BR112015022971B1

BR112015022971B1 - Métodos de fabricação para controlar o teor de lisina c-terminal, galactose e ácido siálico em proteínas recombinantes

Info

Publication number: BR112015022971B1
Application number: BR112015022971-9A
Authority: BR
Inventors: Marcel Flikweert; Charles Goochee; Francis Maslanka; Francisus Johannes Ignatius Nagel; James Ryland; Eugene Schafer
Original assignee: Janssen Biologics B.V.; Janssen Biotech, Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2022-05-17
Also published as: TW201441263A; PL2970980T3; US20160237149A1; EP2970980B1; ZA201507671B; KR102216003B1; LT2970980T; RS57791B1; SI2970980T1; PT2970980T; EP2970980A1; BR112015022971A2; AU2020203864A1; EP2970980A4; JP2016512029A; PH12015501837B1; AU2020203864B2; CA2907140A1; US20220089712A1; PH12015501837A1

Abstract

MÉTODOS DE FABRICAÇÃO PARA CONTROLAR O TEOR DE LISINA C-TERMINAL, GALACTOSE E ÁCIDO SIÁLICO EM PROTEÍNAS RECOMBINANTES. A invenção refere-se a um um método para produzir um anticorpo, como um anticorpo anti-TNF ? (por exemplo, infliximab) tendo um teor de lisina C-terminal de cerca de 20% a cerca de 70% e um teor de ácido siálico de cerca de 1% a cerca de 20% , compreendendo cultivar uma célula hospedeira responsiva a zinco transfectada com DNA que codifica o anticorpo em um meio de cultura compreendendo ao menos 0,5 ?M de zinco; e controlar a concentração de zinco no meio de cultura, produzindo, assim, o anticorpo.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A lisina C-terminal (CTL) é rapidamente removida de anticorpos injetados, incluindo o infliximab, por meio de carboxipeptidases endógenas que circulam na corrente sanguínea (Cai, B. et al., "C- terminal Lysine Processing of Human Immunoglobulin G2 Heavy Chain in Vivo," Biotechnol. Bioeng. 2011; 108: 404-412) e, portanto, acredita- se que tem pouco, se algum, impacto sobre a segurança e eficácia do produto. Entretanto, o teor de CTL nas proteínas recombinantes tendo resíduos de CTL pode ser usado como uma medida da consistência de fabricação e homogeneidade do produto.

[002] Ao contrário do conteúdo de CTL, o teor de ácido siálico das proteínas recombinantes tem sido associado com muitos fenômenos de importância fisiológica em humanos. Por exemplo, a presença de ácido siálico em glicoproteínas, como a eritropoietina, promove uma meia-vida circulatória longa, enquanto que a ausência de ácido siálico na eritropoietina leva à rápida eliminação da proteína da circulação. Além disso, o teor de ácido siálico aumentado em proteínas pode modular a imunogenicidade da proteína em humanos. Devido à importância do ácido siálico na segurança e eficácia do produto, o teor de ácido siálico deve ser mantido dentro de uma faixa reflexiva da faixa usada na clínica.

[003] Portanto, existe uma necessidade de compreender e controlar fatores relacionados com o processo que afetam o teor de CTL e de ácido siálico das proteínas recombinantes, particularmente de proteínas recombinantes, como REMICADE® (infliximab) ou HUMIRA® (adalimumab), que são administrados aos seres humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] São revelados na presente invenção métodos para a pro-dução de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo antifator de necrose tumoral alfa (TNFα), como o anticorpo monoclonal cA2 (também chamado na presente invenção como infliximab), com um teor de lisina C-terminal desejado (CTL), teor de ácido siálico, de galactose e/ou a razão entre ácido siálico e galactose, por meio do controle das condições de cultura, incluindo a concentração de zinco, a concentração de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e o momento de coleta.

[005] Uma modalidade da invenção é o método para a produção de um anticorpo tendo um teor de lisina C-terminal de cerca de 20% a cerca de 70% e um teor de ácido siálico de cerca de 1% a cerca de 20%, compreendendo cultivar uma célula hospedeira responsiva a zinco transfectada com DNA que codifica o anticorpo em um meio de cultura compreendendo ao menos 0,5 μM de zinco; e controlar a concentração de zinco no meio de cultura, produzindo, assim, o anticorpo. Em algumas modalidades, o teor de lisina C-terminal do anticorpo é de cerca de 40% a cerca de 70%, por exemplo, cerca de 55% a cerca de 65%, por exemplo, ou cerca de 60%. Em algumas modalidades o teor de ácido siálico do anticorpo é de cerca de 3% a cerca de 14%. Em algumas modalidades, o anticorpo tem um teor de galactose de cerca de 50% a cerca de 90%, ou cerca de 45% a cerca de 85%. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma razão entre o ácido siálico e a galactose de cerca de 0,05 a cerca de 0,20.

[006] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- TNFα, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, sendo que o dito anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, (i) inibe competitivamente a ligação de A2 (N° de Acesso ATCC PTA-7045) ao TNFα humano; e (ii) se liga a um epitopo neutralizante do TNFα humano com uma afinidade de, ao menos, 1 x 108 litro/mol, medida como uma constante de associação (Ka). O anticorpo anti- TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode ser da classe de imunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgM e, em algumas modalidades, compreende uma região constante de IgG1. Em algumas mo-dalidades, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado a partir do grupo consistindo em Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv.

[007] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα ou frag-mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região constante humana e uma região variável não humana, ou uma região constante humana e uma região variável humana.

[008] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende pelo menos uma cadeia leve humana e pelo menos uma cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia leve de A2 (N° de Acesso ATCC PT A-7045). Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia pesada de A2 (N° de Acesso ATCC PTA-7045). Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia leve de A2 (N° de Acesso ATCC PTA-7045) e a cadeia pesada compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia pesada de A2 (N° de Acesso ATCC PTA-7045).

[009] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα ou frag-mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região constante da IgG1 humana e uma região variável não huma- na-compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a par- tir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5, ou codificada por uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα ou frag-mento de ligação a antígeno do mesmo possui especificidade epitópi- ca idêntica ao anticorpo monoclonal cA2 e, em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é o anticorpo monoclonal cA2.

[0011] Em algumas modalidades, a concentração de zinco no meio de cultura está na faixa de cerca de 0,6 μM a cerca de 6,5 μM, ou cerca de 0,6 μM a cerca de 1,1 μM.

[0012] Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende ainda um total de EDTA em uma faixa de concentração de cerca de 2,5 μM a cerca de 30 μM ou de cerca de 5 μM a cerca de 16 μM e o método compreende ainda o controle da concentração de EDTA no meio de cultura.

[0013] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a recuperação do anticorpo, por exemplo, quando as células hospedeiras responsivas a zinco no meio de cultura atingem uma densidade celular de cerca de 1,5 milhões de células por mL a cerca de 11 milhões de células por mL ou de cerca de 3 milhões de células por mL a cerca de 11 milhões de células por mL. Em algumas modalidades, a concentração de zinco é controlada até que o anticorpo seja recuperado ou durante a fase de crescimento exponencial das células hospedeiras responsivas a zinco.

[0014] Em algumas modalidades da invenção, o controle da concentração de zinco compreende o monitoramento da concentração de zinco no meio de cultura, e a regulação da concentração de zinco no meio de cultura, de modo que a concentração de zinco no meio de cultura seja ao menos 0,5 μM ou na faixa de cerca de 0,6 μM a cerca de 6,5 μM.

[0015] Em algumas modalidades da invenção, a célula hospedeira responsiva a zinco é uma célula SP2/0.

[0016] Uma outra modalidade da invenção é um método para controlar o teor de lisina C-terminal de um anticorpo tendo um teor de lisina C-terminal de cerca de 20% a cerca de 70%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a bios- síntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0017] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para controlar o teor de ácido siálico de um anticorpo tendo um teor de ácido siálico de cerca de 1% a cerca de 20%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossín- tese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0018] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para controlar o teor de galactose de um anticorpo tendo um teor de galactose de cerca de 50% a cerca de 90%, em um processo para a bi- ossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossín- tese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0019] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para controlar a razão entre ácido siálico e galactose em um anticorpo tendo uma razão entre ácido siálico e galactose de cerca de 0,05 a cerca de 0,20, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0020] Em algumas modalidades de um método para controlar o teor de CTL, ácido siálico ou galactose, ou a razão entre de ácido siá- lico e galactose, o anticorpo é um anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e/ou o anticorpo é biossintetizado por uma célula SP2/0.

[0021] Em uma modalidade, o anticorpo é um mAb que se liga aos aminoácidos de um epitopo de TNF, o qual é produzido por meio de um hibridoma recombinante ou por um hospedeiro. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico é um anticorpo que reconhece um epitopo reconhecido pelo A2. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico designado como A2 quimérico (cA2) (isto é, infliximab).

[0022] A caracterização e os métodos de fabricação e uso de anticorpos anti-TNF são revelados e descritos em detalhes, por exemplo, em "Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses", George Heavner et al., patente US n° 7.250.165, depositada em 1 de agosto de 2001, concedida em 31 de julho de 2007 e "Anti- TNF antibodies, compositions, methods and uses", Jill Giles-Komar et al., pedido de patente US n° 10/394.471, publicação US n° 2004/018 5047 A1, depositada em 21 de março de 2003 e "Recombinant A2-specific TNFα- specific antibodies", Junming Le et al., patente US n° 7.252.823, depo-sitada em 6 de fevereiro de 2004, concedida em 7 de agosto de 2007 (todos incorporadas na presente invenção a título de referência em sua totalidade).

[0023] Em algumas modalidades, os anticorpos incluem o mAb murino A2, que é produzido por uma linhagem de células designada c134A e o anticorpo quimérico cA2, que é produzido por uma linhagem de células designada c168A. A linhagem de células c134A está armazenada em Janssen Research & Development, Welsh & McKean Road, Springhouse, PA. A linhagem de células c168A está armazenada em Janssen Research & Development, 200 Great Valley Parkway, Malvern, Pensilvânia, 19355, Janssen Biologics BV, Leiden, Países Baixos.

[0024] Os métodos apresentados na presente invenção, podem ser usados para melhorar homogeneidade em batelada, por exemplo, em um processo de fabricação comercial, como o processo de fabricação usado para produzir o infliximab, um anticorpo monoclonal anti- TNFα usado no tratamento, por exemplo, de doenças autoimunes em humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0025] O supracitado será evidente, com a descrição mais particular a seguir, de modalidades exemplificadoras da invenção, conforme ilustrado nas figuras anexas.

[0026] A patente ou depósito de pedido contém pelo menos um desenho executado colorido. Cópias dessa patente ou publicação de pedido de patente com desenhos coloridos serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[0027] A Figura 1 mostra um eletroferograma de tubo capilar de focagem isoelétrica (cIEF) de uma amostra de infliximab.

[0028] A Figura 2 é uma curva ajustada da porcentagem de des-lisina (% da falta lisina C-terminal, abreviada como des-Lis) a partir de mapeamento peptídico de fase reversa como uma função da porcentagem do Pico 1 de cIEF e mostra a correlação entre o teor de CTL (expresso em percentagem de des-Lys) e a porcentagem do Pico 1.

[0029] A Figura 3 é um gráfico de remoção de CTL (expressa em percentagem de des-Lyi e calculada usando os dados do método do pico 1 de cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a remoção de CTL. Eixo Y: % desl-Lis Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0030] A Figura 4 é um gráfico da porcentagem de oligossacarí- deos de infliximab com ácido siálico, tal como determinado pelo método WAX, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a porcentagem de ácido siálico. Eixo Y: % de ácido siálico Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0031] A Figura 5 é um gráfico da densidade de células viáveis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a densidade de células viáveis. Eixo Y: densidade de células viáveis (milhões de células viáveis/mL); Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0032] A Figura 6 é um gráfico da porcentagem de células viáveis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a viabilidade da cultura. Eixo Y: % de células viáveis, eixo X: idade de biorreator em dias.

[0033] A Figura 7 é um gráfico da concentração de infliximab como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a concentração de infliximab. A concentração em mg/mL do eixo y, como indicado contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorreator em dias.

[0034] A Figura 8A é um gráfico da remoção de CTL (expressa como porcentagem de des-Lys e calculada usando os dados do Pico 1 do método cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a remoção de CTL na presença de Zn+2 0,76 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorreator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de Zn+2 0,76 μM foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento). Eixo Y: % desl-Lis Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0035] A Figura 8B é um gráfico de remoção de CTL (expressa em percentagem de des-Lyi e calculada usando os dados do método do pico 1 de cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de EDTA sobre a remoção de CTL na presença de Zn+2 1,7 μM. Eixo Y: % desl-Lis; Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0036] A Figura 9A é um gráfico da porcentagem de oligossacarí- deos de infliximab com ácido siálico, como determinado pelo método WAX, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a porcentagem de ácido siálico na presença de Zn+2 0,76 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorre- ator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de Zn+2 0,76 μM foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento). Eixo Y: % de ácido siálico Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0037] A Figura 9B é um gráfico da porcentagem de oligossacarí- deos de infliximab com ácido siálico, tal como determinado pelo método WAX, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de EDTA sobre o teor de ácido siálico na presença Zn+2 1,7 μM. Eixo Y: % de ácido siálico; Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0038] A Figura 9C é um gráfico da porcentagem de G0F (Componente 1 de WAX), como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a porcentagem de espécies não galactosiladas na presença de Zn+2 0,76 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorreator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de Zn+2 0,76 μM foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento).

[0039] A Figura 9D é um gráfico da porcentagem de G0F(Componente 1 de WAX), como uma função da idade de biorrea- tor, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a por- centagem de espécies não galactosiladas na presença de Zn+2 0,76 μM.

[0040] A Figura 10 é um gráfico da densidade de células viáveis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a porcentagem da densidade de células viáveis na presença de Zn+2 0,76 μM ou Zn+2 1,7 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorreator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de Zn+2 0,76 μM foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento). Eixo Y: densidade de células viáveis (milhões de células viáveis/mL); Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0041] A Figura 11A é um gráfico da porcentagem de células viá-veis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a porcentagem de células viáveis na presença de Zn+2 0,76 μM ou Zn+2 1,7 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorreator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de Zn+2 0,76 μM foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento). Eixo Y: % de células viáveis; Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0042] A Figura 11B é uma vista ampliada dos Dias 0 a 25 do gráfico mostrado na Figura 11A. Eixo Y: densidade de células viáveis (milhões de células viáveis/mL); Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0043] A Figura 12A é um gráfico da concentração de infliximab, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a concentração de infliximab na presença de Zn+2 0,76 μM ou Zn+2 1,7 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorreator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de Zn+2 0,76 μM foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento). A con- centração em mg/mL do eixo y, como indicado contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorreator em dias.

[0044] A Figura 12B é uma vista ampliada dos Dias 0 a 25 do gráfico mostrado na Figura 12A. A concentração em mg/mL do eixo y, como indicado contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorreator em dias.

[0045] A Figura 13A é um gráfico de remoção de CTL (expressa em percentagem de des-Lyi e calculada usando os dados do método do pico 1 de cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação da concentração de EDTA (μM) sobre a remoção de CTL (os resultados são apresentados como uma média da duplicata de dois biorreatores). Eixo Y: % desl-Lis; Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0046] A Figura 13B é um gráfico da porcentagem de oligossacarí- deos de infliximab com ácido siálico, tal como determinado pelo método WAX, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação da concentração de EDTA (μM) sobre o teor de ácido siá- lico (os resultados são apresentados como uma média da duplicata de dois biorreatores). Eixo Y: % de ácido siálico; Eixo X: idade de biorrea- tor em dias.

[0047] A Figura 13C é um gráfico da densidade de células viáveis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a densidade de células viáveis. Eixo Y: densidade de células viáveis (milhões de células viáveis/mL); Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0048] A Figura 13D é um gráfico da porcentagem de células viá-veis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a viabilidade da cultura. Eixo Y: % de células viáveis; Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0049] A Figura 13E é um gráfico da concentração de infliximab como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a concentração de infliximab. A concentração em mg/mL do eixo y, como indicada, contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorreator em dias.

[0050] A Figura 13F é uma vista ampliada dos Dias 0 a 25 do grá-fico mostrado na Figura 13E. A concentração em mg/mL do eixo y, como indicada, contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorrea- tor em dias.

[0051] A Figura 13G é um gráfico da porcentagem de G0F (Com-ponente 1 de WAX), como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a porcentagem de oligossacarídeos de infliximab que não possuem galactose. Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0052] A Figura 14A é um gráfico de remoção de CTL (expressa em percentagem de des-Lyi e calculada usando os dados do método do pico 1 de cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a remoção de CTL. Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0053] A Figura 14B é um gráfico da porcentagem de oligossacarí- deos de infliximab com ácido siálico, tal como determinado pelo método WAX, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre o teor de ácido siálico.

[0054] A Figura 14C é um gráfico da densidade de células viáveis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a densidade de células viáveis. Eixo Y: densidade de células viáveis (milhões de células viáveis/mL); Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0055] A Figura 14D é um gráfico da porcentagem de células viá-veis, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a viabilidade da cultura. Eixo Y: % de células viáveis; Eixo X: idade de biorreator em dias.

[0056] A Figura 14E é um gráfico da concentração de infliximab como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a concentração de infliximab. A concentração em mg/mL do eixo y, como indicada, contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorreator em dias.

[0057] A Figura 14F é uma vista ampliada dos Dias 0 a 25 do grá-fico mostrado na Figura 14E. A concentração em mg/mL do eixo y, como indicada, contém um erro tipográfico. A concentração é em mg/L. Eixo Y: concentração de infliximab (mg/L), eixo X: idade biorrea- tor em dias.

[0058] A Figura 15 é um gráfico da porcentagem de G0F(Componente 1 de WAX), como uma função da idade de biorrea- tor, e mostra o efeito da concentração de EDTA (μM) sobre a porcentagem de oligossacarídeos de infliximab que não possuem galactose.

[0059] A Figura 16 mostra a via biossintética para a maioria dos oligossacarídeos neutros comuns de infliximab, G0F, G1F e G2F e a via biossintética dos oligossacarídeos neutros para formas sialiladas.

[0060] A Figura 17 é um gráfico da remoção de CTL (calculado usando os dados do Pico 1 do método de cIEF) como uma função da concentração de Zn+2, e mostra a porcentagem de remoção de CTL no Dia 20 nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1 (os pontos azuis são os dados e a linha representa a média).

[0061] A Figura 18 é um gráfico da remoção de CTL (calculado usando os dados do Pico 1 do método de cIEF) como uma função da concentração de Zn+2, e mostra a porcentagem de remoção de CTL no Dia 20 no experimento DOE3.

[0062] A Figura 19 é um gráfico do teor de ácido siálico, como uma função da concentração de Zn+2, e mostra a porcentagem de ácido siá- lico no Dia 20 nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1 (a linha representa a média).

[0063] A Figura 20 é um gráfico da percentagem de Componentes 1 de WAX (GOF) como uma função da concentração de Zn+2, e mostra a porcentagem de oligossacarídeos de infliximab que não possuem galactose no Dia 20 nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1.

[0064] A Figura 21 é um gráfico da razão estimada entre ácido siá- lico e galactose (estimada como porcentagem entre ácido siálico/(100- porcentagem do Componente 1 de WAX) como uma função da concentração de Zn+2, e mostra a razão estimada entre de ácido siálico e galactose no Dia 20 nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1.

[0065] A Figura 22 é um gráfico da remoção de CTL (calculado usando os dados do Pico 1 do método de cIEF) como uma função da concentração de EDTA, e mostra o porcentual de remoção de CTL na presença de 1,1 a 1,2 μM de Zn+2 nos Dias 33 a 35 nos experimentos de Mistura N° 1 e N° 2.

[0066] A Figura 23 é um gráfico da porcentagem de ácido siálico, como uma função da concentração de EDTA, e mostra o porcentual de ácido siálico na presença de 1,1 a 1,2 μM de Zn+2 nos Dias 33 a 35 nos experimentos de Mistura N° 1 e N° 2.

[0067] A Figura 24 é um gráfico da porcentagem do Componente 1 de WAX, como uma função da concentração de EDTA, e mostra a porcentagem oligossacarídeos de infliximab que não possuem galactose na presença de de 1,1 a 1,2 μM de Zn+2 nos Dias 33 a 35 nos ex- perimentos de Mistura N° 1 e N° 2.

[0068] A Figura 25 é um gráfico da razão estimada entre ácido siá- lico e galactose (estimada como porcentagem entre ácido siálico/(100 - porcentagem do Componente 1 de WAX) como uma função da concentração de EDTA, e mostra a razão estimada entre de ácido siálico e galactose na presença de 1,1 a 1,2 μM de Zn+2 nos Dias 33 a 35 nos experimentos de Mistura N° 1 e N° 2.

[0069] A Figura 26 é um gráfico da porcentagem de ácido siálico (calculada a partir do Componente 5 de WAX) como uma função da porcentagem de G0F (calculado a partir do Componente 1 de WAX)), e mostra a relação inversa entre a porcentagem de ácido siálico e do Componente 1 de WAX, um indicador de oligossacarídeos de infliximab que não possuem galactose, nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1 e N° 2.

[0070] As Figuras 27A e 27B fornecem diagramas esquemáticos de plasmídeos usados para a expressão das cadeias quimérica H (pA2HG1apgpt) e L (pA2HuKapgpt) do anticorpo quimérico A2.

[0071] A Figura 28 mostra a sequência de aminoácidos de TNF humano como a SEQ ID NO: 1.

[0072] Figuras 29A-29B. A Figura 29A é uma sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 2) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 3) da região variável de cadeia leve clonada de cA2. A Figura 29B é uma sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 4) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 5) da região variável de cadeia pesada clonada de cA2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0073] Uma descrição de modalidades exemplificadoras da invenção segue.

[0074] Uma modalidade proporciona um método para a produção de um anticorpo tendo um teor de lisina C-terminal de cerca de 20% a cerca de 70% e um teor de ácido siálico de cerca de 1% a cerca de 20%, compreendendo cultivar uma célula hospedeira responsiva a zinco transfectada com DNA que codifica o anticorpo em um meio de cultura compreendendo ao menos 0,5 μM de zinco; e controlar a concentração de zinco no meio de cultura, produzindo, assim, o anticorpo.

[0075] O conteúdo de CTL é expresso na presente invenção, co-mo a porcentagem de cadeias pesadas que possuem uma lisina C- terminal e pode ser calculado usando a seguinte equação: conteúdo de CTL (%) = (número de cadeias pesadas que possuem um CTL)/(número total de cadeias pesadas) x 100. A remoção de CTL é expressa na presente invenção, como a porcentagem de cadeias pesadas que não possuem uma lisina C-terminal (des-Lis). Dessa forma, "80% Des-Lis" é equivalente a um teor de CTL de 20%. Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o teor de CTL do anticorpo ou do anticorpo anti-TNFα, ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é de cerca de 40% a cerca de 70%, especificamente, cerca de 55% a cerca de 65%, e, mais especificamente, cerca de 60%.

[0076] O teor de ácido siálico é expresso na presente invenção, como a porcentagem de oligossacarídeos contendo ácido siálico, e pode ser calculado usando a seguinte equação: teor de ácido siálico (%) = (número de oligossacarídeos contendo um ácido siáli- co)/(número total de oligossacarídeos) x 100. Esta equação se aplica independentemente do número de resíduos de ácido siálico nos oli- gossacarídeos. Em outras palavras, independentemente da existência ou não, por exemplo, de um ou dois resíduos de ácido siálico no oli- gossacarídeo, o oligossacarídeo só é contado uma vez com o propósito de cálculo do teor de ácido siálico. Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o teor ácido siálico do anticorpo ou do anticorpo anti-TNFα, ou do fragmento de ligação a antíge- no do mesmo, é de cerca de 3% a cerca de 14%.

[0077] O teor de galactose é expresso na presente invenção, co-mo a porcentagem de oligossacarídeos contendo galactose, e pode ser calculado usando a seguinte equação: teor de galactose (%) = (número de oligossacarídeos contendo uma galactose)/(número total de oligossacarídeos) x 100. Esta equação se aplica independentemente do número de unidades galactose nos oligossacarídeos. Em outras palavras, independentemente da existência ou não, por exemplo, de um ou dois resíduos de galactose no oligossacarídeo, o oligossacarí- deo só é contado uma vez com o propósito de cálculo do teor de galactose. Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, um anticorpo ou anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tem um teor de galactose de cerca de 50% a cerca de 90% e, especificamente, de cerca de 45% a cerca de 85%.

[0078] Tipicamente, ambas as cadeias pesadas de um anticorpo, como o infliximab, são glicosiladas. Entretanto, em algumas circuns-tâncias, algumas das cadeias pesadas permanecem aglicosiladas. Por exemplo, em algumas modalidades, cerca de 94% das moléculas de anticorpo são glicosiladas em ambas as cadeias, cerca de 6% das moléculas de anticorpo são hemiglicosiladas, e cerca de 0,1% das moléculas de anticorpo são totalmente aglicosiladas.

[0079] A razão entre ácido siálico e galactose é calculada a partir da relação molar entre ácido siálico e galactose nos oligossacarídeos do infliximab. Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o anticorpo ou o anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, tem uma razão entre ácido siálico e galactose de cerca de 0,05 a cerca de 0,20.

[0080] "Células hospedeiras responsivas a zinco", como usado na presente invenção, significa uma célula hospedeira que responde a flutuações na concentração de zinco no seu meio de cultura. A capaci- dade de resposta de uma célula hospedeira às flutuações na concentração de zinco pode ser avaliada, por exemplo, por meio da medição do efeito de concentrações de zinco variadas sobre o teor de CTL, o teor de ácido siálico, o teor de galactose e a razão entre ácido siálico e galactose em um anticorpo produzido pela célula hospedeira. Métodos para avaliar o teor de CTL, o teor de ácido siálico, o teor de galactose e a razão entre de ácido siálico e galactose em um anticorpo produzido por uma célula hospedeira estão descritos na Exemplificação.

[0081] A invenção proporciona um meio de cultura compreendendo uma quantidade de zinco maior que cerca de 0,5 μM. Em algumas modalidades, a concentração de zinco no meio de cultura está na faixa de cerca de 0,6 μM a cerca de 6,5 μM e, de preferência na faixa de cerca de 0,6 μM a cerca de 1,1 μM. Em algumas modalidades, a quantidade ou a concentração de zinco no meio de cultura é não tóxica para as células hospedeiras responsivas a zinco, por exemplo, não reduz ou reduz substancialmente a viabilidade das células, o crescimento das células ou produção de anticorpos, particularmente nos primeiros 20 a 25 dias de cultura.

[0082] Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende, ainda, o ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) ("EDTA" ou "EDTA total", como chamado na presente invenção) em uma faixa de concentração de cerca de 2,5 μM a cerca de 30 μM e, de preferência, em uma faixa de concentração de cerca de 5 μM a cerca de 16 μM. "EDTA isento de ferro", como é usado na presente invenção, refere-se ao EDTA que não está quelado ao ferro (Fe+3). A quantidade ou concentração de EDTA isento de ferro (abreviada como [EDTA - Fe+3]) pode ser calculada por meio da subtração da quantidade ou da concentração de Fe+3 da quantidade ou concentração de EDTA total. O íon Fe+3 tem a maior afinidade pelo EDTA dentre os íons metálicos no meio de cultura. Portanto, Fe+3, quando presente, preferencialmente se ligará ao EDTA no meio de cultura celular. A concentração de EDTA isento de ferro representa o EDTA disponível para se ligar a Zn+2 e outros íons metálicos no meio de cultura.

[0083] Em algumas modalidades dos métodos descritos na pre-sente invenção, a quantidade ou a concentração de EDTA e/ou EDTA isento de ferro meio de cultura é não tóxica para as células hospedeiras responsivas a zinco, por exemplo, não reduz ou reduz substancialmente a viabilidade das células, o crescimento das células ou produção de anticorpos, particularmente nos primeiros 20 a 25 dias de cultura.

[0084] "Controlar", como usado na presente invenção, significa verificar e/ou regular. Controlar inclui detectar/medir uma substância sendo controlada (direta ou indiretamente) e usar essas medições para fornecer retroinformação para que sejam feitas correções em direção ao resultado desejado. Controlar inclui monitorar e regular, por exemplo, a concentração de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro em um meio de cultura. Tipicamente, a concentração de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro é controlada pela duração da cultura. Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, a concentração de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro é controlada durante a fase de crescimento exponencial das células hospedeiras responsivas a zinco, ou durante aproximadamente os primeiros 10 a 25 dias de cultura.

[0085] A concentração de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro no meio de cultura pode ser controlada, por exemplo, por meio do monitoramento do nível de zinco e/ou EDTA e/ou isento de ferro EDTA no meio de cultura; e da regulação do nível de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro no meio de cultura. Portanto, em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o controle da concentração de zinco compreende o monitoramento da concentração de zinco no meio de cultura, e a regulação da concentração de zinco no meio de cultura, de modo que a concentração de zinco no meio de cultura seja ao menos 0,5 μM ou de cerca de 0,6 μM a cerca de 6,5 μM.

[0086] Métodos para monitoramento do nível de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro são conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, a concentração de zinco e de outros íons metálicos pode ser medida por meio de espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), enquanto que a concentração de EDTA pode ser medida por um método de HPLC.

[0087] "Regular", como usado na presente invenção, significa colocar ou manter em ordem. A regulação inclui manter, por exemplo, a concentração de zinco e/ou EDTA em um meio de cultura, e ajustar, por exemplo, a concentração de zinco e/ou EDTA em um meio de cultura, conforme necessário. Dessa forma, o zinco (por exemplo, uma quantidade não tóxica de zinco) pode ser incluído no meio de cultura em uma concentração inicial de, por exemplo, superior a cerca de 5 μM, então, ajustado a uma concentração de, por exemplo, de 0,6 μM a cerca de 1,1 μM. O ajuste pode ser feito, por exemplo, simultaneamente com ou logo após a transição da fase exponencial de crescimento para a fase estacionária. Alternativamente, a concentração de zinco pode ser mantida a uma concentração de, por exemplo, 0,6 μM a cerca de 1,1 μM para a duração da cultura.

[0088] A regulação do nível de zinco e/ou EDTA e/ou EDTA isento de ferro pode ser alcançada, por exemplo, através da adição direta de zinco, ferro e/ou EDTA ao meio de cultura; através da mistura de matérias-primas que contenham zinco, ferro e/ou EDTA; através do tratamento das matérias-primas para ajustar as concentrações de zinco, ferro e/ou EDTA das mesmas; e/ou através da modificação do processo de fabricação da matéria-prima para alcançar níveis desejados de zinco, ferro e/ou EDTA. Os métodos para a regulação dos componentes do meio de cultura são conhecidos pelos versados na técnica.

[0089] O meio de cultura pode compreender outros ingredientes além de zinco e/ou EDTA. A escolha de um meio de cultura adequado está no âmbito do conhecimento de um versado na técnica. Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio isento de soro.

[0090] Quaisquer células hospedeiras conhecidas na técnica para uso na produção de anticorpos podem ser usadas, incluindo células de mamíferos, como células SP2/0, por exemplo, células SP2/0 de camundongo (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581). Outros exemplos de células hospedeiras sãolinhagens celulares murinasNS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 8511050 3), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem celular de mi- eloma humano exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celulares úteis incluem aquelas derivadas de células do ovário do hamster chinês (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD, EUA), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ou DG44. As células podem ser cultivadas em suspensão monocelular ou de uma maneira dependente de ancoramento.

[0091] Uma variedade de sistemas de cultura são conhecidos na técnica, incluindo frascos, garrafas cilíndricas e biorreatores, por exemplo, biorreatores de tanque agitado. O meio de cultura pode ser adicionado em um processo em batelada, em que o meio de cultura é adicionado uma vez às células, de uma só vez ou, de preferência, em um processo de alimentação em batelada, em que pequenas quantidades de meio de cultura são adicionadas periodicamente. As células hospedeiras também podem ser cultivadas em uma cultura de perfu- são, que envolve a remoção contínua de um volume de meio de cultura a partir da cultura, e a substituição do volume removido com um vo lume comparável de meio fresco. Tipicamente, as culturas perfundidas podem ser operadas para atingir densidades celulares mais elevadas do que as culturas em batelada, e podem ser mantidas por longos períodos de tempo. As culturas perfundidas também permitem coletas repetidas.

[0092] Os métodos para a produção de um anticorpo podem compreender ainda a recuperação do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser recuperado quando as células hospedeiras res- ponsivas a zinco no meio de cultura atingem uma densidade celular de cerca de 1,5 milhões de células por mL a cerca de 11 milhões de células por mL e de preferência de 3 milhões de células por mL a cerca de 11 milhões de células por mL. Um anticorpo pode ser recuperado, por exemplo, por meio de captura direta do produto (DPC). Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, a concentração de zinco é controlada até o anticorpo ser recuperado.

[0093] O teor de CTL e de ácido siálico pode ainda ser controlado com mais precisão, por meio do controle da idade das células no memento da coleta ou recuperação do produto. Portanto, em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o anticorpo é recuperado simultaneamente com ou logo após a transição da fase exponencial de crescimento para a fase estacionária. Em outras modalidades, o anticorpo é recuperado durante a fase estacionária de cres-cimento da cultura. Em algumas modalidades, o anticorpo é recuperado dentro dos primeiros 25 dias de cultura, por exemplo, nos Dias 10 a 25, Dias 15 a 20, ou em torno do Dia 20. Em outras modalidades, o anticorpo é recuperado após os primeiros 25 dias de cultura.

[0094] Também é proporcionado na presente invenção, um método para controlar o teor de lisina C-terminal de um anticorpo tendo um teor de lisina C-terminal de cerca de 20% a cerca de 70%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o méto- do compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0095] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para controlar o teor de ácido siálico de um anticorpo tendo um teor de ácido siálico de cerca de 1% a cerca de 20%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossín- tese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0096] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para controlar o teor de galactose de um anticorpo tendo um teor de galactose de cerca de 50% a cerca de 90%, em um processo para a bi- ossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossín- tese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0097] Também é proporcionado na presente invenção, um método para controlar a razão entre ácido siálico e galactose em um anticorpo tendo uma razão entre ácido siálico e galactose de cerca de 0,05 a cerca de 0,20, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método compreendendo monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo.

[0098] Em algumas modalidades de um método para controlar o teor de CTL, ácido siálico ou galactose, ou a razão entre de ácido siá- lico e galactose, o anticorpo é um anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e/ou o anticorpo é biossintetizado por uma célula SP2/0 ou uma célula CHO.

Anticorpos e fragmentos dos mesmos

[0099] Como usado aqui, um "anticorpo" inclui um anticorpo inteiro e qualquer fragmento de ligação a antígeno ou uma cadeia única dos mesmos.

[00100] Os anticorpos podem incluir, ao menos, uma dentre uma região constante de cadeia pesada (HC), uma região variável de cadeia pesada (Hv), uma região variável de cadeia leve (Lv) e uma região constante de cadeia leve (Lc), em que um Ab policlonal, Ab monoclonal, fragmento e/ou regiões dos mesmos incluem, ao menos, uma região de cadeia pesada variável (Hv) ou de cadeia leve da região variável (Lv) que se liga a uma porção de um antígeno e inibe e/ou neutraliza, ao menos, uma atividade biológica do antígeno.

[00101] Um anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção pode compreender uma região de ligação a an- tígeno que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região determinante de complementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de pelo menos uma região variável de cadeia leve. Tais anticorpos podem ser preparados através da união química de várias porções (por exemplo, CDRs, estrutura) do anticorpo com o uso de técnicas convencionais, através do preparo e da expressão de uma (isto é, uma ou mais) molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo com o uso de técnicas convencionais de tecnologia de DNA re- combinante ou através do uso de qualquer outro método adequado.

[00102] Um anticorpo pode ser de primata, de mamíferos, murino, quimérico, humanizado ou humano. Um anticorpo pode incluir, por exemplo, pelo menos um dentre anticorpos quiméricos murino- humano, anticorpos murinos, anticorpos humanos ou quaisquer porções dos mesmos, tendo pelo menos um fragmento de ligação a antí- geno ou região de uma região variável da imunoglobulina.

[00103] Os anticorpos quiméricos são porções diferentes de moléculas que são derivadas de diferentes espécies animais, como os que têm a região variável derivada de um mAb murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Por exemplo, eles podem manter, ao menos, um domínio distinto, usualmente o domínio variável, de uma espécie e o restante de outra espécie; por exemplo, anticorpos quiméricos camundongo-humano. Eles são usados principalmente para re-duzir a imunogenicidade na aplicação e para aumentar o rendimento na produção, por exemplo, onde anticorpos monoclonais murinos (mAbs) têm rendimentos superiores aos hibridomas, mas imunogenici- dade maior em humanos, de modo que mAbs quiméricos muri- no/humano são usados. Anticorpos quiméricos e métodos para a sua produção são conhecidos na técnica (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); e Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Essas referências estão incorporadas na presente invenção a título de referência em sua totalidade.

[00104] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo quimérico" inclui imunoglobulinas monovalentes, divalentes ou polivalentes. Um anticorpo quimérico monovalente é um dímero (HL) formado por uma cadeia H quimérica associada através de pontes dissulfeto com uma cadeia L quimérica. Um anticorpo quimérico divalente é um tetrâmero (H2L2) formado por dois dímeros HL associados através de pelo menos uma ponte dissulfeto. Um anticorpo quimérico polivalente pode também ser produzido, por exemplo, por meio do emprego de uma região CH que agrega (por exemplo, a partir de uma cadeia H de IgM, ou cadeia μ).

[00105] Os anticorpos "humanizados" (também conhecidos como anticorpos enxertados com CDR) são produzidos por um processo pa ra reduzir a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais (mAb) a partir de fontes xenogênicas (geralmente roedores) e para melhorar as funções efetoras (por exemplo, ADCC, ativação do complemento e/ou ligação de C1q). Em geral, um anticorpo humanização tem um ou mais resíduos de aminoácido a partir de uma fonte que não é humana, por exemplo, mas não se limitando a, camundongo, rato, coelho, primata não humano ou outro mamífero. O mAb manipulado pode ser manipulado usando técnicas de biologia molecular. A simples enxertia de CDR das regiões determinantes de complementaridade de roedor (CDRs) em estruturas humanas frequentemente resulta em perda de afinidade e/ou especificidade de ligação ao mAb original. Com o propósito de humanizar um anticorpo, o projeto do anticorpo humanizado pode incluir variações, como substituições conservativas de aminoáci- dos nos resíduos das CDRs e retrossubstituição de resíduos do mAb de roedor nas regiões estruturais humanas (retromutações). Os métodos para manipulação ou humanização de anticorpos não humanos ou humanos são bem conhecidos na técnica.

[00106] O termo "anticorpo humano", como usado na presente invenção, inclui anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas ou próximas a sequências correspondentes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (por exem-plo, mutações introduzidas por meio de mutagênese aleatória ou sítio específica in vitro ou por mutação somática in vivo). Dessa forma, como usado na presente invenção, o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual substancialmente toda a parte da proteína (por exemplo, CDR, estrutura, CL, domínios de CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3), dobradiça, (VL, VH)) é substancialmente similar ao anticorpo da linhagem germinativa humana.

[00107] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo humano" também refere-se a um anticorpo no qual substancialmente toda parte da proteína (por exemplo, CDR, estrutura, CL, domínios de CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3), dobradiça, (VL, VH)) é substancialmente não imunogênica em seres humanos, com somente alterações ou variações de sequência sem importância. De forma similar, os anticorpos designados de primatas (macaco, babuíno, chimpanzé, etc.), de roedores (camundongo, rato, coelho, porquinho da Índia, hamster e similares) e outros mamíferos designam tais anticorpos específicos de espécies, subgênero, gênero, subfamília e família. Um anticorpo humano pode ser produzido por uma célula não humana animal ou procariótica ou eucariótica que é capaz de expressar, de modo funcional, genes de imunoglobulina humana redisposta (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia leve). Adicionalmente, quando um anticorpo humano é um anticorpo de filamento único, o mesmo pode compreender um ligante pep- tídico que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Por exemplo, um Fv pode compreender um ligante peptídico, de dois a cerca de oito glicinas ou outros resíduos de aminoácido, o qual conecta a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia le-ve. Tais ligantes peptídicos são considerados como de origem humana.

[00108] Os anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglo- bulina, incluindo anticorpos IgG, IgM, IgA e IgE, GILD e subclasses dos mesmos. Como usado na presente invenção, "isotipo" se refere à classe do anticorpo (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada. Em humanos, existem cinco isotipos de cadeia pesada e dois isotipos de cadeias leves. Para a cadeia pesada, IgA1 e 2; IgD; IgG1, 2, 3 e 4; IgE; e IgM são os isoti- pos de cadeias pesadas. Kappa e lambda são isotipos de cadeias le-ves. Em certas modalidades, a cadeia pesada é uma cadeia pesada da classe IgG. Em outras modalidades, a cadeia pesada é uma cadeia pesada da classe IgM. Em certas modalidades, a cadeia pesada compreende ainda, pele menos cerca de 8 aminoácidos de uma região J.

[00109] Anticorpos podem ser anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) para anticorpos que podem ser identificados na forma solúvel ou ligada, e os fragmentos, as regiões ou derivados dos mesmos, fornecidos por qualquer técnica conhecida, como, mas não limitada a clivagem enzimáti- ca, síntese de peptídeos ou técnicas recombinantes. Tais anticorpos podem ser capazes de se ligar a porções de um antígeno (por exemplo, TNF) que inibem a ligação do antígeno aos receptores do antíge- no.

[00110] Anticorpos policlonais são populações heterogêneas das moléculas de anticorpo derivadas de soros de animais imunizados com um antígeno.

[00111] Um anticorpo monoclonal (mAb) contém uma população substancialmente homogênea de anticorpos específicos para um antí- geno. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade de ligação única por um epitopo específico.

[00112] MAbs podem ser obtidos por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Consulte, por exemplo, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975); patente US n° 4.376.110, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); E Harlow eLane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), estando a totalidade de seus conteúdos aqui incorporados, a título de referência.

[00113] Um anticorpo anti-idiotípico (anti-Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos, em geral, associados à região de liga- ção a antígeno de outro anticorpo. O anticorpo anti-Id também pode ser usado como um "imunógeno" para induzir uma resposta imunológi- ca ainda outro animal, produzindo um chamado anticorpo anti-anti-Id. O anti-anti-Id pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original que induziu o anti-Id. Dessa forma, por meio do uso dos anticorpos para os determinantes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clones idênticos que expressam anticorpos de especificidade idêntica.

[00114] Os fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, Fab, Fab’, F (ab’)2 e Fv. Estes fragmentos não possuem o fragmento Fc de um anticorpo intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação e pode ter menos ligação a tecido não específica que um anticorpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Estes fragmentos são produzidos a partir de anticorpos intactos usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de clivagem proteolítica com enzimas como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsi- na (para produzir fragmentos F(ab’)2).

[00115] Como usado na presente invenção, o termo "fragmento de ligação a antígeno" refere-se à porção de uma molécula de anticorpo que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antí- geno e conferem ao anticorpo sua especificidade e afinidade pelo an- tígeno. Um "antígeno" é uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de induzir um animal a produzir anticorpo capaz de se ligar a um epi- topo desse antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais de um epito- po. A região de anticorpo inclui os resíduos de aminoácidos "estruturais" necessários para manter a conformação apropriada dos resíduos de ligação a antígeno.

[00116] Um "fragmento de ligação a antígeno" ou porção do mesmo inclui, por exemplo, anticorpos de cadeia única e fragmentos dos mesmos. Exemplos de fragmentos de ligação a antígeno incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ligação de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb em que os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia polipeptídica única; e (vi) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) isoladas. Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, os fragmentos podem incluir uma ou mais porções da cadeia do anticorpo, como as regiões de diversidade ou variáveis, de dobradiça ou constantes da cadeia pesada ou as regiões vari-áveis, de dobradiça ou constantes da cadeia leve.

[00117] A região de ligação ao antígeno pode ser de origem não humana, por exemplo, murina. Em algumas modalidades, a região de ligação ao antígeno pode ser derivada de um coelho ou um roedor, tal como um rato ou um hamster.

[00118] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo quimérico pode ser derivado de um anticorpo não humano específico para um antígeno humano. Em algumas modalidades, as fontes de DNA que codifica tal anticorpo quimérico incluem linhagens celulares que produzem anticorpos, de preferência, linhagens celulares híbridas co- mumente conhecidas como hibridomas. Em uma modalidade, o hibri- doma é a linhagem celular de hibridoma A2.

[00119] O termo "epitopo" significa um determinante proteico capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epitopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm usualmente caracte- rísticas estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Um "epitopo" pode ser aquela parte de qualquer molécula capaz de ser reconhecida e ligada por um anticorpo em uma ou mais das regiões de ligação a antígeno do Ab. Por "inibir e/ou neutralizar o epitopo" entende-se um epitopo que, quando ligado por um anticorpo, resulta em perda de atividade biológica da molécula ou organismo contendo o epitopo, in vivo, in vitro ou in situ e com mais preferência in vivo, por exemplo, a ligação do TNF a um receptor de TNF.

[00120] Os anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos isolados, recombinantes e/ou sintéticos.

[00121] Um "anticorpo recombinante", como usado na presente invenção, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes. O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"),refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante tenha sido introduzido. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, linhagens celulares CHO ou a linhagem celular derivada de mi- eloma de camundongo SP2/0. Anticorpos recombinantes, como anti-corpos murinos ou quiméricos murino-humano ou humano-humano podem ser produzidos usando técnicas conhecidas. Consulte, por exemplo, Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1987, 1992, 1993); e Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), estando a totalidade de seus conteúdos aqui incorporados, a título de referência.

[00122] Os anticorpos, fragmentos ou derivados tendo cadeias H quiméricas e cadeias L da mesma ou de diferente especificidade de ligação da região variável, podem ser preparados, por exemplo, por meio de associação apropriada das cadeias polipeptídicas individuais, de acordo com as etapas de métodos conhecidos, por exemplo, de acordo com Ausubel supra, Harlow, infra e Colligan, infra, estando a totalidade de seu conteúdo aqui incorporada, a título de referência.

[00123] Com esta abordagem, os hospedeiros que expressam cadeias H quiméricas (ou os seus derivados) são cultivados separadamente a partir de hospedeiros que expressam cadeias L quiméricas (ou os seus derivados), e as cadeias de imunoglobulina são recuperadas separadamente e então, associadas. Alternativamente, as hospedeiras podem ser cocultivadas e as cadeias deixadas associar espontaneamente no meio de cultura, seguido por recuperação da imuno- globulina, fragmento ou derivado montada.

[00124] As células híbridas são formadas pela fusão de uma célula produtora de anticorpo anti-hTNFα não humano, tipicamente, uma célula do baço de um animal imunizado contra TNF natural ou recombi- nante humano, ou um fragmento peptídico da sequência proteica do TNFα humano. Alternativamente, a célula produtora de anticorpos não humanos anti-TNFα pode ser um linfócito B obtida do sangue, baço, linfonodos ou outros tecidos de um animal imunizado com TNF.

[00125] O segundo parceiro de fusão, que proporciona a função de imortalização, pode ser uma célula linfoblastoide ou uma célula de plasmacitoma ou mieloma, que não é em si uma célula produtora de anticorpo, mas é maligna. Em algumas modalidades, as células do parceiro de fusão incluem o hibridoma SP2/0-Ag14, abreviado como SP2/0 (ATCC CRL1581) e o mieloma P3X63Ag8 (ATCC TIB9), ou seus derivados. Consulte, por exemplo, Ausubel infra, Harlow infra e Colligan, infra, estando a totalidade de seu conteúdo aqui incorporada, a título de referência.

[00126] Um "anticorpo isolado", como usado na presente invenção, tem por objetivo se referir a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que têm diferentes especificidades antigênicas. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo de um antígeno humano pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outros materiais celulares e/ou produtos químicos.

[00127] Métodos para determinar a especificidade e afinidade do mAb por meio de inibição competitiva, podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988), Colli- gan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), e Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), estando a totalidade de seu conteúdo aqui incorporada, a título de referência.

[00128] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo biologicamente ativo. Anticorpos biologicamente ativos têm uma atividade específica de ao menos 20%, 30% ou 40%, e, de preferência, de ao menos 50%, 60% ou 70%, e, com mais preferência, ao menos 80%, 90% ou 95% a 100% daquele anticorpo nativo (não sintético), endógeno ou relacionado e conhecido. Os métodos de analisar e quantificar medições de atividade enzimática e especificidade de substrato, são bem conhecidos pelos versados na técnica.

Anticorpos anti-TNFα

[00129] Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos pelos métodos descritos na presente invenção são anticorpos antifator α de necrose tumoral (TNFα). Como usado na presente invenção, o fator α de necrose tumoral (TNFα) e o fator de necrose tumoral (TNF) são usados de forma intercambiável referindo-se ao fator α de necrose tumoral (TNFα), exceto onde especificamente especificado em contrário. De modo semelhante, os anticorpos para o fator α de necrose tumoral (TNFα) e o fator de necrose tumoral (TNF) e os anticorpos antifator α de necrose tumoral (TNFα) e os antifator de necrose tumoral (TNF) são usados de forma intercambiável, exceto onde especificamente especificado em contrário.

[00130] O TNFα é homotrímero solúvel de subunidades proteicas de 17 kD (Smith et al., J. Biol. Chem. 262:6951- 6954 (1987)). Uma forma precursora ligada à membrana de TNF, de 26 kD, também existe (Kriegler et al., Cell 53:45-53 (1988)). Para revisões sobre TNF, consulte Beutler, et al., Nature 320:584 (1986), Old, Science 230:630 (1986), e Le, et al., Lab. Invest. 56:234. A sequência primária completa de TNFα humano, de acordo com Pennica et al., Nature 312:724-729 (1984) é mostrada na Figura 28 (SEQ ID NO: 1).

[00131] TNFα pode causar ações pró-inflamatórias que resultam em lesão tecidual. O fator de necrose tumoral (TNFα) medeia ou está envolvido em diversas patologias, como, mas não limitadas a, infecções bacterianas, virais ou parasitárias, doenças inflamatórias crônicas, doenças autoimunes, doenças malignas e/ou doenças neurodegenerati- vas. Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos têm atividade neutralizante e/ou inibitória contra o TNF.

[00132] Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos quiméricos anti-TNF murino-humano de alta afinidade, e fragmentos ou regiões dos mesmos, que têm potente atividade neutralizante e/ou inibitória contra o TNFα humano in vivo. Tais anticorpos e anticorpos quiméricos podem incluir aqueles gerados por imunização usando hTNFα recombinante purificado (SEQ ID NO: 1) ou fragmentos peptí- dicos dos mesmos.

[00133] Em algumas modalidades, os anticorpos e seus fragmentos se ligam especificamente ao TNFα. Em algumas modalidades, eles podem também diminuir, bloquear, anular, interferir, evitar e/ou inibir TNF RNA, DNA ou síntese de proteína, liberação de TNF, sinalizador de receptor de TNF, clivagem de TNF na membrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF in situ, in vivo e/ou in vitro.

[00134] Em algumas modalidades, o anticorpo é cA2. Um anticorpo quimérico cA2 consiste na região variável de ligação a antígeno do anticorpo IgG1 anti-TNFα humano de camundongo com alta afinidade de neutralização, designado A2, com as regiões constantes de uma imu- noglobulina IgG1 kappa humana. A região IgG1 Fc humana aprimora a função efetora do anticorpo alogeneico, aumenta a meia-vida de circu-lação no soro e diminui a imunogenicidade do anticorpo. A avidez e a especificidade epitópica do anticorpo quimérico cA2 são derivadas da região variável do anticorpo murino A2. Em uma modalidade particular, uma fonte de ácidos nucleicos que codificam a região variável do anticorpo murino A2 é a linhagem de células hibridoma A2.

[00135] Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal murino A2 é produzido por uma linhagem de células selecionadas c134A. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico cA2 é produzido por uma linhagem celular designada c168A.

[00136] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode compreender, ao menos, uma das CDR3 de cadeia pesada de cA2 e/ou uma cadeia leve de CDR3 de cA2. Em uma modalidade particular, o anticorpo ou fragmento de ligação a an- tígeno pode ter uma região de ligação a antígeno que compreende pelo menos uma porção de pelo menos uma CDR de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) tendo a sequência de aminoácidos das CDRs 1, 2 e/ou 3 correspondentes de cA2. Em outra modalidade particular, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno ou variante pode ter uma região de ligação a antígeno que compreende pelo menos uma porção de pelo menos uma CDR de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) tendo a sequência de aminoácidos das CDRs 1, 2 e/ou 3 correspondentes de cA2. Em uma modalidade, as três CDRs de cadeia pesada e as três CDRs de cadeia leve do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno têm a sequência de aminoácidos das CDRs correspondentes de pelo menos um dentre o mAb A2 ou cA2, conforme descrito na presente invenção.

[00137] A avidez e a especificidade epitópica do quimérico A2 são derivadas da região variável do anticorpo murino A2. Em um ELISA de fase sólida, foi observada competição cruzada pelo TNF entre A2 quimérico e murino, indicando uma especificidade epitópica idêntica de cA2 e do A2 murino. A especificidade do cA2 para o TNF-α foi confirmada pela sua incapacidade de neutralizar os efeitos citotóxicos da linfotoxina (TNF-β). O A2 quimérico neutraliza o efeito citotóxico de ambos TNFα humanos natural e recombinante de maneira dose- dependente. A partir de ensaios de ligação de cA2 e TNF humano re- combinante, a constante de afinidade do cA2 foi calculada como sendo 1,8 x 109 M1.

[00138] Métodos de rastreio que podem ser usados para determinar a atividade neutralizante de TNF de um composto neutralizante de TNF podem incluir ensaios in vitro ou in vivo. Tais ensaios in vitro podem incluir um ensaio de citotoxicidade do TNF, como um radioimuno- ensaio, que determina uma diminuição na morte celular por contato com o TNF, tal como TNF de chimpanzé ou humano na forma isolada ou recombinante, sendo que a presença simultânea de um composto de TNF neutralizante reduz o grau ou a taxa de morte celular. A morte celular pode ser determinada usando os valores da ID50 que representam a concentração de um composto neutralizante de TNF que diminui a taxa de morte celular em 50%. Por exemplo, os mAb’s, A2 e cA2 são encontrados para ter ID50 de cerca de 17 mg/ml + /- 3 mg/ml, como 14 a 20 mg/ml, ou qualquer intervalo ou valor nele.

[00139] Em algumas modalidades, os anticorpos podem inibir competitivamente a ligação ao TNFa humano in vivo do mAb anti-TNFα murino A2, mAb quimérico cA2 ou de um anticorpo possuindo subs- tancialmente as mesmas características de ligação específica, por exemplo, a especificidade epitópica, como A2 e/ou cA2.

[00140] Os epitopos reconhecidos pelos anticorpos, e fragmentos e regiões dos mesmos, podem incluir 5 ou mais aminoácidos, compreendendo pelo menos um aminoácido de cada ou ambas as seguintes sequências de aminoácidos de TNF, que fornecem um epitopo topográfico ou tridimensional de TNF, que é reconhecido por, e/ou ligar com atividade anti-TNF, um anticorpo para TNF, ou fragmentos dos mesmos: 59-80: Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly- Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His- Thr-Ile (AA 59 a 80 da SEQ ID NO: 1); e 87-108: Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala- Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro- Glu-Gly (AA 87-108 da SEQ ID NO: 1).

[00141] Em algumas modalidades, os anticorpos, fragmentos e as regiões de anticorpos anti-TNF reconhecem epitopos incluindo 5 ami- noácidos contendo, pelo menos, um aminoácido dos resíduos de ami- noácidos 87 a 108 ou resíduos 59 a 80 e 87 a 108 do hTNFα (da SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, os anticorpos, fragmentos e regiões de anticorpos anti-TNF não reconhecem epitopos de pelo menos um dentre os aminoácidos 11a 13, 37 a 42, 49 a 57 ou 155 a 157 do hTNFα (SEQ ID N:1). (O sítio de ligação putativo do receptor, conforme apresentado por Eck e Sprang (J. Biol. Chem. 264(29): 1759517605 (1989)).

[00142] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico anti-hTNF compreendendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, cada uma das cadeias compreendendo pelo menos uma parte da região constante humana e ao menos parte de uma região variável (V) de origem não humana, tendo especificidade pelo fator de necrose tumoral alfa TNF, a dita ligação do anticorpo com alta afinidade para ini- bir e/ou neutralizar os epitopos de TNF humano.

[00143] Em uma modalidade, o anticorpo é para uso nos métodos de diagnóstico para detecção de TNF em pacientes ou animais suspeitos de sofrer de condições associadas com a produção anormal de TNF. Em algumas modalidades, os anticorpos para TNF são usados para aliviar os sintomas ou patologias envolvendo TNF, como, mas não se limitando a certas infecções bacterianas, virais ou parasitárias, doenças inflamatórias crônicas, doenças autoimunes, doenças malignas e/ou doenças neurodegenerativas.

[00144] Hibridomas murinos que produzem mAb humanos específicos para TNFβ ou TNFα são formados pela fusão de uma célula de rato parceira de fusão, como SP2/0 e as células de baço de camundongos imunizados contra hTNFα purificado, hTNFα recombinante, peptídeos de TNF naturais ou sintéticos, incluindo peptídeos incluindo 5 ou mais aminoácidos selecionados dentre os resíduos 59 a 80, e 87 a 108 de TNF (da SEQ ID N:1) ou outras preparações biológicas contendo TNF. Para imunizar os camundongos, uma variedade de diferentes protocolos convencionais pode ser seguida. Por exemplo, os camundongos podem receber imunizações primárias e de reforço de TNF.

[00145] Os anticorpos descritos na presente invenção podem se ligar ao TNF humano com uma ampla gama de afinidades (KD). Em uma modalidade, pelo menos um mAb humano pode, opcionalmente, se ligar ao TNF humano com um alto grau de afinidade. Por exemplo, um mAb humano pode se ligar ao TNF humano com um KD igual ou menor que cerca de 10-7 M, por exemplo, mas não se limitando a, 0,1 a 9,9 (ou qualquer intervalo ou valor entre os mesmos) X 10-7, 10-8, 109,10-10, 10-11, 10-12, 10-13 ou qualquer intervalo ou valor entre os mesmos.

[00146] A afinidade ou avidez de um anticorpo por um antígeno po- de ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. (Consulte, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, EUA (1992); e métodos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno particular pode variar se medida sob condições diferentes (por exemplo, concentração de sal, pH). Portanto, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação de antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são, de preferência, realizados com soluções de anticorpo e antígeno padronizadas, e um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito.

[00147] O anticorpo anti-TNF pode compreender pelo menos uma dentre uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos definida. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo anti-TNF compreende pelo menos um de pelo menos uma região variável de cadeia leve, que tem opcionalmente a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N°:3 e/ou pelo menos uma região variável de cadeia pesada, que tem opcionalmente a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N°:5. Os anticorpos que s e ligam ao TNF humano e que compreendem uma região variável definida de cadeia pesada ou de cadeia leve podem ser preparados usando métodos adequados, como exposição de fago (Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)) ou métodos que empregam animais trans- gênicos, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito na presente invenção. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TNF com-preende as sequências da cadeia leve das CDRs CDR1, CD2 e CD3 correspondentes aos resíduos de aminoácidos 24 a 34, 50 a 56 e 89 a 97 de SEQ ID NO: 3, respectivamente, e a cadeia pesada da CDR HCDR1, HCDR2 e HCDR3 correspondentes aos resíduos de aminoá- cidos 31 a 35, 50 a 68 e 101 a 109 da SEQ ID NO: 5, respectivamente, delineada de acordo com Kabat.

[00148] Um anticorpo anti-TNF pode ainda compreender opcionalmente um polipeptídeo de pelo menos um de 70 a 100% dos aminoá- cidos contíguos de pelo menos um dentre as SEQ ID NO: 3 e 5.

[00149] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina, ou porção da mesma (por exemplo, região varíavel) tem cerca de 70 a 100% de identidade (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer intervalo ou valor nele) à cadeia correspondente de pelo menos uma dentre as SEQ ID NOs: 5 ou 9. Por exemplo, a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve pode ser comparada à sequência de SEQ ID NO:8, ou a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de CDR3 pode ser comparada à SEQ ID NO:7. De preferência, 70 a 100% de identidade de aminoácidos (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer intervalo ou valor nessa) é deter-minada com o uso de um algoritmo de computador adequado, conforme conhecido na técnica.

[00150] Sequências das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve exemplificadoras são fornecidas nas SEQ ID NO: 3 e 5. Os anticorpos podem compreender qualquer número de resíduos de ami- noácido contíguos de um anticorpo, sendo que este número é selecionado a partir do grupo de números inteiros que consiste em de 10 a 100% do número de resíduos contíguos em um anticorpo anti-TNF. Opcionalmente, esta subsequência de aminoácidos contíguos é de pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais aminoácidos em comprimento, ou qualquer intervalo ou valor nele. Além disso, o número de tais subsequências pode ser qualquer número inteiro selecionado a partir do grupo consistindo de 1 a 20, tal como ao menos 2, 3, 4, ou 5.

[00151] Os anticorpos incluem uma elevada afinidade e/ou potente inibição de in vivo e/ou anticorpos neutralizantes, fragmentos ou regiões dos mesmos, para ambos os imunoensaios de TNF e a terapia de patologias mediadas por TNF. Tais anticorpos, fragmentos ou regiões, de preferência, terão afinidade pelo hTNFα, expressa como Ka, de pelo menos 108 M-1, com mais preferência, ao menos 109 M-1, como 108 M-1 8 -1 8 -1 9 -1 9 -1 9 -1 , 5 x 10 M , 8 x 10 M , 2 X 10 M , 4 X 10 M , 6 x 10 M , 8 x 109 M-1 ou qualquer intervalo ou valor neles.

[00152] Os anticorpos para TNF incluem anticorpos quiméricos e murinos de elevada afinidade e fragmentos, regiões e derivados tendo uma potente atividade de inibição e/ou neutralização de TNFα in vivo que bloqueiam a atividade de TNF induzida pela secreção de IL-6. Em algumas modalidades, os anticorpos para usos terapêuticos em humanos incluem anticorpos anti-TNFα quiméricos e murinos de elevada afinidade, e fragmentos, regiões e derivados dos mesmos, que bloqueiam a atividade pró-coagulante induzida por TNF, incluindo o bloqueio da expressão induzida por TNF de moléculas de adesão celular, como ELAM -I e ICAM-I e bloqueiam a atividade mitogênica de TNF, in vivo, in situ e in vitro.

[00153] Exemplos adicionais de anticorpos monoclonais anti-TNF são descritos na técnica (Consultar, por exemplo, patente US n° 5.231.024; Moller, A. et al., Cytokine 2 (3):162-169 (1990); pedido de patente US n° 07/943.852 (depositado em 11 setembro de 1992); Rathjen et al., publicação internacional N° WO 91/02078 (publica do em 21 de fevereiro de 1991); Rubin et al., publicação de patente EPO N° 0 218 868 (publicada em 22 de abril de 1987); Yone et al., publicação de patente EPO N° 0 288 088 (publicada em 26 de outubr o de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); e Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987), estando a totalidade de seus conteúdos aqui incorporados, a título de referência).

[00154] Os resultados dos Exemplos descritos a seguir demonstram várias descobertas importantes:

[00155] A remoção de CTL pode ser controlada para menos do que o nível máximo pelo controle de Zn+2 extracelular. Por exemplo, conforme demonstrado pelos braços experimentais no Experimento SMF- 10.1, Experimento DOE3, Experimento de Mistura de BSA N° 1 e Experimento de Mistura de BSA N° 2 descritos a seguir, o teor de CTL pode ser controlado dentro de uma faixa (por ex., 40 a 70%) por meio do controle da concentração extracelular de Zn+2 para um valor < 1,2 μM. Além disso, conforme demonstrado no Experimento DOE3, o controle para um faixa superior de teor de CTL é possível com concentrações mais elevadas de Zn+2 até 6,3 μM.

[00156] Além disso, conforme demonstrado pelos braços experimentais no Experimento DOE3, Experimento de Mistura de BSA N° 1 e Experimento de Mistura de BSA N° 2, dentro de uma faixa de concentrações extracelulares de Zn+2, o teor de CTL pode ainda ser controlado por meio do controle da [EDTA] ou [EDTA - Fe+3] da matriz extracelular.

[00157] Além disso, o teor de ácido siálico pode ser controlado para menos do que o nível máximo pelo controle de Zn+2 extracelular. Por exemplo, conforme demonstrado pelos braços experimentais no Experimento DOE3, Experimento de Mistura de BSA N° 1 e Experimento de Mistura de BSA N° 2, o teor de ácido siálico pode ser controlado dentro de uma faixa (por exemplo, 4 a 70%) por meio do controle da concentração extracelular de Zn+2 para um valor < 1,2 μM. Além disso, conforme demonstrado no Experimento DOE3, o controle para um faixa superior de teor de ácido siálico é possível com concentrações mais elevadas de Zn+2 até 6,3 μM.

[00158] Além disso, conforme demonstrado no Experimento DOE3, Experimento de Mistura de BSA N° 1 e Experimento de Mistura de BSA N° 2, dentro de uma faixa de concentrações extracelulares de Zn+2, o teor de ácido siálico pode ainda ser controlado por meio do controle da [EDTA] ou [EDTA - Fe+3] da matriz extracelular.

[00159] Além disso, como demonstrado no Experimento SFM-10.3 e Experimento DOE3, a produção de anticorpos também pode ser controlada através do controle da concentração extracelular de Zn+2.

[00160] O controle das concentrações de Zn+2, Fe+3 e EDTA para alcançar o controle da adição de ácido siálico, a remoção de CTL e a produção de anticorpo pode ser alcançado através de uma variedade de meios, incluindo qualquer um dos seguintes, sozinho ou em combinação: 1) Adição direta de Zn+2, Fe+3 e EDTA ao meio de cultura, 2) através da mistura de matérias-primas que têm Zn+2, Fe+3 ou EDTA como componentes, 3) através do tratamento das matérias-primas pa-ra ajustar as concentrações de Zn+2, Fe+3 ou EDTA e/ou 4) através da modificação dos processos de fabricação de matérias-primas complexas para alcançar os níveis desejados de Zn+2, Fe+3 e/ou EDTA.

Exemplificação Materiais e métodos

[00161] Os experimentos descritos na presente invenção foram realizados em biorreatores 3L Applikon® controlados, com condições de funcionamento que demonstraram proporcionar resultados que são representativos do processo de infliximab comercial.

[00162] No dia indicado, infliximab foi purificado por captura direta do produto (DPC), usando uma coluna de Proteína A. Então, foi caracterizado por meio de focagem capilar isoelétrica (cIEF) ou do ensaio WAX. O infliximab que foi purificada pela DPC usando uma coluna de proteína A é mencionado neste documento como uma "amostra de DPC " ou "eluído de DPC".

Exemplo 1 - O método cIEF

[00163] cIEF foi usada para calcular o teor de CTL de oligossacarí- deos de infliximab. Existem três fontes de carga de heterogeneidade evidentes na análise de infliximab pré-formulado a granel (PFB): (1) a variabilidade de CTL; (2) o teor de ácido siálico; e (3) a desamidação. Os eluídos típicos de infliximab das amostras iniciais, intermediárias e tardias do biorreator comercial amostras exibem remoção de CTL da cadeia pesada de infliximab de cerca de 30% a 80%, com uma remoção de CTL média em PFB de cerca de 40% a 60%. A CTL da cadeia leve não está sujeita à remoção. A remoção da CTL tende a ser menor para as amostras iniciais do biorreator e aumenta para as amostras intermediárias e tardias. Eluídos típicos de infliximab de amostras iniciais e tardias do biorreator exibem teores de ácido siálico de cerca de 3% a 14% dos oligossacarídeos de IgG. A adição de ácido siálico é tipicamente menor para as amostras iniciais do biorreator e maior para as amostras intermediárias e tardias. O mapeamento de fase reversa de peptídeos revelou baixos níveis de desamidação consistentes, em vários sítios de desamidação para infiximab na cadeia pesada e na cadeia leve.

[00164] Esta heterogeneidade de cargas tipicamente leva a 4 a 6 picos em um eletroforegrama de cIEF. O Pico 1 corresponde ao infliximab não contendo cargas em excesso; ou seja, este pico ou banda contém lisinas C-terminais, sem ácido siálico e sem desamidação. O segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto picos ou bandas contêm 1, 2, 3, 4 e 5 cargas em excesso, respectivamente, devido a uma combinação de remoção de CTL, adição de ácido siálico e desamidação.

[00165] A Figura 1 é um eletroferograma de cIEF de uma amostra de infliximab, e mostra os valores de pI para os Picos 1 a 6.

[00166] Devido ao nível relativamente elevado de remoção de CTL, baixo nível de adição de ácido siálico e à consistência de desamida- ção, a porcentagem relativa do Pico 1 é altamente correlacionada com a remoção de CTL. A Figura 2 é uma curva ajustada da porcentagem de des-lisina (des-Lis) como uma função da porcentagem do Pico 1 e mostra a correlação entre o teor de CTL (expresso em porcentagem de des-Lis) e a porcentagem do Pico 1 em um conjunto de condições experimentais. A correlação representada na Figura 2 foi criada a partir de amostras para as quais a porcentagem de des-Lis de infliximab foi determinada por mapeamento peptídico e a porcentagem do Pico 1 foi determinada por cIEF.

[00167] O teor de CTL é expresso na presente invenção, como a porcentagem de cadeias pesadas que possuem uma lisina C-terminal e pode ser calculado usando a seguinte equação: teor de CTL (%) = (número de cadeias pesadas que possuem uma CTL)/(número total de cadeias pesadas) x 100. A remoção de CTL é expressa na presente invenção, como a porcentagem de cadeias pesadas que não possuem uma lisina C-terminal (des-Lis). Dessa forma, "80% Des-Lis" é equivalente a um teor de CTL de 20%. A correlação entre a porcentagem de des-Lisina e a porcentagem do Pico 1 (conforme medida por cIEF) é válida para amostras de infliximab que apresentam porcentagens típi-cas de remoção de CTL, de adição de ácido siálico e desamidação. Esta correlação, portanto, se aplica aos experimentos descritos na presente invenção porque: (1) adição de ácido siálico por WAX foi determinada para muitas das amostras de DPC destes experimentos, e os resultados indicam que o ácido siálico permaneceu na faixa típica de 3% para as amostras iniciais de biorreator a cerca de 14% para amostras tardias de biorreator (isto é, a porcentagem de ácido siálico permaneceu na faixa dos dados empregados para gerar a correlação da Figura 1); e (2) é razoável assumir que as porcentagens de desa- midação mantiveram-se baixas e consistentes, como foi o caso para as amostras experimentais empregadas para gerar a correlação da Figura 1.

[00168] A remoção de CTL nesses experimentos variou entre os valores típicos de 30 a 60%, a valores mais elevados. Sob estas condições, a remoção de CTL continuará a ser o determinante dominante da porcentagem do Pico 1.

Exemplo 2 - O ensaio wax

[00169] O ensaio WAX foi usado para determinar o teor de ácido siálico e o teor de galactose de oligossacarídeos de infliximab. No ensaio, N-oligossacarídeos ligados são liberados de IgG usando PNGase F e, em seguida, são derivatizados usando uma solução de ácido an- tranílico e cianoboro-hidreto de sódio. As amostras são purificadas usando filtros de náilon 0,45 micron ACRODISC® e analisadas em um Agilent 1100 HPLC com um detector de fluorescência. As identidades de pico são resolvidas usando padrões de N-glicanos comercialmente disponíveis.

[00170] No ensaio WAX descrito na presente invenção, o Componente 5A é a porcentagem de oligossacarídeos de infliximab contendo ácido siálico. O Componente 1 está altamente correlacionado com a porcentagem de oligossacarídeos de infliximab sem galactose. Portanto, (100 - porcentagem do Componente 1) representa uma estimativa razoável da porcentagem de oligossacarídeos de infliximab que contêm galactose.

[00171] Na cadeia pesada de infliximab, um resíduo asparagina (Asn) é glicosilado com um oligossacarídeo, que pode conter, por exemplo, um ou dois resíduos de galactose e um ou dois resíduos de ácido siálico. O teor de galactose de infliximab é expresso na presente invenção, como a porcentagem de oligossacarídeos contendo galactose, e pode ser calculado usando a seguinte equação: teor de galactose (%) = (número de oligossacarídeos contendo uma galacto- se)/(número total de oligossacarídeos) x 100. Esta equação se aplica independentemente do número de unidades galactose nos oligossaca- rídeos. Em outras palavras, independentemente da existência ou não, por exemplo, de um ou dois resíduos de galactose no oligossacarídeo, o oligossacarídeo só é contado uma vez com o propósito de cálculo do teor de galactose.

[00172] O teor de ácido siálico de infliximab é expresso na presente invenção, como a porcentagem de oligossacarídeos contendo ácido siálico, e pode ser calculado usando a seguinte equação: teor de ácido siálico (%) = (número de oligossacarídeos contendo um ácido siáli- co)/(número total de oligossacarídeos) x 100. Esta equação se aplica independentemente do número de resíduos de ácido siálico nos oli- gossacarídeos. Em outras palavras, independentemente da existência ou não, por exemplo, de um ou dois resíduos de ácido siálico no oli- gossacarídeo, o oligossacarídeo só é contado uma vez com o propósito de cálculo do teor de ácido siálico.

[00173] Tipicamente, ambas as cadeias pesadas de infliximab são glicosiladas. Entretanto, em algumas circunstâncias, algumas das cadeias pesadas permanecem aglicosiladas. Por exemplo, em algumas modalidades, cerca de 94% das moléculas de infliximab são glicosila- das em ambas as cadeias, cerca de 6% das moléculas de infliximab são hemiglicosiladas, e cerca de 0,1% das moléculas de infliximab são totalmente aglicosiladas.

[00174] A razão entre ácido siálico e galactose é calculada a partir da relação molar entre ácido siálico e galactose nos oligossacarídeos do infliximab.

Exemplo 3 - Estudos de retenção de coleta

[00175] Dois estudos foram conduzidos em que a coleta de infliximab isento de células foi realizada por períodos prolongados. O propósito desses estudos foi compreender se a remoção de CTL poderia ocorrer de modo extracelular (ou seja, pós-secreção).

[00176] O ácido siálico é conhecido por ser adicionado às glicopro- teínas, de modo intracelular, antes da secreção. Entretanto, a remoção extracelular de ácido siálico das glicoproteínas recombinantes secre- tadas, foi reportada para culturas celulares de ovário de hamster chinês (CHO). Para as células CHO, a sialidase é libertada para o meio extracelular a partir de células lisadas. Dessa forma, um segundo propósito dos estudos de retenção de extração foi para esclarecer se há remoção extracelular de ácido siálico na coleta isenta de células para o processo de infliximab.

[00177] Um estudo de retenção de coleta usando a coleta a partir da fabricação em escala em biorreatores demonstrou que a retenção da coleta em condições variáveis (clarificada, coleta isenta de células retida por 30 dias a 2 a 14°C; a coleta sem clarifi cação retida por 14 dias a 2 a 8°C) e diferentes tempos de biorreatores não tiveram impacto sobre o perfil do gel de cIEF de infliximab.

[00178] Para reforçar estes resultados, um outro estudo de retenção de coleta foi conduzido. O infliximab da coleta isenta de células foi coletado em dois biorreatores. Para cada biorreator, uma parte da coleta foi imediatamente purificada por cromatografia em Proteína A para produzir o eluído de DPC. A outra parte da coleta foi armazenada por 7 dias a temperaturas entre 10 a 14°C (uma temperat ura de armazenamento típica), antes do processamento a um eluído de DPC. A temperatura de coleta em retenção foi monitorada por uma sonda no refri-gerador e controlada por ajuste manual. As quatro amostras de eluído de DPC foram então analisadas por cIEF para qualquer evidência de mudança de distribuição de carga que indique remoção de CTL ou ácido siálico na coleta.

[00179] Este estudo de retenção não revelou nenhuma diferença significativa nos padrões de cIEF para os eluídos de DPC feitos imedi- atamente a partir da colheita ou da colheita retida por 7 dias a uma temperatura de 10 a 12 °C antes da purificação por Proteína A.

[00180] Os estudos de retenção de coleta demonstram que a remoção de CTL da cadeia pesada de infliximab está provavelmente ocorrendo de modo intracelular. De modo semelhante, o teor de ácido siá- lico de oligossacarídeos de infliximab é determinado de modo intracelular.

Exemplo 4 - O experimento SFM-10.1

[00181] O termo SFM-10.1 corresponde ao meio SFM-10 infliximab sem BSA e líquido CM2 (Parte B) (incluindo insulina contendo zinco). O propósito do Experimento SFM-10.1 foi investigar o impacto da su- plementação de Zn+2 sobre a produção de infliximab.

[00182] As quatro condições experimentais representam o meio SFM-10.1 suplementado com de sulfato de zinco hepta-hidratado, que foi adicionado em uma quantidade suficiente para adicionar Zn+2 0,25, 0,5, 1,0 ou 2,0 μM à concentração final do meio. A concentração total de Zn+2 em cada experimento foi a soma desta suplementação mais o Zn+2 oriundo do PRIMATONE® (disponível junto à Kerry Ingredients and Flavours, Beloit, WI), que foi determinada como sendo 0,49 μM (com base na análise de metais). Dessa forma, as concentrações totais de zinco nestas quatro biorreatores são razoavelmente estimadas como 0,74, 1,0, 1,5 e 2,5 μM. A concentração de Fe+3 nestes biorreato- res foi de 5,8 μM, com base na análise dos metais do lote de PRIMA- TONE® empregado. A concentração de EDTA é estimada como sendo 2 μM, oriunda da transferrina. EDTA tem uma afinidade muito mais forte pelo Fe+3 do que pelo Zn+2 e outros cátions divalentes. Portanto, o cálculo [EDTA - Fe+3] pode representar a concentração de EDTA que está disponível para quelar Zn+2. Portanto, este primeiro conjunto de experimentos, pode-se esperar que não haja EDTA livre disponível para se ligar ao Zn2+extracelular. Tabela 1. Concentrações de Zn+2, Fe+3, EDTA e [EDTA - Fe+3] nos quatro biorreatores do experimento SFM-10.1 (as concentrações estão em μM).

[00183] A Figura 3 é um gráfico de remoção de CTL (expressa em percentagem de des-Lis e calculada usando os dados do método do Pico 1 de cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a remoção de CTL. Os biorreatores com concentrações totais Zn+2 de cerca de 1,5 e 2,5 M exibiram 70% a 80% de remoção de CTL em todos os pontos no tempo. Não há alteração na distribuição de carga em função da idade de biorreator, já que todos os pontos no tempo (amostras de biorreator iniciais, intermediárias e tardias) têm alta remoção de CTL. O biorrea- tor com uma concentração de Zn+2 de 1,0 M exibiu 60% de remoção de CTL nos pontos de amostra iniciais do estudo e cerca de 70% de remoção nos intermediários e tardios. O biorreator com uma concentração de Zn+2 de cerca de 0,74 M exibiram aumento de remoção de CTL em função da idade de biorreator.

[00184] A Figura 4 é um gráfico da porcentagem de oligossacarí- deos de infliximab com ácido siálico, tal como determinado pelo método WAX, como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de Zn+2 sobre a porcentagem de ácido siálico. A Figura 4 mostra que não houve uma tendência clara na adição de ácido siálico como uma função da concentração de Zn+2 neste experimento.

[00185] Não se sabe se esta falta de impacto representa uma verdadeira insensibilidade do teor de ácido siálico à concentração extra- celular de Zn+2 no contexto do meio SFM-10.1 se trata de uma reflexão de ruído experimental, dado o pequeno número de biorreatores, ou se pode ter sido havido uma falha de procedimento com a implementação experimental.

[00186] As Figuras 5 a 7 são gráficos da densidade de células viáveis, da viabilidade da cultura e da concentração de infliximab, respectivamente, como uma função do tempo, e mostram o efeito de várias concentrações de Zn+2 no experimento SFM-10.1. Os resultados no período antes de a densidade celular alvo ser alcançada, aproximadamente no Dia 15 a 20, é o mais revelador, já que isto representa um período em que todo biorreator é operado regularmente. Depois que a densidade celular alvo é alcançada, as células são retiradas das culturas diariamente, em uma tentativa de manter a concentração celular alvo, e variações deste procedimento de remoção podem causar flutuações na densidade celular, viabilidade da cultura e concentração de anticorpos.

[00187] No experimento SFM-10.1, no biorreator com 0,74 μM de Zn+2 houve menor taxa de crescimento celular, menor viabilidade da cultura e menor concentração de anticorpos antes da densidade de células alvo ser alcançada do que os biorreatores contendo 1,5 e 2,5 μM de Zn+2. O biorreator com 1,0 μM de Zn+2 exibiu desempenho em todos os casos, que foi intermediário entre os biorreatores com 0,74 μM e os biorreatores com 1,5 ou 2,5 μM de Zn+2.

[00188] As condições deste experimento foram favoráveis ao acúmulo de Zn+2 pelas células SP2/0. A [EDTA - Fe+3] é menor que zero, indicando que todo o EDTA está quelado ao Fe+3 e não está disponível para quelar Zn2+ no meio extracelular. Além disso, outro potencial quelador, a BSA, estava ausente do meio.

[00189] Apesar de estas condições favoráveis para o acúmulo de Zn+2, os resultados experimentais indicam um impacto das concentra- ções extracelulares de Zn+2 de 0,74 e 1,0 μM na remoção de CTL, no crescimento inicial de células, na viabilidade da cultura e na concentração de anticorpo, particularmente nos primeiros 20 dias da cultura. Os resultados não mostram um impacto evidente de Zn+2 sobre a adição de ácido siálico, condições deste experimento.

[00190] Sem se ater à teoria, estes resultados são consistentes com as seguintes hipóteses:

[00191] • As células SP2/0 precisam acumular Zn+2 intracelular pa ra apoiar os processos intracelulares associados com enzimas que requerem o cofator Zn+2. Isso inclui as enzimas responsáveis pela remoção de CTL, crescimento celular, divisão celular e produção de anticorpos.

[00192] • Concentrações de Zn+2 da ordem de 0,74 a 1,0 μM não proporcionam Zn+2 extracelular suficiente para suprir adequadamente estes processos intracelulares que requerem Zn+2 durante as fases iniciais do processo de produção no biorreator.

[00193] • O efeito é mais pronunciado nos primeiros 20 dias de cul tura. Este é o período em que a quantidade intracelular de Zn+2, por célula, está sendo continuamente reduzido devido à divisão celular. Ou seja, a cada vez que uma célula se divide, o Zn+2 acumulado é dividido entre as células filhas. Em 0,74 a 1,0 μM de Zn+2 extracelular, a incorporação celular de Zn+2 não consegue acompanhar a redução celular de Zn+2 devido à duplicação celular. Dessa forma, as células são deficientes em Zn+2 e apresentam crescimento celular, viabilidade da cultura e produtividade de anticorpo não ideais.

[00194] • Após cerca do Dia 20, as células estão perto de sua den sidade de celular alvo para a cultura de perfusão, e a divisão celular desacelera. A partir desse ponto em diante, a taxa de redução intracelular de Zn+2 devido à divisão celular diminui, e a incorporação celular é suficiente para assegurar o aumento de Zn+2 por acúmulo pelas cé- lulas ao longo do tempo. Sob estas condições e depois do dia 20, as células aumentam gradualmente as suas reservas intracelulares de Zn+2.

[00195] • Para o biorreator com 0,74 μM de Zn+2, o padrão de acúmulo de Zn+2 como uma função da idade de biorreator é responsável pelas mudanças observadas no padrão de cIEF como uma função da idade de biorreator. Ou seja, a remoção de CTL corre no mínimo no Dia 20, o ponto na cultura quando a enzima intracelular carbo- xipeptidase será mais deficiente cofator Zn+2 requerido. Após a divisão desacelerar e após o Dia 20, a remoção de CTL aumenta devido ao aumento do acúmulo de Zn+2, levando a um aumento da função da carboxipeptidase.

[00196] Para os braços experimentais com 1,5 μM e 2,5 μM de Zn+2, a concentração extracelular de Zn+2 é suficientemente elevada para que as enzimas celulares não tenham deficiência de Zn+2 em qualquer ponto na cultura. Dessa forma, a remoção de CTL ocorre em uma taxa elevada do Dia 20 até o Dia 60. De modo semelhante, o crescimento celular, a viabilidade da cultura e a produção de anticorpos continuam em taxas elevadas como uma função do dia de cultura.

Exemplo 5 - O experimento DOE3

[00197] Seguindo as diretrizes geradas no experimento SFM-10.1, um experimento mais detalhado foi realizado usando o meio SFM-10 com infliximab comercial para sondar os impactos da concentração extracelular de Zn+2, EDTA e Fe+3 na remoção de CTL, adição de ácido siálico, crescimento celular, viabilidade da cultura e produção de anticorpos.

[00198] Foi alegado que a ligação extracelular de Zn+2 ao EDTA poderia, hipoteticamente, inibir o acúmulo intracelular de Zn+2. Uma vez que o Fe+3 extracelular teria uma afinidade de ligação muito maior ao EDTA do que o Zn+2, foi alegado que o fator chave na determina- ção do acúmulo intracelular de Zn+2 pode ser a [EDTA-Fe+3].

[00199] O experimento DOE3 incluiu doze biorreatores. A média para este experimento foi o meio comercial SFM-10. Os lotes escolhidos de PRIMATONE®, insulina, transferrina e BSA geraram níveis basais de 0,76 μM de Zn+2, 5,9 μM de EDTA e 0,9 μM de Fe+3. Uma matriz de condições experimentais foi criada por meio da suplementa- ção de Zn+2, EDTA e/ou Fe+3, como indicado na Tabela 2. Tabela 2. Concentrações de Zn+2, Fe+3, EDTA e [EDTA - Fe+3] nos Doze biorreatores do Experimento DOE3 (as concentrações estão em μMl

a Os braços do biorreator são designados pelas concentrações aproximadas de Fe+3, Zn+2 e EDTA(em μM). b O biorreator "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" (M12COO3) experimentou um desvio significativo no protocolo experimental. Antes do Dia 13, a concentração de Zn+2 do meio foi de 6,3 μM. No dia 13, o médio foi ajustado para o valor alvo de 0,76 μM. Ou seja, este biorreator foi submetido a uma concentração de Zn+2 muito elevada no início do período de cultura celular.

[00200] No experimento DOE3, a concentração total de Zn+2 variou de 0,76 a 1,7 μM, a concentração de Fe+3 a variou de 0,90 a 5,4 μM, a concentração de EDTA variou de 5,9 a 26,8 μM, e [EDTA - Fe+3] variou entre 0,53 a 23,6 μM.

[00201] Na análise dos resultados experimentais de DOE3, o im-pacto de Zn+2 foi dominante sobre os impactos das [EDTA] e [EDTA- Fe+3] extracelulares. Dessa forma, é razoável na apresentação seguinte dos resultados para o grupo experimental DOE3, resultados como uma função da [Zn+2] em cada biorreator; seis biorreatores foram direcionados para a [Zn+2] de 0,76 μM e seis biorreatores foram direcionados para a [Zn+2] de 1,7 μM.

[00202] A Figura 8A é um gráfico da remoção de CTL (expressa como porcentagem de des-Lys e calculada usando os dados do Pico 1 do método cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a remoção de CTL na presença de Zn+2 0,76 μM (a concentração inicial de Zn+2 no biorreator correspondente ao marcador "Fe:5 Zn:1 EDTA:10" foi de 6,3 μM, ao invés de 0,76 μM; a concentração alvo de 0,76 μM de Zn+2 foi implementada a partir do Dia 13 até ao final do experimento). A Figura 8B é um gráfico de remoção de CTL (expressa em percentagem de des-Lyi e calculada usando os dados do método do pico 1 de cIEF) como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito da variação das concentrações de EDTA sobre a remoção de CTL na presença de Zn+2 1,7 μM. Tal como no experimento SFM-10.1, os biorreatores do experimento DOE3 exibiram uma forte relação entre a porcentagem de remoção de CTL e a concentração de Zn+2.

[00203] Os biorreatores com 0,76 μM de Zn+2 apresentaram por-centagem de remoção de CTL significativamente menor que os biorre- atores com 1,7 μM de Zn+2. Os biorreatores com a maior concentração de Zn+2 exibiram 60% a 75% de remoção de CTL nos períodos de cultura iniciais, intermediários e tardios. Os biorreatores com uma menor concentração de Zn+2 apresentaram 40% de remoção de CTL nos Dias 10 a 20, e remoção de CTL aumentou progressivamente em função do dia da cultura, alcançando 60% de remoção de CTL no final das culturas. Estes resultados são consistentes com o efeito da concentração de Zn+2 observados no experimento SFM-10.1.

[00204] Como observado anteriormente, o biorreator rotulado "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" experimentou uma concentração de Zn+2 muito elevada de 6,3 μM antes do Dia 13, o que se correlaciona com 80% de remoção de CTL nas fases iniciais de cultura, a maior eficiência na remoção de CTL obtida neste estudo. A porcentagem de remoção de CTL neste biorreator gradualmente caiu após a correção da sua concentração de meio para 0,76 μM de Zn+2 no Dia 13. Com uma taxa de perfusão de cerca de 0,7 volumes de cultura por dia, a concentração de Zn+2 no biorreator de produção teria caído para 0,76 μM no intervalo de 10 dias ou menos. Entretanto, a porcentagem de remoção de CTL permaneceu muito maior neste biorreator do que nos seus biorre- atores irmãos em 0,76 μM de Zn+2. Ou seja, as células parecem ter um mecanismo que "lembra" da exposição passada ao Zn+2.

[00205] Sem se ater à teoria, acredita-se na hipótese de que esta "memória" celular refere-se ao acúmulo de Zn+2 no interior das células. Este Zn+2 acumulado pode não ser revertido por uma súbita redução da concentração extracelular de Zn+2. É provável que o Zn+2 acumulado por célula só possa ser reduzido por meio de divisão celular subsequente, na qual o Zn+2 acumulado é dividido entre as células filhas. Sob as condições do experimento DOE3, o grau de divisão celular foi limitado após as células alcançarem a densidade celular alvo aproximadamente no Dia 15 a 20.

[00206] A remoção de CTL nos Dias 10 e 13 para o biorreator "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" é de cerca de 80%, maior do que para os bior- reatores em 1,7 μM de Zn+2. Isto sugere que, sob as condições experimentais do experimento DOE3, 1,7 μM de Zn+2 não é suficiente para saturar a necessidade das células de Zn+2.

[00207] Conforme observado acima, os resultados do experimento DOE3 correlacionam-se fortemente com a concentração de Zn+2. Entretanto, dentro dos resultados a uma dada concentração de Zn+2, existe evidência de um efeito de EDTA (ou EDTA - Fe + 3) sobre a remoção de CTL. Entre os biorreatores com 0,7 μM de Zn+2, os dois biorreatores com a menor remoção de CTL nos Dias 13, 20 e 28 tiveram as maiores [EDTA] e [EDTA - Fe+3] (biorreatores "Fe:1 Zn:1 EDTA:25" e "Fe:5 Zn:1 EDTA:28") (Figura 8A). Por outro lado, o bior- reator com as menores [EDTA] e [EDTA - Fe+3] teve a maior remoção de CTL ("Fe:1 Zn:1 EDTA:6").

[00208] De modo semelhante, entre os biorreatores com 1,7 μM de Zn+2, os dois biorreatores com a menor remoção de CTL nos Dias 13, 20 e 28 tiveram as maiores [EDTA] e [EDTA - Fe+3] ("Fe:3 Zn:2 EDTA:27") (Figura 8B).

[00209] As Figuras 9A e 9B mostram que há uma diferença significativa no teor de ácido siálico como uma função da [Zn+2] no experimento DOE3. Nos dias 10 a 20, há um teor de ácido siálico significativamente maior nos biorreatores com 1,7 μM de Zn+2 (Figura 9B) do que nos biorreatores em 0,76 μM (Figura 9A). Para as amostras de biorreator "tardias", a diferença no teor de ácido siálico se estreita, mas ainda é superior em 1,7 μM de Zn+2 do que em 0,76 μM de Zn+2.

[00210] As Figuras 9A e 9B são também evidência da "memória de Zn+2" celular discutida acima. No biorreator "Fe:5, Zn:1, EDTA:10", o teor de ácido siálico foi muito alto, no ponto no tempo mais inicial para este biorreator, e manteve-se muito mais elevado do que nos seus biorreatores irmãos tendo 0,76 μM de Zn+2 ao longo de todo o período de cultura, apesar do fato de as concentrações extracelulares de Zn+2 em todos os biorreatores terem sido as mesmas até aproximadamente o Dia 20.

[00211] O teor de ácido siálico nos Dias 10 e 13 para o biorreator "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" é de cerca de 18%, maior do que para os bior- reatores tendo 1,7 μM de Zn+2. Isto sugere que, sob as condições experimentais do experimento DOE3, 1,7 μM de Zn+2 não é suficiente para saturar a necessidade das células de Zn+2 para apoiar a adição de ácido siálico.

[00212] Conforme observado acima, os resultados do experimento DOE3 correlacionam-se fortemente com a concentração de Zn+2. Entretanto, dentro dos resultados a uma dada concentração de Zn+2, existe evidência de um efeito de EDTA (ou EDTA - Fe + 3) sobre a adição de ácido siálico. A Figura 9A mostra que, entre os biorreatores com 0,7 μM de Zn+2, o teor de ácido siálico no Dia 38 aumenta à medida que a [EDTA] diminui. A Figura 9B mostra que, no Dias 20 e 38, o teors de ácido siálico aumenta à medida que a [EDTA] diminui.

[00213] No experimento DOE3, os cinco biorreatores com 0,76 μM de Zn+2 tiveram uma taxa muito menor de crescimento celular durante os primeiros 20 dias (antes de alcançar a densidade celular alvo) do que os seis biorreatores que tinham 1,7 μM de Zn+2 (Figura 10). Conforme observado anteriormente, o biorreator rotulado "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" experimentou uma concentração de Zn+2 muito alta de 6,3 μM antes do Dia 13. O biorreator exibiu comportamento de crescimento celular no período antes do Dia 20 que correspondeu aos biorreato- res com 1,7 μM de Zn+2. Estes dados sugerem que uma concentração extracelular de Zn+2 de 1,7 μM é suficiente para saturar as necessidades intracelulares de Zn+2 das células para a divisão celular.

[00214] As Figuras 11A e 11B mostram que a viabilidade da cultura de cinco biorreatores com 0,76 μM de Zn+2 foi menor durante os primeiros 30 dias do que a viabilidade da cultura dos seis biorreatores com 1,7 μM de Zn+2. De observação específica, o biorreator rotulado de "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" exibiu alta viabilidade da cultura nos Dias 10 e 13, mas, em seguida, voltou a coincidir com o seu biorreator irmão com uma concentração de Zn+2 de 0,76 μM, logo após a concentração de Zn+2 ser corrigida. Isto apoia a hipótese de que a viabilidade da cultura está relacionada com a concentração extracelular instantânea de Zn+2, não com os estoques de Zn+2 no interior da célula.

[00215] As Figuras 12A e 12B mostram que a concentração de anticorpo de cinco biorreatores com 0,76 μM de Zn+2 foi menor nos primeiros 20 dias do que a concentração de anticorpo dos seis biorreato- res com 1,7 μM de Zn+2. O biorreator rotulado "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" exibiu concentração de anticorpos comparável aos biorreatores em 1,7 μM Zn+2, apoiando a hipótese de que a produção de anticorpos está relacionada com o Zn+2 acumulado, ao invés do valor instantâneo de de Zn+2 extracelular.

[00216] As Figuras 10, 11A, 11B, 12A e 12B mostram que não há correlação clara entre a [EDTA] e a densidade de células viáveis, a viabilidade da cultura e a concentração de anticorpo nos resultados de DOE3.

[00217] O experimento DOE3 incluiu uma faixa de [Zn+2], [EDTA] e [EDTA - Fe+3]. Por exemplo, [EDTA - Fe+3] variou de 0,5 a 23 μM. Entretanto, o fator dominante no resultado destes experimentos foi a concentração extracelular de Zn+2, variando de 0,76 μM a 1,7 μM (e inicialmente 6,3 μM no biorreator "Fe:5, Zn:1, EDTA:10"). Os biorreato- res com Zn+2 extracelular de 1,7 μM tiveram remoção de CTL, teor de ácido siálico, crescimento celular inicial, viabilidade da cultura inicial e produção de anticorpos inicial significativamente mais elevados que os biorreatores com Zn+2 extracelular de 0,76 μM (Figuras 8A, 8B, 9A, 9B, 10, 11A, 11B, 12A e 12B).

[00218] Dentro dos biorreatores, em uma determinada concentra- ção de Zn+2, houve alguma evidência de um efeito secundário da [EDTA] (ou [EDTA - Fe + 3]) sobre a remoção de CTL e a adição de ácido siálico (Figuras 8A, 8B, 9A e 9B). Os resultados não proporcionaram evidências de um impacto da [EDTA] sobre o crescimento celular, a cultura viabilidade e a produção de anticorpo (Figuras 10, 11A, 11B, 12A e 12B). O impacto da [EDTA] foi mais plenamente explorado nos Experimentos de Mistura de BSA #1 e #2, a serem discutidos na próxima seção.

[00219] Conforme observado anteriormente, o biorreator rotulado "Fe:5, Zn:1, EDTA:10" experimentou uma concentração de Zn+2 muito alta de 6,3 μM antes do Dia 13, então foi retornado à concentração alvo de Zn+2 de 0,76 μM. Este biorreator exibiu crescimento celular inicial (Figura 10), viabilidade da cultura (Figuras 11A e 11B) e produtividade de anticorpo (Figuras 12A e 12B) comparáveis aos biorreatores, com 1,7 μM de Zn+2. Entretanto, este biorreator exibiu maior remoção de CTL inicial e teor de ácido siálico do que os biorreatores em 1,7 μM de Zn+2. O biorreator exibiu uma "memória" para a alta concentração inicial de Zn+2 que se estendia além da correção da concentração ex- tracelular de Zn+2, para a remoção de CTL, teor de ácido siálico, densidade celular e produção de anticorpo (Figuras 8A, 8B, 9A, 9B, 10, 12A e 12B). Entretanto, o biorreator não apresentou uma memória para a viabilidade da cultura; ou seja, a viabilidade da cultura foi corrigida sem atraso conforme a concentração extracelular de Zn+2 diminuiu de 6,3 μM para 0,76 μM (Figuras 11A e 11B).

[00220] As Figura 9C e 9D são gráficos da porcentagem de G0F (Componente 1 de WAX), como uma função da idade de biorreator, e mostra o efeito de várias concentrações de EDTA sobre a porcentagem de espécies não galactosiladas na presença de 0,76 μM de Zn+2 e 1,7 μM de Zn+2.

[00221] Os resultados do experimento DOE3 são consistentes com a hipótese expressa anteriormente para o experimento SFM-10.1. Hipóteses adicionais também surgem:

[00222] • A remoção de CTL, a adição de ácido siálico, o cresci mento celular e a expressão do anticorpo estão relacionados com a quantidade acumulada intracelular de Zn+2, ao invés da concentração extracelular corrente de Zn+2. Os estoques acumulados de Zn+2 são baseados na história passada do Zn+2 extracelular, não na concentração extracelular imediata. Esta é a base para uma "memória celular" sobre o passado extracelular de Zn+2.

[00223] • A viabilidade da cultura está relacionada com a concen tração extracelular corrente de Zn+2.

[00224] Sob as condições deste experimento, uma concentração extracelular de 1,7 μM de Zn+2 foi suficiente para saturar a necessidade das células de Zn+2 para apoiar a atividades enzimáticas relacionadas ao crescimento celular e à expressão de anticorpos. Entretanto, 1,7 μM de Zn+2 não foi suficiente para saturar a necessidade das células de Zn+2 para apoiar a remoção de CTL ou a adição de ácido siáli- co. Estas hipóteses estão apoiadas pelos resultados do biorreator "Fe:5, Zn:1, EDTA:10", que tinha uma concentração de Zn+2 de 6,3 μM antes ao Dia 13.

Exemplo 6 - Experimentos de mistura de BSA N° 1 e N ° 2

[00225] Estes dois experimentos empregaram meio SFM-10. Em cada experimento, os mesmos lotes de PRIMATONE® e insulina foram empregados, garantindo uma concentração constante de Zn+2 e Fe+3. Nos Experimentos de Mistura de BSA N° 1 e N° 2, as concentrações de Zn+2 foram de 1,1 e 1,2 μM, respectivamente.

[00226] Em cada experimento, os lotes de BSA contendo concentrações altas e baixas de EDTA foram identificados e então misturados para criar uma faixa de concentrações de EDTA nos biorreatores. O Experimento de Mistura de BSA N° 1 empregou oito bi orreatores, com biorreatores em duplicata em quatro concentrações de EDTA. Biorrea- tores em duplicata no Experimento de Mistura de BSA N° 1 são rotulados como "A" e "B". O Experimento de Mistura de BSA N° 2 empregou oito biorreatores, cada um com uma concentração de EDTA diferente. As Tabelas 3 e 4 listam as concentrações de Zn+2, Fe+3, EDTA e EDT - Fe nos biorreatores nos Experimentos de Mistura de BSA N° 1 e N° 2. Tabela 3. Concentrações de Zn+2, Fe+3, EDTA e [EDTA - Fe+3] nos Oito Biorreatores do Experimento de Mistura de BSA N° 1 (as concen trações estão em μM).

aBraços do biorreator são designados pela concentração aproximada de EDTA (em μM). Tabela 4. Concentrações de Zn+2, Fe+3, EDTA e [EDTA - Fe+3] nos Oito Biorreatores do Experimento de Mistura de BSA N° 2 (as concen- trações estão em μM).

a Os braços do biorreator são designados pela concentração aproxi- mada de EDTA (em μM).

[00227] Em ambos os experimentos de mistura de BSA, os biorrea- tores com as concentrações mais elevadas de EDTA experimentaram menos remoção de CTL, e vice-versa - os biorreatores com concentrações menores de EDTA experimentaram um aumento de remoção de CTL. O efeito foi mais evidente no Dia 35 em cada experimento, então diminuiu nos dias de cultura mais tardios (Figuras 13A e 14A).

[00228] Em ambos os experimentos de mistura de BSA, os biorrea- tores com as concentrações mais elevadas de EDTA experimentaram menor teor de ácido siálico, e vice-versa - os biorreatores com concentrações menores de EDTA experimentaram maior teor de ácido siálico. O efeito foi sustentado para as amostras de biorreator iniciais, inter-mediárias e tardias (Figuras 13B e 14B).

[00229] Em ambos os experimentos de mistura de BSA, os biorrea- tores com concentrações maiores de EDTA e menores de EDTA exibiram crescimento celular comparável (Figura 13C e 14C) e viabilidade da cultura comparável (Figuras 13D e 14D).

[00230] Um efeito menor da concentração de EDTA foi observado sobre a produção de anticorpos nos experimentos de mistura de BSA. No Experimento de Mistura de BSA N° 1, os biorreato res com alto e baixo EDTA foram comparáveis na produção de anticorpos antes de alcançar a densidade celular alvo. Durante o período imediatamente após alcançar a densidade celular alvo (a partir aproximadamente do Dia 15 ao Dia 25) biorreatores com maior EDTA têm menor expressão de anticorpos do que os biorreatores com baixo EDTA (Figuras 13E e 13F). No Experimento de Mistura de BSA N° 2, uma re dução da produção de anticorpos foi observada para as duas maiores [EDTA] a partir de Dia 10, e os biorreatores com a menor [EDTA] exibiram produção de anticorpos mais elevada aproximadamente no Dia 5 (Figuras 14E e 14F). Entretanto, o efeito da [EDTA] sobre a produção de anticorpos não foi observado no experimento DOE3 (Figura 12B).

[00231] Para biorreatores com Zn+2 extracelular de cerca de 1,1 a 1,2 μM, os experimentos de mistura de BSA mostraram que a concentração de EDTA pode ter um impacto significativo sobre a remoção de CTL e a adição de ácido siálico. Além disso, pode haver um impacto menor da concentração de EDTA sobre a produção de anticorpos durante o período do Dia 10 ao Dia 25, embora esse efeito não tenha sido evidente no experimento DOE3. Nestas concentrações de Zn+2, o EDTA não teve impacto perceptível sobre o crescimento celular ou a viabilidade da cultura.

[00232] Uma vez que a concentração de Fe+3 foi constante nos biorreatores dos experimentos de mistura de BSA, as correlações acima observadas para a [EDTA] são igualmente válidas para a [EDTA - Fe+3].

[00233] Em ambos experimentos de mistura de BSA, foi mostrado que a diminuição da concentração de EDTA leva a uma diminuição na percentagem de oligossacarídeos agalactosilados (Figuras 13G e 15). Dessa forma, a redução da concentração de EDTA leva tanto a mais galactose quanto a mais teor de ácido siálico.

[00234] Sem se ater à teoria, os dados dos experimentos de mistura de BSA apoiam as seguintes hipóteses:

[00235] • EDTA (ou [EDTA - Fe+3]) pode influenciar na taxa de ab sorção de Zn+2 pelas células. Este efeito provavelmente é mais evidente quando a concentração extracelular de Zn+2 é baixa, e as células estão enfrentando deficiência intracelular de Zn+2 no apoio de enzimas que necessitam de Zn+2.

[00236] • As células têm sistemas intracelulares elaborados para armazenamento e distribuição de Zn+2, e existem prioridades para a distribuição de Zn+2 em períodos de limitação de Zn+2. Sob condições de limitação de Zn+2, as células irão definir uma prioridade sobre os processos intracelulares que exijam Zn+2 para a divisão celular. Dessa forma, nos Experimentos de Mistura de BSA N° 1 e N° 2, não houve impacto do EDTA sobre o crescimento das células, porque as células tinham Zn+2 adequado para a divisão celular sob as condições deste estudo. De modo semelhante, a expressão dos anticorpos foi minimamente afetada pelo EDTA sob as condições deste experimento. A distribuição intracelular de Zn+2 para apoiar a remoção de CTL e a adição de ácido siálico têm uma menor prioridade intracelular do que a distribuição de Zn+2 para o crescimento celular. Dessa forma, sob condições em que o EDTA não afeta o crescimento celular, pode haver um impacto significativo do EDTA sobre a remoção de CTL e a adição de ácido siálico.

[00237] Biorreatores de infliximab são operados nos primeiros 15 a 20 dias de um modo que se assemelha à cultura de batelada alimentada. Ou seja, as células são inoculadas com uma baixa densidade celular inicial, e são continuamente alimentadas pelos os próximos 15 a 20 dias com meio fresco para apoiar crescimento das células e a expressão de anticorpos. Portanto, os resultados experimentais descritos na presente invenção se aplicam igualmente a culturas de batelada alimentada e de perfusão.

Exemplo 7 - Análise adicional de DOE3 e Mistura de BSA N° 1 e N° 2 Experimentos

[00238] Os experimentos DOE3 e de mistura BSA foram todos conduzidos no mesmo laboratório, usando o mesmo modelo biorreator de pequena escala, e as amostras foram analisadas pelo mesmo grupo de ensaios. Portanto, deverá ser possível comparar os resultados dos experimentos DOE3 e de misura de BSA N° 1 e N° 2 um com o outro.

[00239] No experimento DOE3 e no experimento de mistura de BSA N° 1, as amostras foram coletadas no Dia 20, e fora m analisados por meio de cIEF e do ensaio WAX. As Figuras 17, 19, 20 e 21 mostram os dados do Dia 20 do experimento DOE3 e do experimento de Mistura de BSA N° 1 plotados juntos. Os resultados mostr ados nas Figuras 17, 19 e 20 apoiam as análises anteriores, ou seja, que a remoção de CTL aumenta com o aumento da [Zn+2], o teor de ácido siálico aumenta com o aumento da [Zn+2] e a percentagem de oligossacarídeos agalactosilados diminui com o aumento da [Zn+2]. Estes dois últimos resultados são consistentes com a promoção das reações enzimáticas na adição de galactose e adição de ácido siálico, como mostrado na FIG. 16.

[00240] A Figura 21 mostra que a razão entre ácido siálico e galactose aumenta com o aumento da [Zn+2].

[00241] A Figura 26 é um gráfico da porcentagem de ácido siálico (Componente 5 de WAX) como uma função da porcentagem de G0F (o componente dominante agalactosil do Componente 1 de WAX), e mostra a relação inversa entre a porcentagem de ácido siálico e a porcentagem de oligossacarídeos agalactosil, nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1 e N° 2. A Figura 26 mostra q ue a adição de galactose e a adição de ácido siálico tendem a ser acopladas nos experimentos DOE3 e de Mistura de BSA N° 1 e N° 2, co nsistente com um acoplamento das reações catalisadas por galactosiltransferase e sialiltransferase. Em outras palavras, os fatores que melhoram essas duas reações de glicosilação direcionam mais G0F para oligossacarí- deos contendo ácido siálico.

[00242] Ambos os experimentos de Mistura de BSA N° 1 e N° 2 incluem uma amostra coletada nos Dias 33 a 35. As Figuras 22 a 25 mostram os dados do Dias 33 a 35 a partir dos experimentos de Mistura de BSA N° 1 e N° 2. As Figuras 22 a 25 mostram q ue em concentrações mais baixas de EDTA, existe maior remoção de CTL, teor de ácido siálico mais elevado, menor porcentagem de oligossacarídeos agalactosil, e uma razão mais elevada entre ácido siálico e galactose.

[00243] Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos publicados e referências citadas na presente invenção estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

[00244] Embora essa invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências às modalidades exemplificadoras da mesma, será compreendido pelo versado na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem se distanciar do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Método para produzir um anticorpo antifator α de necrose tumoral (anti-TNFα) IgG tendo um teor de lisina C-terminal de 20% a 70%, um teor de ácido siálico de 1% a 20%, e um teor de galactose de 50% a 90%, o método caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar células SP2/0 transfectadas com DNA que codifica o anticorpo anti-TNFα IgG em um meio de cultura compreendendo de 0,74 μM a 2,5 μM de zinco; e controlar a concentração de zinco no meio de cultura, produzindo, dessa forma, o anticorpo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o teor de lisina C-terminal do anticorpo é de 40% a 70%.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o teor de lisina C-terminal do anticorpo é de 55% a 65%.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o teor de lisina C-terminal do anticorpo é de 60%.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o teor de ácido siálico do anticorpo é de 3% a 14%.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-TNFα (i) inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal produzido a partir do hibridoma depositado sob o N° de Acesso ATCC PTA-7045 ao TNFα humano; e (ii) se liga a um epitopo neutralizante do TNFα humano com uma afinidade de, ao menos, 1 x 108 litro/mol, medida como uma constante de associação (Ka).

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα é um anticorpo humano.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα é um anticorpo humano ou quimérico.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα é da classe de imunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα compreende uma região constante de IgG1.

11. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv.

12. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα compreede: uma cadeia leve que compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia leve do anticorpo monoclonal produzido a partir do hibridoma depositado sob o N° de Acesso ATCC PTA-7045; uma cadeia pesada que compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia pesada do anticorpo monoclonal produzido a partir do hibridoma depositado sob o N° de Acesso ATCC PTA-7045; ou uma cadeia leve que compreende todas as regiões de ligação a antígeno da cadeia leve do anticorpo monoclonal produzido a partir do hibridoma depositado sob o N° de Acesso ATCC PTA-7045

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα compreende uma região variável não humana compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região variável não humana compreende um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 2 e SEQ ID NO: 4.

15. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα tem especificidade epitópica idêntica ao infliximab.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα é infliximab.

17. Método da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda um total de EDTA em uma faixa de concentração de 2,5 μM a 30 μM, e o método compreende ainda o controle da concentração de EDTA isento de ferro no meio de cultura.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda EDTA livre em uma faixa de concentração de 5 μM a 16 μM.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a recuperação do anticorpo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é recuperado quando as células SP2/0 no meio de cultura atingem uma densidade celular de 1,5 milhões de células por mL a 11 milhões de células por mL.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é recuperado quando as células SP2/0 no meio de cultura atingem uma densidade celular de 3 milhões de células por mL a 11 milhões de células por mL.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a concentração de zinco é controlada até o anticorpo ser recuperado.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de zinco é controlada durante uma fase de crescimento exponencial das células SP2/0.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o controle da concentração de zinco compreende o monitoramento da concentração de zinco no meio de cultura, e a regulação da concentração de zinco no meio de cultura, de modo que a concentração de zinco no meio de cultura seja de 0,74 μM a 2,5 μM.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma razão entre o ácido siálico e a galactose de 0,05 a 0,20.

26. Método para controlar o teor de lisina C-terminal de um anticorpo antifator α de necrose tumoral (anti-TNFα) IgG tendo um teor de lisina C-terminal de 20% a 70%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende: monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo, de modo que o meio de cultura compreende de 0,74 μM a 2,5 μM de zinco.

27. Método para controlar o teor de ácido siálico de um anticorpo antifator α de necrose tumoral (anti-TNFα) IgG tendo um teor de ácido siálico de 1% a 20%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende: monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo, de modo que o meio de cultura compreende de 0,74 μM a 2,5 μM de zinco.

28. Método para controlar o teor de galactose de um anticorpo antifator α de necrose tumoral (anti-TNFα) IgG tendo um teor de galactose de 50% a 90%, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende: monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo, de modo que o meio de cultura compreende de 0,74 μM a 2,5 μM de zinco.

29. Método para controlar a razão entre o ácido siálico para a galactose em um anticorpo antifator α de necrose tumoral (anti- TNFα) IgG tendo uma razão entre o ácido siálico e a galactose de 0,05 a 0,20, em um processo para a biossíntese do anticorpo em um meio de cultura, o método caracterizado por compreender: monitorar o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo; e regular o nível de zinco no meio de cultura durante a biossíntese do anticorpo, de modo que o meio de cultura compreende de 0,74 μM a 2,5 μM de zinco.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-TNFα (i) inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal produzido a partir do hibridoma depositado sob o N° de Acesso ATCC PTA-7045 ao TNFα humano; e (ii) se liga a um epitopo neutralizante do TNFα humano com uma afinidade de, ao menos, 1 x 108 litro/mol, medida como uma constante de associação (Ka).

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-TNFα tem especificidade epitópica idêntica ao infliximab.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é infliximab.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é biossintetizado por uma linhagem celular SP2/0.