RS50858B - Anti-tnf antitela, kompozicije, metode i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-tnf antitela, kompozicije, metode i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS50858B
RS50858B YUP-91/03A YUP9103A RS50858B RS 50858 B RS50858 B RS 50858B YU P9103 A YUP9103 A YU P9103A RS 50858 B RS50858 B RS 50858B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
tnf
human
antibodies
tnv
Prior art date
Application number
YUP-91/03A
Other languages
English (en)
Inventor
Jill Giles-Komar
David M. Knight
George Heavner
Bernard Scallon
David Shealy
Original Assignee
Centocor Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40673117&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50858(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centocor Inc. filed Critical Centocor Inc.
Publication of YU9103A publication Critical patent/YU9103A/sh
Publication of RS50858B publication Critical patent/RS50858B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Antitelo koje sadržiregione koji određuju komplementarnost (CDRs) teškog lanca i promenjive 'framework' regione (FRs) mAb TNV148 kao stoje prikazano na slici 4; iCDRs lakog lanca i promenjive FRs mAb TNV148 kao stoje prikazano na slici 5;opciono još sadrži specifičnu supstituciju prolina u serin u FR3 mAb TNV148B kao stoje prikazano na slici 4.Prijava sadrži još 5 nezavisnih i 2 zavisna patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak odnosi se na antitela specifična za alfa protein faktora nekroze tumora (TNF).
STANJE TEHNIKE
TNF alfa je solubilan homodimer sasatvljen od subjedinica od 17 kD (Smith et al., J. Biol. Chem. 262:6951-6954 (1987)). Takođe postoji prekursor TNF- od 26 kD koji je vezan za membranu (Kriegler et al., Cell 53:45-53 (1998)). Za revijalne radove vezane za TNF videti Beutler et al., Nature 320:584 (1986); Old, Science 230:630 (1986); i Lee et al., Lab. Invest. 56:234 (1987).
Pored monocita i makrofaga i druge ćelije proizvode TNF alfa. Na primer, humane ne-monocitne tumorske ćelijske linije proizvode TNF alfa.(Rubin et al., J.Exp.Med. 164:1350 (1986); Spriggs et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:6563
(1987)). CD4+ i CD8+ limfociti iz periferne krvi i neke kultivisane T i B ćelijske linije (Čuturi et al., J. Exp. Med. 165:1581 (1987); Sung et al., J. Exp. Med. 168:1539 (1988); Turner et al., Eur. J. Immunol: 17:1807-1814 (1987)) takođe proizvode TNF alfa.
TNF alfa izaziva pro-inflaminatoma dešavanja koja se događaju kod povrede tkiva, kao što je degradacija hrskavice i kosti (Saklatvala, Nature 322:547-549
(1986); Bertolini, Nature 319:516-518 (1986)), indukcija adhezije molekula, indukujući prokoagulantsku aktivnost na vaskulamim endotelijajnim ćelijama (Pober et al., J. Immunol. 136:1680 (1986)), povećanje adherence neutrofila i limfocita (Pober et al., J. Immunol. 138:3319 (1987)), i stimulaciju oslobađanja aktivirajućeg faktora trombocita iz makrofaga, neutrofila i vaskularnih endotelijalnih ćelija (Camussi etal., J. Exp. Med. 166:1390 (1987)).
Skorašnji dokazi povezuju TNF alfa sa infekcijama (Cerarrti et al., Immunol
Today 9:28 (1988)), imunim poremećajima, neoplastićnim patologijama (Oliffet
al., Cell 50:555 (1987)) autoimunim patologijama i kalem-versus-domaćin (graft-
versus-host) patologijama (Pigue et al., J. Exp. Med 166:1280 (1987)). Povezanost
TNF alfa sa kancerom i infektivnim patologijama često se odnosi na kataboličko
stanje domaćina. Pacijenti sa kancerom pate od gubitka težine, često povezanim sa
anoreksijom.
Ekstenzivan gubitak koji je povezan sa kancerom i drugim obolenjima, poznat je
kao "kaheksija" (Kern etal., J. Parent. Enter. Nutr. 12:286-298 (1988)). Kaheksija
uključuje progresivan gubitak težine, anoreksiju, i stalnu eroziju bezmasne telesne
mase kao odgovor na rast tumora. Stanje kaheksije izaziva dosta kancer
morbiditeta i mortaliteta. Postoji dokaz daje TNF alfa uključen u kaheksiju kod
kancera, infektivnih patologija, i drugih kataboličkih stanja (videti, e.g., Beutler
and Cerami, Ann.Rev. Immunol. 7:625-655 (1989)).
Za TNF alfa se veruje da ima krucijalnu ulogu u gram-negativnim sepsama i
endotoksičnom šoku (michie et al., Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debetes et al.,
Second Vienna Shock Forum, p. 463-466 (1989); Simpson et al., Critic. Care
Clin. 5:27-47 (1989)), uključujući temperaturu, stanje malaksalosti, anoreksiju, i
kaheksiju. Endotoksini snažno aktiviraju proizvodnju monocita/makrofaga i
sekreciju TNF alfa i drugih citokina (kornbluth et al., J. Immunol. 137:2585-2591
(1986) ). TNF alfa i drugi citokini izvedeni iz monocita posreduju u metaboličkim
i neurohormonalnim odgovorima na endotoksine (Michie et al., New Engl. J.
Med. 318:1481-1486 (1988)). Administracija endotoksina humanim volonterima
stvara akutne bolesti sa simptomima sličnim gripu uključujući temperaturu,
tahikardiju, povišenu metaboličku stopu i oslobađanje hormona stresa (Revhaug et
al., Arch. Surg. 123:162-170 (1988). Cirkulišući TNF alfa povećavavaju se kod
pacijenata koji pate od Gram -negativne sepse (Waag et al., Lancet 1:355-357
(1987) ;Hammerle et al., Second Vienna Shock Forum, p.715-718 (1989); Debets
et al.UCrit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra et al., J. Infect. Dis. 161:982-987(1990)).
Tako je TNF alfa povezan sa inflaminatornim obolenjima; autoimunim
obolenjima, virusnim, bakterijskim i parazitskim infekcijama, malignitetima, i/ili
neurodegenerativnim obolenjima dobar jc cilj ("target") za specifične biološke terapije za bolesti, kao što je reumatoidni artritis i Kronova bolest. Prijavljeni su korisni efekti u otvoreno obeleženim ispitivanjima (open-label trials) sa himernim
monoklonalnim antitelom za TNF alfa (cA2) sa supresijom inflaminacije i sa
uspcšniir. Icč-jiijcm posle povraćaja kod reumatoidnog artritisa (Elliot et al.,
Arthritis Rheum. 36:1681-1690 (1993); i Elliot et al., Lancet 344:1125-1127
(1994)). Antitcla na "modulatorni" materijal koji je okarakterisan kao kahetin
(kasnije je nađeno daje identičan sa TNF) otkrivena su u Cerami et al., (EPO
Patent Publicalion 0212489,4 mart, 1987). Rečeno je da su ovakva antitelakorisna u dijagnostičkim imunoesejim i u terapijama šoka kod bakterijskih infekcija. Rubin et al., (EPO Patent Publication 0128868,22 April, 1987) otkrili su monoklonalna antitela na humani TNF, hibridome koje sekretuju ovakva antitela, metode za proizvodnju ovakvih antitela, i upotrebu ovakvih antitela u imunoeseju za TNF. Yone et al., (EPO Patent Publication 0288088,26 oktobar, 1988) otkrili su anti-TNF antitela, uključujući mAbs (monoklonalna antitela Ma), i njihovu upotrebu u imunoesejskom dijagnoziranju patologija, pogotovu Kavasakijeve patologije i bakterijske infekcije. Za telesne tečnosti pacijenta sa Kavasakijevom patologijom (infantilni akutni febrilni mukokutanozni sindrom limfnih čvorova; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1967); Kavvasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1985)) rečeno je da sadrže povišen nivo TNF-a koji je povezan sa progresijom patologije (Yone et al., supra).
Drugi istraživači opisali su mAbs (Ma) specifična za rekombinantni humani TNF koji je imao neutrališuću aktivnostin vivo(Liang, C-M. et al., (Biochem. Biophvs. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, A. et al., Hvbridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hvbridoma 6:359-369 (1987); Bringman, TS. et al., Hvbridoma 6:489-507 (1987); Hirai et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987); Moller, A. et al., (Cvtokine 2:162-169 (1990)). Neki od ovih mAbs (Ma) su korišćeni za mapiranje epitopa humanih TNF i za razvoj enzimskih imunocseja (Fendly et al., supra; Hirai et al., supra; Moller et al., supra) i za asisitiranje u prečišćavanju rekombinantnog TNF (Bringman et al., supra). Međutim, ove studije ne obezbeđuju bazu za proizvodnju TNF neutrališućih antitela koja se mogu koristiti u in vivio dijagnostici ili korišćrnju u teraputske svrhe kod ljudi, na osnovu imunogenosti, nedostatku specifičnosti i/ili farmaceutskoj pogodnosti.
Pokazano jc da neutrališući antiserum ili mAbs (Ma) za TNF kod sisara od čoveka ukidaju štetne fiziološke promene i sprečavaju smrt nakon letalnog izazova u eksperimentalnoj endotoksemiji i bakteremiji. Ovaj efekat je dcmnostriran kod glodarskog eseja letalnosti i primatnog model sistema patologije (Mathinson, J. C. etal., J. Clin. Invest. 81:1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 229:869-871
(1985); Tracey, K.J. et al., Nature 330:662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al.,
Immunol. Lett. 17:311-318 (1988); Silva, A. T. etal., J. Infect. Dis. 162:42M27 ,
(1990); Opal, S. M. et al., J. Infect. Dis. 161:1148-1152 (1990); Hinshavv, L. B., et al., Circ. Shock 30:279-292 (1990)).
Pretpostavljeno mesto za vezivanje receptora na hTNF-u je otkriveno od strane Eck i Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), 17595-17605 (1989), koji su identifikovali mesto za vezivanje receptora na TNF-u koje obuhvata amino kiseline 11-13, 37-42,49-57 i 155-157. PCT prijava \VO91/02078 (sa prioritetom od 7 avgust 1989) otkriva ligande TNF koji mogu da sc vežu za monoklonalna antitela koja imaju sledeće epitope: makar jedan od 1-20, 56-77, i 108-127; makar dva od 1-20, 56-77,108-127 i 135-ili 136-155;sveod 1-30, 117-128 i 141-153; sve od 1-26, 117-128 i 141-153; sve od 22-40,49-96 ili-97, 110-127 i 136-153; sve od 12-22, 36-45,96-105 i 132-157; sve od oba od 1-20 i 76-90; sve od 22-40, 69-97, 105-128 i 135-155; sve od 22-31 i 146-157; sve od 22-40 i 49-98; makar jedan od 22-40,49-98 i 69-97, oba od 22-40 i 70-87.
WO 97/29131 opisuje humana antitela koja se vežu za humani TNFa. Kaže se da antitela imaju visok afinitet za humani TNFa (Kdod IO"<8>M ili manje), usporavaju brzinu disocijacije humanog TNFa (KofrIO"<3>sec"<1>ili nižu) i da su u stanju da neutralizuju humanu TNFa aktivnostin vitroiin vivo.
Nehumana sisarska, himema, poliklonalna (e.g., anti-serum) i/ili monoklonalna antitela (Mabs) i fragmenti (e.g., proteolitičke digestije ili njihovi fuziono proteinski proizvodi) su potencijalni terapeutski agensi koji se istražuju u nekim slučajevima pokušaja lečenja određenih bolesti. Međutim, ovakva antitela ili fragmenti mogu izaivati imuni odgovor kada se daju ljudima. Ovakav imuni odgovor može rezultirati u uklanjanju antitela ili fragmenta iz cirkulacije posredovanom kompleksom, i tako ponavljanje administarcije čini nepogodnim za terapiju, i tako smanjujući terapeutsku dobrobit za pacijenta i limitirajući readministarciju antitela ili fragmenta. Na primer, ponavljanje davanja antitela ili fragmenata sa ne humanim delovima može dovesti do serumske bolesti i/ili anafalaksije. Da bi se izbegli ovi i drugi problemi, primenjcn je veći broj pristupa da bi se smanjila imunogenost ovakvih antitela i njihovih delova, uključujući himerizaciju i humanizaciju kao što je poznato u ovoj oblasti. Ovi kao i drugi pristupi, međutim mogu i dalje rezultirati u antitelima ili fragmentima sa nekom imunogenošću, niskim afinitetom, niskom aviditetom, ili sa problemima vezanim za ćelijske kulture, industrijsku proizvodnju, i/ili nizak prinos. Tako ovakva antitela ili fragmenti mogu biti manje idealni za proizvođače ili za upotrebu kao terapeutskih proteina.
Na osnovu ovoga, postoji potreba da se obezbede anti-TNF antitela ili fragmenti koji prevazilaze jedan ili više ovih problema, kao poboljšanja kod poznatih antitela ili njihovih fragmenata.
SUŠTINA PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana humana, primarna, glodarska, sisarska, i/ili himema anti-TNF antitela, kompozicije anti-TNF antitela, kodirajuće nukleinske kiseline, vektore, ćelije domaćine, kompozicije, i upotrebu, kao što je ovde opisano i omogućeno, u kombinaciji sa onim Stoje poznato u ovoj oblasti tehnike.
Antitelo na osnovu ovog pronalaska je antitelo koje sadrži regione koji određuju komplemetranost (CDRs) teškog lanca i pormenjive 'frameNvork' regione (!<:>Rs) mAb TNV148 kao što je prikazano na slici 4; i CDRs lakog lanca i promenjive FRs mAb TNV148 kao što je prikazano na slici 5; opciono još sadrži specifičnu supstituciju prolina u serin u FR3 mAb TNV148B kao što je prikazano na slici 4. Antitelo iz ovog pronalaska može biti derivat od bilo kog sisarskog, ali bez ograničenja na humano, mišije, zečije, pacovsko, glodarsko ili bilo koja njihova kombinacija, i slično.
Ovaj opis pronalaska takođe daje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema prikaznom pronalasku; rekombinantni vektor koji sadrži pomenuti molekul nukleinske kiseline; ćeliju domaćina koja sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu ili vektor; kompoziciju koja sadrži pomenuto antitelo i faramceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač; i pomenuto antitelo ili kompozicija za upotrebu u dijagnozi ili terapiji, naročito za upotrebu u lečenju imunih bolesti.
Ovaj opis pronalaska obezbeđuje, u jednom aspektu, izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži komplementarni, ili sa kojim može da hibridizuje, polinukleotid koji kodira specifična anti-TNF antitela, koji sadrži makar jednu njegovu specificiranu sekvencu, domen, deo ili varijantu. Ovaj opis pronalaska dalje obezbeđuje rekombinantne vektore koji sadrže pomenute molekule nukleinskih kiselina anti-TNF antitela, ćelije domaćine koji sadrže ovakve nukleinske kiseline i/ili rekombinantne vektore, kao i metode za pravljenje i/ili upotrebu ovakvih nukleinskih kiselina antitela, vektore i/ili ćelije domaćine.
Makar jedno antitelo iz ovog pronalaska vezuje makar jedan epitop specifičan za makar jedan TNF protein, njegovu subjedinicu, fragment, deo ili bilo koju njihovu kombinaciju. Makar jedan epitop može da sadrži makar jedan region za vezivanje antitela koji obuhvata makar jedan deo pomenutog proteina, epitop koji je poželjno da sadrži makar 1-5 amino kiselina makar jednog njegovog dela kao što je ali ne limitiran na makar jednan funkcionalan, ekstracelularan, solubilan, hidrofilni, eksternalni ili citoplazmatski domen pomenutog proteina, ili njegovog dela.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jedno izolovano anti-TNF antitelo kao što je opisano ovde, gde antitelo poseduje jednu aktivnost, kao što je, ali bez limitiranja na inhibiciju TNF-om indukovanih čelijskih adhezionih molekula, inhibiciju TNF vezivanja za receptor, "Artritic indcx" (artritijski indeks) poboljšanje u mišijem modelu, (videti e.g., Primcre 3-7). Anti-TNF antitelo može tako biti skrinovano za odgovarajuću aktivnost na osnovu poznatih metoda, kao što je ali bez limitiranja, makar jedna biološka aktivnost ka TNF proteinu.
Ovaj opis pronalaska takođe obezbeđuje makar jednu metodu za eksprimiranje makar jednog anti-TNF antitela, ili TNF-anti idiopatskog antitela, u ćeliji domaćinu, koja obuhvata gajenje ćelija domaćina !:n.o što je ovde opisano u uslovima naznačeno time da se makar jedno anti-TNF antitelo eksprimira u količinama koje se mogu detektovati i/ili povratiti.
Ovaj opis pronalaska takođe obezbeđuje makar jednu kompoziciju koja sadrži (a) izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira anti-TNF antitelo i/ili antitelo kao stoje ovde opisano; i (b) pogodan nosač ili rastvarač. Nosač ili rastvarač mogu opcionalno biti farmaceutski prihvatljivi, na osnovu poznatih nosača ili rastvarača. kompozicija može dalje opcionalno da sadrži makar još jedno jedinjenje, protein ili kompoziciju.
Ovaj opis pronalaska dalje obezbeđuje makar jedan anti-TNF antitelo metod ili kompoziciju, za administraciju terapeutski efektivne količine da bi se modulisalo ili lečilo makar jedno stanje povezano sa TNF-om u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu i/ili pre, posle ili za vreme povezanog stanja, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili je ovde opisano.
Ovaj opis pronalaska takođe obezbeđuje makar jednu kompoziciju, sredstvo i/ili metodu za dostavu terapeutski ili profilaktički efektivne količine makar jednog anti-TNF antitela, na osnovu ovog pronalaska.
Ovaj opis pronalaska dalje obezbeđuje makar jednu anti-TNF antitelo metodu ili kompoziciju za dijagnostifikovanje makar jednog stanja povezanog sa TNF-om u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu i/ili pre, posle ili za vreme povezanog stanja, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili kao što je ovde opisano.
Ovaj opis pronalaska takođe obezbeđuje makar jednu kompoziciju, uređaj i/ili metod za dostavu za dijagnostifikovanje makar jednog anti-TNF antitela, na osnovu ovog pronalaska.
OPIS SLIKA
Slika 1 predstavlja grafički prikaz koji pokazuje esej sposobnostiTNV mAbs (Ma) u supernatantu hibridoma ćelija da inhibira vezivanje TNFV za za rekombinantni TNF receptor. Različite količine supematanta hibridoma ćelija koji sadrže poznate količine TNFV mAb su preinkubirane sa fiksnim koncentracijama (5 ng/ml)<115>I-obeleženim TNFV. Mešavina je prebačena na Opti ploče sa 96 bunarčića koje su'prethodno obložene sa p55-sf2, rekombinantni TNF receptor/IgG fuzioni protein. Količina TNFV koja se vezuje za p55 receptor u prisustvu mAbs određena je posle ispiranja i otklanjanja nevezanog materijala i brojanjem pomoću gama brojača. Iako je osam uzoraka TNV mAb testirano u ovim eksperimentima, radi pojednostavljenja tri mAbs za koje je analizom DNK sekvenci pokazano da su identična sa jednim drugim TNV mAbs (videti odeljak 5.2.2) nisu ovde prikazani. Svaki uzorak jc testiran u duplikatu. Rezultati su prikazani i predstavljaju rezultat dva nezavisna eksperimenta.
Slika 2 prikazuje DNK sekvence varijabilnog regiona teškog lanca TNV mAb (Ma). Gen iz germinativnih ćelija (linija gonocita- germi ine) pokazuje daje DP-46 gen. 'TNV" ukazuje daje prikazana sekvenca sekvenca TNV 14, TNV 15, TNV148 i TNV196. Prva tri nukleotida u TNV sekvenci definišu Met kodon inicijacije translacije. Tačke u sekvenci TNV mAb (Ma) gena pokazuju daje nukleotid isti kao i u sekvenci germ inativne ćelije. Prvih 19 nukleotida (podvučeni) u okviru TNV sekvenci odgovaraju oligonukleotidu koji se upotreblajva u PCR-amplifikaciji (umnožavanje lančanom reakcijom polimeraze) varijabilnog regiona. Translacija amino kiselina (skraćenice su sa jednim slovom) koja počinje sa zrelim mAb (Ma) prikazana je samo za gene germinativnih ćelija. Tri CDR domena u aminokiselinskoj translaciji germunativnih ćelija su obeležena sa "bold" i podvučena. Linije obeležene TNV148(B) pokazuju da su prikazane sekvence povezane sa oba i TNV 148 i TNV148(B). Prekidi u sekvencama DNK (CDR3) germinativnih ćelija su posledica sekvenci za koje se nezna ili ne postoje u genu germinativne ćelije.Tcški lanci TNV mAB (Ma) koriste J6 vezujuću sekvencu.
Slika3 pokazuje DNK sekvencu varijabilnih regiona lakog lanca TNV mAb (Ma). Prikazan gen germinativne ćelije je predstavnik Vg/38K familiji kapa varijabilnih gena germinativne ćelije. Tačke na genskim sekvencama TNV mAb (Ma) pokazuju nukleotid koji je isti kao i kod sekvence germinativne ćelije. Prvih 16 nukleotida (podvučeni) TNV sekvence odgovaraju oligonukleotidu koji se upotreblajva u PCR-amplifikaciji varijabilnog regiona. Translacija amino kiselina zrelog mAb (skraćenice su sa jednim slovom) prikazana je samo za gene germinativnih ćelija. Tri CDR domena u aminokiselinskoj translaciji germinativnih ćelija su obeležena sa "bold" i podvučena. Linije obeležene TNV148(B) pokazuju da su prikazane sekvence povezane sa oba i TNV 148 i TNV148(B). Prekidi u sekvencama DNK (CDR3) germinativnih ćelija su posledica sekvenci za koje se nezna ili ne postoje u genu germinativne ćelije. Laki lanci TNV mAb koriste J3 vezujuću sekvencu.
Slika 4pokazuje izvedenu amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca TNV mAb (Ma). Prikazane amino kiselinske sekvence (skraćenice su sa jednim slovom) izvedene su iz DNK sekvenci koje su određene i iz nekloniranih PCR proizvoda i iz kloniranih PCR proizvoda. Amino sekvence su prikazane podeljene u domene, sekretornu signalnu sekvencu (signal), framevvork (FW), i region za određivanje komplementarnosti (CDR). Amino kiselinska sekvenca za DP-46 gen germinativne ćelije prikazana je na vrhu za svaki domen. Tačke pokazuju daje amino kiselina u TNV mAb identična genu germinativne ćelije. TNV148(B) pokazuje daje prikazana sekvenca povezana i sa TNV148 i TNV148(B). "TNV" ukazuje na to daje prikazana sekvenca povezana sa svim TNV mAbs (Ma) osim ako nije prikazana drugači ja sekvenca. Crtice u sekvenci (CDR3) germinativne ćelije ukazuje na to d:i s-.švence nisu poznate ili no postoje u genu germinativnih ćelija.
Slika5 pokazuje izvedenu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca TNV mAb (Ma). Prikazane amino kiselinske sekvence (skraćenice su sa jednim slovom) izvedene su iz DNK sekvenci koje su određene i iz nekloniranih PCR proizvoda i iz kloniranih PCR proizvoda. Amino sekvence su prikazane podeljene u domene, sekretornu signalnu sekvencu (signal), framework (FW), i region za određivanje komplementarnosti (CDR). Amino kiselinska sekvenca za Vg/38K-tip lakog lanca gena germinativnih ćelija prikazana je na vrhu za svaki domen. Tačke pokazuju daje amino kiselina u TNV mAb identična genu germinativnih ćelija. TNV148(B) pokazuje daje prikazana sekvenca povezana i sa TNV148 i TNV148(B). "Sve" ukazuje na to daje prikazan sekvenca povezana sa TNV 14, TNV 15, TNV 148, TNV 148(B) i TNV 186.
Slika 6 prikazuje shematsku ilustraciju plazmida koji eksprimira teški i laki lanac koji je upotrebljen za pravljenje rTNV148B-eksprimirajuće C466 ćelija, pl 783 je plazmid sa teškim lancem i pl 776 je plazmid sa lakim lancem. rTNV 148B domeni koji kodiraju varijabilan i konstantan region prikazani su kao crni boksovi.Prikazana su relevantna restrikciona mesta. Plazmidi su prikazani u takvoj orjentaciji da se transkripcija sa Ab gena odigrava u smeru kazaljke na satu. Plazmid pl783 je dug 19.35 kb a plazmid p!776 je dugačak 15.06 kb. Poznata je kompletna nukleotidna sekvenca oba plazmida. Kodirajuća sekvenca za varijabilan region u pl783 može se lako zameniti sa drugom sekvencom za varijabilni region teškog lanca zamenom BsiWI/BstBI restrikcionog fragmenta. Kodirajuća sekvenca za varijabilni region u pl776 može se lako zameniti sa drugom sekvencom za varijabilni region zamenom SalI/Aflll restrikcionog fragmenta.
Slika 7 je grafički prikaz analize krive rasta pet ćelijskih linija koje proizvode rTNV148B. Kulture su inicirane 0 dana zasađivanjem ćelija u T75 boce u I5Q+MHX medijumu do vijabilne ćelijske gustine od 1.0 X IO<5>ćelija /ml u zaprem ini od 30 ml. Ćelijske kulture upotrebljne u ovim studijama su bile kontinuirane kulture od momenta kada su urađene transfekcije i subkloniranja. Sledcćih dana ćelije u T bocama su resuspendovane i uklonjeni su alikvoti kultura od 0.3 ml. Studije krive rasta završene su kada je broj ćelija pao ispod 1.0 X 10<5>ćelija /ml. Broj živih ćelija u alikvotu određenje "typan Blue" ekskluzijom i ostatak alikvotakoji je sačuvan za kasnije mAb (Ma) određivanjem koncentracije. Urađen je ELISA za humani IgG za sve uzorke alikvota u isto vreme.
Slika 8 pokazuje grafički prikaz poređenja stope ćelijskog rasta u prisustvu različitih koncentracija MHX selekcije. Ćelijski subklonovi C66A i C466B su potopljeni u medijumu bez MHX (IMDM, 5%FBS, 2mM glutamin) i kultivisane dva dodatna dana. Obe ćelijske kulture su zatim podeljene u tri kulture koje su bile bez MHX, sa 0.2X MHX, ili IX MHX. Jedan dan kasnije, u sveže T75 boce zasađene su kulture sa početnom gustinom od 1.0 X 10<5>ćelija/ml i ćelije su prebrojavane na 24 časa tokom jedne nedelje. Duplirajuća vremena tokom prvih 5 dana proračunata su pomoću formule u SOP PD32.025 i prikazana su iznad crti. Slika 9 pokazuje grafički prikaz stabilnosti mAb (Ma) produkcije tokom vremena od strane dve ćelijske linije koje proizvode rTNV148B. Za započinjanje dugotrajnih serijskih kultura u šoljama za kulture sa 24 bunarčića, upotrebljeni su ćelijski subklonovi koji su bili u kontinuiranim kulturama od izvođenja transfekcija i subkloniranja. Ćelije su gajenc u I5Q medijumu sa ili bez MIIX selekcije. Ćelije su kontinuirano pasažirane deljenjem kultura svaka 4 do 6 dana da bi se održale vijabilne kulture dok su prethodne kulture puštene da se potroše. Alikvoti supernatanata potrošenih ćelija su pokupljeni malo posle što su kulture potrošene i sačuvani su dok se nisu odredile koncentracije mAb (Ma). Urađen je ELISA za humani IgG za sve uzorke alikvota u isto verme.
Slika 10 pokazuje promene težine artritis miš model miševa Tg 197 kao odgovor na anti-TNF antitela iz ovog pronalaska kada se porede sa kontrolama iz primera 4. Sa otprilike 4 nedelje starosti Tgl97 određeni su miševi za proučavanje na osnovu pola i telesne težine, i svrstani u jednu od 9 grupa i tretirani su sa pojedinačnom intraperitonealnom bolus dozom Dulbekovog PBS-a (D-PBS) ili sa anti-TNF antitelom iz ovog pronalaska (TNV 14, TNV 148 ILI TNV 196) sa po ili 1 mg/kg ili 10 mg/kg. kada su analizirane težine kao promene od pre-doze, životinje kojima je davano lOmg/kg cA2 pokazivale su konstantno veće dobijanje u težini nego životinje tretirane sa D-PBS u ovoj studiji. Ovo dobijanje u težini bilo je značajno u nedeljama 3-7. Životinje tretirane sa lOmg/kg TNV 148 takođe su ostvarile značajno dobijanje u težini u 7 nedelji ove studije.
Slika 11A-C predstavljaju progresiju ozbiljnosti bolesti baziranu na artritiskom indeksu kao stoje predstavljeno u primeru 4. Artritiski indeks grupe tertirane sa cA2 bio je niži od kontrolne D-PBS grupe tokom ostatka studije (7 nedelja) počevši od 3. nedelje. Životinje tretirane sa 1 mg/kg TNV 14 i životinje tretirane sa I mg/kg cA2 nisu pokazale značajnu redukciju Al posle 3 nedelje kada su upoređene sa grupom tretiranom sa D-PBS. Nije bilo značajne razlike između grupa tretiranih sa lOmg/kg kada se pojedinačno uporede sa drugima sa sličnim dozama (lOmg/kg cA2 u poređenju sa 10 mg/kg TNV 14, 148 i 196). Kada su upoređene grupe tertirane sa 1 mg/kg, grupa tretirana sa 1 mg/kg TNV 148 pokazivala je značajno niži Al nego grupa tretirana sa 1 mg/kg cA2 na 3, 4 i 7 nedelja. Img/kg TNV 148 takođe je bila značajno niža nego kod 1 mg/kg TNV 14 grupe na 3 i 4 nedelje. Iako je TNV 196 poakzivala značajnu redukciju Al do 6 nedelje studije (kada se poredi sa grupom tretiranom sa D-PBS-om), TNV 148 je bila jedina lmg/kg grupa koja je ostala značajna na kraju ove studije.
Slika 12 pokazuje promene težine artritis miš model miševa Tg 197 kao odgovor na anti-TNF antitela iz ovog pronalaska kada se porede sa konrolnim iz primera 5. Kada su imali otprilike 4 nedelje odabrani su Tgl97 miševi iz studije, na osnovu njihove težine, i svrstani u jednu od 8 grupa i tretitrani sa intraperitonealnom bolus dozom kontolnog proizvoda (D-PBS) ili antitelom (TNV 14, TNV148) 3mg/kg (0 nedelja). Injekciranje je ponovljeno kod svih životinja 1, 2, 3, i 4 nedelje. Grupe 1-6 su procenjene za efikasnost test proizvoda, uzorci seruma, dobijeni iz životinja iz grupa 7 i 8 su procenjene za indukciju imunog odgovora i farmakokinetičkog uklanjanja TNV14 i TNV148 u 2, 3, i 4 nedelji.
Slika 13 A-C su grafički prikazi progresa ozbiljnosti bolesti u primeru 5 bazirano na artritiskom indeksu. Grupe tretirane sa 10 mg/kg cA2 imale su artritiski indeks značajno niži nego kontrolna grupa tretirana sa D-PBS počevši od 2. nedelje i nastavljeno je tokom ostatka studi je (5 nedelja). Životinje tertirane sa 1 mg/kg ili 3 mg/kg cA2 i životninje tretirane sa 3 mg/kg TNV 14 nisu uspele da dostignu bilo kakvu značajnu redukciju Al ubilo kom momentu tokom trajanja studije kada se uporede sa d-PBS kontrolnom grupom. Životinje tertirane sa 3 mg/kg TNV 148 pokazivale su značajnu redukciju kada su se poredile sa grupom tretiranom sa d-PBS počevši od 3. nedelje i nastavljajući tokom 5. nedelje. Životinje tretirane sa 10 mg/kg cA2 pokazivale su značajnu redukciju Al kada su poređene sa obe grupe nižih doza (1 mg/kg i 3 mg/kg) cA2 u 4. i 5. nedelji studije i takođe je značajno niži od životinja tretiranih sa TNV14 tokom nedelja 3-5. lako je izgledalo da ne postoje značajne razlike između bilo koje 3 mg/kg grupe, Al za životinje tretirane sa 3mg/kg TNV 14 bili su značajno viši u nekim momentima nego kod životinja tretiranih sa 10 mg/kg a životinje tretirane sa TNV 148 nisu se značajno razlikovale od životinja tretiranih sa 10 mg/kg cA2.
Slika 14 pokazuje promenu težine artritis miš model miševa Tg 197 kao odgovor na anti-TNF antitela iz ovog pronalaska kada se porede sa kontrolom iz primera 6. Sa otprilike 4 nedelje odabrani su Tgl97 studijski miševi, na osnovu pola i telesne težine, i raspoređeni u 6 grupa za tertiranje i davana im je pojedinačna intraperitonealna bolus doza antitela (cA2, ili TNV148) u količini ili 3 mg/kg ili 5 mg/kg. U ovoj studiji korišćene su D-PBS i 10 mg/kg cA2 kontrolne grupe.
Slika 15 predstavlja progresiju ozbiljnosti bolesti baziranu na artritiskom indeksu kao što je predstavljeno u primeru 6. Sve grupe koje su tretirane pokazivale su neki nivo zaštite u nekim momentima, sa 5 mg/kg cA2 i 5 mg/kg TNV148 koji pokazuju značajnu redukciju Al u nedeljama 1-3 i sve grupe su pokazivale redukciju u 2. nedelji. Kasnije u studiji životinje tretirane sa 5 mg/kg cA2 pokazivele su neki nivo protekcije, sa značajnim redukcijama u 4, 6, i 7 nedelji. Niske doze (3 mg/kg) oba i cA2 i TNV148 pokazivale su značajnu redukciju u 6. nedelji i sve grupe koje su tretirane pokazivale su značajne redukcije u 7. nedelji. Nijedna od grupa nije bila sposobna da održi značajnu redukciju do kraja studije (8 nedelja. Nije bilo značajnih razlika između bilo koje grupe koja je tretirana (isključujući grupu sa fiziološkim rastvorom) u bilo kom momentu.
Slika 16 prikazuje promenu težine artritis miš model miševa Tg 197 kao odgovor na anti-TNF antitela iz ovog pronalaska kada se porede sa kontrolom iz primera 7. Da bi sc uporcdila efikasnost jedne intraperitonealne doze TNV-al48 (izveden iz hibridoma ćelija) i rTNV148B (izvedene iz transfektovanih ćelija). Kada su imali otprilike 4 nedelje odabrani su Tgl97 studijski miševi, na osnovu pola i telesne težine, i svrstani su u jednu od 9 grupa za tretiranje i davana im je pojedinačna intraperitonealna bolus doza Dulbekovog PBS-a(D-PBS) ili antitela (TNV 148, rTNV148B) 1 mg/kg.
Slika 17 predstavlja progresiju ozbiljnosti bolesti baziranu na artritiskom indeksu kao što je predstavljeno u primeru 7. Artritiski indeks grupe tretirane sa 10 mg/kg cA2 bio je niži od D-PBS kontrolne grupe počevši od 4. nedelje i trajalo je do kraja studije (8 nedelja). Obe grupe i ona tretirana sa TNV 148 i ona sal mg/kg cA2 pokazivale su značajnu redukciju Al u 4. nedelji. lako prethodne studije (P-099-017) su pokazivale daje TNV148 malo bolje bilo u redukciji artritiskog indeksa posle jednog 1 mg/kg intraperitonealnog bolus, ova studija je pokazala da Al iz obe verzije grupa koje su tretirane sa TNVantitelima bio nešto viši. Iako se (sa izuzetkom 6. nedelje) grupa tretirana sa 1 mg/kg cA2 nije značajno povećala kada se uporedi sa 10 mg/kg cA2 grupom i grupe tretirane sa TNV 148 bile su značajno više u 7. i 8. nedelji, nije bilo značajne razlike u Al između 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV 148 i 1 mg/kg TNV USB u bilo kom momentu studije.
OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana, rekombinantna i/ili sintetička anti-TNF humana, primatna, glodarska, sisarska, himerna, antitela kao i kompozicije i kodirajuće molekule nukleinskih kiselina koje sadrže najmanje jedan polinukleotid koji kodira makar jedno anti-TNF antitelo prema pronalasku. Ovaj pronalazak dalje obuhvata, ali nije time limitiran, upotrebu takvih antitela na primer u dijagnostičkim i terapeutskim kompozicijama, postupcima i uređajima.
Kao što je ovdekorišćeno, "anti-tumor nekrozni faktor alfa antitelo", "anti-TNF antitelo", "deo anti-TNF antitela", ili "fragment ant-TNF antitela" i/ili "varijanta TNF antitela" i slično, uključuju bilo koji protein ili molekul sa peptidom koji sadrži makar deo imunoglobinskog molekula, kao što je, ali nije njime limitiran, makar jedan region za određivanje komplementarnosti (complementaritv deternining region-CDR) teškog ili lakog lanca ili deo za vezivanje Uganda, varijabilan region teškog ili lakog lanca, konstantan region teškog ili lakog lanca, framework region, ili njegov deo, ili najmanje jedan deoTNF receptora ili vezujućeg proteina, koji se može ugraditi u antitelo iz ovog pronalaska. Ovakvo antitelo opcionalno utiče na specifičan ligand, tako što, ali nije limitiran time, antitelo moduliše, smanjuje, povećava, antagonizuje, angonizuje, ublažava, povišava, olakšava, blokira, inhibira, ukida i/ili utiče na makar jednu aktivnost TNF ili na njegovo vezivanje, ili na aktivnost i vezivanje receptora za TNF,in vitro, in situi/iliin vivo.Kao nelimkirajući primer odgovarajuće anti-TNF antitelo, određeni delovi ili varijanta, može da veže makar jedan TNF''i njegove određene delove, varijante ili domene. Odgovarajuće anti-TNF antitelo, određeni delovi ili varijante mogu takođe opcionalno da utiču makar na jednu funkciju ili aktivnost TNF, kao što je, ali nije time limitirana, sinteza RNK, DNK ili proteina, oslobađanje TNF, receptorski "signaling" TNF-a, sečenje membrane TNF-om, aktivnost TNF-a, proizvodnja i/ili sinteza TNF-a. Izraz "antitelo" ima za nameru da dalje obuhvati antitela, digestione fragmente, njihove određene delov i varijante, uključujući oponašanje antitela ili obuhvatajući delove antitela koja oponašaju strukturu i/ili funkciju antitela ili njivovog fragmenta ili dela, uključujući jednolančana antitela i njihove fragment. Funkcionalni fragmenti obuhvataju antigen vezujuće fragmente koji se vezuju za sisarski TNF. Na primer, fragmenti antitela koji su sposobni da se vežu za TNF ili njegov deo, uključujući, iako nisu time limitirani, Fab (e.g., digestijom papainom), Fab' (e.g., digestijom sa pepsinom i delimičnom redukcijom) i F(ab')2(e.g., digestijom sa pepsinom), facb (e.g., digestijom sa plazminom), pFc' (e.g., digestijom sa pepsinom ili plazminom), Fđ (e.g., digestijom sa pepsinom, parcijalnom redukcijom i ponovnom agregacijom), Fv ili scFv (e.g., tehnikama molekularne biologije) fragmente, koji su obuhvaćeni ovim pronalaskom (videti, e.g., Colligan ImmunoIogy, supra).
Ovakvi fragmenti mogu se dobiti sečenjem sa enzimima, sintetičkim ili rekombinantnim tehnikama, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili kao što je ovde opisano. Antitela se takođe mogu proizvesti u različitim skraćenim oblicima upotrebom gena za antitela u koje je jedan ili više stop kodona ubačeno uzvodno od prirodnog stop kodona. Na primer, kombinacija gena koji kodiraju deo teškog lanca F(ab')2može se dizajnirati tako da se uključe DNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i/ili zglobni (hinge) region teškog lanca. Različiti delovi antitela mogu se spojiti hemijskim putem konvencionalnim tehnikama, ili se mogu pripremiti kao jedan protein od nastavljajućih različitih delova pomoću tehnika genetičkog inžinjerstva.
Kao što se ovde koristi, izraz "humano antitelo" odnosi se na antitelo u okviru koga u suštini svaki deo proteina (e.g., CDR, framework, CL, CHđomeni(e.g., CH1, CH2, CH3), zglob (VL, V,,)), je u suštini neimunogen začoveka, sa minornim promenama u sekvenci ili varijantama. Slično, antitela natnenjena primatima (majmunu, babunu, šimpanzi itd.), glodarima (mišu, pacovu, zecu, morskom prasetu, hrčku, i sličnim) i drugim sisarima označava antitela specifična za podvrstu, pod rod, rod, podfamiliju, familiju. Dalje himerna antitela uključuju bilo koju kombinaciju gore opisanih. Ovakve promene ili varijante opcionalno i poželjno je da zadržavaju ili redukuju imunogenost u ljudima ili drugim vrstama u odnosu na nemodifikovano antitela. Tako humano antitelo je različito od himernog ili humanizovanog antitela. Naglašeno je da se humano antitelo takođe može proizvesti u ne-humanoj životinji ili prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji koja je sposobna da eksprimira funksionalno preuređene humane imunoglobulinske (ea\. težak lanac i/ili lak lanac). Dalje, kada je humano antitelo jednolančano a;ni:.!v,, ono sadrži linker peptid koji se ne nalazi u nativnim humanim antitelima. Na primer, Fv može da sadrži linker polipeptid, od dva do oko osam glicina ili drugih amino kiselinskih ostataka, koji povezuje varijabilan region teškog lancai varijabilan region lakog lanca. Ovakvi linker peptidi se smatraju da su humanog porekla.
Bispecifična, heterospecifična ili slična antitela mogu se takođe koristiti, ona koja su monoklonalna, poželjno je da su humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za makar dva različita antigena. U ovom slučaju jedna od specifičnosti vezivanja je za protein TNF, dok je druga za bilo koji drugi antigen. Metode za proizvodnju bispecifičnih antitela poznate su u ocoj oblasti nauke. Tradicionalno rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se bazira na koekspresiji dva imunoglobulinska težak lanac-Iak lanac para, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Zbog slučajnog odabiranja i slaganja imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od koji samo jedno ima odgovarajuću bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje potrebnog pravog molekula, koje se odigrava najčešće kroz korake afinitativne hromatografije, je poprilično trško, i prinos proizvoda je nizak. Otkrivene su slične procedure, e.g., u WO 93/08829, US Patent Nos, 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
Anti-TNF antitela (nazivaju se i TNF antitela) prema ovom pronalasku, mogu opcionalno imati osobine kao što su visoki afinitet vezivanja za TNF i opcionalno i poželjno nisku toksičnost. Posebno je korisno u ovom pronalasku, antitelo prema pronalasku, gde pojedinačne komponente, kao što su varijabilan region, konstantan region i framework, pojedinačno i/ili kolektivno, opcionalno i poželjno sa niskom imunogenošću. Antitela koja se mogu koristiti u ovom pronalasku opcionalno karakteriše njihova sposobnost da se koriste u lečenju pacijenata tokom dužeg vremenskog perioda sa merljivim ublažavanjem simptoma, i niska i/ili prihvatljiva toksičnost. Niska ili prihvatljiva imunogenost i/ili visoki afinitet, kao i druga odgovarajuća svojstva, mogu da doprinesu ostvarenim terapeutskim rezultatima. "Niska imunogenost" je ovde definisana kao značajan porast HAFLAJTACA ili HAMA odgovora kod manje od oko 75% ili što je poželjnije kod manje od 50% pacijenata koji su lečeni i/ili porast niskog titra kod tertiranih pacijenata (manje od 300, poželjno manje od oko 100 izmerenih pomoću duplog antigenskog enzimskog imunoeseja) (Elliott et al., Lancet 344:1125-1127
(1994)).
Korist
Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu se iskoristiti za proizvodnju najmanje jednog anti-TNF antitela ili njegove specificirane varijante, koje se može koristiti za merenje ili mproizvodnju u ćeliji, tkivu, organu ili životinji (uključujući sisare i ljude), za dijagnostifikovanje, monitoring, modulaciju, lečenje, ublažavanje, pomoć u prevenciji incidence, ili redukciji simptoma, najmanje jednog stanja povezanog za TNF-om, selektovanog od, ali ne njime limitirano, makar jednog imunog poremećaja ili bolesti, kardiovaskularnog poremećaja ili bolesti, infekcije, malignog oboljenja, i/ili neurološkog poremećaja ili bolesti, ili nekog drugog poznatog ili specificiranog stanja povezanog sa TNF-om.
Ovakav metod može da obuhvata administraciju effektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedan TNF u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, kome treba modulacija, olakšavanje, umanjenje, prevencija ili redukcija simptoma; efekata i mehanizama. Efektivna količina može da oduhvati količine od oko 0.001 do 500 mg/kg za pojedinačno (e.g., bolus (za gutanje)), više puta ili kontinuirano davanje, ili da bi se dostigla koncentracija seruma od 0.01-5000 mg/ml serumske koncentracije za pojedinačno, više puta i kontinuirano davanje, ili bilo koji efektivan opseg ili vrednost istih, kao što se radi i određuje upotrebom poznatih metoda, što je ovde opisano ili je poznato upućenima u ovu oblast.
Citati
Sve publikacije ili ovde citirani patenti koji pokazuju kakva je situacija u ovoj oblasti tehnike bila u momentu nastanka ovog pronalaska i/ili obezbeđuju opis i izvođenje ovog pronalaska. Publikacije se odnose na bilo koje naučne publikacije ili publikacije pacijenata, ili informacije koje su dostupne u bilo kom medijskom formatu, uključujući sve zabeležene, elektronske i štampane formate. Posebno pominjemo sledeće: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, NY (1989); Harlovv and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY
(1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Ine, NY (1994-2001); Colligan et al-, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ine, NY, NY (1997-2001).
Antitela iz ovog pronalaska
Makar jedno anti-TNF antitelo iz ovog pronalaska može biti opcionalno proizvedeno od strane ćelijske linije, mešovite ćelijske linije, besmrtnih ćelija ili klonalne populacije besmrtnih ćelija, što je poznato u ovoj oblasti nauke. Videti e.g., Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biolog}'. John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in lmmunologv, John \Viley & Sons, Ine, NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ine, NY, NY (1997-2001).
Humana antitela koja su specifična za TNF protein ili njegov fragment, mogu se izazvati protiv odgovarajućeg imunogenog antigena, kao stoje izolovani i/ili TNF protein ili njegov deo (uključujući sintetičke molekule, kao što su sintetički peptidi). Druga specifična ili opšta sisarska antitela mogu se dobiti na sličan način. Priprema imunogenih antigena, i proizvodnja monoklonalnih antitelamože se izvesti primenom bilo koje pogodne tehnike.
Po jednom pristupu, hibridoma se proizvodi fuzijom pogodnih besmrtnih ćelijskih linija (e.g., ćelijske linije mieloma kao što su. ali nisu njima limitirane, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1,1.5, veće od 243, P3X63Ag8.653, Sp2MAI, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, N1H 3T3, HL-69, MLA 144, NAMAIVVA, NEURO 2A, ili slične, ili heteromilome (heteromylomas), njihovi fuzioni proizvidi, ili bilo koja ćelija ili fuziona ćelija izvedena iz njih, ili neka druga odgovarajuća linija koja je poznata u ovoj oblasti. Videti, e.g..wvvw.atcc.lifetech.com. sa ćelijama koje proizvode antitela, kao što su, bez ograničavanja na njih, izolovane ćelije slezine, iz periferalne krvi, limfe, krajnika, ili druge imune ćelije ili one koje sadrže B limfocite, ili bilo koje ćelije koje eksprimiraju konstantne, varijabilne ili framework iki CDR sekvence teškog ili lakog lanca, ili kao endogene ili heterologne nukleinske kiseline, kao rekombinantne ili endogene viralne, bakterijske, od algi, prokariotske, od vodozemaca, insektske, od gmizavaca, riblje, sisarske, glodarske, konjske, goveđe, jareće, ovčije, primtne, eukariotske, genomske DNK, cDNK, mitohondrijska DNK ili RNK, hloroplastna DNK ili RNK, hnRNK, iRNK, tRNK, jedno, dvo ili trolančana, hibridizovana, ili bilo koja njihova kombinacija. Videti Ausubel, supra, and Collingan, Immunologv, supra, Chapter 2.
Ćelije koje proizvode antitela mogu se dobiti iz periferne krvi ili što je poželjnijeiz slezine, limfnih čvorava, poreklom od čoveka ili drugh odgovarajućih životinja, koje su imunizovane sa antigenom od interesa. Može se koristiti bilo koja odgovarajuća ćelija domaćin za ekspresiju heterolognih ili endogenih nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo, njegov specificiran fragment ili varijantu, iz ovog pronalaska. Fuzionisane ćelije (hibridome) ili rekombinantne ćelije mogu se izolovati pomoću uslova selektivnih kultura ili nekim drugim poznatim prigodnim metodama, i takođe mogmogu biti klonirane pomoću ograničavanja razblaž.cnja ili odabira ćelija, ili nekih drugih poznatih metoda. Ćeli je koje proizvode antitela sa željenim specifičnostima mogu se selektovati odgovarajućim esejom (e.g., ELISA metodom).
Druge pogodne metode za proizvodnju ili izolaciju antitela željene specifičnosti mogu se koristiti, ukjučujući, ali nisu njima ograničene, metode koje selektuju rekombinantno antitelo izpeptidne ili proteinske biblioteke (e.g., ali nisu njima limitirane, bakteriofagne, ribozomalne, oligonukleotidne, RNK, cDNK ili slične izložene biblioteke; e.g., kao što su dostupne iz Cambridge Antibodv Technologies, Camridgeshire, UK; MorphoSvs, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Svveden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berlkely, CA; Ixsus. Videti e.g., EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; W092/16619: WO96/07754; (Scripps); EP 614 989
(MorphoSvs); W095/l6027 (Biolnvent);WO88/06630; WO90/3890 (Dyax); US 4,704,692 (Ezon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400;(Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys);; ili stohaksički dobijeni peptidi ili proteini - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, sada AppliedMolecular Evolution (AME)) ili retko po imunizaciji transgenih životinja (e.g., SCID miš, Ngvuen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al.,m Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 91996); Eren et al., Immunol. 93;154-161 (1998), kao i povezani
patenti i prijave) koji su sposobni za proizvodnju repertoara humanih antitela, kao stoje poznato u ovoj oblasti i/ili kako je ovde opisano. Takve tehnike, uključuju, ali nisu njima limitirane, "ribosomal display" (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:14130-14135 (Nov. 1998)(; tehnologije proizvodnje pojedinačne ćelije (e.g., metod selektovanog limfocitnog antitela (selected lymphocyte antybody method - "SLAM") (US pat. No. 5,627,052, vven et al., J.ImmunoI. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996); "gel microdroplet" i "flow" citometrija (Povvel et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., .1. Immun.Meth. 182:155-163
(1995) Kenney et al., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); selekcija B-ćelija
<*>Steenbakkers et al., Molec.Biol.Reports 19:125-134 (1994); Jonak et aaal., Progress Biotech, Vol5, ln vitro Immunization in Hybridoma Technologv, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Nethcrlands
(1988)).
Metode za inžinjering humanizovanih ne-humanih ili huamnih antitela se takođe može koristiti i dobro je poznata u ovoj oblasti. Uopšteno, humanizovana ili isprojektovano antitelo poseduje jdan ili više amino kiselinski ostataka iz izvora ne-humanog porekla, e.g., ali nije limitirana samo na miša, pacova, zeca, ne-humanog primata ili druge sisare. Ovi humani amino kiselinski ostaci često se označavaju kao "import" (uvezcn)(i) ostaci, koji se tipično uzimaju od "import" varijabilnog, konstantnog ili nekog drugog domena poznate humane sekvence. Poznate huamne !g sekvence su otkriven■•. e.g., www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phagc/hdb. lit lm; ww.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antybodyrcsource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/- pedro/research.tools.htm I ;wwvv.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/imrnunology/CH05/kuby05.htm; wwvvlibrary.thinkquest.org/12429/immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/! 996/vlab; www.path.cam.ac.uk/- mrc7/mikeimages.html; vvwwantibodyresource.com/; www.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/-hcenter/indeks.html; www.biotech.ufl.edu/-hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html;wwwnal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.rn.ehime-u.ac.jp/-yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/links.html; www.biotesh.ufl.edu/-fcc/protocol.html; vvww.isacnet.org/sites-geo.html;ax imtl.imt.uni-marburg.de/-rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/-jraats/loinks.htm;www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pubIic/INTRO.htmI; www.ibt.unam.mx/vir/V-mice.html; imgt.cnusc.fr.8l04/; www.biochem.ucl.ac.uk/-martin/abs/index.htlm; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; wwwunizh.ch/- honegger/AHOseminar/SlideOLhtml; www.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/- mrc7/humanisation/TAHHP.htlm; www.ibt.unam.mx/vir/struvture/stat-aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/- fmolina/web-pages/pept/spottech.html; www.jerin.de/fr-products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.htm; kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US. Dept. Health (1983).
Ovako importovane sekvence mogu se koristaiti za smanjenje imunogenosti ili za redukciju, pojačavanje ili modifikovanje vezivanja, afinitativnosti, "on-rate", "off-rate", avidity, specifičnosti, polu-života ili bilo koje druge poželjne karakteristike, što je poznato u ovoj oblasti. Generalno deo ili čitave nečhumane CDR sekvence sezadržavaju dok se nečhumane sekvence varijabilnih i konstantnih regiona zamenjuju sa humanim ili drugim amino kiselinama. Antitela mogu takođe opcionalno biti humanizovane uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i drugih željenih biološkij osobina. Da bi se ovo postiglo, humanizovana antitela mogu se opcionalno pripremiti procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanih proizvoda pomoću trodimenzionalnih modela roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su dostupni svima i poznati onima koji se bave ovim delom nauke. Dostupni su kompjuterski programi koji prikazuju i ilustruju pretpostavljene trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu pretpostavljene uloge u funkcionisanju kandidata imunoglobulinske sekvence, i.e., analizu ostataka koji utiču na mogućnost imunoglobulinskog kandidata da se veže za antigen. Na ovaj način, Fr ostaci mogu se selektovati i kombinovati iz konsenzusnih i importovanih sekvenci tako daje dobiju željene karakteristike antitela kao stoje na primer povećan afinitet za ciljni antigen(e). Generalno ostaci CDR su direktno suštinski uključeni u procese koji utiču na vezivanje antigena. Humanizacija ili konstrukcija antitela iz ovog pronalaska može se uraditi poznatim metodama, kao što suoni opisani u, ali nisu njima limitirani, Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeven et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151:2296(1993); Chotia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Čarter et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA) 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), US patent Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483,
5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539,; 4816567, PCT/:US98/16280,US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, uključujući reference koje su citirane u tom smislu.
vlnti-TNF antitelo takođe se može dobiti imunizacijom transgene životinje (e.g., miša, pacova, hrčka, ne-umanog primata, i sličnih) koje su sposobne da proizvedu repertoar humanih antitela, kao što je ovde opisano i/ili ka što je poznato u ovoj oblasti. Ćelije koje proizvode humano anti-TNF antitelo mogu se izolovati iz ovakvih životinja i prevesti u besmrtno stanje pomoću odgovarajućih metoda, kao što su one opisane ovde.
Transgeni miševi koji su sposobni da proizvode repertoar humanih antitela koja se vezuju za humane antigene, može se proizvesti poznatim metodama (e.g., ali nije limitirana njima, U.S. Pat. Nos: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 i 5,789,650 izdati Londberg et al.; Jakobovits et al., WO98/50433, Jakobovits et al., W098/24983, Londberg et al., WO 98/24884, Londberg et al., VVO 97/13852, Londberg et al., WG7 94/25585, Kucherlapten et al., WO 96/34096, Kucherlapten et al., EP 0463 15 1 B1, Kucherlapten et al., EP 0710 719 Al, surani et al, US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al, VVO 90/04036, Bruggemann et al, EP 0438 474 BI, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Tavlor et al, Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al. Nature Genetics 15:146-159 (1997), Tavlor et al, nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(8):3720-3724 (1993), Lonberg et al, Int Rev Immunol 13(1)65-93 (1995) i Fisgvvald et al, Nat Biotechnol 14(7)845-851
(1996)). Uopšteno, ovi miševi sadrže makar jedan transgen koji ima DNK iz makar jednog humanog imunoglobulinskog lokusa koji je funkcionalno rearanžiran, ili koji može podleći funkcionalnom rearanžiranju. Endogeni imunoglobulinski Iokusi kod ovakvog miša mogu biti prekinuti ili deletirani da bi se eliminisala sposobnost životinje da proizvodi antitela koja su kodirana endogenim genima.
Pregled (screening) antitela na specifično vezivanje za slične proteine ili fragmente može se konvencionalno postići pomoću (peptide displav libraries) biblioteka izloženih peptida. Ovaj metod obuhvata skrining ogromnih kolekcija peptida radi pronalaženja pojedinačnih članova koji imaju potrebne funkcije ili strukturu. Skrining antitela preko biblioteka izloženih peptida dobro je poznato u ovoj oblasti. Izložene peptidne sekvence mogu biti dugačke 3 do 5000 ili više amino kiselina, najčešće 5-100 amino kiselina, i često od 8 do oko 25 amino kiselina. Kao dodatak da bi se usmerili hemijske sintetičke metode za dobijanje peptidnih biblioteka, opisano je nekoliko metoda rekombinante DNK Jedan tip uključuje izlaganje peptidne sekvence na površini bakteriofaga ili ćelije. SAvaki bakteriofag ili ćelija sadrži nuklrotidnu sekvencu koja kodira određenu izloženu peptidnu sekvencu. Ovakve metode su opisane u PCT Patent Publications Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818 i93/08278. Drugi sistemi za dobijanje biblioteka peptida imaju aspekte obe, i hemijske sinteze i rekombinantnih metoda. Videt PCT Patent Publications Nos 92/05258, 92/14843 i 96/19256. takođe videti US Patent Publications Nos 5,658,754; i 5.643,768. Biblioteke izloženih peptida, vektor i kitovi za skrining su komercijalni i dostupni od snabdevača kao što su Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge antibodv Technologies (Cambridgeshire, UK). Videti e.g, U.S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, đodeljeno Enzon-u; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, đodeljeno Dyax-u; 5427908, 5580717, đodeljeno Affymax-u; 5885793 đodeljeno Cambridge antibody Technologies;5750373 đodeljeno Genetech-u; 5618920, 5595898,5576195, 5693493, 5698417, đodeljeno Xoma-i, Colligan-u, supra; Ausbel-u, supra; ili Sambrook-u, supra.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se takođe pripremiti upotrebom najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-TNF antitelo da bi se obezbedile transgene životinje ili sisari, kao koze, krave, konji, ovce,i slične, koje proizvode ovakva antitela u svom mleku. Ovakve životinje se mogu obezbediti pomoću poznatih metoda.Videti e.g, bez limitiranja na njih, US Patent nos. 5,827,690, 5,849,992, 4,873,316, 5,849,992, 5,994,616, 5,563,362, 5,304,489, i slični.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se dodatno pripremiti pomoću najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-TNF antitelo da bi se dobile transgene biljke i gajene biljne ćelije ( e.g, bez limitiranja na njih, duvan i kukuruz) koji proizvode takva antitela, specifične delove ili varijante u biljnim delovima ili ćelijskim kulturama od njih. Kao nel imitiraj ući primer, listovi transgenog duvana koji eksprimiraju rekombinantne proteine uspešno se koriste za dobijanje velikih količina rekombinantnih proteina, e.g, korišćenjem inducibilnog promotora, videti, e.g, Cramer et al, Curr. Top. Microbiol. immunol. 240:95-118 (1999) i reference citirane u tom radu. takođe transgeni kukuruz korišćrn je za ekspresiju sisarskih proteina za potrebe komercijalne proizvodnje, sa biološkim aktivnostima ekvivalentnim onima proizvedenim u drugim rekombinantnim sistemima ili prečišćenim iz prirodnog izvora. Videti, e.g, Hood et al, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) i reference koje su tu citirane.Takođe su antitela proizvedena u velikim količinama iz semena transgenih biljaka uključujući fragmente ar.titela, kao što su jednolarcčana antitela (scFv's) uključujući semena duvana i krtole krompira. Videti e.g, Conrad et al, Plant Mol. Biol. 38:101-109
(1998) i reference koje su tu citirane, tako antitela iz ovog pronalaska mogu biti proizvedena takođe pomoću transgenih biljaka, na osnovu poznatih metoda. Videti takode,e.g, Fisher et al.. Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct.
1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al, Plant Phvsiol. 109:341-6 (1995);Whitelam etal, Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); i reference koje su tu citirane.
Antitela iz ovog pronalaska mogu vezati humani TNF sa širokim opsegomafiniteta (KD). U poželjnijem ostvarenju, najmanje jedno humano MA (monoklonalno antitelo) iz ovog pronalaska može opcionalno da veže humani TNF sa visokim afinitetom. Na primer, humano Ma može vezati humani TNF sa KD jednakim ili manjim od 10<7>M, kao , bez limitiranja na njega; 0.1-9.9 (ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga) X IO"<1>, 10"\10", IO"<10>, 10", IO"<12>, 10", ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga.
Afinitet ili avidity antitela za antigen može se eksperimentalno odrediti pomoću bilo koje prigodne metode. (Videti, na primer, Berzofskv, et al, "Antibodv-Antigen Interactions," U Fundamental Immunologv, Paul, W. E, Ed, Raven Press: New York, NY (1984) Kubv, Janis, lmmunoIogy, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); i metode opisane u njima). Izmeren afinitet određenog antitela određene antitelo-antigen interakcije može da varira pod različiti uslovima (e.g, koncentracija soli, pH). Zatoje poželjno da se metenje afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena (e.g, KD, Ka, Kd) izvodi u standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i sa standardizovanim puferom, kao što je pufer koji je opisan ovde.
Molekuli nukleinskih kiselina
Koristeći informacije koje su ovde obezbeđene, molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska koji kodira najmanje jedno anti-TNF antitelo može se dobiti pomoću metoda opisanih ovde ili onih koje su poznate u ovoj oblasti.
Molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska mogu biti u formi RNK, kao što su iRNK, hnRNK, tRNK ili drugoj formi, ili u formi DNK, uključujući, ali ne limitirana njima, cDNK i genomska DNK dobijene kloniranjem ili proizvedene sintetički, ili bilo koja njihova kombinacija. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana, ili bilo koja njihova kombinacija. Bilo koji deo makar jednog lanca DNK ili RNK može biti kodirajući lanac, poznat kao "sense" lanac, ili može biti nekodirajući, poznat kao "anti-sense" lanac.
Ovde opisani izolovani molekuli nukleinskih kiselina mogu obuvatiti molekule nukleinskih kiselina koje sadrže otvoren okvir čitanja (ORF, open reading frame), opcionalno sa jednim ili više introna, e.g, ali nisu njima limitirani, makar jedan specificirani deo makar jedne CDR, kao CDR1, CDR2 i/ili CDR3 makar jednog teškog lanca (e.g, SEQ ID NOS: 1-3), ili lakog lanca (e.g, SEQ ID NOS.4-6); molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže kodirajuće sekvence za anti-TNF antitelo ili variajbilni region (e.g, SEQ ID NOS:7,8); i molekuli nukleinskih kiselina koje obuhvataju sekvence suštinski različite od ovde opisanih u tekstu iznad, ali koje usled izrođenosti genetskog koda, ipak i dalje kodiraju anti-TNF antitelo kao što je ovde opisano i/ili je poznato u ovoj oblasti. Naravno, genetski kod je dobro poznat u nauci. Zato bi bila rutina za nekoga koje obučen za ovu oblast nauke da generiše ovakav izrađene varijante nukleinskih kiselina koje kodiraju specifična anti-TNF antitela iz ovog pronalaska. Videti e.g, Ausubel et al, supra. Nelimitirajući primeri izolovanih molekula nukleinskih kiselina uključuju SEQ IDNOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, koji odgovaraju nelimitirajućim primerima kodiranja nukleinskih kiselina, istim redom, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 i LC CDR3.
Kao što je ovde ukazano, molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira anti-TNF antitelo može da uključi, ali ne da bude time limitiran, one koje same kodiraju amino kiselinske sekvence fragmenta antitela; kodirajuću sekvencu za celo antitelo ili njegov deo; kodirajuću sekvencu za antitelo, njegov deo, fragment, kao i dodatne sekvence, kao one kodirajuće sekvence za makar jedan "signal leader" (signalni/lider peptid) ili fuzioni peptid, sa ili bez. napred navedenih dodatnihkodirajućih sekvenci, kao mšto je makat jedan intron, zajedno sa dodatnim, nekodirajućim sekvencam, uključujući, bez limitiranja na njih, nekodirajuće 5' i 3' sekvence, kao transkribovane (one koje se prepisuju), netranslantovane (one koje se ne prevodejsekvence koje imaju ulogu u transkripciji, procesovanju (obradi) iRNK, uključujući splajsing i poliadenilacione signale (na primer- vezivanje ribozoma i stabilnost iRNK); dodatna kodirajuća sekvenca koja kodira za dodatne amino kiseline, kao one koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti. Tako sekvenca koja kodira dodatne amino kiselinemože se fuzionisati sa marker sekvencom, kao što je sekvenca koja kodira peptid koji olakšava prečišćavanje fuzionisanog antitela koje sadrži njegov deo ili fragment.
Konsti uisanje nukleinskih kiselina
Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se dobiti pomoću (a) rekombinantnih metoda (b) sintetičkim tehnikama (c) tehnikama prečišćavanja, ili njohovim kombinacijama, stoje poznato u ovoj oblasti.
Nukleinske kiseline mogu zgodno da sadrže sekvence, dodatne u odnosu na polinukleotid iz ovog pronalaska. Na primer, polilinker, mesto za kloniranja koje sadrži jedno ili više restrikcionih mesta za endonuklcaze, može se ubaciti u nukleinsku kiselinu da bi se pomoglo izolaciji polinukleotida. Takođe sevence koje se prevode u procesu translacije mogu se ubaci'.: da bi se olakšala izolacija translatovanog polinukleotida iz ovog pronalaska. Na primer heksa-histidin marker sekvenca obezbeđuje zgodan način za prečišćavanje proteina iz ovog pronalaska. Nukleinska kiselina iz ovog pronalaska isključujući kodirajuću sekvencu, je opcionalno vektor, adapter, iii linker za kloniranje i/ili ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska.
Dodatne sekvence mogu se dodati ovim sekvencama za kloniranje i/ili ekspresiju da bi se optimizovala njihova funkcija u kloniranju i/ili ekspresiji, da bi se pomogla izolacija polinukleotida, ili poboljšalo unošenje polinukleotida u ćeliju. Upotreba vektora za kloniranje, ekspresionih vektora i linkera je poznata u ovoj oblasti. (Videti, e.g, Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
Rekombinantne metode za konstruisanje nukleinskih kiselina
Sastav izolovanih nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska, kao RNK, cDNK, genomska DNK, ili njihova kombinacija, može se dobiti iz bioloških izvora koristeći različit broj metodologija poznatih onima koji se bave ovom oblašću. U nekim ostvarenjima, oligonukleotidne probe koje selektivno hibridizuju, pod strogim (stringent) uslovima, sa polinukleotidima iz ovog pronalaska, koriste se za identifikaciju željene sekvence u bibliotekama cDNK ili genomske DNK. Izolacija RNK, i konstruisanje biblioteka cDNK i genomske DNK, je dobro poznat onima sa običnim znanjem u ovoj oblasti (Videti, e.g, Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
Metode skrinovanja i izolacije nukleinskih kiselina
cDNK i genomske biblioteke mogu se skrinovati pomoću probe koja se bazira na sekvenci polinukleotida iz ovog pronalaska, kao što su one otkrivene ovde. Probe se mogu koristiti za hibridizaciju sa sekvencama genomske DNK ili cDNK da bi se izolovali homologi geni u istom ili drugim organizmima. Oni koji se bave ovom oblašću biće zadovoljni time što se može u eseju upotrebiti različiti stepeni strogosti (stringencv) hibridizacije; ili hibridizacijaili medijum za ispiranje mogu biti "stringent". Kako uslovi za hibridizaciju postaju sve strožiji ("stringent"), mora postojati viši stepen komplementarnosti između probe i targeta da bi se dogodilo formiranje dupleks formacije. Stepen "stringent" može se kontrolisati jednim ili više parametrom, temperaturom, jonskom jačinom, pH i prisustvom delimično denaturisanim rastvaračem kao što je formamid. Na primer "stringencv" hibridizacije se zgodno menja pramenom polariteta rastvora reaktanta (reactant solution), kroz na primer manipulaciju koncentracije formamida u opsegu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identitet sekvence) koji je potreban za vezivanje koje se može detektovati variraće u skladu sa "stringencv" hibridizacion^g medijuma i/ili medijuma za ispiranje. Stepen komplementarnosti bi bio optimalan 100%, ili 70-100%, ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ove. ivleđutim treba da se razume da male varijacije u sekvenci probe i prajmera mogu se kompenzovati redukcijom "stringent" medijuma za hibridizaciju i/ili ispiranje.
Metode za umnožavanje RNK ili DNK su dobro poznate u ovoj oblasti i mogu se koristiti na osnovu ovog pronalaska bez preteranog eksperimentisanja, bazirane na učenjima i vodstvu koje je ovde predstavljeno.
Poznate metode DNK ili RNK umnožavanja uključuju ali nisu njima limitirana, reakciju lančane polimeraze (PCR- Polimerase Chain Reaction) i srodni proceci amplifikacije (e.g., U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, za mullis et al,; 4,795,699 i 5,921,794 za Tabor, et al,; 5,142,033, za Innis; 5,122,464 za VVilson et al,; 5,091,310 za Innis; 5.066,584 za Gvllensten, et al,; 4.889,818 za Gelfand et al,; 4,994,370 za Silver et al; 4,766,067 za Bisvvas; 4,656,134 za Ringold) i RNK posredovana ampliftkacija koja upoterbljava anti-sense RNK za ciljnu sekvencu kao matrica za sintezu dvolančane dNK (U.S. Patent No. 5,130,238 za Malek et al sa zaštićenom markom, imenom NASBA), (videti, e.g, Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
Na primer, tehnika lančane reakcije polimeraze (PCR) može da se iskoristi za umnožavanje polintikleotidnih sekvenci iz ovog pronalaska i srodnih gena direktno iz cDNK ili genomskih biblioteka. PCR i drugein vitrometode za umnožavanje mogu takođe biti od koristi na primer, za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine koji treba da se eksprimiraju, za stvaranje nukleinskih kiselina koje će služiti kao probe za detekciju prisustva željene iRNK u uzorku, za sekvenciranje nukleinskih kiselina, i druge potrebe. Primeri tehnika koje su dovoljne da usmere obučene ljude iz ove oblasti kroz metode amlifikacije mogu se naći u Berger, supra, Sambrook, supra i Ausubel, supra, kao i Mullis te al, U.S Patent No 4,683,202 (1987); i Innis, et al, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds, Academic Press Ine, San Diego, CA (1990). Komercijalno dostupni kitovi za genomsko PCR umnožavanje poznati su u ovoj oblasti, videti, e.g, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Dodatno, e.g, T4 gen 32 protein (Boehringer Manheim) može se koristiti da bi se poboljšao prinos dugih PCR proizvoda.
Sintetičke metode za konstruisanje nukleinskih kiselina
Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se takođe pripremiti direktnom hemijskom sintezom pomoću poznatih metoda (videti, e.g, Ausubel, et al, supra) Hemijskom sintezom se generalno proizvodi jednolančani oligonukleotid, koji se može prevesti u dvolančanu DNK hibridizacijotn sa komplementarnom sekvencom, ili polimerizacijomsa DNK polimerazom koja koristi kao matricu pojedinačan lanac. Neko iz ove oblasti shvatiće daje hemijska sinteza DNK ograničena na sekvence od oko 100 ili više baza, dok se duže sekvence mogu dobiti ligacijom kraćih sekvenci.
Rekombinantne ekspresione kasete
Dalje ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantne ekspresione kasete koje obuhvataju nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. Sekvenca nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, na primer cDNK ili genomske sekvence koje kodiraju antitelo iz ovog pronalaska, mogu se koristiti za konstruisanje rekombinacionih ekspresionih kaseta koje se mogu ubaciti u makar jednog željenog domaćina. Rekombinaciona ekspresiona kaseta tipično sadrži polinukleotid iz ovog pronalaska operativno povezanog sa regulatornim sekvencama inicijacije transkripcije koje će diktirati transkripciju polinukleotida u željenoj ćeliji domaćinu. Oba promotora, i heterologi i nehetorologi (i.e. endogeni) mogu se upotrebiti za usmeravanje ekspresije nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.
U nekim ostvarenjima, izolovane nukleinske kiseline služe kao promotor, enhancer (pojačivač) ili neki drugi elementi, mogu se ubaciti na odgovarajućr mesto (uzvodno, nizvodno ili u intron) neheterologe forme polinukleotida iz ovog pronalaska tako da "up" ili "dovvn" regulišu (pojačavaju ili smanjuju) ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska. Na primer, endogeni promotori mogu se promenitiin vivoiliin vitromutacijom, delecijom i/ili substitucijom.
Vektori i ćelije domaćini
Ovaj pronalazak takođe se odnosi na vektore koji uključuju izlovane molekule nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska, ćelije domaćine koji su stvorene genetičkim inžeinjerstvom sa rekombinantnim vektorima, i na proizvodnju makar jednog anti -TNF antitela rekombinantnim tehnikama, stoje poznato u ovoj oblasti. Videti e.g, Sambrook, et al, supra; Ausubel, et al, supra.
Polinukleotidi mogu opcionalno spojeni sa vektorom koji sadrži selektivni marker za propagaciju u domaćinu. Generalno, plazmidni vektor se unosi u precipitat, kao stoje precipitat kalcijum fosfata, ili u kopmleksu sa naelektrisanim lipidom. Ako je vektor virus, može se upakovatiin vitropomoću odgovarajuće ćelije za pakovanje i zatim se procesom transdukcije ubaciti u ćelije domaćine. Ubačeno parče DNK trebalo bi biti operativno povezano sa odgovarajućim promotorom-Ekspresioni konstrukti dalje sadrže mesta za inicijaciju transkripcije, terminacije, i region koji se prepisuje (trenskribuje), mesto za vezivanje ribozoma u procesu translacije. Kodirajući deo zrelog iranskripta koji se eksprimira od strane konstrukata uključiće (poželjno je) na početku mesto za inicijaciju translacij i terminacioni kodon (e.g, UAA, UAG ili UGA), pozicioniran na odgovarajućem mestu na kraju iRNK koja se prevodi, poželjno sa UAA i UAG za sisarsku ili cukariotsku ekspresiju.
Biće poželjno ali opcionalno da ekspresioni vektori sadrže makar jedan selektivni marker. Ovakvi markeri uključuju rezistenciju na, e.g, ali nisu limitirani samo na njih, metotreksat (MTX), dihidrofolat reduktazu (DHFR, U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665, 4,656,134, 4,956,288, 5,149,636; 5,179,017, ampicilin, neomicin (G418), mikofenolna kiselina, ili glutamin sintetaza (GS, UP,Pat.Nos. 5,122,464, 5,770,359; 5,827,739) za kulture eukariotskih ćelija, i gene za rezistenciju na tetraciklin ili ampicilinza gajenjeE. colii drugih bakterija ili prokariota. Odgovarajući medijumi za gajenje i uslovi za gore opisane ćelije domaćine poznati su u ovoj oblasti nauke. Pogodni vektori biće već očigledni onima koji se bave ovom oblašću. Na ubacivanje vektorskog konstrukta u čeliju domaćina može se uticati sa kalcijum fosfatnom transfekcijom, DF.AR-dekstran posredovanom transfekcijom, katjonsko lilidno posredovanom transfekcijom, elektroporacijom, transdukcijom infekcijom ili drugim poznatim metodama. Ove metode su opisane u ovoj oblasti kao kod Sambrook, supra, Poglavlja 1-4 i 16-18; Ausubel, supra, Poglavlja 1,9,13,15,16.
Najmanje jedno antitelo iz ovog pronalaska može se eksprimirati u modifikovanoj formi, kao fuzioni protein, i može uključiti ne samo sekrecione signale, već i dodatne heterologe funkcionalne regione. Na primer, region sa dodatnim amino kiselinama, pogotovu onih sa naelektrisanjem, može se dodati na N-terminus antitela da bi se poboljšala stabilnost i otpornost u ćeliji domaćinu, tokom prčišćavanja, ili tokom kasnijih faza manipulacija i skladištenja. Takođe, peptidne delove (moieties) mogu se dodati antitelu iz ovog pronalaska da bi se olakšalo prečišćavanje. Ovakvi regioni mogu se ukloniti pre finalne pripreme antitela ili makar njihovi delovi. Ovakve metode su opisane u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima kao kod Sambrook, supra, Poglavlja 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, supra, Poglavlja 16, 17, i 18.
Oni koji se bave osnovnim problemima u ovoj oblasti su upućeni u ekspresione sisteme koji su dostupni, za ekspresiju nukleinsku kiselinu koja kodira protein iz ovog pronalaska.
Alternativno nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati u ćeliji -domaćinu pretvaranjem (manipulacijom) u ćeliji domaćinu koja sadrži endogenu DNK koja kodira antitelo iz ovog pronalasku. Ovakve metode su poznate u ovoj oblasti, e.g, kao što su opisane u US Patent Nos. 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746 i 5,733,761.
Sisarske ćelije predstavljaju ilustraciju ćelijskih kultura koje su korisne za proizvodnju antitela, njihovih specificiranih delova ili varijanti. Sisarski ćelijski sestemi često će biti u formi "monolavers" tj. ćelija koje su rasporođene u jednom sloju, ali mogu se koristiti i suspenzije ćelija ili bioreaktori. Veliki broj pogodnih domaćinskih, ćelijskih linija koje su sposobne da eksprimiraju intaktne glikozilovane proteine razvi jeno je u ovoj oblasti, i uključuje COS-1 (e.g, ATCC CRL 1650), COS-7 (e.g, ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (e.g, ATCC CRL - 10), CHO (e.g, ATCC CRL 1610), I BSC-1 (e.g, ATCC CRL -26) ćelijske linije, cos-7 ćelije, CHO ćelije, hep G2 ćelije, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 ćelije, HeLa ćelije i slične, koje su već dostupne i mogu se nabaviti od na primer, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.attc.org). Poželjne domaćinske ćelijske linije uključuju one koje vode poreklo iz limfnih organa kao ćelije mieloma ili limfoma. Poželjnije domaćinske ćelijske linije su P3X63Ag8.653 ćelije (ATrC Acession number CRL-1580) i SP2/0-Agl4 (ATTC Acession number CRL-1851).U naročito poželjnijem ostvarenju rekombinantna ćelija je P3X63Ag8.653 ćelija ili SP2/0-Agl4 ćelija.
Ekspresioni vektori za ove ćelije uključuju jednu ili više od sledećih kontrolnih sekvenci, kao što je, ali nisu limitirane na "origin" replikacije; promotor (e.g, kasne ili rane SV40 promotore, CMV promotor (US. Patent Nos. 5,168,062; 5,385,839), HSv tk promotor, pgk (fosfoglicerat kinaza) promotor, EF-1 alfa promotor (US. Patent No. 5,266,491), makar jedan humani imunoglobulinski promotor; enhancer, i/ili informativna mesta za obradu (processing information sites), kao mesto vezivanja ribozoma, mesta "splajsovanja" RNK, poliadenilovana mesta (e.g, SV40 velika T Ag poli A dodatno mesto - large T Ag poly A adition site), i sekvence za terminaciju transkripcije. Videti, e.g, Ausubelet al, supra; ili Sambrook et al, supra. Druge ćelije koje se mogu koristiti za proizvodnju nukleinskih kiselina ili proteina iz ovog pronalaskatakođe su poznate i/ili dostupne, kao na primer, kod American Tyoe Collection catalogue of cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ili nekog drugog poznatog izvora.
Kada se upotrebljavaju eukariotske domaćinske ćelije, karakteristično je da se u
vektor ubacuju sekvence za poliadenilaciju ili terminaciju. Primer za sekvencu za terminaciju je poliadenilatna sekvenca iz goveđeg gena za hormon rasta, takođe se mogu uključiti i sekvence za tačno "splajsovanje" transkripta. Primer za sekvencu za splajsovanje je VP1 intron iz SV40 (Sprague, et al, J. Virol. 45:773-781
(1983)). Dodatno genske sekvence za kontrolu replikacije u ćeliji domaćinu takođe se mogu ugraditi u vektor, kao što je poznato u ovoj oblasti.
Prečišćavanjeantitela
Anti-TNF antitelo može se izdvojiti i prečistiti iz kultura rekombinantnih ćelija poznatim metodama, uključujući, ali ne njima limitiran, prečišćavanje proteinom A, precipitacija amnijum sulfatom ili etanolom, kiselinska ekstrakcija, hromatografija izmenom anjona i katjona, fosfocelulozna hromatografija, hromatografija pomoću hidrofobne interakcije, afinitativna hromatografija, hidroksilapatit hromatografija i lecitinska hromatografija. High performance liquid chromatography (HPLC) (tečna hromatografija visoke performanse), može se takođe upotrebiti. Videti, e.g, Colligan Current Protocols in Immunologv, ili Current Protocols in Protein Science, John Wiley& Sons, NY, NY (1997-2000), e.g. Poglavlja I, 4, 6, 8, 9, 10.
Antitela iz ovog pronalaska obuhvataju prirodno prečišćene proizvode, proizvode dobijene hemijskim sintetičkim procedurama, i proizvode dobijene rekombinantnim tehnikama iz eukariotskog domaćina, uključujući, na primer ćelije kvasca, viših biljaka, insekata i sisara. U zavisnosti koji se domaćin koristi u procedurama rekombinantne proizvodnje, antitelo iz ovog pronalaska može biti glikozilovano ili može biti neglikozilovano, ali je glikozilovano poželjnije. Ovakve metode opisane su u mnogim laboratorijskim priručnicima, ka Sambrook, supra, odeljci 17.37-17.42; Ausubel, supra, poglavlja 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, supra, poglavlja 12-14.
Anti-TNF antitela
Izolovana antitela iz ovog pronalaska sadrže specifične amino kiselinske sekvence antitela u vezi sa priloženim patentnim zahtevima koje su kodirane pogodnim polinukleotidom ili bilo kojim izolovanim ili pripremljenim antitelom. Poželjno je da humano antitelo vezuje humani TNF, i tako delimično ili u potpunosti neutrališe makar jednu biološku aktivnost proteina. Antitelo, koje delimično ili poželjnije u potpunosti neutrališe makar jednu biološku aktivnost makar jednog TNF proteina ili njegovog fragmenta, može da vezuje protein ili fragment i tako inhibira aktivnosti posredovane kroz vezivanje TNF-a za receptor za TNF ili kroz druge TNF-zavisne ili posredovane mehanizme. Ovde upotrebljen izraz "neutrališuće antitelo" odnosi se na antitelo koje može da inhibirabilo koju TNF zavisnu aktivnost za oko 20-120%, poželjno za oko 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ili više u zavisnosti od eseja. Kapacitet anti-TNF antitela da inhibira TNF zavisnu aktivnost poželjno je da se proceni makar jednim TNF proteinskim ili receptor esejom kao stoje ovde opisano i/ilije poznato u ovoj oblasti. Humano antitelo iz ovog pronalaska može pripadati bilo kojoj klasi (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itd) ili izotop i može da sadrži kappa ili lambda laki lanac. U jednom ostvarenju, humano antitelo sadrži IgG teški lanac ili njegov dcfinisan deo, na primer, makar jedan od izotipova, IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. Antitela ovog tipa mogu se pripremiti upotrebom transgenog miša ili drugog transgenog ne-humanog sisara koje sadrži makar jedan humani transgeni lak lanac (e.g, IgG, IgA i IgM (e.g, yl, y2, y3, y4)) kao što je ovde opisano i/ili poznato u ovoj oblasti. U drugom ostvarenju anti-humano TNF humano antitelo sadrži IgGl teški lanac i IgGl laki lanac.
Makar se jedno antitelo iz ovog pronalaska vezuje za makar jedan specificiran epitop koji je specifičan za makar jedan TNF protein, njegovu subjedinicu fragment, deo ili bilo ko ju kombinaciju istih. Makar jedan epitop može da sadrži makar jedan region za vezivanje antitela koji sadrži makar jedan deo pomenutog proteina, poželjno je de taj epitop sadrži makar jedan ekstracelularan, solubilan, hidrofiian, eksterni ili citoplazmatski deo pomenutog proteina. Makar jedan specificirani epitop može da sadrži bilo koju kombinaciju makar jedne amino kiselinske sekvence od najmanje 1-3 amino kiseline od sveukupnog specificiranog dela susednih amino kiselina od SEQ ID NOS: 9.
Antitelo prema ovom pronalasku je antitelo koje sadrži regione koji određuju komplemetranost (CDRs) teškog lanca i pormenjive Tramework' regione (FRs) mAb TNV 148 kao što je prikazano na slici 4; i CDRs lakog lanca i promenjive FRs mAb TNV148 kao stoje prikazano na slici 5; opciono još sadrži specifičnu supstituciju prolina u serin u FR3 mAb TNV 148B kao što je prikazano na slici 4. Ovakva antitela mogu se pripremiti hemijskim pripajanjem različitih delova (e.g, CDR-a, framevvork) antitela pomoću konvencionalnih tehnika pripremom i ekspresijom (jednog ili više) molekula anuklinskih kiselina koje kodiraju antitelo pomoću konvencionalnih tehnika rekombinantne DNK tehnologije ili pomoću bilo koje druge odgovarajuće metode.
Anti-TNF antitelo može da sadrži varjabilne regione teškog i lakog lanca jednog od mAb TnV148 i mAb TNV MSB kao što je prikazano na slikama 4 i 5. Antitela koja se vezuju za humani TNF i koji obuhvataju definisan varijabilnih region teškog lanca ili lakog lancamogu se pripremiti odgovarajućim metodama, kao što je izlaganje faga (phage displav) (Katsube, Y, et al, Int. J. Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)) ili pomoću metoda sa transgenim životinjama kao one poznate u ovoj oblasti i/ili koje su ovde opisane. Na primer transgeni miš, koji sadrži funkcionalno rearanžiran ttransgen za težak lanac humanog imunoglobulina i transgen koji sadrži DNK iz humanog imunoglobulinskog lokusa za lak lanac koji može podvrći funkcionalnom rearanžiranju, može biti imunizovan sa humanim TNF-om ili njegovim fragmentom da bi se izivala produkcija antitela. Ako je potrebno ćelije koje proizvode antitela mogu se izolovati i hibridome ili druge besmrtne ćelije koje proizvode antitela mogu se pripremiti kao što je ovde opisano i/ili kao Stoje poznato u ovoj oblasti. Alternativno, antitelo, specificiran deo ili varijanta mogu se eksprimirati pomoću nukleinske kiseline ili njenog dela u pogodnoj domaćinskoj ćeliji.
Konzervativna substitucija amino kiselina odnosi se na zamenu prve amino kiseline drugom amino kiselinom koja poseduje hemijske i/ili fizičke osobine (e.g, šarža, struktura, polaritet, hidrofobnost/hidrofilnost) slične onima koje poseduje prva amino kiselina. Konzervativne substitucije uključuju zamenu jedne amino kiseline sa drugom u okviru sledećih grupa: lizin (K), arginin (R) i histidin (H); aspartat (D) i glutamat (E); asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D i E; alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (P), triptofan (W), metionin (M), cistein (C) i glicin (G); F, W i Y; C, S i T.
Aminokiselinskikodovi
Amino kiseline koje ulaze u satav anti-TNF antitela iz ovog pronalaska se često predstavljaju skraćenicama. Označavanje amino kiselina može biti usmereno ka tome da se svaka amino kiselini predstavi kodom od jednog slova, tri slova, imenom, ili kodonom(ima) od tri nukleotida kao što se radi u ovoj oblasti (see Alberts, B, et al, Molecular Biology of The Cell, Third Ed, Garland Publishing, Ine, Nevv York, 1994)
Anti-TNF antitelo iz ovog pronalaska može da uključi jednu ili više amino kiselinskih substitucija, delecija ili adicija, ili usled prirodnih mutacija ili zbog čovekove manipulacije, kao stoje ovde specificirano.
Naravno obučena osoba učiniće da broj amino kiselinskih substitucija zavisi od mnogih faktora, uključujući gore opisane. Uopšteno govoreći broj amino kiselinskih substitucija, insercija ili delecija za bilo koje dato anti-TNF antitelo neće biti veće od 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10,9, 8, 7, 6,5,4,3,2, 1, kao 1-30 ili bilo koji opseg u okviru tih vrednosti kao što je ovde specificirano.
Amino kiseline iz anti-TNF antitela iz ovog pronalaska, koje su esencijalne za njegovo funkcionisanje, mogu se identifikovati metodama koje su poznate u ovoj oblasti, kao što je "site directed" mutageneza ili "alanine-scanning" mutageneza (e.g, Ausubel, supra, Poglavlje 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Na osnovu druge procedure uvode se pojedinačne alaninske mutacije na svakom ostatku u molekula. Dobijeni mutanlni molekuli zatim se testiraju biološke aktivnosti, kao na primer ali nisu njime limitirane, neutrališuća aktivnost TNF-a. Mesta koja su kritična za vezivanje antitela mogu se takođe identifikovati strukturnom analizom kao kristalizacijom, nukleaernom magnetnom rezonancom ili fotoafinitativnim obeležavanjem (Smith, et al, J. Mol Biol. 224:899-904 (1992) i de Vos et al, Science 255:306-312 (1992)).
Oni iz ove oblasti ceniće što ovaj pronalazak uključuje makar jedno biološki aktivno antitelo iz ovog pronalaska. Biološki aktivna antitela imaju specifičnu aktivnost od 20%, 30%, ili 40%, poželjno je 50%, 60%, ili 70%, i najpoželjnije 80%, 90%, ili 95%-1000% od nativnog i (ne-sintetičkog), endogenog ili srodnog i poznatog antitela. Metode eseja i kavntifikovanje rezultata enzimatske aktivnosti! substratne specifičnosti, poznate su onima koji se bave ovom oblašću.
U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na ovde opisana humana antitela, koja su modifikovana tako što je kovalentnim vezivanjem dodat organski deo. Ovakve modifikacije modu proizvesti antitelo sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama (e.g, produženin vivopoluživot u serumu). Organska polovina može biti linearna ili razgranata hidrofilna polimerna grupa, masno kiseiinska grupa, ili masno kiseiinska estarska grupa. U posebnom ostvarenju, hidrofilna polimerna grupa može imati molekulsku težinu od 800 do oko 120,000 Daltona i može biti polialkan glikol, (e.g, polietilen glikol (PEG)), polipropilen glikol (PPG)), karbohidratni polimer, amino kiselinski polimer ili polivinilni pirolidon, i masna kiselina ili estar masne kiseline množe obuhvatiti od osam do oko četrdeset atoma ugljenika.
Modifikovana antitela iz ovog pronalaska mogu sadržati jednu ili više organskih dodataka (moietv) koji su kovalentno vezeni direktno ili indirektno za antitelo. Svaki organski deo koji je vezan za antitelo iz ovog pronalaska može nezavisno biti hidrofilna polimerna grupa, grupa masne kiseline, ili estarska grupa masne kiseline. Kao što se ovde koristi izraz "masna kiselina" obuhvata monokarboksilne kiseline i đikarboksilne kiseline. "Hidrofilna polimerna grupa", izraz koji se ovde koristi, odnosi se na organski polimer koji je bolje rastvorljiv u vodi nego u oktanu. Tako antitelo modifikovano kovalentnim vezivanjem polizinaje obuhvaćeno ovim pronalaskom. Hidrofilni polimeri pogodni za modifikovanje antitela ovog pronalaska mogu biti linrarni ili razgranati, i oduhvataju na primer, polialkan glikole (e.g, PEG, monometoksi-polietilen giikol (mPEG), PPG i slične), ugljene hiđrate (e.g, dekstran, celuloza, oligosaharidi, polipropilen oksid i slični) i polivinil pirolidin. Poželjno je da hidrofilni polimer koji modifikuje antitelo iz ovog pronalaska ima molekulsku težinu od oko 800 do oko 150,000 Đakona kao odvojen molekularni entitet. Može se koristiti na primer PEG50ooi, PEG2fl,ooo, naznačeno time da je zbir (subscript) prosečna molekularna težine polimera u đakonima. Hidrofilna polimerna grupa može se zameniti sa jednom ili oko šest alkil grupa, grupa masnih kiselina ili grupa estara masnih kiselina. Hidrofilni polimeri koji su subtituisani sa grupama masnih kiselina ili estarskim grupama mogu se pripremiti pomoću odgovarajućih metoda. Na primer, polimer koji sadrži amino grupu može se povezatisa karboksilatom masne kiseline ili estra masne kiseline, i aktiviran karboksilat (e.g, aktiviran sa N,N-karbonil diimidazolom) iz masne kiseline ili estra masne kiseline može se povezati hidroksilnom grupom na polimeru.
Masne kiseline ili estri masnih kiselina koji su pogodni za modifikovanje antitela iz ovog pronalaska mogu biti saturisani ili sadrže jednu ili viže jedinica nesturacije. Masne kiseline koje su pogodne za modifikovanje antitela iz ovog pronalaska uključuju, na primer, n-dodekanoat (C|2, laurat), n-tetradekanoat (C,4, arahidat), n-oktadekanoat (C,8, stearat), n-eikosanoat (C20,arahidat), n-dokosanoat (C22, behenat), n-triakontanoat (C30), n-tetrakontanoat (C40), c/.v-A9-oktadekanoat (C,g, oleat), svicis- A5,%, \ 1,14-eikosatetraenoat (C20,arahidonat), oktandioična kiselina, tetradekandioična kiselina, oktadekandioična kiselina, dokosandioična kiselina, i slične. Pogodni estri masnih kiselina uključuju mono-estre dikarboksilnih kiselina koje sadrže linearnu ili granajuću nižu alkil grupu. Niža alkil grupa može da obuhvati od jedan do oko dvanaest, poželjno je jedan doko šest atoma ugljenika.
Modifikovana humana antitela mogu se pripremiti pogodnom metodom, kao što je reakcija sa jednim ili više modifikujućih agensa. "Modifikujući agens", izraz koji se koristi ovde, odnosi se na pogodnu organsku grupu (e.g, hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline) koja sadrži aktivirajuću grupu. "Aktivirajuća grupa" je hemijski deo ili funkcionalna grupa koja može pod odgovarajućim uslovima, može da reaguje sa drugom hemijskom grupom i tako formira kovalentnu vezu između modifikujućeg agensa i druge hemijske grupe. Na primer, amin reaktivne aktivirajuće grupe uključuju elektrofilne grupe kao što su tozilat, mezilat, halo (hloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroksisukcinimidil estri (NHS) i slični. Aktivirajuće grupe koje mogu reagovati sa tiolima, uključuju, na primer, maleimid, jodoacetil, akrilolil, piridil disulfide, tiol 5-tiol-nitrobenzoične kiseline (TNB-tiol), i slični. Aldehidna funkcionalna grupa može se povezati sa molekulima koji sadrže amin- ili hidrazid, i azidna grupa može da reaguje sa trovalentnom fosforskom grupom i dobija se fosforamidatna ili fosforimidna povezivanja. Pogodne metode za ubacivanje aktivirajućih grupa u molekule poznati su u ovoj oblasti (videti na primer, Hermanson, G. T, Bioconjugate Tchniques, Academic Press; san Diego, CA (1996)). Aktivirajuća grupa može direktno biti vezana za organsku grupu (e.g, hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline), ili preko linkerskog dela, na primer dvovalentne C,-Ct2grupe, naznačeno time da se jedan ili više atoma ugljenika mogu zameniti heteroatomom kao stoje, kiseonik, azot ili sumpor. Pogodan linkerski deo uključuje na primer, tetraetilen glikol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH i - CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-NH-. Modifikujući agensi koji sadrže linkerski deo mogu se proizvesti, na primer, reakcijom mono-Boc-alkildiamina (e.g, mono-Boc-etilendiamin, mono-Boc-diaminoheksan) sa masnom kiselinom u prisustvu l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) da bi se formirala amidna veza između slobodnog amina i karboksilata masne kiseline. Boe zaštitna grupa može se ukloniti iz produkta tretiranjem sa trifluoracetilnom kiselinom (TFA) da bi se otkrio primarni amin koji se može povezati sa drugim karboksilatom kao što je opisano, ili može da reaguje sa maleičnim anhidridom i dobijeni proizvod je preveden u ciklično stanje (cvclized) da bi se dobio aktiviran malemiđo derivat masne kiseline. (Videti za primer, Thompson, et al, WO 92/16221).
Modifikovana antitela iz ovog pronalaska mogu se proizvesti reakcijom humanog antitela sa modifikujućim agensom. Na primer organski delovi mogu se vezati za antitelo na "non- site" specifični način upotrebom amin-reaktivnog modifikujućeg agensa, na primer, NHS estar ili PEG. Modifikovana humana antitela mogu se takođe pripremiti redukujući disulfidne veze (e.g, sulfidne veze između lanaca) antitela ili fragmenti za vezivanje antigena. Redukovano antitelo može zatim reagovati sa tiol-reaktivnim modifikujućim agensom da bi se proizvelo modifikovano antitelo iz ovog pronalaska. Modifikovana humana antitela koja sadrže organski deo koji je vezan za specifično mesto na antitelu iz ovog pronalaska mogu se pripremiti uz pomoć pogodnih metoda, kao što je reverzna proteoliza (Fisch et al,Bioconjugate Chcm,3:147-153 (1992; Werlen et al,Bioconjugate Chetn.5:411-417 (1994); Kumaran et al,ProteinSci.6(10):2233-2241 (1997); Itoh etal,Bioorg. Chcm.,24(l):59-68 (1996): Capellas et al,Biotechnol. Bioeng.,56(4):456-463(1997)), i metode opisane u Hermanson, G. T,Bioconjugate Tehniques,Academic Press:San Diego , CA (1996).
KOMPOZICIJE ANTI-TNF ANTITELA
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jedan sastav anti-TNF antitela koji sadrži makar jedno, makar dva, makar tri, makar četiri, makar pet, makar šest ili više anti-TNF tela od njih, kao što je opisano ovde, i/i-li je poznato u ovoj oblasti, koja su obezbeđena u kompoziciji, mešavini ili formi koja se ne pojavljuje u prirodi.
Kompozicije anti-TNF antitela iz ovog pronalaska dalje mogu da obuhvate makar jednu od pogodnih i efektivnih količina kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedno anti-TNF antitelo od ćelije, tkiva, organa, životinje ili pacijenta sa potrebom za ovakvu modulaciju, tretman ili terapiju, opcionalno dalje sadrži makar jedan selektovani iz makar jednog TNF antagonista (e.g, ali bez limitacije na TNF antitelo ili fragment, solubilan TNF receptor ili fragment, njegov fuzioni protein, ili mali molekul TNF antagonista), antireumatika (e.g, metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatioprin, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokin sulfat, leflunomid, sulfasalzin), mišićnog relaksanta, narkotika, ne steroidnog anti-inflaminatornog leka (NSAID), analgezika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromišićnog blokatora, antimikrobialnog (e.g, aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (e.g, epoetin alfa), "filgastrim" (e.g, G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacije, imunoglobulina, imunosupresora, (e.g, basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitoraza leukotriena, metilksantina, kromolina epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvtne), citokina ili citokin antagonista ili antitela. Nelimitirajući primeri ovakvih citokina uključuju ali nisu njima limitirani, bilo koji IL-1, IL-23, IL-6, anti tumorska antitela, hemoterapeutske agense, ili radiacione terapije. Pogodne doze su poznate u ovoj oblasti. Videti, e.g, \Vells et al, eds, Pharmacotherapv J landbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia
(2000), Deluxe edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).
Ovakve anti-kancerogene ili anti-infektivne mogu uključiti molekule toksina koji su povezani, vezani, ko-formulisani, zajedno se daju, sa makar jednim antitelom iz - ovog pronalaska. Toksin opcionalno može da selektivno ubije patološku ćeliju ili tkivo. Ovakvi toksini mogu biti ali nisu njima limitirani, prečišćeni ili rekombinantni toksini ili njihovi fragmenti koji sadrže makar jedan citotoksični domen toksina, e.g, selektovan od jednog od sledećih: ricin. difterija toksin, "venom" (otrov iz zmije, pauka, škorpije ili slične životinje) toksin, ili bakterijski toksin. Izraz toksin takocte uključuje oba endotoksine i egzotoksine koje proizvodi bilo koja prirodna, mutantna ili rekombinantna bakterija ili virusi, koji mogu da izazovu bilo koje patološko stanje u čoveku ili drugim sisarima, uključujući toksinski šok, koji može da se završi smrću. Ovakvi toksini mogu da uključe, ali nisu njima limitirani, enterotoksikogeni toplptno osetljiv enterotoksin /:'.coli(LT), toplotno stabilan enterotoksin (ST), citotoksin izShigella,enterotoksin i izAeromonas- a,toksin-1 toksičnog šok sindroma (TSST-1), stafilokokni enerotoksin A (SEA), B (SEB), ili C (SEC), streptokokni enterotoksini i slični. Ovakve bakterije uključuju, ali nisu njima limitirane, bakterijske sojeve vrstaenteroksigenska E. coli (ETEC), enterohemoralgična E. coli (e.g,sojevi serotipa 0157:H7),Staphyllococcus species(e.g,StaphylIococcus aureus, Staphvllococcus pyogenes), Shigellaspecies ( e.g,Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydiiiShigella sonnei), Salmonellaspecies (e.g,Salmonella typhi, Salmonella cholera- suis, Salmonella eneritidis), Clostridiumspecies (e.g,Clostridium perfringes, dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacterspecies (e.g,Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), Helicobacterspecies (e.g,Helicobacter pvlori), Aeromonasspecies (e.g,Aeromonas sobna, Aeromonas
hydrophylla, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Versinia
enterocolitica, Vibriosspecies (e.g,Vibrios cholerae, Vibrios parachemolylicus), Klebsiella species, Pseudomonas aeruginosa,iStreplococci.Videti e.g, Stein, ed, INTERNAL MEDICINE, 3rd ed, pp 1-13, Little, Brovvn and Co, Boston
(1990); Evans et al, eds, Bacterial Infectious of Humans: Epidemiologv and Control, 2nd ed, pp 239-254, Plenum Medcal Book Co, Nevv York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3rd Ed, Churchill Livingstone, Nevv York (1990); Berkovv et al, eds, The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co, Rahway, NJ, 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990).
Anti-TNF antitelo tj njegova jedinjenja, sastav ili njihova kombinacija iz ovog pronalaska može dalje da sadrži makar jedan od pomoćnih delova kao što je, ali nije njime limitiran, kao što je razblaživač, onaj koji vezuje (binder), stabilizator, puferi, soli, liofilizovani rastvarači, prezervativi, adjuvant ili slični. Farmaceutski prihvatljive pomoćne tvari su poželjne. Neiimitirjući primeri i metode za pripremanje ovakvih sterilnih rastvora poznate su u ovoj oblasti, kao na primer, ali bez limitiranja, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciencee, 18th Edition, Mack publishing Co. (Easton, PA) 1990. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu se rutinski selektovati, da budu pogodni za administraciju, rastvorljivost i/ili stabilnost TNF antitela, kompozicije kao što je poznato u ovoj oblasti ili je ovde opisano.
Farmacutski ekscipijeni i aditivi korisni za ovde opisanu kompoziciju uključuju, bezi limitiranja, proteine, peptide, amino kiseline, lipide, i ugljene hidrate (e.g, šećeri, uključujući monosaharide, di-, tri-, tetra- i oligošaharide; derivate šećera kaošto su alditoli. aldolne kiseline, esterifikovane šećere i slične; i polisaharide ili polimere šećera), koji mogu biti prisutni pojedinačno ili u kombinaciji, sadržavajući sami ili u kombinaciji 1-99.99% po težini ili zapremini. Egzamplarni proteinski ekspicijenti uključuju serum albumin ka humani serum albumin (HSA), rekombinantni humani albumin (rllA), želatin, kazein, i slični. Reprezentativne komponente amino kiseiine/antitela, koje takođe mogu funkcionisati u pufcrskom kapacitetu (buffer capacitv), uključuju alanin, glicin, arginin, betain, histidin, glutaminska kiselina, aspartanska kiselina, cistein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aspartam, i slične. Jedna amino kiselina koja je poželjna je glicin.
Ekspicijenti ugljenih hidrata pogodni za upotrebu u ovom pronalasku uključuju, na primer, monosaharide kao stoje fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza D-manoza, sorboza i slični; disaharide kao laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slične; polisaharide, kao rafinoza, melezitoza. maltodekstrini, dekstriani, škrobovi, i slični; i alditoli, kao manitol, ksilitol, maltitol, lacitol, ksilitol sorbitol(glucitol), mionozitol i slični. Poželjni ugljohidratni ekspicijenti za upotrebu u ovom pronalasku su manitol, trehaloza i rafinoza.
Kompozicije anti-TNF antitela može takođe uključiti pufer ili pH podešavajući agens; tipično pufer je so pripremljena iz organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi uključuju soli organskih kiselina kao soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, ugljene kiseline, tartarne kiseline, sukcinilne kiseline, sirćetne kiseline, ili ptalične kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid ili fosfatni puferi. Poželjni puferi za upotrebu u ovoj kompoziciji su soli organskih kiselina kao na primer citrat.
Dodatno, kompozicije anti-TNF antitela iz ovog pronalaska mogu uključiti polimerne ekspicijente/aditive kao polivinilpirolidoni, fikoli (polimerni šećer), dekstarti (e.g, ciklodekstrini, kao 2-hidroksipropiI-p-cikIodekstrin), polietilen glikoli, agensi za ukus (flavoring agensi), antimikrobijalni agensi, zaslađivači, antioksidanti, antistatički agensi, "surfactans" (površinski aktivni agensi) (e.g, polisorbati kao "TVVEEN 20" i "TWEEN 80"), lipidi (e.g, fosfolipidi, masne kiseline), steroidi (e.g, holesterol), helti (e.g, EDTA).
Ovi i drugi dodatni farmaceutski ekspicijeni i/ili aditivi pogodni za upotrebu u kompozicijama anti-TNF antitela, na osnovu pronalaska poznati su ovoj oblasti, e.g, navedeno kao "Remington: Science & Practice of Pharmacv" 19th ed, Williams& Williams, (1995), i u "Phvsicianžs Desk reference", 52nd ed, Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Poželjni nosači ili ekspicijentni materijali su ugljrni hidrati (e.g, saharidi i alditoli) i puferi (e.g, citratni) ili polimerni agensi.
FORMULACIJE
Kao stoje notirano u tekstu iznad, ovaj pronalazak obezbeđuje stabilne formulacije, poželjno je fosfatni pufer sa fiziološkim rastvorom ili odabranom solju, kao i konzervirane rastvore koje sadrže konzervanse kao i višenamenske sačuvane formulacije pogodne za upotrebu u farmaciji ili veterini, koji se satoje od makar jednog anti-TNF antitela u formulaciji kojaje farmaceutski prihvatljiva. Konzervirane formulacije sadrže makar jedan poznati konzervans ili opcionalno odabran iz grupe koja se satoji od makar jednog fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, fenilživinog nitrata, fenoksietanola, formaldehida, hlorobutanola, tnagnezijum hlorida (e.g, heksahidrat), alkilparabena (metil, etil, propil, butil i slični), benzalkonijum hlorida, benzetonijum hlorida natrijum dehidroacetat i timerosala, ili njihove mešavine u vodenom rastvaraču. Bilo koja pogodna koncentracija ili mešavina može se upotrebiti kao što je poznato u ovoj oblasti, kao 0.001-5% ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru toga, kao ali bez limitiranja, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02,0.03,0.05,0.09, 0.1,0.2, 0.3,0.4,0.5,0.6, 0.7,0.8,0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, koji opseg ili vrednost u okviru toga. Nelimitirajući primeri uključuju, bez konzervansa, 0.1-2% m-krezol (e.g, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% benzil alkohol (e.g, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% timerosal (e.g, 0.005, 0.01), 0.001-2% fenol (0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%(, 0.0005-1.0% alkilparabeni (e.g, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) i slični.
Kao što je notirano u tekstu iznad, ovaj pronalazak obezbeđuje član (article) proizvođača, koji se sastoji od materijala za pakovanje i makar jedne vajle koja sadrži rastvor makar jednog anti-TNF antitela sa preporučenim puferima i/ili prezervativima, opcionalno u vodenom rastvaraču, naznačeno time da pomenuti materijal za pakovanje ima etiketu na kojoj se ukazuje na to da se ovakav rastvor može držati tokom perioda od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 sata ili duže. Ovaj pronalazak dalje obuhvata član proizvođača, koji se sastoji od materijala za pakovanje, prve vajle koja sadrži liofilizovano makar jedno anti-TNF antitelo i drugu vajlu sa vodenim rastvaračem preporučenog pufera ili konzervansa, naznačeno time da materijal za pakovanje ima etiketu na kojoj se ukazuje pacijentu da rekonstituiše makar jedno anti-TNF antitelo u vodenom rastvaraču da bi se formirao rastvor koji se može držati tokom perioda od 24 časa ili duže.
Makar jedno anti-TNF antitelo upotrebljeno u skladu sa ovim pronalaskom, može se proizvesti rekombinantnim načinima, uključujući iz ćelija sisara ili pripremom trensgena, ili može biti pročišćeno iz nekog drugog biološkog izvora, kao što je ovde opisano ili poznato u ovoj oblasti.
Opseg makar jednog anti-TNF antitela u proizvodu iz ovog pronalaska uključuje količine dobijene po rekonstituciji, u vlažno/suvo sistemu, koncentracije od oko 1.0 pg/ml do oko 1000 mg/ml, iako se može raditi i sa nižim i višim koncentracijama koje zavise od vozila za dostavu sa kojim se namerava da radi, e.g, formulacije rastvora će se razlikovati kod transdermalnih flastera, pulmonarnog, transmukoznog ili osmotskog ili metoda mikro pumpe.
Poželjno je da, opcionalno vodeni rastvarač dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv konzervans. Poželjni konzervansi uključuju one selektovane iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metil, etil, propil, butil, i slični), benzalkonium hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili njihove kombinacije. Koncentracija konzervansa upotrebljenih u formulaciji je koncentracija dovoljna da dovede do anti-mikrobijalnog efekta. Ovakve koncentracije zavise od konzervansa koji je selektovan i već su određene od strane obučenih u ovoj oblasti.
Drugi ekscipijenti, e.g, izotonični agensi, puferi, antioksidanti, enhanceri konzervansa, mogu se opcionalno, a i poželjno je, dodati rastvaraču. Izotonični agens, kao stoje glicerin, često se upotrebljava u poznatim koncentracijama. Fiziološki tolerantan pufer poželjno je dodati da bi se obezbedila bolja kontrola pH. Formulacije mogu pokriti širok opseg pH, kao od oko pH 4 do oko pH 10, i poželjnije opsege od oko pH 5 do oko pH 9, i najpoželjnije opseg od oko 6.0 do oko pH 8.0. Poželjno je da formulacija iz ovog pronalaska ima pH između 6.8 i oko 7.8. Poželjni puferi uključuju fosfatne pufere, najpoželjnije natrijum fosfat, pogotovu fosfat puferovan u fiziološkom rastvoru (phosphate buffered saline
PBS).
Drugi aditivi, kao farmaceutski prihvatljivi rastvarači kao Tween20 (poliksietilen (20) sorbitan monolaurat), Tvveen 40 (poliksietilen (20) sorbitan monopalmitat, Tvveen 80 (poliksietilen (20) sorbitan monooelat), Pluronic F68 (polietilksilen polioksipropilen blok kopolimeri), i PEG (polietilen glikol) ili nejonski "surfactants" (površinski aktivni agensi) kao polisorbat 20 ili 80 ili poloksamer 184 ili 188, PluronicRpolis, drugi blok ko-polimeri, i helatori kao EDTA i EGTA, mogu se opcionalno dodati formulaciji ili kompoziciji da bi se smanjila agregacija. Aditivi su pogotovo korisni ako je pumpa ili plastični kontejner upotrebljen za administraciju formulacije. Prisustvo farmaceutski prihvatljivih "surfetant" ublažuje tendenciju proteina da agregira.
Formulacije iz ovog pronalaska mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog anti-TNF antitela i konzervansa odabranog iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metil, etil, propil, butil, i slični), benzalkonium hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili njihove kombinacije u vodenom rastvoru. Mešanje makar jednog anti-TNF antitela sa konzervansom u vodenom rastvaraču izvodi se pomoću konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodna Formulacija, na primer, izmerena količina makar jednog anti-TNF antitela u rastvoru pufera se kombinuje sa željenim konzervansom u rastvoru pufera u količinama koje su dovoljne da obezbede željene koncentracije proteina i konzervansa. Varijacije u ovom procesu će prepoznati svako koje obučen u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled po kome se komponente dodaju, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pll na kojoj se priprema formulacija, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i načine administracije koje se upotrebljavaju.
Formulacije za koje je prijavljen patentni zahtev mogu seobezbediti pacijentu kao čisti rastvori ili kao dve vajle, od jedne vajle liofilizovanog makar jednog anti-
TNF antitela koji se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži vodu, konzervans i/ili ekscipijent, poželjno je fosfatni pufer i/ili slani rastvor i odabrana so, u vodenom rastvaraču. Vajla sa jedinstvenim rastvorom ili dve vajle koje zahtevaju rekonstituciju mogu se više puta koristiti i mogu zadovoljiti jedan ili viš ciklusa lečenja pacijenta i tako obezbediti bolju režim lečenja nego što je trenutno dostupan.
Predmeti koji se ovde prijavljuju od strane proizvodjača mogu se upotrebiti za administraciju od momentalnog do 24 časa ili dužeg perioda. Na osnovu toga ovde prijavljeni predmeti od strane proizvodjača pružaju značajne prednosti pacijentu. Formulacije ovog pronalaska mogu se opcionalno bezbedno čuvati na temperaturama od oko 2 do 40°C i mogu zadržati biološku aktivnost proteina tokom produženog vremenskog perioda i tako omogućavajući obcležavanje paketa na kome se ukazuje da se rastvor može držati i/ili upotrebiti tokom perioda od 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ili 96 sati ili duže. Ako se upotrebljava konzervisani rastvarač, ovakva nalepnica može uključiti upotrebu od 1 do 12 meseci, pola, jedne i po i/ili dve godine.
Rastvori makar jednog anti-TNF antitela mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog antitela u vodenom rastvaraču. Mešanje se vrši pomoću konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremio pogodan rastvarač, na primer, odmorena količina makar jednog antitela u vodi ili puferu se kombinuje u količinama dovoljnim da se obezbedi željena koncentracija proteina i opcionalno konzervansa i pufera. Varijacije ovih procesa biće prepoznate od strane osobe obučene u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled po kome se komponente dodaju, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se priprema formulacija, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i načine administracije koje se upotrebljavaju.
Prijavljeni proizvodi mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvori ili kao duple vajle koje se sastoje od vajle sa liofilizovanim makar jednim anti-TNF antitelom, koje se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži vodeni rastvarač. Cisti rastvori u ovom slučaju mogu biti veličine od jednog litra ili više, obezbeđujući veliki rezrevoar iz koga se mogu uzimati manje porcije makat jednog rastvora antitela, jedan ili više puta za transfer u manje vajle i tako kupce i/ili pacijente obezbediti od strane apoteka ili klinika.
Priznata sredstva koja obuhvataju sistem od jedne vajle uključuju one penove (pen injeetor), naprave za dostavu rastvora, kao što su BD Pens. BD Autojector<R>, HumajectR, NovoPenR, B-D<R>Pen, AutoPen<R>, i OptiPen\ GenolropinPen<R>, Genotronorm Pen<R>, HumatroPen<R>, Reco-Pen<R>, Roferon Pen<R>, Biojector\ (jeci<1>', J-tip Needle-Free Injeetor<1*>, Intraject<K>, Medi-Ject<R>, e.g, napravljeni ili razvijeni od strane Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, wwvv.becktondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Svvitzerland, www.disetronic.com; Bioject,Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, VVeston medical (Peterbourgh, UK, www.Weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Poznata sredstva koja sadrže sistem duple vajle uključuju one "pen-injector" sisteme za rekonstituciju liofilizovanog leka u pakovanju za dostavu rekonstituisanog rastvora kao sto je HumatroPen<R.>
Proizvodi koji se ovde prijavljuju uključuju matrijal za pakovanje. Materijal za pakovanje obezbeđuje, dodatno informaciji koja se zahteva od strane regulatornih agencija, uslov pod kojim se proizvod može koristiti. Materijal za pakovanje ovog pronalaska obezbeđuje uputstva pacijentu kako da rekonstituiše makar jedno anti-TNF antitelo u vodenom rastvaraču u cilju formiranja rastvora i potrebe da se rastvor iskoristi tokom perioda od 2 do 24 sata ili više za proizvod iz dve vajle, vlažno/suvo. Za pojedinačnu vajlu, proizvod koji je rastvor, nalepnica ukazuje da se ovakav rastvor može upotrebiti tokom perioda od 2 do 24 časa ili više. Ovde prijvljeni proizvodi su korisni za humanu upotrebu farmaceutičkih proizvoda.
Formulacije ovog proizvoda mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog anti-TNF antitela i odabranog pufera, poželjno je fosfatnog pufera, fiziološkog rastvora ili odabrane soli. Mešanje mara jednog antitela i pufera u vodenom rastvaraču izvodi se pomoću konvencionalnih metoda rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodn formulacija, na primer, ođmerena količina makar jednog antitela u vodi ili puferu s kombinuje sa željenim puferskim agensom u vodi, u količinama dovoljnim da se obezbede željene koncentracije proteina i pufera. Varijacije ovog procesa biće prepoznate ođ osobe koja je obučena u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosleđ komponenti koje se dodaju da li se upotrebljavaju dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se formulacija priprema, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i način administracije koji je upotrebljen.
Prijavljene stabilne ili konzervirane formulacije mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvor ili kao duple vajle koje obuhvataju jednu vajlu liofilizovanog makar jednog anti-TNF antitela koja se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži konzervans ili pufer i ekscipijent u vodenom rastvaraču. Vajla sa jedinstvenim rastvorom ili dve vajle koje zahtevaju rekonstituciju mogu se više puta koristiti i . mogu zadovoljiti jedan ili viš ciklusa lečenja pacijenta i tako obezbediti bolju režim lečenja nego što je trenutno dostupan.
Makar jedno anti-TNF antitelo u stabilnoj ili konzervisanoj formulaciji ili rastvoru koji su ovde opisani može se dati pacijentu u skladu sa ovim pronalaskom preko različitih metoda dostave, uključujući SC ili IM injektiranje; transdermalno, pulmonarno, transmukozalno, kao imnlant, osmotska pumpa, kaseta, mikropumpa ili drugi načini koji korist obučeni u ovoj oblati kao i oni poznati u ovoj oblasti nauke.
TERAPEUTSKE PRIMENE
Antitelo ili kompozicija prema pronaslaku može biti za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za TNF, u ćeiliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, što je poznato u ovoj oblasti ili ovde opisano.
Naročito, oni mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za TNF, u ćeiliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, bez limitiranja na, makar jednu bolest vezanu za preteranu gojaznost, imunitet, kardiovaskularnu bolest, infektivnu bolest, malignu bolest ili neurološku bolest.
Određenije, oni mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za TNF, u ćeiliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, bez limitiranja, makar jedan od reumatidnog artritisa, juvenalnog reumatidnog artritisa, sistemskog "onset" (ukjučivanje) juvenilnog reumatidnog artritis, psoijatični artritis, ankilozni spondilitis, čir na želucu, seronegativnma artropatijeza, osteo artritis, inflaminatorna crevna bolest, ulerativni kolitis. sistemski lupus eritromatozis, ntifosfolipidni sindrom, iridociklitis/uveistis/optički neuritis, idiopatska plućna fibroza, sistemski vaskulitis/vegnerova granulomatoza, sarkoidoza, orhitis/reverzne procedure vazektomije, alergijske/atopijske bolesti, astma, alergijski rimitis, ekcema, alergijski kntaktni dermatitis, alergijski konjuktivitis, hipersenzitivni pneumonitis, transplanti, odbacivanje transplantiranog organa, presadjeno tkivo-versus-domaćin obolenje, sindrom sistemskog inflaminatornog odgovora, sindrom sepse, grampozitivna sepsa, gram negativna sepsa, kulturno negativna sepsa, gljivična sepsa, "neutropenic fewer", urosepsa, meningokokemija, trauma/krvarenje, opekotine, izlaganje jonizujućem zračenju, akutni pankreatitis, adultni respiratorni "đistress" sindrom, reumatoidni artritis, alkoholom indukovan hepatitis, hronične inflaminatorne patologije, sarkoidoza, kronova patologija, srpasta anemija, dijabetes, nefroza, atopične bolesti, hipersenzitivne reakcije, alergijski rimitis, polenska groznica, perenialni rinitis, konjuktivitis, endometrioza, astma, urtikarija, sistemska anafalaksija, dermatitis, "perniciosus" anemija, hemolitička bolest, trombocitopenija, odbacivanje bilo ko presadjenog organa ili tkiva, odbacivanje presadjenog bubrega, odbacivanje presadjenog srca, odbacivanje presadjene jetre, odbacivanje presadjenog pankreasa, odbacivanje presadjenih pluća, odbacivanje presadjene kosne srži (BMT), odbacivanje kožnog "alograft"-a, odbacivanje presadjene hrskavice, odbacivanje kosnog grafta, odbacivanje presadjenog dvanaestopalačnog creva, odbacivanje fetalnog timus implanta, odbacivanje paratiroidnog transplanta, odbacivanje ksenografta bilo kog organa ili tkiva, odbacivanje alografta, anti-receptorna hipersenzitivna reakcija, Gravova bolest, Rejnudova bolest, insulin rezistentan dijabetes tipa B, astma, miastenija gravis, citotoksičnost posredovano antitelom, hipersenzitivne reakcije tipa 3, sistemski lupus eritematozus, POEMS sindrom (polineuropatija organomegalija, endokrinopaija, monoklonalna gamopatija, i sinrdom promene kože), polineuropatija organomegalija, endokrinopaija, monoklonalna gamopatija, i sindrom promene kože, antifosfolipidni sindrom, "pemphigus", skleroderma,
bolest pomešanog vezivnog tkiva, idiopatska Adisonova bolest, dijabetes mellitus, hronični aktivni hepatitis, primarna bilijarna ciroza, vitiligo, vaskulitis, post-MI kardiotomni sindrom, hipersenzitivnost tipa IV, kontaktni dermatitis,
hipersenzitivni pneumonitis, odbacivanje alografta, granulome usled intracelularnih organizama, senzitivnost na lek, metabolički/idiopatski, Vilsonova bolest, hemakromatozis, alfa-l-antitripsin deficijencija, dijabetska retinopatija, Hašimotov tiroiditis, osteoporoza, procena hipotalamične-hipofizne-adrenalne ose, primarna bilijarna ciroza, tiroiditis, encefalomialitis, kaheksija, cistična fibroza, neonatalna hronična bolest pluća, hronična opstruktivna plućna bolest (COPD), familijarna hematofagocitična limfohistiocitoza, dermatološka stanja, psorijaza, alopecija, nefrotični sindom, nefritis, glomerularni nefritis, akutni renalni prestanak rada, hemodijaliza, uremija, toksičnost, preeklamsija, okt3 terapija, anti-cd3 terapija, terapija citokininom, hemoterapija, radiaciona terapija (e.g.
uključujući, bez limitiranja, "toast hernija", anemija, kaheksija, i si.), hronična salicilna intoksikacija i slično. Videti, e.g, The Maerck Manual, 12th-17th editions, Merck & Coampany, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al, Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).
Antitelo ili kompozicija prema pronalasku mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jedne kardiovaskularne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu uključujući, bez limitiranja na njih, makar jedan od: srčani "stun" sindrom, infarkt miokarda, "congestiv hard failure", moždani udar, ishemični moždani udar, izliv krvi, arterioskleroza i arteoskleroza, restenoza, dijabetska arteriosklerotična bolest, hipertenzija, arterijalna hipertenzija, renovaskulatma hipertenzija, sinkopa, šok, sifilis kadriovaskularnog sistema, prestanak rada srca, "cor pulmonale", primarna plućna hipertenzija, srčana aritmija, ektopični artrijalni otkucaji, artrijalno podrhtavanje, artrijalna fibrilacija (zadržana ili paroksimalna), post perfuzioni sistem, kardiopulmonarni bajpas inflam inatom i odgovor, haotična ili multifokalna atrijalna tahikardija, tahikardija sa normalnim uskim QRS, specifična aritmija, ventrikularna fibrilacija, "His bundle" aritmija, atrioventrikulami blok, "bundle branch" blok, miokardijalni ishemični poremećaju, bolest koronarne arterije, angina pektoris, infark miokarda, kardiomiopatija, dilatirana kongestivna kardiomiopatija, restriktivna kardiomiopatija, "valvular" srčano obolenje. endokarditis, perikardijalna bolest, kardijačni tumori, "aordic"i periferalni aneurizmi, diskecija aorte, zapaljenje aorte, okluzija abdominale aorte i njenih grana, periferalni vaskularni poremećaji, okluzivni arterijalni poremećaji,
periferalna arterosklerotična bolest, tromboangitis obliterans, funkcionalni periferalni arterijalni poremećaji, Raynaud-ov fenomen i bolest, akrocijanoza, eritromelalgija, bolesti vena, venska tromboza, proširene vene,"arteriovenous" fistula, limfederma, lipedema, nestabilna angina, reperfuziona povreda,
"postpump" sindom, ishemija-reperfuziona povreda i slično.
Antitelo ili kompozicija prema pronalasku mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jedne infektivne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali ne limitiran njima, makar jedan od sledećih: akutna ili honična bakterijska infekcija, akutni i hronični parazitski ili infektivni procesi, uključujući bakterijsku, virusnu i gljivičnu infekciju, HIV infekciju/HIV neuropatiju, meningitis, hepatitis (A, B ili C ili slični), septički artritis, peritinitis, upala pluća, piglotitis, Ecoli OI57:h7, hemolitički uremični sindrom/trombolitička trombocitopenička purpura, malarija, "dengue" hemoralgična groznica, leišmanijazis, lepra, sindrom toksičnog šoka, streptokokalni miozitis, gas gangrena, mvcobacterium tuberculosis, mvcobacteriumavium intracellulare, pneumocvstis, carinni pneumonija, pelvična inflaminatorna bolest, orhitis/epiddidimitis, legionella, Lajmska bolest, influenca A, Epstein-Barr virus, "vital-asociated" hemofagocitični sindom, "vital" encefalitis/aseptički meningitis i slično;
Antitelo ili kompozicija prema pronalasku mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jednog malignog oboljenja u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu uključujući, ali ne limitiran njima, makar jedan od sledećih: leukemija, akutna leukemija, akutna limfoblastna leukemija (ALL), ALL B-ćelija, T-ćelija, ili FAB, akutna miloidna leukemija (AML), hronička mielocitna leukemija (CML), hronična limfocitna lukemija (CLL), "hairvcell" leukemija, mielodiplastični sindrom (MDS), limfoma, Hočkinsonova bolest, maligna limfoma, ne-Hočkinsonova limfoma, Burkitova limfoma, višestruka mieloma, Kapozijeva sarkoma, kolorektalni karcinom, karcinom pankreasa, nazofarilgijalni karcinom, maligna histocitoza, paraneoplastični sindrom/hiperkalcemija malignosti, "solid" tumori, adenokarcinom, sarkom, maligni melanom, hemangioma, bolesti metastaze, resorpcija kosti povezana sa kancerom, bol u kostima povezan sa kancerom i si,
Antitleo ili kompozicija prema pronalasku mogu biti za modulaciju i lečenje makar jednog neurološkog oboljenja u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu uključujući, ali ne limitiran njima, makar jedno od sledećih: neurodegenerativne bolesti, multipna skleroza, migrenozne glavobolje, AIDS dementia complex, bolest demijelinizacije, kao što je multipna skleroza ili akutni transferzalni mielitis; ekstrapiramidalni i cerebralni poremećaji kao što su lezije kortikospinalnog sistema; poremećaji bazalnih ganglija ili cerebralni poremećaji; poremećaji hiperkinetičkog kretanja kao što su Ilungtinton's Chorea i senilna ehorea; poremećaji kretanja izazvani lekovima, kao što su oni izazvani lekovima koji blokiraju dopaminske receptore CNS-a; poremećaj hipokinetčkog kretanja, kao Parlunsonova bolest; Progresivni "supranucleo Palsy"; strukturalne lezije cerebeluma; spinocerebralne degeneracije, kao spinalna ataksija, Friedrich-ova ataksija, cerebelarne kortikalne degeneracijem ''multiple system" degeneracije (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, i Machado-Joseph); sistemski poremećaji (Refsum-sova bolest, abetalipoprotemia, ataksia, talengiektazija, i mitohondrijalni multi. sistemski poremećaj); poremećaji demijelinizacije "core"-a, kao što su multipna skleroza, akutni transversni mielitis; i poremećaji motornih jedinica kao što su neurogene muskularne atrofije (ćelijska degeneracija prednjeg roga, kao amiotrofha lateralna skleroza, infantilna spinalna muskularna atrofija i juvenilna spinalna muskularna atrofija); Alzhajmerova bolest; Daunov sindrom u srednjim godinama; Diffise Levi bolest tela;senilna demencija "Levvy body" tipa, "vvernicke-Korsakoss" sindrom; hronični alkoholizam; Creutsfeld-Jakob bolest; "Subacut sclerosing panencephalitis" Hallerrorden-Spatz bolest; i demencia pugilistica i slično. Videti e.g, the Merck Manual, 16th Edition, Merck & Companv, Rahvvav, NJ, (1992).
Kompozicija prema pronaalsku može biti korišćena u postupku koji obuhvata davanje efektivne količine ćelije, tkiva, organu, životinji, ili pacijentu kome je potrebno. Ovakva metoda dalje može obuhvatiti ko-administraciju ili kombinovanu terapiju za lečenje takve bolesti imuniteta, gde davanje pomenute kompozicije, dalje obuhvata davanje pre, za vreme, i/ili posle, makar jednog selektovanog od makar jednog TNF antagonista (e.g, ali nije limitiran na TNF antitelo ili fragment, solubilni TNF fragment, njegov fuzioni protein, mali molekul TNfF antagonist), antireumatika (e.g, metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopiren, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokinsulfat, leflunomid, sulfasazlin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni anti-inflaminatorni lek (NSAID), analgezik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobialni (e.g, aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, taksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (e.g, epoetin alfa), "filgastrim" (e.g, G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacija, imunoglobulina, imunosupresora, (e.g, basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokin ili citokin antagonist. Videti, e.g, Wells et al, eds, Pharmacofherapy Ilandbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).
TNF antagonisti pogodni za kompozicije, kombinovanu terapiju, ko-administraciju, sredstva i/ili metode iz ovog pronalaska (dalje obuhvataju makar jedno antitelo, njegov specificiran deo ili varijantu, iz ovog pronalaska), obuhvataju, ali nisu limitirana na njih, anti-TNF antitela, njihove fragmente za vezivanje antigena, i receptorne molekule koji se specifično vezuju za TNF; jedinjenja koja sprečavaju i/ili inhibiraju sintezu TNF-a, oslobađanje TNF-a ili njegovo delovanje na ciljne ćelije kao što su talidomid, tenidap, inhibitori fosfodiesteraza (e.g, pentoksifilin i rolipam), agonisti A2b adenozinski receptora i enhanseri A2b adenozinski receptora; jedinjenja koja sprečacaju i/ili inhibiraju signalizaciju TNF receptora, kao inhibitori mitogen aktivirajućih protein kinaza (MAP) jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju TNF sečenje membrane, kao što su inhibitori metaloproteinaza; jedinjenja koja blokiraji i/ili inhibiraju aktivnost TNF-a, kao što su inhibitori enzima koji prevodi angiotenzin (ACE angiotensin converting enzvme) (e.g, kaptopril); i jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju proizvodnju TNF-a i/ili njihovu sintezu, kao što su inhibitori MAP kinaze.
Kao što se ovde koristi "antitelo faktora nekroze tumora", "TNF antitelo", TNFa antitelo", ili njegov fragment i slično, smanjuje, blokira, ukida ili interferira sa TNFa aktivnošćuin vitro, in situi/ili poželjno jein vivo.Na primer pogodno TNF humano antitelo iz ovog pronalaska može da veže TNFa i uključuje anti-TNF antitela, njihovih fragmenata za vezivanje antigena, i specificirane mutante ili domene koji se vezuju specifično za TNFa. Pogodno TNF antitelo ili njegov fragment, može takođe da smanjuje, blokira, ukida ili interferira spreči i/ili inhibira sintezu TNF RNK, DNK ili proteina, oslobađanje TNF-a, signalizaciju TNF receptora, membransko TNF sečenje, aktivnost TNF-a. proizvodnju i/ili sintezu TNF-a.
Himerno antitelo cA2 sastoji se od antigen vezujućeg varijabilnog regiona mišijeg neutrališućeg visokoafinitativnog anti-humanog TNFa IgGl, označen kao A2, i konstantnog regiona humanog IgGl, kappa imunoglobulina. Humani IgGl Ec region poboljšava efektornu funkciju alogenog antitela, povećava polu život cirkulišućeg seruma i smanjuje imunogenost antitela. Aviditv i specifičnost epitopa himernog cA2 antitela je izvedena iz varijabilnog regiona mišijeg antitela A2. U posebnom ostvarenju poželjan izvor nukleinske kiseline koja kodira varijabilan region mišijeg A2 antitela je A2 hibridoma ćelijska linija.
Himerno A2 (ĆA2) neutrališe citotoksični efekat oba, i prirodnog i rekombinantnog humanog.TNFa na način koji zavisi od doze. Iz eseja za vezivanje himernog cA2 antitela i rekombinantnog humanog TNFa, izračunato je daje konstanta afinitativnosti himernog antitela cA2 1.04 X 10'°M''. Poželjne metode za određivanje specifičnosti i afinitativnosti monoklonalnog antitela kompetitivnom inhibicijom može se naći u Harlovv, et al, antibodies: ALaboratorv Manual,Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, Nevv York, 1988; Colligan et al, eds,Current Protocols in Iirmuinologv,Grecn Publishing Assoc, and Wiley Interscience, Nevv York, (1992-2000); Kozber et al, Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al, eds.Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience, Nevv York (1987-2000): i Muller,Metod. Enzymol.,92:589-601 (1983).
U posebnom ostvarenju m misije monoklonalno A2 anittelo se proizvodi od strane ćelijske linije označene kao cl34A. Himerno cA2 antitelo se proizvodi od strane ćelijske linije označene kao cl68A.
Dodatni primeri monoklonalnih anti-TNF antitela koji se mogu upotrebiti u ovom pronalasku opisani su u ovoj oblasti (videti, e.g, U.S. Patent No. 5,231,024; Moller, A. et al, Cvtokine 2(3).T62-169 (1990); U.S Application No. 07/943,852 (popunjen 11 septembra, 1992); Rathjen et al, International Publication No WO 91/02078 (objavljeno 21 februara 191); Rubin et al, EPO Patent Publication No 0 218 868 (objavljeno 22 aprila, 1987); Liang et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meageretal, Hvbridoma 6:305-311 (1987); Fendly etal, Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman et al, Hybridoma, 6:489-507 (1987); i Hirai et al, J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).
TNF receptorski molekuli
Poželjni TNF receptorski molekuli korisni za ovaj pronalazak su oni koji vezuju TNFa sa visokim afinitetom (videti e.g, Feldman, et al, International Publication No WO 92/07076 (objavljeno 30 aprila 1992); Schall et al,Cell,61:361-370
(1990);i Loetcher et al, Cell 61:351-359(I990),čije su reference kompletno obuhvaćane ovde referencama)) i opcionalno poseduju nisku imunogenost. Posebno su korisni za ovaj pronalazak, 55 kDa (p55TNF-R) i 75 kDa (p75TNF-R) ćelijski površinski receptori. Skraćene forme ovih receptora koji sadrže ekstracelularne domene (ECD) receptora ili njegovih funkcionalnih delova (e.g, Corcoran, et al,Eur. J. Biochem.223:831 840 (1994)), takođe su korisni za ovaj pronalazak. Isečene forme ovih receptora, koji sdrže ECD, detektovana se u mokraći i serumu kao TNFa inhibitorni vezujući proteini od 30 kDa i 40 kDa (Engelman, H. etal,./. Biol. Chem.265:1531-1536 (1990)).
Multimerni molekuli TNF receptora i TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli, i
njihovi derivati" i fragmenti, su dodatni primeri TNF receptorskih molekula koji su korisni za metode i kompozicije iz ovog pronalaska. Molekuli TNF receptora koji se mogu koristiti u ovom pronalasku karakterišu se sposobnošću da leče pacijente tokom produžeg vremenskog perioda sa"dobrim do odličnim ublažavanjem simptoma i niskom toksičnošču. Niska imunogenost i/ili visoka afinitativnost, kao i druge nedefinisane osobine, mogu da doprinesu ostvarenim terapeutskim rezultatima.
Multimerni molekuli TNF receptora koji su korisni za ovaj pronalazak sadrže sve ili funkcionalni deo ECD jednog ili više TNF receptora povezanih preko jednog ili više polilinkera ili nepeptidnih linkera, kao sto je polietilen glikol (PEG). Multimerni molekuli dalje mogu da sadrže signalni peptid sekretovanog proteina koji usmerava ekspresiju rnultimernog molekula. Ovi multimerni molekuli i metode za njihovu proizvodnju opisane su u U.S. Application No. 08/437,533 (podnet9 maja 1995).
TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli koji su korisni za metode i kompozicije iz ovog pronalaska obuhvataju makar jedan deo jednog ili više imunoglobuiinskoih molekula ili ceo ili funkcionalni deo jednog ili više TNF receptora. Ovi imunoreceptorski ftrzioni molekuli mogu se sastaviti kao monomeri, ili hetero- ili homo-multimeri. Imunoreceptorski fuzioni molekuli mogu biti takođe monovalentni ili multivalentni. Primer za ovakav TNF imunoreceptorski fuzioni molekul je TNF receptorski/IgG fuzioni protein. TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli i metode za njihovo dobijanje opisani su u ovoj oblasti (Lesslauer, et al.,Eur. J. Immunol.21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10353-10359 (1991); Peppel etal.,/. Exp. Med.174:1483-1489 (1991); Kolls et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:215-219 (1994); Butler et al,Cytokine6(6):616-623 (1994); Baker et al,Eur. J. Immunol.24:2040-2048 (1994); Beutler et al, U.S. Patent No. 5,447,851; i U.S Application No. 08/442,1333 (popunjen 16 maja 1995). Metode za proizvodnju imunoreeeptorskih fuzionih molekula mogu se takođe naći u Capon et al, U.S. Patent No. 5,116,964; capon et al, U.S. Patent No. 5,225,538;i Capon et al. Nature337:523-531 (1989).
Funkcionalni ekvivalent, derivat, fragment ili region TNF receptorskog molekula odnosi se na deo TNF receptorskog molekula, ili deo sekvence za TNF receptorski molekul koja kodira TNF receptorski molekul, koja je dovoljna po veličini i sekvencama da funkcionalno liči na TNF receptorski molekul koji se može koristiti u ovom pronalasku (e.g, da se veže za TNF sa visokim afinitetom i da poseduje nisku imunogenost). Funkcionalni ekvivalent TNF receptorskog molekula takođe uključuje modifikovane receptorske molekule koji funkcionalno liče TNF receptorskim molekulima koji se mogu koristiti u ovom pronalasku (e.g, da se veže za TNF sa visokim afinitetom i da poseduje nisku imunogenost). Na primer, funkcionalni ekvivalent TNF receptorskog molekula može da sadrži "SILENT" kodon ili jednu ili više amino kiselinskih substitucija, delecija ili adicija (e.g, substitucija jedne kisele amino kiseline drugom kiselom amino kiselinom; ili substitucija jednog kodona ko ji kodira istu ili različitu hidrofobnu amino kiselinudrugim kodonom koji kodira hidrofobnu amino kiselinu. Videti Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biologv, Green Publishing'Assoc. and Wiley-lnterscience, Nevv York (1987-2000).
Citokini uključuju bilo koji poznati citokin. Videti, e.g,
wvvvv.CopewithCytokines.oom. Antagonisti citokina uključuju, ali nisu njima limitirani, bilo koje antitelo, njegov fragment ili onaj koji ga oponaša (mimetic), bilo koji solubilni receptor, fragment ili onaj koji ga oponaša, bilo koji mali molekul antagonist, ili njihova kombinacija,
Terpeutski tretmani. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korišćene u postupku za lečenje poremećaja posredovanih TNF-om, koja se sastoji od davanja efektivne količine ćeliji, organu, tkivu, životinji ili pacijentu kome je potrebno. Ovakav postupak može opcionalno dalje da obuhvati ko-administraciju ili kombinovanu terapiju za lečenje ovakvih obolenja imuniteta, gde davanje pomenute kompozicije, dalje obuhvata davanje, pre, uporedo, i/ili posle, makar jednog selektovanog iz makar jednog makar jednog selektovanog od makar jednog TNF antagonista (e.g, ali nije limitiran na TNF antitelo ili fragment, solubilni TNF fragment, njegov fuzioni protein, mali molekul TNF antagonist), antireumatika (e.g, metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopiren, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokinsulfat, leflunomid, sulfasazlin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni anti-inflaminatorni lek (NSAID), analgezik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobialnog (e.g, aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (e.g, cpoetin alfa), "filgastrim" (e.g, G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacije, imunoglobulina, imunosupresora, (e.g, basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikioplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromoiina, epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokina ili citokin antagonista.
Tipično, na lečenje patoloških stanja utiče administracija efektivne količine ili doze makar jedne kompozicije anti-TNF antitela koja je ukupno u prošeku u opsegu od oko 0.01 do 500 miligrama makar jednog anti TNF antitela po kilogramu pacijenta po jednoj dozi, i poželjnoje od oko 0.1 do 100 miligrama antitela/kilogramu pacijenta po jednoj ili više administracija,, u zavisnosti od specifične aktivnosti koja se nalazi u kompoziciji. Alternativno, efektivna koncentracija seruma može da obuhvati 0.1-5000 ug/ml koncentracije seruma po jednoj ili više administracija. Pogodne doze poznate u lekarima i zavisiće naravo, od određenog stanja bolesti, specifične aktivnosti kompozicije koja se daje, i naročito tretmana pod kojim je pacijent. U nekim slučajevima da bi se postigla željena terapeutska količina, neophodno je obezbediti ponavljanje administracije, i.e, ponavljanje pojedinačnog davanja određene monitorovane ili odmerene doze, gde se pojedinačna davanja ponavljaju dok s"ne postigne željena dnevna doza ili željeni efekat.
Poželjne doze opcionalno uključuju 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41. 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 67, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i/ili 100-500 mg/kg/davanju, ili bilo koji njihov opseg, vrednost ili fragment, da bi se ostvarila serumsk koncentracija od 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10.0, 10.5, 10.9, 11.0, 11.5, 11.9, 12.0, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 14.9, 15.0, 15.5, 15.9, 16.0, 16.5, 16.9, 17.0, 17.5, 17.9, 18.0, 18.5, 18.9, 19.0, 19.5, 19.9, 20.0, 20.5,20.9,21,22, 23,24. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, loo, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 i/ili 5000 pg/ml koncentracije seruma po jednoj ili više administracija ili bilo koji njihov opseg, vrednost ili fragment.
Alternativno, doza koja se dostavlja može da varira u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamičke karakteristike određenog agensa, i od načina i puta administracije; godina, zdravlja, i težine recipijenta; priroda i stepen simptoma, vrste uporednog tretmana, frekvence tretmana, i željenog efekta. Uobičajeno doza aktivnog sastojka može biti oko 0.1 do 100 miligrama po kilogramu telesne mase. Uobičajeno 0.1 do 50, poželjno 0.1 do 10 miligram po kilogramu po administraciji ili u formi za odloženo oslobađanje, je dovoljno za dobijanje željenih rezultata.
Kao nelimitirajući primer, lečenje ljudi ili životinja može se obezbediti kao jednokratna ili periodična doza makar jednog antitela iz ovog pronalaska 0.1 do
100 mg/kg, kao što je 0.5, 0.9, 1.0, l.l, 1,5,1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 mg/kg, po danu, na makar jedan dan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30 ili 40, ili
alternativno ili dodatno, makar jedne od nedelje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22, 23,24,25,26, 27,28, 29, 30,31,32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ili 52 ili alternativno ili dodatno, makar jedne od 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 godina ili bilo koje njihove kombinacije, upotrebom jednokratne ili infuzione ili ponovljenih doza.
Forme doza (kompozicija) pogodne za administraciju generalno sadrže od oko 0.1 miligrama do oko 500 miligramaaktivnog sastojka po jedinici ili kontejneru. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni satojak uobičajeno će biti prisutni u količini od 0.5-99.999% po težini bazirano na ukupnoj težini kompozicije.
Za parenleruinu administraciju, antitelo se može formulisati kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovan prah u asocijaciji, ili posebno obezbeđen, sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim prevoznim sredstvom (vehicle). Primeri za ovakva prevozna sredstva su voda, fiziološki rasvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i 1-10% humani serum albumin. Takođe se mogu koristiti lipozomi i nevodena prevozvozna sredstva kao fiksirana ulja. Prevozno sredstvo ili liofilizovani prah mogu sadržati aditivi koji održavaju izotoničnost (e.g, natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (e.g, puferi i konzervansi). Formulacija se steriliše poznatim ili pogodnim tehnikama.
Pogodni farmaceutski nosači opisani su u najnovijem izdanju Remingtonove Pharmaceutical Sciences, A. Osol, standardni referentni tekst u ovom polju.
Alternativne administracije
Mnoge poznate i razvijene metode mogu se koristiti, na osnovu ovog pronalaska, za administraciju farmaceutski efektivnih količina makar jednog anti-TNF antitela na osnovu ovog pronalaska. Dok se pulmonarna adminisracija koristi u opisu koji sledi, drugi oblici administracije sa pogodnim rezultatima mogu se koristiti na osnovu ovog pronalaska.
TNF antitela iz ovog pronalaska mogi se dostaviti u nosaču, kao rastvor, emulzija, koloid ili suspenzija, ili kao suvi prah, koristeći bilo koji od mnogih sredstava i metoda pogodnih za administraciju putem inhalacije ili drugih načina opisanih ovde ili poznatih u ovoj oblasti.
Parenteralne formulacije i administracije
Formulacije za parenteralnu administraciju mogu da sadrže poznate eksptcijente sterilnu vodu ili fiziološki rastvor, polialklen glikole kao što su polietilen glikol, ulja biljnog porekla, hidrogenizovani naftaleni i slični. Vodene ili uljane suspenzije za injektiranje mogu se pripremiti upotrebom odgovarajućeg emulzifikatora ili ovlaživača i suspending agensa na osnovu poznatih metoda. Agensi za injeciranje mogu biti ne-toksični, agens za rastvaranje koji se ne administrira oralno kao vodeni rastvor ili sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u rastvaraču. Kao rastvarač ili prevozno sredstvo koje se koristi, dozvoljeni su voda, Ringerov rastvor, izotonični fiziološki rastvor, itd; kao običan rastvarač ili suspending rastvarač, može se koristiti sterilno involatile ulje. Za ove potrebe mogu se koristiti bilo koja vrsta involatile ulja i masnih kiselina uključujući prirodna ili sintetička ili polusintetička masna ulja ili masne kiseline; prirodni, sintetički ili polusintetički mono-, ili di-, ili tri-gliceridi. "Parental" (roditeljska) administracija je poznata u ovoj oblasti i uključuje ali nije njima limitirana, konvencionalne načine injekciranja, sredstvo za injeciranje bez igle pod pritiskom gasa kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,851,198 i sredstvo za lasersku perforaciju kao što je opisano u U. S. Pat. No. 5,839,446, kompletno obuhvaćeno ovde referncom.
Alternativno davanje
Ovaj pronalazak dalje se odnosi na administraciju makar jednog anti-TNF antitela na sledeće načine: subkutanozno, intramuskularno, intravensko, intrartikularno, intrabronhijalno, intraabdominalno, intrakapsularno, intrahrskavičavo, intracavitarno, intracelijarno, intracerebelarno, intracerebroventrikularno, intrakolikalno, intracervikalno, intraintragastrikalno, intrahepatikalno, intramiokardijalno, intraostealno, intrapelvikalno, intraperikardijalno, intraperitonealno, intrapleurealno, intraprostatno, intrapulmonarno, intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauteralno, intravezikularno, bolus (za gutanje), vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno, ili transdermalno. Makar jedna kompozicija anti-TNF antitela može se pripremiti za parenteralnu upotrebu (subkutanoznu, intramuskularnu ili intravensku) ili bilo koju drugu administraciju pogotovu u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za upoterbu za vaginalnu ili rektalnu administraciju pogotovu u poličvrstom stanju kao što su, ali bez limitiranja na njih, kreme i supozitorije; za bukalnu ili sublingvalnu administraciju, kao što su, ali bez limitiranja na njih, u obliku tableta ili kapsula; ili intranazalno kao što su, ali bez limitiranja na njih, forme praha, nazalne kapljice ili aerosoli ili određeni agensi; ili transdermalno, kao što su, ali bez limitiranja na njih, gel, mast, losion, suspenzija ili flasterski sistemi dostave koji sa hemijskim enhanserima kao što je dimetil sulfoksid da bi se ili mođifikovala kožna struktura ili povećala koncentracija leka u transdermalnom flasteru (Junginger, et al, u "Drug Permation Enhancement", Hseih, D. S. Eds, pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nevv York 1994, kompletno ovde obuhvaćeni referncom), ili sa oksidujućim agensom koji omogućava primenu formulacija koje sadrže proteine i peptide na koži (WO 98/53847), ili primene električnih polja za kreiranje tranzijentnih transportnih puteva kao što je elektroporacija, ili za povećanje mobilnosti naelektrisanih lekova kroz kožu kao jontoforeza, ili primenu ultrazvuka kao što je sonoforeza (U. S. Pat. Nos. 4,309,989 i 4,767, 402) (gore pomenute publikacije i patenti su kompletno obuhvaćeni ovde referencom).
Pulmonarna (plućna)/nazalna administracija
Za pulmonarnu administraciju, poželjno je da se dostavi makar jedna kompozicija anti-TNF antitela, određene veličine koja je efektivna za dosezanje nižih disajnih puteva pluća ili sinusa. Na osnovu pronalaska, makar jedno anti-TNF antitelo može se dostaviti pomoću različitih naprava za inhalaciju ili pomoću nazalnih naprava koje su poznate u ovoj oblasti, za administraciju terapeutskog agensa putem inhaliranja. Ova sreu.^ ,a za deponovanje aerosolnih formulacija u sinusnu šupljinu ili alveole pacijenta, uključuju aerosolnc pumpice (metered dose inhalors), nebuizatore (nebulizers), generatori suvog praha, sprejevi, i slični. Druga sredstva koja su pogodna za usmeravanje plućne ili nazalne administracije antitela poznati su uvoj oblasti. Sva ova sredstva mogu koristiti formulacije pogodne za administraciju za određivanje/raspoređivanje (dispensing) antitela u aerosoiu. Ovakvi aerosoli mogu sadržati ili rastvore (obe, i vodene i ne-vodene) ili čvrste čestice. Aerosolne pumpice kao Ventoli<R>Metered dose inhalers, tipično koriste propellent (pokretač) gas i zahteva podstrek tokom inspiracije (videti, e.g, WO 94/16970, WO 98/35888). Inhalatori suvog praha kao Turbuhaler<*>(Astra), Rotahaler<R>(Glaxo), Diskus<R>(Glaxo), Spiros i m inhalator (sredstva označena od strane Inhale Terapeutics, i SpinhalerR inhalator praha (Fision)m upotreba "breath actuation" mešanih prahova (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 GIaxo, WO 94/08552 Dura, US 548135 Inhale, WO94/06498 fisons, kompletno obuhvaćeni ovde referencom). Nebulizatori kao AERxTM Aradigm, Ultraven<R>nebulajzer (Mallinckrodt), i AkronII<R>nebulizatori (Marquest Medical Products)
(US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), gore pomenute reference su upotpunosti ovde obuhvaćene referencom, proizvode aerosol iz rastvora, dok aerosolne pumpice, inhalatori suvog praha itd generišu male čestice aerosola. Ovi specifični primeri komercijalno dostupnih sredstava za inhalaciju imaju za cilj da budu
predstavnici specifičnih sredstava pogodnih za primenu u ovom pronalasku, i nisu namenjeni da limitiraju područje ovog pronalaska. Poželjno je da se kompozicija koja sadrži makar jedno anti-TNF antitelo dostavi pomoću inhalatora suvog praha ili spreja. Postoji nekoliko poželjnih osobina koje poseduje sredstvo za inhaliranje za administraciju makar jednog antitela iz ovog pronalaska. Na primer, dostava pomoću sredstva za inhalaciju ima prednost u pouzdanosti, reproducibilnosti i tačnosti. Sredstva za inhalaciju mogu opcionalno da dostave male čestice, e.g, manje od 10 pm, poželjno 1-5 pm, za dobru repiratornost.
Administracija kompozicije TNF antitela uoblikuspreja
Sprej sa TNF antitelo proteinskom kompozicijom može se proizvesti ušpricavanjem pod pritiskom suspenzije ili rastvora makar jednog anti-TNF antitela kroz nosnu šupljinu. Veličina i konfiguracija nosa, primenjeni pritisak, i stopa ubacivanja tečnosti (liquid feed), mogu se odabrati da bi se postigao željeni "output" i veličina čestica. Elektrosprej može se proizvesti, na primer, pomoću električnog polja koji je povezan sa kapilarnim ili nosnim ubacivanjem (feed). Sa prednošću, čestice makar jednog kompozicionog proteina anti-TNF antitela koje se dostavljaju pomoću spreja imaju čestice veličine makar 10 pm, poželjno u opsegu od oko 1 pm do oko 5 pm, i najpoželjnije od oko 2 pm do oko 3 pm.
Formulacija kompozicionog proteina anti-TNF antitela pogodnog za upotrebu u spreju tipično uključuju kompozicioni protein antitela u vodenom rastvoru u koncentracijama od oko 0.1 mg go 100 mg makar jednog kompozicionog proteina anti-TNF antitela po mililitru rastvora ili mg/ml, ili bilo kog drugog opsega ili vrednosti u okviru toga, e.g, ali bez limitiranja na .1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 mg/ml ili mg/gm. formulacija može da uključi agenseb, kao što su ekspicijent, pufer, izotonični agens, konzervans, "surfactant" (površinski aktivni agens), i poželjno cink. Formulacija takođe može da uključi ekpicijent ili agens za stabilizaciju kompozicionog proteina antitela, kao stoje pufer, redukujući agens, "bulk" (veliki) protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" (veliki) proteini korisni za formulaciju kompozicionih protena antitela uključuju albumin, protamin, ili slično, tipični ugljeni hidrati korisni za formulaciju kompozicionih protena antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu i slične. Formulacija kompozicionog proteina anti-TNF antitela može takođe da uključi "surfactant" (površinski aktivni agens), koji može da redukuje ili spreči površinski- izazvanu agregaciju proteinske kompozicije antitela izazvane atomizacijom rastvora pri formiranju aerosola. Različiti konvencionalni "surfactants" (površinski aktivni agensi) mogu se upotrebiti, kao estri poliksietilen masnih kiselina i alkohola, i stri poliksietilen sorbitol masnih kiselina. Količina će generalno varirati u opsegu između 0.001 i 14% po težini formulacije. Posebno poželjni "surfactants" (površinski aktivni agensi) za potrebe ovog pronalaska su poliksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slični. Dodatni agensi poznati u ovoj oblasti za formulaciju proteina kao što je TNF antitelo, ili njegove specificirane varijante ili delovi, mogu se takođe uključiti u formulaciju.
Administracija kompozicije TNF antitela pomoću nebulizatora (Nebulizer)
Kompozicioni protein antitela može se administratirati pomoću nebulizatora, kao što je mlazni nebulizator ili ultrazvučni nebulizator. Tipično, u mlaznom nebulizatoru, izvor kompresovanog vazduha se koristi za stvaranje mlaza vazduha velike brzine kroz otvor. Kako se gas širi van nosa, stvara se region niskog pritiska, koji izvlači rastvor kompozicionog protein antitela kroz kapilarnu cev koja je spojena sa rezervoarom sa tečnošću. Struja tečnosti iz kapilarne cevi se raspodeljuje u nestabilne filamente i kapljice kako napušta cev, stvarajući aerosol. opseg konfiguracija, stopa proticanja, i tipovi "baffle" (prepreke) mogu se upotrebiti da bi se postigle željene karakteristike izvođenja iz datih mlaznih nebulizatora. Kod ultrazvučnog nebulizatora, koristi se električna energija visoke frekvence da bi se stvorila vibraciona, mehanička energija, tipično se koristi piozoelektrični transducer (provodnik). Ova energija se šalje formulaciji kompozicionog protein antitela bilo direktno ili kroz "coupling" tečnost, stvarajući aerosol uključujući kompozicioni protein antitela. Kao prednost, čestice kompozicionog protein antitela dostavljene pomoću nebulizatora imaju veličinu čestice manje od 10 pm, poželjno u opsegu od oko 1 pm do oko 5 pm, i najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm.
Formulacije makar jednog anti-TNF antitela pogodne za upotrebu sa nebulizatorom, bilo mlaznim ili ultrazvučnim, tipično uključuje koncentracije od oko 0.1 do oko 100 mg makar jednog proteina anti-TNF antitela po ml rastvora. Formulacija takođe može da uključi agense kao što su, akspicijent, pufer, izotonični agens, konzervans, "surfactant" (površinski aktivni agens), i požel jno je cink. Formulacija takođe može da uključi ekpicijent ili agens za stabilizaciju kompozicionog proteina anti-TNF antitela, kao što je pufer, redukujući agens, "bulk" (veliki) protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" (veliki) proteini korisni za formulaciju kompozicionih protena anti-TNF antitela uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korisni za formulaciju kompozicionih protena anti-TNF antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu i slične. Makar jedna formulacija anti-TNF antitela može takođe da uključi "surfactant" (površinski aktivni agens), koji može da redukuje ili spreči površinski- izazvanu agregaciju makar jednog anti-TNF antitela izazvane atomizacijom rastvora pri formiranju aerosola. Različiti konvencionalni "surfactants" (površinski aktivni agensi) mogu se upotrebiti, kao estri poliksietilen masnih kiselina i alkohola, i stri poliksietilen sorbitol masnih kiselina. Količina će generalno varirati u opsegu između 0.001 i 4% po težini formulacije. Posebno poželjni "surfactants" (površinski aktivni agensi) za potrebe ovog pronalaska su poliksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slični. Dodatni agensi poznati u ovoj oblasti za formulaciju proteina kao Stoje protein antitelo, mogu se takođe uključiti u formulaciju.
Administracija kompozicije TNF antitela pomoću aerosolnih pumpica
(Metered Dosc inhalors)
Kod aerosolne pumpice (metered dose inhalor -MDI), "propellent" (pokretač), makar jedno anti-TNF antitelo, i bilo koji ekspicijenti ili aditivi nalaze se u kanisteru, kao mešavinam uključujući gas pod pritiskom u tečnom stanju. Aktivacija tj odvrtanje "metering" (za odmeravanje) ventila oslobađa mešavinu u obliku aerosola, poželjno je da su čestice koje on sadrži u opsegu veličine manje od oko 10 pm, poželjno oko l pm do oko 5 pm, i najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm. Željena veličina čestica aerosola može se dobiti upoterbom formulacije kompozicionog proteina antitela, koji se proizvodi različitim metodama poznatim onima koji se bave ovom oblašću nauke, uključujući mlazno drobljenje (jet-milling) u ovoj oblasti, isušivanje sprejom (spray drving), kondenzacija na kritičkoj tački (critical point condensation), i slično. Poželjne aerosolne pumpice uključuju one proizvedene od strane 3M ili Glaxo i upotrebljavaju hidrofluorougljcnični propcllant.
Formulacije makar jednog anti-TNF antitela za upotrebu sa "metered dose" sredstvom za inhaliranje će generalno da sadrži fino razdvojen prah koji sadrži makar jedno anti-TNF antitelo kao suspenziju u ne-vodenom medijumu, na primer. r^tvoreno u propellant-u uz pomoć surfactant-a (površinski aktivni agens), i-ropellant može biti bilo koji kanvencionalni materijal koji se koristi u i tu svrhu, kao hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ili hidrougljenik, uključujući trihlorofluoromrtan, dihloroditluorometan, dihlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoretan, F1FA-I34a (hidrofluoroalkan-134a), HFA-227 (hidrofluoroalkan-227) i slični. Poželjno je da je propellant hidrofluorougljenik. Surfactant (površinski aktivni agens) može biti odabran da stabiliše makar jedno anti-TNF antitelo kao suspenziju u propelantu, da bi se zaštitio aktivni agens od hemijske degradacije, i sličnog. Pogodne surfactans (površinski aktivni agensi) predstavljaju sorbitan trioleat, sojin lecitin, oleinska kiselina, i slični. U nekim slučajevi/na poželjno je upotrebiti rastvarači ka što je etanol. Dodatni agensi koji su poznati u ovoj oblasti, mogu se uključiti u formulaciju proteina kao protein, takođe se mogu uključiti u formulaciju.
Neko ko se bavi ovom oblašću prepoznaćc đa se metode iz ovog pronalaskase mogu ostvariti plućnom administracijom kompozicije makar jednog anti-TNF antitela preko sredstava koja nisu ovde opisana.
Oralne formulacije i administracije
Formulacije za oralno oslanjaju se na ko-administraciju adjuvanta (e.g., rcsorcinoli i ncjonski surfactants (površinski aktivni agensi) kao polioksietilen oleil etar i n-heksadecilpolieti!en etar) da bi se veštački povećala propustljivost zidova creva, kao i na ko-administraciju enzimskih inhibitora (e.g, inhibitori pankreasnog tripsina, diizopropilfluorofosfat (DFF) i trazilol)) da bi se inhibirala degradacija enzima. Aktivna konstitutivna substanca čvrstog tipa forme doze (solid-type dosage form) za oralnu administraciju može se pomešati sa najmanje jednim aditivom, uključujući saharozu, laktozu, celulozu, manitol, trehalozu, rafinozu, maititol, đekstran, škrobove, agar, arginate, hitine, hilosane, pektine, "gum tragacath", "gum arabic", želatin, kolagen, kazein, albumin, sintetičke i polusintetičke polimere, i glicerid. ove forme doza mogu takođe da sadrže drugi(e) tip(ove) aditiva, e.g, inaktivni diluirajući agens, lubrikant kao magnezijum stearat, paraben, konzervans kao sorbinska kiselina, askorbinska kiselina, alfa-tokoferol, antioksidant kao cistein, dezintegralor, vezivač, podebljivač, puferski agens, zaslađivački agens, agens za ukus, parfemski agens itd.
Tablete i pilule mogu se dalje obraditi i od njih se mogu napraviti obloženi enterosolventni (enteric-coating) preparati. Tečni preparati za , oralnu administraciju uključuju emulziju, sirup, suspenziju i rastvor, preparati koji su dozvoljeni za medicinsku upotrebu. Ovi preparati mogu sadržati inaktivne diluirajuće agense koji se obično koriste u pomenutoj oblasti, e.g voda. Lipozomi su takođe opisani kao sistemi za dostavu lekova, insulina i heparina (U.S. Pat. No. 4,239,754). Skorije, mikrosfere veštačkih polimera mešovitih amino kiselina (protenoidi) korišćeni su za dostavu farmaceutskih sredstava (U.S. Pat. No. 4,925,673). Dalje, jedinjenja nosači opisani u U.S. Pat. No.5,879,681 i U.S. Pat. No. 5,5,871,753 koriste se za dostavu biološki aktivnih agenasa oralnim putem i poznati su u ovoj oblasti.
Mukozne formulacije i administarcija
Za absorbciju kroz mukoznu površinu, kompozicije i metode adminstracije makar jednog anti-TNF antitela uključuju emulziju koja sadrži mnoštvo submikronskih čestica, mukoadhezivne makromolekule, bioaktivne peptide, i vodenu kontinuiranu fazu, koja potpomaže absorbciju kroz. mukozalne površine ostvarujući mukoadheziju čestica emulzije (U.S.Pat.No. 5,514,670). Mukozne površine pogodne za primenu emulzija iz ovog pronalaska mogu da uključe kornealni, konjuktivalni, bukalni, sublingvalni, nazalni vaginalni, plućni, želudačni, intestinalni, i rektalni put administracije. Formulacije vaginalne ili rektalne administracije, e.g, supozitorije, mogu da sadrže ekcipijente, na primer, polialkenglikole, vazeline, kakao puter, i slične. Formulacije za intestinalnu administraciju mogu biti čvrsti i sadržati ekpicijente, na primer, laktozu ili mogu biti vodeni ili uljani rastvori nazalnih kapi. Za bukalnu administraciju ekspicijenti uključuju šećere, kalcijum stearat, magnezijum stearat, preželatinizirani škrob, i slične, (U.S.Pat.No. 5,849,695).
Transdermalne formulacije i administarcija
Za transdermalnu administraciju, makar jedno anti-TNF antitelo je inkapsulirano u sredstvu za dostavu kao stoje lipozom ili polimerne nanočestice, mikročestice, makrokapsule, ili mikrosfere (odnosu se kolektivno na mikročestice ukoliko nije drugačije naznačeno). Poznat je veliki broj pogodnih sredstava, uključujući mikročestice napravljene od sintetičkih polimera, kao polihidroksilne kiseline, kao poliaktička kiselina, poliglikolna kiselina, i njihovi kopolimeri, poliortoestri, polianhidridi, polifosfazeni, i prirodni polimeri kao kolagen, poliamino koseline, albumin i drugi proteini, alginat i drugi polisaharidi, i njihove kombinacije (U.S.Pat.Nos.5,814,599).
Produžena administarcija i formulacije
Ponekad može da bude poželjno da se jedinjenja iz ovog pronalaska dostave subjektu tokom produženog vremenskog perioda, na primer, tokom perioda od jedne nedelje do jedne godine, iz pojedinačne administracije. Različite forme doza koje se sporo otpuštaju, depo ili implant forme doza mogu se upotrebiti. Na primer, forma doze može da sadrži farmaceutsko prihvatljivu ne-toksičnu so jedinjenja koje poseduje nizk stepen rastvorljiv^sti u telesnim točnostima, na primer, (a) kiselina dodata soli sa poiibaznom kiselinom kao što je fosforna kiselina, sumporna kiselina, limunska kiselina, tartarna kiselina, tanična kiselina, pamoična kiselina, algininska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalen mono-ili di- sulfonska kiselina, poligalakturonska kiselina i slične (b) so sa polivalentnim katjonom metala kao što je cink, kalcijum, bizmut, barijum, magnezijum, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadrnijum i slični, ili sa organskim katjonom iz e.g, N,N'-dibenzil-etilenamid ili etilendiamin; ili (c) kombinacija od (a) i (b) e.g, so zink tanat. Dodatno, jedinjenja iz ovog pronalaska ili poželjno relativno nerastvorljiva so kao one koje su upravo opisane, mogu biti formulisane u gelu, na primer aluminijum stearat gel sa e.g, sezamovim uljem, pogodni za injektiranje. Posebno su poželjne soli, cink tanat soli, pamoatne soli, i slične. Još jedan tip formulacije za sporo otpuštanje depoa za injektiranje sadržao bi jedinjenje ili so dispergovane za enkapsulaciju u sporo razlažućem, ne-toksičnom, ne-antigenom polimeru kao što je polimer polisirćetne kiseline/poliglikolne kiseline na primer kao što je opisano u U.S. Pat. No. 3,773,919. Jedninjenja ili poželjnije relativno nerastvorljive soli, kao one opisane u tekstu iznad, mogu biti formulisana u holesterol matriks silikatnim talozima (pellets), pogotovu za upoterbu u životinjama. Dodatno sporo oslobađanje, formulacija za depo ili implant, e.g, gasni ili tečni Iipozomi poznati su u literaturi (U.S. Pat.Nos. 5,770,222 i "Sustained and Controlled release Drug Delverv svstem", J. R. Robinson ed, Marcel Dekker, Ine, N.Y,1978).
Pošto smo opisali pronalazak, isti će se bolje razumeti pomoću referenci iz primera koji slede, koji su dopunjeni sa ilustracijama koje nisu limitirajuće.
Primer 1: Kloniranje i ekspresija TNF antitela u sisarskim ćelijama
Tipičan sisarski ekspresioni vektor sadrži makar jedan promotorski element, koji posreduje u inicijaciji transkripcije iRNK, kodirajuću sekvencu za antitelo, i signale potrebne za terminaciju transkripcije i poladenilaciju transkripta. Dodatni elementi uključuju enhancerc, Kozak sekvence i interventne sekvence okružene donorskim i akceptorskim mestom za splajsovanje RNK. Visoko efikasna transkripcija može se postići sa ranim i kasnimpromotorima iz SV40, sa dugim terminalnim ponovcima (DTP) (LTRillong terminal repeats) iz retrovirusa, e.g, RSV, HTLVI, H1VI i rani promotor citomegalovirusa (CMV). Međutim, ćelijski elementi mogu se takođe upotrebiti (e.g, humani aktinski promotor). Pogodni ekspresioni vektori za primenu u ovom pronalasku uključuju, na primer vektore kao, pIRESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, ili pLNX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNK3.1 (+/-),. pcDNK/Zeo (+/-), pcDNK3.1/Hygro (+/-)
(Invitrogen), PSVL i PMSG (Pharmacia, Uppsala, Svveeden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) i pBC12M (ATCC 67109). Sisarske domaćinske ćelije koje bi se mogle koristiti uključuju humane Mela 293., H9 i Jurkat ćelije, misije N1H3T3 ćelije i Cl27 ćelije, Cos 1, Cos 7 i CV1, prepeličije QCl-3 ćelije, misije L ćelije i ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).
Alternativno, gen se može eksprimirati u stabilnim ćelijskim linijama koje sadrže gene integrisane u hromozomu. Kotransfekcija sa selektivnim markerom kao što je dhfr, gpt, neomicin i higromiciri dozvoljavaju identifikaciju i izolaciju transfektovanih ćelija.
Transfektovani gen može se takođe umnožiti da bi eksprimirao velike količine kodiranog antitela. DHFR (dihidrofolat reduktazajmarker je koristan za razvoj ćelijskih linija koje imaju nekoliko stotina ili nekoliko hiljada kopija gena od interesa. Još jedan koristan selekcioni marker je enzim glutamin sintaza (GS)
(Murphy et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992). Upotrebom ovih markera, sisarske ćelije gaje se u selektivnom medijumu i ćelije sa najvećom rezistencijom su one koje se selektuju. Ove ćelijske linije sadrže umnožene gen(e) integrisane u hromozom. Ćelije iz jajnikakineskog hrčka (CHO) i NSO ćelije često se koriste za proizvodnju antitela.
Ekspresioni vektori pCl i pC4 sadrže snažan promotor (LTR) Raus sarkoma virusa (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) plus fragment CMV-enhancera (Boshart, et al, Cell 41:521-530 (1985)). Mesta za višestruka kloniranja e.g, sa mestima za restrikciona sečenja enzima, BamHl, Xbal i Asp718, olakšavaju kloniranje gena od interesa. Vektori dodatno sadrže 3' intron, signal za poliadenilaciju i terminaciju iz pacovskog preproinsulinskog gena.
Kloniranje i ekspresija u CHO ćelijama
Vektor pC4 se koristi za ekspresiju TNF antitela. Plazmid pC4 je derivat plazmida pSV-dhfr (ATCC Acession No 37146). Plazmid sadrži misiji DHFR gen koji stoji pod kontrolom SV40 ranog promotora. Ćelije jajnika kineskog hrčka - ili druge kojima nedostaje dihidrofolatna aktivnost koje se transfektuju sa ovim plazmidima mogu se selektovati gajenjem ćelija na selektivnom medijumu (e.g, alfa minus MEM, Life technologies, Gaithersburg, MD) kome je dodat hematoterapeutski agens metotreksat. Amplifikacija DHFR gena u ćelijama rezistentnim na metotreksat (MTX) dobro je dokumentovana (videti, e.g, F. W. Alt et al, J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin i C. Ma, Biochem. et Biophvs. Acta-1097:107-143 (1990); i M. J. Page i M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68
(1991)(. Ćelije gajene u povišenoj koncentraciji MTX razvile su rezistenciju na lek previše (over) produkujući ciljni enzim, DHFR, kao rezultat amplifikacije DHFR gena. Ako je drugi gen povezan sa DHFR genom, najčešće se on ko-umnožava i over-eksprimira. Poznato jc u oblasti da se ovaj pristup može koristiti za razvoj ćelijskih linija koje nose više od 1,000 kopija amplifikovanog(ih) gena. Zatim, kada se povuče metotreksat, dobijene ćelijske linije sadrže umnožen gen koji je integrisan ujedan ili više hromozoma doma<ć>inske ćelije.
Plazmid pC4 sadrži za ekspresiju gena od interesa, jak promotor dugih terminalnih ponovaka (LTR) Raus sarkoma virusa (Cullen, et al, Molec.Cell.Biol. 5:438-447
(1985)) plus fragment izolovan iz enhancera iz momentalnog ranog gena humanog citomegalovirusa (CMV) (Boshart, et al, Cell 41:521-530 (1985)). Nizvodno od promotora su restrikciona mesta za restrikcione enzime BamHI, Xbal i Asp718 koja omogućavaju integraciju gena. Iza ovih mesta za kloniranje plazmid sadrži 3' intron i poliadenilaciono mesto iz pacovskog preproinsulinskog gena. Drugi visoko efikasni promotori mogu se koristiti za ekspresiju, e.g, promotor humanog b-aktina, SV40 rani ili kasni promotori ili dugi terminalni ponovci iz drugih retrovirusa, e.g, H1V i HTLVI. Clontech-ovi Tet-on i Tet-off genski ekspresioni sistemi i slični sistemi mogu se iskoristiti za ekspresiju TNF na regulisan način u sisarskim ćelijama (M. Gossen, and H. Bujard. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Za poliadenilaciju iRNK mogu se koristiti drugi signali e.g, iz humanog hormona rasta ili globinskih gena. Stabilne ćelijske linije koje nose gen od interesa integrisan u hromozome, mogu se takođe selektovati po kotransfekciji sa sa selekcionim markerom kao gpt, G418 ili higromicin. Upotreba više od jednog selektivnog markera u početku, e.g, G418 plus metotreksat pokazuje prednost. Plazmid pC4 se seče (digerira) sa restrikcionim enzimima i zatim defosforiliše pomoću fosfataze iz creva teleta procedurom poznatom u ovoj oblasti. Vektor se tada izoluje iz 1 % agaroznog gela.
Izolovana DNK koja kodira varijabilni i konstantni region i defosforilovani vektor se zatim ligiraju sa T4 DNK ligazom.E. coliHB101 ili XL-I Blue ćelije se zatim transformišu i bakterije koje sadrže plazmid pC4 sa ubačenim fragmentom se detektuju na primer, restrikcionom analizom.
Ćelije iz jajnika kineskog hrčka (CHO) kojima nedostaje DHFR gen korite se za transfekciju. 5 g ekspresionog plazmida pC4 se kotransfektuje sa o.5 g plazmida pSV2-neo pomoću lipofektina. Plazmid pSV2neo sadrži dominantan selektibilni marker, neo gen iz Tn5 koji kodira enzim koji potvrđuje rezistenciju na grupu antibiotika uključujući G418. Ćelije se zasejavaju u alfa minus MEM sa 1 g/ml G418. Posle dva dana ćelije se tripsiniziraju i zasejavaju u hibridoma pločama za kloniranje (Greiner, Germanv) u alfa minus MEM sa dodatkom 10, 25 ili 50 ng/ml metotroksata plus 1 g/ml G418. Posle oko 10-14 dana pojedinačni klonovi se tripsinizuju u zasejavaju na Petri šoljama sa 6 bunarčića ili boce od 10 ml upotrebljavajući različite koncentracije metatroksata (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klonovi koji rastu na najvećim konccntarcijama metotreksatase zatim prebacuju na nove šoljc sa 6 bunarčića koje sadrže još veće koncentracije metotreksata (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Ista procedura se ponavlja sve dok se ne dobiju klonovi koji rastu na koncentracijama od 100-200 mM. Ekspresija željenog genskog proizvoda se analizira, na primer, pomoću "SDS-PAGE" ili "Western biol" analizom ili "reverse phase 1 !PLC" analizom.
Primer2: Generisanje visoko afinitativnih humanih IgG monoklonalnih antitela reaktivnih sa humanim TNF pomoću transgenih miševa Kratak pregled
Za generisanje visoko afinitativnih, potpuno humanih, monoklonalnih antitela, koji se mogu upotrebiti terapeutski za inhibiciju akcije TNF-a za lečenje jedne ili više TNF-posredovanih obolenja, upotrebljeni su transgeni miševi koji sadrže humane imunoglogulinske gene teškog i lakog lanca. (CBA/JxC57/BL6/J)F2 hibridni miševi koji sadrže humane transgene za varijabilni i konstantni region antitela i za teške iza lake lance, imunizovani su sa humanim rekombinantnim TNF-om (Tavlor et al, International Immunology 6:579-591 (1993); Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Fishvvild et al. Nature Biotechnology 14:845-851 (1996). Nekoliko fuzija dovelo je do jednog ili više grupa kompletnih humanih TNF reaktivnih IgG monoklonalnih antitela. Kompletna humana anti-TNF antitela su dalje okarakterisana. Svi su IgGl. Za ova antitela utvrđeno je da imaju konstantu afiniteta negde između lxl0<9>i 9xl0<12>. Ovakve neočekivano visoke vrednosti afiniteta ovih potpuno humanih monoklonalnih antitela čini ih pogodnim kandidatima za terapeutsku primenu kod TNF-obolenja, patologija ili poremećaja.
Skraćenice
BSA - serum albumin govečeta
C02 - ugljen dioksid
DMSO - dimetil sulfoksid
EIA - enzimski imunoesej
FBS - fetalni serum govečeta
H202 - vodonik peroksid
HRP - peroksidaza rotkvice
ID - interdermalno
Ig - imunoglobulin
TNF - faktor nekroze tumora
IP - intraperitonealno
IV - intravensko
Mab - monoklonalno antitelo (Ma)
OD - optička gustina
OPD - o-fenilenediamin dihidrohlorid
PEG - polietilen glikol
PSA - penicilin, tetraciklin, amfotercin
ST - sobna temperatura
SQ - subkutanozno
v/v - zapremina po zapremini
vv/v - težina po zapremini
Materijal imetode
Životinje
Transgeni miševi koji mogu da eksprimiraju humana antitela poznati su u ovoj oblasti ( i komercijalno su dostupna) (e.g, od GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, i drugi) koja eksprimiraju hu humane imunoglobuline ali ne i misije IgM ili Ig . Na primer, ovakvi transgeni miševi sadrže humane sekvence transgena koji podležu V(D)J sastavljanju, menjanju klasa teškog lanca, somatskim mutacijama da bi se generisao repertoar humanih sekvenci imunoglobulina (Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)). Transgen za laki lanac može seizvesti, e.g, delom iz klona veštačkog hromozoma kvasca koji uključuje skoro pola humanog V regiona germinativnih ćelija. Dodatno, transgen za teški lanac može da kodira oba i humani p i humani l(Fiashwald et al. Nature Biotechnologv 14:854-851 (1996)) i/ili 3 konstantne regione. Miševi izvedeni iz odgovarajućih genotipskih linija mogu se iskoristiti za imunizaciju i fuzione procese da bi se generisala potpuno humana monoklonalna antitela za
TNF.
Imunizacija
Jedan ili više rasporeda za imunizaciju mogu se iskoristiti za generisanje anti-TNF humanih hibridoma. Prvih nekoliko fuzija mogu se izvesti nakon sledećih
protokola za imunizaciju koji služe za primer, ali se mogu upotrebiti i drugi slični protokoli. Nekoliko ženki i/ili hirurški kastriranih transgenih miševa starih 14-20 nedelja imunizovano je IP i/ili ID sa 1-1000 u.g rekombinantnog humanog TNF-a emulzifikovanog sa istom zapreminom TITERMAX ili kompletnog Freundovog adjuvanta u finalnoj zapremini od 100-400 pl (e.g, 200). Svaki miš takođe može opcionalno da primi 1-10 pg u 100 pl fiziološkog rastvora na svaka od dva SQ mesta. Miševi mogu tada biti imunizovani 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 i/ili 21-34 dana kasnije IP (1-400 pg) (i SQ (1-400 pg x 2) sa TNF-om emulzifikovanim sa istom zapreminom TITERMAX ili nekompletnog Freundovog adjuvanta. Miševi su iskrvavljeni 15-25 i 25-40 dana kasnije pomoću retro-orbitalnog punkture bez antikoagulansa. Krv je puštena da se zgruša na ST tokom jednog sata i sakupljen je serum i titriran pomoću TN EIA esejom na osnovu poznatih met vja. Fuzije su izvedene kada ponovljene injekcije nisu dovodile do povećanja titra. U to vreme, miševima se mogla davati finalna IV "booster" injekcija (revakcinacija) od 1-400 pg TNF-a diluiranog u 100 pl fiziološkog rastvora. Tri dana kasnije, miševi su eetanazirutanazirani cervikalnom dislokacijom i aseptički je uklonjena slezina i potpoljena u 10 ml hladnog fosfatom puferovanog fiziološkog rastvora (PBS) koji sadrži 100 U/ml penicilina, 100 pg/m! streptomicina, i 0.25 pg/m! amfotercina B
(PSA). Splenocite (ćelije slezine) su pokupljene sterilnim ubacivanjem tečnosti, PSA-PBS, (perfusing) u slezinu. Ćelije su zatim isprane u hladnom PSA-PBS, prebrajane pomoću ekskluzije Tripan blue bojom i resuspendovane u RPMI 1640 medijumu sa 25 mM HEPES.
Ćelijske fuzije
Fuzija se može izvesti u odnosu 1:1 do 1:10 mišijih mieloma ćelija naspram ćelija slezine na osnovu poznatih metoda, e.g, kao stoje poznato u ovoj oblasti. Kao nelimitirajući primer, ćelije mieloma i ćelije slezine mogu zajedno da formiraju ćelijski talog (pellet). Talog se zatim može lagano resuspendovati tokom 30 sekundi, u 50% rastvoru (w/v) PEG/PBS (PEG molekulska težina 1,450, Sigma) na 37C. Fuzija se tada može zaustaviti lagano dodatkom 10.5 ml RPMI 1640 medijuma koji sadrži 25 mM HEPES (37C) tokom 1 minuta. Fuzionisane ćelije se centrifugiraju tokom 5 minuta na 500-1500 rpm. Ćelije se zatim resuspenduju u HAT medijumu (RPMI 1640 medijum koji sadrži 25 mM Hepes, 10% fetalni klon I serum (Hvclone), 1 mM natrijum piruvat, 4 mM L-glutamin, 10 p-g/ml gentamicin, 2.5% Origen dodatak za kultivisanje - Origen culturing supplement (Fisher), 10% 653-conditioned RPMI 1640/Hepes medijum, 50 pM 2-merkaptoetanol, 100 pM hipoksantin, 0.4 pM aminopterin, i 16 pM timidin) i zatim naneseno na ploče po 200 pl/bunarčiću na 15 ploča za gajenje tkiva sa ravnim dnom i 96 binarčića. Ploče su zatim stavljene u inkubator sa regulisanom vlažnošću, na 37C sa 5% C02 i 95% vazduhom tokom 7 dana.
Detekcija humanih IgG anti-TNF antitela u mišijem serumu
EIA čvrste faze može se koristiti za skrinovanje mišijeg seruma za humana IgG antitela specifična na humani TNF. Ukratko, ploče se mogu obložiti sa TNF 2 pg/ml u PBS-u preko noći. Posel ispiranja u 0.15 M fiziološkom rastvoru koji sadrži 0.02% (v/v) Tvveen 20, bunarčići su blokirani sa 1% (vv/v) BSA u PBS, 200 pl/bunarčiću tokom 1 h na ST. Ploče su isprane i zatim urađene probe sa 50 mL/bunarčiću HRP-obeleženim kozijim anti-humanim IgG, Fc specifičnm razblaženi 1:30,000 u 1%BSA-TBS tokom 1 sata na 37°C. Ploče mogu biti ponovo isprane i 100 pl/bunarčiću sa rastvorom citratnog fosfatnog pufera (0.1 M limunska kiselina i 0.2 M natrijum fosfat, 0.01% H202 i 1 mg/ml OPD) dodato je tokom 15 minuta na ST. Stop rastvor (4N sulfuma kiselina) je tada dodat po 25 ul/bunarčiću i očitan je OD na 490 nm preko automatskog plate spektorofotometra.
Detekcija kompletnih humanih imunogiobulina u supernatantima hibridoma
Hibridome sa pozitivnim rastom koje sekretuju kompletno humane imunoglobuline mogu se detektovati pomoću odgovarajućeg EIA. Ukratko, "pop out" ploče sa 96 bunarčića (VWR, 610744) mogu se obložiti sa 10 pg/ml kozijih anti-humanih IgGFc u natrijum karbonatnom puferu preko noći na 4C. Ploče su isprane i blokirane sa 1% BSA-PBS tokom 1 sata na 37°C i odmah iskorišćene ili zamrznute na -20°C. Nerazblaženi supernatanti hibridoma su inkubirani na pločama tokom 1 sata na 37°C. Ploče su isprane i urađene su probe sa HRP obeleženim kozijim anti-humanim kappa razblaženim 1:10,000 u 1% BSA-PBS tokom 1 sata na 37°C. Ploče su zatim inkubirane sa substratnim rastvorom kao što je ovde opisano.
Određivanje reaktivnosti potpuno humanih anti-TNF
Hibridome kao one opisane u tekstu iznad, mogu biti istovremeno proverene u eseju za reaktivnost sa TNF pomoću odgovarajućeg RIA ili drugih eseja. Na primer, supernatantise inkubiraju na pločama sa anti-humanim IgGFc, isprane i zatim su urađene probe sa radioaktivno obeleženim TNF-om sa odgovarajući "count" (broj) po bunarčiću tokom 1 sata na ST. Bunarčići su isprani dva puta sa PBS i vezani radioaktivni obeleženi TNF je kvantifiokovan pomoću odgovarajućeg brojača.
Hibridome koje sekretuju huamni IgG anti TNF mogu se proširiti u ćelijskoj kulturi i serijski subklonirati limitirajućim razblaženjima. Dobijene populacije klonova mogu se proširiti i krio-sačuvati u medijumu za zamrzavanje (95% FBS, 5%>DMSO) i čuvati u tečnom azotu.
Određivanje izotipova
Određivanje izotipova antitela može se postići uz pomoć EIA formata sličnog onom koji se koristi za skrining mišijeg imunog seruma za specifične titre. TNF može da obloži bunarčiće u pločama sa 96 bunarčića kaošto je gore opisano i prečišćena antitela 2 pg/ml mogu se inkubirati na pločai tokom 1 sata na ST. Ploča se ispiraju i urade se probe sa HRP obeleženim kozijim anti-humanim IgG, ili HRP obeleženi koziji anti-humani IgG3razblažen l:4000 u 1% BSA-PBS tokom 1 sata na ST. Ploča se ponovo ispira i inkubira sa substratnim rastvorom kao stoje gore opisano.
Kinetikavezivanjahumanihanti-TNF antitela sa humanim TNF
Karakteristike vezivanja antitela mogu se zgodno proceniti pomoću "capture" EIA i BIAcore tehnologije, na primer. Stupnjevi koncentracija prečišćenih humanih TNF antitela mogu se proceniti za vezivanje za EIA ploče koje su obloene sa 2 pg/ml TNF u esejima kao što su gore opisani. OD mogu tada biti predstavljeni kao semi logaritamske PLOTS koji pokazuju relativnu efikasnost.
Kvantitativna konstanta vezivanja može se dobiti, e.g, kao što sledi, ili bilo kojom pogodnom poznatom metodom. BIAcore CM-5 (karboksimetil) čip je smešten u BIAcore 2000 jedinicu. HBS pufer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 surfactant, pH7.4) je pušten preko protočne ćelije čipa 5mL/min dok se nije dobila stabilna bazna linija. Rastvor (100 pL) 15 mg EDC (N-etil-N'-)3-dimetil-aminopropil)-karbodiimid hidrohlorid u 200 pL vode dodat je u 100 pL rastvora 2.3 mg NHS (N-nidroksisukcinimid) u 200 uL vode.
Četrdeset (40) pL dobijenog rastvora se injekcira u čip. Šest pL rastvora humanog TNF (15 pg/ml u 10 mM natrijum acetatu, pF14.8) se injecira u čip, što rezultira u povišenju ca.500RU. Pufer se menja u TBS/Ca/Mg/BSA "running" pufer (20 mM Tris, 0.5 M natrijum hlorid, 2 mM kalciju hlorid, 2 mM magnezijum acetat, 0.5% Triton-X-100, 25 pg/ml BSA, pH 7.4) i pušta da teče preko čipa preko noći da se ekvilibriše i hibridizuje ili zadrži bilo koji neizreagovani estri sukcinimida.
Antitela se rastvaraju u "running" pufreru na 33.33, 16.67, 8.33 i 4.17 nM. Nivo protoka je podešen na 30 pg/min i temperaturu instrumenta na 25°C. Dve protočne ćelije su upotrebljene za kinetičke RUNS, jedna u kojoj je TNF imobilisan (uzorak) i drugi nederivatna protočna ćelija (blank). 120 pL svake knocentracije antitela se injecira preko protočnih ćelija pri 30 pL/min (asocijaciona faza) zatim je sledilo 360 sekundi neprekidnog protoka pufera (disocijaciona faza). Površina čipa se regernerisala (faktor nekroze tkiva alfa/kompleks antitela disocirani) pomoću dve, jedna za drugom injekcije 30 pL 2 M guanidin tiocijanata.
Analiza podataka urađena je pomoću BIA evaluation 3.0 ili CLAMP 2.0, kao što je poznato u ovoj oblasti. Za svaku koncentraciju antitela blank sensogram je oduzet od sensograma uzorka. "Global fit" je urađen za obe disocijaciju (kd, sec"') i asocijaciju (ka, moNsec"!) i disociaciona konstanta (KD, mol) proračunato (kd/ks). Tamo gde je afinitet antitela dovoljno veliki da RU uhvaćenih antitela je veći od 100, puštena su dodatna razblažen ja antitela.
Rezultati i diskusija
Generisanje anti-humanih TNF monoklonalnih antitela
Urađeno je nekoloko fuzija i svaka fuzija je posejana na 15 ploča (1440 bunarčića/fuziji) koji su doveli do nekoliko desetina antitela specifičnih za humaniCTTNF). Za neke od ovih je pronađeno da sadrže kombinaciju humanih i mišijih Ig lanaca. Ostale hibridome sekretuju anti-TNF antitela koja se sastoje samo od humanih teških i lakih lanaca. Za sve humane hibridome se očekuje da su IgGl.
Kinetika vezivanja humanih anti-humanih TNF antitela
ELISA analiza je potvrdila da prečišćena antitela iz većine ili svih hibridoma vezuju TNF na način zavistan od koncentracije. Slike 1-2 prikazuju rezultate relativne efikasnosti vezivanja ovih antitela. U ovom slučaju izmerena je aviditv antitela za srodni antigen (epitop). Treba naglasiti da vezivanje TNF direktno za EIA ploču može dovesti do denaturacije proteina i vezivanja koja se odigraju ne mogu biti prava slika vezivanja nedenaturisanog proteina. Pedeste posto vezivanja je spadalo u opseg koncentracija.
Konstanta kvantitativnog vezivanja se dobija pomoću BIAcore analize humanih antitela i otkriva nekoliko humanih monoklonalnih antitela koja imaju visoku KD u rasponu od 1x10"<9>do 7x10 l2.
Zaključci
Izvedeno je nekoliko fuzija pomoću splenocita (ćelije slezine) iz hibridnih miševa koji sadrže humane transgene za varijabilan i konstantan region antitela koji su imunizovani sa humanim TNF. Generisanje set nekoliko kompletno humanih TNF reaktivnih IgG monoklonalnih antitela IgG izotipa. Kompletno humana anti-TNF antitela su dalje okarakterisana. Nkoliko generisanih antitela imaju konstante afiniteta izmeĆu IXIO<9>i 9X10'<2>. Neočekivano visoki afiniteti ovih potpuno humanih monoklonalnih antitela čini ih pogodnim za terapeutske primene kod TNF-povezanih obolenja, patologija ili povezanih stanja.
Primer2: generisanje humanih IgG monoklonalnih antitela koji su reaktivna sa humanim TNFV
Kratak pregled
(CBA/J x C57BL/6J)F2 hibridni miševi (1-4) koji sadrže humane transgene za varijabilni i konstantni region antitela za oba i teški i laki lanac imunizovani su sa rekombinantnim humanim TNFV. Jedna fuzija, nazvana GenTNV, dala je osam totalno humanih IgGKmonoklonalnih antitela koja se vezuju za imobilisani rekombinantni humani TNFa. ubrzo posle identifikacije, osam ćelijskih linija su prebačene na Molekularnu biologiju za dalju karakterizaciju. Sva ova Mabs (Ma) imaju potpuno humane sekvence, i očekuje se da budu manje imunogeni nego cA2 (Remacide) kod ljudi.
Skraćenice:
BSA - serum albumin govečeta
C02 -ugljen dioksid
DMSO - dimetil sulfoksid
EIA -enzimski imunoesej
FBS -fetalni serum govečeta
H202- vodonik peroksid
HC - (heavy chain) težak lanac
HRP - peroksidaza rotkvice
Ig - imunoglobulin
IP - intraperitonealno
IV - intravensko
Mab - monoklonalno antitelo (Ma)
OD - optička gustina
OPD - o-fenilenediamin dihidrohlorid
PEG - polietilen glikol
PSA - penicilin, tetraciklin, amfotercin
ST - sobna temperatura
SQ - subkutanozno
TNFV- faktor nekroze tumora
v/v - zaprem ina po zapremini
\v/v - težina po zapremini
Uvod
Korišćeni su transgeni miševi koji sadrže humane gene za tažak i lak lanac imunoglobulina da bi se dobila humana monoklonalna antitela koja su specifična za humani TNFV . Postoji želja da se ova jedinstvena antitela mogu upotrebiti kao što se cA2 (Remicide) koriste da terapeutski inhibiraju inflaminatorne procese koji su uključeni kod TNFV-posredovanih oboljenja, uz korist povišenog poluživota seruma i smanjenih propratnih efekata koji su vezani za imunogenost.
Materijal i metode
Životinje
Transgeni miševi, koji eksprimiraju imunoglobuline ali ne misiji IgM ili Igk, razvijeni su od strane GenPharm International. Ovi miševi sadrže funkcionalne transgene sa humanom sekvencom koja podleže V(D)J spajanju, promeni klase teškog lanca (heavy chain svvitching) i somatskoj mutaciji da bi se generisao antigen-specifični humanih imunoglobulina (1). Transgen za laki lanac je dobijen delom iz veštačkog hromozomalnog klona kvasca koji uključuje skoro polovinu humanog Vklokusa germinativnih ćelija. Kao dodatak nekoliko VFI gena, transgen teškog lanca (TL) (heavy chain HC) kodira oba i humani m i humaniy\(2) i/ili y3 konstantne regione. Miš dobijen iz HCol2/KCo5 genotipske linije je korišćen za imunizaciju i fuzione procese da bi se dobila monoklonalna antitela koja su ovde opisana.
Prečišćavanje huamnog TNFV
HuamniTNFV je prečišćen iz supernatanta kulture tkiva iz C237A ćelija pomoću afinitativne hromatografije pomoću kolona upakovanih sa TNFV receptor-Fc fuzionim proteinom (p55-sf2) (5) vezne za sefarozu 43(Pharmacia). Ćelijski supernatant je pomešan sa jedno devetinom svoje zaprem ine 10 x Dulbecco PBS (D-PBS) i pušten je krozkolonu na 4°C 4mL/min. Kolona je zatim izprana sa PBS i TNFV je eluiran sa 0.IM natrijum citratom, pH3.5 i neutralisan sa 2 M Tris-HCI pH 8.5. Prečišćen TNFV -uje promenjen pufer sa 10 mM Tris, 0.12 M natrijum hlorid pH 7.5 i profiltriran je kroz filter špric od 2 um.
lmunizacija
Ženka GenPharm miša, oko 16 nedelja stara, imunizovana je IP (200 pl) i ID (100 pl na bazi repa) sa ukupno 100 pg TNFV (lot JG102298 ili JG102098) koji je
emulgovan sa istom zapreminom Titremax adjuvanta 0, 12 i 28 dana. Mišje iskrvavljen 21 i 35 dana retro-orbitalnom punkturom bez antikoagulansa. Krv je puštena da se zgruša na ST tokom 1 sata i sakupljen je serum i titriran pomoću TNFV EIA eseja čvrste faze. Fuzija, nazvana GenTNV, je izvedena pošto je mišu dozvoljeno da se odmori sedam nedelja pošto je injektiran 28 dana. Mišu sa specifičnim titrom 1:160 humanih IgG naspram TNFV zatim je data finalna IV
booster injekcija (revakcinacija) od 50 pg TNFV diluiranog u 100 pL fiziološkog rastvora. Tri dana kasnij, mišje eutanaziran cervikalnom dislokacijom i aseptički je uklonjena slezina i potopljena u 10 rnL hladnog fosfat- puferovanog fiziološko rastvora (PBS) koji sadr.i 100 U/mL penicilina, lOOpg/mL streptomicina, i 0.25 pg/mL amfotercinaB (PSA). Splenocite su pokupljene sterilnim perfusig slezine sa PSA-PBS. Ćelije su isprane sa hladnim PSA-PBS, određen im je broj pomoću Coulter brojača i resuspendovane su u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 25 mM Hepes.
Ćelijskelinije
Ne sekretujući miševi mieloma fuzioni partneri, 653 primljen je u Cell Biologv Services (CBS) grupu 5-14-97 od Centor's Product Development grupe, ćelijska linija je razvijena na RPMI medijumu (JRH Biosciences) kome je dodato 10%
(v/v) FBS (Cell Culture Labs), 1 mM natrijum piruvat, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin (sve je od JRH Biosciences) i kriosačuvan u 95% FBS i 5% DMSO (Sigma), a zatim čuvan u gasovitoj fazi frizera sa tečnim azotom u CBS. Ćelijska banka je bila sterilna (Qualitu Control Centocor, Malvern), i bez mikoplazme (Bionique Laboratories). Ćelije su održavane u log fazi kulture do fuzije. Isprane su sa PBS, određen im je broj, i vijabilnost je određena (veća od 95%) preko "trypan blue" isključivanja pre fuzije.
Huamni TNFV je proizveden od strane rekoinbinantnte ćelijske linije, nazvane C237A, generisane u Molecular biologv u Centor-u. ćelijska linija je razvijena na IMDM medijumu (JRH Biosciences) kome je dodafo 5% (v/v) FBS (Cell Culture Labs), 2 mM L-glutamin (sve je od JRH Biosciences) i 0.5 :g/mL mikofenolne kiseline, i kriosačuvan u 95% FBS i 5% DMSO (Sigma), a zatim čuvan u gasovitoj fazi frizera sa tečnim azotom u CBS (13). Ćelijska banka je bila sterilna (Qualitu Control Centocor, Malvern), i bez mikoplazme (Bionique Laboratories).
Ćelijska fuzija
Ćelijska fuzija je izvedena korišćenjem odnosa 1:1 653 mišijih mijeloma ćelija i vijabilnih mišijih ćelija slezine. Ukratko, ćelije slezine i ćelije mieloma su zajedno istaložene. Talog je lagano resuspendovan tokom 30 sekundi u 1 mL 50% (w/v) PEG/PBS rastvoru (molekulska težina PEG-a je 1,450 g/molu, Sigma) na 37°C. Fuzija je zaustavljena laganim dodavanjem 10.5 mL RPM medijuma (bez aditiva)
(JRH) (37°C) tokom 1 minuta. Fuzionisane ćelije su centrifugirane 5 minuta na 750 rpm. Ćelije su zatim resuspendovane u HAT medijumu (RPMI/HEPES medijum sa 10% fetalnim serimom govečeta (JRH), lmM natrijum piruvat, 2 mM L-glutamin, 10 pg/mL gentamicin, 2.5% Origen dodatak za gajenje (Fisher), 50 pM 2-merkaptoetanol, 1% 653-conditioned RPMI medijum, 100 pM hipoksantin, 0.4 pM aminopterin i 16 p.M timidin) i zatim su nanesene na ploče 200 pL/bunarČiću na ploče za kultivisanje sa ravnim dnom, sa 96 bunarčića. Ploče su zatim stavljene u inkubator sa odgovarajućom vlažnošću, na 37°C sa 5% C02 i 95%o vazduh tokom 7-10 dana.
Detekcija buamnih IgG anti-TNFV antitela u mišijem serumu
EIA čvrste faze upotrebljeni su za skrinovanje mišijeg seruma za humana IgG antitela specifična za humani TNFV. Ukratko, ploče su obložene sa TNFV 1 pg/mL u PBS-u preko noći. Posle ispiranja sa 0.15 M fiziološkim rastvorom sa 0.02% (v/v) Tvveen 20, bunarčići su blokirani sa 1% (vv/v) BSA u PBS, 200 pl/bunarčiću tokom 1 sata na ST. Ploče su ili odmah upotrebljene ili su zamrznute na -20°C za dalju upotrebu. Mišiji serumi su inkubirani u serijama dvostrukih razblaženjana pločama obloženim humanim TNFV 50 pL/bunarčiću na ST tokom 1 sata. Ploče su isprane i urađene su probe sa 50 pL/bunarčiću HRP- obeleženim kozijim anti-humanim IgG, Fc specifični (Accurate) razblaženi 1:30,000 u 1% BSA-PBS tokom 1 sata na ST. Ploče su ponovo isprane i dodato je 100 pL/bunarčiću citrat-fosfatnog substrat rastvora (0.1 M limunska kiselina i 0.2 M natrijum fosfat, 0.01%) H202i I mg/mL OPD) tokom 15 minuta na ST. Stop solution (4N sumporna kiselina) je tada dodata 25 pL/bunarčiću i očitani su OD na 490 nm pomoću automatskog "plate" spektrofotometru.
Detekcija ukupnih humani imunoglobulina u supernatantima hibridoma
Pošto je GenPharm miš sposoban da generiše obe i mišije i humane imunoglobulinske lance, upotrebljena su dva EIA eseja za testiranje klonova hibridoma pozitivnih na rast, na prisustvo oba humana lanca i teški i laki. Ploče su obložene kao stoje gore opisano i nerazblaženi supernatanti hibridoma su inkubirani na pločama tokom 1 sata na 37°C. Ploče su isparne sa ili HRP konjugovanim kozijim anti-humanim kappa (Southern Biotech) antitelima razblaženim 1:10,000 u 1%> BSA-HBSS ih HRP-konjugovanim kozijim anti-humanim IgGFc specifičnim antitelima razblaženim 1:30,000 u 15 BSA-HBSS tokom 1 sata na 37°C. Ploče su zatim inkubirane sa substratnim rastvorom kao što je gore opisano. Klonovi hibridoma koji nisu davali pozitivan signal ni u anti-humanom kappa ni anti-humanom IgGFc formatu bili su odbačeni.
Određivanjeizotipova
Određivanje izotipova antitela je urađeno uz pomoć EIA u formatu sličnom onom koji se koristi za skrining mišijeg imunog seruma za specifične titre. EIA ploče su obložene sa kozijim anti-humanim IgG (H+L) 10 :g/mL u natrijum karbonatnom puferu preko noći na 4EC i blokirana kao što je gore opisano. Cisti supernatanti iz kultura iz 24 bunarčića inkubirani su na ploči tokom 1 sata na ST. Ploča je isprana i urađena je proba sa HRP obeleženim kozijim anti-humanim IgG), IgG2, IgG3ili IgG4(mesta vezivanja) razblaženi 1:4000 u 1% BSA-PBS tokom 1 sata na ST. Ploča se ponovo ispira i inkubira sa substratnim rastvorom kao što je gore opisano.
Rezultati i diskusija
Generisanje totalnih humanih anti-humani TNFV monoklonaln antitela
Jedna fuzija, nazvana GenTNV, izvedena je iz GenPharm miša imunizovanog sa rekombinantnim humanim TNFV proteinom. Iz ove fuzije, skrinovano je 196 hibrida pozitivnog rasta. Identifikovano je osam hubridoma ćelijskih linija koje sekretuju totalna humana IgG antitela reaktivna sa humanim TNFV. Ovih osam ćelijskih linija su sekretovale imunoglobuline humanog IgG* izotipa i sve su dva puta subklonirane limitirajućim razblaženjima da bi se dobile stabilne ćelijske linije (više od 90% hiomogene). Nazivi ćelijskih linija i dodeljivanje odgovarajućeg C koda prikazani su na tabeli l. Svaka od ćelijskih linija je smrznuta u ćelijskim bankama od 12 vajli i čuvana u tečnom azotu.
Roditeljske ćelije koje su sakupljene iz bunarčiće šolja za gajenje sa 24 bunarčića za svaku od osam linija su predate Molecular Biologv grupi 2-18-99 za transfekcijuu i dalju karakterizaciju.
Zaključak
GenTNV fuzija je izvedena pomoću splenocita (ćelije slezine) iz hibridnog miša koji sadrži humane transgene za varijabilan i konstantan region antitela koji je imunizovani sa rekombinantnim humanim TNFV pripremljenim u Centocor-u.. Generisano je osam totalno humanih, TNFV-reaktivnih IgG monoklonalnih antitela IgGic izotipa. Roditeljske ćelijske linija su prebačene u Molecular Biologv grupu za dalju karakterizaciju i razvoj. Jedan od ovih humanihh antitela može se pokazati korisnim u antiinflaminatornim procesima sa potencijalnom koristi smanjene imunogenosti i komplikacija vezane za alergijski tip kada se poredi sa Remicide.
Reference
1. Tavlor, et al, International Itnmunology 6:579-591 (1993).
2. Lonberg, et al. Nature 368:856-859 (1994).
3. Neuberger, et al. Nature BiotechoIogy 14:826 (1996).
4. Fishwild, et al. Nature Biotechnology 14:845-851 (1996).
5. Scallon et al, Cytokine 7:795-770 (1995).
Primer 3: kloniranje i priprema ćelijskih linija koje eksprimiraju humano and- TNFV antitelo
Kratak pregled
Za grupu od osam humanih monoklonalnih antitela (mAbs) sa TNV obeležjem pronađeno je da vezuju imiobilisana humana TNFV sa očigledno visokim avidity. Sedam od osam mAbs (Ma) su pokazivali da efikasno blokiraju vezivanje huTNFV za rekombinantni TNF receptor. Analize sekvenci DNK koje kodiraju sedam Mabs (Ma) polrvdile su da sva mAbs imaju humane V regione. DNK sekvence su takođe otkrile da tri para mAbs su međusobno identična, tako da originalni spisak mAbs sc sastoji ustvari od samo četiri različita mAbs, ostavljeni kao TNV 14/FNV15, TNV148 i TNV196. Bairano na izvedenom amino kiselinskim sekvencama mAbs i rezultatimain vitroTNFV neutralizacije, mAbs TNV148 i TNV 14 su odabrani za dalja proučavanja.
Pošto tokom pretrage baze podataka prolinski ostatak na mestu 75 (framevvork 3) u TNV 148 teškom lancu nije pronađen na tom mestu kod drugih humanih antitela iz iste podgrupe, site-directed mutageneza je izvedena da bi se kodirao serinski ostatak na ovoj poziciji da bi se slagalo sa poznatim sekvencama framevvork germinativnih ćelija. Serinski modifikovana mAbs (Ma) su označena kao TNV148B. DNK umnožena PCR-om koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca TNV148B i TNV14 klonirani su u novo pripremljene ekspresione vektore koji se baziraju na skorašnjim kloniranim genima za teške i lake lance drugih humanih mAb (12B75), otkriveno u US prijavi patenta, podnetoj 7. oktobra, 2000, pod nazivom 1L-12 antitela, kompozicije, metode i upotreba.
P3X63Ag8.653 (653) ćelije ili Sp200-Agl4 (Sp2/0) mišije ćelije mieloma su transfektovane sa ekspresionim plazmidima sa odgovarajućim teškim i lakim lancima i skrinovani su tokom dve runde subkloniranja za ćelijske linije koje proizvode visoke nivoe rekombinantnih TNV 148 i TNV 14 (rTNV148B i rTNV14) mAbs (Ma). Procena krivi rasta i stabilnosti proizvodnje mAbs (Ma) tokom vremena ukazalo je na to da 635-transfektovani klonovi C466D i C466C stabilno proizvode približno 125 :g/ml rTNV148B u potrešenim kulturama gde Sp2/0 transfektant 1.73-12-122 (C467) stabilno proizvodi oko 25 :g/ml rTNV148B mAb (Ma) u potrošenim kulturama. Slične analize ukazivale su da Sp2/0-transfektovani klon C476A proizvodi 18 g/ml rTNV14 u potrošenim kulturama.
Uvod
Za grupu od osam mAbs (Ma) izvedenih iz GenPharm/Medarex miševa imunizovanih sa humanim TNVV (genotip HCol2/KCo5) već je ranije pokazano da vezuju humani TNVV i da imaju totalno humani IgGl, kappa izotipa. Upotrebljen je jednostavan esej za vezivanje da bi se odredilo da li primerci mAbs (Ma) iz ovog pronalaska imaju TNVV neutrališuću aktivnost procenom sposobnosti da blokiraju TNVV vezivanjem za rekombinanatni TNF receptor. Bazirano na tim rezultatima, rezultatima sekvence DNK, iin vitrokarakterizacijama nekoliko mAbs (Ma), za dalje karakterisanje odabran je TNV148 mAb.
Klonirane su sekvence DNK koje kodiraju TNV 148 mAb (Ma), modifikovane da mogu da se uklope u vektpre koji eksprimiraju gene koji kodiraju odgovarajuće konstantne regione, koji se unose u dobro okarakterisane 653 i Sp2/0 mišije ćelije mieloma, i rezultujuče transfektovane ćelijske linije su pregledane dok nisu identifikovani subklonovi koji proizvode 40-puta više mAb (Ma) nego originalne hibridoma ćelijske linije.
Materijali i metode
Reagensi i ćelije
TRIZOL reagens je kupljen od GibcoBRL. Proteinaza K je nabavljena od Sigma Chemical Companv. Reverzna transkriptaza je nabavljena od Life Science, Inc. Taq DNK polimeraza je nabavljena od ili Perkin Elmer Cetus ili Gibco BRL. Restrikcioni enzimi su kupljeni od Nevv England Biolabs. QIAquick PCR Purification Kit je od Qiagen. QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit je kupljen od Stratagene. Wizard kitovi za mini prep i RNasin su od Promega. Optiplates su nabavljene od Packard. 125Jod je kupljen od Amersham. Oligonukleotidi su kupljeni od Kevstone/Biosource International. Imena, identifikacioni brojevi, i sekvence oligonukleotida koji su korišćeni u ovom radu prikazani su u tabeli 1.
Tabela 1. oligonukleotidi korišćeniza kloniranje, konstruisanje ilisekvenciranjeTNVmAb(Ma) gena. Amino kiseline kodirane oligonukleotidima 5'14s i HuH-J6 su prikazane iznad sekvence. "M" amino kiselinski ostatak predstavlja translacioni start kodon. Podvučene sekvence u oligonukleotidima 5'14s i HuH-J6 označavaju BsaWI i BstBI restrikciona mesta. Crtica u HuH-J6 odgovara granici egzon/intron. Obratiti pažnju na to da su oligonukleotidi čija sekvenca odgovara minus lancu napisani u 3'-5" orjentaciji. Dobijena je pojedinačna zamrznuta vajla sa 653 mišijim ćelijama mieloma. Vajla je odmrznuta istog dana i razvijena u T bocama u IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamin (medijum). Ove ćelije su održavane u kontinuiranim kulturama dok nisu transfektovane 2 do 3 nedelje kasnije sa anti-TNF DNK koja je ovde opisana. 5 dana posle datuma odmrzavanja neke od kultura su pokupljene, istaložene centrifugiranjem i resuspendovane u 95% FBS, 5% DMSO, alikvotirane u 30 vajli, zamrznute i sačuvane za dalju upotrebu. Slično je takođe dobijena pojedinačna vajla sa Sp2/0 mišijim ćelijama mieloma. vajla je odmrznuta, novo smrzavanje je pripremljeno kao što je gore opisano, i zamrznute vajle su čuvane u CBS kutijama za smrzavanje AA i AB. Ćelije su odmrznute i korišćene za sve Sp2/0 transfekcije koje su ivde opisane.
Esej zainhibicijuTNF vezivanja za receptor
Supernatanti hibridoma ćelija koje sdarže TNVV mAbs (Ma) iskorišćeni su za esej za utvrđivanje sposobnosti mAbs (Ma) da blokiraju vezivanje TNVV obeležena sa l25I za rekombinantni TNF receptorni fuzioni protein, p55-sf2 (Scallon et al., (1995)Cytokine7:759-770). 50 :1 p55-sf2 na 0.5 :g/ml u PBS-u dodato je u Optoplates da bi se obložili bunarčići tokom jednosatne inkubacije na 37°C. Serijska razblažnja osam TNV ćelijskih supernatanta pripremljena su na pločama sa ravnim dnom sa 96 bunarčića pomoću PBS/0.1%BSA kao rastvaračem. Ćelijski supernatant koji sadrži anti-fL-18 mAb (Ma) je uključen kao negativna kontrola a kao pozitivna kontrola uključenje isti anti-IL-18 supernatantza koji je zakačen cA2 (anti-TNF himerno antitelo, Remicade, US Patent No 5,770,198). TNVV obeležena sa l25I (58 :Ci/:g, D.Shealv) je dodat 100:1 ćelijskim supernatantima do Finalne koncentracije TNVV od 5 ng/ml. Mešavina je preinkubirana tokom 1 sata na ST. Obložene Optiplates su isprane da bi se uklonil nevezani p55-sf2 i 50 :1 TNVV obeležena sa l25l /supernatantu ćelijske mešavine prebačeno je na Otiplates. Posle 2 sata na ST, Optiplates ploče su isprane tri puta sa PBS-Tvveen. Dodato je 100 :1 Microscint-20 i pomoću TopCount gama broj::;:; određeno je cpm vezivanje.
Umnožavanje V gena i analize DNK sekvenci
Ćelije hibridoma su jedan put isprane pre dodavanja TR1ZOL reagensa za pripremu RNK. Između 7xl0<6>i 1.7x107 ćelija je resuspendovano u 1 ml TR1ZOL-
a. Tube su snažno promućkane posle dodavanja 200 pl hloroforma. Uzorci su centrifugirani 10 minuta na4°C. Vodena faza je prebačena u nove tube za mikrofugu i dodata je ista zaprem ina izopropanola. Tube su snažno promućkane i puštena je inkubacija na ST tokom 10 minuta. Uzorci su centrifugirani 10 minuta na 4°C. Taloži si jednom isprani sa 1 ml 70% etanola i kratko sušeni u vakum sušaču. RNK taloži su resuspendovani u 40 pl vode tretirane sa DEPC. Kvalitet pripremljene RNK je određen frakcionisanjem 0.5 pl na 1% agaroznom gelu. RNK se čuvala na -80°C u frizeru do upotrebe.
Da bi se pripremila cDNK teškog i lakog lanca, spremlčjene su mešavine koje sadrže 3 pl RNK i 1 pg ili oligonukleotida 119 (teški lanac) ili oligonukleotida 117 (laki lanac) (videti tabelu 1) u zapremini od 11.5 pl. lMešavina je inkubirana na 70°C 10 minuta u vodenom kupatilu i zatim ohlađena na ledu 10 minuta. Pripremljena je odvojena mešavina od 2.5 pl 10x pufera za reverznu transkriptazu, 10 pl 2.5 mM dNTP-ovi, 1 pl reverzne transkriptaze (20 jedinica), i 0.4 pl RNasin inhibitro ribonukleaze (1 unit). 13.5 pl ove mešavine je dodato u 11.5 pl ohlađene mešavine RNK/oligonukleotid i reakcija je inkubirana tokom 40 minuta na 42°C. Reakcija sinteze cDNK je čuvana na -20°C u frizeru do upotrebe.
Neprečišćene cDNK teškog i lakog lanca su korišćne kao matrice za PCR umnožavanje sekvenci koje kodiraju varijabilni region. Pet parova oligonukleotida (366/354, 367/354, 368/354,369/354, i 370/354, tabela 1) su istovremeno testirani za sposobnost da se vežu pri umnožavanju DNK teškog lanca. Dva oligonukleotidna para (362/208 i 363/208) su istovremeno testirana za sposobnost da se vežu pri umnožavanju DNK lakog lanca. PCR reakcije su izvedene pomoću 2 jedinice PLATINUMTM high fidelitv (HIFI) (visoke preciznosti) Taq DNK polinerazom u totalnoj zapremini od 50 pl: Svaka reakcija sadrži 2 pl cDNK reakcije, 10 pmola svakog oligonukleotida, 0.2 mM dNTP-ove, 5 pl 10 x HIFI pufera i 2 mM magnezijum sulfata. Program na PCR mašini je bio 95°C 5 minuta, zatim 30 ciklusa (94°C 30 sekundi, 62°C 30 sekundi, 68°C tokom 1.5 minuta), na kraju je finalna inubacija na 68°C 10 minuta.
Da bi se PCR proizvodi pripremili za direktno sekvenciranje, prečišćeni su pomoću QIAquickTM PCR Purification Kit na osnovu preporuke protokola proizvođača. DNK je eluirana iz kolone koja se centrifugira pomoću 50 pl sterilne vode i uparena je do zapremine od 10 pl pomoću vakuum sušača. Zatim su pripremnlejne reakcije za sekvenciranje DNK sa 1 pl prečišćenog PCR proizvoda, 10 pM oligonukleotidog prajmera, 4 pl BigDveTerminator™ gotove reakcione smeše, i 14 pl sterilne vode u ukupnoj zapremini od 20 pl. PCR proizvodi teškog lanca sintetisani sa oligonukleotidnim parom 367/354 su sekvencirani sa očigonukleotidnim prajmerima 159 i 360. PCR proizvodi lakog lanca sintetisani sa oligonukleotidnim parom 363/208 su sekvencirani sa očigonukleotidnim prajmerima 34 i 163. Program na PCR mašini imao je 25 ciklusa (94°C 30 sekundi, 50°C 15 sekundi, 60°C tokom 4 minuta) a zatim su ostavljeni preko noći na 4°C. Proizvodi reakcije su frakcionisani na poliakrilamidnom gelu i detektovani pomoću ABI377DNK sekvencera.
'Site-directed' mutageneza za promenu amino kiseline
Jedan nukleotid u DNK sekvenci TNV148 varijabilnog regiona teškog lanca je promenjen da bi se Pro<75>zamenio sa serinonskim ostatkom u TNV 148 mAb (Ma), komplementarni oligonukleotidi, 399 i 400 (tabela 1) su dizajnirani i naručeni da bi se ova zamena izvršila pomoću BsiWI mesta za kloniranje koji se nalazi uzvodno od mesta inicijacije translacije, na osnovu protokola proizvođača. Dobijeni plazmid je nazvan pl 747. JDa bi se unelo BstBI mesto na 3' kraju varijabilnog regiona, dizajniranje 5' oligonukleotidni prajmer sa Sali i BstBI mestima. Ovaj prajmer je upotrebljen sa pUC reverznim prajmerom da bi se amplifikovao fragment od 2.75 kb iz pl747. Ovaj fragment je zatim kloniran natrag u prirodno Sali mesto u 12B75 varijabilni region i Hindlll mesto, i tako je uneto jedinstveno BstBI mesto. Dobijeni internmedijerni vektor, nazvan p 1750, mogao je da primi fragmente varijabilnog regiona sa BsiBW i BstBI krajevima.
Da bi se pripremila verzija vektora za težak lanac u kome je konstantni region takođe izveden iz 12B75 gena, BamHI-Hindll insertu 1750 je prebačen u pBR322 da bi se dobilo EcoRI mesto nizvodno od Hindll mesta. Dobijeni plazmid, p 1768, je zatim isečen sa Hindlll i EcoRI i ligiran sa 5.7 kb HindlH-EcoRI fragmentom iz pl744, subklonom izvedenim kloniranjem velikog Bamlll-BamHI fragmenta iz pl560 u pBC. Dobijeni plazmid, p 1788 i pl 798, koji uključuju IgGl konstantni region iz 12B75 gena i međusobnose razlikuju po tome koliko sadrže J-C introna taškog lanca 12B75.
Da bi se modifikovao 12B75 gen za laki lanac u plazmidu pl 558, fragment od 5.7kb SalI/Aflll koji sadrži 12B75 promotor i varijabilni region je prbačen iz p 1558 u XhoI/AflII mesto plazmida L28. Ovaj novi plazmid, pl 745, obezbedio je manju matricu za korak mutageneze. Oligonukleotidi (C340sall i C340sal2) su korišćeni za unošenje jedinstvenog Sali restrikcionog mesta na 5' kraj varijabilnog regiona pomoću QuickChange™ mutageneze. Dobijeni intermedijerni vektor, p 1746, imao je jedinstvena Sali i Aflll restrikciona mesta u koje se mogu uklonirati fragmenti varijabilnog regiona. Bilo koji fragment varijabilnog regiona koji je kloniran u pl746 mogao bi se povezati sa 3' polovinom gena za laki lanac. Da bi se pripremio restrikcioni fragment iz 3' polovine I2B75 gena za laki lanac koji bi mogao da se koristi za ove potrebe, oligonukleotidi BAHN-1 i BAITN-2 su se međusobno spojili (annealed) da bi formirali dvolančani linker koji sadrži restrikciona mesta BsiWl, Aflll, Hindll i Noti i koji je sadržao krajeve koji su se mogli ligirati sa KpnI i Saci mestima. linker je kloniran izrr.edu KpnI i Sacl rr
u pBC da bio se dobio plazmid p 1757. Fragment od 7.1 kb koji sadrži 12B75 konstantni region lakog lanca, dobijen sečenjem p1558 sa Aflll, zatim parcijalno sečen sa Hindlll, kloniranje između Aflll i Hindll mesta pl 757 da bi se dobio p 1762. Novi plazmid je sadržao jedinstvena mesta za BsiVVI i Aflll u koja može
da se prebaci BsiVVTAfU fragment koji sadrži promotor i varijabilne regione, i tako se spajaju dve polovine gena.
Kloniranje cDNK i sasatavljanje ekspresionih plazmida
Sve RT-PCR reakcije (videti u tekstu iznad) su tretirane sa Klenovim enzimom da bi se dalje popunili DNK krajevi. PCR fragmenti teškog lanca su iseščeni sa restrikcionim enzimima BsiWI i BstBI i zatim klonirani uzmeđu BsiWI i BstBI mesta na plazmidu L28 (L28 je upotrebljen jer intermedijerni vektor pl750 koji se bazira na 12B75 nije bio još uvek pripremljen). Analize DNK sekvenci kloniranih inserta pokazale su da su dobijeni konstrukti dobri i da nem grešaka koje su se mogle uvesti tokom PSCR umnožavanja, dodeljeni identifikacioni brojevi za ove L28 plazmidne konstrukte (za TNV 14, TNV 15, TNV148, TNV148Bi TNV 196) prikazani su u tabeli 2.
BsiVVI/BstBI insreti za TNV 14, TNV148 i TNV148B teških lanaca su prebačeni iz L28 vektora u novo pripremljeni intermediejrni vektor p 1750. Dodeljeni identifikazioni brojevi za ove intermediajrne vektore prikazani su u tabeli 2. Ovaj korak u procesu kloniranja i dalji koraci nisu urađeni za TNV 15 i TNV196. Varijabilni regioni su zatim prebačeni u različite humane IgG ekspresione vektore. Restrikcioni enzimi EcoRI i Hindlll su iskorišćeni da se prebace varijabilni regioniu Centocor-ov prethodno korišćeni IgGl vektor, pl04. dobijeni ekspresioni plazmidi, koji kođiarju IgGl Gm(f) haplotipa, su nazvani pl781 (TNV 14), pl782 (TNV148) i pl783 (TNV148B) (videti tabelu 2). Varijabilni regioni su takođe klonirani uzvodno od IgGl konstantnog regiona izvedenog iz 12B75 (GenPharm) gena. Ekspresioni plazmidi koji kodiraju IgGl Glm(z) alotipa, takođe su pobrojani u tabeli 2.
Tabela 2. Plazmidni identifikacioni bojevi za različite teške i lake lance plazmida. L28 vektor ili pBC vektor pređtavljaju inicijalni Ab cDNK klon. Inserti ubačeni u ove plazmide prebačeni su u nekompletan vektor baziran na 12B75 da bi se napravio intermedijerni plazmid. Još jedan dodatni korak transfera rezultirao finalnim ekspresionim plazmidima koji su ili ubačeni u ćelije posle linearizacije ili su iskorišćeni za prečišćavanje mAb (Ma) genskih inserta pre ćelijske transfekcije.
(ND)=nije urađeno
PCR proizvodi lakog lanca su isečeni sa restrikcionim enzimima Sali i SacII i zatim uklonirani između Sali i SacII mesta u plazmidu pBC. Dve različite verzije lakog lanca, koje se razlikuju za jednu amino kiselinu, nazvane su p 1748 i pl749 (tabela 2). Analize DNK sekvenci potvrdile su da ovi konstrukti imaju tačne odgovarajuće sekvence. SalI/Aflll fragmenti u p 1748 i pI749 su uklonirani između Sali i Aflll mesta intermedijernog vektora da bi se dobili p 1755 i pl756. Ove 5' polovine gena za laki lanac su spojene za 3' polovine gena prebacivanjem BsiVVI/Aflll fragmenta iz p 1755 i pl756 u novo pripremljeni konstrukt pl762 da bi se dobili finalni ekspresioni plazmidi pl 775 i 1776, (tabela 2).
Ćelijske transfekcije, skrining i subkloniranje
Ukupno 15 transfektanata mišijih ćelija mieloma su pripremljeni sa različitim TNV ekspresionim plazmidima (videti tabelu 3 u delu Rezultati i diskusija).GOvi transfektanti su se razlikovali po tome (1) da li su ćelije domaćini bili Sp2/0 ili 653; (2) da lije konstantni region teškog lanca kodiran Centorovim prethodnim IgG vektorom ili I2B75 konstantnim regioivim teškog lanca;(3) da li je mAb (Ma) TNV148B, TNV 148, TNV 14 ili nova : :C7LC kombinacija; (4) da lije DNK linearizovan plazmid ili prečišćen insert Ab gena i (5) da lije prisutna ili odsutna kompletna intronska J-C sekvenca u genu za teški lanac. Dodatno, nekoliko transfekcija je ponovljeno da bi se povećala mogućnost pregleda (skrininga) velikog broja klonova.
Sp2/0 ćelije i 653 ćelije su transfektovane svaka sa mešavinom DNK teškog i lakog lanca (8-12 :b svaki) pomoću elektroporacije pod standardnim uslovima kao što je ranije opisano (Knight DM et al, (1993)Molecular Immunology30:1443-1453). Za transfekcije 1, 2, 3, i 16 linearizovani su odgovarajući plazmidi pomoću sečenja sa restrikcionim enzimom pre same transfekcije. Na primer, Sali i Noti restrikcioni enzimi su korišćeni za linearizaciju TNV148B plazmida teškog lanca pl 783 i plazmid lakog lanca pl 776. Za ostale transfekcije, DNK inserti koji su sadržali samo mAb (Ma) gen odvojeni su od plazmidnog vektora sečenjem plazmida teškog lanca sa BamHI i plazmida lakog lanca sa BsiWI i Noti. Inserti Mab (Ma) gena su prečišćeni elektroforezom na agaroznom gelu i pomoću Qiex kuglica za prečišćevanje (rasins). Ćelije transfektovane sa prečišćenim insertom gena istovremeno su transfektovane sa 3-5 :g pSV2gpt plazmidom linearizovanim sa PstI (p 13) koji je izvor selektibilnog markera. Posle elektroporacije, ćelije su zasejane na šolje za kultivisanje sa 96 bunarčića u IMDM, 15% FBS, 2 mM glutamin i inkubirane na 37°C u 5% CO2inkubatoru. Dva dana kasnije, dodata je ista količina IMDM, 15% FBS, 2 mM glutamina i 2 X MHX selekcije (1 X MHX=0.5 :g/ml mokofenolne kiseline, 2.5 :g/ml hipoksantina, 50 :g/ml ksantina) i ploče su inkubirane dodatnih 2 do 3 nedelje dok su se kolonije formirale.
Ćelijski supernatanti koji su sakupljeni iz bunarčića sa kolonijama i urađeni su eseji za humani IgG pomoću ELISA testa kao što je opisano. Ukratko, različita razblaženja ćelijskih supernatanta su inkubirana u EIA pločama sa 96 bunarčića obloženih sa poliklonalnim kozijim anti-humanim IgGFc fragmentom i zatim je vezani humani IgG detektovan pomoću kozijeg anti-humanog IgG(H+L) konjugovanog saalkalnom fosfatazom i sa odgovarajućim obojenim substratima. Standardne krive, koje su se koristile za standardizovanje istog prečišćenog mAb (Ma) koji se meri u ćelijskom supernatantu, uključene su uz svaku EIA ploču da bi se omogućila kvantifikacija humanih IgG u supernatantima. Ćelije u tim kolonijama koje deluju da proizvode najviše humanih IgG su pasažirane na ploče sa 24 bunarčića za dalje određivanje proizvodnje u potresenim kulturama i zatim su identifikovani najproduktivniji roditeljski klonovi.
Najproduktivniji roditeljski klonovi su subklonirani da bi se idenlifikovali najproduktivniji subklonovi i proizvele homogenije ćelijske linije. Na ploče za gajenje kultura sa 96 bunarčića zasejane su ćelije, jedna ćelija po bunarčiću u IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamina i 1 X MILXC i inkubirane na 37°C u 5% C02inkubatoru tokom 12 do 20 dana dok kolonije nisu postale očigledne. Sakupljeni su ćelijski supernatanti iz bunarčića koje sadrže jednu koloniju po bunarčiću i analizirane su ELISA-om kao što je gore opisano. Odabrane kolonije su pasažirane na ploče sa 24 bunarčića i kulturama je dozvoljeno da se potroše pre identifikovanja najproduktivnijih subklonova kvantifikacijom nivoa humanih IgG u njihovim supernatantima. Proces je ponovljen kada su odabrani subklonovi iz prve ture podvrgnuti drugoj turisubkloniranja. Najbolji subklonovi iz druge ture su odabrani kao ćelijske linije za razvoj.
Karakterizacijaćelijskih subklonova
Odabrani su najbolji subklonovi iz druge ture i urađene su krive rasta da bi se procenili nivoi produkcije mAb (Ma) i karakteristike ćelijskog rasta. U T75 boce zasejanoje 1X10<5>ćelija/ml u 30 ml IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamina i 1 X MFLXC (medijum bez seruma). Uzimani su alikvoti od 300 pl na svakih 24 sata i određivana je gustina živih ćelija. Analize su nastavljene sve dok broj živih ćelija nije pao na manje od 1 X 10<5>ćelija/ml. Za sakupljene alikvote ćelisjkih supernatanta urađeni su eseji za koncentraciju prisustnog antitela. Urađeni su ELISA eseji gde su kao standardi poslužili rTNV148B ili rTNV14JG92399. Uzorci su inkubirani tokom 1 sata na ELISA pločama obloženim sa poliklonalnim kozijim anti-humanim IgGFc i vezani mAb (Ma) su detektovani pomoću kozijeg anti-humanog IgG (H+L) konjugovanog sa alkalnom fosfatazom pri 1:1000 razblaženju.
Takođe su urađene različite analize krivi rasta za dve ćelijske linije da bi se uporedili stepeni rasta u prisustvu različitih količina MHC selekcije. Ćelijske IinijeC466A i C466B su rastopljene u medijumu bez MHX (IMDM, 5% FBS, 2 mMglutamin) i gajene su dva dodatna dana. Obe ćelijske kulture su zatim podeljene u tri kulture koje nisu sadržale niti MHX, 0.2X MHX niti IX MHX (1 X MHX=0.5 :g/ml mokofenolne kiseline, 2.5 :g/ml hipoksantina, 50 :g/ml ksantina). Dan kasnije, u sveže T75 boce zasejane su kulture početne gustine IX IO5 ćelija /ml i ćelije su prebrojavane na 24 sata tokom jedne nedelje. Nisu sakupljeni alikvoti za proizvodnju mAb (Ma). Proračunata su duplirajuća vremena za ove uzorke pomoću formula obezbeđenih u SOP PD32.025.
Izvedene su dodatne studije da bi se procenila stabilnost proizvodnje mAb (Ma) tokom vremena. Kulture su gajene u pločama sa 24 bunarčića u IMDM, 5% FBS, 2 mM glutaminu sa ili bez MHX selekcije. Kulture su podeljene u sveže kulture čim su postajale konfluentne a starije kulture su puštene da se potroše. U tom momentu uzet je alikvot supernatanta i čuvanje na +4°C. Alikvoti su uzimani tokom perioda od 55 do 78 dana. Na kraju ovog perioda, supernatanti su testirani za količinu prisutnih antitela pomoću anti-humanih IgGFc ELISA kao što je naznačeno gore
Rezalti i diskusija
Inhibicija vezivanja TNF za rekombinantni receptor
Urađen je jednosrtavan esej vezivanja da bi se odredilo da lije osam TNF mAbs (Ma) koja se nalaze u supernatantu hibridoma ćelija, sposobno da blokira vezivanje TNFV za receptor. Koncentracije TNV antitela i odgovarajućih supernatanta prvo su određene standardnim ELISA analizama za humani IgG. Rekombinantni p55 TNF receptor/IgG fuzioni protein, p55-sf2, su obložili ELISA ploče i TNFV obeležen sa<125>I je pušten da se veže za p55 receptor u prisustvu varirajućih količina TNF mAbs (Ma). Kao što je prikazano na slici 1, sva osim jednog (TNV 122) od osam TNV mAbs (Ma) efikasno su blokirali vezivanje TNFV za p55 receptor. U stvari, izgleda da su TNV mAbs (Ma) upešniji u inhibiranju vezivanja TNFV nego cA2 antitelo pozitivna kontrola koje je vezano za njegativnu kontrolu supernatanta hibridoma. Interpretacija ovih rezultata je takva daje vrlo verovatno da bi TNV mAb (Ma) blokiralo TNFV bioaktivnost u esejima baziranim na ćeliji iin vivoi zato su zahtcvane dodatne analize.
Analize DNK sekvenci
Potvrda da rRNK kodiraju humana monoklonalna antitela
Kao prvi korak u karakterizaciji sedam TNV mAbs (Ma) (TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNV 118, TNV 148, i TNV 196) koja su pokazivala aktivnost blokiranja TNVV u eseju vezivanja za receptor, izolovana je ukupna RNK iz sedam ćelijskih linija hibridoma koje proizvode mAbs (Ma). Svaki uzorak RNK se zatim koristio za pripremu humanih cDNK za teški i laki lanac antitela, koje sadrže kompletnu signalnu sekvencu, kompletnu sekvencu za varijabilni region, i deo sekvence konstantnog regiona za svako mAb (Ma). Ovi cDNK proizvodi su unoženi u PCR reakcijama i DNK umnožena PCR-om je direktno sekvencirana bez prethodnog kloniranja fragmenta. Sekvencirane cDNK teških lanaca bile su više od 90% identične sa onima iz pet humanih gena germinativnih ćelija prisutnih u miševima, DP-46 (slika 2). Slično, sekvencirane cDNK lakih lanaca bile su ili 100% ili 98% identične sa onima iz pet humanih gena germinativnih ćelija prisutnih u miševima, (slika 3). Ovi rezultati sekvenciranja potvrdili su da RNK molekuli koji su prepisani u cDNK i sekvencirani, kodiraju humane teške lance antitela i lake lance antitela. Treba naglasiti da usled toga što su za PCR umnožavanje varijabilnih regiona korišćeni oligonukleotidi koji odgovaraju 5' kraju signalne kodirajuće sekvence, prve amino kiseline signalnc sekvence ne moraju biti i i sekvence originalnog proizvoda TNV translacije ali predtavljaju prave sekvence rekombinantnih TNV mAbs (Ma).
Jedinstvena neutrališuća mAbs (Ma)
Analiza sekvenci cDNK iza varijabilne regione teškog i lakog lanca za svaki mAb (Ma) otkrila je dajeTNV32 identičan TNV 15, TNV118 je identičan TNV 14, i TNV86 je identičan TNV 148. Rezultati eseja za vezivanje za receptor su se podudarali sa analizama sekvenci DNK, to jest oba TNV86 i TNV 148 su otprilike bile 4 puta bolje u blokiranju vezivanja TNF nego TNV1 18 i TNV14. Zato je dalji rad fokusiran nasamo četiri jedinstvena mAbs, TNV 14, TNV 15, TNV 148 i TNV196.
Srodnost četiri mAbs (Ma)
Rezultati sekvenci DNK otkrili su da su geni koji kodiraju teške lance četiri TNV mAbs (Ma) bili međusobno veoma homologi i da su izgleda izvedeni iz istog gena germinativne ćelije, DP-46 (slika 2). Dodatno, pošto su sve od sekvence CDR teškog lanca bile međusobno veoma slične i slične dužine, i pošto su sve koristile J6 egzon, verovatno su nastale iz jednog događaja VDJ genskog rearanžmana za kojim su sledile somatske promene koje su dovele do stvaranja jedinstvenih mAbs (Ma). Analize DNK sekvenci otkrile su da postoje samo dva različita gena za laki lanac među četiri mAbs (Ma) (slika 3). Sekvence koje kodirju varijabilni region lakog lanca u TNV 14 i TNV 15 su međusobno identične ali i identične sa reprezentativnom sekvencom germinativnih ćelija Vg/38K familije humanih kapa lanaca. TNV 148 i TNV 196 kodirajuće sekvence za laki lanac su međusobno identične ali se od sekvence germinativnih ćelija razlikuju na dva nukleotidna položaja (slika 3).
Oderđene amino kiselinske sekvence četiri mAbs otkrile si srodnost ovih mAbs (Ma). Četiri mAbs sadrže četiri različita teška lanca (slika 4) ali samo dva različita laka lanca (slika 5). Razlike između sekvenci TNV mAbs i sekvenci germinativnih ćelija se odnose uglavnom na CDR domene ali tri mAb teška lanca takođe se razlikuju od sekvence germinativnih ćelija u framevvork regionima (slika 4). U odnosu na framevvork regione DP-46 kodirana antitela germinativnih ćelija, TNV je identičan, TNV 15 se razlikovala po jednoj amino kiselini, TNV148 se razlikovalo po dve amino kiseline i TNV 196 se razlikovao po tri amino kiseline.
Kloniranje cDNK, site-specific mutageneza, i sastavljanje finalnih ekspresionih plazmida
Kloniranje cDNK
Na osnovu DNK sekvence PCR-om umnoženih varijabilnih regiona, naručeni su novi oligonukleotidi da bi se izvela nova runda PCR umnožavanja u cilju adaptiranja kodirajuće sekvence koja će se uklonirati u ekspresione vektore. U slučaju teških lanaca, ovi proizvodi druge runde PCR-a sečeni su restrikcionim enzimima BsiWl i BstBI i klonirani su u plazmidni vektor L28 (identifikacioni brojevi plazmida su prikazani u tabeli 2). U slučaju lakih lanaca, proizvodi druge runde PCR-a sečeni su restrikcionim enzimima Sali i Aflll i klonirani su u plazmidni vektor pBC. Zatim su sekvencirani pjedinačni klonovi da bi se potvrdilo da su sekvence identične prethodnim sekvencama dobijenim sekvenciranjem PCR proizvoda, koji su otkrili najrasprostranjeniji nukleotid za svaku poziciju nukleotida u potencijalno heterogenoj populaciji molekula.
'Site-specific' mutageneza da bi se promenio TNV148
mAbs (Ma) TNV148 i TNV196 su konstantno bili četiri puta potentniji u odnosu na sledeće mAb (TNV14) u neutralizaciji TNFV bioaktivnosti. Međutim, kao što je gore opisano, TNV148 i TNV196 sekvence framework teškog lanca razlikovale su se od framevvork sekvenci germinativnih ćelija. Poređenje TNV 148 sekvence teškog lanca sa drugim humanim antitelima ukazuje na mnogobrojne druge humane mAbs koje sadrže Ile ostatak na poziciji 28 u framevvork 1 (sadrži samo zrelu sekvencu) dok je Pro ostatak na poziciji 75 u framevvork 3 bila neobična amino kiselina za tu poziciju.
Slično poređenje TNV 196 teškog lanca ukazuje na to da tri amino kiseline po kojima se razlikuju od sekvence germinativnih ćelija u framevvork 3 mogu biti retke u humanim antitelima. Postijala je mogućnost da ove razlike učine da TNV148 i TNV196 postanu iminogeni ako se unesu u čoveka. Pošto je TNV148 imao samo jednu amino kiselinu koja je izazivala zabrinutost, i verovalo se da ona nije bitna za vezivanje TNFV, upotrebljena je tehnika site specific mutageneza da bi se izmenio jedan nukleotid u TNV 148 sekvenci za teški lanac (u plazmidu pl 753) tako da Ser ostatak iz germinativnih ćelija bi bio kodiran na mestu Pro ostatka na poziiji 75. dobijeni plazmid je nazvan pl 760 (videti tabelu 2). Dobijeni gen i mAb (Ma) su nazvani TNV148B da bi se razlikovao od originalnog TNV148 gena i mAb (Ma) (videti sliku 5).
Sastavljanje konačnog plazmida
Novi ekspresioni vektori za antitela pripremljeni su na osnovu 12B75 gena za teški i laki lanac koji su ranije klonirani kao genomski fragmenti, lako su pripremljeni različiti ekspresioni plazmidi (videti tabelu 2), u svakom slučaju 5' okolne sekvence, promotor i instronski enhenser su izvedeni iz odgovarajućeg 12B75 gena. Za ekspresione plazmide lakih lanaca, kompletna J-C intron, kodirajuća sekvenca za konstantan region i 3' okolna sekvenca su takođe izvedene iz 12B75 gena za laki lanac. Za ekspresione plazmide teških lanaca koji su nastali u finalnim ćelisjkim linijama (p 1781 i pl783, videti dole u tekstu), kodirajuća sekvenca za humani IgGl konstantan region izveden iz Centorovom ranije kori scenom ekspresionom vektoru (p 104). Važno je da ovde prijavljene finalne proizvodne ćelijske linije eksprimiraju različit alotip (Gm(f')) TN V mAbs (Ma) u odnosu na originalni, izveden iz hibridoma TNV mAbs (Ma) (Glm (z)). Ovo je usled toga što je I2B75 gen za teški lanac, izveden iz GenPharm miševa, kodira Arg ostatak na C-terminalnom kraju CH1 domena dok Centorovi IgG ekspresioni vektor pl 04 na tom mestu kodira Lys ostatak. Pripremljeni su drugi ekspresioni plamidi teških lanaca (e. g, pl786 i pl788) u kojima su, J-C intron, kompletna kodirajuća sekvenca za konstantan region i 3' okolna sekvenca su izvedeni iz 12B75 gena za teški lanac, ali ćelijske linije transfektovane sa ovim genima nisu selektovane kao proizvodne ćelijske linije. Vektori su oprezno dizajnirani da bi se omogućuilo kloniranje u jednom koraku budućih PCR-om umnoženih V regiona koji će rezultirati finalnim plazmidima.
PCR-om umnožene cDNK varijabilnog regiona su prebačene iz L28 ili pCB vektora u intermedijernu fazu, 12B75- bazirane vektore koji su obezbedili region promotora i deo J-C introna (videti tabelu 2 za plazmidne identifikacione brojeve). Restrikcioni fragmenti koji sadrže 5' polovine gena antitela su prebačeni iz ovih intermedijernih vektora u finalne ekspresione vektore koji su obezbedili 5' polovine ovih gena da bi se formirali finalni ekspresioni plazmidi (videti tabelu 2 za plazmidne identifikacione brojeve).
Transfekcije ćelija i subkloniranje
Ekspresioni plazmidi su ili linearizovani restrikscionim sečenjem ili su inserti gena antitela u svakom plazmidu prečišćeni i izbačeni iz okosnice plazmida. Sp2/0 i 653 ćelije mišijeg melanoma su transfektovane sa DNK teškog i lakog lanca pomoću elekstroporacije. Urađeno je petnaest različitih transfekcija. najviše ih je bilo jedinstvenih što je definisano Ab, specifičnim karakteristikama Ab gena, bez obzira da li su geni na linearizovanim celim plazmidima ili se radi o prečišćenim genskim insertima, i doćinskim ćelijskim linijama (sve je na tabeli 3). Za ćelijske supernatante iz klonova rezistentnih na mikofenolnu kiselinu urađeni su eseji za prisustvo humanog IgG ELISA testom i kvantifikovani pomoću prečišćeniih rTNV148B kao referentne standardne krive.
Najproduktivnije rTNV148B ćelijske linije
Deset najproduktivnijih 653 roditeljskih linija iz rTNV148B transfekcije 2 (proizvedeno 5-10: g/ml u potrošenim kuturama u 24 bunarčića) su subklonirane da bi se uradio skrining za produktvnije ćelisjke linije i da Bi se pripremile više homogene populacije ćelija. Dva subklona iz roditeljske linije 2.320, 2.320-17 i 2.320-20. proizvedeno je oko 50: g/ml u potrošenim kuturama u 24 bunarčića, što je predstavljalo porast od pet puta u odnosu na njihovu roditeljsku liniju. Druga runda subklonirnr.ja linija subklonova 2.?20-] 7 i 2.320-20 led
Tabela 3. Sažet pregled ćelijskih transfekcija. Prikazani su dentifikacioni brojevi plazmida za teške i lake lance koji kodiraju svako mAb (Ma).U slučaju transfekcija izvedenih sa prečišćenim insertima mAb gena, plazmid pl 3 (pSV2gpt) je uključen kao izvor gpt selektivnog markera. Konstantni regioni teških lanaca su kodirani ili od strane istog humanog IgGl ekspresionog vektora koji je kodirao Remicade ("stari") ili od strane konstantnih regiona koji se nalaze u okviru 12B75 (GenPharm/Medarex) gena za teški lanac ("novi"). H1/L2 odnosi se na "novo" mAb koje se sastoji od TNV14 teškog lanca i lakog lanca TNV148. Plazmidi p 1783 i p 1801 razlikuju se samo po tome koliko njihovi geni za težak lanac sadrže od J-C introna. Brojevi transfekcija, koji definišu prvi broj opšteg imena za ćelojsku liniju, prikazani su sa desne strane. rTNV148B produkujuće ćelijske linije C466 (A, B, C, D) i C467A koje su ovde opisane nastale su iz transfekcionih brojeva 2 i 1. rTNV14- produkujuće ćelijska linija izvedena je iz transfekcionog broja 3.
Karakterizacija subkloniranih ćelisjkih linija
Da bi se detaljnije okarakterisale karakteristike rasta ćelijskih linija i odredio proizvodni nivoi mAbs (Ma) na većoj skali, izvedene su analize krivi rasta pomoću T75 kultura. Rezultati su pokazali da svaka od četiri C466 serije ćelijskih linija dostiže vrh ćelijske gustine između 1.0 X 106 i 1.25 X 106 ćelija/ml i maksimalne nivoe akumulacije mAb između 114 i 140 :g/ml (slika 7). Suprotno ovome, najproduktivniji Sp2/0 subklon, C467A, dostigao je maksimum ćelijske gustine na 2.0X10<6>ćelija/ml i maksimalne nivoe akumulacije mAb od 25 :g/ml (slika 7). Analize krivi rasta nisu urađene za rTNV14 proizvodnu ćeliljsku liniju, C476A.
Dodatne analize krivi rasta su urađene da bi se uporedile stope rasta pri različitim koncentracijama MHX selekci. Na ova poređenja navela nas je činjinica da C466 ćelije koje se gaje u odsustvu MHX izgleda da brže rastu nego iste ćelije kada se gaje sa normalnom količinom MHX (IX). Zbog toga što citbtoksične koncentracije jedinjenja kao što je mikofenolna kiselina teže da
Da bi se merilo preko nivoa veličine (magnitude), uzeta je u obzir mogućnost da upotreba niže-koncentracije MHX može rezultirati u značajnom ubrzavanju vremena dupliranja broja ćelija bez žrtvovanja stabilnosti proizvodnje mAb (Ma). Ćelijske linije C466A i C466B su gajene iliu:bez MHX, 0.2X MI IX ili IX MHX. Prebrojavanje živih ćelija rađeno je na 24 časa tokom 7 dana. Rezultati su otkrili brzinu ćelisjkog rasta zavisnu od koncentracije MHX (slika 8). Ćelijska linija C466A pokazivala je vreme dupliranja od 25.0 sati u IX MHX ali samo 20.7 sati kada nije bilo MHX. Slično, ćelijska linija C466B pokazivala je vreme dupliranja od 32.4 sati u IX MHX ali samo 22.9 sati kada nije bilo MHX. Važno je da su vremena dupliranja za obe ćelijske linije u 0.2X MHX bila sličnija nego ona koja su zabeležena bez MHX ili u IX MHX (slika 8). Ova otvara mogućnost da se pojačana performansa ćelija u bioreaktorima, zakoje je vreme dupliranja važan parametar, dobije upotrebom manje količine MHX. Međutim, iako postijanost rezultata testa (videti dalje u tekstu) ukazuje na to daje ćelijska linija C466D sposobna da stabilno proizvodi rTNV148B tokom najmanje 60 dana čak i u odsustvu MHX, tets stabilnosti je takođe pokazao više nivoe proizvodnje mAb (Ma) kada su ćelije gajene u prisustvu MHX kada se uporedi sa situacijom bez
MHX.
Da bi se procenila proizvodnja mAb (Ma) iz različitih ćelijskih linija tokom perioda od otprilike 60 dana, izvedeni su testovi stabilnosti na kulturama koje su sadržale, ili ne MHX selekciju. Nisu sve ćelijske linije održavale visok nivo rpoizvodnje mAb. Posle samo dve nedelje gajenja, klon C466A je proizvodio otprilike 45% manje nego na početku studije. Proizvodnja od strane klona C466B je takođe izgledalo da značajno opada. Međutim, klonovi C466C i C466D održavali su jedva stabilnu proizvodnju, a C466D je pokazivao najviše apsolutne nivoe proizvodnje (slika 9)
Zaključak
Od početne grupe od osam humanih mAbs (Ma) protiv TNVV, TNV148B je bio izabran kao najpoželjniji na osnovu nekoliko kriterijuma koji uključuju sekvencu proteina i TNF neutrališući potencijal, kao i TNV 14. Pripremljene su ćelijske linije koje proizvode više od 100 :g/ml rTNV148B i 19 :g/ml rTNV14.
Primer 4: Studija artritičnih miševa pomoću anti-TNF antitela i kontrola upotrebom pojedinačne bolus injekcije
Sa oko 4 nedelje starosti odabrani su TI97 studijski miševi, na osnovu pola i telesne težine, i svrstani u jednu od 9 grupa i tretirani su sa jednom intraperitonealnom bolus dozom Dulbekovog PBS-a (D-PBS) ili sa anti-TNV antitelom iz ovog pronalaska (TNV 14, TNV148 ili TNV 196) i to sa ili 1 mg/kg ili 10 mg/kg.
REZULTATI: Kada su analizirane telesne težine kao promena iz pro-doze, životinje koje su u ovoj studiji tretirane sa 10 mg/kg cA2 pokazivale su konstantno viši novo dobijanja na težini nego životinje koje su tretirane sa D-PBS-om. Dobijanje telesne mase bilo je značajno tokom nedelja 3-7. Životinje tretirane sa 10 mg/kg TNV 148 takođe su postigle značajno dobijanje na težini u 7. nedelji studije, (videti sliku 10).
Slike 11A-C predstavljaju progresiju bolesti baziranu na artritiskom indeksu. Grupe tretirane sa 10 mg/kg cA2 imale su artritiski indeks niži nego nego kontrolna D-PBS grupa u 3. nedeljito se održalo tokom ostatka stiudije (7 nedelja). Životinje tretirane sa 1 mg/kg TNV 14 i životinje tretirane sa 1 mg/kg cA2 nisu pokazivale značajnu redukciju Al posle 3. nedelje kada se uporede sa grupom tretiranom sa D-PBS. Nije bilo značajnih razlika između grupa tretiranih sa 10 mg/kg kada se svaka uporedila sa drugom koja je primila sličnu dozu (10 mg/kg cA2 u poređenju sa 10mg/kgTNV 14, TNV 148 i TNV 196). Kada su upoređene grupe tretirane sa 1 mg/kg , grupa tretirana sa 1 mg/kg TNV 148 pokazivale su značajno niži Al nego one sa 1 mg/kg cA2, 3, 4 i 7 nedelje. 1 mg/kg TNV148 je bila takođe značajno niža nego grupa tretirana sa 1 mg/kg TNV14 u 3. i 4. nedelji. Iako je TNV196 pokazivala značajnu redukciju Al do 6. nedelje studije (kada se uporedi sa D-PBS tretiranom grupom), TNV148 je bila jedina 1 mg/kg tretirana grupa koja je ostala značajna tokom čitave studije.
Primer 5: Studija artritiskih miševa pomoću anti-TNF antitela i kontrole kao višestruke bolus doze
Sa oko 4 nedelje starosti odabrani su T197 studijski miševi, na osnovu pola i telesne težine, i svrstani u jednu od 8 grupa i tretirani su sa intraperitonealnom bolus dozom kontrolne supstance PBS-a (D-PBS) ili sa antitelom (TNV 14, TNV148 ili TNV196) i to sa 3 mg/kg (0 nedelja). Injekcije su ponovo davane u 1, 2, 3, i 4 nedelji. grupe 1-6 su procenjene za efikasnost test supsatnce. Uzorci seruma, dobijeni iz životinja iz grupa 7 i 8 su procenjeni za indukciiju imunog odgovora i farmakokinetičke klirense (clearance) TNV 14 ili TNV 148 u 2, 3, i 4 nedelji.
REZULTATI: Kada su težine analizirane kao promene iz pre-doze nisu zapažene nikakve značajne razlike. Životinje tretirane sa 10 mg/kg cA2 pokazivale su konstantno veće dobijanje na telesnoj masinego životinje tertirane sa D-PBS u ovoj studiji (videti sliku 12).
Slike 13A-C predstavljaju progresiju bolesti baziranu na artritiskom indeksu. Grupe tretirane sa 10 mg/kg cA2 imale su artritiski indeks značajno niži nego nego kontrolna D-PBS grupa upočevši od 2. nedelje i to se održalo tokom ostatka stiudije (5 nedelja). Životinje tretirane sa 1 mg/kg ili 3 mg/kg cA2 i životinje tretirane sa 3 mg/kg TNV14 nisu pokazivale značajnu redukciju Al ni u jednom momentu tokom studije kada se uporede sa kontrolnom grupom tretiranom sa D-PBS. Životinje tretirane sa 3 mg/kgTNV148 pokazale su značajnu redukciju kada se uporede sa kontrolnom grupom tretiranom sa D-PBS počevši od 3. neu'clje i toko 5. nedelje. Životinje tretirane sa 10 mg/kg cA2 pokazivale značajnu redukciju Al kada se uporede sa obe grupe sa nižim dozama (1 mg/kg i 3 mg/kg) cA2 u 4. i 5. nedelji studije i takođe su bile značajno niže nego životinje tretirane sa YNV14 tokom 3-5. nedelje. Iako je delovalo da ne postoji značajna razl ika između grupa tretiranih sa 3 mg/kg, Al životinja tretiranih sa 3 mg/kg TNV 14 su bili značajno viši u nekim momentima nego 10 mg/kg, gde se životinje tretirane sa TNV 148 nisu razlikovale od životinja tretiranih sa 10 mg/kg cA2.
Primer 6: Studija artritiskih miševa pomoću anti-TNF antitela i kontrole kao pojedinačna intraperitonealna bolus doza
Sa oko 4 nedelje starosti odabrani su TI 97 studijski miševi, na osnovu pola i telesne težine, i svrstani u jednu od 6 grupa i tretirani su sa jednom intraperitonealnom bolus dozom antitela (cA2 ili TNV 148) i to sa 3 mg/kg ili 5 mg/kg. U ovoj studiji su upotrebljene D-PBS i 10 mg/kg cA2 kontrolne grupe.
Kada su analizirane težine kao promene od pre-doze, svi tretmani su poklzaivali sličan stepen dobijanja na telesnoj masi. Životinje tretirane sa 3 mg/kg ili 5 mg/kg TNV 148 ili 5 mg/kg cA2 dobijale su značajnu količinu težine rano u studiji (2. i 3. nedelja). Samo životinje tretirane sa TNV 148 su održale značajan dobitak na težini u kasnijem periodu studije. Obe grupe životinja tretiranih sa 3 ili 5 mg/kg TNV148 pokzaivale su značajno dobijanje u 7. nedelji i 3 mg/kg TNV148 životinje su i dalje imale značajno povišenje u 8. nedelji posle injekciranja (videti sliku 14).
Sika 15 predstavlja progresiju bolesti baziranu na artritiskom indeksu. Sve tretirane grupe su pokazivale neku zaštitu tokom početka, 5 mg/kg cA2 i 5 mg/kg TNV 148 su pokazivati značajnu redukciju Al tokom 1-3 nedelje i sve tretirane grupe su pokazivale značajnu redukciju u 2. nedelji. Kasnije tokom studije životinje tretirane sa 5 mg/kg cA2 pokazivale su neku zaštitu, sa značajnim redukcijama u 4, 6 i 7 nedelji. Niske doze (3 mg/kg) obe i cA2 i TNV148 pokazivale su značajnu redukciju u 6. i sve tretirane grupe su pokzaivale značajnu redukju u 7. nedelji. Nijedna od tretiranih grupa nije uspea da održi značajnu redukciju do kraja studije (8 nedelja). Nije bilo značajnih razlika između bilo koje od tretiranih grupa u bilo kom momentu (isključuje se kontrolna grupa sa Fiziološkim rastvorom).
Primer 7: Studija artritiskih miševa pomoću anti-TNF antitela i kontrole kao pojedinačna intraperitonealna bolus doza između anti-TNF antitela i modifikovanog anti-TNF antitela
Da bi se uporedila efikasnost pojedinačne intraperitonealne doze TNV 148 (izvedene iz hibridoma ćelija) i rTNV148B (izvedena iz transfektovanih ćelija). Sa oko 4 nedelje starosti odabrani su TI 97 studijski miševi, na osnovu pola i telesne težine, i svrstani u jednu od 9 grupa i tretirani su sa jednom intraperitonealnom bolus dozom Dulbecco S PBS (D-PBS) ili sa anitelom (TNV 148 ili TNV148B) i to po 1 mg/kg.
Kada su analizirane težine kao promene od pre-doze, životinje tretirane sa 10 mg/kg cA2 poklzaivale su konstantno viši stepen dobijanja telesne mase nego životinje tretirane sa D-PBS-om tokom studije. Ovo dobijanje mase bilo je značajno u 1. nedelji i 3-8 nedeljama. Životinje tretirane sa 1 mg/kg TOV 148 takođe su ostvarile značajno dobijanje mase tokom 5, 6, i 8. nedelje tokom ovr studije. (Videti sliku 16).
Slika 17 predstavlja progresiju bolesti baziranu na artritiskom indeksu. Grupe tertirane sa 10 mg/kg cA2 imale su artritiski indeks niži nego kontrolna grupa tretirana sa D-PBS počevši od 4. nedelje i do kraja studije (8 nedelja). Obe grupe koje su tretirane sa TNV 148 i grupa 1 mg/kg cA2 pokazivale su zančajnu redukciju Al u 4. nedelji. Iako prethodne studije (p-099-017) pokazale su daje TNV148 malo efektivniji u redukciji artritiskog indeksa posle pojedinačne 1 mg/kg intraperitonealne bolus doze, ova studija je pokazala daje Al za obe verzije grupa tretiranih sa TNV antitelom bio nešto viši. Iako (sa izuzetkom 6. nedelje) grupa tretirana sa 1 mg/kg cA2 nije pokzaivala značajno povišenje kada se uporedila sa 10 mg/kg cA2 grupom, i grupe tretirane sa TNV 148 su bile značajno više u 7. i 8. nedelji, nije bilo značajnih razlika u Al između 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV 148 i 1 mg/kg TNV148B u bilo kom momentu studije.
Biće jasno da ovaj pronalazak može da se primeni na drugi način nego što je opisano u ovim opisima i primerima.
Brojne modifikacije i varijacije ovog pronalaska su moguće u svetlu učenja u tekstu iznad i u ospegu priloženih patentnih prijava.

Claims (8)

1. Antitelo koje sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDRs) teškog lanca i promenjive 'framework' regione (FRs) mAb TNV148 kao Stoje prikazano na slici 4; i CDRs lakog lanca i promenjive FRs mAb TNV 148 kao što je prikazano naslici 5; opciono još sadrži specifičnu supstituciju prolina u serin u FR3 mAb TNV148B kao što je prikazano na slici 4.
2. Antitelo prema zahtevu 1, gde pomenuto antitleo sadrži promenjive regioneteškog i lakog lanca mAb TNV 148 i mAb TNV148B kao što je prikazano na slici4 i 5.
3. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva.
4. Rekombinantni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 3.
5. Ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 3 ili vektor prema zahtevu 4.
6. Kompozicija koja sadrži antitelo prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 i farmaceutskiprihvatljiv nosač ili razblaživač.
7. Antitelo prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 ili kompozicija prema zahtevu 6 zaupotrebu u dijagnozi ili lečenju.
8. Antitelo ili kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u lečenju imunih bolesti.
YUP-91/03A 2000-08-07 2001-08-07 Anti-tnf antitela, kompozicije, metode i njihove upotrebe RS50858B (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22336000P 2000-08-07 2000-08-07
US23682600P 2000-09-29 2000-09-29
US09/920,137 US7250165B2 (en) 2000-08-07 2001-08-01 Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU9103A YU9103A (sh) 2006-05-25
RS50858B true RS50858B (sr) 2010-08-31

Family

ID=40673117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-91/03A RS50858B (sr) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-tnf antitela, kompozicije, metode i njihove upotrebe

Country Status (33)

Country Link
US (3) US7250165B2 (sr)
EP (4) EP3118318B1 (sr)
JP (7) JP4748920B2 (sr)
KR (1) KR100883078B1 (sr)
CN (2) CN101980017B (sr)
AT (1) ATE446367T1 (sr)
AU (2) AU2001279227B2 (sr)
BE (1) BE2010C014I2 (sr)
BR (1) BRPI0113110C8 (sr)
CA (1) CA2419205C (sr)
CY (7) CY1109618T1 (sr)
DE (2) DE122010000010I1 (sr)
DK (4) DK1309691T3 (sr)
EA (2) EA007005B1 (sr)
ES (4) ES2527953T3 (sr)
FR (1) FR10C0014I2 (sr)
HK (1) HK1052948B (sr)
HR (1) HRP20030089B1 (sr)
HU (2) HU229523B1 (sr)
IL (3) IL154327A0 (sr)
LT (5) LT3118318T (sr)
LU (3) LU91663I2 (sr)
ME (1) ME00314B (sr)
MX (1) MXPA03001231A (sr)
MY (2) MY157288A (sr)
NO (3) NO333378B1 (sr)
NZ (2) NZ562811A (sr)
PL (1) PL206833B1 (sr)
PT (4) PT1309691E (sr)
RS (1) RS50858B (sr)
SI (4) SI3118318T1 (sr)
UA (1) UA81743C2 (sr)
WO (1) WO2002012502A2 (sr)

Families Citing this family (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
DK0929578T3 (da) * 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US6709655B2 (en) * 2001-02-28 2004-03-23 Instituto Bioclon, S.A. De C.V. Pharmaceutical composition of F(ab1)2 antibody fragments and a process for the preparation thereof
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
TWI327597B (en) 2001-08-01 2010-07-21 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
PL369739A1 (en) * 2001-11-12 2005-05-02 Merck Patent Gmbh Modified anti-tnf alpha antibody
EP1585477A4 (en) * 2001-11-30 2007-06-27 Centocor Inc ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
AU2003244817B2 (en) * 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
US7772372B2 (en) 2002-07-04 2010-08-10 Patrys Limited Neoplasm specific antibodies and uses thereof
NZ555692A (en) * 2002-07-19 2009-02-28 Abbott Biotech Ltd Treatment of TNF alpha related disorders
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
JP2006519763A (ja) 2002-11-08 2006-08-31 アブリンクス エン．ヴェー． 治療用ポリペプチドの投与法およびそのためのポリペプチド
US7335759B2 (en) * 2002-12-02 2008-02-26 Universidad Nacional Autónoma de Méxica (UNAM) Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides
MXPA05005921A (es) 2002-12-02 2005-10-19 Abgenix Inc Anticuerpos dirigidos a factor de necrosis tumoral y sus usos.
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
US20060210563A1 (en) * 2003-07-25 2006-09-21 Juan Lopez De Silanes Administration of anti-cytokine f(ab')2 antibody fragments
AU2004272112A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for conformational epitopes of prefibrillar aggregates
CN1328379C (zh) * 2003-11-13 2007-07-25 中国人民解放军第四军医大学 高亲和力抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因
EP1531162A1 (en) * 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
JP4588763B2 (ja) * 2004-02-06 2010-12-01 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する抗体およびその使用
TWI439284B (zh) 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
GB0414054D0 (en) 2004-06-23 2004-07-28 Owen Mumford Ltd Improvements relating to automatic injection devices
WO2006039638A2 (en) * 2004-09-30 2006-04-13 Centocor, Inc. Treating renal cell carcinoma with an anti-tnf human antibody or fragment
US20060083741A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Hoffman Rebecca S Treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infection
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
SI1839120T1 (sl) 2004-12-21 2013-12-31 Janssen Biotech, Inc. Vektorji na osnovi protitelesa anti-il-12, gostiteljske celice in postopki proizvodnje ter uporabe
US7381802B2 (en) * 2005-04-15 2008-06-03 Universidad Nacional Autónoma De México (UNAM) Human antibodies that specifically recognize the toxin Cn2 from Centruroides noxius scorpion venom
JP5757495B2 (ja) 2005-05-16 2015-07-29 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド びらん性多発性関節炎の治療のためのｔｎｆ阻害剤の使用
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
KR20080048505A (ko) 2005-08-31 2008-06-02 센토코 인코포레이티드 증진된 작용자 기능을 지닌 항체 불변 영역을 생산하기위한 숙주 세포주
TWI424161B (zh) 2005-11-01 2014-01-21 Abbvie Biotechnology Ltd 利用生物標記診斷關節黏連脊椎炎之方法及組合物
WO2007117490A2 (en) 2006-04-05 2007-10-18 Abbott Biotechnology Ltd. Antibody purification
EP2007426A4 (en) 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PSORIASTIC POLYARTHRITIS AND THEIR APPLICATIONS
US20080118496A1 (en) * 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
CA2564435A1 (en) 2006-04-10 2007-10-10 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for monitoring and treating intestinal disorders
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
WO2007120651A2 (en) * 2006-04-10 2007-10-25 Abbott Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9399061B2 (en) * 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
EP2708242A3 (en) 2006-04-10 2014-03-26 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of ankylosing spondylitis
WO2007120626A2 (en) 2006-04-10 2007-10-25 Abbott Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of ankylosing spondylitis
US20090317399A1 (en) * 2006-04-10 2009-12-24 Pollack Paul F Uses and compositions for treatment of CROHN'S disease
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
US20100021451A1 (en) * 2006-06-08 2010-01-28 Wong Robert L Uses and compositions for treatment of ankylosing spondylitis
CN103316402A (zh) 2006-06-30 2013-09-25 艾伯维生物技术有限公司 自动注射装置
CA2842964A1 (en) 2006-09-13 2008-03-20 Abbvie Inc. Cell culture improvements
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
US8034906B2 (en) 2006-10-27 2011-10-11 Abbott Biotechnology Ltd. Crystalline anti-hTNFalpha antibodies
US20090022727A1 (en) 2007-01-26 2009-01-22 Alza Corp. Injectable, nonaqueous suspension with high concentration of therapeutic agent
CN101641094A (zh) * 2007-04-11 2010-02-03 爱尔康研究有限公司 TNFα抑制剂联合抗组胺药治疗变应性鼻炎和变应性结膜炎的用途
WO2008150491A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Abbott Laboratories BIOMARKERS PREDICTIVE OF THE RESPONSIVENESS TO TNFα INHIBITORS IN AUTOIMMUNE DISORDERS
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
JP2010533181A (ja) * 2007-07-13 2010-10-21 アボツト・バイオテクノロジー・リミテツド ＴＮＦα阻害剤の肺投与のための方法及び組成物
CA2697163A1 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Abbott Laboratories Compositions and methods for crystallizing antibodies
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
KR20150080038A (ko) * 2007-11-30 2015-07-08 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 단백질 제형 및 이의 제조방법
KR20100120289A (ko) 2008-01-15 2010-11-15 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 분말상 단백질 조성물 및 이의 제조 방법
JP2011517672A (ja) * 2008-03-24 2011-06-16 アボツト・バイオテクノロジー・リミテツド 骨損失を治療するための方法及び組成物
US11969501B2 (en) 2008-04-21 2024-04-30 Dompé Farmaceutici S.P.A. Auris formulations for treating otic diseases and conditions
MX2010011545A (es) 2008-04-21 2011-04-11 Otonomy Inc Formulaciones para tratar enfermedades y afecciones del oido.
WO2009154995A2 (en) * 2008-05-27 2009-12-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Interleukin 10 receptor (il-10r) antibodies and methods of use
RU2652907C2 (ru) * 2008-06-25 2018-05-03 ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела
CN102164958A (zh) 2008-06-25 2011-08-24 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化
US8784870B2 (en) * 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
EP2306975A4 (en) 2008-07-21 2012-10-31 Otonomy Inc COMPOSITIONS WITH A TAXED RELEASE FOR MODULATING THE EARM STRUCTURE AND THE BORN IMMUNE SYSTEM, AND METHODS OF TREATING EAR OR DISEASE
CN102272326B (zh) 2008-12-30 2014-11-12 森托科尔奥索生物科技公司 预测强直性脊柱炎患者对于抗TNFα抗体的临床反应的血清标记物
EP2424594A4 (en) 2009-04-29 2014-12-24 Abbvie Biotechnology Ltd AUTOMATIC INJECTION DEVICE
CA2760185A1 (en) * 2009-05-04 2010-11-11 Abbott Biotechnology Ltd. Stable high protein concentration formulations of human anti-tnf-alpha antibodies
RU2011150521A (ru) * 2009-05-13 2013-06-20 ПРОТЕИН ДЕЛИВЕРИ СОЛЮШНЗ, ЭлЭлСи Фармацевтическая система для трансмембранной доставки
BR112012007091A2 (pt) * 2009-10-01 2016-04-19 Alcon Res Ltd composições de olopatadina e seus usos
KR101761541B1 (ko) * 2009-10-26 2017-07-26 네스텍 소시에테아노님 항-ｔｎｆ 약물 및 자가항체의 검출을 위한 검정법
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011056644A2 (en) * 2009-10-28 2011-05-12 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-glp-1r antibodies and their uses
WO2011075578A1 (en) 2009-12-16 2011-06-23 Philip Bosch Methods of treating interstitial cystitis
CL2010000019A1 (es) * 2010-01-11 2010-06-11 Univ Chile Anticuerpo monoclonal contra el tnf humano y sus fragmentos, secuencias nucleotidicas que lo codifican, vector de expresion y celulas que las contienen, composiciones y kit que comprenden el anticuerpo, uso de los mismos y metodo para su obtencion.
EP2531613A2 (en) 2010-02-02 2012-12-12 Abbott Biotechnology Ltd. Methods and compositions for predicting responsiveness to treatment with tnf-alpha inhibitor
WO2011095174A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Aarhus Universitet Human herpes virus 6 and 7 u20 polypeptide and polynucleotides for use as a medicament or diagnosticum
CN102167741B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
US20110223208A1 (en) * 2010-03-09 2011-09-15 Beth Hill Non-Aqueous High Concentration Reduced Viscosity Suspension Formulations
US9072668B2 (en) 2010-03-09 2015-07-07 Janssen Biotech, Inc. Non-aqueous high concentration reduced viscosity suspension formulations of antibodies
SG10201503130UA (en) 2010-04-21 2015-06-29 Abbvie Biotechnology Ltd Wearable automatic injection device for controlled delivery of therapeutic agents
WO2011146727A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Philip Bosch Methods of treating interstitial cystitis
LT2575884T (lt) 2010-06-03 2018-09-25 Abbvie Biotechnology Ltd Panaudojimai ir kompozicijos, skirti pūlingo hidradenito (hs) gydymui
SG188190A1 (en) 2010-08-03 2013-04-30 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8821865B2 (en) * 2010-11-11 2014-09-02 Abbvie Biotechnology Ltd. High concentration anti-TNFα antibody liquid formulations
EP2490024A1 (en) 2010-12-22 2012-08-22 Proteomika, S.L. Method to optimize the treatment of patients with biological drugs
EP2471554A1 (en) * 2010-12-28 2012-07-04 Hexal AG Pharmaceutical formulation comprising a biopharmaceutical drug
RU2727040C2 (ru) 2011-01-24 2020-07-17 Эббви Байотекнолоджи Лтд. Автоматические инъекционные устройства, имеющие наформованные поверхности захвата
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
AU2012231178B2 (en) 2011-03-18 2015-11-05 Abbvie Inc. Systems, devices and methods for assembling automatic injection devices and sub-assemblies thereof
ES2669198T5 (es) 2011-03-29 2021-07-20 Abbvie Inc Despliegue de envolvente mejorado en dispositivos de inyección automáticos
CN103619378B (zh) 2011-04-21 2017-03-01 艾伯维公司 可佩戴式自动注射装置
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2890782A1 (en) 2012-09-02 2015-07-08 AbbVie Inc. Methods to control protein heterogeneity
PE20191815A1 (es) 2012-09-07 2019-12-27 Coherus Biosciences Inc Formulaciones acuosas estables de adalimumab
IN2015DN01967A (sr) * 2012-09-19 2015-08-14 Abbvie Biotherapeutics Inc
MY171664A (en) 2012-11-01 2019-10-22 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2014136113A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Protalix Ltd. Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same
EP2964669B1 (en) * 2013-03-06 2018-09-12 Protalix Ltd. Use of plant cells expressing a tnfalpha polypeptide inhibitor in therapy
HK1207960A1 (en) 2013-03-12 2016-02-19 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
KR102216003B1 (ko) 2013-03-15 2021-02-16 얀센 바이오테크 인코포레이티드 재조합 단백질에서 c-말단 라이신, 갈락토스 및 시알산 함량을 제어하기 위한 제조 방법
AU2014227732A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US20160377612A1 (en) * 2013-12-04 2016-12-29 Osaka University Method for predicting therapeutic effect of biological preparation on rheumatoid arthritis
AU2015213678C1 (en) 2014-02-10 2019-03-21 Respivant Sciences Gmbh Mast cell stabilizers treatment for systemic disorders
EP3104854B1 (en) 2014-02-10 2020-04-08 Respivant Sciences GmbH Mast cell stabilizers for lung disease treatment
US20170183376A1 (en) 2014-06-24 2017-06-29 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of purifying antibodies
US10059763B2 (en) 2014-09-03 2018-08-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compound targeting IL-23A and TNF-alpha and uses thereof
US10000551B2 (en) 2014-09-11 2018-06-19 Protalix Ltd. Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
WO2016156466A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Peptide construct having a protease-cleavable linker
JP2018511346A (ja) 2015-03-31 2018-04-26 ブイエイチスクエアード リミテッド ポリペプチド
CA3255406A1 (en) 2015-03-31 2025-07-03 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Tnf-alpha binding polypeptides
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US10238625B2 (en) 2015-08-07 2019-03-26 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of mast cell related disorders with mast cell stabilizers
US10265296B2 (en) 2015-08-07 2019-04-23 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of systemic disorders treatable with mast cell stabilizers, including mast cell related disorders
US11229702B1 (en) 2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
US20170218092A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 Janssen Biotech, Inc. Bispecific Anti-TNF-Alpha/IL17A Antibodies and Anti-TNF-Alpha Antibodies and Methods of Their Use
US10465003B2 (en) * 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
US20170306050A1 (en) 2016-04-08 2017-10-26 Gilead Sciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases
US11071782B2 (en) 2016-04-20 2021-07-27 Coherus Biosciences, Inc. Method of filling a container with no headspace
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
CN109689027A (zh) 2016-06-29 2019-04-26 奥德纳米有限公司 甘油三酯耳用制剂及其用途
CA3035528A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Respivant Sciences Gmbh Cromolyn compositions for treatment of chronic cough due to idiopathic pulmonary fibrosis
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
AU2017339366A1 (en) 2016-10-07 2019-04-11 Respivant Sciences Gmbh Cromolyn compositions for treatment of pulmonary fibrosis
EP4467565A3 (en) 2016-12-21 2025-03-12 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
JOP20190162A1 (ar) 2016-12-30 2019-06-27 Biocad Joint Stock Co تركيبة صيدلانية مائية من جسم مضاد لـ tnf? أحادي النسيلة معاود الارتباط الجيني
CN110234351A (zh) * 2017-01-30 2019-09-13 詹森生物科技公司 用于治疗活动性银屑病关节炎的抗tnf抗体、组合物和方法
KR20240038148A (ko) 2017-02-07 2024-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 강직성 척추염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
CA3129373A1 (en) 2018-05-29 2019-12-05 Abcentra, Llc Compositions and methods for treatment of rheumatoid arthritis and accelerated atherosclerosis
BR112021013903A2 (pt) 2019-01-15 2021-09-21 Janssen Biotech, Inc. Composições e métodos de anticorpos anti-tnf para o tratamento da artrite idiopática juvenil
CN113825769A (zh) 2019-03-14 2021-12-21 詹森生物科技公司 用于产生抗tnf抗体组合物的方法
CA3133381A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
WO2020183271A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
KR20220012883A (ko) 2019-05-23 2022-02-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Il-23 및 tnf 알파에 대한 항체의 병용요법으로 염증성 장질환을 치료하는 방법
CN113939531A (zh) 2019-06-03 2022-01-14 詹森生物科技公司 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法
CN114466864B (zh) 2019-06-21 2024-12-27 索瑞索制药公司 多肽
JP7680377B2 (ja) 2019-06-21 2025-05-20 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
CN111153994B (zh) * 2019-12-31 2021-10-15 武汉班科生物技术股份有限公司 人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体
EP4126919A1 (en) * 2020-03-24 2023-02-08 Bio-Techne Corporation Methods of using a tgf beta knockout cell line and compositions resulting therefrom
BR112022023489A2 (pt) 2020-05-21 2023-03-14 Janssen Biotech Inc Método de tratamento de doença inflamatória intestinal com uma terapia de combinação de anticorpos para il-23 e tnf-alfa
KR20230123980A (ko) * 2020-12-23 2023-08-24 암젠 인크 흡입 제형을 만들기 위한 조건을 선택하는 방법 및시스템
BR112023024064A2 (pt) 2021-05-20 2024-01-30 Janssen Biotech Inc Método de tratamento de doença inflamatória intestinal com uma terapia de combinação de anticorpos para il-23 e tnf-alfa
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
KR20250112233A (ko) 2022-09-07 2025-07-23 엠디엑스 메니지먼트 엘엘씨 암을 치료하기 위한 shp-1 억제제
WO2024097804A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Mdx Management Llc Combination of a tyrosine kinase inhibitor and a pro-inflammatory agent for treating cancer
WO2024184281A1 (en) * 2023-03-03 2024-09-12 Alvotech Hf Liquid formulations comprising golimumab and poloxamer 188
WO2024196822A1 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Mdx Management Llc Compositions and methods for ameliorating adverse effects of therapies
WO2024228134A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Janssen Biotech, Inc. Method of treating ulcerative colitis with a combination of antibodies to il-23 and tnf alpha
TW202508626A (zh) 2023-05-03 2025-03-01 美商健生生物科技公司 以針對ＩＬ－２３及ＴＮＦα的抗體的組合來治療克隆氏症之方法
WO2025038745A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Mdx Management Llc Compositions and methods for activating immune cells
TW202525846A (zh) 2023-08-25 2025-07-01 美商普羅特歐拉吉克適美國公司 抗ｉｌ—１３多特異性抗體構築體及其用途
WO2025099576A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
WO2025188914A1 (en) 2024-03-06 2025-09-12 Mdx Management Llc Tyrosine phosphatase inhibitor 1 (tpi-1) derivatives

Family Cites Families (189)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4822776A (en) 1981-09-08 1989-04-18 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US5700466A (en) 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US4603106A (en) 1982-02-22 1986-07-29 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
AU4434585A (en) 1985-03-30 1986-10-23 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8517895D0 (en) 1985-07-16 1985-08-21 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
DE3650150T2 (de) 1985-08-16 1995-04-27 The Rockefeller University, New York, N.Y. Modulator der anabolischen Aktivität und seine Verwendungen.
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
IL79740A0 (en) 1986-08-17 1986-11-30 Yeda Res & Dev Hepatitis vaccine
NL8720442A (nl) 1986-08-18 1989-04-03 Clinical Technologies Ass Afgeefsystemen voor farmacologische agentia.
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988006630A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Method for the preparation of binding molecules
US5075236A (en) 1987-04-24 1991-12-24 Teijin Limited Method of detecting kawasaki disease using anti-tumor necrosis antibody
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
ES2058199T3 (es) 1987-09-23 1994-11-01 Bristol Myers Squibb Co Heteroconjugados de anticuerpos para la eliminacion de celulas infectadas por el vih.
ATE140731T1 (de) 1988-01-11 1996-08-15 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5770198A (en) 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
DE3823804A1 (de) 1988-07-14 1990-01-18 Basf Ag Neutralisation der in vitro und in vivo toxischen eigenschaften von tnf-(alpha) durch monoklonale antikoerper und den davon abgeleiteten fragmenten
JP2638652B2 (ja) 1988-07-18 1997-08-06 カイロン・コーポレーション カケクチンと反応するモノクロナール抗体
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
US5342613A (en) 1988-12-27 1994-08-30 Health Research Inc. Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
PT92900A (pt) 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
DE59010941D1 (de) 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
DE69017753T3 (de) 1989-05-18 2013-06-20 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
DE69027121T3 (de) 1989-08-07 2001-08-30 Peptech Ltd., Dee Why Bindeligande für tumornekrosisfaktor
AU638762B2 (en) 1989-10-05 1993-07-08 Optein Inc Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
DE69022559T2 (de) 1989-12-13 1996-05-02 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten Tumor-Nekrosisfaktor-Bindungsproteins I (TBP-I).
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
TW212184B (sr) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
EP0557300B1 (en) 1990-10-29 1997-11-19 Chiron Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
US5958413A (en) 1990-11-01 1999-09-28 Celltech Limited Use of antibodies to TNF or fragments derived thereof and xanthine derivatives for combination therapy and compositions therefor
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
AU1235692A (en) 1991-01-18 1992-08-27 Synergen, Inc. Methods for treating tumor necrosis factor mediated diseases
AU1435492A (en) 1991-02-21 1992-09-15 Gilead Sciences, Inc. Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
EP1681305A3 (en) 1991-03-18 2008-02-27 New York University Monoclonal and chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US5698195A (en) 1991-03-18 1997-12-16 New York University Medical Center Methods of treating rheumatoid arthritis using chimeric anti-TNF antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
NL9101124A (nl) 1991-06-28 1993-01-18 Stork Brabant Bv Rotatiezeefdrukmachine.
EP0940154B1 (en) 1991-07-02 2007-04-18 Nektar Therapeutics Device for delivering aerosolized medicaments
SK285960B6 (sk) 1991-07-25 2007-12-06 Biogen Idec Inc. Rekombinantné protilátky na liečenie ľudí
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
EP0525570A3 (en) 1991-07-31 1993-10-06 Miles Inc. Anti-idiotypic antibodies that mimic tnf
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
ATE249840T1 (de) 1991-12-13 2003-10-15 Xoma Corp Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
RO113214B1 (ro) 1992-10-19 1998-05-29 Dura Pharma Inc Inhalator de pulbere uscata
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
JP3549533B2 (ja) 1993-01-19 2004-08-04 グラクソ、グループ、リミテッド 装置
JP3824633B2 (ja) 1993-02-12 2006-09-20 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・リランド・スタンフォード・ジュニアー・ユニバーシティ 標的遺伝子の調節的転写および他の生物学的結果
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
ATE204299T1 (de) 1993-03-05 2001-09-15 Bayer Ag Humane monoklonale anti-tnf alpha antikörper
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
GB9315846D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tumour inhibitors
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
WO1995024220A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US6190691B1 (en) 1994-04-12 2001-02-20 Adolor Corporation Methods for treating inflammatory conditions
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
FR2728793A1 (fr) 1994-12-28 1996-07-05 Oreal Utilisation d'un antagoniste d'histamine, d'un antagoniste d'interleukine 1 et/ou d'un antagoniste de tnf-alpha dans une composition cosmetique, pharmaceutique ou dermatologique et composition obtenue
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
ATE209053T1 (de) 1996-01-03 2001-12-15 Glaxo Group Ltd Inhaliervorrichtung
DK0929578T3 (da) 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
ES2169299T3 (es) 1996-09-03 2002-07-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Procedimiento para la destruccion de celulas tumorales contaminantes en transplantes de celulas madre utilizando anticuerpos especificos.
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
AU2003247411A1 (en) 2002-05-23 2003-12-12 Cognis Corporation NON-REVERTIBLE Beta-OXIDATION BLOCKED CANDIDA TROPICALIS
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
ES2607679T3 (es) 2017-04-03
LU91663I9 (sr) 2018-12-18
HUS1400015I1 (hu) 2016-08-29
HRP20030089A2 (en) 2005-02-28
SI2330129T1 (sl) 2017-01-31
LUC00121I2 (sr) 2020-01-10
NO20030620L (no) 2003-03-31
NO2017046I1 (no) 2017-08-25
FR10C0014I2 (fr) 2011-04-01
LTPA2010004I1 (lt) 2017-03-10
LU91663I2 (fr) 2010-05-12
DK1309691T3 (da) 2009-12-07
JP2004523209A (ja) 2004-08-05
DE122010000010I1 (de) 2010-07-08
EP2330129A2 (en) 2011-06-08
NZ562811A (en) 2009-05-31
US20030049725A1 (en) 2003-03-13
CA2419205C (en) 2010-10-12
HK1052948A1 (en) 2003-10-03
BRPI0113110C8 (pt) 2023-12-05
US20070003548A1 (en) 2007-01-04
LUC00010I1 (sr) 2017-03-20
PT1309691E (pt) 2009-11-27
LUC00010I2 (sr) 2017-05-30
LUC00121I1 (sr) 2019-05-27
CY1118443T1 (el) 2017-06-28
IL195898A (en) 2015-11-30
JP2018046817A (ja) 2018-03-29
NO2013012I1 (no) 2013-07-01
DE60140259D1 (de) 2009-12-03
JP2016019519A (ja) 2016-02-04
HRP20030089B1 (hr) 2011-09-30
JP2019054802A (ja) 2019-04-11
HK1140494A1 (en) 2010-10-15
BR0113110A (pt) 2003-09-16
SI2159230T1 (sl) 2015-01-30
US7691378B2 (en) 2010-04-06
ATE446367T1 (de) 2009-11-15
NO2013012I2 (no) 2013-06-07
JP6590428B2 (ja) 2019-10-16
BE2010C014I2 (sr) 2020-12-15
CA2419205A1 (en) 2002-02-14
CN1468308B (zh) 2010-05-26
HU229523B1 (en) 2014-01-28
US7250165B2 (en) 2007-07-31
MXPA03001231A (es) 2003-10-15
EP3118318B1 (en) 2018-12-05
PL360438A1 (en) 2004-09-06
US7521206B2 (en) 2009-04-21
HUP0302376A2 (hu) 2003-10-28
AU7922701A (en) 2002-02-18
CY2017009I1 (el) 2017-09-13
EP2159230A1 (en) 2010-03-03
ES2331602T3 (es) 2010-01-11
CN101980017B (zh) 2016-08-03
EP2159230B1 (en) 2014-10-29
NO20030620D0 (no) 2003-02-07
CY1116149T1 (el) 2017-02-08
ES2527953T3 (es) 2015-02-02
UA81743C2 (uk) 2008-02-11
WO2002012502A9 (en) 2004-03-04
LT2330129T (lt) 2016-11-25
CY1121353T1 (el) 2020-05-29
BRPI0113110C1 (pt) 2021-08-24
PT3118318T (pt) 2019-03-21
EA009288B1 (ru) 2007-12-28
PL206833B1 (pl) 2010-09-30
KR20030022367A (ko) 2003-03-15
EP2330129B1 (en) 2016-09-21
MY157289A (en) 2016-05-31
CN101980017A (zh) 2011-02-23
IL154327A0 (en) 2003-09-17
HK1052948B (en) 2010-05-07
SI3118318T1 (sl) 2019-02-28
PT2159230E (pt) 2015-02-05
NZ524147A (en) 2005-02-25
WO2002012502A2 (en) 2002-02-14
CN1468308A (zh) 2004-01-14
CY1109618T1 (el) 2012-01-25
LT3118318T (lt) 2019-02-11
LTPA2017008I1 (lt) 2017-04-10
EA007005B1 (ru) 2006-06-30
EA200600126A1 (ru) 2006-10-27
DK2159230T3 (en) 2014-11-17
WO2002012502A3 (en) 2002-10-31
DK2330129T3 (en) 2016-10-24
ME00314B (me) 2011-05-10
HUP0302376A3 (en) 2012-09-28
JP6449113B2 (ja) 2019-01-09
LTPA2019013I1 (lt) 2019-06-25
CY2017009I2 (el) 2017-09-13
JP6564438B2 (ja) 2019-08-21
US20050123541A1 (en) 2005-06-09
CY2019029I1 (el) 2020-05-29
MY157288A (en) 2016-05-31
JP4748920B2 (ja) 2011-08-17
EA200300243A1 (ru) 2003-08-28
EP1309691A2 (en) 2003-05-14
JP2011188862A (ja) 2011-09-29
AU2001279227B2 (en) 2007-09-20
EP1309691B1 (en) 2009-10-21
BRPI0113110B1 (pt) 2018-03-20
SI1309691T1 (sl) 2010-01-29
KR100883078B1 (ko) 2009-02-10
YU9103A (sh) 2006-05-25
IL154327A (en) 2010-06-16
MEP48408A (en) 2011-02-10
NO333378B1 (no) 2013-05-21
EP3118318A1 (en) 2017-01-18
DK3118318T3 (en) 2019-02-18
JP2021036872A (ja) 2021-03-11
BRPI0113110B8 (pt) 2021-05-25
FR10C0014I1 (sr) 2010-04-16
CY2019029I2 (el) 2020-05-29
JP2019216721A (ja) 2019-12-26
CY2010008I2 (el) 2012-01-25
ES2709335T3 (es) 2019-04-16
CY2010008I1 (el) 2012-01-25
PT2330129T (pt) 2016-12-28
EP2330129A3 (en) 2011-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3118318B1 (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
US8241899B2 (en) Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses
US7063964B2 (en) Nucleic acids encoding IL-12 antibody
AU2001279227A1 (en) Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses
HK1233300B (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
HK1233300A1 (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
HK1140494B (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
HK1158225B (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
HK1158225A (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
ZA200301856B (en) Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses.
ZA200301867B (en) Anti-IL-12 antibodies, compositions, methods and uses.