HU229523B1 - Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses - Google Patents

Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses Download PDF

Info

Publication number
HU229523B1
HU229523B1 HU0302376A HUP0302376A HU229523B1 HU 229523 B1 HU229523 B1 HU 229523B1 HU 0302376 A HU0302376 A HU 0302376A HU P0302376 A HUP0302376 A HU P0302376A HU 229523 B1 HU229523 B1 HU 229523B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
tnf
human
antibodies
cells
Prior art date
Application number
HU0302376A
Other languages
English (en)
Inventor
Jill Giles-Komar
David M Knight
George Heavner
Bernard Scallon
David Shealy
Original Assignee
Centocor
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40673117&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU229523(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centocor filed Critical Centocor
Publication of HUP0302376A2 publication Critical patent/HUP0302376A2/hu
Publication of HUP0302376A3 publication Critical patent/HUP0302376A3/hu
Publication of HU229523B1 publication Critical patent/HU229523B1/hu
Priority to HUS1400015C priority Critical patent/HUS1400015I1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Description

A TNE-tüSt promBammaíotikus hatást eredmétiyez. ami szöveti sérülést okoz, mint például porc és csont leépülését [Sakbtvala, Natúré 322, 547-549. old (1986); Bertolmi, Kataré 319, 516-518. old. <1986}}, adhéziós molekulák indakálódását, beleértve koagulácids aktivitás indnkálását az erek eodoíéliális sejtjein (Pober és mtsai.» X tamL 136, 1680, old. (1986)}, a neutrofdek és limfociták tapadásának növekedését (Fobor és mtsai., .1, Immunoi. 138, 3319, old. (1987)], és stimulálja a Yérlemezke-aktiváló faktor felszabadulását a makrotágokból, neutroElekböt és az erek exsdotdliáüs sejtjeiből (Camasst és mtsai., X Exp, Med. 166, 1390, old. <1987)1.
Újabb eredmények kapcsolatba hozzák a TNF-alíás fertőzésekkel (Ceranti és mtsai., Immusol. Today 9, 28. old. (1988)}, immunológiai reítdelleAességekkel, usopláziás betegségekkel [öliö'és taís&i,, Cell 58,555. old. (198?)}, autoimmun betegségekkel és ’graft-versus-hosf betegségekkel [Piguet és misei., 3. Exp. Med, 166, 1280, old. (1987)}, A TNF-sdfa kapcsolata rákkal és fertőző betegségekkel gyakran a gazda kataboiikus állapotával vau AsszelLggésfeeu, A rákos páciensek tömege csökken, ami általában anorexiával jár együtt.
A rákkal és egyéb betegségekkel együtt járd túlzott pusztulást 'eachexia' neves ismerjük (Kern és mísai., J, Patent Erster. Nu.tr, 1.2, 286-298, old, (1988)}, A cuchexiával együtt jár az előrehaladott tömegveszíés, anorexia, és a rosszindulatú növekedésre adott válaszként & sovány testtömeg folyamatos eróziója. A eachektíkus állapot okozza legmkább a rák morbiditását és mortalitását. Van arra bizonyíték, hogy a TNF-aifa szerepet játszik a eachesiában a rákban, fertőző betegségekben és egyéb kaíábolikus állapotokban (lásd például Beuíler és Cer&mi, Aun. Eev. Immunok 7,625-655. old. (1989}}.
zkzt gondolják, hogy a TNT-atía központi szerepet játszik a grasvaegathr szepszisben és az endotoxinos sokkban (Michie és mtsat, 8r. X Surg. 76,678-671. old. (1989); Debets és mtssl, Seeond Vienua Shock Fórum, 463-466.old. (1989): Símpson és mtsai., Crit. Care Clb, 5,27-47, old, <1939)}, beleértve a lázat, rossz közérzetet, anorexiát és a cachexiát Aa endotoxiu erősen aktiválja .a ntonocita'nsakrofág-íermeíésí és FNF-sifa és egyéb cítokinok szekrécióját (Kombluth és mtsai., X immunoi, 137, 2535-2591, öld. (1986}}. A TNF-a!ía és más monoeits. eredetű eitokinek közvetítik. az eodotoxinra adott metabölikns és neurohormonális válaszokat {Msehíe és nttsal, New Bogi, X Med. 318, 1481-1486. old. (1983)}, Endotoxin beadása humán önkénteseknek heveny betegséget okoz mflucttzaszerö tünetekkel, beleértve lázat, szapora szívverést.
-2megnövekedctt meiabolikus sebességet és stresszhormonok felszabadulását (Revfeaug és mtsai,, Arch, Surg, 123, 162-17Θ. old. (198S)j. A keringésben lévő TNF-alfa mennyisége növekszik a örsm-negativ szepszisben szenvedő páciensekben fWaags és mtsai., tmcet i. 355-357. old. (1987); Hanrnserie és mtsat, Seeend Vienna Sfeocfc Fomm, '715-713, old. (1989); Debets ás mísai, Crit Care Med. 17, 489-497. old. (1989); Calaodfa és mísai., 3. fefect. Dis. 161,932-987, old. (1999)},
Hy «sódé® & 'IW-aifát kapcsolatba kozták gyulladásos betegségekkel, atóotsaaun betegségekkel, vitális, bakteriális és parazitikus feriőzésekkel, rosszinduluíá elváltozásokkal és/vagy neurogenerativ betegségekkel, és hasznos célpont betegségek specttite biológiai terápiájára, mini például reumatoid artritisz és/vagy Crok»-fele betegség esetében. A TNF-alfe elleni kiméra nsonoklonális ellenanyaggal (cA2) végzett nyílt klinikai vizsgálatokban jótékony hatásról számoltak be a gynllaáás szappressziójával és sikeres újbóli kezeléssel reurnaíoid arlriítsz újra elöjövsteSénéi (Effioti és mtsai,, Arthritis Rfeeusa. 36, 1681-1690. old. (1993); és Eilioíí és mísai., Láncét 344,11254127. oki. (1994)} és Crobn-téle betegségben (Van Dullsmen és mísai,, DasíroentcroSogy 109, 129-135. old, (1995)], A Ca2-vel végzett randoíntzálí, kettős vak, placebokontroüos vizsgálatban is jótékony hatásról számoltak be rentnatoid aríríttiszben a gyulladás szsppresszlójával [Eilíott és mísai., Láncét 344, 1105-11 ló, old. (1994)}. Cachektínként jetiejnzstt „modulátor” anyag (amelyről később azt találták, hogy azonos a TNF-fel) elleni ellenanyagokaí tárnak fel Cerami és mísai. (9212489. sztoú európai közzétételi Irak 1987. március 4.), Az ilyen ellenanyagokról azt állították, hogy hasznosak diagnosztikai immunológiai vizsgálati eljárásokban és sokk terápiájában bakteriális fertőzések esetén. Robin és mísai. (Ö2188Ó8, számú európai közzétételi irat, 1987, április 22.) humán TNF elleni monoklonálís ellenanyagokat tárnak fel, ilyen ellenanyagokat szekretáié hibridómákat, eljárásokat ilyen ellenanyagok előállítására és ilyen ellenanyagok alkalmazását TNF immunológiai vizsgálati eljárásában. Yene és mísai. (Ö2S8988, számú európai közzétételi irat, 1988. október 26.) anti-TNF ellenanyagokat tártak lel, beleértve monoklonálís ellenanyagokat, és azok alkalmazását betegségek imntanoiőgiai vizsgálati eljárással történő diagnózisában, különösen Kawasaki-féle betegség és bakteriális fertőzés esetében. A Kawasakí-féls betegségben [gyermekkori heveny lázas nyálkahártyái nyirokcsomó szindróma; Kawasaki, T., ÁHergy 16, 178. old. (1967); Kawasaki, T<, Sltonica (Pedisírics) 26, 935. old. (1983)] szenvedő páciens tesífolyadéhnrói azt állították, hogy emelkedett a TNF-szistjük, ami a betegség előrehaladásával állt kapcsolatban (Yone és mtsai., mint feni).
Más kutatók leírtak rdtombináms humán TNF-re specifikus tnonoklonélís ellenanyagokat, amelyeknek semlegesítő aktivitása volt íí? v/ρό (Ltang, C-M. és mísai., Btechem. Bíophys, Rés. Cotnm, 137, 847-854. old. (1986); Metsger, A. és mísai., Hybridoma 6,305-3l1. old. (1987) ; Fendfy és mísai., Hybridoma 6, 359-369. old. (1987) ; Sringtnan, T. S. és mísai,, Hybridoma 6,489-507. old. (1987); Hirai, M. és mísai., 3. immunoi. Meth. 96, 57-62. old. (1987); Mellet, A. és mísai., Cytoksne 2, 162-169. old, (1990)}. Szert monoklonálís ellenanyagok némelyikét alkalmazták a humán TNF epltópjamak térképezésre és enzimes immonolőgiai vizsgálati eljárások kifejlesztésére (Fendly és mísai., mint fent; Rirai és mísai,, mint feni; Moher és sntsai,, mint fent), ás rekomblnáns TNF tisztításának segítésére (Brixtgtaan és tntsaí,, mint fent). Azonban ezek a vizsgálatok nem alapozzák meg TNF-eí semlegesítő ellenanyagok előállítását, amelyek alkalmazhatók #t váró diagnosztikára vagy terápiára emberekben, 3Z.ok immunogemtása, specifitásásak éstfvagy gyógyászati alkrdmazhatóságának hiánya miatt.
-3TMP ellesi semlegesítő srstiszémmnkról vagy monoklosáhs ellenanyagokról kimutatták, hogy embertől elférő emlősökben hatással vannak a káros fiziológiai változásokra. és megakadályozzák a halált Isislís fertőzés «tán kísérletes endotexérnía és hskterémia esetében. Ezt a hatást demonstrálták például rágcsáló letahtási vizsgálati eljárásokban és főemlős beíegség-modeli rendszerekben (Mathíson, 3. C. és mtsaí., I Cím. .tevést «I, 1923-1937. old. (198S); Seníler, B, és mSsal., Science 229, 869-S?l.oift (1935); Tracey, K. 3. és mtsak, Kataré 330, 662-664. old. (1987); Sklntamoto, Y. és misai, Tssmxaei; tett. 17, 311-318. old. (1988); sava, A. X és mtsai, J. Isisei. Dis. 162,421-427. oki. (1990); öptó, S. M. és mtsak, 3. ínfect Dis. 161, 11481152. old. (1990); H&tshaw, t. 8. ésnkste., Clrc. Sboek 38,279-292. old. (1990)].
A hTNF feltételezed reeeptorkölő helyeit Eck és Sprasg tárták fel [I Siói, Chem. 264,- 17595-17605. old. (1989)(, akik a TNF-n í 1-13., 37-42., 49-57. és 155-157, aminosavaít azonosították, mint a kötőhely részeit. A WO 91/02078. számú nemzetközi közzétételi írat (elsőbbségi napja 1989; augusztus 7-e) olyan TNF-lignndnmokat tár fel, amelyek képesek kötődni az alábbi epltópokkaí rendelkező monokkmálís ellenanyagokhoz: az 1-29., 56-77. és 168-127. közül legalább egy; az 1-20., 56-77., 108-127. és 138-149. közöl legalább kettő; az 1-18., 58-65., 115-125. és 138-149. közöl mindegyük; az M8. és 108-128, közül mindegyik; az 56-79., 110-127. és 135- vagy 136-155. közöl mindegyik; az 1-30., 117-128. és 141-153. közöl mindegyik; az 1-26., 117-128. és 141-153. közöl mindegyik; a 22-40,,49-96, vagy -97., 110-127, és 136-153, közül mindegyik; a .12-22,, 36-45,, 96-165, és 132-157, közül mindegyik; sz 1-20. és 76-90. köztli mindkettő; a 22-40., 69-97., 165-12S. és 135 155. közül mindegyik; a 22-31. és 146-157. közöl mindegyik; a 22-40. és 4998. közöl mindegyik; a 22-40., 49-98. és 69-97, közöl legalább egy, g 22-40, és 70-87, közül mindkettő. A WO 97/291131. szántó nemzetközi közzétételi iratban olyan humán ellenanyagokat tárnak fel, amelyek teásán TKPs-hoz kötődnek. Ás ellenanyagokról azt állítják, hogy' magas sz affinitásuk & humán TNFa rmot (ΪΌ** M vagy kisebb Ká-eríék); kiesi a leáisszoeiációs sebességük -a humán TOFewról (IÖ<! sec ’ vagy kisebb Keg-érték) ős képesek semlegesíteni a humán INFn aktivitást in vitt» és in vívó.
Nem-humán emlős, kíméra, polikfonális (például antíszárumok) éWvagy monokfonális ellenanyagok (Mabs) és ffagmensek (például azok proteölitíkhs emésztési vagy fúziós fehérje témákéi) potenciális terápiás ágensek, amelyeket tanulmányoznak bizottyas esetekben bizonyos betegségek kezelésének megpróbálásúra. Azonban sz ilyen ellenanyagok vagy h-agmensek irnsnunvákiszt válthatnak ki, amikor beadják azokat embereknek. Az ilyen immunválasz az ellenanyagok vagy fragmensek ímmttskomples által közvetített kiürítését eredményezheti a keringésből, és az ismételt beadást alkalmatlanná teheti terápiás célra, ezáltal csökkentve a páciensre gyakorolt jótékony terápiás hatást, és korlátozhatja az ellenanyag vagy ffagmens újbóli beadását. Például nem tetten részleteket tartalmaz» ellenanyagok vagy fbagmextsek ismétek beadása szérombetegséghez ős/vagy túlérzékenységhez vezethet. Annak érdekében, hogy elkerüljük ezeket és más problémákat, számos megközelítési utódot megkíséreltek, hogy csökkentsék az ilyen ellenanyagok és ezek részleteinek az ímmunogenitásáí, beleértve a kímerizálást és humanizálást, amint az jól ismert a szakterületen. Ezek és más megközelítést módok azonban még mindig olyan ellenanyagokat vagy fragrnenseket eredményezhetnek, amelyeknek még mmátg van valamennyi imntenogenitása, alacsony az aífnriíáss, alacsony az sviditásn, vagy problémásak sejttenyéssetbea, felnagyításban, gyártásban, és/vagy alacsony a kitermelésük. Ily módon az Ilyen ellenanyagok vagy &agmertsek az ideálisnál kevésbé alkalmasak gyártásra vagy terápiás fehérjeként történő alkalmazásra,
-4Raask megfelelően igény vas oly® aatí-TNF ellenanyagok vagy íragmensek biztosítására, amelyek ezen problémák közöl egyre vagy többre megoldást nyújtanak, valamint igény van az ismert ellenanyagok vagy azok fmgmensei javítására.
Á találmány tárgyat izolált humán, főemlős, rágcsáló, emlős és/vagy kiméra aaö-INF ellenanyagok képezik, valamint astí-TNF elfemmy&g-készítmésysk, kódoló nidtletnsavak, vektorok, gazdasejtek, készítmények, és alkalmazások, amint ezeket a leírásban leírjuk és feltárjuk, kömbináivg mindazzal, ami ismert a szakteröleten,
A találmány szerinti ellenanyag bármilyen olyan ellenanyag, amely tartalmazza:
a TNV14S nionoklonális ellenanyag nehézlánc komplementaritást meghatározó régiók (CDR) és variábilis váztógáóit <FR), amint a 4. ábra bemutatja; és a TMV14S monoklonális ellenanyag könnyűlánc CDRr-Jeit és variábilis FR-jeil, amint az 5. ábra bemutatja;
és amely adott esetben továbbá tartalmazza a megadott prolírt-szerin szubszidöciót & TNVI48B moookionális ellenanyag FR3 régiójában, amint a 4. ábra bemutatja.
Találmány szerinti ellenanyag származhat bármilyen emlősből, nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyálból, patkányból, rágcsálóból; főemlősből, vagy ezek bármilyen kombinációjából, és hasonlókból.. A. találmány tárgyát képezi továbbá izolált nukieinxav-moiekula, amely az találmány szerinti ellenanyagot kódoló poiínukleotidot tartalmaz; rekombíaáns vektor, amely a miklemsav-mofekulát tartalmazza; gazdssejt, amely a nakiemsav-molekuláí vagy a vektort tartalmazza; készítmény, amely az ellenanyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz; és az ellenanyag vagy- a készítmény, diagnózisban vagy terápiában való alkalmazásra, előnyösen immunológiai betegség kezelésében történő alkalmazásra,
A leírás olyan izolált nukfemsav-mofekeiákat ismertet, amelyek tartalmaznak olyan specifikus antiTNF ellenanyagokat kódoló poliaoklcoíidot, vagy komplementerek azzal vagy hlbrídizálsak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza. A .leírás ismertet továbbá az sníi-TbiF ellenanyag nekielasav-rsölekolákat tartalmazó reko?nhináns vektorokat, ilyen nuklemsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazö&sejíeket, valamint eljárásokat Ilyen elientmysg-nnkfeinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.
legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy epitóphoz, amely specifikus legalább egy TNF fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy' epitóp tartalmazhat legalább egy eiienanyagkötő régiét, amely legalább egy részletét tartalmazza a fehérjének, amely epitóp előnyősön annak legalább egy részletének legalább 1-5 aminosavából áll, mint például nem korlátozó példaként a Fehérje legalább egy fanteícmális, extracelteiáris, oldható, hidrofil, kölső vagy dtóplazmatikos doménját, vagy annak bármely részletét,
A találmány tárgyát képezi legalább egy találmány szerinti izolált aati-TNF ellenanyag is, ahol az ellenanyagnak van legalább egy aktivitása, mint például nem korlátozó példaként TNF-sndukáií sejtadhéziós molekulák inhibiciója, TNF receptorhoz történd kötődésének ínblbícíója, Arírixt'szes· Index növelése egér modellbe!?, (lásd például a 3-7, példákat). Egy antl-TNF elfenanyrsgot tehát szkrínelhedtók megfelelő
-5aktlvitásra ismert módszerek -szériát,. mint péltet nem korlátozó példaként legalább egy, TN.F fehérje iránti biológiai aktivitásra,
A leim ismertet legalább egy eljárást ís legalább egy anti-'fNF eifefttmyag vagy TNF antí-idlotípus expresszálíatására gazdassjtbon, amely szerint taiálmárty szerinti gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, ahol legalább egy ssti-TNF ellenanyag expresszálóálk detektálható és/vagy visszanyerhető mennyiségben.
A leírás ismertet legalább egy készítményt is, amely (a) találmány szerinti izolált anti-TNF ellenanyagot kódoló nakbinsavat és/vagy- ellenanyagot és (b) megfelelő hordozót vagy' oldószert tartalmaz, Á hordozó vagy oldószer adott esetben gyógyászatiéig elfogadható lehet, mint például ismert hordozók vágyoldószerek, A készítmény adott esetben továbbá tartalmazhat legalább egy további vegyületet; fehérjét vagy készítményt,
A leírás ismertet továbbá legalább egy anti-TNF ellenanyagot alkalmazó eljárást vagy készítményt, gyógyászstilag hatásos mennyiségben történő beadásra, begy moduláljunk vagy kezeljünk legalább egy TNFfel összefüggó állapotot sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt követben vagy annak során, amint az ismert a szakterüle ten és/vagy a jeles le írásban feltárjuk,
A leírás ismertet legalább egy készítményt, eszközt és/vagy eljárást is, legalább egy taláhnásy szerinti anti-TNF ellenanyag gyógyászatiiag vagy prohlakfikosan hatásos mennyiségben történő beadására,
A leírás ismertet továbbá legalább egy anti-TNF ellenanyagot alkalmazó eljárást vagy készítményt, legalább egy TblF-fel összeíhggó állapot diagnosztizálására sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt kővetően vagy annak során, amint az ismert a szakterületen és/vagy a jelen leírásban feltárjuk.
A leírás ismertet legalább egy készítményt, eszközt és/vagy beadási eljárást is, legalább egy találmány szerinti anti-TNF eliensnyag diagnosztizálására.
Az 1. ábrán TNV monoklonális ellenanyagoknak hibrídöma sejtek feiülüszójáhan TNF-a rekombínáns TNF-receptorfeoz való kötődésének gátlására való képességét bemutató vizsgálati eljárást mutatunk be. Különböző mennyiségű. Ismert mertnyiséga TNV rsonokionális ellenanyagot tartalmazó híbridóma sejiTelölőszét előlnkabáltunk rögzített koncentrációjú (5 ng/ml) uil-vel jelzett TNF-«-vah A keveréket átvittük 9b-mérőhelyes Öp/ipi’aís lemezekre, amelyeket előzőleg bevontunk pSS-sö-vel, amely egy rekombináas TNF-reeeptorilgö fúziós fehérje. A mönoklonálís ellenanyagok jelenlétében a p55-reeepiorhoz kötődök TN'F-a mennyiségét meghatároztuk a nem kötődött anyag elmosása és gamma-számlálóval történő számlálás után. Habár nyolc TNV monoklonális ellenanyag mintát teszteltünk ezekben a kísérletekben, az egyszerűség kedvéért bárom olyan monsklosnáSs- ellenanyagot nem mutatunk be itt, amelyekről DNSszekveneia elemzéssel kimutattuk, hogy azonosak a többi TNV monoktenáhs ellenanyag egyikével (lásd az 5.2.2 fejezetet). Mindegyik mintát két párhuzamosban teszteltük, A bemutatott eredményeket két független kísérletet reprezentálnak.
A 2. ábrán a TNV monoklonális ellenanyag nehéziám: variábilis régiók DNS-szokvencíáit mutatjuk be. Á bemutatott csíravonsl gén a DF-46 gés. ’TNV’ jelzi azt, hegy a bemutatott szekvencia a TNV.I4, TNV I5, TNV 14.8 és TNV 19ő szekvenciája. Az első bárom rtukleottd a TNV szekvenciában a Meí transzlációs inicláciös ködöst kódolja. A TNV monokiersális ellenanyag génszekvenciában a pontok azokat a nukleotidokat
-ő jőízik, amelyek megegyeznek á csífevoaal-szekvetóávai. A TNV szekvenciák első 19 wkleotfega (aláhúzva) megfelel a variábilis régié PCR-attíplirikálásához zákateazott óiígonukleotidnak. Az érett monoklonális ellenanyagiéi kezdődő .aimnesav-traaszláciőt (egybetös rövidítések) csak a csírayonal gén esetében mutatjuk be. A csfeavoaal aminosav-bansdáció bárom CDR-doménját félkövéren és aláhúzással jelöljük. A TNV 148(B) -jelzésé vonalak azt jelzik, hogy a .bemutatott szekvencia mind a TNV14&-höZ, mind a TNV14SB» hez is tartozik. A hiányzó részek a cs&awaal .DNS-szekveacíában (CDR3) amiatt vannak, hogy' & szekvencia nem ismert vagy sem létezik a csítavors&i génben. A TNV' monoklonális ellenanyag nebézíáacábmt a J6 kapcsolőrégió található meg.
A 3, ábrán a TNV monöklonáhs ellenanyag könayülánc variábilis régiók DNS-szekvenciáit mutatjuk be, A bemutatott csíravonal gén a humáB kappa csíravonal variábilis régió gének Vg/ÍSK családjának reprezentatív tagja. A TNY monoklonális ellenanyag génszekvenciában a pontok azokat a «ukfectidokat jelzik, amelyek megegyeznek a csíravonal-szekvesciávnl. A TNV szekvenciák első 16 nukkotidja (aláhúzva) megfelel a variábilis régió PCR-ampííiíkálásához alkalmazott oligonuklesddnak. Az érett monoklonális ellenanyag sminosavMranszláció}át (egybetös rövidítések) csak. a csíravonal gén esetében mutatjuk be, A csíravonal aminosav-trsnszláciá három CDRrööttsénját félkövéren és aláhúzással jelöljük. A TWi48(8) jelzésit vonalak azt jelzik, hogy a bemutatott szekvencia sarad a TNV148»hoz, mind a TNV148B4iez is tartozik. A hiányzó részek a csíravonal DWS-szekvcncíában. (CDR3) amiatt varrnak, hogy a szekvencia nem ismert vagy nem létezik a csíravonal génben. A TNV monoklöíiálís ellenanyag könnyhiláncában a J3 kapcsoiószekvencia található meg,
A 4, ábrán a TNV monokfertális ellenanyag sehézfáne variábilis régiók kikövetkeztetett aminosavszekvenciáit mutatjuk be. A .bemutatott ammosav-szekvencíákat (egybstüs rövidítések) sem klónozott PCRtermékek és klónozott PCR-termékek DNS-szekvenciájából következtetőik ki. A. aminosav-szekvescíákat szekréciós szignáiszekveseia (signai), vázrégjő (FW)- és komplementaritást meghatározó régió (C.DR) döntésekre felosztva mutatjuk 'be. A DP-46 csíravonal gén amiaösav-szekvesciáját minden egyes dómén esetében s felső sorban mutatjuk be. Fontok jelzik azt, ha a TNV monoklotrális ellenanyagban a csíravonal génnel azonos aminosav van, A TNV 148(B) jelzi, hogy a bemutatóit szekvencia mind a TNV 148-hoz, mind- a TNYI4SS-hez is- tartozik. ’TNV1 jelzi azt, ha s szekvencia az összes TNV mönoklonálís dteuanya^hoz tartozik, hacsak eltérő szekvenciát nem mutatunk be, A szaggatott vonal a csíravonal'szeks'endában (CDR3) azt jelzi, hogy' a szekvenciák nem ismertek vagy nem léteznek -a csíravonal génben.
A 5. ábrán a TNV manoklonális ellenanyag könnyüíáne variábilis régiók kikövetkeztetett ammosavszekvenciáit mutatjuk be. A bemutatott amhosav-szekveneiáksí (egybetös rövidítések) nem klónozott PCRtermékek és kiónozott FCR-termékek DNS-szekvenciájából következtettük ki. A undnosav-szekvencíákat szekréciós szígnálszekvencia .(ssgsal), vázrégió (FW) és komplementaritást meghatározó régió (CDR) domónekre felosztva mulatjuk be. A VgZ38K típusú könnyűiáne csíravonal gén mabmssv-szekvenciáját minden egyes dómén esetében a felső sorban matatjuk be, Pontok jelzik azt, ha -a TNV raonoklonális ellenanyagban a esíravonai génnel azonos msinssav van. A TNV 148(B) jelzi, hogy a betnuíatott szekvencia mind a TNV148-feöz, mind a XNVÍ4§8-bez is tartozik. ΆΠ’ jelzi azt, hogy a- bemutatott szekvencia TNV 14, TNV 15. TNV148, TNVÍ 4SB és TNV 186 mindegyikéhez tartozik.
-7Á 6. ábrán az rTMVí488-t expresszáló C466 sejtek előállításához aStateasasíí nehéz és könttyő lánc expresszíős ptamidók. sematikus illusztrációját mutatjuk be. Á pl783 a aehőzlásc plaztnÍd és a pl776 a kösnyülánc piazmid. Az rTWMSS variábilis ás. állandó régiók kódoló doménjeít fekete téglalapokkal jelezzük. A ,Í-C teswofc ímmtusglebalfe eafeaocereít szürke téglalapokkal jelezzük, Fehüntetjtlk a releváns restrikciós helyeket is. A plazmidokst olyan Irányítottságban matatjuk be, hogy az ellenanyag gének transzkripciója az. óramutató járásával megegyező irányban történik. A pl783 pfeasróá 19,3 kb hosszúságii és a pl?76 plazmid 15,06 kb hössz&ságú. Mindkét piazmíd teljes nukteotid-szekvencíája ismert. A pl783 plazmidon a variábilis régió kódoló szekvenciáját, könnyedén belyettesltheíjük másik nehézlánc variábilis régió szekvenciával, a BsiWbBsiBl restrikciós fragmens helyettesítésével, A. pl 776 plsztnidos a variábilis régió kódoló szekvenciáját helysttesitheSjük másik variábilis régió szekvenciával, a SaH/ASll restrikciós fhigmens helyettesítésével,
A 7, ábrás öt r7MV148B-t termelő sejtvonal növekedési görbéjét mutatjuk be. A tenyészeteket a ő. napon sejteknek T?5 edényekbe történő leoltásával indítottuk ISQ+MJfX tápközegben, 1,0 X 105 sejttel életképes sejísílrhséggel 3Ö mi térfogatban. Az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott sejtíestyészeteket folyamatos tenyészetben tartottuk a transzfekíálás óta, és szubklónoztuk azokat Áz azt kővető napokon a Tedényben lévő sejtekiet alaposan felsmszpenááltuk, és 0,3 ml alikvotot vettünk a tenyészetből, A növekedési vizsgálatokat akkor fejeztük be, amikor a sejtszám 1,5 X 10*' sejttel alá esett. Az alikvotban lévő élő sejtek számát íripánkék kizárással határoztuk meg, és az alíkvot megmaradó részét eltettük a tttönokionális ellenanyag koncentrációjának későbbi meghatározására. Ugyanekkor komán IgG ELISA-í hajtottunk végre az összes mintán,
A 8. ábrán a sejtek növekedési sebessége ősszehasonlitásásak: gr&Skus reprezentációját mutatjuk be különböző koncenírádojú MHX-szeiekciÓ jelenlétében. A C466Á és C4ÓŐÖ jelű szubklönökat felolvasztottuk MHX-tnentes tápközegben flhíDM, 5%. FBS, 2 mM glntamís), és további két napos keresztül tenyésztettük azokat. Azután mindkét sejtttmyészetet három tenyészetre osztottak szét, amelyek vagy nem .tartalmaztak MJfX-ep vagy' Ö,2X MHX-eí vagy IX MHX«et tartalmaztak. Egy nappal később friss T75 edényeket oltottunk be a tenyészetekkel, 1 X lő5 .sejttel kiindulási sűrűséggel, és a sejteket .24 órás időközönként megszámoltuk egy héten keresztül. Kiszámítottuk a. megkettöződési időket az- első S napon az SÖF PD32.Ö25 szerinti képlet alkalmazásával, ős azokat a téglalapok felett mutatjuk be,
A 9, ábrán két rTNVl48B«et termelő sejtvonal monöklonálls ellenanyag termelése időbeli stabilitásának a grafikus reprezentációját mutatják be, A szobklónokat Folyamatos tenyészetben tartottuk a tmnszfektálások óta, és sznbklónazásí alkalmaztunk a hosszú távó sorozatos tenyészetek indítására 24mérőhelyes tenyésztő csészéken, A sejteket 15Q tápközegben tenyésztettük MHX szelekció nélkül. A sejteket folyamatosa» passzoltuk a tenyészetek 4-6 naponta történő szétosztásával, hogy űj életképes tenyészeteket tartsunk Fenn, míg a korábbi tenyészeteket hagytuk kimerülni, A kimerült sejtfehllöszőkat összegyűjtöttük röviddel sz után, hogy kimerültek, és tároltak addig, amíg meg nem határoztuk a monoklonális ellenanyagok koncentrációját. Ugyanekkor humán IgG ELlSA-t hajtottunk végre az összes mintás.
A ló. ábrán a Tgl97 aririíiszes modellegér tömegének változását mutatjuk be találmány szerinti aníiTKF ellenanyagokra adott választ:!, amint azt kouírollokkal összehasonlítjuk & 4. példában, Megközelitőieg 4 hetes korban a vizsgálati Tg.197 egereket 9 kezelési csoport egyikebe osztottuk be a nemük és testtömegük
-8alapján, és Osdfeec&o-féle PBS (D~h8S) vagy találmány szerinti mít-INF ellenanyag (TNV 14, TNV14S vagy 'ÍNV1%) egyetlen íntraperttosáíis hótoss dózisával kezeltük vagy 1 mg/kg, vagy 18 mg/kg dózisban. Amikor a tömegeket elemeztük a dózis előttihez mért változásra, a 18 mg/kg. cA2-vei kezeit állatok az egész vizsgálatban következetesen nagyobb tömeggyampodásí mutattak, mint a D-PSS-sel kezelt állatok. Ez a tthneggyarapoáás szignifikáns volt & 3-7. héten, A 18 mg/kg TNV148-cal kezeit állatok szintén szignifikáns tömeggyarapodást matattak a vizsgálat 7, hetében.
A 11 A-l IC. ábrákon & betegség sölyosbodásáí mutatják' be a 4, példa szerint az ariritíszes index alapján. A 18 mg/kg eÁ2-vei kezeit csoport artritiszes indexe alacsonyabb volt a 3. héttől kezdve a vizsgálat hátralévő részében (a 7, hétig), mint a D-PBS kontroli csoporté,. Az 1 mg/kg TNV14-gyel kezeit állatok és az 1 mg/kg cA2-vel kezeit állatok nem mutatták az AT. szignifikáns csökkenését a 3. hét után, amikor összehasonlítottuk azokat a D-PBS-sei kezeit csoporttal. Nem volt szignifikáns különbség a '10 mg/kg-as kezelési csoportok között, amikor azokat a hasonló dózist kapott csoportokhoz hasonlítottuk <10 mg/kg. cA2 összehasonlítva a 18 mg/kg. TNY14-gyel, 148-cal és 190-tai), Amikor az 1 mg/kg-ss kezelést csoportokat hasonlítottuk' össze, az 1 mg/kg TNV 14? csoport szignifikánsan alacsonyabb Aí-i mutatott a 3., 4. és 7. héten, mintáz 1 mg/kg cA2. Az 1 mg/kg TNV148 csoport szintén szignifikánsan alacsonyabb volt a 3. és 4, héten, mint az 1 mg/kg TNV14-gyei kezelt csoport. Habár a TNVÍ9Ő szignifikáns csökkenést mutatott az Ai-bea a vizsgálat ó, hetéig (a D-PSS-sel kezelt csoporttal összehasonlítva), a TNV!4S volt az egyetlen 1 mg/kg-os kezelés, amely szignifikáns maradt s vizsgálat befejezésekor.
A 12. ábrán a TgíS7 srtrifiszes modéilegér tömegesek változását mutatjuk be találmány szerinti aníiTNF ellenanyagokra adott válaszul, amint art kontótokkal összehasonlítjuk az 5, példában. Megközelítőleg 4 hetes korban a vizsgálati Tgí97 egereket 8 kezelési csoport egyikéhe osztottuk be a testtömegük alapján, és kontói anyag (D-PBS) vagy ellenanyag ('FNV14, TNV í 48) ísö'aperitonális boiusz dózisával kezeltük 3 mg/kg dózisban (8. hét). Az tojekciókat minden állatnál megismételtük az L, 2., 3. és 4. héten. Az 1-6, csoportot értékeltük a leszíanyag hatásosságára, Szérummmtáfcai vettünk a 7. és 8. csoport állataitól, és értékeltük szokat immunválasz indukálásám és a TNV 14 vagy’ TNV 14S fenskokisetikaí fciüralésére a 2., 3. és4. héten.
A 13Á-13C. ábrákon a betegség sóiyosbodását mutatjuk be az 5. példa szerint az artritíszes index alapján. A 18 mg/kg oA2-vel kezelt csoport aríritiszes indexe szignifikánssá alacsonyabb volt a 2. háttól kezdve a vizsgálat hátralévő részében (az 5, hétig), mist a D-PBS kontroli csoporté. Áz 1 mg/kg vagy 3 mg/kg cA2~vel kezelt állatok és a 3 tng/kg TOV 14-gyel kezeit állatok a vizsgálat folyamán semmikor -sem érték el az 41 szignifikáns csökkenésék amikor összehasoaiítottuk scsekat a D-PSS-sei kezelt kontroll csoporttal. A 3 mg/kg- TOV148-cal kezelt állatok szjgnifikátis csökkenést mutattak a 3. héttől kezdve az S, hétig, összehasonlítva a D-PBS-scl kezeit csoporttal. A 18 mg/kg cA2-vel kezelt állatok sz. Ál szignifikáns csökkenését mutattak összéhasoniitva a cA2 mindkét alacsonyabb dózisával (1 mg/fcg és 3 mg/kg) a vizsgálat 4. és 5. hetében, és az 41 színién szignifikánsan tdacsonyabh volt, mint a TNV14-gyel kezelt állatoké a 3-5, héten. Habár nem látszott szignifikáns különbség egyik 3 mg/kg-os kezelési csoport között sem, a 3 mg/fcg TNVÍ4-gyel kezeit állatok Al-je bizonyos időpontokban szignífikánssn magasabb volt, mint a 18 mg/kg~msi kezeiteké, míg a TNVí48-eal kezelt állatok nem különböztek szignifikánsan a 18 mg/kg. cA2-vel kezelt állatoktól.
A 14, ábrán & Tgl97 artritiszss modellegér tömegének változását mutatjuk be találmány szerinti mlTNF ellenanyagokra adott válaszul,, amfet azt kontroliokkal összehasonlítjuk a ó. példában. Megközelítőleg 4 hetes korban 3 vizsgálat! Tgí97 egereket é késelési csoport egyikébe ssztotfttk be. a.nemük és testtömegük alapján, és ellenanyag (eAl vagy TNV148) egyetlen mtraperitencáhs bőlusz dózisával kezeltük vagy 3 mg/kg, vagy 5 mg/kg dózisban. Ebben a vizsgálatban D-PBS és 1Ö mg/kg «Α2 kontroll csoportokat aScalmazömk.
A 15 , ábrán a betegség súlyosbodását mutatják be a 6, példa szedet az artritiszes Index alapján. Az összes kezelési csoport mutatott valamekkora védelmet a korábbi időpontokban, az 5 mgkg cA2 és az 5 mg/kg TNV148 az Ál szignifikáns csökkenését m.utaíta az 1-3, héten, és az Összes kezelési csoport szignifikáns csökkenést matatott a 2. héten. A vizsgálat későbbi szakaszában az 5 mg/kg cÁ2-vel kezelt állatok .mutattak valamekkora védelmei, szignifikáns csökkenéssel a 4.» 6. és 7. bélés. Az alacsony dózisú (3 mg/kg) eA2- és TNV14S szigtriskáns csökkenést mutatott a 6. héten, és az Összes kezelést csoport szignifikáns csökkenést mutatott a 7. héten. Az egyik kezelési csoport sem volt képes szignifikáns csökkenést fenntartani a vizsgálat végéig (S. hét). Nem volt szignifikáns különbség egyik kezelési csoport között som, egyik időpontban sem (kivéve a söolösios kontroli csoportot),
A 16. ábrán a Tg 197 artritiszes modellegér tömegének változását mntafjpk be találmány szerinti andTNF ellenanyagokra adott válaszai, amint azt kontroliokkal összehasonlítjuk a 7. példában, A TNV148 (hibridóms sejt eredeti!) és rTNVl4.8B (transz&kíált sejt eredetá) egyetlen iníraperitoneális dózisa hatásosságának összehasonlítása. Megközelítőleg 4 hetes korban a vizsgálati Tg 197 egereket 9 kezelést csoport egyikébe osztottuk be a nemük és testtömegük alapján, és Dalbecee^féle PBS (D-PBS) vagy ellenanyag (TNVΊ48, ÍFNV548S) egyetlen mtraperitoncális bőlusz dózisával kezeltük 1 mg/kg dózisban.
A 17. ábrás a betegség súlyosbodását mutatják be a 7, példa szerint az artritiszes index alapján, A lö mg/kg eA2-veí kezelt csoport artritiszes indexe alacsonyabb volt a 4. héttől kezdve a vizsgálat hátralévő részében (a S. hátig), mint a D-PSS kontroll csoporté. Mind a TN'Vldb'ca? kezelt csoportok, mind az I. mg/kg eA2-vel kezelt csoport az Ál szignifikáns csökkenését mutatta a 4, héten. Habár korábbi vizsgálatok (P-099Öl7j azt mutatták, hegy a FNV148 kissé hatásosabb az artritiszes index csökkentésére egyetlen 1 mg/kg mtrapcrhooeáiís bőtesz beadását követfen, ez a vizsgálat azt mutatta, hogy' az Ál a 7NV ellenanyag mindkét változatával kezeit csoportban kissé magasabb volt. Habár sz 1 mg/kg «A2«veí kezeit csoportban .nem volt szignifikáns növekedés (a ő, hét kivételével), összehasonlítva a lö tttg'kg cA2-vsl kezeit csoporttal és a TNVl48Cal kezelt, csoportokkal szigaiftkánsan magasabbak voltak a 7,és 8. héten, nem volt szignifikáns különbség az Aí-baa sz í mg/kg cÁ2, 1 mg/kg TMV148 és 1 mg/kg TNV 14SB csoportok közőrt a vizsgáim egyetlen pontján sem,
A találmány tárgyát izolált, rekombírtáas és/vagy ssmtetlte anti-TNF .barnást, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, ellenanyagok képezik, valamint készítmények és .kódoló nafcieínsav~®oleku.lák, amelyek legalább egy anh-TNF ellenanyagot kódoló legalább egy poíinukleodd tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi továbbá nem korlátozó példaként ellenanyagok alkalmazása, például diagnosztikai és terápiás készítményekben, eljárásokban és eszközökben.
A leírás szerinti értelemben „aati-tumornekrózis-faktor-alfa ellenanyag”, „anfí-TbíF ellenanyag’, „anti-TNF ellenanyag részlet” vagy „anti-TNF ellenanyag fragmess* és/vagy „antí-TNf ellenanyag variáss”
- wés hasonlók alatt bármilyen olyas fehérje- vagy peptidtartalmá molekulái értünk, amely Immunglobulin moleknla legalább egy részletét tartalmazza, mist például sem korlátozó példaként nehésláne vagy könnydláuc legalább egy fcompfemeswiíást meghatározó régióját (CDR) vagy ásnák bgaodamkótő részletét, nehézláne -vagy könnyílláne variábilis, régióját, nehóriánc vagy könayölésc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, vagy TNF-receptor vagy kőtőfehérje legalább egy részletét, amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Ilyen ellenanyag adott esetben továbbá hat egy speclf&as Hgandumra, mint például nem korlátozó példakést amikor sgy ellenanyag modulál, csökkent, növel, aníagönizál, agonizál, csiliaplt, enyhít, gátol, inhibeát, befolyásol és/vagy zavar legalább egy INF aktivitást vagy kötődést, vagy TNF-receptor ídrtivitást vagy kötődést, te rte-o, /« stez vagy te tevő. Nem korlátozó példaként antí-TNF ellenanyag, meghatározott részlet vagy variáns kötődhet legalább egv TNF-hes, vagy' annak meghatározott részletéhez, variánsához vagy doménjáhos. Egy megfelelő anti~TNF -ellenanyag, megbatározott részelt vagy variáns adott esetben befolyásolhat legalább egy TNF aktivitást vagy fimkcíőt is, mist például nem korlátozó példaként RNS-, DNS- vagy fehérjeszintézist, TNF-feiszsfeadulást, TNF-réoeptor jeltovábbítást, membránTNF-hasitást, TN'F-aktivítást, TNF-isrmelesí -és/vagy szintézist Az „ellenanyag” kifejezés alatt értőnk továbbá ellenanyagokat, azok emésztési fragmenseii, meghatározott részleteit és variánsait, beleértve ellenanyag mlmetíkumokat vagy ellenanyagok olyan részleteit tartalmazókat, amelyek utánozzák egy ellenanyag vagy annak meghatározott Iragmenssnek vágj' részletének a szerkezetét és/vagy funkcióját, beleértve az egyláncó ellenanyagokat és azok íragmenseit. Faukcionális S'agmensek közé tartoznak olyan ellenanyagkötő fragmensek, amelyek emlős TNF-hez kötődnek, TNF-hez vagy annak részletéhez kötődni képes eilensnyagfragnrcnsek találmány tárgykörébe tartozó nem korlátozó példái közé tartozik az Fab (például papaines emésztéssel), Fab' (például pepszines emésztéssel és részleges redukcióval) és F(ab’)2 (például pepszines emésztéssel), fach (például plazmínns emésztéssel), pFc’ (például pepszines vágj' plazminos emésztéssel), Fd (például pepszines emésztéssel, részleges redukcióval és reaggregációval), Fv vagy scFv (péidáal molekuláris biológiai módszerekkel) ftagmens (lásd például C.Mligan, „immunology”, mmt font).
Ilyen fi-agmenseket eozimatiktís hasítással, szintetikus vagy rekombináns módszerekkel állíthatunk elő, amint az ismert a szakterületen és/vagy a leírásban feltárjuk. Ellenanyagok előállíthaték különféle csonkolt formákban is, olyan ellenanyag-gének alkalmazásával, amelyekbe egy vagy' több stopkodon lett beépítve a természetes stcpkodoa helyétől leolvasással ellentétes Irányban, Például tervezhetünk FCab’jz séhézláac részletet kódoló kombinációs gént úgy, hogy' tartalmazza a nehézlánc CH} doménját és/vagy csuklórégióját kódoló DNS-szekveneíákat, Ellenanyagok különféle részleteit összekapcsolhatjuk hagyományos kémiai módsz.erekkel, vagy összefüggő fehérjeként állíthatjuk elő azokat génsebészeti módszerek alkalmazásával.
A leírás szerinti értelembe» & „tortán ellenanyag” kifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amelyben a fehérjének lényegében minden részlete (például CDR, vázrégió, Cu €« bőmének (példás! CH?, CH2, CHj), csukló (Vts V«>jj lényegében nem inummogén emberekben, és csak apró szekvencia-változásokat vagy variációkat tartalmaznak. Hasonlóképpen, főemlős (majom, pávián, csimpánz, sfb.), rágcsáló (egér, patkány, nyúl, tengerímalac, hörcsög és hasonlók) és egyéb emlős megjelölés alatt ilyen táj, ^nemzetség, nemzetség, alcsalád és család ellen specifikus ellenanyagokat értünk. Ezenkívül kintéra ellenanyagok alatt értjük a fentiek bármilyen kombinációját. Ilyen változások ás variációk adott esetben és előnyösen, megtartják vagy csökkentik az ímraunegemtást emberekben vagy más fajokban a nem módosított ellenanyagokhoz képest, ily módon egy Iramán ellenanyag különbözik egy kiméra vagy humanizált elieusnyagtől. Megjegyezzük, hogy Iramán eileoanyagot elő lehet állítani sem humán áOatban vagy olyan preksrióts -vagy eukariota sejtben, amely képes fenkeionslíss© átrendeződött humán irarausglobulra ^például nehózíáac és/vagy könnyülánc) gének expresszálására, Ezenkívül araikor -egy humán ellenanyag egyláncö ellenanyag, az tartalmazhat olyan kspesolópeptídet, amely sem. található meg a természetben megtalálható humán ellenanyagokban. Példán! egy Fv tartalmazd kapcsolőpepődef, mist például kettő és körülbelül nyolc közötti számó· glic'rat vagy más arabosav-oidaliátstoh amelyek összekötik a nehézlánc· variábilis régióját és a könnyöiánc variábilis régióját, ilyen kspcsolópepfidekeí humán eredetűnek tekintünk.
.BJspectSfots, heterospecifikas, heterokonjugált vagy hasonló ellenanyagokat is alkalmazhatunk, amelyek lehetnek motmklooáBs, előnyösen humán vagy humanizált ellenanyagok, amelyeknek legalább két különböző antigén iránt van kÖfőspeciStása. A jelen esetben az egyik köíőspedfitás legalább egy TNF fehérje ellen van, és a másik egy másik antigén elles. Bispecídkus ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek' a szakterületen. Hagyományosan a bispedfikus ellenanyagok rekorabmáns előállítása két ímmaogtefeulin nclrériánc-köonyüláne pár együttes expressrióján alapszik, ahol a két aehéztóucnak különböző a speclfhása (Miistein és Cueilo, Natúré 3Ö5,537. old.. 0983)]. Az immnoglobuSa nehéz és könnyűláncok véletlenszerű választéka miatt ezekben a hlbrídóxtiák (kvaárómák) lö különböző ellenanyag-molekula potenciális keverékét termelik, amelyek közöl csak egynek van meg a helyes bíspeeifikas szerkezete, A helyes molekula tisztítása, arait általában affinitást kromatográfiás lépésekkel végeznek eléggé fáradságos, és a termék klterraelése alacsony, Hasonló eljárásokat tárnak fel például a WÖ93/Ö8S29. számó nemzetközi közzétételi iratban, a 6 21Ö66S, «193 967., 6132 992, 6 106 833., 6 06»285., 6 037 453., 6010 902., 5 989 530;, 5 959 084., 5 959 083., 5 932 448, 5 833 985, 5 821 333., 5 807 706, 5 643 759, 5 601 819, $ 582 996, S 496 549., 4 676 980. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, a WO 91/00360, WO 92/00373. számú nemzetközi közzétételi Iratokban, az EP 03089. számú európai szabadakra iratban, Trsunecker és mísai, EMBO J. 10, 3655. old. (1991), Suresh és misaí, Methoös in Enzyraoiogy 121,210. old (1986).
A találmány szerinti asti-IW ellenanyagok (amelyeket TNF ellenanyagoknak Is nevezőnk) adott esetben a TNF iránti magas affinitással is jellemezhetők, és adott esetben és előnyösen alacsony a toxleításuk, Közelebbről találmány szerinti ellenanyag hasznos g találmány szerint, ha az egyedi komponenseknek - mint például a variábilis régiónak,, állandó régiónak és vd^églőnak - egyedileg és/vagy együttesen adott esetben és előnyösen alacsony az imraunogemtása. A találmány szerint alkalmazható ellenanyagokat adott esetben az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn. kérésztől tartó kezelésére a tünetek mérhető enyhítésével és alacsony és/vagy elfogadható toxieítássak Az alacsony vagy elfogadható ímxtrauögenítás és/vagy stagas •afiSniíás, valamim más megfelelő tulajdonságok hozzájám&sínak az elért terápiás eredményekhez. Az „alacsony íraraunogenítás”~t ügy definiáljuk a leírás· szerinti értelemben, hogy szignifikáns HAHA, HACA vagy MAMA választ vált ki a kezeit pscienseksek kevesebb, mini körülbelül 75%-áhan, vagy előnyösen .kevesebb, mint körülbelül 50%-ában, és/vagy alacsony fiiért hoz létre a kezelt páciensekben (kevesebb, mint körülbelül 3Ő(l-at, előnyőseit kevesebb, mim körülbelül iöő-sí kettős antigén enzimes «umanotóghú vizsgálati eljárással mérve) (Elliott éss mtsai, Láncét 344,1125-1127. old, (1994)},
Α Ikahnasiíatőság
A találmány szerinti izolált tsukiemsavstk alkalmazhatók legalább egv anti-FNF ellenanyag, vagy annak maghatározott variánsának az előállítására, amely alkalmazható legalább egy TNF-áilapot - amely m .korlátozó példakést legalább egy ímmasolőgiaí rendellenesség vagy betegség, szív- és érrendszeri rendellenesség vagy betegség, fertőző, rosszindulatú és/vagy idegrendszeri rendellenesség vagy betegség bármelyike - mérésére vagy kiváltására egy sejtben, szövetben, szervben vagy állatban (beleértve az emlősöket és az embert), diagnosztizálására, monitorozására, modulálására, kezelésére, enyhítésére, előfordulása megelőzésének elősegítésére vagy íteteinek a csökkentésére.
Ilyen eljárás szerint legalább egy anii-TNF ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségét beadjuk egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van tünetek, hatások vagy mechanizmusok ilyen modulálására, kezelésére, enyhítésére, megelőzésére vagy csökkentésére, A hatásos mennyiség tartalmazhat körülbelül 0,001-500 mg/kg mennyiséget egyetlen (például bólusz), többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy Ö,öí-3SGÖ pg/ml széwmkoncenírácíó eléréséhez egyetlen, többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy bármilyen hatásos tartományi: vágy értéket ezek között, amist azt ismert eljárások alkalmazásával elvégezzük és meghatározzak a leírás szerint, vagy ismert az idevágó szakterttfeíeken.
Referenciák
Az Összes, leírásban idézett publikáció és szabadalom a technika állását mutatják be a jelen találmány idején és/vagy a találmány leírását és megvalósíthatóságát biztosítják. Publikáció alatt bármilyen tudományos vagy szabadalmi publikációi értünk, vagy bármilyen egyéb hozzáférhető információt bármilyen média formátumban, beleértve minden rögzített, elektronikus vagy nyomtatott formátumot. Az alábbi referenciákat külön megemlítjük: „Currení Proíocols m Meleetdar Siolögy”, szerk.: Ausubel, és mtsai,, kiad.: John Wíley & Sons, Inc,, NY, NY (1987-2001); „Moleeuiar Clonlug: A Eahoratory Mantsaf', szerk.; Sambrook és mtsai., 2, kiadás, kiad.: Cold Spnng Harbor, NY (1989); Harlow and Larse, ^Anöboáíes: Á Laboratory Manual, kiad,; Cold Spring Harbor, NY (1989); „Current Proíocols is Jmmusolögy”, szerk.; Coliigan és mtsai., kiad.: John Wiiey & Sons, hm., NY (1994-2001); „Cdn-est Proíocols In Protein Science”, szerk.; Coliigan és mtsai., kiad,: Jóim Wiiey & Sons, NY, NY {1997-2081).
A íniáimány szerinti elien&nv&gek
Legalább egy találmány szerinti ellenanyagot előállíthatunk adott esetben egy sejtvonallal, kevert sejtvonallal, immortallzált sejttel vagy ímmsrtalÍzált sejtek kltmáíis populációjával, amint az jól ismert a szakterületen (lásd például „Carrent Protoeofe is Moleeuiar Bíoiogy”, szerk.; Áusubel, ás mtsai,, kiad,: John Wiiey & Sons, Inc., NY, NY {1987-2001); „Moleeuiar Clönisg: A Laboratory Mannal, szerk,: Sambrook és mtsai., 2. kiadás, kiad.; Cold Spríng Hstrhor, NY (1989); Harlow .and tarts, „Antifeodies: A Laboratory Manóéi” kiad.: Cold Spring Harbor, NY (19S9); „Cúrrení Proíocols in ímmunology”, szerk.: Coliigan és mtsai., kiad,: John Wiiey & Sons, Inc,, NY (1994-2001); „Current Proíocols in Protein Science”, szerk.: Coliigan és mtsai,, kiad.; John Wiiey & Sons, NY, NY (1997-2001), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kiíasítás részét képezi.
Humán TNF fehérjékre vagy azok ftagsaenseire specifikus humán ellenanyagokat termeltethetitek egy megfelelő immtmogés antigén ellen, mint például izolált TNF' fehérje vagy annak részlete ellen (beleértve .szintetikus; molekulákat, mint például szintetikus peptiáeket), Más specifikus vagy általános emlős ellenanyagokul hasonlóképpen teratelíeíheúfek. tammogán antigének előállítását és snonoklonálls ellenanyagok termelését bármilyen megfelelő módszer alkalmazásával végrehajthatjuk.
Egy megközelítési mód szerint hibridőmát állítunk elő alkalmas immortaiizáll sejtvn&aí (például mielsma sejtvonal, tatot például nem korlátozó példaként Sp2/9, Sp2/Ö>AG14, NSÖ, N.S1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SAS, Sp2 MÁI, Sp2 SSL Sp2 SÁS, 0937, MLA 144, ACT ÍV, MÖLT*, DA-1, JVUKAT, WBHt, K-562, COS, RAS, NIH 3T3, RL-ŐÖ, MLA 144, MAMÁI WA, NBVRÖ 2A vagy hasonlók, vagy heteromíelómák, azok fúziós termékei, vagy feármilyss azokból származó sejt vagy fúziós sejt, vagy bármilyen, a szakterületen ismert alkatom sejtvonal, lásd például wvw.atcc.mg, wtvw.lifetech.com és hasonlók) fuzíonáltaíásával elien&oyag-íermelő sejtekkel, mint például nem korlátozó példaként izolált vagy klónozott lép, perifériás' vér, nyirok, mandula vagy egyéb Immun vagy B-sejtot tartalmazó sejtekkel, vagy bármilyen más sejtekkel, amelyek nehéz vagy könnyökbe állandó vagy variábilis vagy vázrégiö vagy CDR szekvenciákat expresszáhtak, akár endogén, akár heteroíóg nukíemsavakként, mint rekombínáns vagy endogén, virálls, bakteriális, alga, profcsrióta, kétéltű, rovar, hüllő, hal, emlős, rágcsáló, lóféle, juhféle, kecske, juh, főemlős, eukarióía, genomiális DNS, cDNS, rDNS, mítökondríúlis DNS vagy RNS, kloreplasztlsz DNS. vagy RNS, huRNS, mRNS, tRNS, egyszálú, kétszálú vagy háromszálú, biferídízált és hasonló, vagy ezek kombinációja formájában [lásd például Ausobeí ás mtsaL, mint fent és Coliigsm, „Immunoiogy”, mint fent, 2. fejezeti.
Ellenanyag-termelő sejteket, előállíthatunk jelentőséggel felró antigénnek immunizált emberek vagy más alkalmas állatok perifériás véréből is, vagy előnyösen a lépőkből vagy nyirokcsomóiból. Bármilyen egyéb alkalmas gazdasejtet is alkalmazhatunk heteroíóg vagy endogén, találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott fiagmenséí vagy variánsát kódoló naklelssav expresszáhatására, A fozionáltatott sejteket (híbridóruákj vagy rekombináns sejteket szelektív tenyésztési körülmények között vagy más alkalmas módszerekkel izolálhatjuk, ős korlátozó hígitással vagy sejtváíogatással vagy más ismeri eljárásokkal klónozhatjuk. A kívánt specifsiású ellenanyagokat termelő sejteket alkalmas vizsgálati eljárással (például ELlSA-vai} szelektálhatjuk ki.
Más, kívánt specifításó ellenanyagok előállítására vagy izolálására alkalmas eljárásokat is alkalmazhatunk, nem korlátozó példaként olyan eljárásokat, amelyek rekombináns ellenanyagot '.választanak ki pepiid vagy' fehérje könyvtárból (példán! sem korlátozó példaként bakteriofág, rifeoszóma, oligonukleetíd, RNS, cDNS vagy hasonló prezentációs könyvtárból', például 'amelyek beszerezhetők az alábbi cégektől: Cambridge Aatiboáy Technologies, Cambrídgeshire, UK; MorphoSys, Martlsareid/Plaaegg, DE; Biovation, Áberdeen, Scotland, ÜK; Bioluvent, Lund, Sweáen; Dyax Corp., Enzon, AtTymariBiosite; Koma, Berkeley, CA; Ixsys.lásd például az EP3ŐS684, számú európai szabadalmi hatot, a FCT/GB9Í/Ö1134.; PC'17GB92,/Ö17S5,; PCT/GB92/ÖQ224S.; RCT/Ö892WS83.;. PCW893/0öÓŐ5. számú nemzetközi bejelentéseket; a W35Ö2ÖÖ. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi bejelentést (1994.12.5); a PCT/Ö894/0I422.; PCT/GB94/02óó2.; PCT/C89W83S. számú nemzetközi bejelentéseket; (CAT/MRC); a
WOW14443.; WO 90/14424.; WO 90/14430. ssslmú nemzetközi közzétételi iratokat, a PCT/US94/1234.
számú nemzetközi bejelentést; a WO 92/13619.; WO 96/07754. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Scripps); az EP ö l4 989, számú európai szabadalmi iratot (MojphoSys); a WO 95/14027. számú nemzetközi
-14közzététoli irat (Biolrsvem); Wö 88/96639,; WO 90/3809. számú nemzetközi közzétételi' Iratokat (Dyax); a -4 704 692. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Bnzon); a PCT/US9Í /02989. szánul nemzetközi bejelentést (Adymax.); a 5V0 89/06283. számú nemzetközi közzétételi iratot; az EP 371 998.; EP 550 400-. számú európai szabadalmi iratokat (Koma); az EP 229 046. szántű európai szabadalmi iratot; a PCT/IJS91/07149. számú nemzetközi bejelentést (ixsysjj; vagy véletlenszerűen létrehozott peptfcteket vagy fehérjéket - lásd az 5 723 323., 5 763 192., 5 814 476., 5 817 483., 5 824 514., 5 976 862. .számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat, a WO86/S5803. számú nemzetközi, közzétételi iratot, az EP 590 689. számú európai szabadalmi iratot (Ixsys, jelenleg Applied Möieeular Evelutkm, AM£)j;, vagy amelyek olyas transzgesikus állatok (példáéi SCÍD egerek, Nguyen.-és mtsai,, Microbiol, immunoi. 41, 901907. old. (199'7); Sandhu-és rstsai,, Crlí. Rév. Siöfechool. 16, 95-US. old. (1996); Erén és mlssi,, immunok 93, 154-161, old. (1998), amelyek mindegyike, valamint a kapcsolódó szabadaknak és bejelentések] immunizálásán alapulnak, amelyek -fejesek humán ellenanyagok készletét előállítani, amisí az ismert .a szakterületen és/vagy feltárjuk a leírásban. Ilyen módszerek sem korlátozó példaként a ríboszótna prezentáció (Hanes és mísaí, Proc. Matt Aead, Sci. USA, 94, 4937-4942. old, (1997); Hanes és rstsai., Proc. Natl, Acad. Sci, USA, 95, 14130-14135. old, (1998)}; egysejfes, ellenanyagot slőállitó technológiák (például a szelektált limfocita ellenanyag eljárás CSbAM”) (5 627 052. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Irak Wea és mtsai, J. immunul, 17,887-892. old, (1987); Babcook és mtsai., Píroc. Natl. Acad. Sej. USA 93, 7843-7848. old. (1996)}; géi-ntikrocsepp és áramlási eitometrla (Powell és mtsai.» Smteclmot 8, 333-337. old. (199Ö); One Ceö Systems, Cambridge, MA; Cray és mísai., J, Imrn. Meth, 182,155-163, old, (1995); Kerrny és rntsaL Blo/Technol. 13, 787-79Ö. old. (Í 995)}; B-ssjt szelekció (Sfeenbafckers és mtsai., Molec. Bioi. Reports 19, 125-134, old. (1994); Jónak és mtsai.. „Progress Siotech, 5. kötet, „in Váró íramtmization ia Hybridoms Technology”, szerk.; Botrebaeck, kiad.: Elsevíer Science Publisbers S. V., Amsterdam, Neíherlands £1988)}.
Nem humán vagy humán ellenanyagok génsebészeti ólon történd módosítására és btmianizáiására szolgáló eljárásokat is alkalmazhatunk, amelyek jól ismertek a szakterületen. Általában humanizált vagy génsebészeti úton módosított ellenauysg egy vagy több nem humán forrásból származó amlnosav-eldaHánsot tartalmaz, például nem korlátozó példaként egérbbi, patkányból, nyálból, nem humán főemlősből vagy más emlősből származót. Ezeket a- humán aminosav-oláalláneokat gyakran „import oldaíiáneoknak nevezzük, amelyek tipikusan egy ismert humán szekvencia „Import” variábilis, állandó vagy más doménjából származnak. Ismert humán lg szekvenciákat tárnak fel az alábbi helyeken;
tvvo*\sebi,nim.nlh.gov/entrez'query'.fcgi; wwtv.átec.opg./pháge/hdfe.html; www.sc5quest.e0m/;
www.abcgtn.eötn/; -wwwmtíbo^wcwee.ttoto/tetimee<»t^,toi;
vvww.public.iastate.edtu'-pedro/rssetníchtooiS.htnjl; www.mge3,am-heid«iberg.de/SDAT/lT.hbni; vww.whSwtn^,eom(íwmm^ogy,OW5Aaá^05.1tW;.
w»w.library,thmkqaest.org'12429/ímmt3ue/Antifeady.btml; www,.bíaat.org/granWlecí^es/í996/vj&b/; svww,path.cam.ac,uk/--ínrc7/mike!tnages.htmk wtvw.antibodj'resource.cum/; mcb,hsrvard.sdu./BlöLlnks/lmmj5solog>'.hínd; wwvv.ímmnoologyllsk.eom/;
paáhbos.W!StLedn/'hcenter/5sd«x.bbni; www.bioteeb.nS.edu/'-bcl/'; www.pebio,com/pa/3489!3/340913.html; ww'vv.naLusda.gov/awíe/pubs/anbbödy/; ww,jn.ehitne'n.3C.jp/~y,isubito/Eiisa.htmi; wm.fw,biodesign,com/tabie,&sp: www\lesettd»'a^)teZáavlés/l}nks.hít»l;
-15wwv. biotech.ufl.edu''~fccbpmtoeol.html; mvw-.isatyset,orgf'sites_geo.htjni; ammti.ímt.urúmarburg.de/'-rek/A.EPSísrt,hfml; feaserv,uc.i.kun.ni/--jraats/bnksl.htnri; sww.reeafe.anl· bd.de,íhumuuo.bme.nwu.edu''; wvvtv.nu'c-cpe.cam.ae.ukfőínt-doc/pablic/iNTBO.htmk www. Masaaj.JSX/vír/V_Báce^teí; hugt.cnüsc,ö-.8lö4/; www,biod^.acl.ac.ukZ~njartm/sWindex.htmI; antlbody.feath.ac.uk/; abg^ycw.tensö..etWla&/«<-wwljgen.íartd; <om.a8Í^ch/--ho{tegget/AH!Oswlö»f/SMde0kfahal; www.cryst;bíát,ac>öV~ub»g87s/;. www.mw.nsre.ac;ök/CC/ccaewgAx^^-bra; wvw;paJh.cm,ac,tá^Mti»c?/bmramsaö«ss/TAI-IHPiitol; wvm.,iKötwi.rax/vir/^ame/statjambttó;www.bfesci-missoari:.e<WsjalÖí^ííKÍex.bbnl; www.cry'si.bíocxam.&e.ök/~'fuTOliua/Web-pages/Pept/spoltech.htjnl; »^'w.jeri®s.de/&_.producfs.htm; •www.p^ents.ibm.com/ibtnA»{5 Kabaf. és sntsaL, „Sequenees ef Proteins of teatösologicai Interest”, kiad,: U, S. Dept. Health (1983).
ilyen importált szekvenciákat ídkalmazhuísuk az immunogeuiíás csökkentésére, vagy a kötődés, affinitás, „oa” sebesség, „oíT sebesség, svidiíás, speciStás, féléletidő, vagy bármely más alkalmas jellemző csökkentésére, fokozására vagy- módosítására, amint az ismert a. szakterületen. Általába® a nem barnán vágyhumán CDR-szekveuciák részét vagy egészét megtartjuk, míg a variábilis és állandó régiék nem hantán szekvenciáit helyettesítjük humán vagy tnás wlnosavakk&l Ellenanyagokat adott esetben humanizálhatunk az arsíigén iránti magas aSmítás és egyéb kedvező biológiai tulajdonságok megtartásával is. Ezen cél elérése érdekében humanizált elleK3nyagokat adott esetben a szőlői szekvenciák és különféle konceptuális humanizált termékek elemzése útján állíthatunk elő, a szólói és humanizált szekvenciák háromdimenziós modelljeinek alkalmazásával. Háromdimenziós immunglobulin modellek általánosan hozzáférhetők és ismertek a szakember számára. Beszerezhetők olyan számítógépi programok, amelyek bemutatják és ábrázolják a kiválasztott potenciális Immtmgksbulin-szekvenciák valószínű háromdimenziós konformációs szerkezeteit. Ezen ábrázolások tanulmányozása lehetővé teszi az oidaliárscok vaiószkhl szerepének az elemzését a potenciális smnumglobulia-szekvencia működésében, azaz azon oidalláncok elemzése, amelyek befolyásolják a potenciális immuagiobulin képességét az antigénjéhez való kötődésre. Ily módon FR-oldalláaeokai választhatnak ki, és kombinálhatjuk azokat a konszenzus és import szekvenciákból, oly módon, hogy elérjük a kívánt elieaanyag-íulajdonságot, mint például a megnövekedett affinitást a célantígéu(ek) iránt. Általánosságban a CDR-öldalláncok közvetlenül és leglényegesebb módon részt vesznek az antigéskőtós befolyásolásában, A találmány szerinti ellenanyagok humanizálását és génsebészeti úton történő módosítását bármilyen ismert eljárás alkalmazásával elvégezhetjük, mist például nem korlátozó példaként az alábbi irodalmi helyeken leírtakkal: Winíer (Jones és mtssl, Matere 321, 522, old. <39S6>; Rlechmann és mtsaí. Natúré 332, 323. old. (19SS) ; Verhoeyen és misül, Science 239, 1534. oki (1988), Sims és mtssi., 3. immunoi, 151, 2296. old. (1993); Chothia és tesk, 3. Mól. Bioi. 196, 981, old. (1987), Carter és mtsai,, Froc. Natl. Acad. Sci. USA §9,4285. old. (1992); Eresta és mtsal, 3. immunoi. 15.1, 2ő23. öld. (1993), 5 723 323.,
976 §62., 5 824 514, 5 857483,» 5 854 476., 5 763 Í92„ 5 723 323., 5 766 §86„ 5 714 352,, 6 204 823,.
180 370, 5.593 762, 5 530 10?, 5 535 0§9., 5 225 539.; 4 816 567. számú amerikai. egyesült államokbeli szabadalmi iratok, FCT/US98/I6289„ FCT/USW18978., FCT/US91/09630., PCT/US9 i/05939., PCT/US94/01234., PCT/GS89/01334,, PCT/GB91/1)1134., PC3'A3B92/01755. számú nemzetközi
-16beielemesek; WO 90/14443,, WO 96/14424., WO 9Ö/14430. számú nemzetközi közzétételi iratok, EP 229246. számú európai szabadalmi irat, beleértve az azokban idézést referenciákat is.
Az anti-TNF ellenanyagot adóit esetben előállíthatjuk olyan transsgssíkas állal (például egér, patkány, hörcsög, nem tettes főemlős és hasonlók) Immíuiizáláaávai is, amely képes humán ellenanyagok készletének termelésére, amist azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Hantán antí-TNF ellenanyagot termelő sejteket Izolálhatunk ilyen állatokból, és immortalízáíhatjuk azokat megfelelő eljárások alkalmazásával, mini például a letesbas feltárt eljárásokkal.
Humán antigénekhez kötődő humán ellenanyagok készletét termelő transzgenikns egereket ismert eljárásokkal állíthatunk elő (például nem korlátozó példaként sz 5 770428., 5 569 825., 5 545 W, 5 625 126., 5 625 825., 5 633 425., 5 661 616. és 5 789 65Ö. számú amerikai egyesölt államokbeli szabadalmi iratok (Lonberg és mtsai.); Jakobövits és misai., WO 98/SÖ433. számú nemzetközi közzétételi írat, Jakobovits és mtsai, WO 98/24893, számú nemzetközi közzétételi irat; Lonberg és mtsaí., WO 98/24884. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és misai,. WO 97/13852. szánul nemzetközi közzétételi írat, Lonberg és mtsai., WO 94/25585, számú nemzetközi közzétételi írat, Kucberlapate ás mtsaí,, WO 96/34Ö96. számú nemzetközi közzétételi irat, Rucheriapate és mtsaí,, EP 6463 151 Bl, számú európai szabadalmi irat, Rucherfapaíe és misai., EP 0710 719 Al. számú európai -szabadalmi irat, Surani és mtsai,, S 545 807. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi irat, Bruggemann és misai., WÖ9Ö/04036. számú nemzetközi közzétételi írat, Smggeraann és misai., EP 0438 474 Bl. számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai., EP Ö814 259 A2, számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai., GB 2 272 44-0 A. számú brit szabadalmi irat; Lonberg és mtsai., Natúré 368, 856-859, old. {1994), Taylor és mtsai., int. Immunok 6, 579-591. old. (1994), Green és mtsai., Natúré Geneíics 7, 13-21. old, (1994). Menáez és autó, Natúré Genetics 15,146156, old. (1997), Tayíor és misai,, Nneleic Ádds Research 2Ő, 6287-6295. old, (1992), Tualilon és mtsai,, Proe, Natl. Acad. Sci. VSA 9ö, 3726-3724, old, (1993), Lonberg és ratsai, int. Rév. immunéi. 13, 65-93. old. (1995) és Fishwald és mtsai., Nat Bioteehnoi. 14, 845-851. old, (1996)], Általában ezek az egerek legalább egy transzgént tartalmasnak, amely legalább egy htunán immangiobuíin-íóknszröl származó DNS-t tartalmaz, amely funkcionálisan át van rendezve, vagy amely fenkciosális átrendeződésen mehet át. Az endogén ímmungiobulíö-iőkúss az ilyen egerekben megzavarható vagy deietálható, hogy eiimínúljuk az állat képességét, endogén gének által kódolt ellenanyagok termelésére.
Hasonló fehérjékhez vagy ffagmensekhez specifikusan kötődő ellenanyagok szfcrfnelését kényelmesen elérhetjük peptidprszeittáeiós könyvtárak alkalmazásával. Ez az eljárás magában foglalja peptidek nagy gyűjteményeinek a szkrtnelését kívánt funkciójú vagy szerkezetű egyedi tagokra, PeptídkŐnyvsárak eilenanyag-szkríneiáse jól ismert a szakterületen. A prezentált peptídszekveneiák lehetnek 35900 vagy több aminossv hosszúságúak, .gyakorta 5-109 smiaesav hosszúságúak, és gyakran körülbelül 8-25 amtnosav hosszúságúak. A peptidköayvíárak létrehozására szolgáló közvetlen kémia szintetikus eljárások mellett számos rekomfeináns DNS módszert is leírtak. Az egyik típus peptídszekvencia prezentálását foglalja magában bakteriofág vagy sejt felszínén. Mindegyik bakteriofág vagy sejt tartalmazza az adott prezentált peptidszekveneíát kódoló nukleotid-szekveneiát ilyen eljárásokat tárnak fel a WO 91/17271,. WO 91/18980., WO 91/19818, és WO 93/88278, számú uemstfeőzr közzétételi iratok. Peptidek könyvtárainak létrehozására szolgáló más rendszerelmek vannak ;« vísm kémiai szintézis és rekombináns vonatkozásai is. Lásd a
- I? WO 92/65258., WO 92/14843. és Wö -96/19256, számú nemzetközi közzétételi iratokat. Lásd még az 5 658 754. és 5 643 768. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokai, Peptidprezentációs könyvtárak, vektorok és szkrioelő reagenskészletek beszerezhetők kereskedelmi forgalomban olyan cégektől, mist példáéi az. invitrogea (Carlsbad, CA) és a Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshíre, ÜK). Lásd például & 4 704 692., 4939 666., 4 946 773,, 5 260 293., 5 455030., 5 518 889.» 5 534621., 5 656 73a, 5 763 733., 5 767 269.» 5 856 456, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Iratokat (Enzon); 5 223 499.» 5 463 484.» 5 571698., 5 837 509. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Dysx), 5 427 998,, 5 589 717. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Aöymax); 5 §85 793. száma amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Cambridge antibedy Technologies); 5 750373. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Geaenteeh), 5 618 929,, 5 595 898.» 5 576 195., 5 698 435., 5 693 493., 5 698 417. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokul (Xorsa), Colligan, mmt fém; Aasubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent
A találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk legalább egy anti-TNF ellenanyagot kódoló mskfemsav alkalmazásával is, transzgeníkus állatot előállítva, mist például kecskéket, szarvasmarhákat, lovakat, juhokat és hasonlókat» amelyek ilyen ellenanyagokat termeinek a tejükben. ilyen állatokat ismert eljárások alkalmazásával biztosíthatunk (lásd például nem korlátozó példaként az 5 827 690.; 5 849 992.; 4 873 316,; 5 849 992.; 5 994 616,; 5 565 362.; 5 304 489, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat és hasonlókat j.
Találmány szerinti ellenanyagokat továbbá előállíthatunk legalább egy antí-TNF ellenanyagot kódoló mskleinsav alkalmazáséval, toínszgeniktts növényeket és növényi sejteket (például nem korlátozó példaként dohányt és kukoricái) biztosítva, amelyek ilyen ellenanyagokat, meghatározott részleteket és variánsokat termeinek a növényi részekben vagy az azokból kitenyószleít sejtekben. Nem korlátozó példaként rekombináus fehérjéi expresszáló íranszgeuikus dohányleveleket sikeresen alkalmaztak nagy mennyiségű rekosnbináns fehérje biztosítására, például indukálható promóter alkalmazásával (lásd például Cramer és mtsai., Ctur. Top. Microbol. immunoi. 240» 95-118. old. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat). Ezenkívül trasszgenikus kukoricát alkalmaztak emlős fehérjék expresszáltatására kereskedelmi mennyiségben, más- rekombináns sxpressziós rendszerekben előállított vagy természetes forrásból tisztított fehérjékével ekvivalens aktivitással [lásd például Hooti és sttsm., .Adv. Exp. Med, Biok 964, 127-147. old. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat)> EÖenaayagokM nagy mennyiségben előállítottak tmnszgenikus növényi magvakból is, beleértve ellenanyag feagmenseket, mint. például egylancá ellenanyagokat (scFv), például dohánymagokban és burgonyagumókban [lásd például Courad és mísai.. Plánt Mól. Bioi. 38, löl-í09. old. (199S), és az abban idézed hivatkozásokat). Ily módon a találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk trartszgenikus növények alkairuazásával is. istneri eljárások alkalmazásával [lásd még például Fischer és mtsai, Síoteehnoí. Appi. Biochetn. 39, 99-108. old. (1999), Ma és mtssl., Treaás BlotechneL 13, 522-527. old. (1995); Ma és mtsai., Pisai Physiol. 109,341-346. old. (1995); Wkdelsm ás mtsai,. Bíoohem, Soe, Traas, 22,940-944. old, (1994); és az azokban Idézett hivatkozásokat).
A találmány szerinti ellenanysgsk széles tartományban lévő affinitással (K©> képesek kötődni humán TNF-hez, Egy előnyős megvalósítási mód szerint legalább egy találmány szerinti humán monokksn&lls ellenanyag képes adott esetben magas ariinilással kötődni humán TNF-hez. Például humán monoklonális
-uelteaaayag ló'7 M vagy kisebb K.Q-vel kötődhet humán INF-hez,. mist például nem korlátozó példaként <U9,9 (vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belől) X 18'7,JÓ'8,10’*, ló'5*, 10n, 10% IQ'13 vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül, £gv ellenanyag antigén iránti affinitását vagy aviditásáí kísérletesen határozhatjuk meg bármilyen megfelelő eljárás afeatomásávsi (lásd például Berzofsky és mtsai,, .Anfibody-Antigeü interactioss”, „Fnndamentai Imaumology, szerk.: Paul, W. E,, kiad,: Rávett Press; New York, NY (1984) ; Raby, Janis, „Inunanology”, kiad,: W, H. Freemsm and Compaay: New York, NY (1992); és as azokban leírt eljárások). Egy adott ellenanyag-antigén kölcsönhatás mért sffto&ása változhat, ha különbőzé körülmények között mérjük (például sókomeatráció, pH). ily módon az affinitás és egyéb antigén-kötési paraméterek (például Ks, Κ» K^) mérését előnyösen ellenanyag és antigén standardizált oldataival végezzük, és standardizált puffetrel, mint például a le írásban ismertetett puf&rrei.
Nukleinsav-mofeknlák
A találmány .szerinti információ, alkalmazásával legalább egy anti-TNF ellenanyagot kódoló találmány szerinti nuklemsav-molekula előállítható a leírásban feltárt, vagy a szakterületen ismert eljárás alkalmazásával.
Találmány szerinís auktemsav-moiekulák lehetnek .RNS formájában, mint például xnRNS, huRNB, tRNS vagy bármilyen más torma, vagy DNS formájában, nem korlátozd példaként klónozással nyert vagy szintetikusan előállítóit cDNS vagy genomiális DNS fonna, vagy ezek bármilyen kombinációja. A DNS lehet bátöffiszáiu, kétszálú vagy egyszálú, vagy ezek bármilyen kombinációja. Á DNS vagy RNS legalább egy szálának bármely részlete lehet a kódoló szál, amit masz szálként is ismerünk, vagy lehet a nem kódoló szál, amit antiszensz szálnak is nevezőnk.
A leírásban feltárt izolált nukiemsav-moleküiák közé tartozhatnak olyan ankieinsav-moíekulák, amelyek tartalmaznak egy nyílt leolvasási fázist (ŐRE), adott esetben, egy vagy több iníronttak például sem korlátozó példaként legalább egy nehézlsnc (például 1-3. azonosítószámú szekvencia) vagy legalább egy kőnnyütáne (például 4-6, azonosítószámú szekvencia) legalább egy CDR-jének, rnrnt például CDRÍ, CDR2 és/vagy CD83- legalább egy meghatározott részletét; anti-TNF ellenanyag vagy variábilis régió (például 7,, 8. azonosítószámú szekvencia) kódoló szekvenciáját tartalmazó mádefosavrmoidntláto^ és olyan nukieinsavmolekulákat, amelyek a fent bemutatottaktól lényegesen különböznek, de amelyek a genetikai kód áégeneráltsága miatt még mindig legalább egy találmány szerinti és/vagy a szakterületen Ismert anti-ÍNF ellenanyagot kódolnak. Tennészefesen a genetikai kód jól ismert a szakterületen, ily módón a szakember számára rutin lenne olyan degenerált nuklemsav-variánsokat előállítani., amelyek találmány szerinti specifikus antt-TNF ellenanyagokat kódolnak (lásd például Áusuhel és mtsai., mint fest). Nukleimav-molekulák nem korlátozó példát közé tartoznak a 18., 11,, 12., Í3., 14., 15, azonosítószámú szekvenciák, .amelyek sorrendben a HC CDRi, HC CDR2, HC CDR3, LC CDRÍ, LC CDR2 és LC CDR3 régiót kódoló nem korlátozó íiukleios&vakuak felelnek meg.
Amist a leírásban jelezzük, anti-TNF ellésasysgot kódoló uukleinsavat tartalmazó találmány szerinti nukletusav-stolekulák nem korlátozó példái közé tartoznak azok, amelyek magának az eliesaayagffagmensnek az ammosav-szekvsnciáját kódolják; egy teljes ellenanyag vagy részletének a. kódoló szekvenciáját, ellenanyag, fragmens vagy részlet, valamint további szekvenciák kódoló szekvenciáját, mist
- 19például legalább egy szignálszekveacia vagy fúziós fehérje kódoló szekvenciáját, a fent említett további szekvenciákkal vagy azok uélkSi, mint például legalább egy mtronnsi, együtt további nem kódoló szekvenciákkal, nem korlátozó példaként beleértve átírt aem kódoló 5’ és 3’ szekvenciákat, azokat a nem kódoló szekvenciákat, amelyek szerepet játszanak a transzkripcióban, mRNS-feldolgozásbaa, beleértve -a „splícmg”-ot és poliademlácíós szignálokat (példán! riboszóma-kőtés ás mRNS stabilitása); további aminosavakat kódoló további szekvenciát, mint például amelyek további feakcíókat biztosítanak, By siódon egy ellenanyagot kódoló szekvenciát tuzionáltathaíuuk egy jelző szekvenciához, mint például olyan pepiidet kódoló szekvenciához, amely elősegíti az efleaanyag'&agmensf vagy részletet tartalmazó fezionáltatott eilenasyag tisztítását.
Ns&lesnsavafc előállítása
A találmány szerinti izolált nukleíusavakat (a) rekombmáns eljárások, (b) szintetikus módszerek, (¢) tisztítási módszerek, vagy azok kombínádójával állíthatjuk elő, amint az jól ismert a szakterületen.
A nukfeínsavak kényelmesen tartalmazhatnak szekvenciákat a találmány szerinti polfeidcleoöd mellett. Például egy vagy több esdomádeáz restrikciós helyei tartalmazó többszörös kiónozó helyet mzerfáífeatunk a nuklesusavba, hogy elősegítsük a po&ukfeötíd izolálását. Ezenkívül transzíáötsstó szekvenciákat inzeríálhatunk a találmány szerinti transziáit poiinukleotiá izolálásának elősegítésére. Például egy hexa-hisztidín jelzószekvencia kényelmes lehetőséget biztosit találmány szerinti fehérjék tisztítására. A találmány szerinti nukleinsav kódoló szekvenciája melleit megtalálható nukleiitsav adott esetben egy vektor, adapter vagy kapcsolómolekula a találmány szerinti poltötskleotid klónozására és/vagy expresszáltatására.
További szekvenciákat is alkalmazhatunk, mint például klónozó és/vagy espressziós szekvenciákat, hogy optimalizáljak azok funkcióját a klónozásban és/vagy expresszáliátásbas, hogy elősegítsük a polísukleotiá izolálását, vagy hogy javítsuk a polinukleotídnak sejtbe történő bejuttatását. Klónozó vektorok, expressziós vektorok, adapterek és kapesotenolekulák alkalmazása jól ismert a szakterületen (Lásd például Atísubel, máit fent; vagy Samferoak, mint fent)
Rekomfemáns eljárások uuídeinsavak előállítására
A találmány szerinti izolált nukfeiassv-készthnények, mist például RNS, eDNS, genomiális DNS vagy azok bármilyen kombinációja előállítható biológiai forrásokból, a szakember számára ismeri számos klónozást módszer alkalmazásával. Bizonyos megvalósítási módok szerint olyas oiígomíklsotid-próbákai alkalmazunk a kívánt szekvencia azonosítására cDNS- vagy genomiálls könyvtárba®, amelyek szíringsns körülmények között szelektíven hsbrícizáluak a találmány szerinti polínukleotídokhoz. RNS izolálása és «DNS- és genomíális könyvtárak készítése jól ismert a szakember szántára (lásd például Ansnbel, mint fest; vagy Sambrsok, mint fent)
Nökleinsav szkrínelési és izolálást eljárások cöNS- vagy genomíálís könyvtárai találmány szerinti polmukleotíd szekvenciáján alapuló próbával sskríneíhetünk, mint példád amilyeneket feltárunk a leírásban. Próbákat alkalmazhatunk aesomíábs DNS-sel vsgv cDNS-szekvenciákkal történő híferidszáíásra, hogy homológ géneket izoláljunk ugyanabban vagy különböző organizmusokban. A szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző sztrisgeusségá hibridizációt alkalmazhatunk a vizsgálati eljárásba», és vagy a hibridizációs, vagy a mosási közeg lehet sztringeas. Ahogyan a hibridizációs körülmények szíringensebbé válnak, nagyobb mértékű komplementaritásnak kell
-20lennie a próba és a célszckvensia között hegy kialakuljon a duplex. A szörisgeosség mértékét a hőmérséklet, ionerósség, pH és részlegesen denaturáló oldószerek, mint például fonnaraid közül egy vagy több alkalmazásával szabályozhatják. Példán! a hibridizáció sztrsngensségét kényelmesen változtathatjuk a reagensoldat polaritásának válts zíaíásáv&S, például a fémműid koncentrációjának manipulálásával 0% és 59% közötti tartományban. A detektálható kötődéshez szükséges komplementaritás mértéke (szekvenciaazonosság) változhat a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg szttingensségének megfelelően. A komplementaritás mértéke optimális esetben lötl%. vagy 7Ö-1Ö9%, vagy bármely tartomány vagy érték azok. között. Azonban nyilvánvaló, hogy a próba és & íáncinditók kisebb szekvencia-variációit kompenzálhatjuk a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sziringensségének csökkentésével.
RNS vagy DNS amplifíkálására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és alkalmazhatók a találmány szerint, Indokolatlan kísérletezés nélkül, & lebás szerinti knanítás és iránymutatás alapj án.
ismert DNS vagy RNS smpiiSkációs eljárások sem korlátozó példái közé tartozik a polimerázláncreakció (PCR) és azzal rokon ampürikáclós eljárások [lásd például a 4 6S3 195., 4 683 202., 4 800 159., 4 965 188. számú amerikai egyesölt államokbeli szsbadídun iratokat (Muliis és mísai,);: a 4795 699. és 4 921 794. számú amerikai egyesSlí államokbeli szahadakm Iratokat (Tábor és mísai.); az 5 142 Ö33, számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (teás); az 5 122 464. számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Wiisos ás mísai,); az 5 091 310. szárak amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (ínnís); az 5 066 584. számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (öyíiessten és misai.); a 4 889 S18. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Iratot (Gelfand és mísai); a 4 994 379, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Siiver és mísai.); a 4 766 Ö67. számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi iratot (Biswas); a 4 656 134. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Ringold)], és RNS-közvetitstí arpphrikáció, amely a célszekvencia elleni antiszeasz RNS-t alkalmaz ieraplátként a kétszáló DNS szintéziséhez {5 139 238. száma amerikai egyesült államokbeli szabadalmi hat (Matek és íntsak), kereskedelmi neve KASBA) (lásd például Ausabel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent).
Például po&neráz-íáncreakció (PCR) technológiát alkalmazhatunk találmány szerinti poiirtukleotldok és rokon gének szekvenciáinak az antpiitikálására közvetlenül genomiálls DNS vagy cDNS-könyvtárískböl. A PCR és egyéb ?« rism amplifíkáciős eljárások szintén hasznosak lehetnek például olyan mikieinsavszekvenciák klónozására, amelyek expresszákmtió fehérjéket kódolnak, kívánt mRNS mintában való jelenlétének detektálására szolgáló próbák készítésére, nnkleínsav-sxekvenáiásra, vagy más célokra. Szakember számára az m vrfeo arapSfSsációs eljárások tekintetében elegendő útmutatást nyújtó módszerek példái találhatók az alábbi Irodalmi helyeken: Berger, mint feni, Sambrook, mint fent, és Ausubel, mint fent, valamint Mul.lls és mísai,, 4 683 292, szánul amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat (1987); és innis és mísai,, '”PCR Protoeols A Gnlrie ío Methocls and Applications”, kiad.: Academíc Press Inc., San Díegn, CA (1990). Kereskedelmi forgalomban kapható reagcnskészletek genoraiáns PCR amplifikácíóra ismertek a szakterületen, [lásd példáid ,4<AWűg-e-öC <?«»ö.«íe /O? Ari (Clontech)j. Ezenfelül példán! a T4 gene 55 fehérje (Boshringe? Mannfceím) alkalmazható a hosszú PCR-íeneiékek kitermelésének javítására.
Szintetikus eljárások naklenmvgk előállítására
A találmány szerinti izolált nnkieinssvákat elöállííbstiuk közvetlen kémiai szintézissel is. Ismert eljárások alkalmazásával (lásd például Ansubei, és misai., mint fent). A kémiai szintézis általában egyszálú ~2i olígouukleotid eredményez, amelyet átalakíthatunk kétszálu BNS-se komplementer szállal történő hibrídizálás útján, vagy DNS~polimerázzaí történő polimerizáeióval, az egyszáiö öNS-t terepiéiként alkalmazva. Szakember számára nyilvánvaló, hogy míg a DNS kémiai szintézise korlátozott lehet köríílhelaí 1ÖÖ vagy több bázis bössztiságű szekvenciákra, hosszabb szekvenciákat előállíthatunk rövidebb szekvenciák lígálásával, Rckomfeisáns expressziig kazetták
A találmány tárgyát képezik továbbá találmány szerinti nnkieinsavat tartalmazó rekomfetnáns expressziós kazetták. Találmány szerinti sökieínsavat, például találmány szerinti ellenanyagot kódoló eONS-t vagy genomiáíis szekvenciát alkalmazhatunk olyan rekoínbíná&s expressziós kazetta előállítására, amelyet bejuttathatunk legalább egy kívánt gazdasejtbe. Egy rekombináns expressziős kazetta tipikusan találmány szerinti polinukieotidot tartalmazhat működőképesen kapcsolva transzkripciós mieléclős szabályozó szekvenciákhoz, amelyek irányííhatják a pofoukíeoíid transzkripcióját a tervezett gazdasejtben, Máid beterológ, mind nem hetsrológ (azaz endogén) promótereket alkalmazhatunk találmány szerinti nukleinsavak expresszálíatásának irányítására.
Bizonyos megvalósítási módok szerint promőterként, enhancerként vagy más elemként szolgáló izolált nukleinsavakat jutíaíbartmk be megfelelő pozícióban (leolvasással ellentétes irányban, leolvasással megegyező irányban vagy lámánként) a találmány szerinti pölmukleotíd nem heterológ formájához képest, hogy serkentsük vagy gátoljuk találmány szerinti pollnukleotíd expresszíőját Például endogén promóterekei módosíthatunk in v/vo vagy ín vóro, mutációval, deléeióvai és/va'gy szubsztitúcióval.
Vektoruk és gaasáasejtefc
A találmány tárgyát képezik továbbá slyítn vektorok is, amelyek találmány szerinti izolált nökíeínsavmolefculáfcai tartalmaznak, gazdasejtek, amelyek génsebészed úton módosítva vannak a rekombfeáns vektorokkal, és legalább egy .antí-TNF ellenanyag rekombisáns módszerekkel történő előállítása, amint az jól ismert a szakterületen (lásd például Sambrook és mtsai., mint lent; Ausubel és mtsai,, mint fent).
A polhmkfeoiídokat adott esetben összekapcsolhatjuk egy szelektálható markert tartalmazó vektorral, gazdában valószaporítás céljából Általában plaanidvekíort csapadékban juttatunk be, mint például kalciumfoszfátos kícsapással, vagy töltött lipiádel alkotott komplexben, .Ha vektor egy vírus, azt ;« váró csomagolhatjuk egy megfelelő csomagoló sejtvonal alkalmazásával, és azután transzdnkálhatjak gazdasejtekbe.
A DNS-inzertnek működőképesen kapcsolva kell lennie egy megfelelő pronsóterhez. Az expressziós konstrukciók továbbá tartalmazhatnak helyeket a transzkripció iniciálására, ternrinálására. és az átírt régióban egy riboszoma-kötő helyet a transzlációhoz. A konstrukciók által expresszit érett transzkriptumök kódoló részlete előnyösen tartalmazhat egy transzlációs inidátorí az elejém ás egy termmációs kodon! (például UAA, BOA vagy UAG) megfelelően elhelyezve a íransziálandá mRNS végénél, ahol az UAA és UAG előnyős emlős vagy enkarióta sejtes expresszié esetében,
Expresszíős vektorok előnyös - de csak opcionálissá - tartalmazhatnak legalább egy· szelektálható markert. Ilyen markerek nem korlátozó példái közé tartozik a metotrexát (MTX), dihidrofolát-reduktáz (DHFR, 4 399 216.; 4 634 665.; 4 656 134.; 49562S8.; 5 149636.; 5 179 Öl7, szórná amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), mptciife, neoKÚcin (G4I8), míköfeaolsav vagy glutamín-szintetás (GS, .5 122 464..;. S77Ő3S9.; 5 827 739, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) rezisztencia
- 22 eukarióta sejöenyészet esetén, és totraciklís vagy ampicillln rezísztenciagén S. co/i-ban, vagy más baktériumokban vagy prokm-ióíákbaa történő klónozás esetén. Megfelelő tenyésztő íápkőzegek és körülmények ismertek a szakterületen a fent ismertetett gazdasejtek számára. Alkalmas vektorok nyilvánvalóak a szakember számára, Vektor konstrukció gazdasejtbe történő bejuttatását kalcium-foszfáíos transzfekdóval, DEÁE-dextrás-közveíkett transzfekcióval, kationos lipid által közvetített teanszfekciőval, eíéktroporációval, franszdukcióvaí, fertőzéssel vagy más eljárásokkal hajthatjuk végre. Ilyen eljárásokat leírtak a szakirodalomban, mint példád Sambrook, mint fent, 1-4, és 16-18, fejezet; Ausuhel, mint fest. 1.,9., '13., 15, és 16. fejezet.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyagot expresszálíathatauk módosított formában, mist például föziős febéqsként, és nemcsak szekréciós szignálokat alkalmazhatunk, hanem további beterelő» funkeionális régiókat is. Például további aminesavak, különösen töltött aminosavak egy szakaszát adhatjuk egy ellenanyag N-termínálisáboz, hogy javítsuk a stabilitását és megmaradását a gazxl&sejíben, a tisztítás folyamán vagy az azt követő kezelés és tárolás folyamán. Ezenkívül peplid-molekrúarészeket is hozzáadhatunk a találmány szerinti ellenanyaghoz, hogy' elősegítsük a tisztítását Az. ilyen régiókat eltávolíthatjuk az ellenanyag, vagy legalább annak egy fcagmensések végső elkészítését megelőzően. Ilyen eljárásokat sok standard laboratóriumi kézikönyvben ismertettek, mint például Sambrook, mint fent, 17,20-17,42. és 18.1-18,74, fejezet; Ánsubel, mint fent, lő,, 17, és IS, fejezet.
Az átlagos tudású szakember járatos a találmány szerinti fehérjéi kódoló nukleinsav expresszáltatására beszerezhető számos exprsssziós rendszerben. Más megoldásképpen találmány szerinti nukieinsavakat expresszáltathatunk gazdasejtben, találmány szerinti ellenanyagot kódoló endogén DNS-t tartalmazó gazdasejt (manipuláció átjárt történő) bekapcsolásával, ilyen eljárások jól ismertek a szakterületen, mint például az 5 580 734., 5 64I 67Ö,, 5 733 746. és 5 733 761, számó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Íratok feltárása.
Az ellenanyagok, megbatározott részeik vagy variánsaik termeltetésére alkalmas szemléltető sejttenyészetek az emlős sejtek. Az emlős sejtes rendszerek gyakran sejtek egysejtes rétegének tormájában lehetnek, habár emiősssjt-szuszpenzlök vagy bioreaktorok is alkalmazhatók. Számos, intakt gíikozilált fehérjék expresszálására képes megfelelő gazdasejt-vosaíat kifejlesztettek a szakterületen, mint például a COS-1 (például ATCC CRL 1650), COS-7 (például ATCC CRL-I651), HEK293, BHK21 (például ATCC CRL-íÖ), CHO (például ATCC CRL 1616) és SSC-1 (például ATCC CRL-26) sejtvonalakat, Cos-? sejteket, CHO sejteket, hep G2 sejteket, P3X63Ag8.653, SF2/Ö-Agl4, 293 sejteket, HeLa sejteket és hasonlókat, amelyek könnyen beszerezhetők például az 'American Type Culture CoHeetion’-léi (Manassas, Va, tvww.akx. org). Előnyös gazdasejtek közé tartoznak a syimkeredeíS sejtek, mint például mielóma és limfóma sejtek, Különösen előnyös gazdasejtek a F3X63AgS,653 sejtek (ATCC CRL-1580) és S?2/Ö-Ágl4 sejtek (ATCC CRL-1851). Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerisí a rekotnbisáns sejt P3Xó3Ab8.ő53 vagy1 SP2/0-Agl4 sejt.
Az ezekben a sejtekben alkalmazható expresszíós vektorok tartalmazhatnak az alábbi nem korlátozó példaként szolgáló expressriós szabályozó szekvenciák közöl egyet vagy többet: replíkáciős origó, promóter (például a késői vagy korai SV48 prosnóter, az CMV promótor (5 168'062.; 5 385.; 839, szántó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), HSV tk promőíer, pgk (foszfogticerát-kináz) promóter, EE-1 alfa
-23psomóter (5265491. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), legalább egy humán immtmglobulm pronsóterj; etesse®? és/vagy feldolgozási információs hely, mini például nboszóma-feóöS hely, RNS ’spifeing' hely, políadsmládós hely (például SV40 nagy T antigén poli-A sddictós hely), és transzkripciós tersninátor szekvenciák (lásd például Ausubel, és mtsai-, mint teái; Samörook és mtsai., mint lent). Találmány szerinti nukiémsavsk vagy fehérjék előállítására alkalmas egyéb sejtek ismétek és/vagy beszerezhetők például az ' Atnerican Type CoJtrno CoBectio» Caíaloguc of Cell Lines and Oybrldnmas’-tól (www. atcc.org) vagy más Ismert vagy kereskedelmi fonásokból.
Amikor oafcarióta gazdassjíeket alkalmazunk, tipikusan poliadeniláciős vágj' transzkripciós tertninátor szekvenciákat építünk be a vektorba. Termtsáíor szekvencia egy példája a szarvasmarha növekedési hormon génjéből származó poliadenilációs -szekvencia. Szántén alkalmazhatunk a- transztóptum pontos „splícíng’jére szolgáld szekvenciákat is. ’Splíslng szekvencia egy példája az. 5¥49~b&l származó VP1 tsöoa [Sprague, és mtsai., J. Vlrol. 45, 773-781, old. (1983)], Ezenkívül a gazdasejtben történő replikádé szabályozására szolgáló génszekvenc iákat is beépíthetünk a vektorba, -amint az ismert a szaktertlietes. ESieaesyag tisztítása
Áníi-TNF ellenanyagot jól ismert eljárásek alkalmazásával nyerhetünk vissza és tísztítbatunk rekombínáns sejttenyészetekből. nem korlátozó példaként proteln-Á tisztítással, atmnónmm-snílfátos vagy oíanotes kiesapással, savas- extrakeidval, anion- vagy kationcserélő kromatográSával, foszfoceliulöz kromstográűával, hidrofób kölcsönhatási kromatográflával, affinitást kromatográdávuí, hídroxitapatit teomaíográfiával és lektin kromatográSával, Nagytelj&sitményö foiyadékkromatográflát („HFEC) is alkalmazhatnak -a tisztításra [lásd például Ctelgan, „Gntrent PtöíöcöIs in fcsrauaaology*, vagy „Cement Protocols in Protein Science, kiad.: Jete Wilsy & Sons, NY, NY, (1997-2091), példanl az 1 4., 6., 8., 9,, 10. fejezet],
A találmány szerinti ellenanyagok természetes utón tisztítóit termékek, kémiai szintézis eljárások termékei, és rekomhínáns módszerekkel enkarióta gazdából, többek között példán! élesztő, magtjsabbrendű növényi, rovar és emlős sejtekből előállított termékek. A rekőmbinsns tenyésztési előállítási alk&lsuazoít gazdától f&ggöen a találmány szerinti ellenanyag lehet glikczílált vagy lőhet glikodlálaílan, ahol a. glikozíiált előnyös, ilyen eljárásokat leírtak sok standard laboratóriumi kézikönyvben, m.«tt például Saínbrook, mint fent, 17.37-17.42. szakaszok; Aasabd, mint fest, 10,, 12,, 13., lő., 18. és 20. fejezet; Colligas, „Protein Science, mint fent, 12-14, fejezet.
Anri-TNF eltenauyagek
Á találmány szerinti izolált ellenanyagok a mellékeit igénypontokban meghatározott ellenanyag aRttnosav-azekvendát tartalmaznak, amelyet bármilyen alkalmas poteukleodd kódol, vagy bármilyen izolált vagy «leállított ellenanyagot Előnyösen a humán ellenanyag humán TNF-et köt, és ezdltal részlegesen vagy lényegében semlegesíti a fehérje legalább egy biológiai aktivitását. Ellenanyag, amely részlegesen vagy előnyösen lényegében semlegesíti legalább egy INF fehérje vágj' fragtnens legalább egy aktivitását, kötheti a fehérjét vagy fiagmenst, és ezáltal gátolhatja a TRF-nek a TNE-reeepíorhoz való kötődését? vagy más TNF-től tőggS vagy azáltal közvetített mechanizmusén keresztül történő aktivitását, A leírás szerinti értelemben „semlegesítő ellenanyag alatt olyan ellenanyagot értőnk, amely képes gátolni egy TNF-íuggő aktivitást körülbelül 20-126%-kal, előnyösen legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 79, 75, 89, 85, 90, 91,
-2492,93-, 94,95, 96, 97, 98, -99, lÖÓ%-kal vagy jobban, & vizsgálati eljárástól fuggőeu. Egy snrt-TNP eilesanyag képességét TNF-ÍÖggő aktivitás gátlására el&nyősefi legalább egy alkalmas TNF-íehérje vagy -receptor vizsgálati eljárással állapítjuk meg, amint azt a leírásba® feltárjak és/vagy Ismert a szakterületen, Találmány szerinti barnán eiíenaayag bármilyen osztályba (JgG, IgÁ, IgM, IgE, igD, sib.J vagy izotípusba tartozhat, és tartalmazhat kappa vagy lamhda köunyúláncot Egy megvalósítási mód' szerint a humán ellenanyag IgG nehézláncot vagy Bí&ghatározott tagmensí tartalmaz. például az IgGl, ígG2, IgG3 vagy' IgG4 iz-öífpusok legalább egyikét. Ilyen típasú ellenanyagokat transzgeniküs egerek vagy más- traaszgenifcas nem humán emlősök álkabnazásával áliithamnk elő, amelyek legalább egy humán kősnyuiáne [például IgG, ígA és IgM (például γΐ, -γ2, y3, ?4)j teanszgént tartalmaznak, amist azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Egy másik megvalósítási mód szerint az ami-humán OT ellenanyag IgGl nehézláscot és IgGÍ könayöláacot tartalmaz.
Legalább egy találmány szedőit ellenanyag kötődik legalább egy megbatározott epnópboz, amely specifikus legalább egy TNF fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára, A legalább egy epitöp legalább egy ellenanyag-kötő régiót tartalmazhat, amely a fehérje legalább egy olyan részletét tartalmazza, amely epitóp előnyösen a fehérje legalább egy extraedluláris, oldható, hidrofil, kölső vagy citoplazmatikus részletét tartalmazza. A legalább egy megbatározott epitóp a 9, azonosítószámú szekvencia ősszeíhggö amioössvjfinak teljes meghatározott részletének legalább egy l -3 aminosav hosszúságú legalább egy ttónosav-szekveseíájának bármilyes kombinációját tartalmazhatja.
A találmány szerinti humán ellenanyag olyas ellenanyag, amely tartalmazza:
a TNV148 monokionslis ellenanyag sebézlánc komplementaritást meghatározó régióit (CDR) és variábilis vázrégíőit (FR), amist a 4. ábra bemutatja; és a 1NYI48 monoklonális ellenanyag könnyőiánc C.DR-jeit és variábilis FR-jeít, amint az 3. ábra bemutatj a;
és amely adott esetben továbbá tartalmazza a megadott prolin-szerín szubsztitúciót a TNVT48B monoklonális ellenanyag FR3 régiójában, amint a 4. ábra bemutatja.
Ilyen ellenanyagokat előállíthatok az ellenanyag kiilönbőzó részleteinek (például CDR, vázrégió) kémiai összekapcsolásával, hagyományos módszerek alkalmazásával, az ellenanyagot kódoló (egy vagy több) nukleinsav-molekula előállításával és expresszált&tásával, rekembináns DNS technológia hagyományos módszereinek alkalmazásával, vagy bármely más alkalmas eljárás alkalmazásával.
Az anti-TNP ellenanyag a 4. és S. ábrán bemutatott OÍVI48 monoklosális ellenanyag és TOV548B· mőnokionális ellenanyag egyikének nehéz- és könnyőlánc variábilis régióit tartalmazhat; aHumás TN'F-hez kötődő ellenanyagok, amelyek meghatározott nehéz és k&nnyóláne variábilis régiót tartalmasnak, alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatók elő, mint például fagprezentációval [Katsube, Y. és mtsai., lat X Möl Med. I, 863-868. old, (1998)] vagy trasszgejsikus állatokat alkalmazó eljárásokkal, amint az ismert a szakterületen és/vagy feltárjuk a leírásban. Például funkcionálisan átrendeződött huro&h immunglobulin nehézlánc trsnszgént, és funkcionális átrendeződésre képes humán inauuaglöbaíiíi könsysiánc lökaszről származó DNS-t tartalmazó trasszgént tartalmazó Panszgenikus egeret immunizálhatunk humán TNF-fel vagy annak fragmensével, hogy ellenanyagok termelését váltsuk ki. Kívánt esetben az ellenanyag-termelő sejteket izolálhatjuk és hibridómákaí vagy más Ixnmoríailzáit ellenaRy&g-tenuelő sejteket állíthatunk elő, amint azt a
-25ieíráshan feltárjuk és/vagy ismert a szakteröletes, Más megoldásképpen az ellenanyagot, meghatározón részletet vagy variánst alkalmas gazdasejtben expresszáitathaömk a kódoló sokletosavoak vagy részletének alkalmazásával.
Konzervatív ammosav-szabsztitőrió start egy első amnxssavaak egy másodikkal történő helyettesítését értjük, amelynek a kémiai és/vagy fizikai Ptlájdonságai (például töltése, szerkezete, polaritása, MdrofoMíása/htároíSitása) hasonlóak az első ammosaváihaz, Konzervatív szabsztitóciók közé tartozik egy aminosav helyettesítése egy másikkal az alábbi csoportokon beid’; iízin (K), atginin (R) és hisztsdin (H); aszparagíssav (D) és glutamínsav (E); aszparagin (Nj, gtotamin <Q>, szerin (S), treonis (T), tirozin (Y), K, R, Η, B és E; aterön (A), v&lín (y>, lesein (L), izolenein (1), prolin (P), feniíaiaaiá (F), íriptofen (W), metionin <M), cisztein <C) és glteía (G); F, W és Y; C, S és T.
Aminosav kódok
A találmány szerinti aüii-TNF ellenanyagokat felépítő aminosavakat gyakran rövidítik. Az amísos&vak neveit jelezhetjük az amínosavak egybedís kódjaival* hárombetűs kódjaival, vagy három tmkleotídot tartalmazó kodsnn&l történő megnevezésével, amint az: közismert a. szakterületen (lásd Aiberts, 8. és'tntsaí., „Molecubr Bioíogy of Tfee CeiT’, 3, kiadás, kiad.; Gariasd Pubiíshing, Inc., New York, (1994)]:
Egybefes kód Hárombetűs kód Név Hármas nakleotiá kodon(ok)
A Alá Alsóin GCÁ. GCC, GCG, OCG
C Cys Ciszteín GGC, DOG
D Asp Aszparaginssv GAC, GAG
E Gh; Gtóaminsav GAA, GAG
F Phe Fenifemn GGC, GUU
G Oly Glicin CsGA, GGC.GGG, GGG
H Hís Hiszndin CAC, CAG
ϊ íie l.zohmelo AGA, AGC, AGG
k tys Lizht AAA, AAG
L Len Leacin UGA, WO, CG A, CGC, CUG, CGG
M : Met Merionin AGG
N Asn Aszparagin AAC, AAG
P Pro Prolin CCA, CCC, CCG, ccu
Q öin Gfetomin CAA, CAG
R Árg Arginís AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGG
s Ser Szerá AGC, AGG, GCA, GCC, UCG, UCU
T Thr Treeosn AGA, ACG, ACG, ACü
y Val Valin GGA, GGC, GUG, GUU
W Trp Triptoián ÜGG
Y Tv? Tirozin GAC, G AG
- 24 Tslábrány szerinti aati-IW eilenanyag tartalmazhat egy vagy több aminosav-szuhsztitodót, deióciót vagy addlciót, akár természetes mutáció, akár -emberi manipuláció eredményeképpen, amiét a leírásban feltárjuk.
Természetesen azon ammossv-sznbsztitáeíók száma, arait a szakember végezne, sok tényezőtől függ, beleértve a fent leírtakat. Általánosságban, az amiae^av-szubsztitóciók, inzercíók vagy deíéciók száma bármely adott anti-TNF ellenanyag, íragmess vagy wtám esetében nem több, mint 40, 30,20,19, 18, 17, lő, 15, 14, 13-, 12, Π, 10, 9, 8, 7, ő, 5, 4, 3, 2, I, mint például 1-30, vagy bármely tartomány vagy érték azok között, araiöt a leírásban meghatározzuk.
Találmány számít anti~TH.F ellenanyag funkció szerint essssenetáiis aminosava.it azonosíthatjuk a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, mint például belyspecifikus matagenezissel 'vagy alssinpásztázó rautsgenezíssel {példás! Ansabel, mint fest,. §., 15. fejezet; Camsagham és Wells, Science 244, 1081-1085. old. (1989)j, Az utóbbi eljárás egyedi aWs mutációkat épít bs a molekula miades egyes oldalláncú helyett A kapott mutáns molekulákat azután teszteljük biológiai aktivitásra, -raiot -például nem korlátozó példaként legalább egy WF-et semlegesítő aktivitásra. Az ellenanyag-kötés szempontjából kritikus helyeket azonosíthatjuk szerkezet elemzéssel is, mist például kristályosítással, magsrágneses rezonanciával vagy fötoaíSnitást jelöléssel [Smiíh és tnísaí,, X Mól. Bioi, 224, 899-904., old. (1992) és de Vos és tntsai,, Science 255, 306-312. old, 0992}}.
Amint a szakember számára nyilvánvaló, a találmány -tárgya legalább egy, találmány szerinti biológiailag aktív ellenanyag. A biológiailag aktív ellenanyagoknak az aktivitása legalább 20%-a, 39%-a vagy 4ö%-a. és előnyösen legalább 5ö%-a, 60%-s vagy ?ö%-a, és legelőnyösebben legalább 8ö%-a, 90%-a vagy 95%-1000%-a a natív (nem színtetikas), endogén vagy rokon és ismert fonnának. Enzímatíkas aktivitás és szubszrtái-speciFitás mérésére és mennyiségi meghatározására szolgáló eljárások jól ismertek a szakember számára.
Egy másik ntegvalósbási mód szerint a találmány tárgyát humán ellenanyagok képezik, amint azokat a leírásban feltárjuk, amelyek egy szerves moitolsrész kovalens kapcsolásával módosítva vannak, Az ilyen módosítások olyan ellenanyagot eredményezhetnek, amelynek jnvítortak a íártsakokmettkai paraméterei (például megnövekedett /« vívó széntm-féléieridé). A szerves molekslarész lehet lineáris vagy elágazó hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport vagy zsímv-észter-esoport. Előnyös .tnegvalósftási módok szerint a hidrofil polimer-csoportnak a molekulatömege körülbelül 800 ás körülbelül 120000 Daltos között lehef és az püliaíkán-ghko! {példán! pahertlén-glíkol (PEG), pöijpropilén-glikol (PPG)}, szénhidrát polimer, aminosav polimer vagy palivinil-psrrolidos leltet, és a zsírsav vagy zsírsav-észter csoport körülbelül 8 és körülbelül 40 közötti számú szénatomot tartalmazhat
A találmány szerinti módosított ellenanyagok iMtsímazbatonk egy vagy több szerves molékularészt, amely kovalensen kötődik az ellenanyaghoz, akár közvetlenül, akár közvetetten. A találmány szerinti elietsanyaghoz kötött minden egyes szerves molekiteósz egymástól függetlenül lehet hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport vagy zsírsav-észter-csoport. A. leírás szerinti- értelemben a „zsírsav” kifejezés alatt monokarhoxü-savakaí és dikarboxií-savakaí értünk. A leírás szerint; értelemben „hidrofil polimer-csoport kifejezés alatt olyan szerves polimert értünk, amely jobban oldódik vízben, mint oktáoban. Például a. poiííizm jobban oldódik vízben, mint okránban. Hy módon pohiizin kovalens kapcsolásával módosított ellenanyag a
-27találmány tárgykörébe tartozik. A tedáitóny szerinti eííenanyagok módosítására alkalmas hidjofíl polimerek lehetnek lineárisak vagy elágazóak, mist például políaStán-gükolok (példáiul PEö, moKomeíoxí-polietilénglikoi (mPEG), PPG és hasonlók], szénhidrátok (példán! dextrán, cellulóz, oiigoszacharidok, políszachtedok és hasonlók), hidrofil atntnosavak pelimrjei (például poiíiizin, pohargínin, poliaszpartát és hasonlók), poíiálkán-oxídök (péidáal poiletdén-oxíd, políproldéti-oxid és hasonlók) és pshvíníl-pirrölídon. Előnyösen a találmány szerinti ellenanyagot módosító hidrofil polimer molekulatömege körülbelül 89Ö és körülbelül 150000 Dalion között van különálló molekuláris entitásként. Példád PEGsoos és PEGtea» alkalmazható, ahoi az alsó index a polimer Daltonhsn mért átlagos ínofekuiatemege, A hidrofil polimer-csoport szabsztituálva lehet körülbelül 1-6 alkil-, zsírsav- vagy r^hsav-észter-csoporttal. Zsírsav- vagy zsfesav-éstór-csoporítal szubsztituált hidrofil polimereket, megfelelő eljárások alkalmazásával állíthatunk elő, Például amin-csoportot tartalmazó polimert kapcsoihafiuk a zsírsav vagy zsírsav-észter karboxli-csoporíjához, és zsírsav vagy zsírsavészter aktivált karhoxilját (például Ν,Ν-kaffeontl-áiimidazonal aktivált) kapcsolhatjuk & polimer hiároxHcsoportjához.
Találmány' szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak és zsírsav-észterek lehetnek teltetek, vagy tartalmazhatnak egy vagy' több teiteien kötést. Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak példás! az alábbiak: n-doáekanoát (Ca, íaurát), n-teiradekanoái (Cu, mirisztáí), noctadekanoát (C!s, sztearát), s-eikozanoát (€» araehldát) ís-dokozasoát (C^, behenáí). n-tríakoHtaoöát (CJ0), n-íetrakoníarmáí (C®), císz-Á^-oktadekasoát (Cjg,. oleát), összes ci»z-A5(8síl,14-eíközáüraenöát (C;q, arachidonáí), oktandíonsav, tetradskándionsav, oktadekándsonsav, dokozándíonsav, és hasonlók. Alkalmas zsírsav-észterek közé tartoznak dikarboxslsavafc olyas moKóészterei, amelyek lineáris vagy elágazó, kisebb szénatomszáraó alkil-csopörtot tartalmaznak. A kisebb szénatomszámú alkíl-csoport tartalmazhat körülbelül 112, előnyösen körülbelül 1-6 szénatomot
A módosított humán clienaoyagokat alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő, mint például egy vagy több módosító reagenssel történő reagáltaíássai. A leírás szerinti értelemben „módosító ágens” kifejezés alatt alkalmas szerves csoportot (például hidreírl polimert, zsírsavat, zsírsav-észter) ériünk, amely aktiváló csoportot tartalmaz. Az „aktiváló csoport olyan kémiai moleksiarész vagy funkciós csoport, amely megfelelő körülmények között - képes reagálni egy második kémiai csoporttal, és ezáltal kovalens kötést kialakítani a módosító ágens és a második kémiai csoport között. Példád amís-resktív aktiváló csoportok közé tartoznak elektrofii csoportok, mint például a tozil&í, mezííáí, haló (kloro. bromo, fluoré, jodo), Nhidrexiszukcinimiídíl-észterek (NHS) és hasonlók. Ttotokkal reagáló aktiváló csoportok közé tartozik például a maleimid, jodoacetíi, akríloil, pirtdil-diszulfidctk, S-tiol-S-nib-obenzoesav-fiol (TNB-tiól), és hasotdök. Aldehid funkciós csoportot kapcsolhatunk amint vagy bldrazidot tartalmazó molekulákhoz, és szid csoport reagáltatható trívalens foszíbr-csoporttal, foszforamídát vagy foszforlmtd kötéseket kialakítva. Megfelelő eljárások aktiváló csoportok molekulákba történő beépítésére ismertek a szakterületen (lásd például Hcrmanson, G. T.„ „Bfeeonjugafe TeehaíqoesT. kiad.: Academic Press: Sas Diégo, CA (Í99ő)j, Aktiváló csoport köthető közvetlenül a szenes csoporthoz (például hidrofil polimerhez, zsírsavhoz vagy zsírsavészterhez), vagy kapcsolómolekuián keresztül, például divaless Cj-C^ csoporton kérésztől, amelyben egy vagy több szénatom helyettesíthető heteroatommal, mint például oxigénnel, aitrogámtel vagy kénnel. Megfelelő kapcsolósnoíekulák közé tartozik például a tetraetílén-glikoi, -(CHj)3-, NH-(CH?.A-NH-, és
-28“CHj-O-CHj-CHí-O-CHj-DHrO-CH-NH-, Sapcsoiémolekulát tartalmazó módosító ágenseket előállíthatunk például nteno-Boe-asktldiantin (például stoao-Boc-eÚléndiamas, ?nono>Sec«d}mmobexán) zsírsavval történő reagáltatásávnl I -etil-3-(3-dmtetÍlam«topropiÍ)-ksrbodilmid (BDC) jelenlétében, snrid-kötést kialakítva a szabad amis és a zsírsav karboxília között A Bee védőcspportöt elfevnlfíhatjok a termékről trifluor-ecetsavval (TFAX szabaddá téve a primer amint, amely kapcsolható egy másik karboxilhoz., amint feltártuk, vagy reagáitstható maleinsav-anhídriddel, és a kapott terméket ciklizáihaíjuk, a zsírsav aktivált ntalettrttdoszármazékát előállítva [lásd például Thompson és mfeai., WO 92/1622!, számé nemzetközi közzétételi irat],
A találmány szerinti· módosítóit ellenanyagokat előállíthatjuk humán ellenanyag módosító ágenssel történő reagáitatásával, Példásl a szerves molekularészeket köthetjük az ellenanyaghoz nem specíőkus módon, amln-reakttv módosító ágens alkalmazásával, például PEG NRS-észterévd, Módosított humán ellenanyagokat előállíthatunk ellenanyag vagy antigén-kötő fra^trens disznlfid-kötésemek (például láncon belüli díszulBdkőtéseinek) redukálásával, A redakált ellenanyagot azután rsagáhatbsíjuk tiol-reaktív módosító ágenssel, találmány szerinti módosított ellenanyagot előállítva. Találmány szerinti ellenanyag specifikus helyeihez kötött szerves molekularészt tartalmazó módosított humán ellenanyagokat előállíthatunk megfelelő eljárások alkalmazásával, mint példán! reverz proísöíizissel [Fiseb és mtsaí, Bíoeonjugate Chem, 3, 147-153, old. (1992); Werlea és mtsai., Biocosjagste Chem. 5. 411-417. old. (1994); Knmaran és mísai, Protein Sci, 6, 2233-2241, old. (1997); Itoh és mísak, Bioorg. Chem, 24,; 59-68. old, (1996); Capellas és tntsai., Biotechnoi. Bíoesg, 56, 456-463, old, (1997)] és a Hermanson, G. T. által leírt eljárásokkal („Bloconjugate Techniques.”, 'kiad..: Acadamte Press: SanDiege, CÁ(1996)j.
Á találmány tárgyát képezi legalább egy snti-TNF ellenanyag készítmény is, amely legalább egy, legalább keltő, legalább három, legalább négy, legalább öt, legalább hat vagy több találmány szerinti anti-TNF ellenanyagot tartalmaz, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen, ás amelyek természetben nem előforduló készítményben,, keverékben vagy tormában vannak. Találmány szerinti ellenanyag készítmények. továbbá ttutaknazhatják legalább egy olyas készítmény vagy ^gyógyászati készítmény alkalmas és hatásos mennyiségéi, amely legalább egy' anii-TNF ellenanyagot tartalmaz ilyen modulálást, kezelést vagy terápiái igénylő sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens számára, és adott esetben továbbá tartalmaz legalább egyet az alábbiak .közül: TNP antagonista (például nem korlátozó példaként TNE ellenanyag vagy fragmens, oldható TNF-receptor vagy fingmeus, azok fúziós fehérjéje vágj' klsmoiekulás TNF aatagosísta), aníireunratikura (például metetrexáf auranoftn, anrotioglnkóz, azatíoprin, etanercept, arany-nátríism-tíomslát, hldroxikioroqnln-szailht, iefianomid, sznlfászatetn), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid anfünilammaioríkus drog (NSAIÖ), filjdalomcsíilapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, senromnszkuláris gátiószer, mikrebaslienss szer (például ammöglikozM gotnbaelleses szer, p&mzitaeilenss szer, vírusellenes szer, ksrfeapenem, cefalosporin, flurorqumolon, makróik!, penicillin, sznlfonamld, tetraciklin, egyéb nrikrehssflenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszteroid, anaboíikas meroH diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi attyag, tápanyag, pajzsmirtgy ágens, vitamin, kaJeínnnnal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antíköaguiáns, eritropoietin (például speetin-alta), fiígraszáám (például ö-CSF, Hettpőgen), szargrausoszilm (GM-CSF, Lenkin), smmnnizáió szer, ímmuuglobaltn, immunszuppresszáns (például basílixímsb, clklosporín.
- 39 daclízumsh), növekedési borsos, hömronhelyeítesítő drog, ífcztregéa-recepter modulátor, pupillatágíté szer, oikloplegiás szer, alkilálő ágens, antímetaboiit, mitóíikss htoíbítor, radtoterápiás szer, tteidepresszáns, antimániás ágens, antípszíshotlkus szer, amdolititem, hípnofifcum, szimpatomimstíkum, stimuláns, donepezíl, tatain, aszbrtagyógyszer, béta agonista, ínhaláit szteresd, leukotrién inhibitor, meuixaníin, kromolln, eptaefrín vagy analógja, doraáz-alfa (Pulmozyme), shokin vagy cltokis antagonista. Ilye® citoktoek ®em korlátozó példaként lehetnek IL-1 és JL-23 között bármelyik. A megfelelő dózisok jól ismertek a szakterületen [lásd például „Pharmaeoíberapy Hasdbook”, 2, kiadás, szerk.: Wells és mtsai,, kiad.: Áppleton aud Lángé, Stamlord, CT (2-ÖO0); „PBR Ptomacopoefe, Taraseon Pocket Pharmacoposis 2ööö, Delwte Bdition”, kiad,: Tárásét® Pablishtog, Loma Linda, CA (2ÖöO)j,
Az ilyen rákellenes vagy fertőzéseSfenes szerek tartalmazhatnak toxin molekulákat is, amelyek kapcsolódnak, kötve vannak, együtt varnak kiszerelve vagy együtt vannak beadva legalább egy, találmány szerinti ellenanyaggal. A toxin adott -esetben hathat úgy, hogy szelektíven elpusztítja a patológiás sejtet vagy szövetet A patológiás sejt lehet ráksejt vagy egyéb sejt Ilyen toxin fehet sem korlátozó példaként tisztított vagy* rekornbiuáss toxin vagy íoxin-S-agmens, amely toxin - például ricln, diftéríatoxis, venomtoxin vagy bakteriális toxin - legalább egy funkcionális cltotoxíkus dménját tartaimazza. A toxin kifejezés magában foglal mind endotoxisokat, mind exotoxfeokat, amelyeket bármely temészetbea elóiörduió, mutáns vagy rekombináns baktérium vagy vírus termel, és amelyek bármilyen patológiás állapotot okozhatnak emberekben és egyéb emlősökben, mist például toxin sokkot, ami halált is eredményezhet. Ilyen toxinok nem korlátozó példái enterotoxlgén £ co/1 hdlabííls estorotoxtn (LT), höstabii entarotoxís (ST), Sbígetfa eltotoxin, Awtow esterotoxisok, toxikus sokk szindróma ioxto-1 (TSST-1), S^ájy/öfiöeetö enterotoxin A (SEA), B (SEB) vagy C (SEC), Skreptococess eníerotoxinok és hasonlók. Ilyen baktériumok nent korlátozó példái esterotoxigéo S. coii (BTEC), enterohemorrágiás £ c©$ fajok törzsei (például a 0157:117 szerotípss törzsei), Siapkfá&ceeffss fajok (például StepbyfocGcciw aanms, pypg®m.s), Sbigeiiü fajok (például
Shigeífo ifysenieríae, Shigefía jfexrteri, Sfegeíla beydii és Sóigekto sotmeí), SolmaneSa fejők (például Saimonelia íypfci, Salmonélfa ttómwitíí, Saimonelís erqlerítíifis), CÍOííridiíes fejők ('például Cterzteuffí perfringisns, üfesP-zdfenf d/ftode, Ctoxfridfw? Mama), Cewphiobavier fajok (például CMnptöo&pcter jqfank CpmphÍobacter fgtus), JXeltobacter fajok (például Heliabsctffr pyforff Aerempees- latok (például Aeremonas. sobria, Asromonas hydrűphűa. Aeromenes cavias), jPteisomonas shigettcbdes, Yersina enter&c&fítíca, Ltorios fajok például Ks&rias cMeree* Wbríos parah&maiyticus), -KléMeSa fajok, Psettdcxtstottes: aeragmose és sztreptokokkuszok [lásd például „Internál Medicme”, 3, kiadás, szerk.: Síéin, 113. óid., kiad.; Littfe, Browb. and Co,, Boston, (1990); „Baeíeríal ísfectíoas of Búmat»: Epídemfelogy and Control”, 2. kiadás, szerk.: Evans és mtsai., 239-254. old., kiad.; Pfenurn Medtoal Book Co., New York (1991): Maudcll és tntsaí., „Frindples and Praetícs of Infeelious Diseases, 3, kiadás, kiad.: Churchill Livingstone, New York (1990); „The Merek Manual”, ló. kiadás, szerk,: Berkow és mtsai,, kiad.; Merck and Co., Rairsvay. NJ. (1992); Wood és mtsai, FEMS kScrobiology Insnunology 76, 121-134.old. {1991}; Marraek és mtsai,, Science 248,705-711. old. (1990)),
Találmány szerinti unti-TNF ellenanyag vegyüietek, készítmények és kombinációk továbbá tartalmazhatnak legalább egy megfelelő kiegészítő anyagot, mint például nem korlátozó példaként oldószert, tetőszert, stabilIzáSöszert, puf&reket, sókat, íipofil oldószereket, tartósítószereket, adjuvánsskat és hasonlókat,
-30Győgyászatíiag elfogadható kiegészítő anyagok az előnyösek. Ilyen steril oldatok, és előállításukra szolgáló eljárások sem korlátozó példái jól ismertek a szskterölefon. mint például nem korlátozó példaként „Remmglos’s Pharmaceutieal Sciences1’, lg, kiadás, szerk.; öennaro, kiad.: Msek Fuhlhhíag Co., Sasion, PA (1998). Rutinszerűen választhatunk ki olyan gyógyászaíílag elfogadható hordozókat, amelyek alkalmasak az anti-TNF ellenanyag készítmény beadásának módja, oldhatósága és'vagv stabilitása szerint, amint az jól ismert a szakterületen vágj' feltárjuk a bírásban.
A találmány szeristi készttméayfcen hasznos gyógyászati kötőanyagok és adalékanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak fehérjék, peptidek, amfeosavak, lipidek és szénhidrátok (például cukrok, köztük monoszacharidok, di-, tri-, létra- és oligoszacharidok; derivarizáS cukrok, raját például afditoiök, sldonssvak, á&zterifikált cukrok és hasonlók; és poliszaeharídok vagy ciátorpoSmerek), amelyek egyedül vagy kombinációban lehetnek jelen, 1-99,99% mennyiségben egyedül vagy kombinációban tömeg vágj·- térfogat szerint. Szemléltető fehérje kötőanyagok lehelnek a szérumalbuminok, mint például barnán széramalbwmin (HSA), rckombmáss humán sibumin (rHA), zselatin, kazein és hasonlók. Reprezentatív atnmosavfoHenanyag komponensek - amelyek pufforként is működhetnek - tehetnek ahmis, glicm, argrara, bétáin, hisztidin» gluísminsav, aszparaginssv, cisztein, lízin, leucin, izoleucin, valin, metiosín, feaíiaíania, aszpartám és hasonlók. Egy előnyös araisosav a gífeás.
A találmány szerint megfelelSen alkalmazható szénhidrát kötőanyagok például a monoszaefearidok, mint például fruktőz, rnakóz, galáktóz, glükóz, D-massóz, szorbéz és hasonlók; diszacharidok, mist például iaktóz, szukróz, behálóz, eeliohióz és hasonlók; poliszaeharidok, mint például raS'móz, melesitóz, tnaltodextnnek, dextráook, keményítők és hasonlók; és sidhoiok, mist például manmíoi, xílitol, maliitól, lakktól, xiiltoi szorbköl (ginéitől), míoíuoziiol és hasonlók, A találmány szerbül alkalmazható előnyös szénhidrát kötőanyagok a masaitok írehalózés raffosóz.
Ants-TNF ellenanyag készítmények taríafmazhamak puffon vagy pH-állitó ágenseket is; tipikusan a purfor szerves savból vagy bázisból készített só. Reprezentatív pufforek közé tartoznak szerves savak sói, mist például citromsav, aszkorbinsav, glukossav, szénsav, borkősav, foorostyánkÖsav, ecetsav vagy ftálsav sói, Tris, trometamm-hldroklorid vagy foszfát pufeek. A találmány szerinti készítményekben történő alkalmazásra előnyős pufferek szerves savak sói, mint például eltrát.
Ezenfelül a találmány szerinti antí-TNF ellenanyag készítmények tartalmazhatnak polimer köföanyagokabadaiékanysgokat, mint példán! poiiviaii-pirrolidonökat, fkoil-okat (polimer cukor), dextránokat (például eíklodextrmeket, matt például Ζ-Μ^ΌχίρΓορίΙ-β-είΜοόδχΙτΙηΙ). polietilén-glikofokst. izesfiőszerekel, mikrobaeilenes szereket, édesítőszereket, antioxidánsokst, autisztatikus ágenseket, felsletaklív anyagokat (például pofezorbátokaí, mist például „TWEEN 20*'-at és „TWEEN 30”-8ΐ), lipideket (például fossfolipídeket, zsírsavakat), szíeroídokat (például koleszterint) és komplexképző ágenseket (például EDTA-t).
Ezek és további, találmány szerinti astí-TNF ellenanyag készítményekben történő alkalmazásra megfelelő, ismert gyógyászati kőtőszerek és/vagy adalékanyagok ismertek a szakterületen, például amint a „Remington: The Science & Fractíce of Pitarmaey” [19. kiadás szerit: Williams & Williams (1995)] és a „Fhysician's Desk Reference” [52. kiadás, kiad.: Meditál Ecöjíoesícs, Mostvale, NJ (1998)] felsorolja.
- ál Előnyös hordozó vagy kötöszer anyagok szénhidrátok (például szacharinok és aiüiiöfek) és pufferek (például csírát) vagy polimer ágensek.
Amint feni megjegyeztük, a találmány sárgyár stabil készítmények képesik, ami előnyösen foszfát» puffer sóoldattal vagy egy kiválasztott sóval, valamint tartósított oldatok és kiszerelések, amelyek tartósítószert valamint többszörös felhasználású tartósított kiszereléseket tartalmaz, amelyek alkalmasak gyógyászati vagy állatgyógyászati alkalmazásra, és. amelyek legalább egy anti-TblF ellenanyagot tartalmaznak gyógyászatiéig elfogadható kiszerelésben, Tartósított kiszerelések legalább egy ismert tartósítószert tartalmaznak, vagy adott esetben legalább egyet az alábbiak közül; fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, kierofcrezol, benzilalkobol, feml-hlgany-sltrii, fesoxietanol, formaldehid, kíoröhatoíiot, magnézhmt-klond (például hexahiárát), alkllparabén (metil, etil, propil, buti! és hasonlók), benztókónlton-klörid, beszeíóniomklorid, náfiiam-áehidroaeetát vagy ömerezál» vagy azok. .keveréke vizes oldószerben. Bármilyen megfelelő koncentrációt vagy keverékei alkalmszhatank, amint az ismert a szakterületen, mint például 0,001-5%, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, mint például nem korlátozó példaként 0,081»0,003, 0,805,0,809»
0,O1, 8,02,0,03,0,85,0,09,9,1, Ö& 0,3, 0,4,0,5,0,6, 0,7,0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3,1,4» 1,5, í,ó, 1,7,1,8,1,9,
2,8» .2,1, 2,2,2,3, 2,4» 2,5, 2,5, 2,7» 2,8, 2,9,3,0, 3,1» 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6» 3,7, 3,8» 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6,4;
4,8, 4,9, vagy bármilyen tíírtotoátty vagy érték esek között. Kern korlátozó példa lehet: tartósítószer nélkül, 0,1-2% sn-krszol (például 0,2, 0,3, 0,4, 0,5,0,9, 1,8%), 0,1-3% beszil-alkohol (például 0,5,0,9» 1,1, 1,5, 1,9,
2,0, 2,5%), 8,001-0,5% timerozál (például 0,085, 8,01), 0,001-2,0% fenol (például 8,85, 8,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% alkilpsr&bénfek) (pélááal 0,08875, 0,0009, 0,091» 0,002, 0,805, 0,0075, 0,009, 8,0 í, 8,02, 0,95,0,875,0,09,0,1,8,2,0,3,0,5,0,75,8,9, 1,0%), és tanlók.
Amist fest megjegyeztük, a találmány tárgyát képezi gyártott termék, amely csomagolóanyagét és legalább egy fiolát tartalmaz, amely fiola legalább egy and-TNF ellenanyagot tartalmaz az előírt pofeekkel és/vagy tartósítószerekkel, adott esetben vizes oldószerben, és & csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely jelzi azt, hogy az oldat tárolható I, 2, 3, 4, 5 ,0, 9, 12, 18,20, 24, 30, 36,40, 4.8, 54» 80, 66, 72 órán keresztül vagy tovább, A találmány tárgyát képezi továbbá gyártott termék, amely csomagolóanyagot, egy első, legalább egy liofiilzált sníí-TNF ellenanyagot tartalmazó fiolát, és egy második, előírt putfer vagy tartósítószer vizes oldatát tartalmazó fiolát tartalmaz, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely utasítja s pácienst arra, hogy oldja fel a legalább egy arsíi-TNF ellenanyagot a vizes oldószerben olyas· oldatot előállítva, amely 24 órán keresztül vagy tovább tárolható,
A találmány szerint alkalmazott legalább egy antí-ThiF ellenanyagot rekombínsns ötön áfiítbaljtik elő, beleértve emlős sejtekből vagy írasszgenikns készítményekből, vagy tisztíthatják más biológia forrásokból, amint azt a leírásban feltárjuk vagy ismert a szakterületen.
A találmány szerinti termékben található legalább egy aatí-TNF ellenanyag koneeniráeló-tartoenánya olyan mennyiségeket tartalmaz, hogy egy ttedves/száraz rendszerben a feloldást követően az körülbelül 1,0 Pg-'ml és körülbelül 1008 mg/ml közölt van, habár alacsonyabb és magasabb koncentrációk, is működőképesek, és a tervezett bejnttató eszköztől lűggenek, például oldat kiszerelések különbözhetnek transzdermálís, pulmonárls, nyálkahárty&i vagy ozmotikus pumpa vagy mikropustpa eljárások esetében.
~ 32 Előnyösen a vizes oldószer suton esetben továbbá tartalmaz gyógyászatílag elfogadható tartósítószert is. Előnyős tartósítószerek közé tartoznak az m-teszol, p-krszol, o-fcrszoi, kforokrezoi, benzii-alkohol, alkilparabén (metil, etil, propil» buti! és hasonlók), beazalkómum-klorid, benzeíónhun-klorid, nátriumdehidroaeetát vagy tnnerozál, vagy ezek keverékei. A kiszerelésben alkalmazok tartósítószer koncentrációja olyan, hogy elegendő legyen míkrobaellenes hatás kifejtéséhez. Az ilyen kostceníráeíó íbgg a kiválasztott tartósítószertől, és szskes-ber számára könnyeden meghatározható.
Más kötőanyagok, példán! izotoniás ágensek, pnfferek, snti&stidánsok, tartósítószert segítő anyagok adhatók adott esetben és előnyösen az oldószerhez, l'zotóniás ágenst, mint például glicerint általánosan alkalmaznak ismert koncentrációkban. Előnyösen Ezíolögíallag tolerált paffer is adhatunk javított pHszabályozás biztosítására. A kiszerelések széles pH-tartományt felölelhetnek, mint például körülbelül pH 4 és körülbelül pH 10 közöd» és előnyös tartomány a körülbelül pH 5 és körülbelül pH 9 közötti, és legelőnyösebb tartomány a körülbelül ó,ö és körülbelül 8,0 közötti. Előnyösen a találmány szerinti kiszerelések pH-ja körülbelül ő,8 és körülbelül 7,8 közötti. Előnyös pufferek közé tartoznak a feszfát-pufferek, legelőnyösebben nátrimn-íöszíát, különösen előnyösen a foszfáí-pnfferelt sóoldat (PBS),
Más adalékanyagok, mint példáéi gyógyászatílag elfogadható szolubíHzálö szerek, mist például Twees-20 [polioxietiléri (20) szorfeitás morsulasrátj, Tvveen 40 (polioxíetílén (2ö) szorbitán monopalmitátj, Tween 80 (políoxiétilés (2ő) szorbhán monooleát], Plorosie F68 (polioxíetíién pölíoxipropílén blokkkopolímerek) és PEO (políetilén-glikol) vagy sem ionos felületaktív anyagok, mint példán! poliszorbáí '20 vagy' 80 vagy polexamer Í84 vagy 188, Plurosic® poiiolok, egyéb biokk-kopolinrerek és komplexképzők, mint például EDTA és EGTA adható adott esetben hozzá a kiszerelésekhez vagy kompozíciókhoz -az sggregásáő csökkentésére. Ezek az adalékanyagok különösen hasznosak, ha pumpás vagy műanyag tartályt aikalmszusk a kiszerelés beadására. A gyégyászatilag elfogadható felületaktív anyag jelenléte csökkenti a fehérje aggregáeiórs való hajlamát
A találmány szerinti klszereléseköt olyas eljárással áliithatjnk elő, amely során legalább egy &nti~TNE ellesanyagof összekeverünk vizes oldószerben az alábbi tartósítószerek bármelyikével: fenol, m-krezoi, pkrezol, orkrezol, klorokrezol, beszil-alkohol, alkiiparsbén (msíü, etil, propil, hatil ás hasonlók), benzaSkósiuffi-klorid, benzetőniam-klorid, nátrtam-dehidroacetát vagy timerozál vagy ezek keverékei. A legalább egy aníl-TNF ellenanyag és tartósítószer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy antí-TMF ellenanyag puffereit oldalban lemért mennyiségét kömbiuáliuk pafferelt oldatban lévő kivárd tartósítószerrel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje és s tartósítószer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak sz átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncertlráciő és az alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti kiszereléseket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla íi ólaként, amelyek egyike legalább egy íioőiízált sjtti-TNF ellenanyagot tartalmaz, amelyet feloldandó egy második fiolában, amely vizet, tartósítószert és/vagy kötőanyagokat tartalmaz,, előnyösen feszfáí-puffert és/vagy* sóuldatot vagy kiválasztott sót vizes oidészerhen. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást
-33igénylő dupla fi&Ia dír&feihasználhatő több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily atódoo kényelmesebb kezdési rendet tehet lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állok.
A találmány szerinti gyártott termékek szormaiitól 24 órán belül vagy később történő beadásra alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány szerinti gyártott termékek szignifikáns előnyöket biztosítanak a páciens számára, A találmány szerinti kiszereléseket adott esetheti biztonságosan tárolhatjuk körülbelül 2 és körülbelül 4Ö°C között, és megtartják a fehérje biológiai aktivitását hosszá időn keresztül, ily módon lehetővé tesznek egy olyan címkét a csomagon, amely azt jelzi, hogy az oldat tárolható és/vagy felhasználható 6. 12, 18, 24, 36, 48, 72 vagy 96 órán keresztül vagy tovább. Ha tartósított oldószert alkafetazmtk, az ilyes címke 1~12 hónapos, fél éves, másfél éves és/vagy két éves felhasználást tartalmazhat.
A legalább egy találmány szerinti snti-TNF ellenanyag oldatait olyan eljárással állíthatják elő, amely sétán legalább egy ellenanyagot elkeveritek vizes oldószerben. Az elkeverést hagyományos feloldási és keverési módszerek alkalmazásával hajtjuk végre. Alkalmas oldószer előállításához például legalább egy ellenanyag mért mennyiségű vizes vagy puffsres oldatát kombináljak olyan meraiyiségben» amely megfelelő a fehérje és adott esetben tartósítószer vagy puífer kívánt koncentrációjának biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koseeaíráctó és az alkalmazott beadási mód függvényében,
A találmány szerinti termékeket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy Ífefilizálí amtí-TNP ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz, Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a felíddási igénylő dupla fiola ujrafelhasználiiatő több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelést rendet tesz lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
A találmány szerinti termékeket közvetve biztosíthatják a páciensek számára gyógyszertárak, klinikák vagy egyéb ilyen intézetek és intézmények óíjás, áttetsző oldatként vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy liofilízáit anti-TNF ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Ebben az őseiben sz áttetsző oldat akár egy liter vagy több is fehet, nagyobb készletet biztosítva, amelyből a legalább egy ellenanyag kisebb részleteit ki lehet venni egy vagy több sikalommal, kisebb fiolákba áttéve, és a gyógyszertár vagy klinika biztosítja azokat a vásárlóik és/vagy páciensei k számára.
Ezeket az egyszeres fiolákat tartalmazó ismert eszközök közé tartoznak az oldat bejuttatására szolgáló toll-mjektoros eszközök, mint példáai &£l· Peu, &D AMío/ecíort®, /hono/eor®, AovoPsk®, R-DRFao, .-riPo/feu® és Öpf/Fen®, G&uofeopfePert®, «Seísoávmorm Rgu'li. Híím&'rö ífes®, j?eeo-Pee®, Poferon Bí'ofecrofdb, yect®, J-f.yj Afeeáfe-Fr-ee /«fecíoráö, AfedMccf·®, ameiyket például az alábbi cégek készítenek és fejlesztettek ki: Beesőn Dickensen (Franklin, Lakos, NJ, www.bectondíckesson.com), Disetesnie (Bargdorf, Switzerland, wv¥W,díseöOnic,eo.m); Bksjeet (Portland, Oregon, www.bfeject.eom}; National Medical Prodaeis, Weston Medseal (Iteterbotísegh, UK, www.weston-medíesl.com), Medi-Jecí Corp. (Mfeneapölíx, MN, www.medijeei.com}. Dupla fiolás rendszert tartalmazó ismert eszközök a líofiilzált drog kazettában történő feloldására, és az oldat bejuttatására szolgáló toll-ínjeklor rendszerek, mint például a /AfíííOíroAs'ír®..
-34A találmány szerinti termékek csomagolóanyagot tartalmazrtak, A csostasoléasysg - a hatóságok M megkövetelt isfórtnáelok mellett. · Ismerteti azoka? a körülményeket, amelyek között a termék alkalmazható.. A találmány szerinti csomagolóanyag utasításokat biztosit a páciens számára a legalább egy anti-TNF ellenauysg feloldására a vizes oldószerben oldat kialakítása végett, ás sz oldat alkalmazására. 2-24 órás vagy hosszabb időtartamon belát a kátfíolás, neáves/száraz tennék esetén. Az egyfiolás, oldat termák esetében a címke jelzi, hogy sz ilyen oldat 2-24 érán keresztül vagy tovább is felhasználható, A találmány szerinti termékek, slkabaazbatók humán gyógyászati alkabnazásra,
A találmány szerinti kiszereléseket legalább egy anti-TNF ellenanyag és kiválasztott puffef, előnyösen sóoldatot vagy kiválasztott sót tartalmazó foszfát-puffar összekeverését tartalmazó eljárással lehet előállítani. A legalább egy ellenanyag és pufibr vizes oldószerben íörtéxtő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy ellenanyag vizes vagy puíferes lemért mennyiségét kombináljuk a kívánt pafferelő ágenssel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a feltétje és a puffer kívánt koncentrációjának a biztosítására, Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember szórnám. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet ás a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és sz alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti stabil vagy tartósítod kiszereléseket áttetsző oldatokként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy' dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy líoíilizálf anti-TNF ellenanyagot tartalmaz, ttmelyeí feloldandó egy második Salában, amely tartósítószert vagy puffer és kötőanyagokat tartalmaz vizes oldószerben. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több sikálorsmat, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz tehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
Á legalább egy, találmány szerinti stabil vagy tartósított kiszerelésekben vagy oldatokban lévő antiTN'F ellenanyagot a találmány szerint beadhatjuk a páciensnek számos kSlöufeSe beadási eljárás alkalmazásával, mint például SC vagy ÍM injekcióval; íranszdermálls, pnlmonáris, transzmukóziUis, iíopl&otátum, ozmotikus pumpa, kazetta, rnikropompa, vagy egyéb·, szakember számára ismert módon, amint az ismert a szakterületen.
Terápiás alkalmazások
A találmány szerinti silenaayag vsgy készítmény szolgálhat legalább egy TNF-íel kapcsolatos betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amint az ismert & szakterületen vagy feltárjuk a leírásban.
Előnyösen azok szolgálhatnak legalább egy TNf-fei kapcsolatos betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetheti, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy; elhízás, Immunológiai betegség, szív- és érrendszeri betegség, fertőző betegség, rosszindulatú betegség vagy idegrendszeri betegség.
Közelebbről azok szolgálhatnak legalább egy immunológiai betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy; reumatoiá artri&z, fiatalkori roamatoíd anritiss, szisztémás kialakulásé fiatalkori reumatoid
-35artritísz, sSmörös artritisz, SsszenSvéses eslgolyagyultodas, gyomorfekély, szeronegatív izületi betegségek, ossteoarüiösz, gyalUsdásos bélbetegség, fekéiyes hélgytdisdás, szisztémás toposz eriíematozos, aotifoszfolipid szindróma, szívárv:inyháríya. gyalíadástoveMsz/szemideg gyulladás, idiopátíás puteoeáris ribrózis, szisztémás érgysiSiadás/Wegeser-féle graaaiontatőzís, szarkoídőzis, heregyuiiadás/vazekíémiát megfordító eljárások, allergiás/atópiás betegségek, asztma, allergiás ormyáikaháriya gyulladás, ekcéma, allergiás érintéses bórgyulfedás, allergiás kötöbártya gyulladás, híperszensitivftáses tüdőgyulladás, íranszplantálás, szervátültetés! kilökődés, „graS-verstiS-feost” betegség, szisztémás gyulladásos szindróma, szepszis szindróma, gram-pöztov szepszis, gram-negaiív szepszis, tenyésztésre negatív szepszis, gombás szepszis, rserstropéniás láz, uroszepszis, memsgokökcémia, trarmiaZvérzés, égések, ionizáló sugárzás hatása, heveny hasnyálmirigy gyulladás, felnőttkori légzőszerv! disztressz szindróma, reumatoíd artridsz, alkohol-indukált hepatitisz, krónikus gyulladásos betegségek, szarkoidázls, Croha-féle betegség, sarlósejtes vérszegétsység, diabétesz, nefrózis, atopíás betegségek, toperszenzkívitási reakciók, allergiás orrayálkahártya gyulladás, szénanátha, állandó orrnyálk&háríya gyulladás, kötóhártya gyulladás, wéhrsyálkahártya gyulladás, asztma, csalánkiütés, szisztémás anarilaxis, bőrgyulladás, vészes vérszegénység, hemolidkus betegség, tromboáiopéoia, szöveti vagy szervi gr&ft kilökődése, vese transzptaíáiam kilökődése, szív tenszplaitíátom kilökődése, máj tjraaszptaátea kilökődése, hasnyálmirigy teansapíantátum kilökődése, tüdő transzplssatátotn kilökődése, csontvelő tcauszpls&táta® (SMT) kilökődése, bőr aíiograft kilökődése, porc tra:jszplaníátam kilökődése, csont graft kilökődése, vékonybél teanszplantáíum kilökődése, magzati csecsemőmirigy topiantátnm kilökődése, ineliékpajzsmirígy tetnszpiaotáíum kilökődése, szöveti vagy szervi xeaograft kilökődés, allograíl kilökődése, anli-recepíor híperszenzítívitási reakciók, Graves-beísgsóg, Raynoud-féie betegség, B típusú inzniin-rezisztens diabétesz, asztma, raiaszténia gcávisz, ellenanyag-közvetített citotoxicitás. ΠΙ. típusú biperszenzitivitási reakciók, szisztémás topnss erítemaíőzas, PÖEMS szindróma (poilseuropátía, organomegáha, endokrinopátía, monoklonális gammopátia és bőrelváltozás; szindróma), polineuropátto, organomegálfe, endokrinopátia, monoklonális gammopáíia, bőrelváltozási szindróma, asti-íbszfobplá szindróma, pemfígtssz, szklerodemra, kevert kötőszövet! betegség, idiopádás Addísos-féie betegség, diabétesz meliitusz, krónikus aktív hepatitisz, elsődleges epezsugorodás, vtolígo, érgyulladás, poszt-MÍ cmltotómiás szindróma, ÍV, típusú biperszenzítivitás, érintéses bőrgyttlladás, hiperszenzitivitásos fedőgyulladás, aUograft kilökődése, fetraceitoiáris organizmusok miatti graoulötsák, gyógyszerérzékenység, meíaboliktís/'idiopátiás, Wllson-féle betegség, hemakronratózís, alfa-l-antítripszin hiány, diabetikus retinopéría, Hashimoto-féle pajzsmírigy gyulladás, oszteoporózis, hlpoíaiatníkts-hipöfizls’-adresáíis tengely értékelése, elsődleges epezsugorodás» pajzamírigy gyulladás, enkeíalöraielittsz, csehexia, cisztás tthrózis, csecsemőkori krónikás tüdőbetegség, krónikus obsteuktív tüdőbetegség iCÖPD), örökletes bematofagocitikus límfohiszttocitózls, bőrgyógyászati betegségek, pikkelysömör, hajhullás, nefrózisss szindróma, vesegyuHadás, glonreruláris vesegyolíadás, heveny veseeiégtelenség, hemoshatfzis, urétnia, ioxicítás. rángógöres, ekt3 terápia, antl-CDJ terápia, cítokin terápia, kemoterápia, radi«t«rápia (például sem köriátezó példaként toaszténia, anémia, cachexia és hasonlók)» krónikus szaliciiát mérgezés, és hasonlók (lásd például „Merck MsnuaP, 12-17. kiadások, kiad.: Merck & Cömpany, .Rahway, NI (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), „Pharmacotherapy Hasdbook”, szerk.: Wells ás mtsai., 2, kiadás, kiad,: Áppieton and Lángé, Stamford, Cörm, (1998,2000)],
A találmány szerinti ellenanyag vagy fcésztoéay szolgálhat legalább egy szív- és érrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy; szivhénulás szindróma, szívinfarktus, szívszélhödés, szélütés, isémiás szélütés, vérzés, suterioszklerózis, steroszkierózás» resztsnőris, diabetikus aterioszkierózisos betegség, magas vérayumás, artériás magas vérnyomás, resovassáaááris magas vérnyomás, szív-kihagyás, sokk, szív- és érrendszeri szifilisz, sziveiégteíenség, eor pirfmoMiÍe, elsődleges tüdői magas vérnyomás, szív aritmía, átriális ektópiás szívverés, áíriális szívdobogás, áíriális Sbrillácíó (állandó vagy rohamokban fellépő), perfuzíő utáni szindróma, kardiopulmonáris bypass gyulladásos reakció, kaotikus vagy íSbbközpontá áíriális tachíkardía, szabályos szók QRS taebikaráia, specifikus aritmia, veníriteláris Hbriliáeió, Rís-köteg aritmia, aíriovenírikaláris blokk, kötegelágazás blokk, mlokardiáiís isémiás rendellenességek, koszorúér betegség, augína pekforisa, szívinfarktus, karálömíopátia, 'kitágult vértolulásos kardiondopátia, korlátozott kardiomiopátia, billentyöi szívbetegségek, endokardhísz, perikardiális betegség, szívdaganatok, sorai és perifériás aaearizmus, aortameíszés, aorta gyulladása, sbdotninális aorta és ágainak elzáródása, perifériás érrendszeri rendellenességek, srtériaelzáróáásos rendellenességek, perifériás aterioszkierózisos betegség, troinboangítisz obliieransz, funkcionális perifériás artériás rendellenességek, Raynauá-fáfe jelenség és betegség, akrooísnózis, eritrornelalgia, vénás betegségek, vénás trombózis, viszértágulás, arteriovenózns ííszmia, limfődema, lipödema, sem stabil angina, reperfóziós sérdlás, pumpa utáni szindróma, isémiás reperiőziós sérülés és hasonlók.
A találmány szerinti ellenanyag vagy készítmény szolgálhat legalább egy fertőzó betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy' páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közöl legalább egy; heveny vagy krónikus bakteriális fertőzés, heveny vagy krónikus parazítikus vagy fertőző folyamatok, köztük bakteriális, vitális és gombás fertőzések, HÍViertózés/RW-nertropáda, meningítisz, hepatitisz (A, 8 vagy C, vagy hasonlók), szeptikus artritisz, perítonítisz, tüdőgyulladás, gégefögyuiladás, £, eoó 81$7;h7, bemoHíikus uremiás sziadróma/trombolirikus tromboeiíopéna purpur*, malária, déngue bemofrágíás láz, leismaniázís, lepra, toxikus sokk sáatte, sztreptokakknszos izomgyulladás, gázos üszkösödés, ^e®fea<?íer«ías tnőercKfori, ovmm insraceliulare, cörfm'í íhdógyniiaáás, medencei gyulladásos betegség, horfigyuliadás/menékheregyuliudás, lugrouadö, Lyme betegség, ísfiueuza A, Epsíein-Barr vírus, virális hemafagocitőtíkus srisdröma, virális eukefaldiszuszeptikus meníngitisz, és hasonlók,
A találmány szerinti ellesauyag vagy készítmény szolgálhat legalább egy rosszindulatú betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem. korlátozó példája az alábbiak közöl legalább egy; leukémia, heveny leukémia, heveny .limfohlasztlkus leukémia (ALL), B-sejtes, T-sejtes vagy F'AB ALL, heveny snieloíd leukémia (AML), krónikus míeiocHikus leukémia (CML), krónikus Hmfocítíkus leukémia (CLL), szörsejt leukémia, niisiodípiaszbkus szindróma (MDS\ ihnfőma, Hodgkis-betegség, rosszindnbtú límfóma. sem-hodgkm-límföma, Burkirt-límfóma, tSbsszösrSs mieiőmu, Kapösi-szarkóma, kelorekfális kasuinéma, pankreatíkus kareinóma, nazofaringeális kareinóma, rosszindulatú hisztloeitózis, paraneoplasztikus szindróma/rosszindulatú elváltozás híperkalcémiája, szilárd daganatok, adenokamísómák, szarkómák, rosszindulatú melanóma, hemangióma, áttétes betegség, rákkal kapcsolatos osonífelszívódás, rákkal kapcsolatos csonífájdalom, és hasonlók.
A találmány szerinti ellenanyag vagy készSmény szolgálhat legalább egy idegrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben,, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: neurodegeneratív betegségek, szklerózís multiplex, migrénes fejfájás, AIDS demencia komplex, demielínációs betegségek, mint például szklerózís multiplex és heveny írsnszverz míelitisa; extrapíramidáhs és cerebelióris rendellenességek,, mint például a kortíkospinális rendszer sérülései; a feazális ganglioaok rendellenességei vagy cerebelláris rendellenességek; bíperkinetikus mozgási rendellenességek, mint például Huníington-fele vítusfáne és öregköri vitetáne; gyágyszer-mdukált .mozgási rendellenességek, mint például a CNS dopamin-reeeptorokat gátló gyógyszerekkel indukáltak; hipokinetíkus mozgási rendellenességek, mint példáid Psrkinscn-kór: progresszív szuprarmkleáris bénulás; a eerebeilum szerkezeti sérülései; spsnoeerefeellárís degenerációk, mint például spinális ataxia, .Fríedreicfe-féle ataxia, cerebetlás'ís kortíkális degenerációk, több rendszert érintő degenerációk (Mencei, D^eribe-Tbomas, ShiDrager és Maehado-Joseph}; szisztémás rendellenességek. (Reísum-féle betegség, abétaiíp&protémia, ataxia, telangiektázia és mitokosdriális több rendszeri érintó rendellenességek)· demielinácíós mag rendellenességek, mint például szklerózís multiplex, heveny trsnszverz mielidsz; és a motoros egységek rendellenességei, mint például neurogén muszkuláris atréfíák (enteriőr szarvsejték degenerációja, mint például smioíroftkus laterális szklerózís, gyermekkori spinális muszkuláris síréira és fiatalkori spinális muszkuláris aírófía); ÁIzheiraer-kór; középkorban fellépő Down szindróma; diffúz tewv-féle íesíbetegség; öregkori Lewy-fele elmebaj; WentiekeKorsakoff szindróma: krónikus alkoholizmus; Creutzfeldí-Jakob betegség: szabatost szkierózísos paneskefaliíisz, Rallerrorden-Spatz betegség és d&meatíá pugilistica, és hasonlók, lásd például .Mérek Marinai”, lő.kiadás, kiad.; Merck & Company, Rahway, NJ (1992)..
beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe. Ilyen eljárás adott esetben továbbá tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a készítmény beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak közül; TNF antagonista (például nem korlátozó példaként INF ellenanyag vagy feagmens, oldható TNF-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kísmolekuiás TNF antagonista), antireumaíikum (például meíotrexát, auranoírn, aurodoglökóz, azatioprin, etanercept, arany-ríátrium-tiomaiát, hidroxikloroqum-szuifát, leflunomíd, szulfaszaizíu), izomreiaxáns, narkotikum, nem szteroid antimflanmsatorikus drog (NSÁID), fájdalomcsillapító, érzéstelenító, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátíószer, mikrohaellenes szer (például ammogltkozid, gombsellenes szer, parazhaeilenes szer, vírusellenes szer, ksrbapenem, cetálosporin, flurorqulnolon, makrolid, penicillin, szulfonamíd, tetracíklin, egyéb mikrohaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikoszíeroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmírigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés ellem szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, sntikoaguiúns, eriíropoíetio (például epoetís-alfa), fsigraszüm (például ű-CSF, Neupogen), szargrumoszíim (GM-CSF, Leukín), immunizáló szer, immunglobulin, intmunszuppresszáns (például basílíximab, eiklosporln, daclizumab), növekedési hormon, hormonhelyeítesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pnpiiiaíágiíó szer, eikloplegiás szer, alkiláló ágens, antimetafeolst, iniíoíikus inhibitor, radíoteráplás szer, antidepresszáns, antimániás ágens, antipsziehotíkus szer, anxiolitikum, hipnotikum, szhnpatomim.etikum, stimuláns;, donepezil, takrin, asztmagyőgyszer, béta agonista, iuhalált
-38szteroid, ieukotriéu inhibitor, mstiíssioím. foramolia,. epineffin vagy analógja, domáz-alfa (FiúmoaymeX ciíokin vagy eitokin antsgosists, A megfelelő dózisok jól ismertek a szakferüfeten [lásd például „Phansacodserapy Handboek”, 2, kiadás, szerk,: Wells, kiad.; Appleton and Lángé, Stamford, CT (2ŰÖÖ); „PDR Pharmacopoeia, Tarascos Pocket Phamiaeopoeiu 2ÖÖŐ, Deluxe Edition”, kiad.: Tarascon Publíshíng, borsa Linda, CA (2008)3.
Találmány szerinti készitmenyekbes, kösnhináeios terápiákban, együttes beadásban, eszközökben és/vagy eljárásokban sikaltnazható TNF-antagonísták (amelyek továbbá tartalmaznak legalább egy találmány szeríati ellenanyagot, annak meghatározott részletét vagy variánsát) nem korlátozó példái közé tartoznak antiTNF ellenanyagok, azok antigén-kötő fegmensei, és olyan receptor-molekulák, amelyek speeíSfcusaa kötődnek TNF-hez; olyan vegyületek, amelyek megelőzök és/vagy gátolják INF szintézisét, TNF felszabadulását vagy annak hatását célsejteken, mint például thaiidomide, tenidap, foszfodiészteráz inhibitorok (például pesttoxííy’i&e vagy rolipram), ASb-adenozin-reeeptor agonisták és A2b-adenozin-rsceptor enhancerek; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják a TNF-reeepter jeltovábbítását, matt példán! a mítogén-aktívált protein -{MAP}- kináz mhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a memhrán-TNF hasítását, romi például melalioproteináz inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a INF aktivitását, mint például angmienzin-koavertáló-enzim (ACE) inhibitorok (például captopril); és olyan vegyaietek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF termelését és/vagy szintézisék mint például MAP-fcináz inhibitorok.
A leírás szerinti értelemben „tamornekrőzís-faktor ellenanyag”, „TNF ellenanyag”, „TNF-n ellenanyag” vagy fragmens és hasonló csökkenti, blokkolja, gátolja, megszXlnteti vagy zavarja a TNF-a aktivitását 1« v/mo. /« sftu ávvagy előnyössé m w, Például megtelelő találmány szerinti TNF humán ellenanyagok kötődhetnek TNF-u-hoz, és lehetnek antt-TNF ellenanyagok, azok aniigén-köíö fragmessei, és azok meghatározott nmtánsai vagy dcménjai, amelyek specifikusan kötődnek a TNF-a-hoz, Megfelelő TNF ellenanyag vagy fragmeus csökkentheti, blokkolhatja, megszüntetheti, zavarhatja, megelőzheti és/vagy gátolhatja TNF RNS-, DNS- vagy fehérjeszintézisét, TNF felszabadulását, TNF-receptor jeltovábbítását, rnembtán-'ÍNF hasítását, TNF aktivitását, TNF termelését és/vagy szintézisét.
A cÁ2 kíméra ellenanyag tartalmazza az A2 jelit, magas affinitású semlegesítő egér antl-bumán-TNFα Igöl ellenanyag antigén-kötő variábilis régióját, és tt humán IgG! kapps immunglobulin állandó régióját. A humán Igöl Fe-régió javítja az ellenanyagok allogeneíkus eífektor funkcióit, növeli a keringési féléietidejíiket és csökkenti az ímmunogeaitásukat. A vA2. ktméta ellenanyag avidítása és epitóp-speeifttása az A2 egér ellenanyag variábilis régiójától származik. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér ellenanyag variábilis régióját kódoló nukleinsav előnyös forrása az A2 hibridóma sejtvonal.
A kitnéra A2 ellenanyag (eA2) dóristüggo módon semlegesíts mind a természetes eredetű, mind a rekombínáns humán TNF-n citotoxikus hatásait. A cA2 kimét» ellenanyag és rekombínáns humán TNF-et kötési vizsgálataiból a cA2 kímérs elieuasyag aiTmításí állandója 3,ö4xlGtö M’1 értékűnek adódott, Monokionális ellenanyag specifításájrak és affinitásának meghatározására szolgáló előnyös kompetitlv ínhibíciős eljárások megtalálhatók sz alábbi irodalmi helyeken: Pf&riow és mtsai., „Antíbodies: A Laboratory* Manual”, kiad,: Cold Spring Harbor Laboraíety Press, Cold Sprirtg H&rbor, New York, (1988): „Carrent Protocois ín Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad,: Greene Pnblishing Assoc, and Wíley Loíerscience,
-39N'ew York (I992-28ÖÖ); Kézbőr és mtsai., Immunoi, Today, 4, 72-79, old. (Í983); .„Current Protocols in Motellá? Biotegy”, szett.; Ausubel és rnísaL kiad,: Witey ffiteeienee, New York (1987-2000); és Malter, Meth, Enzymol. 92, 589-601. old. (1983).
Egy előnyős megvalósítási mód szerint az· A2 egér monoklonáiís ellenanyagot a el34A jelű: sejtvonal termeli. A cA2 kbnéra ellenanyagot a előSA jelű sejtvosal termed.
A találmány szerint alkalmazható musoklonális aati-TNF ellenanyagok további példáit feltárják a szakirodalomban [lásd például a 5 231 024, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot; Moher A. es mtsai., Cytokine 2, 102-169. old. (1990); 07/943 §52. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1992, szeptember 11-én); Rathjen és misei., WG91/Ö2Ő78, számú nemzetközi közzétételi irat (közzétéve 1991, február 21-ás); Rubin és mtsai., Ö21S 868. számú európai közzétételi irat (közzétéve 1987. április 22-én); Yóne és mtsai,, 0 288 888, számú európai közzétételi irat (közzétéve 1988. október 26-áa); Eiang és mtsai., Bíocbent. Bíophys. Rés. Comat. 137, 847-854. old.. (1936); Meager és nttsai., Hybridoma 6,. 305-311. old. (1987); Fendiy és mtstu,, Hybrídama 6, 359-369. old, (1987); Bringman és mtsai,, Hybridoma 6,489-50?. old, (19S7) és Hirai és mtsai., J. ímmasol. Meífe. 96, 57-62. öld. (1987)], TNF-receptor molekulák
A találmány szerint alkalmazható előnyös TNF-receptor molekulák azok, amelyek magas affinitással kötődnek a TNF-n-boz [lásd például Feldmanu és mtsai., WO 92/Ö7Ö76. számú nemzetközi közzétételi irat (közzétéve 1992. április 38-án); Sehall és mtsai,, Cell 61,361-370. old. (1990); és Loetseher és mtsai., Coll 61, 35 l-359.old. (1990), amely referenciák teljes terjedelmekben hivatkozás útján a kitardtás' részét képezik], és adott esetben alacsony immunogersitásúak. Közelebbről ez 55 kDa (pS5 TNF-R) és a 75 ©» (p75 TNF-R) sejtfelszíni TNF-reeeptorek alkalmazhatók a találmány szerint. Ezeknek a receptoroknak a csonkolt formás, amelyek a receptorok extraoellulárls dosnánjait (ECD) vagy azok fonksstenálte részleteit: tartalmazzák [lásd például Corcoraa és mtsai., Ear, J, Biochem. 223, 831-849, old, (1994)], szintén alkalmazhatók a találmány szerint. A TNF-reeeptorok ECD-t tartalmazó csonkolt formáit detektálták vizeletben és szérumban,mint 30 kDa és 4ó kDa TNF-u inhtbítorikus kötöfehérjéket [Engeteann FI, és mtsai., J. Bioi. Chem. 265, 1531I536.ofd. (l990)j. Multimer TNF-reeeptor molekulák és TNFAtnmonreceptor fúziós molekulák és azok származékai és iragmensei vagy részletei további példái a találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNF-reeeptor molekuláknak. A találmány szerint alkalmazható TNF-reecptpr molekulákat az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú idős keresztül történő kezelésére, a tünetek jó és kiváló enyhítésével és .alacsony toxichássat Az alaesöay snmanogenitás és/vagy magas affinitás, valamint más meg nem határozod tulajdonságok hozzájárulhatnak az elért terápiás eredményekhez.
A találmány szerint alkalmazható TNE-reeeptör multimer molekulák tartalmazzák két vagy' több TNF-rcoeptor ECD-jének az egészet vagy íuskoibnáiís részletét egy vagy több polipeptid kapcsoíőmolekuMvaí vagy nem peptid kapesolőmoiekötávat, mint például polletüén-glikollal (PEG) összekötve. A multimer molekulák továbbá tartalmazhatják szekretált fehérje szígnálpepfidjét, hogy az irányítsa a multimer molekula expresszíóját. Ezeket a multimer molekulákat és az előállításukra szolgáló eljárásokat a 08/937 533. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben tárták fel (benyújtva 1995. május 9-én).
-48A találmány szerinti eljárásokbsm és készítményekben alkalmazható TAT-immunreeeptor fúziós molekulák egy vagy több inímunglobuiin moleknla legalább egy részletét, és egy vagy több TNF-receptor egészét vagy funkcionális részletét tartalmazzák. Ezeket az immunreceptor fúziós molekulákat monomerekként vagy belenő- vagy hotnomaldtncrekként állíthatjuk össze. Az immunreceptor fúziós molekulák lehetnek monovalensek vagy molrivalsnsek is. Ilyen TNF-temwecqstor fúziós molekula egy példája a TNF-receptor/lgG fúziós fehérje, TNF-immunreeepior fúziós molekulákat és azok előállítására szolgáló eljárásokat feltártak a szakárodaioínfears [Lesslsuer és mísai.. Sár. 3. fenaoaoí. 21, 2883-28M old. (1991) ; Ashkenazi és tntaai., Proc, Natl. Ácaá. Seb 'USA 88, 1Ö535-ÍÖ539. old. (1991); Peppel és mísai., J. Exp. Med. 174, 1483-1489. old. (1991); Kölls és mísai., Pmc. Nstk Arad. Sei. USA 91, 2i5-219.old, (3994); Bntler és mísai., Cytokiue 6, 616-623. old. (1994); Baker és mtsai., Húr. 5, Immunoi. 24, 204ö~2Ö4S.o5d. fi994); Beutler és mísai., 5 447 Sőt. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat; és 08/442 133. számú amerikai egyezők államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1995. május ló-án)j. Eljárások itrununrecepior fúziós molekulák előállítására megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken Is: Capon és mísai,, 5 116 964. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi irat; Capon és mísai., 5 225 538. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi Irat; és Caponés mísai,, Natúré 337, 525-531. old, (1989).
TNF-reeeptor molekula frmkeíonális ekvivalense, származéka vagy régiója alatt a TNF-receptor molekula olyas részleték vagy a TNF-receptor molekulát kódoló TNF-receptor molekula szekvencia olyan részletét értjük, -amely elegendő méretű és szekvenciája ahhoz, hogy funkcionálisan hasonlítson találmány szerint alkalmazható INF-reeeptor molekulákhoz (például magas affinitással köti a TNP-et és alacsony az nnmusogenitása). TNF-receptor molekula fünkciorsális ekvivalense lehet .módosított TNF-receptor molekula is, amely fenkcionúiisan hasonlít találmány szerint alkalmazható TNF-recepíor molekulákra (például magas affinitással köti a TNF-et és alacsony az immunogeniiása). Példáid TNF-receptor molekula, funkcionális ekvivalense tartalmazhat: „SILENT” ködöst vagy egy vagy több amínosav-szubsztirúciót, deledét vagy addiciót (például egy savas atninosav szubsztitúcióját egy másik savas ammosavval; vagy azonos vagy különböző hidrofób amirsosavat kódoló kodon szabszriíúdóját hidroíőh anünosavat kódoló másik kodonnal) [lásd Aosubei és mtsal,, „Current Profocoís ín Molecnlsr Bioiogy”, kiad.: Qreene Pubiishing -Assoc. and Wtiey-iníerscience, New York (1987-2000».
Ciiektn lehet bármilyen ismert citokin (lásd például www.CopewithCytokines.com), Citókin aníagonisták nem korlátozó példái közé tartozik bármilyen ellenanyag, fragmens vagy mítnetrkum, bármilyen oldható receptor, iragmeas vagy tnüuotikum, bármilyen kismolekulás nntagomsía, vagy ezek bármilyen kombinációja.
Terápiás kezelések. Á találmány szerinti készítmény alkalmazható TNF-közvetítctt rendellenesség kezelésére szolgáló eljárásban amely tartalmazza hatásos mennyiségé a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe. Ilyen eljárás adott, esetben továbbá tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a készítmény beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk, az alábbiak közül; TNF antagonísta (például nem korlátozó példaként TNF ellenanyag vagy fragmens, oiditafó TNF-recepíor vagy' ífagmens, azok fúziós fehérjéje vagy kistnolckulás TNF antagonísta). sníirentnaiikum (például metotrew, aumnoün, aurodoglükóz. azatioprin, etanercept, arany-nátrium-tíomalát. bidroxikioroqntn-szalfáí, leflunotnid, szulfaszalzin),
-41izcmrelaxáns, swkotacura, nem szteroid müiitólammaíorikus drog (NSAID), fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzésteiesítö, uwwtsmfctááHs gáílószer, mikrobaeHenss szer (például amwsgiamzid, gombaeílenes szer, parazkaelienes szer, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporín, Sworqulnolon, makrrdid, penicillin, szultouamid, tettaciklm, egyéb xnifoob&ellejtes szer), pikkelysömör elleni szer, kortikeszteroid, anabebkus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmíxxgy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos bontnon. hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, atttikoaguláüs, eritepoietin (például epoetin-aifa), filgraszfim (például ö-CSF, Neopegen), szargramesztím (GM-CSF, Leakín). immunizáló szer, immunglobulin, imsnunszuppresszáns (például basilisímab, eiklosporin, dadizamab), növekedési hormon, bormonhelyettesitő drog, ösztrogém-reeeptor modulátor, pupill&tágiíó szer, clkloplegíás szer, alkiláló ágens, ancjmctsbolit, mitótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, aníimsmás ágens, amipszicboíikus szer, anxiolitikum, hipnotíkura, szimpatomímetikem, stimuláns, dooepezil, ískrírt, aszímagyógyszer, béta agonista, inhaíáit szteroid, íeukotóén inhibitor, metílxanön, kromoiín, epi»eírin vagy analógja, dornáz-alta (Pulmozyme), eitokís vagy ckokin antagomsta.
Tipikusan patológiás állapot kezelését legalább egy anii-TNF ellenanyag készítmény hatásos mennyiségének vagy dózisának beadásával végezzük, amelynek az összmennyísége átlagosan legalább körülbelül Ö,01 és .500 mg közötti tartományba esik legalább egy aati-TNF ellenanyagra vonatkoztatva a páciens kg-jaira dózisanként, és előnyösen legalább körülbelül ö,í és 160 mg ellenanyagáig közötti egyszeri vagy többszöri beadásonként a készteényben található specifikus aktivitástól függően. Más megoldásképpen a hatásos szérumksneeatr&áú 6,1-560© pg/ral szAmmkoneentráció lehet egyszeri vagy többszöri beadásonként, A megfelelő dózisok ismertek a gyakorló orvos -számára, és - természeteses - íhgaheteek az adott, betegség állapotától, a beadott készítmény specifikus aktivitásától és a kezelés alatt álló pácienstől. Bizoítyos esetekben a kívánt terápiás mennyiség eléréséhez szükséges lehet ismételt beadást alkalmazni, azaz egy' monítorozott vagy mért dózis ismételt egyedi beadásaira van szükség, amikor az egyedi beadásokat addig ismételjük, amíg a kívánt napi dózist vagy hatást el nem érjük.
Előnyős dózisok adott esetben tarialmaz&aínak 0,1,6,2,0,3,0,4,0,5,6,6,0,7, Ö,8, 0,9,1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, lő, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65,66,
67, 68, 69, 70, 71, 72, 73-, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98, 99 és/vagy 100-508 mg/kg-οΐ beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értékei ezek között, vagy 0,1, 0,5,0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0,2,5,2,9, 3,8, 3,5, 3,9,4,0,4,5,4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,Ö, 6,5,6,9, 7,0,
7,5, 7,9, 8,6, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, II, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5,
4.9, 5,0, 5,5,, 5,9, 6,9, 6,5, 6,9, 7,9, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 1-0,5-, 10,9, 11, í 1,5, 11,9, 12, 12,5,
12.9, 13,6, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, IS, 18,5,18,9, 19, 19,5, 19,9,20,
20,5, 20,9, 21, .22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 66,. 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, .300, 400, 500, 600, 708, SÖÖ, 900, 1000, 1500, 2000, 2506, 3006, 3580, 4000, 4560 és/vagy 5089 pgfiní saérumkoncentrácíó elérését egyszeri vagy többszöri beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értéket ezek között.
Más megoldásképpen a beadott dózis változhat Ismert tényezők függvényében, mint példát:! az adott ágens farmaködintnntkai jellegzetességei, a beadásának módja és dija; a befogadó kora, egészségi állapota és
-42tőmege; & tünetek természete és mértéke, az. egyidejű kezelések típusa, a kezelés gyakorisága, és a kívánt hatás. Általában a hatóanyag dózisa körülbelül 0, i-100 mgtettőraeg-kg lehet Rendszerint 0,1-50, és előnyösen Ű, l-í ö mg/kg/beadás vagy- fenntartott felsz&badulásö forma hatásos a kívánt eredmények elérésére.
Nem korlátozó példaként emberek vagy állatok kezelését biztosíthatjuk legalább egy, találmány szerinti ellenanyag egyszeri vagy periodikus dózisával 0,1-100 -mg/kg között, nrint például 8, 5, 0,9, 1,8, 1,1,
1,5, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 58, 19, 20, 21, 22,23,24, 25, 26, 27,2«, 29,30, 40, 45, S-Ο, 60, 70, 88, 90 vagy 10Ö tng'Ág naponta, legalábbaz 1,, 2., 3., 4., 5.,6.,7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15,,
16., 17., 18., 59.,, 20., 21., 22,, 23,, 24., 25., 26., 27., 28., 29., 30., 31., 32., 33., 34., 35,, 36., 37., 38., 39. vagy
40. nap legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az L, 2., 3., 4., 5,, 6,. 8„ 9., 10-, 11.,
12., 13., 14., 15,, 16., 17., 18,, 59.,20., 21.,22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30., 31, 32,33, 34, 35, 3ő, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, Sí. vagy 52. hét legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1,2, 3, 4, 5, ó, , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, '59. vagy 26, év legalább egyikén, vagy ezek bármilyes kombinációján, egyszeri, infúziós vagy ismétel dózis alkalmazásával.
A belsőleg történő beadásra alkalmas adagolási alak (készítmény) általában körülbelül 8,1 mg és körülbelül 500 mg hatóanyagot tartalmaz egységenként vagy tartályosként. Ezekben a gyógyászati készítményekben a hatóanyag rendszerint körülbelül 8,5-99,999 tőmeg% mennyiségben lehel jelen a készítmény össztömege alapján,
Pasrenteráiis beadás esetében az- ellenanyagot oldat, szuszpenzió, emulzió vagy liohlízált por formájában szerelhetjük ki, együtt vagy' külön gyógyászatilag elfogadható psreníerális hordozóeszköztől. ilyen hordozóeszközök példái a víz. sóoldat, Risger-oldat, dextróz oldat és 1-10% humán széramalbumis, Líposzómákat és nemvizes hordozóeszközöket, mint példáid rögzített olajokat is alkalmazhatunk. A hordozóeszköz vagy hohhzált por tartalmazhat olyan adalékanyagokat, amelyek fenntartják az izofömásságot (például öátrimn-klorid, mannhol) és a kémiai stabilitást {például polferék és tartósítószerek). A kiszereléseket ismert vagy megfelelő módszerekkel sterilizáljak.
Megfelelő gyógyászati hordozókat ír le a Remingfon's Fharmaeeuiicai Sciences” című könyv (A, Osol), amely egy a szakterületen alkalmazott szokásos kézikönyv.
A találmány szerint sok Ismert és kifejlesztett módot alkalmazhatunk legalább egy találmány szerinti anti-'fNF ellenanyag gyógyászatiig hatásos mennyiségeinek a beadására. Mig pulraonáris beadást alkalmazunk a kővetkező leírásban, a beadás más módjait is alkalmazhatjuk megfelelő eredménnyel a találmány szerbit.
Találmány szerinti TNF ellenanyagokat bejuttathahmk hordozóban oldatként, emulzióként kolloidként vagy szuszperizióként, vagy száraz porkést bármilyen, inhalációs vagy más módos történő beadásra alkalmas különféle eszközök és eljárások alkalmazásával, amint azt feltárjuk a leírásban vagy ismert a szakterületen.
Paresrteráhs kiszerelések és beadás
Farenterális beadásra szolgáló kiszerelések közönséges kötőanyagot mint például steril vizet vagy sóoldatot, pöííaíkáxf-gbköfokat, mint például pobsíílén-glíkoh, növényi eredetű olajokat hidrogénezett
-43naftaléneket és hasonlókat tartalmazhatnak, Injektálásra szolgáló vizes vagy olajos szuszpenziökat megfelelő ewulgeálészer vagy uedvesítöszer és szuszpesdálö égess alkalmazásával áiltífeahink elő ismert eljárások szerint Injektálásra szolgáló ágensek lehetnek -sem toxikus, nem orálisan beadható hígító ágensek, mint példáal vizes oldat vagy steril hyektáihsíó oldat vagy szuszpenzló egy oldószerben. Alkalmazható hordozóeszközként vagy oldószerként víz, Rínger-oldat, izotóníás sóoldat, stb. engedélyezett, szokványos oldószerként vagy szuazpendáló oldószerként steril sem illékony olajat alkalmazhatunk. Ezekre a célokra bármilyen típusú nem illékony olajat és zsírsavat.sifeatezfeaurok, beleértve természetes vagy szintetikus vagy szemíszíntetíktjs zsírolajokat vagy zsírsavakat, természetes vagy szintetikus vagy szemiszíníetikas mono- vagy dí- vagy trígiiceridéket. A pareníerálís beadás Ismert a szakterületen, és magában foglalja nem korlátozó példaként az injekciók hagyomátsyos fwtaáií, gáznyosnásos tümentes injekciós eszközt, amist azt az 5 SS I 19S. számú amerikai egyesúlí államokbeli szabadakat irat feltárja, és lézer perforáló? eszközt, amist az 5 839 446. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja, amelyek teljes terjedehnlikben hivatkozás útján a kitanitás részűt képezik.
Alternatív bejuttatás
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy aníi-TNF ellenanyag beadása pareníerálís, szubkután, mtramnszkuláris, intravénás, intrartiksiárís, istrabroochíális, Iníraabdominális, mtrskapszulárís. ifttrakartilagiáiis, intrakavftális, íniraeelíáhs, intmcelehelláris, ístracerebroventrikaláris, íntrakoíikas, imracervikálís, iniragasztrikus, inírabepaíikus, tóraniiokardiáiís, intmoszíeális, totrapeMkus, intraperíkardlális, iatrsperitooeálís, hiraplsarálls, íntraprosmikus, íaírapulmosáris, iatearektálts, isírarenális, intraretinális, íntraspinálís, iníraszmoviális, míratoracikus, iatrauterin, íntravezikális. bólusz, vagináiig, rektáiis, bukkális, szublmgváhs, mtemszális vagy íranszdermális úton. Legalább egy aatí-TNF ellenanyag készítményt előállíthatunk pareníerálís (szüdkután, btrumwzkuláris vagy intravénás) beadásra, vagy bármilyen egyéb beadásra, előnyösen folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában; vaginális vagy rektáiis beadásra, előnyösen íélszilárd formában, mint például nem korlátozó példaként krém vagy kúp formájában; bukkális vagy' szublingvális beadásra, mini példást! aem korlátozó példaként tabletták vagy· kapszulák formájában; vagy istranazálís beadásra, mist például nem korlátozó példaként porok, orrcseppek vagy aeroszolok vagy bizonyos ágensek formájában; vagy íranssdermális beadásra, mini például nem korlátozó példaként gél, kenőcs, lemosó, szuszpenzió vagy tapasz bejurtaíási rendszer formájában, kémiai enhsncerekkel, mint például dimetil-szalfoxiddal, hogy módosítsuk a bor szerkezetét vagy hogy növeljük a drog koncentrációját a transzdermálís tapaszban [Jursginggr és mísai., „Dreg Permeation Enhancemest”, szerk.: llsieh, D.S., 59-90, old. kiad.: Marcsi Dekker. iné. New York (1994), amely teljes terjedelmében hivatkozás útján a kíisnftás részét képezi), vagy oxidálősserekkel, amelyek lehetővé teszik fehérjéket és peptideket tartalmazó kiszerelések bőrre történő bejuttatását (WÖ 98/53S47. számú nemzetközi közzétételi írat), vagy elektromos mezők alkalmazását, hogy tranziens transzport útvonalai hozzunk létre, mint példáiul elektroporáeídval, vagy hogy növeljük a feltöltött drogok mobilitását a bőrön keresztül, mint például iöKtoforézíssel, vagy ultrahang alkalmazását, mint például szonoforézissei (4 309 989. és 4 76? 4Ö2. szántó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) (a fenti publikációk és szabadalmuk teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitantíás részét képezik).
-44Pulmosáris/nazális beadás
Pultnonáris beadás esetén előnyös legalább egy antl-TNF ellenanyag készítményt bejuttatunk «Iván mérető részecskékben, amelyek hatásosak a tüdő vagy a szinuszok alsó légutainak elérésére, A találmány szerint legalább egy antí-THF ellenanyagot bejuttathatunk a szakterületen terápiás ágens snhaiáciőval történő bejuttatására ismert bármilyen inhaláciös vagy nazális eszköz alkalmazásával, Aeroszolizált kiszerelésekaek a páciens szmaszöregeibe vagy alveolusaíba történő bejuttatására képes ilyen eszközök közé tartoznak mért dázisú inhalátorok nebnlizátorek, szárazpor generátorok, permetezők és hasonlók. Ellenanyagok pútaönárís vagy nazális beadását irányító más alkalmas eszközök szintén ismertek a szakterületen. Minden ilyen eszköz aat ellenanyagnak aeroszolban történő eloszlatásával történő beadásra alkalmas kiszerelést alkalmaz. Ilyen aeroszolok vagy oldatokat (mind vizes, mind nem. vizes),, vagy szilárd részecskéket tartalmazhatnak. Mért dózlsú inhalátorok, mint például a Feu/ohn® mért dózisé inhalátor tipikusan hajtógázt alkalmaznak, és meghajtást igényelnek a belégzés során (lásd például a WO 94/I697Ö,, WG98/3S888. számú nemzetközi közzétételi iratokat), A száraz poros inhalátorok, odrit a [Tarfahater®· (Ástra), RoíahisÍer® (Glaxo), Diíkus® (Glaxo), Sp/ros™ inhalátor (Dóra), az tnhale Therapeutícs által forgalmazott eszközök és a Sbto&u/eí·® poros Inhalátor (Fisons), kevert por lélegzettel való meghajtási alkalmazzák [4 668 218. számú amerikai egyesült ál lamokbeli szabadalmi irat (Astra), EP 237 5Ö7. számú európai szabadalmi hat (Ástra), WO' 97/25086, számú nemzetközi közzétételi irat (Glaxo), WG 94/08552. számú nemzetközi közzétételi irat (Dóra), 5 458 135. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (ínhale), WO 94/06498.. számú nemzetközi közzétételi irat (Fisons), amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás ütjárs a kitordtás részét képezik], Nebuiízátorok, mint ax az Ulfrerent® nebtoízátor (Mallisckrodt) ás az Aoorn nebuHzáter (Marqöest MedseaJ.
Products) (5 404 871. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Aradigm, WO 97/22376. számú nemzetközi közzétételi irat, amelyek mindegyike teljes íerjedelméhen hivatkozás útján a kitanítás részét képezi) aeroszolokat hoznak létre folyadékokból,, tnig a mért dózisa inhalátorok, száraz poros inhalátorok, stb. kis részecskeméreüö aeroszolokat hoznak létre. A kereskedelmi forgatómban kapható inhaláeiós eszközök ezen specifikus példáit csak a találmány gyakorlatba vételéra alkalmas specifikus eszközök reprezentációjának szánjuk, és ne® a találmány oltalmi körét korlátozónak. Előnyösen a legalább egy anti-TNF ellenanyagot tartalmazó készítményt száraz poros inhalátorral vagy' permetezővel juttatjuk be. A találmány szerinti legalább egy ellenanyag beadására szolgáló inhaláeiós eszköznek számos kívánatos tulajdonsága van. Például az inhaláeiós eszköz általi bejuttatás előnyösen megbízható, reprodukálható és pontos. Az inhaláeiós eszköz adott esetben kis száras részecskéket juttathat be, például kisebb, mint körülbelül W a®, előnyösen körülbelül 1-5 ptrt, a jó lélegezhetőség érdekében.
TNF efieaauyag készítmények beadása spraykéní
TNF ellensnyag-késztmény fehérjét tartalmazó sprayt előállíthatunk legalább egy anti-TNF ellenanyagot tartalmazó sznszpenzió vagy oldat fúvókán keresztül nyomás alatt történő átoréselésével. A fúvóba méretét és konfigurációját, az alkalmazott nyomást és a folyadék adagolási sebességét úgy választhatjuk meg, hogy a kívánt kimenetét és részecskeméretet kapjuk, Elekrtosprayí állíthatunk elő például kapiliárisos vagy iüvőkán keresztüli áramlattal kapcsolatban lévő elektromos mezővel. Előnyösen a porlasztóval bejuttatott, legalább egy anti-TNF ellenanyag készítmény részecskéinek a részecskemérete
-45kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a .körtllhelSl 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körűibe® 3 um közötti.
A porlasztóval történő alkalmazásra megfelelő legalább egy antj-TNF ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelései vizes oldatban lévő eljenan.yag-készltméfty fehérjét tartalmaznak az oldat ml-eiként a legalább egy anti-TNF' ellenanyag készítmény körűibe® 9,1 mg és körülbelül 109 ing közötti konceaöációjábas, vagy nag/g mértékegységben, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek közök, példán! nem korlátozó példaként 0,1,0,2,0,3, 0,4,0,5,0,ő, 9,7,0,8, 9,9, t, 2,3,4, 5, 6, 7, K 9,10,! .1, 12, 13,14,15, 16, 17, IS, 19,20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 59, é0, 70, Sö, 90 vagy 109 mg/'mi vagy mg/g koncentrációban, A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mini például kötössert, puffért, izotórdás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és - előnyösen - cinket A kiszerelés tartalmazhat az ellenanyag-készitmény fehérje stabilizálására szolgáló köíőszers vagy ágenst is, mint például puffért, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot Ellenanyag-készítmények kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartósak az albumra, protamin vagy hasonlók. Ellenanyag-készlímény fehérjék kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a sssitecöz, mannltol, laksőz, behálóz, glükóz vagy hasonlók. Az elletsaaysg-kásátínény fehérje kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti az ellenanyag-készítmény fehérje felszíni aggregáeióját, amelyet az oldat aeroszol létrehozása során bekövetkező atomízációja okoz. Különféle hagyományos felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például poiioxletílén-zslrsav-észtereket és -alkoholokat, és polioxíetílés-szorbltol-zstrsav-észteraket. A mennyiségük általában, a 9,901 és 14 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti alkalmazásra a polioxietiién-monooleák poliszorbát 80, peliszorbát 26 vagy hasonlók, fehérje, mint például TNfellenanyagok vagy azok meghatározott részletei vagy variánsai kiszerelésének a szakterületén Ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.
TPÍF ellenanyag készítmények beadása «ebulizátorral
Ellenanyag-készítmény fehérjét beadhatunk nehslizátorral, mint például sugárhajtású Hebötízáterral vagy ultrahangos nefeulizáíotrsL Tipikusan egy sugárhajtású nsbuüzátorban kompresszáit levegő forrást alkalmazunk nyíláson keresztül kilépő nagysebességű levegősugár létrehozására. Ahogyan -a gáz kitágul a f&vóks után, alacsony nyomású régió jön létre, ami ellenanyag-készlímény fehérje oldatát szívja át -a felyadéktaríályboz kapcsolódó kspíilárisesövöa. A- kspilláriscsöböl kilépő folyadékáram instabil szálakká és cseppeké nyítódik szét, aeroszolt hozva létre, Különféle konfigurációkat, áramlási sebességeket és terelötlpusokat alkalmazhaümk egy adott sugárhajtású ssbuiizátor kívánt teljesítményi jellemzőinek eléréséhez. Ultrahangos nebnlízátorbaa amgas öekvenclájú elektromos energiát alkalmazunk mechanikus rezgési energia létrehozására, tipikusan piezoelektromos íranszáukfor alkalmazásával, Ezt az energiát visszük át az eiienanyag-késritmény fehérje kiszerelésre akár közvetlenül, akár kapcsolóiólyadékon keresztül, az. ellenanyag-készítmény fehérjéi tartalmazó aeroszolt hozva létre. Előnyösen a nebulizátorrsl bejuttatott ellenanyag-készítmény fehérje részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 um közötti,
A nehulizáiorrai -- akár sugárhajtásé, akár ultrahangos - történő alkalmazásra megfelelő legalább egy antl-TNF ellenanyag kiszerelései tipikuson az oldat ml-eiként a legalább egy atrti-'FNF ellenanyag-készítmény
- 4ő Fehérje körülbelül Ö,í mg és körülbelül IÖÖ mg közötti koncentrációjában, A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, -mint például Műszert, puffot, izstóaiás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és - előnyösen cinket, A kiszerelés tartalmazhat a legalább egy anti-TNF ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötószert vagy ágenst is, mást példád puíTert, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot, A legalább egy anti-TNF ellenanyag-készítmény kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az alburaia, protarmn vagy hasonlók. A legalább egy anti-TNF ellenanyag kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a sznkróz,, manníiol, hktóz, trehsióz, glükóz vagy hasonlók. A legalább egy anli-TNF ellenanyag kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti a legalább egy anti-TNF ellenanyag felszíni aggregáeióját, amelyet az oldat aeroszol létrehozása során bekövetkező atoraízácíója okoz. Különféle hagyomáttyos felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például poiíoxsefilén-zsírsav-észtereket és -alkoholokat, és polsoxfeíslén-szorbhol-zstrsav-észterekeí. A mennyiségük általában a 0,601 és 4 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti alkalmazásra a potioxietilén-monooleát, pcstiszorbát 80, pohszorhát 20 vagy hasonlók, Fehérje, mist például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szttkterüietérs ismert további ágensek ts alkalmazhatók a kiszerelésben.
TNF ellenanyag készítmények beadása mért dózisa mbalátorrsi
Mért dózisá inhalátorban (MDI) hajtogáz, legalább egy anti-TNF ellenanyag, és bármilyen kötőszer vagy egyéb adalékanyag található fémdobozban, cseppfolyósított kompresszált gázt tartalmazó keverékként. A mérőszelep beindítása a keveréket aeroszolként szabadítja fel, amely előnyösen kisebb, mint körülbelül 1Ö pm, előnyösen a körülbelül 1 gm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 ;im és körülbelül 3 pm közötti méreti részecskéket tartalmaz. A kívánt aeroszol részecskeméretet előállíthatjuk szakember szarnám ismert különféle módokon - mist például ,Jet-milling”, spr&y-szárítás, kritikus ponti kondenzáció vagy hasonlók - előállított ellenanyag-készíteiény fehérje kiszerelés alkalmazásával. Előnyős mért dózist! inhalátorok közé tartoznak a 3M és Glaxo által gyártottak, amelyekben hídfofiuofokarhos hajtőgázt alkalomnak.
A legalább egy anti-TNF eílesaayag tűért dózísú inhalátor eszközzel történő alkalmazására szolgáló kiszerelései általában finom eloszlásü pori tartalmazhatnak, amely legalább egy anti-TNF ellenanyagot tartalmaz szuszpenzióként nem vizes közeim, például fsiszuszpendálva a hajtógázban felületaktív anyag segítségévei, A hajtógáz lehet bármilyen α» a célra hagyományosan alkalmazott anyag, mint például klorofiuorokarhon, hidroklorotluorokarbon, hldrodtiorokarhon vagy szénhidrogén, beleértve trikíorotiuorometást, diklorodlfltíCfrometánt, díklorofetraflnoroetanoit és i,l,l,2-tertafiüoroetánt, HFA-134a-t (hldroliuroa!kán~l34a), HFA-22?-eí {hiárottnrötdkán-227), vagy hasonlókat. Előnyösen a hajtőgáz hiároíluorokarbon. A felülc-taktiv anyagot ágy választhatjuk meg, hogy stabilizálja a hajtógáz-szuszpenzlőbtm a legalább egy anti-TNF ellenanyagot, védte a hatéányagot a kémiai degradációva! szemben, és hasonlók. Alkalmas felületaktív anyagok közé tartozik a szxsrbiíán-trioleáti szójaiecítín, olajsav vagy hasonlók. Bizonyos esetekben oldat aeroszolok előnyösek, oldószerként példáit! etanol alkalmazásával. Fehérje, mint például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.
Átlagos képességű szakember számára nyilvdnv&ló, hogy a találmány szerinti eljárásokat megvalósíthatjuk legalább egy anti-TNF ellenanyag a leírásban nesn feltárt eszközzel történő puimonáris beadásával is.
-47 Orális kiszerelések és beadás
Orális beadásra szolgáló kiszerelések adjuvánsok (például rezorcmoiok és nemionos felületaktív anyagok, mint például polioxíeíilén-oleH-éter és n-hexadecíl-polietiiéo-éter) együttes beadásán alapulnak, amelyek mesterségesen növelik a bélrendszer falának a permeabiMtását, valamint enzüninhíbitorok [például hasnyálmirigy tópsrin mhibítorök, diizcpropil-íluorofoszfát (DFP) és traziiöi] együttes beadásán alapulnak, amelyek gátolják az enzimatikus degradációt. Orális beadásra szolgáló szilárd adagolási fonttá hatóanyag komponensét összekeverhetjük legalább egy adalékanyaggal, mint például szukrózzal, hktózzal, cellulózzal, mannitollal, trehalózzal, raffiaózzál, maltitollaí, dexíránnal, keményítőkkel, ugarral, argínátokkal, kitinekkel, kifozánokkal, pektínekkel, tragakast gumival, gumíarábikummal, zselatumsl, kollagénnel, kazeinnel, albnminnal, szintetikus vagy szetniszlntetíkas polimerekkel és gliceridekkel. Ezek az adagolási formák tartalmazhatnak más típusú adalékanyagokat is, például inaktív hígító ágenseket, kenőanyagokat, mint például magnézinm-sztearáteí, parabéuí, tartósító ágenseket, mint például szofbínsavat, aszkorbinsavaí, alfatokoferolt, anóoxidánst, mint például ciszteist, bomlasztószert, kötőanyagot, pníferelő ágenst, édesítőszert, ízesítőszert, illatosító szert, stb.
Tablettákat és pirulákat továbbalakíthatunk esterikus bevonató készítményekké. Az orális beadásra szolgáló folyékony készítmények közé tartoznak a gyógyászati alkalmazásra engedélyezhető emulzió, szirup, eiíxír, szuszpenzió és oldat készítmények. Ezek a készítmények a szakterületen rendszeresen alkalmazott inaktív hígító ágenseket tartalmazhatnak, mint például vizet. Liposzótnákai is leírtak drogszáilító rendszerként inzulin és heparin esetében (4 239 754. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Újabban kevert sminosavak mesterséges polimereiből (proteiooíd) készült míkrogömböket is alkalmaztak gyógyászati készítmények bejuttatására (4 $25 673. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), Ezenkívül az 5 879081, és 5 871 753. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban feltárt hordözővegyületeket Is alkalmazzák biológiailag aktív ágensek orális bejuttatására.
Mukózáiís kiszerelések és beadás
A nyálkahártyái felszíneken keresztül történő abszorpció esetében a legalább egy anti-TNF ellenanyag beadására szolgáló készítmények és eljárások tartalmazhatnak olyan emulziót, amely sok szubmlkroB részecskét, mukoadbezív makromolekulát, bioakttv pepiidet, és egy Összefüggő vizes fázist tartalmaz, ami elősegíti a nyálkahártya-felszíneken keresztül történő abszorpciót, az emulzió részecskéinek mukoadhézlójának elérésével (5 514 67Q. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi irat), A találmány szerinti emulziók felvitelére alkalmas nyáíktfoártya^elsztaek lehetnek szaruhártyai, kötohártyái, hukkális, szublmgváis, nazális, vagináit», pulmonáris, gyomorheis, intesztiuáiis és rektális beadási utak, Vagínális vagy rektális beadásra szolgáló kiszerelések, például kúpok tartalmazhatnak köíöszereket, például poliaikánglikolokat, vazelint, kakaóvajat és hasonlókat, fatranazáhs beadásra szolgáló kiszerelések lehetnek szilárdak, és kötőszert tartalmazhatnak, mint például lakiért, vagy lehetnek vize» vagy olajos orreseppek. Bakkális beadás esetén a köíöszerek lehetnek cukrok, kalcsum-sztearát, magnézium-sztearát, előre zselatmizálí keményítő és hasonlók (5 849 695. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).
Transzdermáíís kiszerelések és beadás
TmszrienjtáHs beadás esetében a legalább egv anti-TNF ellenanyagot szállítóeszközbe, mint például lipcszómába vagy polimer nanorészecskékhe, mikrorészecskébe, míkrokapszuiáha vagy mikrogőmbőkbe
-48 (melyeket -együttesen mikrorészecskéknek nevezünk, amennyiben másképp nem jelezzük) burkoljuk be. Számos alkalmas eszköz ismén, például szintetikus polimerekből, mini például polSüdtoxí-sávakbói, mini például poli-tejsavbói, poliglikolsavböl és szók kopoiirtKrtjeifcöl, poliottoészterekből, poBanhidriáekb&l és poiifoszfazénekből, és természetes polimerekből, mint például kollagénből, poií-anrinosavakból, aibumínból és egyéb fehérjékből, alglsátból és egyéb pollszacharidokhól, és ezek kombinációiból készített mikrorészecskék (5 814 599. számú amerikai .egyesük államokbeli szabadalmi irat).
Tartós beadás és kiszerelések
Bizonyos esetekben kívánatos lehet a találmány szerinti vegyületeket hosszan tartó időszakon keresztül beadni az alanynak, például egy beadásból egy bét és egy év közötti időtartam alatt, Különféle lassú felszabadulású, depó és hnpíantáPum formákat alkalmazhatunk, Például egy adagolási forma tartalmazhatja a vegyület gyógyászaiba# elfogadható esess toxikus sóját, amelynek alacsony az oldhatósága a testtolyadékokbsn, példás· (a) savaödtóús só polibázísos savval, mint például íoszforsavvai, kénsawah c í izomsávval, horkösssoral, csersavval, pamoinsavvsi, algssavval, poligintammsavs'al, saílalén-mono- vagy dísmlfcnsavval, poligafokteronsavval és hasonlókkal; (b) polivalens fémkation sója, mint például cink, kalcium, bizmut, bárium, magnézium, alnmfehrm, réz, kobalt, nikkel, kadmium és hasonlók, vagy szerves kation sója, például N,N''~dibenziheílléadianún vagy etiléndsamin; vagy (c) (a) és (b) kombinációi, mint például cink csersav sója. Ezenkívül a találmány szerinti vegyületeket - vagy előnyösen - egy előbb ismertetett viszonylag oldhatatlan sót kiszerelhetünk gélben, például slsmhnmn-monosztearát gélben, például Injektálásra alkalmas szezámolajjal. Különösen előnyős sók a cink sók, cink csersav sók, pamoár sók és hasonlók. Az injektálásra szolgáló lassú felszabadulásé depó kiszerelések egy másik típusa a vegyületet vagy sót diszpergálva íartateaz.ná lassan degradálódó, nem toxikus, netn antigénhatású polimerben, mint például pohlakákpoligliköiáí polimerben, például ahogyan a 3 773 9.19. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja. A vegyületeket vagy - előnyösen - a feltárt viszonylag oldhatatlan sókat szílasztikus koleszterin pelleíben is kiszerelhetjük, különösen állati alkalmazásra. További lassú felszabadulású, depó vagy ítrtplasíátum kiszerelések, például gáz vagy folyadék Hposzómák ismertek a szakirodalomban [5 778 222, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és „Sustamcd and Conirolled Release Brug Deiivery Systems”, szerk.: J. R. Robinson, kiad.; Marcel ITekker, Inc., N, Y. (1978)].
A találmány általános ismertetéséi követően az könnyebben is érthető lesz a következő példákra való hivatkozással, amelyeket a szemlélteíés érdekében mutatunk be, és nem tekintjük azokat korlátozónak.
I, példa; TNF ellenanyag klónozása és expresszáltatása emlős sejtekben
Egy tipikus emlős expressziós vektor legulább egy promóíer elemet mrtalmaz, amely irányba az mRNS-nek, az ellenanyag kódoló szekvenciájának és a transzkripció terminációjáhos és a transzkríptum poii&demlácíőjáboz szükséges szignálók transzkripciéjónak az mieláclójál. További elemek kőzó tartoznak enhancerek, Kozak-szekvesteíák, és RNS-sphdng-re szolgáló donor és akceptor helyekkel szegélyezett kőzbensó szekvenciák. Nagyon hatékony transzkripciót érhetünk el az. SV-48-ből származó korai és késői promóíerekkel, a. rettovhusok, például RSV, ETLY1, H1V1 hosszú terminális ismétlődéseivel (LTR) és a citomegaiövirus (CMV) korai protnoterével. Azonban sejtheti elemeket is alkalmazhatunk (például a humán akíin-promótert). Megfelelő expressziós vektor a találmány gyakorlatba vételéhez például olyan vektorok.
-49mint s plRESlneo, pRetro-Qíf, pReíro-On, PLXSN vagy pLNCX (Cloaetech Labs, Paío Alsó, CA), pcDNAS.l <+/-), psDNA/Zeo (+/-) vagy pcDMÁ3,I/B'ygro 07-) (fevitrogéá), PSVL és FMSö (Pfeannacia, Uppsala, Swesfen), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhif (ATCC 37146) és pBC12MÍ (ATCC 67109). Az alkaimszható emlős gazdasejtek közé tartoznak a humán Hala 293, H9 és Jóikat sejtek, egér NJH3T3 és Cl27 sejtek, Cos I, Cos 7 és CV 1, fi&j QC1-3 sebek, egér L sejtek és kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek.
Más megoldásképpen a gént stabil sejivonalakban is expresszáltathaijuk, amelyek tartalmazzák a gént a kromoszómába ínfegrálódva. Együttes trsnszfektálás szelektálható markénál - mint például dhfr, gpt, neomicis vagy higronúei» - lehetővé teszi a transzfeksált sejtek azonosítását és izolálását.
A transzíehtált géneket amplifikálhatjuk is, hogy a kódolt ellenanyag nagy mennyiségét expresszáltassuk. A DH.FR (dihidrofelát-reduktáz) markor alkalmazható olyan sejtvonaisk kifejlesztésére, amelyek a jelentőséggel híré gén több száz vagy több ezer példányát hordozzák. Egy másik alkalmazható szelekciós marker a gjntmnín-szintáz (GS) enzim (Murphy és mtsai., Bhxhem. I. 227, 277-279. old. (199 í); Behbington és mtsai., Bia'Technology lő, 169-175. old. (1992)]. Ezeknek a markereknek az alkalmazásával az emlős sejteket szelektív tápközeghen tenyésztjük, és legmagasabb rezisztenelájú sejteket szelektáljuk kí. Ezek a sejtvonalak az ampliíikált gént a kromoszómába integrálódva tartalmazzák. Kínai hörcsög petefészek (CHO) és NSÖ sejteket gyakran alkalmaznak ellenanyagok termeltetésére,
A pC 1 és pC4 expressziös vektorok a Rous Sarcom Vírus erős promóterét (LTR) tartalmazzák (Cullen és tntsai., Molee. Cell. Bioi, 5, 438-447. old. (19S5)} és a CMV-enh&ncer egy fragmensét (Boshart és mtsai,, Cell 41, 521-530. old, (1985)], Többszörös klónozó helyek, például a BamHÍ, Xbaí és Ásp718 helyeket tartalmazók elősegítik a jelentőséggel bírd gén klónozását. A vektorok ezenfelül tartalmazzák a patkány prepromzniís génjének a 3’ ínirosjái, poliaáemláciős és termlnáclós szignálját.
KJőnnzás és expresszáíUtás CHO sejtekben
A pC4 vektort alkslmazznk TNF ellenanyag expresszáltatására, A pC4 piazmid a pSV2-dh& (ATCC elérési szám: 37146) származéka. A piszmiá tartalmazza az egér DHFR. génjét az SV4Ö korai promóterének a szabályozása alatt. Kínai hörcsög petefészek sejtek, vagy más, dihidroíblát aktivitás nélküli sejtek, amelyek transzfektálva vannak ezekkel a piazmidokkat, szeteksálhaiók a sejteknek metotrexát kemoterápiás szerrel kiegészített szelektív tápközegen (például alfa mínusz MÉM, Life Technologies, Galthersbnrg, M.D) történő tenyésztésével, A DHFR gének ampiriskációját metotrexáfra (ΜΓΧ) rezisztens sejtekben részletesen dokumentálták [lásd példán! F. W, Alt és mtsai., 1. Bioi. Chem. 253, 1357-1370. old, (1978); j. L. Hamlin és C. Ma, Bioehem, et Biopfeys. Acta 1097, 107-143, old. (199Ö); és M, J. Page és M. A. Sydetthasn, Siotechnology 9, 64-68. old. (1991)]. Növekvő koncentrációjú MTX-en tenyésztett sejtekben rezisztencia alakul a drogra a eéienzlm, a DHFR túltermelése mellett, a DHFR gén ampiífíkácíőja eredményeképpen. Ha egy másik gén is fcapcsótódát a DHFR génhez, akkor általában az is együtt ampliíikáiódik és túltermelődík. Ismert a szakterületen, hogy ez a megközelítési mód alkalmazható az ampílilkáit gén(ek) több mint IÖÖO példányát hordozó sejtvonalak kifejlenztésére, Azt követően - amikor a metotrexáim elvonjuk - olyan sejtvonalakat kapunk, amelyek tartalmazzák a?. ampiíSkátí gént a gazöasejt egy vagy több kromoszómájába integrálódva.
A pC4 plazmái a jelentőséggel bíró gén expresszáltatásához tartalmazza a Rous Sarcom Vírus hosszú terminális ismétlődésének (LTR) az erős promóterét (Collett és mtsai,, Molee. Cell. Bioi, 5, 438-447.
-50old. (1955)} és egy izolált Sugmenst a barnás citomegalövirus (CMV) azonnali korai génjének az enhanceréltőí [Boslmrt és sasai., Coll 41, 521-530, old. (1985)}, A prömótertői leolvasással megegyező irányban Baml-il, Xfeal és AspTJB restrikciós eszi® helyek találhatók, amelyek lehetővé teszik a gének integrálását Ezek mögött a kiónozó helyek mögött a plazmád a patkány preproinzulin génjének a 3’ intronját és poliadeniiációs helyét tartalmazza, Más nagyon hatékony promótereket is alkalmazhatunk az expresszáltstásra, mint például a humán β-aktin promóters, az SV4Ö korai vagy késői proraóterét vagy a hosszú terminális ismétlődéseket más retrovirusökhól, például HÍV-bŐi és HTLVI-bét A Cloníech F-rt-Q^és Tet-O? génexpressziós rendszerei és hasonló expressziós rendszerek is alkalmazhatók TNF szabáiynzott sxpresszáhatására emlős sejtekben (M. öossea és H. Bejárd, Proc, Nstl, Acad. Sci. USA 89» 5547-5551, old, (1992)), Az mRNS poüadenüálására más szignálokat, például a humán növekedési hormon génből vagy globin génekből származókat is alkalmazhatunk. A jelentőséggel bíró gént a kromoszómákba integrálódva hordozó- stabil sejtvosalakat kiszelektálhatunk szelektálható markerrel, mint például gpt-vel, G4l8~eal vagy higromicinnel történő együtt óanszíektálasí kővetően. Előnyös kezdetben egynél több szelektálható markért alkalmazni, például G4i8«ae és metcírexátot,
A pC4 plazmidót restrikciós enzimekkel emésztjük, és azután defoszföríláljuk borjú íntesztmáHs fosziatázzal a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. A vektort azután 1%-os agarózgélból izoláljak.
A variábilis és állandó régiót kódoló izolált DNS-t és a defoszforilált vektort azután T4 DNS-iigázzal összeligáljuk. Azután E. e&tj HB 101 vagy XL-1 Blue sejteket transzformálnak, és olyan baktériumokat azonosítunk például restrikciós enzimes elemzés alkalmazásával, amelyek tartalmazzák a fragmenst a pC4 piazmidba iszertáíva.
Aktív DHFR gént nem tartalmazó kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket alkalmazunk a transzfekláláshoz. A pC4 expressziós piazmid 5 g-ját együtt transzfektáljuk 0,5 g pSV2-neo plazmáddal lipofektm alkalmazásával, A pSV2neo plazmád egy domináns szelektálható markert tartalmaz, a Tn5 «eo génjét, amely antibkstikumok egy csoportjára, köztük a G41S-ra való rezisztenciát okoz. A sejteket 1 g/ml G4i8-cal kiegészített alfa mmasz MÉM tápközegre oltjuk le, Két nap .múlva a sejteket tripszinizáijtik, és leoltjuk hlbridőma klónozó lemezekre (Greiner, Germany) 10,..25 vagy' 50 ng/ml meíotrexáltal és 1 górd 0418eal kiegészített alfa mínusz MÉM tápközegben. Körülbelül 10-14 nap elteltével egyedi klónokat tripszimzáiunk, és azután leoltjuk azokat ö-tnérőbelyes csészékre vagy 10 ml-es edényekbe mefotrexát különböző koncentrációinak (50 riM, 100 aM, 260 nki, 400 »M, 800 nM) az alkalmazásával. A metotrexát legmagasabb koncentrációján növekvő klánokat azután átvisszük új S-méröhelyes lemezekre, amelyek metutrexáí még magasabb k&scentráciőját (I mM, 2 mád, 5 mM, 10 mM, 2.0 ®M) tartalmazzák. Ugyanezt az eljárást ismételjdk addig, amíg olyan kiónokaí állítunk elő, amelyek növekednek 100-200 mM koncentráción. Elemezzük a kívánt gén expresszióját, például SDS-PAGE és Western-blot vagy fordított fázisú RPLC elemzéssel.
2. példát Jbfotnán TRF-fel reagáló magas aífusiiásá humán fg<G mennkionáiis ellenanyagok előállítása
Humán nehéz és könnydláne immunglobulin géneket tartalmazó transzgenikus egereket alkalmaztunk magas atSnitású, teljeses feumáo menoklosOs elfenanyagök létrehozására, amelyek terápiásán alkalmazhatók a TNF hatásának gátláséra egy vagy több TNF által, közvetített betegség kezelésében. A nehézláac és könnyűláne humán variábilis és állandó régié eOenanyag-transzgénjeit tartalmazó (CBAZJ x €5?.'Stb/J) F2 hibrid egereket ímmunizákunk humán rekomhináns TNF-iel (Taylor és mtsak, Inti. Immunéi. 6. S79-291. old, (1993); Lenberg és mtsaL, Natúré 308». 855-859. old. (1994); Neuberger, M,, Nemre Biotech. 14, 826. old. (1.996); Físhwild és mtsai, Natúré Blotechnology 14, 845-851. old. {1996}]. Számos fúzió eredményezett egy vagy több teljesen barnás, TNF-fel reagáló ígG monokbaátís ellenanyag-passK. A teljesen humán sml-TNE ellenanyagokat tovább jellemezzük. Mindegyik IgG. Az ilyen ellenanyagokról azt találjuk, hogy az affinkási állandójuk valahol IxiO9 és 9xlö:x között vas. Ezeknek az teljesen humán monoklonális ellenanyagoknak a váratlanul magas aíTínitása alkalmas jelöltté teszi azokat terápiás alkalmazásokban TNF-fel kapcsolatos betegségek, patológiák vagy rendel.leuességek esetében.
Rövidítések
SSA - marhuszérum-albumin
COss - szén-dioxid
DMSO - dimstil-szaifoxid
ΕΪΑ ~ enzimes Immunológiai vizsgálati eljárás
FBS ~ magzati marhaszérum
H2Oj - hidrogén-peroxid
HE? - fonnaperoxidáz
ID - teteradermáiis lg - immunglobulin
TNF - szöveti oekrözis faktor alfa
IP - intraperifoneális
IV - Intravénás
Mab - monoklonális ellenanyag
OD - optikai deszkás
OPD - o-fenilóndiafulu dihidrehíörid
PEG - poketilén-ghköl
FSA - penicillin, szireptornteis, «főtériem
RT - szobahőmérséklet
SQ - szubkulán v/v - térfogatúérfógut ú'/v - tömeg/térfogat
Anyagok és eljárások Állatok
Humán ellenanyagok expresszálásárs képes transzgenlkus egerek ismertek a szakterületen (és kereskedelmi forgalomban kaphatók például az alábbi cégektől; GenPhann ímemaCmnal, San fess, CA;
Abgenix, Freemout, CA, és mások), amelyek humán immunglobulinokat expresszálnak, és egér IgM-et vágyig-' .nem, Például ilyen trsnszgeuikus egerek V(D)J kapcsoláson, uefeézlánp osztály változásán és szomatikus mutációkon keresztübnenö tanén szekveseíájú hanszgéueket tartalmaznak, humán szekvenciája ímmunglobuiinók készletét hozva létre [Lenberg, és mtsai,, Natúré 368, 856-859, old, (1994)1, A könnyőláne transzgéneket például részben élesztő mesterséges kromoszómáról származtathatjuk, amely tartalmazza a csfravonai humán V-régiónak majdnem a felét. Ezenfelül a nehézlánc transzgén mind humán p, mind barnán 1 (Fishwíid és mtsai.. Natúré Bíoteetaology 14, 845-851. old. (1996)3 és/vagy 3 állandó régiókat kódolhat. Megfelelő genotipusos leszármazási vonalból származó egereket alkalmazhatunk az immunizálásban ás fúziós eljárásokban, teljesen humán INF elleni monoklonális ellenanyagokat hozva létre.
Immunizálás
Egy vagy több immunizálási rendet alkalmazhatunk az aníi-TNF humán hihridómák létrehozásához. Az első néhány fúziót az alábbi szemléltető immunizálási protokoll szerint hajthatjuk végre, de más hasonló ismert protokollokat is alkalmazhatunk. Számos 14-20 hetes nőstény és/vagy mútéiileg ivartalanitött éranszgenikns hím egeret immjunizálunk 1F és/vagy ID I-1Ö80 pg rekombináns humán TNF-fel, azonos térfogatú F/r£3hk/AA~szal vagy komplett Freund-féie adjuvátissal emulgeálva 1Ö6-4ÖÖ pl (példán! 2Θ0 pl) végtérfogatban. Mindegyik egér opcionálisan kaphat 1-1Ö ug-ot löö μ! fiziológiás sóoldatban a 2 SQ hely mindegyikés. Az egereket azt kővetően immunizálhatjuk 1-7, 5-12, 1 8-18,17-25 és/vagy 21 -34 nappal később IP (1-48Ö pg) és SQ (I-4Ü9 pg s 2) TNF-fel azonos térfogatú T/ES/öf £4A-szal vagy inkomplett Freund-léle adjuvánssal emulgeálva. Az egereket 12-25 és 25-40 nappal később véreztethetjők retro-orbitálís szórással, véralvadás elleni szer nélkól. A vért azután hagyjuk megakadni RT egy óta keresztül, és a szérumot összegyűjtjük és bíráljuk TNF FIA vizsgálati eljárás alkalmazásával ismert módszerek szerint. Akkor végezzük el a fúziót, amikor a megismételt injekciók sem okozták a literek emelkedését. Ekkor az egerek egy végső IV rttegerősfíő injekciót kaphamak 1-4ÜÖ pg TNF-fel 100 pl fiziológiás sőoldatban hígítva. Három nappal később az egerek eutanizálhaijuk a nyak kiíekerésével, és a lépeket aszeptikusán eltávolítjuk és 10 ml, hideg foszfát-pufferelt söoldsíba (PBS) tesszük, amely 100 ÜZml penicillint, 100 gg/tnl sztreptomicint és 0,25 pg/ml amíötericin B-t (FSA) tartalmaz. A Iépsejteket sterilen begyújtjük a lépnek PSA-FBS-ses történő psrfúziójával. A sejteket egyszer megmossuk hideg BSA-PBS-sel, megszámoljuk tzipánkék festékkizárás alkalmazásával, és újra félssuszpesdáljuk 25 mM Hepes-ttartalmazó RPMÍ1640 tápközegben.
Sejtfúzió
A fúziót ! :! - 1:10 arányban lévő egér ntielósna sejt és életképes lépsejt alkalmazásával hajthatjuk végre ismert módszerek szerint, például amint az ismert a szakterületen, Nem korlátozó példaként Iépsejteket és mielóma sejteket együtt csapadékba vihetünk. A csapadékot azután lassan újra felsznszpendáíhstjuk - 30 másodperc alatt - 1 ml 50% (w/v) PEö/PBS oldatban (a PBQ molekulatömege .1450, Sigma) d/'C-os. A fúziót azután leállíthatjuk 18,5 ml, 25 mM Hepes-t tartalmazó REMI 1640 tápközeg lassú, 1 percen keresztül történő hozzáadásával (37 ’C-es). A füzionáitztott sejteket leeentrifiigáljuk 5 percen keresztül 500-1500 rpmen. A sejteket azután újra felszuszpendáljuk HAT tápközegben (REMI 1640 tápközeg, amely 25 atM Hepes-t, 1G% ffoíírt C/oue / szérumot (Hycloneh 1 mM náíriam-piravátot. 4 stM L-glutaminí, '18 pg/ml gsntamieist, 2,5% örfge» ea/runag //uppfeníáírt-et (Fisher), 10% ő53-kundícionált RPM1 164ö/Hepes iúpközegei, 50 ρΜ 2-merkaptoetanolí, 100 pM hipoxantinr, 0,4 pM aminopterint és lő pM timiáint tartalmas), és azután
- 33 szAlesztjÖk azokat 20® phrnéróhely metmyíségbe» 15 darab 96-mérShelyes, lapos fenekű szöveítenyésztö mlkrotiferlemezre. A lemezeket azután 7-1 ö napra párásitott 3?Τ-οδ inkubátorba helyezzük, amely 5% CO2-t és 95% levegőt tartalmaz.
Bemén IgG anü-TNP ellenanyagok detektálása egér szérumban
SzUárdlazisű EIA-t alkalmazhatunk az egérszérumok humán TNF-re specihkus humán IgQ eltesattyagokra történő szkthse lésére, Röviden, , lemezeket vonhatóak he 2 gg/rnl koncentrációjú TNF-fel éjszakás kérésziül PBS-ben. kísatán mossuk 0,02% (v/v> Tween 2Ö-at tartalmazó 0,15 M sóoldatíal, a mérőhelyeket blokkolfeatjuk .1% (w/vj BSÁ-val PBS-ben, 200' {iVmérőhely mennyiségben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten, A lemezeket azonnal felhasználjuk, vagy lefogyasztjuk -20cC-«n későbbi alkalmazásra. Egérszérum hígításokat fekubábak a TBF-fel bevont lemezeken 50· μί/raérőfeeiy mennyiségben, l órán keresztül szobahőmérsékleten, A lemezeket mossak, és azután próbázzuk 5Q pVmérőhely HRF-vel jelölt, Fcspeeifikös kecske aatl-bumán-igG-vel, l:3öi)Ö0~szeres bigfeásbas 1% BSA-PBS-ben, 1 órán keresztöl szobahőmérsékleten. A lemezeket megint moshatjuk, és IÖŐ pi/mérőbely cldát-ibszfát sznbszírát-sldatot (0,1 M eítremsav és 0,2 M. nátrium-foszfát, 0,8133. 1¾¾ és l mgőnl OPB) adunk hozzájuk 15 percre szobahőmérsékleten. Azután leállító oldatot (4 N kénsavj adunk a mérőhelyekre 25 ul/méröhdy mennyiségben, és leolvassuk az Ofht 490· ran-en automatikus spektrofotométer alkalmazásával.
Teljeses humán h
Teljesen humán immunglobulinokat szekreíálo, pozitív növekedésű híbrídómákat megfelelő ELI alkalmazásával detektálhatunk. Röviden, 96-snéröhelyes ’pop-onf mikrohterleiaezeket (VWR, 610744) 10 pg/ml kecske autt-humán-lgG-Fc-vel vonhatunk be náíríum-karbosát pafferhen éjszakán kérésztől 4’C-os. A lemezeket mossuk és blokkoljuk 1% BSA-PBS-sel 1 órán keresztül 37°C-oa, és azonnal felhasználjuk vagy -2ÖfiC-ost lefagyasztjuk. A higítaflan feíhridóma felűlászókat tókubáljuk a lemezen, 1 órás keresztül 37°C~on, A lemezeket mossuk, és próbázztik HRF-vel jelölt kecske anő-humán-kappával, LÍÖOOÖ-szeresre hígítva 1% BSA-PBS-ben, 1 órán keresztül .37*06». A lemezeket azután szubsztrát oldattal inknbáljuk, amint fent leírtuk.
Teljesen humán anti-TNF ellenanyag reaktivitásának meghatározása
A híbrídómákat - mint fent - egyidejűleg vizsgálhatjuk TNF elleni reaktivitásra Is megfelelő- FIA vagy egyéb vizsgálati eljárás alkalmazásával. Például felSiószökat inkubálunk kecske aad-hamáa-ígG-Fc lemezeken mint fent, mossuk azokat, és próbázzuk mérőhelyenként megfelelő beütésszámú radioaktívon jelölt TNF-fel 1 órán kérésztől szobahőmérsékleten. A mérőhelyeket kétszer mossuk PBS-sek és a kötődött
Aatí-TNF humán IgG Let szekretáló blbridómákat sejhenyészetbeu felszaporltbahmk, és sorozatosan szubklőnozhatónk korlátozó hígítással. A kapott klosális populációkat relszapohthatjuk, és fogyasztva tartósíthatjuk fagyasztó tápközegben (9554 FBS, 5% ÖMSO), és folyékony nitrogénben tárolhatjuk, fzotipizálás
Az ellenanyagok izosípusának meghatározását PIA alkalmazásával hajthatjuk végre, az, egérszérumok specifikus litereinek szkrlneiésérs alkalmazotthoz hasonló fonnáhnnban. 96-mérőheiyes· mikrotiteriemezeket TNF-fel vonbafu.uk be, amint fent leírtuk, és 2 .ugfml koncentrációjú tisztított ellenanyagot luknbáihatunk a lemezen 1 órán keresztül szobahőnsérsékleíen. A lemezt mossuk, és próbázzuk HRP-vel jelölt kecske ásdhumán-ígGs-gyel, vagy BRP-veí jelölt kecske asfehamán-lgGj-maí, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten
-541:4öQÖ-szeresre hígítva 1% BSÁ-PBS-hen. A lemezt ismét mossuk, és szubsztrát oldattal mkubáijúk, amist fent le írtak
Humán anti-humán-TNB ellenanyag kötési kinetikája barnás TNF-hez
Ellenanyagok kötési jellegzetességeit alkalmasa® megállapíthatjuk példán! TNF-befogási ElA-val és BIAcore technológiával. Tisztított humán TNF-e&nssyagek mért koncentrációit értékelhetjük 2 pg'tnl TNFfel bevont EÍA-lemezekhez való kötődés tekintetében, a fest leírt vizsgálati eljárásokban. Az OD-kat azután szemi-logaritmikus grafikonokon ábrázolhatjuk, mutatva a relatív kötési hatékonyságokat
Kvantit&tsv kötési állandókat nyerhetünk például az alábbiak szerint, vagy bármilyen megfeleld ismert eljárás alkalmazásával, Egy #/,4cere C1/-5 (karhoximetil) chipei helyezünk £l4cer& 28®8 készülékbe. MBS puffért <0,01 M HEPFS, 0,15 M NaCi, 3 mM EDTA, 6,005% v/v F20 felSlet&ktív anyag, pH 7,4) áramoltatunk át a chip átfolyó küvettáján, 5 gEpere sebességgel, amíg stabil alapvonalai nem kapunk. 15 mg EDC [N-etii-N'-fd-dfoietil-ammopropíij-karbödiimid hídrokloridj 200 pl vízben készítek oldatát (löö gl-t) hozzáadjuk 2,3 mg NHS (N-hídroxiszukcínínud) 260 pl vízben készíted oldatához (100 μΐ-hez). A kapott oldat 40 pl-ét injektáljuk a ehipre, Humán TNF oldatának <15 pg/ml 10 mM nátríum-acetátban, pH 4,§) 6 pl-ét injektáljuk a ehipre, körülbelül 5öö KU növekedést eredményezve. A pufiért lecseréljük TÖS/Ca/Mg/BSA futtató pufferre (20 mM Trís, 0,1.5 M nátrium-klorid, 2 mM kalchun-kloríd, 2 mM magnézinm-aeetái, 0,5% Triton X-IGö, 25 pg/ml BSA, pH 7,4). és étáramcitatjuk a ehipen éjszakás kérésztől, hogy ekvüíbráijuk azt, és h sdroiízáljunk vagy blokkoljunk minden el nem reagált szakcmimíd-észtert.
Ellenanyagot oldunk fel a futtató pufferben 33,33, 16,67, 8,33 és 4,17 nM koncentrációban. Az áramlási sebességet 30 phpercre állítjuk be, és a. készülék hőmérsékletét 25°C-ra, Két átfolyó küveöát alkalmazunk a kinetikus mérésekhez, az egyikhez TNF-et immohiiizáltunk (minla), és egy második, nem reagáliatoít átfolyó kSvetíáí (vak). Mindegyik ellenanyag-koncentrációból 120 ul-t injektálunk az átfolyó küveöába 3Ö pl/perc sebességgel (asszociációs fázis), majd megszakítás nélkül 366 másodpercen keresztül puffért áramoltatunk (disszoeiácíós fázis). A chip felszínéi regeneráljuk (a szöveti-nekrózis-faktoralfa/ellenanyag komplex dísszociáiódík) 30 pl 2 M guanidin-tiooíanál két egymást kővető injekciójával.
•Az adatok elemzését a M4 eví.dnnrie« 5,ö vagy CIAMP 2.0 alkalmazásával végezzük, amint az ismert a szakterületen. Mindegyik ciienanyug-koncentrációra a vak szenzogjramját kivonjuk a minta szenzogramjáböl. Globális illesztést végzünk mind a disszociációra (k*. sec'5), mind az asszociációra <ks, mof !see'!), és .kiszámítjuk fkd'la) a disszoeiácíós állandót (Kö, moí). Ha az ellenanyag affinitása olyan magas, hogy a befogott ellenanyag Rö-ertéke > 1 Őö, az ellenanyag további hígításait is megfuttatjuk.
Eredmények és diszkusszió
ÁntS~hussá»»TNF monukkmáhs ellenanyagok létrehozása
Számos fúziót végzőnk, és minden egyes fúziót 15 mikrodteriemezre oltunk le (1440 méróhely/fozíö), ami több tucat, humán TNF~re specifikus ellenanyagot eredményez. Ezek közül néhányról azt találjuk, hogy humán és egér Ig-láneok kombinációját tartalmazza. A fennmaradó hibrídómák kizárólag hantán nehéz- és könnyüláscoteat tartalmazó antí-TNF ellenanyagokat szskretáfesk. A humán híbridómáktől azt várjuk, hogy mindegyik Igö 1 legyen.
-55Hamáa aníi-bnnsán-TNF dleansyagefe kötési kinetikája
ELISA elemzés megerősíti, hogy ezeknek a hibnáómáknak a legtöbbjéből tisztított ellenanyag koneeníráeió-fbggő módon kötődik TN.F-bez. /áz 1-2, Mi ezeknek az ellenanyagoknak a relatív kötési haíékünyságát mutatják be. Ebben az esetben az ellenanyagnak a. hozzátartozó antigénjéhez (epiíőpjához) való avidiiásáí mérjük. Meg kell jegyeznünk, hágj' a TNF közvetlen kötődése ss ETA. ntikrotítorlemezhez a fehérje denaturáciéját okozhatta, és a látszólagos kötést affinitások nem tükrözhetik a denaturálatían fehérjéhez való kötődést. Ötvenszázalékos kötődést tahUluítk a koncentrációk egy tartományában.
Kvantitatív kötési állandókat nyerünk a hturtárt ellenanyagok BIAeore elemzésének alkalmazásával, és kiderül, hogy több humán mönoklottálls ellenanyag nagyon magas ariinításó, Ixl θ’9 és 7x10'u közötti Ks’vel.
Konklúzió
Több föziőí végzünk humán variábilis és állítódó régiós ellettanyag transzgéneket tartalmazó, humán “TNF-tsl immunizált hibrid egerekből származó lépsejtek alkalmazásával. Számos, TNF-re reagáló, teljesen humán, IgGl izotipnsba tartozó IgG ntosoklostális ellenanyagot hozunk létre. A teljesen hantán anti-TNF ellenanyagokat tovább jeUemezzSk. A keletkezett ellenanyagok közül többnek IxlQ9 és 9xlOw között van az afErtítási állandója. Ezeknek az teljesen tormán monoklonálís ellenanyagoknak a váratlanul magas afStútása alkalmassá teszi azokat terápiás alkalmazásokra TNF-fbggő betegségek, patológiák vagy kapcsolódó állapotokban,
2. példa; Hantán ΤΝΡ-α-vai reagáló hámén ígG monoklönálls ellenanyagok előállítása
Összefoglalás
A nehéz és kőtmyőlánc humán variábilis és állandó régiós ellenanyag-írartsseénjeit tartalmazó (CSA/J x C57/8D8J) F2 hibád egereket (1-4) immunizáltunk rekombináns humán TNF-n-val. Egy tüzíó, amelyet GenTNV-nek neveztünk, 8 teljesen humán IgGlsc tnönoklonsiis ellenanyagot eredményezett amelyek kötődnek immo&OIzált rekombináns Iramán TNF-s-hoz. Röviddel az azonosítás után a. nyolc sejtvonalat átvittük a Molekuláris Biológiára további jellemzés végett Mivel ezek a monoklonálís ellenanyagok teljesen humán szekvenciáyúak, azt várjak, hogy kevésbé íntmattogének emberekben, mint a cA2 (Fetnleade).
BSA - marbaszérönt-aíbumm
Cöj - szért-díoxid
DMSO - dimedl-sznlfoxíd
El.A - enzimes itntnttotdógtai vizsgálati eljárás
FS'S - magzati marhaszérnm
HjOj - hidrogón-peroxiá
HC - nehézláttc
HRP - tormsperoxidáz lg - irnttrartgiobolin IP - iaíraperitoneálts IV - intravénás
Mab - mönoklonális ellenanyag
OD -- optikai deszkás
ÖPD - o-tmtiiéndiamin difeldrokloriu
PF.O - pehetílén-glikol
FSA - penicillin, sztreptomícin. íusfbíeríein
RT - szobahőmérséklet
SQ - szubkután
7MF-a - iumomekrózis faktor alfa v/v - térfogafiiérfogaí Wf'v — fömegdsrfogat
Bevezetés
Humán nebézlánc és kösmyülánc hnmrmgloöPlín géneket tartalmazó transzganíkus egereket alkalmaztunk rekombínáns humán TMF-íx-ra specifikus teljesen humán monoklonális ellenanyagok előállítására. Azt reméljük, hogy ezek az egyedi ellenanyagok ágy alkalmazhatók, mint a cA2 (Rendesde) alkalmazható a TNF-a-feőzveUtea betegségekben szerepet játszó gyulladásos folyamatok terápiás gátlására, azzal a jótékony hatással, hogy megnövokedett a szérum féléíetídejök és csökkentek az ímmunsgenöással kapcsolatos mellékhatásaik.
Anyagok és <
Humán immunglobulinokat igen, de egér IgM-et vagy ígK-t nem expresszslő traaszgenikus egereket fejlesztettek ki a GenPfearm International cégnél. Szék a transzgenikus egerek olyan- funkcionális humán ellenanyag tr&nszgéneket tartalmaznák, amelyek átesnek V(B).l kapcsoláson, nehézlánc osztályvákozásás és szomatikus mutációkon, humán szekvenciájö immunglobulinok készletét hozva létre (1). A kősmyüíánc transzgénefe részbe® élesztő mesterséges kromossőmáról származnak, amely tartalmazza a csírsvonaibelt humán VK-lőkusznak majdnem a felét. A számos VH gén mellett a nehézlásc (HC) transzgén mind a humán p, mted a humán yl (2) és/vagy γ3 állandó régiókat is kódolja. A HCoWKCoS geaolipusos leszármazási vonalból származó egeret alkalmaztursh az taauaíztóós és fúziós eljárásban a leírás szerinti monoklonális ellenanyagok e lőálkiására.
Humán TNF-a tisztítása
Humán THF-a-t tisztítottunk. C237A sejtekből származó szövettenyésztési lelühíszókból affinitást kromatográfiával, TNF-e-receptor-Fe föziős fehérjét (p55'Sf2) (5) Sepfot/we· 4S-hez (Pbarmacta) kapcsolva tartalmazó oszlop alkalmazásával. A sejílbltltezókat összekevertük egykilenced térfogafctyi löx £>ulbeeco~léle PBS-sel (D-fiBS), és átengedtük az oszlopon 4sC-ou at 4 tnl/pere sebességgel. Az oszlopot azután mostuk PBS-sél, és a TNF-o-t előéltük 8,1 M nátriom-estráttal, pH 3,5 és semlegesítettük 2 M Tris-HCMeL pH 8,5. A tisztított TNF-α pufibrér lecseréltük l ö mk< Ttis, 8,12 M nátrium-kloridra, pH 7.5, és 0,2 pm-es íeesketsáöszötóa átszűrtük.
Ímíaujtteáesók
Egy megközelítőleg lő hetes nóstény GesPáar» egeret immunizáltunk IP (280 pl) és ID (löö pl a farok tövénél) Összesen löö- pg TOF-sc-val (lat iö 102298 vagy 10102098), azonos térfogatú F/temmr adjutánsban emuigeálvs a ö., 12, és 28. napon. Az, egeret a 21, és 35. napon véreztetrilk reirö-orbítSiis
- 57 szúrással, véralvadás elleni .szer sélkűl. Egy órán keresztül hagytuk a vért megakadni szobahőmérsékleten, és a szérumot összegyűjtöttük és bíráltuk szilárdfázisú TbiF'-n EÍÁ vizsgálati eljárás alkalmazásával, A 'GcaTNVnek nevezett fúziót azután végeztük, hegy az, egeret pihenni hagytuk 7 héten keresztül a 28. napon beadott injekciót kővetően, A TKF-« ellen 1: lőö specifikus humán IgG titerö egérnek azután egy végső IV megerősítő injekciót adtunk, 50 pg TNF-«-í hígítva löt) μ( fiziológiás sóoldatbsn. Három nappal később az egeret eutanizáltuk a nyak kítekerésével, és a lépeí aszeptikusán eltávolítótok és 10 ml, hideg ibszfát-pufferelt sóoldatba (PBS) tettük, amely 100 Utol penieliliní, 1813 pgúni sztreptomícint és 8,25 pgúnl amfetericin B-t (FSA) tartalmazott. A iépseiteket sterilen begyűjtöttük a lépnek PSA-PBS-sel történő perfelőiávai, A sejteket egyszer megmostuk hideg PSA-PBS-sel, megszámoltuk Coulter számláló alkalmazásával, és újra felszuszpendáltuk 25 mM Bepes-t tartalmazó RPMí 1640 tápközegben.
Sejtvonalalt
A. nem szekretáló egér mielőma fúziós partnert, a 653-at a ’Celi Biology Services'' (CBS) csoport vette át group 1997. május 14-én a Centoeor Froduct Deyeíopment’ csoportjától. A sejtvonaíaí felszaporítotíuk RPMl íápkSzegben (JRH Bioscíences), amely ki volt egészítve 18% (v/v) FBS-sel (Cell Culture Labs), 1 mM nábtom-piruváttal, 8,1 rnM NEAA-val, 2 mM L-glutaminnal (mindegyik JRH Bíosciences), és fagyasztva tartósítottuk 95% FBS-ben és 5% DMSO-ban (Sigma), majd gőzfeisű folyékony nitrogén fagyasztóban tárotok a CBS-nél. A sejtbauk steril volt (Quaiity Centről Centocor, Maivem), és mentes mikoplazmától (Bioníque Laboratories). A sejteket íog-fázisú tenyészetben tartottuk a fúzióig. FBS-sel mostuk azokat, megszámoltuk, és meghatároztuk az életképességüket (>9S%) tripánkák festékkizárás alkalmazásával a fejét tsegetózően
A humán TNF-ct-í a C237A jelű rekombináns sejtvenalíal állítottuk elő, amelyet a Centocor Molekuláris Biológiai részlege áhított elő. A sejtvonaíaí fölszaporítottuk 1MDM lápközegben (JRH Bioscíences), amely ki volt egészítve 5% (v/v) FBS-sel (Cell Culture Labs), 2. mM L-gtoamínnaí (mindegyik 5RH Bioscíences) és 0,5 pg/sd mikefenoisavvaí. és fagyasztva tartósítottuk 95% PSS-beu és 5% DMSO-ban (Sigma), majd gőzfázísö folyékony nitrogén fagyasztóban tároltuk a CBS-nél (13). A sejtbank steril volt (Quaiity Cöntroi Genloeor, Mídvem), és mentes mikoplazmától (Bionique Laboratories),
A sejtfúziót 1:1 arányban lévé 653-as egér miélóma sejtek és életképes egér lépsejtek alkalmazásával hajtottuk végre. Röviden, lépsejteket ós míelóma sejteket együtt csapadékba vittünk, A csapadékot lassan újra felszuszpendáltuk 30 másodperc alatt 1 ml 50% (w/'v) PEG/PBS oldatban (a PEG molekulatömege 1450, Sigma) 37 ’C-Ott, A fúziót 10,5 ml RPM1 tápközeg (adalékanyagok nélkül, .1RH) í percen keresztül történő lassú hozzáadásával állítottuk le (37 cC-on). A feztónáltatod sejteket lecentrifugáltuk 5 percen keresztül 758 rptn-en. A sejteket azután újra felszo3zpeí?dáltuk HAT tápközegben (RPMVHEPES tápközeg, amely 1Ö% magzati marhaszérumot (J.RH), ϊ mM náíritun-piruvátot, 2 mM L-glutammt, 18 pg/ml gentamicínt, 2,5% O/ge» c&toring 5»ppfefwe«t~«t (Fisher), 58 μΜ 2-merkaptoetanolt, I % d53-kondleioaáit REMI tápközeget, 1ÖÖ p.M hipoxaníint, 8,4 pM smisopterínt és 16 pM timídínt tartalnraz). és azután szélesztettük azokat 288 pl,''mérőhely mennyiségben 5 darab 96-méróhelyes, lapos fenekű szövettenyésztó mikrotiterlemezre, A lemezeket azutto 7-18 napra párásítóit 37 °C-os inkubátorba helyezőik, amely 5% CCM és 95% levegőt tartalmazott.
-58Busnás IgG anfs-T NF-α elienanyagek detektálása egér szérumban
Szilárdfázisó EÍÁ-t alkalmaztunk az egérszérumok humán TNF-a-ra specifikus humán IgG ellenanyagokra történő szkrinelésére, Röviden, lerrtezekeí vonlunk be 1 ug/ml koncentrációjú TNF-a-val éjszakán keresztül FBS-feet». Miután mostuk 0,02% (v/v) Tween 20-at tartalmazó 8,15 M sóoldattal, a mérőhelyeket blokkoltuk 1% (w/v) BSA-val FBS-ben, 288 pl/mérőhely mennyiségben, 1 érán keresztül szobahőmérsékleten.. A lemezeket vagy azonnal felhasználtak, vagy tefagytssztottuk -28°C-on későbbi alkalmazásra. Egérszérumokat inkuhálttok 2-szeres sorozafoigításbsm a humán TNF-s-val bevont lemezeken, 50 nFmérőhely mennyiségben szobahőmérsékleten 1 órán keresztül. A lemezeket mostuk, és azután próbáztuk 50 pl'méróheiy HRP-vel jelölt, Fe-specifikus kecske aníi-hmnán-IgO-vel (Aceurate), 1 ;3O880-szeres hígításban 1% BSA-FBS-ben, 1 Órás kérésziül szobahőmérsékleten, A lemezeket megint mostok, és 100 μ,Ι/méröhely estráí-foszfál szubszlrát-oldaíof (fol M citromsav és 0,2 M nátrium-foszfát, 0,01% RjÖ- és 1 mg/ml ÖPD) adtunk hozzájuk 15 percre szobahőmérsékleten. Leállító oldatot (4 N kénsav) adtunk a mérőhelyre 25 pl/mérőhely mennyiségben, és leolvastok az OD-t 498 nm-en automatikus spektrofotométer alkalmazásával.
Teljesen humán immungfobuflnok detektálása hibridóma felölószófcban
Mivel A GenFharm egér képes egér és hutnán immunglobulin láncok létrehozására is, két különálló EXA vizsgálati eljárást alkalmaztunk a pozitív növekedésű bihridóma kiónok tesztelésére, a humán könnyüláneok és humán nehézláncok jelenlétének vizsgálatára. Mikrotíterfomezeket vontunk be a lenti leírás szerint, és bígítatlan hibridóma feibtúszókaí snkubáltunk a lemezeken 1 órán keresztül 3?*C-on. A lemezeket mostok, és próbáztuk vagy HRP-vel konjugáit kecske anti-hamán-kappa (Southern Biotechj-ellenanyaggal, klÖOÖÖ-szeresre hígítva 1% SSA-HBSS-ben, vagy HRP-vel konjugáit kecske atoí-humán-lgG-Fo-speclfikus ellenanyaggal, 1:38088-szeres:re hígítva 1% BSA-RBSS-ben, I órán keresztül 37 ^C-ort. A lemezeket azután szubsztrát oldattal mkubáítuk, amint fent leírtok. Eldobtok azokat a bihrídótoa kiönokat, amelyek nem adtak pozitív jelet..mind az anti-humán-kappa és ssíi-humán-lgö-Fo E1A lórmátemokhan.
feníSpszálás
Az ellenanyagok izotSpnsának meghalárezását EÍA alkalmazásával hajtottak végre, az egérszérumok specifikus titereinek szkrinelésére alkalmazotthoz hasonló formátumban. EIA míkroíiterlemezekst vontunk be kecske antí~bumán-ígO(R-t-L)-lel 18 pg/ml koncentrítelóban nátrium-karbonát putferben éjszakán keresztül 4 °C-on, és blokkoltok a fenti leírás szerint. 24 mérőhely tenyészetéből származó tiszta feiülöszót ínköbákuak a lemezest 1 órán keresztül szobahőmérsékleten, A lemezt mostuk, és próbáitok HRP-vel jelölt kecske antihumán IgGj., IgGj, XgG3 vagy ígGi ellenanyaggal (Sindíng Síte), I ;4800~szeresre hígítva 1% BSA-FBS-feen, I órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezt ismét mostok, és szubsztrát oldattal ínkubáltuk, amint fent .teírtok..
Eredmények és diszkusszió
Teljesen humán aníl-kumán-TNF-o. monokhmálís ellenanyagok létrehozása
Egy - Gen'FNV-nek nevezett - fúziót végeztünk rekombmáns humán TNF-a fehérjével immunizált GenFharm egérből. Ebből a fúzióból 19ő pozitív nővekedésh hibridet szkrinelíünk. Nyolc hibridóma sejtvonalat azonosítottonk, amelyek teljesen humán, humán TNF-val reagáló IgG ellenanyagokat szekretáltak.
59Ezen nyele sejtvonal mindegyike humán IgGlsr fcsotípmá bsannHglobtáínf szekreter, és mindegyiket kétszer szubklónoztuk korlátozó hígítással, stabil (>9ő% homogén) sejtvonsiakat előállítva. Á sejtvotteak nevek és a megfelelő C-kódckat az 1. táblázatban soroljuk fel. A sejtvon&lak mindegyikét lefagyasztottuk 12-fiolás, folyékony nitrogénben tárolt kutatási sejibankokbtm.
A nyolc sejtventÜBak. a 24-fnérÖhelyes ienyésztöcsészák mérőhelyeiről gyditött szőlős sejtjeit átadtuk a Molekuláris Biológiai csoportnak 1999. február 18-án transzfekcíó és további jellemzés végett.
1. Táblázat GenTNV ssjtvotteak elnevezései
Név C-kód
GenTNVI4.17.12 C414A
Gén'TNV 15.28.11 C415A
GenTNV32.2.í6 C416A
GenTNVSó.14.34 C417Á
GeaTNVll 8.3.36 C418A
GenTNV122.23.2 C419A
GenTNV 148.26.12 C42QA
GenTNV196.9.1 €421A
Konklúzió
A GenTNV fúziót a Ceotoeor-nál előállított rekombináns humán TNF-a-val immunizált, humán variábilis és állandó régió eilesanyagAraEszgáaeket tartalmazó hibrid egérből származó lépsejtekkei hajtottuk végre. Nyolc teljesen bursán, TNF-tt-val reagáló, IgGliC izetlpusű tnonoklonáiís ellenanyagot hoztunk létre. A szülői sejtvonalakat átadtunk a Molekuláris Biológiai csoportnak további jellemzés és fejlesztés végett. Ezen új humán ellenanyagok egyike hasznosnak bizonyulhat antí-inEammatorikus kezelésekben, potenciálisan csökkeni immunogenításaal és allergiás típusú komplikációkkal a Remicade-hez képest.
Hivatkozások
1. Taytorés mtsai,, International Immunoiogy 6,579-591. old. (1993),
2. Lonberg és mtsai., Natúré 368,856-859. old. (1994)
3. Neufeerger M., Natúré Sioíeehnology 14, 826. old. (1996).
4. Fishsvild és mtsai., Natúré Biotechnology 14, 845-851. old. (1996).
5. Scallű© és mtsai., Cytokine 7, 759-770.old, (1995).
3. példa: Komán anfi-TNF-s ellenanyagot espresszáln sejhmnaiak klónozása és előállítása
Nyolc TNV jelű humán monokksnáh's ellenanyag (mÁb) paneljáról azt találtuk, hogy látszólag magas avidltással kötődnek immobilizált humán TNF-u-hoz. A nyolc rnAb közöl hétről kiínatappk, hogy hatékonyan blokkolja a humán TNF-a kötődéséi: rekombináns TNF-reeeptorhoz. A. hét mÁb-ot kódoló DNS szekvenciaelemzése megerősítette, hogy mindegyik mAb-nak humán V-régiója van. A DNS-szekveneíák azt is feltárták, hogy a mAB-ok három párja azonos egymással, oly módim, hogy a nyolc tnAb eredeti panelja csak négy különböző mAb~ot tartalmazott, amelyeket a TNV 14, TNV 15, TNV 148 és TNV 19ő reprezentál, A rnAb-ok kikövetkeztetett ammosav-szekveneiájának az elemzése és őt v/Ní? TNP-a semlegesítési eredmények, alapján a TN VI48 és TNV 14 Hnkb-okai: választottuk ki a további vizsgálatokhoz.
-SöMivel a TMY148 nehézláncában a 75. poziclőfess (3. vázzégiő) iává prolin öldaliáneot sem találtuk meg adatbázis-keresés folyamán as azonos aiesepotlbs tartozó- más humán ellenastyagok ugyanezen pozíciójában, helyspeciiikus DNS mut&genezisí hajtottunk végre széria oidallánc beépítésére ebben a pozícióban, sírnak érdekében, hogy azt összhangba hozzuk ismert cslravonal vázrégíó-szekveneiákkai. A szerionéi módosított mAb-ot IWM&B-nefe neveztük el. A TNV148B és TNV 14 uehéziánc és kösnyüiánc variábilis régióját kódoló, PCR-re? ampUSkált DNS-t újonnan előállított expressziás vektorokba klónoztuk, amelyek egv másik humán tnAb (12875) nemrégiben megklónozott aehézláao és hőnnyűlánc génjein alapultak, amelyeket a 20ÖÖ, október 7-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (elme', „IL-12 Antíbodses, Composidoss, Methods aad IJses”) tár fel,
P3XÖ3ÁgS,S53 (653) sejteket vagy Sp2/Ő-Agl4 (Sp2/0) egór ratelóma sejteket transzfektáítusk a megfelelő nehézláne és könnyaidac expresszlős plazmidokkal, és szkrfnelíük azokat két menet ssubkiósüzássaí rekombináns TNV148B ás TW14 (rTNYÍÓSB és rTNV 14) mAb-okat magas szinten termelő sejtvonalskra, A növekedési görbék és a tnÁb-termelés stabilitásának időbeli értékelése azt mutatta, hogy a ŐSo-Sranszfektá-KS G4éőD és C4őőC kiértek stabilan termeltek megközelítőleg 12$ pgfel rTNVMSB mAb-oí kimerült tenyészetekben, míg az Sp2/0-trsnssfekíáns 1.73-12-122 (C467A) klón stabilan termelt megközelítőleg 25 ,ug/ml rTNYI4SB mAfe-ot kimerült tenyészetekben. Hasonló elemzések azt mutatták, hogy .az Sp2A9-transzlektáss C47SA klón IS pg/tnl rTNY!4~í termelt kimerült tenyészetekben.
Bevezetés
Humán 'íNF-tr-vnl immuaizálí GesPharm/Medsrex egerekből (HC«12/KCo$ genotípus) származó nyolc tnAb paneljáról korábban kimutattuk, hogy kötődnek tatán TNF-o-hoz, és teljesen humán ígOl,feappa izoö'pusúak. Egy egyszeri! kötési vizsgálati eljárást alkalmaztunk -annak meghatározására, hogy vsn-e a találmány szerinti szemléltető mAb-okstsk valőszhrilleg TNF-o-t semlegesítő aktivitásuk, az&knsk a TRF-a-t a rekombináns TNF-receptorboz való kötésében blokkoló képességének az értékelésével, Szén eredmények, DNS-szekveuciaeredmények és több mAb ót rió-o jellegzetességei alapján a TNV148-at választottuk, ki, mint tovább jellerszendő tsAb-ot.
A TNV148 mAh-oí kódoló DNS-szekveneiákat megfciónoztuk, módosítottak, hogy a megfelelő állandó régiókat kódoló génexpresszíós vektorokba beleférjessk, bejuttattak azokat jól jellemzett ó$3-as és Sp2/Ö egér mielóma sejtekbe, és a kapott trsmzfektált sejtvonalakat addig szkrínefcüfc, amíg olyan szubklónokat nem azonositotbmk, amelyek 48-szer több mAb~ot termeitek, mist az eredeti bibridöma ssitvonai.
Anyagok és eljárások
Reagensek és sejtek
A TRÍZOL reagenst a Qlbeo BRL cégtől vásároltuk, A Proteisuase K-t a Sigma Chemical Compasy cégtől szereztük be. A reverz-banszkriptázl a Lile Sciences, Inc, cégtől szereztük be, A Taq DNS-polimerázt vagy a Perkin Elmer Ceírn, vágj1 a víbco SSL cégtől szereztük be, A restrikciós enzimeket a New England Biolabs cégtől vásároltok. A QZdqtíícá PQ? Purtjfoatteft O a Qiagest cégtől származott, A -gíuSCtage dtteZbrecíerí Aritíagen&ris Art-et s Stratagene cégtől vásároltuk. A IT/sar<f p/am/d mirtprep álr-ek és az RNazin a Promega cégtől származtak. Az öpóp/űíe-eket a Packard cégtől szereztük be. A 5ÍSjóáot az Amersham cégtől vásároltuk, A rendelésre készített oligonukleotldokat a KeystoneőBiosoarce- .International cégtől vásároltuk. A
-61 Jelen mutskában aikateazott olígonHkleobdek nevét, azanosítószámát és szekvenciáját az 1, táblázatban mutatjuk be.
L Táblásat A TNV mAb gének klónozására, génsebészeti út»» törtéaö módosítására vagy szekve&átáséra alkalmazott ollgonnkteotldok, Az ST4s és lioH-36 oligonukleotidok által kódod aimnosavakai a szekvencia felett mutatjuk be, Áz ’M’ amínosav-oldallánc reprezentálja a ítznszláctós star&oáeat. Az aláhúzott szekvenciák az 5’ I4s és HuH-36 oibonukleoíldökban sorrendben a BsiWl és BstBí restrikciós helyeket jelzik. A törtjei a HafMé-feaa az exommtroa határnak felel meg. Megjegyezzük, hogy azokat az oligomíkleotidokat, amelynek a szekvenciája a negatív szálnak telel meg, 3’~5’ .irányítottságba» tüntetjük fel.
Név
Szám
Szekvencia
HGl-4b 119 3NTTGGTCCAGTCGGACTGG-5’
HG1-56 354 3,-CACC3'GCACTCGGTGC3T-S’
HGlbg 360 3'-CACTGTTTTGAGTGTGTACGGGÖCTIAAGTT-5’
HG1-6 35 3'-GCCGCACGTGTOÖAAGGG-5’
HCK1-3E 11? 3:-AGTCAAGGI'CGGÁCTGGGTTAAGTT-5’
HuK-THd 208 S'-GTTCTCCCCíGrCACAATCTTCGAATTT-S’
HVKRNAsec: 34 3'-GGGGGTAGACFÁCTCGTC-5>
S’14s
5’46s
S’47s
5’63s
5*73s
BsiWl M D W T W S 1
366 S-TTTCG'i^CGCCACCATGGACTGGACCFGGAGCATC-S'
36? 5-TTTCG'rACGCCÁCCATGGöGTTFGGGCTGAGCTG-3'
368 S-TTTCGTACGCCÁ€CÁTGGAGTTTGGGCTGAGCÁTG-3‘
369 .5’-TTTCXjTACGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCrrC-3‘
370 5-TT'FGGTACGCCACCATGGGGTCAÁCCGCCÁTCCTC-3'
HuH-J6
T V T V S S BstBí
J'-G'FGCCAGTGGCÁGAGGAGTC/CÁTTCAÁGCrfAÁGTT-S'
LK?s kVgs
Sáli M D M R V
363 ó-nTGTCGAGACCÁTGGACATGAGGGTCC (TC) C-3‘
363 5'-TTrGTCGACACCATGGAAGCGCCAGCTC-3!
Höt-33
Ϊ K V D 1 K AS2
380 3!-eTGGIITGÁCGTATAGTTTG/CArrCAGAATTCGGCGCCriT
V148-QC1
399 ó’-GATCTCCAGÁÖACAATtCCAAÖAACÁCGCTGTÁTC-S’
V148-QC2
406 J'-GTAGAGÖlTTCTGTFÁzGGTTCTTGrGCGACATÁG-é’
Egyetlen fagyasztott fiola 65.3-as egér míelóma.sejtet szereztSnk be. A fiolát aznap felolvasztottuk, és felszaporftottak T-edényekben ÍMDM, 5% FSS, 2 rnM glatamin alkalmazásával (tápközeg). Ezeket a sejteket folyamatos tenyészetben tartottuk fenn addig, amíg transzfekíáluk azokat 2-3 héttel később az itt leírt aatí-TNF DNS-seí. A tenyészetek némelyikét begyűjtöttük 5 nappal a felolvasztás után, ceatrifiígálással ieülepítsttük, és újra felsztrszpendáltuk 95% FBS-be®, 5% BMSO-b&n, 30 fiolába osztottuk szét, lefogyasztottuk, ás további felhasználásra tároltuk, Oasontöképpea egyetlen fagyasztott fiola Sp2/Ö egér tnielóma sejtet szereztünk be. A fiolát felolvasztottuk, új fogytsztást állitötttmk elő a fentiek szerint, és a lefagyasztott fiolákat a CSC AA és AB fagyasztószekrényeiben tároltuk. Ezeket a sejteket olvasztottuk fel és alkalmaztuk az összes teásban ismertetett Sp2.-'Ö transzfekcióban,
Vizsgálati eljárás TAT receptorhoz való kötődésének gátlására
A TNV mAb-okat tsrtateazá hibridóma sejtfelülúszökat alkalmaztuk a mAb-oknak usl-yel jelölt TNF-et rekombináns TNF-teceptor tetős fehérjéhez, a p55-sí24söz töriérső kötése gátlására való képességének vizsgálatára (Scallon és tstsak. Cyíokte 7, 759-77Ő. old. (1995)]. 50 pl p55-sf2-4 adtunk 0,5 pg/ml koncentrációban BBS-ben C^^astó-efare a mérőhely bevonása végett, 1 órán keresztül 37 °C-on. A nyolc TNV sejtlelölúszó serozaihigitását állítottuk elő 96-méröhelyes gömbölyű fenekű mikrcttiterfemezeken, hígítöszerként PBS/0,1% 8SA alkalmazásával, Ami-ÍL-ÍS mAb-ot tartalmazd sejtfclülúszór alkalmaztunk negatív kontrollként, és ugyanazt az aníi-IL-lS felüluszót alkalmaztuk pozitív kontrollként cA2-vsl (anti-TNF kunéra ellenanyag, Rernicade, 5 770 198. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) adott koncentrációra beállítva. 5?~vel jelzett TW-s-t (58 pCi/pg, D, Shealy) adtunk 106 pl sejt felülöszőhoz, 5 ag&al TNF~et végkoneentráeíóban. A keveréket elölnkubáltuk 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A bevont Optttp/sm-ekeí mostuk, hogy eliávoteuk a nem kötődött p55~sf2~t, és 59 pl í2íl-TNF-«.'''sejtfelűlúszó keveréket átvsítönk az Öpíytem-ekre, 2 óra elteltével szobahőmérsékleten, az öpbp/ufe-eket Iráromszor megmostak PBS-Tweea-ítel. 190 pl árkunk a mérőhelyhez, és a megkötött epm-st meghatároztuk
TopCeunt geísma co»«*er aikaimazásával.
A Y-gének amplsfikálása és ÖNS-szekvetseia elemzés
A hibridőma sejteket -egyszer mostak FBS-ben, mielőtt hozzáadtuk a TRIZÖ& reagenst RNS előállítása végett. 7 X lö* és 1,7 X lő' közötti számú sejtet újra fetszuszpendáhnak l ml Z38ZÖ£-baa. A csöveket erőteljesen megkevertük 200 ttl kloroform hozzáadása után, A mintákat lecenirííugáituk 4 *C-oa i 6 perces keresztül, A vizes fázist átvittük egy új míkroeetttrifaga csőbe, és azonos térfogatú ízopropanolt adtunk hozzá. A csöveket erőteljesen megkevertük, és lő perces keresztöl szobahőmérsékleten hagytuk. Azután a mintákat leeeaírtíugáituk 4 eC-os 19 perces keresztöl. A csapadékokat egyszer mostuk l ml 70% eforsöll&l és röviden száritotíúk yákmmnszáritőban. Az. RNS-esapadékökat újra felszuszpendáltuk 40 -pl DEPC-cel kezelt vízben. Az RNS-készftmények minőségét 6,5 μΙ elválasztásával határoztuk meg 1% agarózgélen. Az RNS-t -SÖ’C-os- fagyasztóban tároltuk a felhasználásig,
A nehéz!.átse és könnyüláne eDN5-ek előállításához olyan keverékeket állítottunk elő, amely 5 pl RNS-t és 1 pg 119, számú otígonukleobdot (nehéziánc) vagy f17. számú oligonukleotidot (könnyüláne) (lásd az- 1, táblázatot) tarttthnazott 11,5 pl térfogatban. A keveréket 7Ö“C-on inkubáltuk 10 percen keresztül vízfürdőn, majd azután jégen lehütöttük 19 alatt. Egy másik keveréket is elöáfttiottunk, amely 2,5 pl 1ÖX
-63reverz-íranszkripiáz puffért. 16 μΐ 2,5 ntM dNTP-t, 1 pl reverz-transzkriptázt (20 egység) és 6,4 pl RNazin ribonnkfeáz-inhíbitört (1 a»k) tartalmazott Ezen keverék 13,5 pl-ét hozzáadtuk a lekötött RNS/oligötnikleoííd keverék. 1 1,5 pl-éhsz, és a reakciót 46 percen keresztül inkubáltt?k 42 cC-on. A eDNS-szintézis reakciót azután -26 °C-on tároltuk fagyasztóban íeihasználásíg,
A tísstltatfeai nebézlánc és kőnnyülánc cDNS-eket alkalmaztok tempiátként a variábilis régió kódoló szekvenciák PCR-amplíEkálásához. Öt oligonukleoíid párt (366/354, 367/354, 368/354, 369/354 ás 379/354, 1, táblázat) teszteltünk egyidejűleg a nehéziáne DNS ampiirikációjának megiadftásáoak képességére. Két oligonukleotid párt (362/208 ás 363/208) teszteltünk egyidejűleg a könnyülánc DNS amplsSkáesójának megindításának képességére, A PCR-reokeoókat 2 egység PXATZVLót·/™ /ngó ym'eő'ív í'H/A?) Tup DNA p&fyaterase· alkalmazásával hajtottuk végre 58 .pl végíérfogatban. Mindegyik reakció tartalmazott .2 pl cDNSrakciót, 10 porolt az egyes oligonukleotid okból, 0,2 mM dNTF-t, 5 pl 18 X HIFI puffét és 2 mM magnésámnszolfátot, A tensális ciklus program az alábbi volt: 95 ÖC 5 percen keresztül, majd 30 ciklus (94 °C 36 másodperces keresztül, 62 *C 30 másodpercei? keresztül, 68 ®C 1,5 perces keresztül). Azután a végső inkubáiás 10 percig történt 68 cC-on,
A PCR-íermékek közvetlen DNS~szekvesálásá?a való előkészítésként megöszíitottsk azokat a Q/Aquick PCR Pur$eeti&n Kit alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. A DNS-t a eentó&gás oszlopról 50 μ! steril víz alkalmazásával efeáltuk, majd azután beszárítottuk 19 pl térfogaira vákuumszárító alkalmazásával. A DNS szekvenáló reakciókat az alábbi módon állítottuk össze: I pl tisztított RCR-termék, 16 pM öligonukleotíd láneisdiíó, 4 pl Big&pe reatty reacti&n mix és 14 pl steril víz 20 pl össztéribg&tfcan. A 367/354 obgonnklentíd párral előállított nehézlánc PCR-termékeket a 159, és 360, száma oligonakleotió láncbdMskaJ székvenáltak. A 363/208 oligosmkleolid párral előállított könnyűiánc FCRtermékeket a 34,. és 163. számú oligonukleoddokkal szekvonáltuk. A termáíis ciklus program a szekvenáíáshoz az alábbi volt: 25 ciklus (96 °C 36 másodpercen keresztül, 56 eC 15 másodpercen keresztül, 69 eC 4 percen keresztül), majd éjszakán keresztül 4 :'C'-on. A reakdoterrnékeket poliakrilamidgélen választottuk szét, és ,4A/ 377 DNA Sequeneer készülékkel detektáltuk.
Heiyspeclfíkus mtrt&genezb aminosav megváltoztatására
Megváltoztattunk egyetlen oukieotidoí a TNY148 néhézüánc variábilis régiójában annak érdekében, hogy helyettesítsük a Pro?5-St szerín oldáilánccal a TNY14S mAb-ban. komplementer oiígonakleotidokst (a 399. és 466. számót, 1, táblázat) terveztünk és rendeltünk ezen változtatás elkészítéséhez, egy egyedi BslWI klónozó hely alkalmazásával éppen leolvasással ellentétes irányban a transzlációs íníciácíös helytől, a gyártó protokollját követve. A kapott plszmidöí pl74?-aefc neveztük et Egy BstBÍ helynek a variábilis régió 3’ végére történő beépítése végett egy 5’ oligonukleotid láncindítót: terveztünk Sáli és BstBÍ helyekkel. Ezt a láneindhót alkalmaztuk a pUC reverz láncínditóval egy 2,75 kb mérető fragmens amplifikálására a pl 747-ból. ezt a fragmenst azután vísszaktónoztuk a 12B75 variábilis régió természetben előforduló Sáli helye és egy Hindlil hely között, ezáltal beépítve az egyedi BstRI helyet. A kapott köztes vektor, amelynek a neve p i 758, képes befogadni variábilis régió feagmenseket BslWl és BstBÍ helyekkel a végeiken. A nehézlánc vektor olyan változatának az előáll kásához, .amelyben az állandó régió is a 12875 génből származik, a pl 758 SamHIHíndlii inzertjét átvittük pSE322-he annak érdekében, hogy legyen egy EeoRl hely a Hindin helytől a leolvasással megegyező irányban. A kapott píazmídot, a pl768-« azután Hindin és EcoRI enzimekkel
- 64 emésztettük, és ligáinak egv 5,7 kb mérető, pl?44-bŐl származó Jfi;?<HS-EcoRÍ ftagjaenssel, amely a nagy BamHI-SamHl fcagmensnsk a plSőíl-feól a pBC-be való klónozásából származó szubklótt. A kapó» pl 784 plazoridot azután vektorként alkalmaztuk a BslWl és BstBÍ végű TNV Ab cDNS-fragmensek számára. További munkával előaUitottuk a pl788 és pl798 expressziós vektorokat, amelyek tartalmazzák a IgGl állandó régiót a 12B75 génből, és abban különbözések egymástól, hogy az 12875 nehézlánc J-C inSrosnak mekkora részét tartalmazzák.
A pl 558 plazmában lévő 12B75 kötmyüláne gén módosításához a 12875 promóterét és variábilis régióját tartalmazó 5,7 kb méreté SalBAfHI fragmenst átyírtük a pl558-ból az 1,28 plazmid Xhob.AílIJ helyére. Ezí az új plazmid, a pl 745 egy kisebb íempláíot biztosit a «nitagenaas lépés számára. Öligonukleötídokat {C34ősall és C340sai2) alkahnttrtuuk egy egyedi Sáli restrkdós hely beépítésére a variábilis régió 5' végére gmkC&mgg muiagenezissel. A kapott köztes vektornak, a pl'746-nak egyedi Sáli és ASO restrikciós helyei vannak, amelybe variábilis régió fragme»seket lehet klónozni, A pl746-ban klónozott bármilyen variábilis régió tragmens előnyösen a könnytilánc gén 3’ feléhez kapcsolódik. Az 12B75 könnyűlánc gén 3' végéből erre a célra alkalmas restrikciós fragmens előálhtásáboz a BAHN-1 és 8AHN-2 olrgoooklcetiáokat anneáksk egymáshoz BsiWI, AfiB, Hindii! és Nőt! restrikciós helyeket taríalmaző kétszálu kapesoíómolekulát előállítva, amely Kprtl és Sacl helyekre ligálfeaté végeket tartalmazott, Ezt a kapesoíómolekulát klónoztuk a pBC Kpnl és Sacl helyei közé a pl757 plazmidot előállítva, A 12S75 könsyőiáno állandó régióját tartalmazó, a pl558-nak ΑΒΠ enzimmel történő emésztésével, majd Hindii! enzimmel történő részleges emésztésével előállított 7,1 kb méretű ttagmenst beklónoztuk a p!757 Afíll és Hindin helyei közé. előállítva a pl7ő2-í, Ez, az új plazmái egyedi BsiWI és Affil helyeket tartalmazott, amelyek közé a promótert és a variábilis régiókat tartalmazó BslWÁflH fragmens átvihető, a gén két felének egyesítését eredményezve.
cöNS-kJónoaás és espressziós piazmiáok őaszeálhtása
Az: összes RT-PCR reakciót (lásd fent) Klenow-enzimmel kezeltük a DNS-végek betöltése végett. A nehézlánc PCR-fragtnenseket BsiWI és BstBI enzimekkel emésztettük, és azután öekiónozt&k az- L2S plazmid BsiWI és BstBI helyei közé (L28-at alkalmaztunk azért, mert az 32875-őn alapuló pl.750 köztes vektort akkor még sem készítettük el). A klónozott Inzertek BNS-szekvenda elemzése azt matatta, hogy a kapott konstrukciók helyesek voltak, és hogy nem keletkeztek hibák a PCR-amphiskációk folyamán, Ezeknek az L28 plazmid konstrukcióknak a számait (a TNV'! 4, TNV 15, TNV148, TNVI48B és TNV 196 esetében) a 2. táblázatban mutatjuk be.
A TNV14, TNVI48 és TNV148B nehézláncok BslWEBsíBI inzertjeit átvittük az L28 vektorból az újonnan előállított p!75ö köztes vektorba. Ezeknek a köztes pbzmidoknek az azonosítási számait a 2. táblázatban matatjuk be. Ezt a klónozást lépést és az azt követő lépéseket nem végeztük el a TNV 15 és TNV 196 esetében, A variábilis régiókat azután két különböző humán IgGl expressziős vektorba vittük át. Az EeoRÍ és HíndlH restrikciós enzimeket alkalmaztuk a variábilis régióknak a Centocor korábban akkalmazott IgGl vektorába, a pl04-be történő átvitelére. A kapott expressziós plazmidokat, amelyek Gm(f-i-) ahotipusú lgG1-et kódolnak, pl?8! (TNV14), p!782 (TNV148) és p!783 (TNV 1480} néven neveztük (lásd a 2. táblázatot). A variábilis régiókat beklónoriuk az 12B75 (GenPharm) génből származó IgGl állandó régiótól
-65leolvasással ellentétes irányban is. Azokat a Gím(z) adótípusú lgGl-et kódoló expressziós plazmidokat is felsoroljuk a 2. lábíázathap.
2. Táblázat. A különböző nebézláoe és kSsmyhláuc piaznddok azonosítási számai. Az L2S vektor vagy' pBC vektor a kiindulási Ab cDKS-klónt reprezentálja. Ezeknek a plazmidoknak az inzertjeit nem teljes 12B75-alapó vektorba vittük át, hogy köztes plazHUdokat állítsunk elő. Egy további -átviteli lépés eredményezte a végsó expressziós plazmidokat, amelyeket vagy iinearizáiás után sejtekbe juttattunk be, vagy mAb gésínzertek tisztítására alkalmaztunk a sejtekbe történő transzfekciót megelőzően. (NX>) ~ sem végeztük el.
tn.Ab L28 rektor piszoúd sz. Gffl (ft-) Köztes plaznssd Expressziós Cím (z) Expressziós ptozmid sz.
sz. ptezmid sz.
Nehézlcivcek
TNV14 pl751 pl 777 pl 781 pl 786
1KV15 pl 752 (ND) (NO) (NO)
TNV148 pl 753 pi??S p!7S2 pí787
TNV148B pl7ŐÖ pl.779 pl 783 pl788
TNV196 p!754 (ND) (NO) (NO)
pBC vektor Köztes plazmid Expressziós
plazmíd sz, sz. pl&zmíd sz.
A'öiffín vVífecok
TNVÍ 4 pl 748 pi755 pl 775
TNVÍ 5 pl 748 pl 755 pl775
TNVÍ 48 pl 749 pl 756 p 1'776
TNVÍ 96 pl 749 pl 756 pl 776
A könnyüláno ECR-termékeket megemésztettük Sáli és Saeli restrikciós enzimekkel, és azután a pBC plasmld Sáli ós Saeli helyei közé Rléöoztak, A két különböző könnyölánc változatot, amelyek egy amiöösavbsn különböztek, pl?4§-pak és pl 749-nek neveztük el (2, táblázat). A DNS-szekveucia elemzése megerősítette, hogy ezeknek a konstrukcióknak helyes a szekvenciája, A pl74S és pI749 SalKAfiH fragmensesí azután a p 1746 köztes vektor Sah és Afili helyes közé klónoztuk, előállítva sorrendben a pl755 és pl75S plazmáitokat, A könnyüláoe gének ezen 5’ feleit azután összekapcsoltuk a gén 3’ feleivel, s p!75S és pl756 SsiWl/ABB tragmesseiuek az újonnan előállított pl 762 konstrukcióba történő átvitelével, előállítva sorrendben a p!775 és pl776 végső expressziós plazmlöokat (2. táblázat).
Sejtek trausztektáiása, szkrlnelése és sznfekiÓBOzáss összesen 15 íranszfektálást végeztünk egér mielőma -sejteken a különféle TNV expressziós plazrsidökkal (lásd ts 3, táblázatot az 'Eredmények és diszkusszió’ részben). Ezeket ti írnnszfektálásokat aszerint különböztettük meg, hogy (1) a gazáasejí Sp2/ö vagy 653 volt-e; (2) a nehézláae állandó régiót a
-őőCeatocor korábbi IgGl vektora vagy a 12B75 nehézlánc állandó régiója kódolta-e; (3) a mAb TNV 488, TKV 148, TN'V 14 velt-e, vagy egy öj liC/LC kombináció; (4) a DNS Imeanzálí píázmid vagy tlsztitott Ab gén inzert volt-e; és (3) a teljes I-C intíöK szekvencia jelenléte vagy hiánya a nehézláoc génben. Ezenfelül több ransztekciót megisméteithnk, hogy növeljük annak a valószínűségét, hogy nagyszámú klónt lehet sskri'neiní,
Sp2/0 sejteket és 653-as sejteket transzfektáltunk neházláne és kSnnyűlánc DNS keverékével (§-12 pg mindegyikből)· elekhopotációval szokásos körülmények között, amint azt korábban leírták (Knight, D.M és mtsaí., Moíeeular Imnrunofogy 30, 1443-1453. oki. (1993)]. Az L, 2. 3, ás ló. számú transzfekciő esetében a megfelelő expressziós plazmánkat lineaozáltek restrikciós enzimmel történő emésztéssel a transzfekíál&st megelőzően. Például Suli és NötI restrikció» enzimeket alkalmaztunk sorrendben a pl783 és pl77ő jelű TNV14&B nehézlánc píazmidök linearizálásához. A fennmaradó trsnszlekdók esetében a csak a nsAb gént tartalmazó DNS-inzerteket elválasztottuk a plazmidvektoríői a nehézlánc plazmidoksak BamHí enzimmel és a könnyűlánc pl&snudoknak BsiWl és Moll enzimekkel történő emésztésével, A mAfe géninzerteket azután megtisztítottuk agarózgél-elektroforézis és gfex. tisrtitási gyanták alkalmazásával. A tisztított génhrzcríekkd traaszfefctáU sejteket egyidejűleg 3-S pg, Fsű enzimmel linearizált »$V2gpt plazmiddal (p 13) irtmszfsktáhuk, szelektálható markcr forrásúi biztosítva. Az elektroporációt követően a sejtekei leoltottuk 9é-mérőheiyes szöveSenyásztő lemezekre 1MDM, 15% FBS, 2 tói glutamin tápközeghen, és 37 cC-on sakubáltak 5% COj-t tartalmazó inkubátorban. Két nappal kesébb azostiös· térfogatú 1MDM, 5% FBS, 2mM; ghxíamm, 2X M1DC szelekciós (IX MHX « 8,5 ng/ml miko&no&av, 2,5 ug/mi hipoxanfln, 50 gg/mi xantín) tápközeget adtunk a mérőhelyekhez, és a lemezeket további 2-3 héten keresztül irikabáltuk, «míg kolóniák alakultak ki.
A kolóniákat tartalmazó mérőhelyekről gyűjtött sejtek felüiöszoit mértük humán IgG-re ELlSA-val, amint leírtak. Rövides, a sejífélülőszók különböző hígításait inkubáltuk polikíonáiís kecske anii-hamán-IgGFc tragmenssel bevont 9ő-máröhelyes EIA mikretítériemezeksK, és a kötődött humán IgG-t alkaúkus íöszfatázzal konjugált kecske ant!-bumán-lgG(H4L} és megfelelő színes szubsztrátok alkalmazásával detektáltuk, St andardként a sejtek felől úszójában mérttel megegyező tisztított mAb-okat használó standard görbéket atkaimaztunk mindegyik FIA lemezen, a felhiúszőkban található humán IgG mennyiségi meghatározásának lehetővé tételére, A látszólag a legtöbb humán IgG-t termelő kolóniák sejtjeit passzáltak 24-mérőhelyes lemezekre a termelés további meghatározására kimerült tenyészeiekböl, és azt követően azonosítottuk a legjobban termelő szülői klánokat,
A legjobban termelő szülői klóitokat szuhkiónoztuk a jobban termelő szubklőnok meghatározására, és homogénebb sejívonalsk előállítására, 9ő-méröhely«s szővettesyésziő lemezeket oltottunk be mérőhelyenként egy sejttel vagy mérőhelyenként négy sejttel JMDh-í, 5% FBS, 2ntM gíutamin, IX MHX tápközegben, és 3? ’C-oa inkubálttik 5% COj inkubátorban 12-28 napon keresztöl, amíg kolóniák slaknitak ki. A sejtek íeiüiúszóit összegyűjtöttük a mérőhelyenként egy sejtet tartalmazó mérőhelyekből, ás ELlSA-val elemeztük, amim fent iehtek. Kiválasztott kolóniákat 24-merőfeelyss lemezekre passzoltunk, és a tenyészeteket hagytuk kimerülni, mielőtt azonositoítuk a Icgjoblxm termelő szubkiórtökat a felüluszólkban lévő humán IgG szintjének mennyiségi meghatározásával, Ezt az eljárást megismételtük akkor, amikor ki választott első fcörbeh szuhkiónokat egy második sznfcklónozúsnak vetettünk alá. A legjobb második körbeli szubkiőnokat választottuk ki a fejlesztendő sejtvonalakat
-67Sejt szubkiónok jellemzése
Kiválasztottuk a legjobb második foörbeö szubkíönokat, és megvizsgáltuk a növekedési görbéjükét a .ínÁb-tennelés szintjének és növekedési jellegzetességek értékelésére. T75-edésyeket ohotbmk be ί X lö5 .sejt/ml sűrűségben 3Ö ad ÍMDM, 5% FBS, 2 tnM giuíantm és IX MHX iápkőzegben (vagy szérummentcs íápközegben), 3QÖ μΐ-es aiikvötokat vettösk 24 órás időközönként, és meghatároztuk az élő sejtek sűrűségét. Addig folytattok az elemzést, amíg az élő sejtek száma kevesebb sem lett, mint tXlö5 sejtünk A sejtíelülüszók összegyűjtőit ailfcvotja.it megvizsgáltuk a jelenlévő ellenanyag koncentrációjára. Áz ELISA vizsgálati eljárásokat standardként LFNVMSB vagy rTNVM 3G92399 alkalmazásával hajtottak végre. A mintákat 1 órás keresztül mkűbákuk poiiklouálís kecske anti-immán-ígG-Fc-vel bevont BUSA míkrotiterlemezekes, és a kötött snAb-et tslkalikus foszfatázzal konjugáít kecske anti-hírrnán-ígGCH+L) ellenanyaggal detektáltuk LiOöO'Szeres hígításban.
Egy másfajta növekedési görbe elemzést is elvégeztünk két sejtvonai esetében óbból a célból, hogy összehasonlítsuk a növekedési sebességeket külőniéíe mennyiségű MHX szelekció jelenlétében, A C4Ő6A és C-466B jelű sejívonalaka; felolvasztottuk MHX-mentss íápközegben (IMDM, 5% FBS, 2 aM glutamm), és további két napon keresztül tenyésztettök azokat Azután mindkét sejttenyészetet három tenyészetbe osztottuk szét, amelyek vagy nem tartalmaztak MHX-et, vagy 0,2X MIíX~et vagy IX MHX-et tartalmaztak (IX MHX ® 0,5 pg.'tui mikofenolsav, 2,5 gg/snl bpoxantin, 50 pg/rnl xarstin). Egy nappal később friss TTS-edéayeket oltottunk be a tenyészetekkel, t X 10s sejb'ml kiindulási sűrűséggel, és a sejteket 24 órás időközönként megszámohuk egy héten keresztül. Nem gyűjtöttünk al Hívótokat a ruAb-tsrmelés meghatározására. A megkettőződésé időket az SOP PD32.Ű25 iratban megadott képlet alkalmazásával számítottuk ki ezen minták esetében.
További vizsgálatokat végezünk a mAh-termelés időbeli stabilitásának az értékelésére. Tenyészeteket növesztettünk 24-mér§belyes lemezeken ÍMDM, 5% FBS, 2 wM glutamhr íápkózegbeu, MHX szelekcióval vagy anélkül. A tenyészeteket friss tenyészetekre osztottuk szét, amikor kontinenssé váltak, és az öregebb tenyészeteket hagytuk kimerülni. Ekkor egy alikvoíot vettünk a felülűszóbói, és 4 öC-ou tároltak. Az aükvotokat 53-78 napon keresztül gyűjtöttük. Ezen időszak végén a íeiülószókat teszteltük a jelenlévő ellenanyag mennyiségére a fent körvonalazott ami-humán ígö-Fc ELISA alkalmazásával
Eredmények és diszkusszió
TNF rekomblííáus receptorhoz való kötődésének a gátlása
Egy ogysserö kötési vizsgálati eljárási hajtottunk végre annak meghatározására, hogy a feibridóma sejííelűlúszókhön lévő nyolc TNV mAfa képes-e gátolni TNF-« kötődését a receptorhoz. Először meghatároztuk a TNV mAh-ok koncentrációját a megfelelő felüiűszókbas humán IgG elemzésére szokásos ELJSA-vai. Azután EIA lemezeket egy rekombináns p5S TNF-rsceptor/IgG fúziós fehérjével, a p55'Sf2-vel vontunk be, és lísi-vel jelölt TNF-et hagytunk kötődni a p55-receptorbez különböző mennyiségű TNV mAbok jelenlétében. Mint az i. ábrán bemutatjuk, a nyolc TNV mÁb egy kivételével (TNV122) hatásosan blokkolta a TXF~« pS5-reeeptorhoz tónéné kötődését. Valójában a TNV mÁb-ok hatásosabbnak látottak a TNF-a-kötödés gátlásában, mint a cÁ2 pozitív kontroll mAb, amelyet a negatív kontroli híbridóma íelülúszóbs mértünk be, Ezeket sz eredményeket úgy értelmeztük, hogy azt jelzik, hogy nagyon valószínű, hogy & TNV
-68rtsAb-ok gátolnák a IW-o, btoakrivnását sejtes alapú vizsgálati eljárásokban és út v/vo, tehát további elemzések indokoltak. öNS-szekvenehs elemzés .kanak igazolása, hogy axRNS-ek husoán mAb-nkat kódolnak
A hét, raceptorkőtési vizsgálati eljárásban TNF-CE-gátló aktivitást malsló TNV mAb (TNVÍ4,
TNV 15, TNV32, TNVSő, TNV FIS, TNV148 és TNV 196) jellemzésének első lépéseként össz-RNS-t izoláltunk az ezen mAb-okat termelő hét htbridóma ssjívonaibót Azután az egyes RNS-mmtákat alkalmaztok humán ellenanyag uohézlánc és kShnyáláne cDNS-ek előállítására, amelyek tartalmazták a teljes szigoásszekvenekk, a teljes variábilis regié szekvenciát és az állandó régió szekvenciájának egy részét mindegyik mAfe esetében. Ezeket a cDNE-termékeket azután PCR-reskeiökfcan amplifikáituk, és a PCR-rel aenpliükáli D'NS-t közvetlenül nmgszekvenáítukanélkül, hogy először a hagmessekeí megklónoztuk volna. A snegszekvenáít nehézlásc cDNS-ek >9ö%-b3S azonosak voltak a DIMó egérben jelen lévő öt csíravonal gén egyikével (2. ábra). Hasönlöképpen a ínegszekvenálf könnyőíáne cDNS-szekvendák vagy löö%-bas, vagy 98%-baa azonosak voltak az egerekben jelen lévő humán esfeavon&t gének egyikével (3. ábra). Ezek a szekvenálási eredmények megerősítették, hegy a eDNS-sé átírt és megszekvenált RNS-molekalák hnmáa ellenanyag sehézláncokaí és humán ellesauyag kösnySiáncek&í kódoltak. Meg keli jegyeznünk, hogy mivel a variábilis régiókat olyan olígonukleobdokkai ampiínkáitek a PCR-ben, amelyek a szignálszekvencia kódoló szekvenciájának az 5’ végének felelnek meg, a szignálszekveneia első néhány amlnosava nem az eredeti TNV transzlációs termék aktuális szekvenciája, hanem a rekombináns TNV mÁb-ok aktuális szekvenciáját reprezentálja.
Egyedi semlegesítő ®Afe--ok
Az egyes saAb-ok nehézlánc és kbtmytlláne teljes variábilis régióját kódoló cDNS-szekvenciák elemzése feltárta, hogy a TNV32 azonos a WV15-teI, a TNV 118 azonos a TNVlá-gyei és a TNV86 azonos a TNVHS-eal, Á rcceptörkötési vizsgálati eljárás eredményei összhangban állnak a ÖNS-szekvencsa elemesekkel, azaz a TNVSő és TNV 148 megközelítőleg 4-szer jobb, mint a TNV 118 és a TNV14 a TNFkötés gátlásában. A további munka során tehát csak a négy egyedi TNV rnAb-ra (TNVI4, TNV15, TNVÍ48 és TNV 196) koncentráltajrk.
A négy j»Ab rokonsága
A DNS-szekveneia eredmények feltárták, hogy a négy TNV mAb nehézláncát kódoló gének mindegyike erősen homológ egymással, áss ágy íünlk, hogy az összes ugyanabból a csíravonal génből, & ΌΡ46-ből származik (2. ábra). Ezenfelül mivel az -egyes; nehéziáne CDR3 szekvenciák -olyan hasonlóak ás azonos hosszúságnak, és meri mindegyük a $5 exont tartalmazza, azok látszólag egyetlen VDJ géaáriendeződési eseményből származnak, amelyet szomatikus változások követtek, amelyek az egyes mAbOkat egyedivé tették. A DNS-szek vénéin elemzések feltárták, hogy csak két különböző könnyüiásc gén volt a négy mAb között (3. ábra). A TNVI4 és TNV 15 köunytliáne variábilis régiójának kódoló szekvenciája azonos egymással, és a humán kappa láncok Vg/38K esaládájánsk egy reprezentatív csíra vonal-szekvenciájával. A TNV 148- ás TNV 196 kősnytlláne kódoló szekvenciák azonosak egymással, ás? különböznek a csíravonal szekvenciától két naklaeíid-pozicíéban (3-, ábra).
-69Á négy tnAb kikövetkeztetett amirmsav-szekvenciája feltárta az aktuális mAb-ok rokonságát, A négy tnAb különböző nehézfecokal tartalmaz (4, ábra), de csak két különböző könnyüláncot (5. ábra). A TN'V ra.A.b szekvenciák és a csiravonni szekvenciák közötti különbségek leginkább a CDR áostéaekre korlátozódtak, de a mAi> nehézláncok közlll három különbözött a csiravonal szekvenciától s vázrégiökh&n is (4. ábra). A DP-46 cshavonai által kódolt Ab vázrégíókkal összehasonlítva a TNVI4 azonos volt, a TN’V IS csak egy ammnsavban tért el, a TNVI4S csak két atójosavbsa tért el, és a TNV196 három aminosavbaa tért eh
A cDNS-ek klónozása, holyspédiskws mataganezis és a végső expresszsós pbzmidok összeállítása A eDNS~ek Ríéwása
A PCR-rel atnplífikált variábilis régiók DNS-szekvenciája alapján üi oligortukleotidokaí rendeltünk egy másik sorozat FÜR elvégzéséhez, abból a célból, hegy adaptáljak a kódoló szekvenciát, az sxpressziós vektorokba történő klónozáshoz. A nehézíáscok esetében ezen második sorozat PCK termékeit BsiWl és B'stBX restrikciós enzimekkel emésztettük és az L2S klónozó plaznsídvektorba klónoztok (a pl&zmidok azonosítószámsít a 2. táblázatban mutatjuk be). A könnyóláncok esetében a második sorozat PCR termékeit a Sáli és Átin enzimekkel emésztettük és a p&C plazmiávektatha klónoztuk. Azután «gyedl klánokat szckvenálbmk annak Igazolására, hogy a szekvenciájuk azonos a PCR-termékck közvetlen szekvenálásából kapott korábbi szekvenciákkal, ami feltárta a leggyakoribb nukleotidoí az egyes pozíciókban molekulák egy potenciálisan heterogén populációjában, ífelyspeciffims mníagenezís a TNY148 megváltoztatására
A TNVW és TNV 19ó mAb-okat következetesen 4-sz.eresen hatásosabbnak figyeltük meg, mint a kővetkező legjobb raAb-oí (TNV14) a TNF-a bioaktivitás semlegesítésében. Azonban, mint fent leírtuk, a TNV14S és TNY196 nebézláue vásréglö szekvenciák különböztek a esfctvonal vázrégíó szekvenciáktól. A TNYÍ48 nehézláne szekvencia összehasonlítása más humán ellenanyagokkal azt mutatta, hogy több más humán raAb 11« oldailáncot tartalmazott az i. vázrégiő 28, pozíciójában (csak az érett szekvenciát számítva), xníg a Pro oidaildnc a 3. vázrégió 75. pozíciójában szokatlan ammosav volt ebben a pozícióban.
A TNV196 nehézíánc hasonló összehasonlítása azí sugallta, hogy az a három ammosav, mnelyben az különbözik a cslravon&l szekvenciától a 3. vázrsgióban, Atka lehet humán mAb-okban. Lehetséges volt, hogy ezek a különbségek a. TW148-at és a TNV196-OC ímmunogénné teszik embereknek beadva. Mivel a TNV148~fean csak egy aminossv-oidullánc okozott gondot és erről az aidaiiáucről ógy hittük, hogy sem fontos & TNF«a kötésében, helyspeciFkus mutagenezis módszert alkalmaztunk egyetlen nukleotid kicserélésére a TNV14S sehézlánc kódoló szekvenciában (a pl 753 jaki ptozmidban), oly módon, hogy a csiravonal szertö otóalláncát kódolja a prolin helyett a 75. pozícióban. A kapott plazraidot pl?6ö-nak neveztük el (lásd a 2. táblázatot). A kapóit gént és rmAb-ot TNVMSS-sek neveztük el, hogy megkülönböztessük az eredeti TNV 148 géntől és mAb-íól (lásd az 5. ábrát).
Űj ellenanyag expressziéi vektorokat állítottunk elő, amelyek korábban genomiális fragmesshéní· klónozott 12375 nehézlánc és könny-aláné géneken alapultak. Habár különböző TNV expressziős piazmidokat állítottunk elő (lásd a 2, táblázatot), minden esetben az 5' szegélyező szekvenciák, a promóter és az. bírón enhanccr a megfelelő I2B7S génekből származóit. Azon könnyülánc expressziős plaznudok esetében a teljes
-7öJ-C ioíron, az állandó régió kódoló szekvenciája és a 3r szegélyező szekvencia is a 12875 könnyálátic génből származott. A nebézlánc expresszlós plazmidok esetében, amelyek a végsó termelő sejtvwaiakat eredményezték (p 178! és pl'783, lásd alább), a humán IgGi állandó régiót kódoló szekvenciák a Centocor korábban alkalmazott expressziős vektorából (plÖ4) származtak, Fontos, hogy & leírásban Ismerteted végső termelő sejtvonalak az eredeti, hibridóma-eredetű TNV mAb-októl (Gltnízjj eltérő allotípüsú TNV mAb expresszáluak (Gm(N·}]. Ez azért vart, mert a GenPharm egérből származó 12875 nehéziánc gén egy Arg oldallánsot kódol a CH1 dómén Crtermtsális végén, míg a Centocor p!04 IgGl expressziős vektora Lys oldalláncot kódol ebben a pozícióban. Egyéb nehézlánc expresszibe piazmidnkat (például a pl78b és p 178S) is eíőáliitöthmk, amelyekben a J-C bkon, a teljes állandó régiót kódoló szekvencia és a 3’ szegélyezd szekvencia a 12B75 nehézlánc génből származott, de az ezekkel a génekkel iranszíektáit sejtvonalakat nem választottak ki termelő sejívenalakkést. A vektorokat gondosan úgy terveztük, hogy lehetővé tegyék később PCR-rel ampliftkálí V-régiek egylépéses klónozását, ami végső expresszlós piazmidokat eredményezne,
PCR-rei ampiitikáit variábilis régió cDNS-eket vittünk át az L28 vagy pBC vektorból köztes, 12B75ön alapuló vektorokba, amelyek a promőter régiót és a J-C iníron egy részét biztosították (lásd a 2, táblázatot a plazmidok azímosítószámalért), Azután az ellenanyag gének 5’ felét tartalmazó restrikciós fragraenseket vittünk át ezekből a köztes vektorokból a végső expresszlós vektorokba, amelyek tartalmazták a megfelelő· gének 3’ felét, kialakítva a végső expresszlós plazmidokaí (lásd a 2, táblázatot a plazmidok azofiositőszámaiért).
Sejtek transzfektálása és szubklónozás
Az expresszlós piazmidokat vagy linesrszálíuk restrikciós emésztéssel, vagy megtisztítottuk az egyes plazmidok ellenanyag gén Inzertjeit a plazmidok gerincétől. Sp2/Q és ő53-as egér mlelőma sejteket trasszföktáltnnk a nehézlánc és kőnnyűlánc DNS-sel etektroporáció alkalmazásával. Tizenöt különböző transzfekciót végeztünk, amelyek többsége egyedi volt, az Ab alapján, az Ab gének specifikus jellegzetességei alapján, vagy az alapján, hogy a gének imearizált teljes plazmidok vagy tisztított gén inzertek voltak, és a gazda-sejtvonal alapján (összefoglalva a 3. táblázatban). Mikofenoisavra rezisztens kiónok sejtjeinek feiüiószóit vizsgáltuk humán ígG jelenlétére ELlSA-val, és meghatároztuk a mennyiségét tisztított rTNVldSS referencia stetdard görbeként történő alkalmazásával,
A legjobban termelő rTNV1488 sejtvonalak
A 2. rTNV?.48B transzfektálásbói származó tiz legjobban termelő (5-1Ö pg/ml-t termeltek kimerült 24-mérShelyes tenyészetekben) 653-as szülőt sejtvonslaí szubklőnoztuk a legjobban termelő sejtvonalak szkrlnelésére és homogénebb sejtpopuláció előállítására. A 2.320 szülői vonal két szubklónja, a 2.320-17 és a 2.320-2Ö megközelítőleg 50 pg/ml-t termeit kimerült 24-méröhelyes tenyészetekben, ami S-szőrős növekedés volt a szülői vonalukhoz képest, A 2320-17 és 2.320-20 szubklönozásának második menete vezetett.
3. Táblázat A sejtek trasszfektálásáuak összefoglalása. Az egyes mAh-okat kódoló nehézlánc és körtítyülánc plazmidok azonosttószámaít mutatjuk be. A tisztított mAb génmzsriskkel végzett íranszlektálások esetében a pl 3 plazmidót (pSV2gpt) alkalmaztuk a gp? szelektálható marker forrásaként. A nehéziánc állandó régiókat vagy a Rerrdcade-ot kódoló humán ígjGl expressziős vektorral azonosan kódoltak f old’), vagy a 12875-heu (Get;Pharm/'Medarex) található áltendó régió oehéziáüc génnel fnew’), H1/L2 alatt a. TNVI4 nebézlóncból és « TNV 148 könnyűláncből álló „új” mAb-ot értjük. A plW és pl8ÖI plazmidok csak annyiban különbőznek, hogy a ,1-C insres mekkora részét tartalmazzák a nehézlánc génjükben. A traaszfekclók számát mutatjuk a jobb oldalon, ami meghatározza a sejtklónok általános nevének az első -számát Az. rTNVI4SB-t termelő itt bemutatott C46§ (A, S, C, í>) és C467A sejtvonalak sorrendben a 2. és az 1, transzfekelőból származnak Az rTNV 14-t termeté C476A sejtvonal a 3. transzfekcióbél származik.
Plazmldok Trasszfekciá szánts
83Áb HC/LC/gpt HC vekto r DNS formátum Sp2/Ő 653
rTNV 1488 3783/1770 old lineáris 1 2
rTNVl4 1781/1775 old lineáris 3
rTNV 14 3,27-1 C476A Sp2/Ö 19 ug/mi
A szubkiónozott sejtvonslsk jellemzése
A sejtvonaiak növekedési jellegzetességeinek gondosabb jellemzéséhez és a mAb-termelés szintjének nagyobb mennyiségben való meghatározásához növekedési görbe vizsgálatokat hajtottunk végre T75tenyészeíekkek Az eredmények azt mutatták, hogy a négy C466 sorozatba tartozó sejtvonal csúcs ssjtsürűséget éri el l,Ö X íö* és 1,25 X l©4 sejhtnl között, és maximális mAb felhalmozódás! szintet 110 és 140 ug/ml között (7. ábra). Ezzel szemben a legjobban termelő Sp2/Ö szubkión, & C4Ő7A csúcs sejtsüröséget ért el 2,0 X 10á sejvml-nél, és maximális mAb felhalmozódást szintet 25 gg/ml-üél (7. ábra). Nem végeztünk növekedést görbe elemzést a r'FNVl 4-t termelő C476A sejtvonafon.
Egy további növekedési görbe elemzést végeztünk a növekedési sebességek összehasonlítására. MHX szelekció különböző koncentrációi mellett. Ezt az összehasonlítást az az újabb megfigyelés indokolta, hogy az MHX hiányában tenyésztett C4őó sejtek látszólag gyorsabban növekedtek, mint ugyanazok a sejtek normális mennyiségű MHX (IX) jelenlétében. Mivel az olyan vegyületek, mint a ntikofenoisav citotoxikus koncentrációját több nagyságrenden keresztül szokták mérni, azt tételeztük fel, hogy MHX alacsonyabb koncentrációja szignífikáusan gyorsabb sejtkettózödésí időket eredményez a mAb-íennelés stabilitásának a feláldozása nélkül. A C4ŐÓA és C466B sejtvonalakat az alábbi körülmények között tenyésztettük: MHX nélkül, Ö.2X MHX-ben vagy IX MHX-bea, Mértük az éló sejtek szántát 24 órás időközönként S napon keresztül. Az eredmények a sejtnövekedés MHX-kortccuíráció-fúggő sebességét tárták fel (S. ábra), A O4döA sejtvonal 25,0 órás megkettőződést időt matatott IX MHX-ben, de csak 20,7' órát MHX nélkül. Hasonlóképpen, a C4őóS sejtvonal 32,4 órás megkettözödésí időt mutatott IX MHX-ben, de csak 22,9 órát 'MfíX nélkül. Fontos megjegyezni, hogy mindkét sejtvonal megkettőződést Ideje Ö,2X MHX-bsn jobban hasonlított az MHX nélkül rnegfigyelthez, mint az IX MHX-bett rnegfigyelthez (8. ábra). Ez a megfigyelés felveti azt a lehetőséget, hogy bíorenktorokban - amelyekben a megkettőződés! idő fontos paraméter - sejtek fokozott teljesítménye érhető el kevesebb M.HX alkalmazásával. Azonban - habár a stabilitási eredmények (lásd alább) azt mutatják, hogy a C466D sejtvonal képes stabilan termelni .rTNVi48B4 legalább óő rumon keresztül még MHX. jelenléte nélkül Is -a stabilitási eredmények magasabb mAb-termciési szinteket mutattak akkor, amikor a sejteket MBX jelenlétében tenyésztettük, összehasonlítva az MHX hiányával.
A mÁb-íermelés értékelésére különböző sejtvonalakbaa őö napos időszakon keresztül stabilitási teszteket végeztünk olyan tenyészeteké·?, amely vagy tartalmaztak, vagy sem MHX szelekciót, Nem minden sejtvonal tartott fenn magas -mAb-tenneiést Csak két heti tenyésztés után a C466A klón megközelítőleg 4S%kai kevesebbet termeik mint a vizsgálat jnegkezdésekor. Úgy tűnt, hogy a C46B klón termelése Is szignifikánsan csökken. Azonban a C466C és C4óőD kiónok viszonylag stabil termelést tartottak tcns?, és a C4Ó6D mutatta a legmagasabb abszolút termelést szintet (9. ábra).
Konklúzió
A humán TNF-« elleni hrnán mAh-ok kezdeti nyolcas paneljából a TNV148I3-Í, valamint a TW4et választottak kí mint előnyöset olyan krítériwmok alapján, amelyek magokban foglalták a fehérje szekvenciáját és a TNF-semlegesitö képességet. Olyan sejtvösalakat állítottunk elő, amelyek több mint 108 ugÁnl fl'NV148B-t és 19 pgónl rTNV 14-et tennetoek.
4» példa: Artritlszes egerek asti-TNF ellenanyagokat és kontrollokat alkalmazó vizsgálata egyszeri betesz injekció alkalmazásával
Megközelítőleg 4 hetes tóban a vizsgálati Tg 197 egereket 9 kezelési csoport egyikébe osztottuk be a nemük és testtömegük alapján, és Dulbeeco-féle PBS (D-FBS) vagy találmány szerinti tsnti-TNF ellenanyag (TNV14, TbiV148 vagy TNV 196) egyetlen inhaperitosális bólnsz dózisával kezeltük vagy 1 mgZkg, vagy- IQ sng/kg dózisban.
Bredméayek>. Amikor a tömegeket elemeztük a dózis előttihez mért változásra, a 5 Ö mg/kg cA2-vel kezelt állatok az egész vizsgálatban következetesen nagyobb tőmeggyarapodást mutattak, mint & D-PBS-sel kezelt állatok. Ez a tömeggyarapodás szignifikáns volt a 3-7. héten, A 10 mglkg TNVl48~cal kezelt állatok szintén szignifikáns tömeggyarapodást matattak a vizsgálat 7. hetében (lásd az 18, ábrát).
A IIA-HC, ábrákon a betegség súlyosságának az előrehaladását mutatlak he az ariritiszes Index alapján. A. lö mg/kg eA2-vel kezelt csoport ariritiszes indexe alacsonyabb volt a 3. bértől kezdve a vizsgálat hátralévő részében (a 7. hétig), mint a D-PBS kontroll csoporté. Az 1 mg/fcg TNV 14-gyel kezelt állatok és az 1 mg/kg eA2~vd kezeit állatok nem matatták az AI szignifikáns csökkenését a 3, hét után, mikor összehasonlítottuk azokat a D-PSS-seí kezelt csoporttal. Nem volt szignifikáns különbség a 10 jngtkg-os kezelést csoportok között, amikor azokat a hasonló dózist kapott csoportokhoz hasonlitoflnk (lö rag/kg cA2 összehasonlítva a 10 mg/kg TNVt4-gyel, 148-cal és 19ő-tal). Amikor az 1 mg/kg-os kezelési csoportokat hasonlítottak össze, az 1 rag/kg TNV 148 csoport szignifikánsan alacsonyabb Al-t mutatott a 3., 4. és 7. héten, mint az 1 mg/kg cA2. Az 1 mg/kg TNV 148 csoport szintén szigsílikánsan alacsonyabb volt a 3, és 4. héten, intet az 1 mg/kg TNV14-gyei kezelt csoport. Habár a TNVíSŐ szignifikáns csökkenést mutatott az. Aí-ben a vizsgálat ö, hetéig (a D-PBS-sel kezelt csoporttal összehasonlítva), a TNV148 volt az egyetlen 1 mg/kg-os kezelés, amely szignifikáns maradta vizsgálat befejezésekor.
S, példa: Árfrittszes egerek antl-TNP ellenanyagokat és koatroilókat alkalmazó vizsgálata többszőrt bótesz dózisokkal
Megközelítőleg 4 hetes korban a vizsgálat? Tg 197 egereket 8 kezelési csoport egyikébe osztották be a testtöjnegük alapján, és kontroll anyag (D-FBS) vagy ellenanyag (TNV 14, TNV 148) i;?traperítonáhs bótesz dózisával kezeltük 3 mg/kg dózisban (Ö. hét). Az injekciókat minden állatnál megismételtük az 1., 2., 3. és 4, héten. Az l-δ. csoportot értékeltük a tesztasyag hatásosságára. Szérumrniníákat vettSsk a- 7. és 8. csoport állataitól, és értékeltük azokat, immunválasz indukáiására és a TNV 14 vagy 'TNV 14 8 farmakokínetikal kiürülésére a 2„ 3. és 4. héten.
Eredmények: Nem figyeltünk meg szigplfikáns különbségeket, amikor a tömegeket elemeztük a dózisok előtti állapothoz mért változásra, A 10 mg/kg cA2-vel kezelt állatok az egész vizsgálat folyamán következetesen magasabb tömeggyarspndást mutattok, mint a D-PBS-sel kezelt állatok (lásd az 12. ábrát).
A 13A-13C, ábrákon a betegség súlyosságának az előrehaladását muraijuk be az zrtritíszes htdex alapján. A 10 mg/kg oA2-vel kezelt csoport artrtítszes indexe szignifikánsan alacsonyabb volt a 2, héttői kezdve a vizsgálat hátralévő részében (az 5, hétig), mint a D-PBS kontroll csoporté. Az I mg/kg vagy 3 mg/kg cA2-vel kezeit állatok és a 3 mg/kg TNYl 4-vel kezeli állatok a vizsgálat folyamán senunlkor sem érték el az Aí szignifikáns csökkenéséi, amikor összehasonlítottuk szokat a D-FBS-sei kezeli kontroll csoporttal, A 3 mg/kg TNV 148-cal kezelt állatok szignifikáns csökkenést mutattak a 3. bértől kezdve az 5. hétig, összefeasöaKtva a D-PHS-sel kezelt csoporttal. A 10 mg/kg cA2-vel kezelt állatok az ΑΪ szignifikáns csökkenését mutatták összehasonlítva a cA2 mindkét alacsonyabb dózisával (1 mg/kg és 3 mg/kg) & vizsgálat 4, és ,5. hetében, és az AI szintén szignifikánsan alacsonyabb volt, mist a TNV14-gyei kezelt állatoké a 3-5. héten. Habár sem látszott szignifikáns különbség egyik 3 mg/kg-os kezelési csoport között sem, a 3 mg/kg TNV14-gyel kezeit állatok Al-je bizonyos időpontokba® szignifikánsan magasabb volt, mint s lö mg'kg-gal kezeiteké, míg a TNViAít-e&i kezelt állatok ne® különböztek szignifikánsan a 10 mg/kg e.A2-vel kezelt altotoktól.
6. példát Artrfttes egerek sntl-TNF eilesasyagokaí és keatroítokat alkalmazó vizsgálata egyszeri miraperitoaeáfis hólösz dózissal
Megközelítőleg 4 hetes korba® a vizsgálati Tgl§? egereket .6 kezelési csoport egyikébe osztottuk be a nemük és testtömegük alapján, és ellenanyag (cA2 vagy TNV148) egyetlen iniraperáonális bólusz dózisával kezeltük vagy 3 mg/kg, vagy 5 mg/kg dózisban. Ebben a vizsgálatban D-PSS és .10 mg/kg eA2 koaírofi csoportokat alkalmaztunk.
Amikor a tömegeket a dózis előtti állapothoz hasonlítva elemeztök, sz- összes kezelés hasonló tSmeggyampoáást eredményezed. A 3 vagy 5 mg/kg TNVlAS-ve&i vagy 5 mg/kg cA2-vel kezelt állatok szignifikáns mértékű tőmeggyampodást értek el a vizsgálat korai szakaszában (a 2. és 3, héten). 'Csak a TNV 148-eaí kezelt állatok tartották fenn a szignifikáns tSmesgyarapodásí a későbbi időpontokban. Mind a 3, mind as 5 mg/kg TNV148-cal kezelt állatok szignifikancláí mutattak a.'7. héten, és a 3 mg/kg TNV148«cal kezelt állatok még mindig szlgsi fácfesan emelkedeltek voltak 8 héttel az injekciót követben (lásd a 14, ábrát).
A 15. ábrán a betegség súlyosságának az előrehaladását mutatjuk be az artritiszes index stopjárt. Az összes kezelési csoport mutatótt vstotnekkora védelmet a korábbi időpontokban, az 5 mg/kg cA2 ás az 5 mg/kg TNV148 az Aí szignifikáns csökkenését mutatta sz í-3, héten, és az összes kezelési csoport szignifikáns csökkenést mötatotf. a 2, héten. A vizsgálat későbbi szakaszában az 5 mg/kg cA2-vei kezelt állatok mutattak valamekkora védelmet, szignifikáns csökkenéssel á 4., 6. és 7. héten. Az alacsony dózisú (3 mg/kg) eA2 és TNV 148 szignifikáns csökkenést mutatott a ő. héten, és az összes kezelési csoport szignifikáns csökkenést mutatott a 7. héten, Az egyik kezelési csoport sem volt képes szignifikáns csökkenést fenntartani a vizsgálat végéig (8,. hét). Nem volt szignifikáns kSlöubség egyik kezelési csoport között sem, egyik időpontban sem (ki véve a sóoláatos kontroll csoportot).
- 74 7. példa; Ártrítíszes egerek aatl»TN.F ellenanyagokat és· kontrnllokst alkalmazó vizsgálata egyszeri itóraperífonsáhs bóhtsz dózissal antí-TNF ellenanyag és módosított astí-TNF ellenanyag alkalmazásával
A TNV14S (hibridtea sejt eredetű) és rTNV14SB (transzfektálí sejt. eredetű) egyetlen iríír&perrtöneáils dózisa hatásosságának összehasonlítása. Megközelítőleg 4 hetes korban a vizsgálati Tg 197 egereket 9 kezelési csoport egyikébe ösztönük be a nemük és testtömegük alapján, és Dulbecco-féle PBS (DP.BS) vagy ellenanyag (TNV 148, rTNVlASB) egyetlen intraperítoneábs bolusz dózisával kezeltük I mg/kg dózisbai?.
Amikor a tömegeket elemeztük a dózis előttihez mért változásra, a lö mg/kg cA2~vei kezeit állatok az egész vizsgálatban következetesen nagyobb tömsggysrapodsst mutattak, mint a D-PBS-sei kezeit állatok. Ez a tömeggyarapodás szignifikáns volt az 1. és a 3-8. héten. Az 1 mg/kg TNVI48-csl kezelt állatok szintén szignifikáns tömeggyarapodást mutattak a vizsgálat 5,, 6. és 8. hetében (lásd az 16. ábrát).
A 17. ábra® a betegség súlyosságéinak az előrehaladását mutatjuk be az artrítbzes index alapján. A 10 mg/kg cA2-vel kezelt csoport artrltiszes indexe alacsonyabb volt a 4, héttől kezdve a vizsgálat hátralévő részében (a 8. hétig), mint a D-P8S kontroll csoporté. Mind a TNV148~cal kezeit csoportok, mind az 1 mg/kg cA2>vel kezelt csoport az Ál szignifikáns csökkenését matatta a 4. héten. Habár korábbi vizsgálatok (P-Q99017) azt mutatták, hogy a TNV 148 kissé hatásosabb az artritiszes index csökkentésére egyetlen 1 mg/kg intraperitoneális bóíusz beadását követően, ez a vizsgálat azt mutatta, hogy az Aí a TNV ellenanyag mindkét változatával kezelt csoportban kissé magasabb volt. Habár az. I mg/kg cA2-vei kezelt csoportban nem volt szignifikáns növekedés (a 6, hét kivételével), összehasonlítva a 10 mg/kg cÁ2~vel kezelt csoporttal és a TNV14$«eal kezeit csoportokkal szignifikánsan tnagasabbak voltak a 7.és 8. héten, nem volt szignifikáns különbség az Al-btsn az 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg .TNV 148 és 3 mg/kg TNV 148B csoportok között a vizsgálat egyetlen pontján sem.
Nyilvánvaló, hogy a ínláknányí másképpen is gyakorlatba lehet venni, mist ahogyan azt részletesen feltártuk a fend leírásban és példákban.
A találmány számos módosítása és variációja lehetséges a fenti kitanítás fényében, és ezek a csatolt Ígénypontök oltalmi körébe esnek.

Claims (7)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Ellenanyag. amely tartalmazza:
    a TN V14S monoklonalis ellenanyag nehóziánc komplementaritást maghatározó régióit (CDR) és variábilis vázregióií (FR), amint a 4. ábra bemutatja; és a TNV14& monóklenálís ellenanyag könny öláne CDR-jeií és variábilis FR-jen, amint az 5 , ábra bemutatja;
    ás amely adott esetben továbbá tartalmazza a megadott proib-szerin szubsztitúciót a TNV148B monnkkmális ellenanyag FR3 régiójában, amist a 4, ábra bemutatja.
  2. 2. Az 1, igénypont szerinti ellenanyag, ahol az ellenanyag & 4. és 5, ábrán bemutatott TNV148 tnonoklön&iís ellenanyag és TW148B snoanklonáiis ellenanyag egyikének nehéz- és kőnayöláae variábilis régióit tartalmazza.
  3. 3. izolált nukleíusav-mosefeiia, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot kódoló polmukleotidöt tartalmaz.
  4. 4. Rekombinúns vektor, amely 3. igénypont szerinti nukleisssv-möiekulót tartalmaz,
  5. 5. Gazdasejt, amely .3, igénypont szerisíi nukleinsav-meiekalát vagy 4, igíaypoat szerinti vektort tartalmaz.
    S. Xésriímésy, amely 1, vagy 2. igénypont szerinti ellenanyagot és győgyászatílsg elfogadható hordozót vagy oldószert tartalmaz;
  6. 7. Az L vagy 2. igénypont szerinti ellenanyag vagy a ó, igénypont szerinti készítmény, diagnózisban vagy terápiában való alkalmazásra.
  7. 8. A 7. igénypont szerinti ellenanyag vagy készítmény, immunológiai betegség kezelésében történő alkalmazásra.
HU0302376A 2000-08-07 2001-08-07 Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses HU229523B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUS1400015C HUS1400015I1 (hu) 2000-08-07 2014-03-17 Anti-TNF ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22336000P 2000-08-07 2000-08-07
US23682600P 2000-09-29 2000-09-29
US09/920,137 US7250165B2 (en) 2000-08-07 2001-08-01 Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses
PCT/US2001/024785 WO2002012502A2 (en) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0302376A2 HUP0302376A2 (hu) 2003-10-28
HUP0302376A3 HUP0302376A3 (en) 2012-09-28
HU229523B1 true HU229523B1 (en) 2014-01-28

Family

ID=40673117

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302376A HU229523B1 (en) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
HUS1400015C HUS1400015I1 (hu) 2000-08-07 2014-03-17 Anti-TNF ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS1400015C HUS1400015I1 (hu) 2000-08-07 2014-03-17 Anti-TNF ellenanyagok, készítmények, eljárások és alkalmazások

Country Status (33)

Country Link
US (3) US7250165B2 (hu)
EP (4) EP2330129B1 (hu)
JP (7) JP4748920B2 (hu)
KR (1) KR100883078B1 (hu)
CN (2) CN1468308B (hu)
AT (1) ATE446367T1 (hu)
AU (2) AU2001279227B2 (hu)
BE (1) BE2010C014I2 (hu)
BR (1) BRPI0113110C8 (hu)
CA (1) CA2419205C (hu)
CY (7) CY1109618T1 (hu)
DE (2) DE122010000010I1 (hu)
DK (4) DK1309691T3 (hu)
EA (2) EA007005B1 (hu)
ES (4) ES2331602T3 (hu)
FR (1) FR10C0014I2 (hu)
HK (2) HK1052948B (hu)
HR (1) HRP20030089B1 (hu)
HU (2) HU229523B1 (hu)
IL (3) IL154327A0 (hu)
LT (5) LT3118318T (hu)
LU (3) LU91663I2 (hu)
ME (1) ME00314B (hu)
MX (1) MXPA03001231A (hu)
MY (2) MY157289A (hu)
NO (3) NO333378B1 (hu)
NZ (2) NZ562811A (hu)
PL (1) PL206833B1 (hu)
PT (4) PT1309691E (hu)
RS (1) RS50858B (hu)
SI (4) SI1309691T1 (hu)
UA (1) UA81743C2 (hu)
WO (1) WO2002012502A2 (hu)

Families Citing this family (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
CN103275221B (zh) 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US6709655B2 (en) 2001-02-28 2004-03-23 Instituto Bioclon, S.A. De C.V. Pharmaceutical composition of F(ab1)2 antibody fragments and a process for the preparation thereof
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
TWI334439B (en) * 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
EP1448602B1 (en) * 2001-11-12 2010-05-26 MERCK PATENT GmbH Modified anti-tnf alpha antibody
EP1585477A4 (en) * 2001-11-30 2007-06-27 Centocor Inc ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
EP1521776A2 (en) 2002-07-04 2005-04-13 Oncomab Gmbh Neoplasm specific antibodies and uses thereof
CN102755646A (zh) * 2002-07-19 2012-10-31 艾博特生物技术有限公司 TNF α相关疾病的治疗
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
EP2316852B1 (en) 2002-11-08 2014-03-05 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
US7335759B2 (en) * 2002-12-02 2008-02-26 Universidad Nacional Autónoma de Méxica (UNAM) Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
ES2339236T3 (es) * 2003-07-25 2010-05-18 Laboratorios Silanes, S.A. De C.V. Administracion de fragmentos de anticuerpo f(ab')2 anti-tnf-alfa.
EP1660533A4 (en) * 2003-09-12 2009-10-21 Univ California SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES MADE FROM PROTEINS OF DIFFERENT SEQUENCES FOR HIGHLY MOLECULAR AGGREGATIVE INTERMEDIATE PRODUCTS OF AMYLOIDS
CN1328379C (zh) * 2003-11-13 2007-07-25 中国人民解放军第四军医大学 高亲和力抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因
EP1531162A1 (en) 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
PL1766093T3 (pl) * 2004-02-06 2011-11-30 Univ Massachusetts Przeciwciała przeciw toksynom Clostridium difficile i ich zastosowania
TWI439284B (zh) * 2004-04-09 2014-06-01 Abbvie Biotechnology Ltd 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
GB0414054D0 (en) 2004-06-23 2004-07-28 Owen Mumford Ltd Improvements relating to automatic injection devices
WO2006039638A2 (en) * 2004-09-30 2006-04-13 Centocor, Inc. Treating renal cell carcinoma with an anti-tnf human antibody or fragment
US20060083741A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Hoffman Rebecca S Treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infection
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
US7736650B2 (en) * 2004-12-21 2010-06-15 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibody based vectors, host cells, and methods of production and uses
US7381802B2 (en) * 2005-04-15 2008-06-03 Universidad Nacional Autónoma De México (UNAM) Human antibodies that specifically recognize the toxin Cn2 from Centruroides noxius scorpion venom
KR101465456B1 (ko) 2005-05-16 2014-11-27 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 미란성 다발관절염의 치료를 위한 ｔｎｆ 억제제의 용도
US20070041905A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
JP2009508476A (ja) 2005-08-31 2009-03-05 セントカー・インコーポレーテツド 高められたエフェクター機能をもつ抗体定常領域の製造用の宿主細胞株
TWI424161B (zh) 2005-11-01 2014-01-21 Abbvie Biotechnology Ltd 利用生物標記診斷關節黏連脊椎炎之方法及組合物
EP3088410A3 (en) * 2006-04-05 2016-12-28 AbbVie Biotechnology Ltd Antibody purification
EP2666478A3 (en) 2006-04-10 2014-10-22 AbbVie Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriasis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
EP2012586A4 (en) 2006-04-10 2010-08-18 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ANKYLOSANTE SPONDYLARTHRITIS
CA2564435A1 (en) 2006-04-10 2007-10-10 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for monitoring and treating intestinal disorders
US20080118496A1 (en) * 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
EP2666472A3 (en) 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US20090317399A1 (en) * 2006-04-10 2009-12-24 Pollack Paul F Uses and compositions for treatment of CROHN'S disease
EP2010214A4 (en) * 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS
EP2010213A4 (en) * 2006-04-10 2010-08-11 Abbott Biotech Ltd USE AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF JUVENIL RHEUMATOID ARTHRITIS
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
US20100021451A1 (en) * 2006-06-08 2010-01-28 Wong Robert L Uses and compositions for treatment of ankylosing spondylitis
EP2043711A4 (en) 2006-06-30 2017-08-30 AbbVie Biotechnology Ltd Automatic injection device
SG174804A1 (hu) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
EP2684895A1 (en) 2006-10-27 2014-01-15 AbbVie Biotechnology Ltd Crystalline anti-hTNFalpha antibodies
WO2008092084A2 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Centocor, Inc. Injectable non-aqueous suspension with high concentration of therapeutic agent
RU2009141592A (ru) * 2007-04-11 2011-05-20 Алькон Рисерч, Лтд. (Us) ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРА TNFα В СОЧЕТАНИИ С АНТИГИСТАМИННЫМ СРЕДСТВОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО РИНИТА И АЛЛЕРГИЧЕСКОГО КОНЪЮНКТИВИТА
EP2165194A4 (en) 2007-05-31 2010-09-08 Abbott Lab BIOMARKERS FOR PREDICTING RESPONSABILITY TO TNF ALPHA INHIBITORS IN AUTOIMMUNE DISEASES
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
CN101848733A (zh) * 2007-07-13 2010-09-29 艾博特生物技术有限公司 用于肺部给予TNFα抑制剂的方法和组合物
MX2010001488A (es) 2007-08-08 2010-03-01 Abbott Lab Composiciones y metodos para cristalizar anticuerpos.
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
KR20190045414A (ko) * 2007-11-30 2019-05-02 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 단백질 제형 및 이의 제조방법
WO2009090189A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Abbott Gmbh & Co.Kg Powdered protein compositions and methods of making same
JP2011517672A (ja) * 2008-03-24 2011-06-16 アボツト・バイオテクノロジー・リミテツド 骨損失を治療するための方法及び組成物
US11969501B2 (en) 2008-04-21 2024-04-30 Dompé Farmaceutici S.P.A. Auris formulations for treating otic diseases and conditions
MX2010011545A (es) 2008-04-21 2011-04-11 Otonomy Inc Formulaciones para tratar enfermedades y afecciones del oido.
JP2011524741A (ja) * 2008-05-27 2011-09-08 協和発酵キリン株式会社 インターロイキン１０受容体（ｉｌ−１０ｒ）抗体及び使用方法
RU2652907C2 (ru) * 2008-06-25 2018-05-03 ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела
CN102164958A (zh) 2008-06-25 2011-08-24 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化
US8784870B2 (en) * 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
CA2731769C (en) 2008-07-21 2013-09-10 Otonomy, Inc. Controlled-release otic structure modulating and innate immune system modulating compositions and methods for the treatment of otic disorders
BRPI0923806A2 (pt) 2008-12-30 2015-07-14 Centocor Ortho Biotech Inc Marcadores séricos para previsão da resposta clínica a anticorpos anti-tnfa em pacientes com espondilite anquilosante
WO2010127146A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Abbott Biotechnology Ltd Automatic injection device
CN102458469B (zh) * 2009-05-04 2014-12-24 艾伯维生物技术有限公司 人抗TNF-α抗体的稳定高蛋白质浓度制剂
JP2012526840A (ja) * 2009-05-13 2012-11-01 プロテイン デリヴァリー ソリューションズ エルエルシー 膜貫通送達のための製剤系
BR112012007091A2 (pt) * 2009-10-01 2016-04-19 Alcon Res Ltd composições de olopatadina e seus usos
CN104634955B (zh) * 2009-10-26 2016-09-14 雀巢产品技术援助有限公司 检测抗-tnf药物和自身抗体的试验
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011056644A2 (en) 2009-10-28 2011-05-12 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-glp-1r antibodies and their uses
US20110150891A1 (en) 2009-12-16 2011-06-23 Philip Bosch Methods of Treating Interstitial Cystitis
CL2010000019A1 (es) * 2010-01-11 2010-06-11 Univ Chile Anticuerpo monoclonal contra el tnf humano y sus fragmentos, secuencias nucleotidicas que lo codifican, vector de expresion y celulas que las contienen, composiciones y kit que comprenden el anticuerpo, uso de los mismos y metodo para su obtencion.
WO2011097301A2 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Abbott Biotechnology Ltd. METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREDICTING RESPONSIVENESS TO TREATMENT WITH TNF-α INHIBITOR
WO2011095174A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Aarhus Universitet Human herpes virus 6 and 7 u20 polypeptide and polynucleotides for use as a medicament or diagnosticum
CN102167741B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
US9072668B2 (en) 2010-03-09 2015-07-07 Janssen Biotech, Inc. Non-aqueous high concentration reduced viscosity suspension formulations of antibodies
US20110223208A1 (en) * 2010-03-09 2011-09-15 Beth Hill Non-Aqueous High Concentration Reduced Viscosity Suspension Formulations
JP5809242B2 (ja) 2010-04-21 2015-11-10 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド 治療薬の制御送達のための装着型自動注入装置
WO2011146727A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Philip Bosch Methods of treating interstitial cystitis
HUE039740T2 (hu) 2010-06-03 2019-01-28 Abbvie Biotechnology Ltd Alkalmazások és készítmények hidradenitis suppurativa (HS) kezelésére
CN103298834A (zh) 2010-08-03 2013-09-11 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
NZ609469A (en) * 2010-11-11 2015-02-27 Abbvie Biotechnology Ltd Improved high concentration anti-tnfα antibody liquid formulations
EP2490024A1 (en) 2010-12-22 2012-08-22 Proteomika, S.L. Method to optimize the treatment of patients with biological drugs
EP2471554A1 (en) * 2010-12-28 2012-07-04 Hexal AG Pharmaceutical formulation comprising a biopharmaceutical drug
EP2667918B1 (en) 2011-01-24 2017-03-01 AbbVie Biotechnology Ltd Automatic injection devices having overmolded gripping surfaces
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
WO2012129174A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Abbott Laboratories Systems. devices and methods for assembling automatic injection devices and sub-asseblies thereof
WO2012135524A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Abbott Laboratories Improved shroud deployment in automatic injection devices
WO2012145752A2 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Abbott Laboratories Wearable automatic injection device for controlled administration of therapeutic agents
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
CA2883272A1 (en) 2012-09-02 2014-03-06 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
ES2784861T3 (es) 2012-09-07 2020-10-01 Coherus Biosciences Inc Formulaciones acuosas estables de adalimumab
SI2897978T1 (sl) * 2012-09-19 2017-05-31 Abbvie Biotherapeutics Inc. Postopki za identifikacijo protiteles z zmanjšano imunogenostjo
RU2636043C2 (ru) 2012-11-01 2017-11-17 Эббви Инк. Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения
BR112015021708A2 (pt) 2013-03-06 2017-08-29 Protalix Ltd Inibidor de polipetídeo do tnfa, polinucleotídeo isolado, estrutura de expressão de ácido nucleico, célula de planta, composição farmacêutica e método de produção de um inibidor de polipeptídeo do tnfa
CA2902727C (en) * 2013-03-06 2020-08-18 Protalix Ltd. Use of plant cells expressing a tnfalpha polypeptide inhibitor in therapy
CA2905010A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
AU2014227732A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17
PL2970980T3 (pl) 2013-03-15 2019-01-31 Janssen Biotech, Inc Sposoby wytwarzania kontrolujące zawartość C-końcowej lizyny, galaktozy i kwasu sjalowego w rekombinowanych białkach
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
JPWO2015083765A1 (ja) * 2013-12-04 2017-03-16 国立大学法人大阪大学 生物学的製剤による関節リウマチの治療効果を予測判定する方法
CN106535889A (zh) 2014-02-10 2017-03-22 帕塔拉制药有限责任公司 用于治疗肺疾病的肥大细胞稳定剂
CN106456595A (zh) 2014-02-10 2017-02-22 帕塔拉制药有限责任公司 用于系统性病症的肥大细胞稳定剂治疗
WO2015198320A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of purifying antibodies
TWI711629B (zh) 2014-09-03 2020-12-01 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途
US10000551B2 (en) 2014-09-11 2018-06-19 Protalix Ltd. Chimeric polypeptides, polynucleotides encoding same, cells expressing same and methods of producing same
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
KR102622281B1 (ko) 2015-03-31 2024-01-08 소리소 파마슈티컬스 인크. 폴리펩티드
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US10265296B2 (en) 2015-08-07 2019-04-23 Respivant Sciences Gmbh Methods for the treatment of systemic disorders treatable with mast cell stabilizers, including mast cell related disorders
WO2017027387A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Patara Pharma, LLC Methods for the treatment of mast cell related disorders with mast cell stabilizers
US11229702B1 (en) 2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
MA46681A (fr) * 2016-01-28 2019-09-11 Janssen Biotech Inc Anticorps bispécifiques anti-tnf-alpha/il-17a antibodies et anticorps anti-tnf-alpha et leurs procédés d'utilisation
US10465003B2 (en) 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
EP3440113A1 (en) 2016-04-08 2019-02-13 Gilead Sciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases
US11071782B2 (en) 2016-04-20 2021-07-27 Coherus Biosciences, Inc. Method of filling a container with no headspace
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
CN109689027A (zh) 2016-06-29 2019-04-26 奥德纳米有限公司 甘油三酯耳用制剂及其用途
WO2018044942A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Patara Pharma, LLC Cromolyn compositions for treatment of chronic cough due to idiopathic pulmonary fibrosis
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
WO2018067341A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Patara Pharma, LLC Cromolyn compositions for treatment of pulmonary fibrosis
JOP20190162A1 (ar) 2016-12-30 2019-06-27 Biocad Joint Stock Co تركيبة صيدلانية مائية من جسم مضاد لـ tnf? أحادي النسيلة معاود الارتباط الجيني
KR20190113858A (ko) * 2017-01-30 2019-10-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 건선성 관절염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
WO2018147915A1 (en) * 2017-02-07 2018-08-16 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
WO2019232081A1 (en) * 2018-05-29 2019-12-05 Abcentra, Llc Compositions and methods for treatment of rheumatoid arthritis and accelerated atherosclerosis
MX2021008537A (es) 2019-01-15 2021-11-12 Janssen Biotech Inc Composiciones de anticuerpos anti-tnf y métodos para el tratamiento de la artritis idiopática juvenil.
EA202192505A1 (ru) * 2019-03-14 2022-03-29 Янссен Байотек, Инк. Способы получения композиций антитела к фно
AU2020279987A1 (en) 2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
CN113939531A (zh) 2019-06-03 2022-01-14 詹森生物科技公司 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法
CA3144567A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Scott Crowe Polypeptides
JP2022538083A (ja) 2019-06-21 2022-08-31 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
CN111153994B (zh) * 2019-12-31 2021-10-15 武汉班科生物技术股份有限公司 人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体
KR20240012469A (ko) 2021-05-20 2024-01-29 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Il-23 및 tnf 알파에 대한 항체의 병용요법으로 염증성 장질환을 치료하는 방법
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
WO2024054934A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Mdx Management Llc Shp-1 inhibitors for treating cancer

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5700466A (en) 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US4603106A (en) 1982-02-22 1986-07-29 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US4822776A (en) 1981-09-08 1989-04-18 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3546807C2 (hu) 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8517895D0 (en) 1985-07-16 1985-08-21 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
ATE114673T1 (de) 1985-08-16 1994-12-15 Univ Rockefeller Modulator der anabolischen aktivität und seine verwendungen.
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
IL79740A0 (en) 1986-08-17 1986-11-30 Yeda Res & Dev Hepatitis vaccine
EP0318512B1 (en) 1986-08-18 1998-06-17 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988006630A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Method for the preparation of binding molecules
DE3888224T2 (de) 1987-04-24 1994-07-21 Teijin Ltd Bestimmung vom Tumornekrosefaktor; monoklonaler Antikörper und Zusammensetzung.
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
EP0396612B1 (en) 1988-01-11 1996-07-24 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5770198A (en) 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
DE3823804A1 (de) 1988-07-14 1990-01-18 Basf Ag Neutralisation der in vitro und in vivo toxischen eigenschaften von tnf-(alpha) durch monoklonale antikoerper und den davon abgeleiteten fragmenten
NZ229922A (en) 1988-07-18 1992-04-28 Chiron Corp Monoclonal antibodies specifically binding cachectin (tumor necrosis factor) and compositions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5342613A (en) 1988-12-27 1994-08-30 Health Research Inc. Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
PT92900A (pt) 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
DE59010941D1 (de) 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
DE69017753T3 (de) 1989-05-18 2013-06-20 Yeda Research And Development Co., Ltd. Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE10399036I1 (de) 1989-08-07 2004-04-01 Peptide Technology Ltd Bindeligande für Tumornekrosisfaktor.
AU638762B2 (en) 1989-10-05 1993-07-08 Optein Inc Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
DE69022559T2 (de) 1989-12-13 1996-05-02 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten Tumor-Nekrosisfaktor-Bindungsproteins I (TBP-I).
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
TW212184B (hu) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AU8081491A (en) 1990-06-01 1991-12-31 Cetus Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
ATE204902T1 (de) 1990-06-29 2001-09-15 Large Scale Biology Corp Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
US5958413A (en) 1990-11-01 1999-09-28 Celltech Limited Use of antibodies to TNF or fragments derived thereof and xanthine derivatives for combination therapy and compositions therefor
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
DK0567566T4 (da) 1991-01-18 2007-10-22 Amgen Inc Fremgangsmåder til behandling af tumornekrosefaktor-medierede sygdomme
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
AU668864B2 (en) 1991-03-18 1996-05-23 Centocor Inc. Chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
US5698195A (en) 1991-03-18 1997-12-16 New York University Medical Center Methods of treating rheumatoid arthritis using chimeric anti-TNF antibodies
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
NL9101124A (nl) 1991-06-28 1993-01-18 Stork Brabant Bv Rotatiezeefdrukmachine.
KR100246082B1 (ko) 1991-07-02 2000-04-01 인헤일, 인코오포레이티드 에어로졸화된약제를전달하는방법및장치
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
SK285046B6 (sk) 1991-07-25 2006-05-04 Idec Pharmaceuticals Corporation Chimérna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie
EP0525570A3 (en) 1991-07-31 1993-10-06 Miles Inc. Anti-idiotypic antibodies that mimic tnf
DE4125898C2 (de) 1991-08-05 1994-02-03 Hirschmann Richard Gmbh Co Fahrzeugantenne in Form einer Schlitzantenne
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
SK51695A3 (en) 1992-10-19 1995-11-08 Dura Pharma Inc Dry powder medicament inhaler
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
DE69414369T2 (de) 1993-01-19 1999-05-27 Glaxo Group Ltd Aerosol-spender und verfahren zu seiner herstellung
CA2155728C (en) 1993-02-12 2000-04-25 Gerald R. Crabtree Regulated transcription of targeted genes and other biological events
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
PT614984E (pt) 1993-03-05 2001-12-28 Bayer Ag Anticorpos humanos anti-tnf
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9315846D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tumour inhibitors
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US6190691B1 (en) 1994-04-12 2001-02-20 Adolor Corporation Methods for treating inflammatory conditions
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
FR2728793A1 (fr) 1994-12-28 1996-07-05 Oreal Utilisation d'un antagoniste d'histamine, d'un antagoniste d'interleukine 1 et/ou d'un antagoniste de tnf-alpha dans une composition cosmetique, pharmaceutique ou dermatologique et composition obtenue
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
BR9612410A (pt) 1996-01-03 1999-07-13 Glaxo Group Ltd Aparelho para inalação
CN103275221B (zh) 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
EP0826695B1 (de) 1996-09-03 2001-12-12 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Zerstörung von kontaminierenden Tumorzellen in Stammzelltransplantaten mit bispezifischen Antikörpern
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
EP1506302A4 (en) 2002-05-23 2006-02-08 Cognis Ip Man Gmbh CANDIDA TROPICALIS BLOCKED BY OXIDATION BETA NON REVERSIBLE
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
LUC00010I2 (hu) 2017-05-30
HRP20030089A2 (en) 2005-02-28
CA2419205C (en) 2010-10-12
WO2002012502A2 (en) 2002-02-14
JP6449113B2 (ja) 2019-01-09
BRPI0113110C8 (pt) 2023-12-05
UA81743C2 (uk) 2008-02-11
EA009288B1 (ru) 2007-12-28
RS50858B (sr) 2010-08-31
IL154327A0 (en) 2003-09-17
EP3118318A1 (en) 2017-01-18
EP2159230B1 (en) 2014-10-29
HUS1400015I1 (hu) 2016-08-29
US20050123541A1 (en) 2005-06-09
EP3118318B1 (en) 2018-12-05
KR100883078B1 (ko) 2009-02-10
KR20030022367A (ko) 2003-03-15
FR10C0014I1 (hu) 2010-04-16
SI2330129T1 (sl) 2017-01-31
PT2330129T (pt) 2016-12-28
LTPA2019013I1 (lt) 2019-06-25
HUP0302376A3 (en) 2012-09-28
ES2331602T3 (es) 2010-01-11
AU2001279227B2 (en) 2007-09-20
NO20030620D0 (no) 2003-02-07
JP2016019519A (ja) 2016-02-04
EP2159230A1 (en) 2010-03-03
AU7922701A (en) 2002-02-18
NO333378B1 (no) 2013-05-21
LT2330129T (lt) 2016-11-25
ES2709335T3 (es) 2019-04-16
CN1468308B (zh) 2010-05-26
CY2019029I1 (el) 2020-05-29
LUC00121I1 (hu) 2019-05-27
NO2013012I1 (no) 2013-07-01
BE2010C014I2 (hu) 2020-12-15
CY1116149T1 (el) 2017-02-08
LUC00010I1 (hu) 2017-03-20
PT1309691E (pt) 2009-11-27
CY2010008I2 (el) 2012-01-25
EA007005B1 (ru) 2006-06-30
BR0113110A (pt) 2003-09-16
CN101980017B (zh) 2016-08-03
EP2330129A3 (en) 2011-08-03
CY1109618T1 (el) 2012-01-25
DK3118318T3 (en) 2019-02-18
MY157288A (en) 2016-05-31
DK1309691T3 (da) 2009-12-07
EA200300243A1 (ru) 2003-08-28
EP1309691A2 (en) 2003-05-14
CY2017009I2 (el) 2017-09-13
LTPA2010004I1 (lt) 2017-03-10
PL206833B1 (pl) 2010-09-30
NO20030620L (no) 2003-03-31
LTPA2017008I1 (lt) 2017-04-10
US7521206B2 (en) 2009-04-21
LU91663I2 (fr) 2010-05-12
IL154327A (en) 2010-06-16
JP6564438B2 (ja) 2019-08-21
YU9103A (sh) 2006-05-25
HK1140494A1 (en) 2010-10-15
FR10C0014I2 (fr) 2011-04-01
BRPI0113110B8 (pt) 2021-05-25
HUP0302376A2 (hu) 2003-10-28
SI2159230T1 (sl) 2015-01-30
ES2527953T3 (es) 2015-02-02
CY1121353T1 (el) 2020-05-29
EP2330129A2 (en) 2011-06-08
DE60140259D1 (de) 2009-12-03
SI3118318T1 (sl) 2019-02-28
NZ562811A (en) 2009-05-31
CN1468308A (zh) 2004-01-14
US20070003548A1 (en) 2007-01-04
SI1309691T1 (sl) 2010-01-29
US7250165B2 (en) 2007-07-31
LT3118318T (lt) 2019-02-11
PL360438A1 (en) 2004-09-06
LU91663I9 (hu) 2018-12-18
CY2017009I1 (el) 2017-09-13
PT2159230E (pt) 2015-02-05
DK2159230T3 (en) 2014-11-17
WO2002012502A3 (en) 2002-10-31
HK1052948B (zh) 2010-05-07
DE122010000010I1 (de) 2010-07-08
WO2002012502A9 (en) 2004-03-04
CY1118443T1 (el) 2017-06-28
US7691378B2 (en) 2010-04-06
EP2330129B1 (en) 2016-09-21
PT3118318T (pt) 2019-03-21
JP2019054802A (ja) 2019-04-11
ME00314B (me) 2011-05-10
HRP20030089B1 (en) 2011-09-30
JP2011188862A (ja) 2011-09-29
CA2419205A1 (en) 2002-02-14
MEP48408A (en) 2011-02-10
EA200600126A1 (ru) 2006-10-27
CN101980017A (zh) 2011-02-23
CY2019029I2 (el) 2020-05-29
CY2010008I1 (el) 2012-01-25
HK1052948A1 (en) 2003-10-03
JP2004523209A (ja) 2004-08-05
MY157289A (en) 2016-05-31
JP2021036872A (ja) 2021-03-11
JP6590428B2 (ja) 2019-10-16
NO2017046I1 (no) 2017-08-25
JP2018046817A (ja) 2018-03-29
NO2013012I2 (no) 2013-06-07
IL195898A (en) 2015-11-30
ES2607679T3 (es) 2017-04-03
BRPI0113110C1 (pt) 2021-08-24
NZ524147A (en) 2005-02-25
BRPI0113110B1 (pt) 2018-03-20
JP2019216721A (ja) 2019-12-26
LUC00121I2 (hu) 2020-01-10
JP4748920B2 (ja) 2011-08-17
MXPA03001231A (es) 2003-10-15
DK2330129T3 (en) 2016-10-24
US20030049725A1 (en) 2003-03-13
EP1309691B1 (en) 2009-10-21
ATE446367T1 (de) 2009-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229523B1 (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
US7063964B2 (en) Nucleic acids encoding IL-12 antibody
TWI334439B (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
JP4975020B2 (ja) 抗ｍｃｐ−１抗体、組成物、方法および使用
CA2994253C (en) Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
JP2004523209A5 (hu)
JP2008546374A5 (hu)
JP2005512522A (ja) Ｉｌ−１３ムテインタンパク質、抗体、組成物、方法および使用
KR20210142002A (ko) 항-tnf 항체 조성물을 생성하기 위한 제조 방법
KR20210141998A (ko) 항-tnf 항체 조성물의 제조 방법
KR20210141976A (ko) 항-tnf 항체 조성물의 제조 방법
CN116670167A (zh) 用于治疗活动性强直性脊柱炎的抗tnf抗体、组合物和方法
CA3142665A1 (en) Anti-tnf antibody compositions, and methods for the treatment of psoriatic arthritis
WO2009009782A2 (en) Cynomolgus il-17 proteins, antibodies, compositions, methods and uses
NZ794358A (en) Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
TR201820506T4 (tr) Anti-Tnf Antikorlar, Bileşimler, Usuller Ve Kullanımlar
PL205786B1 (pl) Kwas nukleinowy, prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 i kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowania

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: JANSSEN BIOTECH, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): CENTOCOR, INC., US

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: GOLIMUMAB; REG. NO/DATE: EU/1/09/546/001-004 20091001

Spc suppl protection certif: S1400015

Filing date: 20140317

Expiry date: 20210807

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: GOLIMUMAB; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/09/546/001-004 20091006

Spc suppl protection certif: S1400015

Filing date: 20140317

Expiry date: 20210807

Extension date: 20241006