KR102216003B1 - 재조합 단백질에서 c-말단 라이신, 갈락토스 및 시알산 함량을 제어하기 위한 제조 방법 - Google Patents

재조합 단백질에서 c-말단 라이신, 갈락토스 및 시알산 함량을 제어하기 위한 제조 방법 Download PDF

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Abstract

약 20% 내지 약 70%의 C-말단 라이신 함량, 및 약 1% 내지 약 20%의 시알산 함량을 갖는 항체, 예컨대 항-TNFα 항체(예를 들어, 인플릭시맙)를 생산하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 0.5 μM 이상의 아연을 포함하는 배양 배지 중에서 항체를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 아연-반응성 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지 중의 아연의 농도를 제어함으로써 항체를 생산하는 단계를 포함한다.

Description

재조합 단백질에서 C-말단 라이신, 갈락토스 및 시알산 함량을 제어하기 위한 제조 방법{MANUFACTURING METHODS TO CONTROL C-TERMINAL LYSINE, GALACTOSE AND SIALIC ACID CONTENT IN RECOMBINANT PROTEINS}
C-말단 라이신(C-terminal lysine, CTL)은 혈류 중의 내인성 순환 카르복시펩티다제에 의해 인플릭시맙을 비롯한 주입된 항체로부터 신속히 제거되며(문헌[Cai, B. et al., "C-terminal Lysine Processing of Human Immunoglobulin G2 Heavy Chain in Vivo," Biotechnol. Bioeng. 2011; 108:404-412]), 이에 따라 제품 안전성 및 효능에 대한 영향이 있다 하더라도 거의 갖지 않을 것으로 여겨진다. 그러나, CTL 잔기를 갖는 재조합 단백질에서의 CTL 함량은 제조 일관성 및 제품 균질성의 척도로서 사용될 수 있다.
CTL 함량과 대조적으로, 재조합 단백질에서의 시알산 함량은 인간에서의 생리학적 중요성의 많은 현상과 관련되어 왔다. 예를 들어, 에리트로포이에틴과 같은 당단백질에서의 시알산의 존재는 긴 순환 반감기를 촉진시키는 반면, 에리트로포이에틴에서의 시알산의 부재는 순환으로부터의 그 단백질의 신속한 클리어런스(clearance)로 이어진다. 게다가, 단백질에서의 증가된 시알산 함량은 인간에서의 단백질의 면역원성을 조절할 수 있다. 제품 안전성 및 효능에서의 시알산의 중요성으로 인해, 시알산 함량은 클리닉에서 사용되는 범위를 반영하는 범위 내로 유지되어야 한다.
따라서, 재조합 단백질, 특히 인간에게 투여되는 레미케이드(REMICADE)®(인플릭시맙) 또는 휴미라(HUMIRA)®(아달리무맙)와 같은 재조합 단백질에서 CTL 및 시알산 함량에 영향을 주는 공정-관련 인자들을 이해하고 제어해야 할 필요성이 있다.
아연 농도, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA) 농도 및 수확(harvest) 시간을 비롯한 배양 조건을 제어함으로써, 원하는 C-말단 라이신(CTL) 함량, 시알산 함량, 갈락토스 함량 및/또는 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는 항체, 예를 들어 항-종양 괴사 인자 알파(TNFα) 항체, 예컨대 단일클론 항체 cA2(본 명세서에서 인플릭시맙으로도 지칭됨)를 생산하기 위한 방법이 본 명세서에 개시된다.
본 발명의 일 실시 형태는 약 20% 내지 약 70%의 C-말단 라이신 함량, 및 약 1% 내지 약 20%의 시알산 함량을 갖는 항체를 생산하기 위한 방법으로서, 본 방법은 0.5 μM 이상의 아연을 포함하는 배양 배지 중에서 항체를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 아연-반응성 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지 중의 아연의 농도를 제어함으로써 항체를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체의 C-말단 라이신 함량은 약 40% 내지 약 70%, 예를 들어 약 55% 내지 약 65%이거나, 또는 예를 들어 약 60%이다. 일부 실시 형태에서, 항체의 시알산 함량은 약 3% 내지 약 14%이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 50% 내지 약 90%, 또는 약 45% 내지 약 85%의 갈락토스 함량을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항체는 약 0.05 내지 약 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항-TNFα 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 인간 TNFα에 대한 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 결합을 경쟁적으로 억제하고; (ii) 회합 상수(Ka)로서 측정된 1 × 108 리터/몰 이상의 친화도로 인간 TNFα의 중화 에피토프(neutralizing epitope)에 결합한다. 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화(humanized) 항체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역글로불린 클래스 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM의 것일 수 있으며, 일부 실시 형태에서는, IgG1 불변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 불변 영역 및 비-인간 가변 영역, 또는 인간 불변 영역 및 인간 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 인간 경쇄 및 적어도 하나의 인간 중쇄를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 경쇄는 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 경쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중쇄는 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 중쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 경쇄는 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 경쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함하고, 중쇄는 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 중쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG1 인간 불변 영역, 및 서열 번호 2 및 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩되거나, 서열 번호 3 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 비-인간 가변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단일클론 항체 cA2와 동일한 에피토프 특이성(epitopic specificity)을 가지며, 일부 실시 형태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단일클론 항체 cA2이다.
일부 실시 형태에서, 배양 배지 중의 아연의 농도는 약 0.6 μM 내지 약 6.5 μM, 또는 약 0.6 μM 내지 약 1.1 μM의 범위이다.
일부 실시 형태에서, 배양 배지는 약 2.5 μM 내지 약 30 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 16 μM 농도 범위의 EDTA를 추가로 포함하고, 본 방법은 배양 배지 중의 EDTA의 농도를 제어하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은, 예를 들어 배양 배지 중의 아연-반응성 숙주 세포가 약 150만 세포/mL 내지 약 1100만 세포/mL, 또는 약 300만 세포/mL 내지 약 1100만 세포/mL의 세포 밀도에 도달할 때, 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아연의 농도는, 항체가 회수될 때까지, 또는 아연-반응성 숙주 세포의 지수 성장기 동안에 제어된다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 아연의 농도를 제어하는 것은 배양 배지 중의 아연의 농도가 0.5 μM 이상, 또는 약 0.6 μM 내지 약 6.5 μM의 범위가 되도록, 배양 배지 중의 아연의 농도를 모니터링하는 단계, 및 배양 배지 중의 아연의 농도를 조절하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 아연-반응성 숙주 세포는 SP2/0 세포이다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 배양 배지 중에서 약 20% 내지 약 70%의 C-말단 라이신 함량을 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체의 C-말단 라이신 함량을 제어하기 위한 방법으로서, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는, 배양 배지 중에서 약 1% 내지 약 20%의 시알산 함량을 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체의 시알산 함량을 제어하기 위한 방법으로서, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는, 배양 배지 중에서 약 50% 내지 약 90%의 갈락토스 함량을 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체의 갈락토스 함량을 제어하기 위한 방법으로서, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는, 배양 배지 중에서 약 0.05 내지 약 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체 내의 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
CTL, 시알산 또는 갈락토스 함량, 또는 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하기 위한 방법의 일부 실시 형태에서, 항체는 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고/이거나, 항체는 SP2/0 세포에 의해 생합성된다.
일 실시 형태에서, 항체는, TNF의 에피토프의 아미노산과 결합하고 하이브리도마에 의해 또는 재조합 숙주에 의해 생산되는 mAb이다. 일 실시 형태에서, 항체는 A2에 의해 인식되는 에피토프를 인식하는 키메라 항체이다. 다른 실시 형태에서, 항체는 키메라 A2(cA2)(즉, 인플릭시맙)로서 지정된 키메라 항체이다.
항-TNF 항체의 특성화 및 그의 제조 및 사용 방법이, 예를 들어 하기에 상세히 개시되고 기재되어 있다: 2001년 8월 1일에 출원되고 2007년 7월 31일에 허여된 조지 헤브너(George Heavner) 등의 미국 특허 제7,250,165호, "항-TNF 항체, 조성물, 방법 및 용도(Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses)", 및 2003년 3월 21일에 출원된 질 길즈-코마(Jill Giles-Komar) 등의 미국 출원 번호 제10/394,471호, 공개 번호 US 2004/0185047 A1호, "항-TNF 항체, 조성물, 방법 및 용도", 및 2004년 2월 6일에 출원되고 2007년 8월 7일에 허여된 준밍 러(Junming Le) 등의 미국 특허 제 7,252,823호, "재조합 A2-특이적 TNFα-특이적 항체(Recombinant A2-specific TNFα-specific antibodies)"(이들 모두는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함됨).
일부 실시 형태에서, 항체는 c134A로 지정된 세포주에 의해 생산되는 뮤린 mAb A2, 및 c168A로 지정된 세포주에 의해 생산되는 키메라 항체 cA2를 포함한다. 세포주 c134A는 미국 펜실베이니아주 스프링하우스 웰시 앤드 맥킨 로드 소재의 얀센 리서치 앤드 디벨롭먼트(Janssen Research & Development)에 보관되어 있다. 세포주 c168A는 네덜란드 라이덴 소재의 얀센 바이올로직스 비브이(Janssen Biologics BV), 미국 19355 펜실베이니아주 말번 200 그레이트 밸리 파크웨이 소재의 얀센 리서치 앤드 디벨롭먼트에 보관되어 있다.
본 명세서에 개시된 방법은, 예를 들어 상업적 제조 공정, 예컨대, 예를 들어 인간에서의 자가면역 질병의 치료에 사용되는 단일클론 항-TNFα 항체인 인플릭시맙을 생산하기 위해 사용되는 제조 공정에서 배치 균질성(batch homogeneity)을 개선하는 데 사용될 수 있다.
전술한 내용은 첨부 도면에 예시된 바와 같은 본 발명의 예시적인 실시 형태에 대한 하기의 보다 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
이 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행되는 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면을 갖는 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본이 신청 및 필요한 요금의 지불시에 사무소에 의해 제공될 것이다.
도 1은 인플릭시맙의 샘플의 모세관 등전 초점화(capillary isoelectric focusing, cIEF) 전기영동도(electropherogram)를 보여준다.
도 2는 cIEF 피크 1의 백분율의 함수로 나타낸 역상 펩티드 매핑으로부터 얻은 des-라이신의 백분율(결여된 C-말단 라이신(%), des-Lys로 약기됨)의 피팅선도(fitted line plot)이며, CTL 함량(des-Lys의 백분율로서 표현됨)과 피크 1의 백분율 사이의 상관관계를 보여준다.
도 3은 생물반응기 기간(bioreactor age)의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, CTL 제거에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. Y축: % des-Lys; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 4는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸, WAX 방법에 의해 결정된 바와 같은, 시알산을 갖는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 그래프이며, 시알산의 백분율에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. Y축: %시알산; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 5는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포 밀도의 그래프이며, 생존 세포 밀도에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. Y축: 생존 세포 밀도(생존 세포(x100만)/mL); X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 6은 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포의 백분율의 그래프이며, 배양 생존력(culture viability)에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. Y축: %생존 세포, X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 7은 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 인플릭시맙 농도의 그래프이며, 인플릭시맙의 농도에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 8a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수(Day) 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 CTL 제거에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. Y축: %des-Lys; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 8b는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, 1.7 μM Zn+2의 존재 하에서의 CTL 제거에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. Y축: % des-Lys; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 9a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸, WAX 방법에 의해 결정된 바와 같은, 시알산을 갖는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 시알산의 백분율에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. Y축: %시알산; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 9b는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸, WAX 방법에 의해 결정된 바와 같은, 시알산을 갖는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 그래프이며, 1.7 μM Zn+2의 존재 하에서의 시알산 함량에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. Y축: %시알산; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 9c는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 G0F(WAX 성분 1)의 백분율의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 비갈락토실화된(non-galactosylated) 종의 백분율에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다.
도 9d는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 G0F(WAX 성분 1)의 백분율의 그래프이며, 1.7 μM Zn+2의 존재 하에서의 비갈락토실화된 종의 백분율에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다.
도 10은 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포 밀도의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2 또는 1.7 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 생존 세포 밀도에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. Y축: 생존 세포 밀도(생존 세포(×100만)/mL); X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 11a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포의 백분율의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2 또는 1.7 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 배양 생존력에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. Y축: %생존 세포; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 11b는 도 11a에 나타낸 그래프의 일수 0 내지 25의 확대도이다. Y축: 생존 세포 밀도(생존 세포(×100만)/mL); X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 12a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 인플릭시맙 농도의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2 또는 1.7 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 인플릭시맙의 농도에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 12b는 도 12a에 나타낸 그래프의 일수 0 내지 25의 확대도이다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, CTL 제거에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다(결과는 중복된 2개의 생물반응기로부터의 평균으로서 제공되어 있다). Y축: % des-Lys; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13b는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸, WAX 방법에 의해 결정된 바와 같은, 시알산을 갖는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 그래프이며, 시알산 함량에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다(결과는 중복된 2개의 생물반응기로부터의 평균으로서 제공되어 있다). Y축: %시알산; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13c는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포 밀도의 그래프이며, 생존 세포 밀도에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. Y축: 생존 세포 밀도(생존 세포(×100만)/mL); X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13d는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포의 백분율의 그래프이며, 배양 생존력에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. Y축: %생존 세포; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13e는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 인플릭시맙 농도의 그래프이며, 인플릭시맙의 농도에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13f는 도 13e에 나타낸 그래프의 일수 0 내지 25의 확대도이다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 13g는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 G0F(WAX 성분 1)의 백분율의 그래프이며, 갈락토스가 결여되어 있는 인플릭시맙 올리고당의 백분율에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 14a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, CTL 제거에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 14b는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸, WAX 방법에 의해 결정된 바와 같은, 시알산을 갖는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 그래프이며, 시알산 함량에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다.
도 14c는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포 밀도의 그래프이며, 생존 세포 밀도에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. Y축: 생존 세포 밀도(생존 세포(×100만)/mL); X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 14d는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 생존 세포의 백분율의 그래프이며, 배양 생존력에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. Y축: %생존 세포; X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 14e는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 인플릭시맙 농도의 그래프이며, 인플릭시맙의 농도에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 14f는 도 14e에 나타낸 그래프의 일수 0 내지 25의 확대도이다. 표시된 바와 같은 Y축 농도 mg/mL는 오타를 포함한다. 그 농도는 mg/L이다. Y축: 인플릭시맙 농도(mg/L), X축: 생물반응기 기간(단위: 일).
도 15는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 G0F(WAX 성분 1)의 백분율의 그래프이며, 갈락토스가 결여되어 있는 인플릭시맙 올리고당의 백분율에 대한 변동하는 EDTA 농도(μM)의 영향을 보여준다.
도 16은 인플릭시맙의 가장 일반적인 천연 올리고당, G0F, G1F 및 G2F에 대한 생합성 경로, 및 천연 올리고당으로부터 시알화된(sialylated) 형태로의 생합성 경로를 보여준다.
도 17은 Zn+2 농도의 함수로 나타낸 CTL 제거(피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 실험에 대한 일수 20에서의 CTL 제거의 백분율을 보여준다(청색 데이터 포인트 및 선은 평균을 나타낸다).
도 18은 Zn+2 농도의 함수로 나타낸 CTL 제거(피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, DOE3 실험에 대한 일수 13에서의 CTL 제거의 백분율을 보여준다.
도 19는 Zn+2 농도의 함수로 나타낸 시알산 함량의 그래프이며, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 실험에 대한 일수 20에서의 시알산의 백분율을 보여준다(선은 평균을 나타낸다).
도 20은 Zn+2 농도의 함수로 나타낸 WAX 성분 1(G0F)의 백분율의 그래프이며, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 실험에 대한 일수 20에서의 갈락토스가 결여되어 있는 인플릭시맙 올리고당의 백분율을 보여준다.
도 21은 Zn+2 농도의 함수로 나타낸 (%시알산/(100 ― WAX 성분 1의 백분율)로서 추정된) 시알산 대 갈락토스의 추정된 비의 그래프이며, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 실험에 대한 일수 20에서의 추정된 시알산 대 갈락토스 비를 보여준다.
도 22는 EDTA 농도의 함수로 나타낸 CTL 제거(피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, 블렌딩 1번 및 2번 실험에 대한 일수 33 내지 35에서의 1.1 내지 1.2 μM Zn+2의 존재 하에서의 % CTL 제거를 보여준다.
도 23은 EDTA 농도의 함수로 나타낸 시알산의 백분율의 그래프이며, 블렌딩 1번 및 2번 실험에 대한 일수 33 내지 35에서의 1.1 내지 1.2 μM Zn+2의 존재 하에서의 %시알산을 보여준다.
도 24는 EDTA 농도의 함수로 나타낸 WAX 성분 1의 백분율의 그래프이며, 블렌딩 1번 및 2번 실험에 대한 일수 33 내지 35에서의 1.1 내지 1.2 μM Zn+2의 존재 하에서의 갈락토스가 결여되어 있는 인플릭시맙 올리고당의 백분율을 보여준다.
도 25는 EDTA 농도의 함수로 나타낸 (%시알산/(100 ― WAX 성분 1의 백분율)로서 추정된) 시알산 대 갈락토스의 추정된 비의 그래프이며, 블렌딩 1번 및 2번 실험에 대한 일수 33 내지 35에서의 1.1 내지 1.2 μM Zn+2의 존재 하에서의 추정된 시알산 대 갈락토스 비를 보여준다.
도 26은 (WAX 성분 1로부터 계산된) G0F의 백분율의 함수로 나타낸 (WAX 성분 5로부터 계산된) 시알산의 백분율의 그래프이며, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 및 2번 실험에 대한 시알산과 WAX 성분 1 - 이는 갈락토스가 결여되어 있는 인플릭시맙 올리고당의 지표임 - 의 백분율 사이의 반비례 관계를 보여준다.
도 27a 및 도 27b는 키메라 A2 항체의 키메라 H(pA2HG1apgpt) 및 L(pA2HuKapgpt) 사슬의 발현을 위해 사용된 플라스미드의 개략도를 제공한다.
도 28은 서열 번호 1로서의 인간 TNF의 아미노산 서열이다.
도 29a 내지 도 29b. 도 29a는 클로닝된 cA2 경쇄 가변 영역의 핵산 서열(서열 번호 2) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 3)이다. 도 29b는 클로닝된 cA2 중쇄 가변 영역의 핵산 서열(서열 번호 4) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 5)이다.
이어서, 본 발명의 예시적인 실시 형태에 대한 설명이 기재된다.
일 실시 형태는 약 20% 내지 약 70%의 C-말단 라이신 함량, 및 약 1% 내지 약 20%의 시알산 함량을 갖는 항체를 생산하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 0.5 μM 이상의 아연을 포함하는 배양 배지 중에서 항체를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 아연-반응성 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지 중의 아연의 농도를 제어함으로써 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 CTL 함량은 C-말단 라이신을 갖는 중쇄의 백분율로서 표현되며, 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다: CTL 함량(%) = (CTL을 갖는 중쇄의 개수)/(중쇄의 총 개수) × 100. 본 명세서에서 CTL 제거는 C-말단 라이신이 결여되어 있는 중쇄(des-Lys)의 백분율로서 표현된다. 따라서, "80% Des-Lys"는 20% CTL 함량에 상당한다. 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항-TNFα 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 CTL 함량은 약 40% 내지 약 70%, 구체적으로는 약 55% 내지 약 65%, 그리고 더 구체적으로는 약 60%이다.
본 명세서에서 시알산 함량은 시알산을 함유하는 올리고당의 백분율로서 표현되며, 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다: 시알산 함량(%) = (시알산을 함유하는 올리고당의 개수)/(올리고당의 총 개수) × 100. 이 식은 올리고당 내의 시알산 잔기의 개수와는 무관하게 적용된다. 다시 말하면, 예를 들어 올리고당 내에 시알산 잔기가 1개가 존재하든 2개가 존재하든 관계없이, 올리고당은 시알산 함량의 계산 목적을 위해 단지 1회 카운팅된다. 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항-TNFα 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 시알산 함량은 약 3% 내지 약 14%이다.
본 명세서에서 갈락토스 함량은 갈락토스를 함유하는 올리고당의 백분율로서 표현되며, 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다: 갈락토스 함량(%) = (갈락토스를 함유하는 올리고당의 개수)/(올리고당의 총 개수) × 100. 이 식은 올리고당 내의 갈락토스 단위의 개수와는 무관하게 적용된다. 다시 말하면, 예를 들어 올리고당 내에 갈락토스 잔기가 1개가 존재하든 2개가 존재하든 관계없이, 올리고당은 갈락토스 함량의 계산 목적을 위해 단지 1회 카운팅된다. 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항-TNFα 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 갈락토스 함량은 약 50% 내지 약 90%, 그리고 구체적으로는 약 45% 내지 약 85%이다.
전형적으로, 항체, 예컨대 인플릭시맙의 두 중쇄 모두는 글리코실화된다. 그러나, 일부 상황에서, 중쇄들 중 일부는 비글리코실화된(aglycosylated) 상태로 남아 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항체 분자들의 대략 94%는 두 사슬 모두 상에서 글리코실화되고, 항체 분자들의 대략 6%는 헤미-글리코실화되고, 항체 분자들의 대략 0.1%는 완전 비글리코실화된다.
시알산 대 갈락토스의 비는 인플릭시맙의 올리고당 내의 시알산 대 갈락토스의 몰비로부터 계산된다. 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 항체 또는 항-TNFα 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 시알산 대 갈락토스의 비는 약 0.05 내지 약 0.20이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아연-반응성 숙주 세포"는 숙주 세포의 배양 배지 중의 아연 농도의 변동에 반응하는 숙주 세포를 의미한다. 아연 농도의 변동에 대한 숙주 세포의 반응성은, 예를 들어 숙주 세포에 의해 생산된 항체에서의 CTL 함량, 시알산 함량, 갈락토스 함량, 및 시알산 대 갈락토스의 비에 대한 변동하는 아연 농도의 영향을 측정함으로써 평가될 수 있다. 숙주 세포에 의해 생산된 항체에서의 CTL 함량, 시알산 함량, 갈락토스 함량, 및 시알산 대 갈락토스의 비를 평가하기 위한 방법은 실시예에 기재되어 있다.
본 발명은 약 0.5 μM 초과의 아연의 양을 포함하는 배양 배지를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지 중의 아연의 농도는 약 0.6 μM 내지 약 6.5 μM의 범위, 그리고 바람직하게는 약 0.6 μM 내지 약 1.1 μM의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지 중의 아연의 양 또는 농도는 아연-반응성 숙주 세포에 대해 비독성인데, 예를 들어 세포 생존력, 세포 성장 또는 항체 생산을 감소시키지 않거나 사실상 감소시키지 않으며, 이는 배양의 초기 20 내지 25일에 특히 그러하다.
일부 실시 형태에서, 배양 배지는 약 2.5 μM 내지 약 30 μM의 농도 범위, 그리고 바람직하게는 약 5 μM 내지 약 16 μM의 농도 범위의 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)(본 명세서에서 언급된 바와 같은 "EDTA" 또는 "총 EDTA")을 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "철-무함유 EDTA"는 철(Fe+3)로 킬레이트화되지 않은 EDTA를 지칭한다. 철-무함유 EDTA의 양 또는 농도([EDTA ― Fe+3]로 약기됨)는 총 EDTA의 양 또는 농도로부터 Fe3+의 양 또는 농도를 뺌으로써 계산될 수 있다. 이온 Fe+3은 배양 배지 중의 금속 이온들의 EDTA에 대한 최고 친화성을 갖는다. 따라서, Fe+3은 존재할 경우 우선적으로 세포 배양 배지 중에서 EDTA와 결합할 것이다. 철-무함유 EDTA의 농도는 배양 배지 중에서 Zn+2 및 다른 금속 이온들과 결합하는 데 이용가능한 EDTA를 나타낸다.
본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 배양 배지 중의 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 양 또는 농도는 아연-반응성 숙주 세포에 대해 비독성인데, 예를 들어 세포 생존력, 세포 성장 또는 항체 생산을 감소시키지 않거나 사실상 감소시키지 않으며, 이는 배양의 초기 20 내지 25일에 특히 그러하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제어"는 검증 및/또는 조절하는 것을 의미한다. 제어는, (직접적으로 또는 간접적으로) 제어되고 있는 물질을 감지/측정하는 단계, 및 그러한 측정치를 사용하여 피드백을 제공하여 원하는 결과를 향해 보정을 실시하는 단계를 포함한다. 제어는, 배양 배지 중의 아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 농도를 모니터링하는 단계 및 이를 조절하는 단계 둘 모두를 포함한다. 전형적으로, 아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 농도는 배양 지속시간 동안 제어된다. 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 농도는 아연-반응성 숙주 세포의 지수 성장기 동안, 또는 배양의 초기 대략 10 내지 25일 동안 제어된다.
배양 배지 중의 아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 농도는, 예를 들어 배양 배지 중의 아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 수준을 모니터링함으로써; 그리고 배양 배지 중의 아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 수준을 조절함으로써 제어될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 아연의 농도를 제어하는 것은 배양 배지 중의 아연의 농도가 0.5 μM 이상, 또는 약 0.6 μM 내지 약 6.5 μM이 되도록, 배양 배지 중의 아연의 농도를 모니터링하는 단계, 및 배양 배지 중의 아연의 농도를 조절하는 단계를 포함한다.
아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 수준을 모니터링하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 아연 및 다른 금속 이온들의 농도는 유도 결합 플라즈마 질량 분석(ICP-MS)에 의해 측정될 수 있으며, 한편 EDTA 농도는 HPLC 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조절"하는 것은 적절한 상태로 두거나 유지하는 것을 의미한다. 조절 단계는, 예를 들어 배양 배지 중의 아연 및/또는 EDTA의 농도를 유지하는 단계, 및, 필요에 따라, 예를 들어 배양 배지 중의 아연 및/또는 EDTA의 농도를 조정하는 단계를 포함한다. 이로써, 아연(예를 들어, 비독성 양의 아연)은, 예를 들어 약 5 μM 초과의 초기 농도로 배양 배지 중에 포함되고, 이어서, 예를 들어 0.6 μM 내지 약 1.1 μM의 농도로 조정될 수 있다. 조정은, 예를 들어 지수 성장기로부터 정상 상태기(steady-state phase)로의 전이와 동시에 또는 그 직후에 행해질 수 있다. 대안적으로, 아연의 농도는, 배양의 지속시간 동안 예를 들어 0.6 μM 내지 약 1.1 μM의 농도로 유지될 수 있다.
아연 및/또는 EDTA 및/또는 철-무함유 EDTA의 수준의 조절은, 예를 들어 배양 배지에 대한 아연, 철 및/또는 EDTA의 직접적인 첨가를 통해; 아연, 철 및/또는 EDTA를 함유하는 원재료의 블렌딩을 통해; 원재료를 처리하여 그의 아연, 철 및/또는 EDTA 농도를 조정함을 통해; 그리고/또는 원재료의 제조 방법을 변형시켜 원하는 수준의 아연, 철 및/또는 EDTA를 달성함을 통해 달성될 수 있다. 배양 배지의 성분들을 조절하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
배양 배지는 아연 및/또는 EDTA에 더하여 다른 성분들을 포함할 수 있다. 적합한 배양 배지의 선택은 당업자의 지식 범위 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지는 무혈청 배지이다.
항체를 생산하는 데 사용하기 위한 것으로 당업계에 알려진 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있으며, 이에는 포유류 세포, 예컨대 SP2/0 세포, 예를 들어 마우스 SP2/0 세포(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection), CRL-1581)가 포함된다. 다른 예시적인 숙주 세포는 NS0(영국 윌트셔 솔즈베리 소재의 ECACC(European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주이다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO-K1SV(미국 매사추세츠주 워커스빌 소재의 론자 바이올로직스(Lonza Biologics)), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래되는 것들을 포함한다. 세포는 단일-세포 현탁액으로 또는 부착-의존성 방식(anchorage-dependent fashion)으로 배양될 수 있다.
다양한 배양 시스템이 당업계에 알려져 있으며, 이에는 플라스크, 롤러 병, 및 생물반응기, 예를 들어 교반형 탱크 생물반응기가 포함된다. 배양 배지는, 배양 배지가 단일 배치(single batch)로 세포에 1회 첨가되는 배치 공정으로 첨가되거나, 바람직하게는 배양 배지의 작은 배치들이 주기적으로 첨가되는 공급형 배치 공정으로 첨가된다. 숙주 세포는 또한 관류 배양(perfusion culture)으로 배양될 수 있는데, 이는 배양물로부터 일정 부피의 배양 배지를 연속적으로 제거하는 단계, 및 제거된 부피를 비견되는 부피의 새로운 배지로 대체하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 관류된 배양물은 배치 배양물보다 더 높은 세포 밀도를 달성하도록 처리될 수 있으며, 더 오랜 시간 동안 유지될 수 있다. 관류된 배양물은 또한 반복된 수확을 가능하게 한다.
항체를 생산하기 위한 방법은 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 배양 배지 중의 아연-반응성 숙주 세포가 약 150만 세포/mL 내지 약 1100만 세포/mL, 그리고 바람직하게는 약 300만 세포/mL 내지 약 1100만 세포/mL의 세포 밀도에 도달할 때 회수될 수 있다. 항체는, 예를 들어 직접 생산물 포획(direct product capture, DPC)에 의해 회수될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 아연의 농도는 항체가 회수될 때까지 제어된다.
CTL 및 시알산 함량은 생산물 수확 또는 회수시에 세포 연령(cell age)을 제어함으로써 여전히 더 정확하게 제어될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법들의 일부 실시 형태에서, 항체는 지수 성장기로부터 정상 상태기로의 전이와 동시에 또는 그 직후에 회수된다. 다른 실시 형태에서, 항체는 배양 성장의 정상 상태기 동안 회수된다. 일부 실시 형태에서, 항체는 배양의 초기 25일 이내에, 예를 들어 일수 10 내지 25, 일수 15 내지 20, 또는 대략 일수 20에서 회수된다. 다른 실시 형태에서, 항체는 배양의 초기 25일 후에 회수된다.
또한, 배양 배지 중에서 약 20% 내지 약 70%의 C-말단 라이신 함량을 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체의 C-말단 라이신 함량을 제어하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
또한, 배양 배지 중에서 약 1% 내지 약 20%의 시알산 함량을 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체의 시알산 함량을 제어하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
또한, 배양 배지 중에서 약 50% 내지 약 90%의 갈락토스 함량을 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체의 갈락토스 함량을 제어하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
또한, 배양 배지 중에서 약 0.05 내지 약 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는 항체를 생합성하기 위한 공정에서, 상기 항체 내의 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
CTL, 시알산 또는 갈락토스 함량, 또는 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하기 위한 방법의 일부 실시 형태에서, 항체는 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고/이거나, 항체는 SP2/0 세포 또는 CHO 세포에 의해 생합성된다.
항체 및 그의 단편
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 전 항체(whole antibody) 및 그의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일쇄를 포함한다.
항체는 중쇄 불변 영역(Hc), 중쇄 가변 영역(Hv), 경쇄 가변 영역(Lv) 및 경쇄 불변 영역(Lc) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 여기서 다중클론 Ab, 단일클론 Ab, 이들의 단편 및/또는 영역은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역(Hv) 또는 경쇄 가변 영역(Lv)을 포함하며, 이들 영역은 항원의 일부분과 결합하고 항원의 적어도 하나의 생물학적 활성을 억제하고/하거나 중화한다.
항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체를 포함하는 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 그러한 항체는, 종래의 기법을 사용하여 항체의 다양한 부분들(예를 들어, CDR, 프레임워크)을 함께 화학적으로 연결하거나, 재조합 DNA 기술의 종래 기법을 사용하여 항체를 인코딩하는 (하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나, 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
항체는 영장류 항체, 포유류 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체는, 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 적어도 하나의 항원 결합 단편 또는 영역을 갖는, 뮤린-인간 키메라 항체, 뮤린 항체, 인간 항체 또는 이들의 임의의 일부분 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
키메라 항체는, 상이한 부분들이 상이한 동물종, 예컨대 뮤린 mAb로부터 유래되는 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들로부터 유래되는 분자이다. 예를 들어, 이는 하나의 종으로부터 유래되는 적어도 하나의 별개의 도메인들, 통상 가변 도메인 및 다른 하나의 종으로부터 유래되는 나머지를 보유할 수 있으며, 예를 들어 마우스-인간 키메라 항체이다. 이는, 적용시에 면역원성을 감소시키는 데 그리고 생산시에 수율을 증가시키는 데 주로 사용되는데, 예를 들어 뮤린 mAb는 하이브리도마로부터 더 높은 수율을 갖지만 인간에서 더 높은 면역원성을 가져서 인간/뮤린 키메라 mAb를 사용하게 된다. 키메라 항체 및 그의 생산 방법은 당업계에 알려져 있다(문헌[Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984)]; 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]; 문헌[Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985)]; 및 문헌[Harlow and Lane Antibodies: a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]). 이들 참고문헌은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 1가, 2가 또는 다가 면역글로불린을 포함한다. 1가 키메라 항체는 키메라 L 사슬과의 이황화물 가교를 통해 회합된 키메라 H 사슬에 의해 형성된 이량체(HL)이다. 2가 키메라 항체는 적어도 하나의 이황화물 가교를 통해 회합된 2개의 HL 이량체에 의해 형성된 사량체(H2L2)이다. 다가 키메라 항체는 또한, 예를 들어, (예를 들어 IgM H 사슬, 또는 μ 사슬로부터) 응집되는 CH 영역을 사용함으로써 생산될 수 있다.
"인간화" 항체(CDR-이식 항체로도 알려짐)는 이종 공급원(일반적으로 설치류)으로부터의 단일클론 항체(mAb)의 면역원성을 감소시키기 위한, 그리고 효과기 기능(예를 들어, ADCC, 보체 활성화, 및/또는 C1q 결합)을 개선하기 위한 방법에 의해 생산된다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원, 예를 들어, 그러나 한정함이 없이, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 조작된 mAb는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다. 인간 프레임워크 내로의 설치류 상보성-결정 영역(CDR)의 단순 CDR-이식은 종종 원래의 mAb의 결합 친화성 및/또는 특이성의 손실을 초래한다. 항체를 인간화하기 위하여, 인간화 항체의 설계는 CDR의 잔기 내의 보존적 아미노산 치환, 및 설치류 mAb로부터 인간 프레임워크 영역 내로의 잔기의 역치환(back substitution)(역돌연변이(back mutation))과 같은 변형을 포함할 수 있다. 비-인간 또는 인간 항체를 조작 또는 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 그와 근접하게 매칭되는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내(in vitro)에서의 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이 생성에 의해 또는 생체내(in vivo)에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이로써, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 단백질의 사실상 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지(hinge), (VL, VH))이 인간 생식세포계열 항체와 사실상 유사한 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 또한 단백질의 사실상 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어 CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이, 단지 사소한 서열 변화 또는 변형만을 가지면서, 인간에서 사실상 비면역원성인 항체를 지칭한다. 유사하게, 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류(마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 햄스터 등) 및 다른 포유동물에 지정된 항체는 그러한 종, 아속, 속, 아과, 및 과 특이적 항체를 지정한다. 인간 항체는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현시킬 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생산될 수 있다. 또한, 인간 항체가 단일쇄 항체일 때, 인간 항체는 천연 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 약 8개의 글라이신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 간주된다.
항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 이들의 임의의 하위클래스를 비롯한 임의의 면역글로불린 클래스의 항체일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종형(isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 인간에서는, 5개의 중쇄 동종형 및 2개의 경쇄 동종형이 있다. 중쇄의 경우, IgA1 및 2; IgD; IgG1, 2, 3, 및 4; IgE; 및 IgM이 중쇄의 동종형이다. 카파 및 람다는 경쇄의 동종형이다. 소정 실시 형태에서, 중쇄는 IgG 클래스 중쇄이다. 다른 실시 형태에서, 중쇄는 IgM 클래스 중쇄이다. 소정 실시 형태에서, 중쇄는 J 영역의 적어도 약 8개의 아미노산을 추가로 포함한다.
항체는, 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기법과 같은, 그러나 이로 한정되지 않는 임의의 알려진 기법에 의해 제공된, 다중클론 항체, 단일클론 항체(mAb), 가용 형태 또는 결합된 형태로 라벨링될 수 있는 항체에 대한 항-이디오타입(anti-idiotypic)(anti-Id) 항체, 및 이들의 단편, 영역 또는 유도체일 수 있다. 그러한 항체는, 항원 수용체에 대한 항원의 결합을 억제하는, 항원(예를 들어, TNF)의 부분들과 결합할 수 있다.
다중클론 항체는 항원으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래되는 항체 분자들의 이종 집단이다.
단일클론 항체(mAb)는 항원에 특이적인 항체들의 사실상 동종인 집단을 함유하고, 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성을 나타낸다.
mAb는 당업자에게 알려진 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]; 미국 특허 제4,376,110호; 문헌[Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992)]; 및 문헌[Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]; 문헌[Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)]을 참조하며, 이들 참고문헌의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
항-이디오타입(항-Id) 항체는, 일반적으로 항체의 항원-결합 부위와 관련된 특유의 결정인자를 인식하는 항체이다. 항-Id 항체는 또한, 이른바 항-항-Id 항체를 생산하는, 다른 동물에서의 면역 반응을 유도하기 위한 "면역원"으로 사용될 수 있다. 항-항-Id는 항-Id를 유도한 원래의 mAb와 에피토프적으로(epitopically) 동일할 수 있다. 이로써, mAb의 이디오타입 결정인자에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론들을 확인할 수 있다.
항체 단편은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv를 포함한다. 이들 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 결여되어 있고, 순환으로부터 더 신속히 제거되고, 온전한 항체보다 더 적은 비특이적 조직 결합을 가질 수 있다(문헌[Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)]). 이들 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 효소, 예컨대 파파인(Fab 단편을 생산하기 위한 효소) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위한 효소)을 사용한 단백질 분해 절단에 의해 온전한 항체로부터 생산된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은, 항원과 상호작용하고 항체 상에 항원에 대한 그의 특이성 및 친화성을 제공하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분으로서, 이때 항체는 추가적으로, 그러한 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 동물을 유도할 수 있다. 항원은 하나 또는 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 항체 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 입체구조(conformation)를 유지하는 데 필요한 "프레임워크" 아미노산 잔기를 포함한다.
"항원 결합 단편" 또는 그의 일부분은, 예를 들어 단일쇄 항체 및 그의 단편을 포함한다. 항원 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드 사슬 상에 VH 및 VL 도메인이 발현되는 dAb 단편; 및 (vi) 하나 이상의 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 그러한 단편들은 당업계에 알려져 있는 바와 같은, 그리고/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기법에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단편은 항체 사슬의 하나 이상의 부분, 예컨대 중쇄 불변 영역, 연결 영역, 다양성(diversity) 영역 또는 가변 영역, 또는 경쇄 불변 영역, 연결 영역 또는 가변 영역을 포함할 수 있다.
항원 결합 영역은 비-인간, 예를 들어 뮤린 기원의 것일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항원 결합 영역은 토끼 또는 설치류, 예컨대 래트 또는 햄스터로부터 유래될 수 있다.
키메라 항체의 항원 결합 단편은 인간 항원에 특이적인 비-인간 항체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 그러한 키메라 항체를 인코딩하는 DNA를 위한 공급원은 항체를 생산하는 세포주, 바람직하게는, 하이브리도마로 일반적으로 알려진 하이브리드 세포주를 포함한다. 일 실시 형태에서, 하이브리도마는 A2 하이브리도마 세포주이다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 통상 특이적인 3차원 구조적 특성뿐 아니라 특이적인 전하 특성도 갖는다. "에피토프"는 항체의 항원 결합 영역들 중 하나 이상에서 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 임의의 분자의 부분일 수 있다. "에피토프를 억제하고/하거나 중화하는"은, 에피토프가 항체에 의해 결합될 때, 그 결과 생체내에서, 시험관내에서 또는 제자리(in situ)에서, 더 바람직하게는 생체내에서 그 에피토프를 함유하는 분자 또는 유기체의 생물학적 활성, 예를 들어 TNF 수용체에 대한 TNF의 결합이 손실되는 것으로 의도된다.
항체는, 예를 들어 단리된 재조합 및/또는 합성 항체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생산되거나 또는 단리된 모든 항체를 포함한다. 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 내부로 도입된 세포를 지칭한다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어 CHO 세포주 또는 마우스 골수종 SP2/0 유래 세포주를 포함한다. 재조합 항체, 예컨대 뮤린 항체 또는 키메라 뮤린-인간 항체 또는 인간-인간 항체는 알려진 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1987, 1992, 1993)]; 및 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 참조하며, 이들의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
동일하거나 상이한 가변 영역 결합 특이성의 키메라 H 사슬 및 L 사슬을 갖는 항체, 단편 또는 유도체는, 예를 들어, 공지된 방법 단계에 따라, 예를 들어 상기의 문헌[Ausubel], 하기의 문헌[Harlow], 및 하기의 문헌[Colligan]에 따라 개별 폴리펩티드 사슬들의 적절한 회합에 의해 제조될 수 있으며, 이들 참고문헌의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
이러한 접근으로, 키메라 H 사슬(또는 그의 유도체)을 발현하는 숙주는 키메라 L 사슬(또는 그의 유도체)을 발현하는 숙주와 별도로 배양되고, 이들 면역글로불린 사슬은 개별적으로 회수되고 이어서 회합된다. 대안적으로, 이들 숙주는 공배양되고, 사슬들이 배양 배지 중에서 자발적으로 회합되게 한 후, 조립된 면역글로불린, 단편 또는 유도체를 회수할 수 있다.
이들 하이브리드 세포는 비-인간 항-hTNFα 항체-생산 세포, 전형적으로 천연 또는 재조합 인간 TNF에 대해 면역화된 동물의 비장 세포, 또는 인간 TNFα 단백질 서열의 펩티드 단편의 융합에 의해 형성된다. 대안적으로, 비-인간 항-TNFα 항체-생산 세포는 TNF로 면역화된 동물의 혈액, 비장, 림프절 또는 다른 조직들로부터 얻어진 B 림프구일 수 있다.
불멸화 기능을 제공하는 제2 융합 파트너는 림프아구성(lymphoblastoid) 세포 또는 형질세포종 또는 골수종 세포일 수 있는데, 이는 그 자체가 항체 생산 세포는 아니지만 악성이다. 일부 실시 형태에서, 융합 파트너 세포는 SP2/0로 약기되는 하이브리도마 SP2/0-Ag14(ATCC CRL1581) 및 골수종 P3X63Ag8(ATCC TIB9), 또는 그의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 하기 문헌[Ausubel], 하기 문헌[Harlow], 및 하기 문헌[Colligan]을 참조하며, 이들 참조문헌의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 사실상 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나, 인간 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 항원들에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 사실상 없을 수 있다.
경쟁적 억제에 의해 mAb 특이성 및 친화성을 결정하기 위한 방법은, 예를 들어 문헌[Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)], 문헌[Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 및 문헌[Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 생물학적으로 활성인 항체일 수 있다. 생물학적으로 활성인 항체는 천연(비-합성) 내인성이거나 관련되고 공지된 항체의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 또는 95% 내지 100%의 특이적 활성(specific activity)을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성을 검정하는 방법 및 정량화하는 수단이 당업자에게 잘 알려져 있다.
항-TNFα 항체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산되는 항체는 항-종양 괴사 인자-α(TNFα) 항체이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 종양 괴사 인자-α(TNFα)와 종양 괴사 인자(TNF)는, 달리 구체적으로 기재되지 않는 한, 종양 괴사 인자-α(TNFα)를 지칭하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 마찬가지로, 종양 괴사 인자-α(TNFα) 및 종양 괴사 인자(TNF) 항체와 항-종양 괴사 인자-α(TNFα) 및 항-종양 괴사 인자(TNF) 항체는, 달리 구체적으로 기재되지 않는 한, 상호교환가능하게 사용된다.
TNFα는 17 kD 단백질 하위단위들의 가용성 동종삼량체이다(문헌[Smith, et al., J. Biol. Chem. 262:6951- 6954 (1987)]). TNF의 막-결합된 26 kD 전구체 형태가 또한 존재한다(문헌[Kriegler et al., Cell 53:45-53 (1988)]). TNF에 대한 개관을 위하여, 문헌[Beutler, et al., Nature 320:584 (1986)], 문헌[Old, Science 230:630 (1986)], 및 문헌[Le, et al., Lab. Invest. 56:234]을 참조한다. 문헌[Pennica et al., Nature 312:724-729 (1984)]에 따라, 인간 TNFα의 완전한 1차 서열이 도 28(서열 번호 1)에 나타나 있다.
TNFα는 조직 손상을 초래하는 전염증성(pro-inflammatory) 작용을 야기할 수 있다. 종양 괴사 인자(TNFα)는 세균성, 바이러스성 또는 기생충성 감염, 만성 염증성 질병, 자가면역 질병, 악성종양, 및/또는 신경변성 질병과 같은 그러나 이로 한정되지 않는 많은 병상(pathology)을 매개하거나 그들에 관여한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 항체는 TNF에 대한 중화 및/또는 억제 활성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 항체는 고친화성 인간-뮤린 키메라 항-TNF 항체, 및 그의 단편 또는 영역으로, 이들은 인간 TNFα에 대한 생체내에서의 강력한 억제 및/또는 중화 활성을 갖는다. 그러한 항체 및 키메라 항체는 정제된 재조합 hTNFα(서열 번호 1) 또는 그의 펩티드 단편을 사용하여 면역화에 의해 생산된 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체 및 단편은 TNFα에 특이적으로 결합된다. 일부 실시 형태에서, 이들은 또한 시험관내에서, 제자리에서 그리고/또는 생체내에서 TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 소실, 방해, 방지 및/또는 억제할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체는 cA2이다. 키메라 항체 cA2는 A2로 지정된 고친화성 중화 마우스 항-인간 TNFα IgG1 항체의 항원 결합 가변 영역, 및 인간 IgG1의 불변 영역인 카파 면역글로불린으로 이루어진다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이형 항체 효과기 기능을 개선하고, 순환 혈청 반감기를 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 결합력(avidity) 및 에피토프 특이성은 뮤린 항체 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 실시 형태에서, 뮤린 항체 A2의 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 위한 공급원은 A2 하이브리도마 세포주이다.
일 실시 형태에서, 뮤린 단일클론 항체 A2는 c134A로 지정된 세포주에 의해 생산된다. 일 실시 형태에서, 키메라 항체 cA2는 c168A로 지정된 세포주에 의해 생산된다.
일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 cA2의 중쇄 CDR3 및/또는 cA2의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 cA2의 상응하는 CDR 1, 2 및/또는 3의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 CDR(즉, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)의 적어도 일부분을 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 cA2의 상응하는 CDR 1, 2 및/또는 3의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 경쇄 CDR(즉, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)의 적어도 일부분을 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 일 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR은 본 명세서에 기재된 바와 같은 mAb A2 또는 cA2 중 적어도 하나의 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 갖는다.
키메라 A2의 결합력 및 에피토프 특이성은 뮤린 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 고상(solid phase) ELISA에서, 키메라 A2와 뮤린 A2 사이에 TNF에 대한 교차-경쟁이 관찰되었는데, 이는 cA2와 뮤린 A2의 에피토프 특이성이 동일함을 나타낸다. TNF-α에 대한 cA2의 특이성은, cA2가 림프독소(TNF-β)의 세포독성 효과를 중화할 수 없다는 것에 의해 확인되었다. 키메라 A2는 용량 의존적 방식으로 천연 및 재조합 인간 TNF 둘 모두의 세포독성 효과를 중화한다. cA2 및 재조합 인간 TNF의 결합 검정으로부터, cA2의 친화도 상수는 1.8 × 109 M1인 것으로 계산되었다.
TNF 중화 화합물의 TNF 중화 활성을 결정하는 데 사용될 수 있는 스크리닝 방법은 시험관내 또는 생체내 검정을 포함할 수 있다. 그러한 시험관내 검정은 단리된 형태 또는 재조합 형태로 TNF, 예컨대 침팬지 또는 인간 TNF와의 접촉에 의한 세포사의 감소를 결정하는 TNF 세포독성 검정, 예컨대 방사면역 검정을 포함할 수 있으며, 여기서 TNF 중화 화합물의 병존은 세포사의 정도 또는 속도를 감소시킨다. 세포사는, 세포사 속도를 50%까지 감소시키는 TNF 중화 화합물의 농도를 나타내는 ID50 값을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, mAb의 A2 및 cA2는 약 17 mg/ml +/- 3 mg/ml, 예컨대 14 내지 20 mg/ml, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 ID50을 갖는 것으로 확인되었다.
일부 실시 형태에서, 항체들은 항-TNFα 뮤린 mAb A2, 키메라 mAb cA2, 또는 A2 및/또는 cA2와 사실상 동일한 특이적 결합 특성, 예를 들어 에피토프 특이성을 갖는 항체의 인간 TNFα에 대한 결합을 생체내에서 경쟁적으로 억제할 수 있다.
항체, 및 그의 단편 및 영역에 의해 인식되는 에피토프는 TNF의 하기의 아미노산 서열들 각각 또는 이들 둘 모두의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 5개 이상의 아미노산을 포함할 수 있는데, 이때 TNF의 하기의 아미노산 서열들은 TNF의 지형적 또는 3차원적 에피토프를 제공하는 것으로, TNF의 지형적 또는 3차원적 에피토프는 항-TNF 활성, TNF 항체, 또는 그의 단편에 의해 인식되고/되거나 그와 결합한다:
Figure 112015099391821-pct00001
일부 실시 형태에서, 항-TNF 항체의 항체, 단편 및 영역은 (서열 번호 1)의 hTNFα의 아미노산 잔기 87-108 또는 잔기 59-80 및 87-108 둘 모두로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 5개의 아미노산을 포함하는 에피토프를 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-TNF 항체의 항체, 단편 및 영역은 (서열 번호 1의) hTNFα의 아미노산 11-13, 37-42, 49-57 또는 155-157 중 적어도 하나로부터의 에피토프를 인식하지 않는다. (문헌[Eck and Sprang (J. Biol. Chem. 264 (29): 17595-17605 (1989)]에 의해 제시된 바와 같은 추정 수용체 결합 자리(putative receptor binding locus)).
일 실시 형태에서, 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 항-hTNF 키메라 항체이며, 이들 사슬 각각은 인간 불변 영역의 적어도 일부 및 인간 TNF에 대해 특이성을 갖는 비-인간 기원의 가변(V) 영역의 적어도 일부를 포함하며, 상기 항체는 인간 TNF의 억제 및/또는 중화 에피토프에 대해 고친화도로 결합한다.
일 실시 형태에서, 항체는 비정상 TNF 생산과 관련된 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 환자 또는 동물에서 TNF를 검출하기 위한 진단 방법에서 사용하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, TNF 항체는 TNF가 관여하는 증상 또는 병상을 경감시키기 위해 사용되며, 이러한 증상 또는 병상은, 예컨대 세균성, 바이러스성 또는 기생충성 감염, 만성 염증성 질병, 자가면역 질병, 악성종양, 및/또는 신경변성 질병이지만, 이로 제한되지는 않는다.
인간 TNFα 또는 TNFβ에 특이적인 mAb를 생산하는 뮤린 하이브리도마는 마우스 융합 파트너 세포, 예컨대 SP2/0와, 정제된 hTNFα, 재조합 hTNFα, 천연 또는 합성 TNF 펩티드 - (서열 번호 1의) TNF의 잔기 59-80, 및 87-108로부터 선택되는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함함 -, 또는 TNF를 함유하는 다른 생물학적 제제에 대해 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 융합에 의해 형성된다. 마우스를 면역화하기 위해, 각종 다양한 종래의 프로토콜에 따를 수 있다. 예를 들어, 마우스는 TNF의 1차 면역화 및 추가 면역화(boosting immunization)를 받을 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체는 광범위한 친화도(KD)로 인간 TNF와 결합할 수 있다. 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 인간 mAb는 선택적으로 고친화도로 인간 TNF와 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 mAb는 약 10-7 M 이하, 예컨대 0.1 내지 9.9(또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) × 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의, 그러나 이로 제한되지 않는 KD로 인간 TNF와 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992)]; 및 본 명세서에 기재된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Ka, Kd)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다.
항-TNF 항체는 정의된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 항-TNF 항체는, 선택적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 및/또는 선택적으로 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나를 포함한다. 인간 TNF에 결합하고 정의된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 적합한 방법, 예컨대 파지 디스플레이(phage display)(문헌[Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)]) 또는 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자도입(transgenic) 동물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일 실시 형태에서, 항-TNF 항체는 서열 번호 3의 아미노산 잔기 24-34, 50-56 및 89-97에 각각 상응하는 경쇄 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 5의 아미노산 잔기 31-35, 50-68 및 101-109에 각각 상응하는 중쇄 CDR, 즉 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는데, 이는 카바트(Kabat)에 따라 기재된다.
항-TNF 항체는 서열 번호 3 및 5 중 적어도 하나의 70 내지 100%의 연속된 아미노산들 중 적어도 하나의 폴리펩티드를 추가로 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 면역글로불린 사슬, 또는 그의 일부분(예를 들어, 가변 영역)의 아미노산 서열은 서열 번호 3 및 5 중 적어도 하나의 상응하는 사슬과 약 70 내지 100% 동일성(identity)(예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 갖는다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 8의 서열과 비교될 수 있고, 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 7과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 70 내지 100% 아미노산 동일성(즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)은 당업계에 공지된 바와 같이 적합한 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정된다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 3 및 5에 제공되어 있다. 이들 항체는 항체로부터의 임의의 개수의 연속된 아미노산 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 그 개수는 항-TNF 항체 내의 연속된 잔기들의 개수의 10 내지 100%로 이루어진 정수들의 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 연속된 아미노산들의 이러한 하위서열(subsequence)은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 또는 그 이상의 아미노산 길이 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이다. 또한, 그러한 하위서열의 개수는 1 내지 20, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 정수일 수 있다.
항체는 또한, TNF 면역검정 및 TNF-매개 병상의 요법 둘 모두를 위한, 고친화도 및/또는 강력한 생체내 TNF-억제 및/또는 중화 항체, 그의 단편 또는 영역을 포함한다. 그러한 항체, 단편, 또는 영역은, Ka로서 표현된 hTNFα에 대한 친화도가, 바람직하게는 적어도 108 M-1, 더 바람직하게는 적어도 109 M-1, 예컨대 l08 내지 I010 M-1, 5 × 108 M-1, 8 × 108 M-1, 2 × 109 M-1, 4 × 109 M-1, 6 × 109 M-1, 8 × 109 M-1, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값일 것이다.
TNF 항체는 또한, TNF-유도 IL-6 분비를 차단시키는, 강력한 생체내 TNFα-억제 및/또는 중화 활성을 갖는 고친화도 뮤린 및 키메라 항체, 및 단편, 영역 및 유도체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간의 치료학적 용도를 위한 항체는 생체내, 제자리, 및 시험관내에서, 세포 부착 분자들, 예컨대 ELAM-I 및 ICAM-I의 TNF-유도 발현의 차단 및 TNF 유사분열촉진(mitogenic) 활성의 차단을 비롯한 TNF-유도 응집촉진 활성을 차단시키는 고친화도 뮤린 및 키메라 항-TNFα 항체, 및 그의 단편, 영역 및 유도체를 포함한다.
단일클론 항-TNF 항체의 추가의 예가 당업계에 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,231,024호; 문헌[
Figure 112015099391821-pct00002
, A. et al., Cytokine 2(3):162-169 (1990)]; 미국 특허 출원 제07/943,852호(1992년 9월 11일 출원); 라트젠(Rathjen) 등의 국제 출원 공개 WO 91/02078호(1991년 2월 21일 공개); 루빈(Rubin) 등의 유럽 특허 공개 제0 218 868호(1987년 4월 22일 공개); 요네(Yone) 등의 유럽 특허 공개 제0 288 088호(1988년 10월 26일); 문헌[Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986)]; 문헌[Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987)]; 문헌[Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987)]; 문헌[Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987)]; 및 문헌[Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다).
하기에 기재된 실시예의 결과는 다수의 중요한 발견을 입증해준다:
CTL 제거는 세포외 Zn+2의 제어에 의해 최대 수준 미만으로 제어될 수 있다. 예를 들어, 하기에 기술된 SMF-10.1 실험, DOE3 실험, BSA 블렌딩 실험 1번, 및 BSA 블렌딩 실험 2번에서 실험군에 의해 입증된 바와 같이, CTL 함량은 Zn+2의 세포외 농도를 1.2 μM 이하의 값으로 제어함으로써 일정 범위(예를 들어, 40 내지 70%) 내로 제어될 수 있다. 또한, DOE3 실험에서 입증된 바와 같이, CTL 함량의 더 높은 범위로의 제어는 최대 6.3 μM까지의 더 높은 Zn+2 농도를 사용하여 가능하다.
더욱이, 세포외 Zn+2 농도의 일정 범위 내에서, DOE3 실험, BSA 블렌딩 실험 1번, 및 BSA 블렌딩 실험 2번에서 실험군에 의해 입증된 바와 같이, CTL 함량은 세포외 [EDTA] 또는 [EDTA ― Fe+3]를 제어함으로써 추가로 제어될 수 있다.
게다가, 시알산 함량은 세포외 Zn+2의 제어에 의해 최대 수준 미만으로 제어될 수 있다. 예를 들어, DOE3 실험, BSA 블렌딩 실험 1번, 및 BSA 블렌딩 실험 2번에서 실험군에 의해 입증된 바와 같이, 시알산은 Zn+2의 세포외 농도를 1.2 μM 이하의 값으로 제어함으로써 일정 범위(예를 들어, 4 내지 13%) 내로 제어될 수 있다. 더욱이, DOE3 실험에서 입증된 바와 같이, 시알산 함량의 더 높은 범위로의 제어는 최대 6.3 μM까지의 더 높은 Zn+2 농도를 사용하여 가능하다.
또한, 세포외 Zn+2 농도의 일정 범위 내에서, DOE3 실험, BSA 블렌딩 실험 1번, 및 BSA 블렌딩 실험 2번에서 입증된 바와 같이, 시알산 함량은 세포외 [EDTA] 또는 [EDTA ― Fe+3]를 제어함으로써 추가로 제어될 수 있다.
더욱이, SFM-10.3 실험 및 DOE3 실험에서 입증된 바와 같이, 항체 생산 또한 Zn+2의 세포외 농도를 제어함으로써 제어될 수 있다.
시알산 부가, CTL 제거 및 항체 생산의 제어를 달성하기 위한 Zn+2, Fe+3 및 EDTA 농도의 제어는 다양한 수단을 통해 달성될 수 있는데, 이러한 수단에는 하기 중 임의의 것이 포함되며, 이는 단독으로의 것이거나 조합된 것이다: 1) 배양 배지에 대한 Zn+2, Fe+3 및 EDTA의 직접 첨가, 2) 성분으로서 Zn+2, Fe+3 또는 EDTA를 갖는 원재료들의 블렌딩을 통해, 3) Zn+2, Fe+3 또는 EDTA 농도를 조정하도록 원재료들의 처리를 통해, 및/또는 4) Zn+2, Fe+3, 및/또는 EDTA의 원하는 수준을 달성하도록 복합(complex) 원재료들의 제조 방법의 변경을 통해.
실시예
재료 및 방법
상업적인 인플릭시맙 공정을 대표하는 결과를 제공하는 것으로 입증된 작동 조건으로 제어된 3 L 어플리콘(Applikon)® 생물반응기 내에서 본 명세서에 기재된 실험들을 수행하였다.
지정된 날에, 단백질 A 컬럼을 사용하여 직접 생산물 포획(DPC)에 의해 인플릭시맙을 정제하였다. 이어서, 이를 모세관 등전 초점화(cIEF) 또는 WAX 검정에 의해 특성화하였다. 단백질 A 컬럼을 사용하여 DPC에 의해 정제된 인플릭시맙은 본 명세서에서 "DPC 샘플" 또는 "DPC 용리물"로 지칭된다.
실시예 1 - cIEF 방법
cIEF를 사용하여 인플릭시맙 올리고당의 CTL 함량을 계산하였다. 인플릭시맙의 예비-제형화 벌크(pre-formulated bulk, PFB)의 분석에서 명백히 나타나는 전하 이질성(charge heterogeneity)의 3개의 근원이 있다: (1) CTL 가변성; (2) 시알산 함량; 및 (3) 탈아미드화. 초기, 중기 및 후기의 상업용 생물반응기 샘플들로부터의 전형적인 인플릭시맙 용리물은 인플릭시맙의 중쇄로부터의 CTL 제거가 대략 30% 내지 80%로 나타나며, 이때 PFB에서의 평균 CTL 제거는 대략 40% 내지 60%이다. 경쇄 CTL은 제거 대상이 아니다. CTL 제거는 초기 생물반응기 샘플들에 대해 더 낮은 경향이 있고 중기 및 후기 생물반응기 샘플들에 대해 증가된다. 초기 및 후기 생물반응기 샘플들로부터의 전형적인 인플릭시맙 용리물은 IgG 올리고당의 대략 3% 내지 14%의 시알산 함량을 나타낸다. 시알산 부가는 전형적으로 초기 생물반응기 샘플들에 대해 더 낮고, 중기 및 후기 생물반응기 샘플들에 대해 더 높다. 역상 펩티드 매핑은 중쇄 및 경쇄 상의 인플릭시맙에 대한 여러 탈아미드화 부위에서 일관된 낮은 수준의 탈아미드화를 보여주었다.
이러한 전하 이질성은 전형적으로 cIEF 전기영동도에서의 4 내지 6개의 피크로 이어진다. 피크 1은 과잉 전하를 함유하지 않는 인플릭시맙에 상응하는데; 즉, 이 피크 또는 밴드는 양쪽 C-말단 라이신, 시알산 무함유, 및 무 탈아미드화를 포함한다. 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 피크 또는 밴드는, CTL 제거, 시알산 부가 및 탈아미드화의 조합으로 인해, 각각 1, 2, 3, 4 및 5개의 과잉 전하를 포함한다.
도 1은 인플릭시맙의 샘플의 cIEF 전기영동도이며, 피크 1 내지 6에 대한 pI 값을 보여준다.
비교적 높은 수준의 CTL 제거, 낮은 수준의 시알산 부가, 및 탈아미드화의 일관성으로 인해, 피크 1의 상대 백분율은 CTL 제거와 고도의 상관관계가 있다. 도 2는 피크 1의 백분율의 함수로 나타낸 des-라이신(des-Lys)의 백분율의 피팅선도이며, 일정 범위의 실험 조건에 걸쳐 CTL 함량(des-Lys의 백분율로서 표현됨)과 피크 1의 백분율 사이의 상관관계를 보여준다. 도 2에 나타낸 상관관계는 인플릭시맙 샘플들로부터 생성되었는데, 인플릭시맙 샘플들에 대한 des-Lys의 백분율은 펩티드 매핑에 의해 결정되었으며, 피크 1의 백분율은 cIEF에 의해 결정되었다.
본 명세서에서 CTL 함량은 C-말단 라이신을 갖는 중쇄의 백분율로서 표현되며, 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다: CTL 함량(%) = (CTL을 갖는 중쇄의 개수)/(중쇄의 총 개수) × 100. 본 명세서에서 CTL 제거는 C-말단 라이신이 결여되어 있는 중쇄(des-Lys)의 백분율로서 표현된다. 따라서, "80% Des-Lys"는 20% CTL 함량과 등가이다. des-라이신의 백분율과 (cIEF에 의해 측정된 바와 같은) 피크 1의 백분율 사이의 상관관계는 CTL 제거, 시알산 부가, 및 탈아미드화의 전형적인 백분율을 나타내는 인플릭시맙 샘플들에 대해 유효하다. 따라서, 이러한 상관관계는 하기의 이유 때문에 본 명세서에 기재된 실험들에 적용될 것이다: (1) WAX에 의한 시알산 부가가 이들 실험으로부터의 DPC 샘플들의 다수에 대해 결정되었으며, 그 결과가 시알산이, 초기 생물반응기 샘플들에 대한 3% 내지 후기 생물반응기 샘플에 대한 대략 14%의 전형적인 범위 내로 남아있었음(즉, 시알산의 백분율이 도 1의 상관관계를 생성하는 데 사용된 데이터의 범위 내로 남아있었음)을 나타내기 때문에; 그리고 (2) 도 1의 상관관계를 생성하는 데 사용된 실험 샘플들에 대한 경우와 같이, 탈아미드화의 백분율이 낮고 일관되게 남아있는 것으로 가정하는 것이 합리적이기 때문에.
이들 실험에서의 CTL 제거는 30 내지 60%의 전형적인 값으로부터 더 높은 값까지의 범위에 이르렀다. 이들 조건 하에서, CTL 제거는 피크 1의 백분율의 우세한 결정인자로 계속 있을 것이다.
실시예 2 - WAX 검정
WAX 검정을 사용하여 인플릭시맙 올리고당의 시알산 함량 및 갈락토스 함량을 결정하였다. 이 검정에서는, PNGase F를 사용하여 IgG로부터 N-연결 올리고당을 방출시키고, 이어서 시아노붕수소화나트륨 및 안트라닐산의 용액을 사용하여 유도체화한다. 샘플들을 0.45 마이크로미터 나일론 아크로디스크(ACRODISC)® 필터를 사용하여 정제하고, 형광 검출기를 사용하여 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 상에서 분석한다. 구매가능한 N-글리칸 표준물을 사용하여 피크 동일성을 결정한다.
본 명세서에 기재된 WAX 검정에서, 성분 5A는 시알산을 함유하는 인플릭시맙 올리고당의 백분율이다. 성분 1은 갈락토스가 결여되어 있는 인플릭시맙 올리고당의 백분율과 고도의 상관관계가 있다. 따라서, (100 - 성분 1의 백분율)은 갈락토스를 함유하는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 합리적인 추정치를 나타낸다.
인플릭시맙의 중쇄에서, 하나의 아스파라긴(Asn) 잔기는 올리고당으로 글리코실화되며, 이때 올리고당은, 예를 들어 1개 또는 2개의 갈락토스 잔기 및 1개 또는 2개의 시알산 잔기를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 인플릭시맙의 갈락토스 함량은 갈락토스를 함유하는 올리고당의 백분율로서 표현되며, 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다: 갈락토스 함량(%) = (갈락토스를 함유하는 올리고당의 개수)/(올리고당의 총 개수) × 100. 이 식은 올리고당 내의 갈락토스 단위의 개수와는 무관하게 적용된다. 다시 말하면, 예를 들어 올리고당 내에 갈락토스 잔기가 1개가 존재하든 2개가 존재하든 관계없이, 올리고당은 갈락토스 함량의 계산 목적을 위해 단지 1회 카운팅된다.
인플릭시맙의 시알산 함량은 본 명세서에서 시알산을 함유하는 올리고당의 백분율로서 표현되며, 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다: 시알산 함량(%) = (시알산을 함유하는 올리고당의 개수)/(올리고당의 총 개수) × 100. 이 식은 올리고당 내의 시알산 잔기의 개수와는 무관하게 적용된다. 다시 말하면, 예를 들어 올리고당 내에 시알산 잔기가 1개가 존재하든 2개가 존재하든 관계없이, 올리고당은 시알산 함량의 계산 목적을 위해 단지 1회 카운팅된다.
전형적으로, 인플릭시맙의 두 중쇄 모두는 글리코실화된다. 그러나, 일부 상황에서, 중쇄들 중 일부는 비글리코실화된 상태로 남아 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 인플릭시맙 분자들의 대략 94%는 두 사슬 모두 상에서 글리코실화되고, 인플릭시맙 분자들의 대략 6%는 헤미-글리코실화되고, 인플릭시맙 분자들의 대략 0.1%는 완전 비글리코실화된다.
시알산 대 갈락토스의 비는 인플릭시맙의 올리고당 내의 시알산 대 갈락토스의 몰비로부터 계산된다.
실시예 3 - 수확물 홀드(harvest hold) 연구
무세포 인플릭시맙 수확물을 연장된 기간 동안 홀드하여 2가지 연구를 수행하였다. 이들 연구의 목적은 CTL 제거가 세포외에서(즉, 분비 후(post-secretion)에) 일어날 수 있는지를 알아보는 것이었다.
시알산은 분비 전에 세포내로 당단백질에 부가되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 분비된 재조합 당단백질로부터의 시알산의 세포외 제거가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 배양물에 대해 보고되어 있다. CHO 세포의 경우, 시알리다제는 용해된 세포로부터 세포외 배지 중으로 방출된다. 따라서, 이들 수확물 홀드 연구의 두 번째 목적은 인플릭시맙 공정을 위한 무세포 수확물에서의 시알산의 세포외 제거가 있는지를 명확히 하는 것이었다.
제조 규모 생물반응기로부터의 수확물을 사용한 수확물 홀드 연구는 변동하는 조건(청징화된 무세포 수확물은 2 내지 14℃에서 30일 동안 홀드함; 청징화되지 않은 수확물은 2 내지 8℃에서 14일 동안 홀드함) 및 변동하는 생물반응기 기간 하에서 수확물을 홀드하는 것이 인플릭시맙의 cIEF 겔 프로파일에 영향을 주지 않았음을 입증해 주었다.
이들 결과를 뒷받침하기 위하여, 다른 수확물 홀드 연구를 수행하였다. 인플릭시맙 무세포 수확물을 2개의 생물반응기로부터 수집하였다. 각각의 생물반응기에 대해, 수확물의 일부를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하여 DPC 용리물을 생산하였다. 수확물의 다른 일부를, DPC 용리물로 가공하기 전에, 10 내지 14℃의 온도(전형적인 저장 온도)에서 7일 동안 저장하였다. 홀드 중인 수확물의 온도를 냉장고 안의 프로브에 의해 모니터링하고 수동 조정에 의해 제어하였다. 이어서, 수확물 내의 CTL 또는 시알산 제거를 나타낼 전하 분포 변화의 임의의 증거를 위해 cIEF에 의해 4개의 DPC 용리물 샘플을 분석하였다.
이러한 홀드 연구는 수확물로부터 즉시 제조되었거나 단백질 A 정제 전에 10 내지 12℃의 온도에서 7일 동안 홀드된 수확물로부터 제조된 DPC 용리물들에 대한 cIEF 패턴에서 그다지 차이를 나타내지 않았다.
수확물 홀드 연구는 인플릭시맙의 중쇄로부터의 CTL의 제거가 세포내에서 일어날 가능성이 높다는 것을 입증해준다. 유사하게, 인플릭시맙 올리고당의 시알산 함량은 세포내에서 결정된다.
실시예 4 - SFM-10.1 실험
용어 SFM-10.1은 BSA 및 CM2(부분 B) 액체가 결여되어 있는 인플릭시맙 SFM-10 배지(아연-함유 인슐린을 포함함)에 상응한다. SFM-10.1 실험의 목적은 Zn+2 보충이 인플릭시맙의 생산에 미치는 영향을 조사하는 것이었다.
4개의 실험 조건은 황산아연 7수화물로 보충된 SFM-10.1 배지를 나타내며, 이때 황산아연 7수화물은 최종 배지 농도에 0.25, 0.5, 1.0 또는 2.0 μM Zn+2를 가하기에 충분한 양으로 첨가하였다. 각각의 실험에서의 총 Zn+2 농도는 이러한 보충과 (미국 위스콘신주 벨로이트 소재의 케리 인그레디언츠 앤드 플레이버즈(Kerry Ingredients and Flavours)로부터 입수가능한) 프리마톤(PRIMATONE)®으로부터 제공된 Zn+2의 합계였으며, 이는 (금속 분석에 기초하여) 0.49 μM인 것으로 결정되었다. 따라서, 이들 4개의 생물반응기 내의 총 아연 농도는 0.74, 1.0, 1.5 및 2.5 μM로 합리적으로 추정된다. 이들 생물반응기 내의 Fe+3 농도는 사용된 프리마톤® 로트(lot)의 금속 분석에 기초하여 5.8 μM이었다. EDTA 농도는 2 μM인 것으로 추정되는데, 이는 트랜스페린으로부터 제공된 것이다. EDTA는 Zn+2 및 다른 2가 양이온에 대해서보다 Fe+3에 대해서 훨씬 더 강한 친화도를 갖는다. 따라서, [EDTA ― Fe+3]의 계산은 Zn+2를 킬레이트화하는 데 이용될 수 있는 EDTA의 농도를 나타낼 수 있다. 따라서, 이러한 제1 세트의 실험에서는, 세포외 Zn2+와 결합하는 데 이용가능한 유리 EDTA가 없는 것으로 예측될 수 있다.
[표 1]
Figure 112015099391821-pct00003
도 3은 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, CTL 제거에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. 총 Zn+2 농도가 대략 1.5 및 2.5 μM인 생물반응기들은 모든 시점에서 70% 내지 80% CTL 제거를 나타내었다. 모든 시점(초기, 중기 및 후기 생물반응기 샘플)이 높은 CTL 제거를 갖는 바와 같이, 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 전하 분포에서 변화가 없다. Zn+2 농도가 1.0 μM인 생물반응기는 이 연구에서 초기에 60% CTL 제거를, 그리고 중기 및 후기 샘플 시점에서 대략 70% 제거를 나타내었다. Zn+2 농도가 대략 0.74 μM인 생물반응기는 생물반응기 기간의 함수로서 증가하는 CTL 제거를 나타내었다.
도 4는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸, WAX 방법에 의해 결정된 바와 같은, 시알산을 갖는 인플릭시맙 올리고당의 백분율의 그래프이며, 시알산의 백분율에 대한 변동하는 Zn+2 농도의 영향을 보여준다. 도 4는 이 실험에서 Zn+2 농도의 함수로 나타낸 시알산 부가에 있어서 명백한 경향이 없었음을 보여준다.
이러한 영향의 결여가 SFM-10.1 배지와 관련하여 세포외 Zn+2 농도에 대한 시알산 함량의 진둔감도(true insensitivity)를 나타내는지, 소수의 생물반응기들을 고려할 때 그것이 실험상의 노이즈의 반영인지, 또는 실험상의 구현에 관한 절차적인 문제이었을 수 있는지의 여부는 알려져 있지 않다.
도 5 내지 도 7은 시간의 함수로 나타낸, 각각, 생존 세포 밀도, 배양 생존력 및 인플릭시맙 농도의 그래프이며, SFM-10.1 실험에서 Zn+2의 변동하는 농도의 영향을 보여준다. 대략 일수 15 내지 20에서의 목표 세포 밀도에 도달하기 전의 기간에서 결과가 가장 잘 나타나는데, 이는 이것이 모든 생물반응기들이 일관되게 작동되는 기간을 나타내는 바와 같다. 목표 세포 밀도에 도달한 후에, 목표 세포 농도를 유지하려는 시도로 매일 배양물로부터 세포를 제거하며, 이 제거 절차에서의 변동은 세포 밀도, 배양 생존력 및 항체 농도에서 변동을 야기할 수 있다.
SFM-10.1 실험에서, 0.74 μM Zn+2를 갖는 생물반응기는 1.5 및 2.5 μM Zn+2를 함유하는 생물반응기들보다 목표 세포 밀도에 도달하기 전에 더 낮은 세포 성장 속도, 더 낮은 배양 생존력 및 더 낮은 항체 농도를 가졌다. 1.0 μM Zn+2를 갖는 생물반응기는, 각각의 경우에, 0.74 μM Zn+2를 갖는 생물반응기와 1.5 또는 2.5 μM Zn+2를 갖는 생물반응기 사이의 중간인 성능을 나타내었다.
이 실험의 조건은 SP2/0 세포에 의한 Zn+2 축적에 유리하였다. [EDTA ― Fe+3]는 0 미만인데, 이는 모든 EDTA가 세포외 배지에서 Fe+3로 킬레이트화되고, Zn+2를 킬레이트화하는 데 이용가능하지 않음을 나타낸다. 더욱이, 다른 잠재적인 킬레이트화제, BSA는 배지에 부재하였다.
Zn+2 축적에 대한 이들 유리한 조건에도 불구하고, 실험 결과는, 특히 배양의 초기 20일 안에서 CTL 제거, 초기 세포 성장, 배양 생존력, 및 항체 농도에 대한 0.74 및 1.0 μM의 세포외 Zn+2 농도의 영향을 나타낸다. 이들 결과는 이 실험 조건 하에서 시알산 부가에 대한 Zn+2의 명백한 영향을 나타내지 않는다.
어떠한 특정 이론에 의해서도 구애되고자 하지 않지만, 이들 결과는 하기의 가설과 일치된다:
Figure 112015099391821-pct00004
SP2/0 세포는 Zn+2 보조인자 요구량을 갖는 효소와 관련된 세포내 과정을 지지하기 위하여 세포내 Zn+2를 축적해야 한다. 이는 CTL 제거, 세포 성장, 세포 분열, 및 항체 생산을 담당하는 효소들을 포함한다.
Figure 112015099391821-pct00005
약 0.74 내지 1.0 μM 정도의 Zn+2 농도는 생산 생물반응기 공정의 초기 스테이지 동안 이들 Zn+2-필요 세포내 과정을 적당히 공급하기에 충분한 세포외 Zn+2를 제공하지 못한다.
Figure 112015099391821-pct00006
이러한 영향은 배양의 초기 20일 안에서 가장 두드러진다. 이는 세포당 세포내 Zn+2의 양이 세포 분열로 인해 연속해서 감소되고 있는 기간이다. 즉, 세포가 분열될 때마다, 축적된 Zn+2는 딸 세포들 사이에서 분할된다. 0.74 내지 1.0 μM의 세포외 Zn+2에서, Zn+2의 세포 혼입은 세포 배가(cell doubling)로 인해 Zn+2의 세포 감소를 따라잡을 수 없다. 이로써, 세포들은 Zn+2가 결핍되고, 최적이 아닌 세포 성장, 배양 생존력 및 항체 생산성을 나타낸다.
Figure 112015099391821-pct00007
약 일수 20 후에, 세포들은 관류 배양을 위한 그들의 목표 세포 밀도에 근접하고, 세포 분열이 느려진다. 그 시점으로부터 앞으로, 세포 분열로 인한 세포내 Zn+2 감소 속도는 느려지고, 세포 혼입은 시간 경과에 따라 세포당 증가하는 Zn+2 축적을 보장하기에 적당하다. 이들 조건 하에서 그리고 일수 20 후에, 세포들은 그들의 Zn+2의 세포내 저장량을 점진적으로 증가시킨다.
Figure 112015099391821-pct00008
0.74 μM Zn+2를 갖는 생물반응기의 경우, 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 Zn+2 축적의 패턴은 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 cIEF 패턴의 관찰된 변화에 대한 원인이 된다. 즉, CTL 제거는 일수 20에서 최소인데, 배양에서 이 시점은 세포내 효소 카르복시펩티다제가, 필요 Zn+2 보조인자가 가장 많이 결핍될 때이다. 세포 분열이 느려진 후에 그리고 일수 20 후에, CTL 제거는 증가하는 Zn+2 축적으로 인해 증가하며, 이는 증가된 카르복시펩티다제 기능으로 이어진다.
1.5 μM 및 2.5 μM Zn+2를 갖는 실험군의 경우, 세포외 Zn+2 농도는, 배양에서의 임의의 시점에서 세포 효소가 Zn+2 결핍을 겪지 않을 정도로 충분히 높다. 따라서, CTL 제거는 일수 20부터 일수 60에 이르기까지 높은 속도이다. 마찬가지로, 배양 일수의 함수로 나타낸 세포 성장, 배양 생존력 및 항체 생산은 높은 속도로 진행된다.
실시예 5 - DOE3 실험
SFM-10.1 실험에서 얻은 단서에 따라, CTL 제거, 시알산 부가, 세포 성장, 배양 생존력 및 항체 생산에 대한 세포외 Zn+2, EDTA, 및 Fe+3 농도의 영향을 조사하기 위해 시판용 인플릭시맙 SFM-10 배지를 사용하여 더 상세한 실험을 수행하였다.
EDTA에 대한 Zn+2의 세포외 결합이 Zn+2의 세포내 축적을 가설적으로 억제할 수 있는 것으로 추론되었다. 세포외 Fe+3은 Zn+2보다 EDTA에 대한 훨씬 더 높은 결합 친화도를 가질 것이기 때문에, Zn+2의 세포내 축적을 결정하는 데 있어서의 핵심 인자는 [EDTA ― Fe+3]일 수 있는 것으로 추론되었다.
DOE3 실험은 12개의 생물반응기를 포함하였다. 이 실험을 위한 배지는 시판용 SFM-10 배지였다. 프리마톤®, 인슐린, 트랜스페린 및 BSA의 선택된 로트들은 0.76 μM Zn+2, 5.9 μM EDTA, 및 0.9 μM Fe+3의 기저 수준을 생성하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, Zn+2, EDTA, 및/또는 Fe+3의 보충에 의해 실험 조건들의 매트릭스를 생성하였다.
[표 2]
Figure 112015099391821-pct00009
DOE3 실험에서, 총 Zn+2 농도는 0.76 내지 1.7 μM의 범위였으며, Fe+3 농도는 0.90 내지 5.4 μM의 범위였으며, EDTA 농도는 5.9 내지 26.8 μM의 범위였으며, [EDTA ― Fe+3]은 0.53 내지 23.6 μM의 범위였다.
DOE3 실험 결과의 분석에서, Zn+2의 영향은 세포외 [EDTA] 및 [EDTA ― Fe+3]의 영향에 비하여 우세하였다. 따라서, 각각의 생물반응기 내의 [Zn+2]의 함수로서 DOE3 실험 결과들을 그룹화하는 것이 하기의 결과 제시에서 합리적이며; 6개의 생물반응기는 0.76 μM의 [Zn+2]를 목표로 하였으며, 6개의 생물반응기는 1.7 μM의 [Zn+2]를 목표로 하였다.
도 8a는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2(라벨 "Fe:5 Zn:1 EDTA:10"에 상응하는 생물반응기 내의 Zn+2의 초기 농도는 0.76 μM이 아니라 6.3 μM이었으며; 0.76 μM Zn+2의 목표 농도는 일수 13부터 실험의 종료시까지 구현되었음)의 존재 하에서의 CTL 제거에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. 도 8b는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 CTL 제거(des-Lys의 백분율로 표현되고 피크 1 데이터로부터 cIEF 방법을 사용하여 계산됨)의 그래프이며, 1.7 μM Zn+2의 존재 하에서의 CTL 제거에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다. SFM-10.1 실험에서와 같이, DOE3 실험으로부터의 생물반응기들은 CTL 제거의 백분율과 Zn+2 농도 사이에 강한 관계를 나타내었다.
0.76 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들은 1.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들보다 상당히 더 낮은 퍼센트의 CTL 제거를 나타내었다. 더 높은 Zn+2 농도를 갖는 생물반응기들은 배양의 초기, 중기 및 후기 기간에서 60 내지 75% CTL 제거를 나타내었다. 더 낮은 Zn+2 농도를 갖는 생물반응기들은 일수 10 내지 20에서 40% CTL 제거를 나타내었으며, 배양 일수의 함수로서 CTL 제거가 점진적으로 상승하여, 배양의 종료시에 60% CTL 제거에 접근하였다. 이들 결과는 SFM-10.1 실험에서 관찰된 Zn+2 농도의 영향과 일치된다.
앞서 기재된 바와 같이, "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"으로 라벨링된 생물반응기는 일수 13 이전에 6.3 μM의 매우 높은 Zn+2 농도를 겪었으며, 이는 배양의 초기 스테이지에서 80% CTL 제거와 상관관계가 있으며, 최고 CTL 제거가 이 연구에서 달성되었다. 이 생물반응기에서의 CTL 제거의 백분율은 일수 13일에서의 그의 배지 농도를 0.76 μM Zn+2로 보정함에 따라 점진적으로 하락하였다. 하루당 대략 0.7 배양 부피의 관류 속도로, 생산 생물반응기에서의 Zn+2 농도는 10일 이내에 0.76 μM로 떨어졌을 것이다. 여전히, 이 생물반응기에서 0.76 μM Zn+2에서의 CTL 제거의 백분율은 그의 자매(sister) 생물반응기들보다 훨씬 더 높게 유지되었다. 즉, 세포들은 과거의 Zn+2 노출을 "기억하는" 기전을 갖는 것으로 여겨진다.
어떠한 특정 이론에 의해서도 구애되고자 하지 않지만, 이러한 세포 "기억"은 세포 내부에서의 Zn+2의 축적과 관련되어 있는 것으로 가설이 세워진다. 이러한 축적된 Zn+2는 세포외 Zn+2 농도의 갑작스런 감소에 의해 역전될 수 없다. 세포당 축적된 Zn+2는 후속 세포 분열에 의해 단지 감소될 수 있는 가능성이 높은데, 후속 세포 분열에서는 축적된 Zn+2가 딸 세포들 사이에서 분할된다. DOE3 실험의 조건 하에서, 세포 분열의 정도는, 세포들이 대략 일수 15 내지 20에서 목표 세포 밀도에 도달한 후에 제한되었다.
생물반응기 "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"에 대한 일수 10 및 13에서의 CTL 제거는 대략 80%로, 이는 1.7 μM Zn+2의 생물반응기들에 대한 것보다 더 높다. 이는, DOE3 실험의 실험 조건 하에서는, 1.7 μM Zn+2가 Zn+2에 대한 세포들의 요구량을 포화시키는 데 충분하지 않음을 시사한다.
상기에 기재된 바와 같이, DOE3 실험의 결과는 Zn+2 농도와 강한 상관관계가 있다. 그러나, 주어진 Zn+2 농도에서의 결과에서, CTL 제거에 대한 EDTA(또는 EDTA ― Fe+3)의 영향에 대한 증거가 있다. 0.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들 중에서, 일수 13, 20, 및 28에서 최저 CTL 제거를 갖는 2개의 생물반응기는 최고의 [EDTA] 및 [EDTA ― Fe+3]를 가졌다(생물반응기 "Fe:1 Zn:1 EDTA:25" 및 "Fe:5 Zn:1 EDTA:28")(도 8a). 역으로, 최저 [EDTA] 및 [EDTA ― Fe+3]를 갖는 생물반응기는 최고 CTL 제거를 가졌다("Fe:1 Zn:1 EDTA:6").
마찬가지로, 1.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들 중에서, 일수 13, 20, 및 28에서 최저 CTL 제거를 갖는 생물반응기는 최고의 [EDTA] 및 [EDTA ― Fe+3]를 가졌다("Fe:3 Zn:2 EDTA:27")(도 8b).
도 9a 및 도 9b는 DOE3 실험에서 [Zn+2]의 함수로 나타낸 시알산 함량에서 상당한 차이가 있음을 보여준다. 일수 10 내지 20에서는, 0.76 μM Zn+2의 생물반응기들(도 9a)에서보다 1.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들(도 9b)에서 시알산 함량이 상당히 더 높다. "후기" 생물반응기 샘플들의 경우, 시알산 함량의 차이는 좁혀지지만, 0.76 μM Zn+2에서보다 1.7 μM Zn+2에서 여전히 더 높다.
도 9a 및 도 9b 또한 상기에 논의된 세포 "Zn+2 기억"의 증거이다. 생물반응기 "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"에서, 시알산 함량은 이 생물반응기에 대한 가장 초기 시점에서 매우 높았으며, 배양 기간 전체에 걸쳐 0.76 μM Zn+2를 갖는 그의 자매 생물반응기들보다 훨씬 더 높게 유지되었는데, 이는 모든 생물반응기들 내의 세포외 Zn+2 농도가 대략 일수 20까지 동일했을 것이라는 사실에도 불구하고 그러하다.
생물반응기 "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"에 대한 일수 10 및 13에서의 시알산 함량은 대략 18%로, 이는 1.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들에 대한 것보다 상당히 더 높다. 이는, DOE3 실험의 실험 조건 하에서는, 1.7 μM Zn+2가, 시알산 부가를 지지하기 위한 Zn+2에 대한 세포들의 요구량을 포화시키는 데 충분하지 않음을 시사한다.
상기에 기재된 바와 같이, DOE3 실험의 결과는 Zn+2 농도와 강한 상관관계가 있다. 그러나, 주어진 Zn+2 농도에서의 결과에서, 시알산 부가에 대한 [EDTA](또는 [EDTA ― Fe+3])의 영향에 대한 증거가 있다. 도 9a는 0.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들 중에서, 일수 38에서의 시알산 함량이 [EDTA]가 감소함에 따라 증가함을 보여준다. 도 9b는 일수 20 및 38에서의 시알산 함량이 [EDTA]가 감소함에 따라 증가함을 보여준다.
DOE3 실험에서, 0.76 μM Zn+2를 갖는 5개의 생물반응기는 1.7 μM Zn+2를 갖는 6개의 생물반응기보다 (목표 세포 밀도에 도달하기 전인) 초기 20일 동안 훨씬 더 낮은 세포 성장 속도를 가졌다(도 10). 앞서 기재된 바와 같이, "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"으로 라벨링된 생물반응기는 일수 13 이전에 6.3 μM의 매우 높은 Zn+2 농도를 겪었다. 이 생물반응기는, 일수 20 전의 기간에서, 1.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들과 매칭된 세포 성장 거동을 나타내었다. 이들 데이터는 1.7 μM의 세포외 Zn+2 농도가 세포 분열을 위한 Zn+2에 대한 세포들의 세포내 요구량을 포화시키기에 충분함을 시사한다.
도 11a 및 도 11b는 0.76 μM Zn+2를 갖는 5개의 생물반응기의 배양 생존력이 1.7 μM Zn+2를 갖는 6개의 생물반응기의 배양 생존력보다 초기 30일 동안 더 낮았음을 보여준다. 특히 주목할 만한 점은, "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"으로 라벨링된 생물반응기가 일수 10 및 13에서 높은 배양 생존력을 나타내었지만, 이어서 Zn+2 농도가 보정된 직후에 복귀되어서 0.76 μM의 Zn+2 농도를 갖는 그의 자매 생물반응기와 매칭되었다는 것이다. 이는 배양 생존력이, 세포 내의 Zn+2 저장량이 아니라, 세포외 Zn+2의 즉각적인 농도와 관련되어 있다는 가설을 뒷받침한다.
도 12a 및 도 12b는 0.76 μM Zn+2를 갖는 5개의 생물반응기의 항체 농도가 1.7 μM Zn+2를 갖는 6개의 생물반응기보다 초기 20일 동안 더 낮았음을 보여준다. "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"으로 라벨링된 생물반응기는 1.7 μM Zn+2의 생물반응기들과 비견되는 항체 농도를 나타내었는데, 이는 항체 생산이 세포외 Zn+2의 즉각적인 값보다는 오히려 축적된 Zn+2와 관련되어 있다는 가설을 뒷받침한다.
도 10, 도 11a, 도 11b, 도 12a 및 도 12b는 DOE3 결과에서 [EDTA]와 생존 세포 밀도, 배양 생존력 및 항체 농도 사이에 명백한 상관관계가 없음을 보여준다.
DOE3 실험은 일정 범위의 [Zn+2], [EDTA], 및 [EDTA - Fe+3]를 포함하였다. 예를 들어, [EDTA ― Fe+3]는 0.5 내지 23 μM의 범위였다. 그러나, 이들 실험의 결과에서 우세 인자는 Zn+2의 세포외 농도였는데, 이는 0.76 μM 내지 1.7 μM(그리고 생물반응기 "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"에서는 초기에 6.3 μM)이었다. 1.7 μM의 세포외 Zn+2를 갖는 생물반응기들은 0.76 μM의 세포외 Zn+2를 갖는 생물반응기들보다 상당히 더 높은 CTL 제거, 시알산 함량, 초기 세포 성장, 초기 배양 생존력, 및 초기 항체 생산을 가졌다(도 8a, 도 8b, 도 9a, 도 9b, 도 10, 도 11a, 도 11b, 도 12a 및 도 12b).
주어진 Zn+2 농도의 생물반응기들 내에서, CTL 제거 및 시알산 부가에 대한 [EDTA](또는 [EDTA ― Fe+3])의 2차적 영향에 관한 약간의 증거가 있었다(도 8a, 도 8b, 도 9a 및 도 9b). 이들 결과는 세포 성장, 배양 생존력 및 항체 생산에 대한 [EDTA]의 영향에 관한 증거를 제공하지 않았다(도 10, 도 11a, 도 11b, 도 12a 및 도 12b). 다음 섹션에서 논의될 BSA 블렌딩 실험 1번 및 2번에서, [EDTA]의 영향을 더 충분히 탐구하였다.
생물반응기 "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"은 일수 13 이전에 6.3 μM의 매우 높은 Zn+2 농도를 겪었으며, 이어서 0.76 μM의 목표 Zn+2 농도로 복귀시켰다. 이 생물반응기는 1.7 μM Zn+2를 갖는 생물반응기들과 비견되는 초기 세포 성장(도 10), 배양 생존력(도 11a 및 도 11b) 및 항체 생산성(도 12a 및 도 12b)을 나타내었다. 그러나, 이 생물반응기는 1.7 μM Zn+2의 생물반응기들보다 더 큰 초기 CTL 제거 및 시알산 함량을 나타내었다. 이 생물반응기는 초기의 높은 Zn+2 농도에 대해 "기억"을 나타내었으며, 이러한 기억은 CTL 제거, 시알산 함량, 세포 밀도 및 항체 생산에 대하여 세포외 Zn+2 농도의 보정을 지나서 잘 확장되었다(도. 8a, 도 8b, 도 9a, 도 9b, 도 10, 도 12a 및 도 12b). 그러나, 이 생물반응기는 배양 생존력에 대해서는 기억을 나타내지 않았는데; 즉, 세포외 Zn+2 농도가 6.3 μM로부터 0.76 μM까지 떨어짐에 따라 배양 생존력은 지연 없이 보정되었다(도 11a 및 도 11b).
도 9c 및 도 9d는 생물반응기 기간의 함수로 나타낸 G0F(WAX 성분 1)의 백분율의 그래프이며, 0.76 μM Zn+2 및 1.7 μM Zn+2의 존재 하에서의 비갈락토실화된 종의 백분율에 대한 변동하는 EDTA 농도의 영향을 보여준다.
DOE3 실험의 결과는 앞서 SFM-10.1 실험에 대해 표현된 가설과 일치한다. 추가 가설이 또한 확립된다:
Figure 112015099391821-pct00010
CTL 제거, 시알산 부가, 세포 성장 및 항체 발현은 Zn+2의 현재의 세포외 농도라기보다는 오히려 세포내 Zn+2의 축적량과 관련되어 있다. Zn+2의 축적된 저장량은 즉각적인 세포외 농도가 아니라 세포외 Zn+2의 과거 이력에 기초한다. 이는 과거의 세포외 Zn+2에 관한 "세포 기억"에 대한 기초이다.
Figure 112015099391821-pct00011
배양 생존력은 Zn+2의 현재의 세포외 농도와 관련되어 있다.
이 실험의 조건 하에서, 1.7 μM Zn+2의 세포외 농도는 세포 성장 및 항체 발현과 관련되어 있는 효소 활성을 지지하기 위한 Zn+2에 대한 세포들의 요구량을 포화시키기에 충분하였다. 그러나, 1.7 μM Zn+2는 CTL 제거 또는 시알산 부가를 지지하기 위한 Zn+2에 대한 세포들의 요구량을 포화시키기에 충분하지 않았다. 이들 가설은, 일수 13 이전에 Zn+2 농도가 6.3 μM이던 생물반응기 "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"에 대한 결과에 의해 뒷받침된다.
실시예 6 - BSA 블렌딩 실험 1번 및 2번
이들 2개의 실험은 SFM-10 배지를 사용하였다. 각각의 실험에서, 프리마톤® 및 인슐린의 동일한 로트들을 사용하여, Zn+2 및 Fe+3의 일정한 농도를 보장하였다. BSA 블렌딩 실험 1번 및 2번에서, Zn+2 농도는 각각 1.1 및 1.2 μM이었다.
각각의 실험에서는, 고농도 및 저농도의 EDTA를 함유하는 BSA 로트들을 확인하였으며, 이어서 생물반응기 내에서 혼합하여 일정 범위의 EDTA 농도를 생성하였다. BSA 블렌딩 실험 1번은 8개의 생물반응기를 사용하였는데, 이때 4개의 EDTA 농도의 중복된 생물반응기들을 이용하였다. BSA 블렌딩 실험 1번에서의 중복된 생물반응기들은 "A" 및 "B"로 라벨링된다. BSA 블렌딩 실험 2번은 8개의 생물반응기를 사용하였는데, 이들 각각은 상이한 EDTA 농도를 가졌다. 표 3 및 표 4는 BSA 블렌딩 실험 1번 및 2번에서의 생물반응기 내의 Zn+2, Fe+3, EDTA 및 EDTA ― Fe 농도를 열거한다.
[표 3]
Figure 112015099391821-pct00012
[표 4]
Figure 112015099391821-pct00013
두 BSA 블렌딩 실험 모두에서, 더 높은 EDTA 농도를 갖는 생물반응기들은 더 적은 CTL 제거를 겪었으며, 그 역도 성립하였다 - 더 낮은 EDTA 농도를 갖는 생물반응기들은 증가된 CTL 제거를 겪었다. 이러한 영향은 각각의 실험에서 일수 35에서 가장 명백하였으며, 이어서 나중의 배양 일수에서 감소되었다(도 13a 및 도 14a).
두 BSA 블렌딩 실험 모두에서, 더 높은 EDTA 농도를 갖는 생물반응기들은 더 낮은 시알산 함량을 겪었으며, 그 역도 성립하였다 - 더 낮은 EDTA 농도를 갖는 생물반응기들은 더 높은 시알산 함량을 겪었다. 이러한 영향은 초기, 중기 및 후기 생물반응기 샘플들에 대해 지속되었다(도 13b 및 도 14b).
두 BSA 블렌딩 실험 모두에서, 더 높은 EDTA를 갖는 생물반응기들 및 더 낮은 EDTA 농도를 갖는 생물반응기들은 비견되는 세포 성장(도 13c 및 도 14c) 및 비견되는 배양 생존력(도 13d 및 도14d)을 나타내었다.
BSA 블렌딩 실험들에서 항체 생산에 대한 EDTA 농도의 미소한 영향이 주목되었다. BSA 블렌딩 실험 1번에서, 높은 EDTA 생물반응기들 및 낮은 EDTA 생물반응기들은 목표 세포 밀도에 도달하기 전에 비견되는 항체 생산을 갖는다. 목표 세포 밀도에 도달한 직후의 기간 동안(대략 일수 15 내지 일수 25), 더 높은 EDTA를 갖는 생물반응기들은 낮은 EDTA를 갖는 생물반응기들보다 더 낮은 항체 발현을 갖는다(도 13e 및 도 13f). BSA 블렌딩 실험 2번에서는, 일수 10에서 출발하는 2개의 최고 [EDTA]에 대하여 항체 생산의 감소가 주목되었으며, 최저 [EDTA]를 갖는 생물반응기들은 대략 일수 15에서 더 높은 항체 생산을 나타내었다(도 14e 및 도 14f). 그러나, 항체 생산에 대한 [EDTA]의 영향은 DOE3 실험에서는 관찰되지 않았다(도 12b).
대략 1.1 내지 1.2 μM의 세포외 Zn+2를 갖는 생물반응기들의 경우, BSA 블렌딩 실험들은 EDTA 농도가 CTL 제거 및 시알산 부가에 대해 상당한 영향을 가질 수 있음을 입증해 주었다. 게다가, 일수 10 내지 일수 25의 기간 동안 항체 생산에 대한 EDTA 농도의 사소한 영향을 가질 수 있었지만, 이러한 영향은 DOE3 실험에서 명백하지 않았다. 이들 Zn+2 농도에서, EDTA는 세포 성장 또는 배양 생존력에 대한 식별가능한 영향을 갖지 않았다.
Fe+3의 농도는 BSA 블렌딩 실험들의 생물반응기 내에서 일정했기 때문에, [EDTA]에 대해 상기에 기재된 상관관계는 [EDTA ― Fe+3]에 대해서도 동일하게 유효하였다.
두 BSA 블렌딩 실험 모두에서, EDTA 농도의 감소는 비갈락토실화된 올리고당의 백분율의 감소로 이어지는 것으로 밝혀졌다(도 13g 및 도 15). 따라서, EDTA의 농도의 감소는 더 많은 갈락토스 및 더 많은 시알산 함량 둘 모두로 이어진다.
어떠한 특정 이론에 의해서도 구애되고자 하지 않지만, BSA 블렌딩 실험들로부터의 데이터는 하기의 가설을 뒷받침한다:
Figure 112015099391821-pct00014
EDTA(또는 [EDTA ― Fe+3])는 세포들에 의한 Zn+2 흡수의 속도에 영향을 줄 수 있다. 이러한 영향은 Zn+2의 세포외 농도가 낮을 때 가장 분명할 것 같으며, 세포들은 Zn+2 요구를 갖는 효소를 지지하여 세포내 Zn+2 결핍을 겪고 있다.
Figure 112015099391821-pct00015
세포들은 Zn+2를 저장 및 분포시키기 위한 정교한 세포내 시스템을 가지며, Zn+2 한계치의 기간에 Zn+2 분포에 대한 우선권이 있다. Zn+2 한계치의 조건 하에서, 세포들은 세포 분열을 위해 Zn+2를 필요로 하는 세포내 과정에 대해 우선권을 둘 것이다. 따라서, BSA 블렌딩 실험 1번 및 2번에서는, 세포들이 이 연구의 조건 하에서 세포 분열에 대한 충분한 Zn+2를 갖기 때문에, 세포 성장에 대한 EDTA의 영향이 없었다. 마찬가지로, 항체 발현은 이 실험의 조건 하에서 EDTA에 의해 최소한으로 영향을 받았다. CTL 제거 및 시알산 부가를 지지하기 위한 Zn+2의 세포내 분포는 세포 성장을 위한 Zn+2의 분포보다 더 낮은 세포내 우선권을 갖는다. 따라서, EDTA가 세포 성장에 영향을 주지 않는다는 조건 하에서, CTL 제거 및 시알산 부가에 대한 EDTA의 상당한 영향이 있을 수 있다.
인플릭시맙 생물반응기들은 공급-배치 배양(fed-batch culture)과 유사한 방식으로 초기 15 내지 20일에 작동된다. 즉, 세포들을 낮은 초기 세포 밀도에 이르기까지 접종하고, 세포 성장 및 항체 발현을 지지하도록 새로운 배지를 다음 15 내지 20일 동안 연속적으로 공급한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실험 결과들은 공급-배치 배양 및 관류 배양에 동일하게 적용된다.
실시예 7 - DOE3 및 BSA 블렌딩 1번 및 2번의 추가 분석
실험
DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 실험을 모두 동일한 소규모 생물반응기 모델을 사용하여 동일한 실험실에서 수행하였으며, 동일한 검정군에 의해 샘플들을 분석하였다. 따라서, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 및 2번 실험의 결과들을 서로 비교하는 것이 가능해야 한다.
DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 실험에서, 일수 20에서 샘플들을 수집하고, cIEF 및 WAX 검정에 의해 분석하였다. 도 17, 도 19, 도 20 및 도 21은, 도표로 함께 나타낸 DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 실험으로부터의 일수 20의 데이터를 보여준다. 도 17, 도 19 및 도 20에 나타낸 결과는 앞에서의 분석을 뒷받침하는데, 즉 CTL 제거는 증가하는 [Zn+2]에 따라 증가하고, 시알산 함량은 증가하는 [Zn+2]에 따라 증가하고, 비갈락토실 올리고당의 백분율은 증가하는 [Zn+2]에 따라 감소된다는 것을 뒷받침한다. 이들 후자의 2개의 결과는 도 16에 나타낸 바와 같이 갈락토스 부가 및 시알산 부가에 대한 효소 반응들의 촉진과 일치한다.
도 21은 시알산 대 갈락토스의 비가, 증가하는 [Zn+2]에 따라 증가함을 보여준다.
도 26은 G0F(WAX 성분 1의 우세한 비갈락토실 성분)의 백분율의 함수로 나타낸 시알산(WAX 성분 5)의 백분율의 그래프이며, DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 및 2번 실험에 대한 시알산의 백분율과 비갈락토실 올리고당의 백분율 사이의 반비례 관계를 보여준다. 도 26은 갈락토스 부가와 시알산 부가가 DOE3 실험 및 BSA 블렌딩 1번 및 2번 실험에서 커플링되는 경향이 있음을 보여주는데, 이는 갈락토실트랜스퍼라제와 시알릴트랜스퍼라제에 의해 촉매된 반응들의 커플링과 일치한다. 다시 말하면, 이들 2개의 글리코실화 반응을 향상시키는 인자들은 더 많은 G0F를 시알산을 함유하는 올리고당으로 유도한다.
BSA 블렌딩 1번 및 2번 실험 둘 모두는 일수 33 내지 35에서 수집된 샘플을 포함하였다. 도 22 내지 도 25는 BSA 블렌딩 1번 및 2번 실험으로부터의 일수 33 내지 35의 데이터를 보여준다. 도 22 내지 도 25는 더 낮은 EDTA 농도에서, 더 높은 CTL 제거, 더 높은 시알산 함량, 비갈락토실 올리고당의 더 낮은 백분율, 및 더 높은 시알산 대 갈락토스의 비가 있음을 보여준다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시 내용은 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명이 그의 예시적인 실시 형태들을 참조하여 상세하게 나타나 있고 기술되어 있지만, 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 형태 및 세부 사항에서의 다양한 변화들이 본 발명 내에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. JANSSEN BIOLOGICS, B.V. FLIKWEERT, Marcel GOOCHEE, Charles MASLANKA, Francis C. NAGEL, Franciscus Johannes Ignatius RYLAND, James R SCHAEFER, Eugene <120> Manufacturing Methods To Control C-Terminal Lysine, Galactose and Sialic Acid Content In Recombinant Proteins <130> JBI5029WOPCT <140> Not Assigned <141> Not Assigned <150> 61/791,094 <151> 2013-03-15 <160> 30 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Mus Balb/c <220> <221> CDS <222> (1)...(321) <400> 2 gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct gtg agt cca gga 48 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag ttc gtt ggc tca agc 96 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 atc cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca agg ctt ctc ata 144 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 aag tat gct tct gag tct atg tct ggg atc cct tcc agg ttt agt ggc 192 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac act gtg gag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80 gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt cat agc tgg cca ttc 288 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc tcg ggg aca aat ttg gaa gta aaa 321 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Balb/c <400> 3 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 4 <211> 357 <212> DNA <213> Mus Balb/c <220> <221> CDS <222> (1)...(357) <400> 4 gaa gtg aag ctt gag gag tct gga gga ggc ttg gtg caa cct gga gga 48 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc atg aaa ctc tcc tgt gtt gcc tct gga ttc att ttc agt aac cac 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His 20 25 30 tgg atg aac tgg gtc cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg gtt 144 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gct gaa att aga tca aaa tct att aat tct gca aca cat tat gcg gag 192 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt gct 240 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80 gtc tac ctg caa atg acc gac tta aga act gaa gac act ggc gtt tat 288 Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 tac tgt tcc agg aat tac tac ggt agt acc tac gac tac tgg ggc caa 336 Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act ctc aca gtc tcc 357 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Mus Balb/c <400> 5 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 8 cctggatacc tgtgaaaaga 20 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 9 cctggtacct tagtcaccgt ctcctca 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 10 aatagatatc tccttcaaca cctgcaa 27 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 11 atcgggacaa agttggaaat a 21 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 12 ggcggtctgg taccgg 16 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 13 gtcaacaaca tagtcatca 19 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 14 cacaggtgtg tccccaagga aaa 23 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 15 aatctggggt aggcacaa 18 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 16 agtgtgtgtc cccaagg 17 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 17 cacagctgcc cgcccaggtg gcat 24 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 18 gtcgccagtg ctccctt 17 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR oligonucleotides <400> 19 atcggacgtg gacgtgcaga 20 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pHC707 <400> 20 Ile Glu Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pHC707 <400> 21 cacaggtatc caggcctggt accttagtca ccgtctcctc aggtaa 46 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pHC707 <400> 22 cacaggtatc caggca 16 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pHC707 <400> 23 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pHC707 <400> 24 cctggtacct tagtcaccgt ctcctcaggt aa 32 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pLC871 <400> 25 Val Glu Gly Asp Ile Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pLC871 <400> 26 tttgcaggtg ttgaaggaga tatcgggaca aagttggaaa taaaacgtaa gt 52 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pLC671 <400> 27 Val Glu Gly Asp 1 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pLC671 <400> 28 tttgcaggtg ttgaaggaga t 21 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pLC671 <400> 29 Ile Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence of pLC671 <400> 30 atcgggacaa agttggaaat aaaacgtaag t 31

Claims (46)

  1. 20% 내지 70%의 C-말단 라이신 함량, 및 1% 내지 20%의 시알산 함량을 갖는 항체 샘플을 생산하는 방법으로서,
    0.74 내지 2.5 μM의 아연을 포함하는 배양 배지 중에서 상기 항체를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 아연-반응성 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양 배지 중의 아연의 농도를 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체 샘플의 C-말단 라이신 함량이 40% 내지 70%인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항체 샘플의 C-말단 라이신 함량이 55% 내지 65%인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항체 샘플의 C-말단 라이신 함량이 60%인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항체 샘플의 시알산 함량이 3% 내지 14%인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 항-TNFα 항체이고, 상기 항-TNFα 항체는
    (i) 인간 TNFα에 대한 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 결합을 경쟁적으로 억제하고;
    (ii) 회합 상수(Ka)로서 측정시 1×108 리터/몰 이상의 친화도로 인간 TNFα의 중화 에피토프(neutralizing epitope)에 결합하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항-TNFα 항체가 인간 항체인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 항-TNFα 항체가 인간화(humanized) 또는 키메라 항체인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 항-TNFα 항체가 면역글로불린 클래스 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM의 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항-TNFα 항체가 IgG1 불변 영역을 포함하는, 방법.
  11. 제6항에 있어서, 항-TNFα 항체가
    a) A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 경쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함하는 경쇄를 포함하거나;
    b) A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 중쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함하는 중쇄를 포함하거나; 또는
    c) A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 경쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함하는 경쇄 및 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 중쇄의 모든 항원-결합 영역들을 포함하는 중쇄를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항-TNFα 항체가 서열번호 3 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 비-인간 가변 영역을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 비-인간 가변 영역이 서열번호 2 및 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  14. 제6항에 있어서, 항-TNFα 항체가 단일클론 항체 cA2와 동일한 에피토프 특이성(epitopic specificity)을 갖는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항-TNFα 항체가 단일클론 항체 cA2인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 배양 배지가 2.5 μM 내지 30 μM 농도 범위의 총 EDTA를 추가로 포함하고, 상기 방법은 배양 배지 중의 철-무함유 EDTA의 농도를 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 배양 배지가 5 μM 내지 16 μM 농도 범위의 철-무함유 EDTA를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 배양 배지 중의 아연-반응성 숙주 세포가 150만 세포/mL 내지 1100만 세포/mL의 세포 밀도에 도달할 때, 항체가 회수되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 배양 배지 중의 아연-반응성 숙주 세포가 300만 세포/mL 내지 1100만 세포/mL의 세포 밀도에 도달할 때, 항체가 회수되는, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 항체가 회수될 때까지 아연의 농도가 제어되는, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 아연-반응성 숙주 세포의 지수 성장기 동안 아연의 농도가 제어되는, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 아연의 농도를 제어하는 단계가,
    배양 배지 중의 아연의 농도를 모니터링하는 단계, 및
    배양 배지 중의 아연의 농도가 0.74 내지 2.5 μM의 범위가 되도록 배양 배지 중의 아연의 농도를 조절하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 항체 샘플이 45% 내지 90%의 갈락토스 함량을 갖는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 항체 샘플이 50% 내지 85%의 갈락토스 함량을 갖는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 항체 샘플이 0.05 내지 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 아연-반응성 숙주 세포가 SP2/0 세포인, 방법.
  28. 20% 내지 70%의 C-말단 라이신 함량을 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플의 C-말단 라이신 함량을 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    상기 배양 배지가 0.74 내지 2.5 μM의 아연을 포함하도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 1% 내지 20%의 시알산 함량을 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플의 시알산 함량을 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    상기 배양 배지가 0.74 내지 2.5 μM의 아연을 포함하도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 50% 내지 90%의 갈락토스 함량을 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플의 갈락토스 함량을 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    상기 배양 배지가 0.74 내지 2.5 μM의 아연을 포함하도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 0.05 내지 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플 내의 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    상기 배양 배지가 0.74 내지 2.5 μM의 아연을 포함하도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-TNFα 항체인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 항-TNFα 항체가
    (i) 인간 TNFα에 대한 A2(ATCC 기탁 번호 PTA-7045)의 결합을 경쟁적으로 억제하고;
    (ii) 회합 상수(Ka)로서 측정시 1×108 리터/몰 이상의 친화도로 인간 TNFα의 중화 에피토프에 결합하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-TNFα 항체가 단일클론 항체 cA2와 동일한 에피토프 특이성을 갖는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항체가 단일클론 항체 cA2인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 항체가 SP2/0 세포주에 의해 생합성되는, 방법.
  37. 제1항 및 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가
    a) 서열번호 3의 아미노산 24-34, 50-56 및 89-97에 기재된 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 서열; 및
    b) 서열번호 5의 아미노산 31-35, 50-68 및 101-109에 기재된 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하는, 방법.
  38. 20% 내지 70%의 C-말단 라이신 함량, 및 1% 내지 20%의 시알산 함량을 갖는 항체 샘플을 생산하는 방법으로서,
    0.5 내지 6.5 μM의 아연을 포함하는 배양 배지 중에서 상기 항체를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 아연-반응성 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 배양 배지 중의 아연의 농도를 제어함으로써 상기 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. a) 20% 내지 70%의 C-말단 라이신 함량;
    b) 1% 내지 20%의 시알산 함량;
    c) 50% 내지 90%의 갈락토스 함량; 및/또는
    d) 0.05 내지 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비
    를 갖는 IgG 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서 상기 IgG 항체 샘플을 생산하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및
    상기 배양 배지가 0.5 내지 6.5 μM의 아연을 포함하여 600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 0.05 내지 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플 내의 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계; 및
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계를 포함하고,
    항체가 SP2/0 세포주에 의해 생합성되는, 방법.
  41. 20% 내지 70%의 C-말단 라이신 함량, 및 1% 내지 20%의 시알산 함량을 갖는 항체 샘플을 생산하는 방법으로서,
    배양 배지 중에서 상기 항체를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 아연-반응성 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 배양 배지 내 아연의 농도를 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 20% 내지 70%의 C-말단 라이신 함량을 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플의 C-말단 라이신 함량을 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 1% 내지 20%의 시알산 함량을 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플의 시알산 함량을 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 50% 내지 90%의 갈락토스 함량을 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플의 갈락토스 함량을 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 0.05 내지 0.20의 시알산 대 갈락토스의 비를 갖는 항체 샘플을 배양 배지 중에서 생합성하는 공정에서, 상기 항체 샘플 내의 시알산 대 갈락토스의 비를 제어하는 방법으로서,
    항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 모니터링하는 단계;
    600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되도록 상기 항체의 생합성 동안 상기 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계; 및
    항체 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 생합성 동안 배양 배지 중의 아연의 수준을 조절하는 단계에 의해 600만 내지 1000만 세포/mL의 생육 세포 밀도가 되는, 방법.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
AU2013381687A1 (en) 2013-03-12 2015-09-24 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AU2014237635B2 (en) * 2013-03-15 2020-03-12 Janssen Biologics B.V. Manufacturing methods to control C-terminal lysine, galactose and sialic acid content in recombinant proteins
WO2015024977A1 (en) 2013-08-20 2015-02-26 Lek Pharmaceuticals D.D. CELL CULTURE MEDIUM AND PROCESS FOR CONTROLLING α-AMIDATION AND/OR C-TERMINAL AMINO ACID CLEAVAGE OF POLYPEPTIDES
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
BR112018008891A8 (pt) 2015-11-03 2019-02-26 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a pd-1 e tim-3 e seus usos
WO2017083224A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods to manipulate quality attributes of polypeptides produced in cho cells
BR112018012344A2 (pt) 2015-12-17 2018-12-04 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a hla-dr e seus usos
KR102587941B1 (ko) 2016-08-12 2023-10-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자
EP3497126A4 (en) 2016-08-12 2020-04-08 Janssen Biotech, Inc. ANTIBODIES OF FC MODIFIED ANTI-TNFR SUPERFAMILY HAVING IMPROVED AGONIST ACTIVITY AND METHODS OF USE THEREOF
CA3065516A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Janssen Biotech, Inc. Antibodies that specifically bind pd-1 and methods of use
CA3065171A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Janssen Biotech, Inc. Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical ch2-ch3 region mutations
WO2019077628A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Council Of Scientific & Industrial Research ZINC SUPPLEMENTATION TO DECREASE GALACTOSYLATION OF RECOMBINANT GLYCOPROTEINS
MA52772A (fr) 2018-05-24 2021-04-14 Janssen Biotech Inc Anticorps anti-tmeff2 monospécifiques et multispécifiques et leurs utilisations
US20220033487A1 (en) * 2018-12-31 2022-02-03 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of Producing Ustekinumab
UY38803A (es) 2019-07-26 2021-01-29 Janssen Biotech Inc Proteínas que comprenden dominios de unión al antígeno de la peptidasa 2 relacionada con la calicreína y usos de las mismas
CA3148121A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for improved single chain variable fragments
PE20230001A1 (es) 2020-03-13 2023-01-05 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para la union de siglec-3/cd33
CA3184189A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
CA3190307A1 (en) 2020-07-29 2022-02-03 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising hla-g antigen binding domains and their uses
UY39467A (es) 2020-10-13 2022-04-29 Janssen Biotech Inc Inmunidad mediada por células t de bioingeniería, materiales y otros métodos para modular el grupo de diferenciación iv y / o viii
WO2022084915A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising delta-like ligand 3 (dll3) antigen binding domains and their uses
KR20230137393A (ko) 2021-01-28 2023-10-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Psma 결합 단백질 및 이의 용도
EP4314056A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
TW202304986A (zh) 2021-03-24 2023-02-01 美商健生生物科技公司 靶向cd22及cd79b的抗體
KR20240055002A (ko) 2021-09-13 2024-04-26 얀센 바이오테크 인코포레이티드 암 치료를 위한 CD33 x Vδ2 다중특이성 항체
WO2023046322A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceutica Nv Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof
WO2023089587A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
WO2024089551A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Janssen Biotech, Inc. Msln and cd3 binding agents and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011516080A (ja) * 2008-04-07 2011-05-26 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 糖タンパク質の組換え生産の方法
JP2012087144A (ja) * 1991-03-18 2012-05-10 New York Univ ヒト腫瘍壊死因子に特異的なモノクローナルなキメラ抗体
WO2012147053A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Biocon Research Limited A method for reducing heterogeneity of antibodies and a process of producing the antibodies thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
EP0288088B1 (en) 1987-04-24 1994-03-09 Teijin Limited Detection of tumor necrosis factor; monoclonal antibody and kit
JP3443119B2 (ja) 1989-08-07 2003-09-02 ペプテック リミテッド 腫瘍壊死因子結合リガンド
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
FR2807767B1 (fr) † 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
CA2450289A1 (en) † 2003-03-20 2005-05-19 Imclone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
US20040185047A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Jill Giles-Komar Anti- TNF antibodies, compositions, methods and uses
CA2583027A1 (en) † 2004-11-02 2006-10-19 Ares Trading S.A. Serum-free cell culture medium for mammalian cells
US9475858B2 (en) 2011-07-08 2016-10-25 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Cell culture process
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
AU2014237635B2 (en) * 2013-03-15 2020-03-12 Janssen Biologics B.V. Manufacturing methods to control C-terminal lysine, galactose and sialic acid content in recombinant proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012087144A (ja) * 1991-03-18 2012-05-10 New York Univ ヒト腫瘍壊死因子に特異的なモノクローナルなキメラ抗体
JP2011516080A (ja) * 2008-04-07 2011-05-26 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 糖タンパク質の組換え生産の方法
WO2012147053A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Biocon Research Limited A method for reducing heterogeneity of antibodies and a process of producing the antibodies thereof

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