JP2011188862A - 抗−tnf抗体、組成物、方法および使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列をそれぞれ有するmAbTNV148の重鎖相補性決定領域(CDR)1,2,3;および特定のアミノ酸配列をそれぞれ有するmAbTNV148の軽鎖CDR1,2,3を含む抗体。前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。前記核酸分子を含む組換えベクター。前記核酸分子または前記ベクターを含む宿主細胞。前記抗体、および医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。前記抗体を含む、診断用または治療用組成物。免疫関連疾患治療用の前記組成物。
【選択図】なし
Description
発明の背景
発明の分野
本出願は、2000年8月7日に出願された米国特許仮出願第60/223,360号および2000年9月29日に出願された同第60/236,826号に一部基づき、そしてその優先権を主張する(この各々は引用により全部、本明細書に編入する)。
関連分野
TNFアルファは、17kDタンパク質サブユニットの可溶性のホモ三量体である(Smith et al.,J.Biol.Chem.262:6951-6954(1987))。膜に結合した26kDのTNFの前駆体形態も存在する(Kriegler et al.,Cell 53:45-53(1988))。TNFの総説に関しては、Beutler et al.,Nature 320:584(1986);Old,Science 230:630(1986);およびLe et al.,Lab.Invest.56:234(1987)を参照にされたい。
本発明は、当該技術分野で既知である事柄と組み合わせて本明細書に記載し、そして可能とされる、単離されたヒト、霊長類、齧歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および/またはCDR-移植化抗-TNF抗体、免疫グロブリン、それらの開裂産物および他の特定部分および変異体、ならびに抗-TNF抗体組成物、コードするまたは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物およびそれらの作成および使用法を提供する。
本発明は単離された組換えおよび/または合成抗-TNFヒト、霊長類、齧歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化またはCDR-移植化抗体、およびそれに対するTNF抗-イディオタイプ抗体、ならびに組成物および少なくとも1つの抗-TNF抗体または抗-イディオタイプ抗体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んで成るコード核酸分子を提供する。さらに本発明は限定するわけではないがそのような核酸および抗体および抗-イディオタイプ抗体の作成および使用法を含み、診断用および治療用組成物、方法およびデバイスを含む。
用途
本発明の単離された核酸は、少なくとも1つの抗-TNF抗体またはそれらの特定した変異体の生産に使用することができ、これは限定するわけではないが少なくとも1つの免疫障害または疾患、心血管障害または疾患、感染、悪性および/または神経障害または疾患から選択される少なくとも1つのTNF状態を診断、監視、調節、処置、緩和、発生の防止を助け、または症状を減らすために、細胞、組織、器官または動物(哺乳動物およびヒトを含む)を測定または影響を及ぼすために使用することができる。
引用
本明細書に引用するすべての刊行物または特許は全部、それらが本発明のこの時点の技術の状態を示し、かつ/または本発明の説明および可能性(enablement)を提供するので参考により本明細書に編入する。刊行物とは任意の科学的または特許公報、あるいはすべての記録された、電子的または印刷形式を含む任意の媒体形式で入手できる任意の他の情報を称する。以下の技術文献は引用により全部、本明細書に編入する:Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY,(1997-2001)。
本発明の抗体
本発明の少なくとも1つの抗-TNF抗体は、場合により当該技術分野で周知な細胞系、混合細胞系、不死化細胞または不死化細胞のクローン群により生産することができる。例えばAusubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY,(1997-2001)を参照にされたい(各々は全部、引用により本明細書に編入する)。
核酸分子
少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、特定したフラグメント、それらの変異体またはコンセンサス配列の連続するアミノ酸の少なくとも70〜100%をコードするヌクレオチド配列、あるいはこれらの配列の少なくとも1つを含んでなる寄託されたベクターのような本明細書に提供する情報を使用して、少なくとも1つの抗−TNF抗体をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記載する方法または当該技術分野で既知の方法を使用して得ることができる。
抗体フラグメントのみのアミノ酸配列;抗体全体またはその一部の配列;抗体、そのフラグメントまたはその一部の配列、および
さらなる配列(例えば、少なくとも1つのシグナルリーダー配列または融合ペプチド)
をコードするもの(核酸)を含むことができ、
上述のさらなる配列(例えば、少なくとも1つのイントロン)を含んでも含まなくてもよく、
さらなる非コード配列、例えば5’および3’の非コード配列(例えば、転写、mRNAプロセッシングの際の役割(例えば、リボソーム結合性およびmRNA安定性)を果たす、転写され翻訳されない配列であって、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニレーションシグナル)が挙げられるがこれらに限定されない配列を一緒に含むことができ、
さらなるアミノ酸配列(例えば、さらなる機能性をもたらすもの)をコードするさらなるコード配列を含むことができるが、これら配列に限定されない(nucleic acid molecules of the present invention which comprise a nucleic acid encoding an anti-TNF antibody can include, but are not limited to, those encoding the amino acid sequence of an antibody fragment. by itself; the coding sequence for the entire antibody or a portion thereof; the coding sequence for an antibody, fragment or portion, as well as additional sequences, such as the coding sequence of at least one signal leader or fusion peptide, with or without the aforementioned additional coding sequences, such as at least one intron, together with additional, non-coding sequences, including but not limited to, non-coding 5’and 3’ sequences, such as the transcribed, non- translated sequences that play a role in transcription, mRNA processing, including splicing and polyadenylation signals (for example - ribosome binding and stability of mRNA); an additional coding sequence that codes for additional amino acids, such as those that provide additional functionalities)。すなわち抗体をコードする配列は、抗体フラグメントまたは一部を含んで成る融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列と融合させることができる。
本明細書に記載するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明は選択的なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示するポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸を提供する。すなわち本態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含んで成る核酸を単離し、検出し、かつ/または定量するために使用することができる。例えば本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリー中の部分的または完全長クローンを同定し、単離し、または増幅することができる。幾つかの態様ではポリヌクレオチドは単離されたゲノムまたはcDNA配列であり、そうでければヒトまたは哺乳動物核酸ライブラリーに由来するcDNAの相補的である。
核酸の構築
本発明の単離された核酸は、当該技術分野で周知な(a)組換え法、(b)合成法、(c)精製法、またはそれらの組み合わせを使用して作成することができる。
核酸を構築するための組換え法
RNA、cDNA、ゲノムDNAまたはそれらの組み合わせのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知な多数のクローニング法を使用して生物起源から得ることができる。幾つかの態様では、cDNAまたはゲノムDNAライブラリー中の所望する配列を同定するために、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用する。RNAの単離、およびcDNAおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者には周知である(例えばAusubel、同上;またはSambrook、同上を参照にされたい)。
核酸スクリーニングおよび単離法
cDNAまたはゲノムライブラリーは、本明細書に開示するような本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングすることができる。プローブは同じまたは異なる生物中のホモロガスな遺伝子を単離するために、ゲノムDNAまたはcDNA配列とハイブリダイズさせるために使用することができる。当業者は様々な程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションをアッセイに使用することができ;そしてハイブリダイゼーションまたは洗浄媒質のいずれかがストリンジェントであることができることを知っている。ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントになると、2本鎖形成が起こるためにプローブと標的との間の相補性の程度がより大きくならなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、pHおよびホルムアミドのような部分的変性溶媒の存在の1以上により制御することができる。例えばハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば0%〜50%の範囲でホルムアミドの濃度の操作を通して反応溶液の極性を変えることにより都合よく変動させる。検出可能な結合に必要な相補性(配列同一性)の程度は、ハイブリダイゼーション媒質および/または洗浄媒質のストリンジェンシーに従い変動するだろう。相補性の程度は最適には100%または70〜100%、あるいはその中の任意の範囲または値となろう。しかしプローブおよびプライマー中のわずかな配列の変化は、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄媒質のストリンジェンシーを下げることにより補うことができると理解すべきである。
核酸を構築するための合成法
本発明の単離された核酸は、既知の方法により直接的な化学合成により調製することができる(例えばAusubel、同上を参照にされたい)。化学合成は一般に1本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これを相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、または1本鎖を鋳型として使用してDNAポリメラーゼによる重合化により2本鎖DNAに転換することができる。当業者はDNAの化学合成は約100以上の塩基配列に限定され得るが、より長い配列は短い配列の連結により得ることができると認識するだろう。
組換え発現カセット
本発明はさらに、本発明の核酸を含んで成る組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするcDNAまたはゲノム配列は、少なくとも1つの所望する宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築するために使用することができる。組換え発現カセットは典型的には、意図する宿主細胞でポリヌクレオチドの転写を支配する転写開始調節配列に操作可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含んで成る。ヘテロロガスおよび非ヘテロロガス(すなわち内因性)の両方のプロモーターを使用して、本発明の核酸の発現を支配することができる。
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターにより遺伝的に操作された宿主細胞、および当該技術分野で周知な組換え法による少なくとも1つの抗−TNF抗体の生産に関する。例えばSambrook,et al.、同上;Ausubel et al.、同上(各々、引用により全部、本明細書に編入する)を参照にされたい。
抗体の精製
抗−TNF抗体は、限定するわけではないがプロテインA精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知な方法により、組換え細胞培養から回収し、そして精製することができる。高性能液体クロマトグラフィー(“HPLC”)も精製に使用することができる。例えばColligan、免疫学における現在の手法(Current Protocols in Immunology)、またはタンパク質科学における現在の手法(Current Protocols in Protein Science)、ジョン ウィリー & サンズ(John Wiley & Sons)、NY、NY、(1997−2001)、例えば第1、4、6、8、9、10章を参照にされたい(各々が全部、引用により本明細書に編入する)。
抗−TNF抗体
本発明の単離された抗体は、任意の適当なポリヌクレオチドによりコードされる本明細書に開示された抗体のアミノ酸配列、または任意の単離されたまたは調製された抗体を含んで成る。好ましくはヒト抗体または抗原−結合フラグメントはヒトTNFに結合し、そしてそれによりタンパク質の少なくとも1つの生物活性を部分的にまたは実質的に中和する。少なくとも1つのTNFタンパク質またはフラグメントの少なくとも1つの生物活性を部分的に、または好ましくは実質的に中和する抗体、またはそれらの特定した部分または変異体は、タンパク質またはフラグメントに結合することができ、これによりTNFのTNF受容体への結合を通して、または他のTNF−依存的または媒介メカニズムを通して媒介される活性を阻害する。本明細書で使用する用語「中和抗体」とは、アッセイに依存して約20〜120%まで、好ましくは少なくとも約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%以上までTNF−依存的活性を阻害することができる抗体を称する。TNF−依存的活性を阻害するための抗−TNF抗体の能力は、好ましくは本明細書に記載し、かつ/または当該技術分野で知られているような少なくとも1つの適当なTNFタンパク質または受容体アッセイにより評価される。本発明のヒト抗体は、任意のクラス(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)またはアイソタイプであることができ、そしてカッパまたはラムダ軽鎖を含んで成ることができる。1つの態様では、ヒト抗体はIgG重鎖または特定したフラグメント、例えば少なくとも1つのアイソタイプ、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含んで成る。このタイプの抗体は、本明細書に記載し、かつ/または当該技術分野で知られているように、少なくとも1つのヒト軽鎖(例えばIgG、IgAおよびIgM(例えばγ1、γ2、γ3、γ4)導入遺伝子を含んで成るトランスジェニックマウスまたは他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用することにより調製することができる。別の態様では、抗−ヒトTNFヒト抗体はIgG1重鎖およびIgG1軽鎖を含んで成る。
アミノ酸暗号
本発明の抗-TNF抗体を作るアミノ酸は、略されることが多い。アミノ酸の命名は当該技術分野で周知であるように1文字暗号、その3文字暗号、名前または3個のヌクレオチドコドン(1つまたは複数)によりアミノ酸を示すことにより同定することができる(Alberts,B.,et al.,細胞の分子生物学(Molecular Biology of The Cell)、第3版、ガーランド(Garland)出版社、ニューヨーク、1994を参照にされたい):
抗-TNF抗体組成物に対する抗-イディオタイプ抗体
モノクローナルまたはキメラ抗-TNF抗体に加えて、本発明は本発明のそのような抗体に特異的な抗-イディオタイプ抗体(抗-Id)抗体も対象とする。抗-Id抗体は、一般には別の抗体の抗原−結合領域に関連する独自の決定基を認識する抗体である。抗-Idは、Id抗体の起源と同種および属のタイプの動物(例えばマウス系統(strain))を、抗体またはそれらのCDR含有領域で免疫感作することにより調製することができる。免疫感作した動物は、免疫した抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そして応答し、そして抗-Id抗体を生産する。抗-Id抗体は別の動物にも免疫応答を誘導する「免疫原」としても使用することができ、いわゆる抗-抗-Id抗体を生産する。
抗-TNF抗体組成物
また本発明は、本明細書に記載し、かつ/または当該技術分野で既知の、自然には存在しない組成物、混合物または形態である、それらの少なくとも1つの、少なくとも2つの、少なくとも3つの、少なくとも4つの、少なくとも5つの、少なくとも6以上の抗-TNF抗体を含んで成る少なくとも1つの抗-TNF抗体組成物を提供する。そのような組成物は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8の連続するアミノ酸の70〜100%またはそれらの特定したフラグメント、ドメインまたは変異体から成る群から選択される抗-TNF抗体アミノ酸配列の少なくとも1または2つの完全長、C-および/またはN-末端が欠失した変異体、ドメイン、フラグメントまたは特定した変異体を含んで成る自然には存在しない組成物を含んで成る。好適な抗-TNF抗体組成物は、配列番号1、2、3、4、5、6の70〜100%の抗-TNF抗体配列部分、またはそれらの特定したフラグメント、ドメインまたは変異体を含む少なくとも1つのCDRまたはLBRとして、少なくとも1または2つの完全長、フラグメント、ドメインまたは変異体を含む。さらに好適な組成物は、配列番号1、2、3、4、5、6の少なくとも1つの70〜100%の40〜99%、またはそれらの特定したフラグメント、ドメインまたは変異体を含んで成る。そのよう組成物の割合は、当該技術分野で既知の、または本明細書に記載するように重量、容量、濃度、モル濃度、あるいは液体または乾燥溶液、混合物、懸濁液、乳液またはコロイドとしての重量モル濃度による。
製剤
上記のように本発明は安定な製剤を提供し、これは好ましくは食塩水または選択した塩を含むリン酸バッファー、ならびに保存剤を含有する保存溶液および製剤、ならびに医薬または獣医学的使用に適する多用途保存製剤であり、少なくとも1つの抗-TNF抗体を医薬的に許容される製剤中に含んで成る。保存製剤は少なくとも1つの既知の保存剤または任意に少なくとも1つのフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マンガン(例えばヘキサヒドレート)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチル等)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンズエトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはそれらの混合物から成る群から選択される保存剤を水性希釈剤中に含む。適当な濃度または混合物は、0.001〜5%のような、または限定するわけではないが0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9またはこの中の任意の範囲または値のような当該技術分野で知られているように使用することができる。非限定的な例には、保存剤なし、0.1〜2% m-クレゾール(例えば0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、0.1〜3%ベンジルアルコール(例えば0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001〜0.5%チメロサール(例えば0.005、0.01)、0.001〜2.0%フェノール(例えば0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005〜1.0%アルキルパラベン(1つまたは複数)(例えば0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)等を含む。
治療的応用
本発明は、細胞、組織、器官、動物または患者の少なくとも1つのTNF関連疾患を、本発明の少なくとも1つの二重インテグリン抗体を使用して、既知であるように、または本明細書に記載するようにモジュレートまたは処置するための方法も提供する。
(各々は引用により全部、本明細書に編入する)を参照にされたい。
本発明はまた、細胞、組織、器官、動物または患者の少なくとも1つの悪性疾患をモジュレートまたは処置する方法を提供し、そのような悪性疾患には限定するわけではないが少なくとも1つの;白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B-細胞、T−細胞またはFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ芽球性白血病(CLL)、ヘアリーセル白血病、骨髄異形性症候群(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球症、悪性の新生物随伴症候群/高カルシウム血症、充実性腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌に関連する骨の吸収、癌に関連する骨痛(bone pain)等を含む。
TNF受容体分子
本発明に有用な好適なTNF受容体分子は、TNFαに高親和性で結合するものであり(例えばFeldmann et al.、国際公開第92/07076号明細書(1992年4月30日公開);Schall et al.,Cell 61:361-370(1990);およびLoetscher et al.,Cell 61:351-359(1990)を参照にされたい、これらは引用により全部、本明細書に編入する)、そして場合により低い免疫原性を有する。特に55KDa(p55 TNF-R)および75kDa(p75 TNF-R)TNF細胞表面受容体が本発明に有用である。受容体またはそれらの機能的部分の細胞外ドメイン(ECD)を含んで成るこれらの受容体の短縮された形態も(例えばCorcoran et al.,Eur.J.Biochem.223:831-840(1994)を参照にされたい)、本発明に有用である。ECDを含んで成るTNF受容体の短縮化形は、尿および血清中に30kDaおよび40kDaのTNFα阻害結合タンパク質として検出された(Engelmann,H.,et al.,J.Biol.Chem.265:1531-1536(1990))。TNF受容体多量体分子およびTNF免疫受容体融合分子、およびそれらの誘導体およびフラグメントまたは部分は、本発明の方法および組成物に有用であるTNF受容体分子のさらなる例である。本発明で使用できるTNF受容体分子は、症状の良好から優れた緩和および低い毒性で長期間、患者を処置するためのそれらの能力が特徴である。低い免疫原性および/または高い親和性、ならびに他の不確定な特性が達成される治療的結果に寄与し得る。
代替投与
多くの既知の、および開発された様式を、医薬的に有効量の本発明の少なくとも1つの抗-TNF抗体を投与するために、本発明に従い使用することができる。肺投与は処方どおりに使用するが、他の投与様式は本発明に従い使用して適切な結果をもたらすことができる。
非経口製剤および投与
非経口投与用の製剤は、通常の賦形剤として滅菌水または塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレン等を含むことができる。注入用の水性または油性懸濁液は、既知の方法に従い適当な乳化剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して調製することができる。注入用の薬剤は、水溶液または滅菌の注入可能溶液または溶媒中の懸濁液のような非毒性で、非経口投与性の希釈剤であることができる。使用可能な賦形剤または溶剤として、水、リンゲル溶液、等張性塩水等を利用できる;通例の溶媒、または懸濁溶媒として、滅菌の非揮発性油を使用することができる。これらの目的のために、任意の種類の非揮発性油および脂肪酸を使用でき、それらには天然または合成または半合成の脂肪油または脂肪酸;天然または合成または半合成のモノ−またはジ−またはトリ−グリセリドを含む。非経口投与は当該技術分野で知られており、そして限定するわけではないが通例の注入手段、米国特許第5,851,198号明細書に記載されたガスで圧縮した針を含まない注入デバイス、および米国特許第5,839,446号明細書に記載されたレーザーパーホレーターデバイスを含む(これらの明細書は引用により全部、本明細書に編入する)。
代替送達
本発明はさらに少なくとも1つの抗-TNF抗体を、非経口的、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮による投与に関する。少なくとも1つの抗-TNF抗体組成物は、非経口(皮下、筋肉内または静脈内)あるいは任意の他の投与、特に液体溶液または懸濁液で使用するために;膣または直腸投与、特に限定するわけではないがクリームおよび坐薬のような半固体で使用するために;限定するわけではないが錠剤またはカプセル形態のようなバッカル、舌下投与に;あるいは限定するわけではないが粉末、点鼻またはエーロゾルまたは確定薬剤(certain agent)の状態のような鼻内に;あるいは皮膚構造をモディファイし、または経皮パッチ中の薬剤濃度を上げるためのジメチルスルフォキシドのような化学的エンハンサー(Junginger et al.、「薬剤の浸透強化(Drug Permeation Enhancement)」;Hsieh,D.S.、編集、第59-60(マルセルデッカー(Marcel Dekker)社、ニューヨーク 1994、引用により全部、本明細書に編入する)を用いて、またはタンパク質またはペプチドを含む製剤の皮膚上への適用を可能にする酸化剤(国際公開第98/53847号明細書)を用いて、またはエレクトロポレーションのような一過性の輸送路を作るために電場を適用して、またはイオン導入法のような皮膚を通る荷電した薬剤の移動性を上げるために、またはソノホレシス(sonophoresis)のような超音波を適用して(米国特許第4,309,989号および同第4,767,402号明細書)、限定するわけではないがゲル、軟膏、ローション、懸濁液またはパッチ送達系のように経皮的に使用するために調製することができる(上記の刊行物および特許は引用により全部、本明細書に編入する)。
肺/鼻投与
肺投与には、好ましくは少なくとも1つの抗-TNF抗体組成物は、肺または洞のより低い気道に到達するために効果的な粒子サイズで送達される。本発明に従い、少なくとも1つの抗-TNF抗体は吸入による治療薬の投与について当該技術分野で既知の種々の吸入または鼻デバイスのうちの任意のものにより送達することができる。エーロゾル化した製剤を患者の洞腔または肺胞に沈積することができるこれらのデバイスには、計量用量呼吸器(metered dose inhaler)、ネブライザー、乾燥粉末ジェネレーター、噴霧器等を含む。抗体の肺または鼻投与を対象とするために適当な他のデバイスも当該技術分野では既知である。すべてのそのようなデバイスが、エーロゾル中の抗体を分配するための投与に適する製剤に使用することができる。そのようなエーロゾルは、溶剤(水性または非水性の両方)または固体粒子のいずれかから成ることができる。Ventolin(商標)計量用量呼吸器のような計量用量呼吸器は、多くは噴射剤ガスを使用し、そして吸息中の作動が必要である(例えば国際公開第94/16970号、同第98/35888号明細書を参照にされたい)。Turbuhaler(商標)(アストラ:Astra)、Rotahaler(商標)(グラクソ:Glaxo)、Diskus(商標)(グラクソ)、Spiros(商標)呼吸器(ジュラ:Dura)、インハーレセラピューティクス(Inhale Therapeutics)により販売されているデバイスおよびSpinhaler(商標)粉末呼吸器(フィソンス:Fisons)は、混合粉末の呼吸作動を使用する(米国特許第4668218号明細書 アストラ、欧州特許第237507号明細書 アストラ、国際公開第97/25086号明細書 グラクソ、国際公開第94/08552号明細書 ジュラ、米国特許第5458135号明細書 インハーレ、国際公開第94/06498号明細書 フィソンス、すべて引用により本明細書に編入する)。AERx(商標)アラディギム(Aradigm)、Ultravent(商標)ネブライザー(マリンクロッド:Mallinckrodt)、およびAcornII(商標)ネブライザー(マークエスト メディカル プロダクツ:Marquest Medical Products)(米国特許第5404871号明細書 アラディギム、国際公開第97/22376号明細書)(上記技術文献は引用により全部、本明細書に編入する)は溶液からエーロゾルを生成するが、計量用量呼吸器、乾燥粉末呼吸器等は、小さい粒子のエーロゾルを生成する。市販されている呼吸器デバイスのこれらの具体的態様は、本発明の実施に適する具体的なデバイスの代表であることが意図され、本発明の範囲を限定するものではない。好ましくは少なくとも1つの抗-TNF抗体を含んで成る組成物は、乾燥粉末呼吸器または噴霧器により送達される。これらは本発明の少なくとも1つの抗体を投与するための吸入デバイスの幾つかの望ましい特徴である。例えば吸入デバイスによる送達は有利には、信頼性があり、再現性があり、そして正確である。吸入デバイスは場合により、良好な呼吸適性のために小さい乾燥粒子(例えば約10μm未満、好ましくは約1〜5μm)を送達することができる。
噴霧としてTNF抗体組成物の投与
TNF抗体組成物タンパク質を含む噴霧は、少なくとも1つの抗-TNF抗体の懸濁液または溶液を加圧下のノズルを通すことにより生成することができる。ノズルのサイズはおよび形状、かける圧力および液体供給速度は、所望の出力および粒子サイズを達成するために選択することができる。電気噴霧は例えば毛細管またはノズル供給部に連結した電場により生成できる。有利には噴霧器により送達される少なくとも1つの抗-TNF抗体組成物タンパク質の粒子は、約10μm未満、好ましくは約1〜約5μmの範囲、そして最も好ましくは約2μm〜約3μmの粒子サイズを有する。
ネブライザーによるTNF抗体組成物の投与
抗体組成物タンパク質は、ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーのようなネブライザーにより投与することができる。典型的にはジェットネブライザーでは、圧縮空気源を使用してオリフィスを通る高速エアジェットを作成する。ガスがノズルを越えて膨張すると低圧領域が作成され、これが液体リザーバーに連結された毛細管を通って抗体組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流は、管から出る時に不安定なフィラメントおよび液滴に剪断され、エーロゾルを作成する。ある範囲の形状、流速、およびそらせ板型を使用して、上記のジェットネブライザーから所望の性能特性を達成することができる。超音波ネブライザーでは、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電変圧器を使用して、振動的、機械的エネルギーを作成することができる。このエネルギーを直接的に、またはカップリング流体を通すいずれかで抗体組成物タンパク質の製剤に伝え、抗体組成物タンパク質を含むエーロゾルを作成する。有利にはネブライザーにより送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約10μm未満、好ましくは約1μm〜約5μmの範囲、そして最も好ましくは約2μm〜約3μmの粒子サイズを有する。
計量用量呼吸器によるTNF抗体組成物の投与
計量用量呼吸器(metered dose inhaler:MDI)では、噴射剤ガス、少なくとも1つの抗-TNF抗体および任意の賦形剤または他の添加剤を、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターに含む。計量バルブの作動は好ましくは、約10μm未満、好ましくは約1μm〜約5μm、そして最も好ましくは約2μm〜約3μmの範囲のサイズの粒子を含むエーロゾルとしての混合物を放出する。所望のエーロゾル粒子サイズは、ジェット-ミル(jet-milling) 、噴霧乾燥、臨界点縮合等を含む当業者に既知の種々の方法により生成される抗体組成物タンパク質の製剤を使用することにより得ることができる。好適な計量用量呼吸器には、3Mまたはグラクソにより製造されたものを含み、そしてヒドロフルオロカーボン噴射剤を採用するものを含む。
経口製剤および投与
経口用の製剤は、腸壁の透過性を人工的に上げるための補助剤(例えばレゾルシノールおよひポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn-ヘキサデシルポリエチレンのような非イオン性表面活性剤)の同時投与、ならびに酵素的分解を阻害するための酵素インヒビター(例えば膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFF)およびトラシロール)の同時投与に依存する。経口投与用の固体型の剤形の活性成分化合物を、シュクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、澱粉、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマーおよびグリセリドを含む少なくとも1つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は他の種類(1つまたは複数)の添加剤、例えば不活性な希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、パラベンのような潤滑剤、ソルビン酸、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロールのような保存剤、システインのような酸化防止剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、フレーバー(flavoring agent)、香料等も含むことができる。
粘膜製剤および投与
粘膜表面を通して吸収させるために、少なくとも1つの抗-TNF抗体を投与する組成物および方法には、複数のミクロン以下の粒子、粘膜接着性高分子、生物活性ペプチドおよび水性の連続相を含んで成る乳液を含み、これは乳液粒子の粘膜接着を達成することにより粘膜表面を通る吸収を促進する(米国特許第5,514,670号明細書)。本発明の乳液の適用に適する粘膜表面には、角膜、結膜、頬、舌、鼻、膣、肺、胃、腸および直腸経路の投与を含む。膣および直腸投与の製剤、例えば坐薬は、賦形剤として例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオ脂等を含むことができる。鼻内投与用の製剤は固体であることができ、そして賦形剤として例えばラクトースを含み、または点鼻の水性もしくは油性溶液であることができる。バッカル投与には賦形剤は糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、前固化澱粉等を含む(米国特許第5,849,695号明細書)。
経皮組成物および投与
経皮投与には、少なくとも1つの抗-TNF抗体をリポソームまたはポリマー性ナノ粒子、ミクロ粒子、ミクロカプセルまたは微小球(特に言及しない限り、集合的にミクロ粒子と呼ぶ)のような送達デバイスにカプセル化する。多数の適当なデバイスが知られており、それらにはポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリホスファゼンのような合成ポリマー、ならびにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンおよび他のタンパク質、アルギネートおよび他の多糖およびそれらの組み合わせのような天然ポリマーから作られたミクロ粒子を含む(米国特許第5,814,599号明細書)。
持効性投与および組成物
本発明の化合物は個体に長期間、例えば単回投与で1週間から1年間にわたり送達することがしばしば望ましい場合がある。種々の緩効性、貯蔵またはインプラント剤形を利用することができる。例えば剤形は、体液中での溶解性が低い化合物の医薬的に許容される非毒性塩、例えば(a)リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パーム酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレン モノ-またはジ-スルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような多塩基性酸との酸付加塩;(b)亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等のような多価金属カチオン、または例えばN,N'-ジベンジル-エチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩;あるいは(c)(a)および(b)の組み合わせ、例えばタンニン酸亜鉛塩を含むことができる。さらに本発明の化合物は、または好ましくは今ちょうど記載したような比較的不溶性の塩はゲル、例えば注入に適するゴマ油を含む例えばモノステアリン酸アルミニウムゲルに配合することができる。特に好適な塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パーム酸塩等である。注入用の別の種類の緩効性貯蔵製剤は、例えば米国特許第3,773,919号明細書に記載されているようなポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマーのような緩効分解型の非毒性、非抗原性ポリマー中にカプセル化するために分散した化合物または塩を含む。化合物または好ましくは上記の比較的不溶性の塩は、特に動物で使用するために、コレステロールマトリックスシラスティック(silastic)ペレット中に配合することもできる。さらなる緩効性の、貯蔵またはインプラント製剤、例えばガスまたは液体リポソームは技術文献で知られている(米国特許第5,770,222号明細書および「徐放性および放出制御薬剤送達系(Sustained and Controlles Release Drug Delivery Systems)」、J.R.Robinson 編集、マルセルデッカー社、ニューヨーク、1978)。
典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介する少なくとも1つのプロモーター要素、抗体コード配列および転写の終結および転写物のポリアデニレーションに必要なシグナルを含む。さらなる要素にはエンハンサー、Kozak配列およびRNAスプライシングのための供与および受容部位により挟まれた介在配列を含む。高度に効率的な転写はSV40に由来する初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIに由来する長い末端反復配列(LTRS)、およびサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターにより達成され得る。しかし細胞要素(例えばヒトアクチンプロモーター)も使用することができる。本発明を実施するために適当な発現ベクターには、例えばpIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSNまたはpLNCX(クローンテック ラボズ(Clonetech Labos)、パロアルト、カリフォルニア州)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo((+/-)またはpcDNA3.1/Hygro(+/-)(インビトロゲン(Invitrogen))、PSVLおよびPMSG(ファルマシア(Pharmacia)、ウプサラ、スウェーデン)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)およびpBC12MI(ATCC67109)を含む。使用できた哺乳動物宿主細胞には、ヒトHela 293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、quailQC1-3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含む。
CHO細胞中でのクローニングおよび発現
ベクターpC4をTNF抗体の発現に使用する。プラスミドpC4は、プラスミドpSV2-dhfr(ATCC寄託番号37146)の誘導体である。プラスミドはマウスDHFR遺伝子をSV40初期プロモーターの制御下に含む。これらのプラスミドでトランスフェクトしたジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣−または他の細胞は、細胞を化学療法剤であるメトトレキセートを補充した選択培地(例えばアルファマイナスMEM、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲチスバーグ、メリーランド州)中で成長させることにより選択することができる。メトトレキセート(MTX)に対して耐性の細胞中のDHFR遺伝子の増幅が十分に示された(例えば、F.W.Alt,et al.,J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978);J.L.Hamlin and C.Ma.Biochem.et Biophys.Acta 1097:107-143(1990);およびM.J.Page and M.A.Sydenham,Biotechnology 9:64-68(1991)を参照にされたい)。MTXの濃度を上昇させて成長させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として目的酵素であるDHFRの過剰生産により薬剤への耐性を生じる。第2遺伝子がDHFR遺伝子に連結されている場合、これは通常、同時に増幅され(co-amplified)、そして過剰に発現される。当該技術分野では、この取り組みが1000コピー以上の増幅した遺伝子(1つまたは複数)を持つ細胞系を発生するために使用できることが知られている。続いてメトトレキセートを離脱する時、宿主細胞の1以上の染色体(1つまたは複数)に組み込まれた増幅された遺伝子を含む細胞系が得られる。
実施例2:トランスジェニックマウスを使用したヒトTNFに反応性の高親和性ヒトIgGモノクローナル抗体の生成
要約
ヒト重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを使用して、1以上のTNF-媒介疾患を処置するためにTNFの作用を治療的に阻害するために使用できる高親和性の完全にヒトのモノクローナル抗体を生成した。重および軽鎖の両方のヒト可変および定常領域抗体導入遺伝子を含む(CBA/JxC57/BL6/J)F2ハイブリッドマウスを、ヒト組換えTNFで免疫感作する(Taylor et al.,Intl.Immunol.6:579-591(1993):Lonberg,et al.,Nature 368:856-859(1994);Neuberger,M.,Nature Biotech.14:826(1996);Fishwild,et al.,Nature Biotechnology.14:845-851(1996))。幾つかの融合物が完全なヒトTNF反応性IgGモノクローナル抗体の1以上のパネルを生じた。完全なヒト抗-TNF抗体をさらに特徴つける。すべてがIgG1である。そのような抗体は1×109から9×1012の間あたりの親和性定数を有することがわかる。これらの完全なヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、TNF関連疾患、病理または障害における治療的応用に適する候補となる。
略号
BSA−ウシ血清アルブミン
CO2−二酸化炭素
DMSO−ジメチルスルフォキシド
EIA−酵素イムノアッセイ
FBS−ウシ胎児血清
H2O2−過酸化水素
HRP−西洋ワサビペルオキシダーゼ
ID−皮内
Ig−免疫グロブリン
TNF−組織壊死因子アルファ
IP−腹腔内
IV−静脈内
Mab−モノクローナル抗体
OD−光学密度
OPD−o-フェニレンジアミン ジヒドロクロライド
PEG−ポリエチレングリコール
RSA−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン
RT−室温
SQ−皮下
v/v−容量あたりの容量
w/v−容量あたりの重量
材料および方法
動物
ヒト免疫グロブリンを発現するがマウスIgMまたはIgを発現しない、ヒト抗体を発現できるトランスジェニックマウスは当該技術分野では知られており、そして市販されている(例えば、ジェンファーム インターナショナル(GenPharm International)、サンジョーズ、カリフォルニア州;アビジェニックス(Abgenix)、フリーモント、カリフォルニア州、およびその他から)。例えばそのようなトランスジェニックマウスは、V(D)J連結、重鎖クラススイッチ、および免疫グロブリンのヒト配列のレパートリーを生成する体性の突然変異を受けるヒト配列導入遺伝子を含む(Lonberg,et al.,Nature 368:856-859(1994))。軽鎖導入遺伝子は、例えば一部は生殖細胞系ヒトV領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来することができる。加えて、重鎖導入遺伝子はヒトμおよびヒト1(Fishwild,et al.,Nature Biotechnology 14:845-851(1996))および/または3定常領域の両方をコードすることができる。適当な遺伝子系統に由来するマウスを免疫感作および融合法に使用して、TNFに対する完全なヒトモノクローナル抗体を生成することができる。
免疫感作
1以上の免疫感作スケジュールを使用して、抗-TNFヒトハイブリドーマを作成することができる。例示的な免疫感作プロトコールにしたがった後、最初に幾つかの融合を行うことができるが、他の類似の既知のプロトコールを使用することもできる。数匹の14〜20週齢のメスおよび/または外科的に精巣を除去したトランスジェニック体のオスのマウスを、100〜400μl(例えば200)の最終容量中に等容量のTITERMAXまたは完全フロインドアジュバントで乳化した1〜1000μgの組換えヒトTNFを用いてIPおよび/またはIDで免疫感作する。各マウスは場合により1〜10μg(100μLの生理食塩水中)を2つの各SQ部位に受容することができる。マウスは1〜7、5〜12、10〜18、17〜25および/または21〜34日後にIP(1〜400μg)およびSQ(1〜400μg×2)で、等容量のTITERMAXまたは不完全フロインドアジュバントで乳化したTNFを免疫感作することができる。マウスは12〜25および25〜40日後に、後−眼窩穿刺により抗凝固剤無しで採血することができる。次いで血液をRTで1時間凝固させ、そして血清を集め、そしてTNF ELISAアッセイを使用して既知の方法に従い滴定する。融合は反復注射が力価の上昇を引き起こさない時に行う。その時点で、マウスには100μLの生理食塩水中に希釈した1〜400μgのTNFの最後のIV追加注射を与えることができる。3日後、マウスは頸部転位により屠殺し、そして脾臓を無菌的に摘出し、そして100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンおよび0.25μg/mLのアンホテリシンB(PSA)を含む10mLの冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に浸漬する。脾臓細胞は、脾臓にPSA-PBSを無菌的に潅流することにより回収する。細胞を冷PSA-PBS中で1回洗浄し、トリパン ブルー色素による排除を使用して計数し、そして25mM Hepesを含むRPMI 1640培地に再懸濁する。
細胞融合
融合は、1:1〜1:10の比率のマウスミエローマ細胞対生きている脾臓細胞で、例えば当該技術分野で既知の知られている方法に従い行うことができる。非限定的例として、脾臓細胞およびミエローマ細胞を一緒にペレットとすることができる。次にペレットをゆっくりと30秒間にわたり、37℃で1mLの50(重量/容量)%のPEG/PBS溶液に再懸濁する(PEGの分子量は1,450、シグマ)。次いで融合は25mM Hepes(37C)を含有する10.5mLのRPMI1640培地を1分間にわたりゆっくりと加えることにより停止することができる。融合した細胞を500〜1500rpmで5分間遠心する。次いで細胞をHAT培地(25mM Hepes、10%胎児クローンI血清(ハイクローン(Hyclone)、1mM ピルビン酸ナトリウム、4mM L-グルタミン、10μg/mL ゲンタマイシン、2.5%オリジェン(Origen)培養補給物(フィッシャー:Fisher)、10% 653-コンディショニングRPMI1640/Hepes培地、50μM 2-メルカプトエタノール、100μM ヒポキサンチン、0.4μM アミノプテリンおよび16μM チミジン)に再懸濁し、そして次いで200μL/ウェルで15個の96ウェルの平底組織培養プレートにまく。次いでプレートは5%CO2および95%空気を含む37Cの加湿インキューベーター中に7〜10日間、置く。
マウス血清中のヒトIgG抗-TNF抗体の検出
固相EIA'sを使用して、ヒトTNFに特異的なヒトIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングすることができる。簡単に説明すると、プレートを2μg/mLのTNF(PBS中)で一晩コートすることができる。0.02(容量/容量)%のTween 20を含む0.15Mの塩水で洗浄した後、ウェルを1(重量/容量)%BSA(PBS中)、200μL/ウェルでRTにて1時間ブロックすることができる。プレートは直ちに使用するか、または使用するまで−20Cで凍結する。マウス血清の希釈物は、TNFをコートしたプレート上で50μL/ウェルでRTにて1時間インキューベーションする。プレートを洗浄し、そして次いで1:30,000に希釈した(1% BSA-PBS中)50μL/ウェルのHRP-標識ヤギ抗-ヒトIgG、Fc特異的でRTにて1時間、釣り上げる。再度プレートを洗浄し、そして100μL/ウェルのクエン酸-リン酸基質溶液(0.1M クエン酸および0.2M リン酸ナトリウム、0.01%H2O2および1mg/mL OPD)をRTで15分間加えることができる。次いで停止溶液(4N 硫酸)を25μL/ウェルで加え、そしてODは490nmで自動化プレート分光光度計を介して読む。
ハイブリドーマ上清中の完全なヒト免疫グロブリンの検出
完全なヒト免疫グロブリンを分泌する成長陽性ハイブリドーマは、適当なEIAを使用して検出することができる。簡単に説明すると、96ウェルポップ-アウト(pop-out)プレート(VWR、610744)を10μg/mLのヤギ抗-ヒトIgG Fc(炭酸ナトリウムバッファー中)で4℃にて一晩コートすることができる。プレートを洗浄し、そして1%BSA-PBSで37℃にて1時間ブロックし、そして直ちに使用するか、または−20Cに凍結する。希釈していないハイブリドーマ上清をプレート上で37℃で1時間インキューベーションする。プレートを洗浄し、そしてHRP標識ヤギ抗-ヒトカッパ(1%BSA-PBS中で1:10,000に希釈)で37℃にて1時間、釣り上げる。次いでプレートを基質溶液と上記のようにインキューベーションする。
完全なヒト抗-TNF反応性の測定
上記のようなハイブリドーマを、適当なRIAまたは他のアッセイを使用してTNFに対する反応性について同時にアッセイすることができる。例えば上清をヤギ抗-ヒトIgG Fcプレート上で上記のようにインキューベーションし、洗浄し、そして次いでウェルあたり適切なカウントを持つ放射標識TNFでRTにて1時間釣り上げる。ウェルをPBSで2回洗浄し、そして結合した放射標識TNFを適当なカウンターを使用して定量する。
アイソタイピング
抗体のアイソタイプの決定は、特異的力価についてマウス免疫血清をスクリーニングするために使用したものと同じ形式のEIAを使用して行うことができる。TNFは上記のように96-ウェルプレートにコートし、そして精製した2μg/mLの抗体をプレート上でRTにて1時間インキューベーションすることができる。プレートを洗浄し、そしてHRP標識ヤギ抗-ヒトIgG1またはHRP標識ヤギ抗-ヒトIgG3(1%BSA-PBS中で1:4,000に希釈)でRTにて1時間、釣り上げる。次いでプレートを再度、洗浄し、そして基質溶液と上記のようにインキューベーションする。
ヒト抗-ヒトTNF抗体とヒトTNFとの結合動力学
抗体の結合特性は、例えばTNF捕捉EIAおよびBIAcore法を使用して適当に評価することができる。精製したヒトTNF抗体の段階的濃度を、上記のようなアッセイで2μg/mLのTNFでコートしたEIAプレートへの結合について評価することができる。ODは相対的結合効率を示す半−対数プロットとして与えることができる。
結果および考察
抗-ヒトTNFモノクローナル抗体の生成
幾つかの融合を行い、そして各融合は15プレート(1440ウェル/融合)にまいて、ヒトTNFに特異的な数ダースの抗体を得る。もちろん中にはヒトおよびマウスIg鎖の組み合わせから成るものもある。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖および軽鎖のみから成る抗-TNF抗体を分泌する。ヒトのハイブリドーマはすべて、IgG1になると予想される。
ヒト抗-ヒトTNF抗体の結合動力学
ELISA分析では、これらのほとんどのハイブリドーマに由来する精製抗体が濃度依存的様式でTNFに結合することを確認する。図1〜2は、これら抗体の相対的結合効率の結果を示す。この場合、抗体のそのコグネイト抗原(エピトープ)に関するアビディティを測定する。EIAプレートへのTNFの直接結合はタンパク質の変性を引き起こし、そして外見上の結合親和性は非変性タンパク質に対する結合を反映できないことに注目すべきである。50%の結合が1つの濃度範囲で見られる。
結論
幾つかの融合は、ヒトTNFを免疫感作したヒト可変およびヒト定常領域抗体の導入遺伝子を含むハイブリッドマウスの脾臓細胞を使用して行う。数セットの完全なヒトTNF反応性IgGモノクローナル抗体IgG1アイソタイプを生成する。完全なヒト抗-TNF抗体をさらに特性決定する。幾つかの生成した抗体は、1×109から9×1012の間の親和定数を有する。予期せずに、これら完全なヒトモノクローナル抗体の高親和性により、それらはTNF依存性疾患、病理または関連状態における治療的応用に適するようになる。
実施例2:ヒトTNF∀に反応性のヒトIgGモノクローナル抗体の生成
要約
重および軽鎖に関するヒト可変および定常領域抗体導入遺伝子を含む(CBA/JxC57BL/6J)F2ハイブリッドマウス(1〜4)は、組換えヒトTNF∀で免疫感作した。GenTNVと命名された1つ融合体は、固定化した組換えヒトTNFαに結合する8つの全部のヒトIgG1κモノクローナル抗体を生じた。同定してからすぐに、8つの細胞系をさらに特性決定するために分子生物学へ移した。これらのMabは配列が全部ヒトであるので、cA2(Remicade)よりはヒト対する免疫原性が低いと予想される。
略号
BSA−ウシ血清アルブミン
CO2−二酸化炭素
DMSO−ジメチルスルフォキシド
EIA−酵素イムノアッセイ
FBS−ウシ胎児血清
H2O2−過酸化水素
HC−重鎖
HRP−西洋ワサビペルオキシダーゼ
Ig−免疫グロブリン
IP−腹腔内
IV−静脈内
Mab−モノクローナル抗体
OD−光学密度
OPD−o-フェニレンジアミン ジヒドロクロライド
PEG−ポリエチレングリコール
RSA−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン
RT−室温
SQ−皮下
TNF∀−腫瘍壊死因子アルファ
v/v−容量あたりの容量
w/v−容量あたりの重量
はじめに
ヒトの重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを使用して、組換えヒトTNF∀に特異的な全部がヒトのモノクローナル抗体を生成した。cA2(Remicade)がTNF∀が媒介する疾患に関与する炎症プロセスを治療的に阻害するために使用されるように、これらの独自な抗体は血清半減期を上げ、そして免疫原性に関連する副作用を下げて使用できることが期待される。
材料および方法
動物
ヒト免疫グロブリンを発現するがマウスIgMまたはIgκを発現しないトランスジェニックマウスは、ジェンファーム インターナショナルにより開発された。これらのマウスは、V(D)J連結、重鎖クラススイッチ、および抗原−特異的なヒトの免疫グロブリンのレパートリーを生成する体性の突然変異を受ける機能的なヒト抗体導入遺伝子を含む(1)。軽鎖導入遺伝子は、一部は生殖細胞系ヒトVκ座のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来する。幾つかのVH遺伝子に加えて、重鎖(HC)導入遺伝子はヒトμおよびヒトγ1(2)および/またはγ3定常領域の両方をコードする。HCo12/KCo5遺伝子型系統に由来するマウスを、ここに記載するモノクローナル抗体を生成するための免疫感作および融合法に使用した。
ヒトTNF∀の精製
ヒトTNF∀はC237A細胞に由来する組織培養上清からアフィニティークロマトグラフィーにより、Sepharose 4B(ファルマシア)にカップリングしたTNF∀受容体−Fc融合タンパク質(p55-sf2)を充填したカラムを使用して精製した。細胞上清はその1/9容量の10×ダルベッコのPBS(D-PBS)と混合し、そして4℃で4mL/分でカラムに通した。次いでカラムをPBSで洗浄し、そしてTNF∀を0.1M クエン酸ナトリウム、pH3.5で溶出し、そして2M Tris-HCl、pH8.5で中和した。精製したTNF∀は10mM Tris、0.12M 塩化ナトリウムpH7.5にバッファーを変え、そして0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過した。
免疫感作
メスのGenPharmマウス(約16週齢)は、0、12および28日に等容量のTitermaxアジュバントで乳化した100μgのTNF∀(ロット番号JG102298またはJG102098)を用いてIP(200μL)およびID(100μL、尾の基部に)免疫感作した。マウスは21および35日に、後−眼窩穿刺により抗凝固剤無しで採血した。血液をRTで1時間凝固させ、そして血清を集め、そしてTNF∀固相EIAアッセイを使用して滴定した。GenTNVと命名された融合はマウスが28日に注射した後7週間、休ませた後に行った。TNF∀に対して1:160の特異的ヒトIgG力価を持つマウスに、100μLの生理食塩水で希釈した50μgのTNF∀を最後のIV追加免疫注射で与えた。3日後、マウスは頸部転位により屠殺し、そして脾臓を無菌的に摘出し、そして100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンおよび0.25μg/mLのアンホテリシンB(PSA)を含む10mLの冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に浸漬した。脾臓細胞は、脾臓にPSA-PBSを滅菌的に潅流することにより回収した。細胞を冷PSA-PBS中で1回洗浄し、コールター(Coulter)カウンターを使用して計数し、そして25mM Hepesを含むRPMI 1640培地に再懸濁した。
細胞系
非分泌マウスミエローマ融合パートナー、653は、セントコールの製品開発グループ(Centocor's Products Development group)から細胞生物学ーサービス(CBS)に5-14-97に受けた。細胞系は、10(容量/容量)%FBS(セル カルチャーラボズ;Cell Culture Labs)、1mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mM NEAA、2mM L-グルタミン(すべてJRHバイオサイエンス:Bioscienceから)を補充したRPMI培地(JRH Biosciences)で拡大し、そして95%FBSおよび5%DMSO(シグマ)中で寒冷保存し、そしてCBS中で蒸気相液体窒素フリザー中で保存した。細胞バンクは滅菌状態であり(クオリティコントロールセントコール(Quality Control Centocor)、マルベラン(Malvern))、そしてマイコプラズマを含まなかった(バイオユニーク ラボラトリーズ(Bionique Laboratories))。細胞は融合まで対数相カルチャーで維持した。それらをPBS中で洗浄し、計数し、そして融合前にトリパンブルー色素での排除により生存性(>95%)を測定した。
細胞融合
細胞融合は、1:1比率の653マウスミエローマ細胞および生きているマウス脾臓細胞を使用して行った。簡単に説明すると、脾臓細胞およびミエローマ細胞を一緒にペレットとした。次にペレットをゆっくりと30秒間にわたり、1mLの50(重量/容量)%のPEG/PBS溶液に37℃で再懸濁した(PEGの分子量は1,450g/モル、シグマ)。次いで融合は10.5mLのRPMI培地(添加物無し)(JRH)(37℃)を1分間にわたりゆっくりと加えることにより停止した。融合した細胞を750rpmで5分間遠心した。次いで細胞をHAT培地(10%ウシ胎児血清(JRH)、1mM ピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、10μg/mL ゲンタマイシン、2.5%オリジェン(Origen)培養補給物(フィッシャー)、50μM 2-メルカプトエタノール、1% 653コンディショニングRPMI培地、100μM ヒポキサンチン、0.4μM アミノプテリンおよび16μM チミジンを含むRPMI/HEPES培地)に再懸濁し、そして次いで200μL/ウェルで5個の96ウェルの平底組織培養プレートにまいた。次いでプレートは5%CO2および95%空気を含む37℃の加湿インキューベーター中に7〜10日間、置いた。
マウス血清中のヒトIgG抗-TNF∀抗体の検出
固相EIAsを使用して、ヒトTNF∀に特異的なヒトIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングした。簡単に説明すると、プレートを1μg/mLのTNF∀(PBS中)で一晩コートした。0.02(容量/容量)%のTween 20を含む0.15Mの塩水で洗浄した後、ウェルを1(重量/容量)%BSA(PBS中)、200μL/ウェルでRTにて1時間ブロックした。プレートは直ちに使用したか、または使用するまで−20℃で凍結した。マウス血清は、ヒトTNF∀をコートしたプレート上に50μL/ウェルで2倍の連続希釈でRTにて1時間インキューベーションした。プレートを洗浄し、そして次いで1:30,000に希釈した(1% BSA-PBS中)50μL/ウェルのHRP-標識ヤギ抗-ヒトIgG、Fc特異的(アキュレート(Accurate))でRTにて1時間、釣り上げた。再度プレートを洗浄し、そして100μL/ウェルのクエン酸-リン酸基質溶液(0.1M クエン酸および0.2M リン酸ナトリウム、0.01%H2O2および1mg/mL OPD)をRTで15分間加えた。次いで停止溶液(4N 硫酸)を25μL/ウェルで加え、そしてODは490nmで自動化プレート分光光度計を介して読んだ。
ハイブリドーマ上清中の全部ヒトの免疫グロブリンの検出
GenPharmマウスはマウスおよびヒト免疫グロブリン鎖の両方を生産することができるので、2つの別個のEIAアッセイを使用して、ヒト軽鎖およびヒト重鎖の両方の存在について成長陽性ハイブリドーマクローンを試験した。プレートは上記のようにコートし、そして希釈していないハイブリドーマ上清を37℃で1時間プレート上でインキューベーションした。プレートを洗浄し、そしてHRP結合ヤギ抗-ヒトカッパ(サザンバイオテック(Southern Biotech)抗体(1%BSA-HBSS中で1:10,000に希釈)またはHRP-結合ヤギ抗-ヒトIgG Fc特異的抗体(1%BSA-HBSS中で1:30,000に希釈)で37℃にて1時間、釣り上げた。次いでプレートを基質溶液と上記のようにインキューベーションした。抗-ヒトカッパおよび抗-ヒトIgG Fc EIA形式の両方で陽性のシグナルを与えなかったハイブリドーマクローンは捨てた。
アイソタイピング
抗体のアイソタイプの決定は、特異的力価についてマウス免疫血清をスクリーニングするために使用したものと同じ形式のEIAを使用して行った。EIAプレートは上記のようにヤギ抗−ヒトIgG(H+L)を10: g/ml(炭酸ナトリウムバッファー中)で4ECにて一晩コートし、そしてブロックした。24ウェルカルチャーからのそのままの上清をプレート上でRTにて1時間インキューベーションした。プレートを洗浄し、そして1:4000で1%BSA-PBSに希釈したHRP標識ヤギ抗-ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4(バインディングサイト(Binding Site))でRTにて1時間、釣り上げた。プレートを再度洗浄し、そして基質溶液と上記のようにインキューベーションした。
結果および考察
全部がヒトの抗-ヒトTNF∀モノクローナル抗体の生成
GenTNVという名の1つの融合を、組換えヒトTNF∀タンパク質で免疫感作したジェンファームのマウスから行った。この融合から196個の成長陽性ハイブリドーマがスクリーニングされた。ヒトTNF∀と反応性の全部がヒトのIgG抗体を分泌した8個のハイブリドーマ細胞系を同定した。これらの8個の細胞系は各々が、ヒトIgG1κアイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、そしてすべてが限定希釈により2回サブクローン化されて、安定な細胞系(>90%均一)を得た。細胞系の名前および各々のCコード表示は、表1に与える。各細胞系は、12-バイアルの研究細胞バンクで液体窒素中にて凍結された。
GenTNV融合は、セントコールで調製した組換えヒトTNF∀で免疫感作したヒト可変およびヒト定常領域抗体の導入遺伝子を含むハイブリッドマウスの脾臓細胞を使用して行った。8つの全部がヒトのTNF∀-反応性IgGモノクローナル抗体IgG1κアイソタイプが生成した。元の細胞系は、さらなる特性決定および開発のために分子生物学グループに移した。これらの新しいヒト抗体の1つが抗-炎症に有用であることを示し、Remicadeに比べて免疫原性およびアレルギー性の合併症が低い利点を示すことができる。
要約
TNVの名を持つ8つのヒトモノクローナル抗体(mAb)のパネルは、明らかに高いアビディティで固定化ヒトTNF∀に結合することが分かった。8つのうちの7つのmAbは、組換えTNF受容体に結合するhuTNF∀を効率的に遮断することが示された。7つのmAbをコードするDNAの配列分析により、すべてのmAbがヒトV領域を有することが確認された。DNA配列は、3対のmAbが互いに同一であるので、元の8つのmAbパネルがわずか4種のmAb、TNV14、TNV15、TNV148およびTNV196 により表されることも明らかとなった。mAbの推定されるアミノ酸配列およびインビトロTNF∀中和データの結果の分析に基づき、mAbTNV148およびTNV14がさらなる実験に選択された。
はじめに
ヒトTNV∀−免疫感作Genpharma/Medarexマウス(HCo12/KCo5遺伝子型)に由来する8つのmAbパネルは以前、ヒトTNV∀に結合し、そして全部がヒトのIgG1、カッパアイソタイプを有することが示された。単純な結合アッセイを使用して、本発明の例示的なmAbもTNF∀-中和活性を有するのかどうかを、それらが組換えTNF受容体への結合からTNF∀を遮断する能力について評価することにより決定した。いくつかのmAbのこれらの結果、DNA配列結果およびインビトロ特性に基づき、TNV148をさらに特性決定するために選択した。
材料および方法
試薬および細胞
TRIZOL試薬はギブコ(Gibco)BRLから購入した。プロティナーゼKは、シグマケミカルカンパニーから得た。逆転写酵素はライフサイエンス社から得た。Taq DNAポリメラーゼはパーキンエルマーシータス(Perkin Elmer Cetus)またはギブコBRLから得た。制限酵素はニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から購入した。QIAquick PCR精製キットは、キアジェン(Qiagen)からであった。QuickChange 部位特異的突然変異誘発キットはストラタジーン(Stratagene)から購入した。WizardプラスミドminiprepキットおよびRNaseはプロメガからであった。Optiplateはパッカードから得た。125ヨウ素はアマーシャム(Amersham)から購入した。カスタムオリゴメクレオチドはキーストーン/バイオソース インターナショナル(Keystone/Biosource International)から購入した。この実験で使用したオリゴヌクレオチド名、確認番号および配列は、表1に示す。
表1.TNV mAb遺伝子をクローン化し、工作し、または配列決定するために使用するオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド5'14sおよびHuH-J6によりコードされるアミノ酸を、配列の上に示す。'M'アミノ酸残基は、翻訳開始コドンを表す。オリゴヌクレオチド5'14sおよびHuH-J6中の下線を付した配列は、それぞれBsiWIおよびBstBI制限部位を記す。HuH-J6中のスラッシュは、エキソン/イントロン境界に対応する。配列がマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは、3'−5'方向で書くことに注意されたい。
受容体に対するTNF結合の阻害に関するアッセイ
TNV mAbを含むハイブリドーマ細胞上清を使用して、mAbが125I-標識TNF∀が組換えTNF受容体融合タンパク質、p55-sf2に対する結合を遮断する能力についてアッセイした(Scallon et al.(1995) Cytokine 7:759-770)。50:1のp55-sf2を0.5:g/ml(PBS中)でOptiplateに加えて37℃で1時間のインキューベーション中、ウェルをコートした。8つのTNV細胞上清の連続希釈は、PBS/0.1%BSAを希釈物として使用して96-ウェル丸底プレート中に調製した。抗-IL-18 mAbを含む細胞上清を陰性対照として含め、そしてcA2(抗-TNFキメラ抗体、Remicade、米国特許第5,770,198号明細書(引用により全部、本明細書に編入する))でスパイクした同じ抗-IL-18上清を、陽性対照として含んだ。125I-標識TNF∀(58:Ci/:g、D.Shealy)を100:1の細胞上清に加えて、5ng/mlの最終TNF∀濃度とした。混合物をRTで1時間、プレインキューベーションした。コートしたOptiplateを洗浄して非結合p55-sf2を除去し、そして50:1の125I-標識TNF∀/細胞上清混合物をOptiplateに移した。RTで2時間後、OptiplateをPBS-Tweenで3回洗浄した。100:1のMicroscint-20を加え、そして結合したcpmをTopCountガンマカウンターを使用して測定した。
V遺伝子の増幅およびDNA配列分析
ハイブリドーマ細胞はTRIZOL試薬をRNA調製物に加える前にPBSで1回洗浄した。7×106から1.7×107の間の細胞を1mlのTRIZOに再懸濁した。200μlのクロロホルムを加えた後、試験管を激しく振盪した。サンプルを4℃で10分間遠心した。水性相を新しいミクロ遠心管に移し、そして等容量のイソプロパノールを加えた。試験管を激しく振盪し、そして室温で10分間インキューベーションした。次いでサンプルを4℃で10分間遠心した。ペレットを1回、1mlの70%エタノールで洗浄し、そして真空乾燥機でかるく乾燥した。RNAペレットを40μlのDEPC-処理水に再懸濁した。RNA調製物の品質は1%アガロースゲル中で0.5μlを分画することにより決定した。RNAを−80℃の冷凍庫で使用するまで保存した。
アミノ酸を変えるための部位特異的突然変異法
TNV148mAb中のPro75をセリン残基に置き換えるために、TNV148重鎖可変領域DNA配列中の1つのヌクレオチドを変えた。相補的オリゴヌクレオチド、399および400(表1)を設計し、そしてこの変化を 使用して 注文
製造元のプロトコールに従い、翻訳開始部位のすぐ上流の独自なBsiWIクローニング部位。生成したプラスミドをp1747と命名した。可変領域の3'末端にBstBI部位を導入するために、SalIおよびBstBI部位を持つ5'オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このプライマーをpUC逆プライマーと使用して、p1747から2.75kbフラグメントを増幅した。次いでこのフラグメントを12B75可変領域中の自然に存在するSalI部位およびHindIII部位にクローン化して戻し、これにより独自のBstBI部位を導入した。生成した中間ベクター(p1750と命名)は、BsiWIおよびBsiBI末端を持つ可変領域フラグメントを受けることができた。定常領域も12B75遺伝子に由来する重鎖ベクターの変更体を調製するために、HindIII部位の下流にEcoRI部位を持つために、p1750中のBamHI−HindIII挿入物をpBR322に移した。生成したプラスミドp1768を次いでHindIIIおよびEcoRIで消化し、そしてp1744(p1560からの大きなBamHI−BamHIフラグメントをpBCにクローニングすることに由来するサブクローン)からの5.7kbのHindIII−EcoRIフラグメントに連結した。生成したプラスミドp1784は、次いでBsiWおよびBstBI末端を持つTNV Ab cDNAフラグメント用のベクターとして用いた。12B75遺伝子に由来するIgG1定常領域を含み、そしてそれらが含む12B75重鎖J-Cイントロンがどれだけ違うかにより互いに異なる発現ベクターp1788およびp1798を調製するためにさらなる作業を行った。
cDNAクローニングおよび発現プラスミドの集成
すべてのRT-PCR反応物(上記参照)は、クレノー酵素で処理してさらにDNA末端を満たした。重鎖PCRフラグメントを制限酵素BsiWIおよびBstBIで処理し、次いでプラスミドL28のBsiWIとBstBI部位を間にクローン化した(L28は12B75に基づく中間ベクターp1750がまだ調製されていなかったので使用した)。クローン化した挿入物のDNA配列分析は、生成した構築物が正しく、そしてPCR増幅中に導入された誤りがなかったことを示した。これらのL28プラスミド構築物に割り当てられた確認番号(TNV14、TNV15、TNV148、TNV148BおよびTNV196)を表2に示す。
表2.種々の重および軽鎖プラスミドのプラスミド確認番号。
L28ベクターまたはpBCベクターは、最初のAb cDNAクローンを表す。これらプラスミド中の挿入物を、不完全12B75に基づくベクターに移して中間プラスミドを作成した。さらなる転移工程により直線化された後に細胞に導入されるか、または細胞のトランスフェクション前にmAb遺伝子挿入物を精製するために使用する最終的な発現プラスミドを得た。(ND)=行わず。
細胞のトランスフェクション、スクリーニングおよびサブクローニング
マウスミエローマ細胞の全部で15のトランスフェクションは、種々のTNV発現プラスミドを用いて行った(結果および考察の章の表3を参照にされたい)。これらのトランスフェクションは、(1)宿主細胞がSp2/0か、または653か;(2)重鎖定常領域がセントコールの以前のIgG1ベクターまたは12B75重鎖定常領域によりコードされるのか;(3)mAbがTNV148B、TNV148、TNV14または新たなHC/LCの組み合わせか;(4)DNAが直線化されたプラスミドか、または精製されたAb遺伝子挿入物か;および(5)重鎖遺伝子中の完全なJ-Cイントロン配列が存在するか、存在しないのかにより分けられた。さらに幾つかのトランスフェクションを繰り返して、多数のクローンをスクリーニングする見込みを上げた。
細胞サブクローンの特性
最良の2回目のサブクローンを選択し、そしてmAb生産レベルおよび細胞増殖特性を評価するためのに成長曲線を作成した。T75フラスコに1×105細胞/ml(30mlのIMDM、5%FBS、2mM グルタミンおよび1×MHX(または無血清培地)中)でまいた。300μlのアリコートを24時間の間隔で採取し、そして生きている細胞の密度を決定した。分析は生きている細胞数が1×105細胞/ml未満になるまで続けた。集めた細胞上清のアリコートを存在する抗体の濃度についてアッセイした。ELISAアッセイは標準としてrTNV148BまたはrTNV14JG92399を使用して行った。サンプルは1時間、ポリクローナルヤギ抗-ヒトIgG FcをコートしたELISAプレート上でインキューベーションし、そして結合したmAbを1:1000希釈でアルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗-ヒトIgG(H+L)を用いて検出した。
結果および考察
組換え受容体へのTNF結合の阻害
簡単な結合アッセイを行って、ハイブリドーマの細胞上清中に含まれる8種のTNV mAbが受容体へのTNF∀の結合を遮断することができるかどうかを決定した。各細胞上清中のTNV mAb濃度を、最初にヒトIgGについて標準ELISA分析により決定した。次いで組換えp55TNF受容体/IgG融合タンパク質であるp55-sf2をEIAプレートにコートし、そして125I-標識TNF∀を変動するTNV mAb量の存在下でp55受容体に結合させた。図1に示すように、8つのTNV mAbのうち1つ(TNV122)を除き、p55受容体へのTNF∀結合を効率的に遮断した。実際にTNV mAbは、陰性対照であるハイブリドーマ上清に誘起したcA2陽性対照mAbよりもTNF∀結合を効率的に阻害するように見えた。これらの結果はTNV mAbが細胞に基づくアッセイおよびインビボにおいてTNF∀生物活性を遮断し、それゆえにさらなる分析は高度に保証されるであろうことを示していると解釈された。
DNA配列分析
RNAがヒトmAbをコードする確認
受容体結合アッセイでTNF∀-遮断活性を示した7種のTNV mAb(TNV14、TNV15、TNV32、TNV86、TNV118、TNV148およびTNV196)を特性決定する第1段階として、全RNAをこれらmAbを生産する7種のハイブリドーマ細胞系から単離した。次いで各RNAサンプルを使用して、各mAbの完全なシグナル配列、完全な可変領域配列および定常領域配列の一部を含むヒト抗体の重鎖または軽鎖cDNAを調製した。次いでこれらのcDNA生成物をPCR反応で増幅し、そしてPCR-増幅DNAを最初にフラグメントをクローニングすることなく直接配列決定した。配列決定した重鎖cDNAは、マウス中に存在する5個のヒト生殖細胞系遺伝子の1つ、DP-46と>90%同一であった(図2)。同様に配列決定した軽鎖cDNAは、マウス中に存在するヒト生殖細胞系遺伝子の1つと100%または98%同一であった(図3)。これらの配列結果により、cDNAに転写された、そして配列決定されたRNA分子がヒト抗体の重鎖およびヒト抗体の軽鎖をコードしたことが確認された。可変領域はシグナル配列コード配列の5'末端にマップされるオリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅したので、シグナル配列の最初の幾つかのアミノ酸は元のTNV翻訳産物の実際の配列ではないかもしれないが、それらは組換えTNV mAbの実際の配列を表す。
独自な中和mAb
各mAbに関する重鎖および軽鎖の両方の全可変領域に関するcDNA配列の分析により、TNV32がTNV15と同一であり、TNV118がTNV14と同一であり、そしてTNV86がTNV148と同一であることが明らかとなった。受容体結合アッセイの結果はDNA配列分析と一致し、すなわちTNF結合の遮断においてTNV86およびTNV148の両方は、TNV118およびTNV14よりもおよそ4倍良かった。したがって続く作業は独自なTNV mAbであるTNV14、TNV15、TNV148およびTNV196にのみ焦点をあてた。
4種のmAbの関連性
DNA配列の結果は、4種のTNV mAbの重鎖をコードする遺伝子がすべて互いに高度に相同的であることが明らかとなり、しかもすべて同じ生殖細胞系遺伝子であるDP-46に由来すると思われる(図2)。さらに各重鎖CDR3配列は大変類似し、そして同じ長さであるので、そしてそれらはすべてJ6エキソンを使用するので、それらは各々のmAbを独自にする体性変化が続く1つのVDJ遺伝子再配列反応(event)から明らかに生じた。DNA配列分析は、4種のmAb間に2つの明かに異なる軽鎖遺伝子があることが明らかとなった(図3)。TNV14およびTNV15中の軽鎖可変領域コード配列は互いに同一であり、そしてヒトカッパ鎖のVg/38Kファミリーの代表的な生殖細胞系配列と同一である。TNV148およびTNV196軽鎖コード配列は互いに同一であるが、2つのヌクレオチド位置で生殖細胞系配列とは異なる(図3)。
cDNAのクローニング、部位特異的突然変異誘発法および最終発現プラスミドの集成
cDNAのクローニング
PCR-増幅した可変領域のDNA配列に基づき、発現ベクター中にクローン化するコード配列に適合させる目的で別のPCR増幅を行うために、新しいオリゴヌクレオチドを注文した。重鎖の場合は、この第2回目のPCR産物を制限酵素BsiWIおよびBstBIで消化し、そしてプラスミドベクターL28にクローン化した(プラスミドの確認番号については表2に示す)。軽鎖の場合は、第2回目のPCR産物を制限酵素SalIおよびAflIIで消化し、そしてプラスミドベクターpBCにクローン化した。次いで個々のクローンを配列決定して、それらの配列がPCR産物の直接的シークエンシングから得た前の配列と同一であることを確認し、これにより分子の潜在的に異質な群において各位置に最も多いヌクレオチドが明らかになった。
TNV148を変えるための部位特異的突然変異誘発法
mAb TNV148およびTNV196は、TNF∀生物活性の中和において次に最高なmAb(TNV14)よりも4倍以上効力があると一貫して観察された。しかし上記のように、TNV148およびTNV196重鎖フレイムワーク配列は生殖細胞系フレイムワーク配列とは異なった。TNV148重鎖配列を他のヒト抗体と比較することにより、多数の他のヒトmAbがフレイムワーク1の28位にIle残基を含む(成熟配列のみを数えた)が、フレイムワーク3の75位のPro残基はその位置で通常のアミノ酸ではないことが示された。
最終的な発現プラスミドの集成
ゲノムのフラグメントとして以前にクローン化した12B75重鎖および軽鎖遺伝子に基づく新たな抗体発現ベクターを調製した。種々のTNV発現プラスミドを調製したが(表2を参照にされたい)、各々の場合で5'フランキング配列、プロモーターおよびイントロンエンハンサーは各12B75遺伝子に由来した。軽鎖発現プラスミドに関して、完全なJ-Cイントロン、定常領域コード配列および3'フランキング配列も、12B75軽鎖遺伝子に由来した。最終的な生産細胞系をもたらす重鎖発現プラスミド(p1781およびp1783、以下の参照にされたい)については、ヒトIgG1定常領域コード配列は、セントコールの以前に使用した発現ベクター(p104)に由来した。重要なことは、ここで報告された最終的な生産細胞系が元の、ハイブリドーマに由来するTNV-mAb(G1m(z))とは異なるアロタイプ(Gmf(+))のTNV mAbを発現することである。これはジェンファームのマウスに由来する12B75重鎖遺伝子がCH1ドメインのC-末端でArg残基をコードする一方、セントコールのIgG1発現ベクターp104がその位置でLysをコードするからである。ここでJ-Cイントロン、完全な定常領域コード配列および3'フランキング配列は12B75重鎖遺伝子に由来するが、これらの遺伝子でトランスフェクトされた細胞系は生産細胞系として選択されなかった別の重鎖発現プラスミド(例えばp1786およびp1788)を調製した。ベクターは慎重に設計して、最終的な発現プラスミドをもたらす将来のPCR増幅されるV領域の1段階クローニングを可能とした。
細胞のトランスフェクションおよびサブクローニング
発現プラスミドは制限消化により直線化するか、または各プラスミド中の抗体遺伝子挿入物をプラスミド骨格から精製した。Sp2/0および653マウスミエローマ細胞を重鎖および軽鎖DNAを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。15種類のトランスフェクションを行った。そのほとんどが遺伝子が直線化された全プラスミド上でも、または精製された遺伝子挿入物でも、および宿主細胞系でも、Ab遺伝子に特徴的な性質のAbにより定められるように独自であった(表3にまとめた)。マイコフェノール酸に耐性のクローンに由来する細胞上清はELISAによりヒトIgGの存在についてアッセイし、そして参照標準曲線として精製したrTNV148Bを使用して定量した。
最高に生産するrTNV148B細胞系
rTNV148トランスフェクション2から最高に生産する653の元の系の10個(スペント24-ウェル培養で5〜10:g/mlを生産した)をサブクローン化して、より高く生産している細胞系をスクリーニングし、そしてより均一な細胞群を調製した。元の系2.320からの2つのサブクローン2,320-17および2,320-20が、スペント24-ウェル培養で約50:g/mlを生産し、これはそれらの元の系より5倍増加した。サブクローン化した系2.320-17および2.320-20の2回目のサブクローニングは導いた(A second round of subcloning of subcloned lines 2.320-17 and 2.320-20 led)。
表3.細胞トランスフェクションのまとめ。各mAbをコードする重鎖および軽鎖プラスミドの確認番号を示す。精製したmAb遺伝子挿入物を用いて行ったトランスフェクションの場合、プラスミドp13(pSV2gpt)をgpt選択性マーカーの供給源として含めた。重鎖定常領域は、Remicade(旧)をコードするために使用した同じヒトIgG1発現ベクター、または12B75(ジェンファーム/メダレックス)重鎖遺伝子(新)に含まれる定常領域のいずれかによりコードされた。H1/L2は、TNV14重鎖およびTNV148軽鎖から作られた「新規」mAbと呼ぶ。プラスミドp1783およびp1801はどれくらい多くのJ-Cイントロンをそれらの重鎖遺伝子が含むかにより異なるだけである。細胞クローンに関する属名の最初の番号を定めるトランスフェクション番号を右に示す。ここに記載するrTNV148B-生産細胞系C466(A、B、C、D)およびC467Aはそれぞれトランスフェクション番号2および1に由来した。rTNV14-生産細胞系C476Aはトランスフェクション番号3に由来した。
細胞系の成長特性をより注意深く特性決定し、そして大規模でのmAb生産レベルを決定するために、T75培養を使用して成長曲線分析を行った。結果は細胞系のC466シリーズの4種が各々、1.0×106から1.25×106細胞/mlの間のピーク細胞密度、および110から140:g/mlの間の最大mAb蓄積レベルに達したことを示した(図7)。対照的に、最高に生産するSp2/0サブクローンであるC467Aは2.0×106細胞/mlのピーク細胞密度、および25:g/mlの最大mAb蓄積レベルに達した(図7)。成長曲線分析は、rTNV14-生産細胞系、C476Aについては行わなかった。
数桁にわたって測定することで(to be measured over orders of magnitude)、mAb生産の安定性を犠牲にすることなく細胞の倍化時間を有意に速める、より低濃度のMHXの使用を考えることが可能であった。細胞系C466AおよびC466Bは:MHX無し、0.2X MHXまたは1X MHXのいずれかで培養した。生きている細胞数を7日間、24時間の間隔で取った。結果はMHX濃度に依存的な細胞の成長速度が明らかとなった(図8)。細胞系C466Aは1X MHX中での25.0時間の倍化時間を示したが、MHX無しではわずか20.7時間であった。同様に細胞系C466Bは1X MHX中での32.4時間の倍化時間を示したが、MHX無しではわずか22.9時間であった。重要であるのは両方の細胞系について0.2X MHXでの倍化時間が1X MHXよりもMHX無しで観察された時間により近いことであった(図8)。この観察により倍化時間が重要なパラメーターであるバイオリアクター中での強化された細胞性能が、より少ないMHXを使用して実現できることになる可能性が高まる。しかし安定性の試験結果は(以下を参照にされたい)、細胞系C466DがMHXが存在しなくても少なくとも60日間、rTNV148Bを安定に生産できることを示唆し、そしてまた安定性試験はMHXの不存在下に比べてMHXの存在下での細胞を培養した時により高いmAb生産レベルを示した。
結論
ヒトTNF∀に対する8種のヒトmAbの最初のパネルから、タンパク質配列およびTNF中和効力を含む幾つかの基準に基づきTNV148BならびにTNV14が好適であると選択された。100:g/mlのrTNV148Bおよび19:g/ml rTNV14より多くを生産する細胞系を調製した。
実施例4.単回のボーラス注射を使用した、抗-TNF抗体および対照を使用した関節炎マウス実験
約4週齢のTg197実験マウスを、性別および体重に基づき9処置群の1つに割り当て、そしてダルベッコのPBS(D-PBS)または1mg/kgもしくは10mg/kgのいずれかの本発明の抗-TNF抗体(TNV14、TNV148またはTNV196)を単回、腹腔内ボーラス投与で処置した。
結果:体重を投与前からの変化として分析した時、10mg/kgのcA2で処置した動物は実験を通してD-PBS-処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は3〜7週間で有意であった。10mg/kgのTNV148で処置した動物も、実験の7週間目に有意な体重増加に達した。(図10を参照にされたい)。
実施例5:多回のボーラス投与として抗-TNF抗体および対照を使用した関節炎マウス実験
約4週齢のTg197実験マウスを、体重に基づき8処置群の1つに割り当て、そして対照(D-PBS)または3mg/kgの抗体(TNV14、TNV148)(0週)の腹腔内ボーラス投与を用いて処置した。注射は1、2、3及び4週にすべての動物に繰り返した。群1〜6は試験品の効力について評価した。群7および8において動物から得た血清サンプルは、2、3および4週にTNV14またはTNV148の免疫応答の誘導および薬物動力学的クリアランスについて評価した。
結果:投与前からの変化として体重を分析した時、有意差は注目されなかった。10mg/kgのcA2を用いて処置した動物は、実験を通してD-PBS処置した動物よりも一貫して高い体重の増加を示した。(図12を参照にされたい)。
実施例6:単回の腹腔内ボーラス投与として抗-TNF抗体および対照を使用した関節炎マウス実験
約4週齢のTg197実験マウスを、性別および体重に基づき6処置群の1つに割り当て、そして3mg/kgまたは5mg/kgのいずれかの抗体(cA2またはTNV148)の単回腹腔内ボーラス投与を用いて処置した。この実験はD-PBSおよび10mg/kgのcA2対照群を利用した。
実施例7:単回の腹腔内ボーラス投与として抗-TNF抗体および対照を使用した、
抗-TNF抗体および修飾抗-TNF抗体間の関節炎マウス実験
TNV148(ハイブリドーマ細胞に由来する)およびrTNV148B(トランスフェクトした細胞に由来する)の単回腹腔内投与の効果を比較するために、約4週齢のTg197実験マウスを、性別および体重に基づき9処置群の1つに割り当て、そしてダルベッコSPBS(D-PBS)または1mg/kgの抗体(TNV148、rTNV148B)の単回腹腔ボーラス投与を用いて処置した。
[1] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を含んで成る、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体。
[2] 上記抗体が、少なくとも10-9M、少なくとも10-10M,少なくとも10-11Mまたは少なくとも10-12Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[1]に記載のTNF抗体。
[3] 上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[1]に記載のTNF抗体。
[4] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体をコードする単離された核酸。
[5] [4]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。
[6] [5]に記載の単離された核酸を含んで成る原核生物または真核生物宿主細胞。
[7] 上記宿主細胞が、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[6]に記載の宿主細胞。
[8] TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[4]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗-TNF抗体の生産法。
[9] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。
[10] 少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[9]に記載の組成物。
[11] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体に特異的に結合する抗-イディオタイプ抗体またはフラグメント。
[12] 細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:
(a)配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。
[13] 上記の有効量が、0.001〜50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[12]に記載の方法。
[14] 上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[12]に記載の方法。
[15] 上記(a)の接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[12]に記載の方法。
[16] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、上記の少なくとも1つの抗-TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。
[17] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の溶液または凍結乾燥状態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。
[18] 上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[17]に記載の製品。
[19] 配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。
[20] [19]に記載された方法により生産された少なくとも1つの抗-TNF抗体。
[21] (i)配列番号1、2および3の重鎖相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべてのいずれかを含んで成る、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体。
[22] 上記抗体が、少なくとも10-9M、少なくとも10-10M,少なくとも10-11Mまたは少なくとも10-12Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[21]に記載のTNF抗体。
[23] 上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[21]に記載のTNF抗体。。
[24] (i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべてのいずれか、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体をコードする単離された核酸(An isolated nucleic acid encoding at least one isolated mammalian anti-TNF antibody either (i) all of the heavy chain CDR amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1, 2 , and 3; or (ii) all of the light chain CDR amino acids sequences of SEQ ID NOS: 4, 5, and 6.)。
[25] [4]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。
[26] [25]に記載の単離された核酸を含んで成る原核または真核生物宿主細胞。
[27] 上記宿主細胞が、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[26]に記載の宿主細胞。
[28] TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[24]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗-TNF抗体の生産法。
[29] (i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。
[30] 少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[29]に記載の組成物。
[31] (i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体に特異的に結合する抗-イディオタイプ抗体またはフラグメント。
[32] 細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって、
(a)(i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。
[33] 上記の有効量が、0.001〜50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[32]に記載の方法。
[34] 上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[32]に記載の方法。
[35] 上記(a)の接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[32]に記載の方法。
[36] (i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが該少なくとも1つの抗-TNF抗体を、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により接触または投与することに適する上記医療用デバイス。
[37] (i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の溶液または凍結乾燥形態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。
[38] 上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[37]に記載の製品。
[39] (i)配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。
[40] [39]に記載の方法により生産された少なくとも1つの抗-TNF抗体。
[41] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体。
[42] 上記抗体が、少なくとも10-9M、少なくとも10-10M,少なくとも10-11Mまたは少なくとも10-12Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[41]に記載のTNF抗体。
[43] 上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[41]に記載のTNF抗体。
[44] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体をコードする単離された核酸。
[45] [44]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。
[46] [45]に記載の単離された核酸を含んで成る、原核または真核生物宿主細胞。
[47] 上記宿主細胞が、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[46]に記載の宿主細胞。
[48] TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[44]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗-TNF抗体の生産法。
[49] 配列番号1、2、3、4、5または6の少なくとも1つのアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。
[50] 少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[49]に記載の組成物。
[51] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体に特異的に結合する抗-イディオタイプ抗体またはフラグメント。
[52] 細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:
(a)少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。
[53] 上記の有効量が、0.001〜50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[52]に記載の方法。
[54] 上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[52]に記載の方法。
[55] 上記(a)の接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[52]に記載の方法。
[56] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、該少なくとも1つの抗-TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。
[57] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の溶液または凍結乾燥形態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。
[58] 上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[57]に記載の製品。
[59] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。
[60] [59]に記載の方法により生産された少なくとも1つの抗-TNF抗体。
[61] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体。
[62] 上記抗体が、少なくとも10-9M、少なくとも10-10M,少なくとも10-11Mまたは少なくとも10-12Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[61]に記載のTNF抗体。
[63] 上記抗体が、少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[61]に記載のTNF抗体。
[64] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体をコードする単離された核酸。
[65] [64]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。
[66] [65]に記載の単離された核酸を含んで成る原核生物または真核生物宿主細胞。
[67] 上記宿主細胞が、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[66]に記載の宿主細胞。
[68] TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[64]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗-TNF抗体の生産法。
[69] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。
[70] 少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[69]に記載の組成物。
[71] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体に特異的に結合する抗-イディオタイプ抗体またはフラグメント。
[72] 細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:
(a)少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。
[73] 上記の有効量が、0.001〜50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[72]に記載の方法。
[74] 上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[72]に記載の方法。
[75] 上記(a)の接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[72]に記載の方法。
[76] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、上記の少なくとも1つの抗-TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。
[77] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の溶液または凍結乾燥状態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。
[78] 上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[77]に記載の製品。
[79] 少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。
[80] [79]に記載された方法により生産された少なくとも1つの抗-TNF抗体。
[81] 少なくとも1つのヒトCDRを含んで成る少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体であって、該抗体が配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する上記抗体(At least one isolated mammalian anti-TNF antibody, comprising at least one human CDR, wherein said antibody specifically binds at least one epitope comprising at least 1-3, to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.)。
[82] 上記抗体が、少なくとも10-9M、少なくとも10-10M,少なくとも10-11Mまたは少なくとも10-12Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[81]に記載のTNF抗体。
[83] 上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[81]に記載のTNF抗体。
[84] 少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体をコードする単離された核酸であって、該抗体が配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する上記核酸(An isolated nucleic acid encoding at least one isolated mammalian anti-TNF antibody having at least one human CDR, wherein said antibody specifically binds at least one epitope comprising at least 1-3, to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.)。
[85] [84]に記載の単離された核酸を含んで成る、単離された核酸ベクター。
[86] [85]に記載の単離された核酸を含んで成る原核生物または真核生物宿主細胞。
[87] 上記宿主細胞が、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[86]に記載の宿主細胞。
[88] TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[84]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗-TNF抗体の生産法。
[89] 少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体(ここで該抗体は、配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する)、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。
[90] 少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[89]に記載の組成物。
[91] 少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体に特異的に結合する(ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する)、抗-イディオタイプ抗体またはフラグメント。
[92] 細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:
(a)少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体の有効量を含んで成る組成物(ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する)を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。
[93] 上記の有効量が、0.001〜50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[92]に記載の方法。
[94] 上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[92]に記載の方法。
[95] 上記(a)の接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非-ステロイド系抗炎症剤(NSAID)、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[92]に記載の方法。
[96] 少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体(ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する)を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、該少なくとも1つの抗-TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。
[97] 少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体(ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する)の溶液または凍結乾燥状態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。
[98] 上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[97]に記載の製品。
[99] 少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗-TNF抗体(ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1〜3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する)の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。
[100] [99]に記載された方法により生産された少なくとも1つの抗-TNF抗体。
[101] 本明細書に記載の発明。
Claims (7)
- 配列番号:16, 17, 18のアミノ酸配列をそれぞれ有するmAb TNV148の重鎖相補性決定領域(CDR)1, 2, 3; および
配列番号:22, 23, 24のアミノ酸配列をそれぞれ有するmAb TNV148の軽鎖CDR1, 2, 3を含む抗体。 - 請求項1記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
- 請求項2記載の核酸分子を含む組換えベクター。
- 請求項2記載の核酸分子または請求項3記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1記載の抗体、および医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。
- 請求項1記載の抗体を含む、診断用または治療用組成物。
- 免疫関連疾患治療用の請求項6記載の組成物。
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