CN1405127A - 含氮基团的转化方法 - Google Patents

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Abstract

一种将α，β或α，γ－羟伯胺的伯氨基的氮转化为在具有5－6个原子的含氮的单不饱和杂环化合物的氮的方法，包括a)将所述羟胺与过量卤代醛反应，该卤代醛具有醛碳、带有卤素的碳，并且在醛碳和带有卤素的碳之间具有2或3个选自CH2、CH2CH2和OCH2的残基，b)相对于羟胺，加入过量的有机碱，c)用弱酸中和所述碱，和d)用稀释酸水溶液处理。

Description

含氮基团的转化方法
本案系96198605.0号申请的分案申请，原发明名称“定向细胞毒性蒽环型类似物”，PCT国际申请号PCT/EP96/05029，国际申请日1996年11月14日，进入中国国家阶段日1998年5月26日。
本发明部分得到政府支助而完成。政府对本申请中有一定的权利。
本发明属于靶向抗癌蒽环型(omthracycline)衍生物化学领域。更具体地说，它涉及与肽激素，如LH-RH、铃蟾肽和促生长素抑制素类似物共价连接的阿霉素(DOX)或其道诺糖胺(daunosamine)修饰的衍生物(DM-DOX)。这些共价结合物定向于具有肽激素类似物受体的各种肿瘤。
在Schally、Janaky和Bajusz的于1995年9月6授权公开的EP0450461B1中揭示了在第六位上具有细胞毒部分的LH-RH类似物。
在Nett和Glode的于1990年9月7日公开的WO 90/09799中描述了用于损伤促性腺激素的GnRH(LH-RH)类似物。该申请描述了用于损伤促性腺激素的与LH-RH类似物相连的毒素，如蓖麻毒蛋白，并且因而治疗依赖于性激素的癌症。在没有说明连接化学的情况下也提到了LH-RH阿霉素衍生物。
在Schally等于1990年4月6日提出的美国专利申请和于1993年7月15日再次提出的系列申请08/076,846中描述了细胞毒性促生长素抑制素类似物。
A.V.Schally在《抗癌药物》(Anti-Cancer Drugs)5，115-130(1994)的综述中详细说明了许多种肿癌的细胞膜上的LH-RH、铃蟾肽或促生长素抑制素类似物的受体的存在。
G.Weckbecker在他在《Farmac.Ther.》60，245-264(1993)中的综述中列出了一些表明在一些正常和肿癌组织中促生长素抑制素类似物的受体和受体亚型存在的依据。
在N.Bunnett《肠肽：生物化学和生理学》423-445(1994)编者：J.Walsh和G.J.Dockray，Raven Press，纽约和E.Spindell在《激素研究的最新进展》48，(1993)(Academic Press)的综述中讨论了铃蟾肽样肽和在各种正常和肿癌组织中铃蟾肽/GRP受体的存在。
阿霉素(DOX)是目前使用最广且非常有效的抗癌剂。然而，一些肿瘤根本不对它发生反应，且它的应用还受多重抗药性(MDR)和心脏毒性以及嗜中性细胞减少症的限制，这是由于慢性治疗的结果。为了克服这些缺陷并进一步开发蒽环型抗生素结构中存在的巨大的杀肿瘤潜力，已描述了数千种合成衍生物，包括它们与各种载体大分子相连的靶向类似物。
DOX和其类似物的大部分情况描述在《阿霉素》中，David W.Henry，ACS Symposium Series，NO.30，《肿瘤化学治疗》，美国化学协会，pp.15-57(1976)和《阿霉素》，Federico Arcamone，AcademicPress(1981)中。
Mosber等美国专利4,464,529(1984年8月7日)中描述了具有抗肿瘤活性的具有高度活性、烷基化、非交叉抗性的3′-脱氨基-3′-(3″-氰基-4″-吗啉基)-DOX和其衍生物。在《药物化学杂志》1984，27，638-645中还描述了这些“高度有效的吗啉基蒽环型”的合成和生物学评价。
在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88卷，pp.4845-4849，1991年6月中，Gao等描述了通过道诺红菌素衍生物的DNA序列的甲醛介导的烷基化作用。
在《药物化学杂志》35，3208-3214(1992)中描述了具有潜在烷基化取代基的蒽环型类似物。
在1989年12月12日由Pharmacia Carlo Erba提出的欧洲专利434960中描述了用于DOX的道诺糖胺氮烷基化的α，ω-二碘化合物的应用及新的吗啉基DOX衍生物的形成。
在Israel等的美国专利4,299,822(1981年11月10日)中N-三氟乙酰基阿霉素-14O-半戊二酸酯和-半己二酸酯被公开，作为具有改善水溶性的N-三氟乙酰基阿霉素-14O-戊酸酯(AD-32)的类似物。
Horton和Priebe(抗生素杂志，XXXVI，1211-1215)描述了一些与14-OH母体类似物相比，在抗癌活性上没有很大变化的不同蒽环型类似物的14-O-酯。
在设计靶向化学治疗剂技术中，寻求下面的目标：
1.载体分子和化学治疗剂之间稳定的连接，直至达到靶。
2.在结合物中载体分子保留生物特性，例如保留结合特性。
3.在结合物中化学治疗剂保留药物学活性，例如保留细胞毒活性。
4.作为结合的结果，产生相对于未结合部分更强活性和/或较低外周毒性的类似物。
在Sela等的美国专利4,263,279(1981年4月21日)中描述了通过道诺糖胺部分的NaIO4氧化作用及随后的包括载体分子的伯胺的还原性烷基化而进行的DOX的结合作用。
如在《生物化学生物物理研究通讯》1981，102，1048-1054中所描述的，顺乌头酸间隔区被用来借助于pH敏感键将道诺糖胺的氮与大分子载体相连。
Zunino等(1981)《Tumori》67，521-524和《欧洲癌症临床研究》20，421-425中描述了14-溴道诺红菌素和蛋白或多聚-L-氨基酸之间酯键和C-N连接的形成。
如《生物结合物化学》1990 1(5)，325-330所描述的，吗啉代-DOX(高活性的DOX的道诺糖胺修饰类似物)借助于可水解(溶菌体(lysosomotrop)，pH敏感)腙连接与抗体结合，涉及细胞毒试剂的C-13氧代官能团。
如《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1982 79，626-629中所描述，亮氨酸残基的羧酰胺键对酶降解的敏感性被成功地用于包含“间隔臂”肽的DOX结合物中，该“间隔臂”肽优选Ala-Leu-Ala-Leu，其中羧基末端Leu酰化DOX中的道诺糖胺的氮，氨基末端Ala通过二羧酸间隔区与载体相连。
如《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1992 89，927-976所描述的，DOX的道诺糖胺氮通过戊二酸间隔区被酰化，并伴随着严重的细胞毒活性的丧失而与LH-RH类似物相连。
与根据本发明的化合物在治疗各种人类肿瘤中的应用相关的其它参考文献：
1.Schally等(1996)，用GnRH类似物治疗：矛盾和前景，编者，Filicori，M.和Flamigni，C.(Parthenon，Carnforth，U.K.)pp.33-44。
2.Nagy等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，7269-7273。
3.Yano等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，7090-7094。
4.Rekasi等(1993)内分泌学132(5)1991-2000。
5.Srkalovic等(1990)癌症研究50，1841-1846。
6.Emons等(1993)癌症研究53，5439-5446。
7.Emons等(1993)临床内分泌学和代谢杂志77(6)1458-)。
8.Schally，A.V.等(1988)促生长素抑制素类似物的肿瘤学应用，癌症研究48，6977-6985。
9.Schally等(1994)国际胰腺学杂志16，277-280。
10.Srkalovic等(1990)临床内分泌学和代谢杂志70(3)，661-669，4 Pinski等(1994)国际癌症杂志57，574-580。
11.Radulovic等(1992)癌症通迅62，263-271。
12.Qin等(1995)国际癌症杂志60，694-700。
13.Radulovic等(1992)P.S.E.B.M.200，394-401。
14.Radulovic等(1994)Acta Oncologica 33(6)693-701。
15.Pinski等(1993)癌症通迅71，189-196。
16.O′Byrne等(1994)欧洲癌症杂志30A(11)1682-1687。
17.Pinski等(1994)英国癌症杂志70，886-892。
18.Pinski等(1994)癌症研究54，5895-5901。
19.Pinski等(1996)国际癌症杂志65，870-874。
20.Banks等(1992)抗癌药物3，519-523。
21.Reubi和Kvols(1992)癌症研究52，6074-6078。
22.Schally等(1994)国际胰腺学杂志16，277-280。
23.Halmos等(1995)癌症研究55，280-287。
24.Halmos等(1994)癌症通讯85，111-118。
25.Qin等(1994)癌症研究临床肿瘤学杂志120，519-528。
26.Qin等(1994)癌症研究54，1035-1041。
27.Qin等(1995)国际癌症杂志63，257-262。
28.Reile等(1994)前列腺25，29-38。
29.Pinski等(1994)国际癌症杂志57，574-580。
30.Radulovic等(1992)P.S.E.B.M.200，394-401。
31.Radulovic等(1994)Acta Oncologica 33(6)693-701。
32.Pinski等(1993)癌症通讯71，189-196。
33.Pinski等(1994)英国癌症杂志70，886-892。
34.Pinski等(1994)癌症研究54，5895-5901。
所有提到的引用文献被本文引作参考。
本发明化合物为新的靶向细胞毒性肽激素，其包含与肽激素，如LH-RH、铃蟾肽和促生长素抑制素类似物结合的蒽环型细胞毒性剂，如DOX或DM-DOX。这些细胞毒肽激素结合物被设计用来治疗具有结合物特异性受体的肿瘤，如乳腺癌，卵巢症，子宫癌，前列腺癌，胰腺癌，结肠癌，胃癌和肺癌。本文使用的一些这种(未结合)蒽环型细胞毒性剂本质上是新的，并且是高效的，然而对于它们被以未结合物形式使用时，它们的毒性水平太高。
在寻找新的高活性的非交叉抗性的适宜于与肽载体形成共价结合物的DOX类似物中开发出了本发明提出的道诺糖胺修饰的DOX类似物。
通过使用二羧酸间隔区如戊二酸实现了稳定的以共价连接的其组成成员生物活性充分保留的结合物的形成。间隔区的一个羧基与DOX或DM-DOX的14-OH基形成一个酯键，间隔区的另一个羧基与肽载体的精心选择的游离氨基形成一个羧酰胺键。
本发明化合物用下面通式表示
        Q14-O-R-P                        (I)其中Q为通式Q14表示在14位上具有侧链的Q残基，R为H或-C(O)-(CH2)n-C(O)-和n＝0-7，R′为NH2或芳香、饱和或部分饱和的5或6元杂环化合物，其具有至少一个环氮原子，并任选具有与所述环的相邻碳原子结合以形成二环体系的丁二烯残基，P为H或肽部分，适宜地为LHRH、铃蟾肽或促生长素抑制素类似物，但不排除其它生理活性肽。特别希望的是对肿瘤细胞受体具有亲和性的LHRH类似物，尤其是在6位具有D-Lys残基的那些类似物，以及缩短的促生长素抑制素和铃蟾肽类似物。然而当R′为NH2时，R和P不为H。当R和P为H时，那么R′不为NH2。
在本工作的过程中发现了一种新的合成反应。不仅发现阿霉素及其衍生物可借助于二羧酸残基在14位上偶联以产生新的药物学有效的结合物，而且提供了一种新的途径来从相邻和分离，即α，β-或α，γ-羟基伯胺形成部分饱和的杂环残基。本发明特殊的应用在于在糖诺糖胺糖上形成2″-吡咯啉基和1″，3″-四氢吡啶基。然而，此反应还具有更广的应用。当相邻或分离的羟基胺与卤素取代的醛反应时，可形成5和6元部分饱和的杂环残基，其中卤素取代的醛在醛碳和具有卤素基团的碳原子之间具有2或3个残基。这些残基可均为亚甲基，或可包括杂原子如氧。此反应在三个阶段发生。合适地在极性惰性无水有机溶剂中，非常大量过量的卤代醛与羟基胺的酸加成盐反应，由此通过醛基与羟基和氨基缩合形成了五元噁唑烷环(或六元1，3-四氢噁嗪环)。将该产物与有机碱反应，适宜地为叔胺，其中在前面卤代醛的卤素部分与噁唑烷或1，3-四氢噁嗪环的仲胺基之间消除氢卤酸以通过5或6元环的加入形成稠合环结构。接着用弱酸(适宜的有机酸)如冰醋酸中和碱。用酸的水溶液(适宜地为有机酸)处理打开稠合环的噁唑烷或1，3-四氢噁嗪部分。本领域普通技术人员应理解，根据起始的醛，含有氮的最终环可包含至少一个上述另外的杂原子。反应通式可说明如下：其中X′为卤素，适宜地为溴或碘，优选碘，Y为CH2、OCH2、CH2-CH2，Z不存在或为CH2。
当Z不存在时，作为反应的第一个步骤，醛部分形成5元恶唑烷环。当Z为CH2时，醛部分形成6元1，3-四氢噁嗪环。虽然这些环的形成是熟知的，但与通过卤代烷烃侧链在碱性介质如叔胺的无水介质中进行的闭环结合，该反应是新的出人意外的。
附图的简要说明
图1为对于不同剂量水平的本发明化合物和DOX，雌激素依赖性MXT小鼠乳腺癌体积的变化。
图2为对于不同剂量水平的本发明的某化合物、现有技术中的化合物DOX和对照物，雌激素依赖性MXT小鼠乳腺癌的体积变化。
图3为一些细胞毒LHRH类似物对患有雌激素依赖性MXT小鼠乳腺癌的小鼠存活的影响。
图4为在用现有技术中的激动剂和本发明的某化合物治疗期间，带有大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌移植物的雄性哥本哈根大鼠的肿瘤体积图。
图5为用某种本发明的化合物和相应的细胞毒性LH-RH类似物治疗，对患有Dunning R-3327-H前列腺癌的大鼠的肿瘤体积的影响。
图6为用本发明的某化合物和相应的细胞毒性LH-RH类似物治疗，对患有Dunning R-3327-H前列腺癌的哥本哈根大鼠的体重的影响。
图7为通过用本发明的某化合物和DOX治疗所获得的对肿瘤生长的抑制。
优选实施方案的描述
当在R′被某些优选基团取代时，Q残基具有Q1至Q8亚残基的含义，其中Q2至Q8为新的细胞毒性残基。
R′具有产生如下列括号中的所示的Qx残基的含义：NH2(Q1)，吡咯烷-1-基(Q2)，异二氢氮杂茚-2-基(Q3)，3-吡咯啉-1-基(Q4)，3-吡咯烷酮-1-基(Q5)，2-吡咯啉-1-基(Q6)，3-哌啶酮-1-基(Q7)或1，3-四氢吡啶-1-基(Q8)。
因此，如果R-P为H，-R′为-NH2，则Q1为DOX，如果R-P为H，-R′为吡咯烷-1-基，则Q2为3′-脱氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)-阿霉素(Q2)；如R-P为H，-R′为异二氢氮杂茚-2-基，则Q3为3′-脱氨基-3′-(异二氢氮杂茚-2″-基)-阿霉素(Q3)，如果R-P为H，-R′为3-吡咯啉-1-基，则Q4为3′-脱氨基-3′-(3″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素(Q4)；如果R-P为H，-R′为3-吡咯烷酮-1-基，则Q5为3′-脱氨基-3′-(3″-吡咯烷酮-1″-基)-阿霉素(Q5)；如果R-P为H，-R′为2-吡咯啉-1-基，则Q6为3′-脱氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素(Q6)，如果R-P为H，-R′为3-哌啶酮-1-基，则Q7为3′-脱氨基-3′-(3″-哌啶酮-1″-基)-阿霉素(Q7)；如果R-P为H，-R′为1，3-四氢吡啶-1-基，则Q8为3′-脱氨基-3′-(1″，3″-四氢吡啶-1″-基)-阿霉素(Q8)。
利用烷基化作用在5元环中掺入道诺糖胺氮原子的化合物体外活性比在6元环掺入道诺糖胺氮原子的它们的对应物高10-50倍(这些对比物为Q5和Q7以及Q6和Q8)。
在本发明优选的具体实施方案中，在式Q14-O-R-P物质中，R和P不为氢。在P不为氢时，为P1、P2和P3，适宜地P1为LH-RH激动剂载体、LH-RH拮抗剂载体或缩短的LH-RH类似物载体，P2为缩短的促生长素抑制素类似物，P3为铃蟾肽拮抗剂。
适宜地，P1为Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd，其中Xxx为氢或二氨基取代基，如A2Bu或A2Pr，其中
Aaa为Glp，那么Bbb为His，Ccc为Trp，和Ddd为Gly-NH2，
Aaa为Ac-D-Nal(2)，Ac-D-Phe或AcD-Phe(4Cl)，那么Bbb为D-Phe(4Cl)或D-Phe，Ccc为D-Pal(3)和D-Trp，Ddd为D-Ala-NH2；并且当Aaa-Bbb-Ccc为Ac，那么Ddd为-NH
Figure A0214391900121
其中：当Aaa为D-Phe，那么Bbb为Tyr，Ccc为Val，Ddd为Thr或Trp；当Aaa为D-Trp，那么Bbb为Phe，Ccc和Ddd为Thr，和P3为Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuBbb-NH2其中：Aaa为不存在，D-Tpi或D-Phe，Bbb为(CH2-NH)Leu，(CH2-NH)Phe，(CH2-NH)Trp，(CH2-N)Tac或(CH2-N)DM-Tac。
在本发明LH-RH结合类似物的新化合物中，通过如式VII所列的二羧酸间隔区，细胞毒基团Q与LH-RH类似物上的D-Lys侧链或与其上的Xxx基团相连：
Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q14-O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd       (VII)其中m为1或0，n为1或2，前提是当m为1，即(Xxx)为A2Bu或A2Pr时，n为1或2，当m为0，即(Xxx)为H时，n为1。
在本发明促生长素抑制素结合类似物的新化合物中，通过如下式VIII所列的二羧酸间隔区，细胞毒基团Q与促生长素抑制素类似物的氨基末端相连：
在本发明铃蟾肽拮抗剂结合类似物的新化合物中，通过如式IX所列的间隔区，细胞毒基团Q与铃蟾肽拮抗剂的氨基末端相连。
Q14-D-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-VaL-Gly-His-LeuBbb-NH2     (IX)
本发明尤其优选的具体实例为含有Q1和Q6作为细胞毒基团，戊二酸(n＝3)作为与Q1(阿霉素)或Q6(2-吡咯啉并阿霉素)形成14-O-酯键并与肽载体形成羧酸胺键的二羧酸间隔区的那些肽结合物。
本发明的最优选的具体实例为下式的细胞毒LH-RH类似物：1.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q1 14-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；2.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q6 14-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；下式的细胞毒性促生长素抑制素类似物 和
Figure A0214391900133
和下式的细胞毒性铃蟾肽拮抗剂类似物：9.Q1 14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2；10.Q6 14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH211.Q1 14-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2；和12.Q6 14-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2.
在与相邻或分离的，即α，β-或α，γ-羟胺的氮形成部分饱和杂环的新方法中，使用大量过量，适宜地为过量30倍的卤代醛，在无水惰性有机极性非羟基(非质子的)溶剂，适宜地为二甲基甲酰胺中进行反应的第一个步骤，其中4-碘丁醛和5-碘戊醛为尤其有效的。然而，本发明不局限于此，溴可被用来代替碘。此反应以及后续步骤可在室温下进行。
使用过量，适宜地为过量2-4倍的有机碱进行碱化反应步骤。叔胺如三烷基胺适用于此目的。
通过在水存在下，用有机酸处理将由此形成的二环打开以释放相邻或分离的羟基，可使用稀释的含水三氟乙酸，适宜地为在惰性有机溶剂如乙腈中的溶液。通过减压除去挥发物，用已烷萃取过量的卤代化合物，并在HPLC中纯化残余物来纯化产物。
缩写
为了描述本发明的肽和它们的衍生物，使用肽化学技术中普遍接受并在由IUPACIUB生物化学命名委员会推荐的常用的氨基酸缩写(欧洲生物化学杂志，138，9-37(1984))。
各氨基酸残基的缩写以氨基酸的俗名为基础，例如Glp为焦谷氨酸，His为组氨酸，Trp为色氨酸等。除非另有说明，缩写指的是L异构体形式的氨基酸，如Ser为L-丝氨酸，D-Lys为D-赖氨酸。
本发明非常见氨基酸的缩写如下：D-Nal(2)为D-3-(2-萘基)丙氨酸，D-Pal(3)为D-3-(3-吡啶基)丙氨酸，D-Phe(4Cl)为D-4-氯苯丙氨酸。
根据常规书写肽序列，其中N-末端氨基酸位于左边，C-末端氨基酸位于右边，如Glp-His-Trp。
式Leu(CH2-NH)Leu-NH2描述位于亮氨酸和肽序列C末端的亮氨酰胺残基之间的被还原的肽键。
使用的其它缩写为：A2Bu：二氨基丁酸A2Pr：二氨基丙酸BN：铃蟾肽BOP试剂：苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐DIPEA：N，N-二异丙基乙胺DM-DOX道诺糖胺修饰的阿霉素DMF：N，N-二甲基甲酰胺DMTac：5，5-二甲基-噻唑烷-4-羧酸DOX：阿霉素Fmoc：9-芴基甲氧羰基glt：-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-，戊二酰基Glt2O：戊二酸酐HOBt：1-羟基苯并三唑HO-glt-OH：戊二酸HOSu：N-羟基琥珀酰亚胺HPLC：高效液相色谱TFA：三氟乙酸Tac：噻唑烷-4-羧酸Tpi：2，3，4，9-四氢-1H-吡啶并[3，4-b]吲哚-3-羧酸
使用装有168型二极管阵列检测仪的Beckman分析型HPLC系统和System Gold色谱软件(Beckman)来监测化学反应并检查本发明化合物的纯度。使用的柱为DynamaxC-18(250×4.6mm；孔大小：300；颗粒大小：12μm)。溶剂体系由两种成分组成：(i)0.1％TFA水溶液，和(ii)0.1％TFA的70％含水乙腈的溶液，并以1分钟增加1％(ii)的线性梯度形式使用以监测化学反应。用于检查纯度，该体系以等梯度形式使用。
使用Beckman 342型半制备HPLC体系来分离和纯化本发明的化合物。柱为Aquapore Octyl(250×10mm；孔大小：300；颗粒大小：15μm)。溶剂体系为与上面分析型HPLC中的相同。分析
使用Bruker ARX300 NMR分光计(300MHz 1H频率，75MHz13C频率)和电子喷射质谱仪Finnigan-MAT TSQ 7000来鉴定阿霉素衍生物的结构。肽载体的合成
通常以药物学可接受的非毒性盐如酸加成盐的形式将本发明的化合物给药。酸加成盐的例子为氢氯酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、单宁酸盐、马来酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、藻酸盐，pamoate、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。如果以片剂形式给予活性成分，该片剂可包含药物学可接受稀释剂，包括粘合剂如黄蓍胶、玉米淀粉或明胶，崩解剂如藻酸及润滑剂如硬脂酸镁。
如果需要以液体形式给药，甜味剂和/或增香剂可被用作药物学可接受稀释剂的一部分，静脉注射可以等渗生理盐水、磷酸缓冲液等形式完成。
药物组合物通常包含与常规的药物学可接受载体相结合的肽。通常，当静脉给药时，剂量为每千克宿主体重为约1-约100微克肽；口服剂量将更高。总之，通常以与使用其它LHRH、促生长素抑制素和铃蟾肽类似物的临床治疗相同方式来进行使用这些肽的治疗。
这些肽可被通过经静脉、皮下、肌肉内、口服、鼻内或阴道对哺乳动物进行给药以通过与特异受体结合而获得生物激素作用。在LHRH类似物的情况下，这些作用包括可逆的生殖腺活动的抑制，在促生长素抑制素类似物的情况下，抑制胃肠机能。有效剂量随给药形式和被治疗的哺乳动物的具体种类而变化。一个典型的剂型实例为含有该肽的生理盐水溶液，施用该溶液以提供约0.1-2.5mg/kg体重范围内的剂量。可以固体形式或液体形式进行肽的口服给药。
可通过任何肽化学领域的技术人员已知的方法进行本发明肽载体的合成。适宜方法的总汇可在M.Bodanszky，《肽合成原理》，Springer-Verlag，Heidelberg，1984中找到。固相肽合成方法可在J.M.Stewart和J.D.Young的教科书，《固相肽合成》，PierceChem.CO.，Rockford，IL，1984(第二版)中以及G.Barany等的综述《国际肽和蛋白质研究杂志》30，705-739(1987)中查找到。
本发明所采用的LH-RH类似物载体的合成详细描述在美国专利5,258,492(Sandor Bajusz和Andrew V.Schally，1993年11月2日)的实施例中以及Bajusz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，1637-1641(1988)和86，6318-6322(1989)和Janaky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，1023-1027和972-976(1992)的论文中。
本发明所采用的促生长素抑制素类似物载体的合成详细描述在美国专利4,650,787(1987年3月17日，Andrew V.Schally和RenZ.Cai.)的实施例中。对合成的描述也可在Cai等，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 83，1896-1900(1986)和Proc.Natl.Sci.USA 84，2502-2506(1987)的论文中查找到。
本发明所采用的铃蟾肽拮抗剂载体的合成详细描述在Coy等，《生物化学杂志》263，5056-5060(1988)和264，14691-14697(1989)和Cai等，《肽》13，267-271(1992)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，12664-12668(1994)的论文中。
本发明所采用的阿霉素衍生物的合成及它们与不同肽载体的结合物的形成在下面实施例中进行了详细描述，其中这些实施例意在说明而不起限制作用。
实施例1N-Fmoc-Dox14-O-半戊二酸酯的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，并加入30mg(90μmol)Fmoc-Osu，接着加入31μl(180μmol)DIPEA。搅拌3小时后，分析型HPLC检测反应完成。在Speed Vac高真空蒸发器中让溶剂蒸发干，并借助于与0.1％TFA水溶液的摩擦将残余物结晶。将结晶过滤并用冷乙醚洗涤一次以除去痕量过量的Fmoc-Osu。在干燥器中干燥后，获得质量为62mg，98％纯度的N-Fmoc-Dox。产率：94％。
在存在26.1μL(150μmol)DIPEA时，将该中间体与11.4mg(100μmol)Glt2O的1ml无水DMF溶液反应过夜。在Speed Vac中将溶剂蒸发掉，并借助于与0.1％(v/v)TFA水溶液的摩擦将残余油状物固化。如分析型HPLC所检测的，由此得到的粗物质含有70％N-Fmoc-DOX 14-O-半戊二酸酯，20％未反应的N-Fmoc-DOX和10％其它不纯物。此粗产物可不经进一步纯化而用于制备肽DOX结合物。当此粗物质溶解于含0.1％TFA的20ml 60％乙腈水溶液中并上样于半制备性HPLC时，获得了45.7mg 98％纯度的N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯终产物(收率：64％)。
实施例2
3′-脱氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)阿霉素TFA盐(Q2)和其14-O-半戊二酸酯(AN-193)TFA盐的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，并加入171μl(1.3mmol)15倍过量的1，4-二碘丁烷，接着加入45μl(260μmol)3倍过量的DIPEA。室温下将反应混合物搅拌过夜。如分析型HPLC所检测，在16小时后反应完成。在Speed Vac中蒸发掉溶剂，将残余油状物溶解在3ml 0.1％TFA的水溶液中，用乙醚萃取以除去过量的1，4-二碘丁烷。接着将含水提取物上样至HPLC中，获得质量为41.6mg，98％纯度的DOX衍生物(产率68％)。
几乎如实施例1所描述，将由此获得的41.6mg(58μmol)3′-脱氨基-3′-(吡咯烷-1″-基)-阿霉素TFA盐(Q2)与1.2当量Glt2O的无水DMF溶液反应。产率为35％(16.9mg)，纯度为98％。
实施例3
3′-脱氨基-3′-(异二氢氮杂茚-2″-基)阿霉素TFA盐(Q3)的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，加入226mg(1.3mmol)15倍过量的α，α′-二氯-邻二甲苯，接着加入45μl(260μmol)3倍过量的DIPEA和催化量的Nal。16小时后，用Speed Vac除去溶剂，并将残余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，用3ml乙醚萃取以除去过量的卤代化合物。将由此获得的粗物质上样至HPLC。纯化后，获得36mg，98％纯度的最终产物(产率：55％)。
实施例4
3′-脱氨基-3′-(3″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素TFA盐(Q4)的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，并加入136.8μl(1.3mmol)15倍过量的顺-1，4-二氯-2-丁烯(Aldrich)，接着加入45μl(260μmol)3倍过量的DIPEA。16小时后，在Speed Vac中除去溶剂，将残余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，并用3ml己烷萃取以除去过量的卤代化合物。将由此获得的粗物质上样至HPLC。纯化后，获得22.6mg 98％纯度的最终产物(产率：37％)
实施例5
1-氯-4-溴-2-丁酮(C4H6ClBrO)和1-氯-5-溴-2-戊酮(C5H8ClBrO)的制备和分离
在乙醚中，将100.8μl(1mmol)3-溴丙酰氯(Aldrich)与过量的重氮甲烷反应。1小时后，洗脱醚溶液并在TLC进行斑点试验。通过Merck Art NO.5554预涂敷硅胶60 F254的薄层色谱铝片被用作固定相，CHCl3∶MeOH 95∶5(V/V)作为流动相。为了斑点试验，在洗脱后，将2，4-二硝基苯肼试剂(Vogel：实验有机化学教材，P.1061，第三版，Longmans，纽约)被喷射至TLC片上。由形成的重氮甲基酮衍生物显示出Rf为0.3的黄色斑点。接着在乙醚中将醚溶液与无水HCl反应，将重氮甲基酮转化为所需最终产物1-氯-4-溴-2-丁酮。该产物在相同的溶剂体系中使用上述斑点试验试剂，显示出氧代化合物特征性的黄色斑点，Rf为0.8。在溶剂蒸发后，将粗产物上柱(15cm长，2.5cm直径)，其中柱填充有15g硅胶，Merck，9385级，230-400目，孔大小60。液体流动相为纯CHCl3。混合含有所需最终产物的级份(以上面详细描述的斑点试验为特征)并蒸发至干燥。获得质量为1.5g的清亮油状物。收率＝80％。
除了采用4-溴丁酰氯代替3-溴丙酰氯外，几乎与用于1-氯-4-溴-2-戊酮相同的方法从4-溴丁酰氯制备1-氯-5-溴-2-戊酮。获得1.6g清油，收率＝80％。
实施例6
3′-脱氨基-3′-(3″-吡咯烷酮-1′-基)阿霉素TFA盐(Q5)的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，并加入241mg(1.3mmol)15倍过量的1-氯-4-溴-2-丁酮，接着加入45μl(260μmol)3倍过量的DIPEA。16小时后，在Speed Vac中除去溶剂，并将残余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，用3ml己烷萃取以除去过量的卤代化合物。将由此获得的粗物质上样至HPLC。纯化后，获得20.6mg 98％纯度的最终产物(产率：33％)。
实施例7
3′-脱氨基-3′-(3″-哌啶酮-1″-基)-阿霉素TFA盐(Q7)的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，并加入260mg(1.3mmol)15倍过量的1-氯-5-溴-2-戊酮，接着加入45μl(260μmol)3倍过量的DIPEA。16小时后，在Speed Vac中除去溶剂，并将残余物溶解在3ml 0.1％TFA水溶液中，用3ml己烷萃取以除去过量的卤代化合物。将由此获得的粗物质上样至HPLC中。纯化后，获得18mg 95％纯的最终产物(产率：28％)。
实施例8
4-碘丁醛和5-碘戊醛的制备和分离
将1.3mL(10mmol)2-(3-氯丙基)-1，3-二氧戊环(4-氯-正丁醛乙二醇缩醛)溶解在200ml含30g(200mmol，20倍过量)Nal的丙酮中。将溶液回流24小时，接着蒸发至干燥。使用100mL乙醚从无机固体残余物中萃取有机物。接着用50mL H2O，50mL5％Na2S2O3水溶液将醚溶液洗涤一次，并用50mL H2O洗涤3次。真空除去乙醚，将残余油状物溶解在3mL 50％乙酸水溶液中。1小时后，将100ml乙醚加至溶液中，通过用50mL H2O洗涤3次除去乙酸以及乙二醇。在TLC上纯CHCl3中以Rf为0.8将主要产物洗脱。用于醛功能团的斑点试验与实施例5中对于酮所描述的相同。接着除去乙醚，并将黑色油状物上柱(15cm长，2.5cm直径)，其中该柱装填有15g硅胶，Merck，9385级，230-400目，孔大小60。液体流动相为CHCl3。混合含有最终产物(以上面详细描述的斑点试验来特征)的级份并蒸发至干燥。获得1.6g黄色油状物。产率：80％。
几乎以相同方法从2-(4-氯丁基)-1，3-二氧戊环(5-氯-正戊醛乙二醇缩醛)(Fluka)获得5-碘戊醛。获得1.65g黄色油状物。产率：80％。
实施例9
3′-脱氨基-3′-(2″-吡咯啉-1″-基)-阿霉素TFA盐(Q6的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1ml DMF中，并加入515mg(2.6mmol)30倍过量的4-碘丁醛，接着加入45μl(260μmol，3倍过量)DIPEA。1小时后，将100μl冰醋酸加入反应混合物中，接着将该反应混合物滴加至5ml 0.1％TFA的70％乙腈水溶液中(HPLC体系的溶剂ii)。将溶液用2mL 0.1％TFA水溶液稀释，接着在Speed Vac中除去乙腈。将产生的溶液用己烷萃取以除去过量的卤代化合物。将由此获得的物质上样至HPLC。纯化后，获得52mg 98％纯度的最终产物。(产率：85％)。
实施例10
3′-脱氨基-(1″，3″-四氢吡啶-1″-基)-阿霉素TFA盐(Q8)的制备和分离
将50mg(86μmol)DOX盐酸盐溶解在1mL DMF中，并加入552mg(2.6mmol)30倍过量的5-碘戊醛，接着加入45μl(260μmol)3倍过量的DIPEA。1小时后，将100μl冰醋酸加入到反应混合物中，接着将该反应混合物滴加至5ml 0.1％TFA的70％乙腈水溶液中(HPLC体系的溶剂ii)。将溶液用2mL 0.1％TFA水溶液稀释，接着在Speed Vac中除去乙腈。将产生的溶液用己烷萃取以除去过量的卤代化合物。将由此获得的物质上样至HPLC。纯化后，获得46mg 98％纯度的最终产物。(产率：75％)。
实施例11
含DOX的细胞毒性LH-RH激动剂类似物的制备和分离([D-Lys6(DOX14-O-glt)]LH-RH，Q1 14gL)
将60mg(37.5μmol)[D-Lys6]LH-RH和52mg(64％纯度，37.5μmol)N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯(参见实施例1)溶解在1mL DMF中，并加入22mg(50μmol)BOP试剂(Aldrich)、13.5mg(100μmol)HOBt及52μl(300μmol)DIPEA。室温下搅拌1小时后反应完毕。将溶剂蒸发，用3mL乙酸乙酯将残余油状物结晶并接着用3mL乙酸乙酯洗涤两次。随后将90mg粗固体物质溶解在3mL DMF中并加入300μl派啶。 5分钟后，将反应置于冰浴中，并通过加入300μl TFA、700μl吡啶和2mL DMF的混合物将其酸化。在将溶剂蒸发后，通过乙酸乙酯将残余油状物固化。将由此获得的粗固体溶解在含0.1％TFA(i)的1mL 70％乙腈水溶液中，并用3mL 0.1％TFA水溶液(ii)稀释，上样至半制备性HPLC。获得40mg(14.8μmol)98％纯度的最终产物。产率：48％。
实施例12。
含2-吡咯啉并DOX的细胞毒性LH-RH激动剂类似物的制备和分离([D-Lys6(2-吡咯啉并DOX14-O-glt)]LH-RH，Q6 14gl)
将11.2mg(5μmol)Q1 14gl(参见实施例11)溶解在200μl DMF中，并加入30mg(150μmol，30倍过量)4-碘丁醛(实施例8)，接着加入3μl(17μmol)DIPEA。1小时后，反应完毕(参见实施例9)，向反应混合物中加入10μl冰醋酸，接着将反应混合物滴加至1mL 0.1％TFA的70％乙腈水溶液。接着将该溶液用1mL 0.1％TFA水溶液稀释，并真空除去乙腈。随后将剩余水溶液用1mL己烷萃取，并上样至HPLC。获得质量为7.6mg、99％纯度的最终产物。(产率：66％)。
实施例13
含DOX的细胞毒性促生长素抑制素类似物的制备和分离
Figure A0214391900221
将20mg(14.5μmol)D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-VaL-Cys-Thr-NH2(Proc.NatL.Acad.Sci.USA1986，pp.1986-1990)和20mg(64％纯度，14.5μmol)N-Fmoc-DOX 14-O-半戊二酸酯(实施例1)溶解在200μl DMF中，并加入8.8mg(20μmol)BOP试剂(Aldrich)、5.4mg(40μmol)HOBt以及17μl(100μmol)DIPEA。室温下，搅拌1小时后，反应完毕。在真空除去溶剂后，残余物用乙酸乙酯结晶。接着将该固体物质溶解在1mL DMF中，并加入100μl哌啶。7分钟后，将反应置于冰浴中，并通过加入100μl TFA、300μl吡啶和2mL DMF的混合物将其酸化，在溶剂蒸发后，残余油物用乙酸乙酯固化。将由此获得的粗固体溶解在含0.1％TFA(i)的1mL 70％乙腈水溶液中，并用3mL 0.1％TFA水溶液(ii)稀释，上样至半制备性HPLC。获得9.7mg(5.1μmol)95％纯度的最终产物。
实施例14
含2-吡咯啉-1-基-DOX的细胞毒性促生长素抑制素类似
Figure A0214391900231
Q6 14gS)将 (6.4mg，5μmol)溶解在100μl DMF中，并加入2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-半戊二酸酯(4.1mg，5μmol)，接着加入BOP试剂(4.4mg，10μmol)、HOBt(100μmol)和DIPEA(50μmol)。室温下，搅拌2小时后，用20μl AcOH酸化反应混合物，并用含0.1％TFA的500μl 70％乙腈水溶液稀释，再进一步用700μl 0.1％TFA水溶液稀释，上样至HPLC。获得3.9mg(产率：40％)的99％纯度的最终产物。
如实施例9中所述，通过将DOX14-O-半戊二酸酯与4-碘丁醛反应来制备2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-半戊二酸酯。
如实施例11所述，从N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯，通过裂解Fmoc保护基制备DOX14-O-半戊二酸酯。(产率：40％)。
实施例15
含DOX的细胞毒性铃蟾肽拮抗剂的制备和分离
(DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2，Q1 14gB)
将20mg(15.8μmol)Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2(国际肽蛋白质研究杂志38，1991，pp.593-600)和22mg(64％纯度，15.8μmol)N-Fmoc-DOX14-O-半戊二酸酯(实施例1)溶解在200μl DMF中，并加入8.8mg(20μmol)BOP试剂(Aldrich)、5.4mg(40μmol)HOBt以及17μl(100μmol)DIPEA。室温下，搅拌1小时后，反应完毕。在真空除去溶剂后，残余物用乙酸乙酯结晶。接着将该固体物质溶于1mL DMF中，并加入100μl哌啶。 5分钟后，将反应置于冰浴中，并通过加入100μLTFA、300μL吡啶和2mL DMF的混合物将其酸化。在溶剂蒸发后，残余油状物用乙酸乙酯固化。将由此获得的粗固体溶解在含0.1％TFA(i)的1mL 70％乙腈水溶液中并用3mL 0.1％TFA水溶液(ii)稀释，上样至半制备型HPLC。获得13.5mg(7.1μmol)98％纯度的最终产物，产率：45％。
实施例16
含2-吡咯啉-1-基DOX的细胞毒性铃蟾肽拮抗剂类似物的制备和分离
2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2，Q6 14gB
将9.5mg(5μmol)Q1 14gB(实施例15)溶解在200μl DMF中，并加入30mg(150μmol，30倍过量)4-碘丁醛(实施例8)，接着加入3μl(17μmol)DIPEA。1小时后，反应完毕(实施例9)，将10μl冰醋酸加入反应混合物中，接着将反应混合物滴加至1mL 0.1％TFA的70％乙腈水溶液中。将该溶液用1mL 0.1％TFA水溶液稀释，真空除去乙腈。随后将残余的水溶液用1mL己烷萃取，上样至HPLC。获得6mg 98％纯度的最终产物。(产率：60％)。体外细胞毒活性的测定
从Dr.Gunter Berndhardt(德国Regensburg大学)获得MXT雌激素依赖型小鼠乳腺癌细胞系，在测定本发明化合物的抗增殖活性中所采用的所有其它细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
为了评价类似物的活性，以通过结晶紫染色细胞来定量测定生物量为基础，采用微滴定平板的比色细胞毒性分析，其中生物量的定量与细胞数目的确定极为相关(Reile等；分析生物化学187，262-267，1990；Bernhardt G.等，癌症研究与临床肿瘤杂志(1992)，118，35-43；Spruss Th.等，癌症研究与临床肿瘤杂志117，435-443，1991；Gillies R.J.，分析生物化学杂志，159，109-113，1986；Kueng，W.等；分析生物化学，182 16-19，1989)。分析方法
在96孔平板上接种细胞1至2天后，将培养基换成含待测试化合物的新鲜培养基和仅用作对照培养物的新鲜培养基。在培养一段不同的时间后，将细胞用戊二醛固定，并4℃下贮存在胎牛血清(FBS)中直至实验结束。将细胞用结晶紫染色，并用70％乙醇水溶液提取结合的染料。分别用ELA Reader(Bio-Tek Instruments)或Biomek 1000(Beckman)测定590nm或600nm处的光密度。每一数据点代表八个培养孔的平均值。用T/C＝(T-C0)/(C-C0)来计算T/C值，其中T＝处理组培养物的光密度，C＝对照组(未处理)培养物的光密度，C0＝培养开始时培养物的光密度(t＝0)。
实施例17
DOX的道诺糖胺修饰衍生物的体外细胞毒活性
表17-1表明在体外阿霉素及其道诺糖胺修饰衍生物对MCF-7人乳腺癌细胞系的影响。
其道诺糖胺N被结合至具有反应活性功能团的五元环中的细胞毒性基团活性比它们类似的六元环对应物高5-50倍，例如3-吡咯啉-1-基-DOX(Q5)和3-哌啶-1-基-DOX(Q7)以及2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)和1，3-四氢-吡啶-1-基-DOX(Q8)。
表17-1：在体外阿霉素和其道诺糖胺修饰
的衍生物对MCF人乳腺癌细胞系的作用
化合物 培养时间(小时)              在下列浓度(M)时的T/C值
3×10-10  10-9  3×10-9 10-8 3×10-8  10-7
阿霉素(DOX) 70120 9895 8266  5433
吡咯烷-1-基-阿霉素(Q2) 70120 9794 2517  -26-19
哌啶-1-基-阿霉素(AN-183) 70120 114109 7067 40
异二氢氮杂茚-2-基-阿霉素(Q3) 70120 118108 8677  -11-29
3-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q4) 70120 10697 7265 -3-5
3-吡咯烷酮-1-基-阿霉素(Q5) 70120 8767 3025 -28-10
3-哌啶酮-1-基-阿霉素(Q7) 70120 9697 8070 5943
2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6) 70120 5026  -32 -18-9
1，3-四氢吡啶-1-基-阿霉素(Q8) 70120 9699  8893 6962
在96孔平板上将细胞培养于含5％HI-DCC-FBS(热失活葡聚糖包被活性炭处理的胎牛血清)的IMEM培养基中。通过结晶紫染色法确定处理和对照平板中的相对细胞数目，并以T/C值表示，其中T/C＝(T-C0/C-C0)×100[T＝处理组培养物的吸光率，C＝对照培养物的吸光率，C0＝培养开始时的培养物的吸光率(t＝0)。测得的吸光率与细胞数目成正比]。较低的T/C值说明由于处理而导致的癌细胞存活的减少。即75表示与对照100％相比，75％的细胞存活或25％抑制。
实施例18
DOX在LH-RH激动剂肽结合物Q1 14gL中和超活性2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)在LH-RH激动剂肽结合物Q6 14gL中的体外细胞毒活性的充分保留。
表18-1表明在体外，分别与其与LH-RH激动剂类似物的结合物[D-Lys6]LH-RH(Q1 14gL和Q6 14gL)相比，阿霉素和其道诺糖胺修饰衍生物2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6)对MCF-7人乳腺癌细胞系及MXT雌激素依赖小鼠乳腺癌细胞系生长的影响。表18-1：
  化合物 培养时间(小时) 在以下浓度(M)时的MCF-7细胞系的T/C值
3×10-11  10-10  3×10-10  10-9  3×10-9  10-8  3×10-8  10-7
阿霉素*Q1 14gLQ6Q6 14gL 70120701207012070120 50267460 -3-22816 -18-9-24-14  989511178  82668955  54336328
化合物 培养时间(小时) 在下列浓度(M)时的MXT细胞系的T/C值
3×10-11  10-10  3×10-10  10-9  3×10-9  10-8  3×10-8  10-7
阿霉素Q1 14gLQ6Q6 14gL 2650265028692869 90529159 7867815 56-1364-11  85748771  90609159  59437350
在96孔平板上，将MCF-7细胞培养在含5％HI-DCC-FBS的IMEM培养基中。将MXT细胞培养在含0.6g/L L-谷氨酰胺和10％FBS中的RPMI 1640培养基中。*如表17-1所示进行测定。
实施例19
表19-1表明本发明含DOX的促生长素抑制素类似物的体外细胞毒活性被充分保留。
      表19-1：在体外含阿霉素的细胞毒性促生长素抑制
      素类似物对MIIA PaCa-2人胰癌细胞系生长的作用
化合物 培养时间(小时) 在下列在浓度(M)时的T/C值
10-8 10-7  10-6
DOX14-O-glt-S-98*(Q1 14gS98) 2876 93103 9511  32-3
载体类似物S-98* 2876 -- --  9698
DOX14-O-glt-S-121**(Q1 14gS121) 2876 9397 8210  35-4
载体类似物S-121** 2876 -- --  7696
阿霉素 2876 9571 6410  -28-7
在96孔平板上，将细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。
实施例20
在体外，含阿霉素的铃蟾肽拮抗剂的细胞毒类似物对CFPAC-1人胰癌细胞系生长的影响
表20-1表明本发明含DOX的铃蟾肽拮抗剂类似物的体外细胞毒活性被充分保留。表20-1
化合物 培养时间(小时) 在下列浓度(M)时的T/C值
3×10-8 10-7 3×10-7 10-6
DOX14-O-gltB-94(Q1 14gB)B-94*DOX14-O-glt-B-50B-50**DXO  66951376695137669513766951376695137  95959499979810297921009897887349  81572810699987855289310098523220  44281910499100392419991029915107  94010096965-1-2939898-7-6-4
在24孔平板上，将细胞培养在含10％胎牛血清的IMDM培养基中。
*Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Leu-NH2
*D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-(CH2-N)-Tac-NH2
激素衍生物被保留的结合特性。
实施例21
与载体肽[D-Lys6]LH-RH相比，细胞毒性LH-RH激动剂类似物Q1 14gL(带有阿霉素的[D-Lys6]LH-RH)和Q6 14gL(带有2-吡咯啉-1-基-阿霉素的[D-Lys6]LH-RH)的激素活性及受体结合能力表21-1
化合物 激素活性*(相对于LH-RH＝1的LH-反应) 大鼠垂体受体的IC50**值(nM) 乳腺癌受体的IC50*值(nM)
Q1 14gLQ6 14gL[D-Lys6]LH-RH  15108  2.295.592.26  7.246.701.80
在表21-1中
*如S.Vigh和A.V.Schally，《肽》5，241-247(1984)中所描述，在分散的大鼠垂体细胞超灌注系统中确定LH对类似物的反应。
**如B.Szoke等，《肽》，15(2)，359-366(1994)中所描述，在使用[125I]标记的[D-Trp6]LH-RH作为放射性配体的竞争性结合实验中测定类似物与大鼠垂体LH-RH受体和人乳腺癌受体的结合亲和性。结合亲和性用IC50值表示，即抑制50％的放射性配体的特异性结合所需的未标记类似物的浓度。
实施例22
如Carlson等所描述，促生长素抑制素类似物抑制生长激素(GH)从灌注的大鼠垂体释放，“释放促甲状腺素的激素刺激而促生长素抑制素抑制生长激素从灌注的大鼠腺垂体释放”，《内分泌学》，94，1709(1974)。因此，该方法被用来将本发明的细胞毒促生长素抑制素类似物与它们的母体载体分子在它们的激素活性方面进行比较。
分别与其细胞毒衍生物Q1 14gS98-1(DOX14-O-glt-S-98-1)和Q1 14gS121(DOX14-O-glt-S-121)相比，通过促生长素抑制素类似物S-98-1
Figure A0214391900311
和S-121对人生长激素释放激素(hGH-RH(1-29)NH2)的抑制诱导从超灌注的大鼠垂体细胞中释放生长激素。
在大鼠垂体超灌注系统中，以1nM促生长素抑制素和同时1nMhGH-RH(1-29)NH2的剂量给药3分钟。再保持注入促生长素抑制素类似物6分钟。在灌注促生长素抑制素期间(0分钟)及给药结束后30、60和90分钟时测定GH对1nM hGH-RH(1-29)NH2的3分钟给药的反应。数据示于表22-1中。表22-1
促生长素抑制素类似物 在灌注促生长素抑制素类似物后的不同时间里通过3分钟给药1nM hGH-RH(1-29)NH2所诱导的GH的释放**
0分钟 30分钟 60分钟 90分钟
S-98-1Q1 14gS98S-121Q1 14gS121  2.907.88.8  94.79062.258.5  117.689.757.354.3 --77.967.7
**以占在给予促生长素抑制素类似物之前，由注入3分钟1nMhGH-RH(1-29)NH2所诱导的GH释放的百分数来表示。
实施例23使用细胞毒性铃蟾肽拮抗剂对受体结合的研究
如前面(1)所描述，使用Bio-Rad Enzymobead Radio碘化试剂盒进行[Tyr4]BN(Sigma)的放射碘化作用和分离单碘化[125I-Tyr4]BN。用Kris等(3)方法的改进方法(2)，在24孔平板中使用铺满的Swiss 3T3细胞(从美国典型培养物保藏中心获得)进行标记的[Tyr4]BN的结合及由细胞毒铃蟾肽拮抗剂类似物Q6 14 gB的取代。接种3-5天后，将铺满的细胞用Hanks′平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，并在总体积为0.5ml的结合缓冲液中(含有50mM HEPES，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，5mM MgCl2和100ug/ml杆菌肽的DMEM，pH：7.4)，在不存在或存在几种浓度的未标记竞争物(Q6 14gB或BN)的情况下，在37℃下将其与50pM[1251-Tyr4]BN保温30分钟。测定存在1uM未标记配体时的非特异性结合。在用含0.1％BSA(pH＝7.4)的冰冷HBSS洗涤三次后，将细胞用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA溶液洗脱并转移至试管中。用γ-计数器(Micromedic Systems Inc，Huntsville，AL)测定放射性。使用McPherson(4)的放射配体结合分析程序评价结合数据。示于表23-1中的Ki值根据Cheng和Prusoff(5)公式计算得出。
1.Halmos等，癌症通讯，85，111-118(1994)
2.Cai，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12664-12668，(1994)
3.Kris，等，生物化学杂志，262：11215-11220，(1987)
4.McPherson，G.A.药物学方法杂志，14：213-228，(1985)
5.Cheng和Prusoff，生物化学药理学，22：3099-3108，(1973)表23-1
与铃蟾肽比较，细胞毒性铃蟾肽拮抗剂Q6 14gB(2-吡咯啉-1-基-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-leu-ψ-(CH2-N)Leu-NH2与Swiss 3T3细胞系中的铃蟾肽受体的特异性结合的鉴定
 化合物     Ki(nM)
铃蟾肽     1.2
Q1 14gB     1.0
与单独的细胞毒基团比较，激素结合物的有效性和细胞毒性
实施例24
用2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)细胞毒性LH-RH激动剂类似物Q6 14gL(与Q6 14-O-半戊二酸酯相连的[D-Lys6]LH-RH)和(DOX)处理雌激素依赖性的MXT小鼠乳腺癌(KS-49)
为了比较细胞毒性阿霉素衍生物Q6和其被靶向细胞毒性肽结合物Q6 14gL以及熟知的抗肿瘤剂DOX的肿瘤抑制活性，并确定最佳给药方式和无毒剂量，将LH-RH受体阳性MXT(3.2)ovex肿瘤块(1mm3)移植入雌性B6D2F1小鼠中。移植1天后，将小鼠随机分成五个动物组并开始处理。将化合物溶于0.1％三氟乙酸(pH2)中并腹膜内给药。分组、处理方案及剂量以及平均存活时间示于表24-1中。结果总结在表24-2和图1中。
表24-2表明Q6和细胞毒性LH-RH类似物Q6 14gL处理对肿瘤体积及患有雌激素依赖性乳腺癌的小鼠的存活时间的作用。如表24-2所示，在第1，2，7，8，14和15天(组2)给药1.25nmol Q6产生强烈的毒性，平均存活时间为17.4天，明显短于未处理对照组。相比之下，相同剂量的Q6 14gL(组6)产生30.8天的平均存活时间，这明显长于未处理对照组。也可通过比较组2(在16天时为1065mm3)和组6(在31天时为863mm3)的平均最终肿瘤体积来证明Q6 14gL比Q6高的功效。
在不同处理方案中，其中一周中五天给予0.5nmol药物并连续给药三周，比较Q6和Q6 14gL来证明相似的结论。
毒性剂量的阿霉素(总量：1560nmol，平均存活时间：20天)不能根除肿瘤，而用非毒性剂量(总量：7nmol，平均存活时间：＞31天)的Q6 14gL处理导致5只中2只动物存活，并且肿瘤没有发展。
                              表24-1
组号   给药   剂量/注射(nmol)  剂量/注射(μg)  注射/周 注射之间的天数 给药周数 获得的总量  平均存活天数*
  1   对照    22
  2   Q6     1.25     0.92     2     5     3   7.5    17.5
  3   Q6     0.5     0.37     5     2     3   7.5    19.6
  4   Q6     0.25*     0.19     5     2     3   9.5    14.6
  5   Q6     0.2     0.15     5     2     3   21    13.0
  6   Q6 14gL     1.25     2.9     2     5     3   7.5    30.8
  7   Q6 14gL     0.5     1.16     5     2     3   7.5    26.8
  8   Q6 14gL     0.25*     0.58     5     2     3   9.5    18.4
  9   Q6 14gL     0.2     0.46     5     2     3   21    13.6
  10   Q6 14gL     3.5     8.12     1     6     2   7    ＞31
  11   Q6 14gL     4     9.28     1     6     2   8
  12   Q6 14gL     5     11.6     1     6     2   10    13.4
  13   DOX     520     340     1     6     3   1560    20.0
*从第9天至第12天，将剂量提高到2.5nmol从第9天至第12天，将剂量提高到5.0nmol*存活
                                                              表24-2
  号   组                   给药方式 最终肿瘤体积(mm3) 测量时所处的天数 平均存活时间(天) 每组5只小鼠中没有肿瘤的存活小鼠个数
剂量/注射 每周注射的次数 注射之间的间隔(天数) 处理的时  间(周) 注射的总量 在第18天 在第31天
 1   对照组   7322   21   22.0±1.6 0 0
 2   Q6   1.25   2  5  3  7.5   1065   16   17.4±0.2 0 0
 6   Q6 14gL   1.25   2  5  3  7.5   863   31   30.8±0.4** 2 0
 3   Q6   0.5   5  2  3  7.5   2531   18   19.6±0.7 0 0
 7   Q6 14gL   0.5   5  2  3  7.5   3978   31   26.8±2.6** 1 0
 10   Q6 14gL   3.5   1  6  2  7   669   31   ＞31** 4 2
12   Q6 14gL   5.0   1  6  2  10   0   10   13.4 0 0
 13   DOX   520   1  6  3  1560   1560   28   20 1 0
**使用Duncan’s检验，与对照数据相比存活时间明显较长(p＜0.01)，存活时间明显较短(p＜0.01)或(p＜0.05)。
实施例25
仅用(DOX)、细胞毒LH-RH类似物T-107和Q1 14gL处理，对雌激素依赖性MXT小鼠乳腺癌的作用(KS-55)试验化合物：
Q1 14gL：与[D-lys6]LH-RH相连的阿霉素14-O-半戊二酸酯
T-107：与[D-lys6]LH-RH相连的N-戊二酰-阿霉素Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.89.pp.972-976(1992))；和
DOX
分析如下进行：
为了确定最大耐受剂量并比较效果，将MXT(3.2)ovex肿瘤块(1mm3)皮下移植入雌性B6D2F1小鼠。移植1天后，将小鼠随机分成五个动物组，用腹膜内单次注射处理它们。分组和注射示于表25-1中。此表还表明当测量体积时仍患有肿瘤的小鼠的数目和各组的平均存活时间。肿瘤体积变化示于图2中。化合物溶解在0.1％TFA(pH：2.0)中。在第10，13，17和20天时测量肿瘤体积。
如表25-1和图2所示，剂量为850nmol/20g小鼠的T-107，(即与[D-Lys6]LH-RH相连的N-戊二酰-DOX)在抑制肿瘤生长中完全无效。相反，剂量为非毒性剂量650nm/20g小鼠的Q1 14gL(与[D-Lys6]LH-RH相连的14-O-戊二酰-DOX)对肿瘤生长产生强烈的抑制(图)。单剂为650nmol/20g小鼠的单独的DOX具有很高的毒性(平均存活时间：13.6天)并且功效明显较差于Q1 14gL(图2)。
表25
号 组 剂量 具肿瘤小鼠的数目/存活小鼠的数目 平均存活时间，天数
nmol/20g μg/20g  μmol/kg 天10 天13 天17 天20
 123456789  对照组Q1 14gLQ1 14gLQ1 14gLDOXDOXDOXT-107T-107 680710760650700750750850 15201587169842746049316761900 3435.53832.53537.537.544.4  5/51/42/43/53/32/31/15/55/5  5/52/43/44/52/22/35/55/5  5/52/43/44/51/12/25/55/5  5/53/43/4(死亡)1/14/44/4 21.2±0.328.6±6935.3±25**26.0±6632.0±34*(死亡)13.6±2515.2±247.8±1.321.8±0521.6±07
*存活时间明显短于对照组(p＜0.01)**与对照组相比，存活时间明显较长(p＜0.01)或*(p＜0.05)(在第2天意外死亡的一只小鼠从这两组中除去)。
实施例26
细胞毒性LH-RH类似物对雌激素依赖性MXT小鼠乳腺癌的作用(KS-47)用于处理的物质
在一个以前的实验中，日剂量为20nmol的Q2处理17天对肿瘤生长仅具有中等抑制作用，并在为40nmol剂量时具有毒性(平均存活时间为14.6天)。选择了日剂量为30nmol用于本实验，该实验比较Q2 14gL(与[D-Lys6]LH-RH相连的Q2)、Q2(吡咯啉-1-基-阿霉素)、[D-Lys6]LH-RH和[D-Lys6]LH-RH+Q2的功效和毒性。
将MXT(3.2)ovex肿瘤块(1mm3)移植入雌性B6D2F1小鼠中。移植1天后通过每天腹膜内注射开始处理并持续12天。如表26-1所示，所有组接受等摩尔量的化合物。在第10、14和18天测量肿瘤并计算肿瘤体积。数据示于表26-1和图3中。
用每日剂量为30nmol的道诺糖胺修饰的阿霉素类似物Q2(吡咯啉-1-基-DOX)剂量对肿瘤生长产生强的抑制作用(肿瘤体积：在第14天时为144mm3，而对照组为1391mm3)，但在实验结束之前，杀死了所有动物，产生严重的毒性(平均存活17.9天)。类似地，Q2与[D-Lys6]LH-RH混合(混合物)产生强的肿瘤抑制作用(肿瘤体积，在第14天时为80mm3)，但平均存活时间(18.5天)明显短于未处理对照组(23.1天)。作为用Q2 14gL(与[D-Lys6]LH-RH共价结合的Q2)的处理结果，两个动物死亡，一个在第16天，另一个在第26天死亡。从8个存活动物中，仅一个在第18天最后的测量中肿瘤发展，并且它们均看来很健康，但后来它们均开始长出肿瘤。该组的平均存活时间明显较长(28.3天)于对照组。单独用[D-Lys6]LH-RH类似物处理不影响肿瘤生长。
该实验表明Q2 14gL比细胞毒性基团Q2具有更高的功效和较低的外周毒性是由于细胞毒基团与靶向载体LH-RH类似物的共价结合的结果。表26-1细胞毒LH-RH类似物对雌激素依赖性MXT小鼠乳腺癌生长及患有肿瘤的小鼠的存活时间的作用
号 处理 剂量(μg/天) 小鼠的数目 在下面时间的平均肿瘤体积(mm3) 移植后的平均存活时间(天数)
 10  14  18
 12345 对照组Q2 14gLQ2[D-Lys6]LH-RH[D-Lys6]LH-RH+Q2 68.721.348.048.0+21.3  1510101010  25333153165121  139116144134880  479423137400327  23.128.3*17.923.518.5
所有的日剂量为30nmol摩尔当量
明显短于对照组(p＜0.05)
*用Duncan’s检验测得明显长于对照组(p＜0.01)。
实施例27
2-吡咯啉-1-基-DOX(Q6)和细胞毒LH-RH激动剂类似物Q6 14gL(与[D-Lys6]LH-RH相连的Q6 14-O-半戊二酸酯)对雄激素依赖性大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌生长的作用。
将患有激素依赖性Dunning R-3327-H前列腺癌的雄性哥本哈根大鼠用Q6 14gL，一种由与2-吡啉啉-1-基-阿霉素相连的激动剂[D-Lys6]LH-RH组成的促黄体生成素释放激素(LH-RH)的新细胞毒类似物进行处理。在第一个实验中，将2-吡咯啉-1-基-阿霉素以50nmol/kg的浓度作为单一药物(Q6)和与[D-Lys6]LH-RH的未结合混合物或与载体[D-Lys6]LH-RH结合(Q6 14gL)的形式给药。第二次以50nmol/kg单独的基团Q6或与[D-Lys6]LH-RH混合给药后，所有大鼠死亡，表示全身毒性症状，而用细胞毒LH-RH结合物Q6 14gL处理的所有动物存活。使用150nmol/kg Q6 14gL的总剂量处理5周后，将肿瘤从实验开始时的8.35±1.7cm3的最初体积减至4.47±0.8cm3，而对照组的肿瘤继续生长，并测得为17.84±2.2cm3。用Q6 14gL的治疗还明显降低了肿瘤的重量和肿瘤的负担。在设计用来比较Q6和Q6 14gL的功效和毒性的第二个实验中，治疗方案由3次给予25nmol/kg Q6或25nmol/kg和50nmol/kg Q6 14gL组成。当处理开始时，所有组的肿瘤体积在3.9-4.5cm3之间。处理5周后，用50nmol/kg Q6 14gL处理的大鼠中的肿瘤减少至2.3±0.51cm3，然而与未处理动物的15.6±2.2cm3相比，25nmol/kg Q6仍然具有毒性，并仅可将最终肿瘤体积减少至6.76±1.4cm3，类似于用25nmol/kg Q6 14gL获得的结果(6.74±cm3)。样本的组织学评价表明仅在Q6 14gL处理组中有显著的有丝分裂细胞的减少。在未处理的Dunning肿瘤样本的膜上检测到具有高结合能力的LH-RH受体，但在用Q6 14gL处理后，未能发现LH-RH的结合位点，AN-201和Q6 14gL的肿瘤生长的抑制还与EGF受体的结合能力的显著降低相关。如图4-6所示，靶向的细胞毒LH-RH类似物Q6 14gL为一种有效的抗肿瘤剂，它导致大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌的衰退。我们的研究还表明细胞毒LH-RH类似物Q6 14gL比掺入的抗肿瘤基团(Q6)的毒性更小，并且在抑制肿瘤生长中明显更具活性。
实施例27的图说明：
图4，实验I：在由3次使用50nmol/kg激动剂[D-Lys6]LH-RH和50nmol/kg细胞毒LH-RH类似物Q6 14gL组成的处理期间，有大鼠Dunning R-3327-H前列腺癌移植物的雄性哥本哈根大鼠的肿瘤体积，垂直线表示SEM。借助于Duncan’s新的多范围检验，与对照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭头表示的处理在第1、8和29天进行。
+用Q6作为单一药物或与[D-Lys6]LH-RH的未结合混合物处理的动物在第二周死亡。在这两组中显示了在第8天记录的肿瘤的体积。
图5实验II：用25nmol/kg 2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6)、25nmol/kg和50nmol/kg细胞毒LH-RH类似物Q6 14gL处理，对患有Dunning R-3327-H前列腺癌的大鼠的肿瘤体积的影响。垂直线表示SEM。与对照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭头表示的处理在第1、8和29天时进行了3次。图6，实验II：用25nmol/kg 2-吡咯啉-1-基-阿霉素(Q6)、25nmol/kg和50nmol/kg细胞毒LH-RH类似物Q6 14gL处理，对患有Dunning R-3327-H前列腺癌的哥本哈根大鼠的体重的影响。垂直线表示SEM。与对照相比*p＜0.05；**p＜0.01。由箭头表示的处理在第1、8和29天时进行了3次。
实施例28
对阿霉素(DOX)和定向细胞毒性LH-RH激动剂类似物Q1 14gL(与DOX14-O-半戊二酸酯相连的[D-Lys6]LH-RH)对OX-1063人卵巢癌在裸鼠中生的作用的对比研究
人上皮卵巢癌细胞系OV-1063来自一57岁老年妇女卵巢的转移性乳头状囊状肿瘤(Horowitz等(1985)肿瘤学42，332-337)。将1千万个OV-1063细胞皮下注射到三个裸鼠中去让肿瘤生长。将1mm3的这些肿瘤块移植至60个动物中以用于体内抑制生长的研究。实验的目的是证实作为在OV-1063上存在LH-RH受体的结果，LH-RH的细胞毒结合物比它所含的细胞毒基团DOX更为有效且毒性更小。因此，将细胞毒LH-RH结合物的作用与DOX、DOX与载体分子的混合物、单独的载体以及未处理的对照组的作用进行比较。将化合物溶解在0.9％氯化钠水溶液中(生理盐水)。
将平均肿瘤大小为约15mm3的小鼠分成六个组，其中每组9只动物，并在肿瘤移植七天后接受下面的处理：组1，生理盐水；组2，Q1 14gL，剂量为700nmol/20g动物；组3，Q1 14gL，剂量为413nmol/20g动物(对于DOX的最大耐受剂量，MTD)；组4,413nmol/20g动物(MTD)的DOX；组5,700nmol/20g DOX与700nmol/20g[D-Lys6]LH-RH的混合物；组6，载体激动剂类似物[D-Lys6]LH-RH，剂量为700nmol/20g动物。
OV-1063受体分析表明LH-RH的高亲和性结合位点的存在。
结果：如图7所示，用413nmol/20g剂量的Q1 14gL处理(组3)获得了对肿瘤生长的强的抑制作用。动物没有显示严重的毒性症状。与之相比，使用413nmol/20g(12mg/kg，MTD，组4)相同剂量的DOX的处理在实验结束后仍存活的三个动物中没有产生明显的肿瘤生长的抑制。由于毒性，三个动物在第5天死亡，6个动物在第9天死亡。在较高剂量时(700nmol/20g，组2)，Q1 14gL显示出非常强的肿瘤生长抑制作用(图7)。9只动物中的两只死于毒性，1只死于偶然。6只存活动物在实验结束时从体重减少约20％中恢复过来。在组6中，将相同的大剂量(700nmol/20g)DOX与700nmol/[D-lys6]LH-RH混合。由于严重毒性产生的结果，这组所有动物在第5天时死亡。
结论：我们的结果清楚地表明由于在上皮卵巢癌OV-1063的细胞中存在LH-RH受体，靶向细胞毒性LH-RH结合物Q1 14gL比其所含的细胞毒基团阿霉素(Q1)显示出更低的毒性和更高的抗肿瘤活性。

Claims (5)

1.一种将α，β或α，γ-羟伯胺的伯氨基的氮转化为在具有5-6个原子的含氮的单不饱和杂环化合物的氮的方法，包括下面的步骤：
a)将所述羟胺与过量卤代醛反应，该卤代醛具有醛碳、带有卤素的碳，并且在醛碳和带有卤素的碳之间具有2或3个选自CH2、CH2CH2和OCH2的残基，
b)相对于羟胺，加入过量的有机碱，
c)用弱酸中和所述碱，和
d)用稀释酸水溶液处理。
2.权利要求1的方法，其中步骤a)在非质子反应惰性有机溶剂中进行。
3.权利要求1的方法，其中步骤a)在极性非羟基反应惰性有机溶剂中进行。
4.权利要求1的方法，其中溶剂为二甲基甲酰胺。
5.权利要求1的方法，其中醛选自ω-溴-和ω-碘-丁醛和-戊醛。
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