JP3987575B2 - 標的細胞毒性アントラサイクリン類似体 - Google Patents
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Description
本発明は、一部政府の援助で行われた。政府は本出願の一定の権利を有する。
発明の属する分野
本発明は、標的抗癌剤であるアントラサイクリン誘導体化学分野に属する。更に詳細には、本発明は、ドキソルビシン(DOX)又は、ペプチドホルモン類似体、例えばLH−RH、ボンベシン及びソマトスタチンと共有結合したそのダウノサミン変性誘導体(DM−DOX)に関する。これらの共役結合体は、ペプチドホルモン類似体用の受容体を有する種々の腫瘍を標的とする。
先行技術についての説明
第6位に細胞毒性基を有するLH−RH類似体が、シャーリー(Schally)、ジャナキー(Janaky)及びバジャツ(Bajusz)の欧州特許0450461号明細書(grant publication、1995年9月6日)に記載されている。
生殖腺刺激ホルモンを破壊するGnRH(LH−RH)類似体がネット(Nett)及びグロウド(Glode)のWO90/09799号明細書(1990年9月7日発行)に記載されている。この明細書には、性腺刺激ホルモンを破壊し、従って性ホルモンによる癌を治療するためのLH−RHの類似化合物に結合したリシンの様な毒素が記載されている。LH−RHドキソルビシン誘導体についても、リンキングの化学的詳細はないが、記載されている。
細胞毒性ソマトスタチン類似体が、シャリーその他の1990年4月6日出願の米国特許、1993年7月15日再出願の出願番号08/076846号明細書に記載されている。
Anti−Canser Drugs、第5巻、115〜130頁(1994年)のA.V.シャリーの論文に、LH−RH、ボンベシン又はソマトスタチンの類似体の非常に多様な腫瘍の細胞膜上に受容体が存在することについて詳説されている。
G.ウェックベッカー(Weckbecker)は、Farmac.Ther.第60巻、245〜264頁(1993年)の論文で、正常組織及び腫瘍組織上のいくつかでソマトスタチン類似体の受容体及び受容体サブタイプの存在を示す文献を幾つか列記している。
ボンベシン様ペプチド及び種々の正常組織及び腫瘍組織上のボンベシン/GRP受容体の存在について、N.バネット(Bunnett)の論文[Gut Peptides:Biochemistry and Physiology423〜445(1994)Ed.:、J.Walsch and G.J.Dochray,Raven Press,ニューヨーク]及びE.スピンデル(Spindell)の論文[Recent Progress in Hormone Research48(1993)(Academic Press)]で討論されている。
ドキソルビシン(DOX)は、現時点では、最も頻用されており、非常に有効な抗癌剤である。しかし、ある特定の腫瘍はこれに全く反応せず、従ってその使用は、多薬剤耐性(MDR)及び慢性治療の結果である心毒性や好中球減少症が原因となって制限されている。これらの欠点を克服し、抗腫瘍作用を有する有力なアントラキノン構造抗生物質を開発するために、種々のキャリア巨大分子と結合したその標的類似体を含めて、何千もの合成誘導体が発表されている。
DOX及びその類似体の歴史の多くは、“Adriamycin”[David W.Henry、ACS Symposium Series、No.30、Cancer Chemotherapy、American Chemical Society15〜57頁(1976年)]及び本:Doxorubicin、Federico Arcamone、Academic Press(1981年)に記載されている。
抗腫瘍作用を有する、高活性の、アルキル化、非交叉耐性の、3’−デアミノ−3’−(3”−シアノ−4”−モルホリニル)−DOX及びその誘導体が、モシャー(Mosher)その他による米国特許第4464529号明細書(1984年8月7日)に記載されている。これら“強力に有効なモルホリニルアントラキノン”の合成及び生物学的評価は、J.Med.Chem.第27巻、638〜645頁(1984年)にも記載されている。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA第88巻、4845〜4849頁(1991年6月)中で、ガオ(Gao)その他が、ダウノルビシン誘導体によるDNA配列のホルムアルデヒド媒介アルキル化を詳説している。
潜在性アルキル化置換基を有するアントラキノン類似体が、J.Med.Chem.第35巻、3208〜3214頁(1992年)に記載されている。
DOXのダウノサミン窒素をアルキル化するためにα,ω−ジヨード化合物を使用すること、従って新規モルホリニルDOX誘導体の生成が、1989年12月12日、Pharmacia Carlo Erba提出の欧州特許EP第434960号明細書に記載されている。
N−トリフルオルアセチルアドリアマイシン14−O−ヘミグルタレート及び−ヘミアジペートが、改善された水溶性を有するN−トリフルオルアセチルアドリアマイシン14−O−バレレート(AD−32)の類似体として、イスラエル(Israel)その他、米国特許4299822号明細書(1981年11月10日)に記載されている。
ホルトン(Horton)及びプリーベ(Priebe)(J.Antibiotics、XXXVI、1211〜1215)は、14−OH親類似体と比較して抗癌活性があまり異ならない別のアントラサイクリンの14−O−エステルを幾つか記載している。
標的化学療法薬を開発する際に、下記の目標事項が求められる:
1.標的到達までのキャリア分子と化学療法薬の間の安定な結合。
2.結合体内でのキャリア分子の生物学的特性の保持、例えば結合特性保持。
3.結合体内での化学療法薬の薬理学的活性の保持、例えば細胞毒性保持。
4.結合の結果として、非共役結合基に比較して活性がより強力であり、及び/又は末梢毒性が低い類似体の製造。
DOXのダウノサミン基のNaIO4の酸化、引き続いてのキャリア分子の第一アミンを含む還元アルキル化によるDOXの共役結合は、セラ(Sela)その他の米国特許第4263279号明細書(1981年4月21日)中に記載されている。
シス−アコニット酸スペーサーは、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1981年)第102巻、1048〜1054頁に記載されているように、ダウノサミン窒素をpH−感応性結合を有する巨大分子キャリアと結合させるために使用された。
14−ブロモダウノルビシンと蛋白質又はポリ−L−アミノ酸との間のエステル結合及びC−N結合の形成が、ズニノ(Zunino)その他著(1981年)Tumori第67巻、521〜524頁及び(1984年)Eur.J.Canser Clin.Oncol.第20巻、421〜425頁に記載されている。
モルホリノ−DOX(DOXの高活性の、ダウノサミン変性類似体)は、Bioconjugate Chemistry1990(5)、325〜330頁に記載されているように、加水分解可能な(リゾソモトロープ、pH感受性)ヒドラゾン結合(細胞毒性剤のC−13オキソ官能基を含む)を介して抗体と共役結合された。
酵素による変性に対するロイシン残基のカルボキサミド結合の感応性を使用して、“スペーサーアーム”ペプチド、有利にはAla−Leu−Ala−Leuを含有するDOXを共役結合させることに成功したが、その際、カルボキシ末端LeuがDOX中のダウノサミン窒素をアシル化し、アミノ末端Alaがジカルボン酸スペーサーを介してキャリアと結合される(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1982年、79、626〜629頁に記載されているように)。
DOXのダウノサミン窒素は、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992年、89、972−976頁に記載されているように、グルタミン酸スペーサーによりアシル化され、細胞毒性が著しく損なわれてLH−RH類似体に結合された。
種々のヒトの腫瘍を治療するための本発明による化合物の使用に関するその他の文献は下記のものである:
参考文献は全て本明細書に参考までに包含される。
発明の要約
本発明の化合物は、アントラサイクリン細胞毒性剤、例えばDOX又はDM−DOXから成る新規の標的細胞毒性ペプチドホルモンであり、これらはペプチドホルモン、例えばLH−RH類似体、ボンベシン及びソマトスタチンと共役結合している。これらの細胞毒性ペプチドホルモン共役結合体は、共役結合体の特異的な受容体を有する腫瘍、例えば乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膵臓癌、直腸癌、胃癌及び肺癌の治療を目的とする。本明細書で使用されるこれらの(非共役)アントラサイクリン細胞毒性剤のあるものは、それ自体新規であり、非常に有効であるが、その毒性レベルが非結合形で使用するのには高すぎる。
本発明によるダウノサミン変性DOX類似体は、ペプチドキャリアと共有結合を形成するために好適な新規、高活性、非交叉耐性の、DOX類似体の研究の間に開発された。
成分の生物学的活性が充分保持されている安定な共有結合体の形成は、グルタル酸の様なジカルボン酸スペーサーを使用することによって達成された。スペーサーのカルボキシル基1個がDOX又はDM−DOXの14−OH基とのエステル結合1個を形成し、スペーサーの他のカルボキンル基がペプチドキャリアの選択された遊離アミノ基とのカルボキシアミド結合1個を形成する。
本発明の化合物は一般式
Q14−O−R−P (I)
[式中、Qは、一般式
を表わし、Q14は14位に側鎖を有するQ基を表わし、R−は単結合又は−C(O)−(CH2)n−C(O)であり、n=0〜7であり、R’は、NH2又は芳香族飽和又は部分飽和の5員又は6員の複素環式化合物(これは環窒素少なくとも1個を有し、場合により前記環の隣接炭素原子と結合して双環系を形成するブタジエン基を有する)であり、Pは、H又はペプチド基、有利にはLHRH、ソマトスタチン又はボンベシン類似体であるが、その他の生理学的に活性のペプチドを除外するものではない]により表わされる。特に新生物細胞受容体に対する親和性を有するようなLHRH類似体、特に6位にD−Lys基を有するような類似体並びに短縮ソマトスタチン及びボンベシン類似体が好適である。R’がNH2である場合には、R−PはH以外のものである。R−PがHである場合には、R’はNH2以外のものである。
新規合成反応はこの研究の途中で発見された。ドキソルビシン及びその誘導体が、14位でジカルボキシル基を介して結合して、薬理学的作用を有する新規共役結合体を生成することを見出しただけでなく、ビシナル又はディスジャンクトな即ちα,β−又はα,γ−ヒドロキシ第一アミンから部分的に飽和した複素環式基を形成する新規方法も得られた。本発明の詳細な出願は、ダウノサミン糖上の2”−ピロリニル及び1”,3”−テトラヒドロピリジニル基の形成である。しかし、この反応はより広い出願可能性を有する。5及び6員の部分的に飽和した複素環式基は、ビシナル又はディスジャンクトなヒドロキシアミンをアルデヒド炭素とハロゲン基を有する炭素原子との間に2又は3個の基を有するハロゲン−置換アルデヒドとを反応させる場合に、形成することができる。これらの基は全てメチレンであってもよいし、ヘテロ原子、例えば酸素が包含されていてもよい。この反応は3段階で行われる。非常に過剰のハロアルデヒドをヒドロキシアミンの酸塩と、有利には極性不活性無水有機溶剤中で反応させる。それによって、5員のオキサゾリジン環(又は6員の1,3−テトラヒドロオキサジン環)がアルデヒド基をヒドロキシル及びアミン基と縮合させることによって形成される。この生成物を有機塩基、有利には第三アミンを用いて処理し、その際、ハロゲン化水素酸の成分が元のハロアルデヒドのハロ基とオキサゾリジン又は1,3−テトラヒドロオキサジン環の第二アミノ基の間で除去され、5員又は6員環の添加により縮合環構造を形成する。次いで塩基を弱酸、有利には有機酸、例えば氷酢酸で中和する。水性酸、有利には有機酸で処理することのよって、縮合環のオキサゾリジン又は1,3−テトラヒドロキサジン部が開裂する。出発アルデヒドに応じて、最終窒素を含有する環は前記したように少なくとも1個の付加的なヘテロ原子を含有していてよいことは、当業者には理解される。一般的な反応は下記のように図示される:
式中、X’はハロゲン、有利には臭素又は沃素、有利には沃素であり、YはCH2、OCH2、CH2−CH2であり、Zは単結合又はCH2である。
Zが単結合である場合には、反応第1工程としてアルデヒド成分は5員のオキサゾリジン環を形成する。ZがCH2である場合には、アルデヒド基は6員の1,3−テトラヒドロオキサジン環を形成する。このような環形成は公知であるが、例えば無水媒剤中の塩基性媒剤、例えば第三アミン中でのハロアルカン側鎖によって環を閉鎖させることと組み合わせては、この反応は新規であり、意外である。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明による化合物及びDOXの異なる用量レベルに関する、エストロゲン非依存性MXTマウス乳癌の容量変化のプロット図である。
第2図は、本発明による特定の化合物、先行技術の化合物、DOX及び対照の種々の用量レベルに関する、エストロゲン非依存性MXTマウス乳癌の容量変化のプロット図である。
第3図は、エストロゲン非依存性MXTマウス乳癌のマウスの生存に対する細胞毒性LHRH類似体の作用のプロット図である。
第4図は、先行技術のアゴニスト及び本発明の特定の化合物を用いる治療の間の、ラットDunningR−3327−H前立腺癌移植片を有する雄のコペンハーゲンラットにおける腫瘍容量のプロット図である。
第5図は、DunningR−3327−H前立腺癌のラットにおける腫瘍容量に対する本発明の特定の化合物及び相応する細胞毒性LH−RH類似体を用いる治療の効果を示すプロット図である。
第6図は、DunningR−3327−H前立腺癌を有するコペンハーゲンラットの体重に対する、本発明の特定の化合物及び相応する細胞毒性LH−RH類似体を用いる治療の効果を示すプロット図である。
第7図は、本発明の特定の化合物及びDOXを用いる治療により達成された腫瘍増殖の抑制を示すプロット図である。
有利な態様の説明
基Qは、R’で特定の有利な基により置換されている場合には、Q1〜Q8で表わされる亜基を有し、その中Q2〜Q8は新規細胞毒性基である。
R’は、下記の括弧内に列記した有利なQXを生じる有利な値を有する:NH2(Q1)、ピロリジン−1−イル(Q2)、イソインドリン−2−イル(Q3)、3−ピロリン−1−イル(Q4)、3−ピロリドン−1−イル(Q5)、2−ピロリン−1−イル(Q6)、3−ピペリドン−1−イル(Q7)又は1,3−テトラヒドロピリジン−1−イル(Q8)。
従ってR−PがHであり、−R’が−NH2である場合は、Q1はDOXであり、R−PがHであり、−R’がピロリジン−1−イルである場合は、Q2は3’−デアミノ−3’−(ピロリジン−1”−イル)−ドキソルビシン(Q2)であり、R−PがHであり、−R’がイソインドリン−2−イルである場合は、Q3は3’−デアミノ−3’−(イソインドリン−2”−イル)−ドキソルビシン(Q3)であり;R−PがHであり、−R’が3−ピロリン−1−イルである場合は、Q4は3’−デアミノ−3’−(3”−ピロリン−1”−イル)−ドキソルビシン(Q4)であり;R−PがHであり、−R’が3−ピロリドン−1−イルである場合は、Q5は3’−デアミノ−3’−(3”−ピロリドン−1”−イル)−ドキソルビンン(Q5)であり;R−PがHであり、−R’が2−ピロリン−1−イルである場合は、Q6は3’−デアミノ−3’−(2”−ピロリン−1”−イル)−ドキソルビシン(Q6)であり;R−PがHであり、−R’が3−ピペリドン−1−イルである場合は、Q7は3’−デアミノ−3’−(3”−ピロリドン−1”−イル)−ドキソルビシン(Q7)であり;R−PがHであり、−R’が1,3−テトラヒドロ−ピリジン−1−イルである場合は、Q8は3’−デアミノ−3’−(1”,3”−テトラヒドロピリジン−1”−イル)−ドキソルビシン(Q8)である。
アルキル化作用を有する五員環中でダウノサミン窒素を組み込む化合物は、六員環中にダウノサミン窒素を組み込むその同族対照体よりも生体内で10〜50倍活性が高い(この様な組み合わせば、Q5及びQ7並びにQ6及びQ8)。
本発明の有利な態様では、式Q14−O−R−Pの物質中で、R−Pは水素以外のものである。Pが水素以外のものである場合には、即ちP1、P2及びP3であり、有利にはP1がLH−RHアゴニストキャリア、LH−RH拮抗物質キャリア又は短縮LH−RH類似体キャリアである場合には、P2は短縮ソマトスタチン類似体であり、P3はボンベシン拮抗物質である。
有利には、P1は、Aaa−Bbb−Ccc−Ser−Tyr−D−Lys(Xxx)−Leu−Arg−Pro−Ddd[式中、(Xxx)は水素又はジアミノ置換分、例えばA2Bu又はA2Prであり、その際、AaaがGlpである場合には、BbbはHisであり、CccはTrpであり、DddはGly−NH2であり、AaaがAc−D−Nal(2)、Ac−D−Phe又はAcD−Phe(4Cl)である場合には、BbbはD−Phe(4Cl)又はD−Pheであり、CccはD−Pal(3)及びD−Trpであり、DddはD−Ala−NH2であり;Aaa−Bbb−CccがAcである場合には、Dddは−NH−CH2−CH3である]であり;P2は、
[式中、AaaがD−Pheである場合には、BbbはTyrであり、CccはValであり、DddはThr又はTrpであり;AaaがD−Trpである場合には、BbbはPheであり、Ccc及びDddはThrである]であり、P3は、Aaa−Gln−Trp−Ala−Val−Gly−His−Leu Bbb−NH2[式中、Aaaは0、D−Tpi又はD−Pheであり、Bbbは(CH2−NH)Leu、(CH2−NH)Phe、(CH2−NH)Trp、(CH2−N)Tac又は(CH2−N)DMTacである]である。
LH−RH類似体を組み込む本発明の新規化合物中では、細胞毒性基Qは、式VII
[式中、mは1又は0であり、mが1の場合にはnは1又は2である、即ち(Xxx)はA2Bu又はA2Prであり、mが0の場合にはnは1又は2である、即ち(Xxx)はHであり、nは1である]で表わされるように、ジカルボキン酸スペーサーを介して、LH−RH類似体上のD−Lys側鎖又はそれに結合した(Xxx)基に結合している。
ソマトスタチン類似体を組み込む本発明の新規化合物中では、細胞毒性基Qは、式VIII
)で表わされるように、ジカルボキン酸スペーサーを介して、ソマトスタチン類似体のアミノ末端に結合している。
ボンベシン拮抗物質類似体を組み込む本発明の新規化合物中では、細胞毒性基Qは、式IX
で表わされるように、ボンベシン拮抗物質のアミノ末端に結合している。
本発明の特に有利な態様は、細胞毒性基としてのQ1及びQ6及びQ1(ドキソルビシン)又はQ6(2−ピロリノードキソルビシン)と14−O−エステル結合及びペプチドキャリアとカルボキサミド結合を形成するジカルボン酸スペーサーとしてのグルタル酸(n=3)を含有する様なペプチド結合体である。
本発明の最も有利な態様は、下記式:
の細胞毒性LH−RH類似体、下記式:
の細胞毒性ソマトスタチン類似体及び下記式:
の細胞毒性ボンベシン拮抗物質類似体である。
ビシナル又はディスジャンクトの、即ちα,β−又はα,γ−ヒドロキシアミンの窒素と部分的に飽和した複素環式環を形成する新規方法において、反応の第1工程は、無水の不活性有機極性、ノン−ヒドロキシル(中性)溶剤中で行い、有利にはジメチルホルムアミド中で、実質的に過剰の、有利には30倍過剰のハロアルデヒド、4−ヨードブチルアルデヒド及び5−ヨードバレルアルデヒドを使用するのが特に有利である。しかし、本発明はこれらに限定されるものではなく、沃素の代わりに臭素を使用してもよい。この反応及び引続く工程は室温で行うことができる。
塩基処理は、過剰の、有利には2〜4倍過剰の有機塩基を用いて実施する。第三アミン、例えばトリアルキルアミンがこの目的に好適である。
こうして形成した双環を、水の存在で有機酸で処理することのよって開環させて、ビシナル又はディスジャンクトなヒドロキシル基を放出させる。希水性トリフルオル酢酸を、有利には不活性有機溶剤、例えばアセトニトリル中で、使用することができる。揮発物を減圧下で除去し、過剰のハロゲン化合物をヘキサンで抽出し、残分をHPLCで精製することによって、生成物を精製する。
略 語
本発明のペプチド及びその誘導体の記載で、一般にペプチド化学業界で受け入れられており、IUPAC−IUB Commision on Biochemical Nomenclature[European J.Biochem.,138,9〜37頁(1984年]により推奨されているように、アミノ酸に慣用の略語を用いる。
個々のアミノ酸残基の略語は、アミノ酸の慣用名に基づく、例えば、Glpはピログルタミン酸、Hisはヒスチジン、Trpはトリプトファン等である。略語は、他に記載のない限り、アミノ酸のL異性体形を示す、例えばSerはL−セリンであり、D−LysはD−リジンである。
本発明における一般的ではないアミノ酸の略語は下記のものである:D−Nal(2)はD−3−(2−ナフチル)アラニンであり、D−Pal(3)はD−3−(3−ピリジル)アラニンであり、D−Phe(4Cl)はD−4−クロルフェニルアラニンである。
ペプチド配列は、慣用に従って記載し、その際、N−末端アミノ酸は左に、C−末端アミノ酸は右にある、例えばGlp−His−Trp。
式、Leu(CH2−NH)Leu−NH2はペプチド配列のC末端でロイシン及びロイシンアミド基の間の短縮ペプチド結合を表わす。
使用したその他の略語は下記とおりである:
A2Bu:ジアミノ酪酸
A2Pr:ジアミノプロピオン酸
BN:ボンベシン
BOP試薬:ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオルホスフェート
DIPEA:N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DM−DOX:ダウノサミン変性ドキソルビシン
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
DMTac:5,5−ジメチル−トリアゾリジン−4−カルボン酸
DOX:ドキソルビシン
Fmoc:9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
glt:−C(O)−CH2−CH2−CH2−C(O)−、グルタリル
Glt2O:無水グルタル酸
HOBt:1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HO−glt−OH:グルタル酸
HOSu:N−ヒドロキシスクシンイミド
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
TFA:トリフルオル酢酸
Tac:チアゾリジン−4−カルボン酸
Tpi:2,3,4,9−テトラヒドロ−1H−ピリド[3,4−b]インドール−3−カルボン酸。
168型ダイオードアレイ検出器及びシステム ゴールド クロマトグラフィー ソフトウェア(System Gold chromatography software)(Beckman)を具備したベックマン分析HPLCシステムを用いて、化学反応をモニターし、本発明の化合物の純度を検査した。使用したカラムはDynamax C−18(250×4.6mm;孔の大きさ:300Å;粒度:12μm)であった。化学反応をモニターするために、(i)水中の0.1%TFA及び(ii)70%水性アセトニトリル中の0.1%TFAの2種類の成分から成る溶剤系を1分間に1%(ii)増加する直線傾斜法で使用した。系は純粋な対照に関してアイソクラチックモードで使用した。
ベックマンモデル342半調製HPLC系を使用して、本発明の化合物の単離及び精製を行った。カラムはアクアポール オクチル(Aquapore Octyl)(250×10mm;孔の大きさ:300Å;粒度:15μm)であった。溶剤系は前記分析HPLC用に記載したものと同じであった。
分 析
Bruker ARX300 NMR分光計(300MHz 1H周波数、75MHz 13C周波数)及びエレクトロスプレー 質量分光計Finnigan−MAT TSQ7000を使用して、ドキソルビシン誘導体の構造を同定した。
ペプチドキャリアの合成
本発明のペプチドは製薬的に認容性の無毒の塩、例えば酸付加塩の形で投与されることが多い。このような酸付加塩の例は、塩化水素塩、臭化水素塩、硫酸塩、燐酸塩、フマル酸塩、グリコン酸塩、タンニン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、トリフルオル酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、現珀酸塩、アルギン酸塩、パモエート、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。活性成分を錠剤形で投与する場合には、錠剤は、結合剤、例えばトラガント、コーンスターチ又はゼラチン、崩壊剤、例えばアルギン酸及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含む製薬的に認容性の希釈剤を含有することができる。
液体形の投与が望ましい場合には、甘味及び/又は芳香剤を製薬的に認容性の希釈剤の一部として使用することができ、等張食塩水、緩衝剤溶液等中の静脈内投与が有効である。
薬剤組成物は、一般にペプチドを、慣用の製薬的に認容性のキャリアと結合させて含有する。一般に用量は、静脈内投与の場合には宿主の体重1kg当たりペプチド1〜約100ミクログラムであり、経口用量はこれよりはるかに高いであろう。全般的にこれらのペプチドを用いる患者の治療は一般にその他のLHRH類似体、ソマトスタチン及びドキソルビシン類似体を用いる臨床治療と同じように行われる。
これらのペプチドは哺乳類に静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内又は膣内に投与して、特異的な受容体と結合することのよって生物学的ホルモン効果を達成させることができる。LHRH類似体の場合には、これらの効果には生殖腺活性の可逆的な抑制が含まれ、ソマトスタチン類似体の場合には、胃腸機能の抑制が含まれる。有効用量は、投与形及び治療すべき哺乳類の詳細な種類により変わる。代表的な用量形の例は、体重1kg当たり約0.1〜2.5mgの範囲の用量が投与されることになる溶液である、ペプチドを含有す与る生理的食塩水溶液である。ペプチドの経口投与は固体形で投与してもよいし、液体形で投与してもよい。
本発明のペプチドキャリアの合成は、ペプチド化学業界の当業者に公知の任意の方法で実施することができる。好適な方法のまとめがM.ボ−デンスキー(Bodanszy)著、Principles of Peptide Synthesis(Springer−Verlag、ハイデルベルク、1984年)に記載されている。固体相ペプチド合成法は、J.M.スチュワート(Stewart)及びJ.D.ヤング(Young)著、Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chem.Co.、イリノイ州ロックフォード、1984年、第2版)の教科書及びG.バラニー(Barany)その他著、Int.J.Peptide and Protein Res.第30巻、705〜739頁(1987年)の概観に記載されている。
本発明で使用されるLH−RH類似体キャリアの合成は、米国特許第5258492号明細書の(Sandor Bajusz及びAndrew V.Schally、1993年11月2日)の実施例及びバジャツ(Bajusz)その他著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第85巻、1637〜1641頁(1988年)及び第86巻、6318〜6322頁(1989年)及びジャナキー(Janaky)その他著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第89巻、1023〜1027頁及び972〜976頁(1992年)の論文に詳説されている。
本発明で使用されるソマトスタチン類似体キャリアの合成は、米国特許第4650787号明細書(1987年3月17日、Andrew V.Schally及びRenz Z.Cai.)の実施例に詳説されている。合成の説明は、カイ(Cai)その他著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第83巻、1896〜1900頁(1986年)及びProc.Natl.Acad.Sci.USA第84巻、2502〜2506頁(1987年)にも記載されている。
本発明で使用されるボンベシン拮抗物質キャリアの合成は、コイ(Coy)その他著、J.Biol.Chem.第263巻、5056〜5060頁(1988年及び第264巻、14691〜14697頁(1989年)及びカイその他著Peptides第13巻、267〜271頁(1992年)及びProc.Natl.Acad.Sci.USA第91巻、12664〜12668頁(1994年)の論文に詳説されている。
次に実施例に付き、本発明に使用されるドキソルビシン誘導体の合成及び別のペプチドキャリアとの共役結合体の生成を詳説するが、本発明はこれにのみ限定されるものではない。
例1
N−Fmoc−DOX14−0−ヘミグルタレートの製造及び単離
DOX HCl塩、50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、Fmoc−OSu30mg(90μモル)を加え、次いでDIPEA31μl(180μモル)を加えた。3時間攪拌した後、分析HPLCにより評価したように、反応は完了した。溶剤をSpeed Vac高真空蒸発器中で蒸発乾固させ、残分をH2O中の0.1%TFAで摩擦することによって晶出させた。結晶を濾過し、冷エーテルで1回洗浄して痕跡の過剰Fmoc−OSuを除去した。デシケータ中で乾燥させた後、98%純粋なN−Fmoc−DOX、m=62mgが得られた。収率:94%。
中間生成物をGlt2O11.4mg(100μモル)と無水DMF1ml中でDIPEA26.1μl(150μモル)の存在で1晩反応させた。溶剤をSpeed Vac中で蒸発させ、残留油状物を0.1%水性TFA(v/v)で摩擦することによって固体にした。こうして得た粗生成物は、分析HPLCにより評価されるように、N−Fmoc−DOX14−O−ヘミグルタレート70%、未反応N−Fmoc−DOX20%及びその他の不純物10%を含有する。この粗生成物を更に精製せずにペプチドDOX共役結合体の製造に使用することができる。この粗生成物をTFA0.1%を含有する60%水性アセトニトリル20ml中に溶解させ、半調製HPLCにかけると、98%純粋なN−Fmoc−DOX14−O−ヘミグルタレート最終生成物45.7mgが得られた(収率:64%)。
例2
3’−デアミノ−3’−(ピロリジン−1”−イル)−ドデキソルビシンTFA塩(Q2)及びその14−O−ヘミグルタレート(AN−193)TFA塩の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、15倍過剰の1,4−ジヨードブタン171μl(1.3ミリモル)を加え、次いで3倍過剰のDIPEA45μL(260μモル)を加えた。反応混合物を室温で1晩攪拌した。16時間後、分析HPLCにより評価したように、反応は完了した。溶剤をSpeed Vacで蒸発させ、残留した油状物をH2O中の0.1%TFA3ml中に溶解させ、エーテルで抽出して、過剰の1,4−ジヨードブタンを除去する。次いで水性抽出物をHPLCにかけ、98%純粋なDOX誘導体m:41.6mgが得られた(収率68%)。
こうして得た3’−デアミノ−3’−(ピロリジン−1”−イル)−ドキソルビシンTFA塩(Q2)41.6mg(58μモル)をGlt2O1.2当量と無水DMF中で正確に例1に記載したようにして反応させた。収率は35%(16.9mg)であり、純度は98%であった。
例3
3’−デアミノ−3’−(イソインドリン−2”−イル)ドデキソルビシンTFA塩(Q3)の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、15倍過剰のα,α’−ジクロル−オルト−キシレン226mg(1.3ミリモル)を加え、次いで3倍過剰のDIPEA45μl(260μモル)及び触媒量のNaIを加えた。16時間後、溶剤をSpeed Vacで除去し、残分をの0.1%水性TFA3ml中に溶解させ、エーテル3mlで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をHPLCにかけた。精製後、98%純粋な最終生成物36mgが得られた(収率:55%)。
例4
3’−デアミノ−3’−(3”−ピロリン−1”−イル)−ドデキソルビシンTFA塩(Q4)の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、15倍過剰のシス−1,4−ジクロル−2−ブテン(Aldrich)136.8μl(1.3ミリモル)を加え、次いで3倍過剰のDIPEA45μl(260μモル)を加えた。16時間後、溶剤をSpeed Vacで除去し、残分を0.1%水性TFA3ml中に溶解させ、ヘキサン3mlで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をHPLCにかけた。精製後、98%純粋な最終生成物22.6mgが得られた(収率:37%)。
例5
1−クロル−4−ブロム−2−ブタノン(C4H6ClBrO)及び1−クロル−5−ブロム−2−ペンタノン(C5H8ClBrO)の製造及び単離
塩化3−ブロムプロピオニル100.8μl(1ミリモル)(Aldrich)をエーテル中の過剰のジアゾメタンと反応させた。1時間後エーテル性溶液を溶離させ、スポットをTLCで試験した。Merck Art No.5554によるシリカゲル60 F254で下塗りしたで薄層クロマトグラフィーアルミニウムシートを固定相として使用し、CHCl3:MeOH95:5(v/v)を移動相として使用した。スポット試験用に2,4−ジニトロフェニルヒドラジン試薬(Vogel:A textbook of Practical Organic Chemistry、1061頁、第3版、Longamans、ニューヨーク)を溶離後にTLCシートに噴霧した。こうして生成したジアゾメチルケトン誘導体はRf:0.3の黄色のスポットを示した。次いでエーテル性溶液をエーテル中の無水HClと反応させて、ジアゾメチルケトンを、所望の最終生成物である1−クロル−4−ブロム−2−ブタノンに変えた。この生成物は、前記したものと同じ溶剤系中で及びスポット試験試薬を用いて、Rf:0.8の、オキソ化合物の特徴である黄色のスポットを示した。溶剤蒸発後、粗生成物を、シリカゲル15gを充填したカラム(長さ15cm、直径2.5cm)(Merk、等級9385、230〜400メッシュ、孔の大きさ60Å)に入れた。液体移動相は純粋なCHCl3であった。所望の最終生成物(前記スポット試験により確認)を含有するフラクションを混合し、蒸発乾固させた。M=1.5g、透明な油状物が得られた。収率:80%。
1−クロル−5−ブロム−2−ペンタノンは、塩化4−ブロムブチルから1−クロル−4−ブロム−2−ペンタノンに関する記載と同じ方法であるが、塩化3−ブロムプロピオニルに代わりに塩化4−ブロムブチリルを用いて製造した。収率:80%。
例6
3’−デアミノ−3’−(3”−ピロリドン−1”−イル)ドキソルビシンTFA塩(Q5)の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、15倍過剰の1−クロル−4−ブロム−2−ブタノン241mg(1.3ミリモル)を加え、次いで3倍過剰のDIPEA45μl(260μモル)を加えた。16時間後、溶剤をSpeed Vacで除去し、残分を0.1%水性TFA3ml中に溶解させ、ヘキサン3mlで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をHPLCにかけた。精製後、98%純粋な最終生成物20.6mgが得られた(収率:33%)。
例7
3’−デアミノ−3’−(3”−ピペリドン−1”−イル)ドキソルビシンTFA塩(Q7)の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、15倍過剰の1−クロル−5−ブロム−2−ペンタノン260mg(1.3ミリモル)を加え、次いで3倍過剰のDIPEA45μl(260μモル)を加えた。16時間後、溶剤をSpeed Vacで除去し、残分を0.1%水性TFA3ml中に溶解させ、ヘキサン3mlで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た粗生成物をHPLCにかけた。精製後、95%純粋な最終生成物18mgが得られた(収率:28%)。
例8
4−ヨードブチルアルデヒド及び5−ヨードバレルアルデヒドの精製及び単離
2−(3−クロルプロピル)−1,3−ジオキソラン(4−クロル−n−ブチルアルデヒドエチレンアセタール)1.3ml(10ミリモル)(Fluka)をNaI30g(200ミリモル、20倍過剰)を含有するアセトン200ml中に溶解させた。溶液を24時間還流させ、次いで蒸発乾固させた。エーテル100mlを使用して、有機物質を無機固体残分から抽出した。次いでエーテル性溶液をH2O50ml、5%水性Na2S2O350ml溶液で洗浄し、H2O50mlで3回洗浄した。エーテルを真空中で除去し、残留した油状物を50%水性酢酸3ml中に溶解させた。1時間後、エーテル100mlをこの溶液に加え、酢酸並びにエチレングリコールをH2O50mlで3回洗浄することによって除去した。主生成物を、純CHCl3中でTLCでRf:0.8で溶離させた。アルデヒドファンクションのために使用されるスポット試験は例5でケトン用に記載したものと同じであった。次いでエーテルを除去し、黒色油状物をシリカゲル15gを充填したカラム(長さ15cm、直径2.5cm)(Merk、等級9385、230〜400メッシュ、孔の大きさ60Å)に入れた。液体移動相はCHCl3であった。所望の最終生成物(前記スポット試験により確認)を含有するファンクションを混合し、蒸発乾固させた。黄色油状物1.6gが得られた。収率:80%。
5−ヨードバレルアルデヒドが、同様にして、2−(4−クロルブチル)−1,3−ジオキサラン(5−クロル−n−バレルアルデヒド エチレン アセタール)(Fluka)から出発して得られた。黄色油状物1.65gが得られた。収率:80%。
例9
3’−デアミノ−3’−(2”−ピロリドン−1”−イル)ドキソルビシンTFA塩(Q6)の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、30倍過剰の4−ヨードブチルアルデヒド515mg(2.6ミリモル)を加え、次いでDIPEA45μl(260μモル、3倍過剰)を加えた。1時間後、氷酢酸100μlを反応混合物に加え、次いでこれを70%水性アセトニトリル中の0.1%TFA5mlに滴加した(HPLC系の溶剤ii)。この溶液を0.1%TFA溶液2mlで希釈し、次いでアセトニトリルをSpeed Vac中で除去した。残留した溶液をヘキサンで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た生成物をHPLCにかけた。精製後、98%純粋な最終生成物52mgが得られた(収率:85%)。
例10
3’−デアミノ−3’−(1”,3”−テトラヒドロピリジン−1”−イル)ドキソルビシンTFA塩(Q8)の製造及び単離
DOX HCl塩50mg(86μモル)をDMF1ml中に溶解させ、30倍過剰の5−ヨードバレルアルデヒド552mg(2.6ミリモル)を加え、次いで3倍過剰のDIPEA45μl(260μモル)を加えた1時間後、氷酢酸100μlを反応混合物に加え、次いでこれを70%水性アセトニトリル中の0.1%TFA5mlに滴加した(HPLC系の溶剤ii)。この溶液を0.1%TFA水溶液2mlで希釈し、次いでアセトミトリルをSpeed Vac中で除去した。残留した溶液をヘキサンで抽出して、過剰のハロゲン化合物を除去した。こうして得た生成物をHPLCにかけた。精製後、98%純粋な最終生成物46mgが得られた(収率:75%)。
例11
DOXを含有する細胞毒性LH−RH作用物質類似体の精製及び単離
([D−Lys6(DOX14−O−glt)]LH−RH、Q1 14gL)
[D−Lys6]LH−RH60mg(37.5μモル)及びN−Fmoc−DOX14−O−ヘミグルタレート(例1参照)52mg(64%純粋、37.5μモル)をDMF1ml中に溶解させ、BOP試薬(Aldrich)22mg(50μモル)、HOBt13.5mg(100μモル)並びにDIPEA52μl(300μモル)を加えた。1時間室温で攪拌した後、反応は完了する。溶剤を蒸発させ、残留した油状物を酢酸エチル3mlで晶出させ、次いで酢酸エチル3mlで2回洗浄した。次いで粗固体物質をDMF3ml中に溶解させ、ピペリジン300μlを加えた。5分後、反応を氷浴中へ入れ、TFA300μl、ピペリジン700μl及びDMF2mlの混合物を添加することによって酸性にした。溶剤を蒸発させた後、残留した油状物を酢酸エチルで固体にする。こうして得た粗固体をTFA0.1%を含有する70%水性アセトニトリル1ml中に溶解させ(i)、0.1%水性TFA3mlで希釈し(ii)、半調製HPLCにかけた。98%純粋な最終生成物40mg(14.8μモルが得られた。収率:48%。
例12
2−ピロリノ−DOXを含有する細胞毒性LH−RH作用物質類似体の精製
[D−Lys6(2−ピロリノ−DOX14−O−glt)]LH−RH、Q6 14gL)
Q1 14gL 11.2mg(5μモル)(例1参照)をDMF200μl中に溶解させ、4−ヨードブチルアルデヒド(例8)30mg(150μモル、30倍過剰)を加え、次いでDIPEA3μl(17μモル)を加えた。1時間後、反応は完了し(例9参照)、氷酢酸10μlをこの反応混合物に加え、これを次いで70%水性アセトニトリル中の0.1%TFA1mlに滴加した。この溶液を次いで0.1%水性TFAで希釈し、アセトニトリルを真空中で除去した。次いで残留した水溶液をヘキサン1mlで抽出し、HPLCにかけた。m:7.6mg、99%純粋な最終生成物が得られた。(収率:66%)。
例13
DOXを含有する細胞毒性ソマトスタチン類似体の精製及び単離
D−Phe−Cys−Tyr−D−Trp−Lys(Fmoc)−Val−Cys−Thr−NH220mg(14.5μモル)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1986、1986〜1990頁)及びN−Fmoc−DOX14−O−ヘミグルタレート(例1参照)20mg(64%純粋、14.5μモル)をDMF200μl中に溶解させ、BOP試薬(Aldrich)8.8mg(20μモル)、HOBt5.4mg(40μモル)並びにDIPEA17μl(100μモル)を加えた。1時間室温で攪拌した後、反応は完了した。溶剤を真空中で蒸発させた後、残分を酢酸エチルで結晶化させた。次いで固体物質をDMF1ml中に溶解させ、ピペリジン100μlを加えた。7分後に、反応を氷浴中へ入れ、TFA100μl、ピペリジン300μl及びDMF2mlの混合物を添加することによって酸性にした。溶剤を蒸発させた後、残留した油状物を酢酸エチルで固体にする。こうして得た粗固体をTFA0.1%を含有する70%水性アセトニトリル1ml中に溶解させ(i)、0.1%水性TFA3mlで希釈し(ii)、半調製HPLCにかけた。95%純粋な最終生成物9.7mg(5.1μモル)が得られた。収率:35%。
例14
2−ピロリノ−DOXを含有する細胞毒性ソマトスタチン類似体の精製
4mg、5μモル)をDMF100μl中に溶解させ、2−ピロリノ−DOX14−O−ヘミグルタレート(4.1mg、5μモル)を加え、次いでBOP試薬(4.4mg、10μモル)、HOBt(100μモル)及びDIPEA(50μモル)を加えた。2時間室温で攪拌した後、反応混合物をAcOH20μlにより酸性にし、TFA0.1%を含有する70%水性アセトニトリル500μlで希釈し、更に0.1%水性TFA700μlで希釈し、HPLCにかけた。99%純粋な最終生成物3.9mg(収率:40%)が得られた。
例9に記載した様にして、DOX14−O−ヘミグルタレートを4−ヨードブチルアルデヒドと反応させることによって2−ピロリノ−DOX14−O−ヘミグルタレートを製造した。
N−Fmoc−DOX14−O−ヘミグルタレートから、例11に記載したようにしてFmoc保護基を劈開することによってDOX14−O−ヘミグルタレートを製造した。
例15
DOXを含有する細胞毒性ボンベシン拮抗物質の精製及び単離
(DOX14−O−glt−Gln−Trp−Ala−Val−Gly−His−Leu(CH2−NH)Leu−NH2、Q1 14gB)
Gln−Trp−Ala−Val−GIy−His−Leu(CH2−NH)Leu−NH220mg(15.8μモル)(Int.J.Peptide Protein Res.38、1991、539〜600頁)及びN−Fmoc−DOX14−O−ヘミグルタレート(例1)22mg(64%純粋、15.8μモル)をDMF200μl中に溶解させ、BOP試薬(Aldrich)8.8mg(20μモル)、HOBt5.4mg(40μモル)並びにDIPEA17μl(100μモル)を加えた。1時間室温で攪拌した後、反応は完了した。溶剤を真空中で蒸発させ、残分を酢酸エチル3mlで結晶化させた。次いで固体物質をDMF1ml中に溶解させ、ピペリジン100μlを加えた。5分後、反応を氷浴中へ入れ、TFA100μl、ピペリジン300μl及びDMF2mlの混合物を添加することによって酸性にした。溶剤を蒸発させた後、残留した油状物を酢酸エチルで固体にした。こうして得た粗固体をTFA0.1%を含有する70%水性アセトニトリル1ml中に溶解させ(i)、0.1%水性TFA3mlで希釈し(ii)、半調製HPLCにかけた。98%純粋な最終生成物13.5mg(7.1μモルが得られた。収率:45%。
例16
2−ピロリノ−DOXを含有する細胞毒性ボンベシン拮抗物質類似体の精製及び単離
2−ピロリノ−DOX14−O−glt−Gln−Trp−Ala−Val−Gly−His−Leu(CH2−NH)Leu−NH2、Q6 14gB
Q1 14gB9.5mg(5μモル)(例15)をDMF200μl中に溶解させ、4−ヨードブチルアルデヒド(例8)30mg(150μモル、30倍過剰)を加え、次いでDIPEA3μl(17μモル)を加えた。1時間後、反応は完了し(例9参照)、氷酢酸10μlをこの反応混合物に加え、これを次いで70%水性アセトニトリル中の0.1%TFA1mlに滴加した。この溶液を次いで0.1%水性TFAで希釈し、アセトニトリルを真空中で除去した。次いで残留した水溶液をヘキサン1mlで抽出し、HPLCにかけた。98%純粋な最終生成物6mgが得られた。(収率:60%)。
試験管内における細胞毒性の測定
MXTエストロゲン−非依存性マウス乳癌セルラインは、Dr.Gunter Berndhart、University of Regensburg(ドイツ)から入手した。本発明の化合物の抗増殖活性を測定するために使用したその他のセルラインは全てAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手した。
類似体の活性を評価するために、マイクロ滴定プレートの比色細胞毒性分析をクリスタルバイオレットで細胞を染色することによる生物量の定量を基礎にして使用したが、これは細胞数の測定と非常に良好な相関関係を示す。(Reileその他;Anal.Biochem.187、262〜267頁、1990;Bernhardt G.その他、J.Cancer Res.Clin.Oncol.(1992)、118、35〜43;Spruss Th.その他、J.Cancer Res.Clin.Oncol.117、435〜443、1991;Gillies、R.J.Anal.Biochem.159、109〜113、1986;Kueng、W.その他;Anal.Biochem.、182 16〜19、1989)。
分析計画案
96−ウエルプレート中で細胞を播種してから1〜2日後に、培地を試験すべき化合物を含有する新しい培地及び対照培養用だけの新しい培地と交換した。種々の培養時間後に、細胞をグルタリックジアルデヒドで固定し、胎児の牛血清(FBS)下で4℃で実験終了まで保存した。細胞をクリスタルバイオレットで染色し、結合した染色を70%水性EtOHで抽出した。最適密度をEIA Reader(Bio−Tek Instruments)又はBiomek1000(Beckman)を用いて各々590nm又は600mnで測定する。各データ点は8つの培養ウエルの平均値を表わす。T/C値をT/C=(T−CO)/(C−CO)として算出するが、その際、T=処理した培養の光学濃度、C=対照(未処理)培養の光学濃度、CO=培養開始時(t=0)の培地の光学濃度である。
例17
DOXのダウノサミン変性誘導体の試験管内細胞毒性活性
第17−1表は、ドキソルビシン及びそのダウノサミン変性誘導体の、試験管内におけるMCF−7ヒト乳癌セルラインに対する効果を表わす。
反応性基を有する5員環中へ組み込まれたダウノサミンNを有する細胞毒性基は、3−ピロリドン−DOX(Q5)及び3−ピペリドン−DOX(Q7)並びに2−ピロリノ−DOX(Q6)及び1,3−テトラヒドロ−ピリジノ−DOX(Q8)の例として、6員環を有するその同族対照物よりも5〜50倍高い活性を有する。
細胞は、96ウエルプレート上の5%HI−DCC−FBS(熱不活性化した、デキストラン塗布した木炭処理胎児牛血清)を含有するIMEM媒体中で培養した。処理及び対照プレート中の相対細胞数を、クリスタルバイオレット染色法で測定し、T/C値として表わしたが、その際、T/C=(T−C0/C−C0)×100[T=処理培養の吸着、C=対照培養の吸着、C0=培養開始時(t=0)の培養の吸着。測定した吸着は細胞数に比例する]。
低いT/C値は、処理による癌細胞の生存の減少を示唆する。即ち、75は対照の100%と比較して細胞の75%生存又は25%抑制を示す。
例18
LH−RH拮抗ペプチド共役結合体Q1 14gL中のDOX及びLH−RH拮抗ペプチド共役結合体Q6 14gL中の超活性2−ピロリノ−DOX(Q6)の試験管内細胞毒性活性の完全な保持。
第18−1表は、試験管内におけるMCF−7ヒト乳癌セルライン及びMXTエストロゲン非依存性マウス乳癌セルラインの増殖に対する、ドキソルビシン及びそのダウノサミン変性誘導体、2−ピロリノドキソルビシン(Q6)の作用を、そのLH−RH拮抗類似体との共役結合体、[D−Lys6]LH−RH(各々Q1 14gL及びQ6 14gL)との比較して表わす。
MCF−7細胞を96ウエルプレート上で5%HI−DCC−FBSを含有するIMEM培地中で培養した。MXT細胞はL−グルタミン0.6g/l及びFBS10%を含有するRPMI1640培地中で培養した。第17−1と同様にして測定した。
例19
第19−1表は、本発明のDOXを含有するソマトスタチン類似体の試験管内細胞毒性活性が完全に保持されることを示している。
細胞を96ウエルプレート上で胎児牛血清10%を含有するRPMI1640培地中で恒温保持した。
例20
試験管内におけるCFPAC−1ヒト膵臓癌細胞の増殖に対する、ドキソルビシンを含有するボンベシン拮抗物質細胞毒性類似体の効果
第20−1表は、試験管内における本発明のDOXを含有するボンベシン拮抗物質類似体の細胞毒性活性が完全に保持されることを示している。
細胞を、24ウエルプレート上で胎児の牛血清10%を含有するIMDM培地中で恒温保持した。
ホルモン誘導体の保持結合特性
例21
キャリアペプチド、[D−Lys6]LH−RHと比較した、細胞毒性LH−RHアゴニスト類似体Q1 14gL([D−Lys6]LH−RHcarryingDOX及びQ6 14gL([D−Lys6]LH−RHcarrying2−ピロリノ−DOXのホルモン活性及び受容体結合力
第21−1表中、
*類似体に対するLH応答は、S.Vigh及びA.V.Schally、Peptides5、241〜247頁(1984年)に記載されているようにして、分散ラット下垂体細胞過溶融系で測定した。
**ラット下垂体LH−RH受容体及びヒト乳癌受容体に対する類似体の結合親和性は、B.Szokeその他、Peptides、第15(2)巻、359〜366頁(1994年)に記載されているようにして、ラジオリガンドとしての[125I]標識付き[D−Trp6]LH−RHを使用する拮抗結合実験で測定した。結合親和性は、ラジオリガンドの特異的結合を50%抑制するのに必要な非標識付き類似体の濃度であるIC50値で表わした。
例22
ソマトスタチン類似体は、Carisonその他著、Throtropin−releasing hormon stimulation and somatostatin inhibition of growth hormone secretion from perfused rat adenohypophyses Endocrinology、第94巻、1709(1974年)に記載されているように、灌流ラット下垂体からの成長ホルモン(GH)の分泌を抑制する。従って、この方法は本発明の細胞毒性ソマトスタチン類似体を、ホルモン活性に関して、その親キャリア分子と比較するために使用した。
ソマトスタチン類似体S−98−1
及びS−121
による、灌流ラット下垂体細胞からのヒト成長ホルモン放出ホルモン(hGH−RH(1−29)NH2)誘発成長ホルモン放出の抑制と各々その細胞毒性誘導体、Q1 14gS98-1(DOX14−O−glt−S−98−1)及びQ1 14gS121(DOX14−O−glt−S−121)との比較。
ラット下垂体灌流系中で、ソマトスタチン類似体をhGH−RH(1−29)NH21nモルと同時に、1nモル用量で3分間投与した。ソマトスタチン類似体の注入は更に6分間保持した。hGH−RH(1−29)NH21nモルの3分間投与に対するGH応答をソマトスタチン類似体灌流中(0分)及び投与中止後30、60及び90分後に測定した。データは第22−1表に記載した。
例23
細胞毒性ボンベシン類似体を用いる受容体結合試験
Bio−Rad Enzymobead Radio 沃素化キットを用いる[Tyr4]BN(Sigma)の放射沃素化及びモノ−沃素化[125I−Tyr4]BNの単離を前記したようにして行った(1)。標識付き[Tyr4]BNの結合及び細胞毒性ボンベシン拮抗物質類似体、Q6 14gBによる置換を融合性Swiss 3T3細胞(American Type Culture Collectionから入手)を使用して24ウエルプレート中でKrisその他の方法(3)の変法(2)で行った。播種してから3〜4日間後に、融合性細胞をHanks’Balanced Salt Solution(HBSS)で2回洗浄し、総容量0.5mlの結合緩衝剤[HEPES50ミリモル、牛血清アルブミン(BSA)0.1%、MgCl25ミリモル及びバシトラシン100μg/mlを有するDMEM、pH:7.4]中で、種々の濃度の非標識付き競合体(Q6 14gB又はBN)の不在又は存在下で、[125I−Tyr4]BN50pMと一緒に37℃で30分間恒温保持した。非特異的結合を非標識リガンド1μMの存在で測定した。BSA0.1%を含有する氷冷HBSS(pH:7.4)で3回洗浄した後、細胞をトリプシン0.05%/EDTA溶液0.53ミリモルを用いて分離し、管に移した。放射能をγ−カウンター(Micromedic Systems Inc、Huntsville、AL)を用いて測定した。結合データをMcPhersonによる放射リガンド結合分析プログラムを用いて評価した(4)。第23−1表に記載のKi値は、Cheng及びPrusoff(5)の式により算出した。
ホルモン共役結合体対細胞毒性ラジカル単独の比較有効性及び毒性
例24
エストロゲン非依存性MXTマウス乳癌(KS−49)に対する2−ピロリノ−DOX(Q6)、細胞毒性LH−RH作用物質類似体Q6 14gL(Q6 14−O−ヘミグルタレートに結合した[D−Lys6]LH−RH)及び(DOX)を用いる治療
細胞毒性ドキソルビシン誘導体、Q6及びその標的細胞毒性ペプチド共役結合体、Q6 14gL並びに公知抗腫瘍剤、DOXの腫瘍抑制作用を比較し、最適投与法及び無毒用量を決めるために、LH−RH受容体陽性MXT(3.2)ovex腫瘍片(1mm3)を雌のB6D2F1マウスに皮下移植した。移植してから1日後にマウスを5つの動物群に無作為に分け、治療を開始した。化合物を0.1%トリフルオル酢酸(pH2)中に溶解させ、腹腔内に投与した。群、治療法及び用量並びに平均生存時間を第24−1表に記載した。結果を第24−2表及び第1図にまとめた。
第24−2表は、Q6及び細胞毒性LH−RH類似体Q6 14gLを用いる治療のエストロゲン非依存性乳癌マウスの腫瘍容量及び生存に対する作用を表わしている。第24−2表から明らかなように、1、2、7、8、14及び15日目に投与したQ61.25nモル(群2)が平均生存時間17.4日で特性付けられる強い毒性を生じ、これは未治療対照群の生存より有意に短い。これに対して、同じ用量のQ6 14gL(群6)は平均生存時間30.8日であり、これは未治療対照群より有意に長い。Q6に対するQ6 14gLのより高い有効性は、群2(16日目で1065mm3)及び群6(31日目で863mm3)における平均最終腫瘍容量を比較することによっても実証される。
薬剤0.5nモルを3週間連続で1週間に5日間投与した別の治療方法でQ6とQ6 14gLを比較することによって、同様の結論が実証されうる。
ドキソルビシンは有毒用量(総量:1560nモル、平均生存:20日間)で腫瘍を撲滅させることができなかったが、Q6 14gLを無毒用量で用いる治療(総量:7nモル、平均生存:>31日間)によって、5匹中2匹の動物が腫瘍を生じることなしに生存していた。
例25
エストロゲン非依存性MXTマウス乳癌(KS−55)に対する(DOX)、細胞毒性LH−RH類似体T−107及びQ6 14gLの単一治療の効果
試験化合物:
Q1 14gL:[D−Lys6]LH−RHに結合したドキソルビシン14−O−ヘミグルタレート
T−107:[D−Lys6]LH−RHに結合したN−グルタリル−ドキソルビシン、Proc.Natl.Acad.Sci.第89巻、972〜976頁(1992年);及び
DOX
分析は下記のようにして行った:
最高許容用量を決め、効果を比較するために、MXT(3.2)ovex腫瘍片(1mm3)を雌のB6D2F1マウスに皮下移植した。移植してから1日後にマウスを5つの動物群に無作為に分け、それらを1回の腹腔内注射で治療した。群及び用量を第25−1表に記載する。この表には、各群に関して容量測定時に腫瘍を有していたマウスの数及び平均生存時間も記載してある。腫瘍容量変化を第2表に記載する。化合物を0.1%TFA(pH:2.0)中に溶解させた。腫瘍容量は10、13、17及び20日目に測定した。
第25−1表及び第2図から明らかなように、T−107(N−グルタリル−DOXに結合した[D−Lys6]LH−RH)は、850nモル/マウス20gの用量でこの腫瘍の増殖抑制において全く無効である。これに対して、Q1 14gL(14−O−グルタリル−DOXに結合した[D−Lys6]LH−RH)は、無毒用量650nモル/マウス20gで腫瘍増殖の著しい抑制を生じた(図)。DOX単独では650nモル/マウス20gの単一用量で高い毒性を示し(平均生存時間:13.6日間)、Q1 14gLより効果)が有意に少なかった(第2図)。
例26
エストロゲン非依存性MXTマウス乳癌(KS−47)に対する細胞毒性LH−RH類似体の効果
治療に使用される物質
先の実験では1日の用量20nモルで17日間ではQ2は腫瘍増殖に対する軽度の抑制作用しか有さず、40nモル用量では有毒であった(平均生存は14.6日間)。本発明の実験のために、は30nモルの1日の用量を選択し、これをQ2 14gL([D−Lys6]LH−RHに結合したQ2)、Q2(イロリジノ−ドキソルビシン)、[D−Lys6]LH−RH及び[D−Lys6]LH−RH+Q2の効果及び毒性と比較した。
MXT(3.2)ovex腫瘍片(1mm3)を雌のB6D2F1マウスに移植した。治療は移植してから1日後に開始し、1日1回腹腔内注射を12日間続けた。全ての群に、第26−1表に記載したように当モル量の化合物を投与した。腫瘍を10、14及び18日目に測定し、腫瘍容量を計算した。データを第26−1及び第3図に記載する。
ダウノサミン変性ドキソルビシン類似体Q2(ピロリジノ−DOX)30nモルの1日用量で治療することによって、腫瘍増殖に対する強力な抑制が生じた(腫瘍容量:14日目で144mm3対対照群の1391mm3)が、実験終了前に全動物を殺す強烈な毒性(平均生存17.9日間)を生じた。同様に、[D−Lys6]LH−RHと結合したQ2(混合物)も強力な抑制効果を生じた(腫瘍容量:14日目で80mm3)が、平均生存(18.5日間)は未処理対照群(23.1日間)より有意に短かった。Q2 14gL([D−Lys6]LH−RHと共役結合したQ2)を用いる治療の結果として、2匹の動物が死亡したが、1匹は16日目に、1匹は26日目に死亡した。生存していた8匹の動物から18日目の最後測定時に1匹だけが腫瘍が生じ、動物は全て健康に見えたが、後に全ての動物で腫瘍が発生し始めた。この群の平均生存は、対照群より有意に長かった(28.3日間)。D−Lys6]LH−RH単独を用いた治療では腫瘍増殖に効果がなかった。
この実験により、細胞毒性基Q2に対するQ2 14gLの高い効果及び低い末梢毒性が、標的キャリアLH−RH類似体に対する細胞毒性基の共役結合に起因することが実証される。
例27
アンドロゲン依存性ラットDunningR−3327−H前立腺癌の増殖に対する、2−ピロリノ−DOX(Q6)及び細胞毒性LH−RH作用物質類似体Q6 14gL(Q6 14−O−ヘミグルタレートに結合した[D−Lys6]LH−RH)の効果
ホルモン依存性DunningR3327−H前立腺癌を有する雄のコペンハーゲンラットを、2−ピロリノドキソルビシンに結合した作用物質[D−Lys6]LH−RHから成る黄体形成ホルモン放出ホルモン(LH−RH)の新規細胞毒性類似体である、Q6 14gLで処理した。最初の実験で、2−ピロリノドキソルビシンを50nモル/kgの濃度で、単独薬剤(Q6)として及び[D−Lys6]LH−RHとの非共役混合物として又はキャリアとの共役結合体([D−Lys6]LH−RH(Q6 14gL)として、投与した。基Q6単独又は[D−Lys6]LH−RHと混合して50nモル/kgの2番目の投与後に、ラットは全て全身毒性症状で死亡したが、細胞毒性LHRH共役結合体Q6 14gLで処理した動物は全て生き残った。全用量150nモル/kgのQ6 14gLを用いる治療5週間後に、実験開始時の8.35±1.7cm3の元の容量から4.47±0.8cm3に減少したが、対照群の腫瘍は増殖し続け、17.84±2.2cm3になった。Q6 14gLを用いる治療も腫瘍重量及び腫瘍障害を有意に減少させた。Q6及びQ6 14gLの効果及び毒性を比較するための第2の実験で、治療方法はQ625nモル/kg又はQ6 14gL25nモル/kg及び50nモル/kgの3種類の投与から構成されていた。治療を開始した場合に、全ての群の腫瘍容量は3.9〜4.5cm3であった。治療5週間後に、未治療動物では15.6±2.2cm3であるのに比較して、Q6 14gL50nモル/kgで治療したラットで腫瘍は2.3±0.51cm3にも減少したが、Q625nモル/kgはまだ有毒であり、Q6 14gL25nモル/kgを用いて得られた値(6.74±1cm3)と同様に、最終腫瘍容量6.76±1.4cm3へ減少させることができたできたにすぎなかった。試料の組織学的評価から、Q6 14gL治療群のみで有糸分裂細胞の有意な減少が示された。高結合力を有するLH−RH受容体が未治療Dunning腫瘍試料の膜から検出されたが、Q6 14gLで治療後にはLH−RHの結合部位は検出されなかった。AN−201及びQ6 14gLによる腫瘍増殖の抑制はEGF受容体の結合力の有意な減少と関係があった。第4〜6図により示されている様に、標的細胞毒性LH−RH類似体Q6 14gLは、ラットDunningR−3327−H前立腺癌の抑制を生じる有効な抗腫瘍剤である。本試験は、細胞毒性LH−RH類似体Q6 14gLが、組み込まれた抗新生物基(Q6)より遥かに毒性が少なく、腫瘍増殖の抑制作用が有意に高いことも示している。
例27に関する図の説明
第4図。実験I:作用物質[D−Lys6]LH−RH50nモル/kg及び細胞毒性LH−RH類似体Q6 14gL50nモル/kgの3種類の投与から成る治療の間の、ラットDunningR−3327−H前立腺癌移植を有する雄のコペンハーゲンラットにおける腫瘍容量。垂直線はダンカン新多重範囲試験による対照に対するSEMが*p<0.05;**p<0.01を示している。矢印により示される治療は1、8及び29日目に行う。†Q6を単独薬剤として、又は[D−Lys6]LH−RHとの非共役結合混合物として、用いて治療した動物は、第2週内に死亡した。この二つの群で8日目に記録した腫瘍容量が示されている。
第5図。実験II:DunningR−3327−H前立腺癌を有するラットにおける腫瘍容量に対する2−ピロリノドキソルビシン(Q6)25nモル/kg、細胞毒性LH−RH類似体Q6 14gL25nモル/kg及び50nモル/kgを用いる治療の効果。垂直線は対照に対するSEM*p<0.05;**p<0.01を示す。矢印により示される治療は3回、即ち1、8及び29日目に行った。
第6図。実験II:DunningR−3327−H前立腺癌を有するコペンハーゲンラットの体重に対する2−ピロリノドキソルビシン(Q6)25nモル/kg、細胞毒性LH−RH類似体Q6 14gL25nモル/kg及び50nモル/kgを用いる治療の効果。垂直線は対照に対するSEM*p<0.05;**p<0.01を示す。矢印により示される治療は3回、即ち1、8及び29日目に投与した。
例28
ヌードマウスにおけるOV−1063ヒト卵巣癌の増殖に対するドキソルビシン(DOX)及び標的細胞毒性LH−RH作用物質類似体Q1 14gL(DOX14−O−ヘミグルタレートに結合した[D−Lys6]LH−RH)の作用の比較
ヒトの上皮卵巣癌セルラインOV−1063は、57才の女性の卵巣の転移性乳頭状嚢腺癌からのものであった(Horowitzその他(1985年)Oncology42、332〜337頁)。OV−1063の細胞1千万個を3匹のヌードマウスに皮下注射して腫瘍を増殖させた。これら腫瘍片1mm3を生体内増殖抑制試験のために6匹の動物中に移植した。この実験の目的は、OV−1063のLH−RHの受容体の存在の結果としてLH−RHの細胞毒性共役結合体が、それが含有する細胞毒性基であるDOXよりも、効果が大であり、毒性が少ないことを実証することであった。従って細胞毒性LH−RH共役結合体の効果を、DOX、DOXとキャリア分子との混合物、キャリア単独及び未治療対照群の効果と比較した。注射は全て腹腔内に行った。化合物は水中の0.9%塩化ナトリウム(食塩水)中に溶解させた。
平均腫瘍の大きさ約15mm3のマウスを動物9匹の6群に分け、腫瘍移植7日後に次の治療を行った:群1、食塩;群2、700nモル/動物20gの用量のQ1 14gL;群3、413nモル/動物20gの用量(最高許容量、DOXのMDT)のQ1 14gL;群4、413nモル/動物20gの用量(MDT)のDOX;群5、700nモル/20gのDOX及び700nモル/20gの[D−Lys6]LH−RHの混合物;群6、700nモル/20gの用量のキャリア作用物質類似体[D−Lys6]LH−RH。
OV−1063の受容体分析により、LH−RHの高い親和結合部位の存在が判明した。
結果:第7図で明らかなように、腫瘍増殖の強力な抑制が413nモル/20g用量のQ1 14gLを用いる治療(群3)によって達成された。動物には重度の毒性兆候は観察されなかった。これに対して、413nモル/20gの同じ用量で投与されたDOXを用いる治療(12mg/kg、MTD、群4)によっては、実験終了時に生き残っていた3匹の動物で腫瘍増殖の有意な抑制は生じてなかった。毒性のために3匹の動物が5日目に、6匹の動物が9日目に死亡した。より高い用量(700nモル/20g、群2)では、Q1 14gLは腫瘍増殖抑制の非常に強力な抑制を生じた(第7図)。9匹の動物中2匹が毒性のために死亡し、1匹の動物が事故により死亡した。6匹の生き残った動物は実験終了時に約20%の体重減少から回復した。群6で同じ高用量(700nモル/20g)のDOXを700nモルの[D−Lys6]LH−RHと混合した。5日目までにこの群の動物は全て重度の毒性の結果死亡した。
結論:我々の結果から、上皮卵巣癌の細胞OV−1063上のLH−RHの受容体の存在により、標的細胞毒性LH−RH共役結合体Q1 14gLが、それが含有する細胞毒性基、ドキソルビシン(Q1)より毒性が低く、抗腫瘍作用が高いことが明白に実証している。
Claims (18)
- 式
Q14−O−R−P (I)
[式中、Qは、詳細な化学構造
を有し、ここで、−R−は−C(O)−(CH2)n−C(O)−であり及びn=3であり、R’は、NH2又は2−ピロリン−1−イルであり、Pは、P1、P2及びP3であり、
その際、P1は、式:Aaa−Bbb−Ccc−Ser−Tyr−D−Lys(Xxx)−Leu−Arg−Pro−Ddd(式中、(Xxx)は水素、A2Bu又はA2Prであり、その際、AaaがGlpである場合には、BbbはHisであり、CccはTrpであり、DddはGly−NH2であり、AaaがAc−D−Nal(2)である場合には、BbbはD−Phe(4C1)であり、CccはD−Pal(3)及びD−Trpであり、DddはD−Ala−NH2であり;Aaa−Bbb−CccがAcである場合には、Dddは−NH−CH2−CH3であり、基Q14−O−R−はD−Lys基の遊離アミノ基と又は(Xxx)の所に存在する場合には、A2Bu又はA2Prの遊離アミノ基の少なくとも1個とカルボキサアミド結合を形成する)のLH−RH類似体から成る群から選択したものであり、
P2は、式
(式中、AaaがD−Pheである場合には、BbbはTyrであり、CccはValであり、DddはThr又はTrpであり;AaaがD−Trpである場合には、BbbはPheであり、Ccc及びDddはThrであり、基Q14−O−R−はAaa基の末端アミノ基とカルボキシアミド結合を形成する)のソマトスタチンの類似体であり、
P3は、式:
Aaa−Gln−Trp−Ala−Val−Gly−His−Leu Bbb−NH2
(式中、Aaaはゼロ、D−Tpi又はD−Pheであり、Bbbは(CH2−NH)Leu、(CH2−NH)Phe又は(CH2−NH)Trp又は(CH2−N)Tacであり、基Q14−O−R−は、存在するAaa基の末端アミノ基又は存在しない場合にはGlnとカルボキシアミド結合を形成する)のボンベシン拮抗物質類似体である]の化合物、但し、R’がNH2であり、かつPがP2である化合物を除く。 - 式中のPがP1である請求項1に記載の化合物。
- 式中のPがP2である請求項1に記載の化合物。
- 式中のPがP3である請求項1に記載の化合物。
- 請求項1から17までのいずれか1項に記載の化合物及びその製薬学的に認容性のキャリアから成る医薬組成物。
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