JP2007045845A - 標的細胞毒性アントラサイクリン類似体の合成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、α，β−又はα,γ−ヒドロキシ第一アミンの第一アミノ基の窒素を、環中に５と６個の原子を有する一不飽和窒素の窒素を含有する複素環式化合物の窒素に変える方法に関する。
【解決手段】連続工程：
ａ）前記ヒドロキシアミンを、アルデヒド炭素、ハロゲンを有する炭素及びアルデヒド炭素とハロゲンの間にＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２及びＯＣＨ_２から成る群から選択された２又は３個の基を有する、過剰のハロアルデヒドで処理し、
ｂ）ヒドロキシアミンに対して過剰の有機塩基を添加し、
ｃ）前記塩基を弱酸で中和し、
ｄ）希酸水溶液で処理する、
から成ることを特徴とする方法により達成された。
【選択図】なし

Description

本発明は、一部政府の援助で行われた。政府は本出願の一定の権利を有する。

本発明は、標的抗癌剤であるアントラサイクリン誘導体化学分野に属する。更に詳細には、本発明は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）又は、ペプチドホルモン類似体、例えばＬＨ−ＲＨ、ボンベシン及びソマトスタチンと共有結合したそのダウノサミン変性誘導体（ＤＭ−ＤＯＸ）に関する。これらの共役結合体は、ペプチドホルモン類似体用の受容体を有する種々の腫瘍を標的とする。

第６位に細胞毒性基を有するＬＨ−ＲＨ類似体が、シャーリー（Ｓｃｈａｌｌｙ）、ジャナキー（Ｊａｎａｋｙ）及びバジャツ（Ｂａｊｕｓｚ）の欧州特許０４５０４６１号明細書（ｇｒａｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、１９９５年９月６日）に記載されている。

生殖腺刺激ホルモンを破壊するＧｎＲＨ（ＬＨ−ＲＨ）類似体がネット（Ｎｅｔｔ）及びグロウド（Ｇｌｏｄｅ）のＷＯ９０／０９７９９号明細書（１９９０年９月７日発行）に記載されている。この明細書には、性腺刺激ホルモンを破壊し、従って性ホルモンによる癌を治療するためのＬＨ−ＲＨの類似化合物に結合したリシンの様な毒素が記載されている。ＬＨ−ＲＨドキソルビシン誘導体についても、リンキングの化学的詳細はないが、記載されている。

細胞毒性ソマトスタチン類似体が、シャリーその他の１９９０年４月６日出願の米国特許、１９９３年７月１５日再出願の出願番号０８／０７６８４６号明細書に記載されている。

Ａｎｔｉ−Ｃａｎｓｅｒ Ｄｒｕｇｓ、第５巻、１１５〜１３０頁（１９９４年）のＡ．Ｖ．シャリーの論文に、ＬＨ−ＲＨ、ボンベシン又はソマトスタチンの類似体の非常に多様な腫瘍の細胞膜上に受容体が存在することについて詳説されている。

Ｇ．ウェックベッカー（Ｗｅｃｋｂｅｃｋｅｒ）は、Ｆａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．第６０巻、２４５〜２６４頁（１９９３年）の論文で、正常組織及び腫瘍組織上のいくつかでソマトスタチン類似体の受容体及び受容体サブタイプの存在を示す文献を幾つか列記している。

ボンベシン様ペプチド及び種々の正常組織及び腫瘍組織上のボンベシン／ＧＲＰ受容体の存在について、Ｎ．バネット（Ｂｕｎｎｅｔｔ）の論文［Ｇｕｔ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ４２３〜４４５（１９９４）Ｅｄ．：、Ｊ．Ｗａｌｓｃｈ ａｎｄ Ｇ．Ｊ．Ｄｏｃｈｒａｙ,Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ,ニューヨーク］及びＥ．スピンデル（Ｓｐｉｎｄｅｌｌ）の論文［Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４８（１９９３）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）］で討論されている。

ドキソルビシン（ＤＯＸ）は、現時点では、最も頻用されており、非常に有効な抗癌剤である。しかし、ある特定の腫瘍はこれに全く反応せず、従ってその使用は、多薬剤耐性（ＭＤＲ）及び慢性治療の結果である心毒性や好中球減少症が原因となって制限されている。これらの欠点を克服し、抗腫瘍作用を有する有力なアントラキノン構造抗生物質を開発するために、種々のキャリア巨大分子と結合したその標的類似体を含めて、何千もの合成誘導体が発表されている。

ＤＯＸ及びその類似体の歴史の多くは、“Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ”［Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｈｅｎｒｙ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．３０、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ１５〜５７頁（１９７６年）］及び本：Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｆｅｄｅｒｉｃｏ Ａｒｃａｍｏｎｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８１年）に記載されている。

抗腫瘍作用を有する、高活性の、アルキル化、非交叉耐性の、３’−デアミノ−３’−（３”−シアノ−４”−モルホリニル）−ＤＯＸ及びその誘導体が、モシャー（Ｍｏｓｈｅｒ）その他による米国特許第４４６４５２９号明細書（１９８４年８月７日）に記載されている。これら“強力に有効なモルホリニルアントラキノン”の合成及び生物学的評価は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第２７巻、６３８〜６４５頁（１９８４年）にも記載されている。

Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８８巻、４８４５〜４８４９頁（１９９１年６月）中で、ガオ（Ｇａｏ）その他が、ダウノルビシン誘導体によるＤＮＡ配列のホルムアルデヒド媒介アルキル化を詳説している。

潜在性アルキル化置換基を有するアントラキノン類似体が、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３５巻、３２０８〜３２１４頁（１９９２年）に記載されている。

ＤＯＸのダウノサミン窒素をアルキル化するためにα，ω−ジヨード化合物を使用すること、従って新規モルホリニルＤＯＸ誘導体の生成が、１９８９年１２月１２日、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ提出の欧州特許ＥＰ第４３４９６０号明細書に記載されている。

Ｎ−トリフルオルアセチルアドリアマイシン^１４−Ｏ−ヘミグルタレート及び−ヘミアジペートが、改善された水溶性を有するＮ−トリフルオルアセチルアドリアマイシン^１４−Ｏ−バレレート（ＡＤ−３２）の類似体として、イスラエル（Ｉｓｒａｅｌ）その他、米国特許４２９９８２２号明細書（１９８１年１１月１０日）に記載されている。

ホルトン（Ｈｏｒｔｏｎ）及びプリーベ（Ｐｒｉｅｂｅ）（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、ＸＸＸＶＩ、１２１１〜１２１５）は、１４−ＯＨ親類似体と比較して抗癌活性があまり異ならない別のアントラサイクリンの１４−Ｏ−エステルを幾つか記載している。

標的化学療法薬を開発する際に、下記の目標事項が求められる：
１．標的到達までのキャリア分子と化学療法薬の間の安定な結合。
２．結合体内でのキャリア分子の生物学的特性の保持、例えば結合特性保持。
３．結合体内での化学療法薬の薬理学的活性の保持、例えば細胞毒性保持。
４．結合の結果として、非共役結合基に比較して活性がより強力であり、及び／又は末梢毒性が低い類似体の製造。

ＤＯＸのダウノサミン基のＮａＩＯ_４の酸化、引き続いてのキャリア分子の第一アミンを含む還元アルキル化によるＤＯＸの共役結合は、セラ（Ｓｅｌａ）その他の米国特許第４２６３２７９号明細書（１９８１年４月２１日）中に記載されている。

シス−アコニット酸スペーサーは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８１年）第１０２巻、１０４８〜１０５４頁に記載されているように、ダウノサミン窒素をｐＨ−感応性結合を有する巨大分子キャリアと結合させるために使用された。

１４−ブロモダウノルビシンと蛋白質又はポリ−Ｌ−アミノ酸との間のエステル結合及びＣ−Ｎ結合の形成が、ズニノ（Ｚｕｎｉｎｏ）その他著（１９８１年）Ｔｕｍｏｒｉ第６７巻、５２１〜５２４頁及び（１９８４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｓｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第２０巻、４２１〜４２５頁に記載されている。

モルホリノ−ＤＯＸ（ＤＯＸの高活性の、ダウノサミン変性類似体）は、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９０（５）、３２５〜３３０頁に記載されているように、加水分解可能な（リゾソモトロープ、ｐＨ感受性）ヒドラゾン結合（細胞毒性剤のＣ−１３オキソ官能基を含む）を介して抗体と共役結合された。

酵素による変性に対するロイシン残基のカルボキサミド結合の感応性を使用して、“スペーサーアーム”ペプチド、有利にはＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含有するＤＯＸを共役結合させることに成功したが、その際、カルボキシ末端ＬｅｕがＤＯＸ中のダウノサミン窒素をアシル化し、アミノ末端Ａｌａがジカルボン酸スペーサーを介してキャリアと結合される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８２年、７９、６２６〜６２９頁に記載されているように）。

ＤＯＸのダウノサミン窒素は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９２年、８９、９７２〜９７６頁に記載されているように、グルタミン酸スペーサーによりアシル化され、細胞毒性が著しく損なわれてＬＨ−ＲＨ類似体に結合された。

種々のヒトの腫瘍を治療するための本発明による化合物の使用に関するその他の文献は下記のものである：

参考文献は全て本明細書に参考までに包含される。

本発明の化合物は、アントラサイクリン細胞毒性剤、例えばＤＯＸ又はＤＭ−ＤＯＸから成る新規の標的細胞毒性ペプチドホルモンであり、これらはペプチドホルモン、例えばＬＨ−ＲＨ類似体、ボンベシン及びソマトスタチンと共役結合している。これらの細胞毒性ペプチドホルモン共役結合体は、共役結合体の特異的な受容体を有する腫瘍、例えば乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膵臓癌、直腸癌、胃癌及び肺癌の治療を目的とする。本明細書で使用されるこれらの（非共役）アントラサイクリン細胞毒性剤のあるものは、それ自体新規であり、非常に有効であるが、その毒性レベルが非結合形で使用するのには高すぎる。

本発明によるダウノサミン変性ＤＯＸ類似体は、ペプチドキャリアと共有結合を形成するために好適な新規、高活性、非交叉耐性の、ＤＯＸ類似体の研究の間に開発された。

成分の生物学的活性が充分保持されている安定な共有結合体の形成は、グルタル酸の様なジカルボン酸スペーサーを使用することによって達成された。スペーサーのカルボキシル基１個がＤＯＸ又はＤＭ−ＤＯＸの１４−ＯＨ基とのエステル結合１個を形成し、スペーサーの他のカルボキシル基がペプチドキャリアの選択された遊離アミノ基とのカルボキシアミド結合１個を形成する。

本発明の化合物は一般式
Ｑ^１４−Ｏ−Ｒ−Ｐ （Ｉ）
［式中、Ｑは、一般式

(II)
を表わし、Ｑ^１４は１４位に側鎖を有するＱ基を表わし、Ｒ−はＨ又は−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｎ=０〜７であり、Ｒ’は、ＮＨ_２又は芳香族飽和又は部分飽和の５員又は６員の複素環式化合物（これは環窒素少なくとも１個を有し、場合により前記環の隣接炭素原子と結合して双環系を形成するブタジエン基を有する）であり、Ｐは、Ｈ又はペプチド基、有利にはＬＨＲＨ、ソマトスタチン又はボンベシン類似体であるが、その他の生理学的に活性のペプチドを除外するものではない］により表わされる。特に新生物細胞受容体に対する親和性を有するようなＬＨＲＨ類似体、特に６位にＤ−Ｌｙｓ基を有するような類似体並びに短縮ソマトスタチン及びボンベシン類似体が好適である。Ｒ’がＮＨ_２である場合には、Ｒ及びＰはＨ以外のものである。Ｒ及びＰがＨである場合には、Ｒ’はＮＨ_２以外のものである。

新規合成反応はこの研究の途中で発見された。ドキソルビシン及びその誘導体が、１４位でジカルボキシル基を介して結合して、薬理学的作用を有する新規共役結合体を生成することを見出しただけでなく、ビシナル又はディスジャンクトな即ちα，β−又はα,γ−ヒドロキシ第一アミンから部分的に飽和した複素環式基を形成する新規方法も得られた。本発明の詳細な出願は、ダウノサミン糖上の２”−ピロリニル及び１”，３”−テトラヒドロピリジニル基の形成である。しかし、この反応はより広い出願可能性を有する。５及び６員の部分的に飽和した複素環式基は、ビシナル又はディスジャンクトなヒドロキシアミンをアルデヒド炭素とハロゲン基を有する炭素原子との間に２又は３個の基を有するハロゲン−置換アルデヒドとを反応させる場合に、形成することができる。これらの基は全てメチレンであってもよいし、ヘテロ原子、例えば酸素が包含されていてもよい。この反応は３段階で行われる。非常に過剰のハロアルデヒドをヒドロキシアミンの酸塩と、有利には極性不活性無水有機溶剤中で反応させる。それによって、５員のオキサゾリジン環（又は６員の１，３−テトラヒドロオキサジン環）がアルデヒド基をヒドロキシル及びアミン基と縮合させることによって形成される。この生成物を有機塩基、有利には第三アミンを用いて処理し、その際、ハロゲン化水素酸の成分が元のハロアルデヒドのハロ基とオキサゾリジン又は１，３−テトラヒドロオキサジン環の第二アミノ基の間で除去され、５員又は６員環の添加により縮合環構造を形成する。次いで塩基を弱酸、有利には有機酸、例えば氷酢酸で中和する。水性酸、有利には有機酸で処理することのよって、縮合環のオキサゾリジン又は１，３−テトラヒドロキサジン部が開裂する。出発アルデヒドに応じて、最終窒素を含有する環は前記したように少なくとも１個の付加的なヘテロ原子を含有していてよいことは、当業者には理解される。一般的な反応は下記のように図示される：

式中、Ｘ’はハロゲン、有利には臭素又は沃素、有利には沃素であり、ＹはＣＨ_２、ＯＣＨ_２、ＣＨ_２−ＣＨ_２であり、Ｚは単結合又はＣＨ_２である。

Ｚが単結合である場合には、反応第１工程としてアルデヒド成分は５員のオキサゾリジン環を形成する。ＺがＣＨ_２である場合には、アルデヒド基は６員の１，３−テトラヒドロオキサジン環を形成する。このような環形成は公知であるが、例えば無水媒剤中の塩基性媒剤、例えば第三アミン中でのハロアルカン側鎖によって環を閉鎖させることと組み合わせては、この反応は新規であり、意外である。

基Ｑは、Ｒ’で特定の有利な基により置換されている場合には、Ｑ_１〜Ｑ_８で表わされる亜基を有し、その中Ｑ_２〜Ｑ_８は新規細胞毒性基である。

Ｒ’は、下記の括弧内に列記した有利なＱ_Ｘを生じる有利な値を有する：ＮＨ_２（Ｑ_１）、ピロリジン−１−イル（Ｑ_２）、イソインドリン−２−イル（Ｑ_３）、３−ピロリン−１−イル（Ｑ_４）、３−ピロリドン−１−イル（Ｑ_５）、２−ピロリン−１−イル（Ｑ_６）、３−ピペリドン−１−イル（Ｑ_７）又は１，３−テトラヒドロピリジン−１−イル（Ｑ_８）。

従ってＲ−ＰがＨであり、−Ｒ’が−ＮＨ_２である場合は、Ｑ_１はＤＯＸであり、Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’がピロリジン−１−イルである場合は、Ｑ_２は３’−デアミノ−３’−（ピロリジン−１”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_２）であり、Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’がイソインドリン−２−イルである場合は、Ｑ_３は３’−デアミノ−３’−（イソインドリン−２”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_３）であり；Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’が３−ピロリン−１−イルである場合は、Ｑ_４は３’−デアミノ−３’−（３”−ピロリン−１”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_４）であり；Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’が３−ピロリドン−１−イルである場合は、Ｑ_５は３’−デアミノ−３’−（３”−ピロリドン−１”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_５）であり；Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’が２−ピロリン−１−イルである場合は、Ｑ_６は３’−デアミノ−３’−（２”−ピロリン−１”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_６）であり；Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’が３−ピペリドン−１−イルである場合は、Ｑ_７は３’−デアミノ−３’−（３”−ピロリドン−１”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_７）であり；Ｒ−ＰがＨであり、−Ｒ’が１，３−テトラヒドロ−ピリジン−１−イルである場合は、Ｑ_８は３’−デアミノ−３’−（１”，３”−テトラヒドロピリジン−１”−イル）−ドキソルビシン（Ｑ_８）である。

アルキル化作用を有する五員環中でダウノサミン窒素を組み込む化合物は、六員環中にダウノサミン窒素を組み込むその同族対照体よりも生体内で１０〜５０倍活性が高い（この様な組み合わせは、Ｑ_５及びＱ_７並びにＱ_６及びＱ_８）。

本発明の有利な態様では、式Ｑ^１４−Ｏ−Ｒ−Ｐの物質中で、Ｒ及びＰは水素以外のものである。Ｐが水素以外のものである場合には、即ちＰ_１、Ｐ_２及びＰ_３であり、有利にはＰ_１がＬＨ−ＲＨアゴニストキャリア、ＬＨ−ＲＨ拮抗物質キャリア又は短縮ＬＨ−ＲＨ類似体キャリアである場合には、Ｐ_２は短縮ソマトスタチン類似体であり、Ｐ_３はボンベシン拮抗物質である。

有利には、Ｐ_１は、Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｘｘｘ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄｄｄ［式中、（Ｘｘｘ）は水素又はジアミノ置換分、例えばＡ_２Ｂｕ又はＡ_２Ｐｒであり、その際、ＡａａがＧｌｐである場合には、ＢｂｂはＨｉｓであり、ＣｃｃはＴｒｐであり、ＤｄｄはＧｌｙ−ＮＨ_２であり、ＡａａがＡｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）、Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ又はＡｃＤ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）である場合には、ＢｂｂはＤ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）又はＤ−Ｐｈｅであり、ＣｃｃはＤ−Ｐａｌ（３）及びＤ−Ｔｒｐであり、ＤｄｄはＤ−Ａｌａ−ＮＨ_２であり；Ａａａ−Ｂｂｂ−ＣｃｃがＡｃである場合には、Ｄｄｄは−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_３である］であり；Ｐ_２は、

［式中、ＡａａがＤ−Ｐｈｅである場合には、ＢｂｂはＴｙｒであり、ＣｃｃはＶａｌであり、ＤｄｄはＴｈｒ又はＴｒｐであり；ＡａａがＤ−Ｔｒｐである場合には、ＢｂｂはＰｈｅであり、Ｃｃｃ及びＤｄｄはＴｈｒである］であり、Ｐ_３は、Ａａａ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ Ｂｂｂ−ＮＨ_２［式中、Ａａａは０、Ｄ−Ｔｐｉ又はＤ−Ｐｈｅであり、Ｂｂｂは（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｌｅｕ、（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｐｈｅ、（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｔｒｐ、（ＣＨ_２−Ｎ）Ｔａｃ又は（ＣＨ_２−Ｎ）ＤＭＴａｃである］である。

ＬＨ−ＲＨ類似体を組み込む本発明の新規化合物中では、細胞毒性基Ｑは、式ＶＩＩ

［式中、ｍは１又は０であり、ｍが１の場合にはｎは１又は２である、即ち（Ｘｘｘ）はＡ_２Ｂｕ又はＡ_２Ｐｒであり、ｍが０の場合にはｎは１又は２である、即ち（Ｘｘｘ）はＨであり、ｎは１である］で表わされるように、ジカルボキン酸スペーサーを介して、ＬＨ−ＲＨ類似体上のＤ−Ｌｙｓ側鎖又はそれに結合した（Ｘｘｘ）基に結合している。

ソマトスタチン類似体を組み込む本発明の新規化合物中では、細胞毒性基Ｑは、式ＶＩＩＩ

）で表わされるように、ジカルボキン酸スペーサーを介して、ソマトスタチン類似体のアミノ末端に結合している。

ボンベシン拮抗物質類似体を組み込む本発明の新規化合物中では、細胞毒性基Ｑは、式ＩＸ

で表わされるように、ボンベシン拮抗物質のアミノ末端に結合している。

本発明の特に有利な態様は、細胞毒性基としてのＱ_１及びＱ_６及びＱ_１（ドキソルビシン）又はＱ_６（２−ピロリノ−ドキソルビシン）と１４−Ｏ−エステル結合及びペプチドキャリアとカルボキサミド結合を形成するジカルボン酸スペーサーとしてのグルタル酸（ｎ=３）を含有する様なペプチド結合体である。

本発明の最も有利な態様は、下記式：

の細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体、下記式：

の細胞毒性ソマトスタチン類似体及び下記式:

の細胞毒性ボンベシン拮抗物質類似体である。

ビシナル又はディスジャンクトの、即ちα，β−又はα，γ−ヒドロキシアミンの窒素と部分的に飽和した複素環式環を形成する新規方法において、反応の第１工程は、無水の不活性有機極性、ノン−ヒドロキシル（中性）溶剤中で行い、有利にはジメチルホルムアミド中で、実質的に過剰の、有利には３０倍過剰のハロアルデヒド、４−ヨードブチルアルデヒド及び５−ヨードバレルアルデヒドを使用するのが特に有利である。しかし、本発明はこれらに限定されるものではなく、沃素の代わりに臭素を使用してもよい。この反応及び引続く工程は室温で行うことができる。

塩基処理は、過剰の、有利には２〜４倍過剰の有機塩基を用いて実施する。第三アミン、例えばトリアルキルアミンがこの目的に好適である。

こうして形成した双環を、水の存在で有機酸で処理することのよって開環させて、ビシナル又はディスジャンクトなヒドロキシル基を放出させる。希水性トリフルオル酢酸を、有利には不活性有機溶剤、例えばアセトニトリル中で、使用することができる。揮発物を減圧下で除去し、過剰のハロゲン化合物をヘキサンで抽出し、残分をＨＰＬＣで精製することによって、生成物を精製する。
略 語
本発明のペプチド及びその誘導体の記載で、一般にペプチド化学業界で受け入れられており、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．,１３８，９〜３７頁（１９８４年］により推奨されているように、アミノ酸に慣用の略語を用いる。

個々のアミノ酸残基の略語は、アミノ酸の慣用名に基づく、例えば、Ｇｌｐはピログルタミン酸、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｔｒｐはトリプトファン等である。略語は、他に記載のない限り、アミノ酸のＬ異性体形を示す、例えばＳｅｒはＬ−セリンであり、Ｄ−ＬｙｓはＤ−リジンである。

本発明における一般的ではないアミノ酸の略語は下記のものである：Ｄ−Ｎａｌ（２）はＤ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｄ−Ｐａｌ（３）はＤ−３−（３−ピリジル）アラニンであり、Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）はＤ−４−クロルフェニルアラニンである。

ペプチド配列は、慣用に従って記載し、その際、Ｎ−末端アミノ酸は左に、Ｃ−末端アミノ酸は右にある、例えばＧｌｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ。

式、Ｌｅｕ（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｌｅｕ−ＮＨ_２はペプチド配列のＣ末端でロイシン及びロイシンアミド基の間の短縮ペプチド結合を表わす。

使用したその他の略語は下記とおりである：
Ａ_２Ｂｕ：ジアミノ酪酸
Ａ_２Ｐｒ：ジアミノプロピオン酸
ＢＮ：ボンベシン
ＢＯＰ試薬：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオルホスフェート
ＤＩＰＥＡ：Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭ−ＤＯＸ：ダウノサミン変性ドキソルビシン
ＤＭＦ：Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＴａｃ：５，５−ジメチル−トリアゾリジン−４−カルボン酸
ＤＯＸ：ドキソルビシン
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｇｌｔ：−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−、グルタリル
Ｇｌｔ_２Ｏ：無水グルタル酸
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯ−ｇｌｔ−ＯＨ：グルタル酸
ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＴＦＡ：トリフルオル酢酸
Ｔａｃ：チアゾリジン−４−カルボン酸
Ｔｐｉ：２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸。

１６８型ダイオードアレイ検出器及びシステム ゴールド クロマトグラフィー ソフトウェア（Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｂｅｃｋｍａｎ）を具備したベックマン分析ＨＰＬＣシステムを用いて、化学反応をモニターし、本発明の化合物の純度を検査した。使用したカラムはＤｙｎａｍａｘ Ｃ−１８（２５０×４．６ｍｍ；孔の大きさ：３００Å；粒度：１２μｍ）であった。化学反応をモニターするために、（ｉ）水中の０．１％ＴＦＡ及び（ｉｉ）７０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの２種類の成分から成る溶剤系を１分間に１％（ｉｉ）増加する直線傾斜法で使用した。系は純粋な対照に関してアイソクラチックモードで使用した。

ベックマンモデル３４２半調製ＨＰＬＣ系を使用して、本発明の化合物の単離及び精製を行った。カラムはアクアポール オクチル（Ａｑｕａｐｏｒｅ Ｏｃｔｙｌ）（２５０×１０ｍｍ；孔の大きさ：３００Å；粒度：１５μｍ）であった。溶剤系は前記分析ＨＰＬＣ用に記載したものと同じであった。
分 析
Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ３００ ＮＭＲ分光計（３００ＭＨｚ １Ｈ周波数、７５ＭＨｚ １３Ｃ周波数）及びエレクトロスプレー 質量分光計Ｆｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ ＴＳＱ７０００を使用して、ドキソルビシン誘導体の構造を同定した。
ペプチドキャリアの合成
本発明のペプチドは製薬的に認容性の無毒の塩、例えば酸付加塩の形で投与されることが多い。このような酸付加塩の例は、塩化水素塩、臭化水素塩、硫酸塩、燐酸塩、フマル酸塩、グリコン酸塩、タンニン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、トリフルオル酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、琥珀酸塩、アルギン酸塩、パモエート、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。活性成分を錠剤形で投与する場合には、錠剤は、結合剤、例えばトラガント、コーンスターチ又はゼラチン、崩壊剤、例えばアルギン酸及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含む製薬的に認容性の希釈剤を含有することができる。

液体形の投与が望ましい場合には、甘味及び／又は芳香剤を製薬的に認容性の希釈剤の一部として使用することができ、等張食塩水、緩衝剤溶液等中の静脈内投与が有効である。

薬剤組成物は、一般にペプチドを、慣用の製薬的に認容性のキャリアと結合させて含有する。一般に用量は、静脈内投与の場合には宿主の体重１ｋｇ当たりペプチド１〜約１００ミクログラムであり、経口用量はこれよりはるかに高いであろう。全般的にこれらのペプチドを用いる患者の治療は一般にその他のＬＨＲＨ類似体、ソマトスタチン及びドキソルビシン類似体を用いる臨床治療と同じように行われる。

これらのペプチドは哺乳類に静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内又は膣内に投与して、特異的な受容体と結合することのよって生物学的ホルモン効果を達成させることができる。ＬＨＲＨ類似体の場合には、これらの効果には生殖腺活性の可逆的な抑制が含まれ、ソマトスタチン類似体の場合には、胃腸機能の抑制が含まれる。有効用量は、投与形及び治療すべき哺乳類の詳細な種類により変わる。代表的な用量形の例は、体重１ｋｇ当たり約０．１〜２．５ｍｇの範囲の用量が投与されることになる溶液である、ペプチドを含有する生理的食塩水溶液である。ペプチドの経口投与は固体形で投与してもよいし、液体形で投与してもよい。

本発明のペプチドキャリアの合成は、ペプチド化学業界の当業者に公知の任意の方法で実施することができる。好適な方法のまとめがＭ．ボ−デンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｙ）著、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルク、１９８４年）に記載されている。固体相ペプチド合成法は、Ｊ．Ｍ．スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）及びＪ．Ｄ．ヤング（Ｙｏｕｎｇ）著、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード、１９８４年、第２版）の教科書及びＧ．バラニー（Ｂａｒａｎｙ）その他著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．第３０巻、７０５〜７３９頁（１９８７年）の概観に記載されている。

本発明で使用されるＬＨ−ＲＨ類似体キャリアの合成は、米国特許第５２５８４９２号明細書の（Ｓａｎｄｏｒ Ｂａｊｕｓｚ及びＡｎｄｒｅｗ Ｖ．Ｓｃｈａｌｌｙ、１９９３年１１月２日）の実施例及びバジャツ（Ｂａｊｕｓｚ）その他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８５巻、１６３７〜１６４１頁（１９８８年）及び第８６巻、６３１８〜６３２２頁（１９８９年）及びジャナキー（Ｊａｎａｋｙ）その他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、１０２３〜１０２７頁及び９７２〜９７６頁（１９９２年）の論文に詳説されている。

本発明で使用されるソマトスタチン類似体キャリアの合成は、米国特許第４６５０７８７号明細書（１９８７年３月１７日、Ａｎｄｒｅｗ Ｖ．Ｓｃｈａｌｌｙ及びＲｅｎｚ Ｚ．Ｃａｉ．）の実施例に詳説されている。合成の説明は、カイ（Ｃａｉ）その他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８３巻、１８９６〜１９００頁（１９８６年）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８４巻、２５０２〜２５０６頁（１９８７年）にも記載されている。

本発明で使用されるボンベシン拮抗物質キャリアの合成は、コイ（Ｃｏｙ）その他著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６３巻、５０５６〜５０６０頁（１９８８年及び第２６４巻、１４６９１〜１４６９７頁（１９８９年）及びカイその他著Ｐｅｐｔｉｄｅｓ第１３巻、２６７〜２７１頁（１９９２年）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９１巻、１２６６４〜１２６６８頁（１９９４年）の論文に詳説されている。

次に実施例に付き、本発明に使用されるドキソルビシン誘導体の合成及び別のペプチドキャリアとの共役結合体の生成を詳説するが、本発明はこれにのみ限定されるものではない。

例１
Ｎ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートの製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩、５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ３０ｍｇ（９０μモル）を加え、次いでＤＩＰＥＡ３１μｌ（１８０μモル）を加えた。３時間攪拌した後、分析ＨＰＬＣにより評価したように、反応は完了した。溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ高真空蒸発器中で蒸発乾固させ、残分をＨ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡで摩擦することによって晶出させた。結晶を濾過し、冷エーテルで１回洗浄して痕跡の過剰Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを除去した。デシケータ中で乾燥させた後、９８％純粋なＮ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ、ｍ=６２ｍｇが得られた。収率：９４％。

中間生成物をＧｌｔ_２Ｏ１１．４ｍｇ（１００μモル）と無水ＤＭＦ１ｍｌ中でＤＩＰＥＡ２６．１μｌ（１５０μモル）の存在で１晩反応させた。溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で蒸発させ、残留油状物を０．１％水性ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で摩擦することによって固体にした。こうして得た粗生成物は、分析ＨＰＬＣにより評価されるように、Ｎ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ１４−Ｏ−ヘミグルタレート７０％、未反応Ｎ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ２０％及びその他の不純物１０％を含有する。この粗生成物を更に精製せずにペプチドＤＯＸ共役結合体の製造に使用することができる。この粗生成物をＴＦＡ０．１％を含有する６０％水性アセトニトリル２０ｍｌ中に溶解させ、半調製ＨＰＬＣにかけると、９８％純粋なＮ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ１４−Ｏ−ヘミグルタレート最終生成物４５．７ｍｇが得られた（収率：６４％）。

例２
３’−デアミノ−３’−（ピロリジン−１”−イル）−ドデキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_２）及びその１４−Ｏ−ヘミグルタレート（ＡＮ−１９３）ＴＦＡ塩の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、１５倍過剰の１，４−ジヨードブタン１７１μｌ（１．３ミリモル）を加え、次いで３倍過剰のＤＩＰＥＡ４５μＬ（２６０μモル）を加えた。反応混合物を室温で１晩攪拌した。１６時間後、分析ＨＰＬＣにより評価したように、反応は完了した。溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃで蒸発させ、残留した油状物をＨ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ３ｍｌ中に溶解させ、エーテルで抽出して、過剰の１，４−ジヨードブタンを除去する。次いで水性抽出物をＨＰＬＣにかけ、９８％純粋なＤＯＸ誘導体ｍ：４１．６ｍｇが得られた（収率６８％）。

こうして得た３’−デアミノ−３’−（ピロリジン−１”−イル）−ドキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_２）４１．６ｍｇ（５８μモル）をＧｌｔ_２Ｏ１．２当量と無水ＤＭＦ中で正確に例１に記載したようにして反応させた。収率は３５％（１６．９ｍｇ）であり、純度は９８％であった。

例３
３’−デアミノ−３’−（イソインドリン−２”−イル）ドデキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_３）の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、１５倍過剰のα，α’−ジクロル−オルト−キシレン２２６ｍｇ（１．３ミリモル）を加え、次いで３倍過剰のＤＩＰＥＡ４５μｌ（２６０μモル）及び触媒量のＮａＩを加えた。１６時間後、溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃで除去し、残分をの０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌ中に溶解させ、エーテル３ｍｌで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をＨＰＬＣにかけた。精製後、９８％純粋な最終生成物３６ｍｇが得られた（収率：５５％）。

例４
３’−デアミノ−３’−（３”−ピロリン−１”−イル）−ドデキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_４）の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、１５倍過剰のシス−１，４−ジクロル−２−ブテン（Ａｌｄｒｉｃｈ）１３６．８μｌ（１．３ミリモル）を加え、次いで３倍過剰のＤＩＰＥＡ４５μｌ（２６０μモル）を加えた。１６時間後、溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃで除去し、残分を０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌ中に溶解させ、ヘキサン３ｍｌで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をＨＰＬＣにかけた。精製後、９８％純粋な最終生成物２２．６ｍｇが得られた（収率：３７％）。

例５
１−クロル−４−ブロム−２−ブタノン（Ｃ_４Ｈ_６ＣｌＢｒＯ）及び１−クロル−５−ブロム−２−ペンタノン（Ｃ_５Ｈ_８ＣｌＢｒＯ）の製造及び単離
塩化３−ブロムプロピオニル１００．８μｌ（１ミリモル）（Ａｌｄｒｉｃｈ）をエーテル中の過剰のジアゾメタンと反応させた。１時間後エーテル性溶液を溶離させ、スポットをＴＬＣで試験した。Ｍｅｒｃｋ Ａｒｔ Ｎｏ．５５５４によるシリカゲル６０ Ｆ２５４で下塗りしたで薄層クロマトグラフィーアルミニウムシートを固定相として使用し、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ９５：５（ｖ／ｖ）を移動相として使用した。スポット試験用に２，４−ジニトロフェニルヒドラジン試薬（Ｖｏｇｅｌ：Ａ ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０６１頁、第３版、Ｌｏｎｇａｍａｎｓ、ニューヨーク）を溶離後にＴＬＣシートに噴霧した。こうして生成したジアゾメチルケトン誘導体はＲｆ：０．３の黄色のスポットを示した。次いでエーテル性溶液をエーテル中の無水ＨＣｌと反応させて、ジアゾメチルケトンを、所望の最終生成物である１−クロル−４−ブロム−２−ブタノンに変えた。この生成物は、前記したものと同じ溶剤系中で及びスポット試験試薬を用いて、Ｒｆ：０．８の、オキソ化合物の特徴である黄色のスポットを示した。溶剤蒸発後、粗生成物を、シリカゲル１５ｇを充填したカラム（長さ１５ｃｍ、直径２．５ｃｍ）（Ｍｅｒｋ、等級９３８５、２３０〜４００メッシュ、孔の大きさ６０Å）に入れた。液体移動相は純粋なＣＨＣｌ_３であった。所望の最終生成物（前記スポット試験により確認）を含有するフラクションを混合し、蒸発乾固させた。Ｍ=１．５ｇ、透明な油状物が得られた。収率：８０％。

１−クロル−５−ブロム−２−ペンタノンは、塩化４−ブロムブチルから１−クロル−４−ブロム−２−ペンタノンに関する記載と同じ方法であるが、塩化３−ブロムプロピオニルに代わりに塩化４−ブロムブチリルを用いて製造した。収率：８０％。

例６
３’−デアミノ−３’−（３”−ピロリドン−１”−イル）ドキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_５）の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、１５倍過剰の１−クロル−４−ブロム−２−ブタノン２４１ｍｇ（１．３ミリモル）を加え、次いで３倍過剰のＤＩＰＥＡ４５μｌ（２６０μモル）を加えた。１６時間後、溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃで除去し、残分を０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌ中に溶解させ、ヘキサン３ｍｌで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をＨＰＬＣにかけた。精製後、９８％純粋な最終生成物２０．６ｍｇが得られた（収率：３３％）。

例７
３’−デアミノ−３’−（３”−ピペリドン−１”−イル）ドキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_７）の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、１５倍過剰の１−クロル−５−ブロム−２−ペンタノン２６０ｍｇ（１．３ミリモル）を加え、次いで３倍過剰のＤＩＰＥＡ４５μｌ（２６０μモル）を加えた。１６時間後、溶剤をＳｐｅｅｄ Ｖａｃで除去し、残分を０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌ中に溶解させ、ヘキサン３ｍｌで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をＨＰＬＣにかけた。精製後、９５％純粋な最終生成物１８ｍｇが得られた（収率：２８％）。

例８
４−ヨードブチルアルデヒド及び５−ヨードバレルアルデヒドの精製及び単離
２−（３−クロルプロピル）−１，３−ジオキソラン（４−クロル−ｎ−ブチルアルデヒドエチレンアセタール）１．３ｍｌ（１０ミリモル）（Ｆｌｕｋａ）をＮａＩ３０ｇ（２００ミリモル、２０倍過剰）を含有するアセトン２００ｍｌ中に溶解させた。溶液を２４時間還流させ、次いで蒸発乾固させた。エーテル１００ｍｌを使用して、有機物質を無機固体残分から抽出した。次いでエーテル性溶液をＨ_２Ｏ５０ｍｌ、５％水性Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３５０ｍｌ溶液で洗浄し、Ｈ_２Ｏ５０ｍｌで３回洗浄した。エーテルを真空中で除去し、残留した油状物を５０％水性酢酸３ｍｌ中に溶解させた。１時間後、エーテル１００ｍｌをこの溶液に加え、酢酸並びにエチレングリコールをＨ_２Ｏ５０ｍｌで３回洗浄することによって除去した。主生成物を、純ＣＨＣｌ_３中でＴＬＣでＲｆ：０．８で溶離させた。アルデヒドファンクションのために使用されるスポット試験は例５でケトン用に記載したものと同じであった。次いでエーテルを除去し、黒色油状物をシリカゲル１５ｇを充填したカラム（長さ１５ｃｍ、直径２．５ｃｍ）（Ｍｅｒｋ、等級９３８５、２３０〜４００メッシュ、孔の大きさ６０Å）に入れた。液体移動相はＣＨＣｌ_３であった。所望の最終生成物（前記スポット試験により確認）を含有するファンクションを混合し、蒸発乾固させた。黄色油状物１．６ｇが得られた。収率：８０％。

５−ヨードバレルアルデヒドが、同様にして、２−（４−クロルブチル）−１，３−ジオキサラン（５−クロル−ｎ−バレルアルデヒド エチレン アセタール）（Ｆｌｕｋａ）から出発して得られた。黄色油状物１．６５ｇが得られた。収率：８０％。

例９
３’−デアミノ−３’−（２”−ピロリドン−１”−イル）ドキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_６）の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、３０倍過剰の４−ヨードブチルアルデヒド５１５ｍｇ（２．６ミリモル）を加え、次いでＤＩＰＥＡ４５μｌ（２６０μモル、３倍過剰）を加えた。１時間後、氷酢酸１００μｌを反応混合物に加え、次いでこれを７０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ５ｍｌに滴加した（ＨＰＬＣ系の溶剤ｉｉ）。この溶液を０．１％ＴＦＡ溶液２ｍｌで希釈し、次いでアセトニトリルをＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で除去した。残留した溶液をヘキサンで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た生成物をＨＰＬＣにかけた。精製後、９８％純粋な最終生成物５２ｍｇが得られた（収率：８５％）。

例１０
３’−デアミノ−３’−（１”，３”−テトラヒドロピリジン−１”−イル）ドキソルビシンＴＦＡ塩（Ｑ_８）の製造及び単離
ＤＯＸ ＨＣｌ塩５０ｍｇ（８６μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、３０倍過剰の５−ヨードバレルアルデヒド５５２ｍｇ（２．６ミリモル）を加え、次いで３倍過剰のＤＩＰＥＡ４５μｌ（２６０μモル）を加えた１時間後、氷酢酸１００μｌを反応混合物に加え、次いでこれを７０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ５ｍｌに滴加した（ＨＰＬＣ系の溶剤ｉｉ）。この溶液を０．１％ＴＦＡ水溶液２ｍｌで希釈し、次いでアセトミトリルをＳｐｅｅｄ Ｖａｃ中で除去した。残留した溶液をヘキサンで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た生成物をＨＰＬＣにかけた。精製後、９８％純粋な最終生成物４６ｍｇが得られた（収率：７５％）。

例１１
ＤＯＸを含有する細胞毒性ＬＨ−ＲＨ作用物質類似体の精製及び単離
（［Ｄ−Ｌｙｓ^６（ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ）］ＬＨ−ＲＨ、Ｑ_１ ^１４ｇＬ）
［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ６０ｍｇ（３７．５μモル）及びＮ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ１４−Ｏ−ヘミグルタレート（例１参照）５２ｍｇ（６４％純粋、３７．５μモル）をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、ＢＯＰ試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ）２２ｍｇ（５０μモル）、ＨＯＢｔ１３．５ｍｇ（１００μモル）並びにＤＩＰＥＡ５２μｌ（３００μモル）を加えた。１時間室温で攪拌した後、反応は完了する。溶剤を蒸発させ、残留した油状物を酢酸エチル３ｍｌで晶出させ、次いで酢酸エチル３ｍｌで２回洗浄した。次いで粗固体物質をＤＭＦ３ｍｌ中に溶解させ、ピペリジン３００μｌを加えた。５分後、反応を氷浴中へ入れ、ＴＦＡ３００μｌ、ピペリジン７００μｌ及びＤＭＦ２ｍｌの混合物を添加することによって酸性にした。溶剤を蒸発させた後、残留した油状物を酢酸エチルで固体にする。こうして得た粗固体をＴＦＡ０．１％を含有する７０％水性アセトニトリル１ｍｌ中に溶解させ（ｉ）、０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌで希釈し（ｉｉ）、半調製ＨＰＬＣにかけた。９８％純粋な最終生成物４０ｍｇ（１４．８μモルが得られた。収率：４８％。

例１２
２−ピロリノ−ＤＯＸを含有する細胞毒性ＬＨ−ＲＨ作用物質類似体の精製
［Ｄ−Ｌｙｓ^６（２−ピロリノ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ）］ＬＨ−ＲＨ、Ｑ_６ ^１４ｇＬ）
Ｑ_１ ^１４ｇＬ １１．２ｍｇ（５μモル）（例１参照）をＤＭＦ２００μｌ中に溶解させ、４−ヨードブチルアルデヒド（例８）３０ｍｇ（１５０μモル、３０倍過剰）を加え、次いでＤＩＰＥＡ３μｌ（１７μモル）を加えた。１時間後、反応は完了し（例９参照）、氷酢酸１０μｌをこの反応混合物に加え、これを次いで７０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ１ｍｌに滴加した。この溶液を次いで０．１％水性ＴＦＡで希釈し、アセトニトリルを真空中で除去した。次いで残留した水溶液をヘキサン１ｍｌで抽出し、ＨＰＬＣにかけた。ｍ：７．６ｍｇ、９９％純粋な最終生成物が得られた。（収率：６６％）。

例１３
ＤＯＸを含有する細胞毒性ソマトスタチン類似体の精製及び単離

Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨ_２ ２０ｍｇ（１４．５μモル）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６、１９８６〜１９９０頁）及びＮ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ１４−Ｏ−ヘミグルタレート（例１参照）２０ｍｇ（６４％純粋、１４．５μモル）をＤＭＦ２００μｌ中に溶解させ、ＢＯＰ試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ）８．８ｍｇ（２０μモル）、ＨＯＢｔ５．４ｍｇ（４０μモル）並びにＤＩＰＥＡ１７μｌ（１００μモル）を加えた。１時間室温で攪拌した後、反応は完了した。溶剤を真空中で蒸発させた後、残分を酢酸エチルで結晶化させた。次いで固体物質をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、ピペリジン１００μｌを加えた。７分後に、反応を氷浴中へ入れ、ＴＦＡ１００μｌ、ピペリジン３００μｌ及びＤＭＦ２ｍｌの混合物を添加することによって酸性にした。溶剤を蒸発させた後、残留した油状物を酢酸エチルで固体にする。こうして得た粗固体をＴＦＡ０．１％を含有する７０％水性アセトニトリル１ｍｌ中に溶解させ（ｉ）、０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌで希釈し（ｉｉ）、半調製ＨＰＬＣにかけた。９５％純粋な最終生成物９．７ｍｇ（５．１μモル）が得られた。収率：３５％。

例１４
２−ピロリノ−ＤＯＸを含有する細胞毒性ソマトスタチン類似体の精製

４ｍｇ、５μモル）をＤＭＦ１００μｌ中に溶解させ、２−ピロリノ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレート（４．１ｍｇ、５μモル）を加え、次いでＢＯＰ試薬（４．４ｍｇ、１０μモル）、ＨＯＢｔ（１００μモル）及びＤＩＰＥＡ（５０μモル）を加えた。２時間室温で攪拌した後、反応混合物をＡｃＯＨ２０μｌにより酸性にし、ＴＦＡ０．１％を含有する７０％水性アセトニトリル５００μｌで希釈し、更に０．１％水性ＴＦＡ７００μｌで希釈し、ＨＰＬＣにかけた。９９％純粋な最終生成物３．９ｍｇ（収率：４０％）が得られた。

例９に記載した様にして、ＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートを４−ヨードブチルアルデヒドと反応させることによって２−ピロリノ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートを製造した。

Ｎ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートから、例１１に記載したようにしてＦｍｏｃ保護基を劈開することによってＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートを製造した。

例１５
ＤＯＸを含有する細胞毒性ボンベシン拮抗物質の精製及び単離
（ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｌｅｕ−ＮＨ_２、Ｑ_１ ^１４ｇＢ）
Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｌｅｕ−ＮＨ_２２０ｍｇ（１５．８μモル）（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３８、１９９１、５３９〜６００頁）及びＮ−Ｆｍｏｃ−ＤＯＸ１４−Ｏ−ヘミグルタレート（例１）２２ｍｇ（６４％純粋、１５．８μモル）をＤＭＦ２００μｌ中に溶解させ、ＢＯＰ試薬（Ａｌｄｒｉｃｈ）８．８ｍｇ（２０μモル）、ＨＯＢｔ５．４ｍｇ（４０μモル）並びにＤＩＰＥＡ１７μｌ（１００μモル）を加えた。１時間室温で攪拌した後、反応は完了した。溶剤を真空中で蒸発させ、残分を酢酸エチル３ｍｌで結晶化させた。次いで固体物質をＤＭＦ１ｍｌ中に溶解させ、ピペリジン１００μｌを加えた。５分後、反応を氷浴中へ入れ、ＴＦＡ１００μｌ、ピペリジン３００μｌ及びＤＭＦ２ｍｌの混合物を添加することによって酸性にした。溶剤を蒸発させた後、残留した油状物を酢酸エチルで固体にした。こうして得た粗固体をＴＦＡ０．１％を含有する７０％水性アセトニトリル１ｍｌ中に溶解させ（ｉ）、０．１％水性ＴＦＡ３ｍｌで希釈し（ｉｉ）、半調製ＨＰＬＣにかけた。９８％純粋な最終生成物１３．５ｍｇ（７．１μモルが得られた。収率：４５％。

例１６
２−ピロリノ−ＤＯＸを含有する細胞毒性ボンベシン拮抗物質類似体の精製及び単離
２−ピロリノ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ＣＨ_２−ＮＨ）Ｌｅｕ−ＮＨ_２、Ｑ_６ ^１４ｇＢ
Ｑ_１ ^１４ｇＢ９．５ｍｇ（５μモル）（例１５）をＤＭＦ２００μｌ中に溶解させ、４−ヨードブチルアルデヒド（例８）３０ｍｇ（１５０μモル、３０倍過剰）を加え、次いでＤＩＰＥＡ３μｌ（１７μモル）を加えた。１時間後、反応は完了し（例９参照）、氷酢酸１０μｌをこの反応混合物に加え、これを次いで７０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ１ｍｌに滴加した。この溶液を次いで０．１％水性ＴＦＡで希釈し、アセトニトリルを真空中で除去した。次いで残留した水溶液をヘキサン１ｍｌで抽出し、ＨＰＬＣにかけた。９８％純粋な最終生成物６ｍｇが得られた。（収率：６０％）。

試験管内における細胞毒性の測定
ＭＸＴエストロゲン−非依存性マウス乳癌セルラインは、Ｄｒ．Ｇｕｎｔｅｒ Ｂｅｒｎｄｈａｒｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ（ドイツ）から入手した。本発明の化合物の抗増殖活性を測定するために使用したその他のセルラインは全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。

類似体の活性を評価するために、マイクロ滴定プレートの比色細胞毒性分析をクリスタルバイオレットで細胞を染色することによる生物量の定量を基礎にして使用したが、これは細胞数の測定と非常に良好な相関関係を示す。（Ｒｅｉｌｅその他；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７、２６２〜２６７頁、１９９０；Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ Ｇ．その他、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９２）、１１８、３５〜４３；Ｓｐｒｕｓｓ Ｔｈ．その他、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１７、４３５〜４４３、１９９１；Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｒ．Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９、１０９〜１１３、１９８６；Ｋｕｅｎｇ、Ｗ．その他；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８２ １６〜１９、１９８９）。

分析計画案
９６−ウエルプレート中で細胞を播種してから１〜２日後に、培地を試験すべき化合物を含有する新しい培地及び対照培養用だけの新しい培地と交換した。種々の培養時間後に、細胞をグルタリックジアルデヒドで固定し、胎児の牛血清（ＦＢＳ）下で４℃で実験終了まで保存した。細胞をクリスタルバイオレットで染色し、結合した染色を７０％水性ＥｔＯＨで抽出した。最適密度をＥＩＡ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又はＢｉｏｍｅｋ１０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて各々５９０ｎｍ又は６００ｍｎで測定する。各データ点は８つの培養ウエルの平均値を表わす。Ｔ／Ｃ値をＴ／Ｃ=（Ｔ−ＣＯ）／（Ｃ−ＣＯ）として算出するが、その際、Ｔ=処理した培養の光学濃度、Ｃ=対照（未処理）培養の光学濃度、ＣＯ=培養開始時（ｔ=０）の培地の光学濃度である。

例１７
ＤＯＸのダウノサミン変性誘導体の試験管内細胞毒性活性
第１７−１表は、ドキソルビシン及びそのダウノサミン変性誘導体の、試験管内におけるＭＣＦ−７ヒト乳癌セルラインに対する効果を表わす。

反応性基を有する５員環中へ組み込まれたダウノサミンＮを有する細胞毒性基は、３−ピロリドン−ＤＯＸ（Ｑ_５）及び３−ピペリドン−ＤＯＸ（Ｑ_７）並びに２−ピロリノ−ＤＯＸ（Ｑ_６）及び１，３−テトラヒドロ−ピリジノ−ＤＯＸ（Ｑ_８）の例として、６員環を有するその同族対照物よりも５〜５０倍高い活性を有する。第１７−１表：ドキソルビシン及びそのダウノサミン変性誘導体の、試験管内におけるＭＣＦ−７ヒト乳癌セルラインに対する効果

細胞は、９６ウエルプレート上の５％ＨＩ−ＤＣＣ−ＦＢＳ（熱不活性化した、デキストラン塗布した木炭処理胎児牛血清）を含有するＩＭＥＭ媒体中で培養した。処理及び対照プレート中の相対細胞数を、クリスタルバイオレット染色法で測定し、Ｔ／Ｃ値として表わしたが、その際、Ｔ／Ｃ=（Ｔ−Ｃ_０／Ｃ−Ｃ_０）×１００［Ｔ=処理培養の吸着、Ｃ=対照培養の吸着、Ｃ_０=培養開始時（ｔ=０）の培養の吸着。測定した吸着は細胞数に比例する］。

低いＴ／Ｃ値は、処理による癌細胞の生存の減少を示唆する。即ち、７５は対照の１００％と比較して細胞の７５％生存又は２５％抑制を示す。

例１８
ＬＨ−ＲＨ拮抗ペプチド共役結合体Ｑ_１ ^１４ｇＬ中のＤＯＸ及びＬＨ−ＲＨ拮抗ペプチド共役結合体Ｑ_６ ^１４ｇＬ中の超活性２−ピロリノ−ＤＯＸ（Ｑ_６）の試験管内細胞毒性活性の完全な保持。

第１８−１表は、試験管内におけるＭＣＦ−７ヒト乳癌セルライン及びＭＸＴエストロゲン非依存性マウス乳癌セルラインの増殖に対する、ドキソルビシン及びそのダウノサミン変性誘導体、２−ピロリノドキソルビシン（Ｑ_６）の作用を、そのＬＨ−ＲＨ拮抗類似体との共役結合体、［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ（各々Ｑ_１ ^１４ｇＬ及びＱ_６ ^１４ｇＬ）との比較して表わす。

ＭＣＦ−７細胞を９６ウエルプレート上で５％ＨＩ−ＤＣＣ−ＦＢＳを含有するＩＭＥＭ培地中で培養した。ＭＸＴ細胞はＬ−グルタミン０．６ｇ／ｌ及びＦＢＳ１０％を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。第１７−１と同様にして測定した。

例１９
第１９−１表は、本発明のＤＯＸを含有するソマトスタチン類似体の試験管内細胞毒性活性が完全に保持されることを示している。
第１９−１表：試験管内におけるＭＩＩＡ ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌セルラインの増殖に対するドキソルビシンを含有するソマトスタチンの細胞毒性類似体の効果

細胞を９６ウエルプレート上で胎児牛血清１０％を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で恒温保持した。

例２０
試験管内におけるＣＦＰＡＣ−１ヒト膵臓癌細胞の増殖に対する、ドキソルビシンを含有するボンベシン拮抗物質細胞毒性類似体の効果
第２０−１表は、試験管内における本発明のＤＯＸを含有するボンベシン拮抗物質類似体の細胞毒性活性が完全に保持されることを示している。

細胞を、２４ウエルプレート上で胎児の牛血清１０％を含有するＩＭＤＭ培地中で恒温保持した。

ホルモン誘導体の保持結合特性
例２１
キャリアペプチド、［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨと比較した、細胞毒性ＬＨ−ＲＨアゴニスト類似体Ｑ_１ ^１４ｇＬ（［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨｃａｒｒｙｉｎｇＤＯＸ及びＱ_６ ^１４ｇＬ（［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨｃａｒｒｙｉｎｇ２−ピロリノ−ＤＯＸのホルモン活性及び受容体結合力
第２１−１表

第２１−１表中、
^＊類似体に対するＬＨ応答は、Ｓ．Ｖｉｇｈ及びＡ．Ｖ．Ｓｃｈａｌｌｙ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ５、２４１〜２４７頁（１９８４年）に記載されているようにして、分散ラット下垂体細胞過溶融系で測定した。
^＊＊ラット下垂体ＬＨ−ＲＨ受容体及びヒト乳癌受容体に対する類似体の結合親和性は、Ｂ．Ｓｚｏｋｅその他、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１５（２）巻、３５９〜３６６頁（１９９４年）に記載されているようにして、ラジオリガンドとしての［１２５Ｉ］標識付き［Ｄ−Ｔｒｐ６］ＬＨ−ＲＨを使用する拮抗結合実験で測定した。結合親和性は、ラジオリガンドの特異的結合を５０％抑制するのに必要な非標識付き類似体の濃度であるＩＣ５０値で表わした。

例２２
ソマトスタチン類似体は、Ｃａｒｉｓｏｎ その他著、Ｔｈｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｒａｔ ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第９４巻、１７０９（１９７４年）に記載されているように、灌流ラット下垂体からの成長ホルモン（ＧＨ）の分泌を抑制する。従って、この方法は本発明の細胞毒性ソマトスタチン類似体を、ホルモン活性に関して、その親キャリア分子と比較するために使用した。

ソマトスタチン類似体Ｓ−９８−１

及びＳ−１２１

による、灌流ラット下垂体細胞からのヒト成長ホルモン放出ホルモン（ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ２）誘発成長ホルモン放出の抑制と各々その細胞毒性誘導体、Ｑ_１ ^１４ｇＳ^９８−１（ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ−Ｓ−９８−ｌ）及びＱ_１ ^１４ｇＳ^１２１（ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ−Ｓ−１２１）との比較。

ラット下垂体灌流系中で、ソマトスタチン類似体をｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ_２１ｎモルと同時に、１ｎモル用量で３分間投与した。ソマトスタチン類似体の注入は更に６分間保持した。ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ_２１ｎモルの３分間投与に対するＧＨ応答をソマトスタチン類似体灌流中（０分）及び投与中止後３０、６０及び９０分後に測定した。データは第２２−１表に記載した。
第２２−１表

^＊＊ソマトスタチン類似体投与前にｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ_２１ｎＭの３分間注入により誘発したＧＨ放出の％として表わした。
例２３
細胞毒性ボンベシン類似体を用いる受容体結合試験
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｅｎｚｙｍｏｂｅａｄ Ｒａｄｉｏ 沃素化キットを用いる［Ｔｙｒ^４］ＢＮ（Ｓｉｇｍａ）の放射沃素化及びモノ−沃素化［^１２５Ｉ−Ｔｙｒ^４］ＢＮの単離を前記したようにして行った（１）。標識付き［Ｔｙｒ^４］ＢＮの結合及び細胞毒性ボンベシン拮抗物質類似体、Ｑ_６ ^１４ｇＢによる置換を融合性Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を使用して２４ウエルプレート中でＫｒｉｓその他の方法（３）の変法（２）で行った。播種してから３〜４日間後に、融合性細胞をＨａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、総容量０．５ｍｌの結合緩衝剤［ＨＥＰＥＳ５０ミリモル、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％、ＭｇＣｌ_２５ミリモル及びバシトラシン１００μｇ／ｍｌを有するＤＭＥＭ、ｐＨ：７．４］中で、種々の濃度の非標識付き競合体（Ｑ_６ ^１４ｇＢ又はＢＮ）の不在又は存在下で、［^１２５Ｉ−Ｔｙｒ^４］ＢＮ５０ｐＭと一緒に３７℃で３０分間恒温保持した。非特異的結合を非標識リガンド１μＭの存在で測定した。ＢＳＡ０．１％を含有する氷冷ＨＢＳＳ（ｐＨ：７．４）で３回洗浄した後、細胞をトリプシン０．０５％／ＥＤＴＡ溶液０．５３ミリモルを用いて分離し、管に移した。放射能をγ−カウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を用いて測定した。結合データをＭｃＰｈｅｒｓｏｎによる放射リガンド結合分析プログラムを用いて評価した（４）。第２３−１表に記載のＫｉ値は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（５）の式により算出した。

第２３−１表
ボンベシンと比較した、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３セルラインに対するボンベシン受容体への細胞毒性ボンベシン拮抗物質Ｑ_６ ^１４ｇＢ（２−ピロリノ−ＤＯＸ^１４−Ｏ−ｇｌｔ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ψ−（ＣＨ_２−Ｎ）Ｌｅｕ−ＮＨ_２の特異的結合の特性付け

ホルモン共役結合体対細胞毒性ラジカル単独の比較有効性及び毒性
例２４
エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌（ＫＳ−４９）に対する２−ピロリノ−ＤＯＸ（Ｑ_６）、細胞毒性ＬＨ−ＲＨ作用物質類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬ（Ｑ_６ ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートに結合した［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ）及び（ＤＯＸ）を用いる治療
細胞毒性ドキソルビシン誘導体、Ｑ_６及びその標的細胞毒性ペプチド共役結合体、Ｑ_６ ^１４ｇＬ並びに公知抗腫瘍剤、ＤＯＸの腫瘍抑制作用を比較し、最適投与法及び無毒用量を決めるために、ＬＨ−ＲＨ受容体陽性ＭＸＴ（３．２）ｏｖｅｘ腫瘍片（１ｍｍ^３）を雌のＢ_６Ｄ_２Ｆ_１マウスに皮下移植した。移植してから１日後にマウスを５つの動物群に無作為に分け、治療を開始した。化合物を０．１％トリフルオル酢酸（ｐＨ２）中に溶解させ、腹腔内に投与した。群、治療法及び用量並びに平均生存時間を第２４−１表に記載した。結果を第２４−２表及び第１図にまとめた。

第２４−２表は、Ｑ_６及び細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬを用いる治療のエストロゲン非依存性乳癌マウスの腫瘍容量及び生存に対する作用を表わしている。第２４−２表から明らかなように、１、２、７、８、１４及び１５日目に投与したＱ_６１．２５ｎモル（群２）が平均生存時間１７．４日で特性付けられる強い毒性を生じ、これは未治療対照群の生存より有意に短い。これに対して、同じ用量のＱ_６ ^１４ｇＬ（群６）は平均生存時間３０．８日であり、これは未治療対照群より有意に長い。Ｑ_６に対するＱ_６ ^１４ｇＬのより高い有効性は、群２（１６日目で１０６５ｍｍ^３）及び群６（３１日目で８６３ｍｍ^３）における平均最終腫瘍容量を比較することによっても実証される。

薬剤０．５ｎモルを３週間連続で１週間に５日間投与した別の治療方法でＱ_６とＱ_６ ^１４ｇＬを比較することによって、同様の結論が実証されうる。

ドキソルビシンは有毒用量（総量：１５６０ｎモル、平均生存：２０日間）で腫瘍を撲滅させることができなかったが、Ｑ_６ ^１４ｇＬを無毒用量で用いる治療（総量：７ｎモル、平均生存：＞３１日間）によって、５匹中２匹の動物が腫瘍を生じることなしに生存していた。
第２４−１表

^＊ ９日から１２日、用量を２．５ｎモルに増やした。９日から１２日、用量を５．０ｎモルに増やした。
^＊ 生存
第２４−２表

^＊＊ダンカン試験を用いて対照データと比較して、生存は有意に長い（ｐ＜０．０１）、生存は有意に短い（ｐ＜０．０１）又は（ｐ＜０．０５）。

例２５
エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌（ＫＳ−５５）に対する（ＤＯＸ）、細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｔ−１０７及びＱ_６ ^１４ｇＬの単一治療の効果
試験化合物：
Ｑ_１ ^１４ｇＬ：［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨに結合したドキソルビシン^１４−Ｏ−ヘミグルタレート
Ｔ−１０７：［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨに結合したＮ−グルタリル−ドキソルビシン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８９巻、９７２〜９７６頁（１９９２年）；及び
ＤＯＸ
分析は下記のようにして行った：
最高許容用量を決め、効果を比較するために、ＭＸＴ（３．２）ｏｖｅｘ腫瘍片（１ｍｍ^３）を雌のＢ_６Ｄ_２Ｆ_１マウスに皮下移植した。移植してから１日後にマウスを５つの動物群に無作為に分け、それらを１回の腹腔内注射で治療した。群及び用量を第２５−１表に記載する。この表には、各群に関して容量測定時に腫瘍を有していたマウスの数及び平均生存時間も記載してある。腫瘍容量変化を第２表に記載する。化合物を０．１％ＴＦＡ（ｐＨ：２．０）中に溶解させた。腫瘍容量は１０、１３、１７及び２０日目に測定した。

第２５−１表及び第２図から明らかなように、Ｔ−１０７（Ｎ−グルタリル−ＤＯＸに結合した［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ）は、８５０ｎモル／マウス２０ｇの用量でこの腫瘍の増殖抑制において全く無効である。これに対して、Ｑ_１ ^１４ｇＬ（１４−Ｏ−グルタリル−ＤＯＸに結合した［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ）は、無毒用量６５０ｎモル／マウス２０ｇで腫瘍増殖の著しい抑制を生じた（図）。ＤＯＸ単独では６５０ｎモル／マウス２０ｇの単一用量で高い毒性を示し（平均生存時間：１３．６日間）、Ｑ_１ ^１４ｇＬより効果が有意に少なかった（第２図）。
第２５表

^＊ 生存は対照より有意に短い（ｐ＜０．０１）
^＊＊対照と比較して、生存は有意に長い（ｐ＜０．０１）又は＊（ｐ＜０．０５）（事故により２日目に死亡したマウス１匹はこれらの２群から除外した）。

例２６
エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌（ＫＳ−４７）に対する細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体の効果
治療に使用される物質
先の実験では１日の用量２０ｎモルで１７日間ではＱ２は腫瘍増殖に対する軽度の抑制作用しか有さず、４０ｎモル用量では有毒であった（平均生存は１４．６日間）。本発明の実験のために、は３０ｎモルの１日の用量を選択し、これをＱ_２ ^１４ｇＬ（［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨに結合したＱ_２）、Ｑ_２（イロリジノ−ドキソルビシン）、［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ及び［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ＋Ｑ_２の効果及び毒性と比較した。

ＭＸＴ（３．２）ｏｖｅｘ腫瘍片（１ｍｍ^３）を雌のＢ_６Ｄ_２Ｆ_１マウスに移植した。治療は移植してから１日後に開始し、１日１回腹腔内注射を１２日間続けた。全ての群に、第２６−１表に記載したように当モル量の化合物を投与した。腫瘍を１０、１４及び１８日目に測定し、腫瘍容量を計算した。データを第２６−１及び第３図に記載する。

ダウノサミン変性ドキソルビシン類似体Ｑ_２（ピロリジノ−ＤＯＸ）３０ｎモルの１日用量で治療することによって、腫瘍増殖に対する強力な抑制が生じた（腫瘍容量：１４日目で１４４ｍｍ^３対対照群の１３９１ｍｍ^３）が、実験終了前に全動物を殺す強烈な毒性（平均生存１７．９日間）を生じた。同様に、［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨと結合したＱ_２（混合物）も強力な抑制効果を生じた（腫瘍容量：１４日目で８０ｍｍ^３）が、平均生存（１８．５日間）は未処理対照群（２３．１日間）より有意に短かった。Ｑ_２ ^１４ｇＬ（［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨと共役結合したＱ_２）を用いる治療の結果として、２匹の動物が死亡したが、１匹は１６日目に、１匹は２６日目に死亡した。生存していた８匹の動物から１８日目の最後測定時に１匹だけが腫瘍が生じ、動物は全て健康に見えたが、後に全ての動物で腫瘍が発生し始めた。この群の平均生存は、対照群より有意に長かった（２８．３日間）。Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ単独を用いた治療では腫瘍増殖に効果がなかった。

この実験により、細胞毒性基Ｑ_２に対するＱ_２ ^１４ｇＬの高い効果及び低い末梢毒性が、標的キャリアＬＨ−ＲＨ類似体に対する細胞毒性基の共役結合に起因することが実証される。
第２６−１表
エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌の増殖及び腫瘍を有するマウスの生存に対する細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体の作用

１日の用量は全て３０ｎモル当量である。

対照より有意に短い（ｐ＜０．０５）
＊ダンカン試験で対照より有意に長い（ｐ＜０．０１）。

例２７
アンドロゲン依存性ラットＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌の増殖に対する、２−ピロリノ−ＤＯＸ（Ｑ_６）及び細胞毒性ＬＨ−ＲＨ作用物質類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬ（Ｑ_６ ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートに結合した［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ）の効果
ホルモン依存性ＤｕｎｎｉｎｇＲ３３２７−Ｈ前立腺癌を有する雄のコペンハーゲンラットを、２−ピロリノドキソルビシンに結合した作用物質［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨから成る黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）の新規細胞毒性類似体である、Ｑ_６ ^１４ｇＬで処理した。最初の実験で、２−ピロリノドキソルビシンを５０ｎモル／ｋｇの濃度で、単独薬剤（Ｑ_６）として及び［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨとの非共役混合物として又はキャリアとの共役結合体（［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ（Ｑ_６ ^１４ｇＬ）として、投与した。基Ｑ_６単独又は［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨと混合して５０ｎモル／ｋｇの２番目の投与後に、ラットは全て全身毒性症状で死亡したが、細胞毒性ＬＨＲＨ共役結合体Ｑ_６ ^１４ｇＬで処理した動物は全て生き残った。全用量１５０ｎモル／ｋｇのＱ_６ ^１４ｇＬを用いる治療５週間後に、実験開始時の８．３５±１．７ｃｍ^３の元の容量から４．４７±０．８ｃｍ^３に減少したが、対照群の腫瘍は増殖し続け、１７．８４±２．２ｃｍ^３になった。Ｑ_６ ^１４ｇＬを用いる治療も腫瘍重量及び腫瘍障害を有意に減少させた。Ｑ_６及びＱ_６ ^１４ｇＬの効果及び毒性を比較するための第２の実験で、治療方法はＱ_６２５ｎモル／ｋｇ又はＱ_６ ^１４ｇＬ２５ｎモル／ｋｇ及び５０ｎモル／ｋｇの３種類の投与から構成されていた。治療を開始した場合に、全ての群の腫瘍容量は３．９〜４．５ｃｍ^３であった。治療５週間後に、未治療動物では１５．６±２．２ｃｍ^３であるのに比較して、Ｑ_６ ^１４ｇＬ５０ｎモル／ｋｇで治療したラットで腫瘍は２．３±０．５１ｃｍ^３にも減少したが、Ｑ_６２５ｎモル／ｋｇはまだ有毒であり、Ｑ_６ ^１４ｇＬ２５ｎモル／ｋｇを用いて得られた値（６．７４±１ｃｍ^３）と同様に、最終腫瘍容量６．７６±１．４ｃｍ^３へ減少させることができたにすぎなかった。試料の組織学的評価から、Ｑ_６ ^１４ｇＬ治療群のみで有糸分裂細胞の有意な減少が示された。高結合力を有するＬＨ−ＲＨ受容体が未治療Ｄｕｎｎｉｎｇ腫瘍試料の膜から検出されたが、Ｑ_６ ^１４ｇＬで治療後にはＬＨ−ＲＨの結合部位は検出されなかった。ＡＮ−２０１及びＱ_６ ^１４ｇＬによる腫瘍増殖の抑制はＥＧＦ受容体の結合力の有意な減少と関係があった。第４〜６図により示されている様に、標的細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬは、ラットＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌の抑制を生じる有効な抗腫瘍剤である。本試験は、細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬが、組み込まれた抗新生物基（Ｑ_６）より遥かに毒性が少なく、腫瘍増殖の抑制作用が有意に高いことも示している。
例２７に関する図の説明
第４図。実験Ｉ：作用物質［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ５０ｎモル／ｋｇ及び細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬ５０ｎモル／ｋｇの３種類の投与から成る治療の間の、ラットＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌移植を有する雄のコペンハーゲンラットにおける腫瘍容量。垂直線はダンカン新多重範囲試験による対照に対するＳＥＭが^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１を示している。矢印により示される治療は１、８及び２９日目に行う。†Ｑ_６を単独薬剤として、又は［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨとの非共役結合混合物として、用いて治療した動物は、第２週内に死亡した。この二つの群で８日目に記録した腫瘍容量が示されている。
第５図。実験ＩＩ：ＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌を有するラットにおける腫瘍容量に対する２−ピロリノドキソルビシン（Ｑ_６）２５ｎモル／ｋｇ、細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬ２５ｎモル／ｋｇ及び５０ｎモル／ｋｇを用いる治療の効果。垂直線は対照に対するＳＥＭ^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１を示す。矢印により示される治療は３回、即ち１、８及び２９日目に行った。
第６図。実験ＩＩ：ＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌を有するコペンハーゲンラットの体重に対する２−ピロリノドキソルビシン（Ｑ_６）２５ｎモル／ｋｇ、細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体Ｑ_６ ^１４ｇＬ２５ｎモル／ｋｇ及び５０ｎモル／ｋｇを用いる治療の効果。垂直線は対照に対するＳＥＭ^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１を示す。矢印により示される治療は３回、即ち１、８及び２９日目に投与した。

例２８
ヌードマウスにおけるＯＶ−１０６３ヒト卵巣癌の増殖に対するドキソルビシン（ＤＯＸ）及び標的細胞毒性ＬＨ−ＲＨ作用物質類似体Ｑ_１ ^１４ｇＬ（ＤＯＸ^１４−Ｏ−ヘミグルタレートに結合した［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ）の作用の比較
ヒトの上皮卵巣癌セルラインＯＶ−１０６３は、５７才の女性の卵巣の転移性乳頭状嚢腺癌からのものであった（Ｈｏｒｏｗｉｔｚその他（１９８５年）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ４２、３３２〜３３７頁）。ＯＶ−１０６３の細胞１千万個を３匹のヌードマウスに皮下注射して腫瘍を増殖させた。これら腫瘍片１ｍｍ^３を生体内増殖抑制試験のために６匹の動物中に移植した。この実験の目的は、ＯＶ−１０６３のＬＨ−ＲＨの受容体の存在の結果としてＬＨ−ＲＨの細胞毒性共役結合体が、それが含有する細胞毒性基であるＤＯＸよりも効果が大であり、毒性が少ないことを実証することであった。従って細胞毒性ＬＨ−ＲＨ共役結合体の効果を、ＤＯＸ、ＤＯＸとキャリア分子との混合物、キャリア単独及び未治療対照群の効果と比較した。注射は全て腹腔内に行った。化合物は水中の０．９％塩化ナトリウム（食塩水）中に溶解させた。

平均腫瘍の大きさ約１５ｍｍ^３のマウスを動物９匹の６群に分け、腫瘍移植７日後に次の治療を行った：群１、食塩；群２、７００ｎモル／動物２０ｇの用量のＱ_１ ^１４ｇＬ；群３、４１３ｎモル／動物２０ｇの用量（最高許容量、ＤＯＸのＭＤＴ）のＱ_１ ^１４ｇＬ；群４、４１３ｎモル／動物２０ｇの用量（ＭＤＴ）のＤＯＸ；群５、７００ｎモル／２０ｇのＤＯＸ及び７００ｎモル／２０ｇの［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨの混合物；群６、７００ｎモル／２０ｇの用量のキャリア作用物質類似体［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨ。

ＯＶ−１０６３の受容体分析により、ＬＨ−ＲＨの高い親和結合部位の存在が判明した。
結果：第７図で明らかなように、腫瘍増殖の強力な抑制が４１３ｎモル／２０ｇ用量のＱ_１ ^１４ｇＬを用いる治療（群３）によって達成された。動物には重度の毒性兆候は観察されなかった。これに対して、４１３ｎモル／２０ｇの同じ用量で投与されたＤＯＸを用いる治療（１２ｍｇ／ｋｇ、ＭＴＤ、群４）によっては、実験終了時に生き残っていた３匹の動物で腫瘍増殖の有意な抑制は生じてなかった。毒性のために３匹の動物が５日目に、６匹の動物が９日目に死亡した。より高い用量（７００ｎモル／２０ｇ、群２）では、Ｑ_１ ^１４ｇＬは腫瘍増殖抑制の非常に強力な抑制を生じた（第７図）。９匹の動物中２匹が毒性のために死亡し、１匹の動物が事故により死亡した。６匹の生き残った動物は実験終了時に約２０％の体重減少から回復した。群６で同じ高用量（７００ｎモル／２０ｇ）のＤＯＸを７００ｎモルの［Ｄ−Ｌｙｓ^６］ＬＨ−ＲＨと混合した。５日目までにこの群の動物は全て重度の毒性の結果死亡した。
結論：我々の結果から、上皮卵巣癌の細胞ＯＶ−１０６３上のＬＨ−ＲＨの受容体の存在により、標的細胞毒性ＬＨ−ＲＨ共役結合体Ｑ_１ ^１４ｇＬが、それが含有する細胞毒性基、ドキソルビシン（Ｑ_１）より毒性が低く、抗腫瘍作用が高いことが明白に実証している。

本発明による化合物及びＤＯＸの異なる用量レベルに関する、エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌の容量変化のプロット図。 本発明による特定の化合物、先行技術の化合物、ＤＯＸ及び対照の種々の用量レベルに関する、エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌の容量変化のプロット図。 エストロゲン非依存性ＭＸＴマウス乳癌のマウスの生存に対する細胞毒性ＬＨＲＨ類似体の作用のプロット図。 先行技術のアゴニスト及び本発明の特定の化合物を用いる治療の間の、ラットＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌移植片を有する雄のコペンハーゲンラットにおける腫瘍容量のプロット図。 ＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌のラットにおける腫瘍容量に対する本発明の特定の化合物及び相応する細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体を用いる治療の効果を示すプロット図。 ＤｕｎｎｉｎｇＲ−３３２７−Ｈ前立腺癌を有するコペンハーゲンラットの体重に対する、本発明の特定の化合物及び相応する細胞毒性ＬＨ−ＲＨ類似体を用いる治療の効果を示すプロット図。 本発明の特定の化合物及びＤＯＸを用いる治療により達成された腫瘍増殖の抑制を示すプロット図。

Claims (5)

1. α，β−又はα,γ−ヒドロキシ第一アミンの第一アミノ基の窒素を、環中に５と６個の原子を有する一不飽和窒素の窒素を含有する複素環式化合物の窒素に変える方法において、連続工程：
   ａ）前記ヒドロキシアミンを、アルデヒド炭素、ハロゲンを有する炭素及びアルデヒド炭素とハロゲンの間にＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２及びＯＣＨ_２から成る群から選択された２又は３個の基を有する、過剰のハロアルデヒドで処理し、
   ｂ）ヒドロキシアミンに対して過剰の有機塩基を添加し、
   ｃ）前記塩基を弱酸で中和し、
   ｄ）希酸水溶液で処理する、
   から成ることを特徴とする、前記の方法。
2. 工程ａ）を中性反応不活性有機溶剤中で行う、請求項1に記載の方法。
3. 工程ａ）を極性非加水分解反応の不活性有機溶剤中で行う、請求項1に記載の方法。
4. 溶剤がジメチルホルムアミドである、請求項1に記載の方法。
5. アルデヒドをオメガ−ブロム−及びオメガ−ヨード−ブチルアルデヒド及びバレルアルデヒドから成る群から選択する、請求項1に記載の方法。

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