TR201820506T4 - Anti-Tnf Antikorlar, Bileşimler, Usuller Ve Kullanımlar - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, en az bir anti-TNF antikoru, TNF, vektörler, konakçı hücreler, transgenik hayvanlar veya bitkileri şifreleyen izole edilmiş nükleik asitler dahil olmak üzere en az bir yeni anti-TNF antikoru ve bunların terapötik bileşimler, yöntemler ve cihazlar dahil olmak üzere yapım ve kullanma yöntemleri ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME ANTI-TNF ANTIKORLAR, BILESIMLER, USULLER VE KULLANIMLAR Bu bulus tümör nekroz faktörü alfa (TNF) proteinine spesifik antikorlara iliskindir.

BULUSUN ALANI TNF alfa 17 kD'lik protein alt birimlerinin çözünür bir homotrimeridir (Smith ve digerleri, J. Biol. Chem. 262z6951- TNF incelemeleri için bakiniz Beutler ve digerleri, Nature digerleri, Lab. Invest. 56:234 (1987).

Monositler veya makrofajlar disindaki hücreler de TNF alfa üretir. Örnegin beserî monositik olmayan tümör hücresi çizgileri TNF alfa üretir (Rubin ve digerleri, J. Exp. Med. ve bazi kültürlenmis T ve B hücresi çizgileri de (Cuturi ve digerleri, J. Exp. Med. l65:158l (1987); Sung ve digerleri, J.

TNF alfa kikirdak ve kemikte bozulma (Saklatvala, Nature yapisma moleküllerinin uyarilmasi, vasküler endotelyal hücreler üzerinde pihti olusumunu baslatici aktivitenin nötrofillerin ve lenfositlerin yapismasinda artis (Pober ve nötrofiller ve vasküler endotelyal hücrelerden trombosit aktive edici faktör saliminin uyarilmasi (Camussi ve zedelenmesiyle sonuçlanan proenflamatuvar etkilere neden olur.

Son bulgular, TNF alfayi enfeksiyonlar (Cerami ve digerleri, neoplastik patolojiler (Oliff ve digerleri, Cell 50:555 (1987)), otoimmün patolojiler ve graft-versus-host patolojileriyle (Piguet ve digerleri, J. Exp. MedJ 166:128O (1987)) iliskilendirmektedir. TNF alfanin kanser ve enfeksiyöz patolojilerle iliskisi siklikla hastanin katabolik durumuna baglanir. Kanser hastalari genellikle anoreksiyayla iliskili olan kilo kaybindan mustariptir.

Kanserle ve baska hastaliklarla iliskili olan asiri zayiflama olarak ilerleyici kilo kaybi, anoreksi ve yagsiz Vücut kütlesinde sürekli erozyonu kapsar. Kaseksi durumu kanserde hastalik ve Ölüm oraninda artisa neden olur. TNF alfanin kanser, enfeksiyöz patoloji ve diger katabolik durumlardaki kasekside rol oynadigina iliskin bulgular vardir (örnegin bakiniz Beutler ve Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7:625-655 (1989)).

TNF alfanin, ates, kiriklik, anoreksi ve kaseksi de dahil olmak üzere gram negatif septisemi ve endotoksik sokta merkezi bir rol oynadigina inanilmaktadir (Michie ve digerleri, Br. J.

Care Clin. 5:27-47 (1989)). Endotoksin monosit/makrofaj üretimini ve TNF alfa ve diger sitokinlerin salgilanmasini kuvvetle aktive eder (Kornbluth ve digerleri, J. Immunol. sitokinler endotoksine verilen metabolik ve nörohormonal yanitlara aracilik eder (Michie ve digerleri, New Engl. J. uygulamasi ates, tasikardi, metabolik hiz ve stres hormonu saliminda artis da dahil olmak üzere gribe benzer semptomlari olan akut hastaliga yol açmaktadir (Revhaug ve digerleri, septisemiden mustarip hastalarda artar (Waage ve digerleri, O halde TNF alfa enflamatuvar hastaliklar, otoimmün hastaliklar, Viral, baktriyel ve parazitik enfeksiyonlar, habis tümörler ve/Veya nörojeneratif hastaliklarda rol oynamaktadir ve romatoid artrit ve Crohn hastaligi gibi hastaliklarda spesifik biyolojik tedavi için yararli bir hedeftiru TNF alfaya karsi bir kimerik monoklonal antikorla (GAZ) yapilan açik etiketli çalismalarda, romatoid artritte Crohn hastaliginda (Van Dullemen ve digerleri, baskilandigi ve nüksten sonra basarili yeniden tedaviyle yararli etkiler saglandigi bildirilmistir. cA2 ile yapilan randomize, çift kör, plasebo kontrollü bir çalismada da romatoid artritte enflamasyonun baskilanmasiyla basarili sonuçlar bildirilmistir (Elliott ve digerleri, Lancet TNF'yle ayni oldugu bulunmustur) bir “modülatör” malzemeye karsi antikorlar Cerami ve digerleri (4 Mart 1987 tarihli EPO Patent Yayini 0212489) tarafindan bildirilmistir. Bu antikorlarin bakteriyel enfeksiyonlardaki sokun tanisal immünolojik tahlillerinde ve tedavisinde yararli oldugu söylenmistir. Rubin ve digerleri (22 Nisan 1987 tarihli EPO Patent Yayini 0218868) beseri TNF'ye karsi monoklonal antikorlari, bu antikorlari salgilayan hibridomlari, bu antikorlari üretme usullerini ve bu antikorlarin TNF immünolojik tahlilinde kullanimini açiklamistir. Yone ve digerleri (26 Ekim mAb'ler de dahil olmak üzere anti-TNF antikorlari ve bunlarin patolojilerin, özellikle Kawasaki patolojisinin ve bakteriyel enfeksiyonun immünolojik tahlil tanisinda yararlarini açiklamistir. Kawasaki patolojisi olan hastalarin (bebeklerde akut atesli mukokütanöz lenf` nodülü sendromu; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) iliskili olan yüksek TNF seviyeleri içerdigi söylenmistir Baska arastirmacilar in vitro nötralize edici aktivitesi olan rekombinant beseri TNF için spesifik mAb'leri açiklamistir (Liang, C-M. ve digerleri (Biochem. Biophys. Res. Comm. mAb'lerin bazilari beseri TNF'nin epitoplarinin haritasini çikarmak ve enzim immünolojik tahlilleri gelistirmek (Fendly Ve digerleri, yukarida; Hirai ve digerleri, yukarida; Moller ve digerleri, yukarida) ve rekombinant TNF'nin saflastirilmasina yardim etmek (Bringman ve digerleri, yukarida) için kullanildi. Ancak bu Çalismalar immnojeniklik, spesifikligin ve/veya farmasötik uygunlugun olmayisi nedeniyle insanlarda in vivo tani veya tedavi amaçlariyla kullanilabilecek TNF nötralize edici antikorlarin üretimi için bir temel saglamamaktadir.

TNF'ye karsi nötralize edici antiserumlar veya mAb'lerin insan disindaki memelilerde, deneysel endotoksemi ve bakteremide ölümcül provokasyondan sonra olumsuz fizyolojik degisiklikleri ortadan kaldirdigi ve ölümü önledigi gösterilmistir. Bu etki örnegin kemirgen öldürücülük tahlillerinde ve primat patoloji modeli sistemlerinde gösterilmistir (Mathison, J.C. ve hTNF'nin varsayimsal reseptör baglanma yerleri, TNF-a'nin ve 155-157'den olustugunu tespit eden Eck ve Sprang (J. Biol. asagidaki epitoplara sahip monoklonal antikorlara baglanabilen baglanan beseri antikorlar açiklanmaktadir. Antikorlarin beseri TNFd için yüksek bir afiniteye sahip (10"8 M veya daha az Kd); beseri TNFd çözüsümü için bir yavaslama oranina (10-3 san*l veya daha az IQIQ sahip oldugu ve _ün vitro ve ;ni Vivo beseri TNPd aktivitesini nötralize edebildigi belirtilmektedir.

Insan disi memeli, kimerik, poliklonal (örnegin antiserum) ve/veya monoklonal antikorlar (Mab'ler) ve fragmanlari (Örnegin bunlarin proteolitik sindirim veya füzyon proteini ürünleri) bazi hastaliklari tedavi etme çabasi içinde bazi vakalarda arastirilmaktadir. Ancak bu antikorlar veya fragmanlar insanlara uygulandiginda bir bagisiklik yanitina yol açabilir. Böyle bir bagisiklik yaniti antikorlarin veya fragmanlarin dolasimdan bagisiklik kompleksi araciligiyla temizlenmesiyle sonuçlanabilir ve tedavinin tekrar tekrar uygulanmasini imkansiz hale getirebilir, dolayisiyla hasta için terapötik yarar azalabilir` ve antikorun. veya fragmanin yeniden uygulanmasi kisitlanir. Örnegin beseri olmayan kisimlar içeren antikorlarin veya fragmanlarin tekrar tekrar uygulanmasi anafilaksiye yol açabilir. Bu ve baska problemlerden kaçinmak için, bu alanda iyi bilindigi gibi kimerizasyon ve beserilestirme de dahil olmak üzere, bu antikorlarin ve kisimlarinin immünojenikligini azaltmaya yönelik çesitli yaklasimlar denenmistir. Ancak bu ve baska yaklasimlar, bir miktar immünojenüklige, düsük afiniteye, düsük aviditeye sahip antikorlar veya fragmanlarla veya hücre kültürü, ölçekleme, üretimde problemler ve/veya düsük verimlerle sonuçlanabilir. Dolayisiyla bu antikorlar veya fragmanlar imalat veya terapötik proteinler olarak kullanim için ideal olmayabilir.

Dolayisiyla, bu problemlerin birini veya daha fazlasini çözmenin yani sira bilinen antikorlara veya fragmanlara göre gelistirilmis anti-TNE' antikorlarinin, veya fragmanlarinin teminine ihtiyaç duyulmaktadir BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, teknikte bilinenlerle kombinasyon halinde ve burada açiklandigi ve sunuldugu üzere izole insan anti-TNF antikorlari, anti-TNE' antikor bilesimleri, kodlayici nükleik asitler, vektörleri, konak hücreler, bilesimler ve bunlarin kullanimlarini saglamaktadir.

Bu bulus juvenil romatoid artrit kullanim için üç agir zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) ve üç hafif zincir tamamlayicilik belirleme bölgesine sahip olan bir antikor ya da bunun antijen-baglayici fragmanini saglamakta olup, burada: üç agir zincir CDR'si asagidaki amino asit sekansina sahiptir: CDRHl: SYAMH; CDRHZ: FMSYDGSNKKYADSVKG; CDRH3: DRGIAAGGNYYYYGMDV; ve üç hafif zincir CDR'si asagidaki amino asit sekansina sahiptir: CDRLl: RASQVYSYLA; CDRLZ: DASNRAT; CDRL3: QQRSNWPPFT.

Bu bulus ayni zamanda istem 1'deki antikoru ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ya da seyrelticiyi içeren bir bilesim saglamakta olup, burada söz konusu bilesim juvenil romatoid artrit tedavi etmek içindir.

Bu tarifnamede spesifik anti-TNF antikorlari kodlayan bir polinükleotidi içeren, onu tamamlayici olan veya ona hibridize edilen, bunun en az bir belirtilen dizisi, alani, kismi veya çesidini içeren izole edilmis nükleik asit molekülleri açiklanmaktadir. Bu tarifnamede ayrica sözü edilen anti-TNF antikoru nükleik asit moleküllerini içeren rekombinant vektörler, bu nükleik asitleri ve/Veya rekombinant vektörleri açiklayan konak hücrelerin yani sira, bu antikor nükleik asitleri, vektörleri ve/Veya konak hücrelerini hazirlama ve/veya kullanma usulleri açiklanmaktadir.

Bu bulusun en az bir antikoru en az bir TNF proteini, bunun alt birimi, fragmani, kismi veya herhangi bir kombinasyonuna spesifik en az bir belirtilen epitopu baglar. En az bir epitop sözü edilen proteinin en az bir bölümünü içeren en az bir antikor baglayici bölge içerebilir, bu epitop tercihen sinirlandirici olmamak üzere sözü edilen proteinin en az bir islevsel, hücre disi, çözünür, hidrofilik, harici veya sitoplazmik alani veya bunun herhangi bir kismi gibi en az bir kisminin en az 1-5 amino asidini içerir.

Bu bulus ayrica burada açiklandigi gibi en az bir izole edilmis anti-TNF antikoru sunmaktadir, burada antikor sinirlandirici olmamak üzere TNF'nin yol açtigi hücre yapismasi moleküllerinin inhibisyonu, TNF'nin reseptöre baglanmasinin inhibisyonu, fare modelinde artritik endeksin iyilestirilmesi gibi en az bir aktiviteye sahiptir (örnegin bakiniz Örnek 3-7). Dolayisiyla bir anti-TNF antikoru sinirlandirici olmamak üzere bir TNF proteinine karsi en az bir biyolojik aktivite gibi bir aktivite açisindan bilinen usullere göre taranabilir.

Bu tarifnamede ayrica bir konak hücrede en az bir anti-TNF antikorunu eksprese etmek için, burada açiklandigi gibi bir konak hücrenin en az bir anti-TNF antikorunun saptanabilir ve/veya geri kazanilabilir miktarlarda eksprese edildigi kosullar altinda kültürlenmesini içeren en az bir usul açiklanmaktadir.

Bu tarifnamede ayrica (a) burada açiklandigi gibi nükleik asit ve/veya antikoru kodlayan izole edilmis bir anti-TNF antikoru; Ve (b) uygun bir tasiyici veya seyreltici içeren en az bir bilesim açiklanmaktadir. Tasiyici veya seyreltici istege bagli olarak, bilinen tasiyicilara veya seyrelticilere göre farmasötik olarak kabul edilebilir olabilir. Bilesim ayrica istege bagli olarak en az bir baska bilesik, protein veya bilesim içerebilir.

Bu tarifnamede ayrica bu alanda bilindigi ve/veya burada açiklandigi gibi iliskili bir hastaligin öncesinde, sonrasinda veya sirasinda bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada TNF'yle iliskili en az bir hastaligi modüle veya tedavi etmek amaciyla terapötik olarak etkili bir miktari uygulamak için en az bir anti-TNF antikoru usulü veya bilesimi açiklanmaktadir.

Bu tarifnamede ayrica bu bulusa göre, en az bir anti-TNF antikorunun terapötik veya profilaktik olarak etkili bir miktarinin iletimi için en az bir bilesim, tertibat ve/veya usul açiklanmaktadir.

Bu tarifnamede ayrica bu alanda bilindigi ve/veya burada açiklandigi gibi iliskili bir hastaligin öncesinde, sonrasinda veya sirasinda bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada TNF'yle iliskili en az bir hastaligi modüle veya tedavi etmek amaciyla terapötik olarak etkili bir iniktari uygulamak için TNF antikoruyla iliskili en az bir rahatsizligin tanisinin konmasina yönelik en az bir anti-TNF antikoru usulü veya bilesimi açiklanmaktadir.

Bu tarifnamede ayrica bu bulusa göre en az bir anti-TNF antikoru tanisi için en az bir bilesim, tertibat ve/veya usul açiklanmaktadir. ÇIZIMLERIN AÇIKLAMASI Sekil 1 TNV mAb'lerin hibridom hücre üst fazlarinda TNFV'nin rekombinant TNF reseptörüne baglanmasini inhibe etme kabiliyetine iliskin bir tahlili gösteren grafik bir gösterimdir. Bilinen TNV mAb miktarlarini içeren hibridom hücresi üst fazlarinin farkli miktarlari 1251 ile isaretli TNFV tutuldu. Karisim önceden bir rekombinant TNF reseptörü/IgG füzyon proteini olan p55-sf2 ile kaplanmis 96 kuyucuklu Optiplates'e aktarildi. mAb'lerin varliginda p55 reseptörüne baglanan V miktarlari bagli olmayan malzeme yikanarak çikarildiktan ve bir gama sayaci kullanilarak sayildiktan sonra belirlendi. Bu deneylerde sekiz TNV mAb numunesi test edilmekle birlikte, basitlestirme amaciyla DNA dizi analizleriyle diger TNV mAb'lerin biriyle ayni oldugu gösterilen üç mAb (bakiniz Bölüm 5.2.2) burada gösterilmemektedir. Her numune ikiser kez test edildi.

Gösterilen sonuçlar iki bagimsiz deneyin temsilidir.

Sekil 2 TNV mAb agir zincir degisken bölgelerinin DNA dizilerini göstermektedir. Gösterilen germline [esey hücre öncülleri] geni DP-46 genidir. “TNV'ler” gösterilen dizinin TNV14, TNVlS, TNV148 ve TNVl96 dizisi oldugunu belirtmektedir.

TNV dizisindeki ilk üç nükleotit translasyon baslatma Met kodonunu. tanimlamaktadir. TNV' mAb gen dizilerindeki noktalar nükleotidin germline dizisiyle ayni oldugunu belirtmektedir.

TNV dizilerinin ilk 19 nükleotidi (alti çizili) degisken bölgenin PCR amplifikasyonu için kullanilan oligonükleotide karsilik gelir. Olgun mAb ile baslayan bir amino asit translasyonu (tek harfli kisaltmalar) sadece germline geni için gösterilmektedir. Germline amino asit translasyonundaki üç CDR alani kalin ve alti çizili olarak isaretlenir.

TNV148(B) isaretli satirlar gösterilen dizinin hem TNV148 hem de TNAV 148B'ye ait oldugunu belirtmektedir. Germline DNA dizisindeki (CDR3) araliklar dizinin bilinmemesine veya germline geninde var olmamasina baglidir. TNV mAb agir zincirleri J6 birlesme bölgeini kullanir.

Sekil 3 TNV mAb hafif zincir degisken bölgelerinin DNA dizilerini göstermektedir. Gösterilen germline geni beseri kappa germline degisken bölge genlerinin Vg/38K ailesinin temsil edici bir üyesidir. TNV mAb gen dizilerindeki noktalar nükleotidin germline dizisindekiyle ayni oldugunu belirtmektedir` TNV dizilerinin ilk on alti nükleotidi (alti çizili) degisken bölgenin PCR amplifikasyonu için kullanilan oligonükleotide karsilik gelir. Olgun mAb'nin bir amino asit translasyonu (tek harfli kisaltmalar) sadece germline geni için gösterilmektedir. Germline amino asit translasyonundaki üç CDR alani kalin ve alti çizili olarak isaretlenmistir.

TNVl48(B) isaretli satirlar gösterilen dizinin hem TNVl48 hem de TNVl48B'ye ait oldugunu belirtmektedir. Germline DNA dizisindeki (CDR3) araliklar dizinin bilinmemesine veya germline geninde var olmamasina baglidir. TNV mAb hafif zincirleri J3 birlesme dizisini kullanir.

Sekil 4 TNV mAb agir zincir degisken bölgelerinin çikarsanan amino asit dizilerini göstermektedir. Gösterilen amino asit dizileri (tek harfli kisaltmalar) hem klonlanmamis PCR ürünleri hem, de klonlanmis PCR ürünlerinden belirlenen DNA dizilerinden çikarsandi. Amino dizileri salgilayici sinyal dizisi (sinyal), çerçeve (FW) ve tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDN) alanlarina bölünmüs olarak gösterilmektedir. DP- 46 germline geni için amino asit dizisi her alan için en üst satirin üzerinde gösterilmektedir. Noktalar TNV mAb'deki amino asidin germline geniyle ayni oldugunu göstermektedir.

TNV148(B) gösterilen dizinin heni TNVl48'e heHi de TNVl48B'ye ait oldugunu belirtmektedir. TNV'ler, farkli bir dizi gösterilmiyorsa, gösterilen dizinin bütün TNV mAb'lere ait oldugunu belirtir. Germline dizisindeki (CDR3) kisa çizgiler dizilerin bilinmedigini veya germline geninde bulunmadigini belirtir.

Sekil 5 TNV mAb hafif zincir degisken bölgelerinin çikarsanan amino asit dizilerini göstermektedir. Gösterilen amino asit dizileri (tek harfli kisaltmalar) hem klonlanmamis PCR ürünlerinden hem de klonlanmis PCR ürünlerinden belirlenen DNA dizisinden çikarsandi. Amino dizileri salgilayici sinyal dizisi (sinyal), çerçeve (FW) ve tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDN) alanlarina bölünmüs olarak gösterilmektedir.

Vg/38K tipi hafif zincir germline geni için amino asit dizisi her alan için en üst satirin üzerinde gösterilmektedir.

Noktalar TNV mAb'deki amino asidin germline geniyle ayni oldugunu göstermektedir. TNV148(B) gösterilen dizinin hem TNVl48'e hem de TNV148B'ye ait oldugunu belirtmektedir.

TNV186'ya ait oldugunu belirtir.

Sekil 6'da rTNVl4SB eksprese eden C466 hücrelerini hazirlamak için kullanilan agir ve hafif zincir ekspresyon plasmidlerinin sematik gösterimleri sunulmaktadir. rTNVl48B degisken ve sabit bölge kodlama alanlari siyah kutular olarak gösterilmektedir.

J-C intronlardaki immünoglobülin gri kutular olarak gösterilmektedir. Ilgili kisitlama yerleri gösterilmektedir.

Plasmidler Ab genlerinin transkripsiyonu saat yönünde ilerleyecek sekilde yöneltilmis olarak gösterilmektedir.

Plasmid pl776'nin uzunlugu 15.06 kb'dir. Her iki plasmidin tam nükleotit dizileri bilinmektedir. pl783'teki degisken bölge kodlama. dizisi BsiWI/BstBl kisitlama fragmani degistirilerek kolayca baska bir agir zincir degisken bölge dizisiyle degistirilebilir. pl776'daki degisken bölge kodlama dizisi, SaII/AflII kisitlama fragmani degistirilerek baska bir degisken bölge dizisiyle degistirilebilir.

Sekil 7'de bes rTNV148B üretici hücre çizgisinin büyüme egrisi analizlerinin grafik temsili gösterilmektedir. Kültürler 0. günde 30 ml hacim içinde 1.0 X 105 hücre/ml yasayabilir bir hücre yogunlugu elde etmek üzere hücreler 15Q+MHK ortami içinde T75 siselerine tohumlanarak baslatildi. Bu çalismalar için kullanilan kültürler transfeksiyonlar ve alt klonlamalarin yapilmasindan itibaren sürekli kültürdeydi.

Sonraki günlerde, T hücrelerindeki hücreler yeniden iyice süspansiyon haline getirildi ve kültürün 0.3 ml'lik bir temsili miktari çikarildi. Hücre sayilari 1.5 X 105 hücre/ml'nin altina düstügünde büyüme egrisi çalismalari sonlandirildi. Temsili miktardaki canli hücrelerin sayisi tipan mavisi dislamasiyla belirlendi ve temsili miktarin geri kalani sonraki mAb konsantrasyonu tayini için saklandi. Bütün numune temsili ndktarlari için ayni zamanda beseri IgG için bir ELISA yapildi.

Sekil 8'de MHX seleksiyonunun farkli konsantrasyonlarinin varliginda hücre büyümesi hizlarinin karsilastirilmasinin grafik bir temsili gösterilmektedir. C466A ve C466B hücre alt klonlari MHX içermeyen ortamda (IMDM, %5 PES, 2 mM glutamin) çözdürüldü ve iki gün daha kültürlendi. Daha sonra her iki hücre kültürü hiç MHX içermeyen, 0.2X MHX içeren veya lX MHX içeren üç kültüre bölündü. Bir gün sonra, yeni T75 siseleri 1 X 105 hücre/ml baslangiç yogunlugunda kültürlerle tohumlandi ve bir hafta 24 saatlik araliklarla hücreler sayildi. Ilk 5 gün içinde iki katina çikma süreleri SOP PD32.025'teki formül kullanilarak hesaplandi ve çubuklarin üzerinde gösterilmektedir.

Sekil 9 rTNV148 üreten iki hücre çizgisinden zaman içinde mAb üretiminin stabilitesinin grafik temsillerinir göstermektedir.

Transfeksiyonlarin ve alt klonlamalarin yapilmasindan itibaren sürekli kültürde olan hücre alt klonlari 24 kuyucuklu kültür çanaklarinda uzun dönmli seri kültürleri baslatmak için kullanildi. Hücreler MHX seleksiyonuyla ve bu olmadan 15Q ortamda kültürlendi. Önceki kültürlerin tükenmesine izin verilirken yeni yasayabilir kültürleri korumak için kültürler her 4 ila 6 günde bir bölünerek hücreler sürekli olarak geçirildi. Kullanilmis hücre üst fazinin temsili miktarlari kültürler kullanildiktan kisa bir süre sonra toplandi ve mAB konsantrasyonlari belirlenene kadar saklandi. Bütün numune temsili miktarlari üzerinde ayni zamanda beseri IgG için bir ELISA yapildi.

Sekil 10 Örnek 4'teki kontrollerle karsilastirmali olarak bu bulusun anti-TNF antikorlarina yanit olarak artritik fare modeli fareleri Tg 197 agirlik degisikliklerini göstermektedir. Yaklasik olarak 4 haftalikken Tg197 çalisma faraleri cinsiyet ve vücut agirligi temelinde 9 tedavi grubundan birine ayrildi ve 1 mg/kg veya 10 mg/kg dozunda periton içine uygulanan Dulbecco PBS (D-PBS) veya bu bulusun bir anti-TNF antikorunun (TNV14, TNV tek bir bolus dozuyla tedavi edildi. Doz öncesine göre bir degisiklik olarak agirliklar analiz edildiginde, lO mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar çalisma boyunca D-PBS ile tedavi edilen hayvanlara göre tutarli olarak daha yüksek agirlik artisi gösterdiler. Bu agirlik artisi hafta 3-7'de anlamliydi. 10 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar da çalismanin 7. haftasinda anlamli agirlik artisi kaydettiler.

Sekil llA-C Örnek 4'de sunuldugu gibi artritik endeks temelinde hastalik siddetinin ilerleyisini temsil etmektedir. mg/kg CAZ ile tedavi edilen grupta artritik endeks 3. haftadan baslayarak ve çalismanin geri kalani (7 hafta) boyunca devam ederek D-PBS kontrol grubundan daha düsüktü. 1 mg/kg TNVl4 ile tedavi edilen hayvanlarda ve 1 mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlarda, D-PBS ile tedavi edilen grupla karsilastirildiginda 3. haftadan sonra AI'de anlamli bir azalma olmadi. Her biri ayni dozdaki digerleriyle karsilastirildiginda (lO mg/kg cA2 10 mg/kg TNV14, 148 ve l96'yla karsilastirildi) lO mg/kg tedavi gruplari arasinda hiçbir anlamli fark yoktu. l m/kg tedavi gruplari karsilastirildiginda, l mg/kg TNVl48, 3, 4 ve 7. haftalarda l mg/kg cA2'ye göre anlamli olarak daha düsük bir AI gösterdi. l mg/kg TNV148 3. ve 4. haftalarda 1 mg/kg TNV14 ile tedavi edilen gruba göre de anlamli olarak daha düsüktü. TNVl96 çalismanin 6. haftasina kadar (D-PBS ile tedavi edilen grupla karsilastirildiginda) AI'de anlamli bir azalma göstermekle birlikte, çalismanin sonunda anlamli kalan tek 1 mg/kg'lik tedavi TNVl48'di.

Sekil 12 Örnek 5'teki kontrollerle karsilastirmali olarak bu bulusun anti-TNF antikorlarina karsi yanit olarak artritik fare modeli fareleri Tg 197'deki agirlik degisikliklerini göstermektedir. Yaklasik 4 haftalik T2 197 çalisma faraleri vücut agirligi temelinde 8 tedavi grubundan birine ayrildi ve 3 mg/kg dozunda periton içine uygulanan kontrol maddesinin (D- PBS) veya 3 mg/kg dozunda antikorlarin (TNV14, TNV148) bir bolus dozuyla tedavi edildi (hafta 0). l, 2, 3 ve 4. haftalarda bütün hayvanlarda enjeksiyonlar tekrarlandi. Grup l-6 test maddesinin etkinligi açisindan degerlendirildi. Grup 7 ve 8'deki hayvanlardan alinan serum numuneleri 2, :3 ve 4. haftada TNVl4 veya TNVl48'in bagisiklik yaniti ve farmakokinetik tasfiyesi açisindan degerlendirildi.

Sekil 13A-C artritik endeks temelinde Örnek 5'teki hastalik siddetinin ilerlemesini gösteren grafiklerdir. 10 mg/kg CA2 ile tedavi edilen grubun artritik endeksi 2. haftadan baslayarak ve çalismanin geri kalani boyunca (5 hafta) devam ederek D-PBS kontrol grubundan anlamli olarak daha düsüktü. l mg/kg veya 3 mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar ve 3 mg/kg TNVl4 ile tedavi edilen hayvanlarda, dPBS kontrol grubuyla karsilastirildiginda çalisma sirasinda herhangi bir zamanda AI'de herhangi bir anlamli azalma olmadi. 3 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlarda 3. haftada baslayarak ve 5. haftaya kadar devam ederek d-PBS ile tedavi edilen grupla karsilastirildiginda anlamli bir azalma oldu. 10 mg/kg CAZ ile tedavi edilen hayvanlarda, çalismanin 4. ve 5. haftalarinda her iki düsük doz (l mg/kg ve 3 mg/kg) CA2 ile karsilastirildiginda .AI'de anlamli bir azalma oldu ve 3-5. haftalarda TNVl4 ile tedavi edilen hayvanlardakindenden anlamli olarak daha düsüktü. 3 mg/kg tedavi gruplari arasinda anlamli hiçbir fark olmadigi görülmekle birlikte, 3 mg/kg TNVl4 ile tedavi edilen bütün hayvanlar` için AI bazi zaman noktalarinda lO mg/kg'den anlamli olarak daha yüksekti, ancak TNVl48 ile tedavi edilen hayvanlar` lO mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlardan anlamli olarak farkli degildi.

Sekil 14 Örnek 6'daki kontrollerle karsilastirmali olarak bu bulusun anti-TNF antikorlarina yanit olarak artritik fare modeli fareleri Tg l97'deki agirlik degisikliklerini göstermektedir. Yaklasik olarak 4 haftalik Tgl97 çalisma fareleri cinsiyet ve vücut agirligina göre 6 tedavi grubundan birine ayrildi ve 3 mg/kg veya 5 mg/kg'de antikorun (GAZ veya TNVl48) periton içine uygulanan tek bir bolus dozuyla tedavi edildi. Bu çalismada D-PBS ve 10 mg/kg cA2 kontrol gruplari kullanildi.

Sekil 15 Örnek 6'da sunuldugu gibi artritik endeks temelinde hastalik siddetinin ilerleyisini göstermektedir. Bütün tedavi gruplari erken zaman noktalarinda bir miktar koruma sagladi, 5 mg-kg cA2 ve 5 mg/kg TNV148 l-3. haftalarda AI'de anlamli azalmalar gösterdi ve bütün tedavi gruplari 2. haftada anlamli bir azalma gösterdi. Çalismanin ilerleyen evrelerinde 5 mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar bir miktar koruma sagladi ve 4, 6 ve 7. haftalarda anlamli azalmalar gözlemlendi. Hem cA2'nin hem. de TNFV148'in düsük. dozu (3 mg/kg) 6. haftada anlamli azalmalar gösterdi ve bütün tedavi gruplari 7. haftada anlamli azalmalar gösterdi. Tedavi gruplarinin hiçbiri çalismanin sonunda (8 hafta) anlamli bir azalmayi koruyamadi.

Herhangi bir zaman noktasinda tedavi gruplari arasinda (salin kontrol grubu disinda) herhangi bir anlamli fark yoktu.

Sekil 16 Örnek 7'deki kontrollerle karsilastirmali olarak bu bulusun anti-TNF antikorlarina yanit olarak artritim fare modeli fareleri Tg l97'deki agirlik degisikliklerini göstermektedir. TNV148 (hibridoni hücrelerinden elde edildi) ve rTNVl48B'nin (tranfekte olmus hücrelerden elde edildi) periton içine uygulanan tek bir dozunun etkinligini karsilastirmak için, yaklasik olarak 4 haftalik Tgl97 çalisma fareleri cinsiyet ve Vücut agirligi temelinde 9 tedavi grubundan birine ayrildi ve Dulbecco PBS (D-PBS) veya antikorun (TNV 1 mg/kg'de periton içine uygulanan tek bir bolus dozuyla tedavi edildi.

Sekil 17 Örnek 7'de sunuldugu gibi artritik endeks temelinde hastaligin siddetinin ilerleyisini göstermektedir. lO mg/kg cA2 ile tedavi edilen grupta artritik endeks 4. hafta baslayarak ve çalismanin geri kalani (8 hafta) boyunca devam ederek D-PBS kontrol grubundakinden daha düsüktü. Hem TNV148 ile tedavi edilen gruplarda heni de 1 mg/kg CAZ ile tedavi edilen grupta 4. haftada AI'de anlamli bir azalma oldu. Önceki bir çalisma(P-O99-Ol7) TNVl48'in periton içine uygulanan tek bir 1 mg/kg bolusun ardindan Artritik Endeksin azaltilmasinda biraz daha etkili oldugunu göstermekle birlikte, bu çalisma TNV antikorunun her iki versiyonuyla tedavi edilen gruplarda AI'in biraz daha yüksek oldugunu gösterdi. lO mg/kg cA2 grubuyla karsilastirildiginda (6. hafta disinda) 1 mg/kg cAZ ile tedavi edilen grup anlamli olarak yükselmemekle ve TNVl48 ile tedavi edilen gruplar 7. ve 8. haftalarda anlamli olarak daha yüksek olmakla birlikte, çalismanin herhangi bir noktasinda ]_ mg/kg GAZ, J_ mg/kg TNV148 ve ]_ mg/kg 'TNV148B arasinda Al'de anlamli farkliliklar yoktu.

BULUSUN AÇIKLAMASI Mevcut bulus izole edilmis, rekombinan ve/Veya sentetik anti- TNF insan antiorlari ve atni zamanda bu bulusun en az bir anti-TNF antikorunu kodlayan en az bir polinükleotid. içeren kodlayici nükleik asit molekülleri ve bilesimler saglamaktadir. Bu bulus ayrica sinirlandirici olmamak üzere bu antikorlarin örnegin tani ve tedavi bilesimleri, usulleri ve tertibatlarinda kullanimini kapsamaktadir.

Burada bir “anti-tümör nekroz faktörü alfa antikoru,' “anti- TNF antikoru,” “anti-TNF antikor parçasi," veya “anti-TNF antikor fragmani” ve/Veya “anti-TNF antikor varyanti” ve buna benzer terimler sinirlandirici olmamak üzere bu bulusun bir antikoru içine dahil edilebilen bir agir veya hafif zincirin veya bunun ligand baglayici bir parçasinin en az bir tamamlayicilik belirleme bölgesi, bir agir zincir veya hafif zincir degisken bölgesi, bir* agir zincir veya hafif zincir sabit bölgesi, bir çerçeve bölgesi veya bunun herhangi bir parçasi veya bir TNF reseptörünün veya baglayici proteinin en az bir parçasini içeren herhangi bir protein veya peptit içeren molekülü kapsar. Bu antikor istege bagli olarak ayrica sinirlandirici olmamak üzere lmi tür bir antikorun GHI az bir TNF aktivitesini veya baglanmasini veya TNF reseptörü aktivitesini veya baglanmasini, in vitro, in situ ve/veya in vivo module ettigi, azalttigi, arttirdigi, antagonize ettigi, agonize ettigi, hafiflettigi, yatistirdigi, bloke ettigi, inhibe ettigi, iptal ettigi ve/veya müdahale ettigi durumda spesifik ligandi etkiler. Sinirlandirici olmayan bir örnek olarak, uygun bir anti-TNF antikoru, bunun belirtilen parçasi veya varyanti en az bir TNF'yi veya bunun belirtilen parçalarini, varyantlarini veya alanlarini baglayabilir. Uygun bir anti-TNF antikoru, bunun belirtilen parçasi veya varyanti istege bagli olarak sinirlandirici olmamak üzere RNA, DNA veya protein sentezi, TNF salimi, TNF reseptörü sinyalleri, zar TNF yarilmasi, TNF aktivitesi, TNF üretimi ve/veya sentezi gibi en az bir TNF aktivitesini veya islevini de etkileyebilir. fragmanlari da dahil olmak üzere, antikor mimetikleri veya bir antikorun veya bunun belirtilen bir fragmaninin veya parçasinin yapisini ve/veya islevini taklit eden antikor parçalari da dahil olmak üzere, antikorlari, bunlarin sindirim fragmanlarini, belirtilen parçalarini ve varyantlarini da kapsamayi amaçlamaktadir. islevsel fragmanlar arasinda bir memeli TNF'sine baglanan antijen baglayici fragmanlar yer alir. Örnegin sinirlandirici olmamak üzere Fab (örnegin papain sindirimiyle), Fab' (örnegin pepsin sindirimi ve kismi indirgemeyle) ve F(ab')2 (örnegin pepsin sindirimiyle, facb (örnegin plasmin sindirimiyle), pFc' (örnegin pepsin veya plasmin sindirimiyle), Fd (örnegin pepsin sindirimi, kismi indirgeme ve yeniden kümelesmeyle), Fv veya scFv (örnegin moleküler' biyoloji teknikleriyle) fragmanlari da dahil olmak üzere TNF'ye baglanabilen antikor fragmanlari veya bunlarin parçalari bulusun çerçevesi içine girmektedir (örnegin bakiniz, Colligan, Immunology, yukarida).

Bu fragmanlar bu alanda bilindigi ve/veya burada açiklandigi gibi enzimatik yarilma, sentetik veya rekombinant tekniklerle üretilebilir. Antikorlar, dogal durdurma yerinin akis yukarisina bir veya daha fazla durdurma kodonunun dahil edildigi antikor genleri kullanilarak çesitli budanmis formlarda da üretilebilir. Örnegin agir zincirin CH, alan ve/veya mentese bölgesini kodlayan DNA. dizilerini kapsayacak bir F(ab')2 agir zincir parçasini kodlayan bir kombinasyon geni tasarlanabilir. Antikorlarin çesitli parçalari geleneksel tekniklerle kimyasal olarak birlestirilebilir veya genetik mühendisligi teknikleri kullanilarak bitisik bir protein olarak hazirlanabilir.

Burada, “beseri antikor” terimi, proteinin esas itibariyla her parçasinin (örnegin CDR, çerçeve, CL, CH alanlari (örnegin CHl, CH2, CHS), mentese, (V1, VH)) insanlarda esas itibariyla immünojenik olmayip, sadece önemsiz dizi degisiklikleri veya varyasyonlari içerdigi bir antikoru belirtir. Benzer bir sekilde, primat (maymun, babun, sempanze ve benzeri), kemirgen (fare, siçan, tavsan, kobay, hamster ve benzeri) ve diger memeli adlariyla belirtilen antikorlar, bu türe, alt cinse, cinse, alt aileye, aileye spesifik antikorlari belirtir.

Ayrica kimerik antikorlar yukaridakinin herhangi bir kombinasyonunu içerir. Bu degisiklikler veya varyasyonlar istege bagli olarak ve tercihen modifiye edilmemis antikorlara göre insanlarda veya baska türlerde immünojenikligi korur veya azaltir. Dolayisiyla bir beseri antikor kimerik veya beserilestirilmis bir antikordan farklidir. Bir beseri antikorun islevsel olarak yeniden düzenlenmis beseri immünoglobülin (örnegin agir zincir ve/veya hafif zincir) genlerini eksprese edebilen insan disi bir hayvan veya prokaryotik veya ökaryotik hücreyle üretilebilecegi belirtilmektedir. Ayrica bir beseri antikor tek zincirli bir antikor oldugunda, dogal beseri antikorlarda bulunmayan bir baglayici peptit içerebilir. Örnegin bir FV agir zincirin degisken bölgesini ve hafif zincirin degisken bölgesini baglayan, iki ila yaklasik sekiz glisin veya baska amino asit kalintisi gibi bir baglayici peptit içerebilir. Bu baglayici peptitler beseri kökenli kabul edilir.

En az iki farkli antijen için baglanma spesifikliklerine sahip monoklonal, tercihen beseri veya beserilestirilmis antikorlar olan bispesifik, heterospesifik, heterokonjügat veya benzer antikorlar da kullanilabilir. Burada baglanma spesifiklerinin biri en az bir TNF proteini içindir ve digeri diger antijen içindir. Bispesifik antikorlar hazirlama usulleri bu alanda bilinmektedir. Geleneksel olarak, bispesifik antikorlarin rekombinant üretimi iki immünoglobülin agir zincir-hafif zincir çiftinin birlikte ekspresyonuna dayanir, burada iki agir zincir farkli spesifikliklere sahiptir (Milstein ve zincirlerin rastgele tasnifi nedeniyle, bu hibridomlar (kuadromlar) sadece biri dogru bispesifik yapiya sahip olan 10 farkli antikor leekülünün potansiyel bir karisimini üretir.

Dogru molekülün genellikle afinite kromatografisi asamalarina dayanan saflastirilmasi çok zahmetlidir ve ürün verimleri düsüktür. Benzer prosedürler örnegin WO 93/08829, ABD Bu bulusun anti-TNF antikorlari (TNF antikorlari olarak da geçer) istege bagli olarak TNF'ye yüksek afiniteyle baglanmalariyla nitelenebilir ve istege bagli olarak ve tercihen toksisiteleri düsüktür. Özellikle degisken bölge, sabit bölge ve çerçeve gibi tek tek bilesenlerin tek tek ve/veya hep birlikte, istege bagli olarak ve tercihen düsük immünojeniklige sahip oldugu bulusun bir antikoru bu bulusta yararlidir. Bulusta kullanilabilen antikorlar istege bagli olarak, hastalari uzun sürelerle semptomlari ölçülebilir bir seviyede hafifleterek ve düsük ve/veya kabul edilebilir toksisiteyle tedavi edebilmeleriyle nitelenirler. Düsük veya kabul edilebilir immünojeniklik ve/Veya yüksek afinitenin yani sira, diger uygun özellikler de elde edilen terapötik sonuçlara katkida bulunabilir. “Düsük immünojeniklik” burada tedavi edilen hastalarin yaklasik %75'inden azinda veya tercihen yaklasik %50'sinden azinda anlamli HAHA, HACA› veya HAMA yanitlarina yol açma ve/veya tedavi edilen hastada düsük titrelere yol açmayla (çift antijenli enzim immünojenik tahliliyle ölçüldügünde yaklasik 300'den az, tercihen yaklasik lOO'den az) nitelenebilir (Elliott ve digerleri, Lancet Bu bulusun izole edilmis nükleik asitleri sinirlandirici olmamak üzere bir bagisiklik hastaligi veya rahatsizligi, bir kardiyovasküler rahatsizlik veya hastalik, enfeksiyöz, malign ve/veya nörolojik bir rahatsizlik veya hastaligin en az biri arasindan seçilen en az bir TNF hastaliginin bir hücre, doku, organ veya hayvandaki (memeliler ve insanlar dahil) etkisini ölçmek, bu hastaligin tanisini koymak, hastaligi izlemek, modüle etmek, tedavi etmek, hafifletmek, etkisinin önlenmesine yardim etmek veya semptomlarini azaltmak için kullanilabilen en az bir anti-TNF antikorunun veya bunun belirtilen varyantinin üretimi için kullanilabilir.

Böyle bir usul, en az bir anti-TNF antikoru içeren bir bilesimin veya farmasötik bir bilesimin etkili bir miktarinin böyle bir modülasyon, tedavi, hafifletme, önleme veya semptomlarin, etkilerin veya mekanizmalarin azaltilmasina ihtiyaç duyan bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastaya uygulanmasini içerebilir. Etkili miktar burada açiklanan veya ilgili alanda bilinen usuller kullanilarak yapildigi veya belirlendigi üzere tek (örnegin bolus), çoklu veya sürekli uygulama basina yaklasik 0.001 ila 500 mg/kg'lik bir miktari veya tek, çoklu veya sürekli uygulama basina 0.01-5000 ug/ml serum konsantrasyonuna ulasmak için gerekli bir miktari veya bunun etkili bir araligini veya degerini kapsayabilir.

Alintilar Burada referansta bulunulan bütün yayinlar veya patentler bu bulusun yapildigi zaman teknigin bilinen durumunu göstermekte ve/veya bu bulusun açiklamasini ve olanakli kilinmasini saglamaktadir. Yayinlar bilimsel yayinlari veya patent yayinlarina veya kayitli, elektronik veya basili formatlarin tamami dahil olmak üzere herhangi bir yayin formatinda bulunabilen herhangi bir diger bilgiye referansta bulunmaktadir. Asagidaki referanslardan özellikle söz edilmektedir: Ausubel, ve digerleri, der., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987- 2001); Sambrook, ve digerleri, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Basim, Cold. Spring Harbor, NY (1989); Harlow ve Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, ve digerleri, der., Current Protocols in ve digerleri, Current Protocols in Protein Science, John Wiley Bu Bulusun Antikorlari Bu bulusun en az bir anti-TNF antikoru istege bagli olarak bu alanda iyi bilindigi gibi bir hücre Çizgisi, karma bir hücre çizgisi, ölümsüzlestirilmis bir hücre veya hareketsizlestirilmis hücrelerin klonal popülasyonuyla üretilebilir. Örnegin bakiniz, Ausubel, ve digerleri, der., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Cloning: A Laboratory Manual, 2. Basim, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow ve Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, ve digerleri, der., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan ve digerleri, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Beseri TNE' proteinleri veya bunun fragmanlari için. spesifik olan beseri antikorlar izole edilmis ve/Veya TNF proteini veya bunun bir parçasi (sentetik peptitler gibi sentetik moleküller dahil) gibi uygun bir immünojik antijene karsi olusturulabilir. Diger spesifik veya genel memeli antikorlari benzer bir sekilde olusturulabilir. Immünojenik antijenlerin hazirlanmasi ve monoklonal antikor üretimi herhangi bir uygun teknikle yapilabilir.

Bir yaklasimda bir hibridom uygun bir ölümsüz hücre çizgisi (örnegin sinirlandirici olmamak üzere Sp2/O, Sp2/O-AGl4, N80, NEURO 2A. veya bunun gibi bir miyelom hücresi çizgisi veya heteromiyelomlar, bunlarin füzyon ürünleri veya bundan derive edilen herhangi bir hücre veya füzyon hücresi veya bu alanda bilinen herhangi bir baska uygun hücre çizgisi. Örnegin bkz. www.lifetech.com. ve benzeri) sinirlandirici olmamak üzere endojen veya heterolog nükleik asit olarak, rekombinant veya endojen, Viral, bakteriyel, alkal, prokaryotik, amfibi, böcek, Sürüngen, balik, memeli, kemirgen, esek, küçükbas hayvan, keçi, koyun, primat, ökaryotik, genomik DNA, cDNA, rDNa, mitokondriyal DNA veya RNA, kloroplast DNA veya RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, tek, çift veya üç iplikli, hibridize ve buna benzer veya herhangi bir kombinasyonu olarak izole edilmis veya klonlanmis dalak, periferik kan, lenf, bademcik gibi antikor üreten hücrelerle veya baska immün veya B hücresi içeren hücrelerle kaynastirilarak üretilir. Örnegin bakiniz, Asubel, yukarida ve Colligan, Immunology, yukarida, bölüm 2.

Antikor üretici hücreler ilgilenilen antijenle bagisiklik kazandirilmis insanlarin veya baska uygun hayvanlarin periferik kanindan veya tercihen dalak veya lenf nodüllerinden de elde edilebilir. Bu bulusun bir antikorunu, belirtilen fragmanini veya varyantini kodlayan heterolog veya endojen bir nükleik asidi eksprese etmek, için herhangi bir baska uygun konak hücre de kullanilabilir. Kaynasik hücreler (hibridomlar) veya rekombinant hücreler seçici kültür kosullari kullanilarak veya baska uygun bilinen usullerle izole edilebilir ve seyreltme sinirlandirilarak veya hücre siralamasi veya bilinen baska usullerle klonlanabilir. Istenen spesifiklige sahip antikorlar üreten hücreler uygun bir tahlille (örnegin ELISA) seçilebilir.

Sinirlandirici olmamak üzere bir peptit veya protein kitapligi (örnegin sinirlandirici olmamak üzere Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, BK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Iskoçya, BK; Biolnvent, Lund, Isveç; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys'den elde edilebildigi gibi bir bakteriyofaj, ribozom, oligonükleotit, RNA, cDNA› ve benzeri gösterim kitapligindan) rekombinant antikoru seçen usuller PCT/US91/O; veya stokastik olarak üretilmis simdi Applied Molecular Evolution (AME)) veya transgenik hayvanlara bagisiklik kazandirilmasina dayananlar (örnegin SICD fareleri, Nguyen ve digerleri, Microbiol. Immunol. (1998), bunun yani sira iliskili patentler ve basvurular) dahil olmak üzere gerekli spesifiklige sahip antikorlari üretmek veya izole etmek için uygun, bu alanda bilindigi ve/veya burada açiklandigi gibi bir beseri antikorlar repertuvarini üretebilen baska usuller de kullanilabilir. Bu teknikler arasinda sinirlandirici olmamak üzere ribozom gösterimi (Hanes ve digerleri, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:; Hanes ve digerleri, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 95:1: tek hücreli antikor üretme teknolojileri (Örnegin seçilmis lenfosit antikoru usulü (“SLAM”) (ABD Patenti No. 5,627,052, Wen ve jel mikrodamlacik ve akis sitometrisi (Powell ve digerleri, (Steenbakkers ve digerleri, Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak ve digerleri, Progress Biotech, Cilt 5, In Vitro Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Hollanda (1988)) yer alir.

Beseri olmayan veya beseri antikorlari üretmeye veya beserilestirmeye yönelik usuller de kullanilabilir ve bu alanda iyi bilinmektedir. Genellikle, beserilestirilmis veya üretilmis bir antikor insan disi bir kaynaktan, örnegin sinirlandirici olmamak üzere fare, siçan, tavsan, insan disi primat veya baska bir memeliden bir veya daha fazla amino asit kalintisina sahiptir. Bu beseri amino asit kalintilari siklikla, tipik olarak bilinen bir beseri dizinin “ithal” degisken, sabit veya baska bir alanindan alinan “ithal” kalintilar olarak geçer. Bilinen beseri Ig dizileri örnegin asagidaki kaynaklarda açiklanmaktadir: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edul-pedro/research_tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CHOS/kubyOS.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Inunune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/l996/Vlab/; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; www.aatibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.co m/; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/-hcl/; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime- u.ac.jp/~yasuhitolElisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; www.isac- net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni- baserv.uci.kun.nl/~jraatsl/inksl.html; www.recab.uni- hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uklimt- doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/Vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8lO4/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/SlideOl.html; www.cryst.bbk.ac.uk/-ubch7s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CCccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mX/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web- pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr_products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat. ve digerleri, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983).

Bu ithal diziler immünojenikligi azaltmak veya bu alanda bilindigi gibi baglanma, afinite, on-rate, off-rate, avidite, spesifiklik, yarilanma ömrü veya herhangi bir baska uygun özelligi azaltmak, arttirmak veya modifiye etmek için kullanilabilir. Genellikle beseri olmayan veya beseri CDR dizilerinin bir kismi veya tamami korunur, degisken ve sabit bölgelerin beseri olmayan dizileri beseri veya baska amino asitlerle degistirilir. Antikorlar istege bagli olarak antijen için yüksek. afinite ve diger elverisli biyolojik özellikler korunarak da beserilestirilebilir. Bu amaca ulasmak için, beserilestirilmis antikorlar istege bagli olarak parental ve beserilestirilmis dizilerin üç boyutlu modelleri kullanilarak parental dizilerin ve çesitli kavramsal beserilestirilmis ürünlerin bir analiz islemiyle hazirlanabilir. Üç boyutlu immünoglobülin modelleri yaygin bir sekilde bulunmakta ve bu alanda uzman olanlar tarafindan bilinmektedir. Seçilmis aday immünoglobülin dizilerinin muhtemel üç boyutlu sekilsel yapilarini örnekleyen ve gösteren bilgisayar programlari bulunmaktadir. Bu gösterimlerin incelenmesi, aday immünoglobülin dizisinin isleyisinde kalintilarin muhtemel rolünün analizine, yani aday immünoglobülinin antijenine baglanma kabiliyetini etkileyen kalintilarin analizine imkan verir. Böylelikle, FR kalintilari hedef antijen(ler) için daha fazla afinite gibi istenen antikor Özelligine ulasilacak sekilde konsensus dizileri ve ithal dizilerden seçilebilir ve birlestirilebilir. Genel olarak CDR kalintilari antijen baglanmasinin etkilenmesinde dogrudan ve en temel rolü oynar.

Bu bulusun antikorlari Winter (Jones ve digerleri, Nature Mol. Biol. 196:90l (1987), Carter' ve digerleri, Proc. Natl. açiklananlar gibi bilinen herhangi bir usul kullanilarak beserilestirilebilir veya üretilebilir.

Anti-TNF antikoru istege bagli olarak burada açiklandigi ve/veya bu alanda bilindigi gibi bir beseri antikorlar repertuvari üretebilen transgenik bir hayvana (örnegin fare, siçan, hamster, insan disi primat ve benzeri) bagisiklik kazandirilarak da üretilebilir. Bir beseri anti-TNF antikoru üreten hücreler burada açiklanan usuller gibi uygun usuller kullanilarak bu hayvanlardan izole edilebilir ve ölümsüzlestirilebilir.

Beseri antijenlere baglanan bir beseri antikorlar repertuvari üretebilen transgenik fareler` bilinen usullerle üretilebilir (örnegin sinirlandirici olmamak üzere ABD Patentleri No: Jakobovits ve digerlerine ait WO 98/50433, Jakobovits ve digerlerine ait WO 98/24893, Lonberg' ve digerlerine ait WO digerlerine ait WO 94/25585, Kucherlapate ve digerlerine ait Kucherlapate ve digerlerine ait EP 0710 719 A1, Surani ve digerlerine ait ABD Patenti No. 5,545.807, Bruggemann ve digerlerine ait WO 90/04036, Bruggemann ve digerlerine ait EP Lonberg ve digerlerine ait GB 2 272 440 A, Lonberg ve digerleri, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez ve (1996)). Genel olarak bu fareler islevsel olarak yeniden düzenlenmis veya islevsel yeniden düzenlemeden geçebilen en az bir beseri immünoglobülin yerinden DNA içeren en az bir transgene sahiptir. Bu tür farelerdeki endojen immünoglobülin yerleri, hayvanin endojen genler tarafindan kodlanan antikorlar üretme kapasitesini ortadan kaldirmak için yok edilebilir veya silinebilir.

Antikorlar benzer proteinlere veya fragmanlara spesifik baglanma açisindan elverisli bir sekilde peptit gösterim kitapliklari kullanilarak taranabilir. Bu usül istenen isleve veya yapiya sahip tek tek üyeler için büyük. peptit derlemelerinin taranmasini içerir. Peptit gösterim kitapliklarinin antikor taramasi bu alanda iyi bilinmektedir.

Gösterilen peptit dizileri 3 ila 5000 veya daha fazla amino asit uzunlugunda, siklikla 5-100 amino asit uzunlugunda ve çogunlukla yaklasik 8 ila 25 amino asit uzunlugunda olabilir.

Peptit kitapliklari üretmek için dolaysiz kimyasal sentez usullerinin yani sira, çesitli rekombinant DNA usulleri de açiklanmistir. Bir tip usul bir bakteriyofaj veya hücre yüzeyi üzerinde bir peptit dizisinin gösterilmesini içerir. Her bakteriyofaj veya hücre spesifik gösterilen peptit dizisini kodlayan nükleotit dizisini içerir. Bu usuller 91/17271, açiklanmaktadir. Peptit kitapliklari üretmek için baska sistemler heni in vitro kimyasal sentezin hem. de rekombinant usullerin özelliklerine sahiptir. Bakiniz Patent yayinlari No. vektör ve tarama kitleri Invitrogen (Carlsbad, CA) ve Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, BK) gibi tedarikçi firmalardan ticari olarak elde edilebilir. Örnegin devredilmis); 5885793 Cambridge Antibody Technologies'e devredilmis, Colligan, yukarida; Ausubel, yukarida; veya Sambrook, yukarida.

Bu bulusun antikorlari, sütlerinde bu tür antikorlari üreten keçiler, inekler, atlar, koyunlar ve bunun gibi transgenik hayvanlar veya memeliler elde etmek için en az bir anti-TNF antikoru kodlayan nükleik asit kullanilarak da hazirlanabilir.

Bu hayvanlar bilinen usuller kullanilarak temin edilebilir. Örnegin sinirlandirici olmamak üzere bakiniz. ABD Patentleri Bu bulusun antikorlari bu tür antikorlari, bunlarin belirtilen parçalarini veya varyantlarini bunlardan kültürlenen bitki parçalarinda veya hücrelerde üreten transgenik bitkiler ve kültürlenmis bitki hücreleri (örnegin sinirlandirici olmamak üzere tütün ve misir) temin etmek için en az bir anti-TNF antikoru kodlayan nükleik asit kullanilarak da hazirlanabilir.

Sinirlandirici olmayan bir örnek olarak rekombinant proteinleri eksprese eden transgenik tütün yapraklari, örnegin uyarilabilir bir promotör kullanilarak büyük miktarlarda rekombinant proteinler temin etmek için basariyla kullanilmistir. Örnegin bakiniz, Cramer ve digerleri, Curr. referanslar. Baska rekombinant sistemlerde üretilen veya dogal kaynaklardan saflastirilanlara denk biyolojik aktiviteleri olan memeli proteinlerini ticari üretim seviyelerinde eksprese etmek için transgenik misir da kullanilmistir. Örnegin bakiniz Hood ve digerleri, Adv. Exp.

Antikorlar, tütün tohumlari ve patates kökleri de dahil olmak üzere tek zincirli antikorlar (scFv"ler) gibi antikor fragmanlari içeren transgenik bitkilerden de büyük miktarlarda üretilmistir. Örnegin bakiniz Conrad ve digerleri, Plant Mol. bulusun antikorlari, bilinen usullere göre transgenik bitkiler kullanilarak da üretilebilir. Örnegin ayrica bakiniz Fischer Ve digerleri, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Ekim, referanslar.

Bulusun antikorlari beseri TNF'yi çok çesitli afinitelerle (Km baglayabilir. Tercih edilen bir düzenlemede, bu bulusun en az bir beseri mAb'si istege bagli olarak. beseri TNF'yi yüksek afiniteyle baglayabilir. Örnegin bir beseri mAb beseri TNF'yi yaklasik 10'7 M veya daha düsük, örnegin O.l-9.9 (veya buradaki l042, 10_13 veya buradaki herhangi bir aralik veya degerde bir KD ile baglayabilir.

Bir antikorun bir antijen için afinitesi veya aviditesi herhangi bir uygun usul kullanilarak deneysel olarak belirlenebilir. (Örnegin bakiniz Berzofsky ve digerleri, içinde, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); ve burada açiklanan usuller). Belirli bir antikor- antijen etkilesiminin ölçülen afinitesi farkli kosullar (örnegin tuz konsantrasyonu, pH) altinda ölçülürse degisebilir. Dolayisiyla, afinite ve baska antijen baglayici parametrelerin (örnegin K0, Ka, Kd) ölçümleri tercihen antikor ve antijenin standardize edilmis çözeltileriyle ve burada açiklanan tampon gibi standardize edilmis bir tamponla yapilir.

Nükleik Asit Molekülleri Burada sunulan bilgi kullanilarak, bu bulusun en az bir anti- TNF antikorunu kodlayan bir nükleik asit molekülü burada açiklanan veya bu alanda bilinen usuller kullanilarak elde edilebilir.

Bu bulusun nükleik asit. molekülleri klonlamayla elde edilen veya sentetik olarak üretilen mRNA, hnRNA, tRNA veya herhangi bir baska RNA formunda veya sinirlandirici olmamak üzere cDNA ve genomik DNA da dahil olmak üzere DNA formunda veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu olabilir. DNA üç iplikli, çift iplikli veya tek iplikli veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu. olabilir. DNA. veya RNA'nin. en az bir ipliginin herhangi bir parçasi sens iplik olarak da bilinen kodlama ipligi olabilir veya anti-sens iplik olarak da bilinen kodlayici olmayan iplik olabilir.

Burada açiklanan izole edilmis nükleik asit molekülleri arasinda bir veya daha fazla introna sahip bir açik okuma çerçevesi (ORF) içeren nükleik asit molekülleri, örnegin sinirlandirici olmamak üzere en az bir agir zincirin (örnegin DIZ ID NO: 1-3) veya hafif zincirin (örnegin DIZ ID NO: 4-6) CDR1, CDR2 ve/veya CDR3'ü gibi en az bir CDR'nin en az bir belirtilen parçasi; bir anti-TNF antikoru veya degisken bölge için kodlama dizisini (örnegin DIZ ID NO: 7, 8) içeren nükleik asit molekülleri; ve yukarida açiklananlardan esas itibariyla farkil olan, ama genetik kodun dejenerasyonuna bagli olarak burada açiklandigi ve/Veya bu alanda bilindigi gibi hâlâ en az bir anti-TNF antikorunu kodlayan bir nükleotit dizisini içeren nükleik asit molekülleri yer alir. Kuskusuz genetik kod. bu alanda iyi bilinmektedir. Dolayisiyla, bu alanda uzman olanlar için, bu bulusun spesifik anti-TNF antikorlarini kodlayan bu tür dejenere nükleik asit varyantlarini üretmek rutin bir islem olacaktir. Örnegin bakiniz Ausubel, ve digerleri, yukarida. Izole edilmis nükleik asit moleküllerinin sinirlandirici olmayan örnekleri arasinda, sirasiyla HC CDRl, HC CDR2, HC CDR3, LC CDRl, LC CDR2 ve LC CDR3'ü kodlayan bir nükleik asidin sinirlandirici olmayan örneklerine karsilik Burada belirtildigi gibi, bu bulusun bir anti-TNF antikorunu kodlayan bir nükleik asit içeren nükleik asit molekülleri arasinda sinirlandirici olmamak üzere, kendi basina bir antikor fragmaninin amino asit dizisini kodlayanlar; bütün antikor veya bir parçasi için kodlama dizisi; bir antikor, fragman veya parçasi için kodlama dizisinin yani sira ek diziler, örnegin sinirlandirici olmamak üzere uç birlestirme ve poliadenilasyon sinyalleri (örnegin mRNA'nin ribozom baglayiciligi ve stabilitesi) de dahil olmak üzere transkripsiyon, mRNA islemede bir rol oynamayan transkripsiyona tabi tutulmus, translasyondan geçirilmemis diziler gibi kodlayici olmayan 5' ve 3' dizileri de dahil olmak 'üzere ek, kodlayici olmayan dizilerle birlikte, en az bir intron gibi yukarida sözü edilen, ek kodlayici dizilerle birlikte veya bunlar olmadan en az bir sinyal lideri veya füzyon peptidinin kodlama dizisi; ek islevsellikler saglayanlar gibi ek amino asitleri kodlayan ek bir kodlama dizisi yer alir. Dolayisiyla bir antikoru kodlayan dizi bir markör dizisine, örnegin bir antikor fragmani veya parçasi içeren kaynasik antikorun saflastirilmasini kolaylastiran bir peptidi kodlayan bir diziye kaynastirilabilir.

Nükleik Asitlerin Olusturulmasi Bu bulusun izole edilmis nükleik asitleri bu alanda iyi bilindigi gibi (a) rekombinant usuller, (b) sentetik teknikler, (c) saflastirma teknikleri veya bunlarin kombinasyonlari kullanilarak yapilabilir.

Nükleik asitler elverisli bir sekilde bu bulusun bir polinükleotidine ek diziler içerebilir. Örnegin polinükleotidin izolasyonuna yardim etmek için nükleik asit içine bir veya daha fazla. endonükleaz kisitlama yeri içeren bir çoklu klonlama yeri dahil edilebilir. Bu bulusun translasyona tabi tutulmus polinükleotidinin izolasyonuna yardim etmek için translasyona tabi tutulabilir diziler dahil edilebilir. Örnegin bir heksa-histidin markör dizisi, bu bulusun proteinlerini saflastirmak için elverisli bir yol saglar. Bu bulusun nükleik asidi - kodlama dizisi haricinde - istege bagli olarak bu bulusun bir polinükleotidinin klonlanmasi ve/veya ekspresyonu için bir vektör, adaptör veya baglayicidir.

Klonlama ve/veya ekspresyondaki islevlerini optimize etmek için, polinükleotidin izolasyouna yardim etmek için veya polinükleotidin bir hücre içine girisini arttirmak için bu klonlama ve/Veya ekspresyon dizilerine ek diziler ilave edilebilir. Klonlama vektörleri, ekspresyon vektörleri, adaptörler ve baglayicilarin kullanimi bu alanda iyi bilinmektedir. (Örnegin bakiniz, Ausubel, yukarida; veya Sambrook, yukarida) Nükleik Asitleri Olusturmak Için Rekombinant Usuller RNA, cDNA, genomik DNA veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu gibi bu bulusun izole edilmis nükleik asit bilesimleri, bu alanda uzman olanlarin bildigi çesitli klonlama metodolojileri kullanilarak biyolojik kaynaklardan elde edilebilir. Bazi düzenlemelerde, zorlayici kosullar altinda seçici bir sekilde bu bulusun polinükleotidlerine hibridize olan oligonükleotit problari bir cDNA veya genomik DNA kitapliginda istenen diziyi belirlemek için kullanilir. RNA izolasyonu ve cDNA ve genomik kitapliklarin olusturulmasi bu alanda siradan vasiflara sahip olanlarca iyi bilinmektedir. (Örnegin bakiniz, Ausubel, yukarida; veya Sambrook, yukarida) Nükleik Asit Tarama ve Izolasyon Usulleri Bir cDNA veya genomik kitaplik burada açiklananlar gibi bu bulusun bir polinükleotidinin dizisine dayanan bir prob kullanilarak taranabilir. Problar ayni veya farkli organizmalardaki homolog genleri izole etmek için genomik DNA veya CDNA dizileriyle hibridizasyon için kullanilabilir. Bu alanda uzman olanlar tahlilde çesitli hibridizasyon zorlayicilik derecelerinin kullanilabilecegini takdir edeceklerdir; ve hibridizasyon veya yikama ortami zorlayici olabilir. Hibridizasyon kosullarinin zorlayiciligi arttikta, prob ile hedef arasinda çift olusumunun gerçeklesmesi için daha yüksek bir tamamlayicilik derecesi olmasi gerekir.

Zorlayicilik derecesi sicaklik, iyon gücü, pH ve formamit gibi kismen denatüre edici bir çözücünün varliginin biri veya daha fazlasiyla kontrol edilebilir. Örnegin, tepken çözeltinin polaritesi örnegin formamit konsantrasyonunun %0 ila %50 araligi içinde manipülasyonuyla degistirilerek hibridizasyonun zorlayiciligi kolayca degistirilebilir. Saptanabilir baglanma için gerekli olan tamamlayicilik (dizi özdesligi) derecesi hibridizasyon ortaminin ve/Veya yikama ortaminin zorlayiciligina göre degisecektir. Tamamlayicilik derecesi optimal olarak %100 veya %70-100 veya buradaki herhangi bir aralik veya deger olacaktir. Ancak. problar ve primerlerdeki küçük dizi farkliliklarinin hibridizasyon ve/veya yikama ortaminin zorlayiciligi azaltilarak telafi edilebilecegi anlasilmalidir.

RNA veya DNA amplifikasyonu usulleri bu alanda iyi bilinmektedir ve buradaki bilgiler ve rehberlik temelinde, gereksiz deneyler yapilmadan bu bulusa göre kullanilabilir.

Bilinen DNA veya RNA amplifikasyon usulleri arasinda sinirlandirici olmamak üzere polimeraz zincir reaksiyonu (PC) ve iliskili amplifikasyon islemleri (örnegin bakiniz ABD iplikli DNA sentezi için bir sablon olarak hedef diziye anti- sens 'RNA'yi kullanan RNA amplifikasyonu (ABD Patenti No. yer alir. (Örnegin bakiniz Ausubel, yukarida; veya Sambrook, yukarida.) Örnegin bu bulusun polinükleotitlerinin ve iliskili genlerin dizilerinin dogrudan genomik DNA veya cDNA kitapliklardan amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknolojisi kullanilabilir. PCR ve diger in vitro amplifikasyon usulleri, örnegin eksprese edilecek proteinleri kodlayan nükleik asit dizilerini klonlamak, istenen HRNA'nin numunelerde varligini saptamaya yönelik problar olarak kullanim için nükleik asitler olusturmak için veya baska amaçlarla yararli olabilir. Bu alanda uzman olanlari in vitro amplifikasyon usulleri konusunda yönlendirmek için yeterli olan teknikleri nörnekleri Berger, yukarida, Sambrook, yukarida ve Ausubel, yukarida, bunun yani sira Mullis, ve digerleri, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Der., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)'da bulunabilir. Genomik PCR amplifikasyonu için piyasada bulunan kitler bu alanda bilinmektedir. Örnegin bakiniz Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Ayrica uzun PCR ürünlerinin verimini arttirmak için örnegin T4 geni 32 proteini (Boehringer Mannheim) kullanilabilir.

Nükleik Asitleri Olusturmak için Sentetik Usuller Bu bulusun izole edilmis nükleik asitleri bilinen usullerle dogrudan kimyasal sentezle de hazirlanabilir (örnegin bakiniz Ausubel, ve digerleri, yukarida). Kimyasal sentez genellikle tek iplikli bir oligonükleotid üretir, bu tamamlayici bir diziyle hibridizasyon yoluyla veya tek ipligin bir sablon olarak kullanildigi bir DNA polimerazla polimerizasyon yoluyla çift iplikli DNA'ya dönüstürülebilir. DNA'nin kimyasal sentezi yaklasik 100 veya daha fazla baza sahip dizilerle sinirli olabilmekle birlikte, bu alanda uzman olanlar kisa dizilerin birbirine baglanmasiyla daha uzun diziler elde edilebilecegini takdir edeceklerdir.

Rekombinant Ekspresyon Kasetleri Bu bulus ayrica bu bulusun bir nükleik asidini içeren rekombinant ekspresyon kasetleri sunmaktadir. Bu bulusun bir nükleik asidi, örnegin bu bulusun bir antikorunu kodlayan bir cDNA 'veya bir genomik dizi, en az bir istenen konak hücre içine dahil edilebilen bir rekombinant ekpresyon kaseti olusturmak için kullanilabilir. Bir rekombinant ekspresyon kaseti tipik olarak islevsel bir sekilde hedeflenen konak hücrede polinükleotidin transkripsiyonunu yönlendirecek transkripsiyonu baslatilmasini düzenleme dizilerine bagli olan bu bulusun bir polinükleotidini içerecektir. Bu bulusun nükleik asitlerinin ekspresyonunu yönetmek için hem heterolog hem de heterolog olmayan (yani endojen) promotörler kullanilabilir.

Bazi düzenlemelerde, promotör, çogaltici veya baska elemanlar olarak islev gören izole edilmis nükleik asitler bu bulusun bir polinükleotidinin yukari veya asagi regülasyonunu saglayacak sekilde bu bulusun bir polinükleotidinin heterolog olmayan bir formu uygun bir pozisyona (akis yukari, akis asagi veya intron içine) dahil edilebilir. Örnegin endojen promotörler' mutasyon, silinme ve/Veya sübstitüsyonla in vivo veya in vitro degistirilebilir.

Vektörler ve Konak Hücreler Bu bulus ayrica bu bulusun izole edilmis nükleik asit moleküllerini içeren vektörlere, rekombinant vektörlerle genetik olarak üretilen konak hücrelere ve bu alanda iyi bilindigi gibi en az bir anti-TNF antikorunun rekombinant tenkiklerle üretimine iliskindir. Örnegin bakiniz Sambrook, ve digerleri, yukarida; Ausubel, ve digerleri, yukarida.

Polinükleotitler istege bagli olarak bir konak içinde çogalmak için seçilebilir bir markör içeren bir vektörle birlestirilebilir. Genellikle, bir plasmid vektörü bir kalsiyuni fosfat çökeltisi gibi bir çökelti içine veya yüklü bir lipidle bir kompleks içine dahil edilir. Vektör bir virüs ise, uygun bir paketleyici hücre çizgisi kullanilarak in vitro paketlenebilir ve sonra transdüksiyonla konak hücreler içine aktarilir.

DNA eklentisi uygun bir promotöre islevsel olarak bagli olmalidir. Ekspresyon olusumlari ayrica transkripsiyonun baslatilmasi, sonlandirilmasi için yerler ve transkripsiyona tabi tutulmus bölgede translasyon için bir ribozom baglama yeri içerecektir. Olusumlar tarafindan eksprese edilen olgun transkripsiyon kodlama kismi tercihen baslangiçta bir translasyon baslatma ve translasyona tabi tutulacak mRNA'nin ucunda uygun sekilde konumlandirilmis bir sonlandirma kodonu (örnegin UAA, UGA. veya UAG) içerecektir, UAA. ve UAG› memeli veya ökaryotik hücre ekspresyonu için tercih edilir Ekspresyon vektörleri tercihen ama istege bagli olarak en az bir seçilebilir markör içerecektir. Bu markörler arasinda sinirlandirici olmamak üzere ökaryotik hücre kültürü için metotreksat (MTX), dihidrofolat redüktaz (DHFR, ABD Patentleri glutamin sentetaz (GS, ABD Patentleri No. 5,122,464; veya prokaryotikleri kültürlemek için tetrasiklin veya ampisilin direnç genleri yer alir. Yukarida açiklanan konak hücreler` için uygun kültür ortamlari ve kosullari bu alanda bilinmektedir. Uygun vektörler bu alanda› uzman olanlar için açik olacaktir. Bir vektör olusumu bir konak hücre içine kalsiyum fosfat transfeksiyonu, DEAE-dekstran dolayimli transfeksiyon, katyonik lipid dolayimli transfeksiyon, elektroporasyon, transdüksiyon, enfeksiyon veya bilinen baska usullerle dahil edilebilir. Bu usuller bu alanda, örnegin Sambrook, yukarida, Bölüm 1-4 ve 16-18; Ausubel, yukarida, Bölüm 1, 9, 13, 15, l6'da açiklanmaktadir.

Bu bulusun en az bir antikoru modifiye edilmis bir formda, örnegin bir füzyon proteini olarak eksprese edilebilir ve sadece salgilama sinyalleri degil, ayni zamanda ek heterolog islevsel bölgeler içerebilir. Örnegin saflastirma sirasinda veya sonraki tasima ve depolama sirasinda stabiliteyi ve dayanikliligi arttirmak için bir antikorun N-terminusuna bir ek amino asitler, özellikle yüklü amino asitler bölgesi ilave edilebilir. Saflastirmayi kolaylastirmak için bu bulusun bir antikoruna. peptit. gruplari da ilave edilebilir. Bu› bölgeler bir antikorun nihai olarak hazirlanmasindan Önce veya bunun en az bir fragmaninda çikarilabilir. Bu usuller Sambrook, Bölüm 16, 17 ve 18 gibi birçok standart laboratuvar el kitabinda açiklanmaktadir.

Bu alanda siradan vasiflara sahip olanlar bu bulusun bir proteinini kodlayan bir nükleik asidin ekspresyonu için mevcut olan çok sayida ekspresyon sistemi konusunda bilgilidir.

Alternatif olarak, bu bulusun nükleik asitleri bir konak hücrede, bu bulusun bir antikorunu kodlayan endojen DNA içeren bir konak hücrede tahrikle (manipülasyonla) eksprese edilebilir. Bu usuller bu alanda iyi bilinmekte, örnegin ABD açiklanmaktadir.

Antikorlarin, belirtilen parçalarinin veya varyantlarinin üretimi için yararli olan hücre kültürlerinin örnekleri memeli hücreleridir. Memeli hücre sistemleri siklikla hücrelerin tek tabakalari formunda olacaktir, ancak memeli hücre süspansiyonlari veya biyoreaktörler de kullanilabilir. Bu alanda saglam glikozile proteinleri eksprese edebilen çesitli uygun konak hücre çizgileri gelistirilmistir ve bunlar arasinda COS-l (örnegin ATCC CRL 1650), COS-7 (örnegin ATCC CRL-, CHO (örnegin ATCC CRL hücre çizgileri, Cos-7 hücreleri, CHO hücreleri, hep G2 hücreleri, almaktadir, bunlar örnegin American Type Culture Collection, Manassas, Va'dan (www.atcc.org) kolayca elde edilebilir.

Tercih edilen konak hücreler arasinda miyelom ve lenfoma hücreleri gibi lenfoid. kökenli hücreler yer alir. Özellikle tercih edilen konak hücreler P3X63Ag8.653 hücreleri (ATCC Erisim Numarasi CRL-1580) ve SP2/O-Agl4 hücreleridir (ATCC Erisim Numarasi CRL-1851). Özellikle tercih edilen bir düzenlemede, rekombinant hücre bir P3X63Ab8.653 veya bir SP2/O-Ag14 hücresidir.

Bu hücreler için ekspresyon vektörleri arasinda sinirlandirici olmamak üzere bir replikasyon kaynagi; bir promotör (örnegin geç veya erken SV4O promotörleri, CMV promotörü (ABD bir pgk (fosfogliserat kinaz) promotörü, bir EF-l alfa promotörü (ABD Patenti No. 5,266,491), en az bir beseri immünoglobülin promotörü, bir Çogaltici ve/veya isleme bilgisi yerleri, örnegin ribozom baglama yerleri, RNA uç birlestirme yerleri, poliadenilasyon yerleri (örnegin bir SV4O büyük T Ag poli A ilave yeri) ve transkripsiyon sonlandirici diziler gibi ekspresyon kontrolü dizilerinin biri veya daha fazlasi yer alabilir. Örnegin bakiniz Ausubel ve digerleri, yukarida; Sambrook, ve digerleri, yukarida. Bu bulusun nükleik asitlerinin veya proteinlerinin üretimi için yararli olan diger hücreler bilinmektedir ve/Veya örnegin American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) veya baska. bir' bilinen veya ticari kaynaktan elde edilebilmektedir. Ökaryotik konak hücreler kullanildiginda, tipik olarak vektöre poliadenilasyon veya transkripsiyon sonlandirici diziler dahil edilir. Sonlandirici dizilerin bir örnegi sigir büyüme hormonu geninden poliadenilasyon dizisidir. Transkriptin dogru uç birlestirmesi için diziler de dahil edilebilir. Bir uç birlestirme dizisinin bir örnegi SV40'tan VPl introndur alanda bilindigi gibi vektöre konak hücrede replikasyonu kontrol etmek için gen dizileri de dahil edilebilir.

Bir Antikorun Safiastirilmasi Bir anti-TNF antikoru sinirlandirici olmamak kosuluyla protein A saflastirmasi, amonyum sülfat veya etanol çökeltme, asit ekstraksiyonu, anyon veya katyon degisimi kromatografisi, fosfoselüloz kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi, afinite kromatografisi, hidroksilapatit kromatografisi ve lesitin kromatografisi de dahil olmak üzere iyi bilinen usullerle rekombinant hücre kültürlerinden geri kazanilabilir ve saflastirilabilir. Saflastirma için yüksek performansli sivi kromatografisi de (“HPLC”) kullanilabilir. Örnegin bakiniz Colligan, Current Protocols in Immunology veya Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, Bu bulusun antikorlari dogal olarak saflasmis ürünleri, kimyasal sentez prosedürlerinin ürünlerini ve maya, daha yüksek bir bitki, böcek ve memeli hücreleri de dahil olmak üzere Ökaryotik bir konaktan rekombinant tekniklerle üretilen ürünleri kapsar. Bir rekombinant üretim prosedüründe kullanilan konaga bagli olarak, bu bulusun antikoru glikozile edilmis veya edilmemis olabilir, glikozile edilmis olmasi tercih edilir- Bu tür usuller Sambrook, yukarida, Kisim 17.37- Colligan, Protein Science, yukarida, Bölüm 12-14 gibi birçok standart laboratuvar el kitabinda açiklanmaktadir..

Anti-TNF Antikorlari Bu bulusun izole edilmis antikorlari herhangi bir uygun polinükleotit tarafindan kodlanan ilisikteki istemlerde belirtilen spesifik antikor amino asit dizisini veya herhangi bir izole edilmis veya hazirlanmis antikoru içerir. Tercihen beseri antikor beseri TNF'ye baglanir ve böylece proteinin en az bir biyolojik aktivitesini kismen veya hemen hemen tamamen nötralize eder. En az bir TNF proteininin veya fragmaninin en az bir biyolojik aktivitesini kismen veya tercihen hemen hemen tamamen nötralize eden bir antikor, proteini veya fragmani baglayabilir ve böylece TNF'nin TNF reseptörüne baglanmasi veya baska TNF'ye bagimli veya onun aracilik ettigi mekanizmalar araciligiyla aktiviteleri inhibe eder. Burada aktiviteyi tahlile bagli olarak yaklasik %20-120, tercihen en fazla inhibe edebilen bir antikoru belirtir. Bir anti-TNF antikorunun TNF'ye bagimli bir aktiviteyi inhibe etme kapasitesi tercihen burada açiklandigi ve/veya bu alanda bilindigi gibi en az bir` uygun TNF proteini veya reseptörü tahliliyle tahlil edilir. Bulusun bir beseri antikoru herhangi bir siniftan (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD ve benzeri) veya herhangi bir izotip olabilir ve bir kappa veya lambda hafif zinciri içerebilir. Bir düzenlemede beseri antikor bir IgG agir zinciri veya bunun tanimli bir fragmanini, örnegin IgGl, lgG2, IgG3 veya 1gG4 izotiplerinin herhangi birini içerir. Bu tip antikorlar, burada açiklandigi ve/Veya bu alanda bilindigi gibi en az bir beseri hafif zincir (örneginIgG, IgA ve IgM (örnegin v1, y2, y3, y4)) transgeni içeren transgenik bir fare veya baska transgenik, insan disi bir memeli kullanilarak hazirlanabilir. Baska bir düzenlemede, anti-beseri TNF beseri antikoru bir IgGl agir zinciri ve bir IgGl hafif zinciri Bulusun en az bir antikoru en az bir TNF proteini, alt birimi, fragmani, parçasi veya bunlarin herhangi bir kombinasyonuna spesifik en az bir belirtilen epitopu baglar. En az bir epitop sözü edilen, proteinin en az bir* parçasini içeren en az bir antikor' baglama bölgesi içerebilir, bu epitop tercihen sözü edilen proteinin en az bir* hücre disi, çözünür, hidrofilik, dissal veya sitoplazmik parçasindan olusur. En az bir belirtilen epitop DIZ ID NO:9'un en az 1-3 amino asitli en az bir amino asit dizisi ila bitisik amino asitlerinin bütün belirtilen parçasi araligindaki herhangi bir kombinasyonu içerebilir.

Mevcut bulusun antikoru ya da antijen baglayici fragmani, üç agir zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) ve üç hafif zincir tamamlayicilik belirleme bölgesine (CDR) sahip olan bir insan monoklonal antikoru ya da bunun antijen baglayici fragmani olup, içerisindeki üç agir zincir CDR'si sekil 4'te tarif edildigi gibi mAb TNVl48'in uygun CDR'lerinin amino asit dizisine sahiptir; üç hafif zincir CDR'si Sekil 5'te tarif edildigi gibi mAb TNVl48'in uygun CDR'lerinin amino asit dizisine sahiptir; ve söz konusu antikor ya da fragman, 0.1- 9.9 x 10”-1 M'ye esit ya da daha az bir KD degerine sahip bir insan TNF'ye baglanir. Bu antikorlar kimyasal olarak geleneksel teknikler kullanarak antikorun çesitli kisimlarinin (örnegin CDR'ler, çerçeve) kimyasal olarak birlestirilmesi, geleneksel rekombinan DNA teknolojisi teknikleri kullanarak ya da baska uygun herhangi bir metot kullanarak antikoru kodlayan bir (yani bir ya da daha fazla) nükleik asit molekülünün hazirlanmasi ve eksprese edilmesi yoluyla hazirlanabilir.

Anti-TNF antikoru Sekil 4 ve 5'te açiklandigi gibi mAb TNV148 ve mAb TNVl48B'nin birinin agir ve hafif zincir degisken bölgelerini içerebilir- Beseri TNF'ye baglanan ve tanimli bir agir veya hafif zincir degisken bölgesi içeren antikorlar, faj gösterimi (Katsube, Y., ve digerleri, Int J Mol. Med, bilindigi ve/veya burada açiklandigi gibi transgenik hayvanlarin kullanildigi usuller kullanilarak hazirlanabilir. Örnegin islevsel olarak yeniden düzenlenmis bir beseri immünoglobülin agir zincir transgenine ve islevsel yeniden düzenlemeye tabi tutulabilen bir beseri immünoglobülin hafif zincir yerinden DNA içeren bir transgene sahip bir transgenik fareye, antikorlarin üretimini saglamak için beseri TNF veya bunun bir fragmaniyla bagisiklik kazandirilabilir. Istenirse, burada açiklandigi ve/veya bu alanda bilindigi gibi antikor üretici hücreler izole edilebilir~ ve hibridomlar veya baska ölümsüzlestirilmis antikor üretici hücreler hazirlanabilir.

Alternatif olarak antikor, belirtilen parçasi veya varyanti, kodlayici nükleik asit veya parçasi kullanilarak uygun bir konak hücrede eksprese edilebilir.

Koruyucu bir amino asit sübstitüsyonu bir ilk amino asidin, ilk amino aside benzer kimyasal ve/veya fiziksel özelliklere (Örnegin yük, yapi, polarite, hidrofobiklik/hidrofiliklik) sahip ikinci bir amino asitle degistirilmesini belirtir.

Koruyucu sübstitüsyonlar arasinda asagidaki gruplar içinde bir amino asidin bir digeriyle degistirilmesi yer alir: lizin (K), arginin (R) ve histidin (H); aspartat (D) ve glutamat (E); asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D ve E; alanin (A), valin (V), lösin (L), izolösün (I), prolin (P), fenilalanin (F), triptofan (W), metionin (M), sistein (C) ve glisin (G); F, W ve Y; C, 8 ve T.

Amino Asit Kodlari TEK HARFLI ÜÇ HARFLI ÜÇ NÜKLEOTITLI KODON(LAR) C Cys Sistein UGC, UGU Aspartik GAC, GAU Glutamik GAA, GAG F Phe Fenilalanin› UUC, UUU H His Histidin CAC, CAU l Ile Izolösin AUA, AUC, AUU K Lys Lizin AAA, AAG L Leu Lösin M Met Metionin AUG N Asn Asparagin AAC, AAU P Pro Prolin CCA, CCC, CCG, CCU Q Gln Glutamin CAA, CAG R Arg Arginin T Thr Treonin ACA, ACC, ACG, ACU W Trp Triptofan UGG Y Tyr Tirozin UAC, UAU Bu bulusun bir anti-TNF antikoru burada belirtildigi gibi, dogal mutasyonlara veya insanlar tarafindan manipülasyona bagli olarak bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu, silinmesi veya ilavesi içerebilir.

Kuskusuz bu alanda uzman olanlarin yapacagi amino asit sübstitüsyonlarinin sayisi yukarida açiklananlar da dahil olmak üzere birçok faktöre baglidir. Genel anlamda, herhangi bir belirli anti-TNF antikoru, fragmani veya varyanti için amino asit sübstitüsyonlari, eklemeleri veya silinmelerinin örnegin 1-130 veya buradaki herhangi bir aralik veya deger olacaktir.

Bu bulusun bir anti-TNF antikorunda islev için temel önemde olan amino asitler yer yönelimli mutagenez veya alanin tarama mutagenezi gibi bu alanda bilinen usullerle belirlenebilir (örnegin Ausubel, yukarida, Bölüm 8, 15; Cunningham ve Wells, kalintida tek alanin mutasyonlari dahil eder. Daha sonra elde edilen mutant moleküller sinirlandirici olmamak üzere en az bir TNF nötralize aktivite gibi biyolojik aktivite açisindan test edilir. Antikor* baglanmasi için kritik olan yerler de kristalizasyon, nükleer manyetik rezonans veya fotoafiniteyle isaretleme gibi yapisal analizle de belirlenebilir (Smith ve Bu alanda uzman olanlarin takdir edecegi gibi, bu bulus, bu bulusun EMI az bir biyolojik olarak aktif antikorunu içerir.

Biyolojik olarak aktif antikorlar, dogal (sentetik olmayan), endojen veya iliskili ve bilinen antikorun aktivitesinin en az olan bir spesifik aktiviteye sahiptir. Enzimatik aktivite ve substrat spesifikligini degerlendirme ve ölçme usulleri bu alanda uzman olanlarca iyi bilinmektedir.

Bu bulus baska bir yönüyle, bir organik grubun kovalent olarak baglanmasiyla modifiye edilen, burada açiklandigi gibi beseri antikorlara ve antijen baglayici fragmanlara iliskindir. Bu modifikasyon farmakokinetik özellikleri gelismis (örnegin in vivo serum yarilanma ömrü artmis) bir antikor ya da antijen baglayici fragman üretebilir. Organik grup dogrusal veya dallanmis bir hidrofilik polimerik grup, yag asidi grubu veya yag asidi ester grubu olabilir. Özel düzenlemelerde, hidrofilik polimerik grubun molekül agirligi yaklasik 800 ila yaklasik 120,000 Dalton olabilir ve bu grup bir polialkan glikol (örnegin polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol (PPG)), karbonhidrat polimeri, amino asit polimeri veya polivinil pirolidon olabilir ve yag asidi veya yag asidi ester grubu yaklasik sekiz ila yaklasik kirk karbon atomu içerebilir.

Bulusun modifiye edilmis antikorlari ve antijen baglayici fragmanlari antikora dogrudan veya dolayli bir sekilde kovalent olarak. baglanmis bir veya daha fazla organik. grup içerebilir. Bulusun bir antikoruna ya da antijen baglayici fragmanina bagli olan her organik grup bagimsiz bir sekilde hidrofilik bir polimerik grup, bir yag asidi grubu veya bir yag asidi ester grubu olabilir. Burada “yag asidi” terimi, mono-karboksilik asitleri ve di-karboksilik asitleri kapsar.

Bir “hidrofilik polimerik. grup" terimi burada suda oktanda oldugundan daha çok çözünür olan bir organik polimeri belirtmektedir. Örnegin polilizin suda oktanda oldugundan daha çok çözünür. Dolayisiyla polilizinin kovalent olarak baglanmasiyla modifiye edilmis bir antikor bulusun çerçevesi içine girmektedir. Bulusun antikorlarini modifiye etmek için uygun hidrofilik polimerler dogrusal veya dallanmis olabilir ve bunlar arasinda örnegin polialkan glikoller (örnegin PEG, monometoksi-polietilen glikol (mPEG), PPG ve benzeri), karbonhidratlar (örnegin dekstran, selüloz, oligosakaritler, polisakaritler ve benzeri), hidrofilik amino asitlerin polimerleri (Örnegin polilizin, poliarginin, poliaspartat ve benzeri), polialkan oksitler (örnegin polietilen oksit, polipropilen oksit ve benzeri) ve polivinil pirolidon yer alir. Tercihen bulusun antikorunu modifiye eden hidrofilik polimerin molekül agirligi ayri bir moleküler varlik olarak yaklasik 800 ila yaklasik 150,000 Daltondur. Örnegin alt karakterin Dalton olarak polimerin ortalama molekül agirligi oldugu PEGwoo ve PEGm,mo kullanilabilir. Hidrofilik polimerik grup bir ila yaklasik alti alkil, yag asidi veya yag asidi ester grubuyla sübstitüe edilebilir. Bir yag asidi veya yag asidi ester grubuyla sübstitüe edilen hidrofilik polimerler uygun usuller kullanilarak hazirlanabilir. Örnegin bir amin grubu içeren bir polimer yag asidinin veya yag asidi esterin bir karboksilatina baglanabilir ve bir yag asidi veya yag asidi ester üzerindeki bir aktiflesmis karboksilat (örnegin N,N-karbonil diimidazolle aktiflesmis) bir polimer üzerindeki bir hidroksil grubuna baglanabilir.

Bulusun antikorlarini modifiye etmek için uygun yag asitleri ve yag asidi esterler doymus olabilir veya bir veya daha fazla doymamislik birimi içerebilir. Bulusun antikorlarini modifiye etmek için uygun olan yag asitleri arasinda örnegin n- dodekanoat (Cu, laurat), n-tetradekanoat (CM, miristat), n- oktadekanoat (Cim stearat), n-eikozanoat “ho, arakidat) , n- dokozanoat (C2, behenat), n-triakontanoat (Cm), n- tetrakontanoat (Cm), cis-A9-oktadekanoat (Cm, oleat), hep cis- A5,8,ll,l4-eikozatetraenoat (Can arakidonat), oktandioik asit, tetradekandioik. asit, oktadekandioik asit, dokozandioik asit ve benzeri yer alir. Uygun yag asidi esterler arasinda dogrusal veya dallanmis bir düsük alkil grubu içeren dikarboksilik asitlerin Hwno-esterleri yer alir. Düsük alkil grubu bir ila yaklasik on iki, tercihen bir ila yaklasik alti karbon atomu içerir.

Modifiye edilmis beseri antikorlar ve antijen baglayici fragmanlar bir veya daha fazla modifiye edici maddeyle reaksiyon gibi uygun usuller kullanilarak hazirlanabilir. Bir içeren uygun bir organik grubu (örnegin hidrofilik polimer, bir yag asidi, bir yag asidi esteri) belirtir. “Aktive edici grup” uygun kosullar altinda ikinci bir kimyasal grupla reaksiyona girerek. modifiye edici madde ile ikinci kimyasal grup arasinda kovalent bir bag olusturabilen kimyasal bir grup veya islevsel bir gruptur. Örnegin aminle reaktif aktive edici gruplar arasinda tosilat, mesilat, halo (kloro, bromo, floro, iyodo), N-hidroksisüksinimidil esterler (NHS) gibi elektrofilik gruplar ve benzeri yer alir. Tiollerle reaksiyona girebilen aktive edici gruplar arasinda örnegin maleimit, iyodoasetil, akriloil, piridil disülfürler, 5-tiol-2- nitrobenzoik asit tiol (TNB-tiol) ve benzeri yer alir. Bir aldehit islevsel grubu amin veya hidrazit içeren Hmleküllere baglanabilir ve bir azit grubu üç degerli bir fosfor grubuyla reaksiyona girerek fosforamidat veya fosforimit baglari olusturabilir. Moleküllere aktive edici gruplari dahil etmek için uygun usuller* bu alanda. bilinmektedir (örnegin. bakiniz Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques. Academic Press: San Diego, CA (1996)). Aktive edici bir grup organik gruba (örnegin hidrofilik polimer, yag asidi, yag asidi ester) dogrudan veya dogrusal bir grup vasitasiyla, örnegin bir veya daha fazla karbon atomunun oksijen, azot veya kükürt gibi bir heteroatomla degistirilebildigi iki degerli bir Ci-Cm grubu vasitasiyla baglanabilir. Uygun baglayici gruplar arasinda örnegin tetraetilen glikol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2- -CH20-CH2-CH2-O-CH-CHz-O-CH-NH- yer alir. Bir baglayici grup içeren modifiye edici maddeler örnegin, serbest amin ile yag asidi karboksilat arasinda bir amit bagi olusturmak için bir mono-Boc-alkildiamin (örnegin mono-Boc-etilendiamin, mono-Boc- diaminoheksan) l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimidin (EDC) varliginda bir yag asidiyle reaksiyona sokularak üretilebilir. Üründen Boc koruyucu grubu, açiklandigi gibi baska bir karboksilata baglanabilen bir primer amini açiga çikarmak için triflorasetik asitle (TFA) muamele yoluyla çikarilabilir veya maleik anhidrürle muameleden geçirildikten sonra elde edilen ürün siklize edilerek yag asidinin aktiflesmis bir` maleimido türevi üretilir (Örnegin bakiniz Thompson, ve digerleri, WO 92/l6221).

Bulusun modifiye edilmis antikorlari, bir beseri antikor ya da antijen baglayici fragman modifiye edici bir maddeyle reaksiyona sokularak üretilebilir. Örnegin, organik gruplar PEG'in bir NH esteri gibi aminle reaktif bir Hwdifiye edici madde kullanilarak yere spesifik olmayan bir sekilde antikora baglanabilir. Modifiye edilmis beseri antikorlar ya da antijen baglayici fragmanlar, bir antikorun veya antikor baglayici fragmaninin disülfür baglari (örnegin zincir içi disülfür baglari) indirgenerek de hazirlanabilir. Daha sonra indirgenen antikor ya da antijen baglayici fragman tiolle reaktif modifiye edici bir maddeyle reaksiyona sokularak bulusun modifiye edilmis antikoru üretilebilir. Bu bulusun bir antikorunun spesifik yerlerine baganan organik bir grup içeren modifiye edilmis beseri antikorlar ya da antijen baglayici fragmanlar, ters proteoliz (Fisch ve digerleri, Bioconjugate Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)'da açiklanan usuller kullanilarak hazirlanabilir.

ANTI-TNF ANTIKOR BILESIMLERI Bu bulus ayrica burada açiklandigi ve/veya bu alanda bilindigi gibi, dogal olarak olusmus bir bilesim, karisim veya formda temin edilen, en az bir, en az iki, en az üç, en az dört, en az bes, en az alti veya daha fazla anti-TNF antikoru içeren en az bir anti-TNF antikor bilesimi sunmaktadir.

Bu bulusun› anti-TNF antikor` bilesimleri ayrica herhangi bir uygun ve etkili miktarda, böyle bir modülasyon, tedavi veya terapiye ihtiyaç duyan bir hücreye, dokuya, organa, hayvana veya hastaya uygulanan en az bir anti-TNF antikoru içeren en az bir bilesim veya farmasötik bilesim içerebilir, ayrica en az bir TNF antagonisti (örnegin sinirlandirici olmamak üzere bir TNF antikoru veya fragmani, çözünür bir TNF reseptörü veya fragmani, bunlarin füzyon proteinleri veya küçük moleküllü bir TNF antagonisti), bir antiromatizmal (örnegin metotreksat, auranofin, aurotioglukoz, azatioprin, etanersept, altin sodyum tiomalat, hidroksiklorokin sülfat, leflunomit, sülfasalzin), bir kas gevsetici, bir narkotik, steroid olmayan antienflamatuvar bir ilaç (NSAID), bir analjezik, bir anestetik, bir yatistirici, bir lokal anestetik, bir nöromüsküler bloker, bir antimikrobiyal (örnegin aminoglikozit, bir antifungal, bir antiparazitik, bir antiviral, bir karbapenem, sefalosporin, bir flororkinolon, bir makrolit, bir penisilin, bir sülfonamit, bir tetrasiklin, baska bir antimikrobiyal), bir antipsoriatik, bir kortikosteroid, bir anabolik steroid, diyabetle iliskili bir madde, bir* mineral, bir besleyici, bir tiroid. maddesi, bir Vitamin, kalsiyumla iliskili bir hormon, bir antidiyareik, bir öksürük kesici, bir antiemetik, bir ülser önleyici, bir müshil, bir* antikoagülan, bir eritropoietin, (örnegin epoetin alfa), bir filgrastim (örnegin G-CSF, Neupogen), bir sargramostim (GM-GSF, Leukine), bir asi, bir immünoglobülin, bir immünosüpresif (örnegin basiliksimab, siklosporin, daklizumab), bir büyüme hormonu, bir hormon replasmani ilaci, bir östrojen reseptörü modülatörü, bir midriatik, bir sikloplejik, alkilleyici bir madde, bir antimetabolit, bir mitotik inhibitör, bir radyofarmasötik, bir antidepresan, antimanik madde, bir antipsikotik, bir anksiyolitik, bir hipnotik, bir sempatomimetik, bir uyarici, donepezil, takrin, bir astim ilaci, bir beta agonisti, teneffüsle çekilen bir steroid, bir lökotrien inhibitörü, bir metilksantin, bir kromolin, bir epinefrin veya analogu, dornaz alfa (Pulmozym), bir sitokin veya sitokin antagonisti arasindan en az birini içerir. Bu sitokinlerin sinirlandirici olmayan örnekleri arasinda örnegin IL-l ila IL-23'ün herhangi biri yer alir.

Uygun dozajlar` bu alanda iyi bilinmektedir. Örnegin bakiniz Wells ve digerleri, der., Pharmacotherapy Handbook, 2. Basim, Appleton and. Lange, Stamford, CT (2000); PDR. Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Bu kansere karsi veya enfeksiyon önleyici maddeler bu bulusun en az bir antikoruyla iliskili, bagli, birlikte formüle edilen veya birlikte uygulanan toksin molekülleri de içerebilir.Toksin istege bagli olarak patolojik hücreyi veya dokuyu seçici bir sekilde öldürme etkisi yapabilir. Patolojik hücre bir kanser hücresi veya baska bir hücre olabilir. Bu toksinler sinirlandirici olmamak üzere saflastirilmis veya rekombinant toksin veya toksinin en az bir islevsel sitotoksik alanini içeren toksin fragmani olabilir, örnegin risin, difteri toksini, bir venom toksini veya bir bakteriyel toksin arasindan seçilir. Toksin terimi ayrica ölümle sonuçlanabilen, toksin soku da dahil olmak üzere insanlarda ve baska memelilerde herhangi bir patolojik hastaliga neden olabilen, dogal olarak olusan, mutant veya rekombinant bakteriler veya Virüsler tarafindan üretilen endotoksinleri ve eksotoksinleri de kapsamaktadir. Bu toksinler arasinda sinirlandirici olmamak kosuluyla enterotoksijenik E. coli isiya dayaniksiz enterotoksini (LT), isiya dayanikli enterotoksin (ST), Shigella sitotoksin, Aeromonas enterotoksinleri, toksik sok sendromu toksin-l (TSST-l), Stafilokoksik enterotoksin A (SEA), B (SEB) veya C (SEC), Streptokoksik enterotoksinler ve benzeri yer alir. Bu bakteriler arasinda sinirlandirici olmamak kosuluyla bir enterotoksijenik E. coli (ETEC) türünün suslari, enterohemorajik E. coli (örnegin serotip 0157:H7 suslari), Stafilokok türleri (örnegin Staphylococcus aureus, Staphylococcus .pyogenes), Shigella türleri (örnegin Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii ve Shigella sonnei), Salmonella türleri (örnegin Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium türleri (örnegin Clostridium _perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacter türleri (örnegin Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), Heliobakter türleri, (örnegin Heliobacter pylori), Aeroinonas türleri (örnegin Aeromonas sobria, Aeromonas hidrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios türleri (örnegin Vibrios cholerae, Vibrios _parahemolyticus), Klebsiella türleri, Pseudomonas aeruginosa ve Streptokoklar` yer alir.Örnegin bakiniz Stein, der., INTERNAL MEDICINE, 3. basim, s. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans ve digerleri, der., Bacterial digerleri, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3.

Basim., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow ve digerleri, der., The Merck Manual, 16. basim, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood ve digerleri, FEMS Microbiology Bu bulusun anti-TNF antikor bilesikleri, bilesimleri veya kombinasyonlari ayrica sinirlandirici olmamak üzere seyreltici, baglayici, stabilizatör, tamponlar, tuzlar, lipofilik çözücüler, koruyucu, adjuvan veya bunun gibi herhangi bir uygun yardimci maddenin herhangi birini içerebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir yardimci maddeler tercih edilir. Bu steril çözeltilerin ve bunlari hazirlamaya yönelik usullerin sinirlandirici olmayan örnekleri bu alanda bilinmekte, örnegin sinirlandirici olmamak üzere Gennaro, Der., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Basim, Mack Publishing Co. (Baston, PA) 1990'da açiklanmaktadir. Bu alanda iyi bilindigi veya burada açiklandigi gibi anti-TNF antikor ya da fragman bilesiminin uygulama biçimi, çözünürlügü ve/veya stabilitesi için uygun olan farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar rutin bir sekilde seçilebilir.

Bu bulusta yararli olan farmasötik eksipiyanlar ve katki maddeleri arasinda sinirlandirici olmamak üzere, tek tek veya kombinasyon halinde bulunabilen, tek basina veya kombinasyon halinde agirlikça veya hacimce %1-99.99 miktarinda olabilen proteinler, peptitler, amino asitler, lipidler ve karbonhidratlar (örnegin monosakaritler, di-, tri-, tetra- ve oligosakaritler de dahil olmak üzere sekerler; alditoller, aldonik asitler, esterifiye edilmis sekerler ve bunun gibi derive edilmis sekerler; ve polisakaritler ve seker polimerler) yer alir. Örnek protein eksipiyanlari arasinda serum albümini, örnegin beseri serum albümini (HSA), rekombinant beseri albümin (rHA), jelatin, kazein ve benzeri yer alir. Bir tamponlama islevi de görebilen temsil edici amino asit/antikor bilesenleri arasinda alanin, glisin, arginin, betain, histidin, glutamik asit, aspartik asit, sistein, lizin, lösin, izolösin, valin, metionin, fenilalanin, aspartani ve benzeri yer alir. Tercih edilen bir amino asit glisindir.

Bulusta kullanim için uygun karbonhidrat eksipiyanlar arasinda örnegin fruktoz, maltoz, galaktoz, glukoz, D-manoz, sorboz ve bunun gibi monosakaritler; laktoz, sükroz, trehaloz, selobiyoz ve bunun gibi disakaritler; rafinoz, melezitoz, maltodekstrinler, dekstranlar, nisastalar ve bunun gibi polisakaritler; ve manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol sorbitol (glusitol), miyoinozitol ve bunun gibi alditoller` yer alir. Bu bulusta kullanini için tercih. edilen karbonhidrat eksipiyanlar manitol, trehaloz ve rafinozdur.

Anti-TNF antikor bilesimleri bir tampon veya pH ayarlayici bir madde de içerebilir; tipik olarak tampon bir organik asit veya bazdan hazirlanan bir tuzdur Temsil edici tamponlar arasinda sitrik asit, askorbik asit, glukonik asit, karbonik asit, tartarik. asit, süksinik asit, asetik asit veya ftalik asit tuzlari gibi organik asit tuzlari; Tris, trometamin, hidroklorür veya fosfat tamponlar yer alir. Bu bulusta kullanim için tercih edilen tamponlar sitrat gibi organik asit tuzlaridir.

Ayrica bu bulusun bir anti-TNF antikoru polimerik eksipiyanlar/katki maddeleri, örnegin polivinilpirolidonlar, fikoller (polimerik bir seker), dekstratlar (örnegin 2- hidroksihpropil-ß-siklodekstrin gibi siklodekstrinler), polietilen glikoller, tat verici maddeler, antimikrobiyal maddeler, tatlandiricilar, antioksidanlar, antistatik maddeler, yüzey aktif maddeler (örnegin “TWEEN 20” ve “TWEEN 80” gibi polisorbatlar), lipidler (örnegin fosfolipidler, yag asitleri), steroidler (örnegin kolesterol) ve çelatlama maddeleri (örnegin EDTA) içerebilir.

Bunlar ve bulusa uygun anti-TNF antikor bilesimlerinde kullanim için uygun olan bilinen diger farmasötik eksipiyanlar ve/veya katki maddeleri bu alanda bilinmekte, örnegin Williams & Williams, (1995) ve “Physician's Desk Reference", 52. Basim, Medical Economics, Montvale, NJ (1998)'de listelenmektedir. Tercih edilen tasiyici veya eksipiyan malzemeler karbonhidratlar (örnegin sakaritler ve alditoller) ve tamponlar (örnegin sitrat) veya polimerik maddelerdir.

Formülasyonlar Yukarida belirtildigi gibi, bulus, farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyon içinde en az bir TNF antikoru içeren, farmasötikte 'veya veterinerlikte kullanimi için 'uygun tercihen salinle veya seçilen bir tuzla bir fosfat tamponu olan stabil formülasyonlarin yani sira bir koruyucu içeren korunmus çözeltiler ve formülasyonlar, ayrica çok kullanimlik korunmus formülasyonlar sunmaktadir. Korunmus formülasyonlar en az bir bilinen koruyucu içerir veya istege bagli olarak fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, klorokrezol, benzil alkol, fenilmerkürik nitrit, fenoksietanol, formaldehit, klorobütanol, magnezyum klorür (örnegin heksahidrat), alkilparaben (metil, etil, propil, bütil ve benzeri), benzalkonyum klorür, benzetonyum klorür, sodyum dehidroasetat ve timerosalden olusan gruptan veya bunlarin sulu bir seyreltici içindeki karisimlarindan seçilir. Bu alanda bilinen herhangi bir uygun konsantrasyon veya karisim, örnegin %0.001- veya buradaki herhangi bir aralik, örnegin sinirlandirici 4.8, 4.9 veya buradaki herhangi bir aralik veya dager kullanilabilir. Sinirlandirici olmayan örnekler arasinda hiç koruyucu kullanilmamasi, %0.1-2 m-krezol (örnegin %0.2, 0.3. ve benzeri yer alir.

Yukarida belirtildigi gibi, bulus ambalaj malzemesi ve istege bagli olarak. sulu bir seyreltici içinde en az bir anti-TNF antikorunun önerilen tamponlar ve/veya koruyucularla bir çözeltisini içeren en az bir siseyi haiz bir imalat ürünü sunmaktadir, burada sözü edilen ambalaj malzemesi bu bekletilebilecegini belirten bir etiket içerir. Bulus ayrica ambalaj malzemesi, liyofilize edilmis en az bir anti-TNF antikoru içeren bir ilk sise ve önerilen tampon veya koruyucunun sulu bir seyrelticisini içeren ikinci bir siseye haiz bir imalat ürünü sunmaktadir, burada sözü edilen ambalaj malzemesi hastaya yirmi dört saat veya daha uzun bir süre bekletilebilen bir çözelti olusturmak için en az bir anti-TNF antikorunun sulu seyreltici içinde yeniden sulandirilmasi talimatini veren bir etiket içerir.

Bu bulusa göre kullanilan en az bir anti-TNF antikoru örnegin memeli hücresinden veya transgenik terkiplerden rekombinant yollarla üretilebilir veya burada açiklandigi veya bu alanda bilindigi gibi baska biyolojik kaynaklardan saflastirilabilir.

Bu `bulusun ürününde en az bir anti-TNF antikorunun Iniktari, islak/kuru bir sistemde ise, yeniden sulandirildiginda yaklasik 1.0 ug/ml ila yaklasik 1000 mg/ml araligindaki konsantrasyonlari veren miktarlari kapsar, ancak daha düsük ve daha yüksek konsantrasyonlar kullanilabilir ve amaçlanan iletim aracina baglidir, örnegin çözelti formülasyonlari transdermal flaster, pulmoner, transmukozal veya ozmotik veya mikro pompa usullerinde farkli olacaktir.

Tercihen, sulu seyreltici ayrica istege bagli olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir koruyucu içerir. Tercih edilen koruyucular arasinda fenol, m-krezol, p-krezol, o- krezol, klorokrezol, benzil alkol, alkilparaben (metil, etil, propil, bütil ve benzeri), benzalkonyum klorur, benzetonyum klorür, sodyum dehidroasetat ve timerazol veya bunlarin karisimlarindan olusan gruptan seçilenler yer alir.

Formülasyonda kullanilan koruyucu konsantrasyonlari antimikrobiyal bir etki elde etmek için yeterli bir konsantrasyondur. Bu konsantrasyonlar seçilen koruyucuya baglidir ve bu alanda uzman olanlar tarafindan kolayca belirlenebilir.

Seyrelticiye istege bagli olarak ve tercihen baska eksipiyanlar, örnegin izotonisite maddeleri, tamponlar, antioksidanlar, koruyucu çogalticilar ilave edilebilir.

Gliserin gibi bir izotonisite maddesi genellikle bilinen konsantrasyonlarda kullanilir. Fizyolojik olarak tolere edilen bir tampon tercihen daha yüksek pH kontrolü saglamak için ilave edilir. Formülasyonlar yaklasik pH 4 ila yaklasik pH 10 gibi genis bir pH araligini kapsayabilir ve tercih edilen araliklar yaklasik pH 5 ila yaklasik pH 9'dur ve en çok tercih edilen aralik yaklasik 6-0 ila yaklasik 8.0'dir. Tercihen bu bulusun formülasyonlarinin pH'si yaklasik 6.8 ila yaklasik 8.0 araligindadir. Tercihen bu bulusun formulasyonlarinin pH'si yaklasik 6.8 ile yaklasik 7.8 arasindadir. Tercih edilen tamponlar arasinda fosfat tamponlar, en çok tercih edilen durumda sodyum fosfat, özellikle fosfat tamponlu salin (PBS) yer alir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir çözündürücüler, örnegin Tween 20 (polioksietilen (20) sorbitan monolaurat), Tween 40 (polioksietilen (20) sorbitan monopalmitat), Tween 80 (polioksietilen (20) sorbitan monooleat), Pluronic F68 (polioksietilen polioksipropilen blok kopolimerleri) ve PEG (polietilen glikol) veya noniyonik yüzey aktif maddeler, Pluronic® poliller, diger blok kopolimerleri ve EDTA ve EGTA gibi çelatlayicilar gibi baska katki maddeleri istege bagli olarak formülasyonlara veya bilesimlere toplasmayi önlemek için ilave edilebilir. Formülasyonu uygulamak için bir pompa veya plastik bir kap kullaniliyorsa bu katki maddeleri özellikle yararlidir. Farmasötik olarak kabul edilebilir yüzey aktif maddenin varligi proteinin toplasma egilimini azaltir.

Bu bulusun formülasyonlari en az bir anti-TNF antikoru ile fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, klorokrezol, benzil alkol, alkilparaben, (metil, etil, propil, bütil ve benzeri), benzalkonyum klorür, benzetonyum klorür, sodyum dehidroasetat ve timerosal veya bunlarin karisimlarinin sulu bir seyreltici içinde karistirilmasini içeren bir islemle hazirlanabilir. En az bir anti-TNF antikoru ve koruyucunun sulu bir seyreltici içinde karistirilmasi, geleneksel eritme ve karistirma prosedürleriyle uygulanir. Uygun bir formülasyon hazirlamak için, örnegin tamponlu bir çözelti içinde en az bir anti-TNF antikorunun ölçülmüs bir miktari istenen konsantrasyonlarda protein ve koruyucuyu temin etmek için yeterli miktarlarda tamponlu bir çözelti içinde istenen koruyucuyla birlestirilir.

Bu usulün degisik biçimleri bu alanda siradan vasiflara sahip olanlarca takdir edilecektir. Örnegin bilesenlerin ilave edilme sirasi, ek katki maddelerinin kullanilip kullanilmayacagi, formülasyonun hazirlandigi sicaklik ve pH kullanilan konsantrasyon ve uygulama yolu için optimize edilebilen faktörlerdir.

Talep edilen formülasyonlar hastalara berrak çözeltiler olarak veya liyofilize edilmis en az bir anti-TNF antikorunu içeren bir sise ve bunun susuz bir seyreltici içinde yeniden sulandirildigi su, bir koruyucu ve/veya eksipiyanlar, tercihen bir fosfat tampon ve/Veya salin ve seçilmis bir tuz içeren ikinci bir sise olarak iki sise halinde temin edilebilir. Tek çözelti sisesi veya yeniden sulandirilmayi gerektiren çift sise birçok kez kullanilabilir ve hasta tedavisinin tek veya birden fazla kürü için yeterli olabilir ve dolayisiyla su anda mevcut olana göre daha elverisli bir tedavi rejimi temin edebilir.

Burada talep edilen imalat ürünleri, hemen ila yirmi dört saat veya daha uzun bir sürede uygulama için yararlidir.

Dolayisiyla burada talep edilen imalat ürünleri hasta için baska önemli avantajlar sunar. Bulusun formülasyonlari istege bagli olarak yaklasik 2 ila yaklasik 40°C araligindaki sicakliklarda güvenli bir sekilde depolanabilir ve proteinin biyolojik aktivitesini uzun sürelerle koruyabilirler, veya daha uzun bir süre bekletilebilecegini ve/veya kullanilabilecegini gösteren bir ambalaj etiketinin kullanilmasina imkan verirler. Korunmus seyreltici kullanilirsa, bu etiket 1-12 ay, alti ay, bir buçuk ve/veya iki yila kadar kullanimi önerebilir.

Bu bulustaki en az bir anti-TNF antikorunun çözeltileri, en az bir antikorun susuz bir seyreltici içinde karistirilmasini içeren bir islemle hazirlanabilir. Karistirma geleneksel eritme ve karistirma prosedürleriyle yapilabilir.

Uygun bir formülasyon hazirlamak için, örnegin su veya tampon içinde en az bir antikorun ölçülmüs bir miktari proteini temin etmek için yeterli miktarlarda ve istege bagli olarak istenen konsantrasyonlarda bir koruyucu veya tamponla birlestirilir.

Bu usulün degisik biçimleri bu alanda siradan vasiflara sahip olanlarca takdir edilecektir. Örnegin bilesenlerin ilave edilme sirasi, ek katki maddelerinin kullanilip kullanilmayacagi, formülasyonun hazirlandigi sicaklik ve pH kullanilan konsantrasyon ve uygulama yolu için optimize edilebilen faktörlerdir.

Talep edilen formülasyonlar hastalara berrak çözeltiler olarak veya liyofilize edilmis en az bir anti-TNF antikorunu içeren bir sise ve bunun yeniden sulandirildigi bir seyreltici içeren ikinci bir sise olarak iki sise halinde temin edilebilir. Tek çözelti sisesi veya yeniden sulandirilmayi gerektiren çift sise birçok kez kullanilabilir ve hasta tedavisinin tek veya birden fazla kürü için yeterli olabilir ve dolayisiyla su anda mevcut olana göre daha elverisli bir tedavi rejimi temin edebilir.

Talep edilen ürünler eczanelere, kliniklere veya bu tür baska kurumlara. ve kuruluslara. berrak çözeltiler olarak. veya sulu seyrelticiyi içeren ikinci bir siseyle yeniden sulandirilan liyofilize edilmis en az bir anti-TNF antikoru sisesi içeren ikili siseler olarak verilerek hastalara dolayli yolla sunulabilir. Bu durumda berrak çözelti bir litreye kadar veya daha büyük boyutta olabilir, böylece daha küçük siselere aktarilmak üzere bir veya birkaç kez en az bir antikor çözeltisinin daha küçük porsiyonlarinin alinabildigi ve eczane veya klinik tarafindan müsterilerine ve/veya hastalarina sunulabildigi büyük bir depo temin edebilir.

Bu tek siseli sistemleri içeren bilinen aletler arasinda Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Isviçre, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products , Weston Medical (Peterborough, BK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com) tarafindan hazirlanan veya gelistirilen IM) Pens, :BD Autojector@, Humaject®r NovoPen®, B- D®Pen, AutoPen® ve OptiPen®, GenotropinPenQ, Genotronorm Pen& Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject® gibi bir çözeltinin iletimi için kalem-enjektör aletleri yer alir. Iki siseli bir sistemi haiz taninmis aletler arasinda HumatroPen® gibi yeniden sulandirilmis çözeltinin iletimi için bir kartus içinde liyofilize edilen bir ilacin yeniden sulandirilmasina yönelik kalem-enjektör sistemleri yer alir.

Burada talep edilen ürünler ambalaj malzemesi içerir. Ambalaj malzemesi düzenleyici kurumlar tarafindan istenen bilgilere ek olarak, ürünün kullanilabilecegi kosullari belirtir. Bu bulusun ambalaj malzemesi hastaya en az bir anti-TNF antikorunun, bir çözelti olusturmak ve çözeltiyi iki siseli, islak/kuru ürünü için 2-24 saat veya daha uzun bir süre kullanmak için sulu seyreltici içinde yeniden sulandirma talimatlari verir. Tek siseli çözelti ürünü için, etiket bu çözeltinin 2-24 saat veya daha uzun bir süre kullanilabilecegini belirtir. Burada talep edilen ürünler insanlarda farmasötik ürün kullanimi için yararlidir.

Bu bulusun formülasyonlari en az bir anti-TNF antikoru ve seçilmis bir tampon, tercihen salin veya seçilmis bir tuz içeren bir fosfat tamponunun karistirilmasini içeren bir islemle hazirlanabilir. En az bir antikor ve tamponun sulu bir seyreltici içinde karistirilmasi geleneksel eritme ve karistirma prosedürleriyla yapilir. Uygun bir formülasyon hazirlamak için, örnegin su veya tampon içinde en az bir antikorun ölçülmüs bir miktari, istenen konsantrasyonlarda proteini ve tamponu temin etmek için yeterli ndktarlarda su içinde istenen tamponlama maddesiyle birlestirilir. Bu islemin degisik biçimleri bu alanda siradan vasiflara sahip olanlar tarafindan bilinmektedir. Örnegin bilesenlerin ilave edilme sirasi, ek katki maddelerinin kullanilip kullanilmadigi, formülasyonun hazirlandigi sicaklik ve pH kullanilan konsantrasyon ve uygulama yolu için optimize edilebilen faktörlerdir.

Talep edilen stabil veya korunmus formülasyonlar hastalara berrak çözeltiler olarak veya sulu bir seyreltici içinde bir koruyucu veya tampon ve eksipiyanlar içeren ikinci bir siseyle yeniden sulandirilan liyofilize edilmis en az bir anti-TNF antikoru içeren bir siseyi haiz çift siseli sistemler olarak temin edilebilir. Tek çözelti siseli sistem de yeniden sulandirilmasi gereken çift siseli sistem de birden fazla kez tekrar kullanilabilir ve hasta tedavisinin tek veya birden fazla kürü için yeterli olabilir ve dolayisiyla su anda mevcut olana göre daha elverisli bir tedavi rejimi temin eder.

Burada açiklanan stabil veya korunmus formülasyonlar veya çözeltiler içindeki en az bir anti-TNF antikoru bu bulusa göre bir hastaya deri altina veya kas içine enjeksiyon, transdermal, pulmoner, transmukozal, implant, ozmotik pompa, kartus, mikro pompa da dahil olmak üzere çesitli iletim usulleriyle veya bu alanda iyi bilindigi gibi bu alanda uzman olanlarin takdir edecegi baska yollarla uygulanabilir.

Terapötik Uygulamalar Bulusun antikoru veya bilesimi bu alanda bilindigi veya burada açiklandigi gibi bir hücrede, dokuda, organda, hayvanda veya hastada TNF'yle iliskili en az bir hastaligi module veya tedavi etmeye yönelik olabilir. Özellikle bunlar bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada, obezite, bagisiklikla iliskili bir hastalik, bir kardiyovasküler hastalik, bir enfeksiyöz hastalik, malign bir hastalik veya nörolojik bir hastalik da dahil olmak üzere TNF'yle iliskili en az bir hastaligi module veya tedavi edebilir.

Daha spesifik olarak bunlar bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada sinirlandirici olmamak üzere romatoid artrit, genç tipi romatoid artrit, sistemik baslayan genç tipi romatoid artrit, psoriatik artrit, ankilozan spondilit, mide ülseri, seronegatif artropatiler, osteoartrit, enflamatuvar bagirsak hastaligi, ülseratif kolit, sistemik lupus eritematoz, antifosfolipid sendromu, iridosiklit/üveit/optik sinir iltihabi, idyopatik pulmoner fibroz, sistemik vaskülit/Wegener granülamatozu, sarkoidoz, orsit/vazektomi tersine çevirme prosedürleri, alerjik/atopik hastaliklar, astim, alerjik rinit, egzema, alerjik temas dermatiti, alerjik konjunktivit, asiri duyarlilik pnömoniti, transplantlar, organ nakli reddi, graft-versus-host hastaligi, sistemik enflamatuvar yanit sendromu, septisemi sendromu, gram pozitif septisemi, gram negatif septisemi, kültür negatif septisemi, fungal septisemi, nötropenik ates, üroseptisemi, menengokoksemi, travma/kan kaybi, yaniklar, iyonizan radyasyon maruziyeti, eriskin solunum güçlügü sendromu, romatoid artrit, alkolün yol açtigi hepatit, kronik enflamatuvar patolojiler, sarkoidoz, Crohn patolojisi, orak hücreli anemi, diyabet, nefroz, atopik hastaliklar, asiri duyarlilik reaksiyonlari, alerjik rinit, saman nezlesi, sürekli rinit, konjunktivit, endometriyozis, astim, ürtiker, sistemik anafilaksi, dermatit, kötücül anemi, hemolitik hastalik, trombositopeni, herhangi bir organ veya dokunun gref reddi, böbrek nakli reddi, kalp nakli reddi, karaciger nakli reddi, pankreas nakli reddi, akciger nakli reddi, kemik iligi nakli (BMT) reddi, deri allogref reddi, kikirdak nakli reddi, kemik grefi reddi, ince bagirsak nakli reddi, fetal timüs implanti reddi, paratiroid nakli reddi, herhangi bir organ veya dokunun ksenogref reddi, allogref reddi, anti-reseptör asiri duyarlilik reaksiyonlari, Graves hastaligi, Raynoud hastaligi, tip B insüline dirençli diyabet, astim, myastenia gravis, antikor dolayimli sitotoksisite, tip III asiri duyarlilik reaksiyonlari, sistemik lupus eritematosus, POEMS sendromu (polinöropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gamopati ve deri degisiklikleri sendromu), polinöropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gamopati, deri degisiklikleri sendromu, antifosfolipid sendromu, pemfigüs, skleroderma, karma bag dokusu hastaligi, idyopatik Addison hastaligi, diabetes mellitus, kronik aktif hepatit, primer biliyer siroz, vitiligo, vaskülit, MI sonrasi kardiyotomi sendromu, tip IV asiri duyarliligi, temas dermatiti, asiri duyarliliga bagli pnömonit, allogref reddi, hücre içi organizmalara bagli granülomlar, ilaç hassasiyeti, metabolik/idyopatik Wilson hastaligi, hemakromatoz, alfa-l-antitripsin yetersizligi, diyabetik retinopati, hashimoto tiroiditi, osteoporoz, hipotalamik-hipofiz-adrenal ekseni degerlendirmesi, primer biliyer siroz, tiroidit, ansefalomiyelit, kaseksi, kistik fibroz, yenidogan kronik akciger hastaligi, kronik obstrüktif akciger hastaligi (COPD), ailesel hematofagositik lenfohistiositoz, dermatolojik hastaliklar, psoriasis (sedef hastaligi), alopesi, nefrotik sendrom, nefrit, glomerüler nefrit, akut böbrek yetmezligi, hemodiyaliz, üremi, toksisite, preeklampsi, okt3 terapisi, anti-cd3 terapisi, sitokin terapisi, kemoterapi, radyasyon terapisi (örnegin sinirlandirici olmamak üzere toasteni, anemi, kaseksi ve benzeri dahil), kronik salisilat zehirlenmesi ve benzeri de dahil olmak üzere bagisiklikla iliskili en az bir hastaligi modüle veya tedavi edebilirler. Örnegin bakiniz, Merck Manual, digerleri, der., Ikinci Basim, Appleton ve Lange, Stamford, Bulusun antikoru veya bilesimi bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada, sinirlandirici olmamak kosuluyla, kardiyak sok sendromu, miyokart enfarktüsü, konjestif kalp yetmezligi, felç, iskemik felç, kan kaybi, arteryoskleroz, ateroskleroz, restenoz, diyabetik ateryosklerotik hastalik, hipertansiyon, arteryel hipertansiyon, renovasküler hipertansiyon, senkop, sok, kardiyovasküler sistemde sifilis, kalp yetmezligi, kor pulmonale, primer pulmoner hipertansiyon, kardiyak aritmiler, atriyal ektopik atislar, atriyal çarpinti, atriyal fibrilasyon (kalici veya nöbetler halinde), post perfüzyon sendromu, kardiyopulmoner baypas enflamasyon yaniti, kaotik veya çok Odakli atriyal tasikardi, düzenli dar QRS tasikardi, spesifik aritmiler, ventriküler fibrilasyon, his demeti aritmileri, atriyoventriküler blok, demet dal blogu, miyokardiyal iskemik rahatsizliklar, koroner arter hastaligi, angina pektoris, miyokardiyal enfarktüs, kardiyomiyopati, açilmis konjestif kardiyomiyopati, kisitlayici kardiyomiyopati, valvüler kalp hastaliklari, endokardit, perikardiyal hastalik, kalp tümörleri, aortik ve periferal anevrizmalar, aortik diseksiyon, aort enflamasyonu, abdominal aortun ve dallarinin tikanmasi, periferal vasküler rahatsizliklar, tikayici arter rahatsizliklari, periferal aterosklerotik hastalik, tromboanjit obliterans, islevsel periferal arter rahatsizliklari, Raynaud fenomeni ve hastaligi, akrosiyanoz, eritromelalji, venöz hastaliklar, ven trombozu, varis, arteryovenöz fistüller, lenfödem, lipödem, kararsiz angina, reperfüzyon zedelenmesi, post pompa sendromu, iskemi- reperfüzyon zedelenmesi ve benzeri de dahil olmak üzere en az bir` kardiyovasküler` hastaligi modüle veya tedavi etmek için olabilir.

Bulusun antikoru veya bilesimi bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada, sinirlandirici olmamak üzere akut veya kronik bakteriyel enfeksiyon, akut ve kronik parazitik veya enfeksiyöz süreçler,örnegin bakteriyel, viral ve fungal enfeksiyonlar, HIV enfeksiyonu/HIV nöropatisi, menenjit, hepatit (A, B veya C veya benzeri), septik artrit, peritonit, pnömoni, epiglotit, e. coli 0157:h7, hemolitik üremik sendrom/trombolitik trombositopenik purpura, sitma, dengue hemorajik atesi, laysmanyaz, lepra, toksik sok sendromu, streptokoksik miyozit, gazli gangren, mikobakteriyum tüberküloz, mikobakteriyum avium hücreiçi, pnömokistik karini pnömoni, pelvik enflamatuvar hastaligi, orsit/epididimit, lejyonella, lime hastaligi, grip, epstein-barr virüsü, yasamsal hemafagositik sendrom, yasamsal ansefalit/aseptik menenjit ve benzerinin en az biri de dahil olmak üzere en az bir enfeksiyöz hastaligi module veya tedavi etmek için olabilir.

Bulusun antikoru veya bilesimi, bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada, sinirlandirici olmamak kosuluyla lösemi, akut lösemi, akut lenfoblastik lösemi (ALL), B-hücresi, T-hücresi veya FAB ALL, akut miyeloit lösemi (AML), kronik miyelositik lösemi (CML), kronik lenfositik lösemi (CLL), saçakli hücreli lösemi, miyelodisplastik sendrom (MDS), bir lenfom, Hodgkin hastaligi, Hodgkin olmayan lenfoma, Burkitt lenfomasi, multipl miyelom, Kaposi sarkomu, kolorektal karsinom, pankreatik karsinom, nazofaringeal karsinom, malign histiositoz, paraneoplastik sendrom/maligniteye bagli hiperkalsemi, kati tümörler, adenokarsinomlar, sarkomlar, malign melanom, hemanjiyom, metastatik hastalik, kanserle iliskili kemik emilimi, kanserle iliskili kemik agrisi. ve benzerinin. en az biri dahil olmak üzere en az bir malign hastaligi modüle veya tedavi etmek içindir.

Bulusun antikoru veya bilesimi bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastada, sinirlandirici olmamak kosuluyla nörodejeneratif hastaliklar, multipl skleroz, migren bas agrisi, AIDS demans kompleksi, multipl skleroz ve akut transvers miyelit gibi demiyelinizan hastaliklar; kortikospinal sistem lezyonlari gibi ekstrapiramidal ve serebellar rahatsizliklar; bazal gangliyon rahatsizliklari veya serebellar rahatsizliklar; Huntington Koreasi ve yaslilik koreasi gibi hiperkinetik hareket rahatsizliklari; merkezi sinir sistemi dopamin reseptörlerini bloke eden ilaçlarin yol açtigi bozukluklar gibi ilaçlarin yol açtigi hareket bozukluklari; Parkinson hastaligi gibi hipokinetik hareket bozukluklari; Ilerleyici supranükleo Palsi; serebellumda yapisal lezyonlar; spinal ataksi, Friedreich ataksisi, serebellar kortikal dejenerasyon çoklu sistem. dejenerasyonlari (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi- Drager ve Machado-Joseph) gibi spinoserebellar dejenerasyonlar; sistemik rahatsizliklar (Refsum hastaligi, abetalipoprotemi, ataksi, telanjiyektazi ve mitokondrial çoklu sistem hastaligi); multipl skleroz, akut transvers miyelit gibi demiyelinizan core hastaliklari; ve nörojenik kas atrofileri (amyotrofik lateral skleroz, çocuklarda spinal kas atrofisi, genç tipi spinal kas atrofisi gibi ön boynuz hücresi dejenerasyonu) gibi motor birim rahatsizliklari; Alzheimer hastaligi; orta yasta Down Sendromu; Yaygin Lewy cisimcigi hastaligi; Lewy cisimcigi tipi Yaslilik. Bunamasi; Wernicke- Korsakoff sendromu; kronik alkolizm; Creutzfeldt-Jakob hastaligi; Subakut sklerozan panensefalit; ve Dementia pugilistica ve benzerinin en az biri dahil olmak üzere en az bir nörolojik hastaligi modüle veya tedavi etmeye yönelik olabilir. Örnegin bakiniz Merck Manual, 16. Basim, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

Bu bulusun bilesimleri ihtiyaç duyan bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastaya etkili bir miktarin uygulanmasini içeren bir usulde kullanilabilir. Böyle bir usul ayrica, bu tür bagisiklik hastaliklarinin tedavisi için birlikte uygulama veya kombinasyon tedavisini içerebilir, burada sözü edilen bilesigin uygulanmasi ayrica daha önce, ayni zamanda ve/veya daha sonra en az bir TNF antagonisti (örnegin sinirlandirici olmamak üzere bir TNF antikoru veya fragmani, çözünür bir TNF reseptörü veya fragmani, bunun füzyon proteinleri veya küçük moleküllü bir TNF agonisti), bir antiromatizmal (örnegin metotreksat, auranofin, aurotioglukoz, azatioprin, etanersept, altin sodyum tiomalat, hidroksiklorokin sülfat, leflunomit, sülfazalzin), bir kas gevsetici, bir narkotik, steroid olmayan bir antienflamatuvar ilaç (NSAID), bir analjezik, bir yatistirici, bir lokal anestezi maddesi, bir nöromüsküler bloker, bir antimikrobiyal (örnegin aminoglikozit, bir antifungal, bir antiparazitik, bir antiviral, bir karbapenem, sefalosporin, bir flororkinolon, bir makrolit, bir penisilin, bir sülfonamit, bir tetrasiklin, baska bir antimikrobiyal), bir antipsoriatik, bir kortikosteroid, bir anabolik steroid, diyabetle iliskili bir madde, bir mineral, bir besleyici, bir tiroid maddesi, bir vitamin, kalsiyumla iliskili bir hormon, bir antidiyareik, bir öksürük kesici, bir antiemetik, bir ülser önleyici, bir müshil, bir antikoagülan, bir eritropoietin (örnegin epoetin alfa), bir filgrastim (örnegin G-CSF, Neupogen), bir sargramostim (GM-GSF, Leukine), bir asi, bir immünoglobülin, bir immünosüpresif (örnegin basiliksimab, siklosporin, daklizumab), bir büyüme hormonu, bir hormon replasmani ilaci, bir östrojen reseptörü modülatörü, bir midriyatik, bir sikloplejik, alkilleyici bir madde, bir antimetabolit, bir mitotik inhibitör, bir radyofarmasötik, bir antidepresan, antimanik madde, bir antipsikotik, bir anksiyolitik, bir hipnotik, bir sempatomimetik, bir uyarici, donepezil, takrin, bir astim ilaci, bir beta agonisti, teneffüsle çekilen bir steroid, bir lökotrien inhibitörü, bir metilksantin, bir kromolin, bir epinefrin veya analogu, dornaz alfa (Pulmozym), bir sitokin veya sitokin antagonisti arasindan en (az birinin uygulanmasini içerir. Uygun dozajlar bu alanda iyi bilinmektedir, örnegin bakiniz Wells ve digerleri, der., Pharmacotherapy Handbook, 2. Basim, Appleton ve Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Bu bulusun bilesimleri, kombinasyon tedavisi, birlikte uygulama islemi, tertibatlari ve/veya usulleri için uygun TNF antagonistleri (ayrica bu bulusun en az bir antikorunu, bunun belirtilen parçasini ve varyantini içeren) arasinda sinirlandirici olmamak üzere anti-TNF antikorlari, bunlarin antijen baglayici fragmanlari, TNF'ye spesifik olarak baglanan reseptör molekülleri; TNF sentezini, TNF salimini veya hedef hücreler üzerindeki etkisini önleyen ve/veya inhibe eden bilesikler, örnegin talidomit, tenidap, fosfodiesteraz inhibitörleri (örnegin pentoksifilin ve rolipram), A2b adenozin reseptörü agonistleri ve A2b adenozin reseptörü çogalticilar; mitojenin aktive ettigi protein (MAP) kinaz inhibitörleri gibi TNF reseptörü sinyallerini önleyen ve/veya inhibe eden bilesikler; metaloproteinaz inhibitörleri gibi zar TNF yarilmasini bloke ve/veya inhibe eden bilesikler; anjiyotensin dönüstürücü enzim (ACE) inhibitörleri (örnegin kaptopril) gibi TNF aktivitesini bloke ve/Veya inhibe eden bilesikler; ve MAP kinaz inhibitörleri gibi TNF üretimini ve/veya sentezini bloke ve/Veya inhibe eden bilesikler yer Burada. bir “tümöri nekroz faktörü› antikoru,” “TNF antikoru,” vitro, in situ ve/Veya tercihen in Vivo azaltir, bloke eder, inhibe eder, iptal eder veya bu aktiviteye müdahale eder. Örnegin bu bulusun uygun bir TNF beseri antikoru TNFd'yi baglayabilir ve anti-TNF antikorlari, bunlarin antikor baglayici fragmanlari ve spesifik olarak TNFd'ya baglanan belirtilen mutantlari veya alanlarini kapsar. Uygun bir TNF antikoru veya fragmani TNF RNA, DNA veya protein sentezi, TNF salimi, TNF reseptörü sinyalleri, zar TNF yarilmasi, TNF aktivitesi, TNF üretimi ve/Veya sentezini de azaltabilir, bloke edebilir, iptal edebilir, önleyebilir, inhibe edebilir ve/Veya buna müdahale edebilir.

Kimerik antikor cA2, A2 olarak adlandirilan yüksek afiniteli fare anti-beseri TNFd IgGl antikorunun degisken bölgesini ve beseri IgGl kappa immünoglobülin sabit bölgelerini baglayan antijenden olusur. Beseri IgGl Fc bölgesi allojeneik antikor efektör islevini gelistirir, dolasan serum yarilanma ömrünü arttirir ve antikorun immünojenikligini azaltir. Kimerik antikor cA2'nin aviditesi ve epitop spesifikligi siçangil antikor A2'nin degisken bölgesinden derive edilir. Özel bir düzenlemede, siçangil A2'nin degisken bölgesini kodlayan nükleik asitler için tercih edilen bir kaynak A2 hibdirom hücre çizgisidir.

Kimerik A2 (CA2) hem dogal hem de rekombinant beseri TNFd'nin sitotoksik etkisini doza bagimli bir sekilde nötralize eder.

Kimerik antikor cA2 ve rekombinant beseri TNAd'nin baglanma tahlillerinden, kimerik antikor cA2'nin afinite katsayisi l.O4xlOlûM*1 olarak hesaplandi. Rekabetçi inhibisyonla monoklonal antikor spesifikligini ve afinitesini belirlemek için tercih edilen usuller Harlow, ve digerleri, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring› Harbor, New York, l988; Colligan ve digerleri, der., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozbor ve digerleri, der. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Özel bir düzenlemede, siçangil monoklonal antikoru A2, C134A olarak adlandirilan bir hücre çizgisi tarafindan üretilir.

Kimerik antikor cA2, cl68A olarak adlandirilan bir hücre çizgisi tarafindan üretilir.

Bu bulusta kullanilabilen monoklonal anti-TNF antikorlarinin diger örnekleri bu alanda açiklanmaktadir (örnegin bakiniz ABD Patenti No. 5,231,024; Moller, A. ve digerleri, Cytokine (dosyalama tarihi 11 Eylül 1992); Rathjen ve digerleri, Uluslararasi Yayin No. WO 91/02078 (yayimlanma tarihi 21 Subat (yayimlanma tarihi 22 Nisan 1987); Yone ve digerleri, EPO TNF Reseptörü Molekülleri Bu bulusta yararli olan tercih edilen TNF reseptörü molekülleri TNFd'yi yüksek afiniteyle baglayanlardir (örnegin bakiniz burada bütünüyle referansla zikredilen Feldmann ve digerleri, Uluslararasi Yayin No. WO 92/07076 (yayimlanma istege bagli olarak düsük immünojeniklige sahiptirler. Özellikle 55 kDa (p55 TNF-R) ve 75 kDa (p75 TNF-R) TNF hücre yüzeyi reseptörleri bu bulusta yararlidir. Bu reseptörlerin, reseptörlerin islevsel parçalarinin hücre disi alanlarini (ECD) içeren budanmis formlari da (örnegin bakiniz Corcoran ve yararlidir. TNF reseptörlerinin ECD içeren budanmis formlari idrarda ve serumda 30 kDa ve 40 kDa TNFd inhibitörü baglayici proteinler olarak saptanmistir (Engelmann, H. ve digerleri, J. molekülleri ve TNF immünoreseptör füzyon molekülleri ve bunlarin türevleri ve fragmanlari veya parçalari, bu bulusun usullerinde ve bilesimlerinde yararli olan TNF reseptörü moleküllerinin diger örnekleridir. Bulusta kullanilabilen TNF reseptörü molekülleri, hastalari uzun sürelerle semptomlari iyi ila mükemmel bir sekilde zayiflatarak ve düsük toksisiteyle tedavi etme kabiliyetleriyle nitelenir. Düsük immünojeniklik ve/veya yüksek afinitenin yani sira diger tanimlanmamis özellikler de elde edilen terapötik sonuçlara katkida bulunabilir.

Bu bulusta yararli olan TNF reseptörü molekülleri, polietilen glikol (PEG) gibi bir veya daha fazla polipeptit baglayici veya baska peptit olmayan baglayici vasitasiyla baglanan iki veya daha fazla TNF reseptörünün ECD'sinin tamamini veya islevsel bir parçasini içerir. Mültimerik moleküller ayrica mültimerik molekülün ekspresyonunu yönetmek için salgilanan bir proteinin bir sinyal peptidini içerebilir.

Bu bulusun usulleri ve bilesimlerinde yararli olan TNF immünoreseptörü füzyon molekülleri bir veya daha fazla immünoglobülin molekülünün en az bir parçasini ve bir veya daha fazla TNF reseptörünün tümünü veya islevsel bir parçasini içerir. Bu immünoreseptör füzyon nwlekülleri Hmnomerler veya hetero- veya homo-mültimerler olarak biraraya getirilebilir.

Immünoreseptör füzyon molekülleri tek degerli veya çok degerli de olabilir. Böyle bir TNF immünoreseptör füzyon molekülünün bir örnegin TNF reseptörü/IgG füzyon proteinidir. TNF immünoreseptörü füzyon molekülleri ve bunlarin üretimi için usuller bu alanda açiklanmistir (Lesslauer ve digerleri, Eur. digerleri, ABD Patenti No. 5,447,851; ve ABD Patent Basvurusu Immünoreseptör füzyon moleküllerini üretmek için usuller de Capon ve digerleri, ABD Patenti No. 5,116,964; Capon ve digerleri, ABD Patenti No. 5,225,538; ve Capon ve digerleri, TNF reseptörü molekülünün islevsel bir esdegeri, türevi, fragmani veya bölgesi, TNF reseptörü molekülünün veya TNF reseptörü molekülünü kodlayan TNF reseptörü molekülü dizisinin, bu bulusta kullanilabilen TNF reseptörü moleküllerine islevsel olarak benzemek (örnegin TNF'yi yüksek afiniteyle baglamak ve düsük immünojeniklige sahip olmak) için yeterli büyüklük ve diziye sahip parçasini belirtir. TNF reseptörü molekülünün islevsel bir esdegeri ayrica bu bulusta kullanilabilen TNF reseptörü moleküllerine islevsel olarak benzeyen (örnegin TNF'yi yüksek afiniteyle baglayan ve düsük immünojeniklige sahip olan) modifiye edilmis TNF reseptörü moleküllerini da kapsamaktadir. Örnegin TNF reseptörü molekülünün islevsel bir esdegeri bir “SESSIZ” kodon veya bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu, silinmesi veya ilavesini (örnegin bir asidik amino asidin baska bir asidik amino asit yerine ikamesi; veya ayni veya farkli hidrofobik amino asidi kodlayan bir kodonun bir hidrofobik amino asidi kodlayan baska bir kodon yerine sübstitüsyonu) içerebilir.

Bakiniz Ausubel ve digerleri, Current Protocols in Moleoular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New Sitokinler arasinda bilinen herhangi bir sitokin yer alir. Örnegin bakiniz CopewithCytokines.com. Sitokin antagonistleri arasinda sinirlandirici olmamak kosuluyla herhangi bir antikor, fragmani veya mimetigi, herhangi bir küçük moleküllü antagonist veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu yer alir.

Terapötik Tedaviler. Bulusun bilesimi TNF dolayimli bir rahatsizligi tedavi etmek için, etkili bir miktarina ihtiyaç duyan bir hücre, doku, organ, hayvan veya hastaya uygulanmasini içeren bir usulde kullanilabilir. Böyle bir usul istege bagli olarak. ayrica. bu tür bagisiklik hastaliklarini tedavi etmek için birlikte uygulamayi veya kombinasyon terapisini de kapsayabilir, burada sözü edilen bilesimin uygulanmasi, daha önce, es zamanli olarak ve/veya daha sonra bir antiromatizmal (örnegin metotreksat, auranofin, aurotioglukoz, azatioprin, etanersept, altin sodyum tiomalat, hidroksiklorokin sülfat, leflunomit, sülfasalzin), bir kas gevsetici, bir narkotik, steroid olmayan antienflamatuvar bir ilaç (NSAID), bir analjezik, bir anestetik, bir yatistirici, bir lokal anestetik, bir nöromüsküler bloker, bir antimikrobiyal (örnegin aminoglikozit, bir antifungal, bir antiparazitik, bir antiviral, bir karbapenem, sefalosporin, bir flororkinolon, bir makrolit, bir penisilin, bir sülfonamit, bir tetrasiklin, baska bir antimikrobiyal), bir antipsoriatik, bir kortikosteroid, bir anabolik steroid, diyabetle iliskili bir madde, bir mineral, bir besleyici, bir tiroid maddesi, bir vitamin, kalsiyumla iliskili bir hormon, bir antidiyareik, bir öksürük kesici, bir antiemetik, bir ülser önleyici, bir müshil, bir antikoagülan, bir eritropoietin (örnegin epoetin alfa), bir filgrastim (örnegin G-CSF, Neupogen), bir sargramostim (GM-GSF, Leukine), bir asi, bir immünoglobülin, bir immünosüpresif (örnegin basiliksimab, siklosporin, daklizumab), bir büyüme hormonu, bir hormon replasmani ilaci, bir östrojen reseptörü modülatörü, bir midriatik, bir sikloplejik, alkilleyici bir madde, bir antimetabolit, bir mitotik inhibitör, bir radyofarmasötik, bir antidepresan, antimanik madde, bir antipsikotik, bir anksiyolitik, bir hipnotik, bir sempatomimetik, bir uyarici, donepezil, takrin, bir astim ilaci, bir beta agonisti, teneffüsle çekilen bir steroid, bir lökotrien inhibitörü, bir metilksantin, bir kromolin, bir epinefrin veya analogu, dornaz alfa (Pulmozym), bir sitokin veya sitokin antagonisti arasindan en az birinin uygulanmasini içerir.

Tipik olarak, patolojik durumlarin tedavisi, bilesimde bulunan özgül etkinlige bagli olarak doz basina hastanin bir kilogrami için toplam, ortalama veya aralik olarak en az yaklasik 0.01 ila 500 miligram en az bir anti-TNF antikoru ve tercihen tek veya çoklu uygulama için hastanin bir kilogrami için en az yaklasik 0.1 ila 100 miligram antikor olan, en az bir anti-TNF antikoru bilesiminin etkili bir miktarinin veya dozunun uygulanmasiyla yapilir. Alternatif olarak, etkili serum konsantrasyonlari tek veya çoklu uygulama için 0.1-5000 pg/ml serum konsantrasyonunu içerebilir. Uygun dozajlar tip doktorlari tarafindan bilinmektedir ve kuskusuz spesifik hastalik durumuna, uygulanmakta olan bilesimin özgül etkinligine ve tedavi gören spesifik hastaya bagli olacaktir.

Bazi durumlarda, istenen terapötik miktara ulasmak için tekrarlanan uygulamalar, belirli bir izlenen veya ölçülen dozun tekrarlanan tek tek uygulamalari gerekli olabilir, burada tek tek uygulamalar istenen günlük doz veya etkiye ulasilana kadar tekrarlanir.

Tercih edilen dozlar arasinda istege bagli olarak 0.1, 0.2, 100-500 mg/kg/uygulama veya bunun herhangi bir araligi, degeri veya parçasi veya tek veya çoklu uygulama basina 0.1, 0.5, ve/veya 5000 ug/ml serum konsantrasyonuna ulasmak için gerekli olan dozlar veya bunlarin herhangi bir araligi, degeri veya parçasi yer alir.

Alternatif olarak, uygulanan dozaj spesifik maddenin farmakodinamik özellikleri ve uygulama biçimi ve yolu; alicinin yasi, sagligi ve agirligi; semptomlarin yapisi ve düzeyi; es zamanli tedavinin türü, tedavi sikligi ve istenen etki gibi bilinen faktörlere bagli olarak degisebilir.

Genellikle bir etken bilesen dozaji bir kilogram vücut agirligi için yaklasik 0.1 ila 100 miligram olabilir. Normal olarak uygulama basina veya sürekli salim formunda bir kilogram için 0.1 ila 50 ve tercihen 0.1 ila 10 miligram istenen sonuçlari elde etmek için etkilidir.

Sinirlandirici olmayan bir örnek olarak insanlarda veya az birinde veya alternatif veya ek olarak 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, haftanin en az birinde veya alternatif veya ek olarak 1, 2, 3, . yilin en az birinde veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunda tek doz, infüzyon veya tekrarlanan dozlar kullanilarak bu bulusun en az bir antikorunun günde 0.1 ila 100 mg/kg'lik tek veya periyodik bir dozu olarak temin edilebilir.

Içsel uygulama için uygun dozaj formlari (bilesim) genellikle bir birim veya kap için yaklasik 0.1 miligram ila yaklasik 500 miligram etken bilesen içerir. Bu farmasötik bilesimlerde etken bilesen normal olarak bilesimin toplam agirligi temelinde agirlikça yaklasik %0.5-99.99 araligindaki bir miktarda bulunacaktir.

Parenteral uygulama için, antikor farmasötik olarak kabul edilebilir parenteral bir tasiyiciyla birlikte bir çözelti, süspansiyon, emülsiyon veya liyofilize edilmis bir toz olarak formüle edilebilir veya ayri olarak sunulabilir. Bu tasiyicilarin örnekleri su, salin, Ringer çözeltisi, dekstroz çözeltisi ve %1-10 beseri serum albüminidir. Sabit yaglar gibi susuz tasiyicilar ve lipozomlar da kullanilabilir. Tasiyici veya liyofilize toz izotonikligi (örnegin sodyum klorür, manitol) ve kimyasal stabiliteyi (örnegin tamponlar ve koruyucular) koruyan katki maddeleri içerebilir. Formülasyon bilinen veya uygun tekniklerle sterilize edilir.

Uygun farmasötik tasiyicilar bu alanda standart bir referans metni olan Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol'ün en Alternatif Uygulama Bu bulusa uygun en az bir anti-TNF antikorunun farmasötik olarak etkili miktarlarini uygulamak için bu bulusa uygun olarak birçok bilinen ve gelistirilmis uygulama biçimi kullanilabilir. Asagidaki açiklamada akcigerler yoluyla uygulama kullanilmakla birlikte, bu bulusa uygun olarak uygun sonuçlarla baska uygulama biçimleri de kullanilabilir.

Bu bulusun TNF antikorlari bir tasiyici içinde, bir çözelti, emülsiyon, koloid veya süspansiyon olarak veya kuru bir toz olarak, teneffüsle veya burada açiklanan veya bu alanda bilinen baska yollarla uygulama için uygun çesitli tertibatlarin ve usullerin herhangi biri kullanilarak iletilebilir.

Parenteral Formülasyonlar ve Uygulama Parenteral uygulama için formülasyonlar yaygin olarak kullanilan eksipiyanlar olarak steril su veya salin, polietilen glikol gibi polialkilen glikoller, bitkisel kökenli yaglar, hidrojene naftalenler ve benzerini içerebilir.

Enjeksiyon için sulu veya yagli süspansiyonlar, bilinen usullere göre uygun bir emülsifiye edici veya nemlendirici ve bir süspansiyon maddesi kullanilarak hazirlanabilir.

Enjeksiyon için maddeler bir çözelti içinde sulu çözelti veya steril bir enjekte edilebilir* çözelti veya süspansiyon gibi toksik olmayan, agizdan uygulanamayan seyreltici maddeler olabilir. Kullanilabilir tasiyici veya çözücü olarak su, Ringer çözeltisi, izotonik› salin› ve benzerine izin verilir; siradan bir çözücü veya süspansiyon çözücüsü olarak steril uçucu olmayan yag kullanilabilir. Bu amaçlar için, dogal veya sentetik veya yari sentetik sabit yaglar veya yag asitleri; dogal veya sentetik veya yari sentetik mono veya di veya trigliseritler de dahil olmak üzere uçucu olmayan yag ve yag asitlerinin herhangi biri kullanilabilir. Parenteral uygulama bu alanda bilinmekte ve sinirlandirici olmamak üzere geleneksel enjeksiyon, ABD Patenti No. 5,851,198'de açiklandigi gibi gaz basinçli ignesiz bir enjeksiyon tertibati Ve buraya referans yoluyla tamamen dahil edilen ABD Patenti No. 5,839,446'da açiklandigi gibi bir lazerle delme tertibati yer alir.

Alternatif Iletim Bulus ayrica en az bir anti-TNF antikorunun parenteral, deri altina, kas içine, damar içine, eklem içine, bronslar içine, karin içine, kapsül içine, kikirdak içine, kavite içine, intracelial [Vücut bosluklari içine, özellikle beynin karinciklarindan biri içine], beyincik içine, intraserebroventriküler, kolon içine, serviks içine, mide içine, karaciger içine, kalp kasi içine, kemik içine, pelvis içine, kalp dis zari içine, periton içine, plevra içine, prostat içine, akcigerler içine, rektum içine, böbrek içine, retina içine, belkemigi içine, eklem sivisi içine, gögüs içine, rahim içine, mesane içine, bolus, vajinal, rektal, agiz içine, dil altina, burun içine veya transdermal yollarla uygulanmasina iliskindir. En az bir anti-TNF antikoru bilesimi parenteral (deri altina, kas içine veya damar içine) uygulama için veya herhangi bir baska uygulama için özellikle sivi çözeltiler veya süspansiyonlar formunda hazirlanabilir; vajinal veya rektal uygulamada kullanim için özellikle yari kati formlar, örnegin sinirlandirici olmamak üzere kremler ve süpozituvarlar; burun içine, örnegin sinirlandirici olmamak üzere tozlar, burun damlalari veya aerosoller veya bazi maddeler formunda; veya transdermal olarak, örnegin cilt yapisini degistirmek veya transdermal flesterdeki ilaç konsantrasyonunu arttirmak için kimyasal çogalticilarla birlikte (burada bütünüyle referansla zikredilen Junginger, ve digerleri, “Drug Permeation Enhancement” içinde; Hsieh, D. S., Der., s. veya proteinler ve peptitler içeren formülasyonlarin deriye uygulanmasini mümkün kilan oksitleyici maddelerle (WO 98/53847) veya elektroporasyon gibi geçici ulastirma yollari yaratmak için elektrik alanlarinin uygulanmasiyla veya iyontoforez gibi yüklü ilaçlarin derideki hareketliligini arttirmak için veya sonoforez gibi (ABD Patentleri No. olmamak üzere bir jel, merhem, losyon, süspansiyon veya flaster iletim sistemi için hazirlanabilir.

Akcigerler Yoluyla/Burundan Uygulama Akcigerler yoluyla uygulama için, tercihen en az bir anti-TNF antikoru bilesimi akcigerlerin alt teneffüs yollarina veya sinüslere ulasmak için uygun bir parçacik büyüklügünde iletilir. Bulusa göre, en az bir anti-TNF antikoru bu alanda bir terapötik maddenin teneffüsle uygulanmasi için bilinen çesitli teneffüsle veya burundan uygulama tertibatlarinin herhangi biriyle iletilebilir. Aerosollestirilmis formülasyonlari bir hastanin sinüs boslugunda veya alveollerinde birakabilen bu tertibatlar arasinda doz ayarli inhalerler, nebülizörler, kuru toz üreteçleri, spreyler ve benzeri yer alir. Bu alanda antikorlarin akcigerler yoluyla veya buruhdan uygulanmasi için uygun baska tertibatlar da bilinmektedir. Bu tür tertibatlarin hepsinde antikoru bir aerosol içinde iletmeye yönelik uygulama için uygun formülasyonlar kullanilabilir. Bu aerosoller çözeltiler (sulu ve susuz) veya kati parçaciklardan olusabilir. Ventolin® doz ayarli inhaler gibi doz ayarli inhalerlerde tipik olarak bir itici gaz kullanilir ve bunlar soluk alma sirasinda çalistirmayi gerektirir (örnegin bakiniz WO 94/16970, WO 98/35888). Turbuhaler” (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros” inhaler (Dura) (Inhale Therapeutics tarafindan pazarlanan tertibatlar) gibi kuru toz inhalerleri ve Spinhaler® toz inhalerinde (Fisons) karisik bir tozun nefesle 94/06498 Fisons, hepsi burada referansla zikredilmektedir).

AERX” Aradigm, UltraventîB nebulizör (Mallinckrodt), ve .Acorn nebülizörler çözeltilerden aerosoller üretir, doz ayarli inhalerler, kuru toz inhalerleri ve benzeri ise küçük parçacikli aerosoller üretir. Piyasada bulunan teneffüsle uygulama tertibatlarinin bu spesifik örnekleri bu bulusun uygulamasi için uygun spesifik tertibatlarin bir temsili olmaya yöneliktir ve bulusun çerçevesini sinirlandirmaya yönelik degildir. Tercihen en az bir anti-TNF antikoru içeren bir bilesim bir kuru toz inhaleri veya spreyiyle iletilir. Bu bulusun en az bir antikorunu uygulamak için teneffüsle içine çekmeye yönelik bir tertibatin çesitli arzu edilen özellikleri vardir. Örnegin teneffüsle içine çekme tertibatiyla iletim avantajli bir sekilde güvenilir, tekrar üretilebilir ve hassastir. Teneffüsle içine çekme tertibati istege bagli olarak iyi solunum için küçük, Örnegin yaklasik 10 um'den küçük, tercihen yaklasik 1-5 um'lik kuru parçaciklar iletebilir.

TNF Antikor Bilesimlerinin Bir Sprey Olarak Uygulanmasi TNF antikor bilesimi proteinini içeren bir sprey, en az bir anti-TNF antikorunun bir süspansiyonu veya çözeltisi basinç altinda bir memeden itilerek üretilebilir. Meme büyüklügü ve konfigürasyonu, uygulanan basinç ve sivi besleme hizi istenen verimi ve parçacik büyüklügünü elde etmek üzere seçilebilir. Örnegin kapiler besleme veya memeden beslemeyle baglantili olarak bir elektrik alaniyla bir elektrosprey üretilebilir.

Avantajli bir sekilde, bir spreyle iletilen en az bir anti-TNF antikor bilesimi protein parçaciklarinin parçacik büyüklügü yaklasik 10 um'nin altinda, tercihen yaklasik 1 um ila yaklasik 5 um araliginda ve en çok tercih edilen durumda yaklasik 2 um ila yaklasik 3 um araligindadir.

Bir spreyle kullanim için uygun, en az bir anti-TNF antikor bilesimi protein formülasyonlari, antikor bilesimi proteinini sulu bir çözelti içinde tipik olarak bir ml veya mg/gm çözelti için yaklasik 0.1 mg ila yaklasik 100 mg konsantrasyonunda en az bir anti-TNF antikoru bilesimi veya buradaki herhangi bir aralik veya degerde, örnegin sinirlandirici olmamak kosuluyla mg/ml veya mg/gm konsantrasyonunda içerir. Formülasyon bir eksipiyan, bir tampon, bir izotonisite maddesi, bir koruyucu, bir yüzey aktif madde ve tercihen çinko gibi maddeler içerebilir. Formülasyon ayrica bir tampon, indirgeyici bir madde, bir dökme protein veya bir karbonhidrat gibi antikor bilesimi proteininin stabilizasyonu için bir eksipiyan veya madde de içerebilir. Antikor bilesimi proteinlerinin formüle edilmesinde yararli olan dökme proteinler arasinda albümin, protamin veya benzeri yer alir. Antikor bilesimi proteinlerinin formüle edilmesinde yararli olan tipik karbonhidratlar arasinda sükroz, manitol, laktoz, trehaloz, glukoz veya benzeri yer alir. Antikor bilesimi protein formülasyonu ayrica bir aerosolün olusturulmasinda çözeltinin atomizasyonunun neden oldugu antikor bilesimi proteininin yüzeyde olusan kümelesmesini azaltabilen veya önleyebilen bir yüzey aktif madde de içerebilir. Polioksietilen yag asidi esterler ve alkoller ve polioksietilen sorbitol yag asidi esterler gibi çesitli geleneksel yüzey aktif maddeler kullanilabilir. Miktarlar genellikle formülasyonun agirliginca özellikle tercih edilen yüzey aktif maddeler polioksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20 veya benzeridir. TNF antikorlari veya bunlarin belirtilen parçalari veya varyantlari gibi bir proteinin formülasyonu için bu alanda bilinen ek maddeler de formülasyona dahil edilebilir.

TNF Antikor Bilesimlerinin Bir Nebülizörle Uygulanmasi Antikor bilesimi proteini jet nebülizör veya bir ultrasonik nebülizör gibi bir nebülizörle uygulanabilir. Tipik olarak bir jet nebülizörde, bir delikten geçen yüksek hizli bir hava jeti yaratmak için sikistirilmis bir hava kaynagi kullanilir. Gaz memenin ötesinde genlestikçe, antikor bilesimi protein çözeltisini bir sivi haznesine bagli kapiler bir tüpten çeken bir düsük basinç bölgesi yaratilir. Kapiler tüpten gelen sivi akimi tüpten çikarken esitsiz filamanlar ve damlaciklar halinde kirpilarak aerosolü yaratir. Belirli bir jet nebülizörden istenen performans özelliklerini elde etmek için çesitli konfigürasyonlar, akis hizlari ve deflektör tipleri kullanilabilir. Ultrasonik bir nebülizörde, tipik olarak bir piezoelektrikr güç çevirici kullanilarakr titresimsel, mekanik enerji yaratmak için yüksek frekansli elektrik enerjisi kullanilir. Bu enerji antikor bilesimi proteinini içeren bir aerosol yaratilarak, dogrudan veya baglayici bir akiskan vasitasiyla antikor bilesimi proteininin formülasyonuna aktarilir. Avantajli bir sekilde bir nebülizör ile iletilen antikor bilesimi protein parçaciklarinin parçacik büyüklügü yaklasik 10 um'nin altinda, tercihen yaklasik 1 um ila yaklasik 5 um araliginda ve en çok tercih edilen durumda yaklasik 2 um ila yaklasik 3 um araligindadir.

Jet veya ultrasonik bir nebülizörle kullanim için uygun olan en az bir anti-TNF antikoru formülasyonlari tipik olarak bir ml çözelti için yaklasik 0.1 mg ila yaklasik 100 mg konsantrasyonda en eaz bir anti-TNF antikoru proteini içerir.

Formülasyon bir eksipiyan, bir izotonisite maddesi, bir koruyucu bir yüzey aktif madde ve tercihen çinko gibi maddeler içerebilir. Formülasyon bir eksipiyan veya en az bir anti-TNF antikor bilesimi proteinin stabilizasyonu için tampon, indirgeyici bir madde, bir dökme protein veya bir karbonhidrat gibi bir madde de içerebilir. En az bir anti-TNF antikor bilesimi proteinlerinin formüle edilmesinde yararli olan dökme proteinler arasinda albümin, protamin veya benzeri yer alir.

En az bir anti-TNF antikorunun formüle edilmesinde yararli olan tipik karbonhidratlar arasinda sükroz, manitol, laktoz, trehaloz, glukoz veya benzeri yer alir. En az bir anti-TNF antikor bilesimi ayrica bir aerosolün olusturulmasinda çözeltinin atomizasyonunun neden oldugu en az bir anti-TNF antikorunun yüzeyde olusan kümelesmesini azaltabilen veya önleyebilen bir yüzey aktif madde de içerebilir.

Polioksietilen yag asidi esterler ve alkoller ve polioksietilen sorbital yag asidi esterler gibi çesitli geleneksel yüzey aktif maddeler kullanilabilir. Miktarlar genellikle formülasyonun agirliginca %0.00l ila %4 araliginda olacaktirx Bu bulusun amaçlari için özellikle tercih. edilen yüzey aktif maddeler polioksietilen sorbitan mono-oleat, polisorbat 80, polisorbat 20 veya benzeridir. Bu alanda antikor proteini gibi bir proteinin formülasyonu için bilinen ek maddeler de formülasyona dahil edilebilir.

TNF Antikoru Bilesimlerinin Doz Ayarli Bir Inhalerle Uygulanmasi Doz ayarli bir inhalerde (MDI), bir itici, en az bir anti-TNF antikoru ve eksipiyanlar veya diger katki maddeleri sivilastirilmis sikistirilmis bir gaz içeren bir karisim olarak bir teneke kutu içinde bulunur. Ölçme valfinin çalismasi karisimi, tercihen yaklasik 10 um'nin altinda, tercihen yaklasik 1 inn ila yaklasik 5 inn ve en çok tercih edilen durumda yaklasik 2 um ila yaklasik 3 um büyüklük araliginda parçaciklar içeren bir aerosol olarak serbest birakir. Istenen aerosol parçacik büyüklügü, jet ögütme, püskürtmeyle kurutma, kritik nokta kondansasyonu veya benzeri de dahil olmak üzere bu alanda uzman olanlarin bildigi çesitli usullerle üretilen antikor bilesimi proteininin bir formülasyonu kullanilarak elde edilebilir. Tercih edilen doz ayarli inhalerler arasinda 3M veya Glaxo tarafindan imal edilenler ve bir hidroflorokarbon iticinin kullanildiklari yer Doz ayarli bir inhaler tertibatiyla birlikte kullanim için en az bir anti-TNF antikorunun formülasyonlari genellikle susuz bir ortamda bir süspansiyon, örnegin bir yüzey aktif maddenin yardimiyla bir itici içinde süspansiyon haline getirilmis olarak en az bir anti-TNF antikoru içeren ince bölünmüs bir tozu kapsayacaktir. Itici kloroflorokarbon, bir hidrokloroflorokarbon, bir hidroflorokarbon veya trikloroflorometan, diklorodiflorometan, diklorotetrafloroetanol ve l,l,1,2-tetrafloroetan da dahil olmak üzere bir hidrokarbon, HFA-134a (hidrofloroalkan-l34a), HFA-227 (hidrofloroalkan-227) veya bunun gibi bu amaçla kullanilan herhangi bir geleneksel malzeme olabilir. Tercihen itici bir hidroflorokarbondur. Yüzey aktif madde iticideki bir süspansiyon olarakr en az bir anti-TNF antikorunu stabilize etmek için, etken maddeyi kimyasal bozunmaya karsi korumak için ve benzer amaçlar için seçilebilir. Uygun yüzey aktif maddeler arasinda sorbitan trioleat, soya lesitini, oleik asit veya benzeri yer alir. Bazi durumlarda, etanol olarak çözücülerin kullanildigi çözelti aerosolleri tercih edilir. Bu alanda bir proteinin formülasyonu için bilinen protein gibi ek maddeler de formülasyona dahil edilebilir.

Bu alanda siradan vasiflara sahip olanlar bu bulusun usullerinin burada açiklanmayan tertibatlarla en az bir anti- TNF antikoru bilesiminin akcigerler yoluyla uygulanmasiyla saglanabilecegini takdir edeceklerdir.

Agizdan Uygulanan Formülasyonlar ve Uygulama Agizdan uygulamaya yönelik formülasyonlar, bagirsak cidarlarinin geçirgenligini yapay olarak arttirmak için adjuvanlarin (örnegin rezorsinoller ve polioksietilen oleil eter ve n-heksadesilpolietilen eter gibi noniyonik yüzey aktif maddelerin) birlikte uygulanmasinin yani sira enzimatik bozunmayi inhibe etmek için enzimatik inhibitörlerin (örnegin pankreatik tripsin inhibitörleri, diizopropilflorofosfat (DFF) ve trasilol) birlikte uygulanmasina dayanir. Agizdan uygulamaya yönelik kati tip dozaj formunda etken bilesen bilesigi sükroz, laktoz, selüloz, manitol, trehaloz, rafinoz, maltitol, dekstran, nisastalar, agar, arginatlar, kitinler, kitosanlar, pektinler, kitre, arapzamki, jelatin, kolagen, kazein, albümin, sentetik veya yari sentetik polimer ve gliserit de dahil olmak üzere en az bir katki maddesiyle karistirilabilir. Bu dozaj formlari etkisiz seyreltici madde, magnezyum stearat, paraben gibi kayganlastirici, sorbik asit, askorbik asit, alfa-tokoferol gibi koruyucu madde, sistein gibi antioksidan, parçalayici, baglayici, koyulastirici, tamponlama maddesi, tatlandirici madde, tat verici madde, parfüm maddesi ve bunun gibi baska tip katki maddeleri de içerebilir.

Tablet ve haplar ayrica enterik kapli terkipler halinde islenebilir. Agizdan uygulama için sivi terkipler arasinda emülsiyon, surup, eliksir, süspansiyon ve tibbi kullanim için izin verilebilir çözelti terkipleri yer alir. Bu terkipler sözü edilen alanda normal olarak kullanilan etkisiz seyreltici maddeler, örnegin su içerebilir. Lipozomlar da insülin ve heparin için ilaç iletim sistemleri olarak açiklanmistir (ABD Patenti No. 4,239,754). Daha yeni olarak, karma amino asitlerin yapay polimerlerinin mikrokürecikleri (proteinoidler) farmasötikler elde etmek için kullanilmistir ve ABD Patenti No. 5,871,753'te açiklanan tasiyici bilesikler bu alanda bilinen biyolojik etken maddeleri agizdan iletmek için kullanilir.

Mukozal Formülasyonlar ve Uygulama Mukoza yüzeylerinden emilim için, emülsiyon parçaciklarinin mukoadhezyonunu saglayarak mukozal yüzeylerden emilimi arttiran, en az bir anti-TNF antikorunun uygulanmasi için bilesimler ve usuller arasinda birçok mikronalti parçacik, mukoadhezif bir makromolekül, biyoaktif bir peptit ve sulu bir sürekli faz içeren bir emülsiyon içerir (ABD Patentleri No. ,514,670). Bu bulusun emülsiyonlarinin uygulanmasi için uygun mukoza yüzeyleri kornea, konjunktiva, agiz içi, dil alti, burun, vajina, akcigerler, mide, bagirsak 4ve rektuni yoluyla uygulamayi içerebilir. Vajinal veya rektal uygulama için formülasyonlar, örnegin süpozituvarlar eksipiyanlar olarak örnegin polialkilenglikoller, vazelin, kakao yagi ve benzerini içerebilir. Burun içine uygulama için formülasyonlar kati olabilir ve eksipiyanlar olarak örnegin laktoz içerebilir veya sulu veya yagli burun damlalari çözeltileri olabilir. Agiz içine uygulama için eksipiyanlar arasinda sekerler, kalsiyum stearat, magnezyum searat, önceden jelatinize edilmis nisasta ve benzeri yer alir (ABD Patentleri No. 5,849,695).

Transdermal Formülasyonlar ve Uygulama Transdermal uygulama için en az bir anti-TNF antikoru bir lipozom veya polimerik nanoparçaciklar, mikroparçacik, mikrokapsül veya mikrokürecikler (aksi belirtilmedikçe toplu olarak mikroparçaciklar olarak geçer) gibi bir iletim tertibati içinde kapsüllenir. Polihidroksi asitler, örnegin polilaktik asit, poliglikolik asit ve bunlarin kopolimerleri, poliortoesterler, polianhidrürler ve polifosfazenler gibi sentetik polimerlerden ve kolagen, poliamino asitler, albümin Ve diger proteinler, alginat ve diger polisakaritler gibi dogal polimerlerden ve bunlarin kombinasyonlarindan yapilan mikroparçaciklar da dahil olmak üzere çok sayida uygun tertibat bilinmektedir (ABD Patenti. No. 5,814,599).

Uzatilmis Uygulama ve Formülasyonlar Bazen bu bulusun bilesiklerinin hastaya, tek bir uygulamadan uzatilmis sürelerle, örnegin bir hafta ila bir yil araligindaki sürelerde iletilmesi arzu edilebilir. Çesitli yavas salim, depo veya implant dozaj formlari kullanilabilir. Örnegin, bir dozaj formu vücut sivilarinda çözünürlük derecesi düsük olan bilesiklerin farmasötik olarak kabul edilebilir, toksik olmayan bir tuzunu, örnegin (a) fosforik asit, sülfürik asit, sitrik asit, tartarik asit, tanik asit, pamoik asit, alginik asit, poliglutamik asit, naftalen mono veya disülfonik asitler, poligalakturonik asit ve bunun gibi bir asit ilave tuzu; (b) çinko, kalsiyum, bizmut, baryum, magnezyum, alüminyum, bakir, kobalt, nikel kadmiyuni ve bunun gibi çok degerli bir metal katyonuyla veya örnegin N,N'-dibenzil- etilendiamin veya etilendiamiden olusturulan bir organik katyonla bir tuzu; veya (C) (a) ile (b)'nin kombinasyonlarini içerebilir. Ayrica bu bulusun bilesikleri veya tercihen yukarida açiklananlar gibi nispeten çözünmez bir tuz enjeksiyon için uygun bir jel, örnegin bir alüminyum monostearat jel, örnegin susam yagi içinde formüle edilebilir. Özellikle tercih edilen tuzlar çinko tuzlari, çinko tanat tuzlari, pamoat tuzlari ve benzeridir. Enjeksiyon için yavas salim depo formülasyonunun baska bir tipi örnegin ABD Patenti No. 3,773,919'da açiklandigi gibi bir polilaktik asit/poliglikolik asit polimeri gibi yavas bozunan, toksik olmayan, antijenik olmayan bir polimer içinde dagitilmis veya kapsüllenmis bilesigi veya tuzu içerebilir. Bilesikler veya tercihen yukarida açiklananlar gibi nispeten çözünmez tuzlar özellikle hayvanlarda kullanim için kolesterol matrisli silastik peletler halinde de formüle edilebilir. Diger yavas salim, depo veya implant formülasyonlari, örnegin gaz veya sivi lipozomlari literatürde bilinmektedir (ABD Patenti No. ,770,222 ve “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson der., Marcel Dekker, Inc., N.Y., l978).

Genel olarak açiklanan bulus simdi sadece açiklama amaciyla verilen ve sinirlandirici olmasi amaçlanmayan asagidaki örneklere referansla daha iyi anlasilacaktir. Örnek 1: Memeli Hücrelerinde TNF Antikorunun Klonlanmasi ve Eksprese Edilmesi Tipik bir memeli ekspresyon vektörü mRNA transkripsiyonunun baslamasina aracilik eden en az bir promotör elemani, antikor kodlama dizisi ve transkripsiyonun sonlandirilmasi ve transkriptin poliadenilasyonu için gerekli olan sinyalleri içerir. Diger elemanlar arasinda çogalticilar, Kozak dizileri ve yandan RNA uç birlesmesi için verici ve alici yerleriyle kusatilan araya giren diziler yer alir. Son derece etkili transkripsiyon SV40'tan erken ve geç promotörler, Retrovirüslerden uzun terminal tekrarlari (LTR'ler), örnegin RSV, HTLVI, HIVI ve sitomegalovirüsün (CMV) erken promotörüyle saglanabilir. Ancak hücresel elemanlar da (örnegin beseri aktin promotörü) kullanilabilir. Bu bulusun uygulanmasinda kullanim için uygun ekspresyon vektörleri arasinda, örnegin leESlneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN veya pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA veya pcDNA3.l/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL ve PMSG (Pharmacia, ve pBC12MI (ATCC 67109) gibi vektörler yer alir.

Kullanilabilecek memeli konak hücreleri arasinda beseri Hela 293, H9 ve Jurkat hücreleri, fare NIH3T3 ve C127 hücreleri, Cos l, Cos 7 ve CV' 1, bildircin QC1-3 hücreleri, fare L hücreleri ve Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücreleri yer alir.

Alternatif olarak gen bir kromozom içine entegre edilmis geni içeren stabil hücre çizgilerinde eksprese edilebilir. dhfr, gpt, neomisin veya higromisin gibi seçilebilir~ bir~ markörle birlikte transfeksiyon transfekte olmus hücrelerin tespitine ve izolasyonuna imkan verir.

Transfekte edilen gen kodlanmis antikorun büyük iniktarlarini eksprese etmek için amplifikasyona da tabi tutulabilir. DHFR (dihidro folat redüktaz) markörü ilgilenilen genin birkaç yüz, hatta birkaç bin kopyasini tasiyan hücre çizgileri gelistirmek için yararlidir. Baska bir yararli seçim markörü enzim glutamin sentazdir (GS) (Murphy, ve digerleri, Biochem. J. hücreleri seçici ortamda üretilir ve en yüksek dirence sahip hücreler seçilir. Bu hücre çizgileri bir kromozom içine entegre edilmis amplifikasyona tabu tutulmus gen(ler)i içerir. Çin hamsteri yumurtalik (CHO) ve N80 hücreleri siklikla antikorlarin üretimi için kullanilir.

Ekspresyon vektörleri pCl ve pC4 Rous Sarkom Virüsünün güçlü promotörünü (LTR) (Cullen, ve digerleri, Molec. Cell. Biol. Örnegin kisitlama enzimi yarilma yerleri BamHI, Xbal ve Asp7l8 ile çoklu klonlama yerleri ilgilenilen genin klonlanmasini kolaylastirir. Vektörler ayrica siçan preproinsülin geninin 3' intronu, poliadenilasyon ve sonlandirma sinyalini içerir.

CHO Hücrelerinde Klonlama ve Ekspresyon TNF antikorunun ekspresyonu için vektör pC4 kullanilir.

Plasmid pC4 plasmid pSVZ-dhfr'nin (ATCC Erisim No. 37146) bir türevidir. Plasmid SV4O erken promotörünün kontrolü altinda fare DHFR genini içerir. Çin hamsteri yumurtalik hücreleri veya plasmidlerle transfekte edilen dihidrofolat aktivitesinden yoksun Çin hamsteri yumurtalik hücreleri veya baska hücreler kemoterapötik madde metotreksatla takviye edilen seçici bir ortamda (örnegin alfa eksi MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) hücreler üretilerek seçilebilir. DHFR fenlerinin metotreksata (MTX) dirençli hücrelerde amplifikasyonu iyi belgelenmistir (örnegin bakiniz J. L. Hamlin ve C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta lO97:lO7-l43 (1990); ve M. J. Page ve M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). MTX'in artan konsantrasyonlarinda üretilen hücreler DHFR geninin amplifikasyonunun bir sonucu olarak hedef enzim DHFR'yi asiri üreterek ilaca direnç gelistirirler. Ikinci bir gen DHFR genine bagliysa, bu genellikle birlikte amplifiye olur ve asiri eksprese olur. Bu yaklasimin amplifikasyona tabi tutulmus gen(ler)in 1000'den fazla kopyasini tasiyan hücre çizgileri gelistirmek için kullanilabildigi bu alanda bilinmektedir. Daha sonra metotreksat çekildiginde, konak hücrenin bir veya daha fazla kromozomuna entegre edilmis amplifiye olmus geni içeren hücre çizgileri elde edilir.

Plasmid pC4 ilgilenilen geni eksprese etmek için Rous SarkomaVirüsünün uzun terminal tekrarinin (LTR) güçlü promotörünü (Cullen, ve digerleri, Molec. Cell. Biol. 5:438- dolaysiz erken geninin çogalticisindan izole edilen bir fragman (Boshart, ve asagisinda genlerin entegrasyonuna imkan veren BamHI, XbaI ve Asp7l8 kisitlama enzimi yarilma yerleri vardir. Bu klonlama yerlerinin arkasinda, plasmid siçan preproinsülin geninin 3' intronu ve poliadenilasyon yerini içerir. Ekspresyon için baska yüksek verimlilikte promotörler, örnegin beseri b-aktin promotörü, SV4O erken veya geç promotörleri, baska retrovirüslerden, örnegin HIV ve HTLVI'den uzun terminal tekrarlari kullanilabilir. TNF'yi memeli hücrelerinde düzenli bir sekilde eksprese etmek için Clontech'in Tet-Off ve Tet-On gen ekspresyon sistemleri ve benzeri kullanilabilir (M. Gossen (1992)). mRA'nin poliadenilasyonu için, baska sinyaller, örnegin beseri büyüme hormonu veya globin genlerinden sinyaller de kullanilabilir. Kromozomlara dahil edilen ilgilenilen bir geni tasiyan stabil hücre çizgileri de gpt, G418 veya higromisin gibi seçilebilir` bir markörle birlikte transfeksiyon üzerine seçilebilir. Baslangiçta birden fazla seçilebilir markör, örnegin 6418 ve netotreksat kullanilmasi avantajlidir.

Plasmid pC4 kisitlama enzimleriyle sindirilir ve sonra bu alanda iyi bilinen prosedürlerle dana intestinal fosfatazi kullanilarak fosforu giderilir. Daha sonra vektör %1 agaroz jelden izole edilir.

Daha sonra DNA'yi kodlayan izole edilmis degisken ve sabit bölge ve fosforu giderilmis vektör T4 DNA. ligazla baglanir.

Daha sonra E. coli HBlOl veya XL-l Mavi hücreleri dönüstürülür ve örnegin kisitlama enzimi analiziyle plasmid pC4 içine sokulan fragmani içeren bakteriler tespit edilir.

Transfeksiyon için aktif bir DHFR genine sahip olmayan Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücreleri kullanilir. 5 g ekspresyon plasmidi pC4, lipofektin kullanilarak 0-5 g plasmid pSVZ-neo ile birlikte transfekte edilir. Plasmid pSVZneo, basat bir seçilebilir markör, G418 de dahil olmak üzere bir grup antibiyotige direnç veren bir enzimi kodlayan Tn5'ten neo genini içerir. Hücreler l g/ml G418 ile takviye edilmis alfa eksi MEM içinde tohumlanir. 2 gün sonra, hücreler tripsinize ile takviye edilmis alfa eksi MEM içinde hibridom klonlama plakalarinda (Greiner, Almanya) tohumlanir. Yaklasik 10-14 gün sonra, tek tek klonlar tripsinize edilir ve sonra farkli kullanilarak 6 kuyucuklu petri çanaklarinda veya 10 ml'lik siselerde tohumlanir. Daha sonra metotreksatin en yüksek konsantrasyonlarinda üretilen klonlar metotreksatin daha da yüksek konsantrasyonlarini (l mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, mM) içeren yeni 6 kuyucuklu plakalara aktarilir. 100-200 mM konsantrasyonunda üreyen klonlar elde edilene kadar ayni prosedür tekrarlanir. Istenen gen ürününün ekspresyonu, örnegin SBS-PAGE ve Western blot'la veya ters faz HPLC analiziyle analiz edilir. Örnek 2: Transgenik Fareler Kullanilarak Beseri TNF Ile Reaktif Yüksek Afiniteli Beseri IgG Monoklonal Antikorlarinin Üretimi TNF dolayimli bir veya daha fazla. hastaligin tedavisi için TNF'nin etkisini inhibe etmek amaciyla terapötik olarak kullanilabilen yüksek afiniteli, tamamen beseri, monoklonal antikorlari üretmek için beseri agir ve hafif zincir immünoglobülin genlerini içeren transgenik fareler kullanilmistir. Hem agir hem de hafif zincirler için beseri degisken ve sabit bölge antikor transgenlerini içeren (CBA/J x CS7BL6/J) F2 hibrid farelerine rekombinant TNF ile bagisiklik kazandirilir (Taylor ve digerleri, Intl. Immunol. 6:579-591 Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996); Fishwild, ve füzyon tamamen beseri TNF ile reaktif IgG monoklonal antikorlarinin bir veya daha fazla panelini verdi. Tamamen beseri anti-TNF antikorlari daha da karakterize edilir. Hepsi yerde afinite katsayilarina sahip oldugu tespit edilir.

Tamamen beseri bu monoklonal antikorlarin beklenmedik derecede yüksek afiniteleri onlari TNF'yle iliskili hastaliklar, patolojiler veya rahatsizliklarda. terapötik uygulamalar için uygun adaylar haline getirmektedir.

Kisaltmalar BSA - sigir serum albimini CO2 - karbondioksit DMSO - dimetil sülfoksit EIA - enzim immünolojik tahlili FBS - fetal sigir serumu Hdh - hidrojen peroksit HRP - yabanturpu, peroksidaz Tg - immünoglobülin Mab - monoklonal antikor OD - optik yogunluk OPD - o-Fenilendiamin dihidroklorür PEG - polietilen glikol PSA - penisilin, streptomisin, amfoterisin RT - oda sicakligi SQ - deri altindan v/v - hacimce hacim w/v - hacimce agirlik Malzemeler ve Usuller Hayvanlar Beseri antikorlari eksprese edebilen, beseri immünoglobülinleri eksprese eden, ama fare IgM 'veya Ig'sini etmeyen transgenik fareler bu alanda bilinmektedir (ve ticari olarak elde edilebilir (örnegin GenPharm. International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA ve digerlerinden)). Örnegin bu transgenik fareler beseri dizi immünoglobülinlerinin bir repertuvarini üretmek için V(D)J birlesmesi, agir zincir sinif degisikligi ve somatik mutasyona ugrayan beseri dizi transgenleri içerir (Lonberg, ve digerleri, Nature 368t856-859 (1994)). Hafif zincir transgeni örnegin kismen, germline beseri V bölgesinin hemen hemen yarisini içeren bir maya yapay kromozom klonundan derive edilebilir. Ayrica agir zincir transgeni hem beseri p hem de beseri 1 (Fishwild, ve sabit bölgelerini kodlayabilir. TNF'ye karsi tamamen beseri monoklonal antikorlari üretmek için bagisiklik kazandirma ve füzyon islemlerinde uygun genotipik soylardan derive edilen fareler kullanilabilir.

Bagisiklik Kazandirma Anti-TNF beseri hibridomlarini üretmek için bir veya daha fazla bagisiklik kazandirma programi kullanilabilir. Asagidaki örnek bagisiklik kazandirma programindan sonra ilk birçok füzyon yapilabilir, ama buna benzer bilinen baska protokoller de kullanilabilir. 14-20 haftalik birkaç disi ve/veya ameliyatla hadim edilmis transgenik erkek fareye 100-400 uL (örnegin 200) nihai hacimde, esit hacimde TITERMAX veya tam Freund adjuvaniyla emülsifiye edilmis 1-1000 ug rekombinant TNF periton içine ve/Veya deri altina uygulanarak bagisiklik kazandirilir. Her fareye istege bagli olarak 2 adet deri altina uygulama yerinde 100 nL fizyolojik salin içinde 1-10 ug ve/veya 21-34 gün sonra esit hacimde TITERMAX veya tam olmayan Freund adjuvaniyla emülsifiye edilmis TNF periton içine (1-400 üg) ve deri altina (1-400 üg x 2) uygulanarak bagisiklik kazandirilabilir. 12-25 ve 25-40 gün sonra antikoagülan kullanilmadan gözün arkasina. ponksiyonla farelerden kan alinabilir. Daha sonra kan bir saat oda sicakliginda pihtilasmaya birakilir ve serum toplanir ve bilinen usullere göre bir TNF EIA tahliliyle titre edilir. Tekrarlanan enjeksiyonlar titrelerin artmasina neden olmadiginda füzyonlar yapilir. O zaman, farelere 100 uL fizyolojik salin içinde seyreltilmis 1-400 ug TNF'nin nihai bir IV destek enjeksiyonu uygulanabilir. Üç gün sonra farelere servikal dislokasyonla ötanazi uygulanir ve dalaklar aseptik olarak çikarilir ve 100 U/mL penisilin, 100 ug/mL streptomisin ve 0.25 üg/mL amfoterisin B (PSA) içeren 10 uL soguk fosfat tamponlu salin (PBS) içine batirilir. Splenositler dalak PSA-PBS ile steril bir sekilde sivanarak toplanir. Hücreler bir kez soguk PSA-PES içinde yikanir, Trypan mavi boya dislamasi kullanilarak sayilir ve 25 mM Hepes içeren RPMI 1640 ortaminda yeniden süspansiyon haline getirilir.

Hücre Füzyonu Füzyon bilinen usullerle, örnegin. bu alanda. bilindigi gibi, 1:1 ila 1:10 oraninda siçangil miyelom hücreleri ve yasayabilir dalak hücreleriyle uygulanabilir. Sinirlandirici olmayan bir örnek olarak dalak hücreleri ve miyelom hücreleri birlikte peletlenebilir. Daha sonra plet 37°C'de 1 mL %50 (agirlik/hacim) PEG/PBS Çözeltisi (PEG molekül agirligi 1,459, Sigma) içinde 30 saniyede yavas yavas yeniden süspansiyon haline getirilir. Daha sonra füzyon 1 dakikada 25 mM Hepes (37°C) içeren 10.5 mL RPMI 1640 ortami yavas yavas ilave edilerek durdurulabilir. Kaynasmis hücreler daha sonra 5 dakika 500-1500 devir/dakikada santrifüjlenir. Daha sonra hücreler HAT ortaminda (25 mM Hepes, %10 Fetal Klon I serumu (Hyclone), 1 mM sodyum piruvat, 4 mM L-glutamin, 10 ug/mL gentamisin, %2.5 Origen kültürleme takviyesi (Fisher), %10 merkaptoetanol, 100 uM hipoksantin, 0.4 uM aminopterin ve 16 pM timidin içeren RPMI 1640 ortami) yeniden süspansiyon haline getirilir` ve sonra. on bes adet 96 kuyucuklu düz dipli doku kultürü plakasinar 200 uL/kuyucuk seviyesinde kaplanir. Daha sonra plakalar 7-10 gün %5 COz ve %95 hava içeren nemlendirilmis bir 37°C inkübatöre yerlestirilir.

Fare Serumunda Beseri IgG Anti-TNF Antikorlarinin Saptanmasi Fare serumlarinin beseri TNF için spesifik beseri lgG antikorlari açisindan taranmasi için kati faz EIA'lar kullanilabilir. Kisaca plakalar gece boyunca PBS içinde 2 ug/mL TNF ile kaplanabilir. %0.02 (hacim/hacim) Tween 20 içeren 0.15M salin içinde yikandiktan sonra kuyucuklar 1 saat oda sicakliginda 200 uL/kuyucuk seviyesinde PBS içinde %1 (agirlik/hacim) BSA ile bloke edilebilir. Plakalar hemen kullanilir veya daha sonra kullanilmak üzere -20°C'de dondurulabilir. Fare serumu dilüsyonlari 1 saat oda sicakliginda 50 uL/kuyucuk seviyesinde TNF kapli plakalar üzerinde inkübe edilir. Plakalar yikanir ve sonra 1 saat oda sicakliginda %1 BSA-PBS içinde 1:30,000 oraninda seyreltilmis 50 uL/kuyucuk seviyesinde HRP ile isaretlenmis keçi anti- beseri IgG, Fc spesifik ile arastirilir. Plakalar yeniden yikanabilir ve 15 dakika oda sicakliginda 100 uL/kuyucuk seviyesinde sitrat-fosfat substrat çözeltisi (0.1M sitrik asit ve ilave edilir.

Daha sonra 25 uL/kuyucuk durdurma çözeltisi (4N sülfürik asit) ilave edilir ve OD'ler otomatik plakali bir spektrofotometre ile 490 nm'de okunur.

Hibridom Üst Fazlarinda Tamamen Beseri Immünoglobülinlerin Saptanmasi Tamamen beseri immünoglobülinler salgilayan büyüme açisindan pozitif hibridomlar, uygun bir EIA kullanilarak saptanabilir.

Kisaca 96 kuyucuklu açilan plakalar (VWR, 610744) gece boyunca 4°C'de sodyum karbonat tampon içinde 10 ug/mL keçi anti-beseri dondurulur. Seyreltilmemis hibridom üst fazlari bir saat 37°C'de plakalar üzerinde inkübe edilir. Plakalar yikanir ve bir saat 37°C'de %1 BSA-PBS içinde 1:10,000 oraninda seyreltilmis HRP ile isaretlenmis keçi anti-beseri kappa ile arastirilir. Daha sonra plakalar yukarida açiklandigi gibi substrat çözeltisiyle inkübe edilir.

Tamamen Insan Anti-TNF'sinin Belirlenmesi Yukaridaki gibi hibridomlar uygun bir RIA veya baska bir tahlil kullanilarak es zamanli olarak TNF'ye karsi reaktivite açisindan tahlil edilebilir. Örnegin üst fazlar yukaridaki gibi keçi anti-beseri IgG Fc plakalari üzerinde inkübe edildikten sonra 1 saat oda sicakliginda kuyucuk basina uygun sayilarda radyoaktif isaretli TNF ile arastirilir. Kuyucuklar iki kez PBS ile yikanir ve bagli radyoaktif isaretli TNF uygun bir sayaç kullanilarak sayilir.

Beseri IgGl anti-TNF salgilayan hibridomlar hücre kültüründe genisletilebilir ve sinirlandirici seyreltmeyle seri olarak alt klonlanabilir. Elde edilen klonal popülasyonlar genisletilebilir ve dondurma ortaminda (%95 PES, %5 DMSO) dondurularak korunur ve sivi azot içinde saklanir.

Antikorlarin izotip belirlemesi, fare bagisik serumlarini spesifik titreler açisindan taramak için kullanilana benzer bir formatta. bir EIA kullanilarak yapilabilir. TNF yukarida açiklandigi gibi 96 kuyucuklu plakalar üzerine kaplanabilir ve bir saat oda sicakliginda plaka üzerinde 2 ug/mL seviyesinde saflastirilmis antikor inkübe edilebilir. Plaka yikanir ve bir saat oda sicakliginda %1 BSA-PBS içinde 1:4000 oraninda seyreltilmis HRP ile isaretlenmis keçi anti-beseri IgGi veya HRP ile isaretlenmis keçi anti-beseri IgG3 ile arastirilir.

Plaka yeniden yikanir` ve yukarida açiklandigi gibi substrat çözeltisiyle inkübe edilir.

Beseri Anti-Beseri TNF Antikorlarinin Beseri TNF Ile Baglanma Kinetigi Antikorlar için baglanma özellikleri örnegin bir TNF yakalama EIA. ve BIAcore teknolojisi kullanilarak uygun sekilde degerlendirilebilir. Saflastirilmis beseri TNF antikorlarinin dereceli konsantrasyonlari yukarida açiklandigi gibi tahlillerde 2 ug/mL TNF ile kaplanmis EIA plakalarina baglanma açisindan degerlendirilebilir. Daha sonra OD'ler nispi baglanma verimlilikleri gösteren yari-log çizimleri olarak sunulabilir.

Kantitaf baglanma katsayilari örnegin asagidaki gibi veya bilinen herhangi bir baska uygun usulle elde edilebilir. Bir BIAcore CM-5 (karboksimetil) çipi bir BIAcore 2000 birimine yerlestirilir. HBS tamponu (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, %0.005 hacim/hacim P20 yüzey aktif maddesi, pH 7.4) stabil bir referans hatti elde edilene kadar 5 uL/dakikada çipin bir akis hücresi üzerinden akitilir. 200 uL su içindeki mg EDC (N-etil-N'-(3-dimeti1-aminopropi1)-karbodiimit hidroklorür) çözeltisi ( 200 uL su içindeki bir NHS (N- hidroksisuksinimit) (2.3 mg) çözeltisine ( ilave edilir. Elde edilen çözeltinin kirk (40) uL'si çip üzerine enjekte edilir. Bir beseri TNF çözeltisinin (10 mM sodyum asetat içinde 15 ug/mL, pH 4.8) alti uL'si çip üzerine enjekte edilerek yaklasik 500 RU'luk bir artis elde edilir. Tampon TBS/Ca/Mg/BSA akar tamponla (20 mM Tris, 0.15 M sodyum klorür, 2 mM kalsiyum klorür, 2 mM nmgnezyum asetat, %O.5 Triton X- degistirilir ve gece boyunca çip üzerinden akitilarak çip dengelenir ve reaksiyona girmemis süksinimit esterler hidrolize edilir veya kapatilir. eritilir. Akis hizi 30 pL/dakikaya ve alet sicakligi 25°C'ye ayarlanir. Kinetik testler için iki akis hücresi kullanilir: Üzerinde TNF'nin hareketsizlestirildigi bir akis hücresi ve ikinci bir derive edilmemis akis hücresi (bos). Akis hücreleri üzerinden 30 uL/dakikada her antikor konsantrasyonundan 120ser uL enjekte edilir (birlestirme fazi), ardindan kesintisiz 360 saniye tampon akisi gelir (ayrisma. fazi). Çipin yüzeyi 30ar uL'lik ardisik iki adet 2 M guanidin tiosiyanat enjeksiyonuyla tazelenir (doku nekroz faktörü alfa/antikor kompleksi Veri analizi bu alanda bilindigi gibi BIA degerlendirmesi 3.0 veya CLAMP 2.0 kullanilarak yapilir. Her antikor konsantrasyonu için bos sensogram. numune sensogramindan çikarilir. Hem ayrisma (kasanü) hem de birlesme (ka, mol"l san" 1) için bir global uydurma yapilir ve ayrisma katsayisi (Km mol) hesaplanir (kd/ka). Antikor afinitesi yakalanan antikorun RU'lari >100 olacak kadar yüksek oldugunda, antikorun ek dilüsyonlari test edilir.

Sonuçlar ve Tartisma Anti-Beseri TNF Monoklonal Antikorlarinin Üretimi Çesitli füzyonlar yapilir ve her füzyon 15 plakada tohumlanarak (1440 kuyucuk/füzyon) beseri TNF için spesifik birkaç düzine antikor elde edilir. Bunlardan bazilarinin beseri ve fare hafif zincirlerinin bir kombinasyonundan olustugu saptanir. Kalan hibridomlar ise sadece beseri agir ve hafif zincirlerinden olusan anti-TNF antikorlari salgilar.

Beseri hibridomlarin hepsinin IgGl olmasi beklenir.

Beseri Anti-Beseri TNF Antikorlarinin Baglanma Kinetigi ELISA analizi bu hibridomlarin çogundan veya hepsinden alinan saflastirilmis antikorun TNF'yi konsantrasyona bagimli bir sekilde bagladigini teyit etmektedir. Sekil 1-2 bu antikorlarin nispi baglanma verimliliginin sonuçlarini göstermektedir. Bu durumda, antikorun ayni kökenli antijeni (epitop) için aviditesi ölçülür. TNF'nin dogrudan EIA plakasina baglanmasinin proteinin denatürasyonuna neden olabilecegini ve görünür baglanma afinitelerinin denatüre olmayan proteine baglanmayi yansitmayabilecegini belirtmek gerekir. Çesitli konsantrasyonlarda yüzde elli baglanma saptanir.

Kantitatif baglanma katsayilari beseri antikorlarin BlAcore analiziyle elde edilir ve birçok beseri monoklonal antikorun lxlO-9 ila. 7x10'12 araligindaki KD ile çok yüksek afinitesi oldugunu ortaya koyar Sonuçlar Beseri TNF ile bagisiklik kazandirilmis degisken ve sabit bölge antikor transgenleri içeren hibrid farelerden alinan splenositler kullanilarak çesitli füzyonlar yapilir. IgGl izotipinde tamamen beseri TNF ile reaktif birkaç IgG monoklonal antikorundan olusan bir küme üretilir. Tamamen beseri anti-TNF antikorlari daha da karakterize edilir. Üretilen antikorlarin birkaçi lxlO9 ve 9x1012 arasinda afinite katsayilarina sahiptir. Tamamen beseri bu monoklonal antikorlarin beklenmedik yüksek afiniteleri onlari TNF'ye bagimli hastaliklar, patolojiler veya iliskili rahatsizliklarda terapötik uygulamalar için uygun hale getirmektedir. Örnek 2: Beseri TNFV'ye Reaktif Beseri IgG Monoklonal Antikorlarinin Üretimi Hem agir hem de hafif zincirler için beseri degisken ve sabit bölge antikoru transgenleri içeren (CBA/J x C57BL/6J) F2 hibrid farelerine (1-4) rekombinant beseri TNFV ile bagisiklik kazandirildi. GenTNV' adli bir füzyon hareketsizlestirilmis rekombinant beseri TNFd'ya baglanan tamamen beseri sekiz IgGlK monoklonal antikoru verdi. Tespitten hemen sonra, sekiz hücre çizgisi sonraki karakterizasyon için Molecular Biology'ye aktarildi. Bu Mab'ler dizi olarak tamamen beseri olduklari için, insanlarda cA2'den (Remicade) daha olmalari beklenmektedir.

Kisaltmalar BSA - sigir serum albümini CO2 - karbondioksit DMSO - dimetil sülfoksit EIA - enzim immünolojik tahlili FBS - fetal sigir serumu Hxb - hidrojen peroksit HC - agir Zincir HRP - yabanturpu peroksidaz lg - immünoglobülin Mab - monoklonal antikor OD - optik yogunluk OPD - o-Fenilendiamin dihidroklorür PEG - polietilen glikol PSA - penisilin, streptomisin, amfoterisin RT - oda sicakligi SQ - deri altina TNFV - tümör nekroz faktörü alfa V/V - hacimce hacim w/v - hacimce agirlik immünojenik Rekombinant beseri TNFV'ye spesifik tamamen beseri monoklonal antikorlar üretmek için beseri agir ve immünoglobülin› genleri içeren transgenik fareler hafif zincir kullanildi.

Bu benzersiz antikorlarin, serum yarilanma ömrünün artmasi ve immünojeniklige bagli yan etkilerin azalmasi avantajlariyla birlikte, TNFV dolayimli hastalikta rol oynayan enflamatuvar süreçleri terapötik olarak inhibe etmek için cAZ'nin (Remicade) kullanildigi gibi kullanilabilecegi ümit edilmektedir.

Malzemeler ve Usuller Hayvanlar Beseri immünoglobülinleri eksprese eden, ama fare IgM veya ng'si eksprese etmeyen transgenik fareler GenPharm spesifik beseri immünoglobülinlerin (l) repertuvarini üretmek için V(D)J birlesmesi, agir zincir sinif degistirme ve somatik mutasyona ugrayan islevsel beseri antikor transgenleri içerir. Hafif zincir transgenleri kismen, germline beseri VK lokusunun yaklasik olarak yarisini içeren bir maya yapay kromozom klonundan derive edilir. Çesitli VH genlerine ek olarak, agir zincir (HC) transgeni hem beseri u hem de beseri u and beseri yl (2) ve/veya y3 sabit bölgelerini kodlar.

Burada açiklanan monoklonal antikorlari üretmek için bagisiklik kazandirma ve füzyon isleminde HColZ/KCoS genotipik soyundan deriye edilen bir fare kullanildi.

Beseri TNFV'nin Saflastirilmasi Beseri TNFV Sepharose 4B'ye (Pharmacia) bagli TNFV reseptörü- Fc füzyon proteiniyle (p55-sf2) (5) paketlenmis bir kolon kullanilarak afinite kromatografisiyle C237A hücrelerinden doku kültürü üst fazindan saflastirildi. Hücre üst fazi hacminin dokuzda biri 10x Dulbecco PBS (D-PBS) ile karistirildi ve 4 mL/dakikada 4°C'de kolondan geçirildi. Daha sonra kalan PBS ile yikandi ve TNFV O.l M sodyum sitrat, pH 3.5 ile degerlendirildi ve 2 M Tris-HCl pH 8.5 ile nötralize edildi. Saflastirilmis TNFV lO mM Tris, 0.12 M sodyum klorür pH 7.5 içine tampon degisikligine tabi tutuldu ve 0.2 um siringali bir filtreden süzüldü.

Bagisiklik Kazandirma Uygulamalari Yaklasik olarak 16 haftalik disi bir GenPharm faresine O, 12 ve 28. günlerde esit hacimde Titermax adjuvanla emülsifiye edilmis toplam periton içine ( uygulanarak bagisiklik kazandirildi. Farelerden antikoagülan olmadan göz arkasindan ponksiyonla 21. ve 35. günlerde kan alindi. Kan bir saat oda sicakliginda pihtilasmaya birakildi ve toplandi ve TNFV kati faz EIA tahlili kullanilarak titre edildi. GenTNV' olarak adlandirilan füzyon, fare 28. gündeki enjeksiyonun ardindan yedi hafta dinlenmeye birakildiktan sonra yapildi.

TNFV'ye karsi 1:160 spesifik beseri IgG titresine sahip fareye daha sonra 100 ul fizyolojik salin içinde seyreltilmis 50 ug TNFV'nin nihai bir damar içine destek enjeksiyonu yapildi. Üç gün sonra, farelere servikal. dislokasyonla. ötanazi. uygulandi ve dalaklar aseptik olarak çikarildi ve 100 U/mL penisilin, içeren 10 mL soguk fosfat tamponlu salin (PBS) içine batirildi. Dalak PSA-PES ile steril bir sekilde sivanarak splenositler toplandi. Hücreler soguk PSA-FBS içinde bir kez yikandi, bir Coulter sayaci kullanilarak sayildi ve 25 mM Hepes içeren RPMI 1640 ortaminda süspansiyon haline getirildi.

Hücre Çizgileri Salgilayici olmayan fare miyelom füzyon partneri 653 Centocor'un Ürün Gelistirme grubundan 5-14-97'de Hücre Biyolojisi Servisleri (CBS) grubuna alindi. Hücre çizgisi %10 (hacim/hacim) FBS (Hücre Kültürü Laboratuvarlari), l mM sodyum piruvat, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin (hepsi JRH Biosciences'dan) ile takviye edilmis RPMI ortaminda (JRH Biosciences) genisletildi ve %95 FBS ve %5 DMSO (Sigma) içinde dondurularak korunduktan sonra CBS içinde sivi faz sivi azot dondurucuda saklandi. Hücre kümesi sterildi (Quality Control Centocor, Malvern) ve mikoplazma içermiyordu (Bionique Laboratories). Hücreler füzyona kadar log faz kültürde tutuldu. Daha sonra PBS içinde yikandilar, sayildilar ve yasayabilirlik füzyondan önce tripan mavi boya dislamasiyla belirlendi (>%95).

Beseri TNFV Centocor'da Moleküler Biyolojide üretilen C237A olarak adlandirilan bir rekombinant hücre çizgisi tarafindan üretildi. Hücre çizgisi %5 (hacim/hacim) FBS (Hücre Kültürü Laboratuvarlari), 2 mM L-glutamin (hepsi JRH Biosciences'tan) ve 0.5 g/mL mikofenolik asitle takviye edilmis IMDM ortaminda (JRH Biosciences) genisletildi ve %95 FBS ve %5 DMSO (Sigma) içinde dondurularak korunduktan sonra CBS (13) içinde buhar fazi sivi azot dondurucuda saklandi. Hücre kümesi sterildi (Quality Control Centocor, Malvern) ve mikoplazma içermiyordu (Bionique Laboratories).

Hücre Füzyonu Hücre füzyonu lzl oraninda 653 siçangil miyelom hücreleri ve yasayabilir siçangil dalak hücreleri kullanilarak yapildi.

Kisaca, dalak hücreleri ve miyelom, hücreleri birlikte peletlendi. Pelet 30 saniyelik bir sürede 37°C'de l mL %50 (agirlik/hacim) PEG/PBS çözeltisi (PEG molekül agirligi 1,450 g/mol, Sigma) içinde yavas yavas yeniden süspansiyon haline getirildi. (37°C) 1 dakikada yavas yavas ilave edilerek füzyon durduruldu. Kaynasmis hücreler 5 dakika 750 devir/dakikada santrifüjlendi. Daha sonra hücreler HAT ortaminda (%10 Fetal Sigir Serumu (JRH), l mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 10 pg/Hdi gentamisin, %2.5 Origen kültürleme takviyesi (Fisher), 50 uM 2-merkaptoetanol, %1 653-kosullandirilmis RPMI ortami, 100 uM hipoksantin, 0.4 uM aminopterin ve 16 uM timidin içeren RPMI/HEPES) yeniden süspansiyon haline getirildi ve sonra bes adet 96 kuyucuklu düz dipli doku kültürü plakasina 200 uL/kuyucuk seviyesinde kaplandi. Daha sonra plakalar 7-10 gün inkübatörde tutuldu.

Fare Serumunda Beseri IgG Anti-TNFV Antikorlarinin Saptanmasi Fare serumlarini beseri TNFV için spesifik beseri IgG antikorlari açisindan taramak için kati faz ELA'lar kullanildi. Kisaca, %0.02 (hacim/hacim) Tween 20 içeren 0.15 M salin içinde yikamadan sonra, kuyucuklar 1 saat oda sicakliginda 200 uL/kuyucuk seviyesinde PBS içinde %1 (agirlik/hacim) BSA ile bloke edildi. Plakalar ya hemen kullanildi veya daha sonra kullanilmak üzere -20°C'de donduruldu. Fare serumlari 1 saat oda sicakliginda 50 uL/kuyucuk seviyesinde beseri TNFV kapli plakalarda iki katli seri dilüsyonlar içinde inkübe edildi. Plakalar yikandi ve sonra 1 saat oda sicakliginda %1 BSA-PBS içinde 1:30,000 oraninda seyreltilmis 50 uL/kuyucuk HRP ile isaretlenmis keçi anti-beseri IgG, Fc spesifik (Accurate) ile arastirildi.

Plakalar yeniden yikandi ve 15 dakika oda sickliginda 100 uL/kuyucuk seviyesinde sitrat-fosfat substrat çözeltisi (0.1 M sitrik asit ve ile arastirildi. Daha sonra 25 uL/kuyucuk seviyesinde durdurma çözeltisi (4N sülfürik asit) ilave edildi ve OD'ler bir otomatik plaka spektrofotometresi kullanilarak 490 nm'de Hibridom Üst Fazlarinda Tamamen Beseri Immünoglobülinlerin Saptanmasi GenPharm faresi hem fare hem de beseri immünoglobülin Zincirlerini üretebildigi için, büyüme açisindan pozitif hibridom klonlarini hem beseri hafif zincirlerin hem de beseri agiz zincirlerin varligi açisindan test etmek için iki ayri EIA tahlili kullanildi. Plakalar yukarida açiklandigi gibi kaplandi ve seyreltilmemis hibridom üst fazlari bir saat 37°C'de plakalar üzerinde inkübe edildi. Plakalar yikandi ve bir saat 37°C'de 1 BSA-HBSS içinde l:l0,000 oraninda seyreltilmis HRH-konjüge keçi anti-beseri kappa (Southern Biotech) antikoruyla veya %1 BSA-HBSS içinde 1:30,000 oraninda seyreltilmis HRP-konjüge keçi anti-beseri lgG Fc spesifik antikoruyla arastirildi. Daha sonra plakalar yukarida açiklandigi gibi substrat çözeltisiyle birlikte inkübe edildi.

Hem. anti-beseri kappa. hem. de anti-beseri IgG Fc EIA formatlarinda pozitif bir sinyal vermeyen hibridom klonlari Izotip tayini Antikorlarin izotip tayini fare bagisik serumlarini spesifik titreler açisindan taramak için kullanilana benzer bir formatta bir EIA kullanilarak yapildi. EIA plakalari yukarida açiklandigi gibi gece boyunca 4EC'de sodyum karbonat tamponu içinde 10 g/mL seviyesinde keçi anti-beseri IgG (H+L) ile kaplandi ve bloke edildi. 24 kuyucuklu kültürlerden katkisiz üst fazlar* bir saat oda sicakliginda plaka üzerinde inkübe edildi. Plaka yikandi ve bir saat oda sicakliginda %1 BSA-PBS içinde 1:4000 oraninda seyreltilmis HRP ile isaretlenmis keçi anti-beseri IgGi, Ing, IgGg veya IgG4 (Baglama Yeri) ile arastirildi. Plaka yeniden yikandi ve yukarida açiklandigi gibi substrat çözeltisiyle inkübe edildi.

Sonuçlar ve Tartisma Tamamen Beseri Anti-Beseri TNFV Monoklonal Antikorlarinin Üretilmesi GenTNV olarak adlandirilan bir füzyon, rekombinant beseri TNFV proteiniyle bagisiklik kazandirilmis bir GenPharm faresiyle yapildi. Bu füzyondan, 196 büyüme açisindan pozitif hibrid tarandi. Beseri TNFV ile reaktif tamamen beseri IgG antikorlari salgilayan sekiz hibridom hücre çizgisi saptandi.

Bu sekiz hücre çizgisinin her biri beseri IgGlK izotipinde immoglobülinler salgiladi ve hepsi stabil hücre çizgileri (>%9O homojen) elde etmek için kisitlayici seyrelticiyle iki kez alt klonlandi. Hücre adlari ve iliskili C kodu adlandirmalari Tablo 1'de listelenmektedir. Hücre çizgilerinin her biri sivi azot içinde saklanan 12 siseli arastirma hücre banklarinda donduruldu.

Sekiz hücre çizgisinin her biri için 24 kuyucuklu bir kültür çanaginin kuyucuklarindan toplanan parental hücreler 2-19- 99'dar transfeksiyon ve daha fazlar karakterizasyon için Moleküler Biyoloji grubuna teslim edildi.

Tablo 1: GenTNV Hücre Çizgisi Adlandirmalari Ad C Kodu Adlandirmasi GenTNV14.17.12 C414A GenTNV15.28.11 C4l5A GenTNV32.2.16 C416A GenTNV86.14.34 C417A GenTNV122.23.2 C419A GenTNV196.9.1 C421A GenTNV füzyonu Centocor'da hazirlanan rekombinant beseri TNFV ile bagisiklik kazandirilmis beseri degisken ve beseri sabit bölge antikor transgenleri içeren bir hibrid fareden alinan splenositler kullanilarak yapildi. IgGlK izotipinde tamamen beseri, TNFV ile reaktif sekiz IgG monoklonal antikoru üretildi. Parental hücre çizgileri sonraki karakterizasyon ve gelistirme için Moleküler Biyoloji grubuna teslim edildi. Bu yeni beseri antikorlarin birinin, Remicade ile karsilastirildiginda immünojenikligin ve alerjik tipte komplikasyonlarin azaltilmasina iliskin potansiyel yararla birlikte antienflamatuvar açidan yararli oldugu kanitlanabilir.

Referanslar 1. Taylor, ve digerleri,. International Immunology 4. Fishwild, ve digerleri, Nature Biotechnology 14:845- 851 (1996). Örnek 3: Beseri anti-TNFV Antikorunu Eksprese Eden Hücre Çizgilerinin Klonlanmasi ve Hazirlanmasi Bir TNV adlandirmasina sahip sezik beseri monoklonal antikordan (mAb) olusan bir panelin görünür bir sekilde yüksek aviditeyle hareketsizlesmis beseri TNFV'ye baglandigi saptandi. Sekiz mAb'nin yedisinin huTNFV'nin bir rekombinant TNF reseptörüne baglanmasini etkili bir sekilde bloke ettigi gösterildi. Yedi mAb'yi kodlayan DNA'nin dizi analizi bütün mAb'lerin beseri V bölgelerine sahip oldugunu teyit etti. DNA dizileri ayrica, sekiz mAb'den olusan orijinal panel, TNV14, TNV15, TNV148 ve TNV196 ile temsil edilen sadece dört ayri mAb içerecek sekilde mAb'lerin üç çiftinin birbirinin ayni oldugunu ortaya koydu. mAb'lerin çikarsanan amino asit dizilerinin analizleri ve in vitro TNFV nötralizasyon verilerinin sonuçlari temelinde, mAb TNV148 ve TNV14 sonraki çalisma için seçildi.

TNV148 agir zincirinde 75 pozisyonundaki (çerçeve 3) prolin kalintisi bir veri tabani arastirmasinda ayni alt gruba sahip baska beseri antikorlarda o pozisyonda bulunmadigi için, bilinen germline çerçeve dizilerine uymasini saglamak için o pozisyonda bir serin kalintisini kodlamak için yer yönelimli DNA mutagenezi yapildi. Serinle modifiye edilmis mAb TNV148B olarak adlandirildi. TNVl488 ve TNV l4'ün agir ve hafif zincir degisken bölgelerini kodlayan PCR ile amplifiye edilmis DNA 7 Ekim 2000'de dosyalanan, IL-12 Antikorlari, Bilesimleri Usulleri ve Kullanimlari baslikli ABD patent basvurusunda açiklanan baska bir beseri mAb'nin (12B75) yeni klonlanmis agir ve hafif zincir genlerine dayanan yeni hazirlanmis ekspresyon vektörleri içine klonlandi. miyelom hücreleri iliskili agir ve hafif zincir ekspresyon plasmidleriyle trasfekte edildi ve yüksek seviyelerde rekombinant TNVl48B ve TNVl4 (rTNVl48B ve rTNVl4) mAb'ler üreten hücre çizgileri için iki tur alt klonlamayla tarandi.

Büyüme egrileri ve mAb üretiminin zaman içindeki stabilitesinin degerlendirilmesi, 653-transfektan klonlari C466D ve C466C'nin stabil bir sekilde tüketilmis kültürlerde yaklasik olarak 125 :g/ml rTNV148B mAb üretti, Sptransfektan 1.73-'nin ise tükekilmis kültürlerde yaklasik olarak 25 :g/ml rTNVl48B mAb ürettigini ortaya koydu.

Benzer analizler Sp2/O-transfektan klonu C476A'nin tüketilmis kültürlerde 18 :g/ml rTNVl4 ürettimini gösterdi.

Beseri TNFV ile bagisiklik kazandirilmis GenPharm/Medarex farelerden derive edilen sekiz mAb'den olusan bir panelin (HCo l2/KC05 genotip) beseri TNFV'yi bagladigi ve tamamen beseri bir IgGl, kappa izotipine sahip oldugu daha önce gösterildi.

TNFV'nin rekombinant TNF reseptörüne baglanmasini bloke etme kabiliyetleri degerlendirilerek, bulusun örnek mAb'lerinin TNFV nötralize edici aktivitesine sahip olma ihtimali olup olmadigini belirlemek için basit bir baglanma tahlili yapildi.

Bu sonuçlar, DNA dizi sonuçlari ve çesitli mAB'lerin in vitro karakterizasyonu temelinde, TNV148 daha fazla karakterize edilecek mAb olarak seçildi.

TNV148 mAb'yi kodlayan DNA dizileri klonlandi, uygun sabit bölgeleri kodlayan gen ekspresyonu vektörleri içine uymalari için modifiye edildi, iyi karakterize edilmis 653 ve SpZ/O fare miyelom hücreleri içine yerlestirildi ve elde edilen transfekte olmus hücre çizgileri orijinal hibridom hücre çizgisinden 40 kat daha fazla mAb üreten alt klonlar saptanana kadar tarandi.

Malzemeler ve Usuller Tepkime Maddeleri ve Hücreler TRIZOL tepkime maddesi Gibco BRL'den satin alindi. Proteinaz K Sigma Chemical Company'den satin alindi. Ters Transkriptaz Life Sciences, Inc.'ten elde edildi. Taq DNA Polimeraz Perkin Elmer Cetus veya Gibco BRL'den elde edildi. Kisitlama enzimleri New England Biolabs'dan satin alindi. QIAquick PCR Saflastirma Kiti Qiagen'den elde edildi. QuikChange Yer Yönelimli Mutagenez Kiti Stratagene'den satin alindi.

Wizard plasmid miniprep kitleri ve RNasin Promega'dan elde edildi. Optiplates Packard'dan elde edildi. 125Iyot Amersham'dan satin alindi. Özel oligonükleotitler Keystone/Biosource International'dan satin alindi. Bu çalismada kullanilan oligonükleotitlerin adlari, kimlik numaralari ve dizileri Tablo 1'de gösterilmektedir.

Tablo 1. TNV mAb genlerini klonlamak, üretmek veya dizilemek için kullanilan oligonükleotitler. Oligonükleotit 5'l4s ve HuH-J6 tarafindan kodlanan amino asitler dizinin üzerinde gösterilmektedir. “M” amino asit kalintisi translasyon baslatma kodonunu temsil eder. Oligonükleotitler 5'14s ve HuH- J6'da alti çizili diziler sirasiyla BsiWI ve BstBI kisitlama yerlerini isaretler. HuH-J6X'daki egik çizgi ekson/intron sinirina karsilik gelir. Dizisi eksi iplige karsilik gelen oligonükleotitler bir 3'-5' yöneliminde yazilir. 11:11-!) mM glutamin edilene kadar sürekli kültürde tutuldu. dondurulmus Sp2/O fare miyelom hücreleri 3 -TTCIC'TCC-.Ä( .TCGtl-'xiTT-*jfj ~$ iJ'Acxt13ÇAL1413CliifFTé' 3.-(K. I..." .(1. Iri( i .ÃC'TIAUC ':17 L.. - S' BS'WI *4 l) W 1' w 3 1 S›TT(TI':T/-\~f'i.`iCC AC( ` 'CG f3.i\l.”l"-.'3\'Iv.ixiîCTGC .-\C~C.'.~=. ."C -3' J -t: lAi'.. :\(iii".`17[( I I (fî-(A ;Gri il'l'lî ITIT# IGCÜAlîA [ACI-5' 653 fare miyelom hücrelerinin tek bir dondurulmus sisesi elde Sise o gün çözdürüldü ve T siselerinde IMDM, içinde genisletildi. açiklanan anti-TNF DNA ile çözdürme gününden 5 gün sonra toplandi, peletlendi ve %95 FBS, %5 DMSO içinde yeniden haline getirildi, 30 siseye bölündü, donduruldu ve kullanim için saklandi. Benzer bir sekilde, Bu hücreler 2 ila 3 transfekte Kültürlerin bir kismi santrifüjlenerek süspansiyon sonraki sisesi alindi. çözdürüldü, yukarida açiklandigi gibi yeni bir dondurulmus terkip hazirlandi ve dondurulmus siseler CBC dondurma kutulari AA ve AB'de saklandi. Bu hücreler çözdürüldü ve burada açiklanan bütün Sp2/O transfeksiyonlari için kullanildi.

Reseptöre TNT Baglanmasinin Inhibisyonu Için Tahlil mAb'lerin N51 isaretli TNFV'nin rekombinant TNF reseptörü füzyon proteini p55-sf2'ye baglanmasini bloke etme kabiliyetini tahlil etmek için TNV mAb'ler içeren hibridom hücresi üst fazlari kullanildi (Scallon ve digerleri (1995) Cytokine 7:759-770). 37°C'de bir saatlik inkübasyon sirasinda kuyucuklari kaplamak için Optiplates'e PBS içinde 0.5 :g/ml seviyesinde 50:l oraninda p55-sf2 ilave edildi. Seyreltici olarak PBS/%O.l BSA kullanilarak 96 kuyucuklu yuvarlak dipli plakalarda sekiz TNFV hücre üst fazinin seri dilüsyonlari hazirlandi. Anti-IL-18 mAb'yi içeren hücre üst fazi negatif bir kontrol olarak dahil edildi ve cA2 ile (anti-TNF kimerik antikoru, Remicade, ABD Patenti No. 5,770,198) baglanmis ayni anti-IL-18 üst fazi bir pozitif kontrol olarak dahil edildi. 5 ng/ml nihai TNFV konsantrasyonu elde etmek için 10021 hücre üstfazina l ilave edildi. Karisim oda sicakliginda bir saat ön inkübasyona tabi tutuldu. Kaplanmis Optiplates bagli olmayan p55-sfl'i çikarmak için yikandi ve 50:l lül- TNFV/hücre üst faz karisimi Optiplates'e aktarildi. Oda sicakliginda 2 saat sonra, Optiplates üç kez PES-Tween ile yikandi. lOO:l Microscint-ZO ilave edildi ve bagli cpm TopCount gama sayaci kullanilarak belirlendi.

V Genlerinin Amplifikasyonu ve DNA Dizi Analizi Hibridoni hücreleri bir kez PBS içinde yikandiktan sonra RNA hazirlamak için TRIZOL tepkime maddesi ilave edildi. 7 X 106 ve l.7 X 107 arasinda hücreler 1 ml TRIZOL içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. 200 ul kloroform ilave edildikten sonra tüpler kuvvetle çalkalandi. Numuneler 10 dakika 4°C'de santrifüjlendi. Sulu faz taze bir mikrofüj tüpüne aktarildi ve esit hacimde izopropanol ilave edildi.

Tüpler kuvvetle çalkalandi ve 10 dakika oda sicakliginda inkübe olmaya birakildi. Daha sonra numuneler 10 dakika 4°C'de santrifüjlendi. Peletler bir kez 1 ml %70 etanolle yikandi ve vakumlu kurutucuda kisa bir süre kurutuldu. RNA peletleri 40 pl DEPC ile muameleden. geçirilmis suyla yeniden süspansiyon haline getirildi. RNA terkiplerinin kalitesi, 0.5 pl %1 agaroz jel içinde damitilarak belirlendi. RNA kullanilana kadar -80°C dondurucuda saklandi.

Agir ve hafif zincir cDNA'lari hazirlamak için, 11.5 ul hacimde 3 ul RNA ve 1 ug oligonükleotit 119 (agir zincir veya oligonükleotit 117 (hafif zincir) (bakiniz Tablo 1) içeren karisimlar hazirlandi. Karisim 10 dakika bir su banyosunda 70°C'de inkübe edildikten sonra 10 dakika buz üzerinde sogutuldu. 2.5 pl 10X ters transkriptaz tamponu, 10 ul 2.5 mM dNTP'ler, 1 ul ters transkriptaz (20 birim) ve 0.4 ul ribonükleaz inhibitörü RNasin'den U_ birim) olusan ayri bir karisim hazirlandi. Bu karisimdan 13.5 ul 11.5 ul sogutulmus RNA/oligonükleotit karisimina ilave edildi ve reaksiyon 40 dakika 42°C'de inkübe edildi. Daha sonra cDNA sentez reaksiyonu kullanilana kadar -20°C dondurucuda saklandi.

Saflastirilmamis agir ve hafif zincir cDNA'lar degisken bölge kodlama dizilerinin PCR. amplifikasyonu için sablonlar olarak DNA'nin amplifikasyonunu saglama kabiliyetleri açisindan test anda hafif zincir DNA'nin amplifikasyonunu baslatma kabiliyetleri açisindan test edildi. PCR reaksiyonlari toplam 50 ul hacimde 2 birim PLATMUM” yüksek uygunluk dereceli (HIFI) Taq DNA polimeraz kullanilarak uygulandi. Her reaksiyon 2 pl cDNA reaksiyonu, 10 pmol her oligonükleotitten, 0.2 mM dNTP'ler, 5 pl 10 X HIFI Tampon ve 2 mM magnezyum sülfat içeriyordu. Isi döngüleyici programi 5 dakika 95°C, ardindan dakika 68°C'de nihai bir inkübasyon uygulandi.

Dolaysiz DNA dizilemesi için PCR ürünlerini hazirlamak için, bunlar QIAquickTM PCR Saflastirma Kiti imalatçinin protokolüne göre kullanilarak. saflastirildi. DNA 50 pl steril su kullanilarak döner kolondan elute edildikten sonra bir vakumlu kurutucuda 10 pl hacme kadar kurutuldu. Daha sonra DNA dizileme reaksiyonlari 1. ul saflastirilmis PCR ürünü, 10 pM oligonükleotit primeri, 4 ul BigDye Terminator“ hazir reaksiyon karisimi ve 14 pl steril suyla toplam 20 pl hacim için ayarlandi. 367/354 oligonükleotit çiftiyle hazirlanan agir zincir PCR ürünleri oligonükleotit primerleri 159 ve 360 ile dizilendi. 363/208 oligonükleotit çiftiyle hazirlanan hafif zinir PCR ürünleri oligonükleotitler 34 ve 163 ile dizilendi.

Dizileme için isi döngüleyici programi 25 tur (30 saniye 96°C, saniye 50°C, 4 dakika 60°C), ardindan gece boyunca 4°C'ydi.

Reaksiyon ürünleri bir poliakrilamit jelden damitildi ve bir ABI 377 DNA Dizileyicisi kullanilarak saptandi.

Bir Amino Asidi Degistirmek Için Yer Yönelimli Mutagenez TNV 148 mAb'de Pron'i bir Serin kalintisiyla degistirmek için TNV148 agir zincir degisken bölge DNA dizisinde tek bir nükleotit degistirildi. Tamamlayici oligonükleotitler 399 ve tasarlandi ve imalatçinin protokolüne göre, translasyon baslatma yerinin hemen akis yukarisinda benzersiz BsiWI klonlama yeri kullanilarak bu degisikligi yapmak üzere düzenlendi. Elde edilen plasmid p1747 olarak adlandirildi.

Degisken bölgenin 3' ucuna bir BstBl yeri dahil etmek için, Sall ve BstBI yerleriyle bir 5' oligonükleotit primeri tasarlandi. p1747'den 2.75 kb'lik bir fragmani amplifiye etmek için bu primer pUC ters primeriyle birlikte kullanildi. Daha sonra bu fragman 12B75 degisken bölgesindeki dogal olarak olusan Sail yerine ve bir HindIII yerine geri klonlandi, böylece benzersiz BstBl yeri dahil edildi. p1750 adi verilen elde edilen dolaysiz vektör BsiWI ve BstBI uçlarina sahip degisken bölge fragmanlarini kabul edebildi. Sabit bölgenin yine 12B75 geninden derive edildigi agir zincir vektörünün bir versiyonunu hazirlamak için, pl750'deki BamHI-HindIII uzantisi, Hindlll yerinin akis asagisinda bir EcoRI yerine sahip olmak için pBR322'ye aktarildi. Daha sonra elde edilen plasmid. pl768 HindlII ve EcoRl ile sindirildi ve p1560'tan büyük BamHI-BamHI fragmani pBC içine klonlanarak derive edilen bir alt klon olan, pl744'ten 5.7 kb'lik bir HindIII-ECORI fragmanina baglandi. Daha sonra elde edilen plasmid p1784, BsiWI ve BstBI uçlariyla TNV Ab CDNA fragmanlari için vektör olarak kullanildi. 12B75 geninden IgGl sabit bölgesini içeren ve içerdikleri 12B75 agir zincir J-C intronu miktariyla birbirlerinden farklilasan ekspresyon vektörleri pl788 ve pl798'i hazirlamak için ek çalisma yapildi.

Plasmid p1558'de 12B75 hafif zincir genini modifiye etmek için, 12B75 promotörü ve degisken bölgesini içeren 5.7 kb'lik bir SalI/AflII fragmani p1558'den plasmid L28'in XhoI/AflII yerlerine aktarildi. Bu yeni plasmid pl745 mutagenez asamasi için daha küçük bir sablon temin etti. Oligonükleotitler (C34OSalI ve C3405al2) QuikChangeTM mutageneziyle degisken bölgenin 5' ucuna benzersiz bir SalI kisitlama yeri dahil etmek. için kullanildi. Elde edilen ara vektör p1746, içine degisken bölge fragmanlarinin klonlanabildigi benzersiz SalI ve AflII kisitlama yerlerine sahipti. p1746'ya klonlanan herhangi bir degisken bölge fragmani tercihen hafif zincir geninin 3' yarisiyla birlestirilecektir. 12B75 hafif gen zincirinin 3' yarisindan bu amaçla kullanilabilecek bir kisitlama fragmani hazirlamak için, oligonükleotitler BAHN-l ve BAHN-Z, kisitlama yerleri BsiWl, AflII, HindII ve NotI'i içeren ve KpnI ve SacI yerlerine baglanabilen uçlar içeren çift iplikli bir baglayici olusturmak üzere birbirine tavlandi. Bu baglayici pBC'nin KpnI ve SacI yerleri arasina klonlanarak plasmid pl757 elde edildi. p1558 Aflll ile sindirilerek, sonra kismen HindIII ile sindirilerek üretilen l2B75 hafif zincir sabit bölgesini içeren 7.1 kb'lik bir fragman pl757'nin AflII ve HindII yerleri arasina klonlanarak p1762 elde edildi. Bu yeni plasmid içine promotör ve degisken bölgeleri içeren BsiWI/AflII fragmaninin aktarilarak genin iki yarisinin birlestirildigi BsiWI ve AflII için benzersiz yerler içeriyordu. cDNA Klonlamasi ve Ekspresyon Plasmidlerinin Birlestirilmesi Bütün RT-PCR reaksiyonlari (yukariya bakiniz) DNA uçlarini daha da doldurmak için Klenow enzimiyle muameleden geçirildi.

Agir zincir PCR fragmanlari BsiWI ve BstBI kisitlama enzimleriyle sindirildikten sonra plasmid L28'in (12B75 bazli ara vektör pl750 henüz hazirlanmadigi için L28 kullanildi) BsiWI ve BstBI yerleri arasina klonlandi. Klonlanmis eklentilerin DNA dizi analizi, elde edilen olusumlarin dogru oldugunu ve PCR amplifikasyonlari sirasinda dahil edilen hiçbir hata olmadigini gösterdi. Bu L28 plasmid olusumlari (TNV14, TNV15, TNVl48, TNV için atanan kimlik numaralari Tablo 2'de gösterilmektedir.

TNVl4, TNV148 ve TNVl48B agir zincirleri için BsiWI/BstBI eklentileri L28 vektöründen yeni hazirlanan ara vektör pl750'ye aktarildi. Bu ara plasmidlere tahsis edilen kimlik numaralari Tablo 2'de gösterilmektedir. Bu klonlama asamasi ve sonraki asamalar TNV' 15 ve TNV 196 için uygulanmadi. Daha sonra degisken bölgeler iki farkli beseri IgGl ekspresyon vektörü içine aktarildi. Degisken bölgeleri Centocor'un daha önce kullanilan IgGl vektörü plO4 içine aktarmak için kisitlama enzimleri EcoRI ve HindIII kullanildi. Gm(f+) allotipinde bir IgGl'i kodlayan elde edilen ekspresyon plasmidleri pl78l (TNV14), pl (bakiniz Tablo 2) olarak adlandirildi. Degisken bölgeler geninden derive edilen IgGl sabit bölgesinin akis yukarisina da klonlandi. Glm(z) allotipinde bir IgGl'i kodlayan bu ekspresyon plasmidleri de Tablo 2'de listelenmektedir.

Tablo 2. Çesitli agir ve hafif zincir plasmidleri için plasmid kimlik numaralari.

L28 vektörü veya pBC vektörü baslangiç Ab CDNA klonunu temsil eder. Bu plasmidler içine eklentiler ara plasmidleri olusturmak için bir eksik 12B75 bazli vektöre aktarildi. Bir ek transfer asamasi dogrusallastirildiktan sonra hücreler içine dahil edilen veya hücre transfeksiyonundan önce mAb gen eklentilerini saflastirmak için kullanilan nihai ekspresyon plasmidlerini verdi. (ND) = yapilmadi. mAb L28 Ara Gm(f+) Glm(z) vektör Plasmid Ekspresyon Ekspresyon TNVlS pl778 pl782 pl787 pBC vektörAra Plasmid ID Ekspresyon Plasmid ID Plasmidi ID Zincirler pl748 pl755 pl775 Hafif zincir PCRI ürünlerir kisitlamar enzimleri Salla ve SacII ile sindirildikten sonra plasmid pBC'nin SalI ve SacII yerleri arasina klonlandi. Bir amino asitle farklilasan iki farkli hafif zincir versiyonu pl748 ve pl749 olarak adlandirildi (Tablo 2). DNA dizi analizi bu olusumlarin dogru dizilere sahip oldugunu teyit etti. Daha sonra pl748 ve pl749'daki SalI/AflII fragmanlari sirasiyla pl755 ve p1756'yi olusturmak için ara vektör pl746'nin SalI ve AflII yerleri arasina klonlandi. Hafif zincirlerin bu 5' yarilari daha sonra, pl755 ve pl756'dan BsiWI/AflII fragmanlari sirasiyla nihai ekspresyon plasmidleri pl775 ve pl776'yi olusturmak için yeni hazirlanan olusum pl762'ye aktarilarak genin 3' yarilariyla birlestirildi (Tablo 2).

Hücre Transfeksiyonlari, Tarama ve Alt Klonlama Çesitli TNV ekspresyon plasmidleriyle fare miyelom hücrelerinin toplam, 15 transfeksiyonu yapildi (Sonuçlar ve Tartisma bölümünde Tablo 3'e bakiniz). Bu transfeksiyonlar (1) konak hücrelerin Sp2/O veya 653 olmasi; (2) agir zincir sabit bölgesinin Centocor'un önceki IgGl vektörüyle veya 12B75 agir zincir sabit bölgesiyle kodlanmasi; (3) mAb'nin TNVl48B, TNV DNA'nin dogrusallastirilmis plasmid veya saflastirilmis Ab gen eklentisi olmasi; ve (5) agir zincir geninde tam J-C intron dizisinin varligi veya yokluguyla ayirt edildi. Ayrica, çok sayida klonun taranabilme ihtimalini arttirmak için transfeksiyonlarin birçogu tekrarlandi.

Sp2/O hücreleri ve 653 hücrelerinin her biri daha önce açiklandigi gibi (Knight DM ve digerleri (1993) Molecular elektroporasyonla bir agir ve hafif zincir DNA (8-12 :g her biri) karisimiyla transfekte edildi. Transfeksiyon numaralari 1, 2, 3 ve 16 için, uygun ekspresyon plasmidleri transfeksiyondan önce bir kisitlama enzimiyle sindirim yoluyla dogrusallastirildi. Örnegin TNV148B agir zincir plasmid p1783 ve hafif zincir plasmid pl776'yi dogrusallastirmak için sirasiyla SalI ve NotI kisitlama enzimleri kullanildi. Geri kalan transfeksiyonlar için, sadece mAb genini içeren DNA eklentileri, agir zincir plasmidleri BamHI ile ve hafif zincir plasmidleri BsiWI ve NotI ile sindirilerek plasmid vektöründen ayrildi. Daha sonra mAb gen eklentileri agaroz jel elektroforez ve Qiex saflastirma reçineleriyle saflastirildi.

Saflastirilmis gen eklentileriyle transfekte edilen hücreler es zamanli olarak seçilebilir markör kaynagi olarak 3-5 :g PstI ile dogrusallastirilmis pSVngt plasmidle (p13) transfekte edildi. Elektroporasyonun ardindan, hücreler IMDM, çanaklarinda tohumlandi ve %5 C02 inkübatörde 37°C'de inkübe edildi. Iki gün sonra, esit hacimde IMDM, %5 FBS, 2mM glutamin, 2 X MHX seçimi (1 X .MHX : 0.5 :g/ml mikofenolik asit, 2.5 :g/ml hipoksantin, 50 :g/ml ksantin) ilave edildi ve plakalar koloniler olusurken 2 ila 3 hafta daha inkübe edildi.

Kolonilerin oldugu kuyucuklardan toplanan hücre üst fazlari açiklandigi gibi ELISA ile beseri IgG açisindan tahlil edildi.

Kisaca, üst fazlarin degisen dilüsyonlari poliklonal keçi anti-beseri IgG Fc fragmaniyla kaplanmis 96 kuyucuklu EIA plakalarinda inkübe edildi ve sonra bagli beseri IgG Alkalin Fosfatazla konjüge keçi anti-beseri IgG(H+L) ve uygun renk substratlari kullanilarak tespit edildi. Standart olarak hücre üst fazlarinda ölçülen ayni saflastirilmis mAb'nin kullanildigi standart egriler, üst fazlardaki beseri IgG'nin miktar tayinini mümkün kilmak için her EIA. plakasina dahil edildi. En çok beseri IgG'yi ürettigi görülen kolonilerdeki hücreler` tüketilmis kültürlerde ek üretini belirlemeleri için 24 kuyucuklu plakalara geçirildi ve daha sonra en yüksek üretim seviyesine sahip parental klonlar tespit edildi- En yüksek üretimi saglayan parental klonlar en yüksek üretimi saglayan alt klonlari belirlemek. ve daha homojen bir hücre çizgisi hazirlamak için alt klonlandi. 96 kuyucuklu doku kültürü plakalari IMDM, %5 PES, 2 mM glutamin, 1 X MHX içinde kuyucuk basina bir hücre veya kuyucuk basina dört hücreyle tohumlandi ve koloniler görülene kadar 12 ila 20 gün %5 COz'lik bir inkübatörde 37°C'de inkübe edildi. Kuyucuk basina bir koloni içeren kuyucuklardan hücre üst fazlari toplandi ve yukarida açiklandigi gibi ELISA ile analiz edildi. Seçilen koloniler 24 kuyucuklu plakalara geçirildi ve üst fazlarinda beseri IgG seviyelerini belirleyerek en yüksek üretimi saglayan alt klonlari tespit etmeden önce kültürler tükenmeye birakildi. Seçilen ilk tur alt klonlar ikinci bir tur alt klonlamaya tabi tutuldugunda bu islem tekrarlandi. En iyi ikinci tur alt klonlar gelistirilecek hücre çizgileri olarak seçildi.

Hücre Alt Klonlarinin Karakterizasyonu En iyi ikinci tur alt klonlar seçildi ve mAb üretim seviyelerini ve hücre büyüme Özelliklerini degerlendirmek için büyüme egrileri olusturuldu. T75 siseleri 30 ml IMDM, %5 PES, 2 mM glutamin ve lX MHX (veya serumsuz ortam) içindel X 105 hücre/ml ile tohumlandi. 24 saatlik araliklarla 300 ül'lik temsili miktarlar alindi ve canli hücre yogunlugu belirlendi.

Canli hücre sayisi ]_ X 105 hücre/ml'nin altina düsene kadar analizler sürdürüldü. Hücre üst fazlarinin toplanan temsili miktarlari mevcut antikor konsantrasyonu açisindan tahlil edildi. Standart olarak rTNVl48B veya rTNVl4 JG92399 kullanilarak ELISA tahlilleri yapildi. Numuneler 1 saat poliklonal keçi anti-beseri IgG PC ile kaplanmis ELISA plakalari üzerinde inkübe edildi ve bagli mAb lleOO dilüsyonda Alkalin Fosfatazla konjüge keçi anti-beseri miktarlarinin varliginda büyüme hizlarini karsilastirmak için iki hücre çizgisi için farkli bir büyüme egrisi analizi de yapildi. Hücre çizgileri C466A Km& C46û3 MHX içermeyen ortam (IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamin) içinde çözdürüldü, ve iki gün daha kültürlendi. Daha sonra her iki hücre kültürü hiç MHX içermeyen, 0.2X MHX veya lX MHX (lX MHX = 0.5 :g/ml mikofenolik asit, 2.5 :g/ml hipoksantin, 50 :g/ml ksantin) içeren üç kültüre bölündü. Bir gün sonra, yeni T75 siseleri 1 X 105 hücre/ml baslangiç yogunlugunda kültürlerle tohumlandi ve hücreler bir hafta 24 saat araliklarla sayildi. mAb üretimi için temsili miktarlar toplanmadi. Bu numuneler için iki katina çikma süreleri SOP PD32.025'te açiklanan formül kullanilarak hesaplandi. mAb üretiminin zaman içindeki stabilitesini degerlendirmek için baska çalismalar yapildi. Kültürler IMDM, %5 PES, MHX seleksiyonu olmak veya olmamak üzere 2 mM glutamin içinde 24 kuyucuklu plakalarda üretilde. Kültürler konfluent olur olmaz taze kültürlere ayrildi ve daha eski kültür tükenmeye birakildi. Bu sirada, üst fazin bir temsili miktari alindi ve 4°C'de saklandi. Temsili miktarlar 55-78 günlük bir sürede alindi. Bu sürenin sonunda, üst fazlar, yukarida açiklandigi gibi anti-beseri IgG Fc ELISA ile mevcut antikor miktari açisindan test edildi.

Sonuçlar ve Tartisma Rekombinant Reseptöre TNF Baglanmasinin Inhibisyonu Hibridom hücre üst fazinda bulunan sekiz TNV mAb'nin TNFV'nin reseptöre baglanmasini bloke edip edemedigini belirlemek için basit bir baglanma tahlili yapildi. TNV mAb'lerin iliskili hücre üst fazlarindaki konsantrasyonlari ilk olarak beseri IgG için standart ELISA analiziyle belirlendi. Daha sonra bir rekombinant p55 TNF reseptörü/IgG füzyon proteini p55-sf2 EIA plakalari üzerine kaplandi ve 125I isaretli TNFV degisen miktarlarda TNV mAb'lerin varliginda p55 reseptörüne baglanmaya birakildi. Sekil 1'de gösterildigi gibi, sekiz TNV mAb'nin biri (TNVl22) hariç hepsi TNFV'in p55 reseptörüne baglanmasini etkili bir sekilde bloke etti. Aslinda TNV mAb'ler TNFV baglanmasinin inhibisyonunda negatif kontrol hibridom üst fazi içine çivilenmis cA2 pozitif kontrol mAb'den daha etkili görünüyordu. Bu sonuçlar, hücre bazli tahlillerde ve in vivo TNV mAb'lerin TNFV biyoaktivitesini bloke etme kabiliyetinin yüksek oldugunu gösterdi ve dolayisiyla ek analizler yapilmasi gerekli oldu.

DNA Dizi Analizi RNA'larin Beseri mAb'leri Kodladiginin Teyidi Reseptör baglanma tahlilinde TNFV bloke etme kabiliyeti gösteren yedi TNV mAb'nin (TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNVll8, TNVl48 ve TNV196) karakterizasyonundaki ilk asama olarak, bu mAb'leri üreten yedi hibridom hücre çizgisinden total RNA izole edildi. Daha sonra her RNA numunesi her mAb için tam sinyal dizisini, tam degisken bölge dizisini ve sabit. bölge dizisinin bir kismini içeren beseri antikor agir veya hafif zincir cDNA'sini hazirlamak için kullanildi. Daha sonra bu cDNA ürünleri PCR reaksiyonlarinda amplifiye edildi ve PCR ile amplifiye edilen DNA ilk olarak fragmanlar klonlanmadan dogrudan dizilendi. Dizilenen agir zincir cDNA'lari farelerde bulunan bes beseri germline geninden biriyle (DP-46) >%90 özdesti (Sekil 2). Benzer bir sekilde, dizilenen hafif zincir cDNA'lar farelerde bulunan beseri germline genlerin birine transkribe edilen ve dizilenen RNA moleküllerinin beseri antikor agir zincirlerini ve beseri antikor hafif zincirlerini kodladigini teyit etti. Degisken bölgeler sinyal dizisi kodlama dizisinin 5' ucuna eslesen oligonükleotitler kullanilarak PCR amplifikasyonuna tabi tutuldugu için, sinyal dizisinin ilk bes amino asidinin orijinal TNV translasyon ürünlerinin gerçek dizisi olmayip rekombinant TNV› mAb'lerin gerçek dizilerini temsil edebildiklerini belirtmek gerekir.

Benzersiz Nötralize Edici mAb'ler Her mAb için hem agir hem de hafif zincirlerin bütün degisken bölgeleri için cDNA dizilerinin analizleri, TNV32'nin TNVlS'e özdes oldugunu, TNVllB'in TNVl4'e özdes oldugunu ve TNV86'nin TNVl48'e özdes oldugunu ortaya koydu. Reseptör baglanma tahlili sonuçlari DNA dizi analizleriyle tutarliydi, yani hem TNV86 hem de TNVl48 TNF baglanmasinin bloke edilmesinde hem TNVll8'den hem de TNVl4'ten yaklasik olarak 4 kat daha iyiydi.

Bu nedenle sonraki çalismalar sadece dört benzersiz TNV mAb, TNVl4, TNVlS, TNV148 ve TNV196 üzerinde yogunlasti.

Dört mAb'nin Iliskililigi DNA dizisi sonuçlari dört TNV mAb'nin agir zincirlerini kodlayan genlerin hepsinin birbirine son derece homolog oldugunu ve hepsinin ayni germline geninden (DP-46) derive edildiginin görüldügünü ortaya koydu (Sekil 2). Ayrica, agir zincir CDR3 dizilerinin her biri çok benzer ve ayni uzunlukta oldugu için ve hepsi J6 eksonu kullandigi için, görünen o ki bunlar daha sonra her mAb'yi benzersiz kilan somatik degisikliklere ugrayan, tek bir VDJ geni yeniden düzenlemesinden kaynaklanmaktadir. DNA dizi analizleri, dört mAb arasindan sadece iki farkli hafif zincir geni oldugunu ortaya koymustur (Sekil 3). TNV14 ve TNVlS'teki hafif zincir degisken bölge kodlama dizileri birbirine ve beseri kappa zincirlerinin Vg/38K ailesinin temsil edici bir germline dizisine özdestir. TNV148 ve TNV 196 hafif zincir kodlama dizileri birbirine özdestir, ama iki nükleotit pozisyonunda germline diziden farklidir (Sekil 3).

Dört mAb'nin çikarsanan amino asit dizileri, gerçek mAb'lerin iliskililigini ortaya koydu. Dört mAb dört farkli agir zincir (Sekil 4), ama sadece iki farkli hafif zincir (Sekil 5) içermektedir. TNV mAb dizileri ile germline dizileri arasindaki farklar çogunlukla CDR alanlariyla sinirlidir, ama mAb agir zincirlerinin üçü germline dizisinden çerçeve bölgelerinde de farklidir (Sekil 4). DP-46 germline tarafindan kodlanan Ab çerçeve bölgeleriyle karsilastirildiginda, TNV14 özdesti, TNV 15 bir amino asitle farkliydi, TNV148 iki amino asitle farkliydi ve TNV196 üç amino asitle farkliydi. cDNA'larin Klonlanmasi, Yere Spesifik Mutagenez ve Nihai Ekspresyon Plasmidlerinin Birlestirilmesi cDNA'larin Klonlanmasi PCR ile amplifiye edilmis degisken bölgelerin DNA dizisi temelinde, yeni oligonükleotitler ekspresyon vektörleri içine klonlanacak kodlama› dizisini adapte etme amaciyla. baska› bir tur PCR amplifikasyonu yapmak üzere siralandi. Agir zincirlerle ilgili olarak bu ikinci tur PCR'nin ürünleri kisitlama enzimleri BsiWI ve BstBI ile sindirildi ve plasmid vektörü L28 içine klonlandi (plasmid kimlik numaralari Tablo 2'de gösterilmektedir). Hafif zincirlerle ilgili olarak, ikinci tur PCR ürünleri SalI ve AflII ile sindirildi ve plasmid vektörü pBC içine klonlandi. Daha sonra tek tek klonlar, dizilerinin PCR ürünlerinin dogrudan dizilenmesiyle elde edilen önceki diziye özdes oldugunu teyit etmek için dizilendi, bu potansiyel olarak heterojen moleküller popülasyonunda her pozisyonda en bol nükleotidin bulundugunu ortaya koydi.

TNVl48'i Degistirmek Için Yere Spesifik Mutagenez mAb'ler TNVl48 ve TNVl96'nin tutarli olarak TNFV biyoaktivitesinin nötralize edilmesinde sonraki en iyi mAb'den (TNV14) dört kat daha güçlü oldugu gözlemlendi. Ancak yukarida açiklandigi gibi TNV148 ve TNV196 agir zincir çerçeve dizileri germline çerçeve dizilerinden farkliydi. TNVl48 agir zincir dizisinin baska beseri antikorlarla karsilastirilmasi çok sayida baska beseri mAb'nin çerçeve l'de (sadece olgun dizi sayilarak) pozisyon 28'de bir Ile kalintisi içerdigini, çerçeve 3'te 75 pozisyonundaki Pro kalintisinin ise o pozisyonda alisilmadik bir amino asit oldugunu gösterdi.

TNVl96 agir zincirin benzer bir karsilastirmasi, çerçeve 3'te germline dizisinden farklilastigi üç amino asit dizisinin beseri mAb'lerde nadir olabildigini düsündürmektedir. Bu farklarin TNV148 ve TNVl96'yi insanlara uygulandiginda immünojenik kilmasi olasiligi vardi. TNV148 sadece ilgilenilen bir amino asit kalintisina sahip oldugu ve bu kalintinin TNFV baglanmasi için önemsiz olduguna inanildigi için, pozisyon 75'te Pro kalintisi yerine bir germline Ser kalintisinin kodlanacagi sekilde TNV148 agir zincir kodlama dizisinde (plasmid pl753'te) tek bir nükleotidi degistirmek için bir yere spesifik mutagenez teknigi kullanildi. Elde edilen plasmid pl760 olarak adlandirildi (bkz. Tablo 2). Elde edilen gen ve mAb, orijinal TNV148 geni ve mAb'den ayirt edilmesi için TNVl48B olarak adlandirildi (bkz. Sekil 5).

Nihai Ekspresyon Plasmidlerinin Birlestirilmesi Daha önce genomik fragmanlar olarak klonlanan 12B75 agir zincir ve hafif zincir genlerine dayanan yeni antikor ekspresyon vektörleri hazirlandi. Farkli TNV ekspresyon plasmidleri hazirlanmakla birlikte (bkz. Tablo 2), her seferinde 5' sinirdas dizileri, promotör ve intron çogaltici iliskili 12B75 genlerinden derive edildi. Hafif zincir ekspresyon plasmidleri için, tam J-C intron, sabit bölge kodlama dizisi ve 3' sinirdas dizisi de 12B75 hafif zincir geninden derive edildi. Nihai ürün hücre çizgisinde elde edilen agir zincir ekspresyon plasmidleri için (pl78l ve p1783, asagi bakiniz), beseri IgGl sabit bölge kodlama dizileri Centocor'un önceden kullanilmis ekspresyon vektöründen (plO4) derive edildi. Önemli biçimde, burada açiklanan nihai ürün hücre çizgileri orijinal, hibridom türevli TNV mAb'lerden (Glm(z)) farkli bir TNV mAb allotipi (Gm(f+)) eksprese eder. Bunun nedeni GenPharm farelerinden derive edilen 12B75 agir zincir geninin CHl alaninin C- terminal ucunda bir Arg kalintisini kodlamasi, Centocor'un lgGl ekspresyon vektörü p104'ün ise o pozisyonda bir Lys kalintisini kodlamasidir. J-C intron, tam sabit bölge kodlama dizisi ve 3' sinirdas dizisinin 12B75 agir zincir geninden derive edildigi baska agir zincir ekspresyon plasmidleri (örnegin pl786 ve pl788) hazirlandi, ama bu genlerle transfekte edilen hücre çizgileri üretim hücre çizgileri olarak seçilmedi. Vektörler nihai ekspresyon plasmidleriyle sonuçlanacak gelecekteki PCR ile amplifiye edilmis V bölgelerinin tek asamali klonlanmasina imkan vermek için dikkatle tasarlandi.

PCR ile amplifiye edilmis degisken bölge cDNA'lari L28 veya pBC vektörlerinden promotör bölgesini ve J-C intronun bir kismini temin eden ara asama, 12875 bazli vektörlere aktarildi (plasmid kimlik numaralari için Tablo Z'ye bakiniz). Daha sonra antikor genlerinin 5' yarisini içeren kisitlama fragmanlari bu ara asama vektörlerden, iliskili genlerin 3' yarisini temin eden nihai ekspresyon vektörlerine aktarilarak nihai ekspresyon plasmidleri olusturuldu (plasmid kimlik numaralari için Tablo Z'ye bakiniz).

Hücre Transfeksiyonlari ve Alt Klonlama Ekspresyon plasmidleri kisitlama sindirimiyle dogrusallastirildi veya her plasmiddeki antikor gen eklentileri plasmid omurgalarindan saflastirildi. Sp2/O ve 653 fare miyelom hücreleri elektroporasyon kullanilarak. agir ve hafif zincir DNA ile transfekte edildi. Ab, Ab genlerinin spesifik özellikleri, genlerin dogrusallastirilmis tam plasmidler veya saflastirilmis gen eklentileri üzerinde olmasi ve konak hücre çizgisiyle tanimlanmak üzere çogu benzersiz olan on bes farkli transfeksiyon yapildi (Tablo 3'te özetlenmektedir). Mikofenolik aside dirençli klonlardan hücre üst fazlari, ELISA ile beseri IgG'nin varligi açisindan tahlil edildi bir referans standart egrisi olarak saflastirilmis rTNV148B kullanilarak miktar tayini yapildi.

En üretici rTNV148B Hücre Çizgileri rTNVl48B transfeksiyonu Z'den en üretici 653 parental çizgilerinin (tüketilmis 24 kuyücuklü hücre kültürlerinde 5-10 için ve daha homojen bir hücre popülasyonu hazirlamak için alt alt klonu tüketilmis 24 kuyucuklu kültürlerde yaklasik olarak 50 :g/ml üretti, bu parental çizgiye göre 5 katlik bir artis anlamina geliyordu. Alt klonlanmis çizgiler 2.320-17 ve 2.320.20'nin ikinci bir tur alt klonlamasi yapildi.

Tablo 3. Hücre Transfeksiyonlarinin Özeti. Her mAb'yi kodlayan agir ve hafif zincir plasmidlerin kimlik numaralari gösterilmektedir. Saflastirilmis mAb gen eklentileriyle yapilan transfeksiyonlarda, plasmid pl3 (pSV2gpt) gbt seçilebilir markörünün bir kaynagi olarak dahil edildi. Agir zincir sabit bölgeleri Remicade'i (“eski”) kodlayan ayni beseri IgGl ekspresyon vektörüyle veya 12B75 (GenPharm/Medarex) agir zincir geni (“yeni”) içinde bulunan sabit bölgelerle kodlandi. Hl/L2 TNV14 agir zinciri ve TNV148 hafif zincirinden olusan “yeni” bir mAb'yi belirtmektedir.

Plasmidler p1783 ve p1801 sadece agir zincir genlerinin içerdigi J-C intron miktariyla farklilasir. Hücre klonlari için genel adlarin ilk numarasini tanimlayan transfeksiyon numaralari sagda gösterilmektedir. Burada açiklanan rTNV148B üretici hücre çizgileri C ve C467A sirasiyla transfeksiyon numarasi 2 ve l'den derive edildi. rTNV14 üretici hücre çizgisi C476A transfeksiyon numarasi 3'ten derive edildi.

Transfeksiyon mAb Plasmidler HC DNA Sp2/0 653 HC/LC/gpt vektörü formati Alt Klonlanmis Hücre Çizgilerinin Karakterizasyonu Hücre çizgisi büyüme özelliklerini daha dikkatli bir sekilde karakterize etmek ve mAb üretim seviyelerini belirlemek için T75 kültürleri kullanilarak büyüme egrisi analizleri yapildi.

Sonuçlar, hücre çizgilerinin dört C466 serisinin her birinin yogunluguna ve 110 ve 140 :g/ml arasinda maksimal mAb birikimi seviyelerine ulastigini gösterdi (Sekil 7). Buna karsilik, en üretici Sp2/O alt klonu C467A 2.0 X 106 hücre/ml tepe hücre yogunluguna ve 25 :g/ml maksimal mAb birikim seviyelerine ulasti (Sekil 7). rTNV14 üretici hücre çizgisi C476A üzerinde bir büyüme egrisi analizi yapilmadi.

MHX seleksiyonunun farkli konsantrasyonlarindaki büyüme oranlarini karsilastirmak, için ek bir büyüme egrisi analizi yapildi. Bu karsilastirmaya MHX'in yoklugunda kültürlenen C466 hücrelerinin normal miktarda MHX (lX) içinde kültürlenen ayni kültürlerden daha hizli büyüdügünü düsündüren son gözlemler yol açti. Mikofenolik asit gibi bilesiklerin sitotoksik konsantrasyonlari büyüklük sirasinda ölçülme egiliminde oldugu için, daha düsük bir konsantrasyonda MHX kullanmanin mAb üretiminin stabilitesini tehlikeye atmadan hücrenin çok daha hizli iki katina çikma süreleriyle sonuçlanabilecegi düsünüldü. Hücre çizgileri C466A ve C466B hiç MHX kullanilmadin, 0.2X MHX veya lX MHX içinde kültürlendi. Canli hücre sayimlari 7 gün süreyli 24 saat araliklarla yapildi.

Sonuçlar MHX konsantrasyonuna bagimli bir hücre büyümesini ortaya koydu (Sekil 8). Hücre çizgisi C466A lX MHX'te 25.0 saatlik bir iki katina çikma süresi gösterdi, bu süre MHX kullanilmadiginda sadece 20.7 saatti. Benzer bir sekilde hücre çizgisi C466B'nin 1X MHX içinde iki katina çikma süresi 32.4 saat, MIX olmadiginda ise sadece 22.9 saatti. Önemli olarak, 0.2X MHX içinde her iki hücre çizgisi için iki katina çikma süresi lX MHX içinde gözlemlenene göre MHX kullanilmadiginda gözlemlenene daha çok benziyordu (Sekil 8). Bu gözlem, iki katina çikma sürelerinin önemli bir parametre oldugu biyoreaktörlerdeki arttirilmis hücre performansinin daha az MHX kullanilarak gerçeklestirilebilmesi olanagini yaratir.

Ancak, stabilite testi sonuçlari (asagiya bakiniz) hücre çizgisi C466D MHX bulunmadiginda bile en az 60 gün hücre çizgisi C466D'nin stabil olarak rTNVl48B üretebildigini düsündürmekle birlikte, stabilite testi ayrica hücreler MHX'in varliginda kültürlendiginde, MHX'in yoklugunda kültürleme durumuna göre hücrelerin mAb üretim seviyelerinin daha yüksek oldugunu gösterdi.

Yaklasik olarak 60 günlük bir dönemde çesitli hücre çizgilerinden mAb üretimini degerlendirmek için, MHX seleksiyonu içeren veya içermeyen kültürler üzerinde stabilite testleri yapildi. Hücre çizgilerinin hepsi yüksek mAb üretimini korumadi. Sadece iki hafta kültürden sonra, klon C466A çalismanin baslangicina göre yaklasik olarak %45 daha az üretiyordu. Klon C466B'den üretim de önemli ölçüde düsmüs gibi görünüyordu. Ancak, klon C466C ve C466D oldukça sabit bir üretimi korudu, C466D ise en yüksek mutlak üretim seviyelerini gösterdi (Sekil 9).

Beseri TNFV'ye karsi sekiz beseri mAb'den olusan bir ilk panelden TNVl48B protein dizisini ve TNF nötralizasyon gücünün yani sira TNVl4'ün yer aldigi çesitli kriterler temelinde seçildi. lOO :g/ml'den fazla rTNV148B ve 19 :g/ml rTNVl4 üreten hücre çizgileri hazirlandi. Örnek 4; Anti-TNF Antikorlarinin Kullanildigi .Artritik Fare Çalismasi ve Tek Bolus Enjeksiyonunun Kullanildigi Kontroller Yaklasik olarak 4 haftalik Tgl97 çalisma fareleri cinsiyet ve vücut agirligi temelinde 9 tedavi grubundan birine ayrildi ve 1 mg/kg veya 10 mg/kg dozunda Dulbecco PBS'nin (D-PBS) veya bu bulusun bir anti-TNF antikorunun (TNV14, TNVl48 veya TNV196) tek bir periton içine bolus dozuyla tedavi edildi.

SONUÇLAR: Agirliklar doz uygulamasi öncesine göre bir degisiklik olarak analiz edildiginde, 10 mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar, çalisma boyunca D-PBS ile tedavi edilen hayvanlara göre tutarli olarak daha fazla kilo aldilar. Bu kilo alimi 3-7 haftada anlamliydi. 10 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar da çalismanin 7. haftasinda anlamli kilo alimina ulastilar. (Bakiniz, Sekil 10).

Sekil llA-C artritik endeks temelinde hastalik siddetinin ilerlemesini temsil etmektedir.lO mg/kg cA2 ile tedavi edilen grubun artritik endeksi 3. haftadan baslayarak ve çalismanin geri kalani boyunca (hafta 7) devam ederek D-PBS kontrol grubununkinden. daha düsüktü. l m/kg TNV14 ile tedavi edilen hayvanlar ve 1 ng/kg cAZ ile tedavi edilen hayvanlar, D-PBS ile tedavi edilen grupla karsilastirildiginda 3 hafta sonra AI'de anlamli bir azalma göstermedi. Her biri digerlerinin benzer dozlariyla karsilastirildiginda (10 mg/kg cA2 10 mg/kg gruplari arasinda hiçbir anlamli fark yoktu. 1 HQ/kg tedavi gruplari karsilastirildiginda, 1 mg/kg TNV 148 grubu 3, 4 ve 7. haftalarda 1 mg/kg cA2'den anlamli olarak daha düsük bir AI gösterdi. 1 mg/kg TNV148 grubu da 3 ve 4. haftalarda 1 mg/kg TNV14 ile tedavi edilen gruptan anlamla olarak daha düsüktü.

TNV196 çalismanin 6. haftasina kadar D-PBS ile tedavi edilen grupla karsilastirildiginda AI'de anlamli bir azalma gösterdigi halde, TNV148 çalismanin sonunda anlamliligini Örnek 5: Birden Fazla Bolus Dozu olarak Anti-TNF Antikorlarinin ve Kontrollerin Kullanildigi Artritik Fare Çalismasi Yaklasik olarak 4 haftalik Tgl97 çalisma fareleri vücut agirligi temelinde 8 tedavi grubundan birine ayrildi ve 3 mg/kg (hafta 0) seviyesinde kontrol ürünü (D-PBS) veya antikorun (TNV14, TNV148) periton içine uygulanan bir bolus dozuyla tedavi edildi. Enjeksiyonlar bütün hayvanlarda 1, 2, 3 ve 4. haftalarda tekrarlandi. Grup 1-6 test ürünü etkinligi açisindan degerlendirildi. Grup 7 ve 8'deki hayvanlardan alinan serum numuneleri 2, 3 ve 4. haftalarda TNV14 veya TNV148'in bagisiklik yanitinin olusumu ve farmakokinetik tasfiyesi açisindan degerlendirildi.

SONUÇLAR: Agirliklar doz uygulamasi öncesine göre degisiklik olarak analiz edildiginde hiçbir anlamli fark kaydedilmedi. 10 mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar çalisma boyunca D-PBS ile tedavi edilen hayvanlardan tutarli olarak daha yüksek agirlik artisi gösterdi. (Bkz. Sekil 12).

Sekil 13A-C artritik endeks temelinde hastalik siddetinin ilerleyisini temsil eder. 10 mg/kg CAZ ile tedavi edilen grubun artritik endeksi 2. hafta baslamak ve çalismanin geri kalani (hafta 5) boyunca devam etmek üzere D-PBS kontrol grubununkinden anlamli olarak daha düsüktü. 1 mg/kg veya 3 mg/kg CAZ ile tedavi edilen. hayvanlar* ve 3 Ing/kg TNV14 ile tedavi edilen hayvanlar, d-PBS kontrol grubuyla karsilastirildiginda Çalisma boyunca herhangi bir zamanda AI'de anlamli bir azalmaya ulasamadi. 3 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar, 3. hafta baslayarak ve 5. haftaya kadar devam ederek d-PBS ile tedavi edilen gruba göre anlamli bir azalma gösterdi. lO mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar, çalismanin 4. ve 5. haftalarinda cA2'nin her iki düsük dozuyla (1 mg/kg ve 13 mg/kg) karsilastirildiginda AI'de anlamli bir azalma gösterdi ve 3-5. `haftalarda TNV14 ile tedavi edilen hayvanlardan da anlamli olarak daha düsüktü. 3 mg/kg tedavi gruplari arasinda hiçbir anlamli fark yok gibi görünmekle birlikte, 3 mg/kg TNVl4 ile tedavi edilen hayvanlar için AI bazi noktalarda lO mg/kg'den anlamli olarak daha yüksekti, TNVl48 ile tedavi edilen hayvanlar ise 10 mg/kg cAZ ile tedavi edilen hayvanlardan anlamli olarak farkli degildi. Örnek 6: Periton Içine Uygulanan Tek Bolus Dozu Olarak Anti- TNF Antikorlarinin ve Kontrollerin Kullanildigi Artritik Fare Çalismasi Yaklasik olarak 4 haftalik Tgl97 çalisma fareleri cinsiyet ve vücut agirligi temelinde 6 tedavi grubundan birine ayrildi ve 3 mg/kg veya 5 mg/kg seviyesinde antikorun periton içine uygulanan tek bir bolus dozuyla (cA2 veya TNV 148) tedavi edildi. Bu çalismada D-PBS ve 10 ng/kg CAZ kontrol gruplari kullanildi.

Agirliklar doz uygulamasi öncesine göre bir degisiklik olarak analiz edildiginde, bütün tedaviler benzer agirlik alimlariyla sonuçlandi. 3 veya 5 mg/kg TNV148 veya 5 mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlarin agirliginda çalismanin erken asamalarinda (2. ve 3. hafta) bir artis oldu. Sadece TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar daha geç zaman noktalarinda anlamli agirlik kazancini korudu. Hem 3 hem de 5 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar 7. haftada anlamli artis gösterdi ve 3 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar` da enjeksiyondan 8 lnafta sonra hâlâ agirlik anlamli olarak yüksekti. (Bkz. Sekil 14).

Sekil 15 artritik endeks temelinde hastalik siddetinin ilerlemesini temsil etmektedir. Bütün tedavi gruplari erken zaman noktalarinda bir miktar koruma gösterdi, 5 mg/kg cA2 ve mg/kg TNV148 1-3. haftalarda Al'de anlamli azalmalar gösterdi ve bütün tedavi gruplari 2. haftada anlamli bir azalma gösterdi. Çalismanin sonraki asamalarinda 5 Hg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar bir miktar koruma gösterdi, 4, 6 ve 7. haftalarda anlamli azalmalar oldu. Hem cA2'nin hem de TNVl48'in düsük dozu (3 mg/kg) 6. haftada anlamli azalmalar gösterdi ve bütün tedavi gruplari 7. haftada anlamli azalmalar gösterdi. Tedavi gruplarinin hiçbiri çalismanin sonunda (8. hafta) anlamli bir azalmayi koruyamadi. Tedavi gruplari (salin kontrol grubu disinda) arasinda herhangi bir zaman noktasinda anlamli hiçbir fark yoktu. Örnek 7: Anti-TNF Antikoru ve Modifiye Edilmis Anti-TNF Antikoru Arasinda, Periton Içine Uygulanan Tek Bolus Dozu Olarak Anti-TNF Antikorlarinin ve Kontrollerin Kullanildigi Artritik Fareler Çalismasi TNVl48'in (hibridom hücrelerinden derive edilmis) ve rTNV14SB'nin (transfekte edilmis hücrelerden derive edilmis) periton içine uygulanan tek bir dozunun etkinliginin karsilastirilmasi için, yaklasik olarak 4 haftalik Tl97 çalisma fareleri vücut agirligi temelinde 9 tedavi grubundan birine ayrildi ve 1 HQ/kg seviyesinde Dulbecco 8 PES (D-PBS) veya antikorun (TNVl48, rTlVV148B) periton içine uygulanan tek bir bolus dozuyla tedavi edildi.

Agirliklar doz uygulamasi öncesine göre bir degisiklik olarak analiz edildiginde, lO mg/kg cA2 ile tedavi edilen hayvanlar, çalisma boyunca tutarli bir sekilde D-PBS ile tedavi edilen hayvanlara göre yüksek agirlik kazanimi gösterdi. Bu agirlik kazanimi 1. hafta ve 3-8. haftalarda anlamliydi. 1 mg/kg TNV148 ile tedavi edilen hayvanlar ayrica çalismanin sonunda , 6 ve 8. haftalarda anlamli agirlik kazanimi gösterdi.

(Bakiniz, Sekil 16).

Sekil 17 artritik endeks temelinde hastaligin siddetinin ilerleyisini temsil etmektedir. 10 mg/kg GAZ ile tedavi edilen grubun artritik endeksi 4. hafta baslamak ve çalismanin geri kalani (8 hafta) boyunca devam etmek üzere D-PBS kontrol grubundan daha düsüktü. Hem TNV 148 ile tedavi edilen grup hem de 1 mg/kg CA2 ile tedavi edilen grup 4. haftada AI'de anlamli bir azalma gösterdi. Önceki bir çalisma (P-O99-Ol7) TNV148'in periton içine uygulanan tek bir` 1 mg/kg'lik dozunu takiben Artritik. Endeksin azaltilmasinda biraz daha etkili oldugunu göstermekle birlikte, bu çalisma TNV antikoruyla tedavi edilen grubun her iki versiyonundan elde edilen AI'in biraz daha yüksek oldugunu gösterdi. 1 mg/kg cA2 ile tedavi edilen grup (6. hafta istisna olmak üzere) 10 mg/kg CAZ grubuna göre anlamli olarak artmadigi ve TNV 148'le tedavi edilen gruplar 7. ve 8. haftalarda daha yüksek oldugu halde, çalismanin herhangi bir noktasinda 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148 ve 1 mg/kg TNV148B arasinda hiçbir anlamli fark yoktu.

Claims (5)

ISTEMLER

1. Üç agir zincir CDR'sine ve üç hafif zincir CDR'sine sahip olan bir antikor veya bunun bir antijen-baglayici fragmani olup, özelligi; juvenil romatoidin tedavisinde kullanim için olmasidir. Asagidaki amino asit sekansina sahip olan üç agir zincir CDRHl: SYAMH; CDRHZ: FMSYDGSNKKYADSVKG; CDRH3: DRGIAAGGNYYYYGMDV; ve Asagidaki amino asit sekansina sahip olan üç hafif zincir CDRLl: RASQVYSYLA; CDRLZ: DASNRAT; CDRL3: QQRSNWPPFT;

2. Istem l'e göre kullanim için istem l'deki antikor ya da antijen-baglayici fragman olup, özelligi; burada söz konusu antikorun insan olmasidir.

3. Bu istem uyarinca kullanim için istem 1 veya istem 2'nin antikoru olup, burada: Agir zincir amino asit dizisini içerir: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYÄMHWVRQAPGKGL. EWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS; ve hafif zincir amino asit sekansini içerir: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLL PFTFGPGTKVDIK; ve antikor IgGl K'dir.

4. Bir bilesim olup, özelligi; juvenil romatiod artrtin tedavisinde kullanim için istem 1 ya da istem 3'ünün antikorunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ya da seyrelticiyi içermesidir.

5. Juvenil romatoid artritin tedavisinde kullanim için istem 1 ya da 3'teki antikoru içeren bir bilesim olup, özelligi; ayrica bir TNF antagonisti, bir antiromatizmal, bir kas gevsetici, bir narkotik, steroid olmayan antienflamatuvar bir ilaç (NSAID), bir analjezik, bir anestetik, bir kortikosteroid, bir yatistirici, bir lokal anestetik, bir nöromüsküler bloker, bir antimikrobiyal, bir antipsoriatik, bir kortikosteroid, bir anabolik steroid, diyabetle iliskili bir madde, bir mineral, bir besleyici, bir tiroid maddesi, bir vitamin, kalsiyumla iliskili bir hormon, bir antidiyareik, bir öksürük kesici, bir antiemetik, bir ülser önleyici, bir müshil, bir antikoagülan, bir eritropoietin, bir filgrastim, bir sargramostim, bir asi, bir immünoglobülin, bir immünosüpresif, bir büyüme hormonu, bir hormon replasmani ilaci, bir östrojen reseptörü modülatörü, bir midriatik, bir sikloplejik, alkilleyici bir madde, bir antimetabolit, bir mitotik inhibitör, bir radyofarmasötik, bir antidepresan, antimanik madde, bir antipsikotik, bir anksiyolitik, bir hipnotik, bir sempatomimetik, bir uyarici, donepezil, takrin, bir astim ilaci, bir beta agonisti, teneffüsle çekilen bir steroid, bir lökotrien inhibitörü, bir metilksantin, bir kromolin, bir epinefrin veya analogu, dornaz alfa, bir sitokin ve bir sitokin antagonistinden seçilen en az birini içermesidir.