CN105378086B - 用于控制重组蛋白质中c端赖氨酸、半乳糖和唾液酸含量的制造方法 - Google Patents

用于控制重组蛋白质中c端赖氨酸、半乳糖和唾液酸含量的制造方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了一种用于产生抗体诸如抗TNFα抗体(例如，英利昔单抗)的方法，所述抗体具有约20％至约70％的C端赖氨酸含量和约1％至约20％的唾液酸含量；所述方法包括在培养基中培养转染有编码所述抗体的DNA的锌响应宿主细胞，所述培养基包含至少0.5μM的锌；以及控制锌在所述培养基中的浓度，从而生产所述抗体。

Description

用于控制重组蛋白质中C端赖氨酸、半乳糖和唾液酸含量的制 造方法
背景技术
通过血液流中的内源性循环羧肽酶(Cai,B等人，“体内人免疫球蛋白G2重链的C端赖氨酸处理”，《生物技术与生物工程》，2011年； 108:404-412(Cai,B.et al.,“C-terminalLysine Processing of Human Immunoglobulin G2 Heavy Chain in Vivo,”Biotechnol.Bioeng.2011；108:404- 412))，C端赖氨酸(CTL)快速地从注入抗体移除，包括英利昔单抗，并且因此据信对产品安全性和功效具有少量(如果有的话)影响。然而，具有CTL残基的重组蛋白质中的CTL含量可用作制造一致性和产品均质性的量度。
相比于CTL含量，重组蛋白质中的唾液酸含量已与人的生理重要性的许多现象相关联。例如，糖蛋白(诸如促红细胞生成素)中唾液酸的存在促进长循环半衰期，而促红细胞生成素中唾液酸的不存在导致蛋白质从循环的快速清除。此外，蛋白质中增加的唾液酸含量可调节人的蛋白质的免疫原性。由于唾液酸对产品安全性和功效的重要性，唾液酸含量应保持在反应临床所用范围的范围内。
因此，存在理解并控制处理相关因数的需求，这些处理相关因数影响重组蛋白质(特别是施用给人的重组蛋白质，诸如(英利昔单抗)或(阿达木单抗))中的CTL和唾液酸含量。
发明内容
本文所公开的是用于生产抗体(例如，抗肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体，诸如单克隆抗体cA2(本文也称为英利昔单抗))的方法，该抗体通过控制培养条件(包括锌浓度、乙二胺四乙酸(EDTA)浓度和收获时间)具有所需的C端赖氨酸(CTL)含量、唾液酸含量、半乳糖含量和/或唾液酸对半乳糖的比率。
本发明的一个实施例是一种用于生产抗体的方法，该抗体具有约20％至约70％的C端赖氨酸含量和约1％至约20％的唾液酸含量；所述方法包括在培养基中培养转染有编码抗体的DNA的锌响应宿主细胞，该培养基包含至少0.5μM的锌；并且控制锌在培养基中的浓度，从而生产抗体。在一些实施例中，抗体的C端赖氨酸含量为约40％至约70％，例如约55％至约 65％，例如或约60％。在一些实施例中，抗体的唾液酸含量为约3％至约 14％。在一些实施例中，抗体具有约50％至约90％或约45％至约85％的半乳糖含量。在一些实施例中，抗体具有约0.05至约0.20的唾液酸对半乳糖的比率。
在一些实施例中，抗体为抗TNFα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段(i)竞争地抑制A2(ATCC保藏号PTA- 7045)结合至人TNFα；和(ii)以至少1×108升/摩尔的亲和力结合至人 TNFα的中和表位，测量为缔合常数(Ka)。抗TNFα抗体或其抗原结合片段可为例如嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段可为免疫球蛋白类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM，并且在一些实施例中，包括IgG1恒定区域。在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。
在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段包括人恒定区域和非人可变区域，或人恒定区域和人可变区域。
在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段包含至少一个人轻链和至少一个人重链。在一些实施例中，轻链包含A2(ATCC保藏号PTA- 7045)轻链的所有抗原结合区域。在一些实施例中，重链包含A2(ATCC保藏号PTA-7045)重链的所有抗原结合区域。在其它实施例中，轻链包含 A2(ATCC保藏号PTA-7045)轻链的所有抗原结合区域，并且重链包含 A2(ATCC保藏号PTA-7045)重链的所有抗原结合区域。
在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段包含IgG1人恒定区域和非人可变区域；该非人可变区域包含选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，或由选自SEQID NO:2和SEQ ID NO:4的核酸序列进行编码。
在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段具有等同于单克隆抗体cA2的表位特异性，并且在一些实施例中，抗TNFα抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体cA2。
在一些实施例中，锌在培养基中的浓度在约0.6μM至约6.5μM或约 0.6μM至约1.1μM的范围内。
在一些实施例中，培养基还包含浓度范围为约2.5μM至约30μM或约 5μM至约16μM的EDTA，并且所述方法还包括控制EDTA在培养基中的浓度。
在一些实施例中，所述方法还包括回收抗体，例如当培养基中的锌响应宿主细胞达到约1.5百万细胞/mL至约11百万细胞/mL或约3百万细胞 /mL至约11百万细胞/mL的细胞密度时。在一些实施例中，锌的浓度被控制，直至抗体被回收，或在锌响应宿主细胞的对数生长期期间被控制。
在本发明的一些实施例中，控制锌的浓度包括监测锌在培养基中的浓度，和调节锌在培养基中的浓度，以使得锌在培养基中的浓度为至少 0.5μM或在约0.6μM至约6.5μM的范围内。
在本发明的一些实施例中，锌响应宿主细胞为SP2/0细胞。
本发明的另一个实施例是一种用于控制抗体的C端赖氨酸含量的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约20％至约70％的C端赖氨酸含量，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
本发明的另一个实施例是一种用于控制抗体的唾液酸含量的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约1％至约20％的唾液酸含量，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
本发明的另一个实施例是一种用于控制抗体的半乳糖含量的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约50％至约90％的半乳糖含量，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
本发明的另一个实施例是一种用于控制抗体中唾液酸对半乳糖的比率的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约0.05至约 0.20的唾液酸对半乳糖的比率，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
在一种用于控制CTL、唾液酸或半乳糖含量，或唾液酸对半乳糖的比率的方法的一些实施例中，抗体为抗TNFα抗体或其抗原结合片段，和/或抗体由SP2/0细胞生物合成。
在一个实施例中，抗体为结合TNF表位的氨基酸的mAb，mAb通过杂交瘤或重组宿主生产。在一个实施例中，抗体为嵌合抗体，该嵌合抗体识别由A2所识别的表位。在另一个实施例中，抗体为嵌合抗体，该嵌合抗体命名为嵌合A2(cA2)(即，英利昔单抗)。
制备和使用抗TNF抗体的表征和方法详细地公开并描述于例如“抗 TNF抗体、组合物、方法和用途”(George Heavner等人，于2007年7月 31日发布的提交于2001年8月1日的美国专利7,250,165)和“抗TNF抗体、组合物、方法和用途”(Jill Giles-Komar等人，提交于2003年3月21 日的美国申请10/394,471，公布US2004/0185047 A1)，以及“重组A2特异性TNFα特异性抗体”(Junming Le等人，于2007年8月7日发布的提交于2004年2月6日的美国专利7,252,823)中(所有专利全文以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，抗体包括鼠科mAb A2(其由命名为c134A的细胞系生产)和嵌合抗体cA2(其由命名为c168A的细胞系生产)。细胞系 c134A存储于宾夕法尼亚州斯普林豪斯的威尔斯&麦基恩路的杨森研发公司 (Janssen Research&Development,Welsh&McKeanRoad,Springhouse, PA)。细胞系c168A存储于宾夕法尼亚州马尔文的山谷大道200号杨森研发公司(Janssen Research&Development,200 Great Valley Parkway,Malvern,Pennsylvania)(邮编19355)，荷兰莱顿的杨森生物制剂有限公司 (Janssen BiologicsBV,Leiden,The Netherlands)。
本文所公开的方法可用于改善例如商业制造过程中的分批均质性，诸如用于产生在治疗例如人自身免疫性疾病所使用的英利昔单抗、单克隆抗 TNFα抗体的制造过程。
附图说明
上述内容根据如附图所示的本发明实例实施例的下述更具体的描述将显而易见。
本专利或专利申请文件包含至少一张绘制成彩色的附图。在提出请求并支付必要的费用后，美国专利和商标局将会提供本专利或专利申请公开的带彩图副本。
图1示出了英利昔单抗的实例的毛细管等电聚焦(cIEF)电描记图。
图2为作为cIEF峰1百分比的函数映射的反相肽赖氨酸缺乏百分比 (缺乏C端赖氨酸％，缩写为des-Lys)的拟合线曲线图，并且示出了CTL 含量(表达为des-Lys的百分比)和峰1百分比之间的相关性。
图3为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表，并且示出了改变Zn+2浓度对CTL去除的影响。Y轴：desl-Lys％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图4为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗低聚糖与唾液酸的百分比的图表，如通过WAX方法所确定，并且示出了改变Zn+2浓度对唾液酸百分比的影响。Y轴：唾液酸％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图5为作为生物反应器时期的函数的活细胞密度的图表，并且示出了改变Zn+2浓度对活细胞密度的影响。Y轴：活细胞密度(数百万活细胞 /mL)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图6为作为生物反应器时期的函数的活细胞百分比的图表，并且示出了改变Zn+2浓度对培养物存活率的影响。Y轴：活细胞％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图7为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗浓度的图表，并且示出了改变Zn+2浓度对英利昔单抗浓度的影响。所指出的y轴浓度mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图8A为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表，并且示出了在存在0.76μM的Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”的生物反应器中 Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM；0.76μM的Zn+2的目标浓度从第 13天实施直至实验结束)的情况下改变EDTA浓度对CTL去除的影响。Y轴：desl-Lys％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图8B为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表，并且示出了在存在1.7μM的Zn+2的情况下改变EDTA浓度对CTL去除的影响。Y轴： desl-Lys％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图9A为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗低聚糖与唾液酸的百分比的图表，如通过WAX方法所测定，并且示出了在存在0.76μM的 Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1EDTA:10”的生物反应器中Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM；0.76μM的Zn+2的目标浓度从第13天实施直至实验结束)的情况下改变EDTA浓度对唾液酸百分比的影响。Y轴：唾液酸％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图9B为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗低聚糖与唾液酸的百分比的图表，如通过WAX方法所测定，并且示出了在存在1.7μM的Zn+2的情况下改变EDTA浓度对唾液酸含量的影响。Y轴：唾液酸％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图9C为作为生物反应器时期的函数的G0F(WAX组分1)的百分比的图表，并且示出了在存在0.76μM的Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”的生物反应器中Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM； 0.76μM的Zn+2的目标浓度从第13天实施直至实验结束)的情况下改变 EDTA浓度对非半乳糖基物质的影响。
图9D为作为生物反应器时期的函数的G0F(WAX组分1)的百分比的图表，并且示出了在存在1.7μM的Zn+2的情况下改变EDTA浓度对非半乳糖基物质的影响。
图10为作为生物反应器时期的活细胞密度的图表，并且示出了在存在 0.76μM的Zn+2或1.7μM的Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”的生物反应器中Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM；0.76μM的Zn+2的目标浓度从第13天实施直至实验结束)的情况下改变EDTA浓度对活细胞密度的影响。Y轴：活细胞密度(数百万活细胞/mL)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图11A为作为生物反应器时期的活细胞百分比的图表，并且示出了在存在0.76μM的Zn+2或1.7μM的Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”的生物反应器中Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM；0.76μM的Zn+2的目标浓度从第13天实施直至实验结束)的情况下改变EDTA浓度对培养物存活率的影响。Y轴：活细胞％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图11B为图11A所示图表的第0-25天的放大图。Y轴：活细胞密度 (数百万活细胞/mL)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图12A为作为生物反应器时期的英利昔单抗浓度的图表，并且示出了在存在0.76μM的Zn+2或1.7μM的Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”的生物反应器中Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM； 0.76μM的Zn+2的目标浓度从第13天实施直至实验结束)的情况下改变 EDTA浓度对英利昔单抗浓度的影响。所指出的y轴浓度mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图12B为图12A所示图表的第0-25天的放大图。所指出的y轴浓度 mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图13A为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对CTL去除的影响(结果表示为两个重复生物反应器的平均值)。Y轴：desl-Lys％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图13B为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗低聚糖与唾液酸的百分比的图表，如通过WAX方法所测定；并且示出了改变EDTA浓度(μM) 对唾液酸含量的影响(结果表示为两个重复生物反应器的平均值)。Y 轴：唾液酸％；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图13C为作为生物反应器时期的函数的活细胞密度的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对活细胞密度的影响。Y轴：活细胞密度(数百万活细胞/mL)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图13D为作为生物反应器时期的函数的活细胞百分比的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对培养物存活率的影响。Y轴：活细胞％；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图13E为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗浓度的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对英利昔单抗浓度的影响。所指出的y轴浓度 mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图13F为图13E所示图表的第0-25天的放大图。所指出的y轴浓度mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图13G为作为生物反应器时期的函数的G0F(WAX组分1)的百分比的图表，并且示出了改变EDTA浓度(μM)对缺乏半乳糖的英利昔单抗低聚糖百分比的影响。X轴：生物反应器时期，单位为天。
图14A为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对CTL去除的影响。X轴：生物反应器时期，单位为天。
图14B为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗低聚糖与唾液酸的百分比的图表，如通过WAX方法所测定；并且示出了改变EDTA浓度(μM) 对唾液酸含量的影响。
图14C为作为生物反应器时期的函数的活细胞密度的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对活细胞密度的影响。Y轴：活细胞密度(数百万活细胞/mL)；X轴：生物反应器时期，单位为天。
图14D为作为生物反应器时期的函数的活细胞百分比的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对培养物存活率的影响。Y轴：活细胞％；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图14E为作为生物反应器时期的函数的英利昔单抗浓度的图表；并且示出了改变EDTA浓度(μM)对英利昔单抗浓度的影响。所指出的y轴浓度 mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图14F为图14E所示图表的第0-25天的放大图。所指出的y轴浓度 mg/mL包含印刷误差。浓度为mg/L。Y轴：英利昔单抗浓度(mg/L)；X 轴：生物反应器时期，单位为天。
图15为作为生物反应器时期的函数的G0F(WAX组分1)的百分比的图表，并且示出了改变EDTA浓度(μM)对缺乏半乳糖的英利昔单抗低聚糖的百分比的影响。
图16示出了英利昔单抗、G0F、G1F和G2F的最常见中性低聚糖的生物合成途径，和从中性低聚糖至唾液酸化形式的生物合成途径。
图17为作为Zn+2浓度的函数的CTL去除(根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表，并且示出了在DOE3和BSA共混1实验的第20天的CTL去除百分比(蓝色数据点和线表示平均值)。
图18为作为Zn+2浓度的函数的CTL去除(根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表，并且示出了在DOE3实验的第13天的CTL去除百分比。
图19为作为Zn+2浓度的函数的唾液酸含量的图表，并且示出了在 DOE3和BSA共混1实验的第20天的唾液酸百分比(线表示平均值)。
图20为作为Zn+2浓度的函数的WAX组分1(GOF)的百分比的图表，并且示出了在DOE3和BSA共混1实验的第20天缺乏半乳糖的英利昔单抗低聚糖百分比。
图21为作为Zn+2浓度的函数的唾液酸对半乳糖的预估比率(预估为唾液酸百分数/(100﹣WAX组分1百分比))的图表，并且示出了在DOE3和 BSA共混1实验的第20天的唾液酸对半乳糖的预估比率。
图22为作为EDTA浓度的函数的CTL去除(根据峰1数据利用cIEF 方法进行计算)的图表，并且示出了在存在1.1-1.2μM的Zn+2的情况下在共混1和2实验的第33-35天的CTL去除百分数。
图23为作为EDTA浓度的函数的唾液酸百分比的图表，并且示出了在存在1.1-1.2μM的Zn+2的情况下在共混1和2实验的第33-35天的唾液酸百分数。
图24为作为EDTA浓度的函数的WAX组分1百分比的图表，并且示出了在存在1.1-1.2μM的Zn+2的情况下在共混1和2实验的第33-35天缺乏半乳糖的英利昔单抗低聚糖百分比。
图25 为作为EDTA浓度的函数的唾液酸对半乳糖的预估比率(预估为唾液酸百分数/(100﹣WAX组分1百分比))的图表，并且示出了在存在 1.1-1.2μM的Zn+2的情况下在共混1和2实验的第33-35天的唾液酸对半乳糖的预估比率。
图26为作为G0F百分比(根据WAX组分1进行计算)的函数的唾液酸百分比(根据WAX组分5进行计算)的图表，并且示出了对于DOE3和 BSA共混1和2实验的唾液酸和WAX组分1的百分比之间的反相关系，和缺乏半乳糖的英利昔单抗低聚糖的指标。
图27A和27B提供了用于表达嵌合A2抗体的嵌合H(pA2HG1apgpt)和 L(pA2HuKapgpt)链的质粒的示意图。
图28为人TNF的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图29A-29B。图29A为克隆cA2轻链可变区域的核酸序列(SEQ ID NO: 2)和对应氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。图29B为克隆cA2重链可变区域的核酸序列(SEQ ID NO:4)和对应氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
具体实施方式
本发明的示例性实施例的描述如下：
一个实施例提供了一种用于产生抗体的方法，该抗体具有约20至约 70％的C端赖氨酸含量，和约1％至约20％的唾液酸含量，所述方法包括在培养基中培养转染有编码抗体的DNA的锌响应宿主细胞，该培养基包含至少0.5μM的锌；并且控制锌在培养基中的浓度，从而产生抗体。
CTL含量在本文中表达为具有C端赖氨酸的重链的百分比，并且可利用下述公式进行计算：CTL含量(％)＝(具有CTL的重链的数量)/(重链的总数)×100。CTL去除在本文中表达为缺乏C端赖氨酸(des-Lys)的重链的百分比。因此，“80％的Des-Lys”等同于20％的CTL含量。在本文所述方法的一些实施例中，抗体或抗TNFα抗体或其抗原结合片段的CTL含量为约40％至约70％，具体地约55％至约65％，并且更具体地约60％。
唾液酸含量在本文中表达为含有唾液酸的低聚糖的百分比，并且可利用下述公式进行计算：唾液酸含量(％)＝(含有唾液酸的低聚糖的数量)/ (低聚糖的总数)×100。该公式独立地应用低聚糖中唾液酸残基的数量。换句话讲，无论低聚糖中是否存在例如一个或两个唾液酸残基，出于计算唾液酸含量的目的，低聚糖仅计数一次。在本文所述方法的一些实施例中，抗体或抗TNFα抗体或其抗原结合片段的唾液酸含量为约3％至约 14％。
半乳糖含量在本文中表达为含有半乳糖的低聚糖的百分比，并且可利用下述公式进行计算：半乳糖含量(％)＝(含有半乳糖的低聚糖的数量)/ (低聚糖的总数)×100。该公式独立地应用低聚糖中半乳糖单元的数量。换句话讲，无论低聚糖中是否存在例如一个或两个半乳糖残基，出于计算半乳糖含量的目的，低聚糖仅计数一次。在本文所述方法的一些实施例中，抗体或抗TNFα抗体或其抗原结合片段具有约50％至约90％，并且具体地约45％至约85％的半乳糖含量。
通常，抗体诸如英利昔单抗的两个重链被糖基化。然而，在一些情况下，重链中的一些保持非糖基化。例如，在一些实施例中，约94％的抗体分子在两个链上被糖基化，约6％的抗体分子半糖基化，和约0.1％的抗体分子完全非糖基化。
唾液酸对半乳糖的比率根据英利昔单抗的低聚糖中唾液酸对半乳糖的摩尔比进行计算。在本文所述方法的一些实施例中，抗体或抗TNFα抗体或其抗原结合片段具有约0.05至约0.20的唾液酸对半乳糖的比率。
如本文所用，“锌响应宿主细胞”是指响应于锌浓度在其培养基中的波动的宿主细胞。例如，通过测量改变锌浓度对由宿主细胞所生产的抗体中的CTL含量、唾液酸含量、半乳糖含量和唾液酸对半乳糖的比率的影响，可评估宿主细胞对锌浓度波动的响应性。用于估计由宿主细胞所生产的抗体中的CTL含量、唾液酸含量、半乳糖含量和唾液酸对半乳糖的比率的方法在例证中进行描述。
本发明提供了一种培养基，该培养基包含大于约0.5μM的锌量。在一些实施例中，锌在培养基中的浓度在约0.6μM至约6.5μM的范围内，并且优选地在约0.6μM至约1.1μM的范围内。在一些实施例中，锌在培养基中的量或浓度为对锌响应宿主细胞无毒的，例如，不降低或大幅降低细胞存活率、细胞生长或抗体生产，特别是在培养的前20-25天。
在一些实施例中，培养基还包含乙二胺四乙酸(EDTA)(如本文所提及的“EDTA”或“总EDTA”)，其浓度范围为约2.5μM至约30μM，并且其浓度范围优选地为约5μM至约16μM。如本文所用，“无铁EDTA”是指未螯合至铁(Fe+3)的EDTA。无铁EDTA(缩写为[EDTA–Fe+3])的量或浓度可通过从总EDTA的量或浓度减去Fe+3的量或浓度进行计算。金属离子中的离子Fe+3在培养基中具有对EDTA的最高亲和力。因此，Fe+3在存在时将优先地结合细胞培养基中的EDTA。无铁EDTA的浓度表示可用于结合培养基中的Zn+2和其它金属离子的EDTA。
在本文所述方法的一些实施例中，EDTA和/或无铁EDTA在培养基中的量或浓度为对锌响应宿主细胞无毒的，例如，不降低或大幅降低细胞存活率、细胞生长或抗体生产，特别是在培养的前20-25天。
如本文所用，“控制”意指检验和/或调节。控制包括感测/测量被控制 (直接地或间接地)的物质，和利用那些测量结果来提供反馈以朝向所需结果进行校正。控制包括监测和调节例如锌和/或EDTA和/或无铁EDTA在培养基中的浓度。通常，锌和/或EDTA和/或无铁EDTA的浓度被控制培养的持续时间。在本文所述方法的一些实施例中，锌和/或EDTA和/或无铁 EDTA的浓度在锌响应宿主细胞的对数生长期期间或在培养的约前10-25天期间进行控制。
锌和/或EDTA和/或无铁EDTA在培养基中的浓度可通过例如以下方式控制：监测锌和/或EDTA和/或无铁EDTA在培养基中的水平；以及调节锌和/或EDTA和/或无铁EDTA在培养基中的水平。因此，在本文所述方法的一些实施例中，控制锌浓度包括监测锌在培养基中的浓度以及调节锌在培养基中的浓度，以使得锌在培养基中的浓度为至少0.5μM，或约0.6μM至约6.5μM。
监测锌和/或EDTA和/或无铁EDTA的水平的方法对本领域的技术人员是已知的。例如，锌和其它金属离子的浓度可通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行测量，而EDTA浓度可通过HPLC方法进行测量。
对于“调节”，如本文所用，意指顺序放置或维持。调节根据需要包括维持例如锌和/或EDTA在培养基中的浓度，和调整例如锌和/或EDTA在培养基中的浓度。因此，锌(例如，无毒量的锌)可以例如大于约5μM的初始浓度包含于培养基中，然后调整至例如0.6μM至约1.1μM的浓度。调整可例如与从对数生长期过渡至稳定期同时进行，或仅随其之后进行。例如，锌浓度可以培养的持续时间维持在例如0.6μM至约1.1μM的浓度。
锌和/或EDTA和/或无铁EDTA的水平的调整可通过以下方式实现：例如，通过将锌、铁和/或EDTA直接添加至培养基；通过共混包含锌、铁和/或EDTA的原材料；通过处理原材料以调整其锌、铁和/或EDTA浓度；和/或通过修改原材料的制造过程以达到锌、铁和/或EDTA的所需水平。调节培养基的组分的方法对本领域的技术人员是已知的。
培养基可包含除锌和/或EDTA之外的其它成分。合适培养基的选择在本领域的技术人员的知识范围内。在一些实施例中，培养基为无血清培养基。
可使用用于生产抗体的本领域中已知的任何宿主细胞，包括哺乳动物细胞，诸如SP2/0细胞，例如小鼠SP2/0细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC)(American Type Culture Collection(ATCC), Manassas,VA)，CRL1581)。其它示例性宿主细胞为NS0(英国维尔特郡索尔兹伯里的欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK)，ECACC 85110503))、FO (ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠科细胞系。示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(马里兰州沃克斯维尔的隆察生物制剂公司(Lonza Biologics,Walkersville,MD))、CHO-K1 (ATCC CRL-61)或DG44。细胞可在单细胞悬浮液中培养，或以锚定点依赖性方式培养。
多种培养体系在本领域中是已知的，包括烧瓶、滚瓶和生物反应器，例如搅拌槽生物反应器。培养基可以批量方法添加，其中培养基以单批量一次性添加至细胞，或优选地以进料批量方法添加，其中周期性地添加小批量的培养基。宿主细胞还可在灌注培养物中培养，这涉及从培养物连续地去除一定体积的培养基，并且用相当体积的新鲜介质替换去除体积。通常，灌注培养可经操作以实现比批量培养高的细胞密度，并且可维持更长的时间段。灌注培养还允许重复收获。
用于生产抗体的方法还可包括回收抗体。在一些实施例中，当培养基中的锌响应宿主细胞达到约1.5百万细胞/mL至约11百万细胞/mL，并且优选地3百万细胞/mL至约11百万细胞/mL的细胞密度时，抗体可回收。抗体可例如通过直接产品捕获(DPC)回收。在本文所述方法的一些实施例中，锌浓度被控制直至抗体被回收。
CTL和唾液酸含量可通过控制产品收获或回收时的细胞时期更精确地控制。因此，在本文所述方法的一些实施例中，抗体与从对数生长期过渡至稳定期同时回收，或仅随其之后回收。在其它实施例中，抗体在培养生长的稳定期回收。在一些实施例中，抗体在培养的前25天内(例如，在第 10-25天、第15-20天，或约第20天)回收。在其它实施例中，抗体在培养的前25天之后回收。
本文还提供的是一种用于控制抗体的C端赖氨酸含量的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约20％至约70％的C端赖氨酸含量，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
本文还提供的是一种用于控制抗体的唾液酸含量的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约1％至约20％的唾液酸含量，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
本文还提供的是一种用于控制抗体的半乳糖含量的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约50％至约90％的半乳糖含量，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
本文还提供的是一种用于控制抗体中唾液酸对半乳糖的比率的方法，该抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约0.05至约0.20的唾液酸对半乳糖的比率，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基中的水平。
在一种用于控制CTL、唾液酸或半乳糖含量，或唾液酸对半乳糖的比率的方法的一些实施例中，抗体为抗TNFα抗体或其抗原结合片段，和/或抗体由SP2/0细胞或CHO细胞生物合成。
抗体和其片段
如本文所用，“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段或其单链。
抗体可包含重链恒定区域(Hc)、重链可变区域(Hv)、轻链可变区域(Lvc) 和轻链恒定区域(Lc)中的至少一种，其中多克隆Ab、单克隆Ab、其片段和/ 或区域包括结合一部分的抗原并且抑制和/或中和抗原的至少一种生物学活性的至少一种重链可变区域(Hv)或轻链可变区域(Lvc)。
抗体或抗原结合片段可包含这样的抗原结合区域，该抗原结合区域包含至少一个人互补决定区域(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个重链可变区域的变体以及至少一个人互补决定区域(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个轻链可变区域的变体。此类抗体可通过如下方法制备：使用常规技术将抗体的各个部分(例如CDR和构架区)化学连接在一起，使用重组 DNA技术的常规技术或通过使用任何其他合适的方法制备并表达编码该抗体的(一种或多种)核酸分子。
抗体可为灵长类的、哺乳动物的、鼠科的、嵌合的、人源的或人的。抗体可包含例如鼠科-人嵌合抗体、鼠科抗体、人抗体或其任何部分中的至少一种，其具有免疫球蛋白可变区域的至少一个抗原结合片段或区域。
嵌合抗体为衍生自不同动物种类的分子不同部分，诸如具有衍生自鼠科mAb的可变区域和人免疫球蛋白恒定区域的那些。例如，它们可保持来自一个种类的至少一个不同结构域(通常为可变结构域)，并且其余部分来自另一个种类；例如小鼠-人嵌合抗体。它们主要用于降低施用时的免疫原性和增加生产时的收率，例如，其中鼠科mAb具有来自杂交瘤的较高收率但人的较高免疫原性，以使得使用人/鼠科嵌合mAb。嵌合抗体和其生产方法在本领域中是已知的(Cabilly等人，《美国国家科学研究院期刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81:3273-3277(1984年)；Hanes等人，《美国国家科学研究院期刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81:6851-6855(1984 年)；Neuberger等人，《自然》(Nature)，314:268-270(1985年)；以及 Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies:aLaboratoryManual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988年))。这些参考文献全文以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“嵌合抗体”包括一价、二价或多价免疫球蛋白。一价嵌合抗体为由嵌合H链形成的二聚体(HL)，该嵌合H链通过二硫化桥键与嵌合L链缔合。二价嵌合抗体为由两个HL二聚物形成的四聚物 (H2L2)，该两个HL二聚体通过至少一个二硫化桥键缔合。多价嵌合抗体还可例如通过采用聚集的CH区域(例如，从IgM H链或μ链)而生产。
“人源化”抗体(也称为CDR接枝抗体)通过某个过程生产，以降低异种源(常常为啮齿动物)的单克隆抗体(mAb)的免疫原性和改善效应子功能(例如，ADCC，互补活化，和/或C1q结合)。一般来讲，人源化抗体具有一个或多个来自非人来源的氨基酸残基，该非人来源是例如(但不限于) 小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物。工程化mAb可利用分子生物学技术进行工程化。将啮齿动物互补决定区(CDR)简单CDR接枝至人构架区中通常导致结合亲和力和/或原始mAb的特异性的损失。为使抗体人源化，人源化抗体的设计可包含变型形式，诸如CDR残基中的保守氨基酸取代，和残基从啮齿动物mAb至人构架区的反向取代(反向突变)。用于将非人或人抗体进行工程化或人源化的方法在本领域中是熟知的。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有衍生自或紧密匹配人种系免疫球蛋白序列的可变区域和恒定区域的抗体。本发明的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外无规或位点特异性诱变或体内体细胞突变所引起的突变)。因此，如本文所用，术语“人抗体”是指其中基本上蛋白质的每个部分(例如，CDR、构架区、CL结构域、CH结构域(如CH1、CH2、CH3)、铰链区(VL、VH))基本上类似于人种系抗体的抗体。
如本文所用，术语“人抗体”还是指其中基本上蛋白质的每个部分 (例如，CDR、构架区、CL结构域、CH结构域(如CH1、CH2、CH3)、铰链区(VL、VH))在人中基本上是非免疫原性的，仅具有小的序列改变或变型。类似地，指明灵长类(猴、狒狒、黑猩猩等)、啮齿类(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)和其他哺乳动物的抗体表示这些种、亚属、属、亚科和科的特异抗体。人抗体可由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞生产。此外，当人抗体是单链抗体时，它可包含在天然人抗体中不存在的连接肽。例如，Fv可包含连接重链可变区和轻链可变区的连接肽，诸如2至约8个甘氨酸或其他氨基酸残基。此类连接肽被认为是人源的。
抗体可为任何免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD，以及它们的任何亚型。如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgGI)。在人中，存在有五个同种型重链和两个同种型轻链。对于重链，IgA1和2；IgD；IgG1、2、3和4；IgE和IgM是同种型的重链。κ和λ是同种型的轻链。在某些实施例中，重链为IgG类重链。在其它实施例中，重链为IgM类重链。在某些实施例中，重链还包含至少约8个氨基酸的J区域。
抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗个体基因型(抗Id)抗体(这些抗体可以可溶或结合形式进行标记)，和它们的片段、区域或衍生物(通过任何已知技术提供，诸如但不限于酶裂解、肽合成或重组技术)。此类抗体可能够结合抗原(例如，TNF)的部分，该抗原的部分抑制将抗原结合至抗原受体。
多克隆抗体为衍生自以抗原进行免疫的动物血浆的抗体分子的异质群体。
单克隆抗体(mAb)包含特定于抗原的抗体的基本上均匀群体。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单结合特异性。
可通过本领域技术人员已知的方法获得MAb。参见例如Kohler和 Milstein，《自然》(Nature),256:495-497(1975年)；美国专利4,376,110； Ausubel等人编辑的《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约的格林出版联合公司和威利出版社(Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience,N.Y.)，(1987年，1992年)；以及Harlow和 Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies:a Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988年)；Colligan等人编辑的《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)，纽约的格林出版联合公司和威利出版社(Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.)， (1992年，1993年)，这些参考文献的内容全文以引用的方式并入本文。
抗个体基因型(抗Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。抗Id抗体还可以用作“免疫原”以在另一动物中诱导免疫应答，从而生产所谓的抗-抗Id抗体。抗抗Id可为在表位上等同于诱导抗Id的原始mAb。因此，通过将抗体用于mAb的个体基因型决定簇，可能的是识别表达等同特异性的抗体的其它克隆体。
抗体片段包含了例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。这些片段不含完整抗体的Fc片段，更快速地从循环清除，并且具有比完整抗体少的非特异性组织结合(Wahl等人，《核医学杂志》(J.Nucl.Med.)，24,316-325(1983 年))。这些片段利用本领域中已知的方法从完整抗体生产，例如通过用酶的蛋白水解裂解，诸如木瓜蛋白酶(以生产Fab片段)或胃蛋白酶(以生产F(ab')2片段)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体分子的某部分，该部分包含氨基酸残基，该氨基酸残基与抗原相互作用并赋予抗体对于抗原的特异性和亲和力。“抗原”为能够通过抗体进行结合的分子或分子的一部分，该分子或分子的一部分额外地能够诱导动物以生产能够结合至该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个或一个以上的表位。抗体区域包含用以维持抗原结合残基的适当构象所需的“构架区”氨基酸残基。
“抗原结合片段”或其部分包含例如单链抗体和其片段。抗原结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和 VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达；以及(vi)一个或多个分离的互补决定区(CDR)。通过本领域中已知和/或本文描述的酶促裂解、合成或重组技术可生产这些片段。在一些实施例中，片段可包含抗体链的一个或多个部分，诸如重链恒定区域、连接区域、多样区域或可变区域，或轻链恒定区域、连接区域或可变区域。
抗原结合区域可为非人的，例如鼠科起源的。在一些实施例中，抗原结合区域可衍生自兔或啮齿动物，诸如大鼠或仓鼠。
嵌合抗体的抗原结合片段可衍生自特定于人抗原的非人抗体。在一些实施例中，编码此类嵌合抗体的DNA的来源包括生产抗体的细胞系，优选地公知为杂交瘤的杂交体细胞系。在一个实施例中，杂交瘤为A2杂交瘤细胞系。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。“表位”可为能够通过抗体在Ab's抗原结合区域中的一处或多处被识别和结合的任何分子的部分。通过“抑制和/ 或中和表位”预期的是一种表位，该表位在通过抗体结合时导致分子或含有该表位的生物体的生物活性在体内、在体外或原位的损失，更优选地在体内，例如将TNF结合至TNF受体。
抗体可为例如分离抗体、重组抗体和/或合成抗体。
如本文所用，“重组抗体”包括以重组手段制备、表达、形成或分离的所有抗体。术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指重组表达载体已被引入其中的细胞。重组宿主细胞包括例如CHO细胞或小鼠骨髓瘤SP2/0衍生的细胞系。重组抗体，诸如鼠科或嵌合鼠科-人或人-人抗体，可利用已知技术生产。参见例如Ausubel等人编辑的《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约的威利出版社(WileyInterscience,N.Y.)(1987年，1992年，1993年)；和Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(1989年)，其全部内容以引用的方式并入本文。
可制备具有相同或不同可变区域结合特异性的嵌合H链和L链的抗体、片段或衍生物，例如，根据已知的方法步骤(例如，根据Ausubel(在前)、Harlow(在后)和Colligan(在后))通过单独多肽链的适当缔合，这些参考文献全文以引用的方式并入本文。
利用该方法，表达嵌合H链(或其衍生物)的宿主与表达嵌合L链 (或其衍生物)的宿主单独地培养，并且免疫球蛋白链单独地回收，然后缔合。另选地，宿主可进行共培养，并且允许链在培养基中自发地缔合，然后回收组合的免疫球蛋白、片段或衍生物。
杂交体细胞通过融合非人抗hTNFα抗体生产细胞而形成，该非人抗 hTNFα抗体生产细胞通常为针对天然或重组人TNF免疫的动物的脾细胞，或人TNFα蛋白质序列的肽片段。另选地，非人抗TNFα抗体生产细胞可为获得自以TNF免疫的动物的血液、脾、淋巴结或其它组织的B淋巴细胞。
提供永生化功能的第二融合伴侣可为类淋巴细胞或浆细胞瘤或骨髓瘤细胞，其自身不是抗体生产细胞但为恶性的。在一些实施例中，融合伴侣细胞包括杂交瘤SP2/0-Ag14(缩写为SP2/0(ATCC CRL1581))和骨髓瘤 P3X63Ag8(ATCC TIB9)或其衍生物。参见例如Ausubel(在后)、Harlow (在后)和Colligan(在后)，这些参考文献全文以引用的方式并入本文。
如本文所用，“分离的抗体”意指这样的抗体，其基本上不含其他具有不同抗原特异性的抗体。然而，特异性地结合至人抗原的表位的分离抗体可具有对其它相关抗原的交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
用于通过对比性抑制确定mAb特异性和亲和力的方法可见于例如 Harlow等人，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY)，1988年；Colligan等人编辑的《现代免疫学方法》 (Current Protocols in Immunology)，纽约的格林出版联合公司和威利出版社 (Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.)(1992年，1993 年)；和Muller,《酶学方法》(Meth.Enzymol.)，92:-601(1983年)，这些文献全文以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，抗体可为生物活性抗体。生物活性抗体的比活性为天然(非合成)的、内源性或相关的和已知的抗体比活性的至少20％、30％或40％，并且优选为至少50％、60％或70％，并且最优选为至少80％、90％或95％-1000％。测定和定量酶促活性和底物特异性的量度的方法是本领域技术人员熟知的。
抗TNFα抗体
在一些实施例中，由本文所述的方法所生产的抗体为抗肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体。如本文所用，肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子(TNF) 可互换地使用，是指肿瘤坏死因子α(TNFα)，除非另外特别地注明。同样，肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子(TNF)抗体和抗肿瘤坏死因子α (TNFα)和抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体可互换地使用，除非另外特别地注明。
TNFα为17kD蛋白质子单元的可溶同源三聚体(Smith等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，262:6951-6954(1987年))。TNF的膜结合 26kD前体形式也存在(Kriegler等人，《细胞》(Cell)，53:45-53(1988 年))。对于TNF，参见等人，《自然》(Nature)，320:584(1986 年)，老版本，《科学》，(Science)，230:630(1986年)；和Le等人，《实验室研究》(Lab.Invest.)，56:234。根据Pennica等人，《自然》 (Nature)，312:724-729(1984年)，人TNFα的完整一级序列示出于图28 中(SEQ ID NO:1)。
TNFα可引起导致组织损伤的致炎作用。肿瘤坏死因子(TNFα)介导或涉及许多病理，诸如但不限于细菌、病毒或寄生虫性感染、慢性炎性疾病、自身免疫疾病、恶性肿瘤，和/或神经退化性疾病。因此，在一些实施例中，抗体具有针对TNF的中和和/或抑制活性。
在一些实施例中，抗体为高亲和力人-鼠科嵌合抗TNF抗体，和其片段或区域，其具有针对人TNFα的体内潜在抑制和/或中和活性。此类抗体和嵌合抗体可包括通过使用纯化重组hTNFα(SEQ ID NO:1)或其肽片段的免疫所生产的那些。
在一些实施例中，抗体和片段特异性地结合至TNFα。在一些实施例中，它们也可在体外、原位和/或体内降低、阻断、消除、干扰、防止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体标志、膜TNF 裂解、TNF活性、TNF生产和/或合成。
在一些实施例中，抗体为cA2。嵌合抗体cA2由高亲和力中和小鼠抗人TNFαIgG1抗体的抗原结合可变区域(命名为A2)和人IgG1κ免疫球蛋白的恒定区域组成。人IgG1 Fc区域改善同种异体抗体效应子功能，增加循环血清半衰期和减小抗体的免疫原性。嵌合抗体cA2的亲合力和表位特异性来源于鼠抗体A2的可变区。在具体实施例中，编码鼠科抗体A2的可变区域的核酸的来源是A2杂交瘤细胞系。
在一个实施例中，通过命名为c134A的细胞系生产鼠科单克隆抗体 A2。在一个实施例中，由命名为c168A的细胞系生产嵌合抗体cA2。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段可包含cA2的重链CDR3和/或 cA2的轻链CDR3中的至少一者。在一个具体实施例中，抗体或抗原结合片段可具有这样的抗原结合区域，该抗原结合区域包含至少一个重链CDR (即，CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，该重链CDR具有cA2 的对应CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，抗体或抗原结合部分或变体可具有这样的抗原结合区域，该抗原结合区域包含至少一个轻链CDR(即，CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，该轻链CDR具有cA2的对应CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列。在一个实施例中，抗体或抗原结合片段的三个重链CDR和三个轻链 CDR具有如本文所述的mAb A2或cA2中的至少一种的对应CDR的氨基酸序列。
嵌合A2的亲合力和表位特异性来源于鼠科A2的可变区域。在固相 ELISA中，已观察到嵌合A2和鼠科A2之间的TNF的交叉竞争，从而指示 cA2和鼠科A2的等同表位特异性。cA2对TNF-α的特异性通过其中和淋巴毒素(TNF-β)的细胞毒性效应的无能来确认。嵌合A2以依赖剂量的方式中和天然的和重组的人TNF的细胞毒性效应。根据cA2和重组人TNF的结合测定，cA2的亲和力常数计算为1.8×l09M1。
可用于确定TNF中和化合物的TNF中和活性的筛选方法可包括体外或体内测定。此类体外测定可包括TNF细胞毒性测定，诸如放射性免疫测定，其通过接触TNF(诸如分离形式或重组形式的黑猩猩或人TNF)确定细胞死亡的降低，其中TNF中和化合物的并行存在降低了细胞死亡的程度和速率。细胞死亡可利用ID50值确定，该ID50值表示将细胞死亡速率降低了50％的TNF中和化合物的浓度。例如，据发现，mAb's A2和cA2具有约17mg/ml+/-3mg/ml的ID50，诸如14-20mg/ml，或其中的任何范围或值。
在一些实施例中，这些抗体可对比性地体内抑制结合至抗TNFα鼠科 mAb A2、嵌合mAb cA2或抗体的人TNFα，该抗体具有与A2和/或cA2基本上相同的特异性结合特征，例如表位特异性。
由抗体以及其片段和区域所识别的表位可包括5个或更多个氨基酸，这些氨基酸包含下述TNF氨基酸序列的一者或两者的至少一种氨基酸(该氨基酸序列提供了由抗TNF活性、TNF抗体或其片段识别和/或与之结合的 TNF的形貌或三维表位)：
59-80：Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-
Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-
Thr-Ile(SEQ ID NO:1的AA 59-80)；和
87-108：Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-
Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-
Glu-Gly(SEQ ID NO:l的AA 87-108)。
在一些实施例中，抗体、抗TNF抗体的片段和区域识别表位，该表位包括5个氨基酸，这些氨基酸包含得自hTNFα(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基 87-108或残基59-80和87-108两者的至少一种氨基酸。在一些实施例中，抗体、抗TNF抗体的片段和区域不识别表位，该表位得自hTNFα(SEQ ID NO:1)的氨基酸11-13、37-42、49-57或155-157中的至少一个。(由Eck和Sprang(《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，26429：17595-17605(1989 年))所表示的推定受体结合部位。)
在一个实施例中，抗体为抗hTNF嵌合抗体，该抗hTNF嵌合抗体包含两个轻链和两个重链，这些链中的每个包含人恒定区域的至少部分和对人TNF具有特异性的非人起源的可变(V)区域的至少部分，所述抗体以高亲和力结合至人TNF的抑制和/或中和表位。
在一个实施例中，抗体用于诊断方法，该诊断方法用于检测患者或动物中的TNF，该患者或动物被怀疑患有与异常TNF生产相关联的病症。在一些实施例中，TNF抗体用于减轻涉及TNF的症状或病理，诸如但不限于细菌、病毒或寄生感染、慢性炎性疾病、自身免疫疾病、恶性肿瘤，和/或神经退化性疾病。
生产对人TNFα或TNFβ特异性的mAb的鼠科杂交瘤通过融合小鼠融合伴侣细胞而形成，该小鼠融合伴侣细胞诸如针对纯化hTNFα、重组 hTNFα、天然或合成TNF肽免疫的小鼠SP2/0和脾细胞，该肽包括含有5 个或更多个氨基酸的肽，这些氨基酸选自TNF(SEQ ID NO:1)的残基59-80 和87-108，或含有TNF的其它生物制剂。为使小鼠免疫，可遵循多种不同常规方法。例如，小鼠可接收TNF的初级免疫和强化免疫。
本文所述的抗体可以宽泛范围的亲和力(KD)结合人TNF。在一个实施例中，至少一种人mAb可任选以高的亲和力结合人TNF。例如，人mAb 可以等于或小于约10-7M，诸如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)×10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或其中的任何范围或数值的 KD结合人TNF。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适的方法通过实验确定。 (参见例如，Berzofsky等人，“抗体-抗原交互作用(Antibody-Antigen Interactions)”，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，Paul，W.E.编辑，纽约州纽约的乌鸦出版社(Raven Press:New York,NY)(1984年)； Kuby，Janis，《免疫学》(Immunology)，纽约州纽约的威廉W.H.弗里曼出版集团(W.H.Freeman and Company:New York,NY)(1992年)；以及本文所描述的方法)。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则测得的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如KD、Ka、Kd)的测量优选地用抗体和抗原的标准溶液以及标准缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)来进行。
抗TNF抗体可包含具有确定氨基酸序列的重链或轻链可变区中的至少一者。例如，在一个实施例中，抗TNF抗体包含任选地具有SEQ ID NO： 3的氨基酸序列的至少一个轻链可变区域和/或任选地具有SEQ ID NO：5 的氨基酸序列的至少一个重链可变区域中的至少一个。结合至人TNF且包含确定的重链或轻链可变区域的抗体，可如本领域已知和/或如本文所述用合适方法诸如噬菌体展示(Katsube,Y.等人，《国际分子医学杂志》(Int JMol.Med)，1(5):863-868(1998年))或采用转基因动物的方法制备。在一个实施例中，抗TNF抗体包含轻链CDR，分别对应于SEQ ID NO:3的氨基酸残基24-34、50-56和89-97的CDR1、CDR2和CDR3序列；和重链 CDR，分别对应于SEQ ID NO:5的氨基酸残基31-35、50-68和101-109的 HCDR1、HCDR2和HCDR3；根据Kabat描绘。
抗TNF抗体还可任选包含SEQ ID NO：3和5中至少一者的70-100％的邻接氨基酸中的至少一者所成的多肽。
在一些实施例中，免疫球蛋白链或其部分(如可变区域)的氨基酸序列与SEQ IDNOS:3和5中至少一者的相应链的氨基酸序列具有约70-100％的同一性(例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或值)。例如，轻链可变区域的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:8的序列进行比较，或者重链CDR3的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:7进行比较。优选地，用本领域已知的合适计算机算法确定出70-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100或者其中的任何范围或值)。
在SEQ ID 3和5中提供了示例性重链和轻链可变区域序列。抗体可包含任何数目的来自抗体的邻接氨基酸残基，其中该数目选自由抗TNF抗体中邻接残基数目的10-100％组成的整数。任选地，该邻接氨基酸亚序列长度为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多个氨基酸，或其中的任何范围或数值。此外，所述亚序列的数目可以为选自1 至20的任何整数，诸如至少2、3、4或5。
抗体还包括用于TNF免疫测定法和TNF介导病变的疗法两者的高亲和力和/或潜在体内TNF抑制和/或中和抗体、其片段或区域。此类抗体、片段或区域将优选地具有对hTNFα的亲和力，表达为Ka，该亲和力为至少 108M-1，更优选地至少109M-1，诸如l08-I010M-1、5×108M-1、8×108M-1、2 ×109M-1、4×109M-1、6×109M-1、8×109M-1，或其中的任何范围或值。
TNF抗体还包括高亲和力鼠科和嵌合抗体以及片段、区域和衍生物，它们具有阻断TNF诱导的IL-6分泌的潜在体内TNFα抑制和/或中和活性。在一些实施例中，人治疗用途的抗体包括高亲和力鼠科和嵌合抗TNFα抗体，以及其片段、区域和衍生物，它们阻断TNF诱导的促凝血活性，包括阻断TNF诱导的细胞粘附分子(诸如ELAM-I和ICAM-I)的表达，以及在体内、原位和体外阻断TNF促有丝分裂活性。
单克隆抗TNF抗体的额外示例在本领域中有描述(参见，例如美国专利5,231,024；A.等人，Cytokine 2(3):162-169(1990)；美国专利申请 07/943,852(提交于1992年9月11日)；Rathjen等人，国际公布WO 91/02078(公开于1991年2月21日)；Rubin等人，EPO专利公布0218 868(公开于1987年4月22日)；Yone等人，EPO专利公布0288088 (1988年10月26日)；Liang等人，《生物化学和生物物理研究通讯》 (Biochem.Biophys.Res.Comm.)，137:847-854(1986年)；Meager等人，《杂交瘤》(Hybridoma)，6:305-311(1987年)；Fendly等人，《杂交瘤》 (Hybridoma)，6:359-369(1987年)；Bringman等人，《杂交瘤》 (Hybridoma)，6:489-507(1987年)；以及Hirai等人，《免疫法杂志》 (J.Meth.)，96:57-62(1987年)，这些文献全文以引用的方式并入本文)。
下文所述的示例的结果证实了多个重要发现：
CTL去除通过控制细胞外Zn+2可被控制至小于最大水平。例如，如通过下文所描述的SMF-10.1实验、DOE3实验、BSA共混实验1和BSA共混实验2中的实验性臂所证实，CTL含量可通过将细胞外Zn+2浓度控制至≤1.2μM的值被控制在一定范围内(例如，40％至70％)。另外，如DOE3 实验中所展示，用至多6.3μM的较高Zn+2浓度控制至CTL含量的较高范围是可能的。
此外，如通过DOE3实验、BSA共混实验1和BSA共混实验2中的实验性臂所展示，在细胞外Zn+2浓度的一定范围内，CTL含量还可通过控制细胞外[EDTA]或[EDTA–Fe+3]进行控制。
此外，唾液酸含量通过控制细胞外Zn+2可被控制至小于最大水平。例如，如通过DOE3实验、BSA共混实验1和BSA共混实验2中的实验性臂所展示，唾液酸含量可通过将细胞外Zn+2浓度控制至≤1.2μM的值被控制在一定范围内(例如，4％至13％)。另外，如DOE3实验中所证实，用至多6.3μM的较高Zn+2浓度对唾液酸含量的较高范围的控制是可能的。
另外，如通过DOE3实验、BSA共混实验1和BSA共混实验2所展示，在细胞外Zn+2浓度的一定范围内，唾液酸含量还可通过控制细胞外 [EDTA]或[EDTA–Fe+3]进行控制。
此外，如SMF-10.3实验和DOE3实验所展示，抗体生产还可通过控制细胞外Zn+2浓度进行控制。
通过各种手段可实现Zn+2、Fe+3和EDTA浓度的控制以实现唾液酸添加、CTL去除和抗体生产的控制，这些手段包括下述中的任一者(单独或组合)：1)将Zn+2、Fe+3和EDTA直接添加至培养基，2)通过共混具有作为组分的Zn+2、Fe+3或EDTA的原材料，3)通过处理原材料以调整 Zn+2、Fe+3或EDTA浓度，和/或4)通过修改复合原材料的制造过程以达到Zn+2、Fe+3和/或EDTA的所需水平。
例证
材料和方法
本文所述的实验以某些操作条件在受控3L的生物反应器中进行，这些操作条件已被证实用于提供代表商业英利昔单抗过程的结果。
在指示天，英利昔单抗利用蛋白质A柱通过直接产品捕获(DPC)进行纯化。其然后通过毛细管等电聚焦(cIEF)或WAX测定来表征。已利用蛋白质A柱通过DPC纯化的英利昔单抗在本文中称为“DPC样品”或“DPC 洗脱物”。
实例1-cIEF方法
cIEF用于计算英利昔单抗低聚糖的CTL含量。在英利昔单抗预配制整体(PFB)的分析中明显存在三个电荷异质性源：(1)CTL变化；(2)唾液酸含量；和(3)脱酰氨基。早期、中期和后期商业生物反应器样品的典型英利昔单抗洗脱物表现出英利昔单抗的重链的CTL去除为约30％至80％，其中PFB中的平均CTL去除为约40％至60％。轻链CTL未进行去除。 CTL去除对于早期生物反应器样品往往为较低的，并且对于中期和后期生物反应器样品增加。早期和后期生物反应器样品的典型英利昔单抗洗脱物表现出约3％至14％的IgG低聚糖的唾液酸含量。唾液酸添加对于早期生物反应器样品通常为较低的，并且对于中期和后期生物反应器样品为较高的。反相肽映射在重链和轻链上显示出在英利昔单抗的一些脱酰氨基位点一致的、低水平的脱酰氨基作用。
这种电荷异质性通常导致cIEF电描记图中的4至6个峰。峰1对应于不含过量电荷的英利昔单抗；即，该峰或带包含两个C端赖氨酸、不含唾液酸并且没有脱酰氨基作用。由于CTL去除、唾液酸添加和脱酰氨基作用的组合，第二、第三、第四、第五和第六峰或带分别包含1、2、3、4和5 个过量电荷。
图1为英利昔单抗的样品的cIEF电描记图，并且示出了峰1-6的pI 值。
由于较高水平的CTL去除、低水平的唾液酸添加和脱酰氨基的一致性，峰1的相对百分比与CTL去除高度相关联。图2为作为峰1百分比的函数的缺乏赖氨酸(des-Lys)的拟合线曲线图，并且示出了CTL含量(表达为des-Lys的百分比)和整个实验条件范围内的峰1百分比之间的相关性。图2中所描绘的相关性形成自英利昔单抗样品，对于英利昔单抗样品，des- Lys百分比通过肽映射进行确定并且峰1百分比通过cIEF进行确定。
CTL含量在本文中表达为具有C端赖氨酸的重链的百分比，并且可利用下述公式进行计算：CTL含量(％)＝(具有CTL的重链数)/(重链的总数)×100。CTL去除在本文中表达为缺乏C端赖氨酸(des-Lys)的重链的百分比。因此，“80％的Des-Lys”等同于20％的CTL含量。缺乏赖氨酸百分比和峰1百分比(如通过cIEF测量)之间的相关性保存用于英利昔单抗样品，该英利昔单抗样品表现出CTL去除、唾液酸添加和脱酰氨基作用的典型百分比。因此，这种相关性将应用于本文所描述的实验，因为：(1) 通过WAX的唾液酸添加已被确定用于这些实验的多个DPC样品，并且结果指示出唾液酸保持在早期生物反应器样品的3％至晚期生物反应器样品的约14％的典型范围内(即，唾液酸百分比保持在用于生成图1的相关性的数据范围内)；和(2)可合理地认定，脱酰氨基作用百分比保持为低的和一致的，如同用于生成图1的相关性的实验样品的情况。
这些实验中的CTL去除在30％-60％的典型值至更高值的范围内。在这些条件下，CTL去除将继续为峰1百分比的主导决定簇。
实例2-WAX测定
WAX测定用于确定英利昔单抗低聚糖的唾液酸含量和半乳糖含量。在该测定中，N-键合低聚糖利用PNGase F从IgG释放，然后利用邻氨基苯甲酸和氰基硼氢化钠的溶液进行衍生。样品利用0.45微米的尼龙过滤器进行纯化，并用荧光检测器在Agilent 1100 HPLC上进行分析。峰种类利用可商购获得的N聚糖标准物进行解析。
在本文所描述的WAX测定中，组分5A为含有唾液酸的英利昔单抗低聚糖的百分比。组分1与缺乏半乳糖的英利昔单抗低聚糖的百分比高度相关联。因此，(100－组分1的百分比)表示含有半乳糖的英利昔单抗低聚糖的百分比的合理预估。
在英利昔单抗的重链中，一个天冬酰胺(Asn)残基用低聚糖进行糖基化，该低聚糖可包含例如一个或两个半乳糖残基和一个或两个唾液酸残基。英利昔单抗的半乳糖含量在本文中表达为含有半乳糖的低聚糖的百分比，并且可利用下述公式进行计算：半乳糖含量(％)＝(含有半乳糖的低聚糖的数量)/(低聚糖的总数)×100。该公式独立地应用低聚糖中半乳糖单元的数量换句话讲，无论低聚糖中是否存在例如一个或两个半乳糖残基，出于计算半乳糖含量的目的，低聚糖仅计数一次。
英利昔单抗的唾液酸含量在本文中表达为含有唾液酸的低聚糖的百分比，并且可利用下述公式进行计算：唾液酸含量(％)＝(含有唾液酸的低聚糖的数量)/(低聚糖的总数)×100。该公式独立地应用低聚糖中唾液酸残基的数量。换句话讲，无论低聚糖中是否存在例如一个或两个唾液酸残基，出于计算唾液酸含量的目的，低聚糖仅计数一次。
通常，英利昔单抗的两个重链被糖基化。然而，在一些情况下，重链中的一些保持非糖基化。例如，在一些实施例中，约94％的英利昔单抗分子在两个链上被糖基化，约6％的英利昔单抗分子被半糖基化，和约0.1％的英利昔单抗分子被完全非糖基化。
唾液酸对半乳糖的比率根据英利昔单抗的低聚糖中唾液酸对半乳糖的摩尔比进行计算。
实例3-收获保存研究
进行两项研究，其中无细胞英利昔单抗收获被保存延长的周期。这些研究的目的是理解CTL去除是否可在细胞外发生(即，分泌后)。
唾液酸已知在分泌之前在细胞内被添加至糖蛋白。然而，唾液酸从分泌的重组糖蛋白的细胞外去除已被报告用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养。对于CHO细胞，唾液酸酶从裂解细胞被释放入细胞外介质中。因此，这些收获保存研究的第二目的是澄清在英利昔单抗的无细胞收获过程中是否存在唾液酸的细胞外去除。
利用从制造规模生物反应器的收获的收获保存研究证明，将收获保存在不同条件下(澄清无细胞收获在2至14℃下保存30天；非澄清收获在2 至8℃下保存14天)和改变生物反应器时期对英利昔单抗的cIEF凝胶外形没有影响。
为支持这些结果，进行另一项收获保存研究。从两个生物反应器收集英利昔单抗无细胞收获。对于每个生物反应器，收获的一部分立即通过蛋白质A色谱法进行纯化以生产DPC洗脱物。收获的另一部分在处理为DPC 洗脱物之前在10-14℃(典型存储温度)之间的温度下存储7天。保存收获的温度通过冷藏机中的探针进行监测并通过手动调整进行控制。然后，四份DPC洗脱物样通过cIEF分析电荷分布变化的任何迹象，该电荷分布变化将指示收获中的CTL或唾液酸去除。
该保存研究显示出，对于在蛋白质A纯化之前在10-12℃的温度下从收获或从保存7天的收获立即制得的DPC洗脱物，cIEF图案中无显著差异。
收获保存研究证实，CTL从英利昔单抗的重链的去除很可能在细胞内发生。同样，英利昔单抗低聚糖的唾液酸含量在细胞内确定。
实例4-SFM-10.1实验
术语SFM10.1对应于缺乏BSA和CM2(部分B)液体(包含含锌胰岛素)的英利昔单抗SFM-10介质。SFM-10.1实验的目的是探测Zn+2补充对英利昔单抗的生产的影响。
四个实验条件表示补充有硫酸锌七水合物的SFM-10.1介质，该硫酸锌七水合物以足以将0.25、0.5、1.0或2.0μM的Zn+2添加至最终介质浓度的量进行添加。每个实验中的总Zn+2浓度为该补充加上由(购自威斯康星州伯洛伊特的凯瑞食品配料和香精公司(Kerry Ingredients and Flavours,Beloit,WI))贡献的Zn+2(其确定为0.49μM(基于金属分析)) 之和。因此，这些四个生物反应器中的总锌浓度合理地预估为0.74、1.0、1.5和2.5μM。这些生物反应器中的Fe+3浓度为5.8μM，基于所采用的批料的金属分析。EDTA浓度预估为2μM，由铁传递蛋白贡献。EDTA对于Fe+3具有比对于Zn+2和其它二价阳离子远远强的亲和力。因此，[EDTA–Fe+3]的计算可表示可用于螯合Zn+2的EDTA浓度。因此，在第一组的实验中，可期望的是不存在可用于结合细胞外Zn2+的游离EDTA。
表1.SFM-10.1实验的四个生物反应器中的Zn+2、Fe+3、EDTA和[EDTA–Fe+3]的浓度 (浓度以μM为单位)。
生物反应器臂 [Zn+2] [Fe+3] [EDTA] [EDTA–Fe]
Zn:0.74μM 0.74 5.8 2 -3.8
Zn:1.0μM 0.99 5.8 2 -3.8
Zn:1.5μM 1.5 5.8 2 -3.8
Zn:2.5μM 2.5 5.8 2 -3.8
图3为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表；并且示出了改变Zn+2浓度对CTL去除的影响。具有约1.5和2.5μM的总Zn+2浓度的生物反应器在所有时间点表现出70％至80％的CTL去除。作为生物反应器时期的函数的电荷分布无变化，因为所有时间点(早期、中期和后期生物反应器样品)具有高CTL去除。具有1.0μM的Zn+2浓度的生物反应器在研究中的早期表现出60％的CTL去除，并且在中期和后期样品点表现出约 70％的去除。具有约0.74μM的Zn+2浓度的生物反应器表现出作为生物反应器时期的函数的增加CTL去除。
图4为作为生物反应器时期的函数的具有唾液酸的英利昔单抗低聚糖百分比的图表，如通过WAX方法所确定；并且示出了改变Zn+2浓度对唾液酸百分比的影响。图4示出了在本实验中不存在作为Zn+2浓度的函数的唾液酸添加的明确趋势。
未知的是，这种影响的缺乏是否表示唾液酸含量在SFM-10.1介质的情况下对细胞外Zn+2浓度的真实不敏感性，其是否反映少量的生物反应器所给定的实验噪音，或是否可能已成为实验实施的程序问题。
图5-7分别为作为时间的函数的活细胞密度、培养存活率和英利昔单抗浓度的图表，并且示出了在SFM-10.1实验中改变Zn+2浓度的影响。在达到目标细胞密度之前的约第15-20天周期中的结果是最明显的，因为这表示其中每个生物反应器被一致地操作的周期。在达到目标细胞密度之后，细胞每天从培养物移除以试图维持目标细胞浓度，并且该移除过程的变型形式可引起细胞密度、培养存活率和抗体浓度的波动。
在SFM-10.1实验中，具有0.74μM的Zn+2的生物反应器在达到目标细胞密度之前具有比含有1.5和2.5μM的Zn+2的生物反应器低的细胞生长速率、低的培养存活率和低的抗体浓度。具有1.0μM的Zn+2的生物反应器在每种情况下表现这样的性能，该性能为具有0.74μM的Zn+2的生物反应器和具有1.5或2.5μM的Zn+2的生物反应器之间的中间值。
该实验的条件有利于通过SP2/0细胞的Zn+2积聚。[EDTA–Fe+3]小于零，从而指示所有EDTA螯合至Fe+3并且不可用于螯合细胞外介质中的 Zn+2。此外，另一种潜在螯合剂BSA不存在于介质中。
尽管对于Zn+2积聚的这些有利条件，但是实验结果指示了0.74和 1.0μM的细胞外Zn+2浓度对CTL去除、初始细胞生长、培养存活率和抗体浓度的影响，特别是在培养的前20天。这些结果未示出Zn+2在该实验的条件下对唾液酸添加的明确影响。
虽然不希望受任何特定理论束缚，但是这些结果与下述假设一致：
·SP2/0细胞必然积聚细胞内Zn+2以支持与具有Zn+2辅因子要求的酶相关联的细胞内过程。这包括响应于CTL去除、细胞生长、细胞分裂和抗体生产的酶。
·大约0.74至1.0μM的Zn+2浓度在生产物反应器过程的初始阶段期间不提供足够的细胞外Zn+2来充分地供应这些需要Zn+2的细胞内过程。
·效应在培养的前20天最为明显。这是其中细胞内Zn+2的量/细胞由于细胞分裂持续减少的周期。即，每当细胞分裂时，积聚的Zn+2 在子代细胞之间被分解。在0.74至1.0μM的细胞外Zn+2时，Zn+2 的细胞合并由于细胞倍增不能跟上Zn+2的细胞减少。因此，细胞对Zn+2是不足的，并且表现出非最佳的细胞生长、培养存活率和抗体生产率。
·在约第20天之后，细胞接近其灌注培养物的目标细胞密度，并且细胞分裂减慢。从这点开始，细胞内Zn+2减少速率由于细胞分裂而减慢，并且细胞合并不足以确保Zn+2积聚/细胞随时间而增加。在这些条件下和在第20天之后，细胞逐渐地增加其细胞内存储的Zn+2。
·对于具有0.74μM的Zn+2的生物反应器，作为生物反应器时期的函数的Zn+2积聚的图案响应于作为生物反应器时期的函数的cIEF图案的所观察变化。即，当细胞内酶羧肽酶对所需的Zn+2辅因子将为最不足的时，CTL去除在第20天，在培养物中这点为最小值。在细胞分裂减慢之后和在第20天之后，CTL去除由于增加Zn+2积聚而增加，从而导致增加的羧肽酶功能。
对于具有1.5μM和2.5μM的Zn+2的实验臂，细胞外Zn+2浓度为充分高的，使得细胞酶在培养物中的任何点未经历Zn+2不足。因此，CTL去除从第20天至第60天为高速率。同样，作为培养天的函数的细胞生长、培养存活率和抗体生产以高速率继续进行。
实例5-DOE3实验
遵循SFM-10.1实验所生成的指导，利用商业英利昔单抗SFM-10介质执行更详细的实验，以探测细胞外Zn+2、EDTA和Fe+3浓度对CTL去除、唾液酸添加、细胞生长、培养存活率和抗体生产的影响。
据推论，将Zn+2细胞外结合至EDTA可假设地抑制Zn+2的细胞内积聚。因为细胞外Fe+3对于EDTA将具有比Zn+2远远高的结合亲和力，所以据推论，确定Zn+2的细胞内积聚的关键因素可能为[EDTA–Fe+3]。
DOE3实验包括十二个生物反应器。该实验的介质为商业SFM-10介质。胰岛素、铁传递蛋白和BSA的所选择批料形成了 0.76μM的Zn+2、5.9μM的EDTA和0.9μM的Fe+3的基准水平。实验条件的基质通过补充Zn+2、EDTA和/或Fe+3而形成，如表2所指示。
表2.DOE3实验的十二个生物反应器中的Zn+2、Fe+3、EDTA和[EDTA–Fe+3]的浓度 (浓度以μM为单位)。
a生物反应器臂通过Fe+3、Zn+2和EDTA的大约浓度(单位为μM)来命名。
b生物反应器“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”(M12COO3)具有实验方法的显著偏差。在第13天之前，介质的Zn+2浓度为6.3μM。在第13天，介质被调整至0.76μM的目标值。即，该生物反应器在细胞培养的早期经受极高的Zn+2浓度。
在DOE3实验中，总Zn+2浓度在0.76至1.7μM的范围内，Fe+3浓度在0.90至5.4μM的范围内，EDTA浓度在5.9至26.8μM的范围内，并且 [EDTA–Fe+3]在0.53至23.6μM的范围内。
在DOE3实验结果的分析中，Zn+2的影响对于细胞外[EDTA]和 [EDTA–Fe+3]的影响是主导的。因此，合理的是在下述展示的结果中将作为每个生物反应器中的[Zn+2]的函数的DOE3实验结果进行分组；六个生物反应器对于[Zn+2]的目标为0.76μM并且六个生物反应器对于[Zn+2]的目标为1.7μM。
图8A为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表，并且示出了在存在0.76μM的Zn+2(对应于标签“Fe:5 Zn:1 EDTA:10”的生物反应器中 Zn+2的初始浓度为6.3μM，而非0.76μM；0.76μM的Zn+2的目标浓度从第 13天实施直至实验结束)的情况下改变EDTA浓度对CTL去除的影响。图8B为作为生物反应器时期的函数的CTL去除(表达为des-Lys的百分比，并且根据峰1数据利用cIEF方法进行计算)的图表；并且示出了在存在 1.7μM的Zn+2的情况下改变EDTA浓度对CTL去除的影响。如在SFM- 10.1实验中，DOE3实验的生物反应器表现出CTL去除百分比和Zn+2浓度之间的强力关系。
具有0.76μM的Zn+2的生物反应器表现出比具有1.7μM的Zn+2的生物反应器显著低的CTL去除百分数。具有较高Zn+2浓度的生物反应器在培养的早期、中期和后期表现出60％至75％的CTL去除。具有较低Zn+2 浓度的生物反应器在第10-20天表现出40％的CTL去除，并且CTL去除作为培养天的函数逐渐地升高，在培养结束时接近60％的CTL去除。这些结果与在SFM-10.1实验中所观察的Zn+2浓度的影响一致。
如先前所注明，标记“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”的生物反应器在第13天之前出现6.3μM的极高Zn+2浓度，这关联至在培养的早期80％的CTL去除，该研究中所达到的最高CTL去除。该生物反应器中CTL去除百分比在第13天将其介质浓度校正至0.76μM的Zn+2之后逐渐地降低。由于约0.7 培养物体积/天的灌注速率，生产生物反应器中的Zn+2浓度将在10天或更少天内下落至0.76μM。然而，CTL去除百分比在该生物反应器中比在 0.76μM的Zn+2的其姊妹生物反应器中保持高得多。即，细胞似乎具有“记住”以往Zn+2暴露的机制。
虽然不希望受任何特定理论束缚，但是据假设，该细胞“记忆”涉及细胞内部Zn+2的积聚。该积聚的Zn+2不能通过细胞外Zn+2浓度的急剧减小而反向。可能的是，积聚的Zn+2/细胞可仅通过后续的细胞分裂被减少，其中积聚的Zn+2在子代细胞之间进行分裂。在DOE3实验的条件下，细胞分裂的程度在细胞在约第15-20天达到目标细胞密度之后被限制。
生物反应器“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”的CTL去除在第10和13天为约 80％，高于1.7μM的Zn+2的生物反应器。这表明，在DOE3实验的实验条件下，1.7μM的Zn+2不足以使细胞对Zn+2的需求饱和。
如上文所注明，DOE3实验的结果与Zn+2浓度强力相关联。然而，在给定Zn+2浓度的结果范围内，存在EDTA(或EDTA–Fe+3)对CTL去除的影响的迹象。在具有0.7μM的Zn+2的生物反应器之间，在第13、20 和28天具有最低CTL去除的两个生物反应器具有最高[EDTA]和[EDTA– Fe+3](生物反应器“Fe:1 Zn:1 EDTA:25”和“Fe:5 Zn:1 EDTA:28”)(图 8A)。相反地，具有最低[EDTA]和[EDTA–Fe+3]的生物反应器具有最高 CTL去除(“Fe:1 Zn:1 EDTA:6”)。
同样，在具有1.7μM的Zn+2的生物反应器之间，在第13、20和28 天具有最低CTL去除的生物反应器具有最高[EDTA]和[EDTA– Fe+3](“Fe:3 Zn:2 EDTA:27”)(图8B)。
图9A和9B示出，在DOE3实验中存在作为[Zn+2]的函数的唾液酸含量的显著差异。在第10-20天，在具有1.7μM的Zn+2的生物反应器中(图 9B)存在比在0.76μM下的生物反应器中(图9A)显著高的唾液酸含量。对于“后期”生物反应器样品，唾液酸含量的差值缩小，但在1.7μM的 Zn+2下仍比在0.76μM的Zn+2下高。
图9A和9B还为上文所讨论的细胞“Zn+2记忆”的迹象。在生物反应器“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”中，唾液酸含量在该生物反应器的最早时间点为极高的，并且在整个培养周期内保持远远高于具有0.76μM的Zn+2的其姊妹生物反应器，尽管事实是所有生物反应器中的细胞外Zn+2浓度在大约第 20天将为相同的。
生物反应器“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”的唾液酸含量在第10和13天为约 18％，显著高于具有1.7μM的Zn+2的生物反应器。这表明，在DOE3实验的实验条件下，1.7μM的Zn+2不足以使细胞对Zn+2的需求饱和以支持唾液酸添加。
如上文所注明，DOE3实验的结果与Zn+2浓度强力相关联。然而，在给定Zn+2浓度的结果范围内，存在EDTA(或EDTA–Fe+3)对唾液酸添加的影响的迹象。图9A示出了，在具有0.7μM的Zn+2的生物反应器之间，唾液酸含量在第38天随着[EDTA]降低而增加。图9B示出了，在第20 和38天，唾液酸含量随着[EDTA]降低而增加。
在DOE3实验中，具有0.76μM的Zn+2的五个生物反应器在前20天期间(在达到目标细胞密度之前)具有比具有1.7μM的Zn+2的六个生物反应器远远低的细胞生长速率(图10)。如先前所注明，标记“Fe:5,Zn:1, EDTA:10”的生物反应器在第13天之前出现6.3μM的极高Zn+2浓度。该生物反应器在第20天之前的周期内表现出细胞生长行为，这匹配具有 1.7μM的Zn+2的生物反应器。这些数据表明，1.7μM的细胞外Zn+2浓度不足以使细胞对Zn+2用于细胞分裂的细胞内需求饱和。
图11A和11B示出，具有0.76μM的Zn+2的五个生物反应器的培养存活率在前30天期间比具有1.7μM的Zn+2的六个生物反应器的培养存活率低。特别注意，标记“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”的生物反应器在第10和13天表现出高培养存活率，但在校正Zn+2浓度之后立刻回复以匹配具有 0.76μM的Zn+2浓度的其姊妹生物反应器。这支持如下假设，培养存活率与细胞外Zn+2的瞬时浓度相关，与细胞内的Zn+2存储无关。
图12A和12B示出，具有0.76μM的Zn+2的五个生物反应器的抗体浓度在前20天期间比具有1.7μM的Zn+2的六个生物反应器低。标记“Fe:5, Zn:1,EDTA:10”的生物反应器表现出相当于1.7μM的Zn+2的生物反应器的抗体浓度，从而支持如下假设，抗体生产与积聚Zn+2相关，而非与细胞外Zn+2的瞬时值相关。
图10、11A、11B、12A和12B示出，在DOE3结果中的[EDTA]和活细胞密度、培养存活率和抗体浓度之间无明确相关性。
DOE3实验包括特定范围的[Zn+2]、[EDTA]和[EDTA-Fe+3]。例如， [EDTA–Fe+3]在0.5至23μM的范围内。然而，这些实验的成果中的主导因素为Zn+2的细胞外浓度，其在0.76μM至1.7μM的范围内(并且在生物反应器“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”中初始地为6.3μM)。具有1.7μM的细胞外 Zn+2的生物反应器具有比具有0.76μM的细胞外Zn+2的生物反应器显著高的CTL去除、唾液酸含量、初始细胞生长、初始培养存活率和初始抗体生产(图8A、8B、9A、9B、10、11A、11B、12A和12B)。
在给定Zn+2浓度的生物反应器内，存在有[EDTA](或[EDTA– Fe+3])对CTL去除和唾液酸添加的次级影响的一些迹象(图8A、8B、9A 和9B)。这些结果为提供[EDTA]对细胞生长、培养存活率和抗体生产的影响的迹象(图10、11A、11B、12A和12B)。[EDTA]的影响在BSA共混实验#1和#2中进行更完全探究以在下一章节讨论。
“Fe:5,Zn:1,EDTA:10”的生物反应器在第13天之前出现6.3μM的极高Zn+2浓度，然后返回至0.76μM的目标Zn+2浓度。该生物反应器表现出对于具有1.7μM的Zn+2的生物反应器的相当初始细胞生长(图10)、培养存活率(图11A和11B)和抗体生产率(图12A和12B)。然而，该生物反应器表现出比1.7μM的Zn+2的生物反应器大的初始CTL去除和唾液酸含量。该生物反应器表现出对于初始高Zn+2浓度的“记忆”，该“记忆”良好地延伸超过对于CTL去除、唾液酸含量、细胞密度和抗体生产的细胞外Zn+2浓度校正(图8A、8B、9A、9B、10、12A和12B)。然而，该生物反应器未表现出对于培养存活率的记忆；即，随着细胞外Zn+2浓度从6.3μM下降至0.76μM，培养存活率无延缓地被校正(图11A和11B)。
图9C和9D为作为生物反应器时期的函数的G0F(WAX组分1)百分比的图表；并且示出了在存在0.76μM的Zn+2和1.7μM的Zn+2的情况下改变EDTA浓度对非半乳糖化物质的影响。
DOE3实验的结果与先前对于SFM-10.1实验所表达的假设一致。另外的假设还呈现：
·CTL去除、唾液酸添加、细胞生长和抗体表达与细胞内Zn+2的积聚量相关，而非与Zn+2的当前细胞外浓度相关。Zn+2的积聚存储基于细胞外Zn+2以往历史，而非即时细胞外浓度。这是有关以往细胞外Zn+2的“细胞记忆”的基础。
·培养存活率与Zn+2的当前细胞外浓度相关。
在该实验的条件下，1.7μM的Zn+2的细胞外浓度足以使细胞对Zn+2 的需求饱和以支持与细胞生长和抗体表达相关的酶活性。然而，1.7μM的 Zn+2不足以使细胞对Zn+2的需求饱和来支持CTL去除或唾液酸添加。这些假设受在第13天之前具有6.3μM的Zn+2浓度的生物反应器“Fe:5,Zn:1, EDTA:10”的结果支持。
实例6-BSA共混实验1和2
这两个实验采用SFM-10介质。在每个实验中，采用相同批料的和胰岛素，从而确保Zn+2和Fe+3的恒定浓度。在BSA共混实验1和2中，Zn+2浓度分别为1.1μM和1.2μM。
在每个实验中，包含高和低EDTA浓度的BSA批料被识别，然后在生物反应器中混合以形成特定范围的EDTA浓度。BSA共混实验1采用八个生物反应器，其中生物反应器以四个EDTA浓度重复。BSA共混实验1中的重复生物反应器标记为“A”和“B”。BSA共混实验2采用八个生物反应器，各自具有不同EDTA浓度。表3和4列出了BSA共混实验1和2中生物反应器的Zn+2、Fe+3、EDTA和EDTA–Fe浓度。
表3.BSA共混实验1的八个生物反应器中的Zn+2、Fe+3、EDTA和[EDTA–Fe+3]的浓度 (浓度以μM为单位)。
生物反应器臂<sup>a</sup> [Zn+2] [Fe+3] [EDTA] [EDTA–Fe]
“EDTA:6(A)” 1.2 3.1 5.9 2.8
“EDTA:6(B)” 1.2 3.1 5.9 2.8
“EDTA:11(A)” 1.2 3.1 10.8 7.7
“EDTA:11(B)” 1.2 3.1 10.8 7.7
“EDTA:13(A)” 1.2 3.1 13.2 10.1
“EDTA:13(B)” 1.2 3.1 13.2 10.1
“EDTA:16(A)” 1.2 3.1 15.7 12.5
“EDTA:16(B)” 1.2 3.1 15.7 12.5
a生物反应器臂通过EDTA的大约浓度(单位为μM)来命名。
表4.BSA共混实验2的八个生物反应器中的Zn+2、Fe+3、EDTA和[EDTA–Fe+3]的浓度 (浓度以μM为单位)。
生物反应器臂<sup>a</sup> [Zn+2] [Fe+3] [EDTA] [EDTA–Fe]
“EDTA:2.7” 1.1 4.5 2.7 -1.8
“EDTA:4.5” 1.1 4.5 4.5 0.0
“EDTA:4.9” 1.1 4.5 4.9 0.5
“EDTA:14.6” 1.1 4.5 14.6 10.1
“EDTA:15.5” 1.1 4.5 15.5 11.0
“EDTA:15.7” 1.1 4.5 15.7 11.2
“EDTA:19.2” 1.1 4.5 19.2 14.7
“EDTA:26.5” 1.1 4.5 26.5 22.0
a生物反应器臂通过EDTA的大约浓度(单位为μM)来命名。
在两个BSA共混实验中，具有较高EDTA浓度的生物反应器出现较低 CTL去除，反之亦然(具有较低EDTA浓度的生物反应器出现增加CTL去除)。影响在每个实验中第35天下是最明显的，然后在随后的培养天减弱 (图13A和14A)。
在两个BSA共混实验中，具有较高EDTA浓度的生物反应器具有较低唾液酸含量，反之亦然(具有较低EDTA浓度的生物反应器具有较高唾液酸含量)。效果对于早期、中期和后期生物反应器样品持续(图13B和 14B)。
在两个BSA共混实验中，具有较高EDTA和较低EDTA浓度的生物反应器表现出相当的细胞生长(图13C和14C)和相当的培养存活率(图 13D和14D)。
在BSA共混实验中注意到EDTA浓度对抗体生产的微小影响。在BSA共混实验1中，具有高和低EDTA的生物反应器在达到目标细胞密度之前具有相当抗体生产。在紧随达到目标细胞密度之后的周期期间(从约第15天至第25天)，较高EDTA的生物反应器具有比低EDTA的生物反应器低的抗体表达(图13E和13F)。在BSA共混实验2中，注意到两个最高[EDTA]的抗体生产从第10天开始的减少，并且具有最低[EDTA]的生物反应器在约第15天表现出较高抗体生产(图14E和14F)。然而，在 DOE3实验中未观察到[EDTA]对抗体生产的影响(图12B)。
对于具有约1.1至1.2μM的细胞外Zn+2的生物反应器，BSA共混实验证实，EDTA浓度对于CTL去除和唾液酸添加可具有显著影响。此外，在从第10天至第25天的周期期间，可存在EDTA浓度对抗体生产的微小影响，尽管这种影响在DOE3实验中是不明显的。由于这些Zn+2浓度， EDTA对细胞生长或培养存活率具有不可辨别影响。
因为Fe+3浓度在BSA共混实验的生物反应器中恒定，所以上文所注意到的对[EDTA]的相关性对[EDTA–Fe+3]为同等有效的。
在两个BSA共混实验中，减小EDTA浓度示出导致非半乳糖基低聚糖百分比的减小(图13G和15)。因此，减小EDTA浓度导致更多半乳糖和更多唾液酸含量两者。
虽然不希望受任何特定理论束缚，但是BSA共混实验的数据支持下述假设：
·EDTA(或[EDTA–Fe+3])可影响细胞摄入Zn+2的速率。当细胞外Zn+2浓度低时，并且细胞正经历对支持具有Zn+2要求的酶的细胞内Zn+2不足时，这种影响可能是最显而易见的。
·细胞具有用于存储和分布Zn+2的精细细胞内体系，并且在Zn+2限制周期中存在有对Zn+2分布的优先级。在Zn+2限制的条件下，细胞将优先级赋予需要Zn+2用于细胞分裂的细胞内过程。因此，在 BSA共混实验1和2中，EDTA对细胞生长无影响，因为细胞在本研究的条件下具有足够Zn+2用于细胞分裂。同样，抗体表达在该实验的条件下受EDTA以最小程度影响。用以支持CTL去除和唾液酸添加的细胞内Zn+2分布具有比用于细胞生长的Zn+2分布低的细胞内优先级。因此，在其中EDTA不影响细胞生长的条件下，可能存在EDTA对CTL去除和唾液酸添加的显著影响。
英利昔单抗生物反应器在前15-20天以类似分批补料培养的方式操作。即，将细胞接种至低初始细胞密度，并且以新鲜介质连续进料下一15 至20天以支持细胞生长和抗体表达。因此，本文所述的实验结果同等地适用于分批补料和灌注培养。
实例7-DOE3和BSA共混1和2
实验的进一步分析
DOE3和BSA共混实验均利用相同小规模生物反应器型号在相同实验室中进行，并且样品通过相同测定组进行分析。因此，将DOE3和BSA共混1和2实验彼此比较应为可能的。
在DOE3实验和BSA共混1实验中，样品在第20天收集并且通过 cIEF和WAX测定进行分析。图17、19、20和21示出了一起绘制的DOE3 实验和BSA共混1实验的第20天数据。图17、19和20中所示的结果支持先前分析，换句话说，CTL去除随着增加[Zn+2]而增加，唾液酸含量随着增加[Zn+2]而增加，并且非半乳糖基低聚糖百分比随着增加[Zn+2]而降低。后两个结果与半乳糖添加和唾液酸添加的酶反应的促进一致，如图16所示。
图21示出，唾液酸对半乳糖的比率随着增加[Zn+2]而增加。
图26为作为G0F(WAX组分1的主导非半乳糖组分)百分比的函数的唾液酸(WAX组分5)百分比的图表；并且示出了对于DOE3和BSA共混1和2实验的唾液酸百分比和非半乳糖基低聚糖百分比之间的反向关系。图26示出，半乳糖添加和唾液酸添加趋于在DOE3和BSA共混1和2 实验中进行耦合，与通过半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶所催化的反应的耦合一致。换句话讲，增强这两个糖基化反应的因素将更多的G0F引导至含有唾液酸的低聚糖。
BSA共混1和2实验均包含在第33-35天收集的样品。图22-25示出了 BSA共混1和2实验的第33-35天数据。图22-25示出，在较低EDTA浓度下，存在较高CTL去除、较高唾液酸含量、较低非半乳糖基低聚糖百分比，和唾液酸对半乳糖的较高比率。
本文引述的所有专利、已公布的专利申请和参考文献的教导内容全文以引用方式并入。
虽然已通过参照本文的实例实施例来具体示出和描述本发明，但本领域的技术人员将理解可以在不脱离所附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下对其形式和细节进行各种修改。

Claims (39)

1.一种用于生产抗体的方法，所述抗体具有20%至70%的C端赖氨酸含量和1%至20%的唾液酸含量，所述方法包括：
在培养基中培养转染有编码所述抗体的DNA的锌响应宿主细胞，所述培养基包含0.5µM-6.5µM的锌；以及
控制锌在所述培养基中的浓度，从而生产所述抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体的所述C端赖氨酸含量为40%至70%。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体的所述C端赖氨酸含量为55%至65%。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体的所述C端赖氨酸含量为60%。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体的所述唾液酸含量为3%至14%。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体为抗TNFα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段(i)竞争性地抑制A2结合至人TNFα；以及(ii)以至少1 ×108升/摩尔的亲和力结合至人TNFα的中和表位，其测量为缔合常数(Ka)，其中A2为ATCC保藏号PTA-7045杂交瘤产生的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段为人抗体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗TNFα抗体为人源抗体或嵌合抗体。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段为免疫球蛋白类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段包括IgG1恒定区域。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。
12.根据权利要求6所述的方法，其中
a) 轻链包含A2轻链的所有抗原结合区域；或
b) 重链包含A2重链的所有抗原结合区域。
13.根据权利要求6所述的方法，其中轻链包含A2轻链的所有抗原结合区域，并且重链包含A2重链的所有抗原结合区域，其中A2为ATCC保藏号PTA-7045杂交瘤产生的单克隆抗体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段包含非人可变区域；所述非人可变区域包含选自SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述非人可变区域包含多肽，所述多肽通过选自SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4的核酸序列进行编码。
16.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段具有等同于单克隆抗体cA2的表位特异性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体cA2。
18.根据权利要求1所述的方法，其中锌在所述培养基中的浓度在0.6µM至1.1µM的范围内。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含浓度范围为2.5µM至30µM的总EDTA，并且所述方法还包括控制无铁EDTA在所述培养基中的浓度。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述培养基还包含浓度范围为5µM至16µM的游离EDTA。
21.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括回收所述抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中当所述培养基中的所述锌响应宿主细胞达到1.5百万细胞/mL至11百万细胞/mL的细胞密度时，所述抗体被回收。
23.根据权利要求22所述的方法，其中当所述培养基中的所述锌响应宿主细胞达到3百万细胞/mL至11百万细胞/mL的细胞密度时，所述抗体被回收。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述锌浓度被控制直至所述抗体被回收。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述锌浓度在所述锌响应宿主细胞的对数生长期期间被控制。
26.根据权利要求1所述的方法，其中锌在所述培养基中的浓度在0.6µM至6.5µM的范围内。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体具有50%至90%的半乳糖含量。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗体具有45%至85%的半乳糖含量。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体具有0.05至0.20的唾液酸对半乳糖的比率。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述锌响应宿主细胞为SP2/0细胞。
31.一种用于控制抗体的C端赖氨酸含量的方法，所述抗体在用于在包含0.5µM-6.5µM的锌的培养基中生物合成所述抗体的过程中具有20%至70%的C端赖氨酸含量，所述方法包括：
在所述抗体的生物合成期间监测锌在所述培养基中的水平；以及
在所述抗体的生物合成期间调节锌在所述培养基中的水平。
32.一种用于控制抗体的唾液酸含量的方法，所述抗体在用于在包含0.5µM-6.5µM的锌的培养基中生物合成所述抗体的过程中具有1%至20%的唾液酸含量，所述方法包括：
在所述抗体的生物合成期间监测锌在所述培养基中的水平；以及
在所述抗体的生物合成期间调节锌在所述培养基中的水平。
33.一种用于控制抗体的半乳糖含量的方法，所述抗体在用于在包含0.5µM-6.5µM的锌的培养基中生物合成所述抗体的过程中具有50%至90%的半乳糖含量，所述方法包括：
在所述抗体的生物合成期间监测锌在所述培养基中的水平；以及
在所述抗体的生物合成期间调节锌在所述培养基中的水平。
34.一种用于控制抗体中唾液酸对半乳糖的比率的方法，所述抗体在用于在包含0.5µM-6.5µM的锌的培养基中生物合成所述抗体的过程中具有0.05至0.20的唾液酸对半乳糖的比率，所述方法包括：
在所述抗体的生物合成期间监测锌在所述培养基中的水平；以及
在所述抗体的生物合成期间调节锌在所述培养基中的水平。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述抗体为抗TNFα抗体或其抗原结合片段。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述抗体为抗TNFα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段(i)竞争性地抑制A2结合至人TNFα；以及(ii)以至少1× 108升/摩尔的亲和力结合至人TNFα的中和表位，其测量为缔合常数(Ka)，其中A2为ATCC保藏号PTA-7045杂交瘤产生的单克隆抗体。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗体为具有等同于单克隆抗体cA2的表位特异性的抗TNFα抗体或其抗原结合片段。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体cA2。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体由SP2/0细胞系生物合成。
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