CZ25697A3 - Novel compounds - Google Patents

Description

Tento vynález se týká antagonistů lidského interleukinu 4 (IL4) a/nebo lidského interleukinu 13 (IL13) pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucího účinku IL4 a/nebo IL13, stejně jako určitých alergických chorob zprostředkovaných IgE, autoimunitních stavů zprostředkovaných T buňkami a nepřiměřené imunitní odezvy na infekční přípravky.

Dosavadní stav techniky

Interleukiny jsou vylučovány jako peptidové mediátory imunitní odezvy. Každý ze známých interleukinů má řadu účinků na vývoj, aktivaci, proliferaci a diferenciaci buněk imunitního systému. IL4 má fyziologickou úlohu v takových funkcích, ale může také přispívat k patogenezi choroby. IL4 je obzvláště spojen s cestou B vývoje lymfocytu, která vede k vytváření IgE protilátek, které jsou charakteristickým znakem alergických chorob, jako je zevní astma, rinitida, alergická konjunktivitida, atopická dermatitida a anafylaxie. IL4 může také působit jako obecný růstový a diferenciační faktor pro T lymfocyty, které mohou přispívat k poškození tkáně za určitých autoimunitních stavů, jako je diabetes závislý na inzulínu, rozptýlená skleróza a reumatoidní artritida a odhojení štěpu. IL4 může také potlačovat vytváření odezvy zprostředkované buňkami, vyžadované pro potlačování infekční choroby. Proto se může očekávat antagonizmus účinku IL4 na T nebo B lymfocyty, který má příznivé účinky na takové choroby. Nedávno byl identifikován

IL13, který je podobný v mnoha biologických vlastnostech IL4 [A. Minty a kol., Nátuře, 362, 248-250 (1993)], včetně určitých aspektů struktury a/nebo funkce receptoru [G. Aversa a kol., J. Exp. Med., 178, 2213-2218 (1993)].

Lidský IL4 sestává z jediného polypeptidového řetězce ze 129 aminokyselin se 2 možnými N-glykosylačními místy a 6 cysteiny zahrnutými do 3 disulfidových můstků [Η. V. Le a kol., J. Biol. Chem., 263, 10817-10823 (1988)]. Aminokyselinová sekvence IL4 a umístění těchto disulfidových můstků je známo [C. Carr a kol., Biochemistry, 30., 1515-1523 (1991)].

HIS-LYS-CYS-ASP-ILE-TKR-LEU-GLN-GLU-ILE-ILE-LYS-THR-LEU-ASN20 30 SER-LEU-THR-GLU-GLN-LYS-THR-LEU-CYS-THR-GLU-LEU-THR-VAL-THR40

ASP-ILE-PHE-ALA-ALA-SER-LYS-ASN-THR-THR-GLU-LYS-GLU-THR-PHE50 S0

CYS-ARG-ALA-ALA-THR-VAL-LEU-ARG-GLN-PHE-TYR-SER-HIS-HIS-GLU70

LYS-ASP-THR-ARG-CYS-LEU-GLY-ALA-THR-ALA-GLN-GLN-PHE-HIS-ARG80 90 his-lys-gln-leu-ile-arg-phe-leu-lys-arg-leu-asp-arg-asn-leu100

TRP-GLY-LEU-ALA-GLY-LEU-ASN-SER-CYS-PRO-VAL-LYS-GLU-ALA-ASN110 120 GLN-SER-THR-LEU-GLU-ASN-PHE-LEU-GLU-ARG-LEU-LYS-THR-ILE-MET129

ARG-GLU-LYS-TYR-SER-LYS-CYS-SER-SER

Disulfidové můstky jsou mezi zbytky 3 a 127, 24 a 65 a dále 46 a 99. Molekulová hmotnost IL4 se mění podle rozsahu glykosylace od 15 kDa (neglykosylováno) do 60 kDa nebo více (hyperglykosylovaný IL4).

DNA sekvenci pro lidský IL4 také popsal T. Yokota a kol. v P. N. A. S., 83, 5894-5898 (1986).

W093/10235 popisuje určité mutanty IL4, které jsou IL4 antagonisty nebo částečnými antagonisty.

EP-A-0 464 533 uvádí fúzované proteiny, zahrnující různé části konstantní oblasti imunoglobulínových molekul dohromady s jiným lidským proteinem nebo jeho částí.

Podstata vynálezu

Tento vynález skýtá rozpustný protein, který má IL4 a/nebo IL13 antagonistickou nebo částečnou antagonistickou aktivitu, a který zahrnuje IL4 mutantu nebo variantu fúzovanou k alespoň jedné lidské imunoglobulínové konstantní doméně nebo jejímu fragmentu.

Výraz mutanta nebo varianta zahrnuje libovolnou molekulu, jako je komolý nebo jiný derivát IL4 proteinu, který si uchovává schopnost antagonizovat IL4 a/nebo IL13 po vnitřním podání člověkovi. Takové jiné deriváty se mohou připravit adicí, delecí, substitucí nebo přesmykem aminokyselin nebo jejich chemických modifikací.

DNA polymery, které kódují mutanty nebo varianty IL4, se mohou připravit obvyklými způsoby do místa zaměřenou mutagenezí cDNA, která kóduje pro IL4, jako popsal G. Winter a kol. v Nátuře 299, 756-758 (1982) nebo Zoller a Smith v Nucl. Acids Res.,10, 6487-6500 (1982), nebo deleční mutagenezí, jak popsal Chán a Smith v Nucl. Acids Res., 12, 2407-2419 (1984) nebo G. Winter a kol. v Biochem. Soc.

Trans., 12., 224-225 (1984), nebo reakcí polymerázového řetězce, jak popsal Mikaelian a Sergeant v Nucleic Acids Research, 20 . 376 (1992).

Pokud se zde používá výrazu má IL4 a/nebo IL13 antagonistickou nebo částečnou antagonistickou aktivitu, tento výraz znamená, že při testu popsaném Spitsem a kol. v J. Immunology, 139, 1142 (1987) se proliferace T buněk stimulovaná IL4 inhibuje způsobem závislým na dávce.

Vhodné IL4 mutanty jsou uvedeny ve WO93/10235, kde alespoň jedna aminokyselina, která se přirozeně vyskytuje v divokým typu IL4 v libovolné poloze 120 až 128 včetně, je nahrazena rozdílnou přirozenou aminokyselinou. Obzvláště tyrosin, přirozeně se vyskytující v poloze 124, může být nahrazen rozdílnou přirozenou aminokyselinou, jako je glycin nebo výhodněji kyselina asparagová.

Imunoglobulín může být z jakékoli podskupiny (IgG,

IgM, IgA, IgE), ale jde výhodně o IgG, jako je IgGl, IgG3 nebo IgG4. Tato konstantní doména nebo tyto konstantní domény nebo její fragment či jejich fragmenty mohou být odvozeny od těžkého nebo lehkého řetězce nebo od obou takových řetězců. Vynález zahrnuje mutace v imunoglobulinové složce, které eliminují nežádoucí vlastnosti přirozeně se vyskytujícího imunoglobulinu, jako je vázání Fc receptoru a/nebo zavedení požadovaných vlastností, jako je stabilita. Například S. Angal, D. J. King, M. W. Bodmer, A. Turner, A. D. G. Lawson, G. Robens, B. Pedley a R. Adair v Molecular Immunology, sv.

30, str. 105 až 108 (1993) popisují IgG4 molekulu, kde zbytek 241 (Kabatovo číslování) se změní ze šeřinu na prolin. Tato změna zvyšuje poloviční dobu existence IgG4 molekuly v seru. S. M. Canfield a S. L. Morrison v Journal of Experimental Medicine, sv. 173, str. 1483 až 1491, popisují změnu zbytku 248 (Kabatovo číslování) z leucinu na glutamát v IgG3 a z glutamátu na leucin v myším IgG2b. Substituce leucinu za glutamát v dříve jmenovaném případě snižuje afinitu imunoglobulínové molekuly týkající se Fct RI receptorů a substituce leucinu za glutamát v pozdějším případě zvyšuje afinitu.

EP 0 307 434 uvádí různé mutace včetně mutací L až E na zbytku 248 (Kabatovo číslování) v IgG.

Konstantní doména nebo domény nebo její či jejich fragment jsou výhodně celé nebo podstatné části konstantní oblasti těžkého řetězce lidského IgG, výhodněji IgG4.

Z jednoho hlediska IgG složka sestává z CH₂ nebo CHg domén a pantová oblast IgGl zahrnuje cysteinové zbytky přispívající k středně těžkému řetězci disulfidové vazby, například zbytky 11 a 14 IgGl pantové oblasti [B. Frangione a C. Milstein, Nátuře, sv. 216, str. 939 až 941 (1967)]. Výhodně IgGl složka sestává z aminokyselin odpovídajících zbytkům 1 až 4 a 6 až 15 pantu, 1 až 110 CH₂ a 1 až 107 CHg IgGl, které popsal J. Ellison, B. Berson a L. E. Hood v Nucleic Acids Research, sv. 110, str. 4071 až 4079 (1982). Zbytek 5 pantu je změněn z cysteinu v publikované IgGl sekvenci na alanin změnou TGT na GCC v nukleotidové sekvenci. Z jiného hlediska IgG složka je odvozena od IgG4, který zahrnuje CH₂ a CH₃ domény a pantovou oblast, zahrnující cysteinové zbytky přispívající k středně těžkému řetězci disulfidové vazby, například zbytky 8 a 11 IgG4 pantové oblasti [J. R. Piek a C. Milstein,

Nátuře, sv. 216, str. 941 až 942 (1967)]. Výhodně IgG4 složka sestává z aminokyselin odpovídajících zbytkům l až 12 pantu, až až 110 CH₂ a 1 až 107 CH₃ IgG4, jak popsal J. Ellison,

J. Buxbaum a L. Hood v DNA, sv. 1, str. 1 až 18 (1981).

V jednom příkladu vhodná mutace v IgG4, zbytek 10 pantu (zbytek 241, Kabatovo číslování), se mění ze šeřinu (S) v divokém typu na prolin (P) a zbytek 5 CH₂ (zbytek 248, Kabatovo číslování) se mění z leucinu (L) v divokém typu na glutamát (E).

Fúze IL4 mutanty nebo varianty k Ig konstantní doméně nebo fragmentu se dosahuje C-koncovou skupinou jedné složky k N-koncové skupině jiné složky. Výhodně IL4 mutanta nebo varianta je fúzována přes svou C-koncovou skupinu k N-koncové skupině Ig konstantní domény nebo fragmentu.

Z výhodného hlediska sekvence aminokyseliny fúzovaného proteinu podle tohoto vynálezu je představována SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 10.

Z dalšího hlediska tento vynález poskytuje sloučeninu podle tohoto vynálezu, kde způsob její přípravy zahrnuje exprimování DNA kódující tuto sloučeninu v rekombinantní hostitelově buňce a získání produktu.

DNA polymer zahrnující nukleotidovou sekvenci, který kóduje sloučeninu, také tvoří část tohoto vynálezu.

Při výhodném znaku DNA polymer zahrnuje dále uvedenou sekvenci nebo sestává ze sekvence SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 6 nebo SEQ ID č. 9.

Způsob podle tohoto vynálezu může zahrnovat obvyklý rekombinantní technický postup, jako popisuje Maniatis a kol. v Molecular Cloning - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor (1982) a DNA Cloning, sv. I, II a III (D. M. Glover, vyd.,

IRL Press Ltd).

Způsob může obzvláště zahrnovat stupně, které spočívají v tom, že

i) připraví se replikovatelný expresní vektor, který je schopen v hostitelově buňce exprimovat DNA polymer sestávající z nukleotidové sekvence, která kóduje tuto sloučeninu, ii) hostitelova buňka se transformuje tímto vektorem, iii) transformovaná hostitelova buňka se kultivuje za podmínek, které dovolují expresi tohoto DNA polymeru, k produkci uvedené sloučeniny a iv) získá se tato sloučenina.

Vynález také poskytuje způsob přípravy DNA polymeru kondenzací vhodných mono-, di- nebo oligomerních nukleotidových skupin.

Příprava se může provádět chemicky, enzymaticky nebo kombinací obou metod, in vitro nebo in vivo, jak je vhodné. Tak DNA polymer se může připravit enzymatickou ligací vhodných DNA fragmentů obvyklými způsoby, jako popsal D. M. Roberts a kol. v Biochemistry, 24, 5090-5098 (1985).

DNA fragmenty se mohou dostat štěpením DNA obsahující požadované sekvence nukleotidů vhodnými restrikčními enzymy, chemickou syntézou, enzymatickou polymerací na DNA nebo RNA maticích nebo kombinací těchto způsobů.

Štěpení s restrikčními enzymy se může provádět ve vhodném pufru za teploty od 20 do 70 °C, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně s 0,1 až 10 μg DNA.

Enzymatická polymerace DNA se může provádět in vitro za použití DNA polymerázy, jako je DNA polymeráza I (Kelenowův fragment) ve vhodném pufru, který obsahuje podle potřeby nukleosid trifosfáty dATP, dCTP, dGTP a dTTP, za teploty od 10 do 37 °C, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně.

Enzymatická ligace DNA fragmentů se může provádět za použití DNA ligázy, jako je T4 DNA ligáza, ve vhodném pufru za teploty od 4 °C do teploty místnosti, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně.

Chemická syntéza DNA polymeru nebo fragmentů se může provádět za použití chemických postupů běžných pro fosfotriestery, fosfity nebo fosforamidity, při využití technického postupu na tuhé fázi, jako je popsán v Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (vyd. H. G. Gassen a A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), nebo v jiných vědeckých publikacích, jako je například M. J. Gait, H. W. D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat a R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 10, 6243 (1982),

B. S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 24, 5771 (1983), M. D. Matteucci a Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 (1980), M. D. Matteucci a Μ. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 103. 3185 (1983),

S. P. Adams a kol., Journal of the American Chemical Society, 105, 661 (1983), N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus a H. Koester, Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984) a H. W. D. Matthes a kol., EMBO Journal, 3., 801 (1984). Výhodně se používá automatizovaný DNA syntetizér.

DNA polymer se výhodně připravuje ligací dvou nebo více DNA molekul, které dohromady zahrnují DNA sekvenci kódující sloučeninu. Zvláštní způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje ligaci první DNA molekuly, kódující uvedenou IL4 mutantu nebo variantu, a druhé DNA molekuly, kódující uvedenou imunoglobulínovou doménu nebo její fragment.

DNA molekuly se mohou získat štěpení vhodnými restrikčními enzymy vektorů, které nesou požadované kódující sekvence, nebo použitím reakční technologie založené na polymerázovém řetězci.

Přesná struktura DNA molekul a způsob, kterým se získají, závisí na struktuře požadovaného produktu. Návrh vhodné strategie pro konstrukci DNA molekuly kódující pro sloučeninu je běžnou věcí pro odborně vzdělaného pracovníka v oboru.

Exprimování DNA polymeru kódujícího sloučeninu v rekombinantní hostitelově buňce se může provádět pomocí replikovatelného expresního vektoru, který je schopen v hostitelově buňce exprimovat DNA polymer. Expresní vektor je nový a také tvoří část tohoto vynálezu.

Replikovatelný expresní vektor se může připravit podle tohoto vynálezu štěpením vektoru kompatibilního s hostitelovou buňkou, aby se dostal lineární DNA segment, který má neporušený replikon, a kombinací tohoto lineárního segmentu s alespoň jednou DNA molekulou, dohromady s uvedeným lineárním segmentem, kóduje sloučeninu za podmínek ligace.

Ligace lineárního segmentu a více než jedné DNA molekuly se může provádět současně nebo postupně, jak je požadováno.

Tak DNA polymer může být získán nebo vytvořen během konstrukce vektoru, jak je potřebné.

Volba vektoru bude z části určena hostitelovou buňkou, která může být prokaryotická, jako je E. coli, nebo eukaryotická, jako je C127, myší myelom, vaječník čínského křečka nebo Hela buňky, houby, například vláknité houby nebo nebuněčné kvasinky nebo buňky hmyzu, jako je Drosophila. Hostitelova buňka může být také z transgenního zvířete. Mezi vhodné vektory se zahrnují plasmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry. odvozená například od bacilovirů, vakcín nebo Semliki Forest viru.

Příprava replikovatelného expresního vektoru se může provádět obvykle s vhodnými enzymy pro restrikci, polymerací a ligaci DNA, způsoby, které popsal například Maniatis a kol., citováno výše. Polymerace a ligace se mohou provádět jak je svrchu uvedeno pro přípravu DNA polymeru. Štěpení . restrikčních enzymu se může dosahovat ve vhodném pufru za teploty od 20 do 70 °C, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně, s 0,1 až 10 μg DNA.

Rekombinantní hostitelova buňka se podle tohoto vynálezu připravuje transformací hostitelovy buňky replikovatelným expresním vektorem podle vynálezu za transformačních podmínek. Vhodné transformační podmínky jsou běžné a popsal je například Maniatis a kol., citováno výše, nebo DNA Cloning, sv. II, vyd. D. M. Glover, IRL Press Ltd. (1985) .

Volba transformačních podmínek je určena hostitelovou buňkou. Tak bakterie jako host, například jako je E. coli, se může zpracovat s roztokem chloridu vápenatého [Cohen a kol., Proč. Nat. Acad. Sci.,69, 2110 (1973)] nebo s roztokem směsi chloridu rubidného, chloridu manganatého, octanu draselného a glycerolu a potom s kyselinou 3-(N-morfolino)propansulfonovou, chloridem rubidným a glycerolem. Buňky savců v kultuře se mohou trasformovat společným srážením vápníkem z vektoru DNA v buňkách.

Vynález je také rozšířen na hostitelovu buňku transformovanou replikovatelným expresním vektorem podle tohoto vynálezu.

Kultivace transformované hostitelovy buňky za podmínek dovolujících expresi DNA polymeru se provádí běžným způsobem, jak popisuje například Maniatis a kol., DNA Cloning, citováno výše. Tak buňka se výhodně dodává s živnou látkou a kultivuje za teploty pod 45 °C.

Produkt exprese se dostává obvyklými způsoby podle hostitelovy buňky. Když je hostitelovou buňkou bakterie, jako je E. coli, může být lyofilizována fyzikálně, chemicky nebo enzymaticky a proteinový produkt se izoluje z výsledného lyzátu. Pokud produkt má být segregován z buňky bakterie, může se dostávat z periplasmového prostoru nebo živného prostředí. Jestliže hostitelovou buňkou je savec, produkt se může běžně izolovat z živného prostředí.

DNA polymer se může sestavit do vektorů určených pro izolaci stabilních transformovaných savčích buněčných linií exprimujících produkt. Například hovězí papilimavirusové vektory nebo amplifikované (rozšířené) vektory buněk vaječníku čínského křečka [DNA Cloning, sv. II, vyd. D. M. Glover, IRL Press (1985), R. J. Kaufman a kol., Molecular a Cellular Biology, 5, 1750-1759 (1985), G. N. Pavlakis a D.

H. Hamer, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 80 , 397-401 (1983) a D. V. Goeddel a kol., evropská patentová přihláška č. 0 093 619 (1983)].

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají IL4 a/nebo IL13 antagonistickou aktivitu, a proto mají potenciální použití při ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucího účinku IL4 a/nebo IL13, jako jsou alergické choroby zprostředkované IgE, stavy autoimunity zprostředkované T buňkami nebo chronické mikrobiální infekce.

Tento vynález proto dále poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje sloučeninu podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.

Při použití se sloučenina obvykle bude využívat ve formě farmaceutického prostředku, společně s farmaceutickou nosnou látkou, ředidlem a/nebo pomocnou látkou, které jsou vhodné pro člověka, třebaže přesná forma prostředku bude záviset na způsobu podání. Sloučenina může být například použita ve formě aerosolu nebo rozstřikovaného roztoku pro inhalaci nebo sterilních roztoků pro parenterálnímu podání.

Dávková rozmezí pro podání sloučenin podle tohoto vynálezu jsou taková, že vedou k dosažení požadovaného účinku na stav zprostředkovaný IL4 a/nebo IL13, například kdy stavy zprostředkované IgE protilátkou se snižují nebo se zastavuje nebo obrací postup autoimunitních chorob. Dávka se bude obvykle měnit s věkem, rozsahem nebo závažností stavu léčení a kontraindikacemi, pokud se nějaké vyskytují. Jednotková dávka se může měnit do méně než 1 mg do 300 mg, ale obvykle bude v oblasti do 1 do 20 mg na dávku, v jedné nebo několika dávkách, jaké jedné až šesti dávkách za den, takže denní dávka je v rozmezí od 0,02 do 40 mg/kg.

Prostředky vhodné pro injekce mohou být ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí, nebo suchých prášků, které se rozpouštějí nebo suspendují ve vhodném vehikulu před použitím.

Kapalné formy jednotkové dávky se připravují za použití sloučeniny a sterilního pomocného prostředku, který neobsahuje pyrogenní látky. Sloučenina v závislosti na vehikulu a použité koncentraci, se může bud rozpustit nebo suspendovat ve vehikulu. Roztoky se mohou použít pro všechny formy parenterálního podání a obzvláště se používají pro intravenózní infekce. Při přípravě roztoků se sloučenina může rozpustit ve vehikulu, roztok se upraví, aby byl isotonický, pokud je zapotřebí, přidáním chloridu sodného a sterilizuje se filtrací přes sterilní filtr za použití aseptického technického postupu před naplněním do vhodných sterilních lékovek nebo ampulí a jejich neprodyšným uzavřením. Podle jiného provedení, pokud je stabilita roztoku přiměřená, roztok v uzavřených zásobnicích se může sterilizovat autoklávováním. Výhodně se ve vehukulu mohou rozpustit přísady, jako jsou pufrující, solubilizační, stabilizační, konzervační nebo baktericidní, suspendační nebo emulzifikační přípravky a/nebo lokální anestetické přípravky.

Suché prášky, které se rozpouštějí nebo suspendují ve vhodném vehikulu před použitím, se mohou připravit naplněním předem sterilizované léčivé látky a jiných složek do sterilního zásobníku, za použití aseptických technických podmínek ve sterilním prostoru. Podle dalšího provedení se léčivo a jiné složky mohou rozpustit ve vodném prostředí, vzniklý roztok se sterilizuje filtrací a rozdělí do vhodných zásobníků za použití aseptického technického postupu ve sterilní prostoru. Produkt se potom suší vymražováním a zásobníky se neprodyšně uzavřou za aseptických podmínek.

Parenterální suspenze, vhodné pro intramuskulární, subkutánní nebo intradermální injekci, se připravují v podstatě stejným způsobem, jako je uveden výše, s tím rozdílem, že se sterilní sloučenina suspenduje ve sterilním vehikulu, na místo toho, aby se rozpustila, a sterilizace nemusí být doprovázena filtrací. Sloučenina se může izolovat ve sterilním stavu nebo alternativně se může sterilizovat po izolaci, například ozařováním τ paprsky. Výhodně se do prostředku zahrnuje suspendační přípravek, například polyvinylpyrrolidon, aby se usnadnilo rovnoměrné rozdělení sloučeniny.

Prostředky vhodné k podávání respiračním traktem zahrnují aerosoly, roztoky umožňující rozprášení nebo mikrojemné prášky pro insuflaci. V posledně uvedeném případě je výhodná velkost částic menší než 50 μπι, obzvláště menší než 10 μιη. Takové prostředky se mohou připravovat obvyklým způsobem a používají se ve spojení s obvyklým zařízením pro podávání.

Z dalšího hlediska se vynález týká způsobu ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13, který spočívá v tom, že se poškozenému podává účinné množství sloučeniny podle tohoto vynálezu.

Vynález se dále týká sloučeniny podle tohoto vynálezu k použití jako aktivní terapeutická látka, obzvláště pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL 13.

Vynález také poskytuje použití sloučeniny podle tohoto vynálezu při přípravě léčiva pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL 13.

Neočekávané toxikologické účinky se nepředpokládají, pokud se sloučeniny podle tohoto vynálezu podávají v souladu s tímto vynálezem.

Příklady provedení vynálezu

Dále zařazené příklad ilustrují tento vynález.

Příklad 1

IL4.Y124D/IgGl fúzovaný protein

Popisuje se konstrukce IL4.Y124D/IgGl chimérní cDNA, exprese odpovídajícího proteinu v expresním systému savce a jeho aktivita.

1. Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein

a) Konstrukce IL4.Y124D kódující oblasti

Varianta lidského IL4 genu, kterou popsal N. Kruše, H. P. Tony a W. Sebald ve EMBO Journal, 11, 3237 (1992), ve které zbytek 124 v proteinu je pozměněn z tyrosinu v divokém typu na kyselinu asparagovou, se připraví PCR mutagenezí lidské IL4 cDNA (lze zakoupit od British Biotechnology). IL4.Y124D cDNA se inzeruje do expresního vektoru pTR3l2, za použití míst HindlII a BglII [M. J. Browne, J. E. Carey,

C. G. Chapman, A. W. R. Tyrrell, C. Entwisle, G. Μ. P. Lawrence, B. Reavy, I. Dodd, A. Esmail a J. H. Robinson, Journal of Biological Chemistry, 263, 1599 (1988)], za vzniku plasmidu pDB906.

K rozšíření IL4.Y124D molekuly a připojení obvyklých restrikčních míst na každém konci pro subklonování se provede PCR reakce za použití 20 ng pDB906 plasmidu jako substrátu. PCR priméry jsou určeny k zavedení restrikčních enzymových míst, lemovaných 10 až 15 páry bází nukleotidů k zakotvení primérů na každém konci. Sekvence primérů se uvádějí dále:

1) 5' CGA ACC ACT GAA TTC CGC ATT GCA GAG ATA 3' (zahrnuje EcoRI restrikční místo, GAATTC)

2) 5' CAC AAA GAT CCT TAG GTA CCG CTC GAA CAC TIT GA 3 ' (zahrnuje KpnI restrikční místo, GGTACC)

Priméry se použijí v konečné koncentraci 5 ng/μΐ a přidává se dNTP do konečné koncentrace 0,2 mM v celkovém reakčním objemu 100 μΐ. Provede se 31 cyklus PCR. Cykly sestávají z denaturačního stupně za teploty 94 °C v trvání 1 minuty, anelačního stupně za teploty 50 °C během 1 minuty a 30 sekund a elongačního stupně za teploty 72 °C po dobu 1 minuty a 30 sekund. Cyklus jedné denaturace se prodlouží na 5 minut a konečný cyklus elongace se prodlouží na 7 minut.

Při PCR reakci se použije 2,5 jednotek enzymu Taq polymerázy od firmy Advanced Biotechnologies. Připraví se PCR produkt 587 bp. Ten se vyčistí za použití soupravy Promega Magie PCR Cleanup a potom štěpení s EcoRI a KpnI v reakčním pufru 4 (všechny restrikční enzymy se dostanou od firmy GibcoBRL.), k vytvoření kohezních konců. Po uplynutí 4 hodin a 30 minut za teploty 37 °C se reakční směs zahřívá na teplotu 70 °C po dobu 10 minut a potom se sráží ethanolem. Analýza výsledné DNA agarózovou gelovou elektroforézou ukazuje přítomnost tří pásů, přibližně 570 bp, 463 bp a 100 bp. 570 bp fragment představuje plnou délku IL4.Y124D varianty IL4 a je přítomen, protože štěpení je neúplné. Dva menší fragmenty se připraví v důsledku přítomnosti EcoRI místa v IL4.Y124D cDNA. 570 bp pás se čistí postupem Geneclean™ a liguje v BluescriptKS¹™, který se připraví štěpením s EcoRI a s KpnI a posléze s Geneclean™. Tak se vytvoří BluescriptKS⁺/IL4.Y124D rekombinant. Větší množství tohoto rekombinantu DNA se připraví použitím způsobu Magie Maxiprep. IL4.Y124D inzert se excizuje z Bluescript rekombinantu za použití Smál a KpnI. 20 μg rekombinantu DNA se inkubuje s 25 jednotkami Smál v reakčním pufru 4 za teploty 30 °C přes noc. Potom se přidá 25 jednotek KpnI ke štěpení a vše se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 5 hodin. Výsledný fragment o přibližně 580 bp se čistí pomocí Geneclean™, k vytvoření IL4.Y124D/SmaI/KpnI fragmentu.

b) Konstrukce IgGl kódující oblasti

COSFcLink vektor (tabulka 1) obsahuje lidskou IgGl cDNA kódující aminokyseliny 1-4 a 6-15 pantu, 1-110 CH₂ a 1-108 CH₃, jak popsal J. Ellison, B. Berson a L. E. Hood v Nucleic Acids Research, sv. 10, str. 4071 až 4079 (1982). Zbytek 5 pantu se změní z cysteinu v publikované IgGl sekvenci na alanin změnou TGT na GCC v nukleové sekvenci.

Tato látka se klonuje z lidské leukemické ARH-77 buňky IgG plazmy (American Type Tisue Collection), za použití RT-PCR a plně se sekvencuje, k potvrzení identity s publikovanou sekvencí (zveřejněná patentová přihláška W092/00985).

Konstrukce COSFc začne s pUC18 vektorem obsahujícím lidský IgGl cDNA popsaný výše (pUC18-Fc), který se štěpí s KpnI a SacII a podrobí deleci CH₃, pant a část CH₂. Oblast delece se nahradí PCR rozšířeným fragmentem, který obsahuje oblast pant-CH₂. Používá se těchto PCR primérů:

5' TCG AGC TCG GTA CCG AGC CCA AAT CGG CCG ACA AAA CTC ACA C 3 ' a

5' GTA CTG CTC CTC CCG CGG CTT TGT CTT G 3'

DNA fragment obsahující oblast pant-CH₂ se rozšíří z pUC18-Fc, štěpí s KpnI a SacII, čistí na gelu a klonuje v KpnI/SacII štěpeném pUC18-Fc vektoru. Cys, který je umístěn v poloze 230 [Kabatovo číslování, Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. vyd., US Department of Health a Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] IgGl těžkého řetězce, se změní na Ala přes TGT k GCC substituci v nukleotidové sekvenci. Změněná DNA sekvence v jednom z PCR primérů zahrnuje jedinečné místo KpnI na 5' konci pantu. Tento výsledný plasmid se označuje pUC18Fcmod a spojení a PCR rozšířená oblast se sekvencují pro ověření.

Celý pant-CH₂-CH₃ inzert v pUC18-Fcmod se odstraní v jediném DNA fragmentu s KpnI a Xbal, čistí na gelu a liguje do SFcRlCos4 řezu s KpnI a Xbal k vytvoření COSFc.

SFcRlCos4 je odvozen od pST4DHFR [K. Deen, J. S. McDougal, R. Inacker, G. Folena-Wasserman, J. Arthos, J.

Rosenberg, P. J. Maddon, R. Axel a R. W. Sweet, Nátuře, 331, 82 (1988)] a obsahuje rozpustný typ Fc receptorů (SFcRl) inzerovaný mezi promotor cytomegaloviru (CMV) a polyadenylač ní oblasti hovězího růstového hormonu (BGH) a také obsahuje dihydrofolát reduktázu (DHFR) cDNA inzerovanou mezi β-globinový promotor a SV40 prolyadenylační oblasti, SV40 původu z replikace a gen resistentní k ampicilinu pro růst bakterií. Řezem vektoru s KpnI a Xbal se odstraní sFcRl kódující oblast, takže COSFc vektor obsahuje pant-CH₂~CH₃ oblast inzerovanou mezi CMV promotor a BGH polyA oblast.

COSFcLink vektor se připraví z COSFc inzerováním oligonukleotidového spojovníku v jedinečném EcoRI místě vektoru, který znovu vytvoří toho EcoRI místo a také zavede BstEII, Pstl a EcoRV klonující místa. Používají se tyto oligonukleotidy:

5' AAT TCG GTT ACC TGC AGA TAT CAA GCT 3'

3' GCC AAT GGA CGT CTA TAG TTC GAT TAA 5'

Spojení se sekvencuje k ověření orientace vektoru. Velikost konečného vektoru odpovídá 6,37 bp.

c) Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein

K inzerování IL4.Y124D cDNA se COSFcLink vektor připraví štěpením s EcoRV a KpnI takto: 5 μΐ DNA se inkubuje s 15 jednotkami EcoRV v react 2 za teploty 37 °C po dobu 5 hodin a potom se provede srážení ethanolem. Výsledná DNA se štěpí s KpnI v react 4 za teploty 37 °C po dobu 3 hodin a potom se provede vysrážení ethanolem. IL4.Y124D/SmaI/KpnI a COSFcLink/EcoRV/KpnI fragmenty se ligují dohromady za vzniku plasmidu pDB951, který kóduje IL4.Y124D/IgGl fúzovaný protein. Ligace se dosahuje za použití soupravy Amersham DNA Ligation (kódové označení produktu RPN 1507) a reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují do Promega JM109 kompetičních buněk (vysoká účinnost) a umístí do na agar Luria Broth, který obsahuje 50 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth, s obsahem 50 μg/ml ampicilinu, a DNA připraví za použití Promega Magie Minipreps. Produkce IL4.Y124D/COSFcLink rekombinantní DNA se ověří restrikčním štěpením a DNA sekvencováním. Úplná sekvence IL4.Y124D a spojení s COSFcLink DNA se potvrdí DNA sekvencováním (tabulka 2). Kódující sekvence rekombinantní IL4.Y124D/IgGl DNA je uvedena v tabulce 3 a sekvence aminokyseliny fúzovaného proteinu je znázorněna v tabulce 4.

IL4.Y124D/COSFcLink rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití gradientu chloridu česného a DNA se použije k dočasně transfekovaným HeLa buňkám.

2. Exprese fúzovaného proteinu

HeLa buňky rostou v MEMa prostředí (Gibco) s 10% fetálním telecím šerem a 1% glutaminem. Pro test se naočkuje 1 x 10⁶ HeLa buněk v 15 ml prostředí RPMI-1640 s 10 % neonatálního telecího sera a 1 % glutaminu (očkovací prostředí) do baňky o objemu 75 ml čtyři dny před transfekcí. V den před transfekcí se do každé baňky přidá dalších 12,5 ml očkovacího prostředí. V den transfekce se prostředí změní na 15 ml transfekčního prostředí (MEM prostředí s Earleovými solemi, s obsahem 10 % neonatálního telecího sera a 1 % neesenciálních aminokyselin) v čase nula. V čase +3 hodiny se k buňkám přidá 25 μg příslušné DNA v 0,125 M chloridu vápenatého a 1 x HBS (HEPES pufrovaný fyziologický roztok). V čase +7 hodin se buňky podrobí glycerolovému šoku (15 % objem/objem) a potom ponechají inkubovat přes noc v 12,5 ml očkovacího prostředí, které obsahuje 5 mM butyrátu sodného. Následujícího dne se buňky promyjí PBS (Dulbeccoův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a přidá se 12,5 ml sklizňového prostředí (harvest medium, RPMI-1640 s 2 a 7,5 % zásobního roztoku hydrogenuhličitanu sodného). Po dalších 24 hodinách inkubace se supernatanty odstraní, odstředí při frekvenci otáček 1000 za minutu během 5 minut, k odstranění zbytků buněk, a skladují buď za teploty 4 °C nebo za teploty -20 °C.

3. Biologická aktivita

Pro testování supernatantu na IL4 antagonistickou aktivitu se použije způsobu, který popsal Spits a kol. v J. Immunology, 139, 1142 (1987), kdy se lymfocyty lidské periferní krve inkubují po dobu 3 dnů s fytohemaglutinem,

T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptoru. Výsledné balastní buňky se potom stimulují další tři dny s IL4. Proliferace se měří inkorporací ³H thymidinu.

IL4.Y124D/IgGl chiméra inhibuje inkorporací ³H thymidinu lymfocyty lidské periferní krve, stimulovanými 133 pM IL4 v dávce závislé na způsobu.

Příklad 2

IL4.Y124D/IgG4 fúzovaný protein

1. Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein

PCR slouží k rozšíření IL4.Y124D kódující oblasti a zavedení tiché nukleotidové substituce na 3' konci, co vede k vytvoření Xhol místa. Jako substrát pro PC4R reakci se použije 20 ng linearizovaného pDB951 plasmidu (příklad l.l(c)). Používají se tyto oligonukleotidové priméry:

1) 5' CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA CAG GAG ATC 3' (zahrnuje EcoRV restrikční místo, GATATC)

2) 5' CTC GGT ACC GCT CGA GCA CTT TGA GTC TTT 3' (zahrnuje Xhol restrikční místo, CTCGAG).

Druhá PCR reakce slouží k rozšíření pant-CH₂~CH₃ fragmentu lidského IgG4 těžkého řetězce. Substrátem pro tento případ je syntetická lidská IgG4 cDNA s těžkým řetězcem, které sekvence je popsána v tabulce 5, a která je založena na Genbank sekvenci GB:HUMIGCD2 [J. Ellison, J. Buxbaum a L. E. Hood, DNA, 1, 11-18 (1981)]. S publikovanou nukleotidovou sekvencí se provede řada tichých substitucí. Gen se sestaví kombinováním dvou 0,5 kb syntetických DNA fragmentů. Každý 0,5 kb fragment se připraví anelováním řad překrývajících se oligonukleotidů a potom se vnese do mezer pomocí PCR. Dva 0,5 kb fragmenty se spojí v SacII místě a inzerují do pCR2 vektoru. 1,0 kb Apal-BglII fragment obsahující celou konstantní oblast se izoluje a liguje do expresního vektoru, pCD, který obsahuje lidskou IL4 specifickou variabilní oblast. Tento konstrukt se použije jako PCR substrát k rozšíření pant-CH₂-CH₃ oblasti IgG4.

Použité oligonukleotidové priméry pro rozšíření IgG4 pant-CH₂-CH₃ oblasti jsou tyto:

1) 5' GGT GGA CAA CTC GAG CGA GTC CAA ATA TGG 3' (zahrnuje Xhol restrikční místo, CTCGAG)

2) 5' TTA CGT AGA TCT AGA CTA CAC TCA TTT ACC 3’ (zahrnuje Xbal restrikční místo, TCTAGA).

Podmínky pro obě PCR reakce jsou popsány pro derivát pDB951. Uvedeno v krátkosti, použije se priméru v koncentraci 5 ng/μΐ a dNTP při konečné koncentraci 0,2 mM v celkovém reakčním objemu 100 μΐ. Použijí se 2,5 jednotky enzymu Taq polymeráza od firmy Advanced Biotechnologies a provede se 31 cyklus PCR. Cykly sestávají z denaturačního stupně za teploty 94 °C v trvání 1 minuty, anelačního stupně za teploty 50 °C během 1 minuty a 30 sekund a elongačního stupně za teploty 72 °C po dobu 1 minuty a 30 sekund. Cyklus jedné denaturace se prodlouží na 5 minut a konečný cyklus elongace se prodlouží na 7 minut.

Dostanou se PCR produkty o přibližně 700 bp (pant-CH₂-CH₃3 IgG4) a 400 bp (IL4.Y124D) a čistí se za použití soupravy Promega Magie PCR Cleanup. Čištěný PCR reakčni produkt se potom štěpí s dále uvedenými enzymy k vytvoření kohezních konců: Xhol a Xbal pro IgG4 a EcoRV a Xhol pro IL4-Y124D. Štěpené látky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 3 hodin a potom se provede vysrážení ethanolem. Výsledná DNA se analyzuje gelovou elektroforézou a poskytne velikosti přibližně 690 bp (pant-CH₂-CH₃ IgG4) a 370 bp (IL4.Y124D).

Připraví se vektor, do kterého se ligují pant-CH₂-CH₃ IgG4 a IL4.Y124D PCR fragmenty štěpením pDB951 (IL4.Y124D v COSFcLink) s EcoRV a Xbal, k odstranění většiny IL4.Y124D/IgGl fúzované molekuly. Pouze zbývající část je přibližně 75 bp na 5' konci IL4, který není přítomen v IL4.Y124D EcoRV/Xhol fragmentu produkovaném rozšířením PCR.

μ9 pDB951 DNA se štěpí v celkovém objemu 30 μΐ za použití react 2 pufru (GibcoBRL). Výsledný 5,8 kb DNA fragment se čisti za použiti postupu Geneaclean .

Tři popsané fragmenty (IL4.Y124D EcoRV/Xhol, pant-CH₂-CH₃ IgG4 Xhol/Xbal a 5,8 kb fragment získaný z EcoRV/Xbal štěpením pDB951) se ligují dohromady za vzniku plasmidu pDB952, který kóduje IL4.Y124D/IgG4 fúzovaný protein. Ligace se provádí za použití DNA ligační soupravy od firmy Amersham (kód produktu RPN 1507) a reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují do Promega JM109 kompetičních buněk (vysoká účinnost) a umístí na agaru Luria Broth, který obsahuje 50 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth (obsahujícím 50 μΐ/mg ampicilinu) a DNA připraví za použití Promega Magie Minipreps. Produkce IL4.Y124D/IgG4 rekombinantní DNA se ověří restrikční štěpením a úplné IL4.Y124D a pant-CH₂-CH₃ oblasti se ověří DNA sekvencováním. Tabulka popisuje sekvenci kódující oblasti pouze IL4.Y124D/IgG4 fúzované molekuly a tabulka 7 obsahuje sekvenci aminokyseliny fúzovaného proteinu. IL4.Y124D/IgG4 rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití gradientu chloridu česného. DNA se použije k dočasné transfekováným HeLa buňkám.

2. Exprese fúzovaného proteinu

HeLa buňky rostou v MEMa prostředí (Gibco) s 10% fetálním telecím šerem a 1% glutaminem. Pro test se vloží 1 x 10⁶ HeLa buněk v 15 ml prostředí RPMI-1640 s 10 % neonatálního telecího sera a 1 % glutaminu (očkovací prostředí) do baňky o objemu 75 ml čtyři dny před transfekcí. V den před transfekcí se do každé baňky přidá dalších 12,5 ml očkovacího prostředí. V den transfekce se prostředí změní na 15 ml transfekčního prostředí (MEM prostředí s Earleovými solemi, s obsahem 10 % neonatálního telecího sera a 1 % neesenciálních aminokyselin) v čase nula V čase +3 hodiny se k buňkám přidá 25 ug příslušné DNA v 0,125 M chloridu vápenatého a 1 x HBS (HEPES pufrovaný fyziologický roztok). V čase +7 hodin se buňky podrobí glycerolovému šoku (15 % objem/objem) a potom nechají inkubovat přes noc v 12,5 ml očkovacího prostředí, které obsahuje 5 mM butyrátu sodného. Následujícího dne se buňky promyjí PBS (Dulbeccoův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a přidá se 12,5 ml sklizňového prostředí (harvest medium, RPMI-1640 se 2 a 7,5 % zásobního roztoku hydrogenuhličitanu sodného). Po dalších 24 hodinách inkubace se supernatanty odstraní, odstředí při frekvenci otáček 1000 za minutu během 5 minut, k odstranění zbytků buněk, a skladují buď za teploty 4 °C nebo za teploty -20 °C.

3. Biologická aktivita

Pro testování supernatantu na IL4 antagonistickou aktivitu se použije způsobu, který popsal Spits a kol. v J. Immunology, 139. 1142 (1987), kdy se lymfocyty lidské periferní krve inkubují po dobu 3 dnů s fytohemaglutinem,

T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptorů. Výsledné balastní buňky se potom stimulují další tři dny s IL4. Proliferace se měn inkorporaci H thymidinu.

IL4.Y124D/IgGl chiméra inhibuje inkorporaci ³H thymidinu lymfocyty lidské periferní krve stimulovanými 133 pM IL4 v dávce závislé na způsobu.

Příklad 3

IL4.Y124D/IgG4 PE fúzovaný protein

1. Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein

PCR slouží k rozšíření IL4.Y124D kódující oblasti a zavedení tiché nukleotidové substituce na 3' konci, co vede k vytvoření Xhol místa, jak je popsáno v příkladu 2.

Druhá PCR reakce se provádí k rozšíření pant-CH₂~CH₃ fragmentu PE varianty lidského IgG4 těžkého řetězce. V IgG4 PE je zbytek 10 pantu (zbytek 241, Kabatovo číslování) změněn ze šeřinu (S) v divokém typu na prolin (P) a zbytek CH₂ (zbytek 248, Kabatovo číslování) je změněn z leucinu (L) v divokém typu na glutamát (E). S. Angal, D. J. King, M. W. Bodmer, A. Turner, A. D. G. Lawson, G. Roberts, B. Pedley a R. Adair v Molecular Immunology, sv. 30, str. 105 až 108 (1993) popisují IgG4 molekulu, kde zbytek 241 (Kabatovo číslování) je změněn z šeřinu na prolin. Tato změna zvyšuje poloviční dobu existence IgG4 molekul v seru.

IgG4 PE varianta se vytvoří za použití PCR mutageneze na syntetickém lidském IgG4 těžkém řetězci cDNA, popsaném v tabulce 5 a potom se liguje do pCD expresního vektoru. Jde o plasmid, který se používá jako substrát pro PCR reakci rozšiřující pant-CH₂~CH₃ fragment IgG4 PE. Sekvence IgG4 PE varianty je popsána v tabulce 8. Zbytky IgG4 nukleotidové sekvence, které jsou změněny k přípravě PE varianty, jsou tyto (vztaženo k tabulce 8):

zbytek 322 se mění na C v PE variantě z T v divokém typu, zbytek 333 se mění na G v PE variantě z A v divokém typu a zbytek 343-344 se mění na GA v PE variantě z CT v divokém typu.

Pro rozšíření IgG4 PE varianty pant-CH₂~CH₃ oblasti se použijí oligonukleotidové priméry, jako jsou popsány pro derivát pDB952.

Dostanou se PCR produkty o přibližně 700 bp (pant-CH₂-CH₃ IgG4 PE mutantu) a 400 bp (IL4.Y124D) a čistí se za použití soupravy Promega Magie PCR Cleanup. Vyčištěný PCR reakční produkt se potom štěpí dále uvedenými enzymy k vytvoření kohezních konců: Xhol a Xbal pro IgG4 PE a EcoRV a Xhol pro IL4.Y124D. Rozštěpené látky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 3 hodin a potom se provede vysráží ethanolem. Výsledné DNA mají velikost přibližně 690 bp (pant-CH₂-CH₃ IgG4 PE) a 370 bp (IL4.Y124D).

K získání větších množství IgG4 PE varianty, pant-CH₂-CH₃ fragmentu a IL4.Y124D fragmentu se vyčištěné +TM a štěpené PCR produkty liguji do BluescriptKS , který je připraven štěpením bud s Xhol a Xbal pro pant-CH₂-CH₃ IgG4 PE fragmentu nebo EcoRV a Xhol pro IL4.Y124D fragment a potom pomocí Geneclean^TN. Tak se vytvoří BluescriptKS⁴™/ /pant-CH₂~CH₃ IgG4 PE rekombinat a BluescriptKS⁺™/IL4.Y124D rekombinat. Větší množství těchto DNA se produkuje za použití metody Promega Magie Maxiprep. IgG4 PE pant-CH₂~CH₃ fragment se excituje z Bluescript rekombinantu za použití

Xhol a Xbal. Výsledný fragment o přibližně 690 bp se čistí TM

Geneclean , k vytvořeni velikého množství IgG4 PE pant-CH₂-CH₃ Xhol/Xbal fragmentu. IL4.Y124D fragment se excituje z Bluescript rekombinantu za použití EcoRV a Xhol a výsledný fragment o přibližně 370 bp se čistí pomocí

TM

Geneclean .

Připraví se vektor, ve kterém se liguje pant-CH₂-CH₃ IgG4 PE fragment a IL4.Y124D fragment štěpením pDB951 s EcoRV a Xbal, jak je popsáno pro derivát pDB952.

Tři popsané fragmenty (IL4.Y124D EcoRV/Xhol, pant-CH₂-CH₃ IgG4 PE varianta Xhol/Xbal a 5,8 kb fragment získávaný z EcoRV/Xbal štěpení pDB951) se ligují dohromady za vzniku plasmidu pDB953, za použití DNA ligační soupravy od firmy Amersham (kód produktu RPN 1507) a reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují do Promega JM109 kompetenčních buněk (vysoká účinnost) a umístí na agar Luria Broth, který obsahuje 50 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth (obsahujícím 50 μΐ/mg ampicilinu) a DNA připravené za použití Promega Magie Minipreps. Produkce IL4.Y124D/IgG4 variantní rekombinantní DNA se ověří restrikčním štěpením a úplné IL4.Y124D a pant-CH₂-CH₃ variantové oblasti se ověří DNA sekvencováním. Tabulka 9 popisuje sekvenci kódující oblasti pouze IL4.Y124D/IgG4 PE fúzované molekuly a tabulka 10 obsahuje sekvenci aminokyseliny fúzovaného proteinu.

IL4.Y124D/IgG4 rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití gradientu chloridu česného a DNA použije k dočasně transfekováným HeLa buňkám.

2. Exprese fúzovaného proteinu

HeLa buňky rostou v MEMa prostředí (Gibco) s 10% fetálním telecím šerem a 1% glutaminem. Pro test se naočkuje 1 x 10⁶ HeLa buněk v 15 ml prostředí RPMI-1640 s 10 % neonatálního telecího sera a 1 % glutaminu (očkovací prostředí) do baňky o objemu 75 ml čtyři dny před transfekcí. V den před transfekcí se do každé baňky přidá dalších 12,5 ml očkovacího prostředí. V den transfekce se prostředí změní na 15 ml transfekčního prostředí (MEM prostředí s Earleovými solemi, s obsahem 10 % neonatálního telecího sera a 1 % neesenciálních aminokyselin) v čase nula V čase +3 hodiny se k buňkám přidá 25 μ9 příslušné DNA v 0,125 M chloridu vápenatého a 1 x HBS (HEPES pufrovaný fyziologický roztok). V čase +7 hodin se buňky podrobí glycerolovému šoku (15 % objem/objem) a potom nechají inkubovat přes noc v 12,5 ml očkovacího prostředí, které obsahuje 5 mM butyrátu sodného. Následujícího dne se buňky promyjí PBS (Dulbeccoův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a přidá se 12,5 ml sklizňového prostředí (harvest medium, RPMI-1640 se 2 a 7,5 % zásobního roztoku hydrogenuhličitanu sodného). Po dalších 24 hodinách inkubace se supernatanty odstraní, odstředí při frekvenci otáček 1000 za minutu během 5 minut, k odstranění zbytků buněk, a skladují buď za teploty 4 °C nebo za teploty -20 °C.

3. Biologická aktivita

Pro testování supernatantu na IL4 antagonistickou aktivitu se použije způsobu, který popsal Spits a kol. v J. Immunology, 139, 1142 (1987), kdy se lymfocyty lidské periferní krve inkubují po dobu 3 dnů s fytohemaglutinem,

T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptoru. Výsledné balastní buňky se potom stimulují další tři dny s IL4. Proliferace se měří inkorporaci H thymidinu.

IL4.Y124D/IgG4 PE chiméra inhibuje inkorporaci ³H thymidinu lymfocyty lidské periferní krve, stimulovanými 133 pM IL4 v dávce závislé na způsobu.

Příklad 4

Expresní vektor savce obsahující DNA kódující pro IL4.Y124D/ /IgG4 PE

1. Konstrukce DNA pCDN vektor (N. Aiyar, E. Baker, H.-L. Wu, P. Nambi,

R. M. Edwards, J. J. Trill, C. Ellis a D. Bergsma, Molecular and Cellular Biochemistry, 131, 75-86 (1994) obsahuje CMV promotor, polylinkerovou klonující oblast a BGH polyadenylační oblast. Tento vektor také obsahuje bakteriální gen neomycin fosfotransferázy (NEO) inzerovaný mezi β-globinový promotor a SV40 polyadenylačm oblast pro Geneticin^iil selekci, DHFR selekční kazetu inzerovanou mezi β-globinový promotor a BGH polyadenylační oblast pro rozšíření methotrexátu (MTX), amplicilinový resistenční gen pro růst bakterií, a SV40 pocházející z replikace.

K inzerci IL4.Y124D/IgG4 PE cDNA se pCDN vektor připraví štěpením s Ndel a BstXl takto: 15 μg DNA se inkubuje se 30 jednotkami BstXl v react 2 (Gibco-BRL) za teploty 55 °C po dobu l hodiny a potom se provede srážení ethanolem. Výsledná DNA se štěpí Ndel v react 2 za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny a provede vysrážení ethanolem. IL4.Y124D/IgG4 PE fragment se připraví z pDB953 (příklad 3.1) štěpením s BstXl a Ndel takto: 15 ug DNA se inkubuje se 30 jednotkami BstXl v react 2 za teploty 55 °C po dobu 1 hodiny a provede se vysrážení ethanolem. Výsledná DNA se štěpí Ndel v react 2 za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny a provede se vysrážení ethanolem.

IL4.Y124D/IgG4 PE Ndel/BstXl a pCDN Ndel/BstXl fragmenty se ligují dohromady za vzniku plasmidu pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE. Ligace se dosahuje za použití 2 jednotek T4 DNA Ligase (Gibco BRL) s T4 DNA ligázovým pufrem. Reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují v Gibco-BRL DH5a kompetenčních buňkách (subklonující účinek) a umístí na agaru Luria Broth, který obsahuje 75 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth (obsahujícím 50 μΐ/mg ampicilinu) a DNA se připraví alkalickou lýzou. Produkce p-CDN-IL4.Y124D/ /IgG4 PE DNA se potvrdí restrikčními štěpeními. Úplná sekvence rekombinantní IL4.Y124D/IgG4 PE DNA se potvrdí sekvencováním. pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití kolony Qiagen a DNA se použije k dočasnému infikování COS buněk a elektroporaci do CHO buněk, k vytvoření stabilních klonů.

2. Exprese fúzovaného proteinu

a) Dočasná exprese v COS

COS-1 buňky rostou v DMEM prostředí s 10% fetálním telecím šerem. Pro transfekci se buňky naočkují 2 x 10 buněk do misky pro kultivaci tkáně o průměru 35 mm 24 hodin předem. Roztok obsahující 1 μg DNA ve 100 μΐ DMEM zbaveného sera se přidá k roztoku, který obsahuje 6 μΐ reakčního přípravku LIPOFECTAMINE (Gibco-BRL) ve 100 μΐ DMEM bez sera, vše se opatrně rozvíří a inkubuje za teploty místnosti po dobu 45 minut. Buňky se jednou promyjí DMEM zbaveným sera. 0,8 ml DMEM zbaveného sera se přidá k opatrně míchanému roztoku DNA-LIPOFECTAMINE a zředěným roztokem se převrství buňky. Buňky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 5 hodin a potom se k nim přidá 1 ml DMEM, s obsahem 20 % fetálního hovězího sera. Buňky se testují o 48 až 72 hodiny později ke stanovení úrovní exprese.

b) Elektropolace v CHO buňkách

CHO buňky, ACC-098 [suspenze buněčné linie odvozené od CHO DG-44, G. Urlaub, E. Kas, A. M. Carothers a L. A. Chasin, Cell, 33, 405-412, (1983)] se nechá růst v růstového prostředí prostém sera, které je popsáno ve W092/05246. 15 μ9 PCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE plasmidu se štěpí za použití 30 jednotek Notl za teploty 37 °C po dobu 3 hodin k linearizaci plasmidu a potom se provede vysrážení ethanolem. Výsledná DNA se znovu suspenduje v 50 μΐ 1 x TE (10 mM Tris, hodnota pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA se elektroporuje do 1 x 10⁷ ACC-098 buněk, za použití pulzátorové soupravy Bio Rad Gene Pulser při napětí 380 V a elektrické kapacitě 25 μFd. Buňky se znovu suspendují v růstovém prostředí při 2,5 x 10⁴ buňkách na mililitr a 200 μΐ buněčné suspenze se umístí do každé jamky na desce s 96 jamkami. O 48 hodin později se prostředí prudce vnese do růstového prostředí, které obsahuje 400 μg/ml G418 (Geneticin). Za 21 den po selekci se upraví prostředí z kolonie, která vznikla, a podrobí se ELISA testu. Nejvyšší exprimované kolonie se přenesou na desku s 24 jamkami, aby se dosáhlo jejich zvětšení.

Tabulka 1: DNA sekvence COSFcLink vektoru, 6367 bp

SEQ ID č. 1

GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGA7CGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG 6 0

TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT ACAT AACTT 120

ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATG 180

ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT 240

TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT 300

ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360

GACTTTCCTACTTGGCAGTAC ATCT ACGTATTAGTCATCGCT ATTACCATGGTGATGCGG 420

TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC 480

CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540

TGTCGT AAC AACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGT AGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600

TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660

TTACCTGCAGATATCAAGCTAATTCGGTACCGAGCCCAAATCGGCCGACAAAACTCACAC 720

ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC 780

AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA 840

CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA 900

T AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGT 960

CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCpAA 1020 C AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA 1080

ACC ACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT 1140 GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG 1200

GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT 12 60' CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG 1320

CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC 1380 GGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCA 1440

GCCÁTCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCAC 1500

TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTAT 15 60 TCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCA 1620

TGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGGATCTCCCGATC 1680

CCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAAAAAAGGAAAATTAATTTTA 1740

ACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAAAGGATGCTTTAGAGACAGT 1800

GTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGTACCCAGAGCTGAGACTCCT 18 60 AAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTTGTCATCACCGAAGCCTGAT 1920

TCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAG 1980

CC AGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGACAT 2040

AGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCTGCGATTTCGCGCCAAACTT 2100

GACGGCAATCCT AGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTT ATCCCCGCTGCC ATCATGGTTCGAC 2160

CATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTAC 2220

CCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAG 2280

TGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGA 2340

AGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCAC 2400

CACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAAC 2460

CGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGG 2520

AAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTG 2580

AAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACC 2640

CAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACG 2700

AGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTAAAGCTATGCA 2760

TTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA 2820

AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT 2880

TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACGATAGCTTATCTGTGGGC 2940

GATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGATTTAGAAGCCATTTGCCCCC 3000

7GAG7GGGGC77GGGAGCACTAAC777C7CT77CAAAGGAAGCAA7GCAGAAAGAAAAGC 3060 A7ACAAAG7A7AAGC7GCCA7G7AA7AA7GGAAGAAGA7AAGGTTG7A7GAA7TAGATT7 3120 ACA7AC77C7GAA77GAAAC7AAACACC777AAA77C77AAA7A7A7AACACA777CA7A 3180 7GAAAG7A7777ACA7AAG7AAC7CAGA7ACA7AGAAAACAAAGC7AATGA7AGG7G7CC 3240 C7AAAAG77CA777A77AA77C7ACAAA7GA7GAGC7GGCCA7CAAAA77CCAGC7CAAT 3300 TC77CAACGAA77AGAAAGAGCAA7C7GCAAAC7CA7C7GGAA7AACAAAAAACC7AGGA 3360 7AGCAAAAACTCT7C7CAAGGA7AAAAGAACC7C7GG7GGAA7CACCA7GCC7GACCTAA 3420 AGC7G7AC7ACAGAGCAA77G7GA7AAAAAC7GCA7GG7AC7GA7ATAGAAACGGACAAG 3480 7AGACCAA7GGAA7AGAACCCACACACC7A7GG7CAC77GA7C77CAACAAGAGAGC7AA 3540 AACCA7CCAC7GGAAAAAAGACAGCA7777CAACAAA7GG7GC7GGC ACAAC7GG7GG77 3600

A7CA7GGAGAAGAA7G7GAAT7GA7CCAT7CCAATCTCCT7G7AC7AAGG7CAAATCTAA 3660 G7GGA7CAAGGAAC7CCACA7AAAACCAGAGACAC7GAAAC7TA7AGAGGAGAAAG7GGG 3720 GAAAAGCC7CGAAGA7A7GGGCACAGGGGAAAAA77CC7GAA7AGAACAGCAATGGCTTG 3780 TGC7G7AAGA7CGAGAA77GACAAA7GGGACC7CA7GAAAC7CCAAAGCTA7CGGA7CAA 3840 TTCC7CCAAAAAAGCC7CC7CAC7AC77C7GGAA7AGC7CAGAGGCCGAGGCGGCC7CGG 3900 CC7C7GCA7AAATAAAAAAAA77 AG7CAGCCA7GCA7GGGGCGGAGAA7GGGCGGAAC7G 3960

GGCGGAG77AGGGGGGGGA7GGGCGGAG77AGGGGCGGGAC7A7GG77GC7GAC7AA77G 4020 AGA7GCA7GC777GCA7AC77C7GCCTGC7GGGGAGCC7GGGGACT77CCACACC7GG77 4080 GC7GAC7AA77GAGA7GCA7GC777GCA7AC77C7GCC7GC7GGGGAGCC7GGGGACT77 4140 CCACACCC7AACTGACACACA77CCACAGAA77AA77CCCGA7CCCG7CGACCTCGAGAG 4200 CTTGGCGTAATCATGGTCA7AGCTGTT7CCTGTG7GAAAT7G77A7CCGCTCACAA77CC 4260 ACACAACA7ACGAGCCGGAAGCA7AAAG7G7AAAGCC7GGGGTGCC7AATGAG7GAGC0^ 4320 AC7CACA77AA77GCG77GCGC7CAC7GCCCGC777CCAG7CGGGAAACC7G7CGTGCCA 4380 GC7GCA7TAA7GAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG777GCG7A77GGGCGC7CT7C 4440 CGC77CC7CGC7CAC7GACTCGC7GCGC7CGG7CG77CGGC7GCG6CGAGCGG7A7CAGC 4500' 7CAC7CAAAGGCGG7AATACGG77 A7CCAC AGAA7CAGGGGA7AACGCAGGAAAGAACA7 4560

G7GAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCG7AAAAAGGCCGCG77GC7GGCG77TT7 4620 CCA7AGGC7CCGCCCCCC7GACGAGCA7CACAAAAA7CGACGC7CAAG7CAGAGG7GGCG 4680 AAACCCGACAGGAC7A7AAAGA7ACCAGGCG777CCCCC7GGAAGC7CCCTCG7GCGC7C 4740 7CC7G77CCGACCCTGCCGC77ACCGGA7ACC7G7CCGCC777C7CCCTTCGGGAAGCG7 4800 GGCGC777C7CAA7GC7CACGCTGTAGG7A7CTCAG7TCGG7G7AGG7CG77CGC7CCAA 4860 GC7GGGC7G7G7GCACGAACCCČCCG77CAGCCCGACCGC7GCGCCTTATCCGG7AACTA 4920 TCG7C77GAG7CCAACCCGG7 AAGACACG ACTT A7CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA 4980

CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA 5040 CTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTT 5100 CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT 5160 TTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGAT 5220 CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCAT 5280 GAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTT AAATC 5340

AATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC 5400 ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTA 54 60 GATAACTACGAT ACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGA 5520 CCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG 5580 CAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC 5640 TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCAT 5700 CGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG 5760 GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAT 5820 CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA 5880 TTCTCTT ACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAA 5940

GTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGA 6000 TAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGC7CATCAT7GGAAAACGTTCTTCGGG 6060 GCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGC 6120 ACCC AACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGG 6180

AAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT 6240

CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACAT

ATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCČCGAAAAGT

GCCACCT

Tabulka 2: DNA sekvence kódované Y124D/IgGl fúzované v COSFcLink vektoru, 6926 bp

SEQ ID č. 2

GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGATCGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG

TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTT acggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatg

ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT

TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT

ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG

GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG

TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC

CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA

TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC

TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG

TTACCTGCAGATGGGCTGCAGGAATTCCGCATTGCAGAGATAATTGTATTTAAGTGCCTA

GCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTAC

CTGCCATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCG

GCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGA

ACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTG

CCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGT

TCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACA

GGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGG

GCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAA

GGCTAAAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAAT

CGGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT

CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG

TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG

TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT

ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG

CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA

CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG

TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG

ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC

AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA

AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA

CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCC

TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC

TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT

GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTC

GAGGGGGGATCTCCCGATCCCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAA

AAAAGGAAAATTAATTTTAACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAA

AGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGT •ACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTT

GTCATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACAC

6300

6360

6367 molekuly

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

AGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGAGCATATAAQGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCC 2580 TCACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCT 2640 GCGATTTCGCGCCAAACTTGACGGCAATCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTTATCCCC 2700 GCTGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATT 2760 GGC AAGAACGGAGACCT ACCCTGGCCTCCGCTC AGGAACGAGTTCAAGT ACTTCCAAAGA 2820 ATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACC 2880 TGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGT 2940 AGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCC 3000 TTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAG7CGGA 3060 GGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACA 3120 AGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATAT 3180 AAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAG 3240 TATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAÁGTTCTCTGCT 3300 CCCCTCCTAAAGCTATGCATTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGC 3360 TT ATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTC 3420 ACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAA 3480 CGATAGCTTATCTGTGGGCGATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGAT 3540 TTAGAAGCCATTTGCCCCCTGAGTGGGGCTTGGGAGCACTAACTTTCTCTTTCAAAGGAA 3600 GCAATGCAGAAAGAAAAGCATACAAAGT AT AAGCTGCCATGTAATAATGGAAGAAGATAA 3660 GGTTGTATGAATTAGATTTACATACTTCTGAATTGAAACTAAACACCTTTAAATTCTTAA 3720 ATATATAACACATTTCATATGAAAGTATTTTACATAAGTAACTCAGATACATAGAAAkCA 3780 AAGCT AATGATAGGTGTCCCTAAAAGTTCATTTATTAATTCTACAAATGATGAGCTGGCC 3840 ATCAAAATTCCAGCTCAATTCTTCAACGAATTAGAAAGAGCAA^CTGCAAACTCATCTGG 3900 AATAACAAAAAACCTAGGATAGCAAAAACTCTTCTCAAGGATAAAAGAACCTCTGGTGGA 3960 ATCACCATGCCTGACCTAAAGCTGTACTACAGAGCAATTGTGATAAAAACTGCATGGTAC 4020 TGATATAGAAACGGACAAGTAGACCAATGGAATAGAACCCACACACCTATGGTCACTTGA 4080 TCTTCAACAAGAGAGCTAAAACCATCCACTGGAAAAAAGACAGCATTTTCAACAAATGGT 4140 GCTGGCACAACTGGTGGTTATCATGGAGAAGAATGTGAATTGATCCATTCCAATCTCCTT 4200 GTACTAAGGTCAAATCTAAGTGGATCAAGGAACTCCACATAAAACCAGAGACACTGAAAC 4260 TTATAGAGGAGAAAGTGGGGAAAAGCCTCGAAGATATGGGCACAGGGGAAAAATTCCTGA 4320 ATAGAACAGCAATGGCTTGTGCTGTAAGATCGAGAATTGACAAATGGGACCTCATGAAAC 4380 TCCAAAGCTATCGGATCAATTCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCA 44 4 0 GAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAAT AAAAAAAATT AGTCAGCCATGCATGGGG 4500 CGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGAC 4560 TATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGG 4620 GGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGC 4680 TGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCT AACTGACACACATTCCACAGAATTAATTCCCG 4740 ATCCCGTCGACCTCGAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATT 4800 GTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG 4860 GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGT 4920 CGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT 4980 TGCGT ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC 5040 TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGG 5100 ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGG 5160 CCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGAC 5220 GCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG 5280 GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT 5340 TTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGG 5400 TGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT 5460 GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCAC 5520 TGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT 5580 TCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTC 5640 TGCTGAAGCCAGTT ACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCA 5700 CCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT 5760

CTCAAG AAGATCCTTTGATCTTTTCT ACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCAC 5820 GTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCT-TCACCTAGATCCT TTTAAATT 5880 AAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACC 5940 AATGCTT AATC AGTGAGGCACCTATCTC AGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTG 6000 CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTG 60 60 CTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC 6120 CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTA 6180 TTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTG 6240 TTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCT 6300 CCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCC ATGTTGTGCAAAAAAGCGGTT A 63 60 GCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGG 6420 TTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGA 6480 CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTT 6540 GCCCGGCGTCAATACGGGAT AAT ACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCA 6600 TTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTT 6660 CGATGTAACCCACTCGTGC ACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTT 6720 CTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGA 6780 AATGTTGAATACTCAT ACTCTTCCTTTTTCAATATT ATTGAAGC ATTTATCAGGGTT ATT 6840 GTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGC 6900 GCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCT 692 6 Tabulka 3: DNA sekvence kódující oblasti IL4.Y124D/IgGl fúzované molekuly, 1164 bp

SEQ ID Č. 3

ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 6 o

TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120

CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180

AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240

AGCCACCATGAGAAGGACACTGGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300

AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 3 60 AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420

AAGACGATCÁTGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAATCGGCC 4 80 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC 540

TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA 600

TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGT ACGTGG AC 660

GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC 720

CGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG 780

TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 840

GGGC AGCCCCGAG AACCAC AGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG ACCAAG 900

AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 960

TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 1020

GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG 1080

AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGC 1140

CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 1164

Tabulka 4: Sekvence kódovaného IL4.Y124D/IgGl fúzovaného proteinu, 387 aa

SEQ ID č. 4

MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE 51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH

101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ S7LENFLERL K7IMREKDSK 151 CSSG7EPKSA DK7H7CPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT 201 CWVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH 251 QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK 301 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL 351 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK*

Tabulka 5: DNA sekvence syntetické IgG4 cDNA, 1006 bp

SEQ ID č. 5

GCTTCCACCAAGGGCCC ATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 6 0

AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG 120

TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240

TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300

AAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTC 3 60 TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420

TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT 480 ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgYac 540

CG7GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600

TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660

GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 720

AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780

TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 840

GACGGATCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900

AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960

CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGATCTACGTATG 1006

Tabulka 6: DNA sekvence kódující oblasti IL4.Y124D/IgG4 fúzované molekuly, 1149 bp

SEQ ID č. 6

ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGC AAC 6 0

TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120

CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180

AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240

AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCC ACAGGCAC 300

AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 3 60 AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420

AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480

TGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540

AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600

GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660

AATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTTCAACAGC ACGTACCGTGTGGTCAGCGTC 720

C7CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780

AAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840

CC ACAGGTGT AC ACCCTGCCCCCATCCCAGG AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900

ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960

CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTC 1020

CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080

TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140

GGTAAATGA 1149

Tabulka 7: Sekvence kódovaného IL4.Y124D/IgG4 fúzovaného proteinu, 382 aa

SEQ ID č. 7

MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTc.

LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH 101 KQLIRFLKR.L DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK 151 CSSESKYGPP CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD 201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN 251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL 301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS

351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK*

Tabulka 8: DNA sekvence IgG4 PE varianty, 984 bp SEQ ID č. 8

GCTAGT ACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 6 0 AGCACgGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG^CG 12 0 TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180 GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240 TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300 AAATATGGTCCCCCATGCCCAcCATGCCCAGCgCCTGAaTTtgaGGGGGGACCATCAGTC 3 δ 0 TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420 TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCC AGTTCAACTGGTACGTGGAT 480 GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC 540 CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600 TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660 GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 72 0 AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780 TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 84 0 GACGGaTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900 AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960 CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA 984

Tabulka 9: DNA sekvence kódující oblasti IL4.Y124D/lgG4 PE fúzované molekuly, 1149 bp

SEQ ID č. 9

ATGGGTCTC ACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 6 0 TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120 CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180 AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240 AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300 AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 3 60 AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420 AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480 TGCCCACCATGCCCAGCgCCTGAATTTGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540 AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600 GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660 AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGT ACCGTGTGGTCAGCGTC 720

CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780 AAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840 CCACAGGTGTACACCC7GCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900 ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960 CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGaTCCTTCTTC 1020 CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080 TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140 GGTAAATGA 1149

Tabulka 10: Sekvence kódované IL4.Y124D/IgG4 PE varianty fúzovaného proteinu, 382 aa

SEQ ID č. 10

MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE 51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH 101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK 151 CSSESKYGPP CPPCPAPEFE GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD 201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN 251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL 301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LY^RLTVDKS

351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK* <— JO £> C35

O “ > o <3 o

OKY toc?

o czx r—“

O ř\S o<

IL4 a/nebo IL13 i ..

u t

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁR

   1. Rozpustný protein, projevující antagonistickou nebo částečnou antagonistickou aktivitu, vyznačující se tím, že zahrnuje IL4 mutantu nebo variantu fúzovanou k alespoň jedné lidské imunoglobulínové konstantní doméně nebo jejímu fragmentu.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jedna aminokyselina, která se přirozeně vyskytuje v divokým typu IL4 v libovolné poloze 120 až 128 včetně, je nahrazena rozdílnou přirozenou aminokyselinou.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, kde tyrosin, přirozeně se vyskytující v poloze 124, je nahrazen rozdílnou přirozenou aminokyselinou.
4. 4. Sloučenina podle nároku 3, kde tyrosin, přirozeně se vyskytující v poloze 124, je nahrazen kyselinou asparagovou.
5. 5. Sloučenina podle některého z předcházejících nároků, kde imunoglobulín je z podskupiny IgG.
6. 6. Sloučenina podle nároku 5, kde konstantní doména nebo domény nebo její či jejich fragment jsou celé nebo podstatnou částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidského IgG.
7. 7. Sloučenina podle nároku 5, kde konstantní doména nebo domény nebo její či jejich fragment jsou celé nebo podstatnou částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidského

   IgG4.
8. 8. Sloučenina podle nároku 1, která obsahuje sekvenci aminokyseliny představovanou SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 10.
9. 9. Způsob přípravy sloučeniny podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje exprimování DNA kódující tuto sloučeninu v rekombinantní hostitelově buňce a získání produktu.
10. 10. Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, že

    i) připraví se replikovatelný expresní vektor, který je schopen v hostitelově buňce exprimovat DNA polymer sestávající z nukleotidové sekvence, která kóduje tuto sloučeninu, ii) hostitelova buňka se transformuje tímto vektorem, iii) transformovaná hostitelova buňka se kultivuje za podmínek, které dovolují expresi tohoto DNA polymeru, k produkci uvedené sloučeniny a iv) získá se tato sloučenina.
11. 11. DNA polymer, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 8.
12. 12. DNA polymer podle nároku 11, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje nebo sestává ze sekvence SEQ ID č.

    3, SEQ ID č. 6 nebo SEQ ID č. 9.
13. 13. Replikovatelný expresní vektor, vyznačující se tím, že zahrnuje DNA polymer podle nároku ll.
14. 14. Hostitelova buňka, vyznačující se tím, že je transformována replikovatelným expresním vektorem podle nároku 13.
15. 15. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.
16. 16. Způsob ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13, vyznačující se tím, že se poškozenému podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
17. 17. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, k použití pro terapeutické účely.
18. 18. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, k použití pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13.
19. 19. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 8, k přípravě léčiva pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13.