PL170616B1

PL170616B1 - Sposób ekspresji enzymu AHAS o specyficznej opornosci na imidazolinon PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL170616B1
Application number: PL92295470A
Authority: PL
Inventors: Gabriele E Dietrich
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-30
Publication date: 1997-01-31
Also published as: DK0525384T3; ES2153352T3; IL102673A; US5767361A; DE69231551T2; PT525384E; EP0525384A3; RO114348B1; NZ243693A; AU9046098A; KR930002512A; HUT65483A; NO311095B1; US5731180A; US6444875B1; EP0525384A2; TW239161B; AU4335296A; NO923017D0; KR100243996B1

Abstract

1. Sposób ekspresji enzymu AHAS o specyficznej opornosci na imidazolinon, w komórkach gospodarza, z n a m ie n n y ty m , ze komórki gospodarza transformuje sie sekwencja kwasu nukleinowego kodujaca funkcjonalny enzym AHAS kukurydzy, w którym w stosunku do enzymu AHAS kukurydzy typu dzikiego wystepuje substytucja aminokwasu w pozycji 621 nadajaca enzymowi specyficzna opornosc na imidazolinon i hoduje sie te komórki gospodarza w warunkach umozliwiajacych ekspresje enzymu. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekspresji enzymu AHAS o specyficznej oporności na imidazolinon w komórkach gospodarza.

Stosowanie herbicydów w rolnictwie jest obecnie szeroko rozpowszechnione. Chociaż istnieje znaczna liczba dostępnych związków, które skutecznie niszczą chwasty, nie wszystkie jednak herbicydy mogą selektywnie działać na niepożądane rośliny występujące wśród roślin uprawnych będąc również nietoksycznymi dla zwierząt. Często konieczny jest wybór związków, które są po prostu mniej toksyczne dla roślin uprawnych niż dla chwastów. W celu przezwyciężenia tego problemu badania rolnicze zogniskowały się głównie na uzyskaniu roślin uprawnych opornych na herbicydy.

Ważnym aspektem wytworzenia oporności na herbicydjest zrozumienie sposobu działania herbicydu a następnie taka manipulacja uzależnionym szlakiem biochemicznym w roślinach uprawnych, aby uniknąć efektu inhibitowania przy jednoczesnym utrzymaniu przez roślinę jej normalnej biologicznej funkcji. Jedno z pierwszych odkryć biochemicznego mechanizmu działania herbicydów dotyczyło serii niespokrewnionych strukturalnie związków herbicydowych imidazolinonów, sulfonylomoczników i triazolopirymidyn. Obecnie wiadomo (Shaner i wsp., Plant Physiol. 76, 545 - 546, 1984; opis patentowy USA nr 4 761 373), że każdy z tych herbicydów hamuje wzrost roślin przez zakłócenie zasadniczego enzymu potrzebnego· do wzrostu roślin, syntazy acetohydroksykwasu (AHAS; zwanej także syntazą acetomleczanową lub ALS). AHAS jest potrzebna do syntezy aminokwasów izoleucyny, leucyny i waliny.

Wiadomo, że enzym AHAS występuje w roślinach wyższych; znaleziono go również w różnych mikroorganizmach, takich jak drożdże Saccharomyces cerevisiae i bakterie jelitowe, Escherichia coli i Salmonella typhimurium. Dobrze zostały także scharakteryzowane genetyczne podstawy wytwarzania normalnej AHAS w kilku z tych gatunków. Na przykład, zarówno w E. coli jaki w S. typhimurium występujątrzy izozymy AHAS; dwaz nich są wrażliwe naherbicydy, natomiast trzeci nie jest. Każdy z tych izomerów zawiera jedną dużą i jedną małą podjednostkę białkową; mapują się one w operonach I1vIH, I1vGM i I1vBN. U drożdży pojedynczy izozym AHAS został zamapowany w locus ILV2. W każdym przypadku zostały zmapowane formy wrażliwe i oporne oraz oznaczone zostały sekwencje dla różnych alleli (Friden i wsp., Nucl. Acid Res. 13: 3979-3993. 1985; Lawther i wsp., PNAS USA 78: 922-928,1982; Squires i wsp., Nucl.

170 616

Acids Res. 11: 5299-5313, 1983; Wek i wsp., Nucl. Acids Res. 13: 4011-4027, 1985; Falco i Dumas, Genetics 109, 21-35, 985; Falco i wsp., Nucl. Acids Res 13: 4011-4027, 1985).

W tytoniu funkcja AHAS jest kodowana przez dwie niezwiązane geny, SuRA i SuRB. Obydwa geny są zasadniczo identyczne w dojrzałym białku zarówno na poziomie sekwencji nukleotydowej jak i na poziomie aminokwasów, chociaż N-końcowy przypuszczalny region warunkujący translokację przez błony różni się bardziej zasadniczo (Lee i wsp., EMBO J., 7, 1241-1248, 1988). Z kolei Arabidopsis ma pojedynczy gen AHAS, który również został całkowicie zsekwencjonowany (Mazur i wsp.. Plant Physiol. 85, 1110-1117, 1987).

Porównanie sekwencji genów AHAS u roślin wyższych wskazuje na wysoki poziom konserwatywności pewnych regionów sekwencji, mianowicie istnieje co najmniej 10 regionów konserwatywności sekwencji. Uprzednio już przypuszczano, że te konserwatywne regiony są krytyczne dla funkcjonowania enzymu i że utrzymanie tej funkcji jest uzależnione od znacznej konserwatywności sekwencji.

Ostatnio doniesiono (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 013 659), że mutanty wykazujące oporność na herbicydy posiadają mutacje co najmniej w jednym aminokwasie w jednym lub więcej z tych konserwatywnych regionów. Szczególnie wykazano, że substytucja pewnych aminokwasów w miejsce aminokwasu typu dzikiego w tych specyficznych miejscach sekwencji AHAS jest tolerowana i faktycznie powoduje powstanie oporności na herbicydy u roślin z taką mutacją, z jednoczesnym utrzymaniem funkcji katalitycznej. Opisane mutacje kodują albo krzyżową oporność na imidazolinony i sulfonylomoczniki albo specyficzną oporność na sulfonylomoczniki ale nie odkryto specyficznej selektywności na lmidazolin. Wykazano, że mutacje te zachodzą w obydwu loci SuRA i SuRB u tytoniu; podobne mutacje wyizolowano z Aradopsis i drożdży.

Donoszono o specyficznej oporności na imidazolinon u kilku jeszcze roślin. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 761 373 ogólnie opisano zmienioną AHAS jako podstawę oporności na herbicydy u roślin, a zwłaszcza ujawnione są pewne linie kukurydzy opornej na imidazolinon. Haughn i wsp. (Mol.Gen.Genet. 211:266-271, 1988) opisali występowanie podobnego fenotypu u Aradopsis. Sathasivan i wsp. (Nuci. Acid Res., 18:2188, 1990) zidentyfikowali specyficzną oporność na imidazolinon u Arabidopsis jako opartą na mutacji w pozycji 653 w normalnej sekwencji AHAS. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wyizolowano gen kodujący specyficzną oporność na imidazolinon z jednoliściennych i określono, że jest związany z substytucją pojedynczego aminokwasu w sekwencji aminokwasowej AHAS u jednoliściennych typu dzikiego.

Według wynalazku sposób ekspresji enzymu AHAS o specyficznej oporności na imidazolinon, w komórkach gospodarza polega na tym, że komórki gospodarza transformuje się sekwencją kwasu nukleinowego kodującą funkcjonalny enzym AHAS kukurydzy, w którym w stosunku do enzymu AHAS kukurydzy typu dzikiego występuje substytucja aminokwasu w pozycji 621 nadająca enzymowi specyficzną oporność na imidazolinon i hoduje się te komórki gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję enzymu.

W sposobie według wynalazku stosuje się nowe sekwencje kwasu nukleinowego kodujące funkcjonalne enzymy AHAS kukurydzy niewrażliwe na herbicydy imidazolinonowe. Sekwencje te obejmująmutację w kodonie kodującym aminokwas serynę w pozycji 621 w sekwencji AHAS kukurydzy. W korzystnym rozwiązaniu seryna jest zastąpiona asparaginą, ale inne substytucje seryny obejmują kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, glutaminę i tryptofan. Chociaż stosowane w sposobie według wynalazku sekwencje pochodzą z kukurydzy są użyteczne w metodach wytwarzania komórek opornych na imidazolinon innych typów roślin, które obejmują transformowanie docelowej komórki roślinnej przy pomocy jednej lub więcej zmienionych sekwencji. Alternatywnie, do wytwarzania mutantów w komórkach roślinnych lub nasionach zawierających sekwencję kwasu nukleinowego kodującego AHAS niewrażliwy na imidazolinon wykorzystuje się mutagenezę. Ze zmutowanych komórek roślinnych wyizolowanych z hodowli tkankowej regeneruje się następnie rośliny, które mają cechę oporności lub niewrażliwości na imidazolinon.

Dostępność tych nowych opornych na herbicydy roślin umożliwia wprowadzenie nowych metod hodowli roślin uprawnych w obecności imidazolinonów. Zamiast hodowli roślin nieopor4

170 (616 nych pola można obsadzać roślinami opornymi uzyskanymi sposobem według wynalazku przez mutację lub transformację zmutowanymi sekwencjami i obszary uprawne traktować rutynowo herbicydami bez żadnego uszkodzenia roślin uprawnych.

Zmutowane kwasy nukleinowe dostarczają również nowych markerów selekcyjnych do stosowania w doświadczeniach nad transformacją. Sekwencja kwasu nukleinowego kodującą oporną AHAS przed przeniesieniem do komórki gospodarza jest związana z drugim genem i w postaci takiej całej konstrukcji jest wprowadzana do gospodarza metodą transformacji. Komórki, które przypuszczalnie zostały stransformowane hoduje się następnie w obecności hamujących ilości herbicydu; komórki, które przeżyły będą z dużym prawdopodobieństwem posiadały nabyty drugi gen będący przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, gen opornej AHAS może być kotransformowany na niezależnym plazmidzie z genem, który jest przedmiotem zainteresowania, w wyniku czego można spodziewać się, że około 50% wszystkich transformantów otrzymało obydwa geny.

W opisie i zastrzeżeniach stosuje się następujące definicje:

Czynny lub normalny enzym AHAS jest to enzym zdolny do katalizowania pierwszego etapu szlaku syntezy podstawowych aminokwasów, izoleucyny, leucyny i waliny. Sekwencja AHAS typu dzikiego jest to sekwencja obecna we wrażliwym na imidazolinon członku danego gatunku. Roślina oporna jest to roślina, która wytwarza zmutowany ale czynny enzym AHAS i która jest zdolna do osiągnięcia dojrzałości przy wzroście w obecności normalnie hamujących poziomów imidazolinonu. Termin oporny w znaczeniu tu stosowanym obejmuje również rośliny tolerancyjne, tj. takie, które fenotypowo wykazują ujemne ale nie letalne reakcje na imidazolinon.

Na figurze 1 przedstawiona jest aktywność enzymu AHAS w 10-dniowych siewkach kukurydzy (linie kukurydzy A619 lub XI12) w obecności imazetapyru (Pursuii.™ A) lub chlorsulfuronu (Oust ‘^VB). Aktywność AHAS opornej na herbicyd oblicza się jako procent aktywności AHAS w nieobecności inhibitora. Standardowy błąd między doświadczeniami wynosi 10%.

Na figurze 2 przedstawiona jest analiza Southcma genomowych klonów w fagu EMBL3. Fagi 12-1A (z W22), 12-7A, 18-8A, 12-11 i 12-17A (z XI12) trawi się XbaI i Sali, rozdziela się na 1% żelu agarozowym, przenosi się na nitrocelulozę i hybrydyzuje się z fragmentem cDNA AHAS jako sondą.

Na figurze 3 przedstawiona jest analiza Southema genomowego DNA z linii kukurydzy XI12, XA17, QJ22, A188 i B73. DNA trawi się XbaI, rozdziela się na 1% żelu agarozowym, przenosi się na nitrocelulozę i hybrydyzuje się z fragmentem cDNA jako sondą.

Na figurze 4 przedstawiona jest mapa restrykcyjna plazmidu pCD8A. Zmutowany gen AHAS z XI12 był subklonowany jako fragment o długości 8 kz uzyskany za pomocą PstI do wektora pKS(+). Położenie i orientacja genu AHAS jest wskazana strzałką. Miejsca restrykcji PstI, XhoI, HindIII, XbaI i CiaI są oznaczone symbolami.

Figura 5 przedstawia żel sekwencjonujący nukleotydy niekodującego pasma (A) i sekwencji dwuniciowego DNA (B) AHAS klonów W22/4-4, B73/10-4 i XI12/8A w regionie aminokwasów 614 do 633. Pozycja tranzycji cytozyny w tymidynę jest wskazana strzałką.

Na figurze 6 przedstawione są sekwencje nukleotydową i wydedukowana aminokwasowa zmutowanego genu AHAS XI12/8A.

Na figurze 7 przedstawiony jest szereg sekwencji genów XI12/8A, B73/7-4 i W22/1A als2. (*) oznacza zmianę zasady powodującej mutację w pozycji 621, (#) oznacza różnice w stosunku do sekwencji B73/7-4, a (>) oznacza zmiany utajone.

Na figurze 8 przedstawione są sekwencje aminokwasowe i szereg genów XI12/8A, B73/7-4 i W22/1A als2. (*) oznacza mutację w pozycji 621, (#) oznacza różnice w stosunku do sekwencji B73/7-4 a (>) oznacza zmiany utajone.

Gen stosowany w sposobie według wynalazku został wyizolowany z linii kukurydzy XI12 (nasiona zdeponowano w American Type Culture Collection pod numerem 75051) i wstawiony do plazmidu pXI12/8A (zdeponowanego w American Type Culture Collection pod numerem 68643). Może być także wyizolowany z dowolnego innego mutanta ze specyficzną opornością

170 616 herbicydową na imidazolinon, takiego jak linia kukurydzy QJ22 (zdeponowana jak kultura komórkowa w American Type Culture Collection pod numerem 40129) lub z różnych roślin pszenicy (nasiona zdeponowane w American Type Culture Collection pod nr 40994, 40995, 40996 lub 40997). Tworzy się bibliotekę genonowego DNA, np. w fagu EMBL-3 z DNA z jednego z mutantów opornych na imidazolinon, korzystnie z mutanta, który jest homozygotyczny pod względem cechy oporności i poddaje się selekcji za pomocą sondy, która obejmuje całą lub część sekwencji AHAS typu dzikiego.

W kukurydzy gen AHAS znaleziono z dwóch loci als 1 i als 2 (Burr i Burr, Trends in Genetics 7:55-61, 1991); homologia pomiędzy tymi dwoma loci na poziomie nukleotydów wynosi 95%. Mapuje się mutację w Xl12 w locus als 2 na chromosomie 5, natomiast niezmutowany gen mapuje się w locus als 1 na chromosomie 4 (Newhouse i wsp., Imidazolinone resistant crops, In The Imidazolinone Herbicides. Shower i O’Connor (wyd.), CRC Press, Boca Raton, FL, in Press). Za pomocą analizy Southema identyfikuje się niektóre klony zawierające zmutowany gen als 2 i niektóre zawierające niezmutowany gen als 1. Oba typy subklonuje się do wektorów sekwencjonujących i sekwencjonuje się metodą dideoksy.

Sekwencjonowanie i porównanie genów AHAS typu dzikiego i mutantów wykazuje różnicę w jednym nukleotydzie w kodonie kodującym aminokwas w pozycji 621 (fig. 5). Konkretnie, kodon AGT kodujący serynę w typie dzikim jest zmieniony na AAT kodujący asparaginę w zmutowanym AHAS (fig. 8). Zmutowany gen AHAS jest jednakże podobny do genu typu dzikiego, ponieważ koduje białko z 638 aminokwasów, z których pierwszych 40 stanowi peptyd sygnałowy, który, jak sądzi się, jest odszczepiany podczas transportu do chloroplastu in vivo. Wydaje się, że sekwencja genu niezmutowanego als 1 z XI12 jest identyczna jak genu als 1 z B73.

Zmutowane geny stosowane w sposobie według wynalazku nadają oporność na herbicydy imidazolinonowe ale nie nadają oporności na herbicydy sulfonylomocznikowe. Typy herbicydów, na które można nadać oporność sposobem według wynalazku, są opisane np. w opisach patentowych USA nr nr 4 188 487, 4 201 565, 4 221 586, 4 297 128, 4 554 013, 4 608 079, 4 638 068, 4 747 301, 4 650 514, 4 698 092, 4 701 208, 4 709 036, 4 752 323, 4 772 311 i 4 798 619.

Dla fachowca zrozumiałe jest, że sekwencja kwasu nukleinowego przedstawiona na fig. 6 nie jest jedyną sekwencją, którą można stosować do nadawania specyficznej oporności na imidazolinon. Rozważane są także te sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują identyczne białko, ale które, z powodu, degeneracji kwasu genetycznego mają inną sekwencję nukleotydową. W zakres wynalazku wchodzi także stosowanie genów kodujących sekwencje AHAS, w których występuje określona powyżej mutacja, ale które kodują także jedną lub więcej utajonych zmian aminokwasów w częściach cząsteczki nie obejmujących funkcji oporności lub funkcji katalitycznej. Rozważa się także sekwencje genów z innych roślin jednoliściennych opornych na imidazolinon, które mają mutację w odpowiednim regionie sekwencji. Na przykład, rozważa się także zmiany w sekwencji genu, które prowadzą w rezultacie do produkcji chemicznie równoważnego aminokwasu w danym miejscu; tak więc kodon alaniny, hydrofobowego aminokwasu, można łatwo zastąpić kodonem kodującym inną resztą hydrofobową, taką jak glicyna lub resztę bardziej hydrofobową, taką jak walina, leucyna lub izoleucyna.

Podobnie, można przypuszczać, że zmiany, w których jedna ujemnie naładowana reszta jest zastąpiona inną, tak jak kwas asparginowy przez kwas glutaminowy lub jedna dodatnio naładowana reszta inną, tak jak lizyna przez argininę, także dają produkt równoważny biologicznie. W zakres wynalazku wchodzą też geny chimeryczne, w których zastąpiona część genu AHAS kukurydzy jest zrekombinowana z niezmienionymi częściami normalnych genów AHAS z innych gatunków. Wobec tego w opisie i zastrzeżeniach stosowany termin gen AHAS kukurydzy oporny specyficznie na imidazolinon obejmuje też każde z tych alternatywnych rozwiązań, jak również sekwencję na fig. 5.

Wyizolowane sekwencje DNA kodujące AHAS są użyteczne w sposobie według wynalazku do transformowania docelowych roślin uprawnych i nadawania w ten sposób oporności na imidazolinon. Znanych jest wiele technik pozwalających na przeprowadzenie bezpośredniej

170 616 lub pośredniej transformacji roślin wyższych przy pomocy egzogennego DNA i każda metoda, za pomocą której nowa sekwencja może być włączona do genomu gospodarza i stabilnie dziedziczona przez jego potomstwo, jest brana pod uwagę w niniejszym wynalazku. Cecha specyficznej oporności na imidazolinon jest dziedziczona jako pojedynczy dominujący gen jądrowy. Poziom oporności na imidazolinon wzrasta, gdy gen jest w stanie homozygotycznym; tak np. rośliny kukurydzy mają poziom oporności około 1000 razy wyższy niż roślina nieopoma. Rośliny heterozygotyczne w odniesieniu do tej cechy jednak mają oporność około 50-500 razy większą niż rośliny nieoporne.

Transformację komórek roślinnych można przeprowadzić przy użyciu wektorów. Powszechną metodą przeprowadzenia transformacji jest zastosowanie Agrobacterium tumefaciens dla wprowadzenia obcego genu do docelowej komórki roślinnej. Na przykład, zmutowaną sekwencję AHAS wprowadza się do wektora plazmidowego zawierającego sekwencje graniczne w T-DNA plazmidu Ti. Plazmidem tym następnie transformuje się E. coli. Przeprowadza się koniugację trójrodzicielską pomiędzy tym szczepem, szczepem Agrobacterium zawierającym rozbrojony plazmid Ti niosący funkcje wirulencji potrzebne do skutecznego przeniesienia sekwencji T-DNA zawierających AHAS do chromosomu rośliny docelowej oraz drugim szczepem E. coli zawierającym plazmid posiadający sekwencje konieczne dla uruchomienia transferu konstruktu AHAS z E. coli do Agrobacterium. Zrekombinowany szczep Agrobacterium zawierający sekwencje niezbędne dla transformacji rośliny, wykorzystuje się do zakażenia krążków liściowych. Krążki hoduje się na pożywce selekcyjnej i z dobrym wynikiem identyfikuje się stransformowane regeneranty. Otrzymane rośliny są oporne na działanie herbicydu, gdy rosną w jego obecności. Wirusy roślinne również mogą służyć jako środki do transferu egzogennego DNA.

Można także stosować bezpośrednie pobieranie komórek roślinnych. Zwykle protoplasty rośliny docelowej umieszcza się w hodowli w obecności DNA, który ma być przeniesiony, a czynnik wspomagający pobieranie DNA przez protoplast absorbuje się na ich powierzchni. Środkiem nadającym się do tego jest poliglikol etylenowy lub fosforan wapnia.

Alternatywnie, pobieranie DNA można stymulować metodą elektroporacji. W tej metodzie stosuje się impuls elektryczny w celu okresowego otwarcia porów w błonie komórkowej protoplastów, po czym DNA z otaczającego roztworu jest wciągany do komórki przez pory. Podobnie można stosować mikroiniekcję w celu dostarczenia DNA bezpośrednio do jądra komórkowego.

W każdej z powyższych technik transformacja zachodzi w komórce roślinnej w hodowli. Po transformacji komórki roślinne muszą być zregenerowane w całe rośliny Techniki regeneracji dojrzałych roślin z hodowli kalusa lub protoplastu są dobrze poznane dla wielu różnych gatunków (patrz np. Handbook of Plant Cell Culture, t. 1 -5,1983-1989, McMillan, N.Y.). Zatem, po przeprowadzeniu transformacji, zregenerowanie dojrzałych roślin ze stransformowanych komórek roślinnych jest już w zakresie znanej wiedzy.

Znane są także metody alternatywne, które do transformacji nie wymagają, koniecznie użycia izolowanych komórek, a więc i technik regeneracji. Takie metody zwykle określa się jako balistyczne lub metody przyspieszaniacząsteczki; w takich metodach cząstki, metalu pokryte DNA wprowadza się z dużą prędkością do komórek roślinnych albo wstrzeliwując je, z ładunkiem prochu strzelniczego (Klein i wsp., Naturę 327, 70-73, 1987) albo stosując wyładowania elektryczne (EPO 270 356). W ten sposób można trwale stransformować żądaną sekwencją DNA komórki roślinne w hodowli lub roślinne organy lub komórki reprodukcyjne, np. pyłek.

Dla niektórych roślin jednoliściennych i, dwuliściennych korzystną metodą transformacji jest bezpośrednie pobieranie DNA. Np. w kukurydzy ścianę komórkową komórek w hodowli trawi się w buforze zawierającym jeden lub· więcej, enzymów degradujących ścianę komórkową, takich jak celuloza, hemiceluloza i pektynoza, w celu wyizolowania żywych protoplastów. Protoplasty przemywa się kilkakrotnie, aby usunąć enzymy i miesza się z wektorem plazmidowym zawierającym gen będący przedmiotem zainteresowania. Komórki można transformować albo stosując PEG (np. 20% PEG 4000) albo przez elektroporację. Protoplasty umieszcza się na filtrze nitrocelulozowym i hoduje się w pożywce z osadzonymi w niej komórkami kukurydzy

170 616 działającymi jako hodowle zasilające. Po 2-4 tygodniach hodowle z filtru nitrocelulozowego przenosi się na pożywkę zawierającą około 0,32 μΜ imidazolinonu i utrzymuje się w pożywce przez 1-2 miesiące. Filtry nitrocelulozowe z komórkami roślinnymi przenosi się do świeżej pożywki z herbicydami i dożywia się komórki do 2 tygodni. Nie stransformowane komórki przestają rosnąć i po kilku tygodniach obumierają.

Sposób według wynalazku może mieć zastosowanie do transformowania dosłownie każdego typu roślin, zarówno jednoliściennych jak i dwuliściennych. Do roślin uprawnych, które można transformować nadając im oporność na herbicydy, należą: kukurydza, pszenica, ryż, proso, owies, jęczmień, sorgo, słonecznik, bataty, lucerna siewna, burak cukrowy, rośliny z gatunku Brassica, pomidor, papryka, soja, tytoń, melon, dynia, ziemniak, orzech ziemny, groch, bawełna i kakao. Nowe sekwencje można także stosować do transformowania gatunków roślin ozdobnych takich jak róża i leśnych, takich jak sosna i topola.

Nowe sekwencje są użyteczne także jako markery selekcyjne w badaniach genetycznych roślin. Np. transformacji roślin sekwencje kodujące oporność na imidazolinon można byłoby połączyć z tym genem, który ma być użyty do transformacji docelowej komórki roślinnej wrażliwej na imidazolinon. Konstrukcję zawierającą zarówno gen będący przedmiotem zainteresowania jak i sekwencję oporności na imidazolinon wprowadza się do komórki roślinnej, po czym komórki te hoduje się w obecności inhibitującej ilości imidazolinonu. Alternatywnie, drugi gen, będący przedmiotem zainteresowania, można kotransformować do komórek gospodarza w oddzielnym plazmidzie. Komórki roślinne, które przeżyły takie działanie, przypuszczalnie otrzymały gen oporności oraz gen będący przedmiotem zainteresowania, a zatem tylko transformanty przeżywają proces selekcji w obecności herbicydu. Skuteczną transformację i ekspresję obu genów można potwierdzić metodą hybrydyzacji Southema genomowego DNA, metodą PCR lub przez obserwację fenotypowej ekspresji genów.

Wynalazek ilustrują następujące nieograniczające przykłady.

Przykład I. Potwierdzenie oporności na herbicyd całych roślin w XI12.

Rośliny XI12 w stadium liścia V3 (4-5 liści, z których 3 mają widoczne języczki) traktuje się herbicydami przez 10 dni. Imazetapyr stosuje się w dawkach 20(01,50(0 25(0 125 i 62,5 g/ha, chlorsulfuron - 32,16,8,4 i 2 g/ha. Rośliny traktuje się po wzejściu stosując objętość opryskową 400 l/ha. Po opryskaniu rośliny umieszcza się w szklarni w celu dalszej obserwacji.

Imazetapyr we wszystkich dawkach nie działał na rośliny XI12, jednak nie zauważono widocznego wzrostu oporności na chlorsulfuron. Zatem XI12 wykazują selektywną oporność na imidazolinon na poziomie całej rośliny (patrz. fig. 1).

Jak widać także XI12 odziedziczyły oporność jako pojedyńczy dominujący allel genu jądrowego. Heterozygotyczne oporne XI12 są samozapylające się a uzyskane potomstwo segreguje się w stosunku 3 oporne : 1 podatna, jak spodziewano się dla pojedynczego dominującego allelu genu jądrowego. W tym badaniu segregujące siewki opryskuje się po wzejściu letalną dawkę imazetapyru (125 lub 250 g/ha), po czym sporządza się opisany powyżej protokół oprysku aby ustalić segregację oporności.

Przykład II. Ekstrakcja AHAS

Nasiona XI12 wysiewa się do ziemi w szklarni, w której utrzymuje się je w temperaturze 80 C w ciągu dnia i nocy przez 15-godzinny fotookres. Rośliny ścina się po 2 tygodniach po posianiu. Do ekstrakcji AHAS wykorzystuje się podstawową część pędu. 5 g tkanki proszkuje się w ciekłym azocie, po czym homogenizuje się w buforze do próby na AHAS, który stanowi 100 mM buforu-fosforanu potasu (pH 7,5), zawierającego 10 mM pirogronianu, 5 mM MgCl2. 5 mM EDTA 100 μN FAD (dinukleotyd flawinoaldcninowy), 1 mM waliny, 1 mM leucyny, 10% gliceryny i 10 mM cysteiny. Homogenizat odwirowuje się przy 10 000 obr./min. przez 10 minut i 3 ml supematantu nanosi się zrównoważoną kolumnę Bio-Rad Econo-Desalting (10 DG) i eluuje się 4 ml buforu do próby na AHAS.

Aktywność AHAS mierzy się przez ocenę produktu, acetomleczanu, po konwersji do acetoiny przez dekarboksylację w obecności kwasu. Standardowe mieszaniny reakcyjne zawierają enzym w 50 mM fosforanu potasu (pH 7,0) zawierającego 100 mM pirogronianu sodu, 10 mM MgCl2,1 mM pirofosforanu tiaminy, 10 μM FAD i odpowiednie stężenia różnych

170 616 inhibitorów. Mieszaninę taką inkubuje się w 37°C w ciągu 1-3 godzin zależnie od doświadczenia. Pod koniec okresu inkubacji reakcję zatrzymuje się dodając H2SO4 do końcowego stężenia kwasu w probówce 0,85%. Produkt reakcji pozostawia się w 60°C przez 15 minut w celu dekarboksylacji. Wytworzoną acetomę określa się przez inkubację z kreatyną (0,17%) i 1-naftolem (1,7% w 4 N NaOH). Absorpcję barwnego kompleksu mierzy się przy 520 nm.

Aktywność AHAS z B73, A619 lub innych linii kukurydzy typu dzikiego jest bardzo wrażliwa na inhibicję przez imazetapyr (PURSUIT) przy T 50 1 μM (patrz fig. 1). W przeciwieństwie do tego XI12 wykazuje 70-80% aktywności enzymu przy najwyższych stężeniach (100 μΜ) PURSUITU lub ARSENAŁU (imazepyr) i około 70% w obecności SCEPTERU (imazechin). Wynik ten wskazuje na 100-krotny wzrost tolerancji aktywności AHAS z XI12 in vitro na A619. Wrażliwość aktywności AHAS z dwóch linii na sulfonylomoczniki ma różny obraz. W obecności OUST (sulfometuron metylu) przy 100 nM aktywność AHAS z XI12 wynosi tylko 15-20%. Aktywność AHAS z A619 w obecności OUST wynosi 5-10%, a w obecności PURSUITU 15-20% (fig. 1).

Przykład III. Klonowanie genów AHAS z XI12.

Wysiewa się nasiona mutanta XI12 otrzymanego z linii hodowli tkankowej kukurydzy opornej na imidazolinon; wydaje się, że w otrzymanych z nich roślinach zmutowany fenotyp AHAS uległ segregacji. W celu uzyskania homozygotycznego opornego materiału siewnego, przeprowadza się samozapylenie populacji roślin mutantów XI12. Po selekcji na oporność herbicydową przez 3 kolejne sezony wzrostu nasiona są homozygotyczne w stosunku do zmutowanego genu AHAS. Zbiera się homozygotyczne nasiona i używa się je w celu wyhodowania siewek, które mają być wykorzystane do izolacji genu AHAS.

DNA ekstrahuje się z 7-dniowych, bladych z powodu braku światła, siewek z homozygotycznej linii XI12. 60 g tkanki roślinnej sproszkowuje się w ciekłym azocie i przenosi się do 180 ml buforu do ekstrakcji DNA (1,4 M NaCl, 2,0% Ctab (bromek heksadecylotrimetyloamoniowy), 100 mM Tris-Cl pH 8,0,20 mM EDTA, 2% merkaptoetanol) i 54 ml wody. Po inkubacji w 50 - 60°C przez 30 minut zawiesinę ekstrahuje się równą ilością chloroformu. DNA wytrąca się dodatkiem równej ilości buforu do wytrącania (1% Ctab, 50 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM EDTA). W celu oczyszczenia genomowego DNA przeprowadza się wirowanie z wysoką prędkością w 6,6 M CsCl i bromku etydyny (wirnik Ti80, 50 000 obr./min., 20°C, 24 godziny). Oczyszczony DNA ekstrahuje się butanolem nasyconym solą i dializuje się przez 25 godzin wobec 3 zmian 1 1 buforu do dializy (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl). Stężenie genomowego DNA z XI12 określone spektrofotometrycznie wynosi 310 mg/ml, wydajność 0,93 mg.

Genomowy DNA XI12 wykorzystuje się do utworzenia genomowej biblioteki w fagu EMBL-3. DNA częściowo trawi się MboI i rozdziela się fragmenty na gradiencie sacharozy aby otrzymać fragmenty w zakresie wielkości 8-22 kz przed klonowaniem do EMBL-3 w miejscu BamHI. Po otrzymaniu 2,1 x 10” niezależnych klonów, bibliotekę amplifikuje się jeszcze raz. Oznaczone miano biblioteki wynosi 9x10^w pfu/ml.

Aby otrzymać sondy do analizy biblioteki XI12, bibliotekę cDNA z W22 (typu dzikiego) w gtll, z firmy Clontech Inc., CA, przeszukuje się 800 nt sondą BamHI wyizolowaną z genomowego klonu AHAS z Arabidopsis. Fagi rozmieszcza się na płytce z gęstością 50 000 pfu/15 cm płytkę, przenosi się na filtry nitrocelulozowe, poddaje się wstępnej hybrydyzacji w 6 x SSC, 0,2% SDS przez 2 godziny i hybrydyzuje się z sondą AHAS z Arabidopsis w 6 x SSC, 0,2% SDS przez noc. Zidentyfikowany jeden fag dodatni oczyszczono i wykorzystano do subklonowania 1,1 kz fragmentu EcoRI. 1,1 kz fragment EcoRI subklonuje się do pGemA-4 i używa się jako sondy do identyfikacji genów AHAS z XI12.

Bibliotekę genomową Xl12 umieszcza się na 12-15 cm płytkach (w stężeniu 50 000 pfu/płytkę) i przeszukuje się sondą cDNA AHAS z W22. Filtry poddaje · się wstępnej hybrydyzacji (2 godziny) i hybrydyzuje się (przez noc) w buforze Churcha (0,5 M fosforan sodu, 1 mM EDTA, 1% BSA, 7% SDS) w 65°C i przemywa się w 65°C w 2 x SSC, 0,2% SDS i 0,3 x SSC, 0,2% SDS. Ze wszystkich przeszukanych 7,5 x 10” pfu otrzymuje się 12 dodatnich łysinek i 5 dodatnich klonów oczyszcza się i izoluje metodą według Chisholma (BioTechniques 7,21 -23,1989).

170 616

Analiza Southema (fig. 2) wykazała, że klony fagowe reprezentowały dwa typy klonów AHAS: klony typu-1, które zawierają jeden duży fragment XbaI (6,5 kz) hybrydyzujący z sondą cDNA z AHAS, klony typu-2, które zawierają dwafragmenty 2,7 i 3,7 kz hybrydyzujące z sondą cDNA z AHAS. Analiza Southema genomowego DNA z XI12 wykazała, że fragmenty XbaI otrzymane przez trawienie genomowego cDNA z AHAS odpowiadają fragmentom XbaI zidentyfikowanym w klonach fagowych XI12 (fig. 3). Trawienie restrykcyjne i analiza Southema wykazują, że z 5 klonów AHAS jeden klon stanowi zmutowane geny als2 a cztery stanowią geny alsl.

Geny AHAS odpowiadające zmutowanemu locus na chromosomie 5 (klon 12/8A) i niezmutowanemu locus na chromosomie 4 (klon 12/17A) subklonuje się jako fragment Pstl (klon 12/8A) lub jako fragment XbaI (12/17A) do wektora sekwencjonującego pBluescript II KSm 13(+) )pKS+; Stratagene). Obydwa fragmenty Xba! o długości 2,7 kz i 3,7 kz z faga 12/17A zawierają jedną kompletną kopię genów AHAS, które zidentyfikowano. Każdą sekwencję otrzymuje się metodą sekwencjonowania dideoksy (zestawy do sekwencjonowania Pharmacia T7) z użyciem primerów komplementarnych do sekwencji kodującej AHAS.

Stosuje się metody ekstrakcji DNA, klonowania biblioteki genomowej i przeszukiwania biblioteki jak opisane w odniesieniu do genomowego DNA XI12. Geny AHAS B73 subklonuje się do wektora sekwencjonującego pKS+jako fragmenty XbaI i sekwencjonuje się. Sekwencję otrzymuje się metodą sekwencjonowania dideoksy stosując primery komplementarne do sekwencji kodującej AHAS, jak opisano w odniesieniu do genów AHAS SI12.

Poddaje się selekcji bibilotekę genomową W22 w EMBL3 z firmy Clontech Inc., CA. Fagi umieszcza się na płytkach z gęstością 50 000 pfu/17,78 cm płytkę, przenosi się na filtry nitrocelulozowe i hybrydyzuje się z sondą złożoną z cDNA AHAS z W22 opisaną powyżej (warunki prehybrydyzacji i hybrydyzacji: 6 x SSC, 0,5% SDS, 1 x Denhard 100 mg/ml DNA z grasicy cielęcej; 65°C; warunki przemywania: 3X x SSC, 0,2% SDS przez 2 godziny w 65°C i 0,3 x SSC, 0,2% przez 2 godziny). Zidentyfikowano i dalej oczyszczano 2 fagi dodatnie (12/1A i 12/4-4). '

Klon genomowy z W22 12/1A subklonuje się jako dwa fragmenty SalI o długości 0,78 kz (pGemA-4) i 3,0 kz (pGemA-14; Promega) do wektora pGem-A2 oraz jako fragment XbaI o długości do wektora pKS+ (pCD200). Sekwencję kodującej nici genu AHAS z W22 otrzymuje się. przez sekwencjonowanie metodą dideoksy delecji nested (ang.) utworzonych z subklonów pGem A-14 i pGem A-4 faga 12-1 A. Sekwencję tę stosuje się w celu skonstruowania oligonukleotydów komplementarnych do niekodującej nici genu AHAS. Sekwencję nici niekodującej otrzymuje się przez sekwencjonowanie metodą dideoksy klonu pCD200 z użyciem primerów komplementarnych do nici kodującej. Na sekwencjach komplementarnych genu AHAS z W22 konstruuje się primery dla obu nici DNA, które stosuje się do sekwencjonowania genów AHAS wyizolowanych z biblioteki genomowej XI12 i B73.

Przykład IV. Klonowanie genów AHAS z QJ22.

Określono także sekwencję genu kodującego AHAS w linii kukurydzy QJ22, która jest selektywnie oporna na imidazolinony. Skonstruowano bibliotekę genomową QJ22 w wektorze EMBL3. Bibliotekę 800 000 fagów przeszukuje się za pomocą fragmentu SaII/ClaI z 850 nukleotydów, wyizolowanego z klonu AHAS (A-4) pochodzącego z linii kukurydzy typu dzikiego W22. Wybiera się pięć dodatnich fagów i poddaje się je drugiej selekcji w celu częściowego oczyszczenia fagów. Częściowo oczyszczone fagi poddaje się analizie PCR w celu określenia, czy któryś z klonów stanowi gen als 1 QJ22. Takie klony zidentyfikowano jako fragment Xbal o długości 3,7 kz ze specyficznym miejscem SmaI w pozycji 495. Druga selekcja wykazuje obecność jednego klonu dodatniego o takich właściwościach.

Produkt PCR oczyszcza się stosując handlowy zestaw (Magie PCR Preps) firmy Promega, a oczyszczony DNA sekwencjonuje się za pomocą układu sekwencjonującego z polimerazą Taq fmol, również firmy Promega. Analiza sekwencyjna obu nici DNA zmutowanego genu AHAS z QJ22 wykazuje tranzycję nukleotydów z G do A w kodonie dla aminokwasu 621. Ta mutacja jest identyczna jak mutacja widoczna w XI12, a pozostała sekwencja jest typowa dla genu als 1.

170 616

Porównano sekwencje zmutowanych genów AHAS z sekwencjami uzyskanymi z linii kukurydzy typu dzikiego B73 i W22 (fig. 7). Zmutowany gen z XI12 (XI12/8A) i zmutowany gen QJ22 oraz gen typu dzikiego są identyczne za wyjątkiem zmiany dla aminokwasu w pozycji 621, powodującej tranzycję jednego nukleotydu z AGT do AAT (fig. 8). Zmutowany gen XI12/8A z XI12 i gen typu dzikiego B73/7-4 wykazuje dodatkową różnicę 63. Z drugiej strony niezmutowany gen AHAS z XI12 sklonowany z XI12/17A jest całkowicie homologiczny z odpowiednim B73/10-2 w regionie kodującym dojrzałe białko AHAS (danych nie przedstawiono).

Następujące materiały biologiczne zostały zdeponowane w American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20857:

E. coli XLI Blue harboring plazmid pX12/8A zdeponowano 3 lipca 1991 r. pod nr ATCC 68643; nasiona kukurydzy XI12 zdeponowano 16 lipca 1991 r. pod nr ATCC 75051.

170 616

Analiza Southerna fagów wyizolowanych z banku ΧΙ12 EMBL 3

-O -O

σ co

VZl-2l £1-21

H-21

V8-2l

VZ-2l

Vl-2l φ

'c

Φ

v> ζ*»<* ‘,τ*, ,

-O	-O	-O
-SC	-SC	-SC
O	o	CO
uo	hS	O

QQ

CM o

Lu <X

CM

O

Lu

170 616

Analiza Southema genomowego DNA z wsobnych kukurydzy li ni

Xbal—

FIG. 3

Sonda: 1,1 kz EcoRI cDNA z

W 22

170 616 τ

170 616

W22/4-4 Β73/7-4 ΧΙ12/8Α

GATC GATC GATC

FIG. 5A

B

W22/1A B73/7-4 5'TAGTG3' sekwencja: 3'ATCTG5'

ΧΙ12/8Α sekwencja: 5'TAĄTG3'

3'ATTAC5‘

FIG. 5B

Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa zmutowanego genu AHAS z XI12

50 60 70 80 90

X X X X X X

ATG GCC ACC GCC GCC GCC GCG TCT ACC GCG CTC ACT GGC GCC ACT ACC GCT GCG Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala

100 110 120 130 140

XXX XX

CCC AAG GCG AGG CGC CGG GCG CAC CTC CTG GCC ACC CGC CGC GCC CTC GCC GCG

Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ala Ala

150 160 170 180 190

X X X X X

CCC ATC AGG TGC ICA GCG GCG TCA CCC GCC ATG CCG ATG GCT CCC CCG GCC ACC

Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro Met Ala Pro Pro Ala Thr

200 210 220 230 240 250

XX XXX X

CCG CTC CGG CCG TGG GGC CCC ACC GAT CCC CGC AAG GGC GCC GAC ATC CTC GTC Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val

260 270 280 290 300

XX XXX

GAG TCC CTC GAG CGC TGC GGC GTC CGC GAC GTC TTC GCC TAC CCC GGC GGC GCG Glu Ser Leu Glu Arg Cys Gly Val Arg Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

310 320 330 340 350 360

XXX XXX

TCC ATG GAG ATC CAC CAG GCA CTC ACC CGC TCC CCC GTC ATC GCC AAC CAC CTC Ser Met Glu Ile His Gin Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Ala Asn His Leu

370 380 390 400 410

XXX XX

TTC CGC CAC GAG CAA GGG GAG GCC TTT GCG GCC TCC GGC TAC GCG CGC TCC TCG Phe Arg His Glu Gin Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ser Ser

FIG.6A

171 616

42u 43u 440 450 460 χ χ χ x x

GGC CGC GIC GGC GTC TGC ATC GCC ACC ICC GGC CCC GGC GCC ACC AAC CTT GIC Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val

470 480 490 500 510 520

XX XXX X

TCC GCG CTC GCC GAC GCG CIG CIC GAI ICC GIC CCC AIG GIC GCC ATC ACG GGA Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Vat Ala Ile Thr Gly

530 540 550 560 570

XX XXX

CAG GIG CCG CGA CGC ATG ATT GGC ACC Gin Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Ihr

580 590 600

XXX

GAG GTC ACC CGC TCC ATC ACC AAG CAC

Glu Val Thr Arg Ser Ile Ihr Lys His

640 650 x x

ATC CCC CGC GIC GTG CAG GAG GCT TIC

Ile Pro Arg Val Val Gin Glu Ala Phe

690 700 710

XXX

CCG GTG CTT GTC GAC ATC CCC AAG GAC Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp

740 750 760

XXX

TGG GAC AAG CCC ATG AGT CIG CCT GGG Trp Asp Lys Pro Met Ser Leu Pro Gly

GAC GCC TIC CAG GAG ACG CCC ATC GTC Asp Ala Phe Gin Glu Thr Pro Ile Val

610 620 630

XXX

AAC TAC CTG GTC CTC GAC GTC GAC GAC Asn Tyr Leu Vat Leu Asp Val Asp Asp

660 670 680

XXX

TTC CTC GCC TCC TCT GGT CGA CCG GGG

Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly

720 730 x x

ATC CAG CAG CAG ATG GCG GTG CCT GTC

Ile Gin Gin Gin Met Ala Val Pro Val

770 780 790

XXX

TAC ATT GCG CGC CTT CCC AAG CCC CCT Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro

FIG.6B

800 810 820 830 840

XX XXX

GCG ACT GAG TTG CTT GAG CAG GIG CTG CGI CII Gil GGI GAA ICC CGG CGC CCI Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gin Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro

850 860 870 880 890 900

XXX XXX

GTT CTT TAT GTT GGC GGT GCG TGC GCA GCA TCT GGI GAG GAG ITG CGA CGC TTT Val Leu Tyr VaI Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe

910 920 930 940 950

XXX XX

GTG GAG CIG ACT GGA ATC CCG GIC ACA ACI ACI CTI AIG GGC CIC GGC AAC TTC

Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Vat Thr Ihr Thr Leu Het Gly Leu Gly Asn Phe

960 970 980 990 1000

X X X X X

CCC AGC GAC GAC CCA CIG TCT CIG CGC ATG CTA GGI ATG CAT GGC ACG GIG IAT

Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr

1010 1020 1030 1040 1050 1060

XX XXX X

GCA AAI IAT GCA GTG GAI AAG GCC GAT CTG TTG CTT GCA CTI GGI GIG CGG TTT Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Arg Phe

1070 1080 1090 1100 1110

XX XXX

GAT GAT CGT GTG ACA GGG AAG ATT GAG GCT TTT GCA AGC AGG GCT AAG ATT GTG Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val

1120 1130 1140 1150 1160 1170

XXX XXX

CAC GTT GAT ATT GAT CCG GCT GAG ATT GGC AAG AAC AAG CAG CCA CAT GTG TCC His Val Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gin Pro His Val Ser

FIG.6C

170 616

1180 1190 1200 1210 1220 χ X χ χ χ

ATC TGT GCA GAT GTT AAG CTT GCT TTG CAG GGC ATG AAT GCT CIT CTT GAA GGA

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gin Gly Het Asn Ala Leu Leu Glu Gly

1230 1240 1250 1260 1270

X X X X X

AGC ACA TCA AAG AAG AGC TTT GAC TTT GGC TCA TGG AAC GAT GAG TTG GAT CAG

Ser Thr Ser Lys Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu Leu Asp Gin

1280 1290 1300 1310 1320 1330

X Z XXX X

CAG AAG AGG GAA TTC CCC CTT GGG TAT AAA ACA TCT AAT GAG GAG ATC CAG CCA

Gin Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn Glu Glu Ile Gin Pro

1340 1350 1360 1370 1380

XX XXX

CAA TAT GCT ATT CAG GTT CTT GAT GAG CTG ACG AAA GGC GAG GCC ATC ATC GGC Gin Tyr Ala Ile Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Gly

1390 1400 1410 1420 1430 1440

XXX XXX

ACA GGT GTT GGG CAG CAC CAG ATG TGG GCG GCA CAG TAC TAC ACT TAC AAG CGG Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg

1450 1460 1470 1480 1490

X X X X X

CCA AGG CAG TGG TTG TCT TCA GCT GGT CTT GGG GCT ATG GGA TTT GGT TTG CCG

Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro

1500 1510 1520 1530 1540

X X X X X

GCT GCT GCT GGT GCT TCT GTG GCC AAC CCA GGT GTT ACT GTT GTT GAC ATC GAT

Ala Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Vał Asp Ile Asp

1550 1560 1570 1580 1590 1600 xx xxx x

GGA GAT GGT AGC TTT CTC ATG AAC GTT CAG GAG CTA GCT ATG ATC CGA ATT GAG Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Val Gin Glu Leu Aia Met ile Arg ile Giu

FIG.6D

170 616

1610 1620 1630 1640 1650

X X XXX

AAC CTC CCG GTG AAG GTC TTT GTG CTA AAC AAC CAG CAC CTG GGG ATG GIG GIG Aso Leu Pro Val Lys Vql Phe Val Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Vql Val

1660 1670 1680 1690 1700 1710

XXX XXX

CAG IGG GAG GAC AGG TTC TAT AAG GCC AAC AGA GCG CAC ACA TAC TIG GGA AAC Gin Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn

1720 1730 1740 1750 1760

XXX XX

CCA GAG AAT GAA AGI GAG ATA TAI CCA GAI ITC GTG ACG ATC GCC AAA GGG ITC

Pro Glu Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe

1770 1780 1790 1800 1810 x x x x x

AAC ATT CCA GCG GTC CGT GTG ACA AAG AAG AAC GAA GTC CGC GCA GCG ATA AAG

Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn Glu Val Arg Ala Ala He Lys

1820 1830 1840 1850 1860 1870

XX XXX X

AAG ATG CTC GAG ACT CCA GGG CCG TAC CTC TTG GAI ATA ATC GTC CCA CAC CAG Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile He Val Pro His Gin

1880 1890 1900 1910 1920

XX XXX

GAG CAT GTG TTG CCT ATG ATC CCT AAT GGT GGG GCT TTC AAG GAT ATG ATC CTG

Glu His Val Leu Pro Met He Pro Asn Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met He Leu

1930 1940 1950 1960

X X X X

GAT GGT GAT GGC AGG ACT GTG TAC TGATC TAAAA TCCAG CAAG

Asp Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr

FIG.6E

170 616

Sekwencja nukLeotydowa szeregu ΧΪ12/8Α . W'22/ΊΑ i b73/7-4

20 30 40 50 60

ΧΙ12/8Α AACCC TCGCG CCGCC TCCGA GACAG CCGCC GCAAC CAIGG CCACC GCCGC CGCCG CGTCT «22/1Α AACCC TCGCG CCGCC TCCGA GACAG CCGCC GCAAC CATGG CCACC GCCGC CGCCG CGTCT

11111 lilii 11111 11111 lilii lilii 11111 lilii 11111 11111 lilii 11111

B73/7-4 AACCC TCGCG CCGCC TCCGA GACAG CCGCC GCAAC CATGG CCACC GCCGC CGCCG CGTCT

11111 lilii 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 11111 lilii 11111

ΧΙ12/8Α AACCC TCGCG CCGCC TCCGA GACAG CCGCC GCAAC CATGG CCACC GCCGC CGCCG CGTCT

80 90 100 110 120

ΧΙ12/8Α ACCGC GCTCA CTGGC GCCAC TACCG CTGCG CCCAA GGCGA GGCGC CGGGC GCACC TCCTG

U22/1A ACCGC GCTCA CTGGC GCCAC TACCG CTGCG CCCAA GGCGA GGCGC CGGGC GCACC TCCTG lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 ACCGC GCTCA CTGGC GCCAC TACCG CTGCG CCCAA GGCGA GGCGC CGGGC GCACC TCCTG lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

130 140 150 160 170 180

ΧΙ12/8Α GCCAC CCGCC GCGCC CTCGC CGCGC CCATC AGGTG CTCAG CGGCG TCACC CGCCA TGCCG «22/1Α GCCAC CCGCC GCGCC CTCGC CGCGC CCATC AGGTG CTCAG CGGCG TCACC CGCCA TGCCG lilii 11111 lilii 11111 lilii 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 GCCAC CCGCC GCGCC CTCGC CGCGC CCATC AGGTG CTCAG CGGCG TCACC CGCCA TGCCG urn mu mii mu mu 11111 mu mu mu 11111 mu 11111

ΧΙ12/8Α GCCAC CCGCC GCGCC CTCGC CGCGC CCATC AGGTG CTCAG CGGCG TCACC CGCCA TGCCG

190 200 210 220 230 240

ΧΙ12/8Α ATGGC TCCCC CGGCC ACCCC GCTCC GGCCG TGGGG CCCCA CCGAT CCCCG CAAGG GCGCC

S > >

«22/1A ATGGC TCCCC CGGCC ACCCC GCTCC GGCCG TGGGG CCCCA CCGAT CCCCG CAAGG GCGCC mu mu mu mu mu mu 11111 111111111 mu mu i 11

B73/7-4 ATGGC TCCCC CGGCC ACCCC GCTCC GGCCG TGGGG CCCCA CCGAg CCCCG CAAGG GtGCt mu mu mu mu mu mu 11111 mu 1111 mu 111111 u

ΧΠ2/8Α ATGGC TCCCC CGGCC ACCCC GCTCC GGCCG TGGGG CCCCA CCGAT CCCCG CAAGG GCGCC

FIG.7A

170 616

250 260 270 280 290 300

ΧΙ12/8Α GACAT CCTCG TCGAG TCCCT CGAGC GCTGC GGCGT CCGCG ACGTC TTCGC CTACC CCGGC

U22/1A GACAT CCTCG TCGAG TCCCT CGAGC GCTGC GGCGT CCGCG ACGTC TTCGC CTACC CCGGC lilii 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 GACAT CCTCG TCGAG TCCCT CGAGC GCTGC GGCGT CCGCG ACGTC TTCGC CTACC CCGGC

11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

310 320 330 340 350 360

ΧΙ12/8Α GGCGC GTCCA TGGAG ATCCA CCAGG CACTC ACCCG CTCCC CCGTC ATCGC CAACC ACCTC

V22/1A GGCGC GTCCA TGGAG ATCCA CCAGG CACTC ACCCG CTCCC CCGTC ATCGC CAACC ACCTC

11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111

ΧΒ73Ζ7-4 GGCGC GTCCA TGGAG ATCCA CCAGG CACTC ACCCG CTCCC CCGTC ATCGC CAACC ACCTC mu mu mu 1111111111 mu 11111um11111 mu 1111111111

Χ112/8Α GGCGC GTCCA TGGAG ATCCA CCAGG CACTC ACCCG CTCCC CCGTC ATCGC CAACC ACCTC

370 380 390 400 410 420

ΧΙ12/8Α TTCCG CCACG AGCAA GGGGA GGCCT TTGCG GCCTC CGGCT ACGCG CGCTC CTCGG GCCGC >

U22/1A TTCCG CCACG AGCAA GGGGA GGCCT TTGCG GCCTC CGGCT ACGCG CGCTC CTCGG GCCGC

11111 11111 11111 11111 11111 1111 lilii 11111 11111 11111 lilii 11111

B73/7-4 TTCCG CCACG AGCAA GGGGA GGCCT TTGCc GCCTC CGGCT ACGCG CGCTC CTCGG GCCGC mu urn mu 11111 mu 1111 11111 um 1111111111mu11111

ΧΙ12/8Α TTCCG CCACG AGCAA GGGGA GGCCT TTGCG GCCTC CGGCT ACGCG CGCTC CTCGG GCCGC

430 440 450 460 470 480

XI12/8A GTCGG CGTCT GCATC GCCAC CTCCG GCCCC GGCGC CACCA ACCTT GTCTC CGCGC TCGCC >

U22/1A GTCGG CGTCT GCATC GCCAC CTCCG GCCCC GGCGC CACCA ACCTT GTCTC CGCGC TCGCC mu urn mu urn urn mu 1111111111 im mu um mu

B73/7-4 GTCGG CGTCT GCATC GCCAC CTCCG GCCCC GGCGC CACCA ACCTa GTCTC CGCGC TCGCC mu um mu mu mu mu 11111 mu im um um mu

XI12/8A GTCGG CGTCT GCATC GCCAC CTCCG GCCCC GGCGC CACCA ACCTT GTCTC CGCGC TCGCC

FIG.7B

170 616

490 500 510 520 530 540

ΧΙ12/8Α GACGC GCTGC TCGAT TCCGT CCCCA TGGTC GCCAT CACGG GACAG GTGCC GCGAC GCATG

W22/1A GACGC GCTGC TCGAT TCCGT CCCCA TGGTC GCCAT CACGG GACAG GTGCC GCGAC GCATG lilii 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 GACGC GCTGC TCGAT TCCGT CCCCA TGGTC GCCAT CACGG GACAG GTGCC GCGAC GCATG lilii lilii lilii 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 lilii 11111

Χ112/8Α GACGC GCTGC TCGAT TCCGT CCCCA TGGTC GCCAT CACGG GACAG GTGCC GCGAC GCATG

550 560 570 580 590 600

ΧΙ12/8Α ATTGG CACCG ACGCC TTCCA GGAGA CGCCC ATCGT CGAGG TCACC CGCTC CATCA CCAAG

U22/1A ATTGG CACCG ACGCC TTCCA GGAGA CGCCC ATCGT CGAGG TCACC CGCTC CATCA CCAAG urn mu mu mu mu mu mu 11111 mu 11111 mu urn

B73/7-4 ATTGG CACCG ACGCC TTCCA GGAGA CGCCC ATCGT CGAGG TCACC CGCTC CATCA CCAAG urn mu mu 11111 mu urn mu 1111111111 mu mu 11111

610 620 630 640 650 660

ΧΙ12/8Α CACAA CTACC TGGTC CTCGA CGTCG ACGAC ATCCC CCGCG TCGTG CAGGA GGCTT TCTTC

W22/1A CACAA CTACC TGGTC CTCGA CGTCG ACGAC ATCCC CCGCG TCGTG CAGGA GGCTT TCTTC

11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii

B73/7-4 CACAA CTACC TGGTC CTCGA CGTCG ACGAC ATCCC CCGCG TCGTG CAGGA GGCTT TCTTC mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu 11111

670 680 690 700 710 720

ΧΙ12/8Α CTCGC CTCCT CTGGT CGACC GGGGC CGGTG CTTGT CGACA TCCCC AAGGA CATCC AGCAG >

U22/1A CTCGC CTCCT CTGGT CGACC GGGGC CGGTG CTTGT CGACA TCCCC AAGGA CATCC AGCAG

11111 11111 11111 11111 1111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111

B73/7-4 CTCGC CTCCT CTGGT CGACC aGGGC CGGTG CTTGT CGACA TCCCC AAGGA CATCC AGCAG mu mu mu mu 1111 mu mu mu mu mu mu 11111

ΧΙ12/8Α CTCGC CTCCT CTGGT CGACC GGGGC CGGTG CTTGT CGACA TCCCC AAGGA CATCC AGCAG

FIG.7C

170 616

730 740 750 760 770 780

ΧΙ12/8Α CAGAT GGCGG TGCCI GTCTG GGACA AGCCC ATGAG TCIGC CTGGG TACA! TGCGC GCCTT «22/1A CAGAT GGCGG TGCCT GTCTG GGACA AGCCC ATGAG TCTGC CTGGG TACAT TGCGC GCCTT

11111 lilii 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 11111 lilii 11111

B73/7-4 CAGAT GGCGG TGCCT GTCTG GGACA AGCCC ATGAG TCTGC CTGGG TACAT TGCGC GCCTT mu mu mu mu 1111111111 mu mu mu mu mu lim

ΧΙ12/8Α CAGAT GGCGG TGCCT GTCTG GGACA AGCCC ATGAG TCTGC CTGGG TACAT TGCGC GCCTT

790 800 810 820 830 840

ΧΙ12/8Α CCCAA GCCCC CTGCG ACTGA GTTGC TTGAG CAGGT GCTGC GTCTT GTTGG TGAAT CCCGG >

Χ22/ΙΑ CCCAA GCCCC GTGCG ACTGA GTTGC TTGAG CAGGT GCTGC GTCTT GTTGG TGAAT CCCGG mu mu urn mumu urn mu mu11111 mu mu mu

B73/7-4 CCCAA GCCCC CTGCG ACTGA GTTGC TTGAG CAGGT GCTGC GTCTT GTTGG TGAAT GgCGG mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu i m

ΧΙ12/8Α CCCAA GCCCC CTGCG ACTGA GTTGC TTGAG CAGGT GCTGC GTCTT GTTGG TGAAT CCCGG

850 860 870 880 890 900

ΧΙ12/8Α CGCCC TGTTC TTTAT GTTGG CGGTG CGTGC GCAGC ATCTG GTGAG GAGTT GCGAC GCTTT >

«22/1A CGCCC TGTTC TTTAT GTTGG CGGTG GCTGC GCAGC ATCTG GTGAG GAGTT GCGAC GCTTT mu mu mu u u mu mu mu mu mu mu mu mu

B73/7-4 CGCCC TGTTC TTTAT GTgGG CGGTG GCTGC GCAGC ATCTG GTGAG GAGTT GCGAC GCTTT mu mu mu u u mu mu mu mu mu mu mu mu

Χ112/8Α CGCCC TGTTC TTTAT GTTGG CGGTG GCTGC GCAGC ATCTG GTGAG GAGTT GCGAC GCTTT

910 920 930 940 950 960

ΧΙ12/8Α GTGGA GCTGA CTGGA ATCCC GGTCA CAACT ACTCT TATGG GCCTC GGCAA CTTCC CCAGC «22/ΙΑ GTGGA GCTGA CTGGA ATCCC GGTCA CAACT ACTCT TATGG GCCTC GGCAA CTTCC CCAGC mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

B73/7-4 GTGGA GCTGA CTGGA ATCCC GGTCA CAACT ACTCT TATGG GCCTC GGCAA CTTCC CCAGC mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

Χ112/8Α GTGGA GCTGA CTGGA ATCCC GGTCA CAACT ACTCT TATGG GCCTC GGCAA CTTCC CCAGC

FIG.7D

171 616

970 980 990 1000 1010 1020

ΧΙ12/8Α GACGA CCCAC TGTCT CTGCG CATGC TAGGT ATGCA TGGCA CGGTG TATGC AAATI ATGCA )

«22/1Α GACGA CCCAC TGTCT CTGCG CATGC TAGGT ATGCA TGGCA CGGTG TATGC AAATT ATGCA lilii 11111 11111 11111 lilii lilii 11111 111 1 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 GACGA CCCAC TGTCT CTGCG CATGC TAGGT ATGCA TGGgA CGGTG TATGC AAATT ATGCA

11111 11111 11111 11111 lilii lilii 11111 111 1 11111 11111 11111 11111

ΧΙ12/8Α GACGA CCCAC TGTCT CTGCG CATGC TAGGT ATGCA TGGCA CGGTG TATGC AAATT ATGCA

ΧΪ12/8Α

1030 1040 1050 1060 1070 1080

GTGGA TAAGG CCGAT CTGTT GCTTG CACTT GGTGT GCGGT TTGAT GATCG TGTGA CAGGG

U22/IA GTGGA TAAGG CCGAT CTGTT GCTTG CACTT GGTGT GCGGT TTGAT GATCG TGTGA CAGGG)

11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 lilii 1111 11111

B73/7-4 GTGGA TAAGG CCGAT CTGTT GCTTG CACTT GGTGT GCGGT TTGAT GATCG cGTGA CAGGG) lilii 11111 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 11111 1111 11111

ΧΙ12/8Α GTGGA TAAGG CCGAT CTGTT GCTTG CACTT GGTGT GCGGT TTGAT GATCG TGTGA CAGGG

1090 1100 1110 1120 1130 1140

ΧΙ12/8Α AAGAT TGAGG CTTTT GCAAG CAGGG CTAAG ATTGT GCACG TTGAT ATTGA TCCGG CTGAG

U22/1A AAGAT TGAGG CTTTT GCAAG CAGGG CTAAG ATTGT GCACG TTGAT ATTGA TCCGG CTGAG

11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

S73/7-4 AAGAT TGAGG CTTTT GCAAG CAGGG CTAAG ATTGT GCACG TTGAT ATTGA TCCGG CTGAG

11111 11111 11111 lilii lilii 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111

1150 1160 1170 1180 1190 1200

ΧΙ12/8Α ATTGG CAAGA ACAAG CAGCC ACATG TGTCC ATCTG TGCAG ATGTT AAGCT TGCTT TGCAG

U22/1A ATTGG CAAGA ACAAG CAGCC ACATG TGTCC ATCTG TGCAG ATGTT AAGCT TGCTT TGCAG

11111 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 ATTGG CAAGA ACAAG CAGCC ACATG TGTCC ATCTG TGCAG ATGTT AAGCT TGCTT TGCAG

11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111

FIG.7E

170 616

1210 1220 1230 1240 1250 1260

ΧΙ12/8Α GGCAT GAATG CTCTT CTTGA AGGAA GCACA TCAAA GAAGA GCTTT GACTT TGGCT CATGG «22/1A GGCAT GAATG CTCTT CTTGA AGGAA GCACA TCAAA GAAGA GCTTT GACTT TGGCT CATGG

11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 lilii

B73/7-4 GGCAT GAATG CTCTT CTTGA AGGAA GCACA TCAAA GAAGA GCTTT GACTT TGGCT CATGG

11111 11111 lilii 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 lilii 11111

ΧΙ12/8Α GGCAT GAATG CTCTT CTTGA AGGAA GCACA TCAAA GAAGA GCTTT GACTT TGGCT CATGG

1270 1280 1290 1300 1310 1320

ΧΙ12/8Α AACGA TGAGT TGGAT CAGCA GAAGA GGGAA TTCCC CCTTG GGTAT AAAAC ATCTA ATGAG «22/1Α AACGA TGAGT TGGAT CAGCA GAAGA GGGAA TTCCC CCTTG GGTAT AAAAC ATCTA ATGAG mu urn urn mu mu mu mu urn urn 11111 mu mu

B73/65 AACGA TGAGT TGGAT CAGCA GAAGA GGGAA TTCCC CCTTG GGTAT AAAAC ATCTA ATGAG mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

ΧΠ2/8Α AACGA TGAGT TGGAT CAGCA GAAGA GGGAA TTCCC CCTTG GGTAT AAAAC ATCTA ATGAG

1330 1340 1350 1360 1370 1380

ΧΙ12/8Α GAGAT CCAGC CACAA TATGC TATTC AGGTT CTTGA TGAGC TGACG AAAGG CGAGG CCATC «22/1A GAGAT CCAGC CACAA TATGC TATTC AGGTT CTTGA TGAGC TGACG AAAGG CGAGG CCATC mu mu mu mu11111 mu mu mu mu mu mu mu

B73/7-4 GAGAT CCAGC CACAA TATGC TATTC AGGTT CTTGA TGAGC TGACG AAAGG CGAGG CCATC mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

ΧΙ12/ΒΑ GAGAT CCAGC CACAA TATGC TATTC AGGTT CTTGA TGAGC TGACG AAAGG CGAGG CCATC

1390 1400 1410 1420 1430 1440

ΧΙ12/8Α ATCGG CACAG GTGTT GGGCA GCACC AGATG TGGGC GGCAC AGTAC TACAC TTACA AGCGG «22/1Α ATCGG CACAG GTGTT GGGCA GCACC AGATG TGGGC GGCAC AGTAC TACAC TTACA AGCGG mu mu mu mu mu mu mu mu mu urn mu mu

B73/7-4 ATCGG CACAG GTGTT GGGCA GCACC AGATG TGGGC GGCAC AGTAC TACAC TTACA AGCGG mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

ΧΙ12/8Α ATCGG CACAG GTGTT GGGCA GCACC AGATG TGGGC GGCAC AGTAC TACAC TTACA AGCGG

FIG.7F

170 616

1450 1460 1470 1480 1490 1500

ΧΠ2/8Α CCAAG GCAGT GGTTG TCTTC AGCTG GTCIT GGGGC TATGG 6ATTT GGITT GCCGG CTGCT «22/1Α CCAAG GCAGT GGTTG TCTTC AGCTG GTCTT GGGGC TATGG GATTT GGTTT GCCGG CTGCT

11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 CCAAG GCAGT GGTTG TCTTC AGCTG GTCTT GGGGC TATGG GATTT GGTTT GCCGG CTGCT

11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

Χ112/8Α CCAAG GCAGT GGTTG TCTTC AGCTG GTCTT GGGGC TATGG GATTT GGTTT GCCGG CTGCT

1510 1520 1530 1540 1550 1560

ΧΙ12/8Α GCTGG TGCTT CTGTG GCCAA CCCAG GTGTT ACTGT TGTTG ACATC GATGG AGATG GTAGC ' >

U22/1A GCTGG TGCTT CTGTG GCaAA CCCAG GTGTT ACTGT TGTTG ACATC GATGG AGATG GTAGC lilii 11111 lilii lilii lim llll lilii 11111 11111 11111 lilii 11111

B73/7-4 GCTGG TGCTT CTGTG GCaAA CCCAG GTGTc ACTGT TGTTG ACATC GATGG AGATG GTAGC

11111 11111 lilii 11 11 lilii llll lilii 11111 lilii lilii 11111 11111

ΧΙ12/ΒΑ GCTGG TGCTT CTGTG GCCAA CCCAG GTGTT ACTGT TGTTG ACATC GATGG AGATG GTAGC

1570 1580 1590 1600 1610 1620

ΧΙ12/8Α TTTCT CATGA ACGTT CAGGA GCTAG CTATG ATCCG AATTG AGAAC CTCCC GGTGA AGGTC >

U22/1A TTTCT CATGA ACGTT CAGGA GCTAG CTATG ATCCG AATTG AGAAC CTCCC GGTGA AGGTC

11111 11111 11111 lilii lilii lilii 11111 11111 11111 11111 llll 11111

B73/7-4 TTTCT CATGA ACGTT CAGGA GCTAG CTATG ATCCG AATTG AGAAC CTCCC aGTGA AGGTC lilii 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 llll 11111

ΧΙ12/8Α TTTCT CATGA ACGTT CAGGA GCTAG CTATG ATCCG AATTG AGAAC CTCCC GGTGA AGGTC

1630 1640 1650 1660 1670 1680

ΧΙ12/8Α TTTGT GCTAA ACAAC CAGCA CCTGG GGATG GTGGT GCAGT GGGAG GACAG GTTCT ATAAG

W22/1A TTTGT GCTAA ACAAC CAGCA CCTGG GGATG GTGGT GCAGT GGGAG GACAG GTTCT ATAAG

11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 lilii lilii 11111 11111

B73/7-4 TTTGT GCTAA ACAAC CAGCA CCTGG GGATG GTGGT GCAGT GGGAG GACAG GTTCT ATAAG mu mu mu mu mu mu nm 11111 11111 mu 1111111111

FiG.7G

1690 1700 1710 1720 1730 1740

ΧΙ12/8Α GCCAA CAGAG CGCAC ACATA CTTGG GAAAC CCAGA GAATG AAAGT GAGAT ATATC CAGAT

K22/IA GCCAA CAGAG CGCAC ACATA CTTGG GAAAC CCAGA GAATG AAAGT GAGAT ATATC CAGAT

11111 11111 11111 lilii lilii 11111 tlili 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 GCCAA CAGAG CGCAC ACATA CTTGG GAAAC CCAGA GAATG AAAGT GAGAT ATATC CAGAT

11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

1750 1760 1770 1780 1790 1800

ΧΙ12/8Α TTCGT GACGA TCGCC AAAGG GTTCA ACATT CCAGC GGTCC GTGTG ACAAA GAAGA ACGAA

U22/1A TTCGT GACGA TCGCC AAAGG GTTCA ACATT CCAGC GGTCC GTGTG ACAAA GAAGA ACGAA mu mu mu mu mu mu mu 1111111111 um mu mu

B73/7-4 TTCGT GACGA TCGCC AAAGG GTTCA ACATT CCAGC GGTCC GTGTG ACAAA GAAGA ACGAA mu mu mu mu mu mu mu mu mu um mu mu

1810 1820 1830 1840 1850 1860

ΧΙ12/8Α GTCCG CGCAG CGATA AAGAA GATGC TCGAG ACTCC AGGGC CGTAC CTCTT GGATA TAATC

H22/1A GTCCG CGCAG CGATA AAGAA GATGC TCGAG ACTCC AGGGC CGTAC CTCTT GGATA TAATC um um mu um um mu mu mu um mu mu mu

B73/7-4 GTCCG CGCAG CGATA AAGAA GATGC TCGAG ACTCC AGGGC CGTAC CTCTT GGATA TAATC mu mu mu mu mu mu mu mu um um mu um

1870 1880 1890 1900 1910 1920

ΧΙ12/8Α GTCCC ACACC AGGAG CATGT GTTGC CTATG ATCCC TAATG GTGGG GCTTT CAAGG ATATG

W22/1A GTCCC ACACC AGGAG CATGT GTTGC CTATG ATCCC TAgTG GTGGG GCTTT CAAGG ATATG mu mu mu um mu mu mu mu um um mu mu

B73/7-4 GTCCC ACACC AGGAG CATGT GTTGC CTATG ATCCC TAgTG GTGGG GCTTT CAAGG ATATG um mu mu mu mu mu mu u u um mu mu mu

FIG.7H

170 616

1930 1940 1950 1960

ΧΙ12/8Α ATCCT GGATG GTGAT GGCAG GACTG TGTAC TGATC TAAAA TCCAG CAAG

W22/1A ATCCT GGATG GTGAT GGCAG GACTG TGTAC TGATC TAAAA TCCAG CAAG) lilii 11111 lilii lilii 11111 11111 lilii 11111 11111 1111

B73/7-4 ATCCT GGATG GTGAT GGCAG GACTG TGTAC TGATC TAAAA TCCAG CAAG)

11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 1111

ΧΙ12/8Α ATCCT GGATG GTGAT GGCAG GACTG TGTAC TGATC TAAAA TCCAG CAAG

FIG.7 I

170 616

II,. · * , . \ / I Λ / Λ * utozenie ami nokwasow w λιιζ/oA ,Wzz/1A i b73/7-4

20 30 40 50 60

ΧΙ12/8Α MATAA AASTA LTGAT TAAPK ARRRA HLLAT RRALA APIRC SAASP AMPHA PPATP LRPVG «22/1A MATAA AASTA LTGAT TAAPK ARRRA HLLAT RRALA APIRC SAASP AHPHA PPATP LRPWG

11111 11111 111 1 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 MATAA AASTA LTGAT TAAPK ARRRA HLLAT RRALA APIRC SAASP AMPHA PPATP LRPWG

11111 11111 lilii lilii lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

ΧΙ12/8Α MATAA AASTA LTGAT TAAPK ARRRA HLLAT RRALA APIRC SAASP AMPMA PPATP LRPWG

80 30 100 110 120

ΧΙ12/8Α PTDPR KGADI LVESL ERCGV RDYFA YPGGA SMEIH QALTR SPVIA NHLFR HEOGE AFAAS

W22/1A PTDPR KGADI LYESL ERCGV RDYFA YPGGA SMEIH GALTR SPVIA NHLFR HEOGE AFAAS

II 11 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 PTePR KGADI LYESL ERCGV RDYFA YPGGA SMEIH QALTR SPYIA NHLFR HEOGE AFAAS

11 11111 lilii 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111

Χ112/8Α PTDPR KGADI LYESL ERCGV RDYFA YPGGA SMEIH GALTR SPYIA NHLFR HEOGE AFAAS

130 140 150 160 170 180

ΧΙ12/8Α GYARS SGRYG YCIAT SGPGA TNLYS ALADA LLDSY PMYAI TGGVP RRMIG TDAFO ETPIY

W22/1A GYARS SGRVG VCIAT SGPGA TNLYS ALADA LLDSY PMVAJ TGQVP RRMIG TDAFO ETPIV lim lilii 11111 lilii lilii lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 GYARS SGRYG YCIAT SGPGA TNLYS ALADA LLDSV PMYAI TGGYP RRMIG TDAFG ETPIY mu mu mu mu mu mu mu mu iuu mu 11111 mu

ΧΙ12/8Α GYARS SGRVG YCIAT SGPGA TNLYS ALADA LLDSV PMYAI TGGYP RRMIG TDAFG ETPIV

190 200 210 220 230 240

ΧΙ12/8Α EYTRS ITKHN YLYLD YDDIP RVVQE AFFLA SSGRP GPVLV DIPKD IGQQM AYPVW DKPMS

W22/1A EYTRS ITKHN YLVLD VDDIP RVVQE AFFLA SSGRP GPYLY DIPKD IGQQM AVPVW DKPMS urn mu mu urn mu 11111 mu urn mu urn mu urn

B73/7-4 EYTRS ITKHN YLVLD VDDIP RYVQE AFFLA SSGRP GPYLY DIPKD 1GGGM AYPVW DKPMS mu mu mu mu urn mu mu mu 11111 mu nut mu

ΧΙ12/ΒΑ EVTRS ITKHN YLYLD VDD1P RYY8E AFFLA SSGRP GPVLV DIPKD IGQQM AVPVW DKPMS

FIG.8A

171 616

250 260 270 280 290 300

Χ112/8Α LP6YI ARLPK PPATE LLEQV LRLYG ESRRP VLYVG GGCAA SGEEL RRFVE LTGIP VTTTL

Y22/1A LPGYI ARLPK PPATE LLEQV LRLYG ESRRP VLYVG GGCAA SGEEL RRFVE LTGIP YTTTL

11111 11111 lilii 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 LPGYI ARLPK PPATE LLEQV LRLYG ESRRP VLYVG GGCAA SGEEL RRFYE LTGIP VTTTL 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii

ΧΙ12/8Α LPGYI ARLPK PPATE LLEQV LRLVG ESRRP VLYVG GGCAA SGEEL RRFYE LTGIP VTTTL

310 320 330 340 350 360

ΧΙΪ2/8Α MGLGN FPSDD PLSLR MLGMH GTYYA NYAYD KADLL LALGY RFBBR VTuKI EAFAS RAKIV

W22/1A MGLGN FPSDD PLSLR HLGMH GTVYA NYAYD KADLL LALGV RFDDR YTGKI EAFAS RAKIV lilii 11111 lilii 11111 11111 lilii 11111 lilii 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 MGLGN FPSDD PLSLR MLGMH GTVYA NYAVB KADLL LALGV RFDDR VTGKI EAFAS RAKIY 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 lilii

ΧΙ12/8Α MGLGN FPSDD PLSLR MLGMH GTVYA NYAVD KADLL LALGV RFDDR VTGKI EAFAS RAKIY

370 380 390 400 410 420

ΧΙ12/8Α HYDID PAEIG KNKOP HVSIC ADYKL ALQGM NALLE GSTSK KSFDF GSWNB ELDOO KREFP

U22/LA HVDID PAEIG KNKOP HVSIC ABYKL ALQGM NALLE GSTSK KSFDF GSWND ELDOO KREFP

11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111

B73/7-4 HVDID PAEIG KNKOP HYSIC ADYKL ALQGM NALLE GSTSK KSFDF GSWND ELDOO KREFP lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111

ΧΙ12/8Α HYDID PAEIG KNKOP HYSIC ADYKL ALOGM NALLE GSTSK KSFDF GSWND ELDOO KREFP

430 440 450 460 470 480

ΧΙ12/8Α LGYKT SNEE1 OPOYA 1OYLD ELTKG EAIIG TGVGQ HOMYA AOYYT YKRPR QWLSS AGLGA

Y22/1A LGYKT SNEE1 OPOYA IOYLD ELTKG EAIIG T5YG0 HOMYA AOYYT YKRPR OYLSS AGLGA

11111 11111 lilii lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111 11111

B73/7-4 LGYKT SNEE1 OPOYA IOYLD ELTKG EAIIG TGVGQ HQMWA AOYYT YKRPR OYLSS AGLGA lilii 11111 11111 11111 11111 lilii 11111 11111 11111 11111 11111 11111

ΧΙ12/8Α LGYKT SNEEI OPOYA IOYLD ELTKG EAIIG TGYGG HOMWA AOYYT YKRPR OYLSS AGLGA

FIG.8B

170 616

490 500 510 520 530 540

ΧΙ12/8Α MGFGL PAAAG ASYAN PGVTV YDIDG DGSFL MNVQE LAMIR IENLP VKVFV LNNQH LGMW

W22/1A MGFGL PAAAG ASYAN PGYTY YDIDG DGSFL MNVQE LAMIR IENLP VKVFV LNNOH LGMW mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

B73/7-4 MGFGL PAAAG ASYAN PGVTV YDIDG DGSFL MNVQE LAMIR IENLP VKVFV LNNOH LGMW mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

ΧΙ12/8Α MGFGL PAAAG ASYAN PGVTV YDIDG DGSFL MNVQE LAMIR IENLP VKVFV LNNOH LGMW

550 560 570 580 590 600

ΧΙ12/8Α 8WEBR FYKAN RAHTY LGNPE NESEI YPDFY T1AKG FNIPA YRYTK KNEYR AAIKK HLETP «22/1Α QVEDR FYKAN RAHTY LGNPE NESEI YPDFV TIAKG FNIPA YRYTK KNEYR AAIKK MLETP i ui mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

B73/7-4 QVEDR FYKAN RAHTY LGNPE NESEI YPDTV TIAKG FNIPA VRVTK KNEVR AAIKK MLETP i ui mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu mu

ΧΙ12/8Α QVEDR FYKAN RAHTY LGNPE NESEI YPDFV TIAKG FNIPA YRYTK KNEYR AAIKK HLETP

610 620 630

ΧΙ12/8Α GPYLL DIIVP HQEHV LPMIP NGGAF KDMIL DGDGR TYYs x

«22/1A GPYLL DIIVP HQEHV LPMIP sGGAF KDMIL DGDGR TVY>

mu mu mu mu mu mu mu m

B73/7-4 GPYLL D1IYP HQEHV LPMIP sGGAF KDMIL DGDGR TVY> mu mu mu mu uu mu mu m

ΧΙ12/8Α GPYLL DI1YP HQEHV LPMIP NGGAF KDMIL DGDGR TVY

FIG.8C

170 616 aktywność AHAS aktywność AHAS ( % próby kontrolnej ) (% próby kontrolnej )

FIG.1A

1: Aktywność AHAS w XI12 i A 619 w obecności inhibitorów

Fig

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 6.00 zł

FIG. IB

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób ekspresji enzymu AHAS o specyficznej oporności na imidazolinon, w komórkach gospodarza, znamienny tym, że komórki gospodarza transformuje się sekwencją kwasu nukleinowego kodującą funkcjonalny enzym AHAS kukurydzy, w którym w stosunku do enzymu AHAS kukurydzy typu dzikiego występuje substytucja aminokwasu w pozycji 621 nadająca enzymowi specyficzną oporność na imidazolinon i hoduje się te komórki gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję enzymu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki roślinne.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformowaną komórkę roślinną regeneruje się w dojrzałą roślinę wykazującą fenotyp oporności na imidazolinon.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zastępującym aminokwasem jest asparagina.