KR20040037176A - α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민의 1차 아미노기의질소를, 단일 불포화 질소를 함유하는 5 또는 6원의헤테로사이클 화합물의 질소로 전환시키기 위한 방법 - Google Patents

α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민의 1차 아미노기의질소를, 단일 불포화 질소를 함유하는 5 또는 6원의헤테로사이클 화합물의 질소로 전환시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암 안트라사이클린(anthracycline) 유도체를 표적화하는 화학 분야에 속한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 LH-RH, 봄베신(bombesin) 및 소마토스타틴(somatostatin) 같은 펩티드 호르몬의 유사체와 공유적으로 결합된 독소루비신(DOX) 또는 이의 다우노스아민 변형된 유도체(DM-DOX)에 관한 것이다. 이 공유 결합 접합체는 상기 펩티드 호르몬 유사체에 대한 수용체를 갖는 각종의 종양을 표적으로 한다.
본 발명의 화합물은 하기의 화학식 1로 표현되고, Q는 하기 화학식 2로 표현된다(이 때, Q14는 14번 위치에 측쇄를 갖는 Q 잔기를 나타낸다).
화학식 1
Q14-O-R-P
화학식 2
상기 식에 있어서,
R-은 단일 결합 또는 -C(O)-(CH2)n-C(O)-(n은 0 내지 7)이고;
R'는 NH2이거나, 방향족, 포화 또는 부분 포화된 5 내지 6원의 헤테로사이클릭 화합물로서, 하나 이상의 고리(ring) 질소를 갖고, 임의로 상기 고리의 인접한 탄소 원자에 결합된 부타디엔 잔기를 가짐으로써 바이사이클릭 시스템을 형성하는 헤테로사이클릭 화합물이고;
P는 수소 또는 펩티드 잔기이고, 적합하게는 LH-RH, 소마토스타틴 또는 봄베신 유사체이다. 반면에, R'가 NH2인 경우에 R-P는 수소가 아니며, R-P가 수소인 경우에 R'는 NH2가 아니다.
본 연구 과정에서 새로운 합성 반응이 발견되어, 인접 및 분리된, 즉 α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민으로부터 부분 포화된 헤테로 사이클 잔기를 형성하였다.
Q1은 DOX이고; Q2는 3'-데아미노-3'-(피롤리딘-1"-일)-독소루비신(AN 181)이고; Q3는 3'-데아미노-3'-(이소인돌린-1"-일)-독소루비신(AN 184)이고; Q4는 3'-데아미노-3'-(3"-피롤린-1"-일)-독소루비신(AN 185)이고; Q5는 3'-데아미노-3'-(3"-피롤리돈-1"-일)-독소루비신(AN 191)이고; Q6는 3'-데아미노-3'-(2"-피롤린-1"-일)-독소루비신(AN 201)이고; Q7는 3'-데아미노-3'-(3"-피페리돈-1"-일)-독소루비신(AN195)이고; Q8은 3'-데아미노-3'-(1",3"-테트라하이드로피리딘-1"-일)-독소루비신(AN 205)이다. Q1 14gL은 AN 152이고; Q6 14gL은 AN 207이고; Q1 14gS는 AN 162이고; Q6 14gS는 AN 238이고; Q1 14gB는 AN 160이고; Q6 14gB는 AN 215이다.

Description

α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민의 1차 아미노기의 질소를, 단일 불포화 질소를 함유하는 5 또는 6원의 헤테로사이클 화합물의 질소로 전환시키기 위한 방법{A process for the conversion of the nitrogen of a primary amino group of an α,β- or α,γ-hydroxy primary amine into the nitrogen of a monounsaturated nitrogen containing heterocyclic compound having between 5 and 6 atoms in the ring}
본 발명은 항암 안트라사이클린(anthracycline) 유도체를 표적화하는 화학 분야에 속한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 LH-RH, 봄베신(bombesin) 및 소마토스타틴(somatostatin)과 같은 펩티드 호르몬의 유사체와 공유적으로 결합된, 독소루비신(DOX) 또는 이의 다우노스아민 변형된 유도체(DM-DOX)에 관한 것이다. 이 접합체(conjugate)는 상기의 펩티드 호르몬 유사체에 대한 수용체를 갖는 각종의 종양을 표적으로 한다.
6번째 위치에 세포독성 잔기를 갖는 LH-RH 유사체는 문헌[참조: Schally, Janaky and Bajusz, EP 0 450 461 B1, grant publication(1995.09.06)]에 개시되어있다.
생식선 자극 물질을 파괴하는 데 사용되는 GnRH(LH-RH) 유사체는 문헌[참조: Nett and Glode, WO 90/09799(발행일: 1990.09.07)]에 설명되어 있다. 본 출원 발명에서는, 생식선 자극 물질을 파괴하여, 성 호르몬에 의존하는 암을 치료하는 데에 사용되는, LH-RH의 유사체와 결합되어 있는 리신(ricin)같은 독성 물질에 대해 설명하고 있다. LH-RH 독소루비신 유도체는, 결합에 관한, 화학적인 상세한 설명없이 언급되어 있다.
세포독성 소마토스타틴 유사체는 1990년 4월 6일자로 출원되고, 1993년 7월 15일자로 재출원된, 미국 특허 출원(출원 번호 08/076,846)에서 Schally et al.에 의해 설명되어 있다.
문헌[참조: Anti-Cancer Drugs 5, 115-130(1994)]에 실린 A.V.Schally의 평론에서는, LH-RH, 봄베신 또는 소마토스타틴 유사체에 대한 수용체가 광범위한 종양의 세포막상에 존재한다는 사실을 상세히 설명하고 있다.
문헌[참조: Farmac. Ther. 60, 245-264(1993)]에 실린 G. Weckbecker의 평론에서는, 몇몇 정상 또는 종양 조직상에 소마토스타틴 유사체에 대한 수용체 및 수용체 아형(subtype)이 존재한다는 것을 보여주는 참조 문헌들을 몇 가지 제시해 주고 있다.
문헌[참조: Gut Peptides: Biochemistry and Physiology 423-445(1994) Ed.: J. Walsh and G. J. Dockray, Raven Press, New York]에서의 N. Bunnett의 평론 및 문헌[참조: Recent Progress in Hormone Research 48, (1993)(Academic Press)]에서의 E. Spindell의 평론에서는, 봄베신과 유사한 펩티드와 각종의 정상 및 종양 조직상에 봄베신/GRP 수용체가 존재한다는 사실이 논의되어 있다.
독소루비신(DOX)은 현재 가장 널리 사용되며, 또한 매우 강력한 항암제다. 반면에, 어떤 종양들은 이 DOX에 전혀 반응하지 않으며, 오랜 치료에 따른 호중구 감소증(neutropenia) 뿐만 아니라 다중-약제 내성(MDR) 및 심장 독성 때문에 그 사용이 제한된다. 이러한 단점들을 극복하고, 안트라사이클린 항생제의 구조에 내재하는 강력한 종양 제거 잠재력을 또한 이용하기 위해, 수천가지의 합성 유도체 및 다양한 담체 거대 분자에 결합된 이의 표적화된 유사체가 설명되어 왔다.
DOX 및 이의 유사체의 내력 관하여는, 대부분이 문헌[참조: "Adriamycin", David W. Henry, ACS Symposium Series, No. 30, Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, pp. 15-57(1976) 및 Doxorubicin, Federico Arcamone, Academic Press(1981)]에 설명되어 있다.
문헌[참조: Mosher, et al., U.S. Pat. 4,464,529(1984년 8월 7일)]에서는, 활성이 크고 알킬화제이며 교차 내성이 없는(non-cross resistant), 항종양 활성을 갖는 3'-데아미노-3'-(3"-시아노-4"-모르폴리닐)-DOX 및 이의 유도체에 관해 설명하고 있다. 이러한 "강력한 효능을 갖는 모르폴리닐(morpholinyl) 안트라사이클린"의 합성 및 생물학적 평가에 대해서는 문헌[참조: J. Med. Chem. 1984, 27, 638-645]에서 설명하고 있다.
문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 88, pp. 4845-4849(1991년 7월). Gao et al.]에서는, 다우노루비신(daunorubicin) 유도체에 의해 포름알데히드를 매개로 하여 DNA 서열을 알킬화하는 것에 관해 설명하고 있다.
문헌[참조: J. Med. Chem. 35, 3208-3214(1992)]에서는, 잠재되어 있는(latent) 알킬화 치환체를 갖는 안트라사이클린 유사체에 대해 설명하고 있다.
출원인(Pharmacia Carlo Erba)이 1989년 12월 12일자로 출원한 유럽 특허 EP 434,960에서는, DOX의 다우노스아민(daunosamine) 질소의 알킬화 및 이로 인한 새로운 모르폴리닐 DOX 유도체의 형성을 위해 사용되는, α,ω-디요오도(diiodo) 화합물의 용도에 관해 설명하고 있다.
1981년 11월 10일자 미국 특허 4,299,822(Israel,et al.)에서는, N-트리플루오로아세틸아드리아마이신14-O-헤미글루타레이트 및 -헤미아디페이트가 수용성이 개선된 N-트리플루오로아세틸아드리아마이신14-O-발레레이트(AD-32)의 유사체로 개시되어 있다.
Horton 및 Priebe(J. Antibiotics, XXXVI, 1211-1215.)는, 14-OH 모 유사체(parent analog)와 비교하여, 항암 활성에 있어서 큰 차이가 없는, 상이한 안트라사이클린 유사체의 몇몇 14-O-에스테르에 관해 설명하고 있다.
표적화된 화학 치료제를 설계하는 기술에 있어서, 하기의 목표들이 추구된다:
1. 표적에 도달될 때 까지, 담체 분자와 화학 치료제간의 안정된 결합.
2. 접합체내에서, 담체 분자의 생물학적 특성(예를 들면, 결합 특성)의 유지.
3. 접합체내에서, 화학 치료제의 약리학적 활성(예를 들면, 세포독성 활성)의 유지.
4. 접합의 결과, 접합되지 않은 것과 비교해 볼 때, 더 강력한 활성 및/또는 더 낮은 말초 독성을 갖는 유사체의 제조.
1981년 4월 21일자 미국 특허 4,263,279(Sela, et al.)에서는, DOX의 다우노스아민 잔기의 NaIO4산화에 이은, 담체 분자의 1차 아민을 수반하는 환원성 알킬화를 통한, DOX의 접합에 대해 설명하고 있다.
문헌[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981 102, 1048-1054]에 설명되어 있는 바와 같이, 시스-아코니트산(cis-aconitic acid) 스페이서(spacer)를 사용하여, 다우노스아민 질소를, pH-민감성 결합을 갖는 거대 분자 담체에 결합시킨다.
문헌[참조: Zunino et. al(1981) Tumori 67, 521-524 및 (1984) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 20, 421-425]에서, 14-브로모다우노루비신(bromodaunorubicin)과 단백질 또는 폴리-L-아미노산간의 에스테르 결합 및 C-N 결합의 형성에 대해 설명하고 있다.
문헌[참조: Bioconjugate Chemistry 1990 1(5), 325-330]에 설명되어 있는 바와 같이, 세포독성제의 C-13 옥소 기능을 포함한 가수분해성 (라이소조모트롭, pH-민감성) 하이드라존(hydrazone) 결합을 통해서, 모르폴리노-DOX (DOX의 고도로 활성적 다우노스아민 변형된 유사체)가 항체에 접합된다.
문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982 79, 626-629]에 설명되어 있는바와 같이, 류신 잔기의 카르복스아미드(Carboxamide) 결합이 효소에 의한 분해에 민감하다는 사실이, "스페이서 가지(spacer arm)" 펩티드, 바람직하게는 Ala-Leu-Ala-Leu (여기서, 카르복시 말단 Leu은 DOX의 다우노스아민 질소를 아실화하고, 아미노 말단 Ala은 디카르복시산 스페이서를 통해 담체에 결합된다)를 함유하는 DOX의 접합체에 성공적으로 이용되었다.
문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 89, 972-976]에 설명되어 있는 바와 같이, DOX의 다우노스아민 질소가 글루타르산 스페이서에 의해 아실화되고, 세포독성 활성이 크게 감소한 LH-RH 유사체에 결합되었다.
각종의 인간의 종양을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 용도와 관련된 다른 참조 문헌들을 하기에 소개한다:
1. Schally et. al. (1996) in Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives, eds. Filicori, M. ＆ Flamigni, C. (Parthenon, Carnforth, U. K.), pp. 33-44.
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3. Yano et. al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7090-7094.
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9. Schally et. al. (1994) International Journal of Pancreatology 16, 277-280.
10. Srkalovic et. al. (1990) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 70(3), 661-669. 4 Pinski et.al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.
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34. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 5985-5901.
여기서 인용된 모든 문헌들은 상기의 참조 문헌에 있다.
본 발명의 화합물은 펩티드 호르몬(예를 들면, LH-RH, 봄베신 및 소마토스타틴의 유사체)에 결합된 안트라사이클린 세포독성제(예를 들면, DOX 또는 DM-DOX)를 포함하는 신규한, 표적화된 세포독성 펩티드 호르몬이다. 이러한 세포독성 펩티드 호르몬 접합체는, 이에 대한 특이적 수용체를 갖는 암(예를 들면, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 췌장암, 결장암, 위암 및 폐암)의 치료를 위해 설계된 것이다. 본원에서 사용되는, 접합되지 않은 안트라사이클린 세포독성제 중에는, 그 자체로서 신규하고 매우 강력하지만, 그 독성이 너무 강해서 접합되지 않은 형태로 사용되지 못하는 것들이 있다.
본 발명에 의해 제공되는 다우노스아민 변형된 DOX 유사체는, 펩티드 담체와의 공유 접합체 형성에 적합한 신규하고, 활성이 크며, 교차 내성이 없는 DOX 유사체를 찾는 과정에서 개발되었다.
디카르복실산 스페이서(예를 들면, 글루타르산)를 사용하면, 각 성분들의 생물학적 활성이 그대로 유지된 채, 안정한 공유결합된 접합체를 형성할 수 있다. 이 스페이서의 한 카르복시기는 DOX 또는 DM-DOX의 14-OH기와 에스테르 결합을 형성하고, 나머지 다른 한 카르복시기는 펩티드 담체의 잘 선택된 자유 아미노기와 카르복스아미드 결합을 형성한다.
도 1은 각기 다른 투여량의 본 발명 화합물 및 DOX에 대한, 에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스 유방암의 용적 변화를 나타내는 도면이다.
도 2는 각기 다른 투여량의 본 발명의 특정 화합물, 선행기술의 화합물, DOX 및 대조군에 대한, 에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스 유방암의 용적 변화를 나타내는 도면이다.
도 3은 에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스 유방암을 갖는 마우스의 생존에 대한, 특정 세포독성 LHRH 유사체의 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 선행 기술의 효능제(agonist) 및 본 발명의 특정 화합물로 치료하는 동안, 랫트 Dunning R-3327-H-전립선 암종을 이식한 수컷 코펜하겐 랫트의 종양 용적에 대한 도면이다.
도 5는 Dunning R-3327-H-전립선암을 갖는 랫트의 종양 용적에 대한, 본 발명의 특정 화합물 및 대응하는 세포독성 LH-RH 유사체를 사용한 치료 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 Dunning R-3327-H-전립선암을 갖는 코펜하겐 랫트의 체중에 대한, 본 발명의 특정 화합물 및 대응하는 세포독성 LH-RH 유사체를 사용한 치료 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 특정 화합물 및 DOX를 사용한 치료에 따른, 종양 성장 억제를 나타내는 도면이다.
본 발명의 화합물은 하기의 화학식 1로 표현된다(여기서, Q는 하기 화학식 2로 표현되고, 이 때, Q14는 14번 위치에 측쇄를 갖는 Q 잔기를 나타낸다).
Q14-O-R-P
상기 식에 있어서,
R-은 단일 결합 또는 -C(O)-(CH2)n-C(O)-(여기서, n은 0 내지 7이다)이고;
R'는 NH2이거나, 방향족, 포화 또는 부분 포화된 5 내지 6원의 헤테로사이클릭 화합물로서, 하나 이상의 고리(ring) 질소를 갖고, 임의로 상기 고리의 인접한 탄소 원자에 결합된 부타디엔 부위를 가짐으로써 바이사이클릭 시스템을 형성하는 헤테로사이클릭 화합물이고;
P는 수소 또는 펩티드 잔기, 적합하게는 LH-RH, 소마토스타틴 또는 봄베신 유사체이나, 기타 생리학적 활성 펩티드도 배제되지 않는다. 신생물성 세포 수용체에 대해 친화성을 갖는 LH-RH 유사체, 특히 6번 위치에 D-Lys 잔기를 갖는 LH-RH 유사체 및 단축된 소마토스타틴 및 봄베신 유사체가 더욱 바람직하다. 반면에, R'가 NH2인 경우에 R-P는 수소가 아니며, R-P가 수소인 경우에 R'는 NH2가 아니다.
본 발명을 위한 연구과정에서, 새로운 합성 반응을 발견하였다. 14번 위치에서 디카르복실 잔기를 통해, 독소루비신과 이의 유도체가 결합하여, 약리학적으로 효과적인 신규의 접합체를 수득할 수 있다는 사실이 밝혀졌을 뿐만 아니라, 인접 및 분리된, 즉 α,β-또는 α,γ-하이드록시 1차 아민으로부터 부분 포화된 헤테로사이클릭 잔기를 형성하는 새로운 방법이 제공되었다. 본 발명에서는, 특히 다우노스아민당(daunosamine sugar)상에 2"-피롤리닐 및 1",3"-테트라하이드로피리디닐 잔기를 형성하는 데에 적용된다. 그러나, 이러한 본 반응은 널리 적용될 수 있다. 인접 또는 분리된 하이드록시 아민이 알데히드 탄소와 할로기를 가지는 탄소 원자사이에 2 내지 3 잔기를 갖는 할로-치환된 알데히드와 반응할 때, 5 및 6원 부분 포화된 헤테로사이클릭 잔기가 형성된다. 이러한 잔기들은 모두 메틸렌이거나, 산소 같은 헤테로 원자가 포함될 수 있다. 반응은 3 단계로 일어난다. 아주 과량의 할로알데히드를 적합하게는 극성 불활성의 무수 유기 용매중에서 하이드록시 아민의 산성염과 반응시킨다. 이로 인해, 알데히드기를 하이드록시기 및 아민기와 축합시킴으로써, 5원의 옥사졸리딘 고리(또는 6원의 1,3-테트라하이드로옥사진 고리)가 형성된다. 이 생성물을 유기 염기(적합하게는, 3차 아민)로 처리하여, 상기의 할로 알데히드의 할로 잔기와 옥사졸리딘(oxazolidine) 또는 1,3-테트라하이드로옥사진(tetrahydrooxazine) 고리의 2차 아미노기사이의 하이드로-할릭산의 요소들을 제거한 후, 5 내지 6원 고리를 첨가하여 융합된(fused) 고리 구조를 형성한다. 그리고 나서, 이 염기를 빙초산 같은 적당한 유기 약산으로 중화시킨다. 수성산(aqueous acid), 적합하게는 유기산으로 처리하면, 융합된 고리의 옥사졸리딘 또는 1,3-테트라하이드로옥사진 부분이 개환된다. 출발 알데히드에 따라, 고리를 함유하는 최종 질소 함유 환이, 위에서 언급된 바와 같이, 하나 이상의 추가의 헤테로 원자를 함유할 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있을 것이다. 하기 반응식 1에서 일반적인 반응을 보여주고 있다.
상기 식에 있어서,
X'는 할로, 적합하게는 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 요오드이고;
Y는 CH2,OCH2또는 CH2-CH2이고;
Z는 존재하지 않거나 CH2이다.
Z가 존재하지 않는 경우, 알데히드 잔기는 첫 번째 반응 단계로서, 5원 옥사졸리딘 고리를 형성한다. Z가 CH2인 경우, 알데히드 잔기는 6원의 1,3-테트라하이드로옥사진 고리를 형성한다. 이러한 고리의 형성에 관하여는 이미 잘 알려져 있으나, 염기성 배지내에서의 할로알칸 측쇄, 예를 들면 무수 배지내에서의 3차 아민에 의해 형성된 폐환과 함께 본 반응은 새롭고, 놀라운 사실이다.
바람직한 양태의 설명
R'에서 특정 바람직한 그룹으로 치환된 경우, 잔기 Q는 Q1내지 Q8의 아잔기(submoiety) 명칭을 가지며, 이 중 Q2내지 Q8은 신규한 세포독성 잔기이다.
R'는 하기의 괄호안에 열거된 원하는 Qx 잔기를 갖도록 바람직한 값을 갖는다: NH2(Q1), 피롤리딘-1-일(Q2), 이소인돌린-2-일(Q3), 3-피롤린-1-일(Q4), 3-피롤리돈-1-일(Q5), 2-피롤린-1-일(Q6), 3-피페리돈-1-일(Q7) 또는 1,3-테트라하이드로피리딘-1-일(Q8).
따라서, R-P가 H이고 -R'가 -NH2인 경우, Q1은 DOX이며; R-P가 H이고 -R'가 피롤리딘-1-일인 경우, Q2는 3'-데아미노-3'-(피롤리딘-1"-일)-독소루비신(Q2)이고;R-P가 H이고 -R'가 이소인돌린-2-일인 경우, Q3는 3'-데아미노-3'-(이소인돌린-2"-일)-독소루비신(Q3)이고; R-P가 H이고 -R'가 3-피롤린-1-일인 경우, Q4는 3'-데아미노-3'-(3"-피롤린-1"-일)-독소루비신(Q4)이고; R-P가 H이고 -R'가 3-피롤리돈-1-일인 경우, Q5는 3'-데아미노-3'-(3"-피롤리돈-1"-일)-독소루비신(Q5)이고; R-P가 H이고 -R'가 2-피롤린-1-일인 경우, Q6는 3'-데아미노-3'-(2"-피롤린-1"-일)-독소루비신(Q6)이고; R-P가 H이고 -R'가 3-피페리돈-1-일인 경우, Q7는 3'-데아미노-3'-(3"-피페리돈-1"-일)-독소루비신(Q7)이고; R-P가 H이고 -R'가 1,3-테트라하이드로-피리딘-1-일인 경우, Q8은 3'-데아미노-3'-(1",3"-테트라하이드로피리딘-1"-일)-독소루비신(Q8)이다.
알킬화 관능기를 갖는 5원 고리중에 다우노스아민 질소를 포함하는 화합물은, 6원 고리중에 다우노스아민 질소를 포함하는 이의 동질체보다 시험관내에서 10 내지 50배 이상 활성이 크다(이러한 쌍으로는 Q6과 Q8뿐만 아니라 Q5와 Q7이 있다).
본 발명의 바람직한 양태의 경우, 화학식 Q14-O-R-P의 화합물에서, R-P는 수소가 아니다. P가 수소가 아닌 경우 P1, P2및 P3이고, 적합하게는 P1은 LH-RH 효능제 담체, LH-RH 길항제 담체 또는 단축된 LH-RH 유사체 담체이며, P2는 단축된 소마토스타틴 유사체이며, P3는 봄베신 길항제이다.
적합하게는, P1은 Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd이고{여기서, (Xxx)는 수소, 또는 A2Bu 또는 A2Pr 같은 디아미노 치환체이고;
Aaa가 Glp인 경우, Bbb는 His이고, Ccc는 Trp이고, Ddd는 Gly-NH2이며,
Aaa가 Ac-D-NaI(2), Ac-D-Phe 또는 Ac-D--Phe(4Cl)인 경우, Bbb는 D-Phe(4Cl) 또는 D-Phe이고, Ccc는 D-Pal(3) 및 D-Trp이고, Ddd는 D-Ala-NH2이며;
Aaa-Bbb-Ccc가 Ac인 경우, Ddd는 -NH-CH2-CH3이다},
P2는이고
{여기서, Aaa는 D-Phe인 경우, Bbb는 Tyr이고, Ccc는 Val이고, Ddd는 Thr 또는 Trp이며; Aaa가 D-Trp인 경우, Bbb는 Phe이고, Ccc 및 Ddd는 Thr이다},
P3은 Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2이다
{여기서, Aaa는 존재하지 않거나 D-Tpi 또는 D-Phe이고, Bbb는 (CH2-NH)Leu, (CH2-NH)Phe, (CH2-NH)Trp, (CH2-N)Tac 또는 (CH2-N)DMTac이다}.
LH-RH의 유사체를 포함하는 본 발명의 신규한 화합물에 있어서, 세포독성 라디칼 Q는 화학식 3에 제시된 바와 같이 디카르복시산 스페이서를 통해, LH-RH 유사체상의 D-Lys 측쇄 또는 이에 부착된(Xxx) 그룹에 부착되어 있다.
Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q14-O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd
상기 식에 있어서,
m은 1 또는 0이고, n은 1 또는 2이다{단, m이 1일 경우, (Xxx)는 A2Bu 또는 A2Pr이고 n은 1 또는 2이며, m이 0일 경우, (Xxx)는 수소이고 n은 1이다}.
소마토스타틴 유사체를 포함하는 본 발명의 신규한 화합물에 있어서, 세포독성 라디칼 Q는 하기 화학식 4에 제시된 바와 같이 디카르복시산 스페이서를 통해, 소마토스타틴 유사체의 아미노 말단에 부착되어 있다.
봄베신 길항제의 유사체를 포함하는 본 발명의 신규한 화합물에 있어서, 세포독성 라디칼 Q는 하기 화학식 5에 제시된 바와 같이 봄베신 길항제의 아미노 말단에 결합되어 있다.
Q14-O-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2
본 발명의 특히 바람직한 양태는, 세포독성 라디칼로서 Q1및 Q6을 함유하고, Q1(독소루비신) 또는 Q6(2-피롤리노-독소루비신)과 14-O-에스테르 결합을 형성하고 펩티드 담체와 카르복스아미드 결합을 형성하는 디카르복시산 스페이서로서 글루타르산(n=3)을 함유하는 펩티드 접합체이다.
본 발명의 가장 바람직한 양태는, 하기 화학식의 세포독성 LH-RH 유사체:
1. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q1 14-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2;
2. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q6 14-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2;
하기 화학식의 세포독성 소마토스타틴 유사체:
및 하기 화학식의 세포독성 봄베신 길항제이다:
9. Q1 14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2;
10. Q6 14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2;
11. Q1 14-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2; 및
12. Q6 14-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2.
인접한 또는 분리된, 즉 α,β- 또는 α,γ-하이드록시 아민의 질소를 갖는 부분 포화된 헤테로사이클 고리를 형성하는 신규한 방법에 있어서, 반응의 제1단계는 무수 불활성 유기 극성 비-하이드록시(비-양성자성) 용매, 적합하게는 디메틸 포름아미드중에서, 상당한 과량, 적합하게는 30배 과량의 할로 알데히드, 즉 4-요오도부티르알데히드 및 5-요오도발레르알데히드를 사용하여 수행하는 것이 특히 효과적이다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 요오도 대신에 브로모를 사용할 수 있다. 본 반응 및 후속적인 단계들은 주위 온도에서 수행될 수 있다.
염기화 단계는 과량, 적합하게는 2 내지 4배 과량의 유기 염기로 수행된다. 트리알킬아민 같은 3차 아민이 이러한 목적에 적합하다.
이와 같이 형성된 바이사이클 고리는, 물의 존재하에서 유기산 처리에 의해 개환되어 인접한 또는 분리된 하이드록실기를 방출한다. 적합하게는 아세토니트릴 같은 불활성 유기 용매중에서, 희석된 수성 트리푸오르아세트산이 사용된다. 감압하에서 휘발성분을 제거하여 생성물을 정제하고, 헥산으로 과량의 할로 화합물을추출하고, 잔류물을 HPLC상에서 정제한다.
약어
본 발명의 펩티드 및 이의 유도체를 설명하기 위해, 펩티드 화학에서 일반적으로 허용되고, 생화학 용어에 관한 IUPAC-IUB 위원회에 의해 추천된, 아미노산에 대한 통상적인 약어가 사용된다[참조: European J. Biochem., 138, 9-37(1984)].
개개의 아미노산 잔기에 대한 약어는 아미노산의 통칭에 기초한다(예를 들어, Glp는 피로글루탐산이고, His는 히스티딘이고, Trp는 트립토판이다). 약어는 특별히 다른 말이 없는 경우, 아미노산의 L 이성질체형을 나타낸다(예를 들면, Ser은 L-세린 이고, D-Lys는 D-라이신이다).
본 발명에서 특이한 아미노산의 약어는 하기와 같다: D-Nal(2)는 D-3-(2-나프틸)알라닌이고, D-Pal(3)은 D-3-(3-피리딜)알라닌이고, D-Phe(4Cl)은 D-4-클로로페닐알라닌이다.
펩티드 서열은 통상의 방법에 따라 N-말단의 아미노산은 왼쪽에, C-말단의 아미노산은 오른쪽에 표기한다(예를 들면, Glp-His-Trp).
화학식 Leu(CH2-NH)Leu-NH2은 류신과 펩티드 서열의 C-말단에 있는 류신 아미드 잔기간의 환원된 펩티드 결합을 기술한다.
기타 사용되는 약어는 다음과 같다:
A2Bu: 디아미노부티르산
A2Pr: 디아미노프로피온산
BN: 봄베신
BOP시약: 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DM-DOX: 다우노스아민 변형된 독소루비신
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DMTac: 5,5-디메틸-티아졸리딘-4-카르복시산
DOX: 독소루비신
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
glt: -C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-, 글루타릴
Glt2O: 글루타르 무수물
HOBt: 1-하이드록시벤조트리아졸
HO-glt-OH: 글루타르산
HOSu: N-하이드록시석신이미드
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)
TFA: 트리플루오로아세트산
Tac: 티아졸리딘-4-카르복시산
Tpi: 2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-3-카르복실산.
모델 168 다이오드 배열 검출기 및 시스템 골드 크로마토그래피 소프트 웨어(System Gold chromatography software, Beckman)가 장착된 베크만 분석 HPLC 시스템은, 화학 반응을 모니터하고 본 발명의 화합물의 순도를 검사하는데 사용된다. 사용된 칼럼은 다이나맥스(Dynamax) C-18(250x4.6㎜; 공극의 크기: 300Å; 입자 크기: 12㎛)이다. 상기 용매 시스템은 두 가지 성분, 즉 (ⅰ) 물중의 0.1% TFA 및 (ⅱ) 70% 수성 아세토니트릴중의 0.1% TFA로 이루어졌고, 화학 반응을 모니터하기 위해, 1분 안에 1% (ⅱ)로 증가시키는 선형 구배 방식(linear gradient mode)으로 사용된다. 이 시스템은 순도 조절을 위해 등용매(isocratic) 방식으로 사용된다.
베크만 모델 342 반-분취용(semipreparative) HPLC 시스템은 본 발명의 화합물을 분리 및 정제하는데 사용된다. 칼럼은 아쿠아포어 옥틸(Aquapore Octyl, 250x10㎜; 공극의 크기: 300Å; 입자 크기: 15㎛)이다. 용매 시스템은 상기된 분석용 HPLC에 대해 기술된 바와 동일하다.
분석
독소루비신 유도체의 구조를 확인하기 위해, 브루커(Bruker) ARX300 NMR 분광계(300MHZ 1H 주파수, 75MHZ 13C 주파수) 및 전기분무(electrospray) 질량 분광계 Finnigan-MAT TSQ 7000이 사용된다.
펩티드 담체의 합성
본 발명의 펩티드는 약제학적으로 허용되는 비독성염, 예를 들어 산부가염(acid additional salt)의 형태로 종종 투여된다. 상기 산부가염의 예로는, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 포스페이트, 푸마레이트, 글리코네이트, 탄네이트, 말레에이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 석시네이트, 알기네이트, 파모에이트, 말레이트, 아스코르베이트, 타르트레이트 등이 있다. 활성 성분을 정제 형태로 투여하는 경우, 정제는 트라가칸트, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제, 알긴산과 같은 붕해제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 희석제를 함유할 수 있다.
액체형으로 투여하고자 하는 경우, 약제학적으로 허용되는 희석제의 일부로서 감미제 및/또는 향미제를 사용할 수 있으며, 등장성 염수, 인산 완충액 등의 형태로 정맥 투여될 수 있다.
일반적으로 약제학적 조성물은 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 펩티드를 함유한다. 정맥으로 투여되는 경우, 투여량은 통상적으로 숙주의 체중 ㎏당 펩티드 약 1 내지 약 100㎍일 것이다. 경구 투여량은 이보다 휠씬 많을 것이다. 이들 펩티드를 이용한 환자의 치료는, LHRH의 기타 유사체, 소마토스타틴 및 독소루비신의 유사체를 사용하는 임상 치료와 동일한 방법으로 수행된다.
이들 펩티드를 포유류에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내 또는 질내로 투여하여, 특이적 수용체에 대한 결합을 통해 생물학적 호르몬 효과를 거둘 수 있게 할 수 있다. LHRH 유사체의 경우, 이러한 효과 중에는 생식선 활성을 가역적으로 억제하는 것이 포함되며, 소마토스타틴 유사체의 경우, 위장 기능의 억제가 포함된다. 유효 투여량은 투여 형태 및 치료되는 포유류의 특정 종에 따라 달라진다. 한 가지 전형적인 투여 형태의 예로는, 펩티드를 함유한 생리학적인 염수 용액으로서, 체중 ㎏ 당 약 0.1 내지 2.5㎎의 양으로 투여된다. 펩티드를 경구로 투여하는 경우, 액체형 또는 고체형으로 투여할 수 있다.
본 발명의 펩티드 담체의 합성은 펩티드 화학 분야에서 숙련가에게 공지된 모든 기술에 의해 수행될 수 있다. 이에 적합한 기술에 관하여는, 문헌[참조: M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984]에 요약되어 있다. 고체 상 펩티드 합성을 위한 기술에 관하여는, 문헌[참조: J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984(2nd ed.) 및 G. Barany et al., Int. J. Peptide and Protein Res. 30, 705-739(1987)]에 실려 있다.
본 발명에서 사용된 LH-RH 유사체 담체의 합성에 관하여는, 1993년 11월 2일자 미국 특허 제5,258,492호(Sandor Bajusz and Andrew V. Schally)의 실시예 및 논문[참조: Bajusz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1637-1641(1988) and 86, 6318-6322(1989) 및 Janaky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1023-1027 and 972-976(1992)]에 상세히 기술되어 있다.
본 발명에서 사용된 소마토스타틴 유사체 담체의 합성에 관하여는, 1987년 3월 17일자 미국 특허 제4,650,787호(Andrew V. Schally and Ren Z. Cai)의 실시예에 상세히 기술되어 있다. 이 합성에 관하여는, 논문[참조: Cai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1896-1900(1986) and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2502-2506(1987)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 사용된 봄베신 길항제 담체의 합성에 관하여는, 논문[참조: Coy et al., J. Biol. Chem. 263, 5056-5060 (1988) and 264, 14691-14697 (1989) 및 Cai et al., Peptides 13, 267-271 (1992) and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12664-12668 (1994)]에 상세히 기술되어 있다.
본 발명에서 사용된 독소루비신 유도체의 합성 및 이와 상이한 펩티드 담체와의 접합체의 형성에 관하여는, 하기의 실시예에 상세히 기술되어 있다. 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1
N-Fmoc-DOX 14 -O-헤미글루타레이트의 제조 및 분리
DOX HCl 염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, Fmoc-OSu 30㎎(90μ㏖)을 첨가한 후, DIPEA 31㎕(180μ㏖)를 첨가한다. 3시간 동안 교반한 후, 반응은 분석용 HPLC에 의해 평가된 바와 같이 완료된다. 용매를 Speed Vac 고진공 증발기에서 증발 건조시킨 후, 잔류물은 H2O 중의 0.1% TFA로 문질러서 결정화시킨다. 결정체를 여과시킨 후, 냉 에테르로 1회 세척하여 미량의 초과 Fmoc-OSu를 제거한다. 건조기에서 건조시킨 후, 순도가 98%인 N-Fmoc-DOX 62㎎을 수득하였다. 수율: 94%
이 중간체를, DIPEA 26.1㎕(150μ㏖)의 존재하에서, 무수 DMF 1㎖중 Glt2O 11.4㎎(100μ㏖)으로 밤새 반응시킨다. 용매를 Speed Vac에서 증발시키고, 잔류 오일을 0.1% 수성 TFA(v/v)로 문질러 고체화시킨다. 이와 같이 수득된 조 물질(crude material)은 분석용 HPLC에 의해 평가된 바와 같이, 70%의 N-Fmoc-DOX14-O-헤미글루타레이트, 20%의 반응되지 않은 N-Fmoc-DOX 및 10%의 기타 불순물을 포함한다. 이러한 조 생성물은 추가 정제없이 펩티드 DOX 접합체의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 조 물질을 0.1% TFA를 함유한 60%의 수성 아세토니트릴 20㎖ 중에 용해시키고, 반-분취용 HPLC에 적용시켜, 순도가 98%인 N-Fmoc-DOX14-O-헤미글루타레이트 최종 생성물 45.7㎎을 수득하였다(수율: 64%).
실시예 2
3'-데아미노-3'-(피롤리딘-1"-일)-독소루비신 TFA염 (Q 2 ) 및 이의 14-O-헤미글루타레이트(AN-193) TFA염의 제조 및 분리
DOX HCl 염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 15배 과량의 1,4-디요오도부탄 171㎕(1.3m㏖)을 첨가한 후, 3배 과량의 DIPEA 45㎕(260μ㏖)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 16시간 후, 분석용 HPLC에 의해 평가된 바와 같이 반응이 완료된다. 용매를 Speed Vac에서 증발시키고, 잔류 오일을 H2O 중 0.1% TFA 3㎖중에 용해시킨 후, 에테르로 추출하여 과량의 1,4-디요오도부탄을 제거한다. 그리고 나서, 수성 추출물을 HPLC상에 적용시켜서, 순도가 98%인DOX 유도체 41.6㎎을 수득하였다(수율 68%).
이렇게 수득한 3'-데아미노-3'-(피롤리딘-1"-일)-독소루비신 TFA 염 41.6㎎(58μmol)을, 실시예 1에서 기술된 바와 똑같이, 무수 DMF 중의 1.2당량의 Glt2O와 반응시킨다. 수율은 35%(16.9㎎)이고, 순도는 98%이다.
실시예 3
3'-데아미노-3'-(이소인돌린-2"-일)-독소루비신 TFA염 (Q 3 )의 제조 및 분리
DOX HCl 염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 15배 과량의 α,α'-디클로로-오르토-크실렌 226㎎(1.3m㏖)을 첨가한 후, 3배 과량의 DIPEA 45㎕(260μ㏖) 및 촉매량의 Nal을 첨가한다. 16시간 후, 용매를 Speed Vac에서 증발시키고, 잔류물을 0.1% 수성 TFA 3㎖중에 용해시키고, 에테르 3㎖로 추출하여 과량의 할로겐 화합물을 제거한다. 이렇게 수득한 조 물질을 HPLC상에 적용시킨다. 정제 후, 순도가 98%인 최종 생성물 36㎎을 수득하였다(수율: 55%).
실시예 4
3'-데아미노-3'-(3"-피롤린-1"-일)-독소루비신 TFA 염(Q 4 )의 제조 및 분리
DOX HCl 염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 15배 과량의 시스-1,4-디클로로-2-부텐(Aldrich) 136.8㎕(1.3m㏖)을 첨가한 후, 3배 과량의 DIPEA 45㎕(260μ㏖)을 첨가한다. 16시간 후, 용매를 Speed Vac에서 증발시키고, 잔류물을 0.1% 수성 TFA 3㎖중에 용해시킨 후, 헥산 3㎖로 추출하여 과량의 할로겐 화합물을 제거한다. 이렇게 수득한 조 물질을 HPLC상에 적용시킨다. 정제 후, 순도가 98%인 최종 생성물 22.6㎎을 수득하였다(수율: 37%).
실시예 5
1-클로로-4-브로모-2-부타논(C 4 H 6 ClBrO) 및 1-클로로-5-브로모-2-펜타논(C 5 H 8 ClBrO) 의 제조 및 분리
3-브로모프로피오닐 클로라이드 100.8㎕(1m㏖)를 에테르 중의 과량의 디아조메탄과 반응시킨다. 1시간 후, 이 에테르성 용액을 용출시키고, 박층 크로마토그래피(TLC)상에서 스팟 테스트(spot test)를 한다. 실리카 겔 60 F254 (Merck Art No.5554)로 예비 코팅된 TLC 알루미늄 박판을 정지상(stationary phase)으로 사용하고, CHCl3:MeOH 95:5(v/v)를 이동상(mobile phase)으로 사용한다. 스폿 테스트를 하기 위해, 용출 후에 2,4-디니트로페닐하이드라진 시약(Vogel: A Textbook of Practical Organic Chemistry, page 1061, Third Edition, Longmans, New York)을 TLC 박판상에 분무시킨다. 이렇게 형성된 디아조메틸케톤 유도체는 Rf값이 0.3인 황색 스폿을 나타낸다. 이어서, 이 에테르성 용액을 에테르 중의 무수 HCl과 반응시켜, 디아조메틸케톤을 원하는 최종 생성물인 1-클로로-4-브로모-2-부타논으로 전환시킨다. 이 생성물은 동일한 용매 시스템에서, 상기한 스폿 테스트 시약을 사용하였을 때, 옥소 화합물의 특징인 황색 스팟(Rf값: 0.8)을 나타낸다. 용매를 증발시킨 후, 조 생성물을 실리카 겔(Merck, 등급 9385, 230-400 mesh, 공극 크기 60Å) 15g으로 충진된 칼럼(길이 15㎝, 직경 2.5㎝)상에 적용시킨다. 액체의 이동상은 순수한 CHCl3이다. 원하는 최종 생성물(상기에서 상세히 기술된 스폿 테스트에 의해 특성 결정)을 함유한 분획을 혼합한 후, 증발 건조시킨다. 투명한 오일 1.5g을 수득하였다. 수율: 80%.
3-브로모프로피오닐 클로라이드 대신 4-브로모부티릴 클로라이드를 사용하는 것을 제외하고는, 1-클로로-4-브로모-2-펜타논에 대해 기술된 바와 동일하게, 1-클로로-5-브로모-2-펜타논을 4-브로모부티릴 클로라이드로부터 제조한다. 투명한 오일 1.6g을 수득하였다. 수율: 80%.
실시예 6
3'-데아미노-3'-(3"-피롤리돈-1"-일)-독소루비신 TFA염(Q 5 )의 제조 및 분리
DOX HCl 염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 15배 과량의 1-클로로-4-브로모-2-부타논 241㎎(1.3m㏖)을 첨가한 후, 3배 과량의 DIPEA 45㎕(260μ㏖)을 첨가한다. 16시간 후, 용매를 Speed Vac에서 증발시키고, 잔류물을 0.1% 수성 TFA 3㎖중에 용해시킨 후, 헥산 3㎖로 추출하여 과량의 할로겐 화합물을 제거한다. 이렇게 수득한 조 물질을 HPLC상에 적용시킨다. 정제 후, 순도가 98%인 최종 생성물 20.6㎎을 수득하였다(수율: 33%).
실시예 7
3'-데아미노-3'-(3"-피페리돈-1"-일)-독소루비신 TFA염(Q 7 )의 제조 및 분리
DOX HCl 염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 15배 과량의 1-클로로-5-브로모-2-펜타논 260㎎(1.3m㏖)을 첨가한 후, 3배 과량의 DIPEA 45㎕(260μ㏖)를 첨가한다. 16시간 후, 용매를 Speed Vac에서 증발시키고, 잔류물을 0.1% 수성 TFA 3㎖중에 용해시킨 후, 헥산 3㎖로 추출하여 과량의 할로겐 화합물을 제거한다. 이렇게 수득한 조 물질을 HPLC상에 적용시킨다. 정제 후, 순도가 95%인 최종 생성물 18㎎을 수득하였다(수율: 28%).
실시예 8
4-요오도부티르알데히드 및 5-요오도발레르알데히드의 제조 및 분리
2-(3-클로로프로필)-1,3-디옥솔란(4-클로로-n-부티르알데히드 에틸렌 아세탈) 1.3㎖(10m㏖)(Fluka)를 NaI 30g(200m㏖, 20배 과량)을 함유한 아세톤 200㎖ 중에 용해시킨다. 용액을 24시간 동안 환류시킨 후, 증발 건조시킨다. 에테르 100㎖을 사용하여, 무기 고체 잔류물로부터 유기 물질을 추출한다. 그리고 나서, 에테르성 용액을 H2O 50㎖, 5% Na2S2O3수용액 50㎖로 세척하고, H2O 50㎖로 3회 세척한다. 에테르를 진공에서 제거한 후, 잔존 오일을 50% 수성 아세트산 3㎖중에 용해시킨다. 1시간 후, 에테르 100㎖을 상기 용액에 첨가하고, H2O 50㎖로 3회 세척하여 에틸렌 글리콜 및 아세트산을 제거한다. 주 생성물은 순수한 CHCl3로 TLC 상에서 용출된다(Rf값: 0.8). 알데히드 관능기에 대해 사용된 스팟 테스트를, 실시예 5에서 케톤에 대해 기술된 바와 동일하다. 그리고 나서, 에테르를 제거하고, 검은 오일을 실리카 겔(Merck, 등급 9385, 230-400 mesh, 공극 크기 60Å) 15g으로 충진된 칼럼(길이: 15㎝, 직경: 2.5㎝)상에 적용시킨다. 액체의 이동상은 CHCl3이다. 원하는 최종 생성물(상세히 기술된 스폿 시험에 의해 특성 결정)을 포함한 분획을 혼합한 후, 증발 건조시킨다. 황색 오일 1.6g을 수득하였다. 수율: 80%.
5-요오도발레르알데히드는, 2-(4-클로로부틸)-1,3-디옥솔란(5-클로로-n-발레르알데히드 에틸렌 아세탈)(Fluka)로부터 출발하여 동일한 방법으로 수득하였다. 황색 오일 1.65g을 수득하였다. 수율:80%.
실시예 9
3'-데아미노-3'-(2"-피롤린-1"-일)-독소루비신 TFA염(Q 6 )의 제조 및 분리
DOX HCl염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 30배 과량의 4-요오도부티르알데히드 515㎎(2.6m㏖)을 첨가한 후, DIPEA 45㎕(260μ㏖, 3배 과량)를 첨가한다. 1시간 후, 빙초산 100㎕를 반응 혼합물에 첨가한 후, 이 혼합물을 70% 수성 아세토니트릴(HPLC 계의 용매 ⅱ) 중의 0.1% TFA 5㎖에 적가한다. 이 용액을 0.1% 수성 TFA 용액 2㎖로 희석시킨 후, Speed Vac에서 아세토니트릴을 제거한다. 생성된 용액을 헥산으로 추출하여, 과량의 할로겐 화합물을 제거한다. 이렇게 수득된 물질을 HPLC상에 적용시킨다. 정제 후, 순도가 98%인 최종 생성물 52㎎을 수득하였다(수율: 85%).
실시예 10
3'-데아미노-3'-(1",3"-테트라하이드로피리딘-1"-일)-독소루비신 TFA염(Q 8 )의 제조 및 분리
DOX HCl염 50㎎(86μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 30배 과량의 5-요오도발레르알데히드 552㎎(2.6m㏖)을 첨가한 후, 3배 과량의 DIPEA 45㎕(260μ㏖)를 첨가한다. 1시간 후, 빙초산 100㎕를 반응 혼합물에 첨가한 후, 이 혼합물을 70% 수성 아세토니트릴(HPLC 시스템의 용매 ⅱ) 중의 0.1% TFA 5㎖에 적가한다. 이 용액을 0.1% 수성 TFA 용액 2㎖로 희석시킨 후, Speed Vac에서 아세토니트릴을 제거한다. 생성된 용액을 헥산으로 추출하여, 과량의 할로겐 화합물을 제거한다. 이렇게 수득된 물질을 HPLC상에 적용시킨다. 정제 후, 순도가 98%인 최종 생성물 46㎎을 수득하였다(수율: 75%).
실시예 11
DOX를 함유한 세포독성 LH-RH 효능제 유사체([D-Lys 6 (DOX 14 -O-glt)]LH-RH,Q 1 14 gL)의 제조 및 분리
[D-Lys6]LH-RH 60㎎(37.5μ㏖) 및 N-Fmoc-DOX14-O-헤미글루타레이트(실시예 1참조) 52㎎(순도 64%, 37.5μ㏖)을 DMF 1㎖중에 용해시키고, BOP 시약(Aldrich) 22㎎(50μ㏖), HOBt 13.5㎎(100μ㏖) 및 DIPEA 52㎕(300μ㏖)를 첨가한다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응은 완료된다. 용매를 증발시키고, 잔류 오일을 에틸 아세테이트 3㎖에 의해 결정화한 후, 에틸 아세테이트 3㎖로 2회 세척한다. 조 고체 물질 90㎎을 DMF 3㎖중에 용해시킨 후, 피페리딘 300㎕을 첨가한다. 5분 후, 반응물을 빙조(ice bath)내로 옮기고, TFA 300㎕, 피리딘 700㎕ 및 DMF 2㎖의 혼합물을 첨가하여 산성화한다. 용매를 증발시킨 후, 잔류 오일을 에틸 아세테이트로 고체화시킨다. 이렇게 수득된 조 고체를 0.1% TFA를 함유한 70% 수성 아세토니트릴(ⅰ) 1㎖중에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA(ⅱ) 3㎖로 희석시킨 후, 반-분취용 HPLC상에 적용시킨다. 순도가 98%인 최종 생성물 40㎎(14.8μ㏖)을 수득하였다. 수율: 48%.
실시예 12
2-피롤리노-DOX를 함유한 세포독성 LH-RH 효능제 유사체([D-Lys 6 (2-피롤리노-DOX 14 -O-glt)]LH-RH, Q 6 14 gL)의 제조
Q1 14gL 11.2㎎(5μ㏖)(실시예 11 참조)을 DMF 200㎕중에 용해시키고, 4-요오도부티르알데히드(실시예 8) 30㎎(150μ㏖, 30배 과량)을 첨가한 후, DIPEA 3㎕(17μ㏖)을 첨가한다. 1시간 후, 반응은 완료되고(실시예 9 참조), 빙초산 10㎕를 반응 혼합물에 첨가한 후, 이 혼합물을 70% 수성 아세토니트릴 중의 0.1% TFA 1㎖중에 적가한다. 이 용액을 0.1% 수성 TFA로 희석시킨 후, 아세토니트릴을 진공에서 제거한다. 그리고 나서, 잔존 수용액을 헥산 1㎖로 추출한 후, HPLC상에 적용시킨다. 순도가 99%인 최종 생성물 7.6㎎을 수득하였다(수율: 66%).
실시예 13
DOX를 함유한 세포독성 소마토스타틴 유사체 의 제조 및 분리
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-Val-Cys-Thr-NH220㎎(14.5μ㏖)[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, pp. 1986-1990] 및 N-Fmoc-DOX14-O-헤미글루타레이트(실시예 1) 20㎎(순도 64%, 14.5μ㏖)을 DMF 200㎕중에 용해시키고, BOP 시약(Aldrich) 8.8㎎(20μ㏖), HOBt 5.4㎎(40μ㏖) 및 DIPEA 17㎕(100μ㏖)를 첨가한다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응은 완료된다. 진공에서 용매를 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트에 의해 결정화한다. 그리고 나서, 이 고체 물질을 DMF 1㎖중에 용해시키고, 피페리딘 100㎕를 첨가한다. 7분 후, 반응물을 빙조내로 옮긴 후, TFA 100㎕, 피리딘 300㎕ 및 DMF 2㎖의 혼합물을 첨가하여 산성화한다. 용매를 증발시킨 후, 잔류 오일은 에틸 아세테이트로 고체화시킨다. 이렇게 수득된 조 고체를 0.1% TFA를 함유한 70% 수성 아세토니트릴(ⅰ) 1㎖중에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA(ⅱ) 3㎖로 희석시킨 후, 반-분취용 HPLC상에 적용시킨다. 순도가 95%인 최종 생성물 9.7㎎(5.1μ㏖)을 수득하였다. 수율: 35%.
실시예 14
2-피롤리노-DOX를 함유한 세포독성 소마토스타틴 유사체 의 제조
(6.4㎎, 5μ㏖)을 DMF 100㎕중에 용해시키고, 2-피롤리노-DOX14-O-헤미글루타레이트(4.1㎎, 5μ㏖)를 첨가한 후, BOP 시약(4.4㎎, 10μ㏖), HOBt(100μ㏖) 및 DIPEA(50μ㏖)를 첨가한다. 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 AcOH 20㎕로 산성화시키고, 0.1% TFA를 함유한 70% 수성 아세토니트릴 500㎕로 희석시키고, 추가로 0.1% 수성 TFA 700㎕로 희석시킨 후, HPLC상에 적용시킨다. 순도가 99%인 최종 생성물 3.9㎎(수율: 40%)을 수득하였다.
2-피롤리노-DOX14-O-헤미글루타레이트는, 실시예 9에 기술된 바와 같이, DOX14-O-헤미글루타레이트를 4-요오도부티르알데히드와 반응시켜서 제조한다. DOX14-O-헤미글루타레이트는, 실시예 11에 기술된 바와 같이, Fmoc 보호기를 절단시켜 N-Fmoc-DOX14-O-헤미글루타레이트로부터 제조한다. (수율: 40%)
실시예 15
DOX를 함유한 세포독성 봄베신 길항제 (DOX 14 -O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH 2 -NH)Leu-NH 2 , Q 1 14 gB)의 제조 및 분리
Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH220㎎(15,8μ㏖)[참조: Int. J. Peptide Protein Res. 38, 1991, pp. 593-600] 및 N-Fmoc-DOX14-O-헤미글루타레이트(실시예 1) 22㎎(순도 64%, 15.8μ㏖)을 DMF 200㎕중에 용해시키고, BOP 시약 8.8㎎(20μ㏖)(Aldrich), HOBt 5.4㎎(40μ㏖) 및 DIPEA 17㎕(100μ㏖)을 첨가한다. 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응은 완료된다. 용매를 진공에서 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트로 결정화한다. 그리고 나서, 이 고체 물질을 DMF 1㎖중에 용해시킨 후, 피페리딘 100㎕을 첨가한다. 5분 후, 반응물을 빙조로 옮기고, TFA 100㎕, 피리딘 300㎕ 및 DMF 2㎖의 혼합물을 첨가하여 산성화시킨다. 용매를 증발시킨 후, 잔류 오일을 에틸 아세테이트로 고체화한다. 이렇게 수득한 조 고체를 0.1% TFA를 함유한 70% 수성 아세토니트릴(ⅰ) 1㎖중에 용해시키고, 0.1% 수성 TFA(ⅱ) 3ml로 희석시킨 후, 반-분취용 HPLC상에 적용시킨다. 순도가 98% 인 최종 생성물 13.5㎎(7.1μ㏖)을 수득하였다. 수율: 45%.
실시예 16
2-피롤리노-DOX를 함유한 세포독성 봄베신 길항제 유사체 (2-피롤리노-DOX 14 -O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH 2 -NH)Leu-NH 2 , Q 6 14 gB)의 제조 및 분리
Q1 14gB 9.5㎎(5μ㏖)(실시예 15)를 DMF 200㎕중에 용해시키고, 4-요오도부티르알데히드(실시예 8) 30㎎(150μ㏖, 30배 과량)을 첨가한 후, DIPEA 3㎕(17μ㏖)을 첨가한다. 1시간 후, 반응이 완료된 후(실시예 9), 빙초산 10㎕를 반응 혼합물에 첨가한 후, 이 혼합물을 70% 수성 아세토니트릴 중의 0.1% TFA 1㎖에 적가한다. 그리고 나서, 이 용액을 0.1% 수성 TFA로 희석시키고, 아세토니트릴을 진공에서 제거한다. 이어서, 잔존하는 수성 용액을 헥산 1㎖로 추출한 후, HPLC상에 적용시킨다. 순도가 98%인 최종 생성물 6㎎을 수득하였다. (수율: 60%)
시험관내 세포독성 활성의 측정
MXT 에스트로겐-독립적인 마우스의 유방암 세포주는 독일 레겐스부르크 대학의 군터 베른트하르트 박사로부터 수득하였다. 본 발명의 화합물의 항증식 활성의 측정에 사용된 기타 모든 세포주는 ATCC(American Type CUlture Collection)로부터 수득하였다.
유사체의 활성을 측정하기 위해, 크리스탈 바이올렛을 사용한 세포 염색에 의한 바이오매스의 정량화에 기초한, 미세역가 플레이트에서의 세포독성 측색 분석을 사용하며, 이는 세포수 측정과 밀접한 관련이 있다[참조: Reile et al.; Anal.Biochem. 187, 262-267, 1990; Bernhardt G. et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol (1992), 118, 35-43; Spruss Th. et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol 117, 435-443, 1991; Gillies, R. J., Anal. Biochem. 159, 109-113, 1986; Kueng, W. et al; Anal. Biochem., 182 16-19, 1989].
분석 프로토콜
96-웰(well)플레이트에 세포를 접종한 후 1 내지 2일 후에, 배양 배지를 시험될 화합물을 함유한 새로운 배지 및 대조군 배양만을 위한 새로운 배지로 교환한다. 항온처리 시간을 달리한 후, 세포를 글루타르 디알데히드로 고정시키고나서, 송아지 태아 혈청(FBS)하에 40℃에서 실험이 끝날 때까지 보관한다. 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, 결합된 염색액을 70% 수성 EtOH로 추출한다. EIA 판독기(Bio-Tek Instrument) 또는 Biomek 1000(Beckman)을 사용하여, 590㎚ 또는 600㎚에서 각각 광학 밀도를 측정한다. 각각의 데이터 점(point)은 8개의 배양 웰의 평균 수치를 나타낸다. T/C 수치는 T/C=(T-Co)/(C-Co){여기서, T는 처리된 배양물의 광학 밀도이고, C는 대조군(처리하지 않은) 배양물의 광학 밀도이고, Co는 배양 시작시(t=0) 배양물의 광학 밀도이다}로서 계산하였다.
실시예 17
DOX의 다우노스아민 변형된 유도체의 시험관내 세포독성 활성
표 1에서는 시험관내에서 MCF-7 사람의 유방암 세포주에 대한, 독소루비신및 이의 다우노스아민 변형된 유도체의 효과를 보여주고 있다.
반응성 관능기를 갖는 5-원 고리에 다우노스아민 N이 도입된 세포독성 라디칼은, 6-원 고리를 갖는 이의 동족체 대응물, 예를 들면 3-피롤리도노-DOX(Q5) 및 3-피페리도노-DOX(Q7) 뿐만 아니라 2-피롤리노-DOX(Q6) 및 1,3-테트라하이드로-피리디노-DOX(Q8) 보다 활성이 5 내지 50배 이상 더 높다.
시험관내에서 MCF-7 사람의 유방암 세포주에 대한, 독소루비신 및 이의 다우노스아민 변형된 유도체의 효과
화합물 항온처리시간(시간) 농도(M)에서 T/C 수치
3×10-10 10-9 3×10-9 10-8 3×10-8 10-7
독소루비신(DOX) 70120 9895 8266 5433
피롤리디노-DOX(Q2) 70120 9794 2517 -26-19
피페리디노-DOX(AN-183) 70120 114109 7067 40
이소인돌리노-DOX(Q3) 70120 118108 8677 -11-29
3-피롤리노-DOX(Q4) 70120 10697 7265 -3-5
3-피롤리도노-DOX(Q5) 70120 8767 3025 -28-10
3-피페리도노-DOX(Q7) 70120 9697 8070 5943
2-피롤리노-DOX(Q6) 70120 5026 -32 -18-9
1,3-테트라하이드로피리디노-DOX(Q8) 70120 9699 8893 6962
5% HI-DCC-FBS(열로 비활성화된 덱스트란으로 피복된 숯을 처리한 송아지 태아 혈청)를 함유한 IMEM 배지의 96-웰 플레이트상에서 세포를 항온처리한다. 처리된 플레이트 및 대조군 플레이트에서의 상대적인 세포수는, 크리스탈 바이올렛 염색 방법에 의해 측정하고, 이는 T/C=(T-C0/C-C0)×100의 T/C 수치[여기서, T=처리된 배양물의 흡광도, C=대조군 배양물의 흡광도, C0=배양 시작시(t=0) 배양물의 흡광도이고, 측정된 흡광도는 세포수에 비례한다]로서 표현된다. T/C 수치가 작다는 것은, 치료에 의해 암세포의 생존률이 감소한 것을 나타낸다. 즉, 75는 , 대조군(100%)과 비교시, 세포 생존률이 75% 또는 억제율이 25%라는 것을 나타낸다.
실시예 18
LH-RH 효능제 펩티드 접합체 Q 1 14 gL중의 DOX 및 LH-RH 효능제 펩티드 접합체 Q 6 14 gL중의 초활성 2-피롤리노-DOX(Q 6 )의 시험관내에서의 세포독성 활성의 완전한 유지
하기의 표 2에서는 시험관내에서 MCF-7 사람의 유방 암종 세포주 및 MXT 에스트로겐에 독립적인 마우스의 유방암 세포주의 성장에 대한, 독소루비신 및 이의 다우노스아민 변형된 유도체인 2-피롤리노독소루비신(Q6)의 효과를, LH-RH 효능제 유사체인 [D-Lys6]LH-RH(각각 Q1 14gL 및 Q6 14gL) 와의 접합체와 비교하여, 보여준다.
화합물 항온처리시간(시간) 농도(M)에서 MCF-7 세포주 상의 T/C 수치
3×10-11 10-10 3×10-10 10-9 3×10-9 10-8 3×10-8 10-7
독소루비신* 70120 9895 8266 5433
Q1 14gL 70120 11178 8955 6328
Q6 70120 5026 -3-2 -18-9
Q6 14gL 70120 7460 2816 -24-14
화합물 항온처리시간(시간) 농도(M)에서 MXT 세포주 상의 T/C 수치
3×10-11 10-10 3×10-10 10-9 3×10-9 10-8 3×10-8 10-7
독소루비신 2650 8574 9060 5943
Q1 14gL 2650 8771 9159 7350
Q6 2869 9052 786 56-13
Q6 14gL 2869 9159 7815 64-11
MCF-7 세포를, 96-웰 플레이트 상에 5% HI-DCC-FBS를 함유한 IMEM 배지에서 항온처리한다. MXT 세포를 L-글루타민 0.6g/L 및 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지에서 항온처리한다.
* 표 1에서와 같이 측정됨.
실시예 19
하기의 표 3에서는, 시험관내에서 본 발명의 DOX를 함유한 소마토스타틴 유사체의 세포독성 활성이 완전히 유지됨을 보여준다.
시험관내 MIIA PaCa-2 사람의 췌장암 세포주의 성장에 대한, 독소루비신을 함유한 세포독성 소마토스타틴 유사체의 효과
화합물 배양시간(시간) 농도(M)에서 T/C 수치
10-8 10-7 10-6
DOX14-O-glt-S-98*(Q1 14gS98) 2876 93103 9511 32-3
담체 유사체 S-98* 2876 -- -- 9698
DOX14-O-glt-S-121**(Q1 14gS121) 2876 9397 8210 35-4
담체 유사체 S-121** 2876 -- -- 7696
독소루비신 2876 9571 6410 -28-7
세포를 96-웰 플레이트상에서 10% 송아지 태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지에서 항온처리한다.
실시예 20
시험관내 CFPAC-1 사람의 췌장암 세포의 성장에 대한, 독소루비신을 함유한 세포독성 봄베신 길항제 유사체의 효과
하기의 표 4에서는, 시험관내에서 본 발명의 DOX를 함유한 봄베신 길항제 유사체의 세포독성 활성이 완전히 유지됨을 보여준다.
화합물 항온처리시간(시간) 농도(M)에서 T/C 수치
3×10-8 10-7 3×10-7 10-6
DOX14-O-glt 66 95 81 44 9
B-94(Q1 14gB) 95137 9594 5728 2819 40
B-94* 6695137 999798 1069998 10499100 1009696
DOX14-O-glt-B-50 6695137 1029792 785528 392419 5-1-2
B-50** 6695137 1009897 9310098 9910299 939898
DOX 6695137 887349 523220 15107 -7-6-4
세포는 24-웰 플레이트상에서 10% 송아지 태아 혈청을 함유한 IMDM 배지에서 배양한다.
* Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Ψ(CH2-N)-Leu-NH2
** D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Ψ(CH2-N)-Tac-NH2
호르몬 유도체의 보존된 결합 특성
실시예 21
담체 펩티드 [D-Lys 6 ]LH-RH와 비교시, 세포독성 LH-RH 효능제 유사체 Q 1 14 gL (DOX 함유 [D-Lys 6 ]LH-RH) 및 Q 6 14 gL(2-피롤리노-DOX 함유 [D-Lys 6 ]LH-RH)의 호르몬 활성 및수용체 결합 효능
화합물 호르몬 활성*(LH-RH에 대한 LH-반응=1) 랫트의 뇌하수체 수용체에 대한 IC50** 수치(nM) 유방암 수용체에 대한 IC50** 수치(nM)
Q1 14gL 15 2.29 7.24
Q6 14gL 10 5.59 6.70
[D-Lys6]LH-RH 8 2.26 1.80
상기 표에 있어서,
*문헌[참조: S. Vigh and A. V. Schally, Peptide 5, 241-247(1984)]에 기술된 바와 같이, 상기 유사체에 대한 LH 반응은 분산된 랫트의 뇌하수체 세포 초융합 시스템에서 측정한다.
**랫트의 뇌하수체 LH-RH 수용체 및 사람의 유방암 수용체에 대한 상기 유사체의 결합 친화성은, 문헌[참조: B. Szoke et al., Peptides, 15(2), 359-366(1994)]에 기술된 바와 같이, [125I] 표지된 [D-Trp6]LH-RH를 방사능 리간드로서 사용하는 경쟁적 결합 실험에서 측정한다. 결합 친화성은 IC50 수치로 표현되는데, 이는 방사능 리간드의 특이적 결합을 50% 억제하는데 필요한 비표지화된 유사체의 농도이다.
실시예 22
문헌[참조: Carlson et al., Thyrotropin-releasing hormone stimulation and somatostatin inhibition of growth hormone secretion from perfused ratadenohypophyses Endocrinology, 94, 1709-(1974)]에 기술된 바와 같이, 소마토스타틴 유사체가 관류된 랫트의 뇌하수체로부터의 성장 호르몬(GH) 분비를 억제한다. 따라서, 이 방법을 사용하여, 본 발명의 세포독성 소마토스타틴 유사체를 이의 모(parent) 담체 분자와 이들의 호르몬 활성에 대해 비교한다.
과융해된 랫트의 뇌하수체 세포로부터 사람의 성장 호르몬-방출 호르몬(hGH-RH(1-29)NH2)-유도된 성장 호르몬 방출이 소마토스타틴 유사체 S-98-I
및 S-121
에 의해 억제됨을 이들의 세포독성 유도체 Q1 14gS98-1(DOX14-O-glt-S-98-I) 및 Q1 14gS121(DOX14-O-glt-S-121)와 각각 비교한다.
랫트의 뇌하수체의 과융해 시스템에서, 소마토스타틴 유사체를 1nM hGH-RH(1-29)NH2와 함께 약 1nM의 용량으로 3분간 동시에 투여한다. 소마토스타틴 유사체를 6분간 더 주입한다. 1nM의 hGH-RH(1-29)NH2의 3분간 투여에 대한 GH의 반응을, 투여 종료한지 0 및 30, 60 및 90분 후 소마토스타틴 유사체의 관류 동안 측정한다. 표 6에 이에 대한 데이터가 있다.
소마토스타틴 유사체 소마토스타틴 유사체를 주입한 후, 상이한 시점에서 1nM hGH-RH(1-29)NH2의 3분간 투여에 의해 유도된 GH 방출**
S-98-I 2.9 94.7 117.6 -
Q1 14gS98 0 90 89.7 -
S-121 7.8 62.2 57.3 77.9
Q1 14gS121 8.8 58.5 54.3 67.7
** 소마토스타틴 유사체를 투여하기 전, 1nM hGH-RH(1-29)NH2의 3분간 주입에 의해 유도된 GH 방출을 퍼센트로 나타내었다.
실시예 23
세포독성 봄베신 길항제를 이용한 수용체 결합의 연구
초기에 기술 (1)된 바와 같이, 바이오-라드 엔지모비드(Bio-Rad Enzymobead) 방사능 요오드화 키트를 사용한 [Tyr4]BN(Sigma)의 방사능 요오드화 및 모노-요오드화된 [125I-Tyr4]BN의 분리를 수행한다. 표지화된 [Tyr4]BN의 결합 및 세포독성 봄베신 길항제 유사체인 Q6 14gB에 의한 대체는, Kris et al의 방법(3)의 변형된 방법(2)으로 24-웰의 플레이트에서 컨플루언트(confluent) Swiss 3T3 세포(American Type Culture Collection으로부터 수득 가능)를 사용하여 수행한다. 접종 후 3 내지 5일 후, 컨플루언트 세포를 한스 평형 염 용액(Hanks' Balanced Salt Solution: HASS)으로 2회 세척한 후, 총 용적이 0.5㎖인 결합 완충액(50mM HEPES를 갖는 DMEM, 0.1% 소의 혈청 알부민(BSA), MgCl25mM 및 바시트라신 100㎍/㎖, pH: 7.4)중에서 비표지화된 경쟁자(Q6 14gB 또는 BN)가 부존재하거나 또는 약간의 농도로 존재하는 경우에 [125I-Tyr4]BN 50pM과 함께 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 비특이적 결합은 비표지화된 리간드 1μM의 존재하에서 측정한다. 0.1% BSA를 함유한 빙-냉 HBSS(pH: 7.4)로 3회 세척한 후, 세포를 0.05% 트립신/0.53mM EDTA 용액으로 분리한 후, 튜브로 옮긴다. 방사능은 감마-카운터(Micromedic Systems Inc, Huntsville, AL)로 측정한다. 결합 데이터는 McPherson(4)에 의한 방사능 리간드 결합 분석 프로그램을 사용하여 측정한다. 표 7에 나타낸 Ki수치는, Cheng and Prusoff(5)의 공식에 따라 계산하였다.
1. Halmos, et al., Cancer Letters, 85, 111-118 (1994)
2. Cai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 12664-12688, (1994)
3. Kris, et al., J. Biol. Chem, 262: 11215-11220, (1987)
4. McPherson, G. A., J. Pharmaco Methods, 14: 213-228, (1985)
5. Cheng and Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, (1973)
봄베신과 비교시, 세포독성 봄베신 길항제 Q6 14gB[2-피롤리노-DOX14-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-(CH2-N)-Leu-NH2]의 스위스 3T3 세포주상의 봄베신 수용체에 대한 특이적 결합의 특성
화합물 Ki(nM)
봄베신 1.2
Q1 14gB 1.0
세포독성 라디칼 단독일 때와 호르몬 접합체일 때의 효과 및 세포독성에 대한 비교
실시예 24
에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스의 유방암(KS-49)에 대한, 2-피롤리노-DOX(Q 6 ), 세포독성 LH-RH 효능제 유사체 Q 6 14 gL(Q 6 14 - O-헤미글루타레이트에 결합된 [D-Lys 6 ]LH-RH) 및 (DOX)의 처리
세포독성 독소루비신 유도체 Q6, 이의 표적화된 세포독성 펩티드 접합체 Q6 14gL 및 널리 공지된 항신생물제 DOX의 종양 억제 활성을 비교하고 최적의 투여 방법과 비독성 투여량을 결정하기 위해, LH-RH 수용체 양성 MXT(3.2) 오벡스(ovex) 종양 조각(1㎣)을 암컷 B6D2F1 마우스의 피하에 이식한다. 이식 1일 후, 마우스를무작위로 그룹(1그룹당 5마리)으로 나누어 치료를 시작한다. 본 화합물을 0.1% 트리플루오로아세트산(pH 2)중에 용해시킨 후, 복막내로 주입한다. 표 8에서, 그룹, 치료 계획, 투여량 및 평균 생존 시간을 보여주고있다. 결과는 표 9 및 도 1에 요약하였다.
표 9는 종양의 용적 및 에스트로겐-독립적인 유방암을 갖는 마우스의 생존에 대한, Q6및 세포독성 LH-RH 유사체 Q6 14gL을 사용한 치료 효과를 나타낸다. 표 9에서 나타난 바와 같이, Q61.25n㏖을 1, 2, 7, 8, 14 및 15일째에 투여한 경우 (그룹 2), 17.4일의 평균 생존일을 보여주는 강력한 독성을 발휘하였는데, 이는 치료받지 않은 대조군의 생존일보다 상당히 짧다. 비교를 위해, 동일한 용량의 Q6 14gL을 투여한 경우(그룹 6), 평균 생존일이 30.8이었는데, 이는 치료받지 않은 대조군의 생존일보다 상당히 길다. Q6에 비해 Q6 14gL의 효능이 더 높다는 것은, 그룹 2(16일 째 1065㎣) 및 그룹 6(31일 째 863㎣)에서 평균 최종 종양 용적을 비교함으로써 증명될 수 있다.
3주 연속으로 1주에 5일 약물 0.5n㏖을 투여하는 상이한 치료 계획에서, Q6및 Q6 14gL을 비교해도 유사한 결론을 얻을 수 있다.
독성 투여량(총량: 1560n㏖, 평균 생존일: 20일)으로 독소루비신을 처리한 경우 종양을 없앨 수 없지만, 비-독성 투여량(총량: 7n㏖, 평균 생존일: 31일 이상)의 Q6 14gL으로 처리하면 종양이 더 이상 확장되지 않고 동물 5마리 당 2마리는 생존하였다.
그룹번호 투여 용량/주사(n㏖) 용량/주사(㎍) 주사/주 주사 사이의 일수 투여한주 총투여량 평균생존일
1 대조군 22
2 Q6 1.25 0.92 2 5 3 7.5 17.5
3 0.5 0.37 5 2 19.6
4 0.25* 0.19 9.5 14.6
5 0.2 0.15 21 13.0
6 Q6 14gL 1.25 2.9 2 5 7.5 30.8
7 0.5 1.16 5 2 26.8
8 0.25* 0.58 9.5 18.4
9 0.2 0.46 21 13.6
10 3.5 8.12 1 6 2 7 ＞31
11 4 9.28 8
12 5 11.6 10 13.4
13 DOX 520 340 3 1560 20.0
*9일째 부터 12일째까지는 투여량을 2.5n㏖로 증가시킨다. 9일째 부터 12일째까지 용량은 5.0n㏖로 증가시킨다.
번호 그룹 투여의 형태 최종 종양의 용적(㎣) 측정 일수 평균 생존(일) 그룹당5마리의마우스로부터종양없이생존한마우스의 수
용량/주사(n㏖) 주당 주사횟수 주사사이의 휴식(일) 치료 기간(주) 총주사량(n㏖) 18일째 31일째
1 대조군 7322 21 22.0±1.6 0 0
2 Q4 1.25 2 5 3 7.5 1065 16 17.4±0.2 0 0
6 Q6 14gL 1.25 2 5 3 7.5 863 31 30.8±0.4** 2 0
3 Q6 0.5 5 2 3 7.5 2531 18 19.6±0.7 0 0
7 Q6 14gL 0.5 5 2 3 7.5 3978 31 26.8±2.6** 1 0
10 Q6 14gL 3.5 1 6 2 7 669 31 ＞31** 4 2
12 Q6 14gL 5.0 1 6 2 10 0 10 13.4 0 0
13 DOX 520 1 6 3 1560 1560 28 20 1 0
** 생존일은 유의적으로 길어졌다(p＜0.01). 던칸의 시험(Duncan's test)을 사용한 대조군 데이터와 비교시 생존일은 유의적으로 짧아졌다(p＜0.01 또는 p＜0.05).
실시예 25
에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스의 유방암(KS-55)에 대한 DOX, 세포독성 LH-RH 유사체 T-107 및 Q 1 14 gL의 단일 치료의 효과
시험 화합물:
Q1 14gL: [D-Lys6]LH-RH에 결합된 독소루비신14-O-헤미글루타레이트;
T-107: [D-Lys6]LH-RH에 결합된 N-글루타릴-독소루비신[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 89. Pp 972-976(1992)]; 및
DOX
분석은 하기와 같이 수행된다:
최대 허용 투여량을 측정하고 그 효과를 비교하기 위해, MXT(3.2) 오벡스 종양 조각(1㎣)을 암컷 B6D2F1 마우스 피하에 이식한다. 이식 1일 후, 마우스를 무작위로 그룹(1그룹당 5마리)으로 나누고, 복막내로 단일 주사하여 치료한다. 그룹 및 투여량은 표 10에 나타나있다. 이 표에서는, 또한 용적 측정시 종양을 갖는 마우스의 수 및 그룹에 대한 평균 생존 기간도 보여주고 있다. 도 2에서는 종양 용적의 변화를 보여주고 있다. 본 화합물을 0.1% TFA(pH: 2.0)중에 용해시킨다. 종양의 용적은 10, 13, 17 및 20일 째 되는 날에 측정한다.
표 10 및 도 2에서 보듯이, T-107(N-글루타릴-DOX에 결합된 [D-Lys6]LH-RH)은 마우스 20g당 850n㏖의 투여량에서 본 종양의 성장을 억제하는데 있어서 전혀 효과가 없었다. 반면에, Q1 14gL(14-O-글루타릴-DOX에 결합된 [D-Lys6]LH-RH)는 마우스 20g당 650n㏖의 비독성 투여량에서 종양 성장을 강력히 억제하였다(도면). DOX 단독은, 마우스 20g당 650n㏖의 단일 투여량에서 독성이 컸고(평균 생존 기간:13.6일), Q1 14gL 보다 상당히 효과가 적었다(도 2).
번호 그룹 용량 종양 마우스의 수/생존한 마우스의 수 평균 생존
n㏖/20g ㎍/20g μ㏖/㎏ 10일 13일 17일 20일 일수
1 대조군 5/5 5/5 5/5 5/5 21.2±0.3
2 Q1 14gL 680 1520 34 1/4 2/4 2/4 3/4 28.6±6935.3±25**
3 Q1 14gL 710 1587 35.5 2/4 3/4 3/4 3/4 26.0±6632.0±34*
4 Q1 14gL 760 1698 38 3/5 4/5 4/5 (Sacr.) (Sacr.)
5 DOX 650 427 32.5 3/3 2/2 1/1 1/1 13.6±25
6 DOX 700 460 35 2/3 2/3 2/2 15.2±24
7 DOX 750 493 37.5 1/1 7.8±1.3
8 T-107 750 1676 37.5 5/5 5/5 5/5 4/4 21.8±05
9 T-107 850 1900 44.4 5/5 5/5 5/5 4/4 21.6±07
*생존일은 대조군의 생존일에 비해 유의적으로 짧다(p<0.01)
**대조군(2일 째 사고로 죽은 마우스 1마리는 이들 2개의 그룹으로부터 제거하였다)과 비교한 바와 같이, 생존일은 유의적으로 길다(p<0.01 또는 *p<0.05).
실시예 26
에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스의 유방암(KS-47)에 대한 세포독성 LH-RH 유사체의 효과
치료에 사용된 물질
초기 실험에서, Q2는 17일 동안 매일 20n㏖을 투여한 때는 종양 성장에 대한 억제 효과가 그리 크지 않았지만, 40n㏖을 투여한 때에는 독성을 나타내었다(평균 생존 기간: 14.6일). Q2 14gL([D-Lys6]LH-RH에 결합된 Q2), Q2(피롤리디노-독소루비신), [D-Lys6]LH-RH 및 [D-Lys6]LH-RH+Q2의 효능 및 독성을 비교하는 본 실험에서는, 매일 30n㏖의 투여량을 사용하였다.
MXT(3.2) 오벡스 종양 조각(1㎣)을 암컷 B6D2F1 마우스에 이식한다. 이식 1일 후 치료를 시작하고, 하루에 1번씩 12일 동안 복막내로 주사한다. 모든 그룹에 표 11에 나타나 있는 바와 같이 등몰량의 화합물을 주입한다. 종양은 10, 14 및 18일째에 측정하고, 종양의 용적을 계산한다. 데이터는 표 11 및 도 3에 나타내었다.
다우노스아민 변형된 독소루비신 유사체 Q2(피롤리디노-DOX)를 매일 30n㏖ 투여한 치료에서는, 종양 성장 억제 효과가 컸음에 반하여(대조군의 종양 용적 1391㎣에 비해, 14일 째 종양 용적 144㎣), 독성이 너무 강하여 실험이 종료되기 전에 동물들이 모두 죽었다(평균 생존일: 17.9일). 이와 유사하게, [D-Lys6]LH-RH와 혼합된 Q2(혼합물)을 사용한 경우도, 종양 억제 효과가 컸으나(14일 째 종양 용적: 80㎣), 평균 생존일(18.5일)은 비처리된 대조군(23.1일)에 비해 유의적으로 짧았다. Q2 14gL([D-Lys6]LH-RH에 공유 결합된 Q2)로 치료한 결과, 2마리의 동물이 죽었는데 한 마리는 16일 째, 다른 한 마리는 26일 째에 죽었다. 생존한 8마리 중 한 마리에서만 18일 째의 최종 측정에서 종양이 발생되었다. 이들 모두 건강하게 보였으나, 후에 모두에게서 종양이 발생하기 시작하였다. 본 그룹의 평균 생존일은 대조군에 비해 유의적으로 길었다(28.3일). [D-Lys6]LH-RH만으로 치료한 경우, 종양 성장에는 영향이 없었다.
본 실험에서는, 독성 라디칼 Q2에 비해 Q2 14gL이 높은 효능 및 낮은 말초 독성을 갖는 것은, 세포독성 라디칼이 표적화된 담체 LH-RH 유사체에 공유 결합되었기 때문이라는 것을 보여준다.
에스트로겐에 독립적인 MXT 마우스의 유방암의 성장 및 종양을 갖는 마우스의 생존에 대한 세포독성 LH-RH 유사체의 효과
번호 치료 용량(㎍/일) 마우스의 수 측정일에서의 ㎣당 평균종양 용적 이식 후 평균 생존(일)
10 14 18
1 대조군 15 253 1391 4794 23.1
2 Q2 14gL 68.7 10 33 16 23 28.3*
3 Q2 21.3 10 153 144 137 17.9
4 [D-Lys6]LH-RH 48.0 10 165 1348 4003 23.5
5 [D-Lys6]LH-RH+Q2 48.0+21.3 10 121 80 27 18.5
1일 투여량은 모두 30n㏖의 등몰량이다.
대조군보다 유의적으로 짧은 기간(p<0.05).
*던칸의 시험시 대조군 보다 유의적으로 긴 기간(p<0.01).
실시예 27
안드로겐에 의존적인 랫트 Dunning R-3327-H 전립선 암종의 성장에 대한, 2-피롤리노-DOX(Q 6 ) 및 세포독성 LH-RH 효능제 유사체 Q 6 14 gL(Q 6 14 - O-헤미글루타레이트에 결합된 [D-Lys 6 ]LH-RH)의 효과
호르몬에 의존적인 Dunning R-3327-H 전립선 암종을 갖는 수컷 코펜하겐 랫트를, 2-피롤리노독소루비신에 결합된 효능제 [D-Lys6]LH-RH로 이루어진 황체화 호르몬-방출 호르몬(LH-RH)의 새로운 세포독성 유사체인 Q6 14gL로 치료한다. 첫 번째 실험에서, 2-피롤리노독소루비신을 단일 약물(Q6)로서 및 [D-Lys6]LH-RH와 접합되지 않은 혼합물로서 또는 담체 [D-Lys6]LH-RH에 접합된 혼합물(Q6 14gL)로서 50n㏖/㎏의 농도로 투여한다. 50n㏖/㎏의 라디칼 Q6을 2차로 단독으로 또는 [D-Lys6]LH-RH와 혼합하여 투여한 후, 모든 랫트들은 일반적인 독성 증상을 보이며 죽은 반면, 세포독성 LH-RH 접합체 Q6 14gL로 치료한 모든 랫트들은 살아 남았다. Q6 14gL을 총 투여량 150n㏖/㎏로 5주간 치료한 후에, 종양이 실험 시작시 8.35±1.7㎤의 초기 용적에서 4.47±0.8㎤로 감소한 반면, 대조군의 종양은 계속 성장하여 17.84±2.2㎤로 측정되었다. 또한, Q6 14gL을 사용한 치료는 종양 중량 및 종양 부담(burden)를 크게 감소시켰다. Q6및 Q6 14gL의 효능 및 독성을 비교하기 위한 두 번째 실험에서, 치료 요법은 25n㏖/㎏의 Q6또는 25n㏖/㎏ 및 50n㏖/㎏의 Q6 14gL를 3회 적용하는 것으로 이루어져 있다. 치료가 시작되었을 때, 모든 그룹에서의 종양 용적은 3.9 내지4.5㎤ 사이였다. 처리되지 않은 동물의 15.6±2.2㎤와 비교했을 때, 치료 5주 후, 50n㏖/㎏의 Q6 14gL로 치료한 랫트의 종양은 2.3±0.51㎤로 감소한 반면, 25n㏖/㎏의 Q6는 여전히 독성을 가지며 최종 종양 용적을 6.76±1.4㎤로 감소시킬 뿐이고, 이는 25n㏖/㎏의 Q6 14gL에서 얻은 수치(6.74±1㎤)와 유사하다. 표본에 대한 조직학적 평가를 보면, Q6 14gL로 치료한 그룹에서만 유사분열 세포수가 상당히 감소하였다. 결합력이 큰 LH-RH 수용체가 비처리된 Dunning 종양 표본의 세포막에서 검출되었지만, Q6 14gL로 치료한 후 에는 LH-RH에 대한 결합 부위를 발견할 수 없었다. 또한, AN-201 및 Q6 14gL에 의한 종양 성장 억제는 EGF 수용체의 결합 능력의 상당한 감소와 관련이 있다. 도 4 내지 6에서 보듯이, 표적화된 세포독성 LH-RH 유사체 Q6 14gL은 랫트 Dunning R-3327-H 전립선 암종의 퇴행을 유발하는 효과적인 항암제이다. 본 연구에서는, 세포독성 LH-RH 유사체 Q6 14gL이 항신생물성 라디칼(Q6)에 비해 독성이 훨씬 덜하고, 종양 성장의 억제 효과도 훨씬 크다는 것을 보여준다.
실시예 27의 도의 설명:
도 4. 실험 Ⅰ: 50n㏖/㎏의 효능제 [D-Lys6]LH-RH 및 50n㏖/㎏의 세포독성LH-RH 유사체 Q6 14gL을 3회 투여하는 것으로 이루어진 치료 동안의 랫트 Dunning R-3327-H 전립선 암종 이식체를 갖는 수컷 코펜하겐 랫트에서의 종양 용적. 수직선은 평균표준오차(SEM)을 나타낸다. *p<0.05; **p<0.01 대(versus) 대조군 (던칸의 신규한 다중범위 시험(Duncan's new multiple range test)에 의함). 화살표는 1, 8 및 29일 째에 치료한 것을 나타낸다.
＋단일 약물로서 또는 [D-Lys6]LH-RH와 비접합된 혼합물로서 Q6로 치료한 동물은 2번째 주에 죽었다. 이 두 그룹에서, 8일 째 기록된 종양의 용적이 나타나있다.
도 5. 실험 Ⅱ: Dunning R-3327-H 전립선암을 갖는 랫트에서, 종양 용적에 대한 25n㏖/㎏의 2-피롤리노독소루비신(Q6), 25n㏖/㎏ 및 50n㏖/㎏의 세포독성 LH-RH 유사체 Q6 14gL을 이용한 치료 효과. 수직선은 평균표준오차(SEM)을 나타낸다. *p<0.05; **p<0.01 대(versus) 대조군. 화살표는 3회, 즉 1, 8 및 29일 째에 치료한 것을 나타낸다.
도 6. 실험 Ⅱ: Dunning R-3327-H 전립선암을 갖는 코펜하겐 랫트의 체중에 대한 25n㏖/㎏의 2-피롤리노독소루비신(Q6), 25n㏖/㎏ 및 50n㏖/㎏의 세포독성 LH-RH 유사체 Q6 14gL을 이용한 치료 효과. 수직선은 평균표준오차(SEM)을 나타낸다. *p<0.05; **p<0.01 대(versus) 대조군. 화살표는 3회, 즉 1, 8 및 29일 째에 치료한 것을 나타낸다.
실시예 28
누드(nude) 마우스에서 OV-1063 사람의 난소암 성장에 대한, 독소루비신(DOX) 및 표적화된 세포독성 LH-RH 효능제 유사체 Q 1 14 gL(DOX 14 -O-헤미글루타레이트에 결합된 [D-Lys 6 ]LH-RH)의 효과에 대한 비교 연구
사람의 난소 상피 암세포주 OV-1063은 57세 여성의 난소의 전이성 유두상 낭선암종으로부터 기원된다[참조: Horowitz et, al. (1985) Oncology 42, 332-337]. OV-1063의 천만개 세포를 3마리의 누드 마우스의 피하에 주사하여 종양을 성장시킨다. 생체내 성장 억제 연구를 위해, 이들 종양의 1㎣ 조각을 60마리에 이식한다. OV-1063상에 LH-RH에 대한 수용체가 존재하기 때문에, 세포독성 라디칼 DOX를 함유하는 LH-RH의 세포독성 접합체가 세포독성 라디칼 DOX보다 효과적이며 독성이 작다는 것을 보여주는 것이 본 실험의 목적이다. 따라서, 세포독성 LH-RH 접합체의 효과를 DOX, DOX와 담체 분자와의 혼합물, 담체 분자 단독 및 비처리된 대조군의 효과와 비교하였다. 모두 복막내 주사로 투여한다. 화합물을 물(염수) 중에 0.9% 염화나트륨에 용해시킨다.
평균 종양 크기가 약 15mm3인 마우스를 9마리 씩 6개 그룹으로 나눈 후, 종양 이식후 7일 동안 하기의 치료를 한다: 그룹 1, 염수; 그룹 2, 동물 20g 당 700n㏖ 투여량의 Q1 14gL; 그룹 3, 동물 20g 당 413n㏖ 투여량의 Q1 14gL(DOX에 대한 MTD, 최대 허용 투여량); 그룹 4, 동물 20g 당 413n㏖ 투여량의 DOX(MTD); 그룹 5, 동물 20g 당 700n㏖ 투여량의 DOX와 동물 20g 당 700n㏖ 투여량의 [D-Lys6]LH-RH와의 혼합물; 그룹 6, 동물 20g 당 700n㏖ 투여량의 담체 효능제 유사체 [D-Lys6]LH-RH.
OV-1063의 수용체 분석을 통해, LH-RH에 대한 친화성이 큰 결합 부위가 존재한다는 것을 알 수 있었다.
결과: 도 7에 나타난 바와 같이, Q1 14gL(그룹 3)을 413n㏖/20g의 투여량으로치료한 결과, 종양 성장이 크게 억제되었다. 동물들은 독성 증상을 심하게 나타내지 않았다. 비교를 위해, DOX를 413n㏖/20g(12mg/kg, MTD, 그룹 4)의 동일 투여량으로 투여한 치료에서는, 실험 종료시에 생존한 3마리 동물에서 종양 성장 억제 효과가 크지 않았다. 독성으로 인해 5일 째까지 3마리의 동물이 죽었고, 9일 째까지 6마리의 동물이 죽었다. 보다 높은 투여량(700n㏖/20g, 그룹 2)에서, Q1 14gL은 종양 성장을 매우 강력히 억제하였다(도 7). 독성으로 인해 9마리 중 2마리가 죽었고, 1마리는 사고로 죽었다. 살아남은 6마리의 동물은 실험 종료시에 약 20%의 체중 손실로부터 회복되었다. 그룹 6에서, 동일한 투여량(700n㏖/20g)의 DOX를 700n㏖의 [D-Lys6]LH-RH과 혼합하였다. 5일째까지 강한 독성으로 인해 이 그룹의 모든 동물이 죽었다.
결론: 상기 연구 결과를 통해, 난소 상피 암 OV-1063의 세포상에 LH-RH에 대한 수용체가 존재하기 때문에, 세포독성 라디칼인 독소루비신(Q1)을 함유하는 표적화된 세포독성 LH-RH 접합체 Q1 14gL이 세포독성 라디칼인 독소루비신(Q1)보다 낮은 독성 및 높은 항암 활성을 갖는다는 것을 명백히 알 수 있다.
본 발명을 위한 연구과정에서, 14번 위치에서 디카르복실 잔기를 통해, 독소루비신과 이의 유도체가 결합하여, 약리학적으로 효과적인 신규의 접합체를 수득할 수 있다는 사실이 밝혀졌을 뿐만 아니라, 인접 및 분리된, 즉 α,β-또는 α,γ-하이드록시 1차 아민으로부터 부분 포화된 헤테로사이클릭 잔기를 형성하는 새로운 방법이 제공되었다.

Claims (5)

  1. α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민의 1차 아미노기의 질소를, 단일 불포화 질소를 함유하는 5 또는 6원의 헤테로사이클 화합물의 질소로 전환시키기 위한 하기의 순차적 단계를 포함하는 방법:
    (a) 알데히드 탄소를 가지며 또한 할로가 탄소 원자를 함유하고 알데히드 탄소와 CH2, CH2CH2및 OCH2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탄소를 갖는 할로 사이에 2 또는 3개의 잔기를 갖는 할로알데히드의 과량으로 α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민을 처리하는 단계;
    (b) 하이드록시아민에 비해 과량의 유기염기를 첨가하는 단계;
    (C) 상기의 염기를 약산으로 중화시키는 단계; 및
    (d) 희석화한 수성산으로 처리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, (a) 단계가 비양자성 반응 불활성 유기 용매중에서 수행되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계가 극성 비-하이드록시 반응 불활성 유기 용매중에서 수행되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 용매가 디메틸 포름아미드인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 알데히드가 오메가-브로모-, 오메가-요오도-부티르알데히드 및 발레르알데히드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
KR10-2004-7004548A 1995-11-27 1996-11-14 α,β- 또는 α,γ-하이드록시 1차 아민의 1차 아미노기의질소를, 단일 불포화 질소를 함유하는 5 또는 6원의헤테로사이클 화합물의 질소로 전환시키기 위한 방법 KR100467899B1 (ko)

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