczeniu przeciwciałem anty-TNF a zmodyfikowanym przeciwciałem anty-TNF

Badania przeprowadzono, aby porównać skuteczność pojedynczej, dootrzewnowej dawki TNV148 (pochodzących z komórek hybrydom) i rTNV148B (pochodzących z komórek transfekowanych). Myszy Tg197 w wieku około 4 tygodni zakwalifikowano, na podstawie płci i masy ciała, do jednej z 9 grup leczenia i leczono pojedynczymi, dootrzewnowymi wstrzyknięciami dawki PBS Dulbecco (D-PBS) lub przeciwciała (TNV148, rTNV148B) po 1 mg/kg.

Analizowano masy jako zmianę od czasu sprzed podania dawki; zwierzęta leczone 10 mg/kg cA2 wykazywały konsekwentnie większy przyrost masy niż zwierzęta otrzymujące w trakcie badań D-PBS. Ten przyrost masy ciała był znaczący w tygodniu 1 i w tygodniach 3-8. Zwierzęta leczone 1 mg/kg TNV148 także osiągnęły znaczący przyrost masy ciała w 5, 6 i 8 tygodniu badań (patrz Fig. 16).

Fig. 17 przedstawia postęp nasilenia choroby na podstawie wskaźnika zapalenia stawów. Wskaźnik zapalenia stawów grupy leczonej 10 mg/kg cA2 był niższy niż grupy kontrolnej D-PBS, od 4 tygodnia z kontynuacją przez pozostały czas badania (tydzień 8). Zarówno zwierzęta leczone TNV14, jak i zwierzęta leczone 1 mg/kg cA2 wykazywały znaczące zmniejszenie Al w 4 tygodniu. Jakkolwiek poprzednie badania (P-099-017) wykazały, że TNV148 był nieznacznie bardziej skuteczny w obniżaniu wskaźnika zapalenia stawów, gdy podawano go w ilości 1 mg/kg w pojedynczym wstrzyknięciu dootrzewnowym, obecne badania wykazują, że Al jest nieznacznie wyższy w grupach leczonych obiema wersjami przeciwciała TNV. Pomimo, że (z wyjątkiem tygodnia 6) grupa leczona 1 mg/kg cA2 nie wykazywała znaczącego zwiększenia Al w porównaniu do grupy leczonej 10 mg/kg cA2, a grupy leczone TNV wykazywały znaczące zwiększenie Al w tygodniach 7 i 8, nie było znaczących różnic w poziomie Al pomiędzy grupami leczonymi 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148 i 1 mg/kg TNV148B, w dowolnym punkcie czasowym badania.

Jest jasne, że wynalazek może być wykorzystany w sposób inny niż opisany w przedstawionych opisach i przykładach.

W świetle powyższych technik możliwych jest wiele modyfikacji i wariantów obecnego wynalazku, które pozostają w zakresie dołączonych zastrzeżeń.

PL 206 833 B1

Lista sekwencji <110? Giles-Komar, Jill;

David Shealy;

David Knight?

Bernie Scallon;

George Heavner

Przeciwciało, izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, rekombinowany wektor.

<120? komórka gospodarza, kompozycja, przeciwciało i kompozycja do zastosowania w diagnostyce lub terapii <130? CEN250 <160? 1S <170? Patentln Ver 2.0 <210?

<211?

<212? PRT <213? Homo sapiens <400? 1

Arg Tyr Thr Met His 5 <210?

<211?

<212?

PRT <213? Homo sapiens <400? 2

Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 , 10 15 <210? 3 <211? 17 <212? PRT <213? Homo sapiens <400? 3

Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210? 4 <211? 11 <212? PRT <213? Homo sapiens <400? 4

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 15 10 <210?

<211?

<212? PRT <213? Homo sapiens <400? 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210? 6

PL 206 833 B1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Sin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 15 10 <210> 7 «211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Vał

35

40

45

Ala

Val

He

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

30

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Αερ

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

05

90

95

Ala

Arg

Asp

Arg

Sly

Ile

Ser

Al a

Gly

Gly

Asn

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

100 105 110

Met Asp Val 115 <210> 0 , <211> 109 ' <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Sly 1 5 10 ‘ 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr

PL 206 833 B1

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Tle 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 50

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

70 75 BO

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro

30 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 15 10 15

Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu 35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe 50 55 60

Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

70 75 BO

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

B5 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys 115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140

PL 206 833 B1

Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 agatatacta tgcac <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gttatatcat ttgatggaag caataaatac tacgtagact ccgtgaaggg c 51 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gaggcccggg gatcgtatgc ttttgatatc 30 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cc <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gatgcatcca acagggcc <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cagcagcgta gcaactggcc t

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przeciwciało zawierające:

   - regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego i zmienne regiony zrębowe (FR) przeciwciała mAb TNV148 jak opisano na Fig. 4; oraz

   - regiony CDR łańcucha lekkiego i zmienne regiony FR przeciwciała mAb TNV148 jako opisano na Fig. 5;

   - ewentualnie zawierające ponadto specyficzną substytucję proliny seryną w regionie FR3 przeciwciała mAb TNV148B jak opisano na Fig. 4.

   PL 206 833 B1
2. 2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego jednego z przeciwciał mAb TNV148 i mAb TNV148B jak opisano na Fig. 4 i 5.
3. 3. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd kodujący przeciwciało jak określono w zastrz. 1 lub 2.
4. 4. Rekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 3.
5. 5. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 3 albo wektor jak określono w zastrz. 4.
6. 6. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera przeciwciało jak określono w zastrz. 1 lub 2 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.
7. 7. Przeciwciało jak określono w zastrz. 1 lub 2 albo kompozycja jak określono w zastrz. 6 do zastosowania w diagnostyce lub terapii.
8. 8. Przeciwciało lub kompozycja według zastrz. 7 do zastosowania w leczeniu choroby związanej z układem immunologicznym.

   Rysunki

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   Stężenie mAb (mikrog/ml) Steżenie mAb (mikroa/ml)

   Liczba komórek (miliony/ml) Liczba komórek (miliony/ml)

   PL 206 833 B1

   C466A C466B

   Fig. 8

   PL 206 833 B1

   C466C mikrog/ml Ab mikrog/ml Ab

   C466D

   Fig. 9

   PL 206 833 B1

   Fig. 10

   D-PBS cA2-l mg/kg cA2-10 mg/kg

   INY 14-1 mg/kg

   INVI4-10 mg/kg

   ΊΝΥ148-1 mg/kg

   TNYl48-10 mg/kg

   ΤΝΥΊ96-1 mg/kg

   TNV 196-10 mg/kg

   Figurę 1

   Tygodnie lO-i

   Masa ciała

   Zmiany od wartości wyjściowych

   PL 206 833 B1

   Tygodnie

   Wskaźnik stanu zapalnego stawów

   CT D-PĘS (gr.#l)

   E323cA2-l mg/kg (gr. #2)

   BOT TN VI4-1 tng/kg(gr.#4) Fu3STNV14S*l mg/kg (grJfó) b==ITNVl 96-1 mg/kg fgr.#S) ΟΠΠ cA2-10 mg/kg (gr.#3) ssssa TNV14-10 mg/kg (gr.# 5) TNVl 48-10 mg/kg (gr#7) 3EBTNV 196- 10 mg/kg (gr. #9) * Oznacza grupy z wartościami nie obniżonymi znacząco w stosunku do grupy D-PBS

   Wyniki dia wszystkich nie zaznaczonyh grup są znaczące (< 0,050) dJ D-PBS (gr,#l)

   GOT) c A2-1 mg/kg (gr. #2) BE8STNVI4-l mg/kg (gr. #4) Ł523TNVI48-I ingAg(gr.jHt) ΙΞΞΤΚν 196-1 mg/kg tgr.#S) * znaczące (p< 0,05) w porównaniu do soli fizjologicznej f znacząco podniesione wartości w porównani do TNV 148 α D-PBS (gr.#l) □UD cA2-l 0 mg/kg ESSSS TNY14-10 mg/kg (gr# 5) EZZ3 TNV148-10 mg/kg (gr.#7) BBEINY196- 10 mg/kg <gr. #9) • Oznacza grupy z wartościami nie obniżonymi znacząco w stosunku do grupy D-PBS

   Wyniki dla wszystkich nie zaznaczonyh grup są znaczące (< 0,050)

   Wskaźnik stanu zapalnego stawów

   Figurę 3

   Tygodnie

   Fig

   15'

   Wskaźnik stanu zapalnego stawów

   15η

   Figurę 4

   Tygodnie

   Fig. 11 C

   Fig. 11 A

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   PL 206 833 B1

   Średnia dla grupy Średnia dla grupy (g)

   Tygodnie

   Fig. 14 + D-PBS <-· 10 mg/kg cA2 —O— 3 mg/kg cA2 -Δ- 5 mg/kg cA2 -’Ρ- 3 mg/kg INV148 -O- 5 mg/kg INV148 * p<0.05 W porównaniu do grupy D-PBS

   Figurę 1

   ΠΖΣ3 D-PBS ESS33 5 mg/kg c A2 SE 5 mg/kg TNV148 SE 3 mg/kg c A2 E223 3 mg/kg TNV148 ψ w porównaniu do grupy D-PBS

   Figurę 2

   PL 206 833 B1

   Zmiana masy ciała

   Tygodnie

   Średnia dla grupy Średnia dla grupy (gramy)

   - D-PBS ♦—cA2-1 Omg/kg fc—cA2-1 mg/kg f-TNV1 48-1 mg/kg ►- rTNV 148B-1 mg/kg *pznacza wartość p < 0,05 w porównianiu z D-PBS

   Figurę 1

   Fig. 16

   Fig. 17

   D-PBS ΠΞΠΠ3 cA2-1 Omg/kg ES5B8 cA2-1 mg/kg TNV148-1 mg/kg BrTNV148B-1 mg/kg

   *. oznacza wartość p <0,06 w porównaniu z D-PBS

   Figurę 2

   PL 206 833 B1

   Departament Wydawnictw UP RP