ES2607679T3 - Anticuerpos anti-TNF, composiciones, métodos y usos - Google Patents

Anticuerpos anti-TNF, composiciones, métodos y usos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo específico para el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) que tiene tres CDRs de la cadena pesada y tres CDRs de la cadena ligera o un fragmento que enlaza con los mismos, en donde las tres CDRs de la cadena pesada tienen la secuencia de aminoácidos de: CDRH1:SYAMH; CDRH2: FMSYDGSNKKYADSVKG; CDRH3: DRGIAAGGNYYYYGMDV; y las tres CDRs de la cadena ligera tienen la secuencia de aminoácidos de: CDRL1: RASQSVYSYLA; CDRL2: DASNRAT; CDRL3: QQRSNWPPFT; para su uso en el tratamiento de colitis ulcerosa.

Description

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Anticuerpos anti-TNF, composiciones, metodos y usos Descripcion
La presente invencion se refiere a anticuerpos especificos para protelna factor de necrosis tumoral alfa
(TNF).
TECNICA RELACIONADA
El TNF alfa es un homotrlmero de subunidades de protelna de 17 kD soluble (Smith et al., J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). Tambien existe una forma precursora de TNF de 26 kD unida a membrana (Kriegler et al., Cell 53: 45-53 (1988)). Para revisiones acerca de TNF, vease Beutler et al., Nature 320: 584 (1986); Old, Science 230: 630 (1986) y Le et al., Lab. Invest. 56: 234 (1987).
Celulas diferentes a monocitos o macrofagos tambien producen TNF alfa. Por ejemplo, llneas de celulas tumorales no monoclticas humanas producen TNF alfa (Rubin et al., J. Exp. Med. 164: 1350 (1986); Spriggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84: 6563 (1987)). Los linfocitos T de sangre periferica CD4+ y Cd8+ y algunas llneas de celulas T y B cultivadas (Cuturi et al., J. Exp. Med. 165: 1581 (1987); Sung et al., J. Exp. Med. 168: 1539 (1988), Turner et al., Eur. J. Immunol. 17: 1807-1814 (1987)) tambien producen TNF alfa.
TNF alfa provoca acciones pro-inflamatorias que dan como resultado lesion tisular, tal como degradacion de cartllago y huesos (Saklatvala, Nature 322: 547-549 (1986); Bertolini, Nature 319: 516-518 (1986)), induction de moleculas de adhesion, induccion de actividad pro-coagulante en celulas del endotelio vascular (Pober et al., J. Immunol. 136: 1680 (1986)), aumento de la adherencia de neutrofilos y linfocitos (Pober et al., J. Immunol. 138: 3319 (1987)) y estimulacion de la liberation de factor activador de plaquetas a partir de macrofagos, neutrofilos y celulas endoteliales vasculares (Camussi et al., J. Exp. Med. 166: 1390 (1987)).
La evidencia reciente asocia el TNF alfa con infecciones (Cerami et al., Immunol. Today 9: 28 (1988)), trastornos inmunes, patologlas neoplasicas (Oliff et al., Cell 50: 555 (1987)), patologlas autoinmunes y patologlas de injerto frente a hospedador (Piguet et al., J. Exp. Med. 166: 1280 (1987)). La relation de TNF alfa con cancer y patologlas infecciosas con frecuencia esta relacionada con el estado catabolico del hospedador. Los pacientes con cancer sufren de perdida de peso, habitualmente asociada con anorexia.
El debilitamiento considerable que esta asociado con cancer y otras enfermedades, se conoce como “caquexia” (Kern y al. J. Parent. Enter. Nutr. 12: 286-298 (1988)). La caquexia incluye perdida de peso progresiva, anorexia y erosion persistente de masa corporal magra como respuesta a un crecimiento maligno. El estado caquectico provoca gran parte de morbilidad y mortalidad en cancer. Existe evidencia de que TNF alfa esta implicado en caquexia en cancer, patologla infecciosa y otros estados catabolicos (por ejemplo, vease Beutler y Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7: 625-655 (1989)).
Se cree que el TNF alfa juega un papel central en sepsis por gram negativos y choque endotoxico (Michie et al., Br. J. Surg. 76: 670-671 (1989); Debets et al., Second Vienna Shock Forum, pags. 463-466 (1989), Simpson et al., Crit. Care Clin. 5: 27-47 (1989)), incluyendo fiebre, malestar, anorexia y caquexia. La endotoxina activa de forma marcada la production y secretion de monocitos/macrofagos de TNF alfa y otras citoquinas (Kornbluth et al., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)). TNF alfa y otras citoquinas derivadas de monocitos median las respuestas metabolicas y neurohormonales a endotoxina (Michie et al., New Engl. J. Med. 318: 1481-1486 (1988)). La administration de endotoxina a voluntarios humanos produce enfermedad aguda con slntomas similares a la gripe incluyendo fiebre, taquicardia, tasa metabolica aumentada y liberacion de hormona del estres (Revhaug et al., Arch. Surg. 123: 162-170 (1988)). El TNF alfa circulante aumenta en pacientes que sufren de sepsis por gram negativos (Waage et al., Lancet 1: 355-357 (1987); Hammerle et al., Second Vienna Shock Forum, pags. 715-718 (1989); Debets et al., Crit. Care. Med 17: 489-497 (1989); Calandra et al., J. Infect. Dis. 161: 982-987 (1990)).
Por tanto, TNF alfa ha estado implicado en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, malignidades y/o enfermedades neurodegenerativas y es una diana util para terapia biologica especlfica en enfermedades, tales como artritis reumatoide y enfermedad de Crohn. Los efectos beneficiosos en experimentos de etiqueta descubierta con un anticuerpo monoclonal quimerico para TNF alfa (cA2) se han presentado con supresion de inflamacion y con retratamiento satisfactorio despues de recalda en artritis reumatoide (Elliott et al., Arthritis Rheum. 36: 1681-1690 (1993) y Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994)) y en la enfermedad de Crohn (Van Dullemen et al., Gastroenterology 109: 129-135 (1995)). Tambien se han presentado los resultados beneficiosos en un experimento aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo con cA2 en artritis reumatoide con supresion de inflamacion (Elliott et al., Lancet 344: 1105-1110 (1994)). Los anticuerpos para un material “modulador” que se caracterizo como caquectina (que posteriormente se encontro que era identico a TNF) se han descrito por Cerami et al., (Publication de Patente EPO 0212489, 4 de marzo de 1987). Se ha dicho que tales anticuerpos son utiles en inmunoensayos de diagnostico y en terapia de choque en infecciones bacterianas. Rubin et al., (Publicacion de Patente EPO 0218868, 22 de abril de 1987) describieron
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anticuerpos monoclonales para TNF humano, los hibridomas que secretan tales anticuerpos, metodos para producir tales anticuerpos y el uso de tales anticuerpos en inmunoensayo de TNF. Yone et al., (Publicacion de Patente EPO 0288088, 26 de octubre de 1988) describieron anticuerpos anti-TNF, incluyendo mAb y su utilidad en el diagnostico con inmunoensayo de patologlas, en particular patologla de Kawasaki e infeccion bacteriana. Los llquidos corporales de pacientes con patologla de Kawasaki (slndrome de nodulo linfatico mucocutaneo febril agudo infantil; Kawasaki, T., Allergy 16: 178 (1967), Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26: 935 (1985)) se ha dicho que contienen niveles de TNF elevados que estaban relacionados con el progreso de la patologla (Yone et al., mencionado anteriormente).
Otros investigadores han descrito mAb especlficos para TNF humano recombinante que tenlan actividad neutralizante in vitro (Liang, C. M. et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman, T. S. et al., Hybridoma 6: 489507 (1987); Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987); Moller, A. et al., (Cytokine 2: 162-169 (1990)). Algunos de estos mAb se usaron para cartografiar epltopos de TNF humano y desarrollar inmunoensayos enzimaticos (Fendly et al., mencionado anteriormente; Hirai et al., mencionado anteriormente; Moller et al., mencionado anteriormente) y para ayudar en la purificacion de TNF recombinante (Bringman et al., mencionado anteriormente). Sin embargo, estos estudios no proporcionan una base para producir anticuerpos neutralizantes de TNF que se pueden usar para usos de diagnostico o terapeutico in vivo en seres humanos, debido a inmunogenicidad, carencia de especificidad y/o idoneidad farmaceutica.
Los antisueros o mAb neutralizantes para TNF han demostrado en mamlferos diferentes al hombre que anulan los cambios fisiologicos adversos y evitan la muerte despues de exposicion mortal en endotoxemia experimental y bacteriemia. Este efecto se ha demostrado, por ejemplo, en ensayos de mortalidad de roedores y en sistemas de modelo de patologla de primate (Mathison, J C et al., J. Clin. Invest. 81: 1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 229: 869-871 (1985); Tracey, K J, et al., Nature 330: 662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17: 311-318 (1988) Silva, A. T., et al., J. Infect. Dis. 162: 421-427 (1990), Opal, S. M., et al., J. Infect: Dis. 161: 1148-1152 (1990); Hinshaw, L. B., et al., Circ. Shock 30: 279-292 (1990)).
Los loci de union al supuesto receptor de hTNF se han descrito por Eck y Sprang (J. Biol. Chem. 264 (29), 17595-17605 (1989)), que identificaron los loci de union a receptor de TNF-a que consistlan en los aminoacidos 1113, 37-42, 49-57 y 155-157. La Solicitud PCT W091/02078 (fecha de prioridad del 7 de agosto de 1989) describe ligandos de TNF que se pueden unir a anticuerpos monoclonales que tienen los siguientes epltopos: al menos uno de 1-20, 56-77 y 108-127; al menos dos de 1-20, 56-77, 108-127 y 138-149; todos de 1-18, 58-65; 115-125 y 138149; todos de 1-18 y 108-128; todos de 56-79, 110-127 y 135 o 136-155; todos de 1-30,117-128 y 141-153; todos de 1-26, 117-128 y 141-153; todos de 22-40, 49-96 o 97 ,110-127 y 136-153; todos de 12-22, 36-45, 96-105 y 132-157; todos de tanto 1-20 como 76-90; todos de 22-40, 69-97, 105-128 y 135-155; todos de 22-31 y 146-157; todos de 2240 y 49-98; al menos uno de 22-40, 49-98 y 69-97, ambos de 22-40 y 70-87. El documento Wo 97/291131 describe anticuerpos humanos que se unen a TNFa humano. Se cree que los anticuerpos tienen una afinidad alta por TNFa humano (Kd de 10-8 M o menos); una velocidad de disociacion lenta para disociacion de TNFa humano (Koff de 10-3 s-1 o menos) y que son capaces de neutralizar la actividad de TNFa humano in vitro e in vivo.
Los anticuerpos de mamlfero no humano, quimericos, policlonales (por ejemplo, antisueros) y/o monoclonales (mAb) y fragmentos (por ejemplo, productos de digestion proteolltica o de fusion de protelna de los mismos) son agentes terapeuticos potenciales que se estan investigando en algunos casos para intentar tratar determinadas enfermedades. Sin embargo, tales anticuerpos o fragmentos pueden provocar una respuesta inmune cuando se administran a seres humanos. Una respuesta inmune de este tipo puede dar como resultado una eliminacion mediada por complejo inmune de los anticuerpos o fragmentos de la circulacion y hacer que la administracion repetida sea inadecuada para terapia, reduciendo de ese modo el beneficio terapeutico para el paciente y limitando la readministracion del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, la administracion repetida de anticuerpos o fragmentos que comprenden partes no humanas puede conducir a enfermedad del suero y/o anafilaxis. Para evitar estos y otros problemas, se han tomado varios enfoques para reducir la inmunogenicidad de tales anticuerpos y partes de los mismos, incluyendo quimerizacion y humanizacion, como se conoce bien en la tecnica. Sin embargo, estos y otros enfoques aun pueden dar como resultado anticuerpos o fragmentos que tengan alguna inmunogenicidad, afinidad baja, avidez baja o con problemas en cultivo celular, aumento de escala, produccion y/o rendimientos bajos. Por tanto, tales anticuerpos o fragmentos pueden ser menos que adecuados de forma ideal para preparacion o uso como protelnas terapeuticas.
Por consiguiente, existe una necesidad de proporcionar anticuerpos anti-TNF o fragmentos que superen uno mas de estos problemas, as! como mejoras sobre anticuerpos conocidos o fragmentos de los mismos.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona anticuerpos anti-TNF aislados humanos, composiciones de anticuerpos anti-TNF, acidos nucleicos codificantes, vectores, celulas huesped, composiciones y usos de los mismos, como se ha descrito y posibilitado en este documento, en combinacion con lo que se conoce en la tecnica.
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La invention proporciona un anticuerpo o fragmento que enlaza con el antlgeno del mismo que tiene tres CDRs de la cadena pesada y tres CDRs de la cadena ligera, en donde las tres CDRs de la cadena pesada tienen la secuencia de aminoacidos de:
CDRH1:SYAMH;
CDRH2: FMSYDGSNKKYADSVKG;
CDRH3: DRGIAAGGNYYYYGMDV; y
las tres CDRs de la cadena ligera tienen la secuencia de aminoacidos de:
CDRL1: RASQSVYSYLA;
CDRL2: DASNRAT;
CDRL3: QQRSNWPPFT;
para su uso en el tratamiento de colitis ulcerosa.
La invencion tambien proporciona una composition que comprende el anticuerpo de la revindication 1 y un vehlculo o diligente farmacneuticamente aceptable, en donde la composicion es para el tratamiento de la colitis ulcerosa.
La presente memoria descriptiva describe moleculas de acido nucleico aisladas que comprenden, que son complementarias o que hibridan a un polinucleotido que codifica anticuerpos anti-TNF especlficos que comprenden al menos una secuencia especificada, dominio, parte o variante de la misma. La presente memoria descriptiva describe ademas vectores recombinantes que comprenden dichas moleculas de acido nucleico de anticuerpo anti- TNF, celulas huesped que contienen tales acidos nucleicos y/o vectores recombinantes, as! como metodos para preparar y/o usar tales acidos nucleicos de anticuerpo, vectores y/o celulas huesped.
Al menos un anticuerpo de la invencion se une a al menos un epltopo especificado especlfico para al menos una protelna de TNF, subunidad, fragmento, parte o cualquier combination de los mismos. El al menos un epltopo puede comprender al menos una region de union a anticuerpo que comprende al menos una parte de dicha protelna, epltopo que preferiblemente esta comprendido de al menos 1-5 aminoacidos de al menos una parte del mismo, tal como pero sin limitation, al menos un dominio funcional, extracelular, soluble, hidrofilo, externo o citoplasmatico de dicha protelna o cualquier parte del mismo.
La presente invencion tambien proporciona la menos un anticuerpo anti-TNF aislado como se ha descrito en este documento, donde el anticuerpo tiene al menos una actividad, tal como, pero sin limitacion inhibition de moleculas de adhesion celular inducida por TNF, inhibicion de union de TNF a receptor, mejora del Indice Artrltico en un modelo de raton, (veanse, por ejemplo, los Ejemplos 3-7). Por tanto, un anticuerpo anti-TNF se puede seleccionar para una actividad correspondiente de acuerdo con metodos conocidos, tales como pero sin limitacion, al menos una actividad biologica hacia una protelna de TNF.
La presente memoria descriptiva tambien describe al menos un metodo para expresar al menos un anticuerpo anti-TNF, en una celula huesped, que comprende cultivar una celula huesped como se ha descrito en este documento en condiciones en las que al menos un anticuerpo anti-TNF se expresa en cantidades detectables y/o recuperables.
La presente memoria descriptiva tambien describe al menos una composicion que comprende (a) un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-TNF y/o anticuerpo como se ha descrito en este documento y (b) un vehlculo o diluyente adecuado. El vehlculo o diluyente puede ser opcionalmente farmaceuticamente aceptable, de acuerdo con vehlculos o diluyentes conocidos. Opcionalmente, la composicion puede comprender ademas al menos un compuesto, protelna o composicion adicional.
La presente memoria descriptiva describe ademas al menos un metodo o composicion de anticuerpo anti- TNF, para administrar una cantidad terapeuticamente eficaz para modular o tratar al menos una afeccion relacionada con TNF en una celula, tejido, organo, animal o paciente y/o, antes de, posterior a o durante una afeccion relacionada, como se conoce en la tecnica y/o se ha descrito en este documento.
La presente memoria descriptiva tambien describe al menos una composicion, dispositivo y/o metodo de administration de una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-TNF, de acuerdo con la presente invencion.
La presente memoria descriptiva describe ademas al menos un metodo o composicion de anticuerpo anti- TNF, para diagnosticar al menos una afeccion relacionada con TNF en una celula, tejido, organo, animal o paciente y/o, antes de, posterior a o durante una afeccion relacionada, como se conoce en la tecnica y/o se ha descrito en este documento.
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La presente memoria descriptiva tambien describe al menos una composicion, dispositivo y/o metodo de
administracion para el diagnostico de al menos un anticuerpo anti-TNF, de acuerdo con la presente invention.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra una representation grafica que muestra un ensayo para capacidad de mAb de TNV en sobrenadantes de celulas de hibridoma para inhibir union de TNFa a receptor de TNF recombinante. Cantidades variables de sobrenadantes de celulas de hibridoma que contienen cantidades conocidas de mAb de TNV se preincubaron con una concentration fija (5 ng/ml) de TNFa marcado con 125I. La mezcla se transfirio a Optiplates de 96 pocillos que previamente se hablan recubierto con p55-sf2, una protelna de fusion recombinante de receptor de TNF/IgG. La cantidad de TNFa que se unio al receptor p55 en presencia de los mAb se determino despues de lavar el material no unido y el recuento usando un contador gamma. Aunque en estos experimentos se ensayaron ocho muestras de mAb de TNV, por simplicidad no se muestran en este documento tres de los mAb que se demostro mediante analisis de secuencia de ADN que eran identicos a uno de los otros mAb de tNv (vease la section 5.2.2). Cada muestra se ensayo por duplicado. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes.
La Figura 2 muestra secuencias de ADN de las regiones variables de cadena pesada de mAb de TNV. El gen de llnea germinal mostrado es el gen DP-46. “TNV” indica que la secuencia mostrada es la secuencia de de TNV14, TNV15, TNV148 y TNV196. Los primeros tres nucleotidos en la secuencia de TNV definen el codon Met de inicio de traduction. Los puntos en las secuencias de genes de mAb de TNV indican que el nucleotido es el mismo que en la secuencia de llnea germinal. Los primeros 19 nucleotidos (subrayados) de las secuencias de TNV corresponden al oligonucleotido usado para amplificar por PCR la region variable. Una traduccion de aminoacido (abreviaturas de letra unica) que comienza con el mAb maduro se muestra solo para el gen de llnea germinal. Los tres dominios de CDR en la traduccion de aminoacido de llnea germinal estan marcados en negritas y subrayados. Las llneas marcadas TNV148(B) indican que la secuencia mostrada se refiere tanto a TNV148 como TNV148B. Los huecos en la secuencia de ADN de llnea germinal (CDR3) se deben a que la secuencia no se conoce o que no existe en el gen de llnea germinal. Las cadenas pesadas de mAb de TNV usan la region de union J6.
La Figura 3 muestra secuencias de ADN de las regiones variables de cadena ligera de mAb de TNV. El gen de llnea germinal mostrado es un miembro representativo de la familia de Vg/38K de genes de region variable de llnea germinal kappa humanos. Los puntos en las secuencias de genes de mAb de TNV indican que el nucleotido es el mismo que en la secuencia de llnea germinal. Los primeros 16 nucleotidos (subrayados) de las secuencias de TNV corresponden al oligonucleotido usado para amplificar por PCR la region variable. Una traduccion de aminoacidos del mAb maduro (abreviaturas de letras unicas) se muestra solo para el gen de llnea germinal. Los tres dominios de CDR en la traduccion de aminoacidos de llnea germinal estan marcados en negritas y subrayados. Las llneas marcadas TNV148(B) indican que la secuencia mostrada se refiere tanto a TNV148 como a TNV148B. Los huecos en la secuencia de ADN de llnea germinal (CDR3) se deben a que la secuencia no se conoce o que no existe en el gen de llnea germinal. Las cadenas ligeras de mAb de TNV usan la secuencia de union J3.
La Figura 4 muestra secuencias de aminoacidos deducidas de las regiones variables de cadena pesada de mAb de TNV. Las secuencias de aminoacidos mostradas (abreviaturas de letra unica) se dedujeron a partir de la secuencia de ADN determinada a partir de tanto productos de PCR no clonados como productos de PCR clonados. Las secuencias de aminoacidos se muestran divididas en los dominios de secuencia senal secretora (senal), flanqueante (FW) y de region determinante de complementariedad (CDR). La secuencia de aminoacidos para el gen de llnea germinal DP-46 se muestra en la llnea superior de cada dominio. Los puntos indican que el aminoacido en el mAb de TNV es identico al gen de llnea germinal. TNV148(B) indica que la secuencia mostrada se refiere tanto a TNV148 como TNV148B. Los TNV indican que la secuencia mostrada se refiere a todos los mAb de TNV a menos que se muestre una secuencia diferente. Los guiones en la secuencia de llnea germinal (CDR3) indican que las secuencias no se conocen o que no existen en el gen de llnea germinal.
La Figura 5 muestra secuencias de aminoacidos deducidas de las regiones variables de cadena ligera de mAb de TNV. Las secuencias de aminoacidos mostradas (abreviaturas de letra unica) se dedujeron a partir de secuencia de ADN determinada a partir de tanto productos de PCR no clonados como productos de PCR clonados. Las secuencias de aminoacidos se muestran divididas en los dominios de secuencia senal secretora (senal), flanqueante (FW) y region determinante de complementariedad (CDR). La secuencia de aminoacidos para el gen de llnea germinal de cadena ligera de tipo de Vg/38K se muestra en la llnea superior de cada dominio. Los puntos indican que el aminoacido en el mAb de TNV es identico al gen de llnea germinal. TNV148(B) indica que la secuencia mostrada se refiere tanto a TNV como TNV148B. “Todos” indica que la secuencia mostrada se refiere a TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B y TNV186.
La Figura 6 muestra ilustraciones esquematicas de los plasmidos de expresion de cadena pesada y ligera
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usados para preparar las celulas C466 que expresan rTNV148B. p1783 es el plasmido de cadena pesada y p1776 es el plasmido de cadena ligera. Los dominios codificantes de region variable y constante de rTNV148B se muestran como cuadros negros. Los potenciadores de inmunoglobulina en los intrones J-C se muestran como cuadros grises. Se muestran los sitios de restriction pertinentes. Los plasmidos se muestran orientados de forma que la transcription de los genes de Ab progrese en una direction en el sentido de las agujas del reloj. El plasmido p1783 tiene 19,53 kb de longitud y el plasmido p1776 tiene 15,06 kb de longitud. Las secuencias de nucleotidos completas de ambos plasmidos se conocen. La secuencia codificante de region variable en p1783 se puede reemplazar facilmente con otra secuencia de region variable de cadena pesada reemplazando el fragmento de restriccion BsiWI/BstBI. La secuencia codificante de region variable en p1776 se puede reemplazar con otra secuencia de region variable reemplazando el fragmento de restriccion Sall/Afl 11.
La Figura 7 muestra la representation grafica de analisis de curva de crecimiento de cinco llneas celulares productoras de rTNV148B. Los cultivos se iniciaron el dla 0 sembrando las celulas en matraces T75 en medio I5Q + MHX para tener una densidad celular viable de 1,0 X 105 celulas/ml en un volumen de 30 ml. Los cultivos celulares usados para estos estudios hablan estado en cultivo continuo desde que se realizaron transfecciones y subclonaciones. En los dlas posteriores, las celulas en los matraces T se resuspendieron minuciosamente y se retiro una allcuota de 0,3 ml del cultivo. Los estudios de curva de crecimiento se finalizaron cuando los recuentos celulares cayeron por debajo de 1,5 X 105 celulas/ml. El numero de celulas vivas en la allcuota se determino mediante exclusion con azul de tripano y el resto de la allcuota se almaceno para determination de concentration de mAb posterior. Se realizo un ELlSA para IgG humana en todas las allcuotas de muestra al mismo tiempo.
La Figura 8 muestra una representacion grafica de comparacion de Indices de crecimiento celular en presencia de concentraciones variables de seleccion de MHX. Los subclones celulares C466A y C466B se descongelaron en medio sin MHX (IMDM, FBS al 5% y glutamina 2 mM) y se cultivaron durante dos dlas adicionales. Despues ambos cultivos celulares se dividieron en tres cultivos que contenlan no MHX, 0,2X MHX o 1X MHX. Un dla despues, los matraces T75 nuevos se sembraron con los cultivos a una densidad de partida de 1 X 105 celulas/ml y las celulas se recontaron en intervalos de 24 horas durante una semana. Los tiempos de duplication durante los primeros 5 dlas se calcularon usando la formula en SOP PD32.025 y se muestran por encima de las barras.
La Figura 9 muestra representaciones graficas de la estabilidad de production de mAb a lo largo del tiempo a partir de dos llneas celulares productoras de rTNV148B. Los subclones celulares que hablan estado en cultivo continuo desde que se realizaron transfecciones y subclonaciones se usaron para comenzar cultivos seriados a largo plazo en placas de cultivo de 24 pocillos. Las celulas se cultivaron en medio I5Q con y sin selection de MHX. Se realizaron pases de las celulas continuamente separando los cultivos cada 4 a 6 dlas para mantener nuevos cultivos viables mientras que se dejo que los cultivos previos se agotaran. Las allcuotas del sobrenadante celular agotado se recogieron poco despues de que los cultivos se agotaran y se almacenaron hasta que se determinaron las concentraciones de mAb. Se realizo un ELISA para IgG humana en todas las allcuotas de muestra al mismo tiempo.
La Figura 10 muestra cambios de peso en ratones Tg 197 en un modelo de raton de artritis en respuesta a anticuerpos anti-TNF de la presente invention en comparacion con controles en el Ejemplo 4. A aproximadamente 4 semanas de edad los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en el genero y peso corporal, a uno de 9 grupos de tratamiento y se trataron con una dosis de bolo intraperitoneal unica de PBS de Dulbecco (D-PBS) o un anticuerpo anti-TNF de la presente invencion (TNV14, TNV148 o TNV 196) a 1 mg/kg o 10 mg/kg. Cuando los pesos se analizaron como un cambio desde la pre-dosis, los animales tratados con 10 mg/kg de cA2 mostraron ganancia de peso sistematicamente mayor que los animales tratados con D-PBS a traves de todo el estudio. Esta ganancia de peso fue significativa en las semanas 3-7. Los animales tratados con 10 mg/kg de TNV148 tambien consiguieron ganancia de peso significativa en la semana 7 del estudio.
Las Figuras 11A-C representan la progresion de la gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico como se presenta en el Ejemplo 4. El Indice artrltico del grupo tratado con 10 mg/kg de cA2 fue menor que el grupo de control de D-PBS comenzando en la semana 3 y continuando por todo el resto del estudio (semana 7). Los animales tratados con 1 mg/kg de TNV14 y los animales tratados con 1 mg/kg de cA2 no mostraron reduction significativa en AI despues de la semana 3 cuando se compararon con el Grupo tratado con D-PBS. No hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento de 10 mg/kg cuando cada uno se comparo con los otros de dosis similares (10 mg/kg de cA2 en comparacion con 10 mg/kg de TNV14, 148 y 196). Cuando los grupos de tratamiento de 1 mg/kg se compararon, el 1 mg/kg de TNV148 mostro un AI significativamente menor que 1 mg/kg de cA2 a las semanas 3, 4 y 7. El 1 mg/kg de TNV148 tambien fue significativamente menor que el grupo tratado con 1 mg/kg de TNV14 a las 3 y 4 semanas. Aunque TNV196 mostro reduccion significativa en Al hasta la semana 6 del estudio (cuando se comparo con el Grupo tratado con D-PBS), TNV148 fue el unico tratamiento de 1 mg/kg que permanecio significativo a la
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finalizacion del estudio.
La Figura 12 muestra cambios de peso de ratones Tg 197 de un modelo de raton de artritis en respuesta a anticuerpos anti-TNF de la presente invencion en comparacion con controles en el Ejemplo 5. Aproximadamente a 4 semanas de edad los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en peso corporal, a uno de 8 grupos de tratamiento y se trataron con una dosis de bolo intraperitoneal de artlculo de control (D-PBS) o anticuerpo (TNV14, TNV148) a 3 mg/kg (semana 0). Las inyecciones se repitieron en todos los animales en las semanas 1, 2, 3 y 4. Los grupos 1-6 se evaluaron para ensayar la eficacia del artlculo. Las muestras de suero, obtenidas a partir de los animales en los Grupos 7 y 8 se evaluaron para determinar la induccion de respuesta inmune y elimination farmacocinetica de TNV14 o TNV148 en las semanas 2, 3 y 4.
Las Figuras 13A-C son graficos que representan la progresion de la gravedad de la enfermedad en el Ejemplo 5 basandose en el Indice artrltico. El Indice artrltico del grupo tratado con 10 mg/kg de cA2 fue significativamente menor que el del grupo de control de D-PBS comenzando en la semana 2 y continuando durante el resto del estudio (semana 5). Los animales tratados con 1 mg/kg o 3 mg/kg de cA2 y los animales tratados con 3 mg/kg de TNV14 no consiguieron ninguna reduction significativa en Al en ningun momento a lo largo de todo el estudio cuando se compararon con el grupo de control de D-PBS. Los animales tratados con 3 mg/kg de TNV148 mostraron una reduccion significativa cuando se compararon con el grupo tratado con D-PBS comenzando en la semana 3 y continuando hasta la semana 5. Los animales tratados con 10 mg/kg de cA2 mostraron una reduccion significativa en Al cuando se compararon con tanto dosis menores (1 mg/kg y 3 mg/kg) de cA2 en las semanas 4 y 5 del estudio como tambien fue significativamente menor que los animales tratados con TNV14 en las semanas 3-5. Aunque aparentemente no existen diferencias significativas entre cualquiera de los grupos de tratamiento de 3 mg/kg, el Al para los animales tratados con 3 mg/kg de TNV14 fue significativamente mayor en algunos puntos de tiempo que los de 10 mg/kg, mientras que los animales tratados con TNV148 no fueron significativamente diferentes de los animales tratados con 10 mg/kg de cA2.
La Figura 14 muestra cambios de peso en ratones Tg 197 de un modelo de raton de artritis en respuesta a anticuerpos anti-TNF de la presente invencion en comparacion con controles en el Ejemplo 6. Aproximadamente a 4 semanas de edad los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en el genero y peso corporal, a uno de 6 grupos de tratamiento y se trataron con una dosis de bolo intraperitoneal unica de anticuerpo (cA2 o TNV148) a 3 mg/kg o 5 mg/kg. Este estudio utilizo los Grupos de control de D-PBS y de 10 mg/kg de cA2.
La Figura 15 representa la progresion de la gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico como se presenta en el Ejemplo 6. Todos los grupos de tratamiento mostraron alguna protection en puntos de tiempo tempranos, mostrando el de 5 mg/kg de cA2 y el de 5 mg/kg de TNV148 reducciones significativas en Al en las semanas 1-3 y mostrando todos los grupos de tratamiento una reduccion significativa en la semana 2. Posteriormente en el estudio los animales tratados con 5 mg/kg de cA2 mostraron alguna proteccion, con reducciones significativas en las semanas 4, 6 y 7. La dosis baja (3 mg/kg) tanto de cA2 como de TNV148 mostro reducciones significativas en 6 y todos los grupos de tratamiento mostraron reducciones significativas en la semana 7. Ninguno de los grupos de tratamiento fue capaz de mantener una reduccion significativa a la finalizacion del estudio (semana 8). No hubo diferencias significativas entre ninguno de los grupos de tratamiento (excluyendo el grupo de control de solution salina) en ningun punto del tiempo.
La Figura 16 muestra cambios de peso de ratones Tg 197 de un modelo de raton de artritis en respuesta a anticuerpos anti-TNF de la presente invencion en comparacion con los controles en el Ejemplo 7. Para comparar la eficacia de una dosis intraperitoneal unica de TNV148 (obtenido de celulas de hibridoma) y rTNV148B (obtenido de celulas transfectadas). Aproximadamente a 4 semanas de edad los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en genero y peso corporal, a uno de 9 grupos de tratamiento y se trataron con una dosis de bolo intraperitoneal unica de PBS de Dulbecco (D-PBS) o anticuerpo (TNV148, rTNV148B) a 1 mg/kg.
La Figura 17 representa la progresion de la gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico como se presenta en el Ejemplo 7. El Indice artrltico del grupo tratado con 10 mg/kg de cA2 fue menor que el del grupo de control de D-PBS comenzando en la semana 4 y continuando a lo largo del resto del estudio (semana 8). Tanto los Grupos tratados con TNV148 como el Grupo tratado con 1 mg/kg de cA2 mostraron una reduccion significativa en Al en la semana 4. Aunque un estudio previo (documento P-099-017) mostro que TNV148 era ligeramente mas eficaz para reducir el Indice Artrltico a continuation de un bolo intraperitoneal de 1 mg/kg unico, este estudio demostro que el Al de ambas versiones de los grupos tratados con anticuerpo TNV fue ligeramente mayor. Aunque (con exception de la semana 6) el Grupo tratado con 1 mg/kg de cA2 no estaba significativamente aumentado en comparacion con el grupo de 10 mg/kg de cA2 y los Grupos tratados con TNV148 fueron significativamente mayores en las semanas 7 y 8, no hubo diferencias significativas en Al entre 1 mg/kg de cA2, 1 mg/kg de TNV148 y 1 mg/kg de TNV148B en ningun
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punto en el estudio.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invention proporciona anticuerpos aislados, recombinantes y/o sinteticos anti-TNF humano, as! como composiciones moleculas de acidos nucleicos codificantes que comprenden al menos un polinucleotido que codifica al menos un anticuerpo anti-TNF de la invencion. La presente invencion incluye ademas, aunque sin limitation, usos de tales anticuerpos, por ejemplo en composiciones, metodos y dispositivos de diagnostico y terapeuticos.
Como se usa en este documento, un “anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral alfa”, “anticuerpo anti-TNF”, “parte de anticuerpo anti-TNF” o “fragmento de anticuerpo anti-TNF” y/o “variante de anticuerpo anti-TNF” y similares incluyen cualquier protelna o peptido que contiene una molecula que comprende al menos una parte de una molecula de inmunoglobulina, tal como pero sin limitacion, al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una parte de union a ligando de la misma, una region variable de cadena pesada o cadena ligera, una region constante de cadena pesada o cadena ligera, una region flanqueante o cualquier parte de las mismas, o al menos una parte de una protelna receptora o de union de TNF, que se puede incorporar en un anticuerpo de la presente invencion. Tal anticuerpo opcionalmente ademas influye sobre un ligando especlfico, tal como pero sin limitacion, donde tal anticuerpo modula, disminuye, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloquea, inhibe, anula y/o interfiere con al menos una actividad o union de TNF, o con una actividad o union a receptor de TNF, in vitro, in situ y/o in vivo. Como un ejemplo no limitante, un anticuerpo anti TNF adecuado, parte especificada o variante se puede unir al menos un TNF o partes, variantes o dominios especificados del mismo. Un anticuerpo, parte especificada o variante anti-TNF adecuado tambien puede influir opcionalmente sobre al menos una actividad o funcion de TNF, tal como pero sin limitacion, slntesis de ARN, ADN o de protelna, liberation de TNF, serialization de receptor de TNF, escision de TNF de membrana, actividad de TNF, production y/o slntesis de TNF. El termino “anticuerpo” tiene por objeto ademas abarcar anticuerpos, fragmentos de digestion, partes y variantes especificadas de los mismos, incluyendo mimeticos de anticuerpo o que comprenden partes de anticuerpos que mimetizan la estructura y o funcion de un anticuerpo o fragmento o parte especificada del mismo, incluyendo anticuerpos de cadena unica y fragmentos del mismo. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de union a antlgeno que se unen a un TNF de mamlfero. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a TNF o partes del mismo, incluyendo, pero sin limitacion Fab (por ejemplo, mediante digestion con papalna), Fab' (por ejemplo, mediante digestion y reduction parcial con pepsina) y F(ab')2 (por ejemplo, mediante digestion con pepsina), facb (por ejemplo, mediante digestion con plasmina), pFc' (por ejemplo, mediante digestion con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestion, reduccion parcial y reagregacion con pepsina), fragmentos de Fv o scFv (por ejemplo, mediante tecnicas de biologla molecular), estan abarcados por la invencion (vease, por ejemplo, Colligan, Inmunology, mencionado anteriormente).
Tales fragmentos se pueden producir mediante escision enzimatica, tecnicas sinteticas o recombinantes, como se conoce en la tecnica y/o como se ha descrito en este documento. Tambien se pueden producir anticuerpos en una diversidad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los que se han introducido uno o mas codones de parada cadena arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, un gen de combination que codifica una parte de cadena pesada de F(ab')2 se puede disenar para que incluya secuencias de ADN que codifican la region CH, de dominio y/o de bisagra de la cadena pesada. Las diversas partes de anticuerpo se pueden unir qulmicamente mediante tecnicas convencionales o se pueden preparar como una protelna contigua usando tecnicas de ingenierla genetica.
Como se usa en este documento, la expresion “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que sustancialmente cada parte de la protelna (por ejemplo, CDR, flanqueante, dominios Cl, Ch (por ejemplo, Ch1, Ch2, Ch3) bisagra, (VL, VH)) son sustancialmente no inmunogenicas en seres humanos, con solo cambios o variaciones de secuencia menores. De forma similar, los anticuerpos denominados de primate (mono, babuino, chimpance, etc.), de roedor (raton, rata, conejo, cobaya, hamster y similares) y otros mamlferos designan tales anticuerpos especlficos de especie, subgenero, genero, subfamilia y familia. Ademas, los anticuerpos quimericos incluyen cualquier combinacion de los anteriores. Tales cambios o variaciones opcionalmente y preferiblemente conservan o reducen la inmunogenicidad en seres humanos u otras especies con relation a anticuerpos no modificados. Por tanto, un anticuerpo humano es diferente de un anticuerpo quimerico o humanizado. Se senala que un anticuerpo humano se puede producir mediante un animal no humano o celula procariota o eucariota, que sea capaz de expresar genes de inmunoglobulina humana reordenados funcionalmente (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera). Ademas, cuando un anticuerpo humano es un anticuerpo de cadena unica, el mismo puede comprender un peptido enlazador que no se encuentra en anticuerpos humanos nativos. Por ejemplo, un Fv puede comprender un peptido enlazador, tal como a aproximadamente ocho restos de aminoacidos de glicina o diferentes, que conecta la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera. Se considera que tales peptidos enlazadores son de origen humano.
Tambien se pueden usar anticuerpos biespeclficos, heteroespeclficos, heteroconjugados o similares que sean anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tengan especificidades de union por
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al menos dos antlgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es por al menos una protelna de TNF y la otra es por cualquier otro antlgeno. Los metodos para preparar anticuerpos biespeclficos se conocen en la tecnica. Tradicionalmente, la production recombinante de anticuerpos biespeclficos se basa en la co- expresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespeclfica correcta. La purification de la molecula correcta, que habitualmente se realiza mediante etapas de cromatografla por afinidad, es mas bien engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen, por ejemplo, en el documento WO 93/08829, las Patentes de Estados Unidos N° 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, los documentos WO 91/00360, WO 92/0373, EP 03089, Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
Los anticuerpos anti-TNF (tambien denominados anticuerpos de TNF) de la presente invention opcionalmente se pueden caracterizar mediante union de afinidad alta a TNF y opcionalmente y preferiblemente teniendo toxicidad baja. En particular, un anticuerpo de la invencion, en el que los componentes individuales, tales como la region variable, la region constante y flanqueante, individualmente y/o colectivamente, opcionalmente y preferiblemente poseen inmunogenicidad baja, es util en la presente invencion. Los anticuerpos que se pueden usar en la invencion se caracterizan opcionalmente por su capacidad para tratar pacientes durante periodos prolongados con alivio medible de slntomas y toxicidad baja y/o aceptable. La inmunogenicidad baja o aceptable y/o afinidad alta, as! como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapeuticos conseguidos. “Inmunogenicidad baja” se define en este documento como que eleva las respuestas de HAHA, HACA o HAMA significativas en menos de aproximadamente el 75% o preferiblemente menos de aproximadamente el 50% de los pacientes tratados y/o que eleva tltulos bajos en el paciente tratado (menos de aproximadamente 300, preferiblemente menos de aproximadamente 100 medidos con un inmunoensayo de enzima de doble antlgeno) (Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994).
Utilidad
Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion se pueden usar para la produccion de al menos un anticuerpo anti-TNF o variante especificada del mismo, que se puede usar para medir o lograr en una celula, tejido, organo o animal (incluyendo mamlferos y seres humanos), para diagnosticar, controlar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los slntomas de al menos una afeccion de TNF, seleccionada entre, pero sin limitation, al menos uno de un trastorno o enfermedad inmune, un trastorno o enfermedad cardiovascular, un trastorno o enfermedad infeccioso, maligno y/o neurologico.
Un metodo de este tipo puede comprender administrar una cantidad eficaz de una composition o una composition farmaceutica que comprenda al menos un anticuerpo anti-TNF a una celula, tejido, organo, animal o paciente que necesita tal modulation, tratamiento, alivio, prevention o reduction de slntomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede comprender una cantidad de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg por administration unica (por ejemplo, bolo), multiple o continua, o para conseguir una concentration en suero de 0,015000 mg/ml de concentracion en suero por administracion unica, multiple o continua, o cualquier intervalo o valor eficaz en el mismo, como se realiza y se determina usando metodos conocidos, como se ha descrito en este documento o como se conoce en las tecnicas pertinentes.
Citas
Todas las publicaciones o patentes citadas en este documento muestran el estado de la tecnica en el momento de la presente invencion y/o proporcionan description y posibilitacion de la presente invencion. Las publicaciones se refieren a cualquier publication cientlfica o de patente o cualquier otra information disponible en cualquier formato de medios, incluyendo todos los formatos grabados, electronicos o impresos. Las siguientes referencias se mencionan especlficamente: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Anticuerpos de la Presente Invencion
Al menos un anticuerpo anti-TNF de la presente invencion se puede producir opcionalmente mediante una llnea celular, una llnea celular mixta, una celula inmortalizada o poblacion clonal de celulas inmortalizadas, como se conoce en la tecnica. Vease, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al.,
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eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Los anticuerpos humanos que son especlficos para protelnas de TNF humanas o fragmentos de las mismas se puede generar frente a un antlgeno inmunogenico apropiado, tal como protelna aislada y/o de TNF o una parte de la misma (incluyendo moleculas sinteticas, tales como peptidos sinteticos). Otros anticuerpos especlficos o generales de mamlfero se pueden generar de forma similar. La preparacion de antlgenos inmunogenicos y produccion de anticuerpo monoclonal se puede realizar usando cualquier tecnica adecuada.
En un enfoque, se produce un hibridoma fusionando una llnea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una llnea celular de mieloma tal como, pero sin limitacion, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NaMAIWA, NEURO 2A o similares o heteromielomas, productos de fusion de los mismos o cualquier celula o celula de fusion obtenida de los mismos o cualquier llnea celular adecuada como se conoce en la tecnica. Vease, por ejemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com y similares, con celulas productoras de anticuerpo, tales como, pero sin limitacion, celulas de bazo, de sangre periferica, de ganglios linfaticos, de amlgdalas u otras celulas inmunes o que contienen celulas B aisladas o clonadas o cualquiera de otras celulas que expresan secuencias de cadena pesada o ligera constante o variable o flanqueante o CDR, como acido nucleico endogeno o heterologo, como ADN genomico, ADNc, ADNr, ADN mitocondrial o ARN recombinante o endogeno, viral, bacteriano, de algas, procariota, de anfibio, de insecto, de reptil, de pez, de mamlfero, de roedor, de equino, de ovino, de cabra, de oveja, de primate, eucariota, ADN o ARN de cloroplasto, ARNhn, ARNm, ARNt, de cadena unica, doble o triple, hibridado y similares o cualquier combinacion de los mismos. Vease, por ejemplo, Ausubel, mencionado anteriormente y Colligan, Inmunology, mencionado anteriormente, capltulo 2.
Tambien se pueden obtener celulas productoras de anticuerpos a partir de la sangre periferica o, preferiblemente el bazo o ganglios linfaticos, de seres humanos u otros animales adecuados que se han inmunizado con el antlgeno de interes. Tambien se puede usar cualquier otra celula huesped adecuada para expresar acido nucleico heterologo o endogeno que codifica un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, de la presente invention. Las celulas fusionadas (hibridomas) o celulas recombinantes se pueden aislar usando condiciones de cultivo selectivas u otros metodos conocidos adecuados y clonarse mediante dilution llmite o separacion celular u otros metodos conocidos. Las celulas que producen anticuerpos con la especificidad deseada se pueden seleccionar mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).
Se pueden usar otros metodos adecuados para producir o aislar anticuerpos de la especificidad necesaria, incluyendo, pero sin limitacion, metodos que seleccionan anticuerpo recombinante a partir de una biblioteca de peptidos o protelnas (por ejemplo, pero sin limitacion, una biblioteca de presentation de bacteriofago, ribosoma, oligonucleotido, ARN, ADNc o similares; por ejemplo, como las disponibles en Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, Alemania; Biovation, Aberdeen, Escocia, Reino Unido; Biolnvent, Lund, Suecia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Veanse, por ejemplo, los documentos EP 368684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260 (12/5/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT / MRC); WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PGT/US94/1234; W092/18619; WO96/07754; (Scripps), EP 614 989 (MorphoSys); WO95/16027 (Biolnvent); WO88/06630; WO90/3809 (Dyax); U.S. 4.704.692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; PE 371 998, EP 550 400, (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); o peptidos o protelnas generados de forma estocastica, los documentos US5723323, 5763192, 5814476, 5817483 , 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, ahora Applied Molecular Evolution (AME)) o que dependen de la inmunizacion de animales transgenicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93: 154-161 (1998), as! como patentes y solicitudes relacionadas) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se conoce en la tecnica y/o como se ha descrito en este documento. Tales tecnicas, incluyen, pero sin limitacion, presentacion en ribosoma (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Estados Unidos. 94: 4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Estados Unidos. 95: 14130-14135 (Nov. 1998)); tecnologlas de produccion de anticuerpo de celula unica (por ejemplo, metodo de anticuerpo de linfocito seleccionado (“SLAM”) (Patente de Estados Unidos N° 5.627.052, Wen et al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Estados Unidos. 93: 78437848 (1996)); microgotas de gel y citometrla de flujo (Powell et al., Biotechnol. 8: 333-337 (1990), One Cell Systems, Cambridge, MA, Gray et al, J. Imm. Meth. 182: 155-163 (1995); Kenny et al, Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); selection de celulas B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, Palses Bajos (1988).
Los metodos para modificar por ingenierla genetica o humanizar anticuerpos no humanos o humanos tambien se pueden usar y son bien conocidos en la tecnica. En general, un anticuerpo humanizado o modificado por ingenierla genetica tiene uno o mas restos de aminoacidos de una fuente que es no humana, por ejemplo, pero sin limitacion de raton, rata, conejo, primate no humano u otro mamlfero. Estos restos de aminoacidos humanos con frecuencia se denominan restos “importados”, que tlpicamente se toman a partir de una variable, constante u otro
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dominio “importado” de una secuencia humana conocida. Las secuencias de Ig humana conocidas se describen, por ejemplo, en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;
www.sciquest.com/; www.abcam.com/;
www.antibodyresource.com/online-comp.html;
www.public.iastate.edul-pedro/research tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html;
www.wh-freeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/lnunune/Antibody.html;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.acuk~mrc7/mikeimages.html;
www.aatibodyresource.com/; mcb.
harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html; www.immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;
www.bio- tech.ufl.edu/-hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html;
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;
www.rn.ehimeu.ac.jp/~yasuhitolElisa.html;www.biodesign.com/table.asp;
www.icnet.uk/facs/davies/links.html; www.biotech./ufl.edu/~fccl/protocol.html;www.isac-net.org/sites_geo.html;aximt1.imt.uni- marburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraatsl/inks1.html;
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uklimt-doc/public/INTRO.html;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;
www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst./bbk.ac.uk/-ubcg07s;
www.nimr.mrc.ac.uk/CCccaewg/ccaewg.htm;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;
www.biosci.missouri.edu/smithgp/ index.html;
www./cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html;
www.jerini.de/fr_products.htm;
www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. Health (1983).
Tales secuencias importadas se pueden usar para reducir la inmunogenicidad o para reducir, mejorar o modificar la union, afinidad, asociacion, disociacion, avidez, especificidad, semivida o cualquier otra caracterlstica adecuada, como se conoce en la tecnica. Generalmente, parte o todas las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes se reemplazan con aminoacidos humanos u otros aminoacidos. Opcionalmente, los anticuerpos tambien se pueden humanizar con retencion de la afinidad alta por el antlgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos humanizados se pueden preparar opcionalmente mediante un proceso de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales estan disponibles comunmente y son familiares para los especialistas en la tecnica. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y presentan estructuras de conformacion tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antlgeno. De esta manera, se pueden seleccionar restos de FR y combinarse a partir de las secuencias de consenso y de importacion de forma que se consiga la caracterlstica de anticuerpo deseada, tal como la afinidad aumentada por el antlgeno o los antlgenos diana. En general, los restos de cDr estan directamente y mas sustancialmente implicados en la influencia de la union a antlgeno. La humanizacion o modificacion por ingenierla genetica de anticuerpos de la presente invencion se puede realizar usando cualquier metodo conocido, tal como, pero sin limitacion los descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), Patentes de Estados Unidos N° 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, los documentos PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, incluidas las referencias citadas en los mimos.
El anticuerpo anti-TNF tambien se puede generar opcionalmente inmunizando un animal transgenico (por ejemplo, raton, rata, hamster, primate no humano y similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se ha descrito en este documento y/o como se conoce en la tecnica. Las celulas que producen un anticuerpo anti-TNF humano se pueden aislar a partir de tales animales e inmortalizarse usando metodos adecuados, tales como los metodos descritos en este documento.
Se pueden producir ratones transgenicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos que se unan a antlgenos humanos mediante metodos conocidos (por ejemplo, pero sin limitacion, las Patentes de Estados Unidos N° 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 y 5.789.650 expedida a Lonberg et al.; Jakobovits et al., el documento WO 98/50433, Jakobovits et al., el documento WO 98/24893, Lonberg et al., el documento WO 98/24884, Lonberg et al., el documento WO 97/13852, Lonberg et al., el documento WO 94/25585 , Kucherlapate et al., el documento WO 96/34096, Kucherlapate et al., el documento EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al., el documento EP 0710 719 Al, Surani et al., Patente de Estados Unidos N° 5.545.807, Bruggemann et al., el documento WO 90/04036, Bruggemann et al., el documento EP 0438 474 B1, Lonberg et al., el documento EP 0814 259 A2, Lonberg et al., el documento GB 2 272 440 A, Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6 (4) 579-591 (1.994), Green et al, Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci Estados Unidos. 90 (8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13 (1): 65-93 (1995) y Fishwald et al., Nat
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Biotechnol 14 (7): 845-851 (1996). En general, estos ratones comprenden al menos un transgen que comprende ADN de al menos un locus de inmunoglobulina humana que se transpone funcionalmente o que puede experimentar transposicion funcional. Los loci de inmunoglobulina endogenos en tales ratones se pueden alterar o suprimir para eliminar la capacidad del animal de producir anticuerpos codificados por genes endogenos.
La seleccion de anticuerpos para union especlfica a protelnas o fragmentos similares se puede conseguir de manera practica usando bibliotecas de presentacion de peptidos. Este metodo implica la exploracion de grandes colecciones de peptidos para miembros individuales que tengan la funcion o estructura deseada. La seleccion de anticuerpos de bibliotecas de presentacion de peptido se conoce bien en la tecnica. Las secuencias de peptidos presentadas pueden tener de 3 a 5000 o mas aminoacidos de longitud, frecuentemente de 5-100 aminoacidos de longitud y con frecuencia de aproximadamente 8 a 25 aminoacidos de longitud. Ademas de los metodos de slntesis qulmica directos para generar bibliotecas de peptidos, se han descrito varios metodos de ADN recombinante. Un tipo implica la presentacion de una secuencia de peptidos en la superficie de un bacteriofago o celula. Cada bacteriofago o celula contiene la secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de peptidos presentada particular. Tales metodos se describen en las Publicaciones de Patente PCT N° 91/17271, 91/18980, 91/19818 y 93/08278. Otros sistemas para generar bibliotecas de peptidos tienen aspectos tanto de slntesis qulmica in vitro como de metodos recombinantes. Veanse, las Publicaciones de Patente pCt N° 92/05258, 92/14843 y 96/19256. Veanse tambien, las Patentes de Estados Unidos N° 5.658.754 y 5.643.768. Las bibliotecas de presentacion de peptido, vectores y kits de exploracion estan disponibles en el mercado a partir de proveedores tales como Invitrogen (Carlsbad, CA) y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, cedidas a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, cedidas a Dyax, 5427908, 5580717, cedidas a Affymax, 5885793, cedida a Cambridge Antibody Technologies; 5750373, cedida a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, cedida a Xoma, Colligan, mencionado anteriormente; Ausubel, mencionado anteriormente o Sambrook, mencionado anteriormente.
Los anticuerpos de la presente invention tambien se pueden preparar usando al menos un acido nucleico que codifica anticuerpo anti-TNF para proporcionar animales o mamlferos transgenicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas y similares, que producen tales anticuerpos en su leche. Tales animales se pueden proporcionar usando metodos conocidos. Veanse, por ejemplo, pero sin limitation, las patentes de Estados Unidos N° 5.827.690, 5.849.992, 4.873.316, 5.849.992, 5.994.616, 5.565.362, 5.304.489 y similares.
Los anticuerpos de la presente invencion se pueden preparar adicionalmente usando al menos un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-TNF para proporcionar plantas y celulas de plantas cultivadas transgenicas (por ejemplo, pero sin limitacion tabaco y malz) que producen tales anticuerpos, partes especificadas o variantes en las partes de planta o celulas cultivadas a partir de las mismas. Como un ejemplo no limitante, las hojas de tabaco transgenicas que expresan protelnas recombinantes se han usado de forma satisfactoria para proporcionar grandes cantidades de protelnas recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. Vease, por ejemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) y referencias citadas en el mismo. Tambien, se ha usado malz transgenico para expresar protelnas de mamlfero a niveles de production comerciales, con actividades biologicas equivalentes a las que se producen en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Vease, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) y referencias citadas en el mismo. Tambien se han producido anticuerpos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgenicas incluyendo fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos de cadena unica (scFv), incluyendo semillas de tabaco y tuberculos de patata. Vease, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) y referencia citada en el mismo. Por tanto, los anticuerpos de la presente invencion tambien se pueden producir usando plantas transgenicas, de acuerdo con metodos conocidos. Veanse tambien, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (Oct, 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 (1994) y referencias citadas en las mismas.
Los anticuerpos de la invencion se pueden unir a TNF humano con un amplio intervalo de afinidades (KD). En una realization preferida, al menos un mAb humano de la presente invencion se puede unir opcionalmente a TNF humano con afinidad alta. Por ejemplo, un mAb humano se puede unir a TNF humano con una Kd igual o menor de aproximadamente 10-7 M, tal como, pero sin limitacion 0,1-9,9 (o cualquier intervalo o valor dentro del mismo) X 10-7,
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10, 10, 10 , 10 , 10, 10 o cualquier intervalo o valor dentro de los mismos.
La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antlgeno se puede determinar experimentalmente usando cualquier metodo adecuado. (Vease, por ejemplo, Berzofsky, et al., “Antibody-Antigen Interactions,” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992); y metodos descritos en los mismos). La afinidad medida de una interaction anticuerpo-antlgeno particular puede variar si se mide en condiciones diferentes (por ejemplo, concentration de sal y pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parametros de union a antlgeno (por ejemplo, K0 Ka, Kd) preferiblemente se realizan con soluciones normalizadas de anticuerpo y antlgeno y un tampon normalizado, tal como el tampon descrito en este documento.
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Moleculas de Acido Nucleico
Usando una informacion proporcionada en este documento, una molecula de acido nucleico de la presente invention que codifica al menos un anticuerpo anti-TNF se puede obtener usando metodos descritos en este documento o como se conoce en la tecnica.
Las moleculas de acido nucleico de la presente invencion pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNhn, ARNt o cualquier otra forma o en forma de ADN, incluyendo pero sin limitation, ADNc y ADN genomico obtenido mediante donation o producido sinteticamente o cualquier combination de los mismos. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario o cualquier combinacion de las mismas. Cualquier parte de al menos una hebra del ADN o ARN puede ser la hebra codificante, tambien conocida como la hebra sentido o la misma puede ser la hebra no codificante, tambien denominada la hebra antisentido.
Las moleculas de acido nucleico aisladas descritas en este documento incluyen moleculas de acido nucleico que comprenden una fase de lectura abierta (ORF), opcionalmente con uno o mas intrones, por ejemplo, pero sin limitacion, al menos una parte especificada de al menos una CDR, como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de al menos una cadena pesada (por ejemplo, SEC ID N°: 1-3) o cadena ligera (por ejemplo, SEC ID N°: 4-6); moleculas de acido nucleico que comprenden la secuencia codificante de un anticuerpo anti-TNF o region variable (por ejemplo, SEC ID N°: 7 y 8) y moleculas de acido nucleico que comprenden una secuencia de nucleotidos sustancialmente diferente de las que se han descrito anteriormente pero la cual, debido a la degeneracion del codigo genetico, todavla codifica al menos un anticuerpo anti-TNF como se ha descrito en este documento y/o como se conoce en la tecnica. Por supuesto, el codigo genetico se conoce bien en la tecnica. Por tanto, sera de rutina para un especialista en la tecnica la generation de tales variantes de acido nucleico degeneradas que codifiquen anticuerpos anti-TNF especlficos de la presente invencion. Vease, por ejemplo, Ausubel, et al., mencionado anteriormente. Los ejemplo no limitantes de moleculas de acido nucleico aisladas incluyen SEC ID N°: 10, 11, 12, 13, 14 y 15, correspondientes a ejemplos no limitantes de un acido nucleico que codifica, respectivamente, HC de CDR1, HC de CDR2, HC de CDR3, LC de CDR1, LC de CDR2 y LC de CDR3.
Como se ha indicado en este documento, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion que comprenden un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-TNF pueden incluir, aunque sin limitacion, las que codifican la secuencia de aminoacidos de un fragmento de anticuerpo, por si mismo; la secuencia codificante para el anticuerpo completo o una parte del mismo; la secuencia codificante para un anticuerpo, fragmento o parte, as! como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos un peptido senal llder o de fusion, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, tales como al menos un intron, junto con secuencias no codificantes adicionales, incluyendo pero sin limitacion, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas no traducidas que juegan un papel en la transcription, procesamiento de ARNm, incluyendo senales de corte y empalme y de poliadenilacion (por ejemplo, union a ribosoma y estabilidad de ARNm); una secuencia codificante adicional de codifica aminoacidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Por tanto, la secuencia que codifica un anticuerpo se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un peptido que facilita la purification del anticuerpo fusionado que comprende un fragmento o parte de anticuerpo.
Construccion de Acidos Nucleicos
Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion se pueden preparar usando (a) metodos recombinantes, (b) tecnicas sinteticas, (c) tecnicas de purificacion o combinaciones de las mismas, como se conoce bien en la tecnica.
Los acidos nucleicos pueden comprender de forma practica secuencias ademas de un polinucleotido de la presente invencion. Por ejemplo, un sitio de multi-donation que comprenda uno o mas sitios de restriction de endonucleasa se puede insertar en el acido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleotido. Tambien, se pueden insertar secuencias traducibles para ayudar en el aislamiento del polinucleotido traducido de la presente invencion. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las protelnas de la presente invencion. El acido nucleico de la presente invencion, excluyendo la secuencia codificante, es opcionalmente un vector, un adaptador o enlazador para clonacion y/o expresion de un polinucleotido de la presente invencion.
Se pueden anadir secuencias adicionales a tales secuencias de clonacion y/o expresion para optimizar su funcion en la clonacion y/o expresion, para ayudar en el aislamiento del polinucleotido o para mejorar la introduction del polinucleotido en una celula. El uso de vectores de clonacion, vectores de expresion, adaptadores y enlazadores se conoce bien en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Ausubel, mencionado anteriormente, o Sambrook, mencionado anteriormente).
Metodos Recombinantes para Construccion de Acidos Nucleicos.
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Las composiciones de acido nucleico aislado de esta invention, tales como ARN, ADNc, ADN genomico o cualquier combination de los mismos, se puede obtener a partir de fuentes biologicas usando cualquier numero de metodologlas de donation conocidas por los especialistas en la tecnica. En algunas realizaciones, se usan sondas de oligonucleotidos que hibridan selectivamente, en condiciones rigurosas, a los polinucleotidos de la presente invencion para identificar la secuencia deseada en una biblioteca de ADNc o ADN genomico. Los especialistas en la tecnica conocen el aislamiento de ARN y construction de ADNc y bibliotecas genomicas. (Vease, por ejemplo, Ausubel, mencionado anteriormente, o Sambrook, mencionado anteriormente).
Metodos de Seleccion y/o Aislamiento de Acido Nucleico.
Un ADNc o una biblioteca genomica se puede explorar usando una sonda basandose en la secuencia de un polinucleotido de la presente invencion, tales como las que se describen en este documento. Se pueden usar sondas para hibridar con secuencias de ADN genomico o ADNc para aislar genes homologos en organismos iguales o diferentes. Los especialistas en la tecnica apreciaran que se pueden emplear diversos grados de rigurosidad de hibridacion en el ensayo; y la hibridacion o el medio de lavado pueden ser rigurosos. A medida que las condiciones de hibridacion se hacen mas rigurosas, tiene que haber un grado mayor de complementariedad entre la sonda y la diana para que ocurra la formation de duplex. El grado de rigurosidad se puede controlar por uno o mas entre temperatura, fuerza ionica, pH y la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida. Por ejemplo, la rigurosidad de hibridacion se varla de forma practica cambiando la polaridad de la solution reactante a traves de, por ejemplo, manipulation de la concentration de formamida dentro del intervalo del 0% al 50%. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) necesario para la union detectable variara de acuerdo con la rigurosidad del medio de hibridacion y/o el medio de lavado. El grado de complementariedad sera optimamente del 100% o del 70-100% o cualquier intervalo o valor dentro de los mismos. Sin embargo, se debe apreciar que las variaciones de secuencia menores en las sondas y cebadores se pueden compensar reduciendo la rigurosidad del medio de hibridacion y/o de lavado.
Los metodos de amplificacion de ARN o ADN se conocen bien en la tecnica y se puede usar de acuerdo con la presente invencion sin experimentacion excesiva, basandose en los contenidos y la directriz presentada en este documento.
Los metodos conocidos de amplification de ADN o ARN incluyen, pero sin limitation, reaction en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificacion relacionados (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, de Mullis, et al.; 4.795.699 y 4.921.794 de Tabor, et al; 5.142.033 de Innis, 5.122.464 de Wilson, et al.; 5.091.310 de Innis, 5.066.584 de Gyllensten, et al; 4.889.818 de Gelfand, et al; 4.994.370 de Silver, et al; 4.766.067 de Biswas; 4.656.134 de Ringold) y amplificacion mediada por ARN que usa ARN antisentido para dirigir la secuencia como un molde para slntesis de ADN bicatenario (Patente de Estados Unidos N° 5.130.238 de Malek, et al, con la marca comercial NASBA). (Vease, por ejemplo, Ausubel, mencionado anteriormente o Sambrook, mencionado anteriormente.).
Por ejemplo, se puede usar tecnologla de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleotidos de la presente invencion y genes relacionados directamente a partir de bibliotecas de ADN genomico o ADNc. Tambien pueden ser utiles PCR y otros metodos de amplificacion in vitro, por ejemplo, para clonar secuencias de acido nucleico que codifiquen protelnas que se tienen que expresar, para preparar acidos nucleicos para uso como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciacion de acido nucleico o con otros propositos. Los ejemplos de tecnicas suficientes para dirigir a especialistas a traves de metodos de amplificacion in vitro se encuentran en Berger, mencionado anteriormente, Sambrook, mencionado anteriormente y Ausubel, mencionado anteriormente, as! como Mullis, et al., Patente de Estados Unidos N° 4.683.202 (1987) e Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990). En la tecnica se conocen kits disponibles en el mercado para amplificacion por PCR genomica. Vease, por ejemplo, Kit Advantage-GC Genomic PCR (Clontech). Adicionalmente, se puede usar, por ejemplo, la protelna 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de PCR largos.
Metodos Sinteticos para Construccion de Acidos Nucleicos
Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion tambien se pueden preparar mediante slntesis qulmica directa mediante metodos conocidos (vease, por ejemplo, Ausubel, et al., mencionado anteriormente). La slntesis qulmica generalmente produce un oligonucleotido monocatenario, que se puede convertir en ADN bicatenario mediante hibridacion con una secuencia complementaria o mediante polimerizacion con una ADN polimerasa usando la hebra unica como un molde. Un especialista en la tecnica reconocera que mientras la slntesis qulmica de ADN puede limitarse a secuencias de aproximadamente 100 o mas bases, se pueden obtener secuencias mas largas mediante el ligamiento de secuencias mas cortas.
Casetes para la Expresion Recombinante
La presente invencion proporciona ademas casetes para la expresion recombinante que comprenden un
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acido nucleico de la presente invencion. Una secuencia de acido nucleico de la presente invention, por ejemplo un ADNc o una secuencia genomica que codifica un anticuerpo de la presente invencion, se puede usar para construir un casete para la expresion recombinante que se puede introducir en al menos una celula huesped deseada. Un casete para la expresion recombinante tlpicamente comprendera un polinucleotido de la presente invencion unido operativamente a secuencias reguladoras de inicio de la transcription que dirigiran la transcription del polinucleotido en la celula huesped pretendida. Se pueden emplear promotores tanto heterologos como no heterologos (es decir, endogenos) para dirigir la expresion de acidos nucleicos de la presente invencion.
En algunas realizaciones, los acidos nucleicos aislados que sirven como promotores, potenciadores u otros elementos se pueden introducir en la position apropiada (cadena arriba, cadena abajo o en intron) de una forma no heterologa de un polinucleotido de la presente invencion de forma de regular positivamente o negativamente la expresion de un polinucleotido de la presente invencion. Por ejemplo, se pueden alterar promotores endogenos in vivo o in vitro mediante mutation, supresion y/o sustitucion.
Vectores y Celulas Huesped
La presente invencion tambien se refiere a vectores que incluyen moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion, celulas huesped que se modifican por ingenierla genetica con los vectores recombinantes y la production de al menos un anticuerpo anti-TNF mediante tecnicas recombinantes, como se conoce bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al., mencionado anteriormente y Ausubel, et al., mencionado anteriormente.
Los polinucleotidos se pueden unir opcionalmente a un vector que contiene un marcador seleccionable para propagation en un hospedador. En general, se introduce un vector plasmldico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato calcico o en un complejo con un llpido cargado. Si el vector es un virus, el mismo se puede empaquetar in vitro usando una llnea celular de empaquetamiento apropiada y despues transducirse a celulas huesped.
El inserto de ADN se debe unir operativamente a un promotor apropiado. Las construcciones de expresion contendran adicionalmente sitios para inicio y termination de transcripcion y, en la region transcrita, un sitio de union a ribosoma para traduction. La parte codificante de las transcritos maduros expresada por las construcciones preferiblemente incluira un inicio de traduccion en el comienzo y un codon de terminacion (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente en el extremo del ARNm que se tiene que traducir, prefiriendose UAA y UAG para expresion en celulas de mamlfero o eucariotas.
Los vectores de expresion preferiblemente pero opcionalmente incluiran al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, aunque sin limitation, resistencia a metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, Patentes de Estados Unidos N° 4.399.216, 4.634.665, 4.656.134, 4.956.288, 5.149.636, 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), acido micofenolico o glutamina sintetasa (GS, Patente de Estados Unidos N° 5.122.464, 5.770.359, 5.827.739) para cultivo de celulas eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias o procariotas. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las celulas huesped descritas anteriormente se conocen en la tecnica. Los vectores adecuados seran facilmente evidentes para los especialistas en la tecnica. La introduction de una construction de vector en una celula huesped se puede lograr mediante transfection con fosfato calcico, transfection mediada por DEAE-dextrano, transfection mediada por llpido cationico, electroporation, transduction, infection u otros metodos conocidos. Tales metodos se describen en la tecnica, tal como en Sambrook, mencionado anteriormente, capltulos 1-4 y 16-18; Ausubel, mencionado anteriormente, capltulos 1, 9, 13, 15 y 16.
Al menos un anticuerpo de la presente invencion se puede expresar en una forma modificada, tal como una protelna de fusion y puede incluir no solo senales de secretion, sino tambien regiones funcionales heterologas adicionales. Por ejemplo, una region de aminoacidos adicionales, particularmente aminoacidos cargados, se puede anadir al extremo N de un anticuerpo para mejorar la estabilidad y persistencia en la celula huesped, durante purification o durante manejo y almacenamiento posterior. Tambien, se pueden anadir restos peptldicos a un anticuerpo de la presente invencion para facilitar la purificacion. Tales regiones se pueden retirar antes de una preparation final de un anticuerpo o al menos un fragmento del mismo. Tales metodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, mencionado anteriormente, capltulos 17.29-17.42 y 18,1 -18,74; Ausubel, mencionado anteriormente, capltulos 16, 17 y 18.
Los especialistas en la tecnica tienen conocimiento de numerosos sistemas de expresion disponibles para expresion de un acido nucleico que codifica una protelna de la presente invencion.
Como alternativa, los acidos nucleicos de la presente invencion se pueden expresar en una celula huesped mediante activation (por manipulation) en una celula huesped que contiene ADN endogeno que codifica un anticuerpo de la presente invencion. Tales metodos se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 y 5.733.761.
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Las celulas de mamlfero son ilustrativas de cultivos celulares utiles para la production de los anticuerpos, partes especificadas o variantes de los mismos. Los sistemas de celulas de mamlfero con frecuencia estaran en forma de monocapas de celulas, aunque tambien se pueden usar suspensiones o biorreactores de celulas de mamlferos. En la tecnica se han desarrollado varias llneas celulares huesped adecuadas capaces de expresar protelnas glicosiladas intactas e incluyen las llneas de celulas COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26) celulas CoS-7, celulas CHO, celulas hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0- Ag14, celulas 293, celulas HeLa y similares, que estan facilmente disponibles en, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA (
www.atcc.org). Las celulas huesped preferidas incluyen celulas de origen linfoide, tales como celulas de mieloma y de linfoma. Las celulas huesped particularmente preferidas son las celulas P3X63Ag8.653 (Numero de Acceso de ATCC CRL-1580) y celulas SP2/0-Ag14 (Numero de Acceso de ATCC CRL- 1851). En una realization particularmente preferida, la celula recombinante es una celula P3X63Ag8.653 o una celula SP2/0-Ag14.
Los vectores de expresion de estas celulas pueden incluir una o mas de las siguientes secuencias de control de expresion, tales como, pero sin limitation, un origen de replication; un promotor (por ejemplo, promotores tardlo o temprano de SV40, el promotor de CMV (Patentes de Estados Unidos N° 5.168.062 y 5.385.839), un promotor tk de HSV, un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa), un promotor EF-1 alfa (Patente de Estados Unidos N° 5.266.491), al menos un promotor de inmunoglobulina humana, un potenciador y/o sitios de information de procesamiento, tales como sitios de union de ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilacion (por ejemplo, un sitio de adicion de poli A de Ag T grande de SV40) y secuencias de termination de transcription. Vease, por ejemplo, Ausubel et al., mencionado anteriormente y Sambrook, et al., mencionado anteriormente. Otras celulas utiles para la produccion de acidos nucleicos o protelnas de la presente invention se conocen y/o estan disponibles, por ejemplo, en el Catalogo de Llneas Celulares e Hibridomas de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (
www.atcc.org) u otras fuentes comerciales o conocidas.
Cuando se emplean celulas huesped eucariotas, tlpicamente se incorporan en el vector secuencias de poliadenilacion o de terminacion de transcripcion. Un ejemplo de una secuencia de terminacion es la secuencia de poliadenilacion del gen de hormona de crecimiento bovina. Las secuencias para corte y empalme preciso del transcrito tambien se pueden incluir. Un ejemplo de una secuencia de corte y empalme es el intron VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Adicionalmente, se pueden incorporar en el vector secuencias genicas para controlar la replicacion en la celula huesped, como se conoce en la tecnica.
Purificacion de un Anticuerpo
Un anticuerpo anti-TNF se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante metodos bien conocidos, incluyendo pero sin limitacion, purificacion de protelna A, precipitation de sulfato de amonio o de etanol, extraction acida, cromatografla de intercambio anionico o cationico, cromatografla en fosfocelulosa, cromatografla de interaction hidrofoba, cromatografla de afinidad, cromatografla de hidroxiapatita y cromatografla de lectina. Tambien se puede emplear la cromatografla llquida de alto rendimiento (“HPLC”) para purificacion. Vease, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ny, NY, (1997-2001), por ejemplo, capltulos 1, 4, 6, 8, 9 y 10.
Los anticuerpos de la presente invencion incluyen productos purificados de forma natural, productos de procedimientos de slntesis qulmica y productos producidos mediante tecnicas recombinantes a partir de un hospedador eucariota, incluyendo, por ejemplo, celulas de levadura, de plantas superiores de insecto y de mamlfero. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de produccion recombinante, el anticuerpo de la presente invencion se puede ser glicosilado o puede ser no glicosilado, prefiriendose glicosilado. Tales metodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, mencionado anteriormente, Secciones 17.37-17.42; Ausubel, mencionado anteriormente, capltulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, mencionado anteriormente, capltulos 12-14.
Anticuerpos Anti-TNF
Los anticuerpos aislados de la presente invencion comprenden la secuencia de aminoacidos de anticuerpo especlfica mencionada en las reivindicaciones adjuntas codificada por cualquier polinucleotido adecuado o cualquier anticuerpo aislado o preparado. Preferiblemente, el anticuerpo humano se une a TNF humano y, de ese modo, neutraliza parcialmente o sustancialmente al menos una actividad biologica de la protelna. Un anticuerpo que neutraliza sustancialmente, parcialmente o preferiblemente al menos una actividad biologica de al menos una protelna o fragmento de TNF se puede unir a la protelna o fragmento e inhibir, de ese modo, actividades mediadas a traves de la union de TNF al receptor de TNF o a traves de otros mecanismos dependientes o mediados por TNF. Como se usa en este documento, la expresion “anticuerpo neutralizante” se refiere a un anticuerpo que puede inhibir una actividad dependiente de TNF en aproximadamente el 20-120%, preferiblemente en al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, el 100% o mas dependiendo del
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ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-TNF para inhibir una actividad dependiente de TNF se evalua preferiblemente mediante al menos un ensayo de proteina o receptor de TNF adecuado, como se describe en este documento y/o como se conoce en la tecnica. Un anticuerpo humano de la invencion puede ser de cualquier clase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) o isotipo y puede comprender una cadena ligera kappa o lambda. En una realizacion, el anticuerpo humano comprende una cadena pesada de IgG o fragmento definido, por ejemplo, al menos uno de los isotipos, lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4. Los anticuerpos de este tipo se pueden preparar empleando un raton transgenico u otro mamifero no humano transgenico que comprenda al menos un transgen de cadena ligera humana (por ejemplo, IgG, IgA e IgM (por ejemplo, g1, g2, g3 y g4) como se ha descrito en este documento y/o como se conoce en la tecnica. En otra realizacion, el anticuerpo humano anti-TNF humano comprende una cadena pesada de lgG1 y una cadena ligera de lgG1.
Al menos un anticuerpo de la invencion se une al menos un epitopo especificado, especifico para al menos una proteina, subunidad, fragmento, parte de TNF o cualquier combinacion de las mismas. El al menos un epitopo puede comprender al menos una region de union a anticuerpo que comprende al menos una parte de dicha proteina, epitopo que preferiblemente esta comprendido de al menos una parte extracelular, soluble, hidrofila, externa o citoplasmatica de dicha proteina. El al menos un epitopo especificado puede comprender cualquier combinacion de al menos una secuencia de aminoacidos de al menos 1-3 aminoacidos para la parte especificada entera de aminoacidos contiguos de la SEC ID N° 9.
El anticuerpo o fragmento que enlaza con el antigeno de la presente invencion es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que enlaza con el antigeno del mismo que tiene tres CDRs de la cadena pesada y tres CDRs de la cadena ligera, en donde las tres CDRs de la cadena pesada tienen la secuencia de aminoacidos de las CDRs correspondientes de mAb de TNV148 como se ha descrito en la Figura 4; las tres CDRS de la cadena ligera tienen la secuencia de aminoacidos de CDRs correspondientes mAb de TNV148 como se ha descrito en la Figura 5; y el anticuerpo o fragmento enlaza con TNF humano con una Kd igual o menor de 0,1-9,9 x 10-11 M. Tales anticuerpos se pueden preparar uniendo quimicamente las diversas partes (por ejemplo, CDR, flanco) del anticuerpo usando tecnicas convencionales, preparando y expresando una (es decir, una o mas) molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo usando tecnicas convencionales de tecnologia de ADN recombinante o usando cualquier otro metodo adecuado.
El anticuerpo anti-TNF puede comprender las regiones variables de cadena pesada y ligera de un mAb de TNV148 y mAb de TNV148B como se ha descrito en las Figuras 4 y 5. Los anticuerpos que se unen al TNF humano y que comprenden una region variable de cadena pesada o ligera se pueden preparar usando metodos adecuados, tales como presentacion en fago (Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1 (5): 863-868 (1998)) o metodos que emplean animales transgenicos, como se conoce en la tecnica y/o se ha descrito en este documento. Por ejemplo, un raton transgenico, que comprende un transgen de cadena pesada de inmunoglobulina humana reordenado funcionalmente y un transgen que comprende ADN de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana que puede experimentar reordenamiento funcional, se puede inmunizar con TNF humano o un fragmento del mismo para provocar la produccion de anticuerpos. Si se desea, las celulas productoras de anticuerpos se pueden aislar y se pueden preparar hibridomas u otras celulas productoras de anticuerpo inmortalizadas como se ha descrito en este documento y/o como se conoce en la tecnica. Como alternativa, el anticuerpo, parte especificada o variante se puede expresar usando el acido nucleico codificante o parte del mismo en una celula huesped adecuada.
Una sustitucion de aminoacido conservativa se refiere al reemplazo de un primer aminoacido por un segundo aminoacido que tiene propiedades quimicas y/o fisicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad) que son similares a las del primer aminoacido. Las sustituciones conservativas incluyen reemplazo de un aminoacido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cisteina (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.
Codigos de Amino Acidos
Los aminoacidos que forman los anticuerpos anti-TNF de la presente invencion con frecuencia se abrevian. Las denominaciones de aminoacidos se pueden indicar designando el aminoacido por su codigo de letra unica, su codigo de tres letras, nombre, o el codon o codones de tres nucleotidos como se aprecia en la tecnica (vease Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Tercera Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994):
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CODIGO DE LETRA UNICA
CODIGO DE TRES LETRAS NOMBRE CODON O CODONES DE TRES nucleOtidos
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Ala Alanina GCA, GCC, GCG, GCU
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Cys Cistelna UGC, UGU
D
Asp Acido aspartico GAC, GAU
E
Glu Acido Glutamico GAA, GAG
F
Phe Fenilalanina UUC, UUU
G
Gly Glicina GGA, GGC, GGG, GGU
H
His Histidina CAC, CAU
I
Ile Isoleucina AUA, AUC, AUU
K
Lys Lisina AAA, AAG
L
Leu Leucina UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M
Met Metionina AUG
N
Asn Asparagina AAC, AAU
P
Pro Prolina CCA, CCC, CCG, CCU
Q
Gln Glutamina CAA, CAG
R
Arg Arginina AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S
Ser Serina AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T
Thr Treonina ACA, ACC, ACG, ACU
V
Val Valina GUA, GUC, GUG, GUU
W
Trp Triptofano UGG
Y
Tyr Tirosina UAC, UAU
Un anticuerpo anti-TNF de la presente invention puede incluir una o mas sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos, a partir de mutaciones naturales o de manipulation humana, como se especifica en este documento.
Por supuesto, el numero de sustituciones de aminoacidos que un especialista realizarla depende de muchos factores, incluyendo los que se han descrito anteriormente. De forma general, el numero de sustituciones, inserciones o supresiones de aminoacidos para cualquier anticuerpo anti-TNF fragmento o variante dado, no sera de mas de 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tales como 1-30 o cualquier intervalo o valor dentro del mismo, como se especifica en este documento.
Los aminoacidos en un anticuerpo anti-TNF de la presente invencion que son esenciales para funcion se pueden identificar mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida o mutagenesis mediante alanina (por ejemplo, Ausubel, mencionado anteriormente, capltulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). El ultimo procedimiento introduce una mutation de alanina unica en cada resto en la molecula. Las moleculas mutantes resultantes despues se ensayan para determinar la actividad biologica, tal como, pero sin limitation, al menos una actividad neutralizante de TNF. Los sitios que son crlticos para union a anticuerpo tambien se pueden identificar mediante analisis estructural tal como cristalizacion, resonancia magnetica nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) y de Vos, et al., Science 255: 306-312 (1992)).
Como lo apreciaran los especialistas, la presente invencion incluye al menos un anticuerpo biologicamente activo de la presente invencion. Los anticuerpos biologicamente activos tienen una actividad especifica de al menos el 20%, el 30% o el 40% y preferiblemente al menos el 50%, el 60% o el 70% y mas preferiblemente al menos el 80%, el 90% o el 95% -1000% de la del anticuerpo endogeno o relacionado conocido nativo (no sintetico). Los metodos para ensayar y cuantificar mediciones de actividad enzimatica y especificidad de sustrato, son bien
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conocidos por los especialistas en la tecnica.
En otro aspecto, la invencion se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos que enlazan con el antlgeno, como se describe en este documento, que se modifican mediante la union covalente de un resto organico. Tal modificacion puede producir un anticuerpo o fragmento que enlaza con el antlgeno con propiedades farmacocineticas mejoradas (por ejemplo, semivida en suero in vivo aumentada). El resto organico puede ser un grupo polimerico hidrofilo lineal o ramificado, un grupo de acido graso o un grupo de ester de acido graso. En realizaciones particulares, el grupo polimerico hidrofilo puede tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120.000 Dalton y puede ser un polialcano glicol (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), propilenglicol (PPG)), pollmero de carbohidrato, pollmero de aminoacido o polivinil pirrolidona y el grupo de acido graso o de ester de acido graso puede comprender de aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta atomos de carbono.
Los anticuerpos y fragmentos que enlazan con el antlgeno modificados de la invencion pueden comprender uno o mas restos organicos que esten unidos covalentemente, directamente o indirectamente, al anticuerpo. Cada resto organico que esta unido a un anticuerpo de la invencion puede ser independientemente un grupo polimerico hidrofilo, un grupo de acido graso o un grupo de ester de acido graso. Como se usa en este documento, la expresion “acido graso” abarca acidos mono carboxllicos y acidos dicarboxllicos. Un “grupo polimerico hidrofilo”, como se usa la expresion en este documento, se refiere a un pollmero organico que es mas soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polilisina es mas soluble en agua que en octano. Por tanto, un anticuerpo modificado mediante la union covalente de polilisina esta abarcado por la invencion. Los pollmeros hidrofilos adecuados para modificar anticuerpos de la invencion pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcano glicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y similares), carbohidratos (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacaridos, polisacaridos y similares), pollmeros de aminoacidos hidrofilos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y similares), oxidos de polialcano (por ejemplo, oxido de polietileno, oxido de propileno y similares) y polivinil pirrolidona. Preferiblemente, el pollmero hidrofilo que modifica el anticuerpo de la invencion tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150.000 Dalton como una entidad molecular separada. Por ejemplo, se pueden usar PEG50oo y PEG20.000, en los que el sublndice es el peso molecular promedio del pollmero en Dalton. El grupo polimerico hidrofilo se puede sustituir con uno a aproximadamente seis grupos alquilo, de acido graso o de ester de acido graso. Los pollmeros hidrofilos que se sustituyen con un grupo de acido graso o de ester de acido graso se pueden preparar empleando metodos adecuados. Por ejemplo, un pollmero que comprende un grupo amina se puede acoplar a un carboxilato del acido graso o del ester de acido graso y un carboxilato activado (por ejemplo, activado con N,N-carbonil diimidazol) en un acido graso o ester de acido graso se puede acoplar a un grupo hidroxilo en un pollmero.
Los acidos grasos y esteres de acidos grasos adecuados para modificar anticuerpos de la invencion se pueden saturar o pueden contener una o mas unidades de insaturacion. Los acidos grasos que son adecuados para modificar anticuerpos de la invencion incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), N-tetradecanoato (C14, miristato), N-octadecanoato (C18, estearato), N-eicosanoato (C20, araquidato), N-docosanoato (C22, behenato), N- triacontanoato (C30), N-tetracontanoato (C40), cis-A9-octadecanoato (C18, oleato), todos cis-A5, 8, 11 ,14- eicosatetraenoato (C20 araquidonato), acido octanedioico, acido tetradecanodioico, acido octadecanodioico, acido docosanodioico y similares. Los esteres de acidos grasos adecuados incluyen mono-esteres de acidos dicarboxllicos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferiblemente uno a aproximadamente seis, atomos de carbono.
Los anticuerpos humanos modificados se pueden preparar usando metodos adecuados, tales como mediante reaccion de uno o mas agentes modificantes. Un “agente modificante” como se usa la expresion en este documento, se refiere a un grupo organico adecuado (por ejemplo, pollmero hidrofilo, un acido graso o un ester de acido graso) que comprende un grupo activador. Un “grupo activador” es un resto qulmico o grupo funcional que puede, en condiciones apropiadas, reaccionar con un segundo grupo qulmico formando de ese modo un enlace covalente entre el agente modificante y el grupo qulmico. Por ejemplo, los grupos activadores reactivos a amina incluyen grupos electrofilos tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluor, yodo), N-hidroxisucinimidil esteres (NHS) y similares. Los grupos activacion que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acrilolilo, disulfuros de piridilo, acido 5-tiol-2-nitrobenzoico tiol (TNB-tiol) y similares. Un grupo funcional aldehldo se puede acoplar a moleculas que contienen amida o hidrazida y un grupo azida puede reaccionar con un grupo de fosforo trivalente para formar enlaces de fosforamidato o fosforimida. Los metodos adecuados para introducir grupos activadores en moleculas se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo activador se puede unir directamente al grupo organico (por ejemplo, pollmero hidrofilo, acido graso o ester de acido graso) o a traves de un resto enlazador, por ejemplo, un grupo C1-C12 divalente en el que uno o mas atomos de carbono se pueden reemplazar por un heteroatomo tal como oxlgeno, nitrogeno o azufre. Los restos enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-,-NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2O-CH2-CH2-O-CH-CH2-O-CH-NH-. Los agentes modificantes que comprenden un resto enlazador se pueden producir, por ejemplo, haciendo reaccionar una mono- Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un acido graso en presencia de 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre y el carboxilato de acido graso. El grupo protector Boc se puede retirar del producto mediante tratamiento con acido
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trifluoroacetico (TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro carboxilato como se ha descrito o se puede hacer reaccionar con anhidrido maleico y el producto resultante ciclarse para producir un derivado maleimido activado del acido graso. (Vease, por ejemplo, Thompson, et al., el documento WO 92/16221).
Los anticuerpos modificados de la invention se pueden producir haciendo reaccionar un anticuerpo humano con un agente modificante. Por ejemplo, los restos organicos se pueden unir al anticuerpo de una manera no especifica de sitio empleando un agente modificante reactivo a amina, por ejemplo, un NHS ester de PEG. Los anticuerpos humanos modificados tambien se pueden preparar reduciendo los enlaces de disulfuro (por ejemplo, enlaces de disulfuro intracadena) de un anticuerpo o fragmento de union antigeno. Despues, el anticuerpo reducido se puede hacer reaccionar con un agente modificante reactivo a tiol para producir el anticuerpo modificado de la invencion. Los anticuerpos humanos modificados que comprenden un resto organico que esta unido a sitios especificos de un anticuerpo de la presente invencion se pueden preparar usando metodos adecuados, tales como proteolisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5: 411417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10): 2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)), y los metodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).
COMPOSICIONES DE ANTICUERPO ANTI-TNF
La presente invencion tambien proporciona al menos una composition de anticuerpo anti-TNF que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o mas anticuerpos anti-TNF de la misma, como se ha descrito en este documento y/o como se conoce en la tecnica que se proporcionan en una composicion, mezcla o forma de origen no natural. Las composiciones de anticuerpo anti-TNF de la presente invencion pueden comprender ademas al menos una de cualquier cantidad eficaz y adecuada de una composicion o composicion farmaceutica que comprenda al menos un anticuerpo anti-TNF para una celula, tejido, organo, animal o paciente que necesita tal modulation, tratamiento o terapia, comprendiendo ademas opcionalmente al menos uno seleccionado entre al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero sin limitation un anticuerpo de TNF o fragmento, un receptor de TNF o fragmento soluble, proteinas de fusion del mismo o un antagonista de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sodico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglicosido, un antifungico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, un tetraciclina u otro antimicrobiano), un antipsoriasico, un corticoesteroide, un esteroide anabolizante, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un agente nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen) un sargramostim (GM-CSF, Leuquina), una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un farmaco de reemplazo hormonal, un modulador de receptor de estrogenos, un midriatico, un cicloplejico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaceutico, un antidepresivo, un agente anti-maniaco, un antipsicotico, un ansiolitico, un hipnotico, un simpaticomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, una medication para el asma, un antagonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina. Los ejemplos no limitantes de tales citoquinas incluyen, pero sin limitacion, cualquiera de IL-1 a IL-23. Las dosis adecuadas se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Wells et al., Eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopeia, Taras-con Pharmacopeia 2000, Edicion Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000). Tales anti-cancerosos o anti-infectivos tambien pueden incluir moleculas de toxina que estan asociadas, unidas, co-formuladas o que se co-administran con al menos un anticuerpo de la presente invencion. La toxina puede actuar opcionalmente para destruir selectivamente la celula o tejido patologico. La celula patologica puede ser una celula de cancer u otra celula. Tales toxinas pueden ser, pero sin limitacion, toxina o fragmento de toxina purificado o recombinante que comprende al menos un dominio citotoxico funcional de toxina, por ejemplo, seleccionada entre al menos una de toxina de ricina o difteria, una toxina de veneno o una toxina bacteriana. El termino toxina tambien incluye tanto endotoxinas como exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus de origen natural, mutante o recombinante que puede causar cualquier proceso patologico en seres humanos y otros mamiferos, incluyendo choque por toxina, que puede dar como resultado la muerte. Tales toxinas pueden incluir, pero sin limitacion, enterotoxina termolabil de E. coli enterotoxigenica (LT), enterotoxina termoestable (ST), citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina 1 del sindrome choque toxico (TSST-1), enterotoxina estafilococica A (SEA), B (SEB) o C (SEC), enterotoxinas estreptococicas y similares. Tales bacterias incluyen, pero sin limitacion, cepas de una especie de E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enterohemorragica (por ejemplo, cepas del serotipo 0157: H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei), especies de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), especies de Helicobacter, (por
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ejemplo, Helicobacter pylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Plesiomonas shigelloides, Yersinia enterocolitica, especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), species de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y Streptococci. Vease, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3a edicion, pags. 1 -13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al, eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a. Ed., pags. 239-254, Plenum Medical Book Co., Nueva York (1991); Mandelletal, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3a Ed., Churchill Livingstone, Nueva York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16a edicion, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248: 705-711 (1990).
Los compuestos, composiciones o combinaciones de anticuerpo anti-TNF de la presente invencion pueden comprender ademas al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tales como, pero sin limitation, diluyente, aglutinante, estabilizante, tampones, sales, disolventes lipofilos, conservantes, adyuvantes o similares. Se prefieren los auxiliares farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes de y los metodos de preparation de tales soluciones esteriles se conocen bien en la tecnica, tales como, pero sin limitacion, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Se pueden seleccionar de forma rutinaria los vehlculos farmaceuticamente aceptables que sean adecuados para el modo de administration, solubilidad y/o estabilidad de la composition de anticuerpos anti-TNF como se conoce bien en la tecnica o como se ha descrito en este documento.
Los excipientes y aditivos farmaceuticos utiles en la presente composicion incluyen, pero sin limitacion, protelnas, peptidos, aminoacidos, llpidos y carbohidratos (por ejemplo, azucares, incluyendo monosacaridos, di, tri, tetra y oligosacaridos; azucares derivatizados tales como alditoles, acidos aldonicos, azucares esterificados y similares; y polisacaridos o pollmeros de azucar), que se pueden presentar de forma individual o en combination, que comprenden solos o en combinacion el 1-99,99% en peso o volumen. Los excipientes de protelna ilustrativos incluyen albumina de suero tal como albumina serica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caselna y similares. Los componentes de aminoacido/anticuerpo representativos, que tambien pueden funcionar en una capacidad de tamponamiento, incluyen alanina, glicina, arginina, betalna, histidina, acido glutamico, acido aspartico, cistelna, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo y similares. Un aminoacido preferido es glicina.
Los excipientes de carbohidrato adecuados para uso en la invencion incluyen, por ejemplo, monosacaridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacaridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacaridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de carbohidrato preferidos para uso en la presente invencion son manitol, trehalosa y rafinosa.
Las composiciones de anticuerpo anti-TNF tambien pueden incluir un tampon o un agente de ajuste de pH; tlpicamente, el tampon es una sal preparada a partir de un acido o base organico. Los tampones representativos incluyen sales de acidos organicos tales como sales de acido cltrico, acido ascorbico, acido gluconico, acido carbonico, acido tartarico, acido succlnico, acido acetico o acido ftalico; Tris, clorhidrato de trometamina o tampones fosfato. Los tampones preferidos para uso en las presentes composiciones son sales de acidos organicos tales como citrato.
Adicionalmente, las composiciones de anticuerpo anti-TNF de la invencion pueden incluir excipientes/aditivos polimericos tales como polivinil pirrolidonas, ficoles (un azucar polimerico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-b-ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes saporlferos, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestaticos, tensioactivos (por ejemplo, polisorbatos tales como “TWEEN 20” y “TWEEN 80”), llpidos (por ejemplo, fosfollpidos y acidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol) y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).
En la tecnica se conocen estos y otros excipientes y/o aditivos farmaceuticos adecuados conocidos para su uso en las composiciones de anticuerpo anti-TNF de acuerdo con la invencion, por ejemplo, como se enumeran en “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19a Ed., Williams & Williams, (1995), y en el “Physician's Desk Reference”, 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Los materiales de vehlculo o excipiente preferidos son carbohidratos (por ejemplo, sacaridos y alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes polimericos.
Formulaciones
Como se ha indicado anteriormente, la invencion proporciona formulaciones estables, que preferiblemente son un tampon fosfato con solution salina o una sal elegida, as! como soluciones y formulaciones conservadas que contienen un conservante as! como formulaciones conservadas multi uso adecuadas para uso farmaceutico o veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo anti-TNF en una formulation farmaceuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente se seleccionan entre el grupo que consiste en al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencllico, nitrito
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fenilmercurico, fenoxietanol, formaidehldo, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato sodico y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Cualquier concentracion adecuada o mezcla se puede usar como se conoce en la tecnica, tal como el 0,001-5% o cualquier intervalo o valor dentro del mismo, tal como, pero sin limitacion, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o cualquier intervalo o valor dentro de los mismos. Los ejemplos no limitantes incluyen, sin conservante, m-cresol al 0,1-2% (por ejemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9 o 1,0%), alcohol bencllico del 0,1-3% (por ejemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), timerosal del 0,001-0,5% (por ejemplo, 0,005, 0,01), fenol al 0,001-2,0% (por ejemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), alquilparabenos del 0,00051,0% (por ejemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) y similares.
Como se ha indicado anteriormente, la invention proporciona un artlculo de fabrication, que comprende material de envasado y al menos un vial que comprende una solution de al menos un anticuerpo anti-TNF, con los tampones y/o conservantes prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que indica que tal solucion se puede mantener durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o mayor. La invencion comprende ademas un artlculo de fabricacion, que comprende material de envasado, un primer vial que comprende al menos un anticuerpo anti-TNF liofilizado y un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de tampon o conservante prescrito, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que instruye a un paciente a reconstituir el al menos un anticuerpo anti-TNF en el diluyente acuoso para formar una solucion que se puede mantener durante un periodo de veinticuatro horas o mayor.
El al menos un anticuerpo anti-TNF usado de acuerdo con la presente invencion se puede producir mediante medios recombinantes, incluyendo a partir de preparaciones de celulas de mamlfero o transgenicas o se puede purificar a partir de otras fuentes biologicas, como se ha descrito en este documento o como se conoce en la tecnica.
El intervalo de al menos un anticuerpo anti-TNF en el producto de la presente invencion incluye cantidades que producen tras la reconstitution, si estan en un sistema humedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, aunque son funcionales las concentraciones menores y mayores y dependen del vehlculo de administration deseado, por ejemplo, las formulaciones en solucion diferiran de los metodos de parche transdermico, pulmonar, transmucosal o de bomba osmotica o micro bomba.
Preferiblemente, el diluyente acuoso, opcionalmente comprende ademas un conservante farmaceuticamente aceptable. Los conservantes preferidos incluyen aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencllico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato sodico y timerosal o mezclas de los mismos. Las concentraciones de conservante usadas en la formulation son una concentracion suficiente para producir un efecto anti-microbiano. Tales concentraciones dependen del conservante seleccionado y se determinan facilmente por el especialista.
Opcionalmente y preferiblemente, se pueden anadir al diluyente otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, tampones, antioxidantes, conservantes y potenciadores. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa comunmente en concentraciones conocidas. Un tampon fisiologicamente tolerado se anade preferiblemente para proporcionar control de pH mejorado. Las formulaciones pueden abarcar un amplio intervalo de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10 y los intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9 y un intervalo mas preferido de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Preferiblemente, las formulaciones de la presente invencion tienen pH entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,8. Los tampones preferidos incluyen tampones fosfato, mas preferiblemente fosfato sodico, particularmente solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
Se pueden anadir otros aditivos a las formulaciones o composiciones, tales como solubilizantes farmaceuticamente aceptables como Tween 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitan), Tween 40 (monopalmitato de polioxietileno (20) sorbitan), Tween 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitan), Pluronic F68 (copollmeros de bloque de polioxietilen polioxipropileno) y PEG (polietilenglicol) o tensioactivos no ionicos tales como polisorbato 20 u 80 o poloxamero 184 o 188, polioles de Pluronic®, otros copollmeros de bloque y quelantes tales como EDTA y EGTA, para reducir la agregacion. Estos aditivos son particularmente utiles si se usa una bomba o recipiente de plastico para administrar la formulacion. La presencia de tensioactivo farmaceuticamente aceptable mitiga la propension de la protelna a formar agregados.
Las formulaciones de la presente invencion se pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-TNF y un conservante seleccionado entre el grupo que consiste en fenol, m- cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencllico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares),
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cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato sodico y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla de al menos un anticuerpo anti-TNF y conservante en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos de disolucion y mezcla convencionales. Por ejemplo, para preparar una formulacion adecuada se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo anti-TNF en solucion tamponada con el conservante deseado en una solucion tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la protelna y el conservante en las concentraciones deseadas. Un especialista en la tecnica reconocera las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se anaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son todos factores que se pueden optimizar para la concentracion y los medios de administracion usados.
Las formulaciones reivindicadas se pueden proporcionar a pacientes como soluciones transpararentes o como viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-TNF liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferiblemente un tampon fosfato y/o solucion salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. Tanto un vial de solucion unica como un vial doble que requiere reconstitucion se pueden reusar multiples veces y pueden ser suficiente para un ciclo unico o multiples ciclos de tratamiento de paciente y, por tanto, pueden proporcionar un regimen de tratamiento mas conveniente que los que estan disponibles actualmente.
Los presentes artlculos de fabricacion reivindicados son utiles para administracion a lo largo de un periodo de inmediatamente a veinticuatro horas o mayor. Por consiguiente, los presentes artlculos de fabricacion indicados ofrecen ventajas significativas al paciente. Las formulaciones de la invention opcionalmente se pueden almacenar de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente 40°C y conservar la actividad biologica de la protelna durante periodos prolongados de tiempo, permitiendo de ese modo que una etiqueta de envase indique que la solucion se puede mantener y/o usar durante un periodo de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o mayor. Si se usa diluyente conservado, tal etiqueta puede incluir el uso hasta 1-12 meses, medio, uno y medio y dos anos.
Las soluciones de al menos un anticuerpo anti-TNF de la invencion se pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se realiza usando procedimientos de disolucion y mezcla convencionales. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o tampon en cantidades suficientes para proporcionar la protelna y opcionalmente un conservante o tampon en las concentraciones deseadas. Un especialista en la tecnica reconocera las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se anaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son todos factores que se pueden optimizar para la concentracion y medios de administracion usados.
Los productos reivindicados se pueden proporcionar a pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-TNF liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. Tanto un vial de solucion unico como un vial doble que requiere reconstitucion se pueden reusar multiples veces y pueden ser suficientes para un ciclo unico o multiples ciclos de tratamiento de paciente y, de ese modo, proporciona un regimen de tratamiento mas conveniente que los que estan disponibles actualmente.
Los productos reivindicados se pueden proporcionar indirectamente a pacientes proporcionando a farmacias, cllnicas u otras instituciones e instalaciones de este tipo, soluciones transparentes o viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-TNF liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. En este caso, la solucion transparente puede ser hasta un litro o incluso de mayor tamano, proporcionando un recipiente grande a partir del cual partes pequenas de la al menos una solucion de anticuerpo se pueden recuperar una o multiples veces para transferencia a viales mas pequenos y proporcionados por la farmacia o cllnica a sus clientes y/o pacientes.
Los dispositivos reconocidos que comprenden estos sistemas de vial unico incluyen los dispositivos de inyector de pluma para administracion de una solucion tal como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, ijec®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo, como los preparados o desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ,
www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suiza,
www.disetronic.com); Bioject, Portland, Oregon (
www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, RU,
www.weston-medical.com) y Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN,
www.mediject.com). Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de vial doble incluyen los sistemas de inyector de pluma para reconstituir un farmaco liofilizado en un cartucho para administracion de la solucion reconstituida tal como el HumatroPen®.
Los productos reivindicados en este documento incluyen material de envasado. El material de envasado proporciona, ademas de la information requerida por las agencias reguladoras, las condiciones en las cuales se puede usar el producto. El material de envasado de la presente invencion proporciona instrucciones al paciente para
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reconstituir el al menos un anticuerpo anti-TNF en el diluyente acuoso para formar una solucion y para usar la solucion a lo largo de un periodo de 2-24 horas o mayor para el producto de dos viales humedo/seco. Para el producto de solucion de vial unico, la etiqueta indica que tal solucion se puede usar a lo largo de un periodo de 2-24 horas o mayor. Los productos indicados en el presente documento son utiles para uso de producto farmaceutico humano.
Las formulaciones de la presente invencion se pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-TNF y un tampon seleccionado, preferiblemente un tampon fosfato que contiene solucion salina o una sal elegida. La mezcla de el al menos un anticuerpo y tampon en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos de disolucion y mezcla convencionales. Por ejemplo, para preparar una formulacion adecuada, una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o tampon se combina con el agente tampon deseado en agua en cantidades suficientes para proporcionar la protelna y tampon en las concentraciones deseadas. Un especialista en la tecnica reconocera las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se anaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los cuales se prepara la formulacion, son todos factores que se pueden optimizar para la concentracion y medios de administracion usados.
Las formulaciones estables o conservadas reivindicadas se pueden proporcionar a pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-TNF liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene un conservante o un tampon y excipientes en un diluyente acuoso. Tanto un vial de solucion unica como un vial doble que requiere reconstitucion se pueden reusar multiples veces y pueden ser suficientes para un ciclo unico o ciclos multiples de tratamiento de paciente y, de este modo, proporcionan un regimen de tratamiento mas conveniente que los que estan disponibles actualmente.
Al menos un anticuerpo anti-TNF en las formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas en este documento, se puede administrar a un paciente de acuerdo con la presente invencion a traves de una diversidad de metodos de administracion incluyendo inyeccion SC o IM; por via transdermica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmotica, cartucho, micro bomba u otros medios apreciados por los especialistas, como se conoce bien en la tecnica.
Aplicaciones Terapeuticas
El anticuerpo o composicion de la invencion puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con TNF, en una celula, tejido, organo, animal o paciente, como se conoce en la tecnica o como se ha descrito en este documento.
En particular, los mismos pueden ser para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con TNF en una celula, tejido, organo, animal o paciente incluyendo, pero sin limitacion, al menos uno de obesidad, una enfermedad relacionada con el sistema inmune, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad maligna o una enfermedad neurologica.
Mas especlficamente, los mismos pueden ser para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con el sistema inmune, en una celula, tejido, organo, animal o paciente incluyendo, pero sin limitacion, al menos uno de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de aparicion sistemica, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, ulcera gastrica, artropatlas seronegativas, osteoartritis, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistemico, slndrome antifosfollpido, iridociclitis/uveftis/neuritis optica, fibrosis pulmonar idiopatica, vasculitis sistemica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, procedimientos de inversion de orquitis/vasectomla, enfermedades alergicas/atopicas, asma, rinitis alergica, eczema, dermatitis por contacto alergica, conjuntivitis alergica, neumonitis por hipersensibilidad, trasplantes, rechazo de trasplantes de organos, enfermedad de injerto frente a hospedador, slndrome de respuesta inflamatoria sistemica, slndrome de sepsis, sepsis por gram positivos, sepsis por gram negativos, sepsis de cultivo negativo, sepsis fungica, fiebre neutropenica, urosepsis, meningococcemia, trauma/hemorragia, quemaduras, exposicion a radiacion ionizante, pancreatitis aguda, slndrome de estres respiratorio adulto, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologlas inflamatorias cronicas, sarcoidosis, patologla de Crohn, anemia de celulas falciformes, diabetes, nefrosis, enfermedades atopicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alergica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxis sistemica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolltica, trombocitopenia, rechazo de injerto de cualquier organo o tejido, rechazo del trasplante de rinon, rechazo de trasplante de corazon, rechazo de trasplante de hlgado, rechazo de trasplante de pancreas, rechazo de trasplante de pulmon, rechazo de trasplante de medula osea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de trasplante de cartllago, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de trasplante de paratiroides, rechazo de xenoinjerto de cualquier organo o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad antireceptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes resistente a insulina de tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, lupus eritematoso sistemico, slndrome de POEMS (polineuropatla, organomegalia, endocrinopatla, gammapatla monoclonal y slndrome de cambios de piel), polineuropatla, organomegalia, endocrinopatla, gammapatla monoclonal, slndrome de cambio de piel, slndrome antifosfollpido, penfigo, esclerodermia, enfermedad de tejido conectivo mixto, enfermedad de Addison
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idiopatica, diabetes mellitus, hepatitis activa cronica, cirrosis biliar primaria, vitiligo, vasculitis, slndrome de cardiotomla post-MI, hipersensibilidad de tipo IV, dermatitis por contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a farmacos, metabolica/idiopatica, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, deficiencia de alfa 1 antitripsina, retinopatla diabetica, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluacion del eje hipotalamo-hipofisis-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis qulstica, enfermedad pulmonar cronica neonatal, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), linfohistiocitosis hematofagocltica familiar, afecciones dermatologicas, psoriasis, alopecia, slndrome nefrotico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodialisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, terapia con okt3, terapia anti-cd3, terapia de citoquina, quimioterapia, terapia de radiacion (por ejemplo, incluyendo pero sin limitacion, astenia, anemia, caquexia y similares), intoxicacion por salicilato cronica y similares. Vease, por ejemplo, Merck Manual, 12a-17a Ediciones, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Segunda Edicion, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).
El anticuerpo o composicion de la invention puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad cardiovascular en una celula, tejido, organo, animal o paciente incluyendo, pero sin limitacion, al menos una de slndrome de aturdimiento cardlaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, apoplejla, apoplejla isquemica, hemorragia, arteriosclerosis, aterosclerosis, reestenosis, enfermedad arteriosclerotica diabetica, hipertension, hipertension arterial, hipertension renovascular, slncope, choque, slfilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardiaca, cor pulmonale, hipertension pulmonar primaria, arritmias cardlacas, latido ectopico auricular, aleteo auricular, fibrilacion auricular (sostenida o paroxlstica), slndrome post perfusion, respuesta de inflamacion a derivation cardiopulmonar, taquicardia auricular caotica o multifocal, taquicardia regular con QRS estrecho, arritmias especlficas, fibrilacion ventricular, arritmias del haz de His, bloqueo auriculoventricular, bloqueo de la rama del haz, trastornos isquemicos miocardicos, arteriopatla coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatla, cardiomiopatla congestiva dilatada, cardiomiopatla restrictiva, enfermedades cardiacas valvulares, endocarditis, enfermedad pericardica, tumores cardlacos, aneurismas aorticos y perifericos, diseccion aortica, inflamacion de la aorta, oclusion de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos vasculares perifericos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad aterosclerotica periferica, tromboangitis obliterante, trastornos arteriales perifericos funcionales, fenomeno y enfermedad de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fistula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina inestable, lesion de reperfusion, slndrome post bomba, lesion por isquemia-reperfusion y similares.
El anticuerpo o composicion de la invencion puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad infecciosa en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluyendo pero sin limitacion, al menos una de: infection bacteriana aguda o cronica, procesos parasitarios o infecciosos agudos y cronicos, incluyendo infecciones bacterianas, virales y fungicas, infeccion por VIH/neuropatla por VIH, meningitis, hepatitis (A, B o C o similares), artritis septica, peritonitis, neumonla, epiglotitis, E. coli 0157: h7, slndrome uremico hemolltico/purpura trombocitopenica trombolltica, malaria, fiebre de dengue hemorragico, leishmaniasis, lepra, slndrome de choque toxico, miositis estreptococica, gangrena del gas, tuberculosis por mycobacterium, mycobacterium avium intracelular, neumonla por pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pelvica, orquitis/epididimitis, legionella, enfermedad de lyme, influenza A, virus de epstein-barr, slndrome hemafagocltico asociado vital, encefalitis vital/meningitis aseptica y similares.
El anticuerpo o composicion de la invencion puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad maligna en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluyendo pero sin limitacion, al menos uno de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblastica aguda (ALL), ALL de celulas B, celulas T o FAB, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocltica cronica (CML), leucemia linfocltica cronica (CLL), leucemia de celulas vellosas, slndrome mielodisplasico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreatico, carcinoma nasofarlngeo, histiocitosis maligna, slndrome paraneoplasico/hipercalcemia de malignidad, tumores solidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastasica, resorcion osea relacionada con cancer, dolor oseo relacionado con cancer y similares.
El anticuerpo o composicion de la invencion puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad neurologica en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluyendo pero sin limitacion, al menos una de: enfermedades neurodegenerativas, esclerosis multiple, dolor de cabeza de migrana, complejo de demencia del SIDA, enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis multiple y mielitis transversa aguda, trastornos extrapiramidales y cerebelares tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelares; trastornos de movimiento hipercinetico tales como Corea de Huntington y corea senil; trastornos de movimiento inducidos por farmacos, tales como los inducidos por farmacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC; trastornos de movimiento hipocinetico, tales como enfermedad de Parkinson; Paralisis supranuclear Progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de multiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager y Machado-Joseph); trastornos sistemicos (enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia, telangiectasia y trastorno de sistema multiple mitocondrial); trastornos de nucleo
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desmielinizante, tales como esclerosis multiple, mielitis transversal aguda; y trastornos de la unidad motora tales como atrofias musculares neurogenicas (degeneracion de celulas del cuerno anterior, tales como esclerosis lateral amiotrofica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer, slndrome de Down en edad media; enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, Demencia Senil de tipo de cuerpo de Lewy; slndrome de Wernicke-Korsakoff, alcoholismo cronico, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden- Spatz y Demencia pugillstica y similares. Vease, por ejemplo, the Merck Manual, 16a edicion, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).
La composicion de la invention se puede usar en un metodo que comprende administrar una cantidad eficaz a una celula, tejido, organo, animal o paciente que la necesita. Un metodo de este tipo puede opcionalmente comprender ademas la co-administration o terapia de combination para tratar tales enfermedades inmunes, en las que la administration de dicha composicion comprende ademas administrar, antes, simultaneamente y/o despues al menos uno seleccionado entre al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero sin limitation, un anticuerpo de TNF o fragmento, un receptor de TNF soluble o fragmento, protelnas de fusion del mismo o un antagonista de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sodico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida y sulfasalzina), un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglicosido, un antifungico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, una cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina u otros antimicrobianos), un antipsoriasico, un corticosteroide, un esteroide anabolizante, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un agente nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leuquina), una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina y daclizumab), una hormona del crecimiento, un farmaco de reemplazo hormonal, un modulador de receptor de estrogeno, un agente midriatico, un cicloplejico y un alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaceutico, un antidepresivo, un antimanlaco, un antipsicotico, un ansiolltico, un hipnotico, un simpaticomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, una medication para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina. Las dosis adecuadas se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edicion, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edicion Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).
Los antagonistas de TNF adecuados para composiciones, terapia de combinacion, co-administracion, dispositivos y/o metodos de la presente invencion (comprendiendo ademas al menos un anticuerpo, parte especificada y variante del mismo, de la presente invencion), incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos anti-TNF, fragmentos de union a antlgeno del mismo y moleculas receptoras que se unen especlficamente a TNF; los compuestos que evitan y/o inhiben la slntesis de TNF, liberation de TNF o su action en celulas diana, tales como talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y rolipram), agonistas de receptor de adenosina A2b y potenciadores de receptor de adenosina A2b; compuestos que evitan y/o inhiben la serialization del receptor de TNF, tales como inhibidores de protelna quinasa activada por mitogeno (MAP); compuestos que bloquean o inhiben la escision de TNF de membrana, tales como inhibidores de metaloproteinasa; compuestos que bloquean o inhiben la actividad de TNF, tales como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril) y compuestos que bloquean y/o inhiben la production y/o slntesis de TNF, tales como los inhibidores de MAP quinasa.
Como se usa en este documento, un “anticuerpo de factor de necrosis tumoral”, “anticuerpo de TNF”, “anticuerpo de TNFa” o fragmento y similares disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la actividad de TNFa in vitro, in situ y/o preferiblemente in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo humano TNF adecuado de la presente invencion se puede unir a TNFa e incluye anticuerpos anti-TNF, fragmentos de union a antlgeno del mismo y mutantes especificados o dominios del mismo que se unen especlficamente a TNFa. Un anticuerpo de TNF o fragmento adecuado tambien puede disminuir, bloquear, anular, interferir, evitar y/o inhibir la slntesis de ARN, ADN o protelna de TNF, la liberacion de TNF, la senalizacion de receptor de TNF, la escision de TNF en membrana, la actividad de TNF y la produccion y/o slntesis de TNF.
El anticuerpo quimerico cA2 consiste en la region variable de union a antlgeno del anticuerpo anti-lgG1 de TNFa humano de raton neutralizante de afinidad alta, denominado A2, y las regiones constantes de una inmunoglobulina kappa lgG1 humana. La region Fc de lgG1 humana mejora la funcion efectora de anticuerpo alogenico, aumenta la semivida en suero circulante y disminuye la inmunogenicidad del anticuerpo. La avidez y especificidad de epltopo del anticuerpo quimerico cA2 se obtiene de la region variable del anticuerpo murino A2. En una realization particular, una fuente preferida de acidos nucleicos que codifican la region variable del anticuerpo murino A2 es la llnea de celulas de hibridoma A2.
El A2 quimerico (cA2) neutraliza el efecto citotoxico de TNFa humano tanto natural como recombinante de
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una manera dependiente de la dosis. A partir de ensayos de union de anticuerpo quimerico cA2 y TNFa humano recombinante, se calculo que la constante de afinidad del anticuerpo quimerico cA2 era 1,04 x 1010 M-1. Los metodos preferidos para determinar la especificidad y afinidad del anticuerpo monoclonal mediante inhibicion competitiva se pueden observar en Harlow, et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, y Wiley Interscience, Nueva York, (1992-2000); Kozbor et al., Immunol. Today, 4: 72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York (1987-2000); y Muller, Meth. Enzymol., 92: 589-601 (1983).
En una realizacion preferida, se produce anticuerpo monoclonal murino A2 por una llnea celular denominada c134A. El anticuerpo quimerico cA2 se produce por una llnea celular denominada c168A.
Los ejemplos adicionales de anticuerpos anti-TNF monoclonales que se pueden usar en la presente invencion se describen en la tecnica (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.231.024; Moller, A. et al., Cytokine 2(3): 162-169 (1990); Solicitud de Estados Unidos N° 07/943.852 (presentada el 11 de septiembre de 1992); Rathjen et al., Publicacion Internacional N° WO 91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991); Rubin et al.. Publication de Patente EPO N° 0 218 868 (publicada el 22 de abril de 1987); Yone et al., Publicacion de Patente EPO N° 0288 088 (26 de octubre de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854(1986); Meager, et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); y Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987).
Moleculas receptoras de TNF
Las moleculas receptoras de TNF preferidas utiles en la presente invencion son aquellas que se unen a TNFa con afinidad alta (vease, por ejemplo, Feldmann et al., Publicacion Internacional N° WO 92/07076 (publicada el 30 de abril de 1992); Schall et al., Cell 61: 361-370 (1990), y Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990), cuyas referencias se incorporan en este documento en su totalidad como referencia) y opcionalmente poseen inmunogenicidad baja. En particular, los receptores de superficie celular de TNF de 55 kDa (p55 TNF-R) y el de 75 kDa (p75 TNF-R) son utiles en la presente invencion. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares (ECD) de los receptores o partes funcionales de los mismos (vease, por ejemplo, Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223: 831-840 (1994)), tambien son utiles en la presente invencion. Las formas truncadas de los receptores de TNF, que comprenden los ECD, tambien se han detectado en orina y suero como protelnas de union inhibidoras de TNFa de 30 kDa y 40 kDa (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990). Las moleculas multimericas receptoras de TNF y moleculas de fusion de immunorreceptor de TNF y derivados y fragmentos o partes de las mismas, son ejemplos adicionales de moleculas receptoras de TNF que son utiles en los metodos y composiciones de la presente invencion. Las moleculas receptoras de TNF que se pueden usar en la invencion se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes durante periodos prolongados con alivio de bueno a excelente de slntomas y toxicidad baja. La inmunogenicidad baja y/o afinidad alta, as! como otras propiedades indefinidas, pueden contribuir a los resultados terapeuticos conseguidos.
Las moleculas multimericas receptoras de TNF utiles en la presente invencion comprenden toda o una parte funcional de los ECD de dos o mas receptores de TNF unidos a traves de uno o mas enlazadores polipeptldicos u otros enlazadores no peptldicos, tales como polietilenglicol (PEG). Las moleculas multimericas pueden comprender ademas un peptido senal de una protelna secretada para dirigir la expresion de una molecula multimerica.
Las moleculas de fusion de inmunorreceptor de TNF utiles en los metodos y composiciones de la presente invencion comprenden al menos una parte de una o mas moleculas de inmunoglobulina y todo o una parte funcional de uno o mas receptores de TNF. Estas moleculas de fusion de inmunorreceptor se pueden ensamblar como monomeros o hetero u homo-multlmeros. Las moleculas de fusion de inmunorreceptor tambien pueden ser monovalentes o multivalentes. Un ejemplo de una molecula de fusion de inmunorreceptor de TNF de este tipo es la protelna de fusion de receptor de TNF/IgG. Las moleculas de fusion de inmunorreceptor de TNF y los metodos para su production se han descrito en la tecnica (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21: 2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219 (1994); Butler et al., Cytokine 6(6): 616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler et al., Patente de Estados Unidos N° 5.447.851; y Solicitud de los Estados Unidos N° 08/442.133 (presentada el 16 de mayo de 1995). Los metodos para producir moleculas de fusion de inmunorreceptor tambien se pueden encontrar en Capon et al., Patentes de Estados Unidos N° 5.116.964; Capon et al., Patente de Estados Unidos N° 5.225.538; y Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989).
Un equivalente funcional, derivado, fragmento o region de molecula receptora de TNF se refiere a la parte de la molecula receptora de TNF o la parte de la secuencia de la molecula receptora de TNF que codifica la molecula receptora de TNF, que tiene un tamano y secuencias suficientes para parecerse funcionalmente a las moleculas receptoras de TNF que se pueden usar en la presente invencion (por ejemplo, se unen a TNF con afinidad alta y poseen inmunogenicidad baja). Un equivalente funcional de la molecula receptora de TNF tambien
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incluye moleculas receptoras de TNF modificadas que funcionalmente se parecen a moleculas receptoras de TNF que se pueden usar en la presente invencion (por ejemplo, se unen a TNF con afinidad alta y poseen inmunogenicidad baja). Por ejemplo, un equivalente funcional de una molecula receptora de TNF puede contener un codon “SILENTE” o una o mas sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido (por ejemplo, sustitucion de un aminoacido acido por otro aminoacido acido; o sustitucion de un codon que codifica el mismo aminoacido o un aminoacido hidrofobo diferente por otro codon que codifica un aminoacido hidrofobo). Vease Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley-Interscience, Nueva York (1987-2000).
Las citoquinas incluyen cualquier citoquina conocida. Vease, por ejemplo, CopewithCytokines.com. Los antagonistas de citoquina incluyen, pero sin limitacion, cualquier anticuerpo, fragmento o mimetico, cualquier receptor soluble, fragmento o mimetico, cualquier antagonista de molecula pequena o cualquier combinacion de los mismos.
Tratamientos Terapeuticos. La composicion de la invencion se puede usar en un metodo para tratar un trastorno mediado por TNF, que comprende administrar una cantidad eficaz a una celula, tejido, organo, animal o paciente que la necesita. Un metodo de este tipo puede ademas comprender opcionalmente la co-administracion o terapia de combinacion para tratar tales enfermedades inmunes, en las que la administracion de dicha composicion, comprende ademas administrar, antes, simultaneamente y/o despues, al menos uno seleccionado entre al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero sin limitacion, un anticuerpo de TNF o fragmento, un receptor de TNF o fragmento soluble, protelnas de fusion de los mismos o un antagonista de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sodico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglicosido, un antifungico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una flurorquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina u otro antimicrobiano), un antipsoriasico, un corticoesteroide, un esteroide anabolizante, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un agente nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leuquina), una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un farmaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrogeno, un midriatico, un cicloplejico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaceutico, un antidepresivo, un antimanlaco, un antipsicotico, un ansiolltico, un hipnotico, un simpaticomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, una medicacion para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina.
Tlpicamente, el tratamiento de procesos patologicos se logra administrando una cantidad o dosificacion eficaz de al menos una composicion de anticuerpo anti-TNF que totaliza, en promedio, un intervalo de al menos aproximadamente 0,01 a 500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-TNF por kilogramo de paciente por dosis y, preferiblemente, de al menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramos de anticuerpo/kilogramo de paciente por administracion unica o multiple, dependiendo de la actividad especlfica contenida en la composicion. Como alternativa, la concentracion en suero eficaz puede comprender 0,1-5000 mg/ml de concentration en suero por administracion unica o multiple. Los facultativos medicos conocen las dosis adecuadas y, por supuesto, dependeran de la patologla particular, de la actividad especlfica de la composicion que se este administrando y del paciente particular que se este sometiendo al tratamiento. En algunos casos, para conseguir la cantidad terapeutica deseada, puede ser necesario proporcionar administracion repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis controlada o medida particular, donde las administraciones individuales se repiten hasta que se consigue la dosis diaria o el efecto deseados.
Las dosis preferidas opcionalmente pueden incluir 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100-500 mg/kg/ administracion, o cualquier intervalo, valor o fraction de los mismos o para conseguir una concentracion en suero de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1,1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9,
6.0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9,20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9,
14.0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5,, 5,9, 6,0, 6,5,6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12,
12.5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15 , 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20,
20.5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 , 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 y/o 5000 mg/ml de concentracion en suero por administracion unica o multiple, o cualquier intervalo, valor o fraccion de los mismos.
Como alternativa, la dosis administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las caracterlsticas farmacodinamicas del agente particular y su modo y via de administracion; edad, salud y peso del
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receptor; naturaleza y alcance de los slntomas, tipo de tratamiento simultaneo, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Habitualmente, una dosis de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente de 0,1 a 50 y preferiblemente de 0,1 a 10 miligramos por kilogramo por administracion o en forma de liberacion sostenida son eficaces para obtener los resultados deseados.
Como un ejemplo no limitante, el tratamiento de seres humanos o animales se puede proporcionar como una dosis de una sola vez o periodica de al menos un anticuerpo de la presente invencion de 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27,
28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por dla, en al menos en uno de los dlas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 o, como alternativa o adicionalmente, al menos uno de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51 o 52 o, como alternativa o adicionalmente, al menos uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19 o 20 anos o cualquier combinacion de los mismos, usando dosis unica, de infusion o repetidas.
Las formas farmaceuticas (composicion) adecuadas para administracion interna en general contienen de aproximadamente 0,1 miligramo a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o recipiente. En estas composiciones farmaceuticas el ingrediente activo normalmente estara presente en una cantidad de aproximadamente el 0,5-99,999% en peso basandose en el peso total de la composicion.
Para administracion parenteral, el anticuerpo se puede formular como una solucion, suspension, emulsion o polvo liofilizado en asociacion o proporcionado por separado, con un vehlculo parenteral farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehlculos son agua, solucion salina, solucion de Ringer, solucion de dextrosa y albumina serica humana al 1-10%. Los liposomas y vehlculos no acuosos tales como aceites no volatiles tambien se pueden usar. El vehlculo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio y manitol) y estabilidad qulmica (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulacion se esteriliza mediante tecnicas conocidas o adecuadas.
Los vehlculos farmaceuticos adecuados se describen en la edicion mas reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia convencional en este campo.
Administracion Alternativa
Se pueden usar muchos modos conocidos y desarrollados de acuerdo con la presente invencion para administrar cantidades farmaceuticamente eficaces de al menos un anticuerpo anti-TNF de acuerdo con la presente invencion. Aunque se usa administracion pulmonar en la siguiente descripcion, se pueden usar otros modos de administracion de acuerdo con la presente invencion con resultados adecuados.
Los anticuerpos de TNF de la presente invencion se pueden administrar en un vehlculo, como una solucion, emulsion, coloide o suspension, o como un polvo seco, usando cualquiera de una diversidad de dispositivos y metodos adecuados para administracion mediante inhalacion u otros modos descritos en este documento o conocidos en la tecnica.
Formulaciones Parenterales y Administracion
Las formulaciones para administracion parenteral pueden contener como excipientes comunes agua esteril o solucion salina, polialquilen glicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las suspensiones acuosas u oleosas para inyeccion se pueden preparar usando un emulsionante o humectante apropiado y un agente de suspension, de acuerdo con metodos conocidos. Los agentes para inyeccion pueden ser un agente diluyente no toxico, no administrable por via oral, tal como solucion acuosa o una solucion o suspension inyectable esteril en un disolvente. Como el vehlculo o disolvente que se puede usar, se permiten agua, solucion de Ringer, solucion salina isotonica, etc.; como un disolvente ordinario o disolvente de suspension, se puede usar aceite no volatil esteril. Para estos propositos, se puede usar cualquier tipo de aceite y acido graso no volatil, incluyendo aceites grasos o acidos grasos naturales o sinteticos o semisinteticos; mono o di o trigliceridos naturales o sinteticos o semisinteticos. La administracion parenteral se conoce en la tecnica e incluye, pero sin limitacion, medios convencionales de inyecciones, un dispositivo de inyeccion sin aguja a gas presurizado como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.851.198 y un dispositivo perforador laser como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.839.446 incorporada en su totalidad en la presente por referencia.
Administracion Alternativa
La invencion se refiere ademas a la administracion de al menos un anticuerpo anti-TNF mediante medios parenterales, subcutaneos, intramusculares, intravenosos, intrarticulares, intrabronquiales, intraabdominales, intracapsulares, intracartilaginosos, intracavitarios, intraceliales, intracerebelares, intracerebroventriculares, intracolicos, intracervicales, intragastricos, intrahepaticos, intramiocardicos, intraoseos, intrapelvicos,
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intrapericardiacos, intraperitoneales, intrapleurales, intraprostaticos, intrapulmonares, intrarrectales, intrarrenales, intrarretinianos, intraespinales, intrasinoviales, intratoracicos, intrauterinos, intravesicales, de bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdermico. Al menos una composition de anticuerpo anti-TNF se puede preparar para uso para administration parenteral (subcutanea, intramuscular o intravenosa) o de cualquier otro tipo, particularmente en forma de soluciones o suspensiones llquidas; para uso en administracion vaginal o rectal, particularmente en formas semisolidas, tales como, pero sin limitation, cremas y supositorios; para administracion bucal o sublingual tales como, pero sin limitacion, en forma de comprimidos o capsulas; o por via intranasal, tal como, pero sin limitacion, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o determinados agentes; o por via transdermica, tal como, pero sin limitacion, un gel, pomada, locion, suspension o sistema de administracion por parche con potenciadores qulmicos tales como dimetilsulfoxido para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentration de farmaco en el parche transdermico (Junginger, et al., In “Drug Permeation Enhancement”; Hsieh, D. S., Eds., pags. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York 1994, que se incorpora en su totalidad en este documento como referencia), o con agentes oxidantes que permiten la aplicacion de formulaciones que contienen protelnas y peptidos sobre la piel (el documento WO 98/53847) o aplicaciones de campos electricos para crear rutas de transporte transitorias tales como electroporation o para aumentar la movilidad de farmacos cargados a traves de la piel tales como iontoforesis o aplicacion de ultrasonido tal como sonoforesis (Patentes de Estados Unidos N° 4.309.989 y 4.767.402).
Administracion Pulmonar/Nasal
Para administracion pulmonar, preferiblemente al menos una composicion de anticuerpos anti-TNF se administra en un tamano de partlcula eficaz para alcanzar las vlas respiratorias inferiores de los pulmones o de los senos. De acuerdo con la invention, al menos un anticuerpo anti-TNF se puede administrar mediante cualquiera de una diversidad de dispositivos de inhalation o nasales conocidos en la tecnica para administracion de un agente terapeutico mediante inhalacion. Estos dispositivos capaces de depositar formulaciones aerosolizadas en la cavidad sinusal o los alveolos de un paciente incluyen inhaladores de dosis medida, nebulizadores, generadores de polvo seco, pulverizadores y similares. Otros dispositivos adecuados para dirigir la administracion pulmonar o nasal de anticuerpos tambien se conocen en la tecnica. Todos estos dispositivos pueden usar formulaciones adecuadas para la administracion para el reparto de anticuerpo en un aerosol. Tales aerosoles pueden estar comprendidos de soluciones (tanto acuosas como no acuosas) o partlculas solidas. Los inhaladores de dosis medida como el inhalador de dosis medida Ventolin®, tlpicamente usan un gas propulsor y requieren el accionamiento durante la inspiration (Veanse, por ejemplo, los documentos WO 94/16970 y WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics y el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons), usan el accionamiento por respiration de un polvo mixto (los documentos U.S. 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, Wo 94/08552 Dura, U.S. 5458135 Inhala, WO 94/06498 Fisons, que se incorporan en su totalidad en este documento como referencia). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, el nebulizador UltraVent® (Mallinckrodt) y el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (los documentos U.S. 5404871 Aradigm y WO 97/22376), estando las referencias anteriores incorporadas en este documento en su totalidad como referencia, producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo seco, etc. generan aerosoles de partlcula pequena. Estos ejemplos especlficos de dispositivos de inhalacion disponibles en el mercado tienen por objeto ser una representation de dispositivos especlficos adecuados para la practica de esta invencion y no tiene por objeto limitar el alcance de la invencion. Preferiblemente, una composicion que comprende al menos un anticuerpo anti-TNF se administra mediante un inhalador un pulverizador de polvo seco. Existen varias caracterlsticas deseables de un dispositivo de inhalacion para administrar al menos un anticuerpo de la presente invencion. Por ejemplo, la administracion mediante el dispositivo de inhalacion es provechosamente fiable, reproducible y precisa. El dispositivo de inhalacion opcionalmente puede administrar partlculas secas pequenas, por ejemplo, de menos de aproximadamente 10 pm, preferiblemente aproximadamente 1-5 pm, para buena respirabilidad.
Administracion de Composiciones de Anticuerpo de TNF como una Pulverizacion
Una pulverizacion que incluye protelna de composicion de anticuerpo de TNF se puede producir forzando una suspension o solution de al menos un anticuerpo anti-TNF a traves de una boquilla bajo presion. El tamano y la configuration de la boquilla, la presion aplicada y el Indice de alimentation de llquido se pueden elegir para conseguir la production y el tamano de partlcula deseado. Se puede producir una electropulverizacion, por ejemplo, mediante un campo electrico en conexion con una alimentacion capilar o por boquilla. Provechosamente, las partlculas de al menos una protelna de composicion de anticuerpo anti-TNF administradas mediante un pulverizador tienen un tamano de partlcula menor de aproximadamente 10 pm, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y mas preferiblemente de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.
Las formulaciones de al menos una protelna de composicion de anticuerpo anti-TNF adecuadas para su uso con un pulverizador tlpicamente incluyen protelna de composicion de anticuerpo a una solucion acuosa a una concentracion de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una protelna de composicion
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de anticuerpo anti-TNF por ml de solucion o mg/g o cualquier intervalo o valor dentro de los mismos, por ejemplo, pero sin Iimitacion, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml o mg/g. La formulacion puede incluir agentes tales como un excipiente, un tampon, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensioactivo y, preferiblemente, cinc. La formulacion tambien puede incluir un excipiente o agente para estabilizacion de la protelna de composicion de anticuerpo, tal como un tampon, un agente reductor, una protelna de volumen o un carbohidrato. Las protelnas de volumen utiles en la formulacion de protelnas de composicion de anticuerpo incluyen albumina, protamina o similares. Los carbohidratos tlpicos utiles en la formulacion de protelnas de composicion de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La formulacion de protelna de composicion de anticuerpo tambien puede incluir un tensioactivo, que pueden reducir o evitar la agregacion inducida por superficie de la protelna de composicion de anticuerpo causada por la atomizacion de la solucion en la formation de un aerosol. Se pueden emplear diversos tensioactivos convencionales, tales como esteres y alcoholes de acido graso de polioxietileno y esteres de acido graso de polioxietilen sorbitol. Las cantidades generalmente variaran entre el 0,001 y el 14% en peso de la formulacion. Los tensioactivos especialmente preferidos para los propositos de esta invention son monooleato de polioxietileno sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 20 o similares. Los agentes adicionales conocidos en la tecnica para formulacion de una protelna tal como anticuerpos de TNF o partes o variantes especificadas, tambien se pueden incluir en la formulacion.
Administracion de Composiciones de Anticuerpo de TNF Mediante un Nebulizador
Se puede administrar protelna de composicion de anticuerpo mediante un nebulizador, tal como un nebulizador por compresion o un nebulizador ultrasonico. Tlpicamente, en un nebulizador por compresion, se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire de alta velocidad a traves de un orificio. A medida que el gas se expande mas alla de la boquilla, se crea una region de presion baja, que atrae una solucion de protelna de composicion de anticuerpo a traves de un tubo capilar conectado a un deposito de llquido. El chorro de llquido desde el tubo capilar se rompe en filamentos y gotas inestables a medida que sale del tubo, creando el aerosol. Se pueden emplear una variedad de configuraciones, caudales y tipos de tabiques deflectores para conseguir las caracterlsticas de rendimiento deseadas a partir de un nebulizador por compresion dado. En un nebulizador ultrasonico, se usa energla electrica de alta frecuencia para crear energla mecanica vibracional, empleando tlpicamente un transductor piezoelectrico. Esta energla se transmite a la formulacion de protelna de composicion de anticuerpo directamente o a traves de un llquido de acoplamiento, creando un aerosol que incluye la protelna de composicion de anticuerpo. Provechosamente, las partlculas de protelna de composicion de anticuerpo administradas mediante un nebulizador tienen un tamano de partlcula menor de aproximadamente 10 pm, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y mas preferiblemente de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.
Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-TNF adecuadas para uso con un nebulizador, ya sea por compresion o ultrasonico, tlpicamente incluyen una concentration de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una protelna de anticuerpo anti-TNF por ml de solucion. La formulacion puede incluir agentes tales como un excipiente, un tampon, un agente de isotonicidad, un conservante, un tensioactivo y, preferiblemente, cinc. La formulacion tambien puede incluir un excipiente o agente para estabilizacion de la al menos una protelna de composicion de anticuerpo anti-TNF, tal como un tampon, un agente reductor, una protelna de volumen o un carbohidrato. Las protelnas de volumen utiles para formular al menos una protelna de composicion de anticuerpo anti-TNF incluyen albumina, protamina y similares. Los carbohidratos tlpicos utiles para formular al menos un anticuerpo anti-TNF incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La al menos una formulacion de anticuerpo anti-TNF tambien puede incluir un tensioactivo, que puede reducir o evitar la agregacion inducida por superficie del al menos un anticuerpo anti-TNF causada por la pulverization de la solucion en la formacion de un aerosol. Se pueden emplear diversos tensioactivos convencionales, tales como esteres de acidos grasos de polioxietileno y alcoholes y esteres de acidos grasos de polioxietilen sorbitan. Las cantidades generalmente variaran entre el 0,001 y el 4% en peso de la formulacion. Los tensioactivos especialmente preferidos para los propositos de esta invencion son monooleato de polioxietilen sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 20 o similares. Los agentes adicionales conocidos en la tecnica para formulacion de una protelna tal como una protelna de anticuerpo tambien se pueden incluir en la formulacion.
Administracion de Composiciones de Anticuerpo de TNF mediante un Inhalador de Dosis Medida.
En un inhalador de dosis medida (MDI), estan contenidos un propulsor, al menos un anticuerpo anti-TNF y cualquiera de excipientes u otros aditivos en un cartucho como una mezcla que incluye un gas comprimido licuado. El accionamiento de la valvula de medicion libera la mezcla como un aerosol, preferiblemente que contiene partlculas en el intervalo de tamano de menos de aproximadamente 10 pm, preferiblemente aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y mas preferiblemente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm. El tamano de partlcula de aerosol deseado se puede obtener empleando una formulacion de protelna de composicion de anticuerpo producida por diversos metodos conocidos por los especialistas en la tecnica, incluyendo molienda a chorro, secado por pulverizacion, condensation de punto crltico o similares. Los inhaladores de dosis medida preferidos incluyen los fabricados por 3M o Glaxo y que emplean un propulsor de hidrofluorocarbono.
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Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-TNF para uso con un dispositivo inhalador de dosis medida generalmente incluiran un polvo dividido finamente que contiene al menos un anticuerpo anti-TNF como una suspension en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propulsor con la ayuda de un tensioactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado con este proposito, tal como clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarbono, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, dichlorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluroalcano-134a), HFA- 227 (hidrofluroalcano-227) o similares. Preferiblemente, el propulsor es un hidrofluorocarbono. El tensioactivo se puede elegir para estabilizar el al menos un anticuerpo anti-TNF como una suspension en el propulsor, para proteger el agente activo frente a la degradation qulmica y similares. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan, lecitina de soja, acido oleico o similiares. En algunos casos, se prefieren aerosoles de solution que usan disolventes tales como etanol. En la formulation tambien se pueden incluir agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protelna tales como protelna.
Un especialista en la tecnica reconocera que los metodos de la presente invention se pueden conseguir mediante administration pulmonar de al menos una composition de anticuerpo anti-TNF a traves de dispositivos no descritos en este documento.
Formulaciones Orales y Administracion
Las formulaciones para administracion oral dependen de la coadministracion de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y tensoactivos no ionicos tales como polioxietilen oleil eter y n-hexadecilpolietilen eter) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, as! como la coadministracion de inhibidores enzimaticos (por ejemplo, inhibidores de tripsina pancreatica, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradacion enzimatica. El compuesto constituyente activo de la forma farmaceutica de tipo solido para administracion oral puede mezclarse con al menos un aditivo, incluyendo sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma de tragacanto, goma arabiga, gelatina, colageno, caselna, albumina, pollmero sintetico o semisintetico y glicerido. Estas formas farmaceuticas tambien pueden contener otros tipos de aditivos, por ejemplo, agente diluyente inactivo, lubricante tal como estearato de magnesio, parabeno, agente conservante tal como acido sorbico, acido ascorbico, alfa-tocoferol, antioxidante tal como cistelna, disgregante, aglutinante, espesante, agente tamponante, agente edulcorante, agente saporlfero, agente perfumante, etc.
Los comprimidos y plldoras se pueden procesar adicionalmente en preparaciones con recubrimiento enterico. Las preparaciones llquidas para administracion oral incluyen preparaciones de emulsion, jarabe, elixir, suspension y solucion que se pueden usar para uso medico. Estas preparaciones pueden contener agentes diluyentes inactivos usados normalmente en dicho campo, por ejemplo, agua. Los liposomas tambien se han descrito como sistemas de administracion de farmacos para insulina y heparina (Patente de Estados Unidos N° 4.239.754). Mas recientemente, se han usado microesferas de pollmeros artificiales de aminoacidos mixtos (proteinoides) para administrar agentes farmaceuticos (Patente de Estados Unidos N° 4.925.673). Ademas, se conocen en la tecnica los compuestos de vehlculo descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 5.879.681 y 5.871.753 se usan para administrar agentes biologicamente activos por via oral.
Formulaciones y Administracion Mucosa
Para absorcion a traves de superficies de la mucosa, las composiciones y metodos de administracion de al menos un anticuerpo anti-TNF incluyen una emulsion que comprende una pluralidad de partlculas submicrometricas, una macromolecula mucoadhesiva, un peptido bioactivo y una fase continua acuosa, que promueve la absorcion a traves de las superficies de las mucosas consiguiendo la mucoadhesion de las partlculas de emulsion (Patente de Estados Unidos N° 5.514.670). Las superficies mucosas adecuadas para aplicacion de las emulsiones de la presente invencion pueden incluir las vlas de administracion corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para administracion vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao y similares. Las formulaciones para administracion intranasal pueden ser solidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas u oleosas de gotas nasales. Para administracion bucal los excipientes incluyen azucares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidon pregelatinizado y similares (Patente de Estados Unidos N° 5.849.695).
Formulaciones y Administracion Transdermica
Para administracion transdermica, el al menos un anticuerpo anti-TNF se encapsula en un dispositivo de administracion tal como un liposoma o nanopartlculas polimericas, micropartlculas, microcapsulas o microesferas (denominadas colectivamente como micropartlculas a menos que se indique de otra manera). Se conocen varios dispositivos adecuados, incluyendo micropartlculas hechas de pollmeros sinteticos tales como polihidroxiacidos tales como acido polilactico, acido poliglicolico y copollmeros de los mismos, poliortoesteres, polianhldridos y
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polifosfacenos y pollmeros naturales tales como colageno, poliaminoacidos, albumina y otras protelnas, alginato y otros polisacaridos y combinaciones de los mismos (Patente de Estados Unidos N° 5.814.599).
Administracion Prolongada y Formulaciones
Algunas veces puede ser deseable administrar los compuestos de la presente invencion al sujeto durante periodos de tiempo prolongados, por ejemplo, durante periodos de una semana a un ano a partir de una administracion unica. Se pueden utilizar diversas formas farmaceuticas de liberacion lenta, prolongada o de implante. Por ejemplo, una forma farmaceutica puede contener una sal farmaceuticamente aceptable no toxica de los compuestos que tiene un bajo grado de solubilidad en los llquidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adicion de acido con un acido polibasico tal como acido fosforico, acido sulfurico, acido cltrico, acido tartarico, acido tanico, acido pamoico, acido alglnico, acido poliglutamico, acidos mono- o di-sulfonicos de naftaleno, acido poligalacturonico y similares; (b) una sal con un cation metalico polivalente tal como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, nlquel, cadmio y similares o con un cation organico formado a partir de, por ejemplo, N,N'-dibencil- etilendiamina o etilendiamina; (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una sal de tanato de cinc. Adicionalmente, los compuestos de la presente invencion o, preferiblemente, una sal relativamente insoluble tal como las que se acaban de describir, se pueden formular en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio, por ejemplo, aceite de sesamo, adecuado para inyeccion. Las sales particularmente preferidas son las sales de cinc, sales de tanato de cinc, sales de pamoato y similares. Otro tipo de formulacion de liberacion lenta prolongada para inyeccion podrla contener el compuesto o sal dispersado para encapsularse en un pollmero de degradacion lenta, no toxico, no antigenico tal como un pollmero de acido polilactico/acido poliglicolico, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N° 3.773.919. Los compuestos o, preferiblemente, sales relativamente insolubles tales como las que se han descrito anteriormente tambien se pueden formular en granulos silasticos de matriz de colesterol, particularmente para uso en animales. En la bibliografla se conocen formulaciones de liberacion lenta, prolongada o de implante adicionales, por ejemplo, liposomas de gas o llquido (Patente de Estados Unidos N° 5.770.222 y “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N. Y. 19778).
Habiendo descrito la invencion en general, la misma se apreciara mas facilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustracion y no tienen por objeto ser limitantes.
Ejemplo 1: Clonacion y Expresion de anticuerpo de TNF en Celulas de Mamffero
Un vector de expresion de mamlfero tlpico contiene al menos un elemento promotor, que media el inicio de la transcripcion de ARNm, la secuencia codificante de anticuerpo y senales necesarias para la terminacion de transcripcion y poliadenilacion del transcrito. Los elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donadores y aceptores para corte y empalme de ARN. La transcripcion altamente eficaz se puede conseguir con los promotores temprano y tardlo de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRS) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, tambien se pueden usar elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humano). Los vectores de expresion adecuados para su uso en la practica de la presente invencion incluyen, por ejemplo, vectores tales como pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL y PmSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las celulas huesped de mamlfero que se podrlan usar incluyen celulas Hela 293, h9 y de Jurkat, celulas NIH3T3 y C127 de raton, celulas Cos 1, Cos 7 y CV 1, celulas quail QC1-3, celulas L de raton y celulas de ovario de hamster chino (CHO).
Como alternativa, el gen se puede expresar en llneas celulares estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La cotransfeccion con un marcador de seleccion tal como dhfr, gpt, neomicina o higromicina permite la identificacion y aislamiento de las celulas transfectadas.
El gen transfectado tambien se puede amplificar para expresar grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es util para desarrollar llneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interes. Otro marcador de seleccion util es la enzima glutamina sintetasa (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227: 277-279) (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Usando estos marcadores, las celulas de mamlfero se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las celulas con mayor resistencia. Estas llneas celulares contienen el gen o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Las celulas de ovario de hamster chino (CHO) y NSO se usan con frecuencia para la produccion de anticuerpos.
Los vectores de expresion pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)) mas un fragmento del potenciador de CMV (Boshart, et al., Cell 41: 521-530 (1985)). Multiples sitios de clonacion, por ejemplo, con los sitios de escision de enzimas de restriccion BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonacion del gen de interes. Los vectores contienen ademas el intron 3', la senal de poliadenilacion y terminacion del gen de preproinsulina de la rata.
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Clonacion y Expresion en Celulas CHO
El vector pC4 se usa para la expresion de anticuerpo de TNF. El plasmido pC4 es un derivado del plasmido pSV2-dhfr (N° de acceso de la ATCC 37146). El plasmido contiene el gen de DHFR de raton bajo el control del promotor temprano de SV40. Las celulas de ovario de hamster chino u otras celulas que carecen de actividad de dihidrofolato que se transfectan con estos plasmidos se pueden seleccionar cultivando las celulas en un medio selectivo (por ejemplo, alfa-MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el agente quimioterapeutico metotrexato. La amplificacion de los genes de DHFR en las celulas resistentes a metotrexato (MTX) se ha documentado bien (vease, por ejemplo, F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); J. L. Hamlin L y C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990) y M. J. Page y M. A. Sydenham, Biotecnology 9: 64-68 (1991)). Las celulas cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al farmaco mediante la superproduccion de la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificacion del gen de DHFR. Si se une un segundo gen al gen de DHFR, habitualmente se coamplifica y se sobreexpresa. En la tecnica se conoce que este enfoque se puede usar para desarrollar llneas celulares que portan mas de 1.000 copias del gen o los genes amplificados. Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen llneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o mas cromosomas de la celula huesped.
El plasmido pC4 contiene para la expresion del gen de interes el promotor fuerte de la repeticion terminal larga (LTR) del Virus de Sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol 5: 438-447 (1985)) mas un fragmento aislado del potenciador del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) (Boshart, et al., Cell 41:521530 (1985)). Cadena abajo del promotor estan los sitios de escision de enzimas de restriccion BamHI, Xbal y Asp718 que permiten la integracion de los genes. Detras de estos sitios de clonacion el plasmido contiene el intron 3' y el sitio de poliadenilacion del gen de preproinsulina de rata. Tambien se pueden usar otros promotores de alta eficacia para la expresion, por ejemplo, del promotor de b-actina humano, los promotores temprano o tardlo de SV40 o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI. Los sistemas de expresion genica de Clontech Tet-Off y Tet-On y sistemas similares se pueden usar para expresar el TNF de una manera regulada en celulas de mamlfero (M. Gossen y H. Bujard, Proc. Natl., Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992). Para la poliadenilacion del ARNm tambien se pueden usar otras senales, por ejemplo, de los genes de hormona de crecimiento humana o de globina. Tambien se pueden seleccionar llneas celulares estables que portan un gen de interes integrado en los cromosomas tras la cotransfeccion con un marcador de seleccion tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar mas de un marcador de seleccion al principio, por ejemplo, G418 mas metotrexato.
El plasmido pC4 se digiere con enzimas de restriccion y despues se desfosforila usando fosfatasa intestinal de ternero mediante procedimientos conocidos en el tecnica. Despues el vector se alsla a partir de un gel de agarosa al 1%.
La region variable y constante aislada que codifica ADN y el vector desfosforilado se ligan despues con ADN ligasa T4. Despues, celulas HB101 o XL-1 Blue de E. coli se transforman y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plasmido pC4 usando, por ejemplo, analisis de enzimas de restriccion.
Para la transfeccion se usan celulas de ovario de hamster chino (CHO) que carecen de un gen de DHFR activo. 5 g del plasmido de expresion pC4 se cotransfectan con 0,5 g del plasmido pSV2-neo usando lipofectina. El plasmido pSV2neo contiene un marcador de seleccion dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibioticos incluyendo G418. Las celulas se siembran en alfa-MEM complementado con 1 g/ml de G418. Despues de 2 dlas, las celulas se tratan con tripsina y se siembran en placas de clonacion de hibridoma (Greiner, Alemania) en alfa-MEM complementado con 10, 25 o 50 ng/ml de metotrexato mas 1 g/ml de G418. Despues de aproximadamente 10-14 dlas se tratan con tripsina clones unicos y despues se siembran en placas de petri de 6 pocillos o matraces de 10 ml usando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las concentraciones mas altas de metotrexato se transfieren despues a placas nuevas de 6 pocillos que contienen concentraciones aun mas altas de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentracion de 100-200 mM. La expresion del producto genico deseado se analiza, por ejemplo, mediante SDS- PAGE y transferencia de Western o mediante analisis de HPLC de fase inversa.
Ejemplo 2: Generacion de Anticuerpos Monoclonales de IgG Humana de Afinidad Alta Reactivos con TNF Humano Usando Ratones Transgenicos
Sumario
Se han usado ratones transgenicos que contienen genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana para generar anticuerpos monoclonales de afinidad alta completamente humanos que se pueden usar terapeuticamente para inhibir la accion de TNF para el tratamiento de una o mas enfermedades mediadas por TNF. Ratones hlbridos (CBA/J x C57BL6/J)F2 que contienen transgenes de anticuerpos de region variable y constante humanos para cadenas tanto pesada como ligera se inmunizan con TNF recombinante humano (Taylor et al., Intl.
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Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg, et al., Nature 368: 856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14: 826); Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)). Varias fusiones produjeron uno o mas paneles de anticuerpos monoclonales de IgG reactivos con TNF completamente humanos. Los anticuerpos anti-TNF completamente humanos se caracterizaron adicionalmente. Todos son lgG1. Tales anticuerpos se observa que tienen constantes de afinidad entre 1 x 109 y 9 x 1012. Las afinidades inesperadamente altas de estos anticuerpos monoclonales completamente humanos los hacen candidatos adecuados para aplicaciones terapeuticas en enfermedades, patologlas o trastornos relacionados con TNF.
Abreviaturas
BSA - albumina serica bovina
CO2 - dioxido de carbono
DMSO - dimetilsulfoxido
EIA - inmunoensayo enzimatico
FBS - suero fetal bovino
H2O2 - peroxido de hidrogeno
HRP - peroxidasa de rabano picante
ID - intradermico
Ig - inmunoglobulina
TNF - factor de necrosis tisular alfa
IP - intraperitoneal
IV - intravenoso
Mab - anticuerpo monoclonal
DO - densidad optica
OPD - diclorhidrato de o-fenilendiamina
PEG - polietilenglicol
PSA - penicilina, estreptomicina, anfotericina
RT - temperatura ambiente
SC - subcutaneo
v/v - volumen por volumen
p/v - peso por volumen
Materiales y Metodos
Animales
En la tecnica se conocen ratones transgenicos que pueden expresar anticuerpos humanos (y estan disponibles en el mercado (por ejemplo, en GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA y otros) que expresan inmunoglobulinas humanas pero no IgM o Ig de raton. Por ejemplo, tales ratones transgenicos contienen transgenes de secuencia humana que experimentan union V(D) J, cambio de clase de cadena pesada y mutacion somatica para generar un repertorio de inmunoglobulinas de secuencia humana (Lonberg, et al., Nature 368: 856-859 (1994)). El transgen de cadena ligera se puede obtener, por ejemplo, en parte de un clon de cromosoma artificial de levadura que incluye casi la mitad de la region V humana de llnea germinal. Ademas, el transgen de cadena pesada puede codificar regiones constantes tanto p humana como 1 (Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)) y/o 3 humana. Se pueden usar ratones obtenidos a partir de linajes genotlpicos apropiados en los procesos de inmunizacion y fusion para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos contra TNF.
Inmunizacion
Se puede usar uno o mas programas de inmunizacion para generar los hibridomas anti-TNF humano. Las primeras varias fusiones se pueden realizar despues del protocolo de inmunizacion ilustrativo siguiente, pero se pueden usar otros protocolos conocidos similares. Varios ratones macho transgenicos quirurgicamente castrados y/o hembras de 14-20 semanas de edad se inmunizan IP y/o ID con 1-1000 pg de TNF humano recombinante emulsionado con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante completo de Freund en un volumen final de 100-400 pl (por ejemplo, 200). Cada raton tambien puede recibir opcionalmente 1-10 pg en 100 pl de solucion salina fisiologica en cada uno de 2 sitios SC. Despues los ratones se pueden inmunizar 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 y/o 21-34 dlas despues IP (1-400 pg) y SC (1-400 pg x 2) con TNF emulsionado con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante incompleto de Freund. Se pueden tomar muestras de sangre de los ratones 12-25 y 25-40 dlas despues mediante puncion retroorbitaria sin anticoagulante. Despues, se deja que la sangre coagule a temperatura ambiente durante una hora y el suero se recoge y se titula usando un ensayo de EIA de TNF de acuerdo con metodos conocidos. Las fusiones se realizan cuando las inyecciones repetidas no provocan aumento de los tltulos. En ese momento, se proporciona a los ratones una inyeccion de refuerzo IV final de 1-400 pg de TNF diluido en 100 pl de solucion salina fisiologica. Tres dlas despues, los ratones se pueden eutanasiar mediante dislocation cervical y los bazos extirparse de forma aseptica y sumergirse en 10 pl de solucion salina tamponada con fosfato frla (PBS) que
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contiene 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 0,25 mg/ml de anfotericina B (PSA). Los esplenocitos se recogen perfundiendo de forma esteril el bazo con PSA-PBs. Las celulas se lavan una vez en PSA-PBS frlo, se recuentan usando exclusion de colorante Tripan azul y se resuspenden en medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM.
Fusion Celular
La fusion se puede realizar en una proportion de 1:1 a 1:10 de celulas de mieloma murinas respecto a celulas de bazo viables de acuerdo con metodos conocidos, por ejemplo, como se conoce en el tecnica. Como un ejemplo no limitante, las celulas de bazo y celulas de mieloma se pueden sedimentar juntas. Despues, el sedimento se puede resuspender lentamente, durante 30 segundos, en 1 ml de solution de PEG/PBS al 50% (p/v) (peso molecular de pEg 1.450, Sigma) a 37°C. Despues la fusion se puede detener anadiendo lentamente 10,5 ml de medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM (37°C) durante 1 minuto. Las celulas fusionadas se centrifugan durante 5 minutos a 500-1500 rpm. Despues las celulas se resuspenden en medio HAT (medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM, suero Fetal de Clon I al 10% (Hyclone), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 10 mg/ml de gentamicina, complemento de cultivo Origen al 2,5% (Fisher), medio RPMI 1640/Hepes acondicionado con 653 al 10%, 2-mercaptoetanol 50 mM, hipoxantina 100 mM, aminopterina 0,4 mM y timidina 16 mM) y despues se siembran en placas a 200 ml/pocillo en quince placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Despues las placas se colocan en una incubadora humidificada a 37°C que contiene CO2 al 5 % y el 95% de aire durante 7-10 dlas.
Deteccion de Anticuerpos Anti-TNF de IgG Humana en Suero de Raton
Se puede usar ElA en fase solida para explorar sueros de raton para determinar anticuerpos de IgG humanos especlficos para TNF humano. En resumen, se pueden recubrir placas con TNF a 2 mg/ml en PBS durante una noche. Despues de lavar en solucion salina 0,15 M que contiene Tween 20 al 0,02% (v/v), los pocillos se pueden bloquear con BSA al 1% (p/v) en PBS, 200 ml/pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se usan inmediatamente o se congelan a -20°C para uso futuro. Las diluciones de suero de raton se incuban en las placas recubiertas con TNF a 50 ml/pocillo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan y despues se sondan con 50 ml/pocillo de anti-IgG humana de cabra marcado con HRP, Fc especlfico diluido 1:30.000 en BSA- PBS al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se pueden lavar y se anaden 100 ml/pocillo de la solucion de sustrato de citrato-fosfato (acido cltrico 0,1 M y fosfato sodico 0,2 M, H2O2 al 0,01% y 1 mg/ml de OPD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues se anade solucion de parada (acido sulfurico 4 N) a 25 ml/pocillo y se leen las DO a 490 nm mediante un espectrofotometro de placas automatico.
Deteccion de Inmunoglobulinas Completamente Humanas en Sobrenadantes de Hibridoma.
Se pueden detectar hibridomas de cultivo positivo que secretan inmunoglobulinas completamente humanas usando un EIA adecuado. En resumen, se pueden recubrir placas Pop-out de 96 pocillos (VWR, 610744) con 10 mg/ml de Fc anti-IgG humana de cabra en tampon carbonato de sodio durante una noche a 4°C. Las placas se lavan y se bloquean con BSA-PBS al 1% durante una hora a 37°C y se usan inmediatamente o se congelan a -20°C. Los sobrenadantes de hibridoma no diluidos se incuban en las placas durante una hora a 37°C. Las placas se lavan y se sondan con anti-kappa humana de cabra marcada con HRP diluida en 1:10.000 en BSA-PBS al 1% durante una hora a 37°C. Despues las placas se incuban con solucion de sustrato como se ha descrito anteriormente.
Determinacion de Reactividad de Anti-TNF Completamente Humano
Como anteriormente, se pueden ensayar simultaneamente hibridomas para determinar la reactividad contra TNF usando un RIA adecuado u otro ensayo. Por ejemplo, los sobrenadantes se incuban en Fc anti-IgG humana de cabra como anteriormente, se lavan y despues se sondan con TNF marcado radiactivamente con recuentos apropiados por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan dos veces con PBS y se cuantifica el TNF marcado radiactivamente unido usando un contador adecuado.
Los hibridomas que secretan lgG1 humana anti-TNF se pueden expandir en cultivo celular y subclonarse en serie mediante dilution limitante. Las poblaciones clonales resultantes se pueden expandir y crioconservar en medio de congelation (FBS al 95% y DMSO al 5%) y almacenarse en nitrogeno llquido.
Isotipado.
La determinacion de isotipo de los anticuerpos se puede conseguir usando un EIA en un formato similar al usado para explorar los sueros inmunes de raton para tltulos especlficos. Se pueden recubrir placas de 96 pocillos con TNF como se ha descrito anteriormente y se puede incubar anticuerpo purificado a 2 mg/ml en la placa durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lava y se sonda con anti-lgG1 humana de cabra marcado con HRP o anti-lgG3 humana de cabra marcado con HRP diluidos a 1:4000 en BSA-PBS al 1% durante una hora a temperatura ambiente. De nuevo, la placa se lava y se incuba con solucion de sustrato como se ha descrito anteriormente.
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Cinetica de Union de Anticuerpos Humanos Anti-TNF Humano con TNF Humano
Las caracterlsticas de union de los anticuerpos se pueden evaluar de forma adecuada usando una tecnologla de EIA y Biacore de captura de TNF, por ejemplo. Concentraciones clasificadas de anticuerpos de TNF humanos purificados se pueden evaluar para determinar la union a placas de EIA recubiertas con 2 mg/ml de TNF en ensayos como se ha descrito anteriormente. Despues, las DO se pueden presentar como representaciones semilogarltmicas que muestran eficacias de union relativas.
Se pueden obtener las constantes de union cuantitativas, por ejemplo, de la forma siguiente o por cualquier otro metodo adecuado conocido. Una microplaca Biacore CM-5 (carboximetilo) se coloca en una unidad Biacore 2000. Se hace fluir tampon HBS (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005% v/v, pH 7,4) sobre una celda de flujo de la microplaca a 5 ml/minuto hasta que se obtiene una medida basal estable. Una solucion (100 ml) de 15 mg de EDC (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida) en 200 ml de agua se anade a 100 ml de una solucion de 2,3 mg de NHS (N-hidroxisuccinimida) en 200 ml de agua. Cuarenta (40) ml de la solucion resultante se inyectan en la microplaca. Seis ml de una solucion de TNF humano (15 mg/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 4,8) se inyectan en la microplaca, dando como resultado un aumento de aproximadamente 500 RU. El tampon se cambia a tampon de procesamiento TBS/Ca/Mg/BSA (Tris 20 mM, cloruro de sodio 0,15 M cloruro de calcio 2 mM, acetato de magnesio 2 mM, Triton X-100 al 0,5%, 25 mg/ml de BSA, pH 7,4) y se hace fluir sobre la microplaca durante la noche para equilibrarla y para hidrolizar o proteger cualquier ester de succinimida que no haya reaccionado.
Los anticuerpos se disuelven en el tampon de procesamiento a 33,33, 16,67, 8,33 y 4,17 nM. El caudal se ajusta a 30 ml/min y la temperatura del instrumento a 25°C. Se usan dos celdas de flujo para los procesamientos de cinetica, una en la que se habla inmovilizado TNF (muestra) y una segunda celda de flujo no derivatizada (blanco). 120 ml de cada concentracion de anticuerpo se inyectan sobre las celdas de flujo a 30 ml/min (fase de asociacion), seguido de 360 segundos ininterrumpidos de flujo de tampon (fase de disociacion). La superficie de la microplaca se regenera (se disocia el complejo factor de necrosis tisular alfa/anticuerpo) mediante dos inyecciones secuenciales de 30 ml cada una de tiocianato de guanidina 2 M.
El analisis de los datos se realiza usando BIA Evaluation 3.0 o CLAMP 2.0, como se conoce en la tecnica. Para cada concentracion de anticuerpo el sensograma del blanco se resta del sensograma de la muestra. Se realiza un ajuste global tanto para la constante de disociacion (Kd, s'1) como para la de asociacion (Ka, mol-1 s'1) y se calcula la constante de disociacion (Kd, mol) (kd/ka). Cuando la afinidad del anticuerpo es lo suficientemente alta para que las RU de anticuerpo capturado sean >100, se procesan diluciones adicionales del anticuerpo.
Resultados y Discusion
Generacion de Anticuerpos Monoclonales anti-TNF Humano
Se realizan varias fusiones y cada fusion se siembra en 15 placas (1440 pocillos/fusion) que producen varias docenas de anticuerpos especlficos para TNF humano. De estos, se observa que algunos consisten en una combinacion de cadenas de Ig humana y de raton. Los hibridomas restantes secretan anticuerpos anti-TNF que consisten unicamente en cadenas pesada y ligera humanas. De los hibridomas humanos se espera que todos sean lgG1.
Cinetica de Union de Anticuerpos Humanos Anti-TNF Humano
El analisis de ELISA confirma que los anticuerpos purificados a partir de la mayorla o de todos estos hibridomas se unen a TNF de una manera dependiente de la concentracion. Las Figuras 1-2 muestran los resultados de la eficacia de union relativa de estos anticuerpos. En este caso, se mide la avidez del anticuerpo por su antlgeno afln (epltopo). Se ha de observar que la union de TNF directamente a la placa de EIA puede provocar la desnaturalizacion de las protelnas y las afinidades de union aparentes pueden no reflejar la union a protelna desnaturalizada. Se observa union del cincuenta por ciento a lo largo de un intervalo de concentraciones.
Las constantes de union cuantitativas se obtienen usando analisis Biacore de los anticuerpos humanos y revelan que varios de los anticuerpos monoclonales humanos tienen una afinidad muy alta con KD en el intervalo de 1 x 10-9 a 7 x 10-12.
Conclusiones
Se realizan varias fusiones usando esplenocitos a partir de ratones hlbridos que contienen transgenes de anticuerpo de region variable constante humanos que se inmunizan con TNF humano. Se genera un conjunto de varios anticuerpos monoclonales de IgG reactivos con TNF completamente humanos del isotipo lgG1. Los anticuerpos anti-TNF completamente humanos se caracterizan adicionalmente. Varios de los anticuerpos generados tienen constantes de afinidad entre 1 x 109 y 9 x 1012. Las afinidades inesperadamente altas de estos anticuerpos
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monoclonales completamente humanos los hacen adecuados para aplicaciones terapeuticas en enfermedades, patologlas o afecciones relacionadas dependientes de TNF.
Ejemplo 2: Generacion de Anticuerpos Monoclonales de IgG Humanos Reactivos a TNFa Humano
Sumario
Ratones hlbridos (CBA/J x C57BL/6J)F2 (1-4) que contienen transgenes de anticuerpos de region variable y constante humana para cadenas tanto pesada como ligera se inmunizaron con TNFa humano recombinante. Una fusion, denominada GenTNV, produjo ocho anticuerpos monoclonales IgG1k completamente humanos que se unen a TNFa humano recombinante inmovilizado. Poco despues de la identificacion, las ocho llneas celulares se transfirieron a Molecular Biology para una caracterizacion adicional. Ya que estos mAb tienen una secuencia totalmente humana, se espera que los mismos sean menos inmunogenos que cA2 (Remicade) en seres humanos.
Abreviaturas
BSA - albumina serica bovina
CO2 - dioxido de carbono
DMSO - dimetilsulfoxido
EIA - inmunoensayo enzimatico
FBS - suero fetal bovino
H2O2 - peroxido de hidrogeno
HRP - peroxidasa de rabano picante
ID - intradermico
Ig - inmunoglobulina
TNF - factor de necrosis tisular alfa
IP - intraperitoneal
IV - intravenoso
Mab - anticuerpo monoclonal
DO - densidad optica
OPD - diclorhidrato de o-fenilendiamina
PEG - polietilenglicol
PSA - penicilina, estreptomicina, anfotericina
RT - temperatura ambiente
SC - subcutaneo
v/v - volumen por volumen
p/v - peso por volumen
Introduccion
Ratones transgenicos que contienen genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humanos se utilizaron para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos que son especlficos para TNFa humano recombinante. Se espera que estos anticuerpos unicos se puedan usar, de la misma forma que cA2 (Remicade) se usa para inhibir terapeuticamente los procesos inflamatorios implicados en enfermedades mediadas por TNFa con el beneficio de semivida en suero aumentada y efectos secundarios disminuidos en relacion con la inmunogenicidad.
Materiales y Metodos
Animales
Ratones transgenicos que expresan inmunoglobulinas humanas, pero no IgM o Igk de raton, se han desarrollado por GenPharm International. Estos ratones contienen transgenes de anticuerpos humanos funcionales que experimentan union V(D)J, cambio de clase de cadena pesada y mutacion somatica para generar un repertorio de inmunoglobulinas humanas especlficas de antlgeno (1). Los transgenes de cadena ligera se obtienen en parte de un clon de cromosoma artificial de levadura que incluye casi la mitad del locus de Vk humano de llnea germinal. Ademas de varios genes de VH, el transgen de cadena pesada (HC) codifica las regiones constantes tanto m humana como g1 (2) y/o g3 humana. Un raton obtenido del linaje genotlpico HCo12/KCo5 se uso en el proceso de inmunizacion y fusion para generar los anticuerpos monoclonales descritos en este documento.
Purificacion de TNFa Humano
Se purifico TNFa humano a partir de sobrenadante de cultivo de tejido de celulas C237A mediante cromatografla por afinidad usando una columna rellenada con la protelna de fusion receptor TNFa-Fc (p55-sf2) (5) acoplada a Sepharose 4B (Pharmacia). El sobrenadante celular se mezclo con una novena parte de su volumen de PBS de Dulbecco 10x (D-PBS) y se paso a traves de la columna a 4°C a 4 ml/min. Despues la columna se lavo con
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PBS y el TNFa se eluyo con citrato de sodio 0,1 M, pH 3,5 y se neutralizo con Tris-HCI 2 M pH 8,5. El TNFa purificado se sometio a intercambio de tampon en Tris 10 mM, cloruro de sodio 0,12 M, pH 7,5 y se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,2 pm.
Inmunizaciones
Un raton GenPharm hembra, de aproximadamente 16 semanas de edad, se inmunizo IP (200 pl) e ID (100 pl en la base de la cola), con un total de 100 pg de TNFa (lote JG102298 o JG102098) emulsionado con un volumen igual de adyuvante Titermax los dlas 0, 12 y 28. Se tomaron muestras de sangre del raton los dlas 21 y 35 mediante puncion retroorbitaria sin anticoagulante. Se dejo que la sangre coagulara a temperatura ambiente durante una hora y el suero se recogio y titulo usando un ensayo de EIA en fase solida de TNFa. La fusion, denominada GenTNV, se realizo despues de dejar descansar al raton durante siete semanas despues de la inyeccion del dla 28. Al raton, con un titulo de IgG humana especlfico de 1:160 frente a TNFa, se le proporciono despues una inyeccion de refuerzo IV final de 50 pg de TNFa diluido en 100 pl de solucion salina fisiologica. Tres dlas despues, el raton se eutanasio por dislocacion cervical y se extirpo el bazo asepticamente y se sumergio en 10 ml de solucion salina tamponada con fosfato frla (PBS) que contenla 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B (PSA). Los esplenocitos se recogieron prefundiendo de forma esteril el bazo con PSA-PBS. Las celulas se lavaron una vez en PSA-PBS frlo, se contaron usando un contador Coulter y se resuspendieron en medio RPMI 1640 que contenla Hepes 25 mM.
Lfneas celulares
El companero de fusion de mieloma de raton no secretor, 653 se recibio en el grupo Cell Biology Services (CBS) el 5-14-97 a partir del grupo Centocor's Product Development. La linea celular se expandio en medio RPMI (JRH Biosciences) complementado con FBS al 10% (v/v) (Celll Culture Labs), piruvato de sodio 1 mM, NEAA 0,1 mM, L-glutamina 2 mM (todos de JRH Biosciences) y se crioconservo en FBS al 95% y DMSO al 5% (Sigma), despues se almaceno en un congelador de nitrogeno liquido en fase de vapor en CBS. El banco celular era esteril (Quality Control Centocor, Malvern) y estaba libre de micoplasma (Bionique Laboratories). Las celulas se mantuvieron en cultivo de fase logaritmica hasta la fusion. Se lavaron en pBs, se contaron y se determino la viabilidad (>95%) por exclusion de colorante tripan azul antes de la fusion.
Una linea celular recombinante, denominada C237A, generada en Molecular Biology en Centocor produjo TNFa humano. La linea celular se expandio en medio IMDM (JRH Biosciences) complementado con FBS al 5% (v/v) (Cell Culture Labs), L-glutamina 2 mM (todos de JRH Biosciences) y 0,5 pg/ml de acido micofenolico y se crioconservo en FBS al 95% y DMSO al 5% (Sigma), despues se almaceno en un congelador de nitrogeno liquido en fase de vapor en CBS (13). El banco celular era esteril (Quality Control Centocor, Malvern) y estaba libre de micoplasma (Bionique Laboratories).
Fusion Celular
La fusion celular se realizo usando una proporcion 1:1 de celulas de mieloma murinas 653 y celulas de bazo murinas viables. En resumen, las celulas de bazo y las celulas de mieloma se sedimentaron juntas. El sedimento se resuspendio lentamente a lo largo de un periodo de 30 segundos en 1 ml de solucion de PEG/PBS al 50% (p/v) (peso molecular de PEG de 1.450 g/mol, Sigma) a 37°C. La fusion se detuvo anadiendo lentamente 10,5 ml de medio RPMI (sin aditivos) (JRH) (37°C) durante 1 minuto. Las celulas fusionadas se centrifugaron durante 5 minutos a 750 rpm. Despues, las celulas se resuspendieron en medio HAT (medio RPMI/HEPES que contenla suero fetal bovino al 10% (JRH), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM, 10 pg/ml de gentamicina, complemento de cultivo Origen al 2,5% (Fisher), 2-mercaptoetanol 50 pM, medio RPMI acondicionado con 653 al 1%, hipoxantina 100 pM, aminopterina 0,4 pM y timidina 16 pM) y despues se sembraron a 200 pl/pocillo en cinco placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Despues las placas se colocaron en una incubadora a 37°C humidificada que contenla CO2 al 5% y el 95% de aire durante 7-10 dlas.
Deteccion de Anticuerpos Anti-TNFa de IgG Humana en Suero de Raton
Se usaron ELA en fase solida para explorar sueros de raton para anticuerpos de IgG humanos especificos para TNFa humano. En resumen, las placas se recubrieron con TNFa a 1 pg/ml en PBS durante una noche. Despues de lavar en solucion salina 0,15 M que contenia Tween 20 al 0,02% (v/v), los pocillos se bloquearon con BSA al 1% (p/v) en PBS, 200 pl/pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se usaron inmediatamente o se congelaron a -20°C para un uso futuro. Los sueros de raton se incubaron en diluciones seriadas dobles en las placas recubiertas con TNFa humano a 50 pl/pocillo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron y despues se sondaron con 50 pl/pocillo de anti-IgG humana de cabra marcado con HRP, Fc especifico (Accurate) diluido 1:30.000 en BSA-PBS al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron y se anadieron 50 pl/pocillo de la solucion de sustrato de citrato-fosfato (acido citrico 0,1 M y fosfato de sodio 0,2 M, H2O2 al 0,01% y 1 mg/ml de OPD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues se
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anadio solucion de parada (acido sulfurico 4 N) a 25 ml/pocillo y se leyeron las DO a 490 nm usando un espectrofotometro de placas automatico.
Deteccion de Inmunoglobulinas Completamente Humanas en Sobrenadantes de Hibridoma
Debido a que el raton de GenPharm es capaz de generar cadenas de inmunoglobulina tanto de raton como humanas, se usaron dos ensayos de EIA separados para ensayar los clones de hibridoma de cultivo positivo para determinar la presencia de tanto cadenas ligeras humanas como cadenas pesadas humanas. Las placas se recubrieron como se ha descrito anteriormente y los sobrenadantes de hibridomas no diluidos se incubaron en las placas durante una hora a 37°C. Las placas se lavaron y se sondaron con anticuerpo anti-kappa humana de cabra conjugado con HRP (Southern Biotech) diluido 1:10.000 en BSA-HBSS al 1% o anticuerpo especlfico de Fc anti-IgG humana de cabra conjugado con HRP diluido a 1:30.000 en BSA-HBSS al 1% durante una hora a 37°C. Despues las placas se incubaron con solucion de sustrato como se ha descrito anteriormente. Se descartaron los clones de hibridoma que no daban una senal positiva en los formatos de EIA tanto de anti-kappa como Fc anti-IgG humana.
Isotipado
La determination de isotipo de los anticuerpos se consiguio usando un EIA en un formato similar al usado para explorar los sueros inmunes de raton para tltulos especlficos. Las placas de EIA se recubrieron con anti-IgG humana de cabra (H+L) en tampon de carbonato de sodio durante una noche a 4°C y se bloquearon como se ha descrito anteriormente. Los sobrenadantes puros de cultivos de 24 pocillos se incubaron en la placa durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lavo y se sondo con lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 ant-humana de cabra marcado con HRP (Binding Site) diluido a 1:4000 en BSA-PBS al 1% durante una hora a temperatura ambiente. De nuevo, la placa se lavo y se incubo con solucion de sustrato como se ha descrito anteriormente.
Resultados y Discusion.
Generacion de Anticuerpos Monoclonales Anti-TNFa Humano Completamente Humanos
Una fusion, denominada GenTNV, se realizo a partir de un raton de GenPharm inmunizado con protelna TNF-a humana recombinante. A partir de esta fusion, se seleccionaron 196 hlbridos de cultivo positivo. Se identificaron ocho llneas de celulas de hibridoma que secretaban anticuerpos de IgG completamente humanos reactivos con TNFa humano. Estas ocho llneas celulares secretaban cada una inmunoglobulinas del isotipo IgG1k humano y todas se subclonaron dos veces mediante dilution limitante para obtener llneas celulares estables (>90% homogeneas). Los nombres de la llnea celular y las denominaciones de codigo C respectivas se enumeran en la Tabla 1. Cada una de las llneas celulares se congelo en bancos celulares de investigation de 12 viales almacenadas en nitrogeno llquido.
Las celulas parentales recogidas de los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos para cada una de las ocho llneas celulares se pasaron al grupo Molecular Biology el 18-02-99 para una transfection y caracterizacion adicional.
Tabla 1: Denominaciones de Llnea Celular de GenTNV
Nombre
Denominacion de Codigo C
GenTNV14.17.12
C414A
GenTNV15.28.11
C415A
GenTNV32.2.16
C416A
GenTNV86.14.34
C417A
GenTNV118:3.36
C418A
GenTNV122.23.2
C419A
GenTNV148.26.12
C420A
GenTNV196.9.1
C421A
Conclusion
La fusion de GenTNV se realizo utilizando esplenocitos de un raton hlbrido que contenla transgenes de anticuerpo de region variable y constante humanos que se inmunizo con TNFa humano recombinante preparado en Centocor. Se generaron ocho anticuerpos monoclonales de IgG reactivos contra TNFa completamente humanos del isotipo IgG1k. Las llneas celulares parentales se transfirieron al grupo Molecular Biology para caracterizacion y desarrollo adicional. Uno de estos nuevos anticuerpos humanos puede ser util como antiinflamatorio con el beneficio potencial de una inmunogenicidad y complicaciones de tipo alergico disminuidas en comparacion con Remicade.
Bibliografla
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1. Taylor, et al., International Immunology 6: 579.591 (1993).
2. Lonberg, et al., Nature 368: 856-859 (1994).
3. Neuberger, M. Nature Biotechnology 14: 826 (1996).
4. Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996).
5. Scallon, et al., Cytokine 7: 759-770 (1995).
Ejemplo 3: Clonacion y Preparacion de Lfneas Celulares que Expresan Anticuerpos anti-TNFa Humano Sumario
Se observo que un panel de ocho anticuerpos monoclonales humanos (mAb) con una denominacion TNV se unlan a TNFa humano inmovilizado con una avidez aparentemente alta. Siete de los ocho mAb demostraron ser eficaces para bloquear la union de huTNFa a un receptor de TNF recombinante. El analisis de secuencia del ADN que codifica los siete mAb confirmo que todos los mAb tenlan regiones V humanas. Las secuencias de ADN tambien mostraron que tres pares de los mAb eran identicos entre si, de forma que el panel original de ocho mAb contenla solo cuatro mAb diferentes, representados por TNV14, TNV15, TNV148 y TNV196. Basandose en los analisis de las secuencias de aminoacidos deducidas de los mAb y los resultados de los datos de neutralization de TNFa in vitro, se seleccionaron los mAb TNV148 y TNV14 para un estudio adicional.
Debido a que el resto de prolina en la position 75 (region flanqueante 3) en la cadena pesada de TNV148 no se encontro en esa posicion en otros anticuerpos humanos del mismo subgrupo durante una busqueda en una base de datos, se realizo mutagenesis de ADN dirigida para codificar un resto de serina en esa posicion para que concordara con secuencias de region flanqueante de llnea germinal conocidas. Los mAb modificados con serina se denominaron TNV148B. El ADN amplificado por PCR que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera de TNV148B y TNV14 se clono en vectores de expresion recien preparados que se basaban en los genes de cadena pesada y ligera clonados recientemente de otro mAb humano (12B75), descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos presentada el 7 de octubre de 2000, titulada Anticuerpos IL-12, Composiciones, Metodos y Usos.
Celulas P3X63Ag8.653 (653) o celulas de mieloma de raton Sp2/0-Ag14 (SP2/0) se transfectaron con los plasmidos de expresion de cadena pesada y ligera respectivos y se seleccionaron a traves de dos rondas de subclonacion para llneas celulares que producen niveles altos de mAb TNV148B y TNV14 recombinantes (rTNV148B y rTNV14) mAbs. Las evaluaciones de curvas de crecimiento y la estabilidad de la production de mAb a lo largo del tiempo indicaba que los clones transfectantes de 653 C466D y C466C produclan de forma estable aproximadamente 125 mg/ml de mAb rTNV148B en cultivos agotados mientras que el transfectante de SP2/0 1.7312-122 (C467A) produjo de forma estable aproximadamente 25 mg/ml de mAb rTNV148B en cultivos agotados. Analisis similares indicaron que el clon transfectante de Sp2/0 C476A produjo 18 mg/ml de rTNV14 en cultivos agotados.
Introduccion
Un panel de ocho mAb obtenidos a partir de ratones GenPhanm/Medarex inmunizados con TNFa humano (genotipo HCo12/KCo5) demostraron previamente que se unlan a TNFa humano y que tenlan un isotipo kappa de lgG1 completamente humano. Se uso un ensayo de union sencilla para determinar si era probable que los mAb ilustrativos de la invention tuvieran actividad neutralizante de TNFa evaluando su habilidad para bloquear la union de TNFa a receptor de TNF recombinante. Basandose en esos resultados, los resultados de secuencia de ADN y caracterizaciones in vitro de varios de los mAb, se selecciono TNV148 como el mAb que se caracterizarla adicionalmente.
Las secuencias de ADN que codifican el mAb TNV148 se clonaron, se modificaron para ajustarse en vectores de expresion genica que codifican regiones constantes adecuadas, se introdujeron en las celulas de mieloma de raton bien caracterizadas 653 y SP2/0 y las llneas celulares transfectadas resultantes se exploraron hasta que se identificaron subclones que produclan 40 veces mas mAb que la llnea celular de hibridoma original.
Materiales y Metodos
Reactivos y celulas
El reactivo TRIZOL se adquirio en Gibco BRL. Se obtuvo proteinasa K en Sigma Chemical Company. Se obtuvo transcriptasa inversa en Life Sciences, Inc. Se obtuvo ADN Polimerasa Taq en Perkin Elmer Cetus o Gibco BRL. Las enzimas de restriction se adquirieron en New England Biolabs. El Kit de purification de PCR QIAquick era de Qiagen. Un kit de mutagenesis dirigida QuikChange se adquirio en Stratagene. Los kits Wizard plasmid miniprep y RNasin eran de Promega. Se obtuvieron Optiplates en Packard. El 125yodo se adquirio en Amersham. Los oligonucleotidos personalizados se adquirieron en Keystome/Biosource Internacional. Los nombres, numeros de identification y secuencias de los oligonucleotidos usados en este trabajo se muestran en la Tabla 1.
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Tabla 1. Oligonucleotidos usados para clonar, modificar por ingenierfa genetica o secuenciar los genes de mAb TNV. Los aminoacidos codificados por los oligonucleotidos 5'14s y HuH-J6 se muestran encima de la secuencia. El resto aminoacldico “M” representa el codon de inicio de la traduccion. Las secuencias subrayadas en los oligonucleotidos 5'14s y HuH-J6 marcan los sitios de restriccion BsiWI y BstBI, respectivamente. La barra en HuH-J6 corresponde al llmite de exon/intron. Observese que los oligonucleotidos cuya secuencia corresponden a la hebra negativa se escriben en una orientacion 3'-5'.
Nombre
I.D.
HGl-4b
119
HGl-5b
354
HGlhg
360
HG1-6
35
HCK1-3E
117
HuK-3’Hd
208
HVKRNAseq
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Secuencia
T-TTGGTCCAGTCGGACTGG-S’
3’-CACCTGCACTCGGTGCTT-5'
3'-CACTGTTTTGAG'rGTGTACGGGCTTAAGTT-5'
3'-G€CGCACGTGTGGAAGGG-5'
3AGTCAAGGTCGGACTGGCTTAAGTT-51
3,-GTTGTCCCCTCTCACAATCTTCGAATTT-5'
3’-GGCGGTAGACTACTCGTC-5'
5’14s
5'46s
5'47s
5'63s
5'73s
BsiWI M D W T W S I
366 5-TTTCGTACGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATC-3'
367 5’-nTCGTACGCCACCATGGGGTITGGGCrGAGCTG-3'
368 5LTTTCGTACGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCATG-3'
369 5'-TTTCGT ACGCC ACCATG AAAC ACCTGTGGTTCTTC-3’
370 5'-nTCGT ACGCC ACCATGGGGTCAACCGCCATCCTC-3'
T V T
S S
BstBI
HuH-J6 388 3l-GTGCCAGTGGCAGAGGAGTCyCATTCAAOCTTAAGTT-5l
’ t
Sail M D M R V
LK7s 362 5'-TTTGTCGACACCATGGACATGAGGGTCCrrCK:-3t
LVgs 363 S’-TTTGTCGACACCATGGAAGCCCCAGCTC- 3'
HuL-J3
380
T K V D I K AflS
3 'CTGGTTTCACCT AT AGTTTG/C ATTG A GA ATTCGGCGCCTTT
V148-QC1 399 5'-CATCTCCAGAGACAATtCCAAGAACACGCTGTATC-3'
VI48-QC2 400 3'-GTAGAGGTCTCTGTTAaGGTTCTTGTGCGACATAG-S'
Se obtuvo un solo vial congelado de celulas de mieloma de raton 653. El vial se descongelo ese dla y se expandio en matraces T en IMDM, FBS al 5%, glutamina 2 mM (medios). Estas celulas se mantuvieron en cultivo continuo hasta que se transfectaron 2 a 3 semanas mas tarde con el ADN anti-TNF descrito en este documento. Algunos de los cultivos se recogieron 5 dlas despues de la fecha de descongelacion, se sedimentaron mediante centrifugacion y se resuspendieron en FBS al 95%, DMSO al 5%, se dividieron en allcuotas en 30 viales, se
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congelaron y se almacenaron para un uso futuro. De forma similar, se obtuvo un solo vial congelado de celulas de mieloma de raton SP2/0. El vial de descongelo, se preparo una nueva congelacion como se ha descrito anteriormente y los viales congelados se almacenaron en las cajas de congelador CBC AA y AB. Estas celulas se descongelaron y se usaron para todas las transfecciones de SP2/0 descritas en este documento.
Ensayo para Inhibicion de Union de TNF a Receptor
Se usaron sobrenadantes de celulas de hibridoma que contenlan los mAb de TNV para ensayar la capacidad de los mAb de bloquear la union de TNFa marcado con 125I a la protelna de fusion de receptor de TNF recombinante, p55-sf2 (Scallon et al. (1995) Cytokine 7: 759-770). Se anadieron 50 ml de p55-sf2 a 0,5 mg/ml en PBS a Optiplates para recubrir los pocillos durante una incubacion de una hora a 37°C. Se prepararon diluciones seriadas de los ocho sobrenadantes de celulas TNV en placas de fondo redondo de 96 pocillos usando PBS/BSA al 0,1% como diluyente. El sobrenadante celular que contenla mAb anti-IL18 se incluyo como un control negativo y el mismo sobrenadante anti-IL18 con adiciones de cA2 (anticuerpo quimerico anti-TNF, Remicade, patente de Estados Unidos N° 5.770.198) se incluyo como un control positivo. Se anadio TNFa marcado con 125I (58 mCi/mg, D. Shealy) a 100 ml de sobrenadantes celulares para tener una concentracion de TNFa final de 5 ng/ml. La mezcla se preincubo durante una hora a TA. Las Optiplates recubiertas se lavaron para retirar p55-sf1 no unido y 50 ml de la mezcla de TNFa- 125I/sobrenadante celular se transfirio a las Optiplates. Despues de 2 h a TA, las Optiplates se lavaron tres veces con PBS-Tween. Se anadieron 100 ml de Microscint-20 y se determino la cpm unida usando el contador gamma TopCount.
Amplificacion de Genes V y Analisis de Secuencia de ADN
Las celulas de hibridoma se lavaron una vez en PBS antes de la adicion de reactivo TRIZOL para preparacion de ARN. Entre 7 x 106 y 1,7 x 107 celulas se resuspendieron en 1 ml de TRIZOL. Los tubos se agitaron vigorosamente despues de la adicion de 200 ml de cloroformo. Las muestras se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos. La fase acuosa se transfirio a un tubo de microcentrlfuga nuevo y se anadio un volumen igual de isopropanol. Los tubos se agitaron vigorosamente y se dejo que se incubaran a temperatura ambiente durante 10 minutos. Despues, las muestras se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos. Los sedimentos se lavaron una vez con 1 ml de etanol al 70% y se secaron de forma breve en un secador de vaclo. Los sedimentos de ARN se resuspendieron con 40 ml de agua tratada con DEPC. La calidad de las preparaciones de ARN se determino fraccionando 0,5 ml en un gel de agarosa al 1%. El ARN se almaceno en un congelador a -80°C hasta su uso.
Para preparar ADNc de cadena pesada y ligera, se prepararon mezclas que inclulan 3 ml de ARN y 1 mg de oligonucleotido 119 (cadena pesada) u oligonucleotido 117 (cadena ligera) (vease la Tabla 1) en un volumen de 11,5 ml. La mezcla se incubo a 70°C durante 10 minutos en un bano de agua y despues se enfrio en hielo durante 10 minutos. Se preparo una mezcla separada que estaba formada por 2,5 ml de tampon de transcriptasa inversa 10X, 10 ml de dNTP 2,5 mM 1 ml de transcriptasa inversa (20 unidades) y 0,4 ml de inhibidor de ribonucleasa RNasin (1 unidad). 13,5 ml de esta mezcla se anadieron a los 11,5 ml de la mezcla del ARN enfriado/oligonucleotido y la reaccion se incubo durante 40 minutos a 42°C. La reaccion de slntesis de ADNc despues se almaceno en un congelador a -20°C hasta su uso.
Los ADNc de cadena pesada y ligera no purificados se usaron como moldes para amplificar por PCR las secuencias codificantes de region variable. Cinco pares de oligonucleotidos (366/354, 367/354, 368/354, 369/354 y 370/354, Tabla 1) se ensayaron simultaneamente para determinar su capacidad de amplificacion por cebador del ADN de cadena pesada. Dos pares de oligonucleotidos (362/208 y 363/208) se ensayaron simultaneamente para determinar su capacidad de amplificacion por cebador del ADN de cadena ligera. Las reacciones de PCR se realizaron usando 2 unidades de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad (HIFI) PLATMUM™ en un volumen total de 50 ml. Cada reaccion inclula 2 ml de una reaccion de ADNc, 10 pmoles de cada oligonucleotido, dNTP 0,2 mM, 5 ml de tampon HIFl 10 X y sulfato de magnesio 2 mM. El programa de termociclador fue 95°C durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 segundos, 62°C durante 30 segundos, 68°C durante 1,5 minutos). Despues hubo una incubacion final a 68°C durante 10 minutos.
Para preparar los productos de PCR para secuenciacion de ADN directa, los mismos se purificaron usando el Kit de Purificacion de PCR QIAquick™ de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se eluyo de la columna spin usando 50 ml de agua esteril y despues es seco hasta un volumen de 10 ml usando un secador de vaclo. Las reacciones de secuenciacion de ADN se ajustaron despues con 1 ml de producto de PCR purificado, cebador oligonucleotldico 10 mM, 4 ml de mezcla de reaccion preparada BigDye Terminator™ y 14 ml de agua esteril para un volumen total de 20 ml. Los productos de PCR de cadena pesada preparados con el par de oligonucleotidos 367/354 se secuenciaron con cebadores de oligonucleotidos 159 y 360. Los productos de PCR de cadena ligera preparados con el par de oligonucleotidos 363/208 se secuenciaron con los oligonucleotidos 34 y 163. El programa de termociclador para secuenciacion fue 25 ciclos de (96°C durante 30 segundos, 50°C durante 15 segundos, 60°C durante 4 minutos) seguido de 4°C durante una noche. Los productos de reaccion se fraccionaron a traves de un gel de poliacrilamida y se detectaron usando un secuenciador de ADN ABI 377.
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Mutagenesis Dirigida Para Cambiar un Aminoacido
Se cambio un unico nucleotido en la secuencia de ADN de region variable de cadena pesada de TNV148 para reemplazar Pro75 con un resto de Serina en el mAb de TNV148. Se disenaron oligonucleotidos complementarios, 399 y 400 (Tabla 1) y ordenaron para realizar este cambio usando el sitio de clonacion BsiWI unico justo cadena arriba del sitio de inicio de la traduccion, siguiendo el protocolo del fabricante. El plasmido resultante se denomino p1747. Para introducir un sitio BstBI en el extremo 3' de la region variable, se diseno un cebador oligonucleotldico 5' con sitios Sail y BstBI. Este cebador se uso con el cebador inverso pUC para amplificar un fragmento de 2,75 kb de p1747. Despues, este fragmento se volvio a clonar en el sitio Sall de origen natural en la region variable de 12B75 y un sitio Hindlll, introduciendo de este modo el sitio BstBI unico. El vector intermediario resultante, denominado p1750, podrla aceptar fragmentos de region variable con extremos BsiWI y BstBI. Para preparar una version de vector de cadena pesada en la que la region constante tambien procediera del gen 12B75, el inserto BamHI- Hindlll en p1750 se transfirio a pBR322 para tener un sitio EcoRI cadena abajo del sitio HindIII. El plasmido resultante, p1768, despues se digirio con HindIII y EcoRI y se ligo en un fragmento de 5,7 kb HindIII-EcoRI de p1744, un subclon obtenido clonando el fragmento grande de BamHI-BamHI de p1560 en pBC. El plasmido resultante, p1784, despues se uso como vector para los fragmentos de ADNc de Ab de TNV con extremos BsiWI y BstBI. Se realizo trabajo adicional para preparar vectores de expresion, p1788 y p1798, que incluyen la region constante de lgG1 del gen 12B75 y difieren entre si en cuanto del intron J-C de cadena pesada de 12B75 contienen los mismos.
Para modificar el gen de cadena ligera 12B75 en el plasmido p1558, un fragmento de 5,7 kb Sall/Aflll que contiene la region de promotor y variable de 12B75 se transfirio de p1558 a los sitios Xhol/AfIII del plasmido l28. Este nuevo plasmido, p1745, proporciono un molde mas pequeno para la etapa de mutagenesis. Se usaron oligonucleotidos (C340sall y C340sal2) para introducir un sitio de restriction unico SaII en el extremo 5' de la region variable mediante mutagenesis QuikChange™. El vector intermediario resultante, p1746, tenia sitios de restriccion unicos SaII y Aflll en los que se podrlan clonar fragmentos de region variable. Cualquier fragmento de region variable clonado en p1746 se unirla preferiblemente con la mitad 3' del gen de cadena ligera. Para preparar un fragmento de restriccion desde la mitad 3' del gen de cadena ligera 12B75 que se podrla usar con este proposito, los oligonucleotidos BAHN1 y BAHN-2 se hibridaron entre si para formar un enlazador bicatenario que contenla los sitios de restriccion BsiW1, Aflll, Hindll y Notl y que contenla extremos que se podrian ligar en sitios Kpnl y Sacl. Este enlazador se clono entre los sitios Kpnl y Sacl de pBC para producir el plasmido p1757. Un fragmento de 7,1 kb que contiene la region constante de cadena ligera de 12B75 generado digiriendo p1558 con Aflll, y despues digiriendo parcialmente con HindIII, se clono entre los sitios Aflll y Hindll de p1757 para producir p1762. Este nuevo plasmido contenia sitios unicos para BsiWI y Aflll en los que el fragmento BsiWI/Aflll que contenia las regiones de promotor y variables se podia transferir uniendo las dos mitades del gen.
Clonacion y Ensamblaje de ADNc de Plasmidos de Expresion
Todas las reacciones de RT-PCR (vease anteriormente) se trataron con enzima Klenow para llenar adicionalmente los extremos de ADN. Los fragmentos de PCR de cadena pesada se digirieron con enzimas de restriccion BsiWI y BstBI y despues se clonaron entre los sitios BsiWI y BstBI del plasmido L28 (se uso L28 debido a que el vector intermedio basado en 12B75 p1750 no se habia preparado todavia). El analisis de secuencia de ADN de los insertos clonados mostro que las construcciones resultantes eran correctas y que no se habian introducido errores durante las amplificaciones por PCR. Los numeros de identification asignados para estas construcciones de plasmido L28 (para TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B y TNV196) se muestran en la Tabla 2.
Los insertos de BsiWI/BstBI para las cadenas pesadas de TNV14, TNV148 y TNV148B se transfirieron desde el vector L28 hasta el vector intermediario recien preparado, p1750. Los numeros de identificacion asignados para estos plasmidos intermediarios se muestran en la Tabla 2. Esta etapa de clonacion y las etapas posteriores no se realizaron para TNV 15 y TNV 196. Despues, las regiones variables se transfirieron en dos vectores de expresion de lgG1 humana diferentes. Las enzimas de restriccion EcoRI y HindIII se usaron para transferir las regiones variables en el vector de lgG1 usado previamente de Centocor, p104. Los plasmidos de expresion resultantes, que codifican una lgG1 del alotipo Gm(f+), se denominaron p1781 (TNV14), p1782 (TNFV148) y p1783 (TNV148B) (vease la Tabla 2). Las regiones variables tambien se clonaron cadena arriba de la region constante de lgG1 obtenida del gen 12B75 (GenPharm). Esos plasmidos de expresion, que codifican una lgG1 del alotipo Glm(z), tambien se enumeran en la Tabla 2.
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Tabla 2. Numeros de identificacion de plasmido para diversos plasmidos de cadena pesada y ligera. El vector
L28 o vector pBC representa el clon de ADNc de Ab inicial. Los insertos en esos plasmidos se transfirieron a un vector basado en 12B75 incompleto para preparar los plasmidos intermedios. Una etapa de transferencia adicional dio como resultado los plasmidos de expresion finales, que se introdujeron en celulas despues de linealizarse o se usaron para purificar los insertos de gen de mAb antes de la transfeccion celular. (NR) = no realizado. mAb ID de Plasmido ID de Plasmido ID de Plasmido de ID de Plasmido de vector L28 Intermedio Expresion Gm(f+) expresion Glm(z)
Cadenas Pesadas
TNFV14
p1751 p1777 p1781 P1786
TNV15
p1752 (ND) (ND) (ND)
TNV148
p1753 p1778 p1782 p1787
TNV148B
p1760 p1779 p1783 p1788
TNV196
p1754 (ND) (ND) (ND)
ID de Plasmido ID de Plasmido ID de Plasmido de
vector pBC Intermedio expresion
Cadenas Ligeras
TNV14
p1748 p1755 p1775
TNV15
p1748 p1755 p1775
TNV148
p1749 p1756 p1776
TNV196
p1749 p1756 p1776
Los productos de PCR de cadena ligera se digirieron con enzimas de restriccion Sail y Sacll y despues se clonaron entre los sitios Sail y Sacll del plasmido pBC. Las dos diferentes versiones de cadena ligera, que diferlan en un aminoacido, se denominaron p1748 y p1749 (Tabla 2). El analisis de secuencia de ADN confirmo que estas construcciones tenlan las secuencias correctas. Los fragmentos Sall/Aflll en p1748 y p1749 despues se clonaron entre los sitios Sail y Aflll del vector intermediario p1746 para preparar p1755 y p1756, respectivamente. Estas mitades 5' de los genes de cadena ligera despues se unieron a las mitades 3' del gen transfiriendo los fragmentos BsiWI/Aflll de p1755 y p1756 a la construccion recien preparada p1762 para preparar los plasmidos de expresion finales p1775 y p1776, respectivamente (Tabla 2).
Transfecciones, Exploracion y Subclonacion de Celulas
Se realizaron un total de 15 transfecciones de celulas de mieloma de raton con los diversos plasmidos de expresion de TNV (vease la Tabla 3 en la seccion de Resultados y Discusion). Estas transfecciones se distingulan en que (1) las celulas huesped eran SP2/0 o 653; (2) la region constante de cadena pesada estaba codificada por el vector de lgG1 previo de Centocor o la region constante de cadena pesada de 12B75; (3) el mAb era TNV148B, TNV 148, TNV14 o una nueva combinacion de HC/LC; (4) si el ADN era un plasmido linealizado o inserto de gen AB purificado y (5) la presencia o ausencia de la secuencia intronica J-C completa en el gen de cadena pesada. Ademas, se repitieron varias de las transfecciones para aumentar la probabilidad de que se pudiera explorar un gran numero de clones.
Cada una de las celulas SP2/0 y celulas 653 se transfectaron con una mezcla de ADN de cadena pesada y ligera (8-12 mg cada uno) mediante electroporacion usando condiciones convencionales como se ha descrito previamente (Knight, DM et al. (1993) Molecular Immunology 30: 1443-1453). Para los numeros de transfeccion 1, 2, 3 y 16, los plasmidos de expresion apropiados se linealizaron mediante digestion con una enzima de restriccion antes de la transfeccion. Por ejemplo, se usaron enzimas de restriccion Sail y Notl para linealizar el plasmido de cadena pesada de TNV148B p1783 y el plasmido de cadena ligera p1776, respectivamente. Para las transfecciones restantes, se separaron insertos de ADN que contenlan solo el gen de mAb del vector plasmldico digiriendo los plasmidos de cadena pesada con BamHI y plasmidos de cadena ligera, con BsiWI y Notl. Los insertos de genes de mAb despues se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y resinas de purificacion Qiex. Las celulas transfectadas con insertos de genes purificados se transfectaron simultaneamente con 3-5 mg de plasmido pSV2gpt linealizado con Pstl (p13) como una fuente de marcador de selection. Despues de la electroporacion, las celulas se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en IMDM, FBS al 15%, glutamina 2 mM y se incubaron a 37°C en una incubadora de CO2 al 5%. Dos dlas mas tarde, se anadio un volumen igual de IMDM, FBS al 5%, glutamina 2 mM, seleccion de MHX 2X (MHX 1 X = 0,5 mg/ml de acido micofenolico, 2,5 mg/ml de hipoxantina, 50 mg/ml de xantina) y las placas se incubaron durante 2 a 3 semanas adicionales mientras se formaban colonias.
Los sobrenadantes celulares recogidos de pocillos con colonias se ensayaron para determinar IgG humana mediante ELISA como se ha descrito. En resumen, diversas diluciones de los sobrenadantes celulares se incubaron en placas de EIA de 96 pocillos con fragmento Fc anti-IgG humana de cabra policlonal y despues se detecto la IgG humana unida usando anti-IgG humana (H + L) de cabra conjugado con Fosfatasa Alcalina y los sustratos de color apropiados. Las curvas patron, que usaron como patron el mismo mAb purificado que se estaba midiendo en los sobrenadantes celulares, se incluyeron en cada placa EIA para posibilitar la cuantificacion de la IgG humana en los sobrenadantes. Las celulas en esas colonias que parecla que produclan la mayorla de IgG humana se pasaron a
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placas de 24 pocillos para determinaciones de produccion adicionales en cultivos agotados y posteriormente se identificaron los clones parentales de mayor produccion.
Los clones parentales de mayor produccion se subclonaron para identificar subclones de produccion mas alta y para preparar una llnea celular mas homogenea. Placas de cultivo de tejido de 96 pocillos se sembraron con una celula por pocillo o cuatro celulas por pocillo en IMDM, FBS al 5%, glutamina 2 mM, 1 X MHX y se incubaron a 37°C en una incubadora de CO2 al 5% durante 12 a 20 dlas hasta que fueron evidentes las colonias. Los sobrenadantes celulares se recogieron de los pocillos que contenlan una colonia por pocillo y se analizaron mediante ELISA como se ha descrito anteriormente. Las colonias seleccionadas se pasaron a placas de 24 pocillos y se dejo que los cultivos se agotaran antes de identificar los subclones de mayor produccion mediante la cuantificacion de los niveles de IgG humana en sus sobrenadantes. Este proceso se repitio cuando subclones seleccionados de primer ciclo se sometieron a un segundo ciclo de subclonacion. Los mejores clones de segundo ciclo se seleccionaron como las llneas celulares para desarrollo.
Caracterizacion de Subclones Celulares
Se eligieron los mejores subclones de segundo ciclo y se realizaron curvas de crecimiento para evaluar la produccion de los niveles de mAb y las caracterlsticas de crecimiento celular. Se sembraron matraces T75 con 1 x 105 celulas/ml en 30 ml de IMDM, FbS al 5%, glutamina 2 mM y MHX 1X (o medio sin suero). Se tomaron allcuotas de 300 ml en intervalos de 24 h y se determino la densidad de celulas vivas. Los analisis continuaron hasta que el numero de celulas vivas fue menor que 1 x 105 celulas/ml. Se ensayaron las allcuotas recogidas de sobrenadantes celulares para determinar la concentracion de anticuerpo presente. Se realizaron ensayos de ELISA usando un patron de rTNV148B o rTNV14 JG92399. Las muestras se incubaron durante 1 hora en placas de ELISA recubiertas con Fc policlonal de cabra anti-IgG humana y el mAb unido se detecto con anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H + L) conjugado con fosfatasa alcalina a una dilucion 1:1000.
Tambien se realizo un analisis de curvas de crecimiento diferente para dos llneas celulares con el proposito de comparar los Indices de crecimiento en presencia de cantidades variables de selection con MHX. Las llneas celulares C466A y C466B se descongelaron en medios sin MHX (IMDM, FBS al 5% y glutamina 2 mM) y se cultivaron durante dos dlas mas. Los dos cultivos celulares despues se dividieron en tres cultivos que no contenlan MHX o contenlan MHX 0,2X o MHX 1X (MHX 1X = 0,5 mg/ml de acido micofenolico, 2,5 mg/ml de hipoxantina y 50 mg/ml de xantina). Un dla despues, se sembraron matraces T75 nuevos con los cultivos a una densidad inicial de 1 x 105 celulas/ml y se recontaron las celulas en intervalos de 24 horas durante una semana. No se recogieron las allcuotas para la produccion de mAb. Se calcularon tiempos de duplication para estas muestras usando la formula proporcionada en SOP PD32.025.
Se realizaron estudios adicionales para evaluar la estabilidad de la produccion de mAb a lo largo del tiempo. Los cultivos se desarrollaron en placas de 24 pocillos en IMDM, FBS al 5%, glutamina 2 mM, con o sin seleccion con MHX. Los cultivos se separaron en cultivos nuevos en el momento en que se volvlan confluentes y despues se dejaba que se agotara el cultivo mas antiguo. En este momento, se tomo una allcuota de sobrenadante y se almaceno a 4°C. Se tomaron allcuotas a lo largo de un perlodo de 55-78 dlas. Al final de este perlodo los sobrenadantes se ensayaron para determinar la cantidad de anticuerpo presente mediante el ELISA de Fc anti-IgG humana como se ha descrito anteriormente.
Resultados y Analisis
Inhibicion de Union de TNF a Receptor Recombinante
Se realizo un ensayo de union sencillo para determinar si los ocho mAb de TNV que estaban contenidos en el sobrenadante de celulas de hibridoma eran capaces de bloquear la union de TNFa al receptor. Las concentraciones de los mAb de TNV en sus sobrenadantes celulares respectivos se determinaron en primer lugar mediante analisis ELISA convencional para IgG humana. Despues, una protelna de fusion recombinante de receptor de TNF/IgG p55, p55-Sf2, se aplico como un recubrimiento sobre placas de EIA y se dejo que TNFa marcado con 125I se uniera al receptor p55 en presencia de cantidades variables de mAb de TNV. Como se muestra en la Figura 1, todos menos uno (TNV122) de los ocho mAb de TNV bloquearon eficazmente la union de TNFa al receptor p55. De hecho, los mAb de TNV pareclan ser mas eficaces para inhibir la union de TNFa que el mAb de control positivo de cA2 que se habla anadido en cantidades conocidas al sobrenadante de hibridoma de control negativo. Se interpreto que estos indicaban que era altamente probable que los mAb de TNV bloquearan la bioactividad de TNFa en ensayos basados en celulas e in vivo y, por lo tanto, se garantizaron analisis adicionales.
Analisis de la Secuencia de ADN
Confirmacion de que los ARN Codifican mAb Humanos
Como una primera etapa en la caracterizacion de los siete mAb de TNV (TNV14, TNV15, TNV32, TNV86,
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TNV118, TNV148 y TNV196) que mostraron actividad bloqueante de TNFa en el ensayo de union a receptor, se aislo el ARN total a partir de las siete lineas celulares de hibridoma que producen estos mAb. Despues, cada muestra de ARN se uso para preparar ADNc de cadena pesada o ligera de anticuerpo humano que incluia la secuencia senal completa, la secuencia de region variable completa y parte de la secuencia de region constante para cada mAb. Estos productos de ADNc despues se amplificaron en reacciones de PCR y el ADN amplificado por PCR se secuencio directamente sin clonar antes los fragmentos. Los ADNc de cadena pesada secuenciados eran identicos en mas del 90% a uno de los cinco genes de linea germinal humanos presentes en los ratones, DP-46 (Figura 2). De forma similar, los ADNc de cadena ligera secuenciados tenian una identidad del 100% o del 98% con uno de los genes de linea germinal humanos presentes en los ratones (Figura 3). Estos resultados de secuencia confirmaron que las moleculas de ARN que se transcribieron en ADNc y se secuenciaron codificaban cadenas pesadas de anticuerpo humano y cadenas ligeras de anticuerpo humano. Se ha de observar que, debido a que las regiones variables se amplificaron por PCR usando oligonucleotidos que se localizan en el extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia senal, los primeros aminoacidos de la secuencia senal pueden no ser la secuencia real de los productos de traduccion de tNv originales, pero representan las secuencias reales de los mAb de TNV recombinantes.
mAb Neutralizantes Unicos
Los analisis de las secuencias de ADNc para las regiones variables completas de las cadenas tanto pesada como ligera para cada mAb revelaron que TNV32 es identico a TNV15, TNV118 es identico a TNV14 y TNV86 es identico a TNV148. Los resultados de ensayo de union a receptor fueron coherentes con los analisis de secuencia de ADN, es decir, tanto TNV86 como TNV148 eran aproximadamente 4 veces mejores que tanto TNV118 como TNV14 al bloquear la union de TNF. Por lo tanto, el trabajo posterior se ha enfocado no solo en los cuatro mAb de TNV unicos, TNV14, TNV15, TNV148 y TNV196.
Relacion de los Cuatro mAb
Los resultados de secuencia de ADN revelaron que todos los genes que codificaban las cadenas pesadas de los cuatro mAb de TNV eran altamente homologos entre si y parecian haberse obtenido a partir del mismo gen de linea germinal, DP-46 (Figura 2). Ademas, debido a que todas las secuencias de CDR3 de cadena pesada son tan similares y de la misma longitud, y debido a que todas ellas usan el exon J6, aparentemente se originaron a partir de un solo acontecimiento de transposicion de gen VDJ unico que despues estuvo seguido por cambios somaticos que hicieron a cada mAb unico. Los analisis de secuencia de ADN revelaron que habia solo dos genes de cadena ligera diferentes entre los cuatro mAb (Figura 3). Las secuencias codificantes de region variable de cadena ligera en TNV14 y TNV15 son identicas entre si y a una secuencia de linea germinal representativa de la familia Vg/38K de cadenas kappa humanas. Las secuencias codificantes de cadena ligera de TNV148 y TNV196 son identicas entre si pero difieren de la secuencia de linea germinal en dos posiciones de nucleotidos (Figura 3).
Las secuencias de aminoacidos deducidas de los cuatro mAb revelaron la relacion de los mAb reales. Los cuatro mAb contienen cuatro cadenas pesadas diferentes (Figura 4), pero solo dos cadenas ligeras diferentes (Figura 5). Las diferencias entre las secuencias de mAb de TNV y las secuencias de linea germinal estuvieron en su mayor parte confinadas a los dominios de CDR, pero tres de las cadenas pesadas de mAb tambien diferian de la secuencia de linea germinal en las regiones flanqueantes (Figura 4). En comparacion con las regiones flanqueantes de Ab codificadas por la linea germinal DP-46, TNV14 era identico, TNV15 diferia en un aminoacido, TNV148 diferia en dos aminoacidos y TNV196 diferia en tres aminoacidos.
Clonacion de ADNc, Mutagenesis Dirigida y Ensamblaje de Plasmidos de Expresion Finales Clonacion de ADNc
Basandose en la secuencia de ADN de las regiones variables amplificadas por PCR, se ordenaron nuevos oligonucleotidos para realizar otro ciclo de amplification por PCR con el proposito de adaptar la secuencia codificante que se tiene que clonar en vectores de expresion. En el caso de las cadenas pesadas, los productos de este segundo ciclo de PCR se digirieron con enzimas de restriction BsiWI y BstBI y se clonaron en el vector plasmidico L28 (los numeros de identification de plasmido se muestran en la Tabla 2). En el caso de las cadenas ligeras, los productos de PCR de segundo ciclo se digirieron con Sail y Aflll y se clonaron en el vector plasmidico pBC. Despues, los clones individuales se secuenciaron para confirmar que sus secuencias eran identicas a la secuencia previa obtenida a partir de la secuenciacion directa de productos de PCR, lo cual revela el nucleotido mas abundante en cada position en una poblacion potencialmente heterogenea de moleculas.
Mutagenesis Dirigida para Cambiar TNV148
Se observo sistematicamente que los mAb de TNV148 y TNV196 eran cuatro veces mas potentes que el mejor mAb mas proximo (TNV14) para neutralizar la bioactividad de TNFa. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, las secuencias flanqueantes de cadena pesada de TNV148 y TNV196 diferian de las secuencias
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flanqueantes de ilnea germinal. Una comparacion de la secuencia de cadena pesada de TNV148 con otros anticuerpos humanos indico que otros muchos mAb humanos contenlan el resto Ile en la posicion 28 en el flanco 1 (contando solo la secuencia madura), mientras que el resto Pro en la posicion 75 en el flanco 3 era un aminoacido inusual en esa posicion.
Una comparacion similar de la cadena pesada de TNV196 sugirio que los tres aminoacidos en los que difiere de la secuencia de llnea germinal en el flanco 3 pueden ser raros en mAb de humano. Existla una posibilidad de que estas diferencias pudieran volver a TNV148 y TNV196 inmunogenicos si se administraban a seres humanos. Debido a que TNV148 solo tenia un resto aminoacldico de interes y se crela que este resto no era importante para la union de TNF, se uso una tecnica de mutagenesis dirigida para cambiar un solo nucleotido en la secuencia codificante de cadena pesada de TNV148 (en el plasmido p1753) para que se codificara un resto Ser de llnea germinal en lugar del resto Pro en la posicion 75. El plasmido resultante se denomino p1760 (vease la Tabla 2). El gen y mAb resultante se denominaron TNV148B para distinguirlos del gen y mAb originales de TNV148 (vease la Figura 5).
Ensamblaje de Plasmidos de Expresion Final
Se prepararon nuevos vectores de expresion de anticuerpo que estaban basados en los genes de cadena pesada y cadena ligera de 12B75 clonados previamente como fragmentos genomicos. Aunque se prepararon diferentes plasmidos de expresion de TNV (vease la Tabla 2), en cada caso las secuencias flanqueantes 5', el promotor y el potenciador de intron procedlan de los genes 12B75 respectivos. Para los plasmidos de expresion de cadena ligera, el intron J-C completo, la secuencia codificante de region constante y la secuencia flanqueante 3' tambien procedlan del gen de cadena ligera de 12B75. Para los plasmidos de expresion de cadena pesada que dieron como resultado las llneas celulares de production final (p1781 y p1783, vease mas adelante), las secuencias codificantes de region constante de lgG1 humana se obtuvieron a partir del vector de expresion usado previamente de Centocor (P104). De forma importante, las llneas celulares de produccion final presentadas en este documento expresan un alotipo diferente (Gm(f+)) de los mAb de TNV obtenidos de hibridoma originales (G1m(z)). Esto se debe a que el gen de cadena pesada de 12B75 obtenido de los ratones GenPharm codifica un resto Arg en el extremo C terminal del dominio CH1 mientras que el vector de expresion de lgG1 de Centocor P104 codifica un resto Lys en esa posicion. Se prepararon otros plasmidos de expresion de cadena pesada (por ejemplo, p1786 y p1788) en los que el intron J-C, la secuencia codificante de region constante completa y la secuencia flanqueante 3' se obtuvieron a partir del gen de cadena pesada de 12B75, pero las llneas celulares transfectadas con esos genes no se seleccionaron como llneas celulares de produccion. Los vectores se disenaron de forma cuidadosa para permitir la donation de una etapa de regiones V amplificadas por PCR futuras que podrlan dar como resultado plasmidos de expresion finales.
Los ADNc de region variable amplificados por PCR se transfirieron de los vectores L28 o PBC a vectores de fase intermedia de 12.875 bases que proporcionaron la region promotora y parte del intron J-C (veanse en la Tabla 2 los numeros de identification de plasmido). Los fragmentos de restriction que contenlan la mitad 5' de los genes de anticuerpo despues se transfirieron desde estos vectores de fase intermedia a los vectores de expresion final que proporcionaron la mitad 3' de los genes respectivos para formar los plasmidos de expresion final (veanse en la Tabla 2 los numeros de identificacion de plasmido).
Transfecciones y Subclonaciones Celulares
Los plasmidos de expresion se linealizaron mediante digestion de restriccion o los insertos de gen de anticuerpo en cada plasmido se purificaron separandose de las estructuras de los plasmidos. Las celulas de mieloma de raton SP2/0 y 653 se transfectaron con el ADN de cadena pesada y ligera mediante electroporation. Se realizaron quince transfecciones diferentes, la mayorla de las cuales eran unicas como se definla por el Ab, las caracterlsticas especlficas de los genes de Ab, si los genes estaban en plasmidos completos linealizados o insertos de genes purificados y la llnea de celula huesped (resumida en la Tabla 3). Los sobrenadantes celulares de los clones resistentes a acido micofenolico se ensayaron para determinar la presencia de IgG humana mediante ELISA y se cuantificaron usando rTNV148B purificado como una curva patron de referencia.
Llneas Celulares rTNV148B de Produccion mas Alta
Se subclonaron diez de las llneas parentales 653 mejores productoras de la transfection 2 de rTNV148B (produjeron 5-10 mg/ml en cultivos de 24 pocillos agotados) para seleccionar las llneas celulares mejores productoras y para preparar una poblacion celular mas homogenea. Dos de estos subclones de la llnea parental 2.320, 2.320-17 y 2.320-20 produjeron aproximadamente 50 mg/ml en cultivos de 24 pocillos agotados, que era un aumento de 5 veces sobre su llnea parental. Un segundo ciclo de subclonacion de llneas subclonadas 2.320-17 y 2.320-20 condujo a
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Tabla 3. Sumario de Transfecciones Celulares. Se muestran los numeros de identificacion de los plasmidos de cadena pesada y ligera que codifican cada mAb. En el caso de transfecciones hechas con insertos de genes de mAb purificados, se incluyo el plasmido p13 (pSV2gpt) como fuente del marcador de seleccion gpt. Las regiones constantes de cadena pesada estaban codificadas por el mismo vector de expresion de lgG1 humano usado para codificar Remicade (“antiguo”) o por las regiones constantes contenidas dentro del gen de cadena pesada de 12B75 (GenPharm/Medarex) (“nuevo”). H1/L2 se refiere a un mAb “nuevo” conformado por la cadena pesada de TNV14 y la cadena ligera de TNV148. Los plasmidos p1783 y p1801 solo difieren en cuanto del intron J-C contienen sus genes de cadena pesada. Los numeros de transfeccion, que definen el primer numero de los nombres genericos para los clones celulares, se muestran en la derecha. Las llneas celulares productoras de rTNV148B C466 (A, B, C, D) y C467A descritas en este documento se obtuvieron a partir del numero de transfeccion 2 y 1, respectivamente. La llnea de celulas productoras de rTNV14 C476A se obtuvo a partir del numero de transfeccion 3.
mAb
Plasmidos HC/LC/gpt Vector de HC Formato ADN N° de Transfeccion de Sp2/0 652
rTNV148B
1783/1776 Antiguo Lineal 1 2
rTNV14
1781/1775 Antiguo Lineal 3 -
rTNV14
3.27-1 C476A Sp2/0 19 mg/ml
Caracterizacion de Lfneas Celulares Subclonadas
Para caracterizar mas cuidadosamente las caracterlsticas de crecimiento de llnea celular y determinar los niveles de produccion de mAb en una escala mayor, se realizaron analisis de curvas de crecimiento usando cultivos de T75. Los resultados demostraron que cada una de las cuatro series C466 de llneas celulares alcanzaron una densidad celular pico entre 1,0 X 106 y 1,25 x 106 celulas/ml y niveles de acumulacion de mAb maximos de entre 110 y 140 mg/ml (Figura 7). Por el contrario, el subclon SP2/0 mejor productor, C467A, alcanzo la densidad celular maxima de de 2,0 x 106 celulas/ml y los niveles de acumulacion de mAb maximos de 25 mg/ml (Figura 7). No se realizo un analisis de curva de crecimiento en la llnea de celulas productoras de rTNV14, C476A.
Se realizo un analisis de curvas de crecimiento adicional para comparar los Indices de crecimiento en concentraciones diferentes de seleccion con MHX. Esta comparacion estaba impulsada por observaciones recientes de que las celulas C466 cultivadas en ausencia de MHX pareclan crecer mas rapido que las mismas celulas cultivadas en la cantidad normal de MHX (1X). Debido a que las concentraciones citotoxicas de compuestos tales como acido micofenolico tienden a
Para medirse sobre ordenes de magnitud, se considero posible que el uso de una concentracion menor de MHX podrla dar como resultado tiempos de duplicacion de celulas significativamente mas rapidos sin sacrificar la estabilidad de produccion de mAb. Las llneas celulares C466A y C466B se cultivaron en: sin mHx, MHX 0,2X o MHX 1X. Los recuentos de celulas vivas se tomaron en intervalos de 24 horas durante 7 dlas. Los resultados revelaron un Indice de crecimiento celular dependiente de la concentracion de MHX (Figura 8). La llnea celular C466A mostro un tiempo de duplicacion de 25,0 horas en MHX 1X pero de solo 20,7 horas sin MHX. De forma similar, la llnea celular C466b mostro un tiempo de duplicacion de 32,4 horas en MHX 1X pero solo de 22,9 horas sin MHX. Mas importante, los tiempos de duplicacion para ambas llneas celulares en MHX 0,2X fueron mas similares a lo que se ha observado sin MHX que en MHX 1X (Figura 8). Esta observation suscita la posibilidad de que el rendimiento celular potenciado en biorreactores, para los que los tiempos de duplicacion son un parametro importante, se podrla conseguir usando menos MHX. Sin embargo, aunque los resultados de ensayo de estabilidad (vease mas adelante) sugieren que la llnea celular C466D es capaz de producir de forma estable rTNV148B durante al menos 60 dlas incluso sin que este presente MHX, el ensayo de estabilidad tambien mostro niveles de produccion de mAb mas altos cuando las celulas se cultivaron en presencia de MHX en comparacion con la ausencia de MHX.
Para evaluar la produccion de mAb de las diversas llneas celulares durante un perlodo de aproximadamente 60 dlas, se realizaron ensayos de estabilidad en cultivos que contenlan o no contenlan, seleccion con MHX. No todas las llneas celulares mantuvieron una alta produccion de mAb. Despues de apenas dos semanas de cultivo, el clon C466A estaba produciendo aproximadamente el 45% menos que al comienzo del estudio. La produccion de clon C466B tambien parecla reducirse de forma significativa. Sin embargo, los clones C466C y C466D mantuvieron una produccion bastante estable, mostrando C466D los niveles de produccion absolutos mas elevados (Figura 9).
Conclusion
A partir de un panel inicial de ocho mAb humanos frente a TNFa, se selecciono TNV148B como preferido basandose en varios criterios que inclulan la secuencia de la protelna y la potencia de neutralization de TNF, as! como TNV14. Se prepararon llneas celulares que produclan mas de 100 mg/ml de rTNV148B y 19 mg/ml de rTNV14.
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Ejemplo 4: Estudio de Ratones Artriticos Usando Anticuerpos Anti-TNF y Controles Usando una Sola Inyeccion en Embolada.
Aproximadamente a 4 semanas de edad, los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en genero y peso corporal, a uno de nueve grupos de tratamiento y se trataron con una sola dosis intraperitoneal en embolada de PBS de Dulbecco (D-PBS) o un anticuerpo anti-TNF de la presente invencion (TNV14, TNV148 o TNV196) a 1 mg/kg o 10 mg/kg.
RESULTADOS: Cuando los pesos se analizaron como un cambio desde antes de administrar la dosis, los animales tratados con 10 mg/kg de cA2 mostraron una ganancia de peso sistematicamente mayor que los animales tratados con D-PBS a lo largo de todo el estudio. Esta ganancia de peso fue significativa en las semanas 3-7. Los animales tratados con 10 mg/kg de TNV148 tambien consiguieron una ganancia de peso significativa en la semana 7 del estudio (Vease la Figura 10).
Las Figuras 11A-C representan la progresion de gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico. El Indice artrltico del grupo tratado con 10 mg/kg de cA2 fue menor que el del grupo de control de D-PBS comenzando en la semana 3 y continuando a lo largo del resto del estudio (semana 7). Los animales tratados con 1 mg/kg de TNV14 y los animales tratados con 1 mg/kg de cA2 no mostraron reduccion significativa en AI despues de la semana 3 cuando se comparaban con el grupo tratado con D-PBS. No hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento de 10 mg/kg cuando cada uno se comparo con los otros de dosis similar (10 mg/kg de cA2 en comparacion con 10 mg/kg de TNV14, 148 y 196). Cuando se compararon los grupos de tratamiento de 1 mg/kg, el 1 mg/kg de TNV148 mostro un Al significativamente menor que el 1 mg/kg de cA2 a las 3, 4 y 7 semanas. El 1 mg/kg de TNV148 tambien fue significativamente menor que el 1 mg/kg del grupo tratado con TNV14 a las 3 y 4 semanas. Aunque TNV196 mostro una reduccion significativa en Al hasta la semana 6 del estudio (cuando se comparaba con el grupo tratado con D-PBS), TNV148 fue el unico tratamiento de 1 mg/kg que permanecio significativo a la finalizacion del estudio.
Ejemplo 5: Estudio de Ratones Artriticos Usando Anticuerpos Anti-TNF y Controles como Multiples Dosis en Embolada
Aproximadamente a las 4 semanas de edad los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en el peso corporal, a uno de 8 grupos de tratamiento y se trataron con una dosis en embolada intraperitoneal de artlculo de control (D-PBS) o anticuerpos (TNV14, TNV148) a 3 mg/kg (semana 0). Las inyecciones se repitieron en todos los animales en las semanas 1, 2, 3 y 4. Los grupos 1-6 se evaluaron para ensayar la eficacia del artlculo. Las muestras de suero, obtenidas a partir de los animales en los grupos 7 y 8 se evaluaron para induccion de respuesta inmune y eliminacion farmacocinetica de TNV14 o TNV148 en las semanas 2, 3 y 4.
RESULTADOS: No se observaron diferencias significativas cuando los pesos se analizaron como un cambio desde antes de la administracion de la dosis. Los animales tratados con 10 mg/kg de cA2 mostraron una ganancia de peso sistematicamente mayor que los animales tratados con D-PBS a lo largo de todo el estudio. (Vease la Figura 12).
Las Figuras 13A-C representan la progresion de la gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico. El Indice artrltico del grupo tratado con 10 mg/kg de cA2 fue significativamente menor que el grupo de control de D-PBS comenzando en la semana 2 y continuando a lo largo del resto del estudio (semana 5). Los animales tratados con 1 mg/kg o 3 mg/kg de Ca2 y los animales tratados con 3 mg/kg de TNV14 no consiguieron ninguna reduccion significativa en Al en ningun momento a lo largo de todo el estudio cuando se comparaban con el grupo de control d-PBS. Los animales tratados con 3 mg/kg de TNV148 mostraron una reduccion significativa cuando se compararon con el grupo tratado con d-PBS comenzando en la semana 3 y continuando hasta la semana 5. Los animales tratados con 10 mg/kg de cA2 mostraron una reduccion significativa del Al cuando se compararon con las dos dosis inferiores (1 mg/kg y 3 mg/kg) de cA2 en las semanas 4 y 5 del estudio y tambien fue significativamente menor que en los animales tratados con TNV14 en las semanas 3-5. Aunque aparentemente no habla diferencias significativas entre ninguno de los grupos de tratamiento de 3 mg/kg, el Al para los animales tratados con 3 mg/kg de TNV14 era significativamente mayor en algunos puntos de tiempo que el de 10 mg/kg, mientras que los animales tratados con TNV148 no eran significativamente diferentes de los animales tratados con 10 mg/kg de cA2.
Ejemplo 6: Estudio de Ratones Artriticos Usando Anticuerpos Anti-TNF y Controles como una Sola Dosis Intraperitoneal en Embolada.
Aproximadamente a las 4 semanas de edad los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en el genero y en el peso corporal, a uno de 6 grupos de tratamiento y se trataron con una sola dosis intraperitoneal en embolada de anticuerpo (Ca2 o TNV148) a 3 mg/kg o 5 mg/kg. Este estudio utilizo los grupos de control de D-PBS y 10 mg/kg de cA2.
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Cuando los pesos se analizaron como un cambio desde antes de administrar la dosis, todos los tratamientos consiguieron ganancias de peso similares. Los animales tratados con 3 o 5 mg/kg de TNV148 o 5 mg/kg de cA2 ganaron una cantidad significativa de peso mas temprano en el estudio (en las semanas 2 y 3). Unicamente los animales tratados con TNV148 mantuvieron una ganancia de peso significativa en los puntos de tiempo posteriores. Los animales tratados tanto con 3 como 5 mg/kg de TNV148 mostraron un resultado significativo a las 7 semanas y los animales de 3 mg/kg de TNV148 mostraron un resultado significativamente elevado aun a las 8 semanas despues de la inyeccion. (Vease la Figura 14).
La Figura 15 representa la progresion de la gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico. Todos los grupos de tratamiento mostraron alguna proteccion en los puntos de tiempo mas tempranos, mostrando el de 5 mg/kg de Ca2 y el de 5 mg/kg de TNV148 reducciones significativas en Al en las semanas 1-3 y mostrando todos los grupos de tratamiento una reduction significativa en la semana 2. Posteriormente en el estudio los animales tratados con 5 mg/kg de cA2 mostraron alguna proteccion, con reducciones significativas en las semanas 4, 6 y 7. La dosis baja (3 mg/kg) tanto de cA2 como de TNV148 mostro reducciones significativas en la semana 6 y todos los grupos de tratamiento mostraron reducciones significativas en la 7. Ninguno de los grupos de tratamiento fue capaz de mantener una reduccion significativa a la finalization del estudio (semana 8). No hubo diferencias significativas entre ninguno de los grupos de tratamiento (excluyendo el grupo de control de solution salina) en ningun punto del tiempo.
Ejemplo 7: Estudio de Ratones Artrlticos Usando Anticuerpos Anti-TNF y Controles Como una Sola Dosis Intraperitoneal en Embolada entre Anticuerpo Anti-TNF y Anticuerpo Anti-TNF Modificado.
Para comparar la eficacia de una sola dosis intraperitoneal de TNV148 (obtenido a partir de celulas de hibridoma) y rTNV148B (obtenido a partir de celulas transfectadas). Aproximadamente a las 4 semanas de edad, los ratones de estudio Tg197 se asignaron, basandose en el genero y en el peso corporal, a uno de 9 grupos de tratamiento y se trataron con una sola dosis intraperitoneal en embolada de PBS de Dulbecco (D-PBS) o anticuerpo (TNV148, RT1 VV148B) a 1 mg/kg.
Cuando los pesos se analizaron como un cambio desde antes de administrar la dosis, los animales tratados con 10 mg/kg de cA2 mostraron una ganancia de peso sistematicamente mayor que los animales tratados con D- PBS a lo largo de todo el estudio. Esta ganancia de peso fue significativa en las semanas 1 y en las semanas 3-8. Los animales tratados con 1 mg/kg de TNV148 tambien consiguieron una ganancia de peso significativa en las semanas 5, 6 y 8 del estudio. (Vease la Figura 16).
La Figura 17 representa la progresion de la gravedad de la enfermedad basandose en el Indice artrltico. El Indice artrltico del grupo tratado con 10 mg/kg de cA2 fue inferior que el del grupo de control de D-PBS comenzando en la semana 4 y continuando a lo largo del resto del estudio (semana 8). Tanto el grupo tratado con TNV148 como el grupo tratado con 1 mg/kg de cA2 mostraron una reduccion significativa en Al en la semana 4. Aunque un estudio previo (P-099-017) mostro que TNV148 era ligeramente mas eficaz para reducir el Indice Artrltico despues de una sola inyeccion intraperitoneal en embolada de 1 mg/kg, este estudio mostro que el Al de las dos versiones de los grupos tratados con anticuerpo TNV fue ligeramente mayor. Aunque (con exception de la semana 6) el grupo tratado con 1 mg/kg de cA2 no estaba significativamente aumentado cuando se comparaba con el grupo de 10 mg/kg de cA2 y los grupos tratados con TNV148 fueron significativamente mayores en la semana 7 y 8, no hubo diferencias significativas en Al entre 1 mg/kg de cA2, 1 mg/kg de TNV148 y 1 mg/kg TNV148B en ningun punto en el estudio.
<110> Centocor Ortho Biotech Inc.
<120> ANTICUERPOS ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSICIONES, METODOS Y USOS
<130> P055221EP
<150> US 60/223,360
<151> 2000-08-07
<150> US 60/236,826
<151> 2000-09-29
<150> US 09/920,137
<151> 2001-08-01
<160> 15
<170> PatentIn Ver 2.0
<210> 1
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
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Arg Tyr Thr Met His 1 5
<210>2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2
Val lie Ser Phe Asp Gly Ser'Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
<210>3 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp lie 1 5 10
<210>4 <211 > 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10
<210>5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Gar
<210>6 <211 > 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
imagen1
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 15 10
<210>7 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
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Gin 1
Val Gin Leu
Ser
Leu Arg Leu 20
Ala
Met His 35 Trp
Ala
Val 50 He Ser
Lys 65
Gly Arg Phe
Leu
Gin Met Asn
Ala
Arg Asp Arg 100
Met
Asp Val 115
<210>8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Glu lie Val Leu 1
Glu Arg Ala Thr 20
Leu Ala Trp Tyr 35
Tyr Asp Ala Ser 50
Ser Gly Ser Gly 65 ‘
Glu Asp Phe Ala
Phe Thr Phe Gly 100
<210>9 <211>157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Val Glu Ser Gly Gly Gly 5 10
Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25
Val Arg Gin Ala Pro Gly

\ A "

Tyr Asp Gly Ser Asn Lys ' . 55

Thr lie Ser Arg Asp Asn 70 '

Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90
Gly lie Ser Ala Gly Gly 105
Thr Gin Ser Pro Ala Thr 5 10
Leu Ser Cys Arg Ala Ser 25
Gin Gin Lys Pro Gly Gin
'40
Asn Arg Ala Thr Gly lie 55
Thr Asp Phe Thr Leu Thr

70 .

Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 .90

Pro Gly Thr Lys Val Asp 105 ^
Val
Val
Gin Pro Gly 15 Arg
Phe
Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Lys
Gly Leu 45 Glu Trp Val
Tyr
Tyr 60 Ala- Asp Ser Val
Ser 75
Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Thr
Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Asn
Tyr Tyr Tyr 110 Tyr Gly
Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15
Gin Ser Val Ser Ser Tyr 30
Ala Pro Arg Leu Leu lie 45 ’
Pro Ala. Arg Phe Ser Gly 60
lie Ser Ser Leu Glu Pro 75 . 80
Arg Ser Asn Trp Pro Pro 95
lie Lys
5
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Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gin Ala'Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg

20 25 30 "
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Gin Val Leu Phe 50 55 60

Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr lie

65 70 75 80 "
Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

* 85 90 95

lie Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

~ 100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro lie Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys

115 120 . 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu lie Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe ' 130 135 140 " ’

Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He lie Ala Leu . .

145 150 155
<210> 10
<211> 15
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10 agatatacta tgcac 15
<210> 11
<211> 51
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11 gttatatcat ttgatggaag caataaatac tacgtagact ccgtgaaggg c 51
<210> 12
<211> 30
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12 gaggcccggg gatcgtatgc ttttgatatc 30
<210> 13
<211> 42
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cc 42
<210> 14
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 14 gatgcatcca acagggcc
<210> 15
<211> 21
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 15 cagcagcgta gcaactggcc t 21

Claims (5)

  1. 5
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    15
    20
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    65
    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo especlfico para el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que tiene tres CDRs de la cadena pesada y tres CDRs de la cadena ligera o un fragmento que enlaza con los mismos, en donde
    las tres CDRs de la cadena pesada tienen la secuencia de aminoacidos de:
    CDRH1:SYAMH;
    CDRH2: FMSYDGSNKKYADSVKG;
    CDRH3: DRGIAAGGNYYYYGMDV; y
    las tres CDRs de la cadena ligera tienen la secuencia de aminoacidos de:
    CDRL1: RASQSVYSYLA;
    CDRL2: DASNRAT;
    CDRL3: QQRSNWPPFT;
    para su uso en el tratamiento de colitis ulcerosa.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento que enlaza con el antlgeno de la reivindicacion 1 para su uso de acuerdo con la reivindicacion, en donde dicho anticuerpo es humano.
  3. 3. El anticuerpo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 para su uso de acuerdo con esa reivindicacion, en donde:
    la cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos:
    QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGKGL. EWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS; y
    la cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos:
    EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLL IYDASNRATGIPARFSGSGS- GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP PFTFGPGTKVDIK; y
    el anticuerpo es IgG1K.
  4. 4. Una composition que comprende el anticuerpo de las reivindicaciones 1-3 y un vehlculo o diligente farmaceuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de colitis ulcerosa.
  5. 5. Una composicion que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento de colitis ulcerosa, que comprende adicionalmente al menos uno seleccionado de un antagonista del TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriatico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un nutritivo, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemetico, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropieitina, un ilgrastim, un sargramostim, una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un modulador del receptor de estrogenos, un midriatico, un cicloplegico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo , un antimaniaco, un antipsicotico, un ansiolltico, un hipnotico, un simpaticomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolino, una epinefrina o analogo, dornasa alfa, una citoquina y un antagonista de citoquinas.
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Families Citing this family (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
CN103275221B (zh) 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US6709655B2 (en) 2001-02-28 2004-03-23 Instituto Bioclon, S.A. De C.V. Pharmaceutical composition of F(ab1)2 antibody fragments and a process for the preparation thereof
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
TWI334439B (en) * 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
EP1448602B1 (en) * 2001-11-12 2010-05-26 MERCK PATENT GmbH Modified anti-tnf alpha antibody
EP1585477A4 (en) * 2001-11-30 2007-06-27 Centocor Inc ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
EP1521776A2 (en) 2002-07-04 2005-04-13 Oncomab Gmbh Neoplasm specific antibodies and uses thereof
CN102755646A (zh) * 2002-07-19 2012-10-31 艾博特生物技术有限公司 TNF α相关疾病的治疗
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
EP2316852B1 (en) 2002-11-08 2014-03-05 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
US7335759B2 (en) * 2002-12-02 2008-02-26 Universidad Nacional Autónoma de Méxica (UNAM) Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
ES2339236T3 (es) * 2003-07-25 2010-05-18 Laboratorios Silanes, S.A. De C.V. Administracion de fragmentos de anticuerpo f(ab')2 anti-tnf-alfa.
EP1660533A4 (en) * 2003-09-12 2009-10-21 Univ California SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES MADE FROM PROTEINS OF DIFFERENT SEQUENCES FOR HIGHLY MOLECULAR AGGREGATIVE INTERMEDIATE PRODUCTS OF AMYLOIDS
CN1328379C (zh) * 2003-11-13 2007-07-25 中国人民解放军第四军医大学 高亲和力抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
PL1766093T3 (pl) * 2004-02-06 2011-11-30 Univ Massachusetts Przeciwciała przeciw toksynom Clostridium difficile i ich zastosowania
TWI439284B (zh) * 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
GB0414054D0 (en) 2004-06-23 2004-07-28 Owen Mumford Ltd Improvements relating to automatic injection devices
WO2006039638A2 (en) * 2004-09-30 2006-04-13 Centocor, Inc. Treating renal cell carcinoma with an anti-tnf human antibody or fragment
US20060083741A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Hoffman Rebecca S Treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infection
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
US7736650B2 (en) * 2004-12-21 2010-06-15 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibody based vectors, host cells, and methods of production and uses
US7381802B2 (en) * 2005-04-15 2008-06-03 Universidad Nacional Autónoma De México (UNAM) Human antibodies that specifically recognize the toxin Cn2 from Centruroides noxius scorpion venom
KR101465456B1 (ko) 2005-05-16 2014-11-27 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 미란성 다발관절염의 치료를 위한 ｔｎｆ 억제제의 용도
US20070041905A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
JP2009508476A (ja) 2005-08-31 2009-03-05 セントカー・インコーポレーテツド 高められたエフェクター機能をもつ抗体定常領域の製造用の宿主細胞株
TWI424161B (zh) 2005-11-01 2014-01-21 Abbvie Biotechnology Ltd 利用生物標記診斷關節黏連脊椎炎之方法及組合物
EP3088410A3 (en) * 2006-04-05 2016-12-28 AbbVie Biotechnology Ltd Antibody purification
EP2666478A3 (en) 2006-04-10 2014-10-22 AbbVie Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriasis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
EP2012586A4 (en) 2006-04-10 2010-08-18 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ANKYLOSANTE SPONDYLARTHRITIS
CA2564435A1 (en) 2006-04-10 2007-10-10 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for monitoring and treating intestinal disorders
US20080118496A1 (en) * 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
EP2666472A3 (en) 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US20090317399A1 (en) * 2006-04-10 2009-12-24 Pollack Paul F Uses and compositions for treatment of CROHN'S disease
EP2010214A4 (en) * 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS
EP2010213A4 (en) * 2006-04-10 2010-08-11 Abbott Biotech Ltd USE AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF JUVENIL RHEUMATOID ARTHRITIS
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
US20100021451A1 (en) * 2006-06-08 2010-01-28 Wong Robert L Uses and compositions for treatment of ankylosing spondylitis
EP2043711A4 (en) 2006-06-30 2017-08-30 AbbVie Biotechnology Ltd Automatic injection device
SG174804A1 (es) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
EP2684895A1 (en) 2006-10-27 2014-01-15 AbbVie Biotechnology Ltd Crystalline anti-hTNFalpha antibodies
WO2008092084A2 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Centocor, Inc. Injectable non-aqueous suspension with high concentration of therapeutic agent
RU2009141592A (ru) * 2007-04-11 2011-05-20 Алькон Рисерч, Лтд. (Us) ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРА TNFα В СОЧЕТАНИИ С АНТИГИСТАМИННЫМ СРЕДСТВОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО РИНИТА И АЛЛЕРГИЧЕСКОГО КОНЪЮНКТИВИТА
EP2165194A4 (en) 2007-05-31 2010-09-08 Abbott Lab BIOMARKERS FOR PREDICTING RESPONSABILITY TO TNF ALPHA INHIBITORS IN AUTOIMMUNE DISEASES
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
CN101848733A (zh) * 2007-07-13 2010-09-29 艾博特生物技术有限公司 用于肺部给予TNFα抑制剂的方法和组合物
MX2010001488A (es) 2007-08-08 2010-03-01 Abbott Lab Composiciones y metodos para cristalizar anticuerpos.
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
KR20190045414A (ko) * 2007-11-30 2019-05-02 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 단백질 제형 및 이의 제조방법
WO2009090189A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Abbott Gmbh & Co.Kg Powdered protein compositions and methods of making same
JP2011517672A (ja) * 2008-03-24 2011-06-16 アボツト・バイオテクノロジー・リミテツド 骨損失を治療するための方法及び組成物
US11969501B2 (en) 2008-04-21 2024-04-30 Dompé Farmaceutici S.P.A. Auris formulations for treating otic diseases and conditions
MX2010011545A (es) 2008-04-21 2011-04-11 Otonomy Inc Formulaciones para tratar enfermedades y afecciones del oido.
JP2011524741A (ja) * 2008-05-27 2011-09-08 協和発酵キリン株式会社 インターロイキン１０受容体（ｉｌ−１０ｒ）抗体及び使用方法
RU2652907C2 (ru) * 2008-06-25 2018-05-03 ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела
CN102164958A (zh) 2008-06-25 2011-08-24 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化
US8784870B2 (en) * 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
CA2731769C (en) 2008-07-21 2013-09-10 Otonomy, Inc. Controlled-release otic structure modulating and innate immune system modulating compositions and methods for the treatment of otic disorders
BRPI0923806A2 (pt) 2008-12-30 2015-07-14 Centocor Ortho Biotech Inc Marcadores séricos para previsão da resposta clínica a anticorpos anti-tnfa em pacientes com espondilite anquilosante
WO2010127146A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Abbott Biotechnology Ltd Automatic injection device
CN102458469B (zh) * 2009-05-04 2014-12-24 艾伯维生物技术有限公司 人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂
JP2012526840A (ja) * 2009-05-13 2012-11-01 プロテイン デリヴァリー ソリューションズ エルエルシー 膜貫通送達のための製剤系
BR112012007091A2 (pt) * 2009-10-01 2016-04-19 Alcon Res Ltd composições de olopatadina e seus usos
CN104634955B (zh) * 2009-10-26 2016-09-14 雀巢产品技术援助有限公司 检测抗-tnf药物和自身抗体的试验
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011056644A2 (en) 2009-10-28 2011-05-12 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-glp-1r antibodies and their uses
US20110150891A1 (en) 2009-12-16 2011-06-23 Philip Bosch Methods of Treating Interstitial Cystitis
CL2010000019A1 (es) * 2010-01-11 2010-06-11 Univ Chile Anticuerpo monoclonal contra el tnf humano y sus fragmentos, secuencias nucleotidicas que lo codifican, vector de expresion y celulas que las contienen, composiciones y kit que comprenden el anticuerpo, uso de los mismos y metodo para su obtencion.
WO2011097301A2 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Abbott Biotechnology Ltd. METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREDICTING RESPONSIVENESS TO TREATMENT WITH TNF-α INHIBITOR
WO2011095174A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Aarhus Universitet Human herpes virus 6 and 7 u20 polypeptide and polynucleotides for use as a medicament or diagnosticum
CN102167741B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
US9072668B2 (en) 2010-03-09 2015-07-07 Janssen Biotech, Inc. Non-aqueous high concentration reduced viscosity suspension formulations of antibodies
US20110223208A1 (en) * 2010-03-09 2011-09-15 Beth Hill Non-Aqueous High Concentration Reduced Viscosity Suspension Formulations
JP5809242B2 (ja) 2010-04-21 2015-11-10 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド 治療薬の制御送達のための装着型自動注入装置
WO2011146727A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Philip Bosch Methods of treating interstitial cystitis
HUE039740T2 (hu) 2010-06-03 2019-01-28 Abbvie Biotechnology Ltd Alkalmazások és készítmények hidradenitis suppurativa (HS) kezelésére
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
NZ609469A (en) * 2010-11-11 2015-02-27 Abbvie Biotechnology Ltd Improved high concentration anti-tnfα antibody liquid formulations
EP2490024A1 (en) 2010-12-22 2012-08-22 Proteomika, S.L. Method to optimize the treatment of patients with biological drugs
EP2471554A1 (en) * 2010-12-28 2012-07-04 Hexal AG Pharmaceutical formulation comprising a biopharmaceutical drug
EP2667918B1 (en) 2011-01-24 2017-03-01 AbbVie Biotechnology Ltd Automatic injection devices having overmolded gripping surfaces
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
WO2012129174A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Abbott Laboratories Systems. devices and methods for assembling automatic injection devices and sub-asseblies thereof
WO2012135524A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Abbott Laboratories Improved shroud deployment in automatic injection devices
WO2012145752A2 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Abbott Laboratories Wearable automatic injection device for controlled administration of therapeutic agents
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
CA2883272A1 (en) 2012-09-02 2014-03-06 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
ES2784861T3 (es) 2012-09-07 2020-10-01 Coherus Biosciences Inc Formulaciones acuosas estables de adalimumab
SI2897978T1 (sl) * 2012-09-19 2017-05-31 Abbvie Biotherapeutics Inc. Postopki za identifikacijo protiteles z zmanjšano imunogenostjo
RU2636043C2 (ru) 2012-11-01 2017-11-17 Эббви Инк. Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения
BR112015021708A2 (pt) 2013-03-06 2017-08-29 Protalix Ltd Inibidor de polipetídeo do tnfa, polinucleotídeo isolado, estrutura de expressão de ácido nucleico, célula de planta, composição farmacêutica e método de produção de um inibidor de polipeptídeo do tnfa
CA2902727C (en) * 2013-03-06 2020-08-18 Protalix Ltd. Use of plant cells expressing a tnfalpha polypeptide inhibitor in therapy
CA2905010A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
AU2014227732A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17
PL2970980T3 (pl) 2013-03-15 2019-01-31 Janssen Biotech, Inc Sposoby wytwarzania kontrolujące zawartość C-końcowej lizyny, galaktozy i kwasu sjalowego w rekombinowanych białkach
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
JPWO2015083765A1 (ja) * 2013-12-04 2017-03-16 国立大学法人大阪大学 生物学的製剤による関節リウマチの治療効果を予測判定する方法
CN106535889A (zh) 2014-02-10 2017-03-22 帕塔拉制药有限责任公司 用于治疗肺疾病的肥大细胞稳定剂
CN106456595A (zh) 2014-02-10 2017-02-22 帕塔拉制药有限责任公司 用于系统性病症的肥大细胞稳定剂治疗
WO2015198320A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of purifying antibodies
TWI711629B (zh) 2014-09-03 2020-12-01 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途
US10000551B2 (en) 2014-09-11 2018-06-19 Protalix Ltd. Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
KR102622281B1 (ko) 2015-03-31 2024-01-08 소리소 파마슈티컬스 인크. 폴리펩티드
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US10265296B2 (en) 2015-08-07 2019-04-23 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of systemic disorders treatable with mast cell stabilizers, including mast cell related disorders
WO2017027387A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Patara Pharma, LLC Methods for the treatment of mast cell related disorders with mast cell stabilizers
US11229702B1 (en) 2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
MA46681A (fr) * 2016-01-28 2019-09-11 Janssen Biotech Inc Anticorps bispécifiques anti-tnf-alpha/il-17a antibodies et anticorps anti-tnf-alpha et leurs procédés d'utilisation
US10465003B2 (en) 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
EP3440113A1 (en) 2016-04-08 2019-02-13 Gilead Sciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases
US11071782B2 (en) 2016-04-20 2021-07-27 Coherus Biosciences, Inc. Method of filling a container with no headspace
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
CN109689027A (zh) 2016-06-29 2019-04-26 奥德纳米有限公司 甘油三酯耳用制剂及其用途
WO2018044942A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Patara Pharma, LLC Cromolyn compositions for treatment of chronic cough due to idiopathic pulmonary fibrosis
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
WO2018067341A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Patara Pharma, LLC Cromolyn compositions for treatment of pulmonary fibrosis
JOP20190162A1 (ar) 2016-12-30 2019-06-27 Biocad Joint Stock Co تركيبة صيدلانية مائية من جسم مضاد لـ tnf? أحادي النسيلة معاود الارتباط الجيني
KR20190113858A (ko) * 2017-01-30 2019-10-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 건선성 관절염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
WO2018147915A1 (en) * 2017-02-07 2018-08-16 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
WO2019232081A1 (en) * 2018-05-29 2019-12-05 Abcentra, Llc Compositions and methods for treatment of rheumatoid arthritis and accelerated atherosclerosis
MX2021008537A (es) 2019-01-15 2021-11-12 Janssen Biotech Inc Composiciones de anticuerpos anti-tnf y métodos para el tratamiento de la artritis idiopática juvenil.
EA202192505A1 (ru) * 2019-03-14 2022-03-29 Янссен Байотек, Инк. Способы получения композиций антитела к фно
AU2020279987A1 (en) 2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
CN113939531A (zh) 2019-06-03 2022-01-14 詹森生物科技公司 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法
CA3144567A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Scott Crowe Polypeptides
JP2022538083A (ja) 2019-06-21 2022-08-31 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
CN111153994B (zh) * 2019-12-31 2021-10-15 武汉班科生物技术股份有限公司 人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体
KR20240012469A (ko) 2021-05-20 2024-01-29 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Il-23 및 tnf 알파에 대한 항체의 병용요법으로 염증성 장질환을 치료하는 방법
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
WO2024054934A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Mdx Management Llc Shp-1 inhibitors for treating cancer

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5700466A (en) 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US4603106A (en) 1982-02-22 1986-07-29 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US4822776A (en) 1981-09-08 1989-04-18 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3546807C2 (es) 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8517895D0 (en) 1985-07-16 1985-08-21 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
ATE114673T1 (de) 1985-08-16 1994-12-15 Univ Rockefeller Modulator der anabolischen aktivität und seine verwendungen.
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
IL79740A0 (en) 1986-08-17 1986-11-30 Yeda Res & Dev Hepatitis vaccine
EP0318512B1 (en) 1986-08-18 1998-06-17 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988006630A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Method for the preparation of binding molecules
DE3888224T2 (de) 1987-04-24 1994-07-21 Teijin Ltd Bestimmung vom Tumornekrosefaktor; monoklonaler Antikörper und Zusammensetzung.
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
EP0396612B1 (en) 1988-01-11 1996-07-24 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5770198A (en) 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
DE3823804A1 (de) 1988-07-14 1990-01-18 Basf Ag Neutralisation der in vitro und in vivo toxischen eigenschaften von tnf-(alpha) durch monoklonale antikoerper und den davon abgeleiteten fragmenten
NZ229922A (en) 1988-07-18 1992-04-28 Chiron Corp Monoclonal antibodies specifically binding cachectin (tumor necrosis factor) and compositions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5342613A (en) 1988-12-27 1994-08-30 Health Research Inc. Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
PT92900A (pt) 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
DE59010941D1 (de) 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
DE69017753T3 (de) 1989-05-18 2013-06-20 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE10399036I1 (de) 1989-08-07 2004-04-01 Peptide Technology Ltd Bindeligande für Tumornekrosisfaktor.
AU638762B2 (en) 1989-10-05 1993-07-08 Optein Inc Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
DE69022559T2 (de) 1989-12-13 1996-05-02 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten Tumor-Nekrosisfaktor-Bindungsproteins I (TBP-I).
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
TW212184B (es) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AU8081491A (en) 1990-06-01 1991-12-31 Cetus Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
ATE204902T1 (de) 1990-06-29 2001-09-15 Large Scale Biology Corp Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
US5958413A (en) 1990-11-01 1999-09-28 Celltech Limited Use of antibodies to TNF or fragments derived thereof and xanthine derivatives for combination therapy and compositions therefor
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
DK0567566T4 (da) 1991-01-18 2007-10-22 Amgen Inc Fremgangsmåder til behandling af tumornekrosefaktor-medierede sygdomme
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
AU668864B2 (en) 1991-03-18 1996-05-23 Centocor Inc. Chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
US5698195A (en) 1991-03-18 1997-12-16 New York University Medical Center Methods of treating rheumatoid arthritis using chimeric anti-TNF antibodies
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
NL9101124A (nl) 1991-06-28 1993-01-18 Stork Brabant Bv Rotatiezeefdrukmachine.
KR100246082B1 (ko) 1991-07-02 2000-04-01 인헤일, 인코오포레이티드 에어로졸화된약제를전달하는방법및장치
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
SK285046B6 (sk) 1991-07-25 2006-05-04 Idec Pharmaceuticals Corporation Chimérna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie
EP0525570A3 (en) 1991-07-31 1993-10-06 Miles Inc. Anti-idiotypic antibodies that mimic tnf
DE4125898C2 (de) 1991-08-05 1994-02-03 Hirschmann Richard Gmbh Co Fahrzeugantenne in Form einer Schlitzantenne
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
SK51695A3 (en) 1992-10-19 1995-11-08 Dura Pharma Inc Dry powder medicament inhaler
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
DE69414369T2 (de) 1993-01-19 1999-05-27 Glaxo Group Ltd Aerosol-spender und verfahren zu seiner herstellung
CA2155728C (en) 1993-02-12 2000-04-25 Gerald R. Crabtree Regulated transcription of targeted genes and other biological events
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
PT614984E (pt) 1993-03-05 2001-12-28 Bayer Ag Anticorpos humanos anti-tnf
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9315846D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tumour inhibitors
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US6190691B1 (en) 1994-04-12 2001-02-20 Adolor Corporation Methods for treating inflammatory conditions
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
FR2728793A1 (fr) 1994-12-28 1996-07-05 Oreal Utilisation d'un antagoniste d'histamine, d'un antagoniste d'interleukine 1 et/ou d'un antagoniste de tnf-alpha dans une composition cosmetique, pharmaceutique ou dermatologique et composition obtenue
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
BR9612410A (pt) 1996-01-03 1999-07-13 Glaxo Group Ltd Aparelho para inalação
CN103275221B (zh) 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
EP0826695B1 (de) 1996-09-03 2001-12-12 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Zerstörung von kontaminierenden Tumorzellen in Stammzelltransplantaten mit bispezifischen Antikörpern
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
EP1506302A4 (en) 2002-05-23 2006-02-08 Cognis Ip Man Gmbh CANDIDA TROPICALIS BLOCKED BY OXIDATION BETA NON REVERSIBLE
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
LUC00010I2 (es) 2017-05-30
HRP20030089A2 (en) 2005-02-28
CA2419205C (en) 2010-10-12
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US20050123541A1 (en) 2005-06-09
EP3118318B1 (en) 2018-12-05
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KR20030022367A (ko) 2003-03-15
FR10C0014I1 (es) 2010-04-16
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EA007005B1 (ru) 2006-06-30
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CN101980017B (zh) 2016-08-03
EP2330129A3 (en) 2011-08-03
CY1109618T1 (el) 2012-01-25
DK3118318T3 (en) 2019-02-18
MY157288A (en) 2016-05-31
DK1309691T3 (da) 2009-12-07
EA200300243A1 (ru) 2003-08-28
EP1309691A2 (en) 2003-05-14
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US7521206B2 (en) 2009-04-21
LU91663I2 (fr) 2010-05-12
IL154327A (en) 2010-06-16
JP6564438B2 (ja) 2019-08-21
YU9103A (sh) 2006-05-25
HK1140494A1 (en) 2010-10-15
FR10C0014I2 (fr) 2011-04-01
BRPI0113110B8 (pt) 2021-05-25
HUP0302376A2 (hu) 2003-10-28
SI2159230T1 (sl) 2015-01-30
ES2527953T3 (es) 2015-02-02
CY1121353T1 (el) 2020-05-29
EP2330129A2 (en) 2011-06-08
DE60140259D1 (de) 2009-12-03
SI3118318T1 (sl) 2019-02-28
NZ562811A (en) 2009-05-31
CN1468308A (zh) 2004-01-14
US20070003548A1 (en) 2007-01-04
SI1309691T1 (sl) 2010-01-29
US7250165B2 (en) 2007-07-31
LT3118318T (lt) 2019-02-11
PL360438A1 (en) 2004-09-06
LU91663I9 (es) 2018-12-18
CY2017009I1 (el) 2017-09-13
PT2159230E (pt) 2015-02-05
DK2159230T3 (en) 2014-11-17
WO2002012502A3 (en) 2002-10-31
HK1052948B (zh) 2010-05-07
DE122010000010I1 (de) 2010-07-08
WO2002012502A9 (en) 2004-03-04
CY1118443T1 (el) 2017-06-28
US7691378B2 (en) 2010-04-06
EP2330129B1 (en) 2016-09-21
PT3118318T (pt) 2019-03-21
JP2019054802A (ja) 2019-04-11
ME00314B (me) 2011-05-10
HRP20030089B1 (en) 2011-09-30
JP2011188862A (ja) 2011-09-29
CA2419205A1 (en) 2002-02-14
MEP48408A (en) 2011-02-10
EA200600126A1 (ru) 2006-10-27
CN101980017A (zh) 2011-02-23
CY2019029I2 (el) 2020-05-29
CY2010008I1 (el) 2012-01-25
HK1052948A1 (en) 2003-10-03
JP2004523209A (ja) 2004-08-05
MY157289A (en) 2016-05-31
JP2021036872A (ja) 2021-03-11
JP6590428B2 (ja) 2019-10-16
NO2017046I1 (no) 2017-08-25
JP2018046817A (ja) 2018-03-29
NO2013012I2 (no) 2013-06-07
IL195898A (en) 2015-11-30
BRPI0113110C1 (pt) 2021-08-24
NZ524147A (en) 2005-02-25
BRPI0113110B1 (pt) 2018-03-20
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