ES2310222T3 - Sintesis de compuestos heterociclicos que contienen anillos de cinco o seis miembros. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la conversión del nitrógeno de un grupo amino primario de una alfa,beta- o alfa,gamma-hidroxi-amina primaria en el nitrógeno de un compuesto heterocíclico que contiene nitrógeno monoinsaturado que tiene entre 5 y 6 átomos en el anillo, que comprende las etapas secuenciales de a) tratar dicha hidroxi-amina con un exceso de un haloaldehído que tiene un carbono del aldehído, un carbono que porta halo y que tiene 2 ó 3 restos entre el carbono del aldehído y el carbono que porta halo, seleccionado del grupo que consiste en CH2, CH2-CH2 y OCH2, b) añadir un exceso, con relación a la hidroxi-amina, de una base orgánica, c) neutralizar dicha base con un ácido débil y d) tratar con un ácido acuoso diluido.

Description

Síntesis de compuestos heterocíclicos que contienen anillos de cinco o seis miembros.

Campo de la invención

Esta invención es en el campo de la química de derivados de antraciclina anticancerosos dirigidos. Más particularmente, se refiere a una nueva reacción de síntesis en el campo de la doxorubicina (DOX) o sus derivados modificados con daunosamina (DM-DOX) unidos de forma covalente a análogos de hormonas peptídicas, tales como LH-RH, bombesina y somatostatina. Estos conjugados covalentes se dirigen contra diferentes tumores que llevan receptores para los análogos de hormonas peptídicas.

Discusión del estado anterior de la técnica

Se presentan análogos de LH-RH con radicales citotóxicos en la posición sexta en Schally, Janaky y Bajusz, documento EP 0 450 481 B1, publicación de la concesión el 6 de septiembre de 1995.

Se describen análogos de GnRH (LH-RH) para destruir hormonas gonadotropas en Nett y Glode, documento WO 90/09799, publicado el 6 de septiembre de 1990. Esta solicitud describe toxinas, como ricina, unida a análogos de LH-RH para destruir hormonas gonadotropas y curar de esta manera los cánceres dependientes de hormonas sexuales. Se menciona también el derivado de LHRH doxorubicina sin explicar la química de unión.

Se describen análogos citotóxicos de somatostatina por Schally et al. en la solicitud de patente de EE.UU. presentada el 6 de abril de 1990 y vuelta a presentar el 15 de julio de 1993 con el Nº de serie 08/076.846.

Una revisión realizada por Schally en Anti-Cancer Drugs 5, 115-130 (1994) da detalles sobre la presencia de receptores en las membranas celulares de un gran números de tumores para análogos de LH-RH, bombesina o somatostatina.

G. Weckbecker enumera varias referencias que muestran la presencia de receptores y subtipos de receptores para análogos de somatostatina sobre diferentes tejidos normales y tumorales en su revisión en Farmac. Ther. 60, 245-264 (1993).

Se discuten péptidos similares a la bombesina y la presencia de receptores de bombesina/GRP en diferentes tejidos normales y tumorales en la revisión de N. Bunnett en Gut Peptides. Biochemistry and Physiology 423-445 (1994) Ed.: J. Walsh J. Dockray, Raven Press, Nueva York y en E. Spindell en Recent Progress en Hormone Research 48, (1993) (Academic Press).

Actualmente, doxorubicina (DOX) es, en este momento, el agente anticancerígeno más ampliamente utilizado y más potente. Sin embargo, ciertos tumores no responden a él en absoluto y su uso está también limitado por resistencia a los multifármacos (MDR, por sus siglas en inglés) y cardiotoxicidad, así como neutropenia, que son los resultados de tratamientos crónicos. Para superar estas desventajas y para seguir explotando el enorme potencial tumoricida inherente en la estructura de antibióticos de antraciclina, se han descrito miles de derivados sintéticos, incluyendo sus análogos dirigidos unidos a diferentes macromoléculas portadoras.

Se describe la mayor parte de la historia de DOX y de sus análogos en "Adriamycin", David W. Henry, ACS Symposium Series, Nº 30, Cancer Chemoterapy, American Chemical Society, páginas 15-57 (1976) y en el libro Doxorubicin, Federico Arcamone, Academic Press, (1981).

Se describen 3'-desamino-3'-(3''-ciano-4''-morfolinil)-DOX y sus derivados, que son alquilantes y muy activos y sin resistencia cruzada, y que tienen una actividad antitumoral, en Mosher, et al. documento de patente de EE.UU. 4.464.529, de 7 de agosto de 1984. Se describe también la síntesis y evaluación biológica de estas "morfolinil-antraciclinas muy potentes" en J. Med. Chem. 1984, 27, 638-645.

En Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 88, páginas 4845-4849, junio de 1991, Gao et al. describen la alquilación mediada por formaldehído de una secuencia de DNA mediante un derivado de daunorubicina.

Se describen compuestos análogos de antraciclina, que llevan sustituyentes alquilantes latentes en J. Med. Chem. 35, 3208-3214 (1992).

Se describe el uso de un \alpha,\omega-diyodo-compuesto para la alquilación del nitrógeno de la daunosamina de DOX y de esta manera la formación de un nuevo derivado de morfolinil-DOX en el documento de patente europea EP 434 960, solicitada por Pharmacia Carlo Erba el 12 de diciembre de 1989.

Se describen como análogos de ^{14}-O-valerato de N-trifluoroacetil-adriamicina(AD-32) ^{14}-O-hemiglutarato y
^{14}-O-hemiadipato de N-trifluoroacetil-adriamicina con hidrosolubilidad mejorada, en Israel et al., patente de EE.UU. documento 4.299.822, de noviembre de 1981.

Horton y Priebe (J. Antibiotics, XXXVI, 1211-1215) describen varios 14-O-ésteres de diferentes análogos de antraciclina sin grandes cambios en la actividad anticancerosa, en comparación con los análogos antecesores 14-OH.

En la técnica de diseñar agentes quimioterapéuticos dirigidos, se buscan los siguientes objetivos:

1. Unión estable entre la molécula portadora y el agente quimioterapéutico hasta que se haya alcanzado la diana.

2. Conservación de las características biológicas de la molécula portadora dentro del conjugado, tal como propiedades de unión conservadas.

3. Actividad farmacológica conservada del agente quimioterapéutico dentro del conjugado, tal como actividad citotóxica conservada.

4. Como un resultado de la conjugación, la producción de análogos de actividad más intensa y/o toxicidad periférica inferior con respecto a sus restos no conjugados.

Se describe en Sela, et al., patente de EE.UU. Nº 4.263.279, de 21 de abril de 1981, la conjugación de DOX mediante oxidación con NaIO_{4} del resto de daunosamina de DOX seguida de una alquilación reductora que implica a una amina primaria de una molécula portadora.

Se utilizó un espaciador de ácido cis-aconítico para unir el nitrógeno de daunosamina a los portadores macromoleculares con una unión sensible al pH, tal como se describe en Biochem. Biophys. Res. Común. 1981, 102, páginas 1048-1054.

Se describe la formación de enlaces éster y de uniones C-N entre 14-bromodaunorubicina y proteínas o poli-L-aminoácidos por Zunino et al. (1981) Tumori 67, 521-524 y (1984) Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 20, 421-425.

Tal como se describe en Bioconjugate Chemistry 1990 1(5), 325-330, se conjugó morfolino-DOX (un análogo de DOX modificado con daunosamina muy activo) a un anticuerpo mediante una unión de hidrazona hidrolizable (lisosomotropa, sensible al pH), implicando a la función oxo en el C 13 del agente citotóxico.

Tal como se describe en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79, 626-629, se utilizó con éxito la sensibilidad del enlace de carboxamida de un resto de leucina a la degradación enzimática en conjugados de DOX que contenían un péptido con "brazo espaciador", preferiblemente Ala-Leu-Ala-Leu, en el que el terminal carboxilo de Leu acila el nitrógeno de la daunosamina en DOX y el terminal amino de Ala se une al portador a través de espaciador de ácido dicarboxílico.

Tal como se describe en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992,89, 972-976, se aciló el nitrógeno de la daunosamina de DOX mediante un espaciador de ácido glutárico y se unió a análogos de LH-RH con una grave pérdida de la actividad citotóxica.

Otras referencias relacionadas con el uso de los compuestos según la presente invención para el tratamiento de diferentes tumores humanos:

1. Schally et al. (1996) en Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives. Eds. Filicori, M & Flamigni, C (Parthenon, Carnforth, R. U.), páginas 33-44.

2. Nagy et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7269-7273.

3. Yano et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7090-7094.

4. Rekasi et al. (1993) Endocrinology 132 (5) 1991-2000.

5. Srkalovic et al. (1990) Cancer Res. 50, 1841-1846.

6. Emons et al. (1993) Cancer Res. 53, 5439-5446.

7. Emons et al. (1993) J. of Clin. Endocrin. and Metabol. 77 (6) 1458.

8. Schally, A. V. (1988) Oncological applications of somatostatin analogs. Cancer Res. 48, 6977-6985.

9. Schally et al. (1994) Internat. J. of Pancreatology 16, 277-280.

10. Srkalovic et al. (1990) J. of Clin. Endocrin. and Metabol. 70 (3), 661-669. 4 Pinski et al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

11. Radulovic et al. (1992) Cancer Letters 62, 263-271.

12. Quin et al. (1995) Int. J. Cancer 60, 694-700.

13. Radulovic et al. (1992) P. S. E. B. M. 200, 394-401.

14. Radulovic et al. (1994) Acta Oncologica 33 (6) 693-701.

15. Pinski et al. (1993) Cancer Letters 71, 189-196.

16. O'Byrne et al. (1994) Eur. J. of Cancer 30A (11) 1682-1687.

17. Pinski et al. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

18. Pinski et al. (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

19. Pinski et al. (1996) Int. J. Cancer 65, 870-874.

20. Banks et al. (1992) Anticancer Drugs 3, 519-523.

21. Reubi y Kvols (1992) Cancer Res. 52, 6074-6078.

22. Schally et al. (1994) Internat. J. of Pancreatology 16, 277-280.

23. Halmos et al. (1995) Cancer Res. 55, 280-287.

24. Halmos et al. (1994) Cancer Letters 85, 111-118.

25. Quin et al. (1994) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 120, 519-528.

26. Quin et al. (1994) Cancer Res. 54, 1035-1041.

27. Quin et al. (1995) Int. J. Cancer 63, 257-262.

28. Reile et al. (1994) The Prostate 25, 29-38.

29. Pinski et al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

30. Radulovic et al. (1992) P. S. E. B. M. 200, 394-401.

31. Radulovic et al. (1994) Acta Oncologica 33 (6) 693-701.

32. Pinski et al. (1993) Cancer Letters 71, 189-196.

33. Pinski et al. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

34. Pinski et al. (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

Todas las referencias citadas se incorporan aquí como referencia.

Sumario de la invención

Se ha encontrado una nueva reacción de síntesis para los compuestos de la invención, hormonas peptídicas citotóxicas dirigidas que comprenden un agente citotóxico de antraciclina, tal como DOX o DM-DOX, conjugada con una hormona peptídica, tal como análogos de LH-RH, bombesina y somatostatina. Estos conjugados citotóxicos de hormonas peptídicas se diseñan para el tratamiento de tumores que llevan receptores específicos para el conjugado, tal como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de estómago y cáncer de pulmón. Ciertos agentes citotóxicos de antraciclina (no conjugados) que aquí se utilizan son nuevos por sí mismos, y son muy potentes, sin embargo su nivel de toxicidad es demasiado elevado para ser utilizados de forma no conjugada.

Se desarrollaron los compuestos análogos de DOX modificados con daunosamina presentados en esta invención durante una búsqueda de nuevos análogos muy activos, sin resistencia cruzada y apropiados para la formación de conjugados covalentes con portadores peptídicos.

Se consiguió la formación de conjugados estables unidos de forma covalente con las actividades biológicas de sus componentes completamente conservadas utilizando un espaciador de ácido dicarboxílico, como el ácido glutárico. Un grupo carboxílico del espaciador forma un enlace éster con el grupo OH 14 de DOX o DM-DOX y el otro grupo carboxílico del espaciador forma un enlace carboxamido con un grupo amino libre bien elegido del portador peptídico.

Los compuestos de esta invención se representan por la fórmula general

(I)Q^{14}-O-R-P

en la que Q tiene la fórmula general

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1

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Q^{14} significa un resto Q con una cadena lateral en la posición 14,

R es un enlace sencillo o -C(O)-(CH_{2})_{n}-C(O)- y n = 0-7,

R' es NH_{2} o un compuesto aromático heterocíclico, saturado o parcialmente saturado, de 5 o 6 miembros, que tiene al menos un nitrógeno en el anillo y que tiene opcionalmente un resto de butadieno unidos a átomos de carbono adyacentes de dicho anillo para formar un sistema bicíclico,

P es H o un resto peptídico, de manera apropiada un análogo de LHRH, somatostatina o bombesina, pero sin excluir otros péptidos fisiológicamente activos. Son particularmente preferibles los análogos de LHRH que tienen afinidad por los receptores de las células neoplásicas, especialmente los análogos que tienen un resto D-Lys en la posición 6, así como análogos acortados de somatostatina y bombesina. Sin embargo, cuando R' es NH_{2}, entonces R-P es diferente de H. Cuando R-P es H, entonces R' es diferente de NH_{2}.

En el transcurso de este trabajo se ha descubierto una nueva reacción de síntesis. No solamente se encontró que doxorubicina y sus derivados se pueden acoplar a través de un resto dicarboxílico en la posición 14 para proporcionar nuevos conjugados farmacológicamente eficaces, sino que se proporcionó un nuevo modo de formar restos heterocíclicos parcialmente saturados a partir de aminas primarias vecinas y separadas, es decir \alpha,\beta- o \alpha,\gamma-hidroxi-aminas primarias. La aplicación particular en la presente invención era la formación de restos 2''-pirrolinilo y 1'',3''-tetrahidropiridinilo en el azúcar daunosamina. Sin embargo, esta reacción tiene una aplicabilidad más amplia. Se pueden formar restos heterocíclicos de 5 y 6 miembros, parcialmente saturados, cuando una hidroxi-amina vecina o separada se hace reaccionar con un aldehído halo-sustituido con 2 ó 3 restos entre el carbono del aldehído y el átomo de carbono que tiene el grupo halo. Estos restos pueden ser todos metileno, o puede estar implicado un heteroátomo tal como oxígeno. La reacción tiene lugar en tres etapas. Un exceso muy grande del haloaldehído se hace reaccionar con la sal ácida de la hidroxi-amina, adecuadamente en un disolvente orgánico anhidro polar e inerte. Se forma así un anillo de oxazolidina de cinco miembros (o un anillo de 1,3-tetrahidroazina de seis miembros) mediante condensación del grupo aldehído con los grupos hidroxilo y amina. Este producto se trata con una base orgánica, de manera adecuada una amina terciaria, eliminándose los elementos de ácido hidro-hálico entre el resto halo del anterior haloaldehído y el grupo amino secundario del anillo de la oxazolidina o de la 1,3-tetrahidrooxazina para formar una estructura de anillo condensada mediante la adición de un anillo de 5 o 6 miembros. Seguidamente se neutraliza la base con un ácido débil, convenientemente un ácido orgánico tal como ácido acético glacial. El tratamiento con ácido acuoso, convenientemente un ácido orgánico, abre la parte de oxazolidina o 1,3-tetrahidrooxazina del anillo condensado. Se entenderá por los expertos en la técnica que dependiendo del aldehído inicial, el anillo final de nitrógeno contenga al menos un heteroátomo adicional, tal como se menciona anteriormente. Se puede ilustrar como sigue la reacción general:

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2

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3

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4

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en donde

X' es halo, de manera adecuada bromo o yodo, preferiblemente yodo,

Y es CH_{2}, OCH_{2}, CH_{2}CH_{2},

Z no es nada o es CH_{2}.

Cuando Z no es nada, el resto aldehído forma un anillo de oxazolidina de 5 miembros como primera etapa de la reacción. Cuando Z es CH_{3}, el resto aldehído forma un anillo de 1,3-tetrahidrooxazina de 6 miembros. Mientras que formaciones de anillo de este tipo son bien conocidas, en combinación con el cierre del anillo efectuado por la cadena lateral del haloalcano en un medio de reacción de carácter básico, tal como una amina terciaria en un medio anhidro, la reacción es nueva y sorprendente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico de los cambios de volumen de cánceres de mama de ratón MXT independientes de estrógeno para diferentes niveles de dosis de compuestos de la presente invención y de DOX.

La Figura 2 es un gráfico de los cambios de volumen de cánceres de mama de ratón MXT independientes de estrógeno para diferentes niveles de dosis de un cierto compuesto de la presente invención, un compuesto del estado anterior de la técnica, DOX y un control.

La Figura 3 es un gráfico del efecto de ciertos análogos citotóxicos de LHRH en la supervivencia de ratones con cánceres de mama de ratón MXT independientes de estrógeno.

La Figura 4 es un gráfico de volúmenes tumorales en ratas macho de Copenhague que llevan unos trasplantes de carcinoma de próstata Dunning R-33327-H de rata durante el tratamiento con un agonista del estado anterior de la técnica y con un cierto compuesto de la presente invención.

La Figura 5 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con un cierto compuesto de la presente invención y con el correspondiente análogo citotóxico de LH-RH sobre el volumen de los tumores en ratas con cáncer de próstata Dunning R-3327-H.

La Figura 6 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con un cierto compuesto de la presente invención y con el correspondiente análogo citotóxico de LH-RH sobre el peso corporal de ratas de Copenhague que tienen cáncer de próstata Dunning R-3327-H.

La Figura 7 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento tumoral conseguido mediante tratamiento con un cierto compuesto de la presente invención y con DOX.

Descripción de las realizaciones preferidas

El resto Q, cuando se sustituye en R' con ciertos grupos preferidos, tiene designaciones de sub-resto de Q_{1} a Q_{8}, de los cuales Q_{2} a Q_{8} son restos citotóxicos nuevos.

R' tiene los valores preferidos, que lleva a los deseados restos Q_{x} listados entre paréntesis tal como sigue: NH_{2} (Q_{1}), pirrolidin 1-ilo (Q_{2}), isoindolin-2-ilo (Q_{3}), 3-pirrolin-1-ilo (Q_{4}), 3-pirrolidon-1-ilo (Q_{5}), 2-pirrolin-1-ilo (Q_{6}), 3-piperidon-1-ilo (Q_{7}) o 1,3-tetrahidropiridin-1-ilo (Q_{8}).

Así, si R-P es H y -R' es -NH_{2}, Q_{1} es DOX, si R-P es H y R' es pirrolidin-1-ilo, Q_{2} es 3'-desamino-3'-(pirrolidin-1''-il)-doxorubicina (Q_{2}); si R-P es H y -R' es isoindolin-2-ilo, Q_{3} es 3'-desamino-3'-(isoindolin-2''-il)-doxorubicina (Q_{3}); si R-P es H y -R' es pirrolin-1-ilo, Q_{4} es 3'-desamino-3'-(3''-pirrolin-1''-il)-doxorubicina (Q_{4}); si R-P es H y -R' es 3-pirrolidon-1-ilo, Q_{5} es 3'-desamino-3'-(3''-pirrolidon-1''-il)-doxorubicina (Q_{5}); si R-P es H y -R' es 2-pirrolin-1-ilo, Q_{6} es 3'-desamino-3'-(2''-pirrolin-1''-il)-doxorubicina (Q_{6}); si R-P es H y -R' es 3-piperidon-1-ilo, Q_{7} es 3'-desamino-3'-(3''-piperidon-1''-il)-doxorubicina (Q_{7}); si R-P es H y -R' es 1,3-tetrahidro-piridin-1-ilo, Q_{8} es 3'-desamino-3'-(1'',3''-tetrahidropiridin-1''-il)-doxorubicina (Q_{8});

Los compuestos que incorporan el nitrógeno de daunosamina en un anillo de cinco miembros con función alquilante son de 10-50 veces más activos in vitro que sus compuestos homólogos, que incorporan el nitrógeno de daunosamina en un anillo de seis miembros. (Tales pares son Q_{5} y Q_{7}, así como Q_{6} y Q_{8}).

En las realizaciones preferidas de la presente invención, en la sustancia de fórmula Q^{14}-O-R-P, R-P es diferente de hidrógeno. Cuando P es diferente de hidrógeno, es decir cuando es P_{1}, P_{2} y P_{3}, convenientemente cuando P_{1} es un portador de agonista de LH-RH, un portador de antagonista de RH-LH o un portador de un análogo de LH-RH acortado, P_{2} es un análogo de somatostatina acortado y P_{3} un antagonista de bombesina.

Convenientemente, P_{1} es Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd, en la que (Xxx) es hidrógeno o un sustituyente de diamina, tal como A_{2}Bu o A_{2}Pr, en la que cuando:

Aaa es Glp, entonces Bbb es His, Ccc es Trp, y Ddd es Gly-NH_{2}.

Aaa es Ac-D-Nal(2), Ac-D-Phe o AcD-Phe(4Cl), entonces Bbb es D-Phe, Ccc es D-Pal(3) y Ddd es D-Ala-NH_{2}; y cuando Aaa-Bbb-Ccc es Ac, entonces Ddd es -NH-CH_{2}-CH_{3};

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5

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en la que:

cuando Aaa es D-Phe, entonces Bbb es Tyr, Ccc es Val y Ddd es Thr o Trp; y

cuando Aaa es D-Trp, entonces Bbb es Phe, y Ccc y Ddd son Thr; y

P_{3} es Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH_{2}

en la que: Aaa no es nada, o es D-Tpi o D-Phe y Bbb es (CH_{2}-NH)Leu, (CH_{2}-NH)Phe, (CH_{2}-NH)Trp, (CH_{2}-N)Tac o (CH_{2}-N)DMTac.

En los nuevos compuestos de la presente invención que incorporan análogos de LH-RH, el radical citotóxico Q está unido a la cadena lateral de D-Lys sobre los análogos de RH-LH o sobre el grupo (Xxx) que está ahí unido, mediante un espaciador de ácido carboxílico, tal como se formula en la Fórmula VII:

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6

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en la que m es 1 o 0 y n es 1 o 2, con la condición de que cuando m es 1, es decir (Xxx) es A_{2}Bu o A_{2}Pr, n es 1 o 2, cuando m es 0, es decir (Xxx) es H, n es 1.

En los nuevos compuestos de la presente invención que incorporan análogos de somatostatina, el radical citotóxico Q está unido al terminal amino de los antagonistas de somatostatina mediante un espaciador de ácido dicarboxílico, tal como se formula en la Fórmula VIII:

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En los nuevos compuestos de la presente invención que incorporan análogos de bombesina, el radical citotóxico Q está unido al terminal amino de los antagonistas de bombesina, tal como se formula en la Fórmula IX:

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Realizaciones especialmente preferidas de esta invención son aquellos conjugados peptídicos que contienen Q_{1} y Q_{6} como los radicales citotóxicos y ácido glutárico (n = 3) como el espaciador de ácido dicarboxílico formando un enlace éster en O-14 con Q_{1} (doxorrubicina) o Q_{6} (2-pirrolín-doxorrubicina) y un enlace carboxamida con el portador peptídico.

Las realizaciones más preferidas de esta invención son análogos de LH-RH citotóxicos de las siguientes fórmulas:

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análogos citotóxicos de somatostatina de las siguientes fórmulas:

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\hskip 0.5cm

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\hskip 0.5cm

11

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\hskip 0.5cm

12

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\hskip 0.5cm

13

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y

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\hskip 0.5cm

14

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y análogos citotóxicos de bombesina de las siguientes fórmulas:

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15

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y

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\hskip 0.5cm

16

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En el nuevo proceso de formar un anillo heterocíclico parcialmente saturado con el nitrógeno de una hidroxiamina adyacente o separada, es decir \alpha,\beta- o \alpha,\gamma-hidroxiamina, se lleva a cabo la primera etapa de la reacción en un disolvente no hidroxílico (aprótico), polar, orgánico, inerte y anhidro, convenientemente dimetil-formamida utilizándolo en exceso, convenientemente un exceso de 30 veces del halo- aldehído, 4-yodo-butiraldehído y 5-yodo-valeraldehído son especialmente efectivos. Sin embargo, la invención no se limita a éstos, se puede utilizar bromo en lugar de yodo. Esta reacción, así como las siguientes etapas, se pueden llevar a cabo a temperatura ambiente.

La etapa de basificación se lleva a cabo con un exceso, convenientemente un exceso de 2-4 veces, de una base orgánica. Son apropiadas para este objeto las aminas terciarias, tales como trialquilamina.

El anillo bicíclico así formado se abre para liberar el grupo hidroxilo adyacente o separado mediante tratamiento con un ácido orgánico en presencia de agua. Se puede utilizar ácido trifluoroacético acuoso diluido, convenientemente en un disolvente orgánico inerte, tal como acetonitrilo. Se purifica el producto mediante eliminación de los compuestos volátiles bajo presión reducida, los halocompuestos en exceso se extraen con hexano, y se purifica el residuo en
HPLC.

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Abreviaturas

Para la descripción de los péptidos y sus derivados de esta invención, se utilizan las abreviaturas convencionales para los aminoácidos, tal como se aceptan generalmente en la técnica de la química de péptidos y tal como se recomienda por la IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature (European J. Biochem., 138, 9-37
(1984).

Las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se basan en el nombre trivial del aminoácido, p. ej. Glp es ácido piroglutámico, His es histidina, Trp es triptófano, etc. Las abreviaturas indican la forma isómera L del aminoácido, a menos que se diga otra cosa, p. ej. Ser es L-serina, y D-Lys es D-lisina.

Las abreviaturas de aminoácidos no comunes de esta invención son como sigue: D-Nal(2) es D-3-(2-naftil)alanina, y D-Pal(3) es D-3-(3-piridil)alanina, D-phe(4Cl) es D-4-clorofenilalanina.

Las secuencias peptídicas se escriben según el acuerdo estando el terminal N del aminoácido a la izquierda y el terminal C a la derecha, p. ej., Glp-His-Trp.

La fórmula Leu(CH_{2}-NH)Leu-NH_{2} describe un enlace peptídico reducido entre una leucina y un residuo amino de leucina en el terminal C de una secuencia peptídica.

Otras abreviaturas utilizadas son:

A_{2}Bu ácido diaminobutírico

A_{2}Pr: ácido diaminopropiónico

BN: bombesina

Reactivo BOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio

DIPEA: N,N-diisopropiletilamina

DM-DOX: doxorubicina modificada con daunosamina

DMF: N,N-dimetilformamida

DMTac: ácido 5,5-dimetil-tiazolidin-4-carboxílico

DOX: doxorubicina

Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

glt: -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, glutarilo

Glt_{2}O: anhídrido glutárico

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

HO-glt:-OH: ácido glutárico

HOSu: N-hidroxisuccinimida

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución

TFA: ácido trifluoroacético

Tac: ácido tiazolidin-4-carboxílico

Tpl: ácido 2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4]indol-3-carboxílico

Se utilizó un sistema HPLC analítico Beckman equipado con un detector de ordenación de diodos modelo 168 y un software de cromatografía System Gold (Beckman) para controlar las reacciones químicas y para verificar la pureza de los compuestos de esta invención. La columna utilizada era Dynamax C-18 (250 x 4,6 mm; tamaño de poro: 300 \ring{A}; tamaño de partícula: 12 \mum). El sistema de disolventes consistía en dos componentes: (i) TFA al 0,1% en agua, y (ii) TFA al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 70% y utilizado al modo de gradiente linear, creciendo 1% (ii) en 1 min, para controlar las reacciones químicas. Se utilizó el sistema de modo isocrático para controlar la
pureza.

Se utilizó un sistema HPLC semipreparativo Beckman modelo 342 para aislamiento y purificación de los compuestos de esta invención. La columna era Aquapore Octyl (250 x 10 mm; tamaño de poro: 300 \ring{A}; tamaño de partícula: 15 \mum). El sistema de disolventes era el mismo descrito para la HPLC analítica anterior.

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Análisis

Se utilizaron un espectrómetro de RMN Bruker ARX300 (frecuencia de 1H de 300 MHz, frecuencia de 13C 75 MHz) y un espectrómetro de masas de electropulverización Finnigan-MAT TSQ 7000 para la identificación de la estructura de los compuestos derivados de la doxorubicina.

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Síntesis de portadores peptídicos

Los péptidos de la invención se administran a menudo en forma de sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables, tales como sales de adición de ácidos. Ejemplos de tales sales de adición de ácidos son hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, trifluoroacetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartrato, y similares. Si se va a administrar el principio activo en forma de comprimido, el comprimido puede contener un diluyente farmacéuticamente aceptable que comprende un ligante, tal como tragacanto, almidón de maíz o gelatina, un agente desintegrador, tal como ácido algínico, y un lubricante, tal como estearato magnésico.

Si se desea la administración en forma líquida, se puede utilizar un edulcorante y/o saborizante como parte del diluyente farmacéuticamente aceptable, se puede efectuar una administración intravenosa en solución salina isotónica, soluciones de tampón fosfato o similares.

Generalmente las composiciones farmacéuticas contendrán el péptido en unión con un vehículo convencional, farmacéuticamente aceptable. Normalmente, la dosis será desde aproximadamente 1 a aproximadamente 100 microgramos del péptido por kilogramo del peso corporal del huésped cuando se administra de forma intravenosa; las dosis orales serán mucho más elevadas. En conjunto, el tratamiento de sujetos con estos péptidos se lleva generalmente a cabo de la misma manera que el tratamiento clínico utilizando otros análogos de LHRH, somatostatina y análogos de doxorubicina.

Se pueden administrar estos péptidos a mamíferos de forma intravenosa, subcutánea, intramuscular, oralmente, intranasalmente o intravaginalmente para conseguir efectos hormonales biológicos mediante la unión a receptores específicos. En el caso de análogos de LHRH, estos efectos pueden comprender supresión reversible de la actividad gonadal, y en el caso de análogos de somatostatina, inhibición de la función gastrointestinal. Las dosis efectivas variarán con la forma de administración y la especie en particular de mamífero que se esté tratando. Un ejemplo de una forma de dosis típica es una solución salina fisiológica que contiene el péptido, solución que se administra para proporcionar una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 2,5 mg/kg de peso corporal. Se puede realizar la administración oral del péptido o en forma sólida o en forma líquida.

Se puede realizar la síntesis de los portadores peptídicos de la presente invención mediante cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica de química de péptidos. Se puede encontrar un resumen de las técnicas apropiadas en M. Bodanszky, Principles of Peptide Shyntesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984. Se pueden encontrar las técnicas para la síntesis de péptidos en fase sólida en el libro de texto de J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Síntesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2ª ed.) y en la revisión de G. Barany et al., Int. J. Peptide and Protein Res. 30, 705-739 (1987).

Se detalla la síntesis de los portadores de los análogos de LH-RH utilizados en esta invención en los Ejemplos del documento de patente de EE.UU.: 5.258.492, Sandor Bajusz y Andrew W. Schally; 2 de noviembre de 1993 y en los artículos de Bajusz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1637-1641 (1988) y 86, 6318-6322 (1989) y Janaky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1023-1027 y 972-976 (1992).

Se detalla la síntesis de los portadores de análogos de somatostatina utilizados en esta invención en los Ejemplos del documento de patente de EE.UU.: 4.650.787, de 17 de marzo de 1987, Andrew W. Schally y Ren Z. Cai. Se puede encontrar también una descripción de la síntesis en los artículos de Cai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1896-1900 (1986) y Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2502-2 (1987).

Se detalla la síntesis de los portadores de antagonistas de bombesina utilizados en esta invención en los artículos de Coy et al., J. Biol. Chem.,263, 5056-5060 (1988) y 264, 14691-14697 (1989) y de Cai et al., Peptides 13, 267-271 (1992) y Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12664-12668 (1994).

Se detalla la síntesis de los derivados de doxorubicina utilizados en esta invención y la formación de sus conjugados con diferentes portadores peptídicos en los siguientes ejemplos que se pretenden que sean ilustrativos y no limitativos.

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Ejemplo 1

Preparación y aislamiento de ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 30 mg (90 \mumol) de F-moc-OSu seguido de la adición de 31 \mul (180 \mumol) de DIPEA. Después de agitar durante tres horas, la reacción había finalizado, mediante determinación con HPLC analítica. Se evaporó el disolvente hasta sequedad en un evaporador de elevado vacío Speed Vac y se cristalizó el residuo mediante frotamiento con TFA al 0,1% en H_{2}O. Se filtraron los cristales y se lavaron una vez con éter frío para eliminar las trazas de Fmoc-OSu en exceso. Después de secar en un secador, se obtuvo m = 62 mg, de N-Fmoc-DOX de pureza 98%. Rendimiento: 94%.

Se dejó que este compuesto intermedio reaccionara durante toda la noche con 11,4 mg (100 \mumol) de Glt_{2}O en 1 ml de DMF anhidro en presencia de 26,1 \mul (150 \mumol) de DIPEA. Se evaporó el disolvente en Speed Vac y se solidificó el aceite residual mediante frotamiento con TFA acuoso al 0,1% (v/v). El material en bruto así obtenido contiene 70% de ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX, 20% de N-Fmoc-DOX sin reaccionar y 10% de otras impurezas, mediante determinación con HPLC analítica. Se puede utilizar este producto en bruto para la preparación de conjugados peptídicos de DOX sin más purificación. Cuando se disolvió este material en bruto en 20 ml de acetonitrilo acuoso al 60% conteniendo TFA al 0,1% y se aplicó en HPLC preparativa, se obtuvo de producto final 45,7 mg de ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX con pureza de 98% (rendimiento 64%).

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Ejemplo 2

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(pirrolidin-1''-il)-doxorubicina (Q_{2}) y su sal de TFA de 14-O-hemiglutarato (AN-193)

Se disolvió sal de HCl y de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 171 \mul (1,3 mmol), 15 veces en exceso, de 1,4-diyodo-butano seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol), 3 veces en exceso, de DIPEA. Se agitó la mezcla de reacción durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de 16 horas había terminado la reacción, tal como se determinó mediante HPLC analítica. Se evaporó el disolvente en Speed Vac y se disolvió el aceite residual en 3 ml de TFA al 0,1% en H_{2}O y se extrajo con éter para eliminar el 1,4-diyodo-butano en exceso. Seguidamente se aplicó el extracto acuoso sobre HPLC y se obtuvo m = 41,6 mg, de derivado de DOX de pureza 98%. (Rendimiento: 68%).

Se hicieron reaccionar los 41,6 mg (86 \mumol) de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(pirrolidin-1''-il)-doxorubicina (Q_{2}) así obtenidos con 1,2 equivalentes de Glt_{2}O en DMF anhidro, tal como se describe en el Ejemplo 1. El rendimiento era de 64% (16,9 mg) y la pureza era de 98%.

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Ejemplo 3

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(isoindolin-2''-il)-doxorubicina (Q_{3})

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 226 mg (1,3 mmol), 15 veces en exceso, de \alpha,\alpha'-dicloro-orto-xileno seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol), 3 veces en exceso, de DIPEA y cantidad catalítica de Nal. Después de 16 horas se eliminaron los disolventes con Speed Vac y se disolvió el residuo en 3 ml de TFA al 0,1% acuoso y se extrajo con 3 ml de éter para eliminar el compuesto halogenado en exceso. El material en bruto así obtenido se aplicó en HPLC. Después de la purificación se obtuvo el producto final, 36 mg, de pureza 98%. (Rendimiento: 55%).

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Ejemplo 4

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(3''-pirrolin-1''-il)-doxorubicina (Q_{4})

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 136,8 \mul (1,3 mmol), 15 veces en exceso, de cis-1,4-dicloro-2-buteno (Aldrich) seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol), 3 veces en exceso, de DIPEA. Después de 16 horas se eliminaron los disolventes en Speed Vac y se disolvió el residuo en 3 ml de TFA al 0,1% acuoso y se extrajo con 3 ml de hexano para eliminar el compuesto halogenado en exceso. El material en bruto así obtenido se aplicó en HPLC. Después de la purificación se obtuvo el producto final, 22,6 mg, de pureza 98%. (Rendimiento: 37%).

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Ejemplo 5

Preparación y aislamiento de 1-cloro-4-bromo-2-butanona (C_{4}H_{6}ClBrO) y 1-cloro-5-bromo-2-pentanona (C_{5}H_{8} ClBrO)

Se hizo reaccionar cloruro de 3-bromo-propionilo, 100,8 \mul (1 mmol) (Aldrich), con diazometano en exceso en éter. Después de 1 hora, se eluyó y se ensayaron las manchas en TLC. Se utilizó como fase estacionaria de la cromatografía de capa fina hojas de aluminio prerrevestidas con gel de sílice 60 F254 de Merck art. nº 5554 y como fase móvil CHCl_{3}:MeOH 95:5 (v/v). Para el ensayo de manchas se pulverizó sobre la hoja de TLC después de la elución reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina (Vogel: A textbook on Practical Organic Chemistry, página 1061, tercera edición, Longmans, Nueva York). El derivado de diazometilcetona así formado mostraba una mancha amarilla con Rf: 0,3. Seguidamente se hizo reaccionar la solución etérica con HCl anihidro en éter convirtiendo la diazometilcetona en el producto final deseado, 1-cloro-4-bromo-2-butanona. Este producto mostraba una mancha amarilla, característica de los compuestos oxo, con Rf: 0,8 en el mismo sistema de disolventes y con el mismo reactivo de ensayo de manchas descrito anteriormente. Después de la evaporación del disolvente, se aplicó el producto en bruto en una columna (15 cm de longitud, 2,5 cm de diámetro) llena con 15 g de gel de sílice, Merck, grado 9385, 230-400 de malla, tamaño de poro 60 \ring{A}. La fase móvil líquida era CHCl_{3} puro. Se mezclaron las fracciones conteniendo el producto final deseado (caracterizado por el ensayo de manchas detallado anteriormente) y se evaporaron hasta sequedad. M = 1,5 g, se obtuvo un aceite claro. Rendimiento: 80%.

Se preparó 1-cloro-5-bromo-2-pentanona a partir de cloruro de 4-bromo-butirilo exactamente de la misma manera que se describe para 1-cloro-4-bromo-2-pentanona, excepto en que se utilizó cloruro de 4-bromo-butirilo en vez de cloruro de 3-bromo-propionilo, se obtuvieron 1,6 g de aceite claro. Rendimiento: 80%.

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Ejemplo 6

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(3''-pirrolidon-1''-il)-doxorubicina (Q_{5})

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 241 mg (1,3 mmol), 15 veces en exceso, de 1-cloro-4-bromo-2-butanona seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol), 3 veces en exceso, de DIPEA. Después de 16 horas se eliminaron los disolventes en un Speed Vac y se disolvió el residuo en 3 ml de TFA al 0,1% acuoso y se extrajo con 3 ml de hexano para eliminar el compuesto halogenado en exceso. El material en bruto así obtenido se aplicó en HPLC. Después de la purificación se obtuvo el producto final, 20,6 mg, de pureza 98%. (Rendimiento: 33%).

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Ejemplo 7

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(3''-piperidon-1''-il)-doxorubicina (Q_{4})

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 260 mg (1,3 mmol), 15 veces en exceso, de 1-cloro-5-bromo-2-pentanona seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol), 3 veces en exceso, de DIPEA. Después de 16 horas se eliminaron los disolventes en Speed Vac y se disolvió el residuo en 3 ml de TFA al 0,1% acuoso y se extrajo con 3 ml de hexano para eliminar el compuesto halogenado en exceso. El material en bruto así obtenido se aplicó sobre HPLC. Después de la purificación se obtuvo el producto final, 18 mg, de pureza 95%. (Rendimiento: 28%).

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Ejemplo 8

Preparación y aislamiento de 4-yodo-butiraldehído y 5-yodo-valeraldehído

Se disolvieron 1,3 ml (10 mmol) (Fluka) de 2-(3-cloropropil)-1,3-dioxolano (acetal de etileno de 4-cloro-n-butiraldehído) en 200 ml de acetona que contenían 30 g (200 mmol), 20 veces en exceso) de Nal. Se mantuvo la solución en reflujo durante 24 horas seguido de evaporación hasta sequedad. Se utilizaron 100 ml de éter para extraer la materia orgánica del residuo sólido inorgánico. Seguidamente se lavó la solución etérica con 50 ml de H_{2}O, 50 ml de solución acuosa de Na_{2}S_{2}O_{3} al 5% y 3 veces con 50 ml de H_{2}O. Se eliminó el éter al vacío y el aceite remanente se disolvió en 3 ml de ácido acético acuoso al 50%. Después de 1 hora, se añadieron 100 ml de éter a esta solución y se eliminaron el ácido acético así como el etilenglicol mediante el lavado 3 veces con 50 ml de H_{2}O. Se eluyó el producto principal con Rf: 0,8 en TLC en CHCl_{3} puro. El ensayo de manchas utilizado para la función aldehído era el mismo que el descrito para las cetonas en el Ejemplo 5. Seguidamente se eliminó el éter y el aceite negro se aplicó en una columna (15 cm de longitud, 2,5 cm de diámetro) llena con 15 g de gel de sílice, Merck, grado 9385, 230-400 de malla, tamaño de poro 60 \ring{A}. La fase móvil líquida era CHCl_{3} puro. Se mezclaron las fracciones conteniendo el producto final deseado (caracterizado por el ensayo de manchas detallado anteriormente) y se evaporaron hasta sequedad. Se obtuvieron 1,6 g de aceite amarillo. Rendimiento: 80%.

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Se obtuvo 5-yodo-valeraldehído exactamente de la misma manera empezando a partir de 2-(4-clorobutil)-1,3-dioxoloano (acetal de etileno de 5-cloro-n-valeraldehído (Fluka). Se obtuvieron 1,65 g de aceite amarillo. Rendimiento: 80%.

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Ejemplo 9

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(2''-pirrolín-1''-il)-doxorubicina (Q_{6})

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 515 mg (2,6 mmol), 30 veces en exceso, de 4-yodo-butiraldehído seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol, 3 veces en exceso) de DIPEA. Después de 1 hora se añadieron 100 \mul de ácido acético glacial a la mezcla de reacción, la cual se añadió gota a gota a 5 ml de TFA al 0,1% en solución acuosa de acetonitrilo al 70% (disolvente ii del sistema HPLC). Se diluyó esta solución con 2 ml de solución acuosa de TFA al 0,1%, seguido de la eliminación del acetonitrilo en un Speed Vac. Se extrajo la solución resultante con hexano para eliminar el exceso del compuesto halogenado. El material en bruto así obtenido se aplicó en HPLC. Después de la purificación se obtuvo el producto final, 52 mg, de pureza 98%. (Rendimiento:
85%).

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Ejemplo 10

Preparación y aislamiento de sal de TFA de 3'-desamino-3'-(1'',3''-tetrahidropiridin-1''-il)-doxorubicina (Q_{8})

Se disolvió sal de HCl de DOX, 50 mg (86 \mumol), en 1 ml de DMF y se añadieron 552 mg (2,6 mmol), 30 veces en exceso, de 5-yodo-valeraldehído seguido de la adición de 45 \mul (260 \mumol), 3 veces en exceso, de DIPEA. Después de 1 hora se añadieron 100 \mul de ácido acético glacial a la mezcla de reacción, la cual se añadió gota a gota a 5 ml de TFA al 0,1% en solución acuosa de acetonitrilo al 70% (disolvente ii del sistema HPLC). Se diluyó esta solución con 2 ml de solución acuosa de TFA al 0,1%, seguido de la eliminación del acetonitrilo en un Speed Vac. Se extrajo la solución resultante con hexano para eliminar el exceso del compuesto halogenado. El material en bruto así obtenido se aplicó sobre HPLC. Después de la purificación se obtuvo el producto final, 46 mg, de pureza 98%. (Rendimiento: 75%).

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Ejemplo 11

Preparación y aislamiento de análogo citotóxico agonista de LH-RH que contiene DOX, ([D-Lys^{6}(DOX^{14}-O-glt)]LH-RH, Q_{1}^{14}gL)

Se disolvieron [D-Lys^{6}]LH-RH, 60 mg (37,5 \mumol), y 52 mg (64% puro, 37,5 \mumol) de ^{14}-O-hemiglutarato de Fmoc-DOX (véase el Ejemplo 1), en 1 ml de DMF y se añadieron 22 mg (50 \mumol) de reactivo BOP (Aldrich), 13,5 mg (100 \mumol), así como 52 \mul (300 \mumol) de DIPEA. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la reacción había finalizado. Se evaporaron los disolventes y el aceite residual se cristalizó en 3 ml de acetato de etilo y seguidamente se lavó dos veces con 3 ml de acetato de etilo. Seguidamente se disolvieron los 90 mg de materia sólida en bruto en 3 ml de DMF y se añadieron 300 \mul de piperidina. Después de 5 minutos, se colocó la reacción en un baño de hielo y se acidificó mediante la adición de una mezcla de 300 \mul de TFA, 700 \mul de piridina y 2 ml de DMF. Después de la evaporación de los disolventes, se solidificó el aceite residual con acetato de etilo. El sólido en bruto así obtenido se disolvió en 1 ml de acetonitrilo acuoso al 70% que contenía TFA al 0,1% (i) y se diluyó con 3 ml de TFA acuoso al 0,1% (ii) y se aplicó en HPLC semipreparativa, se obtuvo el producto final, 40 mg, (14,8 \mumol) de pureza 98%. Rendimiento: 48%.

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Ejemplo 12

Preparación y aislamiento de análogo citotóxico agonista de LH-RH que contiene 2-pirrolín-DOX, ([D-Lys^{6}(2-pirrolín-DOX^{14}-O-glt)]LH-RH, Q_{6}^{14}gL)

Se disolvió Q_{1}^{14}gL, 11,2 mg (5 \mumol), (véase Ejemplo 11) en 200 \mul de DMF y se añadieron 30 mg (150 \mumol, 30 veces en exceso) de 4-yodo-butiraldehído (Ejemplo 8) seguido de la adición de 3 \mul (17 \mumol) de DIPEA. Después de 1 hora, la reacción había finalizado (véase el Ejemplo 9) y se añadieron 10 \mul de ácido acético glacial a la mezcla de reacción, que se añadió seguidamente gota a gota a 1 ml de TFA al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 70%. Seguidamente se diluyó esta solución con 1 ml de TFA acuoso al 0,1% y se eliminó el acetonitrilo al vacío. Seguidamente se extrajo la solución acuosa remanente con 1 ml de hexano y se aplicó en HPLC, se obtuvo m: 7,6 mg, 99% de producto final puro.

(Rendimiento: 66%).

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Ejemplo 13

Preparación y aislamiento de análogo citotóxico de somatostatina que contiene DOX

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Se disolvió D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(F-moc)-Val-Cys-Thr-NH_{2}, 20 mg (14,5 \mumol) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, páginas 1986-1990) y 20 mg (64% de pureza, 14,5 \mumol) de ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX (Ejemplo 1) en 200 \mul de DMF y se añadieron 8,8 mg (20 \mumol) de reactivo BOP (Aldrich), 5,4 mg (40 \mumol) de HOBt, así como de 17 \mul (100 \mumol) de DIPEA. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la reacción había finalizado. Después de eliminar los disolventes al vacío, se cristalizó el residuo con acetato etílico. Seguidamente se disolvió esta materia sólida en 1 ml de DMF y se añadieron 100 \mul de piperidina. Después de 7 min, se colocó la reacción en un baño de hielo y se acidificó mediante la adición de una mezcla de 100 \mul de TFA, 300 \mul de piperidina y 2 ml de DMF. Después de la evaporación del disolvente, se solidificó el aceite residual con acetato etílico. Se disolvió el sólido en bruto así obtenido en 1 ml de acetonitrilo acuoso al 70% que contenía TFA al 0,1% (i) y se diluyó con 3 ml de TFA acuoso al 0,1% (ii) y se aplicó en HPLC semipreparativa. Se obtuvieron 9,7 mg, (5,1 \mul) de 95% de pureza de producto final.

(Rendimiento: 35%).

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Ejemplo 14

Preparación y aislamiento de un análogo citotóxico de somatostatina que contiene 2-pirrolin-DOX

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(6,4 mg, 5 \mumol) se disolvió en 100 \mul de DMF y se añadió ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX (4,1 mg, 5 \mumol), seguido de reactivo BOP (4,4 mg, 10 \mumol), HOBt (100 \mumol) y DIPEA (50 \mumol). Después de agitar durante 2 hr a temperatura ambiente, la mezcla de reacción acidificó con 20 \mul de AcOH y se diluyó con 500 \mul de acetonitrilo acuoso al 70% que contenía TFA al 0,1% y se volvió a diluir con 700 \mul de TFA acuoso al 0,1% y se aplicó en HPLC. Se obtuvieron 3,9 mg, (rendimiento: 40%) de 99% de pureza de producto final.

Se preparó ^{14}-O-hemiglutarato de 2-pirrolin-DOX haciendo reaccionar ^{14}-O-hemiglutarato de DOX con 4-yodo-butiraldehído, tal como se describe en el Ejemplo 9.

Se preparó ^{14}-O-hemiglutarato de DOX a partir de ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX mediante separación del grupo protector Fmoc, tal como se describe en el Ejemplo 11. (rendimiento 40%).

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Ejemplo 15

Preparación y aislamiento de un análogo citotóxico antagonista de bombesina que contiene 2-pirrolin-DOX, ([DOX^{14}-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH_{2}-NH)Leu-NH_{2}, Q_{1}^{14}gB)

Se disolvió Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH_{2}-NH)Leu-NH_{2}, 20 mg (15,8 \mumol), (Int. J. Peptide Protein Res. 38, 1991, páginas 593-600) y 22 mg (64% de pureza, 15,8 \mumol) de ^{14}-O-hemiglutarato de N-Fmoc-DOX (ejemplo 1) en 200 \mul de DMF y se añadieron 8,8 mg (20 \mumol) de reactivo de BOP (Aldrich), 5,4 mg (40 \mumol) de HOBt, así como 17 \mul (100 \mumol) de DIPEA. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la reacción había finalizado. Después de eliminar los disolventes al vacío, se cristalizó el residuo con acetato etílico. Seguidamente se disolvió esta materia sólida en 1 ml de DMF y se añadieron 100 \mul de piperidina. Después de 5 min, se colocó la reacción en un baño de hielo y se acidificó mediante la adición de una mezcla de 100 \mul de TFA, 300 \mul de piperidina y 2 ml de DMF. Después de la evaporación de los disolventes, se solidificó el aceite residual con acetato etílico. Se disolvió el sólido en bruto así obtenido en 1 ml de acetonitrilo acuoso al 70% que contenía TFA al 0,1% (i) y se diluyó con 3 ml de TFA acuoso al 0,1% (ii) y se aplicó en HPLC semipreparativa. Se obtuvieron 13,5 mg, (7,1 \mumol) de 98% de pureza de producto final. (Rendimiento: 45%).

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Ejemplo 16

Preparación y aislamiento de un análogo citotóxico antagonista de bombesina que contiene 2-pirrolin-DOX

2-pirrolin-DOX^{14}-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH_{2}-NH)Leu-NH_{2}, Q_{6}^{14}gB

Se disolvió Q_{1}^{14}gB, 9,5 mg (5 \mumol), (Ejemplo 15) en 200 \mul de DMF y se añadieron 30 mg (150 \mumol, 30 veces en exceso) de 4-yodo-butiraldehído (Ejemplo 8), seguido de la adición de 3 \mul (17 \mumol) de DIPEA. Después de 1 hora, la reacción había finalizado (Ejemplo 9) y se añadieron 10 \mul de ácido acético glacial a la mezcla de reacción, la cual se añadió gota a gota a 1 ml de TFA al 0,1% en acetonitrilo acuoso al 70%. Seguidamente se diluyó esta solución con 1 ml de TFA acuoso al 0,1% y se eliminó el acetonitrilo al vacío. Seguidamente se extrajo la solución acuosa remanente con 1 ml de hexano y se aplicó en HPLC. Se obtuvieron 6 mg de 98% de pureza de producto final. (Rendimiento: 60%).

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Determinación de la actividad citotóxica in vitro

Se obtuvo una línea celular de carcinoma de mama de ratón independiente de estrógeno MXT del Dr. Gunter Berndhardt, Universidad de Ratisbona, Alemania. Se obtuvieron todas las demás líneas celulares para la determinación de la actividad antiproliferante de los compuestos de esta invención de la American Type Culture Collection
(ATCC).

Para la evaluación de la actividad de los compuestos análogos, se utilizó un ensayo colorimétrico de citotoxicidad en placas de microtitulación basado en la cuantificación de biomasa mediante la tinción de células con cristal violeta, que correlaciona muy bien con la determinación de las cifras de células. (Reile et al.; Anal. Biochem. 187, 262-267, 1990; Bernhardt G. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. (1992), 118, 35-43; Spruss Th. et al. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, 435-443, 1991; Gilles, R. J., Anal. Biochem. 159, 109-113, 1986; Kueng, W. et al.; Anal. Biochem., 182, 16-19, 1989).

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Protocolo del ensayo

De uno a dos día después de colocar las células en placas de 96 pocillos, se cambió el medio de cultivo con medio nuevo que contenía los compuestos que se iban a ensayar y solamente medio nuevo para los cultivos control. Después de cambiar el tiempo de incubación, se fijaban las células con dialdehído glutárico y se almacenaban en suero bovino fetal (FBS) a 4ºC hasta el final del experimento. Se teñían las células con cristal violeta y se extraía la tinción unida con EtOH acuoso al 70%. Se medía la densidad óptica con un lector EIA (Bio-Tek Instruments) o Biomek 1000 (Beckman) a 590 o 600 nm respectivamente. Cada punto de los datos representa el valor medio de ocho pocillos de cultivo. Se calculan los valores T/C como T/C = (T-C0(/(C-C0) en la que T = densidad óptica de los cultivos tratados, C = densidad óptica de los cultivos control (no tratados), C0 = densidad óptica de los cultivos al inicio de la incubación (t = 0).

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Ejemplo 17

Actividad citotóxica in vitro de derivados de DOX modificados con daunosamina

La Tabla 17-1 demuestra los efectos de doxorubicina y sus derivados modificados con daunosamina sobre la línea celular MCF-7 de carcinoma de mama humano in vitro.

Los radicales citotóxicos que tienen su N de daunosamina incorporado en un anillo de cinco miembros con una función reactiva son de 5 a 50 veces más activos que sus homólogos con un anillo de seis miembros, tal como los ejemplos de 3-pirrolidono-DOX (Q_{5}) y 3-piperidono-DOX (Q_{7}), así como 2-pirrolín-DOX (Q_{6}) y 1,3-tetrahidro-piridín-DOX (Q_{8}),

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TABLA 17-1

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20

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Se cultivaron las células en medio IMEM que contenía HI-DCC-FBS al 5% (suero bovino fetal tratado con carbón activo revestido con dextrano inactivado con calor) sobre placas de 96 pocillos. Se determinó el número relativo de células en placas tratadas y control mediante el método de tinción con cristal violeta y se expresó en valores T/C donde T/C = (T-C_{0}/C- C_{0}) x 100 [T = absorbancia de los cultivos tratados, C = absorbancia de los cultivos control,
C_{0} = absorbancia de los cultivos al inicio de la incubación (t = 0). La absorbancia medida es proporcional al número de células]. Los valores inferiores de T/C indican una disminución de la supervivencia de las células cancerosas debido al tratamiento. Es decir, 75 indicaría 75% de supervivencia de células en comparación con 100% para el control o 25% de inhibición.

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Ejemplo 18

Retención total de la actividad citotóxica in vitro de DOX en el conjugado peptídico agonista de RH-LH Q_{1}^{14}gL y en 2-pirrolin-DOX (Q_{6}) superactivo en el conjugado peptídico agonista de LH-RH Q_{6}^{14}gL

La Tabla 18-1 demuestra los efectos de la doxorubicina y su derivado modificado con daunosamina 2-pirrolin-doxorubicina (Q_{6}) en comparación con sus conjugados con el análogo agonista de LH-RH, [D-Lys^{6}]LH-RH (Q_{1}^{14}gL y Q_{6}^{14}gL, respectivamente) sobre el crecimiento in vitro de la línea celular MCF-7 de carcinoma de mama humano y sobre la línea celular MXT de carcinoma de mama de ratón independiente de estrógeno.

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TABLA 18-1

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Ejemplo 19

La Tabla 19-1 demuestra que se retiene totalmente la actividad citotóxica in vitro de los análogos de somatostatina que contienen DOX de la invención.

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TABLA 19-1 Efectos de análogos citotóxicos de somatostatina que contienen doxorubicina sobre el crecimiento de la línea celular MIIA PaCa-2 de cáncer de páncreas humano

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Ejemplo 20

Efectos de análogos citotóxicos de antagonistas de bombesina que contienen doxorubicina sobre el crecimiento de células CFPAC-1 de cáncer de páncreas humano in vitro

La Tabla 20-1 demuestra que se retiene totalmente la actividad citotóxica in vitro de análogos de bombesina que contienen DOX de la invención.

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TABLA 20-1

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Ejemplo 21

Actividades hormonales y potencias de unión al receptor de análogos agonistas de LH-RH Q_{1}^{14}gL ([D-Lys^{6}]LH-RH que lleva DOX) y Q_{6}^{14}gL ([D-Lys^{6}]LH-RH que lleva 2-pirrolín-DOX) en comparación con el péptido portador, [D-Lys^{6}]LH-RH

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TABLA 21-1

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Ejemplo 22

Análogos de somatostatina inhiben la secreción de las hormonas de crecimiento (GH) de pituitaria de rata perfundida, tal como se describe por Carlson et al., Thyrotropin-releasing hormone stimulation and somatostatin inhibition of growth hormone secretion from perfused rat adenohypophyses, Endocrinology, 94, 1709-(1974). Por tanto, se utilizó este método para comparar los análogos citotóxicos de somatostatina de la presente invención con sus moléculas portadoras antecesoras con respecto a sus actividades hormonales.

La inhibición de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento humana (hGH-RH(1-29)NH_{2}) indujo la liberación de la hormona del crecimiento de células perfundidas de la pituitaria de rata mediante análogos de somatostatina S-98-I.

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y S-121

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en comparación con su derivado citotóxico Q_{1}^{14}gS^{98-1} (DOX^{14}-O-glt-S-98-I) y Q_{1}^{14}gS^{121} (DOX^{14}-O-glt-S-121), respectivamente.

En el sistema de superfusión de pituitaria de rata, se administraron los análogos de somatostatina durante 3 min a una dosis 1 nM simultáneamente con hGH-RH(1-29)NH_{2} 1 nM. Se mantuvo la infusión de los análogos de somatostatina durante otros 6 min. Se determinaron las respuestas de GH a la administración de 3 min de hGH-RH(1-29)NH_{2} 1 nM durante la perfusión de los análogos de somatostatina (0 min) y pararon 30, 60 y 90 min después de la administración. Se presentan los datos en la Tabla 22-1.

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TABLA 22-1

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Ejemplo 23

Estudios de unión de receptores con antagonistas citotóxicos de bombesina

Se realizó tal como se describe anteriormente (1) la radioyodación de [Tyr^{4}]BN (Sigma) utilizando un kit de radioyodación Bio-Rad Enzymobead y aislamiento de [^{125-I}-Tyr^{4}]BN monoyodado. Se realizó la unión de [Tyr^{4}]BN marcado y su desplazamiento por el análogo citotóxico antagonista de bombesina Q_{6}^{14}gB utilizando células confluentes Swiss 3T3 (obtenidas de la American Type Culture Collection) en placas de 24 pocillos en una modificación (2) del método de Kris et al (3). De tres a cinco días después del cultivo, se lavaron dos veces las células confluentes con solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) y se incubaron durante 30 min a 37ºC con [^{125-}I-Tyr^{4}]BN 50 pM en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de competidores sin marcar (Q_{6}^{14}gB o BN) en un volumen total de 0,5 ml de tampón de unión (DMEM con HEPES 50 mM, seroalbúmina bovina al 0,1% (BSA), MgCl_{2} 5 mM y 100 \mug/ml de bacitracina, pH: 7,4). Se determinó la unión no específica en presencia de ligando no marcado 1 \muM. Después de tres lavados con HBSS enfriado con hielo que contenía BSA al 1% (pH: 7,4), se despegaron las células con solución de tripsina al 0,05%/EDTA 0,53 mM y se transfirieron a tubos. Se midió la radiactividad con un contador gamma (Micromedic Systems Inc, Huntsville, AL). Se evaluaron los datos de unión utilizando programas de análisis de unión de radioligandos de McPherson (4). Se calcularon los valores K_{j} presentados en la Tabla 23-1 según la fórmula de Cheng y Prusoff (5).

1. Halmos, et al., Cancer Letters, 85, 111-118 (1994).

2. Cai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12664-12668, (1994).

3. Kris, et al., J. Biol. Chem., 262: 11215-11220, (1987).

4. McPherson, G. A., J. Pharmaco Methods, 14: 213-228, (1985).

5. Cheng y Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, (1973).

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TABLA 23-1 Caracterización de la unión específica del antagonista citotóxico de bombesina Q_{6}^{14}gB (2-pirrolín-DOX^{14}- O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-\psi-(CH_{2}-N)Leu-NH_{2} a receptores de bombesina en la línea celular Swiss 3T3 en comparación con bombesina

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Efectividad comparativa y toxicidad de los conjugados hormonales con respecto a solamente el radical citotóxi-
co.

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Ejemplo 24

Tratamiento con 2-pirrolín-DOX (Q_{6}), análogo citotóxico agonista de LH-RH Q_{6}^{14}gL ([D-Lys^{6}]LH-RH unido a ^{14}-O-hemiglutararo de Q_{6}) y (DOX) sobre cánceres de mama de ratón MXT independientes del estrógeno (KS-49)

Para comparar la actividad inhibidora de tumores del derivado citotóxico de doxorubicina, Q_{6}, y su conjugado peptídico citotóxico dirigido, Q_{6}^{14}gL, así como la del agente antineoplásico bien conocido, DOX, y para determinar el modo óptimo de administración y las dosis no tóxicas, se implantaron s. c. en ratones hembra B_{6}D_{2}F1. trozos (1 mm^{3}) de tumor de ovario ectomizado MXT (3.2) positivos para los receptores de LH-RH. Un día después del transplante, se dividieron los ratones al azar en grupos de cinco animales y comenzó el tratamiento. Se disolvieron los compuestos en ácido trifluoroacético al 0,1% (pH 2) y se administraron de manera intraperitoneal. Se muestran en la Tabla 24-1 los grupos, programas de tratamiento y las dosis, así como los tiempos medios de supervivencia. Se resumen los resultados en la Tabla 24-2 y en la Figura 1.

La Tabla 24-2 muestra el efecto del tratamiento con Q_{6} y con el compuesto citotóxico análogo de LH-RH Q_{6}^{14}gL sobre los volúmenes tumorales y supervivencia de ratones con cánceres de mama independientes de estrógeno. Tal como se muestra en la Tabla 24-2, 1,25 nmol de Q_{6}, administrado en los días 1, 2, 7, 8, 14 y 15, (Grupo 2), ejercían una fuerte toxicidad caracterizada por una supervivencia media de 17,4 días, que es significativamente más corta que la del grupo control sin tratar. Comparativamente, la misma dosis de Q_{6}^{14}gL (Grupo 6) daba como resultado una supervivencia media de 30,8 días, que es más significativamente más larga que la del grupo control sin tratar. Se puede demostrar también la mayor eficacia de Q_{6}^{14}gL sobre Q_{6} mediante la comparación de los volúmenes medios tumorales finales en el Grupo 2 (1065 mm^{3} en el día 16) y en el Grupo 6 (863 mm^{3} en el día 31).

Se pueden demostrar conclusiones similares comparando Q_{6} con Q_{6}^{14}gL en un programa diferente de tratamiento, en el que se administraron 0,5 nmol de los fármacos cinco días por semana durante tres semanas consecuti-
vas.

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La doxorubicina con una dosis tóxica (cantidad total: 1560 nmol, supervivencia media: 20 días) no pudo erradicar el tumor, mientras que el tratamiento con Q_{6}^{14}gL con una dosis no tóxica (cantidad total: 7 nmol, supervivencia media; > 31 días) llevó a la supervivencia de 2 de 5 animales, sin desarrollo del tumor.

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TABLA 24-1

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Ejemplo 25

Efectos de un solo tratamiento con (DOX), análogos citotóxicos de LH-RG T-107 y Q_{1}^{14}gL sobre cánceres de mama de ratón MXT independientes de estrógeno (KS-55) Compuestos de ensayo

Q_{1}^{14}gL: ^{14}O-hemiglutarato de doxorubicina unida a [D-Lys^{6}]LH-RH

T-107: N-glutaril-doxorubicina unida a [D-Lys^{6}]LH-RH Proc. Natl. Acad. Sci., vol 89, páginas 972-976 (1992); y DOX

Se realizaron los ensayos tal como sigue:

Para determinar las máximas dosis toleradas y comparar los efectos, se implantaron s. c. en ratones hembra B_{6}D_{2}F1. trozos (1 mm^{3}) de tumor de ovario ectomizado MXT (3.2). Un día después del transplante, se dividieron los ratones al azar en grupos de cinco animales y se trataron con una sola inyección intraperitonealmente. Se muestran en la Tabla 25-1 los grupos y las dosis. La Tabla muestra también las cifras de ratones que tenían tumores cuando se midió el volumen y los tiempos medios de supervivencia para los grupos. Se muestran en la Figura 2 los cambios de volúmenes tumorales. Se disolvieron los compuestos en TFA al 0,1% (pH: 2,0). Se midió el volumen tumoral en los días 10, 13, 17 y 20.

Tal como muestran la Tabla 25-1 y la Figura 2, T-107, ([D-Lys^{6}]LH-RH unido a N-glutaril-DOX) es totalmente inefectivo para inhibir el crecimiento de este tumor a una dosis de 850 nmol/20 g de ratón. Al contrario, Q_{1}^{14}gL, ([D-Lys^{6}]LH-RH unido a 14-O-glutaril-DOX) ejercía una fuerte supresión en el crecimiento del tumor (Figura) a una dosis no tóxica de 650 nmol/20 g de ratón. DOX sola era muy tóxica (tiempo medio de supervivencia: 13,6 días) con una dosis simple de 650 nmol/ratón de 20 g y significativamente menos efectiva, que Q_{1}^{14}gL (Figura 2).

TABLA 25

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Ejemplo 26

Efecto de análogos de LH-RH citotóxicos sobre cánceres de mama de ratón MXT independientes de estrógeno (KS-47) Sustancias utilizadas para el tratamiento

En un experimento anterior, Q_{2} a una dosis diaria de 20 nmol durante 17 días tenía solamente un efecto inhibidor moderado sobre el crecimiento tumoral, y era tóxico a una dosis de 40 nmol (la supervivencia media era 14,6 días). Se eligió una dosis diaria de 30 nmol para el presente experimento, que comparaba la eficacia y toxicidad de Q_{2}^{14}gL (Q_{2} unido a [D-Lys^{6}]LH-RH), Q_{2} (pirrolidin-doxorubicina), [D-Lys^{6}]LH-RH), y [D-Lys^{6}]LH-RH) + Q_{2}.

Se trasplantaron en ratones hembra B_{6}D_{2}F1. trozos (1 mm^{3}) de tumor de ovario ectomizado MXT (3.2). El tratamiento empezó un día después del trasplante y continuó durante 12 días mediante inyecciones i. p. una vez al día. Todos los grupos recibieron cantidades equimolares de los compuestos, tal como se muestra en la Tabla 26-1. Se midieron los tumores en los días 10, 14 y 18, y se calcularon los volúmenes tumorales. los grupos y las dosis. Se muestran los datos en la Tabla 26-1 y en la Figura 3.

El tratamiento con una dosis diaria de 30 nmol de análogo de doxorubicina modificado con daunosamina Q_{2} (pirrolidin-DOX) daba como resultado un fuerte efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral (volumen tumoral: 144 mm^{3} en el día 14 con respecto a 1391 mm^{3} para el grupo control), pero ejercía una grave toxicidad matando a todos los animales antes del final del experimento (supervivencia media 17,9 días). De manera similar, Q_{2} combinado (mezcla) con [D-Lys^{6}]LH-RH daba como resultado un fuerte efecto inhibidor tumoral (volumen tumoral: 80 mm^{3} en el día 14), pero la supervivencia media (18,5 días) era significativamente menor que la del grupo control sin tratar (23,1 días). Como un resultado del tratamiento con Q_{2}^{14}gL, (Q_{2} unido de manera covalente a [D-Lys^{6}]LH-RH), murieron dos animales, uno el día 16 y el otro el día 26. De los 8 animales supervivientes, solamente uno desarrolló tumores en la última medida en el día 18 y todos ellos parecían sanos, pero más tarde todos ellos empezaron desarrollar los tumores. La supervivencia media para este grupo era significativamente mayor (28,3 días, que la del grupo de control. El tratamiento con solamente [D-Lys^{6}]LH-RH) no afectaba al crecimiento tumoral.

Este experimento demuestra que la mayor eficacia y la menor toxicidad periférica de Q_{2}^{14}gL sobre el radical citotóxico Q_{2}se atribuye a la conjugación covalente del radical citotóxico con el análogo portador de LH-RH dirigido.

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TABLA 26-1

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Ejemplo 27

Efectos de 2-pirrolín-DOX (Q_{6}) y del análogo agonista de LH-RH citotóxico Q_{6}^{14}gL ([D-Lys^{6}]LH-RH unido a ^{14}-O-hemiglutarato de Q_{6}) sobre el crecimiento de carcinomas de próstata Dunning R-3327-H en ratas dependientes de andrógenos

Se trataron ratas machos de Copenhague que tenían carcinomas de próstata Dunning R-3327-H con Q_{6}^{14}gL, un nuevo análogo citotóxico de hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH) que consiste en el agonista [D-Lys^{6}]LH-RH unido a 2-pirrolin-doxorubicina. En el primer experimento, se administró 2-pirrolin-doxorubicina con una concentración de 50 nmol/kg, como un solo fármaco (Q_{6}) y como una mezcla sin conjugar con [D-Lys^{6}]LH-RH o conjugada con el portador [D-Lys^{6}]LH-RH (Q_{6}^{14}gL). Después de la segunda administración de 50 nmol/kg de radical de solamente el radical Q_{6} o mezclado con [D-Lys^{6}]LH-RH, todas las ratas murieron con signos de toxicidad general, mientras que sobrevivieron todos los animales que habían sido tratados con el conjugado citotóxico de LH-RH Q_{6}^{14}gL. Después de 5 semanas de tratamiento con una dosis total de 150 nmol/kg de Q_{6}^{14}gL, se retrajeron los tumores desde un volumen original de 8,35 \pm 1,7 cm^{3} al comienzo del experimento a 4,47 \pm 0,8 cm^{3}, mientras que los tumores del grupo de control continuaron creciendo y medían 17,84 \pm 2,2 cm^{3}. La terapia con Q_{6}^{14}gL redujo también significativamente el peso tumoral y la carga tumoral. En el segundo experimento, diseñado para comparar la eficacia y toxicidad de Q_{6} y de Q_{6}^{14}gL, el régimen terapéutico consistía en 3 aplicaciones de 25 nmol/kg de Q_{6} o de 25 nmol/kg y 50 nmol/kg de Q_{6}^{14}gL. Cuando empezó el tratamiento, el volumen tumoral en todos los grupos estaba entre 3,9 y 4,5 cm^{3}. Después de 5 semanas de terapia, los tumores en ratas tratadas con 50 nmol/kg de Q_{6}^{14}gL se retrajeron a 2,3 \pm 0,51 cm^{3}, mientras que 25 nmol/kg de Q_{6} seguía siendo tóxico y solamente podía producir una reducción en el volumen final del tumor de 6,76 \pm 1,4 cm^{3}, similar al obtenido con 25 nmol/kg de Q_{6}^{14}gL (6,74 \pm 1 cm^{3}), en comparación con 15,6 \pm 2,2 cm^{3} para animales sin tratar. La evaluación histológica de los especímenes mostraba una disminución significativa de células mitóticas solamente en los grupos tratados con Q_{6}^{14}gL. Se detectaron receptores de LH-RH con elevada capacidad de unión en las membranas de especímenes tumorales de Dunning sin tratar, pero después del tratamiento con Q_{6}^{14}gL, no se pudieron encontrar lugares de unión para RH-LH. Estaba también asociada la inhibición del crecimiento tumoral mediante AN-201 y Q_{6}^{14}gL con una disminución significativa de la capacidad de unión de receptores de EGF. Tal como se demuestra en las Figuras 4-6, el análogo de LH-RH citotóxico dirigido Q_{6}^{14}gL es un agente eficaz antitumoral causando la regresión de carcinomas de próstata Dunning R-3327-H en ratas. Nuestros estudios también muestran que el análogo de RH-LH citotóxico Q_{6}^{14}gL es mucho menos tóxico que el radical antineoplásico incorporado (Q_{6}), y significativamente más activo en inhibir el crecimiento
tumoral.

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Leyendas de Figuras para el Ejemplo 27

Fig. 4: Experimento I: Volumen tumoral en ratas machos de Copenhague que llevan transplantes de carcinoma de próstata Dunning R-3327-H de rata durante el tratamiento que consiste en 3 aplicaciones de 50 nmol/kg de agonista [D-Lys^{6}]LH-RH y 50 nmol/kg de análogo de RH-LH citotóxico Q_{6}^{14}gL. Las líneas verticales indican la SEM. * p > 0,05; ** p < 0,01 con respecto al control mediante el nuevo ensayo de intervalo múltiple. El tratamiento indicado mediante flechas se aplicó los días 1, 8 y 29.

\ding{61} Los animales tratados con Q_{6}en un solo fármaco o en una mezcla no conjugada con [D-Lys^{6}]LH-RH murieron en la segunda semana. En estos dos grupos se muestra el volumen tumoral registrado el día 8.

Fig. 5: Experimento II: Efecto del tratamiento con 25 nmol/kg de 2-pirrolín-doxorubicina (Q_{6}), 25 nmol/kg y 50 nmol/kg de análogo de LH-RH citotóxico Q_{6}^{14}gL sobre el volumen tumoral en ratas con cáncer de próstata Dunning R-3327-H. Las líneas verticales indican la SEM. * p > 0,05; ** p < 0,01 con respecto al control. El tratamiento indicado mediante flechas se aplicó 3 veces, es decir los días 1, 8 y 29.

Fig. 6: Experimento II: Efecto del tratamiento con 25 nmol/kg de 2-pirrolin-doxorubicina (Q_{6}), 25 nmol/kg y 50 nmol/kg de análogo de LH-RH citotóxico Q_{6}^{14}gL sobre el peso corporal en ratas con cáncer de próstata Dunning R-3327-H. Las líneas verticales indican la SEM. * p > 0,05; ** p < 0,01 con respecto al control. El tratamiento indicado mediante flechas se aplicó 3 veces, es decir los días 1, 8 y 29.

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Ejemplo 28

Estudio comparativo sobre los efectos de doxorubicina (DOX) y análogo agonista de LH-RH citotóxico dirigido Q_{6}^{14}gL ([D-Lys^{6}]LH-RH unido a ^{14}-O-hemiglutarato de Q_{6}) sobre el crecimiento de carcinoma de ovario humano OV-1063 en ratones sin sistema inmune

Línea celular cancerosa de ovario epitelial humano OV-1063 originada de un quisteadenocarcinoma papilar metastático del ovario de una mujer de 57 años de edad (Horowitz et al. (1985) Oncology 42, 332-337). Se inyectaron de forma subcutánea en tres ratones sin sistema inmune diez millones de células de OV-1063. Se transplantaron en sesenta animales trozos de 1 mm^{3} de estos tumores para estudios de inhibición del crecimiento in vivo. El objeto del experimento era demostrar que, como resultado de la presencia de receptores para LH-RH en OV-1063, el conjugado citotóxico de LH-RH era más efectivo y menos tóxico, que DOX, el radical citotóxico que contiene. Así, los efectos del conjugado de LH-RH citotóxico se compararon con los de DOX, con los de la mezcla de DOX con la molécula portadora, con los del portador solo y con los de los grupos control sin tratar. Se administraron todas las inyecciones de manera intraperitoneal. Se disolvieron los compuestos en cloruro sódico al 0,9% en agua (solución salina).

Se dividieron los ratones con un tamaño de tumor medio de aproximadamente 15 mm^{3} en seis grupos de nueve animales y recibieron el siguiente tratamiento siete después del transplante del tumor: grupo 1, solución salina; grupo 2, Q_{6}^{14}gL con una dosis de 700 nmol/animal de 20 g; grupo 3, Q_{6}^{14}gL, con una dosis de 413 nmol/animal de 20 g (dosis tolerada máxima, MTD para DOX); grupo 4, DOX a 413 nmol/animal de 20 g (MTD); grupo 5, mezcla de 700 nmol/20 g de DOX y 700 nmol/20 g de [D-Lys^{6}]LH-RH; grupo 6, análogo agonista portador de [D-Lys^{6}]LH-RH a una dosis de 700 nmol/animal de 20 g.

Los análisis de receptores de OV-1063 mostraban la presencia de lugares de unión de elevada afinidad para LH-RH.

Resultados: Tal como muestra la Fig. 7, se consiguió una fuerte inhibición del crecimiento tumoral mediante tratamiento con Q_{6}^{14}gL, con una dosis de 413 nmol/20 g (grupo 3). Los animales no mostraban signos de grave toxicidad. Por el contrario, el tratamiento con DOX administrado con la misma dosis de 413 nmol/20 g (12 mg/kg, MTD, grupo 4) no daba como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral en los tres animales supervivientes al final del experimento. Tres animales murieron el día cinco y seis animales en el día nueve debido a la toxicidad. Con una dosis más elevada, (700 nmol/20 g, grupo 2), Q_{6}^{14}gL mostraba una inhibición muy fuerte del crecimiento tumoral (Fig. 7). Dos de nueve animales murieron debido a la toxicidad y un animal murió accidentalmente. Los seis animales supervivientes se estaban recuperando de una pérdida de peso de aproximadamente 20% al final del experimento. En el grupo 6, se mezcló la misma dosis elevada (700 nmol/20 g) de DOX con 700 nmol de [D-Lys^{6}]LH-RH. En el día 5, murieron todos los animales de este grupo como resultado de grave toxicidad.

Conclusiones: Nuestros resultados demuestran claramente que debido a la presencia de receptores para LH-RH en las células del cáncer epitelial de ovario OV-1063, el conjugado de LH-RH citotóxico dirigido Q_{6}^{14}gL muestra menor toxicidad y mayor actividad antitumoral que la doxorubicina (Q_{1}). El radical citotóxico que contiene.

Claims (5)

1. Un procedimiento para la conversión del nitrógeno de un grupo amino primario de una \alpha,\beta- o \alpha,\gamma-hidroxi-amina primaria en el nitrógeno de un compuesto heterocíclico que contiene nitrógeno monoinsaturado que tiene entre 5 y 6 átomos en el anillo, que comprende las etapas secuenciales de

a)

tratar dicha hidroxi-amina con un exceso de un haloaldehído que tiene un carbono del aldehído, un carbono que porta halo y que tiene 2 ó 3 restos entre el carbono del aldehído y el carbono que porta halo, seleccionado del grupo que consiste en CH_{2}, CH_{2}-CH_{2} y OCH_{2},

b)

añadir un exceso, con relación a la hidroxi-amina, de una base orgánica,

c)

neutralizar dicha base con un ácido débil y

d)

tratar con un ácido acuoso diluido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) se lleva a cabo en un disolvente orgánico aprótico inerte en la reacción.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) se lleva a cabo en un disolvente orgánico polar, no hidroxílico, inerte en la reacción.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el disolvente es dimetilformamida.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el aldehído se selecciona del grupo que consiste en omega-bromo- y omega-yodo-butiraldehído y valeraldehído.