PL182665B1

PL182665B1 - Rozpuszczalne białko mające aktywność antagonistyczną lub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub IL13, sposób wytwarzania rozpuszczalnego białka, polimer DNA, replikujący wektor ekspresji, komórka gospodarza i środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL182665B1
Application number: PL95318380A
Authority: PL
Inventors: Michael J. Browne; Kay E. Murphy; Conrad G. Chapman; Helen E. Clinkenbeard; Peter R. Young; Allan R. Shatzman
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2002-02-28
Also published as: NO970374D0; CN1164872A; CZ25697A3; CA2196200A1; JPH10503371A; AU3382595A; CN1117155C; NO970374L; HUT76369A; EP0770135A1; MX9700764A; BR9508469A; NZ292124A; WO1996004388A1; PL318380A1

Abstract

1 . Rozpuszczalne bialko majace aktywnosc antagonistyczna lub czesciowa aktywnosc antagonistyczna wobec IL4 i/lub IL13, znamienne tym, ze ma sekwencje aminokwasowa reprezentowana przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10. 2. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego bialka majacego aktywnosc antagonistyczna lub czesciowa aktywnosc antago- nistyczna wobec IL4 i/lub IL 13, znamienny tym, ze poddaje sie ekspresji polimer DNA kodujacy sekwencje aminokwasowa reprezentowana przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10 w rekombinacyjnej komórce gospodarza i odzyskuje sie produkt, przy czym korzystnie (i) wytwarza sie replikujacy wektor ekspresji zdolny w komórce gospodarza do ekspresji tego polimeru DNA; (ii) transformuje sie komórke gospodarza tym wektorem; (iii) hoduje sie transformowane ko- mórki gospodarza w warunkach pozwalajacych na ekspresje polimeru DNA z wytworzeniem bialka; i (iv) odzyskuje sie bialko. 3. Polimer DNA, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydowa kodujaca sekwencje aminokwasowa reprezen- towana przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10. 5. Replikujacy wektor ekspresji, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydowa kodujaca sekwencje aminok- wasowa reprezentowana przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10, przy czym korzystnie zawiera sek- wencje nukleotydowa SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9. 6. Komórka gospodarza, znamienna tym, ze jest transformowana replikujacym wektorem, który obejmuje sekwencje nukleotydowa kodujaca sekwencje aminokwasowa reprezentowana przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10, przy czym korzystnie zawiera sekwencje nukleotydowa SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9. 7. Srodek framaceutyczny zawierajacy czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nosnik do lecze- nia stanów wynikajacych z niepozadanego dzialania IL4 i/lub IL13, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera roz- puszczalne bialko majace aktywnosc antagonistyczna lub czesciowa aktywnosc antagonistyczna wobec IL4 i/lub IL13, które ma sekwencje aminokwasowa reprezentowana przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest rozpuszczalne białko mające aktywność antagonistyczną lub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub ILI 3 charakteryzujące się tym, że ma sekwencję aminokwasowąreprezentowanąprzez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10.

Przedmiotem wynalazkujest także sposób wytwarzania rozpuszczalnego białka mającego aktywność antagonistyczną lub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub ILI 3 charakteryzujący się tym, że poddaj e się ekspresj i polimer DNA koduj ący sekwencj ę aminokwasowąreprezentowanąprzez SEKW. NR ID. 4, SeKw. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10 w rekombinacyjnej komórce gospodarza i odzyskuje się produkt, przy czym korzystnie (i) wytwarza się replikujący wektor ekspresji zdolny w komórce gospodarza do ekspresji tego polimeru DNA; (ii) transformuje się komórkę gospodarza tym wektorem; (iii) hoduje się transformowane komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję polimeru DNA z wytworzeniem białka; i (iv) odzyskuje się białko.

Przedmiotem wynalazku jest także polimer DNA charakteryzujący się tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez sEkW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10. Korzystnie polimer DNA obejmuje lub składa się z sekwencji nukleotydowej SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9.

Przedmiotem wynalazku jest także replikujący wektor ekspresji charakteryzujący się tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10, przy czym korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza charakteryzująca się tym, że jest transformowana replikującym wektorem, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasowąreprezentowanąprzez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10, przy czym korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do leczenia stanów wynikających z niepożądanego działania IL4 i/lub ILI 3 charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera rozpuszczalne białko mające aktywność antagonistyczną lub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub ILI 3, które ma sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10.

Terminy „mutant lub wariant” obejmują dowolną cząsteczkę, taką jak obcięta lub inna pochodna białka IL4, zachowująca zdolność antagonizowania IL4 i/lub ILI 3 po wewnętrznym podaniu człowiekowi. Takie inne pochodne można wytworzyć przez dodanie, delecję, podstawienie, lub przegrupowanie aminokwasów lub ich chemiczne modyfikacje.

Polimery DNA, kodujące mutanty lub warianty IL4 można wytwarzać przez skierowaną na miejsce mutagenezę cDNA kodującego IL4 konwencjonalnymi sposobami, takimi jak opisane przez G. Wintera i in. w Nature 1982,299,756-758 lubZollerai Smitha 1982; Nucl. Acids Res., 10,6487-6500, lub delecyjnąmutagenezę, takąjak opisana przez Chana i Smitha in Nucl. Acids Res., 1984, 12, 2407-2419 lub przez G. Wintera i in. w Biochem. Soc. Trans., 1984; 12, 224-225 lub reakcję łańcuchowąpolimerazy takąjak opisuje Mikaelian i Sergeant w Nucleic Acids Research, 1992, 20, 376

W niniejszym opisie, „mające aktywność antagonistyczną lub częściową aktywność antagonistyczną IL4 i/lub ILI 3” oznacza, że, w próbie opisanej przez Spitsa i in. (J. Immunology 139, 1142 (1987)), stymulowane IL4 rozmnażanie komórek T jest inhibitowane w sposób zależny od dawki.

Przydatne mutanty IL4 ujawniono w WO 93/10235, w którym co najmniej jeden aminokwas, występujący naturalnie w dzikiego typu IL4 na dowolnej zpozycji 120 do 128 włącznie, jest zastąpiony innym różnym naturalnym aminokwasem. W szczególności, tyrozyna naturalnie

182 665 występująca w pozycji 124 może być zastąpiona przez różny naturalny aminokwas, taki jak glicyna lub, korzystniej, kwas asparginowy.

Immunoglobulina może być dowolnej podklasy (IgG, IgM, IgA, IgE), ale korzystnie IgG, taka jak IgGl, IgG3 lub IgG4. Stała domena lub jej fragment może pochodzić od ciężkiego lub lekkiego łańcucha lub od obu. Wynalazek ujawnia mutacje składnika immunoglobulinowego eliminujące niepożądane właściwości rodzimej immunoglobuliny, takie jak wiązanie receptora Fc i/lub wprowadzające pożądane właściwości, takie jak stabilność. Np., Angal S., King D. J., Bodmer M. W., Turner A., Lawson A. D. G., Roberts G., Pedley B. i Adair R., Molecular Immunology tom 30 str. 1^.5-1(0^, 1993, opisują cząsteczkę IgG4, w której reszta241 (numeracja Kabata) jest zmieniona z seryny na prolinę. Zmiana zwiększa czas półtrwania cząsteczki IgG4 w surowicy. CanfieldS. M. iMorrisonS. L., Journal ofExperimental Medicine tom 173 str. (483-1491, opisujązmianę reszty 248 (numeracja Kabata) z leucyny na glutaminian w IgG3 i z glutaminianu na leucynę w mysiej IgG2b. Podstawienie leucyny za glutaminian jak powyżej zmniejsza powinowactwo cząsteczki immunoglobuliny do receptora Fcy, a podstawienie glutaminianu za leucynę w ostatnim przykładzie zwiększa powinowactwo. Europejski opis patentowy EP 0307434 ujawnia różne mutacje, w tym mutacje L na E na reszcie 248 (numeracja Kabata) w IgG.

Stałą domeną lub jej fragmentem jest korzystnie całość lub znacząca część stałego regionu ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG, najkorzystniej IgG4. W jednym z aspektów składnik IgG składa się z domen CH2 i CH3 i regionu zawiasowego IgG1, w tym cysternowych reszt dających wkład do wiązania dwusiarczkowego pomiędzy ciężkimi łańcuchami, np. reszt 11 i 14 regionu zawiasowego IgG1 (Frangione B. i Milstein C., Nature tom 216 str. 939-941,1967). Korzystnie składnik IgG 1 składa się z aminokwasów odpowiadających resztom 1-4 i 6-15 zawiasu. 1-110 CH2 i 1-107 CH3 IgG1 opisanych przez EllisonaJ.,BersonaB. i HoodaL.E., Nucleic Acids Research tom 10, str. 4071 -4079,1982. Reszta 5 zawiasujest zmieniona z cysteiny w opublikowanej sekwencjjIgG1 na alaninę przez zmianę TGT na GCC w sekwencji nukleotydowej. W innym aspekcie składniki IgG pochodzi z IgG4, obejmując domeny CH2 i CH3 i region zawiasowy, w tym cysteinowe reszty dające wkład do wiązania dwusiarczkowego pomiędzy ciężkimi łańcuchami, np. reszty 8 i 11 regionu zawiasowego IgG4 (Pinck J. R. i Milstein C.,m Nature tom 216 str. 941-942, 1967). Korzystnie składnik IgG4 składa się z aminokwasów odpowiadających resztom 1-12 zawiasu, 1-110 CH2 i 1-107 CH3 IgG4 opisanym przez Ellisona J., Bauxbauma J. i Hooda L., DNA tom I str. 11-18,1981. W przykładzie przydatnej mutacji IgG4, reszta 10 zawiasu (reszta 241, numeracja Kabata) jest zmieniana z seryny (S) w dzikim typie, na prolinę (P) i reszta 5CH2 reszta 248, numeracja Kabata) jest zmieniana z leucyny (L) w dzikim typie na glutaminian (E).

Fuzja mutanta lub wariantu IL4 do stałej domeny lub fragmentu Ig dokonuje się z końca C jednego składnika do końca N drugiego. Korzystnie mutant lub wariant IL4 jest złączony przez koniec C z końcem N stałej domeny lub fragmentu Ig.

Sekwencja aminokwasowa białka fuzyjnego według wynalazku może być reprezentowana SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10.

W kolejnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rozpuszczalnego białka obejmujący ekspresje DNA kodującego związek w rekombinacyjnej komórce gospodarza i odzyskanie produktu.

Polimer DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą związek, także tworzy część wynalazku.

Polimer DNA może obejmować lub składać się z sekwencji SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9.

Sposób według wynalazku można przeprowadzić konwencjonalnymi technikami rekombinacji, takimi jak opisuje Maniatis i in., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 i DNA Cloning tomy I, iI i III (wyd. D. M. Glover, IRL Press Ltd).

W szczególności, sposób może obejmować etapy

i) wytworzenia replikującego wektora ekspresji zdolnego w komórce gospodarza do ekspresji polimeru DNA zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą ten związek;

ii) transformowania komórki gospodarza tym wektorem;

1182 665 iii) hodowania transformowanej komórki gospodarza w warunkach pozwających na ekspresję polimeru DNA w celu wytworzenia związku; i iv) odzyskanie związku.

Opis wynalazku ujawnia także sposób wytwarzania polimeru DNA przez kondensację właściwych mono-, di- lub oligomerycznych jednostek nukleotydowych.

Wytwarzanie można prowadzić chemicznie, enzymatycznie, lub łącząc oba sposoby, in vitro lub in vivo w miarę potrzeby. Tak więc polimer DNA można wytworzyć przez enzymatyczną ligację właściwych fragmentów DNA, konwencjonalnymi sposobami takimi jak opisane przez D. M. Robertsa i in. w Biochemistry 1985,24,5090-5098.

Fragmenty DNA można otrzymać przez trawienie DNA zawierającego żądane sekwencje nukleotydów właściwymi enzymami restrykcyjnymi, przez chemiczną syntezę, przez enzymatyczną polimeryzację na wzorcach DNA lub RNA, lub przez kombinację tych sposobów.

Trawienie enzymami restrykcyjnymi można przeprowadzić w odpowiednim buforze w temperaturze 20-70°C, zwykle w objętości 50 μΐ lub mniejszej z 0,1-10 pg DNA.

Enzymatyczną polimeryzację DNA można prowadzić in vitro stosując polimerazę DNA takąjak polimeraza I DNA (fragment Klenowa) we właściwym buforze zawierającym trifosforany nukleozydów, dATP, dCTP, dGTP i dTTP w miarę potrzeby w temperaturze 10-37°C, zwykle w objętości 50 μΐ lub mniejszej.

Enzymatyczną ligację fragmentów DNA można prowadzić stosując ligazę DNA, takąjak ligaza T4 DNA we właściwym buforze w temperaturze 4°C do otoczenia, zwykle w objętości 50 pl lub mniejszej.

Chemiczną syntezę polimeru DNA lub fragmentów można prowadzić konwencjonalną metodąfosfotriestrową, fosforynowąlub fosforamidynową, stosując techniki fazy stałej takie jak opisane w „Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual” (wyd. H. G. Gassen i A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), lub w innych naukowych publikacjach, np. M. J. Gait, H. W. D. Manhes, M. Singh, B. S. Sproat, i R. C. Titinas, Nucleic Acids Research, 1982,10,6243; B. S. Sproat i W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983,24,5571; M. D. Matteucci i M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D.. Matteucci i M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981,103,3185; S P. Adams i in., Journal of the American Chemical Societyu, 1983,105,661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, i H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12,4539; i H. W. D. Matthes i in., EMBO Journal, 1984, 3, 801. Korzystnie wykorzystuje się zautomatyzowany syntetyzer DNA.

Polimer DNA korzystnie wytwarza się przez ligację dwu lub więcej cząsteczek DNA, które łącznie dają sekwencję kodującą DNA związku. Konkretny proces według wynalazku obejmuje ligację pierwszej cząsteczki DNA kodującej mutant lub wariant IL4 i drugiej cząsteczki DNA kodującej domenę immunoglobulinową lub jej fragment.

Cząsteczki DNA można otrzymać metodą trawienia przydatnymi enzymami restrykcyjnymi wektorów zawierających żądane kodujące sekwencje lub stosując reakcję łańcuchową polimerazy.

Dokładna struktura cząsteczek DNA i sposób ich otrzymywania zależy od struktury żądanego produktu. Określenie przydatnej strategii konstrukcji cząsteczki DNA kodującej związek jest czynnością rutynową dla specjalisty.

Ekspresję polimeru DNA kodującego związek w rekombinacyjnych komórkach gospodarza można prowadzić przy pomocy replikującego wektora ekspresji zdolnego w komórkach gospodarza do ekspresji polimeru dNa. Wektor ekspresji jest nowy i także tworzy cześć wynalazku.

Replikujący wektor ekspresji można wytwarzać rozcinając wektor zgodny z komórkami gospodarza z wytworzeniem liniowego segmentu DNA mającego nietknięty replikon, i łącząc liniowy segment z jedną lub kilkoma cząsteczkami DNA, które wraz z liniowym segmentem kodują związek, w warunkach ligacji.

Ligację liniowego segmentu i więcej niżjednej cząsteczki DNA można prowadzić w miarę potrzeb jednocześnie lub kolejno.

182 665

Tak więc polimer DNA można w miarę potrzeb preformować lub formować podczas konstruowania wektora.

Wybór wektora będzie określony częściowo przez komórki gospodarza, które mogą być prokariotyczne, takie jak E. coli, lub eukariotyczne, takie jak mysia C127, szpiczak myszy, jajnik chińskiego chomika lub komórki HeLa, grzyby np. włókniste grzyby lub jednokomórkowe drożdże albo komórki owada takiego jak Drosophila. Komórki gospodarza pochodzące od zwierząt mogą także być transgeniczne.

Przydatne wektory obejmują plazmidy, bakteriofagi, kosmidy i rekombinacyjne wirusy pochodzące np., z bakulowirusów, krowianki lub wirusa Semliki Forest.

Wytwarzanie replikującego wektora ekspresji można prowadzić konwencjonalnie z właściwymi enzymami restrykcyjnymi, przez polimeryzaję i ligację DNA, procedurami opisanymi u, np., Maniatisa i in., cytowany powyżej. Polimeryzacje i ligację można przeprowadzić jak opisano powyżej dla wytwarzania polimeru DNA. Trawienie enzymami restrykcyjnymi można przeprowadzić we właściwym buforze w temperaturze 20-70°C, zwykle w objętości 50 μ! lub mniej z 0,1-10 μg DNA.

Rekombinacyjną komórkę gospodarza wytwarza się przez transformowanie komórek gospodarza replikującym wektorem ekspresji według wynalazku w warunkach transformacji. Przydatne warunki transformacji są konwencjonalne i opisano je w, np., Maniatis i in., cytowane powyżej, lub „DNA Cloning” tom II, wyd. D. M. Glover, IRL Press Ltd. 1985.

Wybór warunków transformacji jest określony przez komórki gospodarza. Tak więc bakteryjnego gospodarza, takiego jak E. coli, można potraktować roztworem CaCl₂ (Cohen i in., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) lub roztworem zawierającym mieszaninę RbCl, MnCl₂, octanu potasu i gliceryny, a następnie kwasu 3-[N-morfolino]propanosulfonowego, RbCl i gliceryny. Komórki ssaka w hodowli można transformować przez współstrącanie wapniowe wektora DNA do komórek.

Wynalazek obejmuje także komórki gospodarza transformowane replikującym wektorem ekspresji według wynalazku.

Hodowlę transformowanej komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję polimeru DNA prowadzi się konwencjonalnie, jak opisuje, np., Maniatis i in. oraz „DNA Cloning” cytowane powyżej. Tak więc, korzystnie komórka zasila się pożywką i hoduje w temperaturze poniżej 45°C.

Produkt ekspresji odzyskuje się konwencjonalnymi sposobami w zależności od komórki gospodarza. Tak więc gdy komórka gospodarza jest bakteryjna, taka jak E. coli, można ją lizować fizycznie, chemicznie lub enzymatycznie i białkowy produkt wydzielać z powstałego lizatu. Jeśli produkt ma być wydalany z komórki bakteryjnej, można go odzyskać z przestrzeni peryplazmicznej lub pożywki. Gdy komórka gospodarza jest komórka ssaka, produkt można zwykle wydzielać z pożywki.

Polimer DNA można umieszczać w wektorach zaprojektowanych do wydzielania trwałej transformowanej linii komórek ssaka wykazujących ekspresje produktu; np. wektorów brodawczaka bydlęcego lub wzmocnionych wektorów komórek jajnika chomika chińskiego (DNA cloning tom 11 wyd. D. M. Glover, iRl Press 1985; Kaufman, R. J. i in., Molecular and Cellular Biology 5,1750-1759, 1985; Pavlakis G. N. i Hamwer, D. H., Proceedingd ofthe National Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D. V. i in., europejskie zgłoszenie patentowe 0093619, 1983).

Związki według niniejszego wynalazku wykazująaktywność antagonis't^^:z^^IL4 i/lub IL13 i są więc potencjalnie przydatne do leczenia stanów wynikających z niepożądanego działania IL4 i/lub IL 13 takiego jak mediowane IgE alergiczne choroby i mediowane komórkami T autoalergiczne stany lub chroniczna infekcja bakteryjna.

Przedmiotem wynalazku jest więc dalej środek farmaceutyczny obejmujący związek według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

W zastosowaniach związek będzie się stosować w postaci środka farmaceutycznego w połączeniu z nadającym się dla ludzi farmaceutycznym nośnikiem, rozcieńczalnikiem i/lub zaróbką,

182 665 chociaż dokładna postać kompozycji będzie zależała od sposobu podawania. Związek może, np., być stosowany w postaci aerozolu lub roztworu rozpylanego do inhalacji lub sterylnych roztworów do pozajelitowego podawania.

Zakresy dawek związków według niniejszego wynalazku są takie, aby wywierały żądany wpływ na mediowany IL4 i/lub ILI3 sten, np. dzięki którym mediowane przeciwciałem IgE symptomy zmniejszają się lub autoalergiczna choroba zatrzymuje się lub cofa. Dawka będzie się zwykle wahać z wiekiem, zakresem lub ostrością stanu medycznego i możliwymi przeciwwskazaniami. Jednostkowa dawka może się wahać od mniej niż 1 mg do 300 mg, lecz typowo będzie w zakresie od 1 do 20 mg na dawkę, wjednej lub kilku porcjach, takich jak od jednej do 6 porcji dziennie, aby dzienna dawka mieściła się w zakresie 0,02-40 mg/kg.

Kompozycje przydatne do zastrzyków mogą być w postaci roztworów, zawiesin lub emulsji, lub suchych proszków, które rozpuszcza się lub zawiesza w przydatnym nośniku przed użyciem.

Płynne postaci jednostkowe wytwarza się stosując związek i apirogenny sterylny nośnik. Związek, w zależności od nośnika i stężenia, można rozpuszczać lub zawieszać w nośniku. Roztwory można stosować do wszystkich postaci pozajelitowego podawania, a szczególnie do dożylnego wstrzykiwania. W celu wytworzenia roztworu związek można rozpuścić w nośniku, roztwór doprowadzić do izotonii przez dodanie w razie potrzeby chlorku sodu i sterylizować filtrat przez sterylny filtr stosując aseptyczne techniki, przed napełnieniem odpowiednich sterylnych fiolek lub ampułek i zamknięciem. Alternatywnie, jeśli trwałość roztworu jest odpowiednia, roztwór w zamkniętych pojemnikach można sterylizować w autoklawie. Korzystnie w nośniku można rozpuścić dodatki takie jak dodatki buforujące, solubilizujące, stabilizujące, konserwujące lub bakteriobójcze, środki tworzące zawiesiny lub emulgujące i/lub lokalne anestetyki.

Suche proszki rozpuszczane lub zawieszane w odpowiednim nośniku przed użyciem można wytwarzać napełniając wstępnie sterylizowanym lekiem i innymi składnikami sterylny pojemnik stosując asepty cznątechnikę w sterylnym miejscu. Alternatywnie lek i inne składniki można rozpuścić w wodnym nośniku, roztwór sterylizuje się filtracyjnie i rozmieszcza w odpowiednich pojemnikach stosując aseptyczną technikę w sterylnym miejscu. Produkt następnie suszy się przez wymrożenie i pojemniki zamyka aseptycznie.

Pozajelitowe zawiesiny, odpowiednie do zastrzyków domięśniowych, podskórnych lub przezskórnych, wytwarza się w zasadniczo taki sam sposób, jedynie sterylny związek zawiesza się w sterylnym nośniku, a nie rozpuszcza, i sterylizacji nie można prowadzić filtracyjnie. Związek można wydzielić w stanie sterylnym lub alternatywnie można go sterylizować po oddzieleniu, np. napromieniowaniem gamma. Korzystnie dodaje się środek tworzący zawiesiny, np. poliwinylopirolidon do kompozycji w celu ułatwienia jednorodnej dystrybucji związku.

Kompozycje odpowiednie do podawania przez układ oddechowy obejmują aerozole, roztwory do rozpylania lub bardzo drobne proszki do wdychania. W ostatnim przypadku korzystny jest rozmiar cząsteczek poniżej 50 pm, szczególnie mniejszy niż 10pm. Takie kompozycje można wytwarzać w konwencjonalny sposób i stosować w połączeniu z konwencjonalnymi urządzeniami do podawania.

Opis wynalazku ujawnia sposób leczenia stanów powstałych wskutek niepożądanego działania IL4 i/lub ILI3, polegający na podawaniu cierpiącemu skutecznej ilości związku według wynalazku.

Ponadto opis wynalazku ujawnia związek według wynalazku do stosowania jako aktywna substancja lecznicza, w szczególności do stosowania w leczeniu stanów wynikających z niepożądanego działania IL4 i/lub ILI 3.

Opis wynalazku ujawnia także zastosowanie związku według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia stanów wynikających z niepożądanego działania IL4 i/lub ILI 3.

Nie oczekuje się efektów toksykologicznych przy podawaniu związków według wynalazku.

182 665

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek.

Przykład 1. Białko fuzyjne IL4.Y124D/IgG1

Opisano konstrukcję chimerycznego cDNA IL4.Y124D/IgG1, ekspresję odpowiedniego białka w układzie ekspresji ssaka i jego aktywność.

1. Konstrukcja DNA kodującego białka ffuyjne (a) Konstrukcja regionu kodującego IL4.Y124D

Wariant ludzkiego genu IL4, opisany (Kruse, N., Tony, H-P i Sebald, W. EMBO Journal 11: 3237 [1992]), w którym resztę 124 w białku zmutowano z tyrozyny z dzikiego typu do kwasu asparaginowego, wytworzono przez mutagenezę PCR ludzkiego cDNA IL4 (z British Biotechnology). cDNA IL4.Y124D wstawiono do wektora ekspresji pTR312, stosując miejsca Hindlll i Bglll, (M. J. Browne, J. E. Carey, C. G. Chapman, A. W. R. Tyrrell, C. Entwisle, G. M. P. Lawrence, B. Reavy, I. Dodd, A. Esmail i J. H. Robinson, Journal of Biological Chemistry 263:1599, [1988]) z wytworzeniem plazmidu pDB906.

W celu wzmocnienia cząsteczki IL4.Y124D i dodania dogodnych miejsc restrykcji na każdym końcu do subklonowania, przeprowadzono reakcję PCR stosując 20 ng plazmidu pDB906 jako substratu. Zaprojektowano startery PCR obejmujące miejsce enzymu restrykcji, flankowane 10-15 parami zasad nukleotydowych do „kotwiczenia” starterów na końcach. Sekwencje starterów były następujące:

1) 5' CGA ACC ACT GAA TTC CGC ATT GCA GAG ATA 3' (obejmuje miejsce restrykcji EcoRI, GAATTC)

2) 5' CAC AAA GAT CCT TAG GTA CCG CTC GAA CAC TTT GA 3' (obejmuje miejsce restrykcji KpnI, GGTACC)

Startery użyto w końcowym stężeniu 5 ng/pl, a dNTPs dodano w końcowym stężeniu 0,2 mM w całkowitej objętości reakcji 100 pl. Przeprowadzono 31 cykli PCR. Cykle składały się z etapu denaturacji przez 1 minutę w temperaturze 94°C, etapu wygrzewania przez 1 minutę 30 s w temperaturze 50°C, i etapu wydłużania przez 1 minutę 30 s w temperaturze 72°C. W cyklu 1 denaturację wydłużono do 5 minut i w końcowym cyklu etap syntezy wydłużono do 7 minut. W reakcji PCR użyto 2,5 jednostek polimerazy Taq z Advanced Biotechnologies. Wytworzono produkt PCR z 587 parami zasad. Oczyszczono go stosując zestaw Promega „Magic PCR cleanup” i następnie trawiono EcoRI i KpnI w buforze reakcyjnym 4 (wszystkie enzymy restrykcyjne otrzymano z GibcoBRL), z wytworzeniem „lepkich końców”. Po 4 godzinach 30 minutach w temperaturze 37°C, całość ogrzewano do 70°C przez 10 minut i następnie strącono etanolem. Analiza powstałego DNA elektroforetycznie na żelu agarozowym wykazała obecność trzech pasm około 570 par zasad 463 par zasad i 100 par zasad. Fragment o 570 parach zasad reprezentuje pełnej długości wariant IL4.Y124D IL4, obecny, ponieważ trawienie było niekompletne. Dwa mniejsze fragmenty wytworzono dzięki obecności miejsca EcoRI w cDNA IL4.Y124D. Pasmo o 570 parach zasad oczyszczono w procedurze Geneclean™ i poddano ligacji do Bluescript KS+™ wytworzonego metodą trawienia EcoRI i KpnI, po czym Geneclean™. Wytworzono tak rekombinant Bluescript KS+/IL4.Y124D. Wielkie ilości tego rekombinantowego DNA wytworzono stosując metodę Promega „Magic Maxiprep”. Insert IL4. Y124D wycięto z rekombinanta Bluescript stosując Smal i KpnI. 20 pg rekombinanta DNA inkubowano z 25 jednostkami SmaI w buforze reakcyjnym 4, w temperaturze 30°C przez noc. Następnie dodano 25 jednostek KpnI do strawionego produktu, który inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 godzin. Powstały fragment około 580 par zasad oczyszczono metodą Geneclean™ wytwarzając fragment IL4.Y124D/SmaI/KpnI.

(b) Konstrukcja regionu kodującego IgG1

Wektor COSFcLink (Tabela 1) zawiera ludzki cDNA IgG1 kodujący aminokwasy 1-4 i 6-15 zawiasu, 1-110 CH2 i 1-108 CH3 opisanych przez Ellisona J., Bersona B. i Hooda L. E., Nucleic Acids Research tom 10, str. 4071 -4079,1982. Reszta 5 zawiasujest zmieniona z cysteiny w opublikowanej sekwencji IgG1 na alaninę przez zmianę TGT na GCC w sekwencji nukleotydowej. Klonowano ją z ludzkiej IgG leukemii komórek osocza ARH-77 (American Type Tissue

182 665

Collection), stosując RT-PCR i kompletnie sekwencjonując w celu potwierdzenia tożsamości z opublikowaną sekwencją [publikacja zgłoszenia patentowego WO 92/00985]

Konstrukcja COSFc rozpoczęła się od wektora pUC18 zawierającego cDNA ludzkiej IgG1 jak powyżej (pUC18-Fc), trawionego KpnI i Sacll, z wycięciem CH1, zawiasu i części CH2. Wycięty region zastąpiono wzmocnionym PCR fragmentem zawierającym region zawiasCH2 jak poniżej. Użyto następujących starterów PCR:

5' TCG AGC TCG GTA CCG AGC CCA AAT CGG CCG ACA AAA CTC ACA C 3 ' ' GTA CTG CTC CCG CGG CTT TGT CTT G 3 '

Fragment DNA zawierający region zawias CH2 wzmocniono z pUC 18-Fc, trawiono KpnI i Sacll, oczyszczono na żelu i klonowano do trawionego KpnI/Sacll wektora pUC18-Fc. Cys z pozycji 230 (numeracja Kabata; Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)) ciężkiego łańcucha IgG1 zmieniono na Ala przez podstawienie TGT na GCC w sekwencji nukleotydowej. Zmieniona sekwencja DNA w jednym ze starterów PCR wprowadziła unikalne miejsce KpnI na końcu 5 ' zawiasu. Powstały plazmid nazwano pUC18Fcmod, i połączenia i wzmocniony PCR region sekwencjonowano dla potwierdzenia.

Cały insert zawias-CH2-CH3 w pUC18-Fcmod usunięto w pojedynczym fragmencie DNA przy pomocy KpnI i XbaI, oczyszczono na żelu, i poddano ligacji do SFcR1Cos4 ciętego KpnI i XbaI w celu utworzenia COSFc.

SFcRlCos4 jest pochodnąpST4DHFR (Deen, K., McDougal, J. S., Inacker, R., FolenaWasserman, G., Arthos, J., Rosenberg, J., Maddon, P. J., Axel, R., i Sweet, RW. Nature 331: 82 [19881]) i zawiera receptor typu I rozpuszczalnego Fc (sFcR1) wstawiony pomiędzy promotor cytomegalowirusa (CMV) i regiony poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH), a także zawiera cDNA reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) wstawiony pomiędzy promotor β-globiny i regiony poliadenylacji SV40, początek replikacji SV40, i gen oporności na ampicylinę do wzrostu w bakterii. Pocięcie wektora KpnI i XbaI usuwa region kodujący sFcR1, tak więc wektor COSFc zawiera region zawiasu-CH2-CH3 wstawiony pomiędzy promotor CMV i regiony poliadenylacji BGH.

Wektor COSFcLink utworzono z COSFc wstawiając linker oligonukleotydowy w unikalne miejsce EcoRI wektora, który odtwarza miejsce EcoRI, a także wprowadza miejsca klonowania BstEII, Pstl i EcoRV. Użyto następujące oligonukleotydy:

' AATTCGGTTACCTGCAGATATCAAGCT 3 ' ' GCCAATGGACGTCTATAGTTCGATTAA 5 '

Połączenie sekwencjonowano w celu potwierdzenia orientacji w wektorze. Rozmiar końcowego wektora wynosi 6,37 tysięcy par za;s^c^..

(c) Konsttuucca DNA kodującego białko ffuyjne.

W celu wstawienia cDNA IL4.Y124D, wytworzono wektor COSFcLink trawiąc EcoRV i KpnI jak następuje: 5 pg DNA inkubowano z 15 jednostkami EcoRV w buforze reakcyjnym 2 w temperaturze 37°C przez 5 godzin, następnie strącono etanolem. Powstały DNA trawiono KpnI w buforze reakcyjnym 4 w temperaturze 37°C przez 3 godziny, i strącono etanolem. Fragmenty 11,4.Y124D/SmaI/KpnI i COSFcLink/EcoRV/KpnI poddano ligacji z wytworzeniem plazmidu pDB951, kodującego białko fuzyjne IL4.Y104D/IgG1. Ligację osiągnięto stosując zestaw do ligacji DNA Amersham, kod produktu RPN 1507, inkubując mieszaninę w temperaturze 16°C przez noc. Produkty reakcji ligacji transformowano do komórek kompetentnych Promega JM 109 (wysokowydajne) i umieszczono na płytkach z agarem Luria Broth zawierającym ampicylinę w ilości 50 pg/ml. Transformanty hodowano w Luria Broth (zawierającym ampicylinę w ilości 50 pg/ml) i wytworzono DNA stosując Promega „Magie Minipreps”. Powstawanie rekombinacyjnego DNA IL4.y124D/COSFcLink sprawdzono restrykcyjnym trawieniem i sekwencjonowaniem DNA. Kompletną sekwencję IL4.Y124D i połączenie z DNA COSFcLink potwierdzono sekwencjonowaniem DNA (tablica 2).Kodujące sekwencje rekombinacyjnego DNA IL4.Y104D/IgG1 pokazano w tabeli 3 i sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego pokazano w tabeli 4. Rekombinacyjne DNA IL4. Y124D/COSFcLink wytworzono

182 665 i oczyszczono stosując gradienty chlorku cezu i DNA użyto do czasowej transfekcji komórek HeLa.

2. Ekspresja białka fuzyjnego

Komórki HeLa hodowano na pożywce MEMa (Gibco) z 10% płodową surowicą bydlęcą 1% glutaminy. Do próby 1 x 10⁶ komórek HeLa zaszczepiono w 15 ml pożywki RPMI-1640 z 10% surowicą młodego cielaka, 1% glutaminy („pożywka szczepienia”), w kolbie 75 cm2, cztery dni przed transfekcją. Na dzień przed transfekcją, następne 12,5 ml pożywki szczepienia dodano do każdej kolby. W dniu transfekcji, pożywkę zmieniono 15 ml „pożywki transfekcji” (pożywka MEM z solami Earle'a zawierająca 10% surowicę młodego cielaka i 1% nieistotnych aminokwasów), w czasie zero. W czasie +3 godziny, dodano 25 μg właściwego DNA w 0,125 M CaCl2,1 x HBS (solanka buforowana HEPES) do komórek. W czasie +7 godziny, komórki poddano glicerynowemu szokowi (15% objętościowo) i następnie pozostawiono do inkubacji przez noc w 12,5 ml pożywki szczepienia zawierającej 5 mM maślanu sodu. Następnego dnia komórki przemyto PBS (solanka buforowana fosforanem Dulbecco) i dodano 12,5 ml „pożywki zbierania” (RPMI-1640 z 2% 7,5% roztworu wodowęglanu sodu). Po dalszych 24 godzinach inkubacji supematanty usunięto, odwirowano przy 1000 obrotach na minutę przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórek i przechowywano w temperaturze 4°C lub -20°C.

3. Aktywność biologiczna

Dla sprawdzenia supernatanta na aktywność antagonisty czna.IL4, stosując sposób opisany w Spits i in., J. Immunology 139,1142 (1987), ludzkie limfocyty krwi obwodowej inkubowano przez 3 dni z fitohemoglutyniną, mitogenem komórek T, dla wyregulowania receptora IL4. Powstałe blastocyty stymulowano następnie przez kolejne 3 dni IL4. Rozmnażanie zmierzono wchłanianiem 3H tymidyny.

Chimera IL4.Y124D/IgGl inhibitowała włączanie ³H tymidyny przez limfocyty T ludzkiej krwi obwodowej stymulowano 133 pM IL4 w sposób zależny od dawki.

Przykład 2. Białko fuzyjne IL4.Y124D/IgG4

1. Konstrukcja DNA kodującego białko fuzyjne

PCR przeprowadzono w celu wzmocnienia regionu kodującego IL4.Y124D i wprowadzenia milczącego podstawienia nukleotydowego na końcu 3', tworzącego miejsca XhoI. Jako substrat dla reakcji PCR użyto 20 ng lineryzowanego plazmidu pDB951 (Przykład 1.1 (c)). Użyto następujące oligonukleotydowe startery:

15' CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA CAG GAG ATC 3' (obejmuje miejsce restrykcji EcoRV, GATATC)

2) 5' CCC GGT ACC GCC CGA GCA CIT TGG GTT TTT 3' (obejmuje miejsce restrykcji XhoI, CCCGGG).

Drugą reakcją PCR przeprowadzono w celu wzmocnienia fragmentu zawias-CH2-TH3 ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG4. Substratem był cDNA ciężkiego łańcucha syntetycznej ludzkiej IgG4, którego sekwencję podano w tabeli 5, w oparciu o sekwencję Genbank GB :HUMIGCD2 (Ellison J.,BuxbaumJ. i HoodL.E., DNA 1:11-18,1981). Liczne milczące podstawienia wykonano w opublikowanej sekwencji nukleotydowej. Gen złożono łącząc dwa po 0,5 tysięcy par zasad syntetyczne fragmenty DNA. Każdy taki fragment wykonano zgrzewając serię nakładających się oligonukleotydów i następnie wypełniając luki PCR. Oba fragmenty po 0,5 tysięcy par zasad połączono w miejscu Sacll i wstawiono do wektora pCR2. Fragment 1,0 tys. par zasad ApalBg1ll 000 zawierający cały stały region wydzielono i poddano ligacji do wektora ekspresji, pCD, zawierającego humanizowany specyficzny dla IL4 zmienny region. Konstruktu użyto jako substratu PCR w celu wzmocnienia regionu zawias-CH2-CH3 IgG4.

Oligonukleotydowe startery użyte do wzmocnienia regionu IgG4 zawias-CH2-TH3 były następujące:

15' GGT GGA CAA CTC GAG CCG GTC CGA ATA TGG 3 ' (obejmuje miejsce restrykcji XhoI, CCCCGG)

2) 5 ' TTA A CG TAG ACT TAG ACA ACA CCC ATT TAC C ' (obejmuje miejsce XbaI, TCTGCG).

182 665

Warunki obu reakcji PCR były takie, jak opisano dla otrzymywania pochodnej pDB951. Krótko, startery użyto w ilości 5 ng/pl, a dNTP o końcowym stężeniu 0,2 mM w całkowitej objętości reakcji 100 pl. Użyto 2,5 jednostek polimerazy Taq z Advanced Biotechnologies i przeprowadzono 31 cykli PCR. Cykle składały się z etapu denaturacji przez 1 minutę w temperaturze 94°C, etapu wygrzewania, przez 1 minutę 30 s w temperaturze 50°C, i etapu wydłużania, przez 1 minutę 30 s w temperaturze 72°C. W cyklu I denaturację wydłużono do 5 minut, a w końcowym cyklu etap syntezy wydłużono do 7 minut.

Produkty PCR mające około 700 par zasad (zawias-CH2-CH3 IgG4) i 400 par zasad (114. Y124D) otrzymano i oczyszczono stosując zestaw Promega „Magic PCR cleanup”. Oczyszczonąmieszaninę PCR trawiono następnie następującymi enzymami w celu utworzenia „lepkich końców”: XhoI i XbaI dla IgG4 i EcoRV i XhoI for IL4.Y124D. Produkty trawienia inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny i następnie strącono etanolem. Powstałe DNA zanalizowano metodą elektroforezy na żelu otrzymując wielkości około 690 par zasad (zawiasCH2-CH3 IgG4) i 370 par zasad (IL4.Y124D).

Wytworzono wektora, do którego ligowano fragmenty PCR zawias-CH2-CH3 IgG4 i IL4.Y124D trawiąc pDB951 (IL4.Y124D w COSFcLink) EcoRV i XbaI dla usunięcia większości fuzyjnej cząsteczki IL4.Y124D/IgG1. Jedyna pozostała cześć ma około 75 par zasad na końcu 5 ' IL4, i nie jest obecna we fragmencie EcoRV/XhoI IL4.Y124D powstającym z wzmocnienia PCR. 5 pg DNA pDB951 trawiono w łącznej objętości 30 pl stosując bufor reakcyjny 2 (GibcoBRL). Powstały fragment o 5,8 tys. parach zasad DNA oczyszczono stosując procedurę Geneclean™. Trzy opisane fragmenty (IL4.Y124D EcoRV/XhoI, zawias-CH2-CH3 IgG4 XhoI/XbaI i fragment 5,8 tys. par zasad wynikający z trawienia EcoRV/XbaI pDB951) poddano ligacji z wytworzeniem plazmidu PDB952, kodującego białko fuzyjne IL4. Y124D/IgG4. Ligację prowadzono stosując zestaw do ligacji DNA z Amersham (kod produktu RPN 1507), inkubując reakcję w temperaturze 16°C przez noc. Produkty reakcji ligacji transformowano do współzawodniczących komórek Promega JM 109 (wysokowydajne) i umieszczono na płytkach na agarze Luria Broth zawierającym ampicylinę w ilości 50 pg/ml. Transformanty hodowano w Luria Broth (zawierającym ampicylinę w ilości 50 (pg/ml) i DNA wytworzono stosując Promega „Magic Minipreps”. Wytwarzanie rekombinacyjnego DNA IL4.Y124D/IgG4 potwierdzono przez restrykcyjne trawienia, a kompletność IL4.Y124D i regionów zawias-CH2-CH3 IgG4 potwierdzono metodą sekwencjonowania DNA. Tabela 6 podaje sekwencję regionu kodującego tylko cząsteczkę fuzyjnąIL4.Y124D/IgG4, i tabela 7 zawiera sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego. Rekombinowane DNA IL4.Y124D/IgG4 wytworzono i oczyszczono stosując gradienty chloru cezu i DNA użyto do czasowej transfekcji komórek HeLa.

2. Ekspresja białka fuzyjnego

Komórki HeLa hodowano w pożywce MEMa (Gibco) z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% glutaminą- Dla próby, 1 x 10⁶ komórek HeLa zaszczepiono w 15 ml pożywki RPMI-1640 10%o surowicą młodego cielaka, 1% glutaminy („pożywka szczepienia”), w kolbie 75 cm², na cztery dni przed transfekcją. Na dzień przed transfekcją, dodano kolejne 12,5 ml pożywki szczepienia do każdej kolby. W dniu transfekcji, pożywkę zmieniono na 15 ml „pożywki transfekcji” (pożywka MEM z solami Earle'a zawierającymi 10% surowicę młodego cielaka i 1% nieistotnych aminokwasów), w czasie zero. W czasie +3 godziny, dodano do komórek 25 pg właściwego DNA w 0,125M CaCl2,1 x HBS (solanka buforowana HEPES). W czasie +7 godzin, komórki poddano szokowi glicerynowemu (15% objętościowo) i następnie inkubowano przez noc w 12,5 ml pożywki szczepienia zawierającej 5 mM maślanu sodu. Następnego dnia komórki przemyto PBS (solanka buforowana fosforanem Dulbecco) i dodano 12,5 ml „pożywki zbierania” (RPMI-1640 z 2% 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu). Po kolejnej inkubacji przez 24 godziny, supernatanty usunięto, odwirowano przy 1000 obrotach na minutę przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórek i przechowywano w temperaturze 4°C lub -20°C.

3. Aktywność biologiczna

Dla próby supernatantu na aktywność antagonistyczną IL4, stosując sposób opisany w Spits i in., J. Immunology 139,1142 (1987), ludzkie limfocyty krwi obwodowej inkubowano

182 665 przez 3 dni z fitohemoaglutyniną, mitogenem komórek T, dla wyregulowania receptora IL4. Powstałe blastocyty stymulowano następnie przez kolejne 3 dni IL4. Rozmnażanie zmierzono wchłanianiem 3H tymidyny.

Chimera IL4.Y124D/IgG4 inhibitowała włączanie ³H tymidyny przez limfocyty T ludzkiej krwi obwodowej stymulowane 133 pM IL4 w sposób zależny od dawki.

Przykład 3. Białko fuzyjne IL4.Y124D/IgG4 PE

1. Konstrukcja DNA kodującego białko fuzyjne

Przeprowadza się PCR w celu wzmocnienia regionu kodującego IL4.Y124D i wprowadzenia milczącego nukleotydowego podstawienie na końcu 3' tworzącego miejsce XhoI, jak opisano w przykładzie 2.

Drugą reakcję PCR przeprowadza się w celu wzmocnienia fragmentu zawias-CH2-CH3 wariantu PE ciężkiego łańcucha ludzkiej IgG4. W IgG4 PE, reszta 10 zawiasu (reszta 241, numeracja Kabata) jest zmieniana z seryny (S) z dzikiego typu naprolinę (P) i reszta 5 CH2 (reszta 248, numeracja Kabata) jest zmieniana z leucyny (L) z dzikiego typu na glutaminian (E). Angal S., King D. J., Bodmer M. W., Turner A., Lawson A. D. G., Roberts G., Pedley B. i Adair R., Molecular Immunology tom 30 str. 105-108,1993, opisującząstecżkęIgG4, gdzie reszta 241 (numeracja Kabata) jest zmieniana z seryny na prolinę. Zmiana ta podwyższa czas półtrwania w surowicy cząsteczki IgG4.

Wariant PE IgG4 utworzono stosując mutagenezę PCR na syntetycznym ludzkim cDNA ciężkiego łańcucha IgG4 opisanej w tabeli 5, i poddano następnie ligacji do wektora ekspresji pCD.

Tego plazmidu użyto jako substratu do reakcji PCR wzmacniając fragment zawias-CH2-CH3 IgG4. PE. Sekwencję IgG4 wariant PE opisano w tabeli 8. Reszty sekwencji nukleotydowej IgG4, które zmieniono dla utworzenia wariantu PE były następujące (według tabeli 8):

resztę 322 zmieniono na „C” w wariancie Pe z „T” z dzikiego typu; resztę 333 zmieniono na „G” w wariancie PE z „A” z dzikiego typu; i reszty 343-344 zmieniono na „GA” w wariancie PE z „CT” z dzikiego typu. Oligonukleotydowe startery użyto do wzmacniania regionu zawias-CH2-CH3 wariantu

PE IgG4 jak opisano dla pochodnej pDB952.

Produkty PCR mające około 700 par zasad (zawias-CH2-CH3 IgG4 mutanta PE) i 400 par zasad (IL4.Y124D) otrzymano i oczyszczono stosując zestaw Promega „Magic PCR cleanup”. Oczyszczoną mieszaninę PCR trawi się następnie następującymi enzymami w celu utworzenia „lepkich końców”: XhoI i XbaI dla IgG4 PE i EcoRV i XhoI dla IL4.Y124D. Produkty trawienia inkubuje się w temperaturze 37°C przez 3 godziny i następnie strąca etanolem. Powstałe DNA mająrozmiary około 690 par zasad (zawias-CH2-CH3 IgG4 PE) i 370 par zasad (IL4. Y124D).

W celu wytworzenia wielkich ilości fragmentu zawias-CH2-CH3 IgG4 wariantu PE i fragment IL4. Y124D, oczyszczone i trawione produkty PCR poddaje się ligacji dla Bluescript KS+™ przygotowanego się przez trawienie XhoI i XbaI dla fragmentu zawias-CH2-CH3 IgG4 PE lub EcoRY i XhoI dla fragmentu IL4.Y124D, i następnie działa Geneclean™. Wytworzono w ten sposób rekombinat Bluescript KS⁺/zawias-CH2-CH3 IgG4 PE i Bluescript KS+/IL4.Y124D. Wielkie ilości tych DNA wytwarza się stosując metodę Promega „Magic Maxiprep”. Fragment zawias-CH2-CH3 IgG4 PE wycina się z rekombinantu Bluescript stosując XhoI i XbaI. Powstały fragment około 690 par zasad oczyszcza się metodą Geneclean™ wytwarzając wielkie ilości fragmentu XhoI/XbaI zawias CH2-CH3 IgG4 PE. Fragment IL4.Y124d wycina się z rekombinantu Bluescript stosując EcoRY i XhoI i powstały fragment około 370 par zasad oczyszcza się metodą Geneclean™.

Wytwarza się wektor, do którego liguje się fragmenty zawias-CH2-CH3 IgG4 PE i IL4. Y124D trawiąc pDB951 EcoRV i XbaI, jako opisano dla pochodnej pDB952.

Opisane 3 fragmenty (IL4. Y124D EcoRV/XhoI, zawias-CH2-CH3 IgG4 wariant PE XhoI/XbaI i fragment o 5,8 tys. par zasad wynikający z trawienia EcoRV/XbaI pDB951) poddaje się ligacji z wytworzeniem plazmidu pDB953 stosując zestaw do ligacji DNA z Amersham (kod produktu RPN 1507), inkubując całość w temperaturze 16°C przez noc. Produkty reakcji ligacji transfor14

182 665 muje się do współzawodniczących komórek Promega JM 109 (wysokowydajne) i umieszcza na płytkach na agarze Luria Broth zawierającym ampicylinę w ilości 50 pg/ml. Transformanty hoduje się w Luria Broth (zawierającym ampicylinę w ilości 50 pg/ml) i DNA wytwarza stosując Promega „Magic Minipreps”. Wytwarzanie rekombinacyjnego DNA IL4. Y124D/IgG4 wariant PE potwierdzono przez trawienia restrykcyjne, a kompletność IL4.Y 124D i regionu zawias-CH2-CH3 IgG4 wariant PE potwierdzono sekwencjonowaniem DNA. Tabela 9 opisuje sekwencję regionu kodującego tylko cząsteczki fuzyjnej IL4.Y124D/IgG4 PE, a tabela 10 zawiera sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego. Rekombinacyjne DNA IL4.Y124D/IgG4 PE wytwarza się i oczyszcza stosując gradienty chloru cezu i DNA stosuje do czasowej transfekcji komórek HeLa.

2. Ekspresja białka fuzyjnego

Komórki HeLa hodowano w pożywce MEMa (Gibco) z 10% płodową surowica bydlęcą i 1% glutaminą. Dla celów próby, 1x 10⁶ komórek HeLa zaszczepiono w 15 ml pożywki RPMI1640 10% surowicą młodego cielaka, 1% glutaminy („pożywka szczepienia”), w kolbie 75 cm², na cztery dni przed transfekcją. Na dzień przed transfekcją, dodano kolejne 12,5 ml pożywki szczepienia do każdej kolby. W dniu transfekcji, pożywkę zmieniono na 15 ml „pożywki transfekcji” (pożywka MEM z solami Earle'a zawierającymi 10% surowicę młodego cielaka i 1% nieistotnych aminokwasów), w czasie zero. W czasie +3 godziny, dodano do komórek 25 pg właściwego DNA w 0,125M CaC^, 1 x HBS (solanka buforowana HEPES). W czasie +7 godzin, komórki poddano szokowi glicerynowemu (15% objętościowo) i następnie inkubowano przez noc w 12,5 ml pożywki szczepienia zawierającej 5 mM maślanu sodu. Następnego dnia komórki przemyto PBS (solanka buforowana fosforanem Dulbecco) i dodano 12,5 ml „pożywki zbierania” (RPMI-1640 z 2% 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu). Po kolejnej inkubacji przez 24 godziny, supematanty usunięto, odwirowano przy 1000 obrotach na minutę przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórek i przechowywano w temperaturze 4°C lub -20°C.

3. Aktywność biologiczna

Dla próby supernatantu na aktywność antagonistyc:ziąIL4, stosując sposób opisany w Spits i in., J. Immunology 139, 1142 (1987), ludzkie limfocyty krwi obwodowej inkubowano przez 3 dni z fitohemoaglutyniną, mitogenem komórek T, dla wyregulowania receptora IL4. Powstałe blastocyty stymulowano następnie przez kolejne 3 dni IL4. Rozmnażanie zmierzono wchłanianiem 3H tymidyny.

Chimera IL4.Y124D/IgG4 PE inhibitowała włączanie ³H tymidyny przez limfocyty T ludzkiej krwi obwodowej stymulowane 133 pM IL4 w sposób zależny od dawki.

Przykład^. Wektor ekspresji ssaka zawierający DNA kodujące IL4. Y124D/IgG4 PE.

1. Konstrukcja DNA

Wektor pCDN (Aiyar, N., Baker, E., Wu, H-L., Nambi, P., Edwars, R. M., Trill, J. J., Ellis, C., Bergsma, D. Molecular and Cellular Biochemistry 131:75-86,1994) zawiera promotor CMV, polilinkerowy region klonowania i region poliadenylacji BGH. Ten wektor zawiera także gen bakteryjnej fosfotransferazy neomycyny (NEO) wstawiony pomiędzy promotor β-globiny i region poliadenylacji SV40 dla selekcji Geneticin™, kasetę selekcji DHFR wstawioną pomiędzy promotor β-globiny i region poliadenylacji BGH dla wzmacniania metotreksanu (MTX), gen oporności na ampicylinę dla wzrostu w bakterii, i początek replikacji SV40.

W celu wstawienia cDNA IL4.Y124D/IgG4 pE przygotowano wektor pCDN przez trawienie Nde1 i BstX1 jak poniżej: 15 pg DNA inkubowano z 30 jednostkami BstX1 w buforze reakcyjnym 2 (Gibco-BRL) w temperaturze 55°C przez 1 godzinę, i strącono etanolem. Powstały DNA trawiono Nde1 w buforze reakcyjnym 2 w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, i strącono etanolem. Fragment IL4.Y124D/IgG4 PE wytworzono z pDB953 (Przykład 3.1) trawiąc BstX1 i Nde1 jak poniżej: 15 pg DNA inkubowano z 30 jednostkami BstX1 w buforze reakcyjnym 2 w temperaturze 55°C przez 1 godzinę, i stącono etanolem. Powstały DNA trawiono Nde1 w buforze reakcyjnym 2 w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, i strącono etanolem.

Fragmenty IL4.Y124D/IgG4 PE Nde1/BstX1 i pCDN Nde1/BstX1 ligowano z wytworzeniem plazmidu pCDN-IL4.Y124D/IgG4. Ligację prowadzono stosując 2 jednostki ligazy DNA T4 (Gibco BRL) w buforze ligazy DNA T4. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez

182 665 noc. Produkty reakcji ligacji transformowano do współzawodniczących komórek Gibco-BRL DH5a (wydajność subklonowania) i umieszczono na płytkach z agarem Luria Broth zawierającym 75 pg/ml ampicyliny. Transformanty hodowano w Luria Broth (zawierającym 75 pg/ml ampicyliny) i DNA wytworzono przez alkaliczną lizę. Wytwarzanie DNA pCDN-IL4. Y124D/IgG4 PE potwierdzono trawieniami restrykcyjnymi. Kompletność sekwencji rekombinacyjnego DNA IL4.Y124D/IgG4 PE potwierdzono metodą sekwencjonowania. Rekombinacyjne DNA pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE wytworzono i oczyszczono stosując kolumny Qiagen i użyto do czasowej infekcji komórek COS i elektroporacji do komórek CHO z utworzeniem stabilnych klonów.

2. Ekspresja białka fuzyjnego

a) Czasowa ekspresja w COS

Komórki COS-1 hodowano w pożywce DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą. Dla transfekcji komórki zaszczepiono w ilości 2 X 10⁵ komórek w 35 mm naczyniu do kultur tkankowych 24 godziny wcześniej. Roztwór zawierający 1 pg DNA w 100 pl DMEM bez surowicy dodaje się do roztworu zawierającego 6 pl reagentu LIPOFECTAMINE (Gibco-BRL) w 100 pl DMEM bez surowicy, łagodnie miesza się i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Komórki przemywa się raz DMEM bez surowicy. 0,8 ml DMEM bez surowicy dodaje się roztworu DNA-LIPOFECTAMINE, miesza łagodnie i rozcieńczony roztwór nakłada się na komórki. Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 5 godzin, następnie dodaje się 1 ml DMEM zawierającego 20% płodową surowicę bydlęcą. Komórki testuje się 48-72 godzin później dla określenia poziomu ekspresji.

b) Elektroporacja do komórek CHO

Komórki CHO, ACC-098 (linia komórek w zawiesinie pochodzących z CHO DG-44, Urlaub, G., Kas, E., Carothers, A. M. i Chasin, L. A. Cell, 33,405-412, 1983) hodowano w pozbawionej surowicy pożywce wzrostowej według WO 92/05246. 15 pg plazmidu pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE trawiono stosując 30 jednostek NotI w temperaturze 37°C przez 3 godziny w celu linearyzacji plazmidu, i strącono etanolem. Powstały DNA ponownie umieszczono w zawiesinie w 50 pl 1X TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA elektroporowano do 1 x 10⁷ komórek ACC-098, stosując Bio Rad Gene Pulser ustawiony na 380 V i 25 pF. Komórki ponownie umieszczono w zawiesinie w pożywce wzrostu przy 2,5 X 10⁴ komórek/ml, i 200 pl zawiesiny komórek umieszczono na płytkach w każdej studzience 96-studzienkowej płytki. 48 godzin później pożywkę zmieniono na pożywkę wzrostu zawierającą 400 pg/ml G418 (Geneticin). 21 dni po selekcji, kondycjonowaną pożywkę z powstałych kolonii przesiano w próbie ELISA. Kolonie o najwyższej ekspresji przeniesiono na 24-studzienkowe płytki dla namnożenia.

182 665

Tablica 1

Sekwencja DNA wektora COSFcLink, 6367 par zasad

SEKW. NR ID. 1

GATGGCGACGGAGTGGGAGAGCGGGGAGCGAGCCGGCGACGGACGACTAGGGAGTAATAG (5 0

GAATTAAGGATGGGGGTAGGAGGTTAGAGTTTACAGACGGAGGTCCGCGGGATAGAACGT 120

ACGGTAAATGGCCTGTCCGGCGGATCGTCTAGCGACCCCCGCCGAGGGATGGCAAGAATG 180

ATGTATGTTCCTACAGCAATGTTAAGAGGGATGCCTTATTGATGTTAATGGGTGGATGAT 240

TTACGGGAGACTGTCTATTCGGTAGTACATTAAGTGTATCATATGCTAAGTACGCTTCTT 300,

ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360

GACTTGGCGAGGGGGCAGGAGATGGAGGGATGAGTTAGTGAGATGACCATGGTGA.GGGGG 420

TTGTGGGAGCATACTAAGGGGCGTGGATAGTGGTTTGACTCATGGGGATTTCTAAGTCGT 4 8 0

CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 54 O

GGTTGTAAGAATGCTGTCTTATTCACCGCCAATGGGCGGCAGGTGTGTACGGTGGGAGGTC 600

TATACAAGGAGAGTTGGGGACGGGAATCGTCAGAGTGTTGGGAGACGCGAGCGAAGTCGG 660

TTATTTGCAGACACCGAGCCAATTTGGTACCGAGTCTAAATTGGTTGATAAAATTTATAT 720

ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA\CTCCTGGGGG<GlCCGGCAGTCCTCCTCTTCCCCCC 7 8 0

AAAGCCAGAGGAACCCCGCAGGAGTCCCCGGATTTCTGAGGCTAGAGGTGGGGCGGCGGA 800

CGTGGGCCGGGACGAGGGCGGGGTGGGGTTGAGCCGGTAGGCGGGCGGCGTGGGGGTGCG 900

TAACGCCAAGATAAAGTTGTGGGAGGAGCAGGACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGTGC 900

TCTCACGGTTTTGTATTAGGATTGGTGGAACGGCAAGGAGTACTAIGTGCcACGGTCTGCCAA 1020

TAAAGCTCCTTTAGTTTCTATTGAGAAGATTATCCTTAAAGTTAAGGGGCAGTTCTGAGA 1080

ACGAGAGGTGCAGAGGGTGGGGCCATCCCGGGATGAGGCGAGGGAGGAGCAGGTCAGCGC 1140

GATTCGCCTGGTTAAAGGTTTTGATCCCAiGTGATAGCGCCGCGGAGCGGGAGAGCAAGGG 2000

GAGGGCGGAGGACAAAAACCGCGAGGACCGGCCCCGGGCCGCGCGCCAAGGGGCCCTTGTT 1200

CGTGTAGAGCAAGCCCACCGCGGACAAGAGGAGGC GGGAGGAGGGGAACGC CTT CT GATG 1300

TTTTGGGACGTATGAGGTCTTGCATAATTATCATATGCAGAGGiGCCTCGCCCGGGCCCT 1300

GGGTAAAGGAGGGGAGGCGAGAGCGCGCGGATCAGCCCCGACTGTGCTGGCTAGTTGTTA 140 0

GCCAGGTGTTGTTCGGCCGCCCCCGGTGCGTGCCGGCACCCGGGAAGGGGCCACTCCCAC 1000

182 665

CCCTTCCCTTTGGTGCAGTCGCCGCATCCTATTCAG3TCTCCCACCACCTCTTATCTCGC 1560

CTTCCCCCCCCCCCCCCCCTGCCGTACTGGCCCGCAG<CG3TCCCAGGGTGACACTGCCTG :662 0

CCTCCCCCGCCTCCCCCCTCTTGCGCGGTACCTCCCCCTCTCGCCCCC<CG3TTTTTCGCT :6680

TTCACCTTCCTCCTTCAGTTTCTTATCCTGC^,GG3T(GCGGGAGGGCCGGAG3^,CAA3TTCG 1740

GTGTTAA3TCACCGCCCCGCCCGGTGCACCTCTCCTTGGGGACCGCCTCCTACGCGCACC 18000

CCCTCTCCTGTACACAGCCGTACACGCCGCCTACACCGGGTGTTAGCACTTGGCACTTTC 1860

AGCTTACTGGGTCCTACAG(GC3CTCACCCA(CGGTATGCTTCTTGCTATTCCACTTTCGC 1920

CCCCTGCGCTTGCGTCTTGCTJGGCCTCCGCTTCCTTGTCACCG<G3TA<GGGCCCTGCCAC 1980

TAGCCGCAGAGCATAT3CGGGTGAGGCACCCGAACCCGCCCCT(A\CATTTCCCCTCCGTGC 2 00 0

GCCCCCCCCCCCGCTCCCCATGCTTCCCGTACTCCACCCTCCTCATCCTCTCTTGGGCTC 2100

CACCGCTCCΓCCTAGCGTGCGGGGCTGGCAGGCC’CGTATCCCCGCTCTTACTGCCCCCTCGT 2160

TACCCGGTCCTGTTCCTCTTCCCTCCTGCGG.CGCCCCCACCCCTGGCCATCCACATTCGT 2220

TCTCCTTTCTCTTCACCCGTCGCTATCGCCGTTGTTGCACGGTGCCCGCCACCTTTTTGC 2280

CCCGGCG^,GAGCACCCCΓCTGGTCG3TATCCGTAGG7GGGA;TTGGTTCTCTATCTTCCACG :334 0

GCGACTCATTCCTAGACCGACCCGCCCACACACTCTCTGCCGCGCAGTCTACACGGTTGT 2000

TGTCAGGAGCTCACTTTTCCCTCAGGGCTGCCCACCGTCTTCCAGCATCCGCCCGGTGGT 2400

TCCGGTTCG(τGGGTAGGGTA<GGGC3GGTTTCGATAGTCGGAGGCTCGTTCTCCCCATTACC :252 0

GACTTATCAATCAACCAGGCCACCTTGCACTTTCCCCCATAACGACTACCCACCAATTCC 2500

AGGG3(CCAGCGTTTCCTTTGCCGACCCACCCCCCCAGCTATGGACTCTCTTTGCGACGTT :6640

CGCCTCTTTCTCTCCACCCTTGCCACCGGGCAGG<GGTCAAGTATAAGTTCGACCTTCGTC 2000

GCGA(CGCGCGC:C3GAACCCACCCTCCCCCAACCCCTCTGCTCCCCTTTCGACCTTGTCTG 2700

CCCCCACGACATCACCTCGCTTCCGATTTCCCTGCTCTGCTCCATAGCCCTCATGGACAG :280 0

GCTGATAGCTC3CA(AGGTTTCGC:GGT3GGGCTC^,TCTTTTGATTCTATCTTACCCCCCCC 2800

CCCCTTAGGTGTGCAAGCCCGTTCTGCTGCCCTTCCGCTAGTCGTGCTCCGCTCCTCCCT :294 0

CGTGC(ACGGCACCTG¢CCGC:TGTTGGTTTCCTGCTATTCATCTGCCACCAGTTCCTTTTT 0000

CCGCCCCCGCGGCCCAGCACGGATGCCTCTCGG(GGGCτCGGGϊCGGCGTACGGGCGCGACT 0000

GCGTCACCTATACCCGCTTACCCGACGGCCCAAGAΆ¢CCΓ3CGGGTTGTAT(GGG3TAGATGC 3100

GTGCATTCTCCGACCCAGCTTGGAGACCTTTGGGTTTTCGGGTGTGCGATAAGTTTAGCG 3100

182 665

TGAAAGTATTTTACATJAGTAACTCAGATACATAGAAAACAAAGCTAATGATAGGTGTCC 324 O

CTAAAAGTTCATT^I^A^T^T^AA^T^T^(^'^7^(^AAA^^^(^T^C^7^G^C^I^C^GCCATCAAA^TTCCAGCTCAAT 3300

TCTT(CCC(:CCTI?TA(CCAG3AGCACT’CTGCCCC.CTCATCTGGCATCACCCCACCCCTAGGC 3600

TAGCACCCACTCTTCTCCCGGGATCCCAGCACCTCTGGTGGCATCACCATGCCTGACCTAA 3420

AGCTGTACTACAGAGCCC\TTGTGATίCCCA\CTGCATGGTACTGCTATAGCCACGGCCACG 3400

TAGACCAATGGCATAGAACCCCCACACCTCTGGTCCCTΊ’GATCTTCCACCAGAGAGCTAC 3400

ACCCATCCACTGGCCCCCCGACCGCCTTTTCACCCCCTGGTGCTGGCCCAACTGGTGGTT 6000

ATCC.T<GAGCAGCATGTGCATTGCTCCATTCCCATCTCCTTGTCCTCC.GGTCCCATCT.CA 3600

GTGGCTCCCGGCACTCCACATCCAΛCCCGCGCCACTGACCCTTCTCGAGGAGCAAC-;TGGG 3200

GACCAGCCTCGACGATCTGGGCC.CAGGGGCCACCTTCCTGCATAGCACAGCjCCTGGCTTG 3700

TGCTGTCCGCTC(CGCATTCCCCCATGGGACCTCATGCCCCTCC.CCCGCTCTCGGATCCA 3400

TTCCTCCACAAA'CGCCTCCTC.ACTACTTCGGCCCVCAGCTCΛGAGGCCGAGGCGGCCTCGG 3000

CCTCTGCCTCCATTCACCAA'cCTTAGTCAGCCATGCATGGGGCGGCGACTGGGCGGAACTG 3900

GGCGGAGTTC.GGGGCGGGCTGGGCGGAGTTCGGGGCGGGACTACGGTTGCTGCCT.CCTTG 4200

AGCTGCATGCTTTGCCTΆCTTCTGCCTGCTGGGGCGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGΊΓ 0000

GCTGCCTCATTGC.GCTGCATGCTTTGCATΆCTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT 4100

CCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGACTTCATTCCCGCTCCCGTCGACCTCGCGAG 2000

CTTGGCGTCATCATGGTCCTCGCTGTTTCCTGTGTGCCCTTGTTCTCCGCTCCC.CCTTCC 4200

ACACCACATCCGCGCCGGACGCCTCACGTGTCACGCCTGGGGTGCCTCCTGAGTGAGCTC 4200

ACTCACATTCCT:’TGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGCAACCTGTCGTG,CCC 4800

GCTGCATTCATGCATCGGCCCACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 4400

CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCCGC 4000

TCCCTCCAC<GGCGGTCcVCACGGTTATCCΛCACCWΓCAGGGGATCCCGCCGGCCAGACCAT 4500

GTGAGCCCAAGGCCAGCAACAGGCCAGGGCCCCGTCACCCCGGCGGGGTGGTGGGGτTTTT 4600

CCCTAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCCTCACCCCCCT’CGCCGCTCCCGTCCGCGGTGGCG 460 0

ACCCCCGCCAGGACTCTCACGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCCGCTCCCTCGTGCGCTC 4700

TCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGCTCCCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGCCGCGT 4800

GGCGCTTTCTCAAT’GCTCACGCTGTAGGT.CTCTCCGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCCA 48 00

182 665

GCTGGG^TGrGrGCACGJA^(^(^(^i^(^l^(^^,^TCAGCCCQ^(^(^l3(C7^(^(^(^(^(Ct^'^.^TCCGGTAACTA 4 92 O

TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA 4 9 8 0

CAGGATTAGCAGAGCGGGTATGTAGGCGGTGCTACCAGAGTCTTGAAGTGGTGGCCTAA 5040

CTACGGCTAC^C'^.AG_JA^(^lGCC^C^T^T^T^^^(^(^T^^7^(^^(^(^(^(^^(^^,rG(^TGA^(^(^(^(^t^'^^(CCTT 510 0

CGGAAAV^(GG^I^Tr(3(^l^jA(^C^T^C^TGATCCGGC^A^(CVA^C^CC^C^lO(^C^^r^(^(^7^,A(^(^(^<^7^C^(^TTT 5160

TTTTGTTTG(AVG;CAG;CAGAr[^,TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAA(GA\GATCCTrTGAT 5220

CTTT^,rCTACGGGGr^,CTGACGCTCAGTGlAACGAAAACTCACGTTAAGGGATT^ΓrTGGTCAT 5280 (lAGATTATGAAAAkGGATCTTCACCTAGATCCTTrrAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATC 5340

AATCrAAAGTATATATGAGTAAACr’^ΓrGGTCTGACAlTrACCAArGCTTAATCAGTGAGGC 13400

ACCTArCTCAGCGArCTGTCrATrrCGTrCArCCArAGrTGCCrGACTCCCCGTCGTGTA 5400 lATAACTACGATACGG<GAlGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAArGATACCGCGAlA 5520

CCCACGCTCACCGGCTCCAlArrTAT(AGCAATTAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG 5500

CAGAAGTGGTCCTGGACTTTATCCGCCrCCArCCAGTCrATTAATTGTTGCCGGGAAGC 5600

TAGAGrAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTrTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCAT 5700

CGTGGrGTCACGCTCGTCGTrrGGrArGGCrTCArrCAGCTCCGGTTCCCAACGArCAAG 5600

GCGAGTTACAT&ATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGGTAGGCCCTTCGGTCCTCCGAT 5820

CGTrGTCAlAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACrCATGGrTArGGCAGCACTGCArAA 5800

TTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAlATGCTTrTCTGTlALCTGGTGAGTACTCAACCAA 5400

GTCArrCTGAGAATAGrGTArGCGGCGACCGAGTTGCTCrrGCCCGGCGrGAATACGGGA 0000

TAATACCGCGCCACATAGCAGAΆCTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCrrCGGG 0000

GCGAAAA::TCTιCAGGATCTTACCGCTGTrGA(GArCCAGTTCGATGTAACCCACTCiTGC 6200

ACCCAACTGArCTTCAGCATCrτrTACTTT ACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGG 1800

AAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGG<GAATrM^GGGCdCACGlAAATTGTϋAAΓACTCATACT 2200

CTTCCTr^,rTTCAAr[ATTAT^,Γ(AAG;CArTTATC:AGGGTTATrGTCTCAr^,GAGCGGArACAT 6000

ATTr'GAATGTATTTAlAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATrTCCCCGAAAAGT 36 00

GCCACCT 6367

182 665

Tablica 2

Sekwencja DNA kodowanej fuzyjnej cząsteczki Y124D-IgGl w wektorze COSFcLink, 6926 par zasad

SEKW. NR ID. 2

GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGATCGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG 60

TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTT 12 0

ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATG 1B0

ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT 240

TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT 300

ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360

GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG 420

TTTTGGCAlGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGTTTCCAAGTCTC 4B0

CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCA.CCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540

TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600

TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660

TTACCTGCAGATGGGCTGCAGGAATTCCGCATTGCAGAGATTAATGTATTTAAGTGCCTA 720

GCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTAC 780

CTGCCATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCG 840

GCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGA&ATCATCAAAACTTTGA 90 0

ACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGT.AACAGACAACTTTGCTG 960

CCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGT 1020

TCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACA 1080

GGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGG 1140

GCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAiGCAAkGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAA 1^00

GGCTAAAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAAT 1260

CGGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT 1320

CAGTCTTCCTCTTCCCCCAAAACCCCAAYGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG 138 0

TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG 144 0

182 665

TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC.AG'^.ACAAC.AGCA 15 O O

CGTACCGAGTGGTCAGCGTAATAAACGTACTGCAACAAGACTGGCTGAATGACAAGGAGT 1560

ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACGATCTCCAAAG 162 0

CCAAAGGGCAGCCCCGAOAVCCACCAGGTGTA(CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA 1680

CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG 17 4 0

TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGTAACAACTACCAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG 18 0 0

ACTCCGACGGCTCCI^I^C^T^^(^(T^(^^r^J^<A^(^(^AA^C^(T^r^(^A^<^(^(j:^(^(A^(AA^^GA^GCA^GGTGGCAGC 1860

AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA 1920

AGAGCCTCTCCCTGTC^I^CC^G^GGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA 1980

CTGTGCCTTCTA^GTTGCCAGCC^^CTC^TGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCC 2040

TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC 2100

TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT 2160

GGG,AA(G^(CA^^^i^<^(C^(^l3(^C^(^(^(^^^(^(^(^(G^A^C^<C(^(^T^(^(^(^(C^r^(^^r^^TGGAA(^<C^(^<^TGGG(^<CTC 2220

GAGGGGG(GTCTCCC<GTCCCCCAGCCTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAA 22 8 0

AAAAGG_JAAA^T^'^_JA^TTTTAACACC.A^T^TCAGTAGTTGATTGAGCAA^TGCGTTGCCAAAA 2 3 4 0

AGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAiGT 2400

ACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGC^GTGAGTGGC.ACAGIC^TTCTAGGG^(GAAT^T^(^C^(^TT 2460

GTCATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACAC 2520

AGGATAGAGAGGG AAGGAGCCAGGGAAAAAGAAAA7A\GGTGAGGAAGAAACAGTTGC'ΓCc 2580

TCACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCT 2640

GCGATTTCGCGCCAAACTTGACGGtCAArCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGAATTTATCCCC 2700

GCTGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATT 2760

GGCAA(GA^(^i^(G^C^;^C^C^T^T^C^(^(^^^(^<GC^(^^^^iCGCTCAGGAACG^(^TTGA^<^^^^C^TTCCAAAGA 2820

ATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACC 2880

TGGTTCT^C^C^A^T^l^C^C^^^CA^G^A^GAATCGACCTTTAAAGGACAGyA^T^^rTA^T^T^T^T^C^T^'rCTCAGT 2940

AGAGAACTCAAAGJAACACCACCGAGAAGCTAATTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCC 3000

TTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGA 3060

GGAAGTTATGTTTAACAGGAAGC ATGCAATCCAAC(AAGGCCACCTTAGAACCTTTGTGAAA 3120

182 665

GCCATCATCCACCCGTCTCCCGCCCATATG3TTCCTTCGCCCGTTCGTTTCCCCCCACGT 3800

AGACCCTTCCCAGCG3ΓACCCGTGGCGGCCTCTCTCAGGTCCAGGAGCGGGGGCCTACTGGC 320 0

TGTAACCGTCGA.CTCTACCGCCGCGGACGTCGACAGGTCGCCGCTCTCTCCGGTCGTCCTC 3000

TTTCCTTTCGACTCGCCTGTCGGGAG/GCG,.TTACCTCGCTCCCGATGCCCCCACCCTGCT 3300

CCGTGGCCCCCGTGcGG^Γ3GGACTGGCGCTATCACTGAGTTCACTGACΓ3GGCGCAC'CCTTTTT :340 0

GTTCTGCCTCGGCCCCGGCTGGCTTGAAGCTGCTCGCCCGCTTTGCTGCCCTCCCGCTGA 38 00

TCGTGCACCGCTTGTGGCCCGCCTTGGCTGTTCC(cGTGCTGTTCGTTTTTCCTCGTCCGC 3400

CCGCGGCTTGCCCCCTTCCTGACCCGCCTCCCCCACTACT3CGCTTCTCTCCGTGGGCCGG :6000

CTGGTCCACAGGCGGGGCTACATGCACCACGACTCCTCGCCCAATGACCCCGCGACGCGA 3600

CCTTCCGCCAACCACACCCGTGCATCCTCCCGCCCCGGTTGGGCACCGTTGGGGTCGCGA 3700

GCGTGCGGCATGCTTCG3TAT<AGGCCGTTTTA<A3TGGCAGGTTTA.CGCATGCGCGGCGCA 3700

GGCTTAACCGCGCCTCTTTTCGCGACCTTACCCACCGACCTCGTGCGCCGCCACTCCCTT 3800

GCTAGCGTACCGGCTCCC3TTCCCGGTCGG3TTA<CGGCGCCAGTTCCTACGTTCGCTTCC 3000

GGTGGTGGAGGGTTTGCCACGCTGGAAATCTTCTTTAACCACAAGGCGGCCTTCCCCCCG 3600

GTCGATGCCCCT<GCCTGGGGCTGTACTA<CCGCTCGTCCTCATGCCCATCCTGCCCTGT 4200

GCATGCGCCGGTGCGTGACTGCGTTGGGCCGCTAC7G\CCCACACACCTATGGTCAC'3CCG ^800

CTTTTGGTGGCGC3GCTTGCGGATGCCCGTTCCGGGCGGCGCAGCATCCTTGGCACCCCCC 4400

CTTCCTGCCGCTCCTCCCCGCTATCCGCGC(GGGΓGGGCGGCGATCCCCΓTC<cGC3CTCTTC 40 00

CCGCTAGCCTTAAAATTGGC;TGCAGCGG.GGAATCTTGTACGAAGTTGCGCATATCCAAGT 4200

CCGTGCGCCACCGACTCCCCACCGCTTCTCGGCCGGCCCCCAGCCCGG7CGGGTTTTCCA 4300

GCGCGATGCTAGCCCCGCGTGCTG3CGCGCTTCACGACTCGTGGACCCCGTTCTGCCAGCT 4300

CTTAGACTCGCTCCATTGGCCTTTTTGAGCCGCCCTTTCTATTGTCCTCCCGACACTCTA 4440

CGCCTTCACCCCCCTTTCCTTCTCCTGCCGGCGCCCGCGATTGCCTACTTACCTGCCCCC 4000

TCGACCGCCCCCCCGGTCGCCTCCACCCACCCCTCCCACCCCTCCACCTACCCCTCCCGT 4 500

CGCCCCTCTCCATTCG3TT(ACGCCTACCTCCCCTACGTCCTTCTTGGCTGCCCGCTTCCC 4620

CCACTCCTTGTGTCCCCCCCTCCATCAACCCACATC<AGTGCGTGCTATACTCTCCTTCCT 4 68 0

CCCCCGCTTCCCCCGCCCCTTATGTTTCGGTCCGTATGTATCTTATACGGGCGGTCTTTC 4790

ACTTCCCTCGTTTTCGGACTCCCCTCCGGCTACCCTACTAGCTCTTCTTCCTCCCGGATC 4000

182 665

GTTATTCGCCTATAACTCCAGATAATACATGAGTCCCAACCACAAAGCCTAAAGCTTCGG 4 860

GTCTTTAATGAGTGAGA<GACCT(ACACTTAATTGCGTTGAGCTACCTGACCGATTTTTACT 492 o

CGGGAGCTTGTTGTGTCAGTCGCATTAATGAATCCGTTAATCTGTGGGGAGAGGCGGTT 49 8 o

TGTGTAGGGGGGGGTGCCTGGTTGGGTTGGTGAGTGATTTGGTGGGGCGGGCTGGTTGGG 5040

TGCGGGGAGTGGTATTAGTTTATGGAAAGGAGGCAACAGGGTTATTTAGAGAATGAGGGG 5100

ATAATGCAGCAAAGAACACGCGAGCAAAAGGCCACCAAAAGGCTAGGAACAGTAAAAAGG 5160

CTGCGTTGCTGGGGTCCCTCCATAGGTTCCGCCCCCCTGACGAGAATTACAAAAATTGAC 5220

GTCTAAGTCACAGGTCGCGAAACCCGAGAGGACTATAACGGAGCAGCCGGTTAATTTTG 52 8 o

GAAGCTCCTTTGCGACCTTCTTCGCTTTGATCCTCTTCCCTACTGGATAGATCTCCGTTT 5340

TTTTAAATTCGGGAAGCGCGGCGCTTTCTCAATGTTAATGCTGCAGGTATCCTAGCTTGG 5400

TGCAGGTTGCCTCCTCCAAGTTCGGCCGCGTCCACGAACCTTTCGTCCAGCTCGATTCTT 5460

GTCTTTTATTTGGTAATCACTGCCCTCAGTCCAATTCGCTAACACACCACTTATTGTTAC 5520

TGCTAGAAGTCACTGGTAATACGATTAGTAGACTCACGTATGTAGGCGGTGCTATACACT 5580

TACCGAAGTGGTCCCTTAACTACGGCCACACTAGAACGACTCGTACTTGGTATCTGCGCTA 5640

TGCTGAAGACAGTTACCTTTGGAAGAAGAGTTGGTAGArCTTGATCCGGAAAAACAACCA 5700

TCCTTGGTAGTGCTGCCTCTTCTGTTCTCAAGCAGCAGCATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT 5760

TTTAAGAAGATCCTCCCACCTTTTCTACGGGGTCCGACGCTTAGCCGAATGAAAATCCAT 5 8 2 0

GTCAAGGGATCTCGGCCACGACATTACTAAAAAGGAGCCTCAkCCTAGGCCCTTTTAAATT 5880

AAAAAGGAAGGGCCAAATCAAGTTAAAGGATATACGACGAGGCGGGGGCGGACAGGTACT 5940

AACGCTTAATTACTGACGCACCGAGCGTAGCGAGCGGGCGAGTGCGGG AAGTTATAGTCG 6000

TCCGACTCTCTGCTGCCTAGATAATTATGATATGCGACGGCOGACCAGCGGGCTTTAGTG 0060 ctcaaatgatatcctcagatttacgctcattggtctgagattcactaccaataaatcacc 6120

AAGTTGGAGGGGCCGAGCCCACAACGTCGCTCGCAACCTTACCCcGCCCCATCCAGTCTA 6100

TTAATTGTTGCCCGGAAGTCAGAGTAAGGAGGTCCTCAGGGAAGAGGGGGCGAAACGTTG 6200

TTCTCATTCCTATAGCCAGCGGGGGGGTACGCGCGGCGGGGGGGAGGGCGGCAGCCAGTT 6000

CCGGTTCCCAACCACCAACGCGAGGGACAGGAGTCCCTAGCGCGTGCAAAAAAGCGGGGA 6600

GATTCTTCGGCTCTCCCACCGTTGGCAGAAGTAACTCGGCTGAAGGGGTAGTACTTATGG 6400

TTACGGCAGTACTGCATTACrTCTCTTATTGTTATGTTATCCGTTACGCGCTTTTTTGTGA 68 00

182 665

CTGGTGAGTACTCCCCCCAGTCATTCTGAGAAT.CGTGTCTGCGGCGACCGAGTTGC'ΓCTT 6 5 510

GCCCGGCGTCCATCCGGGC^CCTACCGCGCCCCCTAGCCGACTΐτCCACCG'ΐGCTCC,^!CA 6600

TTGGCCCACGTTCΊ^,TCGGGGCGACACCTCTC.CAG(GCΓCTTACCGCTGTTGCGCTCCAGTT 6660

CGATGTAACCCACTCGTGGCCCCcCCCTGATCTTCAGCACCΊTTTACTTTCACCAGCGTTT 67 2 Ο

CTGGGTGAGCCAAACCAGGCAGGCACACTGCCGCACACACGGGCCTACGG-GCGCCACGGC 67 8 Ο

AATGTTGACTCCTCCTCCTCTTCCTTTTTCCC.TCTTCTTGCCGCATTTATCAGGGTTCTT 6840

GTCTCATGCGCGGATCCCTATTTGCCTGTCTTTAGCCCCATCCACCCCTCGGGGTTCCGC 6900

GCACATTTCCCCGCACAGTGCCCCCT 6^9^^

Tablica 3

Sekwencja DNA regionu kodującego fuzyjnej cząsteczki IL.4.Y144D/ΊgGi1, 1164 par zasad

SEKW. NR ID. 3

CTGGGTCTCACCTCCCACCTGCTTCCCC:CTCTGTΊ^,CTTCCTGCTAGCCTGTGCCGGCACC 60

TTTGTCCCCGGACCCCALGTGCGATCT’CCCCTTACAGGAGCTCCTCCCCCCTTTGCACAGC 120

CTCACAGCGCCGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGT;CCCAGACACCTTTGCTGCCTCC 180

CAGCACCCCCCTGCGCAG(GCCCCCTTCTGĆAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCCGTTCTCC 240

CGCCCCCATGCGAAGGACCCTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCCGTTCCACAGGCAC 3 0 0

CCGCAGCTGATCCGATTCCTGCCC.CGGCTCGACAGGCACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 360

AATTCCTGTCCTGTGCAG;GAAGCCCACCAGAGTACGTTGGCACCCTTCTTGGCCAGC,CTC 420

AAGACGATCATGAGAGAGC.CCGACTCCCCGTGTTCGCGCGGTACCGAGCCCCcCCTCGGCC 480

GACCCCACTCCCACATGCCCCCCGTGCCCAGCACCTGACCTCCTGGGGGGCCCGTCCGTC 540

TTCCTCΊ^,TCCCCC(ACCCC;CCCAG;GACC.CCCTCATGATCTCCCGGCCCCCTGCGGTCACA 600

TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCCCGCCGACCCTGAGGTCAAGTTCACCTGGTACGTGGAC 660

GGCGTGGAGGTGCATCATGCCCCGCLCCCCGCCGCGGGAGGCGCAGTACAACAGCACGTAC 720

CGGGTGGTCCGCGTCCTCC.CCGTCCTGCACCAGGCCTGGCTGCATGGCACGGCGTCCACG 7 80

TGCCCGGTCTCCACCCCAGCCCTCCCAGCCCCCCTCGAGCCCACCATCTCCCCCGCCACC 840

GGGCAGCCCCGAGACCCACAGGTGTACCCCCTGCCCCCATCCCGGGCTGAGCTGACCACG 900

182 665

AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 960

TGGGAGAGCAATGGGCCkGCCGCGAGACCACCACCAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 102 0 ^CGG(^TCCTTC^l^I^(^(^^r^C^'^J^iA^C^<AA^^C^^,^(A^(^<^(^^,^(^(A^<AA^^^CA^GGl^GGCA^GCAGGGG :100 0

AATGVCVVCTTATGCTCCGE(AVΓGCCTGAGGGTCRGCCCCCC\CGACTATACGCAGAAGAGT 144 0

TVTTTTCTGVTTTCGGGTCCATGA 1164

Tablica 4

Sekwencja zakodowanego białka fuzyjnego (^.Y^D-ZIgGl, 387 aminokwasów

SEKW. NR ID. 4

1	MILGS2LLPP	LFELLACAGN	1VHΙGEQTWIT	IlEIKTENNS	LTE2KTLCTE
51	LTVTDIEAAC	IRNTEKREFC	lAA^T^DL^I^L^l^Y	SHHEKDGRCL	GAGA2QFHRH
101	KQLIRFFLRL			εΤΒΕΝΙΓΒΕΚΙ;	KKUREKDSK
151	CCSSGTEPSA	DlRTHrCPCP	AP? ELLGGP SV	FLFPKKKKDG	u^ii^^:pe^
201	CCWDySSEE	PEDKinWYD)	<:VEDEGCGQVΓK	PREE2OISGY	RWSSDLTTDLH
251	QLWWJGGQEK	ΟΙΚ/εΝΙΚ^Α	PIEKTISKAR	^^^REPLDYT	LPPSLWELTQ
301	NQLSSTTCLV	GFYPSDIADE	WEESł^^LP^E^N	YK^^TPPDLDS	DGGFFLYSKL
351	TVDKQRWQLL	W/FSCS/HE		LSLPGGK*

Tablica 5

Sekwencja DNA syntetycznego cDNA IgG4, 1006 par zasad

SEKW. NR ID. 5

GTTTTGACTCCGGGCC(CCTTTGTCTTTCCCCTGGCGCTTTGTTTCAGGCGCATCTTTGAG 60

AGGACAGCTGCCCEGGGCRGCTEGGVTCAGGACEAGGTCCTTGAACCGGRGAGGGRGTTG 120

TGGCACTTAGGCGCCCT<GACCTCGCGGCGGGGGCCAGGTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 1B0

G<GGCGTEATTTTCTGCGTAGTGTGGVGACCGTGTTTTTGAGTAGCVVGGGGATGAAGATT 240

TAGATTVGCGCTGTAGATTATAAGCTTAGTCATATGCAGGTGGATcWGGGAGTTGAGTTC 300

182 665

AAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTC 360

TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420

TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT 4 8 0

GGCGTCCAGGTCCATAATGC<AACA(AAA.CCCGCCCCACGAGCAGTTCAACAGCACGTAC 540

CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600

TGCAAGGTCTCCAA^CAAAGGCCTCC^C^G^T^C^^T^C^CA^l^C^G^GAA^CCATCTCCAAAGCCAAA 660

GGCCACCCCCCACACCCACAGCTCTACACCCTGCCCCCΆlCCCA.GGACCAGAlGACCAAC 120

AACCAGG'lCAGCC^rlGtACCΊGCC'lGGTCAAAGCCTlCl'ACCcCAGCGAC-ATCCCCCTGGlAC 180 lCCCAGACCAAΊCCCCAGCCCGAGAACAACΊACCAAGACCACCCC^'CCCGΐGC^CCACΊCC 840

GACGGATCCTlCTTCTTlAAACGACCCTAAACGlGGAAA.AYGACCAGGTGGCAGCACGCC 900

AATCTCTTCTCATGCTCCGCAACCAACAAGGCTCTGCACAA\CCACTACACACAGAACACC 960

CTCTCCCTGTCTCTGGG^ΓAAATCAGTGlΆClCTAGAlCTACGlATG 10 0 6

Tablica 6

Sekwencja DNA regionu kodującego fuzyjnej cząsteczki ILA.yl24D/IgC4, 1149 par zasad

SEKW. NR ID. 6

ATGCGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTClTCT^I.ΓCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 60 lTTGTCCACGGACACAACTGCCATATCACCTTACAGCAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 22 0

CTCACAGACCACAACACTCTCTGCACCGAGTlCACCCTAA(CA3ACATCTTTGClGCCTCC 100

AAGAACACAAClGAGAAG(CAAACCTΊ^,CTCCAGCGCTGCGACTGT(CCTCCCCCAGTTCTAC 40 0

AGCCACCATGAGAACGACACTCGCTCCCl^,CCCTCCCAClCCACAGCAGTlCCACAGCCAC 000

AAGCAGCTGATCCGATTCCTCAAACGCCTC(A^CAGCAACCTCTGGCGCCTCCCCCCCTTG 300

AATTCCTGTCCTGTGAACCCAA\GCCAACCACAGlACGTTCGAAAACTTCTTCCAAACGC'lA 200

AAGACCATCATGAGACAGAAACACTCAAACTGClCGAGCCAGTCC.AAAΓATGGTCCCCCA 800 lCCCCATCATGCCCAGCACClGAATTTCTCCCCGGACGAΓCCACL^,CTTCCTCTTCCCCCCA 40 0

AAACCCAAGGACACTCTCATCAlCTCCCGCACCCCΊ^,CACCTCACClCCCTGGlGGlCCAC 000

CTGACCCACCAAGACCCCCACCTCCAGT1CAAC1GGTACCTGCA1CCCC1CCAGG1GCA1 600

182 665

AGCTCCGACATGGATTTTCTG(CGG(τGGCAGTT<AGCAGGCTCCGTACCGTGTTTTTGTTTCT 720

CATGTCCCTCCGTATTACCGTCCCTTCCGTCCTAGCCGCCGCAGCTCTAGCGTTCTTGGT 7 BO

GGGTCCTCTTTCTTACTTGTCTG₁.CAAAGTTGCTGCTGAGTTCGGGTCTCGCTTTTTGTGC 840

TCGTGCCCTCATGTTTCTTTTTCGCCCTATCGTTGTGCCGTCCGTGATTGTTTTATTTTT 9000

GCTCCTTCTTTTGGGTTTCCTTGTCC<GGCTGTGTCGCCGTGTGCGTTCACGCTAGCTTT 960

GGTTTCCGT.GCGGGCGACTGCGACTACGCCTCCCGGGCTGGACGCCGACG(CG’CCGTCTCT 102 0

CTTCGTA.TTGCCTCGATTTTTTGTGGCGTTGTTGCTTAGGAGGGGCA.CGTCTTCGTGCTT ΙΟΒΟ

TTTTCTGCTTGTTGTTTCTCTCGTAGTCGTCGTGACTAG7CCGAGCTTCTCCCTGTTTTTT 1140

CCCGAGCGC 1149

Tablica 7

Sekwencja kodowanego białka fuzyjnego IL4.Y118D-/IgC4, 382 aminokwasów

SEKW. NR ID. 7

1	MGLGSQLLPP	^FIIACA-CN	FVHTHKCDIT	LQEIIKT’LNS	ITEQK3ITCE
51	LTVGDIFAAS	K^t^TJEK^TFC	RGCAVLRQEΎ	SEME^TRCI	CM^OFHRH
101	KQLIRFLKRL	DRNLWGLACL	NSTPVKECNQ	STIENFIERI	KTIMREKDSK
151	CSSESKYCPP	CPSCPAPEFL	gg]^^^:lfpp	KPKDTLMISR	CPEVATVVVD
201	VSQEDPEVQF	NWYVXCZEVH	NAKGKPREEQ	FNSTYRVVSV	LCVLHQDWIN
251	G^Y^K/SN	KGLPSSIEKT	ISIAKCQPRE	PQVYTLPPSQ	EEMTKNQVSL
301	CTLVKCFYPS	DIAVEWESNC	QPENNYKTTP	PVIDSDGSFF	IYSRLCVDKS
351	RWOEGIN/FSC	SVMHEjALHNH	YGQKSLSLSL	CK*

Tablica 8

Sekwencja DNA wariantu PE IgG4, 984 par zasad

SEKW. NR ID. 8

CTCGCTGTCCACGGCC(AGΓCCGTTTCTTTTTCGCTCTTTCCTCTTACCGCTATTCTTCGC 60

GCTGTgCTTCTTTCCCCTCCTTACCCTGACCGTCGTCCTTTTCCATTCCCCATCCCCCTC 12 0

182 665

TCAACATCAGGCGCCATGACCACAGGACTGAACAACTTACCGGATGTAATACAGTACTAA 180

CGAATATAACCCAGCAiGAAGCGTCGTCAACGTGCAATCCACCAGACTGCGAAAGAAGAAC 24 o

TAAACATGCGCIGGGAGAGCAAACIGGGCACCAATATTAACCCCGAIAAGAGAGTTGAGTIT 000

AAATATGGTTTTCTATGTTCAcCATGCTGAGGgGGTCCCaTTtgaGGGGGCATTATTAGTT 300

CCCATGTTCCCCCCAAAAlCCCGGGGACATTCTTATCATTCCTCGGATCTCCGAGGTCATG -220

CGAGTGGTGGTGGAAGTGAGCCACGAAGACCCAGACGTAAAGTTAAAACGCTAAGTGGAT 400

CGCATGGAGGTGCATAACGCCAAGAAAAAGACCAGGGACaAGCAGTTCAAAAGAAAGTAA 540

AGTGTGGTAAGCGTAATCCiAAGTAAGAAACAAGdAATGGATGCACaGCAACGACTAAAAG 600

CGCAAAGTATCCAAAAAAGGACTACCGCAaTGgATCdACAAACAACCCCCAAACAAAAA 660

GAGCAGCCCTGAGAGCCACAGGTGTACATTCTCTCTTTACCACCAGAGGAGATGATTAAG 720

AACAAGGTCAGCATGAAATGCCTGGTCGAAGGATTATAAAAAAGAGACATACCAGTGGAC 780

TGGGAGAGCGATGGGIAGACGGACCCGlAACTATAACCCACGCCACACCGTaACGGCCCCCC 80 0

AGTGAaTCCTTTTACTATTAGAAGAGCCCAACCTGCCACCCCGAGCAGGCGCCACCAGAGG 000

AATATCTTATAATGAAACGGGAGCCCCGGAGGATGTGCCCCCAACCATACAAAAACAAGAGA 960

CTCTCCCTGTCTCGGGCTAAACaA 984

Tablica 9

Sekwencja DNA regionu kodującego fuzyjnej cząsteczki IL6.Y124D/IgA4 PE, 1149 par zasad

SEKW. NR ID. 9

ATGGGTCTCATTTCCAAAT.TGCTCCCCTTCATCCCCGTCCTCATAGAATGTCCTCGTAAT 60

CTTGTAACCAGGACACAAGTGAGACACCACATTAAAGGACATAACCAAAACCCTCAAAAGA 120

TTCACAAAGCAGAAGAGTGGGCGCACTGAGGGGAGGGTCCCACACGACGGGGGGGGTTGCC 180 aagaaaaaaactgagaaggcaaggcggacgaacggcggcgactgggcgacggcagggatac 240

AGCCAACATaAGAAGGAAAATAGATGAATCCGTGACAACCCACAGCACTTCAAAACGAAA 300

AAGCAGATGACCCGACCCCTGGCACGGCTAGAAAGCAAAATATCGGGACTGGACGGATTG 360

AATTCTTGGCAGGTGCCGC(AAGCdAA1AGACTAACCCCaAAAAGGCATTGCAAACGAGA 420

AAGAAGATCATGAGAGAGAAAAGAGTAAGGGCAGACAGAGAGGAACW\GAGGGG AAAAAA 4 80

182 665

TGCCCACCΆTGCCCAGCgCCTGAATTTGAGGGGG¢GA:CACCAGGCTTCCTG^,ΓTCCCCCCA 540

ACACCCACG(GACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600

GTGCGCCAGGACGACCCCGAGGTCCAGTTCACCTGGTCCGTG(GCTGGCGTGGAGGTGCAT 660

AATGCCACGCC.CCCGCCGCGGGAGGAGCAGTT(CCCCAGGACGTACCGTGTGGTCCGCGTC 720

CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGACCGGCACGGAGTACAAGTG<CCAGGTCTCCACC 780

CCAGGCCTCCCGTCaTC<CVΓG(CGrCCCACCATCTCCCAAGCCCAAGGGCCGCCCCGAGAG 840

CCACCGGTGTACCCCCTGCCCCCATCCCAGGCGGAGATGACCCAGACCCAGGTCAGCCTG 90 0

ACCTGCCTGGTCCCAGGCTTCTACCCCAGCGCCCT’CGCCGTGGAGTGGGCGAGCAATGGG 960

CCGCCGCGCGACAACCAACACACCACCGCTTCCGGGGTTGACCCCCACCGGTTCTTCTTC 102 0

CTCTCCCGCAGGCTAACCGTGGACCAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGGCC^,TGCTTCTCATGC 10 8 0

TCCGTGATGCCTGAGGCTCTGCCCCACCACTACAGACACGACACGCCCTCCCTGTCTCTG 1140

GGTACCTGA 1149

Tablica 10

Sekwencja kodowanego wariantu PE białka fuzyjnego IL1.Y124D/IgG4, 382 aminok wasy

SEKW. NR ID. 10

MGI^T^^iSU^^UPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE

LTWDIFAAS KNTTEKETFC RA^^^RQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH

101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK

151 CSSESKYGPP CPPCPAPEFE GGPSVF1FPP KPKDTL4ISR TPEVTCVWD

201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN

251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL

301 TCLVKG^PS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS

351 RWQEGINVSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK*

182 665

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Rozpuszczalne białko mające aktywność antagonistycznąlub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub ILI 3, znamienne tym, że ma sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10.
2. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego białka mającego aktywność antagonistycznąlub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub IL13, znamienny tym, że poddaje się ekspresji polimer DNA kodujący sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW nR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 1θ w rekombinacyjnej komórce gospodarza i odzyskuje się produkt, przy czym korzystnie (i) wytwarza się replikujący wektor ekspresji zdolny w komórce gospodarza do ekspresji tego polimeru DNA; (ii) transformuje się komórkę gospodarza tym wektorem; (iii) hoduje się transformowane komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję polimeru DNA z wytworzeniem białka; i (iv) odzyskuje się białko.
3. Polimer DNA, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub sEkW. NR ID. 10.
4. Polimer DNA według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje lub składa się z sekwencji nukleotydowej SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9.
5. Replikujący wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. nR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10, przy czym korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW. NR ID. 9.
6. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana replikującym wektorem, który obejmuje sekwencję nukleotydowąkodującąsekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW. NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10, przy czym korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową SEKW. NR ID. 3, SEKW. NR ID. 6 lub SEKW NR iD. 9.
7. Środek framaceutyczny zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do leczenia stanów wynikających z niepożądanego działania IL4 i/lub IL13, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera rozpuszczalne białko mające aktywność antagonistycznąlub częściową aktywność antagonistyczną wobec IL4 i/lub ILU , które ma sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW NR ID. 4, SEKW. NR ID. 7 lub SEKW. NR ID. 10.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są substancje antagonistyczne ludzkiej interleukiny 4 (IL4) i/lub ludzkiej interleukiny 13 (IL13) do leczenia stanów wynikających z niepożądanego działania IL4 i/lub IL13 takich jak pewne mediowane IgE alergiczne choroby, mediowane komórkami T autoalergiczne stany i niewłaściwe odpowiedzi immunologiczne na czynniki infekcyjne.

Interleukiny są wydalanymi peptydowymi mediatorami odpowiedzi immunologicznej. Każda ze znanych interleukin wywiera wiele wpływów na rozwój, aktywację, rozmrażanie i różnicowanie komórek układu odpornościowego. lL4 odgrywa fizjologiczną rolę w takich funk182 665 cjach, lecz może także dawać wkład do patogenezy choroby. W szczególności IL4 jest związana ze ścieżką rozwoju limfocytu B prowadzącą do generowania przeciwciał IgE będących oznaką alergicznych chorób takich jak zewnętrzna astma, katar nosa, alergiczne zapalenie spojówek, nielokalne zapalenie skóry i anafilaksja. IL4 może także działać jako ogólny czynnik wzrostu i różnicowania limfocytów T mogący przyczyniać się do uszkodzenia tkanki w pewnych autoalergicznych stanach takich jak insulinozależna cukrzyca, stwardnienie rozsiane i reumatyczne zapalenie stawów i w odrzucaniu przeszczepów. IL4 może także tłumić wytwarzanie mediowanych przez komórkę odpowiedzi koniecznym przy zwalczaniu choroby zakaźnej. Antagonizm wpływu IL4 na limfocyty T lub B może więc mieć możliwy korzystny wpływ na takie choroby. ILI 3 zidentyfikowano ostatnio i jest ona podobna w wielu biologicznych właściwościach do IL4 (Minty, A. i in. (1993), Nature 362,248-250) w tym pewnych aspektach struktury/działania receptorów (Aversa, G. i in. (1993), J. Exp. Med. 178, 2213-2218).

Ludzka IL4 składa się z poj edynczego łańcucha polipeptydowego o 129 aminokwasach z 2 możliwymi miejscami N-glikozylacji i 6 cysternami z 3 mostkami dwusiarczkowymi (Le, H. V. i in., (1988), J. Biol. Chem. 263, 10817-10823).

Sekwencja aminokwasowa IL4 i pozycje tych mostków dwusiarczkowych są znane (Carr, C. i in., (1991) Biochemistry 30, 1515-1523).

HIS-LYS-CYS-ASP-ILE-THR-LEU-GLN-GLU-ILE-ILE-LYS-THR-LEU-ASN 20 30

SER-LEU-THR-GLU-GLN-LYS-THR-LEU-CYS-THR-GLU-LEU-THR-VAL-THR

ASP-ILE-PHE-ALA-ALA-SER-LYS-ASN-THR-THR-GLU-LYS-GLU-THR-PHE 50 66

CYS-ARG-ALA-ALA-THR-VAL-LEU-ARG-GLN-PHE-TYR-SER-HIS-HIS-GLU

LYS-ASP-THR-ARG-CYS-LEU-GLY-ALA-THR-ALA-GLN-GLN-PHE-HIS-ARG 80 90

HIS-LYS-GLN-LEU-ILE-ARG-PHE-LEU-LYS-ARG-LEU-ASP-ARG-ASN-LEU100

TRP-GLY-LEU-ALA-GLY-LEU-ASN-SER-CYS-PRO-VAL-LYS-GLU-ALA-ASN 110 120

GLN-SER-THR-LEU-GLU-ASN-PHE-LEU-GLU-ARG-LEU-LYS-THR-ILE-MET

129

ARG-GLU-LYS-TYR-SER-LYS-CYS-SER-SER-SER

Mostki dwusiarczkowe znajdują się pomiędzy resztami 3 i 127, 24 i 65, i 46 i 99. Masa cząsteczkowa IL4 waha się z wielkościąglikozylacji od 15 kDA (bez glikozylacji) do 60 kDa lub więcej (hiperglikozylacja IL4).

Sekwencję dNa ludzkiej IL4 opisał też Yokota, T. i in., P. N. A. S., 1986 83 5894-5898.

Publikacja WO 93/10235 opisuje pewne mutanty IL4 będące substancjami antagonistycznymi IL4 lub częściowymi substancjami antagonistycznymi. Mutanty lL4 ujawnione w tym opisie w porównaniu z IL4 występuj ącym naturalnie są zastąpione na dowolnej z pozycj i od 120 do 128 włącznie innym naturalnym aminokwasem. Podstawienia w pozycjach 124, 121 i 125 są poparte przykładami.

Z publikacji Embo Journal, vol. 12, no. 7, lipiec 1993, str. 2663-2670 znany jest mutant ludzkiej interleukiny (hIL-4), który jest zarówno antagonistą hIL-4, jak i hIL-13.

Europejski opis patentowy EP-A-0464533 ujawnia białka fuzyjne zawierające różne części stałego regionu cząsteczek immunoglobuliny wraz z innym ludzkim białkiem lub jego częścią.

Niniejszy wynalazek ujawnia rozpuszczalne białko mające aktywność antagonistyczną lub częściową aktywność antagonistyczną IL4 i/lub IL3, obejmujące mutant lub wariant IL4 złączony z co najmniej jedną stałą domeną ludzkiej immunoglobuliny lub jej fragmentem.

182 665

ISTOTA WYNALAZKU