NO324035B1 - Antracyklin-analoger samt blandinger og anvendelser derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse ble gjennomført delvis med Regjerings-(US)-støtte. Denne har visse rettigheter i søknaden.

Foreliggende oppfinnelse vedrører målsøkende anticancer-antracyklinderivater. Mer spesielt angår den doxorubicin (DOX) eller dets daunosamin-modifiserte derivater (DM.DOX), kovalent bundet til analoger av peptidhormoner som LH-RH, bombesin og somatostatin. Disse kovalente konjugater er målsøkende mot forskjellige tumorer som har reseptorer for peptidhormon-analogene.

LH-RH-analoger som har cytotoksiske deler i 6-posisjon er vist Schally, Janaky og Bajusz, EP 0450461B1, av 6. september 1995.

GnRH (LH-RH)-analoger for ødeleggelse av gonadotroper er beskrevet av Nett og Glode i WO 90/09799, publisert 7. september 1990. Denne søknad beskriver toksiner som ricin, bundet til analoger av LH-RH for destruksjon av gonadatrofer og helbreder således kjønnshormon-avhengige cancere. LH-RH-doxorubicinderivater er også nevnt uten spesifisering av bindingskjemien.

Cytotoksiske somatostatin-analoger er beskrevet av Schally et al. i US-søknad av 6. april 1990, inngitt på ny 15. juli 1993 under SN 08/076 846.

En oversikt av A.V. Schally i "Anti-Cancer Drugs", 5,115-130 (1994) gir detaljer når det gjelder nærværet av reseptorer på cellemembranene av et vidt spektrum av tumorer for analoger av LH-RH, bombesin eller somatostatin.

G. Weckbecker angir flere referanser som viser nærværet av reseptorer og reseptor-subtyper for somatostatin-analoger på flere normale og tumorøse vev i sin oversikt i "Farmac. Ther.", 60, 245-264 (1993).

Bombesin-lignende peptider og nærværet av bombesin/GRP-reseptorer på forskjellige normale og tumorøse vev er beskrevet i en oversikt av N. Bunnett i "Gut Peptides: Biochemistry and Physiology", 423-445 (1994), utg.: J. Walsh og G.J. Dockray, Raven Press, New York og av E. Spindell i "Recent Progress in Hormone Research", 48 (1993)

(Academic Press).

Doxorubicin (DOX) er i dag den mest benyttede og et meget potent anticancermiddel. Imidlertid responderer visse tumorer ikke i det hele tatt på forbindelsen og anvendelsen er også begrenset av multidrug-resistens (MDR) og kardiotoksisitet så vel som neutro-peni, som er resultatene av kronisk behandling. For å overvinne disse mangler og for videre å eksploatere det enorme tumoriside potensial som ligger i strukturen hos antracyklin-antibiotika, er det beskrevet tusener av syntetiske derivater inkludert deres mål-søkende analoger bundet til forskjellige bærermakromolekyler.

Mesteparten av historien til DOX og dennes analoger er beskrevet i "Adriamycin", David W. Henry, ACS Symposium serier, nr. 30, "Cancer Chemotherapy,", American Chemical Society, sidene 15-57 (1976) og i boken "Doxorubicin", Federico Arcamone, Academic Press (1981).

Meget aktive, alkylerende, ikke-kryss-resistente 3'-deamino-3'-(3"-cyano-4"-morfolinyl)-DOX og derivater derav som har antitumor-aktivitet er beskrevet av Mosher et al. i US 4 464 529 av 7. august 1984. Syntesen og den biologiske evaluering av disse "Intensely Potent Morpholinyl Anthracyclines" er også beskrevet i "J. Med. Chem.", 1984, 27, 638-645.

I "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", vol. 88, sidene 4845-4849, juni 1991 beskriver Gao et al. formaldehyd-mediert alkylering av en DNA-sekvens med et daunorubicinderivat.

Antracyklin-analoger som har latente alkylerende substituenter er beskrevet i "J. Med. Chem", 35, 3208-3214 (1992).

Antracyclin-analoger som innehar høy invitro aktivitet er beskrevet i GB2124224. Nevnte analoger blir beskrevet å være uløselige i vann og syre.

Bruken av en a,oo-diiodforbindelse for alkylering av daunosaminnitrogenet i DOX og derved dannelse av et nytt morfolinyl-DOX-derivat er beskrevet i EP 434 960, i navnet Pharmacia Carlo Erba den 12. desember 1989.

N-trifluoracetyladriamycin<14->0-hemiglutarat og -hemiadipat er beskrevet som analoger av N-trifluoracetyladriamycin<14->0-valerat (AD-32) med forbedrede vannoppløselighet av Israel et al. i US 4 299 822 av 10. november 1981.

Horton og Priebe ("J. Antibiotics", XXXVI, 1211-1215) beskriver flere 14-0-estere av forskjellige antracyklin-analoger uten noen dramatiske endringer i anticancer-akti vi teten sammenlignet med 14-OH-opphavsanalogene.

Når det gjelder konstruksjon av målsøkende kjemoterapeutiske midler, tilstrebes de følgende mål: 1. Stabil binding mellom bærermolekylet og det kjemoterapeutiske middel inntil målet er nådd. 2. Bibeholdte biologiske karakteristika for bærermolekylet i konjugatet, for eksempel bibeholdte bindingsegenskaper. 3. Bibeholdt farmakologisk aktivitet for det kjemoterapeutiske middel i konjugatet som bibeholdt cytotoksisk aktivitet. 4. Som et resultat av konjugering, fremstilling av analoger med mere intens aktivitet og/eller lavere perifer toksisitet i forhold til ikke-konjugerte deler.

Konjugeringen av DOX ved NaKVoksydering av daunosamindelen av DOX, fulgt av reduktiv alkylering som involverer et primært amin av et bærermolekyl er beskrevet av Sela et al. i US 4 263 279 av 21. april 1981.

En cis-askonitinsyre-spacer ble benyttet for å forbinde daunosaminnitrogen til makro-molekylære bærere med en pH-sensitiv binding som beskrevet i "Biochem. Biophys. Res. Commun.", 1981, 102,1048-1054.

Dannelsen av esterbindinger og C-N-bindinger mellom 14-bromdaunorubicin og proteiner eller poly-L-aminosyrer er beskrevet av Zunino et al. (1981), "Tumori", 67, 521-524 og (1984) "Eur. J. Cancer Clin. Oncol.", 20,421-425.

Morfolino-DOX (en meget aktiv, daunosamin-modifisert analog av DOX) ble konjugert til antistoff via en hydrolyserbar (lysosomotrop, pH-sensitiv) hydrazonbinding under deltagelse av C-13-okso-funksjonen av det cytotoksiske middel, som beskrevet i "Bioconjugate Chemistry", 1990, 1(5), 325-330.

Sensitiviteten for karboksamidbindingen av en leucinrest overfor enzymatisk nedbryt-ning ble benyttet med hell i konjugater av DOX inneholdende et "spacer arm"-peptid, fortrinnsvis Ala-Leu-Ala-Leu, der den karboksyterminale Leu acylerer daunosaminnitrogenet i DOX og den aminoterminale Ala bindes til bæreren via en dikarboksylsyre-spacer som beskrevet i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 1982, 79, 626-629. Daunosaminnitrogenet i DOX ble acylert med en glutarsyre-spacer og bundet til LH-RH-analoger med et vesentlig tap av cytotoksisk aktivitet som beskrevet i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 1992, 89, 972-976.

Ytterligere referanser relatert til bruken av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen for behandling av forskjellige humane tumorer: 1. Schally et al. (1996) i "Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives, utg. Filicori, M. & Flamigni, C. (Parthenon, Carnforth, UK), sidene

33-44.

2. Nagy et al. (1996) "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 93, 7269-7273.

3. Yano et al. (1994) "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 91, 7090-7094.

4. Rekasi et al. (1993) "Endocrinology", 132(5), 1991-2000.

5. Srkalovic et al. (1990) "Cancer Res.", 50, 1841-1846.

6. Emons et al. (1993) "Cancer Res.", 53, 5439-5446.

7. Emons et al. (1993) "Journal of Clin. Endocrin. and Metabol.", 77(6) 1458-)

8. Schally, A. V. (1988) "Oncological applications of somatostatin analogs.", "Cancer

Res.", 48, 6977-6985

9. Schally et al. (1994) "International Journal of Pancreatology", 16,277-280.

10. Srkalovic et al. (1990) "Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism", 70(3), 661-669. 4 Pinski et al. (1994), "Int. J. Cancer", 57, 574-580.

11. Radulovic et al. (1992) "Cancer Letters", 62, 263-271.

12. Qin et al. (1995) "Int. J. Cancer" 60, 694-700.

13. Radulovic et al. (1992), "P.S.E.B.M.", 200, 394-401.

14. Radulovic et al. (1994) "Acta Oncologica", 33(6), 693-701.

15. Pinski et al. (1993) "Cancer Letters", 71,189-196.

16. 0'Byrne et al. (1994) "Eur. J. of Cancer", 70, 886-892.

17. Pinski et al. (1994) "Br. J. of Cancer", 70, 886-892.

18. Pinski et al. (1994) "Cancer Res.", 54, 5895-5901.

19. Pinski et al. (1996) "hit. J. Cancer", 65, 870-874.

20. Banks et al. (1992) "Anticancer Drugs", 3, 519-523.

21. Reubi og Kvols (1992) "Cancer Res.", 52, 6074-6078.

22. Schally et al. (1994) "International Journal of Pancreatology", 16, 277-280.

23. Halmos et al. (1995) "Cancer Res.", 55,280-287.

24. Halmos et al. (1994) "Cancer Letters", 85,111-118.

25. Qin et al. (1994) "J. Cancer Res. Clin. Oncol.", 120, 519-528.

26. Qin et al. (1994) "Cancer Res.", 54,1035-1041.

27. Qin et al. (1995) "Int. J. Cancer", 63, 257-262.

28. Reile et al. (1994) "The Prostate", 25,29-38.

29. Pinski et al. (1994) "Int. J. Cancer", 57, 574-580.

30. Radulovic et al. (1992) "P.S.E.B.M.", 200, 394-401.

31. Radulovic et al. (1994) "Acta Oncologica", 33(6), 693-701.

32. Pinski et al. (1993) "Cancer Letters", 71,189-196.

33. Pinski et al. (1994) "Br. J. of Cancer", 70, 886-892.

34. Pinski et al. (1994) "Cancer Res.", 54, 5895-5901.

Når det gjelder detaljer henvises det til disse henvisninger.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nye, målsøkende cytotoksiske peptidhormoner

omfattende et antracyklin-cytotoksisk middel som DOX eller DM-DOX, konjugert til et peptidhormon, som analoger av LH-RH, bombesin og somatostatin. Disse cytotoksiske peptidhormon-konjugater er konstruert for behandling av tumorer som bærer spesifikke reseptorer for konjugatet, for eksempel brystcancer, ovariecancer, endometrial cancer, prostatacancer, pankreatisk cancer, coloncancer, gastrisk cancer og lungecancer. Visse av disse (ikke-konjugerte) cytotoksiske antracyklinmidler som her benyttes er nye per se og er meget potente, deres toksisitetsnivå er imidlertid for høyt til anvendelse i ikke-konjugert form.

Daunosamin-modifiserte DOX-analoger som presenteres i foreliggende oppfinnelse ble utviklet under en søken etter nye, sterkt aktive, ikke-krysss-resistente analoger av DOX som var egnet for dannelse av kovalente konjugater med peptidbærere.

Dannelsen av stabile, kovalent-bundne konjugater med fullt ut bibeholdte biologiske aktiviteter for komponentene ble oppnådd ved bruk av en dikarboksylsyre-spacer som glutarsyre. En karboksylgruppe i spaceren danner en esterbinding med 14-OH-gruppe av DOX eller DM-DOX og den andre karboksylgruppe i spaceren danner en karboksamidbinding med en godt valgt fri aminogruppe på peptidbæreren.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen representeres ved den generelle formel

der Q har den detaljerte kjemiske struktur:

der

Q<14> angir en Q-del med en sidekjede i 14-posisjon,

der

-R- er en enkeltbinding eller -C(0)-(CH2)n-C(0)- og n = 0-7,

R' er valgt blant gruppen bestående av NH2, en aromatisk eller hydrogenert 5- eller 6-leddet heterocyklisk forbindelse med minst et ringnitrogen og med en butadiendel bundet til nabokarbonatomer i ringen under dannelse av et bicyklisk system,

P er H eller et peptid, forutsatt at når R' er NH2 er R-P forskjellige fra H, og når R-P er H er R' forskjellig fra NH2. Nevnte peptid er hensiktsmessig en LHRH-, somatostatin-eller bombesin-analog, men uten utelukkelse av andre fysiologisk aktive peptider. Spesielt ønskelig er de LHRH-analoger som har affinitet for neoplastisk cellereseptorer, særlig de analoger som har en D-Lys-del i 6-posisjon, så vel som forkortede somatostatin- og bombesin-analoger.

Det er funnet en ny, syntetisk reaksjon i forbindelse med dette arbeid. Ikke bare ble det funnet at doxorubicin og dets derivater kan kobles via en dikarboksylsyredel i 14-posisjon for derved å gi nye, farmakologisk effektive konjugater, men det ble til-veiebragt en ny vei for å danne partielt mettede, heterocykliske deler fra vicinale og disjunkte, det vil si primære a,fi- eller a,y-hydroksyaminer. Den spesielle anvendelse i foreliggende oppfinnelse var dannelsen av 2"-pyrrolinyl- og l",3"-tetrahydropyridinyl-deler av daunosaminsukkeret. Imidlertid har denne reaksjon en bredere anvendelighet.

5- og 6-leddede, partielt mettede heterocykliske deler kan dannes når et vicinalt eller disjunkt hydroksyamin omsettes med et halogensubstituert aldehyd med 2 eller 3 deler mellom aldehydkarbonet og karbonatomet som har halogengruppen. Disse deler kan alle være metylen, eller det kan være involvert et heteroatom som oksygen. Reaksjonen skjer i tre trinn. Et meget stort overskudd av halogenaldehydet omsettes med syresaltet av hydroksyaminet, hensiktsmessig i et polart, inert, vannfritt, organisk oppløsningsmiddel. Det dannes så en 5-leddet oksazolidinring (eller en 6-leddet 1,3-tetrahydrooksazinring) ved kondensasjon av aldehydgruppen med hydroksyl- og amingruppene. Dette produkt behandles med en organisk base, hensiktsmessig et tertiært amin, hvorved elementene av hydrohalogensyren elimineres mellom halogendelen i det tidligere halogenaldehyd og den sekundære aminogruppe i oksazolidin- eller 1,3-tetrahydrooksazinringen for å danne en sammensmeltet ringstruktur ved addisjon av en 5- eller 6-leddet ring. Basen blir så nøytralisert med en svak syre, hensiktsmessig en organisk syre som iseddik. Behandling med vandig syre, fortrinnsvis en organisk syre, åpner oksazolidin- eller 1,3-tetrahydrooksazindelen av den sammensmeltede ring. Det vil være klart for fagmannen at avhengig av utgangsaldehydet kan den endelig nitrogenholdige ring inneholde minst et ytterligere heteroatom som nevnt ovenfor. Den generelle reaksjon kan illustreres som følger:

der

X' er halogen og fortrinnsvis brom eller jod, aller helst jod,

Y er CH2, OCH2, CH2-CH2, og

Z er ingenting eller CH2.

Når Z ikke er til stede, danner aldehyddelen en 5-leddet oksazolidinring som det første trinn i reaksjonen. Når Z er CH2, danner aldehyddelen en 6-leddet 1,3-tetrahydrooksazinring. Mens slike ringdannelser er velkjente, er reaksjonen ny og overraskende i kombinasjon med ringlukningen som effektueres av halogenalkansidekjeden i et basisk medium som et tertiært amin, i et vannfritt medium.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere under henvisning til de vedlagte tegninger, der: Figur 1 er et plott av volumendringer av estrogen-uavhengig MXT-musebrystcancer for

forskjellige dosisnivåer av forbindelser ifølge oppfinnelsen og DOX.

Figur 2 er et plott av volumendringer for estrogen-uavhengig MXT-musebrystcancer for forskjellige dosisnivåer av visse forbindelser ifølge oppfinnelsen, en kjent forbindelse, DOX og en kontroll. Figur 3 er et plott av virkningen av visse cytotoksiske LHRH-analoger på overlevelsen

av mus med estrogen-uavhengige MXT-musebrystcancere.

Figur 4 er et plott over tumorvolurnet i København-hannmus som bærer rotte Dunning R-3327-H-prostatakarsinom-transplantater under behandlingen med en kjent agonist og en spesiell forbindelse ifølge oppfinnelsen. Figur 5 er et plott som viser virkningen av behandlingen med en viss forbindelse ifølge oppfinnelsen og den tilsvarende, cytotoksiske LH-RH-analog på tumorvolurnet i rotter med Dunning R-3327-H-prostatacancer. Figur 6 er et plott som viser virkningen av behandlingen med en spesiell forbindelse ifølge oppfinnelsen og den tilsvarende, cytotoksiske LH-RH-analog på kroppsvekten av København-rotter med Dunning R-3327-H-prostatacancer. Figur 7 er et plott som viser inhiberingen av tumorveksten, oppnådd ved behandling

med en viss forbindelse ifølge oppfinnelsen og DOX.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Delen Q har, når den er substituert på R' med visse foretrukne grupper, subdele-designasjoner Qj til og med Q8, der Q2 til og med Qg er nye, cytotoksiske deler.

R' har de foretrukne verdier som fører til de ønskede Qx-deler som angitt i parenteser som følger: NH2 (Qi), pyrrolidin-l-yl (Q2), isoindolin-2-yl (Q3), 3-pyrrolin-l-yl (Q4), 3-pyrrolidon-l-yl (Q5), 2-pyrrolin-l-yl (Qe), 3-piperidon-l-yl (Q7) eller 1,3-tetrahydropyridin-l-yl(Q8).

Hvis således R-P er H og -R' er -NH2, er Qj DOX; hvis R-P er H og -R' er pyrrolidin-l-yl, er Q2 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-l"-yl)-doxorubicin (Q2); hvis R-P er H og -R' er isoindolin-2-yl, er Q3 3'-deamino-3'-(isoindolin-2"-yl)-doxorubicin (Q3); hvis R-P er H og -R' er 3-pyrrolin-l-yl, er Q4 3'-deamino-3'-(3"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin (Q4); hvis R-P er H og -R' er 3-pyrrolidon-l-yl, er Q5 3'-deamino-3'-(3"-pyrrolidon-l"-yl)-doxorubicin (Q5); hvis R-P er H og -R' er 2-pyrrolin-l-yl, er Q6 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin (Qe); hvis R-P er H og -R' er 3-piperidon-l-yl, er Q7 3'-deamino-3'-(3"-piperidon-l"-yl)-doxorubicin (Q7); hvis R-P er H og -R' er 1,3-tetrahydro-pyridin-l-yl, er Qg 3'-deamino-3'-(l",3"-tetrahydropyridin-l"-yl)-doxorubicin (Q<g>).

Forbindelsene som innarbeider daunosaminnitrogenet i en 5-leddet ring med alkyleringsfunksjon er 10-50 ganger mer aktive in vitro enn deres homologe motstykker som har daunosaminnitrogenet i en 6-leddet ring. (Slike par er Q5 og Q7 samt Q6 og Q<g.>)

I de foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, i substansen med formel Q<14->0-R-P,

er R-P forskjellig fra hydrogen. Der P er forskjellig fra hydrogen, det vil si der den er Pi, P2 og P3, hensiktsmessig der Pi er en LH-RH-agonistbærer, en LH-RH-antagonistbærer eller en forkortet LH-RH-analog bærer, er P2 en forkortet somatostatin-analog og P3 en bombesin-antagonist.

Hensiktsmessig er Pi

der (Xxx) er hydrogen, A2Bu eller A2Pr hvor:

når Aaa er Gip,

så er Bbb His, Ccc er Trp og Ddd er Gly-NH2,

når Aaa er Ac-D-Nal(2),

så er Bbb D-Phe(4Cl), Ccc er D-Pal(3), D-Trp og Ddd er D-Ala-NH2; og når Aaa-Bbb-Ccc er Ac,

såerDdd-NH-CH2-CH3;

P2 er

hvor:

når Aaa er D-Phe,

så er Bbb Tyr, Ccc er Val og Ddd er Thr eller Trp;

når Aaa er D-Trp,

så er Bbb Phe og Ccc og Ddd er Thr;

P3er

hvor:

når Aaa er ingenting, D-Tpi eller D-Phe, så er Bbb (CH2-NH)Leu, (CH2-NH)Phe, (CH2-NH)Trp eller (CH2-N)Tac.

I de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen som inkluderer analoger av LH-RH, er den cytotoksiske rest Q bundet til D-Lys-sidekjeden på LH-RH-analogene eller (Xxx)-gruppene som er bundet til denne, via en dikarboksylsyre-spacer som formulert i formel

VU:

der

m er 1 eller 0, og n er 1 eller 2, forutsatt at når m er 1, det vil si (Xxx) er A2Bu eller A2Pr, er n 1 eller 2 og der m er 0, det vil si (Xxx) er H, er n lik 1.

I de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen som inkorporerer analoger av somatostatin er den cytotoksiske rest Q bundet til aminoterminalen av somatostatin-analogene via en dikarboksylsyre-spacer som formulert i formel VEI:

I de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen som inkorporerer analoger av bombesin-antagonister, er den cytotoksiske rest Q bundet til aminoterminalen av bombesin-antagonistene som formulert i formel IX:

Særlig foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er de peptidkonjugater som inneholder Qi og Cj6 som cytotoksiske rester og glutarsyre (n=3) som dikarboksylsyre-spaceren som danner en 14-O-ester-binding med Qj (doxorubicin) eller Q6 (2-pyrrolin-doxorubicin) og en karboksamidbinding med peptidbæreren.

De mest foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er cytotoksiske LH-RH-analoger med de følgende formler:

cytotoksiske somatostatin-analoger med de følgende formler: og cytotoksiske bombesin-antagonistanaloger med de følgende formler:

I den nye fremgangsmåte for tildanning av en partielt umettet, heterocyklisk ring med nitrogenet i et vicinalt eller disjunkt, det vil si a,B- eller a,y-hydroksyamin, gjennom-føres det første trinn i reaksjonen i et vannfritt, inert, polart, ikke-hydrosylisk (aprotisk) oppløsningsmiddel, fortrinnsvis dimetylformamid, ved bruk av et vesentlig overskudd, hensiktsmessig et 30 gangers overskudd, av halogenaldehydet, idet 4-iodbutyraldehyd og 5-iodvaleraldehyd er særlig effektive. Oppfinnelsen er ikke begrenset til disse, således kan brom benyttes i stedet for jod. Denne reaksjon så vel som de etterfølgende trinn kan gjennomføres ved omgivelsestemperatur.

Basifiseringstrinnet gjennomføres med et overskudd, hensiktsmessig 2 til 4 gangers overskudd av en organisk base. Tertiære aminer som trialkylaminer er egnet for dette formål.

Den således dannede bicykliske ring åpnes for å frigjøre den vicinale eller disjunkte hydroksylgruppe ved behandling med en organisk syre i nærvær av vann. Fortynnet, vandig trifluoreddiksyre, hensiktsmessig i et inert, organisk oppløsningsmiddel som acetonitril kan benyttes. Produktet renses ved fjerning av de flyktige stoffer under redusert trykk og overskuddet av halogenforbindelse ekstraheres med heksan og resten renses ved HPLC.

For beskrivelse av peptidene og deres derivater ifølge oppfinnelsen benyttes det forkortelser for aminosyrene slik de generelt aksepteres i peptidkjemien og slik de er anbefalt av IUPAC-IUB "Commission on Biochemical Nomenclature" ("European J. Biochem.", 138, 9-37 (1984)).

Forkortelsene for de individuelle aminosyrerester er basert på aminosyrens trivialnavn, for eksempel er Gip pyroglutaminsyre, His er histidin, Trp er tryptofan, og så videre. Forkortelsene antyder L-isomerformen av aminosyrene, hvis ikke annet er sagt, for eksempel er Ser L-serin og D-Lys D-lysin.

Forkortelsene for uvanlige aminosyrer i beskrivelsen er som følger: D-Nal(2) er D-3-(2-naftyl)alanin og D-Pal(3) er D-3-(3-pyridyl)alanin, mens D-Phe(4Cl) er D-4-klorfenyl-alanin.

Peptidsekvenser skrives i henhold til konvensjonen hvorved N-terminal-aminosyren befinner seg til venstre og C-terminal-aminosyren til høyre, for eksempel Glp-His-Trp.

Formelen, Leu(CH2-NH)Leu-NH2 beskriver en redusert peptidbinding mellom et leucin og leucinamidresten ved C-terminalen av en peptidsekvens.

Andre forkortelser som benyttes er:

A2BU: diaminosmørsyre

A2Pr: diaminopropionsyre

BN: bombesin

BOP-reagens: benzotriazol-1 -yloksytris(dimetylamino)fosfoniumheksafluorfosfat DIPEA: N,N-diisopropyletylamin

DM-DOX: daunosamin-modifisert doxorubicin

DMF: N,N-dimetylformamid

DMTac: 5,5-dimetyl-tiazolidin-4-karboksylsyre

DOX: doxorubicin

Fmoc: 9-fluorenylmetyloksykarbonyl

glt: -C(0)-CH2-CH2-CH2-C(0)-, glutaryl

Glt20: glutarsyeanhydrid

HOBt: 1-hydroksybenzotriazol

HO-glt-OH: glutarsyre

HOSu: N-hydroksysuccinimid

HPLC: høyytelsesvæskekromatografi

TFA: trifluoreddiksyre

Tac: triazolidin-4-karboksylsyre

Tpi: 2,3,4,9-tetrahydro-1 H-pyrido [3,4-b] indol-3 -karboksylsyre.

Et analytisk Beckman-HPLC-system utstyrt med en diode-analysedetektor modell 168 og et Beckman-system Gold-kromatografisk software ble benyttet for å overvåke de kjemiske reaksjoner og for å undersøke renheten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Den benyttede kolonne var Dynamax C-18 (250 mm x 4,6 mm; porestørrelse: 300 Å; partikkelstørrelse: 12 um). Oppløsningsmiddelsystemet bestod av to komponenter: (i) 0,1% TFA i vann og (ii) 0,1% TFA i 70% vandig acetonitril, og benyttet i en lineær gradientmode med en tilvekst på 1% (ii) i løpet av 1 minutt, for overvåking av de kjemiske reaksjoner. Systemet ble benyttet på isokratisk måte for renhetskontroll.

Det ble benyttet et Beckman modell 342 semipreparativt HPLC-system for isolering og rensing av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Den benyttede kolonne var Aquapore Octyl (250 mm x 10 mm; porestørrelse: 300 Å; partikkelstørrelse: 15 um). Oppløsnings-middelsystemet var det samme som beskrevet for den ovenfor nevnte analytiske HPLC.

Det ble benyttet et Bruker ARX300-NMR-spektrometer (300 MHz 1H frekvens, 75 MHz 13C frekvens) og et Finnigan-MAT TSQ 7000-elektrospray massespektrometer for strukturidentifisering av doxorubicinderivatene.

Syntese av peptidbærer

Peptidene ifølge oppfinnelsen administreres ofte i form av farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske salter som syreaddisjonssalter. Illustrerende for slike syreaddisjonssalter er hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, fumarat, glykonat, tannat, maleat, acetat, trifluoracetat, citrat, benzoat, succinat, alginat, pamoat, malat, askorbat, tartrat og lignende. Hvis den aktive bestanddel skal administreres i tablettform, kan tablettene inneholde et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel som inkluderer et bindemiddel som tragacant, maisstivelse eller gelatin, et disintegreirngsmiddel som alginsyre og et smøremiddel som magnesiumstearat.

Hvis det er ønskelig med en administrering i væskeform, kan søtnings- og/eller smaks-settingsmidler benyttes som en del av det farmasøytisk akseptable fortynningsmiddel, en intravenøs administrering i isotonisk saltoppløsning, fosfatbufferoppløsninger eller lignende, kan tilvirkes.

De farmasøytiske preparater vil vanligvis innehold peptidet i forbindelse med en konvensjonell, farmasøytisk akseptabel bærer. Vanligvis vil dosene ligge fra rundt 1 til rundt 100 mikrogram av peptid pr. kg kroppsvekt for verten, gitt intravenøst, mens orale doser vil være meget høyere. Totalt sett blir behandlingen av individer med disse peptider generelt gjennomført på samme måte som den kliniske behandling ved bruk av andre analoger av LHRH,, somatostatin og analoger av doxorubicin.

Peptidene kan administreres til pattedyr intravenøst, subkutant, intramuskulært, oralt, intranasalt eller intravaginalt for å oppnå biologiske, hormonelle effekter ved binding til spesifikke reseptorer. Når det gjelder LHRH-analoger, kan disse effekter inkludere reversibel suppressjon av gonadal aktivitet, og når det gjelder somatostatin-analoger, inhibering av den gastrointestinale funksjon. Effektive doser vil variere med formen av administrering og de spesielle specier av pattedyr som behandles. Et eksempel på en typisk doseform er en fysiologisk saltoppløsning inneholdende peptidet, hvilken opp-løsning administreres for å tilveiebringe en dose i området rundt 0,1 til 2,5 mg/kg kroppsvekt. Oral administrering av peptidet kan gis enten i fast form eller i flytende form.

Syntesen av peptidbærerne ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres ved en hvilken som

helst kjent teknikk for fagmannen på området peptidkjemi. En oppsummering av egnede teknikker finnes hos M. Bodansky i "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Heidelberg, 1984. Teknikker for fastfase-peptidsyntese finnes hos J.M. Stewart og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. utgave) og i oversikten av G. Barany et al., "Int. J. Peptide and Protein Res.", 30, 705-739 (1987).

Syntesen av LH-RH-analoge bærere som benyttes ifølge oppfinnelsen er detaljert i eksemplene i US 5 258 492 A i navnet Sandor Bajusz og Andrew V. Schally, 2. november 1993, og i artiklene av Bajusz et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 85 1637-1641 (1988)og 86, 6318-6322 (1989) samt Janaky et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 89, 1023-1027 og 972-976 (1992).

Syntesen av somatostatin-analoge bærere som benyttes ifølge oppfinnelsen er detaljert i eksemplene i US 4 650 787 A av 17. mars 1987 i navnet Andrew V. Schally og Ren Z. Cai. En beskrivelse av syntesen kan også finnes i artiklene av Cai et al. i "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 83,1896-1900 (1986) og "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 84,2502-2506 (1987).

Syntesen av bombesin-antagonistbærere som benyttet ifølge oppfinnelsen er detaljert i artiklene av Coy et al. i "J. Biol. Chem.", 263, 5056-5060 (1988) og 264,14691-14697

(1989) og av Cai et al. i "Peptides", 13, 267-271 (1992) og "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 91,12664-12668 (1994).

Syntesen av doxorubicin-derivatene som benyttes ifølge oppfinnelsen og dannelsen av deres konjugater med forskjellige peptidbærere i detalj beskrevet i de følgende, illustrerende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling og isolering av N-Fmoc-DOX<14->0-hemiglutarat

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 30 mg 90 umol) Fmoc-OSu ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 31 (il (180 umol) DIPEA. Efter omrøring i 3 timer var reaksjonen ferdig, bedømt ved analytisk HPLC. Oppløsningsmidlet ble fordampet til tørr tilstand i en Speed Vac-høyvakuumsfordamper og resten krystallisert ved gnidning med 0,1% TFA i H2O. Krystallene ble filtrert og vasket en gang med kold eter for å fjerne spor av overskudd av Fmoc-OSu. Efter tørking i en desikator ble det oppnådd, m=62 mg, 98 %-ig ren N-Fmoc-DOX i et utbytte av 94%.

Dette mellomprodukt ble omsatt over natten med 11,4 mg (100 umol) Gh^O i 1 ml vannfri DMF i nærvær av 26,1 ul (150 umol) DIPEA. Oppløsningsmidlet ble fordampet i en Speed Vac og restoljen ble gjort fast ved gnidning med 0,1% vandig TFA (volum/- volum). Det således oppnådde råstoff inneholdt 70% N-Fmoc-DOX<14->0-hemiglutarat,

20% ikke-omsatt N-Fmoc-DOX og 10% andre urenheter, bedømt ved analytisk HPLC. Dette råprodukt kan benyttes for fremstilling av peptid-DOX-konjugater uten ytterligere rensing. Ved oppløsning av dette materialet i 20 ml 60% vandig acetonitril inneholdende 0,1% TFA og ved bruk av en semipreparat HPLC ble det oppnådd 45,7 mg 98% rent N-Fmoc-DOX<14->0-hemglutarat-sluttprodukt i et utbytte av 64%.

EKSEMPEL 2

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-l"-yi)-doxorubicin-TFA-sait (Q2) og det 14-O-hemiglutarat (AN-193)-TFA-salt.

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 171 ul (1,3 mmol) tilsvarende 15 gangers overskudd av 1,4-diiodbutan ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 ul) tilsvarende 3 gangers overskudd av DIPEA. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Efter 16 timer var reaksjonen ferdig, bedømt ved analytisk HPLC. Oppløsningsmidlet fordampes i Speed Vac og restoljen oppløses i 3 ml 0,1% TFA i H20 og ekstraheres med eter for å fjerne overskuddet av 1,4-diiodbutan. Den vandige ekstrakt ble så underkastet HPLC og m=41,6 mg, 98% ren DOX-derivat ble oppnådd i et utbytte av 68%.

De således oppnådde 41,6 mg (58 umol) 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-l"-yl)-doxorubicin-TFA-salt (Q2) ble omsatt med 1,2 ekvivalenter Glt20 i tørr DMF, nøyaktig som beskrevet i eksempel 1. Utbyttet var 16,9 mg tilsvarende 35% og renheten var 98%.

EKSEMPEL 3

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(isoindolin-2"-yl)doxorubicin-TFA-salt

(Q3)

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 226 mg (1,3 mmol) tilsvarende 15 gangers overskudd av a,a'-diklor-orto-xylen ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 umol) tilsvarende 3 gangers overskudd av DIPEA og katalytiske mengder Nal. Efter 16 timer ble oppløsningsmidlene fjernet i en Speed Vac og resten oppløst i 3 ml 0,1% vandig TFA og ekstrahert med 3 ml eter for å fjerne overskuddet av eter-forbindelsen. Det således oppnådde råmaterialet ble underkastet HPLC. Efter rensing ble det oppnådd 36 mg tilsvarende 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 55%.

EKSEMPEL 4

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(3"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-TFA-salt (Q4)

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 136,8 ul (1,3 mmol) tilsvarende 15 gangers overskudd cis-l,4-diklor-2-buten (Aldrich) ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 ul) tilsvarende 3 gangers overskudd av DIPEA. Efter 16 timer ble oppløsningsmidlene fjernet i en Speed Vac og restene oppløst i 3 ml 0,1% vandig TFA og ekstrahert med 3 ml heksan for å fjerne overskuddet av halogenforbindelsen. Det således oppnådde urene materialet ble underkastet HPLC. Efter rensing ble det oppnådd 22,6 mg 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 37%.

EKSEMPEL 5

Fremstilling og isolering av l-klor-4-brom-2-butanon (C4H6ClBrO) og l-klor-5-brom-2-pentanon (C5H8ClBrO)

3-brompropionylklorid, 100,8 ul (1 mmol) (Aldrich), ble omsatt med overskytende diazometan i eter. Efter 1 time ble den eteriske oppløsning fortynnet og spottestet ved TLC. Det ble benyttet tynnsjiktskromatografi-aluminiumplater som på forhånd var belagt med silikagel 60 F254, Merck Art. nr. 5554 som stasjonær fase og CHCl3:MeOH, 95:5, på volumbasis som mobilfase. For spottesten ble en 2,4-dinitrofenylhydrazin-reagens (Vogel: "A textbook of Practical Organic Chemistry", side 1061, 3. utgave, Longmans, New York) sprayet på TLC-platen efter eluering. Diazometylketonderivatet som derved ble dannet viste en gul flekk ved Rf: 0,3. Den eteriske oppløsning ble så omsatt med vannfri HC1 i eter for å omdanne diazometylketonet til det ønskede sluttprodukt, l-klor-4-brom-2-butanon. Dette produkt viste en gul flekk, karakteristisk for oksoforbindelser, med Rf: 0,8 i det samme oppløsningsmiddelsystem og med spottestreagensen som beskrevet ovenfor. Efter fordamping av oppløsningsmidlet ble det urene sluttprodukt bragt på en kolonne med lengde 15 cm og diameter 2,5 cm, pakket med 15 g silikagel, Merck, kvalitet 9385, 230-400 mesh, porestørrelse 60Å. Den flytende, mobile fase var ren CHCI3. Fraksjoner inneholdende det ønskede sluttprodukt, karakterisert ved den ovenfor beskrevne spottest, ble blandet og fordampet til tørr tilstand. Det oppnådd M=l,5 g, klar olje i et utbytte av 80%. l-klor-5-brom-2-pentanon ble fremstilt fra 4-brombutyrylklorid, nøyaktig på samme måte som beskrevet for l-klor-4-brom-2-pentanon, bortsett fra at 4-brombutyrylklorid ble benyttet i stedet for 3-brompropionylklorid. Det ble oppnådd 1,6 g klar olje tilsvarende 80% utbytte.

EKSEMPEL 6

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(3"-pyrrolidon-l"-yl)-doxorubicin-TFA-salt(Q5)

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 241 mg (1,3 mmol) tilsvarende 15 gangers overskudd av l-klor-4-brom-2-butanonble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 umol) tilsvarende 3 gangers overskudd av DIPEA. Efter 16 timer ble oppløsningsmidlene fjernet i en Speed Vac og resten oppløst i 3 ml 0,1% vandig TFA og ekstrahert med 3 ml heksan for å fjerne overskytende halogenforbindelse. Det således oppnådde råstoff ble underkastet HPLC. Efter rensing ble det oppnådd 20,6 mg 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 33%.

EKSEMPEL 7

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(3"-deamino-3'-(3"-piperidon-l"-yl)-doxorubicin-TFA-salt (Q7)

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 260 mg (1,3 mmol) tilsvarende 15 gangers overskudd av l-klor-5-brom-2-pentanon ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 umol) tilsvarende 3 gangers overskudd av DIPEA. Efter 16 timer ble oppløsningsmidlene fjernet i en Speed Vac og resten oppløst i 3 ml 0,1% vandig TFA og ekstrahert med 3 ml heksan for å fjerne overskuddet av halogenforbindelse. Det således oppnådde råmaterialet ble underkastet HPLC. Efter rensing ble 18 mg 95% rent sluttprodukt oppnådd i et utbytte av 28%.

EKSEMPEL 8

Fremstilling og isolering av 4-iodbutyraldehyd og 5-iodvaleraldehyd

2-(3-klorpropyl)-l,3-dioksolan-(4-klor-n-butyraldehydetylenacetal), 1,3 ml (10 mmol), (Fluka) ble oppløst i 200 ml aceton inneholdende 30 g (200 mmol, 20 gangers overskudd) Nal. Oppløsningen ble kokt under tilbakeløp i 24 timer, fulgt av fordamping til tørr tilstand. 100 ml eter ble benyttet for å ekstrahere det organiske materialet fra den uorganiske, faste rest. Den eteriske oppløsning ble så vasket med 50 ml H2O, 50 ml 5% vandig Na2S203-oppløsning og 3 ganger med 50 ml H2O. Eteren ble fjernet under vakuum og den gjenværende olje oppløst i 3 ml 50 %-ig vandig eddiksyre. Efter 1 time ble 100 ml eter satt til denne oppløsning og eddiksyren så vel som etylenglykolen ble fjernet ved vasking 3 ganger med 50 ml H20. Hovedproduktet ble eluert ved Rf: 0,8 ved TLC i ren CHCI3. Spottesten som ble benyttet for aldehydfunksjonen var den samme som beskrevet for ketonene i eksempel 5. Eteren ble så fjernet og den sorte olje bragt på en kolonne med lengde 15 cm og diameter 2,5 cm, pakket med 15 g silikagel, Merck, kvalitet 9385, 230-400 mesh, porestørrelse 60Å. Den flytende, mobile fase var CHCI3. Fraksjoner inneholdende det ønskede sluttprodukt, karakterisert ved den ovenfor i detalj beskrevne spottest, ble blandet og fordampet til tørr tilstand. Det ble oppnådd 1,6 g gul olje i et utbytte av 80%.

5-iodvaleraldehyd ble oppnådd nøyaktig på samme måte fra 2-(4-klorbutyl)-l,3-dioksolan-(5-klor-n-valeraldehydetylenacetal) (Fluka). Det ble oppnådd 1,65 g gul olje i et utbytte av 80%.

EKSEMPEL 9

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-TFA-salt (Q6)

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 515 mg (2,6 mmol) tilsvarende 30 gangers overskudd av 4-iodbutyraldehyd ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 umol, 3 gangers overskudd) DIPEA. Efter 1 time ble 100 ul iseddik satt til reaksjonsblandingen som så dråpevis ble satt til 5 ml 0,1% TFA i 70% vandig acetonitril (oppløsningsmiddel ii i HPLC-systemet). Denne oppløsning ble fortynnet med 2 ml 0,1% vandig TFA-oppløsning, fulgt av fjerning av acetonitrilet i en Speed Vac. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert med heksan for å fjerne overskuddet av halogenforbindelse. Det således oppnådde materialet ble underkastet HPLC. Efter rensing ble det oppnådde 52 mg 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 85%.

EKSEMPEL 10

Fremstilling og isolering av 3'-deamino-3'-(l",3"-tetrahydropyridin-l"-yl)-doxorubicin-TFA-salt (Q8)

DOX-HCl-salt, 50 mg (86 umol), ble oppløst i 1 ml DMF og 552 mg (2,6 mmol) tilsvarende 30 gangers overskudd av 5-iodvaleraldehyd ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 45 ul (260 umol) tilsvarende 3 gangers overskudd av DIPEA. Efter 1 time ble 100 ul iseddik satt til reaksjonsblandingen som så dråpevis ble satt til 5 ml 0,1% TFA i 70% vandig acetonitril (oppløsningsmiddel ii i HPLC-systemet). Denne oppløsning ble fortynnet med 2 ml 0,1% vandig TFA-oppløsning, fulgt av fjerning av acetonitril i en Speed Vac. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert med heksan for å fjerne overskytende halogenforbindelse. Det således oppnådde materialet ble underkastet HPLC. Efter rensing ble det oppnådd 46 mg 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 75%.

EKSEMPEL 11

Fremstilling og isolering av cytotoksisk LH-RH-agonistanalog inneholdende DOX.

([D-Lys<6>(DOX,<4->0-glt)]LH-RH, Qi<14>gL)

[D-Lys<6>]LH-RH, 60 mg (37,5 umol) og 52 mg (64% rent, 37,5 umol) N-Fmoc-DOX<14->O-hemiglutarat (se eksempel 1) ble oppløst i 1 ml DMF og 22 mg (50 umol) BOP-reagens (Aldrich), 13,5 mg (100 umol) HOBt samt 52 ul (300 umol) DIPEA ble tilsatt. Efter omrøring i 1 time ved romtemperatur var reaksjonen ferdig. Oppløsningsmidlene

ble fordampet og restoljen krystallisert med 3 ml etylacetat og så vasket to ganger med 3 ml etylacetat. De 90 mg rått faststoff ble så oppløst i 3 ml DMF og 300 ul piperidin ble tilsatt. Efter 5 minutter ble reaksjonen anbragt i et isbad og surgjort ved tilsetning av en blanding av 300 ul TFA, 700 ul pyridin og 2 ml DMF. Efter fordamping av oppløs-ningsmidlene ble restoljen bragt til størkning ved hjelp av etylacetat. Det således oppnådde, urene faststoff ble oppløst i 1 ml 70% vandig acetonitril inneholdende 0,1% TFA (i) og fortynnet med 3 ml 0,1% vandig TFA (ii) og underkastet semipreparativ HPLC. Det ble oppnådd 40 mg (14,8 umol) 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 48%.

EKSEMPEL 12

Fremstilling av cytotoksisk LH-RH-agonistanalog inneholdende 2-pyrrolino-DOX-([D-Lys6(2-pyrrolino-DOX,4-0-gIt)]LH-RH, Q614gL)

Qi1<4>gL, 11,2 mg (5 umol), (se eksempel 11) ble oppløst i 200 ul DMF og 30 mg (150 umol, 30 gangers overskudd) 4-iodbutyraldehyd (eksempel 8) ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 3 (0.1 (17 umol) DIPEA. Efter 1 time var reaksjonen ferdig (se eksempel 9) og 10 ^1 iseddik ble satt til reaksjonsblandingen som så dråpevis ble satt til 1 ml 0,1% TFA i 70% vandig acetonitril. Denne oppløsning ble så fortynnet med 1 ml 0,1% vandig TFA og acetonitrilen fjernet under vakuum. Den gjenværende, vandige oppløsning ble så ekstrahert med 1 ml heksan og underkastet HPLC. m:7,6 mg, 99% rent sluttprodukt ble oppnådd i et utbytte av 66%.

EKSEMPEL 13

Fremstilling og isolering av et cytotoksisk somatostatin-analog inneholdende DOX

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-Val-Cys-Thr-NH2, 20 mg (14,5 umol) ("Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 1986, sidene 1986-1990) og 20 mg (64% rent, 14,5 umol) N-Fmoc-

DOX<14->0-hemiglutarat (eksempel 1) ble oppløst i 200 ul DMF og 8,8 mg (20 umol) BOP-reagens (Aldrich), 5,4 mg (40 umol) HOBt så vel som 17 ul (100 umol) DIPEA ble tilsatt. Efter omrøring i 1 time ved romtemperatur var reaksjonen ferdig. Efter fjerning av oppløsningsmidlene under vakuum ble resten krystallisert med etylacetat. Det faste materialet ble så oppløst i 1 ml DMF og 100 ul piperidin ble tilsatt. Efter 7 minutter ble reaksjonsblandingen anbragt i et isbad og surgjort ved tilsetning av en blanding av 100 ul TFA, 300 ul pyridin og 2 ml DMF. Efter fordamping av oppløs-ningsmidlene ble restoljen bragt til størkning med etylacetat. Det således oppnådde urene faststoff ble oppløst i 1 ml 70% vandig acetonitril inneholdende 0,1% TFA (i) og fortynnet med 3 ml 0,1% vandig TFA (ii) og underkastet semipreparativ HPLC. Det ble oppnådd 9,7 mg (5,1 umol) 95% rent sluttprodukt i et utbytte av 35%.

EKSEMPEL 14

Fremstilling av cytotoksisk somatostatin-analog inneholdende 2-pyrrolino-DOX

(6,4 mg, 5 umol) ble oppløst i 100 ul DMF og 2-pyrrolino-DOX<14->0-hemiglutarat (4,1 mg, 5 umol) ble tilsatt, fulgt av BOP-reagens (4,4 mg, 10 umol), HOBt (100 umol) og DJPEA (50 umol). Efter omrøring i 2 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen surgjort med 20 umol AcOH og fortynnet med 500 ul 70% vandig acetonitril inneholdende 0,1% TFA og ytterligere fortynnet med 700 ul 0,1%» vandig TFA og underkastet HPLC. Det ble oppnådd 3,9 mg tilsvarende 40% 99% rent sluttprodukt.

2-pyrrolino-DOX<14->0-hemiglutarat ble fremstilt ved omsetning av DOX<14->0-hemiglutarat med 4-iodbutyraldehyd som beskrevet i eksempel 9.

DOX<14->0-hemiglutarat ble fremstilt fraN-Fmoc-DOX<14->0-hemiglutarat ved å spalte den Fmoc-beskyttende gruppe som beskrevet i eksempel 11. Utbyttet var 40%.

EKSEMPEL 15

Fremstilling og isolering av en cytotoksisk bombesin-antagonist inneholdende DOX(DOX14-0-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-NH)Leu-NH2, Qi14gB)

Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-NH)Leu-NH2j 20 mg (15,8 umol) ("Int. J. Peptide Protein Res.", 38, 1991, sidene 593-600) og 22 mg (64% rent, 15,8 umol) N-Fmoc-DOX<14->0-hemiglutarat (eksempel 1) ble oppløst i 200 ul DMF og 8,8 mg (20 umol) BOP-reagens (Aldrich), 5,4 mg (40 umol) HOBt samt 17 ul (100 umol) DIPEA ble tilsatt. Efter omrøring i 1 time ved romtemperatur var reaksjonen ferdig. Efter fjerning av oppløsningsmidlene under vakuum ble resten krystallisert med etylacetat. Dette faste stoff ble så oppløst i 1 ml DMF og det ble tilsatt 100 ul piperidin. Efter 5 minutter ble reaksjonsblandingen anbragt i et isbad og surgjort ved tilsetning av en blanding av 100 ul TFA, 300 (il pyridin og 2 ml DMF. Efter fordamping av oppløsningsmidlene ble resten bragt til størkning med etylacetat. Det således oppnådde urene faststoff ble oppløst i 1 ml 70% vandig acetonitril inneholdende 0,1% TFA (i) og fortynnet med 3 ml 0,1% vandig TFA (ii) og underkastet semipreparat HPLC. Det ble oppnådd 13,5 mg (7,1 umol) 98% rent sluttprodukt i et utbytte av 45%.

EKSEMPEL 16

Fremstilling og isolering av en cytotoksisk bombesin-antagonistisk analog inneholdende 2-pyrrolino-DOX

2-pyrrolino-DOX,<4->0-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-NH)Leu-NH2, Q6<U>gB

Qi<14>gB, 9,5 mg (5 umol), (eksempel 15) ble oppløst i 200 ul DMF og 30 mg (150 umol, 30 gangers overskudd) 4-iodbutyraldehyd (eksempel 8) ble tilsatt, fulgt av tilsetning av 3 (il (17 umol) DIPEA. Efter 1 time var reaksjonen ferdig (eksempel 9) og 10 ul iseddik ble satt til reaksjonsblandingen som så ble satt dråpevis til 1 ml 0,1% TFA i 70% vandig acetonitril. Denne oppløsning ble så fortynnet med 1 ml 0,1% vandig TFA og acetonitrilet ble fjernet under vakuum. Den gjenværende, vandige oppløsning ble så ekstrahert med 1 ml heksan og underkastet HPLC. 6 mg 98% rent sluttprodukt ble oppnådd i et utbytte av 60%.

Bestemmelse av in vitro cytotoksisk aktivitet.

MXT-estrogen-uavhengig musebrystkarsinomcellelinje ble oppnådd fra dr. Gunter Bernhardt, Universitet i Regensburg, Tyskland. Alle andre cellelinjer som ble benyttet ved bestemmelsen av den antiproliferative aktivitet for forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC).

For bedømmelsen av aktiviteten hos analogene, ble det benyttet en kolorimetrisk cyto-toksisitetsanalyse i mikrotitreringsplater basert på kvantifisering av biomasse ved flekking av celler med krystallfiolett som korrelerer meget godt med bestemmelsen av celleantallet. (Reile et al., "Anal. Biochem.", 187, 262-267,1990; Bernhardt G. et al., "J. Cancer Res. Clin. Oncol.", (1992), 118, 35-43; Spruss Th. et al., "J. Cancer Ree. Clin. Oncol.", 117,435-443, 1991; Gillies R. et al., "J. Anal. Biochem.", 159,109-113, 1986; Kueng W. et al., "Anal. Biochem.", 182,16-19,1989).

Analyseprotokoll

1 til 2 dager efter utspredning av celler i 96-brønners plater ble dyrkingsmediet byttet ut med friskt medium inneholdende forbindelsene under utprøving og friskt medium kun for kontrollkulturer. Efter varierende inkuberingstid blir cellene fiksert med glutarsyre-dialdehyd og lagret under føtalt bovinserum (FBS) ved 4°C til slutten av forsøket. Cellene flekkes med krystallfiolett og bundet flekk ekstraheres med 70% vandig EtOH. Den optiske densitet måles med en EIA Reader (Bio-Tek Instruments) eller Biomek 1000 (Beckman) ved henholdsvis 590 nm eller 600 nm. Hvert datapunkt representerer middelverdien for 8 kulturbrønner. T/C-verdiene beregnes som T/C = (T-C0)/(C-C0), der T = optisk densitet for behandlede kulturer, C = optisk densitet for kontroll (ikke-behandlede) kulturer og CO = optisk densitet for kulturer ved starten av inkuberingen (t=0).

EKSEMPEL 17

In vitro cytotoksisk aktivitet for daunosamin-modiflserte derivater av DOX

Tabell 17-1 viser virkningene av doxorubicin og dens daunosamin-modifiserte derivater på MCF-7 humane brystkarsinomcellelinje in vitro.

Cytotoksiske radikaler med sitt daunosamin N innarbeidet i en 5-leddet ring med en reaktiv funksjon er 5 til 50 ganger mere aktive enn det homologe motstykke med en 6-leddet ring slik det eksemplifiseres ved 3-pyrrolidono-DOX (Q5) og 3-piperidono-DOX (Q7) så vel som 2-pyrrolino-DOX (Q6) og 1,3-tetrahydro-pyridino-DOX (Q8). Celler ble inkubert i IMEM-media inneholdende 5% HI-DCC-FBS (varmeaktivert dekstran-belagte trekull-behandlede føtalbovinserum) på 96-brønners plater. Den relative cellemengde i behandlede og kontrollplater ble bestemt ved krystallfiolett-flekkingsmetoden og uttrykt som T/C-verdier der T/C = (T-C0(C-C0) x 100

[T = absorbans for behandlede kulturer, C =Absorbans for kontrollkulturer,

Co = absorbans for kulturer ved inkuberingsstart (t=0). Den målte absorbans er proporsjonal med celleantallet.]

Lavere T/C-verdier antyder en reduksjon i overlevelsen av cancerøse celler på grunn av behandling. Dette betyr at tallet 75 vil indikerer 75% overlevelse av celler sammenlignet med 100% for kontroll eller 25% inhibering.

EKSEMPEL 18

Full bibeholdelse av cytotoksisk in vitro-aktivitet for DOX i LH-RH-agonistpeptid-konjugat Qi<14>gL og superaktiv 2-pyrrolino-DOX (Q6) i LH-RH-agonistpeptid-konjugat Q6<14>gL.

Tabell 18-1 viser virkningene av doxorubicin og dets daunosamin-modifisert derivat, 2-pyrrolino-doxorubicin (Qe) sammenlignet med deres konjugater med den LH-RH-agonistiske analog, [D-Lys<6>]LH-RH (Qi<14>gL henholdsvis Qe<14>gL) på veksten av MCF-7 human brystkarsinomcellelinjen og MXT estrogen-uavhengig musebrystkarsinomcellelinje in vitro.

MCF-7-celler ble inkubert i IMEM-media inneholdende 5% HI-DCC-FBS på 96 brønners plater. MXT-celler ble inkubert i RPMI 1640-media inneholdende 0,6 g/l L-glutamin og 10% FBS.

<*>Bestemt som i tabell 17-1

EKSEMPEL 19

Tabell 19-1 viser at den cytotoksiske in vitro-aktivitet for somatostatin-analogene inneholdende DOX ifølge oppfinnelsen er fullt ut bibeholdt.

Celler ble inkubert i RPMI 1640-media inneholdende 10% føtalbovinserum på 96 brønners plater.

EKSEMPEL 20

Virkning av cytotoksiske analoger av bombesin-antagonister inneholdende doxorubicin på veksten av CFPAC-1 human pankreatiske cancerceller in vitro

Tabell 20-1 viser at den cytotoksiske aktivitet in vitro av bombesin-antagonistiske analoger inneholdende DOX ifølge oppfinnelsen, fullt ut bibeholdes.

Celler ble inkubert i IMDM-media inneholdende 10% føtal bovinserum på 24 brønners plater.

Bevarte bindingsegenskaper for hormonderivater

EKSEMPEL 21

Hormonelle aktiviteter og reseptorbindingspotensene for cytotoksiske LH-RH-agonistanaloger Qi,<4>gL ([D-Lys<6>]LH-RH med DOX) og Q6<14>gL ([D-Lys<6>]LH-RH med 2-pyrrolino-DOX) sammenlignet med bærerpeptidet, [D-Lys<6>]LH-RH

I tabell 21-1 angir

<*> LH-responser til analoger ble bestemt i dispergert rotte-pituitært cellesuperfusjons-system som beskrevet av S. Vigh og A.V. Schally i "Peptides", 5, 241-247 (1984). <**> Bindingsaffiniteter for analogene til rotte-pituitære LH-RH-reseptorer og humane brystcancerreseptorer ble bestemt i kompetitive bindingsforsøk ved bruk av [ I]-merket [D-Trp6]LH-RH som radioligand som beskrevet av B. Szoke et al. i "Peptides", 15(2), 359-366 (1994). Bindingsaffinitetene var uttrykt ved IC50-verdiene, konsentrasjonen av ikke-merket analog som var nødvendig for å inhibere 50% av den spesifikke binding av radioliganden.

EKSEMPEL 22

Somatostatin-analoger inhiberer sekresjonen av veksthormon (GH) fra perfusert rotte-pituitær som beskrevet av Carlson et al., thyrotropin-frigivende hormonstimulering og somatostatin-inhibering av veksthormonsekresjon fra perfuserte adenohypofyser, "Endocrinology", 94,1709- (1974). I henhold til dette ble metoden benyttet for å sammenligne de cytotoksiske somatostatin-analoger ifølge oppfinnelsen med deres opphavsbærermolekyler med henblikk på de hormonelle aktiviteter.

Inhibering av human veksthormon-frigivende hormon (hGH-RH(l-29)NH2) induserte veksthormon-frigivning fra superfusert rotte-pituitære celler med somatostatin-analoger S-98-1 sammenlignet med deres cytotoksiske derivat, Q^gS<9>8"1(DOX1<4>-0-glt-S-98-l) hen-holdsvi<s> Q<1>14gS<121> (DOX<14->0-glt-S-121).

I rotte-pituitært superfusjonssystem ble somatostatin-analogene administrert i 3 minutter i en 1 nM dose samtidig med 1 nM hGH-RH(l-29)NH2. Infusjonen av somatostatin-analogene ble opprettholdt i ytterligere 6 minutter. GH-responser på 3 minutters administrering av 1 nM hGH-RH(l-29)NH2 ble bestemt under perfusjonen av somatostatin-analogene (0 minutter) og 30, 60 og 90 minutter efter at administreringen var stanset. De oppnådde data er angitt i tabell 22-1.

EKSEMPEL 23

Reseptorbindingsstudier med cytotoksiske bombesin-antagonister

Radioiodinering av [Tur<4>]BN (Sigma) ved bruk av Bio-Rad Enzymobead Radio Iodination kit og isolering av mono-ioderte [<125>I-Tyr<4>]<B>N ble gjennomført som beskrevet tidligere (1). Bindingen av merket [Tyr<4>]BN og forskyvning ved cytotoksisk bombesin-antagonistanalog, Q6<14>gB ble gjennomført ved bruk av konfluente Swiss 3T3-celler (oppnådd fra American Type Culture Collection) i 24 brønnplater i en modifi-kasjon (2) av metoden i henhold til Kris et al (3). 3 til 5 dager efter såing ble de konfluente celler vasket to ganger med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) og inkubert i 30 minutter ved 37°C med 50 pM [<125>I-Tyr<4>]BN i nærvær eller fråvær av flere konsen-trasjoner av ikke-merkede kompetitorer (Q6<14>gB eller BN) i et totalt volum på 0,5 ml bindingsbuffer (DMEM med 50 mM Hepes, 0,1% bovinserumalbumin (BSA), 5 mM MgCl2 og 100 ug/ml bacitracin, pH lik 7,4). Hcke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av 1 um ikke-merket ligand. Efter 3 vaskinger med iskold HBSS inneholdende 0. 1. BSA (pH lik 7,4) ble cellene løsgjort med 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA-opp-løsning og overført til rør. Radioaktiviteten ble målt med en gamma-teller (Micromedic Systems Inc., Huntsville, AL). Bindingsdata ble bedømt ved bruk av radioligand-bindingsanalyseprogrammer i henhold til McPherson (4). Kj-verdier som angitt i tabell 23-1 ble beregnet i henhold til formelen i henhold til Cheng og Prusoff (5).

1. Halmos et al., "Cancer Letters", 85,111-118 (1994)

2. Cai et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 91: 12664-12668 (1994)

3. Kris et al., "J. Biol. Chem.", 262: 11215-11220 (1987)

4. McPherson, G.A., "J. Pharmaco Methods", 14: 213-228 (1985)

5. Cheng og Prusoff, "Biochem. Pharmacol.", 22:3099-3108 (1973).

Sammenligning av effektivitet og toksisitet for hormonkonjugater i forhold til cytotoksisk rest alene

EKSEMPEL 24

Behandling med 2-pyrrolino-DOX (Qé), cytotoksisk LH-RH-agonistanalog Q6<14>gL ([D-Lys<6>]LH-RH bundet til Q6<14->0-hemigIutarat) og (DOX) på estrogen-uavhengige MXT-musebrystcancere (KS-49)

For å sammenligne den tumor-inhiberende aktivitet for det cytotoksiske doxorubicin-derivat, Qj6 og dets målrettede cytotoksiske peptidkonjugat, Q6<14>gL, så vel som det velkjente, antineoplastiske middel DOX og for å bestemme den optimale admini-streringsmåte og de ikke-toksiske doser, ble LH-RH-reseptor-positive MXT (3.2) ovex

tumorstykker (1 mm<3>) implantert subkutant i B6D2Fl-hunnmus. En dag efter transplan-tering ble musene tilfeldig delt i grupper på 5 dyr og behandlingen startet. Forbindelsene ble oppløst i 0,1% trifluoreddiksyre (pH 2) og inngitt intraperitonealt. Grupper, behand-lingsoppsett og doser så vel som de gjennomsnittlig overlevelsestider er vist i tabell 24-1. Resultatene er oppsummert i tabell 24-2 og i figur 1.

Tabell 24-2 viser virkningen av behandlingen med Q6 og cytotoksisk LH-RH-analog, Q6<14>gL på tumorvolumer og overlevelsen av mus med estrogen-uavhengige bryst-cancere. Som vist i tabellen 24-2 utøvet 1,25 nmol Q6, administrert på dagene 1, 2, 7, 8, 14 og 15 (gruppe 2) en sterk toksisitet som karakteriseres ved en midlere overlevelse på 17,4 dager, noe som er signifikant kortere enn den for den ikke-behandlede gruppe. I sammenligning resulterte den samme dose av Q6<14>gL (gruppe 6) i en midlere overlevelse på 30,8 dager, noe som er signifikant lengere den til den ikke-behandlede kontrollgruppe. Høyere effektivitet av Q6<14>gL i forhold til Q6 kan også påvises ved å sammenligne de midlere slutt-tumorvolumer i gruppe 2 (1065 mm<3> på dag 16) og i gruppe 6 (863 mm<3> på dag 31).

Tilsvarende konklusjoner kan påvises ved å sammenligne Q6 og Q6<14>gL i en annen behandlingsrutine der 0,5 nmol medikament administreres 5 dager i uken i tre på hverandre følgende uker.

Doxorubicin i en toksisk dose (total mengde: 1560 nmol, midlere overlevelse lik 20 dager) kunne ikke utslette tumoren, mens behandling med Q6<14>gL ved ikke-toksisk dose (total mengde lik 7 nmol, midlere overlevelse > 31 dager) førte til overlevelse av 2 av 5 dyr uten utvikling av tumoren.

EKSEMPEL 25

Virkningen av en enkelt behandling med (DOX), cytotoksiske LH-RH-analoger T-107 og Qi<14>gL på estrogen-uavhengige MXT-musebrystcancere (KS-55)

Testforbindelser:

Qi<14>gL: Doxorubicin<14->0-hemiglutarat bundet til [D-Lys<6>]LH-RH

T-107: N-glutaryl-doxorubicin bundet til [D-Lys<6>]LH-RH

("Proe. Nati. Acad. Sei.", vol. 89, sidene 972-976 (1992); og

DOX

Analysen ble gjennomført som følger:

For å bestemme de maksimalt tolererte doser og å sammenligne effektene ble MXT (3.2) ovex tumorstykker (1 mm<3>) implantert subkutant i B6D2Fl-hunnmus. En dager efter transplanteringen ble musene tilfeldig delt i grupper på 5 dyr og de ble behandlet med en enkelt injeksjon intraperitonealt. Gruppene og dosene er vist i tabell 25-1. Tabellen viser også antallet mus som hadde tumorer når volumet ble målt og også den midlere overlevelsestid for gruppene. Tumorvolumendringer er vist i figur 2. Forbindelsene ble oppløst i 0,1% TFA (pH: 2,0). Tumorvolurnet ble målt på dagene 10,13,17 og 20.

Som vist i tabell 25-1 og figur 2 er T-107 ([D-Lys<6>]LH-RH bundet til N-glutaryl-DOX) fullstendig ineffektivt med henblikk på å inhibere veksten av denne tumor ved en dose på 850 nmol/20 g mus. I motsetning til dette utviste Q, 14gL, ([D-Lys<6>]LH-RH bundet til 14-O-glutaryl-DOX) sterk suppressjon av tumorvekst (figuren) ved en ikke-toksisk dose på 650 nmol/20 g mus. DOX alene var sterkt toksisk (midlere overlevelsetid: 13,6 dager) ved en enkelt dose på 650 nmol/20 g mus og også signifikant mindre effektiv enn Q1<14>gL(figur2).

EKSEMPEL 26

Effekt av cytotoksiske LH-RH-analoger på estrogen-uavhengige MXT-musebrystcancere (KS-47)

Substanser benyttet for behandling.

I et tidligere forsøk hadde Q2 kun en moderat inhiberende effekt på tumorvekst ved 20 nmol daglig dose i 17 dager og den var toksisk ved 40 nmol dose (midlere overlevelse var 14,6 dager). En daglig dose på 30 nmol ble valgt for det herværende forsøk som sammenlignet effektiviteten og toksisiteten for Q2<I4>gL (Q2 koblet til [D-Lys<6>]LH-RH), Q2(pyrrolidino-doxorubicin), [D-Lys<6>]LH-RH, og [D-Lys<6>]LH-RH + Q2.

MXT (3.2) ovex tumorstykker (1 mm<3>) ble transplantert inn i B6D2Fl-hunnmus. Behandlingen startet en dag efter transplanteringen og ble fortsatt i 12 dager ved intraperitoneale injeksjoner en gang daglig. Alle gruppene fikk ekvimolare mengde av forbindelsene som vist i tabell 26-1. Tumorene ble målt på dagene 10,14 og 18, og tumorvolurnet ble beregnet. De oppnådde data er vist i tabell 26-1 og i figur 3.

Behandlingen med en daglig dose på 30 nmol daunosamin-modifisert doxorubicin-analog Q2 (pyrrolidino-DOX) resulterte i sterkt, inhiberende effekt på tumorveksten (tumorvolurnet: 144 mm<3> på dag 14 og 1391 mm<3> for kontrollgruppen), men utviste alvorlig toksisitet og drepte alle dyrene før slutten av forsøket (midlere overlevelse lik 17,9 dager). På tilsvarende måte resulterte Q2 kombinert (blanding) med [D-Lys<6>]LH-RH i sterk turmor-inhiberende effekt (tumorvolum: 80 mm<3> på dag 14), men den midlere overlevelse på 18,5 dager var signifikant kortere enn den til den ubehandlede kontrollgruppe på 23,1 dager. Som et resultat av behandlingen med Q2<14>gL (Q2 kovalent bundet til [D-Lys<6>]LH-RH) døde to dyr, et dag 16 og det andre dag 26. Fra de 8 over-levende dyr utviklet kun et tumorer ved den siste måling på dag 18 og de syntes alle sunne, men senere begynte alle å utvikle tumorene. Den midlere overlevelse for denne gruppe var signifikant lengere (28,3 dager) enn den til kontrollgruppen. Behandling med [D-Lys<6>]LH-RH alene virket ikke inn på tumorveksten.

Dette forsøk viste at den høyere effektivitet og den lavere perifere toksisitet for Q2<14>gL i forhold til den cytotoksiske rest Q2 kan henføres til den kovalente konjugasjon av den cytotoksiske rest til den målsøkende bærer LH-RH-analog.

Alle doser er 30 nmol ekvimolare mengder.

Signifikant kortere enn kontrollen (p < 0,05)

<*> Signifikant lengere enn kontrollen (p < 0,01) med Duncans test.

EKSEMPEL 27

Effekter av 2-pyrrolino-DOX (Q6) og cytotoksisk LH-RH-agonistanalog bundet til Q6,<4>gL ([D-Lys<6>]LH-RH bundet til Q6<14>gL-0-hemiglutarat) på vekst androgen-avhengig rotte Dunning R-3327-H-prostatakarsinomer.

Copenhagen-hannrotter med hormon-avhengig Dunning R-3327-H-prostatakarsinomer ble behandlet med Q6<14>gL, en ny cytotoksisk analog av luteiniseringshormon-frigivende hormon (LH-RH) bestående av agonisten [D-Lys<6>]LH-RH bundet til 2-pyrrolido-doxorubicin. I den første utførelsesform ble 2-pyrrolino-doxorubicin administrert ved en konsentrasjon av 50 nmol/kg, som et enkelt medikament (Qe) og som en ikke-konjugert blanding med [D-Lys<6>]LH-RH eller konjugert til bæreren [D-Lys<6>]LH-RH (Q6<14>gL). Efter den andre administrering av 50 nmol/kg av resten Q6 alene eller blandet med [D-Lys<6>]LH-RH, døde alle rottene med tegn på generell toksisitet, mens alle dyrene, behandlet i cytotoksisk LH-RH-konjugat Q6<14>gL, overlevde. Efter 5 ukers behandling med en totaldose på 150 nmol/kg Q6<14>gL, trakk tumorene seg tilbake fra et utgangs-volum på 8,35 ±1,7 cm<3> ved begynnelsen av forsøket til 4,47 ± 0,8 cm<3>, der tumorene i kontrollgruppen fortsatte å vokse og målte 17,84 ± 2,2 cm<3>. Terapien med Q6MgL reduserte også signifikant tumorvekten og tumorbelastningen. I det andre forsøk, konstruert for sammenligning av effektivitet og toksisitet av Q6 og Q6<14>gL omfattet det terapeutiske oppsett tre applikasjoner av 25 nmol/kg Q6 eller 25 nmol/kg og 50 nmol/kg Q6<14>gL. Efter at behandlingen var startet, var tumorvolurnet i alle grupper mellom 3,9 og 4,5 cm<3>. Efter 5 ukers terapi trakk tumorene i rotter behandlet med 50 nmol/kg Q6<14>gL seg tilbake til 2,3 ± 0,51 cm<3>, mens 25 nmol/kg Q6 fremdeles var toksisk og kun kunne gi en reduksjon i slutt-tumorvolumet til 6,76 ±1,4 cm<3>, tilsvarende det som ble oppnådd med 25 nmol/kg Q6<14>gL (6,74 ± 1 cm3) sammenlignet med 15,6 n 2,2 cm<3> for ikke-behandlede dyr. Histologisk bedømmelse av prøvene viste en signifikant reduksjon i mitotoksiske celler kun i de Q6<14>gL-behandlede grupper. LH-RH-reseptorer med høy bindingskapasitet ble detektert i membraner av ikke-behandlede Dunning-tumorprøver, men efter behandling med Q6<14>gL ikke ingen bindingsseter finnes for LH-RH. Inhiberingen av tumorvekst med AN-201 og Q6<14>gL ble også assosiert med en signifikant reduksjon i bindingskapasiteten for EGF-reseptorer. Som påvist ved figurene 4-6 er målstyrt cytotoksisk LH-RH-analog Q6<14>gL et effektivt antitumormiddel som forårsaker regresjon av rotte Dunning R-3327-H-prostatakarsinomer. Foreliggende søkers studier har også vist at den cytotoksiske LH-RH-analog Q6<14>gL er meget mindre toksisk enn den antineoplastiske rest (Qjj) som var innarbeidet, og signifikant mere aktiv med henblikk på inhibering av tumorvekst.

Figurforklaring for eksempel 27:

Figur 4. Forsøk I: Tumorvolurnet i Copenhagen-hannrotter med rotte Dunning R-3327-H-prostatakarsinom-transplantater under behandlingen bestående av 3 applikasjon av 50 nmol/kg agonist [D-Lys<6>]LH-RH og 50 nmol/kg cytotoksisk LH-RH-analog Q6<14>gL. Vertikale linjer indikerer SEM.<*> p < 0,05, <**> p < 0,01 versus kontroll ved Duncans nye multippel områdetest. Behandlingen indikert med piler ble gjennomført på dagene 1, 8 og 29.

Å Dyrene behandlet med Q6 som eneste medikament eller en ikke-konjugert blanding med [D-Lys<6>]LH-RH døde den andre uke. I disse to grupper er volumet av tumorene som ble notert på dag 8, vist.

Figur 5. Forsøk II: Virkning av behandlingen med 25 nmol/kg 2-pyrrolino-doxorubicin (Qe), 25 nmol/kg og 50 nmol/kg cytotoksisk LH-RH-analog Q6<M>gL på tumorvolurnet i rotter med Dunning R-3327-H-prostatacancer. Vertikale linjer indikerer SEM.

<*> p < 0,05, <**> p < 0,01 versus kontroll. Behandlingen indikert med piler ble gjennomført 3 ganger, det vil si på dagene 1, 8 og 29.

Figur 6. Forsøk II: Virkning av behandlingen med 25 nmol/kg 2-pyrrolino-doxorubicin (Qå), 25 nmol/kg og 50 nmol/kg cytotoksisk LH-RH-analog Q6<14>gL på kroppsvekten for Copenhagen-rotter med Dunning R-3327-H-prostatacancer. Vertikale linjer angir

SEM.

<*> p < 0,05, <**> p < 0,01 versus kontroll. Behandlingen indikert med piler ble gjennomført 3 ganger, det vil si på dagene 1, 8 og 29.

EKSEMPEL 28

Sammenlignende studie av virkningene av doxorubicin (DOX) og målsøkende cytotoksisk LH-RH-agonistanalog Qi<14>gL ([D-Lys<6>]LH-RH bundet til DOX14-0-hemiglutarat) på veksten av OV-1063 human ovariekarsinom i nakne mus

Human epitel ovarie-cancercellelinje OV-1063 stammet fra en metastatisk papillær cystadenokarsinom fra ovariet til en 57 år gammel kvinne (Horowitz et al. (1985) "Oncology", 42, 332-337) 10 millioner celler av OV-1063 ble injisert subkutant i 3 nakne mus for å dyrke tumorer. Stykker på 1 mm<3> av disse tumorer ble transplantert inn i 60 dyr for in vivo vekstinhiberingsstudier. Formålet med forsøk var å vise at, som et resultat av nærværet av reseptorer for LH-RH på OV-1063, var den cytotoksiske konjugat av LH-RH mer effektivt og mindre toksisk enn DOX, den cytotoksiske rest det inneholdt. Således ble virkningene av cytotoksisk LH-RH-konjugat sammenlignet med det til DOX, blandingen av DOX med bærermolekylet, bæreren alene og de ikke-behandlede kontrollgrupper. Alle injeksjoner ble administrert intrapeirtonealt. Forbindelsene ble oppløst i 0,9% natriumklorid i vann (saline).

Mus med en gjennomsnittlig tumorstørrelse på rundt 15 mm<3> ble delt i 6 grupper på 9 dyr og mottok den følgende behandling 7 dager efter tumortransplanteringen: gruppe 1, saline; gruppe 2, Qi<14>gL i en dose på 700 nmol/20 g dyr; gruppe 3, Qi<14>gL ved en dose på 413 nmol/20 g dyr (maksimal tolerert dose, MTD for DOX); gruppe 4, DOX i en mengde av 413 nmol/20 g dyr (MTD); gruppe 5, blanding av 700 nmol/20 g dyr DOX og 700 nmol/20 g [D-Lys<6>]LH-RH; gruppe 6, bærer-agonistanalog [D-Lys<6>]LH-RH i en dose av 700 nmol/20 g dyr.

Reseptoranalyse av OV-1063 viste nærværet av høyaffinitetsbindingsseter for LH-RH.

Resultater: Som vist i figur 7 ble det oppnådd sterk inhibering av tumorveksten ved behandling med Qi<14>gL i en mengde av 413 nmol/20 g dose (gruppe 3). Dyrene viste ingen tegn på alvorlig toksisitet. I sammenligning resulterte behandling med DOX administrert i samme dose på 413 nmol/20 g (12 mg/kg, MTD, gruppe 4) ikke noen signifikant inhibering av tumorveksten i 3 dyr som overlevet ved slutten av forsøket. 3 dyr døde innen dag 5 og 6 dyr var døde den 9. dag på grunn av toksisitet. Ved en høyere dose (700 nmol/20 g, gruppe 2), viste Qj 14gL meget sterk inhibering av tumorveksten (figur 7). 2 av 9 dyr døde på grunn av toksisitet og 1 dyr døde ved uhell. De 6 over-levende dyr kom seg fra et vekttap på rundt 20% ved slutten av forsøket. I gruppe 6 ble den samme høye dose (700 nmol/20 g) DOX blandet med 700 nmol [D-Lys<6>]LH-RH. Ved dag 5 døde alle dyr i denne gruppe som et resultat av alvorlig toksisitet.

Konklusjoner: De fremlagte resultater viser klart at på grunn av nærværet av reseptorer for LH-RH på cellene av epitel ovariecancer OV-1063, viste målsøkende cytotoksisk LH-RH-konjugat Qi<14>gL lavere toksisitet og høyere antitumoral aktivitet enn doxorubicin (Qi), den cytotoksiske rest det inneholder.

Claims (36)

1. Forbindelse, karakterisert ved formelen: der Q har den detaljerte kjemiske struktur: der -R- er en enkeltbinding eller -C(0)-(CH2)n-C(0)- og n = 0-7, R' er valgt blant gruppen bestående av NH2, en aromatisk eller hydrogenert 5- eller 6-leddet heterocyklisk forbindelse med minst et ringnitrogen og med en butadiendel bundet til nabokarbonatomer i ringen under dannelse av et bicyklisk system, P er H eller et peptid, forutsatt at når R' er NH2 er R-P forskjellige fra H, og når R-P er H er R' forskjellig fra NH2.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R'er valgt blant NH2, pyrrolidin-l-yl, isoindolin-2-yl, 3-pyrrolin-l-yl, 3-pyrrolidon-l-yl, 2-pyrrolin-l-yl, 3-piperidon-l-yl, 1,3-tetrahydropyridin-l-yl, og P er Pi, P2 og P3, der Pi er valgt fra gruppen bestående av en LH-RH-analog med formelen der (Xxx) er hydrogen, A2B11 eller A2Pr hvor: når Aaa er Gip, så er Bbb His, Ccc er Trp og Ddd er Gly-NH2, når Aaa er Ac-D-Nal(2), så er Bbb D-Phe(4Cl), Ccc er D-Pal(3), D-Trp og Ddd er D-Ala-NH2; og når Aaa-Bbb-Ccc er Ac, såerDdd-NH-CH2-CH3; der gruppen Q<14->0-R- danner en karboksamidobinding med den frie aminogruppen i D-Lys-delen eller i det minste med en av de frie aminogruppene til A2BU eller A2Pr når til stede ved (Xxx), P2 er en analog av somatostatin med formelen hvor: når Aaa er D-Phe, så er Bbb Tyr, Ccc er Val og Ddd er Thr eller Trp; når Aaa er D-Trp, så er Bbb Phe og Ccc og Ddd er Thr; der gruppen Q<14->0-R- danner en karboksamidobinding med den terminale aminogruppen til Aaa-delen, P3 er en bombesin-antagonist med formelen: hvor: når Aaa er ingenting, D-Tpi eller D-Phe, så er Bbb (CH2-NH)Leu, (CH2-NH)Phe, (CH2-NH)Trp eller (CH2-N)Tac der gruppen Q<14->0-R- danner en karboksamidobinding med den terminale aminogruppen av Aaa-delen når til stede eller med Gin når den er fraværende.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved atn = 3.

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at R'er NH2.

5. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at R'er 2-pyrrolin-l-yl.

6. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at Per Pi.

7. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved at Per Pi.

8. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved atPerP2.

9. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved atPerP2.

10. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved atPerP3.

11. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved atPerP3.

12. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at-R-P er -H og R' er forskjellig fra NH2.

13. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at-R'er pyrrolidin-l-yl.

14. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at-R'er isoindolin-2-yl.

15. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at -R' er 3-pyrrolin-l-yl.

16. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at-R'er 3-pyrrolidon-l-yl.

17. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at-R'er 2- pyrrolin-l-yl.

18. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at-R'er 3- piperidon-l-yl.

19. Forbindelse ifølge krav 12, karakterisert ved at-R'er 1,3-tetrahydropyridin-1 -yl.

20. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Q]<14> er doxorubicin-14-yl.

21. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Q6<14> er 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-14-yl.

22. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Qj<14> er doxorubicin-14-yl.

23. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Q6<14> er 3'deamino-3'(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-14-yl.

24. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Qj<14> er doxorubicin-14-yl.

25. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Q6<14> er 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-14-yl.

26. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Qi<14> er doxorubicin-14-yl.

27. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Q6<14> er 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-14-yl.

28. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Qi<14> er doxorubicin-14-yl.

29. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Qj;14 er 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-14-yl.

30. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Qj<14> er doxorubicin-14-yl.

31. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved følgende formel der Q6<14> er 3'-deamino-3'-(2"-pyrrolin-l"-yl)-doxorubicin-14-yl.

32. Blanding, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer derav.

33. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 1 for fremstilling av et preparat for behandling av kreft i et pattedyr.

34. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 20 og 21 for fremstilling av et preparat for behandling av forskjellige humane tumorer som har reseptorer for LH-RH inkludert bryst-, ovarie-, endometrial-, prostata-, pankreatisk og coloncancere.

35. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 22-27 for fremstilling av et preparat for behandling av forskjellige humane tumorer som har reseptorer for slike somatostatin-analoger, inkludert bryst-, gastrisk-, pankreatisk- colorektale- og prostatacancere, småcelle- og ikke-småcelle-lungekarsinomer, renalcellekarsinoma, osteosarkomer og hjernetumorer.

36. Anvendelse av forbindelsene ifølge krav 28-31 for fremstilling av et medikament for behandling av forskjellige humane tumorer som har reseptorer for GRP og bombesin-lignende peptider inkludert bryst-, gastriske-, pankreatiske-, colorektale-, prostatacancere, småcelle- og ikke-småcelle-lungekarsinomer og hjernetumorer.