KR20030022367A - 항-ｔｎｆ 항체, 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 항-TNF 항체, TNF, 벡터, 숙주 세포, 형질전환 동물 또는 식물을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 적어도 하나의 신규한 항-TNF 항체, 그의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.

Description

항-ＴＮＦ 항체, 조성물, 방법 및 용도{ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES}
TNF 알파는 17 kD 단백질 서브유니트의 가용성 호모트리머이다((Smith et al., J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). TNF의 막-결합된 26 kD 전구체가 또한 존재한다(Kriegler et al., Cell 53: 45-53 (1988)). TNF에 대한 조사(참조: Beutler et al., Nature 320: 584 (1986); Old, Science 230: 630 (1986); and Le et al., Lab. Invest. 56: 234 (1987)).
단핵 세포 또는 대식 세포 이외의 세포가 또한 TNF 알파를 생성한다. 예를들어, 인간 비-단핵 세포성 종양 세포주는 TNF 알파를 생성한다(Rubin et al., J. Exp. Med. 164 : 1350 (1986); Spriggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6563 (1987)). CD4+ 및 CD8+ 말초 혈액 림프구 및 일부 배양된 T 및 B 세포주(Cuturi et al., J. Exp. Med. 165: 1581 (1987); Sung et al., J. Exp. Med. 168: 1539 (1988); Turner et al., Eur. J. Immunol. 17: 1807-1814 (1987))가 또한 TNF 알파를 생성한다.
TNF 알파는 프로-염증성 작용을 야기하여 조직 손상, 예를 들어 연골 및 뼈의 분해(Saklatvala, Nature 322: 547-549 (1986); Bertolini, Nature 319: 516-518 (1986)), 접착 분자 유도, 혈관 내피 세포상에서 프로응집 활성 유도(Pober et al., J. Immunol. 136: 1680 (1986)), 호중구 및 림프구의 접착 증가(Pober et al., J. Immunol. 138 : 3319 (1987)), 및 대식 세포, 호중구 및 혈관 내피 세포로부터 혈소판 활성 인자 방출 촉진(Camussi et al., J. Exp. Med. 166: 1390 (1987))을 초래한다.
최근 증거는 TNF 알파를 감염(Cerami et al., Immunol. Today 9: 28 (1988)), 면역 질환, 신생 병리학(Oliffet al., Cell 50: 555 (1987)), 자가면역 병리학 및 편대숙주 병리학(Piguet et al., J. Exp. Med. 166: 1280 (1987))에 연관시켰다. 암 및 감염성 병리학에서 TNF 알파의 연관은 종종 숙주의 대사 상태와 관련이 있다. 암 환자는 보통 식욕부진으로 인한 체중 감소로 고통받는다.
암 및 다른 질환으로 수반되는 과다 소모는 "카켁시아(Cachexia)"로 알려져 있다(Kern et al., J. Parent. Enter. Nutr. 12: 286-298 (1988)). 카켁시아는 진행성 체중 감소, 아노렉시아 및 악성 증식으로 인한 마른 몸체의 지속적인 침식증을 포함한다. 카켁시아 상태는 많은 암 이환 및 치사를 가져온다. TNF 알파가 암, 감염성 병리학 및 다른 대사 상태의 카켁시아에 관여한다는 증거가 있다(참조: Beutler and Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7: 625-655 (1989)).
TNF 알파는 그램 음성 패혈증 및 열, 권태감, 아노렉시아 및 카켁시아를 포함하여 내부독 쇼크에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(Michie et al., Br. J. Surg. 76: 670-671 (1989); Debets et al., Second Vienna Shock Forum, p. 463-466 (1989); Simpson et al., Crit. Care Clin. 5: 27-47 (1989)). 엔도톡신은 TNF 알파 및 다른 사이토킨의 분비 및 단핵 세포/대식 세포 생성을 강하게 활성화시킨다 (Kornbluth et al., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)). TNF 알파 및 다른 단핵 세포-유도된 사이토킨은 엔도톡신에 대한 대사 및 신경호르몬 응답을 중재한다 (Michie et al., New Engl. J. Med. 318: 1481-1486 (1988)). 인간 지원자에 엔도톡신의 투여는 열, 타키카디아, 증가된 대사율 및 스트레스 호르몬 방출을 포함한 플루-성(flu-like) 증상을 갖는 급성 병을 야기한다(Revhaug et al., Arch. Surg. 123: 162-170 (1988)). TNF 알파 순환은 그램-음성 패혈증으로 고통받는 환자에서 증가한다(Waage et al., Lancet 1: 355-357 (1987); Hammerle et al., Second Vienna Shock Forum, p. 715-718 (1989); Debets et al., Crit. Care Med. 17: 489-497 (1989); Calandra et al., J. Infect. Dis. 161: 982-987 (1990)).
따라서, TNF 알파는 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 박테리아성 및 기생충성 감염, 악성 암 및/또는 신경퇴행성 질환에 관여하고, 류마티스성 관절염및 크론병에서 특정 생리학적 치료의 유용한 타겟이다. TNF 알파에 대한 키메라 모노클로날 항체(cA2)에 의한 오픈-라벨 시도에서 염증 억제 및 류마티스성 관절염(Elliott et al., Arthritis Rheum. 36: 1681-1690 (1993); and Elliott et al., Lancet 344: 1125-1127 (1994)) 및 크론병(Van Dullemen et al., Gastroenterology 109: 129-135 (1995))의 재발후 성공적인 재치료와 같은 유리한 효과가 보고되었다. cA2에 의한 무작위 이중맹 위약-조절된 시도에서 류마티스성 관절염에서 염증이 억제되는 유리한 결과가 또한 보고되었다(Elliott et al., Lancet 344: 1105-1110 (1994)). 카케틴(이후 TNF와 동일한 것으로 밝혀졌다)으로 특정화되었던 "조절" 물질에 대한 항체가 Cerami 등에 의해 보고되었다(EPO 특허 공개 0212489, 1987년 3월 4일). 이러한 항체는 박테리아성 감염에서 쇼크의 진단 면역분석 및 치료에서 유용한 것으로 보고되었다. Rubin 등(EPO 특허 공개 0218868, 1987년 4월 22일)은 인간 TNF에 대한 모노클로날 항체, 이들 항체를 분비하는 하이브리도마, 상기 항체의 제조방법 및 TNF의 면역분석에서 이들 항체의 용도를 개시하였다. Yone 등(EPO 특허 공개 0288088, 1988년 10월 26일)은 mAbs를 포함한 항-TNF 항체, 및 병리학, 특히 가와사키 병리학 및 박테리아성 감염의 면역분석 진단에서 이들의 유용성에 대해 개시하였다. 가와사키 병을 갖는 환자의 체액(infantile acute febrile mucocutaneous lymph node syndrome; Kawasaki, T., Allergy 16: 178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26: 935 (1985))은 병의 진전과 관련한 상승된 TNF 수준을 포함한다고 알려졌다(Yone et al., supra).
다른 조사는 시험관내에서 활성을 중화시키는 재조합 인간 TNF에 특이적인mAbs를 밝혀냈다(Liang, C-M. et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987) ; Fendly et al., Hybridoma 6: 359-369 (1987) ; Bringman, T. S. et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987); Moller, A. et al. (Cytokine 2: 162-169 (1990)). 이들 mAbs 중 일부는 인간 TNF의 에피토프를 지도화하고, 효소 면역분석을 진전시키고(Fendly et al., supra; Hirai et al., supra ; Moller et al., supra), 재조합 TNF의 정제(Bringman et al., supra)를 돕기위해 사용되었다. 그러나, 이들 연구는 면연원성, 특이성 및/또는 약제학적 안정성 결여로 인해 인간의 생체내에서 진단 또는 치료용으로 사용될 수 있는 TNF 중화 항체를 생성하는 원리를 제공하지 못했다.
TNF에 대해 mAbs를 중화시키는 안티세라는 인간 이외의 포유동물에게서 실험적인 엔도텍세미아 및 박테레미아에서 치명적인 챌린지후 불리한 약리학적 변화를 저지하고 사망을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 효과는 예를 들어 설치류 치사 분석 및 영장류 병리학 모델 시스템에서 입증되었다(Mathison, J. C. et al., J. Clin. Invest. 81 : 1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 229: 869-871 (1985); Tracey, K. J. et al., Nature 330: 662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17: 311-318 (1988); Silva, A. T. et al., J. Infect. Dis. 162: 421-427 (1990); Opal, S. M. et al., J. Infect :-Dis. 161: 1148-1152 , (1990); Hinshaw, L. B. et al., Circ. Shock 30: 279-292 (1990)).
hTNF의 추정 수용체 결합 부위가 Eck 및 Sprang에 의해 기술되었으며(J.Biol. Chem. 264 (29), 17595-17605 (1989), 이들은 아미노산 11-13,37-42, 49-57 및 155-157으로 구성된 TNF-a의 수용체 결합 부위를 알아냈다. PCT 출원 W091/02078호(우선일 1989년 8월 7일)는 하기 에피토프를 갖는 모노클로날 항체에 결합할 수 있는 TNF 리간드를 개시하였다: 1-20, 56-77, 및 108-127의 적어도 하나; 1-20, 56-77, 108-127 및 138-149의 적어도 두개; 1-18, 58-65, 115-125 및 138-149 전부; 1-18, 및 108-128 전부; 56-79, 110-127 및 135- 또는 136-155 전부; 1-30, 117-128 및 141-153 전부; 1-26, 117-128 및 141-153 전부; 22-40, 49-96 또는 -97, 110-127 및 136-153 전부; 12-22, 36-45, 96-105 및 132-157 전부; 1-20 및 76-90 전부; 22-40, 69-97, 105-128 및 135-155 전부; 22-31 및 146-157 전부; 22-40 및 49-98 전부; 22-40, 49-98 및 69-97의 적어도 하나, 22-40 및 70-87 둘 다.
비인간 악성 키메릭 폴리클로날(예를 들어 안티세라) 및/또는 모노클로날 항체((Mabs) 및 단편(예: 단백질 분해 또는 그의 융합 단백질 산물)은 특정 질환을 치료하고자 시도되는 일부의 경우에서 연구되고 있는 잠재적인 치료제이다. 그러나, 이들 항체 또는 단편은 인간에게 투여되었을 때 면역 반응을 유도할 수 있다.이러한 면역 반응은 순환으로부터 항체 또는 단편의 면역 컴플렉스-매개된 클리어런스를 초래하고, 치료에 부적합한 반복 투여를 야기하여 환자에 대한 치료 효과를 감소시키고 항체 또는 단편의 재투여를 제한할 수 있다. 예를 들어, 비인간 부분을 포함한 항체 또는 단편의 반복 투여는 혈청 병 및/또는 아나팔락시스를 야기할 수 있다. 이러한 문제점 및 다른 문제점들을 극복하기 위하여, 당 업계에 알려진 키메라화 및 인간화를 포함하여 상기 항체 및 이들 부분의 면역원성을 감소시키기 위한 다수의 시도가 있어 왔다. 그러나, 이러한 시도 및 다른 시도는 특정 면역원성, 저 친화성, 저 항원항체 결합력을 가지는 항체 또는 단편을 초래할 수 있거나, 세포 배양물에서 스케일 증가, 생산성 및/또는 저 수율과 같은 문제점을 제기한다. 즉, 이들 항체 또는 단편은 치료 단백질로서 제조 또는 사용하기에 이상적으로 연구될 수 없다.
따라서, 상기 문제점중 하나 이상을 극복하는 것 뿐만 아니라 공지된 항체 또는 그의 단편보다 개선된 항-TNF 항체 또는 단편이 요망된다.
본 출원은 부분적으로 각각 그의 내용이 본 원에 참고로 인용되는 2000년 8월 7일 출원된 미국 가출원 60/22,3360호 및 2000년 9월 29일 출원된 60/236,826호를 기초로 하며 이를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 적어도 하나의 종양 괴사 인자 알파(TNF) 단백질 또는 그의 단편에 특이적인 특정 단백질 또는 변이체를 포함하는 항체, 항-TNF 항체를 코딩하는 핵산, 상보 핵산, 벡터, 숙주 세포 인자, 그의 제조방법 및 치료 제제, 투여 및 장치를 포함한 사용방법에 관한 것이다.
도 1은 하이브리도마 세포 상등액에서 재조합 TNF 수용체에 TNF∀이 결합하는 것을 억제하는 TNV mAbs의 능력을 분석한 것을 그래프로 나타낸 것이다. 공지된 양의 TNV mAb를 함유하는 하이브리도마 세포 상등액의 다양한 양을 고정 농도(5 ng/ml)의125I-표지된 TNF∀와 예비배양하였다. 혼합물을 p55-sf2, 재조합 TNF 수용체/IgG 융합 단백질로 미리 코팅된 96-웰 오피플레이트로 옮겼다. 결합되지 않는 물질을 세척해 낸 후 감마 카운터를 사용하여 계수하여 mAbs의 존재하에서 p55 수용체에 결합된 TNF∀의 양을 측정하였다. 이 실험에서 8개의 TNV mAb 샘플이 시험되었으나, 편의상, DNA 서열 분석에 의해 다른 TNV mAbs(Section 5.2.2 참조)중 하나와 동일한 것으로 나타난 세개의 mAms는 여기에 나타내지 않았다. 각 샘플을 듀플리케이트로 실험하였다. 제시된 결과는 두 독립 실험을 나타낸다.
도 2는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 보여진 생식세포주 유전자는 DP-46 유전자이다. 'TNVs'는 보여진 서열이 TNV14, TNV15, TNV148 및 TNV196의 서열임을 나타낸다. 처음 세개의 뉴클레오타이드는 해독 개시 Met 코돈을정의한다. TNV mAb 유전자 서열에서 점은 뉴클레오타이드가 생식세포주 서열과 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 처음 10 뉴클레오타이드(밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭시키기 위하여 사용된 올리고뉴클레오타이드에 상응한다. 성숙 mAb와 시작하는 아미노산 해독(단일 문자 약어)은 단지 생식세포주 유전자에 대해 나타난다. 생식세포주 아미노산 해독에서 세개의 CDR 도메인은 굵게 밑줄 그어 나타내었다. TNV148(B) 표지된 라인은 보여진 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘다에 관한 것임을 나타낸다. 생식세포주 DNA 서열(CDR3)에서 갭은 알려지지 않았거나 생식세포주에 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 중쇄는 J6 연결 영역을 사용한다.
도 3은 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 보여진 생식세포주 유전자는 인간 카파 생식세포주 가변 영역 유전자의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 멤버이다. TNV mAb 유전자 서열에서 점은 뉴클레오타이드가 생식세포주 서열과 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 처음 16 뉴클레오타이드(밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭시키기 위하여 사용된 올리고뉴클레오타이드에 상응한다. 성숙 mAb의 아미노산 해독(단일 문자 약어)은 단지 생식세포주 유전자에 대해 나타난다. 생식세포주 아미노산 해독에서 세개의 CDR 도메인은 굵게 밑줄 그어 나타내었다. TNV148(B) 표지된 라인은 보여진 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘다에 관한 것임을 나타낸다. 생식세포주 DNA 서열(CDR3)에서 갭은 알려지지 않았거나 생식세포주에 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 중쇄는 J3 연결 서열을 사용한다.
도 4는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 보여진 아미노산 서열은(단일 문자 약어)는 비클론 PCR 산물 및 클론된 PCR 산물 둘다로부터 결정된 DNA 서열로부터 추론된다. 아미노산 서열은 분비 신호 서열(신호), 골격(FW) 및 상보 결정 영역(CDR) 도메인으로 분배된다. DP-46 생식세포주 유전자레 대한 아미노산 서열은 각 도메인의 상부 라인에 나타난다. 점은 TNV mAb의 아미노산이 생식세포주 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)는 보여진 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘다에 관한 것임을 나타낸다. 'TNVs'는 보여진 서열이 다른 서열이 나타나지 않는 한 모든 TNV mAbs에 관한 것임을 나타낸다. 생식세포주 서열 (CDR3)에서 선은 서열이 알려지지 않았거나 생식세포주에 존재하지 않는 것을 나타낸다.
도 5는 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 보여진 아미노산 서열은(단일 문자 약어)는 비클론 PCR 산물 및 클론된 PCR 산물 둘다로부터 결정된 DNA 서열로부터 추론된다. 아미노산 서열은 분비 신호 서열(신호), 골격(FW) 및 상보 결정 영역(CDR) 도메인으로 분배된다. Vg/38K-타입 경쇄 생식세포주 유전자에 대한 아미노산 서열은 각 도메인의 상부 라인상에 나타내었다. 점은 TNV mAb의 아미노산이 생식세포주 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)는 보여진 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘다에 관한 것임을 나타낸다. 'All'은 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B 및 TNV186에 관한 것임을 나타낸다.
도 6은 rTNV148B-발현 C466 세포를 만들기 위하여 사용되는 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드의 개략도이다. pl783은 중쇄 플라스미드이고, pl776는 경쇄 플라스미드이다. 도메인을 코딩하는 rTNV148B 가변 및 고정 영역은 검은 박스로 나타내었다. J-C 인트론에서 면역글로불린 인핸서는 회색 박스로 나타내었다. 상대적 제한사이트가 나타내어 졌다. 플라스미드는 Ab 유전자 전사가 시계방향으로 진행되도록 배향하여 나타내었다. 플라스미드 pl783은 길이가 19.53 kb이고, 플라스미드 pl776은 길이가 15.06 kb이다. 양 플라스미드의 완전한 뉴클레오타이드 서열이 알려졌다. pl783의 서열을 코딩하는 가변 영역은 BsiWI/BstBI 제한 단편으로 대체함으로써 다른 중쇄 가변 영역 서열로 용이하게 치환될 수 있다. pl776의 서열으 ㄹ코딩하는 가변 영역은 SalI/AflII 제한 단편으로 대체함으로써 다른 가변 영역 서열로 치환될 수 있다.
도 7은 다섯개 rTNV148B-생성 세포주의 증식 커브 분석을 그래프로 나타낸 것이다. 배양은 세포를 I5Q+MHX 배지에서 30 ml 부피로 1.0 X 10-5세포/ml의 가변 세포 밀도가 되도록 T75 플라스크내로 시딩하여 0일째로 개시시켰다. 이 조사에 사용된 세포 배양물은 형질전환 및 서브클로닝이 수행되기 때문에 연속식 배양물이다. 후속일에, T 플라스크의 세포를 철저히 재현탁시키고, 배양물의 0.3 ml 분취액을 제거하였다. 세포수가 1.5 X 10-5세포/ml 미만으로 떨어지면 증식 커브 조사를 종결하였다. 분취앳에서의 생존 세포수를 티판 블루 배제에 의해 결정하고, 나머지 분취액은 후의 mAb 농도 결정을 위해 보관하였다. 인간 IgG에 대한 ELISA를 모든 동일한 분취액에 대해 동시에 실시하였다.
도 8은 가변 농도의 MHX 선택 존재하에 세포 증식율을 비교하여 그래프로 나타낸 것이다. 세포 서브클론 C466A 및 C466B를 MHX-유리 배지(IMDM. 5% FBS, 2 mM glutamine)로 해동하고, 2일동안 배양하였다. 두 세포 배양물을 MHX, 0.2X MHX 또는 IX MHX를 함유하지 않는 세 배양물로 나누었다. 하루후, 새로운 T75 플라스크에 배양물을 1 X 10-5세포/ml의 출발 밀도로 시딩하고, 1주동안 24 시간 간격으로 세포수를 세었다. SOP PD32.025에서 공식을 사용하여 처음 5일동안 배가 시간을 산정하고, 바상에 나타내었다.
도 9는 두개의 rTNV148B-생성 세포주로부터 시간에 따른 mAb 생산의 안정성을 그래피로 나타낸 것이다. 형질전환 및 서브클로닝이 24-웰 배양 접시에서 장기적인 일련의 배양을 개시시키기 위하여 사용되기 때문에 세포 서브클론은 연속식 배양물이다. 세포를 I5Q 배지에서 MHX를 선택하거나 선택없이 배양하였다. 먼저번뉘 배양물을 폐기하면서 새로운 생존성 배양물을 유지하기 위해 배양물을 매 4 내지 6일마다 스플라이팅하여 세포를 연속하여 계대하였다. mAb 농도가 측정될 때까지 배양물을 폐기 및 저장한 바로 다음에 폐 세포 상등액의 분취물을 수집하였다. 인간 IgG에 대한 ELISA를 모든 동일한 분취액에 대해 동시에 실시하였다.
도 10은 본 발명의 항-TNF 항체에 대한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 실시예 4에서의 대조군과 비교하여 나타낸 것이다. 약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 9개의 처리군중 하나로 나누고, 돌베코(Dulbecco's) PBS (D-PBS) 또는 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148 또는 TNV196)를 1 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 하여 단일 복강내 볼러스 복용약으로 처리하였다. 체중을 예비-용량으로부터의 변화로 분석였을 때, 10 mg/kg cA2로 처리된 동물은 조사동안 D-PBS-처리된 동물보다 일정하게 더 높은 체중 증가를 보였다. 이체중 증가는 3-7주째에 유의적이었다. 10 mg/kg TNV148로 처리된 동물도 또한 조사 7주째에 체중 증가를 보였다.
도 11A-C는 실시예 4에 나타내어진 관절염 지표에 기초하여 질병 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-처리된 그룹의 관절염 지표는 3주째를 시작으로 하여 D-PBS 대조군보다 낮았으며, 조사 나머지(7주)를 통해 유지되었다. 1 mg/kg TNV14로 처리된 동물은 3주후 D PBS-처리군에 비해 AI의 상당한 감소를 나타내는데 실패하였다. 각각을 유사 용량(10 mg/kg cA2 대 10 mg/kg TNV14, 148 및 196)의 다른 것과 비교하였을 때 10 mg/kg 처리군 간에 유의적인 차이는 없었다. 1 mg/kg 처리군을 비교하였을 때, 1 mg/kg TNV148은 3, 4 및 7주째에 I mg/kg cA2보다 AI가 유의적으로 낮았다. 1 mg/kg TNV148도 또한 3 및 4주째에 1 mg/kg TNV14-처리군보다 유의적으로 낮았다. TNV196이 조사의 6주까지에서 AI가 유의적으로 감소하였더라도(D-PBS-처리군과 비교하였을 때), TNV148은 1 mg/kg 처리로도 조사 마지막에` 유의적으로 남아 있었다.
도 12는 본 발명의 항-TNF 항체에 대한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 실시예 5에서의 대조군과 비교하여 나타낸 것이다. 약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 8개의 처리군중 하나로 나누고, 대조 제품(D-PBS) 또는 항체(TNV14, TNV148)를 3 mg/kg(0주)으로 하여 단일 복강내 볼러스 복용약으로 처리하였다. 모든 동물에 대해 주입을 1, 2, 3 및 4주째에 반복하였다. 그룹 1-6을 제품 효율에 대해 평가하였다. 그룹 7 및 8의 동물로부터 얻은 혈청 샘플을 2,3 및 4주째에 면역 응답 유도 및 TNV 14 또는 TNV 148의 약물동력학적 클리어런스에 대해 평가하였다.
도 13A-C는 실시예 5에서 질병 중증도의 진행성을 관절염에 기초하여 그래프로 나타낸 것이다. 10 mg/kg cA2-처리된 그룹의 관절염 지표는 2주째를 시작으로 하여 D-PBS 대조군보다 유의적으로 낮았으며, 조사 나머지(5주)를 통해 유지되었다. 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 cA2로 처리된 동물 및 3 mg/kg TNV14로 처리된 동물은 어떤 시간에서도 D PBS-처리군에 비해 AI의 상당한 감소를 나타내는데 실패하였다. 3 mg/kg TNV148로 처리된 동물은 3주째를 시작으로 하여 5주까지 D PBS-처리군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다. 10 mg/kg cA2 처리된 동물은 조사의 4 및 5주째에 더 낮은 용량(1 mg/kg 및 3 mg/kg)에 비해 AI의 유의적인 감소를 나타내었으며, 또한 3-5주에 TNV14-처리된 동물보다 유의적으로 낮았다. 3 mg/kg 처리군간에 유의적인 차이는 없었지만, 3 mg/kg TNV14로 처리된 동물에 대한 AI는 일부의 시점에 10 mg/kg보다 유의적으로 높았으며, TNV148로 처리된 동물은 10 mg/kg의 cA2로 처리된 동물과 유의적으로 차이나지 않았다.
도 14는 본 발명의 항-TNF 항체에 대한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 실시예 6에서의 대조군과 비교하여 나타낸 것이다. 약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 6개의 처리군중 하나로 나누고, 항체(cA2 또는 TNV148)를 3 mg/kg 또는 5 mg/kg으로 하여 단일 복강내 볼러스 복용약으로 처리하였다. 이 조사는 D-PBS 및 10 mg/kg의 cA2 대조군을 사용하였다.
도 15는 실시예 6에 나타내어진 관절염 지표에 기초하여 질병 중증도의 진행성을 나타낸다. 모든 처리군은 최초 시점에 일부 보호를 나타내었는데, 5 mg/kgcA2 및 5 mg/kg TNV148은 1-3주에 AI의 유의적인 감소를 나타내었으며, 모든 처리군은 2주에 유의적인 감소를 나타내었다. 조사 후반에 5 mg/kg cA2로 처리된 동물은 일부 보호를 나타내었으며, 4, 6 및 7주에 유의적인 감소를 나타내었다. cA2 및 TNV148의 저 용량(3 mg/kg)은 6주에 유의적인 감소를 나타내었으며, 모든 처리군은 7주에 유의적인 감소를 나타내었다. 조사 마지막(8주)에 처리군의 어느 것도 유의적인 감소를 유지할 수 없었다. 어떤 시점에서도 처리군(염수 대조군 제외)간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
도 16은 본 발명의 항-TNF 항체에 대한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 실시예 7에서의 대조군과 비교하여 나타낸 것이다. TNV148(하이브리도마 세포로부터 유도) 및 rTNV148B(형질전환된 세포로부터 유도)의 단일 복강내 투여 효율 비교. 약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 9개의 처리군중 하나로 나누고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 항체(TNV148, rTNV148B)를 1 mg/kg으로 하여 단일 복강내 볼러스 복용약으로 처리하였다.
도 17은 실시예 7에 나타내어진 관절염 지표를 기초로 하여 질병 중증도의 진행을 나타낸 것이다. 10 mg/kg cA2-처리군의 관절염 지표는 4주째를 시작으로 하여 D-PBS 대조군보다 낮았으며, 조사 나머지(8주)를 통해 유지되었다. TNV148-처리군 및 1 mg/kg cA2-처리군 둘 다는 4주에 AI의 유의적인 감소를 나타내었다. 앞선 연구(P-099-017)가 TNV148이 1 mg/kg 복강내 볼러스 단일 투여로 관절염 지표를 감소시키는데 다소 효과적인 것으로 나타났더라도, 이 조사는 TNV 항체-처리군의 두 버전으로부터의 AI가 다소 높음을 보여준다. 1 mg/kg cA2-처리군이 10 mg/kg cA2군에 비해 유의적으로 증가를 나타내지 않았고, TNV148-처리군이 7 및 8주에 유의적으로 높았음을 나타내었더라도(6주 제외), 이 조사의 어떤 시점에서도 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148 및 1 mg/kg TNV148B 간에는 AI에 유의적인 차이가 없었다.
본 발명은 분리, 재조합 및/또는 합성 항-TNF 인간, 영장류, 설치류, 포유 동물, 키메릭, 인간화 또는 CDR-그라프트된 항체 및 TNF 항-이디오타입 항체, 적어도 하나의 항-TNF 항체 또는 항-이디오타입 항체를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 가지는 코딩 핵산 분자 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 진단 및 치료 조성물, 방법 및 장치를 포함하여 상기 핵산 및 항체 및 항-이디오타입 항체의 제조방법 및 사용방법을 제공한다.
본 원에서 사용된 "항종양 괴사 인자 알파 항체", "항-TNF 항체,""항-TNF 항체 부분, "항-TNF 항체 단편 " 및/또는 "항-TNF 항체 변이체" 등은 적어도 일부의 면역글로불린 분자를 가지는 어떠한 단백질 또는 펩타이드 함유 분자도 포함하며, 이는 본 발명의 항체내로 도입될 수 있는 장 또는 경쇄의 상보 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 고정 영역, 골격 영역, 또는 이들의 임의 부분, 또는 TNF 수용체 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분이나 이들로 한정되지 않는다. 상기 항체는 임의로 특정 리간드에 추가로 영향을 미치며, 이는 시험관내, 그 자리 및/또는 생체내에서 적어도 하나의 TNF 활성 또는 결합, 또는 TNF 수용체 활성 또는 결합에 대한 항체의 조절, 감소, 증가, 길항, 작용, 이동, 경감, 블록킹, 억제, 저지 및/또는 방해를 포함하나, 이들로만 한정되지 않는다. 비한정적인 예로 본 발명의 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분 또는변이체가 적어도 하나의 TNF 또는 특정 부분, 변이체 또는 도메인과 결합할 수 있다. 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분 또는 변이체는 또한 임의로 RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 시그널, 막 TNF 분리, TNF 활성, TNF 생성 및/또는 합성이 예시되나 이들로만 한정되지 않는 적어도 하나의 TNF 활성 또는 기능에 영향을 미칠 수 있다. 용어 "항체"는 또한 경쇄 항체 및 그의 단편을 포함한 항체 또는 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모사하는 항체 부분을 포함하거나, 항체 모사체를 포함하여 항체, 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 한다. 기능성 단편은 포유동물 TNF에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab(예를 들어 파파인 분해에 의해), Fab'(예를 들어 펩신 분해 및 부분 환원에 의해) 및 F (ab') 2(예를 들어 펩신 분해에 의해), facb(예를 들어 플라스민 분해에 의해, pFc'(예를 들어 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd(예를 들어 펩신 분해, 부분 환원 및 재응집에 의해), Fv 또는 scFv(예를 들어 분자 생물학 기술에 의해) 단편을 포함하나, 이들로 한정되지 않는, TNF 또는 이들 부분에 결합할 수 있는 항체 또는 단편이 본 발명에 의해 포함된다(참조예: Colligan, Immunology, supra).
상기 단편은 당업계에 알려져 있고/있거나 본 원에 기술된 효소 분해, 합성 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 말단 코돈이 천연 말단 부위의 상부 스트림을 유도하는 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단(truncated) 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어, F (ab')2중쇄 부분을 코딩하는 조합 유전자는 CH1도메인 및/또는 중쇄의 이음새 부분을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 설계된다. 항체의 다양한 부분은 통상적인 기술에 의해 화학적으로 함께 연결되거나, 유전자 공학 기술을 이용하여 접촉 단백질로서 제조될 수 있다.
본 원에 사용된 용어" 인간 항체"는 실질적으로 단백질의 모든 부분(예를 들어 CDR, 골격, CL, CH도메인(예: CH1, CH2, CH3), 이음새(VL, VH))이 인간에게서 실질적으로 비면역원성이며, 아주 소량의 서열 변화 또는 변형만이 일어나는 항체를 의미한다. 유사하게, 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류(마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 햄스터 등) 및 다른 포유동물 지향 항체는 그러한 종, 아속, 속, 아과, 과 특이적 항체를 의미한다. 또한 키메릭 항체는 상기 어떠한 조합을 포함한다. 변화 또는 변형은 임의로 및 바람직하게는 인간 또는 다른 종에게서 에게서 비변형된 항체에 비해 면원성을 감소시키거나, 유지시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메릭 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예: 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 원핵 또는 진핵 세포 또는 인간이 아닌 동물에 의해 제조될 수 있음을 주목바란다. 또한, 인간 항체가 경쇄 항체인 경우, 이것은 천연 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 연결하는 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기와 같은 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 이들 링커 펩타이드는 인간 기원인 것으로 여겨진다.
바람직하게는 인간 또는 인간화된 모노클로날 항체이며 적어도 두개의 상이한 항원에 결합 특이성을 가지는 이중특이적, 헤테로특이적, 헤테로컨쥬게이트 또는 유사 항체가 또한 사용될 수 있다. 본 경우에, 하나의 결합 특이성은 적어도 하나의 TNF 단백질에 대하며, 다른 하나는 다른 항원에 대한다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생성은 두개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는 두개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초한다(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)). 면역글로불린 장 및 경쇄의 불규칙적인 분류때문에, 이들 하이브리도마(콰드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생성하며, 하나만이 정당한 이중특이성 구조를 가진다. 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 통상 행해지는 정당한 분자의 정제는 다소 장애가 따르며, 생성물의 수율은 낮다. 유사한 방법이 예를 들어 전부 본 원에 참고로 인용되는 WO 93/08829, 미국 특허 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)에 기술되어 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항-TNF 항체(또한 TNF 항체로도 언급된다)는 임의로 TNF에 대한 고친화성 결합으로 특정화되며, 임의로 및 바람직하게는 저 저독성을 가진다. 특히, 개개의 성분, 예를 들어 가변 영역, 고정 영역 및 골격이 개별적으로 및/또는 종합적으로, 임의로 및 바람직하게 저 면역원성을 가지는 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체가 본 발명에 유용하다. 본 발명에 사용될수 있는 항체는 임의로 증상을 경감시키고, 낮고/낮거나 허용되는 독성을 가지면서 장기간 환자를 치료항 수 있는 특징을 갖는다. 낮거나 허용되는 면역원성 및/또는 고친화성, 및 다른 적당한 성질은 치료 결과를 성취하는데 기여할 수 있다. "저 면역원성"은 본 원에서 치료 환자의 약 75% 미만, 바람직하게는 약 50% 미만에서 유의적인 HAHA, HACA 또는 HAMA 응답의 상승 및/또는 치료 환자에서 낮은 역가(이중 항원 효소 면역 분석으로 측정된 바 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만)의 상승으로 정의된다(Elliott et al., Lancet 344 : 1125-1127 (1994), 본 원에 참고로 인용).
본 발명의 분리된 핵산은 세포, 저직, 기관 또는 동물(포유동물 및 인간 포함)에서 면역 질환 또는 질병, 심혈관 질환 또는 질병, 감염성, 악성 및/또는 퇴행성 질환 또는 질병중의 적어도 하나에서 선택되나 이들로만 한정되지 않는 적어도 하나의 TNF 증상을 진단, 모니터, 조절, 치료, 경감, 그의 유도 저지 또는 그의 증후를 감소시키는 것을 측정하거나 실행하기 위해 사용될 수 있는 적어도 하나의 항-TNF 항체 또는 그의 특정 변이체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
이 방법은 상기 증후의 조절, 처리, 경감, 저지 또는 감소, 효과 또는 메카니즘을 요하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 유효량은 단일(예: 볼러스), 다중 또는 연속 투여에 대해 약 0.001 내지 500 mg/kg, 또는 단일, 다중 또는 연속 투여당 혈청 농도 0.01-5000 μg/ml, 또는 공지된 방법을 이용하여 행해지고 측정되거나, 본 원에 기술된 바와 같거나, 관련 업계에 공지된 바와 같은 유효 범위 또는 값을 포함할 수 있다.
인용
본 원에 인용된 모든 공보물 또는 특허는 본 발명의 시점에서 당업계의 현황을 반영하고/하거나 본 발명을 설명하고 본 발명의 가능성을 제기하기 위한 것으로본 원에 참고로 인용된다. 공보물은 과학 또는 특허 공보물, 또는 모든 기록, 전자 또는 인쇄 포맷을 포함해 어떤 미디어 포맷으로부터 입수할 수 있는 정보를 의미한다. 하기 문헌이 본 원에 참고로 인용된다: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
본 발명의 항체
본 발명의 적어도 하나의 항-TNF 항체는 임의로 당업계에 알려진 바와 같이, 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클로날 개체군에 의해 제조될 수 있다(참조: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, NY (1989) ; Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001) ; Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001); 이들은 모두 참고로 본 원에 인용된다).
인간 TNF 단백질 또는 그의 단편에 특이적인 인간 항체는 예를 들어 분리된 및/또는 TNF 단백질 또는 그의 부분(합성 분자, 예컨대 합성 펩타이드 포함)과 같이 적합한 면역원성 항원에 대해 생성될 수 있다. 다른 특이적인 또는 일반적인 포유동물 항체가 유사하게 생성될 수 있다. 면역원성 항원 및 모노클로날 항체 생성은 적합한 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
한 접근법으로, 하이브리도마는 적합한 불멸화 세포주(예: 골수종 세포주, 예를들어 Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L. 5, > 243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, 등이 예시되나, 이들로만 한정되지 않는다) 또는 헤테로골수종 그의 융합 생성물 또는 임의 세포 또는 그로부터 유도된 융합 세포, 또는 당업계에 알려진 어떤 적합한 세포주를 융합하여 제조된다. 참조: www. atcc. org, www. lifetech. com., 등(항체 생성 세포, 예를 들어 분리 또는 클론된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 다른 세포를 발현하는 중쇄 또는 경쇄의 고정 또는 가변 또는 골격 또는 CDR 서열(내인성 또는 이종 핵산, 재조합 또는 내인성, 바이러스성, 박테리아성, 조류성, 진핵세포, 양서류, 곤충, 파충류, 어류,포유동물, 설치류, 말, 양, 염소, 영장류, 원핵세포, 게놈 DNA, cDNA, rDNA 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 클로로플라스트 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 스트랜드, 하이브리드화 등 또는 이들의 조합으로서)). 참조: 본 원에 참고로 인용된 Ausubel, supra, and Colligan, Immunology, supra, chapter 2.
항체 생성 세포는 또한 관심있는 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초 혈액 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체 특정 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종성 또는 내인성 핵산을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 융합 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적인 배양 조건 또는 다른 적합한 공지 방법을 이용하여 분리될 수 있거나, 제한 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 공지 기술에 의해 클로닝될 수 있다. 목적하는 특이성으르 갖는 항체를 제공하는 세포가 적합한 분석(예: ELISA)에 의해 선별될 수 있다.
필요한 특이성의 항체를 생성하거나 분리하는 적합한 다른 방법은 당업계에 공지되었고/되었거나 본 원에 기술된 것으로, 펩타이드 또는 단백질 라이브러리(예: 박테리오파지, 리소솜, 올리고뉴클레오타이드, RNA, cDNA 등의 디스플레이 라이브러리; 예를 들어 하기 기관으로부터 입수가능: Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK ; BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. See, e. g., EP 368,684, PCT/GB91/01134 ; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883 ;PCT/GB93/00605; US 08/350260 (5/12/94) ; PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424 ; W090/14430 ; PCT/US94/1234 ; W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent) ; W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283 ; EP 371 998 ; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); 또는 추론적으로 생성된 펩타이드 또는 단백질(US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689(Ixsys, now Applied Molecular Evolution (AME), 각각 본 원에 참고로 인용)로부터 재조합 항체를 선택하거나, 형질전환 동물의 면역화에 좌우되거나(참조, SCID mice, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93: 154-161 (1998), 각각 본 원에 참고로 인용됨) 인간 항체의 레파토리를 생성할 수 있는 방법을 포함하나 이들로만 한정되지 않는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 기술은 이소솜 디스플레이를 포함하나, 이로 한정되지 않는다(Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14130-14135 (Nov. 1998)); single cell antibody producing technologies (e. g., selected lymphocyte antibody method ("SLAM") (US pat. No. 5,627,052, Wen et al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848 (1996)); gel microdroplet and flow cytometry (Powell et al., Biotechnol. 8: 333-337 (1990); One Cell Systems,Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182: 155-163 (1995); Kennyetal., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); B-cell selection (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)).
비인간 또는 인간 항체를 공학화 또는 인간화하는 방법이 또한 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 널리 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 또는 공학적 항체는 비인간, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 또는 다른 포유동물이 예시되나 이들로만 한정되지 않는 기원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 인간 아미노산 잔기는 종종 전형적으로 공지된 인간 서열의 "중요한" 가변, 고정 또는 다른 도메인으로부터 취해진 것으로 "중요한" 잔기로도 언급된다. 공지된 인간 Ig 서열은 개시되었다. 참조: www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi; www. atcc. org/phage/hdb. html; www. sciquest. com/ ; www. abcam. com/ ; www. antibodyresource. com/onlinecomp. html; www. public. iastate. edu/-pedro/researchtools. html; www. mgen. uniheidelberg. de/SD/IT/IT. html; www. whfreeman. com/immunology/CH05/kubyO5. htm; www. library. thinkquest. org/12429/Immune/Antibody. html; www. hhmi. org/grants/lectures/1996/vlab/ ; www. path. cam. ac. uk/-mrc7/mikeimages. html; www. antibodyresource. com/ ; mcb. harvard. edu/BioLinks/Immunology. html. www. immunologylink. com/ ; pathbox. wustl. edu/-hcenter/index. html;www. biotech. ufl. edu/-hcl/ ; www. pebio. com/pa/340913/340913. html; www. nal. usda. gov/awic/pubs/antibody/ ; www. m. ehime-u. ac. jp/-yasuhito/Elisa. html; www. biodesign. com/table. asp; www. icnet. uk/axp/facs/davies/links. html; www. biotech. ufl. edu/-fccl/protocol. html; www. isacnet. org/sites~geo. html; aximtl. imt. uni-marburg. de/-rek/AEPStart. html ; baserv. uci. kun. nl/-jraats/linksl. html ; www. recab. uni-hd. de/immuno. bme. nwu. edu/ ; www. mrc-cpe. cam. ac. uk/imt-doc/public/INTRO. html; www. ibt. unam. mx/vir/V~mice. html ; imgt. cnusc. fr: 8104/ ; www. biochem. ucl. ac. uk/-martin/abs/index. html; antibody. bath. ac. uk/ ; abgen. cvm. tamu. edu/lab/wwwabgen. html; www. unizh. ch/-honegger/AHOseminar/Slide0l. html; www. cryst. bbk. ac. uW~ubogO7s/; www. nimr. mrc. ac. uk/CC/ccaewg/ccaewg. htm; www. path. cam. ac. uk/-mrc7/humanisation/TAHHP. html; www. ibt. unam. mx/vir/structure/stataim. html; www. biosci. missouri. edu/smithgp/index. html; www. cryst. bioc. cam. ac. uk/-fmolinaAVeb-pages/Pept/spottech. html ; www. jerini. de/frproducts. htm; www. patents. ibm. com/ibm. html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. Health (1983), 각각 본 원에 참고로 인용.
이와 같이 이입된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 본 기술에서 알려진 바인딩, 친화성, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 결합활성, 특이성, 반감기, 또는 본 기술에서 공지된 다른 적합한 특징을 감소시키거나, 증강하거나 변형하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 가변 및 고정 영역의 비인간 서열이 인간 또는 다른 아미노산으로 대체되는 동안 유지된다. 항체는 또한 임의로 항원에 대한 높은 친화성과 다른 유용한 생물학적 특성을 보유하여 인간화될 수 있다. 이와 같은 목표를 성취하기 위해, 인간화된 항체는 임의로 부모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 부모 서열과 다양한 개념의 인간화된 산물의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 이용가능하며 본 기술의 숙련자에게 친숙하다. 선택된 후보군의 면역글로불린 서열의 개연성 있는 3차원 형태 구조를 예시다고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용될 수 있다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 유사 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향이 있는 잔기들의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 원하는 항체 특성, 이를테면 표적 항원에 대한 친화성 증가가 이루어지도록 컨센서스(consensus) 및 이입 서열로부터 선택되고 결합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 바인딩에 영향을 미치는데 직접적으로 그리고 가장 실재적으로 관련되어 있다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 엔지니어링은 이를테면, 문헌 [Winter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al. Nature 332: 323 (1988) ; Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993), US patent Nos:5723323, 5976862,5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/ : US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP 229246](각각 전적으로 본 발명에서 참고내용에 속하며, 여기서 인용된 참고문헌이 포함된다)에 기재된 방법을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
항-TNF 항체가 또한 본 발명에서 기재되고/되거나 본 기술에서 공지된, 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자 도입 동물(예, 생쥐, 쥐, 햄스터, 비인간 영장류, 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 인간 항-TNF 항체를 생성하는 세포는 이러한 동물로부터 분리될 수 있으며 적합한 방법, 이를테면 본 발명에 기재된 방법을 이용하여 불멸화될 수 있다.
인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자 도입 생쥐는 공지 방법에 의해 얻을 수 있다(예, 다음 문헌에 한정되지 않는다: U. S. Pat. Nos: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 및 5,789,650; 특허권자 Lonberg et al. ; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B 1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg etal. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368 : 856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6 (4) 579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90 (8) 3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immuzlol 13 (1) : 65-93 (1995) and Fishwald et al., Nat Biotechnol 14 (7): 845-851 (1996), 이들은 각각 본 발명에서 참고내용에 속한다). 일반적으로, 이들 생쥐는 기능적으로 재배열되거나, 기능적 재배열을 수행할 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 유전자 좌(locus)로부터 DNA를 포함한 적어도 하나의 트랜스젠(transgene)을 포함한다. 이러한 생쥐에서 내생적인 면역글로불린 유전자 좌는 동물의 캐패시티를 제거하도록 분쇄되거나 삭제되어 내생적인 유전자에 의해 코드화된 항체를 생성할 수 있다.
유사 단백질 또는 단편에 특이 결합하기 위한 항체 스크리닝은 편리하게도 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 이용하여 성취될 수 있다. 이 방법은 원하는 기능 또는 구조를 가진 각 멤버를 위한 펩타이드의 많은 콜렉션(collection)의 스크리닝을 포함한다. 펩타이드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 본 기술에 잘 알려져 잇다. 디스플레이된 펩타이드 서열은 길이가 3 내지 5000 이상의 아미노산일 수 있으며, 빈번하게는 5-100 아미노산 길이이며, 때때로 약 8 내지 25 아미노산 길이이다. 펩타이드 라이브러리를 생성하기 위한 직접 화학 합성 방법에 더하여, 몇가지 재조합 DNA 방법이 설명된 바 있다. 타입 하나는 박테리오파지 또는 세포의 표면상에 펩타이드 서열의 디스플레이를 포함한다. 각 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩타이드 서열을 코드화 한 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이러한 방법은 PCT 특허 공보 제 91/17271, 91/18980, 91/19818, 및 93/08278호에 기재되어 있다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(Carlsbad, CA), 및 Cambridge antibody Technologies (Cambrigeshir, UK)와 같은 공급업체로부터 상용될 수 있다[참고예, U. S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, Enzon에 양도; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, Dyax에 양도, 5427908, 5580717, Affymax에 양도; 5885793, Cambridge antibody Technologies에 양도; 5750373, Genentech에 양도, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, Xoma에 양도, Colligan, supra; Ausubel, 3llp7a ; 또는 Sambrook, supra](상기 특허 및 공보 각각은 전적으로 본 발명에서 참고내용에 속한다).
본 발명의 항체는 또한 동물의 우유속에 항-TNF 항체를 생성하는 유전자 도입 동물 또는 포유류, 이를테면 염소, 소, 말, 양, 등을 제공하는 핵산을 코드화 하는 적어도 하나의 항-TNF 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 동물은 공지 방법을 이용하여 제공될 수 있다[참조예: 미국 특허 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489 등, 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니며, 각각은 전적으로 본 발명에서 참고내용에 속한다].
본 발명의 항체는 추가로 식물 파트에서 또는 이로부터 배양된 세포에서 이러한 항체, 특정 부분 또는 변이체를 생성하는 유전자 도입 식물 및 배양된 식물 세포(예, 담배 및 옥수수, 이들에 한정되지 않음)를 제공하는 핵산을 코드화 하는 적어도 하나의 항-TNF 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 비제한적인 일예로서, 재조합 단백질을 발현하는 유전자 도입 담배 잎은 예를 들어 유도성 프로모터(promotor)를 이용하여 많은 양의 재조합 단백질을 제공하는데 성공적으로 사용된 바 있다[참조예: Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) 및 여기서 인용된 참고문헌]. 또한, 유전자 도입 옥수수가 다른 재조합 시스템에서 생성되거나 천연원에서 정제된 것들과 동일한 생물학적 활성을 가지며, 상업적 생산 수준으로 포유류 단백질을 발현하는데 사용된 바 있다[참조예, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) 및 여기서 인용된 참고문헌]. 항체는 또한 담배 종자 및 감자 괴경을 비롯하여, 항체 단편, 이를테면 단쇄 항체(scFv's)를 포함한 유전자 도입 식물 종자로부터 대량으로 생산된 바 있다[참조예, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109(1998) 및 여기서 인용된 참고문헌]. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지된 방법에 따라, 유전자 도입 식물을이용하여 제조될 수 있다[참조예: Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 (1994); 및 여기서 인용된 참고문헌]. 또한, 일반적으로 항체의 식물 발현에 대해서도 참조함, 그러나 이들에 한정되지는 않음. 상기 참고문헌의 각각은 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속한다.
본 발명의 항체는 광범위한 친화성(KD)을 가진 인간 TNF를 결합할 수 있다. 바람직한 유형에서, 본 발명의 적어도 하나의 인간 mAb는 임의로 높은 친화성을 가진 인간 TNF를 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간의 mAb는 약 10-7M, 이를테면 0.1-9.9(또는 이 중 어느 범위 또는 값) X 10-7, 10-8, 10-910-10, 10-11, 10-12, 10-13또는 이중 어느 범위 또는 값(그러나, 이들에 한정되지 않음)과 동일하거나, 적은 KD를 가진 인간 TNF를 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화성 또는 결합활성은 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 측정될 수 있다(참조예, Berzofsky, et al.,"Antibody-Antigen Interactions,"In Fundamental Immunologv, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984) ; Kuby, Janis Imszlunolo, gy, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); 및 여기서 기재된 방법). 특정 항체-항원 상호작용에 대해 측정된 친화성은 서로 다른 조건(예, 염 농도, pH)하에 측정되었다면 달라질 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원-결합 변수(예, KD, Ka, Kd)의 측정은 바람지하게는 항체와 항원의 표준 용액, 및 표준 완충액, 이를테면 본 발명에서 기재된 완충액으로 이루어진다.
핵산 분자
본 발명에서 제공된 정보, 이를테면 SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 중적어도 하나의 인접(contiguous) 아미노산의 적어도 70-100%를 코드화 하는 뉴클레오타이드, 이들의 특정 단변, 변이체 또는 컨센서스 서열, 또는 이들 서열 중 적어도 하나를 포함하는 기탁된 벡터를 이용하여, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 코드화 하는 본 발명의 핵산 분자가 본 발명에서 기재된 방법 또는 본 기술에서 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 RNA의 형태, 이를테면 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 다른 형태, 또는 클로닝에 의해 얻어지거나 합성적으로 생성된 cDNA 및 게노믹 DNA를 포함하나 이들에 한정되지 않는 DNA의 형태, 또는 이들의 조합물일 수 있다. DNA는 세가닥, 두가닥, 단일 가닥일 수 있거나, 또는 이들의 조합형일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥 중 일부는 코딩 가닥(또한, 센스 가닥으로 알려짐)일 수 있거나, 비-코딩 가닥(또한 안티-센스 가닥으로 지칭됨)일 수 있다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 임의로 하나 이상의 인트론, 예를 들어 적어도 하나의 중쇄(예, SEQ ID NOS:1-3) 또는 경쇄(예, SEQ ID NOS:4-6)의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3처럼, 적어도 하나의 CDR 중 적어도 하나의 특정부(이들에 한정되지 않음)를 가진 해독틀(open reading frame, ORF)을 포함한 핵산 분자; 항-TNF 항체를 위한 코딩 서열 또는 가변 영역(예, SEQ ID NOS:7,8)을 포함한 핵산 분자; 및 상기에 기재된 것들과 실질적으로 다르지만, 유전자 코드의 퇴화로 인해, 본 발명에서 기재되고/되거나 본 기술에서 공지된 적어도 하나의 항-TNF 항체를 아직 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 본 기술에서 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 특정 항-TNF 항체를위해 코딩하는 이러한 퇴화 핵산 변이체를 생성하는 것은 본 기술의 숙련자에게 일과적일 것이au[참조예: Ausubel, et al., supra], 이러한 핵산 변이체는 본 발명에서 포함된다. 본 발명의 분리된 핵산 분자의 비제한적인 일예는 각각 HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC 가변 영역 및 LC 가변 영역을 코드화 하는 핵산의 비제한적인 일예에 대응하는, SEQ ID NOS:10, 11, 12, 13,14, 15를 포함한다.
다른 일예에서, 본 발명은 각각 ___________________자 기탁된 클론명 ___________ 및 ATCC 기탁 번호 ____________________________로 지칭된 기탁 플라즈미드에 함유된 핵산에 의해 코드화 된 아미노산 서열을 가진 항-TNF 항체를 코드화 하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 제시한 바와 같이, 항-TNF 항체를 코드화 하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 항체 단편의 아미노산 서열을 홀로 코드화하는 것들; 전체 항체 또는 그의 일부를 위한 코딩 서열; 이전에 언급된 추가 코팅 서열, 이를테면 적어도 하나의 인트론과 함께 또는 인트론 없이, 코딩 5' 및 3' 서열을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 추가의 비-코딩 서열, 이를테면 스플라이싱(splicing)과 폴리아데닐화 시그널(예를 들어 리보좀 결합 및 mRNA의 안정성)을 포함하여, 전사, mRNA 프로세싱에서 역할을 수행하는 전사된, 비-번역 서열과 함께, 항체, 단편 또는 일부를 위한 코딩 서열, 또한 추가 서열, 이를테면 적어도 하나의 시그널 리더(signal leader) 또는 퓨전 펩타이드의 코딩 서열; 추가의 아미노산에 대해 코딩하는 추가의 코딩 서열, 이를테면 추가의 작용성을 제공하는 것들을 포함할 수있으나, 이들에 한정되지 않는다. 따라서, 항체를 코드화 하는 서열은 마커 서열, 이를테면 항체 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 항체의 정제를 용이하게 하는 펩타이드를 코드화 하는 서열에 융합될 수 있다.
본 발명에서 기재된 폴리뉴크레오타이드에 선택적으로 혼성화 되는 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 본 발명에서 개시된 폴리뉴클레오타이드에 선택적 혼성화 조건하에 혼성화 되는 분리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이 유형의 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함한 핵산을 분리하고, 검측하고/하거나 정량화 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 기탁 라이브러리에서 부분 또는 완전-길이의 클론을 동정하거나, 분리하거나, 증대하는데 사용될 수 있다. 일부 유형에서, 폴리뉴클레오타이드는 분리되거나, 그렇치 않다면 인간 또는 포유류 핵산 라이브러리로부터 cDNA에 상보적인 게노믹 또는 cDNA 서열이다.
바람직하게는, cDNA 라이브러리는 적어도 80%의 완전-길이의 서열, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%의 완전-길이의 서열, 및 보다 바람직하게는 적어도 95%의 완전-길이의 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 정상화 되어 희귀 서열의 대표성을 증가시킬 수 있다. 상보적인 서열에 비해 감소된 서열 아이덴터티를 가진 서열로서 낮거나 보통의 가혹 혼성화 조건이 전형적이지만, 유일하지는 않게 사용된다. 보통 및 높은 가혹 조건이 임의로 보다 큰 아덴터티의 서열을 위해 사용될수 있다. 낮은 가혹 조건은 약 70%의 서열 아덴터티를 가진 서열의 선택적 혼성화를 허용하며 오르쏘로거스(orthologous) 또는 파라로거스(parlalogous) 서열을 동정하는데 사용될 수 있다.
임의로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에서 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드화 된 항체의 적어도 일부를 코드화 할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 항체를 코드화 하는 폴리뉴클레오타이드에 선택적 혼성화를 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다[참조예: Ausubel, supra; Colligan, supra, 각각 전적으로 본 발명에 참고내용에 속한다].
핵산의 구성
본 발명의 분리된 핵산은 본 기술에서 잘 알려진, (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
핵산은 편리하게도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 더하여 서열을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클리아제 제한 부위를 포함한 멀티-클로닝 부위는 핵산에 삽입되어 폴리뉴클레오타이드의 분리에 도움을 줄 수 있다. 또한, 변역가능한 서열이 삽입되어 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오타이드의 분리에 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한, 본 발명의 핵산은 임의로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.
추가의 서열이 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가되어 클로닝 및/또는발현의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오타이드의 분리를 돕거나, 폴리뉴클레오타이드의 세포로 도입을 증가시킬 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터, 및 링커의 용도는 본 기술에서 잘 알려져 있다(참조예, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra)
핵산을 구성하기 위한 재조합 방법
본 발명의 분리된 핵산 조성물, 이를테면 RNA, cDNA, 게노믹 DNA, 또는 이드의 조합은 본 기술의 숙련자에게 알려진 많은 클로닝 방법을 이용하여 생물학적 원료로부터 얻어질 수 있다. 일부 유형에서, 가혹 조건하에, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 혼성화 되는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 cDNA 또는 게노믹 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 동정하는데 사용된다. RNA의 분리, 및 cDNA와 게노믹 라이브러리의 구성은 본 기술의 통상 숙련자에게 잘 알려져 있다(참조예, Ausubel, supra; 또는 Sambrook, supra).
핵산 스크리닝 및 분리 방법
cDNA 또는 게노믹 라이브러리는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열, 이를테면 본 발명에서 기재된 것들을 기초로 한 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게노믹 DNA 또는 cDNA 서열로서 혼성화 하여 동일하거나 상이한 생물에서 상동 유전자를 분리하는데 사용될 수 있다. 본 기술에서의 숙련자들은 혼성화의 가혹 정도가 시험에서 사용될 수 있으며; 혼성화 또는 세척 매질이 가혹 조건일 수 있다는 사실이 이해될 것이다. 혼성화를 위한 조건이 보다 더 가혹해짐에 따라, 듀플렉스 형성이 발생하도록 프로브와 표적 사이의 보다 큰 상보성 정도가 존재해야 한다. 가혹도는 하나 이상의 온도, 이온 농도, pH 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 가혹성은 편리하게도 반응물 용액의 극성을 변화시켜, 예를 들어 0% 내지 50%의 범위내에서 포름아미드의 농도 조작을 통해 달라진다. 검측가능한 바인딩에 필요한 상보성(서열 아이덴터티)의 정도는 혼성화 매질 및/또는 세척 매질의 가혹성에 따라 달라질 것이다. 상보성의 정도는 최적으로는 100%, 또는 70-100%, 또는 이 중의 어떤 범위 또는 수치일 것이다. 그러나, 프로브와 프라이머에서 최소 서열 변화가 혼성화 및/또는 세척 매질의 가혹성을 감소시킴으로써 보상될 수 있다는 사실이 이해된다.
RNA 또는 DNA의 증대 방법은 본 기술에서 잘 알려져 있으며 본 발명에 따라 부당한 실험 없이 본 발명에서 제시된 교시와 안내를 기준으로 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 증대의 공지 방법은 폴리머라제 체인 반응(PCR) 및 관련 증대 방법(참조예, U. S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, to Mullis, et al.; 4,795,699 and 4,921,794 to Tabor, et al; 5,142,033 to Innis; 5,122,464 to Wilson, et al.; 5,091,310 to Innis; 5,066,584 to Gyllensten, et al ; 4,889,818 to Gelfand, et al; 4,994,370 to Silver, et al; 4,766,067 to Biswas; 4,656,134 to Ringold) 두가닥 DNA 합성으 위한 템플레이트로서 표적 서열에 항-센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증대법(U. S. Patent No. 5,130,238 to Malek, et al, 상표명 NASBA)을 포함하나, 이들에 한정되지 않으며, 참고문헌의 전체 내용은 본 발명에서 참고내용에 속한다(참조예, Ausubel, supra ; 또는 Sambrook, supra.)
예를 들어, 폴리머라제 체인 반응(PCR) 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열과 관련 유전자를 게노믹 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증대하는데 사용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관내 증대 방법은 또한 예를 들어 발현될 단백질을 코드화 하는 핵산 서열을 클로닝하고, 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검측하기 위해, 핵산 서열화를 위해, 또는 다른 목적을 위해 프로브로서 사용하는 핵산을 제조하는데 유용할 수 있다. 시험관내 증대 방법을 통해 숙련자를 지도하는데 충분한 기술의 일예는 문헌 [Berger, supra, Sambrook, supra, and Ausubel, supra, as well as Mullis, et al., U. S. Patent No. 4,683,202 (1987); and Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)]에서 발견된다. 게노믹 PCR 증대를 위한 상용 키트는 본 기술에서 알려져 있다(참조예, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)). 추가로, 예를 들어 T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)은 긴 PCR 제품의 수율을 증가시키는데 사용될 수 있다.
핵산을 구성하기 위한 합성 방법
본 발명의 분리된 핵산은 또한 공지 방법(참조예, Ausubel, et al., supra)에 의한 직접 화학 합성법에 의해 제조될 수 있다. 화학 합성법은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 제조하며, 이 올리고뉴클레오타이드는 상보 서열과 혼성화에 의해, 또는 템플레이트로서 단일 가닥을 이용한 DNA 폴리머라제와의 중합반응에 의해 두가닥 DNA로 전환될 수 있다. 본 기술의 숙련자는 DNA의 화학 합성법이 약 100개 이상의 염기의 서열에 한정될 수 있지만, 보다 긴 서열이 보다 짧은 서열의 결합에 의해 얻어질 수 있다는 사실을 인정할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함한 재조합 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 항체를 코드화 하는 cDNA 또는 게노믹 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 구성하는데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 목적 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 전사를 지시할 전사 개시 조절 서열에 실시가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 이종 및 비-이종(즉, 내생적) 프로모터 둘 다는 본 발명의 핵산의 발현을 지시하는데 사용될 수 있다.
일부 유형에서, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소로서 작용하는 분리된 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 업 또는 다운 조절하도록 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 비이종 형태의 적당한 위치(상류, 하류 또는 인트론내)에 도입될 수 있다. 예를 들어, 내생적 프로모터는 변이, 삭제 및/또는 치환에 의해 생체내에서 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.
벡터와 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로서 유전공학 처리되는 숙주 세포, 및 본 기술에서 잘 알려진, 재조합 기술에 의해 적어도 하나의 항-TNF 항체를 생산하는 것에 관한 것이다(참조예, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra, 각각 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속한다).
폴리뉴클레오타이드는 임의로 숙주에서 전달을 위한 선택성 마커를 함유한 벡터에 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라즈미드 벡터가 침전물, 이를테면 칼슘 포스페이트 침전물로, 또는 충진된 지질과의 착체로 도입된다. 벡터가 바이러스이면, 적합한 패키징 세포주를 이용하여 시험관내로 포장된 다음 숙주 세포로 형질 도입될 수 있다.
DNA 인서트(insert)는 적합한 프로모터에 효과적으로 연결된다. 발현 컨스트럭트(construct)는 전사 개시, 종료를 위한 부위 및 전사된 영역에서, 번역을 위한 리보좀 바인딩 부위를 추가로 함유할 것이다. 컨스트럭트에 의해 발현된 성숙 트랜스크립트(transcript)의 코딩부가 바람직하게는 처음에 번역 개시부와 번역될 mRNA의 말단에 적절히 위치한 종료 코돈(예, UAA, UGA 또는 UAG)(포유류 또는 진핵 세포 발현을 위해 UAA 및 UAG가 바람직함)을 포함할 것이다.
발현 벡터는 바람직하지만 임의로 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는 예를 들어 진핵 세포 배양에 대한 내성과 관련하여 메토트렉세이트(MTX), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR, US Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017), 암피실린,네오마이신(G418), 미코페놀산, 또는 글루타민 신터타제(GS, US Pat. Nos. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739), 및 E. coli 및 다른 박테리아 또는 원핵생물체에서 배항하기 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다(상기 특허는 전적으로 본 발명에서 참고문헌에 속한다). 상기한 숙주 세포를 위한 적합한 배양 배지와 조건은 본 기술에서 알려져 있다. 적합한 벡터는 본 숙련 기술자에게 명백할 것이다. 벡터 컨스트럭트의 숙주 세포로 도입은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 양이온 리피드-매개 트랜스펙션, 전기영동, 형질도입, 감염 또는 다른 공지 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 본 기술, 이를테면 Sambrook, supra, Chapters 1-4 및 16-18; Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16에 기재되어 있다.
본 발명의 적어도 하나의 항체는 변형된 형태, 이를테면 융합 단백질로 발현될 수 있으며, 분비 시그널 뿐만 아니라 추가의 이종 작용 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산, 특히 대전 아미노산의 영역은 항체의 N-말단에 추가되어 정제 중에, 또는 후속 취급과 저장 중에, 숙주 세포의 안정성과 존속을 증가시킬 수 있다. 또한, 펩타이드 부분은 본 발명의 항체에 추가되어 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 항체 또는 그 단편 중 적어도 하나의 최종 제조전에 제거될 수 있다. 이와 같은 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 이를테면 Sambrook, supra, Chapters 1-4 and 16-18; Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16에 기재되어 있다.
본 기술의 통상의 숙련자들은 본 발명의 단백질을 코드화 하는 핵산의 발현을 위해 이용가능한 많은 발현 시스템을 알 수 있다.
별도로, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항체를 코드화 하는 내생적 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 회전시킴으로써(조작에 의해) 숙주 세포에 발현될 수 있다. 이러한 방법은 본 기술에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속하는, US patent Nos. 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746, 및 5,733,761에 기재되어 있다.
항체, 그의 특정 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양체의 예는 포유류 세포이다. 포유류 세포 시스템은 포유류 세포 현탁액 또는 바이오리액터가 또한 사용될 수 있지만, 때로 세포 단층 형태일 것이다. 완전한 글리코실화 단백질을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포주가 본 기술에서 개발된 바 있으며, COS-1 (예, ATCC CRL 1650), COS-7 (예, ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (예, ATCC CRL-10), CHO (예, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1 (예, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들은 예를 들어 American Type Culture Collection, Manassas, Va (www. atcc. org)로부터 쉽게 이용될 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 골수종 및 임파종 세포와 같은 임파계 원의 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC Accession Number CRL-1580) 및 SP2/0-Agl4 세포(ATCC Accession Number CRL-1851)이다. 특히 바람직한 유형에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Agl4 세포이다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 하나 이상의 하기의 발현 조절 서열, 예로서제한하는 것은 아니지만 복제 기원점; 프로모터(예: 후기 또는 조기 SV40 프로모터, CMV 프로모터 (US Pat. Nos. 5,168,062; 5,385,839), HSV tk 프로모터, pgk (포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(US Pat. No. 5,266,491), 적어도 하나의 인간 면역글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 사이트, 예로서 리보좀 결합 사이트, RNA 스플라이스 사이트, 폴리아데닐화 사이트(예: SV40 라지 T Ag 폴리 A 첨가 사이트), 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다(참조, 예:Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra). 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포가 공지되어 있고/거나 예를 들면, American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www. atcc. org) 또는 다른 공지되거나 상업상 공급원으로부터 이용할 수 있다.
진핵동물 숙주 세포를 사용하는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열은 통상 벡터내로 도입된다. 종결자 서열의 한 예는 소의 성장 호르몬 유전자로부터 유래된 폴리아데닐화 서열이다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40(Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)으로부터 유래된 VP1 인트론이다. 추가로, 숙주 세포에서 복제를 조절하는 유전자 서열은 본 분야에 공지된 바와 같이 벡터내로 도입될 수 있다.
항체의 정제
항-TNF 항체는 공지된 방법, 예로서 제한하는 것은 아니지만, 단백질 A 정제법, 황산암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피에 의해 재조합 세포 배양액으로부터 회수하고 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")는 또한 정제를 위해 사용될 수 있다. 참조, 예:Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), 예: Chapters 1,4,6,8,9,10(본 명세서에서 참조문헌으로 인용된다).
본 발명의 항체는 자연 발생의 정제된 산물, 화학 합성법의 산물 및 진핵세포 숙주 예를 들면 효소, 고등식물, 곤충 및 포유동물 세포로부터의 재조합 기술에 의해 생성된 산물을 포함한다. 재조합 생산 방법에서 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글라이코실화되거나 글라시코실화되지 않을 수 있고, 바람직하게는 글라이코실화된다. 상기 방법은 다수의 표준 연구 매뉴얼 예로서 Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10,12,13,16,18 and 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14에 기재되어 있고, 이 모두 참조문헌으로서 인용된다.
항-TNF 항체
본 발명의 분리된 항체는 적합한 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드화 된 본 발명에서 개시된 항체 아미노산 서열, 또는 분리되거나 제조된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 TNF를 결합하고, 이로서 부분적으로 또는 실질적으로 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 중화한다. 적어도 하나의 TNF 단백질 또는 단편의 적어도 하나의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 바람직하게는 실질적으로 중화하는 항체, 또는 그의 특정 부분 또는 변이체는 단백질 또는 단편을 결합할 수 있으며 이로서 TNF의 TNF 리셉터로의 결합 또는 다른 TNF-의존 또는 매개된 메카니즘을 통해 매개된 활성을 억제할 수 있다. 본 발명에서 사용된, 용어 "중화 항체"란 분석 평가에 따라 TNF-의존 활성을 약 20-120%, 바람직하게는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이상 억제할 수 있는 항체를 뜻한다. TNF-의존 활성을 억제하는 항-TNF 항체의 용량은 바람직하게는 본 발명에서 기재되고/되거나 본 기술에서 공지된 바와 같이, 적어도 하나의 적합한 TNF 단백질 또는 리셉터 분석 평가에 의해 평가된다. 본 발명의 인간 항체는 어떤 부류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, 등) 또는 아이소타이프로 될 수 있으며 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 일 유형에서, 인간 항체는 IgG 중쇄 또는 한정된 단편, 예를 들어 아이소타이프, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 적어도 하나를 포함한다. 이러한 형태의 항체는 본 발명에서 기재되고/되거나 본 기술에서 공지된 적어도 하나의 인간 경쇄(예, IgG, IgA 및 IgM(예, γ1, γ2, γ3, γ4) 트랜스젠을 포함한 유전자 도입 생쥐 또는 다른 유전자 도입 비인간 포유류를 이용하여 제조될 수 있다. 다른 유형에서, 항-인간 TNF 인간 항체는 IgG1 중쇄 및 IgG1 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체 적어도 하나는 적어도 하나의 TNF 단백질, 서브유니트, 단편, 부분 또는 이들의 조합물에 특이한 적어도 하나의 특정 에피토프를 결합한다.적어도 하나의 에피토프는 상기 단백질의 부분 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함하며, 이 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 세포외 부분, 가용성 부분, 친수성 부분, 외면 부분 또는 세포질 부분 중 적어도 하나로 구성된다. 적어도 하나의 특정 에피토프는 적어도 1-3 아미노산의 적어도 하나의 아미노산 서열 대 SEQ ID NO:9의 접촉 아미노산의 전체 특정 부분의 조합물을 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체와 적어도 하나의 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 항원-결합 영역을 포함할 것이다. 비제한적인 일예로서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가진 중쇄 CDR3 중 적어도 하나, 및/또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 가진 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 특히 일면에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 상응하는 CDR 1,2 및/또는 3의 아미노산 서열 (예: 서열번호: 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 적어도 하나의 중쇄 CDRs (즉, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 항원-결합 부위를 가질 수 있다. 또다른 일면으로 항체 또는 항원-결합 부위 또는 변이체는 상응하는 CDR 1,2 및/또는 3의 아미노산 서열 (예: 서열번호: 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 적어도 하나의 경쇄 CDRs (즉, CDR4, CDR5 및/또는 CDR6)을 포함하는 항원-결합 부위를 가질 수 있다. 바람직한 일면에서 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDRs 및 3개의 경쇄 CDRs는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 mAbTNV148, TNV15, TNV196, TNV15, TNV118, TNV32, TNV86의 상응하는 CDRs의 아미노산 서열을 갖는다. 그러한 항체는 통상의 기술을 사용하여 항체의 다양한 부위(예: CDRs, 프레임워크)를 함께 화학적으로 연결시키거나, 재조합 DNA 기술의 통상의 방법을 사용하여 항체를 코딩하는 (하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나 다른 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
항-TNF 항체는 정의된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 가변 부위을 포함할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 일면에서 항-TNF 항체는 임의로 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 부위 및/또는 임의로 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 경쇄 가변 부위를 포함한다. 인간 TNF에 결합하고 정의된 중 또는 경쇄 가변 부위를 포함하는 항체를 적절한 방법, 예로서 파지 디스플레이(Katsube, Y., et al., Int JMol. Med, 1 (5) : 863-868 (1998)) 또는 본 분야에 공지되었고/거나 본 명세서에 기재된 유전자도입 동물을 사용하는 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 기능상 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 트랜스진 및 기능상 재배열될 수 있는 인간 면역글로불린 경쇄 로커스로부터의 DNA를 포함하는 트랜스진을 포함하는 유전자도입 마우스를 인간 TNF 또는 그의 단편으로 면역화하여 항체의 생산을 유도할 수 있다. 원하는 경우, 항체 생산 세포가 분리될 수 있고 하이브리도마 또는 다른 무한증식 항체-생산 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같고.거나 본 분야에 공지된 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 항체, 특정 부위 또는 변이체는 적절한 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 그의 부위를 사용하여 발현시킬 수 있다.
본 발명은 또한 항체, 항원-결합 단편, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 쇄 및 CDRs에 관한 것이다. 바람직하게 상기 항체 또는 항원-결합 단편 및 상기 쇄 또는 CDRs를 포함하는 항체는 고결합능(예: KD약 10-9M 보다 적거나 동일)으로 인간 TNF와 결합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 및 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 첫 번째 아미노산의 것과 유사한 화학적 및/또는 물리적 성질(예: 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 두 번째 아미노산에 의해 첫 번째 아미노산의 대체를 언급한다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 하기 그룹내 또다른 것으로 대체하는 것을 포함한다: 리신 (K), 아르기닌(R) 및 히스티딘 (H); 아스파테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴 (N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), K, R, H, D 및 E; 아라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신 (I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글리신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
아미노산 코드
본 발명의 항-TNF 항체를 구성하는 아미노산을 때로 약어로 기재한다. 아미노산 명칭은 본 기술에서 잘 이해되듯이 아미노산을 그의 단일 문자 코드, 그의 세 문자 코드, 명칭, 또는 3개의 뉴클레오타이드 코돈에 의해 표시될 수 있다(참조예,Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994).
단일 문자 코드 3 문자 코드 명칭 3 뉴클로에타이드 코돈
A Ala 알라닌 GCA, GCC, GCG, GCU
C Cys 시스테인 UGC, UGU
D Asp 아스파르트산 GAC, GAU
E Glu 글루탐산 GAA, GAG
F Phe 페닐알라닌 UUC, UUU
G Gly 글리신 GGA, GGC, GGG, GGU
H His 히스티딘 CAC, CAU
I Ile 이소류신 AUA, AUC, AUU
K Lys 리신 AAA, AAG
L Leu 류신 UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M Met 메티오닌 AUG
N Asn 아스파라긴 AAC, AAU
P Pro 프롤린 CCA, CCC, CCG, CCU
Q Gin 글루타민 CAA, CAG
R Arg 아르기닌 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S Ser 세린 AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T Thr 트레오닌 ACA, ACC, ACG, ACU
V Val 발린 GUA, GUC, GUG, GUU
W Trp 트립토판 UGG
Y Tyr 티로신 UAC, UAU
본 발명의 항-TNF 항체는 본 명세서에 구체화된 것과 같이 자연발생 돌연변이 또는 인간 조작으로부터 하나 이상의 아미노산 치한, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
물론, 기술자에 의한 아미노산 치환의 수는 예로서 상기 기재된 것을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 일반적으로 말하면 주어진 항-TNF 항체에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 수는 본 명세서에 구체화된 바와 같이 40 보다 크지 않을 것이며, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, l, 이를테면 1-30 또는 그 값 또는 범위내일 것이다.
기능상 필수적인 본 발명의 항-TNF 항체내 아미노산은 본 분야에 공지된 방법, 예로서, 위치-유도 돌연변이(site-directed mutagenesis) 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이(예: Ausubel, supra, Chapters 8,15; Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989))에 의해 동정할 수 있다. 후자의 방법은 분자내 모든 잔기마다 단일 알라닌을 도입한다. 이어서 생성된 돌연변이 분자를 생물학적 활성, 예로서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 TNF 중화 활성에 대하여 시험한다. 항체 결합에 중요한 위치를 구조 분석, 예로서 결정화, 핵자기공명 또는 광친화성 표식법(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255 : 306-312 (1992)에 의해 동정할 수 있다.
본 발명의 항-TNF 항체는 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 인접 아미노산중 5개 내지 모두로부터 선택되는 적어도 하나의 부위, 서열 또는 조합물을 포함할 수 있다.
추가로 항-TNF 항체는 임의로 적어도 하나의 70-100%의 적어도 하나의 서열번호 7, 8의 인접한 아미노산의 폴리펩티드를 포함한다.
일면에서, 면역글로불린 쇄, 또는 그의 부분(예: 가변 부위, CDR)의 아미노산 서열은 적어도 하나의 서열번호: 7, 8의 상응하는 쇄의 아미노산 서열에 대하여 약 70-100% 아이덴터티 (예: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 값 또는 범위내)를 갖는다. 예를 들면, 경쇄 가변 부위의 아미노산 서열을 서열번호 : 8과 비교할 수 있거나, 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열을 서열번호 : 7과 비교할 수 있다. 바람직하게, 70-100% 아미노산 아이덴터티 (i. e., 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 값 또는 범위내)는 본 분야에 공지된 바와 같이 적절한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 측정한다.
실례의 중쇄 및 경쇄 가변 부위 서열은 서열번호: 7, 8에 제공된다. 본 발명의 항체, 또는 특정 변이체는 어느 갯수의 본 발명의 항체로부터의 인접한 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기에서 갯수는 항-TNF 항체내 인접하는 잔기 갯수의 10-100%로 구성된 정수 그룹으로부터 선택된다. 임의로 인접하는 아미노산의 이 서열의 길이는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 이상의 아미노산또는 그 값 또는 범위내이다. 추가로 상기 서열의 갯수는 1 내지 20, 예로서 적어도 2, 3, 4, 또는 5으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 정수일 수 있다.
숙련자가 이해하듯이, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다. 생물학적으로 활성인 항체는 본래의(비-합성), 내인성 또는 관련되고 공지된 항체의 것과 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 및 바람직하게 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및 가장 바람직하게 적어도 80%, 90%, 또는 95%-1000%로 특이 활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성을 평가하고 측량하는 방법은 본 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다.
또다른 일면으로 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 유기 부위의 공유결합에 의해 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 상기 변형으로 개선된 약동학적 성질(예: 생체내 혈청 반감기 증가)을 갖는 인간 항체 및 항원-결합 단편을 생산할 수 있다. 유기 부위는 선형 또는 분지형 친수성 폴리머 그룹,지방산 그룹, 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 특정 일면에서, 친수성 폴리머 그룹 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고 폴리알칸 글리콜 (예: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 카보하이드레이트 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹은 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합하는 각각의 유기 부위는 독립적으로 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "지방산"은 모노-카복실산 및 디-카복실산을포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어로서 "친수성 폴리머 그룹"은 옥탄보다 물중에서 더욱 가용성인 유기 폴리머를 언급한다. 예를 들면, 폴리리신은 옥탄보다 물중에서 더욱 가용성이다. 따라서, 폴리리신의 공유결합에 의해 변형된 항체가 본 발명에 포함된다. 폴리리신의 공유결합에 의해 변현된 항체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체를 변형시키기에 적절한 친수성 폴리머 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들면, 폴리알칸 글리콜 (예: PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 등), 카보하이드레이트 (예: 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산의 폴리머(예: 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥사이드 (예: 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 항체를 변형하는 친수성 폴리머는 분리된 분자 엔터티로서 약 800내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들면, PEG5000및 PEG20000(여기에서, 아랫첨자는 폴리머의 평균 분자량(달톤)이다)이 사용될 수 있다. 친수성 폴리머 그룹은 1 내지 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환된 친수성 폴리머를 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 아민 그룹으로 포함하는 폴리머는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르상의 활성화된 카복실레이트(예: N, N-카보닐 디이미다졸로 활성화됨)는 폴리머상의 하이드록실 그룹과 커플링될 수 있다.
본 발명의 항체를 변형하는데 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형하는데 적합한 지방산은 예를 들어 n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-아이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-아이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오익 산, 테트라데칸디오익 산, 옥타데칸디오익 산, 도코산디오익 산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 직쇄 또는 측쇄 저급 알킬 그룹을 포함하는 디카복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬 그룹은 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1내지 약 6개의 탄소원자를 포함할 수 있다.
변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 이를테면 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "변형제"는 활성화 그룹을 포함하는 적합한 유기 그룹(예, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)을 뜻한다. "활성화 그룹"은 적당한 조건하에, 제 2의 화학 그룹과 반응하여 변형제와 제 2의 화학 그룹 사이의 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 부분 또는 작용 그룹이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 그룹은 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS), 등과 같은 친전자성 그룹을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 그룹은 예를 들어 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올), 등을 포함한다. 알데히드 작용 그룹은 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있으며, 아지드 그룹은 3가 인 그룹과 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화 그룹을 분자로 도입하는 적합한 방법은 본 기술에 알려져 있다(참조예, Hermanson, G. T., Bioconjtzgate Techniques. Academic Press: San Diego, CA (1996)). 활성화 그룹은 유기 그룹(예, 친수성 포리머, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접, 또는 링커 부분, 예를 들어 2가 C1-C12그룹(여기서 아니 이상의 탄소원자는 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있음)을 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 부분은 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 부분을 포함하는 변형제는 예를 들어 모노-Boc-알킬디아민(예, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)의 존재하에 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. Boc 보호 그룹을 트리플루오로아세트산(TFA)과의 처리에 으해 생성물로부터 제거하여 기재된 바와 같이 또다른 카복실레이트에 커플링될 수 있거나, 무수 말레산과 반응시키고 생성된 생성물을 고리화 하여 지방산의 활성화 말레이미도 유도체를 제조할 수 있는 1차 아민을 노출시킬 수 있다(참조예, Thompson, et al., WO 92/16221, 전체 교시 내용은 본 발명에서 참고문헌에 속함).
본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 변형제와 반응시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 유기 부분은 아민-반응성 변형제, 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 위치-특이성이 없는 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원 단편의 디설파이드 결합(예, 사슬내 디설파이드 결합)을 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체의 특이 부위에 결합되는 유기 부분을 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 이를테면 리버스 단백질가수분해를 이용하여 제조될 수 있다(Fisch et al., Bioconjtzgate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen etal., Bioconfugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaranet al., Protein Sci. 6 (10): 2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24 (1) : 59-68 (1996) ; Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): 456-463 (1997)), and the methods described in Hermanson, G. T., Bioconjzlgate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
항-TNF 항체 조성물로 항-아이디오타이프 항체
모노클로날 또는 키메릭 항-TNF 항체에 더하여, 본 발명은 또한 이와 같은 본 발명의 항체에 대해 특이한 항-아이디오타이프(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 일반적으로 다른 항체의 항원-결합 영역에 연관된 유일한 디터미넌트를 인식하는 항체이다. 항-Id는 항체 또는 그의 CDR 함유 영역을 가진 Id 항체원으로서 동일 종 및 유전형(예 생쥐 스트레인)의 동물을 면역화 하여 제조될 수 있다. 면역화 동물은 면역화 항체의 아이디오타이픽 디터미넌트를 인식하고 반응하여 항-Id 항체를 생성할 것이다. 항-Id 항체는 또한 소위 항-항-Id 항체를 생성하는, 또다른 동물의 면역 반응을 유발하도록 "이뮤노겐"으로서 사용될 수 있다.
항-TNF 항체 조성물
본 발명은 또한 본 발명에서 기재되고/되거나 본 기술에서 알려진, 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 이상의 항-TNF 항체를 함유하며 비자연적 발생 조성물, 혼합물 또는 형태로 제공되는 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변이체의 인접 아미노산 70-100%로 구성된 그룹 중에서 선택된 항-TNF 항체 아미노산 서열의 적어도 하나 또는 2개의 완전 길이, C- 및/또는 N-말단 삭제 변이체, 도메인, 단편, 또는 특정 변이체를 포함한 비자연적 발생 조성물을 함유한다. 바람직한 항-TNF 항체 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변이체 70-100%의 항-TNF 항체 서열 중 적어도 하나의 CDR 또는 LBR 함유 부분으로서 적어도 하나 또는 2개의 완전 길이, 단편, 도메인 또는 변이체를 포함한다. 더욱 바람직한 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변이체 70-100% 중 적어도 하나의 40-99%를 포함한다. 이러한 조성물 퍼센트는 본 기술에 공지되거나 본 발명에서 기재된 바와 같이, 액체 또는 무수 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀전 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰농도, 몰랄농도에 의한 것이다.
본 발명의 항-TNF 항체 조성물은 또한 이러한 조작, 처리 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 함유한 적어도 하나의 조성물 또는 의약 조성물의 적당량 및 유효량을 포함할 수 있으며, 임의로 적어도 하나의 TNF 안타고니스트(예, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 리셉터 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 안타고니스트, 그러나 이들에 한정되지 않음), 항류머티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파잘진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제,항균제(예, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 크르티코스테로이드, 아나볼릭 스테로이드, 당노병 관련 치료제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역제, 면역글로불린, 면역억제제(예, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 리셉터 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사약물, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 안타고니스트 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 이러한 사이토카인의 비제한적인 일예는 IL-1 내지 IL-23을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 적합한 투여량은 본 기술에서 잘 알려져 있다(Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), 각 문헌은 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속한다).
그러한 항암제 또는 항감염제는 최소한 하나의 본발명의 항체와 결합, 조합,공동 투여 또는 공동-제제화된 톡신 분자를 포함할 수 있다. 톡신은 병원 세포 또는 조직을 선택적으로 죽이는 작용을 할 수 있다. 병원은 톡신의 최소한 하나의 기능적 세포독성 도메인, 예를 들면, 리신, 디프테리아 톡신, 베놈 톡신, 또는 박테리아 톡신으로부터 선택된 것을 포함하는 정제된 또는 재조합 톡신 또는 톡신 단편일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 톡신은 어떠한 자연적으로 발생한, 인간 및 기타 포유동물에서, 죽음에 이를 수도 있는 톡신 쇼크를 포함하는 병적 이상을 일으킬 수 있는 돌연변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생성될 수 있는 엔도톡신 또는 엑소톡신을 모두 포함할 수 있다. 그러한 톡신은, 장독성 E. coli 열-불안정 엔테로톡신(LT), 열-안정 엔테로톡신(heat-stable 엔테로톡신 (ST)), Shigella 시토톡신, Aeromonas 엔테로톡신, 독성 쇼크증상 톡신-1 (TSST-1), Staphylococcal 엔테로톡신 A (SEA), B (SEB), 또는 C (SEC), Streptococcal 엔테로톡신 등. 그러한 박테리아는 장독성 E. coli (ETEC), 장출혈 E. coli (예를 들면, strains of serotype 0157: H7), Staphylococcus 종 (예를 들면, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyo유전자s), SSligella 종 (예를 들면, Sltigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, 및 Shigella sonnei), Salmonella 종 (예를 들면, Salmonella hphiw Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium 종 (예를 들면, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacter 종 (예를 들면, Camphlobacterjejuni, Camphlobacter fetus), Heliobacter 종, (예를 들면, Heliobacter pylori), Aeroinonas 종 (예를 들면, Aeromonas sobria, Aerornonashydrophila, Aeromonas caviae), Pleisornonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios 종 (예를 들면, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella 종, Psetedomonas aeruginosa, 및 Streptococci를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 참조, 예를 들면, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown 및 Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology 및 대조, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991) ; Mandell et al, Principles 및 Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone. New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck 및 Co., Rahway, N. J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248 : 705-711 (1990), 참고문헌의 내용은 전체가 본명세서에 참고문헌으로서 포함된다.
본 발명의 항-TNF 항체 화합물, 조성물 또는 이들의 조합은 희석제, 결합제, 안정화제, 버퍼, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 최소한 하나의 보조제를 추가로 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 보조제가 바람직하다. 그러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적 예는 Gennaro, Ed., Rentington's Pharrnaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 선행기술에 널리 공지되어 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 업계에 널리 공지되거나 본명세서에 기술된 바와 같이 투여방법, 항-TNF 항체, 단편 또는 변이체 조성물의 용해도 및/또는 안정성에 적합하도록 루틴하게 선택될 수있다.
본발명에 유용한 약제학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지방, 및 탄수화물(예를 들면, 모노사카리드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카리드 같은 당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등 유도된 당류; 및 다당류 및 당 폴리머)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용되고, 단독 또는 1-99.99% 중량 또는 부피%의 조합을 포함한다. 예시적 단백 부형체는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 버퍼 용량에서도 역할을 갖는, 대표적 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파라트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본발명에 사용에 적합한 탄수화물 부형제는, 예를 들면 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등의 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스등의 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등의 다당류; 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 솔비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등의 알디톨을 포함한다. 본발명에서 사용에 바람직한 탄수호물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및 라피노스이다.
항-TNF 항체 조성물은 버퍼 또는 pH 조절제를 포함할 수 있다; 대표적으로, 버퍼는 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 버퍼는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산염; Tris, 트로메타민 염산, 또는 포스페이트 버퍼를 포함한다. 본발명에의 사용에 바람직한 버퍼는 시트레이트와 같은 유기산염이다.
부가적으로, 본발명의 항-TNF 항체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜스(중합 슈거), 덱스트레이트(예를 들면, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 같은 시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향료, 살균제, 감미제, 항산호제, 정균제, 계면활성제(예를 들면, "TWEEN 20" 및"TWEEN 80" 같은 폴리소르베이트), 지방 (예를 들면, 포스포리피드, 지방산), 스테로이드 (예를 들면, 콜레스테롤), 및 킬레이트제 (예를 들면, EDTA)와 같은 폴리머 부형제/첨가제를 포함할 수있다.
본 발명의 항-TNF 항체, 부분 또는 변이체에 사용하는데 적합한 이들 및 부가적 공지 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들면, "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19'h ed., Williams & Williams, (1995), 및 in the"Physician's Desk Reference", 52"d ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)에 공지되어 있고, 그 개시 내용은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들면, 당류 및 알디톨) 및 버퍼 (예를 들면, 시트레이트) 또는 폴리머제이다.
제제
상기한 바와 같이, 본발명은 안정한 제제를 제공하는데, 이는 바람직하게는 식염주 또는 선택된 염을 갖는 포스페이트 버펴와 더불어 보존된 용액 및 보존제를 함유하는 제제와 더불어 약제학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존된 제제이고, 약제학적으로 허용가능한 제제 내에 최소한 하나의 항-TNF 항체를 포함한다. 보존된 제제는 최소한 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트리트, 페녹시에탄올, 포름알데히디ㅡ 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드(예를 들면, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살, 또는 수성 희석제 내의 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 임의로 선택된 최소한 하나의 공지된 보존제를 포함한다. 적절한 농도 또는 혼합물은 0.001-5%, 또는 그 범위내의 어떤 범위 또는 값과 같이 업계에 공지된 바대로 사용될 수 있고, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4. ,0.5 ,0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 범위내의 어떤 범위 또는 값을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 비제한적 예는 보존제를 포함하지 않거나, 0.1-2% m-크레졸 (예를 들면, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜 (예를 들면, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티머로살 (예를 들면, 0.005,0.01), 0.001-2.0% 페놀 (예를 들면, 0.05,0.25,0.28,0.5,0.9,1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤 (s) (예를 들면, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0. 9, 1.0%), 등을 포함한다.
상기한 바와 같이, 본발명은 충전 물질 및 임의로 수성 희석제 내의 처방된버퍼 및/또는 보존제와 함께 최소한 하나의 항-TNF 항체의 용액을 포함하는 최소한 하나의 바이알을 포함하는, 제조기술을 제공하는데, 여기서 충전 물질은 그러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 시간 또는 그 이상의 시간 동안 사용가능함을 표시하는 라벨을 포함한다. 본발명은 충전 물질 및 동결건조된 항-TNF 항체를 포함하는 제 1 바이알 및, 처방된 버퍼 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제 2 바이알을 포함하는 제조기술을 제공하는데, 충전물질은 수성 희석제 내의 최소한 하나의 항-TNF 항체는 24 시간 또는 그 이상의 시간 동안 사용가능한 용액을 형성함을 표시하도록 재구성한다는 것을 환자에게 알려주는 라벨을 포함한다.
본발명에 따라 사용되는 최소한 하나의 항-TNF 항체는 포유동물 세포 또는 형질전환 제제를 포함하는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있고, 또는 본명세서에서 기술되거나 업계에 공지된 바와 같 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본발명의 생산에서 최소한 하나의 항-TNF 항체의 범위는 습윤/건조 시스템인 경우, 비록 더 낮거나 높은 농도가 사용가능하고 원하는 전달 매체에 의존적이기, 예를 들면 용액 제제는 피부통과 패취, 폐, 점막투과, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과 다르지만, 재구성에 의해 약 1.0μg/ml 내지 약 1000 mg/ml 농도의 수율을 포함한다.
바람직하게는 수성 희석제는 약제학적으로 허용가능한 보존제를 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살, 또는 수성 희석제 내의 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 것이다. 제제 내에 사용된 보존제의 농도는 항-미생물 효과를 내기에 충분한 농도이다. 그러한 농도는 선택된 보존제에 의존하고 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
다른 부형제, 예를 들면 등장화제, 버퍼, 항산화제, 보존성 증강제는 희석제에 부가되는 것이 임의적이고 바람직하다. 글리세린과 같은 등장화제는 공지된 농도에서 통상 사용된다. 생리학적으로 허용되는 버퍼는 향상된 pH 제어를 제공하도록 바람직하게는 부가된다. 제제는 약 pH 4 내지 약 pH 10의 넓은 범위의 pH를 포함하고, 바람직한 범위는 약 pH 5 내지 약 pH 9이고, 가장 바람직한 범위는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 바람직하게는 본발명의 제제는 약 6.8 내지 약 7.8 사이의 pH를 갖는다. 바람직한 버퍼는 포스페이트 버퍼, 더욱 바람직하게는 소듐 포스페이트, 특히포스페이트 버퍼된 식염수(PBS)를 포함한다.
Tween 20 (폴리옥시에티렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), Pluronic F68 (폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머), 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 또는 polysorbate 20 또는 80 또는 poloxamer 184 또는 188, PIuronic? polyls 같은 비이온 계면활성제 , 기타 블록 코-폴리머, EDTA 및 EGTA 같은 킬레이트제 같은 다른 첨가제는 응집을 감소시키기 위해 제제 또는 조성물에 임의로 부가될 수 있다. 이들 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제제를 투여하는데 사용되면 특히 유용하다. 약제학적으로 허용가능한 계면활성제의 존재는 단백질 응집 성향을 완화한다.
본발명의 제제는 최소한 하나의 항-TNF 항체 및, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살 및 수성 희석제 내의 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 보존재를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 내의 최소한 하나의 항-TNF 항체 및 보존제의 혼합은 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행한다. 적절한 제제를 제조하기 위해, 예를 들면, 계량된 양의 버퍼 용액 내의 최소한 하나의 항-TNF 항체가 소기의 농도에서 단백질 및보존제를 제공하는데 충분한 양의 버퍼된 용액 내의 소기의 보존제와 조합시킨다. 이 방법의 변형법은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를들면, 성분의 순서가 부가되고, 부가적 첨가제가 사용되는지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용된 투여 수단 및 농도에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.
청구된 제제는 밝은 용액으로서, 또는, 물, 보존제 및또는 부형제, 바람직하게는 포스페이트 버퍼 및/또는 식염수 및 선택된 염을 수성 희석제 내에서 포함하는 제 2 바이얼과 함께 재구성되는 동결건조된 최소한 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 이중 바이알로서 환자에 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구서을 요구하는 이중 바이알은 여러번 재사용될 수 있고 단일 또는 여러 주기의 환자 치료에 충분하고 따라서 현재 사용되는 것보다 더욱 편리한 치료 레짐을 제공할 수 있다.
본발명의 제조 기술은 즉시 부터 24 시간 또는 그 이상에 걸쳐 투여하는데 유용하다. 따라서, 현재 청구된 제조 기술은 환자에 상당한 이점을 준다. 본발명의 제제는 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안정하게 보존될 수있고 연장된 시간 동안 생물학적 단백질 활성을 유지하고, 따라서 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48,72, 또는 96 시간 또는 그 이상에 걸쳐 사용될 수 있는 용액을 표시하는 패키지 라벨을 허용한다. 보존된 희석제가 사용된 경우, 그러한 라벨은 1-12 달, 반년, 1년 반, 및/또는 2년의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 적어도 하나의 항-TNF 항체의 용액은 수성 희석제에 적어도 하나의 항체를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 혼합은 통상의 용해 및 혼합법을 사용하여 수행한다. 적절한 희석제를 제조하기 위하여 예를 들면, 물 또는 완충액중 적절한 적어도 하나의 항체를 단백질 및 임의로 방부제 또는 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 배합한다. 본 공정의 변형을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 추가의 첨가제의 첨가 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH 모두 사용되는 투여 방법 및 농도에 최적화될 수 있는 모든 요소이다.
청구하는 제품은 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이알과 재구성된 동결된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 투명한 액제 또는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 액제 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 다중 싸이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 더욱 우수한 통상의 치료 요법을 제공하다.
청구하는 제품은 약국, 병원, 또는 다른 기관 및 기구에 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이알과 재구성된 동결된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 투명한 액제 또는 이중 바이알을 제공하여 환자에 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 투명 액제는 1리터 이상 일 수 있고, 이는 소량의 적어도 하나의 항체 액제가 소량의 바이알로 전달되기 위해 단회 또는 다회 회수될 수 있고 약국 또는 병원에 의해 손님 및/또는 환자에게 제공되는 다량 저장고를 제공한다.
이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 인식 장치는 액제 투여를 위한 펜-인젝터 예로서, BD Pens, BD AutojectorpenR, HumajectR; NovoPenR, B-DRPen, AutoPenR, 및 OptiPenR;, GenotropinPenR, Genotronorm PenR;, Humatro PenR;, Reco-PenR, Roferon PenR, BiojectorR;, ijectR, J-tip Needle-Free InjectorR, IntrajectR, Medi-JectR;, 예: Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www. bectondickenson. com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www. disetronic. com; Bioject, Portland, Oregon (www. bioject. com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www. weston-medical. com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www. mediject. com)로부터 제조되거나 개발된 것을 포함한다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 인식 장치는 HumatroPenR.과 같인 재구성 액제의 투여를 위한 카트리지내 동결 약물을 재구성하기 위한 펜인제터를 포함한다.
청구하는 제품은 패킹 재료를 포함한다. 패킹 재료는 조절 기구에 의해 요구되는 정보외에 세품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 패킹 재료는 2개의 바이알, 습윤/건식 제품에 대하여 적어도 하나의 항-TNF 항체를 수성 희석제에서 재구성하여 액제를 제조하고 상기 액제를 2-24시간 이상의 기간동안 사용하도록하는 지시사항을 환자에게 제공한다. 단일 바이알, 액제 제품에 대하여 라벨은 상기 액제를 2-24시간 이상의 기간동안 사용할 수 있음을 지시한다. 청구하는 제품은 인간 약제학적 제품 용도로 유용하다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 항-TNF 항체 및 선택된 완충액, 바람직하게 염수 또는 선택된 염을 포함하는 인산 완충액과 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제내 적어도 하나의 항체 및 완충액을 혼합하는 것은 통상의 희석법 및 혼합법에 의해 수행된다. 적절한 제제를 제조하기 위하여 물 또는 완충액중 적절한 양의 적어도 하나의 항체를 원하는 농도로 단백질 및 완충액을 제공하기 충분한 양으로 물중 원하는 완충제와 혼합한다. 이 과정의 변형법을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 추가의 첨가제의 첨가 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH 모두 사용되는 투여 방법 및 농도에 최적화될 수 있는 모든 요소이다.
청구하는 안정 또는 보존 제제는 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이알과 재구성된 동결된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 투명한 액제 또는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 액제 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 다중 싸이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 더욱 우수한 통상의 치료 요법을 제공하다.
청구하는 안정 또는 보존 제제 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 액제로 적어도 하나의 항-TNF 항체는 본 분야에 공지된 바와 같이 SC 또는 IM 주사; 경피, 경점막, 임플란트, 삼투펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 또는 기술자에 이해되는 다른 방법에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
치료적 적용
본 발명은 본 분야에 공지되거나 본 명세어세 기재된 바와 같이, 본 발명의 적어도 하나의 이중 인테그린 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 TNF 관련 질환을 변형하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 비만, 면역 관련 질환, 심혈관 질환, 감염 질환, 악성 질환 또는 신경질환을 포함하는 적어도 하나의 TNF 관련 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 류마치스(성) 관절염, 연소성 류마치스(성) 관절염, 전신 발현 연소성(onset juvenile 류마치스(성) 관절염), 건선 관절염, 강직성 척추염, 위궤양. 혈청반응음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 항인지질증후군, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 과정, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기 접촉피부염, 알레르기결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식거부반응, 이식편대숙주병, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 증후구, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란증후군, 류마치스(성) 관절염, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론 병, 겸상적혈구성 빈혈, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 담마진, 전신성 아나필락시스(systemic anaphalaxis), 피부염, 악성빈혈, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 기관 또는 조직의 이식편거부반응, 신장 이식거부반응, 심장 이식거부반응, 간이식거부반응, 췌장이식거부반응, 폐이식거부반응, 골수이식(BMT) 거부반응, 피부동종이식거부반응, 연골이식거부거부반응, 뼈이식거부반응, 소장이식거부거부반응, 태아 흉선 임플란트 거부반응, 부갑상선이식거부반응, 기관 또는 조직의 이종이식거부반응, 동종이식거부반응, 항-수용에 과민반응, 그레이브스 병, 레이노 질환, B형 인슐린-내성 당뇨볍, 천식, 중증 근무력증, 항체 관련성 세포독성, III형 과민반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군(폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군), 폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군, 항인지질증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활성 당뇨, 원발성 담낭 경변증, 백반, 혈관염, MI 심장절개 증후군, IV형 거부반응, 접속성 피부염, 거부반응, 폐렴, 동종이식거부반응, 세포내 유기체에의한 흑색종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색(소)증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병(성) 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부하수체부신계 평가, 원발성 담낭 경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 치료법, 항-cd3 치료법, 사이토카인 치료법, 화학요법, 방사선 요법(예: 제한하는 것은 아니지만, 토스트헤니아(toasthenia), 빈혈, 악액질 등), 만성 살리실산 중독등의 조절 또는 치료법에 관한 것이다. 참조: 예: the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972,1977,1982,1987,1992,1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998,2000)(각각 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다).
본 발명은 또한 심인성 졸도 증후군, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸증, 허혈성 뇌졸증, 출혈, 동맥경화(증), 죽상경화, 재협착, 당뇨성 죽상경화증 질환, 고혈압, 동맥(성) 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전증, 폐성심, 원발성 폐 고혈압, 심부정맥, 심방이소성 박동, 심방조동, 심방세동(지효성 또는 발작성), 관류후증후군, 심폐회로 염증 반응, 혼동 또는 다소성 심방 빈맥, 정상협착 QRS 빈맥, 특이 부정맥, 심실세동, 히스속부정맥, 방실차단, 각차단, 심근허혈 질환, 관(상)동맥질환, 협심증, 심근경색, 심근증, 확장형 울혈성 심근증, 제한성 심근병증, 판막성 심장질환, 심내막염, 심낭(심막)질환, 심장암, 대동맥 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 가지 폐색, 말초혈관질환, 폐색성 동맥 질환, 말초 아테롬성 동맥 경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 질환, 레이노 현상 및 질환, 말단청색증, 지단홍통증, 정맥질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방(성) 부종, 불안정형협심증, 재관류 손상, 펌프후 증후군, 허혈성 재관류 손상 등 중 1종 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 하나 이상의 심장혈관 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로는, 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 또는 만성 기생충성 또는 감염성 발생과정, 예로서 박테리아, 바이러스 및 진균 감염, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염(A, B 또는 C 등), 화농성관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염,E. coli0157: h7, 용혈성 요독증 증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅구 출혈성 열, 리슈마니아증, 나병, 독 쇼크 증후군, 연쇄구균 근염, 가스괴저, 마이코박테리움(mycobacterium) 결핵증, 마이코박테리움(mycobacterium) 아븀 인트라셀룰라, 뉴모시스티스 카리니 폐렴, 골반염증성 질환, 고환염/부고환염, 라지오넬라(Lagionella) 감염, 라임 질환 , 인플루엔자 a, 엡스타인 바 바이러스, 생명-관련 혈액 식세포성 증후군, 생명 뇌염/무균성 뇌막염 등의 1종 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 1종 이상의 감염질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병 (CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome)(MDS), 림프종, 호긴 질환, 악성 림프종, 비-호킨 림프종, 버키트림프종, 다중 흑색종, 카포시육종, 결장직장암종, 췌장암종, 비인강악성종양, 악성조직구증, 종양부수증후군/악성종양의 과칼슘혈증, 충실성 종양(solid tumors), 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암관련 골통 등의 1종 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 1종 이상의 악성 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 신경퇴행성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 컴플렉스, 탈수초(성) 질환, 예로서 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌성 질환 예로서 피질척수계 병변; 대뇌기저핵 또는 소뇌질환; 과다운동성 질환 예로서 헝틴통 무도병 및 노인성 무도병; 약물-유도성 운동 질환, 예로서 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 것; 과소운동성 질환, 예로서 파킨슨 질환; 진행성 핵상 마비(Progressive supranucleo Palsy); 소뇌의 구조상 병변; 척수소뇌변성, 예로서 척수성 운동실조증, 프리이드라이히 운동실조(증), 소뇌 피질변성, 다중계 변성(Mencel, Dejerine-Thomas, Shi Drager, and Machado-Joseph) ; 전신 질환(레프섬병, 아베타리포프로테미아, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다중계질환); 탈수초 중심성 질환, 예로서 다발성 경화증, 급성 횡단성 척수염; 및 운동 단위 질환 예로서 신경성 근육 위축증(앞뿔 세포 변성, 예로서 근위축성 측삭 경화증, 영아 척수성 근육 위축증 및 연소성 척수성 근육 위축증); 알츠하이머 질환; 다운증후군; 산재성 루이소체 질환; 루리소페형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프증후군; 만성 알콜중독 ; 크로이츠펠트야콥병; 아급성 경화성 범뇌염, Hallerrorden-Spatz 질환; 및 권투선수치매 등의 1종 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 1종 이상의 신경계질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 질병은 임의로는, 1종 이상의 TNF 항체, 또는 특정 부위 또는 변이체를 함유하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 문헌[the Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992) 등]을 참조한다.
본 발명의 어떠한 방법이던지 1종 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로는 상기 면역질환을 치료하기 위한 공동투여 또는 조합 요법(combination therapy)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 1종 이상의 항-TNF 항체, 그의 특정 부위 또는 변이체의 투여는 1종 이상의 TNF 길항제((예, 제한되지는 않지만, TNF 항체 또는 단편, 용해성 TNF 수용체 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제), 항류마티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 소듐 티오말레이트, 히드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파잘진), 근육이완제, 최면제, 비-스테로이드성 항-염증약 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항균제 (예, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항균제, 카바네넴, 세파로스포린, 플루로르퀴노론, 마크로리드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라시클린, 또다른 항미생물제), 항건선제, 코티코스테로이드, 동화성 스테로이드, 당뇨병 관련 물질, 미네랄, 영양제, 티로이드제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 진토제, 항궤양제, 설사제, 항응집제, 에리트로피에틴 (예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀 (GM-CSF, Leukine), 면역제, 면역글로블린, 면역저해제 (예, 바시릭시맵, 사이클로스포린, 다클리주맵), 성장호르몬, 호르몬 대체제, 에스트로겐 수용체 조절제, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성 약물, 항우울제, 항조제(antimanic agent), 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경작용약, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입성 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸산틴, 크로모린, 에피네프린 또는 유사체, 도네이즈 알파(풀모짐), 사이트카인 또는 사이트카인 길항제로부터 선택된 1종 이상을 전에, 동시에 및/또는 그 후에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 적당한 제형은 당업계에 널리 알려져 있다. 본원에서 전체가 참고문헌으로 인용되는, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000) 등]들을 참조한다.
본 발명의 조성물, 조합 요법, 공동투여, 디바이스 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제 (추가로, 본 발명의 항체, 특정 부위 및 그의 변이체를 포함함)는 다음을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다 : 항-TNF 항체, 그의 항원-결합 프래그먼트, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 이탈 또는 표적 세포에 대한 그의 작용을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예를 들면 탈리도미드(thalidomide), 테니답(tenidap), 포스포디에스테라제 억제제 (펜톡시필린 및 로리프람 등), A2b 아네노신 수용체 길항제 및 A2b 아데노신 수용체 증강제 등; TNF 수용체 신호를 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예를 들면 미토겐 활성화된 단백질(MAP) 키나아제 억제제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예를 들면 메탈로프로테인나제 억제제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예를 들면 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제 (예: 캅토프릴); 및 TNF 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예를 들면 MAP 키나아제 억제제.
본원에서 사용된 바와 같이, "종양 괴사 인자 항체(tumor necrosis factor antibody)", "TNF 항체", "TNFα항체" 프래그먼트 등은 시험관내, 원우치 및/또는 또는 바람직하게는 생체내에서의 TNFα활성을 차단, 억제, 폐기 또는 간섭한다. 예를 들면, 본 발명의 적당한 TNF 인간 항체는 TNFα에 결합할 수 있으며, 항-TNF 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 TNFα에 특이적으로 결합하는 특정 변이주 또는 그의 도메인을 포함한다. 적당한 TNF 항체 또는 프래그먼트는 또한 TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 이탈, TNF 수용체 신호화, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 폐기, 간섭, 방지 및/또는 억제할 수 있다.
키메라 항체 cA2는 A2로 명기된, 고 친화력의 중화 마우스 항-인간 TNFαIgG1 항원, 및 인간IgG1의 일정 영역, 카파 면역글로부린(kappa immunoglobulin)의 항원 결합 가변성 영역으로 이루어져 있다. 인간 IgG1 Fc 영역은 알레지 항체 이펙터(allogeneic antibody effector)기능을 향상시키고, 순환 혈청 반감기를 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 항원항체결합력(avidity) 및 항원결저인자(epitope) 특이성은 뮤린 항체 A2의 가변 영에서 유도된다. 구체적인 실시태양으로서, 생쥐 항체 A2의 가변 영역을 코딩하는 핵산의 바람직한 공급원은 A2 하이브리도마 세포주이다.
키메라 A2(cA2)는 투여량 의존 방식으로 천연 및 재조합 인간 TNFα 모두의 세포독성 효과를 중화시킨다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 평가로부터, 키메라 항체 cA2의 친화 상수는 1.04 x 1010M-1로 계산되어졌다. 단클론항체 특이성 및 경쟁적 억제에 의한 친화도를 결정하기 위한 바람직한 방법은 문헌[Harlow, et al., antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Irramunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozbor et al., linintinol Today, 4 : 72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000); 및 Muller, Meth. Enzymol., 92 : 589-601 (1983)]에서 발견될 수 있으며, 전체가 본원에서 참고문헌으로 삽입된다.
구체적인 실시태양에서, 생쥐 단클론 항체 A2는 c134A로 명기된 세포주에 의해 생산된다. 키메라 항체 cA2는 c168A로 명기된 세포주에 의해 생산된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 단클론 항-TNF 항체의 부가적인 예들은 문헌[U. S. Patent No. 5,231,024; Moller, A. et al., Cytokine 2 (3): 162-169 (1990); U. S. Application No. 07/943,852 (1992. 9. 11 출원); Rathjen et al., International Publication No. WO 91/02078 (1991. 2. 21 공개); Rubin et al., EPO Patent Publication No. 0 218 868 (1987. 4. 27 공개); Yone et al., EPO Patent Publication No. 0 288 088 (1988. 10. 26); Liang, et al., Biochem. BiophysRes. Coma. 137 : 847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6 : 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6 : 359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6 : 489-507 (1987); 및 Hirai, et al., J. Ttnmuizol. illeth. 96 : 57-62 (1987) 등 참조]에서 기술되어져 있으며, 이들은 전부 본원에서 참고문헌으로 삽입된다.
TNF 수용체 분자
본 발명에서 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 고 친화력으로 TNFα에 결합하며, 경우에 따라 낮은 면역원성을 갖는 것들이다 [예를 들면, 본원에서 모두 참고문헌으로 삽입되어 있는, Feldmann et al., International Publication No. WO 92/07076 (published April 30,1992); Schall et al., Cell 61 : 361-370 (1990); 및 Loetscher et al., Cell 61 : 351-359 (1990) 등을 참조]. 특히, 55 kDa (p55TNF-R) 및 75 kDa (p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에서 유용하다. 수용체의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 기능성 부위를 포함하는, 이들 수용체의 트렁케이트된(truncated) 형태가 본 발명에서 또한 유용하다 (Corcoran et al., Emir. J. Biochem. 223 : 831-840 (1994) 등을 참조). ECD를 포함하는, TNF 수용체의 트렁케이트된 형태가 뇨 및 혈청에서 30 kDa and 40 kDa TNFa 억제 결합 단백질로서 검출되어졌다(Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265 : 1531-1536 (1990)). TNF 수용체 멀티머 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자, 및 그의 유도체 및 프래그먼트 또는 부위가 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 TNF 수용체의 부가적인 예이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자는 장기간 동안 양호한 내지 월등한 증상의 경감 및 저독성으로 환자를 치료하는 그의 능력에 의해 특징화된다. 저 면역원성 및/또는 고 친화력, 및 다른 한정되지 않은 성질은 달성된 치료요법 결과에 기여할 수 있다.
본 발명에서 유용한 TNF 수용체 멀티머 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 링커 또는 다른 비펩티드 링커, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 통하여 연결된 둘 이상의 TNF 수용체의 모든 ECD 또는 기능성 부위를 포함한다. 멀티머 분자는 멀티머 분자의 직접 발현으로의 분비 단백질의 신호 단백질을 추가로 함유한다. 이들 멀티머 분자 및 그의 생산 방법은 미국 출원번호 08/437, 533 (1995, 5. 9 출원)에 기술되어 있으며, 그의 내용 전부는 참고 문헌으로 본원에 삽입된다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 한 이상의 면역글로부린 분자의 하나 이상의 부위 및 하나 이상의 TNF 수용체의 모든 또는하나의 기능성 부위를 포함한다. 이들 면역수용체 융합 분자는 단량체, 또는 헤테로- 또는 호모-멀티머로서 조립될 수 있다. 면역수용체 융합 분자는 또한 일가 또는 다가일 수 있다. 이러한 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그들의 생산 방법은 문헌[Lesslauer et al., Eur. J. Isnznunol. 21 : 2883-2886 (1991) ; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174 : 1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 215-219 (1994); Butler et al., Cytokine 6 (6): 616623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24 : 2040-2048 (1994); Beutler et al., U. S. Patent No. 5,447,851; and U. S. Application No. 08/442, 133 (1995. 5. 16 출원)]에 기술되어 있으며, 이들 문헌 각각은 전부 본원에 참고 문헌으로 삽입된다. 면역수용체 융합 분자의 생산 방법은 또한, 문헌[Capon et al., U. S. Patent No. 5,116,964; Capon et al., U. S. Patent No. 5,225,538; and Capon et al., Nature 337 : 525-531 (1989)]에서 발견될 수 있으며, 이들 문헌들은 전부 참고 문헌으로 본원에 삽입된다.
TNF 수용체 분자의 기능성 등가물, 유도체, 프래그먼트 또는 영역은 TNF 수용체 분자의 부위, 또는 본 발명에서 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자 (예컨대, 고 친화력으로 TNF에 결합하고, 낮은 면역원성을 가짐)를 기능적으로 닮기에 충분한 크기와 서열인, TNF 수용체 분자를 코팅하는 TNF 수용체 분자의 부위를 지칭한다. TNF 수용체 분자의 기능성 등가물은 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 TNF 수용체분자(예컨대, 고 친화력으로 TNF에 결합하고, 낮은 면역원성을 가짐)를 기능적으로 닮은 변형된 TNF 수용체 분자를 포함한다. 예를 들면, TNF 수용체 분자의 기능성 등가물은 "SILENT" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환물, 결손물 또는 부가물 (예컨대, 또다른 산성 아미노산의 경우 하나의 산성 아미노산의 치환물; 또는 소수성 아미노산을 코딩하는 또다른 코돈의 경우 동일 또는 상이한 소수성 아미노산의 치환물)을 포함할 수 있다. 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000)]을 참조한다.
사이토카인(cytokine)은 임의의 공지된 사이토카인을 포함한다. 예컨대, 문헌[CopewithCytokines. com.]을 참조한다. 사이토카인 길항제는 임의의 항체, 프래그먼트 또는 유사물, 임의의 가용성 수용체, 프래그먼트 또는 유사물, 임의의 소분자 길항제, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
치료요법적 치료.
본 발명의 임의의 방법은 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 1종 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, TNF 매개 질병을 치료하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로는 상기 면역질환을 치료하기 위한 공동투여 또는 조합 요법(combination therapy)을 추가로 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 1종 이상의 항-TNF 항체, 그의 특정 부위 또는 변이체의 투여는 1종 이상의 TNF 길항제(예, 제한되지는 않지만, TNF 항체 또는 단편, 용해성 TNF 수용체 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제), 항류마티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 골드 소디μM 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플노마이드, 설파살진), 근육이완제, 최면제, 비-스테로이드성 항-염증약 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 극소 마취제, 신경근 차단제, 항균제 (예, 아미노글리코시드, 항진균제, an 항구충제, 항균제, 카바페넴, 세파로스포린, 플루오로퀴놀론, 마크로리드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항미생물제), 항건선제, 코티코스테로이드, 동화성 스테로이드, 당뇨병 관련 약제, 미네랄, 영양제, 티로이드제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 진토제, 항궤양제, 설사제, 항응고제, 에리트로피에이틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역제, 면역글로블린, 면역저해제 (예, 바실리시마브, 시클로스포린, 다실주맵), 성장호르몬, 호르몬 대체제, 에스트로겐 수용체 조절제, 미드리아틱제, 시클로프레그제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성 약물, 항우울제, 항조증제(antimanic agent), 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경작용약, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입성 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로모린, 에피네프린 또는 유사체, 도네이즈 알파 (Pulmozyme), 사이트카인 또는 사이트카인 길항제로부터 선택된 1종 이상을 전에, 동시에 및/또는 그 후에 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
전형적으로, 병리학적 증상의 치료는, 조성물에 함유된 특이 활성에 의존하여, 평균적으로 전부하여 투여당 환자의 1 kg 당 1종 이상의 항-TNF 항체 약 0.01 내지 500 밀리그람 이상에 이르고, 바람직하게는 단일 또는 다회 투여 당 최소한 약 0.1 내지 100 밀리그람 항체/환자 1 kg에 이르는 1종 이상의 항-TNF 항체 조성물의 유효량 또는 제형을 투여함에 의해 달성된다. 별법으로, 효과적인 혈청 농도는 단일 또는 다회 투여당 0.1-5000 μg/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적당한 용량은 의학 분야의 의료진에게 알려져 있으며, 물론 구체적인 질병 상태, 투여할 조성물의 특이 활성, 및 치료가 진행되는 구체적인 환자에 의존한다. 일부 경우에, 발마직한 치료량을 달성하기 위하여, 반복 투여, 즉 특별히 모니터되거나 측정된 양의 반복된 개별 투여(여기서, 개별 ㅌ여는 바람직한 일일 양 또는 효과가 달성될 때까지 반복된다)를 제공할 필요가 있다.
바람직한 용량은 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0,8.5,8.9,9.0,9.5,9.9,10,10.5,10.9,11,11.5,11.9,20,12.5,12.9,13.0,13.5,13.9,14.0,14.5,4.9,5.0,5.5,5.9,6.0,6.5,6.9,7.0,7.5,7.9,8.0,8.5,8.9,9.0,9.5,9.9,10,10.5,10.9,11,11.5,11.9,12,12.5,12.9,13.0,13.5,13.9,14,14.5,15,15.5,15.9,16,16.5,16.9,17,17.5,17.9,18,18.5,18.9,19,19.5,19.9,20,20.5,20.9,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,96,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500, 및/또는 5000 μg/ml 혈청 농도/단일 또는 다회 투여, 또는 임의 범위, 값 또는 그의 분수를 달성하기 위하여, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99 및/또는 100-500 mg/kg/투여, 또는 임의 범위, 값 또는 그의 분수를 임의로 포함할 수 있다.
별법으로, 투여된 용량은 알려진 인자, 예를 들면, 구체적인 시약의 약역학 특성, 및 그의 방식 및 투여 경로; 수용체의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도; 동시 처치의 종류, 처치의 횟수 및 바람직한 효과 등에 의존하여 변할 수 있다. 통상 활성 성분의 용량은 약 0.1 내지 100 밀리그람/체중(kg)일 수 있다. 보통 0.1 내지 50, 및 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그람/투여 또는 서방형(in sustained release form)이 바람직한 결과를 얻는데 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 본 발명의 1종 이상의 항체의 일회 또는 주기적인 투여량, 0.1 내지 100 mg/kg, 예를 들면 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, 또는 40일의 하나 이상에 대해, 또는 별법으로 또는 부가적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51 또는 52 주의 하나 이상에 대해, 또는 별법으로 또는 부가적으로, 1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 또는 20년의 어느 하나에 대해 단일, 융합 또는 반복된 용량을 이용하여 일일당 0.5,0.9,1.0,1.1,1.5,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,45,50,60,70,80,90 또는 100 mg/kg 또는 그의 조합으로서 제공될 수 있다.
내부 투여에 적합한 제형(조성물)은 일반적으로 약 0.1 밀리그람 내지 약 500 밀리그람의 활성 성분/유닛 또는 용기를 포함한다. 이러한 제약 조성물에는 활성 성분이 통상 조성물의 총무게를 기준으로 약 0.5-99.999 중량%의 양으로 존재한다.
비경구 투여의 경우, 항체는 약제학적으로 허용된 비경구 비히클과 함께, 조합하여 또는 별도로 제공되는 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로서 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예로는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 고정유(fixed oil)와 같은 비수성 비히클이 사용될 수도 있다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지시키는 첨가제(예를 들면 염화나트륨, 만니콜) 및 화학안정성을 유지시키는 첨가제 (예를 들면, 완충액 및 보존제)를 포함할 수 있다. 제제는 공지의 또는 적당한 기법에 의해 무균화된다.
적당한 약제학적 담체는 이 분야에서의 표준 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최신판에 기술되어 있다.
대체 투여
많은 공지되고 개발된 방식들이 본 발명에 따른 약제학적으로 유효한 양의 1종 이상의 항-TNF 항체를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 하기 기술에서는 폐 투여가 사용되는 반면, 다른 방식의 투여가 적당한 결과를 갖는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 TNF 항체는 흡입 또는 당업게에서 공지되거나 여기에서 기술된 다른 방식에 의해 투여애 적당한 각종 임의 디바이스 및 방법을 사용하여, 용액, 에멀젼, 콜로이드, 또는 현탁액으로서, 또는 건조 분말로서 담체안에서 이동될 수 있다.
비경구 제형 및 투여
비경구 투여용 제형은 통상적인 부형제 무균수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리알킬렌 글리콜, 채소 기원의 오일, 경화된 나프탈렌 등을 포함할 수 있다. 주사용 수성 또는 오일상 현탁액은 공지된 방법에 따라, 적당한 유화제 또는 가습화제 및 현탁화제를 사용하여 제조될 수 있다. 주사용 시약은 비독성, 비경구 투여용 희석제, 예를 들면 수용액 또는 무균의 주사액 또는 용액 중의 현탁액일 수 있다. 유용한 비히클 또는 용매로서, 링거액, 등장성 식염수 등이 허용된다; 통상의 용매로서 또는 현탁 용매로서, 무균성 비휘발 오일이 사용될 수 있다. 상기 목적을 위하여, 천연 및 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 디- 또는 트리글리세리드 등을 비롯한 임의의 종류의 비휘발 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여가 당업계에 공지되어 있으며, 주사의 종래 수단, 미국 특허 번호 5,851,198에 기술되어 있는 바와 같은, 가스 가압의 니들리스(needleless) 주사 디바이스 및 미국특허 번호 5,839,446에 기술된 바와 같은 레이저 천공지(perforator) 디바이스의 종래 수단을 비롯하나 이에 한정되지는 않으며, 이들은 전체가 참고문헌으로 본원에 삽입된다.
대체 전달
본 발명은 추가로 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복부내, 캡슐내, 모세혈관내, 공동내, 세포내, 뇌내, 뇌강내, 대장내, 쇄골내, 위내, 간내, 근육내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전랍선내, 폐내, 결장내, 신장내, 레티날내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 소포내, 볼루스, 질, 결장, 바칼, 설하, 비내, 또는 경피 수단에 의해 적어도 하나의 항-TNF 항체의 투여에 관한 것이다. 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복부내, 캡슐내, 모세혈관내, 공동내, 세포내, 뇌내, 뇌강내, 대장내, 쇄골내, 위내, 간내, 근육내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 결장내, 신장내, 레티날내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 소포내, 볼루스, 질, 결장, 바칼, 설하, 비내, 또는 경피 수단에 의해 적어도 하나의 항-TNF 항체의 투여에 관한 것이다. 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물은 비경구(피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 다른 투여를 위해 액체 용액 또는 현탁액 형태로; 질 또는 결장 투여를 위해 크림과 좌약을 포함하지만 제한되지는 않는 반고체 형태로; 정제 도는 캡슐제의 형태를 포함하지만 제한되지는 않는 박칼 또는 설하 투여를 위해; 분말, 비내 드롭 또는 에어로졸 또는 특정 제제 형태를 포함하지만 제한되지는 않는 비내로; 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위하여 디메틸설폭사이드와 같은 화학적 증진제(Jnginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90(Marcel Dekker, Inc. New York 1994, 전체를 참고문헌으로 본원에 삽입함), 또는 단백질과 펩타이드를 함유하는 제제를 피부로 적용할 수 있게 하는 산화제(WO 98/53847), 또는 전기천공과 같은 일시적인 수송 경로를 만들거나, 이온토포레시스와 같은 피부를 통한 전하를 띤 약물의 이동성을 증가시키는 전기장의 적용, 또는 소노포레시스와 같은 초음파의 적용(미국특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)를 갖는 패치 전달 시스템과 같은(이들로 제한되지는 않음) 경피로 사용할 수 있도록 제조될 수 있다(상기 간행물 및 특허는 전체가 참고문헌으로 삽입됨).
폐내/비내 투여
폐 투여를 위하여, 바람직하게는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물이 폐 또는 시누스(sinus)에 도달하기에 효과적인 특정 크기로서 전달된다. 본 발명에 따르면, 1종 이상의 항-TNF 항체가 흡입에 의해 치료요법제의 투여를 위해 당업계에 공지된 임의의 각종 흡입 또는 코 디바이스에 의해 전달될 수 있다. 환자의 시누스 공동 내 또는 꽈리 내에 에오로졸화된 제제를 침착시킬 수 있는 이들 디바이스는 계측 용량 흡입기(metered dose inhaler), 분무기(nebulizer), 건조 분말 생성기, 스프레이 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 코 투여에 직접적으로 적용할 수 있는 다른 디바이스가 또한 당업계에서 공지되어 있다. 모든 이러한 디바이스는 에어로졸 내에서 항체의 분산액을 투여하기에 적한한 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액 (수성 및 비수성) 또는 고체 입자로 이루어질 수 있다. Ventolinⓡ 계측 용량 흡입기와 같은 계측 용량 흡입기는 전형적으로 프로펠런트 가스를 사용하며, 들숨 동안 발동작용(actuation)을 필요로 한다(WO 94/16970, WO 98/35888 등을 참조). TurbuhalerTM(Astra), Rotahalereⓡ (Glaxo), Diskusⓡ (Glaxo), SpirosTM흡입기 (Dura), Inhale Therapeutics에서 시판되는 디바이스들, 및 Spinhalerⓡ 분말 흡입기(Fisons) 등의 건식 분말 흡입기들은 혼합 분말의 호흡-발동작용을 이용한다(US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 전부 본원에 참고문헌으로 삽입된다). 계측 용량 흡입기, 건식 분말 흡입기 등은 소입자 에어로졸을 생성하는 반면, AERXTMAradigm 와 같은 흡입기, the Ultraventⓡ 흡입기 (Mallinckrodt), 및 the Acorn IIⓡ 흡입기 (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376, 상기 문헌들은 전부 본원에 참고문헌으로 삽입된다)는 용액으로부터 에어로졸을 생성한다. 상업적으로 구입가능한 흡입 디바이스의 특정 예들은 본 발명의 범위를 한정시키는 것으로 의되지는 않는, 본 발명의 실시예 적합한 특정 디바이스를 나타내는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 1종 이상의 항-TNF-항체를 함유하는 조성물이 건식 분말 흡입기 또는 스프레이에 의해 전달된다. 본 발명의 1종 이상의 항체를 투여하기 위한 흡입 디바이스의 여러 바람직한 특징이 존재한다. 예를 들면, 흡입 디바이스에 의한 전달은 유리하게는 신뢰성이 있고, 재현할 수 있으며, 정확하다. 흡입 디바이스는 경우에 따라 양호한 리스피러비리티(respirability)를 위하여 작은 건식 입자, 예를 들면, 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1-5 μm을 전달할 수 있다.
스프레이로서 TNF 항체 조성물의 투여
TNF 항체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 가압하의 노즐을 통하여 1종 이상의 항-TNF 항체의 현탁액 또는 용액을 관통하게 함으로 제조될 수 있다. 노즐 크기 및 형상, 적용된 압력, 및 액체 공급 속도는 바람직한 생산량 및 입자 크기를 달성하도록 선택될 수 있다. 전기스프레이가 예를 들면 모세관 또는 노즐 공급과 연결하여 전기장에 의해 생산될 수 있다. 유리하게는, 스프레이에 의해 전달된 1종 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1-5 μm의 범위, 및 가장 바람직하게는 약 2-3 μm의 입자를 갖는다.
스프레이로 사용하기에 적합한 1종 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질은 전형적으로 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 1종 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질/용액 ml 또는 mg/gm, 또는 그안의 임의의 범위 또는 값, 예를 들면, . 1, . 2.,. 3,. 4,. 5,. 6,. 7,. 8,. 9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,45,50,60,70,80,90 or 100 mg/ml or mg/gm이나, 이에 한정되는 것은 아닌 농도로 수용액 중의 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제제는 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연 등의 시약을 포함할 수 있다. 제제는 또한 항체 조성물 단백질의 무균화용 부형제 또는 시약, 예를 들면 완충액, 환원제, 벌크 단백질, 또는 카보하이드레이트를 포함할수도 있다. 항체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 포로타민 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질을 제형화하는데 유용한 전형직인 카보하이드레이트는 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질 제제는 또한 에어로졸을 형성하는데 용액의 자동화(atomization)에 의해 유발된 항체 조성물 단백질의 표면-유도 응집을 감소 또는 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 다양한 종래 계면활성제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르가 사용될 수 있다. 사용양은 일반적으로 제제의 0.001 및 14 중량% 사이에 이른다. 본 발명의 목적을 위하여 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. TNF 항체, 또는 특정 부위 또는 변이체 등의 단백질의 제제를 위한 당업계에 공지된 부가적인 시약이 제제 중에 포함될 수도 있다.
흡입기에 의한 TNF 항체 조성물의 투여
항체 조성물 단백질이 젯트 흡입기 또는 초음파 흡입기와 같은 흡입기에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 젯트 흡입기에서는 압축된 공기 공급원이 사용되어 오리피스를 통하여 고속 공기 젯트를 만든다. 기체가 노즐을 넘어서 팽창함에 따라, 저압 영역이 생성되며, 액체 보존기에 연결된 모세관 튜브를 통하여 항체 조성물 단백질의 용액을 인출한다. 모세관 튜브로부터의 액체 스트림은 불안정한 필라멘트 내로 전단(shear)되고 튜브를 빠져나오면서 점적화되어 에어로졸을 형성한다. 형상, 유속, 및 격벽(baffle) 종류의 범위가 주어진 젯트 흡입기로부터의 바람직한 성능 특성을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 초음파 흡입기의 경우, 높은 진동수의 전기 에너지가 사용되어 전형적으로, 압전기 변환기를 사용하는 진동, 기계 에너지를 만들어낸다. 이 에너지는, 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 만드는, 커플링 유체를 통하여 또는 직접 항체 조성물 단백질의 제제로 전달된다. 유리하게는, 흡입기에 의해 전달된 항체 조성물 단백질의 입지는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm의 범위에 이르는 입도를 갖는다.
젯트 또는 초음파 흡입기로서 사용하기에 적합한 1종 이상의 항-TNF 항체의 제제는 전형적으로 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 1종 이상 항-TNF 항체 단백질/용액(ml)의 농도를 포함한다. 제제는 부형제, 완충액, 등장성 시약, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연 등의 시약을 포함할 수 있다. 제제는 또한 완충액, 환원제, 벌크 단백질 또는 카보하이드레이트 등의 1종 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 무균화를 위한 부형제 또는 시약을 포함할 수 있다. 1종 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 1종 이상의 항-TNF 항체를 제제화하는데 유용한 전형적인 카보하이드레이트는 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 1종 이상의 항-TNF 항체 제제는 또한 에어로졸을 형성하는데 용액의 자동화(atomization)에 의해 유발된 항체 조성물 단백질의 표면-유도 응집을 감소 또는 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 다양한 종래 계면활성제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르가 사용될 수 있다. 사용양은 일반적으로 제제의 0.001 및 14 중량% 사이에 이를 것이다. 본 발명의 목적을 위하여 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 항체 단백질 등의 단백질의 제제를 위하여 당업계에 공지된 부가적인 시약이 제제 중에 포함될 수도 있다.
계측 용량 흡입기에 의한 TNF 항체 조성물의 투여
계측 용량 흡입기 (MDI)에서, 프로펠런트, 하나 이상의 항-TNF 항체, 및 임의의 부형제 또는 기타 첨가제가 액체화된 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 통(canister)에 함유된다. 측정 밸브의 발동작용은 바람직하게는 크기가 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm의 입자를 함유하는, 에오로졸로서 혼합물을 방출한다. 바람직한 에어로졸 입도는 젯트-밀링, 스프레이 건조, 임계점 응축(critical point condensation) 등의 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 생산된 항체 조성물 단백질 제제를 사용함으로써 얻어질 수 있다. 바람직한 측정 용량 흡입기는 3M or Glaxo에서 제조하고 하이드로플루오로카본 프로펠런트를 사용하는 것을 포함한다.
계측 용량 흡입기 디바이스와 함께 사용하기 위한 1종 이상의 항-TNF 항체의 제제는 일반적으로 비수성 매질 중의 현탁액으로서, 예를 들면 계면활성제의 도움으로 프로펠런트에 현탁된 1종 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 미분화된 분말을 포함할 것이다. 프로펠런트는 이 목적을 위하여 사용된 임의의 종래 물질, 예를 들면 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a (하이드로플루오로알칸-134a), HFA-227 (하이드로플루오로알칸-227) 등 일 수 있다. 바람직하게는, 프로펠런트는 하이드로플루오로카본이다. 게면활성제는 화학적 분해 등에 대항하여 활성제를 보호하기 위하여, 프로펠런트 중의 현탁액으로서 1종 이상의 항-TNF 항체를 안정화시키기 위해 선택될 수 있다. 적당한 계면활성제는 트리올레이트, 소야 레시틴, 올레산 등을 포함한다. 일부 경우에 용액 에어로졸이 에탄올 등의 용매를 사용하여 바람직하다. 단백질 등의 단백질의 제제를 위하여 당업계에 공지된 부가적인 시약이 또한 제제 중에 포함될 수도 있다.
당업자는 본 발명의 방법이 본원에서 기술하지 않은 디바이스를 통하여 1종 이상의 항-TNF 항체의 폐 투여에 의해 달성될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
경구 제제 및 투여
경구용 제제는 장 벽의 침투성을 인위적으로 증가시키기 위하여 보강제(예를 들면, 레조시놀 및 비이온계 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 공동투여, 및 효소적 분해를 억제하기 위하여 효소 억제제 (예를 들면 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실올)의 공동투여에 의존한다. 경구 투여용의 고체 타입 제형의 활성 성분화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노즈, 말티놀, 엑스트란, 스타치, 한천, 아기네이트, 키틴스, 키토산, 펙틴, 검 트라가칸쓰, 검 아라빅, 겔라탄, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세라이드를 비롯한 1종 이상의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 제형은 또한 다른 타입의 첨가제, 예를 들면 불활성 희석제, 마그네슘 스테아레이트, 파라벤 등의 윤활제, 소르브산, 아스토르브산, 알파-토코페롤 등의 보존제, 시스테인 등의 항산화제, 붕해제, 결합제, 농후제, 완충화제, 감미제, 향료제, 방향제 등을 포함할 수도 있다.
정제 및 필(pill)은 장용피 제제로서 추가로 진행될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 의약 용도로 허용가능한 에멀젼, 시럽, 엘리시르, 현탁약 및 용액 제제를 포함한다. 이들 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대, 물을 포함할 수 있다. 리포좀은 또한 인슐린 및 헤파린용 액 전달 시스템으로서 기술되어진다(U. S. Pat. No. 4,239,754). 좀더 최근에, 혼합 아미노산의 인공적인 중합체의 미세구가 의약물을 전달하기 위해 사용되었다(U. S. Pat. No. 4,925,673). 추가로, U. S. Pat. No. 5,879,681 및 U. S. Pat. No. 5,5,871,753 에 기술된 담체 화합물이 당업계에서 공지된 생물학적으로 활성인 시약을 경구적으로 전달하는데 사용된다.
점막용 제제 및 투여
점막 표면을 통한 흡착의 경우, 1종 이상의 항-TNF 항체를 투여하는 방법 및 조성물은 다수의 서브마이크론 입자, 점막접착성(mucoadhesive) 거대분자, 생체활성 펩타이드, 및 에멀젼 입자의 점막접착성을 달성함으로써 점막 표면을 통하여 흡착을 촉진하는, 수성 연속 상을 포함하는 에멀젼을 포함한다(U. S. Pat. Nos. 5,514,670). 본 발명의 에멀젼의 적용에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 입안, 설하, 코내, 질내, 폐, 위, 장내, 및 항문 투여 경로를 포함한다. 좌약 등의 질내 또는 항문 투여용 제제는 부형제로서, 예를 들면 폴리알킬렌글리콜, 바세린, 코코아 버터 등을 포함할 수 있다. 코내 투여용 제제는 고체일 수 있으며, 부형제로서 예를 들면 락토스를 포함할 수 있거나, 또는 코 점적의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 볼내 투여의 경우, 부형제는 슈거, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미리겔화된 전분 등을 포함한다 (U. S. Pat. Nos. 5,849,695).
경피 제제 및 투여
경피 투여의 경우, 1종 이상의 항-TNF 항체는 리포좀 또는 중합체 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 미세구(달리 언급되지 않는한 마이크로입자로서 통칭됨) 등의 전달 디바이스 내에서 갭슐화된다. 폴리하이드록시 산, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 그의 공중합체, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 및 폴리포스파젠 등의 합성 중합체, 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 등의 천연 중압체 및 다른 단백질, 알기네이트 및 기타 폴리사카라이드, 및 그의 조합으로 제조된 마이크로입자를 비록하여 많은 적당한 디바이스가 알려져 있다 (U. S. Pat. Nos. 5,814,599).
지속 투여 및 제제
때때로 장기간 동안, 예를 들면 단일 투여의 경우 1주 내지 1년 동안 대상에게 본 발명의 화합물을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방, 저장 또는 임플란트 제형이 이용될 수 있다. 예를 들면, 제형은 체액에서 낮은 정도의 용해도를 갖는 화합물의 약제학적으로 허용되는 비독성 염, 예를 들면 (a) 포스포릭산, 술푸릭산, 시트릭산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-설폰산, 폴리갈락투론산 등의 폴리염기산과의 산부가염; (b) 아연, 칼슘, 비스무쓰, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등의 다가 금속 양이온과의 염, 또는 예컨대, N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합, 예컨대, 아연 탄타네이트 염을 포함할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 직전에 기술한 것과 같은 비교적 불용성 염이 겔, 예를 들면 주사에 적합한 세사메 오일(sesame oil) 을 사용한 알루미늄 모노스테아레이트 겔로 제제화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 주사용의 또다른 타입의 서방 저장 제제는 서서히 분해되는 비독성 비항원 중합체, 예컨대, U. S. Pat. No. 3,773,919 등에서 기술된 바와 같은 폴리락트산/플리클리콜산 내에서 캡슐화되기 위해 분산된 화합물 또는 염을 포함할 것이다. 화합물 또는 바람직하게는 상기에서 기술된 것 등의 비교적 불용성 염이 특히 동물에서 사용하기 위해, 또한 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛으로 제제화될 수 있다. 부가적인 서방, 저장 또는 임플란트 제제, 예컨대 기체 또는 액체 리포좀이 문헌 (U. S. Pat. Nos. 5,770,222 및 "Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N. Y., 1978)에서 공지되어 있다. .
본 발명에서 일반적으로 기술한 바로부터 동일물은 하기 실시예를 참고로 더 쉽게 이해될 것이며, 본 실시예는 예시의 목적으로 제공된 것이고 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 포유 세포에서 TNF 항체의 클로닝 및 발현
전형적인 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사 종결과 전사체의 폴리아세틸화를 위해 요구되는 신호를 함유한다. 부가적인 요소는 인핸서, 코작 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여체 및 수용체 위치로 연결되는 중간 서열을 포함한다. 고 효율 전사는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 말단 반복 서열(LTRs), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 프로모터로 달성될 수 있다. 그러나, 세포성 인자 또한 사용될 수 있다(예: 인간 액틴 프로모터). 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 발현 벡터는 예를 들어, pIRES1 neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX(Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1(+/-), pcDNA/Zeo(+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen), PSVL 및 PMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 인간 HeLa 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 세포 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7, 퀘일 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.
다르게는, 유전자는 염색체로 도입된 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 하이그로마이신과 같은 선별 마커로의 공동-형질감염은 형질감염된 세포의 확인 및 분리를 가능하게 한다.
형질감염된 유전자는 또한 대량의 코딩된 항체를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 관심 있는 유전자의 수백 또는 수천 카피를 전달하는 세포주를 발생시키는데 유용하다. 다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 합성효소(GS)(Murphy 등, Biochem J. 227: 277-279(1991); Bebbington 등, Bio/Technology 10: 169-175(1992))이다. 이들 마커를 사용하여, 포유 세포를 선별 배지에서 증식시키고 최고의 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이들 세포주는 염색체로 도입된 증폭 유전자(들)을 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포는 자주 항체 생산에 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 사르코마 바이러스의 강력한 프로모터(LTR)(Cullen 등, Molec. Cell. Biol. 5: 438-447(1985))와 CMV-인핸서(Boshart 등, Cell 41: 521-530(1985)의 단편을 함유한다. 예를 들어 제한효소 절단 위치 BamHⅠ, XbaⅠ 및 Asp718을 갖는, 다중 클로닝 위치는 관심 있는 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터들은 부가적으로, 랫트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.
CHO 세포에서의 클로닝 및 발현
벡터 pC4를 TNF 항체의 발현을 위해 사용하였다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC Accession No. 37146)의 유도체이다. 상기 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절되는 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드에 감염되어 디히드로폴레이트 활성을 상실한 중국 햄스터 난소 또는 다른 세포는 선택적 배지에서 화학치료제인 메토트렉세이트(MTX)를 첨가하여 세포를 생육하여 선택할 수 있다(예, 알파 마이너스 MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD). 메토트렉세이트(MTX)에 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 문헌에 잘 나타나있다(참조, 예, F. W. Alt, 등, J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978) ; J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); 및 M. J. Page 및 M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). 목적 효소, DHFR 유전자의 증폭의 결과로서, DHFR를 과생산함에 의해 약물에 내성을 만든 MTX 농도의 증가에서 세포를 길렀다. 만일 2차 유전자가 DHFR 유전자에 결합하면, 일반적으로 공동 발현 및 과발현된다. 증식된 유전자의 1,000 복제 이상을 전달하는 세포주의 개발을 위한 이같은 연구는 공지이다. 계속하여, 메토트렉세이트를 철회하면 세포주는 숙주세포의 하나 이상의 크로모좀내로 결합된 증폭된 유전자를 포함하여 얻어진다.
플라스미드 pC4 contains for expressing the 유전자 of interest the 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR)의 강력한 목적하는 프로모터를 발한하는 유전자 (Cullen 등, Molec. 세포. Biol. 5: 438-447 (1985)) 더하기 인간 사이토메칼로바이러스 (CMV)의 인접 초기 유전자의 인헨서로부터의 단리된 단편(Boshart,등, 세포 41: 521-530 (1985))을 포함한다. 프로모터의 하류는 유전자의 결합을 위한 BamHI, Xbal, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위이다. 상기 클로닝 부위의 뒤에는 플라스미드는 3' 인트론 및 래트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 다른 고 효율 프로모터가 발현에 사용하기 위해 또한 사용될 수 있다. 예, 인간 β-악틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복, 예, HIV 및 HTLVI Clontech's Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 포유동물 세포에서 조절된 방법으로 TNF를 발현하기 위해 사용될 수 있다(M. Gossen, 및 H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). mRNA 다른 신호의 폴리아데닐화를 위해, 예컨대, 인간 성장 호르몬으로부터 다른 시그날 또는 글로빈 유전자가 사용될 수 있다. 크로모좀내로 도입된 목적 유전자를 전달하는 안정한 세포주는 선별할 수 있는 마커, 예컨대, gpt, G418 또는 히그로마이신를 사용하여 공동형질감염하여 선별할 수 있다. 시작에서 하나이상의 선별 마커, 예, G418 플러스 메토트렉세이트를 사용하는 것이 바람직하다.
플라스미드 pC4를 제한 효소로 분해하고, 그후 송아지 내장 포스파테이즈를 사용하여 공지의 방법으로 탈인산화한다. 벡터를 그후 1% 아가로즈 겔로부터 단리한다.
완전한 TNF 항체를 암호화하는 DNA 서열을 사용하고, 예컨대, 공지의 단계에 따라, 본 발명의 TNF 항체의 HC 및 LC 가변 부분에 상응하는 서열 번호: INSERT MAB AA SEQ ID 1, 및 INSERT MAB AA SEQ ID N02로 나타낸다. 안정한 인간 고정 부분 (즉, HC 및 LC 부분)을 암호화하는 단리된 핵산도 또한 본 작제물에서 사용된다(예, 벡터 p 1351에서 제공되는 것처럼 : INSERT ATCC ACCESSION NμMBER AND ADDITIONAL HC/LC plasmds)
상기 단리된 가변 및 고정 부분을 암호화하는 DNA 및 탈인산화된 벡터를 그후 T4 DNA 리게이즈로 연결한다. E. coli HB 101 또는 XL-1 Blue 세포를 형질전환하고, 예컨대, 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4가 삽입된 단판을 포함하는 세균을 동정하였다.
DHFR 유전자가 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 형질감염에 사용한다. 5 g의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 g의 플라스미드 pSV2-네오에 리포펙틴을 사용하여 공동형질감염하였다. 플라스미드 pSV2네오는 주된 선택 마터, G418를 포함하는 항생체 그룹에 내성을 부혀하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 네오 유전자를 포함한다. 세포는 1 g/ml G418가 첨가된 알파 마이너스 MEM에서 배양하였다. 2일후, 세포를 트립신화하고, 10, 25 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 플러스 1 g/ml G418를 첨가한 알파 마이너스 MEM에서 하이브리도마 클로닝 플레이트에서 배양하였다(Greiner,Germany). 약 10-14일 후에, 단일 클론을 트립신화하고, 다른 농도의 메토트렉세이트 (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용한 6-웰 페트리 디쉬 또는 10 ml 플레이트에서 배양하였다. 메토트렉세이트의 높은 농도에서 자란 클론을 그후 더 높은 농도의 메토트렉세이트(1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 포함하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮겼다. 같은 방법을 100-200 mM에서 자란 클론이 얻어질 때까지 반복하였다. 목적하는 유전자 생성물의 발현을 예컨대, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석법에 의해 분석하였다.
실시예 2: 형질전환 마우스를 사용한 인간 TNF에 반응하는 고 친화성 인간 IgG 모노클론성 항체의 생성
요약
1종 이상 TNF-매개된 질병의 치료를 위한 TNF의 작용의 저해를 위해 치료적으로 사용할 수 있는 고 친화성, 완전한 인간, 모노클론성 항체를 생성하기 위 해 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로블린 유전자를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 중쇄 및 경쇄에 대한 인간 가변 및 고정 부분 항체 트랜스유전자를 포함하는 (CBA/J x C57/BL6/J) F2하이브리드 마우스를 인간 재조합 TNF 로 면역화하였다(Taylor 등, Intl. Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg, 등, Nature 368: 856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14: 826 (1996); Fishwild, 등, Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)). 수개의 융합은 완전한 인간 TNF 반응성 IgG 모노클론성 항체의 하나 이상의 패널을 생성한다. 완전한 인간 항-IL12 항체는 더욱 특징지워진다. 모두 IgGI이다. 상기 항체가 1 x 109및 9 x 1012사이의 친화성 상수를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 완전한 인간 모노클론성 항체의 기대치 않은 고 친화성은 TNF 관련된 질병, 병리 또는 질환에 치료적 적용을 위한 적합한 후보로 만든다.
약어
BSA - 소 혈청 알부민
CO2- 이산화탄소
DMSO - 디메틸 설폭사이드
EIA - 효소 면역어세이
FBS - 소태아 혈청
H202- 과산화수소
HRP - 홍당무과산화효소(horseadish peroxidase)
ID - 피내
Ig - 면역글로블린
TNF - 인터루킨-12
IP - 복강내
IV - 정맥내
Mab - 모노클론성 항체
OD - 광학 정도
OPD - o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드
PEG - 폴리에틸렌 글리콜
PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신
RT - 상온
SQ - 피하
v/v - 부피 대 부피
w/v - 부피 대 무게
물질 및 방법
동물
인간 항체를 발현할 수 있는 형질전환 마우스는 공지이며(상업적으로 구입가능 (예, from GenPharm International, San Jose, CA ; Abgenix, Freemont, CA, 및 others), 마우스 IgM 또는 Ig가 아닌 인간 면역글로블린을 발현한다. 예컨대, 인간 서열 트랜스유전자를 포함하는 상기 형질전환 마우스는 V(D)J 결합, 중쇄 클래스 전환 및 인간 서열 면역글로블린의 레파토리를 생성하기 위한 체돌연변이를 수행한다(Lonberg, 등, Nature 368: 856-859 (1994)). 상기 경쇄 트랜스유전자는 예컨대, 인간 V 부분의 유전자주의 거의 절반을 포함하는 이스트 인공 크로모좀에서부터의 일부에서 유도될 수 있다. 추가로, 중쇄 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 I 양자(Fishwild, 등, Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)) 및/또는 3 고정 부분을 암호화할 수 있다. 적합한 유전자자극성 혈통에서 유래된 마우스가 TNF 면역화에 대한 완전한 인간 모노클론성 항체를 생성하기 위한 면역화 및 융합 방법에 사용될 수 있다.
면역화
하나 이상 면역화 스케쥴을 항-TNF 인간 하이브리도마을 생성하기 위해 사용할 수 있다. 제1 다수 융합은 하기 예시적 면역화 프로토콜에 따라 수행할 수 있고, 다른 유사한 프로토콜을 사용할 수 있다. 다수의 14-20주 기른 암컷 및/또는 수술로 거세한 형질전환 수컷 마우스를 100-400μL(예, 200)의 최종 부피에서 TITERMAX의 같은 부피 또는 완전한 Freund 보조제를 사용하여 증폭된 1-1000μg의 재조합 인간 TNF를 사용하여 IP 및/또는 ID로 면역화한다. 각각의 마우스를 각각의 2 SQ 사이트에서 100μL의 생리적 식염수를 임의로 또한 받을 수 있다. 마우스는 그후 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 및/또는 21-34일 후에 같은 부피의 TITERMAX 또는 불완전한 Freund 보조제를 사용하여 에멀젼화한 TNF를 사용하여 IP (1-400 Hg) 및 SQ (1- 400 μg x 2)로 면역화할 수 있다. 마우스는 항-응고제 없이 레트로-오비탈 천공에 의해 12-Z5 및 25-40일 후에 채혈할 수 있다. 상기 혈액을 그후 RT에서 1시간동안 덩어리로 한후, 혈청을 수집하고, 공지의 방법에 따른 TNF EIA 에세이를 사용하여 적정하였다. 반복된 주사가 적정을 증가하지 않을 때 융합을 수행하였다. 그 때, 마우스는 100 μL의 생리식염수에 희석한 1-400μg의 TNF의 최종 IV 부스터(booster) 주사를 주입할 수 있다. 3일 후, 마우스는 경부 탈골로 죽이고, 비장을 무균적으로 제거하고, 100U/mL 페니실린, 100 pLg/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 ugimL 암포테리신 B (PSA)을 포함하는 10 mL의 찬 인산 버퍼화 식염수(PBS)에 넣었다. 비장세포는 PSA-PBS로 비장을 관류하여 멸균적으로 배양한다. 세포를 찬 PSA-PBS로 세척하고, 트리판 블루 염색 배제(Trypan blue dye exclusion)를 사용하여 계수하고, 25 mM Hepes를 포함하는 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다.
세포 융합
융합은 공지의 방법, 예컨대, 공지기술의 방법에 따라 쥐 골수종 세포 대 생육할 수 있는 비장 세포의 1: 1 내지 1: 10의 비율에서 수행할 수 있다. 비제한적인 예로서, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화할 수 있다. 상기 펠렛은 그후 PEG/PBS 용액 (PEG 분자량 1.450, Sigma)에서 30초간 37℃에서 천천히 재현탁할 수 있다. 상기 융합은 그후 25 mM Hepes (37℃)를 포함하는 10.5 mL의 RPMI 1640 배지를 1분간 천천히 첨가하여 멈출 수 있다. 상기 융합된 세포는 500-1500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 세포를 HAT 배지 (25 mM Hepes, 10% Fetal Clone I 혈청 (Hyclone), 1 mM 소듐 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 10 μg/mL 겐타마이신, 2.5% Origen 배양 보충제(Fisher), 10% 653-컨디션화된 RPMI 1640/Hepes 배지, 50 μM 2-머캅토에탄올, 100 μM 히포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI 1640 배지)에서 재현탁하고, 15개의 96-웰 평판 조직 배양 플레이트에서 200 gL/웰로 도말하였다. 상기 플레이트를 다시 5% CO2및 95% 공기를 포함하는 습윤화한 37℃의 배양기에서 7-10 일간 두었다.
마우스 혈청에서 인간 IgG 항-TNF 항체의 탐지
고상 EIA를 인간 TNF에 특이적 인간 IgG 항체에 대한 마우스의 혈청을 스크린하기 위해 사용할 수 있다. 간단하게 플레이트를 PBS에서 2 μg/mL의 TNF로 밤새 도말할 수 있다. 0.02% (v/v) Tween 20를 포함하는 0.15M 식염수로 세척한 후, 상기 웰을 RT에서 1시간동안 200μL/웰 PBS중의 1% (w/v) BSA로 차단할 수 있다. 플레이트를 미래의 사용을 위해 즉시 또는 -20℃에서 얼려서 사용하였다. 마우스 혈청 희석물을 RT에서 1시간동안 50 μL/웰로 TNF로 코팅된 플레이트상에 배양하였다. 상기 플레이트를 세척하고, 그후, 50 μL/웰의 HRP-표지된 고우트 항-인간 IgG, 1% BSA-PBS에서 1 : 30,000로 특이적 희석된 Fc로 RT에서 1시간동안 프로브하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 100 μL/웰의 시트레이트-인산 기질 용액 (0.1M 시트르산 및 0.2M 소듐 포스페이트, 0.01% H2O2, 및 I mg/mL OPD)를 RT에서 15분간 첨가하였다. 스톱 용액 (4N 황산)을 그후 25 pL/웰에 첨가하고, OD를 자동화 플레이트 스펙트로포토미터를 통해 490 nm에서 판독하였다.
하이브리도마 상청액(Supernates)에서 완전한 인간 면역글로블린의 검색
완전한 인간 면역글로블린을 분비하는 성장 양성 하이브리도마를 적절한 EIA를 사용하여 검색할 수 있다. 간단하게는 탄산 나트륨 버퍼중의 밤새 4℃에서 96 웰 팝-아웃(pop-out) 플레이트 (VWR, 610744) 를 10 μg/mL 고우트 항-인간 IgG를 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS로 1시간동안 37℃에서 차단하고, 즉시 -20℃로 냉동하여 사용하였다. 비희석된 하이브리도마 상청액을 37℃에서 1시간동안 플레이트상에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS로 1: 10,000로 희석된 HRP 표지된 고우트 항-인간 카파를 37℃에서 1시간동안 프로브하였다. 상기 플레이트를 그후 상기한 기질 용액에 배양하였다.
완전한 인간 항-TNF 활성의 측정
상기한 하이브리도마를 적합한 RIA 또는 다른 어세이를 사용하여 TNF에 반응성을 동시에 어세이할 수 있다. 예컨대, 상청액을 상기한 고우트 항-인간 IgG Fc 플레이트상에서 배양하고, 세척하고, 그후 RT에서 1시간동안 웰당 적합한 계수로 방사성 표지된 TNF를 프로브하였다. 하이브리도마를 분비하는 인간 IgGI 항-TNF를 세포 배양액에 펼치고, 제한된 희석으로 계열적으로 서브클론하였다. 생성된 클론성 집단을 펼치고, 냉동배지 (95% FBS, 5% DMSO)에 크리오보존한후, 질소액체중에 보관하였다.
이소타입핑
항체의 이소타입 결정은 특이적 정량을 위한 마우스 면역 혈청을 검색하는데 사용된 것과 유사한 형식으로 EIA를 사용하여 수행할 수 있다. TN를 상기와 같이 96-웰 플레이트에 도말하고, 항체를 정제하고, 2 Ag/mL에서 RT에서 1시간동안 플레이트상에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS로 1 : 4000로 희석된 HRP 표지된 고우트 항-인간 IgG, 또는 HRP 표지된 고우트 항-인간 IgG3 로 1시간동안 RT에서 프로브하였다. 상기 플레이트를 다시 세척하고, 상기한 기질 용액에서 배양하였다.
인간 TNF와 인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동력학
항체에 대한 결합 특성을 TNF 캡쳐 EIA 및 예컨대, BIAcore 기술을 사용하여적절하게 평가할 수 있다. 정제된 인간 TNF 항체의 농도 구배는 상기한 에서이에서 TNF의 2 μg/mL로 코팅된 EIA 플레이트에 결합을 평가할 수 있다. OD로 상대적 결합 효과를 나타내기 위해 세미-로그 플롯을 나타낼 수 있다.
정량적 결합 상수를 예컨대, 하기 또는 공지의 방법으로 얻을 수 있다. BIAcore CM-5 (carboxymethyl) 칩을 BIAcore 2000 유니트상에 둔다. HBS 버퍼 (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 계면활성제, pH 7.4)를 안정한 기준성이 얻어질 때 까지 칩의 세포에 5 μL/분으로 흘렸다. 200 μL의 물중의 15 mg의 EDC(N-에틸-N'-(3-디메틸-아미노프로필)-카보디이미드 염산)의 용액 (100 gel)을 200 L 물중의 2.3 mg의 NHS (N-히드록시석신이미드) 용액 100 μL에 첨가하였다. 40 L의 생성 용액을 칩상에 주사하였다. 6 μL의 인간 TNF (15 μg/mL in 10 mM sodiμM acetate, pH 4.8)용액을 칩상에 주사하였고, 특히 500 RU 의 증가를 나타내었다. 버퍼를 버퍼 (20 mM 트리스, 0.15 M 소듐 클로라이드, 2 mM 칼슘 클로라이드, 2 mM 마그네슘 아세테이트, 0.5% Triton X-100,25 μg/mL BSA, pH 7.4)를 러닝하여 TBS/Ca/Mg/BSA로 바꾸고, 반응하지 않은 숙신이미드 에스테르를 가수분해 및 안정화하기 위해 밤새 칩상에 흘렸다.
항체를 33.33, 16.67, 8.33, 및 4.17 nM의 러닝버버에 용해하였다. 유속을 30 pL/min으로 조정하고, 기구 온도를 25℃로 하였다. 하나는 TNF를 고정화하고(샘플) 및 2번째의 비유도성 플로우 세포 (블랭크), 2개의 플로우 세포를 동력학 실험을 위해 사용하였다. 120μL의 각각의 항체 농도를 30 pL/분 (결합 상)로 흐름 세포에 주사한 후, 비저지된 360초의 버퍼 흐름(분해 상)으로 주사하였다. 칩상의 표면은 30 gL 각각의 2 M 구아니딘 티오시아네이트의 2개의 연적속인 주사에 의해 생성하였다(interleukin-12/분리된 항체 복합물).
데이타의 분석은 공지의 BIA 평가 3.0 또는 CLAMP 2.0을 사용하여 수행하였다. 각각의 항체 농도에 대해, 블랭크 센소그램(sensogram)을 샘플 센소그램으로 부터 공제하였다. 글로발 피트를 양 분리(kdsec-1) 및 결합(ka, mol-1sec-1) 및 분리상수 (Kp, mol) 계산 값 (kd/ka)에 대해 수행하였다. 항체 친화성이 항체 부착의 RU가 100 이상으로 충분히 높으면, 항체의 추가적 희석을 수행하였다.
결과 및 토론
항-인간 TNF 모노클론성 항체의 생성
다수의 융합이 수행되고, 각각의 융합을 15 플레이트 (1440 웰s/융합)에서 배양하여 인간 TNF에 특이적인 수십개의 항체를 생성하였다. 물론, 일부는 인간 및 마우스 Ig 쇄의 결합으로 구성된 것을 발견할 수 있었다. 생성된 하이브리도마는 인간 중쇄 및 경쇄로 구성된 항-TNF 항체를 분비한다. 인간 하이브리도마 모두는 IgGI가 될 것으로 기대한다.
인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학
ELISA 분석은 농도에 의존하는 방법으로 TNF에 결합하는 상기 일부 또는 모든 하이브리도마로부터 정제된 항체를 확인 할 수 있다. 도 1-2는 상기 항체의 상대적 결합 효율의 결과를 나타내다. 이 경우에, 그의 코그네이트(cognate) 항원 (에피토프)에 대한 항체의 결합성을 특정하였다. EIA 플레이트에 직접 결합된 TNF는 단백질의 변성을 일으켜서, 명백한 결합 친화성은 비변성된 단백질의 결합을 반영할 수 없다. 50% 결합을 농도의 범위에서 관찰하였다.
정량 결합 상수를 인간 항체의 BIAcore 분석을 사용하여 얻었고, 다수의 인간 모노클론성 항체는 lx10-9내지 7x10-12범위의 매우 높은 KD를 나타내었다.
결론
다수의 융합은 인간 IL가 면역화된 인간 가변 및 고정 부분 항체 트랜스유전자를 포함하는 하이브리드 마우스 로 부터 비자세포(splenocyte)를 사용하여 수행하였다. IgG1 이소타입을 생성하였다. 완전한 인간 항-TNF 항체를 더욱 특징화하였다. 다수의 생성된 항체는 lx109및 9lx1012사이의 친화성 상수를 나타내었다. 기대하지 않는 상기 완전 인간 모노클론성 항체의 고 부착성은 TNF-의존하는 질병, 병리 또는 관련 질환의 치료의 적용에 이들을 적합하게 한다.
실시예 2: 인간 TNF∀에 반응성인 인간 IgG 단클론 항체의 생성
요약
중쇄 및 경쇄용 인간의 가변성 및 일정한 영역 항체 트랜스젠(transgene)을 함유하는 (CBA/J x C57BL/6J) F2하이브리드 마우스(mice)(1-4)를 재조합 인간 TNF∀로 접종하였다. GenTNV로 명명된 한 융합물(fusion)은 접종된 재조합 인간 TNFα에 결합하는 8개의 전체 인간 IgGIK단클론 항체를 제공하였다. 동정직후, 8개의 세포주를 추가의 특성화를 위하여 분자 바이오로지(Molecular Biology)로 옮겼다. 이러한 맵(Mab)이 서열면에서 완전 인간이기 대문에, 이들은 인간에서의 cA2 (Remicade) 보다 덜 면역원성인 것으로 기대된다.
약어
BSA-소 혈청 알부민
CO2-이산화탄소
DMSO-디메틸 설폭사이드
EIA-효소 면역측정
FBS-소태아 혈청
H2O2-과산화수소
HC-중쇄
HRP-홍당무과산화효소(horseradish peroxidase)
Ig-면역글로부린
IP-복강내(intraperitoneal)
IV-정맥내(intravenous)
Mab-단클론 항체
OD-광학 밀도
OPD-o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드
PEG-폴리에틸렌 글리콜
PSA-페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신
RT-실온
SQ-피하
TNF∀-종양 괴사 인자 알파
v/v-부피/부피
w/v-중량/부피
도입
이간 중쇄 및 경쇄 면역글로부린 유전자(gene)를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 재조합 인간 TNF∀에 특이적인 완전 인간 단클론 항체를 생성하였다. cA2(Remicade)가 TNF∀-매개 질환에 관련된 염증 과정을 치료요법적으로 억제하는데 사용됨에 따라, 이러한 단일 항체를 사용할 수 있다고 기대되며, 혈청 반감기기 증가되는 잇점을 갖고 면역원성에 관한 부작용을 줄이는 잇점을 갖는다.
물질 및 방법
동물
마우스 IgM 또는 Igk가 아닌, 인간 면역글로부린을 발현하는 트랜스제닉 마우스가 GenPharm International에 의해 개발되었다. 이런 마우스는 항원-특이적면역글로부린(1)의 레퍼토리(repertoire)를 생성하기 위해V(D)J조이닝, 중쇄 부루 스위칭 및 개체 돌연변이를 진행하는 기능성 인간 항체 트랜스젠을 포함한다. 경쇄 트랜스젠은 부분적으로 겜라인(germline) 인간 Vk 유전자자리(locus)의 거의 반을 포함하는 이스트 인공 크로모좀 클론에서 유래된다. 여러가지 VH 유전자 이외에, 중쇄(HC) 트랜스젠은 인간 μ 및 인간 γ1(2) 및/또는 γ3 일정 영역을 코딩한다. HCol2/KCo5 게노타입 리니지(genotypic lineage)로부터 유래된 마우스는 면역 및 융합 과정에서 사용되어 여기에서 기술된 단클론 항체를 생성한다.
인간 TNF∀의 정제
인간 TNF∀는 Sepharose 4B (Pharmacia)에 커플링된 TNF∀ 수용체-Fc 융합 단백질 (p55-sf2) (5)로 팩킹된 컬럼을 사용한 친화 크로마토그래피에 의해 C237A로부터 조직 배양 상청액으로부터 정제하였다. 세포 상청액을 lOx Dulbecco's PBS (D-PBS)의 부피 1/9와 혼합하고, 4 ℃에서 4 ml/분으로 컬럼을 통하여 통과시켰다. 컬럼을 PBS로 세척하고, TNF∀를 pH 3.5의 0.1 M 소듐 시트레이트로 유출시키고, 2M Tris-HCl pH 8.5로 중성화시켰다. 정제된 TNF∀는 10 mM Tris 염화나트륨 pH 7.5 내로 완충 교환시키고, 0.2 μm 실린지 필터를 통하여 여과시켰다.
면역화
약 16주된 암컷 GenPharm 마우스를 동일 부피의 Titermax 보조제를 사용하여 유화시킨 TNF∀ (lot JG102298 또는 JG102098) 총 100 μg으로 0, 12 및 28일에 IP(200 μL) 및 ID (100 μL at the base of the tail) 접종시켰다. 이 마우스는 항-혈액응고제없이 레트로-오비탈 천공(puncture)에 의해 21일 및 35일에 출혈시켰다. 혈액은 실온에서 1시간 동안 응고되도록 하고, 혈청을 수거하여 TNF∀ 고체상 EIA 분석법을 사용하여 역가(titer)하였다. 마우스를 7주동안 쉬게 한 후 28일에 주사한 후 GenTNV으로 명칭된 융합을 수행하였다. TNF∀ 에 대항하여 1:160의 특이적 인간 IgG 틸터와 함께 마우스는 그 후 100 μL 생리학적 식염수에 희석시킨 50 μg의 최종 IV 부스터(booster) 주사를 제공받았다. 3일 후에, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시키고, 비장을 무균처리하여 떼어내고, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B (PSA)를 함유하는 10 mL의 냉 포스페이트-완충액 식염수(PBS)에 침지시켰다. 스프레노사이트(splenocyte)를, PSA-PBS로 비장을 무균적으로 과융합(perfuse)함에 의해 배양하였다. 세포를 냉 PSA-PBS에서 일단 세척하고, Coulter 계수기로 계수하고, 25 mM Hepes를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 재현탁시켰다.
세포주
비분비 마우스 골수종 융합 파트너, 653을 Centocor's Product Development 그룹으로부터의 5-14-97 상의 Cell Biology Services (CBS) 그룹 내로 수용하였다. 세포주를 10% (v/v) FBS (Cell Culture Labs), 1 mM 소듐 피루베이트, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민 (모두 JRH Biosciences에서 구입)이 보충되고 95% FBS 및 5% DMSO (Sigma) 내에서 크리오보존(cryopreserve)된 RPMI 배지(JRH Biosciences)에서 팽창시킨 후, CBS 중의 증기상 액체 질소 냉동기(freezer)내에서 저장시켰다. 세포 뱅크는 무균이었으며(Quality Control Centocor, Malvern), 마이코프라즈마 (Bionique Laboratories)가 없었다. 세포를 융합할 때까지 로그(log) 상 배지에서 유지시켰다. 이들을 PBS에서 세척하고, 계수하였으며, 생활력(viability)를 융합 전에 트리판 블루 염료 배제를 통하여 결정하였다(>95%).
인간 TNF∀를, Centocor에서 Molecular Biology에서 생성된, C237A로 명칭된 재조합 세포주에 의해 생산하였다. 세포주를 5% (v/v) FBS (Cell Culture Labs), 2 mM L-글루타민 (모두 JRH Biosciences에서 구입), 0.5: g/ml 마이코페놀산이 보충되고, 95% FBS 및 5% DMSO (Sigma) 내에서 크리오보존(cryopreserve)된 IMDM 배지(JRH Biosciences)에서 팽창시킨 후, CBS(13) 중의 증기상 액체 질소 냉동기(freezer)내에서 저장시켰다. 세포 뱅크는 무균이었으며(Quality Control Centocor, Malvern), 마이코프라즈마(Bionique Laboratories)가 없었다.
세포 융합
1:1 비율의 653 생쥐 골수종 세포 및 생육가능한 생쥐 비장 세포를 사용하여 세포 융합을 수행하였다. 요약하면, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화시켰다. 펠렛을 37 ℃에서 1 mL의 50% (w/v) PEG/PBS 용액 (PEG 분자량: 1,450 g/mole, Sigma) 중에서 30 초 동안 천천히 재현탁시켰다. 1 분에 걸쳐 10.5 mL의 RPMI 배지 (무첨가제) (JRH) (37 ℃)를 천천히 첨가함에 의해 융합을 중지시켰다. 융합된 세포를 750 rpm에서 5 분동안 원심분리시켰다. 그후, 세포를 HAT 배지(10% 소태아 혈청 (JRH), 1 mM 소듐 피루베이트, 2 mM L-글루타민, 10 μg/mL 겐타마이신(gentamicin), 2.5% 오리진(Origen) 배양 보충물(Fisher), 50 μM 2-메르캅토에탄올, 1% 653-컨디션화된 RPMI 배지, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI/HEPES 배지)에 재현탁시킨 후, 5개의 96-웰 평평한 바닥 조직 배양 플레이트 내의 200 μL/웰로 도말시켰다. 그 후 이 플레이트를 5% CO2, 및 95% 공기를 함유하는 가습화된 37 ℃ 배양기에 7-10일 동안 놓아두었다.
마우스 혈청중 인간 IgG 항-TNF∀의 검출
고상 EIAs를 사용하여 인간 TNF∀에 대한 인간 IgG 항체 특이성에 대하여 마우스 혈청을 스크린하였다. 간략히, 플레이트를 PBS에서 1 ㎍/㎖ TNF∀로 밤새 코팅하였다. 0.02%(v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 염수중에서 세척하고 웰을 PBS에서 1% (w/v) BSA로 실온에서 1 시간동안 200 ㎕/웰 차단하였다. 이후 사용을 위해 플레이트를 즉시 사용하거나 -20 ℃에서 동결시켰다. 마우스 혈청을 실온에서 1 시간동안 50 ㎕/웰 인간 TNF∀-코팅 플레이트상에 2 배 시리얼 희석액내에서 배양시켰다. 플레이트를 세척한 후, 1% BSA-PBS중에 1:30,000 희석된 Fc 특이성 (Accurate) 50 ㎕/웰 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG로 실온에서 1 시간동안 프로브하였다. 플레이트를 다시 세척하고 100 ㎕/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액(0.1 M 시트르산 및 0.2 M 소듐 포스페이트, 0.01% H2O2및 1 ㎎/㎖ OPD) 을 실온에서 15 분동안 첨가하였다. 원액(4N 황산)을 25 ㎕/웰로 첨가한 다음, 자동 플레이트 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 OD's를 읽었다.
하이브리도마 상등액중 완전 인간 면역글로불린의 검출
GenPharm 마우스가 마우스 및 인간 면역글로불린 사슬 모두를 생성할 수 있기 때문에, 두 번의 개별적인 EIA 분석법을 사용하여 인간 경쇄 및 인간 중쇄 모두의 존재에 대한 성장-양성 하이브리도마 클론을 시험하였다. 플레이트를 상술한 바와 같이 코팅하고 희석되지 않은 하이브리도마 상등액을 플레이트상에서 37 ℃에서 1 시간동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-HBSS중에 1:30,000으로 희석된 HRP-콘쥬게이트 염소 항-인간 kappa(서던 바이오텍(Southern Biotech) 항체 또는 1% BSA-HBSS중에 1:30,000으로 희석된 HRP-콘쥬게이트 염소 항-인간 IgG Fc 특이성 항체로 37 ℃에서 1 시간동안 프로브하였다. 그후, 플레이트를 상술한 바와 같은 기질 용액으로 배량하였다. 항-인간 kappa 및 항-인간 IgG Fc EIA 포맷 둘다에서 양성 신호를 제공하지 않은 하이브리도마 클론을 버렸다.
아이소타이핑
특이 역가에 대하여 마우스 면역 혈청을 스크린하는데 사용된 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 항체의 아이소타입을 결정하였다. EIA 플레이트를 소듐 카보네이트 완충액중 염소 항-인간 IgG(H+L) 10: g/ml로 4EC에서 밤새 코팅하고 상술한 바와 같이 차단하였다. 24 웰 배양물로부터의 니트 상등액을 실온에서 1 시간동안 플레이트상에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-PBS중 1:4000 희석된 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG1, IgG2, IgG3또는 IgG4(결합 부위)로 실온에서 1 시간동안 프로브하였다. 플레이트를 다시 세척하고 상술한 바와 같은 기질 용액으로 배양하였다.
결과 및 검토
완전 인간 항-인간 TNF∀ 모노클로날 항체의 발생
재조합 인간 TNF∀ 단백질로 면역화된 GenPharm 마우스로부터 지정된 GenTNV인 하나의 융합을 실행하였다. 이 융합으로부터, 196 성장-양성 하이브리드를 스크린하였다. 인간 TNF∀과 반응성인 완전 인간 IgG 항체를 분비하는 8 개의 하이브리도마 세포주를 동정하였다. 이 8 개의 세포주가 각각 인간 IgGκ 아이소타입의 면역글로불린을 분비하였고, 모두 제한 희석에 의해 2 배로 서브클론하여 안정한 세포주(>90% 동종)를 수득하였다. 세포주 이름 및 각각의 C 코드명을 표 1에 열거하였다. 각각의 세포주를 액체 질소중에 저장된 12-바이얼 리서치 세포 뱅크에서 동결시켰다.
각각의 8 개의 세포주에 대하여 24-웰 배양 디쉬의 웰로부터 수집한 모세포를 형질전환 및 추가의 특성화을 위해 2-18-99상의 분자 생물학 그룹으로 제공하였다.
표 1: GenTNV 세포주 명
이름 C 코드명
GenTNV14.17.12GenTNV15.28.11GenTNV32.2.16GenTNV86.14.34GenTNV118.3.36GenTNV122.23.2GenTNV148.26.12GenTNV196.9.1 C414AC415AC416AC417AC418AC419AC420AC421A
결론
센토코르(Centocor)제 재조합 인간 TNF∀로 면역화된 인간 가변 및 일정 영역 항체 트랜스젠으로부터의 스플레노사이트(splenocyte)를 사용하여 GenTNV 융합을 실행하였다. IgGκ 아이소타입의 8 개의 완전 인간 TNF∀-반응성 IgG 모노클로날 항체를 발생시켰다. 모 세포주를 추가의 특성화 및 발생을 위해 분자 생물학 그룹으로 전사시켰다. 이들 새로운 인간 항체중 하나가 Remicade에 비해 면역원성 및 알레르기형 합병증이 감소된 강력한 이점을 가진 항염증제에서 유용하게 함을 입증할 수 있다.
참고문헌
1. Taylor, et al.,l International Immunology 6:579-591 (1993).
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3. Neuberger, M. Nature Biotechnology 14:826 (1996).
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5. Scallon, et al., Cytokine 7:759-770 (1995).
실시예 3: 인간 항-TNF∀ 항체를 발현하는 세포주의 클로닝 및 제조
요약
TNV 명을 가진 8 개의 인간 모노클로날 항체(mAbs) 패널이 명백하게 높은 결합성을 가지면서 고정된 인간 TNF∀에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 8 개의 mAbs중 7 개는 재조합 TNF 수용체에 대하여 유용한 차단 huTNF∀ 결합을 나타내었다. 7 개의 mAbs를 코딩하는 DNA의 서열 분석에 의해 모든 mAbs가 인간 V 영역을 가짐이 확인되었다. DNA 서열은 또한 최초의 8 개의 mAbs가 4TNV14, TNV15, TNV148 및 TNV196으로 표현되는 4 개의 별개의 mAbs만을 함유하는 것과 같이 3 쌍의 mAbs가 동일하였다. 추론된 mAbs의 아미노산 서열의 분석 및 시험관내 TNF∀ 중화 데이터의 결과를 기초로, mAb TNV148 및 TNV14를 추가의 조사를 위해 선택하였다.
TNV148 중쇄중 위치 75(골격 3)에서의 프롤린 잔사가 데이타베이스 조사동안 동일한 서브그룹의 다른 인간 항체중 그 위치에서 발견되지 않았기 때문에, 부위-지정 DNA 돌연변이를 실행시켜 공지된 생식세포주 골격 e 서열에 순응하도록 그 위치에서 세린 잔사를 코딩하였다. 세린 변형된 mAb를 TNV148B로 지정하였다. TNV148B 및 TNV14의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 PCR-증폭 DNA을, IL-12 항체, 조성물, 방법 및 용도라는 명칭으로 2000년 10월 7일 출원되었고 모두 본원에 참고로 속하는 미국 특허출원 제 호에 개시된 또 다른 인간 mAb(12B75)의 최근 클론화된 중쇄 및 경쇄 유전자을 기초로 하여 새롭게 제조된 발현 벡터내로 클로닝하였다.
P3X63Ag8.653(653) 세포 또는 Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 마우스 골수종 세포를 각각의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 감염시키고 높은 레벨의 재조합 TNV148B 및 TNV14(rTNV14) mAbs를 생성하는 세포주에 대한 2 라운드 서브클로닝을 통하여 스크린시켰다. 시간에 관한 성장 곡선 및 mAB 생성 안전성의 평가는 653-형질전환 클론 C466D 및 C466C가 폐배양물(spent culture)중에 대략 125:g/ml의 rTNV148B mAb를 안정하게 생성하는 반면 Sp2/0 형질전환 1.73-12-122(C467A)는 폐배양물중에 대략 25:g/ml의 rTNV148B mAb를 생성하였음을 나타내었다.
도입
인간 TNF∀-면역화된 GenPharm/Medarex 마우스(HCo12/KCo5 유전자형)으로부터 유래된 8 개의 mAbs 패널가 TNF∀를 결합하고 kappa 아이소타입인 완전 인간 IgG1를 갖는 것으로 이미 제시하였다. 본 발명의 예시적인 mAbs가, 재조합 TNF 수용체에 대한 결합으로부터 그의 TNF∀ 차단능 평가에 의해 TNF∀-중화 활성을 가지는 지를 결정하기 위해 간단한 결합 분석법을 사용하였다. 그 결과들, DNA 서열 결과, 및 시험관내 일부 mAbs의 특성을 기초로 하여, 추가로 특성화될 mAb로서 TNV148을 선택하였다.
TNV148mAb를 코딩하는 DNA 서열을 클로닝하고, 적합한 일정 영역을 코딩하는 유전자 발현 벡터내로 고정시키기 위해 변형시키고, 웰-특성화된 653 및 Sp2/0 마우스 골수종 세포내로 도입시킨 후, 생성된 감염 세포주를 서브클론이 최초의 하이브리도마 세포주보다 40-배 이상의 mAb를 생성하였음이 동정될 때까지 스크린하였다.
재료 및 방법
시약 및 세포
TRIZOL 시약은 Gibco BRL로부터 구입하였다. 프로테이나제 K는 Sigma Chemical Company로부터 입수하였다. 역전사효소는 Life Science, Inc.로부터 입수하였다. Taq DNA 폴리메라제는 Perkin Elmer Cetus 또는 Gibco BRL로부터 입수하였다. 제한효소는 New England Biolabs로부터 구입하였다. QIAquic PCR 정제 키트는 Qiagen으로부터 얻었다. QuikChange SITE-Directed Mutagenesis Kit는 Stratagene으로부터 구입하였다. Wizard plasmid miniprep kit 및 RNasin은 Promega로부터 얻었다. 옵티플레이트(Optiplate)는 Packard로부터 입수하였다.125요오드는 Amersham으로부터 구입하였다. 통상의 올리고뉴클레오타이드는 Keystone/Biosource International로부터 구입하였다. 이 작업에서 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열, 지정 번호 및 이름을 표 1에 나타내었다.
표 1. 클론에 사용된 올리고뉴클레오타이드, 엔지니어, 또는 TNV mAb 유전자 서열.올리고뉴클레오타이드 5'14s 및 HuH-J6에 의해 코딩된 아미노산을 서열상에 나타내었다. 'M' 아미노산 잔사는 번역 개시 코돈을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드 5'14s 및 HuH-J6에서 밑줄친 서열은 BsiWI 및 BstBI 제한 부위를 나타낸다. HuH-J6에서 사선은 엑손/인트론 경계에 대응한다. 마이너스-스트랜드에 상응하는 마이너스 올리고뉴클레오타이드의 서열이 3'-5' 배향으로 기술되었음을 유념하기 바란다.
653 마우스 골수종 세포의 단일 동결 바이얼을 수득하였다. 이 바이얼을 당일 해동시키고 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민(매질)중 T 플라스크내에서 팽창시켰다. 이 세포들을 2 내지 3 주후 본원에 기술된 항-TNF DNA 로 감염시킬 때까지 연속 배양하였다. 해동한지 5 일후에 배양물중 일부를 채취하여 원심분리에 의해 펠렛화시키고 95% FBS, 5% DMSO내에서 재현탁시킨 다음, 30 바이얼내로 나누어 넣고, 동결시킨 다음 차후 사용하기 위해 저장하였다. 유사하게, Sp2/0 마우스 골수종 세포의 단일 동결 바이얼을 수득하였다. 바이얼을 해동시키고, 새로운 동결 바이얼을 상술한 바와 같이 제조한 다음, 동결 바이얼을 CBC 냉동 박스 AA 내지 AB에 저장하였다. 이 세포들을 해동시켜 본원에 기술된 모든 Sp2/0 형질전환에 사용하였다.
수용체에의 TNF 결합 억제에 대한 분석
재조합 TNF 수용체 융합 단백질 p55-sf2(Scallon 등 (1995)Cytokine7:759-770)에의125I-표지된 TNF∀ 결합에 대한 mAbs의 차단능에 대하여 분석하기 위해 TNV mAbs를 함유하는 하이브리도마 세포 상등액을 사용하였다. PBS중 0.5 g/ml의 50:1의 p55-sf2를 옵티플레이트에 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 배양동안 웰을 코팅하였다. 8 개의 TNV 세포 상등액의 일련의 희석액을 희석제로서 PBS/0.1% BSA를 사용하여 96-웰 둥근 바닥 플페이트에서 제조하였다. 항-IL-18 mAb를 함유하는 세포 상등액을 음성 대조군으로서 함유하였고, cA2(항-TNF 키메라 항체, Remicade, 모두 참고로서 본원에 속하는 미국 특허 제 5,772,198호)로 스파이크된(spiked) 동일한 항-IL-18 상등액을 양성 대조군으로서 포함하였다. 최종 TNF∀ 농도가 5 ng/ml이 되도록125I-표지된 TNF∀ (58:Ci/:g, D. Shealy)를 100:1 세포 상등액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1 시간동안 예비배양하였다. 코팅된 옵티플레이트를 세척하여 유리된(unbound) p55-sf2를 제거하고, 50:1의125I-TNF∀/세포 상등액 혼합물을 옵티플레이트로 전사시켰다. 실온에서 2 시간후, 옵티플레이트를PBS-Tween으로 세 번 세척하였다. 100:1의 Microscint-20을 첨가한 다음, TopCount gamma counter를 사용하여 cpm 바운드를 결정하였다.
V 유전자의 증폭 및 DNA 서열 분석
하이브리도마 세포를 일단, RNA 제조를 위해 TRIZOL 시약에 첨가하기 전에 PBS로 세척하였다. 7×106내지 1.7×107세포를 1 ml TRIZOL에 재현탁시켰다. 200 ㎕의 클로로포름의 첨가한 후 튜브를 격렬하게 흔들었다. 시료를 4 ℃에서 10 분간 원심분리하였다. 수성상을 후레쉬 마이크로후지(fresh microfuge) 튜브로 옮기고 같은 부피의 이소프로판올을 첨가하였다. 튜브를 격렬하게 흔들고 실온에서 10 분간 배양시켰다. 그 후, 시료를 4 ℃에서 10 분간 원심분리하였다. 펠렛을 70% 에탄올 1 ml로 1 회 세척하고 진공 건조기내에서 간단히 건조시켰다. RNA 펠렛을 40 ㎕ DEPC-처리수로 재현탁시켰다. 1% 아가로스 겔중에 0.5 ㎕ 분류하여 RNA 제제의 품질을 결정하였다. RNA를 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다.
중쇄 및 경쇄 cDNAs를 제조하기 위해, 3 ㎕ RNA, 및 1 ㎍의 올리고뉴클레오타이드 119 (중쇄) 또는 올리고뉴클레오타이드 117 (경쇄)을 11.5 ㎕의 부피로 포함하는 혼합물을 제조하였다. 이 혼합물을 70 ℃에서 10 분간 수조에서 배양한 다음 얼음위에서 10 분간 냉각시켰다. 2.5 ㎕의 10X 역전사효소 완충액, 10 ㎕의 2.5 mM dNTPs, 1 ㎕의 역전사효소(20 유니트) 및 0.4 ㎕의 리보뉴클레아제 억제자RNasin(1 유니트)로 만들어진 별도의 혼합물을 제조하였다. 13.5 ㎕의 이 혼합물을 11.5 ㎕의 냉각 RNA/올리고뉴클레오타이드 혼합물에 첨가하고 반응물을 42 ℃에서 40 분간 배양시켰다. 그 후, cDNA 합성 반응물을 사용할 때까지 -20 ℃의 동결기에 저장하였다.
가변 영역 코딩 서열을 PCR-증폭하기 위한 템플레이트로서 비정제 중쇄 및 경쇄 cDNAs를 사용하였다. 중쇄 DNA의 프라임 증폭능에 대하여 5 개의 올리고뉴클레오타이드 쌍 (366/354, 367/354, 368/354, 369/354 및 370/354, 표 1)를 동시에 시험하였다. 경쇄 DNA의 프라임 증폭능에 대하여 2 개의 올리고뉴클레오타이드 쌍(362/208 및 363/208)을 동시에 시험하였다. 2 유니트의 PLATINUM™ 고충실도 (high fidelity, HIFI) Taq DNA 폴리메라제를 총 부피 50 ㎕로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 각각의 반응물은 2 ㎕의 cDNA 반응물, 10 pmole의 각각의 올리고뉴클레오타이드, 0.2 mM dNTPs, 5 ㎕의 10 X HIFI 완충액 및 2 mM의 마그네슘 설페이트를 포함하였다. 서멀 사이클러 프로그램(thermal cycler program)을 95 ℃ 5 분, 그 후 (94 ℃ 30 초, 62 ℃ 30 초, 68 ℃ 1.5 분)의 30 사이클 실시하였다. 그 후, 68 ℃에서 10 분간 최종 배양하였다.
직접 DNA 서열화를 위한 PCR 산물을 제조하기 위해, 이들을 QIAquick™ PCR 정제 키트를 사용하여 제조업자들의 프로토콜에 따라 정제하였다. DNA를 50 ㎕ 멸균수를 사용하여 스핀 컬럼으로부터 용리시킨 다음, 진공 건조기를 사용하여 10 ㎕의 부피로 건조시켰다. 그후, 총 부피 20 ㎕의 1 ㎕ 정제 PCR 산물, 10 μM 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 4 ㎕ BigDye Terminator 즉석 반응 믹스 및 14 ㎕멸균수로 DNA 서열화 반응시켰다. 올리고뉴클레오타이드 쌍 367/354로 만들어진 중쇄 PCR 산물을 올리고뉴클레오타이드 프라이머 159 및 360으로 서열화하였다. 올리고뉴클레오타이드 쌍 363/208로 만들어진 경쇄 PCR 산물을 올리고뉴클레오타이드 34 및 163으로 서열화하였다. 서열화를 위한 서멀 사이클러 프로그램을 (96 ℃ 36초, 50 ℃ 15 초, 60 ℃ 4 분)의 25 주기, 그 후 4 ℃에서 밤새 실시하였다. 반응 산물을 폴리아크릴아미드 겔을 통하여 분류하고 ABI 377 DNA Sequencer를 사용하여 검출하였다.
아미노산을 전환시키기 위한 부위-지정 돌연변이
Pro75를 TNV148 mAb중 세린 잔사로 교체하기 위해 TNV148 중쇄 가변 영역 DNA 서열중 단일 뉴클레오타이드를 전환시켰다. 상보성 올리고뉴클레오타이드 399 및 400(표 1)를 디자인하고 제조업자들의 프로토콜에 따라 번역 개시 부위의 상향으로만 독특한 BsiWI 클로닝 부위를 사용하여 이와 같이 전환시켰다. 생성된 플라스미드를 p1747로 명명하였다. 가변 영역의 3' 말단에 BstBI 부위를 도입하기 위해, 5' 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 Sa1I 및 BstBI 부위로 디자인하였다. 이 프라이머를 pUC 역 프라이머와 함께 사용하여 p1747로부터 2.75 kb 단편을 증폭시켰다. 그 후, 이 단편을 12B75 가변 영역내에 자연-발생 Sa1I 부위 및 HindIII 부위내로 역 클로닝함으로써 독특한 BstB1 부위를 도입하였다. p1750으로 지정된 생성된 중간체 벡터는 BsiWI 및 BstBI 말단과 함게 가변 영역 단편을 수용할 수 있었다. 일정 영역이 또한 12B75 유전자로부터 유래된 중쇄 벡터의 버젼을 제조하기 위해, HindIII 부위의 EcoRI 부위 하향을 가지도록 p1750내 BamHI-HindIII 삽입체를 pBR322로 전사시켰다. 그후, 생성된 플라스미드 p1768을 HindIII 및 EcoRI로 다이제스트한 다음, p1560에서 pBC로의 큰 BamHI-BamHI 단편을 클로닝함으로써 유래된 서브클론인 p1744로부터의 5.7 kb HindIII-EcoRI 단편에 결찰하였다. 그 후, BsiWI 및 BstBI 말단을 가진 TNV Ab cDNA 단편을 위한 벡터로서 생성된 플라스미드 p1784를 사용하였다. 12B75로부터의 IgG1 일정 영역을 포함하고 이들이 함유하는 12B75 중쇄 J-C 인트론의 양에 의해 서로 구별되는 발현 벡터 p1788 및 p1798을 제조하였다.
플라스미드 p1558내 12B75 경쇄 유전자를 변형시키기 위해, 12B75 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 5.7 kb Sa1I/Af1II 단편을 p1558로부터 플라스미드 L28의 XhoI/Af1II 부위로 전사시켰다. 이 새로운 플라스미드 p1745에 의해 돌연변이 단계에 대하여 보다 작은 플레이트가 제공되었다. QuikChange 돌연변이에 의해 가변 영역의 5' 말단에 독특한 Sa1I 제한 부위를 도입하기 위해 올리고뉴클레오타이드 (C340sa1I 및 C340sa12)를 사용하였다. 생성된 중간체 벡터 p1746은 가변 영역 단편이 클로닝될 수 있는 독특한 Sa1I 및 Af1II를 가졌다. p1746내로 클로닝된 임의의 가변 영역 단편은 경쇄 유전자의 3' 하프와 바람직하게 결합되었다. 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 12B75 경쇄 유전자의 3' 하프로부터 제한 단편을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 BAHN-1 및 BAHN-2를 각각에 어닐링하여, KpnI 및 SacI 부위내로 결찰될 수 있는 말단을 함유하며 제한 부위 BsiW1, Af1II,HindII 및 NotI를 함유하는 이중-가닥 링커를 형성하였다. 이 링커를 pBC의 SacI 및 KpnI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 p1757을 제공하였다. 그 후, Af1II로 p1558을 다이제스팅한 다음 HindIII로 부분적으로 다이제스팅하여 생성된 12B75 경쇄 일정 영역을 함유하는 7.1 kb 단편을 p1757의 Af1II 및 HindII 부위사이에서 클로닝하여 p1762를 수득하였다. 이 새로운 플라스미드는, 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 BsiWI/Af1II 단편이 유전자의 반을 유니팅하여 전사될 수 있는 BsiWI 및 Af1II에 대한 독특한 부위를 함유하였다.
cDNA 클로닝 및 발현 플라스미드의 조합
모든 RT-PCR 반응물(상기 참조)을 DNA 말단에 추가로 충전하기 위해 Klenow 효소로 처리하였다. 중쇄 PCR 단편을 제한 효소인 BsiWI 및 BstBI로 다이제스트하고 플라스미드 L28(12B75를 기본으로 하는 중간체 벡터 p1750이 아직 제조되지 않았기 때문에 L28이 사용됨)의 BsiWI과 BstBI 사이에 클로닝시켰다. 클로닝된 삽입체의 DNA 서열 분석은 생성된 구조물이 정확하고 PCR 증폭동안 에러가 도입되지 않았음을 나타내었다. 이들 L28 플라스미드 구조물에 대해 부여된 동정 번호(TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B 및 TNV196)를 표 2에 나타내었다.
TNV14, TNV148 및 TNV148B 중쇄에 대한 BsiWI/BstBI 삽입체를 L28 벡터로부터 새로 제조된 중간체 벡터인 p1750으로 전사시켰다. 이들 중간체 플라스미드에 대하여 부여된 동정 번호를 표 2에 나타내었다. 이 클로닝 단계 및 서열 단계를 TNV15 및 TNV196에 대하여 실시하였다. 그 후, 가변 영역을 두 개의 상이한 인간IgG1 발현 벡터로 전사시켰다. 제한 효소 EcoRI 및 HindII를 사용하여 가변 영역을 Centocor의 기사용 IgG1 벡터 p104로 전사시켰다. Gm(f+) 알로타입(allotype)의 IgG1을 코딩하는 생성된 발현 플라스미드 p1781(TNV14), p1782(TNV148) 및 p1783(TNV148B)를 디자인하였다(표 2 참조). 가변 영역을 또한 12B75(GenPharm) 유전자로부터 유래된 IgG1 일정 영역의 상향으로 클로닝하였다. G1m(z) 알로타입의 IgG1을 코딩하는 이들 발현 플라스미드를 또한 표 2에 열거하였다.
표 2. 가변 중쇄 및 경쇄 플라스미드에 대한 플라스미드 동정 번호
L28 벡터 또는 pBC 벡터는 초기 Ab cDNA 클론을 나타낸다. 플라스미드내 삽입체는 중간체 플라스미드를 만들기 위해 불완전한 12B75-계 벡터로 전사되었다. 하나의 추가 단계에 의해 선형화된 후 세포내로 도입되거나 세포 형질전환 전에 mAb 유전자 삽입체를 정제하기 위해 사용되는 최종 발현 플라스미드를 생성하였다.
경쇄 PCR 산물을 제한 효소 Sa1I 및 SacII로 다이제스트한 다음 플라스미드 pBC의 Sa1I 및 SacII 부위 사이에 클로닝하였다. 하나의 아미노산에 의해 구별되는 2 개의 상이한 경쇄 버젼 p1748 및 p1749을 디자인하였다(표 2). DNA 서열 분석에 의해 이들 구조물이 정확한 서열을 가짐이 확인되었다. 그 후, p1748 및 p1749내 Sa1I/Af1II 단편을 중간체 벡터 p1746의 Sa1I 및 Af1II 부위 사이에 클로닝하여 p1755 및 p1756을 각각 만들었다. 그 후, BsiWI/Af1II 단편을 p1755 및 p1756로부터 새롭게 제조된 구조물 p1762로 전사시킴으로써 이들 경쇄 유전자의 5' 하프를 유전자 3' 하프에 결합시켜 최종 발현 플라스미드 p1755 및 p1756을 각각 만들었다(표 2).
세포 형질전환, 스크리닝 및 서브클로닝
마우스 골수종 세포의 총 15 형질전환을 다양한 TNV 발현 플라스미드로 실행하였다(결과 및 토론 섹션중 표 3 참조). 이들 형질전환을 (1) 숙주 세포가 Sp2/0 또는 653인지; (2) 중쇄 일정 영역이 Centocor의 이전 IgG1 벡터 또는 12B75 중쇄 일정 영역에 의해 코딩되는지; (3) mAb가 TNV148B, TNV148, TNV14 또는 새로운 HC/LC 조합인지; (4) DNA가 선형화된 플라스미드 또는 정제된 Ab 유전자 삽입체인지; (5) 중쇄 유전자내에 완전 J-C 인트론 서열이 존재하거나 부재하는지에 의해 구별하였다. 또한, 다수의 클론이 스크리닝될 수 있는 가능성을 증가시키기 위해 일부 형질전환을 반복하였다.
Sp2/0 세포 및 653 세포를 각각 앞서 기술된 바와 같은 표준 조건하에서 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA(각각 8-12:g)의 혼합물로 형질전환하였다(Knight DM 등. (1993)Molecular Immunology30:1443-1453). 형질전환 번호 1, 2, 3 및 16에 대하여, 적합한 발현 플라스미드를 형질전환 이전에 제한 효소에 의한 다이제스트에 의해 선형화시켰다. 예를 들어, Sa1I 및 NotI 제한 효소를 사용하여 TNV148B 중쇄 플라스미드 p1783 및 경쇄 플라스미드 p1776을 각각 선형화시켰다. 나머지 형질전환에 대하여, 중쇄 플라스미드를 BamHI로 및 경쇄 플라스미드를 BsiWI 및 NotI로 다이제스트하여 플라스미드 벡터로부터 mAb 유전자만을 함유하는 DNA 삽입체를 분리하였다. 그 후, mAb 유전자 삽입체를 아가로스 겔 일렉트로포레시스(elecrophoresis) 및 Qiex 정제 수지에 의해 정제하였다. 정제 유전자 삽입체로 형질전환된 세포를 동시에 선택 마커의 원으로서 3-5:g의 PstI-선형화된 pSV2gpt 플라스미드(p13)로 형질전환하였다. 일렉트로포레이션후, 세포를 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민내 96-웰 조직 배양 디쉬에 씨딩(seeding)하고 5% CO2배양기에 37 ℃에서 배양하였다. 이틀 후, 동일 부피의 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 2 X MHX 선택(1 X MHX=0.5:g/ml 마이코페놀산, 2.5:g/ml 하이폭사틴, 50:g/ml 크산틴)을 첨가한 다음, 플레이트를 클론이 형성되는 추가의 2 내지 3 주동안 배양하였다.
콜론을 가진 웰로부터 수집한 세포 상등액을 상술한 ELISA에 의해 인간 IgG에 대하여 분석하였다. 간략히 말하자면, 세포 상등액의 다양한 희석액을 폴리클로날 염소 항-인간 IgG Fc 단편으로 코팅된 96-웰 EIA 플레이트에서 배양한 다음, 알칼리 포스페이트-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG(H+L) 및 적합한 컬러 기질을 사용하여 결합된 인간 IgG를 검출하였다. 세포 상등액에서 측정된 동일한 정제 mAb를 표준으로서 사용한 표준 곡선은 상등액중 인간 IgG을 정량할 수 있도록 각 EIA 플레이트상에 포함되었다. 최대 인간 IgG를 생성할 것으로 여겨진 이들 클론중 세포를 폐배양물내에서의 추가의 생성 결정을 위해 24-웰 플레이트내로 통과시키고, 이어 최대-생성 모 클론을 동정하였다.
고-생성 서브클론을 동정하여 더 균질한 세포주를 제조하기 위해 최대-생성 모 클론을 서브클로닝하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트를 콜론이 분리될 때까지 12 내지 20 일간 5% CO2배양기에 37 ℃에서 배양하였다. 웰당 하나의 콜로니를 함유한 웰로부터 세포 상등액을 수집하여 상술한 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 선택된 콜로니를 24-웰 플레이트로 통과시키고, 이들 상등액중 인간 IgG 수준을 정량하여 최대-생성 서브클론을 동정하기 전에 배양물을 소비시켰다. 선택된 제 1-라운드 서브클론이 서브클로닝의 세컨드-라운드에 영향을 받는 경우 이 공정을 반복하였다. 최대 제 1-라운드 서브클론을 발달에 대한 세포주로서 선택하였다.
세포 서브클론의 특성화
최대 세컨드-라운드 서브클론을 선택하고 mAb 생성 수준 및 세포 성장 특성을 평가하기 위해 성장 곡선을 실행하였다. T75 플라스크를 30 ml IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민 및 1X MHX(또는 혈청름 함유하지 않는 매질)내 1×105세포/ml로 씨딩하였다. 300 ㎕의 분취량을 24 시간 간격으로 취하여 살아있는 세포 밀도를 결정하였다. 살아있는 세포의 수가 1×105세포/ml 미만이 될 때까지 분속을 계속하였다. 세포 상등액의 분취량을 모아 존재하는 항체 농도에 대하여 분석하였다. 표준으로서 rTNV148B 또는 rTNV14JG92399를 사용하여 ELISA 분석하였다. 시료를 폴리클로날 염소 항-인간 IgG Fc로 코팅된 ELISA 플레이트상에서 1 시간동안 배양하고, 결합한 mAb를 알칼리 포스페이트-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG(H+L) 1:1000 희석액으로 검출하였다.
MHX 선택량 변화에 대한 성장률을 비교하기 위해 2 개의 세포주에 대하여 상이한 성장 곡선 분석을 실시하였다. 세포주 C466A 및 C466B를 MHX-무함유 매질(IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민)내로 해동시키고 추가로 2 일간 배양하였다. 그 후, 세포 배양물 모두를 MHX 무함유, 0.2X MHX 또는 1X MHX(1X MHX=0.5:g/ml 마이코페놀산, 2.5:g/ml 하이폭사틴, 50:g/ml 크산틴)을 함유하는 세 개의 배양물로 나누었다. 1 일후, 후레쉬 T7 플라스크를 개시 밀도 1×105세포/ml로 배양시킨다음, 24 시간 간격으로 1 주일동안 세포를 계수하였다. mAb 생성에 대한 분취량은 수집하지 않았다. SOP PD32.025에 제공된 식을 사용하여 이들 시료에 대하여 배가 시간(doubling times)을 계산하였다.
경시적인 mAb 생성 안정성을 평가하기 위해 추가로 조사하였다. 배양물을 MHX 선택을 함유하거나 함유하지 않는 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민중 24-웰 플레이트에서 성장시켰다. 배양물이 합류되어 구 배양물이 완전 소비될 때마다 배양물을 후레쉬 배양물내로 분리시켰다. 이 때, 상등액의 분취량을 취하고 4 ℃에서 저잗하였다. 분취량을 55-78일간 취했다. 이 기간의 말미에, 상기 개설된 바와 같이 항-인간 IgG Fc ELISA에 의해 존재하는 항체의 양에 대하여 상등액을 조사하였다.
결과 및 토론
재조합 수용체에 결합하는 TNF의 억제
하이브리도마 세포 상등액에 함유된 8 개의 TNV mAbs가 수용체에 결합하는 TNF∀를 차단할 수 있는지를 결정하기 위해 시료 결합 분석법을 실시하였다. 이들 각각의 세포 상등액내 TNV mAbs 농도를 먼저 인간 IgG에 대한 표준 ELISA 분석법에 의해 결정하였다. 그 후, 재조합 p55 TNF 수용체/IgG 융합 단백질 p55-sf2를 EIA 플레이트상에 코팅하고,125I-표지된 TNF∀를 TNV mAbs의 가변량의 존재하에 p55 수용체에 결합시켰다. 도 1에 도시된 바와 같이 8 개의 TNV mAbs중하나(TNV122)가 p55 수용체에 결합하는 TNF∀를 효과적으로 차단하였다. 사실상, TNV mAbs가 음성 대조군 하이브리도마 상등액내로 스파이크된 cA2 양성 대조군 mAb보다 TNF∀ 결합을 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이들 결과는 TNV mAbs가 세포-계 분석 및 생체내에서 TNF∀ 생체활성을 차단하며, 따라서 추가의 분석이 보증되었음을 나타내는 것으로 해석된다.
DNA 서열 분석
RNAs가 인간 mAbs를 코딩하는 것의 확인
수용체 결합 분석에서 TNF∀-차단 활성을 나타내는 7 개의 TNV mAbs(TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNV118, TNV148 및 TNV196)를 특성화하는 제 1 단계로서, 이들 mAbs를 생성하는 7 개의 하이브리도마 세포주로부터 총 RNA를 분리하였다. 그 후, 각각의 RNA 시료를 사용하여 각각의 mAb에 대하여 일정 영역 서열의 부분, 완전 가변변 영역 서열 및 완전 시그널 서열을 포함하는 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 cDNA를 제조하였다. 그 후, 이들 cDNA 산물을 PCR 반응내로 증폭시키고, PCR-증폭 DNA를 단편을 제 1 클로닝하지 않고 직접 서열화시켰다. 서열화된 중쇄 cDNA은 마우스 DP-46내에 존재하는 5 개의 인간 생식세포주 유전자중 하나와 >90% 동일하였다(도 3). 이들 서열 결과는 RNA 분자가 cDNA내로 전사되고 코딩된 인간 항체 중쇄 및 인간 항체 경쇄를 서열화시킴을 입증하였다.
가변 영역은 시그널 서열 코딩 서열의 5' 말단에 지도화하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR-증폭되기 때문에, 시그널 서열중 최초의 몇몇 아미노산이원래 TNV 번역 산물의 실제 서열이 되는 것이 아니라 재조합 TNV mAbs의 실제 서열을 나타낼 수 있음을 유념하여야 한다.
독특한 중성화 mAbs
각각의 mAb에 대한 중쇄 및 경쇄 둘 다의 모든 가변 영역에 대한 cDNA 서열 분석에 의해 TNV32는 TNV15와 동일하고, TNV118는 TNV14와 동일하며, TNV86은 TNV148과 동일함이 입증되었다. 수용체 결합 분석의 결과는 DNA 서열 분석과 일치하였다, 즉 TNV86 및 TNV148 둘다 TNV118 및 TNV14 모두에 비해 TNF 결합 차단에있어서 약 4-배 정도 우수하였다. 따라서, 후속하는 작업은 4 개의 독특한 TNV mAbs인 TNV14, TNV15, TNV148 및 TNV196에 대해서만 초점을 두었다.
4 개의 mAbs의 유사성
DNA 서열 결과는 4 개의 TNV mAbs의 중쇄를 코딩하는 유전자가 모두 서로 높은 균질성을 가지며 동일한 생식세포주 유전자인 DP-46로부터 모두 유래되었음을 입증하였다(도 2). 또한, 각각의 중쇄 CDR3 서열이 유사하고 같은 길이이기 때문에, 그리고 이들이 모두 J6 엑손을 사용하기 때문에, 이들은 분명히 이후 각각의 mAb를 독특하게 하는 체 변화가 일어나는 단일 VDJ 유전자 재배열 결과로부터 기인하였다. DNA 서열 분석으로부터 4 개의 mAbs 가운데 단지 2 개의 별개의 경쇄 유전자였음이 입증되었다(도 3). TNV14 및 TNV15에서 경쇄 가변 영역 코딩 서열은 서로 동일하며 인간 kappa 사슬의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 생식세포주 서열과 동일하다. TNV148 및 TNV196 경쇄 코딩 서열은 서로 동일하지만 2 개의 뉴클레오타이드 위치에서의 생식세포주 서열과 다르다(도 3).
4 개의 mAbds의 추론된 아미노산 서열이 실제 mAbs의 유사성을 입증하였다. 4 개의 mAbs는 2 개의 별개의 경쇄(도 5)만이 아니라 4 개의 별개의 중쇄(도 4)를 함유한다. TNV mAb 서열과 생식세포주 서열의 차이는 거의 CDR 도메인에 국한되지만, 3 개의 mAb 중쇄는 또한 골격 영역에서 생색세포주 서열과 달랐다(도 4). DP-46 생식세포주-코딩 Ab 골격 영역과 비교하면, TNV14는 동일하였고, TNV15는 하나의 아미노산이 달랐고, TNV148은 2 개의 아미노산이 달랐으며, TNV196은 3 개의 아미노산이 달랐다.
cDNAs의 클로닝, 부위-특이성 돌연변이, 및 최종 발현 플라스미드의 조합
cDNAs의 클로닝
PCR-증폭 가변 영역의 DNA 서열에 의거하면, 새로운 올리고뉴클레오타이드가 코딩 서열이 발현 벡터내로 클로닝되도록 하기 위해 PCR 증폭의 또 다른 라운드를 실행시켰다. 중쇄의 경우, 이 PCR의 제 2 라운드의 산물은 제한 효소인 BsiWI 및 BstBI에 의해 다이제스트되어 플라스미드 벡터 L28내로 클로닝되었다(표 2에 나타낸 플라스미드 동정 번호). 경쇄의 경우, 제 2 라운드 PCR 산물은 Sa1I 및 Af1II에 의해 다이제스트되어 플라스미드 벡터 pBC내로 클로닝되엇다. 그 후, 개개의 클론을, 이들 서열이 분자의 잠재적인 이종 개체중 각각의 위치에 매우 풍부한 뉴클레오타이드를 나타내는 PCR 산물의 직접 서열화로부터 수득된 이전 서열과 동일함을 확인하기 위해 서열화시켰다.
부위-특이성 돌연변이
mAbs TNV148 및 TNV196이 중화 TNF∀ 생체활성이 다음의 최대 mAb(TNV14)보다 4 배 더 강력한 것으로 일정하게 측정되었다. 그러나, 상술한 바와 같이, TNV148 및 TNV196 중쇄 골격 서열은 생식세포주 골격 서열과 달랐다. TNV148 중쇄 서열와 다른 인간 항체의 비교는, 다수의 다른 인간 mAbs가 골격 1의 위치 28에 I1e를 함유하는 반면(성숙 서열만 계수) 골격 3의 위치 75에서 Pro 잔사는 그 위치에서 드문 아미노산이었음을 나타내었다.
TNV196 중쇄의 유사한 비교는 골격 3에서 생식 세포 서열과 다른 3 개의 아미노산이 인간 mAbs에서 희박할 수 있음을 제시하였다. 인간에게 투여할 경우, 이들 차이는 TNV148 및 TNV196 면역성을 제공할 수 있는 가능성이다. TNV148이
관련된 하나의 아미노산 잔사만을 가지고 이 잔사가 TNF∀ 결합에 중요하지 않다고 여기지기 때문에, 생식세포주 Ser 잔사가 Pro 잔사의 위치 75에서 코딩될 수 있도록 TNV148 중쇄 코딩 서열(플라스미드 p1753)중 단일 뉴클레오타이드를 전환시키기 위해 부위-특이성 돌연변이 기술을 사용하였다. 생성된 플라스미드를 p1760이라 명명하였다(표 2 참조). 생성된 유전자 및 mAb를 원래의 TNV148 유전자 및 mAb와 구별하기 위해 TNV148B로 명명하였다(도 5).
최종 발현 플라스미드의 조합
게놈 단편으로서 앞서 클로닝된 12B75 중쇄 및 경쇄 유전자를 기본으로 하는신규한 항체 발현 벡터를 제조하였다. 상이한 TNV 발현 플라스미드가 제조되었지만(표 2 참조), 각 경우에 5' 플랜킹 서열, 프로모터 및 인트론 증강제는 각각의 12B75 유전자로부터 유래되었다. 경쇄 발현 플라스미드의 경우, 완전 J-C 인트론, 일정 영역 코딩 서열 및 플랜킹 서열은 또한 12B75 경쇄 유전자로부터 유래되었다. 최종 생성 세포주를 생성하는 경쇄 발현 플라스미드의 경우(p1781 및 p1783, 이하 참조), 인간 IgG1 일정 영역 코딩 서열은 Centocor의 기사용 발현 벡터(p40)으로부터 유래되었다. 중요하게도, 여기에 보고된 최종 생성 세포주는 원래의 하이브리도마-유래된 TNV mAbs(G1m(z))과는 다른 TNV의 알로타입(Gm(f+))을 발현한다. 이는 GenPharm 마우스로부터 유래된 12B75 중쇄 유전자가 CH1 도메인의 C-말단에서 Arg 잔사를 코딩하는 반면, Centocor의 IgG1 발현 벡터 p104는 그 위치에서 Lys 잔사를 코딩하기 때문이다. J-C 인트론, 완전 일정 영역 코딩 서열 및 3' 플랜킹 서열이 12B75 중쇄 유전자로부터 유래된 다른 중쇄 발현 플라스미드(예, p1786 및 p1788)를 제조하였다. 단, 이들 유전자에 의해 형질전화된 세포주는 생성 세포주로서 선택되지 않았다. 벡터는 최종 발현 플라스미드를 생성하는 추가의 PCR-증폭 V 영역의 일단계 클로닝이 가능하도록 주의깊게 디자인되었다.
PCR-증폭 가변 영역 cDNAs는 L28 또는 pBC 벡터로부터 프로모터 영역 및 J-C 인트론 부분을 제공하는 중간체-단계인 12B75를 기초로하는 벡터로 전사되었다(플라스미드 동정 번호에 대해 표 2 참조). 그 후, 항체 유전자의 5' 하프를 함유하는 제한 단편을 이들 중간체-단계 벡터로부터 각각의 유전자 3' 하프를 제공하는 최종 발현 벡터로 전사시켜 최종 발현 벡터 플라스미드를 형성시켰다.
세포 형질전환 및 서브클로닝
발현 플라스미드는 제한 다이제스트에 의해 선형화되거나 각각의 플라스미드중 항체 유전자 삽입체는 플라스미드 주쇄로부터 정제되었다. Sp2/0 및 653 마우스 골수종 세포는 일렉트로포레이션에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA로 형질전환되었다. 선형화된 전체 플라스미드 또는 정제된 유전자 삽입체 및 숙주 세포주에 존재하는지 어떤지간에 대부분은 Ab 유전자의 특이성인 Ab에 의해 정의된 바와 같이 독특하다. 클론 저항체로부터 마이코페놀산으로의 세포 상등액을 ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대하여 분석하고, 정제 rTNV148B를 기준 표준 곡선으로서 사용하여 정량하였다.
최대-생성 rTNV148B 세포주
rTNV148B 형질전환 2로부터의 최대-생성 653 모주 중 10 개(폐 24-웰 배양물중 5-10:g/ml 생성됨)를 서브클로닝하여 고-생성 세포주에 대하여 스크리닝하여 보다 균질한 세포 개체를 제조하였다. 모주 2.320, 2.320-17 및 2.320-20의 서브클론중 2 개가 폐 24-웰 배양물중 대략 50:g/ml를 생성하였고, 이는 이들 모주보다 5 배 증가되었다. 서브클로닝된 주 2.320-17 및 2.320의 서브클로닝 제 2 라운드가 발생되었다.
표 3. 세포 형질전환의 요약각각의 mAb를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 동정 번호를 나타내었다. 정제 mAb 유전자 삽입체에 의한 형질전환의 경우, 플라스미드 p13(pSV2gpt)가 gpt 선택 마커로서 포함되었다. 이 중쇄 일정 영역은 Remicade('구')를 인코딩하기 위해 사용된 동일한 인간 IgG1 발현 벡터에 의하거나 12B75(GenPharm/Medarex) 중쇄 유전자('신')내에 함유된 일정 영역에 의해 코딩되었다. H1/2는 TNV14 중쇄 및 TNV148 경쇄로 구성된 "신규한" mAb를 의미한다. 플라스미드 p1783 및 p1801은 J-C 인트론 중쇄 유전자가 얼만큼 함유하는지에 의해서만 구별된다. 세포에 대한 유전자명의 제 1 번호를 한정하는 형질전환 번호를 오른쪽에 나타내었다. 본원에 기술된 rTNV148B-생성 세포주 C467A 및 C466(A,B,C,D)은 각각 형질전환 번호 2 및 1로부터 유래되었다. rTNV14-생성 세포주 C476A는 형질전환 번호 3으로부터 유래되었다.
서브클로닝된 세포주의 특성화
세포주 성장 특성을 보다 주의깊게 특성화하여 보다 큰 스케일상의 mAb-생성 수준을 결정하기 위해, T75 배양물을 사용하여 성장 곡선 분석을 수행하였다. 결과는, 세포주중 4 개의 C466 시리즈 각각이 1.0×106및 1.25×106세포/ml 사이의피크 세포 밀도 및 110 내지 140:g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달되었음을 나타내었다. 반대로, 최대-생성 Sp2/0 서브클론, C467A는 2.0×106세포/ml의 피크 세포 밀도 및 25:g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달되었다. rTNV14-생성 세포주인 C476A에 대해서는 성장 곡선 분석을 실시하지 않았다.
상이한 MHX 선택의 농도에서의 성장률을 비교하였기 위해 추가의 성장 곡선 분석을 실시하였다. 이 비교는 MHX의 부재하에 배양된 C466 세포가 통상의 양의 MHX(1X)에서 배양된 동일한 세포에 비해 더 빠르게 성장되었다는 최근 관찰에 의해 촉진되었다.
크기의 순서에 대하여 측정하기 위해, 더 낮은 농도의 MHX을 사용하면 mAb 생성의 안정성을 떨어뜨리지 않고 유의적으로 바른 세포 배가 시간을 일으킬 수 있을 것으로 판단되었다. 세포주 C466A 및 C466B는 MHX 무함유, 0.2X MHX, 또는 1X MHX중에서 배양되었다. 살아있는 세포를 24-시간 간격으로 7일간 계수하였다. 결과는 세포 성장의 MHX 농도-의존률을 입증하였다(도 8). 세포주 C466A는 1X MHX에서 25.0의 배가 시간을 나타내었지만 MHX 무함유에서는 20.7 시간을 나타내었다. 중요하게도, 0.2X MHX에서 세포주 모두에 대한 배가 시간은 1X MHX중에서보다 MHX 무함유에서 측정된 것과 더 유사하였다(도 8). 이러한 측정은 배가 시간이 중요한 파라미터인 경우 생물반응기중에서 증강된 세포 성능은 MHX를 덜 사용함에 의해 실현될 수 있을 가능성을 높였다. 그러나, 안정성 시험 결과(이하 참조)는 세포주 C466D가 MHX가 없는 경우에 조차 적어도 60 일간 rTNV148B를 안정하게 생성할 수 있음을 제시하였지만, 안정성 시험은 또한 세포가 MHX의 부재에 비해 MHX의 존재하에서 배향되었을 때 더 높은 mAb 생성 수준을 나타내었다.
대략 60 일에 걸쳐 다양한 세포주로부터의 mAb 생성을 평가하기 위해, MHX 선택을 함유하거나 함유하지 않은 배양물에 대하여 안정성 시험을 실시하였다. 세포주 모두가 높은 mAb 생성을 유지하지 않았다. 배양한지 고작 2 주후에, 클론 C466A는 조사 초기에 비해 대략 45% 미만으로 생성되었다. 클론 C466B로부터의 생성은 또한 유의적으로 떨어졌다. 그러나, 클론 C466C 및 C466D는 최대 절대 생성 수준을 나타내는 C466D와 함께 매우 안정한 생성을 유지하였다(도 9).
결론
인간 TNF∀에 대한 8 개의 인간 mAbS의 초기 패널로부터, TNV14 뿐만 아니라 TNF 중화 포텐시 및 단백질 서열을 포함한 몇몇 기준을 기초로 하여 TNF∀를 바람직한 것으로서 선택하였다. rTNV148 100:g/ml 및 rTNV14보다 많이 생성하는 세포주를 제조하였다.
실시예 4: 단일 볼루스 주입을 사용하는 대조군 및 항-TNF 항체를 사용하여 관절염 마우스 조사
9 개의 처리 그룹중 하나에 대하여 성별 및 체중을 기초로 하여 대략 4 주령 Tg197 조사 마우스를 선택하고, 1 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148 또는 TNV196) 또는 Dulbecco의 PBS(D-PBS)의 단일 복강내 볼루스 투여에 의해 처리하였다.
결과:투여전으로부터의 변화로서 체중을 분석한 경우, 10 mg/kg cA2로 처리된 동물들이 조사 전체에 걸쳐 D-PBS-처리 동물에 비해 더 높은 체중 증가를 나타내었다. 이 체중 증가는 3-7 주에 유의적이었다. 10 mg/kg TNV148로 처리된 동물은 또한 조사한지 4 주에 유의적으로 체중이 증가하였다(도 10 참조).
도 11A-C는 관절염 인덱스를 기초로 하여 질병 고통의 진행을 나타낸다. R그 후, 10 mg/kg cA2-처리 그룹의 관절염 지수는 3 주에 출발 D-PBS 대조군에서 떨어졌고 나머지 시험기간(7 주) 동안 계속되었다. 1 mg/kg TNV14로 처리된 동물 및 1 mg/kg cA2로 처리된 동물은 D-PBS-처리 그룹과 비교할 경우, 3 주후에 AI의 유의적인 감소를 나타내는데는 실패하였다. 각각을 나머지 유사한 투여와 비교할 경우(10 mg/kg cA2을 10 mg/kg TNV14, 148 및 196과 비교함), 10 mg/kg 처리 그룹사이에서 유의적인 차이는 없었다. 1 mg/kg TNV148은 3, 4 및 7 주에 1 mg/kg cA2보다 상당히 낮은 AI를 나타내었다. 1 mg/kg TNV148은 또한 3 및 4 주에 1 mg/kg TNV14-처리 그룹보다 상당히 낮았다. TNV196은 조사 6 주까지도 AI의 유의적인 감소를 나타내었지만(D-PBS-처리 그룹과 비교할 경우), TNV148은 1 mg/kg 처리만으로도 조사 끝부분에서 유의적이었다.
실시예 5: 다중 볼러스 투약으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하여 관절염 마우스 조사
약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 8개의 처리군중 하나로 나누고, 대조 제품(D-PBS) 또는 항체(TNV14, TNV148)를 3 mg/kg으로(0 일) 하여 복강내 볼러스 투약으로 처리하였다. 모든 동물에서 1, 2, 3 및 4주째에 주입을 반복하였다. 그룹 1-6을 시험 제품 효율에 대해 평가하였다. 그룹 7 및 8에서 수득한 혈청 샘플에 대해 2,3 및 4주째에 면역 응답 유도 및 TNV 14 또는 TNV 148의 약물동력학적 클리어런스에 대해 평가하였다.
결과
예비-용량의 변화로서 체중을 분석하였을 때 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 10 mg/kg cA2 처리된 동물은 조사 내내 시종일관 D-PBS-처리 동물보다 높은 체중 증가를 나타내었다(도 2 참조).
도 13A-C는 관절염 지표에 기초하여 질병 중증도의 진행성을 나타낸 것이다. 10 mg/kg cA2-처리된 그룹의 관절염 지표는 2주째를 시작으로 하여 D-PBS 대조군보다 유의적으로 낮았으며, 조사 나머지(5주)를 통해 유지되었다. 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 cA2로 처리된 동물 및 3 mg/kg TNV14로 처리된 동물은 어떤 시간에서도 D PBS-처리군에 비해 AI의 상당한 감소를 나타내는데 실패하였다. 3 mg/kg TNV148로 처리된 동물은 3주째를 시작으로 하여 5주까지 D PBS-처리군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다. 10 mg/kg cA2 처리된 동물은 조사의 4 및 5주째에 더 낮은 용량(1 mg/kg 및 3 mg/kg)에 비해 AI의 유의적인 감소를 나타내었으며, 또한 3-5주에 TNV14-처리된 동물보다 유의적으로 낮았다. 3 mg/kg 처리군간에 유의적인 차이는 없었지만, 3 mg/kg TNV14로 처리된 동물에 대한 AI는 일부의 시점에 10 mg/kg보다 유의적으로 높았으며, TNV148로 처리된 동물은 10 mg/kg의 cA2로 처리된 동물과 유의적으로 차이나지 않았다.
실시예 6: 단일 복강내 볼러스 투약으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하여 관절염 마우스 조사
약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 6개의 처리군중 하나로 나누고, 항체(cA2 또는 TNV148)를 3 또는 5 mg/kg으로 하여 단일 복강내 볼러스 투약으로 처리하였다. 이 조사는 D-PBS 및 10 mg/kg cA2 대조군을 이용하였다.
체중을 예비-용량으로부터의 변화로서 분석하였을 때, 모든 처리는 유사한 체중 증가를 나타내었다. 3 또는 5 mg/kg TNV148 또는 5 mg/kg cA2로 처리된 동물은 조사 초반부(2 및 3주)에 유이적인 양의 체중 증가를 나타내었다. TNV 148로 처리된 동물만이 후 시점에 유의적인 체중 증가를 유지하였다. 3 및 5 mg/kg TNV148-처리 동물은 7주째에 유의성을 나타내었으며, 3 mg/kg TNV148 동물은 8주째 후 주입시에도 여전히 유의적인 상승을 나타내었다(도 14 참조).
도 15는 관절염 지표에 기초한 질병 중증도의 진행성을 나타낸다. 모든 처리군은 최초 시점에 일부 보호를 나타내었는데, 5 mg/kg cA2 및 5 mg/kg TNV148은 1-3주에 AI의 유의적인 감소를 나타내었으며, 모든 처리군은 2주에 유의적인 감소를 나타내었다. 조사 후반에 5 mg/kg cA2로 처리된 동물은 일부 보호를 나타내었으며, 4, 6 및 7주에 유의적인 감소를 나타내었다. cA2 및 TNV148의 저 용량(3 mg/kg)은 6주에 유의적인 감소를 나타내었으며, 모든 처리군은 7주에 유의적인 감소를 나타내었다. 조사 마지막(8주)에 처리군의 어느 것도 유의적인 감소를 유지할 수 없었다. 어떤 시점에서도 처리군(염수 대조군 제외)간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다.
실시예 17: 항-TNF 항체와 변형된 항-TNF 항체 사이에서 단일 복강내 볼러스제 투약으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하여 관절염 마우스 조사
TNV148(하이브리도마 세포로부터 유도) 및 rTNV148B(형질전환된 세포로부터 유도)의 단일 복강내 투여 효율을 비교하기 위하여 약 4주령의 Tgl97 조사 마우스를 성별 및 체중에 따라 9개의 처리군중 하나로 나누고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 항체(TNV148, rTNV148B)를 1 mg/kg으로 하여 단일 복강내 볼러스 복용약으로 처리하였다.
체중을 예비-투여량으로부터 분석하였을 때, 10 mg/kg cA2로 처리된 동물은 조사 내내 시종일관 D-PBS-처리 동물보다 높은 체중 증가를 보였다. 이러한 체중 증가는 1 및 3-8주에 유의적이었다. 1 mg/kg TNV148로 처리된 동물이 또한 조사의 5, 6 및 8주에 유의적인 체중 증가를 나타내었다(도 16 참조).
도 17은 관절염 지표를 기초로 한 질병 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-처리군의 관절염 지표는 4주째를 시작으로 하여 D-PBS 대조군보다 낮았으며, 조사 나머지(8주)를 통해 유지되었다. TNV148-처리군 및 1 mg/kg cA2-처리군 둘 다는 4주에 AI의 유의적인 감소를 나타내었다. 앞선 연구(P-099-017)가 TNV148이 1 mg/kg 복강내 볼러스 단일 투여로 관절염 지표를 감소시키는데 다소 효과적인 것으로 나타났더라도, 이 조사는 TNV 항체-처리군의 두 버전으로부터의 AI가 다소 높음을 보여준다(6주 제외). 1 mg/kg cA2-처리군이 10 mg/kg cA2 군에 비해 유의적으로 증가를 나타내지 않았고, TNV148-처리군이 7 및 8주에 유의적으로 높았음을 나타내었더라도, 이 조사의 어떤 시점에서도 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148 및 1 mg/kg TNV148B 간에는 AI에 유의적인 차이가 없었다.
본 발명이 상기 언급된 설명 및 실시예에 특별히 기술된 것 이외로 실행될 수 있음은 자명할 것이다.
따라서, 상기 기술에 비추어 첨부된 청구 범위내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변형시키는 것이 가능하다.
[서열목록]
본 발명은 본 원에 기술되어 있고 본 원에서 가능할 수 있는 것으로서, 당 업계에 공지된 것과 조합하여 분리된 인간, 영장류, 설치류, 포유 동물, 키메릭, 인간화 및/또는 CDR-그라프트된 항-TNF 항체, 면역글로불린, 절단 생성물 및 그의 다른 특정 부분 및 변이체 뿐 아니라 항-TNF 항체 조성물, 코딩 또는 상보 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제제, 장치, 트랜스제닉 동물, 및 그의 제조방법 및 사용방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 원에 기술된 적어도 하나의 분리된 항-TNF 항체를 제공한다. 본 발명에 따른 항체는 적어도 일부의 면역글로불린 분자를 포함하는 단백질 또는 펩타이드 함유 분자를 포함하며, 이는 본 발명의 항체내로 도입될 수 있는 장 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 고정 영역, 골격 영역, 또는 이들의 임의영역이나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 포유 동물을 포함하거나, 이들로부터 유도될 수 있으며, 이들로는 인간, 마우스, 토끼, 랫트, 영장류 또는 이들의 조합 등을 포함하나 이들로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 한 측면으로, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 단백질 또는 변이체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 코딩 특정 항-TNF 항체를 포함하거나, 상보적이거나 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 항-TNF 항체 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포 및/또는 재조합 벡터 뿐만 아리나 이러한 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조방법 및 사용방법을 제공한다.
본 발명의 적어도 하나의 항체는 적어도 하나의 TNF 단백질, 서브유니트, 단편, 단백질 또는 이들의 조합에 특이적인 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합한다. 적어도 하나의 에피토프는 상기 단백질의 적어도 한 부분을 가지는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함할 수 있으며, 에피토프는 상기 단백질의 적어도 한 부분의 바람직하게는 적어도 1-5개의 아미노산으로 구성되며, 이는 상기 단백질의 적어도 하나의 기능성, 세포외, 가용성, 친수성, 외부 또는 세포질 도메인, 또는 이들 부분이나 이들로 한정되는 것은 아니다.
적어도 하나의 항체는 임의로 적어도 하나의 상보 결정 영역(CDR)(예; 장 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3) 및/또는 적어도 하나의 고정 또는 가변 골격 영역의 적어도 하나의 특정 부분 또는 이들 부분을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항체 아미노산 서열은 또한 본 원에 기술되었거나 당업계에 알려진 임의로 적어도 하나의 특정 치환, 삽입 또는 결찰을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 원에 기술된 것으로, 예를 들어 TNF-유도 세포 접착 분자 억제, 수용체에 대한 TNF 결합 억제, 마우스 모델에서 관절염 지표 개선이 예시되나 이로 한정되지 않는 적어도 하나의 활성을 갖는 적어도 하나의 분리된 항-TNF 항체를 제공한다(참조예: 실시예 3-7). 항-TNF 항체는 공지된 방법에 따라 상응하는 활성(TNF 단백질에 대한 적어도 하나의 생물학적 활성이 예시되나 이로 한정되지 않는다)에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 TNF 항체에 대한 적어도 하나의 TNF 항-이디오타입(idiotype) 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체는 면역글로불린 분자의 적어도 한 부분을 가지는 단백질 또는 펩타이드 함유 분자를 포함하며, 이는 본 발명의 항체내로 도입될 수 있는 장 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 고정 영역, 골격 영역, 또는 이들의 임의 영역이나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 포유 동물을 포함하거나, 이들로부터 유도될 수 있으며, 이들로는 인간, 마우스, 토끼, 랫트, 영장류 등을 포함하나 이들로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 한 측면으로, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 단백질 또는 변이체를 포함하는 적어도 하나의 TNF 항-이디오타입 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 상보적이거나 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 핵산 분자를 코딩하는 상기 TNF 항-이디오타입 항체를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산을 포함하는 함유하는 숙주 세포 및/또는 재조합 벡터 뿐만 아리나 이러한 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조방법 및 사용방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 원에 기술된 숙주 세포를 적어도 하나의 항-TNF 항체가 검출가능하고/하거나 회수가능한 양으로 발현하는 조건하에서 배양하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 적어도 하나의 항-TNF 항체 또는 TNF 항-이디오타입 항체를 발현하는 적어도 한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 본 원에 기술된 핵산 및/또는 항체를 코딩하는 분리된 항-TNF 항체; 및 (b) 적합한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다. 담체 또는 희석제는 임의로 약제학적으로 허용되는 공지된 담체 또는 희석제일 수 있다. 조성물은 임의로 또한 적어도 하나의 추가의 화합물, 단백질 또는 조성물을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 당업계에 공지되 있고/있거나 본 원에 기술된 것으로, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 및/또는 관련 증상 전, 이후 또는 그 동안 적어도 하나의 TNF 관련 증상을 조절하거나 치료하기에 치료적으로 유효한 양을 투여하기 위한 적어도 하나의 항-TNF 항체 방법 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-TNF 항체의 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양을 전달하기 위한 적어도 하나의 조성물, 장치 및/또는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 당업계에 공지되 있고/있거나 본 원에 기술된 것으로, 세포,조직, 기관, 동물 또는 환자에서 관련 증상 전, 이후 또는 그 동안에 적어도 하나의 TNF 관련 증상을 진단하기 위한 적어도 하나의 항-TNF 항체 방법 또는 조성물을 제공한다/
본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-TNF 항체를 진단하기 위한 적어도 하나의 조성물, 장치 및/또는 전달 방법을 제공한다.

Claims (101)

  1. 서열번호 7 또는 8을 가지는 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는, 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 적어도 10-9M, 적어도 10-10M, 적어도 10-11M 및 적어도 10-12M 중에서 선택된 적어도 하나의 친화도로 TNF와 결합하는 TNF 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 TNF 단백질의 적어도 한 활성을 실질적으로 중성화하는 TNF 항체.
  4. 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  5. 제 4 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산 벡터.
  6. 제 5 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  7. 제 6 항에 있어서, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2,653,SP2/0,293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포 또는 이들의 임의 유도체, 불멸화 또는 형질전환된 세포중에서 선택된 적어도 하나인 숙주 세포.
  8. TNF 항체가 검출가능하거나 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 원 위치 조건하에서 제 4 항에 따른 핵산을 해독하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 제조하는 방법.
  9. 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 적어도 하나의 분리된 항-TNF 항체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제(antipsoriatic), 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제(beta agonist), 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 추가로 함유하는 조성물.
  11. 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체 또는 단편.
  12. (a) 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 유효한 양으로 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 그에 투여하는 것을 특징으로 하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TNF 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 유효한 양이 세포, 조직, 기관 또는 동물 1 킬로그램당 0.001-50 mg인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, (a)의 접촉 또는 투여 전, 이와 동시 또는 그 후에 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 포함하며, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 상기 항-TNF 항체를 접촉시키거나 투여하기에 적합한 의약 장치.
  17. 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 용액 또는 동결건조 형태의 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 함유하는 컨테이너 및 포장재를 갖는, 인간 약제 또는 진단용 제조품.
  18. 제 17 항에 있어서, 컨테이너가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피 전달 장치 또는 시스템의 요소인 제품.
  19. 서열번호 7 또는 8을 포함하는 적어도 하나의 가변 영역을 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 회수가능한 양으로 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 또는 식물 세포를 제공하는 것을 특징으로 하여 상기 항체를 제조하는 방법.
  20. 제 19 항에 따른 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 항-TNF 항체.
  21. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 상보 결정 영역(CDR) 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체.
  22. 제 21 항에 있어서, 적어도 10-9M, 적어도 10-10M, 적어도 10-11M 및 적어도10-12M 중에서 선택된 적어도 하나의 친화도로 TNF와 결합하는 TNF 항체.
  23. 제 21 항에 있어서, 적어도 하나의 TNF 단백질의 적어도 한 활성을 실질적으로 중성화하는 TNF 항체.
  24. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  25. 제 4 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산 벡터.
  26. 제 25 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  27. 제 26 항에 있어서, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2,653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포 또는 이들의 임의 유도체, 불멸화 또는 형질전환된 세포중에서 선택된 적어도 하나인 숙주 세포.
  28. TNF 항체가 검출가능하거나 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 원 위치 조건하에서 제 24 항에 따른 핵산을 해독하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 제조하는 방법.
  29. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 추가로 함유하는 조성물.
  31. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 상보 결정 영역(CDR) 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 단편.
  32. (a) (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 상보 결정 영역(CDR) 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체의 유효량을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 이에 투여하는 것을 특징으로 하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TNF 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 유효량이 세포, 조직, 기관 또는 동물 1 킬로그램당 0.001-50 mg인 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, (a)의 접촉 또는 투여 전, 이와 동시 또는 그 후에 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  36. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 상보 결정 영역(CDR) 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 포함하며, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 상기 항-TNF 항체를 접촉시키거나 투여하기에 적합한 의약 장치.
  37. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 상보 결정 영역(CDR) 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 가지는 용액 또는 동결건조 형태의 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 함유하는 컨테이너 및 포장재를 갖는, 인간 약제 또는 진단용 제조품.
  38. 제 37 항에 있어서, 컨테이너가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피 전달 장치 또는 시스템의 요소인 제품.
  39. (i) 서열번호 1, 2 및 3의 모든 중쇄 상보 결정 영역(CDR) 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 4, 5 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 회수가능한 양으로 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 또는 식물 세포를 제공하는 것을 특징으로 하여 상기 항체를 제조하는 방법.
  40. 제 39 항에 따른 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 항-TNF 항체.
  41. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체.
  42. 제 41 항에 있어서, 적어도 10-9M, 적어도 10-10M, 적어도 10-11M 및 적어도10-12M 중에서 선택된 적어도 하나의 친화도로 TNF와 결합하는 TNF 항체.
  43. 제 41 항에 있어서, 적어도 하나의 TNF 단백질의 적어도 한 활성을 실질적으로 중성화하는 TNF 항체.
  44. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  45. 제 44 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산 벡터.
  46. 제 45 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  47. 제 46 항에 있어서, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2,653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포 또는 이들의 임의 유도체, 불멸화 또는 형질전환된 세포중에서 선택된 적어도 하나인 숙주 세포.
  48. TNF 항체가 검출가능하거나 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 원 위치 조건하에서 제 44 항에 따른 핵산을 해독하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 제조하는 방법.
  49. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 추가로 함유하는 조성물.
  51. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 단편.
  52. (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체의 유효량을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 이에 투여하는 것을 특징으로 하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TNF 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 유효량이 세포, 조직, 기관 또는 동물 1 킬로그램당 0.001-50 mg인 방법.
  54. 제 52 항에 있어서, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  55. 제 52 항에 있어서, (a)의 접촉 또는 투여 전, 이와 동시 또는 그 후에 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  56. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 포함하며, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 상기 항-TNF 항체를 접촉시키거나 투여하기에 적합한 의약 장치.
  57. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 용액 또는 동결건조 형태의 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 함유하는 컨테이너 및 포장재를 갖는, 인간 약제 또는 진단용 제조품.
  58. 제 57 항에 있어서, 컨테이너가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피 전달 장치 또는 시스템의 요소인 제품.
  59. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 회수가능한 양으로 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 또는 식물 세포를 제공하는 것을 특징으로 하여 상기 항체를 제조하는 방법.
  60. 제 59 항에 따른 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 항-TNF 항체.
  61. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질의 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체.
  62. 제 61 항에 있어서, 적어도 10-9M, 적어도 10-10M, 적어도 10-11M 및 적어도 10-12M 중에서 선택된 적어도 하나의 친화도로 TNF와 결합하는 TNF 항체.
  63. 제 61 항에 있어서, 적어도 하나의 TNF 단백질의 적어도 한 활성을 실질적으로 중성화하는 TNF 항체.
  64. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  65. 제 64 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산 벡터.
  66. 제 65 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  67. 제 66 항에 있어서, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2,653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포 또는 이들의 임의 유도체, 불멸화 또는 형질전환된 세포중에서 선택된 적어도 하나인 숙주 세포.
  68. TNF 항체가 검출가능하거나 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 원 위치 조건하에서 제 64 항에 따른 핵산을 해독하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 제조하는 방법.
  69. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서, 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 추가로 함유하는 조성물.
  71. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 단편.
  72. (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체의 유효량을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 이에 투여하는 것을 특징으로 하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TNF 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 유효량이 세포, 조직, 기관 또는 동물 1 킬로그램당 0.001-50 mg인 방법.
  74. 제 72 항에 있어서, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  75. 제 72 항에 있어서, (a)의 접촉 또는 투여 전, 이와 동시 또는 그 후에 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  76. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 포함하며, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  77. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 용액 또는 동결건조 형태의 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 함유하는 컨테이너 및 포장재를 갖는, 인간 약제 또는 진단용 제조품.
  78. 제 77 항에 있어서, 컨테이너가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내,위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피 전달 장치 또는 시스템의 요소인 제품.
  79. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 동일한 TNF 단백질 영역에 결합하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 회수가능한 양으로 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 또는 식물 세포를 제공하는 것을 특징으로 하여 상기 항체를 제조하는 방법.
  80. 제 79 항에 따른 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 항-TNF 항체.
  81. 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체.
  82. 제 81 항에 있어서, 적어도 10-9M, 적어도 10-10M, 적어도 10-11M 및 적어도 10-12M 중에서 선택된 적어도 하나의 친화도로 TNF와 결합하는 TNF 항체.
  83. 제 81 항에 있어서, 적어도 하나의 TNF 단백질의 적어도 한 활성을 실질적으로 중성화하는 TNF 항체.
  84. 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  85. 제 84 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 분리된 핵산 벡터.
  86. 제 85 항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  87. 제 86 항에 있어서, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2,653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포 또는 이들의 임의 유도체, 불멸화 또는 형질전환된 세포중에서 선택된 적어도 하나인 숙주 세포.
  88. TNF 항체가 검출가능하거나 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 원 위치 조건하에서 제 84 항에 따른 핵산을 해독하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 제조하는 방법.
  89. 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  90. 제 89 항에 있어서, 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 추가로 함유하는 조성물.
  91. 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 단편.
  92. (a) 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 적어도하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체의 유효량을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 이에 투여하는 것을 특징으로 하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TNF 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법.
  93. 제 92 항에 있어서, 유효량이 세포, 조직, 기관 또는 동물 1 킬로그램당 0.001-50 mg인 방법.
  94. 제 92 항에 있어서, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  95. 제 92 항에 있어서, (a)의 접촉 또는 투여 전, 이와 동시 또는 그 후에 검출가능한 표지 또는 수용체, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 지양제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체약, 방사성 약물, 항우울제, 항정신병제, 흥분제, 천식약, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 또는 사이토킨 길항제중 적어도 하나중에서 선택된적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 유효한 양으로 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  96. 서열번호 9 의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 포함하며, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피중에서 선택된 적어도 하나의 형식에 의해 접촉 또는 투여되는 방법.
  97. 포장재 및 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 인간 CDR을 포함하는 용액 또는 동결건조 형태의 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 포함하는 컨테이너를 포함하는 인간 약제 또는 진단용 제조품.
  98. 제 97 항에 있어서, 컨테이너가 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복강내, 뇌내, 뇌실내, 창자내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼러스, 질, 직장, 볼, 설하, 비강내 및 경피 전달 장치 또는 시스템의 요소인 제품.
  99. 서열번호 9의 전체 아미노산 서열의 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 인간 CDR을 가지는 적어도 하나의 분리된 포유동물 항-TNF 항체를 회수가능한 양으로 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 또는 식물 세포를 제공하는 것을 특징으로 하여 상기 항체를 제조하는 방법.
  100. 제 99 항에 따른 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 항-TNF 항체.
  101. 본 원에 기재된 모든 발명.
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