BR9611647B1 - análogos citotóxicos colimados da antraciclina e composição contendo os mesmos. - Google Patents

análogos citotóxicos colimados da antraciclina e composição contendo os mesmos. Download PDF

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANALOGOSCITOTÓXICOS COLIMADOS DA ANTRACICLINA E COMPOSIÇÃO CONTENDO OS MESMOS".
Antecedentes da Invenção
A presente invenção foi em parte efetuada com auxílio do go-verno. O governo possui certos direitos sobre este pedido.
Campo da Invenção
A presente invenção se situa no campo da química dos derivados an-ticâncer colimados da antraciclina. Mais particularmente ela está relacionada à do-xorubicina (DOX) ou seus derivados modificados por daunosamina (DM-DOX) liga-dos covalentemente a análogos de hormônios de peptídeos tais como LH-RH,bombesirva e somatostatina. Tais conjugados covalentes são colimados para diver-sos tumores contendo receptores para os análogos de hormônios de peptídeos.
Comentários Sobre a Técnica Anterior
Os análogos de LH-RH que possuem grupamentos citotóxicosna sexta posição são descritos em Schally, Janaki e Bajusz, EP O 450 461B1, publicação de concessão em 6 de setembro de 1995.
Análogos de GnRH(LH-RH) para a destruição de gonadotroresestão descritos em Nett e Glode, WO 90/09 799, publicado em 7 de setem-bro de 1990. Tal pedido descreve toxinas, como a ricina, ligadas a análogosde LH-RH para a destruição de gonadotrofos e que portanto curam cânce-res dependentes de hormônio sexual. Um derivado de doxorubicina de LH-RH é também mencionado, sem especificação da química de ligação.
Análogos citotóxicos da somatostatina são descritos por Schallye outros no Pedido de Patente U.S. depositado em 6 de abril de 1990 e re-depositado em 15 de julho de 1993 sob o N2 de Série 08/076 846.
Um artigo por Α. V. Schally em Anti-Câncer Drugs 5:115-130(1994) fornece detalhes sobre a presença de receptores sobre as membra-nas das células de uma grande diversidade de tumores para análogos deLH-RH, bombesina ou somatostatina.
G. Weckbecker lista várias referências que demonstram a pre-sença de receptores e subtipos de receptores para análogos de somatosta-tina em diversos tecidos normais e de tumores em seu artigo em Farmac.Ther. 60:245-264(1993).
Peptídeos similares à bombesina e a presença de receptoresbombesina/GRP sobre diversos tecidos normais e de tumores são comenta-dos na resenha de N. Bunnett em Gut Peptides: Biochemistry and Physiolo-gy, 423 a 445 (1994), Ed. J. Walsh e G. J. Dockray1 Raven press, New York,EUA, e por E. Spindell em Recent Progress in Hormone Research 48(1993)(Academic Press).
A doxorubicina (DOX) é, no presente, o agente anticâncer maisamplamente usado e potente. No entanto, certos tumores não respondem aela e sua utilização fica também limitada por resistência a múltiplos medi-camentos (MDR - Multidrug Resistance) e cardiotoxicidade, bem como neu-tropenia, que resultam do tratamento crônico. Para superar tais desvanta-gens e para explorar adicionalmente o enorme potencial tumoricida inerenteà estrutura dos antibióticos de antraciclina, milhares de derivados sintéticosforam descritos, incluindo seus análogos colimados (targeted) ligados a di-versas macromoléculas carreadoras.
A maior parte do histórico da DOX e de seus análogos está des-crita em "Adriamycin", David W. Henry, ACS Symposium Series, N° 30,Câncer Chemotherapy, American Chemical Society, páginas 15 a 57 (1976)e no livro Doxorubicin, de Federico Arcamone, Academic Press (1981).
A 3'-desamino 3'-(3"-ciano-4"-morfolinila)-DOX altamente ativa enão resistente à reticulação e derivados da mesma, que possuem atividadeantitumor, são descritos em Mosher e outros, Patente U.S. Ne 4 464 529, de7 de agosto de 1984. A síntese e avaliação biológica dessas "Morfolinil An-traciclinas Intensamente Potentes" estão também descritas no J. Med.Chem. 1984, 27:638-645.
Nos Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 88, páginas 4845 a 4849,de junho de 1991, Gao e outros descrevem a alquilação mediada por for-maldeído de uma seqüência de DNA por um derivado da daunorubicina.
Anáiogos da antraciclina portando substituintes alquilantes la-tentes são descritos no J. Med. Chem. 35:3208-3214 (1992).O uso de um composto de α,ω-diiodo para a alquilação do nitro-gênio da daunosamina da DOX e portanto para a formação de um novo de-rivado morfolinil DOX está descrito na Patente Européia EP 434 960, depo-sitada pela Pharmacia Cario Erba em 12 de dezembro de 1989.
O 140-hemiglutarato e -hemiadipato de N-triflúor acetil adriami-cina são descritos como análogos do 14O-VaIerato de N-triflúor acetil adria-micina (AD-32) com melhor solubilidade em água em Israel e outros, Pa-tente U.S. N- 4 299 822, de 10 de novembro de 1981.
Horton e Priebe (J. Antibiotics, XXXVI, 1211-1215) descrevemvários 14-0-ésteres de diferentes análogos da antraciclina sem quaisquermodificações radicais na atividade anticâncer em comparação aos análogos14-OH originários.
Na técnica de desenvolvimento de agentes quimioterapêuticossão seguidos os seguintes objetivos:
1. Ligação adequada entre a molécula portadora e o agente quimi-oterápico até ser alcançado o alvo.
2. Retenção das características biológicas da molécula carreadorano conjugado, tal como retenção das propriedades de ligação.
3. Retenção da atividade farmacológica do agente quimioterapêu-tico no conjugado, tal como retenção da atividade citotóxica.
4. Como resultado da conjugação, a produção de análogos de ati-vidade mais intensa e/ou toxicidade periférica mais baixa em relação aosgrupamentos não conjugados.
A conjugação da DOX por oxidação com NaIO4 do grupamentodaunosamina da DOX seguida por alquilação redutiva envolvendo uma ami-na primária de uma molécula portadora está descrita em Sela e outros, Pa-tente U.S. N- 4 263 279, de 21 de abril de 1981.
Foi usado um espaçador de ácido cis-aconítico para ligar o ni-trogênio da daunosamina a portadores macromoleculares com uma ligaçãosensível ao pH, tal como descrito em Biochem. Biophys. Res. Commun.,1981, 102:1084-1054.A formação de ligações éster e ligações C-N entre a 14-bromodaunorubicina e proteínas ou poli-L-aminoácidos está descrita em Zunino eoutros (1981) Tumori 67:521-524 e em Eur. J. Câncer Clin. Oncol., 20:421-425, 1984.
A morfolino-DOX (um análogo altamente ativo modificado pordaunosamina da DOX) foi conjugada ao anticorpo através de uma ligaçãohidrazona hidrolisável (lisosomótropo, sensível ao pH), envolvendo a funçãoC-13 oxo do agente citotóxico, tal como descrito em Bioconjugate Chemistry,1990, 1(5):325-330.
A sensibilidade da ligação carboxamida de um resíduo de Ieuci-na à degradação enzimática foi usada com sucesso em conjugados de DOXcontendo um "braço espaçador" de peptídeo, de preferência Ala-Leu-Ala-Leu, em que a Leu carbóxi terminal acila o nitrogênio da daunosamina naDOX e a Ala amino terminal é ligada ao veículo através do espaçador deácido dicarboxílico tal como descrito em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1982,79:629-629.
O nitrogênio da daunosamina da DOX foi acilado por um espa-çador de ácido glutárico e ligado a análogos de LH-RH com uma severaperda da atividade citotóxica, tal como descrito em Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 1992, 89:972-976.
Outras referências relacionadas ao uso dos compostos de acor-do com a presente invenção para o tratamento de diversos tumores em se-res humanos incluem:
1. Schal Iy et. al. (1996) in Treatment with GnRH Analogs: Controversiesand Perspectives, eds. Filicori, M. & Flamigni, C. (Parthenon.Camforth, UK),pp. 33-44.
2. Nagy et.al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93, 7269-7273.
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4. Rekasi et.al.(1993) Endocrinology 132(5) 1991-2000.
5. Srkalovic et.al.(1990) Câncer Res. 50, 1841-1846.
6. Emons eí.aí.(1993) Câncer Res. 53, 5439-5446.7. Emons et.al.(1993) Journal of Clin. Endocrin. and Metabol. 77(6) 1458-)
8. Schally, Α. V. (1988) Oncological applications of somatostatin analogs.Câncer Res. 48, 6977-6985.
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10. Srkalovie et.al.(1990) Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism70(3), 661-669. 4 Pinski et.al.(1994) Int. J. Câncer 57, 574-580.
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13. Radulovic et.al.(1992) P.S.E.B.M. 200, 394-401.
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25. Qin et.al.(1994) J. Câncer Res. Clin. Oncol. 120, 519-528
26. Qin et.al.(1994) Câncer Res. 54, 1035-1041.
27. Qin et.al.(1995) Int. J. Câncer 63, 257-262.
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30. Radulovic et.al.(1992) P.S.E.B.M. 200, 394-401.
31. Radulovic et.al.(1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.
32. Pinski et.al.(1993) Câncer Letters 71, 189-196.
33. Pinski et. al. (1994) Br. J. of Câncer 70, 886-892.
34. Pinski et.al. (1994) Câncer Res. 54, 5895-5901.
Todos os artigos acima mencionados são aqui incorporadoscomo referência.Sumário da Invenção
Os compostos da invenção são hormônios de peptídeos citotó-xicos colimados compreendendo um agente citotóxico de antraciclina, talcomo a DOX ou a DM-DOX1 conjugado a um hormônio de peptídeo, taiscomo análogos de LH-RH1 bombesina e somatostatina. Tais conjugados ci-totoxicos àe hormônios de peptídeos são sintetizados pâfâ o testamento detumores contendo receptores específicos para o conjugado, tais como cân-cer dos seios, câncer dos ovários, câncer do endométrio, câncer da prósta-ta, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer gástrico e câncer dos pul-mões. Alguns dos agentes (não conjugados) citotóxicos de antraciclina aquiutilizados são, por si, novos, sendo altamente potentes. No entanto, seu ní-vel de toxicidade é muito elevado para que eles sejam usados na forma nãoconjugada.
Os análogos de DOX modificados por daunosamina apresenta-dos pela presente invenção foram desenvolvidos durante uma pesquisa pornovos análogos altamente ativos não resistentes à reticulação da DOX,adequados para a formação de conjugados covalentes com veículos depeptídeos.
A formação de conjugados estáveis covalentemente ligados,com atividades biológicas completamente retidas de seus componentes foiconseguida pelo uso de um espaçador de ácido dicarboxílico, tal como oácido glutárico. Um grupo carboxila do espaçador forma uma ligação éstercom o grupo 14-OH da DOX ou DM-DOX e o outro grupo carboxila do espa-çador forma uma ligação carboxamida com um grupo amino livre do veículode peptídeo.
Os compostos da presente invenção são representados pelafórmula geral:
Q14-O-R-P (I)
Na qual Q tem a fórmula<formula>formula see original document page 8</formula>
Q14 significa um grupamento Q com uma cadeia lateral na posição 14, R- éH ou -C(O)-(CH2)n-C(O)- e η é de O a 7;
R' é NH2 ou um composto heterociclo aromático, saturado ouparcialmente saturado de 5 ou 6 membros, possuindo pelo menos um nitro-gênio no anel e opcionalmente possuindo um grupamento butadieno ligadoa átomos de carbono adjacentes do anel para a formação de um sistemabicíclico;
P é H ou um grupamento de peptídeo, adequadamente um LH-RH, ou análogos de somatostatina ou bombesina, porém sem a exclusão deoutros peptídeos fisiologicamente ativos. São particularmente desejáveisaqueles análogos de LHRH possuindo uma afinidade por receptores neo-plásicos de células, especialmente aqueles análogos possuindo um grupa-mento D-Lys na posição 6, bem como análogos encurtados de somatostati-na e bombesina. De qualquer forma quando R' for NH2, então ReP são di-ferentes de H. Quando ReP forem H, então R' é diferente de NH2.
Foi descoberta uma nova reação de síntese durante o cursodeste trabalho. Não só foi descoberto que a doxorubicina e seus deriva-dos podem ser acoplados através de um grupamento dicarboxílico na posi-ção 14 para a produção de novos conjugados farmacologicamente eficazes,como foi também, propiciado um modo de formação de grupamentos hetero-cíclicos parcialmente saturados a partir de aminas primárias vicinais ou se-paradas isto é, α,β- ou α,γ-hidróxi aminas primárias. A aplicação específicana presente invenção foi a formação de grupamentos 2"-pirrolinila e 1",3"-tetraidro ^jiridinila sobre o açúcar de daunosamina. No entanto, tal reaçãopossui aplicação mais ampla. Podem ser formados grupamentos heterocícli-cos parcialmente saturados de 5 e 6 membros quando uma hidróxi aminavicinal ou separada reage com um aldeído halo substituído possuindo 3 ou2 grupamentos entre o carbono de aldeído e o átomo de carbono que portao grupo halo. Tais grupamentos podem ser todos de metileno ou pode estarenvolvido um hetero átomo tal como o oxigênio. A reação ocorre em trêsestágios. Um grande excesso do halo aldeído reage com o sal ácido da hi-dróxi amina, adequadamente em um solvente orgânico polar, inerte, anidro.
É assim formado um anel de oxazolidina de cinco membros (ou um anel deseis membros de 1,3-tetraidro oxazina) por condensação do grupo aldeídocom os grupos hidroxila e amina. Tal produto é tratado com uma base orgâ-nica, por exemplo uma amina terciária, pelo que.os elementos do ácido hi-dro-halogênico são eliminados entre o grupamento halo do halo aldeído ori-ginal e o grupo amino secundário do anel de oxazolidina ou 1,3-tetraidrooxazina para a formação de uma estrutura de anel fundido pela adição deum anel de 5 ou 6 membros. A base é a seguir neutralizada com um ácidofraco, por exemplo um ácido orgânico tal como o ácido acético glacial. Umtratamento com um ácido aquoso, por exemplo um ácido orgânico, abre aporção de oxazolidina ou 1,3-tetraidro oxazina do anel fundido. Será notadopelos técnicos na área que, dependendo do aldeído inicial, o anel contendonitrogênio pode conter pelo menos um hetero átomo adicional tal como aci-ma mencionado. A reação geral pode ser ilustrada da seguinte forma:<formula>formula see original document page 10</formula>
Em que X1 é halogênio, por exemplo bromo ou iodo, de prefe-rência iodo,
Y é CH2, OCH2, CH2CH2,
Z é zero ou CH2.
Quando Z for zero, o grupamento aldeído forma um anel de oxa-zolidina com 5 membros como a primeira etapa da reação. Quando Z forCH2, o grupamento aldeído forma um anel de 1,3-tetraidro oxazina de 6membros. Apesar de tais formações de anel serem bem conhecidas, emcombinação com o fechamento do anel efetuado pela cadeia lateral de haloalcano em um meio básico, tal como uma amina terciária em um meio ani-dro, a reação é nova e surpreendente.Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é um gráfico de mudanças de volume de cânceresmamários MXT estrogeno independentes em ratos para diferentes níveis dedosagem de compostos da presente invenção e DOX.
A Figura 2 é um gráfico de mudanças de volume de cânceresmamários MXT estrogeno independentes em ratos para diferentes níveis dedosagem de um certo composto da presente invenção, um composto datécnica anterior, DOX e um controle.
A Figura 3 é um gráfico do efeito de certos análogos LHRH so-bre a sobrevivência de ratos com cânceres mamários MXT estrogeno inde-pendentes.
A Figura 4 é um gráfico do volume de tumores em ratos Cope-nhagen machos com transplantes de carcinoma da próstata Dunning R-3327-H durante o tratamento com um agonista da técnica anterior e com umcerto composto da presente invenção.
A Figura 5 é um gráfico que mostra o efeito do tratamento comum certo composto da presente invenção e o correspondente análogo LH-RH citotóxico sobre o volume de tumores em ratos com câncer da próstataDunning R-3327-H.
A Figura 6 é um gráfico que mostra o efeito do tratamento comum certo composto da presente invenção e o correspondente análogo LH-RH citotóxico sobre o peso corporal de ratos Copenhagen com câncer dapróstata Dunning R-3327-H.
A Figura 7 é um gráfico que mostra a inibição do crescimento detumores conseguida pelo tratamento com um certo composto da presenteinvenção e DOX.
Descrição das Modalidades Preferidas
O grupamento Q, quando substituído em R' por certos grupospreferidos, possui designações de sub-grupamentos de Q1 a Q8, dos quaisQ2 a Q8 são grupamentos citotóxicos novos.R' possui os valores preferidos, levando aos grupamentos Qxdesejados listados entre parênteses da seguinte forma: NH2 (Qi)1 pirrolidin-1-ila (Q2), isoindolin-2-ila (Q3)1 3-pirrolin-1-ila (Q4)1 3-pirrolidon-1-ila (Q5)1 2-pirrolin-1-ila (Q6)1 3-piperidon-1-ila (Q7)1 ou 1,3-tetraidro piridin-1-ila (Q8).
Dessa forma, se R-P for H e -R' for -NH2, Qi é DOX, se R-P forHe-R' for pirrolidin-1-ila, Q2 é 3'-desamino 3'-(pirrolidin-1"-il) doxorubicina(Q2); se R-P for H e -R' for isoindolin-2-ila, Q3 é 3'-desamino 3'-(isoindolin-2"-il) doxorubicina (Q3); se R-P for H e -R* for 3-pirrolin-1-ila, Q4 é 3-desamino 3'-(3"-pirrolin-1"-il) doxorubicina (Q4); se R-P for H e -R' for 3-pirrolidon-1-ila, Q5 é 3'-desamino 3'-(3"-pirrolidon-1"-il) doxorubicina (Q5); seR-P for H e -R' for 2-pirrolin-1-ila, Q6 é 3'-desamino 3'-(2"-pirrolin-1"-il) doxo-rubicina (Q6); se R-P for H e -R' for 3-piperidon-1-ila, Q7 é 3'-desamino 3'-(3"-piperidon-1"-il) doxorubicina (Q7); se R-P for H e -R' for 1,3-tetraidro piri-din-1-ila, Q8 é 3'-desamino 3'-(1",3"-tetraidro piridin-1"-il) doxorubicina (Q8).
Os compostos que incorporam o nitrogênio da daunosamina emum anel de cinco membros com função alquilante são de 10 a 50 vezesmais ativos in vitro que seus correspondentes homólogos incorporando onitrogênio da daunosamina em um anel de seis membros (tais pares são oQ5 e Q7 bem como Q6 e Q8).
Nas modalidades preferidas da presente invenção, no corpo dafórmula Q14-O-R-P, ReP são diferentes de hidrogênio. Quando P é dife-rente de hidrogênio, isto é, quando ele é P1, P2 e P3l por exemplo quando P1é um veículo de agonista LH-RH1 um veículo de antagonista LH-RH ou umveículo de análogo LH-RH encurtado, P2 é um análogo de somatostatinaencurtado e P3 é um antagonista da bombesina.
P1 é, por exemplo, Aaa-Bbb-Ccc-Ser-tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd, em que (Xxx) é hidrogênio ou um substituinte de diamino tal comoA2Bu ou A2Pr1
em que, quando
Aaa é Glp, Bbb é His, Ccc é Trp e Ddd é GIy-NH2,Aaa é Ac-D-Nal(2), Ac-D-Phe ou AcD-Phe(4CI), Bbb é D-Phe(4CI) ou D-(Phe)1 Ccc é D-Pal(3) e D-Trp e Ddd é D-AIa-NH2 e quandoAaa-Bbb-Cee é Ac, Ddd é -NH-CH2-CH3,
<formula>formula see original document page 13</formula>
em que,
quando Aaa é D-Phe1 Bbb é Tyr1 Cee é Val e Ddd é Thr ou Trp;
e
quando Aaa é D-Trp1 Bbb é Phe1 Cee e Ddd são Thr; e
P3 é Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2em que Aaa é zero, D-Tpi ou D-Phe e Bbb é (CH2-NH)Leu1 (CH2-NH)Phe, (CH2-NH)Trp1 (CH2-N)Tae1 ou (CH2-N)DMTae.
Nos novos compostos da presente invenção incorporando aná-logos de LH-RH1 o radical citotóxico Q está ligado à cadeia lateral de D-Lysnos análogos LH-RH ou no grupo (Xxx) a eles ligados, através de um espa-çador de ácido dicarboxílico tal como formulado na fórmula VII:Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q14-O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd (VII)em que m é 1 ou 0 e η é 1 ou 2, contanto que quando m é 1, isto é, (Xxx) éA2Bu ou A2Pr1 η é 1 ou 2, quando m é O1 isto é, (Xxx) é H1 η é 1.
Nos novos compostos da presente invenção incorporando aná-logos da somatostatina o radical citotóxico Q está ligado ao terminal aminodos análogos de somatostatina através de um espaçador de ácido dicarbo-xílico tal como formulado na fórmula VIII:
<formula>formula see original document page 13</formula>
Nos novos compostos da presente invenção incorporando aná-logos antagonistas de bombesina, o radical citotóxico Q está ligado ao ter-minal amino dos antagonistas de bombesina tal como formulado na fórmula IX:Q14-0-R-Ass-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2 (IX)
As modalidades especialmente preferidas da presente invençãosão constituídas por aqueles conjugados que contêm Qi e Q6 como os radi-cais citotóxicos e o ácido glutárico (n = 3) como o espaçador de ácido dicar-boxílico formando uma ligação éster 14-0 com Qi (doxorubicrna) ou Q6 (2-pirrolino doxorubicina) e uma ligação carboxamida com o veículo de peptídeo.
As modalidades mais preferidas da presente invenção sãoconstituídas por análogos citotóxicos LH-RH das seguintes fórmulas:
1. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Qi14-Q-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2;2. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q614-Q-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2;análogos citotóxicos da somatostatina das seguintes fórmulas:
3. Q114O^It-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-VaI-Cys-Thr-NH2;
4. Q614-0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D^-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
5. Q^4-0-glt-D^-Cys-Phe-D^-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
6. Q614-0-glt-D^-Cys-Phe-D^-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
7. Q114-0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Va!-Cys-Trp-NH2; and
8. Q614-0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2;e análogos citotóxicos de antagonistas da bombesina das seguintes fórmulas:
9. (V-O-glt-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH)Leu-NH2;
10. Q614-0-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH)Leu-NH2
11. Qi14-0-glt-D-Tpi-Gln-Trp-A!a-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH)Leu-NH2; ;e
12. Q614-0-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH)Leu-NH2.
No novo processo de formação de um anel heterocíclico parci-almente saturado com o nitrogênio de uma de uma hidróxi amina vicinal ouseparada, isto é, uma α, β- ou α,γ-hidróxi amina, a primeira etapa da reaçãoé efetuada em um solvente orgânico anidro inerte polar não hidroxílico(aprótico), por exemplo a dimetil formamida, usando-se um excesso subs-tancial, por exemplo um excesso de 30 vezes, do halo aldeído, sendo espe-cialmente eficazes o 4-iodo butiraldeído e o 5-iodo valeraldeído. No entanto,a invenção não fica limitada a esses, o bromo pode ser usado no lugar doiodo. Tal reação, bem como as etapas subseqüentes, pode ser efetuada natemperatura ambiente.
A etapa de basificação é efetuada com um excesso, por exem-pio um excesso de 2 a 4 vezes, de uma base orgânica. Para tal finalidadesão adequadas as aminas terciárias tal como as trialquil aminas.
O anel bicíclico assim formado é aberto para liberar o grupo hi-droxila vicinal ou distante por tratamento com um ácido orgânico na presen-ça de água. Pode ser usado o ácido triflúor acético aquoso diluído, porexemplo em um solvente orgânico inerte tal como a acetonitrila. O produto épurificado pela remoção dos voláteis sob pressão reduzida, o excesso dohalo composto é extraído com hexano e o resíduo purificado por HPLC.
Abreviações
Para a descrição dos peptídeos e de seus derivados da pre-sente invenção, são usadas as abreviações convencionais dos aminoácidostal como são de um modo geral aceitas na técnica da química dos peptídeose tal como recomendado pela IUPAC-IUB Comission on Biochemical No-menclatura (European J. Biochem. 138:9-37, 1984.As abreviações para os resíduos individuais de aminoácidos sãobaseadas no nome comum do aminoácido, por exemplo Glp é o ácido piro-glutâmico, His é a histidina, Trp é o triptofano, etc. as abreviações indicam aforma isomérica L dos aminoácidos, a menos de declaração em contrário,por exemplo Ser é a L-serina e D-Lys é a D-lisina.
As abreviações dos aminoácidos incomuns na presente inven-ção são como segue: D-Nal (2) é a D-3-(2-naftil) alanina e D-Pal(3) é a D-3-(3-piridil) alanina, D-Phe(4CI) é a D-4-cloro fenil alanina.
As seqüências de peptídeos estão escritas de acordo com aconvenção pela qual o aminoácido N-terminal está na esquerda e o aminoá-cido C-terminal na direita, por exemplo, Glp-His-Trp.
A fórmula Leu(CH2-NH)Leu-NH2 descreve uma ligação peptídeoreduzida entre uma Ieucina e um resíduo de Ieucina no terminal C de umaseqüência de peptídeos.
Outras abreviações incluem:
A2Bu: ácido diamino butíricoA2Pr: ácido diamino propiônicoBN: bombesina
reagente BOP: hexaflúor fosfato de benzo triazol-1-ilóxi tris(dimetil amino)fosfônio
DIPEA: Ν,Ν-diisopropil etil aminaDM-DOX: doxorubicina modificada por daunosaminaDMF: Ν,Ν-dimetil formamidaDMTac: ácido 5,5-dimetil tiazolidina 4-carboxílicoDOX: doxorubicina
Fmoc: 9-fluorenil metilóxi carbonilaglt: -C(O)-CH2-CH2-CiH2-C(O)-, glutarilaGIt2O: anidrido glutáricoHOBt: 1-hidróxi benzotriazolHO-glt-OH: ácido glutáricoHOSu: N-hidróxi succinimidaHPLC: cromatografia líquida de alto desempenho
TFA: ácido triflúor acético
Tac: ácido tiazolidina 4-carboxílico
Tpi: ácido 2,3,4,9-tetraidro 1 H-pirido [3,4-b] indol 3-carboxílico.
Foi utilizado um sistema HPLC analítico Beckman equipado comdetetor de arranjo de diodos modelo 168 e programa de cromatografia Sys-tem Gold (Beckman) para monitorar as reações químicas e para conferir apureza dos compostos da presente invenção. A coluna usada era umaDynamax C-18 (250 χ 4,6 mm; tamanho de poros de 300 Â; tamanho departículas de 12 μηη). O sistema solvente consistia de dois componentes: (i)TFA a 0,1% em água e (ii) TFA a 0,1% em solução aquosa a 70% de aceto-nitrila e usado em um modo de gradiente linear, se aumentando (i) em 1% acada 1 minuto, para o monitoramento das reações químicas. O sistema foiusado em modo isocrático para controle da pureza.
Foi utilizado um sistema de HPLC semipreparativa Beckmanmodelo 342 para o isolamento e purificação dos compostos da presente in-venção. A coluna era uma Aquapore Octyl (250 χ 10 mm; tamanho de poros:300 Á; tamanho de partículas de 15 μηι). O sistema solvente era o mesmodescrito para a HPLC analítica acima.
Análise
Foram usados um espectrômetro RMN Bruker ARX300 (300MHz de freqüência 1H, 75 MHz de freqüência 13C) e um espectrômetro demassa por eletroborrifamento Finnigan-MAT TSQ 7000 para a identificaçãoda estrutura dos derivados de doxorubicina.
Síntese dos veículos de peptídeos
Os peptídeos da invenção são amiúde administrados na formade sais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, tais como os sais de adi-ção ácida. Constituem exemplos desses sais de adição ácida o cloridrato,bromidrato, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato,triflúor acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, palmoato, maleato,ascorbato, tartarato e similares. Caso o ingrediente ativo deva ser adminis-trado na forma de comprimidos, o comprimido pode conter um diluente far-maceuticamente aceitável, o qual inclui um aglomerante, tal como o traga-canto, o amido de milho ou a gelatina, um agente de desintegração, talcomo o ácido algínico, e um lubrificante, tal como o estearato de magnésio.
Caso seja desejada a administração em forma líquida, podemser usados edulcorantes ou aromatizante como parte do diluente farmaceu-ticamente aceitável, pode ser efetuada uma administração em solução sali-na isotônica, em soluções de fosfato ou similares.
As composições farmacêuticas irão usualmente conter o peptí-deo em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável convencional.Usualmente a dosagem será de cerca de 1 a cerca de 100 microgramas dopeptídeo por quilograma de peso corporal do hospedeiro, quando adminis-trada por via intravenosa; as dosagens por via oral serão bem maiores. Deforma geral o tratamento dos pacientes com tais peptídeos é geralmenteefetuado da mesma forma que o tratamento clínico utilizando outros análo-gos de LHRH, somatostatina e análogos da doxorubicina.
Tais peptídeos podem ser administrados a mamíferos por viaintravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, intranasal ou intravaginal, parapropiciar efeitos hormonais biológicos através da ligação a receptores espe-cíficos. No caso dos análogos de LHRH, tais efeitos podem incluir a supres-são reversível da atividade gonadal e, no caso dos análogos da somatosta-tina, inibição da função gastrintestinal. As dosagens eficazes irão variar coma forma de administração e com a espécie específica de mamífero que estásendo tratada. Um exemplo de uma típica forma de dosagem é o de umasolução salina fisiológica contendo o peptídeo, solução esta que é adminis-trada para prover uma dose na faixa de cerca de 0,1 a 2,5 mg/kg de pesocorporal. A administração oral do peptídeo pode ser efetuada em forma sóli-da ou líquida.
A síntese dos veículos de peptídeos da presente invenção podeser efetuada por quaisquer técnicas dentre as conhecidas pelos técnicos naárea de química de peptídeos. Um resumo das técnicas adequadas podeser encontrado em M. Bodanszky, Principies of Peptides Synthesis, Sprin-ger-Verlag, Heidelberg1 1984. As técnicas para a síntese de peptídeos emfase sólida podem ser encontradas no livro texto de J. M. Stewart e J. D.Young, Solid Phase Peptide Synthesis1 Pierce Chem. Co., Rockford1 IL1EUA1 1984 (2~ ed.) e na resenha de G. Barany e outros, em Int. J. Peptideand Protein Res., 30:705-739 (1987).
A síntese dos veículos análogos de LH-RH usados na presenteinvenção está detalhada nos exemplos da Patente U.S. N9 5 258 492, deSandor Bajusz e andrew V. Schally, de 2 de novembro de 1993, e nos arti-gos de Bajusz e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:1637-1641 (1988) e86,6318-6322 (1989) e Janaki e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,89:1023-1027 e 972-976 (1992).
A síntese dos veículos de análogos de somatostatina usados napresente invenção está detalhada nos exemplos da Patente U.S. N9 4 650787, de 17 de março de 1987, de Andrew V. Schally e Ren Z. Cai. Uma des-crição da síntese pode também ser encontrada nos artigos por Cai e outros,Proc. Natl. Acad. Sei. USA1 83:1896-1900 (1986) e Proc. Natl. Acad. Sei.USA1 84:2502-2506(1987).
A síntese dos veículos de antagonistas de bombesina usadosna presente invenção está detalhada nos artigos por Coy e outros, no J. Bi-ol. Chem., 263:5056-5060, (1988) e 264:14691-14697 (1989) e por Cai eoutros, Peptides 13:267-271 (1992) e Proc. Natl. Acad. Sei. USA1 91:12664-12668(1994).
A síntese dos derivados de doxorubicina usados na presenteinvenção e a formação de seus conjugados com diferentes veículos depeptídeos estão detalhadas nos exemplos que se seguem, que se destinama ilustrar e não limitar a presente invenção.
Exemplo 1
Preparação e isolamento de O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX14.
O sal de DOX HCI (50 mg, 86 μπιοΙ) foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 30 mg (90 μηποΙ) de Fmoc-OSu seguidos pela adi-ção de 31 μΙ (180 μιτιοί) de DíPEA. Após agitar por três horas, a reação es-tava finalizada, tal como avaliado por HPLC analítica. O solvente foi evapo-rado até a secura em um evaporador Speed Vac de alto vácuo e o resíduocristalizado por trituração com 0,1% de TFA em H2O. Os cristais foram filtra-dos e lavados uma vez com éter frio para remover traços do excesso deFmoc-OSu. Após secagem em um dessecador, foi obtida m = 62 mg de N-Fmoc-DOX 98% pura. Rendimento: 94%.
Este intermediário reagiu durante uma noite com 11,4 mg (100μηηοΙ) de GIt2O em 1 ml de DMF anidra, na presença de 26,1 μΙ (150 μηηοΙ)de DIPEA. O solvente foi evaporado no Speed Vac e o óleo residual solidifi-cado por trituração com 0,1% de TFA aquoso (v/v). 0 material bruto assimobtido contém 70% de O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX14, 20% de N-Fmoc-DOx que não reagiu e 10% de outras impurezas, tal como avaliado porHPLC analítica. Este produto bruto pode ser usado para a preparação deconjugados peptídeo DOX sem purificação adicional. Quando este materialbruto foi dissolvido em 20 ml de acetonitrila aquosa a 60% contendo 0,1%de TFA e aplicado em HPLC semipreparativa, foram obtidos 45,7 mg doproduto final de O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX14 com 98% de pureza(rendimento: 64%).
Exemplo 2
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(pirrolidin-1"-il) doxorubicina (Q2) e seu sal de O-hemiglutarato (AN-193) TFA.
O sal de DOX HCI (50 mg, 86 μηιοΙ) foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 171 μΙ (1,3 mmol), um excesso de 15 vezes, de1,4-diiodo butano, seguido pela adição de 45 μΙ (260 μιηοΙ), um excesso de3 vezes, de DIPEA. A mistura reacional foi agitada durante uma noite natemperatura ambiente. Após 16 horas a reação estava finalizada tal comoavaliado por HPLC analítica. O solvente foi evaporado em Speed Vac e oóleo residual dissolvido em 3 ml de 0,1% de TFA em água e extraído cométer para a remoção do excesso de 1,4-diiodo butano. O extrato aquoso foia seguir aplicado em HPLC obtendo-se 41,6 mg do derivado de DOX com98% de pureza. Rendimento de 68%Os 41,6 mg (58 μιηοΙ) do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(pirrolidin-1"-il)-doxorübicina (Q2) assim obtidos reagiram com 1,2 equiva-lentes de GIt2O em DMF seca, exatamente como descrito no Exemplo 1. 0rendimento foi de 35% (16,9 mg) e a pureza de 98%.
Exemplo 3
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(isoindolin-2"-il) doxorubicina (Q3).
O sal de DOX HCI, 50 mg (86 μηιοΙ), foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 226 mg (1,3 mmol), um excesso de 15 vezes, deα,α'-dicloro-orto-xileno, seguido pela adição de 45 μΙ (260 μηιοΙ), um exces-so de 3 vezes, de DIPEA e uma quantidade catalítica de Nal. Após 16 horasos solventes foram removidos em Speed Vac e o resíduo foi dissolvido em 3ml de 0,1% de TFA em água e extraído com 3 ml de éter para a remoção doexcesso do composto halogenado. O material bruto assim obtido foi aplica-do a HPLC. Após purificação foram obtidos 36 mg de produto final com 98%de pureza (Rendimento de 55%).
Exemplo 4
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(3"-pirrolin-1"-il) doxorubicina (Q4).
O sal de DOX HCI, 50 mg, (86 μιηοΙ), foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 136,8 μΙ (1,3 mmol), um excesso de 15 vezes, decis-1,4-dicloro 2-buteno (Aldrich), seguido pela adição de 45 μΙ (260 μιηοΙ),um excesso de 3 vezes, de DIPEA. Após 16 horas, os solventes foram re-movidos em Speed Vac e o resíduo foi dissolvido em 3 ml de 0,1% de TFAem água e extraído com 3 ml de hexano para a remoção do excesso docomposto halogenado. O material bruto assim obtido foi aplicado a HPLC.
Após purificação foram obtidos 22,6 mg de produto final com 98% de pureza(Rendimento de 37%).
Exemplo 5
Preparação e isolamento de 1-cloro 4-bromo 2-butanona(C4H6CIBrO) e 1-cloro-5-bromo 2-pentanona (C5H8CIBrO).Cloreto de 3-bromo propionila, 100,8 μΙ, (1 mmol)(Aldrich) reagiucom um excesso de diazo metano em éter. Após 1 hora a solução etérea foieluída e mancha testada em TLC. Folhas de alumínio para cromatografia decamada delgada pré-revestidas com sílica gel 60 F254 da Merck (Art. N55554) foram usadas como a fase estacionária e CHCI3:MeOH 95:5 (v/v)como a fase móvel. Para o teste de mancha foi borrifado reagente de 2,4-dinitro fenil hidrazina (Vogel: A Textbook of Praticai Organic Chemistry, pá-gina 1061, terceira edição, Longmans, New York, EUA) sobre a folha deTLC após a eluição. O derivado de diazometil cetona assim formado apre-sentou uma mancha amarela com Rf: 0,3. A solução etérea a seguir reagiucom HCI anidro em éter, convertendo a diazo metil cetona ao produto finaldesejado, a 1-cloro 4-bromo 2-butanona. Tal produto apresentou uma man-cha amarela, características dos oxo compostos, com Rf: 0,8 no mesmosistema solvente e com o reagente para teste de mancha acima descrito.
Após evaporação do solvente, o produto bruto foi aplicado a uma coluna (15cm de comprimento, 2,5 cm de diâmetro) recheada com 15 g de sílica gelMerck tipo 9385, malha 230 a 400, tamanho de poros de 60 Ã. A fase líquidamóvel era de CHCI3 puro. As frações contendo o produto final desejado(caracterizado pelo teste de mancha detalhado acima) foram misturadas eevaporadas até a secura, sendo obtidos 1,5 g de um óleo límpido com ren-dimento de 80%.
A 1 -cloro-5-bromo-2-pentanona foi preparada a partir do cloretode 4-bromo-butirila, exatamente da mesma forma como descrito para a 1-cloro-4-bromo-2-pentanona exceto pelo uso do cloreto de 4-bromo-butirilaem lugar do cloreto de 3-bromo-propionila. Foram obtidos 1,6 g de um óleolímpido com rendimento de 80%.
Exemplo 6
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(3"-pirrolidon-1"-il) doxorubicina (Q5).
O sal de DOX HCI 50 mg (86 μηηοΙ) foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 241 mg (1,3 mmol), um excesso de 15 vezes, de1-cloro-4-bromo-2-butanona, seguido pela adição de 45 μΙ (260 μιτιοΙ), umexcesso de 3 vezes, de DIPEA. Após 16 horas, os solventes foram removi-dos em Speed Vac e o resíduo foi dissolvido em 3 ml de 0,1% de TFA emágua e extraído com 3 ml de hexano para a remoção do excesso do com-posto halogenado. O material bruto assim obtido foi aplicado a HPLC. Apóspurificação, foram obtidos 20,6 mg de produto final com 98% de pureza erendimento de 33%.
Exemplo 7
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(3"-piperidon-1"-il) doxorubicina (Q7).
O sal de DOX HCI 50 mg (86 μΓΤίοΙ) foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 260 mg (1,3 mmol), um excesso de 15 vezes, de1-cloro-5-bromo-2-pentanona, seguido pela adição de 45 μΙ (260 μιηοΙ), umexcesso de 3 vezes, de DIPEA. Após 16 horas, os solventes foram removi-dos em Speed Vac e o resíduo foi dissolvido em 3 ml de 0,1% de TFA emágua e extraído com 3 ml de hexano para a remoção do excesso do com-posto halogenado. O material bruto assim obtido foi aplicado a HPLC. Apóspurificação, foram obtidos 18 mg de produto final com 95% de pureza e ren-dimento de 28%.
Exemplo 8
Preparação e isolamento de 4-iodo butiraldeído e 5-iodovale-raldeído.
2-(3-cloropropil) 1,3-dioxolana (4-cloro-n-butiraldeído etilenoacetal)(1,3 ml, 10 mmol)(Fluka) foi dissolvida em 200 ml de acetona conten-do 30 g (200 mmol, excesso de 20 vezes) de Nal. A solução foi colocadasob refluxo por 24 horas, seguido por evaporação até a secura. 100 ml deéter foram usados para extrair o material orgânico do resíduo inorgânico só-lido. A solução etérea foi a seguir lavada com 50 ml de H2O, 50 ml de solu-ção aquosa a 5% de Na2S2O3 e 3 vezes com 50 ml de H2O. O éter foi remo-vido sob vácuo e o óleo remanescente dissolvido em 3 ml de ácido acéticoaquoso a 50%. Após 1 hora, foram adicionados 100 ml de éter a essa solu-ção e o ácido acético bem como o etiieno glicol foram removidos por lava-gem com 3 vezes 50 ml de H2O. O produto principal foi eluído a Rf: 0,8 naTLC em CHCI3 puro. 0 teste de mancha usado para a função aldeído foi omesmo acima descrito para as cetonas no Exemplo 5. O éter foi a seguirremovido e o óleo preto foi aplicado a uma coluna (15 cm de comprimento,2,5 cm de diâmetro) recheada com 15 g de sílica gel Merck tipo 9385, malha230 a 400, tamanho de poros de 60 À. A fase líquida móvel era de CHCI3.
As frações contendo o produto final desejado (caracterizado pelo teste demancha detalhado acima) foram misturadas e evaporadas até a secura,sendo obtidos 1,6 g de um óleo amarelo com rendimento de 80%.
O 5-iodovaleraldeído foi preparado exatamente da mesma formapartindo-se de 2-(4-clorobutil) 1,3-dioxolana (5-cloro-n-valeraldeído etilenoacetal)(Fluka). Foram obtidos 1,65 g de um óleo amarelo com rendimento de 80%.
Exemplo 9
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(2"-pirrolin-1"-il) doxorubicina (Q6).
O sal de DOX HCI 50 mg (86 μπαοΙ) foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 515 mg (2,6 mmol), um excesso de 30 vezes, de1-iodobutiraldeído, seguido pela adição de 45 μΙ (260 μηιοΙ), um excesso de3 vezes, de DIPEA. Após 1 hora foram adicionados 100 μΙ de ácido acéticoglacial à mistura reacional, a qual foi a seguir adicionada gota a gota a 5 mlde TFA a 0,1% em acetonitrila em água a 70% (solvente (ii) do sistemaHPLC). Tal solução foi diluída com 2 ml de solução aquosa a 0,1% de TFAseguido pela remoção da acetonitrila em Speed Vac. A solução resultantefoi extraída com hexano para remover o excesso do composto halogenado.
O material assim obtido foi aplicado a HPLC. Após purificação foram obtidos52 mg de produto final com 98% de pureza e rendimento de 85%.
Exemplo 10
Preparação e isolamento do sal de TFA de 3'-desamino 3'-(1",3"-tetraidropiridin-1"-il) doxorubicina (Q8).
O sal de DOX HCI 50 mg (86 μηιοΙ) foi dissolvido em 1 ml deDMF e foram adicionados 552 mg (2,6 mmol), um excesso de 30 vezes, de5-iodo valeraldeído, seguido pela adição de 45 μΙ (260 μπιοΙ), um excessode 3 vezes, de DIPEA. Após 1 hora foram adicionados 100 μΙ de ácido acé-tico glacial à mistura reacional, a qual foi a seguir adicionada gota a gota a5 ml de TFA a 0,1% em acetonitrila em água a 70% (solvente (ii) do sistemaHPLC). Tal solução foi diluída com 2 ml de solução aquosa a 0,1% de TFAseguido pela remoção da acetonitrila em Speed Vac. A solução resultantefoi extraída com hexano para remover o excesso do composto halogenado.O material assim obtido foi aplicado a HPLC. Após purificação, foram obti-dos 46 mg de produto final com 98% de pureza e rendimento de 75%.
Exemplo 11
Preparação e isolamento do agonista citotóxico de LH-RH con-tendo DOX ([D-Lys6(D0X14-0-glt)]LH-RH, Qi14gL).
[D-Lys6JLH-RH (60 mg, 37,5 μιηοΙ) e 52 mg (64% puro, 37,5μηιοΙ) de O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOXI 4 (ver Exemplo 1) foram dissol-vidos em 1 ml dimetil formamida e 22 mg (50 μηιοΙ) reagente BOP (Aldrich),13,5 mg (100 μηιοΙ) HOBt, bem como 52 μΙ (300 μηιοΙ) DIPEA foram adicio-nados. Após agitar por 1 hora na temperatura ambiente a reação estava fi-nalizada. Os solventes foram evaporados e o óleo residual foi cristalizadopor 3 ml de acetato de etila e a seguir lavado duas vezes com 3 ml de ace-tato de etila. O material sólidp bruto (90 mg) foi a seguir dissolvido em 3 mlDMF e 300 μΙ de piperidina foram adicionados. Após 5 minutos a misturareacional foi colocada em um banho de gelo e foi acidificada pela adição deuma mistura de 300 μΙ TFA1 700 μΙ de piridina e 2 ml DMF. Após evaporaçãodos solventes, o óleo residual foi solidificado por acetato de etila. O sólidobruto assim obtido foi dissolvido em 1 ml de acetonitrila aquosa a 70% con-tendo 0,1% de TFA (i) e diluída com 3 ml de TFA aquoso a 0,1% (ii) e apli-cada em HPLC semipreparativa. Foram obtidos 40 mg (14,8 μιηοΙ) de pro-duto final com 98% de pureza e rendimento de 48%.
Exemplo 12
Preparação e isolamento do agonista citotóxico de LH-RH con-tendo 2-pirrolino-DOX ([D-Lys6(2-pirrolino-DOX14-0-glt)]LH-RH, Q614gL).Qi14gL (11,2 mg, 5 μΓηοΙ)(νβΓ Exemplo 11) foi dissolvido em 200μΙ de DMF e 30 mg (150 μηιοΙ, excesso de 30 vezes) de 4-iodobutiraldeído(Exemplo 8) foram adicionados seguidos pela adição de 3 μΙ (17 μΓηοΙ) deDIPEA. Após 1 hora a reação havia se completado (ver Exemplo 9) e 10 μΙde ácido acético glacial foram adicionados à mistura reacional, a qual foi aseguir adicionada gota a gota a 1 ml de TFA a 0,1 % em acetonitrila em águaa 70%. Tal solução foi a seguir diluída com 1 ml de solução aquosa a 0,1%de TFA e a acetonitrila foi removida sob vácuo. A solução aquosa remanes-cente foi a seguir extraída com 1 mJ de hexano e aplicada a HPLC. Foramobtidos 7,6 mg de produto final com 99% de pureza e rendimento de 66%.
Exemplo 13
Preparação e isolamento de um análogo citotóxico de somatos-tatina contendo DOX.
(D0X14-,0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, Qi14gS)
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-VaI-Cys-Thr-NH2 20 mg (14,5μηιοίχΡΓοα Natl. Acad. Sei. USA, 1986, páginas 1986 a 1990) e 20 mg(64% pureza, 14,5 μιτιοΙ) de O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOXI4 (Exemplo1) foram dissolvidos em 200 μΙ de DMF e foram adicionados 8,8 mg (20μιτιοΙ) de reagente BOP (Aldrich), 5,4 mg (40 μιτιοΙ) HOBt, bem como 17 μΙ(100 μπιοΙ) DIPEA. Após agitar por 1 hora na temperatura ambiente a rea-ção estava finalizada. Após remoção dos solventes sob vácuo o resíduo foicristalizado por acetato de etila. Esse material sólido foi a seguir dissolvidoem 1 ml DMF e 100 μΙ de piperidina foram adicionados. Após 7 minutos, amistura reacional foi colocada em um banho de gelo e foi acidificada pelaadição de uma mistura de 100 μΙ TFA, 300 μΙ de piridina e 2 ml DMF. Apósevaporação dos solventes, o óleo residual foi solidificado por acetato deetila. O sólido bruto assim obtido foi dissolvido em 1 ml de acetonitrila aquo-sa a 70% contendo 0,1% de TFA (i) e diluída com 3 ml de TFA aquoso a0,1% (ii) e aplicada em HPLC semipreparativa. Foram obtidos 9,7 mg (5,1μιηοΙ) de produto final com 95% de pureza e rendimento de 35%.Exemplo 14
Preparação de análogo citotóxico de somatostatina contendo
(2-pirrolino .-D0X14-0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D^-Lys-Val-Cys-Thr-NH2,Qe14gS)
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-VaI-Cys-Thr-NH2
(6,4 mg, 5 μmol) foi dissolvido em 100 μΙ de DMF e O-hemiglutarato de 2-pirrolino-DOX14 (4,1 mg, 5 μmol) foram adicionados, seguidos por reagenteBOP (4,4 mg, 10 μιτιοΙ), HOBt (100 μηιοΙ) e DIPEA (50 μιηοΙ). Após agitarpor 2 horas na temperatura ambiente, a mistura reacional foi acidificada por20 μl de ácido acético e diluída com 500 μΙ de acetonitrila aquosa a 70%contendo 0,1 % de TFA e adicionalmente diluída com 700 μΙ de TFA aquosoa 0,1% e aplicada em HPLC. Foram obtidos 3,9 mg do produto final com pu-reza de 99% e rendimento de 40%.
O O-hemiglutarato de 2-pirrolino-DOX14 foi preparado pela rea-ção de O-hemiglutarato de DOX14 com 4-iodobutiraldeído, tal como descritono Exemplo 9.
O O-hemiglutarato de DOX14 foi preparado a partir de O-hemiglutarato de N-Fmoc DOX14 por clivagem do grupo protetor Fmoc, talcomo descrito.no Exemplo 11 (rendimento de 40%).
Exemplo 15
Preparação e isolamento de um antagonista citotóxico de bom-besina contendo DOX.
(D0X14-0-glt-Gln-Trp-ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2, Q1^gB)Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH) Leu-NH2, (20 mg, 15,8 μηιοΙ) (Int. J.Peptide Protein Res., 38:593-600, 1991) e 22 mg (64% de pureza, 15,8μπιοΙ) de O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX14 (Exemplo 1) foram dissolvidosem 200 μΙ de DMF e foram adicionados 8,8 mg (20 μιτιοΙ) de reagente BOP(Aldrich), 5,4 mg (40 μπιοΙ) HOBt, bem como 17 μί (100 μπιοΙ) DIPEA. Apósagitar por 1 hora na temperatura ambiente a reação estava finalizada. Apósremoção dos solventes sob vácuo, o resíduo foi cristalizado por acetato deetila. Esse material sólido foi a seguir dissolvido em 1 ml DMF e 100 μΙ depiperidina foram adicionados. Após 5 minutos, a mistura reacional foi colo-cada em um banho de gelo e foi acidificada pela adição de uma mistura de100 μΙ TFA, 300 μΙ de piridina e 2 ml DMF. Após evaporação dos solventes,o óleo residual foi solidificado por acetato de etila. O sólido bruto assim ob-tido foi dissolvido em 1 ml de acetonitrila aquosa a 70% contendo 0,1% deTFA (i) e diluída com 3 ml de TFA aquoso a 0,1% (ii) e aplicada em HPLCsemipreparativa. Foram obtidos 13,5 mg (7,1 μητιοΙ) de produto final com98% de pureza e rendimento de 45%.
Exemplo 16
Preparação e isolamento de um antagonista citotóxico de bom-besina contendo 2-pirrolino-DOX.
2-pirrilin0-D0X14-0-glt-Gln-Trp-Ala-yal-Gly-His-Leu(CH2-NH) Leu-NH2,Q/4gB (9,5 mg, 5 μπηοΙ)(ΕχβιτιρΙο 15) foi dissolvido em 200 μΙ deDMF e 30 mg (150 μιτιοΙ, excesso de 30 vezes) de 4-iodobutiraldeído(Exemplo 8) foram adicionados seguidos pela adição de 3 μΙ (17 μιτιοΙ) deDIPEA. Após 1 hora a reação havia se completado (ver Exemplo 9) e 10 μΙde ácido acético glacial foram adicionados à mistura reacional, a qual foi aseguir adicionada gota a gota a 1 ml de TFA a 0,1 % em acetonitrila em águaa 70%. Tal solução foi a seguir diluída com 1 ml de solução aquosa a 0,1%de TFA e a acetonitrila foi removida sob vácuo. A solução aquosa remanes-cente foi a seguir extraída com 1 ml de hexano e aplicada a HPLC. Foramobtidos 6 mg de produto final com 98% de pureza e rendimento de 60%.
Determinação da atividade citotóxica in vitro.
Uma linhagem de células de carcinoma mamário de ratos MXTestrógeno independente foi obtida através do Dr. Gunter Berndhardt1 daUniversidade de Regensburg, Alemanha. Todas as outras linhagens de cé-lulas usadas na determinação da atividade antiproliferativa dos compostosda presente invenção foram obtidas através da American Type Culture Co-Ilection (ATCC).Para a avaliação da atividade dos análogos, foi usado um en-saio colorimétrico de citotoxicidade em placas de microtitulação com basena quantificação da biomassa pelo manchamento das células com violetacristal, que se correlaciona bastante bem com a determinação dos númerosde células (Reile e outros, Anal. Biochem., 187:262-267, 1990; Berndhardt,G. e outros, J. Câncer Res. Clin. Oncol., 117:435-433, 1991; Gillies, R. J.,Anal. Biochem., 159:109-113, 1986; Kueng, W. e outros; Anal. Biochem.,182:16-19, 1989).
Protocolo de ensaio
Um ou dois dias após a semeadura das células em placas de 96cavidades, o meio de cultura é trocado por meio fresco contendo os com-postos a serem testados e apenas por meio fresco para as culturas de con-trole. Após variar o tempo de incubação, as células são fixadas com dialdeí-do glutárico e armazenadas sob soro bovino fetal (FBS) a 4°C até o final daexperiência. As células são manchadas com violeta cristal e a mancha liga-da é extraída com EtOH aquoso a 70%. A densidade ótica é medida com oEIA Reader (Bio-Tek Instruments) ou Biomek 1000 (Beckman) em 590 nmou 600 nm, respectivamente. Cada ponto de valor representa o valor médiode oito cavidades de cultura. Os valores T/C são calculados como T/C = (T-CO)/(C-CO), em que T = densidade ótica das culturas tratadas, C = densi-dade ótica de culturas controle (não tratadas), CO = densidade ótica deculturas no início da incubação (t = 0).
Exemplo 17
Atividade citotóxica in vitro de derivados de DOX modificadospor daunosamina.
A Tabela 17-1 demonstra os efeitos da doxorubicina e seus de-rivados modificados por daunosamina sobre a linhagem de células de carci-noma humano MCF-7 in vitro.
Os radicais citotóxicos possuindo seu N da daunosamina incor-porado em um anel de 5 membros com uma função reativa são de 5 a 50vezes mais ativos que seus homólogos correspondentes com um anel deseis membros, como os exemplos da 3-pirrolidono-DOX (Q5) e 3-piperidono-DOX (Q7)1 bem como 2-pirrolino-DOX (Q6) e 1,3-tetraidro piridino-DOX (Q8).
Tabela 17-1: Efeitos da doxorubicina e seus derivados modificados por dau-nosamina sobre a linhagem de células de carcinoma humanoMCF-7 in vitro.
<table>table see original document page 30</column></row><table>
As células foram incubadas em meios IMEM contendo 5% Hl-DCC-FBS (soro fetal bovino inativado por calor tratado com carvão revesti-do com dextrano) em placas de 96 cavidades. O número relativo de célulasnas placas com tratamento e de controle foi determinado pelo método demanchamento com violeta cristal e foi expresso como valores T/C em queT/C = (T-Co)/(C-Co)x100, em que T = absorção das culturas tratadas, C =absorção das culturas de controle, C0 = absorção das culturas no início daincubação (t = 0). A absorção medida é proporcional ao número de células.
Os valores mais baixos de T/C indicam um decréscimo na so-brevivência de células câncerosas devido ao tratamento. Em outras pala-vras, 75 indicaria 75% de sobrevivência das células em comparação a 100%para o controle ou 25% de inibição.
Exemplo 18
Retenção completa da atividade citotóxica in vitro de DOX emconjugado de peptídeo agonista de LH-RH Qi14gL e de 2-pirrolino-DOX (Q6)superativo em conjugado de peptídeo agonista de LH-RH Q614gL.
A Tabela 18-1 demonstra os efeitos da doxorubicina e seu deri-vado modificado por daunosamina, 2-pirrolinodoxorubicina (Q6) em compa-ração com seus conjugados com o análogo de agonista LH-RH1 [D-Lys6JLH-RH (Qi14gL e Q614gL, respectivamente) sobre o crescimento da linhagem decélulas de carcinoma mamário humano MCF-7 e da linhagem de células decarcinoma mamário de ratos MXT estrogeno independente in vitro.<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>As células MCF-7 foram incubadas em meios IMEM contendo5% HI-DCC-FBS em placas de 96 cavidades. As células MXT foram incuba-das em meios RPMI 1640 contendo 0,6 g/l de L-glutamina e 10% FBS.(*) determinado como na Tabela 17-1.
Exemplo 19
A Tabela 19-1 demonstra que a atividade citotóxica in vitro dosanálogos de somatostatina contendo DOX da invenção é completamenteretida.
Tabela 19-1: Efeitos dos análogos citotóxicos de somatostatina contendodoxorubicina sobre o crescimento da linhagem de células MIIA PaCa-2 decâncer pancreático humano in vitro.
<table>table see original document page 34</column></row><table>
As células foram incubadas em meios RPMI 1640 contendo 10%de soro bovino fetal em placas de 96 cavidades.
'D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2;
**D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;Exemplo 20
Efeitos de análogos citotóxicos de antagonistas de bombesinacontendo doxorubicina sobre o crescimento de células de câncer pancreáti-co humano CFPAC-1 in vitro.
A Tabela 20-1 demonstra que a atividade citotóxica in vitro deanálogos citotóxicos da bombesina contendo DOX da invenção é completa-mente retida.
Tabela 20-1
<table>table see original document page 35</column></row><table>
As células foram incubadas em meios IMDM contendo 10% desoro bovino fetal em placas de 24 cavidades.
*gln-Trp-ala-Val-Gly-His-Leu-y(CH2-N)-Leu-NH2**D-Phe-Gln-Trp-ala-Val-Gly-His-Leu-v(CH2-N)-Tac-NH2Propriedades de ligação dos derivados de hormônios preservadas.
Exemplo 21
Atividades hormonais e potências de ligação dos receptores deanálogos citotóxicos dos agonistas de LH-RH Q/4gL ([D-Lys6JLH-RH por-tando DOX) e Q614gL ([D-Lys6JLH-RH portando 2-pirrolino DOX) em compa-ração com o peptídeo veículo [D-Lys6JLH-RH.
Tabela 21-1
<table>table see original document page 36</column></row><table>
Na Tabela 21-1:
(*) As reações LH aos análogos foram determinadas em umsistema em superfusão de células pituitárias de rato dispersas tal comodescrito em S. Vigh e Α. V. Schally, Peptides1 5:241-247, 1984.
(**) As afinidades de ligação dos análogos aos receptores LH-15 RH pituitários de ratos e receptores de câncer humano do seio foram deter-minadas em experiências de ligação competitiva usando-se [D-Trp6JLH-RHmarcado [1251] como o radioligante tal como descrito em B. Skoze e outros,Peptides, 15(2):359-366, 1994. As afinidades de ligação foram expressaspor valores IC5o, a concentração de análogo não marcado necessária parainibir 50% da ligação específica do radioligante.
Exemplo 22
Os análogos de somatostatina inibem a secreção do hormôniode crescimento (GH) da pituitária de ratos perfundida tal como descrito porCarlson e outros, (Thyrotropin-releasing hormone stimulation and somatos-tatin inhibition of growth hormone secretion from perfused rat adenohypo-physes, Endocrinology1 94:1709-, 1974). Assim, tal método foi utilizado paracomparar os análogos citotóxicos da somatostatina da presente invenção asuas moléculas carreadoras originárias com relação a suas atividades hor-monais.
A inibição do hormônio Iiberador de hormônio de crescimento(hGH-RH(1-29)NH2) induziu a liberação de hormônio de crescimento a partirde células pituitárias de ratos perfundidas por análogos S-98-1 da soma-tostatina.
<formula>formula see original document page 37</formula>
em comparação a seus derivados citotóxicos Qi14gS98-1(D0X14-0-glt-S-98-I) eQ114gS121 (D0X14-0-glt-S-121), respectivamente.
No sistema em superfusão de pituitárias de ratos, os análogosde somatostatina foram administrados por 3 minutos a uma dosagem de 1nM simultaneamente com 1 nM de hGH-RH(1-29)NH2. A infusão dos análo-gos de somatostatina foi mantida por mais 6 minutos. As reações de GH àadministração por 3 minutos de 1 nM de hGH-RH(1-29)NH2 foram determi-nadas durante a perfusão dos análogos de somatostatina (O minuto) e 30,60 e 90 minutos após ser sustada a administração. Os dados estão na Ta-bela 22-1.Tabela 22-1
<table>table see original document page 38</column></row><table>
(**) Expresso como um percentual da liberação de GH induzida por 3 mi-nutos de infusão de 1 nM hGH-RH(1-29)NH2 antes da administração dosanálogos da somatostatina.
Exemplo 23
Estudos de ligação a receptor com antagonistas citotóxicos dabombesina.
A radioiodização de [Tyr4]BN (Sigma) usando-se um kit Bio-RadEnzymobead Radio Iodination e isolamento do [125I-Tyr4JBN monoiodado foiefetuada tal como acima descrito (1). A ligação do [Tyr4]BN marcado e seudeslocamento pelo análogo citotóxico de antagonista de bombesina, Q614gB,foi conduzida usando-se células Swiss 3T3 confluentes (obtidas através daAmerican Type Culture Collection) em placas de 24 cavidades em uma mo-dificação (2) do método de Kris e outros (3). Três a cinco dias após a seme-adura as células confluentes foram lavadas duas vezes com Hanks' Balan-ced Salt Solution (HBSS) e incubadas por 30 minutos a 37°C com 50 pM de[125I-Tyr4JBN na ausência ou presença de várias concentrações de competi-dores não marcados (Q614gB ou BN) em um volume total de 0,5 ml de tam-pão de ligação (DMEM com 50 mM HEPES, 0,1% albumina de soro bovino(BSA), 5 mM de MgCI2 e 100 μg/ml de bacitracin, pH 7,4). A ligação não-específica foi determinada na presença de 1 μΜ de Iigante não marcado.Após três lavagens com HBSS gelada contendo 0,1% de BSA (pH 7,4) ascélulas foram separadas com solução de 0,05% de tripsina/0,53 mM EDTAe transferidas para tubos. A radioatividade foi medida com um contador ga-ma (Micromedic Systems Inc., Huntsville, AL, EUA). Os dados de ligaçãoforam avaliados usando-se programas de análise de ligação de Iigantes porMcPherson (4). Os valores Ki apresentados na Tabela 23-1 foram calcula-dos de acordo com a fórmula de Cheng e Prusoff (5).
1. Halmos e outros, Câncer Letters, 85:111 -118, 1994
2. Cai e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:12664-12668, 1994
3. Kris e outros, J. Biol. Chem. 262:11215-11220, 1987
4. McPherson, G. A., J. Pharmaco. Methods, 14:213-228, 1985
5. Cheng e Prusoff, Biochem. Pharmacol., 22:3099-3108, 1973.
Tabela 23-1
Caracterização da ligação específica do antagonista citotóxico de bombesi-na Q614gB (2-pirrolino-DOX14-0-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^-(CH2-N)Leu-NH2 a receptores bombesina na linhagem de células Swiss 3T3 emcomparação com a bombesina.
<table>table see original document page 39</column></row><table>
Eficácia comparativa e toxicidade de conjugados de hormôniovs. radical citotóxico isolado.
Exemplo 24
Tratamento com 2-pirrolino DOX-(Q6), análogo citotóxico de a-gonista LH-RH Q614gL ([D-Lys6JLH-RH ligado a Q614-0-hemiglutarato) e(DOX) sobre cânceres mamários de ratos MXT estrógeno independentes(KS-49).
Para comparar a atividade inibidora de tumores do derivadocitotóxico da doxorubicina, Q6, e seu conjugado citotóxico de peptídeocolimado, Q614gL, bem como com o agente antineoplásico bem conhecido,DOX, e para determinar a melhor forma de administração e as dosagens tó-xicas, peças de tumor LH-RH receptor positivo MXT (3.2) ovex (1 mm1) fo-ram implantadas s.c. em ratos fêmea B6D2FI. Um dia após o transplante osratos foram aleatoriamente divididos em grupos de cinco animais e foi inici-ado o tratamento. Os compostos foram dissolvidos em ácido triflúor acéticoa 0,1% (pH 2) e administrados por via intraperitoneal. Os grupos, esquemasde tratamento e dosagens, bem como os tempos médios de sobrevivênciaestão na Tabela 24-1. Os resultados estão resumidos na Tabela 24-2 e naFigura 1.
A Tabela 24-2 mostra o efeito do tratamento com Q6 e o análogocitotóxico Q614gL sobre o volume dos tumores e a sobrevivência de ratoscom cânceres do seio estrogeno independentes. Tal como é mostrado naTabela 24-2, 1,25 nmol de Q6 administrados nos dias 1, 2, 7, 8, 14 e 15(grupo 2) exerceram forte toxicidade caracterizada por uma sobrevida médiade 17,4 dias, que é significativamente mais curta que aquela do grupo decontrole não tratado. Em comparação, a mesma dosagem de Q614gL (grupo6) resultou em uma sobrevida média de 30,8 dias, que é significativamentemais longa que aquela do grupo de controle sem tratamento. A maior eficá-cia do Q614gL em relação ao Q6 pode também ser demonstrada pela compa-ração dos volumes finais médios dos tumores no grupo 2 (1065 mm3 no dia16) e no grupo 6 (863 mm3 no dia 31).
Conclusões similares podem ser demonstradas pela compara-ção de Q6 e Q614gL em um esquema de tratamento diferente em que 0,5nmol dos medicamentos foi administrado por cinco dias por semana por trêssemanas consecutivas.
A doxorubicina em uma dosagem tóxica (quantidade total: 1560nmol, sobrevida média: 20 dias) não podia erradicar o tumor, enquanto queo tratamento com Q614gL na dosagem não tóxica (quantidade total: 7 nmol,sobrevida média: > 31 dias) levou à sobrevivência de 2 dentre 5 animais,sem desenvolvimento do tumor.<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>(**) A sobrevida é significativamente mais longa (p<0,01). A sobrevida é si-gnificativamente mais curta (p<0,01) ou (p<0,05) em comparação com da-dos de controle usando-se o teste de Duncan.
Exemplo 25
Efeitos de um único tratamento com (DOX)1 análogos citotóxicosde LR-RH T-107 e Qi14gL sobre cânceres mamários em ratos MXT estróge-no independentes (KS-55).
Compostos em teste:
Qi14gL: O-hemiglutarato de doxorubicina14 ligado a [D-Lys6]LH-
T-107: N-glutaril doxorubicina ligada a [D-Lys6]LH-RH Proc.
Natl. Acad. Vol. 1992, 89 Pp. 972-976 (1992)); eDOX.
Os ensaios foram efetuados da seguinte forma:
Para determinar as doses máximas toleradas e comparar osefeitos, peças de tumor MXT (3.2) ovex (1 mm3) foram implantadas s.c. emratos fêmea B6D2FI. Um dia após o transplante os ratos foram aleatoria-mente divididos em grupos de cinco animais e foram tratados com uma úni-ca injeção ip. Os grupos e doses estão na Tabela 25-1. A Tabela mostratambém o número de ratos que possuíam tumores quando o volume foi me-dido e os tempos médios de sobrevida para os grupos. As mudanças devolume dos tumores são apresentadas na Figura 2. Os compostos foramdissolvidos em ácido triflúor acético a 0,1% (pH 2). O volume dos tumoresfoi medido nos dias 10, 13, 17 e 20.
Como mostrado na Tabela 25-1 e na Figura 2, o T-107 ([D-Lys6]LH-RH) ligado a N-glutaril DOX) é completamente ineficaz para inibir ocrescimento deste tumor em uma dosagem de 850 nmol/20 g de rato. Emcontraste, Q11V (O-glutaril DOX14 ligado a [D-Lys6JLH-RH) exerceu fortesupressão do crescimento do tumor (Figura) em uma dosagem não tóxica de650 nmol/20 g de rato. A DOX isoladamente era altamente tóxica (tempomédio de sobrevida: 13,6 dias) em uma única dose de 650 nmol/20 g de ratoe significativamente menos eficaz que o Qi14gL (Figura 2).Tabela 25
<table>table see original document page 46</column></row><table>
(*) A sobrevida é significativamente mais curta (p<0,01) que a dos controles.
(**)A sobrevida é significativamente mais longa (p<0,01) ou (*) (p<0,05) emcomparação ao controle (um rato que morreu por acidente no dia 2 foi des-considerado nesses dois grupos).
Exemplo 26
Efeito de análogos citotóxicos de LH-RH sobre cânceres mamá-rios em ratos MXT estrógeno independentes (KS-47).
Substâncias usadas para o tratamento.
Em uma experiência anterior, o Q2 a 20 nmol de dosagem diáriadurante 17 dias apresentou um efeito inibidor apenas moderado sobre ocrescimento do tumor e era tóxico a uma dosagem de 40 nmol (a sobrevidamédia era de 14,6 dias). Uma dosagem diária de 30 nmol foi escolhida paraa presente experiência, que comparou a eficácia e toxicidade de Q214gL (Q2acoplado a [D-Lys6]LH-RH), Q2 (pirrolidino doxorubicina), [D-Lys6JLH-RH e[D-Lys6]LH-RH + Q2.
Peças de tumor MXT (3.2) ovex (1 mm3) foram transplantadaspara ratos fêmea B6D2Fl O tratamento foi iniciado um dia após o trans-plante e foi mantido por 12 dias por meio de injeções ip uma vez ao dia. To-dos os grupos receberam quantidades equimolares dos compostos tal comomostrado na Tabela 26-1. Os tumores foram medidos nos dias 10, 14 e 18 efoi calculado o volume do tumor. Os dados estão na Tabela 26-1 e na Figura 3.
0 tratamento com uma dosagem diária de 30 nmol do análogoQ2 de doxorubicina modificada por daunosamina (pirrolidino DOX) resultouem um forte efeito inibidor sobre o crescimento do tumor (volume do tumor:144 mm3 no dia 14 contra 1391 mm3 para o grupo de controle), porém exer-ceu severa toxicidade matando todos os animais antes do final da experiên-cia (sobrevida média de 17,9 dias). De forma similar, Q2 combinado (emmistura) com [D-Lys6]LH-RH resultou em forte efeito inibidor do tumor(volume do tumor: 80 mm3 no dia 14) porém a sobrevida média (18,5 dias)foi significativamente mais curta que a do grupo de controle sem tratamento(23,1 dias). Como resultado do tratamento com Q214gL (Q2 covalentementeligado a [D-Lys6]LH-RH) dois animais morreram, um no dia 16 e outro no dia26. Dos 8 animais sobreviventes somente um desenvolveu tumores na últi-ma medição no dia 18 e todos aparentavam saúde, porém mais tarde todoseles começaram a desenvolver tumores. A sobrevida média para este grupofoi significativamente mais longa (28,3 dias) que aquela do grupo de con-trole. O tratamento com [D-Lys6]LH-RH) somente não afetou o crescimentodos tumores.
Esta experiência demonstra que a eficácia mais elevada e amenor toxicidade periférica do Q214gL em relação ao radical citotóxico Q2podem ser atribuídas à conjugação covalente do radical citotóxico ao análo-go veícuio de coiimação LH-RH.Tabela 26-1
Efeito de análogos citotóxicos de LH-RH sobre o crescimento de cânceresmamários em ratos MXT estrogeno independentes e sobrevida dos ratoscom tumores.<table>table see original document page 49</column></row><table>Todas as doses são em quantidades de 30 nmol equimolares.Significativamente mais curta que o controle (p<0,05)(*) Significativamente mais longa que o controle (p<0,01) com oteste de Duncan.
Exemplo 27
Efeitos de 2-pirrolino DOX (Q6) e análogo de agonista citotóxicode LH-RH Q614gL ([D-Lys6JLH-RH ligado a Q614-0-hemiglutarato) sobre ocrescimento de carcinomas da próstata de ratos Dunning R-3327-H andró-geno dependentes.
Ratos Copenhagen machos portando carcinomas da próstataDunning R-3327-H hormônio dependentes foram tratados com Q614gL, umnovo análogo citotóxico de hormônio Iiberador de hormônio Iuteinizante (LH-RH) consistindo do agonista [D-Lys6]LH-RH ligado a 2-pirrolino doxorubicinafoi administrado a uma concentração de 50 nmol/kg, na forma de uma doseúnica (Q6) e na forma de uma mistura não conjugada com [D-Lys6]LH-RH ouconjugado ao veículo [D-Lys6]LH-RH(Q614gL). Após a segunda administra-ção de 50 nmol/kg do radical Q6 isoladamente ou em mistura com [D-Lys6]LH-RH, todos os ratos morreram com sinais de toxicidade geral, en-quanto que todos os animais tratados com o conjugado de LH-RH citotóxicoQ614gL sobreviveram. Após 5 semanas de tratamento com uma dosagemtotal de 150 nmol/kg de Q614gL os tumores regrediram de um volume originalde 8,35±1,7 cm3 no início da experiência para 4,47±0,8 cm3, enquanto ostumores no grupo de controle continuaram a crescer e mediram 17,84±2,2cm3. A terapia com Q614gL também reduziu de forma significativa o peso dotumor e a carga do tumor. Na segunda experiência, planejada para compa-rar a eficácia e toxicidade de Q6 e Q614gL, o regime terapêutico consistia de3 aplicações de 25 nmol/kg de Q6 ou 25 nmol/kg de Q614gL. Quando o trata-mento foi iniciado o volume do tumor em todos os grupos ficava entre 3,9 e4,5 cm3. Após 5 semanas de terapia os tumores nos ratos tratados com 50nmol/kg de Q614gL regrediram para 2,3±0,51 cm3, enquanto que 25 nmol/kgde Q6 eram ainda tóxicos e só podiam propiciar uma redução no volume fi-nal do tumor para 6,76±1,4 cm3, similar àquela obtida com 25 nmol/kg deQ614gL (6,7,4±1 cm3), em comparação aos 15,6+2,2 cm3 para os animais nãotratados. A avaliação histológica dos espécimes mostrou um decréscimosignificativo de células mióticas somente nos grupos tratados com Q614gL.Receptores LH-RH com alta capacidade de ligação foram detectados nasmembranas de espécimes de tumor Dunning não tratados, porém após tra-tamento com Q614gL não puderem ser encontrados quaisquer pontos de li-gação para LH-RH. A inibição do crescimento de tumores por AN-201 eQ614gL foi também associada a um decréscimo significativo na capacidadede ligação de receptores EG F. Como demonstrado pelas Figuras 4 a 6, oanálogo citotóxico colimado de LH-RH Q614gL é um agente antitumor eficazque causa regressão de carcinomas da próstata Dunning R-3327-H em ra-tos. Os estudos da Requerente mostram também que o análogo citotóxicode LH-RH Q614gL é muito menos tóxico que o radical antineoplásico (Q6)incorporado e significativamente mais ativo na inibição do crescimento detumores.
Legendas da Figura para o Exemplo 27:
Figura 4, Experiência I: volume de tumores em ratos Copenha-gen machos portando transplantes de carcinoma da próstata Dunning R-3327-H de ratos durante o tratamento consistindo de 3 aplicações de 50nmol/kg de agonista [D-Lys6]LH-RH e 50 nmol/kg de análogo citotóxico deLH-RH Q614gL. As linhas verticais indicam o SEM(*) p<0,05; (**) p<0,01 con-tra o controle pelo novo teste de Duncan de faixa múltipla. O tratamento in-dicado pelas setas foi aplicado nos dias 1, 8 e 29.
(+) Os animais tratados com Q6 isoladamente ou em mistura nãoconjugada com [D-Lys6JLH-RH morreram na segunda semana. Nesses doisgrupos é mostrado o volume de tumores registrado no dia 8.
Figura 5, Experiência II: efeito do tratamento com 25 nmol/kg de2-pirrolino doxorubicina (Q6), 25 nmol/kg e 50 nmol/kg de análogo citotóxicoLH-RH Q614gL sobre o volume de tumores de ratos com câncer da próstataDunning R-3327-H. As linhas verticais indicam o SEM(*) p<0,05; (**) p<0,01contra o controle. O tratamento indicado pelas setas foi aplicado 3 vezes,isto é, nos dias 1, 8 e 29.Figura 6, Experiência II: efeito do tratamento com 25 nmol/kg de2-pirrolino doxorubicina (Q6)1 25 nmol/kg e 50 nmol/kg de análogo citotóxicoLH-RH Q614gL sobre o peso corporal de ratos Copenhagen com câncer dapróstata Dunning R-3327-H. As linhas verticais indicam o SEM(*) p<0,05;
(**) p<0,01 contra o controle. O tratamento indicado pelas setas foi aplicado3 vezes, isto é, nos dias 1, 8 e 29.
Exemplo 28
Estudo comparativo sobre os efeitos da doxorubicina (DOX) eanálogo de agonista citotóxico colimado LH-RH Qi14gL ([D-Lys6JLH-RH Iiga-do a O-hemiglutarato de DOX14) sobre o crescimento de carcinoma ovarianohumano OV-1063 em ratos pelados.
A linhagem de células de câncer ovariano epitelial humano OV-1063 se originou de um cistadenocarcinoma papilar metastático do ováriode uma mulher de 57 anos (Horowitz e outros, 1985, Oncology1 42:332-337).Dez milhões de células de OV-1063 foram injetadas por via subcutânea emtrês ratos pelados para o crescimento de tumores. Peças de 1 mm3 dessestumores foram transplantadas para sessenta animais para estudos de inibi-ção do crescimento in vivo. O objetivo da experiência era demonstrar que,como resultado da presença de receptores para LH-RH em OV-1063, oconjugado citotóxico de LH-RH era mais eficaz e menos tóxico que a DOX, oradical citotóxico que ele continha. Dessa forma os efeitos do conjugado ci-totóxico LH-RH foram comparados àqueles da DOX, da mistura de DOXcom a molécula carreadora, o veículo isoladamente e os grupos de controlenão tratados. Todas as injeções foram administradas por via intraperitoneal.
Os compostos foram dissolvidos em cloreto de sódio a 0,9% em água(solução salina fisiológica).
Os ratos com um tamanho médio de tumor de cerca de 15 mm3foram divididos em seis grupos de nove animais e receberam o seguintetratamento sete dias após o transplante do tumor: grupo 1: solução salina;grupo 2: Qi14gL em uma dosagem de 700 nmol/20 g de animal; grupo 3:Qi14gL em uma dosagem de 413 nmoi/20 g de animai (dose tolerada máxi-ma, MTD, para DOX); grupo 4: DOX a 413 nmol/20 g de animal (MTD); gru-po 5: mistura de 700 nmol/20 g de animal de DOX e 700 nmol/20 g de [D-Lys6JLH-RH; grupo 6: veículo de análogo de agonista [D-Lys6]LH-RH emuma dosagem de 700 nmol/20 g de animal.
A análise de receptor de OV-1063 mostrou a presença de locaisde ligação de alta afinidade para LH-RH.
Resultados: como é mostrado na Figura 7, foi conseguida forteinibição do crescimento de tumores pelo tratamento com Qi14gL em uma do-sagem de 413 nmol/20 g de animal (grupo 3). Os animais não apresentaramsinais de toxicidade severa. Em comparação, o tratamento com DOX admi-nistrado na mesma dosagem de 413 nmol/20 g (12 mg/kg, MTD1 grupo 4)não resultou ém inibição significativa do crescimento de tumores nos trêsanimais que sobreviveram ao final da experiência. Três animais morreramno dia cinco e seis animais estavam mortos no dia nove devido à toxicidade.
Em uma dosagem mais elevada (700 nmol/20 g, grupo 2), o Qi14gL apre-sentou inibição muito forte do crescimento dos tumores (Figura 7). Doisdentre nove animais morreram devido à toxicidade e um animal morreu aci-dentalmente. Os seis animais sobreviventes estavam se recuperando deuma perda de peso de cerca de 20% ao final da experiência. No grupo 6 amesma dosagem elevada (700 nmol/20 g) de DOX foi misturada com 700nmol de [D-Lys6JLH-RH. No dia 5 todos os animais desse grupo haviam mor-rido como resultado de severa toxicidade.
Conclusões: Os resultados da Requerente demonstram clara-mente que devido à presença de receptores para LH-RH nas células docâncer ovariano epitelial OV-1063, o conjugado LH-RH citotóxico colimadoQi14gL apresenta menor toxicidade e maior atividade antitumor que a doxo-rubicina (Qi), o radical que ele contém.

Claims (8)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:Q14-O-R-P (I)na qual Q possui a estrutura química detalhada:na qual -R- é -C(O)-(CH2)n-C(O)- e η é de O a 7,R' é selecionado a partir do grupo consistindo em NH2, urrí hete-rociclo aromático ou hidrogenado de 5 ou 6 membros, possuindo pelo me-nos um nitrogênio no anel, tal heterociclo possuindo um grupamento butadi-eno ligado a átomos de carbono adjacentes do referido anel para a forma-ção de um sistema bicíclico eP é um peptídeo Pi selecionado a partir do grupo consistindoem um análogo LH-RH da fórmula:Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Dddem que (Xxx) é hidrogênio, A2Bu ou A2Pr,em que:quando Aaa é Glp, então Bbb é His, Ccc é Trp e Ddd é GIy-NH2,quando Aaa é Ac-D-Nal(2), então Bbb é D-Phe(4CI), Ccc é D-Pal(3), D-Trp e Ddd é D-AIa-NH2 equando Aaa-Bbb-Ccc é Ac, então Ddd é -NH-CH2-CH3,em que o grupo Q14-O-R- forma uma ligação carboxamido com ogrupo amino livre do grupamento D-Lys ou com pelo menos um dos gruposamino livres de A2Bu ou A2Pr quando presentes em (Xxx).
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R' é selecionado a partir do grupo consistindo em NH2, pir-rolidin-1-ila, isoindolin-2-ila, 3-pirrolin-1-ila, 3-pirrolidon-1-ila, 2-pirrolin-1-ila,-3-piperidon-1-ila, 1,3rtetraidro-piridin-1-ila.
3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que η = 3.
4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que R' é NH2.
5. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que R1 é 2-pirrolin-1-ila.
6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que apresenta a fórmula:Glp-His-T rp-Ser-Tyr-D-Lys(Qi14-0-glt)-Arg-Leu-Pro-Gly-NH2na qual Qi14 é a doxorubicin-14-ila.
7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que apresenta a fórmula:Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q614-0-glt)-Arg-Leu-Pro-Gly-NH2na qual Q614 é a 3'-desamino-3'-(2"-pirrolin-1"-il)-doxorubicin-14-ila.
8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende de-0,8 mg a 200 mg de um composto, como definido na reivindicação 1, e umveículo farmaceuticamente aceitável para o mesmo.
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